CN105200120A - 一种基于荧光定量PCR技术检测β-酪蛋白基因型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种荧光定量PCR技术检测β-酪蛋白基因型的方法，根据β-酪蛋白的碱基序列，设计出分别与A1型β-酪蛋白基因和A2型β-酪蛋白基因相匹配的两组引物，然后将待测样品分别与A1型引物组和A2型引物组进行PCR扩增，扩增过程中不同引物扩增得到的PCR产物会产生不同的荧光信号，随着PCR反应的进行，PCR产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加，每经过一个PCR反应循环收集一次荧光信号，通过荧光信号的强度变化监测PCR产物量的变化，从而分别得到一条荧光信号强度曲线图，根据两个荧光信号的增强先后次序即可判断出奶牛β-酪蛋白基因型。本发明提供的方法能检测出不同的β-酪蛋白基因型，从而保证人们喝的牛奶为含有A2型β-酪蛋白的健康牛奶。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，主要涉及一种基因检测方法，具体来说就是一种应用荧光定量PCR技术检测奶牛不同β-酪蛋白基因型的方法。
背景技术
牛奶中的蛋白质主要分为酪蛋白和乳清蛋白两种。酪蛋白在牛奶蛋白中的含量约占80％左右，乳清蛋白约占14％。牛奶蛋白中一般含有四种酪蛋白，αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白，其中β-酪蛋白约占酪蛋白总量的25～35％。
β-酪蛋白中含有209个氨基酸，而它至少含有13种不同的氨基酸组成，因此分为A1、A2、A3、B、C、D、E、F、H1、H2、I、G。目前大多数养殖奶牛生产的β-酪蛋白，主要为A1和A2两种类型。A1和A2β-酪蛋白之间的主要区别是第67位氨基酸不同，A1β-酪蛋白的67位是组氨酸(密码子为CAT)，A2β-酪蛋白在同一位置是脯氨酸(密码子为CCT)。
在生物体内，β-酪蛋白会水解产生一类由4～11个氨基酸组成，起始氨基酸为酪氨酸的多肽——β-酪啡肽(BCM7)(Tyr-Pro-Phe-Gly-Pro-Ile)就是从这类多肽中分离出来的一种类似吗啡的活性肽，它能够刺激淋巴T细胞的增殖。研究表明，BCM7主要是由A1-酪蛋白在胃蛋白酶、胰蛋白酶和亮氨酸氨基肽酶水解下产生，这是由于A2-酪蛋白67位脯氨酸与其相邻的66位和68位的氨基酸有比较稳定的二级结构，而A1-酪蛋白67位组氨酸与邻近氨基酸的二级结构不稳定，因而容易被水解。很多研究表明，BCM7能够导致缺血性心脏病、动脉粥样硬化、I型糖尿病、新生儿猝死症以及一些精神方面的疾病。
A1β-酪蛋白的摄入与人类疾病之间的关系主要基于流行病学研究，A1β-酪蛋白与相关疾病的危险因素数据和死亡数据主要来源于世界卫生组织(WHO)。新西兰流行病学证据表明A2牛奶比A1牛奶更有益于人类健康。McLachlan对16个国家30-69岁的男性中A1牛奶与心脏病发病率进行了调查，统计结果表明，缺血性心脏病与A1牛奶的消耗有很强的关联性(s＝0.86)。Elliott比较了10个国家0-14岁儿童I型糖尿病的发病率，A1β-酪蛋白与其有较大的关联性(s＝0.726)，在冰岛，由于当地的奶牛主要为A2奶牛，所以该地糖尿病和心脏病的发病率很低。动物学实验也表明表明，喂养A1牛奶的兔子与喂养A2牛奶的兔子相比，胆固醇和血脂水平更高。
因此，需要找到一种能够有效区分分泌A1型β-酪蛋白和A2型β-酪蛋白牛奶的奶牛的方法，从而使得养殖场只繁育能够分泌A2型β-酪蛋白的奶牛品种，保证我们喝的牛奶为含有A2型β-酪蛋白的牛奶。但目前的检测方法无法检测出不同的β-酪蛋白基因型，不能保证人们喝的牛奶为含有A2型β-酪蛋白的牛奶。
发明内容
鉴于目前还没有一种有效检测奶牛的β-酪蛋白基因型的方法存在的，本发明提供一种检测出不同β-酪蛋白基因型的基于荧光定量PCR技术检测β-酪蛋白基因型的方法。
为达到上述目的，本发明的实施例采用如下技术方案：
一种基于荧光定量PCR技术检测β-酪蛋白基因型的方法，其包括以下步骤：
根据β-酪蛋白的碱基序列，设计两组不同的引物，其中一组引物的上游引物3’端和A1型的基因位点匹配，记为A1型引物；另一组引物的上游引物3’端和A2型的基因位点匹配，记为A2型引物，两组引物的下游引物相同；
其中，所述的A1型引物的上游引物为：5’CCTTCCCTGGGCCCATTCA3’；
所述A2型引物的上游引物为5’CCTTCCCTGGGCCCATTCC3’；
A1型引物和A2型引物的下游引物均为5’GATATTTAGGGAAGGGCATTT3’；
将待检测的奶牛基因组DNA分别与A1型引物、A2型引物在两个反应体系中同时进行PCR扩增，扩增后每个样品与每组引物产生一个荧光信号；
监控荧光信号强度；
将待检测的奶牛基因组DNA分别与A1型引物、A2型引物在两个反应体系中同时进行PCR扩增，扩增后每个样品与每组引物产生一个荧光信号，即每个样品产生两个荧光信号，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加，每经过一个PCR反应循环收集一次荧光信号，通过荧光信号的强度变化监测产物量的变化，根据两个荧光信号的增强先后次序即可得出奶牛β-酪蛋白基因型，当A1型引物的荧光信号首先增强时，即可得出样品DNA为A1型；当A2型引物的荧光信号首先增强时，即可得出样品DNA为A2型；当A1型和A2型引物的荧光信号同时增强时，即可得出样品DNA为杂合型。
作为优选方案，所述PCR扩增具体包括如下操作：
取DNA模板1μl，加入SYBRFASTqPCRMasterMix10μl、10pM的上、下游引物各0.5～1.5ul，加双蒸水至15～35ul得PCR扩增体系；将所述扩增体系加热至92～95℃预变性1～5min，然后在90～95℃变性5～15s，60～65℃退火5～15s，70～75℃延伸30～50s，自变性开始至延伸结束记为一次循环，进行30～50次循环的操作。
作为进一步优选方案，所述DNA模板的加量为1μl，所述SYBRFASTqPCRMasterMix的加量为10μl，所述上、下游引物的浓度均为10pM，上、下游模板的加量均为1μl，加双蒸水至20ul得PCR扩增体系；所述预变性的温度为95℃，时间为2min，变性的温度为94℃，时间为10s，退火的温度为61℃，时间为10s，延伸的温度72℃，时间为40s，循环的次数为40次。
作为进一步优选方案，所述监控荧光信号强度具体为：每经过一个PCR反应循环收集一次荧光信号，通过荧光信号的强度变化监测产物量的变化并得到一条荧光信号强度曲线图。
本发明提供的基于荧光定量PCR技术检测β-酪蛋白基因型的方法能检测出不同的β-酪蛋白基因型，从而保证人们喝的牛奶为含有A2型β-酪蛋白的牛奶。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中样品PCR过程中的荧光信号变化图；
图2为实施例2中样品PCR过程中的荧光信号变化图；
图3为实施例3中样品PCR过程中的荧光信号变化图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明作进一步说明。
本发明中所用的奶牛基因组DNA样本采自黑白花奶牛的血液，用目录号为DP304的天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，提取步骤如下：
一、提取实验所需试剂和仪器
移液器和枪头、常温离心机、组织破碎仪、加热器或水浴、计时器、无水乙醇、2ml或1.5ml离心管。
二、准备工作
1)第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇。
2)样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量也下降。
3)若缓冲液GA或GB中有沉淀，可在37℃水浴中重新溶解，摇匀后使用。
4)将加热器或水浴调到所需温度(56℃，65℃，70℃)。
三、操作步骤
1、处理材料
血液：取200μl新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液于1.5ml离心管中，不足200μl可加缓冲液GA补足。(如需处理更大体积血液，如300μl-1ml，应在样品中加入3倍体积红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5min，期间再颠倒混匀几次。10000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。)
2、加入20μlProteinaseK溶液，混匀。(若提取组织基因组，则加入ProteinaseK后，在56℃放置，每小时颠倒混合样品2-3次，直至组织溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠，再进行下一步骤。)
3、加入200μl缓冲液GB，用手轻轻颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮(若没变清亮可适当延长加热时间)，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
4、加入200μl无水乙醇，用手轻轻颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
5、将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入到吸附柱CB3中(吸附柱预先放入2ml收集管中)，12000rpm离心30sec,弃废液，吸附柱放回收集管中。
6、向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前检查是否加入无水乙醇)，12000rpm离心30sec，弃废液，吸附柱放回收集管中。
7、向吸附柱CB3中加入600μl缓冲液PW(使用前检查是否加入无水乙醇)，12000rpm离心30sec，弃废液，吸附柱放回收集管中。
8、重复第7步。
9、将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，弃废液。将吸附柱CB3于室温放置5min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
10、将吸附柱CB3转入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱液TE(TE于65℃预热)，室温放置3min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
11、将上一步离心管中收集到的溶液重新滴加到吸附柱CB3吸附膜的中间部位，室温放置3min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
SYBRFASTqPCRMasterMix为美国KAPABIO公司生产的型号为KK4600的快速定量PCR试剂盒。
根据β-酪蛋白的碱基序列，设计两组不同的引物，其中一组引物的上游引物3’端和A1型的基因位点匹配，记为A1型引物；另一组引物的上游引物3’端和A2型的基因位点匹配，记为A2型引物，两组引物的下游引物相同；
其中，所述的A1型引物的上游引物为：5’CCTTCCCTGGGCCCATTCA3’；
所述A2型引物的上游引物为5’CCTTCCCTGGGCCCATTCC3’；
A1型引物和A2型引物的下游引物均为5’GATATTTAGGGAAGGGCATTT3’。
实施例1
将已知A1型奶牛基因组DNA分别与A1型引物、A2型引物在两个反应体系中同时进行PCR扩增，扩增后每个样品与每组引物产生一个荧光信号，即每个样品产生两个荧光信号，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加，每经过一个PCR反应循环收集一次荧光信号，通过荧光信号的强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光信号强度曲线图，根据两个荧光信号的增强先后次序即可的出奶牛β-酪蛋白基因型，当A1型引物的荧光信号首先增强时，即可得出样品DNA为A1型；当A2型引物的荧光信号首先增强时，即可得出样品DNA为A2型；当A1型和A2型引物的荧光信号同时增强时，即可得出样品DNA为杂合型。
其中，PCR扩增操作如下：取DNA模板1μl，加入SYBRFASTqPCRMasterMix10μl以及10pM的上、下游引物各1μl，加双蒸水至20μl得PCR扩增体系；将所述扩增体系加热至95℃预变性2min，然后在94℃变性10s，61℃退火10s，72℃延伸40s，自变性开始至延伸结束记为一次循环，进行40次循环的操作。
结果如图1所示，A1型引物的荧光信号首先增强，表明样品DNA为A1型。
实施例2
已检测的A2型奶牛基因组DNA分别与A1型引物、A2型引物在两个反应体系中同时进行PCR扩增，扩增后每个样品与每组引物产生一个荧光信号，即每个样品产生两个荧光信号，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加，每经过一个PCR反应循环收集一次荧光信号，通过荧光信号的强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光信号强度曲线图，根据两个荧光信号的增强先后次序即可的出奶牛β-酪蛋白基因型，当A1型引物的荧光信号首先增强时，即可得出样品DNA为A1型，当A2型引物的荧光信号首先增强时，即可得出样品DNA为A2型，当A1型和A2型引物的荧光信号同时增强时，即可得出样品DNA为杂合型。
其中，PCR扩增操作如下：取DNA模板1μl，加入SYBRFASTqPCRMasterMix10μl、10pM的上、下游引物各1μl，加双蒸水至20μl得PCR扩增体系；将所述扩增体系加热至95℃预变性2min，然后在94℃变性10s，61℃退火10s，72℃延伸40s，自变性开始至延伸结束记为一次循环，进行40次循环的操作。
结果如图2所示，A2型引物的荧光信号首先增强，表明样品DNA为A2型。
实施例3
将已检测为杂合型的奶牛基因组DNA分别与A1型引物、A2型引物在两个反应体系中同时进行PCR扩增，扩增后每个样品与每组引物产生一个荧光信号，即每个样品产生两个荧光信号，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加，每经过一个PCR反应循环收集一次荧光信号，通过荧光信号的强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光信号强度曲线图，根据两个荧光信号的增强先后次序即可的出奶牛β-酪蛋白基因型，当A1型引物的荧光信号首先增强时，即可得出样品DNA为A1型；当A2型引物的荧光信号首先增强时，即可得出样品DNA为A2型；当A1型和A2型引物的荧光信号同时增强时，即可得出样品DNA为杂合型。
其中，PCR扩增操作如下：取DNA模板1μl，加入SYBRFASTqPCRMasterMix10μl、10pM上下游引物各1μl，加双蒸水至20μl得PCR扩增体系；将所述扩增体系加热至95℃预变性2min，然后在94℃变性10s，61℃退火10s，72℃延伸40s，进行40次循环的操作。
结果如图3所示，A1型和A2型引物的荧光信号同时增强，表明样品DNA为杂合型。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (4)
1.一种基于荧光定量PCR技术检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
根据β-酪蛋白的碱基序列，设计两组不同的引物，其中一组引物的上游引物3’端和A1型的基因位点匹配，记为A1型引物；另一组引物的上游引物3’端和A2型的基因位点匹配，记为A2型引物，两组引物的下游引物相同；
其中，所述的A1型引物的上游引物为：5’CCTTCCCTGGGCCCATTCA3’；
所述A2型引物的上游引物为5’CCTTCCCTGGGCCCATTCC3’；
A1型引物和A2型引物的下游引物均为5’GATATTTAGGGAAGGGCATTT3’；
将待检测的奶牛基因组DNA分别与A1型引物、A2型引物在两个反应体系中同时进行PCR扩增，扩增后每个样品与每组引物产生一个荧光信号；
监控荧光信号强度；
根据两个荧光信号的增强先后次序即可得出奶牛β-酪蛋白基因型：当A1型引物的荧光信号首先增强时，即可得出样品DNA为A1型；当A2型引物的荧光信号首先增强时，即可得出样品DNA为A2型；当A1型和A2型引物的荧光信号同时增强时，即可得出样品DNA为杂合型。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增具体包括如下操作：
取DNA模板0.5～1.5μl，加入SYBRFASTqPCRMasterMix5～15μl、10pM的上、下游引物各0.5～1.5μl，加双蒸水至15～35μl得PCR扩增体系；将所述扩增体系加热至92～95℃预变性1～5min，然后在90～95℃变性5～15s，60～65℃退火5～15s，70～75℃延伸30～50s，自变性开始至延伸结束记为一次循环，进行30～50次循环的操作。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增具体包括如下操作：所述DNA模板的加量为1μl，所述SYBRFASTqPCRMasterMix的加量为7μl，所述上、下游引物的浓度均为10pM，上、下游模板的加量均为1μl，所述预变性的温度为95℃，时间为2min，变性的温度为94℃，时间为10s，退火的温度为61℃，时间为10s，延伸的温度为72℃，时间为40s，循环的次数为40次。
4.根据权利要求1至3之一所述的检测方法，其特征在于，所述监控荧光信号强度具体为：每经过一个PCR反应循环收集一次荧光信号，通过荧光信号的强度变化监测产物量的变化并得到一条荧光信号强度曲线图。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20151230 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |