CN100393320C - 治疗肌肉萎缩的寡核苷酸药物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及治疗肌肉萎缩的寡核苷酸药物。所述寡核苷酸含有7~75个核苷酸;含有通过非手性5′到3′磷酸核苷间键连接的7~75个邻接的核糖基团;互补于与肌肉萎缩病相关靶基因的5′端非翻译区、翻译起始区、3′端非翻译区和翻译终止区;具有75℃~115℃的熔解温度(Tm,1毫摩尔浓度)。所述的寡核苷酸包括核糖寡核苷酸和脱氧核糖寡核苷酸,并可经化学修饰。本发明优选的寡核苷酸是反义寡核苷酸,也可以是干扰RNA(RNAi)、核酶和脱氧核酶。本发明的寡核苷酸可用于制备治疗动物或人肌肉萎缩药物或营养补剂。
Description
技术领域:
本发明涉及治疗肌肉萎缩或增强肌肉生长的寡核苷酸,本发明还涉及含此寡核苷酸的组合物以及用途。
背景技术:
增强肌肉生长是临床上和农牧业中需要解决的课题。
肌肉萎缩及相关的肌体异常包括肌营养不良、脊髓损伤、神经变性疾病、肌缺乏、恶病质、肌萎缩和糖尿病。这些疾病的通常症状是肌肉减少并伴随着肌无力,严重的将导致残废和死亡。
在农牧业生产中,例如在食用动物的饲养,人们总是希望能增加肌肉的比例成分。
但目前尚无有效的治疗肌肉萎缩或增强肌肉生长的方法。
发明内容:
本发明的目的是提供一类有效的治疗肌肉萎缩或增强肌肉生长的药物或方法。
尽管引起肌肉萎缩的起源是多因素的,但通常是由多种不同基因表达异常所造成。很显然,通过对在此类疾病中异常表达基因的调节,可以达到治疗的目的。
本发明发现某些寡核苷酸具有治疗肌肉萎缩或增强肌肉生长的作用。
所述寡核苷酸的特征是:
(1)含有7~75个核苷酸;
(2)含有通过非手性5′到3′磷酸核苷间键连接的7~75个邻接的核糖基团;
(3)互补于与肌肉萎缩病相关靶基因的5′端非翻译区、翻译起始区、3′端非翻译区和翻译终止区;
(4)具有75℃~115℃的熔解温度(Tm,1毫摩尔浓度)
当本发明所述寡核苷酸用作治疗肌肉萎缩或增强肌肉生长时,可使用一种,也可使用二种或更多种。当使用二种寡核苷酸时,这二种寡核苷酸将各自与相同或不同的肌肉萎缩病相关基因的一段区域互补。
当使用二种寡核苷酸时,第一种寡核苷酸与某一组基因中的第一个基因的5′非翻译区、翻译起始位点、3′非翻译区或翻译终止位点的区域互补,第二种寡核苷酸与同一组或另一组基因中的第二个基因的5′非翻译区、翻译起始位点、3′非翻译区或翻译终止位点的区域互补。
优选地,上述寡核苷酸由10~26个核苷酸组成,具有40℃~85℃的熔解温度(Tm,1微微摩尔浓度)。
所述寡核苷酸还可经化学修饰,成为在糖基2′位上带有取代基团的修饰性寡核苷酸,也具有较好的治疗肌肉萎缩或增强肌肉生长的作用,这些基团包括氧、甲氧基、丙氧基、甲氧-乙氧基、氟、氯、溴、碘。
在一些实例中,修饰性寡核苷酸在3′端或5′带有保护基团。
所述修饰的寡核苷酸还可以是3′末端封闭和/或5′末端封闭的。
本发明所述的寡核苷酸包括核糖寡核苷酸和脱氧核糖寡核苷酸。所述修饰的寡核苷酸的序列选自SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:191。
本发明所述的寡核苷酸是反义寡核苷酸,包括靶向人基因的反义寡核苷酸、靶向动物基因的反义寡核苷酸、针对人肌生长抑制素的代表性反义寡核苷酸。代表性的反义寡核苷酸的序列见表3、表4和表5。
本发明所述的寡核苷酸还可以是可调节肌生长抑制素和其受体表达的干扰RNA(RNAi)。这些干扰RNA为21~25核苷酸组成的双链RNA,在每条链的3′端有2个突出的核苷酸;双链的G+C含量为30~52%;在正义链上的15至19位置上为A/U配对;无分子内重复序列。
本发明所述的寡核苷酸还可以是核酶。
本发明所述的寡核苷酸还可以是可调节肌生长抑制素和其受体表达的脱氧核酶。该脱氧核酶含序列为GGCTAGCTAACGA的催化功能区,可特异性地切割存在于肌生长抑制素和其受体基因mRNA中的嘌呤和嘧啶之间连接键。脱氧核酶与靶基因mRNA的结合是通过两个存在于切割位点5′端和3′端的互补序列与mRNA杂交完成。
用本发明所述的寡核苷酸作为活性物质可以制备多种治疗肌肉萎缩或增强肌肉生长的药物组合物,适用于动物和人。所述的动物包括哺乳动物,如人、马、牛等和非哺乳动物,如鸡等。所述药物组合物中可以含有各种药学上可接受的赋形剂、辅剂。所述药物组合物中,可以含有一种或几种所述寡核苷酸。比如,可含二种、三种、四种、五种或五种以上的修饰性寡核苷酸。
在有些实例中,本发明提供一种含二种或二种以上调节肌生长抑制素和其受体基因表达的寡核苷酸,其中至少有一个寡核苷酸的靶基因是肌生长抑制素基因,至少有一个寡核苷酸的靶基因不是肌生长抑制素基因。
在另一些实例中,药物组合物可含有一种或多种从一组反义寡核苷酸、干扰RNA、核酶或脱氧核酶所选出的物质。
本发明所指的非肌生长抑制素基因包括:但不限于Activin A受体IIB,Tolloidmetalloproteinase,NF-kappaB,TNF-alpha,MuRF1,Caspase-3,Atrogin-1,RAS,P38MAPK,MKK3,MKK6,JNK,c-myc,c-j un,ASK-1,TAK-1 Smad,Cyclin-dependent Kinase inhibitorp21,Gadd45,IL-6和PIF(见表1和表2)。在有些实例中,药物组合物所含的反义寡核苷酸可从表3、4、5中靶向肌生长抑制素基因的寡核苷酸中选出,所含的靶向非肌生长抑制素基因的寡核苷酸可从表3和4中选出。
本发明还提供了在肌生长抑制素基因表达的细胞内,用本发明的寡核苷酸调节肌生长抑制素表达的方法。在另一些实例中,这些调节肌生长抑制素表达的分子可以是反义寡核苷酸、干扰RNA、核酶、脱氧核酶。
本发明还提供了肌生长抑制素基因和非肌生长抑制素基因表达的细胞内,用本发明的反义寡核苷酸、干扰RNA、核酶或脱氧核酶,混合使用调节靶基因的表达。
本发明的寡核苷酸,即包括上述反义寡核苷酸、干扰RNA、核酶、脱氧核酶,可用于治疗人肌肉萎缩病,也可用于食用性动物饲养中增加肌肉的比例与重量。
上述反义寡核苷酸、干扰RNA、核酶、脱氧核酶在药物组合物中可以使用一种,也可以几种同时混合使用。
本发明提供的寡核苷酸对于动物或人的给药剂量为:每公斤体重0.01~100mg。
发明的详细描述
本发明涉及可用于调节与肌萎缩或疾病相关基因的表达的寡核苷酸及其药物组合物,以及用此寡核苷酸促进动物肌肉生长的方法。因此,发明所提供的药物既可用于治疗肌萎缩、异常脂肪积累等疾病,又可用于增强动物肌肉生长,例如畜牧动物。
本发明的药物组合物,方法是利用基因调控寡核苷酸来调节靶基因表达,这些基因调控寡核苷酸(或称为调控分子)包括反义寡核苷酸、干扰RNA(RNAi)、核酶、脱氧核酶。调控的方式可以是用一种调控分子去控制一种涉及肌肉生长发育的基因,例如,肌生长抑制素基因。调控还可以采用多种组合的方式,例如,采用不同类型调控分子的组合;针对同一基因,但不同位点的多种调节分子组合;针对不同基因的多种调节分子组合及上述各种组合方式形成的新的组合。
本发明的修饰性寡核苷酸具有特定的结构和物理化学特性,例如,末端保护,质子化处理,抗酸性,抗核酸酶,含非手性磷酸酯键,修饰性核糖和脱氧核糖取代基。
本发明提供了调节动物和人细胞内基因表达的方法和使用本发明的药物组合物治疗肌肉萎缩病的方法。所述肌肉萎缩病包括肌营养不良、脊髓损伤、神经变性疾病、厌食症、肌缺乏、恶质病、肌萎缩、二型糖尿病、X综合症等。在正常动物中应用本发明药物组合物可增加肌肉的重量和比例。
本发明提供的修饰性寡核苷酸的作用是调节其靶基因的表达。这种调节既可以是抑制,也可以是促进,或者发生其他变化,例如,形成改变的基因产物。抑制是指与野生型相比,该基因表达降低了1%~99%。促进是指与野生型相比,该基因表达增加了1%~99%。
本发明的药物组合物中含有一种或多种能够调节与肌萎缩或肌生长相关基因的寡核苷酸。这些寡核苷酸包括反义寡核苷酸、干扰RNA、核酶、脱氧核酶。寡核苷酸的靶位点可以是某一基因的一个或多个区域,也可以是多个基因的一个以上的位点,例如肌生长抑制素、肌生长抑制素受体和肌生长抑制素转录因子基因。
本发明的药物组合物和应用方法适用于任何与肌萎缩有关的基因,改变或调节这些基因的表达可以对肌萎缩或肌生长产生治疗效果或有益的生物学效应。尽管在肌肉的生长和保持过程中,一些主要基因起着重要的作用,但在大多数情况下,疾病往往涉及多个信号传导途径及每个途径中的多个基因。因此,本发明不仅提供了针对单一基因(例如,肌生长抑制素)的药物,而且还提供了针对多个基因或单一基因的不同区域的药物组合,或以上两种药物的组合。
在表1和表2中列出了代表性靶基因,这些基因可用于设计基因调节药物。
A调节基因表达的药物
任何以核酸为基础的制剂均可用于本发明的药物,其中包括反义寡核苷酸、核酶、干扰RNA和脱氧核酶。这些技术方法的共同点是通过Watson-Crick碱基配对原理,与其靶基因mRNA结合。因此,本发明涉及在严格条件下,多核苷酸与相关基因序列之间的杂交。这里所指的严格条件是一定程度的错配可导致杂交体核酸无法形成。多核苷酸指的是可用于抑制肌萎缩相关基因表达的分子,其也可作为探针和引物,用于诊断和实验室研究。
寡核苷酸指的是含核苷酸(核糖核酸,脱氧核糖核酸或两者)的分子,这些核苷酸通过5′与3′端或5′与2′端连接,所用的核苷酸可以是天然的,也可以是化学合成的类似物,这些类似物可与天然核酸形成配对。例如,氮杂(Aza)和脱氮杂(deaza)嘧啶类似物,氮杂(aza)和脱氮杂(deaza)嘌呤,及其它杂环碱基类似物。这些碱基类似物包括在嘧啶或嘌呤中的一个或多个碳氮原子由氧、硫、硒、磷等取代。
以下分别详述本发明的寡核苷酸所包括的反义寡核苷酸、干扰RNA、核酶和脱氧核酶。
1.反义寡核苷酸
反义寡核苷酸是化学合成的短DNA或RNA,其可通过碱基配对与靶mRNA结合,从而阻断mRNA的翻译或通过激活RNAseH降解mRNA。反义寡核苷酸的作用可通过抑制RNA的拼接、翻译和细胞核与细胞质之间的输送过程。作用机理受寡核苷酸的母体结构改变的影响。反义寡核苷酸可以互补于整个基因序列,也可以互补于靶基因的一部分。
因此,本发明所述的一个反义寡核苷酸的长度可以是5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,60,70,80,90,100或多于100个核苷酸。优选用长度为7~75个核苷酸。反义寡核苷酸优选长度为10~26个核苷酸。
典型的设计反义寡核苷酸的方法包括:(1)选择一个与靶区域邻近或重迭的寡核苷酸,(2)测定与靶基因结合的Gibbs自由能水平,(3)分析杂交熔解温度(Tm),(4)进行序列库分析,以确定其靶位点所处区域,例如,5′端非翻译区、翻译起始区、3′端非翻译区和翻译终止区。优选的反义寡核苷酸一般邻近于翻译起始区或至少有一个核苷酸与翻译起始点重迭。在有些实例中这种重迭不少于三个核苷酸。
基于RNA的二级和高级结构特征,反义RNA或DNA的设计,一般可选在5′端区域。在有些情况下,可选在3′端区域,或在RNA拼接点周围。
本发明的反义寡核苷酸可通过Gibbs自由能分析来确定其与靶RNA的结合强度。这一分析可通过计算机程序进行,常用的程序可在ftp://rna.chem.rochester.edu网站找到,并可参考Matthews等(J.Mol.Biol,1999,288,911-940和RNA,1999,5,1458-1469)。寡核苷酸与靶RNA杂交分子的Gibbs自由能一般≤-20kcal(37℃),优选为≤-25kcal。对于一个10-14个单位的寡核苷酸,其自由能为≤-15kcal;15-17单位的寡核苷酸的杂交自由能为≤-20kcal;18-20单位的寡核苷酸的杂交自由能为≤-25kcal;21-23单位的寡核苷酸的杂交自由能为≤-30kcal;24-26个单位的寡核苷酸的杂交自由能为≤-35kcal。
因此,本发明所提供的寡核苷酸长度为7~75个核苷酸,优选长度为10~26个核苷酸,熔解温度(Tm)约为75℃~115℃(1毫摩尔浓度),优选熔解温度40℃~85℃(1微微摩尔浓度)。互补于靶基因的5′端非翻译区、翻译起始区或终止区;靶基因可以是表1和表2中的任选基因,或其它基因,其表达的调节可对肌萎缩相关的病症产生治疗效果。,
为了有效地在体内应用寡核苷酸,对其进行化学修饰可显著地增加寡核苷酸抗酸和抗酶降解的稳定性,例如,2′-O-甲基、2′-O-烯丙基、交接式核酸(Locked nucleic acids,LNA)和肽链核酸(peptide nucleic acids,PNA)。
反义寡核苷酸可利用在本技术领域熟知的方法通过化学合成或酶连接的方式进行制备。另外,反义寡核苷酸还可以利用表达载体在生物体内产生。尽管在表3,4,5中所例举的反义寡核苷酸均为脱氧核糖核酸组成,其也可以是核糖核酸,例如,用尿嘧啶取代胸腺嘧啶,用核糖基代替脱氧核糖基。因此,本发明的寡核苷酸可以完全由脱氧核糖核酸组成,也可以完全由核糖核酸组合,或由脱氧核糖核酸和核糖核酸混合组成。
本发明所提供的反义寡核苷酸可以是完全同源于表3,4,5中所列举的序列,但也可以与所列序列具有百分之60,70,80,90,95或99的同源性。这种序列同源性分析可采用在本技术领域熟知的方法进行测定,例如,Fasta程序(Oxford Molecular Groupinc),BLAST(WWW.ncbi.nlm.nih.gov)(Atschul等,1997,Nucleic Acids Res,25,3389-3402)。程序的分析参数均采用程序推荐设制。
本发明的反义寡核苷酸的G∶C成份一般为大于35%,优选的比例为大于40%,最佳比例为大于45%。
2.核酶
本发明所述核酶指一种可以特异性切割RNA分子的核酸,其可以是RNA,DNA,核酸类似物或RNA、DNA等的组合。核酶包括几种不同的类型,例如,锤头型核酶(Rossi,J等Pharmac.Ther.50:245-254,1991)(Foster和Symons,Cell 48:11-220;1987)(Haseloff和Gerlach,Nature 328:596-600,1988)(Wallbot和Bruenning,Nature334:196,1988)(Haseloff等US Pat No.5,254,678),发卡型核酶(Hampel等,NucleicAcid Res 18:299-304;US Pat No.5,254,678),Delta肝炎病毒核酶(Perotta和Been,Biochem.31:16,1992),I组内含子型核酶(Cech等,US Pat NO.4,987,071)和RNase P核酶(Takada等,Cell 35:849,1983)。其它参考文献包括:WO 95/29241和WO 95/31551。在这几种不同的核酶类型中,锤头型核酶由于它的简单性和实用性,被广泛地应用于基因调节和可能的疾病治疗中。
锤头型核酶的靶向RNA含NUH,其中N是G、U、C、A中的任何一种,H为C、U或A。该核酶对靶向RNA的识别是通过位于催化保守序列两侧的5~15核苷酸的结合序列。核酶以及编码核酶的DNA可以通过本技术领域熟知的方法进行合成(Heidenreich等,J.FASEB 70(1):90-96,1993;Sproat,Current Opin,Biotechnol 4(1)20-28,1993)。在核酶的合成过程中,可以引入不同的化学修饰,以增强核酶的稳定性,如引入脱氧核苷酸、硫代磷酸键或2′-O-甲基。
因此,本发明提供了可以抑制与肌萎缩相关疾病有关基因表达的核酶,靶基因可以是表1,2中所列的任一基因或多种的组合。核酶的设计可基于锤头型或发卡型模型,其可以是化学合成物(带有或不带化学修饰),也可以是通过表达载体在生物体内产生。这些调节肌萎缩或肌生长的核酶,均可作为本发明药物组合物的成份之一。
3.干扰RNA(RNAi)
RNA干扰是通过双链RNA的导入细胞,从而介导所对应mRNA的降解。此技术已被证明是一种有效的抑制靶基因RNA表达的工具(Elbashir等,Nature 411:494-498 2001;Tuschl等,Genes and Development,13:3191-3197,1999;Zamore,Cell 101:25-33,2000;US pat No.6,506,539)。
RNA干扰的作用机制是通过将对应于靶基因RNA的双链RNA导入细胞,在细胞内,双链RNA被消化成短的干扰RNA(siRNA),其结合于“RNA-诱导的基因抑制复合物”(RISC)。RISC然后引导siRNA与同源的靶RNA互补结合,最终导致靶RNA的降解(Sharp等,Genes Dev 15-485-490,2001)。
本发明提供的药物组合含针对肌萎缩有关基因的干扰RNA,以调节肌生长抑制素或其受体,或其他相关基因的表达。此干扰RNA为21-25核苷酸的双链RNA,在每条链的3′端带有两个突出的核苷酸,双链的G+C含量为30-52%,在正义链上第15~19位置上,为A/U配对,且无分子内重复序列。按照此方法,可以制备针对人肌生长抑制素基因的干扰RNA分子。
4.脱氧核酶
使用脱氧核酶是一种新型的基因抑制技术,其具有反义寡核苷酸的化学稳定性,同时又具有核酶的催化切割RNA的功能,且其合成费用很低。基于这些独特的优点,该技术已被广泛用于体内和体外的基因调控(Sun等Pharmacol.Rev.52(3):325-347;US patNo 6,617,438;US pat No 6,326,174)。
因此,本发明提供了可以抑制与肌萎缩或肌生长相关基因表达的脱氧核酶。这种脱氧核酶的结构包括:(1)催化功能基团,其核苷酸序列为:GGCTAGCTACAACGA。(2)位于催化功能基团5′端的结合序列;(3)位于催化基团3′端的结合序列。脱氧核酶通过二个结合序列,特异性地与肌生长抑制素或其受体基因表达的RNA结合,由催化基团在嘌呤与嘧啶结合点诱导对靶RNA的切割。
B.核酸的化学修饰
本发明所提供的寡核苷酸可以用化学的方式进行修饰。所述修饰是在分子水平上对天然核酸分子结构进行一处或多处化学修饰。
包括以下化学修饰:
1)对碱基、糖基、核苷酸之间的磷酸酯键的修饰,及增加一些取代基,例如,二胺(diamine)、胆固醇或其它亲脂性基团。
2)末端保护:在分子的末端加入保护基团,以防止分子的降解。 这种保护可以是5′端,也可以是3′端,或是两端均被保护。
3)质子化:当该分子溶于中性水时,会引起pH值的降解。质子化可通过将分子在酸溶液中处理后完成。通过这一过程,寡核苷酸所带有的质子受体被质子结合,所述的质子受体存在于取代的或未取代的磷酸基团或存在于中心基团和末端保护基团上。许多核酸的主干结构在低pH下(例如pH1-3)均不稳定。本发明通过引入某些修饰,可使核酸在pH 1~pH 2的条件下,仍具有满意的稳定性,这些修饰包括:2′-卤化物;2′-O-烷基,3′-O-烷基;2′-O-烷基-n(O-烷基)等。由于抗酸性的增加,使这些寡核苷酸更容易被制成药物组合物。
本发明还提供了抗核酸内解酶降解的核酸分子。这种抗酶特性可以通过多种化学修饰而获得,包括2′-O-甲基磷酸二酯键,2′-O-甲烷,2′-O-甲烷-n(O-甲烷),2′-氟,杂合连接键,其它主干结构的修饰。另外,这些修饰还包括对碱基的修饰,例如,甲基化碱基、羟甲基化碱基等。
本发明还提供了抗核酸外解酶降解的核酸分子。寡核苷酸可以通过对其5′端和3′端修饰而获得这种抗酶特性。这些末端修饰包括:反向连接碱基,双脱氧核苷酸,甲磷酸基,烷基,芳基,cordycepin,cytosine arabanoside,2′-甲氧基,乙氧基核苷酸,phosphorothioate连接键,3′-O-甲基碱基,荧光素,肽键连接,二氮苯基,胆固醇,生物素,acridine,rhodamine psoralen,glyceryl,丁醇基,丁基,己醇基和3′-O-烷基。优选的丁醇基结构为OH-CH2 CH2 CH2 CH2-。
修饰性核苷酸还包括对糖基的修饰,例如在2′位3′位取代的核糖核酸或脱氧核糖核酸。核糖基和单核苷酸之间的连接键称为核酸的主干结构。对主干结构的修饰包括连接键以及其它可以增强稳定性和亲和性的修饰,例如,对糖结构的修饰。具体的例子有,在碱基相对于天然右旋异构体糖为反向时,可使用左旋(L-)异构体脱氧核糖;或将糖基的2′-羟基团、2′-卤素元素、2′-O-烷基、2′-O-烷基-n(O-烷基)取代;或者使用下列连接键:2′-O-甲基磷酸二酯键,2′-O-乙基,2′-O-丙基、丁基,2′-O-烷基-n(烷基),2′-甲氧乙氧基,2′-氟,2′-脱氧erythropentofuranosyl,3′-O-甲基、异丁基寡核苷酸,2′-O-(CH2CH2)XCH3以及Butyne连接键。本发明的寡核苷酸可具有部分修饰,或全部修饰,或是不同修饰的组合。
本发明优选修饰性寡核苷酸的连接键是非手性的(achiral),可以含至少3~8个连续的非手性连接键,优选为7~12个非手性连续的连接键;最为优选的是全部的连接键为非手性的。在某些情况下,非手性连接键和手性连接性可以相间存在,例如,两个连续非手性连接键后接一个手性连接键,再跟二个连续非手性连接键;或三个连续的非手性键接一个手性连接键;或四个连续的非手性连接键跟二个手性连接键等。非手性连接键包括,但不限于,磷酸二酯键、硫代磷酸二酯键。
磷酸二酯键可以是5′至3′,5′至2′或5′至5′或以上的组合方向。这种连接键的修饰可以是分子内的(单一或重复),也可以是在RNA或DNA的末端。
本发明所提供的药物组合物的功能效应可用本领域熟知的方法进行测定。这些方法包括体内和体外的,例如,在细胞培养系统中分析药物组合物对靶基因表达的影响和对细胞表型的影响;在体内模型和临床试验中,测定药物组合物的生物学效应,包括药效、药理、药剂、毒理等。体内模型包括建立的疾病动物模型和正常动物。
C药物组合物的构成
本发明提供的药物组合物含有为调节与肌萎缩或肌生长相关基因表达的一种以上的寡核苷酸。根据寡核苷酸的数量、类型、靶基因等,药物组合物中寡核苷酸可以有多种不同的组合方式。寡核苷酸的靶基因可从表1和2中选择。
药物组合物中可以只含单一寡核苷酸,其靶基因可以是肌生长抑制素或其受体,也可以是非肌生长抑制素基因。
药物组合物中可以含一种以上的寡核苷酸,寡核苷酸的种类可以达100种以下,优选的为2~20种。
药物组合物中的寡核苷酸可以是一种类型,例如分别选自反义寡核苷酸,或是核酶;或是干扰RNA,或是脱氧核酶。
药物组合物中也可以包括不同类型的寡核苷酸,例如,反义寡核苷酸与干扰RNA的组合,反义寡核苷酸与脱氧核酶的组合等。
药物组合物中的寡核苷酸可以是靶向单一基因的,其可以是一种类型的寡核苷酸,例如反义寡核苷酸,靶向一个以上的靶位点,例如5′端非翻译区、翻译起始区、3′端非翻译区、翻译终止区等。
药物组合物中的寡核苷酸也可以靶向多种基因,例如,二种以上的寡核苷酸,靶向肌生长抑制素和其受体基因;二种以上的寡核苷酸,靶向非肌生长抑制素基因;二种以上的寡核苷酸,混合靶向肌生长抑制素和非肌生长抑制素基因。
药物组合物中寡核苷酸可以靶向人的基因,也可以靶向不同动物基因,例如牛、猪、鸡、鼠、马、狗和鱼。
D药用,营养添加剂和顺势疗法的寡核苷酸组合物
本发明还进一步提供了药用,营养添加剂和顺势疗法的寡核苷酸组合物。
1.药物组合物
本发明包括药物组合物含至少一种本发明所提供的寡核苷酸。在有些药物组合物中,可以含100种以下不同的寡核苷酸,例如2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,30,40,50,75种。在有些药物组合物中,寡核苷酸是反义寡核苷酸、核酶、干扰RNA、脱氧核酶,或以上的组合。在有些药物组合物中,一种或多种寡核苷酸是修饰性寡核苷酸。在有些化合物中,含一种以上的反义寡核苷酸,其可以是部分或全部修饰的药物组合物。药物组合物中还含有适合于药用的赋形剂和其它辅剂。
本发明的靶向基因可以是单一的,也可以是多种基因的组合。靶向多种基因的药物组合物,可以对不同的信号传导途径进行同时调控,将比靶向单一基因的方法更为有效。另外,由于使用的多个寡核苷酸中的每个寡核苷酸的量相对比较低,因此会大大降低产生毒性的可能性。本发明使用的寡核苷酸为修饰性的,因此要比天然寡核苷酸更加稳定,且与目前常用的修饰方法相比,例如,硫代磷酸二酯键,本发明的寡核苷酸的毒性更低。
本发明的药物组合物可以采用非肠道的,口服或局部的给药方式。
本发明的药物组合物可按本技术领域熟知的技术进行制备。药用载体的选择可根据制剂类型和给药途径,例如,静脉注射,口服,局部,喷雾剂,栓剂,非肠道,或骨髓注射等。赋形剂可含几种药用载体。对于顺势疗法药物组合物其辅剂可采用一些能增加顺势疗效或减轻症状的制剂。另外,药物组合物中所含的稳定剂、防腐剂以及其它的成份一般为药物组合物重量的0.5%~2%。本技术领域的技术人员可确定出适当的给药方式和递药系统。
本发明的药物组合物可按要求制成不同的剂型,包括液体、片剂、药丸、粒状、粉末、软膏、乳剂、针剂或栓剂。任何药物可接受的介质和辅剂均可使用,例如,水、甘油、油类、乙醇、调味剂、防腐剂、食物染料等用于液体制剂,淀粉、糖、稀释剂、颗粒剂、润滑剂、粘合剂、分散剂等用于制备固体制剂。
注射用制剂为寡核苷酸的水溶液,溶剂为符合药用标准的水或生理盐水。注射用液体还可以含适当的液体介质、悬浮剂以及可以调节渗透压的制剂、防腐剂等。实际制作方法和程序对于一个本领域的技术人员来说是熟知的。
局部用药剂型可以制成乳剂、敷料、凝胶、洗液、软膏、液体等。可以加入表面活性剂,以增加药物的深层穿透。这些表面活性剂包括天然的,也可以是化学合成的,例如异丙十四烷酸盐。在有些情况下,药物组合物可采用化妆品用的制剂成分。
喷雾剂型的制备可采用将寡核苷酸溶于或悬浮于喷发剂或喷发剂与溶剂中,例如乙醇作为溶剂。在局部用药剂型和喷雾剂型中,药物比例(寡核苷酸)一般为总重量的0.001%~40%。
栓剂的制备可以将寡核苷酸与脂质介质混合而制成,例如theobroma油、可可奶油、甘油、明胶或聚氧乙烯二醇。
寡核苷酸还可以制成脂质体,以增加寡核苷酸在体内的半衰期。所用脂类包括,但不限于,Cardiolipin,dimyristoyl,dipalmitoyl,dioleoyl phosphatidyl choline,phosphatidyl glycerol,palmitoyloleoyl phosphatidyl choline或phosphatidylglycerol,phosphatidic acid,lysophosphatidic acid,phosphatidyl serine,phosphatidyl inositol,cholesterol。
本发明的药物组合物的给药剂量为每公斤体重0.01~100mg所述寡核苷酸。优选的剂量为每公斤0.01mg~10mg。
当口服给药时,每1~10天可给药一个剂量单位,或每天给药,每天1~10个剂量单位,直到治愈,或症状得到减轻。在有些情况下,用药剂量为每天1~4次。在有些情况下,病人按医嘱每天用药2~3个剂量单位。
2.营养添加剂
本发明所述的营养添加剂指的是可以补充食物的药物组合物,除含一种或二种以上本发明所述寡核苷酸外,还可包括任何可用于人和动物的可食用的物质,这些物质可增强食物的吸收、浓缩、代谢等。营养添加剂。剂型包括片剂、胶囊、粉剂、胶状物、液体等类型。
本发明提供的营养添加剂对患肌萎缩的病人非常有效。也可作为普通人群的营养添加剂。
本发明所述的营养添加剂还可以加入其它营养添加剂,例如,抗氧化剂、维生素、食用纤维素、矿物质等。
营养添加剂还可以含有一些药用介质,例如,乳糖、葡萄糖、果糖、玉米淀粉、土豆淀粉、纤维素等。根据不同的制剂要求,营养添加剂中还可加入稀释剂、粘合剂、充填物、改味剂、食用颜料、防腐剂、稳定剂、调节剂、乳化剂等。
由于人体对寡核苷酸的耐受程度很高,营养添加剂中所含的寡核苷酸量可以很大。每日每公斤体重的摄入量为0.1mg~100mg。
3.顺势疗法药物组合物
顺势疗法指的是给予病人少量能使健康者产生类似该病症状的药物的疗法。本发明的药物组合物可用于该疗法,其制备方法是本技术领域熟知的。例如,将1份固体寡核苷酸与9份乳糖混合即可产生1X固体制剂,重复这一过程即可得到2X,3X,4X…..等不同浓度的制剂。用类似的方法,可制备液体制剂,例如,将1份重量的寡核苷酸与10倍体积的液体混合,产生1X液体;重复这一过程可得到低浓度制剂,例如,取1毫升1X液体,与9毫升稀释剂混合,即可得到2X液体。
本发明的顺势疗法药物组合物含一种或一种以上寡核苷酸的组合,所含寡核苷酸可以是经化学修饰的。在有些情况下,顺势疗法药物组合物可通过安慰剂给药,即将寡核苷酸制剂滴在或喷在由乳糖制备的安慰剂药片上,然后口服。
顺势疗法制剂还可以包括一些有助于缓解症状的介质,例如在US pat No.5,603,915中所述的介质。其还可加入一种电磁介质,如US pat No5,830,140所述。
表7中列出了常用顺势疗法的剂量。
II本发明的方法
本发明进一步提供了使用本发明提供的药物组合物治疗疾病的方法。这些方法包括应用该药物组合物调节细胞内基因表达的方法,用本药物组合物治疗肌肉萎缩症的方法,用于对抗疗法、营养添加、顺势疗法的方法,用于增加食用动物和畜牧动物肌肉生长的方法,以及使用本药物组合物辅助其它治疗的方法。
肌肉萎缩症指的是,以肌肉萎缩为主要原发症状的疾病,例如,肌营养不良、脊髓损伤、神经变性病、肌缺乏、恶质病、肌萎缩等,还可以是一些脂肪和肌肉比例异常增高的疾病,例如,二型糖尿病、X综合症。
在成人和动物中,骨胳肌的萎缩可以是由于缺乏使用肌肉,老化、饥饿和疾病造成的症状,例如,败血症、肌营养不良、艾滋病、衰老和癌症等。肌肉减少的主要特点是,肌细胞内的蛋白质减少,无力,疲劳,肌纤维直径变小。肌细胞内的蛋白质的减少是由于合成的降低和分解的加快。
肌萎缩疾病一般均伴随着一系列基因表达的改变或异常。这一异常表达往往导致机体的病理性变化,可由熟知本领域的临床医生进行确定。例如,对一个糖尿病患者,临床医生可以诊断其体重高于人群平均体重的20%;对一个肌肉消瘦病人,临床医生可以对其测定肌肉力量,并与人群平均值比较,从而确诊是否为肌萎缩。
本发明的靶向基因可以是单一的,也可以是多种基因的组合。靶向多种基因的药物组合物,可以对不同的信号传导途径进行同时调控,将比靶向单一基因的方法更为有效。另外,由于使用的多个寡核苷酸中的每个寡核苷酸的量相对比较低,因此会大大降低产生毒性的可能性。本发明使用的寡核苷酸为修饰性的,因此要比天然寡核苷酸更加稳定,且与目前常用的修饰方法相比,例如,硫代磷酸二酯键,本发明的寡核苷酸的可能毒性很低。
A肌萎缩症状
利用本发明的药物组合物可用于治疗以下(但不限于)症状。
肌营养不良。肌营养不良是一类神经肌肉性疾病,包括假肥大性肌营养不良(DMD),多型性肢带肌营养不良(LGMD)和先天性肌营养不良(CMD),这些疾病的症状为进行性肌肉损伤和减少,组织炎症,纤维和脂肪组织取代肌肉组织,导致一系列的并发症,甚至死亡。
肌缺乏。肌缺乏是一种与衰老有关的肌肉重量、力量和功能损失的疾病,一般在75岁以后发病。致病因素包括无法行动,运动原改变,激素水平降低,蛋白合成水平降低等。除无法行动外,上述因素均与遗传控制基因表达有关。因此,应用寡核苷酸调节相关的基因可以延缓或逆转肌肉损失。
恶质病。恶质病是一种与许多疾病相关的疾病,例如,癌症、艾滋病、败血症和充血性心衰,该病的主要症状特点是骨骼肌和脂肪组织同时大量减少,但不是由于营养不良造成。恶质病是三分之一癌症患者死亡的原因。在致病过程中,细胞因子和肿瘤因子抑制肌肉生长的基因产物导致肌萎缩。有些恶质因子可以选择性地作用于肌浆球蛋白重链在肌小管和鼠肌肉里,肿瘤坏死因子α(TNFα)和γ干扰素可以通过一种RNA依赖型的机制,大大降低肌浆球蛋白的合成(Acharyya等J.Clin lnvest.114:370-378,2004)。肿瘤病人的进行性衰弱导致他们对化疗和放疗的毒性更为敏感,许多病人死地于恶质病相关的症状,而不是肿瘤本身。因此,本发明的药物组合物可逆转由恶质病导致的肌萎缩,有希望成为一种有效的治疗方法。
糖尿病。糖尿病是一种最常见的代谢性疾病。I型糖尿病多在青少年发作,表现为胰岛β细胞的破坏,一般需要胰岛素治疗。II型糖尿病多在成年期发作,占全部糖尿病的80%以上。尽管II型糖尿病可通过改变生活习惯而得到改善,例如,减轻体重和增加肌肉生长等,研究表明调节某些相关基因的表达可以改善某些症状(US pat NO 6,656,475)。
上述仅为举例说明通过调节基因表达可以改善与肌萎缩相关的疾病症状。其它的病症还包括(但不限于)脊髓损伤,神经变性疾病,创伤,缺血性肺病(COPD),厌食症,艾滋病,由于卧床等造成的肌萎缩以及任何由肌肉损伤、肌肉生长异常造成的疾病。
B.治疗用的靶基因
用于治疗的靶基因已列入表1和表2,但不仅限于表中所列。有关基因的详细描述如下。
肌生长抑制素(myostatin)。该基因是调节肌肉生长,直接或间接涉及几乎所有肌萎缩病的主要基因。作为一种分泌型生长因子,它可以在人和动物的肌肉内细胞负性调节肌肉的生长。它属于转化生长因子中的一类,表达于发育型和成熟的肌肉。在缺乏该基因表达的小鼠中,肌肉增加达25~30%(Mcpherron等,Nature,387:83-90,1997;Whittemore等,Biochem.Biophys.Res.Commun.300:965-971,2003;Grobet等,Genesis,35:227-238,2003)。
肌生长抑制素在血液中循环,患肌萎缩的病人血清中的肌生长抑制素均出现增高。因此,该基因已被认为是一种特异的药靶,调节该基因表达可用作治疗与肌萎缩相关疾病的有效方法。
最近报道表明,用肌生长抑制素抗体可以显著的在mdx小鼠中改善肌萎缩症状。在受治疗的小鼠中,不仅正常肌细胞数有所增加,肌肉的力量也大大增强。尽管这一疗效的机制并非完全清楚,但很显然,其与调节/降低肌生长抑制素水平有关。因此,肌生长抑制素的阻断剂是一种很有希望的治疗肌萎缩的手段。
在肌缺乏症中,血清中高水平肌生长抑制素被认为是一种与衰老有关肌缺乏的生物标记。抑制该基因的表达可以是改善和治疗预防肌缺乏症的手段。
肌生长抑制素受体
肌生长抑制素的信号传导类似于Activin和TGF-β。它可以有效地结合II型受体ActRllB与I型受体ALK或ALK5形成杂合复合体,导致对Smad产物的磷酸化,从而控制基因表达和介导肌生长抑制素的效应。Smads是一类信号传导分子,可将有关信号从细胞表面传入细胞核内,通过与DNA和转录因子的作用以调节基因转录。
转录因子
肌原性转录因子MyoD是一种调节肌生长抑制素功能的调节因子。在肌肉细胞内表达的一系列转录因子包括MyoD,myogenin,myf-5和MRF-4/herculin/myf-6。当将以上任-因子引入非生肌细胞内,该细胞可分化为肌细胞。特别是MyoD,其可引导肌肉的细胞生成,抑制增殖,激活分化,诱导收缩表型。
Dystrophin基因
Dystrophin基因已被证明在不同的肌营养不良症中起着主导作用,例如,假肥大性肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD),Becker肌营养不良等。在这些肌营养不良症中dystrophin基因均有不同的突变。利用寡核苷酸,例如反义寡核苷酸,调节这些突变基因的表达,或对突变进行校正,可以达到对肌营养不良的治疗。
恶质病相关基因
恶质病涉及了许多不同的途径和调节因子,例如,肿瘤坏死因子(TNF)。注射TNF给小鼠产生恶质病模型。Activins和肌生长抑制素在几种类型的癌症和感染中表达均增高。以上这些基因均可作为治疗恶质病的药靶。最近,一种新的蛋白,称作癌恶质因子,被证明与恶质病相关,也可以作为一个新的药靶。
糖尿病相关基因
正常的肌肉功能能够保持体内糖的平衡。调节肌生长抑制素的表达而增强肌肉的生长可以起到控制糖尿病的功能。Activin-follistatin系统涉及胰腺的发育,从而影响糖的代谢。最近发现的一些分泌肽和BMP-9均可调节糖的生成与代谢。因此,除了脂生成细胞因子(例如leptin和adiponectin)外,多个TGF-β基因族的成员(包括肌生长抑制素,activin BMP-9)均参与体内的糖平衡和糖尿病。
综上所述,本发明提供的方法是利用本发明的药物在细胞内调节一种或多个基因的表达,这些基因均与肌萎缩症有关,代表性基因列于表1和表2。
在有些情况下,可将细胞,组织或器官在体外分离出来,然后对其用本发明的药物处理,然后将处理的细胞,组织或器官输送回体内。
本发明中所指的疗效是治愈,缓解和预防所对应的症状。例如,用本发明的药物组合物治疗肌萎缩(肌营养不良、肌缺乏、脊髓损伤、神经变性疾病、厌食症、恶质病等),其有疗效指的是增加肌肉体积和重量,增强肌肉力量等。对于预防性效果,本发明的药物组合物可用于有潜在患肌萎缩可能的人,如长期卧床病人,或患有易引起肌萎缩病的病人,或尚未被诊断为恶质病的肿瘤患者。因此,本发明的治疗方法包括对动物和人的任何治疗,包括以下内容:
(1)防止尚未诊断出,但有可能出现的症状;
(2)抑制症状发展;
(3)减轻或逆转症状;
(4)保持体内平衡。
用于人和动物的寡核苷酸药物组合物的剂量取决于所治疗的症状、给药途径、受治个体的生理状况以及治疗是营养性的或是抗病性的,或是顺势疗法的。产生营养性疗效的剂量指的是一种无毒性,且大于能保持理想生理状况最小量的寡核苷酸剂量。产生抗病性疗效的剂量指的是一种无毒性,且大于能产生所希望的生理效应的最小量的寡核苷酸剂量。产生顺势疗效的剂量指的是一种无毒和能产生所希望的生理效应的寡核苷酸的最低剂量。
在表6中举例列举了单一或组合靶基因,用以制备不同寡核苷酸,以医治不同疾病。表中不同基因的组合中,每个基因之间用“/”分开,例如A/B/C,表示寡核苷酸靶基因A,B,C的组合。
本发明的药物组合物还可用于治疗一些动物,例如,鸟类、鱼类和哺乳类动物(特别是鸡、猪、羊、狗、马、猫等),在药物组合物中寡核苷酸对应的靶基因序列为种属特异的。
在进一步的应用中,本发明提供的方法可用于调节食用动物或竞技用动物体内的肌生长抑制素的表达,从而增强肌肉的生长。使用方法和剂量类似对疾病的治疗。在有些情况下,所用剂量,给药途径和疗程依所用于的动物种类和希望达到的效果有所调整。
表1代表性人靶基因
基因名称(Genes) | 基因数据库代码(Accession Number) |
Myostatin | AF104922 |
MyoD | NM002478 |
ARIIb | NM001106 |
TLL2 | AF059516 |
ID-1 | NM002165 |
TACE | NM003183 |
TNF-R1 | NM001065 |
IL6R | NM000565&NM181359 |
MMP2 | NM004530 |
FOXO1 | NM002015 |
Bcl-3 | NM005178 |
FOXO-3 | NM001455&NM201559 |
E3alphaII | AY061884 |
Nfkb-1 | NM003998 |
IL1b | NM000576 |
NF-IL6 | M83667 |
NF-B | M62399&L19067 |
TNF- | NM000594 |
Caspase-3 | NM004346 |
Caspase-1 | NM033292 |
Atrogin-1 | NM058229&NM148177 |
Smad-2 | AF027964 |
PIF | AY90150 |
IL-6 | NM000600 |
表2代表性动物靶基因
基因名称(Genes) | 基因数据库代码(Accession Number) |
Myostatin(牛)Cow | NM001001525 |
Myostatin(马),Horse | AB033541 |
绵羊,Sheep Myostatin | AF019622 |
山羊Myostatin | AY436347 |
兔Myostatin,Rabbit | AY169410 |
Myostatin(猪),Pig | NM214435&AF033855 |
Myostatin(鸡),Chicken | AF019621&AF346599 |
Myostatin(狗,)Dog | AY367768 |
Myostatin(鱼),Fish | AY825248 |
鼠Myostatin,Mouse | NM01834 |
鼠TLII | AF073526 |
鼠AcRIIB | NM007397 |
鼠MyoD1 | NM010866 |
鼠Atrogin-1 | AF441120 |
鼠E3alpha-II | XM358323 |
鼠Foxo3 | NM019740 |
鼠Foxo1 | NM019739 |
鼠MuRF1 | AF294790 |
鼠Caspase3 | NM009810 |
鼠NFkB | NM003998 |
鼠TNF-alpha | NM013693 |
鼠TNF-R1 | NM011609 |
鼠Caspase-1 | BC008152 |
鼠TACE | AB021709 |
鼠IL-1b | NM008361 |
鼠IL-6 | NM031168 |
鼠MMP2 | NM008610 |
鼠p65 | M61909 |
鼠IL-6R | X53802 |
鼠Smad2 | NM010754 |
鼠Cathepsin-B | BC006656 |
表3靶向人基因的反义寡核苷酸序列
表4靶向动物基因的反义寡核苷酸序列
表5针对人肌生长抑制素的代表性反义寡核苷酸
反义寡核苷酸序列(5′→3′)*(Oligonucleotide Sequences) | 序列号Seq ID# |
ACTTgCCACACCAgTgAATCT | 165 |
TCTTgTTCTTgTTTCTTCCTT | 166 |
gTTgCAgTTTTTgCATgATTT | 167 |
ACACAgAgTTgCAgTTTTTgC | 168 |
AATCAgCATAAACAggTAAAT | 169 |
AgATCCACTggACCAgCAACA | 170 |
ACACAgCCCCTCTTTTTCCAC | 171 |
gAgCTgTTTCCAgACgAAgTT | 172 |
AgTggAggAgCTTTgggTAAA | 173 |
TCgCTgCTgTCATCCCTCTgg | 174 |
CCgTTgTagCgTgATAATCgT | 175 |
AGAAAATCAgACTCTgTAggC | 176 |
CATAgTTgggCCTTTACTACT | 177 |
TTgTAggAgTCTCgACgggTC | 178 |
CATAggTTTgATgAgTCTCAg | 179 |
AgTgCCTgggTTCATgTCAAg | 180 |
TCTTCACATCAATgCTCTgCC | 181 |
ATgCCTAAgTTggATTCAggT | 182 |
gCCCATCTTCTCCTggTCCTg | 183 |
gTgTgTCTgTTACCTTgACCT | 184 |
TgTTgAgTgCTCATCACAgTC | 185 |
ATCCAATCCCATCCAAAAgCT | 186 |
TCCAgAgCAgTAATTggCCTT | 187 |
gTgTACCAgATgAgTATgAgg | 188 |
TgggAgTACAgCAAgggCCTg | 189 |
TCgCTggAATTTTCCCATATA | 190 |
ATATAAATCTCATgAgCACCC | 191 |
*反义寡核苷酸的设计是基于人肌生长抑制素基因(myostatin)(AF104922).
表6举例说明用于治疗肌肉萎缩的寡核苷酸药物组合物
寡核苷酸组合(Combinations of oligonucleotides targeting the following genes) |
Myo |
Myo/myoD |
Myo/ActRIIB |
Myo/myoD/ActRIIB |
Myo/ActRIIB/Smad2 |
Myo/NF-kB |
Myo/Atrogin-1 |
Myo/MuRF1 |
Myo/Atrogin-1/MuRF1 |
Atrogin-1/FOXO1 |
Atrogin-1/FOXO3 |
Atrogin-1/FOXO1/FOXO3 |
Myo/MyoD/ActIIB/Samd2/NF-kB |
Atrogin-1/FOXO1/FOXO3/MuRF1 |
表7:顺势疗法使用的RNA/DNA剂量
剂量稀释倍数/效力Dilution/Potency | 微克/公斤体重μg/kg |
2x | 50 |
3x | 5 |
4x | 0.5 |
5x | 0.05 |
6x | 0.005 |
具体实施方式:
以下实施例的列出是为了详细说明本发明,并不对发明的内容加以限制,如表3,4,5中所列的反义寡核苷酸序列为代表性的分子,任何其它可以产生对肌萎缩相关病症产生疗效的反义寡核苷酸,均可用于本发明的药物组合物中。
实施例1细胞水平对肌生长抑制素(Myostatin)的抑制
1.实验目的
本实验是为了在小鼠肌肉细胞系中筛选有活性的RNA寡核苷酸。检测的指标是通过蛋白印迹法观察RNA寡核苷酸对肌生长抑制素表达的影响。
2.实验材料
1)细胞:C2C12细胞系来源于小鼠肌肉细胞,培养于DMEM培养液中,每100毫升DMEM完全培养液中加入15ml胎牛血清,100单位青霉素,100微克链霉素。培养条件为37℃,5%CO2。细胞的分化培养采用2%的马血清培养基,培养条件为37℃,5%CO2。
2)RNA寡核苷酸:七种靶向肌生长抑制素基因不同区域RNA寡核苷酸,每个分子均带有3′端丁烷保护基。用于细胞转染效率实验的RNA寡核苷酸在5′端带有荧光集团FITC标记。
3.实验步骤
1)转染细胞:这一过程是将RNA寡核苷酸通过脂质体道入细胞。
2)分析细胞转染效率:利用流式细胞仪分析转染的效率。
3)基因表达水平的检测:利用蛋白印迹法分析RNA寡核苷酸对靶基因表达的影响。
4.实验结果
1)FACS(fluorescence activating cell sorting)定量分析细胞转染效率转染前一天细胞传代3×105于6孔板中,转染按下述过程进行:
a)于A-管中混合250μlopti-MEM和1μl寡核苷酸(终浓度2μM),室温5分钟;
b)于B-管中混合250μlopti-MEM和4μlLipofectamine-2000,室温5分钟;
c)将A、B管中的溶液混合,室温20-30分钟。
d)将传代的细胞用PBS洗两遍,将混好的溶液加到细胞表面,轻轻混匀。
e)37℃放置4-6小时后,换完全培养基,培养数小时后进行有关检测。
用FITC标记的RNA-oligo转染C2C12细胞(2M)24小时后,倒掉培养液,PBS冲洗细胞两遍,胰酶消化收集细胞于离心管中,吸管反复吹打分散细胞,离心沉淀细胞,PBS重悬,再离心沉淀,反复洗两遍,除去游离的FITC-RNA寡核苷酸,400目钢网过滤使细胞呈单细胞悬液,流式细胞仪分析转染的效率。
以未转染的细胞为空白对照,发荧光的细胞占总细胞的比例代表转染效率。结果显示,在本实验条件下,RNA寡核苷酸在C2C12细胞中的转染效率为45-50%。
2)蛋白印迹法(Western blotting)检测RNA寡核苷酸对酸对肌生长抑制素基因表达的抑制
细胞转染如上所述。用七种RNA寡核苷酸分别转染的C2C12细胞经用细胞裂解液(50mM Tris-HCl,1mM EDTA,2%SDS,5mM DTT,10mM PMSF)裂解。30s超声粉碎,沸水浴变性10min,13,000g离心去除细胞碎片,上清液中蛋白浓度用BCA assay reagent(Pierce Chemical Co,Rockford,IL)测定。100μg蛋白在经12%浓缩胶,分离胶SDS-PAGE电泳分离,电转移至硝酸纤维素膜,5%脱脂奶粉封闭非特异性结合位点,然后膜与相应一抗体4℃孵育12h,洗涤;二抗室温孵育2h,洗涤,加入化学发光底物(Supersignal WestDura Extended Duration Substrate,PIERCE),暗室X光片曝光、显影、定影显示条带,看家蛋白Beta-actin条带作为内对照。肌生长抑制素一抗体的浓度为2μg/ml,Beta-actin的抗体浓度1∶500,0.2μg/ml。
结果显示,实验所用的七种RNA反义寡核苷酸均可以特异性地抑制肌生长抑制素myostatin基因的表达,而对细胞对照蛋白(β-actin)的表达无影响。这一结果表明,本发明所提供的反义RNA寡核苷酸可有效地进入细胞,与靶基因(肌生长抑制素myostatin)的mRNA结合,并使其降解,最终导致其蛋白表达的降低。在实验所用的七种RNA反义寡核苷酸中,分子A,B,C的特异性抑制效果最大(A:ATg Tag CgT CCg AgA gAC;B:TgC ATC ATT TTAAAAATC AgC;C:ACC TAA TgC AAA gCT CAT)。实验所用寡核甘酸均为2′-O-甲基修饰和带有3′端丁氧基保护。
实施例2单一和组合型RNA寡核苷酸对小鼠肌肉生长的抑制比较
1.实验目的:研究RNA寡核苷酸在单一或组合使用条件下体内对肌肉生长的影响。
2.实验材料:三种RNA寡核苷酸分别靶向肌肉生长抑制素基因的5′端非翻译区(A);翻译起始区(B);翻译终止区(C)。每种RNA寡核苷酸按1mg/ml浓度溶于生理盐水。将每种RNA寡核苷酸按等体积混合制成组合型RNA寡核苷酸。
3.实验步骤:实验分五组进行,每组含六只6-8周雌性小鼠。实验采用每三天一次尾静脉注射,注射量为100μl(5mg/kg体重)。实验完成后剥离腿部肌肉称重。
4.实验结果:实验分组为:
A,RNA寡核苷酸A(ATg Tag CgT CCgAgAgAC);
B,RNA寡核苷酸B(TgC ATC ATT TTAAAAATC AgC):
C,RNA寡核苷酸C(ACC TAATgC AAA gCT CAT);
D,RNA寡核苷酸A+B+C;
E,生理盐水对照。
肌生长抑制素可抑制肌肉的生长,抑制该基因的表达将导致促进肌肉生长。本实验用不同RNA寡核苷酸组合静脉注入小鼠体内,对小鼠肌肉生长的影响见下表。肌肉生长促进率(%)为(处理组-生理盐水组)/生理盐水组。
表8单一和组合肌生长抑制素RNA寡核苷酸促进小鼠肌肉生长的比较.
A | B | C | A+B+C | |
肌肉生长促进率(%) | 0.8 | 2.4 | 7.2 | 8.8 |
5.实验结论
从上表可见,合并使用RNA寡核苷酸,相对于单独使用,能够更有效地抑制肌生长抑制素基因的表达,从而促进小鼠肌肉的生长。
实施例3 RNA寡核苷酸组合物对小鼠肌肉生长的影响
1.实验目的
利用三种筛选出的RNA寡核苷酸A,B,C进一步探讨合并使用三种寡核苷酸对小鼠肌肉生长以及在肌肉组织中对及肌生长素基因表达的影响。
2.实验材料
1)实验动物:共24只小鼠,6-8周龄雌鼠。
2)寡核苷酸:将每一个寡核苷酸溶解。三种RNA寡核苷酸(分别靶向靶向myostatin的5′端非翻译区、翻译起始区、翻译终止区)等体积混合,注射量为5mg/kg,每只鼠100μl;四种DNA寡核苷酸(用作对照)等体积混合,注射量为5mg/kg,每只鼠100μl;
3.实验方法和步骤
实验分为A、B、C三组,每组8只鼠。其中:
A组:实验组,注射上述三种RNA寡核苷酸的组合物;
B组:寡核苷酸对照组,注射四种DNA寡核苷酸对照组合物;
C组:处理对照组,注射生理盐水。
具体实验步骤如下:
1)小鼠24只(6-8周),于动物房中稳定一周
2)第8天,称重后,尾静脉注射每只小鼠100μl寡核苷酸或生理盐水
3)第9天,腹腔注射同等量
4)第10天,腹腔注射同第9天
5)重复:静脉-腹腔-腹腔注射循环八次
6)第34天,称重每只小鼠后迅速处死,取腓肠肌和四头肌,称重。取小块组织固定以待组织学检测,其余液氮冷却贮存,蛋白印迹Western Blotting待用。
2.实验结果
1)肌生长素基因反义RNA寡核苷酸组合物对小鼠肌肉生长的影响
实验结束时处死小鼠取腓肠肌和四头肌称重,对数据进行处理,肌肉生长促进率(%)为(处理组-生理盐水组)/生理盐水组。结果见下表:
表9 RNA寡核苷酸组合对小鼠肌肉生长的促进
RNA寡核苷酸组合 | 对照寡核苷酸 | |
肌肉生长促进率(%) | 11.3 | -0.4 |
从上表可见,注射靶向肌生长素基因反义RNA寡核苷酸组合物的实验组其腿部肌肉的平均重量显著高于对照实验组和DNA寡核苷酸对照组,从而证明了反义RNA寡核苷酸能够抑制肌生长抑制素基因的表达,而使其肌肉的生长加快。
2)肌生长素基因反义RNA寡核苷酸组合物对小鼠平均体重的影响
24只小鼠(雌性)分组是随机的,其平均体重均呈现轻微的上升趋势,但组间无显著差异。这一结果表明,RNA寡核苷酸的作用是肌肉特异性的。
3)肌生长素基因反义RNA寡核苷酸组合物对肌生长素基因在肌肉组织中表达的影响
实验进一步地提取了组织总蛋白,以检测肌生长抑制素基因在肌肉组织中的表达情况。肌肉组织在细胞裂解液(50mM Tris-HCl,1mM EDTA,2%SDS,5mM DTT,10mMPMSF)中匀浆,裂解。30s超声粉碎,沸水浴变性10min,13,000g离心去除细胞碎片,上清液中蛋白浓度用BCA assay reagent(Pierce Chemical Co,Rockford,IL)测定。100μg蛋白在经12%浓缩胶,分离胶SDS-PAGE电泳分离,电转移至硝酸纤维素膜,5%脱脂奶粉封闭非特异性结合位点,然后膜与相应一抗体4℃孵育12h,洗涤;二抗室温孵育2h,洗涤,加入化学发光底物(Supersignal West Dura Extended Duration Substrate,PIERCE),暗室X光片曝光、显影、定影显示条带,看家蛋白Beta-actin条带作为内对照。肌生长抑制素一抗体的浓度为2μg/ml,Beta-actin的抗体浓度1∶1000,0.2μg/ml,二抗1∶10000,0.1μg/ml。
蛋白印迹Western Blottmg的检测结果表明RNA-寡核苷酸能够在在小鼠肌肉组织中显著地抑制肌生长抑制素基因的表达,而对组织细胞内对照蛋白无影响,从而证明,RNA寡核苷酸对小鼠肌肉生长的促进是通过抑制肌生长素基因表达产生的。
实施例4肌生长抑制素RNA寡核苷酸组合通过不同给药途径对小鼠肌肉生长的抑制
1.实验目的
研究RNA寡核苷酸组合物在不同给药途径下的体内效果,即对肌肉生长的促进。
2.实验材料
1)动物,共24只小鼠,6-8周龄雌正常小鼠分为A、B、C、D组,每组6只鼠。
2)寡核苷酸:将每一个寡核苷酸溶解于生理盐水中,三种RNA寡核苷酸等体积混合,其分别靶向靶向肌生长抑制素基因myostatin的5′端非翻译区;翻译起始区;翻译终止区,注射剂量为5mg/kg,每只鼠100μg/100μl。
3.实验步骤和方法
实验分四组进行。实验全程为四周。
A组为静脉注射,每三天注射100μl混合寡核苷酸(A+B+C);
B组为静脉和腹腔交替注射,每天注射100μl混合寡核苷酸(A+B+C);
C为生理盐水对照,注射方法如B组;
D为口服,每天由小鼠口内灌入100μl寡核苷酸(A+B+C)
实验结束时处死小鼠取腓肠肌和四头肌称重,对数据进行处理,肌肉生长促进率(%)为(处理组-生理盐水组)/生理盐水组。
4.实验结果
表10 RNA寡核苷酸组合不同注射途径对小鼠肌肉生长的促进
静脉注射 | 静脉+腹腔注射 | 口服 | |
肌肉生长促进率(%) | 25.91 | 22.38 | 18.55 |
从上表可见,RNA寡核苷酸在不同给药途径的条件下,与对照组(生理盐水)相比,均能够有效地抑制肌生长抑制素基因的表达,从而促进小鼠肌肉的生长。
Claims (13)
1.一种治疗肌肉萎缩或增强肌肉生长的经化学修饰的寡核苷酸,特征是:
(1)含有15~75个核苷酸;
(2)至少含有3个连续的非手性5′到3′磷酸核苷间键;
(3)互补于能抑制肌肉生长的靶基因的5′端非翻译区、翻译起始区、3′端非翻译区和翻译终止区,所述靶基因是肌肉生长抑制素基因myostatin或其转录因子Foxo-1、Foxo-3的基因;
(4)1毫摩尔浓度时具有75℃~115℃的熔解温度。
2.如权利要求1所述的寡核苷酸,其特征在于:该寡核苷酸包括核糖寡核苷酸和脱氧核糖寡核苷酸。
3.如权利要求1所述的寡核苷酸,其特征在于:所述寡核苷酸是在糖基2′位上带有取代基团的,所述取代基团选自氧、甲氧基、丙氧基、甲氧-乙氧基、氟、氯、溴、碘。
4.如权利要求1所述的寡核苷酸,其特征在于:该寡核苷酸在3′端和/或5′带有保护基团。
5.如权利要求1所述的寡核苷酸,其特征在于:该寡核苷酸是3′末端封闭和/或5′末端封闭的。
6.如权利要求1所述的寡核苷酸,其特征在于:该寡核苷酸是反义寡核苷酸。
7.如权利要求6所述的寡核苷酸,其特征在于:该寡核苷酸的序列选自SEQID NO:1~3、34~37和40~42。
8.如权利要求1所述的寡核苷酸,其特征在于:该寡核苷酸是干扰RNA、核酶或脱氧核酶。
9.一种治疗肌肉萎缩或增强肌肉生长的寡核苷酸组合物,含有权利要求1-8中任一权利要求所述的寡核苷酸中的一种或多种。
10.如权利要求9所述的组合物,其特征在于:当使用二种寡核苷酸时,这二种寡核苷酸将各自与不同的所述靶基因的一段区域互补;其中,第一种寡核苷酸与某一靶基因的5′非翻译区、翻译起始位点、3′非翻译区或翻译终止位点的区域互补,第二种寡核苷酸与另一靶基因的5′非翻译区、翻译起始位点、3′非翻译区或翻译终止位点的区域互补。
11.如权利要求1-8中任一权利要求所述的寡核苷酸制备治疗动物或人肌肉萎缩药物或营养补剂的用途。
12.如权利要求1-8中任一权利要求所述的寡核苷酸制备增强动物或人肌肉生长的药物或营养补剂的用途。
13.如权利要求12所述的用途,其中所述的动物选自哺乳动物和非哺乳动物。
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