CN106011242A - 羊奶粉中牛奶成分的粗放与精准定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种羊奶粉中牛奶成分的粗放与精准定量检测方法，其是通过普通PCR对掺假模型进行分级，利用荧光定量PCR获得处于各个相应等级的Ct值与掺假比例的关系式，之后通过普通PCR确定待检样品的等级，然后对待检样品进行荧光定量PCR获取Ct值，代入到相应级别的关系方程中从而计算出羊奶粉中牛奶成分的百分含量，本发明将普通PCR与实时荧光定量PCR相结合，能够完成羊奶粉中牛奶成分的定性、粗放与精准定量检测，步步深入，成本逐渐增加，可用于不同层次的需求，其灵敏度更高、特异性更强，且检出限更低，本发明方法可推广用于所有动物粉制剂中的掺假检测，也可被其他动物性产品中动物源成分的检测作为借鉴。
Description
技术领域
本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种羊奶粉中牛奶成分的粗放与精准定量检测方法。
背景技术
近年来乳制品掺假事件屡见不鲜，大部分的情况主要是将廉价易得的原料混入价格更高的原料中进行出售，以图获得更高的利润，如在水牛奶中加入牛奶、羊奶中加入牛奶、牛奶中加入豆奶等等。食品掺假不仅会对消费者造成经济上的损失，而且可能涉及到某些特殊的医疗要求、食物过敏和宗教信仰问题。
目前已出现的许多鉴别乳制品掺假的方法(如电泳、免疫学技术、色谱和质谱等)在一定程度上可以解决上述相关问题，但是就其原理来看，这几种方法均是以品种间乳蛋白或脂肪酸组成的差异为判别点，进而达到鉴别的目的，却各有不足，如免疫学方法和电泳技术主要以蛋白质为鉴别对象，这两种方法对加热处理后的牛奶和乳制品中敏感度大幅降低，且无法对添加了多种未知外源蛋白添加剂的乳制品开展检测。虽然色谱技术可以区分出不同种间蛋白质和脂肪酸组成的差异，但是耗时且劳动强度大。
PCR的原理是根据不同物种间DNA序列的差异设计特异性的引物，然后对其DNA模板进行PCR扩增，进而达到区分不同物种的目的。此种检测技术由于具有极高的灵敏性和可重复性，逐渐代替蛋白分析方法成为主流的检测技术作为分子生物学研究的基础被用于物种鉴别。国内学者运用PCR扩增技术在生鲜奶中进行牛源性和羊源性成分检测，但仅能判断出是否含有牛、羊等物种的成分，未能准确判断出成分的具体含量，且没有在奶粉中进行研究。
发明内容
针对现有技术中的缺陷和不足，本发明的目的在于将普通PCR与实时荧光定量PCR相结合，提供了一种羊奶粉中牛奶成分的粗放与精准定量检测方法，特别是对于加热处理后的羊奶粉仍可适用。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案由以下步骤组成：
(1)准确配制牛奶粉含量分别为0.1％、0.5％、1％、5％、10％、30％、50％、70％和90％的羊奶粉作为标准样品；
(2)向步骤(1)配制的标准样品中分别加入双蒸水，固液比为1∶5～15ml/g，均匀，分别提取标准液的DNA并标准化为50ng/μL；
(3)对各个标准液进行普通PCR扩增，获取各标准液的琼脂糖凝胶电泳图，利用Quantity One软件计算出各标准液的条带密度值，根据各标准液的条带亮度将标准样品分为无掺假、极低、低、中、高、极高、完全掺假7个等级，其中各等级对应的条带密度值M为：
(4)将步骤(3)剩余的9个标准DNA样品，根据普通PCR扩增所得的粗放等级结果，对各标准DNA样品进行荧光定量PCR扩增，并获取对应的Ct值，从而建立粗放定量所获得极低至极高之间的等级的标准样品中牛奶成分百分含量W与Ct值之间的关系式：
(5)取待检样品，按照步骤(2)的操作提取待检样品的DNA并准化为50ng/μL；
(6)将标准化后的待检样品按照步骤(3)的操作进行普通PCR检测，利用QuantityOne软件计算出待检样品条带的密度值，并粗放定量待检样品中牛奶成分的掺假级别，若掺假级别处于无掺假或完全掺假等级，则结束操作；否则，进行下一步；
(7)将待检样品按照步骤(4)的操作进行实时荧光定量PCR检测，获取待检样品对应的Ct值，根据步骤(3)判断的掺假级别将Ct值带入到步骤(4)相应级别的关系式中，从而计算出待检样品中牛奶成分的百分含量。
上述步骤(3)中普通PCR的反应体系为：上、下游引物各0.6μL，DNA模板2μL，2×EsTaq Master mix 6.8μL以及双蒸水10μL；
反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环。
上述步骤(4)中荧光定量PCR的反应体系为：上、下游引物各0.4μL，DNA模板1μL，2×Ultal SYBR Mixture 5μL以及双蒸水3.2μL；
反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸1min，40个循环。
上述普通PCR和荧光定量PCR检测所用上、下游引物相同，其序列对应为：F:5’-CTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAA-3’R:5’-AAATAGGGTTAGATGCACTGAATCCAT-3’，上、下游引物的扩增产物长度为346bp。
本发明的羊奶粉中牛奶成分的粗放与精准定量检测方法是将普通PCR和荧光定量PCR技术相结合的方法对羊奶粉中混入的牛奶成分进行定量检测，不仅为羊奶粉中掺入牛奶成分的检测提供了一种准确、可靠的方法，与现有技术相比，其有益效果是：
1)本发明将普通PCR与实时荧光定量PCR相结合，能够完成羊奶粉中牛奶成分的定性、粗放式定量及精确定量检测，步步深入，成本逐渐增加，可用于不同层次的需求。
2)本发明可操作性强，与其它检测方法相比，灵敏度更高、特异性更强，且检出限更低。
3)本发明选择的引物特异性和灵敏度极强。
4)本发明采用的三步法荧光定量条件，相比于一般的两步法，可以很大程度上提高模板的扩增效率，使得检出限更低，而且本发明的检测方法与羊奶粉的蛋白质含量无关，特别是对于加热处理的羊奶粉也适用，仍然能够实现精准定量。
5)本发明方法可推广用于所有动物粉制剂中的掺假检测，也可被其他动物性产品中动物源成分的检测作为借鉴。
6)本发明的实施，有利于规范目前价格较贵的羊奶粉市场，打击不法分子的掺假，为食品监管部门提供有力的理论武器。
附图说明
图1是标准品普通PCR扩增产物示意图。
具体实施方式
以下结合具体实验和实施例对本发明作更详细的描述，但是本发明不仅限于下述的实施情形。
(一)实验材料
1)样品来源
无添加的全脂纯牛、羊奶粉。
2)试验试剂
磷酸缓冲液(PBS)、OP乳化剂、DNA提取缓冲液、20％十二烷基磺酸钠(SDS)裂解液、蛋白酶K(10mg/mL)、Tris饱和酚、氯仿异戊醇(24∶1)、苯酚、氯仿和异戊醇(25∶24∶1)、冰无水乙醇(-20℃)、70％冰乙醇(-20℃)、TE缓冲液、TAE缓冲溶液、琼脂糖、2×Ultal SYBRMixture、2×Es Taq Master Mixture。
3)主要仪器
超高速低温离心机(3k30，美国Sigma公司)、低速大容量离心机(DL-4C，上海安亭科学仪器厂)、精密微量移液枪(德国Eppendorf)、超微量核酸分析仪(Na-200，杭州艾普仪器设备有限公司)、凝胶成像仪(BIO-BEST200E，美国西盟)、梯度PCR仪(Aritik，美国热电公司)、荧光定量PCR仪(PIKO REAL 96，美国热电公司)
(二)检测过程
(1)准确配制牛奶粉含量分别为0.1％、0.5％、1％、5％、10％、30％、50％、70％和90％的羊奶粉作为标准样品；
(2)向步骤(1)配制的标准样品中分别加入双蒸水，固液比为1:5～15mL/g，均匀，分别提取标准液的DNA并标准化为50ng/μL；
所用DNA的提取方法为：
(2.1)奶粉体细胞分离与富集：将牛、羊奶粉各称取1g溶解于9mL无菌双蒸水中还原成液态奶，在7500r/min，4℃下离心30min；用小勺刮去离心管上层的乳脂，用吸管将中间层的乳蛋白去掉，保留最底部的一层沉淀；向离心管底部加入600μL磷酸缓冲液(PBS)，将底部沉淀捶打悬浮并转移至1.5mL的离心管中，12000r/min常温离心10min，弃去上层液体，保留底部沉淀；再向底部沉淀加乳化剂60μL、PBS 540μL，用振荡器振荡至沉淀完全悬浮，40℃恒温水浴处理10min脱去体细胞周围的乳脂，12000r/min常温离心10min，弃上清，加PBS500μL悬浮沉淀，于12000r/min低温离心10min使体细胞沉淀富集，弃上清；
(2.2)牛奶体细胞消化：向体细胞沉淀中加入350μL的DNA提取缓冲液，50μL的SDS，10μL的蛋白酶K，在56℃下水浴消化过夜。
(2.3)SDS苯酚法提取DNA：首先，向消化产物中加等体积的Tris饱和酚溶液，来回颠倒10min，12000r/min低温离心10min，得到上清液；将上清液转移到另一个1.5mL离心管中，加入等体积的酚、氯仿和异戊醇混合物，其中，苯酚、氯仿和异戊醇按体积比25∶24∶1配制；来回颠倒10min，使沉淀溶解，12000r/min，离心10min，得到上清液；再将上清液转移到另一个1.5mL离心管中，加入等体积的氯仿和异戊醇混合物，其中，氯仿和异戊醇体积比为24∶1，来回颠倒10min，使沉淀溶解，12000r/min，离心10min，得到上清液；
(2.4)核酸沉淀：将上清液转移到另一个1.5mL的离心管，加入2倍体积的-20℃冰无水乙醇沉淀，轻轻振摇，-20℃条件下静置30min，12000r/min离心10min，弃去上层乙醇；底部沉淀用质量浓度为70％是-20℃冰乙醇洗涤，12000r/min，低温离心10min，小心去除上层乙醇，挥发乙醇，加入25μL的TE溶解DNA。
(3)对9个标准DNA样品进行普通PCR扩增，参见图1，获取9个标准DNA的琼脂糖凝胶电泳图，利用Quantity One软件计算出9个标准DNA的电泳条带密度值，根据标准DNA的电泳条带亮度将9个标准样品归类为7个等级：无掺假、极低、低、中、高、极高、完全掺假，其中各等级对应的条带密度值M为：
普通PCR反应体系(20μL)：上、下游引物各0.6μL，DNA模板2μL，2×Es Taq Mastermix 6.8μL以及双蒸水10μL，上、下游引物的扩增产物长度为346bp。
反应程序：95℃预变性10min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s持续30个循环。
上、下游引物序列对应为：F：5’-CTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAA-3’，R：5’-AAATAGGGTTAGATGCACTGAATCCAT-3’。
(4)将步骤(3)剩余的9个标准DNA样品，根据普通PCR扩增所得的粗放等级结果，对各标准DNA样品进行荧光定量PCR扩增，并获取对应的Ct值，从而建立粗放定量所获得处于“极低”至“极高”等级的标准样品中牛奶成分百分含量W与Ct值之间的关系式：
荧光定量PCR反应体系(10μL)：上、下游引物各0.4μL，DNA模板1μL，2×Ultal SYBRMixture 5μL以及双蒸水3.2μL，与步骤(3)所用引物相同。
反应程序(两步法)为：95℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸1min，40个循环。
(5)配制待检样品，按照步骤(2)的操作提取待检样品的DNA并准化为50ng/μL；
(6)将标准化后的待检样品按照步骤(3)的操作进行普通PCR检测，利用QuantityOne软件计算出待检样品条带的密度值，并粗放定量待检样品中牛奶成分的掺假级别，若掺假级别处于无掺假或完全掺假等级，则结束操作；否则，进行下一步；
(7)将待检样品按照步骤(4)的操作进行实时荧光定量PCR检测，获取待检样品对应的Ct值，根据步骤(3)判断的掺假级别将Ct值带入到步骤(4)相应级别的关系式中，从而计算出待检样品中牛奶成分的百分含量。检测结果如下表1所示。
表1为各实施例的待检样品的检测结果
由表1可以看出，本发明的检测结果准确，相对偏差较小。
Claims (5)
1.一种羊奶粉中牛奶成分的粗放与精准定量检测方法，其特征在于由以下步骤组成：
(1)准确配制牛奶粉含量分别为0.1％、0.5％、1％、5％、10％、30％、50％、70％和90％的羊奶粉作为9个标准样品；
(2)向步骤(1)配制的9个标准样品中分别加入双蒸水，固液比为1∶5～15mL/g，均匀，分别提取9个标准奶液的DNA并标准化为50ng/μL，获得9个标准DNA样品；
(3)对9个标准DNA样品进行普通PCR扩增，获取9个标准DNA的琼脂糖凝胶电泳图，利用Quantity One软件计算出9个标准DNA的电泳条带密度值，根据标准DNA的电泳条带亮度将9个标准样品归类为7个等级：无掺假、极低、低、中、高、极高、完全掺假，其中各等级对应的条带密度值M为：
(4)将步骤(3)剩余的9个标准DNA样品，根据普通PCR扩增所得的粗放等级结果，对各标准DNA样品进行荧光定量PCR扩增，并获取对应的Ct值，从而建立粗放定量所获得极低至极高之间的等级的标准样品中牛奶成分百分含量W与Ct值之间的关系式：
(5)取待检奶粉样品，按照步骤(2)的操作提取待检样品的DNA并标准化为50ng/μL；
(6)将标准化后的待检样品按照步骤(3)的操作进行普通PCR检测，利用Quantity One软件计算出待检样品条带的密度值，并粗放定量待检样品中牛奶成分的掺假级别，若掺假级别处于无掺假或完全掺假等级，则结束操作；否则，进行下一步；
(7)将待检样品按照步骤(4)的操作进行实时荧光定量PCR检测，获取待检样品对应的Ct值，根据步骤(3)判断的掺假级别将Ct值带入到步骤(4)相应级别的关系式中，从而计算出待检样品中牛奶成分的百分含量。
2.根据权利要求1所述的羊奶粉中牛奶成分的粗放与精准定量检测方法，其特征在于所述步骤(3)中普通PCR的反应体系为：上、下游引物各0.6μL，DNA模板2μL，2×Es TaqMaster mix 6.8μL以及双蒸水10μL；
反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环。
3.根据权利要求1所述的羊奶粉中牛奶成分的粗放与精准定量检测方法，其特征在于所述步骤(4)中荧光定量PCR的反应体系为：上、下游引物各0.4μL，DNA模板1μL，2×UltalSYBR Mixture 5μL以及双蒸水3.2μL；
反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸1min，40个循环。
4.根据权利要求2或3所述的羊奶粉中牛奶成分的粗放与精准定量检测方法，其特征在于所述上、下游引物的序列对应为：
F:5’-CTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAA-3’
R:5’-AAATAGGGTTAGATGCACTGAATCCAT-3’。
5.根据权利要求4所述的羊奶粉中牛奶成分的粗放与精准定量检测方法，其特征在于所述上、下游引物的扩增产物长度为346bp。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |