TW202302847A - 己酮糖激酶（ＫＨＫ）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法 - Google Patents

己酮糖激酶（ＫＨＫ）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本發明關於靶向己酮糖激酶(KHK)基因的RNAi劑，例如dsRNA劑。本發明也關於使用該些劑以抑制KHK基因表現的方法以及關於在對象治療或預防KHK相關疾患的方法。

Description

己酮糖激酶(KHK)iRNA組成物及其使用方法
本發明係關於己酮糖激酶(KHK)iRNA組成物及使用該組成物以抑制KHK基因表現的方法以及關於在對象治療或預防KHK相關疾患的方法。
相關申請
本申請主張2021年2月26日申請之美國臨時申請案號63/154,005、2021年7月20日申請之美國臨時申請案號63/223,581以及2021年11月18日63/280,668的優先權。前述申請案之各者的全部內容以參考方式併入本文。
序列表
本申請案含有經以ASCII格式電子提出的序列表且其整體以參考方式併入本文。該ASCII複本，創建於2022年2月16日，命名為121301_14720_SL.txt且為572,214位元大小。
流行病學研究已顯示，西方飲食是現代肥胖流行病的主要原因之一。與使用濃縮軟飲料和加工食品相關的果糖攝取增加被認為是導致該流行病的主要因素。於1967年，高果糖玉米甜味劑開始在食品工業中得到廣泛使用。雖然葡萄糖和果糖每個分子的熱量值相同，但這兩種糖的代謝方式不同且利用 不同的GLUT轉運蛋白。果糖幾乎完全在肝臟中代謝，與葡萄糖代謝途徑不同，果糖代謝途徑不受產物反饋抑制的調節(Khaitan Z et al.,(2013)J.Nutr.Metab.2013,Article ID 682673,1-12)。雖然己糖激酶和磷酸果糖激酶(PFK)調節自葡萄糖、果糖激酶或己酮糖激酶(KHK)之甘油醛-3-P的產生，後者負責在肝臟中將果糖磷酸化為果糖-1-磷酸，但不藉由增加果糖-1-磷酸的量級而下調。其結果，所有果糖進入細胞則快速地磷酸化。(Cirillo P.et al.,(2009)J.Am.Soc.Nephrol.20：545-553)。持續利用ATP磷酸化果糖為果糖-1-磷酸造成細胞內磷酸鹽耗竭、ATP耗竭、AMP脫胺酶的活化以及尿酸形成(Khaitan Z.et al.,(2013)J.Nutr.Metab.Article ID 682673,1-12)。增加的尿酸進一步刺激KHK的上調(Lanaspa M.A.et al.,(2012)PLOS ONE 7(10)：1-11)且引起內皮細胞及脂肪細胞功能異常。隨後，果糖-1-磷酸藉由醛縮酶B的作用轉化為甘油醛，且被磷酸化為甘油醛-3-磷酸。後者向下游進入二醇分解途徑以形成丙酮酸，進入檸檬酸循環，自此在營養充足的條件下，檸檬酸從粒線體輸出到胞質液，提供乙醯基輔酶A用於脂肪生成(圖1)。
藉由KHK之果糖的磷酸化，以及脂肪生成的後續活化導致，例如，脂肪肝、高三酸甘油脂血症、脂質血異常以及胰島素抗性。近端腎小管細胞的前炎性變化(proinflammatory changes)業已顯示出藉由KHK活性被誘導(Cirillo P.et al.,(2009)J.Am.Soc.Nephrol.20：545-553)。藉由KHK之果糖的磷酸化係與疾病、疾患或狀況相關，如肝疾病(例如，脂肪肝、脂肪肝炎)、脂質血異常(例如，高脂血症、高LDL膽固醇、低HDL膽固醇、高三酸甘油脂血症、飯後高三酸甘油脂血症)、血糖調控的疾患(例如，胰島素抗性、第2型糖尿病)、心血管疾病(例如，高血壓、內皮細胞功能異常)、腎疾病(例如，急 性腎疾患、腎小管功能異常、近端腎小管的前炎性變化、慢性腎疾患)、代謝症狀群、脂肪細胞功能異常、內臟脂肪沉積、肥胖、高尿酸血症、痛風、攝食異常及過度的糖渴望。因此，所屬技術領域有需求於用以治療與KHK活性相關的疾病、疾患及狀況的組成物及方法。
本發明提供iRNA組成物，該組成物影響編碼己酮糖激酶(KHK)的基因之RNA轉錄物的RNA-誘導緘默化複合體(RNA-induced silencing complex，RISC)-介導的裂解。KHK基因可於細胞內，例如，於對象內的細胞，如人類對象。
一態樣中，本發提供一種雙股核糖核酸(dsRNA)劑，其係用於抑制己酮糖激酶(KHK)於細胞之表現，其中該dsRNA劑包含形成雙股區域的有義股及反義股，其中該有義股包含與SEQ ID NO：1之核苷酸序列差異不多於0、1、2或3個核苷酸之至少15，例如，15、16、17、18、19、20或21個接續核苷酸及該反義股包含與SEQ ID NO：2之核苷酸序列差異不多於0、1、2或3個核苷酸之至少15，例如，15、16、17、18、19、20或21個接續核苷酸。一具體例中，該dsRNA劑包含至少一個熱去安定化核苷酸修飾，例如，無鹼基修飾；與雙鏈體中相反核苷酸的失配；以及去安定化糖修飾、2’-去氧修飾、無環狀修飾、非鎖定核酸(unlocked nucleic acids，UNA)或甘油核酸(glycerol nucleic acid，GNA)，例如，該反義股包含至少一個熱去安定化核苷酸修飾。
另一態樣中，本發明提供雙股核糖核酸(dsRNA)用於抑制己酮糖激酶(KHK)於細胞之表現，其中，該dsRNA包含形成雙股區域的有義股及 反義股，其中該反義股包含包含互補於編碼KHK的mRNA的區域，以及其中，該互補區域包含與表2、3、5、6及8至13中任一者的任一反義核苷酸序列之差異不多於3個核苷酸的至少15個，例如15、16、17、18’19、20、21或22個接續核苷酸。
一具體例中，該dsRNA劑包含有義股及反義股，該有義股包含於其全長對於表2、3、5、6及8至13中任一者的任一有義股核苷酸序列具有至少85%，例如85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核苷酸序列同一性的接續核苷酸序列以及該反義股包含逾期全長對於表2、3、5、6及8至13中任一者的任一有義股核苷酸序列具有至少85%，例如85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核苷酸序列同一性的接續核苷酸序列。
一具體例中，該dsRNA劑包含有義股及反義股，該有義股包含與表2、3、5、6及8至13中任一者的任一有義股核苷酸序列差異不多於三個核苷酸之至少15個，例如15、16、17、18、19、20或21個接續核苷酸以及該反義股包含與表2、3、5、6及8至13中任一者的任一反義股核苷酸序列差異不多於三個核苷酸之至少15個，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23個接續核苷酸。
一具體例中，該dsRNA劑包含有義股及反義股，該有義股包含與表2、3、5、6及8至13中任一者的任一有義股核苷酸序列差異不多於二個核苷酸之至少15個，例如15、16、17、18、19、20或21個接續核苷酸以及該反義股包含與表2、3、5、6及8至13中任一者的任一反義股核苷酸序列差異不多 於二個核苷酸之至少15個，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23個接續核苷酸。
一具體例中，該dsRNA劑包含有義股及反義股，該有義股包含與表2、3、5、6及8至13中任一者的任一有義股核苷酸序列差異不多於一個核苷酸之至少15個，例如15、16、17、18、19、20或21個接續核苷酸以及該反義股包含與表2、3、5、6及8至13中任一者的任一反義股核苷酸序列差異不多於一個核苷酸之至少15個，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23個接續核苷酸。
一具體例中，該dsRNA劑包含有義股及反義股，該有義股包含或由選自表2、3、5、6及8至13中任一者的任一有義股核苷酸序列所成群組之核苷酸序列以及該反義股包含與表2、3、5、6及8至13中任一者的任一反義股核苷酸序列包含或由選自表2、3、5、6及8至13中任一者的任一有義股核苷酸序列所成群組之核苷酸序列。
一態樣中，本發明提供雙股核糖核酸(dsRNA)用於抑制己酮糖激酶(KHK)於細胞之表現，其中，該dsRNA包含形成雙股區域的有義股及反義股，其中該有義股包含與SEQ ID NO：1的核苷酸的核苷酸序列：120-162、164-188、181-207、193-217、209-231、283-306、508-546、568-603、596-632、640-674、746-806、806-835、917-942、936-084、1016-1041、1100-1123、1149-1175、1160-1193、1205-1229、1252-1283、1334-1356、1407-1429、1472-1497、1506-1533、1539-1561、1704-1727、1747-1787、1850-1873、1936-1964、1960-1990、2015-2048、2060-2095、2090-2118、2124-2160、2181-2200、2221-2262的任一者差異不多於0、1、2或3核苷酸的至少15個，例如15、16、17、18、19、 20或21個接續核苷酸，以及該反義股包含與SEQ ID NO：2的相應核苷酸序列差異不多於三個，例如，3、2、1或0個核苷酸的至少15個，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23個接續核苷酸。
一態樣中，本發明提供雙股核糖核酸(dsRNA)用於抑制己酮糖激酶(KHK)於細胞之表現，其中，該dsRNA包含形成雙股區域的有義股及反義股，其中該有義股包含與SEQ ID NO：1的核苷酸的核苷酸序列：517-539、521-543、524-546、517-546、581-603、610-632、747-769、749-771、752-774、755-777、757-779、758-780、764-786、776-798、781-803、747-803、920-942、941-963、944-966、950-972、962-984、920-984、1149-1171、1161-1183、1165-1187、1171-1193、1149-1193、1205-1227、1206-1228、1205-1228、1334-1356、1472-1494、1475-1497、1472-1497的任一者差異不多於0、1、2或3核苷酸的至少15個，例如15、16、17、18、19、20或21個接續核苷酸，以及該反義股包含與SEQ ID NO：2的相應核苷酸序列差異不多於三個，例如，3、2、1或0個核苷酸的至少15個，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23個接續核苷酸。
一態樣中，本發明提供雙股核糖核酸(dsRNA)用於抑制己酮糖激酶(KHK)於細胞之表現，其中，該dsRNA包含形成雙股區域的有義股及反義股，其中該有義股包含與SEQ ID NO：1的核苷酸的核苷酸序列：517-539、524-546、517-546、753-775、757-779、753-779、764-786、767-789、768-790、769-791、764-791、773-795、781-803、773-803、753-803、808-830、937-959、941-963、944-966、941-966、948-970、950-972、948-972、1160-1182、1161-1183、1160-1183、及1207-1229的任一者差異不多於0、1、2或3核苷酸的至少15個， 例如15、16、17、18、19、20或21個接續核苷酸，以及該反義股包含與SEQ ID NO：2的相應核苷酸序列差異不多於三個，例如，3、2、1或0個核苷酸的至少15個，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23個接續核苷酸。
一具體例中，該反義股包含與選自由AD-1613400、AD-1613243、AD-1290757.3、AD-1290878.3、AD-1290969.3、AD-1423317.2、AD-1423327.2、AD-1423336.2、AD-1290599.3、AD-1523172.1、AD-1290837.3、AD-1523173.1、AD-1290884.3、AD-1523174.1、AD-1290959.3、AD-1523175.1、AD-1423311.2、AD-1423324.2、AD-1523176.1、AD-1423329.2、AD-1423333.2、AD-1423330.2、AD-1523177.1、AD-1290885.3、AD-1523178.1、AD-1423334.2、AD-1523179.1、AD-1523180.1、AD-1290539.3、及AD-1523181.1所組成群組的雙鏈體的任一反義股核苷酸序列差異不多於0、1、2或3個核苷酸的至少15個，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23個接續核苷酸。
另一態樣中，本發明提供一種雙股核糖核酸(dsRNA)劑，其係用於抑制己酮糖激酶(KHK)於細胞之表現，其中，該dsRNA包含形成雙股區域的有義股及反義股，其中該有義股包含與SEQ ID NO：1的核苷酸的核苷酸序列：495-517、492-517、500-529、514-551、517-539、524-546、517-548、614-643、625-647、625-660、642-664、642-672、753-811、754-780、762-791、764-786、772-800、781-803、805-827、808-830、809-831、792-838、931-982、944-966、947-969、948-970、948-982、1011-1035、1021-1043、1019-1050、1063-1091、1150-1192、1152-1176、1160-1192、1160-1182、1162-1184、1198-1230、1198-1221、及1202-1230的任一者差異不多於三個，例如3、2、1或0個核苷酸的至少15個，例如15、16、17、18、19、20或21個接續核苷酸，以及該反義股包 含與SEQ ID NO：2的相應核苷酸序列差異不多於三個，例如，3、2、1或0個核苷酸的至少15個接續核苷酸，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23個接續核苷酸。
一態樣中，本發明提供一種雙股核糖核酸(dsRNA)劑，其係用於抑制己酮糖激酶(KHK)於細胞之表現，其中，該dsRNA包含形成雙股區域的有義股及反義股，其中該有義股包含包含與SEQ ID NO：1的核苷酸的核苷酸序列513-556、753-813、936-981、1155-1193、1200-1229、1704-1727、1747-1787、1850-1873、1936-1964、1960-1990、1936-1990、2015-2048、2060-2095、2090-2118、2060-2118、2124-2160、2181-2220、2221-2249、2181-2249、2240-2262、2221-2262、及2181-2262的任一者差異不多於三個，例如3、2、1或0個核苷酸的至少15個，例如15、16、17、18、19、20或21個接續核苷酸，以及該反義股包含與SEQ ID NO：2的相應核苷酸序列差異不多於三個，例如，3、2、1或0個核苷酸的至少15個接續核苷酸，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23個接續核苷酸。
一態樣中，本發明提供一種雙股核糖核酸(dsRNA)劑，其係用於抑制己酮糖激酶(KHK)於細胞之表現，其中，該dsRNA包含形成雙股區域的有義股及反義股，其中該有義股包含與SEQ ID NO：1的核苷酸1207-1229或937-959的核苷酸序列差異不多於三個，例如3、2、1或0個核苷酸的至少15個，例如15、16、17、18、19、20或21個接續核苷酸，以及該反義股包含與SEQ ID NO：2的相應核苷酸序列差異不多於三個，例如，3、2、1或0個核苷酸的至少15個接續核苷酸，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23個接續核苷酸。
一具體例中，該有義股包含與SEQ ID NO：1的核苷酸1207-1229的核苷酸序列差異不多於三個，例如3、2、1或0個核苷酸的至少15個，例如15、16、17、18、19、20或21個接續核苷酸，以及該反義股包含與SEQ ID NO：2的相應核苷酸序列差異不多於三個，例如，3、2、1或0個核苷酸的至少15個接續核苷酸，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23個接續核苷酸。
一具體例中，該dsRNA劑包含至少一種經修飾核苷酸。
一具體例中，該有義股的實質上所有核苷酸；該反義股的實質上所有核苷酸包含修飾；或該有義股的實質上所有核苷酸及該反義股的實質上所有核苷酸包含修飾。
一具體例中，該有義股的所有核苷酸包含修飾；該反義股的所有核苷酸包含修飾；或該有義股的所有核苷酸及該反義股的所有核苷酸包含修飾。
一具體例中，經修飾核苷酸之至少一者係選自下述所成群組：去氧核苷酸、3’-終端去氧胸苷(dT)核苷酸、2’-O-甲基修飾之核苷酸、2’-氟修飾之核苷酸、2’-去氧修飾之核苷酸、鎖定之核苷酸、未鎖定之核苷酸、構形限定之核苷酸、約束之乙基核苷酸、無鹼基之核苷酸、2’-胺基修飾之核苷酸、2’-O-烯丙基修飾之核苷酸、2’-C-烷基修飾之核苷酸、2’-羥基修飾之核苷酸、2’-甲氧基乙基修飾之核苷酸、2’-O-烷基修飾之核苷酸、N-嗎啉基核苷酸、胺基磷酸酯、包含非天然鹼基之核苷酸、四氫呋喃修飾之核苷酸、1,5-失水己糖醇修飾之核苷酸、環己烯基修飾之核苷酸、包含硫代磷酸酯基團之核苷酸、包含甲基膦酸酯基團之核苷酸、包含5’-磷酸酯之核苷酸、包含5’-磷酸酯模擬物之核苷酸、熱去安定化之核苷酸、二醇修飾之核苷酸(glycol modified nucleotide，GNA)、包含2’磷酸酯之核苷酸、及2-O-(N-甲基乙醯胺)修飾之核苷酸，以及其組合。
一具體例中，該核苷酸之修飾選自下述所成群組：LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、甲氧基乙基、2’-O-烷基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-氟、2’-去氧、2’-羥基、及二醇、以及其組合。
一具體例中，經修飾核苷酸之至少一者係選自下述所成群組：去氧-核苷酸、2’-O-甲基修飾核苷酸、2’-氟修飾核苷酸、2’-去氧-修飾核苷酸、例如Ggn、Cgn、Tgn或Agn的二醇修飾核苷酸(GNA)、例如G2p、C2p、A2p、U2p的包含2’磷酸酯之核苷酸、乙烯基-膦酸酯核苷酸、及其組合。
另一具體例中，核苷酸上之修飾之至少一者為熱去安定化核苷酸修飾。
一具體例中，熱去安定化核苷酸修飾係選自下述所成群組：無鹼基修飾；與雙鏈體中相反核苷酸的失配；以及去安定化糖修飾、2’-去氧修飾、無環狀核苷酸、未鎖定核酸(UNA)、及甘油核酸(GNA)。
一些具體例中，經修飾核苷酸包含3’-終端去氧胸苷核苷酸(dT)的短序列。
一些具體例中，核苷酸修飾係2’-O-甲基、GNA及2’氟修飾。
一些具體例中，該dsRNA劑進一步包含至少一個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。一些具體例中，該dsRNA劑包含6-8硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。一具體例中，硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結係於一股的3’-終端。視需要地，該股係反義股。另一具體例中，該股係有義股。相關的具體例中，硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結係於一股的5’-終端。視需要地，該股係該反義股。另一具體例中，該股係該有義股。另一具體例中，硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷 酸間鏈結係於一股的5’-及3’-終端二者。視需要地，該股係該反義股。另一具體例中，該股係該有義股。
雙股區域可為19-30個核苷酸對之長度；19-25核苷酸個核苷酸對之長度；19-23個核苷酸對之長度；23-27個核苷酸對之長度；或21-23核苷酸對之長度。
一具體例中，各股係獨立地為不多於30個核苷酸之長度。
一具體例中，該有義股係21個核苷酸之長度以及該反義股係23個核苷酸之長度。
互補區域可為至少17個核苷酸之長度；介於19及23個核苷酸之長度；或19個核苷酸之長度。
一具體例中，至少一股包含至少1個核苷酸的3’突出。另一具體例中，至少一股包含至少2個核苷酸的3’突出。
一具體例中，該dsRNA劑進一步包含配位子。
一具體例中，該配位子係接合至該dsRNA劑之有義股3’末端。
一具體例中，該配位子係N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
一具體例中，該配位子係經由單價、二價或三價分之鏈結子附接的一個或多個GalNAc衍生物。
一具體例中，配位子係
Figure 111106049-A0202-12-0012-234
一具體例中，該dsRNA劑係如下述方案所示接合至配位子
Figure 111106049-A0202-12-0012-235
 以及，其中X係O或S。
一具體例中，X係O。
一具體例中，該dsRNA劑進一步包含至少一個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結。
一具體例中，硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結係於一股的3’-終端，例如，該反義股或該有義股。
另一具體例中，硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結係於一股的5’-終端，例如，該反義股或該有義股。
一具體例中，硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結係於一股的5’-及3’-終端二者。一具體例中，該股係反義股。
一具體例中，於該雙鏈體之反義股5’-末端位置1的鹼基對係AU鹼基對。
一態樣中，本發明提供一種雙股核糖核酸(dsRNA)劑，其係用於抑制己酮糖激酶(KHK)於細胞之表現，或其醫藥上可接受之鹽，包含形成雙股區域的有義股及反義股，其中
a)有義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-gscsaggaagCfAfCfugagauucgu-3’差異不多於4個鹼基以及反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asdCsgadAudCucagdTgCfuuccugcsasc-3’差異不多於4個鹼基，其中，a、g、c及u為2’-O-甲基(2’-OMe)A、G、C及U；Cf及Uf為2’-去氧-2’-氟(2’-F)C及U；dC、dA及dT為2’-去氧C、A及T；以及s為硫代磷酸酯鏈結；或
b)有義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-csusacggagAfCfGfugguguuugu-3’差異不多於4個鹼基以及反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asdCsaadAcdAccacdGuCfuccguagscsc-3’差異不多於4個鹼基，其中，a、g、c及u為2’-O-甲基(2’-OMe)A、G、C及U；Cf及Uf為2’-去氧-2’-氟(2’-F)C及U；dC、dA，及dG為2’-去氧C、A及G；以及s為硫代磷酸酯鏈結。
一具體例中，
a)有義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-gscsaggaagCfAfCfugagauucgu-3’差異不多於3個鹼基以及反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asdCsgadAudCucagdTgCfuuccugcsasc-3’差異不多於3個鹼基，其中，a、g、c及u為2’-O-甲基(2’-OMe)A、G、C及U；Cf及Uf為2’-去氧-2’-氟(2’-F)C及U；dC、dA及dT為2’-去氧C、A及T；以及s為硫代磷酸酯鏈結；或
b)有義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-csusacggagAfCfGfugguguuugu-3’差異不多於3個鹼基以及反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asdCsaadAcdAccacdGuCfuccguagscsc-3’差異不多於3個鹼基，其中，a、g、c及u為2’-O-甲基(2’-OMe)A、G、C及U；Cf及Uf為2’-去氧-2’-氟(2’-F)C及U；dC、dA，及dG為2’-去氧C、A及G；以及s為硫代磷酸酯鏈結。
一具體例中，
a)有義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-gscsaggaagCfAfCfugagauucgu-3’差異不多於2個鹼基以及反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asdCsgadAudCucagdTgCfuuccugcsasc-3’差異不多於2個鹼基，其中，a、g、c及u為2’-O-甲基(2’-OMe)A、G、C及U；Cf及Uf為2’-去氧-2’-氟(2’-F)C及U；dC、dA及dT為2’-去氧C、A及T；以及s為硫代磷酸酯鏈結；或
b)有義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-csusacggagAfCfGfugguguuugu-3’差異不多於2個鹼基以及反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asdCsaadAcdAccacdGuCfuccguagscsc-3’差異不多於2個鹼基，其中，a、g、c及u為2’-O-甲基(2’-OMe)A、G、C及U；Cf及Uf為2’-去氧-2’-氟(2’-F)C及U；dC、dA，及dG為2’-去氧C、A及G；以及s為硫代磷酸酯鏈結。
一具體例中，
a)有義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-gscsaggaagCfAfCfugagauucgu-3’差異不多於1個鹼基以及反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asdCsgadAudCucagdTgCfuuccugcsasc-3’差異不多於1個鹼基，其中，a、g、c及u為2’-O-甲基(2’-OMe)A、G、C及U；Cf及Uf為2’-去氧-2’-氟(2’-F)C及U；dC、dA及dT為2’-去氧C、A及T；以及s為硫代磷酸酯鏈結；或
b)有義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-csusacggagAfCfGfugguguuugu-3’差異不多於1個鹼基以及反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asdCsaadAcdAccacdGuCfuccguagscsc-3’差異不多於1個鹼基，其中，a、g、c及u為2’-O-甲基(2’-OMe)A、G、C及U；Cf及Uf為2’-去氧-2’-氟(2’-F)C及U；dC、dA，及dG為2’-去氧C、A及G；以及s為硫代磷酸酯鏈結。
一具體例中，
a)有義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-gscsaggaagCfAfCfugagauucgu-3’以及反義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-asdCsgadAudCucagdTgCfuuccugcsasc-3’，其中，a、g、c及u為2’-O-甲基(2’-OMe)A、G、C及U；Cf及Uf為2’-去氧-2’-氟(2’-F)C及U；dC、dA及dT為2’-去氧C、A及T；以及s為硫代磷酸酯鏈結；或
b)有義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-csusacggagAfCfGfugguguuugu-3’以及反義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-asdCsaadAcdAccacdGuCfuccguagscsc-3’，其中，a、g、c及u為2’-O-甲基(2’-OMe)A、G、C及U；Cf及Uf為2’-去氧-2’-氟(2’-F)C及U；dC、dA，及dG為2’-去氧C、A及G；以及s為硫代磷酸酯鏈結。
一具體例中，該dsRNA劑進一步包含配位子。
一具體例中，配位子係接合至該dsRNA劑之有義股3’末端。
一具體例中，配位子係N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
一具體例中，配位子係經由單價、二價、或三價分之鏈結子附接之一個或多個GalNAc衍生物。
一具體例中，配位子係
Figure 111106049-A0202-12-0016-236
一具體例中，該dsRNA劑係如下述方案所示接合至配位子
Figure 111106049-A0202-12-0016-237
以及，其中X係O或S。
一具體例中，X係O。
本發明也提供含有本發明之任一dsRNA劑以及包含本發明之任一dsRNA劑之醫藥組成物之任一者的細胞。
本發明之醫藥組成物可包括於未緩衝溶液之dsRNA劑，例如生理鹽水或水，或本發明之醫藥組成物可包括於緩衝溶液之dsRNA劑，例如，緩衝溶液包含乙酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶蛋白、碳酸鹽或磷酸鹽或其組合；或磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)。
一態樣中，本發明提供於細胞抑制己酮糖激酶(KHK)基因表現的方法。該方法包括將細胞與本發明之任一dsRNA劑或本發明之任一醫藥組成物接觸，藉此於細胞抑制劑同堂激酶(KHK)基因表現。
一具體例中，細胞係於各體內，例如，人類對象，例如，具有己酮糖激酶(KHK)-相關疾患的對象，如選自下述所成群組之KHK-相關疾病：肝疾病(例如，脂肪肝、脂肪肝炎、酒精性脂肪肝炎(NASH))、脂質血異常(例如，高脂血症、高LDL膽固醇、低HDL膽固醇、高三酸甘油脂血症、飯後高三酸甘油脂血症)、血糖調控之疾患(例如，胰島素抗性、第2型糖尿病)、心血管疾病(例如，高血壓、內皮細胞功能異常)、腎疾病(例如，急性腎疾患、腎小管功能異常、近端腎小管的前炎性變化、慢性腎疾患)、代謝症狀群、脂肪細胞功能異常、內臟脂肪沉積、肥胖、高尿酸血症、痛風、飲食疾患及過度糖渴望。
一具體例中，細胞與該dsRNA劑接觸係抑制KHK表現至少50%、60%、70%、80%、90%或95%。
一具體例中，抑制KHK表現降低對象血清中的KHK蛋白質量級至少50%、60%、70%、80%、90%或95%。
一態樣中，本發明提供一種治療具有將受益於減低己酮糖激酶(KHK)表現之疾病或疾患的對象的方法。該方法包括對該對象投藥醫療有效量之本發明之任一dsRNA劑或本發明之任一醫藥組成物，藉此治療具有將受益於減低KHK表現之疾患的對象。
另一態樣中，本發明提供一種預防具有將受益於減低己酮糖激酶(KHK)表現之疾患的對象的至少一種症狀的方法。該方法包括對該對象投藥 醫療有效量之本發明之任一dsRNA劑或本發明之任一醫藥組成物，藉此預防具有將受益於減低KHK表現之疾患的對象的至少一種症狀。
某些具體例中，KHK-相關疾患係肝疾病，例如，脂肪肝疾病如NAFLD或NASH。某些具體例中，KHK-相關疾患係脂質血異常，例如，升高的血清三酸甘油脂、升高的血清三酸甘油脂、升高的血清LDL、升高的血清膽固醇、減低的血清HDL、飯後高三酸甘油脂血症。另一具體例中，KHK-相關疾患係血糖調控疾患，例如，非針對胰島素之免疫回應所造成的胰島素抗性、葡萄糖耐受不良、第2型糖尿病。某些具體例中，KHK-相關疾患係心血管疾病，例如，高血壓、內皮細胞功能異常。某些具體例中，KHK-相關疾患係腎疾病，例如，急性腎疾患、腎小管功能異常、近端腎小管的前炎性變化、慢性腎疾患。某些具體例中，疾病係代謝症狀群。某些具體例中，KHK-相關疾患係之直陳機或功能異常的疾病，例如，內臟脂肪沉積、脂肪肝、肥胖。某些具體例中，KHK-相關疾患係係升高的尿酸的疾病，例如，痛風、高尿酸血症。某些具體例中，KHK-相關疾患係飲食異常或過度糖渴望。
某些具體例中，對對象的dsRNA投藥引起果糖代謝的降低。某些具體例中，dsRNA投藥引起於對象的KHK量級降低，特別是肝的KHK，特別是於具有升高的KHK的對象的KHK-C。某些具體例中，dsRNA投藥引起於對象的果糖代謝的降低。某些具體例中，dsRNA投藥引起尿酸量級的降低，例如，於具有升高的血清尿酸的對象的血清尿酸，例如，與痛風相關的升高的血清尿酸。某些具體例中，dsRNA投藥引起血清脂質的正常化，例如，於具有至少一種異常血清脂質量級的對象的包括飯後三酸甘油脂、LDL、HDL或膽固醇的三酸甘油脂。某些具體例中，dsRNA投藥引起脂質沉積的正常化，例如，肝中脂 質沉積的降低(例如，NAFLD或NASH的降低)、內臟脂肪沉積的降低、體重降低。某些具體例中，dsRNA投藥引起於具有非相關於對胰島素之免疫回應(immune response)之異常胰島素回應或者異常葡萄糖回應的對象的胰島素或葡萄糖回應的正常化。某些具體例中，dsRNA投藥造成腎功能的改善，或腎功能喪失率的停止或減低。某些具體例中，dsRNA引起高血壓(hypertension)的減低，亦即升高的血壓。
某些具體例中，本發明進一步包含對具有KHK-相關疾病的對象投藥額外劑。某些具體例中，所屬技術領域已知用於各種KHK-相關疾病的療法係與本發明之RNAi劑組合使用。該等療法於下文討論。
一具體例中，對象係人類。
一具體例中，該dsRNA劑係以劑量約0.01mg/kg至約50mg/kg投藥至對象。
一具體例中，該dsRNA劑係經皮下投藥至對象。
一具體例中，本發明的方法進一步包括測定來自對象的樣本之KHK量級。
一具體例中，對象樣本中的KHK量級係血液或血清樣本中的KHK蛋白質量級。
一具體例中，本發明的方法進一步包含測定對象的尿酸量級，特別是血清尿酸量級。一具體例中，本發明的方法進一步包含測定對象的尿液果糖量級。一具體例中，本發明的方法進一步對象的血清脂質量級。某些具體例中，本發明的方法進一步包括測定對象的胰島素或葡萄糖敏感度。某些具體例中，果糖代謝的表現或活性的量級降低表明正在治療或預防KHK相關疾病。
本發明也提供套組，其包含本發明之任一dsRNA劑或本發明之任一醫藥組成物，以及視需要地，使用指引。
本發明進一步提供RNA誘導緘默化複合體(RISC)，其包含本發明之任一dsRNA劑的反義股。
另一具體例中，RNAi劑係其醫藥上可接受之鹽。本文中之各RNAi劑的「醫藥上可接受之鹽」包括，但不限於，鈉鹽、鈣鹽、鋰鹽、鉀鹽、銨鹽、鎂鹽、其混合物。所屬技術領域中具有通常知識者將理解RNAi劑，當以多陽離子鹽提供時，每個視需要經修飾的磷酸二酯骨幹的游離酸基團具有一個陽離子及/或任何其他酸性修飾(例如，5’-終端膦酸酯基團)。例如，長度為「n」個核苷酸之寡核苷酸含有n-1個視需要經修飾的磷酸二酯，使得長度為21nt之寡核苷酸可提供為具有20個陽離子(例如，20個鈉陽離子)的鹽。類似地，具有21nt之長度的有義股及具有23nt之長度的反義股的RNAi劑可提供為具有多達42個陽離子(例如，42個鈉陽離子)的鹽。於前述實例中，在RNAi劑也包括5’-終端磷酸酯或5’-終端乙烯基膦酸酯基團時，RNAi劑可提供為具有多達44個陽離子(例如，44個鈉陽離子)的鹽。
本發明係藉由下述詳細說明及圖式進一步闡述。
圖1描述果糖的典型及替代的脂肪生成途徑。典型的途徑中，三酸甘油脂(TG)為藉由包括醛縮酶B及脂肪酸合成酶(FAS)的多種酵素作用的果糖代謝的直接產物。替代的途徑中，果糖磷酸化為果糖-1-磷酸(F-1-P)期間由核苷酸轉換所產生的尿酸造成粒腺體氧化壓力(mtROS)的產生，其引起克氏循 環中烏頭酸酶(ACO2)活性的降低。因此，ACO2受質，檸檬酸鹽，累積且釋放至胞質液而其經由ATP檸檬酸鹽裂解酶(ACL)及脂肪酸合成酶的活化而作用為TG合成的受質。AMPD2，AMP脫胺酶2；IMP，肌苷單磷酸，PO4，磷酸鹽(來自Johnson et al.(2013)Diabetes.62：3307-3315)。
圖2為描繪在投藥後第29天的指定雙鏈體的單一3mg/kg劑量投藥對KHK mRNA和KHK蛋白量級的功效圖。mRNA及蛋白質的量級被描述為正規化至mRNA和蛋白質的投藥前量級的殘餘%。
圖3為描繪在投藥後第50天的指定雙鏈體的單一3mg/kg劑量投藥對KHK mRNA和KHK蛋白量級的功效圖。mRNA及蛋白質的量級被描述為正規化至mRNA和蛋白質的投藥前量級的殘餘%。
圖4為描繪在投藥後第78天的指定雙鏈體的單一3mg/kg劑量投藥對KHK mRNA和KHK蛋白量級的功效圖。mRNA及蛋白質的量級被描述為正規化至mRNA和蛋白質的用藥前量級的殘餘%。
本發明提供iRNA組成物，其有功效於己酮糖激酶(KHK)基因的RNA轉錄物的RNA誘導緘默化複合體(RISC)-介導的裂解。該基因可於細胞內，例如，對象內的細胞，如人類。該些iRNA的使用能在哺乳動物中靶向降解對應基因(KHK基因)的mRNA。
本發明的iRNA業經設計為靶向人類己酮糖激酶(KHK)基因，包括保留於其他哺乳動物物種的己酮糖激酶(KHK)異種同源物(ortholog)的基因部分。不受理論所限制，咸信該些iRNA中的前述特性及特定靶向位點或特 定修飾的組合或次組合賦予本發明的iRNA改善的功效、安定性、效力、耐久性和安全性。
因此，本發明提供用於治療及預防己酮糖激酶(KHK)-相關疾患的方法，例如，肝疾病(例如，脂肪肝、脂肪肝炎、酒精性脂肪肝炎(NASH))、脂質血異常(例如，高脂血症、高LDL膽固醇、低HDL膽固醇、高三酸甘油脂血症、飯後高三酸甘油脂血症)、血糖調控之疾患(例如，胰島素抗性、第2型糖尿病)、心血管疾病(例如，高血壓、內皮細胞功能異常)、腎疾病(例如，急性腎疾患、腎小管功能異常、近端腎小管的前炎性變化、慢性腎疾患)、代謝症狀群、脂肪細胞功能異常、內臟脂肪沉積、肥胖、高尿酸血症、痛風、飲食疾患及過度糖渴望，該方法使用iRNA組成物，該組成物有功效於KHK基因的RNA轉錄物的RNA誘導緘默化複合體(RISC)-介導的裂解。
本發明的iRNA包括RNA股(反義股)，其具有區域多達約30個核苷酸或更少之長度，例如，19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24,20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、或21-22個核苷酸之長度，該區域實質上互補於至少KHK基因的mRNA轉錄物的部分。
某些具體例中，本發明的雙股RNAi劑的股之一者或二者係多達66個核苷酸之長度，例如，36-66、26-36、25-36、31-60、22-43、27-53個核苷酸之長度，具有實質上互補於至少KHK基因的mRNA轉錄物的部分之至少19個接續核苷酸的區域。一些具體例中，該等具有較長長度反義股的iRNA劑，例 如，可包括20-60個核苷酸之長度的第二RNA股(有義股)，其中該有義股及反義股形成18-30個接續核苷酸的雙鏈體。
本發明的iRNA的使用能在哺乳動物中靶向降解對應基因(KHK基因)的mRNA。使用體外檢測，本發明者們業經展現靶向KHK基因的iRNA可強力地介導RNAi，造成KHK基因表現的顯著抑制。因此，包括該些iRNA的方法及組成物有用於治療具有KHK-相關疾患的對象，例如，肝疾病(例如，脂肪肝、脂肪肝炎、酒精性脂肪肝炎(NASH))、脂質血異常(例如，高脂血症、高LDL膽固醇、低HDL膽固醇、高三酸甘油脂血症、飯後高三酸甘油脂血症)、血糖調控之疾患(例如，胰島素抗性、第2型糖尿病)、心血管疾病(例如，高血壓、內皮細胞功能異常)、腎疾病(例如，急性腎疾患、腎小管功能異常、近端腎小管的前炎性變化、慢性腎疾患)、代謝症狀群、脂肪細胞功能異常、內臟脂肪沉積、肥胖、高尿酸血症、痛風、飲食疾患及過度糖渴望。
因此，本發明提供用於治療具有將受益於抑制或減低KHK基因表現的疾患的對象的方法及組合療法，例如，KHK-相關疾患，如肝疾病(例如，脂肪肝、脂肪肝炎、酒精性脂肪肝炎(NASH))、脂質血異常(例如，高脂血症、高LDL膽固醇、低HDL膽固醇、高三酸甘油脂血症、飯後高三酸甘油脂血症)、血糖調控之疾患(例如，胰島素抗性、第2型糖尿病)、心血管疾病(例如，高血壓、內皮細胞功能異常)、腎疾病(例如，急性腎疾患、腎小管功能異常、近端腎小管的前炎性變化、慢性腎疾患)、代謝症狀群、脂肪細胞功能異常、內臟脂肪沉積、肥胖、高尿酸血症、痛風、飲食疾患及過度糖渴望，使用有功效於KHK基因的RNA轉錄物的RNA-誘導緘默化複合體(RISC)-介導的裂解的iRNA組成物。
本發明也提供用於預防具有將受益於抑制或減低KHK基因表現的疾患的對象的至少一種症狀的方法，例如，肝疾病(例如，脂肪肝、脂肪肝炎、酒精性脂肪肝炎(NASH))、脂質血異常(例如，高脂血症、高LDL膽固醇、低HDL膽固醇、高三酸甘油脂血症、飯後高三酸甘油脂血症)、血糖調控之疾患(例如，胰島素抗性、第2型糖尿病)、心血管疾病(例如，高血壓、內皮細胞功能異常)、腎疾病(例如，急性腎疾患、腎小管功能異常、近端腎小管的前炎性變化、慢性腎疾患)、代謝症狀群、脂肪細胞功能異常、內臟脂肪沉積、肥胖、高尿酸血症、痛風、飲食疾患及過度糖渴望。
下述詳細說明揭露如何製造及使用含有iRNA組成物以抑制KHK基因表現，以及用於治療具有將受益於KHK基因表現的抑制及/或減低的疾患的對象的組成物、用途及方法，例如，易患有或經診斷有KHK-相關疾患的對象。
I.定義
為了更容易地理解本發明，首先定義某些術語。此外，應注意，無論何時，當應用參數之數值或數值範圍，該等數值及處於該等所引用之數值中間的範圍亦作為本發明之一部分。
本文中使用之冠詞「一(a)及(an)」指該冠詞之語法賓語的一者或超過一者(亦即，至少一者)。舉例而言，「一要素」意指一個要素或超過一個要素如複數個要素。
本文中使用之術語「包括(including)」意指「包括但不限於(including but not limited to)」，且與後者可互換地使用。
除非語境中明確排除，否則本文中使用之術語「或」意指「及/或」，且與後者可互換地使用。例如，「有義股或反義股」應理解為「有義股或反義股或有義股及反義股」。
本文中使用之術語「約(about)」意指處於本技術領域中之公差範圍內。例如，「約」可理解為與均值偏離2標準偏差。於某些態樣中，約意指±10%。於某些態樣中，約意指±5%。當「約」存在於一系列數字或範圍之前時，理解為「約」可修飾該一系列數字或範圍中之每一個。
處於數字或一系列數字之前的術語「至少(at least)」、「不少於(no less than)」或「或更多(or more)」理解為包括與該術語「至少」相鄰之數字，以及後面之全部數字或邏輯上可包括之整數，如從語境中明顯可知者。例如，核酸分子中之核苷酸的數目必需為整數。例如，「21個核苷酸之核酸分子的至少19個核苷酸」意指19、20或21個核苷酸具有所指示之特性。當至少存在於一系列數字或範圍之前時，理解為「至少」可修飾該一系列數字或範圍中之每一個。
如本文所用，「不多於(no more than)」或「或更低(or less)」理解為與短語相鄰之數值以及邏輯上更低之數值或整數，如從語境中邏輯上推知者，到零為止。例如，具有「不多於2個核苷酸」之突出的雙鏈體具有2、1或0個核苷酸之突出。當「不多於」存在於一系列數字或範圍之前時，理解為「不多於」可修飾該一系列數字或範圍中之每一個。如使用於本文，範圍包括上限及下限兩者。
如本文所用，檢測方法可包括確定所存在之分析質的量低於該方法之檢測量級。
在所指示之靶向位點與正義或反義股的核苷酸序列之間存在矛盾的情況下，以所指示之序列為準。
在序列與其在轉錄物或其他序列所指示之位點之間存在矛盾的情況下，以本說明書中敘述之核苷酸序列為準。
如本文所用，「己酮糖激酶」可與術語「KHK」互換地使用，係指該編碼催化果糖轉化為果糖-1-磷酸的酵素的天然存在的基因。此基因的產物為分解代謝膳食果糖途徑中的第一種酵素。業經鑑定編碼不同的同功型(isoform)的選擇性剪接(alternatively spliced)轉錄物變體。此基因也已知為果糖激酶。
KHK的例示性核苷酸及胺基酸可見於，例如，GenBank存取編號(Accession No.)XM_017004061.1(Homo sapiens(智人KHK；SEQ ID NO：1；reverse complement(反向補體)，SEQ ID NO：2)；NM_006488.3(Homo sapiens KHK；SEQ ID NO：3；reverse complement,SEQ ID NO：4)；NM_000221.3(Homo sapiens KHK；SEQ ID NO：5；reverse complement,SEQ ID NO：6)；GenBank Accession No.NM_001310524.1(Mus musculus(小鼠)KHK；SEQ ID NO：7；reverse complement,SEQ ID NO：8)；GenBank Accession No.NM_031855.3(Rattus norvegicus)(大鼠)KHK；SEQ ID NO：9；reverse complement,SEQ ID NO：10)；GenBank Accession No.XM_005576322.2(Macaca fascicularis(食蟹獼猴)KHK,SEQ ID NO：11；reverse complement,SEQ ID NO：12).
KHK(己酮糖激酶)基因係位於染色體2p23且編碼己酮糖激酶，也已知為果糖激酶。KHK為以醇作為磷酸鹽受體的磷酸轉移酶酵素。KHK屬於碳水化合物激酶的核糖激酶家族(Trinh et al.,ACTA Cryst.,D65：201-211)。已 鑑定己酮糖激酶的二種同功型，KHK-A及KHK-C，其來自全長mRNA的選擇性剪接。該些同功型因含有外顯子3a或3c而不同，以及因位置72及115之間的32個胺基酸而不同。KHK-C mRNA係高量級表現，主要於肝、腎及小腸中。KHK-C對於果糖結合相較於KHK-A具有更低的Km，其結果為於磷酸化膳食果糖非常有效。人類KHK-C mRNA轉錄物的序列可見於，例如，GenBank Accession No.NM_006488.3(Homo sapiens KHK；SEQ ID NO：3)。人類KHK-A mRNA轉錄物的序列可見於，例如，GenBank Accession No.NM_000221.3(SEQ ID NO：5)。全長的人類KHK mRNA序列係提供於GenBank Accession No.GI：XM_017004061.1(SEQ ID NO：1)。
本文提供的iRNA劑可剪接一種或二種KHK同功型。
KHK mRNA序列的額外實例可經由公開可得的資料庫而容易地取得，例如，GenBank、UniProt、OMIM及獼猴基因體計畫(Macaca genome project)網站。
進一步的KHK資訊可見於，例如，www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/‘？term=khk。
前述GenBank存取編號(Accession number)及基因資料庫編號的各者的全部內容係於申請日藉由參照方式併入本文。
術語KHK，如本文所用，也指KHK基因的變體(包括SNP資料庫所提供之變體)。KHK基因內的數種序列變體業經鑑定且可見於，例如，NCBI dbSNP及UniProt(參照，例如，www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/？term=KHK，其全部內容於本案申請日藉由參照方式併入本文。
如使用於本文，「靶向序列(target sequence)」指於KHK基因之轉錄中所形成之mRNA分子之核苷酸序列的連續部分，包括作為初級轉錄產物之RNA加工產物的mRNA。該序列之靶向部分將至少長至足以用作RNAi引導之裂解的受質，該裂解位於在KHK基因之轉錄中所形成之mRNA分子的核苷酸序列的該部分處或鄰近該部分處。一具體例中，靶向序列位於KHK之蛋白質編碼區域內。
靶向序列可係約19至36個核苷酸之長度，例如，約19-30個核苷酸之長度。例如，靶向序列可約19至30個核苷酸之長度，如19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22個核苷酸之長度。某些具體例中，靶向序列19至約23個核苷酸之長度，視需要地21至23個核苷酸之長度。上文引述之範圍及長度之間的範圍及長度亦視為本發明之一部分。
如本文中所使用，術語「包含序列之股」指代包含核苷酸之鏈的寡核苷酸，其中該核苷酸藉由使用標準核苷酸命名法指之序列而揭示。
「G」、「C」、「A」、「T」及「U」各自通常分別表示含有鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶及尿嘧啶作為鹼基之核苷酸。惟，應理解，術語「核糖核苷酸」或「核苷酸」亦可指代經修飾之核苷酸，如下文進一步揭示者，或替代替換部分(moiety)(參照，例如，表1)。熟練之人士熟知，鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤及尿嘧啶可經由其他部分替換而實質上不改變包含承載此替換部分之核苷酸之寡核苷酸的鹼基配對特性。應理解，當提供cDNA序列時，相對 應之mRNA或RNAi劑將包括U替代T。例如而不限於，包含肌苷作為其鹼基之核苷酸可與含有腺嘌呤、胞嘧啶或鳥嘌呤之核苷酸進行鹼基配對。因此，於本發明提出之dsRNA之核苷酸序列中，含有尿嘧啶、鳥嘌呤或腺嘌呤之核苷酸可替換為含有例如肌苷之核苷酸。於另一實例中，寡核苷酸中任意位置之腺嘌呤及胞嘧啶可分別替換為鳥嘌呤及尿嘧啶，以與靶向mRNA形成G-U Wobble鹼基配對。含有此類替換部分之序列適用於本發明提出之組成物及方法。
如本文中可互換使用，術語「iRNA」、「RNAi劑」、「iRNA劑」、「RNA干擾劑」指含有如本文中定義之術語的RNA，且其經由RNA誘導緘默化複合體(RISC)途徑而介導RNA轉錄物的靶向裂解。RNA干擾(RNAi)係引導mRNA之序列特異性降解的製程。iRNA調整例如抑制細胞KHK基因的表現，例如，對象內的細胞，如哺乳動物對象。
一具體例中，本發明之RNAi劑包括單股RNAi，其與靶向RNA序列，例如，KHK靶向mRNA相互作用，以引導該靶向RNA之裂解。不受理論所限制，咸信被引入細胞內之長雙股RNA藉由被稱為切丁酶(Dicer)之第III型核酸內切酶而破碎為siRNA(Sharp et al.(2001)Genes Dev.15：485)。切丁酶，核酸酶-III-樣酶，將此daRNA加工為19至23個鹼基對之短干擾RNA，該短干擾RNA之特徵係具有兩個鹼基之3’突出(Bernstein,et al.,(2001)Nature 409：363)。隨後，此等siRNA被併入RNA-誘導緘默化複合體(RISC)，於該處，一種或多種解旋酶令該siRNA雙鏈體解捲曲，使得補體反義股能夠引導靶向識別(Nykanen,et al.,(2001)Cell 107：309)。當結合至適宜之靶向mRNA時，RISC內之一種或多種核酸內切酶裂解靶向以誘導緘默化(Elbashir,et al.,(2001)Genes Dev.15：188)。因此，於一方面，本發明係關於單股RNA(siRNA)，其 係於細胞內生成且促進RISC複合體之形成以有效於靶向基因的緘默化，亦即KHK基因。因此，術語「siRNA」也使用於本文用以指上文所述之iRNA。
某些具體例中，該RNAi劑可為單股RNA(ssRNA)，其係引入細胞或有機體內以抑制靶向mRNA。單股RNAi劑結合至RISC核酸內切酶Argonaute 2，其隨後裂解靶向mRNA。該單股siRNA通常係15-30個核苷酸且經化學修飾。單股siRNA之設計及測試揭示於美國專利第8,101,348號及Lima et al.,(2012)Cell 150：883-894中，其各者之整體內容藉由參照而併入本文。本文中揭示之任意反義核苷酸序列可用作本文中揭示之單股siRNA或用作藉由Lima et al.,(2012)Cell 150：883-894中揭示之方法化學修飾者。
某些具體例中，用於本發明之組成物、用途及方法中之「RNAi劑」係雙股RNA，且於本文中指為「雙股RNAi劑」、「雙股RNA(dsRNA)分子」、「dsRNA劑」或「dsRNA」。術語「dsRNA」指核糖核酸分子之複合體，其係具有包含兩個反平行且實質上互補之核酸股的雙鏈體結構，該兩個核酸股指為具有相對於靶向RNA亦即KHK基因之「有義(sense)」取向及「反義(antisense)」取向。於本發明之一些具體中，雙股RNA(dsRNA)經由轉錄後基因緘默化機制而觸發靶向RNA，例如，mRNA之降解，本文中，該機制指為RNA干擾或RNAi
通常，dsRNA分子各股的核苷酸大多數為核糖核苷酸，但如本文中所詳述，一股或兩股亦可包括一個或多個非核糖核苷酸，例如去氧核糖核苷酸、經修飾之核苷酸。此外，如本說明書中所用，「iRNA」可包括具有化學修飾之核糖核苷酸；iRNA可包括位於多個核苷酸處之實質性修飾。如使用於本文，術語「經修飾之核苷酸」指獨立具有經修飾之糖部分、經修飾之核苷酸間鏈結、 或經修飾之核酸鹼基的核苷酸，或其任何組合。因此，術語「經修飾之核苷酸」涵蓋例如官能基或原子到核苷酸間鏈結、糖部分或核酸鹼基之取代、加成或移除。適用於本發明之劑的修飾包括本文中所揭露或所屬技術領域中已知之全部類型的修飾。對於本說明書及申請專利範圍之目的，任何此類修飾，如在siRNA類型分子中所用者，為「iRNA」或「RNAi劑」所涵蓋。
本揭露之某些具體例中，若存在於RNAi劑中則去氧核苷酸包含可被視為構建經修飾之核苷酸。
雙鏈體區域可為允許所期望的靶向RNA經由RISC途徑特異性降解的任何長度，且可為範圍由約19至36鹼基對之長度，例如，約19-30鹼基對之長度，例如，約9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36鹼基對之長度、如約19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24,20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22鹼基對之長度。某些具體例中，雙鏈體區域為19-21鹼基對之長度，例如，21鹼基對之長度。上文引述之範圍及長度之間的範圍及長度亦視為本發明之一部分。
形成該雙鏈體結構之兩股可為一個較大RNA分子的不同部分，或它們可為分開的RNA分子。若該兩股為一個較大分子之部分，且因此藉由界於一股之3’末端與形成該雙鏈體結構之相對另一股之5’末端之間的未中斷核苷酸鏈而連結，該連結RNA鏈指為「髮夾環圈」。髮夾環圈可包含至少一個未配對之核苷酸。於一些態樣中，該髮夾環圈可包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、23或更多個未配對之核苷酸。一些具體例中，髮夾環圈可為10個或更 少核苷酸。一些具體例中，髮夾環圈可為8個或更少未配對之核苷酸。一些具體例中，髮夾環圈可為4至10個未配對之核苷酸。一些具體例中，髮夾環圈可為4至8個核苷酸。
若dsRNA之兩個實質上互補之股由分開之RNA分子構成，則那些分子不必但可以共價連結。若兩股藉由除界於一股之3’末端與形成雙鏈體結構之相對另一股之5’末端之間的未中斷核苷酸鏈以外之手段共價連結，則該連結結構指為「鏈結子(linker)」。RNA股可具有相同或相異數目之核苷酸。鹼基對之最大數目係dsRNA之最短鏈中之核苷酸數減去雙鏈體中存在之任意突出。RNAi除了包含雙鏈體結構外，亦可包含一個或多個核苷酸突出。RNAi劑之一具體例中，至少一股包含至少1個核苷酸的3’突出。另一具體例中，至少一股包含至少2個核苷酸的3’突出，例如，2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸。其他具體例中，RNAi劑之至少一股包含至少1個核苷酸的5’突出.某些具體例中，至少一股包含至少2個核苷酸的5’突出，例如，2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸。又其他具體例中，RNAi劑之一股的3’末端及5’末端二者包含至少1個核苷酸的突出。
某些具體例中，本發明之iRNA劑為dsRNA，其各股包含19-23個核苷酸，其與靶向RNA序列交互作用，例如，KHK基因，以導引靶向RNA的裂解。
一些具體例中，本發明之iRNA為與靶向RNA序列交互作用的24-30個核苷酸的dsRNA，例如，KHK靶向mRNA序列，以導引靶向RNA的裂解。
如使用於本文，術語「核苷酸突出(nucleotide overhang)」指從雙股iRNA之雙鏈體結構凸出之至少一個未配對之核苷酸。例如，當dsRNA之一股的3’末端延伸超過另一股之5’末端，或與之相反，則存在核苷酸突出。dsRNA可包含至少一個核苷酸之突出；或者突出可包含至少兩個核苷酸、至少三個核苷酸、至少四個核苷酸、至少五個核苷酸或更多個。核苷酸突出可包含核苷酸/核苷類似物或由其組成，包括去氧核苷酸/核苷。該(等)突出可位於有義股、反義股或其任意組合。再進一步，突出之核苷酸可存在於dsRNA之反義股或有義股的5’-末端、3’-末端或兩者的末端。
一具體例中，dsRNA的反義股具有1-10個核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸的突出於3’-末端或5’-末端。一具體例中，dsRNA的有義股具有1-10個核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸的突出於3’-末端或5’-末端。另一具體例中，突出中的一個或多個核苷酸係以核苷硫代磷酸酯置換。
某些具體例中，dsRNA的反義股具有1-10個核苷酸，例如，0-3、1-3、2-4、2-5、4-10、5-10，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸的突出於3’-末端或5’-末端。一具體例中，dsRNA的有義股具有1-10個核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸的突出於3’-末端或5’-末端。另一具體例中，突出中的一個或多個核苷酸係以核苷硫代磷酸酯置換。
某些具體例中，dsRNA的反義股具有1-10個核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸突出於3’-末端或5’-末端。某些具體例中，於該有義股或該反義股或二者的突出，可包括延伸長度較長於10個核苷酸，例如，1-30個核苷酸、2-30個核苷酸、10-30個核苷酸、10-25核苷酸、10-20個 核苷酸或10-15個核苷酸之長度。某些具體例中，延伸的突出係於該雙鏈體的有義股。某些具體例中，延伸的突出係出現於雙鏈體有義股的3’末端。某些具體例中，延伸的突出係出現於雙鏈體有義股的5’末端。某些具體例中，延伸的突出係於雙鏈體的反義股。某些具體例中，延伸的突出係出現於雙鏈體反義股的3’末端。某些具體例中，延伸的突出係出現於雙鏈體反義股的5’末端。某些具體例中，延伸突出中的一個或多個核苷酸係以核苷硫代磷酸酯置換。某些具體例中，突出包括自我互補的部分，使得突出結構能夠形成在生理條件下為穩定的髮夾結構。
「鈍(blunt)」或「鈍末端(blunt end)」意指在雙股RNA劑之末端無未配對之核苷酸，亦即，無核苷酸突出。「鈍端之(blunt ended)」雙股RNA於其全長度為雙股，亦即亦即，於分子之任一端皆無核苷酸突出。本發明之RNAi劑包括於一末端無核苷酸突出(亦即，具一個突出及一個鈍末端的劑)或於任一末端均無核苷酸突出的RNAi劑。最常見之此類分子將於其全長度上為雙股。
術語「反義股(antisense strand)」或「導引股(guide strand)」指iRNA之股，例如dsRNA，其包括與靶向序列，例如，KHK mRNA序列實質上互補之區域。
如使用於本文，術語「互補之區域」指反義股上，與序列實質上互補的區域，該序列例如靶向序列，例如，本文中所定義的KHK核苷酸序列。若互補之區域與靶向序列不完全互補，則失配可存在於分子之中間區域或終端區域。通常，最能被容忍之失配存在於終端區域，例如，iRNA之5’末端或3’末端之5、4或3個核苷酸內。一些具體例中，本發明之雙股RNA劑包括於反義股 中之核苷酸失配。一些具體例中，本發明之雙股RNA劑之反義股包括不多於4個與靶向mRNA之失配，例如，反義股包括4、3、2、1或0個與靶向mRNA之失配。一些具體例中，本發明之雙股RNA劑之反義股包括不多於4個與有義股的失配，例如，反義股包括4、3、2、1或0個與有義股的失配。一些具體例中，本發明之雙股RNA劑包括於有義股的核苷酸失配。一些具體例中，本發明之雙股RNA劑之有義股包括不多於4個與反義股的失配，例如，有義股包括4、3、2、1或0個與反義股的失配。一些具體例中，核苷酸失配位於例如自iRNA之3’-末端之5、4、3個核苷酸內。於另一具體例中，核苷酸失配，例如，於iRNA劑之3’-終端核苷酸。一些具體例中，失配不處於種子區域(seed region)。
因此，本文中所揭示之RNAi劑可含有一個或多個與靶向序列之失配。一具體例中，本文中所揭示之RNAi劑含有不多於3個失配(亦即，3、2、1或0個失配)。一具體例中，本文中所揭示之RNAi劑含有不多於2個失配。一具體例中，本文中所揭示之RNAi劑含有不多於1個失配。一具體例中，本文中所揭示之RNAi劑含有0個失配。某些具體例中，如果RNAi劑之反義股含有與靶向序列之失配，則該失配可視需要被限定在從互補區域之5’-末端或3’-末端之最末5個核苷酸內。例如，於此類具體例中，對於23個核苷酸之RNAi劑，與KHK基因互補區域之股通常不含於中心13個核苷酸內之任何失配。本文中揭示之方法或該領域中已知之方法可用以測定，含有與靶向序列之失配的RNAi劑在抑制KHK基因之表現中是否有效。慮及具有失配之RNAi劑在抑制KHK基因之表現的效力係重要者，尤其若KHK基因中之特定互補區域係已知於族群內具有多型性序列變異者。
如使用於本文，術語「有義股」或「過客股」指iRNA之股，其包括與如本文中定義之術語之反義股的區域實質上互補的區域。
如使用於本文，「實質上全部核苷酸係經修飾者」大多數並非全部經修飾，且可包括不超過5、4、3、2或1個未經修飾之核苷酸。
如使用於本文，術語「裂解區域」指位於緊鄰裂解位點之區域。裂解位點係靶向之裂解出現處之位點。一些具體例中，裂解區域包含於裂解位點任一末端且緊鄰該裂解位點的三個鹼基。一些具體例中，裂解區域包含位於裂解位點任一末端且緊鄰該裂解位點的兩個鹼基。一些具體例中，裂解位點特異性地出現於反義股的藉由核苷酸10及11鍵結之位點，且該裂解區域包含核苷酸11、12及13。
如使用於本文，且除非明確排除，否則當術語「互補」用來揭示關於第二核苷酸序列之第一核苷酸序列時，指包含該第一核苷酸序列之寡核苷酸或多核苷酸在某些條件下與包含該第二核苷酸序列之寡核苷酸或多核苷酸雜交且形成雙鏈體結構的能力，如具熟練技術之人士所理解者。例如，此等條件可係嚴苛條件，其中嚴苛條件可包括：400mM NaCl、40mM PIPES pH 6.4、1mM EDTA、50℃或70℃、12至16小時，之後洗滌(參見，例如，「Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Sambrook,et al.(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press」)。例如，此等條件可係嚴苛條件，其中嚴苛條件可包括：400mM NaCl、40mM PIPES pH 6.4、1mM EDTA、50℃或70℃、12至16小時，之後洗滌(參見，例如，「Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Sambrook,et al.(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press」)。可施加其他條件，諸如生理學相關條件如可 在有機體內部遭遇者。具熟練技術之人士將能夠根據所雜交之核苷酸的最終應用而測定最適用於兩個序列之互補性測試的一系列條件。
本文中所述之iRNA內，例如，dsRNA內之互補序列，包括包含第一核苷酸序列之寡核苷酸或多核苷酸與包含第二核苷酸序列之寡核苷酸或多核苷酸在一個或兩個核苷酸序列之全長度上的鹼基配對。此類序列可指為彼此「完全互補」。惟，本文中，若第一序列指為與第二序列「實質上互補」，則當雜交為多達30個鹼基對之雙鏈體時，兩個序列可係完全互補，或它們可形成一個或多個但通常不多於5、4、3或2個失配鹼基對，同時在最適於其最終應用之條件下保留雜交的能力，如對基因表現的體外或體內抑制。惟，若兩個寡核苷酸設計為當雜交時形成一個或多個單股突出，則此類突出不應視為關於測定互補性之失配。例如，包含一個長度為21個核苷酸之寡核苷酸及另一個長度為23個核苷酸之寡核苷酸的dsRNA，其中該較長之寡核苷酸包含一個與該較短之核苷酸完全互補的21個核苷酸之序列，對於本文所揭示之目的，仍可指為「完全互補」。
「互補」序列，如使用於本文，亦可包括非Watson-Crick鹼基對或從非天然核苷酸及經修飾之核苷酸形成的鹼基對，或完全由其形成，只要對其雜交能力之上述需求得以滿足即可。此類非Watson-Crick鹼基對包括但不限於，G：U Wobble鹼基配對或Hoogsteen鹼基配對。
本文中術語「互補」、「完全互補」及「實質上互補」可使用於關於dsRNA的有義股及反義股之間、或二個寡核苷酸或多核苷酸之間的鹼基配合，如雙股RNA劑之反義股與靶向序列，由其用途的上下文可以理解。
如使用於本文，與「實質上互補於至少一部份的」傳訊RNA(mRNA)的多核苷酸係指實質上互補於感興趣的mRNA的連續部分(例如，編碼KHK基因的mRNA)的多核苷酸。例如，若序列為實質上互補於編碼KHK基因的mRNA的非中斷部分，則多核苷酸為互補於KHK mRNA的至少一部分。
因此，一些具體例中，本文揭示的反義多核苷酸為完全互補於靶向KHK序列。其他具體例中，本文所揭示的反義多核苷酸為實質上互補於靶向KHK序列，且包含連續的核苷酸序列，該連續的核苷酸序列於其全長至少80%互補於SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11的任一者或SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11的任一者的片段的核苷酸序列的相應區域，如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%互補。
一些具體例中，本文所揭示的反義多核苷酸為實質上互補於靶向KHK序列的片段且包含連續的核苷酸序列，該連續的核苷酸序列於其全長至少80%互補於選自SEQ ID NO：1之核苷酸120-162；164-188；181-207；193-217；209-231；283-306；508-546；568-603；596-632；640-674；746-806；806-835；917-942；936-084；1016-1041；1100-1123；1149-1175；1160-1193；1205-1229；1252-1283；1334-1356；1407-1429；1472-1497；1506-1533；1539-1561；1704-1727；1747-1787；1850-1873；1936-1964；1960-1990；2015-2048；2060-2095；2090-2118；2124-2160；2181-2200；2221-2262之群組之SEQ ID NO：1的片段，如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%互補。
一些具體例中，本文所揭示的反義多核苷酸為實質上互補於靶向KHK序列的片段且包含連續的核苷酸序列，該連續的核苷酸序列於其全長至少 80%互補於選自SEQ ID NO：1之核苷酸517-539；521-543；524-546；517-546；581-603；610-632；747-769；749-771；752-774；755-777；757-779；758-780；764-786；776-798；781-803；747-803；920-942；941-963；944-966；950-972；962-984；920-984；1149-1171；1161-1183；1165-1187；1171-1193；1149-1193；1205-1227；1206-1228；1205-1228；1334-1356；1472-1494；1475-1497；1472-1497之群組之SEQ ID NO：1的片段，如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%互補。
一些具體例中，本文所揭示的反義多核苷酸為實質上互補於靶向KHK序列的片段且包含連續的核苷酸序列，該連續的核苷酸序列於其全長至少80%互補於選自SEQ ID NO：1之核苷酸517-539；524-546；517-546；753-775；757-779；753-779；764-786；767-789；768-790；769-791；764-791；773-795；781-803；773-803；753-803；808-830；937-959；941-963；944-966；941-966；948-970；950-972；948-972；1160-1182；1161-1183；1160-1183；及1207-1229之群組之SEQ ID NO：1的片段，如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%互補。
一些具體例中，本文所揭示的反義多核苷酸為實質上互補於靶向KHK序列的片段且包含連續的核苷酸序列，該連續的核苷酸序列於其全長至少80%互補於選自SEQ ID NO：1之核苷酸495-517、492-517、500-529、514-551、517-539、524-546、517-548、614-643、625-647、625-660、642-664、642-672、753-811、754-780、762-791、764-786、772-800、781-803、805-827、808-830、809-831、792-838、931-982、944-966、947-969、948-970、948-982、1011-1035、1021-1043、1019-1050、1063-1091、1150-1192、1152-1176、1160-1192、1160- 1182、1162-1184、1198-1230、1198-1221、及1202-1230之群組之SEQ ID NO：1的片段，如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%互補。
一些具體例中，本文所揭示的反義多核苷酸為實質上互補於靶向KHK序列的片段且包含連續的核苷酸序列，該連續的核苷酸序列於其全長至少80%互補於選自SEQ ID NO：1之核苷酸513-556、753-813、936-981、1155-1193、1200-1229、1704-1727、1747-1787、1850-1873、1936-1964、1960-1990、1936-1990、2015-2048、2060-2095、2090-2118、2060-2118、2124-2160、2181-2220、2221-2249、2181-2249、2240-2262、2221-2262及2181-2262之群組之SEQ ID NO：1的片段、如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%互補。
其他具體例中，本文所揭示的反義多核苷酸為實質上互補於靶向KHK序列且包含連續的核苷酸序列，該連續的核苷酸序列於其全長至少80%互補於表2、3、5、6及8至13中任一者之任一有義股核苷酸序列或表2、3、5、6及8至13中任一者之任一有義股核苷酸序列的片段、如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%互補。
一具體例中，本揭露之RNAi劑包括與反義多核苷酸實質上互補的有義股，該反義多核苷酸反過來與靶向KHK序列相同，且其中該有義股多核苷酸包含連續的核苷酸序列，該連續的核苷酸序列於其全長至少80%互補於SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12之任一者或SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12 之任一者的片段之核苷酸序列的相應區域，如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%互補。
一些具體例中，本發明之iRNA與反義多核苷酸實質上互補的有義股，該反義多核苷酸反過來與靶向KHK序列相同，且其中該有義股多核苷酸包含連續的核苷酸序列，該連續的核苷酸序列於其全長至少約80%互補於表2、3、5、6及8至13中任一者之任一反義股核苷酸或表2、3、5、6及8至13中任一者之任一反義股核苷酸的片段之任一者，如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%互補。
某些具體例中，有義股及反義股係選自下述雙鏈體之任一者：AD-1613400；AD-1613243；AD-1290757.3；AD-1290878.3；AD-1290969.3；AD-1423317.2；AD-1423327.2；AD-1423336.2；AD-1290599.3；AD-1523172.1；AD-1290837.3；AD-1523173.1；AD-1290884.3；AD-1523174.1；AD-1290959.3；AD-1523175.1；AD-1423311.2；AD-1423324.2；AD-1523176.1；AD-1423329.2；AD-1423333.2；AD-1423330.2；AD-1523177.1；AD-1290885.3；AD-1523178.1；AD-1423334.2；AD-1523179.1；AD-1523180.1；AD-1290539.3；及AD-1523181.1。
一般而言，「iRNA」包括具有化學修飾的核糖核苷酸。該等修飾可包括本文所揭示或所屬技術領域習知的所有類型的修飾。任何該等修飾，如使用於dsRNA分子，針對本說明書及申請專利範圍的目的為「iRNA」所涵括。
本揭露的某些具體例中，若存在於RNAi劑內，則去氧-核苷酸的含入可被認為構成經修飾之核苷酸。
本發明之態樣中，用於本發明之方法及組成物中之劑係單股反義寡核苷酸分子，其經由反義抑制機制抑制靶向mRNA。單股反義RNA分子與靶 向mRNA內之序列互補。單股反義寡核苷酸分子可藉由與mRNA鹼基配對並且物理地阻礙轉譯機制而以化學計量學方式抑制翻譯，參見Dias,N.et al.,(2002)Mol Cancer Ther 1：347-355。單股反義寡核苷酸分子可係約14至約30個核苷酸之長度，且具有與靶向序列互補之序列。例如，單股反義寡核苷酸分子可包含序列，該序列係來自本文所揭示之反義序列中任一者之至少約15、16、17、18、19、20或更多個接續核苷酸。
如使用於本文，短語「使細胞與iRNA接觸」，如為dsRNA，包括藉由任意可能之手段接觸細胞。使細胞與iRNA接觸包括在體外使細胞與iRNA接觸或在體內使細胞與iRNA接觸。接觸可直接或間接進行。因此，例如，iRNA可藉由單獨執行該方法而使其與細胞物理接觸，或替代地，可將iRNA置於將允許或造成其後續與該細胞接觸之條件。
例如，可藉由使用iRNA培育細胞而使該細胞在體外接觸該iRNA。例如，可藉由將iRNA注射到細胞所在的組織中或附近，或藉由將iRNA注射到另一個區域，例如，血流或皮下空間，使劑隨後到達要接觸的細胞所在的組織。例如，iRNA可含有或偶合至配位子，例如，GalNAc，其引導iRNA至感興趣的位點，例如，肝。也可能為接觸的體外及體內方法的組合。例如，細胞亦可體外與iRNA接觸以及後續移植至各體。
某些具體例中，使細胞與iRNA接觸包括藉由有助於或有效於攝入或吸收至細胞而「導入」或「遞送iRNA至細胞」。iRNA的吸收或攝入可經由無助力的擴散或主動細胞過程、或者藉由輔助劑或裝置而發生。導入iRNA至細胞可為體外或體內。例如，對於體內導入，iRNA可注射至組織位點或全身性 投藥。體外導入至細胞包括所屬技術領域習知的方法，如電穿孔及脂染法。進一步的方案係揭示於本文後文中或已知於所屬技術領域。
術語「脂質奈米顆粒」或「LNP」係囊泡，其包含脂質層，該脂質層封裝藥學活性分子如核酸分子，例如iRNA或RNAi劑自其轉錄之質體。LNP揭示於，舉例而言，美國專利第6,858,225號、第6,815,432號、第8,158,601號及第8,058,069號，該等專利之整體內容藉由參照而併入本文。
如使用於本文，「對象」係動物，如哺乳動物，包括靈長類(諸如人、非人靈長類，例如，猴及黑猩猩)、或非靈長類(諸如牛、豬、馬、山羊、兔、綿羊、倉鼠、豚鼠、貓、狗、大鼠、或小鼠)或鳥類，其內源性地或異源性地表現靶向基因。一具體例中，對象係人，如正在進行對將會受益於KHK表現減低之疾病或疾患之治療或評估的人；處於將會受益於KHK表現減低之疾病或疾患之風險下的人；罹患將會受益於KHK表現減低之疾病或疾患的人；或正在進行對將會受益於KHK表現減低之疾病或疾患之治療的人，如本文中所述。一些具體例中，對象係女性人類。其他具體例中，對象係男性人類。一具體例中，對象係成年對象。另一具體例中，對象係小兒對象。
如使用於本文，術語「治療(treating或treatment)」指有益或所欲之結果，如於對象減低KHK-相關疾患之至少一種症狀。治療也包括與非所欲之KHK表現相關之一種或多種徵象或症狀的減低；非所欲之KHK活化或安定化之程度的降低；非所欲之KHK活化或安定化之改善或緩和。「治療」亦可意指相對於在治療缺乏情況下預期之生存期而延長的生存期。在對象之KHK或疾病標記物或症狀程度之情境中，術語「減低」指此程度之統計學顯著之減少。該減少可係，例如，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多。某些具體例中，減少係至少20%。某些具體例中，減少係疾病標記，例如蛋白質或基因表現程度之至少50%。於對象體內之KHK程度的情境中，「減少」為降低至如同不具此疾患之對象正常範圍內所接受的程度。某些具體例中，「減少」是患有疾病的個體的標記或症狀量級與對象在正常範圍內可接受的程度之間的差異的減少，例如，肥胖對象與體重在正常範圍內可接受的對象之間的體重減少程度。
如使用於本文，「預防(prevention or preventing)」，當使用於指疾病、疾患或其狀況時，可藉由減低KHK基因的表現而被治療或緩解，指減低對象將發展與該疾病、疾患或狀況相關症狀的可能性，例如，非所欲或過度的KHK表現及/或活性的症狀，例如，增加的果糖代謝、提升的尿酸及脂質量級。不受機制束縛，已知藉由KHK催化的果糖磷酸化以形成的果糖-1-磷酸不受反饋抑制的調節，此可導致ATP及細胞內磷酸鹽的消耗，以及增加的AMP量級，此造成尿酸的產生。進一步地，果糖-1-磷酸係代謝為甘油醛，其饋至檸檬酸循環而增加乙醯基Co-A的產生，刺激脂肪酸合成。與提升的尿酸及脂肪酸合成相關的疾病及狀況包括，例如，肝疾病(例如，脂肪肝、脂肪肝炎包括酒精性脂肪肝炎(NASH))、脂質血異常(例如，高脂血症、高LDL膽固醇、低HDL膽固醇、高三酸甘油脂血症、飯後高三酸甘油脂血症)、血糖調控之疾患(例如，無關於對胰島素之免疫回應的胰島素抗性、第2型糖尿病)、心血管疾病(例如，高血壓、內皮細胞功能異常)、腎疾病(例如，急性腎疾患、腎小管功能異常、近端腎小管的前炎性變化、慢性腎疾患)、代謝症狀群、脂質沉積或功能異常的疾病(例如，脂肪細胞功能異常、內臟脂肪沉積、肥胖)、提升的尿酸的疾病(例如，高尿酸血症、痛風)以及飲食疾患如過度糖渴望。未發展疾病、疾患或狀況或與 此類疾病、疾患或狀況相關的症狀或合併症的發展減低(例如，在該疾病或疾患的臨床接受的量表至少約10%)或在數日、數週、數月或數年出現延遲的體徵或症狀或疾病進展，被認為是有效的預防。
如使用於本文，術語「己酮糖激酶(KHK)-相關疾病」或「KHK-相關疾患」，為由KHK基因表現或KHK蛋白質產生所引起或與其相關的疾病或疾患。術語「KHK-相關疾病」包括將受益於KHK基因表現、複製或蛋白質活性的減少而受益的疾病、疾患或狀況。KHK-相關疾病的非限制性實例包括，例如，肝疾病(例如，脂肪肝、包括酒精性脂肪肝炎(NASH)的脂肪肝炎)、脂質血異常(例如，高脂血症、高LDL膽固醇、低HDL膽固醇、高三酸甘油脂血症、飯後高三酸甘油脂血症)、血糖調控之疾患(例如，無關於對胰島素之免疫回應的胰島素抗性、第2型糖尿病)、心血管疾病(例如，高血壓、內皮細胞功能異常)、腎疾病(例如，急性腎疾患、腎小管功能異常、近端腎小管的前炎性變化、慢性腎疾患)、代謝症狀群、脂質沉積或功能異常的疾病(例如，脂肪細胞功能異常、內臟脂肪沉積、肥胖)、升高的尿酸的疾病(例如，高尿酸血症、痛風)以及飲食疾患如過度糖渴望。
某些具體例中，KHK-相關疾病為相關於升高的尿酸(例如，高尿酸血症、痛風)。
某些具體例中，KHK-相關疾病為相關於升高的脂質量級(例如，脂肪肝、包括酒精性脂肪肝炎(NASH)的脂肪肝炎、血脂異常)。
「治療有效量」，如使用於本文，係意圖包括RNAi劑的量，當投藥至具有KHK-相關疾病的對象時，足以有效治療疾病(例如，藉由減少、緩解或維持現有疾病或疾病的一種或多種症狀)。「治療有效量」可根據RNAi劑、 該劑如何投藥、疾病及其嚴重度與病史、年齡、體重、家族史、基因組成、之前或偕同治療的類型以及若存在之待治療的對象之其他個別特徵而變化。
「預防有效量」，如使用於本文，係意圖包括RNAi劑的量，當投藥至具有KHK-相關疾病的對象時，足以預防或緩解疾病或該疾病的一種或多種症狀。緩解該疾病包括減緩疾病的成因或減低後期疾病的嚴重度。「預防有效量」可根據RNAi劑、該劑如何投藥、疾病及其嚴重度與病史、年齡、體重、家族史、基因組成、之前或偕同治療的類型以及若存在之待治療的對象之其他個別特徵而變化。
「治療-有效量」或「預防有效量」也包括以適用於任何治療的合理利益/風險比例產生一些期望效果的RNAi劑的量。應用於本發明的方法的iRNA可以以足夠的量給藥以產生適用於此等治療的合理利益/風險比例。
應用於本文之短語「醫藥上可接受的」意指在合理的醫學判斷範圍內，適用於與人類對象及動物對象的組織接觸而無過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症、與合理的利益/風險比例相稱的該等化合物(包括鹽)、材料、組成物或劑型。
如使用於本文之短語「醫藥上可接受的載體」意味醫藥上可接受的材料、組成物或媒劑，如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、製造助劑(例如，潤滑劑、滑石鎂、硬脂鈣或硬脂鋅或硬脂酸)或溶劑囊封材料，涉及將主化合物由身體的一個器官或部分攜帶或運輸到身體的另一器官或部分。各載體在與製劑的其他成分相容且對待治療對象無害的意義上必須為「可接受的」。該等載體為所屬技術領域習知。醫藥上可接受的載體包括用於藉由注射投藥的載體。
術語「降低」在對象或疾病標記或症狀中之KHK基因表現或KHK蛋白產生的量級的情況下，意指在該等量級為統計上顯著的減少。減少可為，例如，至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%或低於檢測方法的檢測量級。某些具體例中，靶向的表現係經正常化，亦即，減少接近或達到在無該等疾患的個體的正常範圍內的量級，例如，體重、血壓或血清脂質量級的正常化。如使用於本文，對象中的「降低」可意指對象之細胞中的基因表現畫蛋白質產生的降低而無須對象的所有細胞或組織的表現降低。例如，如使用於本文，對象中的降低可包括存活對象中的基因表現或蛋白質產生的降低。
術語「降低」也可用於使疾病或疾患的症狀正常化，亦即減低患有KHK-相關疾病的對象的量級與未患有KHK-相關疾病的正常對象的量級之間的差異。例如，如果正常體重為70公斤的對象在治療前體重為90公斤(過重20公斤)和治療後體重為80公斤(過重10公斤)，則對象的體重向正常體重降低50%(10/20 x 100%)。類似地，如果女性的HDL量級從50mg/dL(不佳)增加到57mg/dL，正常量級為60mg/dL，則對象先前量級與正常量級之間的差異為減少70%(對象量級與正常量級之間的10mg/dL差異減少7mg/dL，7/10 x 100%)。如使用於本文，如果疾病與症狀的升高值有關，則「正常」被認為是正常的上限。如果疾病與症狀的減少值相關，則「正常」被認為是正常的下限。
術語「樣本」，如使用於本文，包括從對象分離的類似流體、細胞或組織的集合，以及對象內存在的流體、細胞或組織。生物流體的實例包括血液、血清和漿液、血漿、腦脊液、眼液、淋巴液、尿液、唾液等。組織樣本可包括來自組織、器官或局部區域的樣本。例如，樣本可衍生自特定器官、器官的一 部分或這些器官內的體液或細胞。某些具體例中，樣本可衍生自肝臟(例如，整個肝臟或肝臟的某些部分或肝臟中某些類型的細胞，如，例如，肝細胞)。一些具體例中，「衍生自對象的樣本」意指自對象獲得的尿液。「衍生自對象的樣本」可意指自對象抽取的血液(期可容易地轉換為血漿或血清)。
II.本發明的iRNAs
本發明提供iRNAs其抑制KHK基因的表現。某些具體例中，iRNA包括雙股核糖核酸(dsRNA)分子用以抑制細胞中KHK基因的表現，如對象中的細胞，例如，哺乳動物，如患有或易於發展KHK-相關疾病的人類。dsRNAi劑包括具有互補區域的反義股，該互補區域與KHK基因的表現中所形成的mRNA的至少一部分互補。互補區域為約30個核苷酸或更少之長度(例如，約30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19或18核苷酸或更少之長度)。一旦接觸表現KHK基因的細胞，iRNA抑制KHK基因的表現(例如，人類、靈長類、非靈長類或大鼠的KHK基因)至少約50%如藉由，例如，PCR或分支DNA(bDNA)-為主的方法或藉由蛋白質為主的方法所檢測，如藉由免疫螢光分析，使用例如，西方印漬或流式細胞儀技術。某些具體例中，表現的抑制係藉由本文實施例中提供的qPCR方法用siRNA，例如，以10nM量級，於本文所提供的合適有機體細胞株予以測定。某些具體例中，體內的表現的抑制係於表現人類基因的齧齒動物中藉由人類基因的剔除予以測定，表現人類靶向基因的小鼠或AAV-感染的小鼠，例如，當投藥單劑量時，例如，以3mg/kg於RNA表現的最低點。
dsRNA包括二個RNA股，該股於daRNA將被使用的條件下互補且雜交以形成雙鏈體結構。dsRNA的一股(反義股)包括互補區域，該互補區域為實質上互補，且通常完全互補於靶向序列。靶向序列可衍生自於KHK基因 的表現期間所形成的mRNA的序列。另一股(有義股)包括互補於該反義股的區域，當於合適條件組合時，使得該二股雜交且形成雙鏈體結構。如本文其他處所描述以及如所屬技術領域所習知，dsRNA的互補序列亦可被包含於單一核酸分子的自我互補區域，而不是在分開的寡核苷酸。
通常，雙鏈體結構為15至30鹼基對之長度，例如，15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22鹼基對之長度。某些具體例中，雙鏈體結構為18至25鹼基對之長度，例如，18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-25、20-24,20-23、20-22、20-21、21-25、21-24、21-23、21-22、22-25、22-24、22-23、23-25、23-24或24-25鹼基對之長度，例如，19-21鹼基對之長度。上文引述之範圍及長度之間的範圍及長度亦視為本發明之一部分。
類似地，互補區域對靶向序列為15至30核苷酸之長度，例如，15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24,20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22核苷酸之長度，例如19-23核苷酸之長度或21-23核苷酸之長度。上文引 述之範圍及長度之間的範圍及長度亦視為本發明之一部分。一些具體例中，雙鏈體結構為19至30鹼基對之長度。類似地，互補區域對靶向序列為19至30核苷酸之長度。
一些具體例中，dsRNA為約19至約23核苷酸之長度或約25至約30核苷酸之長度。一般而言，dsRNA為足夠常以作為Dicer酵素的受質。例如，所屬技術領域習知dsRNAs較長於約21-23核苷酸之長度可做為Dicer的受質。所述技術領域中具有通常知識者亦將辨識，靶向裂解的RNA區域通常為較大RNA分子的一部分，通常為mRNA分子。相關的，mRNA靶向的「一部分」為足夠長度的mRNA靶向的連續序列以允許其作為RNAi-導引裂解的受質(亦即，經由RISC途徑的裂解)。
所屬技術領域中具有通常知識者亦將辨識雙鏈體區域為dsRNA的主要功能部份，例如，雙鏈體區域約19至約30鹼基對，例如，約19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24,20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22鹼基對。因此，一具體例中，就其被加工成例如15-30鹼基對的功能性雙鏈體而言，其靶向期望的RNA用以裂解，具有大於30個鹼基對的雙鏈體區域的RNA分子或RNA分子複合物為dsRNA。因此，所屬技術領域中具有通常知識者將辨識一具體例中，miRNA為dsRNA。另一具體例中，dsRNA不為天然發生的miRNA。另一具體例中，有用於靶向KHK基因表現的iRNA劑不是於靶向細胞中藉由裂解較大的dsRNA而產生。
本文所述的dsRNA可進一步包括一或多個單股核苷酸突出，例如，1-4、2-4、1-3、2-3、1、2、3或4個核苷酸。具有至少一個核苷酸突出的dsRNA相對於其鈍-末端的對應部分可具有優異的抑制性特性。核苷酸突出可包含核苷酸/核苷類似物或由其所組成，包括去氧核苷酸/核苷。突出(多個突出)可於有義股、反義股或其任何組合。此外，突出的核苷酸(多個核苷酸)可存在於dsRNA的反義股或有義股的5’-末端、3’-末端或二末端。
dsRNA可藉由所屬技術領域習知的標準方法合成。本發明之雙股RNAi化合物可使用二步驟程序予以製備。首先，分別製備雙股RNA分子的個別股，然後，黏合(anneal)該成分股。使用溶液相、固相或二者製備siRNA化合物的個別股。有機合成提供優勢，包含非天然或經修飾核苷酸的寡核苷酸可容易地製備。類似地，本發明的單股寡核苷酸可使用溶液相或固相有機合成或二者予以製備。
一態樣中，本發明的dsRNA包括至少二個核苷酸序列，有義序列及反義序列。該有義股係選自表2、3、5、6及8-13中任一者所提供的序列群組，以及該有義股的相應反義股係選自表2、3、5、6及8-13中任一者的序列群組。此態樣中，二序列之一者係互補於二序列之另一者，以序列之一者為實質上互補於KHK基因的表現中所產生的mRNA序列。據此，此態樣中，dsRNA將包括二寡核苷酸，其一寡核苷酸係如表2、3、5、6及8-13中任一者的有義股所述，以及第二寡核苷酸係如表2、3、5、6及8-13中任一者的有義股的相應反義股所述。
某些具體例中，dsRNA的實質互補序列係含有於分開的寡核苷酸。其他具體例中，dsRNA的實質互補序列係包含於單一寡核苷酸。
某些具體例中，正義或反義股係選自下述雙鏈體之任一者的正義或反義股：AD-517197.2、AD-517258.2、AD-516748.2、AD-516851.2、AD-519351.2、AD-519754.2、AD-519828.2、AD-520018.2、AD-520035.2、AD-520062.2、AD-520064.2、AD-520065.2、AD-520067.2、AD-75289.2、AD-520069.2、AD-520099.2、AD-67575.7、AD-520101.2、AD-1193323.1、AD-1193344.1、AD-1193350.1、AD-1193365.1、AD-1193379.1、AD-1193407.1、AD-1193421.1、AD-1193422.1、AD-1193429.1、AD-1193437.1、AD-1193443.1、AD-1193471.1、AD-1193481.1或AD-67605.7。
一些具體例中，正義或反義股係選自下述雙鏈體之任一者的正義或反義股：AD-519345.1、AD-519346.1、AD-519347.1、AD-67554.7、AD-519752.3、AD-1010731.1、AD-1010732.1、AD-519343.1、AD-519344.1、AD-519349.1、AD-519350.1、AD-519753.2、AD-519932.1、AD-519935.2、AD-520018.6、AD-517837.2、AD-805635.2、AD-519329.2、AD-520063.2、AD-519757.2、AD-805631.2、AD-516917.2、AD-516828.2、AD-518983.2、AD-805636.2、AD-519754.7、AD-520062.2、AD-67575.9、AD-518923.3、AD-520053.4、AD-519667.2、AD-519773.2、AD-519354.2、AD-520060.4、AD-520061.4、AD-1010733.2、AD-1010735.2、AD-1193323.1、AD-1193344.1、AD-1193350.1、AD-1193365.1、AD-1193379.1、AD-1193407.1、AD-1193421.1、AD-1193422.1、AD-1193429.1、AD-1193437.1、AD-1193443.1、AD-1193471.1、或AD-1193481.1。
一些具體例中，正義或反義股係選自雙鏈體AD-519351的正義或反義股。
將理解，雖然於例如，表2、5、8及10中的序列不描述為經修飾或經接合的序列，本發明之iRNA的RNA，例如，本發明的dsRNA可包含表2、3、5、6及8-13中任一者所述序列之任一者，該序列為未經修飾、未經接合、經修飾或經接合，如本文所述。
所屬技術領域中具有通常知識者將明瞭具有約20至23鹼基對的雙鏈體結構的dsRNA，例如，21鹼基對，被譽為特別有效於誘導RNA干擾(Elbashir et al.,EMBO 2001,20：6877-6888)。然而，其他也已發現較短或較長的RNA雙鏈體結構也可能為有效的(Chu and Rana(2007)RNA 14：1714-1719；Kim et al.(2005)Nat Biotech 23：222-226)。上述具體例中，憑藉表2、3、5、6及8-13中任一者所提供的寡核苷酸序列的性質，本文所述的dsRNA可包括長度為最少21個核苷酸的至少一股。可以合理地預期，相較於上述dsRNA，具有表2、3、5、6及8-13中任一者的序列之任一者減去僅在一端或二端的幾個核苷酸的較短雙鏈體可以同樣有效。因此，具有至少19、20、21、22、23或更多個連續核苷酸的序列的dsRNA，衍生自表2、3、5、6及8-13中任一者的序列之任一者，以及在它們對包含完整序列的dsRNA抑制不超過約5、10、15、20、25或30%的KHK基因表現的能力預期在本發明的範圍內。
此外，提供於表2、3、5、6及8-13的RNA鑑定易受RISC-介導的裂解的KHK轉錄物的位點。據此，本發明進一步特徵在於靶向該等位點內之一者的iRNA。如使用於本文，如果iRNA促進特別位點內任何處得轉錄物裂解，則iRNA係稱為靶向RNA轉錄物的特別位點。該等iRNA通常將包括於表2、3、5、6及8-13中任一者所提供的序列之任一者的至少約19個連續核苷酸，其在KHK基因中偶合至取自所選擇的序列接續續區域的額外核苷酸。
III.本發明之經修飾的iRNA
某些具體例中，本發明之iRNA的RNA，例如，dsRNA，為未經修飾的，且不包含，例如，所屬技術領域習知及本文所描述的化學修飾或接合。其他具體例中，本發明之iRNA的RNA，例如，dsRNA，為經化學修飾以增強安定性或其他有利特徵。本發明之某些具體例中，本發明之iRNA的實質上所有核苷酸為經修飾的。本發明的其他具體例中，iRNA的所有核苷酸或實質上所有核苷酸為經修飾的，亦即，不多於5、4、3、2或1的未經修飾核苷酸存在於iRNA的股。
本發明中特徵的核酸可藉由所屬技術領域已建立的方法予以合成或修飾，如那些描述於“Current protocols in nucleic acid chemistry,”Beaucage,S.L.et al.(Edrs.),John Wiley & Sons,Inc.,New York,NY,USA，其藉由參照併入本文。修飾包括，例如，末端修飾，例如，5’-末端修飾(磷酸化、接合(conjugation)、反向鏈結)或3’-末端修飾(接合、DNA核苷酸、反向鏈結等)；鹼基修飾，例如，以安定鹼基、去安定鹼基或與擴增的伴侶庫(expanded repertoire of partners)配對的鹼基，移除鹼基(無鹼基核苷酸)或接合鹼基；糖修飾(例如，於2’-位置或4’-位置)或糖置換；或骨幹修飾，包括磷酸二酯鏈結的修飾或置換。有用於本文所描述具體例中的iRNA化合物的具體實例包括，但不限於，含有經修飾骨幹或天然核苷間鏈結的RNA。具有經修飾骨幹的RNA除其他外還包括該等於骨幹中不具有磷原子者。出於本說明書的目的，以及有時參照於所屬技術領域，於其核苷間骨幹不具有磷原子的經修飾RNA也可考慮為寡核苷。一些具體例中，經修飾iRNA於其核苷間骨幹將具有磷原子。
經修飾RNA骨幹包括，例如，硫代磷酸酯(phosphorothioate)、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)、磷酸三酯(phosphotriester)、胺基烷基磷酸三酯、甲基；以及其他包括3’-伸烷基膦酸酯及手性膦酸酯的烷基膦酸酯(alkyl phosphonate)、亞磷酸酯(phosphinate)、包括3’-胺基胺基磷酸酯及胺基烷基胺基磷酸酯的胺基磷酸酯(phosphoramidate)、硫羰基胺基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯；以及具有正常3’-5’鏈結的硼烷磷酸酯、其等之2’-5’-鏈結類似物；以及具有反向極性者，其中核苷單元的相鄰對係鏈結3’-5’至5’-3’或2’-5’至5’-2’。也包括各種鹽、混合鹽及游離酸形式。本發明的一些具體例中，本發明之dsRNA劑為游離酸形式。本發明的其他具體例中，本發明的dsRNA劑為鹽形式。一具體例中，本發明的dsRNA劑為鈉鹽形式。某些具體例中，當本發明的dsRNA劑為鈉鹽形式時，鈉離子存在於該劑中作為該劑中存在的實質上所有磷酸二酯及/或硫代磷酸酯基團的抗衡離子。其中實質上所有磷酸二酯及/或硫代磷酸酯鏈結具有鈉抗衡離子的劑包括不多於5、4、3、2或1個磷酸二酯及/或硫代磷酸酯鏈結而無鈉抗衡離子。一些具體例中，當本發明的dsRNA劑為鈉鹽形式時，鈉離子存在於該劑中作為該劑中存在的所有磷酸二酯及/或硫代磷酸酯基團的抗衡離子。
教示上述含磷鏈結的製備的代表性美國專利包括，但不限於，美國專利案號3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,195、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,316、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361、5,625,050、6,028,188、6,124,445、6,160,109、6,169,170、6,172,209、6,239,265、6,277,603、6,326,199、6,346,614、 6,444,423、6,531,590、6,534,639、6,608,035、6,683,167、6,858,715、6,867,294、6,878,805、7,015,315、7,041,816、7,273,933、7,321,029；及美國專利RE39464，其各者的全部內容藉由參照方式併入本文。
其中不包括磷原子的經修飾RNA骨幹具有由短鏈烷基或環烷基核苷間鏈結、混合雜原子及烷基或環烷基核苷間鏈結或一或多個短鏈雜原子或雜環核苷間鏈結所形成的骨幹。該等包括具有N-嗎啉鏈結者(一部分由核苷的糖部分形成)；矽氧烷骨幹；硫化物、亞碸及碸骨幹；甲乙醯基(formacetyl)及硫代甲乙醯基(thioformacetyl)骨幹；亞甲基甲乙醯基(methyleneformacetyl)及硫代甲乙醯基(thioformacetyl)骨幹；含烯的骨幹；胺基磺酸酯骨幹；亞甲基亞胺基及亞甲基肼基骨幹；磺酸酯及胺磺醯胺骨幹；醯胺骨幹；及其它具有混合的N、O、S和CH2組成部分者。
教室上述寡核苷的代表性美國專利包括，但不限於，美國專利案號5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,64,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437、及5,677,439，其各者的全部內容藉由參照方式併入本文。
適宜之RNA模擬物預期用於本文提供的iRNA劑中，其中該核苷酸單元之糖及核苷酸間鏈結二者，亦即骨幹係置換為新穎基團。鹼基單元維持與適宜之核酸靶向化合物雜交。一種此類寡聚化合物，業經顯示具有優異雜交特性之RNA模擬物，係指為胜肽核酸(PNA)。於PNA化合物中，RNA之糖骨幹替換為含有醯胺之骨幹，尤其是胺基乙基甘油骨幹。核酸鹼基得以保留，且直接 或間接地鍵結至骨幹之醯胺部分的氮雜氮原子。教示PNA化合物之製備的代表性美國專利包括，但不限於，美國專利案號5,539,082、5,714,331、5,719,262，其各者的全部內容藉由參照方式併入本文。適用於本發明的iRNA之額外之PNA化合物揭示於，舉例而言，Nielsen et al.,Science,1991,254,1497-1500。
特徵於本發明的一些具體例包括具有硫代磷酸酯骨幹的RNA及具有雜原子骨幹的寡核苷，且具體的為上述美國專利第5,489,677號之--CH2--NH--CH2-、--CH2--N(CH3)--O--CH2--(已知為亞甲基(甲基亞胺基)或MMI骨幹)、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--及--N(CH3)--CH2--CH2--及上述美國專利第5,602,240號之醯胺骨幹。一些具體例中，特徵於本文的RNA具有上述參照之美國專利第5,034,506號之N-嗎啉基骨幹結構。天然的磷酸二酯骨幹係表示為O-P(O)(OH)-OCH2-。
經修飾RNA也可含有一或多個取代糖部分。特徵於本文之iRNAs，例如，dsRNAs，可於2’-位置包括下述之任一者：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基及炔基可為經取代或未經取代之C1至C10烷基或C2至C10烯基及炔基。例示性合適修飾包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2).nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2及O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n及m為由1至約10。其他具體例中，dsRNAs於2’-位置包括下述之任一者：C1至C10低級烷基、經取代的低級烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、雜環烷基、雜環烷芳基、胺基烷基胺基、多烷基胺基、經取代的矽基、RNA裂解基、報導子基(reporter group)、嵌入劑(intercalator)、用於改善iRNA的藥物動力學特性的 基團或用於改善iRNA的藥效動力學特性的基團、以及具有類似特性的其他取代基。一些具體例中，修飾包括2’-甲氧基乙氧基(2’-O--CH2CH2OCH3，亦已知為2’-O-(2-甲氧基乙基)或2’-MOE)(Martin et al.,Helv.Chim.Acta,1995,78：486-504)，亦即，烷氧基-烷氧基基團。另一例示性修飾為2’-二甲基胺基氧基乙氧基，亦即，O(CH2)2ON(CH3)2基團，亦已知為2’-DMAOE，如本文下述實例中所述者，以及2’-二甲基胺基乙氧基乙氧基(亦已知於所屬技術領域為2’-O-二甲基胺基乙氧基乙基或2’-DMAEOE)，亦即，2’-O--CH2--O--CH2--N(CH3)2。進一步例示性修飾包括：5’-Me-2’-F核苷酸、5’-Me-2’-OMe核苷酸、5’-Me-2’-去氧核苷酸(此等三類型中之R及S異構物二者)；2’-烷氧基烷基；及2’-NMA(N-甲基乙醯胺)。
其他修飾包括2’-甲氧基(2’-OCH3)、2’-胺基丙氧基(2’-OCH2CH2CH2NH2)及2’-氟(2’-F)。類似的修飾也可在iRNA的RNA的其他位置完成，特別是3’終端核苷酸或2’-5’鏈結dsRNA的糖的3’位置及5’終端核苷酸的5’位置。iRNA也可具有糖模擬物如替代呋喃戊糖的環丁基部分。教示此等修飾糖結構的製備的代表性美國專利包括，但不限於，美國專利案號4,981,957、5,118,800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5,591,722、5,597,909、5,610,300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5,658,873、5,670,633、及5,700,920，其中某些係與本申請為共同擁有。前述各者的全部內容藉由參照方式併入本文。
iRNA也可包括核鹼基(所屬技術領域中通常簡稱為「鹼基」)修飾物或取代基。如使用於本文，「未經修飾」或「天然」核鹼基包括嘌呤鹼基腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G)，以及嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧 啶(U)。修飾核鹼基包括其它合成的和天然的核鹼基如5’-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤、腺嘌呤及鳥嘌呤的6-甲基及其它烷基衍生物、腺嘌呤及鳥嘌呤的2-丙基及其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-鹵尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-鹵代、8-胺基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羥基及其它8-取代的腺嘌呤及鳥嘌呤、5-鹵代特別是5-溴代、5-三氟甲基及其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤及7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤及7-脫氮雜腺嘌呤以及3-脫氮雜鳥嘌呤和3-脫氮雜腺嘌呤。進一步的核鹼基包括揭示於美國專利案號3,687,808者；Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijn,P.ed.Wiley-VCH,2008中揭示者；The Concise Encyclopedia Of PolymerScience And Engineering，第858-859頁，Kroschwitz,J.,Led.John Wiley & Sons,1990中揭示者；Englisch等人，Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613中揭示者；以及由Sanghvi，YS.,第15章，DsRNA Research and Applications，第289-302頁，Crooke,S.T.和Lebleu,B.,Eds.,CRC Press,1993揭示者。這些核鹼基中的某些對提高本發明的寡聚化合物的結合親和力是特別有利的。這些核鹼基包括5-取代的嘧啶，6-氮雜嘧啶及N-2、N-6以及0-6取代的嘌呤，其包括2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已經表明5-甲基胞嘧啶取代基提高核酸二倍體的穩定性0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.和Lebleu,B.,Eds.,DsRNA Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993，第276-278頁)，並是目前的較佳鹼基取代基，甚至更特別地當與2’-O-甲氧基乙基糖修飾物組合時。
教示上文述及的修飾核鹼基以及其他修示核鹼基的某些的製備的美國專利包括，但不限於，上文述及的美國專利案號3,687,808、4,845,205、5,130,30、5,134,066、5,175,273、5,367,066、5,432,272、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,594,121、5,596,091、5,614,617、5,681,941、5,750,692、6,015,886、6,147,200、6,166,197、6,222,025、6,235,887、6,380,368、6,528,640、6,639,062、6,617,438、7,045,610、7,427,672、及7,495,088，其各者的全部內容藉由參照方式併入本文。
本揭露的iRNA劑也可為修飾以包括一或多個雙環糖部分。「雙環糖」為藉由兩個碳的橋連所形成的環予以修飾的呋喃糖基環，無論相鄰或非相鄰。「雙環核苷(bicyclic nucleoside)」(「BNA」)為具有糖部分的核苷，該糖部分包含藉由糖環的兩個碳的橋連所形成的環，無論相鄰或非相鄰，藉此形成雙環的環系統。某些具體例中，該橋連結糖環的4’-碳及2’-碳，視需要地，經由2’-非環氧原子。因此，一些具體例中，本發明的劑可包括一或多個鎖核酸(locked nucleic acid，LNA)。鎖核酸係具有經修飾之核糖部分的核苷酸，其中該核糖部分包含連結2’碳與4’碳之外接橋。換言之，LNA係包含雙環糖部分之核苷酸，其中該雙環糖部分包含4’-CH2-O-2’橋。這一結構有效地將該核糖「鎖」為3’-環內結構之構形。將鎖核酸加至siRNA中業經顯示增加血清中siRNA安定性，且降低脫靶效應(Elmen,J.et al.,(2005)Nucleic Acids Research 33(1)：439-447；Mook,OR.et al.,(2007)Mol Canc Ther 6(3)：833-843；Grunweller,A.et al.,(2003)Nucleic Acids Research 31(12)：3185-3193)。用於發明之多核苷酸之雙環核苷的實例包括而不限於，包含位於4’核糖基環原子與2’核糖基環原子間之橋的核苷。某些具體例中，本發明之反義多核苷酸劑包括一或多個包含4’至2’橋之雙環核苷。
鎖核苷酸可以藉由以下結構表示(忽略立體化學)，
Figure 111106049-A0202-12-0061-238
其中B係核鹼基或經修飾之核鹼基，以及L係將核糖環之2’-碳與4’-碳鏈接的鏈結子團。此類4’至2’橋接至雙環核苷的實例包括，但不限於，4’-(CH2)-O-2’(LNA)；4’-(CH2)-S-2’；4’-(CH2)2-O-2’(ENA)；4’-CH(CH3)-O-2’(亦指代為「受約束之乙基(constrained ethyl)」或「cEt」)及4’-CH(CH2OCH3)-O-2’(及其類似物；參見，例如，美國專利第7,399,845號)；4’-C(CH3)(CH3)-O-2’(及其類似物；參見，例如，美國專利第8,278,283號)；4’-CH2-N(OCH3)-2’(及其類似物；參見，例如，美國專利第8,278,425號)；4’-CH2-O-N(CH3)-2’(參見，例如，美國專利申請第2004/0171570號)；4’-CH2-N(R)-O-2’，其中R係H、C1-C12烷基、或氮保護基團(參見，例如，美國專利第7,427,672號)；4’-CH2-C(H)(CH3)-2’(參見，例如，Chattopadhyayaet al.,J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；亦即4’-CH2-C(=CH2)-2’(及其類似物；參見，例如，美國專利第8,278,426號)。前述各者的全部內容藉由參照方式併入本文。
教示鎖核酸核苷酸的製備的其他代表性美國專利案及美國專利公開案包括下述者，但不限於：美國專利案號6,268,490、6,525,191、6,670,461、6,770,748、6,794,499、6,998,484、7,053,207、7,034,133、7,084,125、7,399,845、7,427,672、7,569,686、7,741,457、8,022,193、8,030,467、8,278,425、8,278,426、 8,278,283、US 2008/0039618、及US 2009/0012281，其各者的全部內容藉由參照方式併入本文。
前述雙環核苷之任意者可製備為具有一種或多種立體化學糖組態，包括，舉例而言，α-L-呋喃核糖及β-D-呋喃核糖(參照WO 99/14226)。
iRNA的RNA亦可經修飾，以包括一或多個約束之乙基核苷酸。如本文中所用，「約束之乙基核苷酸」或「cEt」係包含雙環糖部分之鎖核酸，其中該雙環糖部分包含4’-CH(CH3)-O-2’橋(亦即，前述結構中之L)。一具體例中，約束之乙基核苷酸係S構形，本文中指為「S-cEt」。
本發明之iRNA亦可包括一或多個「構形上受限之核苷酸(conformationally restricted nucleotides)」(「CRN」)。CRN係具有連結核糖之C2’碳與C4’碳或核糖之C3’碳與C5’碳之鏈結子的核苷酸類似物。CRN將該核糖鎖為安定之構形，且增加其與mRNA之雜交親和性。該鏈接子為足夠長，以將氧置於對於安定性及親和性為最優之位置，從而令核糖不易起皺。
教示上文所述某些CRN的製備的代表性文獻包括，但不限於，美國專利公開案第2013/0190383號、及PCT公開案WO 2013/036868，其各者的全部內容藉由參照方式併入本文。
一些具體例中，本發明之iRNA包含一或多個作為UNA(未鎖核酸，unlocked nucleic acid)核苷酸之單體。UNA係未鎖非環狀核酸，其中該糖之任意鍵業經移除，形成未鎖「糖」殘基。於一實例中，UNA亦涵蓋其C1’-C4’鍵(亦即，位於C1’碳與C4’碳間之碳-氧-碳共價鍵)業經移除之單體。於另一實例中，糖之C2’-C3’鍵(亦即，界於C2’碳與C3’碳之間的碳-碳共價鍵)業經移 除(參照Nuc.Acids Symp.Series,52,133-134(2008)及Fluiter et al.,Mol.Biosyst.,2009,10,1039，以參照方式併入)。
教示UNA的製備的代表性美國專利專利文獻包括，但不限於，美國專利第8,314,227號；及美國專利公開案號2013/0096289、2013/0011922、及2011/0313020，其各者的全部內容藉由參照方式併入本文。
對RNA分子之末端的潛在安定化修飾可包括N-(乙醯基胺基己醯基)-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6-NHAc)、N-己醯基-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6)、N-乙醯基-4-羥基脯胺醇(Hyp-NHAc)、胸腺嘧啶-2’-O-去氧胸腺嘧啶(醚)、N-(胺基己醯基)-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6-胺基)、2-二十二醯基-尿苷-3’-磷酸酯、反向鹼基dT(idT)等。這一修飾之揭露可見於WO 2011/005861。
一實例中，寡核苷酸的3’或5’終端末端係鏈結至反向2’-去氧-經修飾核糖核苷酸，如反向dT(idT)、反向dA(idA)或反向無鹼基2’-去氧核糖核苷酸(iAb)。一特定實例中，反向2’-去氧-經修飾核糖核苷酸係鏈結至寡核苷酸的3’末端，如本文所述有義股的3’-末端，其中該鏈結係經由3’-3’磷酸二酯鏈結或3’-3’-硫代磷酸酯鏈結。
其他實例中，有義股的3’-末端係經由3’-3’-硫代磷酸酯鏈結而鏈結至反向無鹼基核糖核苷酸(iAb)。其他實例中，有義股的3’-末端係經由3’-3’-硫代磷酸酯鏈結而鏈結至反向dA(idA)。
一特定實例中，反向2’-去氧-經修飾核糖核苷酸係鏈結至寡核苷酸的3’末端，如本文所述有義股的3’-末端，其中該鏈結係經由3’-3’磷酸二酯鏈結或3’-3’-硫代磷酸酯鏈結。
其他實例中，有義股的3’-終端核苷酸為反向dA(idA)且係經由3’-3’-鏈結(例如，3’-3’-硫代磷酸酯鏈結)鏈結至前述核苷酸。
本發明之iRNA的核苷酸之其他修飾包括5’磷酸酯或5’磷酸酯模擬物，例如，於iRNA反義股的5’-終端磷酸酯或磷酸酯模擬物。合適的磷酸酯模擬物揭示於，例如美國專利公開案2012/0157511，其全部內容以參照方式併入本文。
A.包含本發明之模體的經修飾之iRNA
本發明之某些態樣中，本發明之雙股RNA劑係包括具有揭露於例如第WO2013/075035公開案中之化學修飾的劑，其全部內容係以參照方式併入本文。如本文及WO2013/075035所示，位於三個連續的核苷酸之三種相同修飾的一或多個模體可引入至dsRNAi劑之有義股或反義股，特別是裂解位點或鄰近該裂解位點處。一些具體例中，該dsRNAi劑之有義股及反義股反而可為完全經修飾。此等模體之引入中斷有義股或反義股的修飾模式(若存在)。該dsRNAi劑可視需要與GalNAc衍生物配位子接合，例如在有義股。
更具體地，當雙股RNAi劑之有義股及反義股為完全經修飾以具有位於dsRNAi劑之至少一股之裂解位點或鄰近該裂解位點處的一或多個位於三個連續的核苷酸之三種相同修飾的模體時，觀察到該dsRNAi劑之基因緘默化活性。
因此，本發提供能體內抑制靶向基因(亦即，KHK基因)表現的雙股RNA劑。該RNAi劑包含有義股及反義股。該RNAi劑之各股可為例如，17-30核苷酸之長度、25-30核苷酸之長度、27-30核苷酸之長度、19-25核苷酸 之長度、19-23核苷酸之長度、19-21核苷酸之長度、21-25核苷酸之長度或21-23核苷酸之長度。
該有義股及反義股典型地形成雙鏈體雙股RNA(「dsRNA」)，本文中也指為「dsRNAi劑」。dsRNAi劑的雙鏈體區域可為，例如，雙鏈體區域可為27-30核苷酸對之長度、19-25核苷酸對之長度、19-23核苷酸對之長度、19-21核苷酸對之長度、21-25核苷酸對之長度或21-23核苷酸對之長度。其他實例中，雙鏈體區域為選自19、20、21、22、23、24、25、26、及27個核苷酸之長度。
某些具體例中，該dsRNAi劑可含有位於一股或兩股之3’-末端、5’-末端、或兩末端的一個或多個突出區域或封端基。該突出可係獨立為1至6個核苷酸之長度，例如，2至6個核苷酸之長度、1至5個核苷酸之長度、2至5個核苷酸之長度、1至4個核苷酸之長度、2至4個核苷酸之長度、1至3個核苷酸之長度、2至3個核苷酸之長度、或1至2個核苷酸之長度。某些具體例中，該突出可包括如上文提供者之延伸突出區域。該突出可係一股長於另一股之結果，或係相同長度之兩股錯開之結果。該突出可與靶標mRNA形成失配，或其可與正在作為靶標之基因序列互補，或可係另一序列。該第一股及第二股亦可接合，例如，藉由額外之鹼基以形成髮夾圈或藉由其他非鹼基鏈結子接合。
某些具體例中，該dsRNA劑的突出區域中的核苷酸可各自獨立地為經修飾或未經修飾核苷酸，包括但不限於2’-糖修飾，如2’-F、2’-O-甲基、胸苷(T)、2`-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(Teo)、2`-O-甲氧基乙基腺苷(Aeo)、2`-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷(m5Ceo)、及其任意組合。
例如，TT可係任意股之任意末端之突出序列。該突出可與靶標mRNA形成失配，或其可與正在作為靶標之基因序列互補，或可係另一序列。
該dsRNA劑之有義股、反義股或二股之5’-突出或3’-突出可為磷酸化。一些具體例中，突出區域含有二個核苷酸，該二個核苷酸之間具有硫代磷酸酯，其中該二個核苷酸可為興同獲不同。一些具體例中，突出係存在於有義股、反義股或二者之3’-末端。一些具體例中，此3’-突出係存在於反義股。一些具體例中，此3’-突出係存在於有義股。
該dsRNAi劑可僅含有單一突出，其強化該RNAi的干擾活性，而不影響其整體活性。例如，單股突出可位於該有義股的3’-末端，或者，替代地，位於反義股3’-末端。RNAi也可具有鈍末端，位於反義股的5’-末端(或有義股的3’-末端)或反之亦然。通常，該dsRNAi劑的反義股於3’-末端具有核苷酸突出，且於5’-末端為鈍的。惟不欲為理論所侷限，於反義股的5’-末端的非對稱性鈍末端及有義股的3’-末端突出有利於該導引股加載入RISC製程。
某些具體例中，dsRNAi劑為19個核苷酸之長度的雙鈍-末端，其中該有義股含有位於自5’-末端起第7、8、9三個連續的核苷酸之三個2’-F修飾的至少一個模體。反義股係含有位於自5’-末端起第11、12、13三個連續的核苷酸之三個2’-O-甲基修飾的至少一個模體。
其他具體例中，該dsRNAi劑係長度為20個核苷酸之雙鈍-末端，其中，有義股係含有位於自5’末端起第8、9、10三個連續的核苷酸之三個2’-F修飾的至少一個模體。反義股係含有位於自5’末端起第11、12、13三個連續的核苷酸之三個2’-O-甲基修飾的至少一個模體。
再其他具體例中，該dsRNAi劑係長度為21個核苷酸之雙鈍-末端，其中，有義股係含有位於自5’末端起第9、10、11三個連續的核苷酸之三個2’-F修飾的至少一個模體。反義股係含有位於自5’末端起第11、12、13三個連續的核苷酸之三個2’-O-甲基修飾的至少一個模體。
某些具體例中，該dsRNAi劑係包含21個核苷酸之有義股及23個核苷酸之反義股，其中，該有義股係含有位於自5’末端起第9、10、11三個連續的核苷酸之三個2’-F修飾的至少一個模體；該反義股係含有位於自5’末端起第11、12、13三個連續的核苷酸之三個2’-O-甲基修飾的至少一個模體，其中，該RNAi劑之一端係鈍端，而另一端係包含2個核苷酸之突出。一些具體例中，該2個核苷酸之突出係位於反義股的3’末端。
當二個核苷酸突出係於反義股的3’-末端時，於終端三個核苷酸之間可存在二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，其中，該三個核苷酸之兩者係突出核苷酸，且第三個核苷酸係與該突出核苷酸之下一個核苷酸配對。一具體例中，該RNAi劑係於有義股的5’-末端及反義股的5’-末端兩處額外具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。某些具體例中，該dsRNAi劑之有義股及反義股中的每一個核苷酸，包括作為模體之一部分的核苷酸，皆為經修飾核苷酸。於些具體例中，各殘基係獨立經2’-O-甲基或3’-氟修飾，如，於交替模體。視需要地，該dsRNAi劑係復包含配位子(如GalNAc3)。
某些具體例中，dsRNAi劑包含有義股及反義股，其中該有義股的長度係25至30個核苷酸殘基，其中，自5’終端核苷酸(位置1)位置1起始至第一股之位置23，係包含至少8個核糖核苷酸；該反義股的長度係36至66個核苷酸殘基，自3’終端核苷酸起始，於與有義股的位置1至23配對以形成雙鏈 體的位置，係包含至少8個核糖核苷酸；其中，至少反義股的3’終端核苷酸係未與有義股配對，且最多6個連續的3’終端核苷酸係未與有義股配對，從而形成1至6個核苷酸之3’單股突出；其中，反義股的5’端係包含10至30個連續的未與有義股配對的核苷酸，從而形成10至30個核苷酸之單股5’突出；其中，當正義與反義股係對準進行最大互補時，至少該有義股的5’終端及3’終端核苷酸係與反義股的核苷酸進行鹼基配對，從而於有義股與反義股的間形成實質上雙鏈體之區域；以及，當將該雙股之核酸引入哺乳動物細胞內時，反義股係沿著該反義股長度有至少19個核糖核苷酸與靶標RNA足量互補，以降低靶標基因表現；以及，其中，該有義股係含有位於三個連續的核苷酸之三個2’-F修飾的至少一個模體，其中，該等模體之至少一者係出現於裂解位點或鄰近該裂解位點處。該反義股係含有位於裂解位點或鄰近該裂解位點處之三個連續的核苷酸之三個2’-O-甲基修飾的至少一個模體。
某些具體例中，dsRNAi劑包含有義股及反義股，其中，該RNAi劑係包含長度為至少25個且至多29個核苷酸的第一股，以及長度為至多30個核苷酸的第二股，且該第二股具有位於自5’末端第11、12、13位置之三個連續的核苷酸之三個2’-O-甲基修飾的至少一個模體；其中，該第一股之3’末端及第二股之5’末端係形成鈍端，且該第二股係於其3’末端比該第一股長1至4個核苷酸，其中，該雙鏈體區域之長度係至少25對核苷酸，且當將該RNAi劑引入哺乳動物細胞內時，該第二股係沿著該第二股長度之至少19個核苷酸與靶標mRNA足量互補，以降低靶標基因表現；以及，其中，dsRNAi劑之切丁酶裂解係優先導致包含該第二股3’末端的siRNA，從而降低該靶標基因於哺乳動物體內的表現。視需要，該dsRNAi劑係復包含配位子。
某些具體例中，該dsRNAi劑的有義股含有位於三個連續的核苷酸之三個相同修飾的至少一個模體，其中，該等模體之一者係出現於該有義股的裂解位點。
某些具體例中，該dsRNAi劑的反義股亦可含有位於三個連續的核苷酸之三個相同修飾的至少一個模體，其中，該等模體之一者係出現於該反義股的裂解位點或鄰近該裂解位點處。
對於具有長度為19至23個核苷酸之長度的雙鏈體區域的dsRNAi劑，反義股的裂解位點典型地位於自5’-末端起之10、11及12位置左右。因此，三個相同修飾之模體可出現於自反義股的9、10、11位置；10、11、12位置；11、12、13位置；12、13、14位置；或13、14、15位置，自反義股的5’-末端之第一個核苷酸開始計數，或於該雙鏈體區域內自反義股5’-末端之第一對成對核苷酸開始計數。反義股中之裂解位點也可根據dsRNAi劑之雙鏈體區域從5’-末端起之長度而改變
該dsRNAi劑之有義股可含有位於該股裂解位點處三個連續的核苷酸之三個相同修飾的至少一個模體；且其反義股可具有位於該股裂解位點或鄰近該位點處三個連續的核苷酸之三個相同修飾的至少一個模體。當該有義股與該反義股形成dsRNA雙鏈體時，可對準該有義股及該反義股，以令該有義股的三個核苷酸之一個模體與該反義股的三個核苷酸之一個模體係具有至少一個核苷酸重疊，亦即，該有義股終模體之三個核苷酸的至少一者係與該反義股中模體之三個核苷酸的至少一者鹼基配對。或者，至少兩個核苷酸可重疊，或全部三個核苷酸可重疊。
一些具體例中，該dsRNAi劑的有義股可含有超過一個位於三個連續的核苷酸之三個相同修飾的模體。第一模體可出現於該股之裂解位點或鄰近該位點處，其他模體可係側翼修飾。本文中，術語「側翼修飾」係指出現於該股之與裂解位點或鄰近該裂解位點處之模體分離的同一股之另一部位的模體。側翼修飾或可與第一模體相鄰，或藉由至少一個或多個核苷酸與後者分離。當該等模體彼此緊鄰時，則該等模體之化學性係彼此截然不同；而當該等模體係藉由一個或多個核苷酸分離時，則其化學性可係相同或不同。可存在兩種或更多種側翼修飾。例如，當存在兩種側翼修飾時，相對於位於裂解位點或鄰近裂解位點處之第一模體，每一側翼修飾可出現於該第一模體之一端或該主模體之另一側。
與有義股類似，該dsRNAi劑之反義股可含有超過一個位於三個連續的核苷酸之三個相同修飾的模體，且該等模體之至少一者係出現於該股之裂解位點或鄰近裂解位點處。此反義股亦可含有一個或多個側翼修飾，該等側翼修飾之取向與可能存在於該有義股中之側翼修飾類似。
一些具體例中，該dsRNAi劑的有義股或反義股的側翼修飾典型地不包括該股之3’末端、5’-末端或二端之最初的一個或兩個末端核苷酸。
其他具體例中，該ds RNAi劑之有義股或反義股的側翼修飾典型地不包括該股之3’末端、5’末端或二端之雙鏈體區域內之最初的一對或兩對成對核苷酸。
當該dsRNAi劑的有義股及反義股各含有至少一個側翼修飾時，該側翼修飾可落在雙練區域的相同末端，且具有一、二或三個核苷酸的重疊。
當該dsRNAi劑的有義股及反義股各含有至少二個側翼修飾時，該有義股及該反義股可以排列而使得來自一股的兩個修飾分別落在雙鏈體區的 一末端，具有一、二或三個核苷酸的重疊；來自一股的兩個修飾落在雙鏈體區域的另一末端，具有一、二或三個核苷酸的重疊；兩個修飾一股落在前導模體的各側，在雙鏈體區域有一、二或三個核苷酸的重疊。
一些具體例中，dsRNAi劑的有義股及反義股中的每個核苷酸，包括為模體的一部份的核苷酸，可為經修飾。各核苷酸可具有相同或不同的修飾，其可以包括非連接磷酸氧中的一種或兩種或連接磷酸氧的一種或多種的一種或多種改變；改變核糖的成分，例如核糖的2’-羥基；用「去磷酸化」連接子大規模替換磷酸鹽部分；天然鹼基的修飾或替換；以及核糖-磷酸骨幹的替換或修飾。
由於核酸係子單元之聚合物，該等修飾之多數出現在核酸內重複之位置，例如，鹼基、磷酸酯部分、或磷酸酯部分之非鏈結性O的修飾。於一些情形中，修飾將出現在該核酸之所有對象位置，但在多數情形中並非如此。舉例而言，修飾可僅出現在3’或5’終端位置，可僅出現在中端區域，例如，出現在中端核苷酸之位置或出現在一股之最末2、3、4、5或10個核苷酸。修飾可出現在雙股區域、單股區域、或二者。修飾可僅出現在RNA之雙股區域，或僅出現在RNA之單股區域。例如，位於非鏈結性O位置之硫代磷酸酯修飾可僅出現在一終端或二終端，可僅出現在終端區域，例如出現在終端核苷酸之位置或出現在一股之最末2、3、4、5或10個核苷酸，或可出現在雙股區域及單股區域，尤其是在終端。5’末端或多個末端可經磷酸化。
其為可能者，例如，提升安定性，在突出中包括特定之鹼基，或在單股突出如5’突出或3’突出或兩者中包括經修飾之核苷酸或核苷酸替代品。例如，可能所欲者係在突出中包括嘌呤核苷酸。於一些態樣中，3’或5’突出中之 全部或一些鹼基可經修飾，如具有本文所述之修飾。修飾可包括，例如，使用在核糖之2’位置具有該領域中已知之修飾者，如使用去氧核糖核苷酸，使用2’-去氧-2’-氟(2’-F)或2’-O-甲基修飾者替代核酸鹼基之核糖，以及使用磷酸酯基團中之修飾如硫代磷酸酯修飾。突出無需與靶向序列同源。
一些具體例中，該有義股及反義股的各殘基係獨立地經LNA、CRN、cET、UNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-去氧、2’-羥基或2’-氟修飾。股可含有多於一個修飾。一具體例中，該有義股及反義股的個殘基獨立經2’-O-甲基或2’-氟修飾。
至少二個不同的修飾典型地存在於有義股及反義股。該二個修飾可為2’-O-甲基或2’-氟修飾或其他。
某些具體例中，Na或Nb包含交替模式的修飾。如本文中所用，術語「交替模式」指具有一個或多個修飾之模體，各修飾出現在一股之交替核苷酸。交替核苷酸可指每二個核苷酸一個或每三個核苷酸一個或類似模式。例如，如果A、B及C各自表示一種類型之對核苷酸之修飾，則交替模體可為「ABABABABABAB...」、「AABBAABBAABB...」、「AABAABAABAAB...」、「AAABAAABAAAB...」、「AAABBBAAABBB...,」或「ABCABCABCABC...」，等。
交替模體中含有之修飾的類型可為相同或不同。例如，如果A、B、C、D各自表示一種類型之對核苷酸之修飾，則交替模體，亦即，每二個核苷酸之修飾可係相同，但有義股或反義股可各自選自交替模體如「ABABAB...」、「ACACAC...」、「BDBDBD...」或「CDCDCD...」等中修飾之若干可能性。
一些具體例中，本發明之dsRNAi劑包含，有義股的交替模體的修飾模式相對於該反義股的交替模體的修飾模式係經位移。該位移可使得有義股的核苷酸的修飾基團與反義股的核苷酸的不同修飾基團相對應，反之亦然。例如，當有義股與反義股在dsRNA雙鏈體中配對時，在該雙鏈體區域內，有義股中之交替模體可始於該股之5’至3’之「ABABAB」，且反義股中之交替模體可始於該股之3’至3’之「BABABA」。作為另一實例，在雙螺旋區域內，有義股中之交替模體可始於該股之5’至3’之「AABBAABB」，且反義股中之交替模體可始於該股之3’至-3’之「BBAABBAA」，使得有義股及反義股的間存在修飾模式之完全或部分位移。
一特定實例中，有義股中之交替模體為股之5’-3’之「ABABAB」，其中各A為未經修飾之核糖核苷酸以及各B為經2’-O甲基修飾核苷酸。
一特定實例中，有義股中之交替模體為股之5’-3’之「ABABAB」，其中各A為經2’-去氧-2’-氟修飾核苷酸以及各B為經2’-O甲基修飾核苷酸。
另一特定實例中，反義股中之交替模體為股之3’-5’之「BABABA」，其中各A為經2’-去氧-2’-氟修飾核苷酸以及各B為經2’-O甲基修飾核苷酸。
一特定實例中，有義股中之交替模體為股之5’-3’之「ABABAB」及反義股中之交替模體為股之3’-5’之「BABABA」，其中各A為未經修飾核糖核苷酸以及各B為2’-O甲基修飾核苷酸。
一特定實例中，有義股中之交替模體為股之5’-3’之「ABABAB」及反義股中之交替模體為股之3’-5’之「BABABA」，其中各A為經2’-去氧-2’-氟修飾核苷酸以及各B為經2’-O甲基修飾核苷酸。
一些具體例中，dsRNAi劑包含有義股起始之2’-O甲基修飾及2’-氟修飾之交替模體的模式相對於該反義股起始之交替模體的模式的位移，亦即，有義股的2’-O甲基修飾與反義股的2’-氟修飾鹼基配對，反之亦然。有義股的位置1可開始為2’-F修飾，及反義股的位置1可開始為2’-O-甲基修飾。
位於三個連續核苷酸之三個相同修飾的一個或多個模體引入有義股或反義股，干擾存在於該有義股及/或反義股的初始修飾模式。此藉由位於三個連續核苷酸之三個相同修飾的一個或多個模體引入有義股或反義股而造成的該有義股或反義股的修飾模式的干擾，可增強對於靶標基因之基因緘默化活性。
一些具體例中，當位於三個連續核苷酸之三個相同修飾的模體引入該等股之任意者時，緊鄰該模體之下一個核苷酸的修飾係不同於該模體之修飾。舉例而言，含有模體之序列部位係「...NaYYYNb...」，其中，「Y」表示位於三個連續核苷酸之三個相同修飾之模體的修飾，以及，「Na」及「Nb」表示緊鄰於結構組元「YYY」之下一個核苷酸的不同於Y之修飾的修飾，以及，其中，Na與Nb可係相同或不同之修飾。或者，當存在翼修飾時，Na或Nb可存在或不存在。
iRNA可進一步包含至少一個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結。該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結修飾可出現於有義股、反義股或二者之該股任意位置的任意核苷酸。舉例而言，該核苷酸間鏈結修飾可出現於有義股或反義股的每一個核苷酸；各核苷酸間鏈結修飾可出現於有義股或反義股的交替模式中；或有義股或反義股可於交替模式中含有兩種核苷酸間鏈結修飾。有義股的核苷酸間鏈結修飾之交替模式可與反義股相同或不同，且有義股的核苷酸間鏈結修飾之交替模式可具有相對於反義股的核苷酸間鏈結修飾之交替模 式的位移。一具體例中，雙股RNAi劑係包含6至8個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。一具體例中，該反義股係包含兩個位於5’-末端之硫代磷酸酯核苷酸間鏈結以及兩個位於3’-末端之硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，且該有義股係包含至少兩個或位於5’-末端或位於3’-末端的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。
一些具體例中，dsRNAi劑包含位於突出區域之硫代磷酸酯或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結修飾。例如，該突出區域可含有兩個核苷酸且在該兩個核苷酸間具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結。核苷酸間鏈結修飾亦可作成以鏈結該突出核苷酸與雙鏈體區域之終端配對核苷酸。例如，至少2、3、4或所有突出核苷酸可經由硫代磷酸酯或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結而鏈結，且視需要，可存在將突出核苷酸與作為該突出核苷酸之下一個成對核苷酸鏈結的額外之硫代磷酸酯或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結。例如，在末端三個核苷酸之間可能存在至少兩個硫代硫酸酯類核苷酸間鏈結，其中該三個核苷酸中之兩者係突出核苷酸，且第三個核苷酸係緊鄰該突出核苷酸之下一個配對核苷酸。此等末端核苷酸可位於反義股的3’末端、有義股的3’末端、反義股的5’末端、及/或有義股的5’末端。
一些具體例中，2-核苷酸突出係於反義股的3’-末端，且在終端三個核苷酸間有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，其中三個核苷酸的二者為突出核苷酸，且第三個核苷酸為緊鄰該突出核苷酸的配對核苷酸。視需要地，dsRNAi劑可在有義股的5’末端及反義股的5’末端兩處額外具有位於終端三個核苷酸之間的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。
一具體例中，dsRNAi劑包含包含與靶標之失配、雙螺旋中之失配、或其組合。該失配可出現在突出區域內或雙螺旋區域內。基於鹼基對促進解離或 熔融之傾向性(例如，基於特定配對之關聯或解離之自由能，自由能係基於個體配對檢查配對的最簡單之途徑，但亦可使用次近鄰分析及類似分析)，可將鹼基對排名。就促進解離而言：A：U係優於G：C；G：U係優於G：C；且I：C係優於G：C(I係肌苷)。失配如非規範配對或除規範配對之外者(如本文中他處所揭示)係優於規範(A：T、A：U、G：C)配對；且包括萬用鹼基之配對係優於規範配對。
某些具體例中，dsRNAi劑包含位於該雙鏈體區域內從反義股5’末端之最前面第1、2、3、4或5個鹼基對的至少一者係選自下列所組成之群組：A：U、G：U、I：C、以及失配例如非規範配對或除規範配對之外者或包括萬用鹼基之配對，以促進反義股於該雙螺旋之5’末端的解離。
某些具體例中，位於該雙螺旋區域內從反義股5’末端之位置1的核苷酸係選自由A、dA、dU、U及dT所組成之群組。或者，位於該雙鏈體區域內從反義股5’末端之最前面第1、2或3個鹼基對的至少一者係AU鹼基對。例如，位於該雙螺旋區域內從反義股5’末端之第一個鹼基對係AU鹼基對。
其他具體例中，於該有義股的3’末端的核苷酸係去氧胸腺嘧啶(dT)，或於該反義股的3’末端的核苷酸係去氧胸腺嘧啶(dT)。例如，有去氧胸腺嘧啶核苷酸之短序列，例如，於該有義股、反義股或二股之3’末端的二個dT核苷酸。
某些具體例中，該有義股序列可由式(I)表示：
5’np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3’ (I)
其中：
i及j各自獨立地為0或1；
p及q各自獨立地為0-6；
各Na獨立地表示包含0-25個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列，各序列包含至少二個不同的經修飾核苷酸；
各Nb獨立地表示包含0-10個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列；
各np及nq獨立地表示突出核苷酸；
其中Nb及Y不具有相同修飾；以及
XXX、YYY、及ZZZ各獨立地表示於三個連續的核苷酸之三個相同修飾的一個模體。一些具體例中，YYY全為2’-F經修飾核苷酸。
一些具體例中，Na或Nb包含交替模式的修飾。
一些具體例中，該YYY模體出現於或接近於該有義股的裂解位。例如，當dsRNAi劑具有17-23核苷酸之長度之雙鏈體區域時，該YYY模體可出現於該有義股的裂解位或其附近(如，可出現於位置6、7、8；7、8、9；9、10、11；10、11、12；或11、12、13)，從5’末端之第1個核苷酸開始起計數；或視需要地，從5’末端之雙鏈體區域內第一個配對核苷酸開始起計數。
一具體例中，i為1及j為0或i為0及j為1或i及j二者皆為1。該有義股可因此由下列式表示：
5’np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’ (Ib)；
5’np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3’ (Ic)；或
5’np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’ (Id)。
當該有義股由式(Ib)表示時，Nb係表示包含0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各Na可獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當該有義股由式(Ic)表示時，Nb係表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各Na可獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當該有義股由式(Id)表示時，各Nb係獨立地表示包含0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。較佳地，Nb係0、1、2、3、4、5或6。各Na可獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
X、Y及Z之各者可彼此相同或不同。
其他具體例中，i為0及j為0，及該有義股可由下述式表示：
5’np-Na-YYY-Na-nq 3’ (Ia)。
當該有義股由式(Ia)表示，各Na獨立地可表示包含2-20、2-15或2-10個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。
一具體例中，RNAi的反義股序列可由式(II)表示：
5’nq’-Na’-(Z’Z’Z’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(X’X’X’)l-N’a-np’3’ (II)
其中：
k及l各自獨立地為0或1；
p’及q’各自獨立地為0-6；
各Na’獨立地表示包含0-25個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列，各序列包含至少二個不同的經修飾核苷酸；
各Nb’獨立地表示包含0-10個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列；
各np’及nq’獨立地表示突出核苷酸；
其中Nb’及Y’不具有相同修飾；以及
X’X’X’、Y’Y’Y’、及Z’Z’Z’各獨立地表示於三個連續的核苷酸之三個相同修飾的一個模體。
一些具體例中，Na’或Nb’包含交替模式的修飾。
Y’Y’Y’模體出現於或接近於反義股的裂解位點。例如，當dsRNAi劑具有17-23核苷酸之長度的雙鏈體區域時，Y’Y’Y’模體可出現於反義股的位置9、10、11；10、11、12；11、12、13；12、13、14；或13、14、15，從5’-末端之第1個核苷酸開始起計數；或視需要地，從5-’末端之雙鏈體區域內第一個配對核苷酸開始起計數。一些具體例中，Y’Y’Y’模體出現於位置11、12、13。
某些具體例中，Y’Y’Y’模體全為2’-OMe經修飾核苷酸.
某些具體例中，k為1及l為0或k為0及l為1或k及l二者皆為1。
反義股可因此由下列式表示：
5’nq’-Na’-Z’Z’Z’-Nb’-Y’Y’Y’-Na’-np’3’ (IIb)；
5’nq’-Na’-Y’Y’Y’-Nb’-X’X’X’-np’3’ (IIc)；或
5’nq’-Na’-Z’Z’Z’-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-X’X’X’-Na，-np’3’ (IId)。
當反義股由式(IIb)表示時，Nb’表示包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。各Na’獨立地表示包含2-20、2-15或2-10個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。
當反義股表示為式(IIc)時，Nb’表示包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。各Na’獨立地表示包含2-20、2-15或2-10個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。
當反義股表示為式(IId)時，各Nb’獨立地表示包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。各Na’獨立地表示包含2-20、2-15或2-10個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。一些具體例中，Nb為0、1、2、3、4、5或6。
其他具體例中，k為0及l為0及反義股可由下述式表示；
5’np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-nq’3’ (Ia)。
當該反義股表示為式(IIa)時，各Na，獨立地表示包含2-20、2-15或2-10個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。
X’、Y’及Z’之各者可彼此相同或不同。
有義股及反義股的各核苷酸可獨立地經以LNA、CRN、UNA、cEt、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-羥基或2’-氟修飾。例如，有義股及反義股的各核苷酸係獨立地經以2’-O-甲基或2’-氟修飾。各X、Y、Z、X’、Y’、及Z’，特別地，可表示2’-O-甲基修飾或2’-氟修飾。
一些具體例中，當雙螺旋區域係21 nt時，該dsRNAi劑的有義股可含有出現在該股之9、10及11位置之YYY模體，從5’-末端之第一個核苷酸開始起計數，或視需要地，在雙鏈體區域內從5’-末端之第一個配對核苷酸開始起計數；以及，Y係表示2’-F修飾。該有義股可額外含有XXX模體或ZZZ模體作為位於雙鏈體區域之相反末端的側翼修飾；以及，XXX與ZZZ係各自獨立地表示2’-OMe修飾或2’-F修飾。
一些具體例中，該反義股可含有出現在該股之11、12及13位置之Y’Y’Y’模體，從5’-末端之第一個核苷酸開始起計數，或視需要地，在雙鏈體 區域內從5’-末端之第一個配對核苷酸開始起計數；以及，Y’係表示2’-O-甲基修飾。該反義股可額外含有X’X’X’模體或Z’Z’Z’模體作為位於雙螺旋區域之相反末端的側翼修飾；以及，X’X’X’與Z’Z’Z’係各自獨立地表示2’-OMe修飾或2’-F修飾。
由上述式(Ia)、(Ib)、(Ic)及(Id)中任一者表示之有義股係分別與由式(IIa)、(IIb)、(IIc)及(IId)中任一者表示之反義股形成雙鏈體。
因此，使用於本發明的方法之dsRNAi劑可包含有義股及反義股，各股具有14至30個核苷酸，iRNA雙鏈體由式(III)表示：
有義；5’np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3’
反義；3’np ’-Na ’-(X’X’X’)k-Nb ’-Y’Y’Y’-Nb ’-(Z’Z’Z’)l-Na ’-nq ，5’(III)
其中：
i、j、k、及l各自獨立地為0或1；
p、p’、q、及q’各自獨立地為0-6；
各Na及Na ’獨立地表示包含0-25個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列，各序列包含至少二個不同的經修飾核苷酸；
各Nb及Nb ’獨立地表示包含0-10個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列；
其中各np’、np、nq’、及nq，其各者可存在或可不存在，獨立地表示突出核苷酸；以及
XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’、及Z’Z’Z’各獨立地表示於於三個連續的核苷酸之三個相同修飾的一個模體。
一具體例中，i為0及j為0；或i為1及j為0；或i為0及j為1；或i及j二者皆為0；或i及j二者皆為1。另一具體例中，k為0及l為0；或k為1及l為0；k為0及l為1；或k及l二者皆為0；或k及l二者皆為1。
形成iRNA雙鏈體的有義股及反義股的例示性組合包括下述式：
5’np-Na-YYY-Na-nq 3’
3’np ’-Na ’-Y’Y’Y’-Na ，nq ’5’(IIIa)
5’np-Na-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3’
3’np ’-Na ’-Y’Y’Y’-Nb ’-Z’Z’Z’-Na ’nq ’5’(IIIb)
5’np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Na-nq 3’
3’np ’-Na ’-X’X’X’-Nb ’-Y’Y’Y’-Na ’-nq ’5’(IIIc)
5’np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3’
3’np ’-Na ’-X’X’X’-Nb ’-Y’Y’Y’-Nb ’-Z’Z’Z’-Na-nq ’5’(IIId)
當dsRNAi劑由式(IIIa)表示時，各Na獨立地表示包含2-20、2-15或2-10個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。
當dsRNAi劑由式(IIIb)表示時，各Nb獨立地表示包含1-10、1-7、1-5或1-4個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。各Na獨立地表示包含2-20、2-15或2-10個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。
當dsRNAi劑表示為式(IIIc)時，各Nb、Nb’獨立地表示包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。各Na獨立地表示包含2-20、2-15或2-10個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。
當dsRNAi劑表示為(IIId)時，各Nb、Nb’獨立地表示包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。各Na、Na ’獨立地表示包含2-20、2-15或2-10個經修飾核苷酸的寡核苷酸序列。Na、Na’、Nb及Nb ’之各者獨立地包含交替模式的修飾。
式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、及(IIId)中之X、Y、及Z之各者可彼此相同或不同。
當dsRNAi劑由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、及(IIId)表示時，Y核苷酸之至少一者可與Y’核苷酸之一者形成鹼基對。替代地，Y核苷酸之至少二者與相應的Y’核苷酸形成鹼基對；或Y核苷酸之全部三者與相應的Y’核苷酸形成鹼基對。
當dsRNAi劑由式(IIIb)或(IIId)表示時，Z核苷酸之至少一者可與Z’核苷酸之一者形成鹼基對。替代地，Z核苷酸之至少二者與相應的Z’核苷酸形成鹼基對；或Z核苷酸之全部三者與相應的Z’核苷酸形成鹼基對。
當dsRNAi劑表示為式(IIIc)或(IIId)時，X核苷酸之至少一者可與X’核苷酸之一者形成鹼基對。替代地，X核苷酸之至少二者與相應的X’核苷酸形成鹼基對；或X核苷酸之全部三者與相應的X’核苷酸形成鹼基對。
某些具體例中，Y核苷酸的修飾不同於Y’核苷酸的修飾，Z核苷酸的修飾不同於Z’核苷酸的修飾或X核苷酸的修飾不同於X’核苷酸的修飾。
某些具體例中，當dsRNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾為2’-O-甲基或2’-氟修飾。其他具體例中，當RNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾為2’-O-甲基或2’-氟修飾及np’>0及至少一個np’為經由硫代磷酸酯鏈結而鏈結至相鄰核苷酸。又其他具體例中，當RNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾為2’-O-甲基或2’-氟修飾，np’>0及至少一個np’為經由硫代磷酸酯鏈結而鏈結至相鄰核苷酸，及有義股經二價或三價分支鏈結子(下文揭示)接合至一個多個GalNAc衍生物。其他具體例中，當RNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾為2’-O-甲基或2’-氟修飾，np’>0及至少一個np’為經由硫代磷酸酯鏈結而鏈結至相鄰核苷酸，該有義股包含至少一個硫代磷酸酯鏈結，及該有義股經二價或三價分支鏈結子(下文揭示)接合至一個多個GalNAc衍生物。
一些具體例中，當dsRNAi劑由式(IIIa)表示時，Na修飾為2’-O-甲基或2’-氟修飾，np’>0及至少一個np’為經由硫代磷酸酯鏈結而鏈結至相鄰核苷酸，該有義股包含至少一個硫代磷酸酯鏈結，及該有義股經二價或三價分支鏈結子(下文揭示)接合至一個多個GalNAc衍生物。
一些具體例中，dsRNAi劑為含有由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示之至少兩個雙鏈體的多聚物，其中該等雙鏈體係藉由鏈結子連結。該鏈接子可為可裂解者或不可裂解者。視需要地，該多聚物進一步包含包含配位子。該等雙鏈體之各者可以相同基因或兩個不同基因為靶標；或該等雙鏈體之各者可以相同基因之兩個不同靶標位點為靶標。
一些具體例中，dsRNAi劑為含有由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示之三、四、五、六或更多個雙鏈體的多聚物，其中該等雙鏈體係藉由鏈結子連結。該鏈結子可為可裂解者或不可裂解者。視需要地，該多 聚物進一步包含配位子。該等雙鏈體之各者可以相同基因或兩個不同基因為靶標；或該等雙鏈體之各者可以相同基因之兩個不同靶標位點為靶標。
一具體例中，由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示之二個dsRNAi劑係在5’末端及一個或兩個3’末端彼此鏈結，且視需要地接合至配位子。該等劑之各者可以相同基因或兩個不同基因為靶標；或該等劑之各者可以相同基因之兩個相異靶標位點為靶標。
某些具體例中，本發明之RNAi劑可含有低數目之含有2’-氟修飾的核苷酸，例如，10個或更少具有2’-氟修飾的核苷酸。例如，該RNAi劑可含有10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0個具有2’-氟修飾的核苷酸。特定具體例中，本發明之RNAi劑係含有10個具有2’-氟修飾之核苷酸，例如，在有義股含有4個具有2’-氟修飾之核苷酸且在反義股含有6個具有2’-氟修飾之核苷酸。另一具體具體例中，本發明之RNAi劑係含有6個具有2’-氟修飾之核苷酸，例如，在有義股含有4個具有2’-氟修飾之核苷酸且在反義股含有2個具有2’-氟修飾之核苷酸。
其他具體例中，本發明之RNAi劑可含有超低數目之含有2’-氟修飾的核苷酸，如2個或更少含有2’-氟修飾的核苷酸。例如，RNAi劑可含有2、1或0個具有2’-氟修飾的核苷酸。於特定具體例中，該RNAi劑可含有2個具有2’-氟修飾之核苷酸，例如，在有義股含有0個具有2’-氟修飾之核苷酸且在反義股含有2個具有2’-氟修飾之核苷酸。
多個文獻揭示可用於本發明的方法.的多聚iRNA。此類文獻包括WO2007/091269、美國專利第7,858,769號、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887及WO2011/031520，其各者的完整內容以參照方式併入本文。
某些具體例中，本揭露之組成物及方法包括本文所揭示之RNAi劑的膦酸乙烯酯(VP)修飾。例示性具體例中，本揭露之經5’-膦酸乙烯酯修飾之核苷酸具有結構：
Figure 111106049-A0202-12-0086-239
 其中X係O或S；
R為氫、羥基、氟或C1-20烷氧基(例如，甲氧基或正十六烷氧基)；
R5’為=C(H)-P(O)(OH)2及C5’碳與R5’之間的雙鍵為E或Z取向(例如，E取向)；以及
B為核鹼基或經修飾之核鹼基，視需要地，其中B為腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
本揭露之膦酸乙烯酯可附接至本揭露之dsRNA之反義股或有義股。某些具體例中，本揭露之膦酸乙烯酯附接至dsRNA之反義股，視需要地附接在dsRNA之反義股的5’末端。
膦酸乙烯酯修飾亦預期用於本揭露之組成物及方法中。一種示例性膦酸乙烯酯結構包括牽涉結構，其中R5’為=C(H)-OP(O)(OH)2，以及於C5’碳與R5’之間的雙鍵為E或Z取向(例如，E取向)。
如下文中更詳細揭示，含有一個或多個碳水化合物部分至iRNA之複合的iRNA可優化該iRNA之一種或多種特性。於多種情形中，該碳水化合物部分將附接至該RNAi劑之經修飾之子單元。例如，iRNA之一個或多個核糖 核苷酸子單元的核糖可替換為另一部分，如其附接有碳水化合物配位子之非碳水化合物(如，環狀)載劑。本文中，其子單元之核糖業經如是替換的核糖核苷酸子單元係指為核糖替換修飾子單元(RRMS)。環狀載劑可為碳環系統，亦即，所有環原子係碳原子；或為雜環系統，亦即，一個或多個環原子可係雜環如氮、氧、硫。環狀載劑可係單環系統，或可含有兩個或多個環如稠環。環狀載劑可係完全飽和之環系統或其可含有一個或多個雙鍵。
配位子可經由載劑附接至多核苷酸。載劑係包括(i)至少一個「骨幹附接點」，較佳兩個「骨幹附接點(backbone attachment point)」，以及(ii)至少一個「繫帶附接點(tethering attachment point)」。如本文中所用，「骨幹附接點」係指官能基如羥基，或通常係鍵，其可用於且適用於將該載劑併入核糖核酸之骨幹如磷酸酯或經修飾之磷酸酯如含硫之骨幹中。於一些具體例中，「繫帶附接點」(TAP)係指環狀載劑之構建環原子，例如，碳原子或雜原子(與提供骨幹附接點之原子截然不同)，其係連結所選擇之部分。該部分可係例如碳水化合物，如單糖、二醣、三醣、四醣、寡醣及多醣。視需要地，所選擇之部分係藉由中介繫帶連結至該環狀載劑。因此，該環狀載劑一般將包括官能基，例如，胺基，或通常係提供適用於將另一化學實體如配位子併入或繫帶至另一化學體，例如，構建環的配位子。
該iRNA可經由載劑接合至配位子，其中該載劑可為環狀基團或非環狀基團；較佳地，該環狀基團係選自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧雜環戊基、噁唑烷基、異噁唑烷基、嗎啉基、噻唑啉基、異噻唑啉基、喹噁啉基、嗒嗪酮基、四氫呋喃基及十氫萘基；較佳地，該非環狀基團係選自絲胺醇骨幹或二乙醇胺骨幹。
i.熱去安定化修飾
某些具體例中，可以藉由將熱去安定化修飾併入反義股的種子區域內而優化dsRNA分子，以進行RNA干擾。如本文所用，「種子區域」意指位於所指股之5’末端的位置2至9。例如，可以將熱去安定化修飾併入反義股的種子區域中以減低或抑制脫靶基因緘默化。
術語「熱去安定化修飾」包括將導致dsRNA具有比不具有此類修飾之dsRNA之Tm低的總體熔融溫度(Tm)的修飾。例如，熱去安定化修飾可以將dsRNA之Tm降低1-4℃，諸如，1℃、2℃、3℃或4℃。並且，術語「熱去安定化核苷酸」指代含有一個或多個熱去安定化修飾之核苷酸。
業經發現具有包含位於從反義股5’末端計數最先9個核苷酸內之雙螺旋之至少一個熱去安定化修飾之反義股的dsRNA，具有減低之脫靶基因緘默化活性。據此，於一些態樣中，反義股包含位於從反義股5’末端計數最先9個核苷酸內之雙螺旋的至少一個(例如，一個、兩個、三個、四個、五個或更多個)熱去安定化修飾。一些具體例中，雙鏈體之一個或多個熱去安定化修飾係位於從反義股5’末端計數之位置2至9處，諸如位置4至8處。一些進一步具體例中，雙鏈體之熱去安定化修飾係位於從反義股5’末端計數之位置6、7或8處。再一些具體例中，雙鏈體之熱去安定化修飾係位於從反義股5’末端計數之位置7處。一些具體例中，雙鏈體之熱去安定化修飾係位於從反義股5’末端計數之位置2、3、4、5或9處。
iRNA劑包含有義股及反義股，各股具有14至40個核苷酸。RNAi劑可由式(L)表示：
Figure 111106049-A0202-12-0089-241
 式(L)中，B1、B2、B3、B1’、B2’、B3’及B4’各自獨立地為含有選自下列所組成群組之修飾的核苷酸：2’-O-烷基、2’-取代之烷氧基、2’-取代之烷基、2’-鹵基、ENA、及BNA/LNA。一具體例中，B1、B2、B3、B1’、B2’、B3’及B4’係各含有2’-OMe修飾。一具體例中，B1、B2、B3、B1’、B2’、B3’及B4’各含有2’-OMe修飾或2’-F修飾。一具體例中，B1、B2、B3、B1’、B2’、B3’及B4’之至少一者係含有2’-O-N-甲基乙醯胺基(2’-O-NMA，2’O-CH2C(O)N(Me)H)修飾。
C1為置於與反義股的種子區域(亦即，反義股的5’-末端的位置2至8)相反位點之熱學去安定化核苷酸。例如，C1為位於有義股的與反義股的5’-末端的位置2至8之核苷酸配對的位置。一實例中，C1為位於自有義股的5’-末端的位置15。C1核苷酸係承載可包括無鹼基修飾在內之熱學去安定化修飾；與雙螺旋中相反核苷酸之失配；以及糖修飾如2’-去氧修飾或非環狀核苷酸如未鎖核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)。依具體例中，C1為具有選自下列所組成之群組的熱學去安定化修飾：i)與反義股中相反核苷酸之失配；ii)選自下列所組成之群組的無鹼基修飾：
Figure 111106049-A0202-12-0089-240
；及iii)選自下列所組成之群組的糖修飾：
Figure 111106049-A0202-12-0090-244
Figure 111106049-A0202-12-0090-242
，其中B為經修飾或未經修飾核酸鹼基，R1及R2獨立地為H、鹵素、OR3或烷基；及R3為H、烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖。一具體例中，C1中的熱去安定化修飾為選自下列所組成之群組的失配：G：G、G：A、G：U、G：T、A：A、A：C、C：C、C：U、C：T、U：U、T：T、及U：T；及視需要地，失配對中至少一個核酸鹼基為a2’-去氧核酸鹼基。一實例中，C1中的熱去安定化修飾為GNA或
Figure 111106049-A0202-12-0090-243
。
T1、T1’、T2’、及T3’各獨立地表示各自獨立地表示包含修飾之核苷酸，該修飾係向該核苷酸提供小於或等於2’-OMe修飾之位阻效應。位阻效應係指修飾之位阻效果的總和。確定核苷酸之修飾之位阻效果的方法係所屬技術領域具有通常知識者所已知者。該修飾可位於該核苷酸之核糖的2’位置，或係對非核糖核苷酸、非環狀核苷酸、或該核苷酸之骨幹的與該核糖之2’位置相似或等效的修飾，且係向該核苷酸提供小於或等於2’-OMe修飾之位阻效應。例如，T1、T1’、T2’及T3’係各自獨立地選自DNA、RNA、LNA、2’-F、及2’-F-5’-甲基。於某些具體例中，T1係DNA。於某些具體例中，T1’係DNA、RNA或LNA。於某些具體例中，T2’係DNA或RNA。於某些具體例中，T3’係DNA或RNA。
n1、n3、及q1獨立地為4至15個核苷酸之長度。
n5,q3，及q7獨立地為1-6個核苷酸之長度。
n4、q2、及q6獨立地為1-3核苷酸之長度；替代地，n4為0。
q5係獨立地為0-10個核苷酸之長度。
n2及q4獨立地為0-3個核苷酸之長度。
替代地，n4為0-3個核苷酸之長度。
一具體例中，n4可為0。一實例中，n4為0，及q2及q6為1。其他實例中，n4為0，及q2及q6為1，於有義股的位置1至5內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(自有義股的5’-末端起計數)，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。
一具體例中，n4、q2、及q6各為1。
一具體例中，n2、n4、q2、q4、及q6各為1。
一具體例中，當有義股係19至22個核苷酸之長度且n4係1時，C1係位於有義股的5’-末端的位置14至17。一具體例中，C1係位於有義股的5’-末端的位置15。
一具體例中，T3’係始於反義股的5’末端的位置2。一實例中，T3’係始於反義股的5’末端的位置2，且q6係等於1。
一具體例中，T1’係始於反義股的5’末端的位置14。一實例中，T1’係始於反義股的5’末端的位置14，且q2係等於1。
例示性具體例中，T3’係始於反義股的5’末端的位置2，且T1’係始於反義股的5’末端的位置14。一實例中，T3’係始於反義股的5’末端的位置2，且q6係等於1以及T1’係始於反義股的5’末端的位置14，且q2係等於1。
一具體例中，T1’及T3’係藉由11個核苷酸之長度而分開(亦即，T1’及T3’之核苷酸不計算在內)。
一具體例中，T1’係位於反義股的5’末端的位置14。一實例中，T1’係位於反義股的5’末端的位置14且q2係等於1，以及，該修飾係位於非核糖、非環狀或骨幹之一個或多個2’位置且係提供比2’-OMe核糖更低之位阻效應。
一具體例中，T3’係位於反義股的5’末端的位置2。於一實例中，T3’係位於反義股的5’末端的位置2且q6係等於1，以及，該修飾係位於非核糖、非環狀或骨幹之一個或多個2’位置且係提供低於或等於2’-OMe核糖之位阻效應。
一具體例中，T1係位於有義股的裂解位點。於一個具體例中，當有義股係19至22個核苷酸之長度且n2係1時，T1係位於有義股的5’末端的位置11。例示性具體例中，當有義股係19至22個核苷酸之長度且n2係1時，T1係位於有義股的5’末端的位置11之裂解位點。
一具體例中，T2’係始於反義股的5’末端的位置6。一實例中，T2’係位於反義股的5’末端的位置6至10，且q4係1。
例示性具體例中，當有義股係19至22個核苷酸之長度時，T1係位於有義股的裂解位點，例如，位於從有義股的5’末端的位置11，且n2係1；T1’係位於從反義股的5’末端的位置14，且q2係等於1，且T1’之修飾係位於核 糖之2’位或位於非核糖、非環狀或骨幹之多個位置且係提供低於2’-OMe核糖之位阻效應；T2’係位於從反義股的5’末端的位置6至10，且q4係1；以及，T3’係位於從反義股的5’末端的位置2，且q6係等於1，以及，T3’之修飾係位於核糖之2’位或位於非核糖、非環狀或骨幹之多個位置且係提供低於或等於2’-OMe核糖之位阻效應。
一具體例中，T2’係始於反義股的5’末端的位置8。一實例中，T2’係始於反義股的5’末端的位置8，且q4係2。
一具體例中，T2’係始於反義股的5’末端的位置9。於一實例中，T2’係位於反義股的5’末端的位置9，且q4係1。
一具體例中，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為1，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為6，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1，有義股的位置1至5內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(自有義股的5’-末端起計數)，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。
一具體例中，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為1，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為6，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1，有義股的位置1至5內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(自有義股的5’-末端起計數)，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1，有義股的位置1至5內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(自有義股的5’-末端起計數)，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為6，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為7，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為6，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為7，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為 1，有義股的位置1至5內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(自有義股的5’-末端起計數)，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為1，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為6，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為1，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為6，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1，有義股的位置1至5內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(自有義股的5’-末端起計數)，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為5，T2’為2’-F，q4為1，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；視需要地於反義股的3’-末端具有至少2個額外的TT。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為5，T2’為2’-F，q4為1，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；視需要地於反義股的3’-末端具有至少2個額外的TT，有義股的位置1至5內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(自有義股的5’-末端起計數)，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1，有義股的位置1至5內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端起計數)，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端起計數)。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F， q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1，有義股的位置1至5內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(自有義股的5’-末端起計數)，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1，有義股的位置1至5內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(自有義股的5’-末端起計數)，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。
RNAi劑可包含位於該有義股或反義股的5’末端的含磷基團。該5’末端之含磷基團可係5’末端磷酸酯(5’-P)、5’末端硫代磷酸酯(5’-PS)、5’末端二硫代磷酸酯(5’-PS2)、5’-末端乙烯基膦酸酯(5’-VP)、5’末端甲基膦酸酯(MePhos)、或5’-去氧-5’-C-丙二醯基(
Figure 111106049-A0202-12-0098-245
)。當該5’末端之含磷基團係5’-末端乙烯基膦酸酯(5’-VP)時，該5’-VP可係5’-E-VP異構物(亦即，反式-乙烯基膦酸酯，
Figure 111106049-A0202-12-0098-246
)、5’-Z-VP異構物(亦即，順式-乙烯基膦酸酯，
Figure 111106049-A0202-12-0098-247
)、或其混合物。
一具體例中，RNAi劑包含包含位於該有義股的5’末端的含磷基團。依具體例中，該RNAi劑包含位於該反義股的5’末端的含磷基團。
一具體例中，RNAi劑包含5’-P。一具體例中，RNAi劑包含反義股中之5’-P。
一具體例中，RNAi劑包含5’-PS。一具體例中，RNAi劑包含反義股中之5’-PS。
一具體例中，RNAi劑包含5’-VP。一具體例中，RNAi劑包含反義股中之5’-VP。一具體例中，RNAi劑包含反義股中之5’-E-VP。一具體例中，RNAi劑包含反義股中之5’-Z-VP。.
一具體例中，RNAi劑包含5’-PS2。一具體例中，RNAi劑包含反義股中之5’-PS2。
一具體例中，RNAi劑包含5’-PS2。一具體例中，RNAi劑包含反義股中之5’-去氧-5’-C-丙二醯基。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-PS。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-P。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-VP。5’-VP可為5’-E-VP、5’-Z-VP、或其組合。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-PS2。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；有義股的位置1至5(從該有義股的5’末端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-P。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；有義股的位置1至5(從該有義股的5’末端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-PS。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；有義股的位置1至5(從該有義股的5’末端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-VP.5’-VP可為5’-E-VP、5’-Z-VP、或其組合。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；有義股的位置1至5(從該有義股的5’末端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-PS2。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；有義股的位置1至5(從該有義股的5’末端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以 及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-P。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1。該dsRNA劑亦包含5’-PS。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-VP。5’-VP可為5’-E-VP、5’-Z-VP、或其組合。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-PS2。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；有義股的位置1至5(從5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端起計數)。RNAi劑亦包含5’-P。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；有義股的位置1至5(從5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端起計數)。RNAi劑亦包含5’-PS。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’- OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；有義股的位置1至5(從5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端起計數)。RNAi劑亦包含5’-VP。5’-VP可為5’-E-VP、5’-Z-VP、或其組合。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；有義股的位置1至5(從5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端起計數)。RNAi劑亦包含5’-PS2。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；有義股的位置1至5(從5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端起計數)。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F， q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-P。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-PS。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-VP。5’-VP可為5’-E-VP、5’-Z-VP、或其組合。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-PS2。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為 2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；有義股的位置1至5(從該有義股的5’末端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-P。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；有義股的位置1至5(從該有義股的5’末端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-PS。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1； 有義股的位置1至5(從該有義股的5’末端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-VP。5’-VP可為5’-E-VP、5’-Z-VP、或其組合。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；有義股的位置1至5(從該有義股的5’末端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-PS2。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；有義股的位置1至5(從該有義股的5’末端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F， q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-P。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-PS。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-VP。5’-VP可為5’-E-VP、5’-Z-VP、或其組合。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-PS2。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’- OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；有義股的位置1至5(從該有義股的5’末端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二固硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-P。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；有義股的位置1至5(從該有義股的5’末端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-PS。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；有義股的位 置1至5(從該有義股的5’末端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-VP。5’-VP可為5’-E-VP、5’-Z-VP、或其組合。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；有義股的位置1至5(從該有義股的5’末端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-PS2。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；有義股的位置1至5(從該有義股的5’末端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F， q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；有義股的位置1至5(從該有義股的5’末端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-P及靶向配位子。一具體例中，5’-P係位於該反義股的5’-末端，且該靶向配位子係位於該有義股的3’-末端。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；有義股的位置1至5(從該有義股的5’末端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-PS及靶向配位子。一具體例中，5’-PS係位於該反義股的5’-末端，且該靶向配位子係位於該有義股的3’-末端。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；有義股的位置1至5(從該有義股的5’末端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以 及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-VP(例如，5’-E-VP、5’-Z-VP或其組合)，及靶向配位子。
一具體例中，5’-VP係位於該反義股的5’-末端，且該靶向配位子係位於該有義股的3’-末端。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；有義股的位置1至5(從該有義股的5’末端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-PS2及靶向配位子。一具體例中，5’-PS2係位於該反義股的5’-末端，且該靶向配位子係位於該有義股的3’-末端。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；有義股的位置1至5(從該有義股的5’末端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基及靶向配位子。一具體例中，5’- 去氧-5’-C-丙二醯基係位於反義股的5’-末端，及靶向配位子係位於有義股的3’-末端。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；有義股的位置1至5(從5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端起計數)。RNAi劑亦包含5’-P及靶向配位子。一具體例中，5’-P係位於該反義股的5’-末端，且該靶向配位子係位於該有義股的3’-末端。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；有義股的位置1至5(從5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端起計數)。RNAi劑亦包含5’-PS及靶向配位子。一具體例中，5’-PS係位於該反義股的5’-末端，且該靶向配位子係位於該有義股的3’-末端。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F， q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；有義股的位置1至5(從5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端起計數)。RNAi劑亦包含5’-VP(例如，a 5’-E-VP，5’-Z-VP或其組合)及靶向配位子。一具體例中，5’-VP係位於反義股的5’-末端，及靶向配位子係位於有義股的3’-末端。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；有義股的位置1至5(從5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端起計數)。RNAi劑亦包含5’-PS2及靶向配位子。一具體例中，5’-PS2係位於反義股的5’-末端，及靶向配位子係位於有義股的3’-末端。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，及q7為1；有義股的位置1至5(從5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23內具有 二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端起計數)。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基及靶向配位子。一具體例中，5’-去氧-5’-C-丙二醯基係位於反義股的5’-末端，及靶向配位子係位於有義股的3’-末端。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；有義股的位置1至5(從該有義股的5’末端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-P及靶向配位子。一具體例中，5’-P係位於反義股的5’-末端，及靶向配位子係位於有義股的3’-末端。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；有義股的位置1至5(從該有義股的5’末端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-PS及靶向配位子。一具體例中，5’-PS係位於反義股的5’-末端，及靶向配位子係位於有義股的3’-末端。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；有義股的位置1至5(從該有義股的5’末端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-VP(例如，5’-E-VP、5’-Z-VP或其組合)及靶向配位子。一具體例中，5’-VP係位於反義股的5’-末端，及靶向配位子係位於有義股的3’-末端。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；有義股的位置1至5(從該有義股的5’末端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-PS2及靶向配位子。一具體例中，5’-PS2係位於該反義股的5’-末端，且該靶向配位子係位於該有義股的3’-末端。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為 2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；有義股的位置1至5(從該有義股的5’末端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基及靶向配位子。一具體例中，5’-去氧-5’-C-丙二醯基係位於反義股的5’-末端，及靶向配位子係位於有義股的3’-末端。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；有義股的位置1至5(從該有義股的5’末端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-P及靶向配位子。一具體例中，5’-P係位於該反義股的5’-末端，且該靶向配位子係位於該有義股的3’-末端。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；有義股的位置1至5(從該有義股的5’末端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑 亦包含5’-PS及靶向配位子。一具體例中，5’-PS係位於該反義股的5’-末端，且該靶向配位子係位於該有義股的3’-末端。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；有義股的位置1至5(從該有義股的5’末端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-VP(例如，a 5’-E-VP，5’-Z-VP或其組合)及靶向配位子。一具體例中，5’-VP係位於該反義股的5’-末端，且該靶向配位子係位於該有義股的3’-末端。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；有義股的位置1至5(從該有義股的5’末端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-PS2及靶向配位子。一具體例中，5’-PS2係位於該反義股的5’-末端，且該靶向配位子係位於該有義股的3’-末端。
一具體例中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，及q7為1；有義股的位置1至5(從該有義股的5’末端起計數)內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，反義股的位置1及2具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾以及位置18-23(自反義股的5’-末端起計數)內具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基及靶向配位子。一具體例中，5’-去氧-5’-C-丙二醯基係位於該反義股的5’-末端，且該靶向配位子係位於該有義股的3’-末端。
特別的具體例中，本發明的RNAi劑包含：
(a)有義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)附接至3’-末端之ASGPR配位子，其中，該ASGPR配位子包含經由三價分支鏈結子附接至三個GalNAc衍生物；以及
(iii)於位置1、3、5、7、9至11、13、17、19及21之2’-F修飾，以及於位置2、4、6、8、12、14至16、18及20之2’-OMe修飾(從5’末端起計數)；以及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)於位置1、3、5、7、9至11、13、17、19、21及23之2’-OMe修飾，及於位置2、4、6、8、12、14至16、18、20及22之2’F修飾(從5’末端起計數)；以及
(iii)核苷酸位置21與22之間以及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端起計數)；
其中該dsRNA劑於反義股的3’-末端具有二個核苷酸突出，及於反義股的5’-末端具有鈍末端。
另一特別具體例中，本發明的RNAi劑包含：
(a)有義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)附接至3’-末端之ASGPR配位子，其中，該ASGPR配位子包含經由三價分支鏈結子附接至三個GalNAc衍生物；
(iii)於位置1、3、5、7、9至11、13、15、17、19及21之2’-F修飾，及於位置2、4、6、8、12、14、16、18及20之2’-OMe修飾(從5’末端起計數)；以及
(iv)核苷酸位置1與2之間以及核苷酸位置2與3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端起計數)；以及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)於位置1、3、5、7、9、11至13、15、17、19及21至23之2’-OMe修飾，及於位置2、4、6、8、10、14、16、18及20之2’-F修飾(從5’末端起計數)；以及
(iii)核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間，核苷酸位置21與22之間、及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端起計數)；
其中RNAi劑於反義股的3’-末端具有二個核苷酸突出，及於反義股的5’-末端具有鈍末端。
另一特別的具體例中，本發明的RNAi劑包含：
(a)有義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)附接至3’-末端之ASGPR配位子，其中，該ASGPR配位子包含經由三價分支鏈結子附接至三個GalNAc衍生物；
(iii)於位置1至6、8、10及12至21之2’-OMe修飾，於位置7及9之2’-F修飾，及於位置11之去氧-核苷酸(例如，dT)(從5’末端起計數)；以及
(iv)位置1與2之間以及位置2與3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端起計數)；以及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)於位置1、3、7、9、11、13、15、17及19至23之2’-OMe修飾，及於位置2、4至6、8、10、12、14、16，及18之2’-F修飾(從5’末端起計數)；以及
(iii)核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端起計數)；
其中RNAi劑於反義股的3’-末端具有二個核苷酸突出，及於反義股的5’-末端具有鈍末端。
另一特別的具體例中，本發明之RNAi劑包含：
(a)有義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)附接至3’-末端之ASGPR配位子，其中，該ASGPR配位子包含經由三價分支鏈結子附接至三個GalNAc衍生物；
(iii)於位置1至6、8、10、12、14、及16至21之2’-OMe修飾，及於位置7、9、11、13及15之2’-F修飾；以及
(iv)核苷酸位置1與2之間以及核苷酸位置2與3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端起計數)；以及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)於位置1、5、7、9、11、13、15、17、19、及21至23之2’-OMe修飾，及於位置2至4、6、8、10、12、14、16、18，及20之2’-F修飾(從5’末端起計數)；以及
(iii)核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端起計數)；
其中RNAi劑於反義股的3’-末端具有二個核苷酸突出，及於反義股的5’-末端具有鈍末端。
另一特別的具體例中，本發明之RNAi劑包含：
(a)有義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)附接至3’-末端之ASGPR配位子，其中，該ASGPR配位子包含經由三價分支鏈結子附接至三個GalNAc衍生物；
(iii)於位置1至9、及12至21之2’-OMe修飾，及於位置10及11之2’-F修飾；以及
(iv)核苷酸位置1與2之間以及核苷酸位置2與3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端起計數)；以及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)於位置1、3、5、7、9、11至13、15、17、19、及21至23之2’-OMe修飾，及於位置2、4、6、8、10、14、16、18及20之2’-F修飾(從5’末端起計數)；以及
(iii)核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端起計數)；
其中RNAi劑於反義股的3’-末端具有二個核苷酸突出，及於反義股的5’-末端具有鈍末端。
另一特別的具體例中，本發明之RNAi劑包含：
(a)有義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)附接至3’-末端之ASGPR配位子，其中，該ASGPR配位子包含經由三價分支鏈結子附接至三個GalNAc衍生物；
(iii)於位置1、3、5、7、9至11、及13之2’-F修飾，及於位置2、4、6、8、12、及14至21之2’-OMe修飾；以及
(iv)核苷酸位置1與2之間以及核苷酸位置2與3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端起計數)；以及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)於位置1、3、5至7、9、11至13、15、17至19、及21至23之2’-OMe修飾，及於位置2、4、8、10、14、16、及20之2’-F修飾(從5’末端起計數)；以及
(iii)核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間，及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端起計數)；
其中RNAi劑於反義股的3’-末端具有二個核苷酸突出，及於反義股的5’-末端具有鈍末端。
另一特別的具體例中，本發明之RNAi劑包含：
(a)有義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)附接至3’-末端之ASGPR配位子，其中，該ASGPR配位子包含經由三價分支鏈結子附接至三個GalNAc衍生物；
(iii)於位置1、2、4、6、8、12、14、15、17、及19至21之2’-OMe修飾，及於位置3、5、7、9至11、13、16、及18之2’-F修飾；以及
(iv)核苷酸位置1與2之間以及核苷酸位置2與3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端起計數)；以及
(b)反義股，其具有：
(i)25個核苷酸之長度；
(ii)於位置1、4、6、7、9、11至13、15、17、及19至23之2’-OMe修飾，於位置2、3、5、8、10、14、16、及18之2’-F修飾，及於位置24及25之去氧-核苷酸(例如，dT)(從5’末端起計數)；以及
(iii)核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端起計數)；
其中RNAi劑於反義股的3’-末端具有四個核苷酸突出，及於反義股的5’-末端具有鈍末端。
另一特別的具體例中，本發明之RNAi劑包含：
(a)有義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)附接至3’-末端之ASGPR配位子，其中，該ASGPR配位子包含經由三價分支鏈結子附接至三個GalNAc衍生物；
(iii)於位置1至6、8、及12至21之2’-OMe修飾，及於位置7、及9至11之2’-F修飾；以及
(iv)核苷酸位置1與2之間以及核苷酸位置2與3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端起計數)；以及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)於位置1、3至5、7、8、10至13、15、及17至23之2’-OMe修飾，及於位置2、6、9、14、及16之2’-F修飾(從5’末端起計數)；以及
(iii)核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端起計數)；
其中RNAi劑於反義股的3’-末端具有二個核苷酸突出，及於反義股的5’-末端具有鈍末端。
另一特別的具體例中，本發明之RNAi劑包含：
(a)有義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)附接至3’-末端之ASGPR配位子，其中，該ASGPR配位子包含經由三價分支鏈結子附接至三個GalNAc衍生物；
(iii)於位置1至6、8、及12至21之2’-OMe修飾，及於位置7、及9至11之2’-F修飾；以及
(iv)核苷酸位置1與2之間以及核苷酸位置2與3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端起計數)；以及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)於位置1、3至5、7、10至13、15、及17至23之2’-OMe修飾，及於位置2、6、8、9、14、及16之2’-F修飾(從5’末端起計數)；以及
(iii)核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端起計數)；
其中RNAi劑於反義股的3’-末端具有二個核苷酸突出，及於反義股的5’-末端具有鈍末端。
另一特別的具體例中，本發明之RNAi劑包含：
(a)有義股，其具有：
(i)19個核苷酸之長度；
(ii)附接至3’-末端之ASGPR配位子，其中，該ASGPR配位子包含經由三價分支鏈結子附接至三個GalNAc衍生物；
(iii)於位置1至4、6，及10至19之2’-OMe修飾，及於位置5，及7至9之2’-F修飾；以及
(iv)核苷酸位置1與2之間以及核苷酸位置2與3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端起計數)；以及
(b)反義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)於位置1、3至5、7、10至13、15、及17至21之2’-OMe修飾，及於位置2、6、8、9、14及16之2’-F修飾(從5’末端起計數)；以及
(iii)核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置19及20之間、及核苷酸位置20及21之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端起計數)；
其中RNAi劑於反義股的3’-末端具有二個核苷酸突出，及於反義股的5’-末端具有鈍末端。
某些具體例中，使用於本發明的方法之iRNA為選自表2、3、5、6及8至13之任一者所列之劑。該等劑可進一步包含配體。
IV.接合至配位子的iRNA
本發明之iRNA之RNA的另一修飾牽涉將一個或多個增強該iRNA之活性、細胞分佈或細胞攝取(例如到細胞內)之配體、部分或接合物化學鏈結至該iRNA。此等部分包括但不限於脂質部分如膽固醇部分(Letsinger et al.,Proc.Natl.Acid.Sci.USA,1989,86：6553-6556)、膽酸(Manoharan et al.,Biorg.Med.Chem.Let.,1994,4：1053-1060)、硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660：306-309；Manoharan et al.,Biorg.Med.Chem.Let.,1993,3：2765-2770)、硫代膽固醇(Oberhauser et al.,Nucl.Acids Res.,1992,20：533-538、脂肪鏈例如十二烷二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras et al.,EMBO J,1991,10：1111-1118；Kabanov et al.,FEBS Lett.,1990,259：327-330；Svinarchuk et al.,Biochimie,1993,75：49-54)、磷脂質例如二-十六烷基-rac-甘油或1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-磷酸三乙銨(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36：3651-3654；Shea et al.,Nucl.Acids Res.,1990,18：3777-3783)、聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharan et al.,Nucleosides & Nucleotides,1995,14：969-973)、或金剛烷乙酸(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36：3651-3654)、棕櫚醯基部分(Mishra et al.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264：229-237)、或十八烷基胺或己基胺-羰氧基膽固醇部分(Crooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277：923-937)。
某些具體例中，配體改變其所併入之iRNA劑的分佈、靶向或壽命。於一些態樣中，配體，與不存在這種配體的物種相比，對選定的靶標提供增 強的親和力，例如分子、細胞或細胞類型、腔室(如細胞或器官之腔室)、組織、器官或身體區域。於一些態樣中，配體不會參與雙鏈體核酸中之雙鏈體配對。
配體可包括天然出現之物質，例如蛋白質(例如，人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、或球蛋白)；碳水化合物(例如，聚葡萄糖、聚散葡萄糖、幾丁質、幾丁聚醣、菊糖、環糊精或玻尿酸)；或脂質。配體亦可係重組分子或合成分子，諸如合成聚合物，例如，合成聚胺基酸。聚胺基酸之實例包括聚離胺酸(PLL)、聚L-天冬胺酸、聚L-麩胺酸、苯乙烯-馬來酸酐共聚物、聚(L-乳酸交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-馬來酸酐共聚物、N-(2-羥基丙基)甲基丙烯醯胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚胺酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯醯胺聚合物、或聚磷嗪(polyphosphazine)。聚胺之實例包括：聚伸乙二胺、聚離胺酸(PLL)、精胺、精三胺、聚胺、假肽-聚胺、胜肽模擬性聚胺、樹枝狀聚胺、精胺酸、脒、魚精蛋白、陽離子脂質、陽離子卟啉、聚胺之四級鹽、或α-螺旋胜肽。
配體亦可包括靶向基團，如細胞或組織靶向劑，如凝集素、醣蛋白、脂質或蛋白質，如抗體，其係結合至特定之細胞類型如腎細胞。靶向基團可係促甲狀腺素、促黑素、凝集素、醣蛋白、界面活性劑蛋白A、粘蛋白碳水化合物、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基-半乳糖胺、N-乙醯基葡萄胺糖、多價甘露糖、多價果糖、糖基化聚胺基酸、多價半乳糖、運鐵蛋白、雙膦酸酯、聚麩胺酸鹽、聚天冬胺酸鹽、脂質、膽固醇、類固醇、膽汁酸、葉酸、維生素B12、生物素、或RGD胜肽或RGD胜肽模擬物。某些具體例中，配體係多價半乳糖，例如，N-乙醯基-半乳糖胺。
配體之其他實例包括染料；嵌入劑(例如，吖啶類)；交聯劑(例如，補骨脂素、絲裂黴素C)；卟啉類(TPPC4、德克薩斯卟啉(texaphyrin)、噻卟啉(sapphyrin))；多環芳烴(例如，啡
Figure 111106049-A0202-12-0131-72
、二氫啡
Figure 111106049-A0202-12-0131-73
)；人工核酸內切酶(例如，EDTA)；親脂性分子(例如，膽固醇、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睪固酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉基氧己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十六烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽烯酸、二甲氧基三苯甲基、或啡
Figure 111106049-A0202-12-0131-74
)；以及肽接合物(例如，觸角足突變肽、Tat肽)、烷基化劑、磷酸鹽、胺基、巰基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚胺基、烷基、經取代之烷基、放射標記至標記物、酵素、半抗原(如，生物素)、轉運/吸收促進劑(例如，阿司匹林、維生素E、葉酸)、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、雙咪唑、組胺、咪唑簇、吖啶-咪唑接合物、四氮雜大環之Eu3+錯合物)、二硝基苯基、HRP、或AP。
配體可為蛋白質，如醣蛋白、或胜肽如具有對於共配體之特異親和性的分子、或抗體如結合至特定細胞類型諸如癌細胞、內皮細胞或骨細胞之抗體。配體亦可包括激素及激素受體。它們亦可包括非肽類物質，例如脂質、凝集素、碳水化合物、維生素、輔助因子、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基半乳糖胺、N-乙醯基葡萄胺糖、多價甘露糖、或多價果糖。配體可係，舉例而言，脂質多醣、p38 MAP激酶之活化劑、或NF-κB之活化劑。
配體可為例如藥物之物質，其可藉由例如擾亂細胞之細胞骨幹如藉由擾亂細胞之微管、微絲或中間體絲而增加細胞對iRNA劑之攝取。該藥物可係，舉例而言，泰素(taxon)、長春新鹼、長春鹼、細胞鬆弛素、諾考達唑、海 綿毒素(japlakinolide)、紅海海綿蛋白A、鬼筆環肽(phalloidin)、海洋苔蘚素A(swinholide A)、吲達諾欣(indanocine)、或邁爾素(myoservin)。
一些具體例中，附接至本文中所述之iRNA的配體用作藥物動力學調節子(PK調節子)。PK調節劑係包括親脂質類、膽汁酸、類固醇、磷脂質類似物、胜肽、蛋白質結合劑、PEG、維生素等。例示性PK調節劑係包括但不限於，膽固醇、脂肪酸、膽酸、石膽酸、二烷基甘油酯、二醯基甘油酯、磷脂質、神經脂質、萘普生(naproxen)、布洛芬(ibuprofen)、微生物E、生物素等。包含大量硫代硫酸酯鏈結之寡核苷酸亦已知結合至血清蛋白，因此在骨幹中包含多個硫代磷酸酯鏈結之短寡核苷酸如約5個鹼基、10個鹼基、15個鹼基或20個鹼基之寡核苷酸亦可作為配體(例如，作為PK調節配體)而遵循本發明。此外，於本文所揭示之態樣中，結合血清組分(例如，血清蛋白)之適配體亦適用於作為PK調節性配體而使用。
本發明之接合有配體之iRNA可藉由使用承載側鏈反應性官能度之寡核苷酸如衍生自將鏈結分子附接在寡核苷酸(揭示於下)上者而合成。這一反應性寡核苷酸可直接與可商購之配體、合成為承載多種保護基團之任一者的配體、或具有附接於其上之鏈結部分的配體反應。
本發明之接合物中使用之寡核苷酸可藉由習知之固相合成技術便利且常規性地合成。用於此合成之設備可由多個供應商販售，包括，舉例而言，Applied Biosystems®(Foster City,Calif.)。可額外地或作為另一種選擇地採用該領域中已知之用於此合成之任何其他手段。使用類似技術來製備其他寡核苷酸如硫代磷酸酯及烷基化衍生物亦為已知者。
本發明之接合有配體之寡核苷酸及承載序列特異性鏈結之核苷的配體分子中，該寡核苷酸及寡核苷可在合適DNA合成器使用標準核苷酸或核苷前驅物、或已經承載鏈結部分之核苷酸或核苷接合前驅物、已經承載配體分子之配體-核苷酸或核苷接合前驅物、或承載配體之非-核苷構建模塊而組裝。
當使用已經承載鏈結部分之核苷酸接合前驅物時，典型係完成序列特異性鏈結之核苷的合成，隨後將該配體分子與該鏈結部分反應以形成接合有配體之寡核苷酸。於一些態樣中，本發明之寡核苷酸或經鏈結之核苷係藉由自動合成器使用衍生自配體-核苷接合物之除標準亞磷醯胺之外的亞磷醯胺及可商購且常規用於寡核苷酸合成中之非標準亞磷醯胺來合成。
A.脂質接合物
某些具體例中，配體或接合物係脂質或基於脂質之分子。此類脂質或基於脂質之分子典型可結合血清蛋白諸如人血清白蛋白(HSA)。HSA結合配體允許接合物分佈於靶向組織，如身體之非腎臟靶向組織。舉例而言，靶向組織可係肝臟，包括肝臟之實質細胞。可結合HSA之其他分子亦可用作配體。舉例而言，可使用萘普生或阿司匹林。脂質或基於脂質之配體可(a)增加對於接合物降解之抗性，(b)增加對靶向細胞或細胞膜之靶向或遞送，或(c)可用以調節與血清蛋白例如HSA之結合。
基於脂質之配體可用以調節例如控制(例如，抑制)接合物結合至靶向組織。舉例而言，與HSA之結合更強的脂質或基於脂質之配體將更不可能靶向腎臟，並因此更不可能被從身體清除。與HSA之結合強度較低的脂質或基於脂質之配體可用來令接合物靶向腎臟。
某些具體例中，基於脂質之配體結合HSA。例如，配體可以足夠之親和性結合HSA，使得接合物至非腎臟組織之分佈得以增強。惟，親和性之強度典型係不足以導致該HSA-配體之結合稱為不可逆者。
其他具體例中，基於脂質之配體與HSA之結合弱或根本不結合，使得接合物至腎臟之分佈得以增強。靶向腎細胞之其他部分亦可用於替換該基於脂質之配體或與該基於脂質之配體同時使用。
另一態樣中，該配體係被靶向細胞例如增殖細胞攝取之部分例如維生素。此等尤其可用於治療以例如惡性或非惡性細胞例如癌細胞的非預期之細胞增殖為特徵的病症。示例性維生素包括維生素A、維生素E及維生素K。其他示例性維生素包括B族維生素，如葉酸、維生素B12、核黃素、生物素、吡哆醛、或其他被癌細胞攝取之維生素或營養物質。亦包括者係HSA及低密度脂蛋白(LDL)。
B.細胞滲透劑
另一態樣中，該配體係細胞滲透劑，諸如螺旋細胞滲透劑。於某些態樣中，該劑係雙性劑。示例性劑係肽，例如tat或觸角足突變肽。如果該劑係肽，其可經修飾，包括肽基模擬物、嵌入體、非肽或假肽類鏈結、以及D-胺基酸之使用。螺旋劑典型係α-螺旋劑，並且可具有親脂相及疏脂相。
該配體可為肽或肽模擬物。肽模擬物(本文中亦指為寡肽模擬物)係能折疊為所定義之類似於天然肽之三維結構的分子。肽及肽模擬物至iRNA劑之附接可影響iRNA之藥物動力學分佈，例如藉由提升細胞識別及吸收而影響。肽或肽模擬物部分可係5至50個胺基酸之長度，例如，約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸之長度。
胜肽或胜肽模擬物可為，舉例而言，細胞滲透胜肽、陽離子胜肽、兩親性胜肽、或疏水性胜肽(例如，主要由Tyr、Trp或Phe構成)。肽部分可係樹枝狀肽、受約束之肽或交聯之肽。於另一選擇中，肽部分可包括疏水性膜易位序列(MTS)。示例性之含有MTS的疏水性胜肽係具有下述胺基酸序列的RFGF：AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO：14)。含有疏水性MTS之RFGF類似物(例如，胺基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO：15))亦可為靶向部分。肽部分可為「遞送性」肽，其可攜帶包括肽、寡核苷酸、及蛋白質在內之極性大分子跨越細胞膜。舉例而言，業經發現，來自HIV Tat蛋白質之序列(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO：16))及來自果蠅觸角足突變肽蛋白之序列(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO：17))能發揮遞送肽之功能。胜肽或胜肽模擬物可由DNA之隨機序列編碼，例如從噬菌體呈現庫或一珠一物(OBOC)組合庫鑑定之胜肽(Lam et al.,Nature,354：82-84,1991)。典型地，經由合併之單體單元繫帶至dsRNA劑之胜肽或胜肽模擬物係細胞靶向胜肽諸如精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸(RGD)胜肽或RGD模擬物。肽部分之長度範圍可係約5個胺基酸至約40個胺基酸。該等肽部分可具有結構性修飾，例如以增加安定性或引導構形特性。可使用下文所述之任意結構性修飾。
用於本發明之組成物及方法的RGD肽可為線性或環狀，且可經修飾例如經糖基化或甲基化以促進對特定組織之靶向。含有RGD之肽及肽模擬物可包括D-胺基酸，以及合成RGD模擬物。除了RGD之外，亦可使用靶向整合素配體(諸如PECAM-1或VEGF)之其他部分。
「細胞滲透肽」能滲透細胞例如微生物細胞諸如細菌或真菌細胞，或哺乳動物細胞諸如人類細胞。微生物細胞滲透肽可係，舉例而言，α-螺旋線性 肽(例如，LL-37或Ceropin P1)、含二硫鍵之肽(例如，α-防禦素、β-防禦素或bactenecin)、或僅含有一個或兩個支配性胺基酸之肽(例如，PR-39或indolicidin)。細胞滲透肽亦可包括線性定位訊號(NLS)。舉例而言，細胞滲透胜肽可係雙向兩親性胜肽如MPG，其係衍生自HIV-1 gp41之融合胜肽結構域及SV40的T抗原之NLS(Simeoni et al.,Nucl.Acids Res.31：2717-2724,2003)。
C.碳水化合物接合物
本發明之組成物及方法的一些具體例中，iRNA復包含碳水化合物。接合有碳水化合物之iRNA對於核酸之體內輸送具有優勢，且組成物係適用於體內治療性用途，如本文中所揭示。如本文中所用，「碳水化合物」指碳水化合物自身，其由一個或多個具有至少6個碳原子之單糖單元(其可為線性、分支鏈或環狀)與鍵結至每一碳原子之氧、氮或硫原子所組成；或為具有碳水化合物部分作為其一部分的化合物，該碳水化合物部分由一個或多個具有至少6個碳原子之單糖單元(其可為線性、分支鏈或環狀)與鍵結至每一碳原子之氧、氮或硫原子所組成。代表性碳水化合物包括糖類(單糖、二醣、三醣及含有約4、5、6、7、8、或9個單醣單元之寡醣)，以及多醣如澱粉、糖原、纖維素及多醣膠。具體之單糖包括C5糖類及上述(例如，C5、C6、C7或C8)糖類；二醣及三醣，其包括具有兩個或三個單醣單元(例如，C5、C6、C7或C8)之糖類。
某些具體例中，使用於本發明的組成物及方法的碳水化合物接合物為單糖。
某些具體例中，單糖為N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)。GalNAc接合物，其包含一種或多種N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)衍生物，係揭示於例如美國專利8,106,022中，該專利之整體內容藉由參照而併入本文。於一些態樣 中，GalNAc接合物用作配體，其令iRNA靶向具體細胞。於一些態樣中，GalNAc接合物令iRNA靶向肝臟細胞，例如，藉由用作肝臟細胞(例如，肝細胞)之去唾液酸糖蛋白受體配體。
一些具體例中，碳水化合物接合物包含一個或多個GalNAc衍生物。GalNAc衍生物可經由鏈結子附接，例如，二價或三價分支鏈鏈結子。一些具體例中，一些具體例中，GalNAc接合物為接合至有義股的3’末端。一些具體例中，GalNAc接合物為經由鏈結子接合至iRNA劑(例如，至有義股的3’末端)，例如，本文所揭示之鏈結子。一些具體例中，GalNAc接合物為接合至有義股的5’末端。一些具體例中，GalNAc接合物為經由鏈結子接合至iRNA劑(例如，至有義股的5’末端)，例如，本文所揭示之鏈結子。
本發明之某些具體例中，GalNAc或GalNAc衍生物經由單價鏈結子附接至本發明之iRNA劑。一些具體例中，GalNAc或GalNAc衍生物經由二價鏈結子附接至本發明之iRNA劑。本發明之又一些具體例中，GalNAc或GalNAc衍生物經由三價鏈結子附接至本發明之iRNA劑。本發明之其他具體例中，GalNAc或GalNAc衍生物經由四價鏈結子附接至本發明之iRNA劑。
某些具體例中，本發明之雙股RNAi劑包含一個附接至該iRNA劑之GalNAc或GalNAc衍生物。某些具體例中，本發明之雙股RNAi劑含複數(例如，2、3、4、5或6)個GalNAc或GalNAc衍生物，其經由複數個單價鏈結子而各自獨立附接至該雙股RNAi劑之複數個核苷酸。
一些具體例中，舉例而言，當本發明之iRNA劑之二股皆係一個更大分子之一部分且藉由位於一股之3’-末端與另一股之5’-末端之間的不間斷核苷酸鏈連結而形成包含複數個未配對核苷酸的髮夾環圈時，該髮夾環圈內之 每一個未配對核苷酸可獨立包含經由單價鏈結子附接之GalNAc或GalNAc衍生物。髮夾環圈亦可藉由雙鏈體之一股的延伸突出形成。
一些態樣中，舉例而言，當本發明之iRNA劑之二股皆係一個更大分子之一部分且藉由位於一股之3’-末端與另一股之5’-末端之間的不間斷核苷酸鏈連結而形成包含複數個未配對核苷酸的髮夾環圈時，該髮夾環圈內之每一個未配對核苷酸可獨立包含經由單價鏈結子附接之GalNAc或GalNAc衍生物。髮夾環圈亦可藉由雙鏈體之一股的延伸突出形成。
一具體例中，使用於本發明之組成物及方法的碳水化合物接合物係選自下述所成群組：
Figure 111106049-A0202-12-0138-248
Figure 111106049-A0202-12-0138-249
Figure 111106049-A0202-12-0139-250
Figure 111106049-A0202-12-0139-251
Figure 111106049-A0202-12-0139-252
Figure 111106049-A0202-12-0139-253
Figure 111106049-A0202-12-0139-254
Figure 111106049-A0202-12-0140-255
Figure 111106049-A0202-12-0140-256
Figure 111106049-A0202-12-0140-257
Figure 111106049-A0202-12-0140-258
Figure 111106049-A0202-12-0141-259
Figure 111106049-A0202-12-0141-260
Figure 111106049-A0202-12-0141-261
Figure 111106049-A0202-12-0141-262
Figure 111106049-A0202-12-0141-263
Figure 111106049-A0202-12-0141-264
Figure 111106049-A0202-12-0141-265
Figure 111106049-A0202-12-0142-267
Figure 111106049-A0202-12-0142-268
Figure 111106049-A0202-12-0142-269
Figure 111106049-A0202-12-0142-270
Figure 111106049-A0202-12-0142-266
，其中Y為O或S且n為3-6(式XXIV)；
Figure 111106049-A0202-12-0143-271
，其中Y為O或S且n為3-6(式XXV)；
Figure 111106049-A0202-12-0143-273
Figure 111106049-A0202-12-0143-272
，其中X係O或S(式XXVII)；
Figure 111106049-A0202-12-0144-274
Figure 111106049-A0202-12-0144-275
Figure 111106049-A0202-12-0144-276
Figure 111106049-A0202-12-0144-277
Figure 111106049-A0202-12-0145-278
Figure 111106049-A0202-12-0145-279
Figure 111106049-A0202-12-0145-280
另一具體例中，使用於本發明之組成物及方法的碳水化合物接合物為單糖。一具體例中，單糖為N-乙醯基半乳糖胺，如
Figure 111106049-A0202-12-0146-281
一些具體例中，RNAi劑為如下述方案經由鏈結子附接至碳水化合物接合物，其中X係O或S
Figure 111106049-A0202-12-0146-282
一些具體例中，RNAi劑為接合至表1所定義之L96且如下所示：
Figure 111106049-A0202-12-0146-283
使用於本文所述具體例之另一代表性碳水化合物接合物包括，但不限於，
Figure 111106049-A0202-12-0147-284
 (式XXXVI)，當X或Y之一者為寡核苷酸時，另一者為氫。
一些具體例中，合適的配體為揭示於WO 2019/055633的配體，其全部內容以參照方式併入本文。一具體例中，配體包含下述結構：
Figure 111106049-A0202-12-0147-285
本發明之某些具體例中，GalNAc或GalNAc衍生物經由單價鏈結子附接至本發明之iRNA劑。一些具體例中，GalNAc或GalNAc衍生物經由二價鏈結子附接至本發明之iRNA劑。本發明之又一些具體例中，GalNAc或GalNAc衍生物經由三價鏈結子附接至本發明之iRNA劑。
一具體例中，本發明的雙股RNAi劑包含附接至iRNA劑的一個或多個GalNAc或GalNAc衍生物。GalNAc可經由鏈結子附接至有義股或反義股的任何核苷酸。GalNac可附接至有義股的5’-末端、有義股的3’末端、反義股 的5’-末端或反義股的3’-末端。一具體例中，GalNAc為附接至有義股的3’末端，例如，經由三價鏈結子。
其他具體例中，本發明的雙股RNAi劑包含複數(例如，2、3、4、5或6)個GalNAc或GalNAc衍生物，其經由複數個鏈結子，例如，單價鏈結子，而各自獨立地附接至雙股RNAi劑之複數個核苷酸。
一些具體例中，例如，當本發明之iRNA劑之二股皆為一個更大分子之一部分且係藉由位於一股之3’-末端與另一股之5’-末端之間的不間斷核苷酸鏈連結而形成包含複數個未配對核苷酸的髮夾環圈時，該髮夾環圈內之每一個未配對核苷酸可獨立包含經由單價鏈結子附接之GalNAc或GalNAc衍生物。
一些具體例中，碳水化合物接合物進一步包含如上文所述的一個或多個另外配體，例如但不限於，PK調節子或細胞滲透肽。
適用於本發明之額外之碳水化合物接合物及鏈結子包括彼等於PCT公開案號WO 2014/179620及WO 2014/179627中所揭示者，其各自之整體內容藉由參照而併入本文。
D.鏈結子(Linkers)
一些具體例中，本文中揭示之接合物或配體可使用多種鏈結子附接至iRNA寡核苷酸，該鏈接基可係可裂解者或不可裂解者。
術語「鏈結子」或「鏈結基團」意指將化合物之兩個部分連結在一起如將化合物之兩個部分共價附接的有機部分。鏈結基典型係包含直接鍵結或原子如氧或硫，單元如NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH或原子之鏈，例如但不限於，經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或 未經取代之炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、雜芳基烷基、雜芳基烯基、雜芳基炔基、雜環基烷基、雜環基烯基、雜環基炔基、芳基、雜芳基、雜環基、環烷基、環烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基雜芳基烷基、烷基雜芳基烯基、烷基雜芳基炔基、烯基雜芳基烷基、烯基雜芳基烯基、烯基雜芳基炔基、炔基雜芳基烷基、炔基雜芳基烯基、炔基雜芳基炔基、烷基雜環基烷基、烷基雜環基烯基、烷基雜環基炔基、烯基雜環基烷基、烯基雜環基烯基、烯基雜環基炔基、炔基雜環基烷基、炔基雜環基烯基、炔基雜環基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基雜芳基、烯基雜芳基、炔基雜芳基，其一個或多個亞甲基可由O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜環基中繼或終止；其中R8係氫、醯基、脂族或經取代之脂族。於某些態樣中，鏈結子係約1至24個原子、2至24個原子、3至24個原子、4至24個原子、5至24個原子、6至24個原子、6至18個原子、7至18個原子、8至18個原子、7至17個原子、8至17個原子、6至16個原子、7至16個原子、或8至16個原子。
可裂解之鏈結基團在細胞外足夠安定，但當進入靶向細胞時裂解以釋放被該鏈結子保持在一起之兩個部分。一具體例中，可裂解之鏈結基團在靶向細胞內或在第一參考條件(其可係例如經選擇以模擬或呈現細胞內之條件)下之裂解比在個體血液內或在第二參考條件(其可係例如經選擇以模擬或呈現見於血液或血清中之條件)下之裂解快至少約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更高、或至少約100倍。
可裂解之鏈接基團係對於裂解劑例如pH、氧化還原電位或可降解分子之存在為敏感者。通常，與在血清或血液中相比，裂解劑在細胞內更為普遍或以更高量級或活性被發現。此類降解劑之實例包括：氧化還原劑，其係選擇用於特定之受質或其不具有受質特異性，包括例如細胞內存在之可降解氧化還原可藉由還原可裂解之鏈結基團的氧化酶、還原酶或還原劑如硫醇；酯酶；內切酶，或可創建酸性環境之劑如導致pH為5或更低之彼等；可藉由作為通用酸、肽酶(其可係受質特異性者)及磷酸酶作動而水解或降解酸可裂解之鏈結基團的酶。
可裂解之鏈結基團如二硫鍵可能對於pH敏感。人血清之pH為7.4，而細胞內平均pH略低，為7.1-7.3之範圍。胞內體具有酸性更強之pH，為5.5至6.0之範圍；而溶酶體甚至具有酸性更強之pH，約為5.0。一些鏈結子將具有可裂解之鏈結基團，該鏈結基團在選定之pH裂解，從而在細胞內將陽離子脂質從該配體釋放出來或將該陽離子脂質釋放如所欲之細胞腔室內。
鏈結子可包括可藉由特定酶裂解之可裂解之鏈結基團。併入鏈結子的可裂解之鏈結基團的類型可取決於待作為靶向之細胞。舉例而言，肝臟靶向配體可透過包括酯基之鏈結子而鏈結至鏈結子。肝細胞富含酯酶，因此鏈結子在肝細胞中將比在不富含酯酶之細胞類型內更有效地被裂解。其他富含酯酶之細胞類型包括肺、腎皮質及睪丸之細胞。
當靶向細胞類型係富含肽酶者如肝細胞及滑膜細胞時，可使用含有肽鍵之鏈結子。
一般而言，可藉由測試降解劑(或條件)裂解備選鏈結基團之能力而評估該備選之可裂解鏈結基團的適用性。亦所欲者為亦測試該備選可裂解鏈結基團在血液中或當與其他非靶向組織接觸時之抵抗裂解的能力。因此，可測 定第一條件與第二條件間之裂解相對敏感性，其中該第一條件係選擇為靶向細胞內之裂解標記物，且該第二條件係選擇為其他組織或生物流體例如血液或血清中之裂解標記物。該等評估可在無細胞之系統內、細胞內、細胞培養物內、器官或組織培養物內、或在整個動物體內進行。可能有用者為，在無細胞或培養條件下作成初始評估，並藉由在整體動物體內之進一步評估而證實之。一些具體例中，可用之備選化合物在細胞內(或在選擇以模擬細胞內條件之體外條件下)之裂解比在血液或血清中(或在選擇以模擬細胞外條件之體外條件下)快至少約2倍、4倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或約100倍。
i.氧化還原可裂解之鏈結基團
某些具體例中，可裂解之鏈結基團係氧化還原可裂解之鏈結基團，其當還原或氧化時被裂解。可經還原裂解之鏈結基團的實例係二硫鏈結基團(-S-S-)。為了確定備選可裂解鏈結基團是否係合適之「可還原裂解之鏈結基團」或例如是否適用於與特定iRNA部分及特定靶向劑合用，可查看本文中揭示之方法。舉例而言，可藉由以二硫蘇糖醇(DTT)或使用該領域中已知試劑之還原劑溫育來評估備選者，該溫育模擬在細胞例如靶向細胞內將會觀察到之裂解速率。該等備選物亦可在經選擇以模擬血液或血清條件之條件下評估之。一者中，備選化合物在血液中被裂解至多約10%。其他具體例中，可用之備選化合物在細胞內(或在選擇以模擬細胞內條件之體外條件下)之降解比在血液或血清中(或在選擇以模擬細胞外條件之體外條件下)快至少約2倍、4倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或約100倍。備選化合物之裂解 速率可使用標準酶動力學分析在經選擇以模擬細胞內介質之條件下測定，並將其與在經選擇以模擬細胞外介質之條件下所測者比較。
ii.基於磷酸酯之可裂解鏈結基團
其他具體例中，可裂解之鏈結子包含基於磷酸酯之可裂解鏈結基團。基於磷酸酯之可裂解鏈結基團藉由降解或水解該磷酸酯基團之劑而裂解。在細胞內裂解磷酸酯基團之劑的實例係酶如細胞內之磷酸酶。磷酸酯系鏈結基團之實例為-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-，其中，Rk於每次出現時可獨立為C1-C20烷基、C1-C20鹵烷基、C6-C10芳基或C7-C12。例示性具體例包括-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-及-O-P(S)(H)-S-。於一個態樣中，磷酸酯系鏈結基團係-O-P(O)(OH)-O-。此等備選者可使用與上述之彼等類似之方法評估。
iii.酸可裂解之鏈結基團
其他具體例中，可裂解之鏈結子包含酸可裂解之鏈結基團。酸可裂解之鏈結基團係在酸性條件下被裂解之鏈結基團。於一些態樣中，酸可裂解之鏈結基團係在pH為約6.5或更低(例如，約6.0、5.5、5.0或更低)之酸性環境中被裂解，或被劑諸如可用作通用酸之酶裂解。於細胞內，特異性低pH胞器如胞內體及溶酶體，可提供用於酸可裂解之鏈結基團的裂解環境。酸可裂解之鏈結基團之實例包括但不限於腙類、酯類、及胺基酸之酯類。酸可裂解之鏈結基團可 具有通式-C=NN-、C(O)O、或-OC(O)。例示性具體例為，當附接至酯之氧(烷氧基)的碳係芳基時，經取代之烷基、或四級烷基如二甲基戊基或第三丁基。此等備選者可使用與上述之彼等類似之方法評估。
iv.基於酯之可裂解鏈結基團
其他具體例中，可裂解之鏈結子包含可裂解之鏈結子包含基於酯之可裂解鏈結基團。基於酯之可裂解鏈結基團由酶諸如酯酶或醯胺酶在細胞內裂解。基於酯之可裂解鏈結基團的實例包括但不限於伸烷基、伸烯基及伸炔基之酯類。酯可裂解之鏈結基團可具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。此等備選者可使用與上述之彼等類似之方法評估。
v.基於胜肽之可裂解鏈結基團
又其他具體例中，可裂解之鏈結子包含基於胜肽之可裂解鏈結基團。基於肽之可裂解鏈結基團由酶諸如肽酶及蛋白酶在細胞內裂解。基於肽之可裂解基團在胺基酸間形成以獲得寡肽(例如，二肽、三肽等)及多肽之肽鍵。基於肽之可裂解基團不包括醯胺基團(-C(O)NH-)。醯胺基團可在任意伸烷基、伸烯基或伸炔基之間形成。肽鍵在胺基酸間形成以獲得肽及蛋白質之特異類型的醯胺鍵。基於肽之裂解基團通常限定為在胺基酸間形成而獲得肽及蛋白質的肽鍵(亦即，醯胺鍵)，且不包括該完整醯胺官能基。基於肽之可裂解鏈結基團具有通式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA與RB係兩個相鄰胺基酸之R基團。此等備選者可使用與上述之彼等類似之方法評估。
一些具體例中，本發明之iRNA為經由鏈結子接合至碳水化合物。本發明之具有鏈結子之iRNA碳水化合物接合物之非限制性實例包括，但不限於，
Figure 111106049-A0202-12-0154-286
Figure 111106049-A0202-12-0154-287
Figure 111106049-A0202-12-0154-288
Figure 111106049-A0202-12-0154-289
Figure 111106049-A0202-12-0155-290
Figure 111106049-A0202-12-0155-291
Figure 111106049-A0202-12-0155-301
 (式XLIII)，以及
Figure 111106049-A0202-12-0155-292
 (式XLIV)，當X或Y之一者為寡核苷酸時，另一者為氫。
本發明之組成物及方法的某些具體例中，配體為經由二價或三價鏈結子附接之一個或多個「GalNAc」(N-乙醯基半乳糖胺)衍生物。
一具體例中，本發明之dsRNA接合至選自式(XLV)至(XLVIII)中任一者所示結構組成之群組的二價或三價分支鏈之鏈結子：：
Figure 111106049-A0202-12-0156-294
其中：
q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B及q5C於每次出現時獨立表示0至20，其中，該重複單元可係相同或相異；
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C於每次出現時獨立地不存在或係CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；
Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C於每次出現時係獨立為不存在或係伸烷基、經取代之伸烷基(其中，一個或多個亞甲基可藉由O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R’)=C(R”)、C≡C或C(O)之一者或多者中斷或封端)；
R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C於每次出現時獨立地不存在或係NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH=N-O、
Figure 111106049-A0202-12-0157-295
、
Figure 111106049-A0202-12-0157-296
、
Figure 111106049-A0202-12-0157-297
、
Figure 111106049-A0202-12-0157-298
、
Figure 111106049-A0202-12-0157-299
或雜環基；L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B及L5C係表示配體，亦即，於每次出現時係各自獨立為單糖(如GalNAc)、二醣、三醣、四醣、寡醣、或多醣；且Ra係H或胺基酸側鏈。三價複合GalNAc衍生物係尤其可與RNAi劑合用，以用於抑制靶向基因之表現，例如式(XLIX)之彼等：
Figure 111106049-A0202-12-0157-300
其中L5A、L5B及L5C表示單糖，如GalNAc衍生物。
合適之接合GalNAc衍生物之二價及三價分支鏈之鏈結子的實例包括但不限於，上文作為式II、VII、XI、X、及XIII所引用之結構。
教示RNA接合物之製備之代表性美國專利包括但不限於，美國專利第4,828,979號、第4,948,882號、第5,218,105號、第5,525,465號、第 5,541,313號、第5,545,730號、第5,552,538號、第5,578,717號、第5,580,731號、第5,591,584號、第5,109,124號、第5,118,802號、第5,138,045號、第5,414,077號、第5,486,603號、第5,512,439號、第5,578,718號、第5,608,046號、第4,587,044號、第4,605,735號、第4,667,025號、第4,762,779號、第4,789,737號、第4,824,941號、第4,835,263號、第4,876,335號、第4,904,582號、第4,958,013號、第5,082,830號、第5,112,963號、第5,214,136號、第5,082,830號、第5,112,963號、第5,214,136號、第5,245,022號、第5,254,469號、第5,258,506號、第5,262,536號、第5,272,250號、第5,292,873號、第5,317,098號、第5,371,241號、第5,391,723號、第5,416,203號、第5,451,463號、第5,510,475號、第5,512,667號、第5,514,785號、第5,565,552號、第5,567,810號、第5,574,142號、第5,585,481號、第5,587,371號、第5,595,726號、第5,597,696號、第5,599,923號、第5,599,928號、第5,688,941號、第6,294,664號、第6,320,017號、第6,576,752號、第6,783,931號、第6,900,297號、第7,037,646號、第8,106,022，其各者的全部內容藉由參照方式併入本文。
所指定化合物不必所有位置均經一致修飾，且事實上可在單一化合物中或甚至在iRNA中之單一核苷引進超過一個上述修飾。本發明亦包括呈嵌合(chimeric)化合物之iRNA化合物。
本發明內容中，「嵌合」iRNA化合物或「嵌合體」為含有二個或更多個化學上獨立區域之iRNA化合物，如dsRNAi劑，該各區域由至少一個單體單位組成，亦即以dsRNA化合物為例，為由核苷酸組成。此等iRNA通常含有至少一個區域，其中RNA係經修飾，以致於增加iRNA對核酸酶降解之抗性、增加細胞吸收性、或增加對靶向核酸之結合親和性。iRNA之另一區域可作為可以裂解RNA：DNA或RNA：RNA雜合體之酵素之受質。例如，RNase H為細胞內 切核酸酶，其裂解RNA：DNA雙鏈體之RNA股。因此活化RNase H之結果為裂解RNA靶向，藉以大幅加強iRNA抑制基因表現之效力。結果，當採用嵌合性dsRNA時，經常可以採用較短之iRNA得到類似硫代磷酸酯去氧dsRNA與相同靶向區域雜交後得到之結果。RNA靶向之裂解作用照例可採用凝膠電泳分析法檢測，且若必要時，可聯合採用所屬技術領域上已知之核酸雜交技術。
某些例子中，iRNA之RNA可藉由非配體基團修飾。許多種非配體分子已與iRNA接合，以加強iRNA之活性、細胞分佈性或細胞吸收性，且進行此等接合法之程序可從科學文獻中取得。此等非配體部份體包括脂質部份體，如膽固醇(Kubo,T.等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.,2007,365(1)：54-61；Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86：6553)、膽酸(Manoharan等人，Biorg.Med.Chem.Let.,1994,4：1053)、硫醚，例如，己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660：306；Manoharan等人，Biorg.Med.Chem.Let.,1993,3：2765)、硫膽固醇(Oberhauser等人，Nucl.Acids Res.,1992,20：533)、脂肪族鏈，例如，十二烷二醇或十一烷基(Saison-Behmoaras等人，EMBO J,1991,10：1111；Kabanov等人，FEBS Lett.,1990,259：327；Svinarchuk等人，Biochimie,1993,75：49)、磷脂，例如，二-十六烷基-消旋性-甘油或1,2-二-O-十六烷基-消旋性-甘油基-3-膦酸三乙基銨鹽(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.,1995,36：3651；Shea等人，Nucl.Acids Res.,1990,18：3777)、多元胺或聚乙二醇鏈(Manoharan等人，Nuclosides & Nuclotides,1995,14：969)、或金剛烷乙酸(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.,1995,36：3651)、棕櫚基部份體(Mishra等人，Biochim.Biophys.Acta,1995,1264：229)、或十八烷基胺或己基胺基-羰基氧膽固醇部份體(Crooke等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277：923)。教示此等 RNA接合物製法之代表性美國專利案已如上述。典型接合法程序涉及合成在序列之一個或多個位置帶有胺基連接基之RNA。該胺基再與準備接合之分子採用適當偶合或活化試劑反應。該接合反應可在RNA仍結合在固態擔體時進行或可在裂解RNA後，在液相中進行。通常採用HPLC法純化RNA接合物，產生純的接合物。
V.本發明之iRNA的遞送
可採用許多不同方式傳遞本發明iRNA至細胞中，例如個體，如人類個體(例如，有此需要之個體，如容易罹患或經診斷患有KHK-相關疾患，如本文所述者)內之細胞。例如，可能由細胞與本發明iRNA於體外或體內接觸，進行傳遞。亦可直接投藥包含iRNA之組成物(例如，dsRNA)給個體，進行體內傳遞。或者，可能間接投藥編碼並主導iRNA表現之一或多種載體，進行體內傳遞。此等替代法更進一步於下文中討論。
一般而言，本發明iRNA可採用任何傳遞核酸分子之方法(活體外或活體內)(參見例如，Akhtar S.與Julian RL.(1992)Trends Cell.Biol.2(5)：139-144與WO94/02595，其完整揭示內容已藉由參照之方式併入本文中)。用於體內傳遞時，要傳遞iRNA分子之考量因素包括例如，所傳遞分子之生物安定性、預防所傳遞分子在靶向組織中之非特異性效應及累積。RNA干擾法亦已顯示可藉由直接注射法成功局部傳遞至CNS(Dorn,G.等人(2004)Nucleic Acids 32：e49；Tan,PH.等人(2005)Gene Ther.12：59-66；Makimura,H.等人(2002)BMC Neurosci.3：18；Shishkina,GT.等人(2004)Neuroscience 129：521-528；Thakker,ER.等人(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：17270-17275；Akaneya,Y.等人(2005)J.Neurophysiol.93：594-602)。修飾RNA或醫藥載劑亦可讓iRNA靶向標靶組織， 並避免不期望之脫靶效應。iRNA分子可採用化學法接合親脂性基團(如膽固醇)進行修飾，以加強細胞吸收並預防降解。例如，由主導對抗ApoB之iRNA與親脂性膽固醇部份體之接合物全身注射至小鼠，結果減弱肝與空腸中之apoB mRNA(Soutschek,J.等人(2004)Nature 432：173-178)。
另一替代具體例，可使用藥物傳遞系統(如奈米粒子、樹枝狀物、聚合物、脂質體或陽離子性傳遞系統)傳遞iRNA。帶正電價之陽離子性傳遞系統可促進iRNA分子(帶負電價)之結合性，亦加強在帶負電價之細胞膜上之交互作用，讓細胞有效吸收iRNA。陽離子性脂質、樹枝狀物、或聚合物可與iRNA結合，或誘導形成囊封iRNA之囊泡或膠束(參見例如，Kim SH.等人(2008)Journal of Controlled Release 129(2)：107-116)。形成囊泡或膠束可在全身投藥時進一步預防iRNA降解。製造及投藥陽離子性-iRNA複合物之方法係習此所屬技術領域者之能力範圍內(參見例如，Sorensen,DR.等人(2003)J.Mol.Biol 327：761-766；Verma,UN.等人(2003)Clin.Cancer Res.9：1291-1300；Arnold,AS等人(2007)J.Hypertens.25：197-205，其等完整揭示內容已藉由參照之方式併入本文中)。適用於全身性傳遞iRNA之藥物傳遞系統之有些非限制性實例包括DOTAP(Sorensen,DR.等人(2003)，如上述文獻；Verma,UN.等人(2003)，如上述文獻)、「固態核酸脂質粒子」(Zimmermann,TS.等人(2006)Nature 441：111-114)、心磷脂(cardiolipin)(Chien,PY.等人(2005)Cancer Gene Ther.12：321-328；Pal,A.等人(2005)Int J.Oncol.26：1087-1091)、聚乙二亞胺(Bonnet ME.等人(2008)Pharm.Res.Aug 16 Epub ahead of print；Aigner,A.(2006)J.Biomed.Biotechnol.71659)、Arg-Gly-Asp(RGD)肽類(Liu,S.(2006)Mol.Pharm.3：472-487)、與聚醯胺基胺類(Tomalia,DA.等人(2007)Biochem.Soc.Trans.35：61-67；Yoo,H. 等人(1999)Pharm.Res.16：1799-1804)。一些具體例中，iRNA與環糊精形成複合物，供全身性投藥。iRNA與環糊精之投藥方法及醫藥組成物可參見美國專利案案號7,427,605，其完整揭示內容已藉由參照之方式併入本文中。
A.編碼本發明iRNA之載體
靶向KHK基因之iRNA可由插入DNA或RNA載體中之轉錄單位表現(參見例如，Couture,A等人TIG.(1996),12：5-10；Skillern,A.等人之國際PCT公開案案號WO 00/22113、Conrad之國際PCT公開案案號WO 00/22114、與Conrad之美國專利案案號6,054,299)。該表現可為過渡性(數小時至數週)或持續性(數週至數個月或更久)，依所採用之特定構築體及靶向組織或細胞型態而定。此等轉殖基因可呈線性構築體、環狀質體、或病毒載體引進，其可為整合或非整合載體。亦可構築該轉殖基因，使其得以呈染色體外質體遺傳(Gassmann等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92：1292)。
本文所說明方法與組成物可利用之病毒載體系統包括，但不限於：(a)腺病毒載體；(b)逆轉錄病毒載體，包括但不限於：慢病毒(lentivirus)載體、莫洛尼氏白血病病毒(moloney murine leukemia virus)等等；(c)腺相關病毒載體；(d)單純皰疹病毒載體；(e)SV 40載體；(f)多瘤病毒載體；(g)乳突病毒載體；(h)小核糖核酸病毒載體；(i)痘病毒載體，如正痘(orthopox)，例如，牛痘病毒載體或鳥痘，例如，金絲雀痘或禽痘；與(j)輔助病毒依賴性或無腸腺病毒。複製缺陷病毒亦有利。細胞基因組中不一定會引進不同載體。若需要時，該構築體可包括用於轉錄之病毒序列。或者，該構築體可引至可以進行附加體型複製之載體中，例如，EPV與EBV載體。用於iRNA之重組表現之構築體通常需要調 節元素，例如，啟動子、加強子等等，以確保iRNA於靶向細胞中之表現。下文將進一步說明有關載體與構築體之其他態樣。
VI.本發明之醫藥組成物
本發明亦包括一種含有本文所說明iRNA之醫藥組成物與調配物。一具體例中，本文提供含有本文所說明iRNA與醫藥上可接受之載體之醫藥組成物。含有該iRNA之醫藥組成物適用於預防或治療與KHK基因的表現或活性相關的疾病或疾患。此等醫藥組成物係依據傳遞模式調配。其中一實例為一種調配成以非經腸式傳遞而全身性投藥之組成物，例如，經皮下(SC)、肌內(LM)、或經靜脈內(IV)傳遞。本發明醫藥組成物可投藥足以抑制KHK基因表現之劑量。
一些具體例中，本發明之醫藥組成物為無菌。另一具體例中，本發明醫藥組成物沒有致熱原。
本發明之醫藥組成物可投藥足以抑制KHK基因表現之劑量。一般而言，本發明iRNA之合適劑量在每天每公斤體重約0.001至約200.0毫克之範圍內，通常在每天每公斤體重約1至50mg之範圍內。典型之本發明iRNA之合適劑量為約0.1mg/kg至約5.0mg/kg之範圍內，較佳為約0.3mg/kg至約3.0mg/kg。重複劑量療程可包括依規律方式投藥醫療有效量之iRNA，如每個月、每3-6個月一次、或一年一次。某些具體例中，iRNA係約每個月投藥一次至約每6個投藥一次。
初始治療療程後，該治療法可減少投藥頻率。可依據疾病嚴重度決定持續治療時間。
其他具體例中，醫藥組成物之單一劑量可以為長效性，因此可在 不超過1、2、3或4個月之間隔內投藥。本發明之一些具體例中，本發明醫藥組成物之單一劑量係約每個月投藥一次。本發明之其他具體例中，本發明醫藥組成物之單一劑量係每季(亦即約每3個月)投藥一次。本發明之其他具體例中，本發明醫藥組成物之單一劑量係一年投藥兩次(亦即約每6個月一次)。
所屬技術領域中具有通常知識者咸了解，某些因子會影響有效治療個體時所需之劑量與投藥時程，包括但不限於：個體中出現之突變、過去之治療、個體之一般健康或年齡、及其他現有疾病。此外，適當時，以預防或醫療有效量之組成物治療個體時，可包括單次治療或一系列治療。
iRNA可依靶向特定組織(例如，肝細胞)之方式傳遞。
本發明之醫藥組成物包括但不限於：溶液、乳液、及包含脂質體之調配物。此等組成物可由各種不同組份產生，包括但不限於：預成型液體、自行乳化之固體、及自行乳化之半固體。調配物包括彼等靶向肝之調配物。
宜呈單位劑型之本發明之醫藥調配物可依據醫藥業習知技術製備。此等技術包括組合活性成分與醫藥載劑或賦形劑之步驟。通常，調配物之製法為均勻且密切組合活性成分與液態載劑。
A.其他調配物
i.乳液
本發明之組成物可製造並調配成乳液。乳液為其中一種液體呈直徑通常不超過0.1μm之液滴型態勻散在另一種液體中之典型不均相系統(參見例如，Ansel’s Dosage Forms and Drug Delivery Systems，Allen,LV.、Popovich NG.and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed),New York,NY；Idson in Parmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Volume 1,p.199；Rosoff,in Parmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Volume 1,p.245；Block in Parmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Volume 2,p.335；Higuchi等人，in Remington’s Parmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.301)。乳液通常為雙相系統，其包含兩個彼此密切混合與分散之不可混溶之液相。通常，乳液可為油包水(w/o)型或水包油(o/w)型。當水相呈小液滴均勻分佈且分散在大體積之油相中時，所得組成物稱為油包水性(w/o)乳液。或者，當油相呈小液滴均勻分佈且分散在大體積之水相中時，所得組成物稱為水包油性(o/w)乳液。乳液中除了分散相外，可再包含其他組份，且活性藥物可呈溶液存在於水相、油相或本身另呈一相。需要時，乳液中亦可包含醫藥賦形劑，如乳化劑、安定劑、染劑、與抗氧化劑。醫藥乳液亦可為由超過兩相組成之多相乳液，如例如，以油包水包油性(o/w/o)與水包油包水性(w/o/w)乳液為例。此等複合調配物經常提供單純二元乳液沒有之優點。其中o/w乳液之個別油滴包埋小水滴之多相乳液即構成w/o/w乳液。同樣地，由油滴包埋在於油連續相中安定化之水球中，提供o/w/o乳液。
乳液之特徵在於很低或沒有熱力學安定性。通常，乳液之分散相或不連續相均勻分佈在外相或連續相內，並利用乳化劑或調配物之黏度維持此型式。其他安定乳液方式可以使用乳化劑，引進乳液之任一相中。乳化劑可廣義分為四類：合成性界面活性劑、天然乳化劑、吸收基質、與均勻分散之固體(參見例如，Ansel’s Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY； Idson,in Parmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Volume 1,p.199)。
合成性界面活性劑亦已知為表面活性劑，已廣泛用於乳液之調配物，且已於文獻中說明(參見例如Ansel’s Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rieger,in Parmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Volume 1,p.285；Idson,in Parmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,Volume 1,p.199)。界面活性劑通常為兩親性，其包含親水性與疏水性部份。界面活性劑之親水性對疏水性性質之比值稱為親水性/親脂性平衡值(HLB)，係在製備調配物時用於分類及選擇界面活性劑之有利工具。界面活性劑可依據親水性基團性質分成不同類型：非離子性、陰離子性、陽離子性、與兩親性(參見例如Ansel’s Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rieger,in Parmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Volume 1,p.285)。
乳液調配物中亦可包括許多種不同之非乳化材料，其可賦與乳液性質。此等物質包括脂肪、油類、蠟類、脂肪酸、脂肪醇類、脂肪酯類、保濕劑、親水性膠體、防腐劑與抗氧化劑(Block,in Parmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Volume 1,p.335；Idson,in Parmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.), 1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Volume 1,p.199)。
乳液調配物經由皮膚、口、與非經腸式途徑之用途與其製造方法已有文獻說明(參見例如Ansel’s Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,in Parmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Volume 1,p.199)。
ii.微乳液
本發明之一具體例中，iRNA與核酸之組成物係調配成微乳液。微乳液之定義為由水、油與兩親物形成單一之光學上各向同性且熱力學上安定之液體溶液之系統(參見例如Ansel’s Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.與Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rosoff,in Parmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Volume 1,p.245)。典型微乳液為先讓油分散在水性界面活性劑溶液中，然後添加足量之第四組份所形成之系統，通常添加中鏈長度之醇類，以形成透明系統。因此，微乳液亦稱為兩種不混溶液體之熱動力學上安定之各向同性透明分散液，其係利用表面活性分子之界面膜安定化(Leung and Shah,in：Controlled Release of Drugs：Polymers and Aggregate System,Rosoff,M.,Ed.,1989,VCH Publishers,New York,p.185-215)。
iii.微粒
本發明之iRNA可以併入粒子，例如，微粒中。微粒可由噴霧乾燥法產生，但亦可採用其他方法製造，包括冷凍乾燥、蒸發、流化床乾燥法、真空乾燥、或此等技術之組合。
iv.滲透加強劑
一具體例中，本發明使用各種不同滲透加強劑，讓核酸，特定言之iRNA，有效傳遞至動物皮膚。大多數藥物在溶液中係呈離子化與非離子化兩種型式。然而，通常僅有脂質可溶性或親脂性藥物容易穿越細胞膜。已發現，若膜經過滲透加強劑處理時，即使非親脂性藥物亦可穿越細胞膜。除了協助非親脂性藥物擴散通過細胞膜，滲透加強劑亦可加強親脂性藥物之通透性。
滲透加強劑可分成1至5大類，亦即界面活性劑、脂肪酸、膽鹽類、螯合劑、與非螯合性非界面活性劑(參見例如Malmsten,M.,Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)。上述各類滲透加強劑與其用於製造醫藥及其傳遞藥劑之用途係所屬技術領域習知者。
v.賦形劑
與載劑化合物相反，「醫藥載劑」或「賦形劑」為供傳遞一或多種核酸至動物體之醫藥上可接受之溶劑、懸浮劑或任何其他醫藥惰性媒劑。賦形劑可呈液態或固態，並依計畫之投藥方式選擇，以在與核酸及指定之醫藥組成物中其他組份組合時提供所需之填充體積、堅實度等等。此等製劑係所屬技術領域習知者。
vi.其他組份
本發明之組成物可再包含醫藥組成物中常用且所屬技術領域上已建立用量之其他輔助組份。因此例如，組成物可再包含其他可相容之醫藥活性材料，如例如，止癢劑、收斂劑、局部麻醉藥或消炎劑，或可包含其他適用於物理性調配本發明組成物各種不同劑型之材料，如染劑、調味劑、防腐劑、抗氧化劑、不透明劑、增稠劑與安定劑。然而，當添加此等材料時，不應不當干擾本發明組成物中組份之生物活性。調配物可為經殺菌，且若需要時，可與不與調配物之核酸出現不良交互作用之輔劑混合，例如，潤滑劑、防腐劑、安定劑、濕化劑、乳化劑、影響滲透壓之鹽類、緩衝劑、著色劑、調味劑與/或芳香物質等等。
水性懸浮液可含有增加懸浮液黏度之物質，包括例如，羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、或葡聚糖。該懸浮液亦可含有安定劑。
一些具體例中，如本發明所說明特徵之醫藥組成物包括(a)一或多種iRNA化合物與(b)一或多種其功能為非iRNA機轉且適用於治療KHK-相關疾患之製劑，該疾患例如肝疾病(例如，脂肪肝、脂肪肝炎、酒精性脂肪肝炎(NASH))、脂質血異常(例如，高脂血症、高LDL膽固醇、低HDL膽固醇、高三酸甘油脂血症、飯後高三酸甘油脂血症)、血糖調控之疾患(例如，胰島素抗性、第2型糖尿病)、心血管疾病(例如，高血壓、內皮細胞功能異常)、腎疾病(例如，急性腎疾患、腎小管功能異常、近端腎小管的前炎性變化、慢性腎疾患)、代謝症狀群、脂肪細胞功能異常、內臟脂肪沉積、肥胖、高尿酸血症、痛風、飲食疾患及過度糖渴望。
此等化合物之毒性與預防效力可採用標準醫藥程序，於細胞培養中或實驗動物中測定，例如，測定LD50(造成50%族群死亡時之劑量)與ED50(有效預防50%族群時之劑量)。毒性與醫療效應之間之劑量比值即為醫療指 數，以LD50/ED50比值表示。以醫療指數高之化合物較佳。
可採用由細胞培養分析法與動物研究得到之數據來調配用於人類之劑量範圍。如本發明所說明特徵之組成物之劑量通常落在包括極低或無毒性之ED50，如ED80或ED90，之循環量級範圍內。劑量可依所採用劑型及所利用之投藥途徑，在此範圍內變化。用於如本發明所說明特徵之方法所使用之任何化合物之預防有效劑量可先從細胞培養分析法估測。可在動物模式中調配劑量，以使該化合物或若適當時使靶向序列之多肽產物之循環血漿量級達到(例如，達到多肽量級的減低)包括細胞培養物所決定IC50(亦即試驗化合物使症狀達到一半最大抑制性時之量級)或更高抑制程度之範圍。此等資訊可用於更精確決定適用於人類之劑量。可藉由例如，高效液相層析法測定血漿中量級。
除了如上述投藥法外，如本發明所說明特徵之iRNA可與其他已知可有效預防或治療KHK-相關疾患之製劑組合投藥，該疾患例如肝疾病(例如，脂肪肝、脂肪肝炎、酒精性脂肪肝炎(NASH))、脂質血異常(例如，高脂血症、高LDL膽固醇、低HDL膽固醇、高三酸甘油脂血症、飯後高三酸甘油脂血症)、血糖調控之疾患(例如，胰島素抗性、第2型糖尿病)、心血管疾病(例如，高血壓、內皮細胞功能異常)、腎疾病(例如，急性腎疾患、腎小管功能異常、近端腎小管的前炎性變化、慢性腎疾患)、代謝症狀群、脂肪細胞功能異常、內臟脂肪沉積、肥胖、高尿酸血症、痛風、飲食疾患及過度糖渴望。任何情況下，投藥之醫師均可依據採用所屬技術領域上已知或本文所說明標準效力測定法所觀察到之結果來調整iRNA之投藥量與投藥時程。
VII.抑制KHK表現的方法
本發明亦提供一種抑制細胞中KHK基因表現之方法。該方法包括由細胞與可有效抑制細胞中KHK表現之用量之RNAi劑(例如，雙股RNA劑)接觸，藉以抑制細胞中KHK表現。
細胞可於體外或體內與iRNA(例如，雙股RNA劑)接觸。由體內細胞與iRNA之接觸法包括由個體(例如，人類個體)內之細胞或細胞群與iRNA接觸。亦可能組合於體外及於體內接觸細胞之方法。如上文曾討論，可能直接或間接接觸細胞。此外，可能利用靶向配體(包括本文說明或所屬技術領域上已知之任何配體)接觸到細胞。一些具體例中，靶向配體為碳水化合物部份體，例如，GalNAc3配體、或任何其他可以主導RNAi劑到達感興趣部位之配體。
本文所使用術語「抑制」可與「降低」、「緘默化」、「下調」、「壓制」及其他類似術語交換使用，且包括任何程度之抑制作用。
片語「抑制KHK表現」意指抑制任何KHK基因(如例如，小鼠KHK基因、大鼠KHK基因、猴KHK基因、或人類KHK基因)及KHK基因之變異體或突變體之表現。因此，在遺傳操作細胞、細胞群或生物體中，KHK基因可為野生型KHK基因、突變體KHK基因、或轉殖基因之KHK基因。
「抑制KHK基因之表現」包括KHK基因之任何抑制程度，例如，至少部份壓制KHK基因表現。KHK基因之表現可依據與KHK基因之表現有關之任何變數之程度或程度變化來分析，例如，KHK mRNA量級或KHK蛋白質量級。此量級可在個別細胞中或在細胞群中(包括例如，源自個體之樣本)中分析。
可藉由與KHK表現相關之一或多種變數與對照組量級比較其絕對或相對下降程度，以分析抑制性。對照組量級可能為所屬技術領域上採用之任 何型態之對照組量級，例如，投藥前之基線值或由未處理或接受對照物處理(如例如，僅含緩衝劑之對照物或含無活性劑之對照物)之類似個體、細胞或樣本所測得之量級。
應理解，KHK-相關疾病的徵候升高的程度和持續時間將根據徵候而變化。例如，脂質徵候，例如空腹脂質量級、NAFLD、NASH、肥胖；肝腎功能的徵候以及葡萄糖或胰島素反應是持久的徵候，不會在一天甚至一週內以臨床顯著方式發生變化。其他標誌物，例如血清尿酸和葡萄糖量級，以及尿果糖量級，將在幾天內或幾天之間發生變化。回應果糖，血壓可以暫時和持久地升高。由於果糖可能導致體重增加，至少部分是因為減少了飽腹感，果糖攝入與熱量限制相結合可能不會導致體重增加。
此外，根據個體的疾病狀態，多達三分之一的成人和三分之二的兒童吸收果糖不良(Johnson等人(2013)Diabetes.62：3307-3315)，例如，由於腸道中的GLUT5轉運蛋白。然而，重複的接觸果糖會增加果糖的吸收。果糖代謝已被證明因果糖來源而異，例如，在高果糖玉米糖漿與天然水果中，在高濃度時，例如由軟式飲料提供的濃度，葡萄糖可以藉由多元醇途徑轉化為果糖.然而，果糖比葡萄糖具有更多的代謝作用。身體組成，例如瘦體質量，業經證明影響果糖代謝。因此，必須仔細選擇測試及對照的時間安排。
本發明方法之一些具體例中，KHK基因之表現係受到抑制至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%、或達分析法之檢測程度以下。一些具體例中，KHK基因之表現係受到抑制至少70%。一些具體例中，採用實例2提供之分析法，使用10nM siRNA量級，在適當匹配物種之細胞株中測定表現程度。
某些具體例中，體內之表現抑制性係在表現人類基因之囓齒類(例如，表現人類靶向基因(亦即KHK)之感染AAV之小鼠)內，測定敲弱之人類基因，例如，當投藥單劑，例如，3mg/kg時，RNA表現最低。亦可在模式動物系統中測定減敲弱之內因性基因表現，例如，投藥單劑例如，3mg/kg後，RNA表現最低。此等系統適用於人類基因核酸序列與模式動物基因充分接近時，以致人類iRNA得以提供有效減弱模式動物基因。採用實例2所提供PCR方法來測定肝臟中之RNA表現。
KHK基因表現之抑制性可由其中KHK基因已轉錄且已接受處理(例如，由細胞或細胞群與本發明iRNA接觸，或對含有該細胞或細胞群之個體投藥本發明iRNA)之第一細胞或細胞群(此等細胞可能存在於例如，源自個體之樣本)之mRNA表現量下降來表示，因此當與實質上與該第一細胞或細胞群相同，但未曾接受處理(未經過iRNA或未經過靶向所需基因之iRNA處理之對照組細胞(群))之第二細胞或細胞群比較時，KHK基因表現已受到抑制。一些具體例中，採用實例2提供之方法，於物種匹配之細胞株中，使用10nM siRNA量級分析抑制性，並採用下列公式，由處理組細胞中之mRNA表現量相對於對照組細胞中mRNA量級之百分比表示：
Figure 111106049-A0202-12-0173-72
其他具體例中，對KHK基因表現之抑制性可藉由功能上與KHK基因表現相關之參數之下降程度來分析，例如，來自個體之血液或血清中KHK蛋白質量級。可於任何表現KHK之細胞中，不論內因性或來自表現構築體之異 源性，採用所屬技術領域已知之任何分析法測定KHK基因緘默化。
對KHK蛋白質表現之抑制性可由細胞或細胞群所表現之KHK蛋白質量級或個體樣本中之KHK蛋白質量級(例如，源自個體之血液樣本中之蛋白質量級)之下降量級來分析。如上文mRNA抑制性分析法之說明，處理組細胞或細胞群之蛋白質表現量級之抑制性同樣可由相對於對照組細胞或細胞群之蛋白質量級之百分比表示，或由個體樣本，例如，來自個體之血液或血清中之蛋白質量級變化來表示。
可用於分析KHK基因表現之抑制性之對照組細胞、細胞群或個體樣本包括未曾與本發明RNAi劑接觸之細胞、細胞群或個體樣本。例如，對照組細胞、細胞群、或個體樣本可能源於接受RNAi劑治療前之個體(例如，人類或動物個體)或適當之匹配對照族群。
細胞或細胞群之KHK mRNA表現程度可採用所屬技術領域已知用於分析mRNA表現之任何方法測定。一具體例中，測定樣本中之KHK表現量級時，係檢測轉錄之多核苷酸或其一部份，例如，KHK基因之mRNA。可能採用RNA萃取技術，包括例如，使用酸苯酚/胍異硫氰酸酯萃取法(RNAzol B；Biogenesis)、RNeasyTM RNA製備套組(Qiagen®)或PAXgeneTM(PreAnalytixTM，瑞士)，從細胞中萃取RNA。利用核糖核酸雜交法之典型分析法包括核連綴分析法、RT-PCR、RNase保護分析法、北方墨點法、原位雜交法、與微陣列分析法。
一些具體例中，使用核酸探針測定KHK表現量級。本文所採用術語「探針」係指可以選擇性結合特異性KHK之任何分子。探針可由所屬技術領域中具有通常知識者合成，或衍生自適當之生物製劑。探針可能特別設計帶有標 記物。可用為探針之分子實例包括但不限於：RNA、DNA、蛋白質、抗體、與有機分子。
單離之mRNA可用於雜交或擴增檢測，其包括但不限於：南方或北方分析法、聚合酶鏈反應(PCR)分析法、與探針陣列法。其中一種測定mRNA量級之方法涉及由單離之mRNA與可與KHK mRNA雜交之核酸分子(探針)接觸。一具體例中，mRNA係固定在固態表面，並與探針接觸，例如，讓單離之mRNA流經瓊脂凝膠，讓mRNA從凝膠轉移至膜，如硝基纖維素。替代具體例中，由探針固定在固態表面，讓mRNA與探針接觸，例如，使用Affymetrix®基因晶片陣列。所屬技術領域中具有通常知識者很容易擷用已知之mRNA檢測法來測定KHK mRNA量級。
測定樣本中KHK表現量級之替代方法涉及例如，樣本中mRNA之核酸擴增過程或逆轉錄酶(以製備cDNA)，例如，RT-PCR(述於Mullis,1987，美國專利案案號4,683,202之實驗具體例)、連接酶鏈反應(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189-193)、自主序列複製(Guatelli等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878)、轉錄擴增系統(Kwoh等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177)、Q-β複製酶(Lizardi等人(1988)Bio/Technology 6：1197)、滾環式複製(Lizardi等人，美國專利案案號5,854,033)或任何其他核酸擴增方法，然後採用所屬技術領域中具有通常知識者習知之方法檢測擴增之分子。若核酸分子存在量級極低時，此等檢測程序特別適用於檢測此等核酸分子。本發明特別態樣中，由定量式產螢光式RT-PCR(亦即TaqManTM系統)測定KHK表現量級。一些具體例中，採用實例2提供之分析法，使用例如，10nM siRNA濃度，在匹配物種之細胞株中測定表現量級。
可使用膜墨點(如用於雜交分析法，如北方、南方、斑點等等)，或微孔、樣本試管、凝膠、珠粒或纖維(或任何包含已結合核酸之固態擔體)追蹤KHK mRNA之表現量級。參見美國專利案案號5,770,722、5,874,219、5,744,305、5,677,195與5,445,934，其等揭示內容藉由參照之方式併入本文中。亦包括於溶液中使用核酸探針測定KHK表現程度。
一些具體例中，採用分支之DNA(bDNA)分析法或實時PCR(qPCR)分析mRNA表現量級。此等方法之用法舉例說明於本文所出示之實例中。一些具體例中，採用實例2提供之分析法，使用10nM siRNA濃度，在匹配物種之細胞株中測定表現量級。
可採用所屬技術領域已知用於測定蛋白質量級之任何方法測定KHK蛋白質表現量級。此等方法包括例如，電泳法、毛細管電泳法、高效液相層析法(HPLC)、薄層層析法(TLC)、高擴散性層析法、液相或凝膠沉澱反應、吸光光譜分析計、比色分析法、光譜光度分析法、流式細胞計、免疫擴散法(單向或雙向)、免疫電泳、西方墨點、放射免疫分析法(RIA)、酵素-聯結免疫吸附分析法(ELISA)、免疫螢光分析法、電化學發光分析法等等。
一些具體例中，由(例如，肝臟活體組織中)KHK mRNA或蛋白質量級之下降來分析本發明方法之效力。
本發明方法之一些具體例中，對個體投藥iRNA，使iRNA傳遞至個體內之特定部位。可在衍生自該個體內特定部位(例如，肝臟或血液)之流體或組織之樣本中測定KHK mRNA或KHK蛋白質量級或量級變化，一分析KHK表現之抑制性。
本文所採用術語檢測或測定分析物的量級，咸了解係指執行測定 是否含有例如，蛋白質、RNA等材料之步驟。本文所採用之檢測或測定方法包括檢測或測定低於所採用方法之檢測量級之分析物量級。
VIII. 本發明之預防及治療方法
本發明亦提供一種使用本發明iRNA或包含本發明iRNA之組成物來抑制KHK表現之方法，藉以預防或治療KHK-相關疾患，例如，肝疾病(例如，脂肪肝、脂肪肝炎、酒精性脂肪肝炎(NASH))、脂質血異常(例如，高脂血症、高LDL膽固醇、低HDL膽固醇、高三酸甘油脂血症、飯後高三酸甘油脂血症)、血糖調控之疾患(例如，胰島素抗性、第2型糖尿病)、心血管疾病(例如，高血壓、內皮細胞功能異常)、腎疾病(例如，急性腎疾患、腎小管功能異常、近端腎小管的前炎性變化、慢性腎疾患)、代謝症狀群、脂肪細胞功能異常、內臟脂肪沉積、肥胖、高尿酸血症、痛風、飲食疾患及過度糖渴望。本發明方法中，可由細胞體外或活體內與siRNA接觸，亦即細胞可在個體內。
適合使用本發明方法處理之細胞可為任何表現KHK基因之細胞，例如，肝臟細胞。適合使用本發明方法處理之細胞可為哺乳動物細胞，例如，靈長類細胞(如人類細胞，包括嵌合性非人類動物中之人類細胞，或非人類靈長類細胞，例如，猴細胞、或黑猩猩細胞)、或非靈長類細胞。某些具體例中，細胞為人類細胞，例如，人類肝臟細胞。本發明方法中，細胞中之KHK表現係受到抑制至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、或95、或達分析法之檢測量級以下。
本發明之體內方法可包括對個體投藥包含iRNA之組成物，其中該iRNA所包括之核苷酸序列可與接受投藥RNAi劑之哺乳動物之KHK基因之RNA轉錄物之至少一部份互補。組成物可採用所屬技術領域已知之任何方式投 藥，包括但不限於：經口、經腹膜內、或非經腸式途徑，包括經顱內(例如，腦室內、實質內與鞘內)、經靜脈內、經肌內、皮下、穿皮式、呼吸道(氣霧劑)、經鼻、直腸與局部(包括頰與舌下)投藥。某些具體例中，組成物係經靜脈內輸注或注射投藥。某些具體例中，組成物係經皮下注射投藥。某些具體例中，組成物係經肌內注射投藥。
一態樣中，本發明亦提供一種抑制哺乳動物之KHK基因表現之方法。該方法包括對哺乳動物投藥包含靶向哺乳動物細胞中之KHK基因之dsRNA之組成物，並維持該哺乳動物一段足以達到降解KHK基因之mRNA轉錄物之時間，藉以抑制細胞中之KHK基因表現。可採用所屬技術領域已知之任何方法及採用本文說明之方法，例如，實例2中之例如，qRT-PCR，來分析基因表現之降低。可採用所屬技術領域已知之任何方法，例如，ELISA，分析蛋白質產物之降低。某些具體例中，可採用肝穿刺活體組織檢測樣本作為組織材料，來追蹤KHK基因或蛋白質表現之降低。其他具體例中，以血液樣本作為個體樣本，來追蹤KHK蛋白質表現之降低。KHK表現的降低也可以藉由檢測果糖代謝的一種或多種指標來測量果糖代謝的降低來間接評估，例如，尿液中果糖的存在表明缺乏果糖代謝。
本發明進一步提供一種為有需要之個體治療之方法，例如，經診斷患有KHK-相關疾患之個體，如例如，肝疾病(例如，脂肪肝、脂肪肝炎、酒精性脂肪肝炎(NASH))、脂質血異常(例如，高脂血症、高LDL膽固醇、低HDL膽固醇、高三酸甘油脂血症、飯後高三酸甘油脂血症)、血糖調控之疾患(例如，胰島素抗性、第2型糖尿病)、心血管疾病(例如，高血壓、內皮細胞功能異常)、腎疾病(例如，急性腎疾患、腎小管功能異常、近端腎小管的前炎 性變化、慢性腎疾患)、代謝症狀群、脂肪細胞功能異常、內臟脂肪沉積、肥胖、高尿酸血症、痛風、飲食疾患及過度糖渴望。
本發明進一步提供一種為有需要之個體預防之方法。本發明治療方法包括以本發明iRNA投藥個體，例如，可因降低KHK表現而受益之個體，其係投藥預防有效量之靶向KHK基因之iRNA或包含靶向KHK基因之iRNA之醫藥組成物。
一態樣中，本發明提供治療患有將受益於KHK表現降低的疾病的個體的方法，該疾病例如KHK-相關疾病，如肝疾病(例如，脂肪肝、脂肪肝炎、酒精性脂肪肝炎(NASH))、脂質血異常(例如，高脂血症、高LDL膽固醇、低HDL膽固醇、高三酸甘油脂血症、飯後高三酸甘油脂血症)、血糖調控之疾患(例如，胰島素抗性、第2型糖尿病)、心血管疾病(例如，高血壓、內皮細胞功能異常)、腎疾病(例如，急性腎疾患、腎小管功能異常、近端腎小管的前炎性變化、慢性腎疾患)、代謝症狀群、脂肪細胞功能異常、內臟脂肪沉積、肥胖、高尿酸血症、痛風、飲食疾患及過度糖渴望。
某些具體例中，KHK-相關疾患為肝疾病，例如脂肪肝疾病如NAFLD或NASH。某些具體例中，該KHK-相關疾患為脂質血異常，例如，升高的血清甘油三酯、升高的血清LDL、升高的血清膽固醇、降低的血清HDL、餐後高甘油三酯血症。另一具體例中，KHK-相關疾患為血糖控制疾患，例如不是由針對胰島素的免疫回應引起的胰島素抵抗、葡萄糖阻抗、第2型糖尿病。某些具體例中，KHK-相關疾患為心血管疾病，例如高血壓、內皮細胞功能障礙。某些具體例中，KHK-相關疾患為腎臟疾病，例如急性腎臟疾患、腎小管功能障礙、近端腎小管的前炎性變化、慢性腎臟疾病。某些具體例中，該疾病為代謝綜 合症。某些具體例中，KHK-相關疾患為脂質沉積或功能障礙疾病，例如內臟脂肪沉積、脂肪肝、肥胖症。某些具體例中，KHK-相關疾患為尿酸升高的疾病，例如痛風、高尿酸血症。某些具體例中，KHK相關疾患為飲食障礙，例如過度渴望糖
本發明iRNA可呈「游離iRNA」投藥。游離iRNA係在沒有醫藥組成物之存在下投藥。裸iRNA可含於合適緩衝溶液中。緩衝溶液可能包含乙酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶穀蛋白、碳酸鹽、或磷酸鹽、或其任何組合。一具體例中，緩衝溶液為磷酸鹽緩衝生理生理鹽水(PBS)。可以調整包含iRNA之緩衝溶液之pH與滲透壓，以便適合投藥個體。
或者，本發明iRNA可呈醫藥組成物投藥，如dsRNA脂質體調配物。
可能因抑制KHK基因表現而受益之個體為彼等容易罹患或經診斷罹患KHK-相關疾患之個體，如例如，肝疾病(例如，脂肪肝、脂肪肝炎、酒精性脂肪肝炎(NASH))、脂質血異常(例如，高脂血症、高LDL膽固醇、低HDL膽固醇、高三酸甘油脂血症、飯後高三酸甘油脂血症)、血糖調控之疾患(例如，胰島素抗性、第2型糖尿病)、心血管疾病(例如，高血壓、內皮細胞功能異常)、腎疾病(例如，急性腎疾患、腎小管功能異常、近端腎小管的前炎性變化、慢性腎疾患)、代謝症狀群、脂肪細胞功能異常、內臟脂肪沉積、肥胖、高尿酸血症、痛風、飲食疾患及過度糖渴望。
一具體例中，該方法包括投藥本文說明特徵之組成物，以使靶向KHK基因表現下降，如約1、2、3、4、5、6、1-6、1-3、或3-6個月一劑。某些具體例中，組成物係每3-6個月投藥一次。
一些具體例中，適用於本文所說明特徵之方法與組成物之iRNA特異性靶向靶向KHK基因之RNA(原生或已加工)。使用iRNA抑制此等基因表現之組成物及方法可依本文之說明製備及執行。
根據本發明方法投藥iRNA之結果可以預防或治療KHK-相關疾患，例如，例如，肝疾病(例如，脂肪肝、脂肪肝炎、酒精性脂肪肝炎(NASH))、脂質血異常(例如，高脂血症、高LDL膽固醇、低HDL膽固醇、高三酸甘油脂血症、飯後高三酸甘油脂血症)、血糖調控之疾患(例如，胰島素抗性、第2型糖尿病)、心血管疾病(例如，高血壓、內皮細胞功能異常)、腎疾病(例如，急性腎疾患、腎小管功能異常、近端腎小管的前炎性變化、慢性腎疾患)、代謝症狀群、脂肪細胞功能異常、內臟脂肪沉積、肥胖、高尿酸血症、痛風、飲食疾患及過度糖渴望。
可向個體投藥醫療量之iRNA，如約0.01mg/kg至約200mg/kg。
一些具體例中，iRNA係經皮下投藥，亦即皮下注射。可採用一或多次注射來傳遞所需劑量之iRNA給個體。可以在一段時間內重複注射。
可依規律方式重複投藥。某些具體例中，在初始治療療程後，可依減少頻率之方式投藥治療。重複劑量之療程可包括依規律方式投藥醫療量之iRNA，如每個月一次至一年一次。某些具體例中，iRNA係約每個月投藥一次至約每三個月一次、或約每三個月一次至約每六個月一次。
本發明進一步提供一種以iRNA劑或其醫藥組成物於治療可因降低及/或抑制KHK基因表現而受益之個體，例如，患有KHK-相關疾病之個體之方法與用途，其與其他藥劑及/或其他醫療法組合，例如，組合已知藥劑及/或已知醫療法，如例如，彼等目前用於治療此等疾患者。
因此，本發明的一些態樣中，包括單一本發明iRNA劑之方法中，進一步包括對個體投藥一或多種額外醫療劑。
iRNA劑與額外醫療劑及/或治療法可以同時投藥及/或呈相同組合投藥，例如，非經腸式，或該額外醫療劑可作為分開之組成物之一部份投藥或分開時間投藥及/或採用相關技藝習知或本文說明之另一種方法投藥。
IX. KHK-相關疾病的診斷標準及治療
下文提供各種KHK-相關疾病的診斷標準、治療劑和治療注意事項。
A. 高血壓
血清尿酸量級通常不會獲得作為臨床實驗室值。然而，高尿酸血症(尿酸升高)與許多疾病和病症有關，包括痛風、NAFLD、NASH、代謝紊亂、胰島素抵抗(不是由對胰島素的免疫回應引起的)、心血管疾病、高血壓級2型糖尿病。預期降低KHK表現可用於預防或治療與升高的血清尿酸量級相關的一種或多種病症。此外，預期個體將從血清尿酸量級向正常血清尿酸量級或正常血清尿酸量級(例如不超過6.8mg/dl，例如不超過6mg/dl)的正常化中獲得臨床益處，即使沒有與尿酸升高相關的一種或多種疾病的明顯體症或症狀。
高尿酸血症的動物模型包括，例如，高果糖飲食，例如在大鼠級小鼠中，其可以誘導一種或多種脂肪積累，包括脂肪肝、胰島素抗性、第2型糖尿病、肥胖包括內臟肥胖、代謝綜合症、脂聯素降低分泌、腎功能降低及炎症(參照，例如，Johnson et al.(2013)Diabetes.62：3307-3315)。投藥氧嗪酸(oxonic acid)，一種尿酸酶抑制劑，也可用於誘導高尿酸血症(參照，例如，Mazalli et al.(2001)Hypertens.38：1101-1106)。高尿酸血症的遺傳模型包括可從Jackson實 驗室(/jaxmice.jax.org/strain/002223.html)獲得的the B6；129S7-Uoxtm1Bay/J小鼠，它會發展為高尿酸血症，血清尿酸量級高出10倍。
高尿酸血症的各種治療方法已知於所屬技術領域。然而，有些藥劑只能在有限的族群中使用。例如，別嘌呤醇是一種黃嘌呤氧化酶抑制劑，用於降低血清尿酸量級，用於治療多種疾病，例如痛風、包括缺血再灌注損傷在內的心血管疾病、高血壓、動脈粥狀硬化和中風以及炎症性疾病。Pacher et al.,(2006)Pharma.Rev.58：87-114)。然而，別嘌呤醇禁用於腎功能減低的個體，例如慢性腎病、甲狀腺功能減退、高胰島素血症或胰島素抗性；或在易患腎臟病或腎功能減低的個體中，例如患有高血壓、代謝紊亂、糖尿病和老年人的個體。此外，服用口服促凝劑或丙磺舒的個體以及服用利尿劑的個體不應服用別嘌醇，尤其是噻嗪類利尿劑或其他可降低腎臟功能或具有潛在腎臟毒性的藥物。
某些具體例中，本發明的組成物及方法與其他的組成物及方法聯合使用以治療高尿酸血症，例如，別嘌呤醇、氧嘌呤醇、非布索坦(febuxostat)。某些具體例中，本發明的組成物及方法使用於治療，例如起因於年齡、合併症或藥物交互作用之患有腎功能減低或易患有腎功能減低的個體。
B. 痛風
痛風影響大約每40個成年人中的1個，最常見的是30-60歲的男性。痛風較少影響女性。痛風是少數幾種關節炎之一，藉由治療可以避免未來對關節的損害。痛風的特徵是由於腎臟對尿酸的清除不足或尿酸生成過多導致的高尿酸血症，對關節中的尿酸結晶產生炎症反應引起的急性炎症性關節炎的反復發作。果糖相關痛風有時與腎臟、腸道和肝臟中表達的轉運蛋白變體有關。痛風的特徵是痛風石、尿酸單鈉(MSU)晶體在關節和皮下的形成和沉積。與痛風 相關的疼痛與痛風石的大小無關，而是針對MSU晶體的免疫回應的結果。血清尿酸與痛風石大小的減少率之間存在線性反比關係。例如，在一項針對18名非痛風石痛風患者的研究中，所有個體的血清尿酸在開始降尿酸治療後3個月內降至2.7-5.4mg/dL(0.16-0.32mM)(Pascual and Sivera(2007)Ann.Rheum.Dis.66：1056-1058)。然而，對於痛風病史少於10年的患者，MSU晶體從無症狀的膝關節或第一MTP關節消失需要12個月，而痛風病史超過10年的患者則需要18個月。因此，痛風的有效治療不需要完全清除痛風石或消除所有症狀，例如關節疼痛和腫脹、炎症，而只需減少痛風的至少一種體症或症狀，例如減輕痛風的嚴重程度或頻率，同時降低血清尿酸鹽量級。
痛風的動物模式包括氧嗪酸誘導的高尿酸血症(參照，例如，Jang et al.(2014)Mycobiology.42：296-300)。
目前可用的痛風治療在許多個體中是禁用或無效的。別嘌呤醇是一種常見的降低痛風患者尿酸量級的一線治療藥物，如上所述，在許多族群中禁用，尤其是腎功能減低的族群。此外，許多個體用別嘌呤醇治療失敗，例如，儘管治療仍患有痛風發作的個體，或患有與別嘌呤醇相關的皮疹或超敏反應的個體。
某些具體例中，本發明的組成物及方法與其他劑聯合使用以減低血清尿酸。某些具體例中，本發明的組成物及方法與其他劑聯合使用以治療痛風的症狀，例如，鎖痛劑或抗炎劑，例如，NSAIDS。某些具體例中，本發明的組成物及方法使用於治療例如起因於年齡、合併症或藥物交互作用之患有腎功能減低或易患有腎功能減低的個體。
C. 肝疾病
NAFLD相關於高尿酸血症(Xu et al.(2015)J.Hepatol.62：1412-1419)，而高尿酸血症又相關於升高的果糖代謝。非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的定義要求(a)有肝臟脂肪變性的證據，無論是藉由影像學還是藉由組織學，並且(b)沒有導致繼發性肝臟脂肪堆積的原因，例如大量飲酒、使用致脂劑藥物或遺傳性疾病。在大多數患者中，NAFLD相關於代謝危險因子，例如肥胖、糖尿病和血脂異常。NAFLD在組織學上進一步分類為非酒精性脂肪肝(NAFL)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。NAFL被定義為存在肝脂肪變性，但沒有肝細胞膨脹形式的肝細胞損傷證據。NASH被定義為存在肝脂肪變性和伴有肝細胞損傷(氣球樣變)的炎症，伴有或不伴有纖維化(Chalasani et al.(2012)Hepatol.55：2005-2023)。普遍認為，單純性脂肪變性患者的組織學進展非常緩慢(如果有的話)，而NASH患者的組織學進展可能會發展為肝硬化階段疾病。多項研究報告了NAFLD和NASH患者的長期預後。他們的發現可以總結如下：(a)與匹配的對照人群相比，NAFLD患者的總體死亡率增加，(b)NAFLD、NAFL和NASH患者最常見的死亡原因是心血管疾病，以及(c)NASH患者(但不是NAFL)肝臟相關死亡率增加。
NAFLD的動物模型包括各種高脂肪或高果糖餵養的動物模型。NAFLD的遺傳模型包括可從傑克遜實驗室獲得的B6.129S4-Ptentm1Hwu/J級B6.129S4-Ptentm1Hwu/J小鼠。
NAFLD的治療通常是管理導致NAFLD發展的條件。例如，根據需要，用使膽固醇或甘油三酯正常化的藥物治療血脂異常患者，以治療或預防NAFLD的進一步進展。2型糖尿病患者接受藥物治療以使葡萄糖或胰島素敏感性正常化。生活方式的改變，例如飲食和運動的改變，也可用於治療NAFLD。 在NAFLD的小鼠模型中，別嘌呤醇治療既可以防止肝脂肪變性的發展，又可以顯著改善小鼠體內已建立的肝脂肪變性(Xu et al.,J.Hepatol.62：1412-1419,2015)。
某些具體例中，本發明的組成物及方法與其他劑聯合使用以減低血清尿酸。某些具體例中，本發明的組成物及方法與其他劑聯合使用以治療NAFLD的症狀。某些具體例中，本發明的組成物及方法用於治療例如起因於年齡、合併症或藥物交互作用之患有腎功能減低或易患有腎功能減低的個體。
D. 異常血脂症、血糖調控之疾患、代謝症狀群及肥胖
異常血脂症(例如，高脂血症、高LDL膽固醇、低HDL膽固醇、高三酸甘油脂血症、飯後高三酸甘油脂血症)、血糖調控之疾患(例如，胰島素抗性、第2型糖尿病)、代謝症狀群、脂肪細胞功能異常、內臟脂肪沉積、肥胖及過度糖渴望相關餘生高的果糖代謝。下文提供該等病症的特徵或診斷標準。代謝紊亂的動物模型和成分特徵包括各種高脂肪或高果糖餵養的動物模型。遺傳模型包括瘦素缺陷型B6.Cg-Lep ob/J，通常已知為ob或ob/o小鼠，可從傑克遜實驗室(The Jackson Laboratory)獲得。
脂質的正常及異常空腹量級提供於下表。
Figure 111106049-A0202-12-0186-73
Figure 111106049-A0202-12-0187-74
飯後高三酸甘油脂血症主要是由富含甘油三酯的脂蛋白(TRL)的過度產生或分解代謝減少引起的，為遺傳變異和肥胖及胰島素抗性等疾病的結果。
胰島素抗性的特徵為存在下述至少一者：
1.二次不同時間的空腹血糖量級為100-125mg/dL；或
2.口服葡萄糖耐受試驗，葡萄糖攝入後2小時的葡萄糖量級為140-199mg/dL。
如使用於本文，胰島素抗性不包括由於對所用胰島素的免疫回應而導致對胰島素缺乏反應，這通常發生在胰島素依賴型糖尿病的晚期，尤其是第1型糖尿病。
第2型糖尿病的特徵為下述至少一者：
1.二次不同時間的空腹血糖量級為
Figure 111106049-A0202-12-0188-214
126mg/dL；
2.血紅蛋白A1c(A1C)檢測結果為>6.5%或更高；或
3.口服葡萄糖耐受試驗，葡萄糖攝入後2小時的葡萄糖量級為
Figure 111106049-A0202-12-0188-215
200mg/dL。
2型糖尿病和胰島素抵抗的藥物治療包括使用使血糖正常化的藥物治療，例如二甲雙胍(例如，庫魯化(glucophage)、glumetza)、磺醯脲類(例如，格列本脲(glyburide)、格列吡嗪(glipizide)、格列美脲(glimepiride))、美格替奈類(meglitinide)(例如，瑞格列奈(repaglinide)、那格列奈(nateglinide))、噻唑烷二酮類(羅格列酮(rosiglitazone)、吡格列酮(pioglitazone))、DPP-4抑制劑(西格列汀(sitagliptin)、沙格列汀(saxagliptin)、利格列汀(linagliptin))、GLP-1受體拮抗劑(艾塞那肽(exenatide)、利拉魯肽(liraglutide))和SGLT2抑制劑(如卡格列淨(canagliflozin)、達格列淨(dapagliflozin))。
肥胖症的特徵是體內脂肪過多的疾病。體重指數(BMI)的計算方法是用以千克(kg)為單位的體重除以以米為單位的身高(m)的平方，它為大多數人(但不是所有人)提供了一個合理的體脂估計值。一般來說，BMI低於18.5為體重過輕，18.5至24.9為正常，25.0-29.9為超重，30.0-34.9為肥胖(I級)，35-39.9為肥胖(II級)，40.0和更高者極度肥胖(III級)。
用於評估皮下脂肪與內臟脂肪的方法例如在Wajchenberg(2000)Subcutaneous and visceral adipose tissue：their relation to the metabolic syndrome,Endocr Rev.21：697-738中提供，其藉由參照方式併入本文。
代謝症狀群的特徵是一組疾病，這些疾病被定義為以下五個代謝風險因素中的至少三個：
1.大腰圍(女性>35英寸或男性>40英寸)；
2.高甘油三酯量級(>150mg/dl)；
3.低HDL膽固醇(女性<50mg/dl或男性<40mg/dl)；
4.血壓升高(>130/85)或服用治療高血壓的藥物；和
5.升高的空腹血糖(>100mg/dl)或正在服藥治療高血糖。
與NAFLD一樣，代謝症狀群的治療藥物取決於存在的特定風險因素，例如，當血脂異常時使血脂正常化，當它們異常時使葡萄糖或胰島素敏感性正常化。
代謝症狀群、胰島素抵抗級的2型糖尿病通常與腎功能下降或腎功能下降的可能性有關。
某些具體例中，本發明的組成物及方法用於治療患有血脂異常、血糖控制障礙、代謝症狀群和肥胖症的個體。例如，某些具體例中，本發明的組成物及方法用於患有代謝症狀群、胰島素抗性或第2型糖尿病級慢性腎病的個體。某些具體例中，組成物級方法用於患有代謝症狀群、胰島素抵抗或2型糖尿病且患有心血管疾病、甲狀腺功能減退或炎性疾病中的一種或多種的個體；或老年個體(例如，65歲以上)。某些具體例中，組成物級方法用於患有代謝症狀群、胰島素抗性或第2型糖尿病的個體，這些個體還服用如藥物標籤所示可降低 腎功能的藥物。例如，某些具體例中，本發明的組成物及方法用於正在用口服促凝劑或丙磺舒治療的患有代謝症狀群、胰島素抗性或第2型糖尿病的個體。例如，某些具體例中，本發明的組成物級方法用於患有代謝症狀群、胰島素抗性或第2型糖尿病且正在用利尿劑，尤其是噻嗪類利尿劑治療的個體。
某些具體例中，本發明的組成物及方法與其他劑聯合使用以降低血清尿酸。某些具體例中，本發明的組成物及方法與用於治療代謝症狀群、胰島素抗性或第2型糖尿病症狀的藥劑組合使用。某些具體例中，個體用例如降低血壓的藥劑治療，例如利尿劑、β-阻滯劑、ACE抑制劑、血管緊張素II受體阻滯劑、鈣通道阻滯劑、α阻滯劑、α2受體拮抗劑、組合的α-和β-阻滯劑、中樞激動劑、外周腎上腺素能抑制劑和血管擴張劑；降低膽固醇的藥劑，例如他汀類藥物(statins)、選擇性膽固醇吸收抑制劑、樹脂或降脂療法；或使血糖正常化的藥劑，例如二甲雙胍、磺醯脲類、美格替奈類、噻唑烷二酮類、DPP-4抑制劑、GLP-1受體拮抗劑和SGLT2抑制劑。
某些具體例中，本發明的組成物及方法用於治療例如起因於年齡、合併症或藥物相互作用之腎功能降低或對腎功能降低敏感的個體。
iRNA和另外的治療劑可以同時或以相同的組合施用，例如腸胃外施用，或者另外的治療劑可以作為單獨組合物的一部分或在分開的時間或藉由所屬技術領域已知或此處描述的另一種方法施用。
E. 心血管疾病
某些具體例中，本發明的組成物及方法用於治療患有心血管疾病的個體。例如，某些具體例中，本發明的組成物及方法用於患有心血管疾病和慢性腎病的個體。某些具體例中，組成物及方法用於患有心血管疾病的個體，該個 體患有代謝紊亂、胰島素抵抗、高胰島素血症、糖尿病、甲狀腺功能減退或炎性疾病中的一種或多種。某些具體例中，組合物和方法用於患有心血管疾病的個體，該個體還服用如藥物標籤所示可降低腎功能的藥物。例如，某些具體例中，本發明的組成物及方法用於正在用口服促凝劑或丙磺舒治療的患有心血管疾病的個體。例如，某些具體例中，本發明的組成物及方法用於正在用利尿劑，尤其是噻嗪類利尿劑治療的患有心血管疾病的個體。例如，某些具體例中，本發明的組成物及方法用於用別嘌呤醇治療失敗的患有心血管疾病的個體。
某些具體例中，本發明的組成物及方法與其他藥劑聯合使用以降低血清尿酸。某些具體例中，本發明的組成物及方法與用於治療心血管疾病症狀的劑組合使用，例如降低血壓的藥劑，例如利尿劑、β-阻滯劑、ACE抑制劑、血管緊張素II受體阻滯劑、鈣通道阻滯劑、α-阻斷劑、α-2受體拮抗劑、組合的α-及β-阻斷劑、中樞激動劑、外周腎上腺素能抑制劑及血管擴張劑；或降低膽固醇的藥劑，例如他汀類藥物、選擇性膽固醇吸收抑制劑、樹脂或降脂療法。
F. 腎臟疾病
腎臟疾病包括，例如，急性腎疾患、腎小管功能異常、近端腎小管的前炎性變化及慢性腎疾患。
急性腎功能衰竭發生在腎臟突然無法過濾血液中的廢物，導致血清中危險量級的廢物積累和全身化學物質失衡急性腎功能衰竭可在幾小時或幾天內迅速發展，並且在已經住院的個體中最常見，特別是在需要加護照護的危重症個體。急性腎衰竭可能是致命的且需要加護治療。然而，急性腎衰竭可能為可逆的。如果您身體健康，您可能恢復正常或接近正常的腎臟功能。
慢性腎疾患，也稱為慢性腎衰竭，描述腎功能逐漸喪失。當慢性腎疾患達到晚期，危險量級的流體、電解質和廢物會在體內積聚。腎臟疾病的體徵及症狀可包括噁心、嘔吐、食慾不振、疲勞及虛弱、睡眠問題、尿量變化、精神敏銳度下降、肌肉抽搐及痙攣、打隔、腳與腳踝腫脹、持續瘙癢、胸痛，如果流體在心臟內膜周為積聚則呼吸急促，如果流體在肺液周圍積聚，則高的血液壓力(高血壓)難以控制。慢性腎疾患的徵兆和症狀往往是非特異性的且可能發展緩慢，而且直到出現不可逆轉的損害時才會出現。
腎臟疾病是藉由去除造成腎臟損害的有害藥劑或狀況予以治療，例如，正常化血壓以改善腎功能、終止使用可誘導腎損傷的藥劑的治療、減低引起腎臟損傷的炎症或提供腎支持(例如，腎透析)以幫助腎臟功能。
腎功能通常使用一項或多項常規實驗室測試予以測定，BUN(血尿素氮)、肌酐(血液)、肌酐(尿)或肌酐清除率(參照，例如，www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/003435.htm)。這些測試也可以診斷其他器官的狀況。
一般而言，6至20mg/dL的BUN量級被認為是正常的，儘管不同實驗室的正常值可能有所不同。BUN量級升高可能預示著腎臟疾病，包括腎小球腎炎、腎盂腎炎和急性腎小管壞死或腎衰竭。
血肌酐的正常結果是男性為0.7至1.3mg/dL，女性為0.6至1.1mg/dL。血肌酐升高可能表明由於腎損傷或衰竭、感染或血流量減低導致腎功能減低。
尿肌酐(24小時樣本)值範圍為500至2000毫克/天。結果取決於年齡和瘦體重。正常結果是男性每天每公斤體重14到26毫克，女性每天每公 斤體重11到20毫克。異常結果可能表明腎臟受損，例如腎小管細胞受損、腎功能衰竭、流向腎臟的血流量減少或腎臟感染(腎盂腎炎)。
肌酐清除率測試藉由比較尿液中的肌酐量級和血液中的肌酐量級來幫助提供有關腎功能的信息。清除率通常以每分鐘毫升數(ml/min)來衡量。正常值為97至137毫升/分鐘。男性和88至128毫升/分鐘。女用。低於正常值的肌酐清除率可能表明腎臟受損，例如腎小管細胞受損、腎功能衰竭、流向腎臟的血流量或腎臟中的腎小球濾過減少。
某些具體例中，本發明之組成物及方法可使用於治療腎臟疾病。預期該等劑不對腎臟引起傷害。
VII. 套組
在某些方面，本公開提供的套組包括合適的容器，該容器含有siRNA化合物的藥物製劑，例如雙股siRNA化合物或siRNA化合物(例如前體，例如，較大的siRNA化合物，其可加工成siRNA化合物或編碼siRNA化合物的DNA，例如，雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物或其前體)。
該套組包括一或多個dsRNA劑及使用指示，例如，用於投藥預防或治療有效量的dsRNA劑的指示。該dsRNA劑可於小瓶中或於預填充注射器中。套組可視需要進一步包含用於投藥該dsRNA劑的手段(例如，注射裝置，如欲填充注射器)或用於測定KHK抑制性的手段(例如，用於測定KHK RNA、KHK蛋白質及/或KHK活性的手段)。該用於測定KHK抑制性的受段可包含用於獲得來自對象之樣本的手段，如，例如，血漿樣本。本發明之套組可視需要地進一步包含用於測定治療有效量或預防房有效量的手段。
某些具體例中，醫藥製劑的各個組分可以在一個容器中提供，例如小瓶或預填充注射器。替代地，可能希望在兩個或更多個容器中分別提供醫藥製劑的組分，例如，一個容器用於siRNA化合物製劑，並且至少另一個容器用於載體化合物。該套組可以以多種不同的配置進行包裝，例如一或多個容器裝在單一盒中。不同的成分可以組合，例如，根據附隨套組提供的說明。可以根據本文所述的方法組合這些成分，例如，以製備及投藥醫藥組成物。該套組也可包括遞送裝置。
本發明藉由下述實施例進一步例示性說明，該等實施例不應視為限制性。本說明書通篇所引用之全部參考文獻、專利及公開專利申請之整體內容以及圖式及序列表藉由參照而併入本文。
實施例
實施例1. iRNA合成
試劑之來源
若本文中未具體給出試劑之來源，則測量試劑可從任何分子生物學用試劑供應商以用於分子生物學應用之品質/純度標準獲得。
siRNA設計
使用客製R及Python腳本設計靶向人類KHK(human NCBI refseqID：XM_017004061.1；NCBI基因ID：3795)的siRNA。人類KHK REFSEQ mRNA具有2283鹼基的長度。
未修飾的KHK有義股及反義股的核苷酸序列的詳細列表係示於表2、5及8。經修飾的KHK有義股及反義股的核苷酸序列的詳細列表係示於表3、6及9。
應理解，本申請通篇中，不具小數之雙鏈體名稱等同於具有小數之雙鏈體名稱，其僅引用雙鏈體之批號。例如，AD-959917等同於AD-959917.1。
siRNA合成
使用所屬技術領域習知的方法設計、合成及製備siRNA。
簡言之，使用Mermade 192合成儀(BioAutomation)，於固體支撐體使用亞膦醯胺化學作用，以1μmol規格合成siRNA序列。固體支撐體係負載有客製GalNAc配位子(3’-GalNAc接合物)的受控之有孔玻璃(500-1000Å)、通用固體支撐體(AM Chemicals)或感興趣之第一核苷酸。輔助合成試劑及標準2-氰基乙基亞膦醯胺單體(2’-去氧-2’-氟、2’-O-甲基、RNA、DNA)係獲自Thermo-Fisher(Milwaukee,WI)、Hongene(China)或Chemgenes(Wilmington,MA,USA)。額外之亞膦醯胺單體係自供應商處購得、於現場製備、或使用來自各種CMO之客製合成獲得。亞膦醯胺以100mM之量級於乙腈或9：1乙腈：DMF中製備，且使用5-乙硫基-1H-四唑(ETT，於乙腈中之0.25M溶液)偶聯，反應時間為400秒。硫代磷酸酯鏈結使用3-((二甲胺基-亞甲基)胺基)-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT，獲自Chemgenes(Wilmington,MA,USA))之100mM溶液於無水乙腈/吡啶(9：1 v/v)中生成。氧化時間係5分鐘。全部序列皆合成為最終去除DMT(「DMT-off」)。
一旦固相合成完成，即將固體支撐之寡核糖核苷酸以300μL之甲胺(40%水溶液)於室溫在96孔盤中處理大約2小時，以造成從固體支撐體裂解以及後續之全部額外的鹼不穩定保護基團的去除。對於含有經第三丁基二甲基矽基(TBDMS)基團保護之任意天然核糖核苷酸鏈結(2’-OH)的序列，係使用TEA.3HF(三乙胺三氫氟酸鹽)實施第二去保護步驟。向每一種於甲胺水溶 液中之寡核苷酸溶液加入200μL之二甲基亞碸(DMSO)及300μL TEA.3HF，並將該溶液於60℃培育大約30分鐘。培育之後，使盤來至室溫，藉由加入1mL之9：1乙腈：乙醇或1：1乙醇：異丙醇而沉澱粗製寡核苷酸。然後將盤於4℃離心45分鐘，在多通道滴管之輔助下小心地傾倒上清部分。將寡核苷酸小粒重新懸浮於20mM NaOAc，接著，於配備自動採樣器、UV偵檢器、電導計及分液收集器之Agilent LC系統，使用HiTrap尺寸排阻管柱(5mL，GE Healthcare)脫鹽。經脫鹽之樣本係收集於96孔盤，然後藉由LC-MS及UV分光光度計分析以分別證實材料之鑑定及定量。
於Tecan液體操作機器人實施單股之雙鏈體化。於96孔盤中，將正義單股及反義單股以等莫耳比率於1x PBS中合併至10μM之最終量級，將盤密封，於100℃培育10分鐘，之後使其歷時2至3小時之期間緩慢回至室溫。證實了各雙鏈體之量級及鑑定，然後將其用於體外篩選檢測。
實施例2. 體外篩選方法
HepG2細胞培養及96-孔轉染
HepG2細胞於藉由胰蛋白酶作用由盤釋放之前於37℃、於5% CO2氛圍、於補充有10% FBS(ATCC)的Eagle’s Minimum Essential Medium(Gibco)生長至接近匯合。轉染係藉由每孔添加18.5μl的Opti-MEM加上0.25μl的Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen,Carlsbad CA.cat # 13778-150)至5μl的各siRNA雙鏈體至96-孔盤的個別孔而進行。然後混合物於室溫培育15分鐘。然後無抗生素之含有~2 x104個HepG2細胞的80μl完全生長培養基添加至siRNA混合物。RNA純化前培育細胞24小時。單劑量試驗係於10、1及0.1nM最終雙鏈體量級實施。
使用DYNABEADS mRNA單離套組之總RNA單離(Invitrogen TM ,part #：610-12)
於每一孔中，將細胞於含有3μL珠粒的75μl之裂解/結合緩衝液中裂解，且於靜電式振盪器混合10分鐘。使用磁性板支撐體，於Biotek EL406自動執行清洗步驟。珠粒於緩衝液A中清洗(在90μL中)一次，在緩衝液B中清洗一次，並且在緩衝液E中清洗二次，中間有抽吸步驟。最終抽吸後，將完整的11μL RT混合物添加到每一孔中，如下所揭示。
使用ABI高效cDNA反轉錄套組(Applied Biosystems,Foster City,CA,Cat #4368813)的cDNA合成
每一反應中，將1μl 10X緩衝液、0.4μl 25X dNTP、1μl隨機引子、0.5μl反轉錄酶、0.5μl RNase抑制劑及6.6μl之H2O的主混合物添加到每孔中。將盤密封，於靜電式振盪器攪動10分鐘，隨後於37℃培育2小時。之後，將盤於80℃攪動8分鐘。
實時PCR
於384孔盤(Roche cat # 04887301001)的每孔添加二微升(μl)的cDNA至含有0.5μl的人類GAPDH TaqMan探針(4326317E)、0.5μl人類KHK、2μl無核酸酶的水及5μl Lightcycler 480探針主混合物(Roche Cat # 04887301001)的主混合物。實時PCR係於LightCycler480 Real Time PCR系統(Roche)完成。
為了計算相對倍數變化，使用△△Ct方法且正規化至經以10nM AD-1955轉染的細胞或假轉染的細胞實施的檢測進行分析數據。使用XLFit且正規化至經以10nM AD-1955轉染的細胞或假轉染的細胞而使用4參數擬合模型計算IC50。AD-1955的有義股序列及反義股序列為；正義： cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT(SEQ ID NO：18)及反義UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT(SEQ ID NO：19)。
表2及表3所列之dsRNA劑於HepG2細胞的轉染檢測結果示於表4。
表1. 核苷酸序列呈現中使用之核苷酸單體的縮寫。應理解，當此等單體存在於寡核苷酸中，其係藉由5’-3’-磷酸二酯鍵而相互鏈結；並且應理解，當核苷酸含有2’-氟修飾時，則該氟替換位於其母體核苷酸中該位置處之羥基(亦即，其係2’-去氧-2’-氟核苷酸)。
Figure 111106049-A0202-12-0198-75
Figure 111106049-A0202-12-0199-76
Figure 111106049-A0202-12-0200-77
表2. KHK dsRNA的未修飾正義股序列及反義股序列
Figure 111106049-A0202-12-0201-216
Figure 111106049-A0202-12-0202-80
Figure 111106049-A0202-12-0203-81
Figure 111106049-A0202-12-0204-82
Figure 111106049-A0202-12-0205-83
Figure 111106049-A0202-12-0206-84
Figure 111106049-A0202-12-0207-85
Figure 111106049-A0202-12-0208-86
Figure 111106049-A0202-12-0209-217
表3. KHK dsRNA的經修飾正義股序列及反義股序列
Figure 111106049-A0202-12-0209-219
Figure 111106049-A0202-12-0210-90
Figure 111106049-A0202-12-0211-91
Figure 111106049-A0202-12-0212-92
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Figure 111106049-A0202-12-0214-94
Figure 111106049-A0202-12-0215-95
Figure 111106049-A0202-12-0216-96
Figure 111106049-A0202-12-0217-97
Figure 111106049-A0202-12-0218-98
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Figure 111106049-A0202-12-0220-100
Figure 111106049-A0202-12-0221-101
表4. HepG2細胞中的KHK劑量篩選
Figure 111106049-A0202-12-0222-102
Figure 111106049-A0202-12-0223-103
Figure 111106049-A0202-12-0224-104
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Figure 111106049-A0202-12-0228-108
Figure 111106049-A0202-12-0229-109
Figure 111106049-A0202-12-0230-110
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Figure 111106049-A0202-12-0232-112
Figure 111106049-A0202-12-0233-113
實施例3. 額外的dsRNA雙鏈體的設計、合成及體外篩選
使用所屬技術領域習知的方法以及上述實施例1所述的方法，設計、合成及製備額外的雙鏈體。
未修飾的KHK有義股及反義股的核苷酸序列的詳細列表係示於表5。經修飾的KHK有義股及反義股的核苷酸序列的詳細列表係示於表6。
對於轉染，Hep3b細胞(ATCC,Manassas,VA)於藉由胰蛋白酶作用由盤釋放之前於37℃、於5% CO2氛圍、於補充有10% FBS(ATCC)的Eagle’s Minimum Essential Medium(Gibco)生長至接近匯合。轉染係藉由每孔添加7.5μl的Opti-MEM加上0.1μl的Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen,Carlsbad CA.cat # 13778-150)至2.5μl的各siRNA雙鏈體至384-孔盤的個別孔而進行。然後混合物於室溫培育15分鐘。然後無抗生素之含有~1.5 x104個Hep3b 細胞的40μl完全生長培養基添加至siRNA混合物。RNA純化前培育細胞24小時。單劑量試驗係於10nM最終雙鏈體量級實施。
總RNA單離係使用DYNABEADS實施。簡明地，細胞於每孔10μl之含有3μL珠粒的Lysis/Binding Bufferof裂解且於靜電振盪器混合10分鐘。清洗步驟係使用磁性盤支持體於Biotek EL406自動化。珠粒於(於3μL)Buffer A清洗一次，於Buffer B清洗一次，以及於Buffer E清洗二次，中間有抽吸步驟。最終抽吸後，如下文所述，對各孔添加12μL RT混合物。
對於cDNA合成，每孔添加每反應1.5μl 10X Buffer、0.6μl 10X dNTPs、1.5μl Random primers,0.75μl Reverse Transcriptase、0.75μl RNase抑制劑及9.9μl的H2O之主混合物(master mix)。將盤密封，於靜電式振盪器攪動10分鐘後，於37℃培育2小時。之後，將盤於80℃攪動8分鐘。
RT-qPCR係如上述方式實施且如上述方式計算相對倍數變化。
表5及表6中所列之dsRNA劑於Hep3b細胞的轉染檢測的結果係示於表7。
表8提供選擇的dsRNA劑之未修飾的KHK有義股及反義股的核苷酸序的列表。表9提供選擇的dsRNA劑之經修飾的KHK有義股及反義股的核苷酸序的列表。
表5. KHK dsRNA的未修飾的正義股序列及反義股序列
Figure 111106049-A0202-12-0235-221
Figure 111106049-A0202-12-0236-223
表6. KHK dsRNA的經修飾的正義股序列及反義股序列
Figure 111106049-A0202-12-0236-224
Figure 111106049-A0202-12-0237-117
Figure 111106049-A0202-12-0238-118
表7. Hep3b細胞中的KHK單劑量篩選
Figure 111106049-A0202-12-0239-119
表8. KHK dsRNA的未修飾的正義股序列及反義股序列
Figure 111106049-A0202-12-0240-225
Figure 111106049-A0202-12-0241-226
表9. KHK dsRNA的經修飾的正義股序列及反義股序列
Figure 111106049-A0202-12-0241-227
Figure 111106049-A0202-12-0242-123
Figure 111106049-A0202-12-0243-124
實施例4. 額外的dsRNA雙鏈體的設計、合成及體外篩選
額外的siRNA係使用實施例1所述的方法予以設計、合成及製備。
額外的未修飾的KHK有義股及反義股的核苷酸序列的詳細列表係示於表10。經修飾的KHK有義股及反義股的核苷酸序列的詳細列表係示於表11。
表10. KHK dsRNA的未修飾的正義股序列及反義股序列
Figure 111106049-A0202-12-0245-229
Figure 111106049-A0202-12-0246-126
Figure 111106049-A0202-12-0247-127
Figure 111106049-A0202-12-0248-128
Figure 111106049-A0202-12-0249-129
Figure 111106049-A0202-12-0250-130
Figure 111106049-A0202-12-0251-131
Figure 111106049-A0202-12-0252-132
Figure 111106049-A0202-12-0253-133
Figure 111106049-A0202-12-0254-230
表11. KHK dsRNA的經修飾的正義股序列及反義股序列
Figure 111106049-A0202-12-0254-231
Figure 111106049-A0202-12-0255-137
Figure 111106049-A0202-12-0256-138
Figure 111106049-A0202-12-0257-139
Figure 111106049-A0202-12-0258-140
Figure 111106049-A0202-12-0259-141
Figure 111106049-A0202-12-0260-142
Figure 111106049-A0202-12-0261-143
Figure 111106049-A0202-12-0262-144
Figure 111106049-A0202-12-0263-145
Figure 111106049-A0202-12-0264-146
Figure 111106049-A0202-12-0265-147
Figure 111106049-A0202-12-0266-148
Figure 111106049-A0202-12-0267-149
Figure 111106049-A0202-12-0268-150
實施例5. 額外的dsRNA雙鏈體的設計、合成及活替外篩選
基於體外分析物，實施結構-活性關係(SAR)分析。特別地，設計、合成及檢測額外的雙鏈體。
siRNA係使用上述方法設計、合成及製備。如上述方式以該等siRNA於Hep3B細胞及PCH細胞實施體外篩選檢測。
未修飾的KHK有義股及反義股的核苷酸序列的詳細列表係示於表12。經修飾的KHK有義股及反義股的核苷酸序列的詳細列表係示於表13。
對於轉染，細胞(ATCC,Manassas,VA)於藉由胰蛋白酶作用由盤釋放之前於37℃、於5% CO2氛圍、於補充有10% FBS(ATCC)的Eagle’s Minimum Essential Medium(Gibco)生長至接近匯合。轉染係藉由每孔添加7.5μl的Opti-MEM加上0.1μl的Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen,Carlsbad CA.cat # 13778-150)至2.5μl的各siRNA雙鏈體至384-孔盤的個別孔而進行。然後混合物於室溫培育15分鐘。然後無抗生素之含有~1.5 x104個細胞的40μl完全生長培養基添加至siRNA混合物。RNA純化前培育細胞24小時。單劑量試驗係於10、1及0.1nM最終雙鏈體量級實施。
總RNA單離係使用DYNABEADS實施。簡明地，細胞於每孔10μl之含有3μL珠粒的Lysis/Binding Bufferof裂解且於靜電振盪器混合10分鐘。清洗步驟係使用磁性盤支持體於Biotek EL406自動化。珠粒於(於3μL)Buffer A清洗一次，於Buffer B清洗一次，以及於Buffer E清洗二次，中間有抽吸步驟。最終抽吸後，如下文所述，對各孔添加12μL RT混合物。
對於cDNA合成，每孔添加每反應1.5μl 10X Buffer、0.6μl 10X dNTPs、1.5μl Random primers,0.75μl Reverse Transcriptase、0.75μl RNase抑制劑 及9.9μl的H2O之主混合物(master mix)。將盤密封，於靜電式振盪器攪動10分鐘後，於37℃培育2小時。之後，將盤於80℃攪動8分鐘。
RT-qPCR係如上述方式實施且如上述方式計算相對倍數變化。表12及表13中所列之dsRNA劑於Hep3B細胞的轉染檢測的結果係示於表14。表12及表13中所列之dsRNA劑於靈長類食蟹獼猴肝細胞(PCH)的轉染檢測結果係示於表15。
對於Dual-Glo®螢光素酶檢測，細胞(ATCC,Manassas,VA)於藉由胰蛋白酶作用由盤釋放之前於37℃、於5% CO2氛圍、於補充有10% FBS(ATCC)的Eagle’s Minimum Essential Medium(Gibco)生長至接近匯合。Dual-Glo®螢光素酶構築物係產生於含有人類KHK基因體序列的psiCHECK2質體。各雙-螢光素酶質體係使用Lipofectamine 2000(Invitrogen,Carlsbad CA.cat # 11668-019)與siRNA(表12及表13)共轉染至大約2x104個細胞。對於96孔盤之各孔，添加0.5μl的Lipofectamine至100ng的質體載體及單一siRNA(表12及表13)於14.8μl的Opti-MEM且使複合物於室溫15分鐘。然後將混合物添加至經懸浮於80μl的新鮮完全培養基的細胞。細胞培育24校時候測定螢光素酶。單劑量試驗係於10、1及0.1nM最終雙鏈體量級實施。
在siRNA轉染48小時後，測量Firefly(轉染對照)及Rinella(融合至KHK靶向序列)螢光素酶。首先，由細胞移除培養基。然後藉由添加75μl of Dual-Glo® Luciferase Reagent等量於培養劑容積至各孔且混合而測量Firefly螢光素酶活性。混合物於室溫培育30分鐘後於Spectramax(Molecular Devices)測量發光(500nm)以偵測Firefly螢光素酶信號。Renilla螢光素酶活性係藉由添加75μl的室溫Dual-Glo® Stop & Glo® Reagent至各孔且將盤培育10-15分鐘 後，再次測定發光以測定Renilla螢光素酶信號。Dual-Glo® Stop & Glo® Reagent猝冷螢火蟲螢光素酶信號以及持續發光係對於Renilla螢光素酶反應。藉由於各孔內將Renilla(KHK)信號正規化至Firefly(對照)信號而測定siRNA活性。然後評估siRNA活性相對於以相同載體轉染但未經以siRNA或以非-靶向si-RNA處理的細胞的量。所有轉接進行四重複。
表16顯示經以表12及表13指示的劑轉染的細胞之單劑量篩選的Dual-Glo® Luciferase檢測結果。
表12. KHK dsRNA的未修飾的正義股序列及反義股序列
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表13. KHK dsRNA的經修飾的正義股序列及反義股序列
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表14. Hep3b細胞中的KHK單劑量篩選
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表15. PCH細胞中的KHK單劑量篩選
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表16. KHK單劑量篩選(雙-螢光素酶檢測)
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實施例6：siRNA-GalNAC接合物於非人類靈長類的功效
上述堤外研究中所鑑定的候選者的功效，雙鏈體AD-1613062、AD-1613073、AD-1613242、AD-1613243、AD-1613246、AD-1613247、AD-1613400、AD-1634397、AD-1634424及AD-1634425，係進一步研究其於非人類靈長類的有效性。具體地，單劑量3mg/kg之AD-1613062、AD-1613073、AD-1613242、AD-1613243、AD-1613246、AD-1613247、AD-1613400、AD-1634397、AD-1634424或AD-1634425係皮下投藥至食蟹獼猴。於用藥後29日、50日及78日收及血清及組織樣本。
使用來自Macherey-Nagel的NucleoMag RNA套組藉由磁性珠粒為主的抽取方法由肝組織抽取mRNA。使用Applied Biosystems SuperScript IV VILO master mix產生cDNA。使用Taqman探針為主的qPCR定量KHK mRNA，其係正規化至家管基因、ARL6IP4及PPIB的幾何平均。
食蟹獼猴乾鐘的KHK蛋白質的靶向定量係經由在正離子模式下使用平行反應監測(PRM)偶合至質譜儀(LC-MS)的液相層析而實施。選擇用於定量的特徵肽序列為HLGFQSAGEALR(UniProtKB-A0A2K5V1R8-1，胺基酸位置198-209)。
圖2顯示單一3mg/kg劑量之選擇的雙鏈體投藥於用藥後29日對KHK mRNA及蛋白質的量級的功效。
圖3顯示單一3mg/kg劑量之選擇的雙鏈體投藥於用藥後50日對KHK mRNA及蛋白質的量級的功效。
圖4顯示單一3mg/kg劑量之選擇的雙鏈體投藥於用藥後78日對KHK mRNA及蛋白質的量級的功效。
數據展現所指示的劑，例如，AD-1613400及AD-1613243，有效於持久地及強力地抑制KHK Mrna及蛋白質表現。
等效物
彼等熟識本領域者應知悉或能夠僅使用常規實驗來探明本文所揭示之特定具體例及方法的多種等效物。此類等效物意圖涵蓋於下列申請專利範圍之範疇內。

Claims (108)

  1. 一種用於抑制己酮糖激酶(KHK)於細胞之表現的雙股核糖核酸(dsRNA)劑，其中，該dsRNA包含形成雙股區域的有義股及反義股，其中，該反義股包含互補於編碼KHK的mRNA的區域，以及其中，該互補區域包含與表2、3、5、6及8至13中任一者的任一反義核苷酸序列之差異不多於3個核苷酸的至少15個接續核苷酸。
  2. 如請求項1所述的dsRNA劑，其中，該dsRNA劑包含與表2、3、5、6及8至13中任一者的任一有義股核苷酸序列差異不多於三個核苷酸的至少15個接續核苷酸的有義股以及包含與表2、3、5、6及8至13中任一者的任一反義股核苷酸序列差異不多於三個核苷酸的至少15個接續核苷酸的反義股。
  3. 如請求項1所述的dsRNA劑，其中，該dsRNA劑包含與表2、3、5、6及8至13中任一者的任一有義股核苷酸序列差異不多於二個核苷酸的至少15個接續核苷酸的有義股以及包含與表2、3、5、6及8至13中任一者的任一反義股核苷酸序列差異不多於二個核苷酸的至少15個接續核苷酸的反義股。
  4. 如請求項1所述的dsRNA劑，其中，該dsRNA劑包含與表2、3、5、6及8至13中任一者的任一有義股核苷酸序列差異不多於一個核苷酸的至少15個接續核苷酸的有義股以及包含與表2、3、5、6及8至13中任一者的任一反義股核苷酸序列差異不多於一個核苷酸差異的至少15個接續核苷酸的反義股。
  5. 如如請求項1所述的dsRNA劑，其中，該dsRNA劑包含有義股及反義股，該有義股包含選自由表2、3、5、6及8至13中任一者的任一有義股核苷酸序列所組成群組的核苷酸序列以及該反義股包含選自由表2、3、5、6及8至13中任一者的任一反義股核苷酸序列所組成群組的核苷酸序列。
  6. 一種用於抑制己酮糖激酶(KHK)於細胞之表現的雙股核糖核酸(dsRNA)劑，其中，該dsRNA包含形成雙股區域的有義股及反義股，其中，該有義股包含與SEQ ID NO：1的核苷酸的核苷酸序列：120-162、164-188、181-207、193-217、209-231、283-306、508-546、568-603、596-632、640-674、746-806、806-835、917-942、936-084、1016-1041、1100-1123、1149-1175、1160-1193、1205-1229、1252-1283、1334-1356、1407-1429、1472-1497、1506-1533、1539-1561、1704-1727、1747-1787、1850-1873、1936-1964、1960-1990、2015-2048、2060-2095、2090-2118、2124-2160、2181-2200、2221-2262的任一者差異不多於三個核苷酸的至少15個接續核苷酸，以及該反義股包含與SEQ ID NO：2的相應核苷酸序列差異不多於三個核苷酸的至少15個接續核苷酸。
  7. 一種用於抑制己酮糖激酶(KHK)於細胞之表現的雙股核糖核酸(dsRNA)劑，其中，該dsRNA包含形成雙股區域的有義股及反義股，其中，該有義股包含與SEQ ID NO：1的核苷酸的核苷酸序列：517-539、521-543、524-546、517-546、581-603、610-632、747-769、749-771、752-774、755-777、757-779、758-780、764-786、776-798、781-803、747-803、920-942、941-963、944-966、950-972、962-984、920-984、1149-1171、1161-1183、1165-1187、1171-1193、1149-1193、1205-1227、1206-1228、1205-1228、1334-1356、1472-1494、1475-1497、1472-1497的任一者差異不多於三個核苷酸的至少15個接續核苷酸，以 及該反義股包含與SEQ ID NO：2的相應核苷酸序列差異不多於三個核苷酸的至少15個接續核苷酸。
  8. 一種用於抑制己酮糖激酶(KHK)於細胞之表現的雙股核糖核酸(dsRNA)劑，其中，該dsRNA包含形成雙股區域的有義股及反義股，其中，該有義股包含與SEQ ID NO：1的核苷酸的核苷酸序列：517-539、524-546、517-546、753-775、757-779、753-779、764-786、767-789、768-790、769-791、764-791、773-795、781-803、773-803、753-803、808-830、937-959、941-963、944-966、941-966、948-970、950-972、948-972、1160-1182、1161-1183、1160-1183、及1207-1229的任一者差異不多於三個核苷酸的至少15個接續核苷酸，以及該反義股包含與SEQ ID NO：2的相應核苷酸序列差異不多於三個核苷酸的至少15個接續核苷酸。
  9. 如請求項1至8中任一項所述之dsRNA劑，其中該反義股包含與選自由AD-1613400、AD-1613243、AD-1290757.3、AD-1290878.3、AD-1290969.3、AD-1423317.2、AD-1423327.2、AD-1423336.2、AD-1290599.3、AD-1523172.1、AD-1290837.3、AD-1523173.1、AD-1290884.3、AD-1523174.1、AD-1290959.3、AD-1523175.1、AD-1423311.2、AD-1423324.2、AD-1523176.1、AD-1423329.2、AD-1423333.2、AD-1423330.2、AD-1523177.1、AD-1290885.3、AD-1523178.1、AD-1423334.2、AD-1523179.1、AD-1523180.1、AD-1290539.3、及AD-1523181.1所組成群組的雙鏈體的任一反義股核苷酸序列差異不多於三個核苷酸的至少15個接續核苷酸。
  10. 一種用於抑制己酮糖激酶(KHK)於細胞之表現的雙股核糖核酸(dsRNA)劑，其中，該dsRNA包含形成雙股區域的有義股及反義股，其中， 該有義股包含與SEQ ID NO：1的核苷酸的核苷酸序列：495-517、492-517、500-529、514-551、517-539、524-546、517-548、614-643、625-647、625-660、642-664、642-672、753-811、754-780、762-791、764-786、772-800、781-803、805-827、808-830、809-831、792-838、931-982、944-966、947-969、948-970、948-982、1011-1035、1021-1043、1019-1050、1063-1091、1150-1192、1152-1176、1160-1192、1160-1182、1162-1184、1198-1230、1198-1221、及1202-1230的任一者差異不多於三個核苷酸的至少15個接續核苷酸，以及該反義股包含與SEQ ID NO：2的相應核苷酸序列差異不多於三個核苷酸的至少15個接續核苷酸。
  11. 一種雙股核糖核酸(dsRNA)劑，其係用於抑制己酮糖激酶(KHK)於細胞之表現，其中，該dsRNA包含形成雙股區域的有義股及反義股，其中，該有義股包含與SEQ ID NO：1的核苷酸的核苷酸序列：513-556、753-813、936-981、1155-1193、1200-1229、1704-1727、1747-1787、1850-1873、1936-1964、1960-1990、1936-1990、2015-2048、2060-2095、2090-2118、2060-2118、2124-2160、2181-2220、2221-2249、2181-2249、2240-2262、2221-2262、及2181-2262的任一者差異不多於三個核苷酸的至少15個接續核苷酸，以及該反義股包含與SEQ ID NO：2的相應核苷酸序列差異不多於三個核苷酸的至少15個接續核苷酸。
  12. 一種用於抑制己酮糖激酶(KHK)於細胞之表現的雙股核糖核酸(dsRNA)劑，其中，該dsRNA包含形成雙股區域的有義股及反義股，其中，該有義股包含與SEQ ID NO：1的核苷酸1207-1229或937-959的核苷酸序列差異不多於三個核苷酸的至少15個接續核苷酸，以及該反義股包含與SEQ ID NO：2的相應核苷酸序列差異不多於三個核苷酸的至少15個接續核苷酸。
  13. 如請求項12所述的dsRNA劑，其中該有義股包含與SEQ ID NO：1的核苷酸1207-1229的核苷酸序列差異不多於三個核苷酸的至少15個接續核苷酸，以及該反義股包含與SEQ ID NO：2的相應核苷酸序列差異不多於三個核苷酸的至少15個接續核苷酸。
  14. 如請求項1至13中任一項所述的dsRNA劑，其中，該dsRNA包含至少一個經修飾的核苷酸。
  15. 如請求項1至14中任一項所述的dsRNA劑，其中，該有義股的實質上所有核苷酸；該反義股的實質上所有核苷酸包含修飾；或該有義股的實質上所有核苷酸及該反義股的實質上所有核苷酸包含修飾。
  16. 如請求項1至14中任一項所述的dsRNA劑，其中，該有義股的所有核苷酸包含修飾；該反義股的所有核苷酸包含修飾；或該有義股的所有核苷酸及該反義股的所有核苷酸包含修飾。
  17. 如請求項14至16中任一項所述的dsRNA劑，其中，該經修飾的核苷酸之至少一者選自下述所成群組：去氧核苷酸、3’-終端去氧胸苷(dT)核苷酸、2’-O-甲基修飾之核苷酸、2’-氟修飾之核苷酸、2’-去氧修飾之核苷酸、鎖定之核苷酸、未鎖定之核苷酸、構形限定之核苷酸、約束之乙基核苷酸、無鹼基之核苷酸、2’-胺基修飾之核苷酸、2’-O-烯丙基修飾之核苷酸、2’-C-烷基修飾之核苷酸、2’-羥基修飾之核苷酸、2’-甲氧基乙基修飾之核苷酸、2’-O-烷基修飾之核苷酸、N-嗎啉基核苷酸、胺基磷酸酯、包含非天然鹼基之核苷酸、四氫呋喃修飾之核苷酸、1,5-失水己糖醇修飾之核苷酸、環己烯基修飾之核苷酸、包含硫代磷酸酯基團之核苷酸、包含甲基膦酸酯基團之核苷酸、包含5’-磷酸酯之核苷酸、包含5’-磷酸酯模擬物 之核苷酸、包含2’磷酸酯之核苷酸、熱去安定化之核苷酸、二醇修飾之核苷酸(GNA)、包含2’磷酸酯之核苷酸、及2-O-(N-甲基乙醯胺)修飾之核苷酸，以及其組合。
  18. 如請求項14至16中任一項所述的dsRNA劑，其中，該核苷酸之修飾選自下述所成群組：LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、甲氧基乙基、2’-O-烷基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-氟、2’-去氧、2’-羥基、及二醇、以及其組合。
  19. 如請求項14至16中任一項所述的dsRNA劑，其中，該經修飾核苷酸之至少一者係選自下述所成群組：去氧-核苷酸、2’-O-甲基修飾之核苷酸、2’-氟修飾之核苷酸、2’-去氧-修飾之核苷酸、二醇修飾之核苷酸(GNA)、包含2’磷酸酯之核苷酸、乙烯-膦酸酯核苷酸、及其組合。
  20. 如請求項14至16中任一項所述的dsRNA劑，其中，該核苷酸之修飾之至少一者為熱去安定化核苷酸修飾。
  21. 如請求項20所述的dsRNA劑，其中，該熱去安定化核苷酸修飾係選自下述所成群組：無鹼基修飾、與雙鏈體中相反核苷酸的失配、以及去安定化糖修飾、2’-去氧修飾、無環狀修飾、未鎖定核酸(UNA)、及甘油核酸(GNA)。
  22. 如請求項1至21中任一項所述的dsRNA劑，其中，該雙股區域為19-30核苷酸對之長度。
  23. 如請求項22所述的dsRNA劑，其中，該雙股區域為19-25核苷酸對之長度。
  24. 如請求項22所述的dsRNA劑，其中，該雙股區域為19-23核苷酸對之長度。
  25. 如請求項22所述的dsRNA劑，其中，該雙股區域為23-27核苷酸對之長度。
  26. 如請求項22所述的dsRNA劑，其中，該雙股區域為21-23核苷酸對之長度。
  27. 如請求項1至26中任一項所述的dsRNA劑，其中，各股係獨立地不多於30個核苷酸之長度。
  28. 如請求項1至27中任一項所述的dsRNA劑，其中，該有義股係21個核苷酸之長度以及該反義股係23個核苷酸之長度。
  29. 如請求項1至28中任一項所述的dsRNA劑，其中，該互補區域係至少17個核苷酸之長度。
  30. 如請求項1至29中任一項所述的dsRNA劑，其中，該互補區域係介於19及23個核苷酸之長度。
  31. 如請求項1至30中任一項所述的dsRNA劑，其中，該互補區域係介於19個核苷酸之長度。
  32. 如請求項1至31中任一項所述的dsRNA劑，其中，該至少一股包含至少1個核苷酸的3’突出。
  33. 如請求項1至31中任一項所述的dsRNA劑，其中，該至少一股包含至少2個核苷酸的3’突出。
  34. 如請求項1至33中任一項所述的dsRNA劑，其進一步包含配位子。
  35. 如請求項34所述的dsRNA劑，其中，該配位子係接合至dsRNA劑的有義股3’末端。
  36. 如請求項34或35所述的dsRNA劑，其中，該配位子係N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
  37. 如請求項34至36中任一項所述的dsRNA劑，其中，該配位子係經由單價、二價、或三價分之鏈結子附接之一個或多個GalNAc衍生物。
  38. 如請求項36或37所述的dsRNA劑，其中，該配位子係
    Figure 111106049-A0202-13-0008-206
  39. 如請求項38所述的dsRNA劑，其中，該dsRNA劑係如下述方案所示接合至配位子
    Figure 111106049-A0202-13-0008-207
    以及，其中，X為O或S。
  40. 如請求項39所述的dsRNA劑，其中，X為O。
  41. 如如請求項1至40中任一項所述的dsRNA劑，其中，該dsRNA劑進一步包含至少一個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結。
  42. 如請求項41所述的dsRNA劑，其中，該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結係於一股的3’-終端。
  43. 如請求項42所述的dsRNA劑，其中，該股係反義股。
  44. 如請求項42所述的dsRNA劑，其中，該股係有義股。
  45. 如請求項41所述的dsRNA劑，其中，該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結係於一股的5’-終端。
  46. 如請求項45所述的dsRNA劑，其中，該股係反義股。
  47. 如請求項45所述的dsRNA劑，其中，該股係有義股。
  48. 如請求項41所述的dsRNA劑，其中，該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結係於一股的5’-終端及3’-終端二者。
  49. 如請求項48所述的dsRNA劑，其中，該股係反義股。
  50. 如請求項1至49中任一項所述的所述的dsRNA劑，其中，該雙鏈體之反義股的5’-末端位置1的鹼基對為AU鹼基對。
  51. 一種雙股核糖核酸(dsRNA)劑，其係用於抑制己酮糖激酶(KHK)於細胞之表現，或其醫藥上可接受之鹽，包含形成雙股區域的有義股及反義股，其中
    a)有義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-gscsaggaagCfAfCfugagauucgu-3’差異不多於4個鹼基以及反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asdCsgadAudCucagdTgCfuuccugcsasc-3’差異不多於4個鹼基，
    其中，a、g、c及u為2’-O-甲基(2’-OMe)A、G、C及U；Cf及Uf為2’-去氧-2’-氟(2’-F)C及U；dC、dA及dT為2’-去氧C、A及T；以及s為硫代磷酸酯鏈結；或
    b)有義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-csusacggagAfCfGfugguguuugu-3’差異不多於4個鹼基以及反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asdCsaadAcdAccacdGuCfuccguagscsc-3’差異不多於4個鹼基，
    其中，a、g、c及u為2’-O-甲基(2’-OMe)A、G、C及U；Cf及Uf為2’-去氧-2’-氟(2’-F)C及U；dC、dA及dG為2’-去氧C、A及G；以及s為硫代磷酸酯鏈結。
  52. 如請求項51所述之dsRNA劑，其中
    a)有義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-gscsaggaagCfAfCfugagauucgu-3’差異不多於3個鹼基以及反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asdCsgadAudCucagdTgCfuuccugcsasc-3’差異不多於3個鹼基，
    其中，a、g、c及u為2’-O-甲基(2’-OMe)A、G、C及U；Cf及Uf為2’-去氧-2’-氟(2’-F)C及U；dC、dA及dT為2’-去氧C、A及T；以及s為硫代磷酸酯鏈結；或
    b)有義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-csusacggagAfCfGfugguguuugu-3’差異不多於3個鹼基以及反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asdCsaadAcdAccacdGuCfuccguagscsc-3’差異不多於3個鹼基，
    其中，a、g、c及u為2’-O-甲基(2’-OMe)A、G、C及U；Cf及Uf為2’-去氧-2’-氟(2’-F)C及U；dC、dA及dG為2’-去氧C、A及G；以及s為硫代磷酸酯鏈結。
  53. 如請求項51所述之dsRNA劑，其中
    a)有義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-gscsaggaagCfAfCfugagauucgu-3’差異不多於2個鹼基以及反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asdCsgadAudCucagdTgCfuuccugcsasc-3’差異不多於2個鹼基，
    其中，a、g、c及u為2’-O-甲基(2’-OMe)A、G、C及U；Cf及Uf為2’-去氧-2’-氟(2’-F)C及U；dC、dA及dT為2’-去氧C、A及T；以及s為硫代磷酸酯鏈結；或
    b)有義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-csusacggagAfCfGfugguguuugu-3’差異不多於2個鹼基以及反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asdCsaadAcdAccacdGuCfuccguagscsc-3’差異不多於2個鹼基，
    其中，a、g、c及u為2’-O-甲基(2’-OMe)A、G、C及U；Cf及Uf為2’-去氧-2’-氟(2’-F)C及U；dC、dA及dG為2’-去氧C、A及G；以及s為硫代磷酸酯鏈結。
  54. 如請求項51所述之dsRNA劑，其中
    a)有義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-gscsaggaagCfAfCfugagauucgu-3’差異不多於1個鹼基以及反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asdCsgadAudCucagdTgCfuuccugcsasc-3’差異不多於1個鹼基，
    其中，a、g、c及u為2’-O-甲基(2’-OMe)A、G、C及U；Cf及Uf為2’-去氧-2’-氟(2’-F)C及U；dC、dA及dT為2’-去氧C、A及T；以及s為硫代磷酸酯鏈結；或
    b)有義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-csusacggagAfCfGfugguguuugu-3’差異不多於1個鹼基以及反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asdCsaadAcdAccacdGuCfuccguagscsc-3’差異不多於1個鹼基，
    其中，a、g、c及u為2’-O-甲基(2’-OMe)A、G、C及U；Cf及Uf為2’-去氧-2’-氟(2’-F)C及U；dC、dA及dG為2’-去氧C、A及G；以及s為硫代磷酸酯鏈結。
  55. 如請求項51所述之dsRNA劑，其中
    a)有義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-gscsaggaagCfAfCfugagauucgu-3’以及反義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-asdCsgadAudCucagdTgCfuuccugcsasc-3’，
    其中，a、g、c及u為2’-O-甲基(2’-OMe)A、G、C及U；Cf及Uf為2’-去氧-2’-氟(2’-F)C及U；dC、dA及dT為2’-去氧C、A及T；以及s為硫代磷酸酯鏈結；或
    b)有義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-csusacggagAfCfGfugguguuugu-3’以及反義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-asdCsaadAcdAccacdGuCfuccguagscsc-3’，
    其中，a、g、c及u為2’-O-甲基(2’-OMe)A、G、C及U；Cf及Uf為2’-去氧-2’-氟(2’-F)C及U；dC、dA及dG為2’-去氧C、A及G；以及s為硫代磷酸酯鏈結。
  56. 如請求項50至55中任一項所述之dsRNA劑，其進一步包含配位子。
  57. 如請求項56所述之dsRNA劑，其中，該配位子係接合至該dsRNA劑的有義股的3’末端。
  58. 如請求項56或57所述之dsRNA劑，其中，該配位子係N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
  59. 如請求項56至58中任一項所述之dsRNA劑，其中，該配位子係經由單價、二價或三價分之鏈結子附接的一個或多個GalNAc衍生物。
  60. 如請求項58或59所述之dsRNA劑，其中，該配位子係
    Figure 111106049-A0202-13-0013-208
  61. 如請求項60所述的dsRNA劑，其中，該dsRNA劑係如下述方案所示接合至配位子
    Figure 111106049-A0202-13-0013-209
    以及，其中，X為O或S。
  62. 如請求項60所述的dsRNA劑，其中，該X為O。
  63. 一種細胞，其含有如請求項1至62中任一項所述之dsRNA劑。
  64. 一種用於抑制編碼己酮糖激酶(KHK)基因之表現的醫藥組成物，其係包含如請求項1至62中任一項所述之dsRNA劑。
  65. 如請求項64所述的醫藥組成物，其中，該dsRNA劑係於未緩衝溶液中。
  66. 如如請求項65所述的醫藥組成物，其中，該未緩衝溶液係生理鹽水或水。
  67. 如請求項64所述的醫藥組成物，其中，該dsRNA劑係於緩衝溶液中。
  68. 如請求項67所述的醫藥組成物，其中，該緩衝溶液包含乙酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶蛋白、碳酸鹽、或磷酸鹽或其任何組合。
  69. 如請求項68所述的醫藥組成物，其中，該緩衝溶液係磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)。
  70. 一種抑制己酮糖激酶(KHK)基因於細胞之表現的方法，該方法包含將細胞與如請求項1至62中任一項所述之dsRNA劑或如請求項64至69中任一項所述之醫藥組成物接觸，藉此抑制KHK基因於細胞之表現。
  71. 如請求項70所述之方法，其中，該細胞係於對象內。
  72. 如請求項70所述之方法，其中，該對象係人類。
  73. 如請求項71或72所述之方法，其中，該對象具有KHK-相關疾患。
  74. 如請求項73所述之方法，其中，該KHK-相關疾患係選自下述所成群組之肝疾病：非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)及酒精性脂肪肝炎(NASH)。
  75. 如請求項73所述之方法，其中，該KHK-相關疾患係選自下述所成群組之血脂異常：高脂血症、高LDL膽固醇、低HDL膽固醇、高三酸甘油脂血症、飯後高三酸甘油脂血症、脂肪細胞功能異常、內臟脂肪沉積、肥胖及代謝症狀群。
  76. 如請求項73所述之方法，其中，該KHK-相關疾患係選自下述所成群組之血糖調控疾患：胰島素抗性、第2型糖尿病及葡萄糖耐受不良。
  77. 如請求項73所述之方法，其中，該KHK-相關疾患係選自下述所成群組之心血管疾病：高血壓及內皮細胞功能異常。
  78. 如請求項73所述之方法，其中，該KHK-相關疾患係選自下述所成群組之腎疾病：急性腎疾患、腎小管功能異常、近端腎小管的前炎性變化及慢性腎疾患。
  79. 如請求項73所述之方法，其中，該KHK-相關疾患係高尿酸血症。
  80. 如請求項73所述之方法，其中，該KHK-相關疾患係痛風。
  81. 如請求項55至66中任一項所述之方法，其中，該細胞與該dsRNA接觸係抑制KHK之表現至少50%、60%、70%、80%、90%或95%。
  82. 如請求項70至81中任一項所述之方法，其中，該抑制KHK之表現降低對象血清中之KHK蛋白質量級至少50%、60%、70%、80%、90%或95%。
  83. 一種治療具有將受益於減低己酮糖激酶(KHK)表現之疾病或疾患的對象的方法，包含對該對象投藥治療有效量之如請求項1至62中任一項 所述之dsRNA劑或如請求項64至69中任一項所述之醫藥組成物，藉此治療具有將受益於減低KHK表現之疾患的對象。
  84. 一種預防具有將受益於減低己酮糖激酶(KHK)表現之疾患的對象的至少一種症狀的方法，包含對該對象投藥預防有效量之如請求項1至62中任一項所述之dsRNA劑或如請求項64至69中任一項所述之醫藥組成物，藉此預防具有將受益於減低KHK表現之疾患的對象的至少一種症狀。
  85. 如請求項83或84所述之方法，其中，該疾患係KHK-相關疾患。
  86. 如請求項85所述之方法，其中，該KHK-相關疾患係選自下述所成群組之肝疾病：非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)及酒精性脂肪肝炎(NASH)。
  87. 如請求項85所述之方法，其中，該KHK-相關疾患係選自下述所成群組之血脂異常：高脂血症、高LDL膽固醇、低HDL膽固醇、高三酸甘油脂血症、飯後高三酸甘油脂血症、脂肪細胞功能異常、內臟脂肪沉積、肥胖及代謝症狀群。
  88. 如請求項85所述之方法，其中，該KHK-相關疾患係選自下述所成群組之血糖調控疾患：胰島素抗性、第2型糖尿病及葡萄糖耐受不良。
  89. 如請求項85所述之方法，其中，該KHK-相關疾患係選自下述所成群組之心血管疾病：高血壓及內皮細胞功能異常。
  90. 如請求項85所述之方法，其中，該KHK-相關疾患係選自下述所成群組之腎疾病：急性腎疾患、腎小管功能異常、近端腎小管的前炎性變化及慢性腎疾患。
  91. 如請求項85所述之方法，其中，該KHK-相關疾患係高尿酸血症。
  92. 如請求項85所述之方法，其中，該KHK-相關疾患係痛風。
  93. 如請求項83至92中任一項所述之方法，其中，該對象係人類。
  94. 如請求項93所述之方法，其中，該對象具有或傾向於受損的腎功能。
  95. 如請求項83至94中任一項所述之方法，其中，對該對象投藥該dsRNA劑引起血清中一種或多種脂質的降低及/或KHK蛋白質累積的降低。
  96. 如請求項83至95中任一項所述之方法，其中，對該對象投藥該dsRNA劑引起果糖代謝的降低。
  97. 如請求項83至96中任一項所述之方法，其中，該dsRNA劑係以劑量約0.01mg/kg至約50mg/kg投藥至該對象。
  98. 如請求項83至97中任一項所述之方法，其中，該dsRNA劑係皮下投藥至該對象。
  99. 如請求項83至98中任一項所述之方法，進一步包含測定來自該對象之樣本中的KHK量級。
  100. 如請求項99所述之方法，其中，該對象樣本中之KHK量級係血液或血清樣本中之KHK蛋白質量級。
  101. 如請求項83至100中任一項所述之方法，進一步包含測定來自對象之樣本中的果糖代謝量級。
  102. 如請求項83至101中任一項所述之方法，進一步包含測定來自對象之樣本中的尿酸量級。
  103. 如請求項83至102中任一項所述之方法，進一步包含測定來自對象之樣本中的血清脂質量級。
  104. 如請求項83至103中任一項所述之方法，進一步包含對對象投藥用於治療KHK-相關疾患之額外的治療劑。
  105. 一種套組，其係包含如請求項1至62中任一項所述之dsRNA劑或如請求項64至69中任一項所述之醫藥組成物。
  106. 一種小瓶，其係包含如請求項1至62中任一項所述之dsRNA劑或如請求項64至69中任一項所述之醫藥組成物。
  107. 一種注射器，其係包含如請求項1至62中任一項所述之dsRNA劑或如請求項64至69中任一項所述之醫藥組成物。
  108. 一種RNA誘導緘默化複合體(RISC)，其係包含如請求項1至62中任一項所述之dsRNA劑之任一反義股。
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