CN106191279B - 一种鉴别羊肉中掺杂鸭肉的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品质量安全检测技术领域，具体涉及一种鉴别羊肉中掺杂鸭肉的PCR检测方法。本发明以羊肉和鸭肉的线粒体细胞色素b基因为特征靶基因设计了1条通用上游引物F，和2条特异性下游引物：R羊，R鸭，并按照一定浓度比例组成混合引物，通过一次PCR反应即可得到长度各不相同的特异性扩增片段，根据对其电泳检测所得条带分子量的大小进行分析。若被检样本在367bp和480bp处分别出现特异性条带，则说明该样本的羊肉中掺杂了鸭肉；若被检样本在367bp处出现特异条带，而在480bp处未出现特异条带，则说明该样本的羊肉中没有掺杂鸭肉。该方法准确、可靠、简单快捷，可用于食品中肉类种属的筛选和肉类掺假的检测和监管。
Description
技术领域
本发明属于食品质量安全检测技术领域，涉及一种鉴别羊肉中掺杂鸭肉的PCR检测方法。
背景技术
羊肉性温，中医上可益气补虚，促进血液循环，增强抵抗力，历来被当作秋冬御寒和进补的重要食品之一。近年来，随着生活水平的不断提高，羊肉及其制品的消费量不断上升，涮羊肉、烤羊肉、羊肉锅仔等都深受消费者的喜爱。而不法商贩在利益的驱使下，利用食品质量检测手段的不足将相对廉价的鸭肉等加工后冒充羊肉掺入其中进行销售，进而从中牟取暴利，严重侵犯了消费者的合法权益。早期的鉴别方法多为从蛋白质水平对肉类分析，如电泳法、酶联免疫吸附测定等技术，但因操作复杂、耗时耗力、对样品要求高而不能满足肉类鉴定快速、精确的要求。因此，亟需建立一套简单、快速、准确、可靠、特异性高的现代化检测方法。
发明内容
本发明提供一种鉴别羊肉中掺杂鸭肉的PCR检测方法，即提供一种简单、快速、低成本、高效可靠的快速检测肉类掺假的方法，从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种用于鉴别羊肉和鸭肉的PCR引物组，其中包含有：
通用上游引物，其核苷酸序列为
CTGAGGRGGATTCTCAGTRGA(SEQ ID NO:1)；
用于检测羊肉的特异性下游引物，其核苷酸序列为
TGTTGGGAATTGATCGT(SEQ ID NO:2)；
用于检测鸭肉的特异性下游引物，其核苷酸序列为
TAGGAGTTGGGAGAGC(SEQ ID NO:3)；
本发明再一个方面提供一种试剂盒，其中使用了上述的引物组。
本发明另一个方面提供一种鉴别羊肉中掺杂鸭肉的方法，是使用上述的引物组进行PCR扩增鉴定；
上述的方法，其一种操作步骤如下：
1)样品DNA的提取：
提取待检测样品的DNA，
2)PCR扩增：
25μL PCR反应体系中，含10倍的PCR缓冲液2.5μL，4种dNTP各1μmol/L，引物组混合液4μL，1.25U的Taq DNA聚合酶，100ng基因组DNA，其余为灭菌蒸馏水；
PCR反应程序为94℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，32个循环；最后72℃延伸8min。
所述的混合引物为1条通用上游引物F和2条特异性下游引物的混合引物，其中3条引物的浓度比为F:R羊:R鸭＝2:1:1；
3)电泳分析和观察
PCR扩增反应结束后，将5μL扩增产物与1μL 6×Loading Buffer混合，用1.2﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。
本发明所建立的一种鉴别羊肉中掺杂鸭肉的PCR检测方法，其中根据羊、鸭线粒体细胞色素b基因所设计的1条通用上游引物和2条特异性下游引物，其扩增出的条带特异性明显，能有效检测出肉品是否掺假，且引物数量较传统方法减少，从而减少了假阳性的出现。该方法准确、可靠、简单快捷，可用于食品中肉类种属的筛选和肉类掺假的检测和监管。
附图说明
图1为羊、鸭及其混合肉的标准PCR图谱，其中M：标准分子量；泳道1～3分别为羊、鸭及羊鸭混合肉的PCR扩增条带；泳道4：阴性对照；
图2为实施例2～6的PCR图谱，其中M：标准分子量；泳道1～3：实施例2～4的PCR扩增条带；泳道4：阴性对照；泳道5～6：实施例5～6的PCR扩增条带。
具体实施方式
本发明提供一种鉴别羊肉中掺杂鸭肉的PCR检测方法，就是以羊肉和鸭肉的线粒体细胞色素b基因为特征靶基因设计1条通用上游引物通用上游引物F，和2条特异性下游引物：R羊和R鸭，按照一定浓度比例组成混合引物后，通过一次PCR反应即可得到长度各不相同的特异性扩增片段，根据对其电泳检测所得条带分子量的大小进行分析，进而检测肉样是否掺假。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的分析。
实施例1：扩增引物的筛选
首先对PCR反应中最重要的引物进行设计，并对所设计的引物的检测灵敏度进行验证筛选。
1)引物设计
选用种属间特异性差异明显的线粒体细胞色素b基因作为靶基因，同时，为了既实现一次性鉴别出羊肉和鸭肉2个物种的目的，又减少实验中所加入引物的数量，在2个物种靶基因的高度保守区设计通用兼并引物，在各物种的可变区选择各自的特异性引物。设计多组并从中比较选择出一组最优的。要求：(1)每一组引物扩增出来的2条片段长度相互之间必须有明显的差异，以便在电泳检测中区分羊、鸭肉，同时片段长度也不能太长，否则不易实现扩增。(2)这组引物具有物种特异性，而且引物相互之间不会干扰。(3)退火温度也要大致相同，这样才能实现一次PCR反应能够扩增出2条目的条带。利用Oligo 6.0，Primer5.0，DNAMAN等软件设计多组引物，并在预实验中设计引物特异性试验、引物之间的交叉试验、模板之间的交叉试验来进行筛选；确定了几组待筛选的引物组。
2)灵敏度检验
对设计的几组引物进行检测灵敏度的筛选，首先是设置3组鸭肉/羊肉的梯度比例，分别为10g/100g、1g/100g和0.1g/100g，将两者充分混匀后用干净的镊子或剪刀随机剪取6份，每份200mg左右，液氮研磨后置于6个1.5mL离心管中。用动物组织全基因组提取试剂盒提取DNA(购自北京全式金生物技术有限公司)。组织消化时间为2-3小时。纯化的DNA经紫外分光光度仪测得OD260/OD280均在1.8-2.0之间，浓度为20-50ng/μL，将6管DNA相互充分混合均匀，制成一种样品，然后进行PCR扩增，所用的25μL PCR反应体系中，含10倍的PCR缓冲液2.5μL，4种dNTP各1μmol/L，混合引物4μL，1.25U的Taq DNA聚合酶，100ng基因组DNA，其余为灭菌蒸馏水。PCR反应程序为94℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，32个循环；最后72℃延伸8min。所述4种dNTP是指dATP、dGTP、dCTP和dTTP。所述的混合引物为1条通用上游引物通用上游引物F和2条特异性下游引物的混合引物，其中引物的浓度比为F:R羊:R鸭＝2:1:1；
PCR扩增反应结束后，将5μL扩增产物与1μL 6×Loading Buffer混合，用1.2﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。最后确定了能检测出鸭肉当掺杂量低至0.1g/100g的引物组(在实际的制售掺假肉环节，1g/100g的掺假廉价肉对于商贩来说无利可图，因此检测限已足够低。)所筛选出的引物组，其引物的信息如下：
通用上游引物序列为：
A-CTGAGGRGGATTCTCAGTRGA(R＝A/G)(SEQ ID NO:1)；
特异性下游引物序列为：
R羊-TGTTGGGAATTGATCGT(SEQ ID NO:2)；
R鸭-TAGGAGTTGGGAGAGC(SEQ ID NO:3)；
上述引物组的扩增结果如图1所示，M表示Marker，泳道1为羊的特异性扩增条带，泳道2为鸭的特异性扩增条带，泳道3为羊和鸭混合肉的特异性扩增条带，泳道4为阴性对照。其中从图中所示条带的位置可知，羊的特异性引物F/R羊的扩增长度为367bp，鸭的特异性引物F/R鸭的扩增长度为480bp。
实施例2
1、样品准备及DNA提取
取适量市售羊肉和鸭肉，混合成掺杂鸭肉1g/100g的羊肉，充分混合后用干净的镊子或剪刀随机剪取6份，每份20mg左右，液氮研磨后置于6个1.5mL离心管中。用动物组织全基因组提取试剂盒提取DNA(购自北京全式金生物技术有限公司)。组织消化时间为2-3小时。纯化的DNA经紫外分光光度仪测得OD260/OD280均在1.8-2.0之间，浓度为20-50ng/μL，将6管DNA相互充分混合均匀，制成一种样品。
2、PCR扩增
25μL PCR反应体系中，含10倍的PCR缓冲液2.5μL，4种dNTP各1μmol/L，混合引物4μL，1.25U的Taq DNA聚合酶，100ng基因组DNA，其余为灭菌蒸馏水。
PCR反应程序为94℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，32个循环；最后72℃延伸8min。
所述4种dNTP是指dATP、dGTP、dCTP和dTTP。
所述的混合引物为1条通用上游引物通用上游引物F和2条特异性下游引物的混合引物，其中3条引物的浓度比为F:R羊:R鸭＝2:1:1；
3、电泳分析和观察
PCR扩增反应结束后，将5μL扩增产物与1μL 6×Loading Buffer混合，用1.2﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。如图2可知，相应泳道在367bp和480bp均出现特异性条带，说明检测样本中含有羊肉和鸭肉。
实施例3
1、样品准备及DNA提取
取适量市售羊肉串，用干净的镊子或剪刀随机剪取6份，每份20mg左右，液氮研磨后置于6个1.5mL离心管中。用动物组织全基因组提取试剂盒提取DNA(购自北京全式金生物技术有限公司)。组织消化时间为2-3小时。纯化的DNA经紫外分光光度仪测得OD260/OD280均在1.8-2.0之间，浓度为20-50ng/μL，将6管DNA相互充分混合均匀，制成一种样品。
2、PCR扩增
25μL PCR反应体系中，含10倍的PCR缓冲液2.5μL，4种dNTP各1μmol/L，混合引物4μL，1.25U的Taq DNA聚合酶，100ng基因组DNA，其余为灭菌蒸馏水。
PCR反应程序为94℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，32个循环；最后72℃延伸8min。
所述4种dNTP是指dATP、dGTP、dCTP和dTTP。
所述的混合引物为1条通用上游引物通用上游引物F和2条特异性下游引物的混合引物，其中3条引物的浓度比为F:R羊:R鸭＝2:1:1；
3、电泳分析和观察
PCR扩增反应结束后，将5μL扩增产物与1μL 6×Loading Buffer混合，用1.2﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。如图2可知，相应泳道在367bp处出现羊的特异性条带，而在480bp处未出现特异性条带，说明该检测样本中只含有羊肉，未掺杂鸭肉。
实施例4
1、样品准备及DNA提取
取适量市售鸭肉，用干净的镊子或剪刀随机剪取6份，每份20mg左右，液氮研磨后置于6个1.5mL离心管中。用动物组织全基因组提取试剂盒提取DNA(购自北京全式金生物技术有限公司)。组织消化时间为2-3小时。纯化的DNA经紫外分光光度仪测得OD260/OD280均在1.8-2.0之间，浓度为20-50ng/μL，将6管DNA相互充分混合均匀，制成一种样品。
2、PCR扩增
25μL PCR反应体系中，含10倍的PCR缓冲液2.5μL，4种dNTP各1μmol/L，混合引物4μL，1.25U的Taq DNA聚合酶，100ng基因组DNA，其余为灭菌蒸馏水。
PCR反应程序为94℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，32个循环；最后72℃延伸8min。
所述4种dNTP是指dATP、dGTP、dCTP和dTTP。
所述的混合引物为1条通用上游引物通用上游引物F和2条特异性下游引物的混合引物，其中3条引物的浓度比为F:R羊:R鸭＝2:1:1；
3、电泳分析和观察
PCR扩增反应结束后，将5μL扩增产物与1μL 6×Loading Buffer混合，用1.2﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。如图2可知，相应泳道在480bp处出现鸭的特异性条带，而在367bp处未出现羊的特异性条带，说明该检测样本中只含有鸭肉。
实施例5
1、样品准备及DNA提取
取适量市售碎鸭肉，用干净的镊子或剪刀随机剪取6份，每份20mg左右，液氮研磨后置于6个1.5mL离心管中。用动物组织全基因组提取试剂盒提取DNA(购自北京全式金生物技术有限公司)。组织消化时间为2-3小时。纯化的DNA经紫外分光光度仪测得OD260/OD280均在1.8-2.0之间，浓度为20-50ng/μL，将6管DNA相互充分混合均匀，制成一种样品。
2、PCR扩增
25μL PCR反应体系中，含10倍的PCR缓冲液2.5μL，4种dNTP各1μmol/L，混合引物4μL，1.25U的Taq DNA聚合酶，100ng基因组DNA，其余为灭菌蒸馏水。
PCR反应程序为94℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，32个循环；最后72℃延伸8min。
所述4种dNTP是指dATP、dGTP、dCTP和dTTP。
所述的混合引物为1条通用上游引物通用上游引物F和2条特异性下游引物的混合引物，其中3条引物的浓度比为F:R羊:R鸭＝2:1:1；
3、电泳分析和观察
PCR扩增反应结束后，将5μL扩增产物与1μL 6×Loading Buffer混合，用1.2﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。如图2可知，相应泳道在480bp处出现鸭的特异性条带，而在367bp处未出现羊的特异性条带，说明该检测样本中只含有鸭肉。
实施例6
1、样品准备及DNA提取
取适量市售羊肉卷，用干净的镊子或剪刀随机剪取6份，每份20mg左右，液氮研磨后置于6个1.5mL离心管中。用动物组织全基因组提取试剂盒提取DNA(购自北京全式金生物技术有限公司)。组织消化时间为2-3小时。纯化的DNA经紫外分光光度仪测得OD260/OD280均在1.8-2.0之间，浓度为20-50ng/μL，将6管DNA相互充分混合均匀，制成一种样品。
2、PCR扩增
25μL PCR反应体系中，含10倍的PCR缓冲液2.5μL，4种dNTP各1μmol/L，混合引物4μL，1.25U的Taq DNA聚合酶，100ng基因组DNA，其余为灭菌蒸馏水。
PCR反应程序为94℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，32个循环；最后72℃延伸8min。
所述4种dNTP是指dATP、dGTP、dCTP和dTTP。
所述的混合引物为1条通用上游引物通用上游引物F和2条特异性下游引物的混合引物，其中3条引物的浓度比为F:R羊:R鸭＝2:1:1；
3、电泳分析和观察
PCR扩增反应结束后，将5μL扩增产物与1μL 6×Loading Buffer混合，用1.2﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。如图2可知，相应泳道在367bp处出现羊的特异性条带，而在480bp处未出现特异性条带，说明该检测样本中只含有羊肉。
Claims (6)
1.一种用于鉴别羊肉和鸭肉的PCR引物组，其特征在于，所述的引物组中包含有通用上游引物，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1；
用于检测羊肉的下游引物，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2；
用于检测鸭肉的下游引物，其核苷酸序列为SEQ ID NO:3。
2.权利要求1所述的引物组在制备用于鉴别羊肉和鸭肉的试剂盒中的应用。
3.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有权利要求1所述的引物组。
4.一种鉴别羊肉中掺杂鸭肉的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1所述的引物组进行PCR扩增鉴定。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：
1)样品DNA的提取：
提取待检测样品的DNA；
2)PCR扩增：
25μL PCR反应体系中，含10倍的PCR缓冲液2.5μL，4种dNTP各1μmol/L，权利要求1所述的引物组的混合液4μL，1.25U的Taq DNA聚合酶，100ng基因组DNA，其余为灭菌蒸馏水；
PCR反应程序为94℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，32个循环；最后72℃延伸8min；
3)电泳分析和观察
PCR扩增反应结束后，将5μL扩增产物与1μL 6×Loading Buffer混合，用1.2﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的引物组混合液中通用上游引物、用于检测羊肉的下游引物和用于检测鸭肉的下游引物的浓度比为2:1:1。
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