KR20180137108A

KR20180137108A - Lamp를 이용한 닭의 골격계 질환 유발 원인균 검출용 프라이머 및 그 용도

Info

Publication number: KR20180137108A
Application number: KR1020170076318A
Authority: KR
Inventors: 조성준; 송혜순; 배유찬; 권혁만; 박석찬; 이희수
Original assignee: 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장)
Priority date: 2017-06-16
Filing date: 2017-06-16
Publication date: 2018-12-27
Also published as: KR101938557B1

Abstract

본원은 육계에서 골격계 질환을 유발하는 포도상 구균(Staphylococcus spp); 장구균(Enterococcus spp); 대장균(Escherichia coli); 마이코플라즈마 시노비애(Mycoplasma synoviae); 및 조류 레오바이러스(avian reovirus)를 등온증폭 방식으로 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 이용한 상기 세균 및 바이러스들의 검출 방법을 개시한다. 본원에 따른 프라이머는 높은 민감도와 특이성은 물론 신속하게 감염원 혹은 오염원에서 병원체의 감염 혹은 오염 여부를 확인 할 수 있어 수의분야, 식품산업분야, 환경 및 인체분야에서 널리 이용될 수 있으며, 또한 필요한 경우 반응 종결 후 전기영동과 같은 별도의 처리 없이 바로 검출이 가능하여 편리성이 증대된다.

Description

LAMP를 이용한 닭의 골격계 질환 유발 원인균 검출용 프라이머 및 그 용도 {Primers for LAMP based detection of skeletal disease causing pathogen in chicken and its use}

본원은 LAMP 방식을 이용한 골격계 질환을 유발하는 세균 및 바이러스를 정확하고 신속하게 검출하는 기술과 관련된 것이다.

포도상구균은 육계의 골격계 질병을 유발하는 주요한 세균이며, 주로 황색포도상구균(S. aureus)에 의해 감염이 일어나지만 다른 종에 의한 감염도 종종 발생한다. 가금에서의 포도상구균 감염에 의한 임상증상은 감염문호에 따라 다양하게 나타나며, 가장 빈번한 감염문호는 뼈(bone), 건초(tendon sheath), 관절(joint) 등이다. 이외에도 피부, 복장낭(sternal bursa), 난황, 심장, 척추, 눈꺼풀, 고환 등에서도 감염을 일으키며 간과 폐에서 임프종을 유발하기도 한다. 뼈와 관절에 감염시 골수염과 관절염이 발생하여 파행(lameness)을 유발하고 난황에 감염시 제대염, 혈관내 감염시 광범위한 괴사, 피부에 감염시 괴저성 피부염을 유발하여 폐사에 이르게 하며, 발바닥에 감염시 닭발염증 혹은 지류증(bumblefoot)을 유발하여 파행에 이르게 하여 가금 농장에서 경제적 손실을 유발시킨다. 포도상구균은 다양한 시료, 다양한 환경에서 분리되는데 S. aureus 및 S. cohnii가 육계의 골격계 질병의 주요한 원인에 관여되는 것으로 조사되었다. 육계에서 검체에서의 감염원이나 사양 환경에서의 오염원의 정확한 원인을 파악하는 것은 사후 대책 마련과 예방을 위해 중요하다. 포도상구균 감염이나 오염을 확인하는 방법으로서 선택배지를 이용한 배양, 생화학적 성상이나 유전학적 성상을 이용하여 최종 동정하게 된다.

장구균 또한 육계에서 골격계 질병을 유발하는 주요한 원인균이다. 육계 뿐만 아니라 사양의 다양한 환경에서 분리되며 구형의 그람양성균에 속하는 세균이다. 단독, 쌍 혹은 짧은 사슬 모양의 집락 형태를 띠고 있으며 운동성이 없고, 아포를 형성하지 않는 통성 혐기성균이다. 장구균은 어린 일령에서부터 성숙한 주령에 이르기까지 병원성을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 어린 일령에서는 골격계 질병을 비롯하여 세균성 심내막염, 간 육아종, 패혈증 등을 유발한다. 초생추를 입식하여 4주~5주령 사이에 출하하는 어린 일령의 육계 농장에서 경제적 피해를 가져오게 한다. 장구균속 균은 다양한 종(Species)이 알려져 있다. 이들 장구균에 의한 감염원이나 오염원을 정확하게 파악하는 것은 사후 대책 마련과 예방을 위해 중요하다. 장구균을 확인하는 방법으로서 선택배지를 이용한 배양, 생화학적 성상이나 유전학적 성상을 이용하여 최종 동정하게 된다.

대장균 또한 육계에서 골격계 질병을 유발하는 주요한 원인균이다. 대장균에 의해서 발생하는 대장균증은 가금에서 가장 흔한 세균성 질병이며 1차적 원인 혹은 2차적인 원인으로 감염되어 열악한 사양 환경 등의 상황에 따라 심각한 경제적 손실을 유발할 수 있다. 조류의 병원성 대장균(Avian Pathogenic E. coli; APEC)는 가금에서 대장균성패혈증, 출혈성패혈증, 대장균성육아종(Hjarre's disease), 기낭염, 두부종창(대장균증(Colibacillosis), 대장균성성병(venereal colibacillosis), 대장균성연조직염(coliform cellulitis), 복막염(Peritonitis), 전체안구염(Panophalomytis), 난관염(salpingitis), 고환염(orchitis), 골수염/윤활막염(osteomyelitis/synovitis) 등 일련의 대장균증(Colibacilosis)을 유발한다. 육계의 검체나 사양 환경시료로부터 대장균에 의한 감염원이나 오염원을 정확하게 파악하는 것은 사후 대책 마련과 예방을 위해 중요하다. 대장균을 확인하는 방법으로서 선택배지를 이용한 배양, 생화학적 성상이나 유전학적 성상을 이용하여 최종 동정하게 된다. 이 방법은 배지, 생화학적 시험 장비나 시약, 유전학적 시험에 필요한 장비나 시약이 필요로 하고 시간도 오래 걸린다.

마이코플라즈마 시노비애는 가금에 감염되는 세균으로서 일반적으로 4주령에서 16주령의 산란계나 종계, 토종닭에서 마이코플라즈마 시노비애 감염증을 유발한다. 전신성 감염의 경우 전염성 활막염(synovitis)을 유발하고, 관절막(membrane of joint)과 건초(tendon sheath)에 급성에서 만성적으로 감염될 경우 삼출성 활막염(exudative synovitis), 활액낭염(bursitis), 건초염(tenoviginitis)을 유발한다. 상부호흡기에 감염될 경우 무증상 감염의 형태로 나타나며, 뉴캣슬병(ND)이나 닭전염성기관지염(IB)과 혼합 감염될 경우 기낭염을 유발하기도 한다. 마이코플라즈마 시노비애를 진단하기 위해서는 기관, 부비동, 기낭 또는 활막 삼출물 등의 시료를 특수배지를 사용하거나 부화계란을 사용하여 분리한다. 항혈청을 이용한 응집반응이나 PCR과 같은 유전자 증폭법을 이용하여 검출한다. 혈청평판응집반응이나 ELISA와 같은 혈청시험법도 진단에 사용한다. 조기에 검색하여 항생제를 사용하고, 마이코플라즈마 시노비애에 감염되지 않은 종계군으로부터 생산된 종란으로부터 부화된 병아리를 사용하는 것이 예방에 최선책이라 할 수 있다.

레오바이러스(Avian reovirus)는 조류에서 관절염/건초활막염(arthritis/tenosynovitis), 발육방해증후군(Stuting disease), 호흡기성 질병(respiratory disease), 장관질병(enteric disease), 면역억제 및 흡수불량증후군과 같은 다양한 질병조건에서 분리된다. 닭의 경우 임상적으로 정상인 경우에도 쉽게 분리되는 것으로 알려져 있으며, 질병 유발은 닭의 주령이나 면역상태, 바이러스의 병원성 타입과 감염 노출 경로 등에 좌우되는 것으로 알려져 있다. 어린 육계에 감염될 경우는 폐사 증가, 바이러스성 관절염/건활막염 유발, 체중감소, 낮은 사료 효율, 불규칙한 증체율, 품질저하 도계육 등의 경제적 손실을 가져오며, 산란계나 종계에 감염될 경우 바이러스성 관절염으로 인한 파행, 폐사의 증가, 산란 감소, 수정율과 부화율의 감소 및 면역억제, 흡수불량증후군 등이 나타나는 것으로 알려져 있다. 레오바이러스의 진단에는 인대와 인접한 시료, 윤활막, 관절연골 등의 시료를 이용하여 분리 동정하는 방법과 혈청학적 시험을 이용한 진단방법이 있다. 병변이 많이 진행되거나 채취된 시료가 오래되었을 때에는 분리가 어렵다. 특히 레오바이러스는 숙주에 특별한 피해를 주지 않고 대부분의 장기에 존재하므로 관절병변 발생시 해당 부위에서 직접 바이러스를 분리하는 것이 필수적이다. 레오바이러스는 수직수평 전파가 모두 가능하며 환경에 널리 퍼져있고 소독제에 저항성이 강하기 때문에 기계적인 전파에 의한 발생 가능성이 높다. 따라서 조기 검색과 검색 결과를 바탕으로 한 백신접종 등 적절한 예방대책이 중요하다.

이에 산란계, 종계 및 토종닭에서 골격계 질병을 유발하는 상기 5가지 주요한 원인균을 동시에 검출할 수 있고, 기존의 진단방법의 한계를 극복하기 위하여 보다 특이성이 높고 검출감도가 높으며 현장에서의 적용 효용이 높은 검출법의 개발이 필요하다.

미국 등록특허 8,632,968 미국 등록특허 7,888,075 미국 공개특허 2016-0230216 미국 등록특허 7,883,870 미국 공개특허 2004-0005546

본원은 골격계 질병을 유발하는 원인체인 Staphylococcus species(S. aureus 및 S. cohnii), Enterococcus species(E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. cecorum, E. durans, E. columbae, E. avium 및 E. gallinarum), Escherichia coli, Mycoplasma synoviae 및 avian reovirus의 감염여부를 높은 민감도와 특이성을 나타내면서도 신속하고 간편하게 검출할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 Staphylococcus species, Enterococcus species, Escherichia coli 및 Mycoplasma synoviae 검출용 LAMP 분석용 프라이머 세트를 제공한다: 서열번호 13 내지 16으로 표시되는 프라이머를 포함하는 Staphylococcus aureus 및 Staphylococcus cohnii를 동시에 검출할 수 있는 Staphylococcus species 특이적 프라이머 세트; 서열번호 37 내지 40으로 표시되는 프라이머를 포함하는 Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus hirae, Enterococcus cecorum, Enterococcus durans, Enterococcus columbae, Enterococcus avium 및 Enterococcus gallinarum을 동시에 검출할 수 있는 Enterococcus species 특이적 프라이머 세트; 서열번호 67 내지 70 또는 서열번호 73 내지 76으로 표시되는 프라이머를 포함하는 Escherichia coli 특이적 프라이머 세트; 서열번호 103 내지 106으로 표시되는 프라이머를 포함하는 Mycoplasma synoviae 특이적 프라이머 세트.

또 다른 양태에서 본원은 avian reovirus 검출용 RT-LAMP 분석용 프라이머 세트를 제공한다: 서열번호 121 내지 124, 서열번호 127 내지 130 또는 서열번호 133 내지 136으로 표시되는 프라이머를 포함하는 avian reovirus 특이적 프라이머 세트.

본원에 따른 프라이머 세트는 신속한 반응을 위해 LF 프라이머 및 LB 프라이머를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 Staphylococcus species 특이적 프라이머 세트는 서열번호 17 및 18로 표시되는 프라이머; 상기 Enterococcus species 특이적 프라이머 세트는 서열번호 41 및 42로 표시되는 프라이머; 상기 Escherichia coli 특이적 프라이머 세트는 서열번호 71 및 72 또는 서열번호 77 및 78로 표시되는 프라이머; 상기 Mycoplasma synoviae 특이적 프라이머 세트는 서열번호 107 및 108로 표시되는 프라이머; avian reovirus 특이적 프라이머 세트는 서열번호 125 및 126, 131 및 132 또는 137 및 138로 표시되는 프라이머에서 선택된다.

본원에 따른 프라이머 세트는 실시간으로 또는 반응 종결시 증폭산물의 검출을 위해 필요한 경우, 각 세트에 포함된 하나 이상의 프라이머는 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원에 개시된 프라이머 세트를 사용한 인비트로에서 Staphylococcus aureus, Staphylococcus cohnii, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus hirae, Enterococcus cecorum, Enterococcus durans, Enterococcus columbae, Enterococcus avium, Enterococcus gallinarum, Escherichia coli, Mycoplasma synoviae 및 avian reovirus의 감염이 의심되는 대상체의 시료를 제공하는 단계; 본원에 따른 프라이머 세트 중 어느 하나를 제공하는 단계; 상기 시료 및 프라이머 세트를 이용하여 LAMP 또는 RT-LAMP 반응을 수행하는 단계; 및 상기 LAMP 또는 RT-LAMP 반응 결과물을 분석하고 이를 대조군 시료와 비교하여 차이가 있는 경우, 이를 Staphylococcus species, Enterococcus species, Escherichia coli, Mycoplasma synoviae 및 avian reovirus의 감염 또는 오염으로 판정하는 단계를 포함한다.

본원에 따른 프라이머 세트는 Staphylococcus species(S. aureus 및 S. cohnii), Enterococcus species(E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. cecorum, E. durans, E. columbae, E. avium 및 E. gallinarum), Escherichia coli, Mycoplasma synoviae 및 avian reovirus의 검출이 필요한 다양한 시료, 예를 들면 병성감정 시료, 산란계, 종계, 토종닭 검체, 이들의 사양 환경 검체에 대하여 이용될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

본원에 따른 방법에서 LAMP 및 RT-LAMP 반응 결과의 분석은 실시간 또는 반응 종료 후에 모두 가능하며, 증폭 여부는 상기 반응물의 색변화 측정 또는 탁도 (turbidity) 중 하나 이상을 이용한 측정을 통해 결정되며, 음성 대조군과 비교하여 색이 변화하거나 탁도가 증가한 경우, 증폭이 된 것으로 Staphylococcus species(S. aureus 및 S. cohnii), Enterococcus species(E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. cecorum, E. durans, E. columbae, E. avium 및 E. gallinarum), Escherichia coli, Mycoplasma synoviae 및 avian reovirus 양성으로 판단할 수 있다.

본원에 따른, Staphylococcus species(S. aureus 및 S. cohnii), Enterococcus species(E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. cecorum, E. durans, E. columbae, E. avium 및 E. gallinarum), Escherichia coli, Mycoplasma synoviae 및 avian reovirus를 등온증폭 방식으로 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 이용한 상기 세균들 및 바이러스의 검출 방법은 높은 민감도와 특이성은 물론 신속하게 병성감정 시료, 산란계, 종계, 토종닭 등의 검체 또는 이들의 사양환경 시료에서의 병원체의 오염 여부를 검출할 수 있으며, 또한 필요한 경우 반응 종결 후 전기영동과 같은 별도의 처리 없이 바로 검출이 가능하여 편리성이 증대된다.

도 1은 본원의 일 구현예 따른 표 1에 기재된 조합의 프라이머 세트 중 프라이머 3에 대한 Staphylococcus species(S. aureus 및 S. cohnii) 특이적 LAMP 프라이머 세트의 특이도 및 민감도를 색변화 및 아가로스젤 전기영동으로 검출한 결과이다.
도 2는 본원의 다른 구현예 따른 표 2에 기재된 조합의 프라이머 세트 중 프라이머 7에 대한 Enterococcus species(E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. cecorum, E. durans, E. columbae, E. avium 및 E. gallinarum) 특이적 LAMP 프라이머 세트의 특이도 및 민감도를 색변화 및 아가로스젤 전기영동으로 검출한 결과이다.
도 3은 본원의 다른 구현예 따른 표 3에 기재된 Escherichia coli 특이적 LAMP 프라이머 세트의 특이도 및 민감도를 색변화 및 아가로스젤 전기영동으로 검출한 결과이다.
도 4는 본원의 다른 구현예 따른 표 4에 기재된 조합의 프라이머 세트 중 프라이머 18에 대한 Mycoplasma synoviae 특이적 LAMP 프라이머 세트의 특이도 및 민감도를 색변화 및 아가로스젤 전기영동으로 검출한 결과이다.
도 5는 본원의 다른 구현예 따른 표 5에 기재된 avian reovirus 특이적 RT-LAMP 프라이머 세트의 특이도 및 민감도를 색변화 및 아가로스젤 전기영동으로 검출한 결과이다.
상기 각 도면에서 민감도는 적색으로 표시하였다. 각 세트별로 총 7개의 다른 농도 및 음성대조군에서 반응이 수행되었으며 각 농도는 다음과 같다: S. aureus 및 S. cohnii의 DNA 농도는 1 및 9:250pg/㎕, 2 및 10:50pg/㎕, 3 및 11: 10pg/㎕, 4 및 12:2pg/㎕, 5 및 13:400fg/㎕, 6 및 14:80fg/㎕, 7 및 15:16fg/㎕ 및 8 및 16:음성 대조군 ; E. faecalis, E. durans, E. hirae 의 DNA 농도는 1,11 및 16:10pg/㎕, 2, 12 및 17:2pg/㎕, 3, 13 및 18:400fg/㎕, 4, 14 및 19:80fg/㎕, 5, 15 및 20:16fg/㎕, E. faecium의 DNA 농도는 6:50pg/㎕, 7:10pg/㎕, 8:2pg/㎕, 9:400fg/㎕, 10:80fg/㎕, E. columbae의 DNA 농도는 21:250pg/㎕, 22:50pg/㎕, 23:10pg/㎕, 24:2pg/㎕, 25:400fg/㎕, E. avium의 DNA 농도는 26:500pg/㎕, 27:100pg/㎕, 28:20pg/㎕, 29:4pg/㎕, 30:800fg/㎕, E. gallinarum의 DNA 농도는 31:5ng/㎕, 32:1ng/㎕, 33:200pg/㎕, 34:40pg/㎕, 35:8pg/㎕, E. cecorum의 DNA 농도는 36:1.25ng/㎕, 37:250pg/㎕, 38:50pg/㎕, 39:10pg/㎕, 40:2pg/㎕, 41: 음성 대조군 ; Escherichia coli의 DNA 농도는 1:256pg/㎕, 2:64pg/㎕, 3:16pg/㎕, 4:4pg/㎕, 5:1pg/㎕, 6:250fg/㎕, 7:63fg/㎕, 8:음성 대조군, Mycoplasma synoviae의 DNA 농도는 1:12.5ng/㎕, 2:2.5ng/㎕, 3:500pg/㎕, 4:100pg/㎕, 5:20pg/㎕, 6:4pg/㎕, 7:800fg/㎕, 8:음성 대조군, avian reovirus의 RNA 농도는 1:10ng/㎕, 2:2ng/㎕, 3:400pg/㎕, 4:80pg/㎕, 5:16pg/㎕, 6:3.2pg/㎕, 7:640fg/㎕, 8:음성 대조군.

본원은 LAMP 방식을 이용하여 Staphylococcus species(S. aureus 및 S. cohnii), Enterococcus species(E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. cecorum, E. durans, E. columbae, E. avium 및 E. gallinarum), Escherichia coli 및 Mycoplasma synoviae 및 RT-LAMP 방법을 이용한 avian reovirus를 핵산 수준에서 높은 정확도와 민감도로 용이하게 검출할 수 있다는 발견에 근거한 것이다.

양계산업 중 산란계, 종계, 토종닭 산업에서는 어린 일령 및 성숙한 주령에서의 골격계 질병은 생산성과 밀접한 관련이 있다. 골격계 질병은 그 원인이 매우 다양하지만 마이코플라즈마 시노비애, 포도상구균, 장구균 및 대장균의 세균성 질병과 레오바이러스의 바이러스성 원인체가 골격계 질병 원인의 주축이 되고 있다. 이들 병원체들은 어린 일령부터 출하시기까지 혹은 산란시기까지 단독 혹은 복합 감염되거나 1차적 혹은 2차적 감염으로 생산성 저하에 깊이 관여하고 있다. 이들 골격계질병에 대한 효과적인 대처방안은 주요 감염원인체들을 조기에 검색하여 도태시키거나 적절한 항생제를 조기에 사용하거나, 예방 백신을 사용하여 피해를 최대한 줄이는 것이다. 이를 위하여 기존의 생화학적 시험법을 이용하거나 종란에 접종하여 수행하는 분리 및 동정법이나 PCR법 등의 유전자 증폭법이 가진 한계를 극복하고 현장에서 효과적으로 적용할 수 있고, 주요한 골격계 질병 원인체를 동시에 검출할 수 있는 검출법을 개발하고자 하였다.

본원에 따른 LAMP-Staphylo-Entero-E. coli-MS-REO법은 포도상구균, 장구균, 대장균, 마이코플라즈마 시노비애 및 레오바이러스에 대한 각각의 공통 및 특이 프라이머를 작성하고 Loop-Mediated Isothermal Amplification(LAMP)법을 이용하여 상기 다섯 종류 속(genus)에 속하는 세균 및 바이러스 13종을 동시에 검출할 수 있다.

이에 본원은 Staphylococcus species(S. aureus 및 S. cohnii), Enterococcus species(E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. cecorum, E. durans, E. columbae, E. avium 및 E. gallinarum), Escherichia coli, Mycoplasma synoviae 및 avian reovirus를 LAMP 및 RT-LAMP 방법으로 각각 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 이용한 Staphylococcus species(S. aureus 및 S. cohnii), Enterococcus species(E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. cecorum, E. durans, E. columbae, E. avium 및 E. gallinarum), Escherichia coli, Mycoplasma synoviae 및 avian reovirus 의 검출 방법을 개시한다.

한 양태에서 본원은 Staphylococcus species(S. aureus 및 S. cohnii), Enterococcus species(E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. cecorum, E. durans, E. columbae, E. avium 및 E. gallinarum), Escherichia coli, Mycoplasma synoviae 및 avian reovirus를 각각 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 분석용 프라이머 세트에 관한 것이다.

본원에서 사용된 용어 “프라이머”는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로 폴리머라제를 이용한 핵산 증폭 또는 합성 반응에서 그 3´말단에 뉴클레오타이드가 공유결합에 의해 추가되어 연장되는 핵산 분자를 일컫는 것이다. 본원에 따른 프라이머 세트는 핵산의 증폭 즉 LAMP 및 RT-LAMP분석에 사용되는 것이다.

본원에서 용어 “핵산”은 단일가닥 또는 이중 가닥의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로, 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 RNA 또는 DNA 분자 또는 그 유사체 및 그 유도체를 일컫는 것이다. 본원에 따른 프라이머 세트가 사용되는 Staphylococcus species(S. aureus 및 S. cohnii), Enterococcus species(E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. cecorum, E. durans, E. columbae, E. avium 및 E. gallinarum), Escherichia coli, Mycoplasma synoviae 및 avian reovirus 핵산은 유전체의 전부 또는 일부를 포함하고, 일 구현예에서는 DNA 또는 RNA를 포함하는 것이다.

본원에서 사용된 용어 “올리고뉴클레오타이드” 및 “폴리뉴클레오타이드”는 혼용되어 사용되며, 어느 하나는 양자를 모두 포함하는 것이다. 용어 “프라이머”도 “올리고뉴클레오타이드” 및 “폴리뉴클레오타이드”와 혼용되어 사용될 수 있으며, 핵산(RNA or DNA), 앱타머 등을 포함하는 것이다.

본원에서 용어 “검출”은 Staphylococcus species(S. aureus 및 S. cohnii), Enterococcus species(E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. cecorum, E. durans, E. columbae, E. avium 및 E. gallinarum), Escherichia coli, Mycoplasma synoviae 및 avian reovirus의 오염 또는 감염 여부를 핵산의 존재여부 또는 존재할 경우 그 양을 분석하는 것으로, 특히 후술하는 LAMP 분석에 기반을 둔 것이다.

본원에서 사용된 용어 “표적” 또는 “표적 핵산”은 본원의 프라이머 세트가 결합하여 본원에 따른 프라이머 세트에 의해 특이적으로 증폭되는 핵산 서열을 일컫는 것으로, RNA 또는 DNA를 포함하는 것이다.

본원에 따른 프라이머는 표적 핵산에 상보성을 통해 특이적으로 결합을 하고 LAMP 방식으로 표적 핵산을 증폭한다. 본원에서는 특히 표 1 내지 표 5에 기재된 각 균주/바이러스에 특이적인 유전자만을 특이적으로 검출할 수 있다.

LAMP는 등온조건에서 높은 민감도와 특이성으로 표적핵산을 증폭할 수 있는 핵산 증폭 방법 (Notomi, T. et al. 2000. Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA. Nucleic Acids Res 28, E63)으로 가닥교체 (strand displacement) 활성을 갖는 DNA 폴리머레이즈 및 표적핵산의 6개 부위 즉, 5′→ 3′방향으로 B3 영역, B2 영역, B1 영역, F1c 영역, F2c 영역 및 F3c 영역 (상기 영역에 상보적인 영역은 B3c, B2c, B1c, F1, F2 및 F3로 표시)에서 특이적으로 고안된 최소 4개 내지 6개의 프라이머 세트가 사용된다 (한국 특허 제612551호; Nagamine, K. et al. 2002. Accelerated reaction by Loop mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes 16, 223-9 등 참고). 표준 LAMP 반응에는 최소 4 종류의 두 개의 내측 프라이머 FIP (forward inner primer), BIP (backward inner primer)와 두 개의 외측 프라이머 F3 (forward outer primer) 및 B3 (backward outer primer)를 포함한다. 신속한 반응 (Accelerated LAMP)을 위해서는 LF (Loop F) 및 LB (Loop B)를 추가로 포함하여 총 6개의 프라이머가 사용될 수 있다.

LAMP 반응은 크게 개시 구조 생산단계, 사이클링 증폭단계와 신장 및 재사용(recycling) 단계를 포함한다. 개시단계에서 내측 프라이머 FIP를 구성하는 F2 부분이 표적핵산의 F2c 영역에 결합하여 반응을 개시한다. 이어 외측 프라이머 F3 프라이머가 표적핵산의 F3c 영역에 결합하여 가닥교체 DNA 합성이 개시되며 이에 따라 단일가닥 핵산이 생성된다. 이 단일가닥은 F1/F1c 결합을 통해 5′말단에 고리를 형성하며, 여기에 두 번째 내측 프라이머 BIP 및 외측 프라이머 B3가 결합하여 DNA 합성 및 가닥교체 DNA 합성이 일어난다. 그 결과 덤벨 모양의 양 말단에 고리가(stem-loop) 형성된 단일가닥이 형성되고, 여기의 F1 영역의 3′말단으로부터 DNA 합성이 시작된다. 이어 사이클링 증폭단계에서는 두 개의 내측 프라이머만이 사용되며, 처음에는 하나의 내측 프라이머가 고리에 결합하여 가닥교체 DNA 합성이 일어나면서 원래의 고리 형성 단일가닥과 고리구조에서 stem 부위가 두 배 늘어난 새로운 고리 형성 단일가닥이 생성되며 이를 주형으로 하여 가닥교체 DNA 합성이 계속 수행되어 증폭산물이 1시간 이내에 약 10⁹개까지 증폭된다. 보다 상세한 원리 및 각 F3 프라이머, B3 프라이머, FIP 프라이머, BIP 프라이머, Loop F 프라이머 (LF), 및 Loop B (LB)프라이머의 특징 및 기능에 대하여 앞서 언급한 문헌 Notomi et al., 2000 and Nagamine et al., 2002을 참고할 수 있다. RT(reverse transcription) LAMP는 주형으로 RNA를 먼저 DNA로 합성한 후에 LAMP를 수행하는 것으로, RNA를 DNA로 합성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.

본원에서 용어 “상보적” 또는 “상보성”은 소정의 혼성화(교잡), 결합 또는 어닐링 조건에서 프라이머 또는 올리고뉴클레오타이드가 표적 핵산에 와슨-크릭 염기의 페어링을 통해 서열 특이적으로 결합할 수 있는 상태를 일컫는 것으로, 부분적 상보성, 실질적으로 상보성(substantially complementary) 및 완전 상보성 (perfectly complementary)인 것을 모두 포함한다. 실질적으로 상보성이란, 두 가닥의 핵산 서열이 서로 완전히 상보적인 것은 아니지만, 표적 핵산에 결합하여 본원에 따른 효과 즉 표적 서열을 LAMP 방식을 통해 증폭할 수 있는 정도의 상보성을 의미하는 것이다.

본원에서 사용된 용어 “교잡” 또는 “혼성화”는 두 가닥의 상보적 핵산분자가 수소결합을 통해 서열특이적인 복합체를 형성하는 반응을 의미하는 것이다. 교잡은 본원에 따른 프라이머가 사용되는 LAMP 반응에서 프라이머가 표적 핵산 또는 주형(template)의 결합하는 단계를 구성할 수 있다. 교잡의 정도는 이에 관여하는 임의의 두 개의 핵산 분자의 상보성 정도, 이들의 변성 온도(melting temperature, Tm) 또는 교잡의 엄격도(stringency)와 같은 다양한 인자에 의해 영향을 받는다. 교잡 반응 조건도 이를 고려하여 결정될 수 있다. 교잡 반응의 엄격도는 서로 교잡하고자 하는 임의의 두 개의 핵산 분자가 얼마나 용이하게 결합할 수 있는 지를 결정하는 조건으로, 상보성, 반응 온도, 이온 강도 및/또는 교잡 반응액에 포함되는 일반적인 물질의 농도 및 종류에 따라 결정될 수 있으며, 예를 들면 J. Sambrook and D. W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 4th Ed., 2012; and F. M. Ausubel, Ed., Short Protocols in Molecular Biology, Wiley; 5th Ed, 2002 등에 기재된 것 참고 할 수 있다.

본원에서 특이적 결합 또는 교잡은 특정 핵산 분자 또는 프라이머가 표적이 아닌 다른 핵산 이외의 핵산에는 실질적으로 결합하지 않고 표적 핵산에만 결합하는 것을 의미한다. 본원에 따른 프라이머는 높은 엄격도 조건에서 본원에 따른 표적인 Staphylococcus species(S. aureus 및 S. cohnii), Enterococcus species(E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. cecorum, E. durans, E. columbae, E. avium 및 E. gallinarum), Escherichia coli, Mycoplasma synoviae 및 avian reovirus의 핵산 또는 그 상보서열에 특이적으로 결합할 수 있으며, 주형 기반의 DNA 합성에서 프라이머 서열 길이, 완충액, 핵산 종류, pH, 마그네슘 농도 및 반응온도 등을 고려하여 결정할 수 있을 것이다.

본원에서 각 균주에 대한 표적 유전자는 표 1 내지 표 5에 개시된 바와 같으며 각 유전자 부위를 특이적으로 인식하여 높은 민감도로 각 세균/바이러스를 검출할 수 있도록 디자인 되었다. 본원에서는 상술한 바와 같이 LAMP 반응은 표적 유전자를 검출하기 위해 최소 4개 내지 6개의 프라이머를 디자인하고, 일정한 특이성과 민감도를 만족하도록 프라이머 및 반응 조건을 개시하며, 동일 속에 속하는 한 종 이상의 균주를 동시에 검출할 수 있다.

상술한 바와 같이 표준 LAMP 반응에는 최소 4 종류의 다음과 같은 프라이머가 사용된다: FIP (forward inner primer), BIP (backward inner primer), F3 (forward outer primer) 및 B3 (backward outer primer). 그리고 신속한 반응 (Accelerated LAMP)을 위해서는 LF (Loop F) 및 LB (Loop B)를 추가로 포함하여 총 6개의 프라이머가 사용될 수 있다. 각 F3 프라이머, B3 프라이머, FIP 프라이머, BIP 프라이머, Loop F 프라이머 (LF), 및 Loop B (LB) 프라이머의 특징 및 기능에 대하여 앞서 언급한 문헌 Notomi et al., 2000 and Nagamine et al., 2002을 참고할 수 있다.

본원에 따른 표적 핵산 또는 그 상보서열에 특이적으로 결합하는 프라이머는 길이가 최소 10 뉴클레오타이드이며, F3와 B3의 경우 최소 15 뉴클레오타이드이며, FIP와 BIP의 경우 최소 30 뉴클레오타이드이며, LF와 LB의 경우 최소 15 뉴클레오타이드이다. 표적 핵산의 상응하는 부분과 최소 70%의 상보성, 특히 80% 상보성, 더욱 90% 상보성, 더더욱 특히 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상보성을 가진다.

일구현예서 본원에 따른 프라이머는 서열번호 1 내지 138로 표시되는 프라이머 및 이와 실질적으로 동일한 것을 포함하며, 표적 핵산 또는 그 상보서열에 특이적으로 결합한다. 실질적으로 동일한 서열의 프라이머는 서열번호 1 내지 138로 표시되는 프라이머와 70%의 상보성, 특히 80% 상보성, 더욱 특히 90% 상보성, 더더욱 특히 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상보성을 가진다.

본원에 따른 LAMP 프라이머는 표적인 Staphylococcus species(S. aureus 및 S. cohnii), Enterococcus species(E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. cecorum, E. durans, E. columbae, E. avium 및 E. gallinarum), Escherichia coli, Mycoplasma synoviae 및 avian reovirus 핵산에 특이적으로 결합하여 이를 높은 민감도로 검출한다. avian reovirus의 경우 LAMP 반응 함께, 또는 별도의 반응에서 RNA를 DNA로 합성하는 단계가 추가로 필요하다.

본원에 따른 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 스태필로코커스 코니이(Staphylococcus cohnii)를 포함하는 포도상 구균(Staphylococcus spp); 엔테로코커스 파에칼리스(E. faecalis), 엔테로코커스 파에시움 (E. faecium ), 엔테로코커스 히레 (E. hirae ), 엔테로코커스 세코룸 (E. cecorum), 엔테로코커스 듀란스 (E. durans ), 엔테로코커스 콜룸바에 (E. columbae ), 엔테로코커스 아비움 (E. avium ) 및 엔테로코커스 갈리나룸(E. gallinarum)을 포함하는 장구균(Enterococcus spp); 대장균(Escherichia coli); 마이코플라즈마 시노비애(Mycoplasma synoviae); 또는 아비안 레오바이러스(avian reovirus)를 포함하는 육계 골격근 질병 원인균 검출을 위한 LAMP 분석용 프라이머 세트는 다음과 같다.

상기 포도상구균 검출을 위한 상기 F3 프라이머는 서열번호 1, 7, 13, 19, 또는 25로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 프라이머로 표시되고; 상기 B3 프라이머는 서열번호 2, 8, 14, 20, 또는 26으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 FIP 프라이머는 서열번호 3, 9, 15, 21, 또는 27로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 그리고 상기 BIP 프라이머는 서열번호 4, 10, 16, 22, 또는 28로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고, 상기 장구균 검출을 위한 상기 F3 프라이머는 서열번호 31, 37, 43, 49, 55, 또는 61로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고, 상기 B3 프라이머는 서열번호 32, 38, 44, 50, 56, 또는 62로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고, 상기 FIP 프라이머는 서열번호 33, 39, 45, 51, 57, 또는 63으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 그리고, 상기 BIP 프라이머는 서열번호 34, 40, 46, 52, 58, 또는 64로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 대장균 검출을 위한 상기 F3 프라이머는 서열번호 67, 73, 또는 79로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 B3 프라이머는 서열번호 68, 74, 또는 80으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 FIP 프라이머는 서열번호 69, 75, 또는 81로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 및 상기 BIP 프라이머는 서열번호 70, 76, 또는 82로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고, 상기 마이코플라즈마 시노비애 검출을 위한 상기 F3 프라이머는 서열번호 85, 91, 97, 103, 109, 또는 115로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 B3 프라이머는 서열번호 86, 92, 98, 104, 110, 또는 116으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 FIP 프라이머는 서열번호 87, 93, 99, 105, 111, 또는 117로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 그리고 상기 BIP 프라이머는 서열번호 88, 94, 100, 106, 112, 또는 118로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고, 그리고 상기 아비안 레오바이러스 검출을 위한 상기 F3 프라이머는 서열번호 121, 127, 또는 133으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 B3 프라이머는 서열번호 122, 128, 또는 134로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 FIP 프라이머는 서열번호 123, 129, 또는 135로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 및 상기 BIP 프라이머는 서열번호 124, 130, 또는 136으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시될 수 있으며, 각 균주별 각 프라이머 별로 다양한 조합으로 사용될 수 있다.

선택적으로 상기 각 프라이머 세트는 LF 프라이머 및 LB 프라이머를 추가로 포함할 수 있다. 상기 프라이머 세트는 LF 프라이머 및 LB 프라이머를 추가로 포함한다. 특히 상기 포도상구균 검출을 위한 상기 LF 프라이머는 서열번호 5, 11, 17, 23 또는 29로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이고, 상기 LB 프라이머는 서열번호 6, 12, 18, 24 또는 30으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이며; 상기 장구균 검출을 위한 상기 LF 프라이머는 서열번호 35, 41, 47, 53, 59 또는 65로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이고, 상기 LB 프라이머는 서열번호 36, 42, 48, 54, 60 또는 66으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이며; 상기 대장균 검출을 위한 상기 LF 프라이머는 서열번호 71, 77 또는 83으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이고, 상기 LB 프라이머는 서열번호 72, 78 또는 84로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이며; 상기 마이코플라즈마 시노비애 검출을 위한 상기 LF 프라이머는 서열번호 89, 95, 101, 107, 113 또는 119로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이고, 상기 LB 프라이머는 서열번호 90, 96, 102, 108, 114 또는 120으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이며; 그리고

상기 아비안 레오바이러스 검출을 위한 상기 LF 프라이머는 서열번호 125, 131 또는 137로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이고, 상기 LB 프라이머는 서열번호 126, 132 또는 138로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이며, 각 균주별 각 프라이머 별로 다양한 조합으로 사용될 수 있다.

일 구현예에서 본원에서 S. aureus 및 S. cohnii를 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 15로부터 선택되는 FIP, 서열번호 16으로부터 선택되는 BIP, 서열번호 13으로부터 선택되는 F3 및 서열번호 14로부터 선택되는 B3를 포함한다. 다른 구현예에서 S. aureus 및 S. cohnii를 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 15로부터 선택되는 FIP, 서열번호 16으로부터 선택되는 BIP, 서열번호 13으로부터 선택되는 F3, 서열번호 14로부터 선택되는 B3, 서열번호 17에서 선택되는 LF 및 서열번호 18에서 선택되는 LB를 포함한다.

일 구현예에서 본원에서 E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. cecorum, E. durans, E. columbae, E. avium 및 E. gallinarum를 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 39로부터 선택되는 FIP, 서열번호 40으로부터 선택되는 BIP, 서열번호 37로부터 선택되는 F3 및 서열번호 38로부터 선택되는 B3를 포함한다. 다른 구현예에서 E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. cecorum, E. durans, E. columbae, E. avium 및 E. gallinarum를 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 39로부터 선택되는 FIP, 서열번호 40으로부터 선택되는 BIP, 서열번호 37로부터 선택되는 F3, 서열번호 38로부터 선택되는 B3, 서열번호 41에서 선택되는 LF 및 서열번호 42에서 선택되는 LB를 포함한다.

일 구현예에서 본원에서 Escherichia coli를 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 69 또는 75로부터 선택되는 FIP, 서열번호 70 또는 76으로부터 선택되는 BIP, 서열번호 67 또는 73으로부터 선택되는 F3 및 서열번호 68 또는 74로부터 선택되는 B3를 포함한다. 다른 구현예에서 Escherichia coli를 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 69 또는 75로부터 선택되는 FIP, 서열번호 70 또는 76으로부터 선택되는 BIP, 서열번호 67 또는 73으로부터 선택되는 F3 및 서열번호 68 또는 74로부터 선택되는 B3, 서열번호 71 또는 77에서 선택되는 LF 및 서열번호 72 또는 78에서 선택되는 LB를 포함한다.

일 구현예에서 본원에서 Mycoplasma synoviae를 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 105로부터 선택되는 FIP, 서열번호 106으로부터 선택되는 BIP, 서열번호 103으로부터 선택되는 F3 및 서열번호 104로부터 선택되는 B3를 포함한다. 다른 구현예에서 Mycoplasma synoviae를 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 105로부터 선택되는 FIP, 서열번호 106으로부터 선택되는 BIP, 서열번호 103으로부터 선택되는 F3 및 서열번호 104로부터 선택되는 B3, 서열번호 107에서 선택되는 LF 및 서열번호 108에서 선택되는 LB를 포함한다.

일 구현예에서 본원에서 avian reovirus를 특이적으로 검출할 수 있는 RT-LAMP 프라이머 세트는 서열번호 123, 129 또는 135로부터 선택되는 FIP, 서열번호 124, 130 또는 136으로부터 선택되는 BIP, 서열번호 121, 127 또는 133으로부터 선택되는 F3 및 서열번호 122, 128 또는 134로부터 선택되는 B3를 포함한다. 다른 구현예에서 avian reovirus를 특이적으로 검출할 수 있는 RT-LAMP 프라이머 세트는 서열번호 123, 129 또는 135로부터 선택되는 FIP, 서열번호 124, 130 또는 136으로부터 선택되는 BIP, 서열번호 121, 127 또는 133으로부터 선택되는 F3 및 서열번호 122, 128 또는 134로부터 선택되는 B3, 서열번호 125, 131 또는 137에서 선택되는 LF 및 서열번호 126, 132 또는 138에서 선택되는 LB를 포함한다.

본원에 따른 프라이머 및 이를 포함하는 방법은 Staphylococcus species(S. aureus 및 S. cohnii), Enterococcus species(E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. cecorum, E. durans, E. columbae, E. avium 및 E. gallinarum), Escherichia coli, Mycoplasma synoviae 및 avian reovirus의 감염 또는 오염 여부 검출을 위해 위해세균 및 바이러스의 감염 또는 오염 여부가 의심되는 다양한 시료에서 오염, 또는 감염 여부의 스크리닝, 존재 유무 검출 및 정량을 위한 다양한 분석에 유용하게 사용될 수 있다.

본원에 따른 프라이머 세트 및 방법이 사용될 수 있는 시료는 예를 들면 가금의 병성감정 시료, 도축장 등에서의 도축산물, 특히 가금 산업에서의 산란계, 종계, 토종닭 등의 검체 및 이들의 사양 환경시료에 대하여 실시될 수 있다.

또한 이러한 생물학적 시료는 검사 직전에 통상의 시료 수득 방법에 의해 직접 수득한 것이거나 또는 미리 분리되어 보관된 것일 수 있다.

또 다른 구현예에서 본원에 따른 시료는 상술한 시료로부터 분리된 핵산이 시료로서 사용될 수 있다. 분리란 핵산이 포함되어 있던 시료로부터의 분리된 것으로, 다양한 순도로 분리된 것을 포함하는 것이다.

본원에 따른 프라이머 및 이를 포함하는 방법은 위해 세균 및 바이러스가 존재할 가능성이 있는 임의의 시료에서 세균 및 바이러스의 검출을 위해 LAMP 및 RT-LAMP 방식의 분석에 사용된다.

일 구현예에서 반응물은 총 25 ul에 0.2 uM 의 각 F3 및 B3 프라이머, 1.6 uM의 각 FIP 및 BIP 프라이머, 0.8 uM의 각 LF 및 LB 프라이머, 0.4M betaine, 10 mM MgSO4, 1.4 mM dNTPs, 1× ThermoPol reaction buffer (Mmonitor, South Korea), 8 U Bst DNA polymerase (Mmonitor, South Korea) 및 1.0~9.5㎕의 분석이 필요한 시료를 포함한다. 또한 avian reovirus의 RT-LAMP 반응을 위해 반응물은 총 25 ul에 0.2 uM 의 각 F3 및 B3 프라이머, 1.6 uM의 각 FIP 및 BIP 프라이머, 0.8 uM의 각 LF 및 LB 프라이머, 0.4M betaine, 10 mM MgSO4, 1.4 mM dNTPs, 1× ThermoPol reaction buffer (Mmonitor, South Korea), 8 U Enzyme mix (Mmonitor, South Korea) 및 1.0~9.5㎕의 분석이 필요한 시료를 포함한다.

반응물은 이어서 DNA 폴리머라제 활성에 적합한 온도에서 반응된다. 반응온도는 반응에 사용되는 효소, 표적의 핵산 서열을 고려하여 어려움 없이 결정될 수 있다. 이어 반응물은 표적 핵산의 증폭에 적합한 시간으로 반응된다.

증폭 후 증폭반응 산물은 다양한 방법으로 검출될 수 있으며, 예를 들면 DNA 합성에 따른 반응액의 색변화, 탁도변화, 형광 및/또는 전기영동으로 검출될 수 있으며, 검출된 산물은 양성 및/또는 음성 대조군 시료의 산물과 비교되어 정량 또는 정성분석에 사용된다.

또한 프라이머의 비 특이적 프라이밍 발생에 의한 비특이적 증폭여부의 검출이 필요한 경우, 비특이적 핵산 결합제인 에씨디움 브로마이드 또는 피코그린과 같은 물질을 주형을 포함하지 않는 대조군 반응에 사용하여 비특이적으로 합성된 총 증폭산물의 양을 결정할 수 있다.

본원에 따른 프라이머 세트는 감염 또는 오염 여부 검출을 위해 위해세균 및 바이러스의 감염 또는 오염 여부가 의심되는 다양한 시료에서 오염, 또는 감염 여부의 스크리닝, 존재 유무 검출 및 정량을 위한 다양한 분석에 유용하게 사용될 수 있다.

본원에 따른 프라이머를 사용하여 Staphylococcus species(S. aureus 및 S. cohnii), Enterococcus species(E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. cecorum, E. durans, E. columbae, E. avium 및 E. gallinarum), Escherichia coli, Mycoplasma synoviae 및 avian reovirus를 핵산수준에서 검출하고, 이를 대조군 또는 참조군과 비교하여, 핵산의 존재 여부, 핵산 증가, 변화 정도에 따라 Staphylococcus species(S. aureus 및 S. cohnii), Enterococcus species(E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. cecorum, E. durans, E. columbae, E. avium 및 E. gallinarum), Escherichia coli, Mycoplasma synoviae 및 avian reovirus 감염, 오염 또는 항생제 치료를 받는 경우 치료의 효과를 예측할 수 있다.

이하 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명하나, 본 실시예는 예시적인 것일 뿐 어떤 식으로든 본원의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명은 달리 언급이 없는 한 세포생물학, 세포배양, 분자생물학, 유전자 형질전환 기술, 미생물학, DNA 재조합기술에 관한 당업자의 기술수준 내인 통상의 기술을 사용하여 실시될 수 있다. 또한, 일반적인 기술에 관한 보다 자세한 설명은 Molecular Biotechnology: (Bernard et al., ASM press 2014); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Ed. (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012); Short Protocols in Molecular Biology, 5th Ed. (Ausubel F. et al. eds., John Wiley & Sons 2002) 등을 참고할 수 있다.

실시예 1. Staphylococcus species, Enterococcus species, Escherichia coli , Mycoplasma synoviae 및 avian reovirus 확보 및 시료 준비

Staphylococcus aureus(ATCC 25923), Staphylococcus cohnii(ATCC 35662), Enterococcus faecium(ATCC 19434), Enterococcus faecalis(ATCC 29212), Enterococcus hirae(ATCC 8043), Enterococcus cecorum(ATCC 43198), Enterococcus durans(ATCC 19432), Enterococcus avium(ATCC 14025), Enterococcus gallinarum(ATCC 49573), Enterococcus columba(ATCC 51263), Escherichia coli(ATCC 25922) 및 Mycoplasma synoviae(ATCC 25204)를 ATCC(American Type Culture Collection)와 한국미생물보존센터로부터 확보하여 배양한 후 QIAamp DNA Mini kit(Qiagen, Germany)을 제조자의 방법대로 사용하여 DNA를 추출하였다. 또한 본원에서 보유 중인 avian reovirus(S1133)를 QIAamp Viral RNA Mini kit(Qiagen, Germany)을 이용하여 RNA를 추출하였다.

실시예 2. Staphylococcus species, Enterococcus species, Escherichia coli , Mycoplasma synoviae 및 avian reovirus에 특이적인 프라이머 제작

Staphylococcus aureus, Staphylococcus cohnii, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus hirae, Enterococcus cecorum, Enterococcus durans, Enterococcus avium, Enterococcus gallinarum, Enterococcus columbae, Escherichia coli, Mycoplasma synoviae 및 avian reovirus의 정확한 검출을 위해 NCBI 및 GenBank에서 다양한 유전자를 수득하여 Staphylococcus species(S. aureus 및 S. cohnii), Enterococcus species(E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. cecorum, E. durans, E. columbae, E. avium 및 E. gallinarum), Escherichia coli, Mycoplasma synoviae 및 avian reovirus에 각각 특이적인 최종 프라이머를 선정하였다. 구체적으로 Staphylococcus species(S. aureus 및 S. cohnii)의 표적으로 당을 분해하여 에너지를 얻는 물질대사 과정에 관여하는 효소 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GenBank accession number, DQ647040 및 DQ647032), 박테리아의 RNA polymerase β subunit으로 박테리아의 세포벽에 존재하는 폴리펩티드를 만드는 유전자(GenBank accession number, LM651917 및 NC_007795) 및 대사과정의 부산물로 생성된 과산화수소에 의한 세포의 손상을 막기 위해 필요한 효소 catalase(GenBank accession number, AB665064 및 EU259827), Enterococcus species(E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. cecorum, E. durans, E. columbae, E. avium 및 E. gallinarum)의 표적으로 높은 열에 의한 단백질의 손상을 막기 위해 필요한 유전자(GenBank accession number, AF245684, AF245681, AF245666, AF245685, AF245686, AY123649, AF245678 및 AF245667), 단백질의 합성을 위해 반드시 필요한 translation elongation factor(GenBank accession number, HM032777, AF124222, NC_018081, AF274718, NZ_CP012366, AF274719, AF124220 및 AF124223), 여러 환경으로 야기되는 스트레스에 의한 박테리아의 손상을 막기 위해 발현되는 유전자(GenBank accession number, AY328531, AY315820, AF417586, AY328533, AF417585, EU021352, AF417583 및 AF417587) 및 RNA polymerase β subunit(GenBank accession number, AF535175, AF535176, EU021315, HQ611237, EU021298, EU021296, HQ611231 및 HQ611244) 및 Escherichia coli의 표적으로 maltose 및 maltodextrin의 이동에 관여하는 maltose operon protein B(GenBank accession number, EU118059), Mycoplasma synoviae의 표적으로 신호 전달, 단백질 합성 및 세포 증식을 위해 필요한 유전자(GenBank accession number, KC990840) 및 avian reovirus의 표적으로 세포 부착 단백질 유전자(GenBank accession number, L39002)를 기반으로 F3, B3, FIP, BIP, LF 및 LB의 각 프라이머 별로 프라이머를 제작하여 LAMP 증폭용 프라이머 세트를 완성하였다(표 1 내지 표 5). 각 프라이머 염기서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information), Genbank 및 Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi website)를 이용하여 검증한 결과 해당 균주 및 바이러스 외에는 일치하는 염기서열이 존재하지 않았다. 각 프라이머 세트는 LAMP 반응에 최적화되도록 디자인 및 조합된 것으로 특이성 및 민감도 측면에서 우수한 효과를 나타냈다.

[표 1]

[표 2]

[표 3]

[표 4]

[표 5]

실시예 3. LAMP 및 RT-LAMP 반응의 특이도 및 민감도 확인

Staphylococcus species(S. aureus 및 S. cohnii)의 표적으로 제작된 표 1의 프라이머 1 내지 프라이머 5의 프라이머를 이용하여 S. aureus 및 S. cohnii에 대한 등온증폭반응을 확인하였다(도 1a). 등온증폭반응을 통해 선별된 프라이머 3을 이용하여 균주간의 교차반응을 통해 반응물의 색 변화와 전기영동 결과로 특이도를 확인하였다(도 1b). 또한 Enterococcus species(E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. cecorum, E. durans, E. avium 및 E. gallinarum)의 표적으로 제작된 표 2의 프라이머 6 내지 프라이머 11의 6 종류 프라이머를 사용하여 E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. cecorum, E. durans, E. avium 및 E. gallinarum에 대한 등온증폭을 실시한 후 선별된 프라이머 7을 이용하여 균주간의 교차반응을 통한 반응물의 색 변화와 전기영동 결과로 특이도를 확인하였다(도 2a 및 도 2b). 표 3에 표시된 프라이머를 이용하여 균주간의 교차반응을 통해 반응물의 색 변화와 전기영동 결과로 Escherichia coli에 대한 특이도를 확인하였다(도 3a). 그리고 Mycoplasma synoviae의 표적으로 제작된 표 4의 프라이머 15 내지 프라이머 20의 6종류 프라이머를 사용하여 Mycoplasma gallisepticum 및 Mycoplasma synoviae에 대한 등온증폭반응을 확인한 뒤 선별된 프라이머 18을 사용하여 균주간의 교차반응을 통해 반응물의 색 변화와 전기영동 결과로 특이도를 확인하였다(도 4a 및 도 4b). 이를 위해 실시예 1에서 확보한 S. aureus, S. cohnii, E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. cecorum, E. durans, E. columbae, E. avium, E. gallinarum, E. coli 및 Mycoplasma synoviae와 기타 균주들로부터 유전체를 추출한 후 각각의 DNA를 25ng/ul로 준비하였다. 이어 LAMP 분석을 위해 Mmiso DNA amplification kit(Mmonitor, South Korea)을 사용하여 총 부피 25 μl에서 0.2 μM 의 각 F3 및 B3 프라이머, 1.6 μM의 각 FIP 및 BIP 프라이머, 0.8 μM의 각 LF 및 LB 프라이머, 0.4M betaine, 10 mM MgSO₄, 1.4 mM dNTPs, 1× ThermoPol reaction buffer (Mmonitor, South Korea), 8 U Bst DNA polymerase (Mmonitor, South Korea) 및 1μl의 상기 분리한 DNA를 포함하는 조성의 용액을 사용하였다. 상기 조성으로 63℃에서 40분 동안 등온증폭을 실시한 뒤 80℃에서 5분간 반응시켜 반응을 종료하였다.

또한 표 5에 기재된 프라이머 조합 중 붉은색으로 표시된 1개 조합을 이용하여 Infectious bronchitis virus, Newcastle disease virus, Avian Influenza A(H9N2) Virus, Infectious bursal disease virus, Duck hepatitis A virus 및 Avian encephalomyelitis virus 간의 교차반응을 통해 반응물의 색 변화와 전기영동 결과로 avian reovirus에 대한 특이도를 확인하였다(도 5a).

이를 위해 실시예 1에서 확보한 avian reovirus와 Infectious bronchitis virus, Newcastle disease virus, Avian Influenza A(H9N2) Virus, Infectious bursal disease virus, Duck hepatitis A virus 및 Avian encephalomyelitis virus로부터 RNA를 추출한 뒤 50ng/ul로 준비한 후 Mmiso RNA amplification kit(Mmonitor, South Korea)을 사용하여 총 부피 25 μl에서 0.2 μM 의 각 F3 및 B3 프라이머, 1.6 μM의 각 FIP 및 BIP 프라이머, 0.8 μM의 각 LF 및 LB 프라이머, 0.4M betaine, 10 mM MgSO₄, 1.4 mM dNTPs, 1× ThermoPol reaction buffer (Mmonitor, South Korea), 8 U Enzyme mix (Mmonitor, South Korea) 및 1μl의 상기 분리한 RNA를 포함하는 조성의 용액으로 58℃에서 40분 동안 등온증폭을 실시한 뒤 80℃에서 5분간 반응시켜 반응을 종료하였다.

결과는 도 1b, 도 2b, 도 3a, 도 4b 및 도 5a에 기재된 바와 같이 본원에 따른 프라이머 세트는 다른 유사한 균주 및 바이러스에는 교차반응을 하지 않으며, 해당 균주 및 바이러스만 특이적으로 검출하는 것으로 나타났다. 상기 Escherichia coli 및 avian reovirus에 대한 결과는 표 3 및 표 5에 기재된 다른 조합의 프라이머 세트로 각각 특이성을 충분히 나타낼 수 있다.

다음으로 각 조합의 프라이머 세트(표 1 내지 표 5)를 이용하여 Staphylococcus species(S. aureus 및 S. cohnii), Enterococcus species(E. faecalis, E. faecium, E. hirae, E. cecorum, E. durans, E. columbae, E. avium 및 E. gallinarum), Escherichia coli, Mycoplasma synoviae 및 avian reovirus에 대한 민감도를 확인하였다. 우선 S. aureus 및 S. cohnii 유전체를 ㎕ 반응액 중에 250pg, 50pg, 10pg, 2pg, 400fg, 80fg, 16fg의 농도로 사용하여 동일한 조성에서 63℃에서 40분 동안 등온증폭을 실시한 뒤 80℃에서 5분간 반응하고 반응물의 색 변화와 전기영동 결과로 민감도를 확인하였다(도 1c). 또한 Enterococcus faecalis, Enterococcus hirae 및 Enterococcus durans 유전체의 농도는 ㎕ 반응액 중에 10pg, 2pg, 400fg, 80fg, 16fg, Enterococcus faecium 유전체의 농도는 ㎕ 반응액 중에 50pg, 10pg, 2pg, 400fg, 80fg, E.columbae 유전체의 농도는 ㎕ 반응액 중에 250pg, 50pg, 10pg, 2pg, 400fg, Enterococcus avium 유전체의 농도는 ㎕ 반응액 중에 500pg, 100pg, 20pg, 4pg, 800fg, Enterococcus gallinarum 유전체의 농도는 ㎕ 반응액 중에 5ng, 1ng, 200pg, 40pg, 8pg 및 Enterococcus cecorum 유전체의 농도를 ㎕ 반응액 중에 1.25ng, 250pg, 50pg, 10pg, 2pg의 농도로 준비하여 동일한 조성에서 63℃에서 40분 동안 등온증폭을 실시한 뒤 80℃에서 5분간 반응하고 반응물의 색 변화와 전기영동 결과로 민감도를 확인하였다(도 2c). 그리고 Escherichia coli 유전체를 ㎕ 반응액 중에 256pg, 64pg, 16pg, 4pg, 1pg, 250fg, 63fg의 농도로 사용하여 동일한 조성에서 63℃에서 30분 동안 등온증폭을 실시한 뒤 80℃에서 5분간 반응하고 반응물의 색 변화와 전기영동 결과로 민감도를 확인하였다(도 3b). 또한 Mycoplasma synoviae 유전체를 ㎕ 반응액 중에 12.5ng, 2.5ng, 500pg, 100pg, 20pg, 4pg, 800fg의 농도로 사용하여 동일한 조성에서 63℃에서 40분 동안 등온증폭을 실시한 뒤 80℃에서 5분간 반응하고 반응물의 색 변화와 전기영동 결과로 민감도를 확인하였다(도 4c). 마지막으로 avian reovirus 유전체를 ㎕ 반응액 중에 10ng, 2ng, 400pg, 80pg, 16pg, 3.2pg, 640fg의 농도로 준비하여 동일한 조성에서 58℃에서 40분 동안 등온증폭을 실시한 후 80℃에서 5분간 반응하여 반응물의 색 변화와 전기영동 결과로 민감도를 확인하였다(도 5b).

따라서 반응 전에는 보라색으로 존재하다가, DNA 합성 반응이 일어나면서 Mg²⁺ 이온의 농도가 줄어들고 이에 따라서 보라색에서 푸른색으로 색의 변화 일어난다. 색의 변화는 핵산이 증폭되었음을 나타내는 양성 반응.

본원에 따른 방법은 신속하고 편리하게 결과를 눈으로 보고 정성 분석을 할 수 있으며, 또한 분광광도계를 이용하여 650nm 파장에서 흡광도를 측정할 경우 정성 및 정량 분석이 가능한 장점이 있다.

도 1c 내지 도 5b에 기재된 바와 같이 본원에 따른 프라이머 세트를 이용한 균의 검출은 민감도가 S. aureus의 유전체 DNA를 이용한 경우 400fg; S. cohnii 의 유전체 DNA를 이용한 경우 2pg; E. faecalis의 유전체 DNA를 이용한 경우 2pg; E. faecium의 유전체 DNA를 이용한 경우 10pg; E. durans의 유전체 DNA를 이용한 경우 2pg; E. hirae의 유전체 DNA를 이용한 경우 400fg; E. columbae의 유전체 DNA를 이용한 경우 10pg; E. avium의 유전체 DNA를 이용한 경우 4pg; E. gallinarum의 유전체 DNA를 이용한 경우 40pg; E. cecorum의 유전체 DNA를 이용한 경우 50pg; E. coli의 유전체 DNA를 이용한 경우 1pg; Mycoplasma synoviae 유전체 DNA를 이용한 경우 4pg; avian reovirus 유전체 RNA를 이용한 경우 3.2pg으로 매우 높은 것으로 나타났다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Primers for LAMP based detection of skeletal disease causing bacteria in chicken and its use <130> DP201704006P <160> 138 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Staphylococcus sp. gap <400> 1 gtttcaggtg cttcatgtac tac 23 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Staphylococcus sp. gap <400> 2 cgatagcttt agcagcacc 19 <210> 3 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Staphylococcus sp. gap <400> 3 tcaccagtgt aagcgtgaat tgtagctcat tagcaccagt tgctaaagt 49 <210> 4 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of Staphylococcus sp. gap <400> 4 acacaagatg cgcctcacag aaaaggttga gttagggatg atgttttc 48 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Staphylococcus sp. gap <400> 5 accttcaact aaaccgaatt catcgtt 27 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of Staphylococcus sp. gap <400> 6 gacaaacgtc gtgcacgtg 19 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Staphylococcus sp. gap <400> 7 tcgatgttgt gttagaatgt actg 24 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Staphylococcus sp. gap <400> 8 taaaacttta gcaactggtg ct 22 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Staphylococcus sp. gap <400> 9 tcaccattag ctggtgctga gataaagata aagcagaagc 40 <210> 10 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of Staphylococcus sp. gap <400> 10 acaatcgtat acaacactaa ccacaatgag tttgtagtac atgaagca 48 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Staphylococcus sp. gap <400> 11 atactttttt agcgcctgca tcgat 25 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of Staphylococcus sp. gap <400> 12 ggttctgaag ctgttgtttc agg 23 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Staphylococcus sp. rpoB <400> 13 aacgtcgtct atcagcatta 20 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Staphylococcus sp. rpoB <400> 14 actttacgat atggtgtttc aat 23 <210> 15 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Staphylococcus sp. rpoB <400> 15 tagtgagagt agtgaacgta cctggtggtt taacacgtga a 41 <210> 16 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of Staphylococcus sp. rpoB <400> 16 cgtatgtgtc caattgaaac acctcattta cacgtgcata acttgat 47 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Staphylococcus sp. rpoB <400> 17 cacgcacttc catttgagca c 21 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of Staphylococcus sp. rpoB <400> 18 gagggaccaa acattggatt gattaact 28 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Staphylococcus sp. rpoB <400> 19 gctgacgaag aagatagcta t 21 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Staphylococcus sp. rpoB <400> 20 gagtcatcgt tttctaagaa tgg 23 <210> 21 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Staphylococcus sp. rpoB <400> 21 ttaccacgga aacgacatac aacgcacaag caaattctaa attaga 46 <210> 22 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of Staphylococcus sp. rpoB <400> 22 acagttatgg ctaaagaaaa aatgaataca tgctgtcgct gcagaaac 48 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Staphylococcus sp. rpoB <400> 23 tcatcatcca tgaagcgacc atttt 25 <210> 24 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of Staphylococcus sp. rpoB <400> 24 gattacatgg atgtatcgcc taagca 26 <210> 25 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Staphylococcus sp. katA <400> 25 gctgatgctg aacgtga 17 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Staphylococcus sp. katA <400> 26 gttacttggt gcaatgcttc 20 <210> 27 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Staphylococcus sp. katA <400> 27 tctaaagaag aatactggtg tgttattcga ggatttgcgt tgaaatt 47 <210> 28 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of Staphylococcus sp. katA <400> 28 gatccaaagt tatttgctag tttaagtcca gaaatcccag ttgttttg 48 <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Staphylococcus sp. katA <400> 29 cctactaaat cccagttccc ttcttc 26 <210> 30 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of Staphylococcus sp. katA <400> 30 gtgaagcgag atcctagaac aaatatga 28 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Enterococcus sp. Cpn60 <400> 31 attgctgatg caatggaaaa ag 22 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Enterococcus sp. Cpn60 <400> 32 ttctaayaat ggyaagatat cttg 24 <210> 33 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Enterococcus sp. Cpn60 <400> 33 taaccacgat caaattgcat tccttcggtg ttattactat tgaagaatc 49 <210> 34 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of Enterococcus sp. Cpn60 <400> 34 tcwcaataca tggtaactga caagarattt tcttatcagt gatcaa 46 <210> 35 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Enterococcus sp. Cpn60 <400> 35 acatctaatt ctgtttcgat cccttt 26 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of Enterococcus sp. Cpn60 <400> 36 aatggaagct gttttagaaa atcca 25 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Enterococcus sp. tuf <400> 37 gctttgaaag ctttagaagg c 21 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Enterococcus sp. tuf <400> 38 tcaacttcgt caccaacg 18 <210> 39 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Enterococcus sp. tuf <400> 39 tggtttgtcg gtgtcacgtt ctggaagaaa aaatcctaga attaatggc 49 <210> 40 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of Enterococcus sp. tuf <400> 40 ttcatgatgc cagtcgaaga cgtccacgtt caacacgacc tgtagca 47 <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Enterococcus sp. tuf <400> 41 agttgggata tattcgtcaa ctgca 25 <210> 42 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of Enterococcus sp. tuf <400> 42 ctcaattact ggacgtggta ctgt 24 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Enterococcus sp. tuf <400> 43 gttgacgaat acatcccaac 20 <210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Enterococcus sp. tuf <400> 44 gcttcagcgt agtctaayaa tttac 25 <210> 45 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Enterococcus sp. tuf <400> 45 gtagcaacag taccacgwcc agtcgtgaya ctgacaaacc attcatg 47 <210> 46 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of Enterococcus sp. tuf <400> 46 ggtcgtgttg aacgtggwca aacaccwgta acagttgttt tagaagt 47 <210> 47 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Enterococcus sp. tuf <400> 47 attgagaata tgtcttcrac tggcat 26 <210> 48 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of Enterococcus sp. tuf 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sp. groEL <400> 54 acacgtgccg ctgtagaag 19 <210> 55 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Enterococcus sp.rpoB <400> 55 tgaattatca ccaggcgtaa ac 22 <210> 56 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Enterococcus sp.rpoB <400> 56 tacttgtccg atattcatac gtga 24 <210> 57 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Enterococcus sp.rpoB <400> 57 acaacccctt tattaccgtg acgcgtgtct atatcgttca aaaacg 46 <210> 58 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of Enterococcus sp.rpoB <400> 58 tcccgtatta tgccggaaga agatccctaa agggttcaac atgatat 47 <210> 59 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Enterococcus sp.rpoB <400> 59 gccattttat ctccttcgtg gatttta 27 <210> 60 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of Enterococcus sp.rpoB <400> 60 gccattctta cctgatggaa cac 23 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Enterococcus sp.rpoB <400> 61 atctttactc gtgaagctgg 20 <210> 62 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Enterococcus sp.rpoB <400> 62 ttcaacatga tatcgactgg tg 22 <210> 63 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Enterococcus sp.rpoB <400> 63 ccattttatc tccttcgtgg atttgatgaa ttatcaccag gtgtaaac 48 <210> 64 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of Enterococcus sp.rpoB <400> 64 gtcacggtaa taaaggggtt tccatcaggt aagaatggca tat 43 <210> 65 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Enterococcus sp.rpoB <400> 65 acgtttttga acgatataca cacgaac 27 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of Enterococcus sp.rpoB <400> 66 tcccgtatta tgccggaaga a 21 <210> 67 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of E.coli malB <400> 67 caccttcatg gatatcgaga tt 22 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of E.coli malB <400> 68 tggaggattt aagccatctc 20 <210> 69 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of E.coli malB <400> 69 cgagcgtaca gctgcaaaat gatatctttc gataccacga cct 43 <210> 70 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of E.coli malB <400> 70 cccttctccc tttgtaacaa gatgacgcat agtcagccca t 41 <210> 71 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of E.coli malB <400> 71 taacgaaagc ctggggcg 18 <210> 72 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of E.coli malB <400> 72 cctgtcatcg acagcaacat tca 23 <210> 73 <211> 18 <212> DNA <213> 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79 gaattcacct tcatggatat cga 23 <210> 80 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of E.coli malB <400> 80 tagggggtgg aggatttaa 19 <210> 81 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of E.coli malB <400> 81 gcatggcgag cgtacagcta ttgatatctt tcgataccac ga 42 <210> 82 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of E.coli malB <400> 82 tctccctttg taacaacctg tcatctcctg atgacgcata gtca 44 <210> 83 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of E.coli malB <400> 83 caaaatgtaa cgaaagcctg ggg 23 <210> 84 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of E.coli malB <400> 84 cgacagcaac attcatgatg gg 22 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Mycoplasma synoviae vlhA <400> 85 gtggtacagt tgaccctgta 20 <210> 86 <211> 20 <212> DNA 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primer for LAMP detection of Avian reovirus S1 <400> 127 ccatctccaa tttgaagagt gat 23 <210> 128 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Avian reovirus S1 <400> 128 tcckccgagt atgatgtta 19 <210> 129 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Avian reovirus S1 <400> 129 agatagacca tgactcgcgg taggaacggt ttagctatta cagatct 47 <210> 130 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of Avian reovirus S1 <400> 130 ctccgcttag tgtcgctgac aactcgttga gaacagaagt a 41 <210> 131 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Avian reovirus S1 <400> 131 ctccaatgat ttaacacgat cctgc 25 <210> 132 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of Avian reovirus S1 <400> 132 gcgtggtttc attagacatg gac 23 <210> 133 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Avian reovirus S1 <400> 133 accttcgatt taagtgacat aacg 24 <210> 134 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Avian reovirus S1 <400> 134 cggttgggaa agtaattgtg a 21 <210> 135 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Avian reovirus S1 <400> 135 cacagggaac gacgcagctt tatcccatca gacctagcac g 41 <210> 136 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Avian reovirus S1 <400> 136 acgtatcatt cacccgcgat tctacacgtg agctcgagta caccc 45 <210> 137 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Avian reovirus S1 <400> 137 gaatcccgca ctgggaacaa 20 <210> 138 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of Avian reovirus S1 <400> 138 gactcatgcg taccaagcgt 20

Claims

F3 프라이머, B3 프라이머, FIP 프라이머, BIP 프라이머를 포함하는, 스태필 로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 스태필로코커스 코니이(Staphylococcus cohnii)를 포함하는 포도상 구균(Staphylococcus spp); 엔테로코커스 파에칼리스(E. faecalis), 엔테로코커스 파에시움(E. faecium), 엔테로코커스 히레(E. hirae), 엔테로코커스 세코룸(E. cecorum), 엔테로코커스 듀란스(E. durans), 엔테로코커스 콜룸바에(E. columbae), 엔테로코커스 아비움(E. avium) 및 엔테로코커스 갈리나룸(E. gallinarum)을 포함하는 장구균(Enterococcus spp); 대장균(Escherichia coli); 마이코플라즈마 시노비애(Mycoplasma synoviae); 및 아비안 레오바이러스(avian reovirus)를 포함하는, 육계 골격근 질병 원인균 검출을 위한 LAMP 분석용 프라이머 세트로,
상기 포도상구균 검출을 위한 상기 F3 프라이머는 서열번호 1, 7, 13, 19, 또는 25로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 프라이머로 표시되고; 상기 B3 프라이머는 서열번호 2, 8, 14, 20, 또는 26으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 FIP 프라이머는 서열번호 3, 9, 15, 21, 또는 27로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 그리고 상기 BIP 프라이머는 서열번호 4, 10, 16, 22, 또는 28로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고,
상기 장구균 검출을 위한 상기 F3 프라이머는 서열번호 31, 37, 43, 49, 55, 또는 61로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고, 상기 B3 프라이머는 서열번호 32, 38, 44, 50, 56, 또는 62로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고, 상기 FIP 프라이머는 서열번호 33, 39, 45, 51, 57, 또는 63으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 그리고, 상기 BIP 프라이머는 서열번호 34, 40, 46, 52, 58, 또는 64로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고;
상기 대장균 검출을 위한 상기 F3 프라이머는 서열번호 67, 73, 또는 79로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 B3 프라이머는 서열번호 68, 74, 또는 80으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 FIP 프라이머는 서열번호 69, 75, 또는 81로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 및 상기 BIP 프라이머는 서열번호 70, 76, 또는 82로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고,
상기 마이코플라즈마 시노비애 검출을 위한 상기 F3 프라이머는 서열번호 85, 91, 97, 103, 109, 또는 115로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 B3 프라이머는 서열번호 86, 92, 98, 104, 110, 또는 116으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 FIP 프라이머는 서열번호 87, 93, 99, 105, 111, 또는 117로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 그리고 상기 BIP 프라이머는 서열번호 88, 94, 100, 106, 112, 또는 118로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고, 그리고
상기 아비안 레오바이러스 검출을 위한 상기 F3 프라이머는 서열번호 121, 127, 또는 133으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 B3 프라이머는 서열번호 122, 128, 또는 134로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 FIP 프라이머는 서열번호 123, 129, 또는 135로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 및 상기 BIP 프라이머는 서열번호 124, 130, 또는 136으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되는 것인, 육계 골격근 질병 원인균 검출을 위한 LAMP 분석용 프라이머 세트.
제 1 항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 LF 프라이머 및 LB 프라이머를 추가로 포함하며,
상기 포도상구균 검출을 위한 상기 LF 프라이머는 서열번호 5, 11, 17, 23, 또는 29로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이고, 상기 LB 프라이머는 서열번호 6, 12, 18, 24, 또는 30으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이며;
상기 장구균 검출을 위한 상기 LF 프라이머는 서열번호 35, 41, 47, 53, 59, 또는 65로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이고, 상기 LB 프라이머는 서열번호 36, 42, 48, 54, 60, 또는 66으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이며;
상기 대장균 검출을 위한 상기 LF 프라이머는 서열번호 71, 77, 또는 83으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이고, 상기 LB 프라이머는 서열번호 72, 78 또는 84로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이며;
상기 마이코플라즈마 시노비애 검출을 위한 상기 LF 프라이머는 서열번호 89, 95, 101, 107, 113, 또는 119로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이고, 상기 LB 프라이머는 서열번호 90, 96, 102, 108, 114, 또는 120으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이며; 그리고
상기 아비안 레오바이러스 검출을 위한 상기 LF 프라이머는 서열번호 125, 131, 또는 137로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이고, 상기 LB 프라이머는 서열번호 126, 132, 또는 138로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머인,
육계 골격근 질병 원인균 검출을 위한 LAMP 분석용 프라이머 세트.
제 1 항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 다음 중 어느 하나인, 육계 골격근 질병 유발 세균 및 바이러스 검출을 위한 LAMP 또는 RT-LAMP 분석용 프라이머 세트:
상기 포도상 구균을 검출하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27 및 서열번호 28로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중에서 선택되고;
상기 장구균을 검출하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 및 서열번호 40으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45 및 서열번호 46으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51 및 서열번호 52로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57 및 서열번호 58로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63 및 서열번호 64로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중에서 선택되고;
상기 대장균을 검출하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69 및 서열번호 70으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75 및 서열번호 76으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 79, 서열번호 80, 서열번호 81 및 서열번호 82로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중에서 선택되고;
상기 마이코플라즈마 시노비애를 검출하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87 및 서열번호 88로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93 및 서열번호 94로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99 및 서열번호 100으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 103, 서열번호 104, 서열번호 105 및 서열번호 106으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 111 및 서열번호 112로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 115, 서열번호 116, 서열번호 117 및 서열번호 118로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중에서 선택되고; 그리고
상기 아비안 레오바이러스를 검출하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 121, 서열번호 122, 서열번호 123 및 서열번호 124로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 127, 서열번호 128, 서열번호 129 및 서열번호 130으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 133, 서열번호 134, 서열번호 135 및 서열번호 136으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중에서 선택되는 것인, 육계 골격근질병 유발 세균 및 바이러스 검출을 위한 LAMP 또는 RT-LAMP 분석용 프라이머 세트.
제 2 항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 다음 중 어느 하나인, 육계 골격근 질병 유발 세균 및 바이러스 검출을 위한 LAMP 또는 RT-LAMP 분석용 프라이머 세트:
상기 포도상 구균을 검출하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 및 서열번호 24로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중에서 선택되고;
상기 장구균을 검출하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35 및 서열번호 36으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41 및 서열번호 42로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47 및 서열번호 48로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53 및 서열번호 54로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59 및 서열번호 60으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65 및 서열번호 66으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중에서 선택되고;
상기 대장균을 검출하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71 및 서열번호 72로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 76, 서열번호 77 및 서열번호 78로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 79, 서열번호 80, 서열번호 81, 서열번호 82, 서열번호 83 및 서열번호 84로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중에서 선택되고;
상기 마이코플라즈마 시노비애를 검출하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87, 서열번호 88, 서열번호 89 및 서열번호 90으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95 및 서열번호 96으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101 및 서열번호 102로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 103, 서열번호 104, 서열번호 105, 서열번호 106, 서열번호 107 및 서열번호 108로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 111, 서열번호 112, 서열번호 113 및 서열번호 114로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 115, 서열번호 116, 서열번호 117, 서열번호 118, 서열번호 119 및 서열번호 120으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중에서 선택되고; 그리고
상기 아비안 레오바이러스를 검출하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 121, 서열번호 122, 서열번호 123, 서열번호 124, 서열번호 125 및 서열번호 126으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 127, 서열번호 128, 서열번호 129, 서열번호 130, 서열번호 131 및 서열번호 132로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 133, 서열번호 134, 서열번호 135, 서열번호 136, 서열번호 137 및 서열번호 138로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중에서 선택되는 것인, 육계 골격근질병 유발 세균 및 바이러스 검출을 위한 LAMP 또는 RT-LAMP 분석용 프라이머 세트.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 각 세트의 하나 이상의 프라이머는 검출가능한 표지 물질로 표지된 것인, 육계 골격근질병 유발 세균 및 바이러스 검출을 위한 LAMP 또는 RT-LAMP 분석용 프라이머 세트.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트를 이용한 인비트로에서 LAMP 또는 RT-LAMP 방식으로 육계 골격근질병 유발 세균 및 바이러스를 검출하는 방법으로, 상기 방법은 하기의 단계를 포함하는 방법:
육계 골격근질병 유발 세균 및 바이러스 감염 또는 오염이 의심되는 시료를 제공하는 단계;
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트를 제공하는 단계;
상기 시료 및 프라이머 세트를 이용하여 LAMP 또는 RT-LAMP 반응을 수행하는 단계; 및
상기 LAMP 또는 RT-LAMP 반응 중 또는 종료 후에 반응 결과물을 분석하고, 이를 대조군 시료와 비교하여 차이가 있는 경우, 상기 시료를 포도상구균, 장구균, 대장균, 마이코플라즈마 시노비애 및 조류 레오바이러스 감염 또는 오염으로 판정하는 단계.
제 6 항에 있어서,
상기 시료는 가금의 병성감정 시료, 도축산물, 산란계, 종계, 토종닭을 포함하는 검체 또는 사양 환경 시료를 포함하는 것인, 방법.
제 6 항에 있어서,
상기 LAMP 또는 RT-LAMP 반응 결과물의 분석은 상기 반응 결과물의 색변화 측정 또는 탁도(turbidity) 중 하나 이상을 이용하여 측정을 통해 결정되는 것인, 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 LAMP 또는 RT-LAMP 방식을 이용한 육계 골격근질병 유발 세균 및 바이러스 검출용 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 LAMP 또는 RT-LAMP 방식을 이용한 육계 골격근질병 유발 세균 및 바이러스 검출용 키트.