CN116785436A - Ttk基因及ttk的抑制剂在治疗动脉粥样硬化中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药领域，提供了一种TTK基因及TTK的抑制剂在治疗动脉粥样硬化中的应用。本发明以APOE‑/‑TTKWT小鼠及APOE‑/‑TTKKO小鼠为实验对象，通过高脂饮食诱导获得动脉粥样硬化模型，结果表明与APOE‑/‑TTKWT小鼠对比，TTK基因缺失的APOE‑/‑TTKKO小鼠主动脉的斑块面积显著减少。这表明TTK具有促进主动脉斑块形成，促进动脉粥样硬化的作用。针对TTK的上述功能，本发明提出了TTK可作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物中的应用以及TTK的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。本发明的提出为预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化提供了新的靶点和药物，对阐明动脉粥样硬化发生发展过程中的分子机制，寻找动脉粥样硬化治疗的分子靶点具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，涉及TTK基因在治疗动脉粥样硬化中的应用，具体是TTK基因作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物中的应用，及TTK的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。
背景技术
心脑血管疾病是一类由于动脉粥样硬化、高血压等众多因素导致的全身性或系统性血管病变，具有高发病率、高致死率。动脉粥样硬化(Atherosclerosis)是心脑血管疾病的主要病理基础，主要为动脉血管壁内脂质沉积，形成动脉粥样硬化斑块并不断扩大，动脉管壁增厚、变硬、管腔狭窄。动脉粥样硬化不稳定斑块破裂、血小板聚集及血栓形成可引发心肌梗死、卒中等急性致死心脑血管事件发生。
动脉粥样硬化斑块形成是一个复杂的慢性过程，包括ox-LDL等各种有害因素导致血管内膜受损，单核细胞浸润到血管内膜下转化为巨噬细胞，巨噬细胞和血管中膜平滑肌细胞均参与脂质的吞噬，大量的脂质在细胞内积累形成泡沫细胞，后者组成斑块的脂质核心。泡沫细胞累积导致脂质核心扩大，动脉粥样硬化斑块进展。降脂治疗是目前最主要的治疗措施，但是真实世界研究发现在血脂控制达标的患者中，仍有47.5％的颈动脉斑块会持续进展，因此亟需更有效的治疗靶点。
TTK基因位于6q13-q21染色体上，编码丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸蛋白激酶(threonine and tyrosine kinase,TTK)，也称为单极纺锤体1(Monopolar Spindle 1，Mps1),目前被认定为一种双特异性激酶。TTK是构成纺锤体组装检查点(Spindle assemblycheckpoint，SAC)的重要组成成分，已经发现TTK水平的升高与肿瘤的发生和不良预后密切相关，TTK已成为抗癌治疗的重要候选靶点。但关于TTK基因在动脉粥样硬化中的作用尚未见报道。
发明内容
为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于确定TTK基因及TTK的抑制剂与动脉粥样硬化的关系，并提供一种TTK基因及TTK的抑制剂在用于预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化中的新用途。
为了达到上述目的，本发明提供了以下技术方案；
本发明首先确定了TTK基因与动脉粥样硬化关系，具体如下：本发明以APOE-/-TTKWT基因敲除小鼠与APOE-/-TTKKO双基因敲除小鼠为实验对象，通过高脂饲料饮食诱导获得动脉粥样硬化小鼠模型，对主动脉树以及主动脉根部斑块面积研究，结果表明TTK基因敲除能够显著降低主动脉树以及主动脉根部斑块的面积。
由以上结果可知发生动脉粥样硬化时，TTK基因敲除显著减少了动脉粥样硬化的斑块面积，因此TTK具有促进动脉粥样硬化发生发展的作用，为研究防治动脉粥样硬化的新靶点和新策略提供了理论依据和临床基础。
本发明还研究了TTK抑制剂与动脉粥样硬化的关系，具体如下：本发明还以APOE-/-基因敲除小鼠为实验对象，通过高脂饲料饮食诱导获得动脉粥样硬化小鼠模型，分别给予对照载体和TTK抑制剂干预后，对主动脉树斑块面积研究，结果表明TTK抑制剂能够显著降低主动脉树斑块的面积。
由以上结果可知发生动脉粥样硬化时，TTK抑制剂显著减少动脉粥样硬化的斑块面积，缓解动脉粥样硬化。因此TTK抑制剂具有预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的作用，为研究制备预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物提供了理论依据和临床基础。
因此，构建TTK基因过表达的体外细胞模型或动物模型，可用于筛选预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物；TTK基因也可作为基因治疗中的靶基因，设计并制备预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物和/或生物学试剂，通过基因工程技术达到预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的目的。例如以TTK为靶基因，设计可干扰TTK表达的双链siRNA，通过化学方法合成以后，注射入人体通过RNA干扰的方法使TTK基因沉默来治疗动脉粥样硬化；此外，还可以以TTK为靶点设计小分子化合物抑制剂，通过筛选发现其中能够特异性抑制TTK的分子，从而为动脉粥样硬化的治疗提供新的治疗性分子。
针对TTK的上述功能，本发明提出了一种以TTK基因作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。
进一步的：所述预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物为抑制TTK基因表达的药物。
本发明较优的技术方案：所述预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物包括TTK的抑制剂。
本发明较优的技术方案：所述所述的TTK的抑制剂为TTK基因的siRNA、TTK基因的RNA干扰载体或其他能够抑制TTK基因表达或活性的抑制剂中的一种。
针对TTK的抑制剂的上述功能，本发明还提供了一种TTK的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。
本发明较优的技术方案：所述TTK的抑制剂直接作为预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物。
本发明较优的技术方案：所述的TTK的抑制剂为TTK基因的siRNA、TTK基因的RNA干扰载体或其他能够抑制TTK基因表达或活性的抑制剂中的一种。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明发现TTK基因的新功能，即TTK基因具有促进动脉粥样硬化的作用。
(2)基于TTK在促进动脉粥样硬化的功能，为研制预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物提供靶标。
(3)本发明研究出TTK的抑制剂可作为用于制备预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物。
附图说明
图1是实施例1中APOE-/-TTKWT小鼠及APOE-/-TTKKO小鼠的主动脉树油红O染色图；
图2是实施例1中APOE-/-TTKWT小鼠及APOE-/-TTKKO小鼠的主动脉树斑块面积统计图；
图3是实施例2中APOE-/-TTKWT小鼠及APOE-/-TTKKO小鼠的主动脉根部HE和油红O染色图；
图4是实施例2中APOE-/-TTKWT小鼠及APOE-/-TTKKO小鼠的主动脉根部斑块面积统计图；
图5是实施例3中APOE-/-TTKWT小鼠及APOE-/-TTKKO小鼠的血脂检测统计图；其中图A、B、C、D分别是总胆固醇(Total cholesterol)、甘油三酯(Tirglycerides)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)的含量对比图；
图6是实施例4中分别给予对照载体和BAY 1217389处理的小鼠的主动脉树油红O染色图；
图7是实施例4中分别给予对照载体和BAY 1217389处理的小鼠的主动脉树
斑块面积统计图；
图8是实施例5中分别给予对照载体和BAY 1217389处理的小鼠的血脂检测统计图，其中图A、B、C、D分别表示总胆固醇(Total cholesterol)、甘油三酯(Tirglycerides)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)的含量对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
下列实施例中所使用的术语，无特殊说明，与本领域技术人员通常理解的含义相同。未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的常规方案或制造商建议的方案完成。无特殊说明的试剂与材料，均可于市面上购买。
以下实施例中实验用动物及饲养:APOE-/-小鼠购自Jackson lab；TTKf/f小鼠购自江苏集萃药康生物科技有限公司；UbcCreERT2小鼠购自Jackson lab；TTK诱导型全身敲除小鼠(TTKf/f；UbcCreERT2简称为TTKKO)由TTKf/f小鼠和UbcCreERT2小鼠杂交获得；APOE-/-TTKWT小鼠由APOE-/-小鼠与TTKf/f小鼠杂交获得；APOE-/-TTKKO双敲除小鼠由APOE-/-小鼠与TTKKO小鼠杂交获得。
实验动物饲料配方：高脂饲料(HFD，购自北京华阜康生物科技有限公司，按AIN-76A Western diets配方，热量百分比:蛋白质15.8％、脂肪40％、碳水化合物44.2％)。
动物果冻给药：将Splenda粉末加入双蒸水后搅拌均匀，配制20％
(wt/vol)的Splenda溶液；将明胶加入配置的Splenda溶液配制14％(wt/vol)的明胶储备液，搅拌并加热至55-60℃可见溶液变澄清。在果冻模具中每孔加入计算好的药物溶液剂量(1mg/kg)和明胶储备液，体积共200μl，充分混匀，于-20℃下放置3小时左右使其凝固形成果冻。在每周的第1天和第2天分别给予小鼠对照果冻和TTK抑制剂药物果冻，保持小鼠尽可能不受干扰，等待小鼠吃完果冻，每天两次；采用间歇给药的方式，每周给药两天后休息五天，共持续四周。
动物饲养条件:所有实验小鼠均饲养在华中科技大学同济医学院SPF级动物房。每12小时交替照明，温度24±2℃，湿度40％-70％，小鼠自由饮水进食。
油红O染液：使用100mL 100％异丙醇溶解0.5g油红O制成油红O储夜并置于4℃冰箱保存，使用前将储夜和蒸馏水按照3:2进行稀释配制成油红O工作液并进行过滤，油红O工作液正常情况下呈现酒红色且无沉淀。
小鼠动脉粥样硬化模型(AS)获得：
实验动物分组：选用8周龄，体重19-25g，雄性，APOE-/-TTKWT小鼠和APOE-/-TTKKO小鼠，给予高脂饲料(HFD)饲养，APOE-/-TTKWT小鼠组，APOE-/-TTKKO小鼠组共两个组别。
实施例1：
将8周龄，体重19-25g的雄性APOE-/-TTKWT小鼠和APOE-/-TTKKO小鼠，给予高脂饲料(HFD)饲养16周后安乐死并收集标本，从根部到髂总动脉分叉处将主动脉取下，分离外膜和脂肪，使用4％多聚甲醛固定过夜然后进行油红O染色，染色结果如图1所示，图1中主动脉树的油红染色图中主动脉弓是动脉粥样硬化斑块最明显的部位；并对2组小鼠主动脉树区域斑块面积进行统计，统计结果如图2所示。通过图1和图2可以看出，TTK缺失的动脉粥样硬化模型(APOE-/-TTKKO)小鼠较对照(APOE-/-TTKWT)小鼠主动脉树区域的斑块面积明显减少。
实施例2
将8周龄，体重19-25g的雄性APOE-/-TTKWT小鼠和APOE-/-TTKKO小鼠，给予高脂饲料(HFD)饲养16周后安乐死并收集标本，将其心脏组织使用4％多聚甲醛固定过夜并使用OCT进行包埋，将主动脉根部制成10μm冰冻切片，然后进行油红O染色和油红-苏木精(HE)染色，染色结果如图3所示，并对2组小鼠主动脉根部斑块面积进行统计，统计结果如图4所示。通过如图3和图4可以看出TTK缺失的动脉粥样硬化模型(APOE-/-TTKKO)小鼠较对照(APOE-/-TTKWT)小鼠主动脉根部斑块面积明显减少。
实施例3
将8周龄，体重19-25g的雄性APOE-/-TTKWT小鼠和APOE-/-TTKKO小鼠，给予高脂饲料(HFD)饲养16周后安乐死并收集小鼠血样(采血前禁水禁食12h)，常温静置30min后，3000rpm/min离心15min，留取上层血清。分别使用总胆固醇测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，A111-1-1)、甘油三酯测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，A110-1-1)、低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，A113-1-1)和高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，A112-1-1)按照说明书通过微孔板分光光度计测定上述各组小鼠血清中总胆固醇(Total cholesterol)、甘油三酯(Tirglycerides)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)以及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)的含量，并对数据进行统计分析。结果如图5所示，图5中A、B、C、D分别是总胆固醇(Total cholesterol)、甘油三酯(Tirglycerides)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)的含量对比图，通过图5可以看出TTK缺失的动脉粥样硬化模型(APOE-/-TTKKO)小鼠与对照(APOE-/-TTKWT)小鼠相比血脂无显著差异。
实施例4
将8周龄，体重19-25g的雄性APOE-/-小鼠给予高脂饲料(HFD)饲养16周，形成动脉粥样硬化斑块后随机分成2组并继续给予高脂饮食，即对照载体组(Vehicle)和TTK抑制剂组(抑制剂选用BAY 1217389)，4周后安乐死并收集标本。从根部到髂总动脉分叉处将主动脉取下，分离外膜和脂肪，使用4％多聚甲醛固定过夜然后进行油红O染色，染色结果如图6所示；并对2组小鼠主动脉树区域斑块面积进行统计，统计结果如图7所示。通过图6和图7可以看出TTK抑制剂组(BAY 1217389)动脉粥样硬化模型小鼠较载体组(Vehicle)小鼠主动脉树区域的斑块面积明显减少。
实施例5
将8周龄，体重19-25g的雄性APOE-/-小鼠给予高脂饲料(HFD)饲养16周，形成动脉粥样硬化斑块后随机分成2组并继续给予高脂饮食，即对照载体组(Vehicle)和TTK抑制剂组(抑制剂选用BAY 1217389)，4周后安乐死并收集小鼠血样(采血前禁水禁食12h)，常温静置30min后，3000rpm/min离心15min，留取上层血清。使用上述试剂盒按照说明书通过微孔板分光光度计分别测定上述各组小鼠血清中总胆固醇(Total cholesterol)、甘油三酯(Tirglycerides)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)以及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)的含量，并对数据进行统计分析。结果图8所示，图8中A、B、C、D分别是总胆固醇(Totalcholesterol)、甘油三酯(Tirglycerides)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)的含量对比结果，通过图8可以看出TTK抑制剂组(BAY 1217389)动脉粥样硬化模型小鼠与载体组(Vehicle)小鼠相比血脂无显著差异。
上述实施例结果表明，TTK可显著促进主动脉斑块的形成和动脉粥样硬化的发生发展。对TTK基因进行敲除或者使用其抑制剂可减轻动脉粥样硬化病变程度，因此可用于制备预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化疾病的药物。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制。本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可以做出对于以上实施例的各种变型，包括改变、修饰、替代、组合、简化等，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。
Claims (7)
1.一种TTK基因在治疗动脉粥样硬化中的应用，其特征在于：以TTK基因作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物中的应用；所述的应用是非诊断和非治疗的目的。
2.根据权利要求1所述的一种TTK基因在治疗动脉粥样硬化中的应用，其特征在于：所述预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物为抑制TTK基因表达的药物。
3.根据权利要求1所述的一种TTK基因在治疗动脉粥样硬化中的应用，其特征在于：所述预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物包括TTK的抑制剂。
4.根据权利要求3所述的一种TTK基因在治疗动脉粥样硬化中的应用，其特征在于：所述的TTK的抑制剂为TTK基因的siRNA、TTK基因的RNA干扰载体或其他能够抑制TTK基因的表达或TTK活性的抑制剂中的一种。
5.一种TTK的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的一种TTK的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物中的应用，其特征在于：所述TTK的抑制剂直接作为预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物。
7.根据权利要求5或6所述的一种TTK的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗动脉粥样硬化的药物中的应用，其特征在于：所述的TTK的抑制剂为TTK基因的siRNA、TTK基因的RNA干扰载体或其他能够抑制TTK基因表达或TTK活性的抑制剂中的一种。
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