CN104080794B - RNAi试剂、组合物及其用于治疗甲状腺素运载蛋白(TTR)相关疾病的使用方法 - Google Patents

RNAi试剂、组合物及其用于治疗甲状腺素运载蛋白(TTR)相关疾病的使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了靶向甲状腺素运载蛋白(TTR)基因的RNAi试剂(例如双链RNAi试剂)和使用这样的RNAi试剂用于治疗或预防TTR相关疾病的方法。

Description

RNAi试剂、组合物及其用于治疗甲状腺素运载蛋白(TTR)相关 疾病的使用方法
相关申请
本申请要求2011年11月18日提交的美国临时申请号61/561,710、2012年3月26日提交的美国临时申请号61/615,618以及2012年8月6日提交的美国临时申请号61/680,098的优先权，各自的全文内容特此通过引用结合在此。
序列表
本申请含有一个序列表，该序列表已经经由EFS-Web以ASCII格式提交并且特此通过引用以其全文结合在此。创建于2012年11月13日的所述ASCII拷贝被命名为121301WO.txt，并且大小是541,508字节。
发明背景
甲状腺素运载蛋白(TTR)(也称为前白蛋白)见于血清和脑脊髓液(CSF)中。TTR运载视黄醇结合蛋白(RBP)和甲状腺素(T4)，并且还通过其与血液和CSF中的RBP缔合而充当一种视黄醇(维生素A)载体。甲状腺素运载蛋白(Transthyretin)由于其运载(transport)甲状腺素(thyroxine)和视黄醇(retinol)而得名。TTR还充当一种蛋白酶，并且可以裂解蛋白质，包括apoA-I(主要的HDL载脂蛋白)、淀粉样β-肽以及神经肽Y。参看莉斯M.A.(Liz，M.A.)等人(2010)《IUBMB生命》(IUBMB Life)，62(6)：429-435。
TTR是四种富含β片层结构的相同127-氨基酸亚单位(单体)的一种四聚体。每个单体具有两个4链β片层和长椭球的形状。反向平行β-片层相互作用将单体连接成二聚体。来自每个单体的一个短环形成主要二聚体-二聚体相互作用。这两对环将二聚体的相对的凸面β-片层分隔以形成一个内部通道。
肝脏是TTR表达的主要部位。其他显著表达部位包括脉络丛、视网膜(特别是视网膜色素上皮细胞)以及胰腺。
甲状腺素运载蛋白是至少27种不同类型的蛋白质之一，它是淀粉样原纤维形成中的一种前体蛋白。参看关J.(Guan，J.)等人(2011年11月4日)心脏淀粉样变性的当前看法(Current perspectives on cardiac amyloidosis)，《美国生理学杂志-心脏与循环生理学》(Am J Physiol Heart Circ Physiol)，doi：10.1152/ajpheart.00815.2011。淀粉样原纤维在器官和组织中的细胞外沉积是淀粉样变性的标志。淀粉样原纤维由错误折叠的蛋白聚集体构成，这些聚集体可以由前体蛋白的或者过量产生或者特异性突变而产生。TTR的成淀粉样可能性可能与其大量的β片层结构相关；X射线结晶研究表明，某些成淀粉样突变使蛋白质的四聚体结构不稳定。参看例如萨赖瓦M.J.M.(Saraiva M.J.M.)(2002)《分子医学专家评论》(Expert Reviews in Molecular Medicine)，4(12)：1-11。
淀粉样变性是用于由淀粉样沉积物表征的淀粉样疾病群组的一个通用术语。淀粉样疾病基于其前体蛋白来归类；举例来说，名称以用于淀粉样的“A”开始并且接着是前体蛋白的缩写，例如用于成淀粉样甲状腺素运载蛋白(amloidogenic transthyretin)的ATTR。同前。
存在众多TTR相关疾病，其中大多数是淀粉样疾病。正常序列TTR与老年人的心脏淀粉样变性相关，并且被称为老年全身性淀粉样变性(SSA)(也称为老年心脏淀粉样变性(SCA)或心脏淀粉样变性)。SSA通常在多种其他器官中伴随有微观沉积物。TTR淀粉样变性以不同形式显现。当周围神经系统更显著地受影响时，该疾病被称为家族性淀粉样多发性神经病(FAP)。当心脏主要受累但神经系统则不受累时，该疾病被称为家族性淀粉样心肌病(FAC)。TTR淀粉样变性的一种第三主要类型是软脑膜淀粉样变性，也称为软脑膜或脑膜脑血管淀粉样变性、中枢神经系统(CNS)淀粉样变性或淀粉样变性VII型。TTR的突变还可能会引起淀粉样玻璃体混浊、腕管综合征以及甲状腺功能正常的高甲状腺素血症，该疾病是一种非淀粉样疾病，被认为在由于一种突变TTR分子对于甲状腺素具有增加的亲和力而有所增加的甲状腺素与TTR的缔合之后发生。参看例如摩西(Moses)等人(1982)《临床研究杂志》(J.Clin.Invest.)，86，2025-2033。
异常的成淀粉样蛋白质可以或者被遗传或者通过体细胞突变获取。关J.等人(2011年11月4日)心脏淀粉样变性的当前看法，《美国生理学杂志-心脏与循环生理学》，doi：10.1152/ajpheart.00815.2011。甲状腺素运载蛋白相关ATTR是遗传性全身性淀粉样变性的最常见形式。洛巴托L.(Lobato，L.)(2003)《肾脏学杂志》(J.Nephrol.)，16：438-442。TTR突变加速了TTR淀粉样形成的过程，并且是ATTR发展的最重要的风险因素。已知多于85种成淀粉样TTR变体引起全身性家族性淀粉样变性。TTR突变通常引起全身性淀粉样沉积，特别累及周围神经系统，但一些突变与心肌病或玻璃体混浊相关。同前。
V30M突变是最普遍的TTR突变。参看例如洛巴托L.(2003)《肾脏学杂志》，16：438-442。非裔美国人群体中有3.9％携带V122I突变，并且它是FAC的最常见病因。雅各布森D.R.(Jacobson，D.R.)等人(1997)《新英格兰医学杂志》(N.Engl.J.Med.)336(7)：466-73。据估计，SSA影响了多于25％的超过80岁的群体。韦斯特马克P.(Westermark，P.)等人(1990)《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)87(7)：2843-5。
因此，在本领域中存在对用于TTR相关疾病的有效治疗的需要。
发明内容
本发明提供了靶向甲状腺素运载蛋白(TTR)基因的RNAi试剂(例如双链RNAi试剂)。本发明还提供了使用本发明的这些RNAi试剂(例如双链RNAi试剂)抑制TTR表达的方法和治疗或预防一名受试者中的一种TTR相关疾病的方法。本发明至少部分基于以下发现，包含具体化学修饰的RNAi试剂展示一种优越的抑制TTR表达的能力。包括某一模式的化学修饰(例如一种交替模式)和一个配体的试剂在此被展示为在使TTR基因的活性沉默方面是有效的。此外，包括一个或多个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序、在试剂的裂解位点处或附近包括一个这样的基序的试剂展示了出人意料地增强的TTR基因沉默活性。当一个这样的单个化学基序存在于该试剂中时，它优选在裂解区处或附近以便增强基因沉默活性。裂解区是环绕裂解位点(即该标靶mRNA上的裂解发生所处的位点)的区。
因此，在一个方面，本发明特征是RNAi试剂(例如双链RNAi试剂)，用于抑制一种甲状腺素运载蛋白(TTR)的表达。该双链RNAi试剂包括与一条反义链互补的一条有义链。该反义链包括与一种编码甲状腺素运载蛋白的mRNA的一部分互补的一个区。每条链具有14到30个核苷酸，并且该双链RNAi试剂由式(III)表示：
有义链：5′np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3′
反义链：3′np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)1-Na′-nq′5′
(III)。
在式III中，i、j、k以及1各自独立地是0或1；p、p′、q以及q′各自独立地是0-6；每个Na和Na′独立地表示包括0-25个或者被修饰或者未被修饰或者其组合的核苷酸的一个寡核苷酸序列，每个序列包括至少两个被不同地修饰的核苷酸；每个Nb和Nb′独立地表示包括0-10个或者被修饰或者未被修饰或者其组合的核苷酸的一个寡核苷酸序列；每个np、np′、nq以及nq′独立地表示一个突出端核苷酸；XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′以及Z′Z′Z′各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序；Nb上的修饰不同于Y上的修饰，并且Nb′上的修饰不同于Y′上的修饰。在一些实施例中，该有义链与至少一个配体(例如至少一个配体，例如至少一个连接到该有义链的3′端的配体)结合。在其他实施例中，该配体可以与该反义链结合。
在一些实施例中，i是1；j是1；或i和j都是1。
在一些实施例中，k是1；1是1；或k和1都是1。
在一些实施例中，i是0；j是1。
在一些实施例中，i是1；j是0。
在一些实施例中，k是0；1是1。
在一些实施例中，k是1；1是0。
在一些实施例中，XXX与X′X′X′互补，YYY与Y′Y′Y′互补，并且ZZZ与Z′Z′Z′互补。
在一些实施例中，该YYY基序存在于该有义链的裂解位点处或附近。
在一些实施例中，该Y′Y′Y′基序存在于该反义链的从5’端起的11、12以及13位处。
在一些实施例中，该Y′是2′-O-甲基。
在一些实施例中，该Y′是2′-氟基。
在一些实施例中，式(III)被表示为式(IIIa)：
有义链：5′np-Na-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3′
反义链：3′np′-Na′-Y′Y′Y′-Nb′-Z′Z′Z′-Na′nq′5′
(IIIa)。
在式IIIa中，每个Nb和Nb′独立地表示包括1-5个被修饰的核苷酸的一个寡核苷酸序列。
在一些实施例中，式(III)被表示为式(IIIb)：
有义链：5′np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Na-nq 3′
反义链：3′np′-Na′-X′X′X′-Nb′-Y′Y′Y′-Na′-nq′5′
(IIIb)。
在式IIIb中，每个Nb和Nb′独立地表示包括1-5个被修饰的核苷酸的一个寡核苷酸序列。
在一些实施例中，式(III)被表示为式(IIIc)：
有义链：5′np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq3′
反义链：3′np′-Na′-X′X′X′-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-Z′Z′Z′-Na′-nq′5′
(IIIc)。
在式IIIc中，每个Nb和Nb′独立地表示包括1-5个被修饰的核苷酸的一个寡核苷酸序列，并且每个Na和Na′独立地表示包括2-10个被修饰的核苷酸的一个寡核苷酸序列。
在许多实施例中，该双链体区具有15-30个核苷酸对长度。在一些实施例中，该双链体区具有17-23个核苷酸对长度、17-25个核苷酸对长度、23-27个核苷酸对长度、19-21个核苷酸对长度或21-23个核苷酸对长度。
在某些实施例中，每条链具有15-30个核苷酸。
在一些实施例中，这些核苷酸上的这些修饰选自下组，该组由以下各项组成：LNA、HNA、CeNA、2′-甲氧基乙基、′-O-烷基、2′-O-烯丙基、2′-C-烯丙基、2′-氟基、2′-脱氧、2′-羟基及其组合。在一些优选实施例中，这些核苷酸上的这些修饰是2′-O-甲基或2′-氟基。
在一些实施例中，该配体是通过一种二价或三价支链连接子连接的一种或多种N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物。在具体实施例中，该配体是
在一些实施例中，该配体连接到该有义链的3′端。
在一些实施例中，该RNAi试剂与如以下结构式中所示的配体结合：
其中X是O或S。
在一些实施例中，该RNAi试剂与如以下结构式中所示的配体结合：
在一些实施例中，该RNAi试剂进一步包括至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联。在一些实施例中，该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联在一条链的3′末端处。在一些实施例中，该链是该反义链。在其他实施例中，该链是该有义链。
在某些实施例中，该双链体的5′端的1位处的碱基对是一个AU碱基对。
在一些实施例中，这些Y核苷酸含有一个2′-氟基修饰。
在一些实施例中，这些Y′核苷酸含有一个2′-O-甲基修饰。
在一些实施例中，p′＞0。在一些这样的实施例中，每个n与该标靶mRNA互补。在其他这样的实施例中，每个n与该标靶mRNA不互补。在一些实施例中，p、p′、q以及q′是1-6。在一些优选实施例中，p′＝1或2。在一些优选实施例中，p′＝2。在一些这样的实施例中，q′＝0，p＝0，q＝0，并且p′突出端核苷酸与该标靶mRNA互补。在其他这样的实施例中，q′＝0，p＝0，q＝0，并且p′突出端核苷酸与该标靶mRNA不互补。
在一些实施例中，该有义链具有总共21个核苷酸，并且该反义链具有总共23个核苷酸。
在某些实施例中，np′之间的键联包括硫代磷酸酯键联。在一些这样的实施例中，np′之间的键联是硫代磷酸酯键联。
在一些实施例中，该RNAi试剂选自表1中列出的试剂的群组。
在优选实施例中，该RNAi试剂选自下组，该组由以下各项组成：AD-51544、AD-51545、AD-51546以及AD-51547。
在一个甚至更优选的实施例中，该RNAi试剂是具有以下结构的AD-51547：
有义链：5’-UfgGfgAfuUfuCfAfUfgUfaacCfaAfgAfL96-3’(SEQ ID NO：2)
反义链：5’-uCfuUfgGfUfUfaCfaugAfaAfuCfcCfasUfsc-3’(SEQ ID NO：3)
其中小写字母核苷酸(a、u、g、c)表示2′-O-甲基核苷酸；Nf(例如Af)表示一个2′-氟基核苷酸；s表示一个硫代磷酸酯键联；L96表示一个GalNAc3配体。
在另一个方面，本发明特征是一种含有该RNAi试剂的细胞，用于抑制TTR表达。
在另一个方面，本发明特征是一种包含一种RNAi试剂的药物组合物，用于抑制TTR表达。在一些实施例中，该药物组合物是一种包含该RNAi试剂的溶液。在一些实施例中，包含该RNAi试剂的该溶液是一种非缓冲溶液，例如生理盐水溶液或水。在其他实施例中，该溶液是一种缓冲溶液，例如一种磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)的溶液。在其他实施例中，该药物组合物是一种脂质体或一种脂质配制品。在一些实施例中，该脂质配制品包含一种XTC或MC3。
在又另一个方面，本发明特征是抑制一种细胞中的甲状腺素运载蛋白(TTR)表达的方法。这些方法包括使一种细胞与一种RNAi试剂(例如一种双链RNAi试剂)以有效抑制该细胞中的TTR表达的一个量接触，从而抑制该细胞中的TTR表达。
在一些实施例中，该TTR表达被抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％。
在其他实施例中，该细胞在体外与该RNAi试剂接触。在其他实施例中，该细胞存在于一名受试者内。在优选实施例中，该受试者是一个人。
在其他实施例中，该受试者是罹患一种TTR相关疾病的一名受试者，并且该有效量是一个治疗有效量。在其他实施例中，该受试者是有风险患上一种TTR相关疾病的一名受试者，并且该有效量是一个预防有效量。在一些实施例中，有风险患上一种TTR相关疾病的一名受试者是携带与一种TTR相关疾病的发展相关的一种TTR基因突变的一名受试者。
在某些实施例中，该TTR相关疾病选自下组，该组由以下各项组成：老年全身性淀粉样变性(SSA)、全身性家族性淀粉样变性、家族性淀粉样多发性神经病(FAP)、家族性淀粉样心肌病(FAC)、软脑膜/中枢神经系统(CNS)淀粉样变性以及高甲状腺素血症。
在一些实施例中，该受试者具有一种TTR相关淀粉样变性，并且该方法减少该受试者中的一种淀粉样TTR沉积物。
在其他实施例中，该RNAi试剂通过一种选自下组的给药手段给予给该受试者，该组由以下各项组成：皮下、静脉内、肌肉内、支气管内、胸膜内、腹膜内、动脉内、经淋巴、经脑脊髓及其任何组合。在某些实施例中，该RNAi试剂经由皮下或静脉内给药而给予给该受试者。在优选实施例中，该RNAi试剂经由皮下给药而给予给该受试者。在一些这样的实施例中，该皮下给药包括经由一个皮下泵或皮下储槽给药。
在某些实施例中，该RNAi试剂被给予给该受试者，以使得该RNAi试剂被递送到该受试者内的一个具体部位。在一些实施例中，该部位选自下组，该组由以下各项组成：肝脏、脉络丛、视网膜以及胰腺。在优选实施例中，该部位是肝脏。在一些实施例中，该RNAi试剂的递送由肝细胞中存在的脱唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)介导。
在一些实施例中，该RNAi试剂以约0.25mg/kg到约50mg/kg之间、例如约0.25mg/kg到约0.5mg/kg之间、约0.25mg/kg到约1mg/kg之间、约0.25mg/kg到约5mg/kg之间、约0.25mg/kg到约10mg/kg之间、约1mg/kg到约10mg/kg之间、约5mg/kg到约15mg/kg之间、约10mg/kg到约20mg/kg之间、约15mg/kg到约25mg/kg之间、约20mg/kg到约30mg/kg之间、约25mg/kg到约35mg/kg之间或约40mg/kg到约50mg/kg之间的一个剂量给予。
在一些实施例中，该RNAi试剂以约0.25mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约11mg/kg、约12mg/kg、约13mg/kg、约14mg/kg、约15mg/kg、约16mg/kg、约17mg/kg、约18mg/kg、约19mg/kg、约20mg/kg、约21mg/kg、约22mg/kg、约23mg/kg、约24mg/kg、约25mg/kg、约26mg/kg、约27mg/kg、约28mg/kg、约29mg/kg、30mg/kg、约31mg/kg、约32mg/kg、约33mg/kg、约34mg/kg、约35mg/kg、约36mg/kg、约37mg/kg、约38mg/kg、约39mg/kg、约40mg/kg、约41mg/kg、约42mg/kg、约43mg/kg、约44mg/kg、约45mg/kg、约46mg/kg、约47mg/kg、约48mg/kg、约49mg/kg或约50mg/kg的一个剂量给予。
在一些实施例中，该RNAi试剂在两个或更多个剂量中给予。在具体实施例中，该RNAi试剂以选自下组的时间间隔给予，该组由以下各项组成：每隔约2小时一次、每隔约3小时一次、每隔约4小时一次、每隔约6小时一次、每隔约8小时一次、每隔约12小时一次、每隔约24小时一次、每隔约48小时一次、每隔约72小时一次、每隔约96小时一次、每隔约120小时一次、每隔约144小时一次、每隔约168小时一次、每隔约240小时一次、每隔约336小时一次、每隔约504小时一次、每隔约672小时一次以及每隔约720小时一次。
在其他实施例中，该方法进一步包括评估来源于该受试者的一种样品中的TTRmRNA表达或TTR蛋白质表达的水平。
在优选实施例中，给予该RNAi试剂不在该受试者中产生一种炎症应答，如基于来自该受试者的一种样品中的一种选自下组的细胞因子或趋化因子的水平而评估，该组由以下各项组成：G-CSF、IFN-γ、IL-10、IL-12(p70)、IL1β、IL-1ra、IL-6、IL-8、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、TNFα及其任何组合。
在一些实施例中，该RNAi试剂使用一种药物组合物给予。
在优选实施例中，该RNAi试剂在一种溶液中给予。在一些这样的实施例中，该siRNA在一种非缓冲溶液中给予。在一个实施例中，该siRNA在水中给予。在其他实施例中，该siRNA与一种缓冲溶液(如一种乙酸盐缓冲液、一种柠檬酸盐缓冲液、一种醇溶谷蛋白缓冲液、一种碳酸盐缓冲液或一种磷酸盐缓冲液或其任何组合)给予。在一些实施例中，该缓冲溶液是磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)。
在另一个实施例中，该药物组合物是包含SNALP或XTC的一种脂质体或一种脂质配制品。在一个实施例中，该脂质配制品包含一种MC3。
在另一个方面，本发明提供了治疗或预防一名受试者中的一种TTR相关疾病的方法。这些方法包括给予该受试者一个治疗有效量或预防有效量的一种RNAi试剂(例如一种双链RNAi试剂)，从而治疗或预防该受试者中的该TTR相关疾病。
在一些实施例中，来源于该受试者的一种样品中的TTR表达被抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％或至少约70％、至少约80％或至少约90％。
在一些实施例中，该受试者是一个人。
在一些实施例中，该受试者是罹患一种TTR相关疾病的一名受试者。在其他实施例中，该受试者是有风险患上一种TTR相关疾病的一名受试者。
在一些实施例中，该受试者是携带与一种TTR相关疾病的发展相关的一种TTR基因突变的一名受试者。
在某些实施例中，该TTR相关疾病选自下组，该组由以下各项组成：老年全身性淀粉样变性(SSA)、全身性家族性淀粉样变性、家族性淀粉样多发性神经病(FAP)、家族性淀粉样心肌病(FAC)、软脑膜/中枢神经系统(CNS)淀粉样变性以及高甲状腺素血症。
在一些实施例中，该受试者具有一种TTR相关淀粉样变性，并且该方法减少该受试者中的一种淀粉样TTR沉积物。
在一些实施例中，该RNAi试剂通过一种选自下组的给药手段给予给该受试者，该组由以下各项组成：皮下、静脉内、肌肉内、支气管内、胸膜内、腹膜内、动脉内、经淋巴、经脑脊髓及其任何组合。在某些实施例中，该RNAi试剂经由皮下或静脉内给药而给予给该受试者。在优选实施例中，该RNAi试剂经由皮下给药而给予给该受试者。在一些这样的实施例中，该皮下给药包括经由一个皮下泵或皮下储槽给药。
在某些实施例中，该RNAi试剂被给予给该受试者，以使得该RNAi试剂被递送到该受试者内的一个具体部位。在一些这样的实施例中，该部位选自下组，该组由以下各项组成：肝脏、脉络丛、视网膜以及胰腺。在优选实施例中，该部位是肝脏。在一些实施例中，该RNAi试剂的递送由肝细胞中存在的脱唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)介导。
在一些实施例中，该RNAi试剂以约0.25mg/kg到约50mg/kg之间、例如约0.25mg/kg到约0.5mg/kg之间、约0.25mg/kg到约1mg/kg之间、约0.25mg/kg到约5mg/kg之间、约0.25mg/kg到约10mg/kg之间、约1mg/kg到约10mg/kg之间、约5mg/kg到约15mg/kg之间、约10mg/kg到约20mg/kg之间、约15mg/kg到约25mg/kg之间、约20mg/kg到约30mg/kg之间、约25mg/kg到约35mg/kg之间或约40mg/kg到约50mg/kg之间的一个剂量给予。
在一些实施例中，该RNAi试剂以约0.25mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约11mg/kg、约12mg/kg、约13mg/kg、约14mg/kg、约15mg/kg、约16mg/kg、约17mg/kg、约18mg/kg、约19mg/kg、约20mg/kg、约21mg/kg、约22mg/kg、约23mg/kg、约24mg/kg、约25mg/kg、约26mg/kg、约27mg/kg、约28mg/kg、约29mg/kg、30mg/kg、约31mg/kg、约32mg/kg、约33mg/kg、约34mg/kg、约35mg/kg、约36mg/kg、约37mg/kg、约38mg/kg、约39mg/kg、约40mg/kg、约41mg/kg、约42mg/kg、约43mg/kg、约44mg/kg、约45mg/kg、约46mg/kg、约47mg/kg、约48mg/kg、约49mg/kg或约50mg/kg的一个剂量给予。
在一些实施例中，该RNAi试剂在两个或更多个剂量中给予。在具体实施例中，该RNAi试剂以选自下组的时间间隔给予，该组由以下各项组成：每隔约2小时一次、每隔约3小时一次、每隔约4小时一次、每隔约6小时一次、每隔约8小时一次、每隔约12小时一次、每隔约24小时一次、每隔约48小时一次、每隔约72小时一次、每隔约96小时一次、每隔约120小时一次、每隔约144小时一次、每隔约168小时一次、每隔约240小时一次、每隔约336小时一次、每隔约504小时一次、每隔约672小时一次以及每隔约720小时一次。
在其他实施例中，该方法进一步包括评估来源于该受试者的一种样品中的TTRmRNA表达或TTR蛋白质表达的水平。
在优选实施例中，给予该RNAi试剂不在该受试者中产生一种炎症应答，如基于来自该受试者的一种样品中的一种选自下组的细胞因子或趋化因子的水平而评估，该组由以下各项组成：G-CSF、IFN-γ、IL-10、IL-12(p70)、IL1β、IL-1ra、IL-6、IL-8、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、TNFα及其任何组合。
在一些实施例中，该RNAi试剂使用一种药物组合物(例如一种脂质体)给予。
在一些实施例中，该RNAi试剂在一种溶液中给予。在一些这样的实施例中，该siRNA在一种非缓冲溶液中给予。在一个实施例中，该siRNA在生理盐水或水中给予。在其他实施例中，该siRNA与一种缓冲溶液(如一种乙酸盐缓冲液、一种柠檬酸盐缓冲液、一种醇溶谷蛋白缓冲液、一种碳酸盐缓冲液或一种磷酸盐缓冲液或其任何组合)给予。在一些实施例中，该缓冲溶液是磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)。
在另一个方面，本发明提供了一种抑制一种细胞中的甲状腺素运载蛋白(TTR)表达的方法，包括使一种细胞与一种RNAi试剂(例如一种双链RNAi试剂)以有效抑制该细胞中的TTR表达的一个量接触。在一个方面，该双链RNAi试剂选自表1中列出的试剂的群组，从而抑制该细胞中的甲状腺素运载蛋白(TTR)表达。
在另一个方面，本发明提供了一种抑制一种细胞中的甲状腺素运载蛋白(TTR)表达的方法，包括使一种细胞与一种RNAi试剂(例如一种双链RNAi试剂)以有效抑制该细胞中的TTR表达的一个量接触。在一个方面，该双链RNAi试剂选自下组，该组由以下各项组成：AD-51544、AD-51545、AD-51546以及AD-51547，从而抑制该细胞中的甲状腺素运载蛋白(TTR)表达。
在另一个方面，本发明提供了一种治疗或预防一名受试者中的一种TTR相关疾病的方法，包括给予该受试者一个治疗有效量或一个预防有效量的一种RNAi试剂(例如一种双链RNAi试剂)。在一个方面，该双链RNAi试剂选自表1中列出的试剂的群组，从而治疗或预防该受试者中的一种TTR相关疾病。
在又另一个方面，本发明提供了一种治疗或预防一名受试者中的一种TTR相关疾病的方法，包括给予该受试者一个治疗有效量或一个预防有效量的一种RNAi试剂(例如一种双链RNAi试剂)。在一个方面，该双链RNAi试剂选自下组，该组由以下各项组成：AD-51544、AD-51545、AD-51546以及AD-51547，从而治疗或预防该受试者中的一种TTR相关疾病。
在其他方面，本发明提供了用于执行本发明的这些方法的试剂盒。在一个方面，本发明提供了一种试剂盒，用于执行一种抑制一种细胞中的甲状腺素运载蛋白(TTR)表达的方法，该方法包括使一种细胞与一种RNAi试剂(例如一种双链RNAi试剂)以有效抑制所述细胞中的所述TTR表达的一个量接触，从而抑制该细胞中的该TTR表达。该试剂盒包括一种RNAi试剂和使用说明书以及任选地用于将该RNAi试剂给予给该受试者的工具。
本发明由以下详细说明和图式进一步展示。
附图简要说明
图1是一幅图，描绘出给予小鼠一个单个皮下剂量的一种靶向TTR的GalNAc结合RNAi试剂导致TTR mRNA的剂量依赖性抑制。
图2是一幅图，描绘出给予小鼠一个7.5mg/kg或30mg/kg的单个皮下剂量的一种靶向TTR的GalNAc结合RNAi试剂导致TTR mRNA的持久抑制。
图3描绘了人类TTR mRNA序列。
图4是一幅图，描绘出被修饰的RNAi试剂相对于母体AD-45163的改进的沉默活性。
图5是一幅图，描绘出被修饰的RNAi试剂相对于母体AD-45165的改进的沉默活性。
图6是一幅图，描绘出在与被修饰的RNAi试剂一起孵育4小时之后相对于母体AD-45163改进的自由摄取沉默。
图7是一幅图，描绘出在与被修饰的RNAi试剂一起孵育24小时之后相对于母体AD-45163改进的自由摄取沉默。
图8是描绘出在与被修饰的RNAi试剂一起孵育4小时之后相对于母体AD-45165改进的自由摄取沉默的图。
图9是一幅图，描绘出在与被修饰的RNAi试剂一起孵育24小时之后相对于母体AD-45165改进的自由摄取沉默。
图10是一幅图，描绘出在给予一个单个皮下剂量的RNAi试剂AD-51544、AD-51545、AD-45163、AD-51546、AD-51547或AD-45165之后表达hTTR V30M的转基因小鼠中的TTR mRNA的沉默。
图11是一幅图，描绘出在给予一个5mg/kg或1mg/kg的单个皮下剂量的RNAi试剂AD-51544、AD-51545或AD-45163之后表达hTTR V30M的转基因小鼠中的TTR蛋白质抑制。
图12是一幅图，描绘出在给予一个5mg/kg或1mg/kg的单个皮下剂量的RNAi试剂AD-51546、AD-51547或AD-45165之后表达hTTR V30M的转基因小鼠中的TTR蛋白质抑制。
图13描绘了用于接受5×5mg/kg RNAi试剂(顶线)或1×25mg/kg RNAi试剂(底线)的猴中的给药后抽血的方案。
图14是描绘出在皮下给予五个5mg/kg剂量(上图)或一个单个25mg/kg剂量(下图)的AD-45163、AD-51544、AD-51545、AD-51546或AD-51547之后非人类灵长类动物中的TTR蛋白质抑制的图。
图15是一幅图，描绘出在皮下给予2.5mg/kg(白色方块)、5mg/kg(黑色方块)或10mg/kg(图案化的方块)/剂量的AD-51547或给予PBS作为一种阴性对照(灰色方块)之后非人类灵长类动物中的TTR蛋白质抑制。
发明详细说明
本发明提供了靶向甲状腺素运载蛋白(TTR)基因的RNAi试剂(例如双链RNAi试剂)和组合物。本发明还提供了使用本发明的这些RNAi试剂(例如双链RNAi试剂)抑制TTR表达的方法和治疗或预防一名受试者中的一种TTR相关疾病的方法。本发明至少部分基于以下发现，包含具体化学修饰的RNAi试剂展示一种优越的抑制TTR表达的能力。包括某一模式的化学修饰(例如一种交替模式)和一个配体的试剂在此被展示为在使TTR基因的活性沉默方面是有效的。此外，包括一个或多个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序、在试剂的裂解位点处或附近包括一个这样的基序的试剂展示了出人意料地增强的TTR基因沉默活性。当一个这样的单个化学基序存在于该试剂中时，它优选在裂解区处或附近以便增强基因沉默活性。裂解区是环绕裂解位点(即该标靶mRNA上的裂解发生所处的位点)的区。
I.定义
如在此所用，以下术语中的每一者在这一部分中具有与其相关的含义。
术语“包括”在此用以意指短语“包括(但不限于)”并且与其可互换使用。
除非上下文另外明确指示，否则术语“或”在此用以意指术语“和/或”并且与其可互换使用。
如在此所用，一种“甲状腺素运载蛋白”(“TTR”)是指熟知的基因和蛋白质。TTR也称为前白蛋白、HsT2651、PALB以及TBPA。TTR充当视黄醇结合蛋白(RBP)、甲状腺素(T4)以及视黄醇的一种运载体，并且它还充当一种蛋白酶。肝脏将TTR分泌到血液中，并且脉络丛将TTR分泌到脑脊髓液中。TTR还表达于胰腺和视网膜色素上皮细胞中。TTR的最大临床相关性在于，正常和突变TTR蛋白质都可能会形成聚集成细胞外沉积物、从而造成淀粉样变性的淀粉样原纤维。评述参看例如萨赖瓦M.J.M.(2002)《分子医学专家评论》，4(12)：1-11。大鼠甲状腺素运载蛋白的分子克隆和核苷酸序列以及mRNA表达的分布由迪克森P.W.(Dickson，P.W.)等人(1985)《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)260(13)8214-8219描述。人类TTR的X射线晶体结构描述于布莱克C.C.(Blake，C.C.)等人(1974)《分子生物学杂志》(J Mol Biol)88，1-12中。一种人类TTR mRNA转录物的序列可以见于国家生物技术信息中心(NCBI)RefSeq登录号NM_000371。小鼠TTR mRNA的序列可以见于RefSeq登录号NM_013697.2，并且大鼠TTR mRNA的序列可以见于RefSeq登录号NM_012681.1。
如在此所用，“标靶序列”是指在一种TTR基因转录期间形成的一种mRNA分子的核苷酸序列的一个连续部分，包括作为RNA加工一种初级转录产物的一种产物的mRNA。
如在此所用，术语“包含一个序列的链”是指包含由使用标准核苷酸命名法提及的序列描述的核苷酸链的一种寡核苷酸。
“G”、“C”、“A”以及“U”每一者一般对应地代表含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤以及尿嘧啶作为一种碱基的一种核苷酸。“T”和“dT”在此可互换使用并且是指其中核碱基是胸腺嘧啶(例如脱氧核糖胸腺嘧啶)、2′-脱氧胸苷或胸苷的一种脱氧核糖核苷酸。然而，应理解，术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”或“脱氧核糖核苷酸”也可以指一种如下文进一步详述的被修饰的核苷酸或一种替代置换部分。熟练的人员充分认识到，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤以及尿嘧啶可以被其他部分置换而不实质上改变包含一种携带这样的置换部分的核苷酸的一种寡核苷酸的碱基配对性质。举例来说(但不限于)，一种包含肌苷作为其碱基的核苷酸可以与含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸碱基配对。因此，含有尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以在本发明的核苷酸序列中被一种含有例如肌苷的核苷酸所置换。包含这样的置换部分的序列是本发明的实施例。
如在此可互换使用，一种“双链RNAi试剂”、双链RNA(dsRNA)分子(也称为“dsRNA试剂”、“dsRNA”)、“siRNA”、“iRNA试剂”是指核糖核酸分子的一种复合物，具有一种包含两条如下文定义的反向平行并且实质上互补的核酸链的双链体结构。一般来说，每条链的大多数核苷酸是核糖核苷酸，但如在此详细描述，每条或两条链还可以包括一种或多种非核糖核苷酸，例如一种脱氧核糖核苷酸和/或一种被修饰的核苷酸。另外，如本说明书中所用，一种“RNAi试剂”可以包括具有化学修饰的核糖核苷酸；一种RNAi试剂可以在多个核苷酸处包括实质性修饰。这样的修饰可以包括在此披露或本领域中已知的所有类型的修饰。如一种siRNA型分子中所使用，任何这样的修饰出于本说明书和权利要求书的目的都由“RNAi试剂”涵盖。
在另一个实施例中，该RNAi试剂可以是被引入一种细胞或生物体中以抑制一种标靶mRNA的一种单链siRNA。单链RNAi试剂结合到RISC核酸内切酶Argonaute 2，该核酸内切酶然后裂解该标靶mRNA。单链siRNA一般具有15-30个核苷酸并且被化学修饰。单链siRNA的设计和测试描述于美国专利号8,101,348和利马(Lima)等人，(2012)《细胞》(Cell)150：883-894中，各自的全文内容特此通过引用结合在此。在此描述的反义核苷酸序列中的任一者可以用作一种如在此描述或如通过利马等人，(2012)《细胞》150；：883-894中所述的方法化学修饰的单链siRNA。
形成双链体结构的两条链可以是一个更大RNA分子的不同部分，或者它们可以是单独的RNA分子。在这两条链是一个更大分子的一部分并且因此在一条链的3′端与对应的另一条链的5′端之间通过一个非中断核苷酸链连接从而形成该双链体结构时，该连接RNA链被称为一种“发夹环”。在这两条链在一条链的3′端与对应的另一条链的5′端之间通过除一个非中断核苷酸链以外的手段共价连接从而形成该双链体结构时，该连接结构被称为一种“连接子”。这些RNA链可以具有相同或不同数目的核苷酸。碱基对的最大数目是该dsRNA的最短链中的核苷酸数目减去该双链体中存在的任何突出端。除了该双链体结构之外，一种RNAi试剂还可以包含一个或多个核苷酸突出端。术语“siRNA”在此也用以指一种如上文所述的RNAi试剂。
在另一个方面，该试剂是一种单链反义RNA分子。一种反义RNA分子与该标靶mRNA内的一个序列互补。反义RNA可以通过与该mRNA碱基配对并且物理阻隔翻译机构以一种化学计量方式抑制翻译，参看狄亚斯N.(Dias，N.)等人，(2002)《分子癌症治疗学》(MolCancer Ther)1：347-355。该反义RNA分子可以具有约15-30个与该标靶mRNA互补的核苷酸。举例来说，该反义RNA分子可以具有来自表1的反义序列之一的具有至少15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个连续核苷酸的一个序列。
如在此所用，一个“核苷酸突出端”是指当一种RNAi试剂的一条链的一个3′端延伸超出另一条链的5′端时从该RNAi试剂的双链体结构突出的一个或多个不成对的核苷酸，或反之亦然。“钝的”或“钝端”意指在该双链RNAi试剂的那端处不存在不成对的核苷酸，即无核苷酸突出端。一种“钝端的”RNAi试剂是一种在其整个长度上都是双链、即在该分子的任一端处都无核苷酸突出端的dsRNA。本发明的RNAi试剂包括在一端处具有核苷酸突出端(即具有一个突出端和一个钝端的试剂)或在两端处都具有核苷酸突出端的RNAi试剂。
术语“反义链”是指一种双链RNAi试剂的包括与一种标靶序列(例如一种人类TTRmRNA)实质上互补的一个区的链。如在此所用，术语“与一种编码甲状腺素运载蛋白的mRNA的一部分互补的区”是指该反义链上的与一种TTR mRNA序列的一部分实质上互补的一个区。在具有互补性的该区与该标靶序列不完全互补时，错配在末端区中耐受性最大，并且如果存在，那么一般在一个末端区或例如5′和/或3′末端的6个、5个、4个、3个或2个核苷酸内的区中耐受性最大。
如在此所用，术语“有义链”是指一种dsRNA的包括与该反义链的一个区实质上互补的一个区的链。
如在此所用，术语“裂解区”是指定位得与该裂解位点紧紧相邻的一个区。该裂解位点是该标靶上的裂解发生所处的位点。在一些实施例中，该裂解区包含三个在该裂解位点的任一端上并且与其紧紧相邻的碱基。在一些实施例中，该裂解区包含两个在该裂解位点的任一端上并且与其紧紧相邻的碱基。在一些实施例中，该裂解位点具体来说存在于由该反义链的核苷酸10和11结合的位点处，并且该裂解区包含核苷酸11、12以及13。
如在此所用，并且除非另外指示，否则术语“互补”当用以相对于一个第二核苷酸序列描述一个第一核苷酸序列时，是指包含该第一核苷酸序列的一种寡核苷酸或多核苷酸在某些条件下与包含该第二核苷酸序列的一种寡核苷酸或多核苷酸杂交并且形成一种双链体结构的能力，如熟练的人员所理解。这样的条件可以例如是严格条件，其中严格条件可以包括：400mM NaCl，40mM PIPES pH 6.4，1mM EDTA，50℃或70℃持续12-16小时，接着洗涤。可以应用其他条件，如可能在一种生物体中遇到的生理学相关条件。熟练的人员将能够根据这些杂交的核苷酸的最终应用来确定最适用于两个序列的互补性测试的条件组。
当该第一核苷酸序列的这些核苷酸与该第二核苷酸序列的这些核苷酸在该第一和该第二核苷酸序列的整个长度上存在碱基配对时，序列可以是相对于每一者“完全互补”。然而，在此一个第一序列被称为相对于一个第二序列“实质上互补”时，这两个序列可以是完全互补，或它们可以在杂交后形成一个或多个、但一般来说不超过4个、3个或2个错配的碱基对同时维持在与其最终应用最相关的条件下杂交的能力。然而，在两个寡核苷酸被设计以在杂交后形成一个或多个单链突出端时，这样的突出端对于互补性确定不应被视为错配。举例来说，出于在此描述的目的，以下这样一种dsRNA又可以被称为“完全互补”：该dsRNA包含一个21个核苷酸长度的寡核苷酸和另一个23个核苷酸长度的寡核苷酸，其中该更长寡核苷酸包含一个具有与该更短寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列。
如在此所用，就满足以上关于其杂交的能力的要求来说，“互补”序列还可以包括或完全形成自非沃森-克里克碱基对和/或从非天然的和被修饰的核苷酸形成的碱基对。这样的非沃森-克里克碱基对包括(但不限于)G：U摇摆(Wobble)或Hoogstein碱基配对。
在此术语“互补”、“完全互补”以及“实质上互补”可以关于一种dsRNA的有义链与反义链之间或一种dsRNA的反义链与一种标靶序列之间的碱基匹配使用，如将从其用途的上下文了解到。
如在此所用，“与”一种信使RNA(mRNA)“的至少一部分实质上互补”的一种多核苷酸是指与该感兴趣的mRNA(例如一种编码TTR的mRNA)的一个连续部分(包括一个5′UTR、一个开放阅读框(ORF)或一个3′UTR)实质上互补的一种多核苷酸。举例来说，一种多核苷酸在该序列与一种编码TTR的mRNA的一个非中断部分实质上互补时与一种TTR mRNA的至少一部分互补。
如在此所用，术语“抑制”与“减少”、“沉默”、“下调”、“抑止”以及其他类似术语可互换使用，并且包括任何水平的抑制。
如在此所用，短语“抑制一种TTR的表达”包括抑制任何TTR基因(如例如一种小鼠TTR基因、一种大鼠TTR基因、一种猴TTR基因或一种人类TTR基因)以及一种TTR基因的变体或突变体的表达。因此，该TTR基因可以是一种野生型TTR基因、一种突变TTR基因(如一种引起全身性淀粉样沉积的突变TTR基因)或在一种基因操纵的细胞、细胞群组或生物体的情形下是一种转基因TTR基因。
“抑制一种TTR基因的表达”包括一种TTR基因的任何水平的抑制，例如至少部分抑制一种TTR基因的表达，如至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的一个抑制。
一种TTR基因的表达可以基于与TTR基因表达相关的任何变量的水平(例如TTRmRNA水平、TTR蛋白质水平、视黄醇结合蛋白水平、维生素A水平或淀粉样沉积物的数目或程度)来评估。抑制可以通过这些变量中的一者或多者的一个绝对或相对水平与一个对照水平相比的一个降低来评估。该对照水平可以是本领域中所用的任何类型的对照水平，例如，一个投药前基线水平或从未被处理或被一个对照(如例如仅缓冲液的对照或非活性试剂对照)处理的一个类似受试者、细胞或样品测定的一个水平。
如在此所用，短语“使一种细胞与一种RNAi试剂接触”包括通过任何可能手段使一种细胞接触。使一种细胞与一种RNAi试剂(例如一种双链RNAi试剂)接触包括使一种细胞在体外与该RNAi试剂接触或使一种细胞在体内与该RNAi试剂接触。该接触可以直接或间接进行。因此，举例来说，该RNAi试剂可以由执行该方法的个体安置得与该细胞物理接触，或可替代地，该RNAi试剂可以被安置为一种将允许或引起其随后与该细胞接触的情况。
使一种细胞在体外接触可以例如通过与该RNAi试剂一起孵育该细胞来进行。使一种细胞在体内接触可以例如通过以下方式来进行，通过将该RNAi试剂注射到该细胞所位于的组织中或其附近，或通过将该RNAi试剂注射到另一个区域(例如血流或皮下空间)中以使得该试剂随后将到达待接触的该细胞所位于的该组织。举例来说，该RNAi试剂可以含有和/或偶联到将该RNAi试剂指引到一个感兴趣的部位(例如肝脏)的一个配体(例如一个GalNAc3配体)。体外和体内接触方法的组合也是可能的。结合本发明的这些方法，一种细胞还可以在体外与一种RNAi试剂接触并且随后移植到一名受试者中。
如在此所用，一名“患者”或“受试者”旨在包括一个或者人类或者非人类动物，优选地一个哺乳动物，例如一只猴。最优选地，该受试者或患者是一个人。
如在此所用，一种“TTR相关疾病”旨在包括任何与TTR基因或蛋白质相关的疾病。这种疾病可以例如由TTR蛋白质的过量产生、由TTR基因突变、由TTR蛋白质的异常裂解、由TTR与其他蛋白质或其他内生或外生物质之间的异常相互作用引起。一种“TTR相关疾病”包括任何类型的TTR淀粉样变性(ATTR)，其中TTR在异常细胞外聚集体或淀粉样沉积物的形成中起一定作用。TTR相关疾病包括老年全身性淀粉样变性(SSA)、全身性家族性淀粉样变性、家族性淀粉样多发性神经病(FAP)、家族性淀粉样心肌病(FAC)、软脑膜/中枢神经系统(CNS)淀粉样变性、淀粉样玻璃体混浊、腕管综合征以及高甲状腺素血症。TTR淀粉样变性的症状包括感觉神经病变(例如远端肢体的感觉异常、感觉减退)、自主神经病变(例如胃肠功能失调，如胃溃疡；或起立性低血压)、运动神经病变、癫痫、痴呆、脊髓病、多发性神经病、腕管综合征、自主功能不全、心肌病、玻璃体混浊、肾功能不全、肾病变、实质上降低的mBMI(修正的身体质量指数)、脑神经功能障碍以及角膜格子状营养不良。
如在此所用，“治疗有效量”旨在包括一种RNAi试剂当给予给一名患者用于治疗一种TTR相关疾病时足以实现该疾病的治疗(例如通过削弱、改善或维持该现有疾病或一种或多种疾病症状)的量。该“治疗有效量”可以取决于该RNAi试剂、该试剂如何给予、该疾病及其严重程度、和病史、年龄、体重、家族史、基因组成、由TTR表达所介导的病理过程的阶段、先前或伴随治疗(如果有的话)的类型、以及待治疗的该患者的其他个别特征而变化。
如在此所用，“预防有效量”旨在包括一种RNAi试剂当给予给一名尚末经历过或显示出一种TTR相关疾病的症状但可能易患该疾病的受试者时足以预防或改善该疾病或该疾病的一种或多种症状的量。可以得到改善的症状包括感觉神经病变(例如远端肢体的感觉异常、感觉减退)、自主神经病变(例如胃肠功能失调，如胃溃疡；或起立性低血压)、运动神经病变、癫痫、痴呆、脊髓病、多发性神经病、腕管综合征、自主功能不全、心肌病、玻璃体混浊、肾功能不全、肾病变、实质上降低的mBMI(修正的身体质量指数)、脑神经功能障碍以及角膜格子状营养不良。改善该疾病包括减缓该疾病的进程或降低后来患上的疾病的严重程度。该“预防有效量”可以取决于该RNAi试剂、该试剂如何给予、该疾病的风险程度、和病史、年龄、体重、家族史、基因组成、先前或伴随治疗(如果有的话)的类型、以及待治疗的该患者的其他个别特征而变化。
一种“治疗有效量”或“预防有效量”还包括一种RNAi试剂的在适用于任何治疗的合理效益/风险比下产生一定所希望的局部或全身性作用的一个量。本发明的方法中所用的RNAi试剂可以按足以产生一个适用于这样的治疗的合理效益/风险比的一个量给予。
如在此所用，术语“样品”包括从一名受试者分离的一批类似流体、细胞或组织，以及一名受试者内存在的流体、细胞或组织。生物流体的实例包括血液、血清以及浆膜流体、血浆、脑脊髓液、眼部流体、淋巴液、尿液、唾液等。组织样品可以包括来自组织、器官或局部化区域的样品。举例来说，样品可以来源于具体器官、器官的部分或那些器官内的流体或细胞。在某些实施例中，样品可以来源于肝脏(例如整个肝脏或肝脏的某些区段或肝脏中的某些类型的细胞，如例如肝细胞)、视网膜或视网膜的部分(例如视网膜色素上皮细胞)、中枢神经系统或中枢神经系统的部分(例如脑室或脉络丛)或胰腺或胰腺的某些细胞或部分。在一些实施例中，一种“来源于一名受试者的样品”是指从该受试者获得的脑脊髓液。在优选实施例中，一种“来源于一名受试者的样品”是指从该受试者抽取的血液或血浆。在其他实施例中，一种“来源于一名受试者的样品”是指来源于该受试者的肝脏组织(或其子组分)或视网膜组织(或其子组分)。
II.RNAi试剂
本发明提供了具有优越的基因沉默活性的RNAi试剂。在此和在临时申请号61/561，710(本申请对其要求优先权)中显示，一种优越结果可以通过将一个或多个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序引入到一种RNAi试剂的一条有义链和/或反义链中、特别是在裂解位点处或附近而获得。该RNAi试剂的有义链和反义链否则可以被完全修饰。这些基序的引入中断了该有义和/或反义链的修饰模式(如果存在的话)。该RNAi试剂还任选地与一种GalNAc衍生物配体例如在该有义链上结合。产生的RNAi试剂呈现优越的基因沉默活性。
诸位发明人出人意料地发现，当该RNAi试剂的有义链和反义链被完全修饰时，在一种RNAi试剂的至少一条链的裂解位点处或附近具有一个或多个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序卓越地增强该RNAi试剂的基因沉默活性。
因此，本发明提供了能够抑制一种标靶基因(即一种TTR基因)在体内表达的RNAi试剂(例如双链RNAi试剂)。该RNAi试剂包含一条有义链和一条反义链。该RNAi试剂的每条链可以具有在12-30个核苷酸范围内的长度。举例来说，每条链可以在14-30个核苷酸长度、17-30个核苷酸长度、25-30个核苷酸长度、27-30个核苷酸长度、17-23个核苷酸长度、17-21个核苷酸长度、17-19个核苷酸长度、19-25个核苷酸长度、19-23个核苷酸长度、19-21个核苷酸长度、21-25个核苷酸长度或21-23个核苷酸长度之间。
该有义链和该反义链典型地形成一种双链体双链RNA(“dsRNA”)，在此还称为一种“RNAi试剂”。一种RNAi试剂的双链体区可以具有12-30个核苷酸对长度。举例来说，该双链体区可以在14-30个核苷酸对长度、17-30个核苷酸对长度、27-30个核苷酸对长度、17-23个核苷酸对长度、17-21个核苷酸对长度、17-19个核苷酸对长度、19-25个核苷酸对长度、19-23个核苷酸对长度、19-21个核苷酸对长度、21-25个核苷酸对长度或21-23个核苷酸对长度之间。在另一个实例中，该双链体区选自15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26以及27。
在一个实施例中，该RNAi试剂可以在一条链的3′端或5′端或两端处含有RNAi试剂的一个或多个突出端区和/或封端基团。突出端可以具有1-6个核苷酸长度，例如2-6个核苷酸长度、1-5个核苷酸长度、2-5个核苷酸长度、1-4个核苷酸长度、2-4个核苷酸长度、1-3个核苷酸长度、2-3个核苷酸长度或1-2个核苷酸长度。这些突出端可以是一条链比另一条链更长的结果，或两条具有相同长度的链交错的结果。该突出端可以与该标靶mRNA形成一个错配，或它可以与靶向的基因序列互补或可以是其他序列。该第一和该第二链还可以例如通过另外的碱基连接以形成一个发夹或通过其他非碱基连接子连接。
由本发明提供的这些RNAi试剂包括具有如例如2011年11月18日提交的美国临时申请号61/561，710、2010年9月15日提交的国际申请号PCT/US2011/051597以及PCT公布WO2009/073809中披露的化学修饰的试剂，各自的全文内容通过引用结合在此。
在一个实施例中，该RNAi试剂的突出端区中的核苷酸可以各自独立地是一个被修饰或未被修饰的核苷酸，包括(但不限于)被2′-糖修饰的，如2-F、2′-O-甲基、胸苷(T)、2′-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(Teo)、2′-O-甲氧基乙基腺苷(Aeo)、2′-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷(m5Ceo)及其任何组合。举例来说，TT可以是任一链上的任一端的一个突出端序列。该突出端可以与该标靶mRNA形成一个错配，或它可以与靶向的基因序列互补或可以是其他序列。
该RNAi试剂的有义链、反义链或两条链处的5′或3′突出端可以被磷酸化。在一些实施例中，该突出端区含有两个在这两个核苷酸之间具有一个硫代磷酸酯的核苷酸，其中这两个核苷酸可以是相同或不同的。在一个实施例中，该突出端存在于有义链、反义链或两条链的3′端处。在一个实施例中，这一3′突出端存在于该反义链中。在一个实施例中，这一3′突出端存在于该有义链中。
该RNAi试剂可以仅含有一个单个突出端，它可以加强该RNAi的干扰活性而不影响其总稳定性。举例来说，该单链突出端位于该有义链的3′末端处，或可替代地，位于该反义链的3′末端处。该RNAi还可以具有一个位于该反义链的5′端(或该有义链的3′端)处的钝端，或反之亦然。一般来说，该RNAi的反义链在3′端处具有一个核苷酸突出端，并且5′端是钝的。虽然诸位申请人不受理论限制，但理论机制在于，该反义链的5′端处的不对称钝端和该反义链的3′端突出端促进引导链负载到RISC过程中。
在一个实施例中，该RNAi试剂是一个具有19个nt长度的双端钝物，其中该有义链在从5′端起的位置7、8、9处含有至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2′-F修饰的基序。该反义链在从5′端起的位置11、12、13处含有至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2′-O-甲基修饰的基序。
在一个实施例中，该RNAi试剂是一个具有20个nt长度的双端钝物，其中该有义链在从5′端起的位置8、9、10处含有至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2′-F修饰的基序。该反义链在从5′端起的位置11、12、13处含有至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2′-O-甲基修饰的基序。
在一个实施例中，该RNAi试剂是一个具有21个nt长度的双端钝物，其中该有义链在从5′端起的位置9、10、11处含有至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2′-F修饰的基序。该反义链在从5′端起的位置11、12、13处含有至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2′-O-甲基修饰的基序。
在一个实施例中，该RNAi试剂包含一个21个核苷酸(nt)的有义链和一个23个核苷酸(nt)的反义链，其中该有义链在从5′端起的位置9、10、11处含有至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2′-F修饰的基序；该反义链在从5′端起的位置11、12、13处含有至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2′-O-甲基修饰的基序，其中该RNAi试剂的一端是钝的，而另一端包含一个2个nt的突出端。优选地，该2个nt的突出端在该反义链的3′端处。任选地，该RNAi试剂进一步包含一个配体(优选GalNAc3)。
在一个实施例中，该RNAi试剂包含一条有义链和一条反义链，其中该有义链具有25-30个核苷酸残基长度，其中该第一链的从5′末端核苷酸(位置1)开始位置1到23包含至少8个核糖核苷酸；反义链具有36-66个核苷酸残基长度，并且从3′末端核苷酸开始在与有义链的位置1-23配对的位置包含至少8个核糖核苷酸，以形成一种双链体；其中至少反义链的3′末端核苷酸与有义链未配对，并且多达6个连续3′末端核苷酸与有义链未配对，从而形成具有1-6个核苷酸的一个3′单链突出端；其中反义链的5′末端包含从10-30个与有义链未配对的连续核苷酸，从而形成一个10-30个核苷酸的单链5′突出端；其中当有义和反义链经比对达到最大互补性时，至少有义链5′末端和3′末端核苷酸与反义链的核苷酸碱基配对，从而在有义与反义链之间形成一个实质双链体区；并且当双链核酸被引入到一种哺乳动物细胞中时，反义链与一种标靶RNA沿着反义链长度的至少19个核糖核苷酸充分互补以减少标靶基因表达；并且其中该有义链含有至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2′-F修饰的基序，其中这些基序中的至少一者存在于裂解位点处或附近。该反义链在裂解位点处或附近含有至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2′-O-甲基修饰的基序。
在一个实施例中，该RNAi试剂包含有义和反义链，其中该RNAi试剂包含长度是至少25个并且至多29个核苷酸的一条第一链和长度是至多30个核苷酸、在从5′端起的位置11、12、13处具有至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2′-O-甲基修饰的基序的一条第二链；其中该第一链的3′端和该第二链的5′端形成一个钝端并且该第二链在其3′端处比该第一链长1-4个核苷酸，其中该双链体区具有至少25个核苷酸长度，并且当该RNAi试剂被引入到一种哺乳动物细胞中时，该第二链与一种标靶mRNA沿着该第二链长度的至少19个nt充分互补以减少标靶基因表达，并且其中该RNAi试剂的dicer裂解优先地产生包含该第二链的3′端的一种siRNA，从而减少该哺乳动物中的该标靶基因的表达。任选地，该RNAi试剂进一步包含一个配体。
在一个实施例中，该RNAi试剂的有义链含有至少一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序，其中这些基序之一存在于该有义链中的裂解位点处。
在一个实施例中，该RNAi试剂的反义链也可以含有至少一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序，其中这些基序之一存在于该反义链中的裂解位点处或附近。
对于具有17-23个nt长度的一个双链体区的RNAi试剂来说，该反义链的裂解位点典型地在从5′端起的10、11以及12位周围。因此，具有三个相同修饰的基序可以存在于该反义链的9、10、11位；10、11、12位；11、12、13位；12、13、14位；或13、14、15位处，计数从由该反义链的5′端起的第1个核苷酸开始，或计数从该双链体区内从该反义链的5′端起的第1个配对的核苷酸开始。该反义链中的裂解位点还可以根据该RNAi的从5′端起的双链体区的长度而变化。
该RNAi试剂的有义链可以在该链的裂解位点处含有至少一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序；并且反义链可以在该链的裂解位点处或附近具有至少一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序。当该有义链和该反义链形成一个dsRNA双链体时，该有义链和该反义链可以被如此比对，以使得在该有义链上具有三个核苷酸的一个基序和在该反义链上具有三个核苷酸的一个基序具有至少一个核苷酸重叠，即该有义链中的该基序的三个核苷酸中的至少一者与该反义链中的该基序的三个核苷酸中的至少一者形成一个碱基对。可替代地，至少两个核苷酸可以重叠，或所有三个核苷酸都可以重叠。
在一个实施例中，该RNAi试剂的有义链可以含有多于一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序。该第一基序应该存在于该链的裂解位点处或附近并且其他基序可以是翼侧修饰。术语“翼侧修饰”在此是指存在于该链的与同一链的裂解位点处或附近的该基序分隔的另一个部分处的一个基序。该翼侧修饰或者与该第一基序相邻，或者由至少一个或多个核苷酸分隔。当这些基序与彼此紧紧相邻时，则这些基序的化学性质不同于彼此，并且当这些基序由一个或多个核苷酸分隔时，则化学性质可以是相同或不同的。可以存在两个或更多个翼侧修饰。举例来说，当存在两个翼侧修饰时，每个翼侧修饰可以存在于相对于在裂解位点处或附近的该第一基序的一端处或该前导基序的任一侧上。
如同有义链，该RNAi试剂的反义链可以含有至少两个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序，这些基序中的至少一者存在于该链的裂解位点处或附近。这一反义链也可以在一个比对中含有一个或多个与有义链上存在的翼侧修饰类似的翼侧修饰。
在一个实施例中，该RNAi试剂的有义链或反义链上的翼侧修饰典型地在该链的3′端、5′端或两端处不包括前一个或两个末端核苷酸。
在另一个实施例中，该RNAi试剂的有义链或反义链上的翼侧修饰典型地在该链的3′端、5′端或两端处的双链体区内不包括前一个或两个配对的核苷酸。
当该RNAi试剂的有义链和反义链各自含有至少一个翼侧修饰时，该翼侧修饰可以落在该双链体区的同一端上，并且具有一个、两个或三个核苷酸的一个重叠。
当该RNAi试剂的有义链和反义链各自含有至少两个翼侧修饰时，该有义链和该反义链可以被如此比对，以使得各自来自一条链的两个修饰落在该双链体区的一端上，具有一个、两个或三个核苷酸的一个重叠；各自来自一条链的两个修饰落在该双链体区的另一端上，具有一个、两个或三个核苷酸的一个重叠；一条链的两个修饰落在该前导基序的每一侧上，在该双链体区中具有一个、两个或三个核苷酸的一个重叠。
在一个实施例中，该RNAi试剂的有义链和反义链中的每个核苷酸(包括是基序的一部分的核苷酸)可以被修饰。每个核苷酸可以被相同或不同修饰来修饰，该修饰可以包括非键联磷酸酯氧中的一者或两者和/或键联磷酸酯氧中的一者或多者的一个或多个改变；核糖糖的一种成分(例如核糖糖上的2′羟基)的改变；磷酸酯部分经“脱磷酸”连接子的大规模置换；一种天然存在的碱基的修饰或置换；以及核糖-磷酸酯主链的置换或修饰。
由于核酸是亚单位的聚合物，因此许多修饰存在于在核酸内重复的一个位置处，例如一种碱基或一种磷酸酯部分或一种磷酸酯部分的一个非键联O的一个修饰。在一些情况下，修饰将存在于该核酸中的全部标的位置处，但在许多情形下它不会这样。举例来说，一个修饰可以仅存在于3′或5′末端位置处，可以仅存在于一个末端区中，例如在一条链的一个末端核苷酸上或最后2个、3个、4个、5个或10个核苷酸中的一个位置处。一个修饰可以存在于一个双链区、一个单链区或两者中。一个修饰可以仅存在于一种RNA的双链区中或可以仅存在于一种RNA的一个单链区中。举例来说，一个非键联O位置处的一个硫代磷酸酯修饰可以仅存在于一个或两个末端处，可以仅存在于一个末端区中，例如在一条链的一个末端核苷酸上或最后2个、3个、4个、5个或10个核苷酸中的一个位置处，或可以存在于双链和单链区中特别是末端处。一个或多个5′端可以被磷酸化。
为了增强稳定性，可能的是例如在突出端中包括具体碱基或在单链突出端中(例如在一个5′或3′突出端或两者中)包括被修饰的核苷酸或核苷酸替代物。举例来说，可能希望在突出端中包括嘌呤核苷酸。在一些实施例中，一个3′或5′突出端中的全部或一些碱基可以被例如一个在此描述的修饰而修饰。修饰可以包括例如使用核糖糖的2′位处的修饰与本领域中已知的修饰，例如使用2′-脱氧-2′-氟基(2′-F)或2′-O-甲基修饰的脱氧核糖核苷酸代替核碱基的核糖糖，以及磷酸酯基中的修饰，例如硫代磷酸酯修饰。突出端不必与该标靶序列同源。
在一个实施例中，有义链和反义链的每个残基独立地被LNA、HNA、CeNA、2′-甲氧基乙基、2′-O-甲基、′-O-烯丙基、2′-C-烯丙基、2′-脱氧、2′-羟基或2′-氟基修饰。这些链可以含有多于一个修饰。在一个实施例中，有义链和反义链的每个残基独立地被2′-O-甲基或2′-氟基修饰。
至少两个不同修饰典型地存在于有义链和反义链上。那两个修饰可以是2′-O-甲基或2′-氟基修饰或其他修饰。
在一个实施例中，Na和/或Nb包含一种交替模式的修饰。如在此所用，术语“交替基序”是指具有一个或多个修饰、每个修饰存在于一条链的交替核苷酸上的一种基序。交替核苷酸可以指每隔一个核苷酸一个或每隔三个核苷酸一个或一种类似模式。举例来说，如果A、B以及C各自表示对核苷酸的一种类型的修饰，那么交替基序可以是“ABABABABABAB……”、“AABBAABBAABB……”、“AABAABAABAAB……”、“AAABAAABAAAB……”、“AAABBBAAABBB……”或“ABCABCABCABC……”等。
交替基序中所含有的修饰的类型可以是相同或不同的。举例来说，如果A、B、C、D各自表示对核苷酸的一种类型的修饰，那么交替模式(即每隔一个核苷酸上的修饰)可以是相同的，但有义链或反义链中的每一者可以选自交替基序内的修饰的若干种可能，如“ABABAB……”“ACACAC……”、“BDBDBD……”或“CDCDCD……”等。
在一个实施例中，本发明的RNAi试剂包含：用于有义链上的交替基序的修饰模式相对于用于反义链上的交替基序的修饰模式移位。该移位可以是如此以使得有义链的被修饰的核苷酸组对应于反义链的被不同地修饰的核苷酸组，并且反之亦然。举例来说，有义链当与dsRNA双链体中的反义链配对时，该有义链中的交替基序可以从该链的5′-3′从“ABABAB”开始，并且该反义链中的交替基序可以从该双链体区内的该链的5′-3′从“BABABA”开始。作为另一个实例，该有义链中的交替基序可以从该链的5′-3′从“AABBAABB”开始，并且该反义链中的交替基序可以从该双链体区内的该链的5′-3′从“BBAABBAA”开始，以使得在该有义链与该反义链之间存在修饰模式的完全或部分移位。
在一个实施例中，该RNAi试剂包含：最初有义链上的2′-O-甲基修饰和2′-F修饰的交替基序的模式相对于最初反义链上的2′-O-甲基修饰和2′-F修饰的交替基序的模式具有一个移位，即该有义链上的2′-O-甲基修饰的核苷酸与该反义链上的一个2′-F修饰的核苷酸碱基配对，并且反之亦然。该有义链的1位可以从2′-F修饰开始，并且该反义链的1位可以从2′-O-甲基修饰开始。
将一个或多个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序引入到有义链和/或反义链中断了该有义链和/或该反义链中存在的初始修饰模式。通过将一个或多个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序引入到该有义和/或反义链而使该有义和/或反义链的修饰模式的这一中断出人意料地增强了对标靶基因的基因沉默活性。
在一个实施例中，当在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序被引入到这些链中的任一者时，紧挨着该基序的核苷酸的修饰是一个不同于该基序的修饰的修饰。举例来说，含有该基序的序列的一部分是“……NaYYYNb……”，其中“Y”表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的该基序的修饰，并且“Na”和“Nb”表示对紧挨着该基序“YYY”的该核苷酸的不同于Y的修饰的一个修饰，并且其中Na和Nb可以是相同或不同修饰。可替代地，当存在一个翼侧修饰时，Na和/或Nb可以存在或不存在。
该RNAi试剂可以进一步包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联。该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联修饰可以存在于有义链或反义链或两者的链的任何位置中的任何核苷酸上。举例来说，该核苷酸间键联修饰可以存在于该有义链或该反义链上的每个核苷酸上；每个核苷酸间键联修饰可以按一种交替模式存在于该有义链或该反义链上；或该有义链或该反义链可以按一种交替模式含有两个核苷酸间键联修饰。该有义链上的核苷酸间键联修饰的交替模式可以与该反义链相同或不同，并且该有义链上的核苷酸间键联修饰的交替模式可以相对于该反义链上的核苷酸间键联修饰的交替模式具有一个移位。
在一个实施例中，该RNAi在突出端区中包含该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联修饰。举例来说，该突出端区可以含有两个在这两个核苷酸之间具有一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联的核苷酸。还可以作核苷酸间键联修饰以使突出端核苷酸与双链体区内的末端配对的核苷酸键联。举例来说，至少2个、3个、4个或全部的这些突出端核苷酸可以通过硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联而键联，并且任选地，可能存在将突出端核苷酸与紧挨着该突出端核苷酸的一个配对的核苷酸键联的另外的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联。举例来说，在末端三个核苷酸之间可能存在至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键联，其中这三个核苷酸中的两者是突出端核苷酸，并且第三者是紧挨着该突出端核苷酸的一个配对的核苷酸。优选地，这三个末端核苷酸可以在反义链的3′端处。
在一个实施例中，该RNAi试剂在双链体内包含与标靶的错配(多个)或其组合。该错配可以存在于突出端区或双链体区中。碱基对可以基于其促进解离或熔融的倾向来分等级(例如对于一个具体配对的缔合或解离自由能，最简单的方法是基于一个个别对检查这些对，但也可以使用紧接着的相邻物或类似分析)。在促进解离方面，A∶U与G∶C相比是优选的；G∶U与G∶C相比是优选的；并且I∶C与G∶C相比是优选的(I＝肌苷)。错配(例如非标准的或除标准以外的配对(如在此别处所述))与标准(A∶T、A∶U、G∶C)配对相比是优选的；并且包括一种通用碱基的配对与标准配对相比是优选的。
在一个实施例中，该RNAi试剂包含双链体区内从反义链的5′端的前1个、2个、3个、4个或5个碱基对中的至少一者，可以独立地选自下组：A∶U、G∶U、I∶C以及错配的对(例如非标准的或除标准以外的配对)或包括一种通用碱基以促进该双链体的5′端处的该反义链解离的配对。
在一个实施例中，双链体区内从反义链中的5′端起的1位处的核苷酸选自下组，该组由以下各项组成：A、dA、dU、U以及dT。可替代地，该双链体区内从该反义链的5′端起的前1个、2个或3个碱基对中的至少一者是一个AU碱基对。举例来说，该双链体区内从该反义链的5′端起的第一个碱基对是一个AU碱基对。
在一个实施例中，有义链序列可以由式(I)表示：
5′np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3′ (I)
其中：
i和j各自独立地是0或1；
p和q各自独立地是0-6；
每个Na独立地表示包含0-25个被修饰的核苷酸的一个寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个被不同地修饰的核苷酸；
每个Nb独立地表示包含0-10个被修饰的核苷酸的一个寡核苷酸序列；
每个np和nq独立地表示一个突出端核苷酸；
其中Nb和Y不具有相同修饰；并且
XXX、YYY以及ZZZ各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序。优选地YYY都是2′-F修饰的核苷酸。
在一个实施例中，Na和/或Nb包含交替模式的修饰。
在一个实施例中，该YYY基序存在于该有义链的裂解位点处或附近。举例来说，当该RNAi试剂具有一个17-23个核苷酸长度的双链体区时，该YYY基序可以存在于该有义链的裂解位点处或附近(例如：可以存在于位置6、7、8；7、8、9；8、9、10；9、10、11；10、11、12或11、12、13处)，计数从由该5’端起的第1个核苷酸开始；或任选地，计数在该双链体区内从该5′端起的第1个配对的核苷酸处开始。
在一个实施例中，i是1并且j是0，或i是0并且j是1，或i和j都是1。该有义链因此可以由下式表示：
5′np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3′ (Ia)；
5′np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3′ (Ib)；或
5′np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3′ (Ic)。
当该有义链由式(Ia)表示时，Nb表示包含0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个被修饰的核苷酸的一个寡核苷酸序列。每个Na可以独立地表示包含2-20个、2-15个或2-10个被修饰的核苷酸的一个寡核苷酸序列。
当该有义链被表示为式(Ib)时，Nb表示包含0-10个、0-7个、0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个被修饰的核苷酸的一个寡核苷酸序列。每个Na可以独立地表示包含2-20个、2-15个或2-10个被修饰的核苷酸的一个寡核苷酸序列。
当该有义链被表示为式(Ic)时，每个Nb独立地表示包含0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个被修饰的核苷酸的一个寡核苷酸序列。优选地，Nb是0、1、2、3、4、5或6。每个Na可以独立地表示包含2-20个、2-15个或2-10个被修饰的核苷酸的一个寡核苷酸序列。
X、Y以及Z中的每一者可以与彼此相同或不同。
在一个实施例中，该RNAi的反义链序列可以由式(II)表示：
5′nq’-Na′-(Z’Z′Z′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(X′X′X′)1-N′a-np′3′ (II)
其中：
k和1各自独立地是0或1；
p′和q′各自独立地是0-6；
每个Na′独立地表示包含0-25个被修饰的核苷酸的一个寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个被不同地修饰的核苷酸；
每个Nb′独立地表示包含0-10个被修饰的核苷酸的一个寡核苷酸序列；
每个np′和nq′独立地表示一个突出端核苷酸；
其中Nb′和Y′不具有相同修饰；
并且
X′X′X′、Y′Y′Y′以及Z′Z′Z′各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序。
在一个实施例中，Na′和/或Nb′包含交替模式的修饰。
该Y′Y′Y′基序存在于该反义链的裂解位点处或附近。举例来说，当该RNAi试剂具有一个17-23个nt长度的双链体区时，该Y′Y′Y′基序可以存在于该反义链的位置9、10、11；10、11、12；11、12、13；12、13、14；或13、14、15处，计数从由该5′端起的第1个核苷酸开始；或任选地，计数在该双链体区内从该5′端起的第1个配对的核苷酸处开始。优选地，该Y′Y′Y′基序存在于位置11、12、13处。
在一个实施例中，Y′Y′Y′基序都是2′-OMe修饰的核苷酸。
在一个实施例中，k是1并且1是0，或k是0并且1是1，或k和l都是1。
该反义链因此可以由下式表示：
5′nq，-Na′-Z′Z′Z′-Nb′-Y′Y′Y′-Na′-np，3′ (IIa)；
5′nq，-Na′-Y′Y′Y′-Nb′-X′X′X′-np，3′ (IIb)；或
5′nq，-Na′-Z′Z′Z′-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-X′X′X′-Na′-np，3′ (IIc)。
当该反义链由式(IIa)表示时，Nb′表示包含0-10个、0-7个、0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个被修饰的核苷酸的一个寡核苷酸序列。每个Na′独立地表示包含2-20个、2-15个或2-10个被修饰的核苷酸的一个寡核苷酸序列。
当该反义链被表示为式(IIb)时，Nb′表示包含0-10个、0-7个、0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个被修饰的核苷酸的一个寡核苷酸序列。每个Na′独立地表示包含2-20个、2-15个或2-10个被修饰的核苷酸的一个寡核苷酸序列。
当该反义链被表示为式(IIc)时，每个Nb′独立地表示包含0-10个、0-7个、0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个被修饰的核苷酸的一个寡核苷酸序列。每个Na′独立地表示包含2-20个、2-15个或2-10个被修饰的核苷酸的一个寡核苷酸序列。优选地，Nb是0、1、2、3、4、5或6。
X′、Y′以及Z′中的每一者可以与彼此相同或不同。
有义链和反义链的每个核苷酸可以独立地被LNA、HNA、CeNA、2′-甲氧基乙基、2′-O-甲基、2′-O-烯丙基、2′-C-烯丙基、2′-羟基、2′-脱氧或2′-氟基修饰。举例来说，有义链和反义链的每个核苷酸独立地被2′-O-甲基或2′-氟基修饰。每个X、Y、Z、X′、Y′以及Z′具体地说可以表示一个2′-O-甲基修饰或一个2′-氟基修饰。
在一个实施例中，当双链体区具有21个nt时，该RNAi试剂的有义链可以含有存在于该链的9、10以及11位处的YYY基序，计数从由该5′端起的第1个核苷酸开始；或任选地，计数在该双链体区内从该5′端起的第1个配对的核苷酸处开始；并且Y表示2′-F修饰。该有义链另外可以在该双链体区的相反端处含有XXX基序或ZZZ基序作为翼侧修饰；并且XXX和ZZZ各自独立地表示一个2′-OMe修饰或2′-F修饰。
在一个实施例中，反义链可以含有存在于该链的位置11、12以及13处的y′Y′Y′基序，计数从由该5′端起的第1个核苷酸开始；或任选地，计数在该双链体区内从该5′端起的第1个配对的核苷酸处开始；并且Y′表示2′-O-甲基修饰。该反义链另外可以在该双链体区的相反端处含有X′X′X′基序或Z′Z′Z′基序作为翼侧修饰；并且X′X′X′和Z′Z′Z′各自独立地表示一个2′-OMe修饰或2′-F修饰。
由上式(Ia)、(Ib)以及(Ic)中的任一者表示的有义链对应地与由式(IIa)、(IIb)以及(IIc)表示的一条反义链形成一种双链体。
因此，本发明的RNAi试剂可以包含一条有义链和一条反义链，每条链具有14到30个核苷酸，该RNAi双链体由式(III)表示：
有义链：5′np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3′
反义链：3′np’-Na’-(X’X′X′)k-Nb’-Y′Y′Y′-Nb’-(Z′Z′Z′)1-Na’-nq’ 5′
(III)
其中：
i、j、k以及1各自独立地是0或1；
p、p′、q以及q′各自独立地是0-6；
每个Na和Na′独立地表示包含0-25个被修饰的核苷酸的一个寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个被不同地修饰的核苷酸；
每个Nb和Nb′独立地表示包含0-10个被修饰的核苷酸的一个寡核苷酸序列；
其中
每个np′、np、nq′以及nq独立地表示一个突出端核苷酸；并且
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′以及Z′Z′Z′各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序。
在一个实施例中，i是1并且j是0；或i是0并且j是1；或i和j都是1。在另一个实施例中，k是1并且1是0；k是0并且1是1；或k和1都是1。
形成一种RNAi双链体的有义链与反义链的示例性组合包括下式：
5′np-Na-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3′
3′np’-Na’-Y′Y′Y′-Nb’-Z′Z′Z′-Na’nq’ 5′
(IIIa)
5′np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Na-nq 3′
3′np’-Na’-X′X′X′-Nb’-Y′Y′Y′-Na’-nq’ 5′
(IIIb)
5′np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3′
3′np’-Na’-X′X′X′-Nb’-Y′Y′Y′-Nb’-Z′Z′Z′-Na-nq’ 5′
(IIIc)
当该RNAi试剂由式(IIIa)表示时，每个Nb独立地表示包含1-10个、1-7个、1-5个或1-4个被修饰的核苷酸的一个寡核苷酸序列。每个Na独立地表示包含2-20个、2-15个或2-10个被修饰的核苷酸的一个寡核苷酸序列。
当该RNAi试剂被表示为式(IIIb)时，每个Nb、Nb′独立地表示包含0-10个、0-7个、0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个被修饰的核苷酸的一个寡核苷酸序列。每个Na独立地表示包含2-20个、2-15个或2-10个被修饰的核苷酸的一个寡核苷酸序列。
当该RNAi试剂被表示为式(IIIc)时，每个Nb、Nb′独立地表示包含0-10个、0-7个、0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个被修饰的核苷酸的一个寡核苷酸序列。每个Na、Na′独立地表示包含2-20个、2-15个或2-10个被修饰的核苷酸的一个寡核苷酸序列。Na、Na′、Nb以及Nb′中的每一者独立地包含交替模式的修饰
式(III)、(IIIa)、(IIIb)以及(IIIc)中的X、Y以及Z中的每一者可以与彼此相同或不同。
当该RNAi试剂由式(III)、(IIIa)、(IIIb)或(IIIc)表示时，Y核苷酸中的至少一者可以与Y′核苷酸之一形成一个碱基对。可替代地，Y核苷酸中的至少两者与相对应的Y′核苷酸形成碱基对；或Y核苷酸中的全部三者全部与相对应的Y′核苷酸形成碱基对。
当该RNAi试剂由式(IIIa)或(IIIc)表示时，Z核苷酸中的至少一者可以与Z′核苷酸之一形成一个碱基对。可替代地，Z核苷酸中的至少两者与相对应的Z′核苷酸形成碱基对；或Z核苷酸中的全部三者全部与相对应的Z′核苷酸形成碱基对。
当该RNAi试剂表示为式(IIIb)或(IIIc)时，X核苷酸中的至少一者可以与X′核苷酸之一形成一个碱基对。可替代地，X核苷酸中的至少两者与相对应的X′核苷酸形成碱基对；或X核苷酸中的全部三者全部与相对应的X′核苷酸形成碱基对。
在一个实施例中，Y核苷酸上的修饰不同于Y′核苷酸上的修饰，Z核苷酸上的修饰不同于Z′核苷酸上的修饰，和/或X核苷酸上的修饰不同于X′核苷酸上的修饰。
在一个实施例中，该RNAi试剂是一种多聚体，含有至少两个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)或(IIIc)表示的双链体，其中这些双链体由一个连接子连接。该连接子可以是可裂解或不可裂解的。任选地，该多聚体进一步包含一个配体。这些双链体中的每一者可以靶向相同基因或两种不同基因；或这些双链体中的每一者可以在两个不同标靶位点处靶向相同基因。
在一个实施例中，该RNAi试剂是一种多聚体，含有三个、四个、五个、六个或更多个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)或(IIIc)表示的双链体，其中这些双链体由一个连接子连接。该连接子可以是可裂解或不可裂解的。任选地，该多聚体进一步包含一个配体。这些双链体中的每一者可以靶向相同基因或两种不同基因；或这些双链体中的每一者可以在两个不同标靶位点处靶向相同基因。
在一个实施例中，两个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)或(IIIc)表示的RNAi试剂在5′端处键联到彼此，并且3′端中的一者或两者任选地与一个配体结合。这些试剂中的每一者可以靶向相同基因或两种不同基因；或这些试剂中的每一者可以在两个不同标靶位点处靶向相同基因。
不同公开物描述了多聚RNAi试剂。这样的公开物包括WO2007/091269、美国专利号7858769、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887以及WO2011/031520，这些公开物的全文内容特此通过引用结合在此。
含有一个或多个碳水化合物部分与一种RNAi试剂的结合的RNAi试剂可以最佳化该RNAi试剂的一种或多种性质。在许多情况下，该碳水化合物部分将连接到该RNAi试剂的一个被修饰的亚单位。举例来说，一种dsRNA试剂的一个或多个核糖核苷酸亚单位的核糖糖可以被另一个部分(例如一个碳水化合物配体所连接的一个非碳水化合物(优选环状)载体)置换。亚单位的核糖糖已经如此被置换的一种核糖核苷酸亚单位在此被称为一种核糖置换修饰亚单位(RRMS)。一个环状载体可以是一个碳环系统，即全部环原子都是碳原子，或一个杂环系统，即一个或多个环原子可以是一个杂原子，例如氮、氧、硫。该环状载体可以是一个单环系统，或可以含有两个或更多个环，例如稠合环。该环状载体可以是一个充分饱和的环系统，或它可以含有一个或多个双键。
该配体可以经由一个载体连接到该多核苷酸。这些载体包括(i)至少一个“主链连接点”、优选地两个“主链连接点”，和(ii)至少一个“系栓连接点”。如在此所用，一个“主链连接点”是指一个官能团(例如一个羟基)，或一般来说，可用于并且适用于将该载体并入到一种核糖核酸的主链(例如含硫主链)中的一个键(例如磷酸酯或被修饰的磷酸酯)。在一些实施例中，一个“系栓连接点”(TAP)是指该环状载体的连接一个所选部分的一个组成环原子，例如一个碳原子或一个杂原子(不同于提供一个主链连接点的一个原子)。该部分可以是例如一种碳水化合物，例如单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖以及多糖。任选地，该所选部分通过一个介入系栓连接到该环状载体。因此，该环状载体通常将包括一个官能团(例如一个氨基)，或一般来说，提供适用于将另一个化学实体(例如一个配体)并入或系栓到组成环的一个键。
这些RNAi试剂可以经由一个载体与一个配体结合，其中该载体可以是环基或非环基；优选地，该环基选自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1，3]二氧杂环戊烷、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基以及十氢萘；优选地，该非环基选自丝氨醇主链或二乙醇胺主链。
在某些具体实施例中，本发明的RNAi试剂是选自表1中列出的试剂的群组并且由以下各项组成的一种试剂：D1000、D1001、D1002、D1003、D1004、D1005、D1006、D1007、D1008、D1009、D1010、D1011、D1012、D1013、D1014、D1015、D1016、D1017、D1018、D1019、D1020、D1021、D1022、D1023、D1024、D1025、D1026、D1027、D1028、D1029、D1030、D1031、D1032、D1033、D1034、D1035、D1036、D1037、D1038、D1039、D1040、D1041、D1042、D1043、D1044、D1045、D1046、D1047、D1048、D1049、D1050、D1051、D1052、D1053、D1054、D1055、D1056、D1057、D1058、D1059、D1060、D1061、D1062、D1063、D1064、D1065、D1066、D1067、D1068、D1069、D1070、D1071、D1072、D1073、D1074、D1075、D1076、D1077、D1078、D1079、D1080、D1081、D1082、D1083、D1084、D1085、D1086、D1087、D1088、D1089、D1090、D1091、D1092、D1093、D1094、D1095、D1096、D1097、D1098、D1099、D1100、D1101、D1102、D1103、D1104、D1105、D1106、D1107、D1108、D1109、D1110、D1111、D1112、D1113、D1114、D1115、D1116、D1117、D1118、D1119、D1120、D1121、D1122、D1123、D1124、D1125、D1126、D1127、D1128、D1129、D1130、D1131、D1132、D1133、D1134、D1135、D1136、D1137、D1138、D1139、D1140、D1141、D1142、D1143、D1144、D1145、D1146、D1147、D1148、D1149、D1150、D1151、D1152、D1153、D1154、D1155、D1156、D1157、D1158、D1159、D1160、D1161、D1162、D1163、D1164、D1165、D1166、D1167、D1168、D1169、D1170、D1171、D1172、D1173、D1174、D1175、D1176、D1177、D1178、D1179、D1180、D1181、D1182、D1183、D1184、D1185、D1186、D1187、D1188、D1189、D1190、D1191、D1192、D1193、D1194、D1195、D1196、D1197、D1198、D1199、D1200、D1201、D1202、D1203、D1204、D1205、D1206、D1207、D1208、D1209、D1210、D1211、D1212、D1213、D1214、D1215、D1216、D1217、D1218、D1219、D1220、D1221、D1222、D1223、D1224、D1225、D1226、D1227、D1228、D1229、D1230、D1231、D1232、D1233、D1234、D1235、D1236、D1237、D1238、D1239、D1240、D1241、D1242、D1243、D1244、D1245、D1246、D1247、D1248、D1249、D1250、D1251、D1252、D1253、D1254、D1255、D1256、D1257、D1258、D1259、D1260、D1261、D1262、D1263、D1264、D1265、D1266、D1267、D1268、D1269、D1270、D1271、D1272、D1273、D1274、D1275、D1276、D1277、D1278、D1279、D1280、D1281、D1282、D1283、D1284、D1285、D1286、D1287、D1288、D1289、D1290、D1291、D1292、D1293、D1294、D1295、D1296、D1297、D1298、D1299、D1300、D1301、D1302、D1303、D1304、D1305、D1306、D1307、D1308、D1309、D1310、D1311、D1312、D1313、D1314、D1315、D1316、D1317、D1318、D1319、D1320、D1321、D1322、D1323、D1324、D1325、D1326、D1327、D1328、D1329、D1330、D1331、D1332、D1333、D1334、D1335、D1336、D1337、D1338、D1339、D1340、D1341、D1342、D1343、D1344、D1345、D1346、D1347、D1348、D1349、D1350、D1351、D1352、D1353、D1354、D1355、D1356、D1357、D1358、D1359、D1360、D1361、D1362、D1363、D1364、D1365、D1366、D1367、D1368、D1369、D1370、D1371、D1372、D1373、D1374、D1375、D1376、D1377、D1378、D1379、D1380、D1381、D1382、D1383、D1384、D1385、D1386、D1387、D1388、D1389、D1390、D1391、D1392、D1393、D1394、D1395、D1396、D1397、D1398、D1399、D1400、D1401、D1402、D1403、D1404、D1405、D1406、D1407、D1408、D1409、D1410、D1411、D1412、D1413、D1414、D1415、D1416、D1417、D1418、D1419、D1420、D1421、D1422、D1423、D1424、D1425、D1426、D1427、D1428、D1429、D1430、D1431、D1432、D1433、D1434、D1435、D1436、D1437、D1438、D1439、D1440、D1441、D1442、D1443、D1444、D1445、D1446、D1447、D1448、D1449、D1450、D1451、D1452、D1453、D1454、D1455、D1456、D1457、D1458、D1459、D1460、D1461、D1462、D1463、D1464、D1465、D1466、D1467、D1468、D1469、D1470、D1471、D1472、D1473、D1474、D1475、D1476、D1477、D1478、D1479、D1480、D1481、D1482、D1483、D1484、D1485、D1486、D1487、D1488、D1489、D1490、D1491、D1492、D1493、D1494、D1495、D1496、D1497、D1498、D1499、.D1500、D1501、D1502、D1503、D1504、D1505、D1506、D1507、D1508、D1509、D1510、D1511、D1512、D1513、D1514、D1515、D1516、D1517、D1518、D1519、D1520、D1521、D1522、D1523、D1524、D1525、D1526、D1527、D1528、D1529、D1530、D1531、D1532、D1533、D1534、D1535、D1536、D1537、D1538、D1539、D1540、D1541、D1542、D1543、D1544、D1545、D1546、D1547、D1548、D1549、D1550、D1551、D1552、D1553、D1554、D1555、D1556、D1557、D1558、D1559、D1560、D1561、D1562、D1563、D1564、D1565、D1566、D1567、D1568、D1569、D1570、D1571、D1572、D1573、D1574、D1575、D1576、D1577、D1578、D1579、D1580、D1581、D1582、D1583、D1584、D1585、D1586、D1587、D1588、D1589、D1590、D1591、D1592、D1593、D1594、D1595、D1596、D1597、D1598、D1599、D1600、D1601、D1602、D1603、D1604、D1605、D1606、D1607、D1608、D1609、D1610、D1611、D1612、D1613、D1614、D1615、D1616、D1617、D1618、D1619、D1620、D1621、D1622、D1623、D1624、D1625、D1626、D1627、D1628、D1629、D1630、D1631、D1632、D1633、D1634、D1635、D1636、D1637、D1638、D1639、D1640、D1641、D1642、D1643、D1644、D1645、D1646、D1647、D1648、D1649、D1650、D1651、D1652、D1653、D1654、D1655、D1656、D1657、D1658、D1659、D1660、D1661、D1662、D1663、D1664、D1665、D1666、D1667、D1668、D1669、D1670、D1671、D1672、D1673、D1674、D1675、D1676、D1677、D1678、D1679、D1680、D1681、D1682、D1683、D1684、D1685、D1686、D1687、D1688、D1689、D1690、D1691、D1692、D1693、D1694、D1695、D1696、D1697、D1698、D1699、D1700、D1701、D1702、D1703、D1704、D1705、D1706、D1707、D1708、D1709、D1710、D1711、D1712、D1713、D1714、D1715、D1716、D1717、D1718、D1719、D1720、D1721、D1722、D1723、D1724、D1725、D1726、D1727、D1728、D1729、D1730、D1731、D1732、D1733、D1734、D1735、D1736、D1737、D1738、D1739、D1740、D1741、D1742、D1743、D1744、D1745、D1746、D1747、D1748、D1749、D1750、D1751、D1752、D1753、D1754、D1755、D1756、D1757、D1758、D1759、D1760、D1761、D1762、D1763、D1764、D1765、D1766、D1767、D1768、D1769、D1770、D1771、D1772、D1773、D1774、D1775、D1776、D1777、D1778、D1779、D1780、D1781、D1782、D1783、D1784、D1785、D1786、D1787、D1788、D1789、D1790、D1791、D1792、D1793、D1794、D1795、D1796、D1797、D1798、D1799、D1800、D1801、D1802、D1803、D1804、D1805、D1806、D1807、D1808、D1809、D1810、D1811、D1812、D1813、D1814、D1815、D1816、D1817、D1818、D1819、D1820、D1821、D1822、D1823、D1824、D1825、D1826、D1827、D1828、D1829、D1830、D1831、D1832、D1833、D1834、D1835、D1836、D1837、D1838、D1839、D1840、D1841、D1842、D1843、D1844、D1845、D1846、D1847、D1848、D1849、D1850、D1851、D1852、D1853、D1854、D1855、D1856、D1857、D1858、D1859、D1860、D1861、D1862、D1863、D1864、D1865、D1866、D1867、D1868、D1869、D1870、D1871、D1872、D1873、D1874、D1875、D1876、D1877、D1878、D1879、D1880、D1881、D1882、D1883、D1884、D1885、D1886、D1887、D1888、D1889、D1890、D1891、D1892、D1893、D1894、D1895、D1896、D1897、D1898、D1899、D1900、D1901、D1902、D1903、D1904、D1905、D1906、D1907、D1908、D1909、D1910、D1911、D1912、D1913、D1914、D1915、D1916、D1917、D1918、D1919、D1920、D1921、D1922、D1923、D1924、D1925、D1926、D1927、D1928、D1929、D1930、D1931、D1932、D1933、D1934、D1935、D1936、D1937、D1938、D1939、D1940、D1941、D1942、D1943、D1944、D1945、D1946、D1947、D1948、D1949、D1950、D1951、D1952、D1953、D1954、D1955、D1956、D1957、D1958、D1959、D1960、D1961、D1962、D1963、D1964、D1965、D1966、D1967、D1968、D1969、D1970、D1971、D1972、D1973、D1974、D1975、D1976、D1977、D1978、D1979、D1980、D1981、D1982、D1983、D1984、D1985、D1986、D1987、D1988、D1989、D1990、D1991、D1992、D1993、D1994、D1995、D1996、D1997、D1998、D1999、D2000、D2001、D2002、D2003、D2004、D2005、D2006、D2007、D2008、D2009、D2010、D2011、D2012、D2013、D2014、D2015、D2016、D2017、D2018、D2019、D2020、D2021、D2022、D2023、D2024、D2025、D2026、D2027、D2028、D2029、D2030、D2031、D2032、D2033、D2034、D2035、D2036、D2037、D2038、D2039、D2040、D2041、D2042、D2043、D2044、D2045、D2046、D2047、D2048、D2049、D2050、D2051、D2052、D2053、D2054、D2055、D2056、D2057、D2058、D2059、D2060、D2061、D2062、D2063、D2064、D2065、D2066、D2067、D2068、D2069、D2070、D2071、D2072、D2073、D2074、D2075、D2076、D2077、D2078、D2079、D2080、D2081、D2082、D2083、D2084、D2085、D2086、D2087、D2088、D2089、D2090以及D2091。
这些试剂可以进一步包含一个配体，如一个GalNAc配体。
配体
本发明的RNAi试剂(例如双链RNAi试剂)可以任选地与一个或多个配体结合。该配体可以在3′端、5′端或两端处连接到有义链、反义链或两条链。举例来说，该配体可以与该有义链结合。在优选实施例中，该配体与该有义链的3′端结合。在一个优选实施例中，该配体是一个GalNAc配体。在特别优选实施例中，该配体是GalNAc3：
多种多样的实体可以偶联到本发明的RNAi试剂。优选的部分是优选地共价或者直接地或者经由一个介入系栓间接地偶联的配体。
在优选实施例中，一个配体改变了它所并入的分子的分布、靶向或寿命。在优选实施例中，一个配体对一种所选标靶提供了一种增强的亲和力，例如与不存在这种配体的一种种类相比，该所选标靶例如是分子、细胞或细胞类型、区室、受体，例如身体的一个细胞区室或器官区室、组织、器官或部位。对一种所选标靶提供增强的亲和力的配体也被称为靶向配体。
一些配体可以具有核内体溶解性质。该核内体溶解配体促进核内体的溶解和/或本发明的组合物或其组分从核内体向细胞的细胞质的运载。该核内体溶解配体可以是展示出pH依赖性膜活性和融合性的一种多阴离子肽或肽模拟物。在一个实施例中，该核内体溶解配体在核内体pH下呈现其活性构象。“活性”构象是其中该核内体溶解配体促进核内体的溶解和/或本发明的组合物或其组分从核内体向细胞的细胞质的运载的那种构象。示例性核内体溶解配体包括GALA肽(苏巴劳(Subbarao)等人，《生物化学》(Biochemistry)，1987，26：2964-2972)、EALA肽(沃格尔(Vogel)等人，《美国化学会志》(J.Am.Chem.Soc.)，1996，118：1581-1586)及其衍生物(特克(Turk)等人，《生物化学与生物物理学学报》(Biochem.Biophys.Acta)，2002，1559：56-68)。在一个实施例中，该核内体溶解组分可以含有将响应于pH变化而经历电荷变化或质子化的一种化学基团(例如一种氨基酸)。该核内体溶解组分可以是直链或支链的。
配体可以改进运载、杂交以及特异性性质，并且还可以改进所得天然或被修饰的寡核糖核苷酸或包含在此描述的单体的任何组合的一种聚合分子和/或天然或被修饰的核糖核苷酸的核酸酶抗性。
配体一般来说可以包括治疗改性剂，例如用于增强摄取；诊断化合物或报道基，例如用于监测分布；交联剂；以及赋予核酸酶抗性的部分。一般实例包括脂质、类固醇、维生素、糖、蛋白质、肽、多元胺以及肽模拟物。
配体可以包括一种天然存在的物质，如一种蛋白质(例如人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)或球蛋白)；一种碳水化合物(例如一种右旋糖酐、支链淀粉、甲壳质、壳聚糖、菊糖、环糊精或透明质酸)；或一种脂质。该配体还可以是一种重组或合成分子，如一种合成聚合物，例如一种合成聚氨基酸、一种寡核苷酸(例如一种适体)。聚氨基酸的实例包括聚氨基酸是一种聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨基甲酸酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚磷嗪。多元胺的实例包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、多元胺、假肽-多元胺、肽模拟物多元胺、树状多元胺、精氨酸、脒，点精蛋白，阳离子脂质，阳离子卟啉，一种多元胺的季盐或一种α螺旋肽。
配体还可以包括靶向基团，例如一种细胞或组织靶向剂，例如一种凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如结合到一种规定细胞类型(如一种肾细胞)的一种抗体。一种靶向基团可以是一种促甲状腺激素、促黑激素、凝集素、糖蛋白、表面活性剂蛋白质A、粘蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价海藻糖、糖基化的聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸盐、聚谷氨酸盐、聚天冬氨酸盐、一种脂质、胆固醇、一种类固醇、胆汁酸、叶酸盐、维生素B12、生物素、一种RGD肽、一种RGD肽模拟物或一种适体。
配体的其他实例包括染料、插入剂(例如吖啶)、交联剂(例如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、德卟啉、噻啉)、多环芳香族烃(例如吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶或一种螯合剂(例如EDTA)、亲脂性分子，例如胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1，3-双-O(十六基)甘油、香叶氧基己基、十六基甘油、茨醇、薄荷醇、1，3-丙二醇、十七基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)以及肽结合物(例如触足蛋白肽、Tat肽)、烷基化剂、磷酸盐、氨基、巯基、PEG(例如PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、被取代的烷基、放射性标记的标记物、酶、半抗原(例如生物素)、运载/吸附促进剂(例如阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶(例如咪唑、双咪唑、组织胺、咪唑簇、吖啶-咪唑结合物、四氮杂大环的Eu3+络合物)、二硝基苯基、HRP或AP。
配体可以是蛋白质，例如糖蛋白，或肽，例如对一种共配体具有一种特异性亲和力的分子，或抗体，例如结合到一种规定细胞类型(如一种癌细胞、内皮细胞或骨细胞)的一种抗体。配体还可以包括激素和激素受体。它们还可以包括非肽类种类，如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价海藻糖或适体。该配体可以是例如一种脂多糖、p38MAP激酶的一种活化剂或NF-κB的一种活化剂。
该配体可以是可以通过破坏细胞的细胞骨架(例如通过破坏该细胞的微管、微丝和/或中间丝)增加该iRNA试剂摄取到该细胞中的一种物质(例如一种药物)。该药物可以是例如泰素(taxon)、长春新碱、长春碱、松胞菌素、诺考达唑、促微丝聚合剂(japlakinolide)、红海海绵素A、鬼笔环肽、海洋苔藓素A(swinholide A)、茚满诺星(indanocine)或myoservin。
该配体可以通过例如活化一种炎症应答来增加寡核苷酸摄取到该细胞中。将具有这种作用的示例性配体包括肿瘤坏死因子α(TNFα)、介白素-1β或γ干扰素。
在一个方面，该配体是一种脂质或基于脂质的分子。这种脂质或基于脂质的分子优选地结合一种血清蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)。一种结合的配体允许该结合物分布到身体的一种标靶组织，例如一种非肾标靶组织。举例来说，该标靶组织可以是肝脏，包括肝脏的实质细胞。可以结合HSA的其他分子也可以用作配体。举例来说，可以使用萘普生或阿司匹林。一种脂质或基于脂质的配体可以(a)增加对结合物降解的抗性，(b)增加靶向或运载到一种标靶细胞或细胞膜中，和/或(c)可以用于调节与一种血清蛋白(例如HSA)的结合。
一种基于脂质的配体可以用于调节(例如控制)该结合物与一种标靶组织的结合。举例来说，与HSA更强烈结合的一种脂质或基于脂质的配体将更不可能被靶向肾脏并且因此更不可能从身体清除。与HSA较不强烈结合的一种脂质或基于脂质的配体可以用来使结合物靶向肾脏。
在一个优选实施例中，该基于脂质的配体结合HSA。优选地，它以充足的亲和力结合HSA，以使得该结合物将优选地分布到一种非肾组织。然而，优选的是这种亲和力并不是如此强，以使得HSA-配体结合不能逆转。
在另一个优选实施例中，该基于脂质的配体微弱或根本不结合HSA，以使得该结合物将优选地分布到肾脏。代替该基于脂质的配体或除其之外，还可以使用靶向肾细胞的其他部分。
在另一个方面，该配体是由一种标靶细胞(例如一种增殖细胞)吸收的一种部分(例如一种维生素)。它们特别可用于治疗由不期望的细胞增殖(例如恶性或非恶性类型的，例如癌细胞)表征的病症。示例性维生素包括维生素A、E以及K。其他示例性维生素包括B族维生素，例如叶酸、B12、核黄素、生物素、吡哆醛或由癌细胞吸收的其他维生素或营养素。还包括HAS、低密度脂蛋白(LDL)以及高密度脂蛋白(HDL)。
在另一个方面，该配体是一种细胞渗透剂，优选地一种螺旋细胞渗透剂。优选地，该试剂是两亲的。一种示例性试剂是一种肽，如tat或触足蛋白。如果该试剂是一种肽，那么它可以是被修饰的，包括一种肽酰基模拟物、反演体、非肽键或假肽键以及D-氨基酸的使用。该螺旋试剂优选地是优选具有一个亲脂性相和一个疏脂性相的一种α-螺旋试剂。
该配体可以是一种肽或肽模拟物。一种肽模拟物(在此也称为一种寡肽模拟物)是能够折叠成与一种天然肽类似的一种限定三维结构的一种分子。该肽或肽模拟物部分可以是约5-50个氨基酸长，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。一种肽或肽模拟物可以是例如一种细胞渗透肽、阳离子肽、两亲肽或疏水性肽(例如主要由Tyr、Trp或Phe组成)。该肽部分可以是一种树状肽、约束肽或交联肽。在另一个替代方案中，该肽部分可以包括一个疏水性膜转位序列(MTS)。一种含有疏水性MTS的示例性肽是具有氨基酸序列AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO：4)的RFGF。含有一个疏水性MTS的一种RFGF类似物(例如氨基酸序列AALLPVLLAAP)(SEQ ID NO：5)也可以是一个靶向部分。该肽部分可以是可以携载大极性分子(包括肽、寡核苷酸以及蛋白质)穿过细胞膜的一种“递送”肽。举例来说，已经发现来自HIV Tat蛋白(GRKKRRQRRRPPQ)(SEQ ID NO：6)和果蝇触足蛋白(RQIKIWFQNRRMKWKK)(SEQ ID NO：7)的序列能够充当递送肽。一种肽或肽模拟物可以由一个随机DNA序列(如由一个噬菌体展示文库或一珠一化合物(OBOC)组合文库鉴别的一种肽)编码(拉姆(Lam)等人，《自然》(Nature)，354：82-84，1991)。优选地，经由一个并入的单体单元系栓到一种iRNA试剂的该肽或肽模拟物是一种细胞靶向肽，如一种精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽或RGD模拟物。一种肽部分的长度范围可以从约5个氨基酸到约40个氨基酸。这些肽部分可以具有一种结构修饰，以便增加稳定性或指引构象性质。可以使用下文描述的结构修饰中的任一者。一种RGD肽部分可以用于靶向一种肿瘤细胞，如一种内皮肿瘤细胞或一种乳癌肿瘤细胞(齐茨曼(Zitzmann)等人，《癌症研究》(Cancer Res.)，62：5139-43，2002)。一种RGD肽可以促进一种iRNA试剂靶向多种其他组织(包括肺、肾脏、脾脏或肝脏)的肿瘤(青木(Aoki)等人，《癌症基因治疗》(Cancer Gene Therapy)8：783-787，2001)。优选地，该RGD肽将促进一种iRNA试剂靶向肾脏。该RGD肽可以是线性的或环状的，并且可以被修饰(例如糖基化或甲基化)以促进靶向具体组织。举例来说，一种糖基化的RGD肽可以将一种iRNA试剂递送到一种表达αvβ3的肿瘤细胞(豪布纳(Haubner)等人，《核医学杂志》(Jour.Nucl.Med.)，42：326-336，2001)。可以使用靶向富含增殖细胞的标记物的肽。举例来说，含有RGD的肽和肽模拟物可以靶向癌细胞，具体地说展现一种整合素的细胞。因此，可以使用RGD肽、含有RGD的环状肽、包括D-氨基酸的RGD肽以及合成性RGD模拟物。除RGD之外，还可以使用靶向整合素配体的其他部分。一般来说，这样的配体可以用来控制增殖细胞和血管生成。这种类型的配体的优选的结合物靶向PECAM-1、VEGF或其他癌基因(例如一种在此描述的癌基因)
一种“细胞渗透肽”能够渗透一种细胞，例如一种微生物细胞，如一种细菌或真菌细胞，或一种哺乳动物细胞，如一种人类细胞。一种微生物细胞渗透肽可以是例如一种α-螺旋线性肽(例如LL-37或Ceropin P1)、一种含有二硫键的肽(例如α-防御素、β-防御素或细菌素)或一种仅含有一种或两种主要氨基酸的肽(例如PR-39或吲哚力西丁(indolicidin))。一种细胞渗透肽还可以包括一个核定位信号(NLS)。举例来说，一种细胞渗透肽可以是一种两分两亲肽，如MPG，它来源于HIV-1gp41的融合肽域和SV40大T抗原的NLS(西梅奥妮(Simeoni)等人，《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)31：2717-2724，2003)。
在一个实施例中，一种靶向肽可以是一种两亲α-螺旋肽。示例性两亲α-螺旋肽包括(但不限于)天蚕素、莱科毒素(1ycotoxin)、摩西鱼毒肽(paradaxin)、蟾蜍肽抗生素(buforin)、CPF、铃蟾抗菌肽样肽(BLP)、蛇毒抗菌肽(cathelicidin)、角毒素(ceratotoxin)、柄海鞘(S.clava)肽、盲鳗肠道抗菌肽(HFIAP)、爪蟾抗菌肽、brevinins-2、蛙皮抗菌肽(dermaseptin)、蜂毒肽、pleurocidin、H2A肽、非洲爪蟾肽、esculentinis-1以及caerins。许多因素将优选地被认为维持螺旋稳定性的完整性。举例来说，将使用最大数目的螺旋稳定化残基(例如leu、ala或lys)，并且将使用最小数目的螺旋去稳定化残基(例如脯氨酸或环状单体单元)。将考虑加帽残基(例如Gly是一种示例性N-加帽残基)和/或可以将C-末端酰胺化用于提供一个额外H-键以稳定该螺旋。具有相反电荷、间隔i±3或i±4个位置的残基之间的盐桥的形成可以提供稳定性。举例来说，阳离子残基(如赖氨酸、精氨酸、高精氨酸、鸟氨酸或组氨酸)可以与阴离子残基谷氨酸盐或天冬氨酸盐形成盐桥。
肽和肽模拟物配体包括以下配体，那些配体具有天然存在的或被修饰的肽，例如D或L肽；α、β或γ肽；N-甲基肽；氮杂肽；具有一个或多个酰胺的肽，即键联被一个或多个脲、硫脲、氨基甲酸酯或磺酰脲键联置换的肽；或环肽。
该靶向配体可以是能够靶向一种具体受体的任何配体。实例是：叶酸盐、GalNAc、半乳糖、甘露糖、甘露糖-6P、糖簇(如GalNAc簇、甘露糖簇、半乳糖簇)或一种适体。一个簇是两个或更多个糖单元的组合。这些靶向配体还包括整合素受体配体、趋化因子受体配体、转铁蛋白、生物素、血清素受体配体、PSMA、内皮素、GCPII、生长抑素、LDL以及HDL配体。这些配体还可以基于核酸，例如一种适体。该适体可以是未被修饰的或具有在此披露的修饰的任何组合。
核内体释放剂包括咪唑、聚咪唑或寡咪唑、PEI、肽、融合肽、聚羧酸酯、聚阳离子、掩蔽的寡或聚阳离子或阴离子、缩醛、聚缩醛、缩酮/聚酮、原酸酯、具有掩蔽或非掩蔽的阳离子或阴离子电荷的聚合物、具有掩蔽或非掩蔽的阳离子或阴离子电荷的树状聚合物。
PK调节剂代表药代动力学调节剂。PK调节剂包括亲脂体、胆汁酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白结合剂、PEG、维生素等。示例性PK调节剂包括(但不限于)胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰基甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生、布洛芬、维生素E、生物素等。还已知包含许多硫代磷酸酯键联的寡核苷酸与血清蛋白结合，因此在主链中包含多个硫代磷酸酯键联的短寡核苷酸(例如约5个碱基、10个碱基、15个碱基或20个碱基的寡核苷酸)作为配体(例如作为PK调节配体)也属于本发明。
另外，结合血清组分(血清蛋白)的适体作为PK调节配体也属于本发明。
属于本发明的其他配体结合物描述于以下美国专利申请中：2004年8月10日提交的USSN：10/916,185；2004年9月21日提交的USSN：10/946,873；2007年8月3日提交的USSN：10/833,934；2005年4月27日提交的USSN：11/115,989；以及2007年11月21日提交的USSN：11/944,227，这些美国专利申请出于所有目的通过引用以其全文结合。
当存在两个或更多个配体时，这些配体可以都具有相同性质，都具有不同性质，或一些配体具有相同性质而其他配体具有不同性质。举例来说，一种配体可以具有靶向性质、具有核内体溶解活性或具有PK调节性质。在一个优选实施例中，全部这些配体都具有不同性质。
可以将配体偶联到寡核苷酸的不同位置，例如3′末端、5′末端和/或在一个内部位置。在优选实施例中，将该配体经由一个介入系栓(例如一个在此描述的载体)连接到这些寡核苷酸。当将一个单体并入正在生长的链中时，该配体或系栓的配体可以存在于该单体上。在一些实施例中，可以在已经将一个“前体”单体并入正在生长的链中后，将配体经由偶联到该“前体”单体来并入。举例来说，可以将具有例如一个氨基封端的系链(即不具有缔合的配体)的一个单体(例如TAP-(CH2)nNH2)并入一条正在生长的寡核苷酸链。在一个随后的操作中，即在将该前体单体并入该链中后，随后可以将具有一个亲电基团(例如一个五氟苯酯或醛基)的一个配体通过将该配体的该亲电基团与该前体单体的系栓的末端亲核基团偶联来连接到该前体单体。
在另一个实例中，可以并入具有一个适用于参与点击化学反应的化学基团的一个单体，例如一个叠氮化物或炔烃封端的系栓/连接子。在一个随后的操作中，即在将该前体单体并入该链中后，可以将具有一个互补化学基团(例如一个炔烃或叠氮化物)的一个配体通过将该炔烃与该叠氮化物偶联在一起来连接到该前体单体。
对于双链寡核苷酸来说，可以将配体连接到一条或两条链。在一些实施例中，一种双链iRNA试剂含有与有义链结合的一个配体。在其他实施例中，一种双链iRNA试剂含有与反义链结合的一个配体。
在一些实施例中，可以将配体与核碱基、糖部分或核酸分子的核苷间键联结合。与嘌呤核碱基或其衍生物的结合可以在任何位置(包括内环和外环原子)处发生。在一些实施例中，将一种嘌呤核碱基的2-、6-、7-或8-位连接到一个结合物部分。与嘧啶核碱基或其衍生物的结合也可以在任何位置处发生。在一些实施例中，可以将一种嘧啶核碱基的2-、5-以及6-位置用一个结合物部分取代。与核苷的糖部分的结合可以在任何碳原子处发生。可以连接到一个结合物部分的一个糖部分的示例性碳原子包括2′、3′以及5′碳原子。还可以将1′位连接到一个结合物部分，如在一个无碱基残基中。核苷间键联还可以具有结合物部分。对于含磷键联(例如磷酸二酯、硫代硫酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酰酯等)来说，可以直接将该结合物部分连接到该磷原子或与该磷原子结合的一个O、N或S原子。对于含胺或酰胺的核苷间键联(例如PNA)来说，可以将结合物部分连接到该胺或酰胺的氮原子或一个相邻碳原子。
可以使用RNA干扰领域中的任何适合配体，但该配体典型地是一种碳水化合物，例如单糖(如GalNAc)、二糖、三糖、四糖、多糖。
使该配体与该核酸结合的连接子包括以上论述的连接子。举例来说，该配体可以是通过一种二价或三价支链连接子连接的一种或多种GalNAc(N-乙酰葡糖胺)衍生物。
在一个实施例中，本发明的dsRNA与一种二价和三价支链连接子结合，包括式(IV)-(VII)中的任一者中所示的结构：
其中：
q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B以及q5C对于每次出现独立地表示0-20并且其中该重复单元可以是相同或不同的；
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C对于每次出现各自独立地不存在、是CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；
Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C对于每次出现独立地不存在、是亚烷基、被取代的亚烷基，其中一个或多个亚甲基可以由以下各项中的一者或多者间杂或封端：O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R’)＝C(R”)、C≡C或C(O)；
R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C对于每次出现各自独立地不存在、是NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH＝N-O、 或杂环基；
L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B以及L5C表示配体；即对于每次出现各自独立地是一种单糖(如GalNAc)、二糖、三糖、四糖、寡糖或多糖；并且
Ra是H或氨基酸侧链。
三价结合的GalNAc衍生物特别可用于与RNAi试剂一起用于抑制一种标靶基因的表达，如式(VII)的那些：
其中L5A、L5B以及L5C表示一种单糖，如GalNAc衍生物。
结合GalNAc衍生物的适合二价和三价支链连接子基团的实例包括(但不限于)以下化合物：
在其他实施例中，本发明的RNAi试剂是一种选自下组的试剂，该组由以下各项组成：AD-45163、AD-45165、AD-51544、AD-51545、AD-51546以及AD-51547。
III.药物组合物
本发明的RNAi试剂可以通过从其他药物类推被配制用于以任何适宜方式给药以用于人类或兽医学。包含本发明的RNAi试剂的药物组合物可以是例如具有或不具有一种缓冲液的溶液或含有药学上可接受的载体的组合物。这样的组合物包括例如水性或结晶组合物、脂质体配制品、胶束配制品、乳液以及基因治疗载体。
在本发明的方法中，该RNAi试剂可以在一种溶液中给予。一种游离RNAi试剂可以在一种非缓冲溶液中、例如在生理盐水中或在水中给予。可替代地，该游离siRNA还可以在一种适合缓冲溶液中给予。该缓冲溶液可以包括乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐或磷酸盐或其任何组合。在一个优选实施例中，该缓冲溶液是磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)。含有该RNAi试剂的缓冲溶液的pH和克分子渗透压浓度可以被调节，以使得它适合用于给予给一名受试者。
在一些实施例中，该缓冲溶液进一步包含一种用于控制该溶液的克分子渗透压浓度的试剂，以使得克分子渗透压浓度被保持在一个所希望的值下，例如在人血浆的生理值下。可以加入到该缓冲溶液以控制克分子渗透压浓度的溶质包括(但不限于)蛋白质、肽、氨基酸、非代谢聚合物、维生素、离子、糖、代谢物、有机酸、脂质或盐。在一些实施例中，用于控制该溶液的克分子渗透压浓度的该试剂是一种盐。在某些实施例中，用于控制该溶液的克分子渗透压浓度的该试剂是氯化钠或氯化钾。
在其他实施例中，该RNAi试剂被配制为包括一种或多种RNAi试剂和一种药学上可接受的载体的一种组合物。如在此所用，语言“药学上可接受的载体”旨在包括与药物给药相容的任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。将这样的介质和试剂用于药学上活性物质在本领域中是熟知的。除非在任何常规介质或试剂与该活性化合物不相容的情况下，否则涵盖其在这些组合物中的使用。辅助活性化合物也可以并入这些组合物中。
在一个实施例中，该RNAi试剂制剂包括至少一种第二治疗剂(例如除一种RNA或一种DNA以外的一种试剂)。举例来说，用于治疗一种TTR相关疾病(例如一种甲状腺素运载蛋白相关遗传性淀粉样变性(家族性淀粉样多发性神经病，FAP))的一种RNAi试剂组合物可以包括用于改善FAP的一种已知药物，例如他发米帝司(Tafamidis)(INN或Fx-1006A或维尼达克尔(Vyndaqel))。
一种被配制的RNAi试剂组合物可以呈现多种状态。在一些实例中，该组合物是至少部分结晶、均匀结晶和/或无水的(例如它含有少于80％、50％、30％、20％或10％的水)。在另一个实例中，该RNAi试剂在一个水相中，例如在包括水的一种溶液中。
该水相或这些结晶组合物可以并入一种递送媒剂，例如一种脂质体(特别用于水相)或一种颗粒(例如如可以适用于一种结晶组合物的一种微粒)。一般来说，如在此描述，该RNAi试剂组合物以与预期给药方法相容的方式配制。举例来说，在具体实施例中，该组合物通过以下方法中的至少一者来制备：喷雾干燥、冻干、真空干燥、蒸发、流化床干燥或这些技术的一种组合；或与一种脂质一起声处理、冷冻干燥、缩合以及其他自组装。
一种RNAi试剂制剂可以与另一种试剂(例如另一种治疗剂或使RNAi试剂稳定化的一种试剂(例如与该RNAi试剂复合以形成一种iRNP的一种蛋白质))组合配制。再其他试剂包括螯合剂(例如EDTA(例如以移除二价阳离子，如Mg2+))、盐、RNAse抑制剂(例如一种广泛特异性RNAse抑制剂，如RNAsin)等。
在一个实施例中，该RNAi试剂制剂包括另一种siRNA化合物，例如可以针对一种第二基因或针对相同基因介导RNAi的一种第二RNAi试剂。再其他制剂可以包括至少3种、5种、十种、二十种、五十种或一百种或更多种不同RNAi试剂种类。这样的RNAi试剂可以针对类似数目的不同基因介导RNAi。
本发明的iRNA试剂可以被配制用于药物用途。药学上可接受的组合物包含一个治疗或预防有效量的以上实施例中的任一者中的dsRNA试剂中的一者或多者，单独取用或与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)、赋形剂和/或稀释剂一起配制。
制备本发明的药物组合物的方法包括使得一种本发明的RNAi试剂与载体和任选地一种或多种附属成分缔合的步骤。一般来说，通过使得一种本发明的RNAi试剂与液体载体或细粉状固体载体或两者均匀并且紧密地缔合并且然后(必要时)使产物成形来制备这些组合物。
这些药物组合物可以被专门地配制用于以固体或液体形式给予，包括适于以下的形式：(1)口服给药，例如灌药(水性或非水性溶液或悬浮液)、片剂(例如靶向用于经颊、经舌下以及全身性吸收的片剂)、大丸剂、散剂、颗粒剂、用于施用到舌的糊剂；(2)不经肠给药，例如通过皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射，如例如一种无菌溶液或悬浮液或持续释放配制品；(3)局部施用，例如以施用到皮肤的一种乳膏、软膏或一种控制释放贴剂或喷雾剂形式；(4)阴道内或直肠内，例如以子宫托、乳膏或泡沫形式；(5)舌下；(6)经眼；(7)经皮；或(8)经鼻。使用皮下或静脉内方法递送可以是特别有利的。
短语“药学上可接受的”在此用以指属于正确医学判断的范围内、适用于与人类和动物的组织接触而无过量毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症、与一个合理效益/风险比相称的那些化合物、物质、组合物和/或剂型。
如在此所用，短语“药学上可接受的载体”意指参与将标的化合物从身体的一个器官或部位携载或运载到身体的另一个器官或部位的一种药学上可接受的物质、组合物或媒剂，如一种液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如润滑剂、滑石镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌或硬脂酸)或溶剂囊封材料。每种载体必须在与该组合物的其他成分相容并且对患者无害的意义上是“可接受的”。可以充当药学上可接受的载体的物质的一些实例包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖以及蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素和其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素以及乙酸纤维素；(4)粉末状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠以及滑石(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油以及大豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇以及聚乙二醇；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原质水；(17)等渗生理盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；(22)膨胀剂，如多肽和氨基酸；(23)血清组分，如血清白蛋白、HDL以及LDL；以及(22)药物组合物中所用的其他无毒相容物质。
这些组合物可以便利地以单位剂型存在并且可以通过制药领域中熟知的任何方法来制备。可以与一种载体物质组合以产生一个单一剂型的RNAi试剂的量将取决于所治疗的主体和具体给药模式而变化。可以与一种载体物质组合以产生一个单一剂型的RNAi试剂一般来说将是RNAi试剂的产生一种所希望的作用(例如治疗或预防作用)的量。一般来说，在百分之百中，这一量将在从约0.1百分比到约九十九百分比、优选地从约5百分比到约70百分比、最优选地从约10百分比到约30百分比RNAi试剂的范围内。
在某些实施例中，一种本发明的组合物包含一种选自下组的赋形剂，该组由以下各项组成：环糊精、纤维素、脂质体、胶束形成剂(例如胆汁酸)以及聚合载体(例如聚酯和聚酸酐)；和一种本发明的RNAi试剂。在某些实施例中，一种前述组合物使一种本发明的RNAi试剂变得经口生物可用。
在一些情况下，为了延长一种RNAi试剂的作用，希望减缓该试剂从皮下或肌肉内注射的吸收。这可以通过使用具有不良水溶性的结晶或非晶材料的一种液体悬浮液来实现。该RNAi试剂的吸收速率则取决于其溶解速率，该溶解速率又可以取决于晶体尺寸和结晶形式。可替代地，一种不经肠给予的RNAi试剂的延迟吸收可以通过将该试剂溶解或悬浮于一种油媒剂中来实现。
脂质体
一种本发明的RNAi试剂可以被配制用于以一种膜分子集合体(例如一种脂质体或一种胶束)递送。如在此所用，术语“脂质体”是指由两亲脂质组成、以至少一个双层(例如一个双层或多个双层)安排的一种囊泡。脂质体包括具有由一种亲脂性物质和一个水性内部形成的一个膜的单层和多层囊泡。该水性部分含有该RNAi试剂组合物。该亲脂性物质将该水性内部与一个水性外部分离，该水性外部典型地不包括该RNAi试剂组合物，但在一些实例中，它可以包括。脂质体适用于将活性成分转移并且递送到作用位点。因为该脂质体膜与生物膜结构上类似，所以当脂质体被施用到一种组织时，该脂质体双层与细胞膜的双层融合。随着脂质体与细胞的融合进行，包括该RNAi试剂的内部水性内含物被递送到该细胞中，其中该RNAi试剂可以特异性结合到一种标靶RNA并且可以介导RNAi。在一些情况下，这些脂质体还特异性靶向以例如将该RNAi试剂指引到具体细胞类型。
含有一种RNAi试剂的一种脂质体可以通过多种方法制备。在一个实例中，将一种脂质体的脂质组分溶解于一种清洁剂中以使得形成具有该脂质组分的胶束。举例来说，该脂质组分可以是一种两亲阳离子脂质或脂质结合物。该清洁剂可以具有一个高的临界胶束浓度并且可以是非离子的。示例性清洁剂包括胆酸酯、CHAPS、辛基糖苷、脱氧胆酸酯以及月桂酰基肌氨酸。然后将该RNAi试剂制剂加入到包括该脂质组分的这些胶束。该脂质上的阳离子基团与该RNAi试剂相互作用并且在该RNAi试剂周围缩合以形成一种脂质体。在缩合之后，通过例如透析移除该清洁剂以产生一种RNAi试剂脂质体制剂。
在必要时，可以在缩合反应期间通过例如控制加入来加入辅助缩合的一种载体化合物。举例来说，该载体化合物可以是除一种核酸以外的一种聚合物(例如精胺或亚精胺)。还可以调节pH以促进缩合。
用于制造并入一种多核苷酸/阳离子脂质复合物作为递送媒剂的结构组分的稳定多核苷酸递送媒剂的方法进一步描述于例如WO 96/37194中，该文献的全文内容通过引用结合在此。脂质体形成还可以包括以下各项中所述的示例性方法中的一个或多个方面：费尔格纳P.L.(Felgner，P.L.)等人，《美国国家科学院院刊》8：7413-7417，1987；美国专利号4,897,355；美国专利号5,171,678；班厄姆(Bangham)等人《大分子生物学》(M.Mol.Biol.)23：238，1965；奥尔森(Olson)等人《生物化学与生物物理学学报》557：9，1979；(Szoka)等人《国家科学院院刊》75：4194，1978；梅休(Mayhew)等人《生物化学与生物物理学学报》775：169，1984；金姆(Kim)等人《生物化学与生物物理学学报》728：339，1983；以及福永(Fukunaga)等人《内分泌学》(Endocrinol.)115：757，1984。用于制备用作递送媒剂的具有适当尺寸的脂质聚集体的常用技术包括声处理和冷冻-解冻加挤压(参看例如迈尔(Mayer)等人《生物化学与生物物理学学报》858：161，1986)。当连贯地小(50到200nm)并且相对均匀的聚集体是所希望的时，可以使用微流化(梅休等人《生物化学与生物物理学学报》775：169，1984)。这些方法容易适于将RNAi试剂制剂包装到脂质体中。
pH敏感的或带负电的脂质体包埋核酸分子而非具有其的复合物。因为核酸分子和脂质都类似地带电，所以发生排斥而非复合物形成。尽管如此，一些核酸分子包埋于这些脂质体的水性内部内。pH敏感的脂质体已经用以将编码胸苷激酶基因的DNA递送到培养物中的细胞单层。检测外生基因在该标靶细胞中的表达(周(Zhou)等人，《控制释放杂志》(Journal of Controlled Release)，19(1992)269-274)。
一种主要类型的脂质体组合物包括除天然衍生的磷脂酰胆碱以外的磷脂。中性脂质体组合物例如可以由二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)形成。阴离子脂质体组合物一般来说由二肉豆蔻酰磷脂酰甘油形成，而阴离子融合脂质体主要由二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成。另一种类型的脂质体组合物由磷脂酰胆碱(PC)(如例如大豆PC和蛋PC)形成。另一种类型由磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物形成。
在体外和体内将脂质体引入到细胞中的其他方法的实例包括美国专利号5,283,185；美国专利号5,171,678；WO 94/00569；WO 93/24640；WO 91/16024；费尔格纳，《生物化学杂志》269：2550，1994；纳贝尔(Nabel)，《国家科学院院刊》90：11307，1993；纳贝尔，《人类基因疗法》(Human Gene Ther.)3：649，1992；格申(Gershon)，《生物化学》(Biochem.)32：7143，1993；以及施特劳斯(Strauss)《欧洲分子生物学学会杂志》(EMBOJ.)11：417，1992。
在一个实施例中，使用阳离子脂质体。阳离子脂质体具有能够与细胞膜融合的优势。尽管非阳离子脂质体不能够如与质膜一般有效地融合，但在体内由巨噬细胞吸收并且可以用于将RNAi试剂递送到巨噬细胞。
脂质体的其他优势包括：从天然磷脂获得的脂质体是生物相容的并且生物可降解的；脂质体可以并入各种水和脂质可溶性药物；脂质体可以保护其内部区室中的囊封的RNAi试剂免于代谢和降解(罗索夫(Rosoff)，“药物剂型(Pharmaceutical DosageForms)”，利伯曼(Lieberman)，列赫尔(Rieger)以及班克(Banker)(编)，1988，第1卷，第245页)。脂质体配制品的制备中的重要考虑因素是脂质表面电荷、囊泡尺寸以及脂质体的水性体积。
一种带正电的合成阳离子脂质N-[1-(2，3-二油烯氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)可以用于形成与核酸自发地相互作用以形成能够与组织培养细胞的细胞膜的带负电的脂质融合的脂质-核酸复合物的小脂质体，从而导致RNAi试剂的递送(关于DOTMA和其与DNA一起的使用的描述，参看例如费尔格纳P.L.等人，《美国国家科学院院刊》，8：7413-7417，1987和美国专利号4,897,355)。
一种DOTMA类似物1，2-双(油酰氧基)-3-(三甲基氨)丙烷(DOTAP)可以与一种磷脂组合使用以形成复合DNA的囊泡。LipofectinTM(贝塞斯达研究实验室(Bethesda ResearchLaboratories)，盖瑟斯堡(Gaithersburg)，马里兰州(Md.))是用于将高度阴离子的核酸递送到包含与带负电的多核苷酸自发地相互作用以形成复合物的带正电的DOTMA脂质体的活组织培养细胞中的一种有效试剂。当使用足够的带正电的脂质体时，产生的复合物上的净电荷也是正的。以这种方式制备的带正电的复合物自发地连接到带负电的细胞表面，与质膜融合，并且将功能核酸有效地递送到例如组织培养细胞中。另一种可商购的阳离子脂质1，2-双(油酰氧基)-3，3-(三甲基氨)丙烷(“DOTAP”)(宝灵曼公司(Boehringer Mannheim)，印第安纳波利斯(Indianapolis)，印地安那州(Indiana))不同于DOTMA，因为油酰基部分由酯而非醚键联而键联。
其他报道的阳离子脂质化合物包括已经与多种部分结合的那些，包括例如羧基精胺，它已经与两种类型的脂质之一结合并且包括化合物，如5-羧基精胺基甘氨酸二八油酰基酰胺(“DOGS”)(TransfectamTM，普洛麦格(Promega)，麦迪逊(Madison)，威斯康星州(Wisconsin))和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺5-羧基精胺基-酰胺(“DPPES”)(参看例如美国专利号5,171,678)。
另一种阳离子脂质结合物包括脂质与胆固醇的衍生物(“DC-Chol”)，它已经与DOPE组合配制成脂质体(参看高X.(Gao，X.)和黄L.(Huang，L.)，《生物化学与生物物理学研究通讯》(Biochim.Biophys.Res.Commun.)179：280，1991)。通过使聚赖氨酸与DOPE结合而制造的脂质聚赖氨酸已经被报道有效用于在血清存在下的转染(周X.(Zhou，X.)等人，《生物化学与生物物理学学报》1065：8，1991)。对于某些细胞系来说，含有结合的阳离子脂质的这些脂质体据说与含有DOTMA的组合物相比展现更低毒性并且提供更有效的转染。其他可商购的阳离子脂质产品包括DMRIE和DMRIE-HP(维考(Vical)，拉乔拉(La Jolla)，加利福尼亚州(California))和脂染胺(DOSPA)(生命技术公司(Life Technology，Inc.)，盖瑟斯堡，马里兰)。适用于递送寡核苷酸的其他阳离子脂质描述于WO 98/39359和WO 96/37194中。
脂质体配制品特别适合于局部给予，脂质体呈现若干种优于其他配制品的优势。这样的优势包括与所给予的药物的高全身性吸收相关的副作用减小、在所希望的标靶处所给予的药物的积聚增加以及将RNAi试剂给予到皮肤中的能力。在一些实现方式中，脂质体用于将RNAi试剂递送到表皮细胞并且还增强RNAi试剂渗透到皮组织中，例如到皮肤中。举例来说，这些脂质体可以局部地施用。已经记录了被配制为脂质体的药物向皮肤的局部递送(参看例如韦纳(Weiner)等人，《药物靶向杂志》(Journal of Drug Targeting)，1992，第2卷，405-410和杜普莱西斯(du Plessis)等人，《抗病毒研究》(Antiviral Research)，18，1992，259-265；曼尼诺R.J.(Mannino，R.J.)和富尔德-富格利特S.(Fould-Fogerite，S.)，《生物技术》(Biotechniques)6：682-690，1988；伊塔尼T.(Itani，T.)等人《基因》(Gene)56：267-276.1987；尼古劳C.(Nicolau，C.)等人《酶方法》(Meth.Enz.)149：157-176，1987；斯特劳宾格R.M.(Straubinger，R.M.)和帕帕哈乔泡洛斯D.(Papahadjopoulos，D.)《酶方法》101：512-527，1983；王C.Y.(Wang，C.Y.)和黄L.(Huang，L.)，《美国国家科学院院刊》84：7851-7855，1987)。
还检查非离子脂质体系统(特别是包含非离子表面活性剂和胆固醇的系统)以测定其在将药物递送到皮肤中的效用。将包含Novasome I(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)和Novasome II(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)的非离子脂质体配制品用以将一种药物递送到小鼠皮肤的真皮中。这样的具有RNAi试剂的配制品适用于治疗一种皮肤病症。
包括RNAi试剂的脂质体可以被制得高度可变形。这样的变形性可以使得脂质体能够渗透通过小于脂质体的平均半径的孔隙。举例来说，传递体是可变形脂质体的一种类型。传递体可以通过加入表面边界活化剂(通常是表面活性剂)到一种标准脂质体组合物中来制造。包括RNAi试剂的传递体可以例如通过注射皮下递送以便将RNAi试剂递送到皮肤中的角质细胞。为了横穿完整哺乳动物皮肤，脂质囊泡必须在适合的经皮梯度影响下通过一系列各自具有少于50nm的直径的精细孔隙。另外，归因于脂质性质，这些传递体可以自动最佳化(适于例如皮肤中的孔隙的形状)、自动修复，并且经常可以到达其标靶而不破碎，并且通常自动负载。
属于本发明的其他配制品描述于以下美国临时申请中：2008年1月2日提交的序列号61/018,616、2008年1月2日提交的序列号61/018,611、2008年3月26日提交的序列号61/039,748、2008年4月22日提交的序列号61/047,087以及2008年5月8日提交的序列号61/051,528中。2007年10月3日提交的PCT申请号PCT/US2007/080331也描述了属于本发明的配制品。
表面活性剂
表面活性剂在如乳液(包括微乳液)和脂质体的配制品中获得广泛应用(参看上文)。RNAi试剂(或一种前体，例如可以被加工为一种siRNA的一种更大dsiRNA，或编码一种siRNA或前体的一种DNA)组合物可以包括一种表面活性剂。在一个实施例中，siRNA被配制为一种包括一种表面活性剂的乳液。将多种不同类型的表面活性剂(天然和合成)的性质归类并且分等级的最常见方式是通过使用亲水/亲油平衡(HLB)。亲水基团的性质提供了将配制品中所用的不同表面活性剂分类的最有用手段(列赫尔，“药物剂型”，马塞尔德克尔公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约(New York)，纽约州(NY)，1988，第285页)。
如果表面活性剂分子不是离子化的，那么它被归类为一种非离子表面活性剂。非离子表面活性剂在药物产品中获得广泛应用并且在很宽的pH值范围内是可用的。一般来说，其HLB值取决于其结构而在从2到约18范围内。非离子表面活性剂包括非离子酯，如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、脱水山梨糖醇酯、蔗糖酯以及乙氧基化酯。非离子烷醇酰胺和醚(如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇以及乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物)也包括在这一类别中。聚氧乙烯表面活性剂是非离子表面活性剂类别的最普遍的成员。
如果表面活性剂分子当它溶解或分散于水中时携载一个负电荷，那么该表面活性剂被归类为阴离子的。阴离子表面活性剂包括羧酸盐(如皂)、酰基乳酸盐、氨基酸的酰胺、硫酸酯(如烷基硫酸酯和乙氧基化烷基硫酸酯)、磺酸盐(如烷基苯磺酸盐、酰基羟乙磺酸盐、酰基牛磺酸盐)和磺基琥珀酸盐以及磷酸盐。阴离子表面活性剂类别的最重要的成员是烷基硫酸酯和皂。
如果表面活性剂分子当它溶解或分散于水中时携载一个正电荷，那么该表面活性剂被归类为阳离子的。阳离子表面活性剂包括季铵盐和乙氧基化胺。季铵盐是这种类别的最常用的成员。
如果表面活性剂分子具有携载一个或者正或者负电荷的能力，那么该表面活性剂被归类为两性离子的。两性离子表面活性剂包括丙烯酸衍生物、被取代的烷基酰胺、N-烷基甜菜碱以及磷脂。
已经综述了表面活性剂在药品、配制品以及乳液中的使用(列赫尔，“药物剂型”，马塞尔德克尔公司，纽约，纽约州，1988，第285页)。
胶束和其他膜配制品
本发明的RNAi试剂还可以提供为胶束配制品。“胶束”在此被定义为一种具体类型的分子集合体，其中两亲分子以一种球形结构排列以使得这些分子的全部疏水性部分指向内，使得亲水性部分与周围水相接触。如果环境是疏水性的，那么存在相反排列。
可以通过将siRNA组合物的一种水溶液、一种碱金属C8到C22烷基硫酸盐以及一种胶束形成化合物混合来制备适用于通过经皮膜递送的一种混合胶束配制品。示例性胶束形成化合物包括卵磷脂、透明质酸、透明质酸的药学上可接受的盐、乙醇酸、乳酸、甘菊提取物、黄瓜提取物、油酸、亚油酸、亚麻酸、一油精、单油酸酯、单月桂酸酯、琉璃苣籽油、月见草油、薄荷醇、三羟基氧代胆烷基甘氨酸和其药学上可接受的盐、甘油、甘油聚合物、赖氨酸、聚赖氨酸、三油精、聚氧乙烯醚和其类似物、聚醚醇烷基醚和其类似物、鹅脱氧胆酸酯、脱氧胆酸酯以及其混合物。可以在加入碱金属烷基硫酸盐的同时或之后加入胶束形成化合物。混合胶束将在成分的实质上任何种类混合但有力混合下形成，以便提供较小尺寸的胶束。
在一种方法中，制备一种第一胶束组合物，它含有siRNA组合物和至少碱金属烷基硫酸盐。然后将该第一胶束组合物与至少三种胶束形成化合物混合以形成一种混合胶束组合物。在另一种方法中，通过在有力混合下将siRNA组合物、碱金属烷基硫酸盐以及胶束形成化合物中的至少一者混合接着加入剩余胶束形成化合物来制备胶束组合物。
可以加入苯酚和/或间甲酚到混合胶束组合物以稳定化配制品并且防止细菌生长。可替代地，可以将苯酚和/或间甲酚与胶束形成成分一起加入。还可以在该混合胶束组合物形成之后加入一种等渗剂，如甘油。
为了以喷雾形式递送胶束配制品，可以将该配制品放在一个气雾剂分配器中并且将该分配器以一种推进剂馈入。在压力下的该推进剂在该分配器中呈液体形式。调节成分的比率以使得水相与推进剂相成为一体，即存在一个相。如果存在两个相，那么必须在例如通过一个定量阀分配一部分内含物之前震荡该分配器。分配的药剂的剂量被从该定量阀以一种精细喷雾形式推进。
推进剂可以包括含氢的氯氟碳化物、含氢的氟碳化合物、二甲醚以及乙醚。在某些实施例中，可以使用HFA 134a(1，1，1，2四氟乙烷)。
可以通过相对直接的实验测定必需成分的具体浓度。为了通过口腔吸收，通常希望增加(例如至少双倍或三倍)用于通过注射或通过胃肠道给予的剂量。
颗粒
在另一个实施例中，可以将一种本发明的RNAi试剂并入一种颗粒(例如一种微粒)中。微粒可以通过喷雾干燥制造，但也可以通过其他方法(包括冻干、蒸发、流化床干燥、真空干燥或这些技术的一种组合)制造。
IV.用于抑制TTR表达的方法
本发明还提供了抑制一种细胞中的一种甲状腺素运载蛋白(TTR)表达的方法。这些方法包括使一种细胞与一种RNAi试剂(例如双链RNAi试剂)以有效抑制该细胞中的TTR表达的一个量接触，从而抑制该细胞中的TTR表达。
使一种细胞与一种RNAi试剂(例如一种双链RNAi试剂)接触可以在体外或体内进行。使一种细胞在体内与该RNAi试剂接触包括使一名受试者(例如一名人类受试者)内的一种细胞或细胞群组与该RNAi试剂接触。使一种细胞接触的体外和体内方法的组合也是可能的。如上文所论述，使一种细胞接触可以是直接或间接的。此外，使一种细胞接触可以经由一种标靶配体(包括在此描述或本领域中已知的任何配体)实现。在优选实施例中，该标靶配体是一种碳水化合物部分(例如一种GalNAc3配体)或将该RNAi试剂指引到一名受试者的一个感兴趣的部位(例如肝脏)的任何其他配体。
如在此所用，术语“抑制”与“减少”、“沉默”、“下调”、“抑止”以及其他类似术语可互换使用，并且包括任何水平的抑制。
短语“抑制一种TTR的表达”旨在指抑制任何TTR基因(如例如一种小鼠TTR基因、一种大鼠TTR基因、一种猴TTR基因或一种人类TTR基因)以及一种TTR基因的变体或突变体的表达。因此，该TTR基因可以是一种野生型TTR基因、一种突变TTR基因(如一种引起全身性淀粉样沉积的突变TTR基因)或在一种基因操纵的细胞、细胞群组或生物体的情形下是一种转基因TTR基因。
“抑制一种TTR基因的表达”包括一种TTR基因的任何水平的抑制，例如一种TTR基因的表达的至少部分抑制。该TTR基因的表达可以基于与TTR基因表达相关的任何变量的水平或水平变化(例如TTR mRNA水平、TTR蛋白质水平或淀粉样沉积物的数目或程度)来评估。这一水平可以在一种个别细胞中或在一组细胞中(包括例如来源于一名受试者的一种样品)进行评估。
抑制可以通过一个或多个与TTR表达相关的变量的一个绝对或相对水平与一个对照水平相比的一个降低来评估。该对照水平可以是本领域中所用的任何类型的对照水平，例如，一个投药前基线水平或从未被处理或被一个对照(如例如仅缓冲液的对照或非活性试剂对照)处理的一个类似受试者、细胞或样品测定的一个水平。
在本发明的方法的一些实施例中，一种TTR基因的表达被抑制至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。
一种TTR基因的表达的抑制可以通过由一种第一细胞或细胞群组(这样的细胞可以存在于例如来源于一名受试者的一种样品中)表达的mRNA的量的一个减小来显现，其中一种TTR基因被转录并且该细胞或这些细胞已经被处理(例如通过使该细胞或这些细胞与一种本发明的RNAi试剂接触，或通过给予给现在存在或以前存在这些细胞的一名受试者一种本发明的RNAi试剂)，以使得与该第一细胞或细胞群组实质上相同但尚未被如此处理的一种第二细胞或细胞群组(对照细胞(多种))相比，一种TTR基因的表达得到抑制。在优选实施例中，通过使用下式将mRNA于被处理的细胞中的水平表示为mRNA于对照细胞中的水平的百分比来评估该抑制：
可替代地，一种TTR基因的表达的抑制可以就与TTR基因表达功能上有关的一个参数(例如TTR蛋白质表达、视黄醇结合蛋白水平、维生素A水平或包含TTR的淀粉样沉积物的存在)的一个减小而言来评估。可以在任何或者组成性地或者通过基因组工程化表达TTR的细胞中并且通过本领域中已知的任何分析来测定TTR基因沉默。肝脏是TTR表达的主要部位。其他显著表达部位包括脉络丛、视网膜以及胰腺。
一种TTR蛋白质的表达的抑制可以通过由一种细胞或细胞群组表达的TTR蛋白质水平(例如来源于一名受试者的一种样品中表达的蛋白质水平)的一个降低来显现。如以上关于mRNA抑制的评估所解释，一种被处理的细胞或细胞群组中的蛋白质表达水平的抑制可以类似地表示为蛋白质于一种对照细胞或细胞群组中的水平的百分比。
可以用以评估一种TTR基因的表达的抑制的一种对照细胞或细胞群组包括尚未与一种本发明的RNAi试剂接触的一种细胞或细胞群组。举例来说，该对照细胞或细胞群组可以来源于在用一种RNAi试剂处理受试者之前的一名个别受试者(例如一名人类或动物受试者)。
可以使用本领域中已知用于评估mRNA表达的任何方法来测定由一种细胞或细胞群组表达的TTR mRNA的水平或循环TTR mRNA的水平。在一个实施例中，通过检测一种转录的多核苷酸或其部分(例如该TTR基因的mRNA)来测定一种样品中的TTR的表达水平。可以使用RNA提取技术从细胞提取RNA，包括例如使用酸苯酚/胍异硫氰酸酯提取(RNAzol B；生物起源(Biogenesis))、RNeasy RNA制备试剂盒(凯杰(Qiagen))或PAXgene(PreAnalytix，瑞士(Switzerland))。利用核糖核酸杂交的典型分析形式包括核连缀分析、RT-PCR、RNase保护分析(麦尔登(Melton)等人，《核酸研究》(Nuc.AcidsRes.)12：7035)、RNA印迹法、原位杂交以及微阵列分析。可以使用PCT/US 2012/043584中所述的方法检测循环TTR mRNA，该文献的全文内容特此通过引用结合在此。
在一个实施例中，使用一种核酸探针测定TTR的表达水平。如在此所用，术语“探针”是指能够选择性结合到一种具体TTR的任何分子。探针可以由本领域的技术人员合成或来源于适当生物制剂。探针可以具体来说经设计以被标记。可以用作探针的分子的实例包括(但不限于)RNA、DNA、蛋白质、抗体以及有机分子。
可以在包括(但不限于)以下各项的杂交或扩增分析中使用分离的mRNA：DNA印迹或RNA印迹分析、聚合酶链反应(PCR)分析以及探针阵列。一种用于测定mRNA水平的方法包括使该分离的mRNA与可以与TTR mRNA杂交的一种核酸分子(探针)接触。在一个实施例中，将该mRNA固定在一个固体表面上，并且例如通过使该分离的mRNA在一个琼脂糖凝胶上跑胶并且将该mRNA从该凝胶转移到一个膜(如硝化纤维素)而与一种探针接触。在一个替代性实施例中，将该探针或这些探针固定在一个固体表面上，并且使该mRNA例如在一个Affymetrix基因芯片阵列中与该探针或这些探针接触。一名熟练的业内人士可以容易地使已知mRNA检测方法适用于测定TTR mRNA的水平。
用于测定一种样品中的TTR的表达水平的一种替代性方法涉及该样品中的例如mRNA的核酸扩增和/或逆转录酶(用以制备cDNA)的过程，例如通过RT-PCR(穆利斯(Mullis)，1987，美国专利号4,683,202中阐述的实验实施例)、连接酶链式反应(巴拉尼(Barany)(1991)《美国国家科学院院刊》88：189-193)、自主序列复制(瓜泰利(Guatelli)等人(1990)《美国国家科学院院刊》87：1874-1878)、转录扩增系统(郭(Kwoh)等人(1989)《美国国家科学院院刊》86：1173-1177)、Q-β复制酶(利萨尔迪(Lizardi)等人(1988)《生物技术》(Bio/Technology)6：1197)、滚环复制(利萨尔迪等人，美国专利号5,854,033)或任何其他核酸扩增方法，接着使用本领域技术人员所熟知的技术检测扩增的分子。如果这样的分子以极低数目存在，那么这些检测方案尤其可用于检测核酸分子。在本发明的具体方面，通过定量荧光RT-PCR(即TaqManTM系统)测定TTR的表达水平。
可以使用一种膜印迹(如杂交分析中所用，如RNA印迹、DNA印迹、斑点等)或微孔、样品管、凝胶、珠粒或纤维(或包含结合核酸的任何固体载体)监测TTR mRNA的表达水平。参看美国专利号5,770,722、5,874,219、5,744,305、5,677,195以及5,445,934，这些美国专利通过引用结合在此。TTR表达水平的测定还可以包括使用溶液中的核酸探针。
在优选实施例中，使用支链DNA(bDNA)分析或实时PCR(qPCR)评估mRNA表达水平。这些方法的使用描述并且例证于在此呈现的实例中。
可以使用本领域中已知用于测量蛋白质水平的任何方法测定TTR蛋白质表达水平。这样的方法包括例如电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、超扩散色谱、流体或凝胶沉淀素反应、吸收光谱法、比色分析、分光光度分析、流式细胞术、免疫扩散(单个或双倍)、免疫电泳、蛋白质印迹、放射免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附分析(ELISA)、免疫荧光分析、电化学发光分析等。
在一些实施例中，可以通过检测或监测一种淀粉样TTR沉积物的一个减少来监测本发明的方法的功效。如在此所用，减少一种淀粉样TTR沉积物包括一名受试者的一种器官或部位内的TTR沉积物的尺寸、数目或严重程度的任何减小或TTR沉积物的形成的预防或减少，如可以在体外或体内使用本领域中已知的任何方法评估。举例来说，评估淀粉样沉积物的一些方法描述于格茨M.A.(Gertz，M.A.)和拉居库玛S.V.(Rajukumar，S.V.)(编辑)(2010)，《淀粉样变性：诊断与治疗》(Amyloidosis：Diagnosis and Treatment)，纽约：胡马纳出版社(New York：Humana Press)中。评估淀粉样沉积物的方法可以包括淀粉样沉积物的生物化学分析以及视觉或计算机化评估，如例如使用免疫组织化学染色、荧光标记、光学显微术、电子显微术、荧光显微术或其他类型的显微术变得可见。可以使用侵袭性或非侵袭性成像模式(包括例如CT、PET或NMR/MRI成像)评估淀粉样沉积物。
本发明的方法可以减少身体的许多组织或部位中的TTR沉积物，这些组织或部位包括(但不限于)心脏、肝脏、脾脏、食管、胃、肠(回肠、十二指肠以及结肠)、脑、坐骨神经、脊神经后根神经节、肾脏以及视网膜。
如在此所用，术语“样品”是指从一名受试者分离的一批类似流体、细胞或组织，以及一名受试者内存在的流体、细胞或组织。生物流体的实例包括血液、血清以及浆膜流体、血浆、淋巴液、尿液、脑脊髓液、唾液、眼部流体等。组织样品可以包括来自组织、器官或局部化区域的样品。举例来说，样品可以来源于具体器官、器官的部分或那些器官内的流体或细胞。在某些实施例中，样品可以来源于肝脏(例如整个肝脏或肝脏的某些区段或肝脏中的某些类型的细胞，如例如肝细胞)、视网膜或视网膜的部分(例如视网膜色素上皮细胞)、中枢神经系统或中枢神经系统的部分(例如脑室或脉络丛)或胰腺或胰腺的某些细胞或部分。在优选实施例中，一种“来源于一名受试者的样品”是指从该受试者抽取的血液或血浆。在其他实施例中，一种“来源于一名受试者的样品”是指来源于该受试者的肝脏组织或视网膜组织。
在本发明的方法的一些实施例中，该RNAi试剂被给予给一名受试者，以使得该RNAi试剂被递送到该受试者内的一个具体部位。可以使用来源于来自该受试者内的具体部位的流体或组织的一种样品中的TTR mRNA或TTR蛋白质的水平或水平变化的测量来评估TTR表达的抑制。在优选实施例中，该部位选自下组，该组由以下各项组成：肝脏、脉络丛、视网膜以及胰腺。该部位还可以是来自前述部位中的任一者的细胞的一小部分或子组(例如肝细胞或视网膜色素上皮细胞)。该部位还可以包括表达一种具体类型的受体的细胞(例如表达脱唾液酸糖蛋白受体的肝细胞)。
V.用于治疗或预防一种TTR相关疾病的方法
本发明还提供了用于治疗或预防一名受试者中的一种TTR相关疾病的方法。这些方法包括给予该受试者一个治疗有效量或预防有效量的一种本发明的RNAi试剂。
如在此所用，一名“受试者”包括或者一个人或者一个非人类动物，优选一个脊椎动物，并且更优选一个哺乳动物。一名受试者可以包括一个转基因生物体。最优选地，该受试者是一个人，如罹患或倾向于患上一种TTR相关疾病的一个人。
在一些实施例中，该受试者罹患一种TTR相关疾病。在其他实施例中，该受试者是有风险患上一种TTR相关疾病的一名受试者，例如具有与一种TTR相关疾病的发展相关的一种TTR基因突变的一名受试者、具有一个TTR相关疾病家族史的一名受试者或具有表明TTR淀粉样变性的发展的征象或症状的一名受试者。
如在此所用，一种“TTR相关疾病”包括由淀粉样沉积物的形成引起或与其相关的任何疾病，其中原纤维前体由变异或野生型TTR蛋白质组成。突变和野生型TTR导致不同形式的淀粉样沉积(淀粉样变性)。淀粉样变性涉及错误折叠蛋白质的形成和聚集，从而产生削弱器官功能的细胞外沉积物。与TTR聚集相关的临床综合征包括例如老年全身性淀粉样变性(SSA)；全身性家族性淀粉样变性；家族性淀粉样多发性神经病(FAP)；家族性淀粉样心肌病(FAC)；以及软脑膜淀粉样变性，也称为软脑膜或脑膜脑血管淀粉样变性、中枢神经系统(CNS)淀粉样变性或淀粉样变性VII型。
在本发明的方法的一些实施例中，本发明的RNAi试剂被给予给罹患家族性淀粉样心肌病(FAC)和老年全身性淀粉样变性(SSA)的受试者。正常序列TTR造成老年人的心脏淀粉样变性，并且被称为老年全身性淀粉样变性(SSA)(也称为老年心脏淀粉样变性(SCA)或心脏淀粉样变性)。SSA通常在多种其他器官中伴随有微观沉积物。TTR突变加速了TTR淀粉样形成的过程，并且是临床上显著TTR淀粉样变性(也称为ATTR，淀粉样变性-甲状腺素运载蛋白型))发展的最重要的风险因素。已知多于85种成淀粉样TTR变体引起全身性家族性淀粉样变性。
在本发明的方法的一些实施例中，本发明的RNAi试剂被给予给罹患甲状腺素运载蛋白(TTR)相关家族性淀粉样多发性神经病(FAP)的受试者。这样的受试者可能会遭受眼部表现，如玻璃体混浊和青光眼。本领域的技术人员已知，由视网膜色素上皮细胞(RPE)合成的成淀粉样甲状腺素运载蛋白(ATTR)在眼部淀粉样变性的进展中起重要作用。先前研究已经显示，减少RPE细胞、预防玻璃体中的淀粉样沉积的进展、指示RPE中的ATTR表达的有效抑制的全视网膜激光光凝可以成为用于眼部淀粉样变性的一种新颖疗法(参看例如川路T.(Kawaji，T.)等人，《眼科学》(Ophthalmology).(2010)117：552-555)。本发明的方法可用于治疗TTR相关FAP的眼部表现，例如眼部淀粉样变性。该RNAi试剂可以按适用于靶向一种具体组织(如眼睛)的一种方式递送。眼部递送的模式包括眼球后、皮下眼睑、结膜下、筋膜囊下(subtenon)、前房或玻璃体内注射(或内部注射或输注)。用于眼部递送的具体配制品包括滴眼剂或软膏。
另一种TTR相关疾病是高甲状腺素血症，也称为“异常甲状腺素运载蛋白血症性高甲状腺素血症”或“异常前白蛋白血症性高甲状腺素血症”。这种类型的高甲状腺素血症可以在由于一种突变TTR分子对于甲状腺素具有增加的亲和力而有所增加的甲状腺素与TTR的缔合之后发生。参看例如摩西等人(1982)《临床研究杂志》，86，2025-2033。
本发明的RNAi试剂可以使用本领域中已知的任何给药模式给予给一名受试者，包括(但不限于)皮下、静脉内、肌肉内、眼内、支气管内、胸膜内、腹膜内、动脉内、经淋巴、经脑脊髓及其任何组合。在优选实施例中，这些试剂是皮下给予的。
在一些实施例中，该给予是经由积存注射。一个积存注射可以在长时间内以一种连贯方式释放该RNAi试剂。因此，一个积存注射可以降低获得一种所希望的作用(例如TTR的所希望的抑制或一种治疗或预防作用)所需的投药频率。一个积存注射还可以提供更连贯的血清浓度。积存注射可以包括皮下注射或肌肉内注射。在优选实施例中，该积存注射是一个皮下注射。
在一些实施例中，该给予是经由一个泵。该泵可以是一个外部泵或一个手术植入的泵。在某些实施例中，该泵是一个皮下植入的渗透泵。在其他实施例中，该泵是一个输注泵。一个输注泵可以用于静脉内、皮下、动脉或硬膜外输注。在优选实施例中，该输注泵是一个皮下输注泵。在其他实施例中，该泵是将该RNAi试剂递送到肝脏的一个手术植入的泵。
其他给药模式包括硬膜外、脑内、脑室内、鼻给药、动脉内、心内、骨内输注、鞘内和玻璃体内以及经肺。给药模式可以取决于是希望局部治疗还是全身性治疗并且基于有待治疗的部位来进行选择。给药的途径和部位可以被选择以增强靶向。
在一些实施例中，该RNAi试剂以有效抑制一名受试者内的一种细胞中的TTR表达的一个量给予给该受试者。可以使用以上论述的方法评估有效抑制一名受试者内的一种细胞中的TTR表达的量，包括涉及评估TTR mRNA、TTR蛋白质或相关变量(如淀粉样沉积物)的抑制的方法。
在一些实施例中，该RNAi试剂以一个治疗或预防有效量给予给一名受试者。
如在此所用，“治疗有效量”旨在包括一种RNAi试剂当给予给一名患者用于治疗一种TTR相关疾病时足以实现该疾病的治疗(例如通过削弱、改善或维持该现有疾病或一种或多种疾病症状)的量。该“治疗有效量”可以取决于该RNAi试剂、该试剂如何给予、该疾病和其严重程度、和病史、年龄、体重、家族史、基因组成、由TTR表达所介导的病理过程的阶段、先前或伴随治疗(如果有的话)的类型、以及待治疗的该患者的其他个别特征而变化。
如在此所用，“预防有效量”旨在包括一种RNAi试剂当给予给一名尚末经历过或显示出一种TTR相关疾病的症状但可能易患该疾病的受试者时足以预防或改善该疾病或该疾病的一种或多种症状的量。可以得到改善的症状包括感觉神经病变(例如远端肢体的感觉异常、感觉减退)、自主神经病变(例如胃肠功能失调，如胃溃疡；或起立性低血压)、运动神经病变、癫痫、痴呆、脊髓病、多发性神经病、腕管综合征、自主功能不全、心肌病、玻璃体混浊、肾功能不全、肾病变、实质上降低的mBMI(修正的身体质量指数)、脑神经功能障碍以及角膜格子状营养不良。改善该疾病包括减缓该疾病的进程或降低后来患上的疾病的严重程度。该“预防有效量”可以取决于该RNAi试剂、该试剂如何给予、该疾病的风险程度、和病史、年龄、体重、家族史、基因组成、先前或伴随治疗(如果有的话)的类型、以及待治疗的该患者的其他个别特征而变化。
一种“治疗有效量”或“预防有效量”还包括一种RNAi试剂的在适用于任何治疗的合理效益/风险比下产生一定所希望的局部或全身性作用的一个量。本发明的方法中所用的RNAi试剂可以按足以产生一个适用于这样的治疗的合理效益/风险比的一个量给予。
如在此所用，短语“治疗有效量”和“预防有效量”还包括在治疗、预防或管理由TTR表达介导的病理过程或病理过程的症状(多种)中提供一种效益的一个量。TTR淀粉样变性的症状包括感觉神经病变(例如远端肢体的感觉异常、感觉减退)、自主神经病变(例如胃肠功能失调，如胃溃疡；或起立性低血压)、运动神经病变、癫痫、痴呆、脊髓病、多发性神经病、腕管综合征、自主功能不全、心肌病、玻璃体混浊、肾功能不全、肾病变、实质上降低的mBMI(修正的身体质量指数)、脑神经功能障碍以及角膜格子状营养不良。
给予给一名受试者的一种RNAi试剂的剂量可以被定制以平衡一种具体剂量的风险与效益，例如以实现一种所希望的水平的TTR基因抑制(如例如基于TTR mRNA抑制、TTR蛋白质表达或一种淀粉样沉积物的减少而评估，如上文所定义)或一种所希望的治疗或预防作用而同时避免不希望的副作用。
在一个实施例中，该RNAi试剂以约0.25mg/kg到约50mg/kg之间、例如约0.25mg/kg到约0.5mg/kg之间、约0.25mg/kg到约1mg/kg之间、约0.25mg/kg到约5mg/kg之间、约0.25mg/kg到约10mg/kg之间、约1mg/kg到约10mg/kg之间、约5mg/kg到约15mg/kg之间、约10mg/kg到约20mg/kg之间、约15mg/kg到约25mg/kg之间、约20mg/kg到约30mg/kg之间、约25mg/kg到约35mg/kg之间或约40mg/kg到约50mg/kg之间的一个剂量给予。
在一些实施例中，该RNAi试剂以约0.25mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约11mg/kg、约12mg/kg、约13mg/kg、约14mg/kg、约15mg/kg、约16mg/kg、约17mg/kg、约18mg/kg、约19mg/kg、约20mg/kg、约21mg/kg、约22mg/kg、约23mg/kg、约24mg/kg、约25mg/kg、约26mg/kg、约27mg/kg、约28mg/kg、约29mg/kg、30mg/kg、约31mg/kg、约32mg/kg、约33mg/kg、约34mg/kg、约35mg/kg、约36mg/kg、约37mg/kg、约38mg/kg、约39mg/kg、约40mg/kg、约41mg/kg、约42mg/kg、约43mg/kg、约44mg/kg、约45mg/kg、约46mg/kg、约47mg/kg、约48mg/kg、约49mg/kg或约50mg/kg的一个剂量给予。
在一些实施例中，该RNAi试剂在两个或更多个剂量中给予。如果希望促进重复或频繁输注，那么可能可取的是植入一个递送装置，例如一个泵、半永久性支架(例如静脉内、腹膜内、脑池内或囊内)或储集器。在一些实施例中，后续剂量的数目或量取决于一种所希望的作用(例如一种TTR基因的抑制)的实现或一种治疗或预防作用(例如减少一种淀粉样沉积物或减少一种TTR相关疾病的一种症状)的实现。在一些实施例中，该RNAi试剂根据一个规程给予。举例来说，该RNAi试剂可以每周两次、每周三次、每周四次或每周五次给予。在一些实施例中，该规程包括规则地间隔的给药，例如每小时、每隔四小时、每隔六小时、每隔八小时、每隔十二小时、每天、每隔2天、每隔3天、每隔4天、每隔5天、每周、每两周或每月。在其他实施例中，该规程包括紧密间隔的给药，接着是较长时间，在该时间期间不给予该试剂。举例来说，该规程可以包括在相对短的时间(例如约每隔6小时、约每隔12小时、约每隔24小时、约每隔48小时或约每隔72小时)中给予的一组初始剂量，接着是较长时间(例如约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周或约8周)，在该时间期间不给予该RNAi试剂。在一个实施例中，该RNAi试剂最初每小时给予，并且后来以较长间隔时间(例如每天、每周、每两周或每月)给予。在另一个实施例中，该RNAi试剂最初每天给予，并且后来以较长间隔时间(例如每周、每两周或每月)给予。在某些实施例中，较长间隔时间随时间增加或基于一种所希望的作用的实现来测定。在一个具体实施例中，该RNAi试剂在第一周期间每天一次给予，接着从给药的第八天开始每周给药。在另一个具体实施例中，该RNAi试剂在第一周期间每隔一天给予，接着从给药的第八天开始每周给药。
这些规程中的任一者可以任选地被重复用于一个或多个迭代。迭代次数可以取决于一种所希望的作用(例如一种TTR基因、视黄醇结合蛋白水平、维生素A水平的抑制)的实现和/或一种治疗或预防作用(例如减少一种淀粉样沉积物或减少一种TTR相关疾病的一种症状)的实现。
在一些实施例中，该RNAi试剂与其他治疗剂或其他治疗方案一起给予。举例来说，适用于治疗一种TTR相关疾病的其他试剂或其他治疗方案可以包括一个肝移植，它可以降低体内的突变TTR水平；他发米帝司(维尼达克尔)，它使TTR四聚体动力学上稳定，预防TTR成淀粉样所需的四聚体解离；以及利尿剂，它们可以用以例如减少TTR淀粉样变性中的水肿与心脏受累。
在一个实施例中，一名受试者被给予一种RNAi试剂的一个初始剂量和一个或多个维持剂量。该维持剂量或这些维持剂量与该初始剂量相比可以是相同或更低的，例如是该初始剂量的二分之一。一种维持方案可以包括用从每天0.01μg到15mg/kg体重范围内，例如每天10mg/kg、1mg/kg、0.1mg/kg、0.01mg/kg、0.001mg/kg或0.00001mg/kg体重的一个或多个剂量治疗该受试者。这些维持剂量例如不多于每隔2天一次、每隔5天一次、每隔7天一次、每隔10天一次、每隔14天一次、每隔21天一次或每隔30天一次给予。此外，该治疗方案可以持续一段时间，该时间将取决于具体疾病的性质、其严重程度以及该患者的总体病状而变化。在某些实施例中，该剂量可以不多于每天一次，例如不多于每24个、36个、48个或更多个小时一次，例如不多于每隔5或8天一次递送。在治疗之后，可以监测该患者的病状变化。该RNAi试剂的剂量可以或者在该患者不显著响应于当前剂量水平的情况下增加，或者该剂量可以在观测到疾病状态的症状减缓时、在已经消除了疾病状态时或在观测到不希望的副作用时减少。
VI.试剂盒
本发明还提供了用于执行本发明的方法中的任一者的试剂盒。这样的试剂盒包括一种或多种RNAi试剂和使用说明书，例如用于通过使一种细胞与该RNAi试剂或这些RNAi试剂以有效抑制一种TTR表达的一个量接触来抑制该细胞中的该TTR表达的说明书。这些试剂盒可以任选地进一步包括用于使该细胞与该RNAi试剂接触的工具(例如一个注射装置)或用于测量TTR的抑制的工具(例如用于测量TTR mRNA或TTR蛋白质的抑制的工具)。这样的用于测量TTR的抑制的工具可以包括用于从一名受试者获得一种样品(如例如一种血浆样品)的一个工具。本发明的试剂盒可以任选地进一步包括用于将该RNAi试剂或这些RNAi试剂给予给一名受试者的工具或用于测定治疗有效或预防有效量的工具。
本发明由以下实例进一步展示，这些实例不应被视为限制性的。贯穿本申请引用的所有参考文献和公布的专利和专利申请的内容特此通过引用结合在此。
实例
实例1：用TTR-GalNAc结合物抑制TTR
将一个单个剂量的TTR RNAi试剂AD-43527皮下给予给小鼠，并且在给药后72小时测定TTR mRNA水平。
选择小鼠/大鼠可交叉反应GalNAc结合物AD-43527用于在WT C57BL/6小鼠中体内地评估肝脏中的TTR mRNA沉默。AD-43527的每条链的序列展示如下。
链：s＝有义链；as＝反义链
所用配体是GalNAc3：
这一GalNAc3配体使用如下所示的连接子和系栓与有义链的3′端结合：
产生的GalNAc3结合的有义链的结构在以下结构式中展示：
合成并且分析靶向TTR并且具有以下序列和修饰的另外的RNAi试剂。
小鼠/大鼠可交叉反应TTR RNAi试剂
人类/猕猴可交叉反应TTR RNAi试剂；母体双链体是AD-18328[具有GuAAccAAGAGuAuuccAudTdT(SEQ ID NO：12)的有义链5′-3′序列和AUGGAAuACUCUUGGUuACdTdT(SEQ ID NO：13)的反义链5′到3′序列，具有以下修饰：AS上的交替2′F/2′OMe w/2PS]。
L96＝GalNAc3；小写字母nt(a、u、g、c)是2′-O-甲基核苷酸，Nf(即Af)是一个2′-氟基核苷酸；Q11是胆固醇；s是硫代磷酸酯。
将AD-43527经由皮下注射以10μl/g的一个剂量体积以30、15、7.5、3.5、1.75或0.5mg/kg AD-43527的一个剂量给予给雌性C57BL/6小鼠(6-10周，5只/组)。对照动物通过皮下注射以相同剂量体积接受PBS。
在约七十二小时之后，用200μl氯胺酮使小鼠麻醉，并且然后通过切断右尾动脉放血。将肝脏组织收集，急骤冷冻，并且储存在-80℃下直到处理。
在投药后72小时通过测量肝脏中的TTR mRNA评估处理功效。利用支链DNA分析-QuantiGene 1.0(潘诺米克(Panomics))分析TTR肝脏mRNA水平。简单地说，研磨小鼠肝脏样品，并且制备组织溶解物。将肝脏溶解混合物(1体积溶解混合物、2体积无核酸酶的水以及10μl蛋白酶-K/ml的混合物，以达到20mg/ml的一个最终浓度)在65℃下孵育35分钟。加入5μl肝脏溶解物和95μl工作探针组(用于基因靶向的TTR探针和用于内生对照的GAPDH)到捕获板(Capture Plate)中。将捕获板在53℃±1℃下孵育(约16-20小时)。次日，将捕获板用1X洗涤缓冲液(无核酸酶的水、缓冲液组分1以及洗涤缓冲液组分2)洗涤3次，然后在240g下通过离心干燥1分钟。加入100μl扩增探针混合物/孔到捕获板中，将该捕获板以铝箔密封，并且在46℃±1℃下孵育1小时。在1小时孵育之后，重复洗涤步骤，然后加入100μl标记探针混合物/孔。将捕获板在46℃±1℃下孵育1小时。然后将板用1X洗涤缓冲液洗涤，干燥，并且加入100μl底物/孔到捕获板中。将捕获板在46℃下孵育30分钟，接着在室温下孵育30分钟。在孵育之后，将板使用SpectraMax光度计读数。通过从每个一式两份样品减去平均背景值，将所得一式两份GAPDH(对照探针)和TTR(实验探针)值平均，并且然后计算比率：(实验探针-背景值)/(对照探针-背景值)来分析bDNA数据。对于每组计算平均TTR mRNA水平，并且将其归一化为PBS组平均值以按PBS对照组的％形式给出相对TTR mRNA。
结果展示于图1中。靶向TTR的GalNAc结合的RNAi试剂对于TTR mRNA阻断具有约5mg/kg的ED50。这些结果显示，靶向TTR的GalNAc结合的RNAi试剂在抑制TTR mRNA表达方面是有效的。
Section 1.01实例2：用TTR-GalNAc结合物抑制TTR是持久的
向小鼠给予一个皮下剂量(或者7.5mg/kg或者30.0mg/kg)的AD-43527，一种靶向TTR的GalNAc结合的RNAi试剂。在使用实例1中所述的方法处理后1、3、5、7、10、13、15、19、26、33以及41天评估肝脏中的TTR mRNA水平。
结果展示于图2中。在第19天，30.0mg/kg GalNAc结合的RNAi试剂的给予仍展示约50％沉默。表达的完全恢复在第41天发生。
这些结果显示，由靶向TTR的GalNAc结合的siRNA提供的抑制是持久的，持续多达处理后3、5、7、10、13、15、19、26或33天。
实例3.RNA合成和双重退火
1.寡核苷酸合成
在一个AKTAoligopilot合成器或一个ABI 394合成器上合成寡核苷酸。除非另外规定，否则将可商购的受控微孔玻璃固体载体(dT-CPG，引物合成(PrimeSynthesis))和具有标准保护基的RNA亚磷酰胺5′-O-二甲氧基三苯甲基N6-苯甲酰基-2′-叔丁基二甲基硅烷基-腺苷-3′-O-N，N′-二异丙基-2-氰基乙基亚磷酰胺、5′-O-二甲氧基三苯甲基-N4-乙酰基-2′-叔丁基二甲基硅烷基-胞苷-3′-O-N，N′-二异丙基-2-氰基乙基亚磷酰胺、5′-O-二甲氧基三苯甲基-N2--异丁酰基-2′-叔丁基二甲基硅烷基-鸟苷-3′-O-N，N′-二异丙基-2-氰基乙基亚磷酰胺以及5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-叔丁基二甲基硅烷基-尿苷-3′-O-N，N′-二异丙基-2-氰基乙基亚磷酰胺(皮尔斯核酸技术(Pierce Nucleic AcidsTechnologies))用于寡核苷酸合成。2′-F亚磷酰胺5′-O-二甲氧基三苯甲基-N4-乙酰基-2′-氟-胞苷-3′-O-N，N′-二异丙基-2-氰基乙基-亚磷酰胺和5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-氟-尿苷-3′-O-N，N′-二异丙基-2-氰基乙基-亚磷酰胺购自(普洛麦格)。所有亚磷酰胺都以0.2M于乙腈(CH3CN)中的浓度使用，除鸟苷之外，鸟苷以0.2M于10％THF/ANC(v/v)中的浓度使用。使用16分钟的偶联/再循环时间。活化剂是5-乙基硫基四唑(0.75M，美国国际化学(American International Chemicals))，用于PO-氧化，使用碘/水/吡啶，并且用于PS-氧化，使用于2，6-二甲基吡啶/ACN(1∶1v/v)中的PADS(2％)。
使用含有相对应的配体的一个固体载体合成配体结合的链。举例来说，通过用相对应的碳水化合物固体载体开始合成来实现在一个序列的3′端处引入一个碳水化合物部分/配体(例如GalNAc)。类似地，通过在胆固醇载体上开始合成在3′端处引入一个胆固醇部分。一般来说，该配体部分经由如先前实例中所述的一个所选系栓而系栓到反-4-羟基脯氨醇以获得一个羟基脯氨醇-配体部分。该羟基脯氨醇-配体部分然后经由一个琥珀酸酯连接子偶联到一个固体载体，或经由标准亚磷酸化条件转化为亚磷酰胺，以获得所希望的碳水化合物结合物构筑嵌段。从相对应的亚磷酰胺或固体载体(购自生物研究技术(BiosearchTechnologies))合成荧光团标记的siRNA。内部制造负荷是38.6微摩尔/克的油烯基石胆酸(GalNAc)3聚合物载体。还内部制造负荷是42.0微摩尔/克的甘露糖(Man)3聚合物载体。
除非另外规定，否则通过使相对应的亚磷酰胺在标准亚磷酰胺偶合条件下偶联到正在生长的链来实现所选配体在所希望的位置处，例如在序列的5′端处的结合。0.1M亚磷酰胺于无水CH3CN中的溶液在5-(乙基硫基)-1H-四唑活化剂存在下与固体结合寡核苷酸进行长期15分钟偶联。如博凯奇S.L.(Beaucage，S.L.)(2008)siRNA寡核苷酸的固相合成(Solid-phase synthesis of siRNA oligonucleotides).《药物发现与开发的目前见解》(Curr.Opin.Drug Discov.Devel.)，11，203-216；米勒S.(Mueller，S.)，沃尔夫J.(Wolf，J.)以及伊万诺夫S.A.(Ivanov，S.A.)(2004)用于合成RNA的当前策略(CurrentStrategies for the Synthesis of RNA).《当今有机合成》(Curr.Org.Synth.)，1，293-307；夏J.(Xia，J.)，诺罗尼亚A.(Noronha，A.)，透加斯卡I.(Toudjarska，I.)，李F.(Li，F.)，阿金奇A.(Akinc，A.)，布莱池R.(Braich，R.)，弗兰克-卡梅涅茨基M.(Frank-Kamenetsky，M.)，拉杰夫K.G.(Rajeev，K.G.)，埃利M.(Egli，M.)以及马诺哈兰M.(Manoharan，M.)(2006)一种核糖-二氟甲苯甲酰基核苷酸对siRNA的基因沉默活性(GeneSilencing Activity of siRNAs with a Ribo-difluorotoluyl Nucleotide).《ACS化学生物学》(ACS Chem.Biol.)，1，176-183中报道使用标准碘-水或通过用叔丁基氢过氧化物/乙腈/水(10∶87∶3)处理来进行核苷酸间亚磷酸酯向磷酸酯的氧化，具有10分钟氧化等待时间结合的寡核苷酸。通过使用一种硫转移试剂(如DDTT(购自AM化学(AM Chemicals))、PADS和或博凯奇试剂)将亚磷酸酯氧化为硫代磷酸酯来引入硫代磷酸酯。将胆固醇亚磷酰胺内部合成，并且以0.1M于二氯甲烷中的浓度使用。胆固醇亚磷酰胺的偶联时间是16分钟。
2.去保护-I(核碱基去保护)
在完成合成之后，将载体转移到一个100ml玻璃瓶(VWR)。将寡核苷酸从载体裂解，同时在55℃下用80mL乙醇化氨的混合物[氨∶乙醇(3∶1)]使碱基和磷酸酯基去保护6.5小时。将瓶在冰上简单冷却，并且然后将乙醇化氨混合物过滤到一个新的250ml瓶中。将CPG用2×40mL份的乙醇/水(1∶1v/v)洗涤。然后通过旋转蒸发将混合物的体积减少到约30ml。然后将混合物在干冰上冷冻，并且在一个speed vac上在真空下干燥。
3.去保护-II(移除2′TBDMS基团)
将经干燥的残余物再悬浮于26ml三乙胺、三乙胺三氢氟化物(TEA.3HF)或吡啶-HF以及DMSO(3∶4∶6)中，并且在60℃下加热90分钟以移除2′位处的叔丁基二甲基硅烷基(TBDMS)基团。然后将反应物用50ml 20mM乙酸钠淬灭，并且将pH调节到6.5，并且储存于冷冻器中直到纯化。
4.分析
将寡核苷酸通过高效液相色谱(HPLC)分析，随后纯化，并且取决于序列和或结合的配体的性质来选择缓冲液和柱。
5.HPLC纯化
将配体结合的寡核苷酸通过反相制备型HPLC纯化。将未结合的寡核苷酸通过在一个内部填充的TSK凝胶柱上阴离子交换HPLC来纯化。缓冲液是10％CH3CN中的20mM磷酸钠(pH 8.5)(缓冲液A)和10％CH3CN、1M NaBr中的20mM磷酸钠(pH 8.5)(缓冲液B)。将含有全长寡核苷酸的洗脱份汇集，脱盐，并且冻干。将约0.15OD的脱盐的寡核苷酸在水中稀释到150μl，并且然后在专用小瓶中吸取用于CGE和LC/MS分析。最终通过LC-ESMS和CGE分析化合物。
6.RNAi试剂制备
为了制备一种RNAi试剂，将等摩尔量的有义链和反义链在1X PBS中在95℃下加热5分钟，并且缓慢冷却到室温。通过HPLC分析证实双链体的完整性。下表1反映了靶向人类或啮齿动物TTR mRNA的RNAi试剂。
实例4：RNAi试剂的体外筛选
细胞培养和转染
使人类Hep3B细胞或大鼠H.II.4.E细胞(ATCC，马纳萨斯(Manassas)，维吉尼亚州(VA))在37℃下在5％CO2的氛围中在补充有10％FBS、链霉素以及谷氨酰胺(ATCC)的RPMI(ATCC)中生长到接近汇合，随后通过胰蛋白酶化从板释放。通过加入14.8μlOpti-MEM加0.2μl脂染胺(Lipofectamine)RNAiMax/孔(英杰(Invitrogen)，卡尔斯巴德(Carlsbad)加利福尼亚州(CA)，目录号13778-150)到5μl siRNA双链体/孔到一个96孔板中进行转染，并且在室温下孵育15分钟。然后加入不具有抗生素、含有约2×104个Hep3B细胞的80μl完全生长培养基到siRNA混合物。将细胞孵育或者24或者120小时，随后RNA纯化。在10nM和0.1nM最终双链体浓度下执行单个剂量实验，并且使用8、4倍连续稀释用10nM最终双链体浓度的最大剂量进行剂量反应实验。
使用DYNABEADS mRNA分离试剂盒(英杰，件号：610-12)进行总RNA分离
将细胞收获，并且溶解于150μl溶解/结合缓冲液中，然后使用一个Eppendorf热混合器在850rpm下混合5分钟(贯穿处理的搅拌速度相同)。加入十微升磁性珠粒和80μl溶解/结合缓冲混合物到一个圆底板中，并且混合1分钟。将磁性珠粒使用磁性表架捕获，并且将上清液移除而不干扰珠粒。在移除上清液之后，将溶解的细胞加入到剩余珠粒，并且混合5分钟。在移除上清液之后，将磁性珠粒用150μl洗涤缓冲液A洗涤2次，并且混合1分钟。再次捕获珠粒，并且移除上清液。然后将珠粒用150μl洗涤缓冲液B洗涤，捕获，并且移除上清液。接着将珠粒用150μl洗脱缓冲液洗涤，捕获，并且移除上清液。使珠粒干燥2分钟。在干燥之后，加入50ul洗脱缓冲液，并且在70℃下混合5分钟。将珠粒在磁体上捕获持续5分钟。将40μl上清液移出，并且加入到另一个96孔板。
使用ABI高容量cDNA反转录试剂盒(应用生物系统(Applied Biosystems)，福斯特 市(Foster City)，加利福尼亚州，目录号4368813)进行cDNA合成
加入1μl 10×缓冲液、0.4μl 25×dNTP、1μl随机引物、0.5μl反转录酶、0.5μlRNase抑制剂以及1.6μl H2O的主体混合物/反应到5μl总RNA中。使用一个Bio-Rad C-1000或S-1000热循环器(赫苦斯(Hercules)，加利福尼亚州)通过以下步骤产生cDNA：25℃10分钟，37℃120分钟，85℃5秒，4℃保持。
实时PCR
加入2μl cDNA到一个384孔板(罗氏(Roche)目录号04887301001)中的一种主体混合物中，该主体混合物含有0.5μl GAPDH TaqMan探针(应用生物系统目录号4326317E(人类)目录号4308313(啮齿动物))、0.5μl TTR TaqMan探针(应用生物系统目录号HS00174914_ml(人类)目录号Rn00562124ml(大鼠))以及5μl Lightcycler480探针主体混合物(罗氏目录号04887301001)/孔。在一个罗氏LC 480实时PCR机(罗氏)中进行实时PCR。除非另外说明，否则在至少两个独立转染中测试每种双链体，并且一式两份分析每个转染。
为了计算相对倍数变化，将实时数据使用ΔΔCt方法分析，并且归一化到以用10nM AD-1955转染的细胞或模拟转染的细胞执行的分析。将IC50使用一个4参数拟合模型使用XLFit计算，并且归一化到用相同剂量范围内的AD-1955(有义序列：cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT(SEQ ID NO：2202)；反义序列：UCGAAGuCUcAGCGuAAGdTsdT(SEQID NO：2203))转染的细胞或未处理细胞，或到其自身最低剂量。对于每个个别转染以及组合计算IC50，其中将一个单个IC50拟合到来自两个转染的数据。
本发明的具有不同基序修饰的示例性siRNA双链体的基因沉默的结果展示于上表1中。
实例5：靶向TTR的化学修饰的RNAi试剂的体外沉默活性
以下实验显示化学修饰(包括与一个GalNAc3配体一起引入三联体重复基序)对靶向TTR的RNAi试剂的沉默活性的有益作用。所研究的试剂的序列提供于下表2中。与TTRmRNA具有互补性的区如下：RNAi试剂AD-45165、AD-51546以及AD-51547的具有互补性的区是GGATGGGATTTCATGTAACCAAGA(SEQ ID NO：2204)，并且RNAi试剂AD-45163、AD-51544以及AD-51545的具有互补性的区是TTCATGTAACCAAGAGTATTCCAT(SEQ ID NO：2205)。
用于评估Hep3B细胞中的IC50的方案
在Hep3B细胞(一种人类肝癌细胞系)中通过使用脂染胺RNAiMAX进行标准反转染来测定每种被修饰的siRNA的IC50。简单地说，通过与10μL Opti-MEM加0.5μL脂染胺RNAiMax/孔(英杰，卡尔斯巴德加利福尼亚州，目录号13778-150)一起加入5μL Opti-MEM到5μL siRNA双链体/孔到一个96孔板中并且在室温下孵育15-20分钟来进行反转染。在孵育之后，然后加入100μL不具有抗生素、含有12,000-15,000个Hep3B细胞的完全生长培养基到每个孔。将细胞在37℃下在5％CO2的氛围中孵育24小时，随后溶解，并且通过bDNA(Quantigene)分析TTR和GAPDH mRNA。评估从10nM到0.6pM范围内的七种不同siRNA浓度用于IC50测定，并且将siRNA转染的细胞的TTR/GAPDH归一化到用10nM Luc siRNA转染的细胞。结果展示于表2中。
用于评估自由摄取IC50的方案
在用TTR siRNA孵育或者4小时或者24小时之后评估初级猕猴肝细胞中的自由摄取沉默。在从初始暴露起24小时测量沉默。简单地说，在实验开始之前24小时，将96孔培养板在室温下用0.05％-0.1％胶原蛋白(西格玛(Sigma)C3867-1VL)涂布。在分析当天，将siRNA在由补充有吉诺(GIBCO)的维持培养基试剂盒(无血清，生命技术CM4000)的DMEM组成的预加温的涂布培养基(Plating Media)中稀释，并且加入到胶原蛋白涂布的96孔培养板。将冷冻保存的初级猕猴肝细胞在一个37℃水浴中快速解冻，并且立即在涂布培养基中稀释到360,000个细胞/毫升的浓度。将一定体积的细胞悬浮液轻缓地吸取到预涂布的siRNA顶上，以使得最终细胞计数是18,000个细胞/孔。将板轻微旋动以使细胞混合并且均匀地扩散在孔上，并且将其放在一个37℃、5％CO2孵育箱中24小时，随后溶解，并且通过bDNA(Quantigene，Affymetrix)分析TTR和GAPDH mRNA。在用siRNA孵育4小时的情况下，将培养基在暴露于细胞4小时之后倾析，并且用新鲜涂布培养基置换后持续剩余的20小时孵育。用于TTR和GAPDH mRNA的下游分析与上述相同。对于一个典型剂量反应曲线来说，将siRNA通过4倍连续稀释从1μM到0.24nM滴定。
表2：交替TTR-GalNAc和具有三联体基序的变体的体外活性概述
小写字母核苷酸(a、u、g、c)表示2′-O-甲基核苷酸；Nf(例如Af)表示一个2′-氟基核苷酸；s表示一个硫代磷酸酯键联；
L96表示一个GalNAc3配体，黑体核苷酸表示相对于对应母体试剂的变化。每个黑体核苷酸在一个三联体基序的中心处。
结果提供于表2中，并且显示，靶向TTR的被修饰的RNAi试剂提供了增强的沉默活性。
结果：被修饰的RNAi试剂的改进的活性
具有交替化学修饰和一个GalNAc3配体的母体RNAi试剂提供了约0.01nM的Hep3B细胞中的IC50。如图4-5和表2中所示，相对于母体试剂例如通过加入2′-氟基和2′-O-甲基修饰的一个或多个重复三联体修饰的试剂出乎意料地展示增强的沉默活性，达到比相对应的母体试剂好5-8倍的Hep3B细胞中的IC50值。
结果：Hep3B细胞中的自由摄取IC50
如表2和图6-7中所示，相对于母体AD-45163被修饰的RNAi试剂也展示增强的自由摄取沉默。这些被修饰的试剂在24小时孵育期之后展示多于双倍的母体沉默活性，并且在4小时孵育期之后展示接近10倍的母体沉默活性。
如表2和图8-9中所示，相对于母体AD-45165被修饰的RNAi试剂也展示增强的自由摄取沉默。这些被修饰的试剂在24小时孵育期之后展示2-3倍的母体沉默活性，并且在4小时孵育期之后展示5-8倍的母体沉默活性。
总的来说，这些结果显示，在此呈现的被修饰的RNAi试剂(例如AD-51544、AD-51545、AD-51546以及AD-51547)在体外沉默实验中全部展示出乎意料地好的TTR mRNA抑制。
实例6：转基因小鼠中的TTR mRNA沉默以及TTR蛋白质抑制
为了评估RNAi试剂AD-45163、AD-51544、AD-51545、AD45165、AD-51546以及AD-51547的功效，将这些试剂给予给表达具有V30M突变的人类甲状腺素运载蛋白的转基因小鼠(参看桑多斯SD.(Santos，SD.)，费尔南德斯R.(Femaandes，R.)以及萨赖瓦MJ.(Saraiva，MJ.)(2010)《老年神经生物学》(Neurobiology of Aging)，31，280-289)。已知V30M突变引起人类中的家族性淀粉样多发性神经病I型。参看例如洛巴托L.(2003)《肾脏学杂志》，16(3)：438-42。
将RNAi试剂(在PBS缓冲液中)或PBS对照以5mg/kg或1mg/kg的一个单个皮下剂量给予给18-24个月大的小鼠(2只雄性和2只雌性)。在约48小时之后，用200μl氯胺酮使小鼠麻醉，并且然后通过切断右尾动脉放血。将全血分离，并且将血浆分离并且储存在-80℃下直到分析。将肝脏组织收集，急骤冷冻，并且储存在-80℃下直到处理。
通过(i)在投药后48小时测量肝脏中的TTR mRNA和(ii)在出血前和在投药后48小时测量血浆中的TTR蛋白质来评估处理功效。利用支链DNA分析-QuantiGene 2.0(潘诺米克目录号：QS0011)分析TTR肝脏mRNA水平。简单地说，研磨小鼠肝脏样品，并且制备组织溶解物。将肝脏溶解混合物(1体积溶解混合物、2体积无核酸酶的水以及10μl蛋白酶-K/ml的混合物，以达到20mg/ml的一个最终浓度)在65℃下孵育35分钟。然后加入20μ1工作探针组(用于基因标靶的TTR探针和用于内生对照的GAPDH)和80μl组织溶解物到捕获板中。将捕获板在55℃±1℃下孵育(约16-20小时)。次日，将捕获板用1×洗涤缓冲液(无核酸酶的水、缓冲液组分1以及洗涤缓冲液组分2)洗涤3次，然后在240g下通过离心干燥1分钟。加入100μ1预扩增工作试剂到捕获板中，将该捕获板以铝箔密封，并且在55℃±1℃下孵育1小时。在1小时孵育之后，重复洗涤步骤，然后加入100μl扩增工作试剂。在1小时之后，重复洗涤和干燥步骤，并且加入100μl标记探针。将捕获板在50℃±1℃下孵育1小时。然后将板用1×洗涤缓冲液洗涤，干燥，并且加入100μl底物到捕获板中。将捕获板在5到15分钟孵育之后使用SpectraMax光度计读数。通过从每个一式三份样品减去平均背景值，将所得一式三份GAPDH(对照探针)和TTR(实验探针)值平均，并且然后计算比率：(实验探针-背景值)/(对照探针-背景值)来分析bDNA数据。
根据制造商准则利用可商购的试剂盒“AssayMax人类前白蛋白ELISA试剂盒”(AssayPro，圣查尔斯(St.Charles)，密苏里州(MO)，目录号EP3010-1)分析血浆TTR水平。简单地说，将小鼠血浆在1×混合稀释剂中1∶10,000稀释，并且与试剂盒标准物一起加入到预涂布的板，并且在室温下孵育2小时，接着用试剂盒洗涤缓冲液洗涤5次。加入五十微升生物素化的前白蛋白抗体到每个孔中，并且将其在室温下孵育1小时，接着用洗涤缓冲液洗涤5次。加入五十微升抗生蛋白链菌素-过氧化物酶结合物到每个孔，并且将板在室温下孵育30分钟，接着如先前所述洗涤。通过以下方式使反应物显影，加入50微升/孔的色原体底物，并且在室温下孵育10分钟，通过加入50微升/孔终止溶液终止反应。在一个Versamax微板读取器(分子装置(Molecular Devices)，桑尼维尔(Sunnyvale)，加利福尼亚州)上读取450nm下的吸光度，并且利用Softmax 4.6软件包(分子装置)分析数据。
结果展示于图10-12中。图10显示，相对于母体试剂AD-45163和AD-45165，被修饰的RNAi试剂与母体试剂的活性相比展示出类似或更有效的RNA沉默活性。图11显示，试剂AD-51544和AD-51545展示出剂量依赖性沉默活性，并且这些试剂在5mg/kg的一个剂量下的沉默活性与相对应的母体AD-45163的活性类似。图12显示，试剂AD-51546和AD-51547也展示出剂量依赖性沉默活性。此外，AD-51546和AD-51547在5mg/kg的一个剂量下的沉默活性优于相对应的母体AD-45165的活性。
实例7：靶向TTR的RNAi试剂在小鼠中的血清和肝脏药代动力学特征曲线
为了评估RNAi试剂AD-45163、AD-51544、AD-51545、AD-51546以及AD-51547的药代动力学特征曲线，将于PBS缓冲液中的这些试剂使用一种单个IV推注或皮下(SC)给药给予给C57BL/6小鼠。在给药之后的不同时间点评估这些试剂的血浆浓度和肝脏浓度。
血浆药代动力学参数呈现于下表3和4中。血浆中的平均停留时间(MRT)在IV投药之后是约0.2小时并且在SC投药之后是约1小时。在25mg/kg的一个剂量下，试剂AD-51544、AD-51545、AD-51546以及AD-51547展示出类似的血浆药代动力学性质。这些试剂中的每一者从皮下空间具有多于75％的生物可用性。其生物可用性优于以30mg/kg的一个更高剂量给予的母体试剂AD-45163的生物可用性。AD-51544和AD-51547的皮下生物可用性是约100％，而AD-51545的生物可用性是90％，并且AD-51546的生物可用性是76％。
表3：在小鼠中SC给予TTR-GalNAc siRNA之后的血浆PK参数估计的概述
表4：在一个IV推注或SC投予25mg/kg的AD-51544、51545、51546或51547之后小鼠中的血浆siRNA PK参数
结果还指示，RNAi试剂AD-45163、AD-51544、AD-51545、AD-51546以及AD-51547当皮下给予时与当通过IV推注给予时相比在肝脏中达到类似或更高浓度。肝脏药代动力学参数呈现于下表5和6中。肝脏中的峰值浓度(Cmax)和曲线下面积(AUC0-最后)在皮下给药之后与以相同剂量IV给予相同试剂相比高两倍到三倍。肝脏暴露对于AD-51547来说最高并且对于AD-51545来说最低。平均停留时间(MRT)和消除半衰期与AD-51544和AD-51545相比对于AD-51546和AD-51547来说更长。在皮下给药之后，大致MRT对于AD-51546来说是40小时并且对于AD-51547来说是25小时，而MRT对于AD-51544和AD-51545来说较低(约6-9小时)。AD-51546和AD-51547的消除半衰期(41-53小时)也比AD-51544和AD-51545的消除半衰期(6-10小时)高。
表5：在小鼠中SC给予TTR-GalNAc siRNA之后肝脏PK参数估计的概述
表6：在一个IV推注或SC投予25mg/kg的AD-51544、51545、51546或51547之后小鼠中的肝脏siRNA PK参数
实例8：RNAi试剂于猴血清中够体外稳定性
还评估RNAi试剂AD-51544、AD-51545、AD-51546以及AD-51547在猴中的血清稳定性。结果显示，AD-51544、AD-51545以及AD-51547的反义和有义链在约24小时的时期内展示血清稳定性(数据未示出)。
实例9：RNAi试剂在非人类灵长类动物中产生TTR蛋白质的持续抑制
通过在皮下给予五个5mg/kg剂量(每天一个剂量持续5天)或一个单个25mg/kg剂量之后测量TTR蛋白质在食蟹猴血清中的抑制来评估RNAi试剂AD-45163、AD-51544、AD-51545、AD-51546以及AD-51547的RNA沉默活性。通过对第一个剂量之前11天、第一个剂量之前7天以及第一个剂量之前1天的水平取平均值来评估血清中的投药前TTR蛋白质水平。通过从最后剂量之后第1天(即在5×5mg/kg组中的研究第5天和在1×25mg/kg组中的研究第1天)开始直到最后剂量之后第49天(即在5×5mg/kg组中的研究第53天和在1×25mg/kg组中的研究第49天)测定血清中的水平来评估TTR蛋白质的投药后血清水平。参看图13。
如实例6中所述评估TTR蛋白质水平。结果展示于图14和表7和8中。
在接受25mg/kg AD-45163、AD-51544、AD-51546以及AD-51547的组中实现高达约50％的TTR蛋白质的最大抑制(参看表8)。在接受5×5mg/kg AD-45163、AD-51544、AD-51546以及AD-51547的组中实现约70％的TTR蛋白质的更大最大抑制(参看表7)。试剂AD-51545在两种给药方案中都产生较小程度的抑制。约20％或更高的显著抑制在1×25mg/kg和5×5mg/kg方案两者中都在AD-51546和AD-51547的最后剂量之后持续多达49天。一般来说，在5×5mg/kg方案中实现比在1×25mg/kg方案中更好的抑制。
表7食蟹猴中的相对于投药前的血清甲状腺素运载蛋白分数(每天5mg/kg持续5天)
表8食蟹猴中的相对于投药前的血清甲状腺素运载蛋白分数(25mg/kg)
实例10：靶向TTR的RNAi试剂的可耐受性
在全血分析中在细胞因子评估中
为了评估靶向TTR的RNAi试剂(包括AD-45163、AD-51544、AD-51545、AD-51546以及AD-51547)的可耐受性，将每种试剂在一个全血分析中使用来自三个人类供体的血液测试。这些试剂或者是300nM DOTAP转染的或者是1μM无转染试剂(游离siRNA)。以下细胞因子/趋化因子存在少于两倍的变化：G-CSF、IFN-γ、IL-10、IL-12(p70)、IL1β、IL-lra、IL-6、IL-8、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、TNFα。(结果未示出)。
体内评估
为了评估体内可耐受性，将RNAi试剂以125mg/kg的一个剂量皮下注射到CD1小鼠中。在皮下注射AD-45163之后2、4、6、24或48小时观测到无细胞因子诱导。在皮下注射AD-51544、AD-51545、AD-51546或AD-51547之后6或24小时观测到无显著细胞因子诱导。
为了进一步评估体内可耐受性，将多种RNAi试剂(包括AD-45163、AD-51544、AD-51545、AD-51546以及AD-51547)通过在非人类灵长类动物(食蟹猴)中皮下注射5和25mg、每一部位剂量体积在1-2ml之间来进行测试。在注射部位处未观测到红斑或水肿。
单个SC剂量大鼠可耐受性研究
为了评估毒性，将大鼠用100、250、500或750mg/kg AD-45163的一个单个皮下剂量注射(参看表9)。进行以下评估：毒性的临床征象、体重、血液学、临床化学和凝血、器官重量(肝脏和脾脏)；总量和微观评估(肾脏、肝脏、肺、淋巴结、脾脏、睾丸、胸腺、主动脉、心脏、肠(小和大)。
表9：单个SC剂量大鼠可耐受性研究：史泊格多利大鼠中的100、250、500以及750mg/kg AD-45163
结果显示出无测试物相关的毒性临床征象，对体重、器官重量或临床化学的作用。在心脏、肾脏、睾丸、脾脏、肝脏以及胸腺中未观测到组织病理学。在750mg/kg下WBC存在一个非不良的轻微测试物相关的增加(↑68％，主要归因于NEUT和MONO的增加)。这些结果表明，高达750mg/kg的一个单个剂量在大鼠中是充分耐受的。
大鼠中的重复皮下给药的可耐受性
为了评估AD-45163的重复皮下给药的可耐受性，给出300mg/kg的每天皮下注射持续5天，并且在第6天执行尸检。研究设计展示于表10中。
表10：大鼠中的五天重复剂量可耐受性研究
评估以下结果变量：临床征象、体重、血液学、临床化学和凝血、器官重量、总量和微观评估(肝脏、脾脏、肾脏、心脏、胃肠道以及第一和最后注射部位)。结果显示出无测试物相关的临床征象、体重或器官重量作用，并且在临床血液学或化学中也无测试物相关的发现。在第6天活化部分凝血活酶时间(APTT)存在可能的轻微延长(20.4相较于17.4秒)。组织病理学显示在肝脏、脾脏、心脏以及胃肠道中无测试物相关的发现。在肾脏中，观测到管状上皮细胞的最小到轻微肥大(非不良的)。在最后注射部位处，存在最小多灶性单核浸润，非不良的。这些结果表明，母体RNAi试剂AD-45163的五个每天300mg/kg剂量在大鼠中是充分耐受的。
实例11：RNAi试剂在非人类灵长类动物中产生TTR蛋白质的持续抑制
通过在皮下给予“累积期(1oading phase)”的RNAi试剂：或者2.5mg/kg、5mg/kg、或者10mg/kg的五个每天剂量(每天一个剂量持续5天)，接着是“维持期”的RNAi试剂：每周投予或者2.5mg/kg、5mg/kg、或者10mg/kg持续4周之后测量TTR蛋白质在食蟹猴血清中的抑制来评估RNAi试剂AD-51547的RNA沉默活性。通过对第一个剂量之前11天、第一个剂量之前7天以及第一个剂量之前1天的水平取平均值来评估血清中的投药前TTR蛋白质水平。通过从完成累积期之后第1天开始直到维持期的最后剂量之后40天(即研究第70天)测定血清中的相对于投药前的水平来评估TTR蛋白质的投药后血清水平。
如实例6中所述来评估TTR蛋白质水平。结果展示于图15中。
在接受或者2.5mg/kg、5mg/kg、或者10mg/kg AD-51547的所有组中都实现高达约80％的TTR蛋白质的最大抑制。在所有组中到约第14天都实现最低阻断，抑制用或者2.5mg/kg、5mg/kg、或者10mg/kg AD-51547的每周维持剂量维持在最低阻断水平下。对于5和2.5mg/kg剂量水平来说，TTR水平在最后维持剂量的给药当天之后多于40天并未返回到基线。
等效物：
本领域的普通技术人员仅仅使用常规实验将识别或能够确定在此描述的具体实施例和方法的多种等效物。这样的等效物旨在由以上权利要求书的范围所涵盖。

Claims (36)

1.一种双链RNAi试剂，包含与一条反义链互补的一条有义链，其中所述反义链包含与SEQ ID NO:1所示甲状腺素运载蛋白基因的核苷酸504-526互补的序列，其中所述有义链长度为21个核苷酸和所述反义链长度为23个核苷酸，其中所述双链RNAi试剂由式(III)表示：
有义链：5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq3'
反义链：3'np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′5'
(III)
其中：
j＝1，且i、k以及l是0；
p'是2，且p、q以及q'是0；
每个Na和Na'独立地表示包含2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
每个Nb和Nb'独立地表示包含0-7个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
np'表示突出端核苷酸；
YYY、ZZZ和Y'Y'Y'各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序，其中所述Y核苷酸包含2’-氟修饰，所述Y’核苷酸包含2’-O-甲基修饰，和所述Z核苷酸包含2’-O-甲基修饰；并且
其中该有义链与至少一个配体结合，其中所述配体是GalNAc配体。
2.如权利要求1所述的RNAi试剂，其中该YYY基序存在于该有义链的从5’端起的9、10和11位处；或其中该Y'Y'Y'基序存在于该反义链的从5’端起的11、12以及13位处。
3.如权利要求1所述的RNAi试剂，其中所述Na、Na’、Nb和Nb’核苷酸上的修饰各自独立地选自下组，该组由以下各项组成：LNA、HNA、CeNA、2'-甲氧基乙基、2'-O-烷基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-氟、2'-脱氧、2'-羟基及其组合。
4.如权利要求3所述的RNAi试剂，其中所述Na、Na’、Nb和Nb’核苷酸上的修饰是2'-O-甲基、2'-氟或两者。
5.如权利要求1所述的RNAi试剂，其中该配体是
6.如权利要求1所述的RNAi试剂，其中该配体连接到该有义链的3'端。
7.如权利要求6所述的RNAi试剂，其中该RNAi试剂与如以下结构式中所示的配体结合：
其中X是O或S。
8.如权利要求7所述的RNAi试剂，其中该RNAi试剂与如以下结构式中所示的配体结合：
9.如权利要求1所述的RNAi试剂，进一步包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联。
10.如权利要求9所述的RNAi试剂，其中该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联在一条链的3'末端处。
11.如权利要求10所述的RNAi试剂，其中所述链是该反义链或该有义链。
12.如权利要求1所述的RNAi试剂，其中该双链体的反义链的5'端的1位处的该碱基对是一个AU碱基对。
13.如权利要求1所述的RNAi试剂，其中所述np'突出端核苷酸与标靶mRNA互补或其中所述np'突出端核苷酸与标靶mRNA不互补。
14.如权利要求1所述的RNAi试剂，其中至少一个np'经由一个硫代磷酸酯键而键联到一个相邻核苷酸。
15.如权利要求14所述的RNAi试剂，其中所有np'都经由硫代磷酸酯键而键联到相邻核苷酸。
16.如权利要求1所述的RNAi试剂，其中所述RNAi试剂选自下组，该组由以下各项组成：AD-51546，其具有以下结构：
有义链：5’-UfgGfGfAfuUfuCfAfUfgUfaAfcCfAfAfgAfL96-3’，和
反义链：5’-uCfuugGfuUfaCfaugAfaAfuccCfasUfsc-3’；以及
AD-51547，其具有以下结构：
有义链：5’-UfgGfgAfuUfuCfAfUfgUfaacCfaAfgAfL96-3’，和
反义链：5’-uCfuUfgGfUfUfaCfaugAfaAfuCfcCfasUfsc-3’,
其中a、g、c和u是2’-O-甲基A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf是2’-氟A、G、C和U；s是硫代磷酸酯键；和L96是GalNAc3配体。
17.如权利要求1所述的RNAi试剂，其中该RNAi试剂是AD-51547，其具有以下结构：
有义链：5’-UfgGfgAfuUfuCfAfUfgUfaacCfaAfgAfL96-3’，和
反义链：5’-uCfuUfgGfUfUfaCfaugAfaAfuCfcCfasUfsc-3’，
其中a、g、c和u是2’-O-甲基A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf是2’-氟A、G、C和U；s是硫代磷酸酯键；和L96是GalNAc3配体。
18.如权利要求1所述的RNAi试剂，其中所述有义链包含核苷酸序列5’-UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA-3’。
19.如权利要求1所述的RNAi试剂，其中所述有义链包含核苷酸序列5’-UfgGfgAfuUfuCfAfUfgUfaacCfaAfgAfL96-3’和所述反义链包含核苷酸序列5’-uCfuUfgGfUfUfaCfaugAfaAfuCfcCfasUfsc-3’，
其中a、g、c和u是2’-O-甲基A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf是2’-氟A、G、C和U；s是硫代磷酸酯键；和L96是GalNAc3配体。
20.一种双链RNAi试剂，包含有义链和反义链，其中所述有义链由核苷酸序列5’-UfgGfgAfuUfuCfAfUfgUfaacCfaAfgAfL96-3’组成和所述反义链由核苷酸序列5’-uCfuUfgGfUfUfaCfaugAfaAfuCfcCfasUfsc-3’组成，
其中a、g、c和u是2’-O-甲基A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf是2’-氟A、G、C和U；s是硫代磷酸酯键；和L96是GalNAc3配体。
21.一种从肝脏、脉络丛、视网膜或胰腺分离的细胞，含有如权利要求1、17和20中任一项所述的RNAi试剂。
22.一种药物组合物，包含一种如权利要求1-20中任一项所述的RNAi试剂。
23.如权利要求22所述的药物组合物，其中所述RNAi试剂在一种非缓冲溶液中给予。
24.如权利要求23所述的药物组合物，其中所述非缓冲溶液是生理盐水或水。
25.如权利要求22所述的药物组合物，其中所述RNAi试剂与一种缓冲溶液给予。
26.如权利要求25所述的药物组合物，其中所述缓冲溶液包括乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐或磷酸盐或其任何组合。
27.如权利要求26所述的药物组合物，其中所述缓冲溶液是磷酸盐缓冲生理盐水。
28.一种在体外抑制细胞中的一种甲状腺素运载蛋白表达的方法，包括使所述细胞与一种如权利要求1-20中任一项所述的RNAi试剂以有效抑制所述细胞中的所述甲状腺素运载蛋白表达的一个量接触，从而抑制所述细胞中的所述甲状腺素运载蛋白表达。
29.如权利要求1-20中任一项所述的RNAi试剂在制备用于治疗受试者中的甲状腺素运载蛋白相关疾病的药物中的用途。
30.如权利要求29所述的用途，其中所述受试者是一个人。
31.如权利要求29所述的用途，其中所述受试者携带与一种甲状腺素运载蛋白相关疾病的发展相关的一种甲状腺素运载蛋白基因突变。
32.如权利要求29所述的用途，其中所述甲状腺素运载蛋白相关疾病选自下组，该组由以下各项组成：老年全身性淀粉样变性、全身性家族性淀粉样变性、家族性淀粉样多发性神经病、家族性淀粉样心肌病、软脑膜/中枢神经系统淀粉样变性以及高甲状腺素血症。
33.如权利要求29所述的用途，其中所述受试者具有一种甲状腺素运载蛋白相关淀粉样变性，并且所述方法减少所述受试者中的一种淀粉样甲状腺素运载蛋白沉积物。
34.如权利要求29所述的用途，其中所述RNAi试剂皮下给予所述受试者。
35.一种用于执行如权利要求28所述的方法的试剂盒，包括
a)所述RNAi试剂，和
b)使用说明书。
36.一种用于实施如权利要求29所述的用途的试剂盒，包括
a)所述RNAi试剂，
b)使用说明书，以及
c)任选地用于将所述RNAi试剂给予给所述受试者的工具。
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