CN105018581A - 一种基于测序法检测β-酪蛋白基因型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于测序法检测β-酪蛋白基因型的方法，该方法包括以下步骤：根据β-酪蛋白的碱基序列，在6号内含子和7号内含子上设计出一对引物，用引物扩增出7号外显子的片段，所述7号外显子的片段大小为759bp；用引物对待检测的奶牛基因组DNA进行PCR扩增；PCR产物用胶回收试剂盒纯化后，用测序仪进行测序，根据测序分型结果进行判断β-酪蛋白的基因型。本发明提供的基于测序法检测β-酪蛋白基因型的方法能检测出β-酪蛋白不同的基因型，从而保证人们喝的牛奶为A2牛奶。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于测序法检测β-酪蛋白基因型的方法。
背景技术
牛奶中的蛋白质主要分为酪蛋白和乳清蛋白两种，酪蛋白在牛奶蛋白中的含量约占80％左右，乳清蛋白约占14％。牛奶蛋白中一般含有四种酪蛋白，αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白，其中β-酪蛋白约占酪蛋白总量的25-35％。
β-酪蛋白中含有209个氨基酸，而它至少含有13种不同的氨基酸组成，因此分为A1、A2、A3、B、C、D、E、F、H1、H2、I、G。目前大多数养殖奶牛生产的β-酪蛋白，主要为A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白两种类型。在生物体内，β-酪蛋白会水解产生一类由4-11个氨基酸组成，起始氨基酸为酪氨酸的多肽——β-酪啡肽，BCM7(Tyr-Pro-Phe-Gly-Pro-Ile)就是从这类多肽中分离出来的一种类似吗啡的活性肽，它能够刺激淋巴T细胞的增殖。研究表明，BCM7主要是由A1-酪蛋白在胃蛋白酶、胰蛋白酶和亮氨酸氨基肽酶水解下产生，这是由于A2-酪蛋白67位脯氨酸与其相邻的66位和68位的氨基酸有比较稳定的二级结构，而A1-酪蛋白67位组氨酸与邻近氨基酸的二级结构不稳定，因而容易被水解。很多研究表明，BCM7能够导致缺血性心脏病、动脉粥样硬化、I型糖尿病、新生儿猝死症以及一些精神方面的疾病。
A1β-酪蛋白的摄入与人类疾病之间的关系主要基于流行病学研究，A1β-酪蛋白与相关疾病的危险因素数据和死亡数据主要来源于世界卫生组织。新西兰流行病学证据表明A2牛奶比A1牛奶更有益于人类健康。McLachlan对16个国家30-69岁的男性中A1牛奶与心脏病发病率进行了调查，统计结果表明，缺血性心脏病与A1牛奶的消耗有很强的关联性(s＝0.86)。Elliott比较了10个国家0-14岁儿童I型糖尿病的发病率，A1β-酪蛋白与其有较大的关联性(s＝0.726)，在冰岛，由于当地的奶牛主要为A2奶牛，所以该地糖尿病和心脏病的发病率很低。动物学实验也表明表明，喂养A1牛奶的兔子与喂养A2牛奶的兔子相比，胆固醇和血脂水平更高。
因此，我们需要找到一种能够有效区分A1奶牛和A2奶牛的方法，从而使得养殖场只繁育A2奶牛，但目前的检测方法无法检测出β-酪蛋白不同的基因型，不能保证人们喝的牛奶为A2牛奶。
发明内容
鉴于目前检测β-酪蛋白基因型的方法存在的上述不足，本发明提供一种检测出β-酪蛋白不同的基因型的基于测序法检测β-酪蛋白基因型的方法。
为达到上述目的，本发明的实施例采用如下技术方案：
一种基于测序法检测β-酪蛋白基因型的方法，该方法包括以下步骤：
根据β-酪蛋白的碱基序列，在6号内含子和7号内含子上设计出一对引物，用引物扩增出7号外显子的片段，所述7号外显子的片段大小为759bp，所述引物的序列为：
上游引物：5’ACC CCA ATT TCT TAA CCA AAC C3’
下游引物：5’CTC AGC TAT GCT TAT TTT GGA ACC3’；
用引物对待检测的奶牛基因组DNA进行PCR扩增；
PCR产物用胶回收试剂盒纯化后，用测序仪进行测序，根据测序分型结果进行判断β-酪蛋白的基因型。
依照本发明的一个方面，根据测序分型结果进行判断β-酪蛋白的基因型，具体为：
如果β-酪蛋白的67位氨基酸为组氨酸或密码子为CAT,则β-酪蛋白为A1β-酪蛋白；
如果β-酪蛋白的67位氨基酸为脯氨酸或密码子为CCT,则β-酪蛋白为A2β-酪蛋白；
如果β-酪蛋白的67位氨基酸为一个杂合子或序列为CC/AT,则β-酪蛋白为A1A2β-酪蛋白。
依照本发明的一个方面，所述A2β-酪蛋白的106位氨基酸的密码子为CAC。
依照本发明的一个方面，所述A2β-酪蛋白的122位氨基酸的密码子为AGC。
依照本发明的一个方面，所述PCR扩增的体系为DNA模板50ng、热启动Taq DNA聚合酶0.1Μ/μl、2.5μM dNTP2μl、10μM上下游引物各1μl、2×Lengend PCR Bμffer10μl、加ddH2O至50μl。
依照本发明的一个方面，所述PCR扩增的条件：在温度为92-95℃时预变性5min，然后在温度为92-95℃时变性15s、在温度为52-68℃时退火30s、在温度为68-72℃时延伸30s，进行多个循环，最后在温度为68-72℃时延伸7min。
依照本发明的一个方面，所述PCR扩增进行35个循环。
依照本发明的一个方面，所述PCR扩增的条件：在温度为95℃时预变性5min，然后在温度为95℃时变性15s、在温度为63℃时退火30s、在温度为72℃时延伸30s，进行35个循环，最后在温度为72℃时延伸7min。。
本发明实施的优点：本发明的检测方法首先根据β-酪蛋白的碱基序列，在6号内含子和7号内含子上设计出一对引物，用引物扩增出7号外显子的片段，所述7号外显子的片段大小为759bp，所述引物的序列为：
上游引物：5’ACC CCA ATT TCT TAA CCA AAC C3’
下游引物：5’CTC AGC TAT GCT TAT TTT GGA ACC3’；
然后用引物对待检测的奶牛基因组DNA进行PCR扩增；最后PCR产物用胶回收试剂盒纯化后，用测序仪进行测序，根据测序分型结果进行判断β-酪蛋白的基因型，本发明的检测方法的优势在于可以将β-酪蛋白7号外显子全部测出，这样不仅可以检测出67位氨基酸的突变情况，还能检测出106位和122位氨基酸的突变情况，从而可以区分出A1，A2，A3，B这四种β-酪蛋白，因此，本发明人提供的基于测序法检测β-酪蛋白基因型的方法能检测出β-酪蛋白不同的基因型，从而保证人们喝的牛奶为A2牛奶。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明所述测序仪对β-酪蛋白进行测序的分型结果图；
图2为本发明所述PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
图3为本发明所述A2β-酪蛋白的106位测序结果图；
图4为本发明所述A2β-酪蛋白的122位测序结果图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明作进一步说明。
如图1、图2所示，一种基于测序法检测β-酪蛋白基因型的方法，该方法包括以下步骤：
根据β-酪蛋白的碱基序列，在6号内含子和7号内含子上设计出一对引物，用引物扩增出7号外显子的片段，所述7号外显子的片段大小为759bp，所述引物的序列为：
上游引物：5’ACC CCA ATT TCT TAA CCA AAC C3’
下游引物：5’CTC AGC TAT GCT TAT TTT GGA ACC3’；
用引物对待检测的奶牛基因组DNA进行PCR扩增；
PCR产物用胶回收试剂盒纯化后，用测序仪进行测序，根据测序分型结果进行判断β-酪蛋白的基因型。
由于牛奶中蛋白质主要有乳清蛋白和酪蛋白两大类，牛奶蛋白中一般含有四种酪蛋白：αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白，其中β-酪蛋白约占酪蛋白总量的25-35％，是氨基酸的重要来源，同时在体内传递重要的矿物质(如钙和磷等)，促进其消化吸收，β-酪蛋白有两种主要的变异型，即A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白，由于A2β-酪蛋白具有能下优点：
1、A2β-酪蛋白是自然源生的牛奶蛋白，目前A2β-酪蛋白的奶源非常稀有；
2、A2β-酪蛋白更接近母乳的蛋白质；
3、更贴合人体的消化系统，能更天然地呵护消化吸收，同时，A2β-酪蛋白则不会生成BCM-7(因为BCM-7与部分婴儿的1型糖尿病风险升高、免疫反应、消化功能紊乱、自闭症和呼吸功能障碍之间存在关联)。
因此，含有A2β-酪蛋白的牛奶(也就是A2牛奶)受到人们的欢迎，但要甄选出基因纯正的A2奶牛确保生产出合格的A2牛奶，需要极高的技术和专业的质量检测方法。
为了解决上述难题，本发明公开了一种基于测序法检测β-酪蛋白基因型的方法，下面对本发明所述的一种基于测序法检测β-酪蛋白基因型的方法作进一步说明，该方法具体包含以下步骤：
步骤S1：根据β-酪蛋白的碱基序列，在6号内含子和7号内含子上设计出一对引物，用引物扩增出7号外显子的片段，所述7号外显子的片段大小为759bp；
本发明的检测方法根据β-酪蛋白的碱基序列，在6号内含子和7号内含子上设计出一对特异性引物，利用该引物扩增出7号外显子的片段，片段大小为759bp，该引物序列为：
上游引物：5’ACC CCA ATT TCT TAA CCA AAC C3’
下游引物：5’CTC AGC TAT GCT TAT TTT GGA ACC3’
步骤S2：用引物对待检测的奶牛基因组DNA进行PCR扩增；
将待检测的奶牛基因组DNA用设计出的引物进行PCR扩增，扩增的体系为DNA模板50ng、热启动Taq DNA聚合酶0.1Μ/μl、2.5μMdNTP2μl、10μM上下游引物各1μl、2×Lengend PCR Bμffer10μl、加ddH2O至50μl。PCR扩增的条件：在温度为92至95℃时预变性5min，然后在温度为92至95℃时变性15s、在温度为52至68℃时退火30s、在温度为68至72℃时延伸30s，进行多个循环，最后在温度为68至72℃时延伸7min，实际使用时PCR扩增的最优条件为在温度为95℃时预变性5min，然后在温度为95℃时变性15sec、在温度为63℃时退火30sec、在温度为72℃时延伸30sec，共35个循环，最后在温度为72℃时延伸7min。
步骤S3：PCR产物用胶回收试剂盒纯化后，用测序仪进行测序，根据测序分型结果进行判断β-酪蛋白的基因型。
将PCR产物用胶回收试剂盒纯化之后，PCR产物琼脂糖凝胶电泳图见图2,再用ABI3730xl测序仪进行测序，根据测序分型结果进行判断β-酪蛋白的基因型，测序分型结果如图1所示，A1β-酪蛋白67位氨基酸为组氨酸或密码子为CAT，A2β-酪蛋白67位氨基酸为脯氨酸或密码子为CCT，A1A2β-酪蛋白67位氨基酸是一个杂合子或序列为CC/AT。
相比于其他方法，本发明的优势在于可以将β-酪蛋白7号外显子全部测出，这样不仅可以检测出β-酪蛋白的67位氨基酸的突变情况，还能检测出106位和122位氨基酸的突变情况，如图3所示，A2β-酪蛋白的106位氨基酸的密码子为CAC，如图4所示，A2β-酪蛋白的122位氨基酸的密码子为AGC，从而可以区分出A1，A2，A3，B这四种β-酪蛋白，这是其他任何方法都无法完成的。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (8)
1.一种基于测序法检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
根据β-酪蛋白的碱基序列，在6号内含子和7号内含子上设计出一对引物，用引物扩增出7号外显子的片段，所述7号外显子的片段大小为759bp，所述引物的序列为：
上游引物：5’ACC CCA ATT TCT TAA CCA AAC C3’
下游引物：5’CTC AGC TAT GCT TAT TTT GGA ACC3’；
用引物对待检测的奶牛基因组DNA进行PCR扩增；
PCR产物用胶回收试剂盒纯化后，用测序仪进行测序，根据测序分型结果进行判断β-酪蛋白的基因型。
2.根据权利要求1所述基于测序法检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，根据测序分型结果进行判断β-酪蛋白的基因型，具体为：
如果β-酪蛋白的67位氨基酸为组氨酸或密码子为CAT,则β-酪蛋白为A1β-酪蛋白；
如果β-酪蛋白的67位氨基酸为脯氨酸或密码子为CCT,则β-酪蛋白为A2β-酪蛋白；
如果β-酪蛋白的67位氨基酸为一个杂合子或序列为CC/AT,则β-酪蛋白为A1A2β-酪蛋白。
3.根据权利要求2所述基于测序法检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，所述A2β-酪蛋白的106位氨基酸的密码子为CAC。
4.根据权利要求2所述基于测序法检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，所述A2β-酪蛋白的122位氨基酸的密码子为AGC。
5.根据权利要求1至4任一所述基于测序法检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，所述PCR扩增的体系为DNA模板50ng、热启动Taq DNA聚合酶0.1Μ/μl、2.5μM dNTP2μl、10μM上下游引物各1μl、2×Lengend PCR Bμffer10μl、加ddH2O至50μl。
6.根据权利要求5所述基于测序法检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件：在温度为92-95℃时预变性5min，然后在温度为92-95℃时变性15s、在温度为52-68℃时退火30s、在温度为68-72℃时延伸30s，进行多个循环，最后在温度为68-72℃时延伸7min。
7.根据权利要求6所述基于测序法检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，所述PCR扩增进行35个循环。
8.根据权利要求7所述基于测序法检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件：在温度为95℃时预变性5min，然后在温度为95℃时变性15s、在温度为63℃时退火30s、在温度为72℃时延伸30s，进行35个循环，最后在温度为72℃时延伸7min。
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|---|---|
| CN (1) | CN105018581A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108157293A (zh) * | 2018-02-07 | 2018-06-15 | 山东省农业科学院奶牛研究中心 | 一种基于系谱信息简化选择高生产性能a2a2纯合基因型奶牛的育种方法 |
| CN108823321A (zh) * | 2018-06-25 | 2018-11-16 | 北京向中生物技术有限公司 | 一种β-酪蛋白基因分型的HRM检测方法及引物 |
| CN117344032A (zh) * | 2023-12-04 | 2024-01-05 | 允思拓(天津)生物科技有限公司 | 一种β-酪蛋白基因型检测方法及应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1665386A (zh) * | 2002-07-03 | 2005-09-07 | A2有限公司 | 改变牛奶中脂肪酸组成的方法 |
| CN1925741A (zh) * | 2002-05-24 | 2007-03-07 | A2有限公司 | 动物基因分型方法 |
-
2014
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1925741A (zh) * | 2002-05-24 | 2007-03-07 | A2有限公司 | 动物基因分型方法 |
| CN1665386A (zh) * | 2002-07-03 | 2005-09-07 | A2有限公司 | 改变牛奶中脂肪酸组成的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| A.BARROSO ET AL: "A multiplex PCR-SSCP test to genotype bovine β-casein alleles A1,A2,A3,B,and C", 《ANIMAL GENETICS》 * |
| BONSING J.ET AL: "M55158.1", 《GENBANK》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108157293A (zh) * | 2018-02-07 | 2018-06-15 | 山东省农业科学院奶牛研究中心 | 一种基于系谱信息简化选择高生产性能a2a2纯合基因型奶牛的育种方法 |
| CN108157293B (zh) * | 2018-02-07 | 2020-03-20 | 山东省农业科学院奶牛研究中心 | 一种基于系谱信息简化选择高生产性能a2a2纯合基因型奶牛的育种方法 |
| CN108823321A (zh) * | 2018-06-25 | 2018-11-16 | 北京向中生物技术有限公司 | 一种β-酪蛋白基因分型的HRM检测方法及引物 |
| CN117344032A (zh) * | 2023-12-04 | 2024-01-05 | 允思拓(天津)生物科技有限公司 | 一种β-酪蛋白基因型检测方法及应用 |
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