CN117165631B - 一种动脉粥样硬化斑块快速造模基因小鼠的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种动脉粥样硬化斑块快速造模基因小鼠的构建方法。该方法是通过杂交的方法和Cre‑loxP技术获得具有可诱导的胰岛素样生长因子1(Insulin‑likegrowthfactor‑1，IGF1)基因敲除的载脂蛋白E基因(ApoE)敲除小鼠。本发明首次将IGF1基因条件性敲除引入ApoE‑/‑小鼠基因组，结合了两种基因型的特点，方法简单易行，能形成具有大脂质核心、大量的炎症细胞、典型薄纤维帽、血管外向重构等特点的动脉粥样硬化晚期斑块。其成模率高，可重复性好，明显缩短了现有造模时间，为药物研究、器械耗材改进提供良好的动物基础，为探索动脉粥样硬化机制提供了良好平台。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种动脉粥样硬化斑块快速造模基因小鼠的构建方法。
背景技术
目前，我国心血管病死亡是非传染病死亡的首因，心血管病的疾病负担与危害日渐加重，已成为重大的公共卫生问题。导致心血管病死亡的疾病是以动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)为主要病理过程的冠心病，关于动脉粥样硬化的研究，成为近年心血管领域的研究热点。易损斑块破裂是不良心血管事件发生的首要原因，据报道，有超过2/3的急性心梗的发生是源于斑块破裂，但由于动物基因组和人类基因组的差异，以及斑块形成的病理生理过程不同，使目前动物模型易损斑块造模周期长，且与人类易损斑块还有很大差异，因此，建立和人类动脉粥样硬化斑块相似的快速动物模型成为目前亟待解决的难题。
目前用于动脉粥样硬化研究的模型构建主要存在以下几种方式：1、高胆固醇高脂饮食诱导：由于动物与人基因组的不同，即使高胆固醇高脂饮食饲养条件下诱导，鼠、兔等动物仍然不易产生动脉粥样硬化，仅猴子和猪等与人类基因组高度同源的动物能产生类似于人的斑块，但这类动物存在花费贵、饲养时间长、操作难度大等问题，成为研究的主要限制。2、血管机械损伤：通过机械性损伤血管内皮的方式可缩短斑块形成时间，但其造模不稳定，可重复性差，且无法模拟人类斑块形成的整个病理生理过程。3、基因敲除技术：基因敲除技术已广泛用于动脉粥样硬化的研究中，小鼠由于繁殖速度快，饲养时间短，易操作等优势成为基因敲除技术应用最多的动物。
目前广泛应用于动脉粥样硬化研究的基因敲除鼠包括：ApoE-/-小鼠和LDLR-/-小鼠等，正常饮食状态下，ApoE-/-小鼠也能形成动脉粥样硬化斑块，但其周期长，动脉粥样硬化斑块形成缓慢，而高胆固醇高脂饮食饲养的ApoE-/-和LDLR-/-鼠的动脉粥样硬化斑块形成周期缩短至半年内，仍然存在周期长的缺点，且很难观察到人类易损斑块可见的外向重构。基于上述限制，有研究人员利用基因敲除技术构建了ApoE基因敲除犬(公开号为CN106987604A)，该方法优点在于保留疾病原发症状，疾病表型持续时间长，但由于犬饲养时间长，繁殖慢等问题不利于普遍研究。而利用液氮冻伤血管的方法建立的易损斑块模型(公开号为CN101480359A)，不利于研究易损斑块产生的机制和探索干预办法。
综上所述，目前关于动脉粥样易损斑块的研究中，缺乏一种符合人类易损斑块特点的快速动物建模方法。因此，建立和人类动脉粥样硬化斑块相似的快速动物模型成为目前亟待解决的难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种动脉粥样硬化斑块快速造模基因小鼠的构建方法。
本发明的目的是通过以下技术措施来达到的：一种动脉粥样硬化斑块快速造模基因小鼠的构建方法，通过杂交的方法和Cre-loxP重组技术获得具有可诱导的胰岛素样生长因子1(Insulin-likegrowthfactor-1，IGF1)基因条件性敲除的载脂蛋白E基因(ApoE)敲除Cre-loxP小鼠，所述的可诱导的IGF1基因条件性敲除是指小鼠成年后通过腹腔注射他莫昔芬诱导小鼠特异性平滑肌组织IGF1基因敲除。
其中，优选的，所述的组织特异性胰岛素样生长因子1(insulin-likegrowthfactor1，IGF1)基因条件性敲除是指SMMHC-CreERT2IGF1flox。
其中，优选的，所述的构建方法包括以下步骤：
(1)将插入Cre酶特异性识别的loxP位点的IGF1重组基因C57BL/6小鼠与同源ApoE基因敲除小鼠杂交，获得基因型为IGF1flox/-ApoE+/-；雌雄鼠IGF1flox/-ApoE+/-的F1代小鼠自交获得F2代小鼠，F2代小鼠基因型为IGF1flox/floxApoE-/-、IGF1flox/floxApoE+/-、IGF1flox/floxApoE+/+、IGF1flox/-ApoE+/-、IGF1flox/-ApoE-/-、IGF1flox/-ApoE+/+、ApoE+/-、ApoE-/-或ApoE+/+；
(2)将平滑肌特异性表达的SMMHC-CreERT2杂合小鼠(Y染色体携带)与同源ApoE基因敲除小鼠杂交，获得F1’代鼠，F1’代鼠的基因型为SMMHC-CreERT2+/-ApoE+/-(Y染色体携带)或ApoE+/-；选取F1’代SMMHC-CreERT2+/-ApoE+/-雄鼠与ApoE-/-雌鼠杂交，获得F2’代鼠，基因型为SMMHC-CreERT2+/-ApoE-/-、SMMHC-CreERT2+/-ApoE+/-、ApoE+/-或ApoE-/-；
(3)选择步骤(1)中基因型为IGF1flox/floxApoE-/-的F2代雌鼠与步骤(2)中基因型为SMMHC-CreERT2+/-ApoE-/-的F2’代雄鼠杂交，获得F3代小鼠，F3代小鼠基因型为SMMHC-CreERT2 +/-IGF1flox/-ApoE-/-或IGF1flox/-ApoE-/-；
(4)选择F3代鼠中基因型为SMMHC-CreERT2+/-IGF1flox/-ApoE-/-的小鼠，造模前连续腹腔注射诱导剂他莫昔芬10天，然后使用高胆固醇高脂饲料饲养8周即为动脉粥样硬化斑块快速造模基因小鼠。
其中，优选的，所述的高胆固醇高脂饲料的配方为：在小鼠基础饲料中加入猪油25％w/w，酪蛋白26％w/w，胆固醇2％w/w和酒石酸氢胆碱0.22％w/w。
进一步的，本发明还提出了采用由上述方法得到的一种动脉粥样硬化斑块快速造模基因小鼠的构建方法所构建的小鼠在动脉粥样硬化与易损斑块研究中的应用，该研究是以非疾病的治疗为目的。
SMMHC-CreERT2IGF1-loxP是胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor,IGF1)基因的平滑肌组织特异性敲除，IGF1是一种内分泌和自分泌/旁分泌生长因子，通过影响包括巨噬细胞、平滑肌细胞(smooth muscle cell,SMC)、内皮细胞和胶原等多种动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)斑块的构成成分的表型与功能在AS病变进展中起重要作用。IGF-1表达不良可能导致巨噬细胞、SMC和内皮细胞凋亡，胶原分解，纤维帽变薄，脂质核心扩大，AS斑块易损性增加，从而导致斑块易损、斑块破裂和急性冠状动脉事件发生。
申请人前期的研究发现，IGF1水平减低与ST段抬高型心肌梗死斑块破裂和坏死脂质核心增大密切相关，进一步证实了IGF1基因在促进动脉粥样硬化斑块稳定性方面发挥重要作用。因此，IGF1基因的敲除，可通过影响AS斑块内构成影响血管壁结构，促进动脉粥样硬化斑块形成。又由于IGF1基因双敲小鼠(基因型为IGF1-/-)因严重基因缺陷常无法出生或出生后很快死亡，因此，本发明基于杂交和Cre-loxP重组技术构建的IGF1基因可诱导的平滑肌组织条件性敲除小鼠(基因型为SMMHC-CreERT2IGF1flox)，可在小鼠成年后诱导平滑肌组织条件性敲除IGF1基因，从而调控动脉粥样硬化斑块模型的构建。
ApoE是极低密度脂蛋白(VLDL)和高密度脂蛋白(HDL)的组成部分，参与胆固醇的运输，与人的脂蛋白谱相反，小鼠体内HDL较高，而低密度脂蛋白(LDL)含量较低，其胆固醇主要存在于HDL中。敲除ApoE基因后，胆固醇转而主要分布于VLDL中，其携带的大量胆固醇无法被细胞表面脂蛋白受体结合后降解，发生蓄积导致动脉粥样硬化。
既往研究已证实，ApoE敲除小鼠作为一种自发的动脉粥样硬化模型，其与人的动脉粥样硬化进程最为相似，且在高胆固醇高脂饲养后能加速动脉粥样硬化斑块进展。但即使是加速了动脉粥样硬化进展，易损斑块的形成也须在高胆固醇高脂饲养16周以上，故本发明首次基于Cre-loxP重组技术将SMMHC-CreERT2IGF1flox重组基因引入ApoE-/-小鼠基因组，结合了两种基因敲除鼠的特点，成功构建出高胆固醇高脂饲养8周就能快速形成具有大坏死核、多炎症细胞、薄纤维帽、外向重构等人类易损斑块特点的动脉粥样硬化斑块。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
1、按照本发明方法建立的动脉粥样硬化斑块快速造模基因小鼠模型，能形成具有大脂质核心、大量的炎症细胞、典型薄纤维帽、血管外向重构等特点的易损斑块，缩短造模周期，并能更好的模拟人体易损斑块发生的病理生理过程，减少动物实验与人体实际的差距，为药物研究、器械耗材改进提供良好的动物基础，为探索动脉粥样硬化机制提供良好平台，利用这个平台，研究人员能更好地探究易损斑块的特点及其干预方式。
2、本发明方法简单易行，造模周期短，按照本发明方法建立的动脉粥样硬化斑块快速造模基因小鼠模型是以C57BL/6鼠为背景的基因敲除鼠，具有高重复性、易于繁殖等优点，为动脉粥样硬化易损斑块的研究提供了良好的动物基础。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。
附图说明
附图1为构建动脉粥样硬化斑块快速造模基因小鼠模式图。
附图2为Cre-loxP重组技术构建平滑肌组织特异性IGF1基因重组小鼠过程模式图。
附图3为构建基因型SMMHC-CreERT2+/-IGF1flox/-ApoE-/-鼠验证结果图。
附图4为模型小鼠与对照组小鼠高胆固醇高脂饲养后主动脉大体油红O染色图。
附图5为模型小鼠与对照小鼠高胆固醇高脂饲养后主动脉窦冰冻切片HE染色图。
附图6为模型小鼠与对照组小鼠高胆固醇高脂饲养后主动脉根部油红O染色图。
附图7为模型小鼠与对照组小鼠高胆固醇高脂饲养后的测量参数表。
具体实施方式
实施例：如附图1至7所示，动脉粥样硬化斑块快速造模基因小鼠的构建模式图如图1所示。
将基因型为IGF1基因插入Cre重组酶的特异识别的loxP位点的小鼠(基因型：IGF1flox/flox，定购自苏州赛业生物科技有限公司)与ApoE基因敲除小鼠(基因型：ApoE-/-，购买自苏州赛业生物科技有限公司)杂交获得F1鼠，基因型为IGF1flox/-ApoE+/-。将IGF1flox/-ApoE+/-的F1代鼠自交获得F2代小鼠，F2代小鼠基因型为IGF1flox/floxApoE-/-、IGF1flox/ floxApoE+/-、IGF1flox/flox ApoE+/+、IGF1flox/-ApoE+/-、IGF1flox/-ApoE-/-、IGF1flox/-ApoE+/+、ApoE+/-、ApoE-/-或ApoE+/+；取F2代小鼠尾部组织提取DNA进行基因鉴定。(鼠尾基因型鉴定试剂盒为：鼠尾基因型快速鉴定试剂盒：碧云天D7283M)。
鉴定IGF1-loxP基因型：将鼠尾DNA进行PCR扩增，PCR体系为：2xTaqPCRMasterMix:12.5μL，引物(使用F1/R1进行纯杂合验证，确认小鼠的基因型是flox/-、flox/flox还是野生型)各10μM(1μL)，基因组DNA100ng，加ddH2O至25μL，反应条件：94℃3min、94℃30sec、55℃30sec、72℃1min、72℃5min，循环数为35，鉴定引物(5’-3’)为：
CKO-F1：5’-TGATTGGAAAGATCCAGTGTCCC-3’
CKO-R1：5’-GCCCAGTCCTATCACCTTTCTTTT-3’
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，鉴定结果见图3，纯合子(flox/flox)只有单一的339bp条带，杂合子(flox/-)有339bp和271bp两个条带，野生型只有单一的271bp。
鉴定ApoE基因型：将鼠尾DNA进行PCR扩增，PCR体系为：2xTaqPCRMasterMix:12.5μL，引物(ApoE-c共用引物、ApoE-m突变引物、ApoE-w野生型引物)各10μM(1μL)，基因组DNA100ng，加ddH2O至25μL，反应条件：94℃3min、94℃30sec、55℃30sec、72℃1min、72℃5min，循环数为35，鉴定引物(5’-3’)为：ApoE-c:5’-GCCTAGCCGAGGGAGAGCCG-3’
ApoE-w:5’-TGTGACTTGGGAGCTCTGCAGC-3’
ApoE-m:5’-GCCGCCCCGACTGCATCT-3’
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，鉴定结果如图3，ApoE-/-纯合小鼠可扩增出单一的长度为245bp条带，正常野生型鼠可扩增出单一的长度为155bp条带，杂合型可同时扩增出245bp和155bp条带。
将平滑肌特异性表达的SMMHC-CreERT2杂合小鼠(Y染色体携带)与ApoE基因敲除纯合小鼠(ApoE-/-)杂交，获得F1’代鼠，F1’代鼠的基因型为SMMHC-CreERT2+/-ApoE+/-(Y染色体携带)或ApoE+/-；选取F1’代SMMHC-CreERT2+/-ApoE+/-雄鼠与ApoE-/-雌鼠杂交，获得F2’代鼠，基因型为SMMHC-CreERT2+/-ApoE-/-、SMMHC-CreERT2+/-ApoE+/-、ApoE+/-或ApoE-/-(鼠尾基因型鉴定试剂盒同前)。
鉴定SMMHC-CreERT2基因型：将鼠尾DNA进行PCR扩增，PCR体系为：2xTaqPCRMasterMix:12.5μL，引物(使用F1/R1进行验证，确认小鼠的基因型是SMMHC-CreERT2+/-还是SMMHC-CreERT2-/-)各10μM(1μL)，基因组DNA100ng，加ddH2O至25μL，反应条件：94℃3min、94℃30sec、55℃30sec、72℃1min、72℃5min，循环数为35，鉴定引物(5’-3’)为：
SMC-F1:5’-GGAGAGGTGAGGGCCTACTTGTC-3’
SMC-R1:5’-TGTTGTTCAGCTTGCACCAGGC-3’
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，鉴定结果见图3，Y染色体打靶，理论只有雄鼠有单一的280bp阳性条带。
选择基因型为IGF1flox/floxApoE-/-的F2代雌鼠与SMMHC-CreERT2+/-ApoE-/-的F2’代雄鼠杂交，获得F3代，F3代基因型为SMMHC-CreERT2+/-IGF1flox/-ApoE-/-或IGF1flox/-ApoE-/-，提取F3代鼠尾部DNA，分别鉴定SMMHC-CreERT2、IGF1-loxP和ApoE基因型，(鼠尾基因型鉴定试剂盒同前)。
鉴定ApoE基因型同前所述。
选上述F3代小鼠中基因型为SMMHC-CreERT2+/-IGF1flox/-ApoE-/-的小鼠为理想的易损斑块模型。将8周龄模型组小鼠SMMHC-CreERT2+/-IGF1flox/-ApoE-/-诱导IGF1敲除后高胆固醇高脂饲养8周和8周龄对照组ApoE-/-小鼠经高胆固醇高脂饲料饲养(western-typediet,WD)16周后，取其心脏，液氮速冻，OCT包埋后冰冻切片，冷丙酮固定，分别行HE染色和油红O染色，并用ImageJ数据进行分析，统计斑块、血管面积、脂质坏死核心与纤维帽厚度，组间比较无统计学差异，结果见图4、图5、图7。
纯化高胆固醇高脂饲料配方：在小鼠基础饲料中加入猪油25％w/w，酪蛋白26％w/w，胆固醇2％w/w和酒石酸氢胆碱0.22％w/w；购买自江苏省协同医药生物工程有限责任公司，XT108C(2％胆固醇)。
主动脉大体油红O染色，取材后4％多聚甲醛固定24小时，剪开血管，PBS洗3次，每次5min，油红O染色15min，75％酒精洗至正常组织变白，固定拍照，大体染色可见，高胆固醇高脂饲养8周的快速造模组SMMHC-CreERT2+/-IGF1flox/-ApoE-/-小鼠形成动脉粥样硬化程度与高胆固醇高脂饲养16周的对照组ApoE-/-小鼠相比无显著差异，见图4。
高胆固醇高脂饲养8周的SMMHC-CreERT2+/-IGF1flox/-ApoE-/-组小鼠出现血管外向重构，管腔面积增大，坏死核心变大，纤维帽变薄，并可见大量炎性细胞浸润，呈易损斑块特征(见图5)，与高胆固醇高脂饲养16周的ApoE-/-小鼠相比无显著差异。
需要特别说明的是：
图3中A图为不同基因重组小鼠基因电泳鉴定结果图，图3中B图为SMMHC-CreERT2+/-IGF1flox/-ApoE-/-小鼠基因电泳验证结果图。
图4中A图为高胆固醇高脂饲养8周SMMHC-CreERT2+/-IGF1flox/-ApoE-/-小鼠主动脉，图4中B图为高胆固醇高脂饲养16周ApoE-/-小鼠主动脉。
图5中A图为SMMHC-CreERT2+/-IGF1flox/-ApoE-/-小鼠高胆固醇高脂饲养8周后HE染色图；图5中B图为ApoE-/-小鼠高胆固醇高脂饲养16周后HE染色图；图5中C图、图5中D图分别为图5中A图、图5中B图方框部分的放大图。其中，C：坏死核；P：斑块；L：血管腔；箭头所指为最薄纤维帽处。
图6中A为高胆固醇高脂饲养8周SMMHC-CreERT2+/-IGF1flox/-ApoE-/-小鼠主动脉，图6中B为高胆固醇高脂饲养16周ApoE-/-小鼠主动脉。其中，C：坏死核；P：斑块；L：血管腔。
结论：通过本发明方法建立的动脉粥样硬化斑块快速造模基因小鼠能快速形成具有大脂质核心、大量的炎症细胞、典型薄纤维帽、血管外向重构等特点的易损斑块，为探索动脉粥样硬化机制提供良好平台，利用这个平台，研究人员能更好地探究易损斑块的特点及其干预方式。
Claims (3)
1.一种动脉粥样硬化易损斑块快速造模基因小鼠的构建方法，其特征在于：通过杂交的方法和Cre-loxP重组技术获得具有可诱导的胰岛素样生长因子1基因(IGF1)条件性敲除的载脂蛋白E基因(ApoE)敲除Cre-loxP小鼠，所述的可诱导的IGF1基因条件性敲除是指实验前通过腹腔注射他莫昔芬诱导实验鼠特异性平滑肌组织IGF1基因敲除；
包括以下步骤：
(1)将携带IGF1-loxP重组基因C57BL/6鼠与同源ApoE基因敲除鼠杂交，获得基因型为IGF1 flox/- ApoE +/-的F1代鼠，IGF1 flox/- ApoE +/-的F1代鼠自交获得F2代鼠，F2代鼠基因型为IGF1 flox/flox ApoE -/-、IGF1 flox/flox ApoE +/-、IGF1 flox/flox ApoE +/+、IGF1 flox/- ApoE +/-、IGF1 flox/- ApoE -/-、IGF1 flox/- ApoE +/+、ApoE +/-、ApoE -/-或ApoE +/+；
(2)将同源的平滑肌特异性表达的SMMHC-CreERT2杂合小鼠与载脂蛋白ApoE基因敲除小鼠杂交，获得F1’代鼠，F1’代鼠的基因型为SMMHC-CreERT2+/- ApoE +/-或ApoE +/-；选取F1’代SMMHC-CreERT2+/- ApoE +/-雄鼠与ApoE -/-雌鼠杂交，获得F2’代鼠，基因型为SMMHC-CreERT2+/- ApoE -/-、SMMHC-CreERT2+/- ApoE +/-、ApoE +/-或ApoE -/-；
还包括以下步骤：
(3)选择步骤(1)中基因型为IGF1 flox/flox ApoE -/-的F2代雌鼠与步骤(2)中基因型为SMMHC-CreERT2+/- ApoE -/-的F2’代雄鼠杂交，获得F3代小鼠，F3代小鼠基因型为SMMHC-CreERT2 +/- IGF1 flox/- ApoE -/-或IGF1 flox/- ApoE -/-；
(4)选择F3代鼠中基因型为SMMHC-CreERT2+/- IGF1 flox/- ApoE -/-的雄性小鼠，造模前连续腹腔注射诱导剂他莫昔芬10天，然后使用高胆固醇高脂饲料饲养8周即为动脉粥样硬化易损斑块快速造模基因小鼠。
2.根据权利要求1所述的一种动脉粥样硬化易损斑块快速造模基因小鼠的构建方法，其特征在于：所述的高胆固醇高脂饲料的配方为：在小鼠基础饲料中加入猪油25％w/w，酪蛋白26％w/w，胆固醇2％w/w和酒石酸氢胆碱0.22％w/w。
3.权利要求1或2所述的一种动脉粥样硬化易损斑块快速造模基因小鼠的构建方法在制备研究动脉粥样硬化与易损斑块的模型中的应用。
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