KR100756284B1 - 프리온 단백질 유전자, 그의 염기서열, 그들의 제조방법 및그들의 용도 - Google Patents

프리온 단백질 유전자, 그의 염기서열, 그들의 제조방법 및그들의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사슴과 동물에서 만성 소모성 질병 (chronic wasting disease; CWD)을 유발하는 원인 물질인 프리온 단백질 (prion protein; PrP), 그의 유전자 및 그들의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 고라니 (Hydropotes inermis argyropus) 및 꽃사슴 (Cervus nipp)으로부터 유래한 프리온 단백질 및 그의 아미노산 서열, 상기 프리온 단백질의 유전자, 그의 염기서열 및 그의 제조방법 그리고 그들의 용도에 관한 것으로서, 상기 프리온 단백질 및 그의 유전자는 만성 소모성 질환 등의 진단 방법 및 형질전환 동물을 개발하고 이들과 관련된 전염성 해면상 뇌증 및 프리온 질병을 포함한 각종 질환들을 연구하는 데 널리 사용될 수 있다.
만성 소모성 질병, 고라니의 프리온 단백질 및 그의 유전자, 꽃사슴의 프리온 단백질 및 그의 유전자, 형질전환 동물, 만성 소모성 질환의 진단 방법

Description

프리온 단백질 유전자, 그의 염기서열, 그들의 제조방법 및 그들의 용도 {Prion protein gene and its nucleotide sequence, process for preparing the same and uses thereof}
도 1 은 본 발명의 고라니의 프리온 단백질 (PrP) 유전자를 중합효소 연쇄반응으로 증폭시킨 결과를 나타낸 것이다.
도 2 는 본 발명의 고라니의 프리온 단백질 유전자를 클로닝하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3 은 본 발명의 꽃사슴의 프리온 단백질 유전자를 중합효소 연쇄반응으로 증폭시킨 결과를 나타낸 것이다.
도 4 는 본 발명의 꽃사슴의 프리온 단백질 유전자를 클로닝하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 고라니 및 꽃사슴으로부터 유래한 만성 소모성 질병 (chronic wasting disease; 이하, "CWD"라고 약칭함)을 유발하는 프리온 단백질 (prion protein; 이하,"PrP"라고 약칭함) 및 그의 아미노산 서열, 상기 프리온 단백질의 유전자, 그의 염기서열 및 그의 제조방법 그리고 그들의 용도에 관한 것이다.
사슴에서 발생하는 만성 소모성 질병 (chronic wasting disease; CWD)은 사슴과에 속하는 동물인 엘크, 검은꼬리 사슴, 흰꼬리 사슴 및 기타 사슴류 동물에 발생하는 전염성 해면상 뇌증 (transmissible spongiform encephalopathy; TSE)의 일종이다. 현재 만성 소모성 질병 (CWD)은 미국, 캐나다 및 한국 등지에 제한적으로 발생한 것으로 보고되어 있다.
지금까지 만성 소모성 질병은 세포성 프리온 단백질 (PrPC)이 다른 동형 (isoform)의 변형 프리온 (PrPCWD)으로 변환됨으로써 발생하는 것으로 알려져 있다. 다시 말하면, 만성 소모성 질병에 감염된 사슴에서 유래한 변형 프리온 단백질 (PrPCWD)이 감염되지 않은 사슴에 침입하여 사슴 체내에 존재하던 정상 프리온 단백질이 변형되면서 만성 소모성 질병으로 발전한다는 것이다. 이러한 변형 프리온 단백질은 전염성 해면상 뇌증의 다른 원인체와 마찬가지로 단백질 분해효소를 처리해도 완전히 분해되지 않으며, 단백질 용해제에 의해서도 용해되지 않는 물리화학적 특징을 가진다.
또한, 양과 염소에 발생하는 스크래피 (scrapie)를 포함하여 만성 소모성 질병의 또 다른 특징은 수평 감염이 발생할 수 있다는 사실이다. 다시 말하면, 만성 소모성 질병에 감염된 사슴과 동거하는 다른 건강한 사슴들도 일정 기간이 경과하면 CWD 에 감염된다는 것이다. 이러한 수평 전파 경로는 전염성 해면상 뇌증에 걸린 다른 동물들에서는 전혀 관찰되지 않는다.
만성 소모성 질병에 관한 감염 연구는 크게 두 가지의 방법으로 수행된다고 볼 수 있다. 첫번째 방법은 CWD 에 감염된 사슴 또는 엘크의 뇌 유제를 다른 사슴이나 동물에게 직접 접종하여 질병을 유발시키는 것이고; 두번째 방법은 엘크 또는 사슴류 동물의 프리온 단백질 유전자를 발현하는 형질전환 마우스를 개발하여 이 실험용 마우스에 변형된 프리온 단백질 (PrPCWD)을 감염시켜 질병을 유발시키는 것이다. 사슴의 프리온 단백질을 발현하는 형질전환 마우스를 사용하는 방법은 감염 실험 과정이 용이하고 감염 기간을 단축시키는 등 여러 가지 장점을 가진다. 이와 같이 형질전환 마우스를 개발하여 기타 프리온 질병에 관한 연구를 수행하기 위해서는 먼저 프리온 단백질의 유전자를 확보하는 것이 필요하다.
고라니 및 꽃사슴은 만성 소모성 질병 (CWD)에서 배제될 수 없는 감염 가능성을 가지는 사슴과에 속하는 주요한 동물들이다. 그러나 현재까지 국내외에서 고라니 또는 꽃사슴의 프리온 단백질 및 그의 유전자를 분리, 정제하는 연구는 전혀 보고된 바가 없었다.
본 발명자들은 이러한 고라니 및 꽃사슴의 프리온 단백질 유전자의 DNA 염기 서열과 이로부터 유추한 아미노산 서열을 아메리칸 엘크의 프리온 단백질과 비교 분석하면, 만성 소모성 질병과 관련된 이들 프리온 단백질의 고유한 특성을 파악할 수 있고, 이를 통한 연구 성과가 사슴의 만성 소모성 질병의 기초적 연구 및 진단 기법 등의 개발에 중요한 자료를 제공할 것으로 판단하였다.
이에 본 발명자들은 만성 소모성 질병에 관한 진단 및 치료 방법을 개발하기 위하여 계속 연구한 결과, 우리나라에서 서식하는 고라니 (Hydropotes inermis argyropus) 및 꽃사슴 (Cervus nipp)으로부터 유래한 프리온 단백질 유전자를 분자 생물학적 방법으로 클로닝하고 이로부터 DNA 염기 서열 및 아미노산 서열을 확인한 다음, 상기 프리온 단백질의 유전자 및 아미노산 배열 구조를 아메리칸 엘크의 프리온 단백질 및 그의 유전자와 비교 분석하고 이들이 형질전환 마우스를 개발하고 전염성 해면상 뇌증 또는 기타 프리온 질병을 진단하는 데 유용한 점을 확인함으로써 본 발명을 성공적으로 완성하였다.
본 발명은 고라니 및 꽃사슴의 프리온 단백질 및 그의 아미노산 서열, 상기 프리온 단백질의 유전자, 그의 염기서열 및 그의 제조방법 그리고 그들의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고라니로부터 유래한 서열번호 1의 염기 서열 전부 또는 일부를 포함하는 프리온 단백질의 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 최적의 어닐링 온도에서 중합효소 연쇄반응을 진행하여 유전자를 증폭시키는 상기 프리온 단백질 유전자의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 고라니로부터 유래하고, 서열번호 2의 아미노산 서열 전부 또는 일부를 포함하는 프리온 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프리온 단백질 및 그의 유전자를 만성 소모성 질환 을 진단하는 방법 및 형질전환 동물을 개발하는 데 사용하는 용도를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 고라니로부터 유래한 프리온 단백질 (prion protein; PrP)의 유전자를 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 고라니, 학명 Hydropotes inermis argyropus 로부터 유래한 프리온 단백질의 유전자를 제공한다.
본 발명의 프리온 단백질 유전자는 서열번호 1의 염기 서열 전부 또는 일부를 포함한다 (서열목록 참조).
또한, 본 발명은 상기 고라니로부터 유래한 프리온 단백질의 유전자를 포함하는 재조합 클로닝 벡터를 제공한다.
본 발명에서는 상기 프리온 단백질 유전자를 클로닝 벡터에 삽입한 재조합 클로닝 벡터 및 이로 형질전환된 대장균을 Escherichia coli DH5@/pTAwd-prp로 명명하고, 한국생명공학연구원(KRIBB)에 2006년 03월 31일자로 기탁하였다 (수탁번호: KCTC 10929BP).
또한, 본 발명은 고라니 (Hydropotes inermis argyropus)로부터 프리온 단백질 유전자를 얻는 제조방법을 제공한다.
본 발명의 프리온 단백질 유전자는 고라니의 혈액 DNA 로부터 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트를 사용하고, 중합효소 연쇄반응을 94℃에서 5분 디네이처 과정 (denaturation)을 거쳐 94℃에서 45초간 디네이처, 50℃, 51.9℃, 54℃, 56.4℃, 58.8℃, 61.2℃, 63.6℃, 65.9℃, 68.1℃, 70℃에서 60초간 어닐링 (annealing), 72℃에서 90초간 익스텐션 (extension) 과정을 30회 반복한 다음, 마지막으로 72℃에서 5분간 익스텐션 과정으로 수행하여 얻는다.
본 발명은 어닐링 온도 50~61.2℃ 범위에서, 바람직하게는 어닐링 온도 58±1℃ 범위에서 중합효소 연쇄반응을 수행하여 유전자를 증폭시키는 프리온 단백질 유전자의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 고라니로부터 유래한 프리온 단백질을 제공한다.
본 발명의 프리온 단백질은 고라니 (Hydropotes inermis argyropus)로부터 유래하고, 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열 전부 또는 일부를 포함하며, 더욱 바람직하게는 상기 프리온 단백질의 아미노산 서열 중 100번 아미노산 잔기가 아스파라진, 187번 아미노산 잔기가 알라닌 및/또는 226번 아미노산 잔기가 글루타민인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 상기 프리온 단백질 및 그의 유전자를 만성 소모성 질환 등의 진단 방법 및 진단용 키트에 사용하는 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프리온 단백질의 유전자를 이로 형질전환 시킨 형질전환 동물을 제작하는 데 사용하는 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 만성 소모성 질병 및 이와 관련된 해면상 뇌증 및 프리온 질병 등을 포함한 각종 질환들을 연구하는 데 널리 사용될 수 있다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 고라니 (및 꽃사슴)로부터 혈액 DNA 의 추출
고라니 (Hydropotes inermis argyropus) 및 꽃사슴으로부터 DNA 를 추출하기 위하여, 혈액을 재료로 사용하였고, 제너랄 바이오사 (General Bio, Korea)의 혈액 추출 키트를 선택하여 제조사에서 추천하는 방법에 따라 다음의 과정을 수행하였다.
먼저 -70℃ 에 동결 보존된 고라니 및 꽃사슴의 혈액을 200 ㎕ 취하고 20 ㎕의 프로테아제 K (20 ㎎/㎖)를 첨가하였다. 그 다음 200 ㎕의 BL 완충용액을 첨가하고 볼텍싱 (vortexing)한 후 56℃에서 10분 동안 배양 (incubation)하였다. 샘플은 다시 스핀 컬럼 (spin column)에 분주하고 상온에서 1분 동안 8,000 rpm 으로 원심분리하였다. 다시 상기 컬럼을 통과한 액체를 버리고 600 ㎕의 BW 완충용액을 분주한 후 상온에서 1분 동안 1,3000 rpm으로 원심분리를 실시하였다. 그 다음 상기 컬럼을 통과한 액체를 버리고 700 ㎕의 TW 완충용액을 분주한 후 실온에서 1분 동안 1,3000 rpm으로 원심분리를 실시하였다. 그 다음 깨끗한 1.5 ㎖ 원심분리용 튜브에 컬럼을 장착시키고 200 ㎕의 AE 완충용액을 분주한 후 실온에서 2분 동안 배양시켰다. 반응이 끝난 후 실온에서 1분 동안 1,3000 rpm으로 원심분리를 하여 DNA가 용해된 용액을 획득하고, 다음 실험에 사용되기 전까지 -20℃에서 보관하였다.
실시예 2. 프리온 단백질 (PrP) 유전자의 증폭
본 발명은 고라니 및 꽃사슴의 프리온 단백질 (PrP) 유전자를 증폭시키기 위하여, 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction; PCR)을 다음과 같이 수행하였다. 여기서는 아메리칸 엘크의 프리온 단백질 유전자 {진뱅크 (GenBank) 수탁번호: AF016227}를 기초로 하여 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트를 제작하여 사용하였다.
정방향 프라이머 (1-21): 5'-ATG GTG AAA AGC CAC ATA GGC-3'
역방향 프라이머 (750-771): 5'-CTA TCC TAC TAT GAG AAA AAT G-3'
중합효소 연쇄반응은 94℃에서 5분 동안 디네이처 과정 (denaturation)을 실시한 후 다음과 같은 조건 하에서 30회 과정을 반복하며 수행하였다. 구체적으로 94℃에서 45초간 디네이처, 50℃, 51.9℃, 54℃, 56.4℃, 58.8℃, 61.2℃, 63.6℃, 65.9℃, 68.1℃, 70℃에서 60초간 어닐링 (annealing), 72℃에서 90초간 익스텐션 (extension)을 실시하였다. 마지막으로 72℃에서 5분간 익스텐션을 실시하여 중합효소 연쇄반응을 끝마쳤다.
그 결과, 50~61.2℃의 어닐링 온도에서 771 bp의 프리온 단백질 유전자가 성공적으로 증폭된 것을 확인할 수 있었다 (도 1 참조). 또한, 상기 58.8℃의 아닐링 온도에서 가장 명확한 PCR 산물이 증폭되었기 때문에 고라니의 PrP 유전자 증폭 을 위한 최적의 PCR 어닐링 온도는 58±1℃로 판명되었다.
도 1 은 본 발명의 고라니의 프리온 단백질 (PrP) 유전자를 중합효소 연쇄반응으로 증폭시킨 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로 고라니의 혈액에서 채취한 DNA 를 이용하여 PCR 을 수행한 다음 1.5% 아가로스 젤에서 전기영동을 한 결과, 771 bp의 PrP DNA 가 증폭된 것을 확인할 수 있었다. 상기 아가로스 젤 상에 아닐링 온도를 표시하였고, 이 때 레인 1은 100 bp DNA 마커이고; 레인 2 ~ 레인 11은 50~70℃ 범위 내 아닐링 온도이며; 레인 12는 1 kb 사다리 DNA 마커이다.
또한 꽃사슴의 혈액에서 추출한 DNA 를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 상기와 동일한 과정으로 수행하였다. 그 결과, 고라니와 마찬가지로 50~61.2℃ 범위의 아닐링 온도에서 771 bp의 PrP 유전자가 성공적으로 증폭된 것을 확인할 수 있었다 (도 3 참조). 상기 58.8℃의 아닐링 온도에서 가장 명확한 PCR 산물이 증폭되었기 때문에 꽃사슴의 PrP 유전자 증폭을 위한 최적의 PCR 아닐링 온도도 역시 58±1℃인 것으로 판명되었다.
도 3 은 본 발명의 꽃사슴의 프리온 단백질 유전자를 중합효소 연쇄반응으로 증폭시킨 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, 꽃사슴의 혈액에서 채취한 DNA 를 이용하여 PCR 을 수행한 다음 1.5% 아가로스 젤에서 전기영동을 한 결과, 771 bp의 PrP DNA 가 증폭된 것을 확인할 수 있었다. 상기 아가로스 젤 상에 아닐링 온도를 표시하였고, 이 때 레인 1 ~ 레인 5은 50~58.8℃ 범위 내 아닐링 온도이고; 레인 6은 100 bp DNA 마커이며; 레인 7 ~ 레인 11은 61.2~70℃ 범위내 아닐링 온도이고; 레인 12는 1 kb 사다리 DNA 마커이다.
실시예 3. 프리온 단백질 유전자의 클로닝
본 발명은 상기 프리온 단백질의 유전자를 클로닝하기 위하여, 상기 실시예 2 에서 증폭시킨 고라니 및 꽃사슴의 PrP 유전자 산물을 PCR 정제 키트 (Qiagen사 제품)를 사용하여 제조사에서 추천하는 방법에 따라 정제하였다. 구체적으로, 250 ㎕의 PB 완충용액을 PCR 산물과 섞어준 다음 스핀 컬럼에 넣어 60초 동안 12,000 rpm에서 원심분리를 실시하였다. 상기 컬럼을 통과한 완충용액을 버리고 다시 0.75 ㎖의 PE 완충용액을 상기 컬럼에 넣은 다음 60초 동안 12,000 rpm에서 원심분리를 실시하였다. 다시 상기 컬럼을 통과한 완충용액을 버린 다음 용출 완충용액인 10 mM 트리스-HCl 50 ㎕ 를 컬럼에 넣어주고 12,000 rpm에서 60초 동안 원심분리를 실시하여 PCR 산물을 정제하였다.
그 다음, 정제된 PCR 산물 4 ㎕, TOPO TA 클로닝 벡터 (Invitrogen사 제품) 1 ㎕ 및 염 용액 (salt solution) 1 ㎕ 를 섞어주고 실온에서 1시간 동안 라이게이션 반응을 실시하였다. 그 결과 얻은 라이게이션된 산물을 미리 처리된 DH5a 세포 (competent cell)에 섞어 얼음에서 30분 동안 반응시킨 다음 꺼내어 42℃에서 60초 동안 열 쇼크 반응 (heat shock)을 시키고 다시 얼음에서 2분 동안 반응 (incubation)시켰다. 상기에서 미리 처리된 세포 (competent cell)에 250 ㎕의 SOC 배양액을 넣어준 후 37℃에서 진탕 배양기 (shaking incubator)를 사용하여 90분 동안 배양하였다. 그 다음 배양이 끝난 세포 200 ㎕을 취하여 앰피실린 (ampicillin) 100 ㎍/㎖이 첨가된 LB 아가 플레이트에 도포하고 37℃ 배양기에서 하루밤 동안 배양하였다.
실시예 4. 프리온 단백질 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA 의 분리, 정제
본 발명에서는 먼저 프리온 단백질 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA 를 얻기 위하여, 고라니 및 꽃사슴의 PrP 유전자를 획득한 것으로 추정되는 대장균 콜로니를 선별하여 앰피실린 (ampicillin) 100 ㎍/㎖ 이 포함된 1 ㎖의 LB 배양액 (LB broth)에 접종한 후 12시간 동안 37℃에서 진탕 배양하였다. 배양된 대장균 E. coli 를 12,000 rpm에서 1분 동안 원심분리한 다음 세포 상층액을 버리고 세포 펠렛 (pellet)을 취하였다. 그 다음 플라스미드 추출 키트 (plasid DNA extraction kit; Qiagen사 제품)를 사용하여 제조사에서 추천하는 방법에 따라 DNA 를 정제하였다.
구체적으로 세균 펠렛에 250 ㎕의 P1 완충용액 및 250 ㎕의 P2 완충용액을 넣어주고 약 6회 정도 튜브를 뒤집어 주면서 잘 혼합시켰다. 그 결과 얻은 반응 튜브에 350 ㎕ 의 N3 완충용액을 첨가한 다음 약 6회 정도 다시 튜브를 뒤집어 용액을 잘 혼합시킨 후 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리를 실시하였다. 상기에서 얻은 상층액을 취하고 이를 스핀 컬럼으로 옮긴 다음 12,000 rpm에서 60초 동안 다시 원심분리를 실시하였다. 상기 컬럼을 통과한 완충용액을 버리고 다시 0.75 ㎖의 PE 완충용액을 넣은 다음 12,000 rpm에서 60초 동안 원심분리를 실시하였다. 그 다음 스핀 컬럼에 50 ㎕의 EB 완충용액, 10 mM 트리스-HCl 을 넣고 12,000 rpm에서 1분 동안 원심분리를 실시하여 최종적으로 플라스미드 DNA를 정제하였다.
또한, 상기에서 정제된 플라스미드 DNA 를 제한효소 Eco RI 으로 절단하고 771 bp의 절단 산물이 확인된 클론을 고라니의 PrP 유전자를 포함하는 클론들로 선발하였다 (도 2 참조).
도 2 는 본 발명의 고라니의 프리온 단백질 유전자를 클로닝하여 확인한 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로 플라스미드 DNA 를 추출하여 제한효소 Eco RI 으로 절단한 다음 1.5% 아가로스 젤에서 전기영동을 실시하였다. 상기에서 771 bp 로 절단된 조각이 고라니 PrP 유전자로 확인되었으며, 이 때 레인 1은 100 bp DNA 마커이고; 레인 2 ~ 레인 11은 실험에서 얻은 클론들이며; 레인 12는 1 kb 사다리 DNA 마커이다.
또한, 꽃사슴의 PrP 유전자를 포함하고 있는 클론들도 상기에서 정제된 플라스미드 DNA 를 제한효소 Eco RI 으로 절단하고 이 과정에서 771 bp의 절단 산물이 확인된 클론이라고 판단하여 선발하였다 (도 4 참조).
도 4 는 본 발명의 꽃사슴의 프리온 단백질 유전자를 클로닝하여 확인한 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로 플라스미드 DNA 를 추출하여 제한효소 Eco RI 으로 절단한 다음 1.5% 아가로스 젤에서 전기영동을 실시하였다. 상기에서 771 bp 로 절단된 조각이 꽃사슴 PrP 유전자로 확인되었으며, 이 때 레인 1은 100 bp DNA 마커이고; 레인 2 ~ 레인 11은 실험에서 얻은 클론들이며; 레인 12는 1 kb 사다리 DNA 마커이다.
본 발명에서는 상기 프리온 단백질 유전자를 TOPO TA 클로닝 벡터에 삽입한 재조합 클로닝 벡터 및 이로 형질전환된 대장균을 Escherichia coli DH5@/pTAsd-prp로 명명하고, 한국생명공학연구원(KRIBB)에 2006년 03월 31일자로 기탁하였다 (수탁번호: KCTC 10928BP).
실시예 5. 프리온 단백질 유전자의 확인 및 분석
본 발명에서는 상기 프리온 단백질의 유전자를 확인, 분석하기 위하여, 실시예 4 에서 선발하여 정제한 재조합 벡터 DNA 를 제한효소 Eco RI 으로 절단하였다. 구체적으로 10 ㎕의 플라스미드 DNA, 2 ㎕의 10× 반응 완충용액, 0.5 ㎕의 Eco RI 효소, 7.5 ㎕의 증류수를 섞어준 다음 37℃ 2시간 동안 소화시켰다. 반응이 끝나고 얻은 재조합 벡터 DNA 는 1.5% 아가로스 젤 상에서 100 volt로 30분 동안 전기영동한 다음 절단된 771 bp 크기의 DNA 를 확인하는 과정을 반복하여 본 발명의 고라니 또는 꽃사슴의 PrP 유전자를 보유하는 클론인 것을 재확인하였다.
상기 PrP 유전자를 보유한 것으로 최종 확인된 클론들은 ㈜ 마크로젠에 송부하여 자동 염기서열 분석기로 그의 DNA 염기 서열을 결정하였다. 또한, 이 유전자의 염기 서열에서 국제 생명과학 정보센터 (National Center for Biotechnology Information; NCBI)의 오픈 리딩 프레임 (open reading frame; ORF) 추적 프로그램을 이용하고 기존의 확보된 DNA 염기 서열을 기초로 하여 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임의 구조를 분석하였다. 또한 상기 NCBI의 BLAST 프로그램을 이용하여 본 발명의 고라니 또는 꽃사슴의 PrP 유전자의 DNA 염기서열 및 아미노산 서열을 다른 사슴류 동물인 엘크의 것과 비교하여 분석하였다.
그 결과, 본 발명의 고라니의 PrP 유전자는 전체 DNA 염기 서열이 서열번호 1의 771 bp 로 구성된 것을 확인하였다 (서열목록 참조). 또한 상기 771 bp 의 고라니 PrP 유전자로부터 인코딩될 것으로 추측되는 단백질의 아미노산 서열을 분석한 결과, 고라니의 PrP 단백질은 서열번호 2의 총 256개의 아미노산으로 구성된 것을 확인하였다 (서열목록 참조).
또한, 본 발명의 꽃사슴의 PrP 유전자도 역시 전체 DNA 염기서열이 고라니와 마찬가지로 서열번호 3의 771 bp로 구성된 것을 확인하였다 (서열목록 참조). 또한 상기 771 bp의 꽃사슴 PrP 유전자 DNA 로부터 인코딩 될 것으로 추측되는 단백질의 아미노산 서열을 분석한 결과, 꽃사슴의 PrP 단백질도 서열번호 4의 총 256개의 아미노산으로 구성된 것을 확인하였다 (서열목록 참조).
실시예 6. 본 발명의 프리온 단백질 및 유전자의 DNA 염기서열 및 아미노산 서열의 비교 분석
본 발명의 프리온 단백질 및 유전자를 비교 분석하기 위하여, 고라니 및 꽃사슴의 PrP 단백질 및 그 유전자의 DNA 염기 서열 및 아미노산 서열을 아메리칸 엘크 (진뱅크, 수탁번호: AF016227)의 PrP 단백질 및 그 유전자의 DNA 염기 서열 및 아미노산 서열과 비교하였다.
그 결과, 고라니와 꽃사슴에서 PrP 유전자 간의 DNA 염기 서열의 동일성 (homology)은 98.3% 인 것으로 나타났다 (표 1 참조). 구체적으로, 총 771개의 DNA 염기들 중에서 758개의 DNA 염기들이 고라니와 꽃사슴에서 동일한 것으로 조사되었고, 고라니와 아메리칸 엘크 그리고 꽃사슴과 아메리칸 엘크 간에서 PrP 유전자의 DNA 염기 서열은 각각 98.4 및 99.6% 정도로 거의 동일하게 나타났다 (표 1 참조). 또한, 꽃사슴과 아메리칸 엘크가 고라니보다 더욱 동일한 염기 서열의 PrP 유전자를 보유하고 있는 것으로 판명되었다.
고라니, 꽃사슴 및 아메리칸 엘크 간의 PrP 유전자의 동일성
고라니 (%) 꽃사슴 (%) 아메리칸 엘크 (%)
고라니 771/771 (100) 758/771 (98.3) 759/771 (98.4)
꽃사슴 758/771 (98.3) 771/771 (100) 768/771 (99.6)
아메리칸 엘크 759/771 (98.4) 768/771 (99.6) 771/771 (100)
또한, 고라니와 꽃사슴에서 PrP 단백질 간의 아미노산 서열의 동일성은 99.2% 인 것으로 밝혀졌다. 구체적으로 총 256개의 아미노산들 중에서 254개의 아미노산들이 동일한 것으로 조사되었고 (표 2 참조), 고라니와 아메리칸 엘크 그리고 꽃사슴과 아메리칸 엘크 간에서 PrP 단백질의 아미노산 서열은 각각 98.8 와 99.6% 정도로 거의 동일하게 나타났다 (표 2 참조). 또한, 상기 PrP 유전자의 DNA 염기서열의 유사성과 동일하게 꽃사슴의 PrP 단백질이 아메리칸 엘크의 PrP단백질과 보다 더 유사한 것으로 판명되었다.
고라니, 꽃사슴, 아메리칸 엘크의 PrP 단백질의 동일성
고라니 (%) 꽃사슴 (%) 아메리칸 엘크 (%)
고라니 256/256 (100) 254/256 (99.2) 253/256 (98.8)
꽃사슴 254/256 (99.2) 256/256 (100) 255/256 (99.6)
아메리칸 엘크 253/256 (98.8) 255/256 (99.6) 256/256 (100)
특히, 아메리칸 엘크와 고라니의 PrP 단백질 중에서 서로 다른 아미노산 배열은 100번, 187번 및 226번 아미노산 잔기들에서 관찰되었다 (표 3 참조). 구체적으로 아메리칸 엘크의 PrP 단백질은 100번, 187번 및 226번 아미노산 잔기가 각각 세린 (serine), 발린 (valine) 및 글루탐산 (glutamic acid)인데 반하여, 이에 해당되는 고라니의 아미노산 잔기는 각각 아스파라진 (asparagine), 알라닌 (alanine) 및 글루타민 (glutamine)인 것으로 조사되었다.
또한, 아메리칸 엘크와 꽃사슴의 PrP 단백질 중에서 서로 다른 아미노산 배열은 226번 아미노산 잔기에서 관찰되었다 (표 3 참조). 구체적으로 아메리칸 엘크 PrP 단백질은 226번 아미노산 잔기가 글루탐산 (glutamic acid)인데 반하여, 이에 해당되는 꽃사슴의 아미노산 잔기는 글루타민인 것으로 조사되었다. 그러나, 만성 소모성 질병 (CWD)의 감염에서 중요하게 작용하는 것으로 보고된 아미노산 잔기로서, 132번 아미노산 잔기는 아메리칸 엘크, 고라니 및 꽃사슴에서 모두 메티오닌 (methionine)인 것으로 동일하게 확인되었다.
아메리칸 엘크, 고라니 및 꽃사슴의 PrP 단백질에서의 특정 아미노산 잔기들
아미노산기 100번 187번 226번
아메리칸 엘크 세린 발린 글루타민
고라니 아스파라진 알라닌 글루타민
꽃사슴 세린 발린 글루타민
상술한 바와 같이, 본 발명은 고라니 (Hydropotes inermis argyropus) 및 꽃사슴 (Cervus nipp)의 프리온 단백질 및 그의 유전자는 만성 소모성 질환 등의 진단 방법 및 진단용 키트 그리고 이로 형질전환된 실험용 동물을 개발하고 이들과 관련된 전염성 해면상 뇌증 및 프리온 질병 등을 포함한 각종 질환들을 연구하는 도구로서 널리 사용될 수 있다.
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  6. 아미노산 서열 중 100번 아미노산이 아스파라진, 187번 아미노산이 알라닌 및 226번 아미노산이 글루타민인, 고라니 (Hydropotes inermis argyropus)로부터 유래한 프리온 단백질.
  7. 제 6 항에 있어서,
    아미노산 서열 중 100번 아미노산이 아스파라진, 187번 아미노산이 알라닌 및 226번 아미노산이 글루타민인, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 프리온 단백질.
  8. 삭제
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염기서열

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