TW202317762A - 含有類ＰＡＴＡＴＩＮ磷脂酶結構域３（ＰＮＰＬＡ３）的ｉＲＮＡ組成物及其使用方法 - Google Patents

含有類ＰＡＴＡＴＩＮ磷脂酶結構域３（ＰＮＰＬＡ３）的ｉＲＮＡ組成物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本發明係關於靶向含有類Patatin磷脂酶結構域3(PNPLA3)基因之RNAi劑，例如，雙股RNA(dsRNA)劑。本發明亦關於使用此類RNAi劑抑制PNPLA3基因之表現的方法以及預防或治療PNPLA3相關疾患，例如，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的方法。

Description

含有類PATATIN磷脂酶結構域3(PNPLA3)的iRNA 組成物及其使用方法
相關申請
本申請主張2021年6月2日遞交之美國臨時申請第63/195,769號及2021年8月13日遞交之美國臨時申請第63/232,797號之優先權權益。前述申請之整體內容藉由引用併入本文。
序列表
本申請含有序列表，其業經以ASCII格式提交電子版，且藉由引用以其整體併入本文。所述ASCII拷貝於2022年5月31日創建，名為121301-14820_SL.txt，大小為457,724位元組。
過量之甘油三酸酯於肝臟內之蓄積係稱為肝脂肪變性(或脂肪肝)，且與不良代謝結果包括胰島素抗性及血脂異常相關。脂肪肝頻繁見於具有過量酒精攝入之個體及患有肥胖症、糖尿病或高脂血症之個體中。惟，在未攝入過量酒精(>10g/天)的情況下，可發展出非酒精性脂肪肝病 (NAFLD)。NAFLD指稱一系列肝病，其等可從單純性脂肪肝(脂肪變性)進展至非酒精性脂肪肝炎(NASH)至硬化(肝臟的不可逆、晚期瘢痕化)。NAFLD之全部階段皆具有脂肪(脂肪浸潤)於肝臟細胞(肝細胞)中之蓄積的共同之處。
NAFLD系列始於其最單純之階段並從該階段進展，該階段稱為單純性脂肪肝(脂肪變性)。單純性脂肪肝涉及脂肪(甘油三酸酯)於肝臟細胞中蓄積而無發炎(肝炎)或瘢痕化(纖維化)。NAFLD系列中之下一階段及嚴重性程度長度為NASH，其涉及脂肪於肝臟細胞中之蓄積以及肝臟之發炎。發炎性細胞摧毀肝臟細胞(肝細胞壞死)，且NASH最終導致肝臟之瘢痕化(纖維化)，繼之以不可逆的晚期瘢痕化(硬化)。由NASH引起之硬化係NAFLD系列中之最後且最嚴重的階段。
於2008年，使用肝臟之質子磁共振光譜對個體進行全基因體關聯研究以評估肝脂肪含量，鑑定了肝脂肪含量與含有類Patatin磷脂酶結構域3(Patatin-like Phospholipase Domain Containing3)(PNPLA3)基因之間的顯著關聯(參見，舉例而言，Romeo et al.(2008)Nat.Genet.,40(12)：1461-1465)。使用植入小鼠的研究業經證明，PNPLA3中之序列多形性(rs738409，I148M)的表現引起NAFLD，且不活化之PNPLA3於脂質液滴表面之蓄積係與甘油三酸酯於肝臟中之蓄積相關聯(Smagris et al.(2015)Hepatology,61：108-118)。詳細而言，藉由激活刺猬蛋白(Hh)傳訊途徑，導致肝星狀細胞之激活及增殖以及細胞外基質之過量生成及沉積，PNPLA3 I148M變異體係與促進纖維生成之發展相關聯(Chen et al.(2015)World J.Gastroenterol.,21(3)：794-802)。
目前，NAFLD之治療係指向減重及治療任何繼發性症狀，諸如胰島素抗性或血脂異常。迄今，尚無針對NAFLD之藥物治療獲批。因此，對於針對罹患NAFLD之個體的療法存在需求。
本發明提供iRNA組成物，其影響編碼含有類Patatin磷脂酶結構域3(PNPLA3)之基因之RNA轉錄本的RNA誘導型緘默化複合體(RISC)介導之裂解。含有類Patatin磷脂酶結構域3(PNPLA3)可處於細胞內，例如，個體諸如人類個體之細胞內。
一方面，本發明提供用於抑制含有類Patatin磷脂酶結構域3(PNPLA3)在細胞之表現的雙股核糖核酸(dsRNA)劑，其中，該dsRNA劑包含形成雙股區域之有義股及反義股，其中，該有義股包含與SEQ ID NO：1之核苷酸序列相異不超過0、1、2或3個核苷酸之至少15個，例如，15、16、17、18、18、20或21個接續核苷酸(contiguous nucleotide)，並且該反義股包含與SEQ ID NO：2之核苷酸序列相異不超過1、2或3個核苷酸之至少15個，例如，15、16、17、18、18、20或21個接續核苷酸。於一個態樣中，該daRNA劑包含至少一個熱去安定化核苷酸修飾，例如，無鹼基之修飾；與雙鏈體中相反核苷酸之錯配；以及去安定化糖修飾、2’-去氧修飾、非環狀核苷酸、未鎖定之核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)。於一些態樣中，該反義股包含至少一個熱去安定化核苷酸修飾。
於另一方面，本發明提供一種用於抑制含有類Patatin磷脂酶結構域3(PNPLA3)在細胞中之表現的雙股核糖核酸(dsRNA)，其中，該 dsRNA包含形成雙股區域之有義股及反義股，其中，該反義股包含與編碼含有類Patatin磷脂酶結構域3(PNPLA3)之mRNA互補的區域，並且其中，該互補的區域包含與表2、表3、表6及表7之任一者中之任一反義核苷酸序列相異不超過0、1、2或3個核苷酸的至少15個，例如，15、16、17、18、19、20、21、22或23個接續核苷酸。
一方面，本發明提供一種用於抑制含有類Patatin磷脂酶結構域3(PNPLA3)在細胞之表現的雙股核糖核酸(dsRNA)，其中，該dsRNA包含形成雙股區域之有義股及反義股，其中，該有義股包含與SEQ ID NO：1之核苷酸序列的核苷酸187-209、214-238、219-245、283-305、351-379、361-391、395-419、416-439、472-494、483-506、570-598、618-649、631-654、636-659、640-662、643-677、676-710、740-772、782-805、803-825、810-842、864-905、905-927、910-934、919-942、953-983、1062-1087、1069-1097、1078-1108、1094-112、1164-1187、1170-1199、1180-1212、1196-1224、1234-1262、1259-1297、1278-1318、1326-1351、1382-1411、1518-1545、1543-1568、1549-1574、1575-1597、1621-1643、1644-1692、1676-1700、1712-1734、1719-1745、1733-1778、1733-1760、1739-1770、1749-1778、1829-1856、1865-1890、1900-1925、2076-2098、2121-2148、2175-2208或2243-2265的核苷酸序列中之任一者相異不超過0、1、2或3個核苷酸的至少15個，例如，15、16、17、18、19、20或21接續核苷酸，以及該反義股包含來自SEQ ID NO：2之相應核苷酸序列的至少19個接續核苷酸。
一方面，本發明提供一種用於抑制含有類Patatin磷脂酶結構域3(PNPLA3)在細胞內之表現的雙股核糖核酸(dsRNA)劑，其中，該dsRNA包含形成雙股區域之有義股及反義股，其中，該有義股包含與SEQ ID NO：1之核苷酸687-709、1182-1204、1201-1223、1738-1760或2186-2208之核苷酸序列中之任一者相異不超過0、1、2或3個核苷酸的至少15個，例如，15、16、17、18、19、20、21、22或23接續核苷酸，以及該反義股包含來自SEQ ID NO：2之相應核苷酸序列的至少15個接續核苷酸。
於一些態樣中，該反義股包含與選自由AD-1526902.2、AD-1526891.3、AD-1526820.3、AD-1526960.2及AD-1526996.2所組成之群組之雙鏈體的任一反義股核苷酸序列相異不超過0、1、2或3個核苷酸的至少15個，例如，15、16、17、18、19或20個接續核苷酸。
於一些態樣中，該反義股包含與選自由AD-1526902.2、AD-1526891.3、AD-1526820.3及AD-1526960.2所組成之群組之雙鏈體的任一反義股核苷酸序列相異不超過0、1、2或3個核苷酸的至少15個，例如，15、16、17、18、19或20個接續核苷酸。
於一個個態樣中，該dsRNA劑包含至少一個經修飾之核苷酸。
於一個態樣中，該有義股之實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸；該反義股之實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸；或該有義股之實質上全部核苷酸以及該反義股之實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
於一個態樣中，該有義股之全部核苷酸為經修飾之核苷酸；該反義股之全部核苷酸為經修飾之核苷酸；或該有義股之實質上全部核苷酸以及該反義股之全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
於一個態樣中，該等經修飾之核苷酸中之至少一者係選自由去氧核苷酸、3’-端去氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2’-O-甲基修飾之核苷酸、2’-氟修飾之核苷酸、2’-去氧修飾之核苷酸、鎖定之核苷酸(LNA)、未鎖定之核苷酸、構形受限之核苷酸、約束之乙基核苷酸、無鹼基之核苷酸、2’-胺基修飾之核苷酸、2’-O-烯丙基修飾之核苷酸、2’-C-烷基修飾之核苷酸、2’-羥基修飾之核苷酸、2’-甲氧基乙基修飾之核苷酸、2’-O-烷基修飾之核苷酸、N-嗎啉基核苷酸、胺基磷酸酯、包含非天然鹼基之核苷酸、四氫呋喃修飾之核苷酸、1,5-失水己糖醇修飾之核苷酸、環己基修飾之核苷酸、包含硫代磷酸酯基團之核苷酸、包含甲基膦酸酯基團之核苷酸、包含5’-磷酸酯之核苷酸、包含5’-磷酸酯模擬物之核苷酸、熱去安定化之核苷酸、二醇修飾之核苷酸(GNA)、包含2’磷酸酯至核苷酸及2-O-(N-甲基丙烯醯胺)修飾之核苷酸；及其組合所組成之群組。
於一個態樣中，該等經修飾之核苷酸係選自由LNA修飾之核苷酸、1,5-失水己糖醇(HNA)修飾之核苷酸、環己烯基(VeNA)修飾之核苷酸、2’-甲氧基乙基修飾之核苷酸、2’-O-烷基修飾之核苷酸、2’-O-烯丙基修飾之核苷酸、2’-C-烯丙基修飾之核苷酸、2’-氟修飾之核苷酸、2’-去氧修飾之核苷酸、2’-羥基修飾之核苷酸、2’-O-甲基修飾之核苷酸、2’-鹵基修飾之核苷酸及二醇修飾之核苷酸；及其組合所組成之群組。
於一個態樣中，該等經修飾之核苷酸中的至少一者係選自由去氧核苷酸、2’-O-甲基修飾之核苷酸、2’-氟修飾之核苷酸、2’-去氧修飾之核苷酸、二醇修飾之核苷酸(GNA)(例如，Ggn、Cgn、Tgn或Agn)、包含2’-磷酸酯之核苷酸(GNA)(例如，G2p、C2p、A2p、U2p)以及乙烯基-膦酸酯修飾之核苷酸；及其組合所組成之群組。
於另一態樣中，該等經修飾之核苷酸中的至少一者係熱去安定化核苷酸修飾。
於一個態樣中，該熱去安定化核苷酸修飾係選自由無鹼基之修飾；與雙鏈體中相反核苷酸之錯配；以及去安定化糖修飾、2’-去氧修飾、非環狀核苷酸、未鎖定之核酸(UNA)以及甘油核酸(GNA)所組成之群組。
於一些態樣中，該經修飾之核苷酸包含3’-終端去氧-胸腺嘧啶核苷酸(dT)之短序列。
於一些態樣中，核苷酸之修飾係2’-O-甲基、GNA及2’-氟修飾。
於一些態樣中，該dsRNA劑復包含至少一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。於一些態樣中，該dsRNA劑復包含6至8個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。於一個態樣中，該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結位於一股之3’-終端。視需要，該股係反義股。於另一態樣中，該股係正義股。於相關態樣中，該硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結係位於一股之5’-終端。視需要，該股係反義股。於另一態樣中，該股係有義股。於另一實施態樣中，該硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結係位於一股 之5’-終端及3’-終端兩處。視需要，該股係反義股。於另一實施態樣中，該股係有義股。
雙股區域可為19至30個核苷酸對之長度；19至25個核苷酸對之長度；19至23個核苷酸對之長度；23至27個核苷酸對之長度；或21至23個核苷酸對之長度；19、20、21個核苷酸之長度。該雙股區域可具有0、1、2或3個錯配。
於一個態樣中，各股獨立地為不超過30個核苷酸之長度。
於一個態樣中，有義股係21個核苷酸之長度，以及反義股係23個核苷酸之長度。
該互補區域可為至少17個核苷酸之長度；介於19至23個核苷酸間之長度；或19個核苷酸之長度。
於一個態樣中，至少一股包含一具有至少1個核苷酸的3'突出。於另一態樣中，至少一股包含一具有至少2個核苷酸的3’突出。
於一個態樣中，該dsRNA劑復包含配體。
於一個態樣中，該配體係接合至該dsRNA劑之有義股的3’末端。
於一個態樣中，該配體包含N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)衍生物。
於一個態樣中，該配體係N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)衍生物。
於一個態樣中，配體包含透過單價、二價或三價分支鏈之鏈結基接附的一個或多個GalNAc衍生物。
於一個態樣中，配體係透過單價、二價或三價分支鏈之鏈結基接附的一個或多個GalNAc衍生物。
於一個態樣中，該配體包含
Figure 111120479-A0202-12-0009-140
於一個態樣中，該配體係
Figure 111120479-A0202-12-0009-141
於一個態樣中，該dsRNA劑係接合至如下式中所示之配體
Figure 111120479-A0202-12-0009-142
以及，其中，X為O或S。
於一個態樣中，X為O。
於一個態樣中，該dsRNA劑復包含至少一個硫代磷酸酯類或甲基硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。
於一個態樣中，該硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結係位於一股(例如，反義股或有義股)之3’-終端。
於另一態樣中，該硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結係位於一股(例如，反義股或有義股)之5’-終端。
於一個態樣中，硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結位於一股之5’-終端及3’-終端兩處。於一個態樣中，該股係反義股。
於一個態樣中，位於該雙鏈體之反義股之5'-中端位置1的鹼基對係AU鹼基對。
本發明亦提供含有本發明之任意dsRNA劑之細胞及包含本發明之任意dsRNA劑之醫藥組成物。
本發明之醫藥組成物可包括在非緩衝溶液中例如鹽水或水中之dsRNA劑，或本發明之醫藥組成物可包括在緩衝溶液中之dsRNA劑，該緩衝溶液係諸如包含醋酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶蛋白(prolamine)、碳酸鹽或磷酸鹽或其任意組合；或磷酸鹽緩衝液(PBS)。
於一方面，本發明提供抑制含有類Patatin磷脂酶結構域3(PNPLA3)基因在細胞之表現的方法。該方法包括令細胞與本發明之任意dsRNA或本發明之任意醫藥組成物接觸，從而抑制PNPLA3基因在細胞之表現。
於一個態樣中，該細胞係在個體內，例如，人類個體內，例如，患有含有類Patatin磷脂酶結構域3(PNPLA3)相關疾患諸如選自由脂肪肝(脂肪變性)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝臟硬化、脂肪於肝臟內之蓄積、肝臟之發炎、肝細胞壞死、肝臟纖維化、肥胖或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)所組成之群組之含有類Patatin磷脂酶結構域3(PNPLA3)相關疾患的個體內。
於一個態樣中，令該細胞與該dsRNA劑接觸將PNPLA3之表現抑制至少50%、60%、70%、80%、90%或95%。
於一個態樣中，抑制PNPLA3之表現將該個體血清中之PNPLA3蛋白質量級降低至少50%、60%、70%、80%、90%或95%。
一方面，本發明提供治療患有將會從含有類Patatin磷脂酶結構域3(PNPLA3)表現減低中受益之疾患之個體的方法。該方法包括向個體投予治療有效量的本發明之任意dsRNA及本發明之任意醫藥組成物，從而治療患有將會受益於PNPLA3表現減低之疾患的個體。
另一方面，本發明提供預防患有將會從含有類Patatin磷脂酶結構域3(PNPLA3)表現減低中受益之疾患之個體之至少一種症候的方法。該方法包括向個體投予預防有效量的本發明之任意dsRNA及本發明之任意醫藥組成物，從而預防患有將會受益於PNPLA3表現減低之疾患的個體之至少一種症候。
於一個態樣中，該疾患為含有類Patatin磷脂酶結構域3(PNPLA3)相關疾患，例如，含有類Patatin磷脂酶結構域3(PNPLA3)相關疾患係選自選自由脂肪肝(脂肪變性)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝臟硬 化、脂肪於肝臟內之蓄積、肝臟之發炎、肝細胞壞死、肝臟纖維化、肥胖或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)所組成之群組。
於一個態樣中，PNPLA3相關疾患為NAFLD。
於一個態樣中，個體係人類。
於一個態樣中，dsRNA劑係以約0.01mg/kg至約50mg/kg之劑量投予至該個體。
於一個態樣中，dsRNA劑係經皮下投予至個體。
於一個態樣中，本發明之方法包括復測定來自該個體之樣本中PNPLA3的量級。
於一個態樣中，個體樣本中含有類Patatin磷脂酶結構域3(PNPLA3)之量級為血液或血清樣本中含有類Patatin磷脂酶結構域3(PNPLA3)蛋白質量級。
於某些態樣中，本發明之方法復包括將額外治療劑投予至個體。於又一態樣中，該額外治療劑係選自由HMG-CoA還原酶抑制劑、貝特類(fibrate)、膽酸鉗合劑、菸鹼酸、抗血小板劑、血管緊張素轉化酶抑制劑、血管緊張素II受體拮抗劑、醯基輔酶A膽固醇乙醯基轉移酶(ACAT)抑制劑、膽固醇吸收抑制劑、膽固醇酯轉移蛋白(CETP)抑制劑、微粒體三酸甘油酯轉移蛋白(MTTP)抑制劑、膽固醇調節劑、膽酸調節劑、過氧化體增殖激活受體(PPAR)促效劑、基於基因之療法、複合血管保護劑、醣蛋白Ilb/IIIa抑制劑、阿斯匹靈或類阿斯匹靈化合物、IBAT抑制劑、鯊烯合成酶抑制劑、單核細胞趨化蛋白(MCP)-I抑制劑或魚油所組成之群組。
本發明亦提供包含本發明之任意dsRNA及本發明之任意醫藥組成物以及視需要之使用說明書的套組。
藉由下列具體實施方式及圖式進一步示例性說明本發明。
圖1為示意圖，描繪用於靶向人PNPLA3之dsRNA之活體外篩查的整體研究設計。
圖2係圖示在給藥後第14天，經皮下投予單一10mg/kg劑量之所標註dsRNA雙鏈體的小鼠(每個群組，n=3)體內之人類PNPLA3mRNA量級。人類PNPLA3 mRNA量級係相對於使用PBS治療而偵測之對照量級。
本發明提供iRNA組成物，其影響含有類Patatin磷脂酶結構域3(PNPLA3)基因之RNA轉錄本的RNA誘導型緘默化複合體(RISC)介導之裂解。該基因可為處於細胞內，例如個體諸如人體內之細胞內。此等iRNA之使用使得哺乳動物體內相對應基因(含有類Patatin磷脂酶結構域3(PNPLA3)基因)之mRNA的靶向退化成為可能。
本發明之iRNA業經設計為靶向人類含有類Patatin磷脂酶結構域3(PNPLA3)基因，包括在其他哺乳動物物種之含有類Patatin磷脂酶結構域3(PNPLA3)同源物中保守的基因部位。不試圖受限於理論，咸信， 前述特性與此等iRNA中之特定標靶位點或特定修飾之組合或亞組合賦予本發明之iRNA以改善之功效、安定性、效力、耐久性及安全性。
據此，本發明提供使用iRNA組成物治療及預防含有類Patatin磷脂酶結構域3(PNPLA3)相關疾患的方法，該疾患例如脂肪肝(脂肪變性)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝臟之硬化、脂肪於肝臟中之蓄積、肝臟之發炎、肝細胞壞死、肝臟纖維化、肥胖或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，該組成物影響RNA誘導型緘默化複合物(RISC)介導的PNPLA3基因之RNA轉錄本之裂解。
本發明之iRNA包括具有一區域的RNA股(反義股)，其係至多約30個核苷酸或更短之長度，例如，19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24,20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22個核苷酸之長度，該區域實質上與PNPLA3基因之mRNA轉錄本的至少一部分互補。
於某些態樣中，本發明之雙股RNAi劑之一股或兩股係多至66個核苷酸之長度，例如，36至66、26至36、25至36、31至60、22至43、27至53個核苷酸之長度，具有一個實質上與PNPLA3基因之mRNA轉錄本之至少一部分互補的至少19個接續核苷酸之區域。於一些態樣中，此類具有長度較長之反義股的iRNA劑較佳可包括一長度為20至60個核苷酸之第二RNA股(有義股)，其中該有義股與該反義股係形成18至30個接續核苷酸之雙鏈體。
本發明之iRNA的使用使得哺乳動物體內相對應基因(PNPLA3基因)之mRNA的靶向退化成為可能。使用活體外檢定，本發明人等業經證明，靶向PNPLA3基因之iRNA可有效地介導RNAi，導致對PNPLA3基因表現之顯著抑制。因此，包括此等iRNA之方法及組成物可用於治療患有PNPLA3相關疾患之個體，該等疾患例如脂肪肝(脂肪變性)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝臟之硬化、脂肪於肝臟中之蓄積、肝臟之發炎、肝細胞壞死、肝臟纖維化、肥胖或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。
據此，本發明提供使用iRNA組成物治療患有含有類Patatin磷脂酶結構域3(PNPLA3)相關疾病之個體的方法及組合療法，該疾病將會受益於抑制或減低PNPLA3基因之表現，諸如脂肪肝(脂肪變性)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝臟之硬化、脂肪於肝臟中之蓄積、肝臟之發炎、肝細胞壞死、肝臟纖維化、肥胖或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，該組成物影響RNA誘導型緘默化複合物(RISC)介導的PNPLA3基因之RNA轉錄本之裂解。
本發明亦提供用於抑制患有將會受益於抑制或減低PNPLA3基因之表現之疾患的個體之至少一種症候的方法，該疾患例如脂肪肝(脂肪變性)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝臟之硬化、脂肪於肝臟中之蓄積、肝臟之發炎、肝細胞壞死、肝臟纖維化、肥胖或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。舉例而言，於患有NAFLLD之個體中，本發明之方法可減低該個體之至少一種症候，例如，疲勞、虛弱、體重損失、食慾喪失、惡心、腹痛、蜘蛛狀血管、皮膚及眼之黃化(黃疸)、搔癢、腿部液體積聚及腫脹(水腫)、腹部腫脹(腹水)及精神混亂。
下文之詳細說明書係揭露如何製造並使用含有iRNA之組成物以抑制PNPLA3基因表現，以及用於治療將會受益於PNPLA3基因表現之抑制及/或減低之個體的組成物、用途及方法，該個體係例如易患或被診斷患有PNPLA3相關疾患之個體。
I.定義
為了更容易地理解本發明，首先定義某些術語。此外，應注意，無論何時，當應用參數之數值或數值範圍，該等數值及處於該等所引用之數值中間的範圍亦作為本發明之一部分。
本文中使用之冠詞「一(a)」和「一(an)」指稱該冠詞之語法賓語的一者或超過一者(亦即，至少一者)。舉例而言，「一元件」意指一個元件或超過一個元件如複數個元件。
本文中使用之術語「包括」意指「包括但不限於」，且與後者可互換地使用。
除非語境中明確排除，否則本文中使用之術語「或」意指「及/或」，且與後者可互換地使用。例如，「有義股或反義股」理解為「有義股或反義股或有義股及反義股」。
本文中使用之術語「約」意指處於該技藝中之公差範圍內。例如，「約」可理解為與均值偏離2標準偏差。於某些態樣中，約意指±10%。於某些態樣中，約意指±5%。當「約」存在於一系列數字或範圍之前時，理解為「約」可修飾該一系列數字或範圍中之每一個。
處於數字或一系列數字之前的術語「至少」理解為包括與該術語「至少」相鄰之數字，以及後面之全部數字或邏輯上可包括之整數， 如從語境中明顯可知者。例如，核酸分子中之核苷酸的數目必需為整數。例如，「21個核苷酸之核酸分子的至少19個核苷酸」意指19、20或21個核苷酸具有所指示之特性。當「至少」存在於一系列數字或範圍之前時，理解為「至少」可修飾該一系列數字或範圍中之每一個。
如本文所用，「不超過」或「少於」理解為與短語相鄰之數值以及邏輯上更低之數值或整數，如從語境中邏輯上推知者，到零為止。例如，具有「不超過2個核苷酸」之突出的雙鏈體具有2、1或0個核苷酸之突出。當「不超過」存在於一系列數字或範圍之前時，理解為「不超過」可修飾該一系列數字或範圍中之每一個。如本文中所用，範圍包括上限及下限兩者。
如本文所用，偵測方法可包括測定所存在之分析質的量低於該方法之偵測量級。
在所指示之標靶位點與有義或反義股之核苷酸序列之間存在矛盾的情況下，以所指示之序列為準。
在序列與其在轉錄本或其他序列所指示之位點之間存在矛盾的情況下，以本說明書中敘述之核苷酸序列為準。
如本文中所用，「含有類Patatin磷脂酶結構域3」與術語「PNPLA3」可互換使用，指稱一種編碼三醯基甘油脂肪酶之習知基因，該脂肪酶介導脂肪細胞中三醯基甘油水解。
示例性核苷酸及PNPLA3之胺基酸序列可見於，例如，GenBank登錄號NM_025225.2(智人PNPLA3，SEQ ID NO：1；反向互補序列，SEQ ID NO：2)；GenBank登錄號NM_054088.3(小家鼠PNPLA3， SEQ ID NO：3；反向互補序列，SEQ ID NO：4)；GenBank登錄號NM_001282324.1(褐鼠PNPLA3，SEQ ID NO：5；反向互補序列，SEQ ID NO：6)；GenBank登錄號XM_005567051.1(食蟹獼猴PNPLA3，SEQ ID NO：7；反向互補序列，SEQ ID NO：8)；GenBank登錄號XM_001109144.2(恆河獼猴PNPLA3，SEQ ID NO：9；反向互補序列，SEQ ID NO：10)；以及GenBank登錄號XM_005567052.1(食蟹獼猴PNPLA3，SEQ ID NO：11；反向互補序列，SEQ ID NO：12)。
PNPLA3 mRNA序列之其他示例可透過公共資料庫輕易獲得，例如，GenBank、UniProt、OMIM以及獼猴基因組項目網站。
PNPLA3之其他訊息可見於，例如，www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=pnpla3。
自遞交本申請案之日起，前述GenBank登錄號及Gene資料庫號之各者的整體內容藉由引用併入本文。
如本文所用，術語PNPLA3亦指稱PNPLA3基因之變異，包括SNP資料庫中提供之變異體。PNPLA3中之大量序列變異業經鑑定並可見於，例如，NCBI dbSNP及UniProt(參見，例如，www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/?term=pnpla3)，自本申請案遞交之日起，其整體內容藉由引用併入本文。
如本文中所用，「標靶序列」指稱於PNPLA3基因之轉錄過程中形成之mRNA分子之核苷酸序列的接續部分，包括作為初級轉錄產物之RNA加工產物的mRNA。序列之標靶部分將至少長至足以用作RNA引導之裂解的受質，該裂解位於在PNPLA3基因之轉錄過程中形成之mRNA 分子的核苷酸序列的部分處或鄰近該處。於一個態樣中，標靶序列位於PNPLA3之蛋白質編碼區域內。應理解，若標靶序列之核苷酸序列係作為例如cDNA序列或cDNA序列之反義互補序列提供，例如，SEQ ID NO：1至12，則於相對應之mRNA序列中，「Ts」為「Us」。
標靶序列可為約19至36個核苷酸之長度，例如，較佳約19至30個核苷酸之長度。例如，標靶序列可為約19至30個核苷酸之長度，19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22個核苷酸之長度。於某些態樣中，標靶序列係19至23個核苷酸之長度，視需要21至23個核苷酸之長度。上文引述之範圍及長度之間的範圍及長度亦視為本揭露之一部分。
如本文中所使用，術語「包含序列之股」指稱包含核苷酸之鏈的寡核苷酸，其中該核苷酸藉由使用標準核苷酸命名法指稱之序列而揭示。
「G」、「C」、「A」、「T」及「U」各自通常分別表示含有鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶及尿嘧啶作為鹼基之核苷酸。惟，應理解，術語「核糖核苷酸」或「核苷酸」亦可指稱經修飾之核苷酸，如下文進一步揭示者，或替代替換部分(參見，例如，表1)。所屬技術領域中具有通常知識者熟知，鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤及尿嘧啶可經由其他部分替換而實質上不改變包含承載此替換部分之核苷酸之寡核苷酸的鹼基配對 特性。例如而不限於，包含肌苷作為其鹼基之核苷酸可與含有腺嘌呤、胞嘧啶或鳥嘌呤之核苷酸進行鹼基配對。因此，於本發明提出之dsRNA之核苷酸序列中，含有尿嘧啶、鳥嘌呤或腺嘌呤之核苷酸可替換為含有例如肌苷之核苷酸。於另一實例中，寡核苷酸中任意位置之腺嘌呤及胞嘧啶可分別替換為鳥嘌呤及尿嘧啶，以與標靶mRNA形成G-U搖擺(Wobble)鹼基配對。含有此類替換部分之序列適用於本發明提出之組成物及方法。
如本文中可互換使用，術語「iRNA」、「RNAi劑」、「iRNA劑」、「RNA干擾劑」指稱含有如本文中定義之術語的RNA，且其經由RNA誘導型緘默化複合體(RISC)途徑而介導RNA轉錄本的靶向裂解。iRNA透過被稱為RNA干擾(RNAi)之進程而引導mRNA之序列特異性降解。iRNA調整例如抑制細胞如個體如哺乳動物個體體內之細胞中PNPLA3基因的表現。
於一個態樣中，本發明之RNAi劑包括單股RNA，其與標靶RNA序列例如PNPLA3標靶mRNA交互作用，以引導該標靶RNA之裂解。不欲受縛於理論，咸信被引入細胞內之長雙股RNA藉由被稱為切丁酶(Dicer)之第III型核酸內切酶之作用而破碎為siRNA(Sharp et al.(2001)Genes Dev.15：485)。切丁酶，亦稱核酸酶III樣酶，將daRNA加工為19至23個鹼基對之短干擾RNA，該短干擾RNA之特徵為具有兩個鹼基之3’突出部(Bernstein,et al.,(2001)Nature 409：363)。隨後，siRNA被併入RNA誘導型緘默化複合體(RISC)內，於該處，一種或多種解旋酶令siRNA雙鏈體解開，使得補體反義股能夠引導標靶識別(Nykanen,et al.,(2001)Cell 107：309)。當結合至適宜之標靶mRNA時，RISC內之一種或多種核 酸內切酶裂解標靶以誘導靜默(Elbashir,et al.,(2001)GenesDev.15：188)。因此，於一方面，本發明係關於單股RNA(siRNA)，其於細胞內生成且促進RISC複合體之形成，以有效緘默化標靶基因亦即PNPLA3基因。據此，本文中，術語「siRNA」亦用以指稱上揭之iRNA。
於某些態樣中，RNAi劑可為單股siRNA(ssRNAi)，其被引入細胞或有機體內以抑制標靶mRNA。單股RNAi劑結合至RISC核酸內切酶、Argonaute 2，其隨後裂解標靶mRNA。該單股siRNA通常係15至30個核苷酸且經化學修飾。單股siRNA之設計及測試揭示於美國專利第8,101,348號及Lima et al.,(2012)Cell 150：883-894中，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。本文中揭示之任意反義核苷酸序列可用作本文中揭示之單股siRNA或用作藉由Lima et al.,(2012)Cell 150：883-894中揭示之方法化學修飾者。
於某些態樣中，用於本發明之組成物、用途及方法中之「iRNA」係雙股RNA，且於本文中指稱為「雙股RNA劑」、「雙股RNA(dsRNA)分子」、「dsRNA劑」或「dsRNA」。術語「dsRNA」指稱核糖核酸分子之複合體，其具有包含兩個反平行且實質上互補之核酸股的雙鏈體結構，該兩個核酸股指稱為具有相對於標靶RNA亦即PNPLA3基因之「有義」取向及「反義」取向。於本發明之一些態樣中，雙股RNA(dsRNA)透過轉錄後基因緘默化機制而觸發標靶RNA例如mRNA之降解，本文中，該機制指稱為RNA干擾或RNAi。
通常，dsRNA分子之各股之主要部分之核苷酸係核糖核苷酸，但如本文中所詳述，一股或兩股亦可包括一個或多個非核糖核苷酸， 例如去氧核糖核苷酸或經修飾之核苷酸。此外，如本說明書中所用，「iRNA」可包括具有化學修飾之核糖核苷酸；iRNA可包括位於多個核苷酸處之實質性修飾。如本文中所用，術語「經修飾之核苷酸」指稱獨立具有經修飾之糖部分、經修飾之核苷酸間鏈結、或經修飾之核酸鹼基或其任意組合的核苷酸。因此，術語「經修飾之核苷酸」涵蓋例如官能基或原子到核苷酸間鏈結、糖部分或核酸鹼基之置換、加成或移除。適用於本發明之劑中的修飾包括本文中所揭露或該領域中已知之全部類型的修飾。對於本說明書及申請專利範圍之目的，任何此類修飾，如在siRNA類型分子中所用者，為「iRNA」或「RNAi劑」所涵蓋。
於本揭露之某些態樣中，將去氧核苷酸(若存在)包合於RNAi劑中可被視為構建經修飾之核苷酸。
該雙螺旋區域可為允許所欲之標靶RNA透過RISC途徑而特異性降解的任意長度，且可為約19至36個鹼基對之長度範圍，如約19至30個鹼基對之長度，例如，約9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、或36個鹼基對之長度，諸如約19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24,20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22個鹼基對之長度。於某些態樣中，雙鏈體區域係19至21個鹼基對之長度，例如，21個鹼基對之長度。上文引述之範圍及長度之間的範圍及長度亦視為本揭露之一部分。
形成該雙鏈體結構之兩股可為一個較大RNA分子之不同部分，或它們可為獨立之RNA分子。若該兩股係一個較大分子之部分，且因此藉由界於一股之3’末端與形成該雙鏈體結構之相對另一股之5’末端之間的未中斷核苷酸鏈而連結，則該連結RNA鏈指稱為「髮夾環圈」。髮夾環圈可包含至少一個未配對之核苷酸。於一些態樣中，髮夾環圈可包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、23未配對之核苷酸。於一些態樣中，髮夾環圈可為10個或更少核苷酸。於一些態樣中，髮夾環圈可為8個或更少未配對之核苷酸。於一些態樣中，髮夾環圈可為4至10個未配對之核苷酸。於一些態樣中，髮夾環圈可為4至8個核苷酸。
若dsRNA之兩個實質上互補之股由獨立之RNA分子構成，則那些分子不必但可以共價連結。若兩股藉由除界於一股之3’末端與形成雙鏈體結構之相對另一股之5’末端之間的未中斷核苷酸鏈以外之手段共價連結，則該連結結構指稱為「鏈結子」。RNA股可具有相同或相異數目之核苷酸。鹼基對之最大數目係dsRNA之最短鏈中之核苷酸數減去雙鏈體中存在之任意突出。除了雙鏈體結構外，RNAi可包含一個或多個核苷酸突出。於RNAi劑之一個態樣中，至少一股包含至少1個核苷酸的3’突出。於另一態樣中，至少一股包含具有至少2個核苷酸，例如2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸之3’突出。於其他態樣中，RNAi劑之至少一股包含一具有至少1個核苷酸之5’突出。於某些態樣中，至少一股包含具有至少2個核苷酸，例如2、5、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸之3’突出。於又其他態樣中，RNAi劑之一股的3’及5’端包含一具有至少1個核苷酸之突出。
於某些態樣中，本發明之iRNA劑係dsRNA，其各股包含19至23個核苷酸，其與標靶RNA序列例如PNPLA3基因相互作用以引導標靶RNA之裂解。
於一些態樣中，本發明之iRNA劑係24至30個核苷酸之dsRNA，其與標靶RNA序列例PNPLA3標靶mRNA序列相互作用以引導標靶RNA之裂解。
如本文中所用，術語「核苷酸突出」指稱從雙股iRNA之雙鏈體結構凸出的至少一個未配對之核苷酸。舉例而言，當dsRNA之一股的3’末端延伸超過另一股之5’末端，或與之相反，則存在核苷酸突出。dsRNA可包含具有至少一個核苷酸之突出；或該突出可包含至少兩個核苷酸、至少三個核苷酸、至少四個核苷酸、至少五個核苷酸或更多個。核苷酸突出可包含核苷酸/核苷類似物或由其組成，其中該核苷酸/核苷類似物包括去氧核苷酸/核苷。突出可位於有義股上、反義股上或其任意組合上。此外，突出之核苷酸可存在於dsRNA之反義股或有義股之5’末端、3’末端或兩端。
於一個態樣中，dsRNA之反義股具有突出在3’末端或5’末端之1至10個核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個核苷酸。於一個態樣中，dsRNA之有義股具有突出在3’末端或5’末端之1至10個核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個核苷酸。於另一態樣中，該突出中之一個或多個核苷酸被替換為核苷硫代磷酸酯。
於某些態樣中，該dsRNA之反義股具有突出在3’末端或5’末端之1至10個核苷酸，例如0至3、1至3、2至4、2至5、4至10、 5至10個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個核苷酸。於一個態樣中，dsRNA之有義股具有突出在3’末端或5’末端之1至10個核苷酸，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個核苷酸。於另一態樣中，該突出中之一個或多個核苷酸被替換為核苷硫代磷酸酯。
於某些態樣中，dsRNA之反義股具有突出在3’末端或5’末端之1至10個核苷酸，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個核苷酸。於某些態樣中，位於有義股或反義股或兩者之突出可包括長於10個核苷酸之延伸長度，例如，1至30個核苷酸、2至30個核苷酸、10至30個核苷酸、10至25個核苷酸、10至20個核苷酸或10至15個核苷酸之長度。於某些態樣中，延伸之突出位於雙鏈體之有義股。於某些態樣中，延伸之突出存在於雙鏈體之有義股的3’末端。於某些態樣中，延伸之突出存在於雙鏈體之有義股的5’末端。於某些態樣中，延伸之突出位於雙鏈體之反義股。於某些態樣中，延伸之突出存在於雙鏈體之反義股的3’末端。於某些態樣中，延伸之突出存在於雙鏈體之反義股的5’末端。於某些態樣中，延伸之突出中之一個或多個核苷酸被替換為核苷硫代磷酸酯。於某些態樣中，突出包括自身互補之部分，使得該突出能夠形成在生理學條件下安定之髮夾結構。
「鈍」或「鈍端」意指於雙股RNA劑之末端沒有未配對之核苷酸，亦即，沒有核苷酸突出。「鈍端之」雙股RNA劑於其整體長度為雙股，亦即，於分子之每一端皆沒有核苷酸突出。本發明之RNAi劑包括於一端沒有核苷酸突出(亦即，具有一個突出及一個鈍端之劑)或於每一端皆沒有核苷酸突出。最常見之此類分子將於其整體長度為雙股。
術語「反義股」或「導引股」指稱iRNA例如dsRNA之股，其包括與標靶序列例如PNPLA3 mRNA實質上互補之區域。
如本文中所用，術語「互補之區域」指稱反義股之與本文中定義之序列，例如標靶序列例如PNPLA3核苷酸序列實質上互補之區域。若互補之區域與標靶序列不完全互補，則錯配可存在於分子之中間區域或末端區域。通常，最能被容忍之錯配存在於末端區域內，例如iRNA之5’末端或3’末端之5、4或3個核苷酸內。於一些態樣中，本發明之雙股RNA劑包括位於反義股中之核苷酸錯配。於一些態樣中，本發明之雙股RNA劑之反義股包括不超過4個與標靶mRNA之錯配，例如，反義股包括4、3、2、1或0個與標靶mRNA之錯配。於一些態樣中，本發明之雙股RNA劑之反義股包括不超過4個與有義股之錯配，例如，反義股包括4、3、2、1或0個與有義股之錯配。於一些態樣中，本發明之雙股RNA劑包括位於有義股中之核苷酸錯配。於一些態樣中，本發明之雙股RNA劑之有義股包括不超過4個與反義股之錯配，例如，有義股包括4、3、2、1或0個與反義股之錯配。於一些態樣中，核苷酸錯配位於例如自iRNA之3’-末端計數之5、4、3個核苷酸內。於另一態樣中，核苷酸錯配係例如位於iRNA劑之3’-終端核苷酸中。於一些態樣中，錯配不在種子區域中。
因此，本文中所揭示之RNAi劑可含有一個或多個與標靶序列之錯配。於一個態樣中，本文中所揭示之RNAi劑含有不超過3個錯配(亦即，3、2、1或0個錯配)。於一個態樣中，本文中所揭示之RNAi劑含有不超過2個錯配。於一個態樣中，本文中所揭示之RNAi劑含有不超過1個錯配。於一個態樣中，本文中所揭示之RNAi劑含有0個錯配。於某些 態樣中，如果RNAi劑之反義股含有與標靶序列之錯配，則該錯配較佳可被限定在從互補之區域之5’末端或3’末端計數之最末5個核苷酸內。例如，於此類態樣中，對於23個核苷酸之RNAi劑，與PNPLA3基因互補之區域之股通常不含位於中心13個核苷酸處之任意錯配。本文中揭示之方法或該領域中已知之方法可用以確定，含有與標靶序列之錯配的RNAi劑在抑制PNPLA3基因之表現中是否有效。慮及具有錯配之RNAi劑在抑制PNPLA3基因之表現中的效力係重要者，尤其若PNPLA3基因中之特定互補之區域係已知具有該種群內之多形性序列變更。
如本文中所用，術語「有義股」指稱iRNA之股，其包括與如本文中定義之術語之反義股之區域實質上互補之區域。
如本文中所用，「實質上全部核苷酸係經修飾者」大多數並非全部經修飾，且可包括不超過5、4、3、2或1個未經修飾之核苷酸。
如本文中所用，術語「裂解區域」指稱位於緊鄰裂解位點處之區域。裂解位點係標靶之裂解出現處之位點。於一些態樣中，裂解區域包含位於裂解位點任一端且緊鄰該裂解位點的三個鹼基。於一些態樣中，裂解區域包含位於裂解位點任一端且緊鄰該裂解位點的兩個鹼基。於一些態樣中，裂解位點特異性地出現於反義股之藉由核苷酸10及11鍵結之位點，且裂解區域包含核苷酸11、12及13。
如本文中所用且除非明確排除，否則當術語「互補」用來揭示關於第二核苷酸序列之第一核苷酸序列時，指稱包含該第一核苷酸序列之寡核苷酸或多核苷酸在某些條件下與包含該第二核苷酸序列之寡核苷酸或多核苷酸雜交且形成雙鏈體結構的能力，如具熟練技術之人士所理解者。 舉例而言，此等條件可為嚴苛條件，其中嚴苛條件可包括：400mM NaCl、40mM PIPES pH 6.4、1mM EDTA、50℃或70℃、12至16小時，之後洗滌(參見，例如，《分子選殖：實驗室手冊》(“Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Sambrook,et al.(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press))。可施加其他條件，諸如生理學相關條件如可在有機體內部遭遇者。具熟練技術之人士將能夠根據所雜交之核苷酸的最終應用而確定最適用於兩個序列之互補性測試的條件集。
如本文中所述之iRNA如dsRNA內之互補序列包括包含第一核苷酸序列之寡核苷酸或多核苷酸與包含第二核苷酸序列之寡核苷酸或多核苷酸在一個或兩個核苷酸序列之整體長度的鹼基對。此類序列可指稱為彼此「完全互補」。惟，本文中，若第一序列指稱為與第二序列「實質上互補」，則當雜交形成多達30個鹼基對之雙鏈體時，兩個序列可為完全互補，或它們可形成一個或多個但通常不超過5、4、3或2個錯配鹼基對，同時保留在最適於其最終應用之條件下雜交的能力，例如對經由RISC途徑之基因表現的抑制。惟，若兩個寡核苷酸設計為當雜交時形成一個或多個單股突出，則此類突出不應視為關於確定互補性之錯配。舉例而言，包含一個長度為21個核苷酸之寡核苷酸及另一個長度為23個核苷酸之寡核苷酸的dsRNA，其中該較長之核苷酸包含一個與該較短之核苷酸完全互補的21個核苷酸之序列，對於本文所揭示之目的，仍可指稱為「完全互補」。
如本文中所用，「互補之」序列亦可包括非瓦特生-克里克(Watson-Crick)鹼基對或從非天然核苷酸及經修飾之核苷酸形成的鹼基對，或完全由其形成，只要對其雜交能力之上述需求得以滿足即可。此類 非瓦特生-克里克鹼基對包括但不限於，G：U搖擺(Wobble)鹼基對或胡斯坦(Hoogstein鹼基配對。
本文中，術語「互補」、「完全互補」及「實質上互補」可關於dsRNA之有義股與反義股之間或雙股RNA劑之反義股與標靶序列之間的鹼基匹配而使用，如可從其用途之語境中理解者。
如本文中所用，與信使RNA(mRNA)之「至少一部分實質上互補」之多核苷酸指稱與感興趣之mRNA(例如，編碼PNPLA3之mRNA)之接續部分實質上互補之多核苷酸。舉例而言，如果序列與編碼PNPLA3基因之mRNA之非中斷部分實質上互補，則該多核苷酸與PNPLA3 mRNA之至少一部分互補。
據此，於一些態樣中，本文中揭露之反義多核苷酸與標靶PNPLA3序列完全互補。於其他態樣中，反義多核苷酸與標靶互補組分PNPLA3序列實質上互補，且包含一接續核苷酸序列，該接續核苷酸序列在其整個長度上與SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11中任一者或SEQ ID NO：1、3、5、7、9或11中任一者之片段的等效核苷酸序列區域為至少80%互補，諸如約85%、約86%、約87%、約88%、約85%、約90%、約%91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%互補。
於一些態樣中，本文所揭露之反義多核苷酸於標靶PNPLA3序列之片段實質上互補且包含接續核苷酸序列，該接續核苷酸序列在其整個長度上與選自由SEQ ID NO：1之核苷酸187-209、214-238、219-245、283-305、351-379、361-391、395-419、416-439、472-494、483-506、570- 598、618-649、631-654、636-659、640-662、643-677、676-710、740-772、782-805、803-825、810-842、864-905、905-927、910-934、919-942、953-983、1062-1087、1069-1097、1078-1108、1094-112、1164-1187、1170-1199、1180-1212、1196-1224、1234-1262、1259-1297、1278-1318、1326-1351、1382-1411、1518-1545、1543-1568、1549-1574、1575-1597、1621-1643、1644-1692、1676-1700、1712-1734、1719-1745、1733-1778、1733-1760、1739-1770、1749-1778、1829-1856、1865-1890、1900-1925、2076-2098、2121-2148、2175-2208或2243-2265所組成之群組的SEQ ID NO：1之片段為至少80%互補，諸如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%互補。
於一些態樣中，本文揭露之反義多核苷酸與標靶PNPLA3序列之片段實質上互補，並且包含一接續核苷酸序列，該接續核苷酸序列在其整體長度與選自由SEQ ID NO：1之核苷酸687-709、1182-1204、1201-1223、1738-1760或2186-2208所組成之群組的SEQ ID NO：1之片段為至少約80%互補，諸如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約95%、約97%、約98%或約99%互補。於其他態樣中，本文揭露之反義多核苷酸與標靶APOC3序列實質上互補，並且包含一接續核苷酸序列，該接續核苷酸序列係在其整體長度與表2、3、6及7中任一者中之任一有義股核苷酸序列或表2、3、6及7之任一者中任一有義股核苷酸序列的片段為至少約80%互補，諸如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約95%、約97%、約98%、約99%、或100%互補。
於一個態樣中，本揭露之RNAi劑包括一有義股，該有義股與反義多核苷酸實質上互補，該反義多核苷酸反而與標靶PNPLA3序列相同，其中該有義股多核苷酸係包含一接續核苷酸序列，該接續核苷酸序列係在其整體長度與SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12或SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12中任一者片段之等效核苷酸序列區域為至少約80%互補，諸如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約95%、約97%、約98%、約99%、或100%互補。
於一些態樣中，本發明之iRNA包含有義股，該有義股與反義多核苷酸實質上互補，該反義多核苷酸反而與標靶PNPLA3序列相同，其中該有義股多核苷酸包含一接續核苷酸序列，該接續核苷酸序列係在其整體長度與表2、表3、表7及表7中之任一者中任一反義股核苷酸序列或表2、表3、表6及表7中之任一者中任一反義股核苷酸序列的片段為至少約80%互補，諸如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約95%、約97%、約98%、約99%、或100%互補。
於一些態樣中，該有義股及反義股選自雙鏈體AD-1526902.2、AD-1526891.3、AD-1526820.3、AD-1526960.2及AD-1526996.2之任一者。
於一些態樣中，該有義股及反義股選自雙鏈體AD-1526902.2、AD-1526891.3、AD-1526820.3及AD-1526960.2之任一者。
於一些態樣中，該有義股及反義股係選自雙鏈體AD-1526902。
於一些態樣中，該有義股及反義股係選自雙鏈體AD-1526891。
於一些態樣中，該有義股及反義股係選自雙鏈體AD-1526820。
於一些態樣中，該有義股及反義股係選自雙鏈體AD-1526960。
通常，「iRNA」包括具有化學修飾之核糖核苷酸。此類修飾可包括本文中揭露或本領域中已知之全部類型之修飾。對於本說明書及申請專利範圍之目的，任何此類修飾，如在dsRNA分子中所用者，為「iRNA」所涵蓋。
於本揭露之某些態樣中，將去氧核苷酸(若存在)包合於RNAi劑中可被視為構建經修飾之核苷酸。
於本發明之一方面，用於本發明之方法及組成物中之劑係單股反義寡核苷酸分子，其經由反義抑制機制抑制標靶mRNA。單股反義寡核苷酸分子與標靶mRNA內之序列互補。單股反義寡核苷酸可藉由與mRNA進行鹼基配對並且物理地阻礙轉譯機制而以化學計量學方式抑制翻譯，參見，Dias,N.et al.,(2002)Mol Cancer Ther 1：347-355。單股反義寡核苷酸分子可為約14至約30個核苷酸之長度，並且具有與標靶序列互補之序列。舉例而言，單股反義寡核苷酸分子可包含序列，該序列係來自本文所揭示之反義序列中任一者之至少約14、15、16、17、18、19、20或更多個接續核苷酸。
如本文中所用，短語「令細胞與iRNA接觸」包括藉由任意可能之手段接觸細胞。令細胞與iRNA接觸包括在活體外令細胞與iRNA接觸或在活體內令細胞與iRNA接觸。接觸可直接或間接進行。因此，舉例而言，iRNA可藉由單獨執行該方法而令其與細胞物理接觸，或作為另一種選擇，可將iRNA置於將允許或造成其後續與該細胞接觸之境地。
舉例而言，可藉由使用iRNA溫育細胞而令該細胞在活體外完成該接觸。舉例而言，可藉由將iRNA注射至細胞所處之組織內或鄰近該組織處，或藉由將iRNA注射至另一區域例如血流或皮下空間內而使得該劑將後續到達待接觸之細胞所處之組織，從而令該細胞在活體內完成該接觸。舉例而言，iRNA可含有引導iRNA至感興趣之部位例如肝臟之配體例如GalNAc或與配體偶聯。活體外接觸方法與活體內接觸方法之組合亦係可能者。舉例而言，細胞可在活體外與iRNA接觸，並隨後移植入個體體內。
於某些態樣中，令細胞與iRNA接觸包括，藉由促進或影響至該細胞內之攝取或吸收而「將iRNA引入或遞送至細胞內」。iRNA之吸收或攝取可透過無輔助之擴散或活性細胞進程而進行，或藉由輔助劑或裝置而進行。將iRNA引入細胞內可為活體外或活體內進程。舉例而言，對於活體內進行之引入，可將iRNA注射至組織部位或全身性投予。在活體外進行之引入細胞內包括該領域中已知之方法，例如電穿孔及脂質轉染。其他途徑揭示於下文中或係該領域中已知者。
術語「脂質奈米顆粒」或「LNP」係泡囊(vesicle)，其包含脂質層，該脂質層封裝藥學活性分子如核酸分子如iRNA或iRNA自其轉錄 之質體。LNP揭示於，舉例而言，美國專利第6,858,225號、第6,815,432號、第8,158,601號及第8,058,069號，該等專利之整體內容藉由引用而併入本文。
如本文中所用，「個體」係動物諸如哺乳動物，包括靈長類(諸如人、非人靈長類例如猴及黑猩猩)、非靈長類(諸如牛、豬、馬、山羊、兔、綿羊、倉鼠、豚鼠、貓、狗、大鼠、或小鼠)或鳥類，其內源性地或異源性地表現標靶基因。於一個態樣中，個體係人類，諸如正在進行對將會受益於PNPLA3表現減低之疾病或疾患之治療或評估的人類；處於將會受益於PNPLA3表現減低之疾病或疾患風險下的人類；罹患將會受益於PNPLA3表現減低之疾病或疾患的人類；或正在進行對將會受益於PNPLA3表現減低之疾病或疾患之治療的人類，如本文中所述。於一些態樣中，個體係女性人類。於一些態樣中，個體係男性人類。於一個態樣中，個體係成年個體。於其他態樣中，個體係小兒個體。
如本文中所用，術語「治療」或「處理」指稱有益或所欲之結果，諸如減低個體體內PNPLA3相關疾患之至少一種跡象或症候。治療亦包括減低一種或多種與不希望之PNPLA3表現相關的跡象或症候；減輕不希望之PNPLA3激活或安定化之程度；緩解或緩和不希望之PNPLA3激活或安定化。「治療」亦可意指相對於在治療缺失情況下預期之生存期而延長生存期。在個體之PNPLA3或疾病標記物或症候量級之情境中，術語「降低」指稱此量級之統計學顯著之下降。該下降可為，舉例而言，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多。於某些態樣中，下降係至少20%。 於某些態樣中，下降係疾病標記物例如蛋白質或基因表現量級之至少50%。於個體體內之PNPLA3量級的情境中，「降低」較佳係低至如同不具此病變之個體正常範圍內所接受的量級。於某些態樣中，「降低」係苦於疾病之個體的標記物或症候量級與處於個體正常範圍內所接受量級之間之差異的下降，例如，肥胖個體之體重與正常範圍內所接受體重之間的下降量級。
如本文所用，「預防」或「阻止」當關於可藉由減低PNPLA3基因之表現而得以治療或緩解的疾病、疾患或其症狀使用時，係指稱減低個體將會發展出於此疾病、疾患或症狀相關之症狀的可能性，例如，不希望的或過量的PNPLA3表現之症狀，諸如刺猬蛋白傳訊途徑中升高量級之蛋白質的存在、脂肪肝(脂肪變性)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝臟之硬化、脂肪於肝臟中之蓄積、肝臟之發炎、肝細胞壞死、肝臟纖維化、肥胖或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。例如，當具有一種或多種NAFLD風險因素之個體未發展出NAFLD或發展出其嚴重程度低於具有相同風險因素但未接受如本文所揭示治療之群體的NAFLD時，則發展出例如NAFLD之可能性得以減低。沒有發展出疾病、病症或病況，或減小與此疾病、病症或病況相關之症狀的發展(例如，將該疾病或病症之臨床可接受規格上減小至少約10%)，或顯現症狀之延遲(例如，延遲幾天、幾週、幾個月或幾年)，係視為有效之預防。
如本文中所用，術語「含有類Patatin磷脂酶結構域3相關疾病」或「PNPLA3相關疾病」係由PNPLA3基因表現或PNPLA3蛋白質產生造成或與其相關的疾病或病變。術語「PNPLA3相關疾病」包括將會從PNPLA3基因表現、複製或蛋白質活性下降中受益之疾病、病變或病症。 PNPLA3相關疾病之非限制性示例包括，舉例而言，脂肪肝(脂肪變性)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝臟之硬化、脂肪於肝臟中之蓄積、肝臟之發炎、肝細胞壞死、肝臟纖維化、肥胖或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。於另一態樣中，該PNPLA3相關疾病為非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。於另一態樣中，該PNPLA3相關疾病為非酒精性脂肪肝炎(NASH)。於另一態樣中，該PNPLA3相關疾病為肝硬化。於另一態樣中，該PNPLA3相關疾病為胰島素抗性。於另一態樣中，該PNPLA3相關疾病不是胰島素抗性。於一個態樣中，該PNPLA3相關疾病為肥胖。
於一個態樣中，PNPLA3相關疾病為非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。如本文中所使用，「非酒精性脂肪肝病」可與術語「NAFLD」互換使用，係指稱藉由在每天酒精攝入量低於20gm下存在脂肪變性定義之疾病。NAFLD係美國最常見之肝病，且往往與胰島素抵抗型/第2型糖尿病及肥胖相關。NAFLD係體現為脂肪變性、脂肪肝炎、硬化、且有時為肝細胞癌。對於NAFLD之回顧，參見Tolman and Dalpiaz(2007)Ther.Clin.Risk.Manag.,3(6)：1153-1163，其整體內容藉由引用而併入本文。
如本文中所用，「治療有效量」旨在包括RNAi劑之下述之量，當將該RNAi劑投予患有PNPLA3相關疾病之個體時，其量足以有效治療該疾病(例如，藉由削弱、緩解或維持現有疾病或疾病之一種或多種症狀)。「治療有效量」可依據RNAi劑、該劑如何投予、疾病及其嚴重性及待治療之個體的病史、年齡、體重、家族病史、基因組成、先前治療或並行治療之類型(若存在)、以及其他個體特徵而變。
如本文中所用，「預防有效量」旨在包括RNAi劑之下述之量，當將該RNAi劑投予至患有PNPLA3相關疾患之個體時，其量足以預防或緩解該疾病或該疾病之一種或多種症狀。緩解該疾病包括減緩該疾病之進程或減輕後來發展之疾病的嚴重性。「預防有效量」可依據RNAi劑、該劑如何投予、疾病風險程度及待治療之患者的病史、年齡、體重、家族病史、基因組成、先前治療或並行治療之類型(若存在)、以及其他個體特徵而變。
「治療有效量」或「預防有效量」亦包括以可用於任意治療之合理效益/風險比率產生一些所欲效果之RNAi劑的量。本發明方法中採用之iRNA可以足以產生可用於此治療之合理效益/風險比率的量投予。
本文中，短語「藥學上可接受」用以指稱彼等化合物、材料、組成物或劑型，其處於適用於與人類個體及動物個體之組織接觸而無過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症之所謂醫療判斷之範疇內，與合理效益/風險比率相稱。
如本文中所用，短語「藥學上可接受之載體」意指藥學上可接受之材料、組成物或媒介物，諸如液體或固體填料、稀釋劑、賦形劑、製造助劑(例如，潤滑劑、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸鋅、或硬脂酸)、或溶劑封裝材料，其牽涉入將受試化合物從一個器官或身體部分攜帶或運送至另一器官或身體部分。就與製劑之其他成分相容且不損害被治療之個體而言，每一載體必須係「可接受」者。此類載體係該領域中已知者。藥學可接受之載體包括用於藉由注射投予之載體。
如本文中所用，術語「樣本」包括從個體單離之相似體液、細胞或組織的集合，以及個體體內存在之體液、細胞或組織。生物體液之實例包括血液、血清及漿膜液、血漿、腦脊液、眼液、淋巴液、尿液、唾液等。組織樣本可包括來自組織、器官或局部區域之樣本。舉例而言，樣本可源自特定之器官、器官之部分、或彼等器官內之體液或細胞。於某些態樣中，樣本可源自肝臟(例如，全肝或肝臟之某些區段或肝臟中某些類型之細胞，例如，肝細胞)。於一些態樣中，「源自個體之樣本」指稱從個體獲得之尿液。「源自個體之樣本」可指稱來自個體之血液或源自血液之血清或血漿。
II.本發明之iRNA
本發明提供抑制該PNPLA3基因之表現的iRNA。於較佳之態樣中，iRNA包括用於抑制細胞中PNPLA3基因表現之雙股核糖核酸(dsRNA)分子，該細胞係諸如處於個體例如哺乳動物諸如易於發展出PNPLA3相關疾病例如高三酸甘油酯血症之人的體內。該dsRNAi劑包括具有互補之區域之反義股，該互補之區域係與在PNPLA3基因表現中所形成之mRNA的至少一部分互補。該互補之區域係約19至30個核苷酸之長度(例如，約30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20或19個核苷酸之長度)。當與表現PNPLA3基因之細胞接觸時，該iRNA將PNPLA3基因(例如，人類、靈長類、非靈長類或大鼠PNPLA3基因)之表現抑制至少約50%，如藉由例如PCR或基於分支鏈DNA(bDNA)之方法所檢定，或藉由基於蛋白質之方法諸如藉由使用例如西方印漬法之免疫螢光分子或流式細胞術所檢定。於較佳之態樣中，表現之抑制係藉由本文之實施例中 提供之qPCR方法測定，siRNA係例如10nM濃度，於該申請中提供之適宜生物體細胞株中進行。於較佳之態樣中，活體內表現之抑制係藉由敲除表現人類基因之囓齒動物(例如，表現人類標靶基因之小鼠或經AAV轉染之小鼠)體內之人類基因而測定，例如，當在RNA表現之最低點投予3mg/kg之單一劑量時。
dsRNA包括兩個RNA股，在該dsRNA將被使用之條件下，該兩股互補並雜交以形成雙鏈體結構。dsRNA之一股(反義股)包括互補之區域，該互補之區域與標靶系列實質上互補且通常完全互補。標靶序列可源自在PNPLA3基因表現過程中形成之mRNA序列。另一股(有義股)包括一區域，該區域與該反義股互補，使得當在適宜條件下組合時，兩股雜交並形成雙鏈體結構。如本文中他處所述，dsRNA之互補序列亦可作為單個核酸分子之自互補之區域而保護，與作為獨立之寡核苷酸相反。
通常，該雙鏈體結構係15至30個鹼基對之長度，如15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24,20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22個鹼基對之長度。於某些較佳態樣中，雙鏈體結構係18至25個鹼基對之長度，例如，18至25、18至 24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至25、20至24,20至23、20至22、20至21、21至25、21至24、21至23、21至22、22至25、22至24、22至23、23至25、23至24或24至25個鹼基對之長度，例如，19至21個鹼基對之長度。上文引述之範圍及長度之間的範圍及長度亦視為本揭露之一部分。
同樣，與標靶序列互補之區域係15至30個核苷酸之長度，例如，15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24,20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22個核苷酸之長度，例如，19至23個核苷酸之長度或21至23個核苷酸之長度。上文引述之範圍及長度之間的範圍及長度亦視為本揭露之一部分。
於一些態樣中，該雙鏈體區域係19至30個鹼基對之長度。同樣，與標靶序列互補之區域係19至30個核苷酸之長度。
於一些態樣中，該dsRNA係約19至約23個核苷酸之長度，或約25至約30個核苷酸之長度。通常，該dsRNA足夠長，以用作切丁酶之受質。舉例而言，該領域中皆知，長度超過約21至23個核苷酸之dsRNA 可用作切丁酶之受質。具有該領域通常知識者亦應認知，作為裂解標靶之RNA區域最通常係較大RNA分子之一部分，一般為mRNA分子。若相關，則mRNA標靶之「一部分」係mRNA標靶之接續序列，其長度足以令其作為RNAi引導之裂解(亦即，透過RISC途徑裂解)的受質。
所屬技術領域中具有通常知識者亦應認知，雙鏈體區域係dsRNA之主要功能性部分，例如，約19至約30個鹼基對，例如，約19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22個鹼基對之雙鏈體區域。因此，於一個態樣中，就其被加工為例如15至30個鹼基對之以用於裂解之所欲RNA為靶向之官能性雙鏈體的程度而言，具有超過30個鹼基對之RNA分子或RNA分子之複合體係dsRNA。因此，具有通常知識者將認知，於一個態樣中，miRNA為dsRNA。於另一態樣中，dsRNA不是天然出現之miRNA。於另一態樣中，可用於靶向PNPLA3基因表現之iRNA劑並非藉由較大dsRNA之裂解而在標靶細胞內生成。
本文中所述之dsRNA可復包括一個或多個具有例如1至4、2至4、1至3、2至3、1、2、3或4個核苷酸之單股核苷酸突出。相對於其鈍端之對應物，具有至少一個核苷酸突出之dsRNA可具有傑出之抑制特性。核苷酸突出可包含核苷酸/核苷類似物或由其組成，其中該核苷酸/核苷類似物包括去氧核苷酸/核苷。突出可位於有義股、反義股或其任意組合。 此外，突出之核苷酸可存在於dsRNA之反義股或有義股之5’末端、3’末端或兩端。
dsRNA可藉由本領域中已知之標準方法合成。本發明之雙股RNAi化合物可使用兩步之製程來製備。首先，雙股RNA分子之個體股係單獨製備。隨後，將該等組分股(component strand)低溫黏合(anneal)。該siRNA化合物之個體股可使用溶液相有機合成、固相有機合成或兩者製備。有機合成提供下述優點：包含非天然或經修飾之核苷酸的寡核苷酸股可輕易製備之。同樣，本發明之單股寡核苷酸可使用溶液相有機合成、固相有機合成或兩者製備。
一方面，本發明之dsRNA係包括至少兩個核苷酸序列：有義序列及反義序列。該有義股選自表2、表3、表6及表7之任一者中提供之序列所組成之群組，而該有義股之相應反義股序列係選自表2、表3、表6及表7中任一者之序列所組成之群組。於此方面，該兩個序列之一者與該兩個序列之另一者互補，且該等序列之一者與在PNPLA3基因之表現中生成之mRNA序列實質上互補。如是，於此方面，dsRNA將包括兩個寡核苷酸，其中一個寡核苷酸係揭示為表2、表3、表6及表7中任一者之有義股，而第二個寡核苷酸係揭示為表2、表3、表6及表7中任一者之有義股的對應反義股。
於某些態樣中，該dsRNA之實質上互補序列包含在獨立之寡核苷酸。於其他態樣中，該dsRNA之實質上互補序列包含在單個寡核苷酸。
於一些態樣中，該有義股或反義股選自雙鏈體AD-1526902.2、AD-1526891.3、AD-1526820.3、AD-1526960.2及AD-1526996.2之任一者的有義股或反義股。
於一些態樣中，該有義股或反義股選自雙鏈體AD-1526902.2、AD-1526891.3、AD-1526820.3及AD-1526960.2之任一者的有義股或反義股。
於一些態樣中，該有義股或反義股選自雙鏈體AD-1526902之有義股或反義股。
於一些態樣中，該有義股或反義股選自雙鏈體AD-1526891之有義股或反義股。
於一些態樣中，該有義股或反義股選自雙鏈體AD-1526820之有義股或反義股。
於一些態樣中，該有義股或反義股選自雙鏈體AD-1526960之有義股或反義股。
應理解，舉例而言，儘管表3中之序列係揭示為經修飾或經接合之序列，但本發明之iRNA之RNA如本發明之dsRNA可包含表2、表3、表6及表7中任一者中詳述之任一序列，其係未經修飾、未經接合、或經不同於表中所述者之修飾或經不同於表中所述者之接合者。換言之，本發明涵蓋表2、表3、表6及表7之dsRNA，其係未經修飾、未經接合、經修飾或經接合，如本文所揭示。
具有通常知識者應知悉，具有約20至23個鹼基對如21個鹼基對之雙鏈體結構的dsRNA業經被稱為在誘導RNA干擾中尤其有效 (Elbashir et al.,EMBO2001,20：6877-6888)。惟，其他人業經發現，更短或更長之RNA雙鏈體結構亦可為有效者(Chu and Rana(2007)RNA 14：1714-1719；Kimet al.(2005)Nat Biotech 23：222-226)。於上文揭示之態樣中，憑藉本文中提供之寡核苷酸序列之天性，表2、表3、表6及表7中任一者中提供之dsRNA可包括至少一個長度為最少21個核苷酸之股。可合理地預期，僅在一端或兩端減去幾個核苷酸的具有表2、表3、表6及表7中任一者中之序列之較短雙鏈體可能具備與上述dsRNA類似之效果。因此，具有源自表2、表3、表6及表7中任一者之任一序列之至少19、20或更多個接續核苷酸之序列且其抑制PNPLA3基因表現之能力與包含全序列dsRNA相異不超過約5%、10%、15%、20%、25%或30%的dsRNA，係預期處於本發明之範疇內。
此外，表2、表3、表6及表7中提供之RNA鑑定對RISC中介之裂解敏感的PNPLA3轉錄本中之位點。如是，本發明復提出以此等位點之一者為靶向之iRNA。如本文中所用，如果iRNA促進該特定位點內任意處之轉錄本的裂解，則稱該iRNA為以RNA轉錄本之特定位點內為靶向。此iRNA通常將包括來自表2、表3、表6及表7中任一者所提供之任一序列的至少約19個接續核苷酸，該接續核苷酸係與取自PNPLA3基因中所選擇序列之接續區域的另一核苷酸序列偶聯。
III.本發明之修飾iRNA
於某些態樣中，本發明之iRNA之RNA例如dsRNA未經修飾，且不包含例如該領域中已知及本文所述之化學修飾或接合。於其他態樣中，本發明之iRNA之RNA例如dsRNA經化學修飾以增強安定性或其 他有益特徵。於本發明之某些態樣中，本發明之iRNA的實質上全部核苷酸係經修飾。於本發明之其他態樣中，iRNA之全部核苷酸或iRNA之實質上全部核苷酸係經修飾，亦即，不超過5、4、3、2或1個未經修飾之核苷酸存在於iRNA之股內。
本發明提出之核酸可藉由該領域中良好構建之方法合成或修飾，該方法係例如彼等於《現代核酸化學技術》(“Current protocols in nucleic acid chemistry”,Beaucage,S.L.et al.(Edrs.),John Wiley & Sons,Inc.,New York,NY,USA)中揭示者，該文獻藉由引用而併入本文。修飾包括，舉例而言，末端修飾，例如，5’-末端修飾(磷醯化、接合、反向鏈結)或3’-末端修飾(接合、DNA核苷酸、反向鏈結等)；鹼基修飾，例如，替換為安定化鹼基、去安定化鹼基、或與同伴之拓展物進行鹼基對之鹼基，移除鹼基(無鹼基之核苷酸)，或接合鹼基；糖修飾(例如，在2’-位置或4’-位置)或糖之取代；或主幹修飾，包括磷酸二酯類鏈結之修飾或取代。可用於本文所述態樣中之iRNA化合物之具體示例包括，但不限於，含有經修飾之主幹或不含天然核苷酸間鏈結之RNA。具有經修飾之主幹的RNA除此之外亦包括彼等在主幹中不具有磷原子者。對於本說明書之目的，且如該領域中有時參照者，在其核苷酸間主幹中不具有磷原子的經修飾之RNA亦可視為寡核苷酸。於一些態樣中，經修飾之RNA將在其核苷酸間主幹中具有磷原子。
經修飾之RNA主幹包括，舉例而言，具有正常3’-5’鏈結之硫代磷酸酯類、手性硫代磷酸酯類、二硫代磷酸酯類、磷酸三酯類、胺基烷基磷酸三酯類、包括3’-伸烷基磷酸酯類及手性磷酸酯類之甲基及其他烷 基磷酸酯類、膦酸酯類、包括3’-胺基磷醯胺化物及胺基烷基磷醯胺化物之磷醯胺化物、硫羰基磷醯胺化物類、硫羰基烷基磷酸酯類、硫羰基烷基磷酸三酯類、以及硼磷酸酯類；此等之2’-5’鏈結類似物；以及彼等具有反向極性者，其中相鄰至核苷單元對係將3’-5’鏈接至5’-3’或將2’-5’鏈接至5’-2’。亦可包括多種鹽類、混合鹽類及游離酸形式。於本發明之一些態樣中，本發明之dsRNA劑可為游離酸形式。於本發明之其他態樣中，本發明之dsRNA劑可為鹽形式。於一個態樣中，本發明之dsRNA劑可為鈉鹽形式。於某些態樣中，當本發明之dsRNA劑係鈉鹽形式時，鈉離子可作為該劑中存在之實質上全部磷酸二酯及/或硫代磷酸酯基團之抗衡離子而存在於該劑中。其中實質上全部磷酸二酯及/或硫代磷酸酯類鏈結皆具有鈉抗衡離子之劑，包括不超過5、4、3、2或1個沒有鈉抗衡離子之磷酸二酯及/或硫代磷酸酯類鏈結。於一些態樣中，當本發明之dsRNA劑係鈉鹽形式時，鈉離子可作為該劑中存在之全部磷酸二酯及/或硫代磷酸酯基團之抗衡離子而存在於該劑中。
教示上述含磷鏈結之製備的代表性美國專利包括但不限於，美國專利第3,687,808號、第4,469,863號、第4,476,301號、第5,023,243號、第5,177,195號、第5,188,897號、第5,264,423號、第5,276,019號、第5,278,302號、第5,286,717號、第5,321,131號、第5,399,676號、第5,405,939號、第5,453,496號、第5,455,233號、第5,466,677號、第5,476,925號、第5,519,126號、第5,536,821號、第5,541,316號、第5,550,111號、第5,563,253號、第5,571,799號、第5,587,361號、第5,625,050號、第6,028,188號、第6,124,445號、第6,160,109號、第 6,169,170號、第6,172,209號、第6,239,265號、第6,277,603號、第6,326,199號、第6,346,614號、第6,444,423號、第6,531,590號、第6,534,639號、第6,608,035號、第6,683,167號、第6,858,715號、第6,867,294號、第6,878,805號、第7,015,315號、第7,041,816號、第7,273,933號、第7,321,029號、及美國再公告專利第39464號，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。
其內部不包括磷原子之經修飾之RNA主幹具有藉由短鏈烷基或環烷基類核苷酸間鏈結、混合雜原子及烷基或環烷基核苷酸間鏈結、或一個或多個短鏈雜原子或雜環核苷酸間鏈結形成的主幹。此等包括彼等具有N-嗎啉基鏈結(部分地由核苷之糖部分形成)；矽氧烷主幹；硫醚、亞碸及碸主幹；甲醯乙醯基(formacetyl)及硫代甲醯乙醯基主幹；亞甲基甲醯乙醯基及硫代甲醯乙醯基主幹；含有伸烷基之主幹；胺基磺酸酯主幹；亞甲基亞胺基及亞甲基肼基主幹；磺酸酯及磺醯胺主幹；醯胺主幹；以及其他具有混合之N、O、S及CH2組分部分者。
教示上述寡核苷酸之製備的代表性美國專利包括但不限於，美國專利第5,034,506號、第5,166,315號、第5,185,444號、第5,214,134號、第5,216,141號、第5,235,033號、第5,64,562號、第5,264,564號、第5,405,938號、第5,434,257號、第5,466,677號、第5,470,967號、第5,489,677號、第5,541,307號、第5,561,225號、第5,596,086號、第5,602,240號、第5,608,046號、第5,610,289號、第5,618,704號、第5,623,070號、第5,663,312號、第5,633,360號、第5,677,437號、及第5,677,439號，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。
適宜之RNA模擬物預期用於本文提供之iRNA中，其中核苷酸單元之糖及核苷酸間鏈結兩者亦即主幹係替換為新穎基團。鹼基單元維持與適宜之核酸標靶化合物雜交。一種此類寡聚化合物，其中業經顯示具有優異雜交特性之RNA模擬物指稱為勝肽核酸(PNA)。於PNA化合物中，RNA之糖主幹替換為含有醯胺之主幹，尤其是胺基乙基甘油主幹。核酸鹼基得以保留，且直接或間接地鍵結至主幹之醯胺部分的雜(aza)氮原子。教示PNA化合物之製備的代表性美國專利包括但不限於，美國專利第5,539,082號、第5,714,331號、及第5,719,262號，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。適用於本發明之iRNA中之額外之PNA化合物揭示於，舉例而言，Nielsen et al.,Science,1991,254,1497-1500中。
本發明提出之一些態樣包括具有硫代磷酸酯主幹之RNA以及具有雜原子管之寡核苷酸，尤其是上文引用之美國專利第5,489,677號的--CH2--NH--CH2-、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[稱為亞甲基(甲基亞胺基)或MMI主幹]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--及--N(CH3)--CH2--CH2--[其中，天然磷酸二酯主幹表示為--O--P--O--CH2--]，以及上文引用之美國專利第5,602,240號的醯胺主幹。於一些態樣中，本文提出之RNA具有上文引用之美國專利第5,034,506號的N-嗎啉基主幹結構。
經修飾之RNA亦可含有一個或多個經取代之糖部分。本文提出之iRNA如dsRNA可包括位於2’位置之下述之一者：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中該烷基、烯基及炔基可為經取代或未經取代之C1至C10烷基或C2至 C10烯基及炔基。例示性之適宜修飾包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2).nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、及O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n及m係從1至約10。於其他態樣中，dsRNA包括位於2’位置之下述之一者：C1至C10低級烷基、經取代之低級烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、雜環烷基、雜環烷基芳基、胺基烷基胺基、聚烷基胺基、經取代之矽烷基、RNA裂解基團、保護基團、嵌入劑、用於改善iRNA之藥物動力學特性之基團、或用於改善iRNA之藥效動力學特性之基團、以及其他具有類似特性之取代基。於一些態樣中，該修飾包括2’-甲氧基乙氧基(2’-O--CH2CH2OCH3，亦稱為2’-O-(2-甲氧基乙基)或2’-MOE)(Martin et al.,Helv.Chim.Acta,1995,78：486-504)，亦即，烷氧基-烷氧基基團。另一例示性修飾為2’-二甲基胺基氧乙氧基，亦即，O(CH2)2ON(CH3)2基團，亦稱為2’-DMAOE，如下文實施例中所述；以及2’-二甲基胺基乙氧基乙氧基(該領域中亦稱為2’-O-二甲基胺基乙氧基乙基或2’-DMAEOE)，亦即，2’-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2。其他示例性修飾包括：5’-Me-2’-F核苷酸、5’-Me-2’-OMe核苷酸、5’-Me-2’去氧核苷酸(於此三組中，皆係R異構物與S異構物兩者)；2’-烷氧基烷基；以及2’-NMA(N-甲基乙醯胺)。
其他修飾包括2’-甲氧基(2’-OCH3)、2’-胺基丙氧基(2’-OCH2CH2CH2NH2)及2’-氟(2’-F)。類似之修飾亦可在iRNA之RNA上之其他位置作成，尤其是3’終端核苷酸之糖的3’位置或2’-5’鏈結之dsRNA中以及5’終端核苷酸之5’位置。iRNA亦可具有替代呋喃戊糖基糖的糖模 擬物如環丁基部分。教示此類經修飾之糖結構之製備的代表性美國專利包括但不限於，美國專利第4,981,957號、第5,118,800號、第5,319,080號、第5,359,044號、第5,393,878號、第5,446,137號、第5,466,786、第5,514,785號、第5,519,134號、第5,567,811號、第5,576,427號、第5,591,722號、第5,597,909號、第5,610,300號、第5,627,053號、第5,639,873號、第5,646,265號、第5,658,873號、第5,670,633號及第5,700,920號，其中某些為本申請所共同擁有者。前述者各自之整體內容藉由引用併入本文。
iRNA亦可包括核酸鹼基(該領域中一般簡稱為「鹼基」)修飾或取代。如本文中所用，「未經修飾」或「天然」核酸鹼基包括嘌呤鹼基腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G)，以及嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。經修飾之核酸鹼基包括其他合成及天然核酸鹼基，諸如去氧-胸腺嘧啶(dT)、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羥甲基胞嘧啶；黃嘌呤；次黃嘌呤；2-胺基腺嘌呤；腺嘌呤及鳥嘌呤之6-甲基及其他烷基衍生物；腺嘌呤及鳥嘌呤之2-丙基及其他烷基衍生物；2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、2-硫胞嘧啶；5-鹵尿嘧啶、5-鹵胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-鹵、8-胺基、8-巰基、8-硫烷基、8-羥基及其他8-取代之腺嘌呤及鳥嘌呤；5-鹵尤其是5-溴、5-三氟甲基及其他5-取代之尿嘧啶及胞嘧啶；7-甲基鳥嘌呤及7-甲基腺嘌呤；8-氮雜鳥嘌呤及8-氮雜腺嘌呤；7-去氮鳥嘌呤及7-去氮腺嘌呤；以及3-去氮鳥嘌呤及3-去氮腺嘌呤。其他核酸鹼基包括彼等揭露於美國專利第3,687,808號中者；彼等揭露於《生物化學、生物技術及 醫藥中之經修飾之核苷酸》(Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijn,P.ed.Wiley-VCH,2008)中者；彼等揭露於《聚合物科學及工程之簡明百科》(The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,pages 858-859,Kroschwitz,J.L,ed.John Wiley & Sons,1990)中者；此等由Englisch et al.,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613揭露者；以及彼等由《dsRNA研究及應用》第15章第289至302頁(Sanghvi,YS.,Chapter 15,dsRNA Research and Applications,pages 289-302,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Ed.,CRC Press,1993)揭露者。此等核酸鹼基中之某些尤其可用於增加本發明提出之寡聚化合物的結合親和性。此等包括5-取代之嘧啶、6-氮雜嘧啶及N-2、N-6及O-6取代之嘌呤，包括2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙基尿嘧啶及5-丙基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代業經顯示將核酸雙鏈體穩定性增加0.6至1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Eds.,dsRNA Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278)且係示例性之鹼基取代，尤其是當與2’-O-甲氧基乙基糖修飾合用時尤甚。
教示某些上述經修飾之核酸鹼基以及其他經修飾之核酸鹼基的代表性美國專利包括但不限於，上述之美國專利第3,687,808號、第4,845,205號、第5,130,30號、第5,134,066號、第5,175,273號、第5,367,066號、第5,432,272號、第5,457,187號、第5,459,255號、第5,484,908號、第5,502,177號、第5,525,711號、第5,552,540號、第5,587,469號、第5,594,121號、第5,596,091號、第5,614,617號、第5,681,941號、第5,750,692號、第6,015,886號、第6,147,200號、第6,166,197號、第 6,222,025號、第6,235,887號、第6,380,368號、第6,528,640號、第6,639,062號、第6,617,438號、第7,045,610號、第7,427,672號、及第7,495,088號，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。
iRNA之RNA亦可經修飾，以包括一個或多個鎖定之核酸(LNA)。鎖定之核酸係具有經修飾之核糖部分的核苷酸，其中該核糖部分包含連結2’碳與4’碳之外接橋。這一結構有效地將該核糖「鎖定」為3’-環內結構之構形。將鎖定之核酸加至siRNA中業經顯示增加血清中siRNA穩定性，且降低脫靶效應(Elmen,J.et al.,(2005)Nucleic Acids Research 33(1)：439-447；Mook,OR.et al.,(2007)Mol Canc Ther 6(3)：833-843；Grunweller,A.et al.,(2003)Nucleic Acids Research 31(12)：3185-3193)。
於一些態樣中，iRNA之RNA亦可經修飾，以包括一個或多個雙環糖部分。「雙環糖」係藉由兩個原子之橋接而修飾之呋喃糖基環。「雙環核苷」(「BNA」)係核苷，其具有包含連結該糖環之兩個碳原子之橋的糖部分，從而形成雙環系統。於某些態樣中，橋連結糖環之4'碳與2'碳。因此，於一些態樣中，本發明之劑可包括一個或多個鎖定之核酸(LNA)。鎖定之核酸係具有經修飾之核糖部分的核苷酸，其中該核糖部分包含連結2’碳與4’碳之外接橋。換言之，LNA係包含雙環糖部分之核苷酸，其中該雙環糖部分包含4’-CH2-O-2’橋。這一結構有效地將該核糖「鎖定」為3’-環內結構之構形。將鎖定之核酸加至siRNA中業經顯示增加血清中siRNA穩定性，且降低脫靶效應(Elmen,J.et al.,(2005)Nucleic Acids Research 33(1)：439-447；Mook,OR.et al.,(2007)Mol Canc Ther 6(3)：833-843；Grunweller,A.et al.,(2003)Nucleic Acids Research 31(12)：3185-3193)。 用於本發明之多核苷酸之雙環核苷的示例包括而不限於，包含位於4’核糖基環原子與2’核糖基環原子間之橋的核苷。於某些態樣中，本發明之反義多核苷酸劑包括一個或多個包含4’至2’橋之雙環核苷。此類4’至2’橋接之雙環核苷的示例包括但不限於，4’-(CH2)-O-2’(LNA)；4’-(CH2)-S-2’；4’-(CH2)2-O-2’(ENA)；4’-CH(CH3)-O-2’(亦指稱為「約束之乙基」或「cEt」)及4’-CH(CH2OCH3)-O-2’(及其類似物；參見，例如，美國專利第7,399,845號)；4’-C(CH3)(CH3)-O-2’(及其類似物；參見，例如，美國專利第8,278,283號)；4’-CH2-N(OCH3)-2’(及其類似物；參見，例如，美國專利第8,278,425號)；4’-CH2-O-N(CH3)-2’(參見，例如，美國專利公佈第2004/0171570號)；4’-CH2-N(R)-O-2’，其中R係H、C1-C12烷基、或保護基團(參見，例如，美國專利第7,427,672號)；4’-CH2-C(H)(CH3)-2’(參見，例如，Chattopadhyaya et al.,J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；以及4’-CH2-C(=CH2)-2’(及其類似物；參見，例如，美國專利第8,278,426號)。前述者各自之整體內容藉由引用併入本文。
教示鎖定之核酸核苷酸之製備的其他代表性美國專利及美國專利公開包括但不限於下列者：美國專利第6,268,490號、第6,525,191號、第6,670,461號、第6,770,748號、第6,794,499號、第6,998,484號、第7,053,207號、第7,034,133號、第7,084,125號、第7,399,845號、第7,427,672號、第7,569,686號、第7,741,457號、第8,022,193號、第8,030,467號、第8,278,425號、第8,278,426號、第8,278,283號、US2008/0039618、及US2009/0012281，其各自之整體內容係藉由引用而併入本文。
前述雙環核苷之任意者可製備為具有一種或多種立體化學糖組態，包括，舉例而言，α-L-呋喃核糖及β-D-呋喃核糖(參見，WO 99/14226)。
iRNA之RNA亦可經修飾，以包括一個或多個約束之乙基核苷酸。如本文中所用，「約束之乙基核苷酸」或「cEt」包含雙環糖部分之鎖定之核酸，其中該雙環糖部分包含4’-CH(CH3)-O-2’橋。於一個態樣中，約束之乙基核苷酸係S構形，本文中指稱為「S-cEt」。
本發明之iRNA亦可經修飾，以包括一個或多個「構形上受限之核苷酸」(「CRN」)。CRN係具有連結核糖之C2’碳與C4’碳或核糖之C3碳與C5’碳之鏈結子的核苷酸類似物。CRN將該核糖鎖定為適宜之構形，且增加其與mRNA之雜交親和性。該鏈接基足夠長，以將氧置於對於安定性及親和性為最優之位置，從而令核糖不易起皺。
教示上述CRN之製備的代表性專利公開包括但不限於，美國專利公開第2013/0190383號及PCT公開第WO 2013/036868號，其各自之整體內容係藉由引用而併入本文。
於一些態樣中，本發明之iRNA包含一個或多個作為UNA(未鎖定之核酸)核苷酸之單體。UNA係未鎖定之非環狀核酸，其中該糖之任意鍵業經移除，形成未鎖定之「糖」殘基。於一實例中，UNA亦涵蓋其C1’-C4’鍵(亦即，位於C1’碳與C4’碳間之碳-氧-碳共價鍵)業經移除之單體。於另一示例中，糖之C2’-C3’鍵(亦即，位於C2’碳與C3’碳之間的碳-碳共價鍵)業經移除(參見，Nuc.Acids Symp.Series,52,133-134(2008)及Fluiter et al.,Mol.Biosyst.,2009,10,1039，藉由引用併入本文)。
教示UNA之製備的代表性美國專利公開係包括但不限於，美國專利第8,314,227號及美國專利公開第2013/0096289號、第2013/0011922號、及第2011/0313020號，其各自之整體內容係藉由引用而併入本文。
對RNA分子之末端的潛在穩定化修飾可包括N-(乙醯基胺基己醯基)-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6-NHAc)、N-(己醯基-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6)、N-(乙醯基-4-羥基脯胺醇(Hyp-NHAc)、胸腺嘧啶-2’-O-去氧胸腺嘧啶(醚)、N-(胺基己醯基)-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6-胺基)、2-二十二醯基-尿苷-3"-磷酸酯、反向鹼基dT(idT)等。這一修飾之揭露可見於PCT申請第WO 2011/005861號中。
本發明之iRNA之核苷酸的其他修飾包括5’磷酸酯或5’磷酸酯模擬物，如位於iRNA劑之反義股上的5’-終端磷酸酯或磷酸酯模擬物。適宜之磷酸酯模擬物揭露於，舉例而言，美國專利公開第2012/0157511號中，其整體內容藉由引用而併入本文。
A.本發明之包含模體的經修飾之iRNA
於本發明之某些方面，本發明之雙股RNA劑包括具有如例如WO2013/075035中所揭露之化學修飾的劑，該申請各自之整體內容藉由引用而併入本文。WO2013/075035將位於三個接續核苷酸之三個相同修飾的模體提供到dsRNAi劑之有義股或反義股中，尤其在裂解位點處或鄰近裂解位點處。於一些態樣中，dsRNAi劑之有義股及反義股可以其他方式完全修飾。此等基序之引入中斷有義股或反義股之修飾模式(若存在)。dsRNAi劑可視需要與GalNAc衍生物配體例如於有義股接合。
更詳細而言，當雙股RNA劑之有義股及反義股經完全修飾以在dsRNAi劑之至少一股的裂解位點處或鄰近裂解位點處具有位於三個接續核苷酸之三個相同修飾的一個或多個模體時，觀察到了dsRNAi劑之基因緘默化活性。
據此，本發明提供能在活體內抑制標靶基因(亦即，PNPLA3基因)之表現的雙股RNA劑。RNAi劑包含有義股及反義股。RNAi劑之各股可為，例如，17至30個核苷酸之長度、25至30個核苷酸之長度、27至30個核苷酸之長度、19至25個核苷酸之長度、19至23個核苷酸之長度、19至21個核苷酸之長度、21至25個核苷酸之長度、或21至23個核苷酸之長度。
有義股及反義股典型地形成雙鏈體雙股RNA(「dsRNA」)，本文中亦指稱為「dsRNAi劑」。dsRNAi劑之雙鏈體區域可為，舉例而言，雙鏈體區域可為27至30個核苷酸對之長度；19至25個核苷酸對之長度；19至23個核苷酸對之長度；19至21個核苷酸對之長度；21至25個核苷酸對之長度；或21至23個核苷酸對之長度。於另一示例中，該雙鏈體區域係選自19、20、21、22、23、24、25、26及27個核苷酸之長度。
於某些態樣中，dsRNAi劑可含有位於一股或兩股之3’末端、5’末端或兩端的一個或多個突出區域或封端基團。突出可獨立為1至6個核苷酸之長度，例如，2至6個核苷酸之長度、1至5個核苷酸之長度、2至5個核苷酸之長度、1至4個核苷酸之長度、2至4個核苷酸之長度、1至3個核苷酸之長度、2至3個核苷酸之長度、或1至2個核苷酸之長度。於某些態樣中，突出區域可包括上文提供的延伸之突出區域。突出可為一 股比另一股長之結果，或係相同長度之兩股交錯之結果。突出可形成與標靶mRNA之錯配，或其可與待作為標靶之基因序列互補或可為另一序列。第一股與第二股亦可藉由例如額外之鹼基結合以形成髮夾，或藉由其他非鹼基鏈結子接合。
於某些態樣中，dsRNAi劑之突出區域中之核苷酸可各自獨立為經修飾或未經修飾之核苷酸，包括但不限於，2’-糖修飾，諸如2’-F、2’-O-甲基胸苷(T)、2`-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(Teo)、2`-O-甲氧基乙基腺苷(Aeo)、2`-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷(m5Ceo)、及其任意組合。
舉例而言，TT可為任一股上任一端之突出序列。突出可形成與標靶mRNA之錯配，或其可與待作為標靶之基因序列互補或可為另一序列。
位於dsRNAi劑之有義股、反義股或兩個之5’突出或3’突出可經磷酸化。於一些態樣中，突出區域含有兩個核苷酸且在該兩個核苷酸之間具有硫代磷酸酯，其中，兩個核苷酸可為相同或相異。於一些態樣中，突出存在於有義股、反義股或兩股之3’末端。於一些態樣中，這一3’突出存在於反義股。於一些態樣中，這一3’突出存在於有義股。
dsRNAi劑可僅含有單個突出，該突出可強化RNAi劑之干擾活性而不影響其整體安定性。舉例而言，單股突出可位於有義股之3’-末端，或位於反義股之3’-末端。RNAi劑亦可具有鈍端，位於反義股之5’-末端(或有義股之3’-末端)，反之亦然。通常，dsRNAi劑之反義股具有位於3’-末端之核苷酸突出，且5’-末端係鈍端。儘管不欲受縛於理論，但位 於反義股5’-末端之不對稱鈍端以及反義股之3’-末端突出有助於將導引股加載至RISC製程中。
於某些態樣中，dsRNAi劑係19個核苷酸長度之雙鈍端者，其中，有義股含有位於從5’末端計數第7、8、9位置處之三個接續核苷酸之三個2’-F修飾的模體。反義股含有至少一個位於從5’末端計數第11、12、13位置處之三個接續核苷酸之三個2’-O-甲基修飾的模體。
於其他態樣中，dsRNAi劑係20個核苷酸長度之雙鈍端者，其中，有義股含有至少一個位於從5’末端計數第8、9、10位置處之三個接續核苷酸之三個2’-F修飾的模體。反義股含有至少一個位於從5'末端計數第11、12、13位置處之三個接續核苷酸之三個2'-O-甲基修飾的模體。
於再其他態樣中，dsRNAi劑係21個核苷酸長度之雙鈍端者，其中，有義股含有至少一個位於從5’末端計數第9、10、11位置處之三個接續核苷酸之三個2’-F修飾的模體。反義股含有至少一個位於從5’末端計數第11、12、13位置處之三個接續核苷酸之三個2’-O-甲基修飾的模體。
於某些態樣中，dsRNAi劑包含21個核苷酸之有義股及23個核苷酸之反義股，其中，有義股含有至少一個位於從5’末端計數第9、10、11位置處之三個接續核苷酸之三個2’-F修飾的模體；反義股含有至少一個位於從5’末端計數第11、12、13位置處之三個接續核苷酸之三個2’-O-甲基修飾的模體，其中，RNAi劑之一端係鈍端而另一端包含2個核苷酸之突出。較佳地，2個核苷酸之突出位於反義股之3’末端。
當2個核苷酸之突出位於反義股之3’-末端時，在末端三個核苷酸之間可能存在兩個硫代硫酸酯核苷酸間鏈結，其中，該三個核苷酸中 之兩者為突出核苷酸，且第三個核苷酸與緊鄰該突出核苷酸之下一個核苷酸配對。於一個態樣中，RNAi劑在有義股之5’-末端及反義股之5’-末端兩處額外具有位於末端三個核苷酸之間的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。於某些態樣中，dsRNAi劑之有義股及反義股中之每一個核苷酸，包括作為模體之一部分的核苷酸，皆係經修飾之核苷酸。於某些態樣中，每一殘基獨立經2’-O-甲基或3’-氟以例如交替模體方式修飾。視需要，dsRNAi劑復包含配體(較佳係GalNAc3)。
於某些態樣中，dsRNAi劑包含有義股及反義股，其中，有義股係25至30個核苷酸殘基之長度，其中，第一股之從5’終端核苷酸(位置1)開始計數之位置1至23包含至少8個核糖核苷酸；反義股係36至66個核苷酸殘基之長度，且從3’終端核苷酸開始計數，在與有義股之位置1至23配對以形成雙鏈體之位置中包含至少8個核糖核苷酸；其中，至少反義股之3’終端核苷酸未與有義股配對，且至多6個接續之3’終端核苷酸未與有義股配對，從而形成具有1至6個核苷酸之3’單股突出；其中，反義股之5’終端包含10至30個為與有義股配對之接續核苷酸，從而形成具有10至30個核苷酸之單股5’突出；其中，當將有義股與反義股對準以進行最大互補時，至少有義股之5’終端核苷酸及3’終端核苷酸與反義股之核苷酸進行鹼基配對，從而在有義股與反義股之間形成實質上雙鏈體之區域；以及，反義股在沿著反義股長度之至少19個核苷酸與標靶RNA充分互補，以在當將雙股核酸引入哺乳動物細胞內時降低標靶基因之表現；以及，其中，有義股含有至少一個位於三個接續核苷酸之三個2’-F修飾的模體，其中，模體之至少一者出現在裂解位點或鄰近該裂解位點處。反義股含有至 少一個位於裂解位點或鄰近該裂解位點處之三個接續核苷酸上之三個2’-O-甲基修飾的模體。
於某些態樣中，dsRNAi劑包含有義股及反義股，其中，RNAi劑包含具有至少25個且至多29個核苷酸之長度的第一股，以及具有至多30個核苷酸之長度且具有至少一個位於從5’末端計數第11、12、13位置處之三個接續核苷酸之三個2’-O-甲基修飾之模體的第二股；其中，第一股之3’末端及該第二股之5’末端形成鈍端，且第二股於其3’末端比第一股長1至4個核苷酸，其中，雙鏈體區域之長度係至少25個核苷酸，且第二股在沿著第二股長度之至少19個核苷酸上與標靶RNA充分互補，以在當將RNAi劑引入哺乳動物細胞內時降低標靶基因之表現，以及，其中，RNAi劑之切丁酶裂解優先得到包含第二股之3’末端的siRNA，從而降低哺乳動物體內之標靶基因的表現。視需要，dsRNAi劑復包含配體。
於某些態樣中，dsRNAi劑之有義股含有至少一個位於三個接續核苷酸之三個一致修飾的模體，其中，模體之一者出現在有義股之裂解位點處。
於某些態樣中，dsRNAi劑之反義股亦可含有至少一個位於三個接續核苷酸之三個一致修飾的模體，其中，模體之一者出現在反義股之裂解位點或鄰近該裂解位點處。
對於具有19至23個核苷酸之長度之雙鏈體區域的dsRNAi劑，反義股之裂解位點典型位於從5’-末端計數之位置10、11及12附近。因此，三個一致修飾之模體可出現在反義股之位置9、10、11，位置10、11、12，位置11、12、13，位置12、13、14，或位置13、14、15，從反 義股之5’-末端的第一個核苷酸開始計數，或在雙鏈體區域內從反義股之5’-末端的第一個配對核苷酸開始計數。反義股之裂解位點亦可根據dsRNAi之雙鏈體區域從5’-末端計數的長度而改變。
dsRNAi劑之有義股可含有至少一個位於該股之裂解位點處之三個接續核苷酸之三個一致修飾的模體；且反義股可具有至少一個位於該股之裂解位點或鄰近該裂解位點處之三個接續核苷酸之三個一致修飾的模體。當有義股及反義股形成dsRNA雙鏈體時，有義股及反義股可經對準，使得位於有義股之三核苷酸的一個模體與位於反義股之三核苷酸的一個模體具有至少一個核苷酸重疊，亦即，有義股之模體之三個核苷酸之至少一者與反義股之模體之三個核苷酸之至少一者形成鹼基對。或者，至少兩個核苷酸可重疊，或全部三個核苷酸可重疊。
於一些態樣中，dsRNAi劑之有義股可含有超過一個位於三個接續核苷酸之三個一致修飾的模體。第一模體可出現在該股之裂解位點或鄰近該裂解位點處，且其他模體可為側翼修飾。本文中，術語「側翼修飾」指稱出現在該股之另一部位的與位於相同股之裂解位點或鄰近該裂解位點處之模體分隔開來的模體。側翼修飾或與第一模體相鄰或藉由至少一個或多個核苷酸與第一模體分隔開來。當模體彼此緊鄰時，則該等模體之化學性彼此截然不同；而當模體藉由一個或多個核苷酸分隔開來時，則該等化學性可相同或相異。可存在兩個或多個側翼修飾。例如，當存在兩個側翼修飾時，每一側翼修飾可出現在位於裂解位點或鄰近該裂解位點處之第一模體的一段，或出現在該前導模體之任一側。
與有義股相似，dsRNAi劑之反義股可含有超過一個位於三個接續核苷酸之三個一致修飾的模體，且模體之至少一者出現在該股之裂解位點或鄰近該裂解位點處。這一反義股亦可含有一個或多個側翼修飾，該側翼修飾之排列類似於可能存在於該有義股之側翼修飾。
於一些態樣中，dsRNAi劑之有義股或反義股之側翼修飾典型不包括位於該股之3’-末端、5’-末端或兩端之最開始的一個或兩個末端核苷酸。
於其他態樣中，dsRNAi劑之有義股或反義股之側翼修飾典型不包括位於雙鏈體區域內該股之3’-末端、5’-末端或兩端之最開始的一個或兩個配對核苷酸。
當dsRNAi劑之有義股及反義股各自含有至少一個側翼修飾時，該側翼修飾可落入雙鏈體區域之相同末端，且具有一個、兩個或三個核苷酸之重疊。
當dsRNAi劑之有義股及反義股各自含有至少兩個側翼修飾時，有義股與反義股可經對準而使得來自一股之兩個修飾之每一者落入雙鏈體區域之一端且具有一個、兩個或三個核苷酸之重疊；來自一股之兩個修飾之每一者落入雙鏈體區域之另一端且具有一個、兩個或三個核苷酸之重疊；一股之兩個修飾分別落入前導模體之兩端且在雙鏈體區域內具有一個、兩個或三個核苷酸之重疊。
於一些態樣中，dsRNAi劑之有義股及反義股之每一個核苷酸，包括作為模體之一部分的核苷酸，可經修飾。每一核苷酸可藉由相同或相異之修飾而經修飾，該等修飾可包括非鏈結性磷酸酯氧之一者或兩者 或鏈結性磷酸酯氧之一者或多者的一個或多個變更；核糖之構建的變更，如核糖上2’-羥基之變更；以「去磷」鏈結子進行之磷酸酯部分的整體替換；天然出現之鹼基的修飾或替換；以及核糖-磷酸酯主幹的替換或修飾。
由於核酸係子單元之聚合物，多數修飾出現在核酸內重複之位置，如，鹼基、磷酸酯部分、或磷酸酯部分之非鏈結性O的修飾。於一些情形中，該修飾將出現在該核酸之所有受試位置，但在多數情形中並非如此。舉例而言，修飾可僅出現在3’或5’終端位置，可僅出現在終端區域，例如，出現在終端核苷酸之位置或出現在一股之最末2、3、4、5或10個核苷酸內。修飾可出現在雙股區域內、單股區域內、或兩者內。修飾可僅出現在RNA之雙股區域內，或僅出現在RNA之單股區域內。例如，位於非鏈結性O位置之硫代磷酸酯修飾可僅出現在一端或兩端；可僅出現在終端區域，例如出現在終端核苷酸之位置或出現在一股之最末2、3、4、5或10個核苷酸內；或可出現在雙股區域及單股區域內，尤其是在末端。一個或多個5’末端可經磷酸化。
下述係可能者，例如，提升安定性，在突出中包括特定之鹼基，或在單股突出例如5’突出或3’突出或兩者中包括經修飾之核苷酸或核苷酸替代品。例如，可能所欲者係在突出中包括嘌呤核苷酸。於一些態樣中，3'或5’突出中之全部或一些鹼基可經修飾，例如具有本文所述之修飾。修飾可包括，例如，使用在核糖之2’位置具有該領域中已知之修飾者，例如使用去氧核糖核苷酸，使用2’去氧-2’-氟(2’-F)或2’-O-甲基修飾者替代核酸鹼基之核糖，以及使用磷酸酯基團中之修飾例如硫代磷酸酯修飾。突出無需與標靶序列同源。
於一些態樣中，有義股及反義股之每一殘基獨立地經LNA、CRN、cET、UNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’去氧、2’-羥基或2’-氟修飾。該股可含有超過一個修飾。於一個態樣中，有義股及反義股之每一殘基獨立地經2’-O-甲基或2’-氟修飾。
至少兩個相異之修飾典型存在於有義股及反義股。彼等兩個修飾可以為2’-O-甲基或2’-氟修飾等。
於某些態樣中，Na或Nb包含交替模式之修飾。如本文中所用，術語「交替模體」指稱具有一個或多個修飾之模體，每一修飾出現在一股之交替核苷酸上。交替核苷酸可指稱每兩個核苷酸一個或每三個核苷酸一個或類似模式。例如，如果A、B及C各自表示一種類型之對核苷酸之修飾，則交替模體可為「ABABABABABAB...」、「AABBAABBAABB...」、「AABAABAABAAB...」、「AAABAAABAAAB...」、「AAABBBAAABBB...」或「ABCABCABCABC...」等。
交替模體中含有之修飾的類型可為相同或相異。例如，如果A、B、C、D各自表示一種類型之對核苷酸之修飾，則交替模體亦即每兩個核苷酸之修飾可為相同，但有義股或反義股可各自選自交替模體諸如「ABABAB...」、「ACACAC...」、「BDBDBD...」或「CDCDCD...」等中修飾之若干可能性。
於一些態樣中，本發明之dsRNAi劑包含，有義股之交替模體的修飾模式相對於反義股之交替模體的修飾模式位移。該位移可使得有 義股之核苷酸的修飾基團與反義股之核苷酸的不同修飾基團相對應，反之亦然。例如，當有義股與反義股在dsRNA雙鏈體中配對時，在雙鏈體區域內，有義股之交替模體可始於該股之5’至3’之「ABABAB」，且反義股之交替模體可始於該股之5’至3’之「BABABA」。作為另一示例，在雙鏈體區域內，有義股之交替模體可始於該股之5’至3’之「AABBAABB」，且反義股之交替模體可始於該股之5’至3’之「BBAABBAA」，因此有義股與反義股之間存在修飾模式之完全或部分位移。
於一些態樣中，dsRNAi劑包含位於有義股之2’-O-甲基修飾與2’-F修飾起始之交替模體之模式，該模式具有相對於位於反義股之2’-O-甲基修飾與2’-F修飾起始之交替模體之模式的位移，亦即，有義股鹼基對之2’-O-甲基修飾之核苷酸與反義股之2’-F修飾之核苷酸進行鹼基配對，反之亦然。有義股之1位置可始於該2’-F修飾，且反義股之1位置可始於該2’-O-甲基修飾。
將一個或多個位於三個接續核苷酸之三個一致修飾的模體引入有義股或反義股，中斷有義股或反義股中存在之初始修飾模式。藉由將一個或多個位於三個接續核苷酸之三個一致修飾的模體引入有義股或反義股而中斷有義股或反義股的修飾模式，可提升對於標靶基因之基因緘默化活性。
於一些態樣中，當將位於三個接續核苷酸上之三個一致修飾的基序引入任一股中時，位於基序之下一個核苷酸的修飾係不同於該模體之修飾者。例如，含有該模體之序列部位為「...NaYYYNb...」，其中，「Y」表示位於三個接續核苷酸之三個一致修飾的模體，且「Na」及「Nb」表示 位於模體「YYY」之下一個核苷酸上的不同於Y修飾之修飾，且其中Na與Nb可以為相同或相異之修飾。另選地，當存在側翼修飾時，Na或Nb可存在或不存在。
iRNA可復包含至少一個硫代磷酸酯類或甲基硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。硫代磷酸酯或甲基磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾可出現在有義股或反義股或兩股的位於該股任意位置之任意核苷酸。例如，核苷酸間鏈結修飾可出現在有義股或反義股之每一個核苷酸；每一核苷酸間鏈結修飾可以交替模式出現在有義股或反義股；或有義股或反義股可包含交替模式之兩種核苷酸間鏈結修飾。有義股之交替模式之核苷酸間鏈結修飾可與反義股相同或相異，其有義股之交替模式之核苷酸間鏈結修飾可具有相對於反義股之交替模式之核苷酸間鏈結修飾的位移。於一個態樣中，雙股RNAi劑包括6至8個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。於一些態樣中，反義股包括位於5’-末端之兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結以及位於3’-末端之兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，且有義股包含位於5’-末端或3’-末端之至少兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。
於一些態樣中，dsRNA劑包含位於突出區域內之硫代磷酸酯或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結修飾。例如，突出區域可含有兩個核苷酸且在該兩個核苷酸間具有硫代磷酸酯或甲基磷酸酯核苷酸間鏈結。核苷酸間鏈結修飾亦可作成以將突出核苷酸與雙鏈體區域內之終端配對核苷酸鏈結。例如，至少2、3、4或全部突出核苷酸可透過硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結而鏈結，且視需要，可存在將突出核苷酸與作為該突出核苷酸之下一個成對核苷酸鏈結的額外之硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間 鏈結。例如，在終端三個核苷酸之間可能存在至少兩個硫代硫酸酯核苷酸間鏈結，其中該三個核苷酸中之兩者為突出核苷酸，且第三個核苷酸為緊鄰該突出核苷酸之下一個配對核苷酸。此等終端核苷酸可位於反義股之3’-末端、有義股之3’-末端、反義股之5’-末端或反義股之5’-末端。
於一些態樣中，2個核苷酸之突出位於反義股之3’-末端，且在終端三個核苷酸之間可能存在兩個硫代硫酸酯類核苷酸間鏈結，其中該三個核苷酸中之兩者係突出核苷酸，且第三個核苷酸與緊鄰該突出核苷酸之下一個核苷酸配對。視需要，dsRNAi劑可在有義股之5’-末端及反義股之5’-末端兩處額外具有位於末端三個核苷酸之間的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。
於一個態樣中，dsRNAi劑包含與標靶之錯配、雙鏈體中之錯配、或其組合。錯配可出現在突出區域內或雙鏈體區域內。基於鹼基對促進解離或熔融之傾向性(例如，基於特定配對之關聯或解離之自由能，自由能為基於個體配對檢查配對的最簡單之途徑，但亦可使用次近鄰分析及類似分析)，可將鹼基對排名。就促進解離而言：A：U優於G：C；G：U優於G：C；且I：C優於G：C(I為肌苷)。錯配如非規範配對或除規範配對之外者(如本文中他處所揭示)優於規範(A：T、A：U、G：C)配對；且包括萬用鹼基之配對優於規範配對。
於某些態樣中，dsRNAi劑包含，位於雙鏈體區域內之反義股中從5’-末端計數最前列之第1、2、3、4或5個鹼基對的至少一者選自下列所組成之群組：A：U、G：U、I：C、以及錯配例如非規範配對或除規 範配對之外者或包括萬用鹼基之配對，以促進反義股於該雙鏈體之5’-末端的解離。
於某些態樣中，位於該雙鏈體區域內之反義股從5’-末端計數之位置1的核苷酸選自A、dA、dU、U及dT。另選地，位於雙鏈體區域內之反義股從5’-末端計數最前列之第1、2或3個鹼基對的至少一者係AU鹼基對。例如，位於雙鏈體區域內之反義股從5’-末端計數之第一個鹼基對係AU鹼基對。
於其他態樣中，位於有義股之3’-末端之核苷酸係去氧胸苷(dT)，或位於反義股之3’-末端之核苷酸係去氧胸苷(dT)。舉例而言，在有義股、反義股或兩股之3’-末端上存在去氧胸腺嘧啶核苷酸之短序列，例如，兩個dT核苷酸。
於某些態樣中，有義股序列可藉由式(I)表示：
5’ np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3’ (I)
其中：
i及j各自獨立地為0或1；
p及q各自獨立地為0至6；
各Na獨立地表示包含0至25個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列，每一序列包含至少兩個經不同修飾之核苷酸；
各Nb獨立地表示包含0至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列；
各np與nq獨立地表示突出核苷酸；
其中，Nb及Y不具有相同之修飾；以及
XXX、YYY及ZZZ各自獨立地表示一個位於三個接續核苷酸之三個相同修飾的模體。較佳地，YYY全部為2’-F修飾之核苷酸。
於一些態樣中，Na或Nb包含交替模式之修飾。
於一些態樣中，YYY模體出現於有義股之裂解位點處。例如，當dsRNAi劑具有長度為17至23個核苷酸之雙鏈體區域時，YYY模體出現於有義股之裂解位點處或其附近(例如，可出現於位置6、7、8；7、8、9；9、10、11；10、11、12；或11、12、13)，從5’-末端之第1個核苷酸開始計數；或視需要，從5’-末端之雙鏈體區域內第一個配對核苷酸開始計數。
於一個態樣中，i為1且j為0，或i為0且j為1，或i及j兩者皆為1。有義股可因此藉由下列式表示：
5’ np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’ (Ib)；
5’ np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3’ (Ic)；或
5’ np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’ (Id)。
當有義股藉由式(Ib)表示時，Nb表示包含0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各Na可獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當有義股藉由式(Ic)表示時，Nb表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各Na可獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當有義股藉由式(Id)表示時，各Nb獨立地表示包含0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。較佳地，Nb係0、1、2、3、4、5或6。各Na可獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
X、Y及Z各自可彼此相同或相異。
於其他態樣中，i為0且j為0，且有義股可藉由下式表示：
5’ np-Na-YYY-Na-nq 3’ (Ia)。
當有義股由式(Ia)表示時，各Na獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
於一個態樣中，RNAi之反有義股序列可由式(II)表示：
5’ nq’-Na’-(Z’Z’Z’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(X’X’X’)l-N’a-np’ 3’ (II)
其中：
k及l各自獨立地為0或1；
p’及q’各自獨立地為0至6；
各Na’獨立地表示包含0至25個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列，每一序列包含至少兩個經不同修飾之核苷酸；
各Nb’獨立地表示包含0至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列；
各np’與nq’獨立地表示突出核苷酸；
其中，Nb’及Y’不具有相同之修飾；以及
X’X’X’、Y’Y’Y’及Z’Z’Z’各自獨立表示一個位於三個接續核苷酸之三個相同修飾的模體。
於一些態樣中，Na’或Nb’包含交替模式之修飾。
於一個態樣中，Y’Y’Y’基序出現於反義股之裂解位點處。例如，當dsRNAi劑具有長度為17至23個核苷酸之雙鏈體區域時，Y’Y’Y’模體出現於該反義股之位置9、10、11；10、11、12；11、12、13；12、13、14；或13、14、15處，從5’-末端之第1個核苷酸開始計數；或視需要，從5’-末端之雙鏈體區域內第一個配對核苷酸開始計數。較佳地，Y’Y’Y’模體出現於位置11、12、13處。
於某些態樣中，Y’Y’Y’模體全部為2’-OMe修飾之核苷酸。
於某些態樣中，k為1且l為0，或k為0且l為1，或k及l兩者皆為1。
反義股可因此藉由下列式表示：
5’ nq’-Na’-Z’Z’Z’-Nb’-Y’Y’Y’-Na’-np’ 3’ (IIb)；
5’ nq’-Na’-Y’Y’Y’-Nb’-X’X’X’-np’ 3’ (IIc)；或
5’ nq’-Na’-Z’Z’Z’-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-X’X’X’-Na’-np’ 3’ (IId)。
當反義股藉由式(IIb)表示時，Nb’表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各Na’獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當反義股表示為式(IIc)時，Nb’表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各Na’獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當反義股表示為式(IId)時，各Nb’獨立表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各Na’獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。較佳地，Nb為0、1、2、3、4、5或6。
於其他態樣中，k為0且l為0，且反義股可藉由下式表示：
5’ np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-nq’ 3’ (Ia)。
當反義股表示為式(Ia)時，各Na’獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
X’、Y’及Z’各自可彼此相同或相異。
有義股及反義股之每一核苷酸獨立經LNA、CRN、UNA、cET、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-羥基或2’-氟修飾。例如，有義股及反義股之每一核苷酸獨立地經2’-O-甲基或2’-氟修飾。特別地，X、Y、Z、X’、Y’及Z’可各自表示2’-O-甲基修飾或2’-F修飾。
於一些態樣中，當雙鏈體區域係21nt時，dsRNAi劑之有義股可含有出現在該股之9、10及11位置之YYY模體，從5’-末端之第一個核苷酸開始計數，或視需要，在雙鏈體區域內從5’-末端之第一個配對核苷酸開始計數；以及，Y表示2’-F修飾。有義股可額外含有XXX模體或ZZZ模體作為位於雙鏈體區域之相反末端的側翼修飾；以及，XXX與ZZZ各自獨立地表示2’-OMe修飾或2’-F修飾。
於一些態樣中，反義股可含有出現在該股之11、12及13位置之Y’Y’Y’模體，從5’-末端之第一個核苷酸開始計數，或視需要，在雙 鏈體區域內從5’-末端之第一個配對核苷酸開始計數；以及，Y’表示2’-O-甲基修飾。反義股可額外含有X’X’X’模體或Z’Z’Z’模體作為位於雙鏈體區域之相反末端的側翼修飾；以及，X’X’X’與Z’Z’Z’各自獨立地表示2’-OMe修飾或2’-F修飾。
由上述式(Ia)、(Ib)、(Ic)及(Id)中任一者表示之有義股分別與由式(IIa)、(IIb)、(IIc)及(IId)中任一者表示之反義股形成雙鏈體。
據此，用於本發明之方法中的dsRNAi劑可包含有義股及反義股，各股具有14至30個核苷酸，iRNA雙鏈體由式(III)表示：
有義：5’ np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3’
反義：3’ np ’-Na ’-(X’X’X’)k-Nb ’-Y’Y’Y’-Nb ’-(Z’Z’Z’)l-Na ’-nq ’ 5’(III)
其中：
i、j、k及l各自獨立地為0或1；
p、p’、q及q’各自獨立地為0至6；
各Na及Na’獨立地表示包含0至25個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列，個序列包含至少兩個經不同修飾之核苷酸；
各Nb與Nb’獨立地表示包含0至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列；
其中np’、np、nq’及nq各自可存在或不存在，且各自獨立地表示突出核苷酸；以及
XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’及Z’Z’Z’各自獨立地表示一個位於三個接續核苷酸之三個相同修飾的模體。
於一個態樣中，i為0且j為0；或i為1且j為0；或i為0且j為1；或i及j兩者皆為0；或i及j兩者皆為1。於另一態樣中，k為0且l為0；或k為1且l為0；或k為0且l為1；或k及l兩者皆為0；或k及l兩者皆為1。
形成iRNA雙鏈體之有義股與反義股的示例性組合包括下述各式：
5’ np-Na-Y Y Y-Na-nq 3’
3’ np ’-Na ’-Y’Y’Y’-Na ’nq ’ 5’(IIIa)
5’ np-Na-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3’
3’ np ’-Na ’-Y’Y’Y’-Nb ’-Z’Z’Z’-Na ’nq ’ 5’(IIIb)
5’ np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Na-nq 3’
3’ np ’-Na ’-X’X’X’-Nb ’-Y’Y’Y’-Na ’-nq ’ 5’(IIIc)
5’ np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3’
3’ np ’-Na ’-X’X’X’-Nb ’-Y’Y’Y’-Nb ’-Z’Z’Z’-Na-nq ’ 5’(IIId)
當dsRNAi劑藉由式(IIIa)表示時，各Na獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當dsRNAi劑藉由式(IIIb)表示時，各Nb獨立地表示包含1至10、1至7、1至5或1至4個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各Na 獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當dsRNAi劑表示為式(IIIc)時，各Nb、Nb’獨立地表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各Na獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當dsRNAi劑表示為式(IIId)時，各Nb、Nb’獨立地表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各Na及Na’獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。Na、Na’、Nb及Nb’各自獨立地包含交替模式之修飾。
式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)中之X、Y及Z各自可為彼此相同或相異。
當dsRNAi劑由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示時，Y核苷酸之至少一者可與Y’核苷酸之至少一者形成鹼基對。或者，Y核苷酸之至少兩者與相應之Y’核苷酸形成鹼基對；或Y核苷酸之全部三者與相應之Y’核苷酸形成鹼基對。
當dsRNAi劑由式(IIIb)或(IIId)表示時，Z核苷酸之至少一者可與Z’核苷酸之至少一者形成鹼基對。或者，Z核苷酸之至少兩者與相應之Z’核苷酸形成鹼基對；或Z核苷酸之全部三者與相應之Z’核苷酸形成鹼基對。
當dsRNAi劑由式(IIIc)或(IIId)表示時，X核苷酸之至少一者可與X’核苷酸之至少一者形成鹼基對。或者，X核苷酸之至少兩者與相應之X’核苷酸形成鹼基對；或X核苷酸之全部三者與相應之X’核苷酸形成鹼基對。
於某些態樣中，Y核苷酸之修飾不同於Y’核苷酸之修飾，Z核苷酸之修飾不同於Z’核苷酸之修飾，或X核苷酸之修飾不同於X’核苷酸之修飾。
於某些態樣中，當dsRNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾係2'-O-甲基修飾或2'-氟修飾。於其他態樣中，當RNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾係2’-O-甲基修飾或2’-氟修飾，且np’>0，以及，至少一個np’經由硫代磷酸酯鏈結而鏈結至相鄰核苷酸。於再其他態樣中，當RNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾係2’-O-甲基修飾或2’-氟修飾，np’>0，且至少一個np’經由硫代磷酸酯鏈結而鏈結至相鄰核苷酸，以及，有義股透過二價或三價分支鏈之鏈結子(下文揭示)接合至一個多個GalNAc衍生物。於其他態樣中，當RNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾係2’-O-甲基修飾或2’-氟修飾，np’>0，且至少一個np’經由硫代磷酸酯鏈結而鏈結至相鄰核苷酸，有義股包含至少一個硫代磷酸酯鏈結，以及，有義股透過二價或三價分支鏈之鏈結子接合至一個多個GalNAc衍生物。
於一些態樣中，當RNAi劑由式(IIIa)表示時，Na修飾係2’-O-甲基修飾或2’-氟修飾，np’>0，且至少一個np’經由硫代磷酸酯鏈結而鏈結至相鄰核苷酸，有義股包含至少一個硫代磷酸酯鏈結，以及，有義股透過二價或三價分支鏈之鏈結子接合至一個多個GalNAc衍生物。
於一些態樣中，dsRNAi劑為含有至少兩個由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示之雙鏈體的多聚物，其中該等雙鏈體藉由鏈結子連結。鏈結子可以為可裂解者或不可裂解者。視需要，多聚物復包含配體。雙鏈體可各自靶向相同基因或兩個相異基因；或雙鏈體可各自靶向相同基因之兩個相異標靶位點。
於一些態樣中，dsRNAi劑為含有3、4、5、6或更多個由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示之雙鏈體的多聚物，其中雙鏈體藉由鏈結子連結。鏈結子可以為可裂解者或不可裂解者。視需要，多聚物復包含配體。雙鏈體可各自靶向相同基因或兩個相異基因；或雙鏈體可各自靶向相同基因之兩個相異標靶位點。
於一個態樣中，兩個由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)之至少一者表示的dsRNAi劑在5’末端及一個或兩個3’末端彼此鏈結，且視需要接合至配體。該等劑可各自靶向相同基因或兩個相異基因；或該等劑可各自靶向相同基因之兩個相異標靶位點。
於某些態樣中，本發明之RNAi劑可含有低數量之含有2’-氟修飾的核苷酸，如10個或更少具有2’-氟修飾的核苷酸。例如，RNAi劑可含有10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0個具有2’-氟修飾的核苷酸。於具體態樣中，本發明之RNAi劑含有10個具有2’-氟修飾之核苷酸，例如，在有義股含有4個具有2’-氟修飾之核苷酸且在反義股含有6個具有2’-氟修飾之核苷酸。於另一具體態樣中，本發明之RNAi劑含有6個具有2’-氟修飾之核苷酸，例如，在有義股含有4個具有2’-氟修飾之核苷酸且在反義股含有2個具有2’-氟修飾之核苷酸。
於其他態樣中，本發明之RNAi劑可含有超低數量之含有2’-氟修飾的核苷酸，例如2個或更少含有2’-氟修飾的核苷酸。例如，RNAi劑可含有2、1或0個具有2’-氟修飾的核苷酸。於具體態樣中，RNAi劑可含有2個具有2’-氟修飾之核苷酸，例如，在有義股含有0個具有2’-氟修飾之核苷酸且在反義股含有2個具有2’-氟修飾之核苷酸。
多個出版物揭示可用於本發明之方法中的多聚iRNA。此類出版物包括WO2007/091269、美國專利第7,858,769號、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887及WO2011/031520，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。
於某些態樣中，本揭露之組成物及方法包括本文所揭示之RNAi劑的膦酸乙烯酯(VP)修飾。於示例性態樣中，本揭露之膦酸乙烯酯具有下述結構：
Figure 111120479-A0202-12-0078-143
本揭露之膦酸乙烯酯可接附至本揭露之dsRNA之反義股或有義股。於某些較佳態樣中，本揭露之膦酸乙烯酯接附至dsRNA之反義股，視需要接附在dsRNA之反義股的5’末端。
膦酸乙烯酯修飾亦預期用於本揭露之組成物及方法中。示例性膦酸乙烯酯結構係：
Figure 111120479-A0202-12-0079-144
如下文中更詳細揭示，含有一個或多個碳水化合物部分與iRNA之接合的iRNA可優化該iRNA之一種或多種特性。於多種情形中，碳水化合物部分將接附至iRNA之經修飾之子單元。例如，iRNA之一個或多個核糖核苷酸子單元的核糖可替換為另一部分，例如其上接附有碳水化合物配體之非碳水化合物(較佳係環狀)載體。本文中，其子單元之核糖業經如是替換的核糖核苷酸子單元指稱為核糖替換修飾子單元(RRMS)。環狀載體可為碳環系統，亦即，所有環原子皆係碳原子；或係雜環系統，亦即，一個或多個環原子可為雜環如氮、氧、硫。環狀載體可為單環系統，或可含有兩個或多個環如稠環。環狀載體可為完全飽和之環系統，或其可含有一個或多個雙鍵。
配體可經由載體接附至多核苷酸。載體包括(i)至少一個「主幹接附點(backbone attachment point)」，較佳兩個「主幹接附點」，以及(ii)至少一個「繫帶接附點(tethering attachment point)」。如本文中所用，「主幹接附點」指稱官能基如羥基，或通常為鍵，其可用於且適用於將載體併入核糖核酸之主幹如磷酸酯或經修飾之磷酸酯如含硫之主幹中。於一些態樣中，「繫帶接附點」(TAP)指稱環狀載體之構建環原子，例如，碳原子或雜原子(與提供主幹接附點之原子不同)，其連結所選擇之部分。該部分可為例如碳水化合物，例如單糖、二醣、三醣、四醣、寡醣或多醣。視需 要，所選擇之部分藉由媒介繫帶連結至所選擇之載體。因此，環狀載體一般將包括官能基例如胺基，或通常提供適用於將另一化學實體例如配體併入或繫帶至構建環的鍵。
iRNA可經由載體接合至配體，其中該載體可為環狀基團或非環狀基團；較佳地，該環狀基團係選自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌
Figure 111120479-A0202-12-0080-17
基、[1,3]二氧雜環戊烷([1,3]dioxolane)、
Figure 111120479-A0202-12-0080-18
唑烷基、異
Figure 111120479-A0202-12-0080-19
唑烷基、嗎啉基、噻唑啉基、異噻唑啉基、喹
Figure 111120479-A0202-12-0080-20
啉基、嗒
Figure 111120479-A0202-12-0080-21
酮基、四氫呋喃基及十氫萘基；較佳地，該非環狀基團係選自絲胺醇主幹或二乙醇胺主幹。
i.熱去安定化修飾
於某些態樣中，藉由將熱去安定化修飾併入反義股之種子區域(亦即，反義股之5’-末端的位置2至9或反義股之5’-末端的位置2至8)以減低或抑制脫靶基因緘默化，從而優化dsRNA分子以用於RNA干擾。已經發現，具有包含位於從反義股5’-末端計數最先9個核苷酸內之雙鏈體之至少一個熱去安定化修飾之反義股的dsRNA，具有減低之脫靶基因緘默化活性。據此，於一些態樣中，反義股包含位於從反義股5’-末端計數最先9個核苷酸內之雙鏈體的至少一個(例如，一個、兩個、三個、四個、五個或更多個)熱去安定化修飾。於一些態樣中，雙鏈體之一個或多個熱去安定化修飾係位於從反義股5’-末端計數之位置2至9，2至8，或較佳地位置4至8。於又一些態樣中，雙鏈體之熱去安定化修飾係位於從反義股5’-末端計數之位置6、7或8。於再一些態樣中，雙鏈體之熱去安定化修飾係位於從反義股5’-末端計數之位置7。術語「熱去安定化修飾」包括將導致 dsRNA具有較低總體熔融溫度(Tm)(較佳地，Tm比不具有此類修飾之dsRNA之Tm低一度、兩度、三度或四度)的修飾。於一些態樣中，雙鏈體之熱去安定化修飾係位於從反義股5’-末端計數之位置2、3、4、5或9。
iRNA劑包含有義股及反義股，各股具有14至40個核苷酸。RNAi劑可由式(L)表示：
Figure 111120479-A0202-12-0081-145
於式(L)中，B1、B2、B3、B1’、B2’、B3’及B4’各自獨立為含有選自下列所組成群組之修飾的核苷酸：2’-O-烷基、2’-取代之烷氧基、2’-取代之烷基、2’-鹵、ENA、及BNA/LNA。於一個態樣中，B1、B2、B3、B1’、B2’、B3’及B4’各自含有2’-OMe修飾。於一個態樣中，B1、B2、B3、B1’、B2’、B3’及B4’各自含有2’-OMe修飾或2’-F修飾。於一個態樣中，B1、B2、B3、B1’、B2’、B3’及B4’之至少一者含有2’-O-N-甲基乙醯胺基(2’-O-NMA)修飾。
C1為置於與反義股之種子區域(亦即，反義股之5’-末端的位置2至8或反義股之5’末端的位置2至9)相反位點之熱去安定化核苷酸。例如，C1位於有義股之與反義股之5’-末端的位置2至8之核苷酸配對的位置。於一個示例中，C1位於有義股之5’-末端計數的位置15。C1核苷酸承載可包括無鹼基修飾在內之熱學去安定化修飾；與雙鏈體中相反核苷酸之錯配；以及糖修飾如2’-去氧修飾或非環狀核苷酸如未鎖定之核酸(UNA) 或甘油核酸(GNA)。於一個態樣中，C1具有選自下列所組成之群組的熱去安定化修飾：i)與反義股中相反核苷酸之錯配；ii)選自下列所組成之群組的無鹼基修飾：
Figure 111120479-A0202-12-0082-146
；以及iii)選自下列所組成之群組的糖修飾：
Figure 111120479-A0202-12-0082-148
Figure 111120479-A0202-12-0082-147
，其中B係經修飾或未經修飾之核酸鹼基，R1與R2獨立為H、鹵素、OR3、或烷基；以及R3係H、烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖。於一個態樣中，C1中之熱去安定化修飾係選自G：G、G：A、G：U、G：T、A：A、A：C、C：C、C：U、C：T、U：U、T：T、及U：T所組成之群組的錯配；且視需要，該錯配對中之至少一個核酸鹼基係2’-去氧核酸鹼基。於一個示例中，C1中之熱去安定化修飾係GNA或
Figure 111120479-A0202-12-0082-149
T1、T1’、T2’及T3’各自獨立表示包含修飾之核苷酸，該修飾向該核苷酸提供小於或等於2’-OMe修飾之位阻效應。位阻效應指稱修飾之位阻效果的總和。確定核苷酸之修飾之位阻效果的方法係所屬技術領域中具有通常知識者所已知者。修飾可位於該核苷酸之核糖的2’位置，或係對非核糖核苷酸、非環狀核苷酸、或該核苷酸之主幹的與該核糖之2’位置相似或等效的修飾，且向該核苷酸提供小於或等於2’-OMe修飾之位阻效應。例如，T1、T1’、T2’及T3’各自獨立選自DNA、RNA、LNA、2’-F、及2’-F-5’-甲基。於一個態樣中，T1為DNA。於一個態樣中，T1’為DNA、RNA或LNA。於一個態樣中，T2’為DNA或RNA。於一個態樣中，T3’為DNA或RNA。
n1、n3及q1獨立地為4至15個核苷酸之長度。
n5、q3及q7獨立地為1至6個核苷酸之長度。
n4、q2及q6獨立地為1至3個核苷酸之長度；或者，n4為0。
q5獨立地為0至10個核苷酸之長度。
n2及q4獨立地為0至3個核苷酸之長度。
或者，n4係0至3個核苷酸之長度。
於一個態樣中，n4可為0。於一個態樣中，n4為0，且q2及q6為1。於另一示例中，n4為0，且q2及q6為1，具有位於該有義股之位置1至5(從該有義股之5’-末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5’-末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。
於一個態樣中，n4、q2及q6各自為1。
於一個態樣中，n2、n4、q2、q4及q6各自為1。
於一個態樣中，當有義股係19至22個核苷酸之長度時，C1位於有義股之5’-末端的位置14至17，且n4為1。於一個態樣中，C1位於有義股之5’-末端的位置15。
於一個態樣中，T3’始於從反義股之5’末端的位置2。於一示例中，T3’始於從反義股之5’-末端的位置2，且q6等於1。
於一個態樣中，T1’始於從反義股之5’末端的位置14。於一示例中，T1’始於從反義股之5’末端的位置14，且q2等於1。
於例示性態樣中，T3’始於從反義股之5’末端的位置2，且T1’始於從反義股之5’末端的位置14。於一個示例中，T3’始於從反義股之5’末端的位置2，且q6等於1；以及T1’始於從反義股之5’末端的位置14，且q2等於1。
於一個態樣中，T1’與T3’藉由11個核苷酸之長度而分隔開來(亦即，T1’及T3’之核苷酸不計算在內)。
於一個態樣中，T1’位於從反義股之5’末端的位置14。於一個示例中，T1’位於從反義股之5’末端的位置14且q2等於1，以及，修飾位於非核糖、非環狀或主幹之一個或多個2’位置且提供比2’-OMe核糖更低之位阻效應。
於一個態樣中，T3’位於從反義股之5’末端的位置2。於一個示例中，T3’位於從反義股之5’末端的位置2且q6等於1，以及，修飾位 於非核糖、非環狀或主幹之一個或多個2’位置且提供低於或等於2’-OMe核糖之位阻效應。
於一個態樣中，T1位於有義股之裂解位點。於一個態樣中，當有義股係19至22個核苷酸之長度時，T1位於從有義股之5’末端的位置11，且n2為1。於例示性態樣中，當有義股係19中22個核苷酸之長度時，T1位於從有義股之5’末端的位置11之裂解位點，且n2為1。
於一個態樣中，T2’始於從反義股之5’末端的位置6。於一示例中，T2’位於從反義股之5’末端的位置6至10，且q4為1。
於例示性態樣中，當有義股係19至22個核苷酸之長度時，T1位於有義股之裂解位點，例如，位於從有義股之5’末端的位置11，且n2為1；T1’位於從反義股之5’末端的位置14，且q2等於1，且T1’之修飾位於核糖之2’位或位於非核糖、非環狀或主幹之多個位置且提供低於2’-OMe核糖之位阻效應；T2’位於從反義股之5’末端的位置6至10，且q4為1；以及，T3’位於從反義股之5’末端的位置2，且q6等於1，以及，T3’之修飾位於核糖之2’位或位於非核糖、非環狀或主幹之多個位置且提供低於或等於2’-OMe核糖之位阻效應。
於一個態樣中，T2’始於從反義股之5’末端的位置8。於一示例中，T2’始於從反義股之5’末端的位置8，且q4為2。
於一個態樣中，T2’始於從反義股之5’末端的位置9。於一示例中，T2’位於從反義股之5’末端的位置9，且q4為1。
於一個態樣中，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4、T2’為2’-F，q4為1，B3’為2’- OMe或2’-F，q5為6，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。
於一個態樣中，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為1，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為6，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe、n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的 兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為6，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為7，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為6，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe、n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為7，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為6，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為1，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為6，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為5，T2’為2’-F，q4為1，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1；視需要具有位於該反義股之3’-末端的至少2個額外之TT。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為5，T2’為2’-F，q4為1，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1；視需要具有位於該反義股之3’-末端的至少2個額外之TT；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5-末端計數)，以及位於該反義股之位置 1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5-末端計數)。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5-末端計數)。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，且q7為1。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為 2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5-末端計數)。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，且q7為1。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5-末端計數)。
該RNAi劑可包含位於該有義股或反義股之5’-末端的含磷基團。該5’-末端之含磷基團可為5’-末端磷酸酯(5’-P)、5’-末端硫代磷酸酯(5’-PS)、5’-末端二硫代磷酸酯(5’-PS2)、5’-末端乙烯基磷酸酯(5’-VP)、 5’-末端甲基磷酸酯(MePhos)、或5’-去氧-5’-C-丙二醯基(
Figure 111120479-A0202-12-0091-150
)。當該5’-末端之含磷基團係5’-末端乙烯基磷酸酯(5’-VP)時，該5’-VP可為5’-E-VP異構物(亦即，反式-乙烯基磷酸酯，
Figure 111120479-A0202-12-0091-151
)、5’-Z-VP異構物(亦即，反式-乙烯基磷酸酯，
Figure 111120479-A0202-12-0091-152
)、或其混合物。
於一個態樣中，RNAi劑包含位於有義股之5’-末端的含磷基團。於一個態樣中，RNAi劑包含位於反義股之5’-末端的含磷基團。
於一個態樣中，RNAi劑包含5’-P。於一個態樣中，RNAi劑包含於反義股之5’-P。
於一個態樣中，RNAi劑包含5’-PS。於一個態樣中，RNAi劑包含於反義股之5’-PS。
於一個態樣中，RNAi劑包含5’-VP。於一個態樣中，RNAi劑包含於反義股之5’-VP。於一個態樣中，RNAi劑包含於反義股之5’-E-VP。於一個態樣中，RNAi劑包含於反義股之5’-Z-VP。
於一個態樣中，RNAi劑包含5’-PS2。於一個態樣中，RNAi劑包含於反義股之5’-PS2。
於一個態樣中，RNAi劑包含5’-PS2。於一個態樣中，RNAi劑包含於反義股之5’-去氧-5’-C-丙二醯基。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1。RNAi劑亦包含5’-PS。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1。RNAi劑亦包含5’-P。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1。RNAi劑亦包含5’-VP。5’-VP可為5’-E-VP、5’-Z-VP、或其組合。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1。RNAi劑亦包含5’-PS2。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5)內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-P。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至 23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-PS。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-VP。5’-VP可為5’-E-VP、5’-Z-VP、或其組合。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-PS2。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為 2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1。RNAi劑亦包含5’-P。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1。該dsRNA劑亦包含5’-PS。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’ 為2’-OMe，且q7為1。RNAi劑亦包含5’-VP。5’-VP可為5’-E-VP、5’-Z-VP、或其組合。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1。RNAi劑亦包含5’-PS2。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-P。
於一個實施態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3， B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-PS。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-VP。5’-VP可為5’-E-VP、5’-Z-VP、或其組合。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2 的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-PS2。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，m2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，且q7為1。RNAi劑亦包含5’-P。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，且q7為1。RNAi劑亦包含5’-PS。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，且q7為1。RNAi劑亦包含5’-VP。5’-VP可為5’-E-VP、5’-Z-VP、或其組合。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，且q7為1。該dsRNAi RNA劑亦包含5’-PS2。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，且q7為1。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反 義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-P。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-PS。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-VP。5’-VP可為5’-E-VP、5’-Z-VP、或其組合。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-PS2。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3 為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，且q7為1。RNAi劑亦包含5’-P。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，且q7為1。RNAi劑亦包含5’-PS。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，且q7為1。RNAi劑亦包含5’-VP。5’-VP可為5’-E-VP、5’-Z-VP、或其組合。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，且q7為1。RNAi劑亦包含5’-PS2。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3 為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，且q7為1。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-P。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-PS。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為 2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-VP。5’-VP可為5’-E-VP、5’-Z-VP、或其組合。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-PS2。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置 1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)。該RNAi劑亦包含5’-P及靶向配體。於一個態樣中，5’-P位於反義股之5’-末端，且靶向配體位於有義股之3’-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2，-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。 RNAi劑亦包含5’-PS及靶向配體。於一個實施態樣中，5’-PS位於反義股之5’-末端，且靶向配體位於有義股之3’-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-VP(例如，5’-E-VP、5’-Z-VP、或其組合)及靶向配體。
於一個態樣中，5’-VP位於反義股之5’-末端，且靶向配體位於有義股之3’-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。 RNAi劑亦包含5’-PS2及靶向配體。於一個態樣中，5’-PS2位於反義股之5’-末端，且靶向配體位於有義股之3’-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基及靶向配體。於一個態樣中，5’-去氧-5’-C-丙二醯基位於反義股之5’-末端，且靶向配體位於有義股之3’-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-P及靶向配體。於 一個態樣中，5’-P位於反義股之5’-末端，且靶向配體位於有義股之3’-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-PS及靶向配體。於一個態樣中，5’-PS位於反義股之5’-末端，且靶向配體位於有義股之3’-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-VP(例如，5’-E-VP、5’-Z-VP、或其組合)及靶向配體。於一個態樣中，5’-VP位於反義股之5’-末端，且靶向配體位於有義股之3’-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-PS2及靶向配體。於一個態樣中，5’-PS2位於反義股之5’-末端，且靶向配體位於有義股之3’-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-OMe，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基及靶向配體。於一個態樣中，5’-去氧-5’-C-丙二醯基位於反義股之5’-末端，且靶向配體位於有義股之3’-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為 2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5(從該有義股之5’-末端計數)的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5’末端計數)的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從該有義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-P及靶向配體。於一個實施態樣中，5’-P位於反義股之5’末端，且靶向配體位於有義股之3’末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23中的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-PS及靶向配體。於一個態樣中，5’-PS位於反義股之5’-末端，且靶向配體位於有義股之3’-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3 為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-VP(例如，5’-E-VP、5’-Z-VP、或其組合)及靶向配體。於一個態樣中，5’-VP位於反義股之5’-末端，且靶向配體位於有義股之3’-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-PS2及靶向配體。於一個態樣中，5’-PS2位於反義股之5’-末端，且靶向配體位於有義股之3’-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，T2’為2’-F，q4為2，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為5，T3’為2’-F， q6為1，B4’為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基及靶向配體。於一個態樣中，5’-去氧-5’-C-丙二醯基位於反義股之5’-末端，且靶向配體位於有義股之3’-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-P及靶向配體。於一個態樣中，5’-P位於反義股之5’-末端，且靶向配體位於有義股之3’-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置 1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-PS及靶向配體。於一個態樣中，5’-PS位於反義股之5’-末端，且靶向配體位於有義股之3’-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-VP(例如，5’-E-VP、5’-Z-VP、或其組合)及靶向配體。於一個態樣中，5’-VP位於反義股之5’-末端，且靶向配體位於有義股之3’-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’- PS2及靶向配體。於一個態樣中，5’-PS2位於反義股之5’-末端，且靶向配體位於有義股之3’-末端。
於一個態樣中，B1為2’-OMe或2’-F，n1為8，T1為2’-F，n2為3，B2為2’-OMe，n3為7，n4為0，B3為2’-OMe，n5為3，B1’為2’-OMe或2’-F，q1為9，T1’為2’-F，q2為1，B2’為2’-OMe或2’-F，q3為4，q4為0，B3’為2’-OMe或2’-F，q5為7，T3’為2’-F，q6為1，B4’為2’-F，且q7為1；具有位於該有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該有義股之5’-末端計數)，以及位於該反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從該反義股之5’-末端計數)。RNAi劑亦包含5’-去氧-5’-C-丙二醯基及靶向配體。於一個態樣中，5’-去氧-5’-C-丙二醯基位於反義股之5’-末端，且靶向配體位於有義股之3’-末端。
於特定之態樣中，本發明之RNAi劑包含：
(a)有義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)接附至3’-末端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含透過三價分支鏈之鏈結子接附之三個GalNAc衍生物；以及
(iii)位於位置1、3、5、7、9至11、13、17、19及21之2’-F修飾，以及位於位置2、4、6、8、12、14至16、18及20之2’-OMe修飾(從5’末端計數)；
以及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)位於位置1、3、5、9、11至13、15、17、19、21及23之2’-OMe修飾，以及位於位置2、4、6至8、10、14、16、18、20及22之2’-F修飾(從5’末端計數)；以及
(iii)位於位置21與22之間以及位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端計數)；
其中該dsRNA劑具有位於該反義股之3’-末端的具有兩個核苷酸的突出，以及位於該反義股之5’-末端的鈍端。
於另一特定之態樣中，本發明之RNAi劑包含：
(a)有義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)接附至3’-末端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含透過三價分支鏈之鏈結子接附之三個GalNAc衍生物；
(iii)位於位置1、3、5、7、9至11、13、15、17、19及21之2’-F修飾，以及位於位置2、4、6、8、12、14、16、18及20之2’-OMe修飾(從5’末端計數)；以及
(iv)位於位置1與2之間以及位置2與3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端計數)；
以及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)位於位置1、3、5、7、9、11至13、15、17、19及21至23之2’-OMe修飾，以及位於位置2、4、6、8、10、14、16、18及20之2’-F修飾(從5’末端計數)；以及
(iii)位於核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、以及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端計數)；
其中該RNAi劑具有位於該反義股之3’-末端的具有兩個核苷酸的突出，以及位於該反義股之5’-末端的鈍端。
於另一特定之態樣中，本發明之RNAi劑包含：
(a)有義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)接附至3’-末端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含透過三價分支鏈之鏈結子接附之三個GalNAc衍生物；
(iii)位於位置1至6、8、10及12至21之2’-OMe修飾，位於位置7及9之2’-F修飾，以及位於位置11之去氧核苷酸(例如，dT)(從5’末端計數)；以及
(iv)位於位置1與2之間以及位置2與3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端計數)；
以及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)位於位置1、3、7、9、11、13、15、17及19至23之2’-OMe修飾，以及位於位置2、4至6、8、10、12、14、16及18之2’-F修飾(從5’末端計數)；以及
(iii)位於核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、以及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端計數)；
其中該RNAi劑具有位於該反義股之3’-末端的具有兩個核苷酸的突出，以及位於該反義股之5’-末端的鈍端。
於另一特定之態樣中，本發明之RNAi劑包含：
(a)有義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)接附至3’-末端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含透過三價分支鏈之鏈結子接附之三個GalNAc衍生物；
(iii)位於位置1至6、8、10、12、14及16至21之2’-OMe修飾，以及位於位置7、9、11、13及15之2’-F修飾；以及
(iv)位於位置1與2之間以及位置2與3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端計數)；
以及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)位於位置1、5、7、9、11、13、15、17、19及21至23之2’-OMe修飾，以及位於位置2至4、6、8、10、12、14、16、18及20之2’-F修飾(從5’末端計數)；以及
(iii)位於核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、以及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端計數)；
其中該RNAi劑具有位於該反義股之3’-末端的具有兩個核苷酸的突出，以及位於該反義股之5’-末端的鈍端。
於另一特定之態樣中，本發明之RNAi劑包含：
(a)有義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)接附至3’-末端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含透過三價分支鏈之鏈結子接附之三個GalNAc衍生物；
(iii)位於位置1至9及12至21之2’-OMe修飾，以及位於位置10及11之2’-F修飾；以及
(iv)位於位置1與2之間以及位置2與3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端計數)；
以及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)位於位置1、3、5、7、9、11至13、15、17、19及21至23之2’-OMe修飾，以及位於位置2、4、6、8、10、14、16、18及20之2’-F修飾(從5’末端計數)；以及
(iii)位於核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、以及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端計數)；
其中該RNAi劑具有位於該反義股之3’-末端的具有兩個核苷酸的突出，以及位於該反義股之5’-末端的鈍端。
於另一特定之態樣中，本發明之RNAi劑包含：
(a)有義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)接附至3’-末端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含透過三價分支鏈之鏈結子接附之三個GalNAc衍生物；
(iii)位於位置1、3、5、7、9至11及13之2’-F修飾，以及位於位置2、4、6、8、12及14至21之2’-OMe修飾；以及
(iv)位於位置1與2之間以及位置2與3之間的硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結(從5’末端計數)；
以及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)位於位置1、3、5至7、9、11至13、15、17至19及21至23之2’-OMe修飾，以及位於位置2、4、8、10、14、16及20之2’-F修飾(從5’末端計數)；以及
(iii)位於核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、以及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端計數)；
其中該RNAi劑具有位於該反義股之3’-末端的具有兩個核苷酸的突出，以及位於該反義股之5’-末端的鈍端。
於另一特定之態樣中，本發明之RNAi劑包含：
(a)有義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)接附至3’-末端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含透過三價分支鏈之鏈結子接附之三個GalNAc衍生物；
(iii)位於位置1、2、4、6、8、12、14、15、17及19至21之2’-OMe修飾，以及位於位置3、5、7、9至11、13、16及18之2’-F修飾；以及
(iv)位於位置1與2之間以及位置2與3之間的硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結(從5’末端計數)；
以及
(b)反義股，其具有：
(i)25個核苷酸之長度；
(ii)位於位置1、4、6、7、9、11至13、15、17及19至23之2’-OMe修飾，以及位於位置2、3、5、8、10、14、16及18之2’-F修飾，以及位於位置24及25之去氧核苷酸(例如，dT)(從5’末端計數)；以及
(iii)位於核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、以及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端計數)；
其中該RNAi劑具有位於該反義股之3’-末端的具有四個核苷酸的突出，以及位於該反義股之5’-末端的鈍端。
於另一特定之態樣中，本發明之RNAi劑包含：
(a)有義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)接附至3’-末端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含透過三價分支鏈之鏈結子接附之三個GalNAc衍生物；
(iii)位於位置1至6、8及12至21之2’-OMe修飾，以及位於位置7及9至11之2’-F修飾；以及
(iv)位於位置1與2之間以及位置2與3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端計數)；
以及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)位於位置1、3至5、7、8、10至13、15及17至23之2’-OMe修飾，以及位於位置2、6、9、14及16之2’-F修飾(從5’末端計數)；以及
(iii)位於核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、以及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端計數)；
其中該RNAi劑具有位於該反義股之3’-末端的具有兩個核苷酸的突出，以及位於該反義股之5’-末端的鈍端。
於另一特定之態樣中，本發明之RNAi劑包含：
(a)有義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)接附至3’-末端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含透過三價分支鏈之鏈結子接附之三個GalNAc衍生物；
(iii)位於位置1至6、8及12至21之2’-OMe修飾，以及位於位置7及9至11之2’-F修飾；以及
(iv)位於位置1與2之間以及位置2與3之間的硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結(從5’末端計數)；
以及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)位於位置1、3至5、7、10至13、15及17至23之2’-OMe修飾，以及位於位置2、6、8、9、14及16之2’-F修飾(從5’末端計數)；以及
(iii)位於核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、以及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端計數)；
其中該RNAi劑具有位於該反義股之3’-末端的具有兩個核苷酸的突出，以及位於該反義股之5’-末端的鈍端。
於另一特定之態樣中，本發明之RNAi劑係包含：
(a)有義股，其具有：
(i)19個核苷酸之長度；
(ii)接附至3’-末端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含透過三價分支鏈之鏈結子接附之三個GalNAc衍生物；
(iii)位於位置1至4、6及10至19之2’-OMe修飾，以及位於位置5及7至9之2’-F修飾；以及
(iv)位於位置1與2之間以及位置2與3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端計數)；
以及
(b)反義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)位於位置1、3至5、7、10至13、15及17至21之2，-OMe修飾，以及位於位置2、6、8、9、14及16之2’-F修飾(從5’末端計數)；以及
(iii)位於核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置19與20之間、以及核苷酸位置20與21之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結(從5’末端計數)；
其中該RNAi劑具有位於該反義股之3’-末端的具有兩個核苷酸的突出，以及位於該反義股之5’-末端的鈍端。
於某些態樣中，用於本發明之方法中的iRNA係選自表2、表3、表6或表7中任一者中所列之劑。此等劑可復包含配體。
III.接合至配體之iRNA
本發明之iRNA之RNA的另一修飾牽涉將一個或多個增強該iRNA之活性、細胞分佈或細胞攝取(例如，攝取到細胞內)之配體、部分或接合物化學鏈結至該iRNA。此等部分包括但不限於脂質部分諸如膽固醇部分(Letsinger et al.,Proc.Natl.Acid.Sci.USA,1989,86：6553-6556)。於其他態樣中，配體為膽酸(Manoharan et al.,Biorg.Med.Chem.Let.,1994,4：1053-1060)、硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660：306-309；Manoharan et al.,Biorg.Med.Chem.Let.,1993,3：2765-2770)、硫代膽固醇(Oberhauser et al.,Nucl.Acids Res.,1992,20：533-538、脂肪鏈例如十二烷二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras et al.,EMBO J,1991,10：1111-1118；Kabanov et al.,FEBS Lett.,1990,259：327-330；Svinarchuk et al.,Biochimie,1993,75：49-54)、磷脂質例如二-十六烷基-rac-甘油或1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-磷酸三乙銨(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36：3651-3654；Shea et al.,Nucl.Acids Res.,1990,18：3777-3783)、聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharan et al.,Nucleosides & Nucleotides,1995,14：969-973)、或金剛烷乙酸(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36：3651-3654)、棕櫚醯基部分(Mishra et al.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264：229- 237)、或十八烷基胺或己基胺-羰氧基膽固醇部分(Crooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277：923-937)。
於某些態樣中，配體改變其所併入之iRNA劑的分佈、靶向或壽命。於較佳之態樣中，配體提供比缺失此配體者增強的對於所選標靶例如分子、細胞或細胞類型、腔室例如細胞或器官之腔室、組織、器官或身體區域之親和性。較佳之配體不參與雙鏈體核酸中之雙鏈體配對。
配體可包括天然出現之物質，例如蛋白質(例如，人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、或球蛋白)；碳水化合物(例如，聚葡萄糖、聚散葡萄糖、幾丁質、幾丁聚醣、菊糖、環糊精、N-乙醯基葡萄胺糖、N-乙醯基半乳胺糖或玻尿酸)；或脂質。配體亦可為重組分子或合成分子，諸如合成聚合物，例如合成聚胺基酸。聚胺基酸之示例包括聚離胺酸(PLL)、聚L-天冬胺酸、聚L-麩胺酸、苯乙烯-馬來酸酐共聚物、聚(L-乳酸交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-馬來酸酐共聚物、N-(2-羥基丙基)甲基丙烯醯胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚胺酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯醯胺聚合物、或聚磷嗪(polyphosphazine)。聚胺之示例包括：聚伸乙二胺、聚離胺酸(PLL)、精胺、精三胺、聚胺、假肽-聚胺、肽模擬性聚胺、樹枝狀聚胺、精胺酸、脒、魚精蛋白、陽離子脂質、陽離子卟啉、聚胺之四級鹽、或α螺旋肽。
配體亦可包括靶向基團，例如細胞或組織靶向劑，例如凝集素、醣蛋白、脂質或蛋白質，例如抗體，其與特定之細胞類型諸如腎細胞結合。靶向基團可為促甲狀腺素、促黑素、凝集素、醣蛋白、界面活性劑蛋白A、黏蛋白碳水化合物、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基-半乳胺糖、 N-乙醯基葡萄胺糖、多價甘露糖、多價果糖、糖基化聚胺基酸、多價半乳糖、運鐵蛋白、雙膦酸酯、聚麩胺酸鹽、聚天冬胺酸鹽、脂質、膽固醇、類固醇、膽汁酸、葉酸、維生素B12、維生素A、生物素、或RGD肽或RGD肽模擬物。於某些態樣中，配體係多價半乳糖，例如，N-乙醯基-半乳胺糖。
配體之其他示例包括染料；嵌入劑(例如，吖啶類)；交聯劑(例如，補骨脂素、絲裂黴素C)；卟啉類(TPPC4、texaphyrin、Sapphyrin)；多環芳烴(例如，啡
Figure 111120479-A0202-12-0125-22
、二氫啡
Figure 111120479-A0202-12-0125-23
)；人工核酸內切酶(例如，EDTA)；親脂性分子(例如，膽固醇、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睪固酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉基氧己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十六烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽烯酸、二甲氧基三苯甲基、或啡
Figure 111120479-A0202-12-0125-24
)；以及肽接合物(例如，觸角足突變肽、Tat肽)、烷基化劑、磷酸鹽、胺基、巰基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚胺基、烷基、經取代之烷基、放射標記至標記物、酵素、半抗原(如，生物素)、轉運/吸收促進劑(例如，阿司匹林、維生素E、葉酸)、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、雙咪唑、組胺、咪唑簇、吖啶-咪唑接合物、四氮雜大環之Eu3+錯合物)、二硝基苯基、HRP、或AP。
配體可為蛋白質例如醣蛋白、或肽例如具有對於共配體之特異親和性的分子、或抗體例如結合至特定細胞類型諸如肝細胞之抗體。配體亦可包括激素及激素受體。它們亦可包括非肽類物質，例如脂質、凝集素、碳水化合物、維生素、輔助因子、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基半乳胺糖、N-乙醯基葡萄胺糖、多價甘露糖、或多價果糖。配體可為，舉例而言，脂質多醣、p38 MAP激酶之活化劑、或NF-κB之活化劑。
配體可為例如藥物之物質，其可藉由例如擾亂細胞之細胞主幹例如藉由擾亂細胞之微管、微絲或中間體絲而增加細胞對iRNA劑之攝取。該藥物可為，舉例而言，紫杉醇(taxol)、長春新鹼、長春鹼、細胞鬆弛素、諾考達唑、促進微絲聚合劑(japlakinolide)、紅海海綿蛋白A(latrunculin A)、鬼筆環肽(phalloidin)、紅海海綿抗菌素(swinholide A)、吲達諾欣(indanocine)、或邁爾素(myoservin)。
於一些態樣中，接附至本文中所述之iRNA的配體用作藥物動力學調節子(PK調節子)。PK調節子包括親脂質物、膽汁酸、類固醇、磷脂質類似物、肽、蛋白結合劑、PEG、維生素等。示例性PK調節子包括但不限於，膽固醇、脂肪酸、膽酸、石膽酸、二烷基甘油酯、二醯基甘油酯、磷脂質、神經鞘脂質、萘普生(naproxen)、布洛芬(ibuprofen)、維生素E、生物素。包含大量硫代硫酸酯類鏈結之寡核苷酸亦已知結合至血清蛋白，因此在主幹中包含多個硫代磷酸酯類鏈結之短寡核苷酸例如約5個鹼基、10個鹼基、15個鹼基或20個鹼基之寡核苷酸亦可作為配體(例如，作為PK調節配體)而遵循本發明。此外，於本文所揭示之態樣中，結合血清組分(例如，血清蛋白)之適配體亦適用於作為PK調節性配體而使用。
本發明之接合有配體之iRNA可藉由使用承載側鏈反應性官能度之寡核苷酸如衍生自將鏈結分子接附在寡核苷酸(揭示於下)上者而合成。這一反應性寡核苷酸可直接與可商購之配體、合成為承載多種保護基團之任一者的配體、或具有接附於其上之鏈結部分的配體反應。
於本發明之接合物中使用之寡核苷酸可透過習知之固相合成技術便利且一般性地合成。用於此合成之設備可由多個供應商販售，包 括，舉例而言，Applied Biosystems®(Foster City,Calif.)。可額外地或作為另一種選擇地採用該領域中已知之用於此合成之任何其他方法。使用類似技術來製備其他寡核苷酸如硫代磷酸酯及烷基化衍生物亦係已知者。
於本發明之接合有配體之iRNA及承載序列特異性鏈結之核苷的配體分子中，該寡核苷酸及寡核苷可在合適DNA合成器上使用標準核苷酸或核苷前驅物、或已經承載鏈結部分之核苷酸或核苷接合前驅物、已經承載配體分子之配體-核苷酸或核苷接合前驅物、或承載配體之非核苷酸構建模塊而組裝。
當使用已經承載鏈結部分之核苷酸接合前驅物時，典型係完成序列特異性鏈結之核苷的合成，隨後將該配體分子與該鏈結部分反應以形成接合有配體之寡核苷酸。於一些態樣中，本發明之寡核苷酸或經鏈結之核苷係藉由自動合成器使用衍生自配體-核苷接合物之除標準亞磷醯胺之外的亞磷醯胺及可商購且一般用於寡核苷酸合成中之非標準亞磷醯胺來合成。
A.脂質接合物
於某些態樣中，配體或接合物係脂質或基於脂質之分子。此類脂質或基於脂質之分子較佳與血清蛋白例如人血清白蛋白(HSA)結合。HSA結合配體允許該結合物分佈於標靶組織，例如非腎臟之身體標靶組織。舉例而言，標靶組織可為肝臟，包括肝臟之實質細胞。可與HSA結合之其他分子亦可用作配體。舉例而言，可使用萘普生或阿司匹林。脂質或基於脂質之配體可(a)增加對於接合物降解之抗性，(b)增加對標靶細胞或細胞膜之靶向或遞送，或(c)可用以調節與血清蛋白例如HSA之結合。
基於脂質之配體可用以抑制如控制該接合物結合至標靶組織。舉例而言，與HSA之結合強度較高脂質或基於脂質之配體將更不可能靶向腎臟，並因此更不可能被從身體清除。與HSA之結合強度較低的脂質或基於脂質之配體可用來令結合物靶向腎臟。
於某些態樣中，基於脂質之配體結合HSA。較佳地，其以足夠之親和性與HSA結合，使得該結合物將較佳地分佈至非腎臟組織內。惟，較佳係該親和性之強度不足以造成該HSA-配體之結合係不可逆者。
於其他態樣中，基於脂質之配體與HSA之結合弱或根本不結合，使得該接合物將較佳分佈至腎臟內。靶向腎細胞之其他部分亦可用於替換該基於脂質之配體或與該基於脂質之配體同時使用。
於另一態樣中，該配體係被標靶細胞例如增殖細胞攝取之部分例如維生素。此等尤其可用於治療以例如惡性或非惡性細胞如癌細胞的非預期之細胞增殖為特徵的疾患。示例性維生素包括維生素A、維生素E及維生素K。其他示例性維生素包括B族維生素，如葉酸、維生素B12、核黃素、生物素、吡哆醛、或其他被標靶細胞如肝細胞攝取之維生素或營養物質。亦包括者係HSA及低密度脂蛋白(LDL)。
B.細胞滲透劑
於另一態樣中，配體為細胞滲透劑，較佳為螺旋細胞滲透劑。較佳地，該劑係兩親性。示例性劑為肽，例如tat或觸角足突變肽。如果該劑為肽，其可經修飾，包括肽基模擬物、嵌入體、非肽或假肽類鏈結、以及D-胺基酸之使用。該螺旋劑較佳為α-螺旋劑，其較佳具有親脂相及疏脂相。
該配體可為肽或肽模擬物。肽模擬物(本文中亦指稱為寡肽模擬物)為能折疊為所定義之類似於天然肽之三維結構的分子。肽及肽模擬物至iRNA劑之接附可影響iRNA之藥物動力學分佈，例如藉由提升細胞識別及吸收而影響。肽或肽模擬物部分可為5至50個胺基酸之長度，例如，約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸之長度。
肽或肽模擬物可為，舉例而言，細胞滲透肽、陽離子肽、兩親性肽、或疏水性肽(例如，主要由Tyr、Trp或Phe構成)。肽部分可為樹枝狀肽、受約束之肽或交聯之肽。於另一選擇中，肽部分可包括疏水性膜易位序列(MTS)。示例性之含有MTS的疏水性肽係具有下述胺基酸序列的RFGF：AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO：14)。含有疏水性MTS之RFGF類似物(例如，胺基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO：15)亦可為靶向部分。肽部分可為「遞送性」肽，其可攜帶包括肽、寡核苷酸、及蛋白質在內之極性大分子跨越細胞膜。舉例而言，業經發現，來自HIV Tat蛋白質之序列(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO：16)及來自果蠅觸角足突變肽蛋白之序列(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO：17)能起到遞送肽之功能。肽或肽模擬物可由DNA之隨機序列編碼，例如從噬菌體呈現庫或一珠一物(OBOC)組合庫鑑定之肽(Lam et al.,Nature,354：82-84,1991)。經由合併之單體單元繫帶至dsRNA劑之用於細胞靶向目的之肽或肽模擬物的示例係精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸(RGD)肽或RGD模擬物。肽部分之長度範圍可為約5個胺基酸至約40個胺基酸。該等肽部分可具有結構性修飾，例如以增加穩定性或引導構形特性。可使用下文所述之任意結構性修飾。
用於本發明之組成物及方法的RGD肽可為線性或環狀，且可經修飾例如經糖基化或甲基化以促進對特定組織之靶向。含有RGD之肽及肽模擬物可包括D-胺基酸，以及合成RGD模擬物。除了RGD之外，亦可使用其他以整合素配體為標靶之部分。這一配體之較佳接合物靶向PECAM-1或VEGF。
「細胞滲透肽」能滲透細胞例如微生物細胞諸如細菌或真菌細胞，或哺乳動物細胞諸如人類細胞。微生物細胞滲透肽可為，舉例而言，α-螺旋線性肽(例如，LL-37或Ceropin P1)、含二硫鍵之肽(例如，α-防禦素、β-防禦素或制菌肽(bactenecin))、或僅含有一個或兩個支配性胺基酸之肽(例如，PR-39或吲哚西汀(indolicidin))。細胞滲透肽亦可包括線性定位訊號(NLS)。舉例而言，細胞滲透肽可為雙向兩親性肽如MPG，其衍生自HIV-1 gp41之融合肽結構域及SV40的T抗原之NLS(Simeoni et al.,Nucl.Acids Res.31：2717-2724,2003)。
C.碳水化合物接合物
於本發明之組成物及方法的一些態樣中，iRNA復包含碳水化合物。接合有碳水化合物之iRNA對於核酸之活體內遞送具有優勢，且組成物係適用於活體內治療性用途，如本文中所揭示。如本文中所用，「碳水化合物」指稱碳水化合物自身，其由一個或多個具有至少6個碳原子之單醣單元(其可為線性、分支鏈或環狀)與鍵結至每一碳原子之氧、氮或硫原子所組成；或係具有碳水化合物部分作為其一部分的化合物，該碳水化合物部分由一個或多個具有至少六個碳原子之單糖單元(其可為線性、分支鏈或環狀)與鍵結至每一碳原子之氧、氮或硫原子所組成。代表性碳水化合物 包括糖類(單糖、二醣、三醣及含有約4、5、6、7、8、或9個單糖單元之寡醣)，以及多醣如澱粉、糖原、纖維素及多醣膠。具體之單糖包括C5糖類及以上(例如，C5、C6、C7或C8)糖類；二醣及三醣，其包括具有兩個或三個單糖單元(例如，C5、C6、C7或C8)之糖類。
於某些態樣中，用於本發明之組成物及方法中之碳水化合物接合物係單糖。
於某些態樣中，單糖係N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)。GalNAc接合物，其包含一種或多種N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)衍生物，係揭示於例如US 8,106,022中，該專利之整體內容藉由引用而併入本文。於一些態樣中，GalNAc接合物用作配體，其令iRNA靶向具體細胞。於一些態樣中，GalNAc接合物令iRNA靶向肝臟細胞，例如，藉由用作肝臟細胞(例如，肝細胞)之去唾液酸糖蛋白受體配體。
於一些態樣中，碳水化合物接合物包含一個或多個GalNAc衍生物。GalNAc衍生物可經由鏈結子例如二價或三價分支鏈結子接附。於一些態樣中，GalNAc接合物接合至有義股之3’末端。於一些態樣中，GalNAc接合物經由鏈結子例如本文所揭示之鏈結子接合至iRNA劑(例如，接合至有義股之3’末端)。於一些態樣中，GalNAc接合物係接合至有義股之5’末端。於一些態樣中，GalNAc接合物經由鏈結子例如本文所揭示之鏈結子接合至iRNA劑(例如，接合至有義股之5’末端)。
於本發明之某些態樣中，GalNAc或GalNAc衍生物經由單價鏈結子接附至本發明之iRNA劑。於一些態樣中，GalNAc或GalNAc衍生物經由二價鏈結子接附至本發明之iRNA劑。於本發明之又一些態樣中， GalNAc或GalNAc衍生物經由三價鏈結子接附至本發明之iRNA劑。於本發明之其他態樣中，GalNAc或GalNAc衍生物經由四價鏈結子接附至本發明之iRNA劑。
於某些態樣中，本發明之雙股RNAi劑包含一個接附至該iRNA劑之GalNAc或GalNAc衍生物。於某些態樣中，本發明之雙股RNAi劑含複數(例如，2、3、4、5或6)個GalNAc或GalNAc衍生物，其透過複數個單價鏈結子而各自獨立接附至該雙股RNAi劑之複數個核苷酸。
於一些態樣中，舉例而言，當本發明之iRNA劑之兩股皆係一個更大分子之一部分且係藉由位於一股之3’-末端與另一股之5’-末端之間的不間斷核苷酸鏈連結而形成包含複數個未配對核苷酸的髮夾環圈時，該髮夾環圈內之每一個未配對核苷酸可獨立包含經由單價鏈結基接附之GalNAc或GalNAc衍生物。髮夾環圈亦可藉由雙鏈體之一股中的延伸突出形成。
於一些態樣中，舉例而言，當本發明之iRNA劑之兩股皆係一個更大分子之一部分且係藉由位於一股之3’-末端與另一股之5’-末端之間的不間斷核苷酸鏈連結而形成包含複數個未配對核苷酸的髮夾環圈時，該髮夾環圈內之每一個未配對核苷酸可獨立包含經由單價鏈結基接附之GalNAc或GalNAc衍生物。髮夾環圈亦可藉由雙鏈體之一股中的延伸突出形成。
於一個態樣中，用於本發明之組成物及方法中之碳水化合物接合物選自由下列所組成之群組：
Figure 111120479-A0202-12-0133-17
Figure 111120479-A0202-12-0133-18
Figure 111120479-A0202-12-0133-19
Figure 111120479-A0202-12-0133-20
Figure 111120479-A0202-12-0133-21
Figure 111120479-A0202-12-0134-22
Figure 111120479-A0202-12-0134-23
Figure 111120479-A0202-12-0134-24
Figure 111120479-A0202-12-0134-25
Figure 111120479-A0202-12-0135-26
Figure 111120479-A0202-12-0135-27
Figure 111120479-A0202-12-0135-28
Figure 111120479-A0202-12-0135-29
Figure 111120479-A0202-12-0135-30
Figure 111120479-A0202-12-0136-31
Figure 111120479-A0202-12-0136-32
Figure 111120479-A0202-12-0136-33
Figure 111120479-A0202-12-0136-34
Figure 111120479-A0202-12-0136-35
Figure 111120479-A0202-12-0136-36
Figure 111120479-A0202-12-0137-37
Figure 111120479-A0202-12-0137-38
Figure 111120479-A0202-12-0137-139
，其中Y為O或S，且n為3至6(式XXIV)；
Figure 111120479-A0202-12-0137-40
，其中Y為O或S，且n為3至6(式XXV)；
Figure 111120479-A0202-12-0137-41
Figure 111120479-A0202-12-0138-42
，其中X為O或S(式XXVII)；
Figure 111120479-A0202-12-0138-43
Figure 111120479-A0202-12-0139-44
Figure 111120479-A0202-12-0139-45
，以及
Figure 111120479-A0202-12-0139-46
Figure 111120479-A0202-12-0140-47
於另一態樣中，用於本發明之組成物及方法中之碳水化合物接合物係單糖。於一個態樣中，單糖係N-乙醯基半乳胺糖，例如
Figure 111120479-A0202-12-0140-48
於一些態樣中，RNAi劑經由下式所示之鏈結子接附至碳水化合物接合物，其中，X為O或S
Figure 111120479-A0202-12-0140-49
於一些態樣中，RNAi劑接附至如表1中定義且如下所示之L96：
Figure 111120479-A0202-12-0141-50
用於本文所述之態樣中的另一代表性碳水化合物接合物包括但不限於，
Figure 111120479-A0202-12-0141-51
 (式XXXVI)，其中，X或Y之一者為寡核苷酸，且另一者為氫。
於一些態樣中，合適之配體為WO2017/0340661中揭露之配體，該專利之整體內容藉由引用而併入本文。於一態樣中，配體包含以下結構：
Figure 111120479-A0202-12-0142-52
於本發明之某些態樣中，GalNAc或GalNAc衍生物經由單價鏈結子接附至本發明之iRNA劑。於一些態樣中，GalNAc或GalNAc衍生物經由二價鏈結子接附至本發明之iRNA劑。於本發明之又一些態樣中，GalNAc或GalNAc衍生物經由三價鏈結子接附至本發明之iRNA劑。
於一態樣中，本發明之雙股RNAi劑包含一個或多個接附至該iRNA劑之GalNAc或GalNAc衍生物。GalNAc可經由鏈結子接附至有義股或反義股上之任意核苷酸。GalNAc可接附至有義股之5’-末端、有義股之3’末端、反義股之5’-末端、或反義股之3’-末端。於一態樣中，GalNAc經由三價鏈結子接附至有義股之3’末端。
於其他態樣中，本發明之雙股RNAi劑含複數(例如，2、3、4、5或6)個GalNAc或GalNAc衍生物，其透過複數個鏈結子例如單價鏈結子而各自獨立接附至該雙股RNAi劑之複數個核苷酸。
於一些態樣中，舉例而言，當本發明之iRNA劑之兩股皆係一個更大分子之一部分且藉由位於一股之3’-末端與另一股之5’-末端之間的不間斷核苷酸鏈連結而形成包含複數個未配對核苷酸的髮夾環圈時，該髮夾環圈內之每一個未配對核苷酸可獨立包含經由單價鏈結子接附之GalNAc或GalNAc衍生物。
於一些態樣中，碳水化合物接合物復包含如上文所述的一個或多個另外配體，例如但不限於，PK調節子或細胞滲透肽。
適用於本發明之附加碳水化合物接合物及鏈結子包括彼等於PCT公開案第WO 2014/179620號及第WO 2014/179627號中所揭示者，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。
D.鏈結子
於一些態樣中，本文中揭示之接合物或配體可使用多種鏈結子接附至iRNA寡核苷酸，該鏈接基可為可裂解者或不可裂解者。
術語「鏈結子」或「鏈結基團」意指將化合物之兩個部分連結在一起，例如，將化合物之兩個部分共價接附的有機部分。鏈結子典型包含直接鍵結或原子如氧或硫，單元如NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH或原子之鏈，例如但不限於，經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、雜芳基烷基、雜芳基烯基、雜芳基炔基、雜環基烷基、雜環基烯基、雜環基炔基、芳基、雜芳基、雜環基、環烷基、環烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基雜芳基烷基、烷基雜芳基烯基、烷基雜芳基炔基、烯基雜芳基烷基、烯基雜芳基烯基、烯基雜芳基炔基、炔基雜芳基烷基、炔基雜芳基烯基、炔基雜芳基炔基、烷基雜環基烷基、烷基雜環基烯基、烷基雜環基炔基、烯基雜環基烷基、烯基雜環基烯基、烯基雜環基炔基、炔基雜環基烷基、炔基雜環基烯基、炔基雜環基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基雜芳基、烯基雜芳 基、炔基雜芳基，其一個或多個亞甲基可由O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、或經取代或未經取代之雜環基中繼或終止；其中R8係氫、醯基、脂族或經取代之脂族。於一個態樣中，鏈結子係約1至24個原子、2至24個原子、3至24個原子、4至24個原子、5至24個原子、6至24個原子、6至18個原子、7至18個原子、8至18個原子、7至17個原子、8至17個原子、6至16個原子、7至17個原子、或8至16個原子。
可裂解之鏈結基團在細胞外足夠安定，但當進入標靶細胞時裂解以釋放被該鏈結子保持在一起之兩個部分。於較佳之態樣中，可裂解之鏈結基團在標靶細胞內或在第一參考條件(其可為例如經選擇以模擬或呈現細胞內之條件)下之裂解比在個體血液內或在第二參考條件(其可為例如經選擇以模擬或呈現見於血液或血清中之條件)下之裂解快至少約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更高、或至少100倍。
可裂解之鏈接基團係對於裂解劑例如pH、氧化還原電位或可降解分子之存在為敏感者。通常，與在血清或血液中相比，裂解劑在細胞內更為普遍或以更高量級或活性被發現。此類降解劑之示例包括：氧化還原劑，其係選擇用於特定之受質或其不具有受質特異性，包括例如細胞內存在之可降解氧化還原可藉由還原可裂解之鏈結基團的氧化酶、還原酶或還原劑如硫醇；酯酶；內切酶，或可創建酸性環境之劑如導致pH為5或更低之彼等；可藉由作為通用酸、肽酶(其可為受質特異性者)及磷酸酶作動而水解或降解酸可裂解之鏈結基團的酶。
可裂解之鏈結基團如二硫鍵可能對於pH敏感。人血清之pH為7.4，而細胞內平均pH略低，為7.1至7.3之範圍。胞內體具有酸性更強之pH，為5.5至6.0之範圍；而溶酶體甚至具有酸性更強之pH，約為5.0。一些鏈結子將具有可裂解之鏈結基團，該鏈結基團在較佳之pH裂解，從而在細胞內將陽離子脂質從該配體釋放出來或將該陽離子脂質釋放如所欲之細胞腔室內。
鏈結子可包括可藉由特定酶裂解之可裂解之鏈結基團。併入鏈結子的可裂解之鏈結基團的類型可取決於待作為標靶之細胞。舉例而言，肝臟靶向配體可透過包括酯基之鏈結子而鏈結至鏈結子。肝細胞富含酯酶，因此鏈結子在肝細胞中將比在不富含酯酶之細胞類型內更有效地被裂解。其他富含酯酶之細胞類型包括肺、腎皮質及睪丸之細胞。
當靶向細胞類型係富含肽酶者如肝細胞及滑膜細胞時，可使用含有肽鍵之鏈結子。
通常，可藉由測試降解劑(或條件)裂解備選鏈結基團之能力而評估該備選之可裂解鏈結基團的適用性。亦所欲者係亦測試該備選可裂解鏈結基團在血液中或當與其他非標靶組織接觸時之抵抗裂解的能力。因此，可測定第一條件與第二條件間之裂解相對敏感性，其中，該第一條件係選擇為標靶細胞內之裂解標誌物，且該第二條件係選擇為其他組織或生物流體如血液或血清中之裂解標誌物。該等評估可在無細胞之系統內、細胞內、細胞培養物內、器官或組織培養物內、或在整個動物體內進行。可能有用者係，在無細胞或培養條件下作成初始評估，並藉由在整體動物體內之進一步評估而證實之。於較佳之態樣中，可用之備選化合物在細胞內 (或在選擇以模擬細胞內條件之體外條件下)之裂解比在血液或血清中(或在選擇以模擬細胞外條件之體外條件下)快至少約2倍、4倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。
i.氧化還原可裂解之鏈結基團
於某些態樣中，可裂解之鏈結基團係氧化還原可裂解之鏈結基團，其當還原或氧化時被裂解。可經還原裂解之鏈結基團的實例係二硫鏈結基團(-S-S-)。為了確定備選可裂解鏈結基團是否係合適之「可還原裂解之鏈結基團」或例如是否適用於與特定iRNA部分及特定靶向劑合用，可查看本文中揭示之方法。舉例而言，可藉由以二硫蘇糖醇(DTT)或使用該領域中已知試劑之還原劑溫育來評估備選者，該溫育模擬在細胞例如標靶細胞內將會觀察到之裂解速率。該等備選物亦可在經選擇以模擬血液或血清條件之條件下評估之。於一個態樣中，備選化合物在血液中被裂解至多約10%。於其他態樣中，可用之備選化合物在細胞內(或在選擇以模擬細胞內條件之活體外條件下)之降解比在血液或血清中(或在選擇以模擬細胞外條件之活體外條件下)快至少約2倍、4倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或約100倍。備選化合物之裂解速率可使用標準酶動力學分析在經選擇以模擬細胞內介質之條件下測定，並將其與在經選擇以模擬細胞外介質之條件下所測者比較。
ii.基於磷酸酯之可裂解鏈結基團
於其他態樣中，可裂解之鏈結子包含基於磷酸酯之可裂解鏈結基團。基於磷酸酯之可裂解鏈結基團藉由降解或水解該磷酸酯基團之劑而裂解。在細胞內裂解磷酸酯基團之劑的實例係酶如細胞內之磷酸酶。磷 酸酯系鏈結基團之示例係-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-。較佳之態樣係-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-及-O-P(S)(H)-S-。較佳之態樣係-O-P(O)(OH)-O-。此等備選者可使用與上述之彼等類似之方法評估。
iii.酸可裂解之鏈結基團
於其他態樣中，可裂解之鏈結子包含酸可裂解之鏈結基團。 酸可裂解之鏈結基團係在酸性條件下被裂解之鏈結基團。於較佳之態樣中，酸可裂解之鏈結基團係在pH為約6.5或更低(例如，約6.0、5.5、5.0或更低)之酸性環境中被裂解，或被劑諸如可用作通用酸之酶裂解。於細胞內，特異性低pH胞器如胞內體及溶酶體，可提供用於酸可裂解之鏈結基團的裂解環境。酸可裂解之鏈結基團之實例包括但不限於腙類、酯類、及胺基酸之酯類。酸可裂解之鏈結基團可具有通式-C=NN-、C(O)O、或-OC(O)。較佳之態樣係，當接附至酯之氧(烷氧基)的碳係芳基時，經取代之烷基、或四級烷基如二甲基戊基或第三丁基。此等備選者可使用與上述之彼等類似之方法評估。
iv.基於酯之鏈結基團
於其他態樣中，可裂解之鏈結子包含基於酯之可裂解鏈結基團。基於酯之可裂解鏈結基團由酶諸如酯酶或醯胺酶在細胞內裂解。基於酯之可裂解鏈結基團的示例包括但不限於伸烷基、伸烯基及伸炔基之酯類。酯可裂解之鏈結基團可具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。此等備選者可使用與上述之彼等類似之方法評估。
v.基於肽之裂解基團
於其他態樣中，可裂解之鏈結子包含基於肽之可裂解鏈結基團。基於肽之可裂解鏈結基團由酶諸如肽酶及蛋白酶在細胞內裂解。基於肽之可裂解基團在胺基酸間形成以獲得寡肽(例如，二肽、三肽等)及多肽之肽鍵。基於肽之可裂解基團不包括醯胺基團(-C(O)NH-)。醯胺基團可在任意伸烷基、伸烯基或伸炔基之間形成。肽鍵在胺基酸間形成以獲得肽及蛋白質之特異類型的醯胺鍵。基於肽之裂解基團通常限定為在胺基酸間形成而獲得肽及蛋白質的肽鍵(亦即，醯胺鍵)，且不包括該完整醯胺官能基。基於肽之可裂解鏈結基團具有通式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA與RB係兩個相鄰胺基酸之R基團。此等備選者可使用與上述之彼等類似之方法評估。
於一些態樣中，本發明之iRNA透過鏈結子接合至碳水化合物。本發明之組成物及方法之具有鏈結子之iRNA碳水化合物接合體的非限制性示例包括，但不限於，
Figure 111120479-A0202-12-0149-54
Figure 111120479-A0202-12-0149-55
Figure 111120479-A0202-12-0149-56
Figure 111120479-A0202-12-0149-57
Figure 111120479-A0202-12-0149-58
 (式XLI)、
Figure 111120479-A0202-12-0150-59
Figure 111120479-A0202-12-0150-60
Figure 111120479-A0202-12-0150-61
 (式XLIV)，其中，X或Y之一者係寡核苷酸，且另一者係氫。
於本發明之組成物及方法之某些態樣中，配體係一種或多種透過二價或三價分支鏈之鏈結子接附的GalNAc(N-乙醯基半乳胺糖)衍生物。
於一個態樣中，本發明之dsRNA接合至選自式(XLV)至(XLVI)中任一者所示結構組成之群組的二價或三價分支鏈之鏈結基：
Figure 111120479-A0202-12-0151-62
其中：
q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B及q5C於每次出現時獨立地表示0至20，其中，該重複單元可為相同或相異；
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C於每次出現時獨立地為不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；
Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C於每次出現時獨立地為不存在、伸烷基、經取代之伸烷基(其中，一個或多個亞甲基可藉由O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R’)=C(R”)、C≡C或C(O)之一者或多者中斷或封端)；
R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C於每次出現時獨立地為不存在、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)- CH(Ra)-NH-、CO、CH=N-O、
Figure 111120479-A0202-12-0152-64
、
Figure 111120479-A0202-12-0152-65
、
Figure 111120479-A0202-12-0152-66
、
Figure 111120479-A0202-12-0152-63
、
Figure 111120479-A0202-12-0152-67
或雜環基；
L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B及L5C表示配體，亦即，於每次出現時各自獨立為單糖(諸如GalNAc)、二醣、三醣、四醣、寡醣、或多醣；且Ra為H或胺基酸側鏈。三價接合GalNAc衍生物尤其可與RNAi劑合用，以用於抑制標靶基因之表現，例如式(XLIX)之彼等：
Figure 111120479-A0202-12-0152-68
其中L5A、L5B及L5C表示單糖，諸如GalNAc衍生物。
合適之接合GalNAc衍生物之二價及三價分支鏈之鏈結子的示例包括但不限於，上文作為式II、VII、XI、X、及XIII而引用之結構。
教示RNA接合物之製備之代表性美國專利包括但不限於，美國專利第4,828,979號、第4,948,882號、第5,218,105號、第5,525,465號、第5,541,313號、第5,545,730號、第5,552,538號、第5,578,717號、第5,580,731號、第5,591,584號、第5,109,124號、第5,118,802號、第5,138,045號、第5,414,077號、第5,486,603號、第5,512,439號、第5,578,718號、第5,608,046號、第4,587,044號、第4,605,735號、第 4,667,025號、第4,762,779號、第4,789,737號、第4,824,941號、第4,835,263號、第4,876,335號、第4,904,582號、第4,958,013號、第5,082,830號、第5,112,963號、第5,214,136號、第5,082,830號、第5,112,963號、第5,214,136號、第5,245,022號、第5,254,469號、第5,258,506號、第5,262,536號、第5,272,250號、第5,292,873號、第5,317,098號、第5,371,241號、第5,391,723號、第5,416,203號、第5,451,463號、第5,510,475號、第5,512,667號、第5,514,785號、第5,565,552號、第5,567,810號、第5,574,142號、第5,585,481號、第5,587,371號、第5,595,726號、第5,597,696號、第5,599,923號、第5,599,928號、第5,688,941號、第6,294,664號、第6,320,017號、第6,576,752號、第6,783,931號、第6,900,297號、第7,037,646號、第8,106,022，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。
給定化合物之所有位置經均勻修飾係不必要者，且事實上，超過一種前述修飾可併入單個化合物中或甚至併入iRNA之單個核苷。本發明亦包括作為嵌合化合物之iRNA化合物。
於本發明之語境中，「嵌合」iRNA化合物或「嵌合體」係iRNA化合物，較佳係dsRNAi劑，其含有兩個或更多個化學上截然不同之區域，各自由至少一個單體單元構成，亦即，在dsRNA化合物之情形中，該單體單元係核苷酸。此等iRNA典型含有至少一個區域，其中，該RNA經修飾以賦予該iRNA以增加之對核酸酶降解之抗性、增加之細胞攝取、或增加之與標靶核酸之結合親和性。iRNA之附加區域可用作能裂解RNA：DNA雜交體或RNA：RNA雜交體之酶的受質。舉例而言，RNase H係細胞之核 酸內切酶，其裂解RNA：DNA雙鏈體之RNA股。因此，RNase H之激活導致RNA標靶之裂解，從而極大地提升對基因表現之iRNA抑制的效率。因此，當使用嵌合dsRNA時，使用較短之iRNA往往可獲得與使用雜交至相同標靶區域之硫代磷酸酯去氧dsRNA相當的結果。RNA標靶之裂解可藉由凝膠電泳一般偵測之，且若需要，可將凝膠電泳與該領域中已知之相關核酸雜交技術合用。
於某些例子中，iRNA之RNA可藉由非配體基團予以修飾。大量非配體分子業經接合至iRNA以提升iRNA之活性、細胞分佈或細胞攝取，且執行此類接合之過程可在科技文獻中獲得。此類非配體部分業經包括脂質部分，如膽固醇(Kubo,T.et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.,2007,365(1)：54-61；Letsinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86：65533)、膽酸(Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1994,4：1053)、硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660：306；Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3：2765)、硫代膽固醇(Oberhauser et al.,Nucl.Acids Res.,1992,20：533)、脂肪鏈例如十二烷二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras et al.,EMBO J.,1991,10：111；Kabanov et al.,FEBS Lett.,1990,259：327；Svinarchuk et al.,Biochimie,1993,75：49)、磷脂質例如二-十六烷基-rac-甘油或1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-磷酸三乙銨(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36：3651；Shea et al.,Nucl.Acids Res.,1990,18：3777)、聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharan et al.,Nucleosides & Nucleotides,1995,14：969)、或金剛烷乙酸(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995, 36：3651)、棕櫚醯基部分(Mishra et al.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264：229)、或十八烷基胺或己基胺-羰氧基膽固醇部分(Crooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277：923)。教示此類RNA接合物之製備的代表性美國專利列述於上文中。典型之接合策略牽涉在該序列之一個或多個位置承載胺基鏈結子之RNA的合成。胺基隨後與使用合適之偶聯劑或活化劑接合之分子反應。接合反應可使用仍鍵結至固體支撐物之RNA執行，或在RNA於溶液相中裂解後執行。藉由HPLC進行之RNA接合物之純化典型提供純接合物。
IV.本發明之iRNA之輸送
本發明之iRNA至細胞例如個體諸如人類個體(例如，有此需要之個體，諸如易患或被診斷為患有PNPLA3相關疾患例如NAFLD之個體)內之遞送可藉由大量不同方式達成。舉例而言，可藉由將細胞與本發明之iRNA在活體外或活體內接觸而施行遞送。活體內遞送亦可藉由將包含iRNA如dsRNA之組成物投予至個體而直接施行。或者，活體內遞送可藉由投予編碼並引導該iRNA之表現的一種或多種載體而間接施行。此等選擇於下文中進一步檢討。
通常，遞送核酸分子之任意方法(活體外或活體內)可適用於與本發明之iRNA合用(參見，例如，Akhtar S.and Julian RL.(1992)Trends Cell.Biol.2(5)：139-144及WO94/02595，其藉由引用而以其整體併入本文)。對於活體內遞送，為了遞送iRNA分子而慮及之因素包括，舉例而言，所遞送至分子的生物學穩定性、非特異性效應之預防、及所遞送之分子在標靶組織內之蓄積。RNA干擾亦業經顯示藉由直接注射進行之局部遞送的 成功(Dorn,G.,et al.(2004)Nucleic Acids 32：e49；Tan,PH.,et al(2005)Gene Ther.12：59-66；Makimura,H.,et al(2002)BMC Neurosci.3：18；Shishkina,GT.,et al(2004)Neuroscience 129：521-528；Thakker,ER.,et al(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：17270-17275；Akaneya,Y.,et al(2005)J.Neurophysiol.93：594-602)。對RNA或醫藥載體之修飾亦可允許該iRNA以標靶組織為靶向且避免非所欲之脫靶效應。iRNA分子可藉由化學接合至親脂性基團如膽固醇而修飾，以提升細胞攝取且防止降解。舉例而言，將接合至親脂性膽固醇部分之對抗ApoB的iRNA經全身注射至小鼠體內，導致肝臟及空腸兩之apoB mRNA的敲除(Soutschek,J.et al.,(2004)Nature 432：173-178)。
於作為另一種選擇之態樣中，該iRNA可使用藥物遞送系統諸如奈米顆粒、樹枝狀聚合物、聚合物、脂質體、或陽離子遞送系統進行遞送。荷正電之陽離子遞送系統係促進iRNA分子(荷負電)之結合，亦提升在荷負電之細胞膜的相互作用，以允許該細胞對iRNA之有效攝取。陽離子脂質、樹枝狀聚合物或聚合物可或結合至iRNA或被誘導以形成包合iRNA之泡囊或微胞(參見，例如，Kim SH.et al.,(2008)Journal of Controlled Release 129(2)：107-116)。泡囊或微胞之形成進一步防止當全身投予時該iRNA之降解。製作及投予陽離子-iRNA錯合物之方法完全於所屬技術領域中具有通常知識者之能力範圍內(參見，例如，Sorensen,DR.,et al.(2003)J.Mol.Biol 327：761-766；Verma,UN.et al.,(2003)Clin.Cancer Res.9：1291-1300；Arnold,AS et al.(2007)J.Hypertens.25：197-205，其皆藉由引用而整體併入本文)。可用於iRNA之系統性遞送的藥物 遞送系統之一些非限制性示例包括DOTAP(Sorensen,DR.,et al(2003)，同上：Verma,UN.et al.,(2003)，同上)、「固體核酸脂質顆粒」(Zimmermann,TS.et al.,(2006)Nature 441：111-114)、心磷脂(Chien,PY.et al.,(2005)Cancer Gene Ther.12：321-328；Pal,A.et al.,(2005)Int J.Oncol.26：1087-1091)、聚乙亞胺(Bonnet ME.et al.,(2008)Pharm.Res.Aug 16電子優先發佈；Aigner,A.(2006)J.Biomed.Biotechnol.71659)、Arg-Gly-Asp(RGD)肽(Liu,S.(2006)Mol.Pharm.3：472-487)及聚醯胺基胺(Tomalia,DA.et al.,(2007)Biochem.Soc.Trans.35：61-67；Yoo,H.et al.,(1999)Pharm.Res.16：1799-1804)。於一些態樣中，iRNA與環糊精形成用於全身性投予之錯合物。投予方法及iRNA與環糊精之醫藥組成物可見於美國專利第7,427,605號，其藉由引用而以其整體併入本文。
A.編碼本發明之iRNA的載體
靶向PNPLA3基因之iRNA可從插入DNA或RNA載體之轉錄單元表現(參見，例如，Couture,A,et al.,TIG.(1996),12：5-10；Skillern,A.,et al.，國際PCT公開案第WO 00/22113號；Conrad，國際PCT公開案第WO 00/22114號；以及Conrad，美國專利第6,054,299號)。表現可為瞬時者(幾小時至幾週之量級)或持續者(幾週至幾個月或更久)，取決於所使用之具體構造及標靶組織或細胞類型。此等基因轉殖可作為線性構造、環狀質體、或病毒載體而引入，其可為整合載體或非整合載體。基因轉殖亦可構造為允許其被作為粒線體外質體而被繼承(Gassmann,et al.,(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：1292)。
可與本文所述方法及組成物合用之病毒載體系統包括但不限於，(a)腺病毒載體；(b)逆轉錄病毒載體，包括但不限於慢病毒載體、莫洛尼鼠白血病病毒等；(c)腺相關病毒載體；(d)單純皰疹病毒載體；(e)Sv40載體；(f)多瘤病毒載體；(g)乳頭狀瘤病毒載體；(h)小核糖核酸病毒載體；(i)痘病毒載體，例如天花例如牛痘病毒載體，或禽痘例如金絲雀痘或雞痘病毒載體；以及(j)幫手依賴性或裸腺病毒載體。複製缺陷病毒亦可為優勢者。不同之載體將變為或不變為併入該細胞之基因組內。若必要，該等構造可包括用於轉染之病毒序列。或者，該構造可併入能進行附加型複製(episomal replication)之載體例如EPV載體及EBV載體內。用於iRNA之重組表現之構造通常將會需要調節元素，例如啟動子、增強子等，以確保該iRNA在標靶細胞內之表現。對於載體及構造所慮及之其他方面係該領域中已知者。
V.本發明之醫藥組成物
本發明亦包括包括本發明之iRNA的醫藥組成物及製劑。於一態樣中，本文提供含有如本文所揭示之iRNA以及藥學可接受之載體的醫藥組成物。含有iRNA之醫藥組成物可用於預防或治療PNPLA3相關疾患，例如，高三酸甘油酯血症。此等醫藥組成物係基於遞送模式而配製。一個示例係將組成物配製為用於經由腸胃外遞送之系統性投予，例如，藉由皮下(SC)遞送、肌肉內(IM)遞送或靜脈內(IV)遞送。本發明之醫藥組成物可以足以抑制PNPLA3基因表現之劑量投予。
於一些態樣中，本發明之醫藥組成物係無菌者。於另一態樣中，本發明之醫藥組成物係無熱原者。
本發明之醫藥組成物可以足以抑制PNPLA3基因表現之劑量投予。通常，本發明之iRNA的適當劑量將係約0.001至約200.0毫克每公斤接受者體重每天的範圍內，通常係約1至50每公斤體重每天的範圍內。典型地，本發明之iRNA的適宜劑量將係約0.1mg/kg至約5.0mg/kg之範圍，較佳係約0.3mg/kg及3.0mg/kg。重複劑量方案可包括規則地投予治療量之iRNA，諸如每個月一次，每3至6個月一次，或每年一次。於某些態樣中，iRNA係大約每個月投予一次至大約每六個月投予一次。
於初始之治療方案後，該治療之實施頻次可降低。治療之持續時間可基於疾病之嚴重程度而確定。
於其他態樣中，單一劑量之醫藥組成物可為長期持續者，使得劑量係以不超過1、2、3或4個月之間隔投予。於本發明之一些態樣中，單一劑量之本發明之醫藥組成物係約每個月投予一次。於本發明之其他態樣中，單一劑量之本發明之醫藥組成物係約每個季度(亦即，約每三個月)投予一次。於本發明之其他態樣中，單一劑量之本發明之醫藥組成物係約每年投予兩次(亦即，約每六個月投予一次)。
通常知識者應知悉，某些因素可影響有效治療個體所需之劑量及時機，該等因素包括但不限於個體體內存在之突變、先前之治療、個體之一般健康情況或年齡、以及存在之其他疾病。此外，使用適宜的預防或治療有效量之組成物治療個體可包括單一治療或一系列治療。
iRNA可以靶向具體組織(例如，肝細胞)之方式遞送。
本發明之醫藥組成物包括但不限於，溶液、乳液、及含脂質體之製劑。此等組成物可從多種組分生成，該等組分包括但不限於，預成形之液體、自乳化之固體及自乳化之半固體。製劑包括彼等靶向肝臟者。
可便利地以單位劑型存在的本發明之醫藥製劑，可根據醫藥工業中習知之傳統技術製備之。此類技術包括將活性成分與醫藥載體或賦形劑帶至聯合之步驟。通常，藉由將活性成分與液體載體均勻且緊密地帶至聯合而製備製劑。
A.其他製劑
i.乳液
本發明之組成物可製備且配製為乳液。乳液係一種液體以直徑通常超過0.1μm之液滴形式分散於另一種液體中之典型非均質系統(參見，例如，Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Volume 1,p.245；Block in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 2,p.335；Higuchi et al.,in Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.301)。乳液通常包含彼此緊密混合及分散之兩個不互混液體相之 雙相系統。通常，乳液可為油包水(w/o)類或水包油(o/w)類。當水性相經精細切分為小液滴並分散於整塊油性相中時，所得組成物稱為油包水(w/o)乳液。或者，當油性相經精細切分為小液滴並分散於整塊水性相中時，所得組成物稱為水包油(o/w)乳液。乳液除了含有分散相及可作為水性相、油性相存在於溶液中或本身作為單獨一相的活性藥物之外，亦可含有額外之組分。如需要，醫藥賦形劑諸如乳化劑、穩定劑、染料及抗氧化劑亦可存在於乳液中。醫藥乳液亦可為由超過兩相構成之多乳液，舉例而言，油包水包油(o/w/o)乳液及水包油包水(w/o/w)乳液。此類復配製劑往往提供簡單雙相乳液所不具有之某些優點。其中o/w乳液之個體油滴將小水滴容納在內之多乳液係構建w/o/w乳液。同樣，油滴被容納於穩定存在於油性連續相中之水球內的系統，係提供o/w/o乳液。
乳液之特徵在於熱力學穩定性小或沒有。一般情況下，乳液之分散相或不連續相良好地分散在外部相或連續相中，且透過乳化劑手段或形成黏度之手段維持其形式。其他穩定化乳液之手段需要使用可併入乳液之任一相中的乳化劑。廣義上，乳化劑可歸為四類：合成界面活性劑、天然界面活性劑、吸收基質、及精細分散之固體(參見，例如，Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。
合成界面活性劑，亦稱為表面活性劑，業經廣泛用於乳液製劑中且業經在文獻中回顧(參見，例如，Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.285；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,volume 1,p.199)。界面活性劑典型係兩性者且包含親水性部分及疏水性部分。界面活性劑之親水性與疏水性之比率業經定義為親水/親脂平衡(HLB)，且係在製劑之製備中歸類及選擇界面活性劑之有價值的工具。基於其親水性基團之天性，界面活性劑可歸為不同之類別：非離子性、陰離子性、陽離子性及兩性(參見，例如，Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，volume 1,p.285)。
大量非乳化材料亦包括於乳液製劑中，且對乳液之特性有所貢獻。此等包括脂肪、油類、蠟、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、保濕劑親水性膠體、防腐劑及抗氧化劑(Block,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，volume 1,p.335；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，volume 1,p.199)。
乳液製劑經由護膚途徑、口服途徑及腸胃外途徑之應用及其製造方法業經在文獻中回顧(參見，例如，Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。
ii.微乳液
於本發明之一個態樣中，iRNA及核酸之組成物經配製為微乳液。微乳液可定義為水、油及兩性之系統，其係單一光學各向同性且熱力學安定之溶液(參見，例如，Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245)。典型地，微乳液係藉由下述製備之系統，首先，將油分散於界面活性劑水溶液中，隨和加入足量之第四成分，通常係中等鏈長之醇，以形成透明之系統。因此，微乳液亦業經揭示為兩種不互混液體的熱力學安定、各向同性之澄清分散液，該兩種液體藉由表面活性分子之界面膜予以安定化(Leung and Shah，在：Controlled Release of Drugs：Polymers and Aggregate Systems,Rosoff,M.,Ed.,1989,VCH Publishers,New York,pages 185-215)。
iii.微粒
本發明之iRNA可併入顆粒例如微粒中。微粒可藉由噴霧乾燥生產，但亦可藉由其他方法生產，該等其他方法包括凍乾、蒸發、流動床乾燥、真空乾燥、或此等技術之組合。
vi.滲透增強劑
於一個態樣中，本發明採用多種滲透增強劑以實現核酸尤其是iRNA至動物皮膚之有效輸送。大多數藥物以經離子化及未經離子化兩種形式存在於溶液中。惟，一般僅脂溶性或親脂性藥物輕易地跨越細胞膜。業經發現，如果待被跨越之細胞膜經滲透增強劑處理，則即便是非親脂性藥物仍能夠跨越該細胞膜。滲透增強劑除了有助於非親脂性藥物跨越細胞膜之擴散之外，亦提升親水性藥物之滲透能力。
滲透增強劑可分類為屬於下述五大類之一：亦即，界面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑、及非螯合非界面活性劑(參見，例如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)。上文述及之類別的滲透增強劑各自及其在醫藥組成物之製造及藥劑之遞送中的用途係本領域中習知者。
v.賦形劑
與載體化合物相比，「藥物載體」或「賦形劑」係藥學可接受之溶劑、懸浮劑或其他用於將一種或多種核酸遞送至動物之藥學惰性介導物。賦形劑可為液體或固體，且當與核酸及給定醫藥組成物之其他組分合 併時，基於所考慮之計劃投予模式而選擇，以提供所欲之體積、一致性等。此類劑係本領域中習知者。
vi.其他組分
本發明之組成物可額外地含有常見於醫藥組成物中之其他輔助組分，用量為它們在該領域中常用的量級。因此，舉例而言，該等組成物可含有額外、可相容、藥學活性之材料如，舉例而言，止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或抗炎劑，或可含有可用於物理上配製多種類型之本發明之組成物的材料如染料、芳香劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑及安定劑。惟，當加入此類材料時，此類材料應不過度干擾本發明之組成物之組分的生物活性。該製劑可經無菌化，且(若需要)與不與該製劑之核酸進行有害反應的佐劑如潤滑劑、防腐劑、安定劑、潤濕劑、乳化劑、用於影響滲透壓之鹽類、緩衝劑、著色劑、香味劑或芳香物質等混合。
水性懸浮液可含有增加懸浮液黏度之物質，該物質包括，舉例而言，羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。懸浮液亦可含有穩定劑。
於一些態樣中，本發明提出之醫藥組成物係包括(a)一種或多種iRNA及(b)一種或多種劑，其係藉由非iRNA機制而發揮功能且係有用於治療PNPLA3相關疾患例如NAFLD。
此類化合物之毒性及預防功效可藉由標準藥學過程在細胞培養物或實驗動物中測定，例如測定LD50(將群體之50%致死之劑量)及ED50(對群體之50%預防有效之劑量)。毒性與治療功效間之劑量比率係治療係數，且其可表現為LD50/ED50之比率。顯現高治療係數之化合物係較佳者。
從細胞培養檢定及動物研究中獲得之資料可用於配製在人體內使用之劑量範圍。本發明中本文提出之組成物的劑量通常處於包括ED50，較佳ED80或ED90在內之具低毒性或無毒性之循環濃度範圍。劑量可依據所採用之劑型及所使用之投予途徑而在此範圍內變動。對於在本發明提出之方法中使用的任意化合物，最初可從細胞培養物檢定中構建預防有效之劑量。劑量可在動物模型中配製為達成該化合物或(當適宜時)標靶序列之多肽產物的循環血漿濃度範圍(例如，達成多肽之降低之濃度)，該範圍包括如在細胞培養物中測定之IC50(亦即，達成對症候之半最大抑制時該測試化合物之濃度)或更高量級之抑制。此資訊可用來更準確地確定可用於人體之劑量。舉例而言，可藉由高效液相色層分析術量測血漿中之量級。
除了如上文檢討之投予之外，本發明提出之iRNA亦可與其它已知之用於預防或治療NAFLD相關疾患例如NAFLD中的劑合用。在任何情況下，主治醫生皆可基於該領域中已知或本文所述之標準功效測量方法觀察之結果而確定iRNA投予之量及時機。
VI.抑制PNPLA3表現之方法
本發明亦提供抑制PNPLA3基因在細胞內之表現的方法。該方法包括令細胞與其量足以抑制該細胞內PNPLA3之表現的RNAi劑例如雙股RNA劑接觸，從而抑制該細胞內PNPLA3之表現。
細胞與iRNA例如雙股RNA劑之接觸可於活體外或活體內進行。令細胞與iRNA於活體內接觸包括令個體例如人類個體體內之細胞或細胞群組與iRNA接觸。活體外接觸細胞之方法與活體內接觸細胞之方 法的組合亦係可能者。與細胞揭示可為直接或間接者，如上文檢討。此外，與細胞之接觸可經由靶向配體施行，該配體包括本文所揭示或該領域中已知之任意配體。於較佳態樣中，靶向配體係碳水化合物部分，例如GalNAc配體，或將RNAi劑引導至感興趣之位點的任意其他配體。
如本文中所用，術語「抑制」與「減輕」、「緘默化」、「下調」、「阻抑」及其他類似術語可互換使用，且包括任意量級之抑制。
如本文中所用，短語「抑制PNPLA3之表現」旨在指稱抑制任意PNPLA3基因(例如，小鼠PNPLA3基因、大鼠PNPLA3基因、猴PNPLA3基因、或人類PNPLA3基因)以及編碼PNPLA3基因之變異體或突變體的表現。因此，於經基因操縱之細胞、細胞群組或生物體之語境中，PNPLA3基因可為野生型PNPLA3基因、突變型PNPLA3基因或基因轉殖PNPLA3基因。
「抑制PNPLA3基因之表現」包括對PNPLA3基因之任意量級之抑制，例如，對PNPLA3基因之表現的至少部分的阻抑。PNPLA3基因之表現可基於與PNPLA3基因表現相關之任意變項之量級例如PNPLA3mRNA量級、PNPLA3蛋白質量級或量級之改變而評估。這一量級可於個體細胞或細胞群組中評估之，該細胞或細胞群組包括，例如，源自個體之樣本。應理解，PNPLA3係主要表現於肝臟中，但亦表現於腦、膽囊、心臟及腎臟中，並且存在於循環中。
抑制可藉由與PNPLA3表現相關之一個或多個變項之絕對或相對量級與對照量級相比的下降而評估。對照量級可為該領域中使用之任意類型之對照量級，例如投藥前之基線量級，或自未治療或經對照物(例如， 僅含緩衝劑之對照物或非活性劑之對照物)治療之類似個體、細胞或樣本測得之量級。
於本發明之方法的一些態樣中，PNPLA3基因之表現被抑制至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%，或被抑制到低於該檢定之偵測量級。於較佳之態樣中，PNPLA3基因之表現被抑制至少70%。復應理解，抑制某些組織例如肝臟中之PNPLA3表現而不顯著抑制其在其他組織例如腦中之抑制可能係所欲者。於較佳之態樣中，使用實施例2中提供之方法使用10nM siRNA濃度於適宜物種匹配細胞株中測定表現量級。
於某些態樣中，活體內表現之抑制係藉由敲除表現人類基因之囓齒動物(例如，表現人類標靶基因(亦即，PNPLA3)之經AAV轉染之小鼠)體內之人類基因而測定，例如，當在RNA表現之最低點投予3mg/kg之單一劑量時。模型動物系統中外源性基因表現之敲除亦可例如在RNA表現之最低點投予3mg/kg之單一劑量之後測定。當人類基因之核酸序列與模型動物基因足夠接近而使得人類iRNA提供模型動物基因之有效剔除時，此類系統係可用者。肝臟中之RNA表現係使用實施例2中提供之PCR方法測定。
PNPLA3基因表現之抑制可藉由第一細胞或細胞群組(此類細胞可存在於例如來源於個體之樣本中)所表現之mRNA量相對於實質上與第一細胞或細胞群組相同但未經如是理之第二細胞或細胞群組(未經iRNA理或未經靶向感興趣基因之iRNA理的對照細胞)減低而體現，於該細胞或細胞群組中，PNPLA3基因被轉錄並且業經理(例如，藉由令該一個 或多個細胞與本發明之iRNA接觸，或藉由將本發明之iRNA投予至其體內存在或曾經存在該細胞之個體)，使得PNPLA3基因被抑制。於較佳之態樣中，藉由實施例2中提供之方法，使用10nM siRNA濃度，於物種匹配細胞株中評估該抑制，並使用下述公式將經理之細胞內的mRNA量級表示為相對於對照細胞中mRNA量級的百分比：
Figure 111120479-A0202-12-0169-69
於其他態樣中，PNPLA3基因表現之抑制可從功能上與PNPLA3基因表現例如來自個體之血液或血清中PNPLA3蛋白質量級關聯之參數的減低角度進行評估。PNPLA3基因緘默化可於與表現構造物同源或異源的表現PNPLA3之任意細胞內測定，並且藉由該技藝中已知之任意檢定測定。
PNPLA3蛋白表現之抑制可藉由個體樣本中細胞或細胞群組所表現之PNPLA3蛋白量級(例如，於源自個體之血液樣本中的蛋白質量級)之減低而體現。如上所述，對於mRNA阻抑之評估，經處理之細胞或細胞群組中蛋白質表現量級之抑制可類似地表現為相對於對照細胞或細胞群組中蛋白質量級的百分比，或個體樣本例如源自該個體之血液或血清中蛋白質量級的改變。
可用來評估PNPLA3基因表現之抑制的對照細胞、細胞群組或個體樣本包括尚未與本發明之RNAi劑接觸的細胞、細胞群組或個體樣本。舉例而言，對照細胞、細胞群組或個體樣本可源自使用RNAi劑治療 個體之前的個體個體(例如，人類或動物個體)或源自經適宜匹配之群體對照。
細胞或細胞群體所表現之PNPLA3 mRNA量級可使用該領域中已知用於評估mRNA表現之任意方法測定。於一個實施態樣中，樣本中之PNPLA3表現量級可藉由偵測經轉錄之聚核苷酸或其蛋白質例如PNPLA3基因之mRNA而測定。可使用RNA抽取技術，包括例如使用酸酚/異硫氰酸胍抽取(RNAzol B；Biogenesis)、RNeasyTM RNA製備套組(Qiagen®)或PAXgeneTM(PreAnalytixTM，Switzerland)，從細胞中抽取RNA。採用核糖核酸雜交之典型檢定型式包括核連綴檢定、RT-PCR、RNase保護檢定、北方印漬法、原位雜交及微陣列分析。
於一些態樣中，使用核酸探針確定PNPLA3之表現水平。如本文所用，術語「探針」指稱能夠選擇性地結合至特定性PNPLA3的任意分子。探針可由所屬技術領域中具有通常知識者合成，或來源於適宜之生物學製劑。探針可特異性地設計為待標記。可用作探針之分子的實例包括但不限於RNA、DNA、蛋白質、抗體及有機分子。
單離之mRNA可用於雜交或擴增檢定中，該檢定包括但不限於，南方或北方印漬分析(Southern or northern analyses)、聚合酶連鎖反應(PCR)分析及探針陣列。一種用於測定mRNA水平之方法包括令單離之mRNA與可雜交至PNPLA3 mRNA之核酸分子(探針)接觸。於一個具體實施例中，例如，藉由令單離之mRNA於瓊脂糖凝膠上電泳並將mRNA從該凝膠轉移至膜諸如硝基纖維素膜上，從而將mRNA固定於固體表面上並令其與探針接觸。於備選之態樣中，例如，於Affymetrix®基因晶片陣列 中，將探針固定於固體表面上並令mRNA與該探針接觸。通常知識者可輕易地調整已知之mRNA偵測方法以用於測定PNPLA3 mRNA之水平。
用於測定樣本中PNPLA3表現量級之備選方法包括例如樣本中之mRNA的核酸擴增或逆轉錄(以製備cDNA)之製程，該製程係例如藉由RT-PCR(Mullis於1987年於美國專利4,683,202中詳述之實驗性態樣)、連接酶連鎖反應(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189-193)、自我持續之序列複製(Guatelli et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878)、轉錄擴增系統(Kwoh et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177)、Q-β複製酶(Lizardi et al.(1988)Bio/Technology 6：1197)、滾環式複製(Lizardi et al.,US Patent No.5,854,033)或任意其他核酸擴增方法進行，之後使用所屬技術領域中彼等通常知識者習知之技術偵測所擴增之分子。如果核酸分子以非常低之數量存在，則此等偵測方法尤其有用於偵測此類分子。於本發明之特定態樣中，PNPLA3表現之量級係藉由定量螢光RT-PCR(亦即，TaqManTM系統)測定。於較佳之態樣中，使用實施例2中提供之方法使用例如10nM siRNA濃度於物種匹配細胞株中測定表現量級。
可使用膜印漬(諸如雜交分析中所用者，諸如北方印漬、南方印漬、點印漬等)或微孔、樣本管、凝膠、珠或纖維(或包含經結合之核酸的任意固體支撐物)監測PNPLA3 mRNA之表現量級。參見，美國專利第5,770,722號、第5,874,219號、第5,744,305號、第5,677,195號及第5,445,934號，該等專利藉由引用併入本文。PNPLA3表現量級之測定亦可包含使用處於溶液中之核酸探針。
於較佳態樣中，使用分支DNA(bDNA)檢定或實時PCR(qPCR)評估mRNA表現之量級。此等方法之用途揭示且例示於本文之實施例中。於較佳之態樣中，使用實施例2中提供之方法使用10nM siRNA濃度於物種匹配細胞株中測定表現量級。
PNPLA3蛋白表現之量級可使用該領域中已知用於量測蛋白質量級之任意方法測定。此類方法包括，例如，電泳、毛細管電泳、高效液相層析術(HPLC)、薄層層析術(TLC)、超擴散層析術、流體或凝膠沈澱素反應、吸收光譜、比色檢定、分光光度檢定、流式細胞術、免疫擴散(單或雙)、免疫電泳、西方印漬法、放射免疫檢定(RIA)、酶聯免疫吸附檢定(ELISA)、免疫螢光檢定、電化學發光檢定等。
於一些態樣中，本發明之方法的效力藉由PNPLA3 mRNA或蛋白質量級之降低(例如，於肝臟活檢樣本中)評估。
於本發明之方法的一些態樣中，將iRNA投予至個體，使得iRNA被遞送至該個體體內之具體位點。PNPLA3表現之抑制可使用來源於來自該個體特定位點(例如，肝臟或血液)之體液或組織的樣本中PNPLA3 mRNA或PNPLA3蛋白質之量級或量級改變的量測值進行評估。
如本文中所用，術語偵測或確定分析質之量級係理解為意指執行該等步驟以確定材料例如蛋白質、RNA是否存在。如本文中所用，偵測或確定方法包括偵測或確定低於所使用方法之偵測量級的分析質量級。
VII.本發明之預防及治療方法
本發明亦提供使用本發明之iRNA或含有本發明之iRNA之組成物來抑制PNPLA3之表現，從而抑制或治療PNPLA3相關疾患的方 法，該疾患例如脂肪肝(脂肪變性)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝臟之硬化、脂肪於肝臟中之蓄積、肝臟之發炎、肝細胞壞死、肝臟纖維化、肥胖或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。於本發明之方法中，細胞可在活體內或體外與siRNA接觸，亦即，細胞可處於個體體內。
適用於使用本發明之方法處理的細胞可為任何表現PNPLA3基因之細胞，例如，肝細胞、腦細胞、膽囊細胞、心細胞或腎細胞，但較佳係肝細胞。適用於在本發明之方法中使用的細胞可為哺乳動物細胞，例如，靈長動物細胞(諸如人類細胞，包括嵌合非人動物內之人類細胞，或非人類靈長動物細胞例如猴細胞或黑猩猩細胞)或非靈長動物細胞。於某些態樣中，該細胞為人類細胞，例如人類肝細胞。於本發明之方法中，細胞中之PNPLA3表現被抑制至少50、55、60、65、70、75、80、85、90或95，或被抑制到低於該檢定之偵測量級。
本發明之活體內方法可包括對個體投予含有iRNA之組成物，其中該iRNA係包括與待投予該RNAi劑之哺乳動物的PNPLA3基因之RNA轉錄本之至少一部分互補的核苷酸序列。該組成物可藉由該領域中已知之任意手段投予，該手段包括但不限於，口服、腹膜內或腸胃外途徑，包括顱內(例如，腦室內、腦實質內及鞘內)、靜脈內、肌肉內、皮下、透皮、氣管(氣溶膠)、鼻內、直腸內及外用(包括頰腔及舌下)投予。於某些態樣中，該組成物係藉由靜脈內輸液或注射而投予。於某些態樣中，該組成物係藉由皮下注射而投予。於某些態樣中，該組成物係藉由肌肉內注射而投予。
一方面，本發明亦提供抑制PNPLA3基因在哺乳動物體內之表現的方法。該方法包括向哺乳動物投予包含靶向哺乳動物細胞內PNPLA3基因之dsRNA的組成物，並將該哺乳動物維持足以獲得PNPLA3基因之RNA轉錄本退化的時間，從而抑制該PNPLA3基因在細胞中的表現。基因表現之減低可藉由該領域中已知之任意方法及藉由本文中例如實施例2中揭示之方法例如qRT-PCR評估。蛋白質生產之減低可藉由該領域中已知之任意方法例如ELISA評估。於某些態樣中，穿刺肝臟生檢樣本用作組織材料來監測PNPLA3基因或蛋白質表現之減低。於其他態樣中，血液樣本用作個體樣本來監測PNPLA3蛋白質表現之減低。
本發明復提供治療由此需要之個體的方法，該個體例如診斷為患有PNPLA3相關疾患諸如脂肪肝(脂肪變性)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝臟之硬化、脂肪於肝臟中之蓄積、肝臟之發炎、肝細胞壞死、肝臟纖維化、肥胖或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)之個體。
本發明復提供預防有此需要之個體的方法。本發明之治療方法包括向個體(例如，將會受益於PNPLA3表現減低之個體)投予本發明之iRNA，係投予預防有效量之靶向PNPLA3基因之iRNA或投予包含靶向PNPLA3基因之iRNA的組成物。
一方面，本發明係提供治療患有將會從PNPLA3表現之減低中受益之疾患之個體的方法，該疾患例如PNPLA3相關疾病，例如慢性纖維發炎性疾病(例如，癌症，例如肝細胞癌、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝硬化、肝炎、肝細胞壞死、肝纖維化及非酒精性脂肪肝病(NAFLD))。於一個態樣中，該慢性纖維發炎性肝病為NASH。
於一個態樣中，PNPLA3相關疾病係選自由下列所組成之群組：脂肪肝(脂肪變性)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝臟之硬化、脂肪於肝臟中之蓄積、肝臟之發炎、肝細胞壞死、肝臟纖維化、肥胖或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。
如本文中所使用，「非酒精性脂肪肝病」可與術語「NAFLD」互換使用，係指稱藉由在每天酒精攝入量低於20gm下存在脂肪變性定義之疾病。NAFLD係美國最常見之肝病，且往往與胰島素抵抗型/第2型糖尿病及肥胖相關。NAFLD係體現為脂肪變性、脂肪肝炎、硬化、且有時為肝細胞癌。對於NAFLD之回顧，參見Tolman and Dalpiaz(2007)Ther.Clin.Risk.Manag.,3(6)：1153-1163，其整體內容藉由引用而併入本文。
如本文中所使用，「脂肪變性」、「肝脂肪變性」及「脂肪肝病」係指稱甘油三酸酯及其他脂肪類於肝細胞內之蓄積。
如本文中所使用，術語「非酒精性脂肪肝炎」或「NASH」係指稱由脂肪於肝臟內之堆積造成的肝炎及肝損傷。NASH係被稱為非酒精性脂肪肝病(NAFLD)之一組病症的一部分。NASH係類似於酒精性肝病，但出現於飲酒量少或不飲酒之人群中。NASH之主要特徵係肝臟中之脂肪伴隨著驗證及損傷。大多數具有NASH之人群感覺良好，且未能差缺他們的肝臟有問題。儘管如此，NASH可能嚴重化且可導致硬化，其中肝臟被永久損傷且不再能正常工作。對於一般血液測試中所包括之肝臟檢查中發現指標如丙胺酸胺基轉移酶(ALT)或天冬胺酸胺基轉移酶(AST)升高之人士，一般首先懷疑係NASH。當進一步之評估未顯示肝病之明顯原因(例如，藥物損傷、病毒性肝炎或飲酒過量)時或當肝臟之x射線或成像研究係顯示 脂肪時，係懷疑NASH。證實對NASH之診斷並將其與單純脂肪肝區分之位移手段係肝臟生檢。
如本文中所用，組織學上定義之術語「肝硬化」，係以纖維化及正常肝臟結構轉化為結構上部正常之結節為特徵的彌散性肝臟進程。
本發明之iRNA可作為「自由iRNA」投予。自由iRNA係於醫藥組成物之不存在下投予。裸iRNA可於合適之緩衝溶液中。緩衝溶液可包含醋酸鹽、枸櫞酸鹽、醇溶蛋白、碳酸鹽、或磷酸鹽、或其任意組合。於一個具體實施例中，緩衝溶液為磷酸鹽緩衝液(PBS)。含有iRNA之緩衝溶液之pH及滲透壓可經調節，使得其係適用於投予至個體。
或者，本發明之iRNA可作為醫藥組成物投予，例如作為dsRNA脂質體製劑投予。
將會受益於抑制PNPLA3基因表現之個體為易患或經診斷為患有PNPLA3相關疾患諸如脂肪肝(脂肪變性)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝臟之硬化、脂肪於肝臟中之蓄積、肝臟之發炎、肝細胞壞死、肝臟纖維化、肥胖或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)之個體。
於一個態樣中，該方法包括投予本文提出之組成物，使得靶標PNPLA3基因之表現得以降低，例如每劑量造成之降低約持續1、2、3、4、5、6、1至6、1至3或3至6個月。於某些態樣中，組成物係每3至6個月投予一次。
較佳地，可用於本文中提出之方法及組成物之iRNA特異性地靶向標靶PNPLA3基因的RNA(原始的或經理的)。使用iRNA抑制此等基因之表現的組成物及方法可如本文中所揭示者製備及實施。
根據本發明之方法投予該iRNA可導致預防或治療PNPLA3相關疾患，例如，脂肪肝(脂肪變性)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝臟之硬化、脂肪於肝臟中之蓄積、肝臟之發炎、肝細胞壞死、肝臟纖維化、肥胖或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。
個體可經投予治療量之iRNA，諸如約0.01mg/kg至約200mg/kg。
該iRNA較佳係經皮下投予，亦即，藉由皮下注射投予。一次或多次注射可用來將所欲之劑量的iRNA遞送至個體。該注射可在一段時間內重複實施。
該投予可定期重複實施。於某些態樣中，於初始之治療方案後，該治療之實施頻次可降低。重複劑量方案可包括規則地投予治療量之iRNA，諸如每個月一次至每年一次。於某些態樣中，iRNA係約每個月投予一次至每三個月投予一次，或約每三個月投予一次至約每六個月投予一次。
本發明復提供使用本發明之iRNA劑及其醫藥組成物用於治療將會受益於減低及/或抑制PNPLA3基因表現之個體的方法及用途，該個體係例如患有PNPLA3相關疾病之個體，該方法及用途係與其他藥品及/或其他治療方法合用，例如，與已知之藥品及/或已知之治療方法例如彼等當下用於治療此等疾患者合用。
據此，於本發明之一些方面，包括本發明之單一iRNA劑之方法復包括向個體投予一種或多種額外治療劑。
該iRNA劑及額外治療劑及/或治療可同時投予及/或在同一組合中投予，例如腸胃外投予，或該額外治療劑可作為獨立組成物之一部分或在獨立之時間及/或藉由該領域中已知或本文中揭示之另一方法投予。
額外治療劑之示例包括彼等已知用於治療高三酸甘油酯血症及其他由高三酸甘油酯血症所致、與之相關或作為其結果的疾病者。舉例而言，本發明提出的iRNA可與任何此類額外治療劑一起投予。此類劑之示例包括但不限於，HMG-CoA還原酶抑制劑(例如，斯他汀類)、貝特類藥物(fibrate)、膽酸鉗合劑、菸鹼酸、抗血小板劑血管緊張素轉化酶抑制劑、血管緊張素II受體拮抗劑(例如，洛沙坦鉀，諸如Merck & Co.’s Cozaar®)、乙醯輔酶A膽固醇乙醯轉移酶(ACAT)抑制劑、膽固醇吸收抑制劑、膽固醇酯轉移蛋白(CETP)抑制劑、微粒體三酸甘油酯轉移蛋白(MTTP)抑制劑、膽固醇調節劑、膽酸調節劑、過氧化體增殖激活受體(PPAR)促效劑、基於基因之療法、復合血管保護劑(例如，AGI-1067，來自Atherogenics)、糖蛋白Ilb/IIIa抑制劑、阿斯匹靈或類阿斯匹靈化合物、IBAT抑制劑(例如，S-8921，來自Shionogi)、鯊烯合成酶抑制劑、單核細胞趨化蛋白(MCP)-I抑制劑，或魚油。示例性HMG-CoA還原酶抑制劑包括阿托伐他汀(Pfizer之Lipitor®/Tahor/Sortis/Torvast/Cardyl)、普伐他汀(pravastatin)(Bristol-Myers Squibb之Pravachol，Sankyo之Mevalotin/Sanaprav)、辛伐他汀(simvastatin)(Merck之Zocor®/Sinvacor，Boehringer Ingelheim之Denan，Banyu之Lipovas)、洛伐他汀(Merck之Mevacor/Mevinacor，Bexal之Lovastatina、Cepa；Schwarz Pharma之Liposcler)、氟伐他汀(fluvastatin)(Novartis’之Lescol®/Locol/Lochol，Fujisawa之Cranoc， Solvay之Digaril)、西立伐他汀(cerivastatin)(Bayer之Lipobay/GlaxoSmithKline之Baycol)、罗素伐他汀(rosuvastatin)(AstraZeneca之Crestor®)及匹提法他汀(pitivastatin)(依他伐他汀(itavastatin)/利西伐他汀(risivastatin))(Nissan Chemical，Kowa Kogyo，Sankyo及Novartis)。示例性貝特類藥物包括，例如，苯扎貝特(bezafibrate)(例如，Roche之Befizal®/Cedur®/Bezalip®、Kissei之Bezatol)、克氯吩貝(例如，Wyeth之Atromid-S®)、非諾貝特(fenofibrate)(例如，Fournier之Lipidil/Lipantil、Abbott之Tricor®、Takeda之Lipantil、generics)、吉非羅齊(gemfibrozil)(例如，Pfizer之Lopid/Lipur)及環丙貝特(ciprofibrate)(Sanofi-Synthelabo之Modalim®).示例性膽酸鉗合劑包括，例如，銷膽胺(Bristol-Myers Squibb之Questran®及Questran LightTM)、考來替泊(colestipol)(例如，Pharmacia之Colestid)及考來維侖(colesevelam)(Genzyme/Sankyo之WelCholTM)。示例性菸鹼酸療法包括，例如，立即釋放製劑，諸如Aventis之Nicobid、Upsher-Smith之Niacor、Aventis之Nicolar、以及Sanwakagaku之Perycit。菸鹼酸延長釋放製劑包括，例如，Kos Pharmaceuticals之Niaspan以及Upsher-Smith之SIo-Niacin。示例性抗血小板劑包括，例如，阿斯匹靈(例如，Bayer之阿斯匹靈)、氯吡格雷(clopidogrel)(Sanofi-Synthelabo/Bristol-Myers Squibb之Plavix)、以及梯可匹定(例如，Sanofi-Synthelabo之Ticlid及Daiichi之Panaldine)。可與靶向PNPLA3之dsRNA合用的其他類阿斯匹靈化合物包括，例如，Asacard(緩釋阿斯匹靈，Pharmacia製造)及Pamicogrel(Kanebo/Angelini Ricerche/CEPA)。示例性血管緊張素轉化酶抑制劑包括，例如，雷米普利 (Aventis之Altace)及伊那拉普利(例如，Merck & Co.之Vasotec)。示例性乙醯輔酶A膽固醇乙醯轉移酶(AC AT)抑制劑包括，例如，阿伐麥佈(avasimibe)(Pfizer)、依魯麥佈(eflucimibe)(BioMsrieux Pierre Fabre/Eli Lilly)、CS-505(Sankyo及Kyoto)、以及SMP-797(Sumito)。示例性膽固醇吸收抑制劑包括，例如，依澤替米貝(Merck/Schering-Plough Pharmaceuticals之Zetia®)及Pamaqueside(Pfizer)。示例性CETP抑制劑包括，例如，托徹普(Torcetrapib)(亦稱為CP-529414，Pfizer)、JTT-705(Japan Tobacco)及CETi-I(Avant Immunotherapeutics)。示例性微粒體三酸甘油酯轉移蛋白(MTTP)抑制劑包括，例如，英普他派(implitapide)(Bayer)、R-103757(Janssen)及CP-346086(Pfizer)。其他示例性膽固醇調節劑包括，例如，NO-1886(Otsuka/TAP Pharmaceutical)、CI-1027(Pfizer)及WAY-135433(Wyeth-Ayerst)。
示例性膽酸調節劑包括，例如，HBS-107(Hisamitsu/Banyu)、Btg-511(British Technology Group)、BARI-1453(Aventis)、S-8921(Shionogi)、SD-5613(Pfizer)及AZD-7806(AstraZeneca)。示例性過氧化體增殖激活受體(PPAR)促效劑包括，例如，替格列扎(tesaglitazar)(AZ-242)(AstraZeneca)、萘格列酮(Netoglitazone)(MCC-555)(Mitsubishi/Johnson & Johnson)、GW-409544(Ligand Pharniaceuticals/GlaxoSmithKline)、GW-501516(Ligand Pharmaceuticals/GlaxoSmithKline)、LY-929(Ligand Pharmaceuticals及Eli Lilly)、LY-465608(Ligand Pharmaceuticals及Eli Lilly)、LY-518674(Ligand Pharmaceuticals及Eli Lilly)及MK-767(Merck及Kyorin)。示例性基於 基因的療法包括，例如，AdGWEGF 121.10(GenVec)、ApoAl(UCB Pharma/Groupe Fournier)、EG-004(Trinam)(Ark Therapeutics)及ATP-結合級聯運載蛋白-Al(ABCA1)(CV Therapeutics/Incyte,Aventis,Xenon)。示例性醣蛋白Ilb/IIIa抑制劑包括，例如，roxifiban(亦稱為DMP754，Bristol-Myers Squibb)、甘托非邦(Gantofiban)(Merck KGaA/Yamanouchi)及Cromafiban(Millennium Pharmaceuticals)。示例性鯊烯合成酶抑制劑包括，例如，BMS-1884941(Bristol-Myers Squibb)、CP-210172(Pfizer)、CP-295697(Pfizer)、CP-294838(Pfizer)及TAK-475(Takeda)。示例性MCP抑制劑為，例如，RS-504393(Roche Bioscience)。抗動脈粥樣硬化劑BO-653(Chugai Pharmaceuticals)及菸鹼酸衍生物Nyclin(Yamanouchi Pharmacuticals)亦適宜與本發明提出之dsRNA聯合給藥。適用於與靶向PNPLA3之dsRNA一起投予之示例性聯合療法包括，例如，advicor(Niacin/lovastatin，來自Kos Pharmaceuticals)、氨氯地平(amlodipine)/阿托伐他汀(Pfizer)、以及依澤替米貝/辛伐他汀(例如，Vytorin® 10/10、10/20、10/40及10/80錠劑，由Merck/Schering-Plough Pharmaceuticals製造)。用於治療高三酸甘油酯血症並且適用於與靶向PNPLA3之dsRNA聯合投予的藥劑包括，例如，洛伐他汀菸鹼酸Altoprev®延長釋放錠劑(Andrx Labs)、洛伐他汀Caduet®錠劑(Pfizer)、氨氯地平苯磺酸酯、阿托伐他汀鈣Crestor®錠劑(AstraZeneca)、羅素伐他汀鈣Lescol®膠囊(Novartis)、氟伐他汀鈉Lescol®(Reliant,Novartis)、氟伐他汀鈉Lipitor®錠劑(Parke-Davis)、阿托伐他汀鈣Lofibra®膠囊(Gate)、Niaspan延長釋放錠劑(Kos)、菸鹼酸 Pravachol錠劑(Bristol-Myers Squibb)、普伐他汀鈉TriCor®錠劑(Abbott)、非諾貝特Vytorin® 10/10錠劑(Merck/Schering-Plough Pharmaceuticals)、依澤替米貝辛伐他汀WelCholTM錠劑(Sankyo)、鹽酸考來維侖(colesevelam hydrochloride)Zetia®錠劑(Schering)、依澤替米貝Zetia®錠劑(Merck/Schering-Plough Pharmaceuticals)、以及依澤替米貝Zocor®錠劑(Merck)。
於一些態樣中，本發明提出的iRNA可與例如下列者一起投予：吡哆醇、ACE抑制劑(血管張力素轉化酶抑制劑)如貝那普利(benazepril(Lotensin))；血管張力素II受體拮抗劑(ARB)(如，氯沙坦鉀，例如，Merck公司之Cozaar®)，如，坎地沙坦(Atacand)；HMG-CoA還原酶抑制劑(如，他汀)；鈣結合劑，如磷酸纖維素鈉(Calcibind)；營養物質，如，噻嗪類營養物質如鹽酸噻嗪(Microzide)；胰島素敏化劑，如PPARγ激動劑吡格列酮、glp-1r激動劑如利拉魯肽(liraglutatide)、維生素E、SGLT2抑制劑、DPPIV抑制劑、及腎臟/肝臟移植物；或前述者之任意組合。
於一個態樣中，iRNA劑與依澤替米貝/辛伐他汀組合(例如，Vytorin®(Merck/Schering-Plough Pharmaceuticals))聯合投予。於一個態樣中，將iRNA劑投予至患者，然後將額外治療劑投予至患者(反之亦然)。於另一態樣中，iRNA劑與額外治療劑同時投予。
該iRNA劑及額外治療劑及/或治療可同時投予及/或在同一組合中投予，例如腸胃外投予，或該額外治療劑可作為獨立組成物之一部分或在獨立之時間及/或藉由該領域中已知或本文中揭示之另一方法投予。
於一個態樣中，iRNA劑與依澤替米貝/辛伐他汀組合(例如，Vytorin®(Merck/Schering-Plough Pharmaceuticals))聯合投予。於一個態樣中，將iRNA劑投予至患者，然後將額外治療劑投予至患者(反之亦然)。於另一態樣中，iRNA劑與額外治療劑同時投予。
該iRNA劑及額外治療劑及/或治療可同時投予及/或在同一組合中投予，例如腸胃外投予，或該額外治療劑可作為獨立組成物之一部分或在獨立之時間及/或藉由該領域中已知或本文中揭示之另一方法投予。
VIII.套組
於某些方面，本揭露提供包括合適容器之套組，該容器含有siRNA化合物例如雙股siRNA化合物或siRNA化合物(例如，前驅物，例如，可加工為siRNA化合物之較大siRNA化合物，或編碼siRNA化合物之DNA，例如，雙股siRNA化合物、或ssiRNA化合物或其前驅物)。
此類套組包括一種或多種dsRNA劑及使用說明，例如，用於投予預防或治療有效量之dsRNA劑的使用說明書。dsRNA劑可處於小瓶內或預填充之注射器內。套組可視需要復包含用於投予dsRNA劑之機構(例如，注射裝置，諸如預填充之注射器)或用於量測對PNPLA3之抑制的機構(例如，用於量測對PNPLA3 mRNA、PNPLA3蛋白質及/或PNPLA3活性之抑制的機構)。此類用於量測對PNPLA3之抑制的裝置可包含用於從個體獲得樣本例如血漿樣本的裝置。本發明之套組可視需要復包含用於測定治療有效量或預防有效量的裝置。
於某些態樣中，醫藥製劑之個體組分可提供於一個容器例如小瓶或預填充之注射器內。另選地，可能所欲者係將醫藥製劑之組分單獨 提供於兩個或更多個容器中，例如，一個用於siRNA化合物製備的容器以及至少另一個用於載體化合物的容器。套組可包裝成多種不同組態，諸如一個盒子中之一個或多個容器。不同組分可組合，例如，根據套組提供之使用說明書組合。組分可根據本文所揭示之方法組合，例如以製備並投予一種醫藥組成物。套組亦可包括遞送裝置。
本發明藉由下述實施例進一步示例性說明，該等實施例不應視為限制性。本說明書通篇所引用之全部參考文獻、專利及公佈專利申請之整體內容以及非正式序列表及圖式藉由引用而併入本文。
實施例
實施例1：iRNA合成
試劑之來源
若本文中未具體給出試劑之來源，則測量試劑可從任何分子生物學用試劑供應商以用於分子生物學應用之品質/純度標準獲得。
siRNA設計
使用定制之R及Python腳本(script)設計靶向人類含有類Patatin磷脂酶結構域3(PNPLA3)基因(人類：NCBI refseqID NM_025225.2；NCBI GeneID：80339)的siRNA。人類NM_025225.2 REFSEQ mRNA之長度為2805個鹼基。
未修飾之PNPLA3有義股及反義股核苷酸序列的詳細列述顯示於表2中。經修飾之PNPLA3有義股及反義股核苷酸序列的詳細列述顯示於表3中。
應理解，本申請通篇中，不具小數之雙鏈體名稱等同於具有小數之雙鏈體名稱，其僅引用雙鏈體之批號。例如，AD-959917等同於AD-959917.1。
siRNA合成
siRNA係使用本領域已知之方法設計、合成及製備。
簡而言，使用Mermade 192合成儀(BioAutomation)，於固體支撐物上使用亞膦醯胺化學作用，以1μmol規格合成siRNA序列。固體支撐物係負載有定制GalNAc配體(3’-GalNAc接合物)的受控之多孔玻璃(500至1000Å)、通用固體支撐物(AM Chemicals)或感興趣之第一核苷酸。輔助合成試劑及標準2-氰基乙基亞膦醯胺單體(2’-去氧-2’-氟、2’-O-甲基、RNA、DNA)係獲自Thermo-Fisher(Milwaukee,WI)、Hongene(China)或Chemgenes(Wilmington,MA,USA)。另外之亞膦醯胺單體係自供應商處購得、於現場製備、或使用來自各種CMO之定制合成獲得。亞膦醯胺以100mM之濃度於乙腈或9：1乙腈：DMF中製備，並使用5-乙硫基-1H-四唑(ETT，於乙腈中之0.25M溶液)偶聯，反應時間為400秒。亞膦醯胺鏈結使用3-((二甲胺基-亞甲基)胺基)-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT，獲自Chemgenes(Wilmington,MA,USA))之100mM溶液於無水乙腈/吡啶(9：1v/v)中生成。氧化時間係5分鐘。全部序列皆合成為最終去除DMT(「DMT-off」)。
一旦固相合成完成，即將固體支撐之寡核苷酸以300μL之甲胺(40%水溶液)於室溫在96孔板中處理大約2小時，以造成從固體支撐物裂解以及後續之全部另外之鹼不穩定保護基團的去除。對於含有經第三丁 基二甲基矽烷基(TBDMS)基團保護之任意天然核糖核苷酸鏈結(2’-OH)的序列，係使用TEA.3HF(三乙胺三氫氟酸鹽)執行去保護步驟。向每一種於甲胺水溶液中之寡核苷酸溶液中加入200μL之二甲基亞碸(DMSO)及300μL TEA.3HF，並將該溶液於60℃溫育大約30分鐘。溫育之後，令板來至室溫，藉由加入1mL之9：1乙腈：乙醇或1：1乙醇：異丙醇而將粗製寡核苷酸沉澱。然後將板於4℃離心45分鐘，在多通道滴管之輔助下小心地傾倒上清液。將寡核苷酸球丸重新懸浮於20mM NaOAc中，接著，於配備自動採樣器、UV偵測器、電導計及級分收集齊之Agilent LC系統上，使用HiTrap尺寸排阻管柱(5mL，GE Healthcare)脫鹽。經脫鹽之樣本係收集於96孔板中，然後藉由LC-MS及UV分光光度計分析以分別證實材料之身份並定量。
於Tecan液體操作機器人上執行單一股之雙鏈體化。於96孔板中，將有義及反義單一股以等莫耳比率於1x PBS中合併至10μM之最終濃度，將板密封，於100℃溫育10分鐘，之後令其在2至3小時之時間段內緩慢回至室溫。證實了每種雙鏈體之濃度及身份，然後將其用於體外篩查檢定中。
實施例2：活體外篩查方法
Hep3B細胞培養及384孔轉染
令Hep3b及HepG2細胞(ATCC,Manassas,VA)於were grown to near confluence at 37℃在5% CO2氣氛下於Eagle氏最小必需培養基(Gibco)中生長至接近融合，於藉由胰蛋白酶化而自板釋放之前，以10% FBS(ATCC)補充該培養基。藉由下述者轉染細胞：於384孔板之每 一孔中，將每孔14.8μl之Opti-MEM加上0.2μl至Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen，Carlsbad CA目錄# 13778-150)加入5μl之各siRNA雙鏈體中。然後將混合物於室溫下溫育15分鐘。隨後，將含有~2 x104Hep3B或HepG2細胞之80μl的無抗生素培養基加至siRNA混合物中。將細胞孵育24小時，之後進行RNA純化。以50nM、10nM及1nM之最終雙鏈體濃度，執行單劑量實驗。
使用DYNABEADS mRNA單離套組進行之總RNA單離：(Invitrogen TM ，零件編號：610-12)
於每一孔中，將細胞於含有3μL珠的75μl之裂解/結合緩衝液中裂解，並於靜電振盪器上混合10分鐘。使用磁性板支撐物，於Biotek EL406上自動執行洗滌步驟。珠於緩衝液A中洗滌(在90μL中)一次，在緩衝液B中洗滌一次，並且在緩衝液E中洗滌兩次，每兩次洗滌之間執行抽吸步驟。最後一次抽吸之後，將完整的10μL RT混合物添加到每一孔中，如下所揭示。
使用高能cDNA逆轉錄套組(Applied Biosystems,Foster City,CA,Cat #4368813)之cDNA合成
於每一反應中，將1μl 10X緩衝液、0.4μl 25X dNTP、1μl隨機引子、0.5μl逆轉錄酶、0.5μl RNase抑制劑及6.6μl之H2O的預混液添加到每孔中。將板密封，於靜電振盪器上攪動10分鐘，隨後於37℃溫育2小時。此後，將板於80℃攪動8分鐘。
實時PCR
於384孔板(Roche目錄號04887301001)之每孔中，將2微升(μl)之cDNA加入含有0.5μl人類PNPLA3 TaqMan探針(4326317E)、0.5μl人類PNPLA3、2μl無核酸酶水及5μl Lightcycler 480探針預混液(Roche目錄號04887301001)的預混液中。實時PCR係於LightCycler480實時PCR系統(Roche)中進行。
為了計算相對倍數改變，使用△△Ct方法分析資料並將該資料歸一化至使用以10nM AD-1955轉染或模擬轉染之細胞實施的檢定。使用以XLFit進行之4參數擬合模型計算IC50，並歸一化至以AD-1955轉染或模擬轉染之細胞AD-1955之有義及反義序列為：有義cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT(SEQ ID NO：18)及反義UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT(SEQ ID NO：19)。
於Hep3b細胞中進行之表1及表2所列dsRNA劑的篩查結果顯示於表4中。於HepG2細胞中進行之表1及表2所列dsRNA劑的篩查結果顯示於表5中。
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實施例3：靶向PNPLA3之額外雙鏈體
靶向人類PNPLA3基因之額外雙鏈體係使用定制R及Python腳本(script)設計並合成，如上文所揭示。
未修飾之PNPLA3有義股及反義股核苷酸序列的詳細列述顯示於表6中。經修飾之PNPLA3有義股及反義股核苷酸序列的詳細列述顯示於表7中。
該等額外劑之單劑量篩查係藉由自由攝入及轉染執行，如上文所揭示。
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實施例4：dsRNA雙鏈體於小鼠中之活體內篩查
對感興趣之從上述活體外研究鑑定之雙鏈體進行活體內評估。具體而言，於給藥前之第-14天，藉由靜脈內投予，以2 x 1010編碼人類PNPLA3之腺相關病毒8(AAV8)載體的病毒顆粒轉導野生型小鼠(C57BL/6)。特定而言，向小鼠投予編碼人類PNPLA3 mRNA之一部分的AAV8，該AAV8編碼指稱為NM_025225.2之人類PNPLA3 mRNA之開讀框及3’UTR，稱為AAV8-TBG-PI-PNPLA3。
於第0天，對三個小鼠之群組經皮下投予10mg/kg之單次劑量的感興趣之劑或PBS對照物。表8提供治療群組，而表9提供感興趣之雙鏈體。於給藥後之第14天，犧牲動物，收集肝臟樣本並於液氮中速凍。提取肝臟mRNA並藉由RT-QPCR方法分析。
將人類PNPLA3 mRNA量級與管家基因GAPDH比較。隨後將該值標準化至PBS介導物對照群組之平均值。資料係表達為相對於基線值之百分比，並呈現為均值加上標準差。列述於表10中並顯示於圖2中之結果表明，所測試之示例性雙鏈體劑於活體內有效地減低了人類PNPLA3信使RNA之量級。
Figure 111120479-A0202-12-0253-134
Figure 111120479-A0202-12-0253-135
雙鏈體AD-519347之有義及反義股的未修飾之核苷酸序列為：有義5’-CAUUAGGAUAAUGUCUUAUGU-3’；反義5’-ACAUAAGACAUUAUCCUAAUGGG-3’。
雙鏈體AD-519347之有義及反義股的經修飾之核苷酸序列為：有義5’-csasuuagGfaUfAfAfugucuuauguL96-3’；反義5’-asCfsauaAfgAfCfauuaUfcCfuaaugsgsg-3’。
Figure 111120479-A0202-12-0254-136
均等物
彼等所屬技術領域中具有通常知識者應知悉或能夠僅使用一般實驗來探明本文所揭示之具體態樣及方法的多種均等物。此類均等物擬涵蓋於下列申請專利範圍之範疇內。

Claims (79)

  1. 一種用於抑制含有類Patatin磷脂酶結構域3(PNPLA3)在細胞之表現的雙股核糖核酸(dsRNA)劑，其中，該dsRNA劑包含形成雙股區域之有義股及反義股，其中，該反義股包含與編碼PNPLA3之mRNA互補之區域，以及其中，該互補之區域包含與表2、表3、表6及表7的任一者中之任一反義核苷酸序列相異不超過3個核苷酸的至少15個接續核苷酸。
  2. 一種用於抑制含有類Patatin磷脂酶結構域3(PNPLA3)在細胞之表現的雙股核糖核酸(dsRNA)劑，其中，該dsRNA劑包含形成雙股區域之有義股及反義股，其中，該有義股包含與SEQ ID NO：1之核苷酸187-209、214-238、219-245、283-305、351-379、361-391、395-419、416-439、472-494、483-506、570-598、618-649、631-654、636-659、640-662、643-677、676-710、740-772、782-805、803-825、810-842、864-905、905-927、910-934、919-942、953-983、1062-1087、1069-1097、1078-1108、1094-112、1164-1187、1170-1199570570570、1180-1212、1196-1224、1234-1262、1259-1297、1278-1318、1326-1351、1382-1411、1518-1545、1543-1568、1549-1574、1575-1597、1621-1643、1644-1692、1676-1700、1712-1734、1719-1745、1733-1778、1733-1760、1739-1770、1749-1778、1829-1856、1865-1890、1900-1925、2076-2098、2121-2148、2175-2208或2243-2265的核苷酸序列中之任一者相異不超過三個核苷酸的至少15個接續核苷酸，以及該反義股包含來自SEQ ID NO：2之相應核苷酸序列的至少15個接續核苷酸。
  3. 一種用於抑制含有類Patatin磷脂酶結構域3(PNPLA3)在細胞之表現的雙股核糖核酸(dsRNA)劑，其中，該dsRNA包含形成雙股區域之有義股及反義股，其中，該有義股包含與SEQ ID NO：1之核苷酸687-709、1182-1204、1201-1223、1738-1760或2186-2208之核苷酸序列中之任一者相異不超過三個核苷酸的至少15個接續核苷酸，以及該反義股包含來自SEQ ID NO：2之相應核苷酸序列的至少15個接續核苷酸。
  4. 如請求項1至3中任一項所述之dsRNA劑，其中，該反義股包含與選自由AD-1526902.2、AD-1526891.3、AD-1526820.3、AD-1526960.2及AD-1526996.2所組成之群組之劑的任一反義股核苷酸序列相異不超過三個核苷酸的至少15個接續核苷酸。
  5. 如請求項1至3中任一項所述之dsRNA劑，其中，該反義股包含與選自由AD-1526902.2、AD-1526891.3、AD-1526820.3及AD-1526960.2所組成之群組之劑的任一反義股核苷酸序列相異不超過三個核苷酸的至少15個接續核苷酸。
  6. 如請求項1至3中任一項所述之dsRNA劑，其中，該反義股包含與選自由AD-1526902.2、AD-1526891.3、AD-1526820.3及AD-1526960.2所組成之群組之劑的任一反義股核苷酸序列相異不超過兩個核苷酸的至少15個接續核苷酸。
  7. 如請求項1至3中任一項所述之dsRNA劑，其中，該反義股包含與選自由AD-1526902.2、AD-1526891.3、AD-1526820.3及AD-1526960.2所組成之群組之劑的任一反義股核苷酸序列相異不超過一個核苷酸的至少15個接續核苷酸。
  8. 如請求項1至3中任一項所述之dsRNA劑，其中，該有義股及該反義股包含與選自由AD-1526902.2、AD-1526891.3、AD-1526820.3及AD-1526960.2所組成之群組之劑的任一有義股及反義股核苷酸序列相異不超過三個核苷酸的至少15個接續核苷酸。
  9. 如請求項1至3中任一項所述之dsRNA劑，其中，該有義股及該反義股包含與選自由AD-1526902.2、AD-1526891.3、AD-1526820.3及AD-1526960.2所組成之群組之劑的任一有義股及反義股核苷酸序列相異不超過兩個核苷酸的至少15個接續核苷酸。
  10. 如請求項1至3中任一項所述之dsRNA劑，其中，該有義股及該反義股包含與選自由AD-1526902.2、AD-1526891.3、AD-1526820.3及AD-1526960.2所組成之群組之劑的任一有義股及反義股核苷酸序列相異不超過一個核苷酸的至少15個接續核苷酸。
  11. 如請求項1至3中任一項所述之dsRNA劑，其中，該有義股及該反義股包含選自由AD-1526902.2、AD-1526891.3、AD-1526820.3及AD-1526960.2所組成之群組之劑的有義股及反義股核苷酸序列。
  12. 如請求項1至3中任一項所述之dsRNA劑，其中，該有義股及該反義股由選自由AD-1526902.2、AD-1526891.3、AD-1526820.3及AD-1526960.2所組成之群組之劑的有義股及反義股核苷酸序列所組成。
  13. 如請求項1至12中任一項所述之dsRNA劑，其中，該dsRNA劑包含至少一個經修飾之核苷酸。
  14. 如請求項13所述之dsRNA劑，其中，該有義股之實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸；該反義股之實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸；或該有義股之實質上全部核苷酸以及該反義股之實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
  15. 如請求項14所述之dsRNA劑，其中，該有義股之全部核苷酸為經修飾之核苷酸；該反義股之全部核苷酸為經修飾之核苷酸；或該有義股之全部核苷酸以及該反義股之全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
  16. 如請求項13至15中任一項所述之dsRNA劑，其中，該經修飾之核苷酸之至少一者係選自由去氧核苷酸、3’-端去氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2’-O-甲基修飾之核苷酸、2’-氟修飾之核苷酸、2’-去氧修飾之核苷酸、鎖定之核苷酸、未鎖定之核苷酸、構形受限之核苷酸、約束之乙基核苷酸、無鹼基之核苷酸、2’-胺基修飾之核苷酸、2’-O-烯丙基修飾之核苷酸、2’-C-烷基修飾之核苷酸、2’-羥基修飾之核苷酸、2’-甲氧基乙基修飾之核苷酸、2’-O-烷基修飾之核苷酸、N-嗎啉基核苷酸、胺基磷酸酯、包含非天然鹼基之核苷酸、四氫呋喃修飾之核苷酸、1,5-失水己糖醇修飾之核苷酸、環己基修飾之核苷酸、包含硫代磷酸酯基團之核苷酸、包含甲基膦酸酯基團之核苷酸、包含5’-磷酸酯之核苷酸、包含5’-磷酸酯模擬物之核苷酸、熱去安定化之核苷酸、二醇修飾之核苷酸(GNA)、包含2’磷酸酯之核苷酸、及2-O-(N-甲基丙烯醯胺)修飾之核苷酸；及其組合所組成之群組。
  17. 如請求項13至15中任一項所述之dsRNA劑，其中，該等經修飾之核苷酸係選自由LNA修飾之核苷酸、HNA修飾之核苷酸、CeNA修飾之核苷酸、2’-甲氧基乙基修飾之核苷酸、2’-O-烷基修飾之核苷 酸、2’-O-烯丙基修飾之核苷酸、2’-C-烯丙基修飾之核苷酸、2’-氟修飾之核苷酸、2’-去氧修飾之核苷酸、2’-羥基修飾之核苷酸、2’-O-甲基修飾之核苷酸、2’-鹵基修飾之核苷酸及二醇修飾之核苷酸；及其組合所組成之群組。
  18. 如請求項13至15中任一項所述之dsRNA，其中，該經修飾之核苷酸中的至少一者係選自由去氧核苷酸、2’-O-甲基修飾之核苷酸、2’-氟修飾之核苷酸、2’-去氧修飾之核苷酸、二醇修飾之核苷酸(GNA)、包含2’磷酸酯之核苷酸、乙烯基-膦酸酯修飾之核苷酸；及其組合所組成之群組。
  19. 如請求項13至15中任一項所述之dsRNA，其中，該等經修飾之核苷酸中的至少一者為熱去安定化核苷酸修飾。
  20. 如請求項19所述之dsRNA，其中，該熱去安定化核苷酸修飾係選自由無鹼基之修飾；與雙鏈體中相反核苷酸之錯配；以及去安定化糖修飾、2’-去氧修飾、非環狀核苷酸、未鎖定之核酸(UNA)、以及甘油核酸(GNA)所組成之群組。
  21. 如請求項1至20中任一項所述之dsRNA劑，其中，該雙股區域係19至30個核苷酸對之長度。
  22. 如請求項21所述之dsRNA劑，其中，該雙股區域係19至25個核苷酸對之長度。
  23. 如請求項21所述之dsRNA劑，其中，該雙股區域係19至23個核苷酸對之長度。
  24. 如請求項21所述之dsRNA劑，其中，該雙股區域係23至27個核苷酸對之長度。
  25. 如請求項21所述之dsRNA劑，其中，該雙股區域係21至23個核苷酸對之長度。
  26. 如請求項1至25中任一項所述之dsRNA劑，其中，各股係獨立地為不超過30個核苷酸之長度。
  27. 如請求項1至26中任一項所述之dsRNA劑，其中，該有義股係21個核苷酸之長度，以及該反義股係23個核苷酸之長度。
  28. 如請求項1至27中任一項所述之dsRNA劑，其中，該互補之區域係至少17個核苷酸之長度。
  29. 如請求項1至27中任一項所述之dsRNA劑，其中，該互補之區域係介於19至23個核苷酸之間的長度。
  30. 如請求項1至28中任一項所述之dsRNA劑，其中，該互補之區域係19個核苷酸之長度。
  31. 如請求項1至30中任一項所述之dsRNA劑，其中，至少一股包含具有至少1個核苷酸的3’突出。
  32. 如請求項1至30中任一項所述之dsRNA劑，其中，至少一股包含具有至少2個核苷酸的3’突出。
  33. 如請求項1至32中任一項所述之dsRNA劑，復包含配體。
  34. 如請求項33所述之dsRNA劑，其中，該配體係接合至該dsRNA劑之有義股的3’末端。
  35. 如請求項33或34所述之dsRNA劑，其中，該配體包含N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)衍生物。
  36. 如請求項33至35中任一項所述之dsRNA劑，其中，該配體包含透過單價、二價或三價分支鏈之鏈結子接附的一個或多個GalNAc衍生物。
  37. 如請求項35或36所述之dsRNA劑，其中，該配體包含
    Figure 111120479-A0202-13-0007-137
  38. 如請求項37所述之dsRNA劑，其中，該dsRNA劑係接合至如下述式中所示之配體
    Figure 111120479-A0202-13-0007-138
    以及，其中，X為O或S。
  39. 如請求項38所述之dsRNA劑，其中，X為O。
  40. 如請求項1至39中任一項所述之dsRNA劑，其中，該dsRNA劑包含至少一個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結。
  41. 如請求項40所述之dsRNA劑，其中，該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結係位於一股之3’-端。
  42. 如請求項41所述之dsRNA劑，其中，該股係該反義股。
  43. 如請求項41所述之dsRNA劑，其中，該股係該有義股。
  44. 如請求項40所述之dsRNA劑，其中，該硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結係位於一股之5’-終端。
  45. 如請求項44所述之dsRNA劑，其中，該股係該反義股。
  46. 如請求項44所述之dsRNA劑，其中，該股係該有義股。
  47. 如請求項40所述之dsRNA劑，其中，該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結係位於一股之5’-終端及3’-終端兩處。
  48. 如請求項47所述之dsRNA劑，其中，該股係該反義股。
  49. 如請求項1至48中任一項所述之dsRNA劑，其中，位於該雙鏈體之反義股5’-末端之位置1的鹼基對係AU鹼基對。
  50. 一種細胞，其含有如請求項1至49中任一項所述之dsRNA劑。
  51. 一種用於抑制編碼含有類Patatin磷脂酶結構域3(PNPLA3)之基因之表現的醫藥組成物，其包含如請求項1至49中任一項所述之dsRNA劑。
  52. 如請求項51所述之醫藥組成物，其中，該dsRNA劑係在非緩衝溶液中。
  53. 如請求項52所述之醫藥組成物，其中，該非緩衝溶液係鹽水或水。
  54. 如請求項51所述之醫藥組成物，其中，該dsRNA劑係在緩衝溶液中。
  55. 如請求項54所述之醫藥組成物，其中，該緩衝溶液包含醋酸鹽、枸據酸鹽、醇溶蛋白、碳酸鹽或磷酸鹽或其組合。
  56. 如請求項54所述之醫藥組成物，其中，該緩衝溶液係磷酸鹽緩衝液(PBS)。
  57. 一種抑制含有類Patatin磷脂酶結構域3(PNPLA3)基因在細胞中之表現的方法，該方法包括令該細胞與如請求項1至49中任一項所述之dsRNA劑接觸，或與如請求項51至56中任一項所述之醫藥組成物接觸，從而抑制PNPLA3在細胞中之表現。
  58. 如請求項57所述之方法，其中，該細胞係在個體內。
  59. 如請求項58所述之方法，其中，該個體係人類。
  60. 如請求項58所述之方法，其中，該個體患有PNPLA3相關疾患。
  61. 如請求項60所述之方法，其中，該PNPLA3相關疾患係選自由脂肪肝(脂肪變性)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝臟之硬化、脂肪於肝臟中之蓄積、肝臟之發炎、肝細胞壞死、肝臟纖維化、肥胖及非酒精性脂肪肝病(NAFLD)所組成之群組。
  62. 如請求項57至61中任一項所述之方法，其中，令該細胞與該dsRNA劑接觸將PNPLA3之表現抑制至少50%、60%、70%、80%、90%或95%。
  63. 如請求項57至62中任一項所述之方法，其中，抑制PNPLA3之表現將該個體血清中之PNPLA3蛋白質量級降低至少50%、60%、70%、80%、90%或95%。
  64. 一種治療患有將會受益於含有類Patatin磷脂酶結構域3(PNPLA3)表現減低之疾患的個體的方法，該方法包括對該個體投予治療有效量的如請求項1至49中任一項所述之dsRNA劑或如請求項51至56中任一項所述之醫藥組成物，從而治療患有將會受益於PNPLA3表現減低之該疾患的該個體。
  65. 一種預防患有將會受益於含有類Patatin磷脂酶結構域3(PNPLA3)表現減低之疾患的個體之至少一種症候的方法，該方法包括對該個體投予預防有效量的如請求項1至49中任一項所述之dsRNA劑或如請求項51至56中任一項所述之醫藥組成物，從而預防患有將會受益於PNPLA3表現減低之該疾患的該個體之至少一種症候。
  66. 如請求項64或65所述之方法，其中，該疾患係PNPLA3相關疾患。
  67. 如請求項66所述之方法，其中，該PNPLA3相關疾患係選自由脂肪肝(脂肪變性)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝臟之硬化、脂肪於肝臟中之蓄積、肝臟之發炎、肝細胞壞死、肝臟纖維化、肥胖及非酒精性脂肪肝病(NAFLD)所組成之群組。
  68. 如請求項66所述之方法，其中，該PNPLA3相關疾患為NAFLD。
  69. 如請求項66所述之方法，其中，該個體係人類。
  70. 如請求項64或65所述之方法，其中，將該劑投予該個體引起PNPLA3蛋白質蓄積之降低。
  71. 如請求項64至70中任一項所述之方法，其中，該dsRNA劑係以約0.01mg/kg至約50mg/kg之劑量投予該個體。
  72. 如請求項64至71中任一項所述之方法，其中，該dsRNA劑係經皮下投予該個體。
  73. 如請求項64至72中任一項所述之方法，復包含確定來自該個體之樣本中PNPLA3的量級。
  74. 如請求項73所述之方法，其中，該個體樣本中PNPLA3的量級係血液或血清樣本中PNPLA3蛋白質量級。
  75. 如請求項64至74中任一項所述之方法，復包含將用於治療PNPLA3相關疾患之額外治療劑投予該個體。
  76. 一種套組，其包含如請求項1至49中任一項所述之dsRNA劑或如請求項51至56中任一項所述之醫藥組成物。
  77. 一種小瓶，其包含如請求項1至49中任一項所述之dsRNA劑或如請求項51至56中任一項所述之醫藥組成物。
  78. 一種注射器，其包含如請求項1至49中任一項所述之dsRNA劑或如請求項51至56中任一項所述之醫藥組成物。
  79. 一種RNA誘導型緘默化複合體(RISC)，其包含如請求項1至49中任一項所述之反義股。
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