TW202333749A - 補體因子ｂ（ｃｆｂ）ｉｒｎａ組成物及其使用方法 - Google Patents

補體因子ｂ（ｃｆｂ）ｉｒｎａ組成物及其使用方法

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詹姆斯Ｄ 麥金尼奇
馬克Ｋ 史奇蓋爾
艾登 卡斯特瑞諾
伊萊恩 菲什列維奇
克里斯蒂娜 尤修斯
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美商艾拉倫製藥股份有限公司
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Abstract

本發明係關於靶向補體因子B(CFB)基因的RNAi劑，例如，dsRNA劑。本發明還關於使用此RNAi劑抑制CFB基因表現之方法及在個體治療或預防CFB相關疾病的方法。

Description

補體因子B(CFB)IRNA組成物及其使用方法
本發明係關於靶向補體因子B(CFB)基因的RNAi劑，例如，dsRNA劑。本發明還關於使用此RNAi劑抑制CFB基因之方法及在個體治療或預防CFB相關疾病的方法。
相關申請
本申請請求在2021年10月29日提交的美國臨時申請號63/273,215的優先權。該申請的全部內容藉由引用併入本文。
在1890年首次發現補體，當時發現藉由存在於正常血清中的熱穩定抗體，其有助於或「補充(complement)」殺死細菌(Walport,M.J.(2001)N Engl J Med.344：1058)。補體系統由呈可溶性蛋白質存在於血液中或呈膜相關蛋白質存在的超過30個蛋白質組成。補體的活化導致酶反應的連續級聯反應(sequential cascade)，稱之為產生強效之過敏毒素C3a和C5a的形成的補體活化路徑，其引起範圍從化學吸引(chemoattraction)到細胞凋亡(apoptosis)的過多生理反應。最初，補體被認為在先天免疫(innate immunity)中扮演重要角色，在其中執行對入侵的病原體強大而快速的反應。然而，最近越來越明顯的是，補體在涉及T和B 細胞的後天免疫(adaptive immunity)中也扮演重要角色，其有助於病原體的清除(Dunkelberger JR and Song WC.(2010)Cell Res.20：34；Molina H,et al.(1996)Proc Natl Acad Sci U S A.93：3357)、維持免疫記憶防止病原體再入侵及涉及許多人病理狀態(Qu,H,et al.(2009)Mol Immunol.47：185；Wagner,E.and Frank MM.(2010)Nat Rev Drug Discov.9：43)。
已知補體活化藉由3個不同路徑發生：替代路徑、古典路徑及凝集素路徑(圖1)，涉及主要作為非活化酶原(zymogen)存在的蛋白質，該酶原依序被裂解和活化。
古典路徑經常藉由抗體-抗原複合體或藉由C反應蛋白(CRP)活化，兩者與補體成分C1q相互作用。此外，該古典路徑可在沒有免疫複合體的情況下，藉由存在於凋亡小體中磷脂醯絲胺酸而活化。
凝集素路徑藉由結合甘露醣的凝集素(MBL)而啟動，該結合甘露醣的凝集素結合至病原體表面之複合碳水化合物殘基。該古典路徑或凝集素路徑的活化導致(C4b2b)C3轉化酶的活化。
替代路徑藉由C3b之結合而活化，在標靶的表面，其由C3水解自發產生。然後該表面結合的C3b5被因子B識別，形成複合體C3bB。該C3bB複合體轉而被D因子裂解，產生活性形式的AP(C3bBb)的C3轉化酶。C3轉化酶兩種形式將裂解C3形成C3b。然後該C3b結合至更多因子B，經由AP(所謂的替代或放大迴路)增強補體活化，或該C3b導致活性C5轉化酶(C3bBbC3b或C4bC2bC3b)的形成，其裂解C5並觸發產生膜攻擊複合體(MAC)(C5b-9)之形成的晚期事件。
補體系統之失當的活化有責於傳播或啟動許多不同疾病的病理，包括，例如，C3腎絲球病變、全身性紅斑狼瘡(SLE)，例如，狼瘡性腎炎(Lupus Nephritis)、IgA腎病(IgA nephropathy)、糖尿病腎病(diabetic nephropathy)、多囊腎病(polycystic kidney disease)、膜性腎病變(membranous nephropathy)、老年性黃斑部病變(age-related macular degeneration)、非典型性尿毒溶血症候群(atypical hemolytic uremic syndrome)、血栓性微血管病(thrombotic microangiopathy)、重症肌無力(myasthenia gravis)、缺血及再灌流損傷(ischemia and reperfusion injury)、陣發性夜間血紅素尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria)及類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)。
目前，只有一種靶向替代路徑(例如，C5-C5a軸)的療法可用於治療補體成分相關疾病，即抗C5抗體，即依庫珠單株抗體(eculizumab(Soliris®))。雖然已經顯示依庫珠單株抗體有效於用以治療陣發性夜間血紅素尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)、非典型性尿毒溶血症候群(atypical hemolytic uremic syndrome)及重症肌無力(myasthenia gravis)，且目前正在針對其他補體成分相關疾病的臨床試驗中進行評估，然而依庫珠單株抗體療法需要高成本的每週高劑量輸注，接著每兩週一次的維持輸注。更一進而言，大約50%的接受依庫珠單株抗體治療的PNH個體有低量級的溶血，且需要殘餘輸血(residual transfusion)(Hill A,et al.(2010)Haematologica 95(4)：567-73)。
因此，所屬技術領域需要組成物或方法藉由，例如，補體因子B活性的活化，用於治療補體活化相關的疾病、病症及病況。
本發明提供iRNA組成物，其影響RNA誘導之緘默複合物(RISC)介導的編碼補體因子B基因的RNA轉錄物的裂解。補體因子B(CFB)可以在細胞內，例如，個體內的細胞，如人類個體。
因此，在一方面，本發明提供了一種雙股核糖核酸(dsRNA)劑用於抑制細胞中補體因子B(CFB)的表現，其中dsRNA劑包含形成雙股區的有義股(sense strand)及反義股(antisense strand)，其中有義股包含與核苷酸序列SEQ ID NO：1差異不超過0、1、2、3個核苷酸的至少15個，例如，15、16、17、18、19、20或21個連續核苷酸且反義股包含與核苷酸序列SEQ ID NO：8差異不超過1、2或3個核苷酸的至少15個，例如，15、16、17、18、19、20、21、22或23個連續核苷酸。
在另一方面，本發明提供了一種雙股核糖核酸(dsRNA)劑用於抑制細胞中補體因子B(CFB)的表現，其中e9 dsRNA包含形成雙股區的有義股及反義股，其中反義股包含與編碼補體因子B(CFB)的mRNA互補的區，且其中互補的區包含與表2至3任一者中之任一反義核苷酸序列差異不超過0、1、2或3個核苷酸的至少15個，例如，15、16、17、18、19、20、21、22及23個連續核苷酸。
在一實施態樣中，該dsRNA劑包含含有來自表2至3任一者中之任一有義核苷酸序列的有義股。
在一實施態樣中，該dsRNA劑包含含有來自表2至3任一者中之任一反義核苷酸序列的反義股。
在一實施態樣中，該dsRNA劑包含含有來自表2至3任一者中之任一有義核苷酸序列的有義股及含有來自表2至3任一者中之任一反義核苷酸序列的反義股。
在一實施態樣中，該dsRNA劑包含含有核苷酸序列之有義股，該核苷酸序列與表2至3任一者中之任一有義核苷酸序列差異不超過4個核苷酸，及含有核苷酸序列之反義股，該核苷酸序列與表2至3任一者中之任一有義核苷酸序列差異不超過4個核苷酸。
在一實施態樣中，該dsRNA劑包含含有核苷酸序列之有義股，該核苷酸序列與表2至3任一者中之任一有義核苷酸序列差異不超過3個核苷酸，及含有核苷酸序列之反義股，該核苷酸序列與表2至3任一者中之任一有義核苷酸序列差異不超過3個核苷酸。
在一實施態樣中，該dsRNA劑包含含有核苷酸序列之有義股，該核苷酸序列與表2至3任一者中之任一有義核苷酸序列差異不超過2個核苷酸，及含有核苷酸序列之反義股，該核苷酸序列與表2至3任一者中之任一有義核苷酸序列差異不超過2個核苷酸。
在一實施態樣中，該dsRNA劑包含含有核苷酸序列之有義股，該核苷酸序列與表2至3任一者中之任一有義核苷酸序列差異不超過1個核苷酸，及含有核苷酸序列之反義股，該核苷酸序列與表2至3任一者中之任一有義核苷酸序列差異不超過1個核苷酸。
在另一方面，本發明提供了一種雙股核糖核酸(dsRNA)劑用於抑制細胞中補體因子B(CFB)的表現，其中該dsRNA包含形成雙股區的有義股及反義股，其中有義股包與SEQ ID NO：1的核苷酸504至526、640至662、641 至663、995至1017、997至1019、1034至1056、1141至1163、1145至1167、1389至1411、1473至1495、1826至1848、1828至1850、1842至1864、2242至2264、2391至2413、2393至2415、2438至2460或2453至2475中任一者差異不超過0、1、2、3或4個核苷酸的含至少15個，例如，15、16、17、18、19、20或21個連續核苷酸，且反義股包含來自SEQ ID NO：8之對應核苷酸序列的至少15個，例如，15、16、17、18、19、20、21、22或23個連續核苷酸。
在一實施態樣中，該反義股包含與由下組成之群組選擇的雙鏈體之任一反義股核苷酸序列的差異不超過0、1、2、3或4個核苷酸的至少15個，例如，15、16、17、18、19、20、21、22及23個連續核苷酸：AD-1726057；AD-1725763；AD-1725777；AD-1725057；AD-1725096；AD-1728786；AD-1725059；AD-1728276；AD-1728278；AD-1726936；AD-1725472；AD-1724715；AD-1727292；AD-1730477；AD-1727288；AD-1730167；AD-1725408；以及AD-1725761。
在一實施態樣中，該有義股及反義股包含與選自由下組成之群組選擇的雙鏈體之任一有義股核苷酸序列及反義股核苷酸序列的差異不超過0、1、2、3或4個核苷酸的至少15個，例如，15、16、17、18、19、20、21、22及23個連續核苷酸：AD-1726057；AD-1725763；AD-1725777；AD-1725057；AD-1725096；AD-1728786；AD-1725059；AD-1728276；AD-1728278；AD-1726936；AD-1725472；AD-1724715；AD-1727292；AD-1730477；AD-1727288；AD-1730167；AD-1725408；以及AD-1725761。
在一實施態樣中，該有義股及反義股包含由下組成之群組選擇的雙鏈體之有義股核苷酸序列及反義股核苷酸序列：AD-1726057；AD-1725763； AD-1725777；AD-1725057；AD-1725096；AD-1728786；AD-1725059；AD-1728276；AD-1728278；AD-1726936；AD-1725472；AD-1724715；AD-1727292；AD-1730477；AD-1727288；AD-1730167；AD-1725408；以及AD-1725761。
在一實施態樣中，該有義股及反義股由下組成之群組選擇的雙鏈體之有義股核苷酸序列及反義股核苷酸序列組成：AD-1726057；AD-1725763；AD-1725777；AD-1725057；AD-1725096；AD-1728786；AD-1725059；AD-1728276；AD-1728278；AD-1726936；AD-1725472；AD-1724715；AD-1727292；AD-1730477；AD-1727288；AD-1730167；AD-1725408；以及AD-1725761。
在一實施態樣中，該dsRNA劑包含少一修飾的核苷酸。
在一實施態樣中，該有義股的實質上所有核甘酸；反義股的實質上所有核甘酸包含修飾；或有義股的實質上所有核甘酸及反義股的實質上所有核甘酸包含修飾。
在一實施態樣中，該有義股的所有核甘酸包含修飾；反義股的所有核甘酸包含修飾；或有義股的所有核甘酸及反義股的所有核甘酸包含修飾。
在一實施態樣中，該修飾的核苷酸之至少一者選自由下組成的群組：去氧-核苷酸、3’-終端去氧胸苷(dT)核苷酸、2'-O-甲基修飾的核苷酸、2'-氟修飾的核苷酸、2'-去氧-修飾的核苷酸、鎖核苷酸、未鎖核苷酸、構型受限的核苷酸、約束的乙基核苷酸、無鹼基核苷酸、2’-胺基-修飾的核苷酸、2’-O-烯丙基-修飾的核苷酸、2’-C-烷基-修飾的核苷酸、2’-甲氧基乙基修飾的核苷酸、2’-O-烷基-修飾的核苷酸、N-嗎啉基核苷酸、胺基磷酸酯、包含非天然鹼基的核苷酸、四氫吡喃修飾的核苷酸、1,5-脫水己糖醇修飾的核苷酸、環己烯基修飾的核苷酸、包含硫代磷酸酯基團的核苷酸、包含甲基膦酸酯基團的核苷酸、包含5'-磷酸酯 的核苷酸、包含5'-磷酸酯模擬物的核苷酸、包含2'-磷酸酯基團的核苷酸，例如，胞苷-2`-磷酸酯(C2p)；鳥苷-2`-磷酸酯(G2p)；尿苷-2`-磷酸酯(U2p)；腺苷-2`-磷酸酯(A2p)；熱去穩定修飾的核苷酸、乙二醇修飾的核苷酸(GNA)、及2-O-(N-甲基乙醯胺)修飾的核苷酸；及其組合。
在一實施態樣中，該核苷酸的修飾選自由下列組成之群組：LNA、HNA、CeNA、2'-甲氧基乙基、2'-O-烷基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-氟、2'-去氧、2-羥基及乙二醇；及其組合。
在一實施態樣中，該核苷酸的至少一修飾選自由下列組成之群組：去氧-核苷酸、2'-O-甲基修飾的核苷酸、2'-氟修飾的核苷酸、2'-去氧-修飾的核苷酸、乙二醇修飾的核苷酸(GNA)(例如，Ggn、Cgn、Tgn或Agn)、包含2'-磷酸酯基團的核苷酸以及以乙烯基-膦酸酯核苷酸；以及其組合。
在另一實施態樣中，該核苷酸的至少一修飾係熱去穩定核苷酸修飾。
在一實施態樣中，該熱去穩定核苷酸係選自由下組成之群組：無鹼基核苷酸；與雙鏈體中相對核苷酸的錯配；及去穩定糖修飾、2’-去氧修飾、無環核苷酸、未鎖核酸(UNA)及甘油核酸(GNA)。
雙股區可為19至30個核苷酸對長度；19至25個核苷酸對長度；19至23個核苷酸對長度；23至27個核苷酸對長度；或21至23個核苷酸對長度。
在一實施態樣中，各股獨立地為不超過30個核苷酸長度。
在一實施態樣中，有義股為21個核苷酸長度且反義股為23個核苷酸長度。
互補區可為至少17個核苷酸長度；29至23個核苷酸長度；或19個核苷酸長度。
在一實施態樣中，至少一股包含至少1核苷酸的3’突出。在另一實施態樣中，至少一股包含至少2核苷酸的3’突出。
在一實施態樣中，該dsRNA劑進一步包含配體。
在一實施態樣中，該配體接合於dsRNA劑之有義股的3’端。
在一實施態樣中，該配體係乙醯半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
在一實施態樣中，該配體係經由單價、二價或三價分支(branched)連接子連接的係一個或多個GalNAc衍生物。
在一實施態樣中，該配體係
Figure 111140910-A0202-12-0009-199
在一實施態樣中，該dsRNA劑如下方案所示接合至配體：
Figure 111140910-A0202-12-0009-200
且，其中X係O或S。
在一實施態樣中，該X係O。
在一實施態樣中，該dsRNA劑進一步包含至少一硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結。
在一實施態樣中，該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結係位於一股的3’-終端，例如，反義股或有義股。
在另一實施態樣中，該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結係位於一股的5’-終端，例如，反義股或有義股。
在一實施態樣中，該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結係位於一股的5’-及3’-終端二者。在一實施態樣中，該股係反義股。
在一實施態樣中，該雙鏈體之反義股5'-端1位置的鹼基對係AU鹼基對。
本發明還提供含有本發明之任意dsRNA劑的細胞及包含本發明之任意dsRNA劑的醫藥組成物。
本發明的醫藥組成物可包括在無緩衝溶液中的dsRNA劑，例如，鹽水或水，或本發明的醫藥組成物可包含在緩衝溶液中的dsRNA劑，例如，包括乙酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶穀蛋白、碳酸鹽或磷酸鹽或其任意組合的緩衝溶液；或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。
在一方面，本發明提供在細胞中抑制補體因子B基因之表現的方法。該方法包括使細胞與本發明的任意dsRNA劑或本發明的任意醫藥組成物接觸，從而抑制細胞中CFB基因的表現。
在一實施態樣中，該細胞係在個體內，例如，人類個體，例如，具有補體因子B相關障礙的個體。此障礙通常與發炎或免疫系統活化有關，例如膜攻擊複合體介導的分解、過敏反應或溶血。補體因子B相關障礙的非限制性實施例包含陣發性夜間血紅素尿症(PNH)、非典型性尿毒溶血症候群(aHUS)、氣喘、類風濕性關節炎(RA)；抗磷脂抗體症候群；狼瘡性腎炎；缺血再灌流損傷；典型或傳染性溶血性尿毒症候群(tHUS)；緻密物沉積病(dense deposit disease，DDD)；視神經脊髓炎(NMO)；多發性運動神經病變(MMN)；多發性硬化症(MS)；黃斑部病變(例如，老年性黃斑部病變(AMD))；溶血、肝酶升高及低血小板(HELLP)症候群；血栓性血小板低下性紫斑症(TTP)；自發性流產；非免疫性血管炎(Pauci-immune vasculitis)；表皮分解性水疱症(epidermolysis bullosa)；反復流產(recurrent fetal loss)；子癇前症(pre-eclampsia)、創傷性腦損傷(traumatic brain injury)、重症肌無力(myasthenia gravis)、冷凝集素綜合症(cold agglutinin disease)、皮肌炎類天疱瘡(dermatomyositis bullous pemphigoid)、志賀毒素E、大腸桿菌相關溶血性尿毒症候群、C3神經病變、抗嗜中性白血球細胞質抗體相關的血管炎(anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis)(例如，肉芽腫性多血管炎(granulomatosis with polyangiitis)(以前稱為韋格納肉芽腫)、Churg-Strauss二氏症候群(Churg-Strauss syndrome)及顯微鏡下多血管炎(microscopic polyangiitis)、體液和血管移植排斥反應(humoral and vascular transplant rejection)、移植物功能障礙(graft dysfunction)、心肌梗塞(myocardial infarction)(例如，心肌梗死組織損傷和缺血(tissue damage and ischemia in myocardial infarction))、同種異體移植(allogenic transplant)、敗血症(sepsis)(例如，敗血症的結果不佳(poor outcome in sepsis))、冠狀動脈疾病(Coronary artery disease)、皮肌炎(dermatomyositis)、葛瑞 夫茲氏病(Graves' disease)、動脈粥狀硬化(atherosclerosis)、阿茲海默症(Alzheimer's disease)、全身發炎反應敗血症(systemic inflammatory response sepsis)、敗血性休克(septic shock)、脊髓損傷(spinal cord injury)、腎絲球腎炎(glomerulonephritis)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、I型糖尿病(type I diabetes)、牛皮癬(psoriasis)、天皰瘡(pemphigus)、自身免疫性溶血性貧血(autoimmune hemolytic anemia，AIHA)、ITP、肺出血-腎炎症候群(Goodpasture syndrome)、Degos氏病(Degos disease)、抗磷脂症候群(antiphospholipid syndrome，APS)、致命性的APS(CAPS)、心血管疾病(cardiovascular disorder)、心肌炎(myocarditis)、腦血管疾病(cerebrovascular disorder)、周邊(例如，肌肉骨骼)血管疾病、腎血管疾病(renovascular disorder)、腸繫膜/腸血管疾病(mesenteric/enteric vascular disorder)、血管炎(vasculitis)、過敏性紫斑腎炎(Henoch-Schönlein purpura nephritis)、全身性紅斑狼瘡相關血管炎(systemic lupus erythematosus-associated vasculitis)、與類風濕性關節炎相關的血管炎(vasculitis associated with rheumatoid arthritis)、免疫複合血管炎(immune complex vasculitis)、高安氏疾病(Takayasu's disease)、擴張型心肌症(dilated cardiomyopathy)、糖尿病血管病(diabetic angiopathy)、川崎氏病(Kawasaki's disease(動脈炎))、靜脈氣體栓子(venous gas embolus，VGE)及支架置入後再狹窄(restenosis following stent placement)、冠狀動脈旋磨(rotational atherectomy)及經皮穿腔冠狀動脈血管成形術(percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)(參照例如，Holers(2008)Immunological Reviews 223：300-316；Holers and Thurman(2004)Molecular Immunology 41：147-152；美國專利號20070172483)。
在一實施態樣中，該補體因子B相關疾病選自由以下所組成之群組：C3腎絲球病、全身性紅斑狼瘡(SLE)，例如，狼瘡性腎炎、IgA腎病、糖尿病腎病、多囊腎病、膜性腎病變、老年性黃斑部病變、非典型性尿毒溶血症候群、血栓性微血管病(thrombotic microangiopathy)、重症肌無力、缺血再灌流損傷、陣發性夜間血紅素尿症及類風濕性關節炎。
在另一實施態樣中，該補體因子B相關疾病選自由以下所組成之群組：C3腎絲球病、全身性紅斑狼瘡(SLE)，例如，狼瘡性腎炎、IgA腎病、糖尿病腎病、多囊腎病、膜性腎病變、老年性黃斑部病變、非典型性尿毒溶血症候群、血栓性微血管病、重症肌無力、缺血及再灌流損傷、陣發性夜間血紅素尿症及類風濕性關節炎。
在另一實施態樣中，該補體因子B相關疾病選自由以下所組成之群組：C3腎絲球病、全身性紅斑狼瘡(SLE)，例如，狼瘡性腎炎、IgA腎病、糖尿病腎病及多囊腎病。
在一實施態樣中，使該細胞與dsRNA劑接觸抑制CFB之表現至少50%、60%、70%、80%、90或95%。
在一實施態樣中，抑制CFB之表現降低個體血清中CFB蛋白質量級至少50%、60%、70%、80%、90%或95%。
在一方面，本發明提供治療患有將從補體因子B(CFB)之表現減少而受益的障礙的個體的方法。該方法包含將本發明的任意dsRNA或本發明的任意醫藥組成物給藥於個體，從而治療患有將從CFB表現減少而受益的障礙之個體。
在另一方面，本發明提供一種預防將受益於補體因子B(CFB)表現減少的障礙發展的方法，該個體具有障礙之至少一種體徵或症狀但尚未符合該障礙的診斷標準。該方法包括向個體給藥本發明的任意dsRNA或本發明的任何醫藥組成物的預防有效量，從而預防將受益於CFB表現減少的個體進展到符合該障礙的診斷標準。
在一實施態樣中，該障礙係補體因子B(CFB)相關的障礙。
在一實施態樣中，該個體係人類。
在一實施態樣中，該dsRNA劑係以劑量約0.01mg/kg至約50mg/kg向個體給藥。
在一實施態樣中，該dsRNA劑係藉由皮下給藥於個體。
在一實施態樣中，該個體樣本中CFB之量級係血液或血清樣本中的CFB蛋白質量級。
在一實施態樣中，向個體給藥該劑導致溶血減低或CFB蛋白質積累減低。
在一些實施態樣中，本發明的方法進一步包含向個體給藥額外治療劑。
在部分方面，該額外治療劑係靶向C5基因的iRNA劑，如在美國專利號：9,249,415中描述的那些，其全部內容藉由引用併入本文。
在其他方面，該額外治療劑係靶向補體因子B基因，如在美國專利號：10,465,194中描述的那些，其全部內容藉由引用併入本文。
在其他方面，該額外治療劑係C5的抑制劑，如抗補體成分C5抗體或其抗原結合片段(例如，依庫珠單株抗體(依庫珠單株抗體)、拉武珠單株抗體 (ravulizumab)-cwvz或泊澤利單株抗體(pozelimab；REGN3918))或C5肽抑制劑(例如，齊魯普蘭(zilucoplan))。依庫珠單株抗體係人源化單株IgG2/4，kappa輕鏈抗體，其以高親和力特異性結合補體成分C5並抑制C5裂解為C5a和C5b，從而抑制終端補體複合物C5b-9的產生。依庫珠單株抗體如在美國專利號6,355,245中描述的那些，其全部內容藉由引用併入本文。拉武珠單株抗體(ravulizumab)-cwvz係人源化IgG2/4單株抗體，其以高親和力特異性結合補體成分C5並抑制C5裂解為C5a和C5b，從而抑制終端補體複合物C5b-9的產生。拉武珠單株抗體(ravulizumab)-cwvz如在WO2015134894中描述，其全部內容藉由引用併入本文。泊澤利單株抗體(Pozelimab)(也稱為H4H12166P，於US20170355757描述，其全部內容藉由引用併入本文)係全人源(fully-human)IgG4單株抗體，旨在阻斷補體C5因子。齊魯普蘭(Zilucoplan)係合成的大環肽，其以次奈米莫耳(sub-nanomolar)親和力結合補體成分5(C5)並且異位地抑制在古典、替代或凝集素路徑的活化後補體成分5(C5)裂解成C5a和C5b(參見例如，WO2017105939，其全部內容藉由引用併入本文)。
在又其他方面，該額外治療劑係C3肽抑制劑或其類似物。在一實施態樣中，該C3肽抑制劑是坎普他汀(compstatin)。坎普他汀係具有強效和選擇性之C3抑制活性的環狀十三肽。美國專利號7,888,323、7,989,589和8,442,776、美國專利公開號2012/0178694和2013/0053302以及PCT公開號WO 2012/174055、WO 2012/217803中描述了康普他汀及其類似物WO 2013/036778，每一全部內容藉由引用併入本文。
在部分實施態樣中，所屬技術領域已知的用於各種CFB相關疾病的的治療方法與本發明的RNAi劑組合使用。
本發明還提供包含本發明的任意dsRNA或本發明的任意醫藥組成物的套組，及視需要地使用說明。
本發明進一步提供包含包含本發明之任意dsRNA劑的反義股的RNA誘導之緘默複合物(RISC)。
在另一實施態樣中，該RNAi劑係其藥學上可接受的鹽。本文中每種RNAi劑的「藥學上可接受的鹽」包括但不限於鈉鹽、鈣鹽、鋰鹽、鉀鹽、銨鹽、鎂鹽、其混合物。所屬技術領域中具有通常知識者將理解，當RNAi劑作為聚陽離子鹽提供時，在視需要修飾的磷酸二酯主鏈的每個游離酸基和/或任何其他酸性修飾(例如，5’-終端膦酸酯基團)具有一陽離子。例如，長度係「n」個核苷酸的寡核苷酸包含n-1個視需要修飾的磷酸二酯，因此長度係21nt的寡核苷酸可以作為具有多達20個陽離子(例如，20個鈉陽離子)的鹽提供。類似地，具有長度21nt的有義股和長度23nt的反義股的RNAi劑可以作為具有多達42個陽離子(例如，42個鈉陽離子)的鹽提供。在上述實施例中，當RNAi劑還包括5’-終端磷酸酯或5’-終端乙烯基膦酸酯基團時，該RNAi劑可以作為具有多達44個陽離子(例如，44個鈉陽離子)的鹽提供。
本發明藉由以下詳細描述及圖式進一步說明。
圖1說明三種補體路徑：替代、古典和凝集素。
圖2係說明在第7天皮下給藥單劑1mg/kg劑量的指定dsRNA雙鏈體的小鼠(每組n=3)中人類CFB蛋白質量級的圖。人類CFB蛋白質量級顯示為相對以PBS治療方法所決定的對照量級。
本發明提供影響RNA誘導之緘默複合物(RISC)介導的補體因子B(CFB)基因的RNA轉錄物的裂解的iRNA組成物。該基因可在細胞內，例如，在個體的細胞，如人。這些iRNA的使用允許哺乳動物中對應基因(補體因子B)的mRNA的靶向降解。
本發明的iRNA被設計為靶向人補體因子B基因，包括在其他哺乳動物物種的補體因子B直系同源物中保留的基因部分。在不希望受理論限制的情況下，相信上述性質和這些iRNA中的特定標靶位點或特定修飾的組合或次組合賦予本發明的iRNA改進的功效、穩定性、效力、耐用性和安全性。
因此，本發明提供治療或預防補體因子B相關的障礙、疾病或狀況的方法，例如，隨著發炎或免疫系統活化的障礙、疾病或狀況，例如，膜攻擊複合體介導的分解、過敏反應或溶血，例如，C3腎絲球病、全身性紅斑狼瘡(SLE)，例如，狼瘡性腎炎、IgA腎病、糖尿病腎病及多囊腎病，使用影響RNA誘導之緘默複合物(RISC)介導的補體因子B(CFB)基因的RNA轉錄物的裂解的iRNA組成物。
本發明的iRNA包括具有長度多達約30個核苷酸或更少的區的RNA股(反義股)，例如，19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22個核苷酸長度，該區與補體因子B基因的mRNA轉錄物的至少 一部分實質上互補。在部分實施態樣中，本揭露的RNAi劑包括具有區之長度係約21至23核苷酸的RNA股(反義股)，其區與補體因子B基因的mRNA轉錄物的至少一部分實質上互補。
在一些實施態樣中，本發明的雙股RNAi劑的一股或雙股多達66個核苷酸長度，例如，36至66、26至36、25至36、31至60、22至43、27至53核甘酸長度，其具有與補體因子B基因的mRNA轉錄物的至少一部分實質上互補的至少19個連續核苷酸的區。在一些實施態樣中，具有較長反義股長度的此類iRNA劑可以包含含有20至60個核苷酸長度的第二RNA股(有義股)，其中該有義股和該反義股形成18至30個連續核苷酸的雙鏈體。
本發明的iRNA的使用允許哺乳動物中對應基因(補體因子B)的mRNA的靶向降解。使用體外及體內檢測，本發明人已經證明靶向補體因子B基因的iRNA可強效地介導RNAi，導致補體因子B基因表現的顯著抑制。因此，包括這些iRNA的方法及組成物對於治療患有補體因子B相關障礙的個體係有用的，該障礙例如，C3腎絲球病、全身性紅斑狼瘡(SLE)，例如，狼瘡性腎炎、IgA腎病、糖尿病腎病及多囊腎病。
因此，本發明提供用於於治療患有將從補體因子B基因之表現減少或抑制而受益的障礙的個體的方法或聯合治療，該障礙例如，補體因子B相關的疾病，如C3腎絲球病、全身性紅斑狼瘡(SLE)，例如，狼瘡性腎炎、IgA腎病、糖尿病腎病及多囊腎病，使用影響RNA誘導之緘默複合物(RISC)介導的補體因子B(CFB)基因的RNA轉錄物的裂解的iRNA組成物。
本發明還提供了用於預防患有將從補體因子B基因之表現減少或抑制而受益的障礙的個體的至少一症狀的方法，該障礙例如C3腎小球病、系統性紅斑狼瘡(SLE)，例如狼瘡性腎炎、IgA腎病、糖尿病腎病及多囊腎病。
在一些實施態樣中，向個體給藥dsRNA導致在下列的減低：CFB mRNA量級、CFB蛋白質量級、CH50活性(總溶血補體的測量)、AH50(補體替代路徑的溶血活性的測量)的降低、乳酸去氫酶(LDH)(血管內溶血的測量)、血紅蛋白量級；C3、C9、C5、C5a、C5b和可溶性C5b-9複合物中的任何一個或多個的量級。
以下詳細描述揭露如何製備和使用含有iRNA的組成物來抑制補體因子B基因的表現以及用於治療將受益於抑製或減少補體因子B基因表現之個體的組成物、用途和方法，例如，易受或診斷患有補體因子B相關障礙的個體。
I.定義
為了更容易理解本發明，首先定義部分術語。此外，應該注意的係，每當記載參數的值或範圍時，其意在該參數的值或範圍也被插入到該引用的值的中間值和範圍內，以成為本發明的一部分。
冠詞「一(a)」和「一個(an)」在本文中用於指代冠詞的文法對像中的一個或多於一個(即，至少一個)。作為實施例，「一個元素(an element)」係指一個元素或多個元素，例如，多個元素。
術語「包括(including)」在本文中用於表示短語「包括但不限於(including but not limited to)」，並且可以互換使用。
術語「或(or)」在本文中用於表示短語「及/或」，並且可以與短語「及/或」互換使用，除非上下文另有明確說明。例如，「有義股或反義股」被理解為「有義股或反義股或有義股及反義股」。
本文使用的術語「約(about)」係指在本領域的傳統耐受範圍內。例如，「約」可以理解係與平均值相差約2個標準差。在部分實施態樣中，大約意味著±10%。在部分實施態樣中，大約意味著±5%。當約出現在一系列數字或範圍之前時，應理解「約(about)」可以修飾系列或範圍中的每個數字。
在一個數字或一系列數字之前的術語「至少(at least)」、「不少於(no less than)」或「或更多(or more)」被理解係包括與術語「至少(at least)」相鄰的數字，以及包括所有後續的數字或整數，從上下文中清楚。例如，核酸分子中的核苷酸數必須係整數。例如，「21個核苷酸的核酸分子中至少19個核苷酸」係指19、20或21個核苷酸具有指定的特性。當至少出現在一系列數字或範圍之前時，可以理解「至少(at least)」可以修飾系列或範圍中的每個數字。
如本文所用，「不大於(no more than)」或「或小於(or less)」被理解係與短語相鄰的值和邏輯較低(logical lower)的值或整數到零，從上下文邏輯。例如，具有「不超過2個核苷酸的(no more than 2 nucleotides)」突出的雙鏈體具有2、1、0個核苷酸的突出。當在一系列數字或範圍之前出現「不超過(no more than)」時，可以理解「不超過(no more than)」可以修飾該系列或範圍中的每個數字。如本文所用，範圍包括上限和下限。
如本文所用，偵測方法可以包括測定存在的分析物的量低於該方法的偵測濃度。
如果指定的標靶位點與有義股或反義股的核苷酸序列之間發生衝突，則指定的序列優先。
如果序列與其在轉錄物或其他序列的指定位點之間發生衝突，則說明書中記載的核苷酸序列優先。
如本文所用，補體因子B(與術語「CFB」可互換使用)係指熟知的基因和多肽，在所屬技術領域中也稱為AHUS、BF、CFAB、BFD、FB、GBG、FBI12、因子B、備解素、H2-Bf、富含甘胺酸的β糖蛋白、C3前促進劑、備解素因子2B、C3前活化劑、PBF2、富含甘胺酸的β-糖蛋白、C3/C5轉化酶、EC 3.4.21和EC 3.4.21.473。
術語「CFB」包括人類CFB，其胺基酸及核苷酸序列可見於例如，GenBank登錄號GI：1732746151；小鼠CFB，其胺基酸及核苷酸序列可在以下獲得，例如，GenBank登錄號GI：218156288及GI：218156290；大鼠CFB，其胺基酸及核苷酸序列可見於例如，GenBank登錄號GI：218156284；及黑猩猩CFB，其胺基酸及核苷酸序列可見於例如，GenBank登錄號No.GI：57114201。術語「CFB」也包括食蟹獼猴CFB，其胺基酸及核苷酸序列可見於例如，GenBank登錄號GI：544428919及在基因條目中，NSMMUP00000000985(基因座=支架3881：47830：53620)，在獼猴基因組計劃網站(macaque.genomics.org.cn/page/species/index.jsp)。使用，例如，GenBank、UniProt、OMIM及猴基因組網站，很容易獲得CFB mRNA序列的其他實施例。示例性CFB核苷酸序列也可在SEQ ID NOs：1至7獲得。SEQ ID NOs：8至14係個別SEQ ID NOs：1至7的反義序列。
如本文使用，術語「CFB」還指CFB基因的自然發生的DNA序列變異。CFB基因中序列變異的非限制性實施例包含於外顯子12的1598A>G，其導致胺基酸殘基533的離胺酸變為精胺酸；於外顯子6的858C>G，其導致胺基酸殘基286的苯丙胺酸變為甘胺酸；及於外顯子7的967A>G，其導致胺基酸殘基323的離胺酸變為丙胺酸(Tawadrous H.et al.(2010)Pediatr Nephrol.25：947；Goicoechea de Jorge E et al.(2007)Proc Natl Acad Sci.USA 104：240)。如本文使用，術語「CFB」還指CFB基因中的單核苷酸多型性。已經鑑定出CFB基因內的許多序列變異，並且可見於例如NCBI dbSNP和UniProt(參見例如，ncbi.nlm.nih.gov/snp)。
關於CFB的更多訊息，可見於例如，www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/629。
藉由公開可用的數據庫，例如，GenBank、UniProt、OMIM及獼猴基因組網站，很容易獲得CFB mRNA序列的其他實施例。
自提交本申請之日起，上述每個GenBank登錄號和基因數據庫號的全部內容藉由引用併入本文。
如本文使用，「標靶序列(target sequence)」係指補體因子B基因轉錄過程中，形成的mRNA分子之核苷酸序列的連續部分，包含作為初級轉錄產物之RNA加工產物的mRNA。在CFB基因的轉錄過程中，該序列的標靶部分至少長度足夠以作為在或靠近形成的mRNA分子之核苷酸序列部分的iRNA引導裂解(iRNA-directed cleavage)的受質。在一個實施態樣中，該標靶序列係於CFB的蛋白質編碼區內。
該標靶序列可以形成約19至36核苷酸長度，例如，約19至30核苷酸長度。例如，標靶序列長度可以係約19至30個核苷酸、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22核苷酸。在一些實施態樣中，該標靶序列長度為約19至約30個核苷酸。在其他實施態樣中，該標靶序列長度為約19至約25個核苷酸。在又其他實施例中，該標靶序列長度為約19至約23個核苷酸。在一些實施例中，該標靶序列長度為約21至約23個核苷酸。上述範圍和長度之中間的範圍和長度也被認為係本發明的一部分。
如本文所用，術語「包含序列的股(strand comprising a sequence)」係指包含核苷酸之股的寡核苷酸，其係藉由使用標準核苷酸命名法引用的序列所描述的。
「G」、「C」、「A」、「T」和「U」通常分別代表作為鹼基之包含鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸苷和尿嘧啶的核苷酸。然而，應當理解，術語「核糖核苷酸(ribonucleotide)」和「核苷酸(nucleotide)」也可以指修飾的核苷酸，如下進一步詳述，或代理替代部分(參見例如，表1)。所屬技術領域中具有通常知識者非常了解，鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可以被其他部分體替代，而不會實質上改變包含帶有這種替代部分體之核苷酸之寡核苷酸的鹼基配對特性。例如，但不限於，包含肌苷作為其鹼基的核苷酸可以與包含腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸鹼基配對。因此，含有尿嘧啶、鳥嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可在本發明特徵的dsRNA的核苷酸序列中被含有，例如，肌苷的核苷酸替代。在另 一實施例中，寡核苷酸中任何地方的腺嘌呤和胞嘧啶可以分別用鳥嘌呤和尿嘧啶代替，以與標靶mRNA形成G-U Wobble鹼基配對。含有此類置換部分體的序列適用於本發明特徵的組成物和方法。
如本文可互換使用，術語「iRNA」、「RNAi劑」、「iRNA劑」及「RNA干擾劑」係指包含如本文定義之術語的RNA的劑，並且其藉由RNA誘導的緘默複合物(RISC)路徑介導RNA轉錄物的靶向裂解。iRNA藉由已知為RNA干擾(RNAi)的過程引導序列特異性降解。iRNA調節(例如，抑制)細胞中補體因子B基因的表現，例如，在個體，如哺乳類個體。
在一實施態樣中，本發明的RNAi劑包含與標靶RNA序列(例如，補體因子B標靶mRNA序列)以引導標靶RNA的裂解。不希望受理論束縛，據信引入細胞的長雙股RNA被稱為Dicer的第III型核酸內切酶分解成siRNA(Sharp et al.(2001)Genes Dev.15：485)。Dicer係一種類核糖核酸酶的第III型酵素(ribonuclease-III-like enzyme)，將這些dsRNA加工成19至23個鹼基對之具有特徵性的兩個鹼基3'突出的短干擾RNAs(Bernstein,et al.,(2001)Nature 409：363)。這些siRNA稍後將加入RNA誘導之緘默複合物(RISC)中，其中一個或多個解旋酶解開siRNA雙鏈體，使互補反義股引導標靶識別(Nykanen,et al.,(2001)Cell 107：309)。在與適當的標靶mRNA結合後，該RISC內的一個或多個核酸內切酶裂解該標靶以誘導緘默(Elbashir,et al.,(2001)Genes Dev.15：188)。因此，在一方面，本發明內容係關於細胞中產生的單股RNA(siRNA)，並且其促進RISC複合體的形成，以影響標靶基因的緘默，即補體因子B基因。因此，術語「siRNA」如本文所使用，也係指如上所述的iRNA。
在某些實施態樣中，該RNAi劑可以係單股siRNA(ssRNAi)，其被引入細胞或生物體以抑制標靶mRNA。單股RNAi劑結合於RISC核酸內切酶Argonaute 2，然後其裂解標靶mRNA。該單股siRNAs通常為15至30個核苷酸，並經過化學修飾。單股siRNAs的設計及測試如美國專利號8,101,348及Lima et al.,(2012)Cell 150：883-894中所描述，其全部內容藉由引用併入本文。本文所述的任何反義核苷酸序列可用作如本文所述的單股siRNA或藉由Lima et al.,(2012)Cell 150：883-894中所述的方法進行化學修飾。
在某些實施態樣中，用於本發明的組成物、用途及方法的「iRNA」係雙股RNA，並且在本文中被稱為「雙股RNA劑」、「雙股RNA(dsRNA)分子」、「dsRNA劑」或「dsRNA」。術語「dsRNA」係指核糖核酸分子的複合體，具有包含兩條反平行(anti-parallel)，並且實質上互補的核酸股的雙鏈體結構，視為相對於標靶RNA呈現「有義」及「反義」方向，亦即補體因子B(CFB)基因。在本發明的一些實施態樣中，雙股RNA(dsRNA)藉由如本文稱為RNA干擾或RNAi的轉錄後基因緘默機制，去觸發標靶RNA的降解，例如mRNA。
如本文所用，術語「修飾的核苷酸」係指其獨立地具有修飾的糖部分體、修飾的核苷酸間鏈結或修飾的核鹼基或其任意組合的核苷酸。因此，術語修飾的核苷酸包括對核苷酸間鏈結、糖部分體或核鹼基，例如，官能基團或原子，進行取代、加成或去除。適用於本發明之劑的修飾包括本文揭露的或所屬技術領域已知的所有類型的修飾。出於本說明書及申請專利範圍的目的，如在siRNA類型分子中使用，任何此類修飾都含括在「iRNA」或「RNAi劑」中。
在本揭露的某些實施態樣中，如果存在於RNAi劑中，去氧核苷酸的納入(其被認為係天然存在的核苷酸形式)則可以被認為係構成修飾的核苷酸。
雙鏈體區可為允許藉由RISC路徑特異性降解所需標靶RNA的任何長度，並且長度可以約19至36個鹼基對，例如，約19至30個鹼基對長度，例如，約9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36個鹼基對，例如長度約15至30、15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22個鹼基對。在部分實施態樣中，該雙鏈體區的長度係19至21個鹼基對，例如，21個鹼基對長度。上述範圍及長度中間的範圍及長度也被認為係本揭露的一部分。
形成雙鏈體結構的雙股可能係一較大RNA分子之不同的部分，或其可能為分開的RNA分子。當雙股係大分子的部分時，因此在形成雙鏈體結構的一股的3'-端及另一股的5'-端之間，藉由不間斷的核苷酸股連接，該連接RNA股被稱為「髮夾環」。髮夾環可以包含至少一未配對的核苷酸。在一些實 施態樣中，該髮夾環可以包含至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少20個、至少23個或更多個未配對的核苷酸。在一些實施態樣中，該髮夾環可以係10個或更少的核苷酸。在一些實施態樣中，該髮夾環可以係8個或更少的未配對核苷酸。在一些實施態樣中，該髮夾環可以係4至10個未配對的核苷酸。在一些實施態樣中，該髮夾環可以係4至8個核苷酸。
在某些實施態樣中，該雙股寡聚化合物的雙股可以連接在一起。該雙股可在兩端或僅在一端相互連接。藉由在一端連接係表示第一股的5'-端連接到第二股的3'-端或第一股的3'-端連接到第二股的5'-端。當兩股在兩端相互連接時，第一股的5'-端連接到第二股的3'-端，並且第一股的3'-端連接到第二股的5'-端。兩股可以藉由寡核苷酸連接子連接在一起，包括但不限於(N)n；其中，N係獨立地修飾的或未修飾的核苷酸，並且n係3至23。在一些實施態樣中，n係3至10，例如3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施態樣中，寡核苷酸連接子係選自由GNRA、(G)4、(U)4及(dT)4所組成的群組，其中，N係修飾的或未修飾的核苷酸，並且R係修飾的或未修飾的嘌呤核苷酸。連接子中的部分核苷酸可包含在與連接子中其他核苷酸的鹼基對相互作用。該兩股也可以藉由非核苷連接子連接在一起，例如本文所述的連接子。所屬技術領域中具有通常知識者將理解本文描述的任何寡核苷酸化學修飾或變化可用於該寡核苷酸連接子。
髮夾及啞鈴型寡聚化合物將具有等於或至少14、15、15、16、17、18、19、29、21、22、23、24或25個核苷酸對的雙鏈體區。該雙鏈體區的長度可以等於或小於200、100或50。在一些實施態樣中，該 雙鏈體區的長度範圍係15至30、17到23、19到23及19到21個核苷酸對。
髮夾寡聚化合物可具有一股突出或端未配對區，在一些實施態樣中的3'；並且在一些實施態樣中的髮夾的反義側。在一些實施態樣中，突出長度為1至4個，更通常為2至3個核苷酸。可誘導RNA干擾的髮夾寡聚化合物在本文中也稱為「shRNA」。
當dsRNA的兩條實質上互補的股由個別RNA分子組成時，這些分子不需要但可以共價連接。當該雙股藉由形成雙鏈體結構的一股的3'-端及相應另一股的5'-端之間的不間斷核苷酸股以外的方式共價連接時，連接結構稱為「連接子」。該RNA股可具有相同或不同數量的核苷酸。鹼基對的最大數量係dsRNA最短股中的核苷酸數量減去雙鏈體中存在的任何突出。除了雙鏈體結構之外，RNAi可包含一個或多個核苷酸突出。在一RNAi劑的實施態樣中，該至少一股包含至少1核苷酸的3’突出。在其他實施態樣中，該至少一股包含至少2個核苷酸的3’突出，例如，2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸。在其他實施態樣中，該RNAi劑的至少一股包含至少1個核苷酸的5’突出。在其他實施態樣中，該至少一股包含至少2個核苷酸的5’突出，例如，2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸。在其他實施態樣中，RNAi劑之一股的3’及5’端包含至少1個核苷酸的突出。
在某些實施態樣中，本發明的iRNA劑係dsRNA，其每股包含19至23個核苷酸，該dsRNA與標靶RNA序列相互作用(例如，補體因子B基因)以引導標靶RNA的裂解。
在一些實施態樣中，本發明的iRNA係24至30個與標靶RNA序列相互作用的核苷酸(例如，CFB標靶mRNA序列)以引導標靶RNA的裂解。
如本文所用，術語「核苷酸突出(nucleotide overhang)」係指從雙股iRNA的雙鏈體結構突出的至少一未配對核苷酸。例如，當dsRNA一股的3'-端超出另一股的5'-端時，或反之亦然，則存在核苷酸突出。dsRNA可以包含至少一核苷酸的突出；或者，突出可包含至少兩個核苷酸、至少三個核苷酸、至少四個核苷酸、至少五個核苷酸或更多。核苷酸突出可包含核苷酸/核苷的類似物，或由核苷酸/核苷的類似物組成，包括去氧核苷酸/核苷。突出可以在有義股、反義股或其任意組合。此外，突出的核苷酸可以存在於dsRNA的反義股或有義股的5'-端、3'-端或兩端。
在dsRNA的一實施態樣中，該至少一股包含至少一核苷酸的3’突出。在其他實施態樣中，該至少一股包含至少2個核苷酸的3’突出，例如2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸。在其他實施態樣中，該RNAi劑的至少一股包含至少一核苷酸的5’突出。在部分實施態樣中，該至少一股包含至少2個核苷酸的5’突出，例如，2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸。在其他實施態樣中，該RNAi劑之一股的3’及5’端包含至少一核苷酸的突出。
在一實施態樣中，該dsRNA的反義股在3'-端或5'-端具有1至10個核苷酸的突出，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。在一實施態樣中，該dsRNA的有義股在3'-端或5'-端的突出具有1至10個核苷酸的突出，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。在另一實施態樣中，在突出的一個或多個核苷酸被核苷硫代磷酸取代。
在某些實施態樣中，該dsRNA的反義股在3'-端或5'-端的突出具有1至10個核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。在一些實施態樣中，在有義股、反義股或兩者的突出可包含延長長度超過10個核苷酸，例如，1至30個核苷酸、2至30個核苷酸、10至30個核苷酸、10至25個核苷酸或10至15個核苷酸。在某些實施態樣中，該延長的突出係在雙鏈體的有義股。在某些實施態樣中，該延長的突出存在於雙鏈體之有義股的3’端。在某些實施態樣中，該延長的突出存在於雙鏈體之有義股的5’端。在部分實施態樣中，該延長的突出係在雙鏈體的反義股。在某些實施態樣中，該延長的突出係在雙鏈體之反義股的3’端。在某些實施態樣中，該延長的突出係在雙鏈體之反義股的5’端。在某些實施態樣中，在延長的突出的一個或多個核苷酸被硫代磷酸核苷取代。在某些實施態樣中，該突出包括自互補部分，使得突出能夠形成在生理狀況下穩定的髮夾結構。
「鈍端(blunt或blunt end)」係指在雙股RNA劑的端不存在未配對的核苷酸，即，沒有核苷酸突出。「鈍端」雙股RNA劑在其整個長度上都是雙股的，即在分子的兩個端沒有核苷酸突出。本發明的RNAi劑包含在一端不具有核苷酸突出(亦即，不具一突出及一鈍端的劑)或在其中一端不具有核苷酸突出。大多數情況下，這樣的分子在其整個長度上都是雙股的。
術語「反義股」或「引導股」係指iRNA的股，例如，dsRNA，其包括與標靶序列實質上互補的區，例如，CFB mRNA。
如本文使用，術語「互補區」係指反義股中實質上與序列互補的區，例如標靶序列，例如，補體因子B核苷酸序列，如本文定義。當互補區與標靶序列不完全互補時，錯配可以在分子的內部或端區。通常，最能容忍的錯配 位於端區，例如，在iRNA的5'-或3'-端的5、4或3個核苷酸內。在一些實施態樣中，本發明的雙股RNA劑包括反義股中的核苷酸錯配。在一些實施態樣中，本發明的雙股RNA劑的反義股包括不超過4個與標靶mRNA的錯配，例如，該反義股包括4、3、2、1或0個與標靶mRNA的錯配。在一些實施態樣中，本發明的反義股雙股RNA劑包括不超過4個與有義股的錯配，例如，該反義股包括4、3、2、1或0個與有義股的錯配。在一些實施態樣中，本發明的雙股RNA劑包括有義股中的核苷酸錯配。在一些實施態樣中，本發明的雙股RNA劑的有義股包括不超過4個與反義股的錯配，例如，該有義股包括4、3、2、1或0個與反義股的錯配。在一些實施態樣中，該核苷酸錯配例如在距iRNA的3'-端，例如，5、4、3個核苷酸內。在另一實施態樣中，該核苷酸錯配係，例如，在iRNA劑的3'-終端核苷酸中。在一些實施態樣中，該錯配不在種子區中。
因此，如本文所述的RNAi劑可包含一個或多個與標靶序列的錯配。在一實施態樣中，如本文所述的RNAi劑包含不超過3個錯配(即，3、2、1或0個錯配)。在一實施態樣中，如本文所述的RNAi劑包含不超過2個錯配。在一實施態樣中，如本文所述的RNAi劑包含不超過1個錯配。在一實施態樣中，如本文所述的RNAi劑包含0個錯配。在某些實施態樣中，若RNAi劑的反義股包含與標靶序列的錯配，該錯配視需要地限制在互補區的5'-或3'-端的最後5個核苷酸內。例如，在這樣的實施態樣中，對於23個核苷酸的RNAi劑，與CFB基因區互補的該股通常在中央13個核苷酸內，不包含任何錯配。本文所述的方法或所屬技術領域已知的方法，可用於確定含有與標靶序列錯配的RNAi劑係否有效抑制CFB基因的表現。考慮具有錯配的RNAi劑在抑制CFB基因表現 方面的功效很重要，特別係如果CFB基因中的特定互補區在群體中已知具有多態性(polymorphic)序列變異。
如本文所用，術語「有義股(sense strand)」或「過客股(passenger strand)」係指包括與本文定義之反義股區實質上互補的區的RNAi劑的股。
如本文所用，「實質上所有的核苷酸都被修飾」係大程度的但不係完全修飾，且可包括不超過5、4、3、2或1個未修飾的核苷酸。
如本文所用，術語「裂解區(cleavage)」係指緊鄰裂解位點的區。裂解位點係在標靶發生裂解的位點。在一些實施態樣中，該裂解區在裂解位點的任一端且緊鄰裂解位點包含3個鹼基。在一些實施態樣中，該裂解區在裂解位點的任一端且緊鄰裂解位點包含2個鹼基。在一些實施態樣中，裂解位點特異性地出現在由反義股的核苷酸10及11結合的位點，並且裂解區包含核苷酸11、12及13。
如本文所用，除非另有說明，術語「互補(complementary)」當用於描述第一核苷酸序列與第二核苷酸序列相關時，係指寡核苷酸或多核苷酸的能力，在某些條件下，其包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸與包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸雜交並形成雙鏈體結構，如所屬技術領域中具有通常知識者理解的。此類條件可以係，例如「嚴格條件(stringent condition)」，其中嚴格條件可以包括：400mM NaCl、40mM PIPES pH 6.4、1mM EDTA、50℃或70℃維持12至16小時，然後洗滌(參見例如，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Sambrook,et al.(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press)。其他可以應用的條件，例如可以在生物體內遇到的生理相關條件。根據雜交核苷酸 的最終應用，所屬技術領域中具有通常知識者將能夠確定測試兩個序列的互補性之最適合的一組條件。
iRNA內的互補序列，例如本文所述的dsRNA內，包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸與包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一個或兩個核苷酸序列的整個長度上形成鹼基配對。這樣的序列在本文中可以被稱為彼此「完全互補」。然而，在本文中當第一序列被稱為相對於第二序列「實質上互補」時，這兩個序列可以係完全互補的，或其可形成一個或多個，但通常不超過5、4、3或2個錯配鹼基對，在雜交最多30個鹼基對的雙鏈體時，同時保留在與其最終應用的最相關的條件下雜交的能力，例如體外或體內基因表現的抑制。然而，當兩個寡核苷酸被設計成在雜交時形成一個或多個單股突出時，就互補性的決定而言，此類突出不應被視為錯配。例如，包含一長度為21個核苷酸的dsRNA及另一長度為23個核苷酸的寡核苷酸，其中較長的寡核苷酸包含與較短的寡核苷酸完全互補的21個核苷酸的序列，出於本文所述的目的，仍可稱為「完全互補」。
如本文所用，「互補」序列還可以包括(或完全由)非Watson-Crick鹼基對或由非天然及修飾的核苷酸形成的鹼基對形成，只要上述關於其雜交能力的要求得到滿足。此類非Watson-Crick鹼基對包括但不限於G：U Wobble或Hoogsteen鹼基配對。
本文中的術語「互補」、「完全互補」及「實質上互補」可用於dsRNA的有義股及反義股之間、或兩個寡核苷酸或多核苷酸之間的鹼基配對，例如雙股RNA劑的反義股及標靶序列，如從使用其之用途的上下文中所理解的。
如本文所用，與訊息RNA(mRNA)的至少一部分「實質上互補」的多核苷酸係指該多核苷酸與感興趣的mRNA的連續部分實質上互補(例如，編碼補體因子B基因的mRNA)。例如，如果該序列實質上互補於編碼補體因子B基因的mRNA的非間斷部分，則該多核苷酸與至少一部分補體因子B mRNA互補。
因此，在一些實施態樣中，本文揭露的反義股多核苷酸完全互補於標靶CFB序列。
在其他實施態樣中，本文揭露的反義股多核苷酸實質上互補於標靶CFB序列及包含連續核苷酸序列，其全長與對於SEQ ID NOs：1至7的核苷酸序列的等效區或SEQ ID NOs：1至7的片段至少約80%互補，例如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%互補。
在一些實施態樣中，本文揭露的反義多核苷酸實質上互補於標靶CFB序列的片段及包含連續核苷酸序列，其全長與選自SEQ ID NO：1的核苷酸的群組的片段：504至526、640至662、641至663、995至1017、997至1019、1034至1056、1141至1163、1145至1167、1389至1411、1473至1495、1826至1848、1828至1850、1842至1864、2242至2264、2391至2413、2393至2415、2438至2460或2453至2475，至少80%互補，如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%互補。
在其他實施態樣中，本文揭露的反義多核苷酸實質上互補於標靶CFB序列及包含連續核苷酸序列，其全長與表2至3中任一有義股核苷酸序列 至少約80%互補、或表2至3中任一有義股核苷酸序列的片段，如約85%、約90%、約95%或完全互補。
在一實施態樣中，本揭露的RNAi劑包含與反義多核苷酸實質上互補的有義股，反過來說，該反義多核苷酸與標靶CFB序列相同，並且其中該有義股多核苷酸包含一連續核苷酸序列，其全長與SEQ ID NOs：8至14的核苷酸序列的等效區、或SEQ ID NOs：8至14中任一片段，至少約80%互補，例如約85%、約90%、約95%或完全互補。
在一實施態樣中，本發明的iRNA包含與反義多核苷酸實質上互補的有義股，反過來說，該反義多核苷酸與標靶補體因子B互補，並且其中該有義股多核苷酸包含一連續核苷酸序列，其全長與表2至3中任一反義股核苷酸序列、或與表2至3中任一反義股核苷酸序列片段，至少約80%互補，例如約85%、約90%、約95%或完全互補。
在一實施態樣中，該有義股及反義股係選自由以下組成之群組：AD-1726057；AD-1725763；AD-1725777；AD-1725057；AD-1725096；AD-1728786；AD-1725059；AD-1728276；AD-1728278；AD-1726936；AD-1725472；AD-1724715；AD-1727292；AD-1730477；AD-1727288；AD-1730167；AD-1725408及AD-1725761。
在一實施態樣中，該有義股及反義股係選自雙鏈體AD-1726057。
在一實施態樣中，該有義股及反義股係選自雙鏈體AD-1725763。
在一實施態樣中，該有義股及反義股係選自雙鏈體AD-1725777。
在一實施態樣中，該有義股及反義股係選自雙鏈體AD-1725057。
在一實施態樣中，該有義股及反義股係選自雙鏈體AD-1725096。
在一實施態樣中，該有義股及反義股係選自雙鏈體AD-1728786。
在一實施態樣中，該有義股及反義股係選自雙鏈體AD-1725059。
在一實施態樣中，該有義股及反義股係選自雙鏈體AD-1728276。
在一實施態樣中，該有義股及反義股係選自雙鏈體AD-1728278。
在一實施態樣中，該有義股及反義股係選自雙鏈體AD-1726936。
在一實施態樣中，該有義股及反義股係選自雙鏈體AD-1725472。
在一實施態樣中，該有義股及反義股係選自雙鏈體AD-1724715。
在一實施態樣中，該有義股及反義股係選自雙鏈體AD-1727292。
在一實施態樣中，該有義股及反義股係選自雙鏈體AD-1730477。
在一實施態樣中，該有義股及反義股係選自雙鏈體AD-1727288。
在一實施態樣中，該有義股及反義股係選自雙鏈體AD-1730167。
在一實施態樣中，該有義股及反義股係選自雙鏈體AD-1725408。
在一實施態樣中，該有義股及反義股係選自雙鏈體AD-1725761。
在一些實施態樣中，該雙股iRNA劑的雙股區係等於或至少17、18、19、20、21、22、23、23、24、25、26、27、28、29、30或更多核苷酸對長度。
在一些實施態樣中，該雙股iRNA劑的反義股係等於或至少17、18、19、20、21、22、23、23、24、25、26、27、28、29或30核苷酸長度。
在一些實施態樣中，該雙股iRNA劑的有義股係等於或至少17、18、19、20、21、22、23、23、24、25、26、27、28、29或30核苷酸長度。
在一實施態樣中，該雙股iRNA劑的有義股或反義股每一個係18至30核苷酸長度。
在一實施態樣中，該雙股iRNA劑的有義股或反義股每一個係19至25核苷酸長度。
在一實施態樣中，該雙股iRNA劑的有義股或反義股每一個係21至23核苷酸長度。
在一實施態樣中，該iRNA劑的有義股係21個核苷酸長度，且該反義股係23個核苷酸長度，其中該股形成含有在3'-端有2個核苷酸長的單股突出之由21個連續鹼基對組成的雙股區。
在一些實施態樣中，每股的大部分核苷酸係核糖核苷酸，但如本文詳細所述，每一或兩股還可包含一個或多個非核糖核苷酸，例如，去氧核糖核苷酸或修飾核苷酸。此外，「iRNA」可能包括經過化學修飾的核糖核苷酸。此類修改可包括本文揭露的或所屬技術領域已知的所有類型的修改。出於本說明書和申請專利範圍的目的，如在iRNA分子中使用的任何此類修飾都包含在「iRNA」中。
在本揭露的某些實施態樣中，如果存在於RNAi劑中，則包含去氧核苷酸可被視為構成修飾核苷酸。
在一實施態樣中，CFB基因表現之抑制的至少一部分係藉由CFB mRNA的量的減少來評估的，CFB mRNA可以自第一細胞或細胞群組中分離或檢測到，其中CFB基因被轉錄，該第一細胞或細胞群組已經被治療以抑制CFB基因的表現，如相較於實質上相同於第一細胞或細胞群的組第二細胞或細胞群組，但其未經過治療(對照細胞)。抑制程度可以表示為：
Figure 111140910-A0202-12-0038-201
如本文所用，術語「使細胞與iRNA接觸」，例如dsRNA，包括使其藉由任何可能的方式接觸細胞。使細胞與iRNA接觸包括使細胞在體外與iRNA接觸，或使細胞在體內與iRNA接觸。該接觸可以直接或間接進行。因此，例如，iRNA可以藉由施行該方法的個體，使其與細胞物理接觸，或者，可將iRNA置於將允許或導致其隨後與細胞接觸的狀況中。
例如，可以藉由將細胞與iRNA一起培育，完成體外接觸細胞。例如，可以藉由將iRNA注射到細胞所在的組織中或附近，或藉由將RNAi劑注射到另一區，例如，血流或皮下空間，如此劑隨後到達待接觸細胞所在的組織。例如，RNAi劑可以包含或偶聯至配體，例如，GalNAc，其引導或以其他方式將iRNA穩定在感興趣的位點，例如，肝臟。體外和體內接觸方法的組合也係可能的。例如，細胞也可以在體外與iRNA接觸，並隨後移植到個體內。
在某些實施態樣中，使細胞與iRNA接觸包括藉由促進或影響細胞的攝取或吸收來「引入(introducing)」或「傳送iRNA到細胞中(delivering the iRNA into the cell)」。iRNA的吸收或攝取的可以藉由獨立擴散或主動的細胞過程，或藉由輔助劑或裝置而發生。將iRNA引入細胞可以係體外或體內的。例如，對於體內引入，可以將iRNA注射到組織位點或全身給藥。體外引入細胞包括所屬技術領域已知的方法如電穿孔及脂轉染。進一步方法在下文中所述或在所屬技術領域中係已知的。
術語「脂質奈米顆粒(lipid nanoparticle)」或「LNP」係包含包含封裝藥物活性分子之脂質層的囊泡，例如核酸分子，例如，iRNA或從 其質體轉錄的iRNA。LNPs在例如美國專利號6,858,225、6,815,432、8,158,601及8,058,069中有所描述，其全部內容藉由引用併入本文。
如本文所用，「個體」係動物，例如哺乳動物，包括靈長類動物(例如，人類、非人類靈長類動物，例如，猴子及黑猩猩)或非靈長類動物(例如兔、綿羊、倉鼠、豚鼠、狗、大鼠或小鼠)或內源性或異源性表現標靶基因的鳥類。在一實施態樣中，該個體係人類，例如正在治療或評估疾病或病症之將受益CFB表現下降的人類；處於疾病或病症之風險的將受益CFB表現下降的人類；患有疾病或病症之將受益CFB表現下降的人類；或正在治療疾病或病症之將受益如本文所述的CFB表現下降的人類。在部分實施態樣中，該個體係女性個體。在其他實施態樣中，該個體係男性個體。在一實施態樣中，該個體係成人個體。在其他實施態樣中，該個體係兒童個體。
如本文所用，術語「治療(treating或treatment)」係指有益的或期望的結果，如在個體減少CFB相關病症的至少一個症狀或症狀。治療還包含一個或多個與不需要的CFB表現相關的症狀或症狀；減少不需要的CFB活化或穩定的程度；不需要的CFB活化或穩定的改善或緩解。「治療」亦可意指相較於無治療所期望的存活為延長的存活。
術語「較低(lower)」在個體的CFB量級或疾病標誌物或症狀的上下文中係指該量級在統計學上顯著降低。降低可以係，例如，至少10%、15%、20%、25%、30%、%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多。在某些實施態樣中，該降低至少為20%。在某些實施態樣中，該疾病標誌物，例如，蛋白質或基因表量級，係降低至少50%。在個體CFB量級的相關上下文中，「較低」適合地係指量級下降到對於沒有該病症的個 別體而言，可以接受的正常範圍內。在某些實施態樣中，該標靶的表現係經正常化(normalized)，亦即，對於沒有這種病症的個別體，降低朝向或降低到正常範圍內可接受的量級，例如，體重、血壓或血脂量級正常化。如本文所用，個體中的「降低」可指個體細胞中基因表現或蛋白質產生的降低不需要個體所有細胞或組織中表現的降低。例如，如本文所用，在個體中降低可包括個體肝臟中基因表現或蛋白質產生的降低。
術語「較低」還可以用作與疾病或狀況之症狀的正常化相關，亦即在患有CFB相關疾病的個體中減少朝向或在未患有CFB相關疾病的正常個體中的量級之間的差異。例如，如果正常體重為70公斤的個體在治療之前體重為90公斤(超重20公斤)，在治療之後體重為80公斤(超重10公斤)，則該個體的體重朝向正常體重較低50%(10/20 x 100%)。類似地，如果女性的HDL量級從50mg/dL(糟糕)增加至57mg/dL，在作為60mg/dL的正常量級，該個體的前量級與正常量級之間的差異係下降70%(個體量級與正常之間10mg/dL的差異減少7mg/dL，7/10 x 100%)。如本文所用，如果疾病係相關於症狀的數值增加，「正常」係被認為是正常的上限。如疾病係相關於症狀的數值減少，「正常」係被認為是正常的下限。
如本文所用，當「預防(prevention或preventing)」被提及用於將受益於CFB基因表現減少或CFB蛋白產生減少的疾病、病症或狀況時，係指預防有至少一症狀或症狀的個體按天、週、月或年發展進一步的症狀或症狀，從而符合該疾病的診斷標準，如相較於自然歷史研究或疾病的典型進展所預測的。
如本文使用，術語「補體因子B疾病」或「CFB相關的疾病」係藉由或相關於補體活化的疾病或病症。術語「CFB相關的疾病」包含將受益於CFB基因表現、複製或蛋白質活性的降低的疾病、病症或狀況。CFB相關疾病的非限制性實施例包含，例如，陣發性夜間血紅素尿症(PNH)、非典型性尿毒溶血症候群(aHUS)、氣喘、類風濕性關節炎(RA)；抗磷脂抗體症候群；狼瘡性腎炎；缺血再灌流損傷；典型或傳染性溶血性尿毒症候群(tHUS)；緻密物沉積病(dense deposit disease，DDD)；視神經脊髓炎(NMO)；多發性運動神經病變(MMN)；多發性硬化症(MS)；黃斑部病變(例如，老年性黃斑部病變(AMD))；溶血、肝酶升高及低血小板(HELLP)症候群；血栓性血小板低下性紫斑症(TTP)；自發性流產；非免疫性血管炎(Pauci-immune vasculitis)；表皮分解性水疱症(epidermolysis bullosa)；反復流產(recurrent fetal loss)；子癇前症(pre-eclampsia)、創傷性腦損傷(traumatic brain injury)、重症肌無力(myasthenia gravis)、冷凝集素綜合症(cold agglutinin disease)、皮肌炎類天疱瘡(dermatomyositis bullous pemphigoid)、志賀毒素E、大腸桿菌相關溶血性尿毒症候群、C3神經病變、抗嗜中性白血球細胞質抗體相關的血管炎(anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis)(例如，肉芽腫性多血管炎(granulomatosis with polyangiitis)(以前稱為韋格納肉芽腫)、Churg-Strauss二氏症候群(Churg-Strauss syndrome)及顯微鏡下多血管炎(microscopic polyangiitis)、體液和血管移植排斥反應(humoral and vascular transplant rejection)、移植物功能障礙(graft dysfunction)、心肌梗塞(myocardial infarction)(例如，心肌梗死組織損傷和缺血(tissue damage and ischemia in myocardial infarction))、同種異體移植(allogenic transplant)、敗血症(sepsis)(例如，敗血症的結果不佳(poor outcome in sepsis))、冠狀動脈疾病(Coronary artery disease)、皮肌炎(dermatomyositis)、葛瑞夫茲氏病(Graves' disease)、動脈粥狀硬化(atherosclerosis)、阿茲海默症(Alzheimer's disease)、全身發炎反應敗血症(systemic inflammatory response sepsis)、敗血性休克(septic shock)、脊髓損傷(spinal cord injury)、腎絲球腎炎(glomerulonephritis)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、I型糖尿病(type I diabetes)、牛皮癬(psoriasis)、天皰瘡(pemphigus)、自身免疫性溶血性貧血(autoimmune hemolytic anemia，AIHA)、ITP、肺出血-腎炎症候群(Goodpasture syndrome)、Degos氏病(Degos disease)、抗磷脂症候群(antiphospholipid syndrome，APS)、致命性的APS(CAPS)、心血管疾病(cardiovascular disorder)、心肌炎(myocarditis)、腦血管疾病(cerebrovascular disorder)、周邊(例如，肌肉骨骼)血管疾病、腎血管疾病(renovascular disorder)、腸繫膜/腸血管疾病(mesenteric/enteric vascular disorder)、血管炎(vasculitis)、過敏性紫斑腎炎(Henoch-Schönlein purpura nephritis)、全身性紅斑狼瘡相關血管炎(systemic lupus erythematosus-associated vasculitis)、與類風濕性關節炎相關的血管炎(vasculitis associated with rheumatoid arthritis)、免疫複合疾病(immune complex vasculitis)、高安氏血管炎(Takayasu's disease)、擴張型心肌症(dilated cardiomyopathy)、糖尿病血管病(diabetic angiopathy)、川崎病(Kawasaki's disease，動脈炎)、靜脈氣體栓子(venous gas embolus，VGE)及支架置入後再狹窄(restenosis following stent placement)、冠狀動脈旋磨(rotational atherectomy)及經皮穿腔冠狀動脈血管成形術(參照例如，Holers(2008)Immunological Reviews 223：300-316；Holers and Thurman(2004)Molecular Immunology 41：147-152；美國專利公開號20070172483).
在一實施態樣中，該補體因子B相關疾病係選自由以下組成的群組：C3腎絲球病、全身性紅斑狼瘡(SLE)，例如，狼瘡性腎炎、IgA腎病、糖尿病腎病、多囊腎病、膜性腎病變、老年性黃斑部病變、非典型性尿毒溶血症候群、血栓性微血管病(thrombotic microangiopathy)、重症肌無力、缺血再灌流損傷、陣發性夜間血紅素尿症及類風濕性關節炎。
在另一實施態樣中，該補體因子B相關疾病選自由以下所組成之群組：C3腎絲球病、全身性紅斑狼瘡(SLE)，例如，狼瘡性腎炎、IgA腎病、糖尿病腎病及多囊腎病。
關於各種疾病或狀況的症狀和症狀的進一步細節在本文中提供並且是所屬既屬領域公知的。
如本文所用，「治療有效量(therapeutically effective amount)」旨在包括RNAi劑的劑量，當給藥於患有CFB相關疾病的個體時，該RNAi劑足以影響疾病的處置(例如，藉由降低、改善或維持現有疾病或一種或多種疾病症狀)。「治療有效量」可能不同，因為抑制劑、抑制劑的給藥方式、疾病及其嚴重程度以及歷史、年齡、體重、家族史、基因構成、先前或伴隨的處置的類型、(如果有)以及要處置之個體的其他個別特徵。
如本文所用，「預防有效量(Prophylactically effective amount)」意在包括RNAi劑的劑量，當給藥患有CFB相關病症的至少一個徵兆或症狀的個體時，該RNAi劑足以預防或延遲該個體達到疾病的全部診斷標準的進程。疾病的預防包括減緩疾病之全面爆發之進程。「預防有效量」可能不同，因RNAi劑、RNAi劑的給藥方式、疾病風險程度以及病史、年齡、體重、家族史、基因構成、先前或伴隨處置的類型而異，(如果有)以及要處置之個體的其他個別特徵。
「治療有效量」或「預防有效量」還包括在適用於任何處置的合理的益處/風險比率，產生一些期望的局部或全身效果之RNAi劑的劑量。在本發明的方法中使用之iRNA可藉由給藥足夠的劑量以產生適用於該處置的合理的益處/風險比率。
本文使用的術語「藥學上可接受的」係指在合理的醫學判斷範圍內，適用於接觸人類個體及動物個體組織的那些化合物、材料、組成物或劑型，而沒有過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症，其具有合理的益處/風險比。
如本文所用，術語「藥學上可接受的載劑」係指藥學上可接受的材料(包含鹽)、組成物或載體，例如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、製造助劑(例如潤滑劑、滑石鎂、硬脂酸鈣或硬脂酸鋅、或硬脂酸)或溶劑包封材料，該藥學上可接受的載劑包含將主題化合物從一個器官或身體的一部分攜帶或運輸到另一器官或身體的一部分。每一載劑必須係「可接受的」，意即與製劑的其他成分相容並且對治療個體無害。這樣的載劑在所屬技術領域中是已知的。藥學上可接受的載劑包括用於注射給藥的載劑。
如本文所用，術語「樣本」包括從個體分離的類似體液、細胞或組織的集合，以及存在於個體內的體液、細胞或組織。生物體液的實施例包括血液、血清及漿液、血漿、腦脊液、眼液、淋巴液、尿液、唾液等。組織樣本可包括來自組織、器官或局部區的樣本。例如，樣本可以源自特定器官、器官的一部分或這些器官內的體液或細胞。在某些實施態樣中，該樣本可以源自肝臟(例如，整個肝臟或肝臟的某些部分或肝臟中某些類型的細胞，例如，肝細胞)。在一些實施態樣中，「源自個體的樣本」 係指得自個體的尿液。「源自個體的樣本」可以係指來自個體的血液或血液來源的血清或血漿。
II.本發明的iRNAs
本發明提供抑制補體因子B基因表現的iRNAs。在部分實施態樣中，該iRNA包含用於抑制細胞中CFB基因的表現的雙股核糖核酸(dsRNA)分子，例如個體內的細胞，例如，哺乳類，例如容易發展補體因子B相關病症的人。該dsRNA包括具有與在CFB基因表現中形成的mRNA的至少一部分互補的互補區的反義股。該互補區長度係約19至30個核苷酸(例如，30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20或19個核苷酸。當與表現CFB基因之細胞接觸時，該iRNA抑制該CFB基因(例如，人基因、靈長動物基因、非靈長動物基因)之表現至少50%，如藉由例如PCR或基於分支股DNA(bDNA)之方法所分析，或藉由基於蛋白質之方法所分析，例如藉由使用例如西方點墨法之免疫螢光分子或流式細胞術所分析。於某些實施態樣中，表現之抑制係使用藉由本文實施例中提供的qPCR方法，在其中提供之合適的生物細胞株中使用siRNA，例如，10nM濃度。在某些實施態樣中，體內表現的抑制係藉由在表現人類基因之囓齒動物中的人類基因減弱來確定，例如小鼠或表現人類標靶基因的AAV感染的小鼠，例如，當以單劑量給藥時，例如，在RNA表達的最低點(nadir)時為3mg/kg。
在該dsRNA將被使用之狀況下，dsRNA包括兩個互補並雜交以形成雙螺旋結構的RNA股。dsRNA之一股(反義股)包括與標靶系列實質上互補且通常完全互補的互補區。該標靶序列可源自在CFB基因表現過程中形成之mRNA序列。另一股(有義股)包括與該反義股互補的區，使 得當在適宜狀況下組合時，兩股雜交並形成雙螺旋結構。如本文中他處所述，dsRNA之互補序列亦可作為單個核酸分子之自互補區而保有，與作為獨立之寡核苷酸相對。
一般而言，該雙鏈體結構係15至30個鹼基對長度，例如，15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22鹼基對長度。在某些實施態樣中，該雙鏈體結構係18至25個鹼基對長度，例如，18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至25、20至24,20至23、20至22、20至21、21至25、21至24、21至23、21至22、22至25、22至24、22至23、23至25、23至24或24至25個鹼基對長度，例如，19至21個鹼基對長度。上文引述之範圍及長度之間的範圍及長度亦視為本揭露之一部分。
同樣地，與標靶序列互補之區係15至30個核苷酸長度，例如，15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、 19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22個核苷酸長度，例如，19至23個核苷酸長度或21至23個核苷酸長度。上文引述之範圍及長度之間的範圍及長度亦視為本揭露之一部分。
在一些實施態樣中，該雙鏈體區係19至30個鹼基對長度。同樣地，與標靶序列互補之區係19至30個核苷酸長度。
在部分實施態樣中，該dsRNA係約19至約23個核苷酸長度或約25至約30個核苷酸長度。通常，該dsRNA係足夠長以用作Dicer酶之受質。例如，如所屬技術領域中所眾所周知的，長度超過約21至23個核苷酸可做為Dicer之受質。如具有通常知識者將認知，作為裂解標靶之RNA區最通常係較大RNA分子之一部分，一般為mRNA分子。若相關，則mRNA標靶之「一部分」係足夠長度之mRNA標靶的連續序列，以令其作為RNAi引導之裂解(亦即，經由RISC路徑裂解)的受質。
所屬技術領域中具有通常知識將認知該雙螺旋區係daRNA之主要官能部分，例如，約19至約30鹼基對的雙鏈體區，例如，約19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22鹼基對。因此，在一實施態樣中，就其被加工為例如15至30個鹼基對之以用於裂解之靶向所欲RNA為功能性雙鏈體的程度而言，具有超過30個鹼基對之雙鏈體區的RNA分子 或RNA分子之複合體係dsRNA。因此，具有通常知識者將認知在一個實施態樣中，miRNA係dsRNA。於另一實施態樣中，dsRNA不是天然出現之miRNA。於另一實施態樣中，可用於靶向補體因子B基因表現之iRNA劑並非藉由較大dsRNA之裂解而在標靶細胞內生成。
如本文所述的dsRNA可進一步包含一個或多個單股核苷酸突出，例如，1至4、2至4、1至3、2至3、1、2、3或4個核苷酸。具有至少一核苷酸突出的dsRNAs可具有相對於其平端對應物，具有更好的抑制特性。核苷酸突出可包含或由核苷酸/核苷類似物組成，包括去氧核苷酸/核苷。該(等)突出可位於有義股、反義股或其任意組合。此外，該突出之核苷酸可存在於dsRNA之反義股或有義股之5’-端、3’-端或兩端。
可以藉由所術領域中已知的標準方法合成dsRNA。本發明的雙股RNAi化合物可以使用兩步程序來製備。首先，分別製備雙股RNA分子的個別股。然後，對組成股進行黏合。siRNA化合物的個別股可以使用液相或固相有機合成或兩者來製備。有機合成的優點係可以很容易地製備包含非天然或修飾的核酸的寡核苷酸鏈。類似地，本發明的單鏈寡核酸可以使用液相或固相有機合成或兩者來製備。
無論合成方法如何，該siRNA製備都可以在適合配製的溶液(例如，水溶液或有機溶液)中製備。例如，可以將siRNA製備沉澱並重新溶解在純雙蒸餾水中，然後低壓冷凍。然後可以將乾燥的siRNA重新懸浮在適合預期配製過程的溶液中。
在一方面，本發明的dsRNA包含至少2個核苷酸序列，有義序列及反義序列。該有義股係選自表2至3中任一提供之序列的群組，且該有義股 之對應反義股係選自表2至3中任一之序列的群組。在這方面，互補於兩個序列之其一的兩個序列的一者，有實質上與在補充體因子B基因的表現中產生的mRNA的序列互補的序列的一者。因此，在此方面，dsRNA將包括兩個寡核苷酸，其中一寡核苷酸被描述為表2至3中任一的有義股，而第二寡核苷酸被描述為在表2至3的任一中之有義股的對應反義股。
在某些實施態樣中，該dsRNA的實質上互補的序列包含在單獨的寡核苷酸。在其他實施態樣中，該dsRNA的實質上互補的序列包含在單個寡核苷酸。
應當理解，儘管表2中的序列未被描述為修飾的或接合的序列，本發明的iRNA的RNA，例如，本發明的dsRNA，可以包含表2至3任一所列序列的未修飾、未接合，或修飾或接合與其中所述不同的任一者。換句話說，如本文所述，本發明包括表2至3之未修飾的、未綴合的、修飾的或綴合的dsRNA。
具有通常知識者知悉，具有約20至23個鹼基對如21個鹼基對之雙鏈體結構的dsRNA已經被確認為在誘導RNA干擾中尤其有效(Elbashir et al.,EMBO 2001,20：6877-6888)。然而，其他人已經發現，更短或更長之RNA雙鏈體結構亦有效(Chu and Rana(2007)RNA 14：1714-1719；Kim et al.(2005)Nat Biotech 23：222-226)。於上文所述之實施態樣中，表2至3任一者提供之寡核苷酸序列之天性，本文所述之dsRNAs可包括至少一長度為最少21個核苷酸之股。可合理地預期，含有表2至3任一者的任一序列的僅在一端或兩端減去幾個核苷酸之較短雙鏈體可能具備與上述dsRNA類似之效果。因此，具有源自表2至3任一者的任一序列的至少19、20或更多個接續核苷酸之序列，與包含完整序列的dsRNA有所 差異，其抑制補體因子B基因表現的能力不超過約5%、10%、15%、20%、25%或30%，認為在本發明的範圍內。
此外，表2至3提供的RNAs辨認了補體因子B轉錄中易受RISC介導之裂解影響的的位點。因此，本發明的特徵還在於靶向這些位點之一的iRNAs。如本文所用，如果iRNA在特定位點內的任何地方促進轉錄物的裂解，則稱iRNA靶向RNA轉錄本的特定位點內。這樣的iRNA通常包括自表2至3任一者提供的任一序列至少約19個連續核苷酸，偶聯至取自區與補體因子B基因中的選定序列相鄰的額外核苷酸序列。
如本文所述的RNAi劑可包含對於標靶序列的一個或多個錯配。在一實施態樣中，如本文所述的RNAi劑包含不超過3個錯配(亦即，3、2、1或0個錯配)。在一實施態樣中，如本文所述的RNAi劑包含不超過2個錯配。在一實施態樣中，如本文所述的RNAi劑包含不超過1個錯配。在一實施態樣中，如本文所述的RNAi劑包含0個錯配。在某些實施態樣中，如果RNAi劑的反義股含有與標靶序列的錯配，該錯配可以視需要地限制在互補區的從5'-或3'-端的最後5個核酸中。例如，在這樣的實施態樣中，對於23個核苷酸的RNAi劑，與CFB基因的區互補的股通常在中央13個核苷酸內不包含任何錯配。本文描述的方法或所屬技術領域已知的方法可用於確定含有與標靶序列錯配的RNAi劑是否有效抑制CFB基因的表現。考慮具有錯配的RNAi劑在抑制CFB基因表現方面的作用係重要的，特別係如果已知CFB基因中互補的特定區在群體中具有多態性序列變異。
III.本發明的經修飾的iRNAs
在某些實施態樣中，本發明之iRNA的RNA，例如，dsRNA，係未修飾的，且不包含，例如，所述技術領域中已知或本文所述的化學修飾或接合。在其他實施態樣中，本發明之iRNA的RNA，例如，dsRNA，係經過化學修飾以增強穩定性或其他有益特性。在本發明的某些實施態樣中，本發明的iRNA所有核苷酸實質上都被修飾。在本發明的其他實施態樣中，iRNA的所有核苷酸或iRNA的實質上所有核苷酸係都被修飾，即，不超過5、4、3、2或1個未修飾的核苷酸存在於iRNA的一股中。
本發明提出之核酸可藉由所屬技術領域中方法而合成或修飾，如《現代核酸化學技術》(「Current protocols in nucleic acid chemistry」,Beaucage,S.L.et al.(Edrs.),John Wiley & Sons,Inc.,New York,NY,USA)中所述，該文獻藉由引用而併入本文。修飾包括，舉例而言，端修飾，例如，5’-端修飾(磷酸化、接合、反向鏈結)或3’-端修飾(接合、DNA核苷酸、反向鏈結等)；鹼基修飾，例如，置換為安定化鹼基、去安定化鹼基、或與同伴之拓展物進行鹼基配對之鹼基，移除鹼基(無鹼基之核苷酸)，或接合鹼基；糖修飾(例如，在2’-位置或4’-位置)或糖之置換；或主鏈修飾，包括磷酸二酯類鏈結之修飾或置換。可用於本文所述實施態樣中之iRNA化合物之具體實施例包括，但不限於，含有經修飾之主鏈或不含天然核苷酸間鏈結之RNAs。對於本說明書之目的，且如所屬技術領域中有時參照者，在其核苷酸間主鏈中不具有磷原子的經修飾之RNA亦可視為寡核苷酸。在一些實施態樣中，經修飾的iRNA將在其核苷酸間主鏈中具有磷原子。
經修飾之RNA主鏈包括，例如，硫代磷酸酯類、手性硫代磷酸酯類、二硫代磷酸酯類、磷酸三酯類、胺基烷基磷酸三酯類、包括3’- 伸烷基磷酸酯類及手性磷酸酯類之甲基及其他烷基磷酸酯類、膦酸酯類、包括3’-胺基磷醯胺化物及胺基烷基磷醯胺化物之磷醯胺化物、硫羰基磷醯胺化物類、硫羰基烷基磷酸酯類、硫羰基烷基磷酸三酯類、以及具有正常3'-5'鏈結的硼酸磷酸鹽；這些之2’-5’鏈結類似物；以及彼等具有反向極性者，其中相鄰之核苷單元對係將3’-5’鏈結至5’-3’或將2’-5’鏈結至5’-2’。亦可包括多種鹽類、混合鹽類及游離酸形式。於本發明之一些實施態樣中，本發明之dsRNA劑可係游離酸形式。於本發明之其他實施態樣中，本發明之dsRNA劑可係鹽形式。於一實施態樣中，本發明之dsRNA劑可係鈉鹽形式。於某些實施態樣中，當本發明之dsRNA劑係鈉鹽形式時，鈉離子可作為該劑中存在之實質上全部磷酸二酯及/或硫代磷酸酯基團之抗衡離子而存在於該劑中。其中實質上全部磷酸二酯及/或硫代磷酸酯類鏈結皆具有鈉抗衡離子之劑，包括不超過5、4、3、2或1個沒有鈉抗衡離子之磷酸二酯及/或硫代磷酸酯類鏈結。於一些實施態樣中，當本發明之dsRNA劑係鈉鹽形式時，鈉離子可作為該劑中存在之全部磷酸二酯及/或硫代磷酸酯基團之抗衡離子而存在於該劑中
教示上述含磷鏈結之製備的代表性美國專利包括但不限於，美國專利第3,687,808號、第4,469,863號、第4,476,301號、第5,023,243號、第5,177,195號、第5,188,897號、第5,264,423號、第5,276,019號、第5,278,302號、第5,286,717號、第5,321,131號、第5,399,676號、第5,405,939號、第5,453,496號、第5,455,233號、第5,466,677號、第5,476,925號、第5,519,126號、第5,536,821號、第5,541,316號、第5,550,111號、第5,563,253號、第5,571,799號、第5,587,361號、第 5,625,050號、第6,028,188號、第6,124,445號、第6,160,109號、第6,169,170號、第6,172,209號、第6,239,265號、第6,277,603號、第6,326,199號、第6,346,614號、第6,444,423號、第6,531,590號、第6,534,639號、第6,608,035號、第6,683,167號、第6,858,715號、第6,867,294號、第6,878,805號、第7,015,315號、第7,041,816號、第7,273,933號、第7,321,029號、及美國再公告專利第39464號，其每一全部內容藉由引用而併入本文。
其內部不包括磷原子之經修飾的RNA主鏈具有藉由短股烷基或環烷基類核苷酸間鏈結、混合雜原子及烷基或環烷基類核苷酸間鏈結、或一個或多個短股雜原子或雜環類核苷酸間鏈結形成的主鏈。這些包括彼等具有N-嗎啉基鏈結(部分地由核苷至糖部分形成)；矽氧烷主鏈；硫醚、亞碸及碸主鏈；甲醯基及硫代甲醯基主鏈；亞甲基甲醯基及硫代甲醯基主鏈；含有伸烷基之主鏈；胺基磺酸酯主鏈；亞甲基亞胺基及亞甲基肼基主鏈；磺酸酯及磺醯胺主鏈；醯胺主鏈；以及其他具有混合之N、O、S及CH2的組分部分。
教示上述寡核苷酸之製備的代表性美國專利包括但不限於，美國專利第5,034,506號、第5,166,315號、第5,185,444號、第5,214,134號、第5,216,141號、第5,235,033號、第5,64,562號、第5,264,564號、第5,405,938號、第5,434,257號、第5,466,677號、第5,470,967號、第5,489,677號、第5,541,307號、第5,561,225號、第5,596,086號、第5,602,240號、第5,608,046號、第5,610,289號、第5,618,704號、第 5,623,070號、第5,663,312號、第5,633,360號、第5,677,437號、及第5,677,439號，其每一全部內容藉由引用而併入本文。
適合RNA模擬物預期用於本文提供的iRNAs，其中該核苷酸單元之糖及核苷酸間鏈結兩者，亦即，主鏈，係置換為新穎基團。該鹼基單元維持與適宜之核酸標靶化合物雜交。一種此類寡聚化合物，其中已經顯示具有優異雜交特性之RNA模擬物，指稱為胜肽核酸(PNA)。於PNA化合物中，RNA之糖主鏈係置換為含有醯胺之主鏈，尤其是胺基乙基甘油主鏈。核酸鹼基得以保留及直接或間接地鍵結至主鏈之醯胺部分的氮雜氮原子。教示PNA化合物之製備的代表性美國專利包括但不限於，美國專利第5,539,082號、第5,714,331號、及第5,719,262號，其每一全部內容藉由引用而併入本文。適用於本發明之iRNAs劑中之額外之PNA化合物揭示於，舉例而言，於Nielsen et al.,Science,1991,254,1497-1500中。
本發明提出的一些實施態樣包括具有硫代磷酸酯主鏈之RNAs以及具有雜原子主鏈之寡核苷酸，尤其是上文引用之美國專利第5,489,677號的--CH2--NH--CH2-、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[稱為亞甲基(甲基亞胺基)或MMI主鏈]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--及--N(CH3)--CH2--CH2--，以及上文引用之美國專利第5,602,240號的醯胺主鏈。於一些實施態樣中，本文提出之RNAs具有上文引用之美國專利第US 5,034,506號的N-嗎啉基主鏈結構。天然磷酸二酯主鏈可以表示為O-P(O)(OH)-OCH2-。
經修飾之RNA亦可含有一個或多個經取代之糖部分體。本文提出之iRNAs劑，例如，dsRNAs，可包括位於2’-位置之下述之一者：OH；F； O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中該烷基、烯基及炔基可係經取代或未經取代之C1至C10烷基或C2至C10烯基及炔基。示例性之合適修飾包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2及O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n及m係1至約10。於其他實施態樣中，dsRNA包括位於2’位置之下述之一者：C1至C10低級烷基、經取代之低級烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、雜環烷基、雜環烷基芳基、胺基烷基胺基、聚烷基胺基、經取代之矽烷基、RNA裂解基團、保護基團、嵌入劑、用於改善RNAi劑之藥物動力學特性之基團、或用於改善RNAi劑之藥效動力學特性之基團、以及其他具有類似特性之取代基。於一些實施態樣中，該修飾包括2’-甲氧基乙氧基(2'-O--CH2CH2OCH3，亦稱為2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)(Martin et al.,Helv.Chim.Acta,1995,78：486-504)，亦即，烷氧基-烷氧基。另一示例性修飾係2'-二甲基胺基氧乙氧基，亦即，O(CH2)2ON(CH3)2基團，亦稱為2'-DMAOE，如下文實施例中所述；以及2'-二甲基胺基乙氧基乙氧基(所屬技術領域中亦稱為2'-O-二甲基胺基乙氧基乙基或2'-DMAEOE)，亦即，2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2。其他示例性修飾包括：5’-Me-2’-F核苷酸、5’-Me-2’-OMe核苷酸、5’-Me-2’-去氧核苷酸(於此三家族中，皆係R異構物與S異構物兩者)；2’-烷氧基烷基；以及2’-NMA(N-甲基乙醯胺)。
其他修飾包括2'-甲氧基(2'-OCH3)、2'-胺基丙氧基(2'-OCH2CH2CH2NH2)及2'-氟(2'-F)。類似的修飾亦可在iRNA之RNA之其他位置作成，尤其是3’端核苷酸之糖的3’位置或2’-5’鏈結之dsRNA中以及5’端核苷酸之5’位置。iRNA亦可具有替代呋喃戊糖基糖的糖模擬物如 環丁基部分體。教示此類經修飾之糖結構之製備的代表性美國專利包括但不限於，美國專利第4,981,957號、第5,118,800號、第5,319,080號、第5,359,044號、第5,393,878號、第5,446,137號、第5,466,786號、第5,514,785號、第5,519,134號、第5,567,811號、第5,576,427號、第5,591,722號、第5,597,909號、第5,610,300號、第5,627,053號、第5,639,873號、第5,646,265號、第5,658,873號、第5,670,633號、及第5,700,920號，這些中之某些為本申請所共有。前述者每一全部內容藉由引用併入本文。
iRNA亦可包括核酸鹼基(所屬技術領域中一般簡稱為「鹼基」)修飾或取代。如本文中所用，「未經修飾」或「天然」核酸鹼基包括嘌呤鹼基腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G)，以及嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。經修飾之核酸鹼基包括其他合成及天然核酸鹼基，如去氧胸苷(dT)、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羥甲基胞嘧啶；黃嘌呤；次黃嘌呤；2-胺基腺嘌呤；腺嘌呤及鳥嘌呤之6-甲基及其他烷基衍生物；腺嘌呤及鳥嘌呤之2-丙基及其他烷基衍生物；2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、2-硫胞嘧啶；5-鹵尿嘧啶、5-鹵胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-鹵基、8-胺基、8-巰基、8-硫烷基、8-羥基及其他8-取代之腺嘌呤及鳥嘌呤；5-鹵尤其是5-溴、5-三氟甲基及其他5-取代之尿嘧啶及胞嘧啶；7-甲基鳥嘌呤及7-甲基腺嘌呤；8-氮雜鳥嘌呤及8-氮雜腺嘌呤；7-去氮鳥嘌呤及7-去氮腺嘌呤；以及3-去氮鳥嘌呤及3-去氮腺嘌呤。其他核酸鹼基包括彼等揭露於美國專利第3,687,808號中者；彼等揭露於Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijn,P.ed.Wiley-VCH,2008中； 彼等揭露於The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,pages 858-859,Kroschwitz,J.L,ed.John Wiley & Sons,1990中；這些由Englisch et al.,(1991)Angewandte Chemie,International Edition,30：613揭露者；以及彼等由Sanghvi,Y S.,Chapter 15,dsRNA Research and Applications,pages 289-302,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Ed.,CRC Press,1993揭露。這些核酸鹼基中之部分尤其可用於增加本揭露提出之寡聚化合物的結合親和性。這些包括5-取代之嘧啶、6-氮雜嘧啶及N-2、N-6及O-6取代之嘌呤，包括2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙基尿嘧啶及5-丙基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代經顯示將核酸雙鏈體安定性增加0.6至1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Eds.,dsRNA Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278)且係示例性之鹼基取代，尤其是當與2'-O-甲氧基乙基糖修飾合用時。
教示某些上述經修飾之核酸鹼基以及其他經修飾之核酸鹼基的代表性美國專利包括但不限於，上述之美國專利第3,687,808號、第4,845,205號、第5,130,30號、第5,134,066號、第5,175,273號、第5,367,066號、第5,432,272號、第5,457,187號、第5,459,255號、第5,484,908號、第5,502,177號、第5,525,711號、第5,552,540號、第5,587,469號、第5,594,121號、第5,596,091號、第5,614,617號、第5,681,941號、第5,750,692號、第6,015,886號、第6,147,200號、第6,166,197號、第6,222,025號、第6,235,887號、第6,380,368號、第6,528,640號、第6,639,062號、第6,617,438號、第7,045,610號、第7,427,672號、及第7,495,088號，其每一全部內容藉由引用而併入本文。
在部分實施態樣中，還可以修飾本公開的iRNA劑以包括一個或多個雙環糖部分體。「雙環糖(bicyclic sugar)」是藉由兩個原子的橋接修飾的呋 喃糖環。「雙環糖」是由兩個碳原子之橋接形成的環所修飾的呋喃糖環，無論相鄰或非相鄰。「雙環核苷(BNA)」是具有包含藉由橋接連接糖環的兩個碳原子之糖部分體的核苷，無論相鄰或不相鄰，從而形成雙環系統。在部分實施態樣中，該橋連接糖環的4'-碳和2'-碳，視需要地，藉由2'-無環氧原子。因此，在部分實施態樣中，本發明之劑包括一個或多個鎖核酸(LNA)。鎖核酸係具有經修飾之核糖部分的核苷酸，其中該核糖部分體包含連結2’碳與4’碳之外接橋。換言之，LNA係包含4'-CH2-O-2'橋之雙環糖部分體的核苷酸。這一結構有效地將該核糖「鎖」為3’-環內結構之構形。將鎖核酸加至siRNAs中已經顯示增加血清中siRNA安定性，且降低脫靶效應(Elmen,J.et al.,(2005)Nucleic Acids Research 33(1)：439-447；Mook,OR.et al.,(2007)Mol Canc Ther 6(3)：833-843；Grunweller,A.et al.,(2003)Nucleic Acids Research 31(12)：3185-3193)。用於本發明的多核苷酸的雙環核苷的實施例包括但不限於在4'和2'核糖基環原子之間包含橋的核苷。在部分實施態樣中，本發明的反義多核苷酸劑包括一個或多個包含4'至2'橋的雙環核苷。
鎖核苷可以由結構表示(省略立體化學)，
Figure 111140910-A0202-12-0058-202
其中，B係核鹼基或修飾的核鹼基，且L係將2'-碳連接到核糖環的4'-碳的連接基團。
此類4'至2'橋連雙環核苷的實施例包括但不限於4'-(CH2)-O-2'(LNA)；4'-(CH2)-S-2'；4'-(CH2)2-O-2'(ENA)；4'-CH(CH3)-O-2'(也稱為「受約束的乙基(constrained ethyl)」或「cEt」)及4'-CH(CH2OCH3)-O-2'(及其類似物；參見例如，美國專利第7,399,845號)；4'-C(CH3)(CH3)-O-2'(及其類似物；參見例如美國專利號8,278,283)；4'-CH2-N(OCH3)-2'(及其類似物；參見例如美國專利號8,278,425)；4'-CH2-ON(CH3)-2'(參見例如，美國專利公開號2004/0171570)；4'-CH2-N(R)-O-2'，其中R係H、C1至C12烷基，或氮保護基團(參見例如，美國專利號7,427,672；Greene's Protective Groups in Organic Synthes係，Fourth Edition,2006,eds.John Wiley & Sons,Inc.)；4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(參見例如，Chattopadhyaya et al.,J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；及4'-CH2-C(=CH2)-2'(及其類似物；參見例如，美國專利號8,278,426)。前述每一全部內容在此藉由引用併入本文。
鎖核酸核苷酸教示製備的其他代表性美國專利及美國專利公開包括但不限於以下：美國專利號66,268,490；6,525,191；6,670,461；6,770,748；6,794,499；6,998,484；7,053,207；7,034,133；7,084,125；7,399,845；7,427,672；7,569,686；7,741,457；8,022,193；8,030,467；8,278,425；8,278,426；8,278,283；美國2008/0039618；及US2009/0012281，每一全部內容藉由引用併入本文。
任何前述雙環核苷可以被製備具有一個或多個立體化學糖構型包括例如α-L-呋喃核糖及β-D-呋喃核糖(參見WO 99/14226)。
本揭露的iRNA劑也可以被修飾以包括一個或多個受限的乙基核苷酸。如本文所用，「受約束的乙基核苷酸」或「cEt」係包含雙環糖部分的鎖核酸，該雙環糖部分包含4'-CH(CH3)-O-2'橋(即，前述結構中的 L)。在一實施態樣中，受約束的乙基核苷酸處於本文稱為「S-cEt」的S構形。
本發明的iRNA還可以包括一個或多個「構型受限核苷酸(CRN)」。CRN係具有連接核糖的C2'及C4'碳或核糖的C3及-C5'碳之連接子的核苷酸類似物。CRN將核糖環鎖為穩定的構型，並增加與mRNA的雜交親和力。該連接子的長度足以將氧置於最佳位置，以實現穩定性及親和力，因此減少核糖環褶皺。
教示部分上述CRN製備的代表性公開包括但不限於US 2013/0190383；及WO 2013/036868，每一全部內容在此藉由引用併入本文。
在一些實施態樣中，本發明的iRNA包含一個或多個單體，該單體係UNA(未鎖核酸)核苷酸。UNA係未鎖無環核酸，其中糖的任一鍵已被去除，形成未鎖的「糖」殘基。在一實施例中，UNA還包括C1'-C4'之間的鍵已被去除的單體(即C1'及C4'碳之間的共價碳-氧-碳鍵)。在另一實施例中，糖的C2'-C3'鍵(即C2'及C3'碳之間的共價碳-碳鍵)已被去除(參照Nuc.Acids Symp.Series,52,133-134(2008)and Fluiter et al.,Mol.Biosyst.,2009,10,1039，在此藉由引用併入)。
教示UNA製備的代表性美國公開包括但不限於US8,314,227；及美國專利公開號2013/0096289；2013/0011922；及2011/0313020，每一全部內容在此藉由引用併入本文。
對RNA分子端的潛在穩定修飾可以包括N-(乙醯胺基己醯基)-4-羥基脯胺酸(Hyp-C6-NHAc)、N-(己醯基-4-羥基脯胺酸(Hyp-C6)、N- (乙醯基-4-羥基脯胺酸)(Hyp-NHAc)、胸苷-2'-O-去氧胸苷(醚)、N-(胺基己醯基)-4-羥脯胺酸(Hyp-C6-胺基)、2-二十二烷醯基-尿苷-3'-磷酸鹽、反向2'-去氧修飾的核糖核苷酸、例如反向的dT(idT)、反向的dA(idA)及反向的無鹼基2'-去氧核糖核苷酸(iAb)等。該修飾的揭露可見於WO 2011/005861。
在一實施例中，寡核苷酸的3'或5'終端係連接到反向的2'-去氧-修飾的核糖核苷酸，例如反向的dT(idT)、反向的dA(idA)或反向的無鹼基2'-去氧-核糖核苷酸(iAb)。在一具體實施例中，反向的2'-去氧-修飾的核糖核苷酸連接到寡核苷酸的3'端，例如本文描述的有義股的3'-端，其中連接係藉由3'-3'磷酸二酯鏈結或3'-3'-硫代磷酸酯鏈結。
在另一實施例中，該有義股的3'-端藉由3'-3'-硫代磷酸酯鏈結與反向無鹼基核糖核苷酸(iAb)連接。在另一實施例中，該有義股的3'-端藉由3'-3'-硫代磷酸酯鏈結與反向dA(idA)連接。
在一具體的實施例中，該反向的2'-去氧修飾的核糖核苷酸連接到寡核苷酸的3'端，例如本文描述的有義股的3'-端，其中連接係藉由3'-3'磷酸二酯鏈結或3'-3'-硫代磷酸酯鏈結。
在另一實施例中，該有義股的3'-端核苷酸係反向dA(idA)，並藉由3'-3'-鏈結結(例如，3'-3'-硫代磷酸酯鏈結)連接到前面的核苷酸。
本發明的iRNA的其他修飾包括5'磷酸鹽或5'磷酸鹽模擬物，例如，iRNA之反義股的5'-端磷酸鹽或磷酸鹽模擬物。合適的磷酸鹽模擬物揭露於例如US 2012/0157511中，其全部內容藉由引用併入本文。
A.包含模體之本發明的修飾iRNAs
在本發明的某些方面，本發明的雙股RNAi劑包括具有化學修飾的劑，例如在WO 2013/075035中揭露的，其全部內容藉由引用併入本文。如本文及WO 2013/075035中所示，藉由將三個連續核苷酸的三個相同修飾的一個或多個模體引入RNAi劑的有義股或反義股，特別係在裂解位點處或附近，可以獲得優異的結果。在一些實施態樣中，dsRNAi劑的有義股及反義股可以另外被完全修飾。這些模體的引入會中斷有義股或反義股的修飾模式(如果存在)。dsRNAi劑可以視需要地與GalNAc衍生的配體接合，例如在有義股。
更具體地，當雙股RNA劑的有義股和反義股被完全修飾為在dsRNAi劑之至少一股的切割位點處或附近的三個連續核苷酸具有三個相同修飾的一個或多個模體時，觀察了dsRNAi劑的基因緘默活性。
因此，本發明提供了能夠在活體內抑制標標靶基因(即，CFB基因)表現的雙股RNA劑。該RNAi劑包含有義股及反義股。該RNAi劑的每股長度可以係，例如，17至30個核苷酸長度、25至30個核苷酸長度、27至30個核苷酸長度、19至25個核苷酸長度、19至23個核苷酸長度、19至21個核苷酸長度、21至25個核苷酸長度或21至23個核苷酸長度。
有義股及反義股通常形成複合雙股RNA(dsRNA)，在本文也稱為「dsRNAi劑」。該RNAi劑的雙鏈體區可以係27至30個核苷酸對長度、19至25個核苷酸對長度、19至23個核苷酸對長度、19至21個核苷酸對長度、21至25個核苷酸對長度或21至23個核苷酸對長度。在 另一實施例中，該雙鏈體區長度選自為19、20、21、22、23、24、25、26及27個核苷酸。
在某些實施態樣中，該dsRNAi劑可以在一股或兩股的3'-端、5'-端或兩端包含一個或多個突出區或加帽基團。突出可獨立地為1至6個核苷酸長度，例如2至6個核苷酸長度、1至5個核苷酸長度、2至5個核苷酸長度、1至4個核苷酸長度、2至4個核苷酸長度、1至3個核苷酸長度、2至3核苷酸長度或1至2個核苷酸長度。在某些實施態樣中，該突出區可包含如上提供的延伸突出區。突出可為一股比另一股長的結果，或者是兩條相同長度的股交錯的結果。突出可以與標靶mRNA形成錯配，或其可與被靶向的基因序列互補，或者可為另一序列。第一股及第二股也可以連接，例如，藉由額外的鹼基形成髮夾，或藉由其他非鹼基連接子。
在某些實施態樣中，該dsRNAi劑之突出區中的核苷酸可以各自獨立地係修飾的或未修飾的核苷酸，包括但不限於2'-糖修飾的，例如2-F、2'-O-甲基、胸苷(T)、2`-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(Teo)、2`-O-甲氧基乙基腺苷(Aeo)、2`-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷(m5Ceo)及其任意組合。
例如，TT可以係任一股之任一端的突出序列。突出可以與標靶mRNA形成錯配，或其可與被靶向的基因序列互補，或者可為另一序列。
在dsRNAi劑的有義股、反義股或兩股的5'-或3'-突出可被磷酸化。在一些實施態樣中，該突出區包含其之間具有硫代磷酸酯的兩個核苷酸，其中該兩個核苷酸可以相同或不同。在一些實施態樣中，該突 出存在於有義股、反義股或兩股的3'-端。在一些實施態樣中，該3'-突出存在於反義股。在一些實施態樣中，該3'-突出存在於有義股。
RNAi劑可能只包含一突出，其可以增強RNAi的干擾活性，而不影響其整體穩定性。例如，單股突出可以位於有義股的3'-端，或者在反義股的3'-端。該RNAi也可能有鈍端，位於反義股的5'-端(亦即，有義股的3'-端)，反之亦然。通常，dsRNAi劑的反義股在3'-端有一核苷酸突出，而5'-端係鈍的。雖然不希望受限於理論，但該反義股5'端的不對稱平端及反義股的3'-端突出有利於引導股裝載到RISC過程中。
在某些實施態樣中，該dsRNAi劑係長度19個核苷酸的雙鈍端，其中該有義股在來自5'端的位置7、8、9的三個連續核苷酸，其包含三個2'-F修飾的至少一模體。該反義股在距離5'端的位置11、12、13的三個連續核苷酸，包含由三個2'-O-甲基修飾組成的至少一個模體。
在其他實施態樣中，該dsRNAi劑係20個核苷酸長度的雙鈍端，其中該有義股在來自5'端的位置8、9、10的三個連續核苷酸，包含三個2'-F修飾的至少一模體。該反義股在距離5'端的位置11、12、13的三個連續核苷酸，包含由三個2'-O-甲基修飾組成的至少一個模體。
在又一實施態樣中，該dsRNAi劑係21個核苷酸長度的雙鈍端，其中有義股在來自5'-端的位置9、10、11的三個連續核苷酸，包含三個2'-F修飾的至少一模體。反義股在距離5'端的位置11、12、13的三個連續核苷酸，包含由三個2'-O-甲基修飾組成的至少一個模體。
在某些實施態樣中，該dsRNAi劑包含21個核苷酸的有義股及23個核苷酸的反義股，其中該有義股在來自5'端的位置9、10、11的三個連續 核苷酸，包含由三個2'-F修飾的至少一個模體；反義股距離5'端的位置11、12、13的三個連續核苷酸，包含由三個2'-O-甲基修飾組成的至少一個模體，其中RNAi劑的一端係鈍端，而另一端包含一2個核苷酸突出。在一實施態樣中，該2個核苷酸突出位於反義股的3'-端。
當2個核苷酸突出位於反義股的3'-端時，該處三個核苷酸之間可能存在兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，其中三個核苷酸中的兩個係突出核苷酸，且第三個核苷酸係突出核苷酸旁邊的配對核苷酸。在一實施態樣中，該RNAi劑在有義股的5'-端及反義股的5'端的端三個核苷酸之間，其另外具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。在部分實施態樣中，該dsRNAi劑之有義股及反義股中的每一核苷酸，包括作為模體序列一部分的核苷酸，都係修飾的核苷酸。在某些實施態樣中，每個殘基獨立地被2'-O-甲基或2'-氟修飾，例如，在替代模體序列中。視需要地，該RNAi劑復包含配體(例如，GalNAc)。
在某些實施態樣中，該dsRNAi劑包含有義股及反義股，其中有義股長度為25至30個核苷酸，其中從5'端核苷酸(位置1)開始，第一股的位置1至23包含至少8個核糖核苷酸；反義股長度為36至66個核苷酸殘基，從3'端核苷酸開始，在與有義股1至23位配對的位置，包含至少8個核糖核苷酸以形成雙鏈體；其中至少反義股的3'端核苷酸與有義股不成對，並且多達6個連續的3'端核苷酸與有義股不成對，因此形成1至6個核苷酸的3'單股突出；其中反義股的5'端包含10至30個不與有義股配對的連續核苷酸，因此形成10至30個核苷酸的單股5'突出；其中，當有義股及反義股對劑以獲得最大互補性時，至少有義股5'端及3'端核苷酸與反義股的核苷酸鹼基配對，因此在有義股及反義股之間形成實質上雙鏈體區；反義股係沿至少19個反義股長度的核糖核苷酸與標 靶RNA充分互補，在雙股核酸被引入到哺乳動物細胞時，其降地低標靶基因表現；並且其中有義股在三個連續的核苷酸，其包含由三個2'-F修飾組成的至少一個模體，其中至少一模體出現在裂解位點處或附近。反義股在裂解位點處或附近的三個連續核苷酸，其包含由三個2'-O-甲基修飾組成的至少一個模體。
在某些實施態樣中，該dsRNAi劑包含有義股及反義股，其中dsRNAi劑包含長度為至少25且至多29個核苷酸的第一股、及長度為至多30個核苷酸的第二股及至少從5'端開始的第位置11、12、13三個連續核苷酸的三個2'-O-甲基修飾的一模體序列；其中第一股的3'端及第二股的5'端形成鈍端，並且第二股在其3'端比第一股長1至4個核苷酸，其中在長度至少25個核苷酸雙鏈體區區，當RNAi劑被引入哺乳動物細胞時，第二股沿自身長度的至少19個核苷酸與標靶mRNA充分互補，以降低標把基因表現，並且dsRNAi劑的dicer裂解導致包含第二股3'端的siRNA，因此降低哺乳動物中標靶基因的表現。視需要地，該RNAi劑復包含配體。
在某些實施態樣中，該dsRNAi劑的有義股在三個連續核苷酸，含有三個相同修飾的至少一模體，其中模體之一出現在有義股的裂解位點處。
在某實施態樣中，該dsRNAi劑的反義股還可以含有在三個連續核苷酸之三個相同修飾的至少一模體，其中模體之一出現在反義股的裂解位點處或附近。
對於含有雙鏈體區19至23核苷酸長度的dsRNAi劑，反義股的裂解位點通常在5'-端的位置10、11及12附近。因此三個相同修飾的模體可能出現在反義股的位置9、10、11；位置10、11、12；位置11、12、13；位置12、13、14；或位置13、14、15，從反義股5'端的第一核苷酸起算，或從反義股5' 端於雙鏈體區內的第1個配對核苷酸起算。反義股中的裂解位點也可能根據從5'端之dsRNA劑之雙鏈體區的長度而變化。
dsRNAi劑的有義股可以含有在股的裂解位點處的三個連續核苷酸之三個相同修飾的至少一個模體；並且反義股可以具有在股的裂解位點或附近的三個連續核苷酸之三個相同修飾的至少一個模體。當反義股及反義股形成dsRNA雙鏈體時，有義股及反義股可以因而對準有義股之三個核苷酸的一模體，及反義股之三個核苷酸的一個模體，並具有至少一核苷酸重疊，亦即，正義股中模體的三個核苷酸中的至少一核苷酸與反義股中模體的三個核苷酸中的至少一核苷酸形成鹼基對。或者，至少兩個核苷酸可重疊，或者所有三個核苷酸都可重疊。
在一些實施態樣中，該dsRNAi劑的有義股可以含有在三個連續核苷酸之三個相同修飾的一個以上模體。第一模體可出現在股的裂解位點處或附近，而其他模體可以係翼修飾。本文中的術語「翼修飾(wing modification)」係指出現在股的另一局部的模體，該模體與在相同股的裂解位點處或附近的模體分離。該翼修飾與第一模體相鄰或被至少一個或多個核苷酸隔開。當該模體彼此直接相鄰時，模體的化學性質彼此不同，並且當模體被一個或多個核苷酸隔開時，其化學性質可以相同或不同。可能存在兩個或更多個翼修飾。例如，當存在兩個翼修飾時，每個翼修飾可以發生在相對於位於或靠近裂解位點的第一模體的一端，或在前導模體的任一側。
與有義股類似，dsRNAi劑的反義股可以含有在三個連續的核苷酸之三個相同修飾的一個以上模體，其中至少一模體出現在股的裂解位點處或 附近。該反義股還可以含有一個或多個翼修飾，該翼修飾與可能存在於有義股的翼修飾相似的方式排列。
在一些實施態樣中，該dsRNAi劑的有義股或反義股的翼修飾通常不包括股的3'-端、5'-端或兩端的第一個或前兩個端核苷酸。
在其他實施態樣中，該dsRNAi劑的有義股或反義股的翼修飾通常不包括股的3'-端、5'-端或兩端的雙鏈體區內的第一個或前兩個配對的核苷酸。
當該dsRNAi劑的有義股及反義股分別含有至少一翼修飾時，該翼修飾可以落在雙鏈體區的同一端，並且具有1個、2個或3個核苷酸的重疊。
當該dsRNAi劑的有義股及反義股各自含有至少兩個翼修飾時，有義股及反義股可以因而對準，使得來自一股的兩個修飾落到雙鏈體區的一端，具有一個、兩個或三個核苷酸的重疊；兩個修飾個別落在雙鏈體區的另一端，具有一個、兩個或三個核苷酸的重疊；兩個修飾一股落在前導模體的每一側，在雙鏈體區有一個、兩個或三個核苷酸的重疊。
在一些實施態樣中，該dsRNAi劑之有義股及反義股的每一核苷酸，包含模體之部分的核苷酸，可被修飾。每個核苷酸可以用相同或不同的修飾來修飾，其可以包括一個或多個非連接磷酸氧或一個或多個連接磷酸氧的一個或兩者的一個或多個的改變；核糖成分的改變，例如核糖的2'-羥基；用「去磷(dephospho)」連接子批發取代磷酸酯部分體；天然鹼基的修飾或替換；及磷酸核糖主鏈的替換或修飾。
由於核酸是次單元的聚合物，許多修飾發生在核酸內重複的位置，例如，鹼基的修飾或磷酸部分體或磷酸部分體的非連接O。在某些情況下， 修飾將發生在核酸中的所有主體位置(subject positions)，但在許多情況下不會發生。如實施例所述，修飾可能僅發生在3'-或5'終端位置，可能僅發生在端區，例如，端核苷酸的位置或股之最後2、3、4、5、或10個核苷酸。修飾可以發生在雙股區、單股區或兩者中。修飾可以只發生在RNA的雙股區，也可以只發生在RNA的單股區。例如，在非連接O位置的硫代磷酸酯修飾可能僅發生在一個或兩個端，可能僅發生在端區，例如，在端核苷酸的位置處或在股的最後2、3、4、5或10個核苷酸，或可能出現在雙股和單股區，特別是在端。5'-端或端可以被磷酸化。
例如，為了增強穩定性，可能在突出中包括特定鹼基、或在單股突出中包括修飾的核苷酸或核苷酸替代物，例如，在5'-或3'-突出中或同時。例如，在突出包含嘌呤核苷酸係可能需要的。在一些實施態樣中，3'-或5'-突出中的所有或一些鹼基可以被修飾，例如，以本文描述的修飾。修飾可以包括，例如，在核糖的位置2'以所屬技術領域已知的修飾進行修飾，例如，使用去氧核糖核苷酸、2'-去氧-2'-氟(2'-F)或2'-O-甲基修飾而不是核鹼基的核糖，以及磷酸基團中的修飾，例如，硫代磷酸酯修飾。突出不必與標靶序列同源。
在一些實施態樣中，該有義股和反義股的每個殘基獨立地以LNA、CRN、cET、UNA、HNA、CeNA、2'-甲氧基乙基、2'-O-甲基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-去氧、2'-羥基或2'-氟而修飾。股可以含有超過一修飾。在一實施態樣中，有義股和反義股的每個殘基獨立地以2'-O-甲基或2'-氟修飾。
有義股和反義股通常存在至少兩種不同的修飾。這兩種修飾可以係2'-O-甲基或、2'-氟修飾或其他。
在某些實施態樣中，該Na和/或Nb包括交替圖案的變體。如本文所用，術語「交替模體(alternating motif)」係指具有一個或多個修飾的模體，每個修飾發生在一股的交替核苷酸。交替核苷酸可以指每隔一核苷酸一個或每三個核苷酸一個、或類似的模式。例如，如果A、B和C各自代表對核苷酸的一種修飾，則交替模體可以係「ABABABABABAB......」、「AABBAABBAABB......」、「AABAABAABAAB......」、「AAABAAABAAAB......」、「AAABBBAAABBB......」、或「ABCABCABCABC......」等。
交替模體中包含的修飾類型可以相同或不同。例如，如果A、B、C、D各自代表核苷酸的一修飾，則交替模式，亦即，每隔一核苷酸的修飾可能係相同的，但可以選擇有義股或反義股的每一個來自交替模體內的多種修飾可能性，例如「ABABABAB......」、「ACACAC......」、「BDBDBD......」或「CDCCDD......」等。
在一些實施態樣中，本發明的dsRNAi劑包含相對於反義股交替模體的有義股交替模體的修飾模式，該修飾模式係移位的。該移位可以使得有義股的修飾的核苷酸組對應於反義股之不同修飾的核苷酸組，反之亦然。例如，當dsRNA雙鏈體中的有義股與反義股配對時，有義股中的交替模體可以從股的5'至3'以「ABABAB」開頭，而在雙股區內，反義股中的交替模體可以從股的5'至3'以「BABABA」開頭。作為另一實施例，該有義股中的交替模體可以從股的5'至3'以「AABBAABB」開始，而在雙股區，反義股中的交替模體可以從股的5'至3'以「BBAABBAA」開始，因此在有義股和反義股之間的修飾模式完全或部分移位。
在一特定實施例中，該有義股中的交替模體是來自股的5' 3'的「ABABAB」，其中每個A係一未修飾的核糖核苷酸且每個B係一2'-O甲基修飾的核苷酸。
在一特定實施例中，該有義股中的交替模體是來自股的5' 3'的「ABABAB」，其中每個A係2'-去氧-2'-氟修飾的核苷酸，每個B都是2'-O-甲基修飾的核苷酸。
在另一特定實施例中，該反義股中的交替模體是來自股的5' 3'的「BABABA」，其中每個A係2'-去氧-2'-氟修飾的核苷酸，每個B是2'-O-甲基修飾的核苷酸。
在一特定實施例中，該有義股中的交替模體是來自股的5' 3'的「ABABAB」且該反義股中的交替模體是來自股的5' 3'的「BABABA」，其中每個A係未修飾的核苷酸且每個B是2'-O-甲基修飾的核苷酸。
在一特定實施例中，該有義股中的交替模體是來自股的5' 3'的「ABABAB」且該反義股中的交替模體是來自股的5' 3'的「BABABA」，其中每個A係2’-去氧-2’-氟修飾的核苷酸且每個B是2'-O-甲基修飾的核苷酸。
在一些實施態樣中，該dsRNAi劑包含2'-O-甲基修飾交替模體的模式且有義股的2'-F修飾相對於2'-O-甲基修飾的交替模體模式最初發生了偏移且反義股的2'-F修飾，即有義股鹼基的2'-O-甲基修飾核苷酸與反義股的2'-F修飾核苷酸最初配對且反之亦然。有義股的1位可以從2'-F修飾開始，反義股的位置1可以從2'-O-甲基修飾開始。
對有義股或反義股引入在三個連續的核苷酸之三個相同修飾的一個或多個模體會打斷有義股或反義股中存在的初始修飾模式。這種藉由向正 義股或反義股引入在三個連續的核苷酸之三個相同修飾的一個或多個模體來打斷正義股或反義股的修飾模式，其可以增強針對標靶基因的基因緘默活性。
在一些實施態樣中，當三個連續核苷酸的三個相同修飾的模體被引入任一股時，緊鄰該模體之核苷酸的修飾係與模體之修飾不同的修飾。例如，包含模體的序列部分係「......NaYYYNb......」，其中「Y」代表對三個連續核苷酸之三個相同修飾之模體的修飾，「Na」和「Nb」代表對模體的修飾。與Y的修飾不同的模體「YYY」旁邊的核苷酸，其中Na和Nb可以係相同或不同的修飾。或者，當存在翼修飾時，可以存在或不存在Na和/或Nb。
該iRNA可進一步包含至少一硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結。該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結合修飾可發生在有義股或反義股或兩股之任何位置的任何核苷酸。例如，該核苷酸間連接修飾可以發生在有義股和/或反義股的每個核苷酸；每個核苷酸間鏈結修飾可以交替模式發生在有義股和/或反義股；或者有義股或反義股可以包含交替模式的兩個核苷酸間鏈結修飾。有義股的核苷酸間鏈結修飾的交替模式可以與反義股相同或不同，並且有義股的核苷酸間鏈結修飾的交替模式可以相對於核苷酸間鏈結修飾的交替模式具有偏移在反義股。在一實施態樣中，雙股RNAi劑包含6至8個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。在一實施態樣中，反義股在5'-端包含兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，且在3'-端包含兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，並且有義股在5'-端或3'-端包含至少兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。
在一些實施態樣中，該dsRNAi劑在突出區包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結合修飾。例如，突出區可包含在其之間具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結兩個核苷酸。也可以進行核苷酸間連接修飾以將突出 核苷酸與雙鏈體區內的端配對核苷酸連接。例如，至少2、3、4個或所有突出核苷酸可以藉由硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結連接，並且視需要地，可能有額外的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結連接突出核苷酸與緊鄰突出核苷酸的配對核苷酸。例如，可能至少有兩個端三個核苷酸之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，其中三個核苷酸中的兩個係突出核苷酸，第三個係與突出核苷酸相鄰的配對核苷酸。這些端三個核苷酸可以位於反義股的3'-端、有義股的3'-端、反義股的5'-端和/或反義股的5'-端。
在一些實施態樣中，該2個核苷酸突出位於反義股的3'-端，且終端三個核苷酸之間有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，其中三個核苷酸中的兩個係突出核苷酸，第三個核苷酸係與突出核苷酸相鄰的配對核苷酸。視需要地，dsRNAi劑可以在有義股的5'-端和反義股的5'-端的三個核苷酸之間另外具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。
在一實施態樣中，該dsRNAi劑包含與標靶、雙鏈體內或其組合的錯配。錯配可能發生在突出區或雙鏈體區。鹼基對可以根據其促進解離或熔解的傾向(例如，根據特定配對的結合或解離自由能，最簡單的方法係在個別體對的基礎上檢查這些對，儘管也可以使用下一個相鄰或類似的分析)。在促進解離方面：A：U優於G：C；G：U係首選超過G：C；並且I：C優於G：C(I=肌苷)。錯配，例如，非規範或非規範配對(如本文別處所述)優於規範(A：T、A：U、G：C)對；包括通用鹼基的配對優於規範配對。
在某些實施態樣中，該dsRNAi劑包含獨立地選自以下組的反義股5'-端的雙鏈體區內的前1、2、3、4或5個鹼基對中的至少一個：A：U、G： U、I：C和錯配對，例如非規範或非規範配對或包括通用鹼基的配對，以促進反義股在雙鏈體5'-端的解離。
在某些實施態樣中，在雙鏈體區內從反義股的5'-端的位置1的核苷酸選自由A、dA、dU、U和dT組成的群組。或者，從反義股的5'-端的雙鏈體區內的第一個1、2或3個鹼基對中的至少一個係AU鹼基對。例如，從反義股5'-端的雙鏈體區內的第一個鹼基對係AU鹼基對。
在其他實施態樣中，該有義股3'-端的核苷酸係去氧胸苷(dT)或該反義股3'-端的核苷酸係去氧胸苷(dT)。例如，有一個短序列的去氧胸腺嘧啶核苷酸，例如，在有義股、反義股或兩股的3'-端有兩個dT核苷酸。
在某些實施態樣中，該有義股序列可以由式(I)表示：
5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'(I)
其中：
i和j各自獨立地為0或1；
p和q各自獨立地為0至6；
每個Na獨立地表示包含0至25個修飾的寡核苷酸序列的核苷酸，每個序列包含至少兩個不同修飾的核苷酸；
每個Nb獨立地表示包含0至10個修飾的寡核苷酸序列的核苷酸；
每個np和nq獨立地表示突出核苷酸；
其中Nb和Y不具有相同的修飾；和
XXX、YYY和ZZZ各自獨立地表示在三個連續核苷酸的三個相同修飾的一個模體。在一實施態樣中，YYY係所有2'-F修飾的核苷酸。
在一些實施態樣中，Na或Nb包括交替模式的修飾。
在一些實施態樣中，該YYY模體出現在有義股的裂解位點處或附近。例如，當dsRNAi劑具有長度為17至23個核苷酸的雙鏈體區時，該YYY模體可以出現在有義股裂解位點或其附近(例如：可以出現在位置6、7、8；7、8、9；8、9、10、9、10、11、10、11、12；或11、12、13)，從第一個核苷酸開始計數，從5'-端開始；或視需要地，從雙鏈體區內的第一對核苷酸開始計數，從5'-端開始。
在一實施態樣中，i係1及j係0，或者i係0並且j係1，或者i和j都係1。因此有義股可以由以下公式表示：
5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'(Ib)；
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3'(Ic)；或
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'(Id)。
當有義股由式(Ib)表示時，Nb表示包含0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個修飾的核苷酸的寡核苷酸序列。每個Na可以獨立表示包含2至20、2至15或2至10個修飾的核苷酸的寡核苷酸序列。
當有義股由式(Ic)表示時，Nb表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個修飾的核苷酸的寡核苷酸序列。每個Na可以獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個修飾的核苷酸的寡核苷酸序列。
當有義股由式(Id)表示時，每個Nb獨立地表示包含0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個修飾的核苷酸的寡核苷酸序列。在一實施態樣中，Nb係0、1、2、3、4、5或6。每個Na可以獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個修飾的核苷酸序列的寡核苷酸。
X、Y和Z中的每一個可以彼此相同或不同。
在其他實施態樣中，i係0，j係0，有義股可以由以下式表示：
5' np-Na-YYY-Na-nq 3'(Ia)。
當有義股由式(Ia)表示時，每個Na可以獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個修飾的核苷酸的寡核苷酸序列。
在一實施態樣中，該RNAi的反義股序列可以由式(II)表示：
5' nq-Na'-(Z'Z'Z')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(X'X'X')l-N'a-np' 3'(II)
其中：
k和l各自獨立地為0或1；
p'和q'各自獨立地為0至6；
每個Na'獨立地表示包含0至25個修飾的寡核苷酸序列的核苷酸，每個序列包含至少兩個不同修飾的核苷酸；
每個Nb'獨立地表示包含0至10個修飾的寡核苷酸序列的核苷酸；
每個np'和nq'獨立地表示突出核苷酸；
其中Nb'和Y'不具有相同的修飾；和
X'X'X'、Y'Y'Y'和Z'Z'Z'各自獨立地表示三個連續核苷酸的三個相同修飾的一個模體。
在一些實施態樣中，Na'或Nb'包括交替模式的修飾。
Y'Y'Y'模體出現在反義股的裂解位點處或附近。例如，當dsRNAi劑具有17至23個核苷酸長度的雙鏈體區時，Y'Y'Y'模體可以出現在反義股位置9、10、11；10、11、12；11、12、13；12、13、14；或13、14、15，從第1個核苷酸開始計數，從5'-端開始；或視需要地，從雙鏈體區內的第一對核苷酸開始計數，從5'-端開始。在一實施態樣中，Y'Y'Y'模體出現在位置11、12、13。
在某些實施態樣中，Y'Y'Y'模體都係2'-OMe修飾的核苷酸。
在某些實施態樣中，k為1且l為0，或k為0且l為1，或k和l均為1。
反義股可由下式表示：
5' nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-np' 3'(IIb)；
5' nq'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-np' 3'(IIc)；或
5'nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-Na'-np'3'(IId)。
當反義股由式(IIb)表示時，Nb’表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個修飾的核苷酸的寡核苷酸序列。每個Na'獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個修飾的核苷酸的寡核苷酸序列。
當反義股由式(IIc)表示時，Nb'表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個修飾的核苷酸的寡核苷酸序列.每個Na'獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個修飾的核苷酸的寡核苷酸序列。
當反義股由式(IId)表示時，每個Nb'獨立地表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個修飾的核苷酸的寡核苷酸序列。每個Na'獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個修飾的核苷酸的寡核苷酸序列。在一些實施態樣中，Nb為0、1、2、3、4、5或6。
在其他實施態樣中，k為0，l為0，反義股可由下式表示：
5' np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-nq' 3'(Ia)。
當反義股由(IIa)表示時，每個Na'獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個修飾的核苷酸的寡核苷酸序列。
X'、Y'和Z'中的每一個可以彼此相同或不同。
有義股和反義股的每個核苷酸可以獨立地被以下修飾：LNA、CRN、UNA、cEt、乙二醇核酸(GNA)、己糖醇核酸(HNA)、CeNA、2'-甲氧基乙基、2'-O-甲基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-羥基或2'-氟。例如，有義股和反義股的每個核苷酸都獨立地被2'-O-甲基或2'-氟修飾。每個X、Y、Z、X'、Y'和Z'特別可以代表2'-O-甲基修飾或2'-氟修飾。
在一些實施態樣中，當雙鏈體區為21nt時，dsRNAi劑的有義股可含有出現在股的位置9、10和11的YYY模體，從5'-端的第一個核苷酸開始計數，或視需要地，從雙鏈體區內的第一對核苷酸開始計數，從5'-端開始；以及Y代表2'-F修飾。有義股可以另外包含XXX模體或ZZZ模體作為雙股區另一端的翼修飾；及XXX和ZZZ各自獨立地表示2'-OMe修飾或2'-F修飾。
在一些實施態樣中，該反義股可以包含在股的位置11、12、13出現的Y'Y'Y'模體，從5'-端的第一核苷酸開始計數，或視需要地，計數從雙鏈體區內的第一對核苷酸開始計數，從5'-端開始；Y'代表2'-O甲基修飾。該反義股可以另外包含X'X'X'模體或Z'Z'Z'模體，如在雙鏈體區的另一端進行翼修改；X'X'X'和Z'Z'Z'各自獨立地表示2'-OMe修飾或2'-F修飾。
由上述式(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)中任一者表示的有義股與由式(IIa)、(IIb)、(IIb)(IIc)和(IId)中任一者表示的反義股分別地形成雙鏈體。
因此，使用於本發明之方法的dsRNA劑可包含有義股及反義股，各股具有14至30個核苷酸，該iRNA雙鏈體由式(III)表示：
有義：5' np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'
反義：3' np’-Na’-(X’X′X′)k-Nb’-Y′Y′Y′-Nb’-(Z′Z′Z′)l-Na’-nq’5'(III)
其中：
i、j、k及l各自獨立地為0或1；
p、p′、q及q′各自獨立地為0-6；
每個Na及Na’獨立地表示包含0至25個修飾核苷酸的寡核苷酸序列，各序列包含至少二個不同的修飾核甘酸；
每個Nb及Nb’獨立地表示包含0至10個修飾核苷酸的寡核苷酸序列；
其中每個np’、np、nq’及nq，其各者可存在或可不存在，獨立地表示突出核甘酸；以及
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′及Z′Z′Z′各自獨立地表示於三個連續核苷酸之三個相同修飾的一個模體。
在一實施態樣中，i為0且j為0；或i為1且j為0；或i為0且j為1；或者i和j都為0；或者i和j都為1。在另一實施態樣中，k為0且l為0；或k為1且l為0；k為0且l為1；或者k和l都為0；或者k和l都為1。
形成iRNA雙鏈體的有義股和反義股的示例性組合包括下述式：
5' np-Na-Y Y Y-Na-nq 3'
3' np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'nq' 5'(IIIa)
5' np-Na-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3'
3' np'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na'nq' 5'(IIIb)
5' np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Na-nq 3'
3' np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-nq' 5' (IIIc)
5' np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3'
3' np'-Ba'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na-nq' 5'(IIId)
當dsRNAi劑由式(IIIa)表示時，每個Na獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個修飾的核苷酸的寡核苷酸序列。
當dsRNAi劑由式(IIIb)表示時，每個Nb獨立地表示包含1至10、1至7、1至5或1至4個修飾的核苷酸的寡核苷酸序列。每個Na獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個修飾的核苷酸的寡核苷酸序列。
當dsRNAi劑由式(IIIc)表示時，每個Nb、Nb' 5獨立地表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個修飾的核苷酸的寡核苷酸序列。每個Na獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個修飾的核苷酸的寡核苷酸序列。
當dsRNAi劑由式(IIId)表示時，每個Nb、Nb'獨立地表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個修飾的核苷酸的寡核苷酸序列。每個Na、Na'獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個修飾的核苷酸的寡核苷酸序列。Na、Na'、Nb和Nb'中的每一個獨立地包含交替模式的修飾。
式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)中的X、Y和Z中的每一個可以彼此相同或不同。
當dsRNAi劑由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示時，至少一Y核苷酸可以與一Y'核苷酸形成鹼基對。或者，至少Y核苷酸中的兩個與相 應的Y'核苷酸形成鹼基對；或所有三個Y核苷酸都與相應的Y'核苷酸形成鹼基對。
當dsRNAi劑由式(IIIb)或(IIId)表示時，至少一Z核苷酸可以與一Z'核苷酸形成鹼基對。或者，至少兩個Z核苷酸與相應的Z'核苷酸形成鹼基對；或所有三個Z核苷酸都與相應的Z'核苷酸形成鹼基對。
當dsRNAi劑由式(IIIc)或(IIId)表示時，至少一X核苷酸可以與一X'核苷酸形成鹼基對。或者，至少兩個X核苷酸與相應的X'核苷酸形成鹼基對；或所有三個X核苷酸都與相應的X'核苷酸形成鹼基對。
在某些實施態樣中，該Y核苷酸的修飾不同於Y'核苷酸的修飾，該Z核苷酸的修飾不同於Z'核苷酸的修飾，和/或該X核苷酸的修飾不同於X'核苷酸的修飾。
在某些實施態樣中，當dsRNAi劑由式(IIId)表示時，該Na修飾係2'-O-甲基或2'-氟修飾。在其他實施態樣中，當RNAi劑由式(IIId)表示時，該Na修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾，並且np'>0且至少一np'藉由硫代磷酸酯鏈結與相鄰核苷酸相連。在又其他實施態樣中，當RNAi劑由式(IIId)表示時，該Na修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾，np'>0且至少一np'藉由硫代磷酸酯鏈結與相鄰核苷酸連接，且有義股與一個或多個GalNAc衍生物藉由二價或三價支股連接子(如下所述)接合。在其他實施態樣中，當RNAi劑由式(IIId)表示時，該Na修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾，np'>0且至少一np'藉由硫代磷酸酯鏈結與相鄰核苷酸連接，有義股包含至少一硫代磷酸酯鏈結，並且有義股與藉由二價或三價支股連接子連接的一個或多個GalNAc衍生物接合。
在一些實施態樣中，當dsRNAi劑由式(IIIa)表示時，該Na修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾，np'>0且至少一np'藉由硫代磷酸酯鏈結與相鄰核苷酸連接，有義股包含至少一硫代磷酸酯鏈結，並且有義股與藉由二價或三價支股連接子連接的一個或多個GalNAc衍生物接合。
在一些實施態樣中，該dsRNAi劑係含有由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的至少兩個雙鏈體的多聚體，其中該雙鏈體藉由連接子連結。連接子可以係可裂解的或不可裂解的。視需要地，多聚體還包含配體。每個雙鏈體可以靶向相同的基因或兩個不同的基因；或者每個雙鏈體可以在兩個不同的標靶位點靶向相同的基因。
在一些實施態樣中，該dsRNAi劑係含有由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的三、四、五、六或更多個雙鏈體的多聚體，其中該雙鏈體藉由連接子連結。連接子可以係可裂解的或不可裂解的。視需要地，多聚體還包含配體。每個雙鏈體可以靶向相同的基因或兩個不同的基因；或者每個雙鏈體可以在兩個不同的標靶位點靶向相同的基因。
在一些實施態樣中，由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的兩種RNAi劑在5'端相互連接，並且3'端中的一個或兩個視需要地與配體接合。每個劑都可以靶向相同的基因或兩種不同的基因；或者每個劑可以在兩個不同的標靶位點靶向相同的基因。
在某些實施態樣中，本發明的RNAi劑可以包含少量的含有2'-氟修飾的核苷酸，例如，10個或更少的帶有2'-氟修飾的核苷酸。例如，RNAi劑可以含有10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0個帶有2'-氟修飾的核苷酸。在一具體實施態樣中，本發明的RNAi劑含有10個具有2'-氟修飾的核苷酸，例如， 有義股具有2'-氟修飾的4個核苷酸和反義股具有2'-氟修飾的6個核苷酸。在另一具體實施態樣中，本發明的RNAi劑含有6個具有2'-氟修飾的核苷酸，例如，有義股具有2'-氟修飾的4個核苷酸和反義股具有2'-氟修飾的2個核苷酸。
在其他實施態樣中，本發明的RNAi劑可以含有極少數量的含有2'-氟修飾的核苷酸，例如2個或更少的含有2'-氟修飾的核苷酸。例如，RNAi劑可能含有2、1或0個帶有2'-氟修飾的核苷酸。在一具體實施態樣中，該RNAi劑可以含有2個具有2'-氟修飾的核苷酸，例如，在正義有義股具有2-氟修飾的0個核苷酸和在反義股具有2'-氟修飾的2個核苷酸。
各種出版物描述了可用於本發明方法的多聚體iRNAs。這些公開包括WO2007/091269、美國專利號7,858,769、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887和WO2011/031520，其各自的全部內容藉由引用併入本文。
在某些實施態樣中，本揭露的組成物和方法包括如本文所述的RNAi劑的膦酸乙烯酯(VP)修飾。在示例性實施態樣中，本揭露的5'-膦酸乙烯酯修飾的核苷酸具有以下結構：
Figure 111140910-A0202-12-0083-203
其中X係O或S；
R係氫、羥基、氟或C1-20烷氧基(例如，甲氧基或正-十六烷氧基)；
R5'係=C(H)-P(O)(OH)2並且C5'碳和R5'之間的雙鍵在E或Z方向(例如，E方向)；且
B係核鹼基或修飾的核鹼基，視需要地其中B係腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
在一實施態樣中，R5’係=C(H)-P(O)(OH)2且C5'碳和R5'之間的雙鍵在E方向。在另一實施態樣中，R係甲氧基且R5’係=C(H)-P(O)(OH)2且C5'碳和R5'之間的雙鍵在E方向。在另一實施態樣中，X係S、R係甲氧基，且R5’係=C(H)-P(O)(OH)2及C5'碳和R5'之間的雙鍵在E方向。
本揭露的膦酸乙烯酯可以連接至本揭露的dsRNA的反義股或有義股。在某些實施態樣中，本揭露的膦酸乙烯酯連接至dsRNA的反義股，視需要地在dsRNA之反義股的5'-端。
本揭露的組成物和方法也考慮了膦酸乙烯酯修飾。示例性的膦酸乙烯酯結構包括該結構，其中R5'係=C(H)-OP(O)(OH)2並且C5'碳和R5'之間的雙鍵在E或Z方向(例如，E方向)。
如下文更詳細描述的，含有接合至iRNA的一個或多個碳水化合物部分體的iRNA可以優化iRNA的一種或多種特性。在許多情況下，碳水化合物部分體會連接到iRNA的修飾亞單元。例如，可以替換iRNA的一個或多個核糖核苷酸亞單元的核糖與另一個部分體，例如連接有碳水化合物配體的非碳水化合物(例如環狀)載體。其中亞單元的核糖已被如此替換的核糖核苷酸亞單元在本文中稱為核糖替換修飾亞單元(RRMS)。環狀載體可以係碳環系統，即所有環原子都係碳原子或雜環系統，即一個或多個環原子可以係雜原子，例如氮、氧、硫。環狀載體可以係單環系統，或者可以含有兩個或更多個環，例如稠環。環狀載體可以係完全飽和的環系統，或其可含有一個或多個雙鍵。
配體可以藉由載體與多核苷酸連接。載體包括(i)至少一個「主鏈 附接點(backbone attachment point)」，例如兩個「主鏈附接點」和(ii)至少一個「繫帶附接點(tethering attachment point)」。如本文所用，「主鏈附接點」係指官能基，例如一羥基，或者一般來說，一個可用於並適合摻入的鍵載體進入核糖核酸的主鏈，例如磷酸鹽或修飾的磷酸鹽，例如含硫的主鏈。在一些實施態樣中，「繫帶附接點(tethering attachment point)」(TAP)係指連接選定部分體的環狀載體的組成環原子，例如，碳原子或雜原子(不同於提供主鏈附接點的原子)。該部分可以係例如，碳水化合物，例如，單糖、二糖、三糖、四糖、寡糖和多醣。視需要地，選定的部分體藉由插入的繫帶附接至環狀載體。因此，該環狀載體通常將包括官能基，例如，胺基或通常提供鍵結，該鍵結適合於結合或束縛另一化學實體，例如，配體至組成環。
iRNA可以藉經由載體與配體結合接合，該載體可以係環狀基團或非環狀基團。在一些實施態樣中，該環狀基團選自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧雜環戊烷環、噁唑烷基、異噁唑烷基、嗎啉基、噻唑烷基、異噻唑烷基、喹喔啉基、噠嗪酮壬基、四氫呋喃基和十氫化萘。在一些實施態樣中，無非環狀基團選自絲胺醇主鏈或二乙醇胺主鏈。
i.熱去穩定修飾
在某些實施態樣中，可以藉由在反義股的種子區中摻入熱去穩定修飾來優化用於RNA干擾的dsRNA分子。如本文所用，「種子區(seed region)」係指在參考股的5'-端的位置2至9。例如，可以在反義股的種子區中摻入熱去穩定修飾，以降低或抑制脫靶基因緘默。
術語「熱去穩定修飾(thermally destabilizing modification)」包括以下這樣的修飾，該修飾將導致具有比沒有這種修飾的dsRNA的Tm更低的總解股溫度(Tm)的dsRNA。例如，熱去穩定修飾可以將dsRNA的Tm降低1至4℃，例如1、2、3或4攝氏度。並且，術語「熱去穩定核苷酸(thermally destabilizing nucleotide)」係指含有一種或多種熱去穩定化修飾的核苷酸。
已經發現，具有反義股的dsRNA在該反義股的前9個核苷酸位置(從5'-端計數)內包含至少一雙鏈體的熱去穩定修飾，其具有降低的脫靶基因緘默活性。因此，在一些實施態樣中，該反義股在反義股的5'區的前9個核苷酸位置內包含至少一個(例如，一個、兩個、三個、四個、五個或更多個)雙鏈體的熱去穩定修飾。在一些實施態樣中，一個或多個熱不穩定雙鏈體的修飾位於反義股5'-端的位置2至9，例如位置4至8。在一些進一步的實施態樣中，該雙鏈體的熱去穩定化修飾位於反義股5'-端的位置6、7或8。在一些進一步的實施態樣中，該雙鏈體的熱去穩定修飾係位於反義股5'端的位置7。在一些實施態樣中，該雙鏈體的熱去穩定修飾位於反義股5'-端的位置2、3、4、5或9。
熱去穩定修飾可包括，但不限於無鹼基修飾；於相對股中與相對核苷酸的錯配；和糖修飾，例如2'-去氧修飾、無環核苷酸，例如，未鎖核酸(UNA)或乙二醇核酸(GNA)；和2'-5'-連接的核糖核苷酸(「3'-RNA」)。
iRNA劑包含有義股和反義股，每股具有14至40個核苷酸。該RNAi劑可以用下式(L)表示：
Figure 111140910-A0202-12-0087-204
在式(L)中，B1、B2、B3、B1'、B2'、B3'和B4'各自獨立地為核苷酸，核苷酸選自由2'-O-烷基、2'-取代的烷氧基、2'-取代的烷基、2'-鹵、ENA和BNA/LNA組成的修飾群組。在一實施態樣中，B1、B2、B3、B1'、B2'、B3'和B4'各自包含2'-OMe修飾。在一實施態樣中，B1、B2、B3、B1'、B2'、B3'和B4'各自包含2'-OMe或2'-F修飾。在一實施態樣中，B1、B2、B3、B1'、B2'、B3'和B4'中的至少一個含有2'-O-N-甲基乙醯胺(2'-O-NMA)修飾。
C1係熱去穩定核苷酸，位於與反義股種子區相對的位點(即反義股5'-端的2至8位或在參考股之5'-端的位置2至9)。例如，C1位於與反義股5'-端的位置2至8核苷酸配對的有義股位置。在一實施例中，C1位於有義股5'-端的位置15。C1核苷酸帶有熱去穩定修飾，其可以包括無鹼基修飾；與雙鏈體中的相對核苷酸錯配；和糖修飾，例如2'-去氧修飾或非環核苷酸，例如未鎖定的核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)。在一實施態樣中，C1具有選自由以下群組的熱去穩定修飾：i)與反義股的相對核苷酸錯配；ii)選自由以下組成之群組的無鹼 基修飾：
Figure 111140910-A0202-12-0087-205
；iii)選自由 以下組成之群組的糖修飾：
Figure 111140910-A0202-12-0088-206
Figure 111140910-A0202-12-0088-207
，其中B係修飾的或未修飾的核鹼基，R1和R2獨立地係H、 鹵素、OR3或烷基；R3係H、烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖。在一實施態樣中，C1中的熱去穩定修飾係選自由G：G、G：A、G：U、G：T、A：A、A：C、C：C、C：U、C：T、U：U、T：T和U：T組成之群組中的5個錯配；並且視需要地，錯配對中的至少一個核鹼基係2'-去氧核鹼基。在一實施例 中，在C1的熱不穩定修飾係GNA或
Figure 111140910-A0202-12-0088-208
。
T1、T1'、T2'和T3'各自獨立地表示包含修飾的核苷酸，該修飾為核苷酸提供空間體積，其小於或等於2'-OMe修飾的空間體積。空間體積係指修飾的空間效應的總和。用於確定核苷酸修飾之空間效應的方法係所屬技術領域種具有通常知識者已知的。修飾可以在核苷酸的核糖的2'位置，或對非核糖核苷酸、非環核苷酸或與核糖2'位置相似或等同的核苷酸骨架的修飾，並為核苷酸提供空間體積，其小於或等於2'-OMe修飾的空間體積。例如，T1、T1'、T2'和T3' 各自獨立地選自DNA、RNA、LNA、2'-F和2'-F-5'-甲基。在一實施態樣中，T1係DNA。在一實施態樣中，T1'係DNA、RNA或LNA。在一實施態樣中，T2'係DNA或RNA。在一實施態樣中，T3'係DNA或RNA。
n1、n3和q1獨立地為4至15個核苷酸長度。
n5、q3和q7獨立地為1至6個核苷酸長度。
n4、q2和q6獨立地為1至3個核苷酸長度；或者，n4為0。
q5獨立地為0至10個核苷酸長度。
n2和q4獨立為0至3個核苷酸長度。
或者，n4為0至3個核苷酸長度。
在一實施態樣中，n4可以為0。在一實施例中，n4為0，並且q2和q6係1。在另一實施例中，n4係0，並且q2和q6係1，在有義股(從有義股的5'-端開始計數)位置1至5具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾，以及在位置1和2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間連接修飾和在反義股的位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間連接修飾(從反義股的5'-端計數)。
在一實施態樣中，n4、q2和q6各自為1。
在一實施態樣中，n2、n4、q2、q4和q6各自為1。
在一實施態樣中，當有義股長度為19至22個核苷酸，且n4為1時，C1位於有義股5'-端的位置14至17。在一實施態樣中，C1位於有義股5'-端的位置15。
在一實施態樣中，T3'從反義股的5'-端的位置2開始。在一實施例中，T3'位於反義股5'-端的位置2，並且q6等於1。
在一實施態樣中，T1'從反義股的5'端的位置14開始。在一實施 例中，T1'位於反義股5'-端的位置14，並且q2等於1。
在一示例性實施態樣中，T3'從反義股5'端的位置2開始及T1'從反義股5'端的位置14開始。在一實施例中，T3'從反義股5'端的位置2開始及q6等於1且T1'從反義股5'端的位置14開始，q2等於1。
在一實施態樣中，T1'和T3'在長度上被11個核苷酸分開(即不計數T1'和T3'核苷酸)。
在一實施態樣中，T1'位於反義股5'端的位置14。在一實施例中，T1'位於反義股5'-端的位置14，並且q2等於1，並且該修飾在2'位置或非核糖、無環或骨架中的多個位置，相較於2'-OMe核糖，其提供較少的空間體積。
在一實施態樣中，T3'位於反義股5'端的位置2。在一實施例中，T3'位於反義股5'端的位置2，並且q6等於1，並且該修飾在2'位置或非核糖、無環或主鏈中的多個位置，相較於2'-OMe核糖，其提供小於或等於的空間體積。
在一實施態樣中，T1位於有義股的裂解位點。在一實施例中，當有義股為19至22個核苷酸長度時，且n2為1。在一示例性的實施態樣中，T1在有義股的裂解位點從有義股的5'-端的位置11，當有義股的長度為19至22個核苷酸時，並且n2為1。
在一實施態樣中，T2'從反義股5'端的位置6開始。在一實施例中，T2'位於反義股5'-端的位置6至10，q4為1。
在一示例性實施態樣中，當有義股為19至22個核苷酸長度時，T1位於有義股的裂解位點，例如，位於有義股5'-端的位置11，且n2為1；T1'位於反義股5'-端的位置14，q2等於1，對T1'的修飾位於核糖的2'位置或非核糖、無環或骨架的位置，相較於2'-OMe核糖，其提供更少空間體積；T2'位於反 義股5'端的位置6至10，q4為1；T3'位於反義股5'-端的位置2，並且q6等於1，對T3'的修飾位於2'位置或非核糖、非環或骨架位置中，相較於2'-OMe核糖，其提供小於或等於的空間體積。
在一實施態樣中，T2'開始於反義股5'-端的位置8。在一實施例中，T2'開始於反義股5'-端的位置8，且q4為2。
在一實施態樣中，T2'開始於從反義股5'-端的位置9。在一實施例中，T2'位於反義股5'-端的位置9，且q4為1。
在一實施態樣中，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為1，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為6，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1；在有義股的位置1至5計數內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5'-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和在位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5'-端計數)。
在一實施態樣中，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為1，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為6，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'- F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9,T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為6，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F,q1為7，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為6，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F,q1為7，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結 修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為1，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為6，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為1，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為6，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5，-端計數)。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3,B1'為2'-OMe或2'-F,q1為9,T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為5，T2'為2'-F，q4為1，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1；視需要地，在反義股的3'-端有至少2個額外的TT。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'- F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為5，T2'為2'-F，q4為1，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1；視需要地，在反義股的3'-端有至少2個額外的TT；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，在位置1和2內有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾，在反義股的位置18至23(從反義股的5'-端開始計數)內有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4、q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9,T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為1。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4、q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為1。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4、q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。
該RNAi劑可以在有義股或反義股的5'-端包括含磷基團。該5'-端含磷基團可以為5'-端磷酸(5'-P)、5'-端硫代磷酸酯(5'-PS)、5'-端二硫代磷酸酯(5'-PS2)、5'-端乙烯基膦酸酯(5'-VP)、5'-端甲基膦酸酯(MePhos)或5'-去氧-5'-C-丙 二醯基(
Figure 111140910-A0202-12-0096-209
)。當5'-端含磷基團為5'-端乙烯基膦酸酯(5'-VP)時，5'- VP可以為5'-E-VP異構體(即反式-乙烯基膦酸酯，
Figure 111140910-A0202-12-0096-211
)、5'-Z-VP異構 體(即順式膦酸，
Figure 111140910-A0202-12-0096-248
)或其混合物。
在一實施態樣中，該RNAi劑在有義股的5'端包括含磷基團。在一實施態樣中，該RNAi劑在反義股的5'-端包括含磷基團。
在一實施態樣中，該RNAi劑包含5'-P。在一實施態樣中，該RNAi劑在反義股包含5'-P。
在一實施態樣中，該RNAi劑包含5'-PS。在一實施態樣中，該RNAi劑在反義股包含5'-PS。
在一實施態樣中，該RNAi劑包含5'-VP。在一實施態樣中，該RNAi劑在反義股包含5'-VP。在一實施態樣中，該RNAi劑在反義股中包含5'-E-VP。在一實施態樣中，RNAi劑在反義股包含5'-Z-VP。
在一實施態樣中，該RNAi劑包含5'-PS2。在一實施態樣中，RNAi劑在反義股包含5'-PS2。
在一實施態樣中，該RNAi劑包含5'-PS2。在一實施態樣中，該RNAi劑在反義股包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為 3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1。該RNAi劑還包含5'-PS。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1。該RNAi劑還包含5'-P。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1。該RNAi劑還包含5'-VP。該5'-VP可以為5'-E-VP、5'-Z-VP或其組合。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1。該RNAi劑還包含5'-PS2。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4 為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1。該RNAi劑還包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-P。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。RNAi劑還包含5'-PS。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且 q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-VP。該5'-VP可以為5'-E-VP、5'-Z-VP或其組合。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-PS2。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'- F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1。該RNAi劑還包含5'-P。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1。該RNAi劑還包含5'-PS。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1。該RNAi劑還包含5'-VP。5'-VP可以為5'-E-VP、5'-Z-VP或其組合。在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1。該RNAi劑還包含5'-PS2。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1。該RNAi劑還包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4、q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-P。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4、q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-PS。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4、q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置 18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-VP。該5'-VP可以為5'-E-VP、5'-Z-VP或其組合。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4、q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-PS2。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4、q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為 1。該RNAi劑還包含5'-P。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為1。該RNAi劑還包含5'-PS。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9,T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為1。該RNAi劑還包含5'-VP。該5'-VP可以為5'-E-VP、5'-Z-VP或其組合。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為1。該dsRNAi RNA劑還包含5'-PS2。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為1。該RNAi劑還包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為 3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-P。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-PS。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。 該RNAi劑還包含5'-VP。該5'-VP可以為5'-E-VP、5'-Z-VP或其組合。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-PS2。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為1。該RNAi劑還包含5'-P。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為1。該RNAi劑還包含5'-PS。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為1。該RNAi劑還包含5'-VP。該5'-VP可以為5'-E-VP、5'-Z-VP或其組合。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為1。該RNAi劑還包含5'-PS2。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為1。該RNAi劑還包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'- F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4、q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-P。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4、q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-PS。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4、q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-VP。該5'-VP可以為5'-E-VP、5'-Z-VP或其組合。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4、q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-PS2。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4、q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾 和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-P和靶向配體。在一實施態樣中，該5'-P在反義股的5'-端，並且該靶向配體在有義股的3'-端。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-PS和靶向配體。在一實施態樣中，該5'-PS在反義股的5'-端，並且該靶向配體在有義股的3'-端。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-VP(例如，5'-E-VP、5'-Z-VP或其組合)和靶向配體。
在一實施態樣中，該5'-VP在反義股的5'-端，並且該靶向配體在有義股的3'-端。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-PS2和靶向配體。在一實施態樣中，該5'-PS2在反義股的5'-端，並且該靶向配體在有義股的3'-端。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基和靶向配體。在一實施態樣中，該5'-去氧-5'-C-丙二醯基在反義股的5'-端，並且該靶向配體在有義股的3'-端。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4、q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1；在有義 股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-P和靶向配體。在一實施態樣中，該5'-P在反義股的5'-端，並且該靶向配體在有義股的3'-端。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4、q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-PS和靶向配體。在一實施態樣中，該5'-PS在反義股的5'-端，並且該靶向配體在有義股的3'-端。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4、q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-VP(例如，5'-E-VP、5'-Z-VP或其組合)和靶向配體。在一實施態樣中， 該5'-VP在反義股的5'-端，該靶向配體在有義股的3'-端。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4、q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-PS2和靶向配體。在一實施態樣中，該5'-PS2在反義股的5'-端，並且該靶向配體在有義股的3'-端。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4、q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基和靶向配體。在一實施態樣中，該5'-去氧-5'-C-丙二醯基在反義股的5'-端，並且該靶向配體在有義股的3'-端。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為 2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-P和靶向配體。在一實施態樣中，該5'-P在反義股的5'-端，並且該靶向配體在有義股的3'-端。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-PS和靶向配體。在一實施態樣中，該5'-PS在反義股的5'-端，並且該靶向配體在有義股的3'-端。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。 該RNAi劑還包含5'-VP(例如，5'-E-VP、5'-Z-VP或其組合)和靶向配體。在一實施態樣中，該5'-VP在反義股的5'-端，並且該靶向配體在有義股的3'-端。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-PS2和靶向配體。在一實施態樣中，該5'-PS2在反義股的5'-端，並且該靶向配體在有義股的3'-端。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基和靶向配體。在一實施態樣中，該5'-去氧-5'-C-丙二醯基在反義股的5'-端，並且該靶向配體在有義股的3'-端。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'- F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4、q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-P和靶向配體。在一實施態樣中，該5'-P在反義股的5'-端，並且該靶向配體在有義股的3'端。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4、q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-PS和靶向配體。在一實施態樣中，該5'-PS在反義股的5'-端，並且該靶向配體在有義股的3'-端。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4、q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至 23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-VP(例如，5'-E-VP、5'-Z-VP或其組合)和靶向配體。在一實施態樣中，該5'-VP在反義股的5'-端，並且該靶向配體在有義股的3'-端。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4、q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-PS2和靶向配體。在一實施態樣中，該5'-PS2在反義股的5'-端，並且該靶向配體在有義股的3'-端。
在一實施態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4、q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，並且q7為1；在有義股的位置1至5內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從有義股的5’-端計數)，以及在反義股的位置1和2具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾和位置18至23內具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從反義股的5’-端計數)。該RNAi劑還包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基和靶向配體。在一實施態樣中，該5'-去氧-5'-C-丙二醯基在反義股的5'-端，並且該靶向配體在有義股的3'-端。
在一具體實施態樣中，本發明的RNAi劑包含：
(a)有義股，具有：
(i)21個核苷酸長度；
(ii)與3'-端連接的ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含經由三價支鏈連接子附接的三個GalNAc衍生物；和
(iii)位置1、3、5、7、9至11、13、17、19和21的2'-F修飾，以及位置2、4、6、8、12、14至16、18和20的2'-OMe修飾(從5'-端計數)；
和
(b)反義股，具有：
(i)23個核苷酸長度；
(ii)位置1、3、5、9、11至13、15、17、19、21和23的2'-OMe修飾以及位置2、4、6至8、10、14、16、18、20和22的2'-F修飾(從5'-端計數)；和
(iii)核苷酸位置21和22之間以及核苷酸位置22和23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5'-端計數)；
其中，dsRNA劑在反義股的3'-端具有兩個核苷酸突出，在反義股的5'端具有鈍端。
在另一具體實施態樣中，本發明的RNAi劑包含：
(a)有義股，具有：
(i)21個核苷酸長度；
(ii)與3'-端連接的ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含經由三價支鏈連接子附接的三個GalNAc衍生物；
(iii)位置1、3、5、7、9至11、13、15、17、19和21的2'-F修飾，以及位置2、4、6、8、12、14、16、18和20的2'-OMe修飾(從5'-端計數)；和
(iv)核苷酸位置1和2之間以及核苷酸位置2和3之間硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5'-端計數)；
和
(b)反義股，具有：
(i)23個核苷酸長度；
(ii)位置1、3、5、7、9、11至13、15、17、19和21至23的2'-OMe修飾和在位置2、4、6、8、10、14、16、18和20的2'-F修飾(從5'端計數)；
和
(iii)核苷酸位置1和2之間、核苷酸位置2和3之間、核苷酸位置21和22之間以及核苷酸位置22和23的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5'-端計數)；
其中該RNAi劑在反義股的3'-端具有兩個核苷酸突出，並且在反義股的5'-端有鈍端。
在另一具體實施態樣中，本發明的RNAi劑包括：
(a)有義股，具有：
(i)21個核苷酸長度；
(ii)與3'-端連接的ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含經由三價支鏈連接子連接的三個GalNAc衍生物；
(iii)位置1至6、8、10和12至21的2'-OMe修飾，位置7和9的2'-F修飾，以及位置11的去氧核苷酸(例如dT)(從5'-端計數)；和
(iv)核苷酸位置1和2之間以及在核苷酸位置2和3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5'-端計數)；
和
(b)反義股，具有：
(i)23個核苷酸長度；
(ii)位置1、3、7、9、11、13、15、17和19至23的2'-OMe修飾，以及位置2、4至6、8、10、12、14、16和18(從5'-端計數)的2'-F修飾；和
(iii)核苷酸位置1和2之間、核苷酸位置2和3之間、核苷酸位置21和22之間以及核苷酸位置22和23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5'-端計數)；
其中RNAi劑在反義股的'-端具有兩個核苷酸突出，並且在反義股的5'-端有鈍端。
在另一具體實施態樣中，本發明的RNAi劑包括：
(a)有義股，具有：
(i)21個核苷酸長度；
(ii)與3'-端連接的ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含經由三價支鏈連接子連接的三個GalNAc衍生物；
(iii)位置1至6、8、10、12、14和16至21的2'-OMe修飾和位置7、9、11、13和15的2'-F修飾；和
(iv)核苷酸位置1和2之間以及核苷酸位置2和3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5'-端計數)；
和
(b)反義股，具有：
(i)23個核苷酸長度；
(ii)位置1、5、7、9、11、13、15、17、19和21至23的2'-OMe修飾和位置2至4、6、8、10、12、14、16、18和20的2'-F修飾(從5'-端計數)；和
(iii)核苷酸位置1和2之間，核苷酸位置2和3之間，核苷酸位置21和22之間以及核苷酸位置22和23的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5'-端計數)；
其中該RNAi劑在反義股的3'端具有兩個核苷酸突出，並且在反義股的5'-端有鈍端。
在另一具體實施態樣中，本發明的RNAi劑包括：
(a)有義股，具有：
(i)21個核苷酸長度；
(ii)與3'-端連接的ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含經由三價支鏈連接子連接的三個GalNAc衍生物；
(iii)位置1至9和12至21的2'-OMe修飾，以及位置10和11的2'-F修飾；和
(iv)核苷酸位置1和2之間以及核苷酸位置2和3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5'-端計數)；
和
(b)反義股，具有：
(i)23個核苷酸長度；
(ii)在位置1、3、5、7、9、11至13、15、17、19和21至23的2'-OMe修飾和位置2、4、6、8、10、14、16、18和20的2'-F修飾(從5’端計數)；
和
(iii)核苷酸位置1和2之間、核苷酸位置2和3之間、核苷酸位置21和22之間以及核苷酸位置22和23的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’端計數)；
其中該RNAi劑在反義股的3'-端具有兩個核苷酸突出，並且在反義股的5'端有鈍端。
在另一具體實施態樣中，本發明的RNAi劑包括：
(a)有義股，具有：
(i)21個核苷酸長度；
(ii)與3'-端連接的ASGPR配體，其中，該ASGPR配體包含經由三價支鏈連接子連接的三個GalNAc衍生物；
(iii)位置1、3、5、7、9至11和13位的2'-F修飾，以及位置2、4、6、8、12和14至21的2'-OMe修飾；和
(iv)核苷酸位置1和2之間以及核苷酸位置2和3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’端計數)；
和
(b)反義股，具有：
(i)23個核苷酸長度；
(ii)位置1、3、5至7、9、11至13、15、17至19和21至23的2'-OMe修飾，和位置2、4、8、10、14、16和20的2'-F修飾(從5’端計數)；和
(iii)核苷酸位置1和2之間、核苷酸位置2和3之間、核苷酸位置21和22之間以及核苷酸位置22和23的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’端計數)；
其中該RNAi劑在反義股的3'-端具有兩個核苷酸突出，並且在反義股5'-端有鈍端。
在另一具體實施態樣中，本發明的RNAi劑包括：
(a)有義股，具有：
(i)21個核苷酸長度；
(ii)與3'-端連接的ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含經由三價支鏈連接子連接的三個GalNAc衍生物；
(iii)位置1、2、4、6、8、12、14、15、17和19至21的2'-OMe修飾和位置3、5、7、9至11、13、16和18的2'-F修飾；和
(iv)核苷酸位置1和2之間和核苷酸位置2和3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’端計數)；
和
(b)反義股，具有：
(i)25個核苷酸長度；
(ii)位置1、4、6、7、9、11至13、15、17和19至23的2'-OMe修飾、位置2、3、5、8、10、14、16和18的2'-F修飾，以及位置24和25的去氧核苷酸(例如，dT)(從5’端計數)；和
(iii)核苷酸位置1和2之間、核苷酸位置2和3之間、核苷酸位置21和22之間以及核苷酸位置22和23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’端計數)；
其中該RNAi劑在反義股的3'端具有4個核苷酸突出，在反義股的5'-端有鈍端。
在另一個具體的實施態樣中，本發明的RNAi劑包括：
(a)有義股，具有：
(i)21個核苷酸長度；
(ii)與3'-端相連的ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含三個藉由三價支鏈連接子連接的GalNAc衍生物；
(iii)位置1至6、8和12至21的2'-OMe修飾，以及位置7和9至11的2'-F修飾；和
(iv)核苷酸位置1和2之間以及核苷酸位置2和3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’端計數)；
和
(b)反義股，具有：
(i)23個核苷酸長度；
(ii)位置1、3至5、7、8、10至13、15和17至23的2'-OMe修飾、和位置2、6、9、14和16的2'-F修飾(從5'-端計數)；和
(iii)核苷酸位置1和2之間、核苷酸位置2和3之間、核苷酸位置21和22之間以及核苷酸位置22和23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’端計數)；
其中RNAi劑在反義股的3'-端具有兩個核苷酸突出，並且在反義股的5'-端有鈍端。
在另一具體實施態樣中，本發明的RNAi劑包括：
(a)有義股，具有：
(i)21個核苷酸長度；
(ii)與3'-端連接的ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含經由三價支鏈連接子連接的三個GalNAc衍生物；
(iii)位置1至6、8和12至21的2'-OMe修飾，以及位置7和9至11的2'-F修飾；和
(iv)核苷酸位置1和2之間以及核苷酸位置2和3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’端計數)；
和
(b)反義股，具有：
(i)23個核苷酸長度；
(ii)位置1、3至5、7、10至13、15和17至23的2’-OME修飾、以及位置2、6、8、9、14和16的2-F修飾(從5’端計數)；和
(iii)核苷酸位置1和2之間、核苷酸位置2和3之間，核苷酸位置21和22之間以及核苷酸位置22和23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’端計數)；
其中RNAi劑在反義股的3'-端具有兩個核苷酸突出，並且在反義股的5'-端有鈍端。
在另一具體實施態樣中，本發明的RNAi劑包括：
(a)有義股，具有：
(i)19個核苷酸長度；
(ii)與3'-端連接的ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含經由三價支鏈連接子連接的三個GalNAc衍生物；
(iii)位置1至4、6和10至19的2'-OMe修飾，以及位置5和7至9的2'-F修飾；和
(iv)核苷酸位置1和2之間以及核苷酸位置2和3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5'-端計數)；
和
(b)反義股，具有：
(i)21個核苷酸長度；
(ii)位置1、3至5、7、10至13、15和17至212'-OMe修飾，和位置2、6、8、9、14和16的2'-F修飾(從5'-端開始計數)；和
(iii)核苷酸位置1和2之間、核苷酸位置2和3之間、核苷酸位置19和20之間以及核苷酸位置20和21之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5'-端開始計數)；
其中RNAi劑在反義股的3'-端具有兩個核苷酸突出，並且在反義股的5'-端有鈍端。
在某些實施態樣中，用於本發明方法的iRNA係選自表2至3中任一所列的劑。這些劑可進一步包含配體。
III.與配體接合的iRNAs
本發明的iRNA之RNA的另一修飾包含將一種或多種增強iRNA的活性、細胞分佈或細胞攝取的配體、部分或接合物與iRNA化學連接，此類部分體包括但不限於脂質部分體，例如膽固醇部分體((Letsinger et al.,(1989)Proc.Natl.Acid.Sci.USA,86：6553-6556)。在其他實施態樣中，該配體係膽酸(Manoharan et al.,Biorg.Med.Chem.Let.,1994,4：1053-1060)；硫醚，例如，己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660：306-309；Manoharan et al.,Biorg.Med.Chem.Let.,1993,3：2765-2770)；巰基膽固醇(Oberhauser et al.,Nucl.Acids Res.,1992,20：533-538)；脂族鏈，例如，十二烷二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras et al.,EMBO J,1991,10：1111-1118；Kabanov et al.,FEBS Lett.,1990,259：327-330；Svinarchuk et al.,Biochimie,1993,75：49-54)；磷脂，例如，二-十六烷基-rac-甘油或1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-磷酸三乙銨(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36：3651-3654；Shea et al.,Nucl.Acids Res.,1990,18：3777-3783)聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharan et al.,Nucleosides & Nucleotides,1995,14：969-973)；或金剛烷乙酸(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36：3651-3654)、棕櫚基部分體(Mishra et al.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264：229-237)或十八烷基胺或己基胺基-羰基-氧膽固醇部分體(Crooke et al.,(1996)J.Pharmacol.Exp.Ther.,277：923-937)。
在某些實施態樣中，該配體改變其摻入的iRNA的分佈、靶向或壽命。在某些實施態樣中，配體於選定的目標，例如分子、細胞或細胞類型、隔 室，例如身體的細胞或器官，提供增強的親和力，例如，與沒有這種配體的物種相比。在一些實施態樣中，該配體將不參與雙鏈核酸中的雙鏈配對。
配體可以包括天然存在的物質，例如蛋白質(例如，人類血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如，葡聚醣、支鏈澱粉、甲殼素、殼聚醣、菊粉、環糊精、N-乙醯胺基葡萄糖、N-乙醯半乳糖胺或透明質酸)；或脂質。配體也可以為重組的或合成的分子，例如合成的聚合物，例如合成聚胺基酸。聚胺基酸之例包括聚胺基酸為聚離胺酸(polylysine,PLL)、聚L-天冬胺酸、聚L-麩胺酸(poly L-glutamic acid)、苯乙烯-馬來酸酐共聚物、聚(L-乳交酯-共-乙交酯)共聚物(poly(L-lactide-co-glycolied)copolymer)、二乙烯基醚-馬來酸酐共聚物、N-(2-羥丙基)甲基丙烯醯胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇35(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯醯胺聚合物或聚磷嗪。聚胺類之例包括：聚伸乙亞胺(polyethylenimine)、聚離胺酸(PLL)、精胺、亞精胺、多胺、偽胜肽-多胺(pseudopeptide-polyamine)、擬胜肽多胺(peptidomimetic polyamine)、樹枝狀聚合物多胺(dendrimer polyamine)、精胺酸、脒、魚精蛋白、陽離子脂質、陽離子卟啉、多胺的第四級鹽，或α螺旋胜肽。
配體還可以包括靶向基團，例如細胞或組織靶向劑，例如凝集素、糖蛋白、脂質或蛋白質，例如抗體，其與特定細胞類型如腎結合細胞。靶向基團可以為促甲狀腺素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白A、黏液蛋白碳水化合物、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基-半乳糖胺、N-乙醯基葡糖胺多價苷露糖、多價岩藻糖、糖基化聚胺基酸、多價半乳糖、轉鐵蛋白、二膦酸鹽、麩胺酸鹽、聚天門冬胺酸、脂質、膽固醇、類固醇、膽汁酸、葉酸、維生素B12、維生素A、生物素或RGD肽或RGD肽模擬物。在某些實施態樣中，該配體是多 價半乳糖，例如N-乙醯基-半乳糖胺。
配體的其他實例包括染料、嵌入劑(例如吖啶)、交聯劑(例如補骨脂素、絲裂黴素C)、卟啉(TPPC4、特沙弗林(texaphyrin)、沙普沙弗林(Sapphyrin))、多環芳烴(例如吩嗪、二氫吩嗪)、人工核酸內切酶(例如EDTA)、親脂性分子，例如膽固醇、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睾酮、1,3-雙-O(十六烷基)苷油、香葉氧基己基、十六烷基苷油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、肉荳蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽酸、二甲氧基三苯甲基或吩惡嗪)和胜肽接合物(例如，觸角胜肽、Tat胜肽)、烷化劑、磷酸鹽、胺基、巰基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚胺基、烷基、經取代的烷基、放射性指標、酶、半抗原(如生物素)、轉運/吸收促進劑(如阿司匹林、維生素E、葉酸)、合成核糖核酸酶(如咪唑、雙咪唑、組織胺、咪唑簇、吖啶-咪唑接合物、四氮雜大環銪三價錯合物(Eu3+ complexes of tetraazamacrocycles)、二硝基苯基、HRP、或AP。
配體可以係蛋白質，例如糖蛋白，或胜肽，例如對共配體具有特定親和力的分子；或抗體，例如結合特定細胞類型的抗體，例如肝細胞。配體還可以包括荷爾蒙和荷爾蒙受體。其亦可包括非肽類物質，例如脂質、凝集素、碳水化合物、維生素、輔因子、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基-半乳糖胺、N-乙醯基-葡糖胺多價甘露糖或多價岩藻糖。配體可以係例如脂多醣、p38 MAP激酶的活化劑或NF-κB的活化劑。
配體可以為物質，例如藥物，其可增加iRNA劑攝取進入細胞，例如，藉由破壞細胞的細胞骨架，例如，藉由破壞細胞的微管、微絲和/或中間絲。該藥物可以為，例如，紫杉醇(taxol)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼 (vinblastine)、細胞鬆弛素(cytochalasin)、諾考達唑(nocodazole)、阿普拉內酯(japlakinolide)、莨菪鹼A(latrunculin A)、鬼筆環肽(phalloidin)、斯溫霍利德A(swinholide A)、茚滿新鹼(indanocine)或邁爾素(myoservin)。
在一些實施態樣中，與本文所述的iRNA連接的配體充當藥物動力學調節劑(PK調節劑)。PK調節劑包括親脂性物質、膽汁酸、類固醇、磷脂類似物、胜肽、蛋白質結合劑、PEG、維生素等。示例性PK調節劑包括但不限於膽固醇、脂肪酸、膽酸、石膽酸、二烷基甘油酯、二醯基甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生、布洛芬、維生素E、生物素等。包含許多硫代磷酸酯鍵的寡核苷酸已知與血清蛋白結合，因此短寡核苷酸，例如約5個鹼基、10個鹼基的寡核苷酸，在骨架中包含多個硫代磷酸酯鍵的15個鹼基或20個鹼基也適用於本發明作為配體(例如，作為PK調節配體)。此外，結合血清成分(例如血清蛋白)適體(aptamers)也適合在本文所述的實施態樣中用作PK調節配體。
本發明的配體接合的iRNAs可以藉由使用具有側反應性官能團的寡核苷酸來合成，例如源自連接分子連接到寡核苷酸的那些(如下所述)。這種反應性寡核苷酸可以直接與市售配體、合成的帶有多種保護基團的配體或具有與其連接之連接部分的配體反應。
在本發明之用於接合的寡核苷酸可以藉由眾所周知的固相合成技術方便且常規地製備。用於這種合成的設備由幾個供應商出售，包括例如，Applied Biosystems®(Foster City,CA)。可以額外地或替代地使用所屬技術領域已知的用於此類合成的任何其他方法。還已知使用類似的技術來製備其他寡核苷酸，例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。
在本發明之配體接合的iRNAs和帶有序列特異性連接的核苷的 配體分子中，該寡核苷酸和寡核苷可以利用標準核苷酸或核苷前驅物或已經帶有連接部分的核苷酸或核苷接合物前驅物、已經帶有配體分子的配體-核苷酸或核苷-接合物前驅物或或帶有非核苷配體的結構單元，而可以在合適的DNA合成器組裝。
當使用已經帶有連接部分體的核苷酸-接合物前驅物時，序列特異性連接的核苷的合成通常已完成，然後配體分子與連接部分體反應以形成配體-接合的寡核苷酸。在一些實施態樣中，本發明的寡核苷酸或連接的核苷藉由自動化合成儀使用衍生自配體-核苷接合物的亞磷醯胺以及可商購且常規用於寡核苷酸合成的標準亞磷醯胺和非標準亞磷醯胺合成。
A.脂質接合物
在某些實施態樣中，該配體或接合物為脂質或基於脂質的分子。這種脂質或基於脂質的分子結合血清蛋白，例如，人類血清白蛋白(HSA)。HSA結合配體允許將接合物分佈到標靶組織，例如身體的非腎標靶組織。例如，標靶組織可以為肝臟，包括肝臟的實質細胞。其他可以結合HSA的分子也可以用作配體。例如，可以使用奈普洛辛或阿司匹林。脂質或基於脂質的配體可以(a)增加對接合物降解的抗性；(b)增加靶向或轉運到靶細胞或細胞膜中；或(c)可以用於調節與血清蛋白的結合，例如HSA。
基於脂質的配體可用於抑制，例如控制接合物與標靶組織的結合。例如，與HSA結合更強的脂質或基於脂質的配體將不太可能靶向腎臟，因此不太可能從體內清除。與HSA結合較弱的脂質或基於脂質的配體可用於將接合物靶向腎臟。
在某些實施態樣中，該基於脂質的配體結合HSA。在一實施態 樣中，其以足夠的親和力結合HSA，從而使接合物分佈到非腎臟組織。然而，偏好親和力不要太強，以致於不能逆轉HSA-配體結合。
在其他實施態樣中，該基於脂質的配體弱結合或根本不結合HSA，使得接合物將分佈到腎臟。也可以使用靶向腎細胞的其他部分體代替或附加於基於脂質的配體。
在另一方面，該配體為部分體，例如維生素，其被標靶細胞攝入，例如增殖細胞。這些特別適用於處置以非所欲的細胞增殖為特徵的疾病，例如惡性或非惡性類型的疾病，例如癌細胞。示例性維生素包括維生素A、E和K。其他示例性維生素包括維生素B群，例如葉酸、B12、核黃素、生物素、吡哆醛或由標靶細胞，如肝細胞吸收的其他維生素或營養物質。還包括HSA和低密度脂蛋白(LDL)。
B.細胞滲透劑
在另一方面，該配體係細胞滲透劑，例如螺旋細胞滲透劑。在一實施態樣中，該劑係雙性的。示例性劑係胜肽，例如tat或觸角胜肽。如果劑係肽，其可被修飾，包括肽模擬物、轉化體、非胜肽或假胜肽鍵，以及使用D-胺基酸。在一些實施態樣中，該螺旋劑係一α-螺旋劑，其可具有親脂相和疏脂相。
該配體可以係胜肽或胜肽模擬物。胜肽模擬物(本文也稱為寡肽模擬物)係能夠折疊成確定的三維結構的分子類似於天然胜肽。胜肽和胜肽模擬物與iRNA劑的連接可以影響iRNA的藥物動力學分佈，例如藉由增強細胞識別和吸收。胜肽或胜肽模擬部分可以係約5至50個胺基酸長，例如，約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸長。
胜肽或胜肽模擬物可以係例如細胞滲透胜肽、陽離子胜肽、雙性 胜肽或疏水胜肽(例如，主要由Tyr、Trp或Phe組成)。胜肽部分體可以係樹狀肽、約束肽或交聯肽。在另一備選態樣中，該胜肽部分可以包括疏水膜易位序列(MTS)。示例性的含有MTS的疏水性肽係具有胺基酸序列AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO：15)的RFGF。RFGF類似物(例如，胺基酸序列中含有疏水性MTS的AALLPVLLAAP(SEQ ID NO：16)也可以係靶向部分。胜肽部分可以係「遞送(delivery)」胜肽，其可攜帶包括胜肽、寡核苷酸和蛋白質在內的大極性分子穿過細胞膜。例如，來自HIV Tat蛋白(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO：17)和果蠅觸角足蛋白的序列(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO：18)已被發現能夠用作遞送胜肽。胜肽或胜肽模擬物可由DNA的隨機序列編碼，例如從噬菌體資料庫中鑑定的胜肽，或一珠一化合物(one-bead-one-compound,OBOC)資料庫(Lam et al.,Nature,354：82-84,1991)。胜肽或胜肽模擬物藉由摻入的單體單元連接到dsRNA劑以用於細胞靶向目的實施例係精胺酸-甘胺酸-天門冬胺酸(RGD)-肽或RGD模擬物。胜肽部分體的長度範圍可以從大約5個胺基酸到大約40個胺基酸。胜肽部分體可以具有結構修飾，例如以增加穩定性或直接構型特性。可以使用下面描述的任何結構修飾。
用於本發明的組成物和方法的RGD胜肽可以為線性的或環狀的，並且可以被修飾，例如，糖基化或甲基化，以促進靶向特定的組織。含RGD的胜肽和擬胜肽可能包括D-胺基酸以及合成的RGD模擬物。除了RGD，還可以使用其他靶向整合配體的部分體。例如，PECAM-1或VEGF。
「細胞滲透胜肽(cell permeation peptide)」能夠滲透細胞，例如微生物細胞，例如細菌或真菌細胞，或哺乳動物細胞，例如人類細胞。微生物細胞 滲透肽可以為，例如，α-螺旋線性胜肽(例如，LL-37或Ceropin P1)、含二硫鍵的胜肽(例如，α-防禦素(defensin)、β-防禦素(defensin)或細菌素(bactenecin))，或僅含有一個或兩個主要胺基酸的胜肽(例如，PR-39或吲哚里西丁(indolicidin))。細胞滲透胜肽還可以包括核定位信號(NLS)。例如，該細胞滲透胜肽可以為二分(bipartite)雙性胜肽，例如MPG，其衍生自HIV-1 gp41的融合胜肽結構域和SV40大T抗原的NLS(Simeoni et al.,Nucl.Acids Res.31：2717-2724,2003)。
C.碳水化合物結合物
在本發明的組成物和方法的一些實施態樣中，iRNA復包含碳水化合物。該碳水化合物接合的iRNA有利於核酸的體內遞送，以及適用於體內處置用途之如本文所述的組成物。如本文所用，「碳水化合物(carbohydrate)」為指本身為碳水化合物的化合物，其由一個或多個具有至少6個碳原子(可以為直鏈、支鏈或環狀)與每個碳原子鍵合的氧、氮或之硫原子的單糖單元組成；或具有作為其一部分的碳水化合物部分的化合物，該碳水化合物部分由一個或多個單糖單元組成，每個單糖單元具有至少六個碳原子(可以為直鏈的、支鏈的或環狀的)，與每個碳原子鍵合的氧、氮或硫原子。代表性的碳水化合物包括糖(含有約4、5、6、7、8或9個單糖單元的單糖、雙醣、三醣和寡醣)和多醣，例如澱粉、肝醣、纖維素和多醣膠。特定的單糖包括C5及以上(例如，C5、C6、C7或C8)糖；雙醣和三醣包括具有兩個或三個單糖單元(例如，C5、C6、C7或C8)的醣。
在某些實施態樣中，用於本發明之組成物及方法的碳水化合物接合物係單醣。
在某些實施態樣中，該單糖為N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)。包含一種或多種N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)衍生物的GalNAc接合物描述於，例如US 8,106,022中，其全部內容藉由引用併入本文。在一些實施態樣中，該GalNAc接合物用作將iRNA靶向特定細胞的配體。在一些實施態樣中，該GalNAc接合物將iRNA靶向肝細胞，例如，藉由作為肝細胞(例如hepatocytes)之去唾液酸糖蛋白受體的配體。
在一些實施態樣中，該碳水化合物接合物包含一種或多種GalNAc衍生物。該GalNAc衍生物可以藉由連接子連接，例如，二價或三價支鏈連接子。在一些實施態樣中，該GalNAc接合物接合至有義股的3'-端。在一些實施態樣中，該GalNAc接合物藉由連接子，例如本文所述的連接子，接合至iRNA劑(例如，至有義股的3"-端)。在一些實施態樣中，該GalNAc接合物接合至有義股的5'端。在一些實施態樣中，該GalNAc接合物藉由連接子，例如本文所述的連接子，接合至iRNA劑(例如，至有義股的5'-端)。
在本發明的某些實施態樣中，該GalNAc或GalNAc衍生物藉由單價連接子與本發明的iRNA劑連接。在一些實施態樣中，該GalNAc或GalNAc衍生物藉由二價連接子與本發明的iRNA劑連接。在本發明的其它實施態樣中，該GalNAc或GalNAc衍生物藉由三價連接子連接至本發明的iRNA劑。在本發明的其他實施態樣中，該GalNAc或GalNAc衍生物藉由四價連接子與本發明的iRNA劑連接。
在某些實施態樣中，本發明的雙股RNAi劑包含與iRNA劑連接的GalNAc或GalNAc衍生物。在某些實施態樣中，本發明的雙股RNAi劑包含多個(例如，2、3、4、5或6)個GalNAc或GalNAc衍生物，每個藉由多個單價連接子獨立地連接到雙股RNAi劑的多個核苷酸。
在一些實施態樣中，例如，當本發明的iRNA劑的兩股為一個較 大分子的一部分時，該分子之間藉由不間斷的核苷酸鏈連接。一股的3'-端和相應另一股的5'-端形成包含髮夾環(多個未配對核苷酸)，該髮夾環內的每個未配對核苷酸可以獨立地包含藉由單價連接子連接的GalNAc或GalNAc衍生物。該髮夾環也可以由雙股的一股中的延伸突出形成。
在一些實施態樣中，例如，當本發明的iRNA劑的兩股為一個較大分子的一部分時，該分子之間藉由不間斷的核苷酸鏈連接。一股的3'-端和相應另一股的5'-端形成包含多個未配對核苷酸的髮夾環，該髮夾環內的每個未配對核苷酸可以獨立地包含藉由單價連接子連接的GalNAc或GalNAc衍生物。該髮夾環也可以由雙股的一股中的延伸突出形成。
在一實施態樣中，用於本發明的組成物和方法的碳水化合物接合物選自由以下組成的群組：
Figure 111140910-A0202-12-0135-212
Figure 111140910-A0202-12-0135-213
Figure 111140910-A0202-12-0136-214
Figure 111140910-A0202-12-0136-215
Figure 111140910-A0202-12-0136-216
Figure 111140910-A0202-12-0136-217
Figure 111140910-A0202-12-0136-218
Figure 111140910-A0202-12-0137-219
Figure 111140910-A0202-12-0137-220
Figure 111140910-A0202-12-0137-221
Figure 111140910-A0202-12-0137-222
Figure 111140910-A0202-12-0138-223
Figure 111140910-A0202-12-0138-224
Figure 111140910-A0202-12-0138-225
Figure 111140910-A0202-12-0138-226
Figure 111140910-A0202-12-0138-227
Figure 111140910-A0202-12-0138-228
Figure 111140910-A0202-12-0138-229
Figure 111140910-A0202-12-0139-231
Figure 111140910-A0202-12-0139-232
Figure 111140910-A0202-12-0139-233
Figure 111140910-A0202-12-0139-234
Figure 111140910-A0202-12-0139-235
其中Y係O或S，且n係3至6(式XXIV)；
Figure 111140910-A0202-12-0140-236
其中Y係O或S，且n係3至6(式XXV)；
Figure 111140910-A0202-12-0140-237
Figure 111140910-A0202-12-0140-238
，其中X係O或S(式XXVII)；
Figure 111140910-A0202-12-0141-239
Figure 111140910-A0202-12-0141-240
Figure 111140910-A0202-12-0142-241
Figure 111140910-A0202-12-0142-242
在另一實施態樣中，用於本發明的組成物和方法的碳水化合物接合物為單糖。在一實施態樣中，該單糖為N乙醯半乳糖胺，例如
Figure 111140910-A0202-12-0143-243
在一些實施態樣中，該RNAi劑如下方案所示藉由連接子連接至碳水化合物接合物，其中X為O或S
Figure 111140910-A0202-12-0143-244
在一些實施態樣中，該RNAi劑接合至如表1中定義之L96且如下所示：
Figure 111140910-A0202-12-0143-245
用於本文所述實施態樣的另一種代表性碳水化物接合物包括但不限於，
Figure 111140910-A0202-12-0144-246
(式XXXVI)，當X或Y之一為寡核苷酸時，另一為氫。
在一些實施態樣中，合適的配體係WO 2019/055633中公開的配體，其全部內容藉由引用併入本文。在一實施態樣中，配體包括以下結構：
Figure 111140910-A0202-12-0144-247
在本發明的某些實施態樣中，該GalNAc或GalNAc衍生物藉由單價連接子與本發明的iRNA劑連接。在一些實施態樣中，該GalNAc或GalNAc衍生物藉由二價連接子與本發明的iRNA劑連接。在本發明的其它實施態樣中，該GalNAc或GalNAc衍生物藉由三價連接子連接至本發明的iRNA劑。
在一實施態樣中，本發明的雙股RNAi劑包含一個或多個連接至iRNA劑的GalNAc或GalNAc衍生物。該GalNAc可藉由連接子連接至有義股或反義股的任意核苷酸。該GalNAc可連接至有義股的5’-端、有義股的3’-端、 反義股的5’-端或反義股的3’-端。在一實施態樣中，該GalNAc連接至有義股的3’-端，例如，藉由三價連接子。
在其他實施態樣中，本發明的雙股RNAi劑包含多個(例如，2、3、4、5或6)個GalNAc或GalNAc衍生物，每個藉由多個連接子，例如，單價連接子，獨立地連接到雙股RNAi劑的多個核苷酸。
在一些實施態樣中，例如，當本發明的iRNA劑的兩股為一個較大分子的一部分時，該分子之間藉由不間斷的核苷酸鏈連接。一股的3'-端和相應另一股的5'-端形成包含髮夾環(多個未配對核苷酸)，該髮夾環內的每個未配對核苷酸可以獨立地包含藉由單價連接子連接的GalNAc或GalNAc衍生物。
在一些實施態樣中，該碳水化合物接合物進一步包含一個或多個如上所述的額外配體，例如，但不限於PK調節劑或細胞滲透肽。
適用於本發明的其他碳水化合物接合物和連接子包括在PCT公開號WO 2014/179620和WO 2014/179627中描述的那些，每個的全部內容藉由引用併入本文。
D.連接子
在一些實施態樣中，本文所述的接合物或配體可以與具有各種可裂解或不可裂解之連接子的iRNA寡核苷酸連接。
術語「連接子(linker)」或「連接基團(linking group)」為指連接化合物的兩個部分的有機部分，例如共價連接化合物的兩個部分。連接子通常包括直接鍵或原子如氧或硫，單元如NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH或原子鏈，如，但不限於，經取代或未經取代的烷基、經取代或未經取代的烯基、經取代或未經取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、雜芳基烷基、雜芳基 烯基、雜芳基炔基、雜環基烷基、雜環基烯基、雜環基炔基、芳基、雜芳基、雜環基、環烷基、環烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基雜芳基烷基、烷基雜芳基烯基、烷基雜芳基炔基、烯基雜芳基烷基、烯基雜芳基烯基、烯基雜芳基炔基、炔基雜芳基烷基、炔基雜芳基烯基、炔基雜芳基炔基、烷基雜環烷基、烷基雜環烯基、烷基雜環炔基、烯基雜環烷基、烯基雜環烯基、烯基雜環炔基、炔基雜環烷基、炔基雜環烯基、炔基雜環炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基雜芳基、烯基雜芳基、炔基雜芳基，其中一種或多種亞甲基可以被O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、經取代或未經取代的芳基、經取代或未經取代的雜芳基、經取代或未經取代的雜環中斷或封端；其中R8為氫、醯基、脂肪族或取代的脂肪族。在一個實施態樣中，連接子介於約1至24個原子、2至24、3至24、4至24、5至24、6至24、6至18、7至18、8至18、7至17、8至17、6至16、7至17或8至16個原子。
可裂解的連接基團為在細胞外足夠穩定的連接基團，但在進入標靶細胞時被裂解，以釋放以連接子保持在一起的兩個部分。在一實施態樣中，比起在個體的血液中或在第二參考條件下(例如，可選擇模擬或代表血液或血清中發現的病況)可裂解的連接基團在標靶細胞中或在第一參考條件下(例如，可以選擇模擬或代表細胞內條件)的裂解速度快速約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更多，或至少約100倍。
可裂解的連接基團易受裂解劑的影響，例如pH、氧化還原電位或降解分子的存在。通常，裂解劑在細胞內比在血清或血液中更普遍或以更高的量級或活性存在。此類降解劑的實施例包括：為特定受質所選擇或不具有受質特 異性的氧化還原劑，包括，例如存在於細胞中的氧化還原酶或還原酶或諸如硫醇的還原劑，其可藉由以下方式降解氧化還原可裂解的連接基團：還原；酯酶；可產生酸性環境的內體或劑，例如導致pH為5或更低的那些；可以藉由充當一般酸水解或降解酸可裂解連接基團的酶、胜肽酶(可以為受質特異性的)和磷酸酶。
可裂解的連接基團，例如二硫鍵可能對pH敏感。人類血清的pH值為7.4，而細胞內的平均pH值略低，範圍約為7.1至7.3。內體的具有較酸的pH值，在5.5至6.0的範圍內，溶酶體具有更酸地pH值，約為5.0。一些連接子將具有可裂解的連接基團，該基團在一定的pH值下被裂解，從而從細胞內的配體釋放陽離子脂質、或釋放到所需的細胞。
連接子可以包括可被特定酶裂解的可裂解連接基團。併入連接子中的可裂解連接基團的類型可能取決於要靶向的細胞。例如，肝臟靶向配體可以藉由包括酯基的連接子連接至陽離子脂質。肝細胞富含酯酶，因此與不富含酯酶的細胞類型相比，肝細胞中的連接子將被更有效地裂解。其他富含酯酶的細胞類型包括肺細胞、腎皮質細胞和睾丸細胞。
當靶向富含胜肽酶的細胞類型(例如肝細胞和滑膜細胞)時，可以使用包含胜肽鍵的連接子。
一般而言，可藉由測試降解劑(或條件)裂解候選連接基團的能力，來評估候選可裂解連接基團的適用性。測試候選可裂解連接基團在血液中或與其他非目標組織接觸時的抵抗裂解的能力也將為被需要的。因此，可以確定第一種和第二種情況之間對裂解的相對易感性，其中第一種被選擇為指示靶細胞中的裂解，第二種被選擇為指示在其他組織或生物流體中的裂解，例如，血液或血清。該評估可以在無細胞系統、細胞、細胞培養、器官或組織培養或整個動物 中進行。在無細胞或培養條件下進行初步評估，並藉由對整個動物的進一步評估來確認可能很有用。在某些實施態樣中，與血液或血清相比(或在模擬細胞外條件所選擇的體外條件下)，有用的候選化合物在細胞中(或在模擬胞內條件所選擇的體外條件下)的裂解速度至少快約2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或約100倍。
i.氧化還原可裂解連接基團
在某些實施態樣中，可裂解連接基團為氧化還原可裂解連接基團，其在還原或氧化時裂解。可還原裂解的連接基團的實施例為二硫鍵連接基團(-S-S-)。為了確定候選可裂解連接基團為否為合適的「可還原裂解連接基團(reductively cleavable linking group)」，或者例如為否為適合與特iRNA部分體和特定靶向劑一起使用，可以參考本文所述的方法。例如，可以藉由與二硫蘇糖醇(DTT)或其他還原劑一起培育來評估候選物，使用本領域已知的試劑，其模擬在細胞觀察到的裂解速率，例如標靶細胞中。還可以在選擇模擬血液或血清條件的條件下評估候選者。其中一種方法為，候選化合物在血液中最多裂解約10%。在其他實施態樣中，與血液相比(或在模擬胞外條件所選擇的體外條件下)，有用的候選化合物在細胞中(或在模擬胞內條件所選擇的體外條件下)以至少約2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或約100倍的速度降解。候選化合物的裂解速率可以在選擇模擬細胞內介質的條件下，使用標準酶動力學檢測來確定，並與所選擇模擬細胞外介質的條件進行比較。
ii.基於磷酸鹽的可裂解連接基團
在其他實施態樣中，可裂解連接子包含基於磷酸鹽的可裂解連接基團。基於磷酸酯的可裂解連接基團為被降解或水解磷酸基團的劑裂解。裂解細 胞中磷酸基團的劑的實施例為酶，例如細胞中的磷酸酶。基於磷酸酯的連接基團的實施例為-O-P(O)(ORk)-O-、-OP(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-OP(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-，其中每次出現的Rk可以獨立地為C1至C20烷基、C1至C20鹵烷基、C6至C10芳基或C7至C12芳烷基。示例性實施態樣包括-OP(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-,-O-P(O)(OH)-S-,-S-P(O)(OH)-S-,-O-P(S)(OH)-S-,-S-P(S)(OH)-O-,-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-和-O-P(S)(H)-S-。在某些實施態樣中，基於磷酸酯的連接基團為-OP(O)(OH)-O-。這些候選者可以使用與上述類似的方法進行評估。
iii.酸可裂解的連接基團
在其他實施態樣中，該可裂解的連接子包含酸可裂解的連接基團。酸可裂解的連接基團為在酸性條件下裂解的連接基團。在一些實施態樣中，該酸可裂解的連接基團在具有約6.5或更低(例如，約6.0、5.5、5.0或更低)的pH值的酸性環境中被裂解或藉由可充當一般酸之酶的試劑。在細胞中，特定的低pH細胞器，例如內體和溶酶體，可以為酸可裂解的連接基團提供裂解環境。酸可裂解連接基團的實施例包括但不限於腙、酯和胺基酸酯。酸可裂解基團可具有通式-C=NN-、C(O)O或-OC(O)。示例性的實施態樣為當與酯的氧(烷氧基)連接的碳為芳基、取代的烷基或第三烷基，例如二甲基戊基或第三丁基時。這些候選者可以使用與上述方法類似的方法進行評估。
iv.基於酯的連接基團
在其他實施態樣中，該可裂解連接子包含基於酯的可裂解連接基團。基於酯的可裂解連接基團被細胞中的酶如酯酶和醯胺酶裂解。基於酯的可裂解連接基團的實施例包括，但不限於亞(伸)烷基、亞(伸)烯基和亞(伸)炔基的酯。酯可裂解的連接基團具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。這些候選基團可以使用與上述類似的方法進行評估。
v.基於胜肽的裂解基團
在又一些實施態樣中，該可裂解連接子包含基於胜肽的可裂解連接基團。基於胜肽的可裂解連接基團被細胞中的酶如胜肽酶和蛋白酶裂解。基於肽的可裂解連接基團為在胺基酸之間形成的胜肽鍵以產生寡肽(例如二胜肽、三胜肽等)和多胜肽。基於胜肽的可裂解基團不包括醯胺基團(-C(O)NH-)。該醯胺基團可以在任何亞(伸)烷基、亞(伸)烯基或亞(伸)炔基之間形成。該胜肽鍵為胺基酸之間形成的一種特殊類型的醯胺鍵，以產生胜肽和蛋白質。該基於胜肽的裂解基團通常限於在產生胜肽和蛋白質的胺基酸之間形成的胜肽鍵(即醯胺鍵)，並且不包括整個醯胺官能基團。該基於胜肽的可裂解連接基團具有通式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中「RA」和「RB」為兩個相鄰胺基酸的R基團。可以使用與上述類似的方法評估這些候選基團。
在一些實施態樣中，本發明的iRNA藉由連接子與碳水化合物接合。具有本發明的組成物和方法之連接子的碳水化合物接合物的非限制性實施例包括但不限於，
Figure 111140910-A0202-12-0151-55
Figure 111140910-A0202-12-0151-56
Figure 111140910-A0202-12-0151-57
Figure 111140910-A0202-12-0151-58
Figure 111140910-A0202-12-0152-59
Figure 111140910-A0202-12-0152-60
Figure 111140910-A0202-12-0152-61
Figure 111140910-A0202-12-0152-62
(式XLIV)，當X或Y之一為寡核苷酸時，另一為氫。
在本發明的組成物和方法的某些實施態樣中，配體為一個或多個 藉由二價或三價支鏈連接子連接的「GalNAc」(N-乙醯半乳糖胺)衍生物。
在一實施態樣中，本發明的dsRNA接合至選自式(XLV)-(XLVIII)中任一所示結構組的二價或三價支鏈連接子：
Figure 111140910-A0202-12-0153-63
其中：
q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B和q5C每次出現時分別代表0至20，其中重複單元可以相同或不同；
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C每次出現時各自獨立地為不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C每次出現時獨立地為不存在、亞(伸)烷基、取代的亞(伸)烷基，其中一個或多個亞甲基可以被一個或多個O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R')=C(R")、C≡C或C(O)中斷或終止；R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C每次出現時各自獨 立地為不存在、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)- NH-、CO、CH=N-O、
Figure 111140910-A0202-12-0154-66
、
Figure 111140910-A0202-12-0154-67
、
Figure 111140910-A0202-12-0154-68
、
Figure 111140910-A0202-12-0154-69
、
Figure 111140910-A0202-12-0154-72
或雜環基；
L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B和L5C代表配體；即，每次出現時各自獨立地為單醣(例如GalNAc)、二醣、三醣、四醣、寡醣或多醣；並且Ra為H或胺基酸側鏈。三價接合的GalNAc衍生物特別可用於與RNAi劑一起抑制標靶基因的表現，例如式(XLIX)的那些：
Figure 111140910-A0202-12-0154-64
其中L5A、L5B和L5C代表單糖，例如GalNAc衍生物。
接合GalNAc衍生物的合適的二價和三價支鏈連接子基團的實施例包括，但不限於上式II、VII、XI、X和XIII所述的結構。
教示接合物製備的代表性美國專利包括，但不包括僅限於以下美國專利號4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717、5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136； 5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241、5,391,723；5,416,203、5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941；6,294,664；6,320,017；6,576,752；6,783,931；6,900,297；7,037,646；及8,106,022，每一個的全部內容在此藉由引用併入本文。
對給定化合物中的所有位置進行統一修飾係沒有必要，實際上可以將不止一種上述修飾摻入單個化合物中，甚至可以摻入iRNA內的單個核苷中。本發明還包括作為嵌合化合物的iRNA化合物。
在本發明的上下文中，「嵌合(chimeric)」iRNA化合物或「嵌合體(chimeras)」係iRNA化合物，例如dsRNA劑，其包含兩個或更多個化學上不同的區，每個區由至少一個單體單元組成，即在dsRNA化合物情況下的核苷酸。這些iRNA通常包含至少一區，其中RNA被修飾以賦予iRNA對核酸酶降解更多的抗性、更多的細胞攝取和/或更多的對標靶核酸的結合親和力。iRNA的另外區可以用作能夠裂解RNA：DNA或RNA：RNA雜合體之酶的受質。例如實施例，RNase H係細胞內切核酸酶，其裂解RNA：DNA雙鏈體的RNA股。因此，RNase H的活化導致RNA標靶的裂解，從而大大提高了iRNA抑制基因表現的效率。最終，當使用嵌合dsRNA時，與同一靶區雜交的硫代磷酸酯去氧dsRNA相比，通常可以使用較短的iRNA獲得可比較的結果。RNA標靶的裂解可以藉由凝膠電泳進行常規檢測，如果需要，可以藉由所屬技術領域已知的相關核酸雜交技術進行檢測。
在某些情況下，該iRNA的RNA可以被非配體基團修飾。許多非配體分子已與iRNA接合以增強iRNA的活性、細胞分佈或細胞攝取，並且執 行此類接合的手段可在科學文獻中獲得。此類非配體部分包括脂質部分，例如膽固醇((Kubo,T.et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.,2007,365(1)：54-61；Letsinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86：6553)、膽酸(Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1994,4：1053)、硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660：306；Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3：2765)、硫代膽固醇(Oberhauser et al.,Nucl.Acids Res.,1992,20：533)、脂肪鏈，例如十二烷二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras et al.,EMBO J.,1991,10：111；Kabanov et al.,FEBS Lett.,1990,259：327；Svinarchuk et al.,Biochimie,1993,75：49)、磷脂，例如二十六烷基-外消旋-甘油或三乙基銨1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-膦酸鹽(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36：3651；Shea et al.,Nucl.Acids Res.,1990,18：3777)、多胺或聚乙二醇鏈(Manoharan et al.,Nucleosides & Nucleotides,19 95,14：969)，或金剛烷乙酸(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36：3651)，棕櫚基部分(Mishra et al.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264：229))、或十八胺或己基胺基-羰基-氧基膽固醇部分(Crooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277：923)。以上列出了教導製備此類RNA接合物的代表性美國專利。典型的接合程序包括合成在序列的一個或多個位置帶有胺基連接子的RNAs。然後使用合適的偶聯劑或活化劑，使胺基與被接合的分子反應。該接合反應可以在RNA仍與固相支持物結合的情況下進行，也可以在RNA裂解後在溶液相中進行。藉由HPLC純化RNA接合物通常會得到純的接合物。
IV.本發明的iRNA的遞送
將本發明的iRNA遞送至細胞，例如個體內的細胞，例如人類個 體(例如，有其需要的個體，例如易受或確診補體因子B相關病症之個體)可以藉由多個不同的方式實現。例如，可以藉由在體外或體內使細胞與本發明的iRNA接觸，來進行遞送。還可以藉由向個體給藥包含iRNA的組成物，例如，dsRNA，來直接進行體內遞送。或者，可以藉由給藥一種或多種編碼和引導iRNA表現的載體來間接進行體內遞送。這些替代方法將在下面進一步討論。
一般而言，任何遞送核酸分子的方法(體外或體內)都可適用於與本發明的iRNA一起使用(參見例如，Akhtar S.and Julian RL.,(1992)Trends Cell.Biol.2(5)：139-144和WO94/02595，其全部藉由引用併入本文)。對於體內遞送，為了遞送iRNA分子要考慮的因素包括，例如，被遞送分子的生物穩定性、非特異性作用的防止以及遞送分子在標靶組織中的積累。藉由直接注射將RNA干擾局部遞送至中樞神經系統也顯示了成功(Dorn,G.,et al.(2004)Nucleic Acids 32：e49；Tan,PH.,et al(2005)Gene Ther.12：59-66；Makimura,H.,et al(2002)BMC Neurosci.3：18；Shishkina,GT.,et al(2004)Neuroscience 129：521-528；Thakker,ER.,et al(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：17270-17275；Akaneya,Y.,et al(2005)J.Neurophysiol.93：594-602).RNA或藥物載體的修飾也可以允許將iRNA靶向標靶組織且避免非所欲的脫靶效應。iRNA分子可以藉由與親脂性基團化學結合進行修飾，如膽固醇，以增強細胞攝取並防止降解。例如，將引導針對與親脂性膽固醇部分體結合的ApoB的iRNA全身注射到小鼠體內，導致肝臟和空腸中apoB mRNA的敲弱(Soutschek,J.,et al(2004)Nature 432：173-178).
在另一替代實施態樣中，該iRNA可以使用藥物遞送系統遞送，例如奈米顆粒、樹枝狀聚合物、聚合物、脂質體或陽離子遞送系統。帶正電荷的陽離子遞送系統促進iRNA分子(帶負電荷)的結合，且還增強在帶負電荷的細胞 膜的相互作用，以允許細胞有效攝取iRNA。陽離子脂質、樹枝狀聚合物或聚合物可以與iRNA結合，或被誘導形成囊泡或微胞包裹核酸抑制劑(參見例如，Kim SH.et al.,(2008)Journal of Controlled Release 129(2)：107-116)。當全身給藥時，該囊泡或微胞的形成復防止了iRNA的降解。製備和給藥陽離子-iRNA複合體的方法完全在所屬技術領域中具有通常知識者能力內(參見例如，Sorensen,DR.,et al.(2003)J.Mol.Biol 327：761-766；Verma,UN.et al.,(2003)Clin.Cancer Res.9：1291-1300；Arnold，et al.,(2007)J.Hypertens.25：197-205，其全文藉由引用方式併入本文)。可用於iRNAs之全身遞送的藥物遞送系統的一些非限制性實施例包括DOTAP(Sorensen,DR.,et al.(2003),supra；Verma,UN.et al.,(2003),supra)、Oligofectamine(固體核酸脂質顆粒)(Zimmermann,TS.et al.,(2006)Nature 441：111-114)、心磷脂(Chien,PY.et al.,(2005)Cancer Gene Ther.12：321-328；Pal,A.et al.,(2005)Int J.Oncol.26：1087-1091)、聚乙烯亞胺(Bonnet ME.et al.,(2008)Pharm.Res.Aug 16 Epub ahead of print；Aigner,A.(2006)J.Biomed.Biotechnol.71659)、Arg-Gly-Asp(RGD)胜肽(Liu,S.(2006)Mol.Pharm.3：472-487)和聚醯胺-胺(Tomalia,DA.et al.,(2007)Biochem.Soc.Trans.35：61-67；Yoo,H.et al.,(1999)Pharm.Res.16：1799-1804)。在一些實施態樣中，iRNA與環糊精形成用於全身給藥的複合體。核酸抑制劑和環糊精的給藥方法和醫藥組成物可見於美國專利號7,427,605，其藉由引用整體併入本文。
A.本發明之編碼iRNA的載體
靶向補體因子B的iRNA可以從插入DNA或RNA載體中的轉錄單位表現(參見例如，Couture,A,et al.,TIG.(1996),12：5-10；Skillern,A.,et al.,國際PCT公開號WO 00/22113、Conrad，國際PCT公開號WO 00/22114和 Conrad，美國專利號6,054,299)。表現可以為短暫的(以數小時至數週的順序)或持續的(數周至數月或更長時間)，取決於所使用的特定構造(construct)和標靶組織或細胞類型。這些轉基因可以作為線性構造、環狀質體或病毒載體引入，其可為整合或非整合的載體。還可以建構轉基因以允許其作為染色體外質粒被遺傳(Gassmann et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92：1292)。
可用於本文所述的方法和組成物的病毒載體系統包括，但不限於(a)腺病毒載體；(b)逆轉錄病毒載體，包括，但不限於慢病毒載體、moloney鼠白血病病毒等；(c)腺相關病毒載體；(d)單純皰疹病毒載體；(e)SV 40載體；(f)多瘤病毒載體；(g)乳頭狀瘤病毒載體；(h)小核糖核酸病毒載體；(i)痘病毒載體，例如正痘病毒，例如牛痘病毒載體或禽痘病毒，例如金絲雀痘或雞痘；及(j)助手依賴性或無腸腺病毒。缺陷複製病毒也可能為有利的。不同的載體會或不會被整合到細胞的基因組中。如果需要，該構造可以包括用於轉染的病毒序列。或者，可以將構造併入能夠進行附加型複製的載體，例如載體。EPV和EBV載體。用於iRNA的重組表現構造通常需要調節元件，例如啟動子、增強子等，以確保iRNA在標靶細胞中的表現。對於載體和構造要考慮的其他方面在所屬技術領域為已知的。
V.本發明的醫藥組成物
本發明還包括包含本發明的iRNAs之醫藥組成物和製劑。在一實施態樣中，本文提供了如本文所述的包含iRNA的醫藥組成物和藥學上可接受的載體。包含iRNA之醫藥組成物對於預防或治療補體因子B相關病症係有用的。此類醫藥組成物是根據遞送方式配製的。一實施例係配製用於通過腸胃外遞送，例如藉由皮下(SC)、肌內(IM)或靜脈內(IV)遞送的全身給藥的組成物。本發 明的醫藥組成物可以足以抑制補體因子B基因表現的劑量給藥。
在一些實施態樣中，本發明的醫藥組合物是無菌的。在另一實施態樣中，本發明的藥物組合物不含熱原。
本發明的醫藥組成物可以足夠抑制補體因子B的表現的劑量給藥。通常，本發明的iRNA的合適劑量將在接受者的每天每公斤體重約0.001至約200.0毫克的範圍內，通常在每天每公斤體重約1至50毫克的範圍內。通常，本發明的iRNA的合適劑量將在約0.1mg/kg至約5.0mg/kg的範圍內，例如約0.3mg/kg和約3.0mg/kg。重複劑量方案可包括定期給藥處置量的iRNA，例如每月、3至6個月一次至一年一次。在某些實施態樣中，該iRNA的給藥約每月一次至約6個月一次。
在初始治療方案之後，治療可以較低頻率給藥。治療的週期可以根據疾病的嚴重程度而決定。
在其他實施態樣中，單劑量的醫藥組成物可以持久，如以不超過1、2、3或4個月的間隔給藥的劑量。在本發明的一些實施態樣中，本發明的醫藥物組成物的單劑量給藥係大約每月一次。在本發明的其他實施態樣中，每一季(即大約每三個月)給予單劑量之本發明的醫藥組成物。在本發明的其他實施態樣中，每年給藥單劑量的本發明的醫藥組成物兩次(即，大約每六個月一次)。
具有通常知識者將理解，某些因素可以影響有效治療個體所需的劑量和時間，包括但不限於個體中存在的突變、先前的治療、個體的一般健康狀況或年齡以及存在的其他疾病。此外，具有組成物之預防或治療有效量(視情況而定)的個體的治療可包括單一治療或一系列治療。
可以靶向特定組織(例如，肝細胞)的方式遞送iRNA。
本發明的醫藥組成物包括但不限於溶液、乳劑和含脂質體的製劑。這些組成物可由多種組分產生，包括但不限於預製液體、自乳化固體和自乳化半固體。製劑包括那些針對肝臟的那些。
可以方便地以單位劑量形式存在的本發明的醫藥製劑可以根據醫藥工業中熟知的常規技術來製備。這樣的技術包括使活性成分與藥物載體或賦形劑結合的步驟。通常，藉由將活性成分與液體載體均勻且緊密地結合來製備製劑。
A.其他配方
i.乳液
本發明的組成物可以製備和配製為乳液。乳液通常為以直徑超過0.1微米的液滴形式分散在另一種液體中的非均相系統的液體(參考例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Volume 1,p.245；Block in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 2,p.335；Higuchi et al.,in Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.301)。乳液通常係雙相體系，包含相互緊密混合和分散的兩種不混溶的液相。通常，乳液可以係油包水(w/o)或水包油(o/w)類型。當水相被精細分割成微小液滴並分散到大量油相中時，所得組合物稱為油包水(w/o)乳液。或者， 當油相被細分為微小液滴並分散到本體水相中時，所得組合物稱為水包油(o/w)乳液。除了分散相和可以作為溶液存在於水相、油相中或本身作為單獨相的活性藥物之外，乳液還可以包含其他組份。根據需要，乳液、穩定劑、染料和抗氧化劑等藥用賦形劑也可以存在於乳液中。
醫藥乳液也可以係由多於兩個相組成的多重乳液，例如在油包水包油(o/w/o)和水包油包水(w/o/w)乳液的情況下。這種複合的配方通常提供某些簡單的二元乳液所沒有的優點。在多個乳液其中o/w乳液的單個油滴包圍小水滴的多重乳液構成w/o/w乳液。同樣，封閉在水滴中的油滴系統在油性連續相中穩定，提供o/w/o乳液。
乳液的特點係熱力學穩定性很小或沒有。通常，乳液的分散相或不連續相很好地分散到外相或連續相中，並藉由乳化劑或製劑的黏度保持這種形式。乳液的任一相可以係半固體或固體，如乳液型軟膏基質和乳膏的情況。穩定乳液的其他方法需要使用一種可摻入乳液任一相中的乳化劑。乳化劑大致可分為四類：合成表面活性劑、天然乳化劑、吸收基質和精細分散的固體(參見例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,15 Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。
合成表面活性劑，也稱為表面活性劑，在乳液的配方中具有廣泛的適用性，並在文獻中進行了綜述(參見例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.285；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,volume 1,p.199)。表面活性劑通常係雙性的，並且包含親水部分和疏水部分。表面活性劑的親水性與疏水性之比被稱為親水/親油平衡(HLB)，其係在製劑製備過程中，對表面活性劑進行分類和選擇的重要工具。根據親水基團的性質，表面活性劑可分為不同的類別：非離子型、陰離子型、陽離子和雙性(參見例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,30 Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.285)。
乳液配方中還包含大量非乳化材料，其有助於乳液的性能。這些包括脂肪、油、蠟、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、保濕劑、親水膠體、防腐劑和抗氧化劑(Block,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.335；Idson,in Pharmaceutical Dosage 5 Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。
藉由過皮膚病學、口服和非腸道途徑應用乳液製劑及其製造方法綜述了文獻中乳液制劑的應用(參見例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。
ii.微乳液
在本發明的一實施態樣中，iRNA和核酸的組成物被配製成微乳液(microemulsions)。微乳液可以定義為水、油和雙性物的系統，其係一種單一的光學上均質的和熱力學穩定的液體溶液(參見例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,A 5 llen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245)。通常，微乳液係藉由以下這樣製備的系統，首先將油分散在表面活性劑水溶液中，然後加入足量的第四組份，通常係中等鍊長的醇以形成透明系統。因此，微乳液也被描述為熱力學穩定、由表面活性分子的界面膜穩定的兩種不混合溶液體的均質透明分散體(Leung and Shah,in：Controlled Release of Drugs：Polymers and Aggregate Systems,Rosoff,M.,Ed.,1989,VCH Publishers,New York,pages 185-215)。
iii.微粒子
本發明的iRNA可以摻入粒子，例如微粒子中。微粒子可以藉由噴霧乾燥生產，但也可以藉由其他方法生產，包括凍乾、蒸發、流化床乾燥、真空乾燥或這些技術的組合。
iv.滲透增強劑
在一實施態樣中，本發明使用各種滲透增強劑來實現核酸的有效遞送，特別係iRNAs到動物皮膚。大多數藥物以離子化和非離子化形式存在於溶液中。然而，通常只有脂溶性或親脂性藥物容易穿過細胞膜。已經發現，如果要穿過的膜經滲透增強劑處理，即使係非親脂性藥物也可以穿過細胞膜。除了幫 助非親脂性藥物擴散穿過細胞膜外，滲透增強劑還增強了親脂性藥物的滲透性。
滲透增強劑可分為五類之一，即表面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑和非螯合非表面活性劑(參見例如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)。上述每一類滲透增強劑及其在醫藥組成物的製造和醫藥劑的遞送中的用途在所屬技術領域中是眾所周知的。
vi.賦形劑
與載體化合物相比，「藥物載體(pharmaceutical carrier)」或「賦形劑(excipient)」係用於將一種或多種核酸遞送至動物的藥學上可接受的溶劑、懸浮劑或任何其他藥理學惰性載體。並且在與核酸和給定醫藥組成物的其他組份組合時，考慮到計劃的給藥方式來選擇賦形劑以提供所需的體積、稠度等，賦形劑可以係液體或固體。此劑係所屬技術領域中眾所周知的。
vi.其他組份
本發明的組成物還可以包含其他常規存在於醫藥組成物中的附加成分，其用量為本領域確定的使用量級。因此，例如，組成物可以包含額外的、相容的藥學活性物質，例如止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或抗炎劑，或者可以包含用於物理配製本發明的組成物的各種劑型的額外物質，如染料、調味劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑和穩定劑等。然而，這些材料在添加時不應過度干擾本發明組成物之組份的生物活性。製劑可以滅菌，如果需要，可以與助劑混合，例如潤滑劑、防腐劑、穩定劑、潤濕劑、乳化劑、影響滲透壓的鹽、緩衝劑、著色劑、調味劑和/或芳香物質等，其不會與製劑中的核酸發生有害的相互作用。
水性懸浮液可包含增加懸浮液黏度的物質，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇和/或葡聚醣。懸浮液也可以含有穩定劑。
在一些實施態樣中，本發明特徵的醫藥組成物包括(a)一個或多個iRNA和(b)一個或多個藉由非RNAi機制發揮作用，並且可用於處置補體因子B相關病症的劑。
此類化合物的毒性和處置功效可以藉由細胞培養物或實驗動物中的標準藥學程序來確定，例如，用於確定LD50(對50%的族群致死的劑量)和ED50(在50%的族群中處置有效的劑量)。毒性和處置作用之間的劑量比為處置指數，其可表示為比值LD50/ED50。較佳表現出高處置指數的化合物。
從細胞培養試驗和動物研究中獲得的數據可用於制訂用於人類的一系列劑量。本發明特徵的組成物的劑量通常在循環濃度範圍內，包括ED50，如ED80或ED90，幾乎沒有毒性或沒有毒性。根據所用劑型和所用給藥途徑，劑量可在此範圍內變化。對於在本發明的特徵方法中使用的任何化合物，處置處置有效量可以從細胞培養開始測定來估計。可以在動物模型中配製劑量，以達到化合物的循環血漿濃度範圍，或在適當時，達到標靶序列之多肽產物的循環血漿濃度範圍(例如達到降低的多胜肽濃度)，包括IC50(即，達到最大半數(half-maximal)症狀抑制之測試化合物的量級)如在細胞培養物測定的。此類訊息可用於更準確地確定在人體的有用劑量。例如，可以藉由高性能液相層析測量血漿中的量級。
除了其之給藥之外，如上所討論的，本發明中特徵的iRNAs可以與用於補體因子B相關病症的預防或治療的其他已知劑聯合給藥。在任何事 件下，根據使用所屬技術領域已知或本文所述的標準功效測量觀察到的結果，給藥醫師可以調整iRNA給藥之量和時間。
VI.用於抑制補體因子B表現的方法
本發明還提供了抑制細胞中CFB基因表現的方法。該方法包括使細胞與RNAi劑接觸，例如，雙股RNAi劑在細胞中以有效劑量抑制細胞中CFB表現的量，因此抑制細胞中CFB的表現。
使細胞與iRNA(例如雙股RNA劑)接觸，可以在活體外或活體內進行。使活體內細胞與iRNA接觸包括使個體(例如人類個體)內的細胞或細胞群與iRNA接觸。也可為接觸細胞的活體外及活體內方法的組合。如上所述，接觸細胞可以是直接的或間接的。此外，可以藉由靶向配體實現接觸細胞，包括本文所述或所述技術領域已知的任何配體。在一些實施態樣中，該靶向配體係碳水化合物部分體，例如，GalNAc配體，或將RNAi劑引導至感興趣位點的任何其他配體。
如本文所用，術語「抑制(inhibiting)」可與「減少(reducing)」、「緘默(silencing)」、「下調(downregulating)」、「壓抑(suppressing)」及其他類似術語互換使用，並且包括任何量級的抑制。
片語「抑制補體因子B基因的表現」意指抑制任何補體因子B基因的表現(例如，小鼠補體因子B基因、大鼠補體因子B基因、猴補體因子B基因或人類補體因子B基因)以及補體因子B的變體或突變體。因此，在基因操作的細胞、細胞群或有機體的背景下，該補體因子B可為野生型補體因子B基因、突變補體因子B基因或轉基因補體因子B基因。
術語「抑制補體因子B基因的表現」包含補體因子B基因之抑制的任一量級，例如，補體因子B基因的表現的至少部分抑制，如抑制臨床上相關的量級。補體因子B基因的表現可根據與補體因子B表現相關之變量的任一量級或量級的改變，例如，補體因子BmRNA量級或補體因子B的蛋白質量級、或例如，CH50活性作為總溶血補體的測量、AH50測定補體之替交路徑的溶血活性或乳酸去氫酶(LDH)量級作為血管內溶血或血紅蛋白量的測量。可測量C3、C9、C5、C5a、C5b及可溶性C5b-9複合體之量級以評估CFB表現。可以藉由與對照量級相比的這些變量中的一個或多個的絕對或相對量級的降低來評估抑制。可以在個別體細胞或一組細胞中評估該量級，包括例如，來自個體的樣本。據了解，補體因子B主要在肝臟中表現，並存在於循環中。
可藉由與對照量級相比的補體因子B表現相關的一個或多個變量的絕對量級或相對量級的降低來評估抑制。對照量級可以是所屬技術領域中使用的任何類型的對照量級，例如，給藥前基線量級、從類似個體的決定的量級、或從未以對造組處理或處理的(例如，僅緩衝對造組或去活性劑對造組)。
在本發明的方法的一些實施態樣中，補體因子B基因的表現被抑制至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%，或低於檢測的可檢測量級。在部分實施態樣中，補體因子B基因的表現係被抑制至少70%。還應進一步理解，抑制某些組織(例如膽囊)中的補體因子B的表現，而不顯著抑制其他組織(例如腦)中的表現可能是希望的。在某些實施態樣中，以實施例2中提供的測定方法在合適的物種匹配細胞株中用10nM siRNA濃度測定表現量級。
在某些實施態樣中，體內表現的抑制藉由在表現人類基因的囓齒動物中人類基因的減弱來確定，例如，表現人類標靶基因(即，補體因子B)的AAV感染小鼠，例如，當作為單劑量，例如，在RNA表現的最低點時3mg/kg。也可以確定模式動物系統中內源基因表現的減弱，例如，在RNA表現的最低點以例如3mg/kg施用單劑量後。當人類基因和模式動物基因的核酸序列足夠接近以致於人類iRNA提供模式動物基因的有效減弱時，此類系統是有用的。使用實施例2中提供的PCR方法測定肝臟中的RNA表現。
補體因子B基因表現的抑制可以藉由由第一細胞或細胞群表現的mRNA的量而表現出來(例如，此類細胞可能存在於來自個體的樣本中)，其中補體因子B基因被轉錄，並且已經被處理(例如，藉由使細胞與本發明iRNA接觸、或藉由將本發明的iRNA給藥於個體，其中該個體身上存在或曾存在細胞)，因此與第二細胞或細胞組相比，補體因子B基因的表現受到抑制，該第二細胞或細胞組與未經過如此處理的第一細胞或細胞組實質上相同(未用iRNA或未用靶向目的基因的iRNA處理的對照細胞)。在某些實施態樣中，藉由實施例2中使用用10nMsiRNA濃度提供的測定方法在合適的物種匹配細胞株中及經處裡的細胞中mRNA量級的表現，使用以下式表示對照細胞中mRNA量級的百分率：
Figure 111140910-A0202-12-0169-73
在其他實施態樣中，補體因子B基因表現的抑制可以根據與補體因子B基因表現功能性連接之參數的降低來評估，例如，來自個體的血液或血清中的補體因子B蛋白質量級。無論是內源的還是異源的表現構建體，補體因子B基因之緘默可以在表現補體因子B的任何細胞中確定，並且藉由所屬領域已知的任何檢定法。
補體因子B蛋白質的表現抑制可外顯為細胞或細胞群或各體樣本中補體因子B蛋白量級減低(例如，來自個體的血液樣本中的蛋白質量級)。如上所述，為了評估mRNA抑制，經處理細胞或細胞組的蛋白質表現量級抑制可以類似地表示為對照細胞或細胞組的蛋白質量級的百分比，或個體樣本的蛋白質量級，例如，來自個體的血液或血清。
可用於評估補體因子B基因表現抑制的對照細胞、細胞群或個體樣本包括尚未與本發明RNAi劑接觸的細胞、細胞群或個體樣本。例如，對照細胞、細胞群或個體樣品可以源自在使用RNAi劑或適當匹配的群體對照治療個體之前的個別個體(例如，人或動物個體)，然後用RNAi試劑或適當匹配的群體對照治療個體。
由細胞或細胞組表現的補體因子BmRNA量級可以使用所屬技術領域領域已知任何用於評估mRNA表現的方法來確定。在一實施態樣中，樣本中補體因子B的表現量級係藉由檢測轉錄的多核苷酸或其部分來確定，例如補體因子B基因的mRNA。使用RNA提取技術從細胞中提取RNA，包括例如，使用酸性苯酚/異硫氰酸胍提取(RNAzol B；Biogenesis)、RNeasyTMRNA製備套組(Qiagen®)或PAXgeneTM(PreAnalytixTM,Switzerland)。利用核糖核酸雜交的典型檢測形式包括核 連續檢測、RT-PCR、RNase保護檢測、北方墨點法、原位雜交及微陣列分析。
在一些實施態樣中，補體因子B的表現量級係使用核酸探針確定。如本文所用，術語「探針(probe)」係指能夠選擇性結合特定補體因子B的任何分子。探針可以由所屬技術術領域中具有通常知識者合成，或衍生自適當的生物製劑。探針可專門設計用於標記。可用作探針的分子的實施例，包括但不限於RNA、DNA、蛋白質、抗體及有機分子。
分離的mRNA可用於雜交或擴增檢測，包括但不限於南方或北方分析、聚合酶鏈式反應(PCR)分析及探針陣列。一檢測mRNA濃度的方法包括將分離的mRNA與核酸分子(探針)接觸，該核酸分子(探針)可與SOD1mRNA雜交。在一實施態樣中，將mRNA固定在固體表面並與探針接觸，例如藉由在瓊脂糖凝膠運行分離的mRNA並將mRNA從凝膠轉移到膜，例如硝酸纖維素膜。在替代實施態樣中，該探針被固定在固體表面並且mRNA與探針接觸，例如，在基因晶片陣列中。具有通常知識者可以容易地採用已知的mRNA檢測方法來確定補體因子BmRNA量級。
確定樣本中補體因子B表現濃度的另一方法包括樣本中例如mRNA的核酸擴增或反轉錄酶(以製備cDNA)過程，例如，藉由RT-PCR(所述的實驗實施態樣在以下文件詳述，Mullis,1987，美國專利號4,683,202)、連接酶鏈反應(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189-193)，自我持續序列複製(Guatelli et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878)、轉錄擴增系統(Kwoh et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177)、Q-Beta Replicase(Lizardi et al.(1988) Bio/Technology 6：1197)、滾環複製(Lizardiet al.,美國專利號5,854,033)或任何其他核酸擴增方法，然後使用所屬技術領域中通常知識者熟知的擴增分子檢測技術。如果核酸分子以非常低的數量存在，這些檢測方案對於檢測核酸分子特別有用。在發明的特定方面，該CFB的表現量級係藉由定量螢光RT-PCR(即，TaqManTM系統)。在某些實施態樣中，在物種匹配細胞株中藉由實施例2中提供的方法使用，例如，10nM siRNA濃度，確定表現量級。
補體因子BmRNA的表現量級可以藉由使用膜點墨(例如用於雜交分析，例如北方點墨、南方點墨、點墨等)或微孔、樣本管、凝膠、珠子或纖維(或任何包括結合的核酸的固體支持物)。參見美國專利號5,770,722、5,874,219、5,744,305、5,677,195及5,445,934，這些專利藉由引用併入本文。補體因子B表現濃度的檢測還可以包括在溶液中使用核酸探針。
在某些實施態樣中，使用分支DNA(bDNA)檢測或實時PCR(qPCR)評估該mRNA表現量級。這些方法的使用在本文呈現的實施例中進行了描述和舉例說明。在某些實施態樣中，在物種匹配細胞株中藉由實施例2中提供的方法使用10nM siRNA濃度確定表現量級。
CFB蛋白質表現量級可以藉由使用所屬技術領域已知的用於測量蛋白質濃度的任何方法來確定。這樣的方法包括，例如，電泳、毛細管電泳、高效液相層析(HPLC)、薄層層析(TLC)、超擴散層析、流體或凝膠沉澱反應、吸收光譜、比色檢測、分光光度檢測、流式細胞術、免疫擴 散(單或雙)、免疫電泳、蛋白質印跡、放射免疫檢測(RIA)、酶聯免疫吸附檢測(ELISAs)、免疫螢光檢測、電化學發光檢測等。
在一些實施態樣中，本發明方法的功效藉由CFB mRNA或蛋白質量級(例如，肝臟活檢中)的減少來檢測。
在本發明方法的一些實施態樣中，該iRNA被給藥於個體，使iRNA遞送至個體內的特定位點。補體因子B表現的抑制可以藉由使用測量源自個體體內特定位點的液體或組織(例如，肝臟或血液)樣本之補體因子BmRNA或補體因子B蛋白質的量級或變化而評估。
如本文所用，術語偵測或檢測分析物的量級應理解為表示執行步驟以確定材料例如蛋白質、RNA是否存在。如本文所用，偵測或檢測的方法包括偵測或檢測低於所用方法的可偵測量級的分析物量級。
VII.本發明之預防或治療方法
本發明還提供使用本發明iRNA或包含本發明iRNA組成物抑制補體因子B表現的方法，從而預防或治療補體因子B相關病症，例如發性夜間血紅素尿症(PNH)、非典型性尿毒溶血症候群(aHUS)、氣喘、類風濕性關節炎(RA)；抗磷脂抗體症候群；狼瘡性腎炎；缺血再灌流損傷；典型或傳染性溶血性尿毒症候群(tHUS)；緻密物沉積病(dense deposit disease，DDD)；視神經脊髓炎(NMO)；多發性運動神經病變(MMN)；多發性硬化症(MS)；黃斑部病變(例如，老年性黃斑部病變(AMD))；溶血、肝酶升高及低血小板(HELLP)症候群；血栓性血小板低下性紫斑症(TTP)；自發性流產；非免疫性血管炎(Pauci-immunevasculitis)；表皮分解性水疱症(epidermolysis bullosa)；反復流產(recurrent fetal loss)；子癇前症(pre-eclampsia)、創傷性腦損傷(traumatic brain injury)、重症 肌無力(myasthenia gravis)、冷凝集素綜合症(cold agglutinin disease)、皮肌炎類天疱瘡(dermatomyositis bullous pemphigoid)、志賀毒素E、大腸桿菌相關溶血性尿毒症候群、C3神經病變、抗嗜中性白血球細胞質抗體相關的血管炎(anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis)(例如，肉芽腫性多血管炎(granulomatosis with polyangiitis)(以前稱為韋格納肉芽腫)、Churg-Strauss二氏症候群(Churg-Strauss syndrome)及顯微鏡下多血管炎(microscopic polyangiitis)、體液和血管移植排斥反應(humoral and vascular transplant rejection)、移植物功能障礙(graft dysfunction)、心肌梗塞(myocardial infarction)(例如，心肌梗死組織損傷和缺血(tissue damage and ischemia in myocardial infarction))、同種異體移植(allogenic transplant)、敗血症(sepsis)(例如，敗血症的結果不佳(poor outcome in sepsis))、冠狀動脈疾病(Coronary artery disease)、皮肌炎(dermatomyositis)、葛瑞夫茲氏病(Graves' disease)、動脈粥狀硬化(atherosclerosis)、阿茲海默症(Alzheimer's disease)、全身發炎反應敗血症(systemic inflammatory response sepsis)、敗血性休克(septic shock)、脊髓損傷(spinal cord injury)、腎絲球腎炎(glomerulonephritis)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、I型糖尿病(type I diabetes)、牛皮癬(psoriasis)、天皰瘡(pemphigus)、自身免疫性溶血性貧血(autoimmune hemolytic anemia，AIHA)、ITP、肺出血-腎炎症候群(Goodpasture syndrome)、Degos氏病(Degos disease)、抗磷脂症候群(antiphospholipid syndrome，APS)、致命性的APS(CAPS)、心血管疾病(cardiovascular disorder)、心肌炎(myocarditis)、腦血管疾病(cerebrovascular disorder)、周邊(例如，肌肉骨骼)血管疾病、腎血管疾病(renovascular disorder)、腸繫膜/腸血管疾病(mesenteric/enteric vascular disorder)、血管炎(vasculitis)、過敏性紫斑腎炎(Henoch-Schönlein purpura nephritis)、全身性紅斑狼瘡相關血管炎(systemic lupus erythematosus-associated vasculitis)、與類風濕性關節炎相關的血管炎(vasculitis associated with rheumatoid arthritis)、免疫複合疾病(immune complex vasculitis)、高安氏血管炎(Takayasu's disease)、擴張型心肌症(dilated cardiomyopathy)、糖尿病血管病(diabetic angiopathy)、川崎病(Kawasaki's disease，動脈炎)、靜脈氣體栓子(venous gas embolus，VGE)及支架置入後再狹窄(restenosis following stent placement)、冠狀動脈旋磨(rotational atherectomy)及經皮穿腔冠狀動脈血管成形術(percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)(參照例如，Holers(2008)Immunological Reviews 223：300-316；Holers and Thurman(2004)Molecular Immunology 41：147-152；美國專利號20070172483)。
在一實施態樣中，該補體因子B相關疾病選自由以下所組成之群組：C3腎絲球病、全身性紅斑狼瘡(SLE)，例如，狼瘡性腎炎、IgA腎病、糖尿病腎病、多囊腎病、膜性腎病變、老年性黃斑部病變、非典型性尿毒溶血症候群、血栓性微血管病(thrombotic microangiopathy)、重症肌無力、缺血再灌流損傷、陣發性夜間血紅素尿症及類風濕性關節炎。
在另一實施態樣中，該補體因子B相關疾病選自由以下所組成之群組：C3腎絲球病、全身性紅斑狼瘡(SLE)，例如，狼瘡性腎炎、IgA腎病、糖尿病腎病及多囊腎病。
在本發明的方法中，細胞可以在體外或體內與siRNA接觸，即，細胞可以在個體內。
適合使用本發明方法進行治療的細胞可以為任何表現補體因子B基因的細胞，例如，肝細胞、腦細胞、膽囊細胞、心臟細胞或腎細 胞。在一實施態樣中，該細胞係肝臟細胞。適用於本發明方法的細胞可以為哺乳動物細胞，例如，靈長類細胞(例如人類細胞，包括嵌合在非人類動物中的人類細胞、或非人類靈長類細胞，例如，猴細胞或黑猩猩細胞)或非靈長類細胞。在部分實施態樣中，該細胞係人類細胞，例如人類肝臟細胞。在本發明的方法中，細胞中補體因子B表現被抑制至少約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或低於可檢測方法之量級的量級。
本發明的體內方法可以包括向個體給藥含有iRNA的組成物，其中該iRNA包括核苷酸序列，其與給藥RNAi劑的治療哺乳動物的補體因子B基因的RNA轉錄物的至少一部分互補。可以藉由所屬技術領域已知的任何方式給藥該組成物，包括但不限於口服、腹膜內或腸胃外途徑，包括顱內(例如，腦室內、實質內和鞘內、靜脈內、肌肉內、皮下、經皮、氣道(氣霧劑)、鼻腔、直腸和局部(包括口腔和舌下)給藥。在某些實施態樣中，該組成物藉由靜脈輸注或注射給藥。在某些實施態樣中，該組成物藉由皮下注射給藥。在某些實施態樣中，該組成物藉由肌肉內注射給藥。
在一些實施態樣中，給藥係藉由持續注射(depot injection)。持續注射可能會在較長時間內以一致的方式釋放iRNA。因此，持續注射可以減少獲得所需效果所需的給藥頻率，例如，所欲的CFB抑制或治療或預防效果。持續注射還可以提供更一致的血清濃度。持續注射可包括皮下注射或肌肉內注射。在部分實施態樣中，該持續注射係皮下注射。
在一些實施態樣中，該給藥係藉由泵進行的。泵可以為外部泵或手術植入的泵。在某些實施態樣中，該泵係皮下植入的滲透泵。在其 他實施例中，該泵是輸液泵。該輸液泵可用於顱內、靜脈內、皮下、動脈或硬膜外輸液。在部分實施例中，該輸液泵係皮下輸液泵。在其他實施態樣中，該泵係手術植入的泵，其將iRNA遞送至肝臟。
給藥方式可以根據是否需要局部或全身治療及根據需要治療的區來選擇。視需要擇給藥途徑及部位以增強靶向性。
在一方面，本方法還提供了用於抑制哺乳類中補體因子B基因表現的方法。該方法包括向哺乳類給藥dsRNA，其靶向哺乳類細胞中補體因子B基因，並將該哺乳類維持足夠的時間以獲得補體因子B基因之mRNA轉錄物的降解，從而在細胞中抑制補體因子B基因表現。該基因表現的降低可以藉由如本文所述的所屬技術領域已知的任何方法及其他方法而評估，例如qRT-PCR。蛋白質產生的減少可以藉由如本文所述的所屬技術領域已知的任何方法及其他方法而評估，例如ELISA。在部分實施態樣中，穿刺肝活檢樣本作為監測補體因子B基因或蛋白質表現減少的組織材料。在其他實施態樣中，該血液樣本用作用於監測補體因子B蛋白質表現降低的個體樣本。
本發明進一步提供在有其需要的體治療的方法，例如，診斷有補體因子B相關病症的個體，如C3腎絲球病、全身性紅斑狼瘡(SLE)，例如，狼瘡性腎炎、IgA腎病、糖尿病腎病及多囊腎病。
本方法進一步提供了對有需要之個體的預防方法。本發明的治療方法包括對個體給藥本發明的iRNA，例如，對受益於補體因子B表現抑制的個體，給藥預防有效量的靶向補體因子B基因的iRNA，或包含靶向補體因子B基因的iRNA的醫藥組成物。
在一實施態樣中，補體因子B相關疾病係選自有以下組成之群組：陣發性夜間血紅素尿症(PNH)、非典型性尿毒溶血症候群(aHUS)、氣喘、類風濕性關節炎(RA)；抗磷脂抗體症候群；狼瘡性腎炎；缺血再灌流損傷；典型或傳染性溶血性尿毒症候群(tHUS)；緻密物沉積病(dense deposit disease，DDD)；視神經脊髓炎(NMO)；多發性運動神經病變(MMN)；多發性硬化症(MS)；黃斑部病變(例如，老年性黃斑部病變(AMD))；溶血、肝酶升高及低血小板(HELLP)症候群；血栓性血小板低下性紫斑症(TTP)；自發性流產；非免疫性血管炎(Pauci-immune vasculitis)；表皮分解性水疱症(epidermolysis bullosa)；反復流產(recurrent fetal loss)；子癇前症(pre-eclampsia)、創傷性腦損傷(traumatic brain injury)、重症肌無力(myasthenia gravis)、冷凝集素綜合症(cold agglutinin disease)、皮肌炎類天疱瘡(dermatomyositis bullous pemphigoid)、志賀毒素E、大腸桿菌相關溶血性尿毒症候群、C3神經病變、抗嗜中性白血球細胞質抗體相關的血管炎(anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis)(例如，肉芽腫性多血管炎(granulomatosis with polyangiitis)(以前稱為韋格納肉芽腫)、Churg-Strauss二氏症候群(Churg-Strauss syndrome)及顯微鏡下多血管炎(microscopic polyangiitis)、體液和血管移植排斥反應(humoral and vascular transplant rejection)、移植物功能障礙(graft dysfunction)、心肌梗塞(myocardial infarction)(例如，心肌梗死組織損傷和缺血(tissue damage and ischemia in myocardial infarction))、同種異體移植(allogenic transplant)、敗血症(sepsis)(例如，敗血症的結果不佳(poor outcome in sepsis))、冠狀動脈疾病(Coronary artery disease)、皮 肌炎(dermatomyositis)、葛瑞夫茲氏病(Graves' disease)、動脈粥狀硬化(atherosclerosis)、阿茲海默症(Alzheimer's disease)、全身發炎反應敗血症(systemic inflammatory response sepsis)、敗血性休克(septic shock)、脊髓損傷(spinal cord injury)、腎絲球腎炎(glomerulonephritis)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、I型糖尿病(type I diabetes)、牛皮癬(psoriasis)、天皰瘡(pemphigus)、自身免疫性溶血性貧血(autoimmune hemolytic anemia，AIHA)、ITP、肺出血-腎炎症候群(Goodpasture syndrome)、Degos氏病(Degos disease)、抗磷脂症候群(antiphospholipid syndrome，APS)、致命性的APS(CAPS)、心血管疾病(cardiovascular disorder)、心肌炎(myocarditis)、腦血管疾病(cerebrovascular disorder)、周邊(例如，肌肉骨骼)血管疾病、腎血管疾病(renovascular disorder)、腸繫膜/腸血管疾病(mesenteric/enteric vascular disorder)、血管炎(vasculitis)、過敏性紫斑腎炎(Henoch-Schönlein purpura nephritis)、全身性紅斑狼瘡相關血管炎(systemic lupus erythematosus-associated vasculitis)、與類風濕性關節炎相關的血管炎(vasculitis associated with rheumatoid arthritis)、免疫複合疾病(immune complex vasculitis)、高安氏血管炎(Takayasu's disease)、擴張型心肌症(dilated cardiomyopathy)、糖尿病血管病(diabetic angiopathy)、川崎病(Kawasaki's disease，動脈炎)、靜脈氣體栓子(venous gas embolus，VGE)及支架置入後再狹窄(restenosis following stent placement)、冠狀動脈旋磨(rotational atherectomy)及經皮穿腔冠狀動脈血管成形術(percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)(參照例如，Holers(2008)Immunological Reviews 223：300-316；Holers and Thurman(2004)Molecular Immunology 41：147-152；美國專利號20070172483)。
在一實施態樣中，該補體因子B相關疾病選自由以下所組成之群組：C3腎絲球病、全身性紅斑狼瘡(SLE)，例如，狼瘡性腎炎、IgA腎病、糖尿病腎病、多囊腎病、膜性腎病變、老年性黃斑部病變、非典型性尿毒溶血症候群、血栓性微血管病(thrombotic microangiopathy)、重症肌無力、缺血再灌流損傷、陣發性夜間血紅素尿症及類風濕性關節炎。
在另一實施態樣中，該補體因子B相關疾病選自由以下所組成之群組：C3腎絲球病、全身性紅斑狼瘡(SLE)，例如，狼瘡性腎炎、IgA腎病、糖尿病腎病及多囊腎病。
本發明的iRNA可以作為「游離iRNA」給藥。在不存在醫藥組成物的情況下，給藥該游離的iRNA。純iRNA可以在合適的緩衝溶液中。該緩衝溶液可包含乙酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶蛋白、碳酸鹽或磷酸鹽，或其任何組合。在一實施態樣中，該緩衝溶液係磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。含有iRNA的緩衝溶液pH及滲透壓係可以被調整，以使其適合給藥於個體。
或者，本發明的iRNA可以作為醫藥組成物給藥，例如dsRNA脂質體製劑。
受益於抑制補體因子B基因表現的個體是易患或診斷患有CFB相關病症的個體，例如，C3腎絲球病、全身性紅斑狼瘡(SLE)，例如，狼瘡性腎炎、IgA腎病、糖尿病腎病及多囊腎病。
在一實施態樣中，該方法包含給藥本文特徵的組成物，如此減少標靶補體組成B基因的表現，例如每次劑量約1、2、3、4、5、6、1至6、1至3或3至6個月。在某些實施態樣中，每3至6個施用該組成物月一次。
在一實施態樣中，可用於本文特徵的方法和組成物的iRNAs特異性靶向標靶補體因子B基因的RNAs(初級或加工過的)。可如本文所述製備和實施使用iRNAs抑制這些基因表現的組成物和方法。
根據本發明的方法給藥iRNA可預防或治療補體因子B相關的病症，例如，C3腎絲球病、全身性紅斑狼瘡(SLE)，例如，狼瘡性腎炎、IgA腎病、糖尿病腎病及多囊腎病。
可以向個體給藥治療量的iRNA，例如約0.01mg/kg至約200mg/kg。無論體重如何，都可以向個體給藥治療量的iRNA，例如作為固定劑量的約5mg至約1000mg。
在一些實施態樣中，該iRNA經皮下施用，即，藉由皮下注射。一次或多次注射可用於將iRNA的所欲劑量遞送至個體。可以在一段時間內重複注射。
給藥可以定期重複。在某些實施態樣中，在最初的治療方案之後，可以在較低頻率的基礎上給藥治療。重複給藥方案可包括定期施用治療量的iRNA，例如每月一次至每年一次。在某些實施態樣中，該iRNA的施用係約每月一次至約每三個月一次、或約每三個月一次至約每六個月一次。
本發明還提供了iRNA劑或其醫藥組成物的方法和用途，用於與其他藥物或其他治療方法，例如，使用已知的藥物或已知的治療方法，例如目前 用於治療這些疾病的方法，治療將受益於CFB基因表現減少或抑制的個體(例如，患有CFB相關疾病的個體)。
因此，在本發明的一些方面，包括本發明的任一單一iRNA劑的方法還包括向個體施用一個或多個另外的治療劑。iRNA劑和另外的治療劑或治療可以同時或以相同的組合給藥，例如腸胃外，或者另外的治療劑可以作為單獨組成物的一部分或在不同時間或藉由另一在所屬技術領域或本文所述的方法給藥。
在一實施態樣中，本發明的iRNA劑與抗補體組分C5抗體或其抗原結合片段(例如，依庫珠單株抗體或拉武珠單株抗體(ravulizumab)-cwvz、靶向補體組分C5的iRNA劑、靶向補體成分C3的iRNA劑、或C3肽抑製劑(例如，坎普他汀(compstatin))聯合施用。在一實際態樣中，將本發明的iRNA劑施用於患者，然後將額外的治療劑給藥於患者(或反之亦然)。在另一實施態樣中，本發明的iRNA劑和另外的治療劑同時給藥。
本發明的iRNA劑和另外的治療劑或治療可以同時或以相同的組合給藥，例如，腸胃外給藥、或者另外的治療劑可以作為單獨組成物的一部分或在不同時間給藥或藉由所屬技術領域已知或本文描述的另一方法。
VIII.套組
在某些方面，本揭露提供了包括合適容器之含有siRNA化合物的醫藥製劑的套組，例如，雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如，前驅物，例如，可以被加工成ssiRNA化合物的較大的siRNA化合物、或編碼siRNA化合物的DNA，例如，雙股siRNA化合物、或ssiRNA化合物、或其前驅物)。
此類套組包括一個或多個dsRNA劑和使用說明，例如，給藥預 防或治療有效量的dsRNA劑的說明。dsRNA劑可以在小瓶或預裝注射器中。套組可以視需要進一步包含用於給藥dsRNA劑的工具(例如，注射裝置，例如預填充注射器)，或用於測量CFB抑制的工具(例如，用於測量CFB mRNA、CFB蛋白質及CFB活性之抑制的工具)。此類用於測量CFB抑制的工具可包括用於從個體獲得樣本的工具，例如血漿樣本。本發明的套組可以視需要地進一步包括用於確定治療有效量或預防有效量的工具。
在某些實施態樣中，該藥物製劑的各個組份可以在一個容器中提供，例如，小瓶或預裝注射器。或者，可能希望將藥物製劑的組份分開地在兩個或更多個容器中提供，例如，用於siRNA化合物製備的一容器，而至少另一容器用於載體化合物。該套組可以以多種不同的配置進行包裝，例如一個或多個容器裝在一個盒子中。可以組合不同的組份，例如，根據套組提供的說明。可以根據本文所述的方法組合組份，例如以製備和給藥醫藥組成物。該套組還可以包括遞送裝置。
本發明藉由以下實施例進一步說明，不應將其解釋為限制性的。本申請中引用的所有出版物、專利和公開的專利申請的全部內容，以及非正式的序列表和圖式，均藉由引用併入本文。
實施例
實施例1. iRNA合成
劑來源
在本文未具體給出劑來源的情況下，該劑可以從分子生物學劑的任何供應商處，以用於分子生物學的品質/純度標準獲得。
siRNA設計
把項人類補體因子B(CFB)基因的siRNAs(人類：NCBI refseqID NM_001710.6；NCBI GeneID：629)係使用客製R和Python腳本設計。人類NM_001710 REFSEQ mRNA，版本6，長度為2476個鹼基。未修飾的CFB之有義股和反義股核聚酸序列列表詳見表2。修飾的CFB之有義股和反義股核聚酸序列列表詳見表3。
應當理解，在整個申請中，不帶小數的雙鏈體名稱等同於引用帶小數的雙鏈體名稱。例如，AD-959917等同於AD-959917.1。
siRNA合成
使用所屬技術領域已知的常規方法合成和黏合siRNA。
簡而言之，在固體支持物上以亞磷醯胺化學使用Mermade 192合成儀(BioAutomation)以1μmol規模合成siRNA序列。固體支持物是控制的孔玻璃(500-1000Å)，其中載有客製的GalNAc配體(3'-GalNAc接合物)、通用固體支持物(AM Chemicals)或感興趣的第一核苷酸。輔助合成劑及標準2-氰乙基亞磷醯胺單體(2'-去氧-2'-氟、2'-O-甲基、RNA、DNA)得自Thermo-Fisher(Milwaukee,WI)、Hongene(China)或Chemgenes(Wilmington,MA,USA)。其他亞磷醯胺單體從商業供應商處採購、內部製備或使用來自各種CMOs的訂製合成採購。在乙腈或乙腈：DMF(9：1)中製備濃度為100mM的亞磷醯胺，並使用5-乙硫基-1H-四唑(ETT，0.25M溶在乙腈中)以400秒的反應時間偶聯。使用100mM的3-((二甲胺基-亞甲基)胺基)-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT，得自Chemgenes(Wilmington,MA,USA))在無水溶液中生成硫代磷酸酯鏈結乙腈/吡啶(9：1 v/v)。氧化時間為5分鐘。最後去除DMT組(“DMT-Off”)合成所有序列。
固相合成完成後，在室溫，用300μL甲胺(40%水溶液)在96孔板中處理固相支持的寡核糖核苷酸約2小時，以從固相支持物上裂解並隨後去除所有額外的鹼基。不穩定的保護基團。對於包含用第三丁基二甲基甲矽烷基(TBDMS)基團保護的任何天然核糖核苷酸鏈結(2'-OH)的序列，使用TEA.3HF(三乙胺三氫氟酸)進行第二次去保護步驟。向甲胺水溶液中的每種寡核苷酸溶液中加入200μL二甲亞碸(DMSO)及300μL TEA.3HF，並將該溶液在60℃培育約30分鐘。培育後，使該板達到室溫，並藉由添加1mL的9：1乙腈：乙醇或1：1乙醇：異丙醇來沉澱粗寡核苷酸。然後將該孔板在4℃離心45分鐘，並在多通道移液器的幫助下，小心傾析上清液。將寡核苷酸沉澱重新懸浮於20mM NaOAc中，隨後在配備自動進樣器、UV檢測器、電導率計及餾分收集器的安捷倫LC系統上使用HiTrap尺寸排阻管柱(5mL，GE Healthcare)去鹽。將去鹽樣本收集在96孔板中，然後藉由LC-MS及UV光譜分析分別確認身份及量化材料的數量。
在Tecan液體處理機器人進行多個單股的複合。將有義及反義單股以等莫耳比，在96孔板中的1x PBS中混合至終濃度為10μM，將該孔板密封，在100℃培育10分鐘，然後在2至3小時的時間內緩慢恢復至室溫。確認每個雙鏈體的濃度及身份，然後用於體外篩選檢測。
表1：用於核酸序列表示的核苷酸單體的縮寫。應當理解，當這些單體存在於寡核苷酸中時，其藉由5'-3'-磷酸二酯鍵相互連接；並且可以理解，當核苷酸包含2'-氟修飾時，氟取代了母核苷酸中該位置的羥基(即，其為2'-去氧-2'-氟核苷酸)。還應理解，表中的核苷酸縮寫在置於寡核苷酸的3’-末端位置時 省略了3’-磷酸(即，其為3’-OH)。
Figure 111140910-A0202-12-0186-74
Figure 111140910-A0202-12-0187-75
Figure 111140910-A0202-12-0188-76
Figure 111140910-A0202-12-0189-77
表2. 補體B因子dsRNA劑之未修飾的有義股及反義股序列
Figure 111140910-A0202-12-0190-250
Figure 111140910-A0202-12-0191-80
Figure 111140910-A0202-12-0192-81
Figure 111140910-A0202-12-0193-82
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Figure 111140910-A0202-12-0198-87
Figure 111140910-A0202-12-0199-88
Figure 111140910-A0202-12-0200-89
Figure 111140910-A0202-12-0201-90
Figure 111140910-A0202-12-0202-91
Figure 111140910-A0202-12-0203-92
Figure 111140910-A0202-12-0204-93
Figure 111140910-A0202-12-0205-94
Figure 111140910-A0202-12-0206-95
Figure 111140910-A0202-12-0207-96
Figure 111140910-A0202-12-0208-97
Figure 111140910-A0202-12-0209-98
Figure 111140910-A0202-12-0210-100
Figure 111140910-A0202-12-0211-101
Figure 111140910-A0202-12-0212-102
Figure 111140910-A0202-12-0213-103
Figure 111140910-A0202-12-0214-104
Figure 111140910-A0202-12-0215-105
Figure 111140910-A0202-12-0216-251
表3. 補體B因子dsRNA劑之修飾的有義股及反義股序列
Figure 111140910-A0202-12-0216-252
Figure 111140910-A0202-12-0217-108
Figure 111140910-A0202-12-0218-109
Figure 111140910-A0202-12-0219-110
Figure 111140910-A0202-12-0220-111
Figure 111140910-A0202-12-0221-112
Figure 111140910-A0202-12-0222-113
Figure 111140910-A0202-12-0223-114
Figure 111140910-A0202-12-0224-115
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Figure 111140910-A0202-12-0230-121
Figure 111140910-A0202-12-0231-122
Figure 111140910-A0202-12-0232-123
Figure 111140910-A0202-12-0233-124
Figure 111140910-A0202-12-0234-125
Figure 111140910-A0202-12-0235-126
Figure 111140910-A0202-12-0236-127
Figure 111140910-A0202-12-0237-128
Figure 111140910-A0202-12-0238-129
Figure 111140910-A0202-12-0239-130
Figure 111140910-A0202-12-0240-131
Figure 111140910-A0202-12-0241-132
Figure 111140910-A0202-12-0242-133
實施例2. 體外篩選方法
細胞培養及轉染；
在初代人類肝細胞(PHH,BioIVT)中進行轉染測定。藉由在384孔板中每孔中加入5μl Opti-MEM加0.1μl Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen，Carlsbad CA.cat # 13778-150)添加到每孔5μl siRNA雙鏈體，並在室溫培育15分鐘。然後將含有約10 x103個細胞的40μl Invitrogro CP培養基(BioIVT，目錄號Z99029)添加到siRNA混合物中。在RNA純化前將細胞培育24小時。實驗在10nM、1nM和0.1nM進行。
使用DYNABEADS mRNA單離套組單離總RNA：
以Highres Biosolution整合系統使用DynabeadsTM mRNA DIRECTTM純化套組(InvitrogenTM，目錄號61012)分離RNA。簡而言之，將70μL裂解/結合緩衝液和10μL含有3μL磁珠的裂解緩衝液添加到含有細胞的孔板中。將孔板在室溫在電磁振盪器上培育10分鐘，然後捕獲磁珠並去除上清液。然後用90μL洗滌緩衝液A洗滌珠子結合的RNA 2次，用90μL洗滌緩衝液B洗滌一次。然後用90μL洗脫緩衝液洗滌珠子，重新捕獲，並去除上清液。根據製造商的建議，使用高容量cDNA反轉錄套組和RNase抑製劑(Applied BiosystemsTM，目錄號4374967)合成補體DNA(cDNA)。將包含1μL的10X緩衝液、0.4μL的25X三磷酸去氧核糖核苷酸、1μL 10X隨機引子、0.5μL的逆轉錄酶、0.5μL的RNase抑制劑和6.6μL的H2O的主混合物添加到上面分離的RNA中。將孔板密封、混合併在電磁振盪器在室溫培育10分鐘，然後在37℃培育2小時。
藉由進行RT-qPCR分析來量化CFB mRNA量級。在384孔板中，將2μl cDNA添加到主混合物中，每孔含有0.5μl人類或獼猴GAPDH TaqMan探針、0.5μl人或獼猴CFB探針(Hs00156060_m1)和5μl Lightcycler 480探針主混合物(Roche Cat # 048873010010)。即時PCR在LightCycler480即時PCR系統(Roche)中進行。為了計算相對倍數變化，使用Delta-Delta閾值循環(相對定量)(△△Cq[RQ])方法[Schmittgen和Livak 2008]分析即時數據，並將其標準化為使用轉染PBS的細胞進行的對照測定。對於所有樣本，首先將CFB mRNA量級標準化為GAPDH作為參考基因。數據表示為相對於平均PBS控制的CFB mRNA餘留百分比，誤差表示為標準偏差(SD)，源自4次轉染重複。
表2和表3中的dsRNA試劑在PHH細胞中的單劑量轉染篩選結果如表4所示。
表4. 初代人類肝細胞之體外單劑量篩選
Figure 111140910-A0202-12-0244-134
Figure 111140910-A0202-12-0245-135
Figure 111140910-A0202-12-0246-136
Figure 111140910-A0202-12-0247-137
Figure 111140910-A0202-12-0248-138
Figure 111140910-A0202-12-0249-139
Figure 111140910-A0202-12-0250-140
Figure 111140910-A0202-12-0251-141
Figure 111140910-A0202-12-0252-142
Figure 111140910-A0202-12-0253-143
Figure 111140910-A0202-12-0254-144
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Figure 111140910-A0202-12-0256-146
Figure 111140910-A0202-12-0257-147
Figure 111140910-A0202-12-0258-148
Figure 111140910-A0202-12-0259-149
Figure 111140910-A0202-12-0260-150
實施例3. 體外篩選方法
還藉由初代人類肝細胞和初代食蟹猴肝細胞中的轉染和自由攝取評估雙鏈體的一子集。
在初代人類肝細胞(PHH，BioIVT)和初代食蟹猴肝細胞(PCH，BioIVT)中進行轉染和自由攝取測定。藉由在384孔板中每孔中加入5μl Opti-MEM加0.1μl Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen，Carlsbad CA.cat # 13778-150)添加到每孔5μl siRNA雙鏈體，並在室溫培育15分鐘。然後將含有約10 x103個細胞的40μl Invitrogro CP培養基(BioIVT，目錄號Z99029)添加到siRNA混合物中。在RNA純化前將細胞培育24小時。實驗在10nM、1nM和0.1nM進 行。在不使用Liporectamine RNAimax的情況下，與轉染測定類似地進行自由攝取測定，並且在RNA純化之前將細胞陪育48小時。實驗在200nM、100nM、10nM、1nM進行。
以Highres Biosolution整合系統使用DynabeadsTM mRNA DIRECTTM純化套組(InvitrogenTM，目錄號61012)分離RNA。簡而言之，將70μL裂解/結合緩衝液和10μL含有3μL磁珠的裂解緩衝液添加到含有細胞的孔板中。將孔板在室溫在電磁振盪器上培育10分鐘，然後捕獲磁珠並去除上清液。然後用90μL洗滌緩衝液A洗滌珠子結合的RNA 2次，用90μL洗滌緩衝液B洗滌一次。然後用90μL洗脫緩衝液洗滌珠子，重新捕獲，並去除上清液。根據製造商的建議，使用高容量cDNA反轉錄套組和RNase抑製劑(Applied BiosystemsTM，目錄號4374967)合成補體DNA(cDNA)。將包含1μL的10X緩衝液、0.4μL的25X三磷酸去氧核糖核苷酸、1μL 10X隨機引子、0.5μL的逆轉錄酶、0.5μL的RNase抑製劑和6.6μL的H2O的主混合物添加到上面分離的RNA中。將孔板密封、混合併在電磁振盪器在室溫培育10分鐘，然後在37℃培育2小時。
藉由進行RT-qPCR分析來量化CFB mRNA量級。在384孔板中，將2μl cDNA添加到主混合物中，每孔含有0.5μl人類或獼猴GAPDH TaqMan探針、0.5μl人或獼猴CFB探針(Hs00156060_m1)和5μl Lightcycler 480探針主混合物(Roche Cat # 048873010010)。即時PCR在LightCycler480即時PCR系統(Roche)中進行。為了計算相對倍數變化，使用Delta-Delta閾值循環(相對定量)(△△Cq[RQ])方法[Schmittgen和Livak 2008]分析即時數據，並將其標準化為使用轉染PBS的細胞進行的對照測定。對於所有樣本，首先將CFB mRNA量級 標準化為GAPDH作為參考基因。數據表示為相對於平均PBS控制的CFB mRNA餘留百分比，誤差表示為標準偏差(SD)，源自4次轉染重複。
PHH和PCH細胞中單劑量轉染篩選和遊離攝取篩選的結果分別顯示在表5和表6中。
表5. 在初代人類肝細胞的體外單劑量轉染及自由攝取篩選
Figure 111140910-A0202-12-0263-253
Figure 111140910-A0202-12-0264-152
Figure 111140910-A0202-12-0265-153
Figure 111140910-A0202-12-0266-154
Figure 111140910-A0202-12-0267-155
Figure 111140910-A0202-12-0268-254
表6. 在初代猴肝細胞的體外單劑量轉染及自由攝取篩選
Figure 111140910-A0202-12-0268-256
Figure 111140910-A0202-12-0269-158
Figure 111140910-A0202-12-0270-159
Figure 111140910-A0202-12-0271-160
Figure 111140910-A0202-12-0272-161
Figure 111140910-A0202-12-0273-162
實施例4. dsRNA雙鏈體的體內篩選
單劑量研究(1mg/kg)
在體內，從上述體外研究中確定之感興趣的雙鏈體進行了評估。特別是，在給藥前第21天，藉由眼窩後靜脈內遞送，以2 x 1011個編碼人類CFB的腺相關病毒8(AAV8)載體的病毒顆粒誘導野生型小鼠(C57BL/6)。特別是，給藥編碼人類CFB mRNA的一部分的AAV8於小鼠，該編碼人類CFB mRNA編碼開放閱讀框架及人類CFB mRNA的3’UTR，其稱為NM_001710.5，也稱為VCAV-07851.AAV8.HsCFB。
在第0天，對每群組之三隻小鼠皮下給藥1mg/kg劑量之感興趣的雙鏈體或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。表7提供了治療方法設計並提供了感興趣的雙鏈體。在給藥前第0天和給藥後第7天，收集K2EDTA血漿並藉由ELISA(Assay Pro # EF7001)分析樣本中人類CFB蛋白質。所有血漿樣本均在1x稀釋劑中按1：1000稀釋，並根據製造商的操作程序進行ELISA。以GraphPad Prism軟體使用4參數邏輯曲線對數據進行插值(interpolate)。
對於所有樣本，將人類CFB蛋白質量級標準化為個別動物第0天的量級，以計算餘留人類CFB蛋白質的相對百分比。對於每組，計算餘留CFB蛋白質的平均百分比(±標準偏差[SD])。
數據表示為基線值的百分比，並表示為平均值加標準偏差。列於表8和圖2中的結果表明，所測試的示例性雙鏈體劑有效地降低了體內人CFB蛋白的量級。
表7. 治療組
Figure 111140910-A0202-12-0275-164
表8. 體內篩選
Figure 111140910-A0202-12-0275-165
等效物
所屬技術領域中具有通常知識者將認識到，或僅能夠使用常規實驗來確定與本文所述的特定實施例和方法的許多等效物。這些等效物旨在包含在所附申請專利範圍內。
非正式序列表
SEQ ID NO：1
>gi|1732746151|ref|NM_001710.6智人補體因子B(CFB),mRNA
Figure 111140910-A0202-12-0277-175
SEQ ID NO：2
>gi|218156288|ref|NM_008198.2|小鼠補體因子B(Cfb)，轉錄變體1,mRNA
Figure 111140910-A0202-12-0277-176
Figure 111140910-A0202-12-0278-177
SEQ ID NO：3
>gi|218156290|ref|NM_001142706.1|小鼠補體因子B(Cfb)，轉錄變體2,mRNA
Figure 111140910-A0202-12-0278-178
Figure 111140910-A0202-12-0279-179
SEQ ID NO：4
>gi|218156284|ref|NM_212466.3|褐鼠補體因子B(Cfb),mRNA
Figure 111140910-A0202-12-0279-181
Figure 111140910-A0202-12-0280-182
SEQ ID NO：5
>gi|57114201|ref|NM_001009169.1|黑猩猩補體因子B(CFB),mRNA
Figure 111140910-A0202-12-0280-183
Figure 111140910-A0202-12-0281-184
SEQ ID NO：6-食蟹猴補體因子B
>ENSMMUP00000000985[mRNA]locus=scaffold3881：47830：53620：-
Figure 111140910-A0202-12-0281-185
Figure 111140910-A0202-12-0282-186
SEQ ID NO：7
>gi|544428919|ref|XM_005553440.1|PREDICTED：食蟹猴補體因子B(CFB),transcript variant X1,mRNA
Figure 111140910-A0202-12-0282-187
Figure 111140910-A0202-12-0283-188
SEQ ID NO：8
SEQ ID NO：1之反補體
Figure 111140910-A0202-12-0283-189
SEQ ID NO：9
SEQ ID NO：2之反補體
Figure 111140910-A0202-12-0284-190
SEQ ID NO：10
SEQ ID NO：3之反補體
Figure 111140910-A0202-12-0284-191
Figure 111140910-A0202-12-0285-192
SEQ ID NO：11
SEQ ID NO：4之反補體
Figure 111140910-A0202-12-0285-193
Figure 111140910-A0202-12-0286-194
SEQ ID NO：12
SEQ ID NO：5之反補體
Figure 111140910-A0202-12-0286-195
Figure 111140910-A0202-12-0287-196
SEQ ID NO：13
SEQ ID NO：6之反補體
Figure 111140910-A0202-12-0287-197
SEQ ID NO：14
SEQ ID NO：7之反補體
Figure 111140910-A0202-12-0288-198
TW202333749A_111140910_SEQL.xml

Claims (83)

  1. 一種雙股核糖核酸(dsRNA)劑用於抑制細胞中補體因子B(CFB)的表現，其中該dsRNA包含形成雙股區的有義股及反義股，其中該反義股包含與編碼補體因子B(CFB)的mRNA互補的區，且其中該互補的區包含與來自表2至3中任一反義核苷酸序列差異不超過3個核苷酸的至少15個連續核苷酸。
  2. 如請求項1所述的dsRNA劑，其中該dsRNA劑包含含有來自表2至3中任一有義核苷酸序列的有義股。
  3. 如請求項1所述的dsRNA劑，其中該dsRNA劑包含含有來自表2至3中任一反義核苷酸序列的反義股。
  4. 如請求項1所述的dsRNA劑，其中該dsRNA劑包含含有來自表2至3中任一有義核苷酸序列的有義股及含有來自表2至3中任一反義核苷酸序列的反義股。
  5. 如請求項1所述的dsRNA劑，其中該dsRNA劑包含有義股及反義股，該有義股包含與表2至3中任一有義核苷酸序列差異不超過4個核苷酸之核苷酸序列，及該反義股包含與表2至3中任一反義核苷酸序列差異不超過4個核苷酸之核苷酸序列。
  6. 如請求項1所述的dsRNA劑，其中該dsRNA劑包含有義股及反義股，該有義股包含與表2至3中任一有義核苷酸序列差異不超過3個核苷酸之核苷酸序列，及該反義股包含與表2至3中任一反義核苷酸序列差異不超過3個核苷酸之核苷酸序列。
  7. 如請求項1所述的dsRNA劑，其中該dsRNA劑包含有義股及反義股，該有義股包含與表2至3中任一有義核苷酸序列差異不超過2個核苷 酸之核苷酸序列，及該反義股包含與表2至3中任一反義核苷酸序列差異不超過2個核苷酸之核苷酸序列。
  8. 如請求項1所述的dsRNA，其中該dsRNA劑包含有義股及反義股，該有義股包含與表2至3中任一有義核苷酸序列差異不超過1個核苷酸之核苷酸序列，及該反義股包含與表2至3中任一反義核苷酸序列差異不超過1個核苷酸之核苷酸序列。
  9. 一種雙股核糖核酸(dsRNA)劑用於抑制細胞中補體因子B(CFB)的表現，其中該dsRNA包含形成雙股區的有義股及反義股，其中該有義股包含與SEQ ID NO：1的核苷酸504至526、640至662、641至663、995至1017、997至1019、1034至1056、1141至1163、1145至1167、1389至1411、1473至1495、1826至1848、1828至1850、1842至1864、2242至2264、2391至2413、2393至2415、2438至2460或2453至2475中任一者差異不超過三個核苷酸的至少15個連續核苷酸，且該反義股包含與來自SEQ ID NO：8之對應核苷酸序列差異不超過三個核苷酸的至少15個連續核苷酸。
  10. 如請求項1至9中任一項所述的dsRNA劑，其中該反義股包含與由下組成之群組選擇的雙鏈體之反義股核苷酸序列的任一者的差異不超過四個核苷酸的至少15個連續核苷酸：AD-1726057；AD-1725763；AD-1725777；AD-1725057；AD-1725096；AD-1728786；AD-1725059；AD-1728276；AD-1728278；AD-1726936；AD-1725472；AD-1724715；AD-1727292；AD-1730477；AD-1727288；AD-1730167；AD-1725408；以及AD-1725761。
  11. 如請求項1至10中任一項所述的dsRNA劑，其中該有義股及反義股包含與由下組成之群組選擇的雙鏈體之有義股核苷酸序列及反義股核苷 酸序列的任一者的差異不超過四個核苷酸的至少15個連續核苷酸：AD-1726057；AD-1725763；AD-1725777；AD-1725057；AD-1725096；AD-1728786；AD-1725059；AD-1728276；AD-1728278；AD-1726936；AD-1725472；AD-1724715；AD-1727292；AD-1730477；AD-1727288；AD-1730167；AD-1725408；以及AD-1725761。
  12. 如請求項1至11中任一項所述的dsRNA劑，其中該有義股及反義股包含與由下組成之群組選擇的雙鏈體之有義股核苷酸序列及反義股核苷酸序列的任一者的差異不超過三個核苷酸的至少15個連續核苷酸：AD-1726057；AD-1725763；AD-1725777；AD-1725057；AD-1725096；AD-1728786；AD-1725059；AD-1728276；AD-1728278；AD-1726936；AD-1725472；AD-1724715；AD-1727292；AD-1730477；AD-1727288；AD-1730167；AD-1725408；以及AD-1725761。
  13. 如請求項1至12中任一項所述的dsRNA劑，其中該有義股及反義股包含與由下組成之群組選擇的雙鏈體之有義股核苷酸序列及反義股核苷酸序列的任一者的差異不超過兩個核苷酸的至少15個連續核苷酸：AD-1726057；AD-1725763；AD-1725777；AD-1725057；AD-1725096；AD-1728786；AD-1725059；AD-1728276；AD-1728278；AD-1726936；AD-1725472；AD-1724715；AD-1727292；AD-1730477；AD-1727288；AD-1730167；AD-1725408；以及AD-1725761。
  14. 如請求項1至13中任一項所述的dsRNA劑，其中該有義股及反義股包含與由下組成之群組選擇的雙鏈體之有義股核苷酸序列及反義股核苷酸序列的任一者的差異不超過一個核苷酸的至少15個連續核苷酸：AD- 1726057；AD-1725763；AD-1725777；AD-1725057；AD-1725096；AD-1728786；AD-1725059；AD-1728276；AD-1728278；AD-1726936；AD-1725472；AD-1724715；AD-1727292；AD-1730477；AD-1727288；AD-1730167；AD-1725408；以及AD-1725761。
  15. 如請求項1至14中任一項所述的dsRNA劑，其中該有義股及反義股包含由下組成之群組選擇的雙鏈體之有義股核苷酸序列及反義股核苷酸序列：AD-1726057；AD-1725763；AD-1725777；AD-1725057；AD-1725096；AD-1728786；AD-1725059；AD-1728276；AD-1728278；AD-1726936；AD-1725472；AD-1724715；AD-1727292；AD-1730477；AD-1727288；AD-1730167；AD-1725408；以及AD-1725761。
  16. 如請求項1至15中任一項所述的dsRNA劑，其中該有義股及反義股由下組成之群組選擇的雙鏈體之有義股核苷酸序列及反義股核苷酸序列所組成：AD-1726057；AD-1725763；AD-1725777；AD-1725057；AD-1725096；AD-1728786；AD-1725059；AD-1728276；AD-1728278；AD-1726936；AD-1725472；AD-1724715；AD-1727292；AD-1730477；AD-1727288；AD-1730167；AD-1725408；以及AD-1725761。
  17. 如請求項1至16中任一項所述的dsRNA劑，其中該dsRNA劑包含至少一修飾的核苷酸。
  18. 如請求項1至17中任一項所述的dsRNA劑，其中該有義股的實質上所有核苷酸；反義股的實質上所有核苷酸包含修飾；或有義股的實質上所有核苷酸及反義股的實質上所有核苷酸包含修飾。
  19. 如請求項1至18中任一項所述的dsRNA劑，其中該有義股的所有核苷酸包含修飾；該反義股的所有核苷酸包含修飾；或該有義股的所有核苷酸及該反義股的所有核苷酸包含修飾。
  20. 如請求項17至19中任一項所述的dsRNA劑，其中該核苷酸修飾之至少一者選自由下組成的群組：去氧-核苷酸修飾、3’-終端去氧胸苷(dT)核苷酸修飾、2'-O-甲基核苷酸修飾、2'-氟核苷酸修飾、2'-去氧-核苷酸修飾、鎖核苷酸修飾、未鎖核苷酸修飾、構型受限的核苷酸修飾、約束的乙基核苷酸修飾、無鹼基核苷酸修飾、2’-胺基-核苷酸修飾、2’-O-烯丙基-核苷酸修飾、2’-C-烷基-核苷酸修飾、2’-甲氧基乙基核苷酸修飾、2’-O-烷基-核苷酸修飾、N-嗎啉基核苷酸修飾、胺基磷酸酯修飾、包含核苷酸修飾的非天然鹼基、四氫吡喃核苷酸修飾、1,5-脫水己糖醇核苷酸修飾、環己烯基核苷酸修飾、包含硫代磷酸酯基團核苷酸修飾的核苷酸、包含甲基膦酸酯基團核苷酸修飾的核苷酸、包含2'-磷酸酯的核苷酸、包含5'-磷酸酯核苷酸修飾的核苷酸、包含5'-磷酸酯模擬物核苷酸修飾的核苷酸、熱去穩定核苷酸修飾、乙二醇修飾的核苷酸(GNA)核苷酸修飾，及2-O-(N-甲基乙醯胺)核苷酸修飾；及其組合。
  21. 如請求項17至19中任一項所述的dsRNA劑，其中該核苷酸修飾選自由下列組成之群組：LNA、HNA、CeNA、2'-甲氧基乙基、2'-O-烷基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-氟、2'-去氧、2-羥基及乙二醇修飾的核苷酸；及其組合。
  22. 如請求項17至19中任一項所述的dsRNA劑，其中該核苷酸修飾之至少一者選自去氧核苷酸修飾、2'-O-甲基核苷酸修飾、2'-氟核苷酸修飾、 2'-去氧核苷酸修飾，乙二醇(GNA)核苷酸修飾，包括2'-磷酸核苷酸修飾、乙烯基膦酸酯核苷酸修飾和2'-O十六烷基核苷酸修飾的核苷酸；及其組合。
  23. 如請求項17至19中任一項所述的dsRNA劑，其中該核苷酸的至少一修飾係熱去穩定核苷酸修飾。
  24. 如請求項23所述的dsRNA劑，其中該熱去穩定核苷酸係選自由下組成之群組：無鹼基核苷酸；與雙鏈體中相對核苷酸的錯配；及去穩定糖修飾、2’-去氧修飾、無環核苷酸、未鎖核酸(UNA)及乙二醇核苷酸修飾(GNA)。
  25. 如請求項1至24中任一項所述的dsRNA劑，其中該雙股區為19至30個核苷酸對長度。
  26. 如請求項25所述的dsRNA劑，其中該雙股區為19至25個核苷酸對長度。
  27. 如請求項25所述的dsRNA劑，其中該雙股區為19至23個核苷酸對長度。
  28. 如請求項25所述的dsRNA劑，其中該雙股區為23至27個核苷酸對長度。
  29. 如請求項25所述的dsRNA劑，其中該雙股區為21至23個核苷酸對長度。
  30. 如請求項1至29所述的dsRNA劑，其中每股獨立地不超過30個核苷酸長度。
  31. 如請求項1至30中任一項所述的dsRNA劑，其中該有義股為21個核苷酸對長度且該反義股為23個核苷酸對長度。
  32. 如請求項1至31中任一項所述的dsRNA劑，其中該互補區係至少17個核苷酸對長度。
  33. 如請求項1至32中任一項所述的dsRNA劑，其中該互補區係19至23個核苷酸對長度。
  34. 如請求項1至33中任一項所述的dsRNA劑，其中該互補區係19至21個核苷酸對長度。
  35. 如請求項1至34中任一項所述的dsRNA劑，其中該互補區係19至21個核苷酸對長度。
  36. 如請求項1至35中任一項所述的dsRNA劑，其中該至少一股包含至少2核苷酸的3’突出。
  37. 如請求項1至36中任一項所述的dsRNA劑，進一步包含配體。
  38. 如請求項37所述的dsRNA劑，其中該配體接合於dsRNA劑之有義股的3’端。
  39. 如請求項37或38所述的dsRNA劑，其中該配體係乙醯半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
  40. 如請求項37至39中任一項所述的dsRNA劑，其中該配體係一個或多個藉由單價、二價或三價支鏈(branched)連接子連接的GalNAc衍生物。
  41. 如請求項39或40所述的dsRNA劑，其中該配體係
    Figure 111140910-A0202-13-0008-171
  42. 如請求項41所述的dsRNA劑，其中該dsRNA劑如下方案所示接合至配體：
    Figure 111140910-A0202-13-0008-172
    且，其中X係O或S。
  43. 如請求項42所述的dsRNA劑，其中該X係O。
  44. 如請求項1至43中任一項所述的dsRNA劑，其中該dsRNA劑進一步包含至少一硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結。
  45. 如請求項44所述的dsRNA劑，其中該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結係位於一股的3’-終端。
  46. 如請求項45所述的dsRNA劑，其中該股係反義股。
  47. 如請求項45所述的dsRNA劑，其中該股係有義股。
  48. 如請求項44所述的dsRNA劑，其中該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結係位於一股的5’-終端。
  49. 如請求項48所述的dsRNA劑，其中該股係反義股。
  50. 如請求項48所述的dsRNA劑，其中該股係有義股。
  51. 如請求項42所述的dsRNA劑，其中該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結係同位於一股的5’-及3’-終端。
  52. 如請求項50所述的dsRNA劑，其中該股係反義股。
  53. 如請求項1至52中任一項所述的dsRNA劑，其中該雙鏈體之反義股5'-端1位置的鹼基對係AU鹼基對。
  54. 一種細胞，其包含如請求項1至53中任一項所述的dsRNA劑。
  55. 一種用於抑制編碼補體因子B(CFB)的基因表現的醫藥組成物，其包含如請求項1至53中中任一項所述的dsRNA劑。
  56. 如請求項55所述的醫藥組成物，其中該dsRNA劑係在無緩衝溶液中。
  57. 如請求項56所述的醫藥組成物，其中該無緩衝溶液係鹽水或水。。
  58. 如請求項55所述的醫藥組成物，其中該dsRNA劑係在緩衝溶液中。
  59. 如請求項58所述的醫藥組成物，其中該緩衝溶液包含乙酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶穀蛋白、碳酸鹽或磷酸鹽或其任意組合。
  60. 如請求項59所述的醫藥組成物，其中該緩衝溶液係磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。
  61. 一種在細胞中抑制補體因子B基因之表現的方法，該方法包含使該細胞與如請求項1至53中任一項所述的dsRNA劑、或如請求項55至60中任一項所述的任意醫藥組成物接觸，從而抑制該細胞中CFB基因的表現。
  62. 如請求項61所述的方法，其中該細胞係在個體內。
  63. 如請求項62所述的方法，其中該個體係人類。
  64. 如請求項62所述的方法，其中該個體有補體因子B(CFB)相關病症。
  65. 如請求項61至64中任一項所述的方法，其中使該細胞與該dsRNA劑接觸，抑制CFB之表現至少50%、60%、70%、80%、90或95%。
  66. 如請求項61至65中任一項所述的方法，其中該抑制CFB之表現降低個體血清中CFB蛋白質量級至少50%、60%、70%、80%、90%或95%。
  67. 一種治療患有將從補體因子B之表現減少中受益之病症的個體的方法，包含將如請求項1至53中任一項所述的dsRNA劑、或如請求項55至60中任一項所述的醫藥組成物給藥於個體，從而治療患有將從補體因子B表現減少中受益之病症的個體。
  68. 一種在患有將從補體因子B之表現減少中受益之病症的個體中預防至少一徵狀的方法，包含將如請求項1至53中任一項所述的dsRNA劑、或如請求項55至60中任一項所述的醫藥組成物的預防有效量給藥於個體，從而在患有將從補體因子B表現減少中受益之病症的個體中預防至少一徵狀。
  69. 如請求項67或68所述的方法，其中該病症係補體因子B相關的病症。
  70. 如請求項69所述的方法，其中該補體因子B相關的病症係選自由下組成的組：陣發性夜間血紅素尿症(PNH)、非典型性尿毒溶血症候群(aHUS)、氣喘、類風濕性關節炎(RA)；抗磷脂抗體症候群；狼瘡性腎炎；缺血再灌流損傷；典型或傳染性溶血性尿毒症候群(tHUS)；緻密物沉積病(dense deposit disease，DDD)；視神經脊髓炎(NMO)；多發性運動神經病變(MMN)；多發性硬化症(MS)；黃斑部病變(例如，老年性黃斑部病變(AMD))；溶血、肝酶升高及低血小板(HELLP)症候群；血栓性血小板低下性紫斑症(TTP)；自發性流產；非免疫性血管炎(Pauci-immune vasculitis)；表皮分解性水疱症(epidermolysis bullosa)；反復流產(recurrent fetal loss)；子癇前症(pre-eclampsia)、創傷性腦損傷(traumatic brain injury)、重症肌無力(myasthenia gravis)、冷凝集素綜合症(cold agglutinin disease)、皮肌炎類天疱瘡(dermatomyositis bullous pemphigoid)、志賀毒素E、大腸桿菌相關溶血性尿毒症候群、C3神經病變、抗嗜中性白血球細胞質抗體相關的血管炎(anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis)(例如，肉芽腫性多血管炎(granulomatosis with polyangiitis)(以前稱為韋格納肉芽腫)、Churg-Strauss二氏症候群(Churg-Strauss syndrome)及顯微鏡下多血管炎(microscopic polyangiitis)、體液和血管移植排斥反應(humoral and vascular transplant rejection)、移植物功能障礙(graft dysfunction)、心肌梗塞(myocardial infarction)(例如，心肌梗死組織損傷和缺血(tissue damage and ischemia in myocardial infarction))、同種異體移植(allogenic transplant)、敗血症(sepsis)(例如，敗血症的結果不佳(poor outcome in sepsis))、冠狀動脈疾病(Coronary artery disease)、皮肌炎(dermatomyositis)、葛瑞夫茲氏病(Graves' disease)、動脈粥狀硬化(atherosclerosis)、阿茲海默症(Alzheimer's disease)、全身發炎反應敗血症(systemic inflammatory response sepsis)、敗血性休克(septic shock)、脊髓損傷(spinal cord injury)、腎絲球腎炎(glomerulonephritis)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、I型糖尿病(type I diabetes)、牛皮癬(psoriasis)、天皰瘡(pemphigus)、自身免疫性溶血性貧血(autoimmune hemolytic anemia，AIHA)、ITP、肺出血-腎炎症候群(Goodpasture syndrome)、Degos氏病(Degos disease)、抗磷脂症候群(antiphospholipid syndrome，APS)、致命性的APS(CAPS)、心血管疾病(cardiovascular disorder)、心肌炎(myocarditis)、腦血管疾病(cerebrovascular disorder)、周邊(例如，肌肉骨骼)血管疾病、腎血管疾病(renovascular disorder)、腸繫膜/腸血管疾病(mesenteric/enteric vascular disorder)、血管炎(vasculitis)、過敏性紫斑腎炎(Henoch-Schönlein purpura nephritis)、全身性紅斑狼瘡相關血管炎(systemic lupus erythematosus-associated vasculitis)、與類風濕性關節炎相關的血管炎(vasculitis associated with rheumatoid arthritis)、免疫複合血管炎(immune complex vasculitis)、高安氏疾病(Takayasu's disease)、擴張型心肌症(dilated cardiomyopathy)、糖尿病血管病(diabetic angiopathy)、川崎氏病(Kawasaki's disease(動脈炎))、靜脈氣體栓子(venous gas embolus，VGE)及支架置入後再狹窄(restenosis following stent placement)、冠狀動脈旋磨(rotational atherectomy)及經皮穿腔冠狀動脈血管成形術(percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)。
  71. 如請求項69所述的方法，其中該補體因子B相關疾病選自由以下所組成之群組：C3腎絲球病、全身性紅斑狼瘡(SLE)，例如，狼瘡性腎炎、IgA腎病、糖尿病腎病、多囊腎病、膜性腎病變、老年性黃斑部病變、非典型性尿毒溶血症候群、血栓性微血管病(thrombotic microangiopathy)、重症肌無力、缺血再灌流損傷、陣發性夜間血紅素尿症及類風濕性關節炎。
  72. 如請求項69所述的方法，其中該補體因子B相關疾病選自由以下所組成之群組：C3腎絲球病、全身性紅斑狼瘡(SLE)，例如，狼瘡性腎炎、IgA腎病、糖尿病腎病及多囊腎病。
  73. 如請求項67至72中任一項所述的方法，其中該個體係人類。
  74. 如請求項67至73中任一項所述的方法，其中該dsRNA劑係以約0.01mg/kg至50mg/kg的劑量或約5mg或1000mg的劑量向該個體給藥。
  75. 如請求項67至74中任一項所述的方法，其中該dsRNA劑係藉由皮下給藥於該個體。
  76. 如請求項67至75中中任一項所述的方法，復包含向該個體給藥用於治療CFB相關疾病的劑。
  77. 如請求項67至75中中任一項所述的方法，復包含向該個體給藥靶向補體成分C5的iRNA劑或靶向補體成分C3的iRNA劑。
  78. 如請求項59至69中中任一項所述的方法，復包含從該個體樣本中確定補體因子B的量級。
  79. 如請求項78所述的方法，其中該個體樣本中補體因子B之量級係血液或血清樣本中的補體因子B的蛋白質量級。
  80. 一種套組，包含如請求項1至53中任一項所述的dsRNA劑或如請求項55至60中任一項所述的醫藥組成物。
  81. 一種小瓶，包含如請求項1至53中任一項所述的dsRNA劑或如請求項55至60中任一項所述的醫藥組成物。
  82. 一種注射器，包含如請求項1至53中任一項所述的dsRNA劑或請求項55至60中任一項所述的醫藥組成物。
  83. 一種RNA誘導緘默複合物(RISC)，包含如請求項1至53中任一項所述的dsRNA劑的反義股。
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