CN112280853A

CN112280853A - 一种肥胖表型分子标志物及其应用

Info

Publication number: CN112280853A
Application number: CN202011294611.3A
Authority: CN
Inventors: 王志华; 胡依萌; 吕舰; 李丽莉
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2020-11-18
Filing date: 2020-11-18
Publication date: 2021-01-29
Anticipated expiration: 2040-11-18
Also published as: CN112280853B

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种肥胖表型分子标志物及其应用。本发明利用CRISPR/Cas9技术对小鼠Crtc1敲除。在正常喂养条件下，Crtc1敲除鼠(Crtc1^‑/‑)的体重和脂肪重量显著增加，且与食物摄入和能量消耗无直接关系。此外，Crtc1^‑/‑小鼠更容易出现胰岛素抵抗和血脂异常。肝脏和附睾白色脂肪组织(eWAT)的转录组结果表明，Crtc1缺失引起的肥胖主要与脂肪组织中的脂质代谢有关，而与肝脏无关。GSEA和KEGG分析确定PPARγ途径对eWAT中的脂质代谢影响最大。本发明还发现Crtc1敲除严重损害了小鼠的生育能力。总之，本申请表明Crtc1可能成为治疗肥胖的一个潜在靶点。

Description

一种肥胖表型分子标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种肥胖表型分子标志物及其应用。

背景技术

肥胖，与多种高危疾病相关，包括胰岛素抵抗，血脂异常，高血压，心血管疾病和癌症。在肥胖的发展过程中，白色脂肪组织(WAT)中脂肪细胞的体积增大和/或脂肪细胞数量增多，导致WAT感知营养的能力受损，并进一步导致异位脂质沉积。在功能上，皮下白色脂肪组织(sWAT)具有比附睾白色脂肪组织(eWAT)有更大的成脂分化能力。然而，当sWAT无法容纳过多的脂肪沉积时，eWAT中的脂肪积累在一定程度上反映了代谢风险。多种因素与脂肪堆积相关，包括年龄，性别，性激素，遗传学，种族，生活方式等。因此，如何有效的减少脂肪堆积是该领域的主要挑战之一。

Crtc1，CREB调控转录共激活因子1，系CREB转录辅因子家族的成员之一，在存在cAMP刺激的情况下，可作为调节CREB活性的传感器。前期研究发现，Crtc1缺失对小鼠生殖能力有显著影响，还参与了昼夜节律的调节，外周葡萄糖代谢，心脏功能，记忆形成，抑郁症等生理、病理进程。但在肥胖方面的相关研究还尚待探讨。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种肥胖表型分子标志物及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

在本发明中，使用CRISPR/cas9系统构建了Crtc1基因敲除小鼠品系，并研究了Crtc1基因缺失对肝脏和白色脂肪组织脂质代谢的影响。通过RNA测序探索了Crtc1调节脂质代谢的分子机制。我们发明Crtc1在脂质沉积中的作用，并揭示Crtc1成为治疗肥胖的一个新型分子靶标。

本发明是这样实现的，一种肥胖表型分子标志物，所述分子标志物为Crtc1基因和/或Crtc1基因的表达产物。

进一步地，所述Crtc1基因的NCBI号为382056。

进一步地，所述Crtc1基因的表达产物包括Crtc1 mRNA和/或Crtc1蛋白。

本发明还披露了如上述的分子标志物在制备用于构建肥胖模型的试剂或药物中的应用。

本发明还披露了如上述的分子标志物在制备用于调控脂肪细胞的分化、生成或成熟的试剂或药物中的应用。

本发明还披露了如上述的分子标志物在制备用于调控PPARγ信号通路的试剂或药物中的应用。

本发明还披露了如上述的分子标志物在制备用于治疗肥胖的试剂或药物中的应用。

本发明还披露了如上述的分子标志物在制备用于调控生殖能力的试剂或药物中的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

Crtc1是一种调节CREB活性的转录辅助因子，有研究报道与多种代谢综合征相关；但目前Crtc1对脂肪组织代谢的影响及其潜在机制尚不清楚。本发明首先发现Crtc1^-/-小鼠的体重和脂肪重量(包括sWAT，eWAT和BAT)显著增加。此外，我们发现进食量与能量消耗并不是Crtc1缺失小鼠脂肪堆积的主要原因。血浆生化指标检测发现，与Crtc1^+/+小鼠相比，Crtc1^-/-小鼠出现了高血糖症，并出现严重的胰岛素抵抗。肝脏H&E和油红O染色并未检测到Crtc1^-/-小鼠肝脏有明显的脂肪变性；然而，Crtc1^-/-小鼠的脂肪细胞面积显著增加。RNA测序分析和qRT-PCR验证分析表明，Crtc1缺失对脂肪组织(eWAT)显著增加了脂肪酸代谢(Fabp4)和脂肪细胞分化水平(PPARγ和Leptin)，而对肝脏的脂代谢无显著影响。通过eWAT中差异基因(DEGs)的KEGG和GO富集分析，我们深入探究Crtc1导致脂肪沉积的分析机制。结果表明PPAR信号传导途径和转录因子PPARγ显著富集。我们发现，Crtc1与PPARγ并不存在直接蛋白-蛋白相互作用，数据库数据表明在脂肪组织中Creb1 mRNA与PPARγmRNA水平呈负相关。因此本发明认为Crtc1缺失对PPARγ的激活可能与Creb1相关。此外，本发明还发现缺乏Crtc1不会导致生育能力丧失，但严重损害了小鼠的生殖能力。总之，本申请研究发现，Crtc1缺乏引起脂肪堆积可能与PPARγ信号通路的激活有关；表明CRTC1可能成为治疗肥胖的一个潜在分子靶点。

附图说明

图1是CRISPR/Cas9技术对Crtc1基因进行基因编辑原理示意图；

图2是F1代小鼠鉴定策略示意图；

图3是F1代小鼠鉴定电泳结果图；

图4是Crtc1^-/-小鼠自发地发展为肥胖相关数据结果；

图5是Crtc1^-/-和Crtc1^+/+小鼠代谢笼的相关实验数据结果；

图6是Crtc1^-/-小鼠有高血糖与胰岛素抵抗的相关数据结果；

图7是Crtc1^-/-小鼠脂质代谢异常相关数据；

图8是Crtc1缺失对脂肪组织转录组的分析结果；

图9是Crtc1^-/-和Crtc1^+/+小鼠肝脏与附睾白色脂肪组的肝转录组分析结果；

图10是脂质代谢相关基因的验证结果；

图11是Crtc1缺失上调PPAR信号通路。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明下述各实施例中所述常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。

本发明披露了一种肥胖表型分子标志物及其应用。本申请发明人发现Crtc1^-/-小鼠会发生自发的肥胖，且目前尚无相关研究探索Crtc1在脂肪组织中的作用，因此，本发明旨在探究Crtc1对脂肪组织代谢的影响和潜在分子机制的研究。本发明的具体内容如下各实施例所示。

实施例1Crtc1基因敲除小鼠的构建

本实施例中Crtc1基因敲除小鼠的构建委托江苏集萃药康生物科技有限公司完成。敲除基因名称Crtc1，MGI：2142523；NCBI号：382056。采用CRISPR/Cas9技术对Crtc1基因进行基因编辑，原理示意图见图1所示。

利用CRISPR/Cas9技术，设计并体外转录gRNA(表1)，将Cas9、gRNA同时注射到小鼠的受精卵中。Cas9蛋白在gRNA引导下结合到靶位点进而造成DNA双链断裂，从而实现靶位点碱基序列缺失，实现基因敲除。

表1 gRNA序列信息

gRNA名称	gRNA序列(5’→3’)	PAM
			gRNA1	GCTGACATCTGTGAATTGTA，SEQ ID NO.1	GGG
gRNA2	CTGCATGCTGGATCGACAGG，SEQ ID NO.2	TGG

经受精卵显微注射，胚胎移植，获得F0小鼠。通过PCR，测序确认，获得阳性F0代小鼠。

F1代小鼠鉴定策略示意图见图2。野生型：①PCR反应未获得～830bp条带；②PCR反应可以获得260bp条带；杂合子：①PCR反应可以获得～830bp条带；②PCR反应可以获得260bp条带；纯合子：①PCR反应可以获得～830bp条带；②PCR反应未获得260bp条带。

表2 PCR鉴定引物信息

表3鉴定测序方案

引物名称	引物序列
		GPS00000565-Crtc1-KO-tF1	CTTGCTGAGCCTCTTTGCCAG，SEQ ID NO.7

经电泳和测序检测确认(表2-4)，F1代小鼠目标片段完全删除。电泳结果见图3，数字为鼠尾号，WT为C57BL/6J野生型，N为negative空白对照，M为DNA Marker。

表4鉴定PCR条件

实施例2CRTC1调控PPARγ信号通路造成脂肪堆积

1、CRTC1的缺失会造成小鼠的肥胖和不育

本实施例中，发现Crtc1完全敲除Crtc1^-/-小鼠生育能力严重受损。在三个Crtc1^-/-雄性和Crtc1^-/-雌性配繁笼中，仅有一只小鼠出生，并立即死亡。杂合的Crtc1^+/-小鼠具有正常的生育能力，并以预期的孟德尔频率出生(表5)。

表5杂合Crtc1+/-小鼠交配后代小鼠信息

图4Crtc1^-/-小鼠自发地发展为肥胖相关结果。(A)Crtc1^+/+和Crtc1^-/-小鼠的代表性图像和体重；(B)Crtc1^+/+和Crtc1^-/-小鼠进食量的观察；(C)Crtc1^+/+和Crtc1^-/-小鼠进食量的柱状图展示；(D)Crtc1缺失对不同器官重量的影响，包括肝脏,eWAT，sWAT和BAT。数据为平均值±SEM。*P<0.05；**P<0.01，***P<0.001，n.s.表示无统计学差异。

在正常喂养条件下，与8个月大的Crtc1^+/+小鼠相比，Crtc1^-/-小鼠体型更大，体重显著增加(图4A)。我们发现，体重增加的原因主要来自脂肪重量的增加，包括eWAT，sWAT和BAT(图4D)。为探究小鼠体重增加的原因，本实施例进行了配对喂养实验，我们发现Crtc1^+/+和Crtc1^-/-小鼠的进食量并没有明显差别(图4B-C)。

图5Crtc1^-/-小鼠代谢笼相关实验结果。(A)Crtc1^+/+和Crtc1^-/-小鼠的耗氧量；(B)Crtc1^+/+和Crtc1^-/-小鼠的二氧化碳的产生量；(C)Crtc1^+/+和Crtc1^-/-小鼠的产热量；(C)Crtc1^+/+和Crtc1^-/-小鼠的活动次数。

随后，我们进行了代谢笼实验，以研究Crtc1缺失对整体代谢活性的影响。与Crct1^+/+小鼠相比，Crtc1^-/-小鼠白天的耗氧量(图5A)、二氧化碳生成量(图5B)和热量生成(图5C)显著增加；而Crtc1^+/+和Crtc1^-/-小鼠夜间的耗氧量、二氧化碳生成量、产热量无明显差异。相反，Crtc1^-/-小鼠的体力活动相比Crct1^+/+小鼠，有减小的趋势(图5D)。结果表明，Crtc1^-/-小鼠在生长过程中自发地发展为肥胖，与单纯增加食物摄入或减少能量消耗无关。本实施例数据表明在发育过程中Crtc1^-/-小鼠自发地发展为肥胖。

2、CRTC1缺失导致代谢紊乱

图6是Crtc1^-/-小鼠有高血糖与胰岛素抵抗的相关结果。(A)Crtc1^+/+和Crtc1^-/-小鼠的空腹胰岛素水平；(B)Crtc1^+/+和Crtc1^-/-小鼠的胰岛素水平；(C)Crtc1^+/+和Crtc1^-/-小鼠的HOMA-IR值；(D)Crtc1^+/+和Crtc1^-/-小鼠的腹腔注射葡萄糖耐量试验；(E)葡萄糖耐量的曲线下面积。

与Crtc1^+/+小鼠相比，Crtc1^-/-小鼠表现出对胰岛素敏感性的损害，如空腹血糖升高(图6A)，空腹血浆胰岛素升高(图6B)和HOMA-IR(图6C)显著增加。IPTGG结果进一步证实，Crtc1缺失会损害小鼠进食后清除葡萄糖的能力，并引起小鼠胰岛素抵抗(图6D和6E)。

图7Crtc1^-/-小鼠脂质代谢异常相关结果。(A-C)8个月大时Crtc1^+/+和Crtc1^-/-小鼠的甘油三酸酯(A)，总胆固醇(B)，FABP4含量(C)的循环水平；(D)来自Crtc1^+/+和Crtc1^-/-小鼠的肝组织的油红O或H&E染色；(E)肝脏油红色阳性区域的定量；(F)来自Crtc1^+/+和Crtc1^-/-小鼠的eWAT的H&E染色；(G)eWAT中脂肪细胞面积的量化。数据为平均值±SEM。*P<0.05；***P<0.001和n.s.表示无统计学差异。TG，甘油三酸酯。TCh，总胆固醇。

尽管血浆中TCh和TG没有统计学差异，但是Crtc1^-/-小鼠血浆中FABP4的水平较高，FABP4是主要由脂肪细胞分泌的脂肪因子(图7A-C)。肝脏和脂肪是控制脂质代谢的主要组织。H&E和油红O染色显示Crtc1缺乏对肝脏形态和脂质滴的形成没有显著影响(图7D-E)。但是，本实施例发现与Crtc1^+/+小鼠相比，来自Crtc1^-/-eWAT的脂肪细胞平均面积显著增加(图7F-G)。这些数据表明，Crtc1缺失后的代谢紊乱可能归因于脂肪的积累。

3、CRTC1缺失全面影响了脂肪组织中的脂质代谢

图8Crtc1缺失对脂肪的脂质代谢影响。(A)转录组分析流程示意图；(B)分层聚类和(C)PCA图显示了整体样本分布；(D)eWAT中DEGs的火山图，其中红色为上调的基因，蓝色为下调的基因；筛选阈值为|log2(FC)|>1并且P值<0.01；(E)热图展示eWAT中前50位的DEGs；(F)气泡图展示GO富集分析eWAT中脂质代谢相关的生物过程(P<0.05)。

图9Crtc1^-/-和Crtc1^+/+小鼠的肝脏转录组分析结果。(A)肝脏中DEGs的火山图，其中红色为上调的基因，蓝色为下调的基因；筛选阈值为|log2(FC)|>1并且P值<0.01；(B)热图展示肝脏中前50位的DEGs；(C)气泡图展示GO富集分析中生物过程；(D)使用Metascape在线分析eWAT和肝脏中共有的DEGs，内圈代表eWAT或肝脏中的DEGs,紫色曲线连接eWAT和肝脏之间的相同基因，蓝色曲线连接属于相同的GO的DEGs。(E)Metascape对eWAT和肝脏差异基因的联合富集分析。

为了研究CRTC1在脂质代谢中的潜在的分子机制，本实施例使用来自Crtc1^+/+和Crtc1^-/-小鼠的肝脏和eWAT组织进行了转录组分析(图8A)。聚类树和主成成分分析(PCA)表明，Crtc1缺失对eWAT中的转录组的影响大于肝脏中的转录组(图8B和8C)。火山图显示，eWAT中的Crtc1^-/-和Crtc1^+/+之间的差异基因(1050个上调基因和854个下调基因)比肝脏(386个上调基因和97个下调基因)多(图8D，图9A)。在eWAT(图8E)和肝脏(图9B)中以热图展示了前50个差异基因。

eWAT中DEGs的GO富集分析结果(图8F)显示，Crtc1敲除影响了生物过程与脂肪酸代谢和脂肪细胞分化密切相关，包括棕色脂肪细胞分化，脂肪酸代谢过程，脂肪细胞分化，脂质结合和脂质生物合成过程(图8F)。GSEA富集到的信号通路主要包括脂肪酸β氧化，脂肪酸分解代谢过程，脂质氧化，单羧酸分解代谢等(表6)。

表6 eWAT GSEA富集分析结果

相反，肝脏中的DEGs与脂质代谢无显著相关，主要在细胞外区域，细胞外基质，运动的调节，细胞外基质部分和蛋白质细胞外基质中存在显著富集(图9C)。在肝脏中GSEA富集分析进一步证实了这一点(表7)。此外，对肝脏和eWAT之间DEGs的综合富集分析还表明，由Crtc1缺失引起的脂肪积累在很大程度上与脂肪有关，而与肝脏无关(图9E)。

表7肝脏GSEA富集分析结果

图10脂质代谢相关基因的验证结果。通过qRT-PCR(表8-9)检测与肝脏(A)和eWAT(B)中与脂质代谢过程相关的关键基因的表达。数据为平均值±SEM。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001，n.s.表示无统计学差异。

表8 qRT-PCR引物列表

表9 qRT-PCR反应体系

为了验证实验结果，本实施例通过qRT-PCR检查了脂质代谢相关基因的mRNA水平，qRT-PCR的引物序列如表8所示，qRT-PCR的反应组分与程序如表9所示。本实施例发现，在肝脏中，与Crtc1^+/+小鼠相比，Crtc1^-/-组除了Fasn和CD36有显著增加，与脂肪生成，脂肪酸转运和脂肪酸氧化有关的关键基因的表达没有显着的统计学差异(图10A)。但是，与Crtc1^+/+小鼠相比，Crtc1^-/-小鼠与脂肪分化，脂肪生成，脂肪酸运输氧化和运输有关的基因的mRNA水平显着增加(图10B)。

4、Crtc1通过激活PPARγ信号通路促进脂肪生成

图11Crtc1缺失导致PPAR信号通路上调。(A)GSEA富集到PPAR信号通路；(B)PPAR通路中eWAT组织中DEGs的KEGG富集分析，红色表示基因上调，蓝色表示基因被下调；(C-E)通过GEPIA数据库分析人体脂肪中Crtc1，Creb1和PPAR之间的相关性；(F-G)分别通过Flag一抗(F)和HA一抗(G)对Crtc1和PPARγ之间的蛋白质相互作用进行Co-IP验证。

根据GESE(图11A)和KEGG(图11B)的结果，本实施例发现在Crtc1^-/-缺失小鼠中PPAR信号通路显著上调。通过Metascape富集分析，转录因子PPARγ在eWAT的DEGs中显著富集(表10)。有研究报道发现，白色脂肪细胞中PPARγ的激活可通过上调脂肪酸代谢基因(包括C/EBPα，Stat1，Stat5，Fabp4，Lpl，CD36，Glut4，Pepck等)来促进脂肪酸的存储，甘油三酸酯(TG)合成和葡萄糖摄取。这些基因中的大多数在Crtc1^-/-缺失小鼠的eWAT中显著上调(图11B)。这些结果表明Crtc1通过激活PPARγ信号通路促进脂肪生成。

表10 eWAT中显著富集的前10个转录因子

本实施例还检测CRTC1作为转录辅因子是否直接与PPARγ结合以改变其活性，但Co-IP的实验结果表明CRTC1和PPARγ之间没有直接相互作用(图11F-G)。有趣的是，本实施例发现Crtc1在mRNA水平上与Creb1(R＝0.25，P<0.001)正相关，而与Pparγ(R＝0.026，P＝0.55)无显著相关性；Creb1与mRNA与Pparγ的mRNA呈负相关(R＝-0.16，P<0.001)，这些数据表明CRTC1可能通过修饰CREB1来调节Pparγ的转录活性(图11C-E)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 一种肥胖表型分子标志物及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctgacatct gtgaattgta 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgcatgctg gatcgacagg 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cttgctgagc ctctttgcca g 21

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccttcacatc ctcccagaga tgta 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggcaactgag ttcatcctaa cacg 24

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cttgttccca agaggatcaa ggc 23

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cttgctgagc ctctttgcca g 21

Claims

1.一种肥胖表型分子标志物，其特征在于，所述分子标志物为Crtc1基因和/或Crtc1基因的表达产物。

2.根据权利要求1所述的一种肥胖表型分子标志物，其特征在于，所述Crtc1基因的NCBI号为382056。

3.根据权利要求1所述的一种肥胖表型分子标志物，其特征在于：所述Crtc1基因的表达产物包括Crtc1 mRNA和/或Crtc1蛋白。

4.如权利要求1-3任一所述的分子标志物在制备用于构建肥胖模型的试剂或药物中的应用。

5.如权利要求1-3任一所述的分子标志物在制备用于调控脂肪细胞的分化、生成或成熟的试剂或药物中的应用。

6.如权利要求1-3任一所述的分子标志物在制备用于调控PPARγ信号通路的试剂或药物中的应用。

7.如权利要求1-3任一所述的分子标志物在制备用于治疗肥胖的试剂或药物中的应用。

8.如权利要求1-3任一所述的分子标志物在制备用于调控生殖能力的试剂或药物中的应用。