JP2024508896A - アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法 - Google Patents

アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＲＮＡｉ剤、例えば、アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）遺伝子を標的とする二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤に関する。本発明はまた、そのようなＲＮＡｉ剤を使用してＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害する方法、およびＡＮＧＰＴＬ３関連障害、例えば、高脂血症または高トリグリセリド血症などの脂質代謝障害を予防および治療する方法に関する。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、２０２１年３月４日に出願された米国仮特許出願第６３／１５６，４７６号、および２０２２年２月１０日に出願された米国仮特許出願第６３／３０８，６６８号に対する優先権の利益を主張する。先述の出願の各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含んでおり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。先述のＡＳＣＩＩの写しは、２０２２年２月２８日に作成され、１２１３０１＿１５１２０＿ＳＬ．ｔｘｔという名称で、サイズは３１６，６６８バイトである。
アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）は、脂質代謝を調節する分泌因子のアンジオポエチン様ファミリーのメンバーであり、主に肝臓で発現される（Ｋｏｉｓｈｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３０（２）：１５１－１５７）。ＡＮＧＰＴＬ３は、トリグリセリドの加水分解を触媒するリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）と、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）リン脂質を加水分解する内皮リパーゼ（ＥＬ）の触媒活性を二重に阻害する。脂質低下性の、なおも肥満のＫＫ／Ｓｎｋマウスでは、ＡＮＧＰＴＬ３発現の減少は、トリグリセリドのクリアランスを促進することにより、高脂血症および動脈硬化に対する保護効果を有する（Ａｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，４４：１２１６－１２２３）。ヒトＡＮＧＰＴＬ３血漿中濃度は、血漿ＨＤＬコレステロールおよびＨＤＬリン脂質レベルと正に相関する（Ｓｈｉｍａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，２７：３６６－３７２）。
脂質代謝の障害は、トリグリセリドおよび／またはコレステロールなどの血清脂質のレベル上昇をもたらすことがある。血清脂質の上昇は、高血圧、心血管疾患、糖尿病およびその他の病理学的状態と強く関連している。高トリグリセリド血症は、トリグリセリドの血中濃度が高いことを特徴とする脂質代謝障害の一例である。高コレステロール値（高コレステロール血症）の非存在下であっても、アテローム性動脈硬化症と関連している。トリグリセリド濃度が過剰（すなわち、１０００ｍｇ／ｄｌまたは１２ｍｍｏｌ／ｌ超）である場合、高トリグリセリド血症も膵炎につながる可能性がある。高脂血症は、血液中の任意の一つまたはすべての脂質および／またはリポタンパク質のレベル上昇によって特徴付けられる、脂質代謝障害の別の例である。食事、運動、スタチンおよび他の薬剤による治療を含む脂質代謝障害に対する現在の治療は、必ずしも効果的であるとは限らない。したがって、脂質代謝障害を有する対象に対する代替的治療のための当技術分野のニーズがある。
本発明は、アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）をコードする遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）介在性の切断に影響を及ぼすｉＲＮＡ組成物を提供する。ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子は、細胞内に、例えばヒト対象などである対象内の細胞内にあり得る。本発明はまた、ＡＮＧＰＬ３遺伝子の発現を阻害するために、および／またはＡＮＧＰＬ３遺伝子の発現を阻害する、もしくは低減することから利益を得るであろう対象、例えば、高脂血症もしくは高トリグリセリド血症に罹患する、または罹患しやすい対象などの脂質代謝障害に罹患する、または罹患しやすい対象を治療するために、本発明のｉＲＮＡ組成物を使用する方法を提供する。
したがって、一態様では、本発明は、細胞内でアンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤を提供し、ｄｓＲＮＡ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列と０、１、２、または３ヌクレオチド以下だけ異なる１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１などの少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含み、当該アンチセンス鎖は、配列番号２のヌクレオチド配列と１、２、または３ヌクレオチド以下だけ異なる１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３などの少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む。一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、脱塩基修飾、二本鎖内の対向するヌクレオチドとのミスマッチ、および不安定化糖修飾、２’－デオキシ修飾、非環式ヌクレオチド、アンロック核酸（ＵＮＡ）、またはグリセロール核酸（ＧＮＡ）例えば、少なくとも一つの熱不安定化ヌクレオチド修飾を含むアンチセンス鎖など、などの少なくとも一つの熱不安定化ヌクレオチド修飾を含む。
一態様では、本発明は、細胞内でアンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供し、ｄｓＲＮＡ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＡＮＧＰＴＬ３をコードするｍＲＮＡに対して相補的な領域を含み、相補的な領域は、表２～３および７～８のいずれか一つのアンチセンスヌクレオチド配列のいずれか一つと３個以下、例えば３、２、１または０ヌクレオチドが異なる１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３などの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む。
別の態様では、本発明は、細胞内のアンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤を提供し、ｄｓＲＮＡ剤が、センス鎖と、二本鎖領域を形成するアンチセンス鎖とを含み、センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド５８～８０、７３～１０２、７３～１２４、８０～１１４、９１～１１３、９２～１１４、２９１～３２０、２９１～３４２、３０７～３３６、５４０～５６７、５４０～５８９および５４５～５７７のヌクレオチド配列のいずれか一つと三個以下、例えば３、２、１または０個のヌクレオチドが異なる少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個の連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号２の対応するヌクレオチド配列と３個以下、例えば３、２、１または０個のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の、例えば１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３個の連続ヌクレオチドを含む。
一態様では、本発明は、細胞内のアンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤を提供し、ｄｓＲＮＡ剤が、センス鎖と、二本鎖領域を形成するアンチセンス鎖とを含み、センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド５８～８０、８０～１０２、８４～１０６、８７～１０９、９１～１１３、９２～１１４、１８６～２０８、３０７～３２９、３０８～３３０、３１０～３３２、３１４～３３６、５４５～５６７、５５１～５７３、５５３～５７５、５５４～５７６、５５５～５７７、１１３３～１１５５、もしくは１１４０～１１６２のヌクレオチド配列のいずれか一つと三個以下、例えば３、２、１または０個のヌクレオチドが異なる少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個の連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号２の対応するヌクレオチド配列と３個以下、例えば３、２、１または０個のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の、例えば１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３個の連続ヌクレオチドを含む。
別の態様では、本発明は、細胞内のアンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤を提供し、ｄｓＲＮＡ剤が、センス鎖と、二本鎖領域を形成するアンチセンス鎖とを含み、センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド５８～８０、９１～１１３または９２～１１４のヌクレオチド配列のいずれか一つと三個以下、例えば３、２、１または０個のヌクレオチドが異なる少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個の連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号２の対応するヌクレオチド配列と３個以下、例えば３、２、１または０個のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の、例えば１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３個の連続ヌクレオチドを含む。
一態様では、本発明は、細胞内のアンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤を提供し、ｄｓＲＮＡ剤が、センス鎖と、二本鎖領域を形成するアンチセンス鎖とを含み、センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド５８～８０のヌクレオチド配列と三個以下、例えば３、２、１または０個のヌクレオチドが異なる少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１個の連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号２の対応するヌクレオチド配列と３個以下、例えば３、２、１または０個のヌクレオチドが異なる少なくとも１５個の、例えば１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３個の連続ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、ＡＤ－１３３１２０３．１、ＡＤ－１３３１２０６．１、ＡＤ－１３３１２０９．１、ＡＤ－１３３１２１２．１、ＡＤ－１３３１２１３．１、ＡＤ－１３３１３２９．１、ＡＤ－１３３１２３７．１、ＡＤ－１３３１２３８．１、ＡＤ－１３３１２４０．１、ＡＤ－１３３１２４４．１、ＡＤ－１３３１２５６．１、ＡＤ－１３３１２６２．１、ＡＤ－１３３１２６４．１、ＡＤ－１３３１２６５．１、ＡＤ－１３３１２６６．１、ＡＤ－１３３１３１６．１、ＡＤ－１３３１３３８．１、およびＡＤ－１４７９３７２からなる群から選択される二本鎖のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか一つと三個以下、例えば、３、２、１または０個のヌクレオチドが異なる少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３個の連続ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、ＡＤ－１３３１２０３．１、ＡＤ－１３３１２０６．１、ＡＤ－１３３１２０９．１、ＡＤ－１３３１２１２．１、ＡＤ－１３３１２１３．１、ＡＤ－１３３１３２９．１、ＡＤ－１３３１２４０．１、ＡＤ－１３３１２６２．１、ＡＤ－１３３１２６４．１、ＡＤ－１３３１２６５．１、ＡＤ－１３３１２６６．１、およびＡＤ－１４７９３７２からなる群から選択される二本鎖のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか一つと三個以下、例えば、３、２、１または０個のヌクレオチドが異なる少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３個の連続ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、ＡＤ－１３３１２０３．１、ＡＤ－１３３１２０６．１、ＡＤ－１３３１２０９．１、ＡＤ－１３３１２１２．１、ＡＤ－１３３１２１３．１、およびＡＤ－１４７９３７２からなる群から選択される二本鎖のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか一つと三個以下、例えば、３、２、１または０個のヌクレオチドが異なる少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３個の連続ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、ＡＤ－１３３１２１２．１、ＡＤ－１３３１２１３．１、およびＡＤ－１４７９３７２からなる群から選択される二本鎖のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか一つと三個以下、例えば、３、２、１または０個のヌクレオチドが異なる少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３個の連続ヌクレオチドを含む。
一実施形態においては、アンチセンス鎖は、ＡＤ－１４７９３７２のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列と三個以下、例えば、３、２、１または０個のヌクレオチドが異なる少なくとも１５、例えば１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３の連続ヌクレオチドを含む。
一実施形態においては、ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも一の修飾ヌクレオチドを含む。
一実施形態においては、センス鎖の実質的にすべてのヌクレオチド、アンチセンス鎖の実質的にすべてのヌクレオチドが修飾を含む、またはセンス鎖の実質的にすべてのヌクレオチドとアンチセンス鎖の実質的にすべてのヌクレオチドとが修飾を含む。
一実施形態においては、センス鎖のすべてのヌクレオチドが修飾を含むか、アンチセンス鎖のすべてのヌクレオチドが修飾を含むか、またはセンス鎖のすべてのヌクレオチドとアンチセンス鎖のすべてのヌクレオチドとが修飾を含む。
一実施形態では、修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも一つは、デオキシ－ヌクレオチド、３’－末端デオキシチミジン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックヌクレオチド、非ロックヌクレオチド、立体配座的に制限されたヌクレオチド、拘束されたエチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－ヒドロキシル修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、ヌクレオチドを含む非天然の塩基、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’－ホスフェートを含むヌクレオチド、５’－ホスフェート模倣体を含むヌクレオチド、熱不安定化ヌクレオチド、グリコール修飾ヌクレオチド（ＧＮＡ）、２’ホスフェートを含むヌクレオチド、および２－Ｏ－（Ｎ－メチルアセトアミド）修飾ヌクレオチド、ならびにそれらの組み合わせ、からなる群から選択される。
一実施形態においては、ヌクレオチドに対する修飾は、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシル、およびグリコール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
一実施形態では、修飾ヌクレオチドの少なくとも一つが、デオキシ－ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、グリコール修飾ヌクレオチド（ＧＮＡ）、例えばＧｇｎ、Ｃｇｎ、ＴｇｎまたはＡｇｎ、２’ホスフェートを有するヌクレオチド、例えば、Ｇ２ｐ、Ｃ２ｐ、Ａ２ｐ、Ｕ２ｐ、およびビニル－ホスホネートヌクレオチド、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される。
別の実施形態においては、ヌクレオチドに対する修飾の少なくとも一が、熱不安定化ヌクレオチド修飾である。
一実施形態では、熱不安定化ヌクレオチド修飾は、脱塩基修飾、二本鎖において対向するヌクレオチドとのミスマッチ、および不安定化する糖修飾、２’－デオキシ修飾、非環式ヌクレオチド、アンロック核酸（ＵＮＡ）、およびグリセロール核酸（ＧＮＡ）からなる群から選択される。
一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、３’－末端デオキシチミジンヌクレオチド（ｄＴ）の短い配列を含む。
一部の実施形態においては、ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結をさらに含む。一部の実施形態においては、ｄｓＲＮＡ剤は、６～８のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。一実施形態においては、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結は、一方の鎖の３’末端にある。随意に、この鎖はアンチセンス鎖である。別の実施形態においては、この鎖は、センス鎖である。関連する実施形態においては、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結は、一方の鎖の５’末端にある。随意に、この鎖はアンチセンス鎖である。別の実施形態においては、この鎖は、センス鎖である。別の実施形態においては、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結は、一方の鎖の５’末端および３’末端の両方にある。随意に、この鎖はアンチセンス鎖である。別の実施形態においては、この鎖は、センス鎖である。
二本鎖領域は、長さが１９～３０ヌクレオチド対、長さが１９～２５ヌクレオチド対、長さが１９～２３ヌクレオチド対、長さが２３～２７ヌクレオチド対、または長さが２１～２３ヌクレオチド対であり得る。
一実施形態においては、各鎖は独立に、長さが３０ヌクレオチド以下である。
一実施形態においては、センス鎖は、長さが２１ヌクレオチドであり、またアンチセンス鎖は、長さが２３ヌクレオチドである。
相補的領域は、長さが少なくとも１７ヌクレオチド、長さが１９～２３ヌクレオチド、または長さが１９ヌクレオチドであり得る。
一実施形態においては、少なくとも一の鎖が、少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。別の実施形態においては、少なくとも一の鎖が、少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。
一実施形態においては、ｄｓＲＮＡ剤はリガンドをさらに含む。
一実施形態においては、リガンドは、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖の３’末端に対してコンジュゲートされる。
一実施形態においては、リガンドは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である。
一実施形態においては、リガンドは、一価、二価、または三価の分枝リンカーを介して結合した一以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
一実施形態においては、リガンドは、以下のものである。
一実施形態においては、ｄｓＲＮＡ剤は、以下の図に示すようにリガンドにコンジュゲートされ、
式中、ＸはＯまたはＳである。
一実施形態においては、ＸはＯである。
一実施形態においては、ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも一のホスホロチオエートヌクレオチド間連結またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結をさらに含む。
一実施形態においては、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結は、一方の鎖の、例えばアンチセンス鎖またはセンス鎖の、３’末端にある。
別の実施形態においては、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結は、一方の鎖の、例えばアンチセンス鎖またはセンス鎖の、５’末端にある。
一実施形態では、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結は、一方の鎖の５’末端および３’末端の両方にある。一実施形態においては、当該鎖は、アンチセンス鎖である。
一実施形態においては、二本鎖のアンチセンス鎖の５’末端の１位における塩基対が、ＡＵ塩基対である。
一実施形態において、センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｃｕｃｃｕＵｆＣｆＵｆｕｕｕｕａｕｕｇｕｕ－３’（配列番号１８）と４塩基以下で異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｄＡｓｃａｄＡｕｄＡａａａａｄＧａＡｆｇｇａｇｃｕｕｓｇｓｇ－３’（配列番号１９）と４塩基以下で異なり、ａ、ｇ、ｃおよびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、ＣおよびＵであり、ｄＡおよびｄＧは２’－デオキシＡおよびＧであり、ＣｆおよびＵｆは２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、ｓはホスホロチオエート結合である。
一実施形態において、センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｃｕｃｃｕＵｆＣｆＵｆｕｕｕｕａｕｕｇｕｕ－３’（配列番号１８）と３塩基以下で異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｄＡｓｃａｄＡｕｄＡａａａａｄＧａＡｆｇｇａｇｃｕｕｓｇｓｇ－３’（配列番号１９）と３塩基以下で異なり、ａ、ｇ、ｃおよびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、ＣおよびＵであり、ｄＡおよびｄＧは２’－デオキシＡおよびＧであり、ＣｆおよびＵｆは２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、ｓはホスホロチオエート結合である。
一実施形態において、センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｃｕｃｃｕＵｆＣｆＵｆｕｕｕｕａｕｕｇｕｕ－３’（配列番号１８）と２塩基以下で異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｄＡｓｃａｄＡｕｄＡａａａａｄＧａＡｆｇｇａｇｃｕｕｓｇｓｇ－３’（配列番号１９）と２塩基以下で異なり、ａ、ｇ、ｃおよびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、ＣおよびＵであり、ｄＡおよびｄＧは２’－デオキシＡおよびＧであり、ＣｆおよびＵｆは２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、ｓはホスホロチオエート結合である。
一実施形態において、センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｃｕｃｃｕＵｆＣｆＵｆｕｕｕｕａｕｕｇｕｕ－３’（配列番号１８）と１塩基以下で異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｄＡｓｃａｄＡｕｄＡａａａａｄＧａＡｆｇｇａｇｃｕｕｓｇｓｇ－３’（配列番号１９）と１塩基以下で異なり、ａ、ｇ、ｃおよびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、ＣおよびＵであり、ｄＡおよびｄＧは２’－デオキシＡおよびＧであり、ＣｆおよびＵｆは２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、ｓはホスホロチオエート結合である。
一実施形態において、センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｃｕｃｃｕＵｆＣｆＵｆｕｕｕｕａｕｕｇｕｕ－３’（配列番号１８）を含み、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｄＡｓｃａｄＡｕｄＡａａａａｄＧａＡｆｇｇａｇｃｕｕｓｇｓｇ－３’（配列番号１９）を含み、ａ、ｇ、ｃおよびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、ＣおよびＵであり、ｄＡおよびｄＧは２’－デオキシＡおよびＧであり、ＣｆおよびＵｆは２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、ｓはホスホロチオエート結合である。
一実施形態においては、ｄｓＲＮＡ剤はリガンドをさらに含む。
一実施形態においては、リガンドは、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖の３’末端に対してコンジュゲートされる。
一実施形態においては、リガンドは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である。
一実施形態においては、リガンドは、一価、二価、または三価の分枝リンカーを介して結合した一以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
一実施形態においては、リガンドは、以下のものである。
一実施形態において、センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｃｕｃｃｕＵｆＣｆＵｆｕｕｕｕａｕｕｇｕｕＬ９６－３’（配列番号２０）を含み、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｄＡｓｃａｄＡｕｄＡａａａａｄＧａＡｆｇｇａｇｃｕｕｓｇｓｇ－３’（配列番号１９）を含み、ａ、ｇ、ｃおよびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、ＣおよびＵであり、ｄＡおよびｄＧは２’－デオキシＡおよびＧであり、ＣｆおよびＵｆは２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、ｓはホスホロチオエート結合であり、Ｌ９６はＮ－［トリス（ＧａｌＮＡｃ－アルキル）－アミドデカノイル）］－４－ヒドロキシプロリノールである。
一実施形態において、センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｃｕｃｃｕＵｆＣｆＵｆｕｕｕｕａｕｕｇｕｕ－３’（配列番号１８）を含み、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｄＡｓｃａｄＡｕｄＡａａａａｄＧａＡｆｇｇａｇｃｕｕｓｇｓｇ－３’（配列番号１９）を含み、ａ、ｇ、ｃおよびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、ＣおよびＵであり、ｄＡおよびｄＧは２’－デオキシＡおよびＧであり、ＣｆおよびＵｆは２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、ｓはホスホロチオエート結合であり、リガンドは、以下の図に示されるようにセンス鎖の３’端に結合され、
式中、ＸはＯである。
一実施形態では、センス鎖のヌクレオチド配列は、前記ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｃｕｃＣｆｕＵｆＣｆＵｆｕｕｕｕａｕｕｇｕｕ－３’（配列番号２１）と４塩基以下で異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓＡｆｓｃａａＵｆａａａａａｇａＡｆｇＧｆａｇｃｕｕｓａｓａ－３’（配列番号２２）と４塩基以下で異なり、または、センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｇｓｃｕｃｃＵｆｕＣｆＵｆＵｆｕｕｕａｕｕｇｕｕｕ－３’（配列番号２３）と４塩基以下で異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓＡｆｓａｃａＡｆｕａａａａａｇＡｆａＧｆｇａｇｃｕｓｕｓａ－３’（配列番号２４）と４塩基以下で異なり、式中、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、ＣおよびＵであり、ＣｆおよびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、ｓはホスホロチオエート結合である。
一実施形態では、センス鎖のヌクレオチド配列は、前記ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｃｕｃＣｆｕＵｆＣｆＵｆｕｕｕｕａｕｕｇｕｕ－３’（配列番号２１）と３塩基以下で異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓＡｆｓｃａａＵｆａａａａａｇａＡｆｇＧｆａｇｃｕｕｓａｓａ－３’（配列番号２２）と３塩基以下で異なり、または、センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｇｓｃｕｃｃＵｆｕＣｆＵｆＵｆｕｕｕａｕｕｇｕｕｕ－３’（配列番号２３）と３塩基以下で異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓＡｆｓａｃａＡｆｕａａａａａｇＡｆａＧｆｇａｇｃｕｓｕｓａ－３（配列番号２４）と３塩基以下で異なり、式中、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、ＣおよびＵであり、ＣｆおよびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、ｓはホスホロチオエート結合である。
一実施形態では、センス鎖のヌクレオチド配列は、前記ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｃｕｃＣｆｕＵｆＣｆＵｆｕｕｕｕａｕｕｇｕｕ－３’（配列番号２１）と２塩基以下で異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓＡｆｓｃａａＵｆａａａａａｇａＡｆｇＧｆａｇｃｕｕｓａｓａ－３’（配列番号２２）と２塩基以下で異なり、または、センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｇｓｃｕｃｃＵｆｕＣｆＵｆＵｆｕｕｕａｕｕｇｕｕｕ－３’（配列番号２３）と２塩基以下で異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓＡｆｓａｃａＡｆｕａａａａａｇＡｆａＧｆｇａｇｃｕｓｕｓａ－３’（配列番号２４）と２塩基以下で異なり、式中、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、ＣおよびＵであり、ＣｆおよびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、ｓはホスホロチオエート結合である。
一実施形態では、センス鎖のヌクレオチド配列は、前記ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｃｕｃＣｆｕＵｆＣｆＵｆｕｕｕｕａｕｕｇｕｕ－３’（配列番号２１）と１塩基以下で異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓＡｆｓｃａａＵｆａａａａａｇａＡｆｇＧｆａｇｃｕｕｓａｓａ－３’（配列番号２２）と１塩基以下で異なり、または、センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｇｓｃｕｃｃＵｆｕＣｆＵｆＵｆｕｕｕａｕｕｇｕｕｕ－３’（配列番号２３）と１塩基以下で異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓＡｆｓａｃａＡｆｕａａａａａｇＡｆａＧｆｇａｇｃｕｓｕｓａ－３（配列番号２４）と１塩基以下で異なり、式中、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、ＣおよびＵであり、ＣｆおよびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、ｓはホスホロチオエート結合である。
一実施形態では、センス鎖のヌクレオチド配列は、前記ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｃｕｃＣｆｕＵｆＣｆＵｆｕｕｕｕａｕｕｇｕｕ－３’（配列番号２１）を含み、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓＡｆｓｃａａＵｆａａａａａｇａＡｆｇＧｆａｇｃｕｕｓａｓａ－３’（配列番号２２）を含み、または、センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｇｓｃｕｃｃＵｆｕＣｆＵｆＵｆｕｕｕａｕｕｇｕｕｕ－３’（配列番号２３）を含み、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓＡｆｓａｃａＡｆｕａａａａａｇＡｆａＧｆｇａｇｃｕｓｕｓａ －３（配列番号２４）を含み、式中、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、ＣおよびＵであり、ＣｆおよびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、ｓはホスホロチオエート結合である。
一実施形態においては、ｄｓＲＮＡ剤はリガンドをさらに含む。
一実施形態においては、リガンドは、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖の３’末端に対してコンジュゲートされる。
一実施形態においては、リガンドは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である。
一実施形態においては、リガンドは、一価、二価、または三価の分枝リンカーを介して結合した一以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
一実施形態においては、リガンドは、以下のものである。
一実施形態では、センス鎖のヌクレオチド配列は、前記ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｃｕｃＣｆｕＵｆＣｆＵｆｕｕｕｕａｕｕｇｕｕＬ９６－３’（配列番号２５）を含み、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓＡｆｓｃａａＵｆａａａａａｇａＡｆｇＧｆａｇｃｕｕｓａｓａ－３’（配列番号２２）を含み、または、センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｇｓｃｕｃｃＵｆｕＣｆＵｆＵｆｕｕｕａｕｕｇｕｕｕＬ９６－３’（配列番号２８１）を含み、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓＡｆｓａｃａＡｆｕａａａａａｇＡｆａＧｆｇａｇｃｕｓｕｓａ－３’（配列番号２４）を含み、式中、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、ＣおよびＵであり、ＣｆおよびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、ｓはホスホロチオエート結合であり、Ｌ９６はＮ－［トリス（ＧａｌＮＡｃ－アルキル）－アミドデカノイル）］－４－ヒドロキシプロリノールである。
一実施形態において、センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｃｕｃＣｆｕＵｆＣｆＵｆｕｕｕｕａｕｕｇｕｕ－３’（配列番号２１）を含み、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓＡｆｓｃａａＵｆａａａａａｇａＡｆｇＧｆａｇｃｕｕｓａｓａ－３’（配列番号２２）を含み、ａ、ｇ、ｃおよびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、ＣおよびＵであり、ＣｆおよびＵｆは２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、ｓはホスホロチオエート結合であり、リガンドは、以下の図に示されるようにセンス鎖の３’端に結合され、
ならびに、式中、ＸはＯである。
一実施形態において、センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｇｓｃｕｃｃＵｆｕＣｆＵｆＵｆｕｕｕａｕｕｇｕｕｕ－３’（配列番号２３）を含み、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓＡｆｓａｃａＡｆｕａａａａａｇＡｆａＧｆｇａｇｃｕｓｕｓａ－３（配列番号２４）を含み、ａ、ｇ、ｃおよびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、ＣおよびＵであり、ＣｆおよびＵｆは２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、ｓはホスホロチオエート結合であり、リガンドは、以下の図に示されるようにセンス鎖の３’端に結合され、
ならびに、式中、ＸはＯである。
本発明はまた、本発明のｄｓＲＮＡ剤のいずれかを含有する細胞、および本発明のｄｓＲＮＡ剤のいずれかを含む医薬組成物も提供する。
本発明の医薬組成物は、例えば生理食塩水もしくは水である非緩衝溶液中のｄｓＲＮＡ剤を含み得、または本発明の医薬組成物は、例えばアセテート、シトレート、プロラミン、カルボネート、もしくはホスフェート、もしくはそれらの任意の組み合わせを含む緩衝溶液、もしくはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である緩衝溶液中のｄｓＲＮＡ剤を含み得る。
一態様では、本発明は、細胞内でアンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。当該方法は、細胞を本発明のｄｓＲＮＡのいずれかと、または本発明の医薬組成物のいずれかと接触させて、それによって細胞内でＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害することを含む。
一実施形態では、細胞は、対象、例えば、ヒト対象、例えば、脂質代謝障害などのアンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）関連障害を有する対象にある。特定の実施形態では、脂質代謝の障害は、高脂血症または高トリグリセリド血症である。
特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３発現は、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％阻害される。一実施形態においては、ＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害することで、対象の血清中のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルが少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％減少する。
一態様において、本発明は、アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）発現の減少から恩恵を受けることとなる障害を有する対象を治療する方法を提供する。この方法は、本発明のｄｓＲＮＡのいずれかまたは本発明の医薬組成物のいずれかの治療有効量を対象に投与し、それによってＡＮＧＰＴＬ３発現の減少から恩恵を受けることとなる障害がある対象を治療することを含む。
別の態様では、本発明は、アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）発現の減少から恩恵を受けることとなる障害がある対象における少なくとも一つの症状を予防する方法を提供する。この方法は、本発明のｄｓＲＮＡのいずれかまたは本発明の医薬組成物のいずれかの予防的な有効量を対象に投与し、それによってＡＮＧＰＴＬ３発現の減少から恩恵を受けることとなる障害がある対象における少なくとも一つの症状を予防することを含む。
特定の実施形態では、障害は、アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）関連障害、例えば、脂質代謝障害である。特定の実施形態では、脂質代謝の障害は、高脂血症または高トリグリセリド血症である。特定の実施形態では、対象へのｄｓＲＮＡの投与は、一つ以上の血清脂質の減少および／またはＡＮＧＰＴＬ３タンパク質蓄積の減少を引き起こす。
さらなる態様では、本発明はまた、対象におけＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害する方法も提供する。方法は、治療有効量の本明細書に提供されるｄｓＲＮＡのいずれかを対象に投与することを含み、それによって対象におけるＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害する。
一実施形態では、対象はヒトである。
一実施形態においては、ｄｓＲＮＡ剤は、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの用量で対象に投与される。
一実施形態においては、ｄｓＲＮＡ剤は、対象に皮下投与される。
一実施形態では、本発明の方法は、対象からの試料中のＡＮＧＰＴＬ３のレベルをさらに決定することを含む。
一実施形態においては、対象の試料中のＡＮＧＰＴＬ３レベルは、血液試料または血清試料中のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルである。
特定の実施形態においては、本発明の方法は、追加の治療薬を対象に投与することをさらに含む。
本発明はまた、本発明のｄｓＲＮＡのいずれか、または本発明の医薬組成物のいずれか、および任意に使用説明書を含むキットを提供する。一実施形態では、本発明は、細胞内のＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害するのに有効な量で、細胞を本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤と接触させることによって、細胞内のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害する方法を実施するためのキットを提供する。キットは、ＲＮＡｉ剤と、使用説明書を含み、任意に、ＲＮＡｉ剤を対象に投与するための手段を含む。
一実施形態においては、ＲＮＡｉ剤はその薬学的に許容可能な塩である。本明細書のＲＮＡｉ剤の各々の「薬学的に許容可能な塩」としては、これに限定されないが、ナトリウム塩、カルシウム塩、リチウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、それらの混合物が含まれる。当業者であれば、ＲＮＡｉ剤は、ポリカチオン性塩として提供される場合、修飾されていてもよいホソホジエステル骨格および／または任意の他の酸性修飾（例えば、５’末端のホスホネート基）の遊離酸基当たり一のカチオンを有することを理解するであろう。例えば、長さが「ｎ」ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドは、ｎ－１の修飾されていてもよいホスホジエステルを含有し、その結果、長さ２１ｎｔのオリゴヌクレオチドは、最大２０のカチオン（例えば、２０のナトリウムカチオン）を有する塩として提供され得る。同様に、長さ２１ｎｔのセンス鎖と長さ２３ｎｔのアンチセンス鎖とを有するＲＮＡｉ剤は、最大４２のカチオン（例えば、４２のナトリウムカチオン）を有する塩として提供され得る。前述の実施例においては、ＲＮＡｉ剤はまた、５’末端のホスフェート基または５’末端のビニルホスホネート基も含む場合、ＲＮＡｉ剤は、最大４４のカチオン（例えば、４４のナトリウムカチオン）を有する塩として提供され得る。
図１Ａおよび１Ｂは、示されたｄｓＲＮＡ二本鎖の単回３ｍｇ／ｋｇ用量で皮下投与されたマウスの血清試料（群当たりｎ＝３）中のヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルを示すグラフである。血清試料を、投与後７日目または１４日目に採取した。ヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルをＥＬＩＳＡにより決定した。図１Ａは、標準偏差を有する群平均を示す。図１Ｂは、標準偏差を有する個々の点を示す。 図２は、指示されたｄｓＲＮＡ二本鎖の単回用量を皮下投与されたマウス（１群あたりｎ＝３）における投与後１４日目のヒトＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。ヒトＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルは、ＰＢＳ処理で検出された対照レベルに対して示されている。 図３は、ＡＤ－１３３１２１２、ＡＤ－１３３１２１３またはＡＤ－１４７９３７２の単回投与３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇを皮下投与されたカニクイザル（群当たりｎ＝３）の血清中のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質のレベルを示すグラフである。ＡＮＧＰＴＬ３のレベルは、０日目（投与日）に対する変化率として示されている。
本発明は、アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）介在性の切断に影響を及ぼすｉＲＮＡ組成物を提供する。当該遺伝子は、細胞内に、例えば、ヒトなどである対象内の細胞内にあり得る。これらｉＲＮＡの使用は、哺乳動物における対応する遺伝子（ＡＮＧＰＴＬ３）のｍＲＮＡの標的分解を可能にする。
本発明のｉＲＮＡは、ヒトアンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）遺伝子を、他の哺乳動物種のＡＮＧＰＴＬ３オーソログにおいて保存される遺伝子の一部分を含め、標的化するように設計されている。理論に制限されることを意図するものではないが、前述の特徴およびこれらｉＲＮＡにおける特定の標的部位または特定の修飾の組み合わせまたは下位の組み合わせが、本発明のｉＲＮＡの有効性、安定性、効力、耐久性、および安全性を向上させると考えられる。
したがって、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）介在性切断に影響を及ぼすｉＲＮＡ組成物を使用して、アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）関連障害、例えば、高脂血症または高トリグリセリド血症などの脂質代謝障害を治療および予防する方法を提供する。
本発明のｉＲＮＡは、長さが最大約３０ヌクレオチド、またはそれ未満、例えば長さが１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチド、である領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含み、当該領域は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に対して実質的に相補的である。
特定の実施形態においては、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤の一方の鎖または両方の鎖は、長さが最大６６ヌクレオチド、例えば長さが３６～６６、２６～３６、２５～３６、３１～６０、２２～４３、２７～５３ヌクレオチドであり、ＡＮＧＰＴＬ３のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に対して実質的に相補的である少なくとも１９の連続するヌクレオチドの領域を伴う。一部の実施形態では、より長いアンチセンス鎖を有するこうしたｉＲＮＡ剤は、例えば、長さが２０～６０ヌクレオチドの第二のＲＮＡ鎖（センス鎖）を含み得、この場合、センス鎖およびアンチセンス鎖は、１８～３０の連続するヌクレオチドの二本鎖を形成する。
本発明のｉＲＮＡの使用により、哺乳動物における対応する遺伝子（ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子）の標的とされたｍＲＮＡの分解が可能になる。本発明者らは、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を標的とするｉＲＮＡが、ＲＮＡｉを強力に介在し、結果としてＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現の有意な阻害をもたらすことができることを、インビトロアッセイにより実証した。したがって、これらのｉＲＮＡを含む方法および組成物は、ＡＮＧＰＴＬ３関連障害、例えば、高脂血症または高トリグリセリド血症などの脂質代謝障害を有する対象を治療するために有用である。
したがって、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）介在性の切断に影響するｉＲＮＡ組成物を使用して、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害または減少させることで恩恵を受けることとなる障害、例えばアンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）関連疾患、例えば高脂血症または高トリグリセリド血症などの脂質代謝の障害を有する対象を治療する方法および併用療法を提供する。
本発明はまた、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害または減少させることにより恩恵を受けることとなる障害、例えば高脂血症または高トリグリセリド血症などの脂質代謝障害を有する対象において、少なくとも一つの症状を予防する方法も提供する。
以下の発明の詳細な説明は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡを含有する組成物を作製および使用する方法、ならびにＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現の阻害および／または減少から恩恵を受けることとなる対象、例えば、ＡＮＧＰＴＬ３関連障害に感受性があるまたはそれと診断される対象を治療する組成物、使用、および方法を開示している。
Ｉ．定義
本発明がより容易に理解できるように、特定の用語を、最初に定義する。加えて、パラメータの値または値の範囲が列記される場合にはいつでも、その列記された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることを意図していることを意図するものであるということに留意されたい。
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書において、冠詞の文法上の対象の一または二以上（すなわち、少なくとも一つ）を意味するために使用する。例えば、「ある要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、一の要素または二以上の要素、例えば複数の要素、を意味する。
用語「～を含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、語句「～を含むが、これらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」を意味するために本明細書において使用され、また当該語句と区別なく使用する。
用語「または」は、文脈において別途明示しない限り、用語「および／または」を意味するために本明細書において使用され、また当該用語と区別なく使用する。例えば、「センス鎖またはアンチセンス鎖」は、「センス鎖もしくはアンチセンス鎖、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖」として理解される。
用語「約」は、当技術分野において、典型的な許容誤差の範囲内であることを意味するために本明細書で使用する。例えば、「約」は、平均から約２の標準偏差として理解され得る。特定の実施形態においては、約は、±１０％を意味する。特定の実施形態においては、約は、±５％を意味する。一連の数字または範囲の前に約がある場合、「約」は、その連続する数字または範囲のそれぞれを修飾し得ることが理解される。
ある数字または連続する数字の前にある用語「少なくとも」、「以上」または「またはそれ以上」は、文脈から明白な場合、用語「少なくとも」に隣接する数字、および論理的に含まれ得るそれに続く全ての数字または整数を含むことが理解される。例えば、ある核酸分子内のヌクレオチドの数は、整数であるはずである。例えば、「２１ヌクレオチドの核酸分子のうちの少なくとも１９ヌクレオチド」は、１９、２０、または２１ヌクレオチドが、示した特性を有するということを意味する。連続する数字または範囲の前に少なくともがある場合、「少なくとも」は、その連続する数字または範囲のそれぞれを修飾し得ることが理解される。
本明細書において使用する場合、「～以下」または「またはそれ以下」は、その語句に隣接する値と、文脈から論理的である場合はゼロまでのその値より論理的により小さい値または整数として理解される。例えば、「２ヌクレオチド以下」のオーバーハングを有する二本鎖は、２、１、または０ヌクレオチドのオーバーハングを有する。連続する数字または範囲の前に「～以下」がある場合、「～以下」は、その連続する数字または範囲のそれぞれを修飾し得ることが理解される。本明細書において使用する場合、範囲は、上限および下限の両方を含む。
本明細書において使用する場合、検出の方法は、存在する分析物の量がその方法の検出レベルを下回る判定を含み得る。
示した標的部位と、センス鎖またはアンチセンス鎖に関するヌクレオチド配列と矛盾する場合には、示した配列を優先する。
転写物または他の配列上の配列とその示した部位とが一致しない場合には、本明細書において列挙したヌクレオチド配列を優先する。
本明細書で使用される場合、用語「ＡＮＧＰＴＬ３」と互換的に使用される「アンジオポエチン様３」は、血管新生で機能する分泌タンパク質のファミリーのメンバーをコードする周知の遺伝子を指す。主に肝臓で発現されるコードされたタンパク質はさらに、Ｎ末端コイルドコイルドメインドメイン含有鎖およびＣ末端フィブリノゲン鎖にプロセシングされる。Ｎ末端鎖は脂質代謝に重要であり、Ｃ末端鎖は血管新生に関与する可能性がある。この遺伝子の突然変異は、家族性低βリポ蛋白血症２型を引き起こす。
ヒトＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ転写物の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＧＩ：４５２４０８４４３（ＮＭ＿０１４４９５．３、配列番号１、逆相補、配列番号２）、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＧＩ：４１３２７７５０（ＮＭ＿０１４４９５．２、配列番号３、逆相補、配列番号４）に見つけることができる。マウスＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＧＩ：１４２３８８３５４（ＮＭ＿０１３９１３．３、配列番号５、逆相補、配列番号６）に見つけることができる。ラットＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＧＩ：６８１６３５６８（ＮＭ＿００１０２５０６５．１、配列番号７、逆相補、配列番号８）に見つけることができる。カニクイザルＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＧＩ：９８２２２７６６３（ＸＭ＿００５５４３１８５．２、配列番号９、逆相補、配列番号１０）に見つけることができる。アカゲザルＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＧＩ：２９７２７８８４６（ＸＭ＿００１０８６１１４．２、配列番号１１、逆相補、配列番号１２）に見つけることができる。
ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ配列のさらなる例は、例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、ＯＭＩＭ、およびＭａｃａｃａゲノムプロジェクトウェブサイトなどの公開されているデータベースを通じて容易に入手可能である。
ＡＮＧＰＴＬ３に関するさらなる情報は、例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／？ｔｅｒｍ＝ＡＮＧＰＴＬ３に見つけることができる。
先述のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号および遺伝子データベース番号のそれぞれの内容全体は、本願出願日の時点で参照により本明細書に組み込まれる。
用語ＡＮＧＰＴＬ３は、本明細書において使用する場合、ＳＮＰデータベースにおいて提供される変異体を含めたＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のバリエーションも意味する。ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子内の多数の配列バリエーションは特定されており、例えば、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰおよびＵｎｉＰｒｏｔにおいて見られ得る（例えば、その内容全体が本願出願日の時点で参照により本明細書に組み込まれる、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｎｐ／？ｔｅｒｍ＝ＡＮＧＰＴＬ３を参照）。ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子内のＳＮＰの非限定的な例は、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰ寄託番号ｒｓ１９３０６４０３９、ｒｓ１９２７７８１９１、ｒｓ１９２７６４０２７、ｒｓ１９２５２８９４８、ｒｓ１９１９３１９５３、ｒｓ１９１２９３３１９、ｒｓ１９１１７１２０６、ｒｓ１９１１４５６０８、ｒｓ１９１０８６８８０、ｒｓ１９１０１２８４１、またはｒｓ１９０２５５４０３で見出すことができる。
本明細書において使用する場合、「標的配列」は、例えば一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡなどである、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列における連続する部分を意味する。一実施形態においては、配列の標的部分は、少なくとも、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の一部分において、またはその近傍におけるｉＲＮＡ依存性の切断のための基質として機能するのに十分な長さであることとなる。
標的配列は、長さが約１９～３６ヌクレオチド、例えば長さが約１９～３０ヌクレオチドであり得る。例えば、標的配列は、長さにおいて約１９～３０ヌクレオチド、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチドであり得る。特定の実施形態においては、標的配列は、１９～２３ヌクレオチドの長さであり、随意に２１～２３ヌクレオチドの長さである。上記に列記した範囲および長さの間に存在する範囲および長さもまた、本開示の一部であることを意図している。
本明細書において使用する場合、用語「配列を含む鎖」は、標準的なヌクレオチドの用語体系を使用して言及される配列によって説明するヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。
概して、「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」および「Ｕ」のそれぞれが、塩基としてのグアニン、シトシン、アデニン、チミジン、およびウラシルをそれぞれ含むヌクレオチドを表す。しかしながら、用語「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」は、以下においてより詳述されるような修飾ヌクレオチド、または代替置換部分（例えば、表１を参照）も指し得ることは理解されよう。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルは、そのような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合特性を実質的に変えることなく、他の部分で置換することができることを十分に認識している。例えば、これらに限定されるものではないが、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシンまたはウラシルを含むヌクレオチドと塩基対合することができる。したがって、ウラシル、グアニンまたはアデニンを含むヌクレオチドは、本発明で取り上げるｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列において、例えばイノシンを含むヌクレオチドで、置換することができる。別の実施例においては、オリゴヌクレオチド内のいずれの箇所にあるアデニンおよびシトシンも、標的ｍＲＮＡと対合するＧ－Ｕウォッブル塩基を形成するために、それぞれグアニンおよびウラシルで置換することができる。そのような置換部分を含む配列は、本発明で取り上げる組成物および方法に好適である。
本明細書において区別なく使用する用語「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ剤」、「ｉＲＮＡ剤」、「ＲＮＡ干渉剤」は、本明細書において用語が定義されるＲＮＡを含有し、かつＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を介してＲＮＡ転写の標的の切断を介在する薬剤を指す。ｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られるプロセスを介してｍＲＮＡの配列特異的な分解を司る。ｉＲＮＡは、細胞内であって、例えば哺乳動物対象などの対象における細胞内で、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を調節、例えば阻害する。
一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、標的ＲＮＡ配列と、例えばＡＮＧＰＴＬ３標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して標的ＲＮＡの切断を司る、一本鎖ＲＮＡを含む。理論に束縛されることを望むものではないが、細胞内に導入された長い二本鎖ＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ（ダイサー）として知られるＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによって、ｓｉＲＮＡへと分解されると考えられている（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５）。ＤｉｃｅｒであるリボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素は、このｄｓＲＮＡを、特徴的な二つの塩基の３’オーバーハングを有する１９～２３塩基対の低分子干渉ＲＮＡへとプロセシングする（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。その後ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、そこで一または複数のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二本鎖を解き、それによって相補的アンチセンス鎖に対して標的認識を誘導することが可能になる（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ内の一または複数のエンドヌクレアーゼは、標的を切断してサイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。すなわち、一態様では、本発明は、細胞内で生成され、ＲＩＳＣ複合体の形成を促進して、標的遺伝子、すなわちＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のサイレンシングを生じさせる一本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に関する。したがって、用語「ｓｉＲＮＡ」はまた、上記において説明したｉＲＮＡを指すために本明細書において使用される。
特定の実施形態においては、ＲＮＡｉ剤は、細胞または有機体に導入されて標的ｍＲＮＡを阻害する一本鎖ｓｉＲＮＡ（ｓｓＲＮＡｉ）であり得る。一本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼであるアルゴノート２に結合し、それは次いで、標的ｍＲＮＡを切断する。一本鎖ｓｉＲＮＡは、概して、１５～３０ヌクレオチドであり、化学的に修飾されている。一本鎖ｓｉＲＮＡの設計および試験は、米国特許第８，１０１，３４８号およびＬｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ １５０：８８３－８９４に記載されており、そのそれぞれの内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において記載するアンチセンスヌクレオチド配列はいずれも、本明細書において記載する一本鎖ｓｉＲＮＡとして、またはＬｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ １５０：８８３－８９４に記載される方法によって化学的に修飾されるような一本鎖ｓｉＲＮＡとして使用され得る。
特定の実施形態においては、本発明の組成物、使用および方法において使用する「ｉＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡであり、本明細書においては「二本鎖ＲＮＡ剤」、「二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子」、「ｄｓＲＮＡ剤」、または「ｄｓＲＮＡ」と称する。用語「ｄｓＲＮＡ」は、標的ＲＮＡ、すなわちＡＮＧＰＴＬ３遺伝子に関して「センス」または「アンチセンス」配向を有するとして言及する、二本の逆平行の実質的に相補的な核酸鎖を含む二本鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体を指す。本発明の一部の実施形態においては、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、本明細書においてＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉと称する転写後遺伝子サイレンシング機序を経て、標的ＲＮＡの、例えばｍＲＮＡの分解を誘発する。
一般的には、ｄｓＲＮＡ分子の各鎖のヌクレオチドの大部分は、リボヌクレオチドであるが、本明細書において詳細に記載するように、各鎖または両鎖は、一つ以上の非リボヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチド、も含み得る。加えて、本明細書において使用する場合、「ｉＲＮＡ」は、化学修飾を有するリボヌクレオチドを含み得、ｉＲＮＡは、複数のヌクレオチドにおける実質的な修飾を含み得る。本明細書において使用する場合、用語「修飾ヌクレオチド」は、修飾された糖部分、修飾されたヌクレオチド間連結、または修飾された核酸塩基、またはそれらのいずれかの組み合わせを、独立に有するヌクレオチドを指す。したがって、修飾ヌクレオチドなる用語は、ヌクレオシド間連結、糖部分、または核酸塩基に対する、例えば官能基または原子などの置換、付加、または除去を包含する。本発明の当該剤で使用するのに好適な修飾としては、本明細書において開示する修飾または当技術分野で公知の修飾の全てのタイプを包含する。ｓｉＲＮＡタイプの分子において使用される場合、当該修飾はいずれも、本明細書および特許請求の範囲の目的のために「ｉＲＮＡ」または「ＲＮＡｉ剤」で包含される。
本開示の特定の実施形態においては、デオキシ－ヌクレオチドを包含することが、ＲＮＡｉ剤内に存在するならば、修飾ヌクレオチドを構成するとみなすことができる。
二本鎖領域は、ＲＩＳＣ経路を介して所望の標的ＲＮＡの特異的分解を可能にする任意の長さであってもよく、約１９～３６塩基対の長さ、例えば、約１９～３０塩基対の長さ、例えば、約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６塩基対の長さ、例えば、約１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２塩基対の長さの範囲であってもよい。特定の実施形態においては、二本鎖領域は、長さが１９～２１塩基対、例えば長さが２１塩基対である。上記に列記した範囲および長さの間に存在する範囲および長さもまた、本開示の一部であることを意図している。
二本鎖構造を形成する二本の鎖は、一つのより大きいＲＮＡ分子にのうちの異なる部分であり得るか、またはそれらは、別個のＲＮＡ分子であり得る。二本の鎖が、一つのより大きい分子のうちの部分であり、そのために二本鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端とそれに対応するもう一方の鎖の５’末端との間にある中断されないヌクレオチドの鎖でつながっている場合、その接続しているＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」と呼ばれる。ヘアピンループは、少なくとも一の不対のヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、ヘアピンループは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、２３またはそれ以上の不対のヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態においては、ヘアピンループは、１０以下のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態においては、ヘアピンループは、８以下の不対のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態においては、ヘアピンループは、４～１０の不対のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態においては、ヘアピンループは、４～８のヌクレオチドであり得る。
ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な二本の鎖が、別個のＲＮＡ分子で構成される場合、それら分子は必ずしもそうではないが、共有結合で結合することができる。二本の鎖が、二本鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端とそれに対応するもう一方の鎖の５’末端との間にある中断されないヌクレオチドの鎖とは異なる手段で共有結合によりつながっている場合、その接続している構造を「リンカー」と称する。ＲＮＡ鎖は、同数または異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最も短い鎖にあるヌクレオチドの数から二本鎖内に存在するあらゆるオーバーハングを引いた数である。二本鎖構造に加えて、ＲＮＡｉは、一または複数のヌクレオチドオーバーハングを含み得る。ＲＮＡｉ剤の一実施形態においては、少なくとも一方の鎖が、少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。別の実施形態においては、少なくとも一方の鎖が、少なくとも２ヌクレオチドの、例えば２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチドの、３’オーバーハングを含む。他の実施形態においては、ＲＮＡｉ剤の少なくとも一方の鎖が、少なくとも１ヌクレオチドの５’オーバーハングを含む。特定の実施形態においては、少なくとも一方の鎖が、少なくとも２ヌクレオチドの、例えば２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチドの、５’オーバーハングを含む。さらに他の実施形態においては、ＲＮＡｉ剤の一方の鎖の３’末端および５’末端の両方が、少なくとも１ヌクレオチドのオーバーハングを含む。
特定の実施形態では、本発明のｉＲＮＡ剤は、ｄｓＲＮＡであり、その各鎖が１９～２３ヌクレオチドを含み、標的ＲＮＡ配列、例えばＡＮＧＰＴＬ３遺伝子と相互作用して標的ＲＮＡの切断を司る。
一部の実施形態においては、本発明のｉＲＮＡは、標的ＲＮＡ配列と、例えばＡＮＧＰＴＬ３標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して標的ＲＮＡの切断を司る２４～３０ヌクレオチドのｄｓＲＮＡである。
本明細書において使用する場合、用語「ヌクレオチド（の）オーバーハング」は、二本鎖ｉＲＮＡの二本鎖構造から突出する少なくとも一の不対ヌクレオチドを指す。例えば、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３’末端が、もう一方の鎖の５’末端を越えて延びる場合、またはその逆の場合も同様に、ヌクレオチドオーバーハングが存在する。ｄｓＲＮＡは、少なくとも一のヌクレオチドのオーバーハングを含み得、あるいは該オーバーハングは、少なくとも二のヌクレオチド、少なくとも三のヌクレオチド、少なくとも四のヌクレオチド、少なくとも五のヌクレオチド、またはそれ以上を含み得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドなどであるヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含み得るかまたは該類似体からなり得る。オーバーハングは、センス鎖上、アンチセンス鎖上、またはそれらのいずれかの組合せ上にあり得る。さらに、あるオーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖またはセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端、または両末端上に存在し得る。
一実施形態においては、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が、３’末端または５’末端において１～１０ヌクレオチドの、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドの、オーバーハングを有する。一実施形態においては、ｄｓＲＮＡのセンス鎖が、３’末端または５’末端において１～１０ヌクレオチドの、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドの、オーバーハングを有する。別の実施形態においては、オーバーハング内のヌクレオチドの一または複数が、ヌクレオシドチオホスフェートで置換される。
特定の実施形態においては、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が、３’末端または５’末端において１～１０ヌクレオチドの、例えば０～３、１～３、２～４、２～５、４～１０、５～１０、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドの、オーバーハングを有する。一実施形態においては、ｄｓＲＮＡのセンス鎖が、３’末端または５’末端において１～１０ヌクレオチドの、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドの、オーバーハングを有する。別の実施形態においては、オーバーハング内のヌクレオチドの一または複数が、ヌクレオシドチオホスフェートで置換される。
特定の実施形態においては、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が、３’末端または５’末端において１～１０ヌクレオチドの、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドの、オーバーハングを有する。特定の実施形態においては、センス鎖またはアンチセンス鎖上またはその両鎖上のオーバーハングは、１０ヌクレオチドより長い伸長した長さを含み得、例えば長さが１～３０ヌクレオチド、２～３０ヌクレオチド、１０～３０ヌクレオチド、１０～２５ヌクレオチド、１０～２０ヌクレオチド、または１０～１５ヌクレオチドである。特定の実施形態においては、伸長したオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖上にある。特定の実施形態においては、伸長したオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖の３’末端上に存在する。特定の実施形態においては、伸長したオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖の５’末端上に存在する。特定の実施形態においては、伸長したオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖上にある。特定の実施形態においては、伸長したオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖の３’末端上に存在する。特定の実施形態においては、伸長したオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖の５’末端上に存在する。特定の実施形態においては、伸長したオーバーハング内のヌクレオチドの一または複数が、ヌクレオシドチオホスフェートで置換される。特定の実施形態においては、オーバーハングは、オーバーハングが生理学的条件下において安定なヘアピン構造を形成することができるような自己相補性部分を含む。
「ブラント（Ｂｌｕｎｔ）」または「平滑末端（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）」は、二本鎖ＲＮＡ剤のその末端において不対ヌクレオチドがないこと、すなわちヌクレオチドオーバーハングがないことを意味する。「平滑末端である」二本鎖ＲＮＡ剤は、その全長にわたって二本鎖であり、すなわち当該分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングがない。本発明のＲＮＡｉ剤は、一端にヌクレオチドオーバーハングがないＲＮＡｉ剤（すなわち、一のオーバーハングと一の平滑末端とを有する剤）、またはいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングがないＲＮＡｉ剤を含む。ほとんどの場合、こうした分子は、その全長にわたって二本鎖となることとなる。
用語「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」は、標的配列、例えばＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡに対して実質的に相補的である領域を含む、例えばｄｓＲＮＡであるｉＲＮＡの鎖を指す。
本明細書において使用する場合、用語「相補的な領域」は、本明細書において定義されるように、配列、例えば標的配列、例えばＡＮＧＰＴＬ３ヌクレオチド配列に対して実質的に相補的であるアンチセンス鎖上の領域を指す。相補的領域が、標的配列に対して完全に相補的でない場合、そのミスマッチは、分子の内部領域または末端領域内にあり得る。概して、最も許容できるミスマッチは、末端領域内にあり、例えばｉＲＮＡの５’末端または３’末端の５、４または３ヌクレオチドの範囲内にある。一部の実施形態においては、本発明の二本鎖ＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖内のヌクレオチドミスマッチを含む。一部の実施形態においては、本発明の二本鎖ＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、標的ｍＲＮＡとの４以下のミスマッチを含み、例えばアンチセンス鎖が、標的ｍＲＮＡとの４、３、２、１、または０のミスマッチを含む。一部の実施形態においては、本発明のアンチセンス鎖の二本鎖ＲＮＡ剤は、センス鎖との４以下のミスマッチを含み、例えばアンチセンス鎖が、センス鎖との４、３、２、１、または０のミスマッチを含む。一部の実施形態においては、本発明の二本鎖ＲＮＡ剤は、センス鎖内にヌクレオチドミスマッチを含む。一部の実施形態においては、本発明の二本鎖ＲＮＡ剤のセンス鎖は、アンチセンス鎖との４以下のミスマッチを含み、例えばセンス鎖が、アンチセンス鎖との４、３、２、１または０のミスマッチを含む。一部の実施形態においては、ヌクレオチドミスマッチは、例えば、ｉＲＮＡの３’末端から５、４、３ヌクレオチドの範囲内にある。別の実施形態においては、ヌクレオチドミスマッチは、例えば、ｉＲＮＡ剤の３’末端ヌクレオチド内にある。一部の実施形態においては、ミスマッチは、シード領域にはない。
したがって、本明細書において記載するＲＮＡｉ剤は、標的配列に対する一または複数のミスマッチを含有し得る。一実施形態においては、本明細書において記載するＲＮＡｉ剤は、３以下のミスマッチ（すなわち、３、２、１、または０のミスマッチ）を含有する。一実施形態においては、本明細書において記載するＲＮＡｉ剤は、２以下のミスマッチを含有する。一実施形態においては、本明細書において記載するＲＮＡｉ剤は、１以下のミスマッチを含有する。一実施形態においては、本明細書において記載するＲＮＡｉ剤は、０のミスマッチを含有する。特定の実施形態においては、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖が、標的配列に対してミスマッチを含有する場合、該ミスマッチは、随意に、相補的領域の５’末端または３’末端のいずれかから最後の５ヌクレオチドの範囲内にあるように制限することができる。例えば、そのような実施形態においては、２３ヌクレオチドのＲＮＡｉ剤の場合、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の領域に対して相補的な鎖は、概して、中央の１３ヌクレオチドの範囲内にいかなるミスマッチも含まない。本明細書において記載する方法または当技術分野で公知の方法を使用することにより、標的配列に対してミスマッチを含有するＲＮＡｉ剤が、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現の阻害において効果的であるか否かを判定することができる。とりわけ、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子における相補性の特定の領域が、集団内での多形配列バリエーションを有することがわかっている場合には、ＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害するミスマッチを有するＲＮＡｉ剤の有効性を考慮することが重要である。
用語「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」は、本明細書において使用する場合、用語を本明細書において規定しているアンチセンス鎖の領域に対して実質的に相補的である領域を含むｉＲＮＡの鎖を指す。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチドの実質的に全てが修飾されている」は、広く修飾されているが全体が修飾されているものではなく、また５、４、３、２、もしくは１以下の未修飾のヌクレオチドを含み得る。
本明細書において使用する場合、用語「切断領域」は、切断部位に直接隣接して位置する領域を指す。切断部位は、切断が生じる箇所である標的上の部位である。一部の実施形態においては、切断領域は、切断部位のどちらかの末端における直接隣接している三つの塩基を含む。一部の実施形態においては、切断領域は、切断部位のどちらかの末端における直接隣接している二つの塩基を含む。一部の実施形態においては、切断部位は、アンチセンス鎖のヌクレオチド１０および１１によって結合される部位において特異的に生じ、またこの切断領域は、ヌクレオチド１１、１２、および１３を含む。
本明細書において使用する場合、特に別段に示さない限り、用語「相補的」は、第二のヌクレオチド配列との関連において第一のヌクレオチド配列を説明するために使用される場合には、当業者によって理解されることとなるとおり、第二のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと特定の条件下においてハイブリダイズして二本鎖構造を形成する第一のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの能力を指す。かかる条件は、例えば、厳しい条件であり得、当該厳しい条件は、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ ｐＨ ６．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２～１６時間の後の洗浄、を含み得る（例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ ．（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照）。生物体内で遭遇し得るような生理学的に関連のある条件などの他の条件を適用することができる。当業者は、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終的な用途に応じて、二つの配列の相補性の試験に最も適切な条件の組を決定することができる。
ｉＲＮＡ内、例えば本明細書において記載するｄｓＲＮＡ内の相補配列は、一方または両方のヌクレオチド配列の全長にわたって第二のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに対する、第一のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの塩基対合を含む。かかる配列は、本明細書において、互いに対して「完全に相補的」であると称し得る。しかしながら、本明細書において、第一の配列が第二の配列に対して「実質的に相補的」であるという場合、この二つの配列は、完全に相補的であり得るか、またはそれらはその最終的な用途に、例えば、インビトロまたはインビボで、遺伝子発現の阻害に最も関連した条件下でハイブリダイズする能力を維持しつつ、最大３０塩基対の二本鎖についてのハイブリダイゼーションの際に、一つ以上であるが、概して５、４、３、または２以下である、ミスマッチ塩基対を形成し得る。しかしながら、二つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションの際に一以上の一本鎖のオーバーハングを形成するように設計される場合には、かかるオーバーハングは、相補性の判定に関してミスマッチとはみなさないものとする。例えば、長さが２１ヌクレオチドである一方のオリゴヌクレオチドと長さが２３ヌクレオチドであるもう一方のオリゴヌクレオチドとを含むｄｓＲＮＡであって、長い方のオリゴヌクレオチドが、短い方のオリゴヌクレオチドに対して完全に相補的である２１ヌクレオチドの配列を含むようなｄｓＲＮＡは、依然として、本明細書において記載する目的に関しては「完全に相補的」と称し得る。
「相補的」配列は、本明細書において使用する場合、ハイブリダイズするそれらの能力に関する上記の要件を満足する限り、非ワトソン・クリック塩基対、または非天然の修飾ヌクレオチドから形成された塩基対も含み得るか、または全体的にそれらから形成され得る。かかる非ワトソン・クリック塩基対としては、これらに限定されるものではないが、Ｇ：Ｕウォッブル塩基対またはフーグスティーン塩基対が挙げられる。
本明細書における用語「相補的」、「完全に相補的」および「実質的に相補的」は、それらの使用の文脈から理解されることとなるとおり、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間、または二本鎖ＲＮＡ剤のアンチセンス鎖と標的配列などである二つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド間における塩基マッチングに関連して使用され得る。
本明細書において使用する場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部に対して実質的に相補的」であるポリヌクレオチドは、目的のｍＲＮＡ（例えば、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子をコードするｍＲＮＡ）の連続する部分に対して実質的に相補的であるポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、配列が、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子をコードするｍＲＮＡの中断されない部分に対して実質的に相補的である場合、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの少なくとも一部に対して相補的である。
したがって、一部の実施形態においては、本明細書において開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは、標的ＡＮＧＰＴＬ３配列に対して完全に相補的である。他の実施形態では、本明細書に開示される前記アンチセンスポリヌクレオチドは、標的ＡＮＧＰＴＬ３配列に対して実質的に相補的であり、および配列番号１、３、５、７、９、もしくは１１のいずれか一つのヌクレオチド配列の等価領域に対して、または配列番号１、３、５、７、９、もしくは１１のいずれか一つの断片に対して、その全長に対して少なくとも８０％相補的である連続するヌクレオチド配列を含み、例えば、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％相補的である。
一部の実施形態においては、本明細書において開示するアンチセンスポリヌクレオチドは、標的ＡＮＧＰＴＬ３配列の断片に対し実質的に相補的であり、また配列番号１のヌクレオチド７３～１０２、７３～１２４、８０～１１４、２９１～３２０、２９１～３４２、３０７～３３６、５４０～５６７、５４０～５８９および５４５～５７７の群から選択された配列番号１の断片に対して、その全長に対して少なくとも８０％相補的である連続するヌクレオチド配列を含み、例えば約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％相補的である。
一部の実施形態においては、本明細書において開示するアンチセンスポリヌクレオチドは、標的ＡＮＧＰＴＬ３配列の断片に対し実質的に相補的であり、また配列番号１のヌクレオチド８０～１０２、８４～１０６、８７～１０９、９１～１１３、９２～１１４、１８６～２０８、３０７～３２９、３０８～３３０、３１０～３３２、３１４～３３６、５４５～５６７、５５１～５７３、５５３～５７５、５５４～５７６、５５５～５７７、１１３３～１１５５、または１１４０～１１６２の群から選択された配列番号１の断片に対して、その全長に対して少なくとも８０％相補的である連続するヌクレオチド配列を含み、例えば約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％相補的である。
他の実施形態においては、本明細書において開示するアンチセンスポリヌクレオチドは、標的ＡＮＧＰＴＬ３配列に対して実質的に相補的であり、また表２～３および７～８のいずれか一つのうちのいずれか一つにおけるセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか一つまたは表２～３および７～８のいずれか一つにおけるセンス鎖ヌクレオチド配列のうちのいずれか一つの断片に対して、その全長にわたって少なくとも約８０％相補的である連続するヌクレオチド配列を含み、例えば約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％相補的である。
一実施形態では、本開示のＲＮＡｉ剤は、アンチセンスポリヌクレオチドに実質的に相補的であり、ひいては標的ＡＮＧＰＴＬ３配列と同じであるセンス鎖を含み、および当該センス鎖ポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０、もしくは１２のヌクレオチド配列等価領域に対して、または配列番号２、４、６、８、１０または１２のいずれか一つの断片に対して、その全長に対して少なくとも約８０％相補的である連続するヌクレオチド配列を含み、例えば約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％相補的である。
一部の実施形態においては、本発明のｉＲＮＡは、同様に標的ＡＮＧＰＴＬ３配列に対して相補的であるアンチセンスポリヌクレオチドに実質的に相補的であるセンス鎖を含み、また該センス鎖ポリヌクレオチドは、表２～３および７～８のいずれか一つのうちのいずれか一つにおけるアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか一つ、または表２～３および７～８のいずれか一つにおけるアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のうちのいずれか一つの断片に対して、その全長にわたって少なくとも約８０％相補的である連続するヌクレオチド配列を含み、例えば約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％相補的である。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、ＡＤ－１３３１２０３．１、ＡＤ－１３３１２０６．１、ＡＤ－１３３１２０９．１、ＡＤ－１３３１２１２．１、ＡＤ－１３３１２１３．１、ＡＤ－１３３１３２９．１、ＡＤ－１３３１２３７．１、ＡＤ－１３３１２３８．１、ＡＤ－１３３１２４０．１、ＡＤ－１３３１２４４．１、ＡＤ－１３３１２５６．１、ＡＤ－１３３１２６２．１、ＡＤ－１３３１２６４．１、ＡＤ－１３３１２６５．１、ＡＤ－１３３１２６６．１、ＡＤ－１３３１３１６．１、およびＡＤ－１３３１３３８．１からなる群から選択される二本鎖のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか一つと０、１、２または３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の連続ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、ＡＤ－１３３１２０３．１、ＡＤ－１３３１２０６．１、ＡＤ－１３３１２０９．１、ＡＤ－１３３１２１２．１、ＡＤ－１３３１２１３．１、ＡＤ－１３３１３２９．１、ＡＤ－１３３１２４０．１、ＡＤ－１３３１２６２．１、ＡＤ－１３３１２６４．１、ＡＤ－１３３１２６５．１およびＡＤ－１３３１２６６．１からなる群から選択される二本鎖のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか一つと０、１、２または３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の連続ヌクレオチドを含む。一実施形態において、アンチセンス鎖は、ＡＤ－１３３１２０３．１、ＡＤ－１３３１２０６．１、ＡＤ－１３３１２０９．１、ＡＤ－１３３１２１２．１、およびＡＤ－１３３１２１３．１からなる群から選択される二本鎖のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか一つと０、１、２または３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の連続ヌクレオチドを含む。
概して、「ｉＲＮＡ」は、化学修飾を有するリボヌクレオチドを含む。かかる修飾は、本明細書に開示される、または当技術分野で公知のすべての種類の修飾を含み得る。こうした修飾はいずれも、ｄｓＲＮＡ分子において使用される場合、本明細書および特許請求の範囲の目的のためには「ｉＲＮＡ」で包含される。
本開示の特定の実施形態においては、デオキシ－ヌクレオチドを包含することが、ＲＮＡｉ剤内に存在するならば、修飾ヌクレオチドを構成するとみなすことができる。
本発明の一態様では、本発明の方法および組成物で使用するための薬剤が、アンチセンス阻害機構を介して標的ｍＲＮＡを阻害する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子である。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、標的ｍＲＮＡ内の配列に対して相補的である。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡと塩基対形成し、翻訳機構を物理的に妨害することによって、化学量論的に翻訳を阻害することができる。Ｄｉａｓ，Ｎ．ｅｔ ａｌ ．，（２００２）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １：３４７－３５５を参照。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、約１４～約３０ヌクレオチド長であってもよく、標的配列に相補的な配列を有してもよい。例えば、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、本明細書に記載されるアンチセンス配列のいずれか一つから少なくとも約１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の連続ヌクレオチドである配列を含んでもよい。
ｄｓＲＮＡなどの「ｉＲＮＡと細胞を接触させること」なる語句は、本明細書において使用される場合、任意の可能な手段によって細胞を接触させることを包む。細胞をｉＲＮＡと接触させることは、インビトロで細胞をｉＲＮＡと接触させること、またはインビボで細胞をｉＲＮＡと接触させることを含む。接触させることは、直接的または間接的に行われ得る。したがって、例えば、ｉＲＮＡは、方法を個別に実施することで細胞と物理的に接触させ得るか、あるいはｉＲＮＡは、その後に細胞と接触することを可能するまたは接触させることとなるような状況に置かれ得る。
細胞をインビトロで接触させることは、例えば、細胞をｉＲＮＡと共にインキュベートすることによってなされ得る。細胞をインビボで接触させることは、例えば該細胞が存在している組織内へもしくはその付近にｉＲＮＡを注入することによって、または別の領域内に、例えば血流内または皮下腔内にｉＲＮＡを注入して、それによって当該剤がその後に、接触させようとする細胞が存在している組織に到達することとなるようにすることによって、なされ得る。例えばｉＲＮＡは、例えば肝臓などである対象部位に向けてｉＲＮＡを誘導するリガンド、例えばＧａｌＮＡｃ、を含有し得るまたは当該リガンドに結合され得る。インビトロおよびインビボでの接触方法の組合せもまた可能である。例えば細胞を、インビトロでｉＲＮＡと接触させて、その後に対象に移植することもできる。
特定の実施形態においては、細胞をｉＲＮＡと接触させることは、細胞内への取り込みまたは吸収を促進するまたは生じさせることによって「導入すること」または「ｉＲＮＡを細胞内に送達すること」を含む。ｉＲＮＡの吸収または取り込みは、自発的な拡散もしくは活性な細胞内プロセスを介して、または補助の薬剤もしくはデバイスによって、生じ得る。ｉＲＮＡの細胞内への導入は、インビトロまたはインビボにおいてであり得る。例えば、インビボでの導入の場合、ｉＲＮＡは、組織部位に注入され得るかまたは全身的に投与され得る。インビトロでの細胞内への導入としては、当技術分野で公知の方法、例えばエレクトロポレーション法およびリポフェクション法などが挙げられる。さらなるアプローチは、本明細書の下記において説明されるか、または当技術分野で公知である。
用語「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」は、例えば核酸分子など、薬学的に活性な分子を封入する脂質層を含むベシクルであり、例えばｉＲＮＡまたはｉＲＮＡの転写元のプラスミドなどである。ＬＮＰは、例えば米国特許第６，８５８，２２５号、第６，８１５，４３２、８，１５８，６０１号、および第８，０５８，０６９号に記載されており、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「対象」は哺乳類などの動物であり、霊長類（ヒト、例えばサル、およびチンパンジーである非ヒト霊長類など）、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、またはマウスなど）、または内因性または異種性のいずれかで標的遺伝子を発現する鳥が挙げられる。ある実施形態においては、対象はヒトであり、例えばＡＮＧＰＴＬ３発現の減少により恩恵を受けることとなる疾患または障害に関して治療または評価されるヒト、ＡＮＧＰＴＬ３発現の減少により恩恵を受けることとなる疾患または障害のリスクがあるヒト、ＡＮＧＰＴＬ３発現の減少により恩恵を受けることとなる疾患または障害を有するヒト、または本明細書に記載されるＡＮＧＰＴＬ３発現の減少により恩恵を受けることとなる疾患または障害が治療されるヒトなどである。一部の実施形態においては、対象は、女性であるヒトである。他の実施形態においては、対象は、男性であるヒトである。一実施形態においては、対象は、成人である対象である。別の実施形態においては、対象は、小児である対象である。
本明細書において使用される場合、用語「治療する」または「治療」は、対象におけるＡＮＧＰＴＬ３関連障害の少なくとも一の兆候または症状を減少させるなど、有益または望ましい転帰を指す。治療はまた、望ましくないＡＮＧＰＴＬ３発現に関連する一つ以上の徴候または症状の減少、望ましくないＡＮＧＰＴＬ３の活性化または安定化の程度の低下、望ましくないＡＮＧＰＴＬ３の活性化または安定化の改善または緩和を含む。「治療」はまた、治療が行われない場合に予想される生存時間と比較して、生存時間を延ばすことも意味し得る。対象におけるＡＮＧＰＴＬ３のレベルまたは疾患マーカーまたは症状の文脈での用語「低下させる（ｌｏｗｅｒ）」は、こうしたレベルの統計学的に有意な減少を指す。減少は、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上であり得る。特定の実施形態においては、減少は、少なくとも２０％である。特定の実施形態においては、減少は、疾患マーカーにおいて、例えばタンパク質レベルまたは遺伝子発現レベルにおいて、少なくとも５０％である。対象におけるＡＮＧＰＴＬ３のレベルの文脈での「低下させる」は、好ましくは、当該障害のない個体における正常な領域の範囲内として受け入れられるレベルまで減少することである。特定の実施形態においては、「低下させる」は、疾患を患っている対象におけるマーカーまたは症状のレベルと、個体が正常な範囲内で受け入れられるレベルとの間の差の減少、例えば肥満である個体と正常な範囲内に受容される体重の個体との間での体重の減少のレベルである。
本明細書で使用される場合、疾患、障害、またはその状態に関連して使用される場合、「予防」または「予防する」は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現の減少によって治療または改善されてもよく、対象が、そのような疾患、障害、または状態、例えば、望ましくないまたは過剰なＡＮＧＰＴＬ３発現および／または活性、例えば、高トリグリセリドレベルまたは発疹性黄色腫を発症する可能性の減少を指す。高トリグリセリドレベルまたは発疹性黄色腫を発症する可能性は、例えば、高トリグリセリドレベルまたは発疹性黄色腫の一つ以上のリスク因子を有する個体が、高トリグリセリドレベルまたは発疹性黄色腫を発症しないか、または同じリスク因子を有し、本明細書に記載される治療を受けていない集団と比較して重症度がより低い高トリグリセリドレベルまたは発疹性黄色腫を発症する場合、低減される。疾患、障害、または状態を発症しないこと、またはこうした疾患、障害、または状態に関連する症状の発症の減少（例えば、その疾患または障害に対して臨床的に受け入れられる規模の少なくとも約１０％の減少）、または遅延された症状の提示の遅延（例えば、数日、数週間、数か月、または数年の遅延）は、有効な予防とみなされる。
本明細書で使用される場合、用語「血清脂質」は、血液中に存在する任意の主要な脂質を指す。血清脂質は、遊離形態で、またはタンパク質複合体、例えばリポタンパク質複合体の一部として、血液中に存在し得る。血清脂質の非限定的な例としては、総コレステロール（ＴＧ）、低比重リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）、高比重リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ－Ｃ）、非常に低比重リポタンパク質コレステロール（ＶＬＤＬ－Ｃ）、および中比重リポタンパク質コレステロール（ＩＤＬ－Ｃ）などのトリグリセリドおよびコレステロールが挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「アンジオポエチン様３関連疾患」または「ＡＮＧＰＴＬ３関連疾患」は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現またはＡＮＧＰＴＬ３タンパク質産生によって引き起こされるか、またはそれに関連する疾患または障害である。「ＡＮＧＰＴＬ３関連疾患」という用語は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現、複製、またはタンパク質活性の減少から恩恵を受ける疾患、障害、または状態を含む。一部の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３関連疾患は、脂質代謝の障害である。
本明細書で使用される場合、「脂質代謝の障害」は、脂質代謝の乱れに関連するか、またはそれによって引き起こされる任意の障害を指す。例えば、この用語は、高脂血症をもたらし得る任意の障害、疾患または状態、または血液中の脂質および／またはリポタンパク質のいずれかまたは全てのレベルの異常な上昇によって特徴付けられる状態を含む。この用語は、家族性高トリグリセリド血症、家族性部分リポジストロフィー１型（ＦＰＬＤ１）などの遺伝性障害、または疾患、障害もしくは状態（例えば、腎不全）、食事、または特定の薬剤（例えば、ＡＩＤＳまたはＨＩＶの治療に使用される高度に活性な抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）の結果として）の結果として誘発または取得された障害などの誘発または後天性障害を指す。脂質代謝の例示的な障害としては、限定されるものではないが、アテローム性動脈硬化症、脂質異常症、高トリグリセリド血症（薬剤誘発性高トリグリセリド血症、利尿薬誘発性高トリグリセリド血症、アルコール性高トリグリセリド血症、βアドレナリン遮断薬誘発性高トリグリセリド血症、エストロゲン誘発性高トリグリセリド血症、グルココルチコイド誘発性高トリグリセリド血症、レチノイド誘発性高トリグリセリド血症、シメチジン誘導性高トリグリセリド血症、ならびに家族性高トリグリセリド血症、高トリグリセリド血症を伴う急性膵炎、カイロミクロン症候群、家族性カイロミクロン血症、Ａｐｏ－Ｅ欠損症または抵抗性、ＬＰＬ欠損症または活動低下、高脂血症（家族性複合型高脂血症を含む）、高コレステロール血症、高コレステロール血症に関連する痛風、黄色腫症（皮下コレステロール沈着物）、不均一なＬＰＬ欠損症を伴う高脂血症、および高ＬＤＬ血症と不均一なＬＰＬ欠損症を伴う高脂血症が挙げられる。
脂質代謝障害に関連する心血管疾患も、本明細書に定義されるように、「脂質代謝の障害」とみなされる。これらの疾患には、冠動脈疾患（虚血性心疾患とも呼ばれる）、冠動脈疾患に関連する炎症、再狭窄、末梢血管疾患、および脳卒中が含まれうる。
体重に関連する障害も、本明細書に定義されるように、脂質代謝の障害とみなされる。こうした障害には、肥満、代謝症候群の独立した構成要素を含む代謝症候群（例えば、中心性肥満、ＦＢＧ／前糖尿病／糖尿病、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、および高血圧）、甲状腺機能低下症、尿症、および体重増加（急速な体重増加を含む）、体重減少、体重減少の維持、または体重減少後の体重減少のリスクに関連する他の状態を含みうる。
血糖障害は、本明細書に定義されるように、さらに「脂質代謝の障害」とみなされる。そのような障害には、糖尿病、高血圧、およびインスリン抵抗性に関連する多嚢胞性卵巣症候群が含まれうる。脂質代謝の他の例示的な障害としては、腎移植、ネフローゼ症候群、クッシング症候群、先端巨大症、全身性エリテマトーデス、ジスグロブリン血症、リポジストロフィー、グリコゲノーシスＩ型、およびアジソン病も挙げられ得る。
「治療有効量」は、本明細書において使用する場合、ＡＮＧＰＴＬ３関連疾患がある対象に投与されたときに、（例えば、既存の疾患または疾患の一もしくは複数の症状を減少、改善、または維持することによって）疾患の治療を行うのに十分なＲＮＡｉ剤の量を含むことが意図される。「治療有効量」は、ＲＮＡｉ剤、当該剤の投与方法、疾患およびその重症度および病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、ある場合には先行するまたは併用する治療の種類、および治療しようとする対象の他の個人的特徴、に応じて変動し得る。
「予防的有効量」は、本明細書において使用する場合、ＡＮＧＰＴＬ３関連障害を有する対象に投与されたときに、疾患または疾患の一もしくは複数の症状を予防または改善するのに十分である、ＲＮＡｉ剤の量を含むことが意図される。疾患の改善は、疾患の経過を鈍化させること、またはこれから発症する疾患の重症度を減少させることを含む。「予防的有効量」は、ＲＮＡｉ剤、当該剤の投与方法、疾患のリスクの程度、および病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、ある場合には先行するまたは併用する治療の種類、および治療しようとする患者の他の個人的特徴、に応じて変動し得る。
「治療有効量」または「予防的有効量」はまた、任意の治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスク比においていくつかの所望の効果を生じるＲＮＡｉ剤の量も含む。本発明の方法において用いるｉＲＮＡは、そうした治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスク比を生じるのに十分な量で投与され得る。
語句「薬学的に許容可能」は、本明細書において、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしに、合理的なベネフィット／リスク比に見合う、健全な医学的判断の範囲内でのヒト対象および動物対象の組織との接触での使用に好適であるそれら化合物（塩類を含む）、組成物または剤形を指すために用いる。
語句「薬学的に許容される担体」は、本明細書において使用する場合、一つの臓器または身体の部分から、別の臓器または身体の部分への主題化合物の運搬または輸送に関与する、薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルであって、例えば液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、潤滑剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくはステアリン酸亜鉛、またはステアリン酸）、または溶媒封入材料など、を意味する。各担体は、製剤の他の原材料に対して適合性であり、かつ治療される対象に対して有害であってはならないという意味において「許容される」ものでなければならない。こうした担体は、当技術分野で公知である。薬学的に許容される担体には、注射による投与のための担体が含まれる。
用語「試料」は、本明細書において使用する場合、対象から単離された同様の体液、細胞、または組織、および対象内に存在する体液、細胞、または組織の採取物を包含する。生体液の例としては、血液、血清、および漿液、血漿、髄液、眼液、リンパ液、尿、唾液などが挙げられる。組織試料は、組織、臓器、または局所領域からの試料を含み得る。例えば、試料は、特定の臓器、臓器の部分、またはそれら臓器内の体液もしくは細胞に由来するものであり得る。特定の実施形態では、試料は、肝臓（例えば、肝全体または肝臓の特定のセグメント、または肝臓内の特定のタイプの細胞、例えば肝細胞など）に由来するものであり得る。一部の実施形態においては、「対象に由来する試料」は、対象から取得した尿を指す。「対象に由来する試料」は、対象からの血液または血液由来の血清もしくは血漿を指すこともある。
ＩＩ．本発明のｉＲＮＡ
本発明は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡを提供する。特定の実施形態においては、ｉＲＮＡは、例えばＡＮＧＰＴＬ３関連障害、例えば脂質代謝の障害、例えば、高脂血症または高トリグリセリド血症を発症しやすいヒトなど、例えば哺乳類である対象内の細胞などである細胞内でＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を含む。ｄｓＲＮＡｉ剤は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現の際に形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部に対して相補的である相補的領域を有するアンチセンス鎖を含む。相補的領域は、長さが約１９～３０ヌクレオチド（例えば、長さが約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、または１９ヌクレオチド）である。
ｉＲＮＡは、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を発現する細胞と接触させると、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子（例えば、ヒト、霊長類、非霊長類、またはラットのＡＮＧＰＴＬ３遺伝子）の発現を少なくとも約５０％阻害するが、これは例えばＰＣＲまたは分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）による方法によって、またはタンパク質による方法、例えば免疫蛍光法などによって、例えばウエスタンブロット法またはフローサイトメトリー技術を使用して、検定した場合である。特定の実施形態では、発現の阻害は、その中に提供される適切な生物細胞株中で、例えば１０ｎＭの濃度でのｓｉＲＮＡを用いた、本明細書の実施例に提供されるｑＰＣＲ方法によって決定される。特定の実施形態においては、インビボでの発現の阻害は、例えばＲＮＡ発現の最低値では３ｍｇ／ｋｇで、例えば単回投与として投与した場合に、ヒト遺伝子を発現するげっ歯類、例えばヒト標的遺伝子を発現するマウスまたはＡＡＶ感染マウスにおいて、ヒト遺伝子をノックダウンすることによって決定される。
ｄｓＲＮＡは、二本のＲＮＡ鎖を含み、それらは、相補的であり、またｄｓＲＮＡが使用されることとなる条件下においてハイブリダイズして二本鎖構造を形成する。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、標的配列に対して、実質的に相補的であり、また概して完全に相補的である、相補的領域を含む。標的配列は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現の際に形成されたｍＲＮＡの配列から得られ得る。もう一方の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖に対して相補的である領域を含むため、当該二本の鎖は、好適な条件下で組み合わされた場合に、ハイブリダイズして二本鎖構造を形成する。本明細書の他の箇所で説明し、また当技術分野で公知であるように、ｄｓＲＮＡの相補配列はまた、別個のオリゴヌクレオチド上において相対するように、単一の核酸分子の自己相補領域として含ませることもできる。
概して、二本鎖構造は、１５～３０塩基対の長さ、例えば、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２塩基対の長さである。特定の実施形態においては、二本鎖構造は、長さが１８～２５塩基対、例えば、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～２５、２１～２４、２１～２３、２１～２２、２２～２５、２２～２４、２２～２３、２３～２５、２３～２４または２４～２５塩基対の長さであり、例えば１９～２１塩基対の長さである。上記に列記した範囲および長さの間に存在する範囲および長さもまた、本開示の一部であることを意図している。
同様に標的配列に対する相補的な領域が、１５～３０ヌクレオチド長、例えば、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチド長であり、例えば、１９～２３ヌクレオチド長、または２１～２３ヌクレオチド長である。上記に列記した範囲および長さの間に存在する範囲および長さもまた、本開示の一部であることを意図している。
一部の実施形態においては、二本鎖構造は、長さが１９～３０塩基対である。同様に、標的配列に対して相補的な領域は、長さが１９～３０ヌクレオチドである。
一部の実施形態においては、ｄｓＲＮＡは、長さが約１９～約２３ヌクレオチド、または長さが約２５～約３０ヌクレオチドである。概して、ｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ酵素のための基質として機能するのに十分に長い。例えば、長さが約２１～２３ヌクレオチドより長いｄｓＲＮＡが、Ｄｉｃｅｒのための基質として機能することができることは、当技術分野において周知である。当業者も認識することとなるように、切断のために標的とされるＲＮＡの領域は、ほとんどの場合、より長いＲＮＡ分子、多くの場合ｍＲＮＡ分子の一部である。関連する場合、ｍＲＮＡ標的の「一部」は、ＲＮＡｉ依存性切断（すなわち、ＲＩＳＣ経路を経る切断）のための基質となることを可能にさせるのに十分な長さのｍＲＮＡ標的の連続する配列である。
当業者であれば、二本鎖領域が、ｄｓＲＮＡの一次官能部分である、例えば、約１９～約３０塩基対、例えば、約１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２塩基対の二本鎖領域である、ことを理解するであろう。すなわち、一実施形態においては、切断のために所望のＲＮＡを標的とする例えば１５～３０塩基対の機能性二本鎖へとプロセシングされる限り、３０超の塩基対の二本鎖領域を有するＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子の複合体は、ｄｓＲＮＡである。したがって、当業者は、一実施形態においては、ｍｉＲＮＡがｄｓＲＮＡであることを認識するであろう。別の実施形態においては、ｄｓＲＮＡは、天然に生じるｍｉＲＮＡではない。別の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現を標的とするのに有用なｉＲＮＡ剤は、より大きなｄｓＲＮＡの切断により標的細胞中で生成されない。
本明細書において記載するｄｓＲＮＡは、一または複数の一本鎖のヌクレオチドオーバーハングをさらに含み得、例えば１～４、２～４、１～３、２～３、１、２、３、または４ヌクレオチドである。少なくとも一のヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、それらの平滑末端の相手方と比較して、優れた阻害特性を有し得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドなどであるヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含み得るかまたは該類似体からなり得る。オーバーハングは、センス鎖上、アンチセンス鎖上、またはそれらのいずれかの組合せ上にあり得る。その上、オーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖またはセンス鎖の５’末端、３’末端、または両末端上に存在し得る。
ｄｓＲＮＡは、当技術分野で公知の標準的な方法で合成することができる。本発明の二本鎖ＲＮＡｉ化合物は、二段階手法を使用して調製され得る。最初に、二本鎖ＲＮＡ分子の個々の鎖が、別個に調製される。次いで、当該構成要素の鎖がアニーリングされる。ｓｉＲＮＡ化合物の個々の鎖は、溶液相または固相の有機合成またはその両方を使用して調製することができる。有機合成は、非天然のヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖を容易に調製することができるという利点を提供する。同様に、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、溶液相または固相の有機合成またはその両方を使用して調製することができる。
一態様においては、本発明のｄｓＲＮＡは、少なくとも二のヌクレオチド配列、センス配列およびアンチセンス配列を含む。センス鎖は、表２～３および７～８のうちのいずれか一つに提供される配列群から選択され、またセンス鎖の対応するアンチセンス鎖は、表２～３および７～８のうちのいずれか一つの配列群から選択される。この態様においては、二つの配列の一方は、二つの配列の他方に対して相補的であり、この場合、配列の一方は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現の際に生じたｍＲＮＡの配列に対して実質的に相補的である。このように、この態様においては、ｄｓＲＮＡは、二つのオリゴヌクレオチドを含むこととなるが、一つのオリゴヌクレオチドは、表２～３および７～８のいずれか一つにおいてセンス鎖として記載され、第二のオリゴヌクレオチドは、表２～３および７～８のいずれか一つにおいて該センス鎖の対応するアンチセンス鎖として記載される。
特定の実施形態においては、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、それぞれのオリゴヌクレオチド上に含有される。他の実施形態においては、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、ひとつのオリゴヌクレオチド上に含有される。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、ＡＤ－１３３１２０３．１、ＡＤ－１３３１２０６．１、ＡＤ－１３３１２０９．１、ＡＤ－１３３１２１２．１、ＡＤ－１３３１２１３．１、ＡＤ－１３３１３２９．１、ＡＤ－１３３１２３７．１、ＡＤ－１３３１２３８．１、ＡＤ－１３３１２４０．１、ＡＤ－１３３１２４４．１、ＡＤ－１３３１２５６．１、ＡＤ－１３３１２６２．１、ＡＤ－１３３１２６４．１、ＡＤ－１３３１２６５．１、ＡＤ－１３３１２６６．１、ＡＤ－１３３１３１６．１、およびＡＤ－１３３１３３８．１からなる群から選択される二本鎖のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか一つと０、１、２または３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の連続ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、ＡＤ－１３３１２０３．１、ＡＤ－１３３１２０６．１、ＡＤ－１３３１２０９．１、ＡＤ－１３３１２１２．１、ＡＤ－１３３１２１３．１、ＡＤ－１３３１３２９．１、ＡＤ－１３３１２４０．１、ＡＤ－１３３１２６２．１、ＡＤ－１３３１２６４．１、ＡＤ－１３３１２６５．１およびＡＤ－１３３１２６６．１からなる群から選択される二本鎖のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか一つと０、１、２または３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の連続ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、ＡＤ－１３３１２０３．１、ＡＤ－１３３１２０６．１、ＡＤ－１３３１２０９．１、ＡＤ－１３３１２１２．１、およびＡＤ－１３３１２１３．１からなる群から選択される二本鎖のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか一つと０、１、２または３個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の連続ヌクレオチドを含む。
例えば表３の配列は、修飾された配列またはコンジュゲートされた配列として記述されていないが、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えば本発明のｄｓＲＮＡは、表２～３および７～８のいずれか一つに明記される配列のうちのいずれか一つを含み得、それらは、修飾されていない、コンジュゲートされていない、またはその中に記載されるものとは異なるように修飾もしくはコンジュゲートされたものである。言い換えれば、本発明は、本明細書に記載されるような、修飾されていない、コンジュゲートされていない、修飾された、またはコンジュゲートされた、表２～３および７～８のｄｓＲＮＡを包含する。
当業者は、約２０から２３塩基対、例えば２１塩基対の二本鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉を導入する際に特に有効であるとして歓迎されてきたことを十分に意識している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ ２００１，２０：６８７７－６８８８）。しかしながら、他の者らは、それよりも短いまたは長いＲＮＡ二本鎖構造も有効であり得ることを発見してきた（Ｃｈｕ ａｎｄ Ｒａｎａ（２００７）ＲＮＡ １４：１７１４－１７１９、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３：２２２－２２６）。上記において説明した実施形態においては、表２～３および７～８のいずれか一つに提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質を理由に、本明細書において記載するｄｓＲＮＡは、最小２１ヌクレオチドの長さの少なくとも一の鎖を含むことができる。表２～３および７～８のいずれか一つの中の配列のいずれか一つを有するより短い二本鎖から、一方または両方の末端上の少数のヌクレオチドのみを差し引いたものが、上述したｄｓＲＮＡと比較して同様に有効であり得ると合理的に予想することができる。したがって、表２～３および７～８のいずれか一つの配列のいずれか一つから誘導され、かつＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を約５、１０、１５、２０、２５、または３０％以下の阻害率で阻害する能力が全配列を含むｄｓＲＮＡとは異なっているものである、少なくとも１９、２０、またはそれ以上の連続するヌクレオチドの配列を有するｄｓＲＮＡは、本発明の範囲内であることが企図される。
さらに、表２～３および７～８に提供されるＲＮＡが、ＲＩＳＣ介在性の切断に感受性であるＡＮＧＰＴＬ３転写物中の部位を特定する。このように、本発明はさらに、これら部位のうちの一つ内を標的とするｉＲＮＡを取り上げる。本明細書において使用する場合、ｉＲＮＡは、ｉＲＮＡがＲＮＡ転写物の特定の部位内のいずれかの場所で転写物の切断を促進するならば、該特定の部位内を標的としているといわれる。かかるｉＲＮＡは、概して、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子内の選択された配列に隣接する領域から取られた追加のヌクレオチド配列に結合した、表２～３および７～８のいずれか一つに提供される配列のいずれか一つからの少なくとも約１９の連続するヌクレオチドを含むこととなる。
ＩＩＩ．本発明の修飾ｉＲＮＡ
特定の実施形態においては、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡは、未修飾であり、また例えば当技術分野において公知で本明細書に記載の化学修飾またはコンジュゲーションを含まない。他の実施形態においては、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡは、安定性または他の有益な特徴を増強するように化学修飾される。本発明の特定の実施形態においては、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの実質的にすべてが修飾される。本発明の他の実施形態においては、ｉＲＮＡのヌクレオチドの全て、またはｉＲＮＡのヌクレオチドの実質的に全てが修飾され、すなわち５以下、４以下、３以下、２以下、または１以下の未修飾ヌクレオチドがｉＲＮＡの鎖内に存在する。
本発明において取り上げる核酸は、当技術分野で十分に確立された方法によって、例えば“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，” Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ、に記載された方法などによって合成または修飾することが可能であり、当該文献は参照により本明細書に組み込まれる。修飾としては、例えば末端修飾、例えば５’末端修飾（リン酸化、コンジュゲーション、逆方向連結）または３’末端修飾（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆方向連結など）や、塩基修飾、例えば安定化塩基、不安定化塩基、もしくは伸長したレパートリーのパートナーと塩基対合する塩基での置換、塩基除去（脱塩基ヌクレオチド）もしくはコンジュゲートされた塩基や、糖修飾（例えば２’位または４’位における）もしくは糖の置換や、またはホスホジエステル連結の修飾もしくは置換をはじめとする骨格修飾が挙げられる。本明細書において記載する実施形態において有用なｉＲＮＡ化合物の具体例としては、これに限定されないが、修飾骨格を含有する、または非天然のヌクレオシド間連結を含有するＲＮＡが挙げられる。修飾骨格を有するＲＮＡとしては、中でも、骨格内にリン原子を有さないものが挙げられる。本明細書の目的上、時には当技術分野で言及されるように、そのヌクレオシド間骨格内にリン原子を有さない修飾ＲＮＡもまた、オリゴヌクレオシドであるとみなされ得る。一部の実施形態においては、修飾ｉＲＮＡは、そのヌクレオシド間骨格内にリン原子を有することとなる。
修飾ＲＮＡ骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルのホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホロアミダートを含むホスホロアミダート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに通常の３’－５’連結を有するボラノホスフェート、これらの２’－５’連結類似体、およびヌクレオシド単位の隣接する対が連結された３’－５’と５’－３’または２’－５’と５’－２’であるものである反転した極性を有するものが挙げられる。種々の塩、混合塩および遊離酸の形態も挙げられる。本発明の一部の実施形態においては、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、遊離酸形態である。本発明の他の実施形態においては、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、塩形態である。一実施形態においては、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、ナトリウム塩形態である。特定の実施形態においては、本発明のｄｓＲＮＡ剤がナトリウム塩形態である場合には、ナトリウムイオンが、薬剤中に存在するホスホジエステルおよび／またはホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏｔａｔｅ）基の実質的に全てに対する対イオンとして薬剤中に存在する。ホスホジエステルおよび／またはホスホロチオエート連結の実質的に全てがナトリウム対イオンを有する薬剤は、５、４、３、２または１以下の、ナトリウム対イオンを有さないホスホジエステルおよび／またはホスホロチオエート連結を含む。一部の実施形態においては、本発明のｄｓＲＮＡ剤がナトリウム塩形態である場合は、ナトリウムイオンは、薬剤中に存在するホスホジエステルおよび／またはホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏｔａｔｅ）基の全てに対する対イオンとして存在する。
上記リン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９５号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３１６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号、第５，６２５，０５０号、第６，０２８，１８８号、第６，１２４，４４５号、第６，１６０，１０９号、第６，１６９，１７０号、第６，１７２，２０９号、第６，２３９，２６５号、第６，２７７，６０３号、第６，３２６，１９９号、第６，３４６，６１４号、第６，４４４，４２３号、第６，５３１，５９０号、第６，５３４，６３９号、第６，６０８，０３５号、第６，６８３，１６７号、第６，８５８，７１５号、第６，８６７，２９４号、第６，８７８，８０５号、第７，０１５，３１５号、第７，０４１，８１６号、第７，２７３，９３３号、第７，３２１，０２９号、および米国特許第ＲＥ３９４６４号が含まれ、それら各々の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
骨格内にリン原子を含まない修飾ＲＮＡ骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間連結または一もしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環のヌクレオシド間連結によって形成される骨格を有する。これらとしては、モルホリノ連結を有するもの（ヌクレオシドの糖部分から一部形成される）、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格、ならびにＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２の混合した構成要素部分を有する他のものが挙げられる。
上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許としては、これらに限定されないが、米国特許第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、および第５，６７７，４３９号が挙げられ、このそれぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ヌクレオチド単位の、糖およびヌクレオシド間連結の両方が、すなわちその骨格が、新規の基と置換されているものである本明細書で提供するｉＲＮＡにおいて使用するのに好適なＲＮＡ模倣体が考察される。この塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。ＲＮＡ模倣体が優れたハイブリダイゼーション特性を有するとわかっているものである一つのこのようなオリゴマー化合物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物においては、ＲＮＡの糖骨格は、アミド含有骨格で、特にアミノエチルグリシン骨格で置換されている。核酸塩基が、保持されて、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、これに限定されないが、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号および第５，７１９，２６２号が挙げられ、このそれぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明のｉＲＮＡにおける使用に好適であるさらなるＰＮＡ化合物は、例えばＮｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７－１５００に記載されている。
本発明で取り上げる一部の実施形態には、ホスホロチオエート骨格をもつＲＮＡおよびヘテロ原子骨格をもつオリゴヌクレオシドが挙げられ、特に上記で参照した米国特許第５，４８９，６７７号の、－－ＣＨ２－－ＮＨ－－ＣＨ２－、－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｏ－－ＣＨ２－－［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られる］、－－ＣＨ２－－Ｏ－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－、－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－、および－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－ＣＨ２－－、および上記で参照した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格、が挙げられる。一部の実施形態においては、本明細書において取り上げるＲＮＡは、上記で参照した米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有する。天然のホスホジエステル骨格は、Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－ＯＣＨ２－として表され得る。
修飾ＲＮＡはまた、一つまたは複数の置換された糖部分を含有し得る。本明細書において取り上げられるｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡは、２’位に以下のうちの一つを含み得る：ＯＨ、Ｆ、Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルキル、Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルケニル、Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルキニル、またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルであって、式中アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換されたまたは非置換のＣ１～Ｃ１０アルキルまたはＣ２～Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。例示的な好適な修飾としては、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２が挙げられ、式中、ｎおよびｍは、１～約１０である。他の実施形態においては、ｄｓＲＮＡは、２’位において以下のうちの一つを含む：Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリルまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、干渉物質、ｉＲＮＡの薬物動態特性を改善するための基またはｉＲＮＡの薬力学的特性を改善するための基、および同様の特性を有する他の置換基。一部の実施形態においては、修飾は、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８：４８６－５０４）、すなわちアルコキシ－アルコキシ基、が挙げられる。別の例示的な修飾には、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、本明細書において以下の実施例において記載されるような、２’－ＤＭＡＯＥとしても知られる、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野で２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち２’－Ｏ－－ＣＨ２－－Ｏ－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）２がある。さらなる例示的な修飾としては、５’－Ｍｅ－２’－Ｆヌクレオチド、５’－Ｍｅ－２’－ＯＭｅヌクレオチド、５’－Ｍｅ－２’－デオキシヌクレオチド、（これら三つのファミリー内のＲおよびＳ異性体の両方）、２’－アルコキシアルキル、および２’－ＮＭＡ（Ｎ－メチルアセトアミド）が挙げられる。
他の修飾としては、２’－メトキシ（２’－ＯＣＨ３）、２’－アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２’－フルオロ（２’－Ｆ）が挙げられる。同様の修飾はまた、ｉＲＮＡのＲＮＡ上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上または２’－５’連結ｄｓＲＮＡ中の糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位においてもなされ得る。ｉＲＮＡはまた、ペントフラノース糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有し得る。このような修飾された糖構造の調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許出願第４，９８１，９５７号、５，１１８，８００号、５，３１９，０８０号、５，３５９，０４４号、５，３９３，８７８号、５，４４６，１３７号、５，４６６，７８６号、５，５１４，７８５号、５，５１９，１３４号、５，５６７，８１１号、５，５７６，４２７号、５，５９１，７２２号、５，５９７，９０９号、５，６１０，３００号、５，６２７，０５３号、５，６３９，８７３号、５，６４６，２６５号、５，６５８，８７３号、５，６７０，６３３号、および５，７００，９２０号が挙げられるが、限定されるものではなく、これらの一部は本出願と共有されている。前述のものの各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
ｉＲＮＡはまた、核酸塩基（当技術分野では単に「塩基」と称することも多い）の修飾または置換を含み得る。本明細書において使用する場合、「未修飾の（修飾されていない）」または「天然の」核酸塩基としては、プリン塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾核酸塩基としては、他の合成核酸塩基および天然核酸塩基が挙げられ、例えばデオキシチミジン（ｄＴ）、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニルウラシルおよびシトシン、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよび他の８－置換のアデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチルおよび他の５－置換のウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－ダアザアデニン（ｄａａｚａａｄｅｎｉｎｅ）ならびに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンなどである。さらなる核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８に開示されるもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８－８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３に開示されるもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９－３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３に開示されるもの、が挙げられる。これら核酸塩基のうちの一部は、特に本発明で取り上げるオリゴマー化合物の結合親和性を増大するのに有用である。これらには、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジンおよびＮ－２、Ｎ－６および０～６置換のプリンが含まれ、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシンが挙げられる。５－メチルシトシン置換は、核酸の二本鎖安定性を０．６～１．２℃高めることがわかっており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６－２７８）、そしてさらにより具体的には２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合には、模範的な塩基置換である。
上記の修飾核酸塩基ならびに他の修飾核酸塩基のうちの特定のものの調製を教示する代表的な米国特許としては、これに限定されるものではないが、上記に記載の米国特許第３，６８７，８０８号、第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、第５，６８１，９４１号、第５，７５０，６９２号、第６，０１５，８８６号、第６，１４７，２００号、第６，１６６，１９７号、第６，２２２，０２５号、第６，２３５，８８７号、第６，３８０，３６８号、第６，５２８，６４０号、第６，６３９，０６２号、第６，６１７，４３８号、第７，０４５，６１０号、第７，４２７，６７２号、および第７，４９５，０８８号が挙げられ、そのそれぞれの内容全体が、参照により本明細書において組み込まれる。
一部の実施形態においては、本開示のＲＮＡｉ剤はまた、一または複数の二環式糖部分を含むように修飾され得る。「二環式糖」は、隣接するかまたは非隣接かにかかわらず、二つの炭素の架橋によって形成される環によって修飾されるフラノシル環である。「二環式のヌクレオシド」（「ＢＮＡ」）は、隣接するかまたは非隣接かにかかわらず糖環の二つの炭素原子を架橋して形成される環を含み、それによって二環式環系を形成する糖部分を有するヌクレオシドである。特定の実施形態においては、架橋が、糖環の４’－炭素と２’－炭素を接続するが、これは随意に２’－非環式酸素原子を介する。したがって、一部の実施形態においては、本発明の剤は、一または複数のロック核酸（ＬＮＡ）を含み得る。ロック核酸は、リボース部分が２’および４’炭素を接続する追加の架橋を含むものである、修飾リボース部分を有するヌクレオチドである。言い換えれば、ＬＮＡは、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’架橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオチドである。この構造は、３’－ｅｎｄｏ構造立体配座内にリボースを効率的に「ロックする」。ｓｉＲＮＡへのロック核酸の付加により、血清中でのｓｉＲＮＡ安定性が増大し、オフターゲット効果が低減するとわかっている（Ｅｌｍｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３（１）：４３９－４４７、Ｍｏｏｋ，ＯＲ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ Ｃａｎｃ Ｔｈｅｒ ６（３）：８３３－８４３、Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１（１２）：３１８５－３１９３）。本発明のポリヌクレオチドで使用するための二環式ヌクレオシドの例としては、これに限定するものではないが、４’および２’のリボシル環原子の間の架橋を含むヌクレオシドが挙げられる。特定の実施形態においては、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド剤としては、４’から２’への架橋を含む一または複数の二環式ヌクレオシドが挙げられる。
ロックされたヌクレオシドは、この構造（立体化学は省略する）によって表すことができ、
式中、Ｂは、核酸塩基または修飾核酸塩基であり、Ｌは、リボース環の２’－炭素と４’－炭素とを結合する連結基である。かかる４’から２’の架橋された二環式ヌクレオシドの例としては、これに限定するものではないが、４’－（ＣＨ２）－Ｏ－２’（ＬＮＡ）、４’－（ＣＨ２）－Ｓ－２’、４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’（ＥＮＡ）、４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’（「拘束されたエチル」または「ｃＥｔ」とも称される）および４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）－Ｏ－２’（およびその類似体、例えば米国特許第７，３９９，８４５号を参照）、４’－Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）－Ｏ－２’（およびその類似体、例えば米国特許第８，２７８，２８３号を参照）、４’－ＣＨ２－Ｎ（ＯＣＨ３）－２’（およびその類似体、例えば米国特許第８，２７８，４２５号を参照）、４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－２’（例えば米国特許出願公開第２００４／０１７１５７０号を参照）、４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’であって式中ＲはＨ、Ｃ１～Ｃ１２アルキルまたは窒素保護基（例えば米国特許第７，４２７，６７２号を参照）、４’－ＣＨ２－Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）－２’（例えばＣｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００９，７４，１１８－１３４を参照）、および４’－ＣＨ２－Ｃ（＝ＣＨ２）－２’（およびその類似体、例えば米国特許第８，２７８，４２６号を参照）、が挙げられる。前述のものの各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
ロック核酸ヌクレオチドの調製を教示するさらなる代表的な米国特許および米国特許出願公開公報としては、これに限定されるものではないが、米国特許第６，２６８，４９０号、第６，５２５，１９１号、第６，６７０，４６１号、第６，７７０，７４８号、第６，７９４，４９９号、第６，９９８，４８４号、第７，０５３，２０７号、第７，０３４，１３３号、第７，０８４，１２５号、第７，３９９，８４５号、第７，４２７，６７２号、第７，５６９，６８６号、第７，７４１，４５７号、第８，０２２，１９３号、第８，０３０，４６７号、第８，２７８，４２５号、第８，２７８，４２６号、第８，２７８，２８３号、米国特許出願公開第２００８／００３９６１８号および米国特許出願公開第２００９／００１２２８１号が挙げられ、この各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
例えばα－Ｌ－リボフラノースおよびβ－Ｄ－リボフラノースをはじめとする一または複数の立体化学的な糖立体配座を有する前述の二環式ヌクレオシドのいずれもが、調製可能である（国際公開第９９／１４２２６号を参照）。
ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、一または複数の拘束されたエチルヌクレオチドを含むように修飾され得る。本明細書において使用される場合、「拘束されたエチルヌクレオチド」または「ｃＥｔ」は、４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’架橋（先述の構造におけるＬ）を含む二環式糖部分を含むロック核酸である。一実施形態においては、拘束されたエチルヌクレオチドは、Ｓ立体配座であり、本明細書において「Ｓ－ｃＥｔ」と称する。
本発明のｉＲＮＡはまた、一または複数の「立体配座的に制限されたヌクレオチド」（「ＣＲＮ」）を含み得る。ＣＲＮは、リボースのＣ２’炭素およびＣ４’炭素を、またはリボースのＣ３炭素および－Ｃ５’炭素を接続するリンカーを有するヌクレオチド類似体である。ＣＲＮは、リボース環を安定な立体配座にロックして、ｍＲＮＡに対するハイブリダイゼーション親和性を増大する。リンカーは、酸素を安定性および親和性にとって最適な位置に配置するのに十分な長さのものであり、その結果、リボース環のパッカリングを少なくさせる。
上記のＣＲＮのうちの特定のものの調製を教示する代表的な刊行物としては、これに限定されるものではないが、米国特許出願公開第２０１３／０１９０３８３号およびＰＣＴ公開公報である国際公開第２０１３／０３６８６８号が挙げられ、この各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態においては、本発明のｉＲＮＡは、ＵＮＡ（アンロック核酸）ヌクレオチドである一または複数のモノマーを含む。ＵＮＡは、アンロック非環式核酸であり、その糖の結合のいずれもが除去されていて、アンロック「糖」残基を形成しているものである。一実施例においては、ＵＮＡはまた、Ｃ１’－Ｃ４’間の結合が除去されているモノマーも包含する（すなわち、Ｃ１’炭素とＣ４’炭素との間の共有結合による炭素－酸素－炭素間結合）。別の実施例においては、糖のＣ２’－Ｃ３’結合（すなわち、Ｃ２’炭素とＣ３’炭素との間の共有結合による炭素－炭素間結合）が除去されている（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒｉｅｓ，５２，１３３－１３４（２００８）およびＦｌｕｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，２００９，１０，１０３９を参照されたく、これは参照により本明細書に組み込まれる）。
ＵＮＡの調製を教示する代表的な米国の刊行物として、これに限定されるものではないが、米国特許第８，３１４，２２７号、および米国特許出願公開第２０１３／００９６２８９号、第２０１３／００１１９２２号、および第２０１１／０３１３０２０号が挙げられ、この各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
ＲＮＡ分子の末端に対する安定化修飾として可能性があるものとしては、Ｎ－（アセチルアミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－ＮＨＡｃ）、Ｎ－（カプロイル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６）、Ｎ－（アセチル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－ＮＨＡｃ）、チミジン－２’－Ｏ－デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ－（アミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－アミノ）、２－ドコサノイル－ウリジン－３’－ホスフェート、逆方向２’－デオキシ－修飾リボヌクレオチド、例えば逆方向ｄＴ（ｉｄＴ）および逆方向ｄＡ（ｉｄＡ）など、ならびに逆方向脱塩基２’－デオキシリボヌクレオチド（ｉＡｂ）およびその他のものなどが挙げられ得る。この修飾の開示内容は、国際公開第２０１１／００５８６１号に見ることができる。
一実施例においては、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端は、例えば逆方向ｄＴ（ｉｄＴ）、逆方向ｄＡ（ｉｄＡ）、または逆方向脱塩基２’－デオキシリボヌクレオチド（ｉＡｂ）などである逆方向２’－デオキシ修飾リボヌクレオチドに連結される。一つの特定の実施例においては、逆方向２’－デオキシ－修飾リボヌクレオチドは、本明細書に記載するセンス鎖の３’末端など、オリゴヌクレオチドの３’末端に連結され、ここで当該連結は、３’－３’ホスホジエステル連結または３’－３’－ホスホロチオエート連結を介している。
別の実施例においては、センス鎖の３’末端は、３’－３’－ホスホロチオエート連結を介して、逆方向脱塩基リボヌクレオチド（ｉＡｂ）に連結される。別の実施例においては、センス鎖の３’末端は、３’－３’－ホスホロチオエート連結を介して、逆方向ｄＡ（ｉｄＡ）に連結される。
一つの特定の実施例においては、逆方向２’－デオキシ－修飾リボヌクレオチドは、本明細書に記載するセンス鎖の３’末端など、オリゴヌクレオチドの３’末端に連結され、ここで当該連結は、３’－３’ホスホジエステル連結または３’－３’－ホスホロチオエート連結を介している。
別の実施例においては、センス鎖の３’末端ヌクレオチドは、逆方向ｄＡ（ｉｄＡ）であり、また３’－３’－連結（例えば、３’－３’－ホスホロチオエート連結）を介して先行するヌクレオチドに連結されている。
本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの他の修飾としては、５’ホスフェートまたは５’ホスフェート模倣体、例えばｉＲＮＡのアンチセンス鎖上の５’末端ホスフェートまたはホスフェート模倣体、が挙げられる。好適なホスフェート模倣体は、例えば米国特許出願公開第２０１２／０１５７５１１号に開示されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Ａ．本発明のモチーフを含む修飾ｉＲＮＡ
本発明の特定の態様においては、本発明の二本鎖ＲＮＡ剤としては、例えば国際公開第２０１３／０７５０３５号において開示されるような化学修飾を有する剤が挙げられ、当該公報は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書および国際公開第２０１３／０７５０３５号において示されるように、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一修飾のうちの一つ以上のモチーフが、特に切断部位またはその近傍において、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖に導入され得る。一部の実施形態においては、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、別様に完全に修飾され得る。これらモチーフの導入は、存在する場合にはセンス鎖またはアンチセンス鎖の修飾パターンを中断する。このｄｓＲＮＡｉ剤は、随意に、例えばセンス鎖上で、ＧａｌＮＡｃ誘導体リガンドとコンジュゲートし得る。
より具体的には、二本鎖ＲＮＡ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖が、ｄｓＲＮＡｉ剤の少なくとも一方の鎖の切断部位またはその近傍において、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾のうちの一以上のモチーフを有するように完全に修飾された場合に、ｄｓＲＮＡｉ剤の遺伝子サイレンシング活性が観察された。
したがって、本発明は、インビボで標的遺伝子（すなわち、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子）の発現を阻害可能な二本鎖ＲＮＡ剤を提供する。このＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。ＲＮＡｉ剤の各鎖は、例えば、長さが１７～３０ヌクレオチド、長さが２５～３０ヌクレオチド、長さが２７～３０ヌクレオチド、長さが１９～２５ヌクレオチド、長さが１９～２３ヌクレオチド、長さが１９～２１ヌクレオチド、長さが２１～２５ヌクレオチド、または長さが２１～２３ヌクレオチドであり得る。
センス鎖およびアンチセンス鎖は、典型的には、本明細書において「ｄｓＲＮＡｉ剤」とも称する二重の二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）を形成する。ｄｓＲＮＡｉ剤の二本鎖領域は、例えば、長さが２７～３０ヌクレオチド対、長さが１９～２５ヌクレオチド対、長さが１９～２３ヌクレオチド対、長さが１９～２１ヌクレオチド対、長さが２１～２５ヌクレオチド対、または長さが２１～２３ヌクレオチド対とすることができる二本鎖領域であり得る。別の実施例においては、二本鎖領域は、長さが１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６および２７ヌクレオチドから選択される。
特定の実施形態においては、ｄｓＲＮＡｉ剤は、一方の鎖または両鎖の３’末端、５’末端または両末端において一または複数のオーバーハング領域またはキャッピング基を含有し得る。オーバーハングは、独立に、長さが１～６ヌクレオチド、例えば２～６ヌクレオチドの長さ、１～５ヌクレオチドの長さ、２～５ヌクレオチドの長さ、１～４ヌクレオチドの長さ、２～４ヌクレオチドの長さ、１～３ヌクレオチドの長さ、２～３ヌクレオチドの長さ、または１～２ヌクレオチドの長さであり得る。特定の実施形態においては、オーバーハング領域は、上述のように、伸長したオーバーハング領域を含み得る。オーバーハングは、一方の鎖がもう一方よりも長い結果、または同一の長さの二本の鎖がねじれている結果であり得る。このオーバーハングは、標的ｍＲＮＡとミスマッチを形成し得る、または標的とする遺伝子配列に対して相補的であり得る、または別の配列であり得る。第一および第二の鎖を、例えば、ヘアピンを形成する追加の塩基によって、または他の非塩基リンカーによって、連結することもできる。
特定の実施形態においては、ｄｓＲＮＡｉ剤のオーバーハング領域内のヌクレオチドは、それぞれ独立して、２’－糖修飾の、例えば２’－Ｆ、２’－Ｏ－メチルの、チミジン（Ｔ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、およびこれらのいずれかの組合せを含むがこれに限定されない、修飾または未修飾のヌクレオチドであり得る。
例えばＴＴは、いずれかの鎖上のいずれかの末端のためのオーバーハング配列であり得る。このオーバーハングは、標的ｍＲＮＡとミスマッチを形成し得る、または標的とする遺伝子配列に対して相補的であり得る、または別の配列であり得る。
ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖、アンチセンス鎖または両鎖の５’－または３’－のオーバーハングは、リン酸化され得る。一部の実施形態においては、オーバーハング領域は、二つのヌクレオチドの間にホスホロチオエートを有する二つのヌクレオチドを含有し、当該二つのヌクレオチドは、同一であり得るか、または異なり得る。一部の実施形態においては、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖または両鎖の３’末端に存在する。一部の実施形態においては、この３’－オーバーハングは、アンチセンス鎖内に存在する。一部の実施形態においては、この３’－オーバーハングは、センス鎖内に存在する。
ｄｓＲＮＡｉ剤は、その全体的な安定性に影響を及ぼすことなく、ＲＮＡｉの干渉活性を強化することができる単一のオーバーハングのみを含有し得る。例えば、一本鎖のオーバーハングは、センス鎖の３’末端に、あるいはアンチセンス鎖の３’末端に位置し得る。ＲＮＡｉはまた、アンチセンス鎖の５’末端（またはセンス鎖の３’末端）に位置する、または逆も同じである、平滑末端を有し得る。概して、ｄｓＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、３’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、また５’末端は平滑である。理論に拘束されることを望むことなく、こうした非対称であるアンチセンス鎖の５’末端にある平滑末端およびアンチセンス鎖の３’末端オーバーハングであることが、ＲＩＳＣプロセスへのガイド鎖挿入に好都合である。
特定の実施形態においては、ｄｓＲＮＡｉ剤は、長さが１９ヌクレオチドの二重平滑末端であるものであり、センス鎖が、５’末端から７、８、９位において三つの連続するヌクレオチド上に三つの２’－Ｆ修飾の少なくとも一つのモチーフを含有する。アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、および１３位において三つの連続するヌクレオチド上に三つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも一つのモチーフを含む。
他の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ剤は、長さが２０ヌクレオチドの二重平滑末端であり、センス鎖は、５’末端から８、９、および１０位において三つの連続するヌクレオチド上に三つの２’－Ｆ修飾の少なくとも一つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、および１３位において三つの連続するヌクレオチド上に三つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも一つのモチーフを含む。
さらに他の実施形態では、ｄｓＲＮＡｉ剤は、長さが２１ヌクレオチドの二重平滑末端であり、センス鎖は、５’末端から９、１０、および１１位において三つの連続するヌクレオチド上に三つの２’－Ｆ修飾の少なくとも一つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、および１３位において三つの連続するヌクレオチド上に三つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも一つのモチーフを含む。
特定の実施形態においては、ｄｓＲＮＡｉ剤は、２１ヌクレオチドのセンス鎖および２３ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含むものであり、センス鎖が、５’末端から９、１０および１１位において三つの連続するヌクレオチド上の三つの２’－Ｆ修飾の少なくとも一つのモチーフを含有し、アンチセンス鎖が、５’末端から１１、１２および１３位において三つの連続するヌクレオチド上の三つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも一つのモチーフを含有し、ＲＮＡｉ剤の一方の末端が平滑であり、もう一方の末端が２ヌクレオチドのオーバーハングを含む。一実施形態においては、２ヌクレオチドのオーバーハングが、アンチセンス鎖の３’末端にある。
２ヌクレオチドのオーバーハングが、アンチセンス鎖の３’末端にある場合には、末端の三つのヌクレオチドの間に二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結があり得るものであり、該三つのヌクレオチドのうち二つが、オーバーハングヌクレオチドであり、三番目のヌクレオチドが、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合したヌクレオチドである。一実施形態においては、ＲＮＡｉ剤は、さらに、センス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の５’末端の両方において末端の三つのヌクレオチドの間に二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を有する。特定の実施形態においては、モチーフの一部であるヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖内の全てのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである。特定の実施形態においては、各残基は独立に、例えば交互モチーフで、２’－Ｏ－メチルまたは３’－フルオロで修飾されている。随意に、ｄｓＲＮＡｉ剤は、リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ３）をさらに含む。
特定の実施形態においては、ｄｓＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むものであり、センス鎖が、長さが２５～３０ヌクレオチド残基であり、５’末端ヌクレオチド（１位）から開始して、第一の鎖の１位～２３位が、少なくとも８リボヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、長さが３６～６６ヌクレオチド残基であり、また３’末端ヌクレオチドから開始して、センス鎖の１～２３位と対合した位置において少なくとも８リボヌクレオチドを含んで二本鎖を形成するものであり、アンチセンス鎖の少なくとも３’末端ヌクレオチドがセンス鎖と対合せず、また最大６の連続する３’末端ヌクレオチドはセンス鎖と対合せず、それによって１～６ヌクレオチドの３’単一鎖のオーバーハングを形成し、アンチセンス鎖の５’末端が、センス鎖と対合しない１０～３０の連続するヌクレオチドを含み、それによって１０～３０ヌクレオチドの単一鎖の５’オーバーハングを形成し、少なくともセンス鎖５’末端および３’末端ヌクレオチドが、センス鎖およびアンチセンス鎖が最大の相補性で整列する場合にアンチセンス鎖のヌクレオチドと塩基対合し、それによってセンス鎖およびアンチセンス鎖間の実質的に二本鎖の領域を形成し、またアンチセンス鎖が、アンチセンス鎖長の少なくとも１９リボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳類細胞に導入されたときに標的遺伝子発現を低減させ、またセンス鎖が、三つの連続するヌクレオチド上に三つの２’－Ｆ修飾の少なくとも一つのモチーフを含有するものであり、モチーフのうちの少なくとも一つが、切断部位においてまたは切断部位の近傍で生じる。アンチセンス鎖は、切断部位においてまたはその近傍で三つの連続するヌクレオチド上の三つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも一つのモチーフを含有する。
特定の実施形態においては、ｄｓＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むものであり、該ｄｓＲＮＡｉ剤が、少なくとも２５ヌクレオチドであり最大でも２９ヌクレオチドである長さを有する第一の鎖、および５’末端から１１、１２、１３位において三つの連続するヌクレオチド上の三つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも一つのモチーフをもつ最大でも３０ヌクレオチドである長さを有する第二の鎖を含むものであり、第一の鎖の３’末端および第二の鎖の５’末端が平滑末端を形成し、また第二の鎖が、その３’末端において第一の鎖よりも長い１～４ヌクレオチドであるものであり、二本鎖領域が、長さが少なくとも２５ヌクレオチドであり、第二の鎖が、第二の鎖の長さのうちの少なくとも１９ヌクレオチドに沿って標的ｍＲＮＡに対して十分に相補的であり、ＲＮＡｉ剤が哺乳類細胞に導入されたときに標的遺伝子発現を低減するものであり、またｄｓＲＮＡｉ剤のＤｉｃｅｒ切断が、第二の鎖の３’末端を含むｓｉＲＮＡを結果として生じ、それによって哺乳類において標的遺伝子の発現が低減する。随意に、ｄｓＲＮＡｉ剤は、リガンドをさらに含む。
特定の実施形態においては、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の少なくとも一つのモチーフを含有し、該モチーフのうち一つは、センス鎖中の切断部位において生じる。
特定の実施形態においては、ｄｓＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖はまた、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の少なくとも一つのモチーフを含有することができるものであり、当該モチーフのうち一つが、アンチセンス鎖内の切断部位においてまたはその近傍で生じる。
長さが１９～２３ヌクレオチドである二本鎖領域を有するｄｓＲＮＡｉ剤については、アンチセンス鎖の切断部位は通常、５’末端からおよそ１０、１１および１２位にある。したがって、三つの同一の修飾のモチーフは、アンチセンス鎖の、９、１０、１１位、１０、１１、１２位、１１、１２、１３位、１２、１３、１４位、または１３、１４、１５位において生じ得、これら数字はアンチセンス鎖の５’末端から一つ目のヌクレオチドから開始するか、またはこれら数字はアンチセンス鎖の５’末端から二本鎖領域内の一つめの対合したヌクレオチドから開始する。アンチセンス鎖内の切断部位はまた、５’末端からのｄｓＲＮＡｉ剤の二本鎖領域の長さに応じて変わり得る。
ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、鎖の切断部位において三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の少なくとも一つのモチーフを含有し得、またアンチセンス鎖は、鎖の切断部位においてまたはその近傍において三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の少なくとも一つのモチーフを有し得る。センス鎖およびアンチセンス鎖がｄｓＲＮＡ二本鎖を形成する場合には、センス鎖およびアンチセンス鎖は、センス鎖上の三つのヌクレオチドの一つのモチーフおよびアンチセンス鎖上の三つのヌクレオチドの一つのモチーフが、少なくとも一つのヌクレオチドオーバーラップを有するように、すなわちセンス鎖内のモチーフの三つのヌクレオチドの少なくとも一つが、アンチセンス鎖内のモチーフの三つのヌクレオチドの少なくとも一つと塩基対合を形成するように、整列され得る。あるいは、少なくとも二つのヌクレオチドが重複してもよく、または三つのヌクレオチドの全てが重複してもよい。
一部の実施形態においては、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の二以上のモチーフを含有し得る。第一のモチーフは、鎖の切断部位においてまたはその近傍に生じ得、またその他のモチーフが、ウイング修飾であり得る。本明細書において「ウイング修飾」という用語は、同一の鎖の切断部位においてまたはその近傍においてのモチーフから分離されている鎖の別の部分において生じるモチーフを指す。ウイング修飾は、第一のモチーフに隣接しているか、または少なくとも一もしくは複数のヌクレオチドで分離されている。モチーフが互いにすぐ隣に隣接する場合には、モチーフの化学的性質は、互いに別個であり、またモチーフが一または複数のヌクレオチドで分離されている場合には、その化学的性質は、同一であっても異なっていてもよい。二以上のウイング修飾が存在する場合もある。例えば、二つのウイング修飾が存在する場合には、各ウイング修飾は、切断部位においてもしくはその近傍における第一のモチーフに対して一つの末端において生じ得、またはリードモチーフのいずれかの側で生じ得る。
センス鎖と同様に、ｄｓＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の二つ以上のモチーフを含有し得、該モチーフの少なくとも一つは鎖の切断部位またはその近傍において生じる。このアンチセンス鎖はまた、センス鎖上に存在し得るウイング修飾と同様のアラインメント内に一または複数のウイング修飾を含有し得る。
一部の実施形態においては、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖上のウイング修飾は、典型的には、鎖の３’末端、５’末端または両末端において最初の一または二の末端ヌクレオチドを含まない。
他の実施形態においては、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖上のウイング修飾は、典型的には、鎖の３’末端、５’末端または両末端において二本鎖領域内の最初の一つまたは二つの対合したヌクレオチドを含まない。
ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖が各々、少なくとも一つのウイング修飾を含有する場合には、ウイング修飾は、二本鎖領域の同一末端に入り得、また一、二または三つのヌクレオチドの重複部分を有する。
ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖が各々、少なくとも二つのウイング修飾を含有する場合には、センス鎖およびアンチセンス鎖は、それぞれの一本鎖に由来する二つの修飾が、一、二または三ヌクレオチドの重複部分を有する二本鎖領域の一方の末端に入り、一本鎖からの二つの修飾がそれぞれ、一、二または三のヌクレオチドの重複部分を有する二本鎖領域のうちのもう一方の末端に入り、一本鎖からの二つの修飾が、二本鎖領域内の一、二または三のヌクレオチドの重複部分を有するリードモチーフの両側に入るように、整列され得る。
一部の実施形態においては、モチーフの一部であるヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖内のどのヌクレオチドも、修飾され得る。各ヌクレオチドは、同一または異なる修飾で修飾され得、当該修飾は、非連結性ホスフェート酸素の一方もしくは両方の、または連結性ホスフェート酸素の一もしくは複数のうちの一または複数の変更、リボース糖の構成成分の、例えばリボース糖上の２’－ヒドロキシルの変更、ホスフェート部分の「脱リン酸化」リンカーとの大規模な置換、天然に存在する塩基の修飾または置換、およびリボースホスフェート骨格の置換または修飾を含み得る。
核酸はサブユニットのポリマーであるので、修飾の多くは、核酸内で反復される位置で生じ、例えば塩基またはホスフェート部分、またはホスフェート部分の非連結のＯの修飾である。一部の場合においては、修飾は、核酸中の対象位置の全てにおいて生じることとなるが、多くの場合、生じることとならない。例として、修飾は、３’末端または５’末端の位置においてのみ生じ得、末端領域においてのみ生じ得、例えば鎖の末端ヌクレオチド上の位置、または鎖の最後の２、３、４、５もしくは１０ヌクレオチドにおいて生じ得る。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域または両方において生じ得る。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域内においてのみ生じ得、またはＲＮＡの一本鎖領域内においてのみ生じ得る。例えば、非連結性Ｏ位置におけるホスホロチオエート修飾は、一方または両方の末端においてのみ生じ得、末端領域においてのみ生じ得、例えば鎖の末端ヌクレオチド上の位置または鎖の最後の２、３、４、５もしくは１０ヌクレオチド内において生じ得、または二本鎖内および一本鎖領域において、特に末端で、生じ得る。５’末端をリン酸化することが可能である。
それにより、例えば安定性を増強すること、オーバーハング内に特定の塩基を含めること、または一本鎖のオーバーハング内、例えば５’オーバーハングもしくは３’オーバーハング内、または両オーバーハング内に、修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチド代替物を含めることが可能であり得る。例えば、オーバーハング内にプリンヌクレオチドを含めることが望ましいものであり得る。一部の実施形態においては、３’オーバーハングまたは５’オーバーハング内の塩基の全てまたは一部が、例えば本明細書において記載する修飾で修飾され得る。修飾は、例えば、当技術分野で公知である修飾でのリボース糖の２’位における修飾の使用、例えば、核酸塩基のリボ糖の代わりに修飾された、デオキシリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）または２’－Ｏ－メチルの使用、およびホスフェート基における修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾、を含み得る。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。
一部の実施形態においては、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、ＬＮＡ、ＣＲＮ、ｃＥＴ、ＵＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシル、または２’－フルオロで独立に修飾される。鎖は、二以上の修飾を含有し得る。一実施形態においては、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロで独立に修飾される。
少なくとも二つの異なる修飾が、典型的には、センス鎖およびアンチセンス鎖上に存在する。それら二つの修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾などであり得る。
特定の実施形態においては、ＮａまたはＮｂは、交互パターンの修飾を含む。「交互モチーフ」という用語は、本明細書で使用する場合、一または複数の修飾を有するモチーフを指し、各修飾が、一本鎖の交互ヌクレオチド上で生じる。交互ヌクレオチドとは、一つ置きのヌクレオチド毎に一つまたは三つのヌクレオチド毎に一つまたは類似のパターンを指し得る。例えばＡ、ＢおよびＣが各々、ヌクレオチドに対する一タイプの修飾を表す場合、当該交互モチーフは、「ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ・・・」、「ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ・・・」、「ＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢ・・・」、「ＡＡＡＢＡＡＡＢＡＡＡＢ・・・」、「ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ・・・」または「ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ・・・」などであり得る。
交互モチーフ内に含有されるこのタイプの修飾は、同一である場合も、異なっている場合もある。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄが各々、ヌクレオチド上の一タイプの修飾を表す場合、交互パターンが、すなわち一つ置きのヌクレオチド上の修飾が、同一であり得るが、センス鎖またはアンチセンス鎖の各々が、例えば「ＡＢＡＢＡＢ・・・」、「ＡＣＡＣＡＣ・・・」、「ＢＤＢＤＢＤ・・・」、または「ＣＤＣＤＣＤ・・・」などである交互モチーフの範囲内のいくつかの可能性のある修飾から選択され得る。
一部の実施形態においては、本発明のｄｓＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖上の交互モチーフの修飾パターンに対して相対的にシフトされているセンス鎖上の交互モチーフの修飾パターンを含む。当該移動は、センス鎖のヌクレオチドの修飾基が、アンチセンス鎖のヌクレオチドの異なるように修飾された基に対応するようになされたものであり得、逆もまた同様である。例えば、センス鎖は、ｄｓＲＮＡ二本鎖内のアンチセンス鎖と対合する場合、センス鎖内の交互モチーフは、鎖の５’から３’へ「ＡＢＡＢＡＢ」で開始し得、またアンチセンス鎖内の交互モチーフは、二本鎖領域内の鎖の５’から３’へ「ＢＡＢＡＢＡ」で開始し得る。別の例として、センス鎖内の交互モチーフは、鎖の５’から３’へ「ＡＡＢＢＡＡＢＢ」で開始し得、またアンチセンス鎖内の交互モチーフは、二本鎖領域内の鎖の５’から３’へ「ＢＢＡＡＢＢＡＡ」で開始し得、その結果、センス鎖およびアンチセンス鎖間の修飾パターンの完全なシフトまたは部分的なシフトが存在するようになる。
一つの特定の例では、センス鎖内の交互モチーフは、該鎖の５’‐３’から「ＡＢＡＢＡＢ」であり、各Ａは、非修飾リボヌクレオチドであり、また各Ｂは、２’－Ｏメチル修飾ヌクレオチドである。
一つの特定の例では、センス鎖内の交互モチーフは、該鎖の５’‐３’から「ＡＢＡＢＡＢ」であり、各Ａは、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、また各Ｂは、２’－Ｏメチル修飾ヌクレオチドである。
別の特定の実施例においては、アンチセンス鎖内の交互モチーフは、当該鎖の３’－５’から「ＢＡＢＡＢＡ」であり、各Ａは、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、また各Ｂは、２’－Ｏメチル修飾ヌクレオチドである。
一つの特定の例では、センス鎖内の交互モチーフは、該鎖の５’‐３’から「ＡＢＡＢＡＢ」であり、またアンチセンス鎖内の交互モチーフは、該鎖の３’－５から「ＢＡＢＡＢＡ」であり、各Ａは、未修飾リボヌクレオチドであり、また各Ｂは、２’－Ｏメチル修飾ヌクレオチドである。
一つの特定の例では、センス鎖内の交互モチーフは、該鎖の５’‐３’から「ＡＢＡＢＡＢ」であり、またアンチセンス鎖内の交互モチーフは、該鎖の３’－５から「ＢＡＢＡＢＡ」であり、各Ａは、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、また各Ｂは、２’－Ｏメチル修飾ヌクレオチドである。
一部の実施形態においては、ｄｓＲＮＡｉ剤は、センス鎖上の２’－Ｏ－メチル修飾と２’－Ｆ修飾の交互モチーフのパターンを含み、最初に、アンチセンス鎖上の２’－Ｏ－メチル修飾と２’－Ｆ修飾の交互モチーフのパターンに対して相対的なシフトを有し、すなわち、センス鎖の塩基対上の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドと、アンチセンス鎖上の２’－Ｆ修飾ヌクレオチドを含み、その逆もまた同様である。センス鎖の１位は、２’－Ｆ修飾で開始し得、またアンチセンス鎖の１位は、２’－Ｏ－メチル修飾で開始し得る。
センス鎖またはアンチセンス鎖への三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の一または複数のモチーフの導入は、センス鎖またはアンチセンス鎖内に存在する最初の修飾パターンを中断する。センス鎖またはアンチセンス鎖への三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の一または複数のモチーフを導入することによるセンス鎖またはアンチセンス鎖の修飾パターンの中断は、標的遺伝子に対する遺伝子サイレンシング活性を増強し得る。
一部の実施形態においては、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾のモチーフが鎖のいずれかに導入される場合、該モチーフに隣接するヌクレオチドの修飾は、そのモチーフの修飾とは異なる修飾である。例えば、モチーフを含有する配列の部分は、「・・・ＮａＹＹＹＮｂ・・・」であり、ここで「Ｙ」は三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾のモチーフの修飾を表し、また「Ｎａ」および「Ｎｂ」は、Ｙの修飾とは異なるモチーフ「ＹＹＹ」に隣接するヌクレオチドに対する修飾を表し、ここでＮａおよびＮｂは同一または異なる修飾であり得る。あるいは、ウイング修飾が存在する場合、ＮａまたはＮｂは存在してもよく、または存在しなくてもよい。
ｉＲＮＡは、少なくとも一つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結をさらに含み得る。ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾は、鎖の任意の位置においてセンス鎖、アンチセンス鎖または両鎖の任意のヌクレオチド上で生じ得る。例えば、ヌクレオチド間連結修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上のどのヌクレオチド上でも生じ得、各ヌクレオチド間連結修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上で交互パターン内で生じ得、またはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖は、交互パターン内で両方のヌクレオチド間連結修飾を含み得る。センス鎖上のヌクレオチド間連結修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同一または異なり得、またセンス鎖上のヌクレオチド間連結修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上のヌクレオチド間連結修飾の交互パターンに対して相対的なシフトを有し得る。一実施形態においては、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、６～８のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態においては、アンチセンス鎖は、５’末端において二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結と、３’末端において二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結とを含み、またセンス鎖は、５’末端または３’末端のいずれかに少なくとも二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。
一部の実施形態においては、ｄｓＲＮＡｉ剤は、オーバーハング領域内にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、二つのヌクレオチド間にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結を有する二つのヌクレオチドを含有し得る。ヌクレオチド間連結修飾はまた、オーバーハングヌクレオチドを二本鎖領域内の末端の対合したヌクレオチドと連結するようになされ得る。例えば、少なくとも２、３、４または全てのオーバーハングヌクレオチドは、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結によって連結され得、随意に、オーバーハングヌクレオチドを、オーバーハングヌクレオチドと隣接する対合したヌクレオチドと連結するさらなるホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結が存在し得る。例えば、三つのヌクレオチドのうち二つがオーバーハングヌクレオチドであり、三番目が、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合したヌクレオチドである、末端の三つのヌクレオチド間に少なくとも二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結が存在し得る。これら末端の三つのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端、センス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の５’末端、またはアンチセンス鎖の５’末端にあり得る。
一部の実施形態においては、２－ヌクレオチドオーバーハングが、アンチセンス鎖の３’末端にあり、末端の三つのヌクレオチド間に二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結が存在し、当該三つのヌクレオチドのうち二つが、オーバーハングヌクレオチドであり、また三番目のヌクレオチドが、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合したヌクレオチドである。随意に、ｄｓＲＮＡｉ剤は、さらに、センス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の５’末端の両方において末端の三つのヌクレオチド間に二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を有し得る。
一実施形態においては、ｄｓＲＮＡｉ剤は、標的との、二本鎖内のミスマッチまたはその組合せを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域内または二本鎖領域内に生じ得る。塩基対は、解離または融解を促進するそれらがもつ傾向に基づいて格付けされ得る（例えば、特定の対合の会合または解離の自由エネルギーに基づくものであり、最も単純なアプローチとしては、個々の対ごとに対を調べることであるが、次に、隣接するまたは同様の分析も使用可能である）。解離の促進の点では、Ａ：ＵはＧ：Ｃより好ましく、Ｇ：ＵはＧ：Ｃより好ましく、またＩ：ＣはＧ：Ｃより好ましい（Ｉ＝イノシン）。ミスマッチ、例えば非標準の対合または標準以外の対合（本明細書において別の箇所に記載される）が、標準（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）の対合より好ましく、またユニバーサル塩基を含む対合が、標準の対合より好ましい。
特定の実施形態においては、ｄｓＲＮＡｉ剤は、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃの群から独立に選択されるアンチセンス鎖の５’末端から二本鎖領域内の最初の１、２、３、４または５塩基対、および例えば非標準の対合または標準以外の対合またはユニバーサル塩基を含む対合であるミスマッチ対のうちの少なくとも一つを含み、二本鎖の５’末端においてアンチセンス鎖の解離を促進する。
特定の実施形態においては、アンチセンス鎖内の５’末端から二本鎖領域内の１位におけるヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、ＵおよびｄＴから選択される。あるいは、アンチセンス鎖の５’末端から二本鎖領域内の最初の１、２または３の塩基対のうち少なくとも一つは、ＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の５’末端から二本鎖領域内の最初の塩基対は、ＡＵ塩基対である。
他の実施形態においては、センス鎖の３’末端におけるヌクレオチドは、デオキシチミジン（ｄＴ）であるか、またはアンチセンス鎖の３’末端におけるヌクレオチドは、デオキシチミジン（ｄＴ）である。例えば、デオキシチミジンヌクレオチドの短い配列、例えばセンス鎖、アンチセンス鎖または両鎖の３’末端上の二つのｄＴヌクレオチド、が存在する。
特定の実施形態においては、センス鎖配列は、式（Ｉ）：
５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉ）
で表され得、
式中、
ｉおよびｊは各々独立に、０または１であり、
ｐおよびｑは各々独立に、０～６であり、
各Ｎａは独立に、０～２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表すものであって、各配列は少なくとも二つの異なるように修飾されたヌクレオチドを含み、
各Ｎｂは独立に、０～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
各ｎｐおよびｎｑは独立に、オーバーハングヌクレオチドを表すものであり、
式中、ＮｂおよびＹは、同一の修飾を有さず、ならびに
ＸＸＸ、ＹＹＹおよびＺＺＺは各々独立に、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の一のモチーフを表す。一実施形態においては、ＹＹＹは、すべて２’－Ｆ修飾ヌクレオチドである。
一部の実施形態においては、ＮａまたはＮｂは、交互パターンの修飾を含む。
一部の実施形態においては、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位においてまたはその近傍において生じる。例えば、ｄｓＲＮＡｉ剤が、１７～２３ヌクレオチドの長さの二本鎖領域を有する場合、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位においてまたはその近傍において生じ得（例えば、６、７、８位、７、８、９位、８、９、１０位、９、１０、１１位、１０、１１、１２位、または１１、１２、１３位において生じ得る）、この数字は、５’末端から、第一のヌクレオチドから開始し、または随意に、この数字は、５’末端から、二本鎖領域内の最初の対合したヌクレオチドにおいて開始する。
一実施形態においては、ｉは１であり、かつｊは０であり、またはｉは０であり、かつｊは１であり、またはｉおよびｊの両方が１である。したがって、センス鎖は、以下の式、
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉｂ）、
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉｃ）、または
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉｄ）
で表され得る。
センス鎖が式（Ｉｂ）で表される場合、Ｎｂは、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは独立に、２～２０、２～１５または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
センス鎖が式（Ｉｃ）で表される場合、Ｎｂは、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは独立に、２～２０、２～１５または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
センス鎖が式（Ｉｄ）で表される場合、各Ｎｂは独立に、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。一実施形態では、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５、または６である。各Ｎａは独立して、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
Ｘ、ＹおよびＺの各々は、互いに同一であっても、異なっていてもよい。
他の実施形態においては、ｉは０であり、かつｊは０であり、またセンス鎖は、式
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉａ）
で表され得る。
センス鎖が、式（Ｉａ）で表される場合、各Ｎａは独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
一実施形態においては、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖配列は、式（ＩＩ）：
５’ｎｑ’－Ｎａ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｌ－Ｎ’ａ－ｎｐ’３’（ＩＩ）
で表され得、
式中、
ｋおよびｌは各々独立に、０または１であり、
ｐ’およびｑ’は各々独立に、０～６であり、
各Ｎａ’は独立に、０～２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表すものであり、各配列は、少なくとも二つの異なるように修飾されたヌクレオチドを含み、
各Ｎｂ’は独立に、０～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
各ｎｐ’およびｎｑ’は独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し、
式中、Ｎｂ’およびＹ’は、同一の修飾を有さず、ならびに
Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々独立に、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の一つのモチーフを表す。
一部の実施形態においては、Ｎａ’またはＮｂ’は、交互パターンの修飾を含む。
Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の切断部位においてまたはその近傍において生じる。例えば、ｄｓＲＮＡｉ剤が、１７～２３ヌクレオチドの長さの二本鎖領域を有する場合、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の９、１０、１１位、１０、１１、１２位、１１、１２、１３位、１２、１３、１４位、または１３、１４、１５位において生じ得、この数字は、５’末端から、最初のヌクレオチドから開始し、または随意に、この数字は、５’末端から、二本鎖領域内の最初の対合したヌクレオチドにおいて開始する。一実施形態においては、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、１１位、１２位、１３位において生じる。
特定の実施形態においては、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、全て２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチドである。
特定の実施形態においては、ｋは１であり、かつｌは０であるか、またはｋは０であり、かつｌは１であるか、またはｋおよびｌは両方とも１である。
したがって、アンチセンス鎖は、以下の式：
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｐ’３’（ＩＩｂ）、
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－ｎｐ’３’（ＩＩｃ）、または
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎａ’－ｎｐ’３’（ＩＩｄ）
で表され得る。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｂ）で表される場合、Ｎｂ ’は、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｃ）で表される場合、Ｎｂ’は、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｄ）で表される場合、各Ｎｂ’は独立に、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。一実施形態においては、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５、または６である。
他の実施形態においては、ｋは０であり、かつｌは０であり、またアンチセンス鎖は、式：
５’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’３’（Ｉａ）
で表され得る。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩａ）で表される場合、各Ｎａ’は独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
Ｘ’、Ｙ’およびＺ’の各々は、互いに同一であってもよく、異なっていてもよい。
センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立に、ＬＮＡ、ＣＲＮ、ＵＮＡ、ｃＥｔ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－ヒドロキシルまたは２’－フルオロで独立に修飾され得る。例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロで独立に修飾される。各Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’は、特に２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾を表し得る。
一部の実施形態においては、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、二本鎖領域が２１ｎｔ（ヌクレオチド）である場合に鎖の９、１０および１１位において生じるＹＹＹモチーフを含有し得、この数字は、５’末端から、最初のヌクレオチドから開始し、または随意に、この数字は、５’末端から、二本鎖領域内の最初の対合したヌクレオチドにおいて開始し、またＹは、２’－Ｆ修飾を表す。センス鎖は、二本鎖領域の対向する側の末端においてウイング修飾としてＸＸＸモチーフまたはＺＺＺモチーフをさらに含有し得、またＸＸＸおよびＺＺＺは各々独立に、２’－ＯＭｅ修飾または２’－Ｆ修飾を表す。
一部の実施形態においては、アンチセンス鎖は、鎖の１１、１２、１３位において生じるＹ’Ｙ’Ｙ’モチーフを含有し得、この数字は、５’末端から、最初のヌクレオチドから開始し、または随意に、この数字は、５’末端から、二本鎖領域内の最初の対合したヌクレオチドにおいて開始し、またＹ’は、２’－Ｏ－メチル修飾を表す。アンチセンス鎖は、二本鎖領域の対向する側の末端においてウイング修飾としてＸ’Ｘ’Ｘ’モチーフまたはＺ’Ｚ’Ｚ’モチーフをさらに含有し得、またＸ’Ｘ’Ｘ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々独立に、２’－ＯＭｅ修飾または２’－Ｆ修飾を表す。
上記の式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）および（Ｉｄ）のいずれか一つで表されるセンス鎖は、それぞれ式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）および（ＩＩｄ）のいずれか一つで表されるアンチセンス鎖と二本鎖を形成する。
したがって、本発明の方法において使用するｄｓＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み得、各鎖は、１４～３０ヌクレオチドを有し、ｉＲＮＡ二本鎖は、以下の式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ ’－Ｎａ ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ ’－ｎｑ ’５’
（ＩＩＩ）
で表され、
式中、
ｉ、ｊ、ｋおよびｌは各々独立に、０または１であり、
ｐ、ｐ’、ｑおよびｑ’は各々独立に、０～６であり、
各ＮａおよびＮａ ’は独立に、０～２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも二つの異なるように修飾されたヌクレオチドを含み、
各ＮｂおよびＮｂ ’は独立に、０～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
式中、各ｎｐ’、ｎｐ、ｎｑ’およびｎｑは、それらの各々が、存在していても存在していなくてもよく、オーバーハングヌクレオチドを独立に表し、
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々独立に、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の一つのモチーフを表す。
一実施形態においては、ｉは０であり、かつｊは０であり、またはｉは１であり、かつｊは０であり、またはｉは０であり、かつｊは１であり、またはｉおよびｊは両方とも０であり、またはｉおよびｊは両方とも１である。別の実施形態においては、ｋは０であり、かつｌは０であり、またはｋは１であり、かつｌは０であり、ｋは０であり、かつｌは１であり、またはｋおよびｌは両方とも０であり、またはｋおよびｌは両方とも１である。
ｉＲＮＡ二本鎖を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖の例示的な組合せとしては、以下の式が挙げられる。
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ ’－Ｎａ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ ’ｎｑ ’５’
（ＩＩＩａ）
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ ’－Ｎａ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ ’ｎｑ ’５’
（ＩＩＩｂ）
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ ’－Ｎａ ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ ’－ｎｑ ’５’
（ＩＩＩｃ）
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ ’－Ｎａ ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ－ｎｑ ’５’
（ＩＩＩｄ）
ｄｓＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩａ）で表される場合、各Ｎａは独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ｄｓＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｂ）で表される場合、各Ｎｂは独立に、１～１０、１～７、１～５、または１～４の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ｄｓＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｃ）で表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’は独立に、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ｄｓＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）で表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’は独立に、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ、Ｎａ ’は独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。Ｎａ、Ｎａ’、Ｎｂ、およびＮｂ ’の各々は独立に、交互パターンの修飾を含む。
式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）の中のＸ、Ｙ、およびＺの各々は、互いに同一であっても異なっていてもよい。
ｄｓＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）で表される場合、Ｙヌクレオチドのうちの少なくとも一つが、Ｙ’ヌクレオチドのうちの一つと塩基対を形成し得る。あるいは、少なくとも二つのＹヌクレオチドが、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成し、または三つのＹヌクレオチドすべてが、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
ｄｓＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｂ）または（ＩＩＩｄ）で表される場合、Ｚヌクレオチドのうちの少なくとも一つが、Ｚ’ヌクレオチドのうちの一つと塩基対を形成し得る。あるいは、少なくとも二つのＺヌクレオチドが、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成し、または三つのＺヌクレオチドすべてが、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
ｄｓＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｃ）または（ＩＩＩｄ）で表される場合、Ｘヌクレオチドのうちの少なくとも一つが、Ｘ’ヌクレオチドのうちの一つと塩基対を形成し得る。あるいは、Ｘヌクレオチドのうちの少なくとも二つが、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成し、またはＸヌクレオチドのうちの三つすべてが、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
特定の実施形態においては、Ｙヌクレオチド上の修飾は、Ｙ’ヌクレオチド上の修飾とは異なるか、Ｚヌクレオチド上の修飾は、Ｚ’ヌクレオチド上の修飾とは異なるか、またはＸヌクレオチド上の修飾は、Ｘ’ヌクレオチド上の修飾とは異なる。
特定の実施形態においては、ｄｓＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）で表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾である。他の実施形態においては、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）で表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、またｎｐ’＞０および少なくとも一つのｎｐ’は、ホスホロチオエート連結を介して隣接するヌクレオチドに連結する。さらに他の実施形態においては、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）で表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０および少なくとも一つのｎｐ’は、ホスホロチオエート連結を介して隣接するヌクレオチドに連結し、またセンス鎖は、二価または三価の分枝リンカー（以下に記載する）を介して結合される一または複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる。他の実施形態においては、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）で表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０および少なくとも一つのｎｐ’は、ホスホロチオエート連結を介して隣接するヌクレオチドに連結し、センス鎖は、少なくとも一つのホスホロチオエート連結を含み、またセンス鎖は、二価または三価の分枝リンカーを介して結合される一または複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる。
一部の実施形態においては、ｄｓＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩａ）で表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０および少なくとも一つのｎｐ’は、ホスホロチオエート連結を介して隣接するヌクレオチドに連結し、センス鎖は、少なくとも一つのホスホロチオエート連結を含み、またセンス鎖は、二価または三価の分枝リンカーを介して結合される一または複数のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる。
一部の実施形態においては、ｄｓＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）および（ＩＩＩｄ）で表される少なくとも二つの二本鎖を含有する多量体であり、該二本鎖は、リンカーで接続される。該リンカーは、切断可能である場合も、切断可能でない場合もある。随意に、多量体は、リガンドをさらに含む。二本鎖の各々は、同一の遺伝子または二つの異なる遺伝子を標的にし得、または二本鎖の各々は、二つの異なる標的部位における同一の遺伝子を標的とし得る。
一部の実施形態においては、ｄｓＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）および（ＩＩＩｄ）で表される三、四、五、六、またはそれ以上の二本鎖を含有する多量体であり、該二本鎖は、リンカーで接続される。該リンカーは、切断可能である場合も、切断可能でない場合もある。随意に、多量体は、リガンドをさらに含む。二本鎖の各々は、同一の遺伝子または二つの異なる遺伝子を標的にし得、または二本鎖の各々は、二つの異なる標的部位における同一の遺伝子を標的とし得る。
一実施形態においては、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）および（ＩＩＩｄ）のうちの少なくとも一で表される二つのｄｓＲＮＡｉ剤は、５’末端において、また３’末端の一方または両方において、互いに連結され、随意に、リガンドにコンジュゲートされる。当該剤は各々、同一の遺伝子または二つの異なる遺伝子を標的とし得、または当該剤の各々が、二つの異なる標的部位において同一の遺伝子を標的にし得る。
特定の実施形態においては、本発明のＲＮＡｉ剤は、２’－フルオロ修飾を含有する少数のヌクレオチド、例えば２’－フルオロ修飾を有する１０以下のヌクレオチド、を含有し得る。例えば、ＲＮＡｉ剤は、２’－フルオロ修飾を有する１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１または０のヌクレオチドを含有し得る。特定の実施形態においては、本発明のＲＮＡｉ剤は、２’－フルオロ修飾を有する１０ヌクレオチド、例えばセンス鎖内に２’－フルオロ修飾を有する４ヌクレオチド、およびアンチセンス鎖内に２’－フルオロ修飾を有する６ヌクレオチド、を含有する。別の特定の実施形態においては、本発明のＲＮＡｉ剤は、２’－フルオロ修飾を有する６ヌクレオチド、例えばセンス鎖内に２’－フルオロ修飾を有する４ヌクレオチド、およびアンチセンス鎖内に２’－フルオロ修飾を有する２ヌクレオチド、を含有する。
他の実施形態においては、本発明のＲＮＡｉ剤は、２’－フルオロ修飾を含有する極めて少数のヌクレオチド、例えば２’－フルオロ修飾を含有する２以下のヌクレオチド、を含有し得る。例えば、ＲＮＡｉ剤は、２’－フルオロ修飾を有する２、１または０のヌクレオチドを含有し得る。特定の実施形態においては、ＲＮＡｉ剤は、２’－フルオロ修飾を有する２ヌクレオチド、例えばセンス鎖内に２－フルオロ修飾を有する０ヌクレオチド、およびアンチセンス鎖内に２’－フルオロ修飾を有する２ヌクレオチド、を含有し得る。
種々の公開公報には、本発明の方法において使用され得る多量体ｉＲＮＡが記載されて いる。当該公開公報としては、国際公開第２００７／０９１２６９号、米国特許第７，８５８，７６９号、国際公開第２０１０／１４１５１１号、国際公開第２００７／１１７６８６号、国際公開第２００９／０１４８８７号、および国際公開第２０１１／０３１５２０号が挙げられ、それら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態においては、本開示の組成物および方法は、本明細書において記載するようなＲＮＡｉ剤のビニルホスホネート（ＶＰ）修飾を含む。例示的な実施形態においては、本開示の５’－ビニルホスホネート修飾ヌクレオチドが、以下の構造を有し、
式中、ＸはＯまたはＳであり、
Ｒは、水素、ヒドロキシ、フルオロ、またはＣ１～２０アルコキシ（例えば、メトキシまたはｎ－ヘキサデシルオキシ）であり、
Ｒ５’は、＝Ｃ（Ｈ）－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり、またＣ５’炭素とＲ５’との間の二重結合が、Ｅ配座またはＺ配座（例えば、Ｅ配座）であり、また
Ｂは、核酸塩基または修飾核酸塩基であり、随意に、Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはウラシルである。
本開示のビニルホスホネートは、本開示のｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかに結合し得る。特定の実施形態においては、本開示のビニルホスホネートは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖に、随意にｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端において、結合する。
本開示の組成物および方法のためにビニルホスフェート修飾も企図される。例示的なビニルホスフェート構造は、前述した構造を含み、式中、Ｒ５’は＝Ｃ（Ｈ）－ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２であり、またＣ５’炭素およびＲ５’間の二重結合は、Ｅ配座またはＺ配座（例えば、Ｅ配座）である。
以下により詳細に記載するように、ｉＲＮＡへの一つまたは複数の炭水化物部分のコンジュゲーションを含有するｉＲＮＡは、ｉＲＮＡの一つまたは複数の特性を最適化できる。多くの場合、炭水化物部分は、ｉＲＮＡの修飾サブユニットに結合することとなる。例えば、ｉＲＮＡの一つまたは複数のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖は、別の部分、例えば炭水化物リガンドが結合される非炭水化物（好ましくは、環式）のキャリア、で置換され得る。リボヌクレオチドのサブユニットであって、該サブユニットリボース糖がそのように置換されているリボヌクレオチドサブユニットを、本明細書においては、リボース置換修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）と称する。環式キャリアは、環状炭素系であり得、すなわち、すべての環原子が炭素原子であるか、または複素環系であり得、すなわち、一つまたは複数の環原子が例えば、窒素、酸素、硫黄であるヘテロ原子であり得る。環式キャリアは、単環式環系であり得、または二以上の環、例えば縮合環、を含有し得る。環式キャリアは、完全に飽和の環系であり得、または一つもしくは複数の二重結合を含有し得る。
リガンドは、キャリアを介してポリヌクレオチドに結合し得る。該キャリアは、（ｉ）少なくとも一つの「骨格結合点」、例えば二つの「骨格結合点」と、（ｉｉ）少なくとも一つの「係留結合点」とを含む。「骨格結合点」とは、本明細書で使用する場合、例えば、ヒドロキシル基などの官能基を指し、または概して、リボ核酸の骨格、例えば、ホスフェート、もしくは例えば、硫黄含有などの修飾ホスフェートの骨格内にキャリアを組み込むために利用可能であり好適である結合を指す。一部の実施形態における「係留結合点」（ＴＡＰ）とは、選択された部分を接続する環式キャリアの構成環原子、例えば炭素原子またはヘテロ原子（骨格結合点を提供する原子とは別の）を指す。この部分は、例えば、炭水化物であり得、例えば単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖または多糖であり得る。随意に、選択部分は、介在する係留によって環式キャリアに接続される。したがって環式キャリアは、しばしば、例えばアミノ基である官能基を含む、または概して結合であって、構成する環への、例えばリガンドである別の化学的実体の組み込みもしくは係留に適している結合を提供することとなる。
ｉＲＮＡは、キャリアを介してリガンドにコンジュゲートし得るものであり、該キャリアは、環式基または非環式基であり得る。一実施形態では、環式基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリル、およびデカリンから選択される。一実施形態では、非環式基は、セリノール骨格またはジエタノールアミン骨格である。
ｉ．熱不安定化修飾
特定の実施形態では、アンチセンス鎖のシード領域中に熱不安定化修飾を組み込むことによって、ｄｓＲＮＡ分子をＲＮＡ干渉のために最適化できる。本明細書で使用される場合、「シード領域」は、参照される鎖の５’末端の２～９位を意味する。例えば、熱不安定化修飾をアンチセンス鎖のシード領域に組み込み、標的外遺伝子サイレンシングを低減または阻害することができる。
「熱不安定化修飾」という用語は、そうした修飾を有していないｄｓＲＮＡの融解温度（Ｔｍ）よりも低い全体的な融解温度（Ｔｍ）を有するｄｓＲＮＡをもたらすこととなる修飾を含む。例えば、熱不安定化修飾は、ｄｓＲＮＡのＴｍを、例えば摂氏一度、二度、三度、または四度など、１～４℃だけ減少させることができる。また、用語「熱不安定化ヌクレオチド」は、一つまたは複数の熱不安定化修飾を含有するヌクレオチドを指す。
アンチセンス鎖の５’末端から数えて最初の９ヌクレオチドの位置内にある二本鎖の少なくとも一つの熱不安定化修飾を含むアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡが、オフターゲット遺伝子サイレンシング活性を低減したことを発見した。したがって、一部の実施形態においては、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’領域の最初の９ヌクレオチドの位置内に、二本鎖の少なくとも一つ（例えば、一、二、三、四、五またはそれより多い）の熱不安定化修飾を含む。一部の実施形態においては、一つまたは複数の、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から２～９位に、例えば４～８位に、位置する。一部のさらなる実施形態においては、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から６、７または８位に位置する。さらに一部のさらなる実施形態においては、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から７位に位置する。一部の実施形態においては、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から２、３、４、５または９位に位置する。
ｉＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４～４０ヌクレオチドを有する。ＲＮＡｉ剤は、以下の式（Ｌ）：
（Ｌ）、で表され得る。
式（Ｌ）中、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’は各々独立に、２’－Ｏ－アルキル、２’－置換アルコキシ、２’－置換アルキル、２’－ハロ、ＥＮＡ、およびＢＮＡ／ＬＮＡからなる群から選択される修飾を含有するヌクレオチドである。一実施形態においては、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’はそれぞれ、２’－ＯＭｅ修飾を含有する。一実施形態においては、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’はそれぞれ、２’－ＯＭｅ修飾または２’－Ｆ修飾を含有する。一実施形態においては、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’のうちの少なくとも一つは、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ、２’－Ｏ－ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｍｅ）Ｈ）修飾を含有する。
Ｃ１は、アンチセンス鎖のシード領域に対向する部位（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２～８位）に配置された熱不安定化ヌクレオチドである。例えば、Ｃ１は、アンチセンス鎖の５’末端の２～８位におけるヌクレオチドと対合するセンス鎖の位置にある。一実施例においては、Ｃ１は、センス鎖の５’末端から１５位にある。Ｃ１ヌクレオチドは、脱塩基修飾、二本鎖における対向するヌクレオチドとのミスマッチ、例えば２’－デオキシ修飾または非環式ヌクレオチド、例えばアンロック核酸（ＵＮＡ）もしくはグリセロール核酸（ＧＮＡ）などの糖修飾、または２’－５’結合リボヌクレオチド（３’－ＲＮＡ）を含み得る熱不安定化修飾を保持する。一実施形態においては、Ｃ１は、ｉ）アンチセンス鎖内の対向するヌクレオチドとのミスマッチ、ｉｉ）以下からなる群から選択される脱塩基修飾：
、
ならびにｉｉｉ）糖修飾であって、
、
、
、
、
、および
からなる群から選択され、式中、Ｂは、修飾または未修飾の核酸塩基、Ｒ１およびＲ２は独立に、Ｈ、ハロゲン、ＯＲ３、またはアルキル、およびＲ３はＨ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖である、糖修飾からなる群から選択される熱不安定化修飾を有する。一実施形態においては、Ｃ１における熱不安定化修飾は、Ｇ：Ｇ、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕ、Ｇ：Ｔ、Ａ：Ａ、Ａ：Ｃ、Ｃ：Ｃ、Ｃ：Ｕ、Ｃ：Ｔ、Ｕ：Ｕ、Ｔ：Ｔ、およびＵ：Ｔからなる群から選択されるミスマッチであり、随意に、ミスマッチ対内の少なくとも一つの核酸塩基が、２’－デオキシ核酸塩基である。一実施例においては、Ｃ１における熱不安定化修飾は、ＧＮＡまたは
である。
Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、およびＴ３’はそれぞれ独立に、２’－ＯＭｅ修飾の立体的嵩高さと等しいかまたはそれ以下の立体的嵩高さをヌクレオチドに提供する修飾を含むヌクレオチドを表す。立体的嵩高さは、修飾の立体効果の総和を指す。ヌクレオチドの修飾の立体効果を決定する方法は、当業者に公知である。修飾は、ヌクレオチドのリボース糖の２’位にあり得る、または非リボースヌクレオチド、非環式ヌクレオチド、もしくはリボース糖の２’位と類似もしくは同等であるヌクレオチドの骨格に対する修飾であり得、そしてヌクレオチドに、２’－ＯＭｅ修飾の立体的嵩高さ以下の立体的嵩高さを提供する。例えば、Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、およびＴ３’は、それぞれ独立に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’－Ｆ、および２’－Ｆ－５’－メチルから選択される。一実施形態においては、Ｔ１はＤＮＡである。一実施形態においては、Ｔ１’はＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＬＮＡである。一実施形態においては、Ｔ２’はＤＮＡ、またはＲＮＡである。一実施形態においては、Ｔ３’はＤＮＡ、またはＲＮＡである。
ｎ１、ｎ３、およびｑ１は独立に、４～１５ヌクレオチドの長さである。
ｎ５、ｑ３、およびｑ７は独立に、１～６ヌクレオチドの長さである。
ｎ４、ｑ２、およびｑ６は独立に、１～３ヌクレオチドの長さであり、あるいはｎ４は０ヌクレオチドの長さである。
ｑ５は独立に、０～１０ヌクレオチドの長さである。
ｎ２、およびｑ４は独立に、０～３ヌクレオチドの長さである。
あるいは、ｎ４は、０～３ヌクレオチドの長さである。
一実施形態においては、ｎ４は、０であり得る。一実施例においては、ｎ４は０であり、またｑ２およびｑ６は１である。別の実施例においては、ｎ４は０であり、またｑ２およびｑ６は１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数える）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数える）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。
一実施形態においては、ｎ４、ｑ２、およびｑ６はそれぞれ１である。
一実施形態においては、ｎ２、ｎ４、ｑ２、ｑ４、およびｑ６はそれぞれ１である。
一実施形態においては、Ｃ１は、センス鎖が１９～２２ヌクレオチドの長さ、かつｎ４が１であるとき、センス鎖の５’末端の１４～１７位にある。一実施形態においては、Ｃ１は、センス鎖の５’末端の１５位にある。
一実施形態においては、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位において開始する。一実施例においては、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位にあり、またｑ６が１に等しい。
一実施形態においては、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位において開始する。一実施例においては、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位にあり、またｑ２が１に等しい。
例示的な実施形態においては、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位から開始し、またＴ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位から開始する。一実施例においては、Ｔ３’はアンチセンス鎖の５’末端から２位から開始し、またｑ６が１に等しく、またＴ１’はアンチセンス鎖の５’末端から１４位から開始し、またｑ２が１に等しい。
一実施形態においては、Ｔ１’およびＴ３’は、１１ヌクレオチドの長さ（すなわち、Ｔ１’およびＴ３’ヌクレオチドは数えない）だけ分離される。
一実施形態においては、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位にある。一実施例においては、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位にあり、またｑ２が１に等しく、また非リボースの非環式または骨格における２’位にある修飾は、２’－ＯＭｅリボースよりも少ない立体的嵩高さである。
一実施形態においては、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位にある。一実施例においては、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位にあり、またｑ６が１に等しく、また非リボースの非環式または骨格における２’位における修飾は、２’－ＯＭｅリボースよりも少ないまたは同等の立体的嵩高さである。
一実施形態においては、Ｔ１はセンス鎖の切断部位にある。一実施例においては、Ｔ１は、センス鎖が１９～２２ヌクレオチドの長さ、かつｎ２が１であるとき、センス鎖の５’末端から１１位にある。例示的な実施形態においては、Ｔ１は、センス鎖が１９～２２ヌクレオチドの長さ、かつｎ２が１であるとき、センス鎖の５’末端から１１位にあるセンス鎖の切断部位にある。
一実施形態においては、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から６位において開始する。一実施例においては、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から６～１０位にあり、またｑ４が１である。
例示的な実施形態においては、Ｔ１は、センス鎖の切断部位にあり、例えばセンス鎖が１９～２２ヌクレオチドの長さ、かつｎ２が１のとき、センス鎖の５’末端から１１位にあり、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端から１４位にあり、またｑ２が１に等しく、そしてＴ１’に対する修飾は、リボース糖の２’位、または２’－ＯＭｅリボースよりも立体的嵩高さが少ない非リボースの非環式または骨格内の位置にあり、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から６～１０位にあり、またｑ４が１であり、ならびにＴ３’は、アンチセンス鎖の５’末端から２位にあり、またｑ６が１に等しく、またＴ３’に対する修飾は、２’位にあるか、または２’－ＯＭｅリボースよりも立体的嵩高さが少ない非リボースの非環式または骨格内の位置にある。
一実施形態においては、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から８位において開始する。一実施例においては、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から８位にあり、またｑ４が２である。
一実施形態においては、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から９位において開始する。一実施例においては、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端から９位にあり、またｑ４が１である。
一実施形態においては、Ｂ１’は２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が１であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が６であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。
一実施形態においては、ｎ４は０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が１であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が６であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１である。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が６であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が７であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１である。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が６であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が７であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が１であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が６であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１である。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が１であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が６であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が５であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が１であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１であり、随意に、これらはアンチセンス鎖の３’末端において少なくとも２のさらなるＴＴを伴う。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が５であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が１であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１であり、随意に、これらはアンチセンス鎖の３’末端において少なくとも２のさらなるＴＴを伴い、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１である。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１である。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１である。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。
ＲＮＡｉ剤は、センス鎖またはアンチセンス鎖の５’末端においてリン含有基を含み得る。５’末端リン含有基は、５’末端ホスフェート（５’－Ｐ）、５’末端ホスホロチオエート（５’－ＰＳ）、５’末端ホスホロジチオエート（５’－ＰＳ２）、５’末端ビニルホスホネート（５’－ＶＰ）、５’末端メチルホスホネート（ＭｅＰｈｏｓ）、または５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニル
であり得る。５’末端リン含有基が５’末端ビニルホスホネート（５’－ＶＰ）である場合、５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ異性体（すなわち、トランス－ビニルホスホネート、
）、
５’－Ｚ－ＶＰ異性体（すなわち、シス－ビニルホスホネート、
）
のいずれか、またはそれらの混合物であり得る。
一実施形態においては、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の５’末端においてリン含有基を含む。一実施形態においては、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の５’末端においてリン含有基を含む。
一実施形態においては、ＲＮＡｉ剤は、５’－Ｐを含む。一実施形態においては、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖内に５’－Ｐを含む。
一実施形態においては、ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳを含む。一実施形態においては、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖内に５’－ＰＳを含む。
一実施形態においては、ＲＮＡｉ剤は、５’－ＶＰを含む。一実施形態においては、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖内に５’－ＶＰを含む。一実施形態においては、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖内に５’－Ｅ－ＶＰを含む。一実施形態においては、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖内に５’－Ｚ－ＶＰを含む。
一実施形態においては、ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳ２を含む。一実施形態においては、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖内に５’－ＰＳ２を含む。
一実施形態においては、ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳ２を含む。一実施形態においては、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖内に５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルを含む。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳも含む。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐも含む。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはそれらの組み合わせであり得る。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳ２も含む。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐも含む。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳも含む。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはそれらの組み合わせであり得る。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳ２も含む。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐも含む。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１である。ｄｓＲＮＡ剤はまた、５’－ＰＳも含む。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはそれらの組み合わせであり得る。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳ２も含む。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐも含む。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳも含む。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはそれらの組み合わせであり得る。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳ２も含む。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐも含む。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳも含む。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはそれらの組み合わせであり得る。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１である。ｄｓＲＮＡｉ ＲＮＡ剤はまた、５’－ＰＳ２も含む。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐも含む。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳも含む。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはそれらの組み合わせであり得る。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳ２も含む。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐも含む。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳも含む。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはそれらの組み合わせであり得る。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳ２も含む。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐも含む。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳも含む。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはそれらの組み合わせであり得る。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳ２も含む。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐおよびターゲティングリガンドも含む。一実施形態においては、５’－Ｐは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、またターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳおよびターゲティングリガンドも含む。一実施形態においては、５’－ＰＳは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、またターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰ（例えば、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはそれらの組み合わせ）、およびターゲティングリガンドも含む。
一実施形態においては、５’－ＶＰは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、またターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳ２およびターゲティングリガンドも含む。一実施形態においては、５’－ＰＳ２は、アンチセンス鎖の５’末端にあり、またターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルおよびターゲティングリガンドも含む。一実施形態においては、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、またターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐおよびターゲティングリガンドも含む。一実施形態においては、５’－Ｐは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、またターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳおよびターゲティングリガンドも含む。一実施形態においては、５’－ＰＳは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、またターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰ（例えば、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはそれらの組み合わせ）、およびターゲティングリガンドも含む。一実施形態においては、５’－ＶＰは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、またターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳ２およびターゲティングリガンドも含む。一実施形態においては、５’－ＰＳ２は、アンチセンス鎖の５’末端にあり、またターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－ＯＭｅであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルおよびターゲティングリガンドも含む。一実施形態においては、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、またターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐおよびターゲティングリガンドも含む。一実施形態においては、５’－Ｐは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、またターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳおよびターゲティングリガンドも含む。一実施形態においては、５’－ＰＳは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、またターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰ（例えば、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはそれらの組み合わせ）、およびターゲティングリガンドも含む。一実施形態においては、５’－ＶＰは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、またターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳ２およびターゲティングリガンドも含む。一実施形態においては、５’－ＰＳ２は、アンチセンス鎖の５’末端にあり、またターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、Ｔ２’が２’－Ｆであり、ｑ４が２であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が５であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルおよびターゲティングリガンドも含む。一実施形態においては、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、またターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐおよびターゲティングリガンドも含む。一実施形態においては、５’－Ｐは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、またターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳおよびターゲティングリガンドも含む。一実施形態においては、５’－ＰＳは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、またターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰ（例えば、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはそれらの組み合わせ）、およびターゲティングリガンドも含む。一実施形態においては、５’－ＶＰは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、またターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳ２およびターゲティングリガンドも含む。一実施形態においては、５’－ＰＳ２は、アンチセンス鎖の５’末端にあり、またターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態においては、Ｂ１が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１が８であり、Ｔ１が２’Ｆであり、ｎ２が３であり、Ｂ２が２’－ＯＭｅであり、ｎ３が７であり、ｎ４が０であり、Ｂ３が２’－ＯＭｅであり、ｎ５が３であり、Ｂ１’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１が９であり、Ｔ１’が２’－Ｆであり、ｑ２が１であり、Ｂ２’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３が４であり、ｑ４が０であり、Ｂ３’が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５が７であり、Ｔ３’が２’－Ｆであり、ｑ６が１であり、Ｂ４’が２’－Ｆであり、またｑ７が１であり、これらはセンス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端から数えて）の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖の５’末端から数えて）の１位および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾ならびに１８～２３位の範囲内にある二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾とを伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルおよびターゲティングリガンドも含む。一実施形態においては、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、またターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
特定の実施形態においては、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）３’末端に結合したＡＳＧＰＲリガンドであって、三価分枝リンカーを介して結合した三つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、ＡＳＧＰＲリガンド、および
（ｉｉｉ）１位、３位、５位、７位、９位から１１位、１３位、１７位、１９位、および２１位における２’－Ｆ修飾、および２位、４位、６位、８位、１２位、１４位から１６位、１８位、および２０位における２’－ＯＭｅ修飾（５’末端から数えて）、
ならびに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）１位、３位、５位、９位、１１位から１３位、１５位、１７位、１９位、２１位および２３位における２’－ＯＭｅ修飾、および２位、４位、６位から８位、１０位、１４位、１６位、１８位、２０位および２２位における２’－Ｆ修飾（５’末端から数えて）、および
（ｉｉｉ）ヌクレオチド２１位と２２位の間、およびヌクレオチド２２位と２３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、を含み、
ｄｓＲＮＡ剤が、アンチセンス鎖の３’末端において二つのヌクレオチドのオーバーハングを有し、またアンチセンス鎖の５’末端において平滑末端を有する。
別の特定の実施形態においては、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）３’末端に結合したＡＳＧＰＲリガンドであって、三価分枝リンカーを介して結合した三つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、ＡＳＧＰＲリガンド、
（ｉｉｉ）１位、３位、５位、７位、９位から１１位、１３位、１５位、１７位、１９位、および２１位における２’－Ｆ修飾、および２位、４位、６位、８位、１２位、１４位、１６位、１８位、および２０位における２’－ＯＭｅ修飾（５’末端から数えて）、および
（ｉｖ）ヌクレオチドの１位と２位の間、およびヌクレオチドの２位と３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、
ならびに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）１位、３位、５位、７位、９位、１１位から１３位、１５位、１７位、１９位、および２１位から２３位における２’－ＯＭｅ修飾、および２位、４位、６位、８位、１０位、１４位、１６位、１８位、および２０位における２’Ｆ修飾（５’末端から数えて）、および
（ｉｉｉ）ヌクレオチドの１位と２位の間、ヌクレオチドの２位と３位の間、ヌクレオチドの２１位と２２位の間、およびヌクレオチドの２２位および２３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、を含み、
ＲＮＡｉ剤が、アンチセンス鎖の３’末端において二つのヌクレオチドのオーバーハングを有し、またアンチセンス鎖の５’末端において平滑末端を有する。
別の特定の実施形態においては、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）３’末端に結合したＡＳＧＰＲリガンドであって、三価分枝リンカーを介して結合した三つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、ＡＳＧＰＲリガンド、
（ｉｉｉ）１位から６位、８位、１０位、および１２位から２１位における２’－ＯＭｅ修飾、７位および９位における２’－Ｆ修飾、および１１位におけるデオキシ－ヌクレオチド（例えば、ｄＴ）（５’末端から数えて）、および
（ｉｖ）ヌクレオチドの１位と２位の間、およびヌクレオチドの２位と３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、
ならびに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）１位、３位、７位、９位、１１位、１３位、１５位、１７位、および１９位から２３位における２’－ＯＭｅ修飾、および２位、４位から６位、８位、１０位、１２位、１４位、１６位、および１８位における２’－Ｆ修飾（５’末端から数えて）、および
（ｉｉｉ）ヌクレオチドの１位と２位の間、ヌクレオチドの２位と３位の間、ヌクレオチドの２１位と２２位の間、およびヌクレオチドの２２位および２３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、を含み、
ＲＮＡｉ剤が、アンチセンス鎖の３’末端において二つのヌクレオチドのオーバーハングを有し、またアンチセンス鎖の５’末端において平滑末端を有する。
別の特定の実施形態においては、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）３’末端に結合したＡＳＧＰＲリガンドであって、三価分枝リンカーを介して結合した三つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、ＡＳＧＰＲリガンド、
（ｉｉｉ）１位から６位、８位、１０位、１２位、１４位、および１６位から２１位における２’－ＯＭｅ修飾、および７位、９位、１１位、１３位、および１５位における２’－Ｆ修飾、および
（ｉｖ）ヌクレオチドの１位と２位の間、およびヌクレオチドの２位と３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、
ならびに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）１位、５位、７位、９位、１１位、１３位、１５位、１７位、１９位、および２１位から２３位における２’－ＯＭｅ修飾、および２位から４位、６位、８位、１０位、１２位、１４位、１６位、１８位、および２０位における２’－Ｆ修飾（５’末端から数えて）、および
（ｉｉｉ）ヌクレオチドの１位と２位の間、ヌクレオチドの２位と３位の間、ヌクレオチドの２１位と２２位の間、およびヌクレオチドの２２位および２３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、を含み、
ＲＮＡｉ剤が、アンチセンス鎖の３’末端において二つのヌクレオチドのオーバーハングを有し、またアンチセンス鎖の５’末端において平滑末端を有する。
別の特定の実施形態においては、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）３’末端に結合したＡＳＧＰＲリガンドであって、三価分枝リンカーを介して結合した三つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、ＡＳＧＰＲリガンド、
（ｉｉｉ）１位から９位、１２位から２１位における２’－ＯＭｅ修飾、および１０位および１１位における２’－Ｆ修飾、および
（ｉｖ）ヌクレオチドの１位と２位の間、およびヌクレオチドの２位と３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、
ならびに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）１位、３位、５位、７位、９位、１１位から１３位、１５位、１７位、１９位、および２１位から２３位における２’－ＯＭｅ修飾、および２位、４位、６位、８位、１０位、１４位、１６位、１８位、および２０位における２’－Ｆ修飾（５’末端から数えて）、および
（ｉｉｉ）ヌクレオチドの１位と２位の間、ヌクレオチドの２位と３位の間、ヌクレオチドの２１位と２２位の間、およびヌクレオチドの２２位および２３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、を含み、
ＲＮＡｉ剤が、アンチセンス鎖の３’末端において二つのヌクレオチドのオーバーハングを有し、またアンチセンス鎖の５’末端において平滑末端を有する。
別の特定の実施形態においては、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）３’末端に結合したＡＳＧＰＲリガンドであって、三価分枝リンカーを介して結合した三つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、ＡＳＧＰＲリガンド、
（ｉｉｉ）１位、３位、５位、７位、９位から１１位、および１３位における２’－Ｆ修飾、および２位、４位、６位、８位、１２位、および１４位から２１位における２’－ＯＭｅ修飾、および
（ｉｖ）ヌクレオチドの１位と２位の間、およびヌクレオチドの２位と３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、
ならびに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）１位、３位、５位から７位、９位、１１位から１３位、１５位、１７位から１９位、および２１位から２３位における２’－ＯＭｅ修飾、および２位、４位、８位、１０位、１４位、１６位、および２０位における２’－Ｆ修飾（５’末端から数えて）、および
（ｉｉｉ）ヌクレオチドの１位と２位の間、ヌクレオチドの２位と３位の間、ヌクレオチドの２１位と２２位の間、およびヌクレオチドの２２位および２３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、を含み、
ＲＮＡｉ剤が、アンチセンス鎖の３’末端において二つのヌクレオチドのオーバーハングを有し、またアンチセンス鎖の５’末端において平滑末端を有する。
別の特定の実施形態においては、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）３’末端に結合したＡＳＧＰＲリガンドであって、三価分枝リンカーを介して結合した三つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、ＡＳＧＰＲリガンド、
（ｉｉｉ）１位、２位、４位、６位、８位、１２位、１４位、１５位、１７位、および１９位から２１位における２’－ＯＭｅ修飾、および３位、５位、７位、９位から１１位、１３位、１６位、および１８位における２’－Ｆ修飾、および
（ｉｖ）ヌクレオチドの１位と２位の間、およびヌクレオチドの２位と３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、
ならびに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２５ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）１位、４位、６位、７位、９位、１１位から１３位、１５位、１７位、および１９位から２３位における２’－ＯＭｅ修飾、２位、３位、５位、８位、１０位、１４位、１６位、および１８位における２’－Ｆ修飾、および２４位および２５位におけるデオキシ－ヌクレオチド（例えば、ｄＴ）（５’末端から数えて）、および
（ｉｉｉ）ヌクレオチドの１位と２位の間、ヌクレオチドの２位と３位の間、ヌクレオチドの２１位と２２位の間、およびヌクレオチドの２２位および２３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、を含み、
ＲＮＡｉ剤が、アンチセンス鎖の３’末端において四つのヌクレオチドのオーバーハングを有し、またアンチセンス鎖の５’末端において平滑末端を有する。
別の特定の実施形態においては、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）３’末端に結合したＡＳＧＰＲリガンドであって、三価分枝リンカーを介して結合した三つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、ＡＳＧＰＲリガンド、
（ｉｉｉ）１位から６位、８位、および１２位から２１位における２’－ＯＭｅ修飾、および７位、および９位から１１位における２’－Ｆ修飾、および
（ｉｖ）ヌクレオチドの１位と２位の間、およびヌクレオチドの２位と３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、
ならびに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）１位、３位から５位、７位、８位、１０位から１３位、１５位、および１７位から２３位における２’－ＯＭｅ修飾、および２位、６位、９位、１４位、および１６位における２’－Ｆ修飾（５’末端から数えて）、および
（ｉｉｉ）ヌクレオチドの１位と２位の間、ヌクレオチドの２位と３位の間、ヌクレオチドの２１位と２２位の間、およびヌクレオチドの２２位および２３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、を含み、
ＲＮＡｉ剤が、アンチセンス鎖の３’末端において二つのヌクレオチドのオーバーハングを有し、またアンチセンス鎖の５’末端において平滑末端を有する。
別の特定の実施形態においては、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）３’末端に結合したＡＳＧＰＲリガンドであって、三価分枝リンカーを介して結合した三つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、ＡＳＧＰＲリガンド、
（ｉｉｉ）１位から６位、８位、および１２位から２１位における２’－ＯＭｅ修飾、および７位、および９位から１１位における２’－Ｆ修飾、および
（ｉｖ）ヌクレオチドの１位と２位の間、およびヌクレオチドの２位と３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、
ならびに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）１位、３位から５位、７位、１０位から１３位、１５位、および１７位から２３位における２’－ＯＭｅ修飾、および２位、６位、８位、９位、１４位、および１６位における２’－Ｆ修飾（５’末端から数えて）、および
（ｉｉｉ）ヌクレオチドの１位と２位の間、ヌクレオチドの２位と３位の間、ヌクレオチドの２１位と２２位の間、およびヌクレオチドの２２位および２３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、を含み、
ＲＮＡｉ剤が、アンチセンス鎖の３’末端において二つのヌクレオチドのオーバーハングを有し、またアンチセンス鎖の５’末端において平滑末端を有する。
別の特定の実施形態においては、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）以下を有するセンス鎖：
（ｉ）１９ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）３’末端に結合したＡＳＧＰＲリガンドであって、三価分枝リンカーを介して結合した三つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含む、ＡＳＧＰＲリガンド、
（ｉｉｉ）１位から４位、６位、および１０位から１９位における２’－ＯＭｅ修飾、および５位、および７位から９位における２’－Ｆ修飾、および
（ｉｖ）ヌクレオチドの１位と２位の間、およびヌクレオチドの２位と３位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、
ならびに
（ｂ）以下を有するアンチセンス鎖：
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ、
（ｉｉ）１位、３位から５位、７位、１０位から１３位、１５位、および１７位から２１位における２’－ＯＭｅ修飾、および２位、６位、８位、９位、１４位、および１６位における２’－Ｆ修飾（５’末端から数えて）、および
（ｉｉｉ）ヌクレオチドの１位と２位の間、ヌクレオチドの２位と３位の間、ヌクレオチドの１９位と２０位の間、およびヌクレオチドの２０位および２１位の間（５’末端から数えて）のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、を含み、
ＲＮＡｉ剤が、アンチセンス鎖の３’末端において二つのヌクレオチドのオーバーハングを有し、またアンチセンス鎖の５’末端において平滑末端を有する。
特定の実施形態においては、本発明の方法で使用するｉＲＮＡは、表２～３および７～８のいずれか一から選択される剤から選択される剤である。これら剤は、リガンドをさらに含み得る。
ＩＩＩ．リガンドにコンジュゲートしたｉＲＮＡ
本発明のｉＲＮＡのＲＮＡの別の修飾は、ｉＲＮＡの活性、細胞分布または例えば細胞内への細胞取り込みを増強する一つまたは複数のリガンド、部分またはコンジュゲートと、ｉＲＮＡを化学的に連結することを含む。かかる部分としては、コレステロール部分などの脂質部分が挙げられるが、これらに限定されない（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３－６５５６）。他の実施形態においては、リガンドは、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４：１０５３－１０６０）、チオエーテル、例えばベリル－Ｓ－トリチルチオール（ｂｅｒｙｌ－Ｓ－ｔｒｉｔｙｌｔｈｉｏｌ）（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６－３０９、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５－２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３－５３８）、脂肪鎖、例えばドデカンジオール残基またはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１９９１，１０：１１１１－１１１８、Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７－３３０、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９－５４）、リン脂質、例えばジヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１－３６５４、Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７－３７８３）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９－９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１－３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９－２３７）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ－カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３－９３７）である。
特定の実施形態においては、リガンドは、それが組み込まれるｉＲＮＡ剤の分布、ターゲティング、または寿命を変化させる。一部の実施形態においては、リガンドは、例えばこのようなリガンドが存在しない種と比較した場合に、選択された標的に対する、例えば分子、細胞または細胞型、例えば細胞または臓器のコンパートメントなどのコンパートメント、組織、身体の器官または領域に対する、親和性の増強をもたらす。一部の実施形態においては、リガンドは、二本鎖核酸における二本鎖対合には関与しない。
リガンドとしては、天然に存在する物質、例えばタンパク質（例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）またはグロブリン）、炭水化物（例えばデキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミンまたはヒアルロン酸）、または脂質等を挙げることができる。リガンドはまた、組換え分子または合成分子、例えば合成ポリマー、例えば合成ポリアミノ酸であり得る。ポリアミノ酸の例としては、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－無水マレイン酸共重合体、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド（Ｌ－ｌａｃｔｉｄｅ－ｃｏ－ｇｌｙｃｏｌｉｅｄ））共重合体、ジビニルエーテル－無水マレイン酸共重合体、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸（ｐｏｌｙ（２－ｅｔｈｙｌａｃｒｙｌｌｉｃ ａｃｉｄ））、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはポリホスファジンであるポリアミノ酸が挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩またはαヘリックスペプチドが挙げられる。
リガンドはまた、ターゲティング基が含まれ得、例えば細胞または組織ターゲティング剤であり、例えばレクチンであり、例えば腎細胞など特定の細胞型に結合する糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば抗体である。ターゲティング基は、甲状腺刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤プロテインＡ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ビオチン、またはＲＧＤペプチドもしくはＲＧＤペプチド模倣体であり得る。特定の実施形態においては、リガンドは、多価ガラクトース、例えばＮ－アセチル－ガラクトサミンである。
リガンドの他の例としては、色素、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラーレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン（ｔｅｘａｐｈｙｒｉｎ）、サフィリン（Ｓａｐｐｈｙｒｉｎ））、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子、例えばコレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレンブタン酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進物質（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾールコンジュゲート、テトラアザマクロサイクルのＥｕ３＋錯体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰまたはＡＰが挙げられる。
リガンドは、タンパク質、例えば糖タンパク質、またはペプチド、例えば共リガンド（ｃｏ－ｌｉｇａｎｄ）に対して特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば肝細胞などである特定の細胞型に結合する抗体、であり得る。リガンドにはまた、ホルモンおよびホルモン受容体が含まれ得る。それらにはまた、非ペプチド種、例えば脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補助因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノースまたは多価フコース、が含まれ得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼのアクチベーターまたはＮＦ－κＢのアクチベーターであり得る。
リガンドは、例えば細胞の細胞骨格系を破壊することによって、例えば細胞の微小管、微小線維または中間径線維を破壊することによって、細胞内へのｉＲＮＡ剤の取り込みを増大し得る物質、例えば薬物であり得る。薬物は、例えば、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ、ラトルンクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ（ｓｗｉｎｈｏｌｉｄｅ Ａ）、インダノシン（ｉｎｄａｎｏｃｉｎｅ）またはミオセルビン（ｍｙｏｓｅｒｖｉｎ）であり得る。
一部の実施形態においては、本明細書において記載するｉＲＮＡに結合するリガンドは、薬物動態モジュレーター（ＰＫモジュレーター）として作用する。ＰＫモジュレーターとしては、親油性物質、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが挙げられる。例示的ＰＫモジュレーターとしては、これに限定されないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられる。いくつかのホスホロチオエート連結を含むオリゴヌクレオチドはまた、血清タンパク質に結合することが知られており、従って、短いオリゴヌクレオチド、例えば骨格中に複数のホスホロチオエート連結を含む、約５塩基、１０塩基、１５塩基または２０塩基のオリゴヌクレオチドもまた、リガンドとして（例えば、ＰＫ調節リガンドとして）本発明に適している。さらに、血清成分（例えば、血清タンパク質）を結合するアプタマーもまた、本明細書において記載する実施形態においてＰＫ調節リガンドとして使用するのに適している。
本発明のリガンドがコンジュゲートしたｉＲＮＡは、反応性官能性ペンダント側鎖を有するオリゴヌクレオチドの使用によって合成でき、例えば該ペンダント側鎖は該オリゴヌクレオチド（以下に記載される）上への連結分子の結合に由来するものなどである。この反応性オリゴヌクレオチドを、市販のリガンド、種々の保護基のいずれかを有する合成されたリガンド、またはそれに結合する連結部分を有するリガンドと、直接反応させてもよい。
本発明のコンジュゲートにおいて使用するオリゴヌクレオチドは、固相合成の周知の技術によって好都合に、ごく普通に作製できる。このような合成のための機器は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）社（カリフォルニア州、フォスターシティ）をはじめとするいくつかのベンダーによって販売されている。当技術分野で公知であるこうした合成のための任意の他の方法を、追加的に、または代替として、使用してもよい。例えばホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などである、他のオリゴヌクレオチドを調製する同様の技術を使用することも知られている。
本発明のリガンドがコンジュゲートしたｉＲＮＡおよびリガンド分子を保有する配列特異的な連結ヌクレオシドにおいて、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドは、標準ヌクレオチドまたはヌクレオシドの前駆体を利用する好適なＤＮＡシンセサイザー、または連結部分を既に保有するヌクレオチドもしくはヌクレオシドのコンジュゲート前駆体、リガンド分子を既に保有するリガンドヌクレオチドもしくはリガンドヌクレオシドのコンジュゲート前駆体、または非ヌクレオシドリガンド保有構成単位上において組み立てられ得る。
連結部分を既に保有するヌクレオチド－コンジュゲート前駆体を使用する場合には、典型的に、配列特異的に連結されるヌクレオシドの合成が完了してから、次いで、リガンド分子が連結部分と反応して、リガンドがコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドを形成する。一部の実施形態においては、本発明のオリゴヌクレオチドまたは連結ヌクレオシドは、市販の、オリゴヌクレオチド合成でごく普通に使用する標準ホスホラミダイトおよび非標準ホスホラミダイトに加えて、リガンド－ヌクレオシドコンジュゲートから誘導したホスホラミダイトを使用して、自動化シンセサイザーによって合成される。
Ａ．脂質コンジュゲート
特定の実施形態においては、リガンドまたはコンジュゲートは、脂質または脂質系分子である。一実施形態において、このような脂質または脂質系分子は、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を結合する。ＨＳＡ結合性リガンドは、身体の標的組織への、例えば腎臓でない標的組織への、コンジュゲートの分布を可能にする。例えば標的組織は、肝臓の実質細胞を含めた肝臓であり得る。ＨＳＡを結合可能である他の分子もまた、リガンドとして使用できる。例えば、ナプロキセンまたはアスピリンを使用できる。脂質または脂質系リガンドは、（ａ）コンジュゲートの分解に対する耐性を増大できる、（ｂ）標的の細胞もしくは細胞膜内へのターゲティングもしくは輸送を増大できる、または（ｃ）血清タンパク質、例えばＨＳＡへの結合を調整するために使用できる。
脂質系リガンドを使用して、標的組織へのコンジュゲートの結合を阻害する、例えば制御することができる。例えば、より強力にＨＳＡに結合する脂質または脂質系リガンドは、腎臓を標的とする可能性が低く、したがって身体から排除される可能性が低くなる。コンジュゲートが腎臓を標的とするように、あまり強力にＨＳＡに結合しない脂質または脂質系リガンドを使用することができる。
特定の実施形態においては、脂質系リガンドは、ＨＳＡを結合する。一実施形態においては、それはコンジュゲートが非腎臓組織に分布されることとなるように、十分な親和性でＨＳＡを結合する。しかしながら、この親和性は、ＨＳＡ－リガンド間結合を元に戻すことができないほど強力ではないことが好ましい。
他の実施形態では、脂質系リガンドは、ＨＳＡを弱く結合するか、または全く結合しない。一実施形態では、コンジュゲートは腎臓に分布される。脂質系リガンドの代わりに、またはそれに加えて、腎臓細胞を標的とする他の部分も使用できる。
別の態様においては、リガンドは、標的細胞、例えば増殖性細胞によって取り込まれる、例えばビタミンである部分である。これらは、例えば悪性または非悪性種の、例えばがん細胞の望まれない細胞増殖を特徴とする障害の治療に特に有用である。例示的ビタミンとしては、ビタミンＡ、ＥおよびＫが挙げられる。他の例示的ビタミンとしては、ビタミンＢ、例えば葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、または肝細胞等の標的細胞によって取り込まれる他のビタミンまたは栄養素が挙げられる。ＨＳＡおよび低比重リポタンパク（ＬＤＬ）もまた挙げられる。
Ｂ．細胞透過剤
別の態様においては、リガンドは、細胞透過剤、例えばヘリックス細胞透過剤などである。一実施形態においては、該細胞透過剤は、両親媒性である。例示的な細胞透過剤としては、例えばｔａｔまたはａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａなどのペプチドがある。該細胞透過剤がペプチドである場合、それは修飾可能であり、これにはぺプチジル模倣体、逆位の異性体（ｉｎｖｅｒｔｏｍｅｒ）、非ペプチドまたはシュードペプチドの連結およびＤ－アミノ酸の使用が挙げられる。一実施形態においては、ヘリックス剤は、親油性相および疎油性相を有するアルファヘリックス剤である。
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣体（本明細書においてオリゴペプチド模倣体とも称する）は、天然ペプチドと類似する規定された三次元構造にフォールディング可能な分子である。ペプチドおよびペプチド模倣体のｉＲＮＡ剤への結合は、細胞認識および吸収を増強することなどによって、ｉＲＮＡの薬物動態分布に影響を及ぼし得る。ペプチドまたはペプチド模倣体部分は、約５～５０アミノ酸長であり得、例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸長である。
ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば、細胞透過ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチドまたは疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束されたペプチドまたは架橋されたペプチドであり得る。別の選択肢としては、ペプチド部分は、疎水性の膜輸送配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドとしては、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号１４）を有するＲＦＧＦがある。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号１５）はまた、ターゲティング部分であり得る。ペプチド部分は「送達」ペプチドであり得、これはペプチド、オリゴヌクレオチド、および細胞膜横断タンパク質を含む大きな極性分子を担持することができる。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号１６））およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１７））よりの配列は、送達ペプチドとして機能する能力があることが見出されている。ペプチドまたはペプチド模倣体は、ＤＮＡのランダム配列によってコードされ得、例えばファージディスプレイライブラリーまたはｏｎｅ－ｂｅａｄ－ｏｎｅ化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリー（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２－８４，１９９１）から特定されるペプチドなどである。細胞ターゲティングの目的のために組み込まれた単量体ユニットを介してｄｓＲＮＡ剤に係留したペプチドまたはペプチド模倣体の例としては、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）－ペプチドまたはＲＧＤ模倣体がある。ペプチド部分は、長さが、約５アミノ酸～約４０アミノ酸の範囲であり得る。ペプチド部分は、例えば安定性を増大させるまたは立体配座特性を司るなどの構造的な修飾を有し得る。以下に記載する構造的な修飾のいずれもが利用可能である。
本発明の組成物および方法において使用するためのＲＧＤペプチドは、直鎖状であっても環状であってもよく、また特定の組織へのターゲティングを促進するように修飾、例えばグリコシル化またはメチル化、されてもよい。ＲＧＤ含有ペプチドおよびペプチジオ模倣体（ｐｅｐｔｉｄｉｏｍｉｍｅｍｔｉｃ）は、Ｄ－アミノ酸ならびに合成ＲＧＤ模倣体を含み得る。ＲＧＤに加えて、例えばＰＥＣＡＭ－１またはＶＥＧＦなどであるインテグリンリガンドを標的とする他の部分を使用できる。
「細胞透過ペプチド」は、細胞に、例えばバクテリア細胞もしくは真菌細胞などである微生物細胞、または例えばヒト細胞などである哺乳類細胞に、透過可能である。微生物細胞透過性ペプチドは、例えばα－ヘリックス直鎖ペプチド（例えば、ＬＬ－３７またはセロピン（Ｃｅｒｏｐｉｎ）Ｐ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α－デフェンシン、β－デフェンシンまたはバクテネシン（ｂａｃｔｅｎｅｃｉｎ））または一つもしくは二つの支配的なアミノ酸のみを含有するペプチド（例えば、ＰＲ－３９またはインドリシジン）であり得る。細胞透過性ペプチドはまた、核移行シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。例えば、細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ－１ ｇｐ４１とＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳとの融合ペプチドドメインに由来する、例えばＭＰＧなどである、二部分の両親媒性ペプチドであり得る（Ｓｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７－２７２４，２００３）。
Ｃ．炭水化物コンジュゲート
本発明の組成物および方法の一部の実施形態においては、ｉＲＮＡは、炭水化物をさらに含む。炭水化物をコンジュゲートしたｉＲＮＡは、本明細書に記載するように、核酸のインビボでの送達に有利であると同時にインビボでの治療的使用に適した組成物である。本明細書において使用する場合、「炭水化物」とは、各炭素原子に結合した酸素、窒素もしくは硫黄原子とともに少なくとも六個の炭素原子を有する一もしくは複数の単糖単位で構成されている炭水化物自体（直鎖状、分枝または環状であり得る）、またはその一部として、各炭素原子に結合した酸素、窒素もしくは硫黄原子とともに各々が少なくとも６個の炭素原子を有する一または複数の単糖単位で構成されている炭水化物部分（直鎖状、分枝または環状であり得る）を有する化合物、のいずれかである化合物を指す。代表的な炭水化物としては、糖（単糖、二糖、三糖、および約４、５、６、７、８または９の単糖単位からなるオリゴ糖）ならびに多糖、例えばデンプン、グリコーゲン、セルロースおよび多糖類樹脂、が挙げられる。特定の単糖としては、Ｃ５、および上記の（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８）糖が挙げられ、二糖および三糖としては、二または三の単糖単位（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８）を有する糖が挙げられる。
特定の実施形態においては、本発明の組成物および方法において使用する炭水化物コンジュゲートは、単糖である。
特定の実施形態においては、単糖は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。一つまたは複数のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体を含むＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、例えば米国特許第８，１０６，０２２号に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態においては、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、ｉＲＮＡが特定の細胞を標的にするリガンドとして機能する。一部の実施形態においては、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、例えば肝臓の細胞（例えば、肝細胞）のアシアロ糖タンパク質受容体のリガンドとして機能することによって、ｉＲＮＡが肝臓の細胞を標的にする。
一部の実施形態においては、炭水化物コンジュゲートは、一つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。ＧａｌＮＡｃ誘導体は、リンカーを介して、例えば二価または三価の分枝リンカーを介して、結合させることができる。一部の実施形態においては、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、センス鎖の３’末端にコンジュゲートされる。一部の実施形態においては、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、リンカーを介して、例えば本明細書において記載するようなリンカーを介して、ｉＲＮＡ剤に（例えば、センス鎖の３’末端に）コンジュゲートされる。一部の実施形態においては、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、センス鎖の５’末端にコンジュゲートされる。一部の実施形態においては、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、リンカーを介して、例えば本明細書において記載するようなリンカーを介して、ｉＲＮＡ剤に（例えば、センス鎖の５’末端に）コンジュゲートされる。
本発明の特定の実施形態においては、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、一価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合する。一部の実施形態においては、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、二価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合する。本発明のさらに他の実施形態においては、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、三価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合する。本発明の他の実施形態においては、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、四価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合する。
特定の実施形態においては、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ｉＲＮＡ剤に結合した一のＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。特定の実施形態においては、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、複数の（例えば、２、３、４、５または６の）ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含み、この各々は、独立して、複数の一価リンカーを介して二本鎖ＲＮＡｉ剤の複数のヌクレオチドに結合する。
一部の実施形態においては、例えば、本発明のｉＲＮＡ剤の二本の鎖が、複数の対合しないヌクレオチドを含むヘアピンループを形成する、一方の鎖の３’末端と、対応するもう一方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの中断されない鎖によって接続した一つのより大きな分子の一部である場合には、該ヘアピンループ内の対合しないヌクレオチドは各々、一価リンカーを介して結合したＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を独立に含み得る。このヘアピンループはまた、二本鎖のうち一方の鎖内の伸長したオーバーハングによって形成される場合もある。
一部の実施形態においては、例えば、本発明のｉＲＮＡ剤の二本の鎖が、複数の対合しないヌクレオチドを含むヘアピンループを形成する、一方の鎖の３’末端と、対応するもう一方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの中断されない鎖によって接続した一つのより大きな分子の一部である場合には、該ヘアピンループ内の対合しないヌクレオチドは各々、一価リンカーを介して結合したＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を独立に含み得る。このヘアピンループはまた、二本鎖のうち一方の鎖内の伸長したオーバーハングによって形成される場合もある。
一実施形態においては、本発明の組成物および方法において使用するための炭水化物コンジュゲートは、以下からなる群から選択される：
式ＩＩ、
式ＩＩＩ、
式ＩＶ、
式Ｖ、
式ＶＩ、
式ＶＩＩ、
式ＶＩＩＩ、
式ＩＸ、
式Ｘ、
式ＸＩ、
式ＸＩＩ、
式ＸＩＩＩ、
式ＸＩＶ、
式ＸＶ、
式ＸＶＩ、
式ＸＶＩＩ、
式ＸＶＩＩＩ、
式ＸＩＸ、
式ＸＸ、
式ＸＸＩ、
式ＸＸＩＩ、
式ＸＸＩＩＩ、
、
式中、ＹはＯまたはＳであり、ｎは３～６であり（式ＸＸＩＶ）、
、
式中、ＹはＯまたはＳであり、ｎは３～６であり（式ＸＸＶ）、
式ＸＸＶＩ、
、
式中、ＸはＯまたはＳであり（式ＸＸＶＩＩ）、
式ＸＸＶＩＩ、式ＸＸＩＸ、
式ＸＸＸ、
式ＸＸＸＩ、
式ＸＸＸＩＩ、
式ＸＸＸＩＩＩ、
式ＸＸＸＩＶ。
別の実施形態においては、本発明の組成物および方法において使用する炭水化物コンジュゲートは、単糖である。一実施形態においては、単糖は、Ｎ－アセチルガラクトサミンであり、例えば
式ＩＩ、
などである。
一部の実施形態においては、ＲＮＡｉ剤は、以下の概略図で示すようなリンカーを介して炭水化物コンジュゲートに結合し、式中Ｘは、ＯまたはＳである。
一部の実施形態においては、ＲＮＡｉ剤は、表１において規定され、以下に示す、Ｌ９６にコンジュゲートする。
本明細書において記載する実施形態において使用するための別の代表的な炭水化物コンジュゲートとしては、これに限定されないが、
（式ＸＸＸＶＩ）、が挙げられ、ＸまたはＹのうち一方がオリゴヌクレオチドである場合は、もう一方が水素である。
一部の実施形態においては、適したリガンドは、国際公開第２０１９／０５５６３３号において開示されるリガンドであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態においては、リガンドは、以下の構造を含む。
本発明の特定の実施形態においては、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、一価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合する。一部の実施形態においては、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、二価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合する。本発明のさらに他の実施形態においては、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、三価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合する。
一実施形態においては、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ｉＲＮＡ剤に結合した一または複数のＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。ＧａｌＮＡｃは、センス鎖またはアンチセンス（ａｎｔｓｉｓｅｎｓｅ）鎖上のリンカーを介して任意のヌクレオチドに結合し得る。ＧａｌＮａｃは、センス鎖の５’末端、センス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の５’末端またはアンチセンス鎖の３’末端に結合し得る。一実施形態においては、ＧａｌＮＡｃは、例えば三価リンカーを介して、センス鎖の３’末端に結合する。
他の実施形態においては、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、複数の（例えば、２、３、４、５または６の）ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含み、各々が独立に、複数のリンカー、例えば一価リンカーを介して、二本鎖ＲＮＡｉ剤の複数のヌクレオチドに結合する。
一部の実施形態においては、例えば、本発明のｉＲＮＡ剤の二本の鎖が、複数の対合しないヌクレオチドを含むヘアピンループを形成する、一方の鎖の３’末端と、対応するもう一方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの中断されない鎖によって接続した一つのより大きな分子の一部である場合には、該ヘアピンループ内の対合しないヌクレオチドは各々、一価リンカーを介して結合したＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を独立に含み得る。
一部の実施形態においては、炭水化物コンジュゲートは、これに限定されないがＰＫモジュレーターまたは細胞透過ペプチドなどである、上記のような一または複数のさらなるリガンドをさらに含む。
本発明において使用するのに適したさらなる炭水化物コンジュゲートおよびリンカーとしては、ＰＣＴ公開公報である国際公開第２０１４／１７９６２０号および国際公開第２０１４／１７９６２７号に記載されるものが挙げられ、当該公報は各々の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Ｄ．リンカー
一部の実施形態においては、本明細書において記載するコンジュゲートまたはリガンドを、切断可能である場合も切断可能でない場合もある種々のリンカーを用いてｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに結合させることができる。
「リンカー」または「連結基」という用語は、化合物の二つの部分を接続する、例えば化合物の二つの部分を共有結合で結合させる、有機部分を意味する。典型的には、リンカーは、直接結合、または酸素もしくは硫黄などの原子、ＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨなどのユニット、または原子の鎖であって、例えばこれに限定されるものではないが、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、ヘテロシクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘレロシクリルアルキニル（ａｌｋｙｌｈｅｒｅｒｏｃｙｃｌｙｌａｌｋｙｎｙｌ）、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘレロアリール（ａｌｋｙｎｙｌｈｅｒｅｒｏａｒｙｌ）など、を含み、一もしくは複数のメチレンが、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、または置換もしくは非置換複素環によって中断または終結され得、式中、Ｒ８は、水素、アシル、脂肪族、または置換された脂肪族である。一実施形態においては、リンカーは、約１～２４原子、２～２４、３～２４、４～２４、５～２４、６～２４、６～１８、７～１８、８～１８、７～１７、８～１７、６～１６、７～１７、または８～１６原子である。
切断可能な連結基とは、細胞の外部で十分に安定であるが、標的細胞内に入ると、切断されて、リンカーが一緒に保持している二つの部分を放出する基である。例示的な一実施形態においては、切断可能な連結基は、対象の血液中で、または第二の参照条件下（例えば血液または血清中で見られる条件を模倣または表すように選択され得る）においてよりも、標的細胞において、または第一の参照条件下（例えば、細胞内条件を模倣または表すように選択され得る）で、少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、またはそれ以上、または少なくとも１００倍速い速度で切断される。
切断可能な連結基は、切断剤、例えばｐＨ、酸化還元電位または分解性分子の存在、の影響を受け易い。概して切断剤は、血清または血液中においてよりも、細胞の内部で、より広範に広がっているかまたはより高いレベルもしくは活性で見られる。このような分解剤の例としては、特定の基質のために選択される、または基質特異性を有さない酸化還元剤、例えば還元によって酸化還元切断可能な連結基を分解できる、細胞中に存在する、例えばメルカプタンなどの酸化酵素もしくは還元酵素または還元剤や、エステラーゼや、エンドソームまたは酸性環境を作出できる試薬、例えば５以下のｐＨをもたらす試薬や、一般酸、ペプチダーゼ（基質特異的であり得る）およびホスファターゼとして作用することによって酸切断可能な連結基を加水分解もしくは分解できる酵素が挙げられる。
切断可能な連結基、例えばジスルフィド結合などは、ｐＨの影響を受け易い場合がある。ヒト血清のｐＨは７．４であるが、平均細胞内ｐＨはわずかに低く、約７．１～７．３の範囲である。エンドソームは、５．５～６．０の範囲のより酸性のｐＨであり、またリソソームは、およそ５．０のさらにより酸性のｐＨである。一部のリンカーは、選択されたｐＨで切断され、それによって細胞の内部でリガンドから、または細胞の所望のコンパートメント中に、カチオン性脂質を放出するものである、切断可能な連結基を有することとなる。
リンカーは、特定の酵素によって切断可能である切断可能な連結基を含み得る。リンカー中に組み込まれる切断可能な連結基の種類は、標的にする細胞に左右され得る。例えば、肝臓ターゲティングリガンドは、エステル基を含むリンカーを介してカチオン性脂質に連結できる。肝細胞は、エステラーゼが豊富であるため、リンカーは、肝細胞中では、エステラーゼが豊富でない細胞型においてよりも効率的に切断されることとなる。エステラーゼが豊富な他の細胞型としては、肺、腎皮質および精巣の細胞が挙げられる。
肝細胞および滑膜細胞などのペプチダーゼが豊富な細胞型を標的とする場合には、ペプチド結合を含有するリンカーを使用することができる。
概して、候補の切断可能な連結基の適合性は、分解剤が候補連結基を切断する能力（または条件）を試験することによって評価可能である。また、血液中で、または他の非標的組織と接触したときに、切断に抵抗する能力について候補の切断可能な連結基を試験することもまた望ましいであろう。したがって、第一および第二の条件の間での切断に対する相対的な感受性を決定することができるものであり、ここで第一の条件は、標的細胞において切断を示すように選択され、第二の条件は、他の組織または生物学的流体中で、例えば血液もしくは血清中で、切断を示すように選択される。評価は、無細胞系において、細胞において、細胞培養液において、臓器または組織の培養液において、または動物全身において、実施され得る。無細胞条件または培養条件において最初の評価を行うことおよび動物全身におけるさらなる評価によって確認することが、有用であり得る。特定の実施形態においては、有用な候補化合物は、血液もしくは血清（または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で）と比較して、細胞中で（または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で）少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００倍速く切断される。
ｉ．酸化還元切断可能な連結基
特定の実施形態においては、切断可能な連結基は、還元または酸化の際に切断される酸化還元切断可能な連結基である。還元的に切断可能な連結基の例としては、ジスルフィド連結基（－Ｓ－Ｓ－）が挙げられる。候補の切断可能な連結基が、適した「還元的に切断可能な連結基」であるか、または例えば、特定のｉＲＮＡ部分および特定のターゲティング剤とともに使用するのに適しているか否かを決定するために、本明細書において記載する方法に目を向けることができる。例えば、細胞中であって、例えば標的細胞中で観察されるであろう切断の速度を模倣する、当技術分野で公知の試薬を使用してジチオスレイトール（ＤＴＴ）または他の還元剤とともにインキュベートすることによって、候補を評価することができる。候補はまた、血液または血清条件を模倣するように選択された条件下で評価することもできる。ある条件においては、候補化合物は、血液中で最大約１０％切断される。他の実施形態においては、有用な候補化合物は、血液中（または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比較して、細胞中で（または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で）少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または約１００倍速い速度で分解される。候補化合物の切断の速度は、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下での標準酵素動態アッセイを用いて決定され、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較され得る。
ｉｉ．ホスフェート系の切断可能な連結基
他の実施形態においては、切断可能なリンカーは、ホスフェート系の切断可能な連結基を含む。ホスフェート系の切断可能な連結基は、ホスフェート基を分解または加水分解する試薬により切断される。細胞中においてホスフェート基を切断する試薬の例としては、細胞中のホスファターゼなどの酵素がある。ホスフェート系連結基の例としては、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－があり、式中、Ｒｋはそれぞれの出現において、独立に、Ｃ１～Ｃ２０アルキル、Ｃ１～Ｃ２０ハロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、またはＣ７～Ｃ１２アラルキルであり得る。例示的な実施形態としては、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－、および－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－が挙げられる。特定の実施形態においては、ホスフェート系連結基は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。これら候補は、上述のものと類似した方法を使用して評価することができる。
ｉｉｉ．酸切断可能な連結基
他の実施形態においては、切断可能なリンカーは、酸切断可能な連結基を含む。酸切断可能な連結基は、酸性条件下で切断される連結基である。特定の実施形態においては、酸切断可能な連結基は、ｐＨが約６．５またはそれより低い（例えば、約６．０、５．５、５．０またはそれより低い）ものである酸性環境において、または一般酸として作用できる酵素などの試薬によって、切断される。細胞においては、特定の低ｐＨオルガネラ、例えばエンドソームおよびリソソームは、酸切断可能な連結基のための切断環境をもたらすことができる。酸切断可能な連結基の例としては、これに限定されないが、ヒドラゾン、エステルおよびアミノ酸のエステルが挙げられる。酸切断可能な基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または－ＯＣ（Ｏ）を有し得る。例示的な実施形態は、炭素がエステルの酸素に結合している場合（アルコキシ基）、アリール基、置換アルキル基、または第三級アルキル基、例えばジメチルペンチルもしくはｔ－ブチルである。これら候補は、上述のものと類似した方法を使用して評価することができる。
ｉｖ．エステル系連結基
他の実施形態においては、切断可能なリンカーは、エステル系の切断可能な連結基を含む。エステル系の切断可能な連結基は、細胞中でエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステル系の切断可能な連結基の例としては、これに限定されないが、アルキレン、アルケニレンおよびアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステルの切断可能な連結基は、一般式－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－を有する。これら候補は、上述のものと類似した方法を使用して評価することができる。
ｖ．ペプチド系切断基
さらに他の実施形態においては、切断可能なリンカーは、ペプチド系の切断可能な連結基を含む。ペプチド系の切断可能な連結基は、細胞中でペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチド系の切断可能な連結基は、アミノ酸の間で形成されて、オリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチドが得られるペプチド結合である。ペプチド系の切断可能な基は、アミド基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレンまたはアルキネレンの間で形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸の間で形成されて、ペプチドおよびタンパク質が得られるアミド結合の特殊な型である。ペプチド系の切断基は、概して、アミノ酸の間で形成されてペプチドおよびタンパク質が得られるペプチド結合（すなわち、アミド結合）に限定されて、全てのアミド官能基を含むものではない。ペプチド系の切断可能な連結基は、一般式－ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）－を有するものであり、式中、ＲＡおよびＲＢは、二つの隣接するアミノ酸のＲ基である。これら候補は、上述のものと類似した方法を使用して評価することができる。
一部の実施形態においては、本発明のｉＲＮＡは、リンカーを介して炭水化物にコンジュゲートされる。本発明の組成物および方法のリンカーを有するｉＲＮＡ炭水化物コンジュゲートの限定されない例としては、これに限定されないが、
（式ＸＸＸＶＩＩ）、
（式ＸＸＸＶＩＩＩ）、
（式ＸＸＸＩＸ）、
（式ＸＬ）、
（式ＸＬＩ）、
（式ＸＬＩＩ）、
（式ＸＬＩＩＩ）、および
（式ＸＬＩＶ）が挙げられ、ＸまたはＹの一方がオリゴヌクレオチドである場合、もう一方は、水素である。
本発明の組成物および方法の特定の実施形態においては、リガンドは、二価または三価の分枝リンカーを介して結合した一または複数の「ＧａｌＮＡｃ」（Ｎ－アセチルガラクトサミン）誘導体である。
一実施形態においては、本発明のｄｓＲＮＡは、以下の式（ＸＬＶ）～（ＸＬＶＩ）のいずれかに示す構造の群から選択される二価または三価の分枝リンカーにコンジュゲートされる：
式ＸＸＸＸＶ 式ＸＬＶＩ
式ＸＬＶＩＩ 式ＸＬＶＩＩＩ
式中、
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂおよびｑ５Ｃは、出現ごとに独立に、０～２０を表し、また繰り返し単位は、同一である場合も、異なる場合もあり、
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃは、出現ごとに独立に、存在しない、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ、またはＣＨ２Ｏであり、
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃは、出現ごとに独立に、存在しない、アルキレン、置換アルキレンであり、式中一または複数のメチレンが、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡ＣまたはＣ（Ｏ）のうち一または複数によって中断または終結され得、
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃは、出現ごとにそれぞれ独立に、存在しない、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ（Ｒａ）－ＮＨ－、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ－Ｏ、
またはヘテロシクリルであり、
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ、およびＬ５Ｃはリガンドを表し、すなわち、出現ごとにそれぞれ独立に、単糖（ＧａｌＮＡｃなど）、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、または多糖であり、またＲａはＨまたはアミノ酸側鎖である。三価コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体は、標的遺伝子の発現を阻害するＲＮＡｉ剤と共に使用するのに特に有用であり、例えば以下の式（ＸＬＩＸ）のものなどであり、
式ＸＬＩＸ
式中、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ、およびＬ５Ｃは、単糖、例えばＧａｌＮＡｃ誘導体を表す。
ＧａｌＮＡｃ誘導体をコンジュゲートする二価および三価の分枝のリンカー基の例としては、これに限定されないが、式ＩＩ、ＶＩＩ、ＸＩ、ＸおよびＸＩＩＩのような上記で列挙した構造が挙げられる。
ＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許としては、これに限定されるものではないが、米国特許第４，８２８，９７９号、第４，９４８，８８２号、第５，２１８，１０５号、第５，５２５，４６５号、第５，５４１，３１３号、第５，５４５，７３０号、第５，５５２，５３８号、第５，５７８，７１７号、第５，５８０，７３１号、第５，５９１，５８４号、第５，１０９，１２４号、第５，１１８，８０２号、第５，１３８，０４５号、第５，４１４，０７７号、第５，４８６，６０３号、第５，５１２，４３９号、第５，５７８，７１８号、第５，６０８，０４６号、第４，５８７，０４４号、第４，６０５，７３５号、第４，６６７，０２５号、第４，７６２，７７９号、第４，７８９，７３７号、第４，８２４，９４１号、第４，８３５，２６３号、第４，８７６，３３５号、第４，９０４，５８２号、第４，９５８，０１３号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，２４５，０２２号、第５，２５４，４６９号、第５，２５８，５０６号、第５，２６２，５３６号、第５，２７２，２５０号、第５，２９２，８７３号、第５，３１７，０９８号、第５，３７１，２４１号、第５，３９１，７２３号、第５，４１６，２０３号、第５，４５１，４６３号、第５，５１０，４７５号、第５，５１２，６６７号、第５，５１４，７８５号、第５，５６５，５５２号、第５，５６７，８１０号、第５，５７４，１４２号、第５，５８５，４８１号、第５，５８７，３７１号、第５，５９５，７２６号、第５，５９７，６９６号、第５，５９９，９２３号、第５，５９９，９２８号、第５，６８８，９４１号、第６，２９４，６６４号、第６，３２０，０１７号、第６，５７６，７５２号、第６，７８３，９３１号、第６，９００，２９７号、第７，０３７，６４６号、および第８，１０６，０２２号が挙げられ、この各々の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
所与の化合物において全ての位置について均一に修飾される必要はなく、実際には、先述の修飾のうち二つ以上を単一の化合物内に、またはさらにｉＲＮＡ内の単一のヌクレオシドにおいて組み込むことができる。本発明はまた、キメラ化合物であるｉＲＮＡ化合物も含む。
本発明の文脈における「キメラ」ｉＲＮＡ化合物または「キメラ」は、二つ以上の化学的に区別される領域を含有する、例えばｄｓＲＮＡｉ剤などであるｉＲＮＡ化合物であり、そのそれぞれが少なくとも一のモノマー単位、すなわちｄｓＲＮＡ化合物の場合にはヌクレオチド、により構成される。これらｉＲＮＡは、典型的には、少なくとも一の領域であって、そこでＲＮＡが、ｉＲＮＡに対してヌクレアーゼ分解に対する耐性の増大、細胞取り込みの増大または標的核酸に対する結合親和性の増大を付与するように修飾されるものである、少なくとも一の領域を含有する。ｉＲＮＡの追加的な領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡの複合型を切断可能である酵素のための基質として機能し得る。例として、リボヌクレアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。したがって、リボヌクレアーゼＨの活性化が、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによって遺伝子発現のｉＲＮＡ阻害の効率を大きく増強する。結果的に、これに匹敵する結果は、しばしば、同一の標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、キメラｄｓＲＮＡを使用する場合により短いｉＲＮＡで得ることができる。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動によって、また必要に応じて、当技術分野で公知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技術によって、ごく普通に検出可能である。
特定の例においては、ｉＲＮＡのＲＮＡは、非リガンドの基によって修飾できる。ｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞取り込みを増強するために、いくつかの非リガンドの分子がｉＲＮＡにコンジュゲートされてきたので、当該コンジュゲーションを実施するための手順は、科学文献において利用可能である。こうした非リガンドの部分には、脂質部分、例えばコレステロール（Ｋｕｂｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００７，３６５（１）：５４－６１、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、チオエーテル、例えばヘキシル－Ｓ－トリチルチオール（ｈｅｘｙｌ－Ｓ－ｔｒｉｔｙｌｔｈｉｏｌ）（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、脂肪鎖、例えばドデカンジオール残基またはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０：１１１、Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、リン脂質、例えばジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１、Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）、が含まれてきた。このようなＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許は、上記で列挙している。典型的なコンジュゲーションプロトコールは、配列の一または複数の位置にアミノリンカーを有するＲＮＡの合成を伴う。次いで、アミノ基が、適切なカップリングまたは活性化試薬を使用することによってコンジュゲートされている分子と反応する。コンジュゲーション反応は、ＲＮＡがまだ固体支持部に結合している状態で、または溶液相でＲＮＡが切断された後で実施可能である。典型的には、ＨＰＬＣによるＲＮＡコンジュゲートの精製によって、純粋なコンジュゲートが得られる。
ＩＶ．本発明のｉＲＮＡの送達
本発明のｉＲＮＡの、細胞、例えばヒト対象などである対象（例えば、脂質代謝障害などのＡＮＧＰＴＬ３関連障害に感受性があるまたは診断された対象など、それを必要とする対象）内の細胞への送達は、いくつかの異なる方法で達成され得る。例えば、送達は、細胞をインビトロまたはインビボのいずれかで本発明のｉＲＮＡと接触させることによって実施され得る。インビボでの送達はまた、ｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡ、を含む組成物を対象に投与することによって直接的に実施され得る。あるいは、インビボでの送達は、ｉＲＮＡをコードしてその発現を誘導する一または複数のベクターを投与することによって間接的に実施し得る。これら選択肢は、下記においてさらに説明される。
概して、核酸分子を送達（インビトロまたはインビボで）する任意の方法は、本発明のｉＲＮＡで使用するのに適合させることができる（例えば、Ａｋｈｔａｒ Ｓ．ａｎｄ Ｊｕｌｉａｎ ＲＬ．（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（５）：１３９－１４４および国際公開第９４／０２５９５号を参照されたく、これらは参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。インビボでの送達の場合、ｉＲＮＡ分子を送達するために考慮するファクターとしては、例えば、送達される分子の生物学的安定性、非特異的な影響の防止、および標的組織内での送達される分子の蓄積が挙げられる。ＲＮＡ干渉はまた、直接注射によるＣＮＳへの局所送達での成功もわかっている（Ｄｏｒｎ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３２：ｅ４９、Ｔａｎ，ＰＨ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：５９－６６、Ｍａｋｉｍｕｒａ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ（２００２）ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：１８、Ｓｈｉｓｈｋｉｎａ，ＧＴ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １２９：５２１－５２８、Ｔｈａｋｋｅｒ，ＥＲ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：１７２７０－１７２７５、Ａｋａｎｅｙａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．９３：５９４－６０２）。ＲＮＡまたは医薬担体の修飾もまた、ｉＲＮＡの標的組織へのターゲティングを可能にし、望ましくないオフターゲット効果を回避させることができる。ｉＲＮＡ分子は、細胞取込みを強化し、分解を防止するために、例えばコレステロールなどの親油性基への化学コンジュゲーションによって修飾され得る。例えば、親油性コレステロール部分にコンジュゲートさせたＡｐｏＢへと誘導されるｉＲＮＡは、マウスに全身的に注射されたところ、結果として肝臓および空腸の両方においてａｐｏＢ ｍＲＮＡのノックダウンを生じた（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３－１７８）。
代替的な実施形態においては、ｉＲＮＡは、例えばナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性送達系などである薬剤送達システムを使用して送達可能である。正に荷電したカチオン性の送達系は、ｉＲＮＡ分子（負に荷電した）の結合を促進し、また負に荷電した細胞膜での相互作用も高め、それにより細胞によるｉＲＮＡの効率的な取り込みを可能にもする。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、ｉＲＮＡに結合することができるか、またはｉＲＮＡを封入するベシクルまたはミセルを形成するように誘導することができる（例えば、Ｋｉｍ ＳＨ，ｅｔ ａｌ（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １２９（２）：１０７－１１６を参照）。ベシクルまたはミセルの形成はさらに、全身投与したときのｉＲＮＡの分解を防止する。カチオン性のｉＲＮＡ剤複合体を作製および投与する方法は、十分に当業者の能力の範囲内である（例えば、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ３２７：７６１－７６６、Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９：１２９１－１３００、Ａｒｎｏｌｄ，ＡＳ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２５：１９７－２０５を参照されたく、これらは参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。ｉＲＮＡの全身送達に有用な薬剤送達システムのいくつかの非限定的な例としては、ＤＯＴＡＰ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ ａｌ（２００３），ｓｕｐｒａ；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ，ｅｔ ａｌ（２００３），ｓｕｐｒａ），“ｓｏｌｉｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｌｉｐｉｄ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ”（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ＴＳ，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：１１１－１１４），ｃａｒｄｉｏｌｉｐｉｎ（Ｃｈｉｅｎ，ＰＹ，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：３２１－３２８；Ｐａｌ，Ａ，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｉｎｔ Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２６：１０８７－１０９１），ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（Ｂｏｎｎｅｔ ＭＥ，ｅｔ ａｌ（２００８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．Ａｕｇ １６ Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ；Ａｉｇｎｅｒ，Ａ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７１６５９），Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）ｐｅｐｔｉｄｅｓ（Ｌｉｕ，Ｓ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．３：４７２－４８７），ａｎｄ ｐｏｌｙａｍｉｄｏａｍｉｎｅｓ（Ｔｏｍａｌｉａ，ＤＡ，ｅｔ ａｌ（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３５：６１－６７；Ｙｏｏ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１７９９－１８０４）が挙げられる。一部の実施形態においては、ｉＲＮＡは、全身投与のためにシクロデキストリンと複合体を形成する。投与の方法およびｉＲＮＡとシクロデキストリンとによる医薬組成物は、米国特許第７，４２７，６０５号に見ることができ、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
Ａ．本発明のｉＲＮＡをコードしたベクター
ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を標的とするｉＲＮＡは、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターに挿入された転写ユニットから発現され得る（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ａ，ｅｔ ａｌ．，ＴＩＧ．（１９９６），１２：５－１０、Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，ＡらによるＰＣＴ国際出願の公開公報である国際公開第００／２２１１３号、ＣｏｎｒａｄによるＰＣＴ国際出願の公開公報である国際公開第００／２２１１４号、およびＣｏｎｒａｄによる米国特許第６，０５４，２９９号を参照）。発現は、使用される特定の構築物および標的組織または細胞型に応じて、一過性的（数時間から数週間のオーダー）または持続的（数週間から数か月またはそれ以上）であり得る。これら導入遺伝子は、直鎖状の構築物、環状プラスミド、または統合ベクターもしくは非統合ベクターであり得るウイルスベクターとして導入することができる。導入遺伝子は、染色体外プラスミドとして継代されることを可能にするように構築することもできる（Ｇａｓｓｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１２９２）。
本明細書において記載する方法および組成物と共に用いることができるウイルスベクターシステムとしては、これらに限定されるものではないが、（ａ）アデノウィルスベクター、（ｂ）レトロウイルスベクター、例えばこれに限定されるものではないが、レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスなど、（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター、（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター、（ｅ）ＳＶ４０ベクター、（ｆ）ポリオーマウイルスベクター、（ｇ）パピローマウイルスベクター、（ｈ）ピコルナウイルスベクター、（ｉ）ポックスウイルスベクター、例えばオルソポックスなどであり、例えばワクシニアウイルスベクターなど、またはトリポックスであり、例えばカナリアポックスもしくは鶏痘など、ならびに（ｊ）ヘルパー依存性アデノウィルスまたはガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）アデノウィルスが挙げられる。複製欠損ウイルスもまた有利であり得る。異なるベクターは、細胞のゲノムの中に組み込まれるようになるかまたは組み込まれるようにならないであろう。当該構築物は、所望の場合、トランスフェクションのためのウイルス配列を含めることができる。あるいは、構築物は、エピソーム複製が可能なベクター内に、例えばＥＰＶベクターおよびＥＢＶベクター内に、組み込むことができる。ｉＲＮＡの組換え発現のための構築物は、概して、標的細胞におけるｉＲＮＡの発現を確実にするために、調節要素を、例えばプロモーター、エンハンサーなどを、必要とするであろう。ベクターおよび構築物を考慮する他の態様は、当技術分野で公知である。
Ｖ．本発明の医薬組成物
本発明はまた、本発明のｉＲＮＡを含む医薬組成物および製剤も含む。一実施形態においては、本明細書において説明されるような、ｉＲＮＡを含有する医薬組成物と、薬学的に許容される担体とを本明細書において提供する。ｉＲＮＡを含有する医薬組成物は、ＡＮＧＰＴＬ３関連障害、例えば脂質代謝障害を予防または治療するのに有用である。そのような医薬組成物は、送達の態様に基づいて製剤化される。一例としては、非経口送達により、例えば皮下（ＳＣ）、筋肉内（ＩＭ）、または静脈内（ＩＶ）の送達により、全身投与用に製剤化される組成物である。本発明の医薬組成物は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害するのに十分な投薬量で投与され得る。
一部の実施形態においては、本発明の医薬組成物は、無菌である。別の実施形態においては、本発明の医薬組成物は、発熱因子なしである。
本発明の医薬組成物は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害するのに十分な投薬量で投与され得る。概して、本発明のｉＲＮＡの好適な用量は、１日当たりレシピエントの体重１キログラム当たり約０．００１～約２００．０ミリグラムの範囲、概して１日当たり体重１キログラム当たり約１～５０ｍｇの範囲とすることとなる。典型的には、本発明のｉＲＮＡの適切な用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５．０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約３．０ｍｇ／ｋｇの範囲とすることとなる。反復投与レジメンとしては、例えば毎月、３～６か月に１回、または１年に１回など、治療量のｉＲＮＡの定期的な投与を含み得る。特定の実施形態においては、ｉＲＮＡは、およそ１か月当たり１回～およそ６か月当たり１回で投与される。
初回治療レジメンの後、治療は、少ない頻度で施与することができる。治療期間は、疾患の重症度に基づいて決定することができる。
他の実施形態においては、医薬組成物の単回投与が、持続性であり得ることにより、その投与は、１か月以下、２か月以下、３か月以下、または４か月以下の間隔で投与される。本発明の一部の実施形態においては、本発明の医薬組成物の単回投与が、およそ月１回投与される。本発明の他の実施形態においては、本発明の医薬組成物の単回投与が、年に４回（すなわち、およそ三ヶ月に１回）投与される。本発明の他の実施形態においては、本発明の医薬組成物の単回投与が、年に２回（すなわち、およそ六ヶ月に１回）投与される。
当業者は、例えばこれらに限定されるものではないが、対象に存在する変異、過去の治療、対象の健康全般または年齢、および存在する他の疾患などである特定のファクターが、対象を効果的に治療するために必要な投薬量および投薬のタイミングに影響を及ぼし得ることを理解するであろう。その上、必要に応じて予防的に有効な量または治療有効量の組成物での対象の治療には、単回治療または一連の治療が含まれ得る。
ｉＲＮＡは、特定の組織（例えば、肝細胞）を標的とする様式で送達され得る。
本発明の医薬組成物としては、これに限定されるものではないが、溶液、エマルション、およびリポソーム含有製剤を含む。これら組成物は、予め形成した液体、自己乳化型固体、および自己乳化型半固体を含めるがこれらに限定されない様々な構成要素から生成することができる。製剤としては、肝臓を標的とするものが挙げられる。
本発明の医薬製剤は、単位剤形で簡便に存在し得るものであるが、製薬産業において周知の従来技術に従って調製することができる。こうした技術としては、活性成分を医薬担体または賦形剤と会合させる工程を含む。概して、製剤は、活性成分を液体担体と均一にかつ密に会合させることによって調製される。
Ａ．さらなる剤形
ｉ．エマルション
本発明の組成物は、エマルションとして調製および製剤化することができる。エマルションは、典型的には、一方の液体が、通常直径０．１μｍを超える液滴の形態でのもう一方の液体中に分散した不均一系である（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９、Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５、Ｂｌｏｃｋ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｐ．３３５、Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．３０１を参照）。エマルションは、多くの場合、互いに密に混合し分散した二の不混和性液相を含む二相系である。概して、エマルションは、油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）のいずれかのものであり得る。水相が、細かく分かれて微細な液滴として大量の油相中に分散している場合、その結果として得られる組成物を、油中水型（ｗ／ｏ）エマルションと呼ぶ。あるいは、油相が、細かく分かれて微細な液滴として大量の水相中に分散している場合、その結果として得られる組成物を、水中油型（ｏ／ｗ）エマルションと呼ぶ。エマルションは、分散相と、水相、油相、または別個の相としてのそれ自体のいずれかの中に溶液として存在し得る活性薬物とに加えて、追加的な成分を含有し得る。乳化剤、安定剤、色素、および抗酸化剤などの医薬賦形剤も、必要に応じてエマルション中に存在していてもよい。医薬エマルションは、例えば、油中水中油型（ｏ／ｗ／ｏ）および水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）エマルションの場合などで、二相以上で構成される多相エマルションでもあってもよい。こうした複合剤形によれば、多くの場合、単純な二相エマルションでは与えられない一定の利点がもたらされる。ｗ／ｏ／ｗエマルションは、ｏ／ｗエマルションの個々の油滴が小水滴を封入する多相エマルションにより構成される。同様に、ｏ／ｗ／ｏエマルションは、連続油相中で安定化した水の小滴中に封入された油滴の系によりもたらされる。
エマルションは、熱力学的安定性がほとんどないかまたは全くないことが特徴である。多くの場合、エマルションの分散相または不連続相は、外部相または連続相中に良好に分散しており、乳化剤または製剤の粘度によってこの形態で維持される。エマルションを安定化させる他の手段としては、該エマルションのいずれかの相に組み込まれ得る乳化剤の使用を必要とする。乳化剤は、以下の四つのカテゴリ、合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤、および微細分散固体、に大きく分類することができる（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照）。
表面活性剤としても知られる合成界面活性剤は、エマルションの剤形において広い適用可能性が見出されており、文献において検討されてきている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ、Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照）。界面活性剤は、典型的には両親媒性であるので、親水性部分および疎水性部分を含む。界面活性剤の疎水性に対する親水性の比は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と命名されており、製剤の調製において界面活性剤を分類および選択する際の有益なツールである。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて以下の異なるクラス、非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性に分類することができる（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５を参照）。
非常に多様な非乳化材料もまた、エマルション製剤に含まれて、エマルションの特性に寄与する。これらとしては、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、湿潤剤、親水性コロイド、保存剤、および抗酸化剤が挙げられる（Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。
皮膚、経口、および非経口経路によるエマルション製剤の適用ならびにそれらの製造方法は、文献において検討されてきている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照）。
ｉｉ．マイクロエマルション
本発明の一実施形態においては、ｉＲＮＡおよび核酸の組成物は、マイクロエマルションとして製剤化される。マイクロエマルションは、単一の、光学的等方性で熱力学的に安定した液体溶液である、水、油、および両親媒性物質の系として規定され得る（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ、Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５を参照）。典型的には、マイクロエマルションは、はじめに油を界面活性剤水溶液に分散させ、次いで十分な量の第四の成分、概して中鎖のアルコール、を加えて透明な系を形成することによって調製される系である。したがって、マイクロエマルションはまた、表面活性分子の界面膜によって安定化される、二つの不混和性液体の熱力学的に安定で等方的に透明な分散液として説明されてもいる（Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｓｈａｈ，ｉｎ：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．，Ｅｄ．，１９８９，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ １８５－２１５）。
ｉｉｉ．マイクロ粒子
本発明のｉＲＮＡは、粒子、例えば微粒子、に組み込まれてもよい。マイクロ粒子は、噴霧乾燥によって製造することができるが、凍結乾燥、蒸発、流動床乾燥、真空乾燥、またはこれらの技術の組合せなどの他の方法によっても製造され得る。
ｉｖ．浸透促進剤
一実施形態においては、本発明は、核酸の、特にｉＲＮＡの、動物の皮膚への効率的な送達を有効にするために、様々な浸透促進剤を採用する。大部分の薬物は、イオン化形態および非イオン化形態の両方で溶液中に存在する。しかしながら、通常、脂溶性または親油性の薬剤のみが、細胞膜を容易に横断する。横断しようとする膜が、浸透促進剤で処理されていれば、非親油性薬剤であっても細胞膜を横断することができることが分かっている。浸透促進剤はまた、非親油性薬剤が細胞膜を横断して拡散するのを補助することに加えて、親油性薬剤の透過性も高める。
浸透促進剤は、五つの広いカテゴリ、すなわち界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、および非キレート化非界面活性剤、のうちのひとつに属するものとして分類することができる（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照）。上述の浸透促進剤の分類の各々、および医薬組成物の製造および医薬品の送達におけるそれらの使用は、当技術分野で周知である。
ｖ．賦形剤
担体化合物とは対照的に、「医薬担体」または「賦形剤」は、一または複数の核酸を動物に送達する、薬学的に許容される溶媒、懸濁剤または任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は、液体または固体であり得、核酸および所定の医薬組成物を他の成分と併用される場合に、所望の体積、稠度などをもたらするように計画された投与の様式を念頭において選択される。こうした薬剤は、当技術分野で周知である。
ｖｉ．他の成分
本発明の組成物は、医薬組成物中で従来見られた他の補助成分を、その技術分野で確立されたそれらの使用レベルにおいて追加的に含有することができる。したがって、例えば、組成物は、追加的な、適合性の、薬学的に活性な材料、例えば止痒剤、収れん剤、局部麻酔剤、もしくは抗炎症剤などを含有することができ、または本発明の組成物の様々な剤形を物理的に製剤化する際に有用な追加的な材料、例えば色素、香味剤、防腐剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、および安定剤などを含有することができる。ただし、こうした材料は、添加したときに、本発明の組成物の成分の生物活性を過度に妨害すべきではない。製剤は、滅菌され、また所望により、例えば潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝剤、着色剤、香味剤、または芳香物質などである、製剤の核酸と有害に相互作用しない補助剤と混合してもよい。
水性懸濁液は、懸濁液の粘度を増加する物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどを含有することができる。懸濁液はまた、安定剤を含有し得る。
一部の実施形態においては、本発明において取り上げる医薬組成物は、（ａ）一または複数のｉＲＮＡ、および（ｂ）非ｉＲＮＡの機序によって機能し、ＡＮＧＰＴＬ３３関連障害、例えば脂質代謝の障害を治療する際に有用である、一つまたは複数の薬剤を含む。
こうした化合物の毒性および予防効果は、例えばＬＤ５０（集団のうちの５０％に致死的である用量）およびＥＤ５０（集団のうちの５０％において予防的に有効な用量）を判定するために、細胞培養物または実験動物において標準的な薬学的手順によって判定することができる。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指数となり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。
細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータは、ヒトにおける使用のためにある範囲の投薬量を製剤化する際に使用することができる。本発明における本明細書において取り上げる組成物の投薬量は、概して、わずかな毒性であるかまたは毒性が全くない、例えばＥＤ８０またはＥＤ９０などであるＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内である。投薬量は、用いる剤形および利用する投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本発明において取り上げる方法で使用される任意の化合物に関して、最初に、細胞培養アッセイから予防的に有効な用量を見積もることができる。細胞培養において決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量阻害を達成する試験化合物の濃度）またはより高い阻害レベルを含む、化合物の、または適切な場合には、標的配列のポリペプチド産物の循環血漿濃度の範囲を達成する（例えば、ポリペプチドの濃度減少を達成する）ように、用量を動物モデルにおいて計画することができる。こうした情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に判定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって、測定することができる。
それらの投与に加えて、上述したように、本発明において取り上げるｉＲＮＡは、ＡＮＧＰＴＬ３関連障害、例えば脂質代謝の障害の予防または治療に使用される他の公知の薬剤と併用して投与することができる。いずれにしても、投与する医師は、当技術分野で公知であるかまたは本明細書で記載した、有効性の標準的尺度を使用して観察された結果に基づいて、ｉＲＮＡ投与の量およびタイミングを調整することができる。
ＶＩ．ＡＮＧＰＴＬ３発現を阻害する方法
本発明はまた、細胞内でＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。この方法は、細胞を、細胞内でＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害するのに有効である量のＲＮＡｉ剤と、例えば二本鎖ＲＮＡ剤と接触させ、それによって細胞においてＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害することを含む。
細胞の、ｉＲＮＡとの、例えば二本鎖ＲＮＡ剤との接触は、インビトロまたはインビボで行うことができる。細胞をインビボでｉＲＮＡ剤と接触させることは、対象内の、例えばヒト対象内の細胞または細胞の群をｉＲＮＡと接触させることを含む。インビトロおよびインビボで細胞を接触させる方法を組み合せることも可能である。細胞を接触させることは、上記に記載したように直接的であっても間接的であってもよい。さらに、細胞を接触させることは、本明細書に記載する、または当技術分野で公知の任意のリガンドをはじめとするターゲティングリガンドを介して達成できる。一部の実施形態では、ターゲティングリガンドは、炭水化物部分、例えばＧａｌＮＡｃ３リガンドであるか、またはＲＮＡｉ剤を目的の部位に向ける任意の他のリガンドである。
「阻害すること」という用語は、本明細書で使用する場合、「低減すること」、「サイレンシングすること」、「下方制御すること」、「抑制すること」および他の同様の用語と区別なく使用され、いずれかのレベルの阻害を含む。
「ＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害すること」という語句は、任意のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子（例えば、マウスＡＮＧＰＴＬ３ ３遺伝子、ラットＡＮＧＰＴＬ３遺伝子、サルＡＮＧＰＴＬ３遺伝子、またはヒトＡＮＧＰＴＬ３遺伝子）、ならびにＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のバリアントまたは変異体の発現の阻害を指すことが意図されている。したがって、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子は、遺伝子操作された細胞、細胞の群または生物の文脈で、野生型ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子、変異ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子、または遺伝子導入ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子であり得る。
「ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害すること」は、任意のレベルでのＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の阻害、例えばＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現の少なくとも部分的抑制を含む。ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現と関連する任意の変数、例えばＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルもしくはＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルなどの、レベル、またはレベルの変化に基づいて評価され得る。ＡＮＧＰＴＬ３の発現はまた、血清脂質、トリグリセリド、コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ－Ｃ、ＶＬＤＬ－Ｃ、ＩＤＬ－Ｃおよび総コレステロールを含む）、または遊離脂肪酸のレベルに基づいて間接的に評価されてもよい。このレベルは、例えば対象に由来する試料を含めた、個々の細胞または細胞群において評価され得る。ＡＮＧＰＴＬ３は、主に肝臓で発現されることが理解される。
阻害は、対照レベルと比較した、ＡＮＧＰＴＬ３発現と関連する一つ以上の変数の絶対レベルまたは相対レベルの低下によって評価され得る。対照レベルは、当技術分野で利用される任意の種類の対照レベルであり得、例えば投与前ベースラインレベル、または未処理であるかもしくは対照（例えば、バッファーのみの対照または不活性薬剤対照など）で処理された同様の対象、細胞もしくは試料から決定されるレベルであり得る。
本発明の方法の一部の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、またはアッセイの検出レベルを下回るまで阻害される。一部の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現は、少なくとも７０％阻害される。さらに、例えば脳などの他の組織中での発現の有意な阻害を伴うことのない、例えば肝臓中などの特定の組織中でのＡＮＧＰＴＬ３の発現の阻害が所望される場合があることが理解される。一部の実施形態では、発現レベルは、適切な種に合致した細胞株において１０ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度を有する実施例２に提供されるアッセイ方法を使用して決定される。
特定の実施形態においては、インビボでの発現の阻害は、例えばＲＮＡ発現の最低値では３ｍｇ／ｋｇで、例えば単回投与として投与した場合に、ヒト遺伝子を発現するげっ歯類において、例えばヒト標的遺伝子（すなわち、ＡＮＧＰＴＬ３）を発現するＡＡＶ感染マウスにおいて、ヒト遺伝子をノックダウンすることによって決定される。例えばＲＮＡ発現の最低値では３ｍｇ／ｋｇで、例えば単回投与として投与後に、モデル動物系における内因性遺伝子の発現のノックダウンも判定することができる。当該系は、ヒト遺伝子とモデル動物遺伝子の核酸配列が十分に近いことによりヒトｉＲＮＡがモデル動物遺伝子の効果的なノックダウンをもたらす場合に有用である。肝臓におけるＲＮＡ発現は、実施例２に提供されるＰＣＲ法を使用して判定される。
ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現の阻害は、第一の細胞または細胞の群と実質的に同一であるが、そのように処理されていない第二の細胞または細胞の群（ｉＲＮＡで処理されていない、または目的の遺伝子を標的とするｉＲＮＡで処理されていない対照細胞）と比較した、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子が転写され、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現が阻害されるように処理（例えば、細胞または複数の細胞を本発明のｉＲＮＡと接触させることによって、または本発明のｉＲＮＡを、細胞が存在しているもしくは存在していた対象に投与することによって）されている第一の細胞または細胞の群（このような細胞は、例えば、対象に由来する試料中に存在し得る）によって発現されるｍＲＮＡの量の低減によって現れ得る。一部の実施形態では、阻害は、種が一致する細胞株において１０ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度を使用して実施例２に提供される方法により評価され、処理された細胞におけるｍＲＮＡのレベルを、対照細胞のｍＲＮＡのレベルに対するパーセンテージとして以下の式で表す。
他の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現の阻害は、例えば対象からの血液または血清中のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルなど、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現に機能的に結びついたパラメータの減少の観点から評価され得る。ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子サイレンシングは、発現コンストラクトからの内因性または異種性いずれかのＡＮＧＰＴＬ３を発現する任意の細胞において、当技術分野で公知の任意のアッセイによって決定され得る。
ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の発現の阻害は、細胞または細胞の群によって、または対象の試料中において発現されるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質のレベル（例えば、対象に由来する血液試料中のタンパク質のレベル）の低減によって現れ得る。上記において説明したように、ｍＲＮＡ抑制の評価のために、処理した細胞または細胞の群におけるタンパク質発現レベルの阻害を、同様に、対照の細胞または細胞の群におけるタンパク質のレベルの、または例えば対象由来の血液または血清である対象の試料中のタンパク質レベルの変化の百分率として表すことができる。
ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現の阻害を評価するために使用できる対照の細胞、細胞の群、または対象の試料には、本発明のＲＮＡｉ剤とまだ接触していない細胞、細胞の群または対象の試料が含まれる。例えば、対照の細胞、細胞の群、または対象の試料は、ＲＮＡｉ剤を用いる対象の処理の前の個々の対象（例えば、ヒトまたは動物対象）またはある適切に合致する集団の対照に由来し得る。
細胞または細胞の群によって発現されるＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡのレベルは、ｍＲＮＡ発現を評価するための当技術分野で公知の任意の方法を使用して決定できる。一実施形態においては、試料中のＡＮＧＰＴＬ３の発現のレベルは、転写されたポリヌクレオチドまたはその一部を、例えばＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のｍＲＮＡを検出することによって決定される。ＲＮＡは、例えば酸フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出（ＲＮＡｚｏｌ Ｂ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社）、ＲＮｅａｓｙ（商標）ＲＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）社）またはＰＡＸｇｅｎｅ（商標）（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ（商標）社、スイス国）を使用することを含む、ＲＮＡ抽出技術を使用して細胞から抽出され得る。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用する典型的なアッセイ形式としては、核ラン－オンアッセイ、ＲＴ－ＰＣＲ、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ、ノーザンブロッティング、インサイツハイブリダイゼーションおよびマイクロアレイ分析が挙げられる。
一部の実施形態においては、ＡＮＧＰＴＬ３の発現のレベルは、核酸プローブを使用して決定される。「プローブ」という用語は、本明細書において使用する場合、特定のＡＮＧＰＴＬ３に選択的に結合可能である任意の分子を指す。プローブは、当業者によって合成できる、または適切な生物学的調製物から誘導できる。プローブは、標識されるように特異的に設計してもよい。プローブとして利用できる分子の例としては、これに限定されないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体および有機分子が挙げられる。
単離されたｍＲＮＡは、これに限定されるものではないが、サザン分析またはノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析およびプローブアレイをはじめとする、ハイブリダイゼーションアッセイまたは増幅アッセイにおいて使用することができる。ｍＲＮＡレベルを決定する方法のひとつとしては、単離されたｍＲＮＡを、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡとハイブリダイズできる核酸分子（プローブ）と接触させることを含む。一実施形態においては、例えば、単離されたｍＲＮＡをアガロースゲルにかけてｍＲＮＡをゲルから膜へ、例えばニトロセルロースに移行させることによって、ｍＲＮＡを固体表面上に固定化し、プローブと接触させる。代替的な実施形態においては、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）遺伝子チップアレイにおいて、プローブを固体表面に固定化して、ｍＲＮＡをプローブと接触させる。当業者ならば、公知のｍＲＮＡ検出方法を、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡのレベルを決定する際に使用するために容易に適応させることができる。
試料中のＡＮＧＰＴＬ３の発現レベルを決定する代替的な方法は、例えばＲＴ－ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓによる１９８７年の米国特許第４，６８３，２０２号に記載の実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９－１９３）、自家持続配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４－１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３－１１７７）、Ｑ－ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉらによる米国特許第５，８５４，０３３号）、または任意の他の核酸増幅法と、その後に当業者に周知の技術を使用した増幅分子の検出を行うことによる、試料中の例えばｍＲＮＡの核酸増幅または反転転写（ｃＤＮＡを調製するため）のプロセスを伴う。これら検出スキームは、特に、核酸分子が非常に少ない数で存在する場合に該核酸分子の検出のために有用である。本発明の特定の態様においては、ＡＮＧＰＴＬ３の発現レベルは、定量的な蛍光発生ＲＴ－ＰＣＲ（すなわち、ＴａｑＭａｎ（商標）システム）によって決定される。一部の実施形態においては、発現レベルは、その種に合致した細胞系において、例えば１０ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度を使用する実施例２に提供される方法で決定される。
ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの発現レベルは、メンブレンブロット（例えば、ノーザン、サザン、ドットなどといったハイブリダイゼーション分析において使用されるような）またはマイクロウェル、試料チューブ、ゲル、ビーズまたは繊維（または結合している核酸を含む任意の固相支持体）を使用して観察され得る。米国特許第５，７７０，７２２号、第５，８７４，２１９号、第５，７４４，３０５号、第５，６７７，１９５号、および第５，４４５，９３４号を参照されたく、これらは参照によって本明細書に組み込まれる。ＡＮＧＰＴＬ３発現レベルの決定はまた、溶液中で核酸プローブを使用することを含み得る。
一部の実施形態においては、ｍＲＮＡ発現のレベルは、分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイまたはリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して評価される。これら方法の使用は、本明細書において示す実施例において記載し、例示している。一部の実施形態では、発現レベルは、その種に一致した細胞株において、１０ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度を使用する実施例２に提供される方法で決定される。
ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質発現のレベルは、タンパク質レベルの測定のための当技術分野で公知 の任意の方法を使用して決定され得る。こうした方法としては、例えば電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィー、流体またはゲル沈降反応、吸収分光法、比色分析、分光学的定量法、フローサイトメトリー、免疫拡散法（一重または二重）、免疫電気泳動、ウエスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、電気化学発光アッセイなどが挙げられる。
一部の実施形態においては、本発明の方法の有効性は、ＡＮＧＰＴＬ３のｍＲＮＡまたはタンパク質レベル（例えば、肝生検において）の減少によって評価される。
本発明の方法の一部の実施形態においては、ｉＲＮＡは、ｉＲＮＡが、対象内の特定の部位に送達されるように対象に投与される。ＡＮＧＰＴＬ３の発現の阻害は、対象（例えば、肝臓または血液）内の特定の部位から流体または組織に由来する試料中のＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡまたはＡＮＧＰＴＬ３タンパク質のレベルの測定値または該レベルの変化を使用して評価され得る。
本明細書において使用する場合、分析物のレベルを検出することまたは決定することという用語は、物質が、例えばタンパク質、ＲＮＡが存在するか否かを決定する工程を実施することを意味すると理解される。本明細書において使用する場合、検出するまたは決定する方法は、使用する方法の検出のレベルを下回る分析物のレベルの検出または決定を含む。
ＶＩＩ．本発明の予防および治療方法
本発明はまた、本発明のｉＲＮＡ、または本発明のｉＲＮＡを含有する組成物を使用して、ＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害し、それによってＡＮＧＰＴＬ３関連障害、例えば脂質代謝の障害に関連する障害を予防または治療する方法も提供する。本発明の方法においては、細胞をインビトロまたはインビボでｓｉＲＮＡと接触させることができる、すなわち、細胞は対象内にあり得る。
本発明の方法を使用する治療に適した細胞は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を発現する任意の細胞、例えば、幹細胞であり得る。本発明の方法での使用に適した細胞は、哺乳類細胞、例えば霊長類細胞（例えば、キメラ非ヒト動物中のヒト細胞をはじめとするヒト細胞、またはサル細胞もしくはチンパンジー細胞などの非ヒト霊長類細胞など）、または非霊長類細胞であり得る。特定の実施形態においては、細胞は、ヒト細胞、例えばヒト肝細胞である。本発明の方法においては、ＡＮＧＰＴＬ３の発現は、細胞内で、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５、またはアッセイの検出レベルを下回るレベルまで阻害される。
本発明のインビボでの方法は、対象に、ｉＲＮＡを含有する組成物を投与することを含み得、該ｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ剤を投与しようとする哺乳類のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と相補的であるヌクレオチド配列を含む。組成物は、当技術分野で公知の任意の手段によって投与され得るが、例えばこれに限定されるものではないが、経口、腹腔内、または頭蓋内（例えば、脳室内、実質内およびくも膜下腔内）、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、鼻腔、直腸などの非経口経路、および局所（頬側および舌下を含む）投与が含まれる。特定の実施形態においては、組成物は、静脈内への注入または注射によって投与される。特定の実施形態においては、組成物は、皮下注射によって投与される。特定の実施形態においては、組成物は、筋肉内注射によって投与される。
一態様では、本発明はまた、哺乳類におけるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害する方法も提供する。方法は、哺乳動物に、哺乳動物の細胞内においてＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含む組成物を投与することおよび哺乳動物をＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間の間維持し、それによって、細胞内においてＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害することを含む。遺伝子発現の低減は、当技術分野で公知の任意の方法によって、また例えば実施例２にある、本明細書において記載される方法、例えばｑＲＴ－ＰＣＲによって評価され得る。タンパク質産生の低減は、当技術分野で公知の任意の方法によって、例えばＥＬＩＳＡによって評価され得る。特定の実施形態では、穿刺肝生検試料が、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子またはタンパク質の発現の減少を観察するための組織材料として機能する。他の実施形態では、血液試料が、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質発現の減少を観察するための対象の試料として機能する。
本発明はさらに、それを必要とする対象における、例えば脂質代謝の障害などのＡＮＧＰＴＬ３関連障害と診断された対象における、治療方法を提供する。一実施形態では、脂質代謝の障害を有する対象は、高脂血症を有する。別の実施形態では、脂質代謝の障害を有する対象は、高トリグリセリド血症を有する。
本発明はさらに、それを必要とする対象における予防方法を提供する。本発明の治療方法は、対象に、例えばＡＮＧＰＴＬ３発現の減少から恩恵を受けることとなる対象に、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡまたはＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含む医薬組成物を予防的有効量で、本発明のｉＲＮＡを投与することを含む。
一態様では、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ３発現の減少、例えば、脂質代謝障害、例えば、高脂血症または高トリグリセリド血症などのＡＮＧＰＴＬ３関連疾患から利益を得る障害を有する対象を治療する方法を提供する。ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現の減少および／または阻害から利益を得るであろう対象の治療には、治療治療（例えば、対象が、発疹性キサントーマを有する）および予防的治療（例えば、対象が、発疹性キサントーマを有していない、または対象が、発疹性キサントーマを発生するリスクがある場合がある）が含まれる。
本発明のｉＲＮＡは、「フリーのｉＲＮＡ」として投与され得る。フリーのｉＲＮＡは、医薬組成物の不在下で投与される。当該そのままのｉＲＮＡは、適した緩衝溶液中にあってもよい。該バッファー溶液は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、またはリン酸塩、またはそれらの任意の組合せを含み得る。一実施形態においては、緩衝溶液は、リン酸緩衝食生理塩水（ＰＢＳ）である。ｉＲＮＡを含有する緩衝溶液のｐＨおよびモル浸透圧濃度は、対象への投与に好適であるように調整され得る。
あるいは、本発明のｉＲＮＡは、医薬組成物として、例えばｄｓＲＮＡリポソーム製剤として、投与され得る。
ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現の阻害から利益を得るであろう対象は、例えば高脂血症または高トリグリセリド血症などの脂質代謝障害などのＡＮＧＰＴＬ３関連障害を発症しやすいまたは診断される対象である。一実施形態では、方法は、標的ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現が、投与当たり約１、２、３、４、５、６、１～６、１～３、または３～６か月などの間、減少するように、本明細書において取り上げる組成物を投与することを含む。特定の実施形態においては、組成物は３～６か月に１回投与される。
一実施形態では、本明細書において特徴付けられる方法および組成物にとって有用なｉＲＮＡは、標的ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のＲＮＡ（一次またはプロセシングされた）を特異的に標的とする。ｉＲＮＡを使用してこれら遺伝子の発現を阻害する組成物および方法は、本明細書に記載するように調製および実施され得る。
本発明の方法によるｉＲＮＡの投与は、ＡＮＧＰＴＬ３関連障害、例えば、脂質代謝障害、例えば、高脂血症または高トリグリセリド血症の防止または治療をもたらし得る。対象には、治療量のｉＲＮＡ、例えば約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇなどが投与され得る。
一実施形態においては、ｉＲＮＡは、皮下に、すなわち皮下注射により、投与される。所望の用量のｉＲＮＡを対象に送達するために、一回または複数回の注射を使用してもよい。一定期間にわたって、注射を反復してもよい。
投与を定期的に反復してもよい。特定の実施形態においては、最初の治療レジメン後に、より少ない頻度で治療を施与することができる。反復投与レジメンとしては、例えば１か月に１回から１年に１回など、治療量のｉＲＮＡの定期的な投与を含み得る。特定の実施形態においては、ｉＲＮＡは、約１か月に１回～約３か月に１回、または約３か月に１回～約６か月に１回投与される。
本発明は、さらに、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現の低減および／または阻害から恩恵を受けることとなる対象を、例えばＡＮＧＰＴＬ３関連疾患がある対象を、治療するためのｉＲＮＡ剤またはその医薬組成物の方法および使用を、他の医薬および／または他の治療方法と、例えば公知の医薬および／または公知の治療方法、例えばこれら障害を治療するために現在採用されているものなどと組み合わせて、提供する。
したがって、本発明の一部の態様においては、本発明の単一のｉＲＮＡ剤のいずれかを含む方法は、対象に一または複数の追加の治療薬を投与することをさらに含む。
例えば、特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とするｉＲＮＡは、例えば、脂質代謝障害の治療に有用な薬剤と組み合わせて投与される。例えば、ＡＮＧＰＴＬ３発現の減少から利益を得る対象、例えば、脂質代謝の障害を有する対象を治療するのに適した追加の薬剤は、一つ以上の血清脂質を低下させる薬剤を含み得る。こうした薬剤の非限定的な例としては、例えばスタチンなどのＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ阻害剤などのコレステロール合成阻害剤を挙げることができる。スタチンには、アトルバスタチン（リピトール）、フルバスタチン（レスコール）、ロバスタチン（メバゾール）、ロバスタチン徐放性（アルトトレフ）、ピタバスタチン（リバロ）、プラバスタチン（プラバコール）、ロスバスタチン（クレストール）、およびシンバスタチン（ゾーコル）が含まれ得る。脂質代謝障害の治療に有用な他の薬剤としては、胆汁封鎖剤、例えば、コレスチラミンおよび他のレジン、ＶＬＤＬ分泌阻害剤、例えばナイアシン、親油性抗酸化物質、例えば、プロブコール、アシル－ＣｏＡコレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害剤、ファルネソイドＸ受容体拮抗薬、ステロール調節結合タンパク質切断活性化タンパク質（ＳＣＡＰ）活性化因子、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤、ＡｐｏＥ関連ペプチド、およびＡＮＧＰＴＬ３に対する治療用抗体が挙げられ得る。追加の治療薬はまた、コレステリルエステル輸送タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害剤などの高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）を上昇させる薬剤を含んでもよい。さらに、追加の治療薬はまた、栄養補助食品、例えば、魚油を含んでもよい。ｉＲＮＡおよび追加の治療薬は、同時におよび／または同一の組合せで、例えば非経口的に投与され得、または追加の治療薬が、別個の組成物の一部として、および／もしくは別個の時間に、もしくは当技術分野で公知のもしくは本明細書において記載する別の方法によって、投与され得る。
ｉＲＮＡ剤および追加の治療薬および／もしくは治療は、同時におよび／もしくは同一の組合せで、例えば非経口的に投与され得、または追加の治療薬が、別個の組成物の一部として、または別個の時間に、および／もしくは当技術分野で公知のもしくは本明細書において記載する別の方法によって、投与され得る。
ＶＩＩＩ．キット
特定の態様においては、本開示は、例えば二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物またはｓｉＲＮＡ化合物であるｓｉＲＮＡ化合物（例えば前駆体、例えばｓｉＲＮＡ化合物にプロセシングすることができるより大きなｓｉＲＮＡ化合物、または例えば二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物もしくはｓｓｉＲＮＡ化合物またはその前駆体であるｓｉＲＮＡ化合物をコードするＤＮＡ）の医薬製剤を含有する適切な容器を含むキットを提供する。
こうしたキットは、一または複数のｄｓＲＮＡ剤と、使用のための使用説明書、例えば予防的有効量または治療有効量のｄｓＲＮＡ剤を投与するための説明書とを含む。ｄｓＲＮＡ剤は、バイアル瓶または予め充填された注射器内にあり得る。キットは、随意に、ｄｓＲＮＡ剤を投与するための手段（例えば、予め充填された注射器などの注入デバイス）、またはＡＮＧＰＴＬ３の阻害を測定するための手段（例えば、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質、および／またはＡＮＧＰＴＬ３活性の阻害を測定するための手段）をさらに含んでもよい。こうしたＡＮＧＰＴＬ３の阻害を測定する手段は、対象からの試料、例えば血漿試料を得るための手段を含み得る。本発明のキットは、随意に、治療有効量または予防的有効量を決定するための手段をさらに含み得る。
特定の実施形態においては、医薬製剤の個々の成分は、一容器で、例えばバイアル瓶または予め充填された注射器で提供され得る。あるいは、医薬製剤の成分を別々に二以上の容器で、例えばｓｉＲＮＡ化合物調製物用の一つの容器と担体化合物のための少なくとももう一つの容器とで、提供することが望ましいものであり得る。キットは、単一の箱内に一または複数の容器などであるいくつかの様々な構成で包装され得る。この様々な構成要素は、例えばキットと共に提供される使用説明書に従って、組み合わせることができる。当該構成要素は、例えば医薬組成物を調製および投与するために、本明細書において説明した方法に従って組み合わせることができる。キットはまた、送達デバイスも含むことができる。
本発明について、以下の実施例によってさらに説明するが、これらは限定として解釈されるべきではない。本願全体を通して引用されるすべての参考文献、特許公報、および公開された特許出願、ならびに非公式な配列表および図の内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
実施例１．ｉＲＮＡの合成
試薬の供給元
本明細書において試薬の供給元が具体的に与えられていない場合には、当該試薬は、分子生物学で応用するための品質／純度基準にある分子生物学用の試薬の任意の供給元から得ることができる。
ｓｉＲＮＡの設計
ヒトアンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）遺伝子（ヒトＮＣＢＩ ｒｅｆｓｅｑＩＤ：ＮＭ＿０１４９９５．３およびＮＭ＿０１４９９５．２；ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ：２７３２９）を標的とするｓｉＲＮＡを、カスタムＲおよびＰｙｔｈｏｎスクリプトを使用して設計した。ヒトＮＭ＿０１４９９５．３ ＲＥＦＳＥＱ ｍＲＮＡは、長さが２９５１塩基である。ヒトＮＭ＿０１４９９５．２ ＲＥＦＳＥＱ ｍＲＮＡは、長さが２１２６塩基である。
この非修飾ＡＮＧＰＴＬ３のセンス鎖とアンチセンス鎖のヌクレオチド配列の詳細なリストを、表２に示す。この修飾ＡＮＧＰＴＬ３のセンス鎖とアンチセンス鎖のヌクレオチド配列の詳細なリストを、表３に示す。
本願全体にわたって、小数のない二本鎖名は、小数付きの二本鎖名と同等であり、単に二本鎖のバッチ番号を指しているということを理解されたい。例えば、ＡＤ－９５９９１７は、ＡＤ－９５９９１７．１と同等である。
ｓｉＲＮＡの合成
ｓｉＲＮＡを、当技術分野で公知の方法を使用して設計、合成、および調製した。
簡潔に述べると、ｓｉＲＮＡ配列を、固体支持体上でホスホラミダイトの化学的性質を用いてＭｅｒｍａｄｅ １９２シンセサイザー（ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ社）を使用して１μｍｏｌスケールで合成した。固体支持体は、カスタムＧａｌＮＡｃリガンド（３’－ＧａｌＮＡｃコンジュゲート）、ユニバーサル固体支持体（ＡＭ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）、または目的の第一ヌクレオチドを装填した制御された細孔ガラス（５００～１０００Å）とした。補助合成試薬および標準的な２－シアノエチルホスホラミダイトモノマー（２’－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、ＲＮＡ、ＤＮＡ）を、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ社（ウィスコンシン州ミルウォーキー）、Ｈｏｎｇｅｎｅ社（中華人民共和国）、またはＣｈｅｍｇｅｎｅｓ社（米国マサチューセッツ州ウィルミントン）から取得した。追加のホスホラミダイトモノマーを、市販の供給元から調達するか、組織内で調製するか、または様々なＣＭＯからのカスタム合成を使用して調達した。ホスホラミダイトを、アセトニトリルまたは９：１のアセトニトリル：ＤＭＦのいずれかの中で１００ｍＭの濃度で調製し、反応時間４００秒で、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ、アセトニトリル中０．２５Ｍ）を使用して結合した。無水アセトニトリル／ピリジン（９：１ｖ／ｖ）中の３－（（ジメチルアミノ－メチリデン）アミノ）－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－チオン（ＤＤＴＴ、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ社（ウィルミントン、マサチューセッツ州、米国）より取得）の１００ｍＭ溶液を使用して、ホスホロチオエート連結を生成した。酸化時間は５分であった。全ての配列を、ＤＭＴ基の最終的な除去（「ＤＭＴ－Ｏｆｆ」）で合成した。
固相合成が完了したら、固体支持したオリゴリボヌクレオチドを、９６ウェルプレート中、室温で、３００μＬのメチルアミン（４０％水溶液）で約２時間にわたって処理し、固体支持体から切断させ、その後追加的な塩基不安定性保護基をすべて除去した。ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基で保護された任意の天然リボヌクレオチド連結（２’－ＯＨ）を含有する配列に関しては、ＴＥＡ．３ＨＦ（トリエチルアミントリヒドロフルオリド）を使用して第二の脱保護工程を実施した。メチルアミン水溶液中の各オリゴヌクレオチド溶液に、２００μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および３００μＬのＴＥＡ．３ＨＦを加えて、この溶液を６０℃で約３０分間インキュベートした。インキュベート後、プレートを室温まで自然に戻し、１ｍＬの９：１アセトニトリル：エタノールまたは１：１エタノール：イソプロパノールの添加によって、粗オリゴヌクレオチドを沈殿させた。次いでプレートを４℃で４５分間遠心分離し、上清を、マルチチャネルピペットの補助により慎重にデカントした。オリゴヌクレオチドペレットを、２０ｍＭのＮａＯＡｃ中に再懸濁し、その後、オートサンプラー、ＵＶ検出器、電気伝導度計、およびフラクションコレクターを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ＬＣシステム上で、ＨｉＴｒａｐ分子ふるいカラム（５ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して脱塩した。脱塩した試料を９６ウェルプレートに回収し、次いでＬＣ－ＭＳおよびＵＶ分光分析法により分析して、それぞれで同一性を確認し、物質の量を定量した。
一本鎖の二重化を、Ｔｅｃａｎ社のリキッドハンドリングロボットで行った。センス鎖とアンチセンス鎖のそれぞれの単鎖を、９６ウェルプレートにおいて１×ＰＢＳ中１０μＭの最終濃度まで等モル比で合わせて、このプレートを密封し、１００℃で１０分間インキュベートし、その後２～３時間かけてゆっくりと室温まで自然に戻した。各二本鎖の濃度および同一性を確認し、その後インビトロスクリーニングアッセイに利用した。
実施例２．インビトロスクリーニング法
細胞培養および３８４ウェルのトランスフェクション
トランスフェクションのために、初代カニクイザル肝細胞（ＰＣＨ）細胞またはＨｅｐ３ｂ細胞（ＡＴＣＣ社、バージニア州マナッサス）を、１０％のＦＢＳ（ＡＴＣＣ社）で補ったイーグル最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ社）中、５％のＣＯ２雰囲気下、３７℃で、ほぼコンフルエントまで増殖させてから、トリプシン化によりプレートから放出した。トランスフェクションを、ウェル当たり７．５μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭと０．１μｌのリポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッドカタログ番号１３７７８－１５０）を、３８４ウェルプレートの個々のウェルに、２．５μｌの各ｓｉＲＮＡ二本鎖に、添加することによって実施した。次いで混合物を、室温で１５分間インキュベートした。次いでｓｉＲＮＡ混合物に、約１．５×１０４個の細胞を含有する抗生物質を有さない完全増殖培地を４０μｌ添加した。細胞を２４時間インキュベートし、その後ＲＮＡの精製を行った。１０ｎＭ、１ｎＭ、および０．１ｎＭの最終二本鎖濃度で、単回投与試験を実施した。
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）社、部品番号：６１０－１２）を使用した全ＲＮＡの単離
細胞を、ウェル当たり３μＬのビーズを含有する７５μｌの溶解／結合バッファー中で溶解し、静電式振とう機上で１０分間混合した。洗浄工程は、磁気プレート支持体を使用して、Ｂｉｏｔｅｋ ＥＬ４０６上で自動化した。ビーズを、バッファーＡ中で一回、バッファーＢ中で一回、およびバッファーＥ中で二回、それぞれの間に吸引工程を入れて洗浄した（９０μＬ中で）。最後の吸引後、以下に説明するように、完全な１０μＬのＲＴ混合物を各ウェルに加えた。
ＡＢＩ Ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州フォスターシティ、カタログ番号＃４３６８８１３）を用いたｃＤＮＡ合成
１反応当たり、１μｌの１０×バッファー、０．４μｌの２５×ｄＮＴＰ、１μｌのランダムプライマー、０．５μｌの逆転写酵素、０．５μｌのリボヌクレアーゼ阻害剤および６．６μｌのＨ２Ｏのマスターミックスを、各ウェルに加えた。プレートを密封し、静電式振とう機で１０分間振とうし、次いで３７℃で２時間インキュベートした。その後、プレートを８０℃で８分間振とうした。
リアルタイムＰＣＲ
２マイクロリットル（μｌ）のｃＤＮＡを、３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ社カタログ番号＃ ０４８８７３０１００１）において、ウェル当たり、０．５μｌのヒトＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（４３２６３１７Ｅ）、０．５μｌのヒトＡＮＧＰＴＬ３、２μｌのヌクレアーゼを含まない水、および５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ社カタログ番号＃ ０４８８７３０１００１）を含有するマスターミックスに添加した。リアルタイムＰＣＲは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０リアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ社）において実施した。
相対的な倍率変化を算出するために、データを、ΔΔＣｔ法を使用して分析し、１０ｎＭのＡＤ－１９５５でトランスフェクトされた細胞またはモックのトランスフェクト細胞により実施されるアッセイに対して正規化した。ＩＣ５０は、ＸＬＦｉｔを使用して４パラメータの当てはめモデルを使用して計算し、ＡＤ－１９５５でトランスフェクトした細胞またはモックのトランスフェクト細胞に対して正規化した。ＡＤ－１９５５のセンス配列およびアンチセンス配列は、センス配列がｃｕｕＡｃＧｃｕＧＡＧｕＡｃｕｕｃＧＡｄＴｓｄＴ（配列番号２７）であり、またアンチセンス配列がＵＣＧＡＡＧｕＡＣＵｃＡＧＣＧｕＡＡＧｄＴｓｄＴ（配列番号２８）である。
初代カニクイザル肝細胞（ＰＣＨ）の表２および表３に列挙されたｄｓＲＮＡ剤の単回投与スクリーニングの結果を、表４に示す。
表１．核酸配列表現で使用されるヌクレオチドモノマーの略語。これらモノマーは、オリゴヌクレオチド中に存在するとき、５’－３’－ホスホジエステル結合によって相互に連結されることが理解され、またヌクレオチドが２’－フルオロ修飾を含有するとき、フルオロが親ヌクレオチド内のその位置においてヒドロキシを置換する（すなわち、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチドである）ことが理解されるであろう。












表２．ＡＮＧＰＴＬ３ ｄｓＲＮＡ剤の未修飾のセンス鎖配列およびアンチセンス鎖配列













































表３．ＡＮＧＰＴＬ３ ｄｓＲＮＡ剤の修飾のセンス鎖配列およびアンチセンス鎖配列










































表４．初代カニクイザル肝細胞（ＰＣＨ）におけるＡＮＧＰＴＬ３用量スクリーニング














実施例３．マウスにおけるｄｓＲＮＡ二本鎖のインビボスクリーニング
上記のインピトロ研究から同定された目的の二本鎖をインビボで評価した。特に、投与前－１４日目に、ヒトＡＮＧＰＴＬ３をコードするアデノ随伴ウイルス８（ＡＡＶ８）ベクターの２×１０１１のウイルス粒子の静脈内投与によって野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）に形質導入した。特に、マウスに、ＮＭ＿０１４４９５．３として参照されるヒトＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡのオープンリーディングフレームおよび３’ＵＴＲをコードするＡＡＶ８を投与した。
０日目に、三匹のマウスの群に、目的の薬剤（表５を参照されたい）またはＰＢＳ対照の単回の３ｍｇ／ｋｇ用量を皮下投与した。投与後７日目または１４日目に、血清試料を採取し、血清試料中のＡＮＧＰＴＬ３レベルをＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。結果は、群平均および標準偏差（ＳＤ）（図１Ａ）、およびＳＤでプロットされた個々の点（図１Ｂ）とともに示される。３ｍｇ／ｋｇの陽性対照であるＡＤ－７４７５７を用いた処置は、７日目および１４日目に予想通り３ｎｇ／ｍＬ以下となった。いくつかの化合物のクラスターは、ベンチマーク群（点線）と類似の、またはそれらを下回るＡＮＧＰＴＬ３のレベルをもたらした。具体的には、ヒトＡＮＧＰＴＬ３転写物、例えば、ＡＤ－１３３１２０３．１、ＡＤ－１３３１２０６．１、ＡＤ－１３３１２０９．１、ＡＤ－１３３１２１２．１、およびＡＤ－１３３１２１３．１におけるヌクレオチド８０～１１４の領域を標的とする化合物のほとんどが、ＡＤ－７４７５７と同様のＫＤを示した。
投与後１４日目に、動物を屠殺し、肝臓試料を採取し、液体窒素中で瞬間凍結した。組織ｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＱＰＣＲ法によって分析した。ヒトＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルを、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨと比較した。次いで、値をＰＢＳビヒクル対照群の平均に対して正規化した。データは、ベースライン値のパーセントとして表され、平均＋標準偏差として示された。図２に示される結果は、試験された例示的な二本鎖剤が、インビボでヒトＡＮＧＰＴＬ３メッセンジャーＲＮＡのレベルを効果的に低減することを実証する。
表５．インビボスクリーニングのための目的の二本鎖


実施例４．構造活性相関（ＳＡＲ）解析
実施例２および３のインビトロおよびインビボ解析に基づいて、構造活性相関（ＳＡＲ）解析を選択された二本鎖に対して行った（表６を参照のこと）。特に、追加の二本鎖を設計、合成し、インビトロおよびインビボでアッセイした。
ｓｉＲＮＡは、当技術分野で公知の通例の方法を使用して合成およびアニーリングした。これらのｓｉＲＮＡを用いたＰＣＨ細胞およびＨｅｐ３Ｂ細胞におけるインビトロスクリーニングアッセイを、上述のように行った。
非修飾ＡＮＧＰＴＬ３のセンス鎖とアンチセンス鎖のヌクレオチド配列の詳細なリストを、表７に示す。この修飾ＡＮＧＰＴＬ３のセンス鎖とアンチセンス鎖のヌクレオチド配列の詳細なリストを、表８に示す。
初代カニクイザル肝細胞（ＰＣＨ）の表７～８に列挙されたｄｓＲＮＡ剤の単回投与スクリーニングの結果を、表９に示す。
Ｈｅｐ３ｂ細胞における表７～８のｄｓＲＮＡ剤の単回投与スクリーニングの結果を、表１０に示す。
表６．ＳＡＲ解析の目的の二本鎖



表７．ＡＮＧＰＴＬ３ ｄｓＲＮＡ剤の未修飾のセンス鎖配列およびアンチセンス鎖配列
















































表８．ＡＮＧＰＴＬ３ ｄｓＲＮＡ剤の修飾のセンス鎖配列およびアンチセンス鎖配列



















































表９．初代カニクイザル肝細胞（ＰＣＨ）におけるＡＮＧＰＴＬ３用量スクリーニング















































実施例５．マウスにおけるｄｓＲＮＡ二本鎖のインビボスクリーニング
上記のインピトロ研究から同定された目的の二本鎖をインビボで評価した。特にマウスは、マウス当たり２ｅ１１ウイルス粒子で、ｈＡＮＧＰＴＬ３（完全長ヒト）を含有するＡＡＶで形質導入した。形質導入の４週間後、マウスに、目的の二本鎖の３ｍｇ／ｋｇの単回投与を皮下投与した。投与後７日目および１４日目に、血清を収集し、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｈＡＮＰＴＬ３ ＥＬＩＳＡ、ＤＡＮＬ３０）によりｈＡＮＧＰＴＬ３タンパク質のレベルを決定した。これらの分析の結果を以下の表１１に示す。１時点当たり平均三匹のマウスを使用し、７日目および１４日目のＰＢＳ対照からの試料と比較したｈＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の割合を表１１に示す。
表１１．インビボのＡＮＧＰＴＬ３ ｄｓＲＮＡスクリーニング


実施例６．インビボで選択されたｄｓＲＮＡ二本鎖のＳＡＲ解析
構造活性相関（ＳＡＲ）解析も、上述のようにインビボで評価した。簡潔に述べると、マウス当たり２ｅ１１ウイルス粒子で、ｈＡＮＧＰＴＬ３を含有するＡＡＶを用いてマウスを形質導入した。形質導入の２週間後、マウスに目的の二本鎖を皮下投与し、血清を０日目（投与日）、７日目、１４日目、および２８日目に採取した。上述のように、ＥＬＩＳＡによりｈＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルを決定した。０日目と比較した平均パーセントとして示される結果を、表１２および表１３に示す。
表１２：インビボでのＡＮＧＰＴＬ３ ｄｓＲＮＡの構造活性相関（ＳＡＲ）－７日目および１４日目の結果



表１３．インビボでのＡＮＧＰＴＬ３ ｓｉＲＮＡの構造活性相関（ＳＡＲ）－２８日目の結果


実施例７．非ヒト霊長類研究におけるｓｉＲＮＡ－ＧａｌＮＡＣコンジュゲートの効果
上述のインビボ研究、ＡＤ－１３３１２１２、ＡＤ－１３３１２１３およびＡＤ－１４７９３７２からのリード候補を、非ヒト霊長類におけるそれらの有効性についてさらに調査した。詳細には、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのＡＤ－１３３１２１２、ＡＤ－１３３１２１３およびＡＤ－１４７９３７２の単回投与が、カニクイザルに皮下投与された。血清を動物から毎週収集し、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の血清レベルをＥＬＩＳＡにより決定した。投与日（０日目）のレベルと比較したＡＮＧＰＴＬ３の変化率として示される結果を、図３に示す。
均等物
当業者は、本明細書に記載される特定の実施形態および方法に対する多くの均等物を認識するか、または通例の実験のみを使用して確認することができるであろう。こうした均等物は、添付の特許請求の範囲に包含されることを意図する。

Claims (102)

  1. 細胞内でアンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、前記ｄｓＲＮＡ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、ＡＮＧＰＴＬ３をコードするｍＲＮＡに対して相補的な領域を含み、前記相補的な領域が、表２～３、および７～８のうちのいずれか一つにおけるアンチセンスヌクレオチド配列のいずれか一つと３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤。
  2. 細胞内でアンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、前記ｄｓＲＮＡ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド５８～８０、７３～１０２、７３～１２４、８０～１１４、２９１～３２０、２９１～３４２、３０７～３３６、５４０～５６７、５４０～５８９および５４５～５７７のヌクレオチド配列のいずれか一つと３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２の対応するヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下だけ異なるの少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤。
  3. 細胞内でアンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、前記ｄｓＲＮＡ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド５８～８０、８０～１０２、８４～１０６、８７～１０９、９１～１１３、９２～１１４、１８６～２０８、３０７～３２９、３０８～３３０、３１０～３３２、３１４～３３６、５４５～５６７、５５１～５７３、５５３～５７５、５５４～５７６、５５５～５７７、１１３３～１１５５、または１１４０～１１６２のヌクレオチド配列のいずれか一つと３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２の対応するヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤。
  4. 細胞内においてアンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、前記ｄｓＲＮＡ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド５８～８０、９１～１１３または９２～１１４のヌクレオチド配列のいずれか一つと３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２の対応するヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤。
  5. 細胞内においてアンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、前記ｄｓＲＮＡ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド５８～８０のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２の対応するヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤。
  6. 前記アンチセンス鎖は、ＡＤ－１３３１２０３．１、ＡＤ－１３３１２０６．１、ＡＤ－１３３１２０９．１、ＡＤ－１３３１２１２．１、ＡＤ－１３３１２１３．１、ＡＤ－１３３１３２９．１、ＡＤ－１３３１２３７．１、ＡＤ－１３３１２３８．１、ＡＤ－１３３１２４０．１、ＡＤ－１３３１２４４．１、ＡＤ－１３３１２５６．１、ＡＤ－１３３１２６２．１、ＡＤ－１３３１２６４．１、ＡＤ－１３３１２６５．１、ＡＤ－１３３１２６６．１、ＡＤ－１３３１３１６．１、ＡＤ－１３３１３３８．１、およびＡＤ－１４７９３７２からなる群から選択される二本鎖のうちのアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか一つと３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  7. 前記アンチセンス鎖は、ＡＤ－１３３１２０３．１、ＡＤ－１３３１２０６．１、ＡＤ－１３３１２０９．１、ＡＤ－１３３１２１２．１、ＡＤ－１３３１２１３．１、ＡＤ－１３３１３２９．１、ＡＤ－１３３１２４０．１、ＡＤ－１３３１２６２．１、ＡＤ－１３３１２６４．１、ＡＤ－１３３１２６５．１、ＡＤ－１３３１２６６．１、およびＡＤ－１４７９３７２からなる群から選択される二本鎖のうちのアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか一つと３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  8. 前記アンチセンス鎖は、ＡＤ－１３３１２０３．１、ＡＤ－１３３１２０６．１、ＡＤ－１３３１２０９．１、ＡＤ－１３３１２１２．１、ＡＤ－１３３１２１３．１、およびＡＤ－１４７９３７２からなる群から選択される二本鎖のうちのアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか一つと３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  9. 前記アンチセンス鎖は、ＡＤ－１３３１２１２．１、ＡＤ－１３３１２１３．１、およびＡＤ－１４７９３７２からなる群から選択される二本鎖のうちのアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか一つと、３ヌクレオチド以下だけ異なる、少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  10. 前記アンチセンス鎖は、ＡＤ－１４７９３７２のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列と、３ヌクレオチド以下だけ異なる、少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  11. 前記ｄｓＲＮＡ剤が、少なくとも一つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  12. 前記センス鎖の実質的にすべてのヌクレオチド、前記アンチセンス鎖の実質的にすべてのヌクレオチドが修飾を含むか、または前記センス鎖の実質的にすべてのヌクレオチドと前記アンチセンス鎖の実質的にすべてのヌクレオチドとが修飾を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  13. 前記センス鎖のすべてのヌクレオチドが修飾を含むか、前記アンチセンス鎖のすべてのヌクレオチドが修飾を含むか、または前記センス鎖のすべてのヌクレオチドと前記アンチセンス鎖のすべてのヌクレオチドとが修飾を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  14. 前記修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも一つは、デオキシ－ヌクレオチド、３’－末端デオキシチミジン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックヌクレオチド、アンロックヌクレオチド、立体配座的に制限されたヌクレオチド、拘束されたエチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－ヒドロキシ修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホラミデート、ヌクレオチドを含む非天然の塩基、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’－ホスフェートを含むヌクレオチド、５’－ホスフェート模倣体を含むヌクレオチド、熱不安定化ヌクレオチド、グリコール修飾ヌクレオチド（ＧＮＡ）、２’ホスフェートを含むヌクレオチド、および２－Ｏ－（Ｎ－メチルアセトアミド）修飾ヌクレオチド、ならびにそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、請求項１１～１３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  15. 前記ヌクレオチドに対する修飾は、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシル、およびグリコール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１１～１３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  16. 前記修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも一つが、デオキシ－ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、グリコール修飾ヌクレオチド（ＧＮＡ）、２’ホスフェートを含むヌクレオチドおよびビニル－ホスホネートヌクレオチド、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１１～１３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  17. 前記ヌクレオチドにおける修飾のうちの少なくとも一つが、熱不安定化ヌクレオチド修飾である、請求項１１～１３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  18. 前記熱不安定化ヌクレオチド修飾が、脱塩基修飾、二本鎖における対向するヌクレオチドとのミスマッチ、および不安定化糖修飾、２’－デオキシ修飾、非環式ヌクレオチド、アンロック核酸（ＵＮＡ）、およびグリセロール核酸（ＧＮＡ）からなる群から選択される、請求項１７に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  19. 前記二本鎖領域が、１９～３０ヌクレオチド対の長さである、請求項１～１８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  20. 前記二本鎖領域が、１９～２５ヌクレオチド対の長さである、請求項１９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  21. 前記二本鎖領域が、１９～２３ヌクレオチド対の長さである、請求項１９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  22. 前記二本鎖領域は、２３～２７ヌクレオチド対の長さである、請求項１９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  23. 前記二本鎖領域は、２１～２３ヌクレオチド対の長さである、請求項１９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  24. 各鎖が、独立に、３０ヌクレオチド以下の長さである、請求項１～２３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  25. 前記センス鎖が、２１ヌクレオチドの長さであり、前記アンチセンス鎖が、２３ヌクレオチドの長さである、請求項１～２４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  26. 前記相補的な領域が、少なくとも１７ヌクレオチドの長さである、請求項１～２５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  27. 前記相補的な領域が、１９から２３ヌクレオチドの長さである、請求項１～２６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  28. 前記相補的な領域が、１９ヌクレオチドの長さである、請求項１～２７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  29. 少なくとも一つの鎖は、少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  30. 少なくとも一つの鎖は、少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  31. リガンドをさらに含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  32. 前記リガンドが、前記ｄｓＲＮＡ剤の前記センス鎖の３’末端にコンジュゲートされる、請求項３１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  33. 前記リガンドが、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である、請求項３１または３２に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  34. 前記リガンドが、一価、二価、または三価の分枝リンカーを介して結合した一つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である、請求項３１～３３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  35. 前記リガンドが、以下のものである、請求項３３または３４に記載のｄｓＲＮＡ剤。
    Figure 2024508896000161
  36. 前記ｄｓＲＮＡ剤が、以下の概略図に示すように前記リガンドにコンジュゲートし、
    Figure 2024508896000162
     式中、ＸはＯまたはＳである、請求項３５に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  37. 前記ＸはＯである、請求項３６に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  38. 前記ｄｓＲＮＡ剤が、少なくとも一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結をさらに含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  39. 前記ホスホロチオエートヌクレオチド間連結またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結は、一つの鎖の３’末端にある、請求項３８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  40. 前記鎖は、前記アンチセンス鎖である、請求項３９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  41. 前記鎖は、前記センス鎖である、請求項３９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  42. 前記ホスホロチオエートヌクレオチド間連結またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結は、一つの鎖の５’末端にある、請求項３８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  43. 前記鎖は、前記アンチセンス鎖である、請求項４２に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  44. 前記鎖は、前記センス鎖である、請求項４２に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  45. 前記ホスホロチオエートヌクレオチド間連結またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結は、一つの鎖の５’末端および３’末端の両方にある、請求項３８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  46. 前記鎖は、前記アンチセンス鎖である、請求項４５に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  47. 前記二本鎖の前記アンチセンス鎖の５’末端の１位における塩基対が、ＡＵ塩基対である、請求項１～４６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  48. 前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｃｕｃｃｕＵｆＣｆＵｆｕｕｕｕａｕｕｇｕｕ－３’（配列番号１８）と４塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｄＡｓｃａｄＡｕｄＡａａａａｄＧａＡｆｇｇａｇｃｕｕｓｇｓｇ－３’（配列番号１９）と４塩基以下だけ異なり、
    式中、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり、ｄＡおよびｄＧは、２’－デオキシＡおよびＧであり、ＣｆおよびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、ｓはホスホロチオエート結合である、請求項１～４７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  49. 前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｃｕｃｃｕＵｆＣｆＵｆｕｕｕｕａｕｕｇｕｕ－３’（配列番号１８）と３塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｄＡｓｃａｄＡｕｄＡａａａａｄＧａＡｆｇｇａｇｃｕｕｓｇｓｇ－３’（配列番号１９）と３塩基以下だけ異なり、
    式中、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり、ｄＡおよびｄＧは、２’－デオキシＡおよびＧであり、ＣｆおよびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、ｓはホスホロチオエート結合である、請求項１～４７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  50. 前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｃｕｃｃｕＵｆＣｆＵｆｕｕｕｕａｕｕｇｕｕ－３’（配列番号１８）と２塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｄＡｓｃａｄＡｕｄＡａａａａｄＧａＡｆｇｇａｇｃｕｕｓｇｓｇ－３’（配列番号１９）と２塩基以下だけ異なり、
    式中、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり、ｄＡおよびｄＧは、２’－デオキシＡおよびＧであり、ＣｆおよびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、ｓはホスホロチオエート結合である、請求項１～４７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  51. 前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｃｕｃｃｕＵｆＣｆＵｆｕｕｕｕａｕｕｇｕｕ－３’（配列番号１８）と１塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｄＡｓｃａｄＡｕｄＡａａａａｄＧａＡｆｇｇａｇｃｕｕｓｇｓｇ－３’（配列番号１９）と１塩基以下だけ異なり、
    式中、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり、ｄＡおよびｄＧは、２’－デオキシＡおよびＧであり、ＣｆおよびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、ｓはホスホロチオエート結合である、請求項１～４７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  52. 前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｃｕｃｃｕＵｆＣｆＵｆｕｕｕｕａｕｕｇｕｕ－３’（配列番号１８）を含み、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｄＡｓｃａｄＡｕｄＡａａａａｄＧａＡｆｇｇａｇｃｕｕｓｇｓｇ－３’（配列番号１９）を含み、
    式中、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり、ｄＡおよびｄＧは、２’－デオキシＡおよびＧであり、ＣｆおよびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、ｓはホスホロチオエート結合である、請求項１～４７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  53. リガンドをさらに含む、請求項４８～５２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  54. 前記リガンドが、前記ｄｓＲＮＡ剤の前記センス鎖の３’末端にコンジュゲートされる、請求項５３に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  55. 前記リガンドが、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である、請求項５３または５４に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  56. 前記リガンドが、一価、二価、または三価の分枝リンカーを介して結合した一つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である、請求項５３～５５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  57. 前記リガンドが、以下のものである、請求項５３～５６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
    Figure 2024508896000163
  58. 前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｃｕｃｃｕＵｆＣｆＵｆｕｕｕｕａｕｕｇｕｕＬ９６－３’（配列番号２０）を含み、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｄＡｓｃａｄＡｕｄＡａａａａｄＧａＡｆｇｇａｇｃｕｕｓｇｓｇ－３’（配列番号１９）を含み、
    式中、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり、ｄＡおよびｄＧは、２’－デオキシＡおよびＧであり、ＣｆおよびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、ｓはホスホロチオエート結合であり、ならびにＬ９６はＮ－［トリス（ＧａｌＮＡｃ－アルキル）－アミドデカノイル）］－４－ヒドロキシプロリノールである、請求項４８～５７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  59. 前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｃｕｃｃｕＵｆＣｆＵｆｕｕｕｕａｕｕｇｕｕ－３’（配列番号１８）を含み、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｄＡｓｃａｄＡｕｄＡａａａａｄＧａＡｆｇｇａｇｃｕｕｓｇｓｇ－３’（配列番号１９）を含み、
    式中、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり、ｄＡおよびｄＧは、２’－デオキシＡおよびＧであり、ＣｆおよびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、ｓはホスホロチオエート結合であり、
    リガンドが、以下の概略図に示されるように、前記センス鎖の３’末端にコンジュゲートされ、
    Figure 2024508896000164
     式中、ＸはＯである、請求項４７～５８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  60. 前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｃｕｃＣｆｕＵｆＣｆＵｆｕｕｕｕａｕｕｇｕｕ－３’（配列番号２１）と４塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓＡｆｓｃａａＵｆａａａａａｇａＡｆｇＧｆａｇｃｕｕｓａｓａ－３’（配列番号２２）と４塩基以下だけ異なり、または
    前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｇｓｃｕｃｃＵｆｕＣｆＵｆＵｆｕｕｕａｕｕｇｕｕｕ－３’（配列番号２３）と４塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓＡｆｓａｃａＡｆｕａａａａａｇＡｆａＧｆｇａｇｃｕｓｕｓａ－３’（配列番号２４）と４塩基以下だけ異なり、
    式中、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり、ＣｆおよびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、ｓはホスホロチオエート結合である、請求項１～４７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  61. 前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｃｕｃＣｆｕＵｆＣｆＵｆｕｕｕｕａｕｕｇｕｕ－３’（配列番号２１）と３塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓＡｆｓｃａａＵｆａａａａａｇａＡｆｇＧｆａｇｃｕｕｓａｓａ－３’（配列番号２２）と３塩基以下だけ異なり、または
    前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｇｓｃｕｃｃＵｆｕＣｆＵｆＵｆｕｕｕａｕｕｇｕｕｕ－３’（配列番号２３）と３塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓＡｆｓａｃａＡｆｕａａａａａｇＡｆａＧｆｇａｇｃｕｓｕｓａ－３’（配列番号２４）と３塩基以下だけ異なり、
    式中、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり、ＣｆおよびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、ｓはホスホロチオエート結合である、請求項１～４７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  62. 前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｃｕｃＣｆｕＵｆＣｆＵｆｕｕｕｕａｕｕｇｕｕ－３’（配列番号２１）と２塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓＡｆｓｃａａＵｆａａａａａｇａＡｆｇＧｆａｇｃｕｕｓａｓａ－３’（配列番号２２）と２塩基以下だけ異なり、または
    前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｇｓｃｕｃｃＵｆｕＣｆＵｆＵｆｕｕｕａｕｕｇｕｕｕ－３’（配列番号２３）と２塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓＡｆｓａｃａＡｆｕａａａａａｇＡｆａＧｆｇａｇｃｕｓｕｓａ－３’（配列番号２４）と２塩基以下だけ異なり、
    式中、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり、ＣｆおよびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、ｓはホスホロチオエート結合である、請求項１～４７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  63. 前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｃｕｃＣｆｕＵｆＣｆＵｆｕｕｕｕａｕｕｇｕｕ－３’（配列番号２１）と１塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓＡｆｓｃａａＵｆａａａａａｇａＡｆｇＧｆａｇｃｕｕｓａｓａ－３’（配列番号２２）と１塩基以下だけ異なり、または
    前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｇｓｃｕｃｃＵｆｕＣｆＵｆＵｆｕｕｕａｕｕｇｕｕｕ－３’（配列番号２３）と１塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓＡｆｓａｃａＡｆｕａａａａａｇＡｆａＧｆｇａｇｃｕｓｕｓａ－３’（配列番号２４）と１塩基以下だけ異なり、
    式中、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり、ＣｆおよびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、ｓはホスホロチオエート結合である、請求項１～４７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  64. 前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｃｕｃＣｆｕＵｆＣｆＵｆｕｕｕｕａｕｕｇｕｕ－３’（配列番号２１）を含み、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓＡｆｓｃａａＵｆａａａａａｇａＡｆｇＧｆａｇｃｕｕｓａｓａ－３’（配列番号２２）を含み、または
    前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｇｓｃｕｃｃＵｆｕＣｆＵｆＵｆｕｕｕａｕｕｇｕｕｕ－３’（配列番号２３）を含み、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓＡｆｓａｃａＡｆｕａａａａａｇＡｆａＧｆｇａｇｃｕｓｕｓａ－３’（配列番号２４）を含み、
    式中、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり、ＣｆおよびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、ｓはホスホロチオエート結合である、請求項１～４７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  65. リガンドをさらに含む、請求項６０～６４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  66. 前記リガンドが、前記ｄｓＲＮＡ剤の前記センス鎖の３’末端にコンジュゲートされる、請求項６５に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  67. 前記リガンドが、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である、請求項６５または６６に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  68. 前記リガンドが、一価、二価、または三価の分枝リンカーを介して結合した一つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である、請求項６５～６７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  69. 前記リガンドが、以下のものである、請求項６５～６８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
    Figure 2024508896000165
  70. 前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｃｕｃＣｆｕＵｆＣｆＵｆｕｕｕｕａｕｕｇｕｕＬ９６－３’（配列番号２５）を含み、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓＡｆｓｃａａＵｆａａａａａｇａＡｆｇＧｆａｇｃｕｕｓａｓａ－３’（配列番号２２）を含み、または
    前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｇｓｃｕｃｃＵｆｕＣｆＵｆＵｆｕｕｕａｕｕｇｕｕｕＬ９６－３’（配列番号２８１）を含み、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓＡｆｓａｃａＡｆｕａａａａａｇＡｆａＧｆｇａｇｃｕｓｕｓａ－３’（配列番号２４）を含み、
    式中、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり、ＣｆおよびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、ｓはホスホロチオエート結合であり、ならびにＬ９６はＮ－［トリス（ＧａｌＮＡｃ－アルキル）－アミドデカノイル）］－４－ヒドロキシプロリノールである、請求項６０～６９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  71. 前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｃｕｃＣｆｕＵｆＣｆＵｆｕｕｕｕａｕｕｇｕｕ－３’（配列番号２１）を含み、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓＡｆｓｃａａＵｆａａａａａｇａＡｆｇＧｆａｇｃｕｕｓａｓａ－３’（配列番号２２）を含み、
    式中、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり、ＣｆおよびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、ｓはホスホロチオエート結合であり、
    リガンドが、以下の概略図に示されるように、前記センス鎖の３’末端にコンジュゲートされ、
    Figure 2024508896000166
     ならびに
    式中、ＸはＯである、請求項６０～７０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  72. 前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｇｓｃｕｃｃＵｆｕＣｆＵｆＵｆｕｕｕａｕｕｇｕｕｕ－３’（配列番号２３）を含み、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓＡｆｓａｃａＡｆｕａａａａａｇＡｆａＧｆｇａｇｃｕｓｕｓａ－３’（配列番号２４）を含み、
    式中、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり、ＣｆおよびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、ｓはホスホロチオエート結合であり、
    リガンドが、以下の概略図に示されるように、前記センス鎖の３’末端にコンジュゲートされ、
    Figure 2024508896000167
     ならびに
    式中、ＸはＯである、請求項６０～７０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  73. 請求項１～７２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を含有する、細胞。
  74. 請求項１～７２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を含む、アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）をコードする遺伝子の発現を阻害する医薬組成物。
  75. ｄｓＲＮＡ剤は、非緩衝溶液中にある、請求項７４に記載の医薬組成物。
  76. 前記非緩衝溶液は、生理食塩水または水である、請求項７５に記載の医薬組成物。
  77. 前記ｄｓＲＮＡ剤は、緩衝溶液中にある、請求項７４に記載の医薬組成物。
  78. 前記緩衝溶液は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、またはリン酸塩、またはそれらのいずれかの組合せを含む、請求項７７に記載の医薬組成物。
  79. 前記緩衝溶液が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、請求項７８に記載の医薬組成物。
  80. 細胞内でアンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）遺伝子の発現を阻害する方法であって、前記方法が、前記細胞を請求項１～７２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤、または請求項７４～７９のいずれか一項に記載の医薬組成物と接触させて、それによって前記細胞内で前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害することを含む、方法。
  81. 前記細胞は、対象内にある、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記対象が、ヒトである、請求項８１に記載の方法。
  83. 前記対象が、ＡＮＧＰＴＬ３関連障害を有する、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記ＡＮＧＰＴＬ３関連障害が、脂質代謝の障害である、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記脂質代謝障害が、高脂血症または高トリグリセリド血症である、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記細胞を前記ｄｓＲＮＡ剤と接触させることで、ＡＮＧＰＴＬ３の発現が少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％阻害される、請求項８０～８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. ＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害することにより、前記対象の血清中のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルを少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％減少させる、請求項８０～８６のいずれか一項に記載の方法。
  88. アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）発現の減少から恩恵を受けることとなる障害のある対象を治療する方法であって、請求項１～７２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤または請求項７４～７９のいずれか一項に記載の医薬組成物の治療有効量を前記対象に投与し、それによってＡＮＧＰＴＬ３発現の減少から恩恵を受けることとなる前記障害がある前記対象を治療することを含む、方法。
  89. アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）発現の減少から恩恵を受けることとなる障害のある対象における少なくとも一の症状を予防する方法であって、請求項１～７２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤または請求項７４～７９のいずれか一項に記載の医薬組成物の予防的有効量を前記対象に投与し、それによってＡＮＧＰＴＬ３発現の減少から恩恵を受けることとなる前記障害がある前記対象における少なくとも一の症状を予防することを含む、方法。
  90. 前記障害が、ＡＮＧＰＴＬ３関連障害である、請求項８８または８９に記載の方法。
  91. 前記ＡＮＧＰＴＬ３関連障害が、脂質代謝の障害である、請求項９０に記載の方法。
  92. 前記脂質代謝障害が、高脂血症または高トリグリセリド血症である、請求項９１に記載の方法。
  93. 前記対象がヒトである、請求項８８～９２のいずれか一項に記載の方法。
  94. 前記対象への前記薬剤の投与が、一つ以上の血清脂質の減少および／またはＡＮＧＰＴＬ３タンパク質蓄積の減少を引き起こす、請求項８８～９３のいずれか一項に記載の方法。
  95. 前記ｄｓＲＮＡ剤は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの用量で前記対象に投与される、請求項８８～９４のいずれか一項に記載の方法。
  96. 前記ｄｓＲＮＡ剤は、前記対象に皮下投与される、請求項８８～９５のいずれか一項に記載の方法。
  97. 前記対象からの試料中のＡＮＧＰＴＬ３レベルを判定することをさらに含む、請求項８８～９６のいずれか一項に記載の方法。
  98. 前記対象からの試料中のＡＮＧＰＴＬ３レベルが、血液試料または血清試料中のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルである、請求項９７に記載の方法。
  99. ＡＮＧＰＴＬ３関連障害を治療するために、追加の治療薬を前記対象に投与することをさらに含む、請求項８８～９８のいずれか一項に記載の方法。
  100. 請求項１～７２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤、または請求項７４～７９のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む、キット。
  101. 請求項１～７２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤、または請求項７４～７９のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む、バイアル。
  102. 請求項１～７２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤、または請求項７４～７９のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む、シリンジ。
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