CN110512013B - 一种应用高分辨率熔解曲线法鉴别三种棒状杆菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种使用高分辨率熔解曲线法鉴别棒状杆菌菌种的方法，以及用于该方法的基因扩增引物。所述方法包括如下步骤：(1)以待检测样本的DNA为模板，扩增棒状杆菌的ssrA基因的区间序列；(2)使用高分辨率熔解曲线法获取步骤(1)的扩增产物的高分辨率熔解曲线；(3)对步骤(2)获得的熔解曲线进行判读。本发明提供的高分辨率熔解曲线法扩增条件简单，反应快速，具有优异的灵敏度和特异性，可特异性的检出纹带棒状杆菌、丙酸棒状杆菌和模拟棒状杆菌。

Description

一种应用高分辨率熔解曲线法鉴别三种棒状杆菌的方法
技术领域
本发明涉及高分辨率熔解曲线在纹带棒状杆菌(Corynebacterium striatum)、丙酸棒状杆菌(Corynebacterium propinquum)和模拟棒状杆菌(Corynebacteriumsimulans)鉴别诊断中的应用，属于分子生物学和微生物学领域。
背景技术
棒状杆菌属(Corynebacterium spp.)，属于放线菌目、棒状杆菌科，是一群革兰阳性菌，在自然界中广泛存在。该属种类繁多，过去人们主要关注白喉棒状杆菌，其致病力强，能产生强烈的外毒素而引起白喉。随着疫苗接种计划的有效实施，白喉棒状杆菌感染病例显著降低。然而，近年来由非白喉棒状杆菌(non-diphtheriae Corynebacterium species)导致的机会性感染、院内感染，甚至暴发感染逐渐增多。临床上主要表现为皮肤和软组织感染、呼吸道感染、尿路感染，有时引起严重的菌血症、脑膜炎、腹膜炎和心内膜炎等。值得注意的是，在这类快速新兴的棒状杆菌中，纹带棒状杆菌分离率最高，且大多为多重耐药菌，感染后可供选择的抗菌药物甚少，给临床治疗带来了很大的困难。
准确、及时地将棒状杆菌鉴定至种水平，对疾病诊断和治疗至关重要。目前对于棒状杆菌的鉴定主要依赖于传统的痰涂片镜检和生化试验。然而，以上两种方法耗时耗力，且重复性差，易产生错判。16S rRNA和rpoB测序准确性高，但较为费时且价格昂贵，增加了鉴定的时间和经济成本。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laserdesorption ionization–time of flight,MALDI-TOF-MS)简单、快速、有效，然而质谱在许多基层医院并未普及，且无法区分一些难以鉴别的棒状杆菌。事实上，一些棒状杆菌很难鉴定至种水平。例如，纹带棒状杆菌、丙酸棒状杆菌和模拟棒状杆菌具有相似的菌落形态和培养特性。纹带棒状杆菌和模拟棒状杆菌的16S rRNA基因同源性高达98％，其生化反应十分相似。此外，质谱法易将模拟棒状杆菌或丙酸棒状杆菌鉴定为纹带棒状杆菌。当前的诊断方法很少能够准确鉴定以上三种棒杆菌，并且大多数方法依赖于细菌的纯培养。因而，急需发展一种便捷、经济、灵敏和特异的诊断技术在种水平上区分纹带棒状杆菌、丙酸棒状杆菌和模拟棒状杆菌。
高分辨率熔解曲线(High-resolution melting,HRM)分析法是一种快速、低成本检测单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism,SNP)的方法。该测定法在PCR扩增后无需额外仪器设备，仅根据PCR产物解链特征，鉴别核酸序列差异。聚合酶链反应过程中，荧光饱和染料与双链DNA结合。当温度升高时，双链DNA解链，荧光强度降低。通过实时监测升温过程中荧光染料强度，可形成熔解曲线。核苷酸序列的GC含量、长度和SNP位点会影响熔解曲线的位置和形状。根据熔解曲线的差异，可有效区分不同菌种。该方法简单、快速，易于操作，提取核酸后仅需2小时即可解读结果。此外，HRM不限于细菌培养物，可直接检测从临床样品中提取的DNA。
考虑到痰涂片镜检、生化鉴定等方法耗时长、准确性低，16S rRNA检测成本高、MOLDI-TOF MS尚存偏差性及受限于细菌分离培养等问题，将HRM法用于棒状杆菌的快速检测十分必要。
发明内容
本发明的目的是为了弥补现有技术的不足，应用高通量熔解曲线分析方法，同时鉴别三种棒状杆菌。建立快速、高灵敏性和高特异性的核酸检测体系，用以进行纹带棒状杆菌、丙酸棒状杆菌和模拟棒状杆菌的快速鉴定。
基于上述发明目的，本发明针对棒状杆菌的保守序列ssrA基因，首次提供了能鉴别上述三种棒状杆菌的特异性引物，其核苷酸序列为：F：TCAGCGTGACTACGCCCTC(SEQ IDNO.1)，R：RCYTCGCCAGGGCTTCTC SEQ ID NO.2)。反向引物加入两个简并碱基。
本发明首先提供了一种使用高分辨率熔解曲线法鉴别三种棒状杆菌的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)以待检测样本的DNA为模板，扩增棒状杆菌的ssrA基因的区间序列，所述区间序列为纹带棒状杆菌ssrA基因的109-341bp，模拟棒状杆菌ssrA基因的109-341bp，或者丙酸棒状杆菌ssrA基因的111-350bp；
(2)使用高分辨率熔解曲线法获取步骤(1)的扩增产物的高分辨率熔解曲线；
(3)对步骤(2)获得的熔解曲线进行判读。
在一个优选的实施方案中，所述基因扩增为荧光定量PCR扩增。
在一个更为优选的实施方案中，所述PCR扩增的上下游引物序列分别为SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。
更为优选地，所述PCR的反应条件为：95℃预变性10min，95℃变性15s，63℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，升降温速度1.6℃/s。
在一个优选的实施方案中，所述高分辨率熔解曲线法的熔解程序为：95℃10s，60℃1min，0.025℃/s升温至95℃15s，60℃15s，以1.6℃/s速率升降温，同时连续监测荧光强度，得到荧光强度变化率-温度熔解曲线。
在一个更为优选的实施方案中，在所述高分辨率熔解曲线法中使用的荧光染料为Evagreen。
在又一个优选的实施方案中，所述棒状杆菌包括纹带棒状杆菌、丙酸棒状杆菌和模拟棒状杆菌。
更为优选地，在步骤(3)所述判读中，纹带棒状杆菌Tm值为88.910℃；丙酸棒状杆菌Tm值为88.438℃；模拟棒状杆菌Tm值为87.855℃。
其次，本发明还提供了一组用于高分辨率熔解曲线法鉴别棒状杆菌菌种中基因扩增引物的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子的序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
最后，本发明还提供了一种使用上述多核苷酸分子并以高分辨率熔解曲线法鉴别棒状杆菌菌种的检测方法。
本发明可用于细菌培养物和人体分泌物样本中纹带棒状杆菌、丙酸棒状杆菌和模拟棒状杆菌的检测，为疾病监测提供可靠依据。
本发明公开的高分辨率熔解曲线法具有快速、经济、便捷、敏感、特异等优点。
首先，本发明提供的方法可在2h内完成整个反应体系的扩增。HRM采用全密闭反应管检测与结果分析，无需进行PCR产物电泳检测，简化操作流程，降低实验检测成本，避免样品和环境的交叉污染。
其次，本发明提供的方法灵敏度高。对纹带棒状杆菌、丙酸棒状杆菌和模拟棒状杆菌的检测下限为100fg,灵敏度达100％。
第三，本发明提供的扩增方法具有很高的特异性。在标准反应条件下，运用HRM技术检测30种常见致病菌和机会致病菌时未出现非特异性扩增，阳性扩增仅出现在纹带棒状杆菌、丙酸棒状杆菌和模拟棒状杆菌，说明该检测体系的特异性良好。
附图说明
图1.三种棒状杆菌ssrA序列比对结果；
图2A.鉴别三种棒状杆菌的导数熔解曲线图；
图2B.鉴别三种棒状杆菌的标准化熔解曲线图；
图2C.鉴别三种棒状杆菌的熔解曲线差值图；
图3.高分辨率熔解曲线的灵敏度评价结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
本发明中使用的主要设备与试剂：
NanoDrop ND-1000分光光度计为美国Thermo Fisher Scientific公司产品。荧光定量PCR仪为ABI QuantStudio 6flex。DNA提取试剂盒(QIAamp DNA minikits)购于德国Qiagen公司，PCR反应体系混合物(2×Taqman PCR MasterMix)购于美国Thermo FisherScientific公司。饱和染料(Evagreen,20×in Water)购于美国Biotium公司。其余试剂均为常规市售试剂。
本发明中所使用的标准菌株及临床菌株：
纹带棒状杆菌、丙酸棒状杆菌和模拟棒状杆菌的标准菌株购于德国微生物菌种保藏中心。棒状杆菌临床分离株收集自2016年1月到2018年3月北京、河北和广东地区。其他菌株来源于中国疾病预防控制中心传染病预防控制所保藏，具体信息见表3。
HRM引物设计：
棒状杆菌ssrA基因序列既具有保守性，又在不同种间具有多态性。利用这一特性，针对上述三种棒状杆菌ssrA基因的保守区域设计PCR引物。使用DNAStar软件中的Seqman对靶基因序列进行同源性分析，见图1。截取一致序列，使用软件CmSuite v8进行引物设计。引物经评估避免形成引物二聚体，同时经由NCBI进行BLAST比对，验证引物特异性。引物序列为：F：TCAGCGTGACTACGCCCTC，R：RCYTCGCCAGGGCTTCTC。
实施例1.HRM法检测体系的建立
1.提取基因组：按照Qiagen公司的DNA提取试剂盒说明书，提取纹带棒状杆菌、丙酸棒状杆菌、模拟棒状杆菌及其他细菌的基因组。利用NanoDrop ND-1000分光光度计检测DNA纯度和浓度，分装后置于-20℃保存备用。
2.反应在总体积为30μl条件下进行，反应体系见表1。在每次试验中，加入1μl的鼻疽诺卡氏菌基因组作为阴性对照。为排除污染，以1μl的无菌去离子水代替核酸，作为空白对照。
表1HRM法反应体系
Figure BDA0002191551610000051
Figure BDA0002191551610000061
3.扩增条件：在ABI QuantStudio 6flex上进行反应，PCR反应和HRM程序如表2：
表2PCR反应及HRM程序
Figure BDA0002191551610000062
4.结果判读：利用QuantStudioTM Real-Time PCR软件进行结果分析，基于熔解曲线、标准化图和差异图判断棒状杆菌菌种，见图2ABC。
实施例2.HRM检测体系的特异性
以2016年1月到2018年3月分离于北京、河北和广东地区的64株纹带棒状杆菌、3株丙酸棒状杆菌和2株模拟棒状杆菌临床分离株DNA为模板，利用高分辨率熔解曲线法鉴定三种棒状杆菌，其检测结果与传统分离培养法和16S rRNA鉴定结果一致，表明本发明方法能有效地用于三种棒状杆菌的区分鉴定。如图2A和图2B所示：纹带棒状杆菌Tm值为88.910℃；丙酸棒状杆菌Tm值为88.438℃；模拟棒状杆菌Tm值为87.855℃。
以鼻疽诺卡氏菌、绿脓杆菌、肺炎链球菌、肺炎军团菌、蜡样芽胞杆菌、空肠弯曲杆菌、大肠杆菌等常见的致病菌和条件致病菌DNA为模板，评价HRM反应体系的特异性。HRM法检测30种常见致病菌和机会致病菌时未出现特异性扩增，表明该检测体系的特异性较好，菌株背景见表3。
表3.用于检测的菌株背景信息
Figure BDA0002191551610000071
Figure BDA0002191551610000081
注：DSM：德国微生物菌种保藏中心；ATCC：美国微生物菌种保藏中心；ICDC：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所。
实施例3.HRM检测体系的灵敏度
使用去离子水对三种棒状杆菌(纹带棒状杆菌、丙酸棒状杆菌和模拟棒状杆菌)基因组DNA进行倍比稀释：10ng/μl,100pg/μl,10pg/μl,1pg/μl,100fg/μl,10fg/μl。以10倍系列稀释的三种棒状杆菌的标准菌株DNA为模板，以1μl的无菌去离子水代替核酸作为空白对照，进行HRM扩增。结果表明该方法对纹带棒状杆菌、丙酸棒状杆菌和模拟棒状杆菌DNA模板的检测下限为100fg，见图3。
实施例4.HRM法检测体系应用于临床痰标本的检测
1.临床标本：从北京某医院收集88份临床痰标本，每一份痰标本分为两份，一份用于分离培养，一份经4％氢氧化钠溶液预处理后，使用DNA纯化试剂盒(
Figure BDA0002191551610000082
GenomicDNA Purification Kit)，按操作说明提取核酸，用于HRM检测。
2.分离培养、MCDA法和HRM法检出率比较
使用分离培养法、HRM法以及本科室前期建立的多交叉恒温扩增技术(MCDA)对88份痰标本进行平行检测，结果见表4。培养阳性42例，阳性率为47.7％(42/88)。MCDA法扩增阳性59例，阳性率为67％(59/88)。HRM扩增阳性为63例，阳性率为71.5％(63/88)。42例培养阳性的样品中，利用MCDA法检测，有5例为阴性，其余为阳性；利用HRM法检测，除有1例为阴性外，其余均为阳性(表5)。
表4.分离培养法、MCDA法及HRM法检测人痰标本中的棒杆菌
Figure BDA0002191551610000091
注：NA：未检出。
表5.分离培养法、MCDA法与HRM法检测痰标本的差异性分析
Figure BDA0002191551610000092
3.分离培养、MCDA法和HRM法检出效能的比较
痰标本阳性(true positive)的定义：1)培养阳性且16S rRNA鉴定为纹带棒状杆菌、丙酸棒状杆菌或模拟棒状杆菌。2)培养阴性，但HRM法和MCDA法均为阳性。痰标本阴性(true negative)：培养、HRM法和MCDA法均为阴性。
按照以上标准，88份痰标本中，64份(72.7％)标本为真阳性，24份标本为真阴性。培养法、MCDA法和HRM法灵敏度分别为65.6％(95％CI，52.6-76.7％)，92.2％(95％CI，82.0-97.1％)和98.4％(95％CI，90.5-99.9％)，结果见表6。三种方法的特异性均为100％(95％CI，82.8-100％)。HRM法和MCDA法的灵敏度均高于培养法(McNemar检验,P<0.001)。HRM法与MCDA法的Kappa一致性系数为0.893(95％CI,0.792to 0.995)，大于0.75，表示两种方法的一致性较好。综上，HRM法表现出比培养法更高的灵敏度，同时相对于MCDA法(仅能鉴别纹带棒状杆菌)，其可以同时鉴别纹带棒状杆菌、丙酸棒状杆菌和模拟棒状杆菌。
表6.分离培养、MCDA法和HRM法检出效能的比较
Figure BDA0002191551610000101
序列表
<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
<120> 一种应用高分辨率熔解曲线法鉴别三种棒状杆菌的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 棒状杆菌属(Corynebacterium spp)
<400> 1
tcagcgtgac tacgccctc 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 棒状杆菌属(Corynebacterium spp)
<400> 2
rcytcgccag ggcttctc 18

Claims (1)

1.一组用于高分辨率熔解曲线法鉴别三种棒状杆菌的引物对，其特征在于，所述引物对的序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
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