CN111100941A - 用于具产毒潜能青霉菌的快速检测引物探针及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于具产毒潜能青霉菌的快速检测引物探针及方法，属于生物技术领域。本发明涉及用于潜藏型产毒青霉菌快速检测的寡核苷酸引物及探针，这是本发明的技术要点。本发明还涉及用于测定潜藏型产毒青霉菌的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括使用针对潜藏型产毒青霉菌快速检测的特异性寡核苷酸引物及探针。本发明还涉及针对潜藏型产毒青霉菌的特异性寡核苷酸引物及探针在检测食品中潜藏型产毒青霉菌的应用。使用本发明的PCR检测方法，能够简单、快速、特异且灵敏地检测出食品中是否含有潜藏型产毒青霉菌。

Description

用于具产毒潜能青霉菌的快速检测引物探针及方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于潜藏型产毒青霉菌快速检测的寡核苷酸引物及探针，用于测定潜藏型产毒青霉菌的实时荧光PCR检测方法，以及潜藏型产毒青霉菌的特异性寡核苷酸引物和探针在检测食品中潜藏型产毒青霉菌中的应用。

背景技术

青霉，一般是指青霉属（Penicillium），和曲霉属（AsPergillus）有亲缘关系，有二百几十种，代表种是灰绿青霉，从土壤或空气中很易分离。分枝成帚状的分生孢子从菌丝体伸向空中，各顶端的小梗产生链状的青绿—褐色的分生孢子，根据分生孢子顶端的膨大与否，与曲霉属（AsPergillus）相区别。自从弗莱明（A．Fleming，1929）发现特异青霉（Penicillium notatum）产生抑制细菌生长物质青霉素以来，已对该属菌的很多种进行了研究。特异青霉已被用于制造青霉素，但不具这种机能的种还很多，同时很多青霉甚至产生毒枝菌素。

青霉属菌分布很广，土壤、空气、腐败的有机物质及食品中到处都可以检测到。有些种的青霉是重要的工业用菌，能生产多种有机酸和抗菌素(如常见的青霉素等)，如淡黄青霉（Penicillium Luteum）、产黄青霉（P. chysogenum）等；有些种则是工业生产及视频的破坏者，是引起粮食霉变发热的主要菌，如纯绿青霉（P. viridicatum）、圆弧青霉（P. cyclopium）等；有些青霉会产生毒素，使粮食和食品带毒，还具有浓烈的气味，或分泌色素，造成粮食、食品、饲料变色变味。

青霉属能够产生毒素的霉菌主要有：黄绿青霉（P. citreoviride，又名：异青霉P. toxicarum）、桔青霉（P. citrimum）、圆弧青霉（P. cyclopium）、岛青霉（P. islandicum）、展开青霉（P. patulum，又名：荨麻青霉P. u-rticae）、纯绿青霉（P. viridicatum）、皱褶青霉（P. rugulosum）、产紫青霉（P. purpurogenum）、红青霉（P. vubrum）、扩展青霉（P. expan-sum）等等。由潜藏型产毒青霉菌产生的真菌毒素的化学、生物学和毒理学性质多种多样，其共同的毒性主要表现在致DNA损伤和细胞毒性两个方面。主要的毒性作用包括致癌作用、遗传毒性、致畸作用、肝细胞毒性、中毒性肾损害、生殖紊乱和免疫抑制等。

过去对食品中微生物检测的标准方法主要采用传统的形态学观察和生化反应，存在试验周期较长、操作步骤繁琐、灵敏度低、主观依赖性强等缺陷。此外，由于微生物的种类和生长环境十分复杂，导致有些微生物在培养过程中生长缓慢甚至无法人工培养，这也造成了传统检测方法的局限性。

现代生物技术以其方便、准确、迅速、简洁的特点，从基因水平上检测潜藏型产毒青霉菌，灵敏度更高、特异性更强，其结果为证明食品中是否含有潜藏型产毒青霉菌提供了真实、可靠的依据，已成为近年来世界各国的许多机构和学者致力的研究方向。但是，分子生物学技术在潜藏型产毒青霉菌快速检测的应用还处于初步探索阶段。

聚合酶链式反应(PCR)是通过扩增待测样品的DNA，使其能够从最初的微小数量增至足以达到检测限量的巨大数量。PCR方法已用于多种多样的基因检测中。实时荧光PCR在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析，使PCR技术从定性水平发展到定量水平。近几年，在分子生物学研究中，利用定量PCR对基因表达结果进行检测，获得了应用。由于其大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性、并能有效地减少实验过程中产生污染的危险，目前已广泛应用于各个领域。

目前，国内外少见报道能快速、简单、特异且灵敏地检测食品中潜藏型产毒青霉菌的方法。

因此，本领域需要一种快速、特异性好、灵敏度高的潜藏型产毒青霉菌的检测方法，进行食品中潜藏型产毒青霉菌的快速检测。

发明内容

本发明的一个目的在于，提供快速检测潜藏型产毒青霉菌的特异性寡核苷酸引物及探针。

本发明的另一个目的在于，提供快速测定潜藏型产毒青霉菌的实时荧光PCR检测方法。

本发明的再提供潜藏型产毒青霉菌的特异性寡核苷酸引物和探针在检测食品中潜藏型产毒青霉菌中的应用。

针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明以潜藏型产毒青霉菌的DNA为检测基础，根据编码潜藏型产毒青霉菌的细胞骨架蛋白—β-微管蛋白（beta-tubulin）区的基因为靶标基因设计引物及探针，利用实时荧光PCR法检测样品中的潜藏性产毒青霉菌。

在一个优选的实施方案中，所述编码β-微管蛋白（beta-tubulin）区序列的特异性引物对及探针序列为

Pen-F：5′- AGCTCGAGCGTATGAACGTCTAC-3′；

Pen-R：5′-ATGGTACCGGGCTCCAAATCGA-3′；

Pen-P：5′-ROX-TGGTCGGAATATYATGCTGCGTTGTTTGG-BHQ2-3′。所述PCR反映参数为：50℃预热 2 min，95 ℃预变性 10 min；后 40个循环为 95 ℃变性 15 s，60 ℃退火1 min。

实时荧光定量PCR即在常规PCR方法的基础上，加入荧光标记的探针或者荧光染料，随着PCR产物的积累，探针或染料发出的荧光信号增强，而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每产生一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR产物形成完全同步。因此可以实时监控整个PCR反应过程，并最终检测出待测样品的初始拷贝数，从而可检测待测食品中是否含有潜藏型产毒青霉菌。

本发明的实时荧光PCR检测方法采用完全闭管检测，无需PCR后处理，避免了交叉污染和假阳性。本发明的方法巧妙地运用了PCR技术的DNA高效扩增、核酸杂交的特异性和荧光检测技术的快速和敏感性，具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。使用本发明的实时荧光PCR检测方法，其简单、快速、特异且灵敏的特点适合用于潜藏型产毒青霉菌的快速检测。

附图说明

图1是显示实时荧光PCR检测潜藏型产毒青霉菌的引物探针组合特异性结果，其中荧光曲线1-2为潜藏型产毒青霉菌基因扩增曲线、3-10为曲霉菌、镰刀菌及空白对照扩增曲线。

图2是检测潜藏型产毒青霉菌特异性引物探针组合的灵敏度的结果，其中1-12为进行实时荧光PCR扩增的DNA溶液的浓度，依次为20 ng/µL、2 ng/µL、0.2 ng/µL、20 pg/µL、2 pg/µL、0.2 pg/µL、20 fg/µL、2 fg/µL、0.2 fg/µL、20 ag/µL、2 ag/µL以及空白对照，重复3次。

图3是食品样品检测结果，其中荧光曲线1为馒头中青霉菌扩增曲线，荧光曲线2-4分别为米粉、大米及空白对照(无菌水)的扩增曲线。

具体实施方式

通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下实施例。

实施例1

本实施例根据编码潜藏型产毒青霉菌的细胞骨架蛋白—β-微管蛋白（beta-tubulin）区的序列为靶标基因设计引物探针。按照Wizard^® SV Gel and PCR Clean-Up System的操作说明对青霉菌DNA进行PCR后的产物进行纯化、回收。通过PCR克隆测序获得编码潜藏型产毒青霉菌的细胞骨架蛋白—β-微管蛋白（beta-tubulin）区的序列，经NCBI与相关目的基因序列比对同源率达到98%。

PCR克隆测序得到的编码潜藏型产毒青霉菌的细胞骨架蛋白—β-微管蛋白（beta-tubulin）区的基因如下：

AGCTCGAGCG TATGAACGTC TACTTCACCC ATGTAAGTTG CGTGTCCAGT CAATGCCGGAATACTGAACT CGACTCTAAT CGATGGAACT GTTGTTTCTT AGGCCAGCGG TGACAAGTAC GTTCCCCGTGCCGTTCTGGT CGATTTGGAG CCCGGTACCA T

实施例2

本事实例为通过如下试验对潜藏型产毒青霉菌的引物和探针进行了特异性和灵敏度验证。所使用的用于检测潜藏型产毒青霉菌的特异性引物对及探针序列为：

Pen-F：5′- AGCTCGAGCGTATGAACGTCTAC-3′；

Pen-R：5′-ATGGTACCGGGCTCCAAATCGA-3′；

Pen-P：5′-ROX-TGGTCGGAATATYATGCTGCGTTGTTTGG-BHQ2-3′。在本实施例中，检测青霉菌作为阳性对照，曲霉菌和镰刀菌作为阴性对照并添加空白对照。

所使用的检测主要仪器：

微量移液器(10 µL 、100 µL 、1000 µL Eppendorf)、荧光定量PCR仪(ABI 7500Applied Biosystems，USA)、高速台式离心机(SIGMA 1-16，德国)、超微量分光光度计(ThermoFisher NanoDrop One，USA)等

检测主要试剂：

FastDNA™ SPIN Kit，购于MP Biomedicals公司；TaqMan™ Gene Expression MasterMix，购于ThermoFisher Scientific公司；Wizard^® SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega，USA)；引物及探针由上海生工生物工程有限公司合成等。

检测主要步骤：

1 菌株培养及模板DNA的制备

将实验菌株接活化后接种于查氏液体培养基中，于恒温摇床上25℃、120 r/min培养12d，真空抽滤后收集菌丝体，无菌超纯水洗涤数次并用无菌滤纸吸干水分，用于基因组DNA的提取。使用FastDNA™ SPIN Kit提取基因组DNA，并用超微量分光光度计测定DNA浓度，将DNA稀释至20 μg/mL，作为Real-time PCR扩增反应的DNA模板；将提取的DNA溶液用无菌水分别稀释为10 ng/µL、1 ng/µL、100 pg/µL、10 pg/µL、1 pg/µL、0.1 pg/µL的浓度，用于分析引物探针组合的绝对检测限；-20ºC保存备用。

2 实时荧光PCR检测所用引物和探针

Pen-F：5′- AGCTCGAGCGTATGAACGTCTAC-3′；

Pen-R：5′-ATGGTACCGGGCTCCAAATCGA-3′；

Pen-P：5′-ROX-TGGTCGGAATATYATGCTGCGTTGTTTGG-BHQ2-3′。

3 实时荧光PCR反应体系：

TaqMan Universal PCR Master Mix 12.5μL

探针(10 μM) 0.5μL

上游引物(10 μM) 1μL

下游引物(10 μM) 1μL

模板DNA 2μL

加ddH₂O至总体积为25μL

注：每次PCR检测均设立相应的空白对照(用配制反应体系的超纯水代替DNA模板，检测试剂是否受到污染)；

4 实时荧光PCR反应参数：

50℃ 预热2 min

95℃ 预变性10 min

95℃ 15 s

60℃ 1 min

40个循环。

注：不同仪器应将PCR各试剂及反应参数做适当调整。

如图1所示，利用实时荧光PCR特异性检测编码潜藏型产毒青霉菌的细胞骨架蛋白—β-微管蛋白（beta-tubulin）区序列时，青霉菌阳性对照均出现典型的扩增曲线，而其它样品：曲霉菌、镰刀菌及空白对照(ddH₂O)均未出现扩增曲线，充分说明本实验设计的引物探针对潜藏型产毒青霉菌样品表现较好的特异性。

为确定潜藏型产毒青霉菌特异性引物探针组合的绝对检测限，将提取的DNA溶液用无菌水分别稀释为20 ng/µL、2 ng/µL、0.2 ng/µL、20 pg/µL、2 pg/µL、0.2 pg/µL、20fg/µL、2 fg/µL、0.2 fg/µL、20 ag/µL、2 ag/µL的浓度，分别按上述条件进行实时荧光PCR扩增，结果如图2所示。潜藏型产毒青霉菌DNA浓度为20 ng/µL、2 ng/µL、0.2 ng/µL、20 pg/µL、2 pg/µL、0.2 pg/µL、20 fg/µL、2 fg/µL时有特异性扩增曲线，而浓度降至0.2 fg/µL以下时，无特异性扩增曲线出现。实验结果表明建立的实时荧光PCR检测方法能够检出潜藏型产毒青霉菌的含量为0.2 fg/µL。

实施例3

本发明的发明人通过如下试验对食品中的潜藏型产毒青霉菌进行了验证。使用FastDNA™ SPIN Kit提取食品样品的DNA进行实时荧光PCR反应，以确定所建立的实时荧光PCR方法是否具有可行性。

如图3所示，利用编码潜藏型产毒青霉菌的细胞骨架蛋白—β-微管蛋白（beta-tubulin）区序列时，阳性对照和其中一种食品样品均在基线以上典型的荧光扩增曲线，而其他样品及空白对照扩增曲线均在基线位置，表明该方法能有效检测出潜藏型产毒青霉菌。

Claims (3)

1.用于实时荧光PCR方法检测潜藏型产毒青霉菌的核苷酸引物对及探针，其中所述引物对选自以下引物对

Pen-F：5′- AGCTCGAGCGTATGAACGTCTAC-3′；

Pen-R：5′-ATGGTACCGGGCTCCAAATCGA-3′；

Pen-P：5′-ROX-TGGTCGGAATATYATGCTGCGTTGTTTGG-BHQ2-3′。

2.潜藏型产毒青霉菌的实时荧光PCR检测方法，所述方法包括使用权利要求1中任一项所述的特异性寡核苷酸引物对及探针。

3.权利要求1-2任一项所述的特异性寡核苷酸引物对及探针在检测食品中潜藏型产毒青霉菌的应用。

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