CN105018582A - 一种基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法，该方法包括以下步骤：根据β-酪蛋白的碱基序列，设计出含有Dde？I酶切位点的引物；利用引物扩增出片段，所述片段可使A2β-酪蛋白中产生一个Dde？I酶切位点；用引物对待检测的奶牛基因组DNA进行PCR扩增；利用限制性内切酶Dde？I进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳的结果进行判断。本发明提供的基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法能检测出β-酪蛋白不同的基因型，从而保证人们喝的牛奶为A2牛奶。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法。
背景技术
牛奶中的蛋白质主要分为酪蛋白和乳清蛋白两种，酪蛋白在牛奶蛋白中的含量约占80％左右，乳清蛋白约占14％。牛奶蛋白中一般含有四种酪蛋白，αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白，其中β-酪蛋白约占酪蛋白总量的25-35％。
β-酪蛋白中含有209个氨基酸，而它至少含有13种不同的氨基酸组成，因此分为A1、A2、A3、B、C、D、E、F、H1、H2、I、G。目前大多数养殖奶牛生产的β-酪蛋白，主要为A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白两种类型。在生物体内，β-酪蛋白会水解产生一类由4-11个氨基酸组成，起始氨基酸为酪氨酸的多肽——β-酪啡肽，BCM7(Tyr-Pro-Phe-Gly-Pro-Ile)就是从这类多肽中分离出来的一种类似吗啡的活性肽，它能够刺激淋巴T细胞的增殖。研究表明，BCM7主要是由A1-酪蛋白在胃蛋白酶、胰蛋白酶和亮氨酸氨基肽酶水解下产生，这是由于A2-酪蛋白67位脯氨酸与其相邻的66位和68位的氨基酸有比较稳定的二级结构，而A1-酪蛋白67位组氨酸与邻近氨基酸的二级结构不稳定，因而容易被水解。很多研究表明，BCM7能够导致缺血性心脏病、动脉粥样硬化、I型糖尿病、新生儿猝死症以及一些精神方面的疾病。
A1β-酪蛋白的摄入与人类疾病之间的关系主要基于流行病学研究，A1β-酪蛋白与相关疾病的危险因素数据和死亡数据主要来源于世界卫生组织。新西兰流行病学证据表明A2牛奶比A1牛奶更有益于人类健康。McLachlan对16个国家30-69岁的男性中A1牛奶与心脏病发病率进行了调查，统计结果表明，缺血性心脏病与A1牛奶的消耗有很强的关联性(s＝0.86)。Elliott比较了10个国家0-14岁儿童I型糖尿病的发病率，A1β-酪蛋白与其有较大的关联性(s＝0.726)，在冰岛，由于当地的奶牛主要为A2奶牛，所以该地糖尿病和心脏病的发病率很低。动物学实验也表明表明，喂养A1牛奶的兔子与喂养A2牛奶的兔子相比，胆固醇和血脂水平更高。
因此，我们需要找到一种能够有效区分A1奶牛和A2奶牛的方法，从而使得养殖场只繁育A2奶牛，但目前的检测方法无法检测出β-酪蛋白不同的基因型，不能保证人们喝的牛奶为A2牛奶。
发明内容
鉴于目前检测β-酪蛋白基因型的方法存在的上述不足，本发明提供一种检测出β-酪蛋白不同的基因型的基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法。
为达到上述目的，本发明的实施例采用如下技术方案：
一种基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法，该方法包括以下步骤：
根据β-酪蛋白的碱基序列，设计出含有Dde I酶切位点的引物，所述引物的序列为：
上游引物：5’ACC CCA ATT TCT TAA CCA AAC C3’
下游引物：5’GAG TAA GAG GAG GGA TGT TTT GTG GGA GGC TCT3’；
利用引物扩增出片段，所述片段可使A2β-酪蛋白中产生一个Dde I酶切位点；
用引物对待检测的奶牛基因组DNA进行PCR扩增；
利用限制性内切酶Dde I进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳的结果进行判断。
依照本发明的一个方面，根据琼脂糖凝胶电泳的结果进行判断，具体为：
如果PCR扩增后的产物无法被Dde I切开或存在一个253bp的条带,则β-酪蛋白为A1β-酪蛋白；
如果PCR扩增后的产物进行酶切后同时存在一个218bp的条带和一个35bp的条带,则β-酪蛋白为A2β-酪蛋白；
如果PCR扩增后的产物进行酶切后同时存在一个218bp的条带和一个253bp的条带,则β-酪蛋白为A1A2β-酪蛋白。
依照本发明的一个方面，所述酶切的体系包括PCR产物9ul、限制性内切酶0.2ul和缓冲液1ul；所述酶切的条件为37℃孵育1-8h，65℃热失活20min。
依照本发明的一个方面，在β-酪蛋白的67位氨基酸附近设计出含有Dde I酶切位点的引物，所述酶切的条件为37℃孵育2h，65℃热失活20min。
依照本发明的一个方面，所述PCR扩增的体系为DNA模板50ng、热启动Taq DNA聚合酶0.1U/ul、2.5uM dNTP1ul、10uM上下游引物各1ul、2×Lengend PCR Buffer10ul、加ddH2O至20ul。
依照本发明的一个方面，所述PCR扩增的条件：在温度为92-95℃时预变性5min，然后在温度为92-95℃时变性15s、在温度为52-65℃时退火30s、在温度为68-72℃时延伸30s，进行多个循环，最后在温度为68-72℃时延伸7min。
依照本发明的一个方面，所述PCR扩增进行35个循环。
依照本发明的一个方面，所述PCR扩增的条件：在温度为95℃时预变性5min，然后在温度为95℃时变性15s、在温度为61℃时退火30s、在温度为72℃时延伸30s，进行35个循环，最后在温度为72℃时延伸7min。
本发明实施的优点：本发明的检测方法首先根据β-酪蛋白的碱基序列，在β-酪蛋白的67位氨基酸附近设计出含有Dde I酶切位点的引物，所述引物的序列为：
上游引物：5’ACC CCA ATT TCT TAA CCA AAC C3’
下游引物：5’GAG TAA GAG GAG GGA TGT TTT GTG GGA GGC TCT3’；
然后利用引物扩增出片段，所述片段可使A2β-酪蛋白中产生一个Dde I酶切位点；再用引物对待检测的奶牛基因组DNA进行PCR扩增；最后利用限制性内切酶Dde I进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳的结果进行判断，本发明的检测方法利用A1β-酪蛋白与A2β-酪蛋白67位氨基酸的第二个碱基不同，设计出特异性的引物，使A2β-酪蛋白产生一个Dde I酶切位点，而A1β-酪蛋白没有酶切位点，然后利用酶切技术，从而有效区分出A1β-酪蛋白与A2β-酪蛋白，因此，本发明人提供的基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法能检测出β-酪蛋白不同的基因型，从而保证人们喝的牛奶为A2牛奶。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明所述的一种基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法的示意图；
图2为本发明所述酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明作进一步说明。
如图1、图2所示，一种基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法，该方法包括以下步骤：
根据β-酪蛋白的碱基序列，设计出含有Dde I酶切位点的引物，所述引物的序列为：
上游引物：5’ACC CCA ATT TCT TAA CCAAAC C3’
下游引物：5’GAG TAA GAG GAG GGA TGT TTT GTG GGA GGC TCT3’；
利用引物扩增出片段，所述片段可使A2β-酪蛋白中产生一个Dde I酶切位点；
用引物对待检测的奶牛基因组DNA进行PCR扩增；
利用限制性内切酶Dde I进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳的结果进行判断。
由于牛奶中蛋白质主要有乳清蛋白和酪蛋白两大类，牛奶蛋白中一般含有四种酪蛋白：αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白，其中β-酪蛋白约占酪蛋白总量的25-35％，是氨基酸的重要来源，同时在体内传递重要的矿物质(如钙和磷等)，促进其消化吸收，β-酪蛋白有两种主要的变异型，即A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白，由于A2β-酪蛋白具有能下优点：
a、A2β-酪蛋白是自然源生的牛奶蛋白，目前A2β-酪蛋白的奶源非常稀有；
b、A2β-酪蛋白更接近母乳的蛋白质；
c、更贴合人体的消化系统，能更天然地呵护消化吸收，同时，A2β-酪蛋白则不会生成BCM-7(因为BCM-7与部分婴儿的1型糖尿病风险升高、免疫反应、消化功能紊乱、自闭症和呼吸功能障碍之间存在关联)。
因此，含有A2β-酪蛋白的牛奶(也就是A2牛奶)受到人们的欢迎，但要甄选出基因纯正的A2奶牛确保生产出合格的A2牛奶，需要极高的技术和专业的质量检测方法。
为了解决上述难题，本发明公开了一种基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法，下面对本发明所述的一种基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法作进一步说明，该方法具体包含以下步骤：
步骤S1：根据β-酪蛋白的碱基序列，设计出含有Dde I酶切位点的引物；
本发明的检测方法根据β-酪蛋白的碱基序列，在β-酪蛋白的67位氨基酸附近设计出含有Dde I酶切位点的引物，一般在β-酪蛋白67位氨基酸的第二个碱基设计出含有Dde I酶切位点的引物，所述引物的序列为：
上游引物：5’ACC CCA ATT TCT TAA CCA AAC C3’
下游引物：5’GAG TAA GAG GAG GGA TGT TTT GTG GGA GGC TCT3’
步骤S2：利用引物扩增出片段，所述片段可使A2β-酪蛋白中产生一个Dde I酶切位点；
利用引物扩增出片段，所述片段可使A2β-酪蛋白中产生一个Dde I酶切位点，酶切之后就会产生一个218bp的条带和一个35bp的小条带。
步骤S3：用引物对待检测的奶牛基因组DNA进行PCR扩增；
将待检测的奶牛基因组DNA用设计出的引物进行PCR扩增，PCR扩增的体系为DNA模板50ng、热启动Taq DNA聚合酶0.1U/ul、2.5uM dNTP1ul、10uM上下游引物各1ul、2×Lengend PCR Buffer10ul、加ddH2O至20ul；PCR扩增的条件：在温度为92-95℃时预变性5min，然后在温度为92-95℃时变性15s、在温度为52-65℃时退火30s、在温度为68-72℃时延伸30s，进行多个循环，最后在温度为68-72℃时延伸7min，实际使用时PCR扩增的最优条件为在温度为95℃时预变性5min，然后在温度为95℃时变性15s、在温度为61℃时退火30s、在温度为72℃时延伸30s，进行35个循环，最后在温度为72℃时延伸7min。
步骤S4：利用限制性内切酶Dde I进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳的结果进行判断。
利用限制性内切酶Dde I进行酶切，酶切的体系包括PCR产物9ul、限制性内切酶0.2ul和缓冲液1ul，酶切的条件为37℃孵育1-8h，65℃热失活20min，实际应用中，最优的酶切的条件为37℃孵育2h，65℃热失活20min。根据酶切产物的琼脂糖凝胶电泳的结果进行判断β-酪蛋白的基因型，如果PCR扩增后的产物无法被Dde I切开，也就是说PCR扩增后的产物存在一个253bp的条带,则β-酪蛋白为A1β-酪蛋白；如果PCR扩增后的产物进行酶切后同时存在一个218bp的条带和一个35bp的条带,则β-酪蛋白为A2β-酪蛋白；如果PCR扩增后的产物进行酶切后同时存在一个218bp的条带和一个253bp的条带,则β-酪蛋白为A1A2β-酪蛋白。
本发明的检测方法利用A1β-酪蛋白与A2β-酪蛋白67位氨基酸的第二个碱基不同，设计出特异性的引物，使A2β-酪蛋白产生一个Dde I酶切位点，而A1β-酪蛋白没有酶切位点，然后利用酶切技术，从而有效区分出A1β-酪蛋白与A2β-酪蛋白，因此，本发明人提供的基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法能检测出β-酪蛋白不同的基因型，从而保证人们喝的牛奶为A2牛奶。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (8)
1.一种基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
根据β-酪蛋白的碱基序列，设计出含有Dde I酶切位点的引物，所述引物的序列为：
上游引物：5’ACC CCA ATT TCT TAA CCA AAC C3’
下游引物：5’GAG TAA GAG GAG GGA TGT TTT GTG GGA GGC TCT3’；
利用引物扩增出片段，所述片段可使A2β-酪蛋白中产生一个Dde I酶切位点；
用引物对待检测的奶牛基因组DNA进行PCR扩增；
利用限制性内切酶Dde I进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳的结果进行判断。
2.根据权利要求1所述基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，根据琼脂糖凝胶电泳的结果进行判断，具体为：
如果PCR扩增后的产物无法被Dde I切开或存在一个253bp的条带,则β-酪蛋白为A1β-酪蛋白；
如果PCR扩增后的产物进行酶切后同时存在一个218bp的条带和一个35bp的条带,则β-酪蛋白为A2β-酪蛋白；
如果PCR扩增后的产物进行酶切后同时存在一个218bp的条带和一个253bp的条带,则β-酪蛋白为A1A2β-酪蛋白。
3.根据权利要求1所述基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，所述酶切的体系包括PCR产物9ul、限制性内切酶0.2ul和缓冲液1ul；所述酶切的条件为37℃孵育1-8h，65℃热失活20min。
4.根据权利要求3所述基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，在β-酪蛋白的67位氨基酸附近设计出含有Dde I酶切位点的引物，所述酶切的条件为37℃孵育2h，65℃热失活20min。
5.根据权利要求1至4任一所述基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，所述PCR扩增的体系为DNA模板50ng、热启动Taq DNA聚合酶0.1U/ul、2.5uM dNTP1ul、10uM上下游引物各1ul、2×Lengend PCR Buffer10ul、加ddH2O至20ul。
6.根据权利要求5所述基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件：在温度为92-95℃时预变性5min，然后在温度为92-95℃时变性15s、在温度为52-65℃时退火30s、在温度为68-72℃时延伸30s，进行多个循环，最后在温度为68-72℃时延伸7min。
7.根据权利要求6所述基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，所述PCR扩增进行35个循环。
8.根据权利要求7所述基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件：在温度为95℃时预变性5min，然后在温度为95℃时变性15s、在温度为61℃时退火30s、在温度为72℃时延伸30s，进行35个循环，最后在温度为72℃时延伸7min。
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|---|---|
| CN (1) | CN105018582A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105925717A (zh) * | 2016-07-04 | 2016-09-07 | 山东省农业科学院奶牛研究中心 | 一种检测A1和A2型β-酪蛋白奶牛的方法及其试剂盒 |
| CN108157293A (zh) * | 2018-02-07 | 2018-06-15 | 山东省农业科学院奶牛研究中心 | 一种基于系谱信息简化选择高生产性能a2a2纯合基因型奶牛的育种方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030221202A1 (en) * | 1995-05-16 | 2003-11-27 | Mclachlan Corran Norman Stuart | Milk lacking beta-casein A1 |
| CN1925741A (zh) * | 2002-05-24 | 2007-03-07 | A2有限公司 | 动物基因分型方法 |
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030221202A1 (en) * | 1995-05-16 | 2003-11-27 | Mclachlan Corran Norman Stuart | Milk lacking beta-casein A1 |
| CN1925741A (zh) * | 2002-05-24 | 2007-03-07 | A2有限公司 | 动物基因分型方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| A.BARROSO ET AL: "A multiplex PCR-SSCP test to genotype bovine β-casein alleles A1,A2,A3,B,and C", 《ANIMAL GENETICS》 * |
| BONSING J.ET AL: "M55158.1", 《GENBANK》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105925717A (zh) * | 2016-07-04 | 2016-09-07 | 山东省农业科学院奶牛研究中心 | 一种检测A1和A2型β-酪蛋白奶牛的方法及其试剂盒 |
| CN108157293A (zh) * | 2018-02-07 | 2018-06-15 | 山东省农业科学院奶牛研究中心 | 一种基于系谱信息简化选择高生产性能a2a2纯合基因型奶牛的育种方法 |
| CN108157293B (zh) * | 2018-02-07 | 2020-03-20 | 山东省农业科学院奶牛研究中心 | 一种基于系谱信息简化选择高生产性能a2a2纯合基因型奶牛的育种方法 |
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