KR101518872B1 - 가금의 세균성 전신성 질병 원인균 진단용 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 진단 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 가금의 세균성 전신성 질병 원인균 진단용 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 진단 키트에 관한 것으로 보다 상세하게는 서열번호 1의 포워드 프라이머(forward primer)와 서열번호 2의 리버스 프라이머(reverse primer)로 이루어져 가금의 세균성 전신성 질병 원인균인 대장균을 진단할 수 있는 프라이머 세트, 서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어져 가금의 세균성 전신성 질병 원인균인 리메렐라균을 진단할 수 있는 프라이머 세트, 서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어져 가금의 세균성 전신성 질병 원인균인 살모넬라균을 진단할 수 있는 프라이머 세트 중에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 가금의 세균성 전신성 질병 원인균 진단 조성물, 상기 프라이머 세트를 하나 이상 포함하여 가금의 세균성 전신성 질병 원인균을 선택적으로 진단 및/또는 동시에 진단할 수 있는 진단 키트 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 진단 키트를 이용하여 3종의 가금의 세균성 전신성 질병 원인균인 대장균(Escherichia coli, E.coli), 리메렐라균(Riemerella anatipestifer, R. anatipestifer), 살모넬라균(Salmonella spp.)을 선택적으로 진단 및/또는 동시에 진단할 수 있는 진단 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 가금의 세균성 전신성 질병 원인균 진단용 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 진단 키트에 관한 것으로 보다 상세하게는 서열번호 1의 포워드 프라이머(forward primer)와 서열번호 2의 리버스 프라이머(reverse primer)로 이루어져 가금의 세균성 전신성 질병 원인균인 대장균을 진단할 수 있는 프라이머 세트, 서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어져 가금의 세균성 전신성 질병 원인균인 리메렐라균을 진단할 수 있는 프라이머 세트, 서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어져 가금의 세균성 전신성 질병 원인균인 살모넬라균을 진단할 수 있는 프라이머 세트 중에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 가금의 세균성 전신성 질병 원인균 진단용 PCR 조성물, 상기 프라이머 세트를 하나 이상 포함하여 가금의 세균성 전신성 질병 원인균을 선택적으로 진단 및/또는 동시에 진단할 수 있는 진단 키트 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 진단 키트를 이용하여 3종의 가금의 세균성 전신성 질병 원인균인 대장균(Escherichia coli, E.coli), 리메렐라균(Riemerella anatipestifer, R. anatipestifer), 살모넬라균(Salmonella spp.)을 선택적으로 진단 및/또는 동시에 진단할 수 있는 진단 방법에 관한 것이다.
상기에서 가금은 닭, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 꿩 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
리메렐라균(Riemerella anatipestifer, R. anatipestifer)은 운동성이 없는 그람 음성 간균으로 1932년 미국에서 처음 보고되었으며, 지금까지 21가지 혈청형이 알려져 있다. 국내에서는 현재 4가지 혈청형(1형, 4형, 7형 및 16형)이 존재하며 주로 1형 및 7형이 유행한다고 알려져 있으며, 리메렐라균에 대한 혈청형 감별은 평판응집반응이나 한천침강반응을 이용한다.
리메렐라균에 의한 리메렐라 감염증은 오리, 거위, 칠면조 등의 가금 및 야생조류에서 섬유소성 심외막염, 간포막염, 기낭염, 뇌막염 등을 특징으로 하는 급성 및 만성 패혈증성 전염성 질병이다. 이 질병은 높은 폐사율, 체중감소 및 품질 저하 등을 유발하기 때문에 전 세계적으로 오리 등 가금 관련 산업에 심각한 피해를 주고 있다. 이 세균은 혈청형, 숙주의 연령, 감염 경로 등에 따라 질병의 정도가 매우 다양하다. 1∼8주령의 오리에서 감수성이 매우 높으며 5주령 이하의 오리에 감염시 임상증상을 보인 후 1∼2일 이내에 대부분 폐사하게 된다. 국내에서는 주로 3∼5주령 사이에 발생하고 있다.
리메렐라균은 어린 오리의 인후두 점막부위에서 정상적으로 존재하다가 주로 호흡기나 피부의 상처를 통해 감염이 이루어지며 잠복기는 보통 2∼5일이다. 콧물, 기침 등의 호흡기 증상과 함께 보행불량, 진전 등의 신경증상을 보이고, 리메렐라균에 감염된 오리의 폐사율은 5∼90％로 알려져 있다. 리메렐라균이 감염된 오리의 증상은 육안적으로 심낭, 간포막, 기낭에서 섬유소성 삼출물이 흔히 관찰되며 비장종대 및 만성 진행시 괴사성 피부염도 관찰되기도 한다. 최종진단은 임상증상 및 부검소견만으로는 불가능하며, 균 분리 등의 검사를 통해 이루어지는데 통상적으로 간 등의 샘플을 혈액배지에 도말하고 37℃에서 48∼72시간 동안 배양한 후 동정하는 검사에 의해 이루어진다.
리메렐라 감염증과 감별해야 하는 세균성 패혈증의 원인으로는 대장균 감염증, 파스튜렐라 멀토시다 감염증, 스트렙토코커스 감염증, 살모넬라 감염증 등이 있다. 리메렐라 감염증의 경우 이들 질병과 임상증상 및 육안 소견이 매우 유사하며, 이들 원인체가 중복 감염 될 경우, 세균의 분리 후 생화학동정을 통해 감별해야 한다. 하지만 세균의 생화학적 동정은 시간과 노력이 많이 든다는 단점이 있으며, 또한 리메렐라균은 파스튜렐라균과 형태가 매우 유사하여 진단에 어려움이 있다.
2011년도 대한민국 농림수산검역검사본부의 오리 병성감정 결과 대장균에 의한 대장균 감염증이 9건, 살모넬라균에 의한 살모넬라 감염증이 7건, 리메렐라균에 의한 리메렐라 감염증이 6건으로 확인되었으며, 2011년 7월부터 9월까지 3개월 동안 오리 농장의 질병검사를 수행한 결과 17농장(34건) 중 14농장(16건)에서 리메렐라 감염증이 확인되어 국내 오리 생산농가에 막대한 피해를 주고 있는 것으로 나타났다.
상기의 리메렐라균에 의한 오리 등의 가금 이외에도 가금의 세균성 전신성 질병 원인균인 대장균, 살모넬라균에 의한 감염에 의해 가금의 생산농가 및/또는 생산지역에 경제적으로 많은 피해를 주고 있다.
이에 본 발명자들은 가금에서 전신성 질병을 일으키는 3종의 원인균인 대장균, 리메렐라균 및 살모넬라균을 신속히 진단할 수 있는 진단용 조성물 및/또는 진단 키트를 개발하고자 대장균, 리메렐라균 및 살모넬라균을 구분하는 특이 신규 프라이머 세트를 디자인하고, 상기 프라이머 세트를 포함하는 가금 전신성 질병 유발 3종의 원인균인 대장균, 리메렐라균 및 살모넬라균을 선택적으로 진단 및/또는 동시에 진단할 수 있는 진단용 PCR 조성물, 상기 프라이머 세트를 포함하여 가금 전신성 질병 유발 3종의 원인균인 대장균, 리메렐라균 및 살모넬라균을 선택적으로 진단 및/또는 동시에 진단할 수 있는 진단 키트, 바람직하게는 다중 중합효소 연쇄반응 진단 키트 및 상기 진단 키트를 이용하여 가금 전신성 질병 유발 3종의 원인균인 대장균, 리메렐라균 및 살모넬라균을 선택적으로 진단 및/또는 동시에 진단할 수 있는 진단 방법을 완성하였다.
상기에서 언급한 본 발명의 가금 전신성 질병 유발 3종의 원인균인 대장균, 리메렐라균 및 살모넬라균을 진단할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 진단용 PCR 조성물 또는 진단 키트는 다중 중합효소 연쇄반응(Multiplex polymerase chain reaction, Multiplex PCR)을 실시함으로써 신속하게 가금 전신성 질병 유발 3종의 원인균을 선택적으로 진단 및/또는 동시에 진단할 수 있도록 하였다. 또한 본 발명의 가금 전신성 질병 유발 3종의 원인균인 대장균, 리메렐라균 및 살모넬라균을 진단할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 진단용 PCR 조성물 또는 진단 키트는 국내 병성감정기관의 진단 표준화를 위해 특이도와 민감도의 문제점을 해결하였으며, 진단용 PCR 조성물의 경우 진단 반응에 필요한 중합효소 연쇄반응 혼합액을 건조함으로써 용액 상태의 진단용 PCR 조성물과 성능은 동등하게 유지하면서 보관 기간을 향상시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
한편 본 발명과 관련된 선행기술로서 한국특허 제10-0252383호에 가축에서 설사를 일으키는 병원성 대장균의 신속 진단을 위한 멀티플렉스 PCR 기법(multiplex polymerase chain reaction-based method)에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 한번의 PCR 반응에 동시에 적용할 수 있는 4종의 섬모항원 각각에 대한 PCR 프라이머(primer)의 개발 및 이들 프라이머들을 동시에 이용하는 대장균 섬모항원의 동시 진단을 위한 멀티플렉스 PCR 기법을 나타내고 있다.
또한 한국특허 제10-0984785호에 살모넬라 티피무리움을 정확하고 신속하고, 정량적으로 진단할 수 있는 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) 진단용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 살모넬라 티피무리움 진단용 키트, 상기 프라이머 세트를 이용하여 대상 시료에서 살모넬라 티피무리움을 진단하는 방법, 살모넬라 티피무리움 진단용 올리고뉴클레오티드 프로브 및 상기 프로브가 고정화된 마이크로어레이를 나타내고 있다.
그리고 한국특허 제10-0834026호에 국내에서 주로 발생하는 야외 병원성 리메렐라균의 감염을 효과적으로 방어할 수 있어 리메렐라 감염에 의한 오리의 폐사를 예방할 수 있는 국내에서 분리되고 높은 병원성을 갖는 혈청형 1형 및 7형 및 면연증강제를 포함하는 리메렐라 감염증 예방용 리메렐라균 백신 및 이의 제조방법을 나타내고 있다.
그러나 본 발명은 상기의 선행기술들과 대비시 발명의 기술적 특징이 서로 달라 발명의 구성이 서로 다른 발명이다.
본 발명의 제1 목적은 가금 전신성 질병을 유발하는 3종의 원인균인 대장균, 리메렐라균, 살모넬라균을 진단할 수 있는 프라이머 세트를 제공하고자 한다.
본 발명의 제2 목적은 가금 전신성 질병을 유발하는 3종의 원인균인 대장균, 리메렐라균, 살모넬라균을 진단할 수 있는 프라이머 세트를 하나 이상 포함하도록 하여 가금 전신성 질병을 유발하는 3종의 세균을 선택적으로 진단 및/또는 동시에 진단할 수 있는 진단 키트, 바람직하게는 다중 중합효소 연쇄반응 진단 키트(multiplex PCR kit)를 제공하고자 한다. 상기의 진단 키트는 PCR 반응에 필요한 모든 시약이 1회 테스트 용량으로 혼합, 분주 및 건조되어 있어 숙련되지 않은 검사자라도 손쉽게 가금 전신성 질병을 유발하는 3종의 세균을 진단할 수 있다.
본 발명의 제3 목적은 진단용 PCR 조성물에 있어서, 서열번호 1의 포워드 프라이머와 서열번호 2의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 중에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하도록 하여 가금의 세균성 전신성 질병 원인균을 진단할 수 있는 PCR 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 제4 목적은 상기의 가금 전신성 질병을 유발하는 3종의 원인균인 대장균, 리메렐라균, 살모넬라균을 진단할 수 있는 프라이머 세트를 하나 이상 포함하는 진단 키트, 바람직하게는 다중 중합효소 연쇄반응 진단 키트(multiplex PCR kit)를 이용하여 가금 전신성 질병을 유발하는 3종의 세균을 선택적으로 진단 및/또는 동시에 진단할 수 있는 진단 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 서열번호 1의 포워드 프라이머(forward primer)와 서열번호 2의 리버스 프라이머(reverse primer)로 이루어져 가금의 세균성 전신성 질병 원인균인 대장균을 진단할 수 있는 프라이머 세트, 서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어져 가금의 세균성 전신성 질병 원인균인 리메렐라균을 진단할 수 있는 프라이머 세트, 서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어져 가금의 세균성 전신성 질병 원인균인 살모넬라균을 진단할 수 있는 프라이머 세트를 제공할 수 있다.
본 발명은 진단용 PCR 조성물에 있어서, 서열번호 1의 포워드 프라이머와 서열번호 2의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 중에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하도록 하여 가금의 세균성 전신성 질병 원인균을 진단할 수 있는 PCR 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명은 상기의 서열번호 1의 포워드 프라이머와 서열번호 2의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 하나 이상 포함하도록 하여 가금의 세균성 전신성 질병을 유발하는 3종의 원인균인 대장균(Escherichia coli, E.coli), 리메렐라균(Riemerella anatipestifer, R. anatipestifer), 살모넬라균(Salmonella spp.)을 선택적으로 진단 및/또는 동시에 진단할 수 있는 진단 키트, 바람직하게는 다중 중합효소 연쇄반응 진단 키트(multiplex PCR kit)를 제공할 수 있다.
본 발명은 상기의 서열번호 1의 포워드 프라이머와 서열번호 2의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 하나 이상 포함하는 진단 키트를 이용하여 3종의 가금의 세균성 전신성 질병 원인균인 대장균, 리메렐라균, 살모넬라균을 선택적으로 진단 및/또는 동시에 진단할 수 있는 진단 방법을 제공할 수 있다.
본 발명은 3종의 가금 전신성 질병 원인균인 대장균, 리메렐라균, 살모넬라균을 진단할 수 있는 프라이머 세트, 상기 3종의 가금 전신성 질병 원인균인 대장균, 리메렐라균, 살모넬라균을 진단할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 진단용 PCR 조성물, 상기 3종의 가금 전신성 질병 원인균인 대장균, 리메렐라균, 살모넬라균을 진단할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 진단 키트, 바람직하게는 다중 중합효소 연쇄반응 키트를 이용하여 3종의 가금 전신성 질병 원인균을 2시간 이내에 신속, 간편하게 진단할 수 있다. 또한 민감도가 높아 배양액 내에 존재하는 미량의 유전자를 진단할 수 있어 빠른 시간에 가금의 질병 원인을 진단할 수 있어 가금 질병 방역에 기여할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 3(액상형 PCR 조성물)의 다중 중합효소 연쇄반응을 이용하여 3종의 가금 전신성 질병 원인균인 대장균(E.coli), 리메렐라균(RA), 살모넬라균(Sal)을 측정결과 및 실시예 4(건조형 PCR 조성물)의 다중 중합효소 연쇄반응을 이용하여 3종의 가금 전신성 질병 원인균인 대장균(E.coli), 리메렐라균(RA), 살모넬라균(Sal)을 측정결과를 나타낸 것이다(Lane M:100 bp DNA ladder, 1:액상형 PCR 혼합액, 2: 건조형 PCR 혼합물, N:negative control).
도 2는 실시예 4(건조형 PCR 조성물)의 다중 중합효소 연쇄반응을 이용하여 3종의 가금 전신성 질병 원인균인 대장균(E.coli), 리메렐라균(RA), 살모넬라균(Sal)을 측정시의 민감도를 나타낸 결과이다(Lane M:100 bp DNA ladder, 1∼7: 가금 전신성 질병 원인균 3종(대장균, 리메렐라균, 살모넬라균)의 20ng∼20fg DNA(각 lane별로 10진 단계 희석), N:negative control).
도 3은 동물질병 표준검사법(농림수산검역검사본부, 2011년)에 따른 리메렐라균의 중합효소 연쇄반응의 민감도 측정 결과이다(Lane M:100 bp DNA ladder, 1∼7:가금 전신성 질병 원인균인 리메렐라균의 20ng∼20fg DNA(각 lane별로 10진 단계 희석), N:negative control).
도 4는 동물질병 표준검사법(농림수산검역검사본부, 2011년)에 따른 살모넬라균의 중합효소 연쇄반응의 민감도 측정 결과이다(Lane M:100 bp DNA ladder, 1∼7:가금 전신성 질병 원인균인 살모넬라균의 20ng∼20fg DNA(각 lane별로 10진 단계 희석), N:negative control).
도 2는 실시예 4(건조형 PCR 조성물)의 다중 중합효소 연쇄반응을 이용하여 3종의 가금 전신성 질병 원인균인 대장균(E.coli), 리메렐라균(RA), 살모넬라균(Sal)을 측정시의 민감도를 나타낸 결과이다(Lane M:100 bp DNA ladder, 1∼7: 가금 전신성 질병 원인균 3종(대장균, 리메렐라균, 살모넬라균)의 20ng∼20fg DNA(각 lane별로 10진 단계 희석), N:negative control).
도 3은 동물질병 표준검사법(농림수산검역검사본부, 2011년)에 따른 리메렐라균의 중합효소 연쇄반응의 민감도 측정 결과이다(Lane M:100 bp DNA ladder, 1∼7:가금 전신성 질병 원인균인 리메렐라균의 20ng∼20fg DNA(각 lane별로 10진 단계 희석), N:negative control).
도 4는 동물질병 표준검사법(농림수산검역검사본부, 2011년)에 따른 살모넬라균의 중합효소 연쇄반응의 민감도 측정 결과이다(Lane M:100 bp DNA ladder, 1∼7:가금 전신성 질병 원인균인 살모넬라균의 20ng∼20fg DNA(각 lane별로 10진 단계 희석), N:negative control).
본 발명은 가금 전신성 질병 원인균을 진단할 수 있는 프라이머 세트를 나타낸다.
본 발명은 서열번호 1의 포워드 프라이머(forward primer)와 서열번호 2의 리버스 프라이머(reverse primer)로 이루어진 가금의 세균성 전신성 질병 원인균 진단용 프라이머 세트(promer set)를 나타낸다.
상기에서 서열번호 1의 포워드 프라이머와 서열번호 2의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트는 가금의 세균성 전신성 질병 원인균인 대장균(Escherichia coli, E.coli)을 진단할 수 있다.
본 발명은 서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 가금의 세균성 전신성 질병 원인균 진단용 프라이머 세트를 나타낸다.
상기에서 서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트는 가금의 세균성 전신성 질병 원인균인 리메렐라균(Riemerella anatipestifer, R. anatipestifer)을 진단할 수 있다.
본 발명은 서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 가금의 세균성 전신성 질병 원인균 진단용 프라이머 세트를 나타낸다.
상기에서 서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트는 가금의 세균성 전신성 질병 원인균인 살모넬라균(Salmonella spp.)을 진단할 수 있다.
상기에서 가금은 닭, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 꿩 중에서 선택된 어느 하나 일 수 있으며, 바람직하게는 닭 또는 오리일 수 있다.
본 발명의 가금 전신성 질병 원인균을 진단할 수 있는 프라이머 세트는 3종의 가금 전신성 질병 원인균인 대장균, 리메렐라균, 살모넬라균에 대해 Escherichia coli gene(GenBank accession No. CP001925.1), R. anatipestifer gene(GenBank accession No. NC_014738.1), Salmonella spp. gene(GenBank accession No. EU 348369.1)의 염기서열 사이에서 길이는 22∼23bp, Tm값은 60∼65℃가 되도록 염기서열을 선택하여 정방향 프라이머(Forward primer) 및 역방향 프라이머(Reverse primer)로 이루어진 프라이머 세트로 구성하였다(표 1 참조). Tm값은 MP primer 프로그램을 사용하여 체크하였다.
| 항목 | 프라이머 | 비고 |
| 대장균 | F : GTCCGAGCGCGACCAGTGAAAA | 서열번호 1 |
| R : TCGAGATCGACCGTCTCGCCAA | 서열번호 2 | |
| 리메렐라균 | F : CCGCACAAGCGGTGGATCATGT | 서열번호 3 |
| R : TCGCAGTGTAGCTGCCCTCTGT | 서열번호 4 | |
| 살모넬라균 | F : TCTCCCCCTCTTCATGCGTTAC | 서열번호 5 |
| R : CCTTTGACGGTGCGATGAAGTT | 서열번호 6 |
*상기 표 1에서 프라이머의 F는 정방향 프라이머(Forward primer)를 나타내며, R은 역방향 프라이머(Reverse primer)를 나타낸다.
상기 표 1에 기재된 프라이머들은 각 타겟(target) 별 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트가 각각 개별적으로 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 실시 및/또는 혼합된 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 실시되어 3종의 가금 전신성 질병 원인균인 대장균, 리메렐라균 및 살모넬라균을 각각 개별적 및/또는 동시에 진단할 수 있다.
본 발명은 가금의 세균성 전신성 질병 원인균을 진단할 수 있는 PCR 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명은 진단용 PCR 조성물에 있어서, 서열번호 1의 포워드 프라이머와 서열번호 2의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 중에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하도록 하여 가금의 세균성 전신성 질병 원인균을 진단할 수 있는 PCR 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명은 진단용 PCR 조성물에 있어서, 서열번호 1의 포워드 프라이머와 서열번호 2의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 중에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하도록 하여 3종의 가금 전신성 질병 원인균인 대장균, 리메렐라균 및 살모넬라균을 각각 개별적 및/또는 동시에 진단할 수 있는 진단용 PCR 조성물을 포함한다.
상기의 진단용 PCR 조성물은 서열번호 1의 포워드 프라이머와 서열번호 2의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 중에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트 이외에 종래 진단용 PCR 조성물에 사용되는 성분을 사용할 수 있으며, 이러한 종래 진단용 PCR 조성물의 성분의 일예로서 반응용 완충용액, dNTP, Mg2+이온, DNA 중합효소가 포함될 수 있다.
상기 반응용 완충용액은 1∼10mM TrisHCl, 10∼40mM KCl(pH 9.0)을 사용할 수 있으며, 상기 dNTP는 dATP, dTTP, dGTP, dCTP 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
상기 조성물에서 실험상의 편의, 안정화 및 반응성 향상을 위해 안정화제 및/또는 비반응성 염료 등를 포함할 수 있다.
상기 비반응성 염료 물질이란 중합효소연쇄반응에 영향을 미치지 않는 물질로부터 선택되어져야 하며, 중합효소연쇄반응 산물을 이용한 분석이나 식별을 위해 사용되는 것을 목적으로 한다. 이러한 조건을 만족시키는 물질로는 로다민, 탐라, 락스, 브로모페놀 블루, 크실렌 시아놀, 브로모크레졸 레드, 크레졸 레드 등의 수용성 염료로 사용될 수 있다. 상기 비반응성 염료 물질은 진단용 PCR 조성물 전체 중량 대비 0.0001∼0.01중량%의 함량으로 포함될 수 있으며, 0.001∼0.005중량%의 함량으로 포함되는 것이 바람직하다. 만일, 비반응성 염료 물질이 진단용 PCR 조성물 전체 중량 대비 0.0001중량% 미만의 함량으로 첨가되는 경우에는 중합효소연쇄반응 후 전기영동시 염료의 농도가 낮아 시료의 이동을 육안으로 관측하기 어려운 문제점이 있고, 진단용 PCR 조성물 전체 중량 대비 0.01중량% 초과의 함량으로 첨가되는 경우 중합효소연쇄반응 시 고농도의 수용성 염료가 반응 저해제로 작용될 수 있는 문제점이 있다. 또한, 전기영동 시 시료의 이동을 방해할 수 있는 문제점이 있다.
또한, 상기 다가알코올류는 본 발명의 조성물을 보다 안정화시키기 위한 안정화 물질로 사용될 수 있으며, 글루코스, 글리세롤, 만니톨, 갈락시톨, 글루시톨, 솔비톨 중 하나 이상의 물질을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 다가알코올류는 10∼500mM의 함량으로 포함될 수 있으며, 50∼300mM의 함량으로 포함되는 것이 바람직하다. 만일, 다가알코올류가 500mM를 초과하게 되면 수용성 중합체 자체의 용해도로 인해 수용액으로 용해하기 어려우며, 높은 점도로 인해 충분한 혼합이 이루어지기 어렵고, 부피가 필요 이상으로 커지며, 중합효소연쇄반응을 위해 멸균 증류수로 용해시 용해가 쉽게 되지 않는다. 또한, 중합효소연쇄반응시 고농도의 수용성 중합체가 반응 저해제로 작용할 수 있는 문제점이 있다. 그리고, 10mM 미만이면 대상효소와 표면 물분자를 충분히 코팅하여 보호할 수 없기 때문에 효율적인 효소의 안정화 효과를 기대하기 어려우며 또한, 용액의 점도가 너무 낮아 튜브 바닥면 전체에 넓게 퍼지면서 이상적인 형태로 건조되지 못하는 문제점과 효소가 충분히 보호되지 못하는 문제점이 있다. 본 발명에서는 다가알코올류 이외에도 안정화 물질로서 젤라틴, 소형청 알부민, Thesit, PEG-8000을 사용하는 것이 가능하다.
상기 조성물은 액상 형태로 제공될 수 있으며, 안정성, 보관의 간편성 및 장기 보관성을 증가시키기 위하여 건조된 상태인 것이 바람직하다. 상기 건조는 일반적인 상온건조, 가온건조, 동결건조, 감압건조와 같은 공지의 건조 방법에 의해 수행될 수 있으며, 조성물의 성분이 손실되지 않는 한, 임의의 건조 방법은 모두 사용가능하다. 상기와 같은 건조 방법은 사용되는 효소의 종류 및 양에 따라 상이하게 적용될 수 있으며, 본 발명에서는 바람직하게는 동결건조 또는 진공원심분리를 이용한 감압건조 방법이 사용될 수 있다.
상기 조성물은 한 반응 튜브 내에 혼합시킨 후 동결하거나 건조시킴으로써 안정화된 상태로 제조하여 사용하게 됨으로써, 중합효소연쇄반응 동안에 별도의 혼합과정이 필요하지 않으므로 반응 중 혼합으로 인한 오류를 방지 할 수 있으며, 안정성, 반응성 및 보관성을 향상시킬 수 있다.
상기에서 본 발명의 진단용 PCR 조성물에 있어서, 서열번호 1의 포워드 프라이머와 서열번호 2의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 중에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트는 진단용 PCR 조성물 전체 중량 대비 0.01∼10중량％를 사용할 수 있다.
상기에서 3종의 가금 전신성 질병 원인균인 대장균, 리메렐라균 및 살모넬라균을 각각 개별적 및/또는 동시에 진단할 수 있는 진단용 PCR 조성물은 대장균, 리메렐라균, 살모넬라균를 진단할 수 있는 프라이머 세트를 제외한 나머지 성분인 반응용 완충용액, dNTP, Mg2+이온, DNA 중합효소들은 이들이 이미 함유된 제품, 예를 들면 AccuPowerㄾ Gold Multiplex PCR Premix(Cat K- 2115)(바이오니아, 대한민국)를 사용할 수 있다.
본 발명은 가금의 세균성 전신성 질병 원인균을 진단할 수 있는 진단 키트를 포함한다.
본 발명은 3종의 가금 세균성 전신성 질병 원인균인 대장균, 리메렐라균 및 살모넬라균을 개별적 및/또는 동시에 진단할 수 있는 진단 키트를 포함한다.
상기의 진단 키트는 닭, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 꿩 중에서 선택된 어느 하나의 가금의 세균성 전신성 질병 원인균을 진단할 수 있다.
상기의 진단 키트는 닭, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 꿩 중에서 선택된 어느 하나의 가금에 대한 3종의 세균성 전신성 질병 원인균인 대장균, 리메렐라균 및 살모넬라균을 개별적 및/또는 동시에 진단할 수 있다.
상기의 진단 키트는 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용한 PCR 키트일 수 있다.
상기의 진단 키트는 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 이용한 다중 PCR 키트일 수 있다.
상기의 진단 키트는 서열번호 1의 포워드 프라이머와 서열번호 2의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 중에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하여 3종의 가금 세균성 전신성 질병 원인균인 대장균, 리메렐라균 및 살모넬라균을 각각 개별적 및/또는 동시에 진단할 수 있다.
상기의 진단 키트는 서열번호 1의 포워드 프라이머와 서열번호 2의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 중에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트 이외에 PCR 반응에 사용되는 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼와 같은 시약을 포함할 수 있으며, 이러한 시약은 PCR 반응에 사용되는 것을 통상의 기술자가 적의 선택하여 실시할 수 있으면 족하므로 이하 PCR 반응에 사용되는 시약에 대한 자세한 내용은 생략하기로 한다.
본 발명은 상기에서 언급한 가금의 세균성 전신성 질병 원인균을 진단할 수 있는 진단 키트를 이용하여 대상 시료로부터 가금의 세균성 전신성 질병 원인균을 진단할 수 있는 진단 방법을 포함한다.
본 발명은 상기에서 언급한 가금의 세균성 전신성 질병 원인균을 진단할 수 있는 진단 키트를 이용하여 대상 시료로부터 3종의 가금 세균성 전신성 질병 원인균인 대장균, 리메렐라균 및 살모넬라균을 개별적 및/또는 동시에 진단할 수 있는 진단 방법을 포함한다.
상기의 진단 키트를 이용한 가금의 세균성 전신성 질병 원인균을 진단할 수 있는 진단 방법은 닭, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 꿩 중에서 선택된 어느 하나의 가금에 대한 세균성 전신성 질병 원인균을 진단할 수 있다.
상기의 진단 키트를 이용한 가금의 세균성 전신성 질병 원인균을 진단할 수 있는 진단 방법은 닭, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 꿩 중에서 선택된 어느 하나의 가금에 대한 3종의 세균성 전신성 질병 원인균인 대장균, 리메렐라균 및 살모넬라균을 각각 개별적 및/또는 동시에 진단할 수 있다.
상기의 가금의 세균성 전신성 질병 원인균을 진단할 수 있는 진단 방법은 서열번호 1의 포워드 프라이머와 서열번호 2의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트 중에서 선택된 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 PCR 진단용 조성물에 주형 DNA를 함유한 시료를 혼합하는 단계; 상기 혼합물이 증폭될 수 있도록 반응, 바람직하게는 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계를 포함하는 실시할 수 있다.
본 발명의 가금의 세균성 전신성 질병 원인균 진단용 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 진단 키트에 대해 다양한 조건으로 실시한바, 본 발명의 목적을 달성하기 위해서는 상기에서 언급한 조건의 가금의 세균성 전신성 질병 원인균 진단용 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 진단 키트를 제공하는 것이 바람직하다.
이하 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 주형 DNA 제조
다중 중합효소 연쇄반응을 실시하기 위해 먼저 주형 DNA를 추출하였다. 사용한 균주는 캐나다 몬트리올 수의과대학으로부터 제공받은 대장균(6610, 13310), 대한민국 농림수산검역검사본부에서 분양받은 리메렐라균(ATCC 11845, ATCC 51411, ATCC 51412), 살모넬라균(ATCC 14028, ATCC 15479, ATCC 7001, ATCC 19945, ATCC 9184)를 혈액배지(Sheep blood agar plate, 아산제약(주), 한국)에 상기 균주를 접종한 후 37℃에서 24∼72시간 배양하였다. 그 후 단일 콜로니를 채취하여 DNesay Blood & Tissue kit(Qiagen사제, USA)를 사용하여 DNA를 추출하였다.
상기에서 대장균으로부터 추출한 DNA의 염기서열 중 타켓 진 시퀀스(target gene sequence)를 서열번호 7에 나타내었고, 리메렐라균으로부터 추출한 DNA의 염기서열 중 타켓 진 시퀀스(target gene sequence)를 서열번호 8에 나타내었고, 살모넬라균으로부터 추출한 DNA의 염기서열 중 타켓 진 시퀀스(target gene sequence)를 서열번호 9에 나타내었다
상기에서 대장균, 리메렐라균 및 살모넬라균에서 추출한 각각의 DNA는 UV 분광도계로 농도와 순도를 측정한 다음 순도가 1.8∼2.0인 것을 확인한 후 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)에서 주형 DNA로 사용하였다.
주형 DNA는 다중 중합효소 연쇄반응시 사용하기 쉽도록 1ㅧ TE buffer(10mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1mM EDTA)를 이용하여 10ng/㎕로 희석하여 다음 사용시까지 -70℃에 보관하였다.
<실시예 2> 프라이머 디자인
3종의 가금 전신성 질병 유발 원인균에 대해 E. coli gene(GenBank accession No. CP001925.1), R. anatipestifer gene(GenBank accession No. NC_014738.1), Salmonella spp. gene(GenBank accession No. EU 348369.1)의 염기서열 사이에서 길이는 22∼23bp, Tm값은 60∼65℃가 되도록 염기서열을 선택하여 정방향 프라이머(Forward primer) 및 역방향 프라이머(Reverse primer)로 이루어진 3종의 가금 전신성 질병 유발 원인균 진단용 프라이머 세트를 구성하고 이를 아래의 표 2에 나타내었다.
상기에서 Tm값은 MP primer 프로그램을 사용하여 체크하였다.
| 항목 | 프라이머 | 비고 |
| 대장균 | F : GTCCGAGCGCGACCAGTGAAAA | 서열번호 1 |
| R : TCGAGATCGACCGTCTCGCCAA | 서열번호 2 | |
| 리메렐라균 | F : CCGCACAAGCGGTGGATCATGT | 서열번호 3 |
| R : TCGCAGTGTAGCTGCCCTCTGT | 서열번호 4 | |
| 살모넬라균 | F : TCTCCCCCTCTTCATGCGTTAC | 서열번호 5 |
| R : CCTTTGACGGTGCGATGAAGTT | 서열번호 6 |
*상기 표 2에서 염기서열의 F는 정방향 프라이머(Forward primer)를 나타내며, R은 역방향 프라이머(Reverse primer)를 나타낸다.
<실시예 3> 액상형 PCR 조성물을 이용한 다중 중합효소 연쇄반응
다중 중합효소 연쇄반응에 사용할 PCR 조성물은 AccuPowerㄾ Gold Multiplex PCR Premix(Cat K- 2115)(바이오니아, 대한민국)를 기본으로 실시예 2의 표 2에 기재된 3종의 가금 전신성 질병 원인균인 대장균, 리메렐라균, 살모넬라균를 진단하기 위한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 한 세트로 각각 조합하고 총 용량이 10㎕가 되도록 혼합한 후 96 well 플레이트에 분주하였다.
이후 상기의 PCR 조성물에 상기 실시예 1에서 추출한 3종의 가금 전신성 질병 원인균인 대장균, 리메렐라균, 살모넬라균의 DNA를 각각 주형으로 첨가하고, 멸균증류수로 총 용량이 20㎕가 되도록 분주하여 완전히 용해되도록 혼합하여 액상형 PCR 조성물을 얻었다.
상기의 액상형 PCR 조성물은 MyGenieTM 96 Gradient Thermal Block을 이용하여 다중 중합효소 연쇄반응을 실시하고 이의 결과를 도 1에 나타내었다(도 1 참조).
상기의 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)은 95℃에서 5분간 변성시킨 후, 95℃에서 30초와 65℃에서 1분 30초씩 30사이클, 72℃에서 5분간 반응시켰다.
한편, 도 1에서 Negative control은 주형 DNA 대신 증류수(distilled water, DW)로 사용한 결과를 나타낸 것으로서, DW를 Negative control로 사용하는 이유는 주형 DNA 대신에 DW 사용하는 경우 PCR 결과에 대한 반응으로 no band 상태이어야 하지만 band가 나타날 경우 Positive control 혹은 실시예에 대한 주형 DNA가 PCR 실험시 오염(contamination) 되었다고 판단할 수 있기 때문이다.
<실시예 4> 건조형 PCR 조성물을 이용한 다중 중합효소 연쇄반응
실시예 3의 액상형 PCR 조성물을 건조한 건조형 PCR 조성물을 이용하여 다중 중합효소 연쇄반응을 실시하였다. 이는 시약의 동결건조 조건에 의해 PCR 성능이 영향을 받지 않음을 확인하고 사용의 편리성 및 재현성이 향상된 3종의 가금 전신성 질병 유발 원인균을 진단할 수 있는 진단 키트를 제공하기 위함이다.
다중 중합효소 연쇄반응에 사용할 건조형 PCR 조성물은 AccuPowerㄾ Gold Multiplex PCR Premix(Cat K- 2115)(바이오니아, 대한민국)를 기본으로 실시예 2의 표 2에 기재된 각각의 3종의 가금 전신성 질병 원인균인 대장균, 리메렐라균, 살모넬라균를 진단하기 위한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 한 세트로 각각 조합하고 총 용량이 10㎕가 되도록 혼합한 후 96 well 플레이트에 분주하고, SuperCentra2(바이오니아, 한국)를 이용하여 50분간 건조(진공도 :-76cmHg)하였다.
상기의 건조된 PCR 조성물에 상기 실시예 1에서 추출한 3종의 가금 전신성 질병 원인균인 대장균, 리메렐라균, 살모넬라균의 DNA를 각각 주형으로 첨가하고, 멸균증류수로 총 용량이 20㎕가 되도록 분주하여 건조물이 완전히 용해되도록 혼합하였다. 이후 MyGenieTM 96 Gradient Thermal Block을 이용하여 다중 중합효소 연쇄반응을 실시하고 이의 결과를 도 1에 나타내었다(도 1 참조).
상기의 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)은 95℃에서 5분간 변성시킨 후, 95℃에서 30초와 65℃에서 1분 30초씩 30사이클, 72℃에서 5분간 반응시켰다.
도 1에서 보듯이 실시예 3의 액상형 PCR 조성물을 이용한 다중 중합효소 연쇄반응 결과와 실시예 4의 건조형 PCR 조성물을 이용한 다중 중합효소 연쇄반응 결과를 비교시 동일한 반응결과가 나타나 PCR 반응시 사용되는 조성물은 건조 조건에서도 영향을 받지 않음을 확인하였다(도 1에서 Lane M:100 bp DNA ladder, 1:실시예 3(액상형 PCR 조성물 이용)의 다중 중합효소 연쇄반응 결과, 2:실시예 4(건조형 PCR 조성물 이용)의 다중 중합효소 연쇄반응 결과, N:negative control)
한편, 도 1에서 Negative control은 주형 DNA 대신 증류수(distilled water, DW)로 사용한 결과를 나타낸 것으로서, DW를 Negative control로 사용하는 이유는 주형 DNA 대신에 DW 사용하는 경우 PCR 결과에 대한 반응으로 no band 상태이어야 하지만 band가 나타날 경우 Positive control 혹은 실시예에 대한 주형 DNA가 PCR 실험시 오염(contamination) 되었다고 판단할 수 있기 때문이다.
<실시예 5> 본 발명과 기존 검사법과의 민감도 비교
실시예 1에서 추출한 3종의 가금 전신성 질병 원인균인 대장균, 리메렐라균, 살모넬라균의 DNA를 각각 주형으로 첨가하되, 상기의 대장균, 리메렐라균, 살모넬라균의 DNA를 20ng∼20fg(각각 10진 단계 희석)으로 첨가하는 것을 제외하고는 상기 실시예 3 및 실시예 4에 기재된 방법을 이용하여 다중 중합효소 연쇄반응을 실시하고 이들의 결과를 도 2에 나타내었다.
농심수산검역검사본부에서 분양받은 리메렐라균(ATCC 11845, ATCC 51411, ATCC 51412)을 사용하고 동물질병 표준검사법(농림수산검역검사본부, 2011년)을 이용한 리메렐라균의 측정결과를 도 3에 나타내었고, 살모넬라균(ATCC 14028, ATCC 15479, ATCC 7001, ATCC 19945, ATCC 9184)을 사용하고 동물질병 표준검사법(농림수산검역검사본부, 2011년)을 이용한 살모넬라균의 측정결과를 도 4에 나타내었다.
상기 도 2, 도 3 및 도 4의 결과에서처럼 본 발명의 실시예 3 및 실시예 4는 대장균 주형 DNA를 2pg까지 진단이 가능하였으나(도 2참조, Lane M:100 bp DNA ladder, 1∼7:가금 패혈증 원인균 3종(대장균, 리메렐라균, 살모넬라균) 20ng∼20fg DNA(각 lane별로 10진 단계 희석), N:negative control), 동물질병 표준검사법(농림수산검역검사본부, 2011년)은 20pg까지 진단이 가능하여(도 3, 도 4 참조, 도 3, 도 4에서 Lane M:100 bp DNA ladder, 1∼7:가금 패혈증 원인균 2종(리메렐라균, 살모넬라균) 20ng∼20fg DNA(각 lane별로 10진 단계 희석), N:negative control) 본 발명에 의한 3종의 가금 전신성 질병 원인균인 대장균, 리메렐라균, 살모넬라균을 진단하는 진단 방법이 기존 동물질병 표준검사법(농림수산검역검사본부, 2011년) 보다 민감도가 10배 이상 우수함을 알 수 있었다.
<실시예 6> 분리균주를 이용하여 발명품과 기존 검사법과의 진단효율 비교
가금 세균성 전신성 질병 유발 원인균으로서 농림수산검역검사본부 질병진단과에서 보관중인 대장균, 리메렐라균, 살모렐라균에 대한 각각의 분리주 60주를 대상으로 본 발명의 상기 실시예 4에서 언급한 다중 중합효소 연쇄반응을 이용한 가금 세균성 전신성 질병 유발 원인균의 진단 효율 및 기존 동물질병 표준검사법(농림수산검역검사본부, 2011년)을 이용한 가금 세균성 전신성 질병 유발 원인균의 진단 효율을 측정하고 이들의 결과를 아래의 표 3에 나타내었다.
| 진단대상 | 실시예 4 | 기존 검사법 | |||
| 양성 | 음성 | 양성 | 음성 | ||
| 대장균 | 20 | 40 | 진단불가 | ||
| 리메렐라균 | 20 | 40 | 20 | 40 | |
| 살모넬라균 | 20 | 40 | 20 | 40 | |
*표 3에서 기존 검사법은 기존 동물질병 표준검사법(농림수산검역검사본부, 2011년)이다.
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 3종의 가금 세균성 전신성 질병 유발 원인균 진단 방법은 기존 동물질병 표준검사법(농림수산검역검사본부, 2011년)과 동등한 효율을 보이고, 기존 동물질병 표준검사법에 측정하지 못한 대장균을 추가로 진단할 수 있어 기존 동물질병 표준검사법(농림수산검역검사본부, 2011년)에 비해 3종의 가금 세균성 전신성 질병 유발 원인균에 대한 진단효율이 향상되었음을 알 수 있었다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명의 3종의 가금 전신성 질병 원인균인 대장균, 리메렐라균, 살모넬라균을 진단할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 진단 키트, 바람직하게는 다중 중합효소 연쇄반응 키트를 이용하여 3종의 가금 전신성 질병 원인균을 2시간 이내에 신속, 간편하게 진단할 수 있다. 또한 민감도가 높아 배양액 내에 존재하는 미량의 유전자를 진단할 수 있기 때문에 이를 가금 전신성 질병 원인균 진단에 적용 시 빠른 시간에 가금의 질병 원인을 진단할 수 있어 가금류 질병 방역에 기여할 수 있고, 이러한 가금류 질병 방역에의 도움은 가금류 사육 농가의 생산성 향상에 기여할 수 있다는 측면에서 산업상 이용가능성이 있다.
<110> Animal, Plant and Fisheries Quarantine and Inspection Agency
BIONEER CORPORATION
<120> Primer set for detection of systemic bacterial diseases of
Poultry and PCR kits thereof
<130> 9094
<160> 9
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> forward primer
<400> 1
gtccgagcgc gaccagtgaa aa 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> reverse primer
<400> 2
tcgagatcga ccgtctcgcc aa 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> forward primer
<400> 3
ccgcacaagc ggtggatcat gt 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> reverse primer
<400> 4
tcgcagtgta gctgccctct gt 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> forward primer
<400> 5
tctccccctc ttcatgcgtt ac 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> reverse primer
<400> 6
cctttgacgg tgcgatgaag tt 22
<210> 7
<211> 1485
<212> DNA
<213> E. coli gene(GenBank accession No. CP001925.1)
<400> 7
ttgtcacggc cgagacttat agtcgctttg tttttatttt ttaatgtatt tgtacatgga 60
gaaaataaag tgaaacaaag cactattgca ctggcactct taccgttact gtttacccct 120
gtgacaaaag cccggacacc agaaatgcct gttctggaaa accgggctgc tcagggcgat 180
attactgcac ccggcggtgc tcgccgctta acggctgatc agaccgccgc tctgcgtgat 240
tctcttagcg ataaacctgc aaaaaatatt attttgctga ttggcgatgg gatgggggat 300
tcggaaatta ctgccgcacg taattatgcc gaaggtgcgg gcggcttttt taaaggtatc 360
gatgccttac cgcttaccgg gcaatacact cactatgcgc tgaataaaaa aaccggaaaa 420
ccggactacg tcaccgactc ggctgcatca gcaaccgcct ggtcaaccgg tgtcaaaacc 480
tataacggcg cgctgggcgt cgatattcac gaaaaagatc acccaacgat tctggaaatg 540
gcaaaagccg caggtctggc gaccggtaac gtttctaccg cagagttgca ggatgccacg 600
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gaaaaatgtc cgggtaacgc tctggaaaaa ggcggaaaag gatcgattac cgaacagctg 720
cttaacgctc gtgccgacgt tacgcttggc ggcggcgcaa aaacctttgc tgaaacggca 780
accgctggtg aatggcaggg aaaaacgctg cgtgaacagg cacaggcgcg tggttatcag 840
ttggtgagcg atgctgcctc actgaattcg gtgacggaag cgaatcagca aaaacccctg 900
cttggcctgt ttgctgacgg caatatgcca gtgcgctggc taggaccgaa agcaacgtac 960
cacggtaata tcgataagcc cgcagtcacc tgtacgccta atccgcaacg taatgacagt 1020
gtaccgaccc tggcacagat gaccgacaaa gccattgaat tgttgagtaa aaatgagaaa 1080
ggctttttcc tgcaagttga aggtgcgtca atcgataaac aggatcatgc tgcgaatcct 1140
tgtgggcaaa ttggcgagac ggtcgatctc gatgaagccg tacaacgggc gctggaattc 1200
gccaaaaagg atggtaacac gctggtcata gtcaccgctg atcacgccca cgccagccag 1260
attgttgcgc cggataccaa agctccgggc ctcactcagg cgctaaatac caaagatggc 1320
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cagttgcgta ttgcggcgta tggcccgcat gccgccaatg tcgttggact gaccgaccag 1440
accgatctct tctacaccat gaaagccgct ctggggctga aataa 1485
<210> 8
<211> 1505
<212> DNA
<213> R. anatipestifer gene(GenBank accession No. NC_014738.1)
<400> 8
agagtttgat cctggctcag gatgaacgct agcgggaggc ctaacacatg caagccgagc 60
ggtagagtgt cttcggatac ttgagagcgg cgtacgggtg cggaacacgt gtgcaacctg 120
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catcaattag tattgaaagc tccggcggat agagatgggc acgcgcaaga ttagatagtt 240
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<211> 1568
<212> DNA
<213> Salmonella spp. gene(GenBank accession No. EU 348369.1)
<400> 9
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ttatcaatca gtaccagccg tcttatcttg attgaagccg atgccggtga aattatcgcc 300
acgttcgggc aattcgttat tggcgatagc ctggcggtgg gttttgttgt cttctctatt 360
gtcaccgtgg tccagtttat cgttattacc aaaggttcag aacgcgtcgc ggaagtcgcg 420
gcccgatttt ctctggatgg tatgcccggt aaacagatga gtattgatgc cgatttgaag 480
gccggtatta ttgatgcgga tgccgcgcgc gaacggcgaa gcgtactgga aagggaaagc 540
cagctttacg gttcctttga cggtgcgatg aagtttatca aaggtgacgc tattgccggc 600
atcattatta tctttgtgaa ctttattggc ggcatttcgg tggggatgac ccgccatggt 660
atggatttgt cctccgctct gtctacttat accatgctga ccattggtga tggtcttgtc 720
gcccagatcc ccgcattgtt gattgcgatt agtgccggtt ttatcgtgac tcgcgtaaat 780
ggcgatagcg ataacatggg gcggaatatc atgacgcagc tgttgaacaa cccatttgta 840
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ccgttgatat tacttgtgcc gaagagccgg cgtgaagatc tggaaaaagc tcaacttgcg 1140
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gaaacaaaac atatgctcga ccaactggaa gcgaaatttc ctgatttact taaagaagtg 1560
ctcagaca 1568
Claims (13)
- 서열번호 1의 포워드 프라이머(forward primer)와 서열번호 2의 리버스 프라이머(reverse primer)로 이루어진 프라이머 세트;
서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 및
서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, 가금의 세균성 전신성 질병 원인균 진단용 프라이머 세트. - 제1항에 있어서,
서열번호 1의 포워드 프라이머와 서열번호 2의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트는 가금의 세균성 전신성 질병 원인균인 대장균을 진단하는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트는 가금의 세균성 전신성 질병 원인균인 리메렐라균을 진단하는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트는 가금의 세균성 전신성 질병 원인균인 살모넬라균을 진단하는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트. - 제1항, 제2항, 제4항 및 제6항 중 선택된 어느 한 항에 있어서,
상기 가금은 닭, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 꿩 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 프라이머 세트. - 진단용 PCR 조성물에 있어서,
서열번호 1의 포워드 프라이머와 서열번호 2의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 포함하도록 하여 가금의 세균성 전신성 질병 원인균을 진단할 수 있는 진단용 PCR 조성물. - 제8항에 있어서,
상기 가금은 닭, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 꿩 중에서 선택된 어느 하나이며, 상기 가금의 세균성 전신성 질병 원인균은 대장균, 리메렐라균, 살모넬라균 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 진단용 PCR 조성물. - 서열번호 1의 포워드 프라이머와 서열번호 2의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, 가금의 세균성 전신성 질병 원인균 진단용 진단 키트.
- 제10항에 있어서,
서열번호 1의 포워드 프라이머와 서열번호 2의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트는 대장균을 진단하고, 서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트는 리메렐라균을 진단하고, 서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트는 살모넬라균을 진단하는 것을 특징으로 하는 가금의 세균성 전신성 질병 원인균 진단용 진단 키트. - 서열번호 1의 포워드 프라이머와 서열번호 2의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트, 서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 진단 키트를 이용한 가금의 세균성 전신성 질병 원인균의 진단 방법.
- 제12항에 있어서,
서열번호 1의 포워드 프라이머와 서열번호 2의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트는 대장균을 진단하고, 서열번호 3의 포워드 프라이머와 서열번호 4의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트는 리메렐라균을 진단하고, 서열번호 5의 포워드 프라이머와 서열번호 6의 리버스 프라이머로 이루어진 프라이머 세트는 살모넬라균을 진단하는 것을 특징으로 하는 가금의 세균성 전신성 질병 원인균의 진단 방법.
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