CN116473020A - 一种Macrosialin基因缺失动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法及其应用 - Google Patents

一种Macrosialin基因缺失动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于动物模型构建技术领域，尤其涉及一种Macrosialin基因缺失动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法及其应用。所述构建方法包括：将ApoE‑/‑基因型小鼠的Macrosialin基因敲除，获得ApoE‑/+Macrosialin‑/+基因型的F0代小鼠；将F0代小鼠与ApoE‑/‑基因型小鼠回交，筛选获得ApoE‑/‑Macrosialin‑/+基因型的F1代小鼠；将F1代小鼠自交，筛选获得ApoE‑/‑Macrosialin‑/‑基因型的F2代小鼠，经高脂饮食诱导获得动脉粥样硬化小鼠模型。本发明选取Macrosialin基因为靶点，利用CRISPR/Cas9系统敲除该基因，筛选获得Macrosialin和ApoE双等位基因均敲除的纯合子个体即动脉粥样硬化小鼠模型，其可正常繁育和哺乳且能稳定遗传，为研究Macrosialin基因在AS发生、发展中的作用及AS诊断治疗等提供了经济、稳定、便捷、高效的小鼠模型。

Description

一种Macrosialin基因缺失动脉粥样硬化小鼠模型的构建方 法及其应用
技术领域
本发明涉及动物模型构建技术领域，特别涉及一种Macrosialin基因缺失动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法及其应用。
背景技术
动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是由遗传、环境等多因素导致的局灶性慢性炎症血管疾病，以脂质沉积、内膜增厚为特征，形成粥样斑块病灶或纤维脂质斑块，是造成心血管疾病、中风和外周动脉疾病的主要原因。动脉粥样硬化的特征是粥样斑块的形成，粥样斑块形成的病理基础是泡沫细胞的形成。泡沫细胞大部分来源于聚集于动脉内膜下的巨噬细胞，小部分由平滑肌细胞和内皮细胞转化而来。血液循环中的单核细胞迁移到动脉内膜下层并分化为巨噬细胞。血管内膜下层的氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)被巨噬细胞表面的清道夫受体识别并大量吞噬，导致脂质在巨噬细胞中积累，巨噬细胞转化为富含脂质的泡沫细胞。泡沫细胞及ox-LDL对动脉粥样斑块的作用主要体现在以下两个方面：一方面，泡沫细胞产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)并诱导一系列炎症反应，招募更多的巨噬细胞进入血管内膜下层转化为泡沫细胞，导致血管壁出现脂肪条纹，加速动脉粥样硬化的进程；另一方面，ox-LDL进一步诱导泡沫细胞坏死，形成的坏死核心是晚期斑块不稳定的典型特征。斑块破裂会跟随血液流动堵塞心脑血管，这是造成脑梗和心梗的直接原因。因此，减轻巨噬细胞吞噬脂质，减缓炎症反应以及防止斑块破裂对防治动脉粥样硬化性心血管疾病具有重要意义。
巨噬细胞黏蛋白(Macrosialin)作为一种清道夫受体能够结合修饰的LDL、磷脂酰丝氨酸和凋亡细胞。Macrosialin基因在单核巨噬细胞表面特异性高且丰度高的特点，使得巨噬细胞黏蛋白具有结合和内化ox-LDL的可能性。目前，巨噬细胞黏蛋白在泡沫细胞形成和动脉粥样硬化发展中的作用尚不清楚。
实验动物模型在科学实验和药物研发中占有重要地位，小鼠和基因工程小鼠资源是目前疾病机制研究、基因功能研究、药物创制等领域最重要的动物模型之一，也是这些领域创新研究的必须条件。利用基因工程小鼠针对动脉粥样硬化病理过程中的各个分子环节进行研究，对阐明动脉粥样硬化发生发展过程中的分子机制，寻找动脉粥样硬化治疗的分子靶点和相关疾病的治疗具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种Macrosialin基因缺失动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法，通过成功在小鼠体内敲除Macrosialin基因以探索该基因的表达与动脉粥样硬化疾病发生、发展的相互关系，以此为研究Macrosialin在动脉粥样硬化疾病发生、发展中的作用及动脉粥样硬化药物筛选等方面提供经济、便捷、可靠的动物模型，并进一步提供了以Macrosialin基因作为药物靶标在筛选治疗动脉粥样硬化疾病的药物中的应用以及Macrosialin抑制剂在制备治疗动脉粥样硬化疾病药物中的应用。
本发明第一方面提供了一种Macrosialin基因缺失动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
S1、将ApoE-/-基因型小鼠的Macrosialin基因敲除，获得ApoE-/+Macrosialin-/+基因型的F0代小鼠；
S2、将所述F0代小鼠与所述ApoE-/-基因型小鼠回交，筛选获得ApoE-/-Macrosialin-/+基因型的F1代小鼠；
S3、将所述F1代小鼠自交，筛选获得ApoE-/-Macrosialin-/-基因型的F2代小鼠，经高脂饮食诱导，获得动脉粥样硬化(AS)小鼠模型；
其中，步骤S1中，所述F0代小鼠的获得具体包括如下步骤：
S11、将所述Macrosialin基因的2号外显子区设计为敲除区域，分别设计并合成靶向2号外显子区上、中和下游的3个sgRNA；
S12、将Cas9 mRNA和3个所述sgRNA注入受精卵细胞中，筛选存活的所述受精卵并移植至假孕雌鼠体内孕育，从出生小鼠中筛选得到ApoE-/+Macrosialin-/+基因型的所述F0代小鼠；其中，所述受精卵由ApoE-/-基因型小鼠精子和C57BL/6小鼠卵细胞体外受精形成。
进一步地，步骤S11中，3个所述sgRNA分别靶向2号外显子的95-117bp、157-179bp和271-293bp。
进一步地，步骤S11中，3个所述sgRNA靶向的DNA序列分别如SEQ ID NO.1-3所示。
进一步地，步骤S11中，所述sgRNA通过体外转录技术合成得到，包括以下步骤：设计用于扩增所述sgRNA的引物IVT-1、IVT-2、IVT-3和IVT-4，以pX330质粒为模板，将引物IVT-1、IVT-2和IVT-3分别与引物IVT-4配对，通过PCR反应分别扩增获得对应的DNA产物，以所述DNA产物分别作为模板，经体外转录并纯化获得所述sgRNA；其中，用于扩增所述sgRNA的引物的DNA序列如SEQ ID NO.4-7所示。
进一步地，步骤S12中，所述Cas9 mRNA通过体外转录技术合成得到，包括以下步骤：以线性化pST1374-Cas9质粒为模板，经体外转录并纯化获得所述Cas9 mRNA。
进一步地，步骤S12中，每个所述sgRNA和所述Cas9 mRNA以等比例注射进受精卵细胞中。
另外，本发明第二方面提供了如上所述的Macrosialin基因缺失动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法构建得到的动脉粥样硬化小鼠模型在研究Macrosialin基因与动脉粥样硬化疾病相关作用和机制中应用以及在研究动脉粥样硬化发生、发展与动脉粥样硬化药物筛选中的应用。
另外，本发明第三方面提供了Macrosialin基因作为药物靶标在筛选治疗动脉粥样硬化疾病的药物中的应用。
另外，本发明第四方面提供了Macrosialin抑制剂在制备治疗动脉粥样硬化疾病药物中的应用。
本发明的优点及积极效果为：
1、本发明选取Macrosialin基因为靶点，设计针对小鼠Macrosialin基因2号外显子区上游、中游和下游的3个特异性打靶位点以保证小鼠Macrosialin基因的大片段缺失，之后利用CRISPR/Cas9系统敲除ApoE-/-小鼠的Macrosialin基因，获得F0代Macrosialin基因和ApoE基因双敲除的杂合子小鼠，然后与ApoE-/-小鼠回交，得到的后代进行自交，获得Macrosialin双等位基因敲除和ApoE双等位基因敲除的纯合子个体，在高脂饮食诱导下，得到动脉粥样硬化小鼠模型，其可正常繁育和哺乳，血清血脂生化指标无明显差异，且能获得稳定的遗传，为研究Macrosialin基因在动脉粥样硬化疾病发生、发展中的作用及动脉粥样硬化诊断治疗等研究提供了经济、稳定、便捷、高效的小鼠模型。
2、本发明研究发现Macrosialin基因与动脉粥样硬化息息相关，其能够促进或恶化AS的发生、发展，基于该特性和功能，Macrosialin基因可作为药物靶标用于筛选治疗动脉粥样硬化疾病的药物，Macrosialin抑制剂可用于制备治疗动脉粥样硬化疾病药物，这为研究防治AS的新靶点和新策略提供了理论依据和临床基础，对于AS的基础研究具有一定的原创性、实用性和启发性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例sgRNA靶向Macrosialin基因的设计原理图；
图2为本发明实施例ApoE-/+Macrosialin-/+基因型F0代小鼠的荧光PCR基因型检测示意图；
图3为本发明实施例ApoE-/+Macrosialin-/+基因型F0代小鼠的Sanger测序图；
图4为本发明实施例高脂喂养ApoE-/-Macrosialin-/-基因型小鼠和对照ApoE-/-基因型小鼠12周期间体重分析图；
图5为本发明实施例高脂喂养ApoE-/-Macrosialin-/-基因型小鼠和对照ApoE-/-基因型小鼠12周后血清生化血脂四项检测图；
图6为本发明实施例高脂喂养ApoE-/-Macrosialin-/-基因型小鼠和对照ApoE-/-基因型小鼠12周后主动脉根部油红O染色分析图；
图7为本发明实施例高脂喂养ApoE-/-Macrosialin-/-基因型小鼠和对照ApoE-/-基因型小鼠12周或18周后全主动脉油红O染色分析图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。
本发明实施例提供了一种Macrosialin基因缺失动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
S1、将ApoE-/-基因型小鼠的Macrosialin基因敲除，获得ApoE-/+Macrosialin-/+基因型的F0代小鼠；
S2、将所述F0代小鼠与所述ApoE-/-基因型小鼠回交，筛选获得ApoE-/-Macrosialin-/+基因型的F1代小鼠；
S3、将所述F1代小鼠自交，筛选获得ApoE-/-Macrosialin-/-基因型的F2代小鼠，经高脂饮食诱导，获得动脉粥样硬化(AS)小鼠模型；
其中，步骤S1中，所述F0代小鼠的获得具体包括如下步骤：
S11、根据Macrosialin基因结构，将所述Macrosialin基因的2号外显子区设计为敲除区域，分别设计并合成靶向2号外显子区上、中和下游的3个sgRNA；
S12、将Cas9 mRNA和3个所述sgRNA注入受精卵细胞中，筛选存活的所述受精卵并移植至假孕雌鼠体内孕育，从出生小鼠中筛选得到ApoE-/+Macrosialin-/+基因型的所述F0代小鼠；其中，所述受精卵来源于ApoE-/-基因型小鼠精子和C57BL/6小鼠卵细胞体外受精。
为了阐明Macrosialin基因与动脉粥样硬化疾病的关系，研究Macrosialin如何影响动脉粥样硬化的发生发展，本发明特选取Macrosialin基因为靶点，首次确定了3个针对小鼠Macrosialin基因的特异性打靶位点，分别位于Macrosialin基因的2号外显子区上游、中游和下游，这3个靶点具有较高的剪切效率以保证小鼠Macrosialin基因的大片段缺失，之后利用CRISPR/Cas9系统对ApoE-/-背景的小鼠进行Macrosialin基因敲除，获得F0代Macrosialin基因和ApoE基因双敲除的杂合子小鼠，然后与ApoE-/-小鼠回交，得到的后代进行自交，通过基因型筛选，获得Macrosialin双等位基因敲除和ApoE双等位基因敲除的纯合子个体，在高脂饮食诱导下，得到动脉粥样硬化小鼠模型，其可正常繁育和哺乳，免疫系统和野生型小鼠无显著性差异，为研究在动脉粥样硬化疾病发生、发展中的作用奠定了基础。
进一步通过实验数据分析证实，与对照组ApoE-/-小鼠的动脉粥样硬化(AS)症状相比，构建的ApoE-/-Macrosialin-/-基因型小鼠的AS症状明显改善，血清血脂生化指标无明显差异，且能获得稳定的遗传，表明Macrosialin缺失动脉粥样硬化模型小鼠构建成功，具有非常重要的基础研究和实际应用价值。且前述实验数据证实Macrosialin基因敲除会抑制AS的发生、减缓了AS的病变程度，说明Macrosialin基因的表达能够促进或恶化AS的发生、发展，为开发AS治疗的新方案提供了新的思路和理论基础。因此，本发明的构建方法能够为研究Macrosialin基因在动脉粥样硬化疾病发生、发展中的作用及动脉粥样硬化诊断治疗等研究提供经济、稳定、便捷、高效的ApoE和Macrosialin双基因敲除纯合小鼠模型。而且，本发明所获得的动脉粥样硬化小鼠模型有利于满足研究动脉粥样硬化的不同需求，节省了经济成本与时间成本，具有十分重要的潜在应用价值。
需要说明的是，ApoE-/-基因型是指载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)的两个等位基因的基因序列均被删除，得到ApoE纯合缺失的小鼠；相应地，ApoE-/+基因型是指其中一个ApoE等位基因的基因序列被删除，得到ApoE杂合子小鼠。Macrosialin-/-基因型和Macrosialin-/+基因型具有与前述相同的含义，在此不再赘述。
另外，需要说明的是，基因敲除是指通过一定的手段使机体特定的基因失活或缺失的技术，在本发明的上下文中，敲除与缺失具有相同含义。
为了更好实现Macrosialin基因特异性的敲除或缺失以及保证敲除的效率，上述的3个所述sgRNA分别靶向Macrosialin基因2号外显子的95-117bp、157-179bp和271-293bp。
具体地，3个所述sgRNA靶向的DNA序列分别如下所示：
Macrosialin-sgRNA1：5’-TGGGCCTGTGGCTGGTCGTAGGG-3’(参见SEQ ID NO.1)；
Macrosialin-sgRNA2：5’-ATGAGTGACAGTTGTGGGTCCGG-3’(参见SEQ ID NO.2)；
Macrosialin-sgRNA3：5’-AGGGTGAGGGCCAACAGTGGAGG-3’(参见SEQ ID NO.3)。
本发明以Macrosialin基因2号外显子的95-117bp、157-179bp和271-293bp为靶点，设计特异性靶向这3个位点的特异性sgRNA，该靶点具有较高的剪切效率，可以提高基因敲除效率，并可以保证小鼠Macrosialin基因的大片段缺失，确保Macrosialin基因彻底失去其功能，并且有利于子代小鼠Macrosialin基因型的检测鉴定。
可选地，步骤S11中，所述sgRNA通过体外转录技术合成得到，具体而言，包括以下步骤：设计用于扩增sgRNA的引物IVT-1、IVT-2、IVT-3和IVT-4，以pX330质粒为模板，将引物IVT-1、IVT-2和IVT-3分别与引物IVT-4配对，通过PCR反应分别扩增获得对应的DNA产物，以前述所述的DNA产物分别作为模板，经体外转录并纯化获得Macrosialin-sgRNA1、Macrosialin-sgRNA2和Macrosialin-sgRNA3。所述用于扩增sgRNA的引物的DNA序列如下所示；
IVT-1：
5’-TTCTAATACGACTCACTATAGGTGGGCCTGTGGCTGGTCGTAGGGGTTTTAGAGCTAGA-3’(参见SEQ ID NO.4)；
IVT-2：
5’-TTCTAATACGACTCACTATAGGATGAGTGACAGTTGTGGGTCCGGGTTTTAGAGCTAGA-3’(参见SEQ ID NO.5)；
IVT-3：
5’-TTCTAATACGACTCACTATAGGAGGGTGAGGGCCAACAGTGGAGGGTTTTAGAGCTAGA-3’(参见SEQ ID NO.6)；
IVT-4：
5’-AAAAAAGCACCGACTCGGTGCC-3’(参见SEQ ID NO.7)。
可选地，步骤S12中，所述Cas9 mRNA通过体外转录技术合成得到，包括以下步骤：以线性化pST1374-Cas9质粒为模板，经体外转录并纯化获得所述Cas9 mRNA。
为了提高基因敲除的效率，步骤S12中，所述Macrosialin-sgRNA1、所述Macrosialin-sgRNA2、所述Macrosialin-sgRNA3和所述Cas9 mRNA以等比例即等量注射进受精卵细胞中。一般而言，所述Macrosialin-sgRNA1、所述Macrosialin-sgRNA2、所述Macrosialin-sgRNA3和所述Cas9 mRNA注射浓度均为10-100ng/μL，通过将终浓度相同的四者混合均匀，之后采用显微注射，以保证四者在受精卵细胞中等比例存在。
基于相同的发明构思，本发明另一实施例提供了如上所述的Macrosialin基因缺失动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法构建得到的动脉粥样硬化小鼠模型在研究Macrosialin基因与动脉粥样硬化疾病相关作用和机制的应用。具体地，为在动脉粥样硬化基础研究中的应用，或者为在研究Macrosialin对动脉粥样硬化发生、发展与动脉粥样硬化药物筛选中的应用。更具体地，本发明已证实Macrosialin基因全身性敲除能够减缓动脉粥样硬化的发生发展，后续基于此模型可以研究Macrosialin基因是否影响到活性氧的产生、炎症信号通路的激活、细胞的凋亡等等基础性的机制研究；另外，针对动脉粥样硬化药物筛选，一方面通过Macrosialin抑制剂抑制该基因的表达或抑制蛋白功能，比如针对Macrosialin的抗体、干扰RNA的研制；另一方面针对Macrosialin减缓动脉粥样硬化的具体机制，间接的提供治疗和药物研发的方向。
所述Macrosialin基因缺失动脉粥样硬化小鼠模型的应用与如上所述的Macrosialin基因缺失动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法相对于现有技术所具有的优势相同，在此不再赘述。
另外，本发明成功在小鼠体内缺失了Macrosialin基因，并通过对上述所述的Macrosialin基因缺失动脉粥样硬化小鼠模型的深入研究探索了该基因的表达与AS疾病发生、发展的相互关系，确定了Macrosialin基因缺失具有抑制AS斑块形成的作用，主要体现在动脉粥样斑块显著减少，动脉粥样硬化显著减轻，这提示Macrosialin基因的表达能够促进AS的发生、发展，为研究防治AS的新靶点和新策略提供了理论依据和临床基础，对于AS的基础研究具有一定的原创性、实用性和启发性。
基于Macrosialin基因的上述特性和功能，Macrosialin基因可作为药物靶点，构建Macrosialin基因过表达或沉默的体外细胞模型或动物模型，用于筛选预防、缓解和治疗AS的药物，例如通过筛选发现其中能够特异性抑制Macrosialin的分子，从而为AS的治疗提供新的治疗性分子。Macrosialin基因也可作为基因治疗中的靶基因，设计并制备预防、缓解和治疗AS的药物或生物学试剂，通过基因工程技术达到预防、缓解和治疗AS的目的。例如以Macrosialin基因为靶基因，设计可干扰Macrosialin表达的siRNA，通过化学方法合成以后，注射入实验体内通过RNA干扰的方法使Macrosialin基因沉默来治疗动脉粥样硬化；还可以设计并构建Macrosialin的突变体，注射后进入细胞，竞争野生型Macrosialin的作用底物，从而抑制Macrosialin的功能，起到治疗目的。
基于上述所述的发明构思，本发明再一实施例提供了Macrosialin基因作为药物靶标在筛选治疗动脉粥样硬化疾病的药物中的应用。
基于上述所述的发明构思，本发明又一实施例提供了Macrosialin抑制剂在制备治疗动脉粥样硬化疾病药物中的应用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
需要说明的是，下列实施例中，ApoE基因敲除小鼠(基因型为ApoE-/-)购自美国Jackson Laboratory实验室，该小鼠高脂饲料喂养数周后患动脉粥样硬化。高脂饲料来自Research Diets公司，货号D12108C。pX330质粒购于Addgene公司；pT7-3×Flag-hCas9质粒为馈赠质粒。
另外，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照制造厂商所建议的条件；其他实验用品未经说明，均为市售商品。
实施例1
一种Macrosialin基因缺失动脉粥样硬化小鼠模型构建方法，包括以下步骤：
S1、将ApoE-/-基因型的小鼠的Macrosialin基因敲除，获得ApoE-/+Macrosialin-/+基因型的F0代小鼠。
其中，F0代小鼠的获得具体包括如下步骤：
S11、在小鼠基因组数据库MGI(http://www.informatics.jax.org/)中获取Macrosialin基因序列，根据Macrosialin基因结构及CRISPR/Cas9系统原理，将Macrosialin基因的2号外显子区(Exon2，Exon ID：ENSMUSE00000329550)设为敲除区域，使用CRISPOR在线设计软件(http://crispor.tefor.net/crispor.cgi)设计三个特异性位点作为sgRNA的靶序列，三个特异性位点位于Exon2区的95-117bp、157-179bp和271-293bp，设计分别靶向这三个特异性位点的3个sgRNA，sgRNA靶向的Exon2区DNA序列分别如下所示：
Macrosialin-sgRNA1：5’-TGGGCCTGTGGCTGGTCGTAGGG-3’(参见SEQ ID NO.1)；
Macrosialin-sgRNA2：5’-ATGAGTGACAGTTGTGGGTCCGG-3’(参见SEQ ID NO.2)；
Macrosialin-sgRNA3：5’-AGGGTGAGGGCCAACAGTGGAGG-3’(参见SEQ ID NO.3)。
之后根据sgRNA的DNA序列设计4条引物，交由上海百力格生物技术有限公司合成，引物序列如下所示，其中，下划线所示为T7启动子序列，阴影部分所示为Cas9识别位点：
IVT-1：5’-TTCTAATACGACTCACTATAGGTGGGCCTGTGGCTGGTCGTAGGGGTTTTAGAGCTAGA-3’(参见SEQ ID NO.4)；
IVT-2：5’-TTCTAATACGACTCACTATAGGATGAGTGACAGTTGTGGGTCCGGGTTTTAGAGCTAGA-3’(参见SEQ ID NO.5)；
IVT-3：5’-TTCTAATACGACTCACTATAGGAGGGTGAGGGCCAACAGTGGAGGGTTTTAGAGCTAGA-3’(参见SEQ ID NO.6)；
IVT-4：5’-AAAAAAGCACCGACTCGGTGCC-3’(参见SEQ ID NO.7)；
使用上述5’端包含T7启动子序列的引物进行PCR扩增反应，反应体系和PCR程序分别如表1-2所示：
表1 PCR扩增反应体系
表2 PCR扩增反应程序
PCR反应完成后，使用Invitrogen PCR回收试剂盒(Invitrogen，K220001)对PCR反应产物进行分离和纯化，得到3个含T7启动子的双链DNA片段。
之后，使用试剂盒(NEB，E2050S)进行体外转录，按如表3所示的反应体系添加各物质，充分混合后，置于37℃反应4h，即获得体外转录产物。使用Ambion RNA纯化试剂盒(Ambion，AM1909)回收并纯化体外转录产物，即得到Macrosialin-sgRNA1、Macrosialin-sgRNA2和Macrosialin-sgRNA3。
表3 sgRNA体外转录体系
S12、获取Cas9 mRNA，将Cas9 mRNA和Macrosialin-sgRNA1、Macrosialin-sgRNA2和Macrosialin-sgRNA3用无RNA酶的超纯水(Invitrogen，10977015)稀释，使四者的终浓度均达到50ng/μL，充分混合后通过显微注射系统将其注射入已制备好的受精卵细胞中，置于37℃、5％二氧化碳培养箱恢复1h，从中筛选存活的受精卵并移植至假孕C57BL/6雌鼠体内孕育，从出生小鼠中筛选得到ApoE-/+Macrosialin-/+基因型的F0代小鼠。
其中，Cas9 mRNA通过体外转录得到，具体而言，包括以下步骤：使用高纯度质粒抽提试剂盒(天根生化科技有限公司，DP116)提取Cas9载体质粒DNA(pST1374-Cas9)，之后使用AgeI限制性内切酶处理，得到线性化pST1374-Cas9，酶切反应体系如表4所示，置于37℃恒温箱反应12h。之后对前述酶切产物进行DNA琼脂糖凝胶电泳，若该产物呈现单一条带并大于未酶切处理Cas9质粒，则表明载体质粒线性化成功。
表4质粒pST1374-Cas9酶切反应体系
使用DNA回收试剂盒(天根生化科技有限公司，DP205)对线性化质粒进行分离和纯化，即获得Cas9 DNA体外转录模板。
之后，使用Invitrogen试剂盒(Invitrogen，AMB1345-5)进行体外转录，按如表5所示的反应体系添加各物质，充分混合后，置于37℃反应2h，向上述产物中加入1μL TURBODNase后充分混匀，置于37℃继续反应15min。之后进行加尾反应，按如表6所示的反应体系添加各物质，充分混合后，置于37℃反应孵育45min。将前述产物使用Ambion RNA纯化试剂盒(Ambion，AM1909)回收所得即为Cas9 mRNA。
表5 Cas9 mRNA体外转录反应体系
表6 Cas9 mRNA加尾反应体系
其中，受精卵细胞的制备方法包括：向2只8周龄C57BL/6雌鼠体内注射孕马血清和人绒毛膜促性腺激素，使小鼠处于超排卵状态后，与1只ApoE-/-基因型背景雄鼠进行合笼培养。挑选见栓0.5天的C57BL/6雌鼠进行CO2处死，用显微镊从输卵管中取出成团的卵子并进行透明质酸酶消化，选择优质的单个胚胎置于M16培养基中培养待用。
其中，从出生小鼠中筛选得到ApoE-/+Macrosialin-/+基因型的F0代小鼠具体包括：挑选出生一周健康的F0代小鼠，提取鼠尾DNA作为模板DNA，通过PCR反应进行基因型鉴定，PCR反应体系和程序分别如表7-8所示。
表7通过PCR反应进行基因型鉴定的反应体系
表8通过PCR反应进行基因型鉴定的反应程序
上述所用上游引物和下游引物序列如下：
GeneTy-F：5’-TCTCCTGCCATCCTTCACGAT-3’(见SEQ ID NO.8，5’端使用FAM荧光进行标记)；
GeneTy-R：5’-TTCCTCTTCCCTGCTGAACGA-3’(见SEQ ID NO.9)。
毛细血管电泳检测：取10μL上述PCR产物进行琼脂糖电泳检测基因型，如果呈现明显的条带，则将该PCR产物稀释200倍后与甲酰胺、标准分子量内参DNA进行充分混合，待变性后置于测序仪上进行毛细管电泳。使用Genemapper软件对电泳结果进行数据分析，获得PCR产物的大小，与Macrosialin野生型鼠尾的PCR产物大小459bp(DNA序列见SEQ IDNO.10)相比，F0代小鼠DNA的扩增片段的碱基数目发生了缺失，结果如图2所示，F0代小鼠为杂合子，一条染色体为野生型(WT)，另外一条染色体缺失190bp(KO)。
进一步通过TA克隆检测小鼠基因型：F0代小鼠的鼠尾PCR扩增产物经TA克隆酶连反应(天根生化科技有限公司，DP205)获得含有PCR扩增产物的酶连产物。用DH5α感受态细胞对酶连产物进行转化，将转化菌液涂布于培养皿并置于37℃培养箱培养过夜。挑取培养皿中单克隆菌落进行扩增培养，小提后对其基因型进行Sanger测序鉴定。图3为Macrosialin基因敲除小鼠的基因型，与图2毛细血管电泳结果一致，证实本发明获得了ApoE-/+Macrosialin-/+基因型的F0代小鼠。
S2、将ApoE-/+Macrosialin-/+基因型的F0代小鼠与ApoE-/-基因型的小鼠回交，筛选获得ApoE-/-Macrosialin-/+基因型的F1代小鼠；
S3、将ApoE-/-Macrosialin-/+基因型的F1代小鼠自交，利用基因型鉴定在F2代小鼠中筛选出Macrosialin基因和ApoE基因双敲除的纯合子小鼠(ApoE-/-Macrosialin-/-基因型)，通过高脂饮食诱导，获得AS小鼠模型。保留F2代中得到的纯合子小鼠用于后续繁殖。
实施例2
对实施例1中获得的Macrosialin基因缺失AS小鼠模型(基因型为ApoE-/-Macrosialin-/-)和对照小鼠(基因型为ApoE-/-)进行高脂饲喂12周，每周定时记录体重，结果见图4，横坐标为饲喂时间，纵坐标为体重百分比。数据分析表明，Macrosialin基因缺失AS模型小鼠与对照小鼠相比体重变化无显著差异。
在高脂喂养Macrosialin基因缺失AS小鼠模型(基因型为ApoE-/-Macrosialin-/-)和对照小鼠(基因型为ApoE-/-)12周后，内眦取血，3000rpm离心5min获得小鼠血清，然后使用全自动生化分析仪(ADVIA2400，SIEMENS)对血清总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)血脂四项生化指标进行检测，结果见图5，横坐标为检测指标，纵坐标为浓度(单位mmol/L)。经统计分析数据表明，Macrosialin基因缺失的AS模型小鼠的血脂生化指标较对照组无统计学差异。
在高脂喂养Macrosialin基因缺失AS小鼠模型(基因型为ApoE-/-Macrosialin-/-)和对照小鼠(基因型为ApoE-/-)12周后，将小鼠以仰卧位展开，并用针固定于泡沫操作台使小鼠身体呈现“大”字，用无菌剪刀剪开胸腔及腹腔，用0.9％生理盐水对心脏进行泵血排空。取出心脏放入4％多聚甲醛过夜保存并使用OCT进行包埋。选取主动脉根部制成10μm冰冻切片，然后对其进行油红O染色。油红O染色液配置方法为：使用的油红O储存液由100mL100％异丙醇与0.5g油红O制成并置于4度冰箱保存。使用前将储存液和蒸馏水以3:2的比例进行稀释配制油红O工作液并进行避光过滤，获得酒红色且无沉淀的油红工作液。如图6的主动脉根部的油红O染色所示，与对照组相比，Macrosialin基因缺失AS模型小鼠的主动脉根部斑块面积(lesion area(％of arotic root))显著减少。以上实验结果说明Macrosialin缺失减轻了AS的病变程度。
在高脂喂养Macrosialin基因缺失AS小鼠模型(基因型为ApoE-/-Macrosialin-/-)和对照小鼠(基因型为ApoE-/-)12周或18周后，去除多余内脏器官，取出整个全主动脉，将主动脉沿中线展开并用4％多聚甲醛固定，油红染色分析结果表明Macrosialin基因缺失AS模型小鼠较对照小鼠全主动脉区域的斑块(plaque area/aorta area)显著减少(见图7)。
综合分析上述实验结果表明，与对照ApoE-/-基因型小鼠相比，Macrosialin基因缺失(基因型为ApoE-/-Macrosialin-/-)将引起动脉粥样斑块显著减少，动脉粥样硬化显著减轻，一方面表明本发明利用CRISPR/Cas9系统对ApoE-/-基因型背景小鼠进行Macrosialin基因敲除并构建的Macrosialin基因缺失动脉粥样硬化模型小鼠是成功的，为AS相关疾病的治疗研究提供了稳定、便捷且高效的模型小鼠，为相关研究节省了经济成本与时间成本，在AS的药物研发和临床科学研究的动物模型方面发挥十分重要的作用；另一方面，反映出Macrosialin基因的表达与AS的发生发展息息相关，该基因有望作为新的药物靶点或者通过开发抑制该基因表达的抑制剂如siRNA等有望预防、改善或治疗AS病症。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种Macrosialin基因缺失动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将ApoE-/-基因型小鼠的Macrosialin基因敲除，获得ApoE-/+Macrosialin-/+基因型的F0代小鼠；
S2、将所述F0代小鼠与所述ApoE-/-基因型小鼠回交，筛选获得ApoE-/-Macrosialin-/+基因型的F1代小鼠；
S3、将所述F1代小鼠自交，筛选获得ApoE-/-Macrosialin-/-基因型的F2代小鼠，通过高脂饮食诱导，获得动脉粥样硬化(AS)小鼠模型；
其中，步骤S1中，所述F0代小鼠的获得具体包括如下步骤：
S11、将所述Macrosialin基因的2号外显子区设计为敲除区域，分别设计并合成靶向2号外显子区上、中和下游的3个sgRNA；
S12、将Cas9 mRNA和3个所述sgRNA注入受精卵细胞中，筛选存活的所述受精卵并移植至假孕雌鼠体内孕育，从出生小鼠中筛选得到ApoE-/+Macrosialin-/+基因型的所述F0代小鼠；其中，所述受精卵由ApoE-/-基因型小鼠精子和C57BL/6小鼠卵细胞体外受精形成。
2.根据权利要求1所述的Macrosialin基因缺失动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤S11中，3个所述sgRNA分别靶向所述Macrosialin基因的2号外显子的95-117bp、157-179bp和271-293bp。
3.根据权利要求2所述的Macrosialin基因缺失动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤S11中，3个所述sgRNA靶向的DNA序列分别如SEQ ID NO.1-3所示。
4.根据权利要求3所述的Macrosialin基因缺失动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤S11中，所述sgRNA通过体外转录技术合成得到，包括以下步骤：设计用于扩增所述sgRNA的引物IVT-1、IVT-2、IVT-3和IVT-4，以pX330质粒为模板，将引物IVT-1、IVT-2和IVT-3分别与引物IVT-4配对，通过PCR反应分别扩增获得对应的DNA产物，以所述DNA产物分别作为模板，经体外转录并纯化获得所述sgRNA；
其中，用于扩增所述sgRNA的引物的DNA序列如SEQ ID NO.4-7所示。
5.根据权利要求1-4任一项所述的Macrosialin基因缺失动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤S12中，所述Cas9 mRNA通过体外转录技术合成得到，包括以下步骤：以线性化pST1374-Cas9质粒为模板，经体外转录并纯化获得所述Cas9 mRNA。
6.根据权利要求1-4任一项所述的Macrosialin基因缺失动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤S12中，每个所述sgRNA和所述Cas9 mRNA以等比例注射进受精卵细胞中。
7.如权利要求1-6任一项所述的Macrosialin基因缺失动脉粥样硬化小鼠模型的构建方法构建得到的动脉粥样硬化小鼠模型在研究Macrosialin基因与动脉粥样硬化疾病相关作用和机制中应用以及在研究动脉粥样硬化发生、发展与动脉粥样硬化药物筛选中的应用。
8.Macrosialin基因作为药物靶标在筛选治疗动脉粥样硬化疾病的药物中的应用。
9.Macrosialin抑制剂在制备治疗动脉粥样硬化疾病药物中的应用。
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