JP2023506258A - パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）ｉＲＮＡ組成物およびその使用法 - Google Patents

パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）ｉＲＮＡ組成物およびその使用法 Download PDF

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Abstract

本発明は、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）遺伝子ターゲティングＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤に関する。本発明はまた、このようなＲＮＡｉ剤を使用して、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害する方法、ならびにＰＮＰＬＡ３関連障害、例えば、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を防止および処置する方法にも関する。

Description

関連出願
本出願は、２０１９年１２月１６日に出願された米国特許仮出願第６２／９４８，４４５号、および２０２０年６月１８日に出願された同第６３／０４０，６０２号の利益を主張する。前出の各々の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットにおいて、電子的に提出され、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる配列表を含有する。１２月３日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、１２１３０１－１０６２０＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、１，０９７，１６９バイトのサイズである。
肝臓内の、過剰なトリグリセリドの蓄積は、肝臓脂肪症（または脂肪肝）として公知であり、インスリン抵抗性および脂質異常症を含む、有害な代謝転帰と関連する。脂肪肝は、アルコール摂取が過剰な対象、および肥満、糖尿病、または高脂血症を有する対象において、高頻度において見出される。しかし、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、過剰なアルコール摂取の非存在下（＞１日当たり１０ｇ）において発症しうる。ＮＡＦＬＤとは、単純性脂肪肝（脂肪症）から、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変（肝臓の、不可逆性であり、進行性である瘢痕化）へと進行しうる、広範なスペクトルにわたる肝疾患を指す。ＮＡＦＬＤの全ての病期は、一般に、肝細胞（肝細胞）内の脂肪の蓄積（脂肪性浸潤）を有する。
ＮＡＦＬＤスペクトルは、単純性脂肪肝（脂肪症）と呼ばれる、その最初期により始まり、ここから進行する。単純性脂肪肝は、炎症（肝炎）または瘢痕化（線維症）を伴わない、肝細胞内の脂肪（トリグリセリド）の蓄積を伴う。ＮＡＦＬＤスペクトル内の、次の病期および重症度は、肝細胞内の脂肪の蓄積のほか、肝炎を伴うＮＡＳＨである。炎症性細胞は、肝細胞を破壊し（肝細胞壊死）、ＮＡＳＨは、最終的に、肝臓の瘢痕化（線維症）をもたらし、続いて、不可逆性であり、進行性である瘢痕化（肝硬変）をもたらす。ＮＡＳＨにより引き起こされる肝硬変は、ＮＡＦＬＤスペクトル内の、最終であり、かつ、最も重度である病期である。
２００８年、肝脂肪含量について査定する、肝臓についての陽子磁気共鳴分光法を伴う、個体についての全ゲノム関連研究において、肝脂肪含量と、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）遺伝子との間において、有意な関連が同定された［例えば、Romeo et al. (2008) Nat. Genet., 40(12):1461-1465を参照されたい］。ノックインマウスによる研究は、ＰＮＰＬＡ３内の、配列多型（ｒｓ７３８４０９、Ｉ１４８Ｍ）の発現が、ＮＡＦＬＤを引き起こし、脂質液滴上における、触媒的に非活性のＰＮＰＬＡ３の蓄積が、肝臓内のトリグリセリドの蓄積と関連することを裏付けている［Smagris et al. (2015) Hepatology, 61:108-118］。具体的に述べると、ＰＮＰＬＡ３のＩ１４８Ｍ変異体は、ヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達経路を活性化させ、肝星状細胞の活性化および増殖、ならびに細胞外マトリックスの過剰な発生および沈着をもたらすことにより、線維形成の発生の促進と関連した［Chen et al. (2015) World J. Gastroenterol., 21(3):794-802］。
現行において、ＮＡＦＬＤのための処置は、体重の減少、およびインスリン抵抗性または脂質異常症など、任意の続発状態の処置へと方向付けられている。現在のところ、ＮＡＦＬＤのための薬理学的処置は、承認されていない。したがって、ＮＡＦＬＤを患う対象のための治療が必要とされている。
本発明は、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）をコードする遺伝子のＲＮＡ転写物の、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介切断に影響を及ぼすｉＲＮＡ組成物を提供する。パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）は、細胞内、例えば、ヒト対象などの対象内部の細胞内のＰＮＰＬＡ３でありうる。
ある態様において、本発明は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列と、０、１、２、または３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号２のヌクレオチド配列と、１、２、または３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の連続ヌクレオチドを含む、細胞内のパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤を提供する。一実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つの熱不安定性ヌクレオチド修飾、例えば、脱塩基性修飾；二重鎖内の対向ヌクレオチドとのミスマッチ；ならびに不安定性糖修飾、２’－デオキシ修飾、非環状ヌクレオチド、アンロック核酸（ＵＮＡ）、またはグリセロール核酸（ＧＮＡ）を含み、例えば、アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定性ヌクレオチド修飾を含む。
別の態様において、本発明は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）をコードするｍＲＮＡに対する相補性領域を含み、相補性領域が、表２～１１、２１、２４、２７、３０、３２、３３、３６、３７、４９、または５０のうちのいずれか１つにおけるアンチセンスヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと、０、１、２、または３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の連続ヌクレオチドを含む、細胞内のパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供する。
一態様において、本発明は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列の、ヌクレオチド６７７～７２１；６８３～７２１；７７３～８１７；１１８５～１２９５；１１８５～１２４１；１２０２～１２９５；１２０２～１２４１；１２５５～１２９５；１７３８～１７９２；１９０１～１９４５；１９２０～１９４５；２１０８～２２０８；２１０８～２１６６；２１０８～２１３６；２１２１～２１６６；２１２１～２２０８；２１６９～２２０８；２１７６～２２０８；または２２３９～２２６５のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと、０、１、２、または３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号２の対応するヌクレオチド配列に由来する、少なくとも１９の連続ヌクレオチドを含む、細胞内のパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供する。
一態様において、本発明は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列の、ヌクレオチド５７４～５９６；６７７～６９９；６８３～７０５；６９９～７２１；７７３～７９５；７９５～８１７；１１８５～１２０７；１１９２～１２１４；１２０２～１２２４；１２０８～１２３０；１２０９～１２３１；１２１０～１２３２；１２１１～１２３３；１２１２～１２３４；１２１３～１２３３；１２１４～１２３４；１２１４～１２３６；１２１５～１２３７；１２１６～１２３８；１２１９～１２３７；１２１９～１２４１；１２５５～１２７５；１２５６～１２７６；１２５７～１２７５；１２５７～１２７７；１２５８～１２７８；１２５９～１２７９；１２６０～１２７８；１２６０～１２８０；１２６１～１２８１；１２６２～１２８２；１２６３～１２８３；１２６４～１２８２；１２６４～１２８４；１２６５～１２８５；１２６７～１２８５；１２６６～１２８６；１２６６～１２８８；１２６７～１２８５；１２６７～１２８７；１２６８～１２９０；１２６９～１２８９；１２７０～１２９０；１２７１～１２９１；１２７２～１２９２；１２７３～１２９３；１２７４～１２９４；１２７５～１２９５；１６３１～１６５３；１７３８～１７６０；１７３９～１７６１；１７４０～１７６０；１７４０～１７６２；１７４１～１７６３；１７４４～１７６６；１７４６～１７６６；１７５０～１７７２；１７５１～１７７３；１７５２～１７７４；１７５３～１７７５；１７５４～１７７６；１７５５～１７７７；１７５６～１７７８；１７５７～１７７９；１７５８～１７８０；１７５９～１７８１；１７６０～１７８２；１７６１～１７８３；１７６２～１７８２；１７６２～１７８４；１７６３～１７８５；１７６４～１７８６；１７６５～１７８７；１７６６～１７８６；１７６６～１７８８；１７６７～１７８７；１７６８～１７８８；１７６７～１７８９；１７６９～１７８９；１７７０～１７８８；１７７０～１７９０；１７７１～１７９１；１７７２～１７９２；１８１５～１８３７；１９０１～１９２３；１９２０～１９４２；１９２３～１９４５；２１１２～２１３０；２１６９～２１９１；２１７１～２１９１；２１７６～２１９８；２１７７～２１９９；２１７８～２２００；２１７９～２２０１；２１８０～２２０２；２１８１～２２０３；２１８３～２２０５；２１８４～２２０６；２１８６～２２０８；２２３９～２２６１；２２４１～２２６３；２２４２～２２６４；または２２４３～２２６５のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと、０、１、２、または３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号２の対応するヌクレオチド配列に由来する、少なくとも１９の連続ヌクレオチドを含む、細胞内のパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供する。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、ＡＤ－５１７１９７．２；ＡＤ－５１７２５８．２；ＡＤ－５１６７４８．２；ＡＤ－５１６８５１．２；ＡＤ－５１９３５１．２；ＡＤ－５１９７５４．２；ＡＤ－５１９８２８．２；ＡＤ－５２００１８．２；ＡＤ－５２００３５．２；ＡＤ－５２００６２．２；ＡＤ－５２００６４．２；ＡＤ－５２００６５．２；ＡＤ－５２００６７．２；ＡＤ－７５２８９．２；ＡＤ－５２００６９．２；ＡＤ－５２００９９．２；ＡＤ－６７５７５．７；ＡＤ－５２０１０１．２；ＡＤ－６７６０５．７；ＡＤ－１１９３３２３．１；ＡＤ－１１９３３４４．１；ＡＤ－１１９３３５０．１；ＡＤ－１１９３３６５．１；ＡＤ－１１９３３７９．１；ＡＤ－１１９３４０７．１；ＡＤ－１１９３４２１．１；ＡＤ－１１９３４２２．１；ＡＤ－１１９３４２９．１；ＡＤ－１１９３４３７．１；ＡＤ－１１９３４４３．１；ＡＤ－１１９３４７１．１；およびＡＤ－１１９３４８１．１からなる群から選択される二重鎖の、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと、０、１、２、または３ヌクレオチド以下（ｎｏｒ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ）異なる、少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の連続ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、ＡＤ－５１９３４５．１、ＡＤ－５１９３４６．１、ＡＤ－５１９３４７．１、ＡＤ－６７５５４．７、ＡＤ－５１９７５２．３、ＡＤ－１０１０７３１．１、ＡＤ－１０１０７３２．１、ＡＤ－５１９３４３．１、ＡＤ－５１９３４４．１、ＡＤ－５１９３４９．１、ＡＤ－５１９３５０．１、ＡＤ－５１９７５３．２、ＡＤ－５１９９３２．１、ＡＤ－５１９９３５．２、ＡＤ－５２００１８．６、ＡＤ－５１７８３７．２、ＡＤ－８０５６３５．２、ＡＤ－５１９３２９．２、ＡＤ－５２００６３．２、ＡＤ－５１９７５７．２、ＡＤ－８０５６３１．２、ＡＤ－５１６９１７．２、ＡＤ－５１６８２８．２、ＡＤ－５１８９８３．２、ＡＤ－８０５６３６．２、ＡＤ－５１９７５４．７、ＡＤ－５２００６２．２、ＡＤ－６７５７５．９、ＡＤ－５１８９２３．３、ＡＤ－５２００５３．４、ＡＤ－５１９６６７．２、ＡＤ－５１９７７３．２、ＡＤ－５１９３５４．２、ＡＤ－５２００６０．４、ＡＤ－５２００６１．４、ＡＤ－１０１０７３３．２、ＡＤ－１０１０７３５．２；ＡＤ－１１９３３２３．１；ＡＤ－１１９３３４４．１；ＡＤ－１１９３３５０．１；ＡＤ－１１９３３６５．１；ＡＤ－１１９３３７９．１；ＡＤ－１１９３４０７．１；ＡＤ－１１９３４２１．１；ＡＤ－１１９３４２２．１；ＡＤ－１１９３４２９．１；ＡＤ－１１９３４３７．１；ＡＤ－１１９３４４３．１；ＡＤ－１１９３４７１．１；およびＡＤ－１１９３４８１．１からなる群から選択される二重鎖の、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと、０、１、２、または３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の連続ヌクレオチドを含む。
一態様において、本発明は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖が、配列番号１の、ヌクレオチド１２００～１２５０、１２０５～１２５０、１１２１０～１２５０、１２００～１２４５、１２００～１２４０、１２００～１２３５、１２００～１２３７、１２０５～１２３７、１２１０～１２３２、１２１２～１２３７、１２１２～１２３４、１２５０～１３００、１２５５～１３００、１２６０～１３００、１２５０～１２９５、１２５０～１３９０、１２５０～１２８５、１２５０～１２８２、１２５５～１２８２、１２６０～１２８２、１２６２～１３００、１２６２～１２９５、１２６２～１３９０、および１２６２～１２８２のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと、３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号２の対応するヌクレオチド配列に由来する、少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含む、細胞内のパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供する。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、ＡＤ－５１９３４５、ＡＤ－１１９３３５０、ＡＤ－１１９３３６５、ＡＤ－１１９３４３７；およびＡＤ－５１９３４７からなる群から選択される二重鎖の、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと、０、１、２、または３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の連続ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、二重鎖である、ＡＤ－５１９３５１のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列と、０、１、２、または３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の連続ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、二重鎖である、ＡＤ－１１９３３５０のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列と、０、１、２、または３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の連続ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、二重鎖である、ＡＤ－１１９３３６５のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列と、０、１、２、または３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の連続ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、二重鎖である、ＡＤ－１１９３４３７のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列と、０、１、２、または３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の連続ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、二重鎖である、ＡＤ－５１９３４７のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列と、０、１、２、または３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の連続ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全ては、修飾を含むか；アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全ては、修飾を含むか；またはセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全て、およびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全ては、修飾を含む。
一実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの全ては、修飾を含むか；アンチセンス鎖のヌクレオチドの全ては、修飾を含むか；またはセンス鎖のヌクレオチドの全て、およびアンチセンス鎖のヌクレオチドの全ては、修飾を含む。
一実施形態において、修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、デオキシヌクレオチド、３’末端デオキシチミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックヌクレオチド、アンロックヌクレオチド、配座固定ヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基性ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－ヒドロキシル（ｈｙｄｒｏｘｌｙ）修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキシニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’－リン酸を含むヌクレオチド、５’－リン酸模倣体を含むヌクレオチド、熱不安定性ヌクレオチド、グリコール修飾ヌクレオチド（ＧＮＡ）、および２－Ｏ－（Ｎ－メチルアセトアミド）修飾ヌクレオチド；ならびにこれらの組合せからなる群から選択される。
一実施形態において、ヌクレオチド上の修飾は、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシル、およびグリコール；ならびにこれらの組合せからなる群から選択される。
一実施形態において、修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、デオキシヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、グリコール修飾ヌクレオチド（ＧＮＡ）、例えば、Ｇｇｎ、Ｃｇｎ、Ｔｇｎ、またはＡｇｎ、およびビニルホスホネートヌクレオチド；ならびにこれらの組合せからなる群から選択される。
別の実施形態において、ヌクレオチド上の修飾のうちの少なくとも１つは、熱不安定性ヌクレオチド修飾である。
一実施形態において、熱不安定性ヌクレオチド修飾は、脱塩基性修飾；二重鎖内の対向ヌクレオチドとのミスマッチ；ならびに不安定性糖修飾、２’－デオキシ修飾、非環状ヌクレオチド、アンロック核酸（ＵＮＡ）、およびグリセロール核酸（ＧＮＡ）からなる群から選択される。
一部の実施形態において、修飾ヌクレオチドは、３’末端デオキシチミンヌクレオチド（ｄＴ）の短い配列を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド上の修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾、ＧＮＡ修飾、および２’フルオロ修飾である。
一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結をさらに含む。一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、６つ～８つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。一実施形態において、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結は、１つの鎖の３’末端にある。鎖は、アンチセンス鎖でもよい。別の実施形態において、鎖は、センス鎖である。関連の実施形態において、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結は、１つの鎖の５’末端にある。鎖は、アンチセンス鎖でもよい。別の実施形態において、鎖は、センス鎖である。別の実施形態において、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結は、１つの鎖の５’末端および３’末端の両方にある。鎖は、アンチセンス鎖でもよい。別の実施形態において、鎖は、センス鎖である。
二本鎖領域は、１９～３０ヌクレオチド対の長さ；１９～２５ヌクレオチド対の長さ；１９～２３ヌクレオチド対の長さ；２３～２７ヌクレオチド対の長さ；または２１～２３ヌクレオチド対の長さでありうる。
一実施形態において、各鎖は、独立に、３０ヌクレオチド以下の長さである。
一実施形態において、センス鎖は、２１ヌクレオチドの長さであり、アンチセンス鎖は、２３ヌクレオチドの長さである。
相補性領域は、少なくとも１７ヌクレオチドの長さ；１９～２３ヌクレオチドの間の長さ；または１９ヌクレオチドの長さでありうる。
一実施形態において、少なくとも１つの鎖は、少なくとも１ヌクレオチドの３’突出を含む。別の実施形態において、少なくとも１つの鎖は、少なくとも２ヌクレオチドの３’突出を含む。
一実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、リガンドをさらに含む。
一実施形態において、リガンドは、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖の３’末端とコンジュゲートされている。
一実施形態において、リガンドは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である。
一実施形態において、リガンドは、一価、二価、または三価の分枝状リンカーを介して接合されている１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
一実施形態において、リガンドは、
Figure 2023506258000001
 である。
一実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、以下の図式
Figure 2023506258000002
 において示されるリガンドとコンジュゲートされ、Ｘは、ＯまたはＳである。
一実施形態において、Ｘは、Ｏである。
一実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結をさらに含む。
一実施形態において、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結は、１つの鎖の３’末端、例えば、アンチセンス鎖またはセンス鎖にある。
別の実施形態において、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結は、１つの鎖の５’末端、例えば、アンチセンス鎖またはセンス鎖にある。
一実施形態において、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結は、１つの鎖の５’末端および３’末端の両方にある。一実施形態において、鎖は、アンチセンス鎖である。
一実施形態において、二重鎖のアンチセンス鎖の５’末端の１位における塩基対は、ＡＵ塩基対である。
本発明はまた、本発明のｄｓＲＮＡ剤のうちのいずれか、および本発明のｄｓＲＮＡ剤のうちのいずれかを含む医薬組成物を含有する細胞も提供する。
本発明の医薬組成物は、ｄｓＲＮＡ剤を、非緩衝液中、例えば、生理食塩液または水中に含む場合もあり、本発明の医薬組成物は、ｄｓＲＮＡ剤を、緩衝液中、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、プロクラミン塩、炭酸塩、もしくはリン酸塩、またはこれらの任意の組合せを含む緩衝液；あるいはリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）中に含む場合もある。
一態様において、本発明は、細胞内のパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。方法は、細胞を、本発明のｄｓＲＮＡ、または本発明の医薬組成物のいずれかと接触させ、これにより、細胞内のＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害することを含む。
一実施形態において、細胞は、対象、例えば、ヒト対象、例えば、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓内の脂肪の蓄積、肝炎、肝細胞壊死、肝線維症、肥満、または非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）からなる群から選択される、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）関連障害などのパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）関連障害を有する対象内部の細胞である。
一実施形態において、細胞を、ｄｓＲＮＡ剤と接触させることは、ＰＮＰＬＡ３の発現を、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％阻害する。
一実施形態において、ＰＮＰＬＡ３の発現を阻害することは、対象の血清中のＰＮＰＬＡ３タンパク質レベルを、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％低下させる。
一態様において、本発明は、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）発現の低減から利益を得る障害を有する対象を処置する方法を提供する。方法は、対象へと、治療有効量の、本発明のｄｓＲＮＡ、または本発明の医薬組成物のいずれかを投与し、これにより、ＰＮＰＬＡ３発現の低減から利益を得る障害を有する対象を処置することを含む。
別の態様において、本発明は、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）発現の低減から利益を得る障害を有する対象における、少なくとも１つの症状を防止する方法を提供する。方法は、対象へと、予防有効量の、本発明のｄｓＲＮＡ、または本発明の医薬組成物のいずれかを投与し、これにより、ＰＮＰＬＡ３発現の低減から利益を得る障害を有する対象における、少なくとも１つの症状を防止することを含む。
一実施形態において、障害は、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）関連障害であり、例えば、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）関連障害は、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓内の脂肪の蓄積、肝炎、肝細胞壊死、肝線維症、肥満、または非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）からなる群から選択される。
一実施形態において、ＰＮＰＬＡ３関連障害は、ＮＡＦＬＤである。
一実施形態において、対象は、ヒトである。
一実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、対象へと、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの用量において投与される。
一実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、対象へと、皮下投与される。
本発明についての一実施形態において方法は、対象に由来する試料中のＰＮＰＬＡ３レベルをさらに決定することを含む。
一実施形態において、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）の、対象試料中レベルは、血液試料中または血清試料中の、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）タンパク質レベルである。
ある特定の実施形態において、本発明の方法は、対象へと、さらなる治療剤を投与することをさらに含む。さらなる実施形態において、さらなる治療剤は、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、フィブレート、胆汁酸封鎖剤、ナイアシン、抗血小板薬剤、アンジオテンシン転換酵素阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、アシルＣｏＡコレステロールアセチルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害剤、コレステロール吸収阻害剤、コレステロールエステル輸送タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害剤、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＴＰ）阻害剤、コレステロールモジュレーター、胆汁酸モジュレーター、ペルオキシソーム増殖活性化させた受容体（ＰＰＡＲ）アゴニスト、遺伝子ベースの治療、複合血管保護剤、糖タンパク質Ｉｌｂ／ＩＩＩａ阻害剤、アスピリンまたはアスピリン様化合物、ＩＢＡＴ阻害剤、スクアレンシンターゼ阻害剤、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）Ｉ阻害剤、または魚油からなる群から選択される。
本発明はまた、本発明のｄｓＲＮＡ、または本発明の医薬組成物のいずれかと、適宜、使用のための指示書とを含むキットも提供する。
図１は、表示のｄｓＲＮＡ二重鎖の、単回の３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの投与を皮下において実施された、投与後７日目または１４日目のマウス（群１つ当たりのｎ＝３）における、ヒトＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。ヒトＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡレベルを、ＰＢＳ処置により検出される対照レベルと比べて示す。 図２は、実施例３に記載される通りに、表示のｄｓＲＮＡ二重鎖の単回投与を皮下において実施された、投与後７日目のマウス（群１つ当たりのｎ＝３）における、ヒトＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。ヒトＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡレベルを、ＰＢＳ処置により検出される対照レベルと比べて示す。 図３は、表示のｄｓＲＮＡ二重鎖の、単回の１０ｍｇ／ｋｇの投与を皮下において実施された、投与後７日目のマウス（群１つ当たりのｎ＝３）における、ヒトＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。ヒトＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡレベルを、ＰＢＳ処置により検出される対照レベルと比べて示す。 図４は、実施例３に記載される通りに、表示のｄｓＲＮＡ二重鎖の、単回の１０ｍｇ／ｋｇの投与、または複数回にわたる１０ｍｇ／ｋｇの投与を皮下において実施された、投与後７日目のマウス（群１つ当たりのｎ＝３）における、ヒトＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。ヒトＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡレベルを、ＰＢＳ処置により検出される対照レベルと比べて示す。 図５は、表示のｄｓＲＮＡ二重鎖の、単回の１０ｍｇ／ｋｇの投与を皮下において実施された、投与後７日目のマウス（群１つ当たりのｎ＝３）における、ヒトＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。ヒトＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡレベルを、ＰＢＳ処置により検出される対照レベルと比べて示す。 図６は、表示のｄｓＲＮＡ二重鎖の、単回の１０ｍｇ／ｋｇの投与を皮下において実施された、投与後７日目のマウス（群１つ当たりのｎ＝３）における、ヒトＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。ヒトＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡレベルを、ＰＢＳ処置により検出される対照レベルと比べて示す。 図７は、表示のｄｓＲＮＡ二重鎖の、単回の１０ｍｇ／ｋｇの投与を皮下において実施された、投与後７日目のマウス（群１つ当たりのｎ＝３）における、ヒトＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。ヒトＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡレベルを、ＰＢＳ処置により検出される対照レベルと比べて示す。
本発明は、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）遺伝子のＲＮＡ転写物の、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介切断を実行する（ｅｆｆｅｃｔ）ｉＲＮＡ組成物を提供する。遺伝子は、細胞内、例えば、ヒト対象などの対象内部の細胞内の遺伝子でありうる。これらのｉＲＮＡの使用は、哺乳動物における、対応する遺伝子（パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）遺伝子）のｍＲＮＡのターゲティング分解を可能とする。
本発明のｉＲＮＡは、他の哺乳動物種のパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）オーソログ内において保存される遺伝子の部分を含め、ヒトパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）遺伝子をターゲティングするようにデザインされている。理論に限定されることを意図せずに述べると、これらのｉＲＮＡにおける、前出の特性および特異的標的部位または特異的修飾の組合せまたは部分的組合せは、本発明のｉＲＮＡに、有効性、安定性、効能、持続性、および安全性の改善を付与すると考えられる。
したがって、本発明は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子のＲＮＡ転写物の、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介切断を実行するｉＲＮＡ組成物を使用して、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）関連障害、例えば、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓内の脂肪の蓄積、肝炎、肝細胞壊死、肝線維症、肥満、または非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を処置および防止するための方法を提供する。
本発明のｉＲＮＡは、最大において、約３０ヌクレオチドまたはこれ未満の長さ、例えば、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチドの長さであり、ＰＮＰＬＡ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と、実質的に相補的である領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含む。
ある特定の実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤の鎖の一方または両方は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と、実質的に相補的である、少なくとも１９連続ヌクレオチドの領域を伴う、最大において、６６ヌクレオチドの長さ、例えば、３６～６６、２６～３６、２５～３６、３１～６０、２２～４３、２７～５３ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態において、長さの長いアンチセンス鎖を有する、このようなｉＲＮＡ剤は、好ましくは、２０～６０ヌクレオチドの長さの、第２のＲＮＡ鎖（センス鎖）を含むことが可能であり、この場合、センス鎖およびアンチセンス鎖は、１８～３０連続ヌクレオチドの二重鎖を形成する。
本発明のｉＲＮＡの使用は、哺乳動物における、対応する遺伝子（ＰＮＰＬＡ３遺伝子）のｍＲＮＡのターゲティング分解を可能とする。インビトロアッセイを使用して、本発明者らは、ＰＮＰＬＡ３遺伝子をターゲティングするｉＲＮＡが、ＲＮＡｉを、強力に媒介する結果として、ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現の著明な阻害をもたらすことを裏付けている。したがって、これらのｉＲＮＡを含む方法および組成物は、ＰＮＰＬＡ３関連障害、例えば、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓内の脂肪の蓄積、肝炎、肝細胞壊死、肝線維症、肥満、または非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を有する対象を処置するために有用である。
したがって、本発明は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子のＲＮＡ転写物の、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介切断に影響を及ぼすｉＲＮＡ組成物を使用して、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現の阻害または低減から利益を得る障害、例えば、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓内の脂肪の蓄積、肝炎、肝細胞壊死、肝線維症、肥満、または非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）などのパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）関連疾患を有する対象を処置するための方法および組合せ療法を提供する。
本発明はまた、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現の阻害または低減から利益を得る障害、例えば、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓内の脂肪の蓄積、肝炎、肝細胞壊死、肝線維症、肥満、または非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を有する対象における、少なくとも１つの症状を防止するための方法も提供する。例えば、ＮＡＦＬＬＤを有する対象において、本発明の方法は、対象における、少なくとも１つの症状、例えば、疲労感、衰弱、体重の減少、食欲の減退、悪心、腹痛、クモ状血管、皮膚および眼の黄変（黄疸）、掻痒、体液の固化および脚部腫脹（浮腫）、腹部腫脹（腹水）、ならびに精神錯乱を軽減しうる。
以下の「発明を実施するための形態」は、ｉＲＮＡを含有する組成物をどのようにして作り、使用して、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害するのかについて開示するほか、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現の阻害および／または低減から利益を得る対象、例えば、ＰＮＰＬＡ３関連障害に罹患しやすいか、またはこれを伴うと診断された対象を処置するための組成物、使用、および方法を開示する。
Ｉ．定義
本発明が、よりたやすく理解されうるように、まず、ある特定の用語について規定する。加えて、パラメータの値または値の範囲が列挙される場合は常に、値および列挙される値の中間の範囲もまた、本発明の一部であると意図されることに注意されたい。
本明細書において、「ある（ａ）」および「ある（ａｎ）」という冠詞は、１つまたは１つを超える（すなわち、少なくとも１つの）、冠詞の文法的対象を指すように使用される。例として述べると、「要素」とは、１つの要素または１つを超える要素、例えば、複数の要素を意味する。
本明細書において、「～を含むこと」という用語は、「～を含むがこれらに限定されないこと」という語句を意味するように使用され、これと互換的に使用される。
本明細書において、「または」という用語は、文脈により、そうでないことが明確に指し示されない限りにおいて、「および／または」という用語を意味するように使用され、これと互換的に使用される。例えば、「センス鎖またはアンチセンス鎖」は、「センス鎖もしくはアンチセンス鎖、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖」と理解される。
「約」という用語は、本明細書において、当技術分野における、典型的な公差の範囲内にあることを意味するように使用される。例えば、「約」とは、平均値から、約２標準偏差であると理解されうる。ある特定の実施形態において、「約」は、±１０％を意味する。ある特定の実施形態において、「約」は、±５％を意味する。「約」が、一連の数または範囲の前に存在する場合、「約」は、一連の数または数の範囲の各々を修飾しうることが理解される。
数または一連の数の前の、「少なくとも」という用語は、「少なくとも」という用語と隣接する数、および文脈から明らかである通り、論理的に含まれうる後続の全ての数または整数を含むように理解される。例えば、核酸分子内のヌクレオチドの数は、整数でなければならない。例えば、「２１ヌクレオチドの核酸分子のうちの、少なくとも１９のヌクレオチド」とは、１９、２０、または２１のヌクレオチドが、指し示された特性を有することを意味する。「少なくとも」が、一連の数または範囲の前に存在する場合、「少なくとも」は、一連の数または数の範囲の各々を修飾しうることが理解される。
本明細書において使用される、「～以下」または「～未満」は、文脈から論理的である通り、この語句と隣接する値、および、ゼロまでの、これを論理的に下回る値または整数であると理解される。例えば、「２ヌクレオチド以下」の突出を伴う二重鎖は、２、１、または０ヌクレオチドの突出を有する。「以下」が、一連の数または範囲の後に存在する場合、「以下」は、一連の数または数の範囲の各々を修飾しうることが理解される。本明細書において使用された、範囲は、上限および下限の両方を含む。
本明細書において使用される検出法は、存在する解析物の量が、方法の検出レベルを下回ることの決定を含みうる。
指し示される標的部位と、センス鎖またはアンチセンス鎖のヌクレオチド配列との間において齟齬が生じる場合は、指し示される配列が優先される。
配列と転写物上に指し示されるその部位、または他の配列との間において齟齬が生じる場合は、本明細書において列挙されるヌクレオチド配列が優先される。
本明細書において、「ＰＮＰＬＡ３」という用語と互換的に使用される、「パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３」とは、脂肪細胞内の、トリアシルグリセロールの加水分解を媒介する、トリアシルグリセロールリパーゼをコードする、周知の遺伝子を指す。
ＰＮＰＬＡ３の、例示的なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０２５２２５．２［ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＰＮＰＬＡ３；配列番号１；リバース相補体、配列番号２］；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０５４０８８．３［マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＰＮＰＬＡ３；配列番号３；リバース相補体、配列番号４］；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００１２８２３２４．１［ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）ＰＮＰＬＡ３；配列番号５；リバース相補体、配列番号６］；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＸＭ＿００５５６７０５１．１［カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＰＮＰＬＡ３；配列番号７；リバース相補体、配列番号８］；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＸＭ＿００１１０９１４４．２［アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）ＰＮＰＬＡ３；配列番号９；リバース相補体、配列番号１０］；およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＸＭ＿００５５６７０５２．１［カニクイザルＰＮＰＬＡ３；配列番号１１；リバース相補体、配列番号１２］において見出されうる。
ＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡ配列のさらなる例については、公開データベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、ＯＭＩＭ、およびマカク属（Ｍａｃａｃａ）ゲノムプロジェクトウェブサイトを介してたやすく入手可能である。
ＰＮＰＬＡ３についてのさらなる情報は、例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／？ｔｅｒｍ＝ｐｎｐｌａ３において見出されうる。
前出のＧｅｎＢａｎｋ受託番号および遺伝子データベース番号の各々については、本出願の出願日現在の全内容が、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書において使用される、ＰＮＰＬＡ３という用語はまた、ＳＮＰデータベースに提示された変異体を含むＰＮＰＬＡ３遺伝子の変異も指す。ＰＮＰＬＡ３遺伝子内の、多数の配列（ｓｅｕｑｎｃｅ）変異が同定されており、例えば、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰおよびＵｎｉＰｒｏｔにおいて見出されうる（例えば、本出願の出願日現在の、その全内容が、参照により本明細書に組み込まれる、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｎｐ／？ｔｅｒｍ＝ｐｎｐｌａ３を参照されたい。
本明細書において使用される、「標的配列」とは、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の転写時に形成されるｍＲＮＡ分子であって、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続部分を指す。配列の標的部分は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の転写時に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列のこの部分における、またはこの近傍における、ｉＲＮＡにより導かれる切断のための基質として用いられるのに、少なくとも十分に長いであろう。一実施形態において、標的配列は、ＰＮＰＬＡ３のタンパク質コード領域内にある。
標的配列は、約１９～３６ヌクレオチドの長さ、例えば、好ましくは、約１９～３０ヌクレオチドの長さでありうる。例えば、標的配列は、約１９～３０ヌクレオチド、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチドの長さでありうる。ある特定の実施形態において、標的配列は、１９～２３ヌクレオチドの長さであり、２１～２３ヌクレオチドの長さでもよい。上記において列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本開示の一部であると想定される。
本明細書において使用される、「配列を含む鎖」という用語は、標準的なヌクレオチド命名法を使用して言及される配列により記載されるヌクレオチド鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」、および「Ｕ」は、各々、一般に、それぞれ、グアニン、シトシン、アデニン、チミジン、およびウラシルを、塩基として含有するヌクレオチドを表す。しかし、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語はまた、下記においてさらに詳述される、修飾ヌクレオチド、またはサロゲートの置きかえ部分（例えば、表１を参照されたい）も指す場合があることが理解されるであろう。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルが、このような置きかえ部分を保有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合特性を、実質的に変更せずに、他の部分により置きかえられうることを十分に承知しているであろう。例えば、限定せずに述べると、イノシンを、その塩基として含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対合しうる。よって、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含有するヌクレオチドは、本発明において特色づけられるｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列内において、例えば、イノシンを含有するヌクレオチドにより置きかえられうる。別の例において、オリゴヌクレオチド内のいずれかの位置におけるアデニンおよびシトシンは、それぞれ、標的ｍＲＮＡと、Ｇ－Ｕゆらぎ塩基対合を形成するように、グアニンおよびウラシルにより置きかえられうる。このような置きかえ部分を含有する配列は、本発明において特色づけられる組成物および方法に適する。
本明細書において互換的に使用される、「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ剤」、「ｉＲＮＡ剤」、「ＲＮＡ干渉剤」という用語は、この用語が本明細書において規定される通り、ＲＮＡを含有し、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を介して、ＲＮＡ転写物のターゲティング切断を媒介する薬剤を指す。ｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として公知の過程を介して、ｍＲＮＡの配列特異的分解を方向付ける。ｉＲＮＡは、細胞内、例えば、哺乳動物対象などの対象内部の細胞内のＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を、モジュレートする、例えば、阻害する。
一実施形態において本発明のＲＮＡｉ剤は、標的ＲＮＡ配列、例えば、ＰＮＰＬＡ３の標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を方向付ける一本鎖ＲＮＡを含む。理論に束縛されることを望まずに述べると、細胞へと導入された、長鎖の二本鎖ＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒとして公知のＩＩＩ型エンドヌクレアーゼにより、ｓｉＲＮＡへと分解されると考えられる［Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485］。リボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素であるＤｉｃｅｒは、ｄｓＲＮＡを、特徴的な２塩基の３’突出を伴う、１９～２３塩基対の短鎖干渉ＲＮＡへとプロセシングする［Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363］。次いで、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）へと組み込まれ、ここで、１つまたは複数のヘリカーゼが、ｓｉＲＮＡ二重鎖をほどき、相補性のアンチセンス鎖が、標的の認識を誘導することを可能とする［Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309］。適切な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ内の、１つまたは複数のエンドヌクレアーゼは、標的を切断して、サイレンシングを誘導する［Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188］。したがって、一態様において、本発明は、細胞内において生成し、標的遺伝子、すなわち、ＰＮＰＬＡ３遺伝子のサイレンシングを実行するＲＩＳＣ複合体の形成を促進する一本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に関する。したがって、本明細書において、「ｓｉＲＮＡ」という用語はまた、上記において記載されたｉＲＮＡを指すようにも使用される。
ある特定の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、標的ｍＲＮＡを阻害するように、細胞または生物へと導入される一本鎖ｓｉＲＮＡ（ｓｓＲＮＡｉ）でありうる。一本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼであるＡｒｇｏｎａｕｔｅ ２に結合し、次いで、これが、標的ｍＲＮＡを切断する。一本鎖ｓｉＲＮＡは、一般に、１５～３０ヌクレオチドであり、化学修飾されている。一本鎖ｓｉＲＮＡのデザインおよび試験については、それらの各々の全内容が、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，１０１，３４８号、およびLima et al., (2012) Cell 150:883-894において記載されている。本明細書において記載されるアンチセンスヌクレオチド配列のうちのいずれかは、本明細書において記載されるか、またはLima et al., (2012) Cell 150:883-894において記載されている方法により化学修飾された、一本鎖ｓｉＲＮＡとして使用されうる。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物、使用、および方法における使用のための「ｉＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡであり、本明細書において、「二本鎖ＲＮＡ剤」、「二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子」、「ｄｓＲＮＡ剤」、または「ｄｓＲＮＡ」と称される。「ｄｓＲＮＡ」という用語は、２つの、アンチパラレルの、実質的に相補的な核酸鎖を含む二重鎖構造を有する、リボ核酸分子の複合体を指し、標的ＲＮＡ、すなわちＰＮＰＬＡ３遺伝子に対して「センス」および「アンチセンス」の方向を有すると称される。本発明の一部の実施形態において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、本明細書において、ＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉと称される、転写後遺伝子サイレンシング機構を介して、標的ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡの分解を誘発する。
一般に、ｄｓＲＮＡ分子の各鎖のヌクレオチドの大部分は、リボヌクレオチドであるが、本明細書において、詳細に記載される通り、各鎖または鎖の両方はまた、１つまたは複数の非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドも含みうる。加えて、本明細書において使用される「ｉＲＮＡ」は、化学修飾を伴うリボヌクレオチドを含む場合があり；ｉＲＮＡは、複数のヌクレオチドにおける、実質的な修飾を含みうる。本明細書において使用される、「修飾ヌクレオチド」という用語は、独立に、修飾糖部分、修飾ヌクレオチド間連結、もしくは修飾ヌクレオ塩基、またはこれらの任意の組合せを有するヌクレオチドを指す。したがって、修飾ヌクレオチドという用語は、例えば、官能基または原子の、ヌクレオシド間連結、糖部分、またはヌクレオ塩基への置換、付加、またはこれらからの除去を包含する。本発明の薬剤における使用に適する修飾は、本明細書において開示されるか、または当技術分野において公知である、全ての種類の修飾を含む。ｓｉＲＮＡ型分子において使用される、任意のこのような修飾は、本明細書および特許請求の範囲を目的とする「ｉＲＮＡ」、または「ＲＮＡｉ剤」により包含される。
本開示についてのある特定の実施形態において、ＲＮＡｉ剤中に存在する場合のデオキシヌクレオチドの組入れは、修飾ヌクレオチドを構成すると考えられる。
二重鎖領域は、ＲＩＳＣ経路を介して、所望の標的ＲＮＡの特異的分解を可能とする、任意の長さであることが可能であり、約１９～３６塩基対の長さ、例えば、約１９～３０塩基対の長さ、例えば、約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６塩基対の長さ、約１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２塩基対などの長さの範囲でありうる。ある特定の実施形態において、二重鎖領域は、１９～２１塩基対の長さ、例えば、２１塩基対の長さである。上記において列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本開示の一部であると想定される。
二重鎖構造を形成する２つの鎖は、１つの大型のＲＮＡ分子の異なる部分の場合もあり、別個のＲＮＡ分子の場合もある。２つの鎖が、１つの大型分子の一部であり、したがって、一方の鎖の３’末端と、対する他方の鎖の５’末端との間において二重鎖構造を形成する、非中断ヌクレオチド鎖により接続される場合、接続するＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」と称される。ヘアピンループは、少なくとも１つの非対合ヌクレオチドを含みうる。一部の実施形態において、ヘアピンループは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、２３、またはこれを超える非対合ヌクレオチドを含みうる。一部の実施形態において、ヘアピンループは、１０ヌクレオチド以下でありうる。一部の実施形態において、ヘアピンループは、８非対合ヌクレオチド以下でありうる。一部の実施形態において、ヘアピンループは、４～１０非対合ヌクレオチドでありうる。一部の実施形態において、ヘアピンループは、４～８ヌクレオチドでありうる。
ｄｓＲＮＡの、２つの実質的な相補鎖が、別個のＲＮＡ分子に含まれる場合、これらの分子、共有結合的に接続される必要はないが、共有結合的に接続される場合がある。２つの鎖が、一方の鎖の３’末端と、対する他方の鎖の５’末端との間において二重鎖構造を形成する、非中断ヌクレオチド鎖以外の手段により、共有結合的に接続される場合、接続構造は、「リンカー」と称される。ＲＮＡ鎖は、同じ数のヌクレオチドを有する場合もあり、異なる数のヌクレオチドを有する場合もある。最大の塩基対数は、最も短いｄｓＲＮＡ鎖中のヌクレオチド数から、二重鎖中に存在する、任意の突出を差し引いた数である。二重鎖構造に加えて、ＲＮＡｉは、１つまたは複数のヌクレオチド突出を含みうる。ＲＮＡｉ剤についての一実施形態において、少なくとも１つの鎖は、少なくとも１ヌクレオチドの３’突出を含む。別の実施形態において、少なくとも１つの鎖は、少なくとも２ヌクレオチドの３’突出、例えば、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチドの３’突出を含む。他の実施形態において、ＲＮＡｉ剤の、少なくとも１つの鎖は、少なくとも１ヌクレオチドの５’突出を含む。ある特定の実施形態において、少なくとも１つの鎖は、少なくとも２ヌクレオチドの５’突出、例えば、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチドの５’突出を含む。さらに他の実施形態において、ＲＮＡｉ剤の１つの鎖の、３’末端および５’末端のいずれも、少なくとも１ヌクレオチドの突出を含む。
ある特定の実施形態において、本発明のｉＲＮＡ剤は、その各鎖が、１９～２３ヌクレオチドを含み、標的ＲＮＡ配列、例えば、ＰＮＰＬＡ３遺伝子と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を方向付けるｄｓＲＮＡである。
一部の実施形態において、本開示のｉＲＮＡは、標的ＲＮＡ配列、例えば、ＰＮＰＬＡ３の標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を方向付ける、２４～３０ヌクレオチドのｄｓＲＮＡである。
本明細書において使用される、「ヌクレオチドの突出」という用語は、二本鎖ｉＲＮＡの二重鎖構造から突出する、少なくとも１つの非対合ヌクレオチドを指す。例えば、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３’末端が、他方の鎖の５’末端を越えて伸長するか、またはこの逆である場合、ヌクレオチドの突出が存在する。ｄｓＲＮＡは、少なくとも１ヌクレオチドの突出を含むことが可能であるが；代替的に、突出は、少なくとも２ヌクレオチド、少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド、またはこれを超えるヌクレオチドを含みうる。ヌクレオチドの突出は、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドを含む、ヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含みうるか、またはこれらからなりうる。突出（複数可）は、センス鎖上にある場合もあり、アンチセンス鎖上にある場合もあり、これらの任意の組合せの上にある場合もある。さらに、ヌクレオチド（複数可）の突出は、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖またはセンス鎖５’末端に存在する場合もあり、３’末端に存在する場合もあり、両末端に存在する場合もある。
一実施形態において、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端または５’末端において、１～１０ヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドの突出を有する。一実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、３’末端または５’末端において、１～１０ヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドの突出を有する。別の実施形態において、突出内のヌクレオチドのうちの１つまたは複数は、チオリン酸ヌクレオシドにより置きかえられる。
ある特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端または５’末端において、１～１０ヌクレオチド、例えば、０～３、１～３、２～４、２～５、４～１０、５～１０、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドの突出を有する。一実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、３’末端または５’末端において、１～１０ヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドの突出を有する。別の実施形態において、突出内のヌクレオチドのうちの１つまたは複数は、チオリン酸ヌクレオシドにより置きかえられる。
ある特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端または５’末端において、１～１０ヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドの突出を有する。ある特定の実施形態において、センス鎖もしくはアンチセンス鎖、またはこれらの両方における突出は、１０ヌクレオチド、例えば、１～３０ヌクレオチド、２～３０ヌクレオチド、１０～３０ヌクレオチド、１０～２５ヌクレオチド、１０～２０ヌクレオチド、または１０～１５ヌクレオチドの長さを超えて伸長する長さを含みうる。ある特定の実施形態において、伸長突出は、二重鎖のセンス鎖上に存在する。ある特定の実施形態において、伸長突出は、二重鎖のセンス鎖の３’末端上に存在する。ある特定の実施形態において、伸長突出は、二重鎖のセンス鎖の５’末端上に存在する。ある特定の実施形態において、伸長突出は、二重鎖のアンチセンス鎖上に存在する。ある特定の実施形態において、伸長突出は、二重鎖のアンチセンス鎖の３’末端上に存在する。ある特定の実施形態において、伸長突出は、二重鎖のアンチセンス鎖の５’末端上に存在する。ある特定の実施形態において、伸長突出内のヌクレオチドのうちの１つまたは複数は、チオリン酸ヌクレオシドにより置きかえられる。ある特定の実施形態において、突出は、突出が、生理学的条件下において安定である、ヘアピン構造を形成することが可能であるように、自己相補性部分を含む。
「平滑」または「平滑末端」とは、二本鎖ＲＮＡ剤のこの末端において、非対合ヌクレオチドが存在しない、すなわち、ヌクレオチド突出が存在しないことを意味する。「平滑末端の」二本鎖ＲＮＡ剤は、その全長にわたり、二本鎖である、すなわち、分子のいずれの末端においても、ヌクレオチド突出が存在しない。本発明のＲＮＡｉ剤は、一方の末端において、ヌクレオチド突出を伴わないＲＮＡｉ剤（すなわち、１つの突出末端と、１つの平滑末端とを伴う薬剤）、またはいずれの末端においても、ヌクレオチド突出を伴わないＲＮＡｉ剤を含む。このような分子は、その全長にわたり、二本鎖であることが極めて多いであろう。
「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」という用語は、標的配列、例えば、ＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡと実質的に相補的な領域を含む、ｉＲＮＡ鎖、例えば、ｄｓＲＮＡ鎖を指す。
本明細書において使用される、「相補性領域」という用語は、配列、例えば、標的配列、例えば、本明細書において規定される、ＰＮＰＬＡ３ヌクレオチド配列と実質的に相補的なアンチセンス鎖上の領域を指す。相補性領域が、標的配列と、完全に相補的ではない場合、ミスマッチは、分子の内部領域内の場合もあり、末端領域内の場合もある。一般に、許容度が最も大きなミスマッチは、例えば、ｉＲＮＡの５’末端または３’末端から、５、４、３ヌクレオチドの範囲の末端領域内にある。一部の実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖内に、ヌクレオチドミスマッチを含む。一部の実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、標的ｍＲＮＡとの、４つ以下のミスマッチを含む、例えば、アンチセンス鎖は、標的ｍＲＮＡとの、４つ、３つ、２つ、１つ、または０のミスマッチを含む。一部の実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、センス鎖との、４つ以下のミスマッチを含む、例えば、アンチセンス鎖は、センス鎖との、４つ、３つ、２つ、１つ、または０のミスマッチを含む。一部の実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡ剤は、センス鎖内に、ヌクレオチドミスマッチを含む。一部の実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡ剤のセンス鎖は、アンチセンス鎖との、４つ以下のミスマッチを含む、例えば、センス鎖は、アンチセンス鎖との、４つ、３つ、２つ、１つ、または０のミスマッチを含む。一部の実施形態において、ヌクレオチドミスマッチは、例えば、ｉＲＮＡの３’末端から、５、４、３ヌクレオチドの範囲内にある。別の実施形態において、ヌクレオチドミスマッチは、例えば、ｉＲＮＡ剤の３’末端ヌクレオチド内にある。一部の実施形態において、ミスマッチ（複数可）は、シード領域内にない。
したがって、本明細書において記載されるＲＮＡｉ剤は、標的配列との、１つまたは複数のミスマッチを含有しうる。一実施形態において、本明細書において記載されるＲＮＡｉ剤は、３つ以下のミスマッチ（すなわち、３つ、２つ、１つ、または０のミスマッチ）を含有する。一実施形態において、本明細書において記載されるＲＮＡｉ剤は、２つ以下のミスマッチを含有する。一実施形態において、本明細書において記載されるＲＮＡｉ剤は、１つ以下のミスマッチを含有する。一実施形態において、本明細書において記載されるＲＮＡｉ剤は、０のミスマッチを含有する。ある特定の実施形態において、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖が、標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチは、相補性領域の５’末端または３’末端から最後の５ヌクレオチドの範囲内に制約されてもよい。例えば、このような実施形態において、２３ヌクレオチドのＲＮＡｉ剤について、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の領域と相補性である鎖は、一般に、中央部の１３ヌクレオチドの範囲内の任意のミスマッチを含有しない。本明細書において記載される方法、または当技術分野において公知の方法は、標的配列とのミスマッチを含有するＲＮＡｉ剤が、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現の阻害において、有効であるのかどうかを決定するのに使用されうる。ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現の阻害における、ミスマッチを伴うＲＮＡｉ剤の有効性の検討は、とりわけ、ＰＮＰＬＡ３遺伝子内の、特定の相補性領域が、集団内において、多型性の配列変異を有することが公知である場合に、重要である。
本明細書において使用される、「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」という用語は、この用語が本明細書において規定される通り、アンチセンス鎖の領域と、実質的に相補的である領域を含むｉＲＮＡ鎖を指す。
本明細書において使用される、「ヌクレオチドの実質的に全てが修飾されている」とは、大部分が修飾されているが、完全には修飾されていないことであり、５つ、４つ、３つ、２つ、または１つを超えない、非修飾ヌクレオチドを含みうる。
本明細書において使用される、「切断領域」という用語は、切断部位に、直に隣接して配置された領域を指す。切断部位とは、切断が生じる、標的上の部位である。一部の実施形態において、切断領域は、切断部位のいずれかの末端上にあり、切断部位に直に隣接する、３つの塩基を含む。一部の実施形態において、切断領域は、切断部位のいずれかの末端上にあり、切断部位に直に隣接する、２つの塩基を含む。一部の実施形態において、切断部位は、アンチセンス鎖のヌクレオチド１０および１１が結合した部位において特異的に生じ、切断領域は、ヌクレオチド１１、１２、および１３を含む。
本明細書において使用され、そうでないことが指し示されない限りにおける、「相補性」という用語は、第１のヌクレオチド配列について、第２のヌクレオチド配列との関係において記載するのに使用される場合、当業者により理解される通り、ある特定の条件下において、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズし、二重鎖構造を形成する、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの能力を指す。このような条件は、例えば、５０℃または７０℃において、１２～１６分間にわたる、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、およびそれに続く洗浄を含みうる、厳密な条件でありうる［例えば、“Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい］。生物の内部において遭遇しうる、生理学的に関連する条件など、他の条件も、適用されうる。当業者は、ハイブリダイズされるヌクレオチドの最終的な適用に従い、２つの配列の相補性についての試験に最も適切な条件のセットを決定することができるであろう。
ｉＲＮＡ内の相補性配列、例えば、本明細書において記載されるｄｓＲＮＡ内の相補性配列は、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの、ヌクレオチド配列の一方または両方の全長にわたる塩基対合を含む。本明細書において、このような配列は、互いに照らして、「完全に相補的」であると称されうる。しかし、本明細書において、第１の配列が、第２の配列に照らして、「実質的に相補的」であると称される場合、２つの配列は、完全に相補的な場合もあり、それらの最終的な適用、例えば、ＲＩＳＣ経路を介する、遺伝子発現の阻害に最も関連する条件下において、ハイブリダイズする能力を保持しながら、一般に、３０塩基対までの二重鎖のためのハイブリダイゼーション時において、５つ、４つ、３つ、または２つを超えない１つまたは複数のミスマッチ塩基対を形成する場合もある。しかし、２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーション時に、１つまたは複数の一本鎖突出を形成するようにデザインされる場合、このような突出は、相補性の決定に関して、ミスマッチとは考えられないものとする。例えば、２１ヌクレオチドの長さの、１つのオリゴヌクレオチドと、２３ヌクレオチドの長さの、別のオリゴヌクレオチドとを含み、長い方のオリゴヌクレオチドが、短い方のオリゴヌクレオチドと、完全に相補的である、２１ヌクレオチドの配列を含むｄｓＲＮＡも、やはり、本明細書において記載される目的のためには、「完全に相補的」であると称されうる。
本明細書において使用される「相補性」配列はまた、ハイブリダイズするそれらの能力に関する、上記の要件が満たされる限りにおいて、非ワトソン－クリック型塩基対、または非天然ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドから形成される塩基対も含みうるか、または完全にこれらから形成されうる。このような非ワトソン－クリック型の塩基対は、Ｇ：Ｕゆらぎ塩基対合またはフーグステイン型塩基対合を含むがこれらに限定されない。
本明細書において、「相補性」、「完全に相補的」、および「実質的に相補的」という用語は、それらの使用の文脈から理解される通り、ｄｓＲＮＡのセンス鎖と、アンチセンス鎖との間、または二本鎖ＲＮＡ剤のアンチセンス鎖と、標的配列との間の塩基マッチングに関して使用されうる。
本明細書において使用される、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部と実質的に相補的」であるポリヌクレオチドとは、目的のｍＲＮＡ（例えば、ＰＮＰＬＡ３遺伝子をコードするｍＲＮＡ）の連続部分と実質的に相補的であるポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、配列が、ＰＮＰＬＡ３遺伝子をコードするｍＲＮＡの非中断部分と、実質的に相補的である場合、ＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である。
したがって、一部の実施形態において、本明細書において開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは、標的であるＰＮＰＬＡ３配列と、完全に相補的である。他の実施形態において、本明細書において開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは、標的であるＰＮＰＬＡ３配列と、実質的に相補的であり、その全長にわたり、配列番号１、３、５、７、９、もしくは１１のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列の同等領域、または配列番号１、３、５、７、９、もしくは１１のうちのいずれか１つの断片に対して、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％相補的であるなど、少なくとも８０％相補的である、連続ヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態において、本明細書において開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは、標的であるＰＮＰＬＡ３配列の断片と、実質的に相補的であり、その全長にわたり、配列番号１の、ヌクレオチド６７７～７２１；６８３～７２１；７７３～８１７；１１８５～１２９５；１１８５～１２４１；１２０２～１２９５；１２０２～１２４１；１２５５～１２９５；１７３８～１７９２；１９０１～１９４５；１９２０～１９４５；２１０８～２２０８；２１０８～２１６６；２１０８～２１３６；２１２１～２１６６；２１２１～２２０８；２１６９～２２０８；２１７６～２２０８；または２２３９～２２６５の群から選択される、配列番号１の断片に対して、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％相補的であるなど、少なくとも８０％相補的である、連続ヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態において、本明細書において開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは、標的であるＰＮＰＬＡ３配列の断片と、実質的に相補的であり、その全長にわたり、配列番号１の、ヌクレオチド５７４～５９６；６７７～６９９；６８３～７０５；６９９～７２１；７７３～７９５；７９５～８１７；１１８５～１２０７；１１９２～１２１４；１２０２～１２２４；１２０８～１２３０；１２０９～１２３１；１２１０～１２３２；１２１１～１２３３；１２１２～１２３４；１２１３～１２３３；１２１４～１２３４；１２１４～１２３６；１２１５～１２３７；１２１６～１２３８；１２１９～１２３７；１２１９～１２４１；１２５５～１２７５；１２５６～１２７６；１２５７～１２７５；１２５７～１２７７；１２５８～１２７８；１２５９～１２７９；１２６０～１２７８；１２６０～１２８０；１２６１～１２８１；１２６２～１２８２；１２６３～１２８３；１２６４～１２８２；１２６４～１２８４；１２６５～１２８５；１２６７～１２８５；１２６６～１２８６；１２６６～１２８８；１２６７～１２８５；１２６７～１２８７；１２６８～１２９０；１２６９～１２８９；１２７０～１２９０；１２７１～１２９１；１２７２～１２９２；１２７３～１２９３；１２７４～１２９４；１２７５～１２９５；１６３１～１６５３；１７３８～１７６０；１７３９～１７６１；１７４０～１７６０；１７４０～１７６２；１７４１～１７６３；１７４４～１７６６；１７４６～１７６６；１７５０～１７７２；１７５１～１７７３；１７５２～１７７４；１７５３～１７７５；１７５４～１７７６；１７５５～１７７７；１７５６～１７７８；１７５７～１７７９；１７５８～１７８０；１７５９～１７８１；１７６０～１７８２；１７６１～１７８３；１７６２～１７８２；１７６２～１７８４；１７６３～１７８５；１７６４～１７８６；１７６５～１７８７；１７６６～１７８６；１７６６～１７８８；１７６７～１７８７；１７６８～１７８８；１７６７～１７８９；１７６９～１７８９；１７７０～１７８８；１７７０～１７９０；１７７１～１７９１；１７７２～１７９２；１８１５～１８３７；１９０１～１９２３；１９２０～１９４２；１９２３～１９４５；２１１２～２１３０；２１６９～２１９１；２１７１～２１９１；２１７６～２１９８；２１７７～２１９９；２１７８～２２００；２１７９～２２０１；２１８０～２２０２；２１８１～２２０３；２１８３～２２０５；２１８４～２２０６；２１８６～２２０８；２２３９～２２６１；２２４１～２２６３；２２４２～２２６４；または２２４３～２２６５の群から選択される、配列番号１の断片に対して、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％相補的であるなど、少なくとも８０％相補的である、連続ヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態において、本明細書において開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは、標的であるＰＮＰＬＡ３配列の断片と、実質的に相補的であり、その全長にわたり、配列番号１の、ヌクレオチド１２００～１２５０、１２０５～１２５０、１１２１０～１２５０、１２００～１２４５、１２００～１２４０、１２００～１２３５、１２００～１２３７、１２０５～１２３７、１２１０～１２３２、１２１２～１２３７、１２１２～１２３４、１２５０～１３００、１２５５～１３００、１２６０～１３００、１２５０～１２９５、１２５０～１３９０、１２５０～１２８５、１２５０～１２８２、１２５５～１２８２、１２６０～１２８２、１２６２～１３００、１２６２～１２９５、１２６２～１３９０、および１２６２～１２８２の群から選択される、配列番号１の断片に対して、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％相補的であるなど、少なくとも８０％相補的である、連続ヌクレオチド配列を含む。
他の実施形態において、本明細書において開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは、標的であるＰＮＰＬＡ３配列と、実質的に相補的であり、その全長にわたり、表２～１１、２１、２４、２７、３０、３２、３３、３６、３７、４９、もしくは５０のうちのいずれか１つにおける、センス鎖のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つ、または表２～１１、２１、２４、２７、３０、３２、３３、３６、３７、４９、もしくは５０のうちのいずれか１つにおける、センス鎖のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの断片に対して、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％相補的であるなど、少なくとも約８０％相補的である、連続ヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、本開示のＲＮＡｉ剤は、アンチセンスポリヌクレオチドと、実質的に相補的であるセンス鎖を含み、アンチセンスポリヌクレオチドは、標的であるＰＮＰＬＡ３配列と同じであり、この場合、センス鎖ポリヌクレオチドは、その全長にわたり、配列番号２、４、６、８、１０、もしくは１２のヌクレオチド配列の同等領域、または配列番号２、４、６、８、１０、もしくは１２のうちのいずれか１つの断片に対して、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％相補的であるなど、少なくとも約８０％相補的である、連続ヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態において、本開示のｉＲＮＡは、アンチセンスポリヌクレオチドと、実質的に相補的であるセンス鎖を含み、アンチセンスポリヌクレオチドは、標的であるＰＮＰＬＡ３配列と相補的であり、この場合、センス鎖ポリヌクレオチドは、その全長にわたり、表２～１１、２１、２４、２７、３０、３２、３３、３６、３７、４９、もしくは５０のうちのいずれか１つにおける、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つ、または表２～１１、２１、２４、２７、３０、３２、３３、３６、３７、４９、もしくは５０のうちのいずれか１つにおける、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの断片に対して、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％相補的であるなど、少なくとも約８０％相補的である、連続ヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、二重鎖である、ＡＤ－５１７１９７．２；ＡＤ－５１７２５８．２；ＡＤ－５１６７４８．２；ＡＤ－５１６８５１．２；ＡＤ－５１９３５１．２；ＡＤ－５１９７５４．２；ＡＤ－５１９８２８．２；ＡＤ－５２００１８．２；ＡＤ－５２００３５．２；ＡＤ－５２００６２．２；ＡＤ－５２００６４．２；ＡＤ－５２００６５．２；ＡＤ－５２００６７．２；ＡＤ－７５２８９．２；ＡＤ－５２００６９．２；ＡＤ－５２００９９．２；ＡＤ－６７５７５．７；ＡＤ－５２０１０１．２；ＡＤ－６７６０５．７、ＡＤ－１１９３３２３．１；ＡＤ－１１９３３４４．１；ＡＤ－１１９３３５０．１；ＡＤ－１１９３３６５．１；ＡＤ－１１９３３７９．１；ＡＤ－１１９３４０７．１；ＡＤ－１１９３４２１．１；ＡＤ－１１９３４２２．１；ＡＤ－１１９３４２９．１；ＡＤ－１１９３４３７．１；ＡＤ－１１９３４４３．１；ＡＤ－１１９３４７１．１；およびＡＤ－１１９３４８１．１のうちのいずれか１つから選択される。
一部の実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、二重鎖である、ＡＤ－５１９３４５．１、ＡＤ－５１９３４６．１、ＡＤ－５１９３４７．１、ＡＤ－６７５５４．７、ＡＤ－５１９７５２．３、ＡＤ－１０１０７３１．１、ＡＤ－１０１０７３２．１、ＡＤ－５１９３４３．１、ＡＤ－５１９３４４．１、ＡＤ－５１９３４９．１、ＡＤ－５１９３５０．１、ＡＤ－５１９７５３．２、ＡＤ－５１９９３２．１、ＡＤ－５１９９３５．２、ＡＤ－５２００１８．６、ＡＤ－５１７８３７．２、ＡＤ－８０５６３５．２、ＡＤ－５１９３２９．２、ＡＤ－５２００６３．２、ＡＤ－５１９７５７．２、ＡＤ－８０５６３１．２、ＡＤ－５１６９１７．２、ＡＤ－５１６８２８．２、ＡＤ－５１８９８３．２、ＡＤ－８０５６３６．２、ＡＤ－５１９７５４．７、ＡＤ－５２００６２．２、ＡＤ－６７５７５．９、ＡＤ－５１８９２３．３、ＡＤ－５２００５３．４、ＡＤ－５１９６６７．２、ＡＤ－５１９７７３．２、ＡＤ－５１９３５４．２、ＡＤ－５２００６０．４、ＡＤ－５２００６１．４、ＡＤ－１０１０７３３．２、ＡＤ－１０１０７３５．２、ＡＤ－１１９３３２３．１；ＡＤ－１１９３３４４．１；ＡＤ－１１９３３５０．１；ＡＤ－１１９３３６５．１；ＡＤ－１１９３３７９．１；ＡＤ－１１９３４０７．１；ＡＤ－１１９３４２１．１；ＡＤ－１１９３４２２．１；ＡＤ－１１９３４２９．１；ＡＤ－１１９３４３７．１；ＡＤ－１１９３４４３．１；ＡＤ－１１９３４７１．１；およびＡＤ－１１９３４８１．１のうちのいずれか１つから選択される。
一部の実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、二重鎖である、ＡＤ－５１９３４５．１；ＡＤ－１１９３３５０．１；ＡＤ－１１９３３６５．１；ＡＤ－１１９３４３７．１；およびＡＤ－５１９３４７．１のうちのいずれか１つから選択される。
一部の実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、二重鎖である、ＡＤ－５１９３５１に由来する。
一実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、二重鎖である、ＡＤ－１１９３３５０に由来する。
一実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、二重鎖である、ＡＤ－１１９３３６５に由来する。
一実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、二重鎖である、ＡＤ－１１９３４３７に由来する。
一実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、二重鎖である、ＡＤ－５１９３４７に由来する。
一般に、「ｉＲＮＡ」は、化学修飾を伴うリボヌクレオチドを含む。このような修飾は、本明細書において開示されるか、または当技術分野において公知である、全ての種類の修飾を含みうる。ｄｓＲＮＡ分子において使用される、任意のこのような修飾は、本明細書および特許請求の範囲を目的とする「ｉＲＮＡ」により包含される。
本開示についてのある特定の実施形態において、ＲＮＡｉ剤中に存在する場合のデオキシヌクレオチドの組入れは、修飾ヌクレオチドを構成すると考えられる。
本発明のある態様において、本発明の方法および組成物における使用のための薬剤は、アンチセンス阻害機構を介して、標的ｍＲＮＡを阻害する、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子である。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、標的ｍＲＮＡ内の配列と相補的である。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡとの塩基対合により、化学量論的に翻訳を阻害する場合もあり、翻訳機構を、物理的に妨害することにより、翻訳を阻害する場合もあるが、Dias, N. et al., (2002) Mol Cancer Ther 1:347-355を参照されたい。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、約１４～約３０ヌクレオチドの長さであることが可能であり、標的配列と相補性である配列を有しうる。例えば、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、本明細書において記載されるアンチセンス配列のうちのいずれか１つに由来する、少なくとも約１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはこれを超える連続ヌクレオチドである配列を含みうる。
本明細書において使用される、ｄｓＲＮＡなどの「ｉＲＮＡと細胞を接触させること」という語句は、任意の可能な手段により細胞を接触させることを含む。細胞をｉＲＮＡと接触させることは、インビトロにおいて細胞をｉＲＮＡと接触させること、またはインビボにおいて細胞をｉＲＮＡと接触させることを含む。接触は、直接的になされる場合もあり、間接的になされる場合もある。したがって、例えば、ｉＲＮＡは、方法を実施する個人により、細胞と、物理的に接触させられる場合もあり、代替的に、ｉＲＮＡは、それがその後細胞と接触することを可能とする状況、またはそれをその後細胞と接触させる状況に置かれる場合もある。
インビトロにおける細胞の接触は、例えば、細胞を、ｉＲＮＡと共にインキュベートすることによりなされうる。インビボにおける細胞の接触は、例えば、ｉＲＮＡを、細胞が位置する組織へと、またはこの近傍に注射することによりなされる場合もあり、薬剤が、その後、接触させられる細胞が位置する組織に到達するように、ｉＲＮＡを、別の領域、例えば、血流または皮下腔へと注射することによりなされる場合もある。例えば、ｉＲＮＡは、ｉＲＮＡを、目的の部位、例えば、肝臓へと方向付けるリガンド、例えば、ＧａｌＮＡｃを含有する場合もあり、これとカップリングされる場合もある。インビトロにおいて接触させる方法と、インビボにおいて接触させる方法との組合せもまた、可能である。例えば、細胞はまた、インビトロにおいて、ｉＲＮＡと接触させられ、その後対象へと移植される場合もある。
ある特定の実施形態において、細胞をｉＲＮＡと接触させることは、細胞への取込みまたは吸収を容易とするか、またはこれらをもたらすことにより、「ｉＲＮＡを、細胞へと導入すること」または「ｉＲＮＡを、細胞へとデリバリーすること」を含む。ｉＲＮＡの吸収または取込みは、自発的拡散または能動的な細胞内過程を介して生じる場合もあり、補助的薬剤または補助的デバイスにより生じる場合もある。ｉＲＮＡの、細胞への導入は、インビトロにおける導入の場合もあり、インビボにおける導入の場合もある。例えば、インビボにおける導入のために、ｉＲＮＡは、組織部位へと注射される場合もあり、全身投与される場合もある。インビトロにおける、細胞への導入は、電気穿孔およびリポフェクションなど、当技術分野において公知の方法を含む。さらなる手法については、本明細書の下記において記載されるか、または当技術分野において公知である。
「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」という用語は、核酸分子、例えば、ｉＲＮＡ、またはｉＲＮＡが転写されるプラスミドなど、薬学的活性分子を封入する脂質層を含む小胞である。ＬＮＰについては、例えば、それらの全内容が、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，８５８，２２５号、同第６，８１５，４３２号、同第８，１５８，６０１号、および同第８，０５８，０６９号において記載されている。
本明細書において使用される、「対象」とは、標的遺伝子を、内因的に発現するか、または異種発現する、霊長動物（ヒト、非ヒト霊長動物、例えば、サルおよびチンパンジーなど）、非霊長動物（ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、またはマウスなど）を含む哺乳動物、または鳥類などの動物である。ある実施形態において、対象は、本明細書において記載される、ＰＮＰＬＡ３発現の低減から利益を得る疾患もしくは障害のために処置されるか、またはこれらについて評価されるヒト；ＰＮＰＬＡ３発現の低減から利益を得る疾患もしくは障害の危険性があるヒト；ＰＮＰＬＡ３発現の低減から利益を得る疾患もしくは障害を有するヒト；またはＰＮＰＬＡ３発現の低減から利益を得る疾患もしくは障害のために処置されるヒトなどのヒトである。一部の実施形態において、対象は、女性のヒトである。他の実施形態において、対象は、男性のヒトである。一実施形態において、対象は、成人対象である。別の実施形態において、対象は、小児科対象である。
本明細書において使用される、「～を処置すること」または「処置」という用語は、対象におけるＰＮＰＬＡ３関連障害の少なくとも１つの徴候または症状の低減など、有益な結果または所望の結果を指す。処置はまた、望ましくないＰＮＰＬＡ３発現と関連する、１つまたは複数の徴候または症状の軽減；望ましくないＰＮＰＬＡ３の活性化または安定化の程度の減少；望ましくないＰＮＰＬＡ３の活性化または安定化の改善または緩和も含む。「処置」はまた、処置の非存在下において期待される生存と比較した、生存の延長も意味しうる。対象におけるＰＮＰＬＡ３もしくは疾患マーカーのレベルまたは症状の文脈における、「低下」という用語は、このようなレベルの、統計学的に有意な低下を指す。低下は、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはこれを超える低下でありうる。ある特定の実施形態において、低下は、少なくとも２０％である。ある特定の実施形態において、低下は、疾患マーカー、例えば、タンパク質レベルまたは遺伝子発現レベルの少なくとも５０％の低下である。対象におけるＰＮＰＬＡ３レベルの文脈における、「低下」は、好ましくは、このような障害を伴わない個体について、正常の範囲内として許容されるレベルまでの降下である。ある特定の実施形態において、「低下」とは、疾患を患う対象についてのマーカーまたは症状のレベルと、個体について、正常の範囲内として許容されるレベルとの間の差違の減少、例えば、肥満個体と、正常の範囲内として許容される体重を有する個体との間の体重の減少のレベルである。
本明細書において、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現の低減による処置または改善が可能である疾患、障害、またはそれらの状態に言及して使用される場合の、「防止」または「～を防止すること」は、対象が、このような疾患、障害、または状態、例えば、ヘッジホッグシグナル伝達経路内のタンパク質レベルの上昇、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓内の脂肪の蓄積、肝炎、肝細胞壊死、肝線維症、肥満、または非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の存在など、望ましくないか、または過剰である、ＰＮＰＬＡ３発現の症状と関連する症状を発症する可能性の低減を指す。例えば、ＮＡＦＬＤを発症する可能性は、例えば、ＮＡＦＬＤについての、１つまたは複数の危険性因子を有する個体が、ＮＡＦＬＤを発症しないか、または同じ危険性因子を有し、かつ、本明細書において記載される処置を施されない集団と比べて、重症度が低度であるＮＡＦＬＤを発症する場合に低減される。疾患、障害、もしくは状態の無発症、またはこのような疾患、障害、もしくは状態と関連する症状の発生の低減（例えば、この疾患または障害について、臨床的に許容されたスケールにおいて、少なくとも約１０％）、または遅延した症状の提示（例えば、日単位、週単位、月単位、または年単位による）は、有効な防止であると考えられる。
本明細書において使用される、「パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３関連疾患」または「ＰＮＰＬＡ３関連疾患」という用語は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現またはＰＮＰＬＡ３タンパク質の産生により引き起こされるか、またはこれと関連する疾患または障害である。「ＰＮＰＬＡ３関連疾患」という用語は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現、複製、またはＰＮＰＬＡ３タンパク質活性の低下から利益を得る疾患、障害、または状態を含む。ＰＮＰＬＡ３関連疾患の非限定例は、例えば、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝（ｌｖｉｅｒ）硬変、肝臓内の脂肪の蓄積、肝炎、肝細胞壊死、肝線維症、肥満、または非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を含む。別の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３関連疾患は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である。別の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３関連疾患は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である。別の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３関連疾患は、肝硬変である。別の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３関連疾患は、インスリン抵抗性である。別の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３関連疾患は、インスリン抵抗性ではない。一実施形態において、ＰＮＰＬＡ３関連疾患は、肥満である。
一実施形態において、ＰＮＰＬＡ３関連疾患は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である。本明細書において、「ＮＡＦＬＤ」と互換的に使用される、「非アルコール性脂肪肝疾患」という用語は、１日当たりの２０ｍｇ（ｇｍ）未満のアルコール摂取の存在下における、大血管脂肪症の存在により規定される疾患を指す。ＮＡＦＬＤは、米国において、最も一般的な肝臓疾患であり、一般に、インスリン抵抗性／２型糖尿病および肥満と関連する。ＮＡＦＬＤは、脂肪症、脂肪性肝炎、肝硬変により顕在化し、場合によって、肝細胞癌により顕症化する。ＮＡＦＬＤの総説については、それらの全内容が、参照により本明細書に組み込まれる、Tolman and Dalpiaz (2007) Ther. Clin. Risk. Manag., 3(6):1153-1163を参照されたい。
本明細書において使用される、「治療有効量」は、ＰＮＰＬＡ３関連疾患を有する対象へと投与された場合に、疾患の処置を実行する（例えば、既存の疾患、または疾患の１つもしくは複数の症状を減少させるか、改善するか、または維持することにより）のに十分である、ＲＮＡｉ剤の量を含むことが意図される。「治療有効量」は、ＲＮＡｉ剤、薬剤がどのように投与されるのか、疾患ならびにその重症度および既往歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子組成、存在する場合、先行処置または併用処置の種類、および処置される対象の、他の個々の特徴に応じて変動しうる。
本明細書において使用される、「予防有効量」は、ＰＮＰＬＡ３関連障害を有する対象へと投与された場合に、疾患または疾患の１つもしくは複数の症状を防止または改善するのに十分である、ＲＮＡｉ剤の量を含むことが意図される。疾患の改善は、疾患の経過の緩徐化、または遅発性疾患の重症度の軽減を含む。「予防有効量」は、ＲＮＡｉ剤、薬剤がどのように投与されるのか、疾患の危険性の程度および既往歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子組成、存在する場合、先行処置または併用処置の種類、および処置される対象の、他の個々の特徴に応じて変動しうる。
「治療有効量」または「予防有効量」はまた、任意の処置に適用可能な、妥当な有益性／危険性比において、何らかの所望の効果をもたらす、ＲＮＡｉ剤の量も含む。本発明の方法において利用されるｉＲＮＡは、このような処置に適用可能な、妥当な有益性／危険性比をもたらすのに十分な量において投与されうる。
本明細書において、「薬学的に許容される」という語句は、正しい医学的判断の範囲内において、ヒト対象および動物対象の組織との接触における使用であって、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わず、妥当な有益性／危険性比に見合う使用に適する化合物、素材、組成物、または剤形を指すのに用いられる。
本明細書において使用される、「薬学的に許容可能な担体」という語句は、液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、製造補助剤［例えば、滑沢剤、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、またはステアリン酸亜鉛、またはステアリン（ｓｔｅｒｉｃ）酸］、または対象化合物の、１つの臓器もしくは体内の部分から、別の臓器もしくは体内の部分への移送または輸送に関与する、溶媒封入材料など、薬学的に許容可能な材料、組成物、または媒体を意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性であり、処置される対象に対して有害でないという意味において、「許容可能」でなければならない。このような担体は、当技術分野において公知である。薬学的に許容される担体は、注射による投与のための担体を含む。
本明細書において使用される、「試料」という用語は、対象から単離された、同様の体液、細胞、または組織のほか、対象内部に存在する体液、細胞、または組織のコレクションを含む。体液の例は、血液、血清および漿液、血漿、脳脊髄液、眼液、リンパ、尿、唾液などを含む。組織試料は、組織、臓器、または限局領域に由来する試料を含みうる。例えば、試料は、特定の臓器、臓器の部分、またはこれらの臓器内の体液もしくは細胞に由来しうる。ある特定の実施形態において、試料は、肝臓（例えば、全肝臓もしくは肝臓のある特定のセグメント、または、例えば、肝細胞など、肝臓内のある特定の種類の細胞）に由来しうる。一部の実施形態において、「対象に由来する試料」とは、対象から得られた尿を指す。「対象に由来する試料」は、対象からの血液、または血液由来の血清もしくは血漿を指す場合がある。
ＩＩ．本発明のｉＲＮＡ
本発明は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡを提供する。好ましい実施形態において、ｉＲＮＡは、対象、例えば、ＰＮＰＬＡ３関連障害、例えば、高トリグリセリド血症を発症しやすいヒトなどの哺乳動物内部の細胞などの細胞内のＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を含む。ｄｓＲＮＡｉ剤は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現において形成されるｍＲＮＡのうちの、少なくとも一部と相補性である相補性領域を有するアンチセンス鎖を含む。相補性領域は、約１９～３０ヌクレオチドの長さ（例えば、約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、または１９ヌクレオチドの長さ）である。ＰＮＰＬＡ３遺伝子を発現する細胞と接触させると、ｉＲＮＡは、例えば、ＰＣＲもしくは分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）ベースの方法、または、例えば、ウェスタンブロット法またはフローサイトメトリー法を使用する免疫蛍光解析などによる、タンパク質ベースの方法によりアッセイされる通り、ＰＮＰＬＡ３遺伝子（例えば、ヒト、霊長動物、非霊長動物、またはラットのＰＮＰＬＡ３遺伝子）の発現を、少なくとも約５０％阻害する。好ましい実施形態において、発現の阻害は、本明細書の実施例に提示されるｑＰＣＲ法により、例えば、この実施例において用意される、適切な生物細胞系内の濃度を１０ｎＭとするｓｉＲＮＡについて決定される。好ましい実施形態において、インビボにおける発現の阻害は、例えば、３ｍｇ／ｋｇにおける、例えば、単回投与として投与された場合の、ヒト遺伝子を発現する齧歯動物、例えば、ヒト標的遺伝子を発現するマウスまたはＡＡＶ感染マウスの、ＲＮＡ発現の最低レベルにおける、ヒト遺伝子のノックダウンにより決定される。
ｄｓＲＮＡは、相補的であり、ｄｓＲＮＡが使用される条件下において、二重鎖構造を形成するようにハイブリダイズする、２つのＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡのうちの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、標的配列と、実質的に相補的であり、一般に、完全に相補的である、相補性領域を含む。標的配列は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現時に形成される、ｍＲＮＡの配列に由来しうる。他方の鎖（センス鎖）は、適切な条件下において組み合わされた場合に、２つの鎖がハイブリダイズし、二重鎖構造を形成するように、アンチセンス鎖と相補的である領域を含む。本明細書の別の箇所において記載され、当技術分野において公知の通り、ｄｓＲＮＡの相補性配列はまた、別個のオリゴヌクレオチド上の相補性配列と対比される、単一核酸分子の自己相補性領域としても含有されうる。
一般に、二重鎖構造は、１５～３０塩基対の長さ、例えば、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２塩基対の長さである。ある特定の好ましい実施形態において、二重鎖構造は、１８～２５塩基対の長さ、例えば、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～２５、２１～２４、２１～２３、２１～２２、２２～２５、２２～２４、２２～２３、２３～２５、２３～２４または２４～２５塩基対の長さ、例えば、１９～２１塩基対の長さである。上記において列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本開示の一部であると想定される。
同様に、標的配列と相補的な領域は、１５～３０ヌクレオチドの長さ、例えば、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチドの長さ、例えば、１９～２３ヌクレオチドの長さまたは２１～２３ヌクレオチドの長さである。上記において列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本開示の一部であると想定される。
一部の実施形態において、二重鎖構造は、１９～３０塩基対の長さである。同様に、標的配列と相補的な領域は、１９～３０ヌクレオチドの長さである。
一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、約１９～約２３ヌクレオチドの長さ、または約２５～約３０ヌクレオチドの長さである。一般に、ｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ酵素のための基質として用いられるのに十分な程度に長い。例えば、当技術分野において、約２１～２３ヌクレオチドの長さを超えるｄｓＲＮＡが、Ｄｉｃｅｒのための基質として用いられうることは周知である。当業者がまた認識する通り、切断のためにターゲティングされるＲＮＡの領域は、しばしば、ｍＲＮＡ分子である、大型のＲＮＡ分子の一部であることが極めて多い。該当する場合、ｍＲＮＡ標的の「一部」は、それが、ＲＮＡｉにより導かれる切断（すなわち、ＲＩＳＣ経路を介する切断）のための基質となることを可能とするのに十分な長さの、ｍＲＮＡ標的の連続配列である。
当業者はまた、二重鎖領域が、ｄｓＲＮＡの、主要な機能的部分、例えば、約１９～約３０塩基対、例えば、約１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２塩基対の二重鎖領域であることも認識するであろう。したがって、一実施形態において、所望のＲＮＡを、切断のためにターゲティングする、例えば、１５～３０塩基対の機能的二重鎖へとプロセシングされる限りにおいて、３０塩基対を超える二重鎖領域を有する、ＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子の複合体は、ｄｓＲＮＡである。したがって、当業者は、一実施形態において、ｍｉＲＮＡが、ｄｓＲＮＡであることを認識するであろう。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、天然に存在するｍｉＲＮＡではない。別の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現をターゲティングするのに有用なｉＲＮＡ剤は、標的細胞内において、大型のｄｓＲＮＡの切断によっては生成しない。
本明細書において記載されるｄｓＲＮＡは、例えば、１～４、２～４、１～３、２～３、１、２、３、または４ヌクレオチドの、１つまたは複数の一本鎖ヌクレオチド突出をさらに含みうる。少なくとも１つのヌクレオチドの突出を有するｄｓＲＮＡは、それらの平滑末端対応物と比べて、優れた阻害特性を有しうる。ヌクレオチドの突出は、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドを含む、ヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含みうるか、またはこれらからなりうる。突出（複数可）は、センス鎖上にある場合もあり、アンチセンス鎖上にある場合もあり、これらの任意の組合せの上にある場合もある。さらに、ヌクレオチド（複数可）の突出は、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖またはセンス鎖の５’末端上、３’末端上、または両末端上に存在しうる。
ｄｓＲＮＡは、当技術分野において公知の標準的方法により合成されうる。本発明の二本鎖ＲＮＡｉ化合物は、２工程手順を使用して調製されうる。まず、二本鎖ＲＮＡ分子の個々の鎖を、個別に調製する。次いで、鎖の構成要素をアニーリングさせる。ｓｉＲＮＡ化合物の個々の鎖は、液相有機合成もしくは固相有機合成、またはこれらの両方を使用して調製されうる。有機合成は、非天然ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖が、容易に調製されうるという利点をもたらす。同様に、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、液相有機合成もしくは固相有機合成、またはこれらの両方を使用して調製されうる。
ある態様において、本発明のｄｓＲＮＡは、少なくとも２つのヌクレオチド配列である、センス配列およびアンチセンス配列を含む。センス鎖は、表２～１１、２１、２４、２７、３０、３２、３３、３６、３７、４９、または５０のうちのいずれか１つに提示された配列群から選択され、センス鎖の、対応するアンチセンス鎖は、表２～１１、２１、２４、２７、３０、３２、３３、３６、３７、４９、または５０のうちのいずれか１つの配列群から選択される。この態様において、２つの配列のうちの１つは、２つの配列のうちの他方と相補的であり、配列のうちの１つは、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現において生成するｍＲＮＡの配列と、実質的に相補的である。このように、この態様において、ｄｓＲＮＡは、１つのオリゴヌクレオチドが、表２～１１、２１、２４、２７、３０、３２、３３、３６、３７、４９、または５０のうちのいずれか１つにおいて、センス鎖として記載され、第２のオリゴヌクレオチドが、表２～１１、２１、２４、２７、３０、３２、３３、３６、３７、４９、または５０のうちのいずれか１つにおいて、センス鎖の、対応するアンチセンス鎖として記載される、２つのオリゴヌクレオチドを含むであろう。
ある特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡの、実質的に相補的な配列は、別個のオリゴヌクレオチドに含有される。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡの、実質的に相補的な配列は、単一のオリゴヌクレオチドに含有される。
ある特定の実施形態において、センス鎖またはアンチセンス鎖は、二重鎖である、ＡＤ－５１７１９７．２；ＡＤ－５１７２５８．２；ＡＤ－５１６７４８．２；ＡＤ－５１６８５１．２；ＡＤ－５１９３５１．２；ＡＤ－５１９７５４．２；ＡＤ－５１９８２８．２；ＡＤ－５２００１８．２；ＡＤ－５２００３５．２；ＡＤ－５２００６２．２；ＡＤ－５２００６４．２；ＡＤ－５２００６５．２；ＡＤ－５２００６７．２；ＡＤ－７５２８９．２；ＡＤ－５２００６９．２；ＡＤ－５２００９９．２；ＡＤ－６７５７５．７；ＡＤ－５２０１０１．２；ＡＤ－１１９３３２３．１；ＡＤ－１１９３３４４．１；ＡＤ－１１９３３５０．１；ＡＤ－１１９３３６５．１；ＡＤ－１１９３３７９．１；ＡＤ－１１９３４０７．１；ＡＤ－１１９３４２１．１；ＡＤ－１１９３４２２．１；ＡＤ－１１９３４２９．１；ＡＤ－１１９３４３７．１；ＡＤ－１１９３４４３．１；ＡＤ－１１９３４７１．１；ＡＤ－１１９３４８１．１；またはＡＤ－６７６０５．７のうちのいずれか１つの、センス鎖またはアンチセンス鎖から選択される。
一部の実施形態において、センス鎖またはアンチセンス鎖は、二重鎖である、ＡＤ－５１９３４５．１、ＡＤ－５１９３４６．１、ＡＤ－５１９３４７．１、ＡＤ－６７５５４．７、ＡＤ－５１９７５２．３、ＡＤ－１０１０７３１．１、ＡＤ－１０１０７３２．１、ＡＤ－５１９３４３．１、ＡＤ－５１９３４４．１、ＡＤ－５１９３４９．１、ＡＤ－５１９３５０．１、ＡＤ－５１９７５３．２、ＡＤ－５１９９３２．１、ＡＤ－５１９９３５．２、ＡＤ－５２００１８．６、ＡＤ－５１７８３７．２、ＡＤ－８０５６３５．２、ＡＤ－５１９３２９．２、ＡＤ－５２００６３．２、ＡＤ－５１９７５７．２、ＡＤ－８０５６３１．２、ＡＤ－５１６９１７．２、ＡＤ－５１６８２８．２、ＡＤ－５１８９８３．２、ＡＤ－８０５６３６．２、ＡＤ－５１９７５４．７、ＡＤ－５２００６２．２、ＡＤ－６７５７５．９、ＡＤ－５１８９２３．３、ＡＤ－５２００５３．４、ＡＤ－５１９６６７．２、ＡＤ－５１９７７３．２、ＡＤ－５１９３５４．２、ＡＤ－５２００６０．４、ＡＤ－５２００６１．４、ＡＤ－１０１０７３３．２、ＡＤ－１０１０７３５．２、ＡＤ－１１９３３２３．１；ＡＤ－１１９３３４４．１；ＡＤ－１１９３３５０．１；ＡＤ－１１９３３６５．１；ＡＤ－１１９３３７９．１；ＡＤ－１１９３４０７．１；ＡＤ－１１９３４２１．１；ＡＤ－１１９３４２２．１；ＡＤ－１１９３４２９．１；ＡＤ－１１９３４３７．１；ＡＤ－１１９３４４３．１；ＡＤ－１１９３４７１．１；またはＡＤ－１１９３４８１．１のうちのいずれか１つの、センス鎖またはアンチセンス鎖から選択される。
一部の実施形態において、センス鎖またはアンチセンス鎖は、二重鎖である、ＡＤ－５１９３４５．１；ＡＤ－１１９３３５０．１；ＡＤ－１１９３３６５．１；ＡＤ－１１９３４３７．１；およびＡＤ－５１９３４７．１のうちのいずれか１つの、センス鎖またはアンチセンス鎖から選択される。
一部の実施形態において、センス鎖またはアンチセンス鎖は、二重鎖であるＡＤ－５１９３５１のセンス鎖またはアンチセンス鎖から選択される。
一実施形態において、センス鎖またはアンチセンス鎖は、二重鎖であるＡＤ－１１９３３５０のセンス鎖またはアンチセンス鎖から選択される。
一実施形態において、センス鎖またはアンチセンス鎖は、二重鎖であるＡＤ－１１９３３６５のセンス鎖またはアンチセンス鎖から選択される。
一実施形態において、センス鎖またはアンチセンス鎖は、二重鎖であるＡＤ－１１９３４３７のセンス鎖またはアンチセンス鎖から選択される。
一実施形態において、センス鎖またはアンチセンス鎖は、二重鎖であるＡＤ－５１９３４７のセンス鎖またはアンチセンス鎖から選択される。
例えば、表３、５、７、９、１１、２１、２４、２７、３０、３２、３６、および５０における配列は、修飾配列またはコンジュゲート配列として記載されないが、本開示のＲＮＡｉのＲＮＡ、例えば、本発明のｄｓＲＮＡは、修飾されていないか、コンジュゲートされていないか、またはその中の記載とは異なる形において修飾されるか、もしくはコンジュゲートされた、表２～１１、２１、２４、２７、３０、３２、３３、３６、３７、４９、または５０のうちのいずれか１つに明示された配列のうちのいずれか１つを含みうることが理解されるであろう。言い換えると、本発明は、修飾されていないか、コンジュゲートされていないか、または本明細書において記載される通りに修飾されるか、もしくはコンジュゲートされた、表２～１１、２１、２４、２７、３０、３２、３３、３６、３７、４９、または５０のｄｓＲＮＡを包含する。
当業者は、約２０～２３塩基対、例えば、２１塩基対の二重鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉の誘導において、特に、有効であると言われていることについて承知している［Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888］。しかし、他の研究者らは、より短い二重鎖構造またはより長いＲＮＡ二重鎖構造もまた、有効でありうることを見出している［Chu and Rana (2007) RNA 14:1714-1719; Kim et al. (2005) Nat Biotech 23:222-226］。上記において記載された実施形態において、表２～１１、２１、２４、２７、３０、３２、３３、３６、３７、４９、または５０のうちのいずれか１つに提示されたオリゴヌクレオチド配列の性質により、本明細書において記載されるｄｓＲＮＡは、最小において、２１ヌクレオチドの長さの、少なくとも１つの鎖を含みうる。一方または両方の末端における、少数のヌクレオチドだけを差し引いた、表２～１１、２１、２４、２７、３０、３２、３３、３６、３７、４９、または５０のうちのいずれか１つ内の配列のうちのいずれか１つを有する、より短い二重鎖も、上記において記載されたｄｓＲＮＡと比較して、同様に有効でありうることが妥当に期待されうる。よって、表２～１１、２１、２４、２７、３０、３２、３３、３６、３７、４９、または５０のうちのいずれか１つの配列のうちのいずれか１つに由来する、少なくとも１９、２０、またはこれを超える連続ヌクレオチドの配列を有し、全長配列を含むｄｓＲＮＡの、約５、１０、１５、２０、２５、または３０％を超えない阻害により、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害する、それらの能力において異なるｄｓＲＮＡは、本発明の範囲内にあることが想定される。
加えて、表２～１１、２１、２４、２７、３０、３２、３３、３６、３７、４９、または５０に提示されたＲＮＡは、ＰＮＰＬＡ３転写物における、ＲＩＳＣ媒介切断に感受性の部位（複数可）を同定する。このように、本発明は、これらの部位のうちの１つの内部をターゲティングするｉＲＮＡをさらに特色とする。ｉＲＮＡが、この特定の部位の内部のいずれかの位置において、転写物の切断を促進する場合に、本明細書において使用されるｉＲＮＡは、ＲＮＡ転写物の特定部位の内部をターゲティングすると言われる。このようなｉＲＮＡは、一般に、ＰＮＰＬＡ３遺伝子内の、選択された配列と隣接する領域から採取された、さらなるヌクレオチド配列へとカップリングされた、表２～１１、２１、２４、２７、３０、３２、３３、３６、３７、４９、または５０のうちのいずれか１つに提示された配列のうちのいずれか１つに由来する、少なくとも約１９連続ヌクレオチドを含む。
ＩＩＩ．本発明の修飾ｉＲＮＡ
ある特定の実施形態において、本開示のＲＮＡｉのＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、修飾されておらず、例えば、当技術分野において公知であり、本明細書において記載される化学修飾またはコンジュゲーションを含まない。他の実施形態において、本開示のＲＮＡｉのＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、安定性または他の有益な特徴を増強するように、化学修飾されている。本発明のある特定の実施形態において、本開示のＲＮＡｉのヌクレオチドの実質的に全ては、修飾されている。本発明についての他の実施形態において、ｉＲＮＡのヌクレオチドの全て、またはｉＲＮＡのヌクレオチドの実質的に全ては、修飾されている、すなわち、５つ、４つ、３つ、２つ、または１つを超えない非修飾ヌクレオチドが、ｉＲＮＡ鎖内に存在する。
本発明において特色づけられる核酸は、参照により本明細書に組み込まれる、“Current protocols in nucleic acid chemistry,” Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USAにおいて記載されている方法など、当技術分野において十分に確立された方法により、合成または修飾されうる。修飾は、例えば、末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化、コンジュゲーション、逆連結）または３’末端修飾（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆連結など）；塩基修飾、例えば、安定化塩基、不安定性塩基、またはパートナーの拡大レパートリーと塩基対合する塩基による置きかえ、塩基の除去（脱塩基性ヌクレオチド）、またはコンジュゲート塩基；糖修飾（例えば、２’位または４’位における）もしくは糖の置きかえ；またはホスホジエステル連結の修飾または置きかえを含む骨格修飾を含む。本明細書において記載される実施形態において有用なｉＲＮＡ化合物の具体例は、修飾骨格を含有するＲＮＡ、または天然ヌクレオシド間連結を含有しないＲＮＡを含むがこれらに限定されない。修飾骨格を有するＲＮＡは、とりわけ、骨格内にリン原子を有さないＲＮＡを含む。本明細書の目的のために、かつ、場合によって、当技術分野において言及される通り、それらのヌクレオシド間骨格内に、リン原子を有さない修飾ＲＮＡはまた、オリゴヌクレオシドであるとも考えられうる。一部の実施形態において、修飾ｉＲＮＡは、それらのヌクレオシド間骨格内に、リン原子を有するであろう。
修飾ＲＮＡ骨格は、例えば、通常の３’－５’連結を有する、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル、および３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む、他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびにボラノホスフェート、これらの２’－５’連結類似体、ならびに隣接するヌクレオシド単位の対が、５’－３’に対して、３’－５’連結されるか、または５’－２’に対して、２’－５’連結される、逆極性を有する類似体を含む。多様な塩形態、混合塩形態、および遊離酸形態もまた、含まれる。本発明の一部の実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、遊離酸形態にある。本発明についての他の実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、塩形態にある。本発明についての一実施形態においてｄｓＲＮＡ剤は、ナトリウム塩形態にある。ある特定の実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡ剤が、ナトリウム塩形態にある場合、ナトリウムイオンは、薬剤中に、薬剤中に存在する、ホスホジエステル基および／またはホスホロチオエート基の実質的に全てに対する対イオンとして存在する。ホスホジエステル連結および／またはホスホロチオエート連結の実質的に全てが、ナトリウム対イオンを有する薬剤は、ナトリウム対イオンを伴わない、５つ、４つ、３つ、２つ、または１つを超えない、ホスホジエステル連結および／またはホスホロチオエート連結を含む。一部の実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡ剤が、ナトリウム塩形態にある場合、ナトリウムイオンは、薬剤中に、薬剤中に存在する、ホスホジエステル基および／またはホスホロチオエート基の全てに対する対イオンとして存在する。
上記のリン含有連結の調製について教示する、代表的な米国特許は、それらの各々の全内容が、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９５号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３１６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；同第５，６２５，０５０号；同第６，０２８，１８８号；同第６，１２４，４４５号；同第６，１６０，１０９号；同第６，１６９，１７０号；同第６，１７２，２０９号；同第６，２３９，２６５号；同第６，２７７，６０３号；同第６，３２６，１９９号；同第６，３４６，６１４号；同第６，４４４，４２３号；同第６，５３１，５９０号；同第６，５３４，６３９号；同第６，６０８，０３５号；同第６，６８３，１６７号；同第６，８５８，７１５号；同第６，８６７，２９４号；同第６，８７８，８０５号；同第７，０１５，３１５号；同第７，０４１，８１６号；同第７，２７３，９３３号；同第７，３２１，０２９号；米国再発行特許第３９４６４号を含むがこれらに限定されない。
その中においてリン原子を含まない修飾ＲＮＡ骨格は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルによるヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルによるヌクレオシド間連結、または１つもしくは複数の短鎖の、ヘテロ原子または複素環を伴うヌクレオシド間連結により形成される骨格を有する。修飾ＲＮＡ骨格は、モルホリノ連結（部分的に、ヌクレオシドの糖部分から形成される）を有する修飾ＲＮＡ骨格；シロキサン骨格；スルフィド骨格、スルホキシド骨格、およびスルホン骨格；ホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル骨格およびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ骨格およびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート骨格およびスルホンアミド骨格；アミド骨格；および混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２構成部分を有する骨格を含む。
上記のオリゴヌクレオシドの調製について教示する、代表的な米国特許は、それらの各々の全内容が、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；および同第５，６７７，４３９号を含むがこれらに限定されない。
ヌクレオチド単位の、糖およびヌクレオシド間連結の両方、すなわち、骨格が、新規の基により置きかえられた、本明細書において提示されるｉＲＮＡにおける使用に適するＲＮＡ模倣体が想定される。塩基単位は、適切な核酸ターゲティング（ｔａｒｇｅｔ）化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。ＲＮＡ模倣体が、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されている、１つのこのようなオリゴマー化合物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、ＲＮＡの糖骨格は、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格により置きかえられる。ヌクレオ塩基は、保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に、直接的に、または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物調製について教示する、代表的な米国特許は、それらの各々の全内容が、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号を含むがこれらに限定されない。本発明のｉＲＮＡにおける使用に適する、さらなるＰＮＡ化合物については、例えば、Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500において記載されている。
本発明において特色づけられる、一部の実施形態は、ホスホロチオエート骨格を伴うＲＮＡ、およびヘテロ原子骨格を伴うオリゴヌクレオシドを含み、特に、上記において参照された米国特許第５，４８９，６７７号の－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２－［メチレン（メチルイミノ）骨格またはＭＭＩ骨格として公知である］、－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、および－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－［式中、天然のホスホジエステル骨格は、－Ｏ－Ｐ－Ｏ－ＣＨ２－として表される］、および上記において参照された米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格を含む。一部の実施形態において、本明細書において特色づけられるＲＮＡは、上記において参照された米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有する。
修飾ＲＮＡはまた、１つまたは複数の置換糖部分も含有しうる。ｉＲＮＡ、例えば、本明細書において特色づけられるｄｓＲＮＡは、２’位において、以下：ＯＨ；Ｆ；Ｏ－アルキル、Ｓ－アルキル、もしくはＮ－アルキル；Ｏ－アルケニル、Ｓ－アルケニル、もしくはＮ－アルケニル；Ｏ－アルキニル、Ｓ－アルキニル、もしくはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキル［式中、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換の、Ｃ１～Ｃ１０のアルキル、またはＣ２～Ｃ１０のアルケニルおよびアルキニルでありうる］のうちの１つを含みうる。例示的な適切な修飾は、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２［式中、ｎおよびｍは、１～約１０である］を含む。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、２’位において、以下：Ｃ１～Ｃ１０の低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ－アルカリールまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、挿入剤、ｉＲＮＡの薬物動態特性を改善するための基、またはｉＲＮＡの薬力学特性を改善するための基、および同様の特性を有する、他の置換基のうちの１つを含む。一部の実施形態において、修飾は、２’－メトキシエトキシ［２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしても公知の、２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３］（Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504）、すなわち、アルコキシ－アルコキシ基を含む。別の例示的修飾は、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、本明細書の下記の実施例において記載される通り、２’－ＤＭＡＯＥとしても公知の、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野においてまた、２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても公知である）、すなわち、２’－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ２）２である。さらなる例示的修飾は、５’－Ｍｅ－２’－Ｆヌクレオチド、５’－Ｍｅ－２’－ＯＭｅヌクレオチド、５’－Ｍｅ－２’－デオキシヌクレオチド（これら３つのファミリー内の、Ｒ異性体およびＳ異性体の両方）；２’－アルコキシアルキル；および２’－ＮＭＡ（Ｎ－メチルアセトアミド）を含む。
他の修飾は、２’－メトキシ（２’－ＯＣＨ３）、２’－アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、および２’－フルオロ（２’－Ｆ）を含む。同様の修飾はまた、ｉＲＮＡのＲＮＡ上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位、または２’－５’連結されたｄｓＲＮＡ内、および５’末端ヌクレオチドの５’位においてもなされうる。ｉＲＮＡはまた、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分などの糖模倣体も有しうる。このような修飾糖構造について教示する、代表的な米国特許は、それらのうちのある特定の特許が、本出願と共に共同所有される、米国特許第４，９８１，９５７号；同第５，１１８，８００号；同第５，３１９，０８０号；同第５，３５９，０４４号；同第５，３９３，８７８号；同第５，４４６，１３７号；同第５，４６６，７８６号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５１９，１３４号；同第５，５６７，８１１号；同第５，５７６，４２７号；同第５，５９１，７２２号；同第５，５９７，９０９号；同第５，６１０，３００号；同第５，６２７，０５３号；同第５，６３９，８７３号；同第５，６４６，２６５号；同第５，６５８，８７３号；同第５，６７０，６３３号；および同第５，７００，９２０号を含むがこれらに限定されない。前出の各々の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
ｉＲＮＡはまた、ヌクレオ塩基（当技術分野において、単に、「塩基」と称されることが多い）の修飾または置換も含みうる。本明細書において使用される、「非修飾」ヌクレオ塩基または「天然」ヌクレオ塩基は、プリン塩基である、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基である、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾ヌクレオ塩基は、デオキシチミン（ｄＴ）、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの、６－メチル誘導体および他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの、２－プロピル誘導体および他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン、および２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよび５－ハロシトシン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシン、６－アゾウラシル、６－アゾシトシン、および６－アゾチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロアデニンおよび８－ハログアニン、８－アミノアデニンおよび８－アミノグアニン、８－チオールアデニンおよび８－チオールグアニン、８－チオアルキルアデニンおよび８－チオアルキルグアニン、８－ヒドロキシルアデニン類似体（ａｎａｌ）および８－ヒドロキシルグアニン類似体、他の８－置換アデニンおよび８－置換グアニン、５－ハロウラシルおよび５－ハロシトシン、特に、５－ブロモウラシルおよび５－ブロモシトシン、５－トリフルオロメチルウラシルおよび５－トリフルオロメチルシトシン、および他の５－置換ウラシルおよび５－置換シトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニン（ｄａａｚａａｄｅｎｉｎｅ）、ならびに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンなど、他の合成ヌクレオ塩基および天然ヌクレオ塩基を含む。さらなるヌクレオ塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているヌクレオ塩基；Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008に開示されているヌクレオ塩基；The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990に開示されているヌクレオ塩基；Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613により開示されているヌクレオ塩基；およびSanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993により開示されているヌクレオ塩基を含む。これらのヌクレオ塩基のうちのある特定のヌクレオ塩基は、本発明において特色づけられるオリゴマー化合物の結合アフィニティーを増大させるために、特に、有用である。これらは、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、ならびにＮ－２置換プリン、Ｎ－６置換プリン、ならびに２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、および５－プロピニルシトシンを含む０～６置換プリンを含む。５－メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６～１．２℃増大させることが示されており（Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278）、なおより特定すると、２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合に、例示的塩基置換である。
上記において言及された修飾ヌクレオ塩基のうちのある特定の修飾ヌクレオ塩基のほか、他の修飾ヌクレオ塩基の調製について教示する、代表的な米国特許は、それらの各々の全内容が、参照により本明細書に組み込まれる、上記において言及された、米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９４，１２１号；同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；同第５，６８１，９４１号；同第５，７５０，６９２号；同第６，０１５，８８６号；同第６，１４７，２００号；同第６，１６６，１９７号；同第６，２２２，０２５号；同第６，２３５，８８７号；同第６，３８０，３６８号；同第６，５２８，６４０号；同第６，６３９，０６２号；同第６，６１７，４３８号；同第７，０４５，６１０号；同第７，４２７，６７２号；および同第７，４９５，０８８号を含むがこれらに限定されない。
ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１つまたは複数のロック核酸（ＬＮＡ）を含むようにも修飾されうる。ロック核酸とは、２’炭素と、４’炭素とを接続する、追加の架橋を含む、修飾リボース部分を有するヌクレオチドである。この構造は、リボースを、３’側内部構造コンフォメーション内に、有効に「ロックする」。ロック核酸の、ｓｉＲＮＡへの付加は、血清中のｓｉＲＮＡの安定性を増大させ、オフターゲット効果を低減することが示されている［Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193］。
一部の実施形態において、ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１つまたは複数の二環式糖部分を含むようにも修飾されうる。「二環式糖」とは、２つの原子の架橋により修飾されたフラノシル環である。「二環式ヌクレオシド」（「ＢＮＡ」）は、糖環の２つの炭素原子を接続し、これにより、二環式環系を形成する架橋を含む糖部分を有するヌクレオシドである。ある特定の実施形態において、架橋は、糖環の４’炭素と、２’炭素とを接続する。したがって、一部の実施形態において、本発明の薬剤は、１つまたは複数のロック核酸（ＬＮＡ）を含みうる。ロック核酸は、２’炭素と、４’炭素とを接続する、追加の架橋を含む、修飾リボース部分を有するヌクレオチドである。言い換えると、ＬＮＡは、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’架橋を含む、二環式糖部分を含むヌクレオチドである。この構造は、リボースを、３’側内部構造コンフォメーション内に、有効に「ロックする」。ロック核酸の、ｓｉＲＮＡへの付加は、血清中のｓｉＲＮＡの安定性を増大させ、オフターゲット効果を低減することが示されている［Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193］。本発明のポリヌクレオチドにおける使用のための二環式ヌクレオシドの例は、限定せずに述べると、リボシル環の４’原子と、２’原子との間の架橋を含むヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態において、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド剤は、４’－２’架橋を含む、１つまたは複数の二環式ヌクレオシドを含む。このような４’－２’架橋二環式ヌクレオシドの例は、４’－（ＣＨ２）－Ｏ－２’（ＬＮＡ）；４’－（ＣＨ２）－Ｓ－２’；４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’（ＥＮＡ）；４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’（別称：「拘束エチル」または「ｃＥｔ」）、および４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）－Ｏ－２’（およびこれらの類似体；例えば、米国特許第７，３９９，８４５号を参照されたい）；４’－Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）－Ｏ－２’（およびこれらの類似体；例えば、米国特許第８，２７８，２８３号を参照されたい）；４’－ＣＨ２－Ｎ（ＯＣＨ３）－２’（およびこれらの類似体；例えば、米国特許第８，２７８，４２５号を参照されたい）；４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－２’（例えば、米国特許公開第２００４／０１７１５７０号を参照されたい）；４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’［式中、Ｒは、Ｈ、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、または保護基である］（例えば、米国特許第７，４２７，６７２号を参照されたい）；４’－ＣＨ２－Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）－２’（例えば、Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134を参照されたい）；ならびに４’－ＣＨ２－Ｃ（＝ＣＨ２）－２’（およびこれらの類似体；例えば、米国特許第８，２７８，４２６号を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。前出の各々の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
ロック核酸ヌクレオチドの調製について教示する、さらなる、代表的な米国特許および米国特許公開は、それらの各々の全内容が、参照により本明細書に組み込まれる、以下：米国特許第６，２６８，４９０号；同第６，５２５，１９１号；同第６，６７０，４６１号；同第６，７７０，７４８号；同第６，７９４，４９９号；同第６，９９８，４８４号；同第７，０５３，２０７号；同第７，０３４，１３３号；同第７，０８４，１２５号；同第７，３９９，８４５号；同第７，４２７，６７２号；同第７，５６９，６８６号；同第７，７４１，４５７号；同第８，０２２，１９３号；同第８，０３０，４６７号；同第８，２７８，４２５号；同第８，２７８，４２６号；同第８，２７８，２８３号；ＵＳ２００８／００３９６１８；およびＵＳ２００９／００１２２８１を含むがこれらに限定されない。
例えば、α－Ｌ－リボフラノースおよびβ－Ｄ－リボフラノースを含む、１つまたは複数の糖立体化学配置（ＷＯ９９／１４２２６を参照されたい）を有する、前出の二環式ヌクレオシドのうちのいずれかが調製されうる。
ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１つまたは複数の拘束エチルヌクレオチドを含むようにも修飾されうる。本明細書において使用される、「拘束エチルヌクレオチド」または「ｃＥｔ」とは、４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’架橋を含む二環式糖部分を含むロック核酸である。一実施形態において、拘束エチルヌクレオチドは、本明細書において、「Ｓ－ｃＥｔ」と称される、Ｓコンフォメーション内にある。
本開示のｉＲＮＡはまた、１つまたは複数の「配座固定ヌクレオチド」（「ＣＲＮ」）も含みうる。ＣＲＮは、リボースのＣ２’炭素と、Ｃ４’炭素とを接続するリンカー、またはリボースのＣ３炭素と、－Ｃ５’炭素とを接続するリンカーを伴うヌクレオチド類似体である。ＣＲＮは、リボース環を、安定的コンフォメーションへとロッし、ｍＲＮＡに対するハイブリダイゼーションアフィニティーを増大させる。リンカーは、リボース環のパッカリングの減少を結果としてもたらす、安定性およびアフィニティーに最適の位置に酸素を配置するのに十分な長さである。
上記において言及されたＣＲＮのうちのある特定のＣＲＮの調製について教示する、代表的な公報は、それらの各々の全内容が、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１３／０１９０３８３号；およびＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／０３６８６８号を含むがこれらに限定されない。
一部の実施形態において、本開示のｉＲＮＡは、ＵＮＡ（アンロック核酸）ヌクレオチドである、１つまたは複数の単量体を含む。ＵＮＡは、アンロック非環状核酸であり、この場合、糖の結合のうちのいずれかが除去され、アンロック「糖」残基を形成する。一例において、ＵＮＡはまた、Ｃ１’－Ｃ４’間結合（すなわち、Ｃ１’炭素と、Ｃ４’炭素との間の、共有結合的炭素－酸素－炭素間結合）が除去された単量体も包含する。別の例において、糖のＣ２’－Ｃ３’間結合（すなわち、Ｃ２’炭素と、Ｃ３’炭素との間の、共有結合的炭素－炭素間結合）が除去されている（参照により本明細書に組み込まれる、Nuc. Acids Symp. Series, 52, 133-134 (2008)およびFluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039を参照されたい）。
ＵＮＡの調製について教示する、代表的な米国公報は、それらの各々の全内容が、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，３１４，２２７号；および米国特許公開第２０１３／００９６２８９号；同第２０１３／００１１９２２号；および同第２０１１／０３１３０２０号を含むがこれらに限定されない。
ＲＮＡ分子の末端に対する、潜在的な安定化修飾は、Ｎ－（アセチルアミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－ＮＨＡｃ）、Ｎ－（カプロイル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６）、Ｎ－（アセチル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－ＮＨＡｃ）、チミジン－２’－０－デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ－（アミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－アミノ）、２－ドコサノイル－ウリジン－３’’－リン酸、逆塩基であるｄＴ（ｉｄＴ）、および他の安定化修飾を含みうる。この修飾についての開示は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／００５８６１号において見出されうる。
本開示のｉＲＮＡのヌクレオチドに対する、他の修飾は、アンチセンスｉＲＮＡ鎖上に、５’リン酸または５’リン酸模倣体、例えば、５’末端のリン酸またはリン酸模倣体を含む。適切なリン酸模倣体については、例えば、それらの全内容が、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１２／０１５７５１１号において開示されている。
Ａ．本発明のモチーフを含む修飾ｉＲＮＡ
本発明のある特定の態様において、本発明の二本鎖ＲＮＡ剤は、例えば、それらの各々の全内容が、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１３／０７５０３５において開示されている、化学修飾を伴う薬剤を含む。ＷＯ２０１３／０７５０３５は、特に、切断部位における、またはこの近傍における、３つの連続ヌクレオチド上の、３つの同一な修飾によるモチーフの、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖への導入を提示している。一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、他の形において、完全に修飾されうる。これらのモチーフの導入は、存在する場合、センス鎖またはアンチセンス鎖の修飾パターンを中断する。ｄｓＲＮＡｉ剤は、例えば、センス鎖上において、ＧａｌＮＡｃ誘導体リガンドとコンジュゲートされてもよい。
より具体的には、二本鎖ＲＮＡ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖が、ｄｓＲＮＡｉ剤の、少なくとも１つの鎖の切断部位において、またはこの近傍において、３つの連続ヌクレオチド上の、３つの同一な修飾による、１つまたは複数のモチーフを有するように、完全に修飾された場合、ｄｓＲＮＡｉ剤の遺伝子サイレンシング活性が観察された。
したがって、本発明は、インビボにおいて、標的遺伝子（すなわち、ＰＮＰＬＡ３遺伝子）の発現を阻害することが可能な、二本鎖ＲＮＡ剤を提供する。ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。ＲＮＡｉ剤の各鎖は、例えば、１７～３０ヌクレオチドの長さ、２５～３０ヌクレオチドの長さ、２７～３０ヌクレオチドの長さ、１９～２５ヌクレオチドの長さ、１９～２３ヌクレオチドの長さ、１９～２１ヌクレオチドの長さ、２１～２５ヌクレオチドの長さ、または２１～２３ヌクレオチドの長さでありうる。
センス鎖およびアンチセンス鎖は、典型的に、本明細書においてまた、「ｄｓＲＮＡｉ剤」とも言及される、二重鎖である、二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）を形成する。ｄｓＲＮＡｉ剤の二重鎖領域は、例えば、２７～３０ヌクレオチド対の長さ、１９～２５ヌクレオチド対の長さ、１９～２３ヌクレオチド対の長さ、１９～２１ヌクレオチド対の長さ、２１～２５ヌクレオチド対の長さ、または２１～２３ヌクレオチド対の長さでありうる。別の例において、二重鎖領域は、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、および２７ヌクレオチドの長さから選択される。
ある特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、鎖の一方または両方の３’末端、５’末端、または両末端において、１つまたは複数の突出領域またはキャッピング基を含有しうる。突出は、独立に、１～６ヌクレオチドの長さ、例えば、２～６ヌクレオチドの長さ、１～５ヌクレオチドの長さ、２～５ヌクレオチドの長さ、１～４ヌクレオチドの長さ、２～４ヌクレオチドの長さ、１～３ヌクレオチドの長さ、２～３ヌクレオチドの長さ、または１～２ヌクレオチドの長さでありうる。ある特定の実施形態において、突出領域は、上記において提示された伸長突出領域を含みうる。突出は、一方の鎖が、他方の鎖より長い結果である場合もあり、同じ長さの２つの鎖が付着末端鎖である結果の場合もある。突出は、標的ｍＲＮＡと、ミスマッチを形成する場合もあり、ターゲティングされる遺伝子配列と相補的である場合もあり、別の配列である場合もある。第１の鎖と、第２の鎖とはまた、例えば、ヘアピンを形成するように、さらなる塩基により接続される場合もあり、他の非塩基リンカーにより接続される場合もある。
ある特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤の突出領域内のヌクレオチドは、各々、独立に、２’－Ｆ、２’－Ｏ－メチル、チミジン（Ｔ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、およびこれらの任意の組合せなどの２’糖修飾ヌクレオチドを含むがこれらに限定されない、修飾ヌクレオチドの場合もあり、非修飾ヌクレオチドの場合もある。
例えば、ＴＴは、いずれかの鎖上のいずれかの末端のための突出配列でありうる。突出は、標的ｍＲＮＡと、ミスマッチを形成する場合もあり、ターゲティングされる遺伝子配列と相補的である場合もあり、別の配列である場合もある。
ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖における、５’突出または３’突出は、リン酸化されうる。一部の実施形態において、突出領域（複数可）は、２つのヌクレオチドの間に、ホスホロチオエートを有する、２つのヌクレオチドを含有し、この場合、２つのヌクレオチドは、同じ場合もあり、異なる場合もある。一部の実施形態において、突出は、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の３’末端に存在する。一部の実施形態において、この３’突出は、アンチセンス鎖内に存在する。一部の実施形態において、この３’突出は、センス鎖内に存在する。
ｄｓＲＮＡｉ剤は、その全体的な安定性に影響を及ぼさずに、ＲＮＡｉの干渉活性を強化しうる、１つだけの突出を含有しうる。例えば、一本鎖突出は、センス鎖の３’末端に配置される場合もあり、代替的に、アンチセンス鎖の３’末端に配置される場合もある。ＲＮＡｉはまた、アンチセンス鎖の５’末端（またはセンス鎖の３’末端）に配置された平滑末端を有する場合もあり、この逆の場合もある。一般に、ｄｓＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、３’末端において、ヌクレオチドの突出を有し、５’末端は、平滑末端である。理論に束縛されることを望まずに述べると、アンチセンス鎖の５’末端における平滑末端と、アンチセンス鎖の３’末端突出との非対称性は、ＲＩＳＣ工程へのガイド鎖のローディングに好適である。
ある特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、１９ヌクレオチドの長さの両端型ブラントマー（ｂｌｕｎｔｍｅｒ）であり、センス鎖は、５’末端の７、８、９位における、３つの連続ヌクレオチド上における、３つの２’－Ｆ修飾のうちの、少なくとも１つのモチーフを含有する。アンチセンス鎖は、５’末端の１１、１２、１３位における、３つの連続ヌクレオチド上における、３つの２’－Ｏ－メチル修飾のうちの、少なくとも１つのモチーフを含有する。
他の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、２０ヌクレオチドの長さの両端型ブラントマーであり、センス鎖は、５’末端の８、９、１０位における、３つの連続ヌクレオチド上における、３つの２’－Ｆ修飾のうちの、少なくとも１つのモチーフを含有する。アンチセンス鎖は、５’末端の１１、１２、１３位における、３つの連続ヌクレオチド上における、３つの２’－Ｏ－メチル修飾のうちの、少なくとも１つのモチーフを含有する。
さらに他の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、２１ヌクレオチドの長さの両端型ブラントマーであり、センス鎖は、５’末端の９、１０、１１位における、３つの連続ヌクレオチド上における、３つの２’－Ｆ修飾のうちの、少なくとも１つのモチーフを含有する。アンチセンス鎖は、５’末端の１１、１２、１３位における、３つの連続ヌクレオチド上における、３つの２’－Ｏ－メチル修飾のうちの、少なくとも１つのモチーフを含有する。
ある特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、２１ヌクレオチドのセンス鎖、および２３ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、５’末端の９、１０、１１位における、３つの連続ヌクレオチド上における、３つの２’－Ｆ修飾のうちの、少なくとも１つのモチーフを含有し；アンチセンス鎖は、５’末端の１１、１２、１３位における、３つの連続ヌクレオチド上における、３つの２’－Ｏ－メチル修飾のうちの、少なくとも１つのモチーフを含有し、ＲＮＡｉ剤の一方の末端は、平滑末端であるが、他方の末端は、２ヌクレオチドの突出を含む。好ましくは、２ヌクレオチドの突出は、アンチセンス鎖の３’末端にある。
２ヌクレオチドの突出が、アンチセンス鎖の３’末端にある場合、末端の３つのヌクレオチドの間に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結が存在する場合があり、３ヌクレオチドのうちの２つは、突出ヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドは、突出ヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、加えて、センス鎖の５’末端、およびアンチセンス鎖の５’末端の両方において、末端の３つのヌクレオチドの間に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を有する。ある特定の実施形態において、モチーフの一部であるヌクレオチドを含む、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖内およびアンチセンス鎖内のあらゆるヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、各残基は、独立に、例えば、交互モチーフ内の、２’－Ｏ－メチルまたは３’－フルオロにより修飾される。ｄｓＲＮＡｉ剤は、リガンド（好ましくは、ＧａｌＮＡｃ３）をさらに含んでもよい。
ある特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、２５～３０ヌクレオチド残基の長さであり、５’末端ヌクレオチド（１位）から始まり、第１の鎖の１～２３位は、少なくとも８つのリボヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖は、３６～６６ヌクレオチド残基の長さであり、３’末端のヌクレオチドから始まり、センス鎖の１～２３位と対合する位置において、二重鎖を形成するように、少なくとも８つのリボヌクレオチドを含み；この場合、アンチセンス鎖の、少なくとも３’末端ヌクレオチドは、センス鎖と非対合であり、３’末端における、最大において６つの連続ヌクレオチドは、センス鎖と非対合であり、これにより、１～６ヌクレオチドの一本鎖３’突出を形成し；アンチセンス鎖の５’末端は、センス鎖と非対合である、１０～３０の連続ヌクレオチドを含み、これにより、１０～３０ヌクレオチドの一本鎖５’突出を形成し；少なくともセンス鎖の５’末端および３’末端ヌクレオチドは、センス鎖と、アンチセンス鎖とが、最大の相補性についてアライメントされる場合に、アンチセンス鎖のヌクレオチドと塩基対合し、これにより、センス鎖と、アンチセンス鎖との間に、実質的な二重鎖領域を形成し；アンチセンス鎖は、二本鎖核酸が、哺乳動物細胞へと導入される場合に、標的遺伝子の発現を低減するように、アンチセンス鎖の、少なくとも１９リボヌクレオチドの長さにわたり、標的ＲＮＡと十分に相補的であり；センス鎖は、３つの連続ヌクレオチド上の、３つの２’－Ｆ修飾のうちの、少なくとも１つのモチーフを含有し、この場合、モチーフのうちの少なくとも１つは、切断部位において、またはこの近傍において存在する。アンチセンス鎖は、鎖の切断部位において、またはこの近傍において、３つの連続ヌクレオチド上の、２’－Ｏ－メチル修飾のうちの、少なくとも１つのモチーフを含有する。
ある特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ｄｓＲＮＡｉ剤は、少なくとも２５ヌクレオチドであり、最大において２９ヌクレオチドの長さである、第１の鎖と、５’末端の１１、１２、１３位における、３つの連続ヌクレオチド上の、３つの２’－Ｏ－メチル修飾のうちの、少なくとも１つのモチーフを伴う、最大において３０ヌクレオチドの長さである、第２の鎖とを含み；第１の鎖の３’末端と、第２の鎖の５’末端とは、平滑末端を形成し、第２の鎖は、その３’末端において、第１の鎖より１～４ヌクレオチド長く、少なくとも２５ヌクレオチドの長さである二重鎖領域と、第２の鎖とは、ＲＮＡｉ剤が、哺乳動物細胞へと導入される場合に、標的遺伝子の発現を低減するように、第２の鎖の、少なくとも１９ヌクレオチドの長さにわたり、標的ｍＲＮＡと十分に相補的であり、この場合、ＤｉｃｅｒによるｄｓＲＮＡｉ剤の切断は、優先的に、第２の鎖の３’末端を含むｓｉＲＮＡを結果としてもたらし、これにより、哺乳動物における標的遺伝子の発現を低減する。ｄｓＲＮＡｉ剤は、リガンドをさらに含んでもよい。
ある特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、３つの連続ヌクレオチド上の、３つの同一な修飾のうちの、少なくとも１つのモチーフを含有し、この場合、モチーフのうちの１つは、センス鎖内の切断部位において存在する。
ある特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖はまた、３つの連続ヌクレオチド上の、３つの同一な修飾のうちの、少なくとも１つのモチーフも含有する場合があり、この場合、モチーフのうちの１つは、アンチセンス鎖内の切断部位において、またはこの近傍において存在する。
１９～２３ヌクレオチドの長さの二重鎖領域を有するｄｓＲＮＡｉ剤のために、アンチセンス鎖の切断部位は、典型的に、５’末端の１０、１１、および１２位近傍である。したがって、３つの同一な修飾によるモチーフは、アンチセンス鎖の５’末端の、最初のヌクレオチドからのカウント、またはアンチセンス鎖の５’末端の二重鎖領域内の、最初の対合ヌクレオチドからのカウントにより、アンチセンス鎖の９、１０、１１位；１０、１１、１２位；１１、１２、１３位；１２、１３、１４位；または１３、１４、１５位においしうる。アンチセンス鎖内の切断部位はまた、ｄｓＲＮＡｉ剤の二重鎖領域の５’末端からの長さに従っても変化しうる。
ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、鎖の切断部位において、３つの連続ヌクレオチド上の、３つの同一な修飾のうちの、少なくとも１つのモチーフを含有する場合があり；アンチセンス鎖は、鎖の切断部位において、またはこの近傍において、３つの連続ヌクレオチド上の、３つの同一な修飾のうちの、少なくとも１つのモチーフを有しうる。センス鎖とアンチセンス鎖とが、ｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する場合、センス鎖およびアンチセンス鎖は、センス鎖上の３つのヌクレオチドによる１つのモチーフと、アンチセンス鎖上の３つのヌクレオチドによる１つのモチーフとが、少なくとも１つのヌクレオチドの重複を有する、すなわち、センス鎖内のモチーフの３つのヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、アンチセンス鎖内のモチーフの３つのヌクレオチドのうちの少なくとも１つと共に、塩基対を形成するようにアライメントされうる。代替的に、少なくとも２つのヌクレオチドが重複する場合もあり、３つのヌクレオチド全てが重複する場合もある。
一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、３つの連続ヌクレオチド上の、３つの同一な修飾による、１つを超えるモチーフを含有しうる。第１のモチーフは、鎖の切断部位において、またはこの近傍において存在する場合があり、他のモチーフは、ウィング修飾でありうる。本明細書における、「ウィング修飾」という用語は、同じ鎖の切断部位またはこの近傍におけるモチーフから隔てられた、鎖の別の部分において存在するモチーフを指す。ウィング修飾は、第１のモチーフに隣接するか、または少なくとも１つもしくは複数のヌクレオチドにより隔てられる。モチーフが、互いと直に隣接する場合、モチーフの化学的特性は、互いと顕著に異なり、モチーフが、１つまたは複数のヌクレオチドにより隔てられている場合（ｔｈａｎ）、化学的特性は、同じ場合もあり、異なる場合もある。２つまたはこれを超えるウィング修飾が存在しうる。例えば、２つのウィング修飾が存在する場合、各ウィング修飾は、切断部位もしくはこの近傍、またはリードモチーフのいずれかの側に存在する、第１のモチーフに対して、１つの末端において存在しうる。
センス鎖と同様に、ｄｓＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、３つの連続ヌクレオチド上の、３つの同一な修飾による、１つを超えるモチーフを含有する場合があり、モチーフのうちの少なくとも１つは、鎖の切断部位において、またはこの近傍において存在する。このアンチセンス鎖もまた、アライメントにおいて、センス鎖上に存在しうるウィング修飾と同様の、１つまたは複数のウィング修飾を含有しうる。
一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖上またはアンチセンス鎖上のウィング修飾は、典型的に、鎖の３’末端、５’末端、または両末端において、最初の１つまたは２つの末端ヌクレオチドを含まない。
他の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖上またはアンチセンス鎖上のウィング修飾は、典型的に、鎖の３’末端、５’末端、または両末端において、二重鎖領域内の、最初の１つまたは２つの対合ヌクレオチドを含まない。
ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖が、各々、少なくとも１つのウィング修飾を含有する場合、ウィング修飾は、二重鎖領域の同じ末端に位置する可能性があり、１つ、２つ、または３つのヌクレオチドの重複を有しうる。
ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖が、各々、少なくとも２つのウィング修飾を含有する場合、センス鎖およびアンチセンス鎖は、１つの鎖に由来する、２つずつの修飾が、二重鎖領域の一方の末端に位置し、１つ、２つ、または３つのヌクレオチドの重複を有し；１つの鎖に由来する、２つずつの修飾が、二重鎖領域の他方の末端に位置し、１つ、２つ、または３つのヌクレオチドの重複を有し；１つの鎖に由来する、２つずつの修飾は、リードモチーフの各側に位置し、二重鎖領域内に、１つ、２つ、または３つのヌクレオチドの重複を有するようにアライメントされうる。
一部の実施形態において、モチーフの一部であるヌクレオチドを含む、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖内およびアンチセンス鎖内のあらゆるヌクレオチドは、修飾されうる。各ヌクレオチドは、非連結型リン酸酸素の一方もしくは両方、または連結型リン酸酸素のうちの１つもしくは複数の、１つまたは複数の変更；リボース糖の構成要素、例えば、リボース糖上の、２’－ヒドロキシルの変更；リン酸部分の、「脱リン酸」リンカーによる全体的な置きかえ；天然に存在する塩基の修飾または置きかえ；およびリボース－リン酸骨格の置きかえまたは修飾を含みうる、同じ修飾または異なる修飾により修飾されうる。
核酸は、サブユニットのポリマーであるので、修飾の多く、例えば、塩基、またはリン酸部分、またはリン酸部分の非結合型Ｏの修飾は、核酸内において反復される位置において生じる。一部の場合に、修飾は、核酸内の対象位置の全てにおいて生じるであろうが、多くの場合には、そうでないであろう。例として述べると、修飾は、３’末端位または５’末端位だけにおいて生じる場合があり、末端領域内だけにおいて、例えば、末端ヌクレオチド上の位置において、または鎖の最後の２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは１０のヌクレオチドにおいて生じうる。修飾は、二重鎖領域、単鎖領域、またはこれらの両方において生じうる。修飾は、ＲＮＡの二重鎖領域だけにおいて生じる場合もあり、ＲＮＡの単鎖領域だけにおいて生じる場合もある。例えば、非結合型Ｏ位におけるホスホロチオエート修飾は、末端の一方または両方だけにおいて生じる場合もあり、末端領域内だけにおいて、例えば、末端ヌクレオチド上の位置において、または鎖の最後の２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは１０のヌクレオチドにおいて生じる場合もあり、二重鎖領域内および単鎖領域内において、特に、末端において生じる場合もある。５’末端または両末端は、リン酸化されうる。
例えば、安定性を増強するために、突出内に特定の塩基を含むか、または単鎖突出内、例えば、５’突出内もしくは３’突出内、またはこれらの両方に修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチドサロゲートを含むことが可能でありうる。例えば、突出内にプリンヌクレオチドを含むことが所望でありうる。一部の実施形態において、３’突出内または５’突出内の塩基の全部または一部は、例えば、本明細書において記載される修飾により修飾されうる。修飾は、例えば、当技術分野において公知の修飾を伴う、リボース糖の２’位における修飾の使用、例えば、ヌクレオ塩基内のリボ糖ではなく２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）または２’－Ｏ－メチル修飾されたデオキシリボヌクレオチドの使用、およびリン酸基内の修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾の使用を含みうる。突出は、標的配列と相同である必要がない。
一部の実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、独立に、ＬＮＡ、ＣＲＮ、ｃＥＴ、ＵＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシル、または２’－フルオロにより修飾される。鎖は、１つを超える修飾を含有しうる。一実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、独立に、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロにより修飾される。
少なくとも２つの異なる修飾は、典型的に、センス鎖上およびアンチセンス鎖上に存在する。これらの２つの修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾の場合もあり、２’－フルオロ修飾の場合もあり、他の修飾の場合もある。
ある特定の実施形態において、ＮａまたはＮｂは、交互パターンによる修飾を含む。本明細書において使用される、「交互モチーフ」という用語は、各修飾が、１つの鎖の交互ヌクレオチド上において存在する、１つまたは複数の修飾を有するモチーフを指す。交互ヌクレオチドとは、ヌクレオチド２つごとに１つ、もしくはヌクレオチド３つごとに１つ、または同様のパターンを指す場合がある。例えば、Ａ、Ｂ、およびＣが、各々、ヌクレオチドに対する修飾のうちの、１つ種類を表す場合、交互モチーフは、「ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ・・・」、「ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ・・・」、「ＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢ・・・」、「ＡＡＡＢＡＡＡＢＡＡＡＢ・・・」、「ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ・・・」、または「ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ・・・」などでありうる。
交互モチーフ内に含有される修飾の種類は、同じ場合もあり、異なる場合もある。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄが、各々、ヌクレオチド上の修飾のうちの、１つ種類を表す場合、交互パターン、すなわち、ヌクレオチド１つおきのヌクレオチド上の修飾は、同じでありうるが、センス鎖またはアンチセンス鎖の各々は、「ＡＢＡＢＡＢ・・・」、「ＡＣＡＣＡＣ・・・」、「ＢＤＢＤＢＤ・・・」、または「ＣＤＣＤＣＤ・・・」など、交互モチーフ内の修飾のいくつかの可能性から選択されうる。
一部の実施形態において、ｄｓ本発明のＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖上の交互モチーフのための修飾パターンと比べてシフトした、センス鎖上の交互モチーフのための修飾パターンを含む。シフトは、センス鎖の修飾ヌクレオチド群が、アンチセンス鎖の異なる修飾ヌクレオチド群に対応し、この逆も成り立つようなシフトでありうる。例えば、センス鎖が、ｄｓＲＮＡ二重鎖内のアンチセンス鎖と対合する場合、二重鎖領域内において、センス鎖内の交互モチーフは、鎖の５’から３’へと、「ＡＢＡＢＡＢ」により始まる場合があり、アンチセンス鎖内の交互モチーフは、鎖の５’から３’へと、「ＢＡＢＡＢＡ」により始まる場合がある。別の例として述べると、センス鎖と、アンチセンス鎖との間において、修飾パターンの、完全なシフトまたは部分的なシフトがなされるように、二重鎖領域内において、センス鎖内の交互モチーフは、鎖の５’から３’へと、「ＡＡＢＢＡＡＢＢ」により始まる場合があり、アンチセンス鎖内の交互モチーフは、鎖の５’から３’へと、「ＢＢＡＡＢＢＡＡ」により始まる場合がある。
一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、初期における、アンチセンス鎖上の、２’－Ｏ－メチル修飾と、２’－Ｆ修飾との交互モチーフパターンと比べて、シフトを有する、初期における、センス鎖上の、２’－Ｏ－メチル修飾と、２’－Ｆ修飾との交互モチーフパターンを含む、すなわち、センス鎖上の２’－Ｏ－修飾ヌクレオチドは、アンチセンス鎖上の２’－Ｆ修飾ヌクレオチドと塩基対合し、この逆も成り立つ。センス鎖の１位は、２’－Ｆ修飾により始まる場合があり、アンチセンス鎖の１位は、２’－Ｏ－メチル修飾により始まる場合がある。
３つの連続ヌクレオチド上の、３つの同一な修飾による、１つまたは複数のモチーフの、センス鎖またはアンチセンス鎖への導入は、センス鎖内またはアンチセンス鎖内に存在する、初期の修飾パターンを中断する。３つの連続ヌクレオチド上の、３つの同一な修飾による、１つまたは複数のモチーフを、センス鎖またはアンチセンス鎖へと導入することによる、センス鎖またはアンチセンス鎖の修飾パターンに対する、この中断は、標的遺伝子に対する遺伝子サイレンシング活性を増強しうる。
一部の実施形態において、３つの連続ヌクレオチド上の、３つの同一な修飾によるモチーフが、鎖のうちのいずれかへと導入される場合、モチーフに隣接するヌクレオチドの修飾は、モチーフの修飾と異なる修飾である。例えば、モチーフを含有する配列の一部は、「・・・ＮａＹＹＹＮｂ・・・」［配列中、「Ｙ」は、３つの連続ヌクレオチド上の、３つの同一な修飾によるモチーフの修飾を表し、「Ｎａ」および「Ｎｂ」は、モチーフ「ＹＹＹ」に隣接するヌクレオチドに対する修飾であって、Ｙの修飾と異なる修飾を表し、この場合、ＮａおよびＮｂは、同じ修飾の場合もあり、異なる修飾の場合もある］である。代替的に、ウィング修飾が存在する場合、ＮａまたはＮｂは、存在する場合もあり、存在しない場合もある。
ｉＲＮＡは、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結をさらに含みうる。ホスホロチオエートヌクレオチド間連結またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結による修飾は、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の、鎖の任意の位置の、任意のヌクレオチドにおいて生じうる。例えば、ヌクレオチド間連結による修飾は、センス鎖上またはアンチセンス鎖上の、あらゆるヌクレオチドにおいて生じる場合もあり；各ヌクレオチド間連結による修飾は、センス鎖上またはアンチセンス鎖上の交互パターンにおいて生じる場合もあり；センス鎖またはアンチセンス鎖が、両方のヌクレオチド間連結による修飾を、交互パターンにおいて含有する場合もある。センス鎖上の、ヌクレオチド間連結による修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同じ場合もあり、異なる場合もあり、センス鎖上の、ヌクレオチド間連結による修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上の、ヌクレオチド間連結による修飾の交互パターンと比べて、シフトを有しうる。一実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、６つ～８つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、５’末端における、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結、および３’末端における、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、センス鎖は、５’末端または３’末端における、少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。
一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、突出領域内に、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結による修飾を含む。例えば、突出領域は、２つのヌクレオチドの間に、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結を有する、２つのヌクレオチドを含有しうる。ヌクレオチド間連結による修飾はまた、突出ヌクレオチドを、二重鎖領域内の、末端の対合ヌクレオチドと連結するようにもなされうる。例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、または全ての突出ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結を介して連結されうるが、突出ヌクレオチドを、突出ヌクレオチドに隣接する、対合ヌクレオチドと連結する、さらなるホスホロチオエートヌクレオチド間連結またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結がなされてもよい。例えば、末端の３つのヌクレオチドの間に、少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結が存在する場合があり、この場合、３つのヌクレオチドのうちの２つは、突出ヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドは、突出ヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。これらの末端における３つのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端にある場合もあり、センス鎖の３’末端にある場合もあり、アンチセンス鎖の５’末端にある場合もあり、アンチセンス鎖の５’末端にある場合もある。
一部の実施形態において、２ヌクレオチドの突出は、アンチセンス鎖の３’末端にあり、末端の３つのヌクレオチドの間に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結が存在するが、この場合、３つのヌクレオチドのうちの２つは、突出ヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドは、突出ヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。加えて、ｄｓＲＮＡｉ剤は、末端の３つのヌクレオチドの間に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を、センス鎖の５’末端、およびアンチセンス鎖の５’末端の両方において有してもよい。
一実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、二重鎖内の標的とのミスマッチ（複数可）、またはこれらの組合せを含む。ミスマッチは、突出領域内において生じる場合もあり、二重鎖領域内において生じる場合もある。塩基対は、解離または融解を促進する、それらの傾向に基づきランク付けされうる［例えば、特定の対合の会合または解離の自由エネルギーについて、最も簡単な手法は、個々の対塩基における対について検討することであるが、最近接塩基対法（ｎｅｘｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ）または同様の解析もまた、使用されうる］。解離の促進に関して：Ａ：Ｕは、Ｇ：Ｃより好ましく；Ｇ：Ｕは、Ｇ：Ｃより好ましく；Ｉ：Ｃは、Ｇ：Ｃ（Ｉ＝イノシン）より好ましい。ミスマッチ、例えば、非カノニカルまたはカノニカル以外の対合（本明細書の別の箇所において記載される）は、カノニカル（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）の対合より好ましく；ユニバーサル塩基を含む対合は、カノニカルの対合より好ましい。
ある特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、独立に、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃ、およびミスマッチ対、例えば、非カノニカルの対合もしくはカノニカルの対合以外の対合、または二重鎖の５’末端における、アンチセンス鎖の解離を促進するように、ユニバーサル塩基を含む対合の群から選択される、アンチセンス鎖の５’末端の二重鎖領域内の、最初の１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの塩基対のうちの少なくとも１つを含む。
ある特定の実施形態において、アンチセンス鎖の５’末端の二重鎖領域内の、１位におけるヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、Ｕ、およびｄＴから選択される。代替的に、アンチセンス鎖の５’末端の二重鎖領域内の、最初の１つ、２つ、または３つの塩基対のうちの少なくとも１つは、ＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の５’末端の二重鎖領域内の、最初の塩基対は、ＡＵ塩基対である。
他の実施形態において、センス鎖の３’末端におけるヌクレオチドが、デオキシチミン（ｄＴ）であるか、またはアンチセンス鎖の３’末端におけるヌクレオチドが、デオキシチミン（ｄＴ）である。例えば、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の３’末端において、デオキシチミンヌクレオチドの短い配列、例えば、２つのｄＴヌクレオチドが存在する。
ある特定の実施形態において、センス鎖配列は、式（Ｉ）：
５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉ）
［式中：
ｉおよびｊは、各々、独立に、０または１であり；
ｐおよびｑは、各々、独立に、０～６であり；
各Ｎａは、独立に、０～２５の修飾ヌクレオチドを含み、各配列が、少なくとも２つの、修飾が異なるヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各Ｎｂは、独立に、０～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐおよび各ｎｑは、独立に、突出ヌクレオチドを表し；
ここで、ＮｂとＹとは、同じ修飾を有さず；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、およびＺＺＺは、各々、独立に、３つの連続ヌクレオチド上の、３つの同一な修飾による、１つのモチーフを表す。好ましくは、ＹＹＹは、全て、２’－Ｆ修飾ヌクレオチドである］
により表されうる。
一部の実施形態において、ＮａまたはＮｂは、交互パターンによる修飾を含む。
一部の実施形態において、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位において、またはこの近傍において存在する。例えば、ｄｓＲＮＡｉ剤が、１７～２３ヌクレオチドの長さの二重鎖領域を有する場合、ＹＹＹモチーフは、５’末端の、最初のヌクレオチドからのカウントにより；または５’末端の二重鎖領域内の、最初の対合ヌクレオチドにおけるカウントによってもよい、センス鎖の、切断部位（例えば、６、７、８；７、８、９；８、９、１０；９、１０、１１；１０、１１、１２；または１１、１２、１３位において存在しうる）において、またはこの近傍において存在しうる。
一実施形態において、ｉは、１であり、ｊは、０であるか、またはｉは、０であり、ｊは、１であるか、またはｉおよびｊのいずれも、１である。したがって、センス鎖は、以下の式：
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉｂ）；
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉｃ）；または
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉｄ）
により表されうる。
センス鎖が、式（Ｉｂ）により表される場合、Ｎｂは、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立に、２つ～２０、２つ～１５、または２つ～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表しうる。
センス鎖が、式（Ｉｃ）として表される場合、Ｎｂは、０～１０、０～７つ、０～１０、０～７つ、０～５つ、０～４つ、０～２つ、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立に、２つ～２０、２つ～１５、または２つ～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表しうる。
センス鎖が、式（Ｉｄ）として表される場合、各Ｎｂは、独立に、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５、または６である。各Ｎａは、独立に、２つ～２０、２つ～１５、または２つ～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表しうる。
Ｘ、Ｙ、およびＺの各々は、互いと同じ場合もあり、異なる場合もある。
他の実施形態において、ｉは、０であり、ｊは、０であり、センス鎖は、式：
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉａ）
により表されうる。
センス鎖が、式（Ｉａ）により表される場合、各Ｎａは、独立に、２つ～２０、２つ～１５、または２つ～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表しうる。
一実施形態において、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖配列は、式（ＩＩ）：
５’ｎｑ’－Ｎａ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｌ－Ｎ’ａ－ｎｐ’３’（ＩＩ）
［式中：
ｋおよびｌは、各々、独立に、０または１であり；
ｐ’およびｑ’は、各々、独立に、０～６であり；
各Ｎａ’は、独立に、０～２５の修飾ヌクレオチドを含み、各配列が、少なくとも２つの、修飾が異なるヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各Ｎｂ’は、独立に、０～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ’および各ｎｑ’は、独立に、突出ヌクレオチドを表し；
ここで、Ｎｂ’とＹ’とは、同じ修飾を有さず；
Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々、独立に、３つの連続ヌクレオチド上の、３つの同一な修飾による、１つのモチーフを表す］
により表されうる。
一部の実施形態において、Ｎａ’またはＮｂ’は、交互パターンによる修飾を含む。
Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の切断部位において、またはこの近傍において存在する。例えば、ｄｓＲＮＡｉ剤が、１７～２３ヌクレオチドの長さの二重鎖領域を有する場合、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、５’末端の、最初のヌクレオチドからのカウントにより；または５’末端の二重鎖領域内の、最初の対合ヌクレオチドにおけるカウントによってもよい、アンチセンス鎖の、９、１０、１１；１０、１１、１２；１１、１２、１３；１２、１３、１４；または１３、１４、１５位において存在しうる。好ましくは、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、１１、１２、１３位において存在する。
ある特定の実施形態において、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、全て、２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチドである。
ある特定の実施形態において、ｋは、１であり、ｌは、０であるか、またはｋは、０であり、ｌは、１であるか、またはｋおよびｌのいずれも、１である。
したがって、アンチセンス鎖は、以下の式：
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｐ’３’（ＩＩｂ）；
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－ｎｐ’３’（ＩＩｃ）；または
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎａ’－ｎｐ’３’（ＩＩｄ）
により表されうる。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｂ）により表される場合、Ｎｂ’は、０～１０、０～７つ、０～１０、０～７つ、０～５つ、０～４つ、０～２つ、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立に、２つ～２０、２つ～１５、または２つ～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｃ）として表される場合、Ｎｂ’は、０～１０、０～７つ、０～１０、０～７つ、０～５つ、０～４つ、０～２つ、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立に、２つ～２０、２つ～１５、または２つ～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｄ）として表される場合、各Ｎｂ’は、独立に、０～１０、０～７つ、０～１０、０～７つ、０～５つ、０～４つ、０～２つ、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立に、２つ～２０、２つ～１５、または２つ～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５、または６である。
他の実施形態において、ｋは、０であり、ｌは、０であり、アンチセンス鎖は、式：
５’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’３’（Ｉａ）
により表されうる。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩａ）として表される場合、各Ｎａ’は、独立に、２つ～２０、２つ～１５、または２つ～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。Ｘ’、Ｙ’、およびＺ’の各々は、互いと同じ場合もあり、異なる場合もある。
センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立に、ＬＮＡ、ＣＲＮ、ＵＮＡ、ｃＥｔ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－ヒドロキシル、または２’－フルオロにより修飾されうる。例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立に、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロにより修飾される。各Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｘ’、Ｙ’、およびＺ’は、特に、２’－Ｏ－メチル修飾を表す場合もあり、２’－フルオロ修飾を表す場合もある。
一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、二重鎖領域が、２１ｎｔである場合に、５’末端の、最初のヌクレオチドからのカウントにより、または５’末端の二重鎖領域内の、最初の対合ヌクレオチドにおけるカウントによってもよい鎖の９、１０、および１１位において存在するＹＹＹモチーフを含有する場合があり；Ｙは、２’－Ｆ修飾を表す。センス鎖は、加えて、二重鎖領域の反対端において、ウィング修飾としての、ＸＸＸモチーフまたはＺＺＺモチーフを含有する場合もあり；ＸＸＸおよびＺＺＺは、各々、独立に、２’－ＯＭｅ修飾または２’－Ｆ修飾を表す。
一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、５’末端の、最初のヌクレオチドからのカウントにより、または５’末端の二重鎖領域内の、最初の対合ヌクレオチドにおけるカウントによってもよい鎖の１１、１２、１３位において存在するＹ’Ｙ’Ｙ’モチーフを含有する場合があり；Ｙ’は、２’－Ｏ－メチル修飾を表す。アンチセンス鎖は、加えて、二重鎖領域の反対端において、ウィング修飾としての、Ｘ’Ｘ’Ｘ’モチーフまたはＺ’Ｚ’Ｚ’モチーフを含有する場合もあり；Ｘ’Ｘ’Ｘ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々、独立に、２’－ＯＭｅ修飾または２’－Ｆ修飾を表す。
上記の式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、および（Ｉｄ）のうちのいずれか１つにより表されるセンス鎖は、それぞれ、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、および（ＩＩｄ）のうちのいずれか１つにより表されるアンチセンス鎖と共に、二重鎖を形成する。
したがって、本発明の方法における使用のためのｄｓＲＮＡｉ剤は、各鎖が、１４～３０ヌクレオチドを有する、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むことが可能であり、ｉＲＮＡ二重鎖は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’
（ＩＩＩ）
［式中：
ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、各々、独立に、０または１であり；
ｐ、ｐ’、ｑ、およびｑ’は、各々、独立に、０～６であり；
各Ｎａおよび各Ｎａ’は、独立に、０～２５の修飾ヌクレオチドを含み、各配列が、少なくとも２つの、修飾が異なるヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各Ｎｂおよび各Ｎｂ’は、独立に、０～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
ここで、それらの各々が存在する場合もあり、存在しない場合もある、各ｎｐ’、ｎｐ、ｎｑ’、およびｎｑは、独立に、突出ヌクレオチドを表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、各々、独立に、３つの連続ヌクレオチド上の、３つの同一な修飾による、１つのモチーフを表す］
により表されうる。
一実施形態において、ｉは、０であり、ｊは、０であるか；またはｉは、１であり、ｊは、０であるか；またはｉは、０であり、ｊは、１であるか；またはｉおよびｊのいずれも、０であるか；ｉおよびｊのいずれも、１である。別の実施形態において、ｋは、０であり、ｌは、０であるか；またはｋは、１であり、ｌは、０であり；ｋは、０であり、ｌは、１であるか；またはｋおよびｌのいずれも、０であるか；ｋおよびｌのいずれも、１である。
ｉＲＮＡ二重鎖を形成する、センス鎖と、アンチセンス鎖との例示的組合せは、下記の式：
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’ｎｑ’５’
（ＩＩＩａ）
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ’ｎｑ’５’
（ＩＩＩｂ）
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’
（ＩＩＩｃ）
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ－ｎｑ’５’
（ＩＩＩｄ）
を含む。
ｄｓＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩａ）により表される場合、各Ｎａは、独立に、２つ～２０、２つ～１５、または２つ～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ｄｓＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｂ）により表される場合、各Ｎｂは、独立に、１～１０、１～７、１～５、または１～４の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立に、２つ～２０、２つ～１５、または２つ～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ｄｓＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｃ）として表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’は、独立に、０～１０、０～７つ、０～１０、０～７つ、０～５つ、０～４つ、０～２つ、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立に、２つ～２０、２つ～１５、または２つ～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ｄｓＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）として表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’は、独立に、０～１０、０～７つ、０～１０、０～７つ、０～５つ、０～４つ、０～２つ、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ、Ｎａ’は、独立に、２つ～２０、２つ～１５、または２つ～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。Ｎａ、Ｎａ’、Ｎｂ、およびＮｂ’の各々は、独立に、交互パターンによる修飾を含む。
式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）における、Ｘ、Ｙ、およびＺの各々は、互いと同じ場合もあり、異なる場合もある。
ｄｓＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）により表される場合、Ｙヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、Ｙ’ヌクレオチドのうちの１つと共に、塩基対を形成しうる。代替的に、Ｙヌクレオチドのうちの少なくとも２つは、対応するＹ’ヌクレオチドと共に、塩基対を形成するか；またはＹヌクレオチドの３つ全ては、全て、対応するＹ’ヌクレオチドと共に、塩基対を形成する。
ｄｓＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｂ）または（ＩＩＩｄ）により表される場合、Ｚヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、Ｚ’ヌクレオチドのうちの１つと共に、塩基対を形成しうる。代替的に、Ｚヌクレオチドのうちの少なくとも２つは、対応するＺ’ヌクレオチドと共に、塩基対を形成するか；またはＺヌクレオチドの３つ全ては、全て、対応するＺ’ヌクレオチドと共に、塩基対を形成する。
ｄｓＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｃ）または（ＩＩＩｄ）として表される場合、Ｘヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、Ｘ’ヌクレオチドのうちの１つと共に、塩基対を形成しうる。代替的に、Ｘヌクレオチドのうちの少なくとも２つは、対応するＸ’ヌクレオチドと共に、塩基対を形成するか；またはＸヌクレオチドの３つ全ては、全て、対応するＸ’ヌクレオチドと共に、塩基対を形成する。
ある特定の実施形態において、Ｙヌクレオチド上の修飾は、Ｙ’ヌクレオチド上の修飾と異なるか、Ｚヌクレオチド上の修飾は、Ｚ’ヌクレオチド上の修飾と異なるか、またはＸヌクレオチド上の修飾は、Ｘ’ヌクレオチド上の修飾と異なる。
ある特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）により表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾である。他の実施形態において、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）により表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート連結を介して、隣接ヌクレオチドと連結される。さらに他の実施形態において、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）により表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート連結を介して、隣接ヌクレオチドと連結され、センス鎖は、二価または三価の分枝状リンカー（下記に記載される）を介して接合されている１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体とコンジュゲートされている。他の実施形態において、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）により表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート連結を介して、隣接ヌクレオチドと連結され、センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含み、センス鎖は、二価または三価の分枝状リンカーを介して接合されている１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体とコンジュゲートされている。
一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩａ）により表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート連結を介して、隣接ヌクレオチドと連結され、センス鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含み、センス鎖は、二価または三価の分枝状リンカーを介して接合されている１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体とコンジュゲートされている。
一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）により表される少なくとも２つの二重鎖を含有する多量体であり、この場合、二重鎖は、リンカーにより接続される。リンカーは、切断型の場合もあり、切断型でない場合もある。多量体は、リガンドをさらに含んでもよい。二重鎖の各々は、同じ遺伝子をターゲティングする場合もあり、２つの異なる遺伝子をターゲティングする場合もあり；二重鎖の各々は、２つの異なる標的部位における、同じ遺伝子をターゲティングする場合もある。
一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）により表される３つ、４つ、５つ、６つ、またはこれを超える二重鎖を含有する多量体であり、この場合、二重鎖は、リンカーにより接続される。リンカーは、切断型の場合もあり、切断型でない場合もある。多量体は、リガンドをさらに含んでもよい。二重鎖の各々は、同じ遺伝子をターゲティングする場合もあり、２つの異なる遺伝子をターゲティングする場合もあり；二重鎖の各々は、２つの異なる標的部位における、同じ遺伝子をターゲティングする場合もある。
一実施形態において、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）のうちの少なくとも１つにより表される、２つのｄｓＲＮＡｉ剤は、５’末端、および３’末端の一方または両方において、互いと連結され、リガンドとコンジュゲートされてもよい。薬剤の各々は、同じ遺伝子をターゲティングする場合もあり、２つの異なる遺伝子をターゲティングする場合もあり；薬剤の各々は、２つの異なる標的部位における、同じ遺伝子をターゲティングする場合もある。
ある特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、２’－フルオロ修飾を含有する、少数のヌクレオチド、例えば、２’－フルオロ修飾を含有する、１０以下のヌクレオチドを含有しうる。例えば、ＲＮＡｉ剤は、２’－フルオロ修飾を伴う、１０、９つ、８つ、７つ、６つ、５つ、４つ、３つ、２つ、１つ、または０のヌクレオチドを含有しうる。具体的な実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、２’－フルオロ修飾を伴う、１０のヌクレオチド、例えば、センス鎖内の、２’－フルオロ修飾を伴う、４つのヌクレオチド、およびアンチセンス鎖内の、２’－フルオロ修飾を伴う、６つのヌクレオチドを含有する。別の具体的実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、センス鎖内の、２’－フルオロ修飾を伴う、６つのヌクレオチド、例えば、２’－フルオロ修飾を伴う、４つのヌクレオチド、およびアンチセンス鎖内の、２’－フルオロ修飾を伴う、２つのヌクレオチドを含有する。
他の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、２’－フルオロ修飾を含有する、極少数のヌクレオチド、例えば、２’－フルオロ修飾を含有する、２つ以下のヌクレオチドを含有しうる。例えば、ＲＮＡｉ剤は、２’－フルオロ修飾を伴う、２つ、１つ、または０のヌクレオチドを含有しうる。具体的な実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、２’－フルオロ修飾を伴う、２つのヌクレオチド、例えば、センス鎖内の、２－フルオロ（２－ｆｌｕｏｒｏ）修飾を伴う、０のヌクレオチド、およびアンチセンス鎖内の、２’－フルオロ修飾を伴う、２つのヌクレオチドを含有しうる。
多様な公報が、本発明の方法において使用されうる多量体ｉＲＮＡについて記載している。このような公報は、それらの各々の全内容が、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００７／０９１２６９、米国特許第７，８５８，７６９号、ＷＯ２０１０／１４１５１１、ＷＯ２００７／１１７６８６、ＷＯ２００９／０１４８８７、およびＷＯ２０１１／０３１５２０
を含む。
ある特定の実施形態において、本開示の組成物および方法は、本明細書において記載されるＲＮＡｉ剤のビニルホスホネート（ＶＰ）修飾を含む。例示的実施形態において、本開示のビニルホスホネートは、以下の構造：
Figure 2023506258000003
 を有する。本開示のビニルホスホネートは、本開示のｄｓＲＮＡアンチセンス鎖またはセンス鎖へと接合されていてもよい。ある特定の好ましい実施形態において、本開示のビニルホスホネートは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖へと接合され、これはｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端における接合であってもよい。
ビニルホスフェート修飾もまた、本開示の組成物および方法のために想定される。例示的ビニルホスフェート構造は、
Figure 2023506258000004
 である。
下記においてより詳細に記載される通り、１つまたは複数の炭水化物部分の、ｉＲＮＡへのコンジュゲーションを含有するｉＲＮＡは、ｉＲＮＡの１つまたは複数の特性を最適化しうる。多くの場合において、炭水化物部分は、ｉＲＮＡの修飾サブユニットへと接合されるであろう。例えば、ｉＲＮＡの、１つまたは複数のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖は、別の部分、例えば、炭水化物リガンドが接合された、非炭水化物（好ましくは、環状）担体により置きかえられうる。本明細書において、サブユニットのリボース糖が、このように置きかえられたリボヌクレオチドサブユニットは、リボース置換修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）と称される。環状担体は、炭素環式環系の場合もあり、すなわち、全ての環原子が炭素原子の場合もあり、複素環式環系の場合もある、すなわち、１つまたは複数の環原子が、ヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、硫黄の場合もある。環状担体は、単環式環系の場合もあり、２つまたはこれを超える環、例えば、融合環を含有する場合もある。環状担体は、完全飽和環系の場合もあり、１つまたは複数の二重結合を含有する場合もある。
リガンドは、担体を介して、ポリヌクレオチドへと接合されていてもよい。担体は、（ｉ）少なくとも１つの「骨格接合点」、好ましくは、２つの「骨格接合点」、および（ｉｉ）少なくとも１つの「テザリング接合点」を含む。本明細書において使用される、「骨格接合点」とは、官能基、例えば、ヒドロキシル基、または、一般に、担体の、リボ核酸の骨格、例えば、リン酸骨格、または修飾リン酸骨格、例えば、硫黄含有骨格への組込みに利用可能であり、これに適する結合を指す。一部の実施形態において、「テザリング接合点」（ＴＡＰ）とは、選択部分を接続する、環状担体の構成要素である環原子、例えば、炭素原子またはヘテロ原子（骨格接合点をもたらす原子と顕著に異なる原子）を指す。部分は、例えば、炭水化物、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、または多糖でありうる。選択部分は、テザーを、環状担体へと介在させることにより接続されてもよい。したがって、環状担体は、官能基、例えば、アミノ基を含むか、または一般に、別の化学的実体、例えば、リガンドの、構成要素である環への組込みまたはテザリングに適する結合をもたらすことが多いであろう。
ｉＲＮＡは、担体を介して、リガンドへとコンジュゲートされていてもよく、この場合、担体は、環状基の場合もあり、非環状基の場合もあり；好ましくは、環状基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフラニル、およびデカリンから選択され；好ましくは、非環状基は、セリノール骨格またはジエタノールアミン骨格である。
ｉ．熱不安定性修飾
ある特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子は、オフターゲットの遺伝子サイレンシングを低減または阻害するように、アンチセンス鎖のシード領域（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２～９位における）内に熱不安定性修飾を組み込むことにより、ＲＮＡ干渉について最適化されうる。アンチセンス鎖の５’末端からカウントして、最初の９ヌクレオチドの位置の範囲内に、二重鎖の、少なくとも１つの熱不安定性修飾を含むアンチセンス鎖を伴うｄｓＲＮＡは、オフターゲットの遺伝子サイレンシング活性を低減していることが発見されている。したがって、一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’領域の、最初の９ヌクレオチドの位置の範囲内に、二重鎖の、少なくとも１つの（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはこれを超える）熱不安定性修飾を含む。一部の実施形態において、二重鎖の、１つまたは複数の熱不安定性修飾（複数可）は、アンチセンス鎖の５’末端から、２～９位、または、好ましくは、４～８位内に配置される。一部のさらなる実施形態において、二重鎖の熱不安定性修飾（複数可）は、アンチセンス鎖の５’末端から、６、７、または８位に配置される。一部のなおさらなる実施形態において、二重鎖の熱不安定性修飾は、アンチセンス鎖の５’末端の７位に配置される。「熱不安定性修飾（複数可）」という用語は、全体的な融解温度（Ｔｍ）を低下させたｄｓＲＮＡ［好ましくは、このような修飾を有さないｄｓＲＮＡのＴｍより、１、２、３、または４度低いＴｍを結果としてもたらす修飾（複数可）を含む。一部の実施形態において、二重鎖の熱不安定性修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から、２、３、４、５、または９位に配置される。
ｉＲＮＡ剤は、各鎖が、１４～４０ヌクレオチドを有する、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。ＲＮＡｉ剤は、式（Ｌ）：
Figure 2023506258000005
 ［式（Ｌ）中、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’は、各々、独立に、２’－Ｏ－アルキル、２’－置換アルコキシ、２’－置換アルキル、２’－ハロ、ＥＮＡ、およびＢＮＡ／ＬＮＡからなる群から選択される修飾を含有するヌクレオチドである。一実施形態において、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’は、各々、２’－ＯＭｅ修飾を含有する。一実施形態において、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’は、各々、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆ修飾を含有する。一実施形態において、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、およびＢ４’のうちの少なくとも１つは、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾を含有する］
により表されうる。
Ｃ１は、アンチセンス鎖のシード領域（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２～８位における）と向かい合う部位に配置された、熱不安定性ヌクレオチドである。例えば、Ｃ１は、アンチセンス鎖の５’末端の２～８位におけるヌクレオチドと対合する、センス鎖の位置にある。一例において、Ｃ１は、センス鎖の５’末端の１５位にある。Ｃ１ヌクレオチドは、脱塩基性修飾を含みうる、熱不安定性修飾；二重鎖内の対向ヌクレオチドとのミスマッチ；および２’－デオキシ修飾などの糖修飾、または非環状ヌクレオチド、例えば、アンロック核酸（ＵＮＡ）もしくはグリセロール核酸（ＧＮＡ）を保有する。一実施形態において、Ｃ１は、ｉ）アンチセンス鎖内の対向ヌクレオチドとのミスマッチ；ｉｉ）
Figure 2023506258000006
 からなる群から選択される、脱塩基性修飾；およびｉｉｉ）
Figure 2023506258000007
 、および
Figure 2023506258000008
 ［式中、Ｂは、修飾ヌクレオ塩基または非修飾ヌクレオ塩基であり、Ｒ１およびＲ２は、独立に、Ｈ、ハロゲン、ＯＲ３、またはアルキルであり；Ｒ３は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖である］
からなる群から選択される糖修飾からなる群から選択される、熱不安定性修飾を有する。一実施形態において、Ｃ１内の熱不安定性修飾は、Ｇ：Ｇ、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕ、Ｇ：Ｔ、Ａ：Ａ、Ａ：Ｃ、Ｃ：Ｃ、Ｃ：Ｕ、Ｃ：Ｔ、Ｕ：Ｕ、Ｔ：Ｔ、およびＵ：Ｔからなる群から選択されるミスマッチであり；ミスマッチ対内の、少なくとも１つのヌクレオ塩基は、２’－デオキシヌクレオ塩基であってもよい。一例において、Ｃ１内の熱不安定性修飾は、ＧＮＡまたは
Figure 2023506258000009
 である。
Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、およびＴ３は、各々、独立に、２’－ＯＭｅ修飾の立体的嵩高さ以下の立体的嵩高さをヌクレオチドにもたらす修飾を含むヌクレオチドを表す。立体的嵩高さとは、修飾の立体効果の合計を指す。当業者には、ヌクレオチドの修飾の立体効果を決定するための方法が公知である。修飾は、ヌクレオチドのリボース糖の２’位における修飾の場合もあり、非リボースヌクレオチド、非環状ヌクレオチド、またはヌクレオチドの骨格への修飾であって、リボース糖の２’位への修飾と同様または同等の修飾の場合もあり、２’－ＯＭｅ修飾の立体的嵩高さ以下の立体的嵩高さをヌクレオチドにもたらす。例えば、Ｔ１、Ｔ１’、Ｔ２’、およびＴ３’は、各々、独立に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、２’－Ｆ、および２’－Ｆ－５’－メチルから選択される。一実施形態において、Ｔ１は、ＤＮＡである。一実施形態において、Ｔ１’は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＬＮＡである。一実施形態において、Ｔ２’は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。一実施形態において、Ｔ３’は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。
ｎ１、ｎ３、およびｑ１は、独立に、４～１５ヌクレオチドの長さである。
ｎ５、ｑ３、およびｑ７は、独立に、１～６ヌクレオチド（複数可）の長さである。
ｎ４、ｑ２、およびｑ６は、独立に、１～３ヌクレオチド（複数可）の長さであり；代替的に、ｎ４は、０である。
ｑ５は、独立に、０～１０ヌクレオチド（複数可）の長さである。
ｎ２およびｑ４は、独立に、０～３ヌクレオチド（複数可）の長さである。
代替的に、ｎ４は、０～３ヌクレオチドの長さである。
一実施形態において、ｎ４は、０でありうる。一例において、ｎ４は、０であり、ｑ２およびｑ６は、１である。別の例において、ｎ４は、０であり、ｑ２およびｑ６は、１であり、センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。
一実施形態において、ｎ４、ｑ２、およびｑ６は、各々、１である。
一実施形態において、ｎ２、ｎ４、ｑ２、ｑ４、およびｑ６は、各々、１である。
一実施形態において、Ｃ１は、センス鎖が、１９～２２ヌクレオチドの長さである場合、センス鎖の５’末端の１４～１７位にあり、ｎ４は、１である。一実施形態において、Ｃ１は、センス鎖の５’末端の１５位にある。
一実施形態において、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端の２位に始まる。一例において、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端の２位にあり、ｑ６は、１に等しい。
一実施形態において、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端の１４位に始まる。一例において、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端の１４位にあり、ｑ２は、１に等しい。
例示的実施形態において、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端の２位からから始まり、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端の１４位から始まる。一例において、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端の２位から始まり、ｑ６は、１に等しく、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端の１４位から始まり、ｑ２は、１に等しい。
一実施形態において、Ｔ１’と、Ｔ３’とは、１１ヌクレオチドの長さ（すなわち、Ｔ１’ヌクレオチドおよびＴ３’ヌクレオチドをカウントしない）で隔てられている。
一実施形態において、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端の１４位にある。一例において、Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端の１４位にあり、ｑ２は、１に等しく、２’位、または非リボース、非環状もしくは骨格における位置における修飾は、２’－ＯＭｅリボース未満の立体的嵩高さをもたらす。
一実施形態において、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端の２位にある。一例において、Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端の２位にあり、ｑ６は、１に等しく、２’位、または非リボース、非環状もしくは骨格における位置における修飾は、２’－ＯＭｅリボース以下の立体的嵩高さをもたらす。
一実施形態において、Ｔ１は、センス鎖の切断部位にある。一例において、Ｔ１は、センス鎖が、１９～２２ヌクレオチドの長さである場合に、センス鎖の５’末端の１１位にあり、ｎ２は、１である。例示的実施形態において、Ｔ１は、センス鎖が、１９～２２ヌクレオチドの長さである場合に、センス鎖の５’末端の１１位における、センス鎖の切断部位にあり、ｎ２は、１である。
一実施形態において、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端の６位に始まる。一例において、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端の６～１０位にあり、ｑ４は、１である。
例示的実施形態において、Ｔ１は、センス鎖が、１９～２２ヌクレオチドの長さである場合に、センス鎖の切断部位、例えば、センス鎖の５’末端の１１位にあり、ｎ２は、１であり；Ｔ１’は、アンチセンス鎖の５’末端の１４位にあり、ｑ２は、１に等しく、Ｔ１’への修飾は、リボース糖の２’位、または非リボース、非環状もしくは骨格における位置にあり、２’－ＯＭｅリボースほど立体的に嵩が高くなく；Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端の６～１０位にあり、ｑ４は、１であり；Ｔ３’は、アンチセンス鎖の５’末端の２位にあり、ｑ６は、１に等しく、Ｔ３’への修飾は、２’位、または非リボース、非環状もしくは骨格における位置にあり、２’－ＯＭｅリボース以下の立体的嵩高さをもたらす。
一実施形態において、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端の８位に始まる。一例において、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端の８位に始まり、ｑ４は、２である。
一実施形態において、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端の９位に始まる。一例において、Ｔ２’は、アンチセンス鎖の５’末端の９位にあり、ｑ４は、１である。
一実施形態において、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、１であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、６であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。
一実施形態において、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、１であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、６であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１である。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、６であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、７であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１である。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、６であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、７であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、１であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、６であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１である。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、１であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、６であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、５であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、１であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１であり；アンチセンス鎖の３’末端において、少なくとも２つのさらなるＴＴを伴ってもよい。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、５であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、１であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１であり；アンチセンス鎖の３’末端において、少なくとも２つのさらなるＴＴを伴ってもよく；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１である。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（５’末端からカウントする）内の、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（５’末端からカウントする）内の、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１である。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１である。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。
ＲＮＡｉ剤は、センス鎖またはアンチセンス鎖の５’末端において、リン含有基を含みうる。５’末端のリン含有基は、５’末端のリン酸（５’－Ｐ）、５’末端のホスホロチオエート（５’－ＰＳ）、５’末端のホスホロジチオエート（５’－ＰＳ２）、５’末端のビニルホスホネート（５’－ＶＰ）、５’末端のメチルホスホネート（ＭｅＰｈｏｓ）、または５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニル（
Figure 2023506258000010
 ）でありうる。５’末端のリン含有基が、５’末端のビニルホスホネート（５’－ＶＰ）である場合、５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ異性体（すなわち、ｔｒａｎｓ－ビニルホスフェート、
Figure 2023506258000011
 ）、５’－Ｚ－ＶＰ異性体（すなわち、ｃｉｓ－ビニルホスフェート、
Figure 2023506258000012
 ）、またはこれらの混合物でありうる。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の５’末端において、リン含有基を含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の５’末端において、リン含有基を含む。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、５’－Ｐを含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖内に、５’－Ｐを含む。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳを含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖内に、５’－ＰＳを含む。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、５’－ＶＰを含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖内に、５’－ＶＰを含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖内に、５’－Ｅ－ＶＰを含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖内に、５’－Ｚ－ＶＰを含む。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳ２を含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖内に、５’－ＰＳ２を含む。
一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、５’－ＰＳ２を含む。一実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖内に、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルを含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはこれらの組合せでありうる。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳ２も含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはこれらの組合せでありうる。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳ２も含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１である。ｄｓＲＮＡ剤はまた、５’－ＰＳも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはこれらの組合せでありうる。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳ２も含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（５’末端からカウントする）内の、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（５’末端からカウントする）内の、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（５’末端からカウントする）内の、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（５’末端からカウントする）内の、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（５’末端からカウントする）内の、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（５’末端からカウントする）内の、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはこれらの組合せでありうる。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（５’末端からカウントする）内の、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（５’末端からカウントする）内の、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳ２も含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（５’末端からカウントする）内の、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（５’末端からカウントする）内の、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはこれらの組合せでありうる。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１である。ｄｓＲＮＡｉ ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡｉ ＲＮＡ）はまた、５’－ＰＳ２も含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはこれらの組合せでありうる。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳ２も含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはこれらの組合せでありうる。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳ２も含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１である。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰも含む。５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはこれらの組合せでありうる。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳ２も含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルも含む。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐおよびターゲティングリガンドも含む。一実施形態において、５’－Ｐは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、ターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内の、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳおよびターゲティングリガンドも含む。一実施形態において、５’－ＰＳは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、ターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰ（例えば、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはこれらの組合せ）、およびターゲティングリガンドも含む。
一実施形態において、５’－ＶＰは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、ターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳ２およびターゲティングリガンドも含む。一実施形態において、５’－ＰＳ２は、アンチセンス鎖の５’末端にあり、ターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルおよびターゲティングリガンドも含む。一実施形態において、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、ターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（５’末端からカウントする）内の、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（５’末端からカウントする）内の、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐおよびターゲティングリガンドも含む。一実施形態において、５’－Ｐは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、ターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（５’末端からカウントする）内の、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（５’末端からカウントする）内の、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳおよびターゲティングリガンドも含む。一実施形態において、５’－ＰＳは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、ターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（５’末端からカウントする）内の、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（５’末端からカウントする）内の、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰ（例えば、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはこれらの組合せ）、およびターゲティングリガンドも含む。一実施形態において、５’－ＶＰは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、ターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（５’末端からカウントする）内の、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（５’末端からカウントする）内の、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳ２およびターゲティングリガンドも含む。一実施形態において、５’－ＰＳ２は、アンチセンス鎖の５’末端にあり、ターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－ＯＭｅであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（５’末端からカウントする）内の、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（５’末端からカウントする）内の、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルおよびターゲティングリガンドも含む。一実施形態において、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、ターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐおよびターゲティングリガンドも含む。一実施形態において、５’－Ｐは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、ターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳおよびターゲティングリガンドも含む。一実施形態において、５’－ＰＳは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、ターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰ（例えば、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはこれらの組合せ）、およびターゲティングリガンドも含む。一実施形態において、５’－ＶＰは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、ターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳ２およびターゲティングリガンドも含む。一実施形態において、５’－ＰＳ２は、アンチセンス鎖の５’末端にあり、ターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、Ｔ２’は、２’－Ｆであり、ｑ４は、２であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、５であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルおよびターゲティングリガンドも含む。一実施形態において、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、ターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－Ｐおよびターゲティングリガンドも含む。一実施形態において、５’－Ｐは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、ターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳおよびターゲティングリガンドも含む。一実施形態において、５’－ＰＳは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、ターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＶＰ（例えば、５’－Ｅ－ＶＰ、５’－Ｚ－ＶＰ、またはこれらの組合せ）、およびターゲティングリガンドも含む。一実施形態において、５’－ＶＰは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、ターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－ＰＳ２およびターゲティングリガンドも含む。一実施形態において、５’－ＰＳ２は、アンチセンス鎖の５’末端にあり、ターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
一実施形態において、Ｂ１は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｎ１は、８であり、Ｔ１は、２’Ｆであり、ｎ２は、３であり、Ｂ２は、２’－ＯＭｅであり、ｎ３は、７であり、ｎ４は、０であり、Ｂ３は、２’－ＯＭｅであり、ｎ５は、３であり、Ｂ１’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ１は、９であり、Ｔ１’は、２’－Ｆであり、ｑ２は、１であり、Ｂ２’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ３は、４であり、ｑ４は、０であり、Ｂ３’は、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆであり、ｑ５は、７であり、Ｔ３’は、２’－Ｆであり、ｑ６は、１であり、Ｂ４’は、２’－Ｆであり、ｑ７は、１であり；センス鎖の１～５位（センス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１および２位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴い、アンチセンス鎖の１８～２３位（アンチセンス鎖の５’末端からカウントする）内に、２つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結による修飾を伴う。ＲＮＡｉ剤はまた、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルおよびターゲティングリガンドも含む。一実施形態において、５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルは、アンチセンス鎖の５’末端にあり、ターゲティングリガンドは、センス鎖の３’末端にある。
特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）センス鎖であって、
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端へと接合されたＡＳＧＰＲリガンドであって、三価の分枝状リンカーを介して接合された、３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；ならびに
（ｉｉｉ）１、３、５、７、９～１１、１３、１７、１９、および２１位における２’－Ｆ修飾、ならびに２、４、６、８、１２、１４～１６、１８、および２０位における２’－ＯＭｅ修飾（５’末端からカウントする）
を有するセンス鎖と；
（ｂ）アンチセンス鎖であって、
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）１、３、５、９、１１～１３、１５、１７、１９、２１、および２３位における２’－ＯＭｅ修飾、ならびに２、４、６～８、１０、１４、１６、１８、２０、および２２位（５’末端からカウントする）における２’Ｆ修飾；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド位置２１と２２との間、およびヌクレオチド位置２２と２３との間（５’末端からカウントする）におけるホスホロチオエートヌクレオチド間連結
を有するアンチセンス鎖と
を含み；
この場合、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端における、２つのヌクレオチド突出、およびアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を有する。
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）センス鎖であって、
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端へと接合されたＡＳＧＰＲリガンドであって、三価の分枝状リンカーを介して接合された、３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１、３、５、７、９～１１、１３、１５、１７、１９、および２１位における２’－Ｆ修飾、ならびに２、４、６、８、１２、１４、１６、１８、および２０位における２’－ＯＭｅ修飾（５’末端からカウントする）；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド位置１と２との間、およびヌクレオチド位置２と３との間（５’末端からカウントする）におけるホスホロチオエートヌクレオチド間連結
を有するセンス鎖と；
（ｂ）アンチセンス鎖であって、
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）１、３、５、７、９、１１～１３、１５、１７、１９、および２１～２３位における２’－ＯＭｅ修飾、ならびに２、４、６、８、１０、１４、１６、１８、および２０位（５’末端からカウントする）における２’Ｆ修飾；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド位置１と２との間、ヌクレオチド位置２と３との間、ヌクレオチド位置２１と２２との間、およびヌクレオチド位置２２と２３との間（５’末端からカウントする）におけるホスホロチオエートヌクレオチド間連結
を有するアンチセンス鎖と
を含み；
この場合、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端における、２つのヌクレオチド突出、およびアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を有する。
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）センス鎖であって、
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端へと接合されたＡＳＧＰＲリガンドであって、三価の分枝状リンカーを介して接合された、３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１～６、８、１０、および１２～２１位における２’－ＯＭｅ修飾、７、および９位における２’－Ｆ修飾、ならびに１１位（５’末端からカウントする）におけるデオキシヌクレオチド（例えば、ｄＴ）；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド位置１と２との間、およびヌクレオチド位置２と３との間（５’末端からカウントする）におけるホスホロチオエートヌクレオチド間連結
を有するセンス鎖と；
（ｂ）アンチセンス鎖であって、
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９～２３位における２’－ＯＭｅ修飾、ならびに２、４～６、８、１０、１２、１４、１６、および１８位における２’－Ｆ修飾（５’末端からカウントする）；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド位置１と２との間、ヌクレオチド位置２と３との間、ヌクレオチド位置２１と２２との間、およびヌクレオチド位置２２と２３との間（５’末端からカウントする）におけるホスホロチオエートヌクレオチド間連結
を有するアンチセンス鎖と
を含み；
この場合、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端における、２つのヌクレオチド突出、およびアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を有する。
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）センス鎖であって、
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端へと接合されたＡＳＧＰＲリガンドであって、三価の分枝状リンカーを介して接合された、３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１～６、８、１０、１２、１４、および１６～２１位における２’－ＯＭｅ修飾、ならびに７、９、１１、１３、および１５位における２’－Ｆ修飾；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド位置１と２との間、およびヌクレオチド位置２と３との間（５’末端からカウントする）におけるホスホロチオエートヌクレオチド間連結
を有するセンス鎖と；
（ｂ）アンチセンス鎖であって、
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）１、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、および２１～２３位における２’－ＯＭｅ修飾、ならびに２～４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、および２０位における２’－Ｆ修飾（５’末端からカウントする）；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド位置１と２との間、ヌクレオチド位置２と３との間、ヌクレオチド位置２１と２２との間、およびヌクレオチド位置２２と２３との間（５’末端からカウントする）におけるホスホロチオエートヌクレオチド間連結
を有するアンチセンス鎖と
を含み；
この場合、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端における、２つのヌクレオチド突出、およびアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を有する。
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）センス鎖であって、
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端へと接合されたＡＳＧＰＲリガンドであって、三価の分枝状リンカーを介して接合された、３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１～９、および１２～２１位における２’－ＯＭｅ修飾、ならびに１０、および１１位における２’－Ｆ修飾；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド位置１と２との間、およびヌクレオチド位置２と３との間（５’末端からカウントする）におけるホスホロチオエートヌクレオチド間連結
を有するセンス鎖と；
（ｂ）アンチセンス鎖であって、
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）１、３、５、７、９、１１～１３、１５、１７、１９、および２１～２３位における２’－ＯＭｅ修飾、ならびに２、４、６、８、１０、１４、１６、１８、および２０位における２’－Ｆ修飾（５’末端からカウントする）；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド位置１と２との間、ヌクレオチド位置２と３との間、ヌクレオチド位置２１と２２との間、およびヌクレオチド位置２２と２３との間（５’末端からカウントする）におけるホスホロチオエートヌクレオチド間連結
を有するアンチセンス鎖と
を含み；
この場合、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端における、２つのヌクレオチド突出、およびアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を有する。
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）センス鎖であって、
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端へと接合されたＡＳＧＰＲリガンドであって、三価の分枝状リンカーを介して接合された、３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１、３、５、７、９～１１、および１３位における２’－Ｆ修飾、および２、４、６、８、１２、および１４～２１位における２’－ＯＭｅ修飾；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド位置１と２との間、およびヌクレオチド位置２と３との間（５’末端からカウントする）におけるホスホロチオエートヌクレオチド間連結
を有するセンス鎖と；
（ｂ）アンチセンス鎖であって、
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）１、３、５～７、９、１１～１３、１５、１７～１９、および２１～２３位における２’－ＯＭｅ修飾、ならびに２、４、８、１０、１４、１６、および２０位における２’－Ｆ修飾（５’末端からカウントする）；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド位置１と２との間、ヌクレオチド位置２と３との間、ヌクレオチド位置２１と２２との間、およびヌクレオチド位置２２と２３との間（５’末端からカウントする）におけるホスホロチオエートヌクレオチド間連結
を有するアンチセンス鎖と
を含み；
この場合、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端における、２つのヌクレオチド突出、およびアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を有する。
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）センス鎖であって、
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端へと接合されたＡＳＧＰＲリガンドであって、三価の分枝状リンカーを介して接合された、３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１、２、４、６、８、１２、１４、１５、１７、および１９～２１位における２’－ＯＭｅ修飾、ならびに３、５、７、９～１１、１３、１６、および１８位における２’－Ｆ修飾；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド位置１と２との間、およびヌクレオチド位置２と３との間（５’末端からカウントする）におけるホスホロチオエートヌクレオチド間連結
を有するセンス鎖と；
（ｂ）アンチセンス鎖であって、
（ｉ）２５ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）１、４、６、７、９、１１～１３、１５、１７、および１９～２３位における２’－ＯＭｅ修飾、２、３、５、８、１０、１４、１６、および１８位における２’－Ｆ修飾、ならびに２４および２５位（５’末端からカウントする）におけるデオキシヌクレオチド（ｄｅｓｏｘｙ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）（例えば、ｄＴ）；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド位置１と２との間、ヌクレオチド位置２と３との間、ヌクレオチド位置２１と２２との間、およびヌクレオチド位置２２と２３との間（５’末端からカウントする）におけるホスホロチオエートヌクレオチド間連結
を有するアンチセンス鎖と
を含み；
この場合、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端における、４つのヌクレオチド突出、およびアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を有する。
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）センス鎖であって、
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端へと接合されたＡＳＧＰＲリガンドであって、三価の分枝状リンカーを介して接合された、３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１～６、８、および１２～２１位における２’－ＯＭｅ修飾、ならびに７、および９～１１位における２’－Ｆ修飾；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド位置１と２との間、およびヌクレオチド位置２と３との間（５’末端からカウントする）におけるホスホロチオエートヌクレオチド間連結
を有するセンス鎖と；
（ｂ）アンチセンス鎖であって、
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）１、３～５、７、８、１０～１３、１５、および１７～２３位における２’－ＯＭｅ修飾、ならびに２、６、９、１４、および１６位における２’－Ｆ修飾（５’末端からカウントする）；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド位置１と２との間、ヌクレオチド位置２と３との間、ヌクレオチド位置２１と２２との間、およびヌクレオチド位置２２と２３との間（５’末端からカウントする）におけるホスホロチオエートヌクレオチド間連結
を有するアンチセンス鎖と
を含み；
この場合、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端における、２つのヌクレオチド突出、およびアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を有する。
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）センス鎖であって、
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端へと接合されたＡＳＧＰＲリガンドであって、三価の分枝状リンカーを介して接合された、３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１～６、８、および１２～２１位における２’－ＯＭｅ修飾、ならびに７、および９～１１位における２’－Ｆ修飾；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド位置１と２との間、およびヌクレオチド位置２と３との間（５’末端からカウントする）におけるホスホロチオエートヌクレオチド間連結
を有するセンス鎖と；
（ｂ）アンチセンス鎖であって、
（ｉ）２３ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）１、３～５、７、１０～１３、１５、および１７～２３位における２’－ＯＭｅ修飾、ならびに２、６、８、９、１４、および１６位における２’－Ｆ修飾（５’末端からカウントする）；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド位置１と２との間、ヌクレオチド位置２と３との間、ヌクレオチド位置２１と２２との間、およびヌクレオチド位置２２と２３との間（５’末端からカウントする）におけるホスホロチオエートヌクレオチド間連結
を有するアンチセンス鎖と
を含み；
この場合、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端における、２つのヌクレオチド突出、およびアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を有する。
別の特定の実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、
（ａ）センス鎖であって、
（ｉ）１９ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）３’末端へと接合されたＡＳＧＰＲリガンドであって、三価の分枝状リンカーを介して接合された、３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）１～４、６、および１０～１９位における２’－ＯＭｅ修飾、ならびに５、および７～９位における２’－Ｆ修飾；ならびに
（ｉｖ）ヌクレオチド位置１と２との間、およびヌクレオチド位置２と３との間（５’末端からカウントする）におけるホスホロチオエートヌクレオチド間連結
を有するセンス鎖と；
（ｂ）アンチセンス鎖であって、
（ｉ）２１ヌクレオチドの長さ；
（ｉｉ）１、３～５、７、１０～１３、１５、および１７～２１位における２’－ＯＭｅ修飾、ならびに２、６、８、９、１４、および１６位における２’－Ｆ修飾（５’末端からカウントする）；ならびに
（ｉｉｉ）ヌクレオチド位置１と２との間、ヌクレオチド位置２と３との間、ヌクレオチド位置１９と２０との間、およびヌクレオチド位置２０と２１との間（５’末端からカウントする）におけるホスホロチオエートヌクレオチド間連結
を有するアンチセンス鎖と
を含み；
この場合、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の３’末端における、２つのヌクレオチド突出、およびアンチセンス鎖の５’末端における平滑末端を有する。
ある特定の実施形態において、本発明の方法における使用のためのｉＲＮＡは、表２～１１、２１、２４、２７、３０、３２、３３、３６、３７、４９、または５０のうちのいずれか１つにおいて列挙された薬剤から選択される薬剤である。これらの薬剤は、リガンドをさらに含みうる。
ＩＩＩ．リガンドへとコンジュゲートされたｉＲＮＡ
本開示のＲＮＡｉのＲＮＡの、別の修飾は、ｉＲＮＡへと、活性、細胞内分布、またはｉＲＮＡの、例えば、細胞への取込みを増強する、１つまたは複数のリガンド、部分、またはコンジュゲートを、化学的に連結することを伴う。このような部分は、コレステロール部分などの脂質部分を含むがこれらに限定されない（Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556）。他の実施形態において、リガンドは、コール酸［Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060］、チオエーテル、例えば、ベリル－Ｓ－トリチルチオール［Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770］、チオコレステロール［Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538］、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基［Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54］、リン脂質、例えば、ジヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールもしくはトリエチル－アンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－ホスホネート［Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783］、ポリアミン鎖もしくはポリエチレングリコール鎖［Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973］、またはアダマンタン酢酸［Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654］、パルミチル部分［Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237］、またはオクタデシルアミン部分もしくはヘキシルアミノカルボニルオキシコレステロール部分［Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937］である。
ある特定の実施形態において、リガンドは、それが組み込まれるｉＲＮＡ剤の分布、ターゲティング、または寿命を変更する。好ましい実施形態において、リガンドは、例えば、このようなリガンドが存在しない分子種と比較した、選択標的、例えば、分子、細胞または細胞型、コンパートメント、例えば、細胞コンパートメントもしくは臓器コンパートメント、組織、臓器、または体内の領域に対するアフィニティーの増強をもたらす。好ましいリガンドは、二重鎖核酸内における、二重鎖の対合に参与しない。
リガンドは、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、またはグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、またはヒアルロン酸）；または脂質などの天然に存在する物質を含みうる。リガンドはまた、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸などの組換え分子または合成分子でもありうる。ポリアミノ酸の例は、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル－無水マレイン酸コポリマー、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンを含む。ポリアミンの例は、ポリエチレンイミン、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣体ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロトアミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩、またはアルファ－ヘリックス型ペプチドを含む。
リガンドはまた、ターゲティング基、例えば、細胞ターゲティング剤または組織ターゲティング剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質、またはタンパク質、例えば、腎細胞など、指定の細胞型に結合する抗体も含みうる。ターゲティング基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン系炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパレート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、フォレート、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ビオチン、またはＲＧＤペプチドもしくはＲＧＤペプチド模倣体でありうる。ある特定の実施形態において、リガンドは、多価ガラクトース、例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミンである。
リガンドの他の例は、色素、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラーレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、複素環芳香族炭水化物（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子［例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸，Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン、およびペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換されたアルキル、放射性標識化マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾールコンジュゲート、テトラアザ大員環のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰを含む。
リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質、もしくはペプチド、例えば、コリガンドに対して特異的アフィニティーを有する分子、または抗体、例えば、肝細胞など、指定の細胞型に結合する抗体でありうる。リガンドはまた、ホルモンおよびホルモン受容体も含みうる。リガンドはまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、または多価フコースなど、ペプチド以外の分子種も含みうる。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化因子、またはＮＦ－κＢの活性化因子でありうる。
リガンドは、物質、例えば、例えば、細胞骨格を破壊することにより、例えば、細胞微小管、マイクロフィラメント、または中間径フィラメントを破壊することにより、ｉＲＮＡ剤の、細胞への取込みを増大させうる薬物でありうる。薬物は、例えば、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド、ラトルンクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビン（ｍｙｏｓｅｒｖｉｎ）でありうる。
一部の実施形態において、本明細書において記載される、ｉＲＮＡへと接合されているリガンドは、薬物動態モジュレーター（ＰＫモジュレーター）として作用する。ＰＫモジュレーターは、親油性物質、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合性薬剤、ＰＥＧ、ビタミンなどを含む。例示的なＰＫモジュレーターは、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンを含むがこれらに限定されない。多数のホスホロチオエート連結を含むオリゴヌクレオチドもまた、血清タンパク質に結合することが公知であり、したがって、骨格内に、複数のホスホロチオエート連結を含む、短いオリゴヌクレオチド、例えば約５塩基、１０塩基、１５塩基、または２０塩基のオリゴヌクレオチドもまた、リガンド（例えば、ＰＫモジュレーティングリガンド）として、本発明に適する。加えて、血清成分（例えば、血清タンパク質）に結合するアプタマーもまた、本明細書において記載される実施形態におけるＰＫモジュレーティングリガンドとしての使用に適する。
本発明のリガンドコンジュゲート型ｉＲＮＡは、連結分子の、オリゴヌクレオチドへの接合に由来する、反応性のペンダント官能基（下記において記載される）など、反応性のペンダント官能基を保有するオリゴヌクレオチドの使用により合成されうる。この反応性オリゴヌクレオチドは、市販のリガンド、様々な保護基のうちのいずれかを保有する合成リガンド、または連結部分が接合されているリガンドと、直接反応させられうる。
本発明のコンジュゲートにおいて使用されるオリゴヌクレオチドは、周知の固相合成法を介して、好都合に、かつ、規定的に作製されうる。このような合成のための装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）を含む、いくつかの販売元により販売されている。加えて、または代替的に、当技術分野において公知である、このような合成のための、他の任意の方法も利用されうる。同様の技法を使用して、ホスホロチオエート誘導体およびアルキル化誘導体など、他のオリゴヌクレオチドを調製することもまた、公知である。
本発明のリガンドコンジュゲート型ｉＲＮＡ、および配列特異的連結型ヌクレオシドを保有するリガンド分子において、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドは、標準的なヌクレオチド前駆体もしくはヌクレオシド前駆体、または連結部分を既に保有するヌクレオチドコンジュゲート前駆体もしくはヌクレオシドコンジュゲート前駆体、リガンド分子を既に保有するリガンド－ヌクレオチドコンジュゲート前駆体もしくはリガンド－ヌクレオシドコンジュゲート前駆体、またはヌクレオシド以外のリガンド保有構成要素を用いて、適切なＤＮＡ合成器上においてアセンブルされうる。
連結部分を既に保有する、ヌクレオチドコンジュゲート前駆体を使用する場合、典型的に、配列特異的連結型ヌクレオシドの合成が完了し、次いで、リガンドコンジュゲート型オリゴヌクレオチドを形成するように、リガンド分子が、連結部分と反応させられる。一部の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドまたは連結型ヌクレオシドは、市販されており、オリゴヌクレオチド合成において規定的に使用されている、標準的なホスホルアミダイトおよび非標準的なホスホルアミダイトに加えて、リガンド－ヌクレオシドコンジュゲートに由来するホスホルアミダイトを使用して、自動式合成器により合成される。
Ａ．脂質コンジュゲート
ある特定の実施形態において、リガンドまたはコンジュゲートは、脂質または脂質ベースの分子である。このような脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。ＨＳＡ結合性リガンドは、コンジュゲートの、標的組織、例えば、体内の腎臓以外の標的組織への分布を可能とする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝組織でありうる。ＨＳＡに結合しうる、他の分子もまた、リガンドとして使用されうる。例えば、ナプロキセンまたはアスピリンが使用されうる。脂質または脂質ベースのリガンドは、（ａ）コンジュゲートの分解に対する抵抗性を増大させる場合もあり、（ｂ）標的細胞または標的細胞膜へのターゲティングまたは輸送を増大させる場合もあり、（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合を調整するのに使用される場合もある。
脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートの、標的組織への結合を阻害する、例えば、制御するのに使用されうる。例えば、ＨＳＡに強く結合する、脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓へとターゲティングされる可能性が小さく、したがって、体内からクリアリングされる可能性が小さいであろう。ＨＳＡに弱く結合する、脂質または脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートを、腎臓へとターゲティングするのに使用されうる。
ある特定の実施形態において、脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡに結合する。好ましくは、脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートが、好ましくは、腎臓以外の組織へと分布するように、十分なアフィニティーにより、ＨＳＡに結合する。しかし、アフィニティーは、ＨＳＡ－リガンド間の結合が解消されえないほどには強くならないことが好ましい。
他の実施形態において、脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートが、好ましくは、腎臓へと分布するように、ＨＳＡに、弱く結合するか、または全く結合しない。腎細胞へとターゲティングする、他の部分もまた、脂質ベースのリガンドの代わりに、またはこれに加えて使用されうる。
別の態様において、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖細胞により取り込まれる部分、例えば、ビタミンである。これらは、特に、例えば、悪性型細胞または非悪性型細胞、例えば、がん細胞による、望ましくない細胞増殖により特徴づけられる障害を処置するために有用である。例示的ビタミンは、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫを含む。他の例示的ビタミンは、ビタミンＢ（Ｂ ｖｉｔａｍｉｎ）、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサル、または肝細胞などの標的細胞により取り込まれる、他のビタミンもしくは栄養物を含む。また、ＨＳＡおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も含まれる。
Ｂ．細胞透過剤
別の態様において、リガンドは、細胞透過剤、好ましくは、ヘリックス型細胞透過剤である。好ましくは、薬剤は、両親媒性である。例示的薬剤は、ｔａｔまたはアンテノペディアなどのペプチドである。薬剤が、ペプチドである場合、薬剤は修飾されることが可能であり、ペプチジル模倣体、インバートマー、非ペプチド連結またはシュードペプチド連結、およびＤ－アミノ酸の使用を含む。ヘリックス剤は、好ましくは、親油性相および疎油性相を有する、好ましくは、アルファ－ヘリックス剤である。
リガンドは、ペプチドの場合もあり、ペプチド模倣体の場合もある。ペプチド模倣体（本明細書においてまた、オリゴペプチド模倣体とも言及される）は、天然ペプチドと同様の、規定された三次元構造へとフォールディングすることが可能な分子である。ペプチドおよびペプチド模倣体の、ｉＲＮＡ剤への接合は、細胞による認識および吸収を増強することなどにより、ｉＲＮＡの薬物動態分布に影響を及ぼしうる。ペプチド部分またはペプチド模倣体部分は、約５～５０アミノ酸長、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長でありうる。
ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば、細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば、主に、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、またはＰｈｅからなる）でありうる。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束ペプチド、または架橋ペプチドでありうる。別の代替例において、ペプチド部分は、疎水性ＭＴＳ（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含みうる。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号１４）を有する組換え線維芽細胞増殖因子（ＲＦＧＦ）である。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体［例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号１５）はまた、ターゲティング部分でもありうる。ペプチド部分は、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質を含む、大型の極性分子を、細胞膜を越えて運びうる、「デリバリー」ペプチドでありうる。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質［ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号１６）］およびショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）アンテナペディアタンパク質［ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１７）］に由来する配列は、デリバリーペプチドとして機能することが可能であることが見出されている。ペプチドまたはペプチド模倣体は、ファージディスプレイライブラリー、またはＯＢＯＣ（ｏｎｅ－ｂｅａｄ－ｏｎｅ－ｃｏｍｐｏｕｎｄ）コンビナトリアルライブラリー（Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991）から同定されるペプチドなど、ＤＮＡのランダム配列によりコードされうる。細胞をターゲティングすることを目的として組み込まれた単量体単位を介して、ｄｓＲＮＡ剤へとテザリングされるペプチドまたはペプチド模倣体の例は、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）ペプチドまたはＲＧＤ模倣体である。ペプチド部分は、約５アミノ酸～約４０アミノ酸の長さの範囲でありうる。ペプチド部分は、安定性または直接的なコンフォメーション特性を増大させる構造的修飾などの構造的修飾を有しうる。下記において記載される構造的修飾のうちのいずれかが利用されうる。
本発明の組成物および方法における使用のためのＲＧＤペプチドは、直鎖状の場合もあり、環状の場合もあり、特異的組織（複数可）へのターゲティングを容易とするように修飾されうる、例えば、グリコシル化またはメチル化されうる。ＲＧＤ含有ペプチドおよびペプチド模倣体は、Ｄ－アミノ酸のほか、合成ＲＧＤ模倣体を含みうる。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドをターゲティングする、他の部分も使用することができる。このリガンドの、好ましいコンジュゲートは、ＰＥＣＡＭ－１またはＶＥＧＦをターゲティングする。
「細胞透過性ペプチド」は、細胞、例えば、細菌細胞もしくは真菌細胞などの微生物細胞、またはヒト細胞などの哺乳動物細胞を透過することが可能である。微生物細胞透過性ペプチドは、例えば、α－ヘリックス型直鎖状ペプチド［例えば、ＬＬ－３７またはセクロピンＰ１（Ｃｅｒｏｐｉｎ Ｐ１）］、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α－デフェンシン、β－デフェンシン、またはバクテネシン）、または１つまたは２つの主要アミノ酸だけを含有するペプチド（例えば、ＰＲ－３９またはインドリシジン）でありうる。細胞透過性ペプチドはまた、核局在化シグナル（ＮＬＳ）も含みうる。例えば、細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ－１ ｇｐ４１およびＳＶ４０大型Ｔ抗原のＮＬＳなどの融合ペプチドドメインに由来するＭＰＧなどの二部分型両親媒性ペプチドでありうる（Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003）。
Ｃ．炭水化物コンジュゲート
本発明の組成物および方法についての、一部の実施形態において、ｉＲＮＡは、炭水化物をさらに含む。炭水化物コンジュゲートｉＲＮＡは、本明細書において記載される、インビボにおける核酸のデリバリーのほか、インビボにおける治療的使用に適する組成物に有利である。本明細書において使用される、「炭水化物」とは、酸素原子、窒素原子、もしくは硫黄原子が、各炭素原子へと結合した、少なくとも６つの炭素原子（直鎖状の場合もあり、分枝状の場合もあり、環状の場合もある）を有する、１つまたは複数の単糖単位から構成される炭水化物自体；または各々が、酸素原子、窒素原子、もしくは硫黄原子が、各炭素原子へと結合した、少なくとも６つの炭素原子（直鎖状の場合もあり、分枝状の場合もあり、環状の場合もある）を有する、１つまたは複数の単糖単位から構成される炭水化物部分を、その一部として有する化合物である化合物を指す。代表的炭水化物は、糖（約４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、または９つの単糖単位を含有する、単糖、二糖、三糖、およびオリゴ糖）、ならびにデンプン、グリコーゲン、セルロース、および多糖ガムなどの多糖を含む。具体的単糖は、Ｃ５およびこれを上回る糖（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８）を含み；二糖および三糖は、２つまたは３つの単糖単位（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８）を有する糖を含む。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物および方法における使用のための炭水化物コンジュゲートは、単糖である。
ある特定の実施形態において、単糖は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。１つまたは複数のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体を含むＧａｌＮＡｃコンジュゲートについては、例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ８，１０６，０２２において記載されている。一部の実施形態において、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、ｉＲＮＡを、特定の細胞へとターゲティングするリガンドとして用いられる。一部の実施形態において、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、例えば、肝細胞（例えば、肝細胞）のアシアロ糖タンパク質受容体に対するリガンドとして用いられることにより、ｉＲＮＡを、肝細胞へとターゲティングする。
一部の実施形態において、炭水化物コンジュゲートは、１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。ＧａｌＮＡｃ誘導体は、リンカー、例えば、二価または三価の分枝状リンカーを介して接合されていてもよい。一部の実施形態において、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、センス鎖の３’末端とコンジュゲートされている。一部の実施形態において、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、リンカー、例えば、本明細書において記載されるリンカーを介して、ｉＲＮＡ剤と（例えば、センス鎖の３’末端と）コンジュゲートされている。一部の実施形態において、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、センス鎖の５’末端とコンジュゲートされている。一部の実施形態において、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、リンカー、例えば、本明細書において記載されるリンカーを介して、ｉＲＮＡ剤と（例えば、センス鎖の５’末端と）コンジュゲートされている。
本発明のある特定の実施形態において、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、一価リンカーを介して、本発明のｉＲＮＡ剤へと接合されている。一部の実施形態において、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、二価リンカーを介して、本発明のｉＲＮＡ剤へと接合されている。本発明についての、さらに他の実施形態において、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、三価リンカーを介して、本発明のｉＲＮＡ剤へと接合されている。本発明についての他の実施形態において、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、四価リンカーを介して、本発明のｉＲＮＡ剤へと接合されている。
ある特定の実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ｉＲＮＡ剤へと接合された、１つのＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。ある特定の実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、各々が、独立に、複数の一価リンカーを介して、二本鎖ＲＮＡｉ剤の、複数のヌクレオチドへと接合された、複数の（例えば、２、３、４、５、または６）ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。
一部の実施形態において、例えば、本発明のｉＲＮＡ剤の２つの鎖が、一方の鎖の３’末端と、それぞれの他方の鎖の５’末端との間の非中断ヌクレオチド鎖により接続され、複数の非対合ヌクレオチドを含むヘアピンループを形成する、１つの大型分子の一部である場合、ヘアピンループ内の、各非対合ヌクレオチドは、独立に、一価リンカーを介して接合された、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含みうる。ヘアピンループはまた、二重鎖の一方の鎖内の伸長突出によっても形成されうる。
一部の実施形態において、例えば、本発明のｉＲＮＡ剤の２つの鎖が、一方の鎖の３’末端と、それぞれの他方の鎖の５’末端との間の非中断ヌクレオチド鎖により接続され、複数の非対合ヌクレオチドを含むヘアピンループを形成する、１つの大型分子の一部である場合、ヘアピンループ内の、各非対合ヌクレオチドは、独立に、一価リンカーを介して接合された、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含みうる。ヘアピンループはまた、二重鎖の一方の鎖内の伸長突出によっても形成されうる。
本発明についての一実施形態において組成物および方法における使用のための炭水化物コンジュゲートは、
Figure 2023506258000013
Figure 2023506258000014
Figure 2023506258000015
Figure 2023506258000016
Figure 2023506258000017
 ［式中、Ｙは、ＯまたはＳであり、ｎは、３～６である］（式ＸＸＩＶ）；
Figure 2023506258000018
 ［式中、Ｙは、ＯまたはＳであり、ｎは、３～６である］（式ＸＸＶ）；
Figure 2023506258000019
Figure 2023506258000020
 ［式中、Ｘは、ＯまたはＳである］（式ＸＸＶＩＩ）；
Figure 2023506258000021
Figure 2023506258000022
Figure 2023506258000023
 からなる群から選択される。
別の実施形態において、本発明の組成物および方法における使用のための炭水化物コンジュゲートは、単糖である。一実施形態において、単糖は、
Figure 2023506258000024
 などのＮ－アセチルガラクトサミンである。
一部の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、以下の図式［式中、Ｘは、ＯまたはＳである］
Figure 2023506258000025
 において示されるリンカーを介して、炭水化物コンジュゲートへと接合されている。
一部の実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、表１において規定され、下記：
Figure 2023506258000026
 に示される通りに、Ｌ９６とコンジュゲートされている。
本明細書において記載される実施形態における使用のための、別の代表的炭水化物コンジュゲートは、
Figure 2023506258000027
 （式ＸＸＸＶＩ）［式中、ＸまたはＹのうちの一方が、オリゴヌクレオチドである場合、他方は、水素である］
を含むがこれらに限定されない。
一部の実施形態において、適切なリガンドは、それらの全内容が、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１９／０５５６３３において開示されているリガンドである。一実施形態において、リガンドは、下記の構造：
Figure 2023506258000028
 を含む。
本発明のある特定の実施形態において、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、一価リンカーを介して、本発明のｉＲＮＡ剤へと接合されている。一部の実施形態において、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、二価リンカーを介して、本発明のｉＲＮＡ剤へと接合されている。本発明についての、さらに他の実施形態において、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、三価リンカーを介して、本発明のｉＲＮＡ剤へと接合されている。
本発明についての一実施形態において二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ｉＲＮＡ剤へと接合された、１つまたは複数のＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。ＧａｌＮＡｃは、センス鎖上またはアンチセンス（ａｎｔｓｉｓｅｎｓｅ）鎖上のリンカーを介して、任意のヌクレオチドへと接合されていてもよい。ＧａｌＮａｃは、センス鎖の５’末端、センス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の５’末端、またはアンチセンス鎖の３’末端へと接合されていてもよい。一実施形態において、ＧａｌＮＡｃは、例えば、三価リンカーを介して、センス鎖の３’末端へと接合されている。
他の実施形態において、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、各々が、独立に、複数のリンカー、例えば、一価リンカーを介して、二本鎖ＲＮＡｉ剤の、複数のヌクレオチドへと接合された、複数の（例えば、２、３、４、５、または６）ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。
一部の実施形態において、例えば、本発明のｉＲＮＡ剤の２つの鎖が、一方の鎖の３’末端と、それぞれの他方の鎖の５’末端との間の非中断ヌクレオチド鎖により接続され、複数の非対合ヌクレオチドを含むヘアピンループを形成する、１つの大型分子の一部である場合、ヘアピンループ内の、各非対合ヌクレオチドは、独立に、一価リンカーを介して接合された、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含みうる。
一部の実施形態において、炭水化物コンジュゲートは、ＰＫモジュレーターまたは細胞透過性ペプチドなどであるがこれらに限定されない、上記において記載された、１つまたは複数のさらなるリガンドをさらに含む。
本発明における使用に適する、さらなる炭水化物コンジュゲートおよびリンカーは、それらの各々の全内容が、参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／１７９６２０号および第ＷＯ２０１４／１７９６２７号において記載されている、炭水化物コンジュゲートおよびリンカーを含む。
Ｄ．リンカー
一部の実施形態において、本明細書において記載されるコンジュゲートまたはリガンドは、切断型の場合もあり、切断型でない場合もある、多様なリンカーにより、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドへと接合されていてもよい。
「リンカー」または「連結基」という用語は、化合物の２つの部分を接続する有機部分、例えば、化合物の２つの部分を共有結合的に接合する有機部分を意味する。リンカーは、典型的に、直接的結合、または酸素もしくは硫黄などの原子、ＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨなどの単位、または置換アルキルもしくは非置換アルキル、置換アルケニルもしくは非置換アルケニル、置換アルキニルもしくは非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロ（ｈｅｒｅｒｏ）シクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリールなどであるがこれらに限定されない原子鎖であって、１つもしくは複数のメチレンが、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）、置換アリールもしくは非置換アリール、置換ヘテロアリールもしくは非置換ヘテロアリール、または置換複素環もしくは非置換複素環［式中、Ｒ８は、水素、アシル、脂肪族、または置換脂肪族である］により中断もしくは終結する原子鎖を含む。一実施形態において、リンカーは、約１～２４原子、２～２４、３～２４、４～２４、５～２４、６～２４、６～１８、７～１８、８～１８、７～１７、８～１７、６～１６、７～１７、または８～１６原子である。
切断型連結基とは、細胞外においては十分に安定であるが、標的細胞内に入ると、切断されて、リンカーが一体に保持している、２つの部分を放出する連結基である。好ましい実施形態において、切断型連結基は、標的細胞内、または第１の基準条件（例えば、細胞内条件を模倣するか、またはこれを表すように選択されうる）下において、対象の血液中、または第２の基準条件（例えば、血液中または血清中において見出される条件を模倣するか、またはこれを表すように選択されうる）下の、少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、もしくはこれを超える速度、または少なくとも１００倍の速度において切断される。
切断型連結基は、切断剤、例えば、ｐＨ、レドックスポテンシャル、または分解性分子の存在に感受性である。一般に、切断剤は、血清中または血液中より、細胞の内部において、高頻度であるか、または高レベルもしくは高活性において見出される。このような分解剤の例は、特定の基質について選択されるレドックス剤、または基質特異性を有さないレドックス剤であって、例えば、細胞内に存在し、還元によりレドックス切断型連結基を分解しうるメルカプタン；エステラーゼ；エンドソーム、または酸性環境、例えば、５もしくはこれ未満のｐＨを結果としてもたらす酸性環境を創出しうる薬剤；一般酸、ペプチダーゼ（基質特異的でありうる）、およびホスファターゼとして作用することにより、酸切断型連結基を加水分解または分解しうる酵素などの、酸化酵素または還元酵素もしくは還元剤を含むレドックス剤を含む。
ジスルフィド結合などの切断型連結基は、ｐＨに感受性でありうる。ヒト血清のｐＨは、７．４であるが、細胞内の平均ｐＨは、やや低値であり、約７．１～７．３の範囲である。エンドソームは、５．５～６．０の範囲の、酸性度が強いｐＨを有し、リソソームは、およそ５．０の、酸性度がなお強いｐＨを有する。一部のリンカーは、好ましいｐＨにおいて切断され、これにより、カチオン性脂質を、細胞内部のリガンドから、または所望の細胞コンパートメントへと放出する切断型連結基を有するであろう。
リンカーは、特定の酵素により切断される切断型連結基を含みうる。リンカーへと組み込まれる切断型連結基の種類は、ターゲティングされる細胞に依存しうる。例えば、肝ターゲティングリガンドは、エステル基を含むリンカーを介して、カチオン性脂質へと連結されうる。肝細胞は、エステラーゼに富むので、リンカーは、エステラーゼに富まない細胞型より、肝細胞内において、より効率的に切断されるであろう。エステラーゼに富む、他の細胞型は、肺、腎皮質、および精巣の細胞を含む。
ペプチド結合を含有するリンカーは、肝細胞および滑膜細胞など、ペプチダーゼに富む細胞型をターゲティングする場合に使用されうる。
一般に、候補切断型連結基の適性は、候補連結基を切断する、分解剤（または分解条件）の能力について調べることにより査定されうる。また、候補切断型連結基を、血液中の切断、または他の非標的組織との接触時における切断に抵抗する能力について調べることも所望されるであろう。したがって、第１の条件が、標的細胞内の切断を指し示すように選択され、第２の条件が、他の組織内、または体液中、例えば、血液中もしくは血清中の切断を指し示すように選択される場合の、第１の条件と、第２の条件との間における、切断に対する相対感受性を決定することができる。査定は、無細胞系、細胞、細胞培養物、臓器培養物もしくは組織培養物、または動物全体において実施されうる。無細胞条件または培養物条件において初期査定を行い、動物全体における、さらなる査定により確認することが有用でありうる。好ましい実施形態において、有用な候補化合物は、細胞（または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下において）内において、血液中または血清中（または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下において）と比較して、少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍の速度において切断される。
ｉ．レドックス切断型連結基
ある特定の実施形態において、切断型連結基は、還元時または酸化時に切断される、レドックス切断型連結基である。還元切断型連結基の例は、ジスルフィド連結基（－Ｓ－Ｓ－）である。候補切断型連結基が、適切な「還元切断型連結基」であるのかどうか、または、例えば、特定のｉＲＮＡ部分および特定のターゲティング剤を伴う使用に適するのかどうかを決定するために、本明細書において記載される方法を検討することができる。例えば、候補物質は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、または細胞内、例えば、標的細胞内において観察される切断速度を模倣する、当技術分野において公知の試薬を使用する、他の還元剤を伴うインキュベーションにより査定されうる。候補物質はまた、血液中条件または血清中条件を模倣するように選択される条件下においても査定されうる。一実施形態（ｏｎｅ）において、候補化合物は、血中の最大において、約１０％切断される。他の実施形態において、有用な候補化合物は、細胞（または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下において）内において、血液中（または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下において）と比較して、少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または約１００倍の速度において分解される。候補化合物の切断速度は、標準的な酵素反応速度アッセイを、細胞内媒体（ｍｅｄｉａ）を模倣するように選び出された条件下において使用して決定され、細胞外媒体を模倣するように選び出された条件と比較されうる。
ｉｉ．リン酸ベースの切断型連結基
他の実施形態において、切断型リンカーは、リン酸ベースの切断型連結基を含む。リン酸ベースの切断型連結基は、リン酸基を分解または加水分解する薬剤により切断される。細胞内のリン酸基を切断する薬剤の例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。リン酸ベースの連結基の例は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－である。好ましい実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－、および－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－である。好ましい実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。これらの候補連結基は、上記において記載された方法と類似の方法を使用して査定されうる。
ｉｉｉ．酸切断型連結基
他の実施形態において、切断型リンカーは、酸切断型連結基を含む。酸切断型連結基は、酸性条件下において切断される連結基である。好ましい実施形態において、酸切断型連結基は、ｐＨを約６．５以下（例えば、約６．０、５．５、５．０、またはこれ未満）とする酸性環境において、または一般酸として作用しうる酵素などの薬剤により切断される。細胞内において、エンドソームおよびリソソームなど、特異的な低ｐＨ細胞小器官は、酸切断型連結基のための切断環境をもたらす。酸切断型連結基の例は、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸のエステルを含むがこれらに限定されない。酸切断型基は、一般式：－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または－ＯＣ（Ｏ）を有しうる。好ましい実施形態は、エステル（アルコキシ基）の酸素へと接合された炭素が、アリール基、置換アルキル基、またはジメチルペンチルもしくはｔ－ブチルなどの三級アルキル基である実施形態である。これらの候補連結基は、上記において記載された方法と類似の方法を使用して査定されうる。
ｉｖ．エステルベースの連結基
他の実施形態において、切断型リンカーは、エステルベースの切断型連結基を含む。エステルベースの切断型連結基は、細胞内のエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素により切断される。エステルベースの切断型連結基の例は、アルキレン基、アルケニレン基、およびアルキニレン基のエステルを含むがこれらに限定されない。エステル切断型連結基は、一般式：－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－を有する。これらの候補連結基は、上記において記載された方法と類似の方法を使用して査定されうる。
ｖ．ペプチドベースの切断型連結（ｃｌｅａｖｉｎｇ）基
さらに他の実施形態において、切断型リンカーは、ペプチドベースの切断型連結基を含む。ペプチドベースの切断型連結基は、細胞内のペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素により切断される。ペプチドベースの切断型連結基は、オリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチドをもたらすように、アミノ酸の間において形成されるペプチド結合である。ペプチドベースの切断型連結基は、アミド基［－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－］を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレン、またはアルキニレン（ａｌｋｙｎｅｌｅｎｅ）の間において形成されうる。ペプチド結合は、アミノ酸の間において形成されて、ペプチドおよびタンパク質をもたらす、特殊な種類のアミド結合である。ペプチドベースの切断型連結基は、一般に、アミノ酸の間において形成され、ペプチドおよびタンパク質をもたらすペプチド結合（すなわち、アミド結合）に限定され、アミド官能基の全体を含まない。ペプチドベースの切断型連結基は、一般式：－ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）－［式中、ＲＡおよびＲＢは、２つの隣接するアミノ酸のＲ基である］を有する。これらの候補連結基は、上記において記載された方法と類似の方法を使用して査定されうる。
一部の実施形態において、本開示のｉＲＮＡは、リンカーを介して、炭水化物とコンジュゲートされている。ｉＲＮＡの、本発明の組成物および方法のリンカーを伴う、炭水化物コンジュゲートの非限定例は、
Figure 2023506258000029
Figure 2023506258000030
 （式ＸＬＩＶ）［式中、ＸまたはＹのうちの一方が、オリゴヌクレオチドである場合、他方は、水素である］
を含むがこれらに限定されない。
本発明の組成物および方法についての、ある特定の実施形態において、リガンドは、二価または三価の分枝状リンカーを介して接合された、１つまたは複数の「ＧａｌＮＡｃ」（Ｎ－アセチルガラクトサミン）誘導体である。
本発明についての一実施形態においてｄｓＲＮＡは、式（ＸＬＶ）～（ＸＬＶＩ）のうちのいずれかに示された構造の群から選択される、二価または三価の分枝状リンカー：
Figure 2023506258000031
 ［式中、
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ、およびｑ５Ｃは、独立に、各出現について、０～２０を表し、この場合、反復単位は、同じ場合もあり、異なる場合もあり；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃは、各々、独立に、各出現について、非存在、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ、またはＣＨ２Ｏであり；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃは、独立に、各出現について、非存在、アルキレン、置換アルキレンであり、この場合、１つまたは複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡Ｃ、またはＣ（Ｏ）のうちの１つまたは複数により、中断される場合もあり、終結する場合もあり；
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃは、各々、独立に、各出現について、非存在、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ（Ｒａ）－ＮＨ－、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ－Ｏ、
Figure 2023506258000032
 、またはヘテロシクリルであり；
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃは、各々、独立に、各出現について、リガンドを表す；すなわち、単糖（ＧａｌＮＡｃなど）、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、または多糖を表し；Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖である］とコンジュゲートされている。三価コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体は、式（ＸＬＩＸ）：
Figure 2023506258000033
 ［式中、Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃは、ＧａｌＮＡｃ誘導体などの単糖を表す］
のＲＮＡｉ剤など、標的遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤を伴う使用に、特に、有用である。
ＧａｌＮＡｃ誘導体をコンジュゲートする、適切な二価の分枝状リンカーおよび三価の分枝状リンカー基の例は、上記において、式ＩＩ、ＶＩＩ、ＸＩ、Ｘ、およびＸＩＩＩとして列挙された構造を含むがこれらに限定されない。
ＲＮＡコンジュゲートの調製について教示する、代表的な米国特許は、それらの各々の全内容が、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号；同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号；同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号；同第５，６８８，９４１号；同第６，２９４，６６４号；同第６，３２０，０１７号；同第６，５７６，７５２号；同第６，７８３，９３１号；同第６，９００，２９７号；同第７，０３７，６４６号；および同第８，１０６，０２２号を含むがこれらに限定されない。
所与の化合物内の全ての位置が、一様に修飾されることは必要でなく、実際、前述の修飾のうちの１つを超える修飾は、単一の化合物内に組み込まれる場合もあり、ｉＲＮＡ内の単一のヌクレオシドに組み込まれる場合さえある。本発明はまた、キメラ化合物である、ｉＲＮＡ化合物も含む。
本発明の文脈における、「キメラ」ｉＲＮＡ化合物または「キメラ」とは、各々が、少なくとも１つの単量体単位、すなわち、ｄｓＲＮＡ化合物の場合におけるヌクレオチドから構成される、２つまたはこれを超える、化学的に顕著に異なる領域を含有するｉＲＮＡ化合物、好ましくは、ｄｓＲＮＡｉ剤である。これらのｉＲＮＡは、典型的に、ｉＲＮＡに、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性の増大、細胞内取込みの増大、または標的核酸に対する結合アフィニティーの増大を付与するように、ＲＮＡが修飾された、少なくとも１つの領域を含有する。ｉＲＮＡのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド体またはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッド体を切断することが可能な酵素のための基質として用いられうる。例として述べると、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する、細胞内エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮアーゼＨの活性化は、ＲＮＡ標的の切断を結果としてもたらし、これにより、ｉＲＮＡによる遺伝子発現の阻害の効率を大幅に増強する。結果として、キメラｄｓＲＮＡが使用される場合、同じ標的領域とハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、より短いｉＲＮＡにより同等の結果が得られうることが多い。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動および、必要な場合、関連の当技術分野において公知の核酸ハイブリダイゼーション法により、常套的に検出されうる。
ある特定の場合に、ｉＲＮＡのＲＮＡは、非リガンド基により修飾されうる。活性、細胞内分布、またはｉＲＮＡの細胞への取込みを増強するために、多数の非リガンド分子が、ｉＲＮＡへとコンジュゲートされており、このようなコンジュゲーションを実施するための手順は、学術文献において入手可能である。このような非リガンド部分は、コレステロール部分などの脂質部分［Kubo, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61; Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553］、コール酸［Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053］、チオエーテル、例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオール［Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765］、チオコレステロール［Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533］、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基［Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49］、リン脂質、例えば、ジヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールもしくはトリエチル－アンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート［Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777］、ポリアミン鎖もしくはポリエチレングリコール鎖［Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969］、またはアダマンタン酢酸［Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651］、パルミチル部分［Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229］、またはオクタデシルアミン部分もしくはヘキシルアミノカルボニルオキシコレステロール部分［Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923］を含んだ。このようなＲＮＡコンジュゲートの調製について教示する代表的米国特許は、上記において列挙されている。典型的なコンジュゲーションプロトコールは、配列の１つまたは複数の位置において、アミノリンカーを保有するＲＮＡの合成を伴う。次いで、適切なカップリング試薬または活性化試薬を使用して、アミノ基を、コンジュゲートされている分子と反応させる。コンジュゲーション反応は、ＲＮＡが固体支持体に結合したまま実施される場合もあり、ＲＮＡを切断した後、溶液相中において実施される場合もある。ＨＰＬＣによるＲＮＡコンジュゲートの精製は、典型的に、純粋なコンジュゲートをもたらす。
ＩＶ．本開示のｉＲＮＡのデリバリー
本開示のｉＲＮＡの、細胞、例えば、ヒト対象（例えば、ＰＮＰＬＡ３関連障害、例えば、ＮＡＦＬＤに罹患しやすいか、またはこれを伴うと診断された対象など、それを必要とする対象）などの対象内部の細胞へのデリバリーは、多数の異なる形において達成されうる。例えば、デリバリーは、インビトロまたはインビボにおいて、細胞の、本開示のｉＲＮＡとの接触により実施されうる。インビボにおけるデリバリーはまた、ｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡを含む組成物を、対象へと投与することによっても、直接的に実施されうる。代替的に、インビボにおけるデリバリーは、ｉＲＮＡをコードする、１つまたは複数のベクターを投与し、ｉＲＮＡの直接的な発現をもたらすことにより、間接的にも実施されうる。これらの代替法については、下記において、さらに論じられる。
一般に、核酸分子をデリバリーする任意の方法（インビトロまたはインビボにおいて）は、本開示のｉＲＮＡを伴う使用に適合させられうる［例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Akhtar S. and Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139-144；およびＷＯ９４／０２５９５を参照されたい］。インビボにおけるデリバリーについて、ｉＲＮＡ分子をデリバリーするために検討すべき因子は、例えば、デリバリーされた分子の生物学的安定性、非特異的作用の防止、およびデリバリーされた分子の標的組織内蓄積を含む。ＲＮＡ干渉はまた、直接的な注射による、ＣＮＳへの局所的デリバリーによる成功も示している［Dorn, G., et al. (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH., et al (2005) Gene Ther. 12:59-66; Makimura, H., et al (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., et al (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, ER., et al (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-17275; Akaneya,Y., et al (2005) J. Neurophysiol. 93:594-602］。ＲＮＡの修飾または医薬担体はまた、ｉＲＮＡの、標的組織へのターゲティングを可能とし、所望されないオフターゲット効果を回避することも可能である。ｉＲＮＡ分子は、細胞内の取込みを増強し、分解を防止するように、コレステロールなどの親油性基との化学コンジュゲーションにより修飾されうる。例えば、親油性コレステロール部分とコンジュゲートされたＡｐｏＢに対して方向付けられたｉＲＮＡが、マウスへと全身注射される結果として、肝臓および空腸の両方における、ａｐｏＢ ｍＲＮＡのノックダウンがもたらされた［Soutschek, J., et al (2004) Nature 432:173-178］。
代替的実施形態において、ｉＲＮＡは、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性デリバリーシステムなどの薬物デリバリーシステムを使用してデリバリーされうる。正に帯電したカチオン性デリバリーシステムは、ｉＲＮＡ分子（負に帯電した）の結合を容易とし、また、細胞によるｉＲＮＡの効率的な取込みを可能とするように、負に帯電した細胞膜における相互作用も増強する。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、ｉＲＮＡに結合される場合もあり、ｉＲＮＡを封入する小胞またはミセル［例えば、Kim SH, et al (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116を参照されたい］を形成するように誘導される場合もある。小胞またはミセルの形成は、全身投与された場合に、ｉＲＮＡの分解をさらに防止する。カチオン性ｉＲＮＡ複合体を作製し、投与するための方法は、十分に、当業者の能力の範囲内にある［例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Sorensen, DR, et al (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, UN, et al (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, AS et al (2007) J. Hypertens. 25:197-205を参照されたい］。ｉＲＮＡの全身デリバリーに有用な薬物デリバリーシステムの、一部の非限定例は、ＤＯＴＡＰ［Sorensen, DR., et al (2003), supra; Verma, UN, et al (2003), supra］、「固体核酸脂質粒子」［Zimmermann, TS, et al (2006) Nature 441:111-114］、カルジオリピン［Chien, PY, et al (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328; Pal, A, et al (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091］、ポリエチレンイミン［Bonnet ME, et al (2008) Pharm. Res. Aug 16 Epub ahead of print; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659］、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド［Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487］、およびポリアミドアミン［Tomalia, DA, et al (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H., et al (1999) Pharm. Res. 16:1799-1804］を含む。一部の実施形態において、ｉＲＮＡは、シクロデキストリンと共に、全身投与のための複合体を形成する。ｉＲＮＡおよびシクロデキストリンの投与のための方法および医薬組成物は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第７，４２７，６０５号において見出されうる。
Ａ．本発明のｉＲＮＡをコードしたベクター
ＰＮＰＬＡ３遺伝子をターゲティングするｉＲＮＡは、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターへと挿入された転写単位から発現される［例えば、Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10；Skillern, A, et al.、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ００／２２１１３号；Ｃｏｎｒａｄ、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ００／２２１１４号；およびＣｏｎｒａｄ、米国特許第６，０５４，２９９号を参照されたい］。発現は、使用される具体的コンストラクト、および標的組織または標的細胞型に応じて、一過性（数時間～数週間のオーダーにおける）の場合もあり、持続性（数週間～数カ月間またはこれを超える）の場合もある。これらのトランス遺伝子は、組込型の場合もあり、非組込型ベクターの場合もある、直鎖状コンストラクト、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入されうる。トランス遺伝子はまた、追加の染色体性プラスミドとして受け継がれることを可能とするように構築される場合もある［Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292］。
本明細書において記載される方法および組成物と共に利用されうるウイルスベクター系は、（ａ）アデノウイルスベクター；（ｂ）レンチウイルスウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスなどを含むがこれらに限定されない、レトロウイルスベクター；（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター；（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター；（ｅ）ＳＶ４０ベクター；（ｆ）ポリオーマウイルスベクター；（ｇ）パピローマウイルスベクター；（ｈ）ピコルナウイルスベクター；（ｉ）オルトポックスウイルスベクター、例えば、ワクシニアウイルスベクター、またはアビポックスウイルスベクター、例えば、カナリアポックスウイルスベクターまたは鶏痘ウイルスベクターなどのポックスウイルスベクター；および（ｊ）ヘルパー依存性アデノウイルスまたはガットレスアデノウイルスを含むがこれらに限定されない。複製欠損ウイルスもまた、有利でありうる。ベクターにより、細胞ゲノムへと組み込まれる場合もあり、組み込まれない場合もある。コンストラクトは、所望の場合、トランスフェクションのためのウイルス配列を含みうる。代替的に、コンストラクトは、エピソーム内の複製が可能なベクター、例えば、ＥＰＶベクターおよびＥＢＶベクターへと組み込まれうる。ｉＲＮＡの組換え発現のためのコンストラクトは、一般に、標的細胞内のｉＲＮＡの発現を確保するように、調節的要素、例えば、プロモーター、エンハンサーなどを要求する。ベクターおよびコンストラクトについて検討すべき他の側面は、当技術分野において公知である。
Ｖ．本発明の医薬組成物
本発明はまた、本発明のｉＲＮＡを含む、医薬組成物および製剤も含む。本明細書の一実施形態においては、本明細書において記載される、ｉＲＮＡを含有する医薬組成物と、薬学的に許容される担体とが提示される。ｉＲＮＡを含有する医薬組成物は、ＰＮＰＬＡ３関連障害、例えば、高トリグリセリド血症を防止または処置するために有用である。このような医薬組成物は、デリバリー方式に基づき製剤化される。一例は、例えば、皮下（ＳＣ）デリバリー、筋内（ＩＭ）デリバリー、または静脈内（ＩＶ）デリバリーによる非経口デリバリーを介する全身投与のために製剤化された組成物である。本発明の医薬組成物は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害するのに十分な投与量において投与されうる。
一部の実施形態において、本発明の医薬組成物は、滅菌である。別の実施形態において、本発明の医薬組成物は、発熱物質非含有である。
本発明の医薬組成物は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害するのに十分な投与量において投与されうる。一般に、本開示のｉＲＮＡの適切な用量は、１日当たり、レシピエントの体重１キログラム当たり、約０．００１～約２００．０ミリグラムの範囲であり、一般に、１日当たり、体重１キログラム当たり、約１～５０ｍｇの範囲であろう。典型的に、本開示のｉＲＮＡの適切な用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５．０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約３．０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。反復投与レジメンは、毎月、３～６カ月間ごとに１回、または１年ごとに１回など、定期的な、治療量のｉＲＮＡの投与を含みうる。ある特定の実施形態において、ｉＲＮＡは、１カ月ごとに約１回～６カ月ごとに約１回投与される。
初期の処置レジメンの後、処置は、より低い頻度において投与されうる。処置の持続期間は、疾患の重症度に基づき決定されうる。
他の実施形態において、投与が、１、２、３、または４カ月を超えない間隔においてなされるように、医薬組成物の単回投与のための用量は、長期にわたり残存しうる。本発明の一部の実施形態において、本発明の医薬組成物の単回投与のための用量は、１カ月ごとに約１回投与される。本発明の他の実施形態において、本発明の医薬組成物の単回投与のための用量は、毎年４回（すなわち、約３カ月ごとに）投与される。本発明についての他の実施形態において、本発明の医薬組成物の単回投与のための用量は、毎年２回（すなわち、６カ月ごとに約１回）投与される。
当業者は、対象において存在する突然変異、既往の処置、対象の全般的健康状態または年齢、および存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない、ある特定の因子が、対象を有効に処置するのに要求される投与量およびタイミングに影響を及ぼしうることを理解するであろう。さらに、適切な予防有効量または治療有効量の組成物による、対象の処置は、単回処置または処置シリーズを含みうる。
ｉＲＮＡは、特定の組織（例えば、肝細胞）をターゲティングするようにデリバリーされうる。
本発明の医薬組成物は、溶液、エマルジョン、およびリポソーム含有製剤を含むがこれらに限定されない。これらの組成物は、あらかじめ形成された液体、自己乳化固体、および自己乳化半固体を含むがこれらに限定されない、様々な成分から作出されうる。製剤は、肝臓をターゲティングする製剤を含む。
好都合に、単位剤形において提示される、本発明の医薬製剤は、医薬業界において周知の常套的な技法に従い調製されうる。このような技法は、有効成分を、医薬担体（複数可）または賦形剤（複数可）と会合させる工程を含む。一般に、製剤は、有効成分を、液体担体と、一様にかつ緊密に会合させることにより調製される。
Ａ．さらなる製剤
ｉ．エマルジョン
本発明の組成物は、エマルジョンとして調製および製剤化されうる。エマルジョンは、典型的に、１つの液体が、別の液体中に、通例、直径が０．１μｍを超える液滴の形態において分散させられた、不均一系である［例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi et al., in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301を参照されたい］。エマルジョンは、互いと緊密に混合され、分散させられた、２つの不混和液相を含む二相系であることが多い。一般に、エマルジョンは、油中水（ｗ／ｏ）型の場合もあり、水中油（ｏ／ｗ）型の場合もある。水性相が、微小な液滴へと微細に分割され、微小な液滴として、バルク油性相へと分散させられる場合、結果として得られる組成物は、油中水（ｗ／ｏ）エマルジョンと呼ばれる。代替的に、油性相が、微小な液滴へと微細に分割され、微小な液滴として、バルク水性相へと分散させられる場合、結果として得られる組成物は、水中油（ｏ／ｗ）エマルジョンと呼ばれる。エマルジョンは、分散相に加えて、さらなる成分と、水性相、油性相、または別個の相としてのそれ自体において、溶液として存在しうる、活性薬物とを含有しうる。乳化剤、安定化剤、色素、および抗酸化剤などの医薬賦形剤もまた、必要に応じて、エマルジョン中に存在しうる。医薬エマルジョンはまた、例えば、油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）エマルジョン、および水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）エマルジョンの場合など、２つを超える相から構成される、複数のエマルジョンでもありうる。このような複合体製剤は、単純な二元エマルジョンがもたらさない、ある特定の利点をもたらすことが多い。ｏ／ｗエマルジョンの個々の油滴が、小型の水滴を封入する、複数のエマルジョンは、ｗ／ｏ／ｗエマルジョンを構成する。同様に、油性の連続相中において安定化させられた、水の小球内に封入された油滴系は、ｏ／ｗ／ｏエマルジョンをもたらす。
エマルジョンは、熱力学的安定性が殆どまたは全く存在しないことにより特徴づけられる。エマルジョンの分散相または不連続相は、外部相または連続相へと十分に分散させられ、乳化剤または製剤の粘性により、この形態において維持されることが多い。エマルジョンを安定化させる、他の手段は、エマルジョンのいずれかの相へと組み込まれうる乳化剤の使用を伴う。乳化剤は、大きく、４つの類別：合成界面活性剤、天然に存在する乳化剤、吸収塩基、および微細分散固体へと分類されうる［例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199を参照されたい］。
表面活性剤としてもまた公知の、合成界面活性剤は、エマルジョン製剤において、広範に適用されており、文献中において総説されている［例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199を参照されたい］。界面活性剤は、典型的に、両親媒性であり、親水性部分と、疎水性部分とを含む。界面活性剤の、親水性性質の、疎水性性質に対する比は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と称されており、製剤を調製する場合の、界面活性剤の類別および選択において、有用なツールである。界面活性剤は、親水性基の性質に基づき、異なるクラス：非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両親媒性界面活性剤へと分類されうる［例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285を参照されたい］。
多種多様な非乳化材料もまた、エマルジョン製剤に含まれ、エマルジョンの特性に寄与する。これらは、脂肪、油、蝋、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、保湿剤、親水性コロイド、保存剤、および抗酸化剤を含む［Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199］。
皮内経路、経口経路、および非経口経路を介する、エマルジョン製剤の適用、およびそれらの製造のための方法については、文献において総説されている［例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199を参照されたい］。
ｉｉ．マイクロエマルジョン
本発明についての一実施形態において、ｉＲＮＡおよび核酸の組成物は、マイクロエマルジョンとして製剤化される。マイクロエマルジョンは、最適に等方性であり、熱力学的に安定な、単一の溶液である、水、油、両親媒物の系として規定されうる［例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245を参照されたい］。典型的に、マイクロエマルジョンとは、まず、油を、界面活性剤水溶液中に分散させ、次いで、十分量の第４の成分、一般に、中間鎖長のアルコールを添加して、透明系を形成することにより調製される系である。したがって、マイクロエマルジョンはまた、表面活性分子の界面膜により安定化させられる、２つの不混和液体の、熱力学的に安定であり、等方的に透明な分散体としても記載されている［Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215］。
ｉｉｉ．マイクロ粒子
本開示のｉＲＮＡは、粒子、例えば、マイクロ粒子へと組み込まれうる。マイクロ粒子は、噴霧乾燥により作製されうるが、また、凍結乾燥、蒸発、流動層乾燥、真空乾燥、またはこれらの技法の組合せを含む、他の方法によっても作製されうる。
ｉｖ．透過増強剤
一実施形態において、本発明は、核酸、特に、ｉＲＮＡの、動物の皮膚への、効率的なデリバリーをもたらす、多様な透過増強剤を利用する。大半の薬物は、溶液中、イオン化形態および非イオン化形態の両方において存在する。しかし、通例、脂質可溶性または親油性の薬物だけが、細胞膜をたやすく越える。越えられる膜が、透過増強剤により処理される場合、非親油性薬物であってもなお、細胞膜を越えることが発見されている。細胞膜を越える、非親油性薬物の拡散の補助に加えて、透過増強剤はまた、親油性薬物の透過性も増強する。
透過増強剤は、５つの大きな類別、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート化剤、および非キレート化非界面活性剤のうちの１つに属するものとして分類されうる［例えば、Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92を参照されたい］。上述の透過増強剤のクラスの各々、ならびに医薬組成物の製造および医薬剤のデリバリーにおけるこれらの使用は、当技術分野において周知である。
ｖ．賦形剤
担体化合物と対照的に、「医薬担体」または「賦形剤」とは、１つまたは複数の核酸を、動物へとデリバリーするための、薬学的に許容される溶媒、懸濁剤、または、他の任意の、薬理学的に不活性の媒体である。賦形剤は、液体の場合もあり、固体の場合もあり、核酸、および所与の医薬組成物の他の成分と組み合わされた場合に、所望のバルク、粘稠性などをもたらすように、計画された、念頭にある投与方式により選択される。このような薬剤は、当技術分野において周知である。
ｖｉ．他の成分
本発明の組成物は、加えて、医薬組成物中に、当技術分野において確立された、それらの用法レベルにおいて、常套的に見出される、他の補助成分を含有しうる。したがって、例えば、組成物は、例えば、鎮痒剤、収斂剤、局所麻酔剤、または抗炎症剤など、さらなる、適合性の、薬学的に活性の材料を含有する場合もあり、着色剤、香味剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、および安定化剤など、本発明の組成物の多様な剤形の物理的調合において有用な、さらなる材料を含有する場合もある。しかし、このような材料は、添加された場合に、本発明の組成物の成分の生物学的活性に、過度に干渉しないものとする。製剤は、滅菌処理され、所望の場合に、製剤の核酸（複数可）と、有害な形において相互作用しない補助剤、例えば、滑沢剤、保存剤、安定化剤、保湿剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝剤、着色剤、香味剤、または芳香物質などと混合される。
水性懸濁液は、懸濁液の粘性を増大させる物質であって、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含む物質を含有しうる。懸濁液はまた、安定化剤も含有しうる。
一部の実施形態において、本発明において特色づけられる医薬組成物は、（ａ）１つまたは複数のｉＲＮＡ、および（ｂ）ｉＲＮＡ以外の機構により機能し、ＰＮＰＬＡ３３関連障害、例えば、ＮＡＦＬＤの処置において有用である、１つまたは複数の薬剤を含む。
このような化合物の毒性および予防的有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団のうちの５０％に対して、致死性である用量）、およびＥＤ５０（集団のうちの５０％において、予防的に有効である用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物における、標準的な薬学的手順により決定されうる。毒性作用と、治療効果との用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表される。高治療指数を呈する化合物が好ましい。
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用のための、投与量範囲の策定において使用されうる。本発明における、本明細書において特色づけられる組成物の投与量は、一般に、毒性を、殆どまたは全く伴わない、ＥＤ５０、好ましくは、ＥＤ８０、またはＥＤ９０を含む、循環濃度の範囲内にある。投与量は、利用される剤形、および利用される投与経路に応じて、この範囲内において変動しうる。本発明において特色づけられる方法において使用される任意の化合物について、予防有効用量は、まず、細胞培養アッセイから推定されうる。細胞培養物中において決定される、ＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する、被験化合物の濃度）またはこれを超える阻害レベルを含む用量は、化合物または、適切な場合、標的配列のポリペプチド産物の、循環血漿濃度範囲を達成する（例えば、ポリペプチド濃度の低下を達成する）ように、動物モデルにおいて策定されうる。このような情報は、ヒトにおける有用用量を、より正確に決定するのに使用されうる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定されうる。
上記において論じられた、それらの投与に加えて、本発明において特色づけられるｉＲＮＡは、ＰＮＰＬＡ３（ａＰＮＰＬＡ３）関連障害、例えば、ＮＡＦＬＤの防止または処置のために使用される、他の公知の薬剤と組み合わせても投与されうる。いずれにせよ、投与する医師は、当技術分野において公知であるか、または本明細書において記載されている、有効性についての標準的な尺度を使用して観察される結果に基づき、ｉＲＮＡ投与の量およびタイミングを調整することができる。
ＶＩ．ＰＮＰＬＡ３の発現を阻害するための方法
本発明はまた、細胞内のＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害する方法も提供する。方法は、細胞を、細胞内のＰＮＰＬＡ３の発現を阻害するのに有効な量のＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡ剤と接触させ、これにより、細胞内のＰＮＰＬＡ３の発現を阻害することを含む。
細胞の、ｉＲＮＡ、例えば、二本鎖ＲＮＡ剤との接触は、インビトロにおいてなされる場合もあり、インビボにおいてなされる場合もある。インビボにおける細胞の、ｉＲＮＡとの接触は、対象、例えば、ヒト対象の内部の細胞または細胞群の、ｉＲＮＡとの接触を含む。細胞を接触させるインビトロ法とインビボ法との組合せもまた、可能である。上記において論じられた通り、細胞の接触は、直接的な場合もあり、間接的な場合もある。さらに、細胞の接触は、本明細書において記載されるか、または当技術分野において公知の、任意のリガンドを含む、ターゲティングリガンドを介して達せられうる。好ましい実施形態において、ターゲティングリガンドは、炭水化物部分、例えば、ＧａｌＮＡｃ３リガンド、またはＲＮＡｉ剤を、目的の部位へと方向付ける、他の任意のリガンドである。
本明細書において使用される、「～を阻害すること」という用語は、「～を低減すること」、「～をサイレンシングすること」、「～を下方調節すること」、「～を抑制すること」、および他の同様の用語と互換的に使用され、任意のレベルの阻害を含む。
「ＰＮＰＬＡ３の発現を阻害すること」という語句は、任意のＰＮＰＬＡ３遺伝子［例えば、マウスＰＮＰＬＡ３ ３（ＰＮＰＬＡ３ ３）遺伝子、ラットＰＮＰＬＡ３遺伝子、サルＰＮＰＬＡ３遺伝子、またはヒトＰＮＰＬＡ３遺伝子など］のほか、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の変異体または突然変異体の発現の阻害を指すように意図される。したがって、ＰＮＰＬＡ３遺伝子は、野生型ＰＮＰＬＡ３遺伝子の場合もあり、突然変異体ＰＮＰＬＡ３遺伝子の場合もあり、遺伝子操作された細胞、細胞群、もしくは生物の文脈における、トランスジェニックＰＮＰＬＡ３遺伝子の場合もある。
「ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現の阻害」は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の、任意のレベルの阻害、例えば、ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現の、少なくとも部分的な抑制を含む。ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現と関連する、任意の変数のレベル、またはレベルの変化、例えば、ＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡレベルまたはＰＮＰＬＡ３タンパク質レベルに基づき評価されうる。このレベルは、例えば、対象に由来する試料を含む、個々の細胞または細胞群において評価されうる。ＰＮＰＬＡ３は、主に、肝臓内において発現されるが、また、脳内、胆嚢内、心臓内、および腎臓内においても発現され、循環中においても存在することが理解される。
阻害は、ＰＮＰＬＡ３の発現と関連する、１つまたは複数の変数の絶対レベルまたは相対レベルの、対照レベルと比較した低下により評価されうる。対照レベルは、当技術分野において利用される、任意の種類の対照レベル、例えば、投与前のベースラインレベル、または非処置であるか、もしくは対照（例えば、緩衝液だけの対照または非活性薬剤対照など）により処置された、同様の対象、細胞、もしくは試料から決定されるレベルでありうる。
本発明の方法についての、一部の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、またはアッセイの検出レベルを下回るレベルまで阻害される。好ましい実施形態において、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現は、少なくとも７０％阻害される。他の組織内、例えば、脳内における発現の著明な阻害を伴わない、ある特定の組織内、例えば、肝臓内における、ＰＮＰＬＡ３発現の阻害が所望でありうることがさらに理解される。好ましい実施形態において、発現レベルは、種をマッチさせた、適切な細胞系のｓｉＲＮＡ濃度を１０ｎＭとする、実施例２に提示されるアッセイ法を使用して決定される。
ある特定の実施形態において、インビボにおける発現の阻害は、例えば、３ｍｇ／ｋｇにおける、例えば、単回投与として投与された場合の、ヒト遺伝子を発現する齧歯動物、例えば、ヒト標的遺伝子（すなわち、ＰＮＰＬＡ３）を発現するＡＡＶ感染マウスの、ＲＮＡ発現の最低レベルにおける、ヒト遺伝子のノックダウンにより決定される。モデル動物系における、内因性遺伝子発現のノックダウンもまた、例えば、例えば、３ｍｇ／ｋｇにおける単回投与後の、ＲＮＡ発現の最低レベルにおいて決定されうる。このような系は、ヒトｉＲＮＡが、モデル動物遺伝子の有効なノックダウンをもたらすように、ヒト遺伝子の核酸配列と、モデル動物遺伝子の核酸配列とが、十分に近縁である場合に有用である。肝臓内のＲＮＡ発現は、実施例２に提示されるＰＣＲ法を使用して決定される。
ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現の阻害は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現が、第１の細胞または細胞群と、実質的に同一であるが、このように処置されていない、第２の細胞または細胞群［ｉＲＮＡにより処置されていないか、または目的の遺伝子へとターゲティングされるｉＲＮＡにより処置されていない対照細胞（複数可）］と比較して阻害されるように、ＰＮＰＬＡ３遺伝子が転写され、処置されている（例えば、１つもしくは複数の細胞を、本発明のｉＲＮＡと接触させることにより、または本発明のｉＲＮＡを、細胞が存在するか、もしくは存在した対象へと投与することにより）、第１の細胞または細胞群（このような細胞は、例えば、対象に由来する試料中に存在しうる）により発現されるｍＲＮＡの量の低減により顕示されうる。好ましい実施形態において、阻害は、種をマッチさせた細胞系において、１０ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度を使用し、以下の式：
Figure 2023506258000034
 を使用して、処置細胞内のｍＲＮＡのレベルを、対照細胞内のｍＲＮＡのレベルに対する百分率として表す、実施例２に提示される方法により評価される。
他の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現の阻害は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現と機能的に関連するパラメータ、例えば、対象に由来する血液中または血清中のＰＮＰＬＡ３タンパク質レベルの低減に関して評価されうる。ＰＮＰＬＡ３遺伝子のサイレンシングは、内因性ＰＮＰＬＡ３を発現するか、または発現コンストラクトから異種ＰＮＰＬＡ３を発現する任意の細胞内において、当技術分野において公知の任意のアッセイにより決定されうる。
ＰＮＰＬＡ３タンパク質発現の阻害は、細胞もしくは細胞群により発現するＰＮＰＬＡ３タンパク質レベル、または対象試料中のＰＮＰＬＡ３タンパク質レベル（例えば、対象に由来する血液試料中のタンパク質レベル）の低減により顕示されうる。ｍＲＮＡ抑制の評価について、上記において説明された通り、処置細胞内または細胞群内のタンパク質発現レベルの阻害は、同様に、対照細胞内もしくは対照細胞群内のタンパク質レベルに対する百分率として、または対象試料中、例えば、対象に由来する血液中もしくは血清中のタンパク質レベルの変化としても表されうる。
ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現の阻害について評価するのに使用されうる、対照細胞、細胞群、または対象試料は、本発明のＲＮＡｉ剤と接触させられていない細胞、細胞群、または対象試料を含む。例えば、対照細胞、細胞群、または対象試料は、ＲＮＡｉ剤による対象の処置の前における、個々の対象（例えば、ヒト対象または動物対象）に由来する場合もあり、マッチが適切な集団対照に由来する場合もある。
細胞または細胞群により発現するＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡのレベルは、ｍＲＮＡ発現について評価するための、当技術分野において公知の任意の方法を使用して決定されうる。一実施形態において、試料中のＰＮＰＬＡ３の発現レベルは、転写されるポリヌクレオチド、またはその部分、例えば、ＰＮＰＬＡ３遺伝子のｍＲＮＡを検出することにより決定される。ＲＮＡは、例えば、酸フェノール／イソチオシアン酸グアジニン抽出（ＲＮＡｚｏｌ Ｂ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、ＲＮｅａｓｙ（商標）ＲＮＡ調製キット［Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）］またはＰＡＸｇｅｎｅ（商標）［ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ（商標）、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ］の使用を含む、ＲＮＡ抽出法を使用して、細胞から抽出されうる。リボ核酸ハイブリダイゼーションを用いる、典型的なアッセイフォーマットは、核ランオンアッセイ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護アッセイ、ノーザンブロット法、インサイチューハイブリダイゼーション、およびマイクロアレイ解析を含む。
一部の実施形態において、ＰＮＰＬＡ３の発現レベルは、核酸プローブを使用して決定される。本明細書において使用される、「プローブ」という用語は、特異的なＰＮＰＬＡ３に選択的に結合することが可能な、任意の分子を指す。プローブは、当業者により合成される場合もあり、適切な生物学的調製物に由来する場合もある。プローブは、標識付けされるように、特異的にデザインされうる。プローブとして利用されうる分子の例は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、および有機分子を含むがこれらに限定されない。
単離ｍＲＮＡは、サザン解析またはノーザン解析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）解析、およびプローブアレイを含むがこれらに限定されない、ハイブリダイゼーションアッセイまたは増幅アッセイにおいて使用されうる。ｍＲＮＡレベルを決定するための１つ方法は、単離ｍＲＮＡを、ＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡとハイブリダイズしうる核酸分子（プローブ）と接触させることを伴う。一実施形態において、例えば、単離ｍＲＮＡを、アガロースゲル上において泳動させ、ｍＲＮＡを、ゲルから、ニトロセルロースなどの膜へと転写することにより、ｍＲＮＡは、固体表面上に固定化され、プローブと接触させられる。代替的実施形態において、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）遺伝子チップアレイにおいて、プローブ（複数可）は、固体表面上に固定化され、ｍＲＮＡは、プローブと接触させられる。当業者は、公知のｍＲＮＡ検出法を、ＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡのレベルの決定における使用のために、たやすく適合させることができる。
試料中のＰＮＰＬＡ３の発現レベルを決定するための代替的方法は、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ、１９８７、米国特許第４，６８３，２０２号において明示されている実験的実施形態）、リガーゼ連鎖反応［Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193］、自己持続配列複製［Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878］、転写増幅系［Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177］、Ｑベータレプリカーゼ［Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197］、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉら、米国特許第５，８５４，０３３号）、または他の任意の核酸増幅法に続く、当業者に周知の技法を使用する増幅された分子の検出による、例えば、試料中のｍＲＮＡに対する核酸増幅工程または逆転写酵素工程（ｃＤＮＡを調製する工程）を伴う。これらの検出スキームは、とりわけ、このような分子が、極めて少数存在する場合における、核酸分子の検出に有用である。本発明の特定の態様において、ＰＮＰＬＡ３の発現レベルは、定量蛍光ＲＴ－ＰＣＲ［すなわち、ＴａｑＭａｎ（商標）システム］により決定される。好ましい実施形態において、発現レベルは、例えば、種にマッチさせた細胞系において、１０ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度を使用する、実施例２に提示される方法により決定される。
ＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡの発現レベルは、膜ブロット（ノーザンブロット、サザンブロット、ドットブロットなどのハイブリダイゼーション解析において使用される膜ブロットなど）、またはマイクロウェル、試験管、ゲル、ビーズ、またはファイバー（または結合核酸を含む、任意の固体支持体）を使用してモニタリングされうる。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７７０，７２２号、同第５，８７４，２１９号、同第５，７４４，３０５号、同第５，６７７，１９５号、および同第５，４４５，９３４号を参照されたい。ＰＮＰＬＡ３発現レベルの決定はまた、溶液中の核酸プローブの使用も含みうる。
好ましい実施形態において、ｍＲＮＡ発現のレベルは、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイまたはリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して評価される。これらの方法の使用は、本明細書に提示される実施例において記載され、例示される。好ましい実施形態において、発現レベルは、種をマッチさせた細胞系において、１０ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度を使用する、実施例２に提示される方法により決定される。
ＰＮＰＬＡ３タンパク質発現のレベルは、タンパク質レベルの測定のための、当技術分野において公知の任意の方法を使用して決定されうる。このような方法は、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高拡散クロマトグラフィー、流体沈降素反応またはゲル沈降素反応、吸収分光法、比色アッセイ、分光光度アッセイ、フローサイトメトリー、免疫拡散（単一免疫拡散または二重免疫拡散）、免疫電気泳動、ウェスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、電気化学発光アッセイなどを含む。
一部の実施形態において、本発明の方法の有効性は、ＰＮＰＬＡ３のｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベル（例えば、肝生検中の）の低下により評価される。
本発明の方法についての、一部の実施形態において、ｉＲＮＡは、ｉＲＮＡが、対象内部の特異的部位へとデリバリーされるように、対象へと投与される。ＰＮＰＬＡ３の発現の阻害は、対象内部の特異的部位からの体液または組織（例えば、肝臓または血液）に由来する試料中のＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡまたはＰＮＰＬＡ３タンパク質のレベルまたはレベルの変化の測定を使用して評価されうる。
本明細書において使用された、解析物のレベルの検出または決定という用語は、素材、例えば、タンパク質、ＲＮＡが存在するのかどうかを決定する工程の実施を意味するように理解される。本明細書において使用される、検出または決定する方法は、使用される方法のための検出レベルを下回る解析物レベルの検出または決定を含む。
ＶＩＩ．本発明の予防法および処置法
本発明はまた、本発明のｉＲＮＡ、または本発明のｉＲＮＡを含有する組成物を使用して、ＰＮＰＬＡ３の発現を阻害し、これにより、ＰＮＰＬＡ３関連障害、例えば、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓内の脂肪の蓄積、肝炎、肝細胞壊死、肝線維症、肥満、または非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を防止または処置する方法も提供する。本発明の方法において、細胞は、インビトロまたはインビボにおいて、ｓｉＲＮＡと接触させられうる、すなわち、細胞は、対象内部の細胞でありうる。
本発明の方法を使用する処置に適する細胞は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子を発現する任意の細胞、例えば、肝細胞、脳細胞、胆嚢細胞、心臓細胞、または腎臓細胞でありうるが、好ましくは、肝細胞でありうる。本発明の方法における使用に適する細胞は、哺乳動物細胞、例えば、霊長動物細胞（キメラ非ヒト動物におけるヒト細胞を含むヒト細胞、または非ヒト霊長動物細胞、例えば、サル細胞もしくはチンパンジー細胞など）の場合もあり、非霊長動物細胞の場合もある。ある特定の実施形態において、細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒト肝細胞である。本発明の方法において、ＰＮＰＬＡ３発現は、細胞内において、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、もしくは９５、またはアッセイの検出レベルを下回るレベルまで阻害される。
本発明のインビボ法は、対象へと、ｉＲＮＡを含有する組成物を投与することを含む場合があり、この場合、ｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ剤が投与される哺乳動物のＰＮＰＬＡ３遺伝子のＲＮＡ転写物のうちの、少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含む。組成物は、頭蓋内（例えば、脳室内、実質内、および髄腔内）投与、静脈内投与、筋内投与、皮下投与、経皮投与、気道内投与（エアロゾールによる投与）、経鼻、直腸内投与、および局所投与（口腔内投与および舌下投与を含む）を含む、経口経路、腹腔内経路、または非経口経路を含むがこれらに限定されない、当技術分野において公知の任意の手段により投与されうる。ある特定の実施形態において、組成物は、静脈内注入または静脈内注射により投与される。ある特定の実施形態において、組成物は、皮下注射により投与される。ある特定の実施形態において、組成物は、筋内注射により投与される。
一態様において、本発明はまた、哺乳動物において、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害するための方法も提供する。方法は、哺乳動物へと、哺乳動物の細胞内のＰＮＰＬＡ３遺伝子をターゲティングするｄｓＲＮＡを含む組成物を投与することと、ＰＮＰＬＡ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたり、哺乳動物を維持し、これにより、細胞内のＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害することとを含む。遺伝子発現の低減は、当技術分野において公知の任意の方法、および本明細書の、例えば、実施例２において記載される方法、例えば、ｑＲＴ－ＰＣＲ法により評価されうる。タンパク質産生の低減は、当技術分野において（ｉｔ）公知の任意の方法、例えば、ＥＬＩＳＡにより評価されうる。ある特定の実施形態において、穿刺による肝臓生検試料は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現またはＰＮＰＬＡ３タンパク質発現の低減をモニタリングするための組織素材として用いられる。他の実施形態において、血液試料は、ＰＮＰＬＡ３（ｔｈｅＰＮＰＬＡ３）タンパク質発現の低減をモニタリングするための対象試料として用いられる。
本発明は、それを必要とする対象、例えば、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓内の脂肪の蓄積、肝炎、肝細胞壊死、肝線維症、肥満、または非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）などのＰＮＰＬＡ３関連障害を伴うと診断された対象における処置法をさらに提供する。
本発明は、それを必要とする対象における予防法をさらに提供する。本発明の処置法は、本発明のｉＲＮＡを、対象、例えば、ＰＮＰＬＡ３発現の低減から利益を得る対象へと、ＰＮＰＬＡ３遺伝子をターゲティングするｉＲＮＡ、またはＰＮＰＬＡ３遺伝子をターゲティングするｉＲＮＡを含む医薬組成物の予防有効量において投与することを含む。
一態様において、本発明は、ＰＮＰＬＡ３発現の低減から利益を得る障害、例えば、慢性線維性炎症性肝疾患［例えば、がん、例えば、肝細胞癌、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝炎、肝細胞壊死、肝線維症、および非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）などのＰＮＰＬＡ３関連疾患を有する対象を処置する方法を提供する。一実施形態において、慢性線維性炎症性肝疾患は、ＮＡＳＨである。
一態様において、本発明は、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）発現の低減から利益を得る障害を有する対象を処置する方法における使用のための、本発明の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供する。
別の態様において、本発明は、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）発現の低減から利益を得る障害を有する対象における、少なくとも１つの症状を防止する方法における使用のための、本発明の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供する。
一態様において、本発明は、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）発現の低減から利益を得る障害を有する対象を処置するための医薬の製造における、本発明の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の使用を提供する。
別の態様において、本発明は、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）発現の低減から利益を得る障害を有する対象における、少なくとも１つの症状を防止するための医薬の製造における、本発明の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の使用を提供する。
一実施形態において、医薬は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの用量における投与のための医薬である。一実施形態において、医薬は、皮下投与のための医薬である。
一実施形態において、障害は、ＰＮＰＬＡ３関連疾患である。
一実施形態において、ＰＮＰＬＡ３関連疾患は、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓内の脂肪の蓄積、肝炎、肝細胞壊死、肝線維症、肥満、または非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）からなる群から選択される。
本明細書において、「ＮＡＦＬＤ」と互換的に使用される、「非アルコール性脂肪肝疾患」という用語は、１日当たりの２０ｍｇ未満のアルコール摂取の存在下における、大血管脂肪症の存在により規定される疾患を指す。ＮＡＦＬＤは、米国において、最も一般的な肝臓疾患であり、一般に、インスリン抵抗性／２型糖尿病および肥満と関連する。ＮＡＦＬＤは、脂肪症、脂肪性肝炎、肝硬変により顕在化し、場合によって、肝細胞癌により顕症化する。ＮＡＦＬＤの総説については、それらの全内容が、参照により本明細書に組み込まれる、Tolman and Dalpiaz (2007) Ther. Clin. Risk. Manag., 3(6):1153-1163を参照されたい。
本明細書において使用される、「脂肪症」、「肝臓脂肪症」、および「脂肪肝疾患」という用語は、肝細胞内のトリグリセリドおよび他の脂肪の蓄積を指す。
本明細書において使用された、「非アルコール性脂肪性肝炎」または「ＮＡＳＨ」という用語（ｔｈｅｒ ｔｅｒｍ）は、肝臓内の脂肪の蓄積により引き起こされる、肝臓の炎症および損傷を指す。ＮＡＳＨは、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）と呼ばれる状態群の一部である。ＮＡＳＨは、アルコール性肝疾患に酷似するが、アルコールを、殆どまたは全く飲まない人々において生じる。ＮＡＳＨの主要な特徴は、炎症および損傷を伴う、肝臓内の脂肪である。ＮＡＳＨを伴う人々の大半は、体調が良いと感じており、肝臓問題を有することに気づかない。しかしながら、ＮＡＳＨは、重度となる場合があり、肝臓が、恒久的に損傷を受け、瘢痕化し、もはや、適正に働くことができない、肝硬変をもたらしうる。ＮＡＳＨは、通例、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）など、規定の血液検査パネルに含まれる肝検査値が上昇していることが見出される人において、まず疑われる。さらなる査定が、肝疾患の明らかな理由（投薬、ウイルス性肝炎、またはアルコールの過剰な使用など）を示さず、肝臓についてのｘ線研究またはイメージング研究が、脂肪を示す場合、ＮＡＳＨが疑われる。ＮＡＳＨの診断を実証し、これを、単純性脂肪肝から隔てる、唯一の手段は、肝生検である。
組織学的に規定され、本明細書において使用される、「肝硬変」という用語は、線維症により特徴づけられるびまん性肝臓過程、および通常の肝臓アーキテクチャーの、構造的に異常な小節への転換である。
本発明のｉＲＮＡは、「遊離ｉＲＮＡ」として投与されうる。遊離ｉＲＮＡは、医薬組成物の非存在下において投与される。ネイキッドｉＲＮＡは、適切な緩衝液中のネイキッドｉＲＮＡでありうる。緩衝液は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、もしくはリン酸塩、またはこれらの任意の組合せを含みうる。一実施形態において、緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）である。ｉＲＮＡを含有する緩衝液のｐＨおよび浸透圧は、対象への投与に適するように調整されうる。
代替的に、本発明のｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡリポソーム製剤などの医薬組成物として投与されうる。
ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現の阻害から利益を得る対象は、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓内の脂肪の蓄積、肝炎、肝細胞壊死、肝線維症、肥満、または非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）など、ＰＮＰＬＡ３関連障害に罹患しやすいか、またはこれを伴うと診断された対象である。
ある実施形態において、方法は、標的ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現が、投与１回当たり、約１、２、３、４、５、６、１～６、１～３、または３～６カ月間などにわたり低下するように、本明細書において特色づけられる組成物を投与することを含む。ある特定の実施形態において、組成物は、３～６カ月ごとに１回投与される。
好ましくは、本明細書において特色づけられる方法および組成物に有用なｉＲＮＡは、標的ＰＮＰＬＡ３遺伝子のＲＮＡ（一次ＲＮＡまたはプロセシングされたＲＮＡ）を特異的にターゲティングする。ｉＲＮＡを使用して、これらの遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法は、本明細書において記載される通りに調製および実施されうる。
本発明の方法に従う、ｉＲＮＡの投与は、ＰＮＰＬＡ３関連障害、例えば、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓内の脂肪の蓄積、肝炎、肝細胞壊死、肝線維症、肥満、または非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の防止または処置を結果としてもたらしうる。
対象は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇなど、治療量のｉＲＮＡを投与されうる。
ｉＲＮＡは、好ましくは、皮下投与される、すなわち、皮下注射により投与される。１回または複数回の注射は、所望用量のｉＲＮＡを、対象へとデリバリーするのに使用されうる。注射は、ある期間にわたり反復されうる。
投与は、定期的に反復されうる。ある特定の実施形態において、初期の処置レジメンの後、処置は、より低い頻度において投与されうる。反復投与レジメンは、１カ月ごとに１回～１年ごとに１回など、定期的な、治療量のｉＲＮＡの投与を含みうる。ある特定の実施形態において、ｉＲＮＡは、１カ月ごとに約１回～３カ月ごとに約１回、または３カ月ごとに約１回～６カ月ごとに約１回投与される。
本発明は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現の低減および／または阻害から利益を得る対象、例えば、ＰＮＰＬＡ３関連疾患を有する対象を処置するためのｉＲＮＡ剤またはその医薬組成物の、他の医薬および／または他の治療法、例えば、例えば、これらの障害を処置するために現在利用されている医薬および／または治療法など、公知の医薬および／または公知の治療法と組み合わせた方法および使用をさらに提供する。
したがって、本発明についての一部の態様において、本発明のいずれかの単一のｉＲＮＡ剤を含む方法および使用は、さらに、対象へと、１つまたは複数のさらなる治療剤を投与することを含む。
ｉＲＮＡ剤、ならびにさらなる治療剤および／または処置は、同時に、かつ／または同じ組合せにおいて、例えば、非経口投与される場合もあり、さらなる治療剤は、別個の組成物の一部として、もしくは別個の時点において、かつ／または当技術分野において公知であるか、もしくは本明細書において記載される、別の方法により投与される場合もある。
さらなる治療剤の例は、高トリグリセリド血症、および高トリグリセリド血症により引き起こされるか、これと関連するか、またはこの転帰である、他の疾患を処置するための、公知の治療剤を含む。このような薬剤の例は、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（例えば、スタチン）、フィブレート、胆汁酸封鎖剤、ナイアシン、抗血小板剤、アンジオテンシン転換酵素阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト［例えば、Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．製のＣｏｚａａｒ（登録商標）などのロサルタンカリウム］、アシルＣｏＡコレステロールアセチルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害剤、コレステロール吸収阻害剤、コレステロールエステル輸送タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害剤、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＴＰ）阻害剤、コレステロールモジュレーター、胆汁酸モジュレーター、ペルオキシソーム増殖活性化受容体（ＰＰＡＲ）アゴニスト、遺伝子ベースの治療、複合型血管保護剤（例えば、Ａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃｓ製のＡＧＩ－１０６７）、糖タンパク質Ｉｌｂ／ＩＩＩａ阻害剤、アスピリンもしくはアスピリン様化合物、ＩＢＡＴ阻害剤（例えば、塩野義製薬株式会社製のＳ－８９２１）、スクアレンシンターゼ阻害剤、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）Ｉ阻害剤、または魚類油を含むがこれらに限定されない。例示的なＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ阻害剤は、アトロバスタチン［Ｐｆｉｚｅｒ製のＬｉｐｉｔｏｒ（登録商標）／Ｔａｈｏｒ／Ｓｏｒｔｉｓ／Ｔｏｒｖａｓｔ／Ｃａｒｄｙｌ］、プラバスタチン（Ｂｒｉｓｔｏｌ－ＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ製のＰｒａｖａｃｈｏｌ、株式会社三共製のＭｅｖａｌｏｔｉｎ／Ｓａｎａｐｒａｖ）、シンバスタチン［Ｍｅｒｃｋ製のＺｏｃｏｒ（登録商標）／Ｓｉｎｖａｃｏｒ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ製のＤｅｎａｎ、Ｂａｎｙｕ製のＬｉｐｏｖａｓ］、ロバスタチン（Ｍｅｒｃｋ製のＭｅｖａｃｏｒ／Ｍｅｖｉｎａｃｏｒ、Ｂｅｘａｌ製のＬｏｖａｓｔａｔｉｎａ、Ｃｅｐａ；Ｓｃｈｗａｒｚ Ｐｈａｒｍａ製のＬｉｐｏｓｃｌｅｒ）、フルバスタチン［Ｎｏｖａｒｔｉｓ製のＬｅｓｃｏｌ（登録商標）／Ｌｏｃｏｌ／Ｌｏｃｈｏｌ、藤沢薬品工業製のＣｒａｎｏｃ、Ｓｏｌｖａｙ製のＤｉｇａｒｉｌ］、セリバスタチン（Ｂａｙｅｒ製のＬｉｐｏｂａｙ／ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ製のＢａｙｃｏｌ）、ロスバスタチン［ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ製のＣｒｅｓｔｏｒ［登録商標）］、およびピタバスタチン（ｐｉｔｉｖａｓｔａｔｉｎ）（イタバスタチン／リシバスタチン）（日産化学株式会社、興和株式会社、株式会社三共、およびＮｏｖａｒｔｉｓ）を含む。例示的フィブレートは、例えば、ベザフィブラート［例えば、Ｒｏｃｈｅ製のＢｅｆｉｚａｌ（登録商標）／Ｃｅｄｕｒ（登録商標）／Ｂｅｚａｌｉｐ（登録商標）、Ｋｉｓｓｅｉ製のＢｅｚａｔｏｌ］、クロフィブラート［例えば、Ｗｙｅｔｈ製のＡｔｒｏｍｉｄ－Ｓ（登録商標）］、フェノフィブラート［例えば、Ｆｏｕｒｎｉｅｒ製のＬｉｐｉｄｉｌ／Ｌｉｐａｎｔｉｌ、Ａｂｂｏｔｔ製のＴｒｉｃｏｒ（登録商標）、ジェネリックである、武田薬品工業株式会社製のＬｉｐａｎｔｉｌ］、ゲムフィブロジル（例えば、Ｐｆｉｚｅｒ製のＬｏｐｉｄ／Ｌｉｐｕｒ）、およびシプロフィブラート［Ｓａｎｏｆｉ－Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ製のＭｏｄａｌｉｍ（登録商標）］を含む。例示的胆汁酸封鎖剤は、例えば、コレスチラミン［Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ製のＱｕｅｓｔｒａｎ（登録商標）およびＱｕｅｓｔｒａｎ Ｌｉｇｈｔ（商標）］、コレスチポール（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製のＣｏｌｅｓｔｉｄ）、およびコレセベラム［Ｇｅｎｚｉｍｅ／株式会社三共製のＷｅｌＣｈｏｌ（商標）］を含む。例示的ナイアシン療法は、例えば、Ａｖｅｎｔｉ製のＮｉｃｏｂｉｄ、Ｕｐｓｈｅｒ－Ｓｍｉｔｈ製のＮｉａｃｏｒ、Ａｖｅｎｔｉ製のＮｉｃｏｌａｒ、および株式会社三和化学研究所製のＰｅｒｙｃｉｔなどの即放製剤を含む。ナイアシンの持続放出製剤は、例えば、Ｋｏｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ製のＮｉａｓｐａｎおよびＵｐｓｈｅｒ－Ｓｍｉｔｈ製のＳＩｏ－Ｎｉａｃｉｎを含む。例示的抗血小板剤は、例えば、アスピリン（例えば、Ｂａｙｅｒ製のアスピリン）、クロピドグレル（Ｓａｎｏｆｉ－Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ／Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ製のＰｌａｖｉｘ）、およびチクロピジン（例えば、Ｓａｎｏｆｉ－Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ製のＴｉｃｌｉｄおよび第一製薬株式会社製のＰａｎａｌｄｉｎｅ）を含む。ＰＮＰＬＡ３をターゲティングするｄｓＲＮＡとの組合せにおいて有用な、他のアスピリン様化合物は、例えば、Ａｓａｃａｒｄ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製の徐放アスピリン）およびパミコグレル（Ｋａｎｅｂｏ／Ａｎｇｅｌｉｎｉ Ｒｉｃｅｒｃｈｅ／ＣＥＰＡ）を含む。例示的なアンジオテンシン転換酵素阻害剤は、例えば、ラミプリル（例えば、Ａｖｅｎｔｉ製のＡｌｔａｃｅ）およびエナラプリル（例えば、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．製のＶａｓｏｔｅｃ）を含む。例示的なアシルＣｏＡコレステロールアセチルトランスフェラーゼ（ＡＣ ＡＴ）阻害剤は、例えば、アバシミブ（Ｐｆｉｚｅｒ）、エフルシミブ（ＢｉｏＭｓｒｉｅｕｘ Ｐｉｅｒｒｅ Ｆａｂｒｅ／Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＣＳ－５０５（株式会社三共および京都薬品工業株式会社）、およびＳＭＰ－７９７（Ｓｕｍｉｔｏ）を含む。例示的なコレステロール吸収阻害剤は、例えば、エゼチミブ［（Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ－Ｐｌｏｕｇｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｚｅｔｉａ（登録商標）］およびＰａｍａｑｕｅｓｉｄｅ（Ｐｆｉｚｅｒ）を含む。例示的なＣＥＴＰ阻害剤は、例えば、Ｔｏｒｃｅｔｒａｐｉｂ（別称：ＣＰ－５２９４１４、Ｐｆｉｚｅｒ）、ＪＴＴ－７０５（日本たばこ産業株式会社）、およびＣＥＴｉ－Ｉ（Ａｖａｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）を含む。例示的なミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＴＰ）阻害剤は、例えば、イムプリタピド（Ｂａｙｅｒ）、Ｒ－１０３７５７（Ｊａｎｓｓｅｎ）、およびＣＰ－３４６０８６（Ｐｆｉｚｅｒ）を含む。他の例示的なコレステロールモジュレーターは、例えば、ＮＯ－１８８６（大塚製薬株式会社／ＴＡＰ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、ＣＩ－１０２７（Ｐｆｉｚｅｒ）、およびＷＡＹ－１３５４３３（Ｗｙｅｔｈ－Ａｙｅｒｓｔ）を含む。
例示的な胆汁酸モジュレーターは、例えば、ＨＢＳ－１０７（久光製薬株式会社／Ｂａｎｙｕ）、Ｂｔｇ－５１１（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ）、ＢＡＲＩ－１４５３（Ａｖｅｎｔｉｓ）、Ｓ－８９２１（塩野義製薬株式会社）、ＳＤ－５６１３（Ｐｆｉｚｅｒ）、およびＡＺＤ－７８０６（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）を含む。例示的なペルオキシソーム増殖活性化受容体（ＰＰＡＲ）アゴニストは、例えば、テサグリタザル（ＡＺ－２４２）（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、Ｎｅｔｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ（ＭＣＣ－５５５）（田辺三菱製薬株式会社／Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ＧＷ－４０９５４４（Ｌｉｇａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＧＷ－５０１５１６（Ｌｉｇａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＬＹ－９２９（Ｌｉｇａｎｄ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓおよびＥｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＬＹ－４６５６０８（Ｌｉｇａｎｄ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓおよびＥｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＬＹ－５１８６７４（Ｌｉｇａｎｄ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓおよびＥｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、およびＭＫ－７６７（Ｍｅｒｃｋおよび杏林製薬株式会社）を含む。例示的な遺伝子ベースの治療は、例えば、ＡｄＧＷＥＧＦ１２１．１０（ＧｅｎＶｅｃ）、ＡｐｏＡｌ（ＵＣＢ Ｐｈａｒｍａ／Ｇｒｏｕｐｅ Ｆｏｕｒｎｉｅｒ）、ＥＧ－００４（Ｔｒｉｎａｍ）（Ａｒｋ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、およびＡＴＰ結合性カセット輸送体Ａｌ（ＡＢＣＡｌ）（ＣＶ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ／Ｉｎｃｙｔｅ、Ａｖｅｎｔｉｓ、Ｘｅｎｏｎ）を含む。例示的な糖タンパク質Ｉｌｂ／ＩＩＩａ阻害剤は、例えば、ロキシフィバン（別称：ＤＭＰ７５４、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、Ｇａｎｔｏｆｉｂａｎ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ／山之内製薬株式会社）、およびＣｒｏｍａｆｉｂａｎ（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含む。例示的なスクアレンシンターゼ阻害剤は、例えば、ＢＭＳ－１８８４９４１（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＣＰ－２１０１７２（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＣＰ－２９５６９７（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＣＰ－２９４８３８（Ｐｆｉｚｅｒ）、およびＴＡＫ－４７５（武田薬品工業株式会社）を含む。例示的ＭＣＰ－Ｉ阻害剤は、例えば、ＲＳ－５０４３９３（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）である。抗アテローム性動脈硬化剤であるＢＯ－６５３（Ｃｈｕｇａｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、およびニコチン酸誘導体であるＮｙｃｌｉｎ（山之内製薬株式会社）もまた、本発明において特色づけられるｄｓＲＮＡと組み合わせて投与するために適切である。ＰＮＰＬＡ３をターゲティングするｄｓＲＮＡを伴う投与に適する、例示的な組合せ療法は、例えば、アドビコル（Ｋｏｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ製のナイアシン／ロバスタチン）、アムロジピン／アトロバスタチン（Ｐｆｉｚｅｒ）、およびエゼチミブ／シンバスタチン［例えば、Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ－Ｐｌｏｕｇｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ製のＶｙｔｏｒｉｎ（登録商標）１０／１０、１０／２０、１０／４０、および１０／８０錠］を含む。高トリグリセリド血症を処置するための薬剤であり、ＰＮＰＬＡ３をターゲティングするｄｓＲＮＡと組み合わせた投与に適する薬剤は、例えば、ロバスタチン／ナイアシンである、Ａｌｔｏｐｒｅｖ（登録商標）Ｅｘｔｅｎｄｅｄ－Ｒｅｌｅａｓｅ Ｔａｂｌｅｔｓ（Ａｎｄｒｘ Ｌａｂｓ）、ロバスタチンである、Ｃａｄｕｅｔ（登録商標）Ｔａｂｌｅｔｓ（Ｐｆｉｚｅｒ）、アムロジピンベシル酸塩／アトロバスタチンカルシウムである、Ｃｒｅｓｔｏｒ（登録商標）Ｔａｂｌｅｔｓ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ロスバスタチンカルシウムである、Ｌｅｓｃｏｌ（登録商標）Ｃａｐｓｕｌｅｓ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フルバスタチンナトリウムである、Ｌｅｓｃｏｌ（登録商標）（Ｒｅｌｉａｎｔ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フルバスタチンナトリウムである、Ｌｉｐｉｔｏｒ（登録商標）Ｔａｂｌｅｔｓ（Ｐａｒｋｅ－Ｄａｖｉｓ）、アトロバスタチンカルシウムである、Ｌｏｆｉｂｒａ（登録商標）Ｃａｐｓｕｌｅ（Ｇａｔｅ）、Ｎｉａｓｐａｎ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ－Ｒｅｌｅａｓｅ Ｔａｂｌｅｔｓ（Ｋｏｓ）、ナイアシンである、Ｐｒａｖａｃｈｏｌ Ｔａｂｌｅｔｓ（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、プラバスタチンナトリウムである、ＴｒｉＣｏｒ（登録商標）Ｔａｂｌｅｔｓ（Ａｂｂｏｔｔ）、フェノフィブラートである、Ｖｙｔｏｒｉｎ（登録商標）１０／１０ Ｔａｂｌｅｔｓ（Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ－Ｐｌｏｕｇｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、エゼチミブ、シンバスタチンである、ＷｅｌＣｈｏｌ（商標）Ｔａｂｌｅｔｓ（株式会社三共）、コレセベラム塩酸塩である、Ｚｅｔｉａ（登録商標）Ｔａｂｌｅｔｓ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）、エゼチミブである、Ｚｅｔｉａ（登録商標）Ｔａｂｌｅｔｓ（Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ－Ｐｌｏｕｇｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、およびエゼチミブである、Ｚｏｃｏｒ（登録商標）Ｔａｂｌｅｔｓ（Ｍｅｒｃｋ）を含む。
一部の実施形態において、本発明において特色づけられるｉＲＮＡは、例えば、ピリドキシン、ＡＣＥ阻害剤（アンジオテンシン転換酵素阻害剤）、例えば、ベナゼプリル（Ｌｏｔｅｎｓｉｎ）；アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト（ＡＲＢ）［例えば、Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．製のＣｏｚａａｒ（登録商標）などのロサルタンカリウム］、例えば、Ｃａｎｄｅｓａｒｔａｎ（Ａｔａｃａｎｄ）；ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（例えば、スタチン）；カルシウム結合剤、例えば、セルロースリン酸ナトリウム（Ｃａｌｃｉｂｉｎｄ）；利尿剤、例えば、チアジド利尿剤、など、ヒドロクロロチアジド（Ｍｉｃｒｏｚｉｄｅ）；ＰＰＡＲγアゴニストピオグリタゾンなどのインスリン増感剤、リラグルチド（ｌｉｒａｇｌｕｔａｔｉｄｅ）などのｇｌｐ－１ｒアゴニスト、ビタミンＥ、ＳＧＬＴ２阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、および腎臓／肝臓移植；または前出のうちのいずれかの組合せと共に投与されうる。
一実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、エゼチミブ／シンバスタチンの組合せ剤［例えば、Ｖｙｔｏｒｉｎ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ－Ｐｌｏｕｇｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）］と組み合わせて投与される。一実施形態において、ｉＲＮＡ剤が、患者へと投与され、次いで、さらなる治療剤が、患者へと投与される（またはこの逆がなされる）。別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤と、さらなる治療剤とは、同時に投与される。
ｉＲＮＡ剤、ならびにさらなる治療剤および／または処置は、同時に、かつ／または同じ組合せにおいて、例えば、非経口投与される場合もあり、さらなる治療剤は、別個の組成物の一部として、もしくは別個の時点において、かつ／または当技術分野において公知であるか、もしくは本明細書において記載される、別の方法により投与される場合もある。
一実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、エゼチミブ／シンバスタチンの組合せ剤［例えば、Ｖｙｔｏｒｉｎ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ－Ｐｌｏｕｇｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）］と組み合わせて投与される。一実施形態において、ｉＲＮＡ剤が、患者へと投与され、次いで、さらなる治療剤が、患者へと投与される（またはこの逆がなされる）。別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤と、さらなる治療剤とは、同時に投与される。
ｉＲＮＡ剤、ならびにさらなる治療剤および／または処置は、同時に、かつ／または同じ組合せにおいて、例えば、非経口投与される場合もあり、さらなる治療剤は、別個の組成物の一部として、もしくは別個の時点において、かつ／または当技術分野において公知であるか、もしくは本明細書において記載される、別の方法により投与される場合もある。
ＶＩＩＩ．キット
ある特定の態様において、本開示は、ｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物による医薬製剤、またはｓｉＲＮＡ化合物（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ化合物へとプロセシングされうる、大型のｓｉＲＮＡ化合物、あるいはｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、もしくはｓｓｉＲＮＡ化合物、またはこれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含有する、適切な容器を含むキットを提示する。
このようなキットは、１つまたは複数のｄｓＲＮＡ剤と、使用のための指示書、例えば、予防有効量または治療有効量のｄｓＲＮＡ剤（複数可）を投与するための指示書とを含む。ｄｓＲＮＡ剤は、バイアル内に入れられる場合もあり、あらかじめ充填されたシリンジ内に入れられる場合もある。キットは、ｄｓＲＮＡ剤を投与するための手段（例えば、あらかじめ充填されたシリンジなどの注射デバイス）、またはＰＮＰＬＡ３の阻害を測定するための手段（例えば、ＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡ、ＰＮＰＬＡ３タンパク質、および／またはＰＮＰＬＡ３活性の阻害を測定するための手段）をさらに含んでもよい。ＰＮＰＬＡ３の阻害を測定するための、このような手段は、例えば、血漿試料など、対象に由来する試料を得るための手段を含みうる。本発明のキットは、治療有効量有効量または予防有効量を決定するための手段をさらに含んでもよい。
ある特定の実施形態において、医薬製剤の個々の成分は、１つの容器、例えば、バイアルまたはあらかじめ充填されたシリンジにより提供されうる。代替的に、医薬製剤の成分を、２つまたはこれを超える容器、例えば、ｓｉＲＮＡ化合物の調製物のための１つの容器、および担体化合物のための、少なくとも別の容器により、個別に提供することが所望される場合もある。キットは、一つの箱の中の、１つまたは複数の容器など、多数の異なる構成においてパッケージングされうる。異なる成分は、例えば、キットと共に提供される指示書に従い組み合わされうる。成分は、例えば、医薬組成物を調製および投与するために、本明細書において記載される方法に従い組み合わされうる。キットはまた、デリバリーデバイスも含みうる。
本発明は、限定的なものとみなされるべきではない、以下の実施例により、さらに例示される。本出願を通して引用される、全ての参考文献、特許、および特許出願公開のほか、非公式の配列表および図面の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
［実施例１］
ｉＲＮＡの合成
試薬の供給源
本明細書において、試薬の供給源が、具体的に与えられない場合、このような試薬は、分子生物学における適用のための品質／純度基準において、分子生物学のための試薬の任意の供給源から得ることができる。
ｓｉＲＮＡのデザイン
ヒトパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）遺伝子（ヒト：ＮＣＢＩ ｒｅｆｓｅｑＩＤ：ＮＭ＿０２５２２５．２；ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ：８０３３９）をターゲティングするｓｉＲＮＡは、カスタムのＲスクリプトおよびＰｙｔｈｏｎスクリプトを使用してデザインした。ヒト ＮＭ＿０２５２２５．２ ＲＥＦＳＥＱ ｍＲＮＡは、２８０５塩基の長さを有する。
非修飾ＰＮＰＬＡ３のセンス鎖およびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列についての詳細なリストを、表２、４、６、８、および１０に示す。修飾ＰＮＰＬＡ３のセンス鎖およびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列についての詳細なリストを、表３、５、７、９、１１、２１、２４、２７、および３０に示す。
本出願を通して、小数を伴わない二重鎖名は、二重鎖のバッチ番号を参照するに過ぎない、小数を伴う二重鎖名と同等であることが理解されるものとする。例えば、ＡＤ－９５９９１７は、ＡＤ－９５９９１７．１と同等である。
ｓｉＲＮＡの合成
当技術分野において公知の方法を使用して、ｓｉＲＮＡを、デザイン、合成、および調製した。
略述すると、ｓｉＲＮＡ配列は、固体支持体上のホスホルアミダイト化学反応を伴う、Ｍｅｒｍａｄｅ １９２合成器（ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ）を使用して、１マイクロモルのスケールにおいて合成した。固体支持体は、カスタムのＧａｌＮＡｃリガンド（３’－ＧａｌＮＡｃコンジュゲート）、ユニバーサルの固体支持体（ＡＭ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、または目的の第１のヌクレオチドをロードされた、制御型多孔性ガラス（５００～１０００Å）であった。補助的合成試薬、および標準的２－シアノエチルホスホルアミダイト単量体（２’－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、ＲＮＡ、ＤＮＡ）は、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、Ｈｏｎｇｅｎｅ（Ｃｈｉｎａ）、またはＣｈｅｍｇｅｎｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）から得た。さらなるホスホルアミダイト単量体は、市販の供給元から調達するか、社内において調製するか、または多様な受託製造機関（ＣＭＯ）による、カスタムの合成を使用して調達した。ホスホルアミダイトは、アセトニトリルまたは９：１のアセトニトリル：ＤＭＦ中の濃度を１００ｍＭとして調製し、反応時間を４００秒間として、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ、アセトニトリル中に０．２５Ｍ）を使用してカップリングさせた。ホスホロチオエート連結は、無水アセトニトリル／ピリジン（９：１ ｖ／ｖ）中に、１００ｍＭの３－［（ジメチルアミノ－メチリデン）アミノ］－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－チオン［ＤＤＴＴ；Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）製］溶液を使用して作出した。酸化時間は、５分間であった。全ての配列は、ＤＭＴ基の最終除去（「ＤＭＴ－Ｏｆｆ」）により合成した。
固相合成が完了したら、固体支持オリゴリボヌクレオチドを、９６ウェルプレート内、室温において、３００μＬのメチルアミン（４０％水溶液）により、約２時間にわたり処理して、固体支持体からの切断に続き、さらなる塩基不安定性保護基全ての除去をもたらした。ＴＥＡ．３ＨＦ（トリエチルアミントリヒドロフルオリド）を使用して、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基により保護された、任意の天然リボヌクレオチド連結（２’－ＯＨ）を含有する配列のために、第２の脱保護工程を実施した。メチルアミン水溶液中の、各オリゴヌクレオチド溶液へと、２００μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、および３００μＬのＴＥＡ．３ＨＦを添加し、溶液を、６０℃において、約３０分間にわたりインキュベートした。インキュベーションの後、プレートを、室温へと戻し、９：１のアセトニトリル：エタノールまたは１：１のエタノール：イソプロパノール１ｍＬを添加することにより、粗オリゴヌクレオチドを沈殿させた。次いで、プレートを、４℃において、４５分間にわたり遠心分離し、マルチチャネルピペットを一助として、上清を、注意深くデカントした。オリゴヌクレオチドペレットを、２０ｍＭのＮａＯＡｃ中に再懸濁させ、その後、ＨｉＴｒａｐサイズ除外カラム（５ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、オートサンプラー、ＵＶ検出器、導電率計、およびフラクションコレクターを装備したＡｇｉｌｅｎｔ ＬＣシステム上において使用して脱塩させた。脱塩試料は、９６ウェルプレートに回収し、次いで、材料それぞれの識別を確認し、材料の量を定量するように、ＬＣ－ＭＳおよびＵＶ分光法により解析した。
単鎖の二重鎖化は、Ｔｅｃａｎリキッドハンドリングロボット上において実施した。センス単鎖と、アンチセンス単鎖とを、等モル比において、９６ウェルプレート内の、１倍濃度のＰＢＳ中で組み合わせて、１０μＭの最終濃度とし、プレートをシーリングし、１００℃において、１０分間にわたりインキュベートし、その後、２～３時間にわたり、ゆっくりと、室温に戻した。各二重鎖の濃度および識別を確認し、次いで、その後、インビトロスクリーニングアッセイに利用した。
［実施例２］
インビトロスクリーニング法
Ｈｅｐ３Ｂ細胞の培養および３８４ウェルにおけるトランスフェクション
Ｈｅｐ３ｂ細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、５％ＣＯ２の雰囲気、１０％のＦＢＳ（ＡＴＣＣ）を補充した、イーグル最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ）中、３７℃において、コンフルエンシー（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）近くまで増殖させてから、トリプシン処理により、プレートから放出した。トランスフェクションは、９６ウェルプレート内の個々のウェルの、５μｌずつのｓｉＲＮＡ二重鎖へと、ウェル１つ当たり１４．８μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ＋０．２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．；型番：１３７７８－１５０）を添加することにより実施した。次いで、混合物を、室温において、１５分間にわたりインキュベートした。次いで、Ｈｅｐ３Ｂ細胞約２×１０４個を含有する、抗生剤を伴わない８０μｌの完全増殖培地を、ｓｉＲＮＡ混合物へと添加した。細胞を、ＲＮＡ精製の前に、２４時間にわたりインキュベートした。単回投与実験は、最終二重鎖濃度を、１０ｎＭおよび０．１ｎＭとして実施し、１０ｎＭ～１２８ｐＭの範囲にわたり、８×５倍の系列希釈液を使用して、用量反応実験を行った。
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ｍＲＮＡ単離キット［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）；型番：６１０－１２］を使用する、全ＲＮＡの単離
細胞を、ウェル１つ当たり３μＬのビーズを含有する、７５μｌのＬｙｓｉｓ／Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ中に溶解させ、静電シェーカーにおいて、１０分間にわたり混合した。洗浄工程は、磁性プレート支持体を使用して、Ｂｉｏｔｅｋ ＥＬ４０６上において自動化した。ビーズは（９０μＬ中において）、間に吸引工程を伴い、緩衝液Ａ中において、１回、緩衝液Ｂ中において、１回、緩衝液Ｅ中において、２回洗浄した。最終回の吸引に続き、完成した１０μＬのＲＴ混合物を、下記で記載される通りに、各ウェルへと添加した。
ＡＢＩ Ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ；型番：４３６８８１３）を使用するｃＤＮＡ合成
ウェル１つ当たり、反応１回当たり１０倍濃度の緩衝液１μｌ、２５倍濃度のｄＮＴＰ０．４μｌ、１μｌのランダムプライマー、０．５μｌの逆転写酵素、０．５μｌのＲＮアーゼ阻害剤、および６．６μｌのＨ２Ｏのマスターミックスを添加した。プレートをシーリングし、静電シェーカーにおいて、１０分間にわたり攪拌し、次いで、摂氏３７度において、２時間にわたりインキュベートした。これに続き、プレートを、摂氏８０度において、８分間にわたり攪拌した。
リアルタイムＰＣＲ
２マイクロリットル（μｌ）のｃＤＮＡを、３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ；型番：０４８８７３０１００１）内に、ウェル１つ当たり０．５μｌのヒトＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（４３２６３１７Ｅ）、０．５μｌのヒトＰＮＰＬＡ３、２μｌのヌクレアーゼ非含有水、および５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ；型番：０４８８７３０１００１）を含有するマスターミックスへと添加した。リアルタイムＰＣＲは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０リアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）において行った。
相対倍数変化を計算するために、ΔΔＣｔ法を使用して、データを解析し、１０ｎＭのＡＤ－１９５５をトランスフェクトされた細胞、またはモックトランスフェクト細胞により実施されたアッセイに対して正規化した。ＩＣ５０Ｓは、ＸＬＦｉｔを使用する、４パラメータ当てはめモデルを使用して計算し、ＡＤ－１９５５をトランスフェクトされた細胞、またはモックトランスフェクト細胞に対して正規化した。ＡＤ－１９５５のセンス配列およびアンチセンス配列は、センス：ｃｕｕＡｃＧｃｕＧＡＧｕＡｃｕｕｃＧＡｄＴｓｄＴ（配列番号１８）、およびアンチセンス：ＵＣＧＡＡＧｕＡＣＵｃＡＧＣＧｕＡＡＧｄＴｓｄＴ（配列番号１９）である。
インビトロにおける、ルシフェラーゼ／内因性二重スクリーニングアッセイ
Ｃｏｓ－７細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、５％ＣＯ２の雰囲気、１０％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ（ＡＴＣＣ）中、３７℃において、コンフルエンシー近くまで増殖させてから、トリプシン処理により、プレートから放出する。単回投与実験は、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、および０．１ｎＭにおいて実施した。ｓｉＲＮＡおよびｐｓｉＣＨＥＣＫ２－ＰＮＰＬＡ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０２５２２５．２）プラスミドのトランスフェクションは、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含有するプラスミドにより実施した。トランスフェクションは、ウェル１つ当たり５μＬのｓｉＲＮＡ二重鎖、および５μＬ（５ｎｇ）のｐｓｉＣＨＥＣＫ２プラスミドを、ウェル１つ当たり４．９μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ＋０．１μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．；型番：１３７７８－１５０）と共に添加することにより実施し、次いで、室温において、１５分間にわたりインキュベートした。次いで、混合物を、３５μＬの新鮮な完全培地中に再懸濁させた細胞へと添加した。トランスフェクト細胞を、５％ＣＯ２の雰囲気中、３７℃においてインキュベートした。
ｓｉＲＮＡ、およびｐｓｉＣＨＥＣＫ２プラスミドによるトランスフェクションの４８時間後、ホタル（トランスフェクション対照）およびレニラ属（Ｒｅｎｉｌｌａ）（ＰＮＰＬＡ３標的配列へと融合させ）のルシフェラーゼを測定した。まず、培地を細胞から除去した。次いで、ホタルルシフェラーゼ活性は、培養培地容量と同等である、２０μＬのＤｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼ試薬を、各ウェルへと添加し、混合することにより測定した。混合物を、室温において、３０分間にわたりインキュベートしてから、ホタルルシフェラーゼシグナルを検出するように、発光（５００ｎｍ）を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）上において測定した。室温において、２０μＬのＤｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ（登録商標）試薬を、各ウェルへと添加することにより、レニラ属ルシフェラーゼ活性を測定し、プレートを、１０～１５分間にわたりインキュベートしてから、発光を、再度測定して、レニラ属ルシフェラーゼシグナルを決定した。Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ（登録商標）試薬は、ホタルルシフェラーゼシグナルをクエンチングし、レニラ属ルシフェラーゼ反応については、発光を持続させた。ｓｉＲＮＡ活性は、各ウェル内において、レニラ属（ＰＮＰＬＡ３）シグナルを、ホタル（対照）シグナルに対して正規化することにより決定した。次いで、ｓｉＲＮＡ活性の大きさを、同じベクターをトランスフェクトされたが、ｓｉＲＮＡにより処置されていないか、または非ターゲティングｓｉＲＮＡにより処置された細胞と比べて評価した。全てのトランスフェクションは、ｎ＝４として行った。
細胞の培養およびトランスフェクション
ウェル１つ当たり４．９μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ＋０．１μＬのＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．；型番：１３７７８－１５０）を、ウェル１つ当たり５μＬのｓｉＲＮＡ二重鎖へと添加することにより、３８４ウェルプレート内の細胞に、４連の各ｓｉＲＮＡ二重鎖をトランスフェクトし、室温において、１５分間にわたりインキュベートした。次いで、細胞約５×１０３個を含有する、４０μＬのＭＥＤＩＡを、ｓｉＲＮＡ混合物へと添加した。細胞を、ＲＮＡ精製の前に、２４時間にわたりインキュベートした。実験は、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、および０．１ｎＭにおいて実施した。トランスフェクション実験は、Ｃｏｓ７細胞内において実施した。
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ｍＲＮＡ単離キットを使用する、全ＲＮＡの単離
ＤＹＮＡＢＥＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；型番：６１０１２）を使用する、ＢｉｏＴｅｋ－ＥＬ４０６プラットフォーム上の自動式プロトコールを使用して、ＲＮＡを単離した。略述すると、７０μＬのＬｙｓｉｓ／Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ、および３μＬの磁気ビーズを含有する、１０μＬの溶解緩衝液を、細胞を伴うプレートへと添加した。プレートを、電磁気シェーカー上、室温において、１０分間にわたりインキュベートし、次いで、磁気ビーズを捕捉し、上清を除去した。次いで、ビーズに結合させたＲＮＡを、１５０μＬの洗浄緩衝液Ａにより、２回にわたり洗浄し、洗浄緩衝液Ｂにより、１回洗浄した。次いで、ビーズを、１５０μＬの溶出緩衝液により洗浄し、再捕捉し、上清を除去した。
ＡＢＩ Ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ；型番：４３６８８１３）を使用するｃＤＮＡ合成
反応１回当たり、１μＬの１０倍濃度の緩衝液、０．４μＬの２５倍濃度のｄＮＴＰ、１０倍濃度のランダムプライマー１μＬ、０．５μＬの逆転写酵素、０．５μＬのＲＮアーゼ阻害剤、および６．６μＬのＨ２Ｏを含有する１０μＬのマスターミックスを、上記において単離されたＲＮＡへと添加した。プレートをシーリングし、電磁気シェーカー上、室温において、１０分間にわたりインキュベートし、続いて、３７℃において、２時間にわたるインキュベーションにかけた。
リアルタイムＰＣＲ
２μＬのｃＤＮＡを、３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ；型番：０４８８７３０１００１）内に、ウェル１つ当たり０．５μＬのヒトまたはマウスのＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；型番：４３５２９３４Ｅまたは４３５１３０９）、および０．５μＬの適切なＰＮＰＬＡ３プローブ（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから市販されている）、および５μＬのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ；型番：０４８８７３０１００１）を含有するマスターミックスへと添加した。リアルタイムＰＣＲは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０リアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）において行った。Ｎ＝４として、各二重鎖について調べ、データは、非標的対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされた細胞に対して正規化した。相対倍数変化を計算するために、ΔΔＣｔ法を使用して、リアルタイムデータを解析し、非標的対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトされた細胞により実施されたアッセイに対して正規化した。
表２および３に列挙されたｄｓＲＮＡ剤についての、Ｃｏｓ７細胞におけるスクリーニングの結果を、表１２に示す。表４および５に列挙されたｄｓＲＮＡ剤についての、Ｃｏｓ７細胞におけるスクリーニングの結果を、表１３に示す。表４および５に列挙されたｄｓＲＮＡ剤についての、Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるスクリーニングの結果を、表１４に示す。表６および７に列挙されたｄｓＲＮＡ剤についての、Ｃｏｓ７細胞におけるスクリーニングの結果を、表１５に示す。表８および９に列挙されたｄｓＲＮＡ剤についての、Ｃｏｓ７細胞におけるスクリーニングの結果を、表１６に示す。表８および９に列挙されたｄｓＲＮＡ剤についての、Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるスクリーニングの結果を、表１７に示す。表１０および１１に列挙されたｄｓＲＮＡ剤についての、Ｃｏｓ７細胞におけるスクリーニングの結果を、表１８に示す。表１０および１１に列挙されたｄｓＲＮＡ剤についての、Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるスクリーニングの結果を、表１９に示す。
表1: 核酸配列表示において使用される、ヌクレオチド単量体の略号。これらの単量体は、オリゴヌクレオチド内に存在する場合、5'-3'-ホスホジエステル結合により相互に連結されることが理解されるであろう。
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［実施例３］
マウスにおける、ｄｓＲＮＡ二重鎖のインビボスクリーニング
上記のインビトロ研究から同定された、目的の二重鎖を、インビボにおいて査定した。特に、投与前の－１４日目において、ヒトＰＮＰＬＡ３をコードする８型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ８）ベクターのウイルス粒子２×１０１１個を、これらの静脈内投与により、野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）へと形質導入した。特に、マウスに、ＮＭ＿０２５２２５．２（ＡＡＶ８．－ＴＢＧ－ＰＩ－ＰＮＰＬＡ３）として参照される、ヒトＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡのオープンリーディングフレームおよび３’ＵＴＲをコードするＡＡＶ８を投与した。
０日目に、マウス３匹の群に、単回投与による３ｍｇ／ｋｇまたは単回投与による１０ｍｇ／ｋｇの、目的の薬剤またはＰＢＳ対照を皮下投与した。表２０は、処置群を提示し、表２１は、目的の二重鎖のセンス鎖およびアンチセンス鎖の、修飾（ｍｏｄｉｆｉｄｅｄ）ヌクレオチド配列を提示する。投与後７日目にまたは１４日目に、動物を屠殺し、肝臓試料を回収し、液体窒素中において瞬時凍結させた。組織ｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＱＰＣＲ法により解析した。
ヒトＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡレベルを、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨと比較した。次いで、値を、ＰＢＳ媒体対照群の平均に対して正規化した。データはベースライン値に対するパーセントとして表し、平均値＋標準偏差として提示した。表２２に一覧され、図１に示された結果は、例示的な被験二重鎖剤が、インビボにおいて、ヒトＰＮＰＬＡ３メッセンジャーＲＮＡのレベルを、有効に低減することを裏付ける。
Figure 2023506258000107
Figure 2023506258000108
Figure 2023506258000109
Figure 2023506258000110
さらなる上記のインビトロ研究から同定された、目的の二重鎖はまた、インビボにおいても査定した。特に、投与前の－１４日目において、ヒトＰＮＰＬＡ３をコードする８型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ８）ベクターのウイルス粒子２×１０１１個を、これらの静脈内投与により、野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）へと形質導入した。特に、マウスに、ＮＭ＿０２５２２５．２（ＡＡＶ８．－ＴＢＧ－ＰＩ－ＰＮＰＬＡ３）において参照される、ヒトＰＮＰＬＡ３のオープンリーディングフレームおよび３’ＵＴＲをコードするＡＡＶ８を投与した。
時点０である、０日目に、マウス３匹の群に、約１時間後に、単回投与による７ｍｇ／ｋｇの、時点０において投与された、同じ薬剤を後続させる、０日目、時点０における、単回投与による３ｍｇ／ｋｇの、目的の薬剤（ＡＤ－５１７２５８．２を例外とする）またはＰＢＳ対照を皮下投与した。ＡＤ－５１７２５８．２を投与されたマウスは、０日目、時点０における、単回投与による３ｍｇ／ｋｇだけを投与された。表２０は、処置群を提示し、表２１は、目的の二重鎖のセンス鎖およびアンチセンス鎖の、修飾ヌクレオチド配列を提示する。投与後７日目に、動物を屠殺し、肝臓試料を回収し、液体窒素中において瞬時凍結させた。組織ｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＱＰＣＲ法により解析した。
ヒトＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡレベルを、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨと比較した。次いで、値を、ＰＢＳ媒体対照群の平均に対して正規化した。データはベースライン値に対するパーセントとして表し、平均値＋標準偏差として提示した。表２５に一覧され、図２に示された結果は、例示的な被験二重鎖剤が、インビボにおいて、ヒトＰＮＰＬＡ３メッセンジャーＲＮＡのレベルを、有効に低減することを裏付ける。
Figure 2023506258000111
Figure 2023506258000112
Figure 2023506258000113
Figure 2023506258000114
Figure 2023506258000115
さらなる上記のインビトロ研究から同定された、目的の二重鎖はまた、インビボのＡＡＶ滴定研究においても査定した。特に、投与前の－１４日目において、ヒトＰＮＰＬＡ３をコードする８型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ８）ベクターのウイルス粒子２×１０１１、２×１０１０、２×１０９、または２×１０８個を、これらの静脈内投与により、野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）へと形質導入した。特に、マウスに、ＮＭ＿０２５２２５．２（ＡＡＶ８．－ＴＢＧ－ＰＩ－ＰＮＰＬＡ３）として参照される、ヒトＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡのオープンリーディングフレームおよび３’ＵＴＲをコードする、ヒトＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡの一部をコードするＡＡＶ８を投与した。
時点０である、０日目に、マウス３匹の群に、単回投与による１０ｍｇ／ｋｇの、目的の薬剤またはＰＢＳ対照を皮下投与した。表２６は、処置群を提示し、表２７は、目的の二重鎖のセンス鎖およびアンチセンス鎖の、修飾ヌクレオチド配列を提示する。投与後７日目に、動物を屠殺し、肝臓試料を回収し、液体窒素中において瞬時凍結させた。組織ｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＱＰＣＲ法により解析した。
ヒトＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡレベルを、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨと比較した。次いで、値を、ＰＢＳ媒体対照群の平均に対して正規化した。データはベースライン値に対するパーセントとして表し、平均値＋標準偏差として提示した。表２８に一覧され、図３に示された結果は、例示的な被験二重鎖剤が、インビボにおいて、ヒトＰＮＰＬＡ３メッセンジャーＲＮＡのレベルを、有効に低減することを裏付ける。
Figure 2023506258000116
Figure 2023506258000117
Figure 2023506258000118
Figure 2023506258000119
さらなる上記のインビトロ研究から同定された、目的の二重鎖はまた、インビボにおいても査定した。特に、投与前の－１４日目において、ヒトＰＮＰＬＡ３をコードする８型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ８）ベクターのウイルス粒子２×１０１１個（１ｍｌのゲノムコピー２．４×１０１３に対応する）を、静脈内投与により、野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）へと形質導入した。特に、マウスに、ＮＭ＿０２５２２５．２（ＡＡＶ８．－ＴＢＧ－ＰＩ－ＰＮＰＬＡ３）として参照される、ヒトＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡのオープンリーディングフレームおよび３’ＵＴＲをコードする、ヒトＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡの一部をコードするＡＡＶ８を投与した。
０日目に、目的の各薬剤について、マウス３匹の１つの群に、単回投与による１０ｍｇ／ｋｇの、目的の薬剤またはＰＢＳ対照を皮下投与した。目的の各薬剤について、マウス３匹の別の群に、０日目における、単回投与による１０ｍｇ／ｋｇの、目的の薬剤またはＰＢＳ対照、ならびに１日目における、後続投与による１０ｍｇ／ｋｇの薬剤を皮下投与した。目的の各薬剤について、マウス３匹の第３の群に、０日目における、単回投与による１０ｍｇ／ｋｇの、目的の薬剤またはＰＢＳ対照、１日目における、後続投与による１０ｍｇ／ｋｇの薬剤、ならびに２日目における、さらなる投与による１０ｍｇ／ｋｇの薬剤を皮下投与した。表２９は、処置群を提示し、表３０は、目的の二重鎖のセンス鎖およびアンチセンス鎖の、修飾ヌクレオチド配列を提示する。最終回投与を行った７日後に、動物を屠殺し、肝臓試料を回収し、液体窒素中において瞬時凍結させた。組織ｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＱＰＣＲ法により解析した。
ヒトＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡレベルを、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨと比較した。次いで、値を、ＰＢＳ媒体対照群の平均に対して正規化した。データはベースライン値に対するパーセントとして表し、平均値＋標準偏差として提示した。表３１に一覧され、図４に示された結果は、例示的な被験二重鎖剤が、インビボにおいて、ヒトＰＮＰＬＡ３メッセンジャーＲＮＡのレベルを、有効に低減することを裏付ける。
Figure 2023506258000120
Figure 2023506258000121
Figure 2023506258000122
Figure 2023506258000123
Figure 2023506258000124
［実施例４］
さらなるｄｓＲＮＡ二重鎖のデザイン、合成、およびインビトロスクリーニング
当技術分野において公知であり、上記の実施例１において記載された方法を使用して、さらなるｓｉＲＮＡを、デザイン、合成、および調製した。
非修飾ＰＮＰＬＡ３のセンス鎖およびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列についての、さらなる詳細なリストを、表３２に示す。修飾ＰＮＰＬＡ３のセンス鎖およびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列についての詳細なリストを、表３３に示す。
トランスフェクションのために、細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、５％ＣＯ２の雰囲気、１０％のＦＢＳ（ＡＴＣＣ）を補充した、イーグル最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ）中、３７℃において、コンフルエンシー近くまで増殖させてから、トリプシン処理により、プレートから放出した。トランスフェクションは、３８４ウェルプレート内の個々のウェルの、２．５μｌずつのｓｉＲＮＡ二重鎖へと、ウェル１つ当たり７．５μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ＋０．１μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．；型番：１３７７８－１５０）を添加することにより実施した。次いで、混合物を、室温において、１５分間にわたりインキュベートした。次いで、Ｈｅｐ３Ｂ細胞約１．５×１０４個を含有する、抗生剤を伴わない４０μｌの完全増殖培地を、ｓｉＲＮＡ混合物へと添加した。細胞を、ＲＮＡ精製の前に、２４時間にわたりインキュベートした。単回投与実験は、最終二重鎖濃度を、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、および０．１ｎＭとして実施した。
全ＲＮＡの単離は、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳを使用して実施した。略述すると、細胞を、ウェル１つ当たり３μＬのビーズを含有する、１０μｌのＬｙｓｉｓ／Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ中に溶解させ、静電シェーカーにおいて、１０分間にわたり混合した。洗浄工程は、磁性プレート支持体を使用して、Ｂｉｏｔｅｋ ＥＬ４０６上において自動化した。ビーズは（３μＬ中において）、間に吸引工程を伴い、緩衝液Ａ中において、１回、緩衝液Ｂ中において、１回、緩衝液Ｅ中において、２回洗浄した。最終回の吸引に続き、完成した１２μＬのＲＴ混合物を、下記で記載される通りに、各ウェルへと添加した。
ｃＤＮＡ合成のために、ウェル１つ当たり、反応１回当たり１０倍濃度の緩衝液１．５μｌ、１０倍濃度のｄＮＴＰ０．６μｌ、１．５μｌのランダムプライマー、０．７５μｌの逆転写酵素、０．７５μｌのＲＮアーゼ阻害剤、および９．９μｌのＨ２Ｏのマスターミックスを添加した。プレートをシーリングし、静電シェーカーにおいて、１０分間にわたり攪拌し、次いで、摂氏３７度において、２時間にわたりインキュベートした。これに続き、プレートを、摂氏８０度において、８分間にわたり攪拌した。
ＲＴ－ｑＰＣＲは、上記において記載された通りに実施し、相対倍数変化も、上記において記載された通りに計算した。
表３２および３３に列挙されたｄｓＲＮＡ剤についての、Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるトランスフェクションアッセイの結果を、表３４に示す。表３２および３３に列挙されたｄｓＲＮＡ剤についての、初代カニクイザル肝細胞（ＰＣＨ）におけるトランスフェクションアッセイの結果を、表３５に示す。
Figure 2023506258000125
Figure 2023506258000126
Figure 2023506258000127
Figure 2023506258000128
Figure 2023506258000129
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Figure 2023506258000135
Figure 2023506258000136
Figure 2023506258000137
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Figure 2023506258000140
Figure 2023506258000141
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Figure 2023506258000143
Figure 2023506258000144
Figure 2023506258000145
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Figure 2023506258000147
Figure 2023506258000148
Figure 2023506258000149
Figure 2023506258000150
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Figure 2023506258000152
Figure 2023506258000153
Figure 2023506258000154
Figure 2023506258000155
Figure 2023506258000156
［実施例５］
構造－活性相関解析
実施例４におけるインビトロ解析に基づき、構造－活性相関（ＳＡＲ）解析を実施した。特に、さらなる二重鎖を、インビトロおよびインビボにおいてデザイン、合成、およびアッセイした。
当技術分野において公知であり、上記において記載された方法を使用して、ｓｉＲＮＡを、デザイン、合成、および調製した。Ｈｅｐ３Ｂ細胞およびＰＣＨ細胞における、これらのｓｉＲＮＡについてのインビトロスクリーニングアッセイは、上記において記載された通りに実施した。
非修飾ＰＮＰＬＡ３のセンス鎖およびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列についての詳細なリストを、表３６に示す。修飾ＰＮＰＬＡ３のセンス鎖およびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列についての詳細なリストを、表３７に示す。
表３６および３７に列挙されたｄｓＲＮＡ剤についての、Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるトランスフェクションアッセイの結果を、表３８に示す。表３６および３７に列挙されたｄｓＲＮＡ剤についての、初代カニクイザル肝細胞（ＰＣＨ）におけるトランスフェクションアッセイの結果を、表３９に示す。
Figure 2023506258000157
Figure 2023506258000158
Figure 2023506258000159
Figure 2023506258000160
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Figure 2023506258000162
Figure 2023506258000163
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Figure 2023506258000165
Figure 2023506258000166
Figure 2023506258000167
Figure 2023506258000168
Figure 2023506258000169
Figure 2023506258000170
Figure 2023506258000171
Figure 2023506258000172
Figure 2023506258000173
Figure 2023506258000174
Figure 2023506258000175
Figure 2023506258000176
Figure 2023506258000177
［実施例６］
マウスにおける、ｄｓＲＮＡ二重鎖のインビボスクリーニング
上記のインビトロＳＡＲ研究から同定された、目的の二重鎖を、インビボにおいて査定した。特に、投与前の－１４日目において、ヒトＰＮＰＬＡ３をコードする８型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ８）ベクターのウイルス粒子２×１０１０個を、静脈内投与により、野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）へと形質導入した。特に、マウスに、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ＰＩ－ＰＮＰＬＡ３と称される、ＮＭ＿０２５２２５．２として参照される、ヒトＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡのオープンリーディングフレームおよび３’ＵＴＲをコードする、ヒトＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡの一部をコードするＡＡＶ８を投与した。
０日目に、マウス３匹の群に、単回投与による１０ｍｇ／ｋｇの、目的の薬剤またはＰＢＳ対照を皮下投与した。表４０は、処置群を提示し、表４１は、目的の二重鎖を提示する。投与後７日目に、動物を屠殺し、肝臓試料を回収し、液体窒素中において瞬時凍結させた。肝臓ｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＱＰＣＲ法により解析した。
ヒトＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡレベルを、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨと比較した。次いで、値を、ＰＢＳ媒体対照群の平均に対して正規化した。データベースライン値に対するパーセントとして表し、平均値＋標準偏差として提示した。表４２に一覧され、図５に示された結果は、例示的な被験二重鎖剤が、インビボにおいて、ヒトＰＮＰＬＡ３メッセンジャーＲＮＡのレベルを、有効に低減することを裏付ける。
Figure 2023506258000178
Figure 2023506258000179
Figure 2023506258000180
さらなる上記のインビトロＳＡＲ研究から同定された、目的の二重鎖を、インビボにおいて査定した。特に、投与前の－１４日目において、ヒトＰＮＰＬＡ３をコードする８型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ８）ベクターのウイルス粒子２×１０１０個を、これらの静脈内投与により、野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）へと形質導入した。特に、マウスに、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ＰＩ－ＰＮＰＬＡ３と称される、ヒトＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡのうちの、ＮＭ＿０２５２２５．２の全長転写物をコードするＡＡＶ８を投与した。
０日目に、マウス３匹の群に、単回投与による１０ｍｇ／ｋｇの、目的の薬剤またはＰＢＳ対照を皮下投与した。表４３は、処置群を提示し、表４４は、目的の二重鎖を提示する。投与後７日目に、動物を屠殺し、肝臓試料を回収し、液体窒素中において瞬時凍結させた。肝臓ｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＱＰＣＲ法により解析した。
ヒトＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡレベルを、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨと比較した。次いで、値を、ＰＢＳ媒体対照群の平均に対して正規化した。データベースライン値に対するパーセントとして表し、平均値＋標準偏差として提示した。表４５に一覧され、図６に示された結果は、例示的な被験二重鎖剤が、インビボにおいて、ヒトＰＮＰＬＡ３メッセンジャーＲＮＡのレベルを、有効に低減することを裏付ける。
Figure 2023506258000181
Figure 2023506258000182
Figure 2023506258000183
Figure 2023506258000184
さらなる上記のインビトロＳＡＲ研究から同定された、目的の二重鎖を、インビボにおいて査定した。特に、投与前の－１４日目において、ヒトＰＮＰＬＡ３をコードする８型アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ８）ベクターのウイルス粒子２×１０１０個を、これらの静脈内投与により、野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）へと形質導入した。特に、マウスに、ＡＡＶ８－ＴＢＧ－ＰＩ－ＰＮＰＬＡ３と称される、ＮＭ＿０２５２２５．２として参照される、ヒトＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡのオープンリーディングフレームおよび３’ＵＴＲをコードするＡＡＶ８を投与した。
０日目に、マウス３匹の群に、単回投与による１０ｍｇ／ｋｇの、目的の薬剤またはＰＢＳ対照を皮下投与した。表４６は、処置群を提示し、表４７は、目的の二重鎖を提示する。投与後７日目に、動物を屠殺し、肝臓試料を回収し、液体窒素中において瞬時凍結させた。肝臓ｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＱＰＣＲ法により解析した。
ヒトＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡレベルを、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨと比較した。次いで、値を、ＰＢＳ媒体対照群の平均に対して正規化した。データベースライン値に対するパーセントとして表し、平均値＋標準偏差として提示した。表４８に一覧され、図７に示された結果は、例示的な被験二重鎖剤が、インビボにおいて、ヒトＰＮＰＬＡ３メッセンジャーＲＮＡのレベルを、有効に低減することを裏付ける。
Figure 2023506258000185
Figure 2023506258000186
Figure 2023506258000187
Figure 2023506258000188
［実施例７］
さらなるｄｓＲＮＡ二重鎖のデザイン、合成、およびインビトロスクリーニング
当技術分野において公知であり、上記の実施例１において記載された方法を使用して、さらなるｓｉＲＮＡを、デザイン、合成、および調製した。
非修飾ＰＮＰＬＡ３のセンス鎖およびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列についての、さらなる詳細なリストを、表４９に示す。修飾ＰＮＰＬＡ３のセンス鎖およびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列についての詳細なリストを、表５０に示す。
さらなる薬剤についての単回投与スクリーンは、自由取込みおよびトランスフェクションにより実施した。
自由取込みのために、ウェル１つ当たり、ＰＢＳ中に２．５μｌのｓｉＲＮＡ二重鎖を、９６ウェルプレートへと添加することにより、実験を実施した。次いで、初代カニクイザル肝細胞（ＰＣＨ）約１．５×１０４個を含有する完全増殖培地（４７．５μｌ）を、ｓｉＲＮＡへと添加した。細胞を、ＲＮＡ精製およびＲＴ－ｑＰＣＲの前に、４８時間にわたりインキュベートした。単回投与実験は、最終二重鎖濃度を、５００ｎＭ、１００ｎＭ、１０、および１ｎＭとして実施した。
トランスフェクションのために、Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、５％ＣＯ２の雰囲気、１０％のＦＢＳ（ＡＴＣＣ）を補充した、イーグル最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ）中、３７℃において、コンフルエンシー近くまで増殖させてから、トリプシン処理により、プレートから放出した。トランスフェクションは、個々のウェル内の個々のウェルの、２．５μｌずつのｓｉＲＮＡ二重鎖へと、ウェル１つ当たり７．５μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ＋０．１μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．；型番：１３７７８－１５０）を添加することにより実施した。次いで、混合物を、室温において、１５分間にわたりインキュベートした。次いで、Ｈｅｐ３Ｂ細胞約１．５×１０４個を含有する、抗生剤を伴わない４０μｌの完全増殖培地を、ｓｉＲＮＡ混合物へと添加した。細胞を、ＲＮＡ精製の前に、２４時間にわたりインキュベートした。単回投与実験は、最終二重鎖濃度を、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、および０．１ｎＭとして実施した。
全ＲＮＡの単離は、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳを使用して実施した。略述すると、細胞を、ウェル１つ当たり３μＬのビーズを含有する、１０μｌのＬｙｓｉｓ／Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ中に溶解させ、静電シェーカーにおいて、１０分間にわたり混合した。洗浄工程は、磁性プレート支持体を使用して、Ｂｉｏｔｅｋ ＥＬ４０６上において自動化した。ビーズは、（３μＬ中において）間に吸引工程を伴い、緩衝液Ａ中において、１回、緩衝液Ｂ中において、１回、緩衝液Ｅ中において、２回洗浄した。最終回の吸引に続き、完成した１２μＬのＲＴ混合物を、下記で記載される通りに、各ウェルへと添加した。
ｃＤＮＡ合成のために、ウェル１つ当たり、反応１回当たり１．１０倍濃度の緩衝液５μｌ、１０倍濃度のｄＮＴＰ０．６μｌ、１．５μｌのランダムプライマー、０．７５μｌの逆転写酵素、０．７５μｌのＲＮアーゼ阻害剤、および９．９μｌのＨ２Ｏのマスターミックスを添加した。プレートをシーリングし、静電シェーカーにおいて、１０分間にわたり攪拌し、次いで、３７℃において、２時間にわたりインキュベートした。これに続き、プレートを、８０℃において、８分間にわたり攪拌した。
ＲＴ－ｑＰＣＲは、上記において記載された通りに実施し、相対倍数変化も、上記において記載された通りに計算した。
表４９および５０に列挙されたｄｓＲＮＡ剤についての、Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるトランスフェクションアッセイの結果を、表５１に示す。表４９および５０に列挙されたｄｓＲＮＡ剤についての、初代カニクイザル肝細胞（ＰＣＨ）における自由取込み実験の結果を、表５２に示す。
Figure 2023506258000189
Figure 2023506258000190
Figure 2023506258000191
Figure 2023506258000192
Figure 2023506258000193
Figure 2023506258000194
Figure 2023506258000195
Figure 2023506258000196
Figure 2023506258000197
Figure 2023506258000198
Figure 2023506258000199
Figure 2023506258000200
Figure 2023506258000201
Figure 2023506258000202
Figure 2023506258000203
Figure 2023506258000204
Figure 2023506258000205
Figure 2023506258000206
Figure 2023506258000207
Figure 2023506258000208
Figure 2023506258000209
Figure 2023506258000210
Figure 2023506258000211
Figure 2023506258000212
Figure 2023506258000213
Figure 2023506258000214
Figure 2023506258000215
Figure 2023506258000216
Figure 2023506258000217
Figure 2023506258000218
Figure 2023506258000219
本発明の実施形態
ある態様において、本発明は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列と、０、１、２、または３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号２のヌクレオチド配列と、１、２、または３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の連続ヌクレオチドを含む、細胞内のパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤を提供する。一実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つの熱不安定性ヌクレオチド修飾、例えば、脱塩基性修飾；二重鎖内の対向ヌクレオチドとのミスマッチ；ならびに不安定性糖修飾、２’－デオキシ修飾、非環状ヌクレオチド、アンロック核酸（ＵＮＡ）、またはグリセロール核酸（ＧＮＡ）を含み、例えば、アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定性ヌクレオチド修飾を含む。
別の態様において、本発明は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）をコードするｍＲＮＡに対する相補性領域を含み、相補性領域が、表２～１１、２１、２４、２７、３０、３２、３３、３６、３７、４９、または５０のうちのいずれか１つにおけるアンチセンスヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと、０、１、２、または３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の連続ヌクレオチドを含む、細胞内のパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供する。
一態様において、本発明は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列の、ヌクレオチド６７７～７２１；６８３～７２１；７７３～８１７；１１８５～１２９５；１１８５～１２４１；１２０２～１２９５；１２０２～１２４１；１２５５～１２９５；１７３８～１７９２；１９０１～１９４５；１９２０～１９４５；２１０８～２２０８；２１０８～２１６６；２１０８～２１３６；２１２１～２１６６；２１２１～２２０８；２１６９～２２０８；２１７６～２２０８；または２２３９～２２６５のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと、０、１、２、または３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号２の対応するヌクレオチド配列に由来する、少なくとも１９の連続ヌクレオチドを含む、細胞内のパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供する。
一態様において、本発明は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列の、ヌクレオチド５７４～５９６；６７７～６９９；６８３～７０５；６９９～７２１；７７３～７９５；７９５～８１７；１１８５～１２０７；１１９２～１２１４；１２０２～１２２４；１２０８～１２３０；１２０９～１２３１；１２１０～１２３２；１２１１～１２３３；１２１２～１２３４；１２１３～１２３３；１２１４～１２３４；１２１４～１２３６；１２１５～１２３７；１２１６～１２３８；１２１９～１２３７；１２１９～１２４１；１２５５～１２７５；１２５６～１２７６；１２５７～１２７５；１２５７～１２７７；１２５８～１２７８；１２５９～１２７９；１２６０～１２７８；１２６０～１２８０；１２６１～１２８１；１２６２～１２８２；１２６３～１２８３；１２６４～１２８２；１２６４～１２８４；１２６５～１２８５；１２６７～１２８５；１２６６～１２８６；１２６６～１２８８；１２６７～１２８５；１２６７～１２８７；１２６８～１２９０；１２６９～１２８９；１２７０～１２９０；１２７１～１２９１；１２７２～１２９２；１２７３～１２９３；１２７４～１２９４；１２７５～１２９５；１６３１～１６５３；１７３８～１７６０；１７３９～１７６１；１７４０～１７６０；１７４０～１７６２；１７４１～１７６３；１７４４～１７６６；１７４６～１７６６；１７５０～１７７２；１７５１～１７７３；１７５２～１７７４；１７５３～１７７５；１７５４～１７７６；１７５５～１７７７；１７５６～１７７８；１７５７～１７７９；１７５８～１７８０；１７５９～１７８１；１７６０～１７８２；１７６１～１７８３；１７６２～１７８２；１７６２～１７８４；１７６３～１７８５；１７６４～１７８６；１７６５～１７８７；１７６６～１７８６；１７６６～１７８８；１７６７～１７８７；１７６８～１７８８；１７６７～１７８９；１７６９～１７８９；１７７０～１７８８；１７７０～１７９０；１７７１～１７９１；１７７２～１７９２；１８１５～１８３７；１９０１～１９２３；１９２０～１９４２；１９２３～１９４５；２１１２～２１３０；２１６９～２１９１；２１７１～２１９１；２１７６～２１９８；２１７７～２１９９；２１７８～２２００；２１７９～２２０１；２１８０～２２０２；２１８１～２２０３；２１８３～２２０５；２１８４～２２０６；２１８６～２２０８；２２３９～２２６１；２２４１～２２６３；２２４２～２２６４；または２２４３～２２６５のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと、０、１、２、または３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号２の対応するヌクレオチド配列に由来する、少なくとも１９の連続ヌクレオチドを含む、細胞内のパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供する。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、ＡＤ－５１７１９７．２；ＡＤ－５１７２５８．２；ＡＤ－５１６７４８．２；ＡＤ－５１６８５１．２；ＡＤ－５１９３５１．２；ＡＤ－５１９７５４．２；ＡＤ－５１９８２８．２；ＡＤ－５２００１８．２；ＡＤ－５２００３５．２；ＡＤ－５２００６２．２；ＡＤ－５２００６４．２；ＡＤ－５２００６５．２；ＡＤ－５２００６７．２；ＡＤ－７５２８９．２；ＡＤ－５２００６９．２；ＡＤ－５２００９９．２；ＡＤ－６７５７５．７；ＡＤ－５２０１０１．２；ＡＤ－６７６０５．７；ＡＤ－１１９３３２３．１；ＡＤ－１１９３３４４．１；ＡＤ－１１９３３５０．１；ＡＤ－１１９３３６５．１；ＡＤ－１１９３３７９．１；ＡＤ－１１９３４０７．１；ＡＤ－１１９３４２１．１；ＡＤ－１１９３４２２．１；ＡＤ－１１９３４２９．１；ＡＤ－１１９３４３７．１；ＡＤ－１１９３４４３．１；ＡＤ－１１９３４７１．１；およびＡＤ－１１９３４８１．１からなる群から選択される二重鎖の、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと、０、１、２、または３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の連続ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、ＡＤ－５１９３４５．１、ＡＤ－５１９３４６．１、ＡＤ－５１９３４７．１、ＡＤ－６７５５４．７、ＡＤ－５１９７５２．３、ＡＤ－１０１０７３１．１、ＡＤ－１０１０７３２．１、ＡＤ－５１９３４３．１、ＡＤ－５１９３４４．１、ＡＤ－５１９３４９．１、ＡＤ－５１９３５０．１、ＡＤ－５１９７５３．２、ＡＤ－５１９９３２．１、ＡＤ－５１９９３５．２、ＡＤ－５２００１８．６、ＡＤ－５１７８３７．２、ＡＤ－８０５６３５．２、ＡＤ－５１９３２９．２、ＡＤ－５２００６３．２、ＡＤ－５１９７５７．２、ＡＤ－８０５６３１．２、ＡＤ－５１６９１７．２、ＡＤ－５１６８２８．２、ＡＤ－５１８９８３．２、ＡＤ－８０５６３６．２、ＡＤ－５１９７５４．７、ＡＤ－５２００６２．２、ＡＤ－６７５７５．９、ＡＤ－５１８９２３．３、ＡＤ－５２００５３．４、ＡＤ－５１９６６７．２、ＡＤ－５１９７７３．２、ＡＤ－５１９３５４．２、ＡＤ－５２００６０．４、ＡＤ－５２００６１．４、ＡＤ－１０１０７３３．２、ＡＤ－１０１０７３５．２；ＡＤ－１１９３３２３．１；ＡＤ－１１９３３４４．１；ＡＤ－１１９３３５０．１；ＡＤ－１１９３３６５．１；ＡＤ－１１９３３７９．１；ＡＤ－１１９３４０７．１；ＡＤ－１１９３４２１．１；ＡＤ－１１９３４２２．１；ＡＤ－１１９３４２９．１；ＡＤ－１１９３４３７．１；ＡＤ－１１９３４４３．１；ＡＤ－１１９３４７１．１；およびＡＤ－１１９３４８１．１からなる群から選択される二重鎖の、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと、０、１、２、または３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の連続ヌクレオチドを含む。
一態様において、本発明は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖が、配列番号１の、ヌクレオチド１２００～１２５０、１２０５～１２５０、１１２１０～１２５０、１２００～１２４５、１２００～１２４０、１２００～１２３５、１２００～１２３７、１２０５～１２３７、１２１０～１２３２、１２１２～１２３７、１２１２～１２３４、１２５０～１３００、１２５５～１３００、１２６０～１３００、１２５０～１２９５、１２５０～１３９０、１２５０～１２８５、１２５０～１２８２、１２５５～１２８２、１２６０～１２８２、１２６２～１３００、１２６２～１２９５、１２６２～１３９０、および１２６２～１２８２のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと、３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号２の対応するヌクレオチド配列に由来する、少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含む、細胞内のパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供する。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、ＡＤ－５１９３４５、ＡＤ－１１９３３５０、ＡＤ－１１９３３６５、ＡＤ－１１９３４３７；およびＡＤ－５１９３４７からなる群から選択される二重鎖の、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと、０、１、２、または３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の連続ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、二重鎖である、ＡＤ－５１９３５１のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと、０、１、２、または３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の連続ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、二重鎖である、ＡＤ－１１９３３５０のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと、０、１、２、または３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の連続ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、二重鎖である、ＡＤ－１１９３３６５のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと、０、１、２、または３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の連続ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、二重鎖である、ＡＤ－１１９３４３７のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと、０、１、２、または３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の連続ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、二重鎖である、ＡＤ－５１９３４７のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと、０、１、２、または３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の連続ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。
一実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全ては、修飾を含むか；アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全ては、修飾を含むか；またはセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全て、およびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全ては、修飾を含む。
一実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの全ては、修飾を含むか；アンチセンス鎖のヌクレオチドの全ては、修飾を含むか；またはセンス鎖のヌクレオチドの全て、およびアンチセンス鎖のヌクレオチドの全ては、修飾を含む。
一実施形態において、修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、デオキシヌクレオチド、３’末端デオキシチミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックヌクレオチド、アンロックヌクレオチド、配座固定ヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基性ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－ヒドロキシル修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキシニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’－リン酸を含むヌクレオチド、５’－リン酸模倣体を含むヌクレオチド、熱不安定性ヌクレオチド、グリコール修飾ヌクレオチド（ＧＮＡ）、および２－Ｏ－（Ｎ－メチルアセトアミド）修飾ヌクレオチド；ならびにこれらの組合せからなる群から選択される。
一実施形態において、ヌクレオチド上の修飾は、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシル、およびグリコール；ならびにこれらの組合せからなる群から選択される。
一実施形態において、修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、デオキシヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、グリコール修飾ヌクレオチド（ＧＮＡ）、例えば、Ｇｇｎ、Ｃｇｎ、Ｔｇｎ、またはＡｇｎ、およびビニルホスホネートヌクレオチド；ならびにこれらの組合せからなる群から選択される。
別の実施形態において、ヌクレオチド上の修飾のうちの少なくとも１つは、熱不安定性ヌクレオチド修飾である。
一実施形態において、熱不安定性ヌクレオチド修飾は、脱塩基性修飾；二重鎖内の対向ヌクレオチドとのミスマッチ；ならびに不安定性糖修飾、２’－デオキシ修飾、非環状ヌクレオチド、アンロック核酸（ＵＮＡ）、およびグリセロール核酸（ＧＮＡ）からなる群から選択される。
一部の実施形態において、修飾ヌクレオチドは、３’末端デオキシチミンヌクレオチド（ｄＴ）の短い配列を含む。
一部の実施形態において、ヌクレオチド上の修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾、ＧＮＡ修飾、および２’フルオロ修飾である。
一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結をさらに含む。一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、６つ～８つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。一実施形態において、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結は、１つの鎖の３’末端にある。鎖は、アンチセンス鎖でもよい。別の実施形態において、鎖は、センス鎖である。関連の実施形態において、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結は、１つの鎖の５’末端にある。鎖は、アンチセンス鎖でもよい。別の実施形態において、鎖は、センス鎖である。別の実施形態において、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結は、１つの鎖の５’末端および３’末端の両方にある。鎖は、アンチセンス鎖でもよい。別の実施形態において、鎖は、センス鎖である。
二本鎖領域は、１９～３０ヌクレオチド対の長さ；１９～２５ヌクレオチド対の長さ；１９～２３ヌクレオチド対の長さ；２３～２７ヌクレオチド対の長さ；または２１～２３ヌクレオチド対の長さでありうる。
一実施形態において、各鎖は、独立に、３０ヌクレオチド以下の長さである。
一実施形態において、センス鎖は、２１ヌクレオチドの長さであり、アンチセンス鎖は、２３ヌクレオチドの長さである。
相補性領域は、少なくとも１７ヌクレオチドの長さ；１９～２３ヌクレオチドの間の長さ；または１９ヌクレオチドの長さでありうる。
一実施形態において、少なくとも１つの鎖は、少なくとも１ヌクレオチドの３’突出を含む。別の実施形態において、少なくとも１つの鎖は、少なくとも２ヌクレオチドの３’突出を含む。
一実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、リガンドをさらに含む。
一実施形態において、リガンドは、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖の３’末端とコンジュゲートされている。
一実施形態において、リガンドは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である。
一実施形態において、リガンドは、一価、二価、または三価の分枝状リンカーを介して接合されている１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
一実施形態において、リガンドは、
Figure 2023506258000220
 である。
一実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、以下の図式
Figure 2023506258000221
 において示されるリガンドとコンジュゲートされ、Ｘは、ＯまたはＳである。
一実施形態において、Ｘは、Ｏである。
一実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結をさらに含む。
一実施形態において、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結は、１つの鎖の３’末端、例えば、アンチセンス鎖またはセンス鎖にある。
別の実施形態において、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結は、１つの鎖の５’末端、例えば、アンチセンス鎖またはセンス鎖にある。
一実施形態において、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結は、１つの鎖の５’末端および３’末端の両方にある。一実施形態において、鎖は、アンチセンス鎖である。
一実施形態において、二重鎖のアンチセンス鎖の５’末端の１位における塩基対は、ＡＵ塩基対である。
本発明はまた、本発明のｄｓＲＮＡ剤のうちのいずれか、および本発明のｄｓＲＮＡ剤のうちのいずれかを含む医薬組成物を含有する細胞も提供する。
本発明の医薬組成物は、ｄｓＲＮＡ剤を、非緩衝液中、例えば、生理食塩液または水中に含む場合もあり、ｄｓＲＮＡ剤を、緩衝液中、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、もしくはリン酸塩、またはこれらの任意の組合せを含む緩衝液；あるいはリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）中に含む場合もある。
一態様において、本発明は、細胞内のパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。方法は、細胞を、本発明のｄｓＲＮＡ、または本発明の医薬組成物のいずれかと接触させ、これにより、細胞内のＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害することを含む。
一実施形態において、細胞は、対象、例えば、ヒト対象、例えば、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓内の脂肪の蓄積、肝炎、肝細胞壊死、肝線維症、肥満、または非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）からなる群から選択される、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）関連障害などのパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）関連障害を有する対象内部の細胞である。
一実施形態において、細胞を、ｄｓＲＮＡ剤と接触させることは、ＰＮＰＬＡ３の発現を、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％阻害する。
一実施形態において、ＰＮＰＬＡ３の発現を阻害することは、対象の血清中のＰＮＰＬＡ３タンパク質レベルを、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％低下させる。
一態様において、本発明は、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）発現の低減から利益を得る障害を有する対象を処置する方法を提供する。方法は、対象へと、治療有効量の、本発明のｄｓＲＮＡ、または本発明の医薬組成物のいずれかを投与し、これにより、ＰＮＰＬＡ３発現の低減から利益を得る障害を有する対象を処置することを含む。
別の態様において、本発明は、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）発現の低減から利益を得る障害を有する対象における、少なくとも１つの症状を防止する方法を提供する。方法は、対象へと、予防有効量の、本発明のｄｓＲＮＡ、または本発明の医薬組成物のいずれかを投与し、これにより、ＰＮＰＬＡ３発現の低減から利益を得る障害を有する対象における、少なくとも１つの症状を防止することを含む。
一実施形態において、障害は、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）関連障害であり、例えば、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）関連障害は、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓内の脂肪の蓄積、肝炎、肝細胞壊死、肝線維症、肥満、または非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）からなる群から選択される。
一実施形態において、ＰＮＰＬＡ３関連障害は、ＮＡＦＬＤである。
一実施形態において、対象は、ヒトである。
一実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、対象へと、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの用量において投与される。
一実施形態において、ｄｓＲＮＡ剤は、対象へと、皮下投与される。
本発明についての一実施形態において方法は、対象に由来する試料中のＰＮＰＬＡ３レベルをさらに決定することを含む。
一実施形態において、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）の、対象試料中レベルは、血液試料中または血清試料中の、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）タンパク質レベルである。
ある特定の実施形態において、本発明の方法は、対象へと、さらなる治療剤を投与することをさらに含む。さらなる実施形態において、さらなる治療剤は、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、フィブレート、胆汁酸封鎖剤、ナイアシン、抗血小板薬剤、アンジオテンシン転換酵素阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、アシルＣｏＡコレステロールアセチルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害剤、コレステロール吸収阻害剤、コレステロールエステル輸送タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害剤、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＴＰ）阻害剤、コレステロールモジュレーター、胆汁酸モジュレーター、ペルオキシソーム増殖活性化受容体（ＰＰＡＲ）アゴニスト、遺伝子ベースの治療、複合血管保護剤、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤、アスピリンまたはアスピリン様化合物、ＩＢＡＴ阻害剤、スクアレンシンターゼ阻害剤、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）Ｉ阻害剤、または魚類油からなる群から選択される。
本発明はまた、本発明のｄｓＲＮＡ、または本発明の医薬組成物のいずれかと、適宜、使用のための指示書とを含むキットも提供する。
均等物
当業者は、規定以下の実験を使用して、本明細書において記載される、具体的実施形態および方法に対する、多くの均等物を認識するか、また確認することができるであろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲により包含されることが意図される。

Claims (73)

  1. 二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）をコードするｍＲＮＡに対する相補性領域を含み、相補性領域が、表２～１１、２１、２４、２７、３０、３２、３３、３６、３７、４９、または５０のうちのいずれか１つにおけるアンチセンスヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと、３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含む、細胞内のＰＮＰＬＡ３の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）。
  2. 二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖が、配列番号１の、ヌクレオチド６７７～７２１；６８３～７２１；７７３～８１７；１１８５～１２９５；１１８５～１２４１；１２０２～１２９５；１２０２～１２４１；１２５５～１２９５；１７３８～１７９２；１９０１～１９４５；１９２０～１９４５；２１０８～２２０８；２１０８～２１６６；２１０８～２１３６；２１２１～２１６６；２１２１～２２０８；２１６９～２２０８；２１７６～２２０８；または２２３９～２２６５のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと、３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号２の対応するヌクレオチド配列に由来する、少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含む、細胞内のパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）。
  3. 二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖が、配列番号１の、ヌクレオチド５７４～５９６；６７７～６９９；６８３～７０５；６９９～７２１；７７３～７９５；７９５～８１７；１１８５～１２０７；１１９２～１２１４；１２０２～１２２４；１２０８～１２３０；１２０９～１２３１；１２１０～１２３２；１２１１～１２３３；１２１２～１２３４；１２１３～１２３３；１２１４～１２３４；１２１４～１２３６；１２１５～１２３７；１２１６～１２３８；１２１９～１２３７；１２１９～１２４１；１２５５～１２７５；１２５６～１２７６；１２５７～１２７５；１２５７～１２７７；１２５８～１２７８；１２５９～１２７９；１２６０～１２７８；１２６０～１２８０；１２６１～１２８１；１２６２～１２８２；１２６３～１２８３；１２６４～１２８２；１２６４～１２８４；１２６５～１２８５；１２６７～１２８５；１２６７～１２８７；１２６８～１２９０；１２６９～１２８９；１２７０～１２９０；１２７１～１２９１；１２７２～１２９２；１２７３～１２９３；１２７４～１２９４；１２７５～１２９５；１６３１～１６５３；１７３８～１７６０；１７３９～１７６１；１７４０～１７６０；１７４０～１７６２；１７４１～１７６３；１７４４～１７６６；１７４６～１７６６；１７５０～１７７２；１７５１～１７７３；１７５２～１７７４；１７５３～１７７５；１７５４～１７７６；１７５５～１７７７；１７５６～１７７８；１７５７～１７７９；１７５８～１７８０；１７５９～１７８１；１７６０～１７８２；１７６１～１７８３；１７６２～１７８２；１７６２～１７８４；１７６３～１７８５；１７６４～１７８６；１７６５～１７８７；１７６６～１７８６；１７６６～１７８８；１７６７～１７８７；１７６８～１７８８；１７６７～１７８９；１７６９～１７８９；１７７０～１７８８；１７７０～１７９０；１７７１～１７９１；１７７２～１７９２；１８１５～１８３７；１９０１～１９２３；１９２０～１９４２；１９２３～１９４５；２１１２～２１３０；２１６９～２１９１；２１７１～２１９１；２１７６～２１９８；２１７７～２１９９；２１７８～２２００；２１７９～２２０１；２１８０～２２０２；２１８１～２２０３；２１８３～２２０５；２１８４～２２０６；２１８６～２２０８；２２３９～２２６１；２２４１～２２６３；２２４２～２２６４；または２２４３～２２６５のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと、３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号２の対応するヌクレオチド配列に由来する、少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含む、細胞内のパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）。
  4. アンチセンス鎖が、ＡＤ－５１７１９７．２；ＡＤ－５１７２５８．２；ＡＤ－５１６７４８．２；ＡＤ－５１６８５１．２；ＡＤ－５１９３５１．２；ＡＤ－５１９７５４．２；ＡＤ－５１９８２８．２；ＡＤ－５２００１８．２；ＡＤ－５２００３５．２；ＡＤ－５２００６２．２；ＡＤ－５２００６４．２；ＡＤ－５２００６５．２；ＡＤ－５２００６７．２；ＡＤ－７５２８９．２；ＡＤ－５２００６９．２；ＡＤ－５２００９９．２；ＡＤ－６７５７５．７；ＡＤ－５２０１０１．２；ＡＤ－１１９３３２３．１；ＡＤ－１１９３３４４．１；ＡＤ－１１９３３５０．１；ＡＤ－１１９３３６５．１；ＡＤ－１１９３３７９．１；ＡＤ－１１９３４０７．１；ＡＤ－１１９３４２１．１；ＡＤ－１１９３４２２．１；ＡＤ－１１９３４２９．１；ＡＤ－１１９３４３７．１；ＡＤ－１１９３４４３．１；ＡＤ－１１９３４７１．１；ＡＤ－１１９３４８１．１；およびＡＤ－６７６０５．７からなる群から選択される二重鎖の、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと、３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  5. アンチセンス鎖が、ＡＤ－５１９３４５．１、ＡＤ－５１９３４６．１、ＡＤ－５１９３４７．１、ＡＤ－６７５５４．７、ＡＤ－５１９７５２．３、ＡＤ－１０１０７３１．１、ＡＤ－１０１０７３２．１、ＡＤ－５１９３４３．１、ＡＤ－５１９３４４．１、ＡＤ－５１９３４９．１、ＡＤ－５１９３５０．１、ＡＤ－５１９７５３．２、ＡＤ－５１９９３２．１、ＡＤ－５１９９３５．２、ＡＤ－５２００１８．６、ＡＤ－５１７８３７．２、ＡＤ－８０５６３５．２、ＡＤ－５１９３２９．２、ＡＤ－５２００６３．２、ＡＤ－５１９７５７．２、ＡＤ－８０５６３１．２、ＡＤ－５１６９１７．２、ＡＤ－５１６８２８．２、ＡＤ－５１８９８３．２、ＡＤ－８０５６３６．２、ＡＤ－５１９７５４．７、ＡＤ－５２００６２．２、ＡＤ－６７５７５．９、ＡＤ－５１８９２３．３、ＡＤ－５２００５３．４、ＡＤ－５１９６６７．２、ＡＤ－５１９７７３．２、ＡＤ－５１９３５４．２、ＡＤ－５２００６０．４、ＡＤ－５２００６１．４、ＡＤ－１０１０７３３．２および、ＡＤ－１０１０７３５．２からなる群から選択される二重鎖の、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと、３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  6. 二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖が、配列番号１の、ヌクレオチド１２００～１２５０、１２０５～１２５０、１１２１０～１２５０、１２００～１２４５、１２００～１２４０、１２００～１２３５、１２００～１２３７、１２０５～１２３７、１２１０～１２３２、１２１２～１２３７、１２１２～１２３４、１２５０～１３００、１２５５～１３００、１２６０～１３００、１２５０～１２９５、１２５０～１３９０、１２５０～１２８５、１２５０～１２８２、１２５５～１２８２、１２６０～１２８２、１２６２～１３００、１２６２～１２９５、１２６２～１３９０、および１２６２～１２８２のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと、３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号２の対応するヌクレオチド配列に由来する、少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含む、細胞内のパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）。
  7. アンチセンス鎖が、ＡＤ－５１９３５１、ＡＤ－５１９３４５、ＡＤ－１１９３３５０、ＡＤ－１１９３３６５、ＡＤ－１１９３４３７；およびＡＤ－５１９３４７からなる群から選択される二重鎖の、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと、３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  8. ｄｓＲＮＡ剤が、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  9. センス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、修飾を含むか；アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、修飾を含むか；またはセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全て、およびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが、修飾を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  10. センス鎖のヌクレオチドの全てが、修飾を含むか；アンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが、修飾を含むか；またはセンス鎖のヌクレオチドの全て、およびアンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが、修飾を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  11. 修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、デオキシヌクレオチド、３’末端デオキシチミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックヌクレオチド、アンロックヌクレオチド、配座固定ヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基性ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－ヒドロキシル修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキシニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’－リン酸を含むヌクレオチド、５’－リン酸模倣体を含むヌクレオチド、熱不安定性ヌクレオチド、グリコール修飾ヌクレオチド（ＧＮＡ）、および２－Ｏ－（Ｎ－メチルアセトアミド）修飾ヌクレオチド；ならびにこれらの組合せからなる群から選択される、請求項８から１０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  12. ヌクレオチド上の修飾が、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシル、およびグリコール；ならびにこれらの組合せからなる群から選択される、請求項８から１０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  13. 修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、デオキシヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、グリコール修飾ヌクレオチド（ＧＮＡ）、およびビニルホスホネートヌクレオチド；ならびにこれらの組合せからなる群から選択される、請求項８から１０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  14. ヌクレオチド上の修飾のうちの少なくとも１つが、熱不安定性ヌクレオチド修飾である、請求項８から１０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  15. 熱不安定性ヌクレオチド修飾が、脱塩基性修飾；二重鎖内の対向ヌクレオチドとのミスマッチ；ならびに不安定性糖修飾、２’－デオキシ修飾、非環状ヌクレオチド、アンロック核酸（ＵＮＡ）、およびグリセロール核酸（ＧＮＡ）からなる群から選択される、請求項１４に記載のｄｓＲＮＡ。
  16. 二本鎖領域が、１９～３０ヌクレオチド対の長さである、請求項１から１５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  17. 二本鎖領域が、１９～２５ヌクレオチド対の長さである、請求項１６に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  18. 二本鎖領域が、１９～２３ヌクレオチド対の長さである、請求項１６に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  19. 二本鎖領域が、２３～２７ヌクレオチド対の長さである、請求項１６に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  20. 二本鎖領域が、２１～２３ヌクレオチド対の長さである、請求項１６に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  21. 各鎖が、独立に、３０ヌクレオチド以下の長さである、請求項１から２０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  22. センス鎖が、２１ヌクレオチドの長さであり、アンチセンス鎖が、２３ヌクレオチドの長さである、請求項１から２１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  23. 相補性領域が、少なくとも１７ヌクレオチドの長さである、請求項１から２２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  24. 相補性領域が、１９～２３ヌクレオチドの間の長さである、請求項１から２３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  25. 相補性領域が、１９ヌクレオチドの長さである、請求項１から２４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  26. 少なくとも１つの鎖が、少なくとも１ヌクレオチドの３’突出を含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  27. 少なくとも１つの鎖が、少なくとも２ヌクレオチドの３’突出を含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  28. リガンドをさらに含む、請求項１から２７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  29. リガンドが、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖の３’末端とコンジュゲートされている、請求項２８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  30. リガンドが、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である、請求項２８または２９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  31. リガンドが、一価、二価、または三価の分枝状リンカーを介して接合されている１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である、請求項２８から３０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  32. リガンドが、
    Figure 2023506258000222
     である、請求項３０または３１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  33. 以下の図式
    Figure 2023506258000223
     において示されるリガンドとコンジュゲートされ、Ｘは、ＯまたはＳである、請求項３２に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  34. Ｘが、Ｏである、請求項３３に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  35. 少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結をさらに含む、請求項１から３４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  36. ホスホロチオエートヌクレオチド間連結またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結が、１つの鎖の３’末端にある、請求項３５に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  37. 鎖が、アンチセンス鎖である、請求項３６に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  38. 鎖が、センス鎖である、請求項３６に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  39. ホスホロチオエートヌクレオチド間連結またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結が、１つの鎖の５’末端にある、請求項３５に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  40. 鎖が、アンチセンス鎖である、請求項３９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  41. 鎖が、センス鎖である、請求項３９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  42. ホスホロチオエートヌクレオチド間連結またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結が、１つの鎖の５’末端および３’末端の両方にある、請求項３５に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  43. 鎖が、アンチセンス鎖である、請求項４２に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  44. 二重鎖のアンチセンス鎖の５’末端の１位における塩基対が、ＡＵ塩基対である、請求項１から４３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  45. 請求項１から４４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を含有する細胞。
  46. パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）をコードする遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって、請求項１から４４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を含む医薬組成物。
  47. ｄｓＲＮＡ剤が、非緩衝液中にある、請求項４６に記載の医薬組成物。
  48. 非緩衝液が、生理食塩液または水である、請求項４７に記載の医薬組成物。
  49. 前記ｄｓＲＮＡ剤が、緩衝液中にある、請求項４６に記載の医薬組成物。
  50. 緩衝液が、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、もしくはリン酸塩、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項４９に記載の医薬組成物。
  51. 緩衝液が、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）である、請求項５０に記載の医薬組成物。
  52. 細胞内のパタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）遺伝子の発現を阻害する方法であって、細胞を、請求項１から４４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤、または請求項４８から５１のいずれか一項に記載の医薬組成物と接触させ、これにより、細胞内のＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を阻害することを含む方法。
  53. 細胞が、対象内部の細胞である、請求項５２に記載の方法。
  54. 対象が、ヒトである、請求項５３に記載の方法。
  55. 対象が、ＰＮＰＬＡ３関連障害を有する、請求項５２に記載の方法。
  56. ＰＮＰＬＡ３関連障害が、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓内の脂肪の蓄積、肝炎、肝細胞壊死、肝線維症、肥満、および非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）からなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
  57. 細胞を、ｄｓＲＮＡ剤と接触させることが、ＰＮＰＬＡ３の発現を、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％阻害する、請求項５２から５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. ＰＮＰＬＡ３の発現を阻害することが、対象の血清中のＰＮＰＬＡ３タンパク質レベルを、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％低下させる、請求項５２から５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）発現の低減から利益を得る障害を有する対象を処置する方法であって、対象へと、治療有効量の、請求項１から４４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤、または請求項４６から５１のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与し、これにより、ＰＮＰＬＡ３発現の低減から利益を得る障害を有する対象を処置することを含む方法。
  60. パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）発現の低減から利益を得る障害を有する対象における、少なくとも１つの症状を防止する方法であって、対象へと、予防有効量の、請求項１から４４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤、または請求項４６から５１のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与し、これにより、ＰＮＰＬＡ３発現の低減から利益を得る障害を有する対象における、少なくとも１つの症状を防止することを含む方法。
  61. 障害が、ＰＮＰＬＡ３関連障害である、請求項５９または６０に記載の方法。
  62. ＰＮＰＬＡ３関連障害が、脂肪肝（脂肪症）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝硬変、肝臓内の脂肪の蓄積、肝炎、肝細胞壊死、肝線維症、肥満、および非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）からなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
  63. ＰＮＰＬＡ３関連障害が、ＮＡＦＬＤである、請求項６１に記載の方法。
  64. 対象が、ヒトである、請求項６１に記載の方法。
  65. 対象への薬剤の投与が、ＰＮＰＬＡ３タンパク質蓄積の減少を引き起こす、請求項５９または６０に記載の方法。
  66. ｄｓＲＮＡ剤が、対象へと、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの用量において投与される、請求項５９から６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. ｄｓＲＮＡ剤が、対象へと、皮下投与される、請求項５９から６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 対象に由来する試料（複数可）中のＰＮＰＬＡ３レベルを決定することをさらに含む、請求項５９から６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 対象試料（複数可）中のＰＮＰＬＡ３レベルが、血液試料（複数可）中または血清試料（複数可）中のＰＮＰＬＡ３タンパク質レベルである、請求項６８に記載の方法。
  70. 対象へと、ＰＮＰＬＡ３関連障害の処置のためのさらなる治療剤を投与することをさらに含む、請求項５９から６９のいずれか一項に記載の方法。
  71. 請求項１から４４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤、または請求項４６から５１のいずれか一項に記載の医薬組成物を含むキット。
  72. 請求項１から４４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤、または請求項４６から５１のいずれか一項に記載の医薬組成物を含むバイアル。
  73. 請求項１から４４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤、または請求項４６から５１のいずれか一項に記載の医薬組成物を含むシリンジ。
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