TW202309280A - 跨膜絲胺酸蛋白酶６（ＴＭＰＲＳＳ６）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法 - Google Patents

跨膜絲胺酸蛋白酶６（ＴＭＰＲＳＳ６）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本發明係關於靶向跨膜絲胺酸蛋白酶6(Transmembrane protease,serine 6，TMPRSS6)基因之RNAi劑，例如，雙股RNA(dsRNA)劑。本發明亦關於使用此類RNAi劑來抑制TMPRSS6基因之表現的方法以及預防及治療TMPRSS6相關疾患的方法，該等疾患為，例如，與鐵過載相關之疾患及/或無效性紅血球生成之疾患，例如，遺傳性血鐵沉積症、β-地中海型貧血(例如，重度β-地中海型貧血及中度β-地中海型貧血)、真性紅血球增多症、骨髓化生不良症候群、先天性紅血球生成不良性貧血、丙酮酸鹽激酶缺乏、造紅血球性紫質沉著病、帕金森氏症、阿茲海默氏症及弗里德希氏共濟失調。

Description

跨膜絲胺酸蛋白酶6(TMPRSS6)iRNA組成物及其使用方法
相關申請
本申請案主張於2021年4月26日遞交之美國臨時專利申請案第63/179,607號及2021年11月11日遞交之美國臨時專利申請案第63/278,227號之優先權。前述申請案各自之整體內容係藉由引用併入本文。
序列表
本申請含有序列表，其業經以ASCII格式提交電子版，且係藉由引用以其整體併入本文。所述ASCII副本於2022年4月18日建立，名為121301_15420_SL.TXT，大小為673,291位元組。
本發明係關於跨膜絲胺酸蛋白酶6(TMPRSS6)iRNA劑及使用此iRNA劑抑制TMPRSS6基因之表現以及預防及/或治療TMPRSS6相關疾患的方法。
TMPRSS6(跨膜絲胺酸蛋白酶6)，亦稱為蛋白裂解酶(matriptase)-2，係一種第II型絲胺酸蛋白酶。其主要在肝臟中表現，但高含量之TMPRSS6 mRNA亦見於腎臟中，而在子宮中含量較低，且在多種其他組織中偵檢到的量低得多(Beliveau et al.,2019,Cell Chemical Biology 26,1559-1572)。TMPRSS6經由調控鐵調素(hepcidin)表現而在鐵恆定中發揮關鍵作用。鐵調素為一種肝源性肽激素，作為全身性鐵恆定之中心調節劑而為人所知，並且其產生之失衡導致一系列鐵疾患之發病機制。鐵調素藉由阻斷腸對膳食鐵之吸收以及鐵自巨噬細胞及肝細胞之釋放而發揮功能(Ganz T.2011,Blood,vol.117,17,4425-4433)。可透過由BMP共受體血幼素(hemojuvelin(HJV))媒介之BMP/SMAD依賴性訊號傳導級聯，因應於鐵而刺激鐵調素基因表現。TMPRSS6藉由裂解BMP共受體HJV來抑制BMP媒介之鐵調素上調，因此阻止BMP傳訊、SMAD易位至細胞核以及鐵調素轉錄活化，這引起鐵調素含量的下調(Finberg,K.E.,et al.,2010,Blood 115,3817-3826；Wang,C.Y.,et al.,2014 Front.Pharmacol.5,114)。
因此，TMPRSS6之抑制導致鐵調素含量增加，使其成為用於與鐵過載及不適當之低鐵調素相關之疾患及用於其中鐵限制係所欲者之疾患的有吸引力之藥理學標靶。多種疾患，諸如地中海型貧血、血鐵沉積症及某些類型之骨髓化生不良症候群(MDS)係與鐵過載相關，鐵過載係以鐵含量增加為特徵的狀況。鐵過載可在多種組織中導致過量鐵沉積，並可最終導致組織及器官損傷。此外，鐵限制在某些疾患諸如真性紅血球增多症中係所欲者。
目前，對於與鐵過載相關之疾患及其中鐵限制係所欲者之疾患(例如，真性紅血球增多症)的治療包括靜脈切開術或靜脈切開放血術，其係從身體去除富鐵血液之治療；脾切除術；鐵螯合療法；及節食。惟，此等治療並非總 是有效。據此，本領域中對於用於患有與鐵過載相關之疾患之患者的替代性治療存在需求。
本發明係提供iRNA組成物，其影響編碼跨膜絲胺酸蛋白酶6(TMPRSS6)之基因之RNA轉錄物的RNA誘導型沉默複合物(RNA-induced silencing complex，RISC)媒介之裂解。TMPRSS6基因可處於細胞內，例如，受試者諸如人類受試者體內之細胞內。本發明亦提供使用本發明之iRNA組成物抑制TMPRSS6基因之表現及/或治療將會受益於抑制或降低TMPRSS6基因之表現之受試者的方法，該受試者例如罹患或經證實罹患TMPRSS6相關疾患的受試者，該疾患為，例如，鐵過載相關疾患及/或無效性紅血球生成之疾患，諸如地中海型貧血，例如，β-地中海型貧血、血鐵沉積症、骨髓化生不良症候群(MDS)或真性紅血球增多症。
據此，一方面，本發明係提供一種雙股核糖核酸(dsRNA)劑，其用於抑制跨膜絲胺酸蛋白酶6(TMPRSS6)在細胞內之表現，其中該dsRNA劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股，其中該反義股包含與編碼TMPRSS6之mRNA互補的區域，並且其中該互補的區域包含與表2至7中任一者中之任一反義核苷酸序列相異不超過0、1、2或3個核苷酸的至少15個，例如，15、16、17、18、19或20個連續核苷酸。
於一個態樣中，該dsRNA劑包含：正義股，其包含在其整個長度與表2至7中任一者中之任一正義股核苷酸序列具有至少85%，例如，85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核苷酸序 列同一性的連續核苷酸序列；及反義股，其包含在其整個長度與表2至7中任一者中之任一反義股序列具有至少85%，例如，85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核苷酸序列同一性的連續核苷酸序列。
於一個態樣中，該dsRNA劑包含：正義股，其包含與表2至7中任一者中之任一正義股核苷酸序列相異不超過三個核苷酸的至少15個，例如，15、16、17、18、19、20或21個連續核苷酸；及反義股，其包含與表2至7中任一者中之任一反義股核苷酸序列相異不超過三個核苷酸的至少15個，例如，15、16、17、18、19、20或21個連續核苷酸。
於一個態樣中，該dsRNA劑包含：正義股，其包含與表2至7中任一者中之任一正義股核苷酸序列相異不超過兩個核苷酸的至少15個，例如，15、16、17、18、19、20或21個連續核苷酸；及反義股，其包含與表2至7中任一者中之任一反義股核苷酸序列相異不超過兩個核苷酸的至少15個，例如，15、16、17、18、19、20或21個連續核苷酸。
於一個態樣中，該dsRNA劑包含：正義股，其包含與表2至7中任一者中之任一正義股核苷酸序列相異不超過一個核苷酸的至少15個，例如，15、16、17、18、19、20或21個連續核苷酸；及反義股，其包含與表2至7中任一者中之任一反義股核苷酸序列相異不超過一個核苷酸的至少15個，例如，15、16、17、18、19、20或21個連續核苷酸。
於一個態樣中，該dsRNA劑包含：正義股，其包含選自由表2至7中任一者中之任一正義股核苷酸序列所組成之群組的核苷酸序列或由其組 成；及反義股，其包含選自由表2至7中任一者中之任一反義股核苷酸序列所組成之群組的核苷酸序列或由其組成。
一方面，本發明係提供一種雙股核糖核酸(dsRNA)，其用於抑制跨膜絲胺酸蛋白酶6(TMPRSS6)在細胞中之表現，其中該dsRNA劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股，其中該正義股包含與SEQ ID NO：1之核苷酸187至210、227至254、322至363、362至390、398至420、404至429、410至435、439至461、443至467、448至474、460至483、466至488、496至519、519至542、526至548、557至593、641至671、652至676、687至713、725至762、757至794、886至908、921至951、956至987、1051至1082、1233至1269、1279至1313、1313至1341、1327至1351、1415至1439、1447至1480、1464至1486、1486至1509、1559至1589、1571至1595、1579至1609、1707至1735、1738至1764、1806至1828、1864至1886、1934至1966、1967至1991、2008至2031、2015至2043、2042至2072、2287至2311、2297至2354、2336至2361、2360至2384、2416至2438、2481至2510、2496至2527、2526至2558、2665至2693、2693至2719、2707至2729、2799至2821、2851至2874、2971至2999、2981至3006及3155至3195的核苷酸序列中之任一者相異不超過三個，例如，3、2、1或0個核苷酸的至少15個，例如，15、16、17、18、19、20或21個連續核苷酸，並且該反義股包含與SEQ ID NO：2之相對應核苷酸序列相異不超過3個，例如，3、2、1或0個核苷酸的至少15個連續核苷酸。
一方面，本發明係提供一種雙股核糖核酸(dsRNA)劑，其用於抑制跨膜絲胺酸蛋白酶6(TMPRSS6)在細胞中之表現，其中該dsRNA劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股，其中該正義股包含與SEQ ID NO：1之核苷酸230 至252、324至346、560至578、560至582、2338至2360、3163至3185、3169至3191及3172至3194的核苷酸序列中之任一者相異不超過三個，例如，3、2、1或0個核苷酸的至少15個，例如，15、16、17、18、19、20或21個連續核苷酸，並且該反義股包含與SEQ ID NO：2之相對應核苷酸序列相異不超過三個，例如，3、2、1或0個核苷酸的至少15個，例如，15、16、17、18、19、20或21個連續核苷酸。
一方面，本發明係提供一種雙股核糖核酸(dsRNA)劑，其用於抑制跨膜絲胺酸蛋白酶6(TMPRSS6)在細胞中之表現，其中該dsRNA劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股，其中該正義股包含與SEQ ID NO：1之核苷酸560至578、2338至2360及3169至3191的核苷酸序列中之任一者相異不超過三個，例如，3、2、1或0個核苷酸的至少15個，例如，15、16、17、18、19、20或21個連續核苷酸，並且該反義股包含與SEQ ID NO：2之相對應核苷酸序列相異不超過3個，例如，3、2、1或0個核苷酸的至少15個，例如，15、16、17、18、19、20或21個連續核苷酸。
於一個態樣中，該反義股包含與選自由AD-1556360、AD-1571158、AD-1571033、AD-1554875、AD-1571160、AD-1555117、AD-1554911及AD-1556915所組成之群組的雙鏈體之反義股核苷酸序列中之任一者相異不超過三個，例如，3、2、1或0個核苷酸的至少15個，例如，15、16、17、18、19、20或21個連續核苷酸。
於一個態樣中，該反義股包含與選自由AD-1556360、AD-1571158及AD-1571033所組成之群組的雙鏈體之反義股核苷酸序列中之任一者相異不 超過三個，例如，3、2、1或0個核苷酸的至少15個，例如，15、16、17、18、19、20或21個連續核苷酸。
於一個態樣中，該dsRNA劑包含至少一個經修飾之核苷酸。
於一個態樣中，該正義股之實質上全部核苷酸包含修飾；該反義股之實質上全部核苷酸包含修飾；或該正義股之實質上全部核苷酸及該反義股之實質上全部核苷酸包含修飾。
於一個態樣中，該正義股之全部核苷酸包含修飾；該反義股之全部核苷酸包含修飾；或該正義股之全部核苷酸及該反義股之全部核苷酸包含修飾。
於一個態樣中，該等經修飾之核苷酸之至少一者係選自由下列所組成之群組：去氧核苷酸、3'-端去氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修飾之核苷酸、2'-氟修飾之核苷酸、2'-去氧修飾之核苷酸、鎖定之核苷酸、未鎖定之核苷酸、構形限定之核苷酸、約束之乙基核苷酸、無鹼基之核苷酸、2'-胺基修飾之核苷酸、2'-O-烯丙基修飾之核苷酸、2'-C-烷基修飾之核苷酸、2'-羥基修飾之核苷酸、2'-甲氧基乙基修飾之核苷酸、2'-O-烷基修飾之核苷酸、N-嗎啉基核苷酸、胺基磷酸酯、包含非天然鹼基之核苷酸、四氫呋喃修飾之核苷酸、1,5-失水己糖醇修飾之核苷酸、環己烯基修飾之核苷酸、包含硫代磷酸酯基團之核苷酸、包含甲基膦酸酯基團之核苷酸、包含5'-磷酸酯之核苷酸、包含5'-磷酸酯模擬物之核苷酸、熱去安定化核苷酸、二醇修飾之核苷酸(GNA)、包含2'-磷酸酯之核苷酸及2-O-(N-甲基丙烯醯胺)修飾之核苷酸，及其組合。
於一個態樣中，核苷酸上之修飾係選自由下列所組成之群組：LNA、HNA、CeNA、2'-甲氧基乙基、2'-O-烷基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-氟、2'-去氧、2'-羥基及二醇；及其組合。
於一個態樣中，該等經修飾之核苷酸中之至少一者係選自由下列所組成之群組；去氧-核苷酸、2'-O-甲基修飾之核苷酸、2'-氟修飾之核苷酸、2'-去氧-修飾之核苷酸、二醇修飾之核苷酸(GNA)(例如，Ggn、Cgn、Tgn或Agn)、包含2'-磷酸酯之核苷酸(例如，G2p、C2p、A2p或U2p)及乙烯基-磷酸酯核苷酸；及其組合。
於一些態樣中，經修飾之核苷酸包含3'-端去氧胸苷核苷酸(dT)的短序列。
於一些態樣中，該dsRNA劑復包含至少一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。於一些態樣中，該dsRNA劑包含6至8個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。於一個態樣中，該硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結係位於一股之3'-端。視需要，該股係反義股。於另一態樣中，該股係正義股。於相關態樣中，該硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結係位於一股之5'-端。視需要，該股係反義股。於另一態樣中，該股係正義股。於另一態樣中，該硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結係位於一股之5'-端及3'-端兩處。視需要，該股係反義股。於另一態樣中，該股係正義股。
該雙股區域可為19至30個核苷酸對之長度；19至25個核苷酸對之長度；19至23個核苷酸對之長度；23至27個核苷酸對之長度；或21至23個核苷酸對之長度。
於一個態樣中，各股獨立地為不超過30個核苷酸之長度。
於一個態樣中，該正義股為21個核苷酸之長度，且該反義股為23個核苷酸之長度。
該互補的區域可為至少17個核苷酸之長度；19至23個核苷酸之間之長度；或19個核苷酸之長度。
於一個態樣中，至少一股包含至少1個核苷酸的3'突出。於另一態樣中，至少一股包含至少2個核苷酸的3'突出。
於一個態樣中，該dsRNA劑復包含配體。
於一個態樣中，該配體係接合至該dsRNA劑之正義股的3'末端。
於一個態樣中，該配體係接合至該dsRNA劑之正義股的5'末端。
於一個態樣中，該配體為N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)衍生物。
於一個態樣中，該配體為透過單價、二價或三價分支鏈連接子接附的一個或多個N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)衍生物。
於一個態樣中，該配體為
Figure 111115644-A0202-12-0009-147
於一個態樣中，該dsRNA劑係如下述方案所示接合至配體
Figure 111115644-A0202-12-0010-148
以及，其中X為O或S。
於一個態樣中，X為O。
於一個態樣中，該dsRNA劑係如下述方案所示接合至配體
Figure 111115644-A0202-12-0010-149
於一個態樣中，該dsRNA劑復包含至少一個硫代磷酸酯類或甲基硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。
於一個態樣中，該硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結係位於一股，例如，該反義股或正義股之3'-端。
於另一態樣中，該硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結係位於一股，例如，該反義股或正義股之5'-端。
於一個態樣中，該硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結係位於一股之5'-端及3'-端兩處。於一個態樣中，該股係該反義股。
於一個態樣中，位於該雙鏈體之反義股之5'-末端位置1的鹼基對為AU鹼基對。
於一個態樣中，該正義股包含與5'-GACGCCACGCAUGCUGUGUGU-3'(SEQ ID NO：119)之核苷酸序列相異不超過0、1、2或3個核苷酸之至少17個連續核苷酸。
於一個態樣中，該正義股包含與5'-GACGCCACGCAUGCUGUGUGU-3'(SEQ ID NO：119)之核苷酸序列相異不超過0、1、2或3個核苷酸之至少19個連續核苷酸。
於一個態樣中，該正義股包含5'-GACGCCACGCAUGCUGUGUGU-3'(SEQ ID NO：119)之核苷酸序列或由其組成。
於一個態樣中，該反義股包含與5'-ACACACAGCAUGCGUGGCGUCAC-3'(SEQ ID NO：245)之核苷酸序列相異不超過0、1、2或3個核苷酸之至少17個連續核苷酸。
於一個態樣中，該反義股包含與5'-ACACACAGCAUGCGUGGCGUCAC-3'(SEQ ID NO：245)之核苷酸序列相異不超過0、1、2或3個核苷酸之至少19個連續核苷酸。
於一個態樣中，該反義股包含與5'-ACACACAGCAUGCGUGGCGUCAC-3'(SEQ ID NO：245)之核苷酸序列相異不超過0、1、2或3個核苷酸之至少21個連續核苷酸。
於一個態樣中，該反義股包含5'-ACACACAGCAUGCGUGGCGUCAC-3'(SEQ ID NO：245)之核苷酸序列或由其組成。
於一個態樣中，該正義股包含5'-GACGCCACGCAUGCUGUGUGU-3'(SEQ ID NO：119)之核苷酸序列，且該反義股包含5'-ACACACAGCAUGCGUGGCGUCAC-3'(SEQ ID NO：245)之核苷酸序列。
於一個態樣中，該正義股與5'-gsascgccacGfCfAfugcugugugu-3'(SEQ ID NO：371)之核苷酸序列相異不超過3個，例如，0、1、2或3個經修飾之核苷酸，其中a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；且s為硫代磷酸酯類鏈結。
於一個態樣中，該反義股與5'-asdCsacdAcdAgcaudGcGfuggcgucsasc-3'(SEQ ID NO：497)之核苷酸序列相異不超過3個，例如，0、1、2或3個經修飾之核苷酸，其中a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；其中dA、dG及dC分別為2`-去氧腺苷-3`-磷酸酯、2`-去氧鳥苷-3`-磷酸酯及2`-去氧胞苷-3`-磷酸酯；且s為硫代磷酸酯類鏈結。
於一個態樣中，該正義股包含5'-gsascgccacGfCfAfugcugugugu-3'(SEQ ID NO：371)之核苷酸序列，且該反義股包含5'-asdCsacdAcdAgcaudGcGfuggcgucsasc-3'(SEQ ID NO：497)之核苷酸序列，其中a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別 為2'-氟A、G、C及U；其中dA、dG及dC分別為2`-去氧腺苷-3`-磷酸酯、2`-去氧鳥苷-3`-磷酸酯及2`-去氧胞苷-3`-磷酸酯；且s為硫代磷酸酯類鏈結。
於一個態樣中，該正義股包含5'-gsascgccacGfCfAfugcuguguguL96-3'(SEQ ID NO：371)之核苷酸序列，且該反義股包含5'-asdCsacdAcdAgcaudGcGfuggcgucsasc-3'(SEQ ID NO：497)之核苷酸序列，其中a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；其中dA、dG及dC分別為2`-去氧腺苷-3`-磷酸酯、2`-去氧鳥苷-3`-磷酸酯及2`-去氧胞苷-3`-磷酸酯；s為硫代磷酸酯類鏈結；且L96為N-[參(GalNAc-烷基)-醯胺基癸醯基)]-4-羥基脯胺醇。
於一個態樣中，該正義股包含5'-gsascgccacGfCfAfugcugugugu-3'(SEQ ID NO：371)之核苷酸序列，且該反義股包含5'-asdCsacdAcdAgcaudGcGfuggcgucsasc-3'(SEQ ID NO：497)之核苷酸序列，其中a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；其中dA、dG及dC分別為2`-去氧腺苷-3`-磷酸酯、2`-去氧鳥苷-3`-磷酸酯及2`-去氧胞苷-3`-磷酸酯；且s為硫代磷酸酯類鏈結，其中該正義股之3'-末端係如下述方案所示接合至配體：
Figure 111115644-A0202-12-0013-150
以及，其中X為O。
於一個態樣中，該正義股包含與5'-CCUUUGGAAUAAAGCUGCCUU-3'(SEQ ID NO：844)之核苷酸序列相異不超過0、1、2或3個核苷酸之至少17個連續核苷酸。
於一個態樣中，該正義股包含與5'-CCUUUGGAAUAAAGCUGCCUU-3'(SEQ ID NO：844)之核苷酸序列相異不超過0、1、2或3個核苷酸之至少19個連續核苷酸。
於一個態樣中，該正義股包含5'-CCUUUGGAAUAAAGCUGCCUU-3'(SEQ ID NO：844)之核苷酸序列或由其組成。
於一個態樣中，該反義股包含與5'-AAGGCAGCUUUAUUCCAAAGGGC-3'(SEQ ID NO：1868)之核苷酸序列相異不超過0、1、2或3個核苷酸之至少17個連續核苷酸。
於一個態樣中，該反義股包含與5'-AAGGCAGCUUUAUUCCAAAGGGC-3'(SEQ ID NO：1868)之核苷酸序列相異不超過0、1、2或3個核苷酸之至少19個連續核苷酸。
於一個態樣中，該反義股包含與5'-AAGGCAGCUUUAUUCCAAAGGGC-3'(SEQ ID NO：1868)之核苷酸序列相異不超過0、1、2或3個核苷酸之至少21個連續核苷酸。
於一個態樣中，該反義股包含5'-AAGGCAGCUUUAUUCCAAAGGGC-3'(SEQ ID NO：1868)之核苷酸序列或由其組成。
於一個態樣中，該正義股包含5'-CCUUUGGAAUAAAGCUGCCUU-3'(SEQ ID NO：844)之核苷酸序列，且該反義股包含5'-AAGGCAGCUUUAUUCCAAAGGGC-3'(SEQ ID NO：1868)之核苷酸序列。
於一個態樣中，該正義股與5'-cscsuuugGfaAfUfAfaagcugccuu-3'(SEQ ID NO：2095)之核苷酸序列相異不超過3個，例如，0、1、2或3個經修飾之核苷酸，其中a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；且s為硫代磷酸酯類鏈結。
於一個態樣中，該反義股與5'-asAfsggdCa(G2p)cuuuauUfcCfaaaggsgsc-3'(SEQ ID NO：2324)之核苷酸序列相異不超過3個，例如，0、1、2或3個經修飾之核苷酸，其中a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；其中G2p為鳥苷-2'-磷酸酯；且s為硫代磷酸酯類鏈結。
於一個態樣中，該正義股包含5'-cscsuuugGfaAfUfAfaagcugccuu-3'(SEQ ID NO：2095)之核苷酸序列，且該反義股包含5'-asAfsggdCa(G2p)cuuuauUfcCfaaaggsgsc-3'(SEQ ID NO：2324)之核苷酸序列，其中a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；其中G2p為鳥苷-2'-磷酸酯；且s為硫代磷酸酯類鏈結。
於一個態樣中，該正義股包含5'-cscsuuugGfaAfUfAfaagcugccuuL96-3'(SEQ ID NO：2095)之核苷酸序列，且該反義股包含5'-asAfsggdCa(G2p)cuuuauUfcCfaaaggsgsc-3'(SEQ ID NO：2324)之核苷酸序列，其中a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、 Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；其中G2p為鳥苷-2'-磷酸酯；s為硫代磷酸酯類鏈結；且L96為N-[參(GalNAc-烷基)-醯胺基癸醯基)]-4-羥基脯胺醇。
於一個態樣中，該正義股包含5'-cscsuuugGfaAfUfAfaagcugccuu-3'(SEQ ID NO：2095)之核苷酸序列，且該反義股包含5'-asAfsggdCa(G2p)cuuuauUfcCfaaaggsgsc-3'(SEQ ID NO：2324)之核苷酸序列，其中a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；其中G2p為鳥苷-2'-磷酸酯；s為硫代磷酸酯類鏈結；並且其中該正義股之3'-末端係如下述方案所示接合至配體：
Figure 111115644-A0202-12-0016-151
以及，其中X為O。
於一個態樣中，該正義股包含與5'-UCACCUGCUUCUUCUGGUU-3'(SEQ ID NO：1686)之核苷酸序列相異不超過0、1、2或3個核苷酸之至少17個連續核苷酸。
於一個態樣中，該正義股包含5'-UCACCUGCUUCUUCUGGUU-3'(SEQ ID NO：1686)之核苷酸序列或由其組成。
於一個態樣中，該反義股包含與5'-AACCAGAAGAAGCAGGUGA-3'(SEQ ID NO：1790)之核苷酸序列相異不超過0、1、2或3個核苷酸之至少17個連續核苷酸。
於一個態樣中，該反義股包含5'-AACCAGAAGAAGCAGGUGA-3'(SEQ ID NO：1790)之核苷酸序列或由其組成。
於一個態樣中，該正義股包含5'-UCACCUGCUUCUUCUGGUU-3'(SEQ ID NO：1686)之核苷酸序列，且該反義股包含5'-AACCAGAAGAAGCAGGUGA-3'(SEQ ID NO：1790)之核苷酸序列。
於一個態樣中，該正義股與5'-UfcAfcCfuGfcUfuCfuUfcUfgGfsusUf-3'(SEQ ID NO：1974)之核苷酸序列相異不超過3個，例如，0、1、2或3個經修飾之核苷酸，其中a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；且s為硫代磷酸酯類鏈結。
於一個態樣中，該反義股與5'-asAfscCfaGfaAfgAfaGfcAfgGfusGfsa-3'(SEQ ID NO：)之核苷酸序列相異不超過3個，例如，0、1、2或3個經修飾之核苷酸，其中a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；且s為硫代磷酸酯類鏈結。
於一個態樣中，該正義股包含5'-UfcAfcCfuGfcUfuCfuUfcUfgGfsusUf-3'(SEQ ID NO：2203)之核苷酸序列，且該反義股包含5'-asAfscCfaGfaAfgAfaGfcAfgGfusGfsa-3'(SEQ ID NO：)之核苷酸序 列，其中a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；且s為硫代磷酸酯類鏈結。
於一個態樣中，該正義股包含5'-Q191sUfcAfcCfuGfcUfuCfuUfcUfgGfsusUf-3'(SEQ ID NO：1974)之核苷酸序列，且該反義股包含5'-asAfscCfaGfaAfgAfaGfcAfgGfusGfsa-3'(SEQ ID NO：2203)之核苷酸序列，其中a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；s為硫代磷酸酯類鏈結；且Q191為N-[參(GalNAc-烷基)-醯胺基十二烷醯基]-(S)-吡咯啶-3-醇-硫代磷酸酯(p-C12-(GalNAc-烷基)3)。
於一個態樣中，該正義股包含5'-UfcAfcCfuGfcUfuCfuUfcUfgGfsusUf-3'(SEQ ID NO：1974)之核苷酸序列，且該反義股包含5'-asAfscCfaGfaAfgAfaGfcAfgGfusGfsa-3'(SEQ ID NO：2203)之核苷酸序列，其中a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；且s為硫代磷酸酯類鏈結；其中該正義股之5'-末端係如下述方案所示接合至配體：
Figure 111115644-A0202-12-0018-152
於另一態樣中，該RNAi劑為其醫藥上可接受之鹽。本文之RNAi劑中之各者的「醫藥上可接受之鹽」包括但不限於，鈉鹽、鈣鹽、鋰鹽、鉀鹽、 銨鹽、鎂鹽、其混合物。本領域熟練人士將知悉，當該RNAi劑提供為多陽離子鹽時具有一個陽離子每視需要經修飾之磷酸二酯類主鏈及/或任何其他酸性修飾(例如，5'-端磷酸酯基團)的游離酸基團。例如，「n」核苷酸之長度的寡核苷酸含有n-1個視需要經修飾之磷酸二酯，使得21 nt之長度的寡核苷酸可提供為具有至多20個陽離子(例如，20個鈉陽離子)的鹽。類似地，具有21 nt之長度的正義股及23 nt之長度的反義股的RNAi劑可提供為具有至多42個陽離子(例如，42個鈉離子)的鹽。在前述實例中，若該RNAi劑亦包括5'-端磷酸酯或5'-端乙烯基膦酸酯基團，則該RNAi劑可提供為具有至多44個陽離子(例如，44個鈉陽離子)的鹽。
本發明亦提供含有本發明之任一dsRNA劑的細胞及包含本發明之任一dsRNA劑的醫藥組成物。
本發明之醫藥組成物可包括處於非患者溶液(例如，鹽水或水)中的dsRNA劑，或本發明之醫藥組成物可包括處於緩衝溶液(例如，包含醋酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶榖蛋白、碳酸鹽、磷酸鹽或其任意組合的緩衝溶液；或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS))中的dsRNA劑。
一方面，本發明係提供一種抑制跨膜絲胺酸蛋白酶6(TMPRSS6)基因在細胞內之表現的方法。該方法包括令該細胞與本發明之任一dsRNA或本發明之任一醫藥組成物接觸，從而抑制TMPRSS6基因在細胞內之表現。
於一個態樣中，該細胞處於受試者體內，該受試者為例如人類受試者例如，患有跨膜絲胺酸蛋白酶6(TMPRSS6)相關疾患的人類受試者，該疾患為諸如與鐵過載相關之疾患及/或無效性紅血球生成之疾患，例如，遺傳性血 鐵沉積症、β-地中海型貧血(例如，重度β-地中海型貧血及中度β-地中海型貧血)、真性紅血球增多症、骨髓化生不良症候群、先天性紅血球生成不良性貧血、丙酮酸鹽激酶缺乏、造紅血球性紫質沉著病、帕金森氏症、阿茲海默氏症及弗里德希氏共濟失調(Friedreich Ataxia)。
於一些態樣中，該TMPRSS6相關疾患為β-地中海型貧血。於一個態樣中，該TMPRSS6相關疾患為重度β-地中海型貧血。於另一態樣中，該TMPRSS6相關疾患為中度β-地中海型貧血。於一些態樣中，該TMPRSS6相關疾患為真性紅血球增多症。
於某些態樣中，該TMPRSS6表現被抑制至少約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。於一個態樣中，抑制TMPRSS6之表現將該受試者血清中之TMPRSS6蛋白含量減少至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。
於某些態樣中，令該細胞與該dsRNA劑接觸將鐵調素之表現增加至少50%、60%、70%、80%、90%或95%。於一個態樣中，增加鐵調素之表現將該受試者血清中之鐵調素蛋白含量增加至少50%、60%、70%、80%、90%或95%。
一方面，本發明係提供一種治療患有將會受益於跨膜絲胺酸蛋白酶6(TMPRSS6)表現降低之疾患之受試者的方法。該方法包括向受試者投予治療有效量的本發明之任一dsRNA或本發明之任一醫藥組成為，從而治療該患有將會受益於TMPRSS6表現降低之疾患的受試者。
另一方面，本發明係提供一種預防患有將會受益於跨膜絲胺酸蛋白酶6(TMPRSS6)表現降低之疾患之受試者之至少一種症狀的方法。該方法 包括向受試者投予預防有效量的本發明之任一dsRNA或本發明之任一醫藥組成物，從而預防患有將會受益於TMPRSS6表現降低之疾患之受試者的至少一種症狀。
於某些態樣中，該疾患為跨膜絲胺酸蛋白酶6(TMPRSS6)相關疾患，例如，與鐵過載相關之疾患及/或無效性紅血球生成之疾患，例如，遺傳性血鐵沉積症、β-地中海型貧血(例如，重度β-地中海型貧血及中度β-地中海型貧血)、真性紅血球增多症、骨髓化生不良症候群、先天性紅血球生成不良性貧血、丙酮酸鹽激酶缺乏、造紅血球性紫質沉著病、帕金森氏症、阿茲海默氏症及弗里德希氏共濟失調。
於一些態樣中，該TMPRSS6相關疾患為β-地中海型貧血。於一個態樣中，該TMPRSS6相關疾患為重度β-地中海型貧血。於另一態樣中，該TMPRSS6相關疾患為中度β-地中海型貧血。於一些態樣中，該TMPRSS6相關疾患為真性紅血球增多症。
於某些態樣中，向受試者投予dsRNA在該受試者中引起鐵含量、鐵蛋白含量及/或運鐵蛋白飽和度減少及/或TMPRSS6蛋白蓄積減少。於一些態樣中，向受試者投予dsRNA在該受試者中引起血紅素含量及/或血容比量級增加。
又一方面，本發明亦提供抑制TMPRSS6在受試者中之表現的方法。該方法包括向受試者投予治療有效量的本文所提供之任一dsRNA，從而抑制TMPRSS6在受試者中之表現。
於一個態樣中，該受試者為人類。
於一個態樣中，該dsRNA劑係以約0.01mg/kg至約50mg/kg之劑量向受試者投予。
於一個態樣中，該dsRNA劑係經皮下或經靜脈內向受試者投予。
於一個態樣中，本發明之方法包括進一步測定來自手術者之樣品中的TMPRSS6含量。
於一個態樣中，該受試者樣品中的TMPRSS6含量為血液、血清或肝臟樣品中的TMPRSS6蛋白含量。
於一個態樣中，本發明之方法包括進一步確定來自受試者之樣品中的鐵含量及/或鐵調素含量。
於某些態樣中，本發明之方法復包含向受試者投予額外治療劑。於一個態樣中，本發明之方法復包含向受試者投予鐵螯合劑，例如，去鐵酮(deferiprone)、去鐵胺(deferoxamine)及地拉羅司(deferasirox)。
本發明亦提供套組，其包含本發明之任一dsRNA或本發明之任一醫藥組成物，以及視需要，使用說明。於一個態樣中，本發明提供一種套組，其用於藉由令細胞與有效抑制TMPRSS6在該細胞內之表現的量的本發明之雙股RNAi劑接觸來實施抑制TMPRSS6基因在細胞內之表現的方法。該套組包含RNAi劑及使用說明，以及視需要，用於向受試者投予該RNAi劑的裝置。
本發明亦提供一種RNA誘導型沉默複合物(RISC)，其包含本發明之任一dsRNA劑的反義股。
圖1係示意圖，其描繪測定本文所揭露之dsRNA劑在食蟹獼猴體內的活體內功效。
圖2係曲線圖，其顯示在給藥後第21、22、57及85天，在經皮下投予單次3mg/kg或10mg/kg劑量之所指示之dsRNA雙鏈體的食蟹獼猴(n=3隻每組)體內保留的血清TMPRSS6 mRNA之百分比。TMPRSS6 mRNA含量係相對於從投予PBS作為對照的食蟹獼猴獲得之對照含量顯示。
圖3係曲線圖，其顯示在給藥後第1、8、15、22、29、36、43、50、57、64、71、78及85天，在經皮下投予單次3mg/kg或10mg/kg劑量之所指示之dsRNA雙鏈體的食蟹獼猴(n=3隻每組)中的血漿鐵含量，作為相對於給藥前含量之百分比。
圖4係曲線圖，其顯示在給藥後第1、8、15、22、29、36、43、50、57、64、71、78及85天，在經皮下投予單次3mg/kg或10mg/kg劑量之所指示之dsRNA雙鏈體的食蟹獼猴(n=3隻每組)中的百分比運鐵蛋白飽和度。
本發明係提供iRNA組成物，其影響跨膜絲胺酸蛋白酶6(TMPRSS6)基因之RNA轉錄物的RNA誘導型沉默複合物(RISC)媒介之裂解。該基因可處於細胞內，例如，受試者諸如人體內之細胞內。此等iRNA之使用使得哺乳動物中相對應基因(TMPRSS6)之mRNA的靶向降解成為可能。
本發明之iRNA業經設計為靶向人類跨膜絲胺酸蛋白酶6(TMPRSS6)基因，包括該基因的在其他哺乳動物物種之TMPRSS6異種同源物中守恆的部分。不欲受限於理論，咸信，前述特異性與此等iRNA中之特異性標靶 位點或特異性修飾的組合或亞組合賦予本發明之iRNA以改善之功效、安定性、效力、持久性及安全性。
據此，本發明係提供使用iRNA組成物治療及預防跨膜絲胺酸蛋白酶6(TMPRSS6)相關疾患的方法，該疾患為例如與鐵過載相關之疾患及/或無效性紅血球生成之疾患，例如，遺傳性血鐵沉積症、β-地中海型貧血(例如，重度β-地中海型貧血及中度β-地中海型貧血)、真性紅血球增多症、骨髓化生不良症候群、先天性紅血球生成不良性貧血、丙酮酸鹽激酶缺乏，該等組成物對TMPRSS6基因之RNA轉錄物的RNA誘導型沉默複合物(RISC)媒介之裂解具有效應。
本發明之iRNA包括RNA股(反義股)，該股具有至多約30個核苷酸之長度的區域，例如，19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24,20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22個核苷酸之長度，該區域係實質上與TMPRSS6基因之mRNA轉錄物的至少一部分互補。
於某些態樣中，本發明之雙股RNAi劑之一股或兩股係至多66個核苷酸之長度，如36至66、26至36、25至36、31至60、22至43、27至53個核苷酸之長度，具有一個實質上與TMPRSS6基因之mRNA轉錄物之至少一部分互補的至少19個連續核苷酸之區域。於一些態樣中，此類具有長度較長之反義股的iRNA劑可例如包括長度為20至60個核苷酸之第二RNA股(正義股)，其中該正義股與該反義股形成18至30個連續核苷酸之雙鏈體。
本發明之iRNA的使用使得哺乳動物中相對應基因(TMPRSS6基因)之mRNA的靶向降解成為可能。使用活體外檢定，本發明業經證明，靶向TMPRSS6基因之iRNA可強勁地媒介RNAi，導致TMPRSS6基因表現的顯著抑制。因此，包括此等iRNA之方法及組成物可用於治療患有TMPRSS6相關疾患之受試者，該疾患為例如與鐵過載相關之疾患及/或無效性紅血球生成之疾患，例如，遺傳性血鐵沉積症、β-地中海型貧血(例如，重度β-地中海型貧血及中度β-地中海型貧血)、真性紅血球增多症、骨髓化生不良症候群、先天性紅血球生成不良性貧血、丙酮酸鹽激酶缺乏、造紅血球性紫質沉著病、帕金森氏症、阿茲海默氏症及弗里德希氏共濟失調。
據此，本發明係提供使用iRNA組成物治療患有將會受益於抑制或降低TMPRSS6基因表現之疾患之受試者的方法，該疾患為例如跨膜絲胺酸蛋白酶6(TMPRSS6)相關疾病，諸如與鐵過載相關之疾患及/或無效性紅血球生成之疾患，例如，遺傳性血鐵沉積症、β-地中海型貧血(例如，重度β-地中海型貧血及中度β-地中海型貧血)、真性紅血球增多症、骨髓化生不良症候群、先天性紅血球生成不良性貧血、丙酮酸鹽激酶缺乏，該等組成物對TMPRSS6基因之RNA轉錄物的RNA誘導型沉默複合物(RISC)媒介之裂解具有效應。
本發明亦提供預防患有將會受益於抑制或降低TMPRSS6基因表現之疾患之受試者之至少一種症狀的方法，該疾患為，例如，與鐵過載相關之疾患及/或無效性紅血球生成之疾患，例如，遺傳性血鐵沉積症、β-地中海型貧血(例如，重度β-地中海型貧血及中度β-地中海型貧血)、真性紅血球增多症、骨髓化生不良症候群、先天性紅血球生成不良性貧血、丙酮酸鹽激酶缺乏、造紅血球性紫質沉著病、帕金森氏症、阿茲海默氏症及弗里德希氏共濟失調。
下述之詳細說明書揭露如何製作及使用含有用以抑制TMPRSS6基因表現之iRNA的組成物、用途、以及治療將會受益於TMPRSS6基因表現之抑制及/或降低之受試者的方法，該等受試者為例如易患或經診斷為患有TMPRSS6相關疾患之受試者。
I.定義
為了更容易地理解本發明，首先定義某些術語。此外，應注意，無論何時，當應用參數之數值或數值範圍，該等數值及處於該等所引用之數值中間的範圍亦作為本發明之一部分。
本文中使用之冠詞「一」指稱該冠詞之語法賓語的一者或超過一者(亦即，至少一者)。舉例而言，「一元件」意指一個元件或超過一個元件，例如，複數個元件。
本文中使用之術語「包括」意指「包括但不限於」，且與後者可互換地使用。
除非語境中明確排除，否則本文中使用之術語「或」意指「及/或」，且與後者可互換地使用。舉例而言，「正義股或反義股」係理解為「正義股或反義股或者正義股及反義股」。
本文中使用之術語「約」意指處於該領域中之公差範圍內。例如，「約」可理解為與均值偏離2標準偏差。於某些態樣中，約意指±10%。於某些態樣中，約意指±5%。當約存在於一系列數字或範圍之前時，係理解為「約」可修飾該一系列數字或範圍中之各者。
在一個數字或一系列數字之前的術語「至少」、「不少於」或「或更多」係理解為包括與該術語「至少」相鄰之數字以及全部後續數字或邏輯上可 以包括的整數，如自上下文清晰可見者。舉例而言，核酸分子中的核苷酸數目必須為整數。舉例而言，「21個核苷酸核酸分子的至少19個核苷酸」意指19、20或21個核苷酸具有所指示之特性。當「至少」存在於一系列數字或範圍之前時，係理解為「至少」可修飾該一系列數字或範圍中之各者。
如本文所用，「不超過」或「或更少」係理解為與該片語相鄰之值及邏輯上更低之值或整數，如自上下文清晰可見者，到零為止。舉例而言，具有「不超過2個核苷酸」突出的雙鏈體具有2、1或0個核苷酸突出。當「不超過存在於一系列數字或範圍之前時，係理解為「不超過」可修飾該一系列數字或範圍中之各者。如本文所用，範圍包括上限及下限兩者。
如本文所用，偵檢方法可包括對其存在之量低於該方法偵檢水準者之分析物的測定。
在所指示之標靶位點與正義股或反義股之核苷酸序列之間存在衝突的情況下，以所指示的序列為準。
在序列與其轉錄物或其他序列上所指示之位點之間存在衝突的情況下，以說明書中引述之核苷酸序列為準。
如本文所用，「跨膜絲胺酸蛋白酶6」與術語「TMPRSS6」可互換地使用，指稱第II型漿膜絲胺酸蛋白酶(TTSP)基因或蛋白質。TMPRSS6亦稱為matriptase-2、IRIDA(鐵難治性缺鐵性貧血)、跨膜絲胺酸蛋白酶6、第II型跨膜絲胺酸蛋白酶6及膜結合嵌合體蛋白酶matriptase-2。TMPRSS6為一種絲胺酸蛋白酶，為大約899個胺基酸之長度的第II型跨膜蛋白。TMPRSS6含有多個域，例如，一個短的胞內域、一個跨膜域、海一個膽精子蛋白/腸激酶/聚集蛋白(agrin)(SEA)域、兩個補體因子/海膽胚胎生長因子/BMP域(CUB)、三個a類LDL- R域(LDLa)及一個具有守恆之His-Asp-Ser三聯體(HDS)的胰蛋白酶氧絲胺酸蛋白酶域。
人類TMPRSS6 mRNA轉錄物之序列可見於，舉例而言，GenBank登錄號GI：1755203660(NM_153609.4；SEQ ID NO：1；反向補體，SEQ ID NO：2)。小鼠TMPRSS6 mRNA之序列可見於，舉例而言，GenBank登錄號GI：125656151(NM_027902.2；SEQ ID NO：3；反向補體，SEQ ID NO：4)。大鼠TMPRSS6 mRNA之序列可見於，舉例而言，GenBank登錄號GI：194474097(NM_001130556.1；SEQ ID NO：5；反向補體，SEQ ID NO：6)。食蟹獼猴(Macaca fascicularis)TMPRSS6 mRNA之序列可見於，舉例而言，GenBank登錄號GI：982272225(XM_005567384.2；SEQ ID NO：7；反向補體，SEQ ID NO：8)。恆河獼猴(Macaca mulatta)TMPRSS6 mRNA之序列可見於，舉例而言，GenBank登錄號GI：1622838152(XM_015150283.2；SEQ ID NO：9；反向補體，SEQ ID NO：10)。
TMPRSS6 mRNA序列之其他實例可透過可公共獲得之資料庫輕易獲得，例如，GenBank、UniProt、OMIM及獼猴(Macaca)基因體計畫網站。
關於TMPRSS6之進一步資訊可見於，舉例而言，www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/？term=TMPRSS6。
截至本申請案遞交之日，前述GenBank登錄號及基因資料庫編號中之各者的整體內容係藉由引用併入本文。
如本文所用，術語TMPRSS6亦指稱TMPRSS6基因之變異，包括SNP資料庫中提供之變異體。TMPRSS6基因內之大量序列變異業經鑑定並可見於，舉例而言，NCBI dbSNP及UniProt(參見例如， www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/？term=TMPRSS6，截至本申請案遞交之日，其整體內容藉由引用併入本文)。
如本文中所用，「標靶序列」指稱於TMPRSS6基因之轉錄過程中形成之mRNA分子之核苷酸序列的連續部分，包括作為初級轉錄產物之RNA加工產物的mRNA。於一態樣中，該序列之標靶部分將至少長至足以用作iRNA引導之裂解的受質，該裂解位於在TMPRSS6基因之轉錄過程中形成之mRNA分子的核苷酸序列的部分處或鄰近該處。
標靶序列可為約19至36個核苷酸之長度，例如，約19至30個核苷酸之長度。例如，標靶序列可約19至30個核苷酸之長度，19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22個核苷酸之長度。於某些態樣中，標靶序列為19至23個核苷酸之長度，視需要為21至23個核苷酸之長度。上文引述之範圍及長度之間的範圍及長度亦視為本揭露之一部分。
如本文中所使用，術語「包含序列之股」指稱包含核苷酸之鏈的寡核苷酸，其中該核苷酸係藉由使用標準核苷酸命名法指稱之序列而揭示。
「G」、「C」、「A」、「T」及「U」各自通常分別表示含有鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶及尿嘧啶作為鹼基之核苷酸。惟，應理解，術語「核糖核苷酸」或「核苷酸」亦可指稱經修飾之核苷酸，如下文進一步揭示者，或替代置換部分(參見，例如，表1)。熟練之人士熟知，鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤及尿嘧啶可經由其他部分置換而實質上不改變包含承載此置換部分之核苷酸 之寡核苷酸的鹼基配對特性。例如而不限於，包含肌苷作為其鹼基之核苷酸可與含有腺嘌呤、胞嘧啶或鳥嘌呤之核苷酸進行鹼基配對。因此，於本發明提出至dsRNA之核苷酸序列中，含有尿嘧啶、鳥嘌呤或腺嘌呤之核苷酸可置換為含有例如肌苷之核苷酸。於另一實例中，寡核苷酸中任意位置之腺嘌呤及胞嘧啶可分別置換為鳥嘌呤及尿嘧啶，以與標靶mRNA形成G-U Wobble鹼基配對。含有此類置換部分之序列適用於本發明提出之組成物及方法。
如本文中可互換使用，術語「iRNA」、「RNAi劑」、「iRNA劑」、「RNA干擾劑」指稱含有如本文中定義之術語的RNA，且其經由RNA誘導型沉默複合物(RISC)路徑媒介RNA轉錄物的靶向裂解。iRNA係透過被稱為RNA干擾(RNAi)之進程而引導mRNA至序列特異性降解。iRNA調整，例如，抑制TMPRSS6基因在細胞例如受試者諸如哺乳動物受試者體內之細胞中的表現。
於一個態樣中，本發明之RNAi劑係包括單股RNA，其與標靶RNA序列例如TMPRSS6標靶mRNA交互作用，以引導該標靶RNA之裂解。不欲受縛於理論，咸信被引入細胞內之長雙股RNA係藉由稱為切丁酶(Dicer)之第III型核酸內切酶而破碎為siRNA(Sharp et al.(2001)Genes Dev.15：485)。切丁酶，核酸酶III樣酶，將dsRNA加工為19至23個鹼基對之短干擾RNA，該短干擾RNA之特徵為具有兩個鹼基之3'突出(Bernstein,et al.,(2001)Nature 409：363)。隨後，該siRNA被併入RNA誘導型沉默複合物(RISC)內，於該處，一種或多種解旋酶令該siRNA雙鏈體解捲曲，使得補體反義股能夠引導標靶辨識(Nykanen,et al.,(2001)Cell 107：309)。當結合至適宜之標靶mRNA時，該RISC內之一種或多種核酸內切酶裂解該標靶以誘導緘默化(Elbashir,et al.,(2001)Genes Dev.15：188)。因此，於一方面，本發明係關於單股RNA(siRNA)，其係於 細胞內生成且促進RISC複合物之形成以有效緘默化該標靶基因亦即TMPRSS6基因。據此，本文中，術語「siRNA」亦用以指稱如上述之iRNA。
於某些態樣中，該RNAi劑可為單股siRNA(ssRNAi)，其經引入細胞或生物體內以抑制標靶mRNA。單股RNAi劑結合至RISC核酸內切酶Argonaute 2，其隨後裂解標靶mRNA。該單股siRNA通常為15至30個核苷酸且經化學修飾。單股siRNA之設計及測試描述於美國專利第8,101,348號中及Lima et al.,(2012)Cell 150：883-894中，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。本文中揭示之任一反義核苷酸序列可用作本文中揭示之單股siRNA或用作藉由Lima et al.,(2012)Cell 150：883-894中揭示之方法化學修飾者。
於某些態樣中，用於本發明之組成物、用途及方法中之「iRNA」為雙股RNA，且於本文中指稱為「雙股RNA劑」、「雙股RNA(dsRNA)分子」、「dsRNA劑」或「dsRNA」。術語「dsRNA」指稱核糖核酸分子之複合物，其為具有包含兩個反平行且實質上互補之核酸股的雙鏈體結構，該兩個核酸股指稱為具有相對於標靶RNA亦即TMPRSS6基因之「正義」取向及「反義」取向。於本發明之一些態樣中，雙股RNA(dsRNA)透過轉錄後基因緘默化機制來觸發標靶RNA例如mRNA之降解，本文中，該機制指稱為RNA干擾或RNAi。
通常，dsRNA分子之每一股之主要部分之核苷酸為核糖核苷酸，但如本文中所詳述，各股或兩股亦可包括一個或多個非核糖核苷酸，例如，去氧核糖核苷酸及/或經修飾之核苷酸。此外，如本說明書中所用，「iRNA」可包括具有化學修飾之核糖核苷酸；iRNA可包括位於多個核苷酸處之實質性修飾。如本文中所用，術語「經修飾之核苷酸」指稱獨立地具有經修飾之糖部分、經修飾之核苷酸間鏈結、經修飾之核鹼基或其任意組合的核苷酸。因此，術語「經修飾 之核苷酸」涵蓋例如官能基或原子至核苷酸間鏈結、糖部分或核鹼基之置換、加成或移除。適用於本發明之劑中的修飾包括本文中所揭露或該領域中已知之全部類型的修飾。對於本說明書及申請專利範圍之目的，任何此類修飾，如在siRNA類型分子中所用者，係為「iRNA」或「RNAi劑」所涵蓋。
於本揭露之某些態樣中，在RNAi劑內包括去氧-核苷酸(若存在)可視為構建經修飾之核苷酸。
該雙鏈體區域可為允許所欲之標靶RNA透過RISC途徑特異性降解的任意長度，且可為約19至36個鹼基對之長度範圍，例如，約19至30個鹼基對之長度，舉例而言，約9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36個鹼基對之長度，諸如約19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24,20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22個鹼基對之長度。於某些態樣中，該雙鏈體區域為19至21個鹼基對之長度，例如，21個鹼基對之長度。上文引述之範圍及長度之間的範圍及長度亦視為本揭露之一部分。
形成該雙鏈體結構之兩股可為一個較大RNA分子之不同部分，或它們可為獨立之RNA分子。若該兩股為一個較大分子之部分，且因此藉由界於一股之3'末端與形成該雙鏈體結構之相對另一股之5'末端之間的未中斷核苷酸鏈而連結，則該連結RNA鏈指稱為「髮夾環圈」。髮夾環圈可包含至少一個未配對之核苷酸。於一些態樣中，該髮夾環圈可包含至少2、3、4、5、6、7、 8、9、10、20、23或更多未配對之核苷酸。於一些態樣中，該髮夾環圈可為10個或更少核苷酸。於一些態樣中，該髮夾環圈可為8個或更少未配對之核苷酸。於一些態樣中，該髮夾環圈可為4至10個未配對之核苷酸。於一些態樣中，該髮夾環圈可為4至8個核苷酸。
若dsRNA之兩個實質上互補之股由分離之RNA分子構成，則彼等分子不必但可以共價連結。若該兩股藉由除界於一股之3'末端與形成該雙鏈體結構之相對另一股之5'末端之間的未中斷核苷酸鏈以外之手段共價連結，則該連結結構指稱為「連接子」。該等RNA股可具有相同或相異數目之核苷酸。鹼基對之最大數目為該dsRNA之最短鏈中之核苷酸數減去該雙鏈體中存在之任意突出。RNAi除了包含該雙鏈體結構外，亦可包含一個或多個核苷酸突出。於RNAi劑之一個態樣中，至少一股包含至少1個核苷酸的3'突出。於另一態樣中，至少一股包含至少2個，例如，2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸的3'突出。於其他態樣中，RNAi劑之至少一股包含至少1個核苷酸的5'突出。於某些態樣中，至少一股包含至少2個，例如，2、5、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸的3'突出。於又其他態樣中，RNAi劑之至少一股的3'末端及5'末端兩者皆包含至少1個核苷酸的突出。
於某些態樣中，本發明之iRNA劑為dsRNA，其各股包含19至23個核苷酸，其與標靶RNA序列例如TMPRSS6基因交互作用以引導該標靶RNA之裂解。
於一些態樣中，本發明之iRNA為24至30個核苷酸之dsRNA，其與標靶RNA序列例如TMPRSS6標靶mRNA序列交互作用以引導該標靶RNA之裂解。
如本文中所用，術語「核苷酸突出」指稱從雙股iRNA之雙鏈體結構凸出的至少一個未配對之核苷酸。舉例而言，當dsRNA之一股的3'末端延伸超過另一股之5'末端，或與之相反，則存在核苷酸突出。dsRNA可包含具有至少一個核苷酸之突出；替代性地該突出可包含至少兩個核苷酸、至少三個核苷酸、至少四個核苷酸、至少五個核苷酸或更多個。核苷酸突出可包含核苷酸/核苷類似物或由其組成，其中該核苷酸/核苷類似物包括去氧核苷酸/核苷。該(等)突出可位於正義股、反義股或其任意組合。此外，突出之核苷酸可存在於dsRNA之反義股或正義股之5'末端、3'末端或兩端。
於一個態樣中，dsRNA之反義股具有位於3'末端或5'末端的1至10個核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸之突出。於一個態樣中，dsRNA之正義股具有位於3'末端或5'末端的1至10個核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸之突出。於另一態樣中，該突出中之一個或多個核苷酸係替換為核苷硫代磷酸酯。
於某些態樣中，dsRNA之反義股具有位於3'末端或5'末端的1至10個核苷酸，例如，0至3、1至3、2至4、2至5、4至10、5至10個，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸之突出。於一個態樣中，dsRNA之正義股具有位於3'末端或5'末端的1至10個核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸之突出。於另一態樣中，該突出中之一個或多個核苷酸係替換為核苷硫代磷酸酯。
於某些態樣中，dsRNA之反義股具有位於3'末端或5'末端的1至10個核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸之突出。於某些態樣中，位於正義股或反義股或兩者之突出可包括長於10個核苷酸之延伸長 度，例如，1至30個核苷酸、2至30個核苷酸、10至30個核苷酸、10至25個核苷酸、10至20個核苷酸或10至15個核苷酸之長度。於某些態樣中，延伸之突出位於該雙鏈體之正義股。於某些態樣中，延伸之突出存在於該雙鏈體之正義股的3'末端。於某些態樣中，延伸之突出存在於該雙鏈體之正義股的5'末端。於某些態樣中，延伸之突出位於該雙鏈體之反義股。於某些態樣中，延伸之突出存在於該雙鏈體之反義股的3'末端。於某些態樣中，延伸之突出存在於該雙鏈體之反義股的5'末端。於某些態樣中，該延伸之突出中之一個或多個核苷酸係替換為核苷硫代磷酸酯。於某些態樣中，該突出包括自互補部分，使得該突出能夠形成在生理條件下安定的髮夾結構。
「鈍」或「鈍端」意指在雙股RNA劑之末端處沒有未配對之核苷酸，亦即，沒有核苷酸突出。「鈍端之」雙股RNA劑在其整個長度上為雙股，亦即，在該分子之任一末端處皆沒有核苷酸突出。本發明之RNAi劑包括在一個末端處沒有核苷酸突出之RNAi劑(亦即，具有一個突出及一個鈍端之劑)或在任一末端處皆沒有核苷酸突出之RNAi劑。最常見之此類分子將在其整個長度上為雙股。
術語「反義股」或「引導股」指稱iRNA例如dsRNA之股，其包括與標靶序列例如TMPRSS6mRNA實質上互補之區域。
如本文中所用，術語「互補之區域」指稱反義股的與標靶序列，舉例而言，如本文中定義之序列例如TMPRSS6核苷酸序列實質上互補的區域。若該互補之區域與標靶序列不完全互補，則誤配可存在於該分子之中間區域或末端區域。通常，最能被容忍之誤配係存在於末端區域內，例如，該iRNA之5'末端或3'末端之5、4或3個核苷酸內。於一些態樣中，本發明之雙股RNA劑包 括位於反義股之核苷酸誤配。於一些態樣中，本發明之雙股RNA劑之反義股包括不超過4個與標靶mRNA之誤配，例如，該反義股包括4、3、2、1或0個與標靶mRNA之誤配。於一些態樣中，本發明之雙股RNA劑之反義股包括不超過4個與正義股之誤配，例如，該反義股包括4、3、2、1或0個與正義股之誤配。於一些態樣中，本發明之雙股RNA劑包括位於正義股之核苷酸誤配。於一些態樣中，本發明之雙股RNA劑之正義股包括不超過4個與反義股之誤配，例如，該正義股包括4、3、2、1或0個與反義股之誤配。於一些態樣中，該核苷酸誤配位於，舉例而言，從iRNA之3'末端計數之5、4、3個核苷酸內。於另一態樣中，該核苷酸誤配位於，舉例而言，iRNA劑之3'端核苷酸內。於一些態樣中，該(等)誤配不在種子區域內。
因此，本文中所揭示之RNAi劑可含有一個或多個與標靶序列之誤配。於一個態樣中，本文中所揭示之RNAi劑含有不超過3個誤配(亦即，3、2、1或0個誤配)。於一個態樣中，本文中所揭示之RNAi劑含有不超過2個誤配。於一個態樣中，本文中所揭示之RNAi劑含有不超過1個誤配。於一個態樣中，本文中所揭示之RNAi劑含有0個誤配。於某些態樣中，如果該RNAi劑之反義股含有與標靶序列之誤配，則誤配可視需要被限定在從互補區域之5'末端或3'末端計數之最末5個核苷酸內。舉例而言，於此類態樣中，對於23個核苷酸之RNAi劑，與TMPRSS6基因之區域互補的股通常不含位於中心13個核苷酸處之任意誤配。本文中揭示之方法或該領域中已知之方法可用以確定，含有與標靶序列之誤配的RNAi劑在抑制TMPRSS6基因之表現中是否有效。慮及具有誤配之RNAi劑在抑制TMPRSS6基因之表現中的功效很重要，尤其若TMPRSS6基因中之特定互補區域係已知具有該種群內之多形性序列變異。
如本文中所用，術語「正義股」指稱iRNA之股，其包括與如本文中定義之術語之反義股之區域實質上互補的區域。
如本文中所用，「實質上全部核苷酸係經修飾」為大部分但不是全部皆經修飾，且可包括不超過5、4、3、2或1個未經修飾之核苷酸。
如本文中所用，術語「裂解區域」指稱位於緊鄰裂解位點處之區域。裂解位點為該標靶之裂解出現處之位點。於一些態樣中，裂解區域包含位於裂解位點任一端且緊鄰該裂解位點的三個鹼基。於一些態樣中，裂解區域包含位於裂解位點任一端且緊鄰該裂解位點的兩個鹼基。於一些態樣中，裂解位點特異性地出現於反義股之藉由核苷酸10及11鍵結之位點，且裂解區域包含核苷酸11、12及13。
如本文中所用且除非明確排除，否則當術語「互補」用來揭示關於第二核苷酸序列之第一核苷酸序列時，指稱包含該第一核苷酸序列之寡核苷酸或多核苷酸在某些條件下與包含該第二核苷酸序列之寡核苷酸或多核苷酸雜交且形成雙鏈體結構的能力，如具熟練技術之人士所理解者。舉例而言，此等條件可為嚴苛條件，其中嚴苛條件可包括：400mM NaCl、40mM PIPES pH6.4、1mM EDTA、50℃或70℃、12至16小時，之後洗滌(參見，例如，《分子克隆：實驗室手冊》(「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」,Sambrook,et al.(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press))。可施加其他條件，諸如生理學相關條件如可在生物體內部遭遇者。具熟練技術之人士將能夠根據所雜交之核苷酸的最終應用而確定最適用於兩個序列之互補性測試的條件集。
如本文中所述之iRNA，例如，dsRNA內之互補序列，包括包含第一核苷酸序列之寡核苷酸或多核苷酸與包含第二核苷酸序列之寡核苷酸或多 核苷酸在一個或兩個核苷酸序列之整體長度上的鹼基配對。此類序列可指稱為彼此「完全互補」。惟，本文中，若第一序列指稱為與第二序列「實質上互補」，則當雜交形成至多30個鹼基對之雙鏈體時，兩個序列可為完全互補，或其等可形成一個或多個但通常不超過5、4、3或2個誤配鹼基對，同時保留在最適於其最終應用之條件下雜交的能力，例如，在活體外或活體內對基因表現的抑制。惟，若兩個寡核苷酸係經計為當雜交時形成一個或多個單股突出，則此類突出應視為關於確定互補性之誤配。舉例而言，包含一個長度為21個核苷酸之寡核苷酸及另一個長度為23個核苷酸之寡核苷酸的dsRNA，其中該較長之核苷酸包含一個與該較短之核苷酸完全互補的21個核苷酸之序列，對於本文所揭示之目的，仍可指稱為「完全互補」。
如本文中所用，「互補」序列亦可包括非Watson-Crick鹼基對或從非天然核苷酸及經修飾之核苷酸形成的鹼基對，或完全由其形成，只要滿足其雜交能力之上述需求得以滿足即可。此類非Watson-Crick鹼基對包括但不限於，G：U Wobble鹼基配對或Hoogsteen鹼基配對。
本文中，術語「互補」、「完全互補」及「實質上互補」可關於dsRNA之正義股與反義股之間或兩個寡核苷酸或多核苷酸之間，諸如雙股RNA劑之反義股與標靶序列之間的鹼基配對而使用，如可從其用途之語境中理解者。
如本文中所用，與信使RNA(mRNA)之「至少一部分實質上互補」之多核苷酸指稱與感興趣之mRNA(例如，編碼TMPRSS6基因之mRNA)之連續部分實質上互補之多核苷酸。舉例而言，如果多核苷酸與編碼TMPRSS6基因之mRNA之非中斷部分實質上互補，則該序列與TMPRSS6 mRNA之至少一部分互補。
據此，於一些態樣中，本文中揭露之反義多核苷酸與標靶TMPRSS6序列完全互補。於其他態樣中，本文所揭露之反義股多核苷酸與標靶TMPRSS6序列實質上互補且包含連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列在其整個長度上與SEQ ID NO：1、3、5、7或9中者任一者或SEQ ID NO：1、3、5、7或9中者任一者之片段至少約80%互補，諸如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%互補。
於一些態樣中，本文所揭露之反義多核苷酸與標靶TMPRSS6序列之片段實質上互補且包含連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列在其整個長度上與選自由SEQ ID NO：1之核苷酸187至210、227至254、322至363、362至390、398至420、404至429、410至435、439至461、443至467、448至474、460至483、466至488、496至519、519至542、526至548、557至593、641至671、652至676、687至713、725至762、757至794、886至908、921至951、956至987、1051至1082、1233至1269、1279至1313、1313至1341、1327至1351、1415至1439、1447至1480、1464至1486、1486至1509、1559至1589、1571至1595、1579至1609、1707至1735、1738至1764、1806至1828、1864至1886、1934至1966、1967至1991、2008至2031、2015至2043、2042至2072、2287至2311、2297至2354、2336至2361、2360至2384、2416至2438、2481至2510、2496至2527、2526至2558、2665至2693、2693至2719、2707至2729、2799至2821、2851至2874、2971至2999、2981至3006及3155至3195組成之群組的SEQ ID NO：1之片段至少80%互補，諸如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%互補。
於一些態樣中，本文所揭露之反義多核苷酸與標靶TMPRSS6序列實質上互補且包含連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列在其整個長度上與選自由SEQ ID NO：1之核苷酸230至252、324至346、560至578、560至582、2338至2360、3163至3185、3169至3191及3172至3194所組成之群組的SEQ ID NO：1之片段至少80%，互補，諸如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%互補。
於一些態樣中，本文所揭露之反義多核苷酸與標靶TMPRSS6序列實質上互補且包含連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列在其整個長度上與選自由SEQ ID NO：1之核苷酸560至578、2338至2360及3169至3191所組成之群組的SEQ ID NO：1之片段至少80%，互補，諸如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%互補。
於其他態樣中，本文所揭露之反義股多核苷酸與標靶TMPRSS6序列實質上互補且包含連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列在其整個長度上與表2至7中任一者中之任一正義股核苷酸序列或表2至7中任一者中之任一正義股核苷酸序列之片段至少約80%互補，諸如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%互補。
於一個態樣中，本揭露之RNAi劑包括正義股，該正義股與反義多核苷酸實質上互補，該反義多核苷酸繼而與標靶TMPRSS6序列互補，並且其中該正義股多核苷酸包含連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列在其整個長度上與SEQ ID NO：2、4、6、8或10或SEQ ID NO：2、4、6、8或10中任一者之片段之核苷酸序列的等效區域至少約80%互補，諸如約85%、約90%、約91%、 約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%互補。
於一些態樣中，本發明之iRNA包括正義股，該正義股與反義多核苷酸序列實質上互補，該反義多核苷酸繼而與標靶TMPRSS6序列互補，並且其中該正義股多核苷酸包含連續核苷酸序列，該連續核苷酸序列在其整個長度上與表2至7中任一者中之任一反義股核苷酸序列或表2至7中任一者中之任一反義股核苷酸序列之片段至少約80%互補，諸如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或100%互補。
於某些態樣中，該正義及反義股係選自雙鏈體AD-1556360、AD-1571158、AD-1571033、AD-1554875、AD-1571160、AD-1555117、AD-1554911及AD-1556915中之任一者。
於某些態樣中，該正義及反義股係選自雙鏈體AD-1556360、AD-1571158及AD-1571033中之任一者。
通常，「iRNA」包括具有化學修飾的核糖核苷酸。此類修飾可包括本文所揭露或本領域中已知的全部類型之修飾。對於本說明書及申請專利範圍之目的，任何此類修飾，如在dsRNA分子中所用者，係為「iRNA」所涵蓋。
於本揭露之某些態樣中，在RNAi劑內包括去氧-核苷酸(若存在)可視為構建經修飾之核苷酸。
在本發明之一方面，用於本發明之方法及組成物中之劑為單股反義寡核苷酸分子，其經由反義抑制機制來抑制標靶mRNA。該單股反義寡核苷酸分子與標靶mRNA內之序列互補。該單股反義寡核苷酸可藉由與mRNA配備 並物理阻塞翻譯機構而以化學計量方式抑制翻譯，參見Dias,N.et al.,(2002)Mol Cancer Ther 1：347-355。該單股反義寡核苷酸分子可為約14至約30個核苷酸之長度，且具有與標靶序列互補的序列。舉例而言，該單股反義寡核苷酸分子可包含來自本文所揭示之任一反義序列的至少約14、15、16、17、18、19、20或更多個連續核苷酸。
如本文中所用，片語「令細胞與iRNA諸如dsRNA接觸」包括藉由任意可能之手段接觸細胞。令細胞與iRNA接觸包括在活體外令細胞與iRNA接觸或在活體內令細胞與iRNA接觸。該接觸可直接或間接進行。因此，舉例而言，可藉由單獨實施該方法而令iRNA與細胞物理接觸，或替代性地，可將iRNA置於將會允許或造成其後續與該細胞接觸之境地。
舉例而言，可藉由將細胞與iRNA一起溫育而在活體外接觸該細胞。舉例而言，可藉由將iRNA注射至細胞所處之組織內或鄰近該組織處，或藉由將iRNA注射至另一區域例如血流或皮下空間內而使得該劑將會後續到達待接觸之細胞所處之組織，從而在活體內接觸該細胞。舉例而言，該iRNA可含有引導該iRNA至感興趣之部位例如肝臟之配體例如GalNAc，或與該配體偶合。活體外接觸方法與活體內接觸方法之組合亦係可能者。舉例而言，細胞亦可在活體外與iRNA觸，並隨後移植入受試者體內。
於某些態樣中，令細胞與iRNA接觸係包括，藉由促進或影響至該細胞內之攝取或吸收而「將iRNA引入或輸送至細胞內」。iRNA之吸收或攝取可透過無輔助之擴散或活性細胞進程進行，或藉由輔助劑或裝置進行。將iRNA引入細胞內可為活體外及/或活體內進程。舉例而言，對於活體內引入，可將iRNA注射至組織部位或全身性投予。活體外引入細胞內係包括該領域中已知 之方法，諸如電穿孔及脂質轉染。其他途徑揭示於下文中及/或為該領域中已知者。
術語「脂質奈米顆粒」或「LNP」為包含脂質層之媒介物，該脂質層封裝醫藥活性分子諸如核酸分子例如iRNA或iRNA自其轉錄之質體。LNP揭示於，舉例而言，美國專利第6,858,225號、第6,815,432號、第8,158,601號及第8,058,069號，該等專利之整體內容藉由引用而併入本文。
如本文中所用，「受試者」為動物諸如哺乳動物，包括靈長類(例如，人、非人靈長類如猴及黑猩猩)、非靈長類(例如，牛、豬、馬、山羊、兔、綿羊、倉鼠、豚鼠、貓、狗、大鼠或小鼠)或鳥，其或內源性地或異源性地表現標靶基因。於一個態樣中，受試者為人類，諸如正在對將會受益於TMPRSS6表現降低之疾病或疾患進行治療或評估的人類；處於將會受益於TMPRSS6表現降低之疾病或疾患風險下的人類；患有將會受益於TMPRSS6表現降低之疾病或疾患的人類；或正在對將會受益於TMPRSS6表現降低之疾病或疾患進行治療的人類，如本文中所揭示。於一些態樣中，該受試者為女性人類。於其他態樣中，該受試者為男性人類。於一個態樣中，該受試者為成年受試者。於另一態樣中，該受試者為小兒受試者。
如本文中所用，術語「處理」或「治療」指稱優異或所欲之結果，諸如降低受試者中TMPRSS6相關疾患之至少一種徵象或症狀。治療亦包括降低與不希望之TMPRSS6表現相關的一種或多種徵象或症狀；減輕不希望之TMPRSS6活化或安定化之程度；緩解或緩和不希望之TMPRSS6活化或安定化。「治療」亦可意指相對於在治療缺失情況下預期之存活期而延長存活期。在受試者中TMPRSS6或疾病標記或症狀之含量/的情境中，術語「下降」指稱此含量/ 量級之統計學顯著之減少。該減少可為，舉例而言，至少10%、15%、20%、25%、30%、%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多。於某些態樣中，減少為至少20%。於某些態樣中，該減少為疾病標記，例如，蛋白質或基因表現量級減少至少50%。於受試者體內之TMPRSS6含量的情境中，「下降」為低至如同不具此疾患之個體至正常範圍內所接受的量級。於某些態樣中，「下降」係罹患疾病之受試者之標記或症狀量級與個體正常範圍內之接受量級之間的差異減少，例如，肥胖個體與具有正常範圍內之接受體重之間的體重減少量級。
如本文所用，「預防」或「防止」當有關可藉由TMPRSS6基因表現降低而治療或減輕的疾病、疾患或其病症使用時，指稱受試者將發展出與此疾病、疾患或病症相關之症狀的可能性降低，例如，不希望的或過度的TMPRSS6表現之症狀，諸如提高的鐵含量或鐵失調。發展出升高之鐵含量或鐵失調的可能性降低，舉例而言，當具有關於升高之鐵含量或鐵失調的風險因素的個體或未能發展出升高之鐵含量或發展出升高之鐵含量或鐵失調但嚴重程度低於具有相同風險因素而未接受本文所揭示之治療的群體時。沒有發展出疾病、疾患或病症，或減小與此疾病、疾患或病症相關之症狀的發展(例如，將該疾病或疾患之臨床可接受規格上減小至少約10%)，或展現出症候之延遲(例如，延遲幾天、幾週、幾個月或幾年)，係視為有效之預防。
如本文所用，術語「跨膜絲胺酸蛋白酶6相關疾病」或「TMPRSS6相關疾病」為一種疾病或疾患，其係由TMPRSS6基因表現或TMPRSS6蛋白質產生所引起或與其相關。術語「TMPRSS6」相關疾病包括將會受益於TMPRSS6基因表現、複製或蛋白質活性減少的疾病、疾患或病症。
於一些態樣中，TMPRSS6相關疾病為與鐵過載相關之疾患，鐵過載為以升高之鐵含量或鐵失調為特徵的狀況。舉例而言，鐵過載可以由遺傳狀況引起，由從飲食中攝取的鐵升高引起，或由經胃腸道外投予過量鐵引起，該投予包括過量鐵之靜脈內注射及輸血性鐵過載。
於一些態樣中，TMPRSS6相關疾病為無效性紅血球生成之疾患。無效性紅血球生成為類紅血球前驅細胞數的不正常擴張伴有無核紅血球的非產生性合成，導致貧血及缺氧。特定而言，類紅血球細胞的增加未能造成紅血球的相對應增加。因此，鐵吸收仍然因應於緊迫而增加，但鐵沉積在器官中而非用於生成更多紅血球。
於一些態樣中，TMPRSS6相關疾患包括但不限於，遺傳性血鐵沉積症、自發性血鐵沉積症、原發性血鐵沉積症、繼發性血鐵沉積症、重度青少年血鐵沉積症、新生兒血鐵沉積症、含鐵芽細胞性貧血、溶血性貧血、紅血球生成不良性貧血、鐮狀細胞性貧血、血紅素病、地中海貧血(例如，β-地中海型貧血及α-地中海型貧血)、真性紅血球增多症、骨髓化生不良症候群、先天性紅血球生成不良性貧血、丙酮酸鹽激酶缺乏、慢性肝病、緩發性皮膚病變紫質症、紅血球生成性紫質症、無鐵傳遞蛋白質貧血、遺傳性酪胺酸血症、腦肝腎症候群、自發性肺血鐵沉積症、腎血鐵沉積症。
於一些態樣中，TMPRSS6相關疾患包括與過量鐵之口服投予、輸血性鐵過載及過量鐵之靜脈內注射相關之疾患。
於其他態樣中，TMPRSS6相關疾患亦包括具有與鐵過載相關或由其所引起之症狀的疾患。此類症狀包括增加的肝病(肝硬化、癌症)風險、心臟病發作或心衰竭、糖尿病、骨關節炎、骨質疏鬆症、代謝症候群、甲狀腺功能低 下症、性腺低能症及在一些情況下早產死亡。於一個態樣中，TMPRSS6相關疾患包括與鐵過載及/或鐵失調相關之神經退化性疾患，諸如阿茲海默氏症、帕金森氏、杭丁頓氏症、弗里德希氏共濟失調、癲癇及多發性硬化症。靶向TMPRSS6之iRNA(例如，表2至7中任一者中所揭示之iRNA)的投予可治療此等症狀中之一者或多者，或防止藉由增加之鐵含量而加重之疾病或疾患的發展或進展。
於一個態樣中，該TMPRSS6相關疾患為β-地中海型貧血。β-地中海型貧血為一組以β-球蛋白鏈之合成中的基因缺陷為特徵的遺傳性疾患中的任一者。在純合狀態下，β-地中海型貧血(「重度地中海型貧血」)引起重度的輸血依賴性貧血。在雜合狀態下，β-地中海型貧血形狀(「輕度地中海型貧血」)引起輕度至中度的小紅血球性貧血。「中度地中海型貧血」為一種β-地中海型貧血，其導致受試者的疾病之臨床嚴重程度在介於輕度β-地中海型貧血之輕度症狀與重度β-地中海型貧血之間的某處。若干實驗室測試可用於幫助偵檢並診斷地中海型貧血，舉例而言，全血計數，以測定紅血球數及血紅素數；血液抹片測試；血紅素電泳；基因定序；或鐵測試，以檢查鐵含量、鐵蛋白含量、不飽和鐵結合能力量級、總鐵結合能力量級或運鐵蛋白飽和度。存在於紅血球中之血紅素的類型及相應量為地中海型貧血的另一指示物。β-地中海型貧血擾亂β-血紅素鏈形成與α-血紅素鏈形成的平衡並引起次要血紅素組成部分的增加。故，重度β-地中海型貧血患者經常具有更大百分比的Hb F。彼等患有輕度β-地中海型貧血者經常具有升高分率的Hb A2。
於一個態樣中，β-地中海型貧血為重度地中海型貧血。於另一態樣中，β-地中海型貧血為中度地中海型貧血。
於一些態樣中，該TMPRSS6相關疾患為真性紅血球增多症。真性紅血球增多症為一種類型的血液癌症，其引起骨髓產生過量紅血球。此等過量細胞經常增厚血管，使得患者更容易發展出血凝塊，及其他併發症諸如中風或心臟病發作。可實施若干測試以幫助偵檢並診斷真性紅血球增多症，舉例而言，全血計數、血液抹片測試、紅血球生成素含量測試、骨髓抽吸或生檢或基因定序。
如本文中所用，「治療有效量」旨在包括RNAi劑之下述之量，當將該RNAi劑向患有TMPRSS6相關疾病之受試者投予時，其量足以有效治療該疾病(例如，藉由削弱、緩解或維持現有疾病或疾病之一種或多種症狀)。「治療有效量」可依據RNAi劑、該劑如何投予、疾病及其嚴重程度及待治療之受試者的病史、年齡、體重、家族病史、基因組成、先前治療或並行治療之類型(若存在)、以及其他個別特徵而變。
如本文中所用，「預防有效量」旨在包括RNAi劑之下述之量，當將該RNAi劑向患有TMPRSS6相關疾病之受試者投予時，其量足以預防或緩解該疾病或該疾病之一種或多種症狀。緩解該疾病包括減緩該疾病之進程或減輕後來發展之疾病的嚴重程度。「預防有效量」可依據RNAi劑、該劑如何投予、疾病風險程度及待治療之患者的病史、年齡、體重、家族病史、基因組成、先前治療或並行治療之類型(若存在)、以及其他個別特徵而變。
「治療有效量」或「預防有效量」亦包括以可用於任意治療之合理效益/風險比率產生一些所欲之效應之RNAi劑的量。本發明之方法中採用之iRNA可以足以產生可用於此治療之合理效益/風險比率的量給投予。
本文中，短語「醫藥上可接受」用以指稱彼等化合物、材料(包括鹽)、組成物或劑型，其處於適用於與人類受試者及動物受試者之組織接觸而無 過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症的所謂醫療判斷之範疇內，與合理效益/風險比率相稱。
如本文中所用，短語「醫藥上可接受之載劑」意指醫藥上可接受之材料、組成物或媒介物，諸如液體或固體填料、稀釋劑、賦形劑、製造助劑(如，潤滑劑、雲母、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸鋅或硬脂酸)或溶劑封裝材料，其參與將受試化合物從一個器官或身體部分攜帶或運送至另一器官或身體部分。就與製劑之其他成分相容且不損害被治療之受試者而言，每一載劑必須為「可接受」。此類載劑為本領域中已知者。醫藥上可接受之載劑包括用於藉由注射投予之載劑。
如本文中所用，術語「樣品」包括從受試者分離之相似體液、細胞或組織的集合，以及受試者體內存在之體液、細胞或組織。生物體液之實例包括血液、血清及漿膜液、血漿、腦脊液、眼液、淋巴液、尿液、唾液等。組織樣品可包括來自組織、器官或局部區域之樣品。舉例而言，樣品可源自特定之器官、器官之部分或彼等器官內之體液或細胞。於某些態樣中，樣品可源自肝臟(例如，全肝或肝臟之某些區段或肝臟中某些類型之細胞，例如，肝細胞)。於一些態樣中，「源自受試者之樣品」指稱從該受試者抽取之血液或血漿。「源自受試者之樣品」可指稱來自該受試者之血液或血液源性血清或血漿。
II.本發明之iRNA
本發明係提供抑制TMPRSS6基因之表現的iRNA。於某些態樣中，該iRNA包括雙股核糖核酸(dsRNA)分子，其用於抑制TMPRSS6基因在細胞諸如受試者體內之細胞內的表現，該受試者為例如哺乳動物，諸如容易發展出TMPRSS6相關疾患的人類受試者，該疾患為例如與鐵過載相關之疾患及/或無效性紅血球生 成之疾患，例如，遺傳性血鐵沉積症、β-地中海型貧血(例如，重度β-地中海型貧血及中度β-地中海型貧血)、真性紅血球增多症、骨髓化生不良症候群、先天性紅血球生成不良性貧血、丙酮酸鹽激酶缺乏、造紅血球性紫質沉著病、帕金森氏症、阿茲海默氏症及弗里德希氏共濟失調。該dsRNAi劑包括具有互補區域之反義股，該互補區域與在TMPRSS6基因表現中所形成之mRNA的至少一部分互補。該互補區域係約19個至30個核苷酸之長度(例如，約30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20或19個核苷酸之長度)。
當與表現TMPRSS6基因之細胞接觸時，該iRNA將該TMPRSS6基因(例如，人類、靈長類、非靈長類或大鼠TMPRSS6基因)之表現抑制至少約50%，如藉由舉例而言PCR或基於分支鏈DNA(bDNA)之方法，諸如藉由使用舉例而言西方印漬術之免疫螢光分析或流式細胞分析術所檢定。於某些態樣中，表現之抑制係藉由本文之實施例中提供之qPCR方法，使用例如10nM濃度之siRNA在其中所提供之適宜生物體細胞株中測定。於某些態樣中，活體內表現之抑制係藉由在表現人類基因之囓齒動物(例如，小鼠或表現該人類標靶基因之AAV感染小鼠)中該人類基因的敲除來測定，例如，當以單次劑量例如3mg/kg投予時在RNA表現之最低點確定的敲除。
dsRNA包括兩個RNA股，在該dsRNA將被使用之條件下，該兩股互補並雜交以形成雙鏈體結構。dsRNA之一股(該反義股)包括互補區域，該互補區域與標靶序列實質上互補且通常完全互補。標靶序列可源自在TMPRSS6基因表現過程中形成之mRNA序列。另一股(該正義股)係括一區域，該區域與該反義股互補，使得當在適宜條件下組合時，兩股雜交並形成雙鏈體結構。如本 文中他處所述，dsRNA之互補序列亦可作為單個核酸分子之自互補區域而保護，與作為獨立之寡核苷酸相反。
通常，該雙鏈體結構為15至30個鹼基對之長度，例如，15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24,20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22個鹼基對之長度。於某些態樣中，該雙鏈體結構為18至25個鹼基對之長度，例如，18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至25、20至24,20至23、20至22、20至21、21至25、21至24、21至23、21至22、22至25、22至24、22至23、23至25、23至24或24至25個鹼基對之長度，舉例而言，19至21個鹼基對之長度。上文引述之範圍及長度之間的範圍及長度亦視為本揭露之一部分。
同樣，與標靶序列互補之區域為15至30個核苷酸之長度，例如，15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、 20至25、20至24,20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22個核苷酸之長度，舉例而言，19至23個核苷酸之長度或21至23個核苷酸之長度。上文引述之範圍及長度之間的範圍及長度亦視為本揭露之一部分。
於一些態樣中，該雙鏈體結構為19至30個鹼基對之長度。同樣，與標靶序列互補之群友為19至30個核苷酸之長度。
於一些態樣中，該dsRNA為約19至約23個核苷酸之長度，或約25至約30個核苷酸之長度。通常，該dsRNA係足夠長，以用作切丁酶之受質。舉例而言，該領域中習知，長度超過約21至23個核苷酸之dsRNA可用作切丁酶之受質。具有該領域通常知識者亦將知悉，作為裂解標靶之RNA區域最通常為較大RNA分子之一部分，一般為mRNA分子。若相關，則mRNA標靶之「一部分」為mRNA標靶之連續序列，其長度足以令其作為RNAi引導之裂解(亦即，透過RISC途徑裂解)的受質。
所屬技術領域具通常知識者亦將知悉，該雙鏈體區域為dsRNA的主要功能部分，例如，約19至約30個鹼基對，例如，約19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24,20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22個鹼基對的雙鏈體區域。因此，於一個態樣中，就其被加工為例如15至30個鹼基對之以用於裂解之所欲RNA為靶向之官能性雙鏈體的程度而言，具有超過30個鹼基對之RNA分子或RNA分子之複合物為dsRNA。因此，具有通常知識之技術人員將知悉，於一個態樣中，miRNA 為dsRNA。於另一態樣中，dsRNA不是天然出現之miRNA。於另一態樣中，可用於以TMPRSS6基因表現為靶向之iRNA劑並非藉由較大dsRNA之裂解而在標靶細胞內生成。
如本文所揭示之dsRNA可復包括一個或多個具有例如1至4、2至4、1至3、2至3、1、2、3或4個核苷酸之單股核苷酸突出。相對於其鈍端之對應物，具有至少一個核苷酸突出之dsRNA可具有傑出的抑制特性。核苷酸突出可包含核苷酸/核苷類似物或由其組成，其中該核苷酸/核苷類似物包括去氧核苷酸/核苷。該(等)突出可位於正義股、反義股或其任意組合。此外，突出之核苷酸可存在於dsRNA之反義股或正義股之5'末端、3'末端或兩端。
dsRNA可藉由本領域中已知之標準方法合成。本發明之雙股RNAi化合物可使用兩步程序製備。首先，單獨製備雙股RNA分子之個別股。隨後，將該等組分股黏著。該siRNA化合物之個別股可使用溶液相有機合成、固相有機合成或兩者製備。有機合成提供下述優點：包含非天然或經修飾之核苷酸的寡核苷酸股可輕易製備之。同源，本發明之單股寡核苷酸可使用溶液相有機合成、固相有機合成或兩者製備。
一方面，本發明之dsRNA包括至少兩個核苷酸序列：正義序列及反義序列。該正義股係選自表2至7之任一者中提供之序列之群組，而該正義股之反義股之相對應反義股係選自表2至7中任一者之序列之群組。於此方面，該兩個序列之一者與該兩個序列之另一者互補，且該等序列之一者與在TMPRSS6基因之表現中生成之mRNA序列實質上互補。如是，於此方面，dsRNA將包括兩個寡核苷酸，其中一個寡核苷酸係揭示為表2至7中任一者之正義股，而第二個寡核苷酸係揭示為表2至7中任一者之正義股的相對應反義股。
於某些態樣中，該dsRNA之實質上互補序列包含在獨立之寡核苷酸。於其他態樣中，該dsRNA之實質上互補序列包含在單個寡核苷酸。
於一個態樣中，該反義股包含與表2至7中任一者中之任一反義股核苷酸序列相異不超過三個，例如，0、1、2或3個核苷酸的至少15個，例如，15、16、17、18、19或20個連續核苷酸。
應理解，舉例而言，儘管表3或5中之序列未揭示為經修飾或經接合之序列，但本發明之iRNA的RNA，例如，本發明之dsRNA，可包含表2至7中任一者中詳述之任一序列，其係未經修飾、未經接合或經不同於表中所述者之修飾或接合。換言之，本發明涵蓋表2至7之dsRNA，其等係未經修飾、未經接合、經修飾或經接合，如本文所揭示。
熟練人士應知悉，具有約20至23個鹼基對(例如21個鹼基對)之雙鏈體結構的dsRNA已被譽為在誘導RNA干擾中尤其有效(Elbashir et al.,EMBO 2001,20：6877-6888)。惟，其他人已發現，更短或更長之RNA雙鏈體結構亦可為有效者(Chu and Rana(2007)RNA 14：1714-1719；Kim et al.(2005)Nat Biotech 23：222-226)。於上文揭示之態樣中，憑藉表2至7中任一者中提供之寡核苷酸序列之天性，本文所揭示之dsRNA可包括至少一個長度為最少21個核苷酸之股。可合理地預期，具有僅在一端或兩端減去幾個核苷酸之表2至7中任一者中之任一序列的較短雙鏈體可能具備與上述dsRNA類似之效果。因此，具有源自表2至7中任一者之任一序列之至少19、20或更多個連續核苷酸且在其等抑制TMPRSS6基因表現之能力方面與包含全序列之dsRNA相異不超過約5%、10%、15%、20%、25%或30%的dsRNA，係預期在本發明之範疇內。
此外，提供在表2至7的RNA鑑定TMPRSS6轉錄物中易進行RISC媒介之裂解的位點。如是，本發明復提出靶向此等位點中之一者的iRNA。如本文中所用，如果iRNA促進該特定位點內任意處之轉錄物的裂解，則稱該iRNA為以RNA轉錄物之特定位點內為靶向。此iRNA通常將包括來自表2至7中任一者所提供之一個序列的至少約19個連續核苷酸，該連續核苷酸係取自與TMPRSS6基因中所選擇序列之連續區域的額外核苷酸序列偶合。
III.本發明之修飾iRNA
於某些態樣中，本發明之iRNA之RNA，例如，dsRNA係未經修飾，且不包含例如該領域中已知及本文所述之化學修飾或接合。於其他態樣中，本發明之iRNA之RNA，例如，dsRNA係經化學修飾以增強至性或其他有益特徵。於本發明之某些態樣中，本發明之iRNA的實質上全部核苷酸係經修飾。於本發明之其他態樣中，iRNA之全部核苷酸或iRNA之實質上全部核苷酸係經修飾，亦即，該iRNA之股中存在不超過5、4、3、2或1個未經修飾之核苷酸。
本發明提出之核酸可藉由該領域中良好構建之方法合成及/或修飾，諸如彼等於《現代核酸化學技術》(“Current protocols in nucleic acid chemistry”,Beaucage,S.L.et al.(Edrs.),John Wiley & Sons,Inc.,New York,NY,USA)中揭示者，該文獻藉由引用併入本文。修飾包括，舉例而言，末端修飾，例如，5'末端修飾(磷醯化、接合、反向鏈結)或3'末端修飾(接合、DNA核苷酸、反向鏈結等)；鹼基修飾，例如，置換為安定化鹼基、去安定化鹼基或與配偶體之拓展物進行鹼基配對之鹼基，移除鹼基(無鹼基之核苷酸)，或經接合之鹼基；糖修飾(例如，在2'-位置或4'-位置)或糖之置換；或主鏈修飾，包括磷酸二酯類鏈結之修飾或置換。可用於本文所述態樣中之iRNA化合物之具體實例包括，但不限於，含有經修飾 之主鏈或不含天然核苷酸間鏈結之RNA。具有經修飾之主鏈的RNA除此之外亦包括彼等在主鏈中不具有磷原子者。對於本說明書之目的，且如該領域中有時參照者，在其核苷酸間主鏈中不具有磷原子的經修飾之RNA亦可視為寡核苷酸。於一些態樣中，經修飾之RNA將在其核苷酸間主鏈中具有磷原子。
經修飾之RNA主鏈包括，舉例而言，具有正常3'-5'鏈結之硫代磷酸酯類、手性硫代磷酸酯類、二硫代磷酸酯類、磷酸三酯類、胺基烷基磷酸三酯類、包括3'-伸烷基磷酸酯類及手性磷酸酯類之甲基及其他烷基磷酸酯類、膦酸酯類、包括3'-胺基磷醯胺化物及胺基烷基磷醯胺化物之磷醯胺化物、硫羰基磷醯胺化物類、硫羰基烷基磷酸酯類、硫羰基烷基磷酸三酯類、以及硼磷酸酯類；此等之2'-5'連接類似物；以及彼等具有反向極性者，其中相鄰的核苷單元對將3'-5'連接至5'-3'或將2'-5'連接至5'-2'。亦可包括多種鹽類、混合鹽類及游離酸形式。於本發明之一些態樣中，本發明之dsRNA劑可為游離酸形式。於本發明之其他態樣中，本發明之dsRNA劑可為鹽形式。於一個態樣中，本發明之dsRNA劑可為鈉鹽形式。於某些態樣中，當本發明之dsRNA劑為鈉鹽形式時，鈉離子可作為該劑中存在之實質上全部磷酸二酯及/或硫代磷酸酯基團之抗衡離子而存在於該劑中。其中實質上全部磷酸二酯及/或硫代磷酸酯類鏈結為具有鈉抗衡離子之劑包括不超過5、4、3、2或1個沒有鈉抗衡離子之磷酸二酯及/或硫代磷酸酯類鏈結。於一些態樣中，當本發明之dsRNA劑為鈉鹽形式時，鈉離子可作為該劑中存在之全部磷酸二酯及/或硫代磷酸酯基團之抗衡離子而存在於該劑中。
教示上述含磷鏈結之製備的代表性美國專利包括但不限於，美國專利第3,687,808號、第4,469,863號、第4,476,301號、第5,023,243號、第5,177,195號、第5,188,897號、第5,264,423號、第5,276,019號、第5,278,302 號、第5,286,717號、第5,321,131號、第5,399,676號、第5,405,939號、第5,453,496號、第5,455,233號、第5,466,677號、第5,476,925號、第5,519,126號、第5,536,821號、第5,541,316號、第5,550,111號、第5,563,253號、第5,571,799號、第5,587,361號、第5,625,050號、第6,028,188號、第6,124,445號、第6,160,109號、第6,169,170號、第6,172,209號、第6,239,265號、第6,277,603號、第6,326,199號、第6,346,614號、第6,444,423號、第6,531,590號、第6,534,639號、第6,608,035號、第6,683,167號、第6,858,715號、第6,867,294號、第6,878,805號、第7,015,315號、第7,041,816號、第7,273,933號、第7,321,029號及美國再公告專利第39464號，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。
其內部不包括磷原子之經修飾之RNA主鏈具有藉由短鏈烷基或環烷基類核苷酸間鏈結、混合雜原子及烷基或環烷基類核苷酸間鏈結或一個或多個短鏈雜原子或雜環類核苷酸間鏈結形成的主鏈。此等包括彼等具有N-嗎啉基鏈結(部分地由核苷至糖部分形成)；矽氧烷主鏈；硫醚、亞碸及碸主鏈；甲醯基及硫代甲醯基主鏈；亞甲基甲醯基及硫代甲醯基主鏈；含有伸烷基之主鏈；胺基磺酸酯主鏈；亞甲基亞胺基及亞甲基肼基主鏈；磺酸酯及磺醯胺主鏈；醯胺主鏈；以及其他具有混合之N、O、S及CH2組分部分者。
教示上述寡核苷酸之製備的代表性美國專利包括但不限於，美國專利第5,034,506號、第5,166,315號、第5,185,444號、第5,214,134號、第5,216,141號、第5,235,033號、第5,64,562號、第5,264,564號、第5,405,938號、第5,434,257號、第5,466,677號、第5,470,967號、第5,489,677號、第5,541,307號、第5,561,225號、第5,596,086號、第5,602,240號、第5,608,046號、第5,610,289 號、第5,618,704號、第5,623,070號、第5,663,312號、第5,633,360號、第5,677,437號及第5,677,439號，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。
合適之RNA模擬物係預期用於本文所提供之iRNA中，其中該核苷酸單元之糖及核苷酸間鏈結兩者亦即主鏈係置換為新穎基團。鹼基單元維持與適宜之核酸標靶化合物雜交。一種此類寡聚化合物，其中業經顯示具有優異雜交特性之RNA模擬物，指稱為肽核酸(PNA)。於PNA化合物中，RNA之糖主鏈係置換為含有醯胺之主鏈，尤其是胺基乙基甘油主鏈。核鹼基得以保留且直接或間接地鍵結至主鏈之醯胺部分的氮雜氮原子。教示PNA化合物之製備的代表性美國專利包括但不限於，美國專利第5,539,082號、第5,714,331號及第5,719,262號，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。適用於本發明之iRNA中之額外之PNA化合物揭示於，舉例而言，Nielsen et al.,Science,1991,254,1497-1500中。
本發明提出之一些態樣包括具有硫代磷酸酯主鏈之RNA以及具有雜原子主鏈之寡核苷酸，尤其是上文引用之美國專利第5,489,677號的--CH2--NH--CH2-、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[稱為亞甲基(甲基亞胺基)或MMI主鏈]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--及--N(CH3)--CH2--CH2--，以及上文引用之美國專利第5,602,240號的醯胺主鏈。於一些態樣中，本文提出之RNA具有上文引用之美國專利第5,034,506號的N-嗎啉基主鏈結構。天然磷酸二酯主鏈可表示為O-P(O)(OH)-OCH2-。
經修飾之RNA亦可含有一個或多個經取代之糖部分。本文提出之iRNA如dsRNA可包括位於2'位置之下述之一者：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中該烷基、烯基及 炔基可為經取代或未經取代之C1至C10烷基或C2至C10烯基及炔基。示例性合適修飾包括O[(CH2)nO] mCH3、O(CH2).nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2) nCH3,O(CH2)nONH2及O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n及m為1至約10。於其他態樣中，dsRNA包括位於2'位置之下述之一者：C1至C10低級烷基、經取代之低級烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、雜環烷基、雜環烷基芳基、胺基烷基胺基、聚烷基胺基、經取代之矽烷基、RNA裂解基團、保護基團、嵌入劑、用於改善iRNA之藥物動力學特性之基團或用於改善iRNA之藥效動力學特性之基團、以及其他具有類似特性之取代基。於一些態樣中，該修飾包括2'-甲氧基乙氧基(2'-O--CH2CH2OCH3，亦稱為2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)(Martin et al.,Helv.Chim.Acta,1995,78：486-504)，亦即，烷氧基-烷氧基基團。另一示例性修飾為2'-二甲基胺基氧乙氧基，亦即，O(CH2)2ON(CH3)2基團，亦稱為2'-DMAOE，如下文實施例中所述；以及2'-二甲基胺基乙氧基乙氧基(該領域中亦稱為2'-O-二甲基胺基乙氧基乙基或2'-DMAEOE)，亦即，2'-O--CH2--O--CH2--N(CH3)2。其他示例性修飾包括：5'-Me-2'-F核苷酸、5'-Me-2'-OMe核苷酸、5'-Me-2'-去氧核苷酸(於此三組中，皆為R異構物與S異構物兩者)；2'-烷氧基烷基；以及2'-NMA(N-甲基乙醯胺)。
其他修飾包括2'-甲氧基(2'-OCH3)、2'-胺基丙氧基(2'-OCH2CH2CH2NH2)及2'-氟(2'-F)。類似之修飾亦可在iRNA之RNA之其他位置作成，尤其是3'端核苷酸之糖的3'位置或2'-5'鏈結之dsRNA中以及5'端核苷酸之5'位置。iRNA亦可具有替代呋喃戊糖基糖的糖模擬物諸如環丁基部分。教示此類經修飾之糖結構之製備的代表性美國專利包括但不限於，美國專利第 4,981,957號、第5,118,800號、第5,319,080號、第5,359,044號、第5,393,878號、第5,446,137號、第5,466,786號、第5,514,785號、第5,519,134號、第5,567,811號、第5,576,427號、第5,591,722號、第5,597,909號、第5,610,300號、第5,627,053號、第5,639,873號、第5,646,265號、第5,658,873號、第5,670,633號及第5,700,920號，其中之某些為本申請所共有。前述者各自之整體內容藉由引用併入本文。
iRNA亦可包括核鹼基(該領域中一般簡稱為「鹼基」)修飾或取代。如本文中所用，「未經修飾」或「天然」核鹼基包括嘌呤鹼基腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G)，以及嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。經修飾之核鹼基包括其他合成及天然核鹼基，諸如去氧胸苷(dT)、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羥甲基胞嘧啶；黃嘌呤；次黃嘌呤；2-胺基腺嘌呤；腺嘌呤及鳥嘌呤之6-甲基及其他烷基衍生物；腺嘌呤及鳥嘌呤之2-丙基及其他烷基衍生物；2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、2-硫胞嘧啶；5-鹵尿嘧啶、5-鹵胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-鹵、8-胺基、8-巰基、8-硫烷基、8-羥基及其他8-取代之腺嘌呤及鳥嘌呤；5-鹵特定而言5-溴、5-三氟甲基及其他5-取代之尿嘧啶及胞嘧啶；7-甲基鳥嘌呤及7-甲基腺嘌呤；8-氮雜鳥嘌呤及8-氮雜腺嘌呤；7-去氮鳥嘌呤及7-去氮腺嘌呤；以及3-去氮鳥嘌呤及3-去氮腺嘌呤。其他核鹼基包括彼等揭露於美國專利第3,687,808號中者；彼等揭露於《生物化學、生物技術及醫藥中之經修飾之核苷酸》(Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijn,P.ed.Wiley-VCH,2008)中者；彼等揭露於《聚合物科學及工程之簡明百科》(The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,pages 858- 859,Kroschwitz,J.L,ed.John Wiley & Sons,1990)中者；此等由Englisch et al.,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613揭露者；以及彼等由《dsRNA研究及應用》第15章第289至302頁(Sanghvi,YS.,Chapter 15,dsRNA Research and Applications,pages 289-302,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Ed.,CRC Press,1993)揭露者。此等核鹼基中之某些特別可用於增加本發明提出之寡聚化合物的結合親和性。此等包括5-取代之嘧啶、6-氮雜嘧啶及N-2、N-6及0-6取代之嘌呤，包括2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙基尿嘧啶及5-丙基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已顯示將核酸雙鏈體安定性增加0.6至1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Eds.,dsRNA Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278)且為示例性鹼基取代，當與2'-O-甲氧基乙基糖修飾合用時尤甚。
教示某些上述經修飾之核鹼基以及其他經修飾之核鹼基的代表性美國專利包括但不限於，上述之美國專利第3,687,808號、第4,845,205號、第5,130,30號、第5,134,066號、第5,175,273號、第5,367,066號、第5,432,272號、第5,457,187號、第5,459,255號、第5,484,908號、第5,502,177號、第5,525,711號、第5,552,540號、第5,587,469號、第5,594,121號、第5,596,091號、第5,614,617號、第5,681,941號、第5,750,692號、第6,015,886號、第6,147,200號、第6,166,197號、第6,222,025號、第6,235,887號、第6,380,368號、第6,528,640號、第6,639,062號、第6,617,438號、第7,045,610號、第7,427,672號及第7,495,088號，其各自之整體內容藉由引用併入本文。
於一些態樣中，本揭露之RNAi劑亦可經修飾以包括一個或多個雙環糖部分。「雙環糖」為一種經由環修飾的呋喃糖基環，該環係藉由橋接無論 相鄰或非相鄰與否之兩個碳所形成。「雙環核苷」(「BNA」)為一種具有糖部分之核苷，該糖部分包含藉由橋接該糖環的無論相鄰或非相鄰與否之兩個碳所形成，從而形成雙環狀環系統。於某些態樣中，該橋連結糖環之4'碳與2'碳，視需要經由2'-非環之氧原子。因此，於一些態樣中，本發明之劑可包括一個或多個鎖定之核酸(LNA)。鎖定之核酸為具有經修飾之核糖部分的核苷酸，其中該核糖部分包含連結2'碳與4'碳之外接橋。換言之，LNA為包含雙環糖部分之核苷酸，該雙環糖部分包含4'-CH2-O-2'橋。這一結構有效地將該核糖「鎖定」為3'-環內結構之構形。將鎖定之核酸加至siRNA中已顯示增加血清中siRNA安定性，且降低脫靶效應(Elmen,J.et al.,(2005)Nucleic Acids Research 33(1)：439-447；Mook,OR.et al.,(2007)Mol Canc Ther 6(3)：833-843；Grunweller,A.et al.,(2003)Nucleic Acids Research 31(12)：3185-3193)。用於本發明之多核苷酸之雙環核苷的實例包括而不限於，包含位於4'核糖基環原子與2'核糖基環原子間之橋的核苷。於某些態樣中，本發明之反義多核苷酸劑包括一個或多個包含4'至2'橋之雙環核苷。
鎖定之核苷可由以下結構表示(忽略立體化學)，
Figure 111115644-A0202-12-0061-153
其中B為核鹼基或經修飾之核鹼基，且L為將核糖環之2'-碳連接至4'-碳之連接基團。此類4'至2'橋接之雙環狀核苷的實例包括但不限於4'-(CH2)-O-2'(LNA)；4'-(CH2)-S-2'；4'-(CH2)2-O-2'(ENA)；4'-CH(CH3)-O-2'(亦稱為「受約束之乙基」或「cEt」)及4'-CH(CH2OCH3)-O-2'(及其類似物；參見例如， 美國專利第7,399,845號)；4'-C(CH3)(CH3)-O-2'(及其類似物；參見例如，美國專利第8,278,283號)；4'-CH2-N(OCH3)-2'(及其類似物；參見例如，美國專利第8,278,425號)；4'-CH2-O-N(CH3)-2'(參見例如，美國專利申請案第2004/0171570號)；4'-CH2-N(R)-O-2'，其中R為H、C1-C12烷基或氮保護基團(參見例如，美國專利第7,427,672號)；4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(參見例如，Chattopadhyaya et al.,J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；及4'-CH2-C(=CH2)-2'(及其類似物；參見例如，美國專利第8,278,426號)。前述者各自之整體內容藉由引用併入本文。
教示鎖定之核酸核苷酸之製備的其他代表性美國專利及美國專利公開包括但不限於下列者：美國專利第6,268,490號、第6,525,191號、第6,670,461號、第6,770,748號、第6,794,499號、第6,998,484號、第7,053,207號、第7,034,133號、第7,084,125號、第7,399,845號、第7,427,672號、第7,569,686號、第7,741,457號、第8,022,193號、第8,030,467號、第8,278,425號、第8,278,426號、第8,278,283號、第2008/0039618號及第2009/0012281號，其各自之整體內容藉由引用併入本文。
前述雙環核苷之任意者可製備為具有一種或多種立體化學糖組態，包括，舉例而言，α-L-呋喃核糖及β-D-呋喃核糖(參見，WO 99/14226)。
iRNA之RNA亦可經修飾，以包括一個或多個受約束之乙基核苷酸。如本文中所用，「受約束之乙基核苷酸」或「cEt」為包含雙環糖部分的鎖定之核酸，其中該雙環糖部分包含4'-CH(CH3)-O-2'橋(亦即，前述結構中之L)。於一個態樣中，受約束之乙基核苷酸為S構形，本文中指稱為「S-cEt」。
本發明之iRNA亦可經修飾，以包括一個或多個「構形上受限之核苷酸」(「CRN」)。CRN為具有連結核糖之C2'碳與C4'碳或核糖之C3碳與C5' 碳之連接子的核苷酸類似物。CRN將該核糖鎖定為安定之構形，且增加其與mRNA之雜交親和性。該連接子足夠長，以將氧置於對於安定性及親和性為最優之位置，從而令核糖不易起皺。
教示上述CRN之製備的代表性專利公開包括但不限於，美國專利公開第第2013/0190383號及PCT公開第WO 2013/036868號，其各自之整體內容藉由引用併入本文。
於一些態樣中，本發明之iRNA包含一個或多個作為UNA(未鎖定之核酸)核苷酸之單體。UNA為未鎖定之非環狀核酸，其中該糖之任意鍵業經移除，形成未鎖定之「糖」殘基。於一個實例中，UNA亦涵蓋其C1'-C4'鍵(亦即，位於C1'碳與C4'碳間之碳-氧-碳共價鍵)已移除之單體。於另一實例中，糖之C2'-C3'鍵(亦即，C2'碳與C3'碳之間的碳-碳共價鍵)已移除(參見，Nuc.Acids Symp.Series,52,133-134(2008)及Fluiter et al.,Mol.Biosyst.,2009,10,1039，藉由引用併入本文)。
教示UNA之製備的代表性美國專利公開包括但不限於，美國專利第8,314,227號及美國專利公開第2013/0096289號、第2013/0011922號及第2011/0313020號，其各自之整體內容藉由引用併入本文。
對RNA分子之末端的潛在安定化修飾可包括N-(乙醯基胺基己醯基)-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6-NHAc)、N-(己醯基-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6)、N-(乙醯基-4-羥基脯胺醇(Hyp-NHAc)、胸腺嘧啶-2'-O-去氧胸腺嘧啶(醚)、N-(胺基己醯基)-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6-胺基)、2-二十二醯基-尿苷-3'-磷酸酯、反向2'-去氧-繼續說之核糖核苷酸諸如反向dT(idT)、反向dA(idA)及反向無鹼基2'-去氧核糖核苷酸(iAb)等。該修飾之揭露可見於WO 2011/005861中。
於一個實例中，寡核苷酸之3'或5'末端係連接至反向2'-去氧-修飾之核糖核苷酸諸如反向dT(idT)、反向dA(idA)或反向無鹼基2'-去氧核糖核苷酸(iAb)。於一個特定實例中，反向2'-去氧-修飾之核糖核苷酸係連接至寡核苷酸之3'末端，諸如本文所揭示之正義股的3'末端，其中該連接係經由3'-3'磷酸二酯類鏈結或3'-3'-硫代磷酸酯類鏈結。
於另一實例中，正義股之3'末端係經由3'-3'-硫代磷酸酯類鏈結連接至反向無鹼基核糖核苷酸(iAb)。於另一實例中，正義股之3'末端係經由3'-3'-硫代磷酸酯類鏈結連接至反向dA(idA)。
於一個特定實例中，反向2'-去氧-修飾之核糖核苷酸係連接至寡核苷酸之3'末端，諸如本文所揭示之正義股的3'末端，其中該連接係經由3'-3'磷酸二酯類鏈結或3'-3'-硫代磷酸酯類鏈結。
於另一實例中，正義股之3'端核苷酸為反向dA(idA)且經由3'-3'-鏈結(例如，3'-3'-硫代磷酸酯類鏈結)連接至在先核苷酸。
本發明之iRNA之核苷酸的其他修飾包括5'磷酸酯或5'磷酸酯模擬物，如位於iRNA之反義股的5'端磷酸酯或磷酸酯模擬物。適宜之磷酸酯模擬物係揭露於，舉例而言，美國專利公開第2012/0157511號中，其整體內容藉由引用併入本文。
A.本發明之包含模體的經修飾之iRNA
於本發明之某些方面，本發明之雙股RNA劑包括具有如例如WO2013/075035中所揭露之化學修飾的劑，其各自之整體內容藉由引用併入本文。如本文中及WO2013/075035中所示，可將一個或多個位於三個連續核苷酸的三個相同修飾之模體引入dsRNAi劑之正義股或反義股中，特定而言在或鄰近 裂解位點處。於一些態樣中，dsRNAi劑之正義股及反義股可以其他方式經完全修飾。此等模體之引入打斷正義或反義股之修飾模式(若存在)。dsRNAi劑可視需要與GalNAc衍生物配體接合，例如在正義股。
更詳而言，當雙股RNA劑之正義股及反義股經完全修飾以在或鄰近dsRNAi劑之至少一個的裂解位點處具有一個或多個位於三個連續核苷酸之三個相同修飾之模體時，觀察到dsRNAi劑之基因緘默化活性。
據此，本發明提供能在活體內抑制標靶基因(亦即，TMPRSS6基因)之表現的雙股RNA劑。該RNAi劑包含正義股及反義股。該RNAi劑之各股可為，舉例而言，17至30個核苷酸之長度、25至30個核苷酸之長度、27至30個核苷酸之長度、19至25個核苷酸之長度、19至23個核苷酸之長度、19至21個核苷酸之長度、21至25個核苷酸之長度或21至23個核苷酸之長度。
該正義股及反義股典型係形成雙鏈體雙股RNA(「dsRNA」)，本文中亦指稱為「dsRNAi劑」。dsRNAi劑之雙鏈體區域可為，舉例而言，該雙鏈體區域可為27至30個核苷酸對之長度、19至25個核苷酸對之長度、19至23個核苷酸對之長度、19至21個核苷酸對之長度、21至25個核苷酸對之長度或21至23個核苷酸對之長度。於另一實例中，該雙鏈體區域係選自19、20、21、22、23、24、25、26及27個核苷酸之長度。
於某些態樣中，該dsRNAi劑可含有位於一股或兩股之3'末端、5'末端或兩端的一個或多個突出區域或封端基團。該突出可獨立地為1至6個核苷酸之長度，例如，2至6個核苷酸之長度、1至5個核苷酸之長度、2至5個核苷酸之長度、1至4個核苷酸之長度、2至4個核苷酸之長度、1至3個核苷酸之長度、2至3個核苷酸之長度或1至2個核苷酸之長度。於某些態樣中，該突 出區域可包括如上文所提供的延長之突出區域。該等突出可為一股比另一股長之結果，或係相同長度之兩股交錯之結果。該突出可形成與標靶mRNA之誤配，或其可與待作為標靶之基因序列互補或可為另一序列。該第一股與第二股亦可藉由例如額外之鹼基接合以形成髮夾，或藉由其他非鹼基連接子連接。
於某些態樣中，該dsRNAi劑之突出區域中之核苷酸可各自獨立為經修飾或未經修飾之核苷酸，包括但不限於，2'-糖修飾，例如，2'-F、2'-O-甲基胸苷(T)，2`-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(Teo)，2`-O-甲氧基乙基腺苷(Aeo)，2`-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷(m5Ceo)，及其任意組合。
舉例而言，TT可為任一股之任一端之突出序列。該突出可形成與標靶mRNA之誤配，或其可與待作為標靶之基因序列互補或可為另一序列。
位於該dsRNAi劑之正義股、反義股或兩個之5'突出或3'突出可經磷酸化。於一些態樣中，該突出區域含有兩個核苷酸且在該兩個核苷酸之間具有硫代磷酸酯，其中該兩個核苷酸可為相同或相異。於一些態樣中，該突出係存在於正義股、反義股或兩股之3'末端。於一些態樣中，該3'突出係存在於反義股。於一些態樣中，該3'突出係存在於正義股。
該dsRNAi劑可僅含有單個突出，該突出可強化該RNAi劑之干擾活性而不影響其整體安定性。舉例而言，該單股突出可位於正義股之3'末端，或替代性地位於反義股之3'末端。該RNAi劑亦可具有鈍端，位於反義股之5'末端(亦即，正義股之3'末端)，反之亦然。通常，該dsRNAi即之反義股具有位於3'末端之核苷酸突出，且5'端為鈍端。儘管不欲受縛於理論，但位於反義股5'末端之不對稱鈍端以及反義股之3'末端突出有助於將導引股加載至RISC製程中。
於某些態樣中，該dsRNAi劑係19個核苷酸長度之雙鈍端者，其中正義股含有至少一個位於從5'末端計數第7、8、9位置處之三個連續核苷酸之三個2'-F修飾的模體。反義股含有至少一個位於從5'末端計數第11、12及13位置處之三個連續核苷酸之三個2'-O-甲基修飾的模體。
於其他態樣中，該dsRNAi劑係20個核苷酸長度之雙鈍端者，其中正義股含有至少一個位於從5'末端計數第8、9、10位置處之三個連續核苷酸之三個2'-F修飾的模體。反義股含有至少一個位於從5'末端計數第11、12及13位置處之三個連續核苷酸之三個2'-O-甲基修飾的模體。
於又其他態樣中，該dsRNAi劑係21個核苷酸長度之雙鈍端者，其中正義股含有至少一個位於從5'末端計數第9、10、11位置處之三個連續核苷酸之三個2'-F修飾的模體。反義股含有至少一個位於從5'末端計數第11、12及13位置處之三個連續核苷酸之三個2'-O-甲基修飾的模體。
於某些態樣中，該dsRNAi劑包含21個核苷酸之正義股及23個核苷酸之反義股，其中該正義股含有至少一個位於從5'末端計數第9、10及11位置處之三個連續核苷酸之三個2'-F修飾的模體；該反義股含有至少一個位於從5'末端計數第11、12及13位置處之三個連續核苷酸之三個2'-O-甲基修飾的模體，其中該RNAi劑之一端為鈍端而另一端包含具有2個核苷酸之突出。於一個態樣中，該2個核苷酸之突出位於反義股之3'末端。
當該2個核苷酸之突出位於反義股之3'末端時，在末端三個核苷酸之間可能存在兩個硫代硫酸酯類核苷酸間鏈結，其中該三個核苷酸中之兩者為該突出核苷酸，且第三個核苷酸與緊鄰該突出核苷酸之下一個核苷酸配對。於一個態樣中，該RNAi劑在正義股之5'末端及反義股之5'末端兩處額外具有位於 末端三個核苷酸之間的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。於某些態樣中，該dsRNAi劑之正義股及反義股中之各核苷酸，包括作為該等模體之一部分的核苷酸，皆為經修飾之核苷酸。於某些態樣中，各殘基係獨立地經2'-O-甲基或3'-氟以例如交替模體方式修飾。視需要，該dsRNAi劑復包含配體(諸如GalNAc3)。
於某些態樣中，該dsRNAi劑包含正義股及反義股，其中該正義股為25至30個核苷酸殘基之長度，其中第一股之從5'端核苷酸(位置1)開始計數之位置1至23包含至少8個核糖核苷酸；該反義股為36至66個核苷酸殘基之長度，且從3'端核苷酸開始計數，在與正義股之位置1至23配對以形成雙鏈體之位置中包含至少8個核糖核苷酸；其中至少反義股之3'端核苷酸未與正義股配對，且至多6個連續之3'端核苷酸未與正義股配對，從而形成具有1至6個核苷酸之3'單股突出；其中反義股之5'端包含10至30個為與正義股配對之連續核苷酸，從而形成具有10至30個核苷酸之單股5'突出；其中，當將該正義股與反義股對準以進行最大互補時，至少該正義股之5'端核苷酸及3'端核苷酸與反義股之核苷酸進行鹼基配對，從而在該正義股與反義股之間形成實質上雙鏈體之區域；以及，反義股在沿著反義股長度之至少19個核苷酸與標靶RNA充分互補，以在當將該雙股核酸引入哺乳動物細胞內時降低標靶基因之表現；以及，其中該正義股含有至少一個位於三個連續核苷酸之三個2'-F修飾的模體，其中該等模體之至少一者係出現在裂解位點或鄰近該裂解位點處。反義股含有至少一個位於裂解位點或鄰近該裂解位點處之三個連續核苷酸之三個2'-O-甲基修飾的模體。
於某些態樣中，該dsRNAi劑包含正義股及反義股，其中該dsRNAi劑包含具有至少25個且至多29個核苷酸之長度的第一股，以及具有至多30個 核苷酸之長度且具有至少一個位於從5'末端計數第11、12、13位置處之三個連續核苷酸之三個2'-O-甲基修飾之模體的第二股；其中該第一股之3'末端及該第二股之5'末端係形成鈍端，且該第二股係於其3'末端比該第一股長1至4個核苷酸，其中該雙鏈體之長度為至少25個核苷酸，且該第二股係在沿著該第二股長度之至少19個核苷酸與標靶mRNA充分互補，以在當將該RNAi劑引入哺乳動物細胞內時降低標靶基因之表現，以及，其中該dsRNAi劑之切丁酶裂解得到包含該第二股之3'末端的siRNA，從而降低該哺乳動物體內之標靶基因的表現。視需要，該dsRNAi劑復包含配體。
於某些態樣中，該dsRNAi劑之正義股含有至少一個位於三個連續核苷酸之三個相同修飾的模體，其中該等模體之一者出現在正義股之裂解位點處。
於某些態樣中，該dsRNAi劑之反義股亦可含有至少一個位於三個連續核苷酸之三個相同修飾的模體，其中該等模體之一者出現在或鄰近反義股之裂解位點處。
對於具有19至23個核苷酸之長度之雙鏈體區域的dsRNAi劑，該反義股之裂解位點典型係位於從5'末端計數之位置10、11及12附近。因此，該等三個相同修飾之模體可出現在反義股之位置9、10、11，位置10、11、12，位置11、12、13，位置12、13、14，或位置13、14、15，從該反義股之5'末端的第一個核苷酸開始計數，或在該雙鏈體區域內從該反義股之5'末端的第一個配對核苷酸開始計數。該反義股之裂解位點亦可根據該dsRNAi劑之雙鏈體區域從5'末端計數的長度而改變。
該dsRNAi劑之正義股可含有至少一個位於該股之裂解位點處之三個連續核苷酸之三個相同修飾的模體；且該反義股可具有至少一個在或鄰近該股之裂解位點處之三個連續核苷酸之三個相同修飾的模體。當正義股及反義股形成dsRNA雙鏈體時，該正義股及該反義股可經對準，使得位於該正義股之一個三核苷酸模體與位於該反義股之一個三核苷酸模體具有至少一個核苷酸重疊，亦即，該正義股中模體之三個核苷酸之至少一者與該反義股中模體之三個核苷酸之至少一者鹼基配對。替代性地，至少兩個核苷酸可重疊，或全部三個核苷酸可重疊。
於一些態樣中，該dsRNAi劑之正義股可含有超過一個位於三個連續核苷酸之三個相同修飾的模體。第一模體可出現在或鄰近該股之裂解位點處，且其他模體可為側翼修飾。本文中，術語「側翼修飾」指稱出現在該股之另一部位的與在或鄰近同一股之裂解位點處之模體分隔開來的模體。側翼修飾或與第一模體相鄰或藉由至少一個或多個核苷酸與第一模體分隔開來。當該等模體彼此緊鄰時，則該等模體之化學性彼此不同；而當該等模體藉由一個或多個核苷酸分隔開來時，則該等化學性可為相同或相異。可存在兩個或多個側翼修飾。例如，當存在兩個側翼修飾時，每一側翼修飾可出現在或鄰近裂解位點處之第一模體的一段，或出現在該前導模體之任一側。
與正義股相似，該dsRNAi劑之反義股可含有超過一個位於三個連續核苷酸之三個相同修飾的模體，且該等模體之至少一者出現在或鄰近該股之裂解位點處。該反義股亦可含有一個或多個側翼修飾，該側翼修飾之排列係類似於可能存在於該正義股之側翼修飾。
於一些態樣中，該dsRNAi劑之正義股或反義股之側翼修飾典型不包括位於該股之3'末端、5'末端或兩端之最開始的一個或兩個末端核苷酸。
於其他態樣中，該dsRNAi劑之正義股或反義股之側翼修飾典型不包括位於該雙鏈體區域內該股之3'末端、5'末端或兩端之最開始的一個或兩個配對核苷酸。
當該dsRNAi劑之正義股及反義股各自含有至少一個側翼修飾時，該側翼修飾可落入該雙鏈體區域之相同末端，且具有一個、兩個或三個核苷酸之重疊。
當該dsRNAi劑之正義股及反義股各自含有至少兩個側翼修飾時，該正義股與該反義股可經對準而使得來自一股之兩個修飾之每一者落入該雙鏈體區域之一端且具有一個、兩個或三個核苷酸之重疊；來自一股之兩個修飾之每一者落入該雙鏈體區域之另一端且具有一個、兩個或三個核苷酸之重疊；一股之兩個修飾分別落入該前導模體之各側且在該雙鏈體區域內具有一個、兩個或三個核苷酸之重疊。
於一些態樣中，該dsRNAi劑之正義股及反義股中之每一個核苷酸，包括作為該等模體之一部分的核苷酸，可為經修飾。每一核苷酸可藉由相同或相異之修飾而經修飾，該等修飾可包括非鏈結性磷酸酯氧之一者或兩者或鏈結性磷酸酯氧之一者或多者的一個或多個變更；核糖之構建的變更，例如，核糖上2'-羥基之變更；以「去磷」連接子進行之磷酸酯部分的整體置換；天然出現之鹼基的修飾或置換；以及核糖-磷酸酯主鏈的置換或修飾。
由於核酸為子單元之聚合物，該等修飾之多數出現在核酸內重複之位置，例如，鹼基、磷酸酯部分或磷酸酯部分之非鏈結性O的修飾。於一些 情形中，該修飾將出現在該核酸之所有受試位置，但在多數情形中並非如此。舉例而言，修飾可僅出現在3'或5'端位置，可僅出現在末端區域，例如，出現在末端核苷酸之位置或出現在一股之最末2、3、4、5或10個核苷酸內。修飾可出現在雙股區域內、單股區域內或兩者內。修飾可僅出現在RNA之雙股區域內，或僅出現在RNA之單股區域內。例如，位於非鏈結性O位置之硫代磷酸酯修飾可僅出現在一端或兩端；可僅出現在末端區域，例如出現在末端核苷酸之位置或出現在一股之最末2、3、4、5或10個核苷酸內；或可出現在雙股區域及單股區域內，尤其是在末端。一個或多個5'末端可經磷酸化。
下述者係可能者，例如，提升安定性，在突出中包括特定鹼基，或在單股突出例如5'突出或3'突出或兩者中包括經修飾之核苷酸或核苷酸替代品。例如，可能所欲者係在突出中包括嘌呤核苷酸。於一些態樣中，3'或5'突出中之全部或一些鹼基可經修飾，例如，具有本文所述之修飾。修飾可包括，例如，使用在核糖之2'位置具有該領域中已知之修飾者，例如使用去氧核糖核苷酸，使用2'-去氧-2'-氟(2'-F)或2'-O-甲基修飾者替代核鹼基之核糖，以及使用磷酸酯基團中之修飾例如硫代磷酸酯修飾。突出無需與標靶序列同源。
於一些態樣中，該正義股及反義股之每一殘基係獨立經LNA、CRN、cET、UNA、HNA、CeNA、2'-己氧基乙基、2'-O-甲基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-去氧、2'-羥基或2'-氟修飾。該股可含有超過一個修飾。於一個態樣中，該正義股及反義股之每一殘基係獨立經2'-O-甲基或2'-氟修飾。
至少兩個相異之修飾係典型存在於該正義股及反義股。彼等兩個修飾可為2'-O-甲基或2'-氟修飾等。
於某些態樣中，Na或Nb包含交替模式之修飾。如本文中所用，術語「交替模體」指稱具有一個或多個修飾之模體，各修飾出現在一股之交替核苷酸。交替核苷酸可指稱每兩個核苷酸一個或每三個核苷酸一個或類似模式。例如，如果A、B及C各自表示一種類型之對核苷酸之修飾，則交替模體可為「ABABABABABAB…」、「AABBAABBAABB…」、「AABAABAABAAB…」、「AAABAAABAAAB…」、「AAABBBAAABBB…」或「ABCABCABCABC…」等。
交替模體中含有之修飾的類型可為相同或相異。例如，如果A、B、C、D各自表示一種類型之對核苷酸之修飾，則交替模體亦即每兩個核苷酸之修飾可為相同，但正義股或反義股可各自選自交替模體諸如「ABABAB…」、「ACACAC…」、「BDBDBD…」或「CDCDCD…」等中修飾之若干可能性。
於一些態樣中，本發明之dsRNAi劑包含，該正義股之交替模體的修飾模式相對於該反義股之交替模體的修飾模式位移。該位移可使得正義股之核苷酸的修飾基團係與反義股之核苷酸的不同修飾基團相對應，反之亦然。例如，當正義股與反義股在dsRNA雙鏈體中鹼基配對時，在該雙鏈體區域內，該正義股中之交替模體可始於該股之5'至3'之「ABABAB」且該反義股中之交替模體可始於該股之5'至3'之「BABABA」。作為另一實例，在該雙鏈體區域內，正義股中之交替模體可始於該股之5'至3'之「AABBAABB」，且該反義股中之交替模體可始於該股之5'至3'之「BBAABBAA」，因此該正義股與反義股之間存在修飾模式之完全或部分位移。
於一些態樣中，該dsRNAi劑包含位於正義股之2'-O-甲基修飾與2'-F修飾起始之交替模體之模式，該模式具有相對於位於反義股之2'-O-甲基 修飾與2'-F修飾起始之交替模體之模式的位移，亦即，正義股鹼基對之2'-O-甲基修飾之核苷酸與反義股之2'-F修飾之核苷酸進行鹼基配對，反之亦然。正義股之1位置可始於該2'-F修飾，且反義股之1位置可始於該2'-O-甲基修飾。
將一個或多個位於三個連續核苷酸之三個相同修飾的模體引入該正義股或反義股中，係中斷該正義股或反義股中存在之初始修飾模式。藉由將一個或多個位於三個連續核苷酸之三個相同修飾的模體引入正義股或反義股中而中斷該正義股或反義股的修飾模式，係出乎意料地提升了對於標靶基因之基因緘默化活性。
於一些態樣中，當將位於三個連續核苷酸之三個相同修飾的模體引入任一股中時，位於該模體之下一個核苷酸的修飾係不同於該模體之修飾者。例如，含有該模體之序列部位為「…NaYYYNb…」，其中，「Y」表示位於三個連續核苷酸之三個相同修飾的模體，且「Na」及「Nb」表示位於模體「YYY」之下一個核苷酸上的不同於Y修飾之修飾，且其中Na與Nb可為相同或相異之修飾。替代性地，當存在側翼修飾時，Na或Nb可存在或不存在。
該iRNA可復包含至少一個硫代磷酸酯類或甲基硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該硫代磷酸酯或甲基磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾可出現在正義股、反義股或兩股之位於該股任意位置之任意核苷酸。例如，該核苷酸間鏈結修飾可出現在正義股或反義股之每一個核苷酸；各核苷酸間鏈結修飾可以交替模式出現在正義股或反義股；或正義股或反義股可含有交替模式之兩種核苷酸間鏈結修飾。正義股之交替模式之核苷酸間鏈結修飾可與反義股相同或相異，其正義股之交替模式之核苷酸間鏈結修飾可具有相對於反義股之交替模式之核苷酸間鏈結修飾的位移。於一個態樣中，雙股RNAi劑包含6至8個硫代磷酸酯類核苷酸 間鏈結。於一些態樣中，反義股包含位於5'端之兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結以及位於3'端之兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，且正義股包含位於5'端或3'端之至少兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。
於一些態樣中，該dsRNAi劑包含位於突出區域內之硫代磷酸酯或甲基磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾。例如，該突出區域可含有兩個核苷酸且在該兩個核苷酸間具有硫代磷酸酯或甲基磷酸酯類核苷酸間鏈結。核苷酸間鏈結修飾亦可作成以將該突出核苷酸與雙鏈體區域內之末端配對核苷酸鏈結。例如，至少2、3、4或全部突出核苷酸可透過硫代磷酸酯或甲基磷酸酯類核苷酸間鏈結而鏈結，且視需要，可存在將突出核苷酸與作為該突出核苷酸之下一個成對核苷酸鏈結的額外之硫代磷酸酯或甲基磷酸酯類核苷酸間鏈結。例如，在末端三個核苷酸之間可能存在至少兩個硫代硫酸酯類核苷酸間鏈結，其中該三個核苷酸中之兩者係突出核苷酸，且第三個核苷酸係緊鄰該突出核苷酸之下一個配對核苷酸。此等末端核苷酸可位於反義股之3'末端、正義股之3'末端、反義股之5'末端或正義股之5'末端。
於一些態樣中，2個核苷酸之突出位於反義股之3'末端，且在末端三個核苷酸之間可能存在兩個硫代硫酸酯類核苷酸間鏈結，其中該三個核苷酸中之兩者為該突出核苷酸，且第三個核苷酸係與緊鄰該突出核苷酸之下一個核苷酸配對。視需要，該dsRNAi劑可在正義股之5'末端及反義股之5'末端兩處額外具有位於末端三個核苷酸之間的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。
於一個態樣中，該dsRNAi劑包含與標靶之誤配、雙鏈體中之誤配或其組合。該誤配可出現在突出區域內或雙鏈體區域內。基於鹼基對促進解離或熔融之傾向性(例如，基於特定配對之締合或解離之自由能，自由能係基於個 體配對檢查配對的最簡單之途徑，但亦可使用次近鄰分析及類似分析)，可將鹼基對排名。就促進解離而言：A：U優於G：C；G：U優於G：C；且I：C優於G：C(I為肌苷)。誤配，例如，非規範配對或除規範配對之外者(如本文中他處所揭示)，優於規範(A：T、A：U、G：C)配對；且包括萬用鹼基之配對優於規範配對。
於某些態樣中，該dsRNAi劑包含，位於該雙鏈體區域內之反義股中從5'末端計數最前列之第1、2、3、4或5個鹼基對的至少一者係選自下列所組成之群組：A：U、G：U、I：C、以及誤配例如非規範配對或除規範配對之外者或包括萬用鹼基之配對，以促進反義股於該雙鏈體之5'末端的解離。
於某些態樣中，位於該雙鏈體區域內之反義股中從5'末端計數之第1個位置處的核苷酸係選自A、dA、dU、U及dT。替代性地，位於該雙鏈體區域內之反義股中從5'末端計數最前列之第1、2或3個鹼基對的至少一者為AU鹼基對。舉例而言，位於該雙鏈體區域內之反義股中從5'末端計數之第一個鹼基對為AU鹼基對。
於其他態樣中，正義股之3'末端處的核苷酸為去氧胸苷(dT)，或反義股之3'末端之核苷酸為去氧胸苷(dT)。舉例而言，正義股、反義股或兩股之3'末端存在去氧胸苷核苷酸之短序列，舉例而言，兩個dT核苷酸。
於某些態樣中，該正義股序列可由式(I)表示：
5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3' (I)
其中：
i及j係各自獨立為0或1；
p及q係各自獨立為0至6；
各Na獨立地表示包含0至25個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列，各序列包含至少兩個經不同修飾之核苷酸；
各Nb獨立地表示包含0至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列；
各np與nq獨立地表示突出核苷酸；
其中，Nb及Y不具有相同之修飾；以及
XXX、YYY及ZZZ各自地獨立表示一個位於三個連續核苷酸之三個相同修飾的模體。於一個態樣中，YYY全部為2'-F修飾之核苷酸。
於一些態樣中，Na或Nb包含交替模式之修飾。
於一些態樣中，該YYY模體出現在或鄰近正義股之裂解位點處。例如，當該dsRNAi劑具有長度為17至23個核苷酸之雙鏈體區域時，該YYY模體出現在正義股之裂解位點處或其左近(例如，可出現在位置6、7、8；7、8、9；8、9、10；9、10、11；10、11、12；或11、12、13處)，從5'末端之第一個核苷酸開始計數；或視需要，從5'末端之雙鏈體區域內第一個配對核苷酸開始計數。
於一個態樣中，i為1且j為0，或i為0且j為1，或i及j兩者皆為1。該正義股可因此藉由下列式表示：
5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Ib)；
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3' (Ic)；或
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Id)。
當該正義股由式(Ib)表示時，Nb表示包含0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各Na可獨立第表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當該正義股由式(Ic)表示時，Nb表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各Na可獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當該正義股由式(Id)表示時，各Nb獨立地表示包含0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。於一個態樣中，Nb為0、1、2、3、4、5或6。各Na可獨立地表示包含2至20、2至15或2-10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
X、Y及Z各自可為彼此相同或相異。
於其他態樣中，i為0且j為0，且該正義股可藉由下式表示：
5' np-Na-YYY-Na-nq 3' (Ia)。
當該正義股由式(Ia)表示時，各Na獨立地表示包含2至20、2至15或2-10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
於一個態樣中，該RNAi之反正義股序列可由式(II)表示：
5' nq'-Na'-(Z'Z'Z')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(X'X'X')l-N'a-np' 3' (II)
其中：
k及l係各自獨立為0或1；
p'及q'係各自獨立為0至6；
各Na'獨立地表示包含0至25個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列，各序列包含至少兩個經不同修飾之核苷酸；
各Nb'獨立地表示包含0至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列；
各np'與nq'獨立地表示突出核苷酸；
其中，Nb'及Y'不具有相同之修飾；以及
X'X'X'、Y'Y'Y'及Z'Z'Z'各自獨立地表示一個位於三個連續核苷酸之三個相同修飾的模體。
於一些態樣中，Na'或Nb'包含交替模式之修飾。
於一個態樣中，該Y'Y'Y'模體出現在或鄰近反義股之裂解位點處。例如，當該dsRNAi劑具有長度為17至23個核苷酸之雙鏈體區域時，該Y'Y'Y'模體出現在該反義股之位置9、10、11；10、11、12；11、12、13；12、13、14；或13、14、15處，從5'末端之第一個核苷酸開始計數；或視需要，從5'末端之雙鏈體區域內第一個配對核苷酸開始計數。於一個態樣中，該Y'Y'Y'模體出現在位置11、12、13處。
於某些態樣中，Y'Y'Y'模體全部為2'-OMe修飾之核苷酸。
於某些態樣中，k為1且l為0，或k為0且l為1，或k及l兩者皆為1。
該反義股可因此藉由下列式表示：
5' nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-np' 3' (IIb)；
5' nq'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-np' 3' (IIc)；或
5' nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-Na'-np' 3' (IId)。
當該反義股由式(IIb)表示時，Nb'表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各Na'獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當該反義股表示為式(IIc)時，Nb'表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各 Na'獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當該反義股表示為式(IId)時，各Nb'獨立地表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各Na'獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。於一個態樣中，Nb為0、1、2、3、4、5或6。
於其他態樣中，k為0且l為0，且該反義股可藉由下式表示：
5' np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-nq' 3' (Ia)。
當該反義股表示為式(Ia)時，各Na獨立地表示包含2至20、2至15或2-10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
X'、Y'及Z'各自可為彼此相同或相異。
該正義股及反義股之每一核苷酸係獨立地經LNA、CRN、UNA、cET、HNA、CeNA、2'-己氧基乙基、2'-O-甲基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-羥基或2'-氟修飾。例如，該正義股及反義股之每一核苷酸係獨立地經2'-O-甲基或2'-氟修飾。特別地，X、Y、Z、X'、Y'及Z'可各自表示2'-O-甲基修飾或2'-F修飾。
於一些態樣中，當雙鏈體區域為21 nt時，該dsRNAi劑之正義股可含有出現在該股之9、10及11位置之YYY模體，從5'末端之第一個核苷酸開始計數，或視需要，在雙鏈體區域內從5'末端之第一個配對核苷酸開始計數；以及，Y表示2'-F修飾。該正義股可額外含有XXX模體或ZZZ模體作為位於雙鏈體區域之相反末端的側翼修飾；以及，XXX與ZZZ各自獨立地表示2'-OMe修飾或2'-F修飾。
於一些態樣中，反義股可含有出現在該股之11、12及13位置之Y'Y'Y'模體，從5'末端之第一個核苷酸開始計數，或視需要，在雙鏈體區域內從5'末端之第一個配對核苷酸開始計數；以及，Y'表示2'-O-甲基修飾。該反義股可額外含有X'X'X'模體或Z'Z'Z'模體作為位於雙鏈體區域之相反末端的側翼修飾；以及，X'X'X'與Z'Z'Z'各自獨立地表示2'-OMe修飾或2'-F修飾。
由上述式(Ia)、(Ib)、(Ic)及(Id)中任一者表示之正義股係分別與由式(IIa)、(IIb)、(IIc)及(IId)中任一者表示之反義股形成雙鏈體。
據此，用於本發明之方法中的dsRNAi劑可包含正義股及反義股，各股具有14至30個核苷酸，該iRNA雙鏈體由式(III)表示：
正義：5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'
反義：3' np '-Na '-(X'X'X')k-Nb '-Y'Y'Y'-Nb '-(Z'Z'Z')l-Na '-nq ' 5' (III)
其中：
i、j、k及l係各自獨立為0或1；
p、p'、q及q'係各自獨立為0至6；
各Na及Na '獨立地表示包含0至25個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列，各序列包含至少兩個經不同修飾之核苷酸；
各Nb及Nb'獨立地表示包含0至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
其中，各np、nq及nq'可存在或不存在，且各自獨立地表示突出核苷酸；
XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'及Z'Z'Z'各自獨立地表示一個位於三個連續核苷酸之三個相同修飾的模體。
於一個態樣中，i為0且j為0；或i為1且j為0；或i為0且j為1；或i及j兩者皆為0；或i及j兩者皆為1。於另一態樣中，k為0且l為0；或k為1且l為0；或k為0且l為1；或k及l兩者皆為0；或k及l兩者皆為1。
形成iRNA雙鏈體之正義股與反義股的示例性組合包括下述各式：
5' np-Na-YYY-Na-nq 3'
3' np '-Na '-Y'Y'Y'-Na 'nq ' 5' (IIIa)
5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'
3' np '-Na '-Y'Y'Y'-Nb '-Z'Z'Z'-Na 'nq ' 5' (IIIb)
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3'
3' np '-Na '-X'X'X'-Nb '-Y'Y'Y'-Na '-nq ' 5' (IIIc)
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'
3' np '-Na '-X'X'X'-Nb '-Y'Y'Y'-Nb '-Z'Z'Z'-Na-nq ' 5' (IIId)
當該dsRNAi劑由式(IIIa)表示時，各Na獨立地表示包含2至20、2至15或2-10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當該dsRNAi劑由式(IIIb)表示時，各Nb獨立地表示包含1至10、1至7、1至5或1-4個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各Na獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當該dsRNAi劑表示為式(IIIc)時，各Nb、Nb'獨立地表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各Na獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當該dsRNAi劑表示為式(IIId)時，各Nb、Nb'獨立地表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各Na、Na '獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。Na、Na'、Nb及Nb '中之各者獨立地包含交替模式之修飾。
式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)中之X、Y及Z中之各者可為彼此相同或相異。
當該dsRNAi劑由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示時，Y核苷酸之至少一者可與Y'核苷酸之至少一者進行鹼基配對。替代性地，Y核苷酸之至少兩者係與相應之Y′核苷酸進行鹼基配對；或Y核苷酸之全部三者係與相應之Y′核苷酸進行鹼基配對。
當該dsRNAi劑由式(IIIb)或(IIId)表示時，Z核苷酸之至少一者可與Z'核苷酸之至少一者進行鹼基配對。替代性地，Z核苷酸之至少兩者係與相應之Z′核苷酸進行鹼基配對；或Z核苷酸之全部三者係與相應之Z′核苷酸進行鹼基配對。
當該dsRNAi劑由式(IIIc)或(IIId)表示時，X核苷酸之至少一者可與X'核苷酸之至少一者進行鹼基配對。替代性地，X核苷酸之至少兩者係與相應之X′核苷酸進行鹼基配對；或X核苷酸之全部三者係與相應之X′核苷酸進行鹼基配對。
於某些態樣中，Y核苷酸之修飾係不同於Y'核苷酸之修飾，Z核苷酸之修飾係不同於Z'核苷酸之修飾，或X核苷酸之修飾係不同於X'核苷酸之修飾。
於某些態樣中，當該dsRNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾為2'-O-甲基修飾或2'-氟修飾。於其他態樣中，當該RNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾為2'-O-甲基修飾或2'-氟修飾，且np'>0，以及，至少一個np'係經由硫代磷酸酯鏈結連接至相鄰核苷酸。於又其他態樣中，當該RNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾為2'-O-甲基修飾或2'-氟修飾，np'>0，且至少一個np'經由硫代磷酸酯鏈結連接至相鄰核苷酸，以及，該正義股係透過二價或三價分支鏈之連接子(下文揭示)接合至一個多個GalNAc衍生物。於其他態樣中，當該RNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾為2'-O-甲基修飾或2'-氟修飾，np'>0，且至少一個np'係經由硫代磷酸酯鏈結連接至相鄰核苷酸，該正義股包含至少一個硫代磷酸酯鏈結，以及，該正義股係透過二價或三價分支鏈之連接子接合至一個多個GalNAc衍生物。
於一些態樣中，當該dsRNAi劑由式(IIIa)表示時，Na修飾為2'-O-甲基修飾或2'-氟修飾，np'>0，且至少一個np'係經由硫代磷酸酯鏈結連接至相鄰核苷酸，該正義股包含至少一個硫代磷酸酯鏈結，以及，該正義股係透過二價或三價分支鏈之連接子接合至一個多個GalNAc衍生物。
於一些態樣中，該dsRNAi劑為含有至少兩個由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示之雙鏈體的多聚物，其中該等雙鏈體藉由連接子連結。該連接子可為可裂解者或不可裂解者。視需要，該多聚物復包含配體。該等雙鏈體中之各者可靶向相同基因或兩個相異基因；或該等雙鏈體中之各者可靶向相同基因之兩個相異標靶位點。
於一些態樣中，該dsRNAi劑為含有三、四、五、六或更多個由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示之雙鏈體的多聚物，其中該等雙鏈體係藉由連接子連結。該連接子可為可裂解者或不可裂解者。視需要，該多聚物復包含配體。該等雙鏈體中之各者可靶向相同基因或兩個相異基因；或該等雙鏈體中之各者可靶向相同基因之兩個相異標靶位點。
於一個態樣中，兩個由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示之dsRNAi劑係在5'末端及一個或兩個3'末端彼此連接，且視需要接合至配體。該等劑中之各者可靶向相同基因或兩個相異基因；或該等劑中之各者可靶向相同基因之兩個相異標靶位點。
於某些態樣中，本發明之RNAi劑可含有低數量之含有2'-氟修飾的核苷酸，例如10個或更少具有2'-氟修飾的核苷酸。例如，該RNAi劑可含有10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0個具有2'-氟修飾的核苷酸。於具體態樣中，本發明之RNAi劑含有10個具有2'-氟修飾之核苷酸，例如，在正義股中含有4個具有2'-氟修飾之核苷酸且在反義股中含有6個具有2'-氟修飾之核苷酸。於另一具體態樣中，本發明之RNAi劑含有6個具有2'-氟修飾之核苷酸，例如，在正義股中含有4個具有2'-氟修飾之核苷酸且在反義股中含有2個具有2'-氟修飾之核苷酸。
於其他態樣中，本發明之RNAi劑可含有超低數量之含有2'-氟修飾的核苷酸，如2個或更少含有2'-氟修飾的核苷酸。舉例而言，該RNAi劑可含有2、1或0個具有2'-氟修飾的核苷酸。於具體態樣中，該RNAi劑可含有2個具有2'-氟修飾之核苷酸，例如，在正義股中含有0個具有2'-氟修飾之核苷酸且在反義股中含有2個具有2'-氟修飾之核苷酸。
多個出版物揭示可用於本發明之方法中的多聚iRNA。此類出版物包括WO2007/091269、美國專利第7,858,769號、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887及WO2011/031520，其各自之整體內容藉由引用併入本文。
於某些態樣中，本揭露之組成物及方法包括如本文所揭示之RNAi劑的乙烯基膦酸酯(VP)修飾。於示例性態樣中，本揭露的經5'乙烯基膦酸酯修飾之核苷酸具有結構：
Figure 111115644-A0202-12-0086-154
其中X為O或S；
R為氫、羥基、氟或C1-20烷氧基(例如，甲氧基或正十六烷氧基)；
R5'為=C(H)-P(O)(OH)2，且C5'碳與R5'之間的雙鍵為E或Z取向(例如，E取向)；以及
B為核鹼基或經修飾之核鹼基，視需要，其中B為腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
本揭露之乙烯基膦酸酯可接附至本揭露之dsRNA的反義股或正義股。於某些態樣中，本揭露之乙烯基膦酸酯係接附至dsRNA之反義股，視需要，在該dsRNA之反義股的5'末端接附。
乙烯基膦酸酯修飾亦預期用於本揭露之組成物及方法。示例性乙烯基膦酸酯結構包括在先結構，其中R5為=C(H)-OP(O)(OH)2，且C5'碳與R5'之間的雙鍵為E或Z取向(例如，E取向)。
如下文中更詳細揭示，含有接合至iRNA之一個或多個碳水化合物部分的iRNA劑可優化該iRNA之一種或多種特性。於多種情形中，該碳水化合物部分將接附至該iRNA之經修飾之子單元。舉例而言，iRNA劑之一個或多個核糖核苷酸子單元的核糖可替換為另一部分，例如其接附有碳水化合物配體之非碳水化合物(諸如環狀)載劑。本文中，其子單元之核糖經如是替換的核糖核苷酸子單元指稱為核糖替換修飾子單元(RRMS)。環狀載劑可為碳環系統，亦即，全部環原子皆為碳原子；或係雜環系統，亦即，一個或多個環原子可為雜源自，例如，氮、氧、硫。環狀載劑可為單環系統，或可含有兩個或多個環如稠環。環狀載劑可為完全飽和之環系統，或其可含有一個或多個雙鍵。
配體可經由載劑接附至多核苷酸。載劑包括(i)至少一個「主鏈接附點」，諸如兩個「主鏈接附點」，以及(ii)至少一個「繫帶接附點」。如本文中所用，「主鏈接附點」指稱官能基例如羥基，或通常係鍵，其可用於且適用於將該載劑併入核糖核酸之主鏈例如磷酸酯或經修飾之磷酸酯例如含硫之主鏈中。於一些態樣中，「繫帶接附點」(TAP)指稱環狀載劑之構建環原子，例如，碳原子或雜原子(與提供主鏈接附點之原子截然不同)，其連結所選擇之部分。該部分可為例如碳水化合物，例如單糖、二醣、三醣、四醣、寡醣或多醣。視需要，所選擇之部分係藉由中介繫帶連結至該環狀載劑。因此，該環狀載劑一般將包括官能基例如胺基，或通常係提供適用於將另一化學實體例如配體併入或繫帶至構建環的鍵。
該RNA可經由載劑接合至配體，其中該載劑可為環狀基團或非環狀基團。於一個態樣中，環狀基團係選自吡咯啶基、吡唑啉基、吡唑啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧雜環戊烷、
Figure 111115644-A0202-12-0087-17
唑啶基、異
Figure 111115644-A0202-12-0087-18
唑啶 基、嗎啉基、噻唑啶基、異噻唑啶、喹
Figure 111115644-A0202-12-0088-19
啉基、嗒
Figure 111115644-A0202-12-0088-21
基、四氫呋喃基及十氫萘。於一個態樣中，非環狀基團為絲胺醇主鏈或二乙醇胺主鏈。
i.熱去安定化修飾
於某些態樣中，dsRNA分子可藉由將熱去安定化修飾併入反義股之種子區域中而針對RNA進行優化。如本文中所用，「種子區域」意指在參考股之5'末端的位置2至9處或在參考股之5'末端的位置2至8處。舉例而言，可將熱去安定化修飾併入反義股之種子區域中以降低或抑制脫靶基因緘默化。
術語「熱去安定化修飾」包括將會導致dsRNA的總體熔融溫度(Tm)低於不具此類修飾之dsRNA之Tm的修飾。舉例而言，熱去安定化修飾可將dsRNA的Tm減少1至4℃，諸如1、2、3或4℃。以及，術語「熱去安定化核苷酸」指稱含有一個或多個熱去安定化修飾的核苷酸。
已經發現，具有在自5'末端計數之前9個核苷酸位置內具有至少一個雙鏈體熱去安定化修飾之反義股的dsRNA具有降低的脫靶基因緘默化活性。據此，於一些態樣中，反義股包含位於該反義股之5'區域之前9個核苷酸位置內的至少一個(例如，一個、兩個、三個、四個、五個或更多個)雙鏈體熱去安定化修飾。於一些態樣中，一個或多個雙鏈體熱去安定化修飾位於自該反義股之5'末端計數的位置2至9中，諸如位置4至8中。於又一些態樣中，雙鏈體熱去安定化修飾位於自該反義股之5'末端計數的位置6、7或8。於再又一些態樣中，雙鏈體熱去安定化修飾位於自該反義股之5'末端計數的位置7。於一些態樣中，雙鏈體熱去安定化修飾位於自該反義股之5'末端計數的位置2、3、4、5或9。
iRNA劑包含正義股及反義股，各股具有14至40個核苷酸。該RNAi劑可由式(L)表示：
Figure 111115644-A0202-12-0089-155
於時(L)中，B1、B2、B3、B1'、B2'、B3'及B4'各自獨立地為含有選自下列所組成群組之修飾的核苷酸：2'-O-烷基、2'-取代之烷氧基、2'-取代之烷基、2'-鹵、ENA及BNA/LNA。於一個態樣中，B1、B2、B3、B1'、B2'、B3'及B4'各自含有2'-OMe修飾。於一個態樣中，B1、B2、B3、B1'、B2'、B3'及B4'各自含有2'-OMe修飾或2'-F修飾。於一個態樣中，B1、B2、B3、B1'、B2'、B3'及B4'中之至少一者含有2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA,2'O-CH2C(O)N(Me)H)修飾。
C1為置於與反義股之種子區域相對之位點(亦即，在反義股之5'末端的位置2至8，或在反義股之5'末端的位置2至9)的熱去安定化核苷酸。例如，C1位於正義股之與反義股之5'末端的位置2至8之核苷酸配對的位置。於一個實例中，C1位於正義股之5'末端計數的位置15。C1核苷酸承載可包括無鹼基修飾在內之熱去安定化修飾；與雙鏈體中相對核苷酸之誤配；以及糖修飾諸如2'-去氧修飾或非環狀核苷酸例如未鎖定之核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)，或2'-5'-連接之核糖核苷酸(「3'-RNA」)。於一個態樣中，C1具有選自下列所組成之群組的熱去安定化修飾：i)與反義股中相對核苷酸之誤配；ii)選自下列所組成之群組的無鹼基修飾：
Figure 111115644-A0202-12-0090-156
；以及iii)選自下列所 組成之群組的糖修飾：
Figure 111115644-A0202-12-0090-157
Figure 111115644-A0202-12-0090-158
，其中B為經修飾或未經修飾之核鹼基，R1與R2獨立地為H、鹵 素、OR3或烷基；以及R3為H、烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖。於一個態樣中，C1中之熱去安定化修飾係選自G：G、G：A、G：U、G：T、A：A、A：C、C：C、C：U、C：T、U：U、T：T及U：T所組成之群組的誤配；且視需要，該無配對中之至少一個核酸鹼基為2'-去氧核酸鹼基。於一個實例中，C1中之熱去安定化 修飾為GNA或
Figure 111115644-A0202-12-0090-159
。
T1、T1'、T2'及T3'各自獨立地表示包含修飾之核苷酸，該修飾向該核苷酸提供小於或等於2'-OMe修飾之位阻效應。位阻效應指稱修飾之位阻效果的總和。測定核苷酸之修飾之位阻效果的方法係該領域技術人員所已知者。該修飾可位於該核苷酸之核糖的2'位置，或為對非核糖核苷酸、非環狀核苷酸或該核苷酸之主鏈的與該核糖之2'位置相似或等效的修飾，且向該核苷酸提供小於 或等於2'-OMe修飾之位阻效應。舉例而言，T1、T1'、T2'及T3'各自獨立地選自DNA、RNA、LNA、2'-F及2'-F-5'-甲基。於一個態樣中，T1為DNA。於一個態樣中，T1'為DNA、RNA或LNA。於一個態樣中，T2'為DNA或RNA。於一個態樣中，T3'為DNA或RNA。
n1、n3及q1獨立地為4至15個核苷酸之長度。
n5、q3及q7獨立地為1至6個核苷酸之長度。
n4、q2及q6獨立地為1至3個核苷酸之長度；替代性地，n4為0。
q5獨立地為0至10個核苷酸之長度。
n2及q4獨立地為0至3個核苷酸之長度。
替代性地，n4為0至3個核苷酸之長度。
於一個態樣中，n4可為0。於一個實例中，n4為0，且q2及q6為1。於另一實例中，n4為0，且q2及q6為1，具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。
於一個態樣中，n4、q2及q6係各自為1。
於一個態樣中，n2、n4、q2、q4及q6係各自為1。
於一個態樣中，當正義股係19至22個核苷酸之長度且n4為1時，C1位於正義股之5'末端的位置14至17。於一個態樣中，C1位於正義股之5'末端的位置15。
於一個態樣中，T3'始於反義股之5'末端計數的位置2。於一個實例中，T3'始於反義股之5'末端計數的位置2，且q6等於1。
於一個態樣中，T1'始於反義股之5'末端計數的位置14。於一個實例中，T1'始於反義股之5'末端計數的位置14，且q2等於1。
於示例性態樣中，T3'始於反義股之5'末端計數的位置2處，且T1'始於反義股之5'末端計數的位置14。於一個實例中，T3'始於反義股之5'末端計數的位置2，且q6等於1；以及T1'始於反義股之5'末端計數的位置14，且q2等於1。
於一個態樣中，T1'與T3'係藉由11個核苷酸之長度而分隔開來(亦即，T1'及T3'之核苷酸不計算在內)。
於一個態樣中，T1'位於反義股之5'末端計數的位置14。於一個實例中，T1'位於反義股之5'末端計數的位置14處且q2等於1，以及，該修飾位於非核糖、非環狀或主鏈之一個或多個2'位置且提供比2'-OMe核糖更低之位阻效應。
於一個態樣中，T3'位於反義股之5'末端計數的位置2。於一個實例中，T3'位於反義股之5'末端計數的位置2且q6等於1，以及，該修飾位於非核糖、非環狀或主鏈之一個或多個2'位置且提供低於或等於2'-OMe核糖之位阻效應。
於一個態樣中，T1位於正義股之裂解位點處。於一個態樣中，當正義股係19至22個核苷酸之長度且n2為1時，T1位於正義股之5'末端計數的位置11。於示例性態樣中，當正義股係19至22個核苷酸之長度時，T1位於正義股之5'末端計數的位置11之裂解位點處，且n2為1。
於一個態樣中，T2'始於反義股之5'末端計數的位置6。於一個實例中，T2'始於反義股之5'末端計數的位置6至10，且q4為1。
於示例性態樣中，當正義股係19至22個核苷酸之長度時，T1位於正義股之裂解位點處，例如，位於從正義股之5'末端計數的位置11，且n2為1；T1'位於從反義股之5'末端計數的位置14，且q2等於1，且T1'之修飾位於核糖之2'位或位於非核糖、非環狀或主鏈之多個位置且提供低於2'-OMe核糖之位阻效應；T2'位於從反義股之5'末端計數的位置6至10，且q4為1；以及，T3'位於從反義股之5'末端計數的位置2，且q6等於1，以及，T3'之修飾位於核糖之2'位或位於非核糖、非環狀或主鏈之多個位置且提供低於或等於2'-OMe核糖之位阻效應。
於一個態樣中，T2'始於反義股之5'末端計數的位置8。於一個實例中，T2'始於反義股之5'末端計數的位置8，且q4為2。
於一個態樣中，T2'始於反義股之5'末端計數的位置9。於一實例中，T2'位於反義股之5'末端計數的位置9，且q4為1。
於一個態樣中，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F、q3為4、T2'為2'-F、q4為1，B3'為2'-OMe或2'-F、q5為6、T3'為2'-F、q6為1、B4'為2'-OMe、且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。
於一個態樣中，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為1，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為6，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯 類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為係2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為6，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為7，T1'為係2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為6，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為7，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3' 為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為係2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為1，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為6，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為1，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為6，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為5，T2'為2'-F，q4為1，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1；視需要具有位於該反義股之3'末端的至少2個額外之TT。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為5，T2'為2'-F，q4為1，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1；視需要具有位於該反義股之3'末端的至少2個額外之TT；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為係2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。
該RNAi劑可包含位於該正義股或反義股之5'末端的含磷基團。該5'末端之含磷基團可為5'末端磷酸酯(5'-P)、5'末端硫代磷酸酯(5'-PS)、5'末端二硫代磷酸酯(5'-PS2)、5'-末端乙烯基磷酸酯(5'-VP)、5'末端甲基磷酸酯(MePhos) 或5'-去氧-5'-C-丙二醯基(
Figure 111115644-A0202-12-0098-160
)。當該5'末端之含磷基團係5'-末端乙 烯基磷酸酯(5'-VP)時，該5'-VP可為5'-E-VP異構物(亦即，反式-乙烯基膦酸酯，
Figure 111115644-A0202-12-0098-161
)、5'-Z-VP異構物(亦即，反式-乙烯基膦酸酯，
Figure 111115644-A0202-12-0098-162
)或其混 合物。
於一個態樣中，該RNAi劑包含位於正義股之5'末端的含磷基團。於一個態樣中，該RNAi劑包含位於反義股之5'末端的含磷基團。
於一個態樣中，該RNAi劑包含5'-P。於一個態樣中，該RNAi劑包含位於反義股之5'-P。
於一個態樣中，該RNAi劑包含5'-PS。於一個態樣中，該RNAi劑包含位於反義股之5'-PS。
於一個態樣中，該RNAi劑包含5'-VP。於一個態樣中，該RNAi劑包含位於反義股之5'-VP。於一個態樣中，該RNAi劑包含位於反義股之5'-E-VP。於一個態樣中，該RNAi劑包含位於反義股之5'-Z-VP。
於一個態樣中，該RNAi劑包含5'-PS2。於一個態樣中，該RNAi劑包含位於反義股之5'-PS2。
於一個態樣中，該RNAi劑包含5'-PS2。於一個態樣中，該RNAi劑包含位於反義股之5'-去氧-5'-C-丙二醯基。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為係2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1。該RNAi劑亦包含5'-PS。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為係2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1。該RNAi劑亦包含5'-P。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為係2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1。該RNAi劑亦包含5'-VP。該5'-VP可為5'-E-VP、5'-Z-VP或其組合。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為係2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1。該RNAi劑亦包含5'-PS2。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為係2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1。該RNAi劑亦包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-P。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-PS。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-VP。該5'-VP可為5'-E-VP、5'-Z-VP或其組合。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-PS2。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷 酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1。該RNAi劑亦包含5'-P。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1。該dsRNA劑亦包含5'-PS。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1。該RNAi劑亦包含5'-VP。該5'-VP可為5'-E-VP、5'-Z-VP或其組合。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe 或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1。該RNAi劑亦包含5'-PS2。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1。該RNAi劑亦包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-P。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該 反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-PS。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-VP。該5'-VP可為5'-E-VP、5'-Z-VP或其組合。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-PS2。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1；具有位於該正義 股之位置1至5(從5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為係2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1。該RNAi劑亦包含5'-P。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為係2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1。該RNAi劑亦包含5'-PS。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為係2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1。該RNAi劑亦包含5'-VP。該5'-VP可為5'-E-VP、5'-Z-VP或其組合。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為係2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2， B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1。該dsRNAi RNA劑亦包含5'-PS2。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為係2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1。該RNAi劑亦包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-P。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷 酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-PS。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-VP。該5'-VP可為5'-E-VP、5'-Z-VP或其組合。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-PS2。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3' 為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1。該RNAi劑亦包含5'-P。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1。該RNAi劑亦包含5'-PS。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1。該RNAi劑亦包含5'-VP。該5'-VP可為5'-E-VP、5'-Z-VP或其組合。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1。該RNAi劑亦包含5'-PS2。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1。該RNAi劑亦包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-P。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核 苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-PS。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-VP。該5'-VP可為5'-E-VP、5'-Z-VP或其組合。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-PS2。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1；具有位於該正義股 之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-P及靶向配體。於一個態樣中，該5'-P位於該反義股之5'末端，且該靶向配體位於該正義股之3'末端。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-PS及靶向配體。於一個態樣中，該5'-PS位於該反義股之5'末端，且該靶向配體位於該正義股之3'末端。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-VP(例如，5'-E-VP、5'-Z-VP或其組合)及靶向配體。
於一個態樣中，該5'-VP位於該反義股之5'末端，且該靶向配體位於該正義股之3'末端。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-PS2及靶向配體。於一個態樣中，該5'-PS2位於該反義股之5'末端，且該靶向配體位於該正義股之3'末端.
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1 為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基及靶向配體。於一個態樣中，該5'-去氧-5'-C-丙二醯基位於該反義股之5'末端，且該靶向配體位於該正義股之3'末端.
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-P及靶向配體。於一個態樣中，該5'-P位於該反義股之5'末端，且該靶向配體位於該正義股之3'末端。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該 反義股之位置1及2(從5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-PS及靶向配體。於一個態樣中，該5'-PS位於該反義股之5'末端，且該靶向配體位於該正義股之3'末端。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-VP(例如，5'-E-VP、5'-Z-VP或其組合)及靶向配體。於一個態樣中，該5'-VP位於該反義股之5'末端，且該靶向配體位於該正義股之3'末端。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-PS2及靶向配體。於一個態樣中，該5'-PS2位於該反義股之5'末端，且該靶向配體位於該正義股之3'末端.
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'-OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-OMe，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基及靶向配體。於一個態樣中，該5'-去氧-5'-C-丙二醯基位於該反義股之5'末端，且該靶向配體位於該正義股之3'末端.
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-P及靶向配體。於一個態樣中，該5'-P位於該反義股之5'末端，且該靶向配體位於該正義股之3'末端。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1；具有位於 該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-PS及靶向配體。於一個態樣中，該5'-PS位於該反義股之5'末端，且該靶向配體位於該正義股之3'末端。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-VP(例如，5'-E-VP、5'-Z-VP或其組合)及靶向配體。於一個態樣中，該5'-VP位於該反義股之5'末端，且該靶向配體位於該正義股之3'末端。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核 苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-PS2及靶向配體。於一個態樣中，該5'-PS2位於該反義股之5'末端，且該靶向配體位於該正義股之3'末端.
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，T2'為2'-F，q4為2，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為5，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基及靶向配體。於一個態樣中，該5'-去氧-5'-C-丙二醯基位於該反義股之5'末端，且該靶向配體位於該正義股之3'末端。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-P及靶向配體。於一個態樣中，該5'-P位於該反義股之5'末端，且該靶向配體位於該正義股之3'末端。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-PS及靶向配體。於一個態樣中，該5'-PS位於該反義股之5'末端，且該靶向配體位於該正義股之3'末端。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-VP(例如，5'-E-VP、5'-Z-VP或其組合)及靶向配體。於一個態樣中，該5'-VP位於該反義股之5'末端，且該靶向配體位於該正義股之3'末端。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe 或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-PS2及靶向配體。於一個態樣中，該5'-PS2位於該反義股之5'末端，且該靶向配體位於該正義股之3'末端。
於一個態樣中，B1為2'-OMe或2'-F，n1為8，T1為2'F，n2為3，B2為2'-OMe，n3為7，n4為0，B3為2'OMe，n5為3，B1'為2'-OMe或2'-F，q1為9，T1'為2'-F，q2為1，B2'為2'-OMe或2'-F，q3為4，q4為0，B3'為2'-OMe或2'-F，q5為7，T3'為2'-F，q6為1，B4'為2'-F，且q7為1；具有位於該正義股之位置1至5(從該正義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，以及位於該反義股之位置1及2(從該反義股之5'末端計數)的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於該反義股之位置18至23中的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。該RNAi劑亦包含5'-去氧-5'-C-丙二醯基及靶向配體。於一個態樣中，該5'-去氧-5'-C-丙二醯基位於該反義股之5'末端，且該靶向配體位於該正義股之3'末端。
於特定態樣中，本發明之RNAi劑包含：
(a)正義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)接附至3'末端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含透過三價分支鏈連接子接附的三個GalNAc衍生物；以及
(iii)位於位置1、3、5、7、9至11、13、17、19及21(從5'末端計數)之2'-F修飾，以及位於位置2、4、6、8、12、14至16、18及20之2'-OMe修飾；
以及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)位於位置1、3、5、9、11至13、15、17、19、21及23(從5'末端計數)之2'-OMe修飾，以及位於位置2、4、6、8、10、14、16、18、20及22之2'-F修飾；以及
(iii)位於位置21與22(從5'末端計數)之間以及位置22與23之間的硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結；
其中該dsRNA劑具有位於該反義股之3'末端的具有兩個核苷酸之突出，以及位於該反義股之5'末端的鈍端。
於另一特定態樣中，本發明之RNAi劑包含：
(a)正義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)接附至3'末端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含透過三價分支鏈連接子接附的三個GalNAc衍生物；
(iii)位於位置1、3、5、7、9至11、13、15、17、19及21(從5'末端計數)之2'-F修飾，以及位於位置2、4、6、8、12、14、16、18及20之2'-OMe修飾；以及
(iv)位於位置1與2(從5'末端計數)之間以及位置2與3之間的硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結；
以及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)位於位置1、3、5、9、11至13、15、17、19及21至23(從5'末端計數)之2'-OMe修飾，以及位於位置2、4、6、8、10、14、16、18及20之2'-F修飾；以及
(iii)位於核苷酸位置1與2(從5'末端計數)之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、以及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結；
其中該RNAi劑具有位於該反義股之3'末端的具有兩個核苷酸之突出，以及位於該反義股之5'末端的鈍端。
於另一特定態樣中，本發明之RNAi劑包含：
(a)正義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)接附至3'末端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含透過三價分支鏈連接子接附的三個GalNAc衍生物；
(iii)位於位置1至6、8、10及12至21(從5'末端計數)之2'-OMe修飾，位於位置7及9之2'-F修飾，以及位於位置11之去氧核苷酸(例如，dT)；以及
(iv)位於位置1與2(從5'末端計數)之間以及位置2與3之間的硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結；
以及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)位於位置1、3、7、9、11、13、15、17及19至23(從5'末端計數)之2'-OMe修飾，以及位於位置2、4至6、8、10、12、14、16及18之2'-F修飾；以及
(iii)位於核苷酸位置1與2(從5'末端計數)之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、以及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結；
其中該RNAi劑具有位於該反義股之3'末端的具有2個核苷酸之突出，以及位於該反義股之5'末端的鈍端。
於另一特定態樣中，本發明之RNAi劑包含：
(a)正義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)接附至3'末端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含透過三價分支鏈連接子接附的三個GalNAc衍生物；
(iii)位於位置1至6、8、10、12、14及16至21之2'-OMe修飾，以及位於位置7、9、11、13及15之2'-F修飾；以及
(iv)位於位置1與2(從5'末端計數)之間以及位置2與3之間的硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結；
以及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)位於位置1、5、7、9、11、13、15、17、19及21至23(從5'末端計數)之2'-OMe修飾，以及位於位置2至4、6、8、10、12、14、16、18及20之2'-F修飾；以及
(iii)位於核苷酸位置1與2(從5'末端計數)之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、以及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結；
其中該RNAi劑具有位於該反義股之3'末端的具有2個核苷酸之突出，以及位於該反義股之5'末端的鈍端。
於另一特定態樣中，本發明之RNAi劑包含：
(a)正義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)接附至3'末端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含透過三價分支鏈連接子接附的三個GalNAc衍生物；
(iii)位於位置1至9及12至21之2'-OMe修飾，以及位於位置10及11之2'-F修飾；以及
(iv)位於位置1與2(從5'末端計數)之間以及位置2與3之間的硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結；
以及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)位於位置1、3、5、9、11至13、15、17、19及21至23(從5'末端計數)之2'-OMe修飾，以及位於位置2、4、6、8、10、14、16、18及20之2'-F修飾；以及
(iii)位於核苷酸位置1與2(從5'末端計數)之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、以及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結；
其中該RNAi劑具有位於該反義股之3'末端的具有2個核苷酸之突出，以及位於該反義股之5'末端的鈍端。
於另一特定態樣中，本發明之RNAi劑包含：
(a)正義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)接附至3'末端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含透過三價分支鏈連接子接附的三個GalNAc衍生物；
(iii)位於位置1、3、5、7、9至11及13(從21'末端計數)之2'-F修飾，以及位於位置2、4、6、8、12及14之2'-OMe修飾；以及
(iv)位於位置1與2(從5'末端計數)之間以及位置2與3之間的硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結；
以及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)位於位置1、3、5至7、9、11至13、15、17至19及21至23(從5'末端計數)之2'-OMe修飾，以及位於位置2、4、8、10、14、16及20之2'-F修飾；以及
(iii)位於核苷酸位置1與2(從5'末端計數)之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、以及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結；
其中該RNAi劑具有位於該反義股之3'末端的具有2個核苷酸之突出，以及位於該反義股之5'末端的鈍端。
於另一特定態樣中，本發明之RNAi劑包含：
(a)正義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)接附至3'末端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含透過三價分支鏈連接子接附的三個GalNAc衍生物；
(iii)位於位置1、2、4、6、8、12、14、15、17及19至21之2'-OMe修飾，以及位於位置3、5、7、9至11、13、16及18之2'-F修飾；以及
(iv)位於位置1與2(從5'末端計數)之間以及位置2與3之間的硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結；
以及
(b)反義股，其具有：
(i)25個核苷酸之長度；
(ii)位於位置1、4、6、7、9、11至13、15、17及19至23(從5'末端計數)之2'-OMe修飾，位於位置2、3、5、8、10、14、16及18之2'-F修飾，以及位於位置24及25之去氧核苷酸(例如，dT)；以及
(iii)位於核苷酸位置1與2(從5'末端計數)之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、以及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結；
其中該RNAi劑具有位於該反義股之3'末端的具有四個核苷酸之突，以及位於該反義股之5'末端的鈍端。
於另一特定態樣中，本發明之RNAi劑包含：
(a)正義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)接附至3'末端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含透過三價分支鏈連接子接附的三個GalNAc衍生物；
(iii)位於位置1至6、8及12至21(從5'末端計數)之2'-OMe修飾，以及位於位置7及9至11之2'-F修飾；以及
(iv)位於位置1與2(從5'末端計數)之間以及位置2與3之間的硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結；
以及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)位於位置1、3至5、7、8、10至13、15及17至23(從5'末端計數)之2'-OMe修飾，以及位於位置2、6、9、14及16之2'-F修飾；以及
(iii)位於核苷酸位置1與2(從5'末端計數)之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、以及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結；
其中該RNAi劑具有位於該反義股之3'末端的具有2個核苷酸之突出，以及位於該反義股之5'末端的鈍端。
於另一特定態樣中，本發明之RNAi劑包含：
(a)正義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)接附至3'末端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含透過三價分支鏈連接子接附的三個GalNAc衍生物；
(iii)位於位置1至6、8及12至21(從5'末端計數)之2'-OMe修飾，以及位於位置7及9至11之2'-F修飾；以及
(iv)位於位置1與2(從5'末端計數)之間以及位置2與3之間的硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結；
以及
(b)反義股，其具有：
(i)23個核苷酸之長度；
(ii)位於位置1、3至5、7、10至13、15及17至23(從5'末端計數)之2'-OMe修飾，以及位於位置2、6、8、9、14及16之2'-F修飾；以及
(iii)位於核苷酸位置1與2(從5'末端計數)之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間、以及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結；
其中該RNAi劑具有位於該反義股之3'末端的具有2個核苷酸之突出，以及位於該反義股之5'末端的鈍端。
於另一特定態樣中，本發明之RNAi劑包含：
(a)正義股，其具有：
(i)19個核苷酸之長度；
(ii)接附至3'末端之ASGPR配體，其中該ASGPR配體包含透過三價分支鏈連接子接附的三個GalNAc衍生物；
(iii)位於位置1至4、6及10至19(從5'末端計數)之2'-OMe修飾，以及位於位置5及7至9之2'-F修飾；以及
(iv)位於位置1與2(從5'末端計數)之間以及位置2與3之間的硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結；
以及
(b)反義股，其具有：
(i)21個核苷酸之長度；
(ii)位於位置1、3至5、7、10至13、15及17至21(從5'末端計數)之2'-OMe修飾，以及位於位置2、6、8、9、14及16之2'-F修飾；以及
(iii)位於核苷酸位置1與2(從5'末端計數)之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置19與20之間、以及核苷酸位置20與21之間的硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結；
其中該RNAi劑具有位於該反義股之3'末端的具有2個核苷酸之突出，以及位於該反義股之5'末端的鈍端。
於某些態樣中，用於本發明之方法中的iRNA係選自表2至7中任一者中所列之劑。此等劑可復包含配體。
III.接合至配體之iRNA
本發明之iRNA之RNA的另一修飾包括將一個或多個增強該iRNA之活性、細胞分佈或細胞攝取例如到細胞中的配體、部分或接合物化學連接至該iRNA。此等部分包括但不限於脂質部分諸如膽固醇部分(Letsinger et al.,Proc.Natl.Acid.Sci.USA,1989,86：6553-6556)。於其他態樣中，配體為膽酸(Manoharan et al.,Biorg.Med.Chem.Let.,1994,4：1053-1060)；硫醚，例如，己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660：306-309；Manoharan et al.,Biorg.Med.Chem.Let.,1993,3：2765-2770)；巰基膽固醇(Oberhauser et al.,Nucl.Acids Res.,1992,20：533-538)；脂族鏈，例如，十二烷二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras et al.,EMBO J,1991,10：1111-1118：Kabanov et al.,FEBS Lett.,1990,259：327-330；Svinarchuk et al.,Biochimie,1993,75：49-54)；磷脂，例如，二-十六烷基-rac-甘油或1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-磷酸三乙銨(Manoharan et al., Tetrahedron Lett.,1995,36：3651-3654；Shea et al.,Nucl.Acids Res.,1990,18：3777-3783)聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharan et al.,Nucleosides & Nucleotides,1995,14：969-973)；或金剛烷乙酸(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36：3651-3654)、棕櫚基部分(Mishra et al.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264：229-237)或十八烷基胺或己基胺基-羰基-氧膽固醇部分(Crooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277：923-937)。
於某些態樣中，配體改變其所併入之iRNA劑的分佈、靶向或壽命。於一些態樣中，配體提供比缺失此配體之物質增強的對於所選標靶例如分子、細胞或細胞類型、隔室例如細胞或器官之隔室、組織、器官或身體區域之親和性。與以下態樣中，配體不參與雙鏈體核酸中之雙鏈體配對。
配體可包括天然出現之物質，諸如蛋白質(例如，人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如，聚葡萄糖、聚散葡萄糖、幾丁質、幾丁聚醣、菊糖、環糊精、N-乙醯基葡萄胺糖、N-乙醯基半乳胺糖或玻尿酸)；或脂質。配體亦可為重組分子或合成分子，諸如合成聚合物，例如合成聚胺基酸。聚胺基酸之實例包括聚離胺酸(PLL)、聚L-天冬胺酸、聚L-麩胺酸、苯乙烯-馬來酸酐共聚物、聚(L-乳酸交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-馬來酸酐共聚物、N-(2-羥基丙基)甲基丙烯醯胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚胺酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯醯胺聚合物或聚磷嗪(polyphosphazine)。聚胺之實例包括：聚伸乙二胺、聚離胺酸(PLL)、精胺、精三胺、聚胺、假肽-聚胺、肽模擬性聚胺、樹枝狀聚胺、精胺酸、脒、魚精蛋白、陽離子脂質、陽離子卟啉、聚胺之四級鹽或α-螺旋肽。
配體亦可包括靶向基團，例如細胞或組織靶向劑，例如凝集素、醣蛋白、脂質或蛋白質，例如抗體，其結合至特定之細胞類型諸如腎細胞。靶向基團可為促甲狀腺素、促黑素、凝集素、醣蛋白、界面活性劑蛋白A、黏蛋白碳水化合物、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基-半乳胺糖、N-乙醯基葡萄胺糖、多價甘露糖、多價果糖、糖基化聚胺基酸、多價半乳糖、運鐵蛋白、雙膦酸酯、聚麩胺酸鹽、聚天冬胺酸鹽、脂質、膽固醇、類固醇、膽汁酸、葉酸、維生素B12、維生素A、生物素或RGD肽或RGD肽模擬物。於某些態樣中，該配體為多價半乳糖，例如，N-乙醯基半乳胺糖。
配體之其他實例包括染料、嵌入劑(例如，吖啶類)、交聯劑(例如，補骨脂素、絲裂黴素C)、卟啉類(TPPC4、特沙弗林(texaphyrin)、沙普沙弗林(Sapphyrin))、多環狀芳族烴(例如，啡
Figure 111115644-A0202-12-0131-142
、二氫啡
Figure 111115644-A0202-12-0131-144
)、人工核酸內切酶(例如，EDTA)、親脂性分子(例如，膽固醇、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睪固酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉基氧己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十六烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽烯酸、二甲氧基三苯甲基或啡
Figure 111115644-A0202-12-0131-146
)；以及肽接合物(例如，觸角足突變肽、Tat肽)、烷基化劑、磷酸鹽、胺基、巰基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚胺基、烷基、經取代之烷基、放射標記之標記物、酶、半抗原(例如，生物素)、轉運/吸收促進劑(例如，阿司匹林、維生素E、葉酸)、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、雙咪唑、組胺、咪唑簇、吖啶-咪唑接合物、四氮雜大環之Eu3+錯合物)、二硝基苯基、HRP或AP。
配體可為蛋白質例如醣蛋白或肽例如具有對於共配體之特異親和性的分子或抗體例如結合至特定細胞類型諸如肝細胞之抗體。配體亦可包括 激素及激素受體。其等亦可包括非肽類物質，諸如脂質、凝集素、碳水化合物、維生素、輔助因子、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基半乳胺糖、N-乙醯基葡萄胺糖、多價甘露糖或多價果糖。配體可為，舉例而言，脂質多醣、p38 MAP激酶之活化劑或NF-κB之活化劑。
配體可為物質例如藥物，其可藉由舉例而言擾亂細胞之細胞骨幹例如藉由擾亂細胞之微管、微絲或中間體絲而增加細胞對iRNA劑之攝取。該藥物可為，舉例而言，泰素(taxol)、長春新鹼、長春鹼、細胞鬆弛素、諾考達唑、海綿毒素(japlakinolide)、紅海海綿蛋白A、鬼筆環肽(phalloidin)、海洋苔蘇素(swinholide)A、吲達諾欣(indanocine)或邁爾素(myoservin)。
於一些態樣中，接附至本文中所揭示之iRNA的配體係用作藥物動力學調節劑(PK調節劑)。PK調節劑係包括親脂質類、膽汁酸、類固醇、磷脂質類似物、肽、蛋白質結合劑、PEG、維生素等。示例性PK調節劑包括但不限於，膽固醇、脂肪酸、膽酸、石膽酸、二烷基甘油酯、二醯基甘油酯、磷脂質、神經脂質、萘普生(naproxen)、布洛芬(ibuprofen)、微生物E、生物素。包含大量硫代硫酸酯類鏈結之寡核苷酸亦已知結合至血清蛋白，因此在主鏈中包含多個硫代磷酸酯類鏈結之短寡核苷酸，例如約5個鹼基、10個鹼基、15個鹼基或20個鹼基之寡核苷酸亦可作為配體(例如，作為PK調節配體)而遵循本發明。此外，於本文所揭示之態樣中，結合血清組分(例如，血清蛋白)之適配體亦適用於作為PK調節性配體而使用。
本發明之經接合配體之iRNA可藉由使用承載側鏈反應性官能度之寡核苷酸諸如衍生自將連接分子接附在寡核苷酸(揭示於下)而合成。該反應性 寡核苷酸可直接與可商購之配體、合成為承載多種保護基團之任一者的配體或具有附接於其之鏈結部分的配體反應。
於本發明之接合物中使用之寡核苷酸可透過習知之固相合成技術便利且常規性地合成。用於此合成之設備可由多個供應商販售，包括，舉例而言，應用生物系統Applied Biosystems®(Foster City,Calif.)。可額外地或替代性地採用該領域中已知之用於此合成之任何其他方法。使用類似技術來製備其他寡核苷酸諸如硫代磷酸酯及烷基化衍生物亦係已知者。
於本發明之經接合配體之iRNA及承載序列特異性鏈結之核苷的配體分子中，該寡核苷酸及寡核苷可在適宜之DNA合成器使用標準核苷酸或核苷前驅物或已經承載連接部分之核苷酸或核苷接合前驅物、已經承載配體分子之配體-核苷酸或核苷接合前驅物或承載配體之非核苷酸構建模塊而組裝。
當使用已經承載連接部分之核苷酸接合前驅物時，典型係完成序列特異性連接之核苷的合成，隨後將該配體分子與該連接部分反應以形成經接合配體之寡核苷酸。於一些態樣中，本發明之寡核苷酸或經連接之核苷係藉由自動合成器使用衍生自配體-核苷接合物之除標準亞磷醯胺之外的亞磷醯胺及可商購且常規用於寡核苷酸合成中之非標準亞磷醯胺來合成。
A.脂質接合物
於某些態樣中，配體或接合物為脂質或基於脂質之分子。於一個態樣中，此類脂質或基於脂質之分子結合血清蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)。HSA結合配體允許該接合物分佈於標靶組織，例如非腎臟之身體標靶組織。舉例而言，該標靶組織可為肝臟，包括肝臟之實質細胞。可結合HSA之其他分子亦可用作配體。舉例而言，可使用萘普生或阿司匹林。脂質或基於脂質之配體可(a)增加對於接 合物降解之抗性，(b)增加對標靶細胞或細胞膜之靶向或輸送，及/或(c)可用以調節與血清蛋白例如HSA之結合。
基於脂質之配體可用以抑制如控制該接合物結合至標靶組織。舉例而言，與HSA之結合更強的脂質或基於脂質之配體更不可能靶向腎臟，並因此更不可能被從身體清除。與HSA之結合強度較低的脂質或基於脂質之配體可用來令該接合物靶向腎臟。
於某些態樣中，該基於脂質之配體結合HSA。於一個態樣中，其係以足夠之親和力結合HSA，使得該接合物將分佈至非腎臟組織內。惟，較佳係該親和力之強度不足以造成該HSA-配體之結合不可逆。
於其他態樣中，該基於脂質之配體與HSA的結合弱或根本不結合。於一個態樣中，該接合物將分佈至腎臟。靶向腎細胞的其他部分亦可用於替換該基於脂質之配體或與該基於脂質之配體同時使用。
於另一方面，該配體為被標靶細胞例如增殖細胞攝取之部分例如維生素。此等係尤其可用於治療以例如惡性或非惡性細胞例如癌細胞的非預期之細胞增殖為特徵的病變。示例性維生素包括維生素A、維生素E及維生素K。其他示例性維生素包括B族維生素，例如葉酸、維生素B12、核黃素、生物素、吡哆醛或其他被標靶細胞諸如肝細胞攝取之維生素或營養物質。亦包括者係HSA及低密度脂蛋白(LDL)。
B.細胞滲透劑
於另一方面，該配體為細胞滲透劑，諸如螺旋細胞滲透劑。於一個態樣中，該劑為兩性劑。示例性劑為肽，諸如tat或觸角足突變肽。如果該劑為肽，其可 經修飾，包括肽基模擬物、嵌入體、非肽或假肽類鏈結、以及D-胺基酸之使用。於一個態樣中，該螺旋劑為α-螺旋劑，其具有親脂相及疏脂相。
該配體可為肽或肽模擬物。肽模擬物(本文中亦指稱為寡肽模擬物)係能折疊為所定義之類似於天然肽之三維結構的分子。肽及肽模擬物與iRNA劑之接附可影響iRNA之藥物動力學分佈，例如藉由提升細胞識別及吸收而影響。該肽或肽模擬物部分可為5至50個胺基酸之長度，例如，約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸之長度。
肽或肽模擬物可為，舉例而言，細胞滲透肽、陽離子肽、兩性肽或疏水性肽(例如，主要由Tyr、Trp或Phe構成)。該肽部分可為樹枝狀肽、受約束之肽或交聯之肽。於另一替代者中，該肽部分可包括疏水性膜易位序列(MTS)。示例性之含有MTS的疏水性肽為具有下述胺基酸序列的RFGF：AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO：14)。含有疏水性MTS之RFGF類似物(例如，胺基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO：15))亦可為靶向部分。該肽部分可為「輸送」肽，其可攜帶包括肽、寡核苷酸及蛋白質在內之極性大分子跨越細胞膜。舉例而言，已經發現來自HIV Tat蛋白之序列(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO：16)及果蠅觸角足突變肽蛋白之序列(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO：17)能夠發揮作為輸送肽的功能。肽或肽模擬物可由DNA之隨機序列編碼，諸如從噬菌體呈現庫或一珠一物(OBOC)組合庫鑑定之肽(Lam et al.,Nature,354：82-84,1991)。經由合併之單體單元繫帶至dsRNA劑以用於細胞靶向目的之肽或肽模擬物的實例為係精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸(RGD)肽或RGD模擬物。肽部分之長度範圍可為約5個胺基酸至約40個胺基酸。該等肽部分可具有結構性修飾，例如以增加安定性或引導構形特性。可使用下文所述之任意結構性修飾。
用於本發明之組成物及方法的RGD肽可為線性或環狀，且可經修飾，例如經糖基化或甲基化，以促進對特定組織之靶向。含有RGD之肽及肽模擬物可包括D-胺基酸，以及合成RGD模擬物。除了RGD之外，亦可使用其他靶向整合素配體之部分，例如，PECAM-1或VEGF。
「細胞滲透肽」能夠滲透細胞例如微生物細胞諸如細菌或真菌細胞，或哺乳動物細胞諸如人類細胞。微生物細胞滲透肽可為，舉例而言，α-螺旋線性肽(例如，LL-37或天蠶素(Ceropin)P1)、含二硫鍵之肽(例如，α-防禦素、β-防禦素或牛抗菌肽(bactenecin))或僅含有一個或兩個支配性胺基酸之肽(例如，PR-39或吲哚青素(indolicidin))。細胞滲透肽亦可包括線性定位訊號(NLS)。舉例而言，細胞滲透肽可為雙向兩性肽諸如MPG，其係衍生自HIV-1 gp41之融合肽結構域及SV40的T抗原之NLS(Simeoni et al.,Nucl.Acids Res.31：2717-2724,2003)。
C.碳水化合物接合物
於本發明之組成物及方法的一些態樣中，iRNA復包含碳水化合物。經接合碳水化合物之iRNA對於核酸之活體內輸送具有優勢，且組成物係適用於活體內治療性用途，如本文中所揭示。如本文中所用，「碳水化合物」指稱碳水化合物自身，其係由一個或多個具有至少6個碳原子之單糖單元(其可為線性、分支鏈或環狀)與鍵結至每一碳原子之氧、氮或硫原子所組成；或指稱具有碳水化合物部分作為其一部分的化合物，該碳水化合物部分係由一個或多個具有至少6個碳原子之單糖單元(其可為線性、分支鏈或環狀)與鍵結至每一碳原子之氧、氮或硫原子所組成。代表性碳水化合物包括糖類(單糖、二醣、三醣及含有約4、5、6、7、8或9個單糖單元之寡醣)，以及多醣諸如澱粉、糖原、纖維素及多醣膠。 具體之單糖包括C5糖類及上述(例如，C5、C6、C7或C8)糖類；二醣及三醣，其包括具有兩個或三個單糖單元(例如，C5、C6、C7或C8)之糖類。
於某些態樣中，用於本發明之組成物及方法中之碳水化合物接合物為單糖。
於某些態樣中，該單糖為N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)衍生物。包含一個或多個N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)衍生物的GalNAc接合物係描述於舉例而言US 8,106,022中，其整體內容藉由引用併入本文。於一些態樣中，GalNAc接合物充當配體，其將iRNA靶向至特定細胞。於一些態樣中，GalNAc將該iRNA靶向至肝臟細胞，例如，藉由充當肝臟細胞(例如，肝細胞)之去唾液酸糖蛋白受體的配體。
於一些態樣中，該碳水化合物接合物包含一個或多個GalNAc衍生物。GalNAc衍生物可經由連接子例如二價或三價分支鏈連接子接附。於一些態樣中，GalNAc接合物係接合至該dsRNA劑之正義股的3'末端。於一些態樣中，GalNAc接合物係經由連接子例如本文所揭示之連接子接合至iRNA劑(例如，接合至正義股之3'末端)。於一些態樣中，GalNAc接合物係接合至該dsRNA劑之正義股的5'末端。於一些態樣中，GalNAc接合物係經由連接子例如本文所揭示之連接子接合至iRNA劑(例如，接合至正義股之5'末端)。
於本發明之某些態樣中，該GalNAc或GalNAc衍生物係經由單價連接子接附至本發明之iRNA劑。於一些態樣中，該GalNAc或GalNAc衍生物係經由二價連接子接附至本發明之iRNA劑。於本發明之又其他態樣中，該GalNAc或GalNAc衍生物係經由三價連接子接附至本發明之iRNA劑。於本發 明之其他態樣中，該GalNAc或GalNAc衍生物係經由四價連接子接附至本發明之iRNA劑。
於某些態樣中，本發明之雙股RNAi劑包含接附至該iRNA劑的一個GalNAc或GalNAc衍生物。於某些態樣中，本發明之雙股RNAi劑包含複數(例如，2、3、4、5或6)個GalNAc或GalNAc衍生物，其各自透過複數個單價連接子各自獨立地接附至該雙股RNAi劑之複數個核苷酸。
於一些態樣中，舉例而言，當本發明之iRNA劑之兩股皆為一個更大分子之一部分且係藉由位於一股之3'末端與另一股之5'末端之間的不間斷核苷酸鏈連結而形成包含複數個未配對核苷酸的髮夾環圈時，該髮夾環圈內之每一個未配對核苷酸可獨立地包含經由單價連接子接附之GalNAc或GalNAc衍生物。髮夾環圈亦可藉由該雙鏈體之一股中的延長之突出形成。
於一些態樣中，舉例而言，當本發明之iRNA劑之兩股皆為一個更大分子之一部分且係藉由位於一股之3'末端與另一股之5'末端之間的不間斷核苷酸鏈連結而形成包含複數個未配對核苷酸的髮夾環圈時，該髮夾環圈內之每一個未配對核苷酸可獨立地包含經由單價連接子接附之GalNAc或GalNAc衍生物。髮夾環圈亦可藉由該雙鏈體之一股中的延長之突出形成。
於一個態樣中，用於本發明之組成物及方法中之碳水化合物接合物係選自下列所組成之群組：
Figure 111115644-A0202-12-0139-17
Figure 111115644-A0202-12-0139-18
Figure 111115644-A0202-12-0139-19
Figure 111115644-A0202-12-0139-20
Figure 111115644-A0202-12-0139-21
Figure 111115644-A0202-12-0140-22
Figure 111115644-A0202-12-0140-23
Figure 111115644-A0202-12-0140-24
Figure 111115644-A0202-12-0140-25
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Figure 111115644-A0202-12-0141-27
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Figure 111115644-A0202-12-0141-29
Figure 111115644-A0202-12-0141-30
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Figure 111115644-A0202-12-0142-33
Figure 111115644-A0202-12-0142-34
Figure 111115644-A0202-12-0142-35
Figure 111115644-A0202-12-0142-38
Figure 111115644-A0202-12-0142-39
Figure 111115644-A0202-12-0143-40
Figure 111115644-A0202-12-0143-41
Figure 111115644-A0202-12-0143-42
，其中Y係O或S，且n係3至6(式XXIV)；
Figure 111115644-A0202-12-0143-43
，其中Y係O或S，且n係3至6(式XXV)；
Figure 111115644-A0202-12-0143-45
Figure 111115644-A0202-12-0144-46
，其中X係O或S(式XXVII)；
Figure 111115644-A0202-12-0144-47
Figure 111115644-A0202-12-0145-49
Figure 111115644-A0202-12-0145-48
Figure 111115644-A0202-12-0146-50
於另一態樣中，用於本發明之組成物及方法中之碳水化合物接合物為單糖。於一個態樣中，該單糖為N-乙醯基半乳胺糖，例如
Figure 111115644-A0202-12-0146-51
於一些態樣中，該RNAi劑係經由連接子接附至碳水化合物，如下述方案所示，其中X為O或S
Figure 111115644-A0202-12-0146-52
於一些態樣中，該RNAi劑係接合至L96，如表1中所定義並如下所示：
Figure 111115644-A0202-12-0147-53
用於本文所述之態樣中的另一代表性碳水化合物接合物係包括但不限於，
Figure 111115644-A0202-12-0147-54
(式XXXVI)，其中，X或Y之一者為寡核苷酸，且另一者為氫。
於一些態樣中，合適之配體係揭露於WO 2019/055633中，其整體內容藉由引用併入本文。於一個態樣中，該配體包含以下結構：
Figure 111115644-A0202-12-0147-55
於本發明之某些態樣中，該GalNAc或GalNAc衍生物係經由單價連接子接附至本發明之iRNA劑。於一些態樣中，該GalNAc或GalNAc衍生物係經由二價連接子接附至本發明之iRNA劑。於本發明之又其他態樣中，該GalNAc或GalNAc衍生物係經由三價連接子接附至本發明之iRNA劑。
於一個態樣中，本發明之雙股RNAi劑包含接附至該iRNA劑的一個或多個GalNAc或GalNAc衍生物。GalNAc可經由連接子接附至正義股或反義股之任意核苷酸。GalNAc可接附至反義股之5'末端、正義股之3'末端、反義股之5'末端或正義股之3'末端。於一個態樣中，GalNAc經由三價連接子接附至正義股的3'末端。
於其他態樣中，本發明之雙股RNAi劑包含複數(例如，2、3、4、5或6)個GalNAc或GalNAc衍生物，其各自透過複數個連接子例如單價連接子各自獨立地接附至該雙股RNAi劑之複數個核苷酸。
於一些態樣中，舉例而言，當本發明之iRNA劑之兩股皆為一個更大分子之一部分且係藉由位於一股之3'末端與另一股之5'末端之間的不間斷核苷酸鏈連結而形成包含複數個未配對核苷酸的髮夾環圈時，該髮夾環圈內之每一個未配對核苷酸可獨立地包含經由單價連接子接附之GalNAc或GalNAc衍生物。
於一些態樣中，該碳水化合物接合物復包含如上文所述的一個或多個額外之配體，例如但不限於，PK調節劑或細胞滲透肽。
適用於本發明之額外之碳水化合物接合物及連接子包括彼等揭示於PCT申請第WO 2014/179620號及第WO 2014/179627號中者，其各自之整體內容藉由引用併入本文。
D.連接子
於一些態樣中，本文中揭示之接合物或配體可使用多種連接子接附至iRNA寡核苷酸，該連接子可為可裂解者或不可裂解者。
術語「連接子」或「連接基團」意指將化合物之兩個部分連結在一起，例如將化合物之兩個部分共價附接的有機部分。連接子典型係包含直接鍵結或原子諸如氧或硫，單元諸如NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH或原子之鏈，諸如但不限於，經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、雜芳基烷基、雜芳基烯基、雜芳基炔基、雜環基烷基、雜環基烯基、雜環基炔基、芳基、雜芳基、雜環基、環烷基、環烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基雜芳基烷基、烷基雜芳基烯基、烷基雜芳基炔基、烯基雜芳基烷基、烯基雜芳基烯基、烯基雜芳基炔基、炔基雜芳基烷基、炔基雜芳基烯基、炔基雜芳基炔基、烷基雜環基烷基、烷基雜環基烯基、烷基雜環基炔基、烯基雜環基烷基、烯基雜環基烯基、烯基雜環基炔基、炔基雜環基烷基、炔基雜環基烯基、炔基雜環基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基雜芳基、烯基雜芳基、炔基雜芳基，其一個或多個亞甲基可由O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜環基中繼或終止；其中R8為氫、醯基、脂族或經取代之脂族。於一個態樣中，該連接子約1至24個原子、2至24個原子、3至24個原子、4至24個原子、5至24個原子、6至24個原子、6至18個原子、7至18個原子、8至18個原子、7至17個原子、8至17個原子、6至16個原子、7至17個原子或8至16個原子。
可裂解之連接基團在細胞外係足夠安定，但當進入標靶細胞時裂解以釋放被該連接子保持在一起之兩個部分。於示例性態樣中，該可裂解之連接基團在標靶細胞內或在第一參考條件(其可為例如經選擇以模擬或呈現細胞內之條件)下之裂解比在受試者血液內或在第二參考條件(其可為例如經選擇以模擬或呈現見於血液或血清中之條件)下之裂解快至少約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更高或至少100倍。
可裂解之連接基團對於裂解劑例如pH、氧化還原電位或可降解分子之存在為敏感者。通常，與在血清或血液中相比，裂解劑在細胞內更為普遍或以更高量級或活性被發現。此類降解劑之實例包括：氧化還原劑，其係選擇用於特定之受質或其不具有受質特異性，包括例如細胞內存在之可降解氧化還原可藉由還原可裂解之連接基團的氧化酶、還原酶或還原劑諸如硫醇；酯酶；內切酶，或可創建酸性環境之劑例如彼等導致pH為5或更低者；可藉由作為通用酸、肽酶(其可為受質特異性者)及磷酸酶作動而水解或降解酸可裂解之連接基團的酶。
可裂解之連接基團諸如二硫鍵可能對於pH敏感。人血清之pH為7.4，而細胞內平均pH略低，為7.1至7.3之範圍。胞內體具有酸性更強之pH，為5.5至6.0之範圍；而溶酶體甚至具有酸性更強之pH，約為5.0。一些連接子將具有可裂解之連接基團，該連接基團在選定pH裂解，從而在細胞內將陽離子脂質從該配體釋放出來或將該陽離子脂質釋放到所欲之細胞腔室內。
連接子可包括可藉由特定酶裂解之可裂解之連接基團。併入連接子內的可裂解之連接基團之類型可取決於待作為標靶之細胞。舉例而言，肝臟靶向配體可透過包括酯基之連接子而連接至連接子。肝細胞富含酯酶，因此該連接 子在肝細胞中將比在不富含酯酶之細胞類型內更有效地被裂解。其他富含酯酶之細胞類型包括肺、腎皮質及睪丸之細胞。
當靶向細胞類型係富含肽酶者諸如肝臟細胞及滑膜細胞時，可使用含有肽鍵之連接子。
通常，可藉由測試降解劑(或條件)裂解備選連接基團之能力而評估該備選之可裂解連接基團的適用性。亦所欲者係亦測試該備選可裂解連接基團在血液中或當與其他非標靶組織接觸時之抵抗裂解的能力。因此，可測定第一條件與第二條件間之裂解相對敏感性，其中該第一條件係選擇為標靶細胞內之裂解標誌物，且該第二條件係選擇為其他組織或生物流體如血液或血清中之裂解標誌物。該等評價可在無細胞之系統內、細胞內、細胞培養物內、器官或組織培養物內或在整個動物體內進行。可能有用者係，在無細胞或培養條件下作成初始評價，並藉由在整體動物體內之進一步評價而證實。於某些態樣中，可用之備選化合物在細胞內(或在選擇以模擬細胞內條件之體外條件下)之裂解比在血液或血清中(或在選擇以模擬細胞外條件之體外條件下)快至少約2倍、4倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。
i.氧化還原可裂解之連接基團
於某些態樣中，可裂解之連接基團為氧化還原可裂解之連接基團，其在還原或氧化時被裂解。可經還原裂解之連接基團的實例為二硫連接基團(-S-S-)。為了確定備選可裂解連接基團是否為適宜之「可還原裂解之連接基團」或例如是否適用於與特定iRNA部分及特定靶向劑合用，可查看本文中揭示之方法。舉例而言，可藉由以二硫蘇糖醇(DTT)或使用該領域中已知試劑之還原劑溫育來評估備選者，該溫育模擬在細胞如靶標細胞內將會觀察到之裂解速率。該等被選中亦可 在經選擇以模擬血液或血清條件之條件評價。於一個態樣中，備選化合物在血液中被裂解至多約10%。於其他態樣中，可用之備選化合物在細胞內(或在選擇以模擬細胞內條件之體外條件)之降解比在血液或血清中(或在選擇以模擬細胞外條件之體外條件)快至少約2倍、4倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或約100倍。備選化合物之裂解速率可使用標準酶動力學分析在經選擇以模擬細胞內介質之條件測定，並將其與在經選擇以模擬細胞外介質之條件所測定者比較。
ii.基於磷酸酯之可裂解連接基團
於其他態樣中，可裂解之連接子包含基於磷酸酯之可裂解連接基團。基於磷酸酯之可裂解連接基團係藉由降解或水解該磷酸酯基團之劑而裂解。在細胞內裂解磷酸酯基團之劑的實例為酶諸如細胞內之磷酸酶。基於磷酸酯之連接基團的實例為-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-，其中Rk在每次出現時可獨立地為C1-C20烷基、C1-C20鹵烷基、C6-C10芳基或C7-C12芳烷基。示例性態樣包括-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-及-O-P(S)(H)-S-。於某些態樣中，基於磷酸酯 之連接基團為-O-P(O)(OH)-O-。此等備選者可使用與上述之彼等類似之方法評價。
iii.酸可裂解之連接基團
於其他態樣中，可裂解之連接子包含酸可裂解之連接基團。酸可裂解之連接基團為在酸性條件下被裂解之連接基團。於某些態樣中，酸可裂解之連接基團在pH為約6.5或更低(例如，約6.0、5.5、5.0或更低)之酸性環境中被裂解，或被劑諸如可用作通用酸之酶裂解。於細胞內，特異性低pH胞器諸如胞內體及溶酶體，可提供用於酸可裂解之連接基團的裂解環境。酸可裂解之連接基團的實例包括但不限於腙類、酯類及胺基酸之酯類。酸可裂解之連接基團可具有通式-C=NN-、C(O)O或-OC(O)。示例性態樣為，接附至酯之氧(烷氧基)的碳為芳基、經取代之烷基或四級烷基諸如二甲基戊基或第三丁基。此等備選者可使用與上述之彼等類似之方法評價。
iv.基於酯之連接基團
於其他態樣中，可裂解之連接子包含基於酯之可裂解連接基團。基於酯之可裂解連接基團由酶諸如酯酶或醯胺酶在細胞內裂解。基於酯之可裂解連接基團的實例包括但不限於伸烷基、伸烯基及伸炔基之酯類。酯可裂解之連接基團可具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。此等備選者可使用與上述之彼等類似之方法評價。
v.基於肽之裂解基團
於又其他態樣中，可裂解之連接子包含基於肽之可裂解連接基團。基於肽之可裂解連接基團係由酶諸如肽酶或蛋白酶在細胞內裂解。基於肽之可裂解基團為在胺基酸間形成以獲得寡肽(例如，二肽、三肽等)及多肽之肽鍵。基於肽之可裂解基團不包括醯胺基團(-C(O)NH-)。該醯胺基團可在任意伸烷基、伸烯基或伸 炔基之間形成。肽鍵為在胺基酸間形成以獲得肽及蛋白質之特定類型的醯胺鍵。基於肽之裂解基團通常限定為在胺基酸之間形成而獲得肽及蛋白質的肽鍵(亦即，醯胺鍵)，且不包括該完整醯胺官能基。基於肽之可裂解連接基團具有通式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA及RB為兩個相鄰胺基酸之R基團。此等備選者可使用與上述之彼等類似之方法評價。
於一些態樣中，本發明之iRNA係透過連接子接合至碳水化合物。本發明之組成物及方法的與連接子接合之iRNA碳水化合物接合物的非限制性實例包括，但不限於，
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(式XLIV)，其中，X或Y之一者為寡核苷酸，且另一者為氫。
於本發明之組成物及方法的某些態樣中，配體為透過二價或三價分支鏈連接子接附的一種或多種「GalNAc」(N-乙醯基半乳胺糖)衍生物。
於一個態樣中，本發明之dsRNA係接合至選自式(XLV)至(XLVI)中任一者所示結構組成之群組的二價或三價分支鏈連接子：
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 其中：
q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B及q5C於每次出現時係獨立表示0至20，其中該重複單元可為相同或相異；
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C於每次出現時獨立地為不存在或係CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；
Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C於每次出現時獨立地為不存在或係伸烷基、經取代之伸烷基(其中一個或多個亞甲基可藉由O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R')=C(R")、C≡C或C(O)之一者或多者中斷或封端)；
R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C於每次出現時獨立地為不存在或係NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、 CO、CH=N-O、
Figure 111115644-A0202-12-0157-67
、
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、
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、
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、
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或雜環基；
L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B及L5C表示配體，亦即，在每次出現時各自獨立地為單糖(諸如GalNAc)、二醣、三醣、四醣、寡醣或多醣；且Ra為H或胺基酸側鏈。三價接合GalNAc衍生物尤其可與RNAi劑合用，以用於抑制標靶基因之表現，諸如式(XLIX)之彼等：
Figure 111115644-A0202-12-0157-66
其中L5A、L5B及L5C表示單糖，諸如GalNAc衍生物。
適宜之接合GalNAc衍生物之二價及三價分支鏈連接子的實例包括但不限於，上文作為式II、VII、XI、X及XIII而引用之結構。
教示RNA接合物之製備的代表性美國專利包括但不限於，美國專利第4,828,979號、第4,948,882號、第5,218,105號、第5,525,465號、第5,541,313號、第5,545,730號、第5,552,538號、第5,578,717號、第5,580,731號、第5,591,584號、第5,109,124號、第5,118,802號、第5,138,045號、第5,414,077號、第5,486,603號、第5,512,439號、第5,578,718號、第5,608,046號、第4,587,044號、第4,605,735號、第4,667,025號、第4,762,779號、第4,789,737號、第4,824,941號、第4,835,263號、第4,876,335號、第4,904,582號、第4,958,013號、第5,082,830號、第5,112,963號、第5,214,136號、第5,082,830號、第5,112,963號、第5,214,136號、第5,245,022號、第5,254,469號、第5,258,506號、第5,262,536號、第5,272,250號、第5,292,873號、第5,317,098號、第5,371,241號、第5,391,723號、第5,416,203號、第5,451,463號、第5,510,475號、第5,512,667號、第5,514,785號、第5,565,552號、第5,567,810號、第5,574,142號、第5,585,481號、第5,587,371號、第5,595,726號、第5,597,696號、第5,599,923號、第5,599,928號、第5,688,941號、第6,294,664號、第6,320,017號、第6,576,752號、第6,783,931號、第6,900,297號、第7,037,646號及第8,106,022，其各自之整體內容係藉由引用而併入本文。
給定化合物之所有位置經均勻修飾係不必要者，且事實上，超過一種前述修飾可併入單個化合物中或甚至併入iRNA之單個核苷處。本發明亦包括作為嵌合化合物之iRNA化合物。
於本發明之語境中，「嵌合」iRNA化合物或「嵌合體」為iRNA化合物，諸如dsRNAi劑，其含有兩個或更多個化學上不同之區域，各區域由至 少一個單體單元構成，亦即，在dsRNA化合物之情形中，該單體單元為核苷酸。此等iRNA典型地含有至少一個區域，其中該RNA經修飾以賦予該iRNA以增加之對核酸酶降解之抗性、增加之細胞攝取或增加之與標靶核酸之親和性。該iRNA之額外區域可用作能裂解RNA：DNA雜交體或RNA：RNA雜交體之酶的受質。舉例而言，RNase H為細胞之核酸內切酶，其裂解RNA：DNA雙鏈體之RNA股。因此，RNase H之活化導致RNA標靶之裂解，從而極大地提升對基因表現之iRNA抑制的效率。因此，當使用嵌合dsRNA時，使用較短之iRNA往往可獲得與使用雜交至相同標靶區域之硫代磷酸酯去氧dsRNA相當的結果。RNA標靶之裂解可藉由凝膠電泳常規偵檢之，且若需要，可將凝膠電泳與該領域中已知之相關核酸雜交技術合用。
於某些情況下啊，iRNA之RNA可藉由非配體基團修飾。大量非配體分子業經接合至iRNA以提升iRNA之活性、細胞分佈或細胞攝取，且實施此類接合之過程可在科技文獻中獲得。此類非脂質部分業經包括脂質部分，諸如膽固醇(Kubo,T.et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.,2007,365(1)：54-61；Letsinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86：6553)；膽酸(Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1994,4：1053)；硫醚，例如，己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660：306；Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3：2765)；巰基膽固醇(Oberhauser et al.,Nucl.Acids Res.,1992,20：533)；脂族鏈，例如，十二烷二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras et al.,EMBO J.,1991,10：111；Kabanov et al.,FEBS Lett.,1990,259：327；Svinarchuk et al.,Biochimie,1993,75：49)；磷脂，例如，二-十六烷基-rac-甘油或1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-磷酸三乙銨(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36：3651；Shea et al.,Nucl.Acids Res.,1990,18：3777)；聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharan et al.,Nucleosides & Nucleotides,1995,14：969)；或金剛烷乙酸(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36：3651)、棕櫚基部分(Mishra et al.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264：229)或十八烷基胺或己基胺基-羰基-氧膽固醇部分(Crooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277：923)。教示此類RNA接合物之製備的代表性美國專利業經列述於上文中。典型之接合策略包括在該序列之一個或多個位置處承載胺基連接子之RNA的合成。該胺基隨後與使用適宜之偶合劑或活化劑接合之分子反應。該接合反應可使用仍鍵結至固體支撐物之RNA實施，或在RNA於溶液相中裂解後實施。藉由HPLC進行的RNA接合物之純化典型地提供純的接合物。
IV.本發明之iRNA之輸送
本發明之iRNA到細胞，例如受試者諸如人類受試者(例如，有此需要之受試者，諸如易患或經診斷為患有TMPRSS6相關疾患的受試者，該疾患為例如與鐵過載相關之疾患及/或無效性紅血球生成之疾患)體內細胞的輸送可以不同方式達成。舉例而言，可藉由將細胞與本發明之iRNA在活體外或活體內接觸而實施輸送。活體內輸送亦可藉由將包含iRNA如dsRNA之組成物給藥至受試者而直接實施。替代性地，活體內輸送可藉由將編碼並引導該iRNA之表現的一種或多種載體給藥而間接實施。此等替代物係於下文中進一步檢討。
通常，輸送核酸分子之任意方法(活體外或活體內)可適用於與本發明之iRNA合用(參見，例如，Akhtar S.and Julian RL.(1992)Trends Cell.Biol.2(5)：139-144及WO94/02595，其係藉由引用而以其整體併入本文)。對於活體內輸送，為了輸送iRNA分子而慮及之因素包括，舉例而言，所輸送之分子的生物學安定性、非特異性效應之預防及所輸送之分子在標靶組織內之蓄積。RNA干 擾亦業經顯示藉由直接注射進行之局部輸送至CNS的成功(Dorn,G.,et al.(2004)Nucleic Acids 32：e49；Tan,PH.,et al(2005)Gene Ther.12：59-66；Makimura,H.,et al(2002)BMC Neurosci.3：18；Shishkina,GT.,et al(2004)Neuroscience 129：521-528；Thakker,ER.,et al(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：17270-17275；Akaneya,Y.,et al(2005)J.Neurophysiol.93：594-602)。對RNA或醫藥載劑之修飾亦可允許該iRNA以標靶組織為靶向且避免非所欲之脫靶效應。iRNA分子可藉由化學接合至親脂性基團諸如膽固醇而修飾，以提升細胞攝取且防止降解。舉例而言，接合至親脂性膽固醇部分之對抗ApoB的iRNA係經全身性注射至小鼠體內，導致肝臟及空腸兩處之apoB mRNA的敲弱(Soutschek,J.,et al(2004)Nature 432：173-178)。
於替代性態樣中，該iRNA可使用藥物輸送系統如奈米顆粒、樹枝狀聚合物、聚合物、脂質體或陽離子輸送系統進行輸送。荷正電之陽離子輸送系統係促進iRNA分子(荷負電)之結合，亦提升在荷負電之細胞膜處的交互作用，以允許該細胞對iRNA之有效攝取。陽離子脂質、樹枝狀聚合物或聚合物可鍵結至iRNA，或經引入以形成封裝iRNA之媒介物或微胞(參見，例如，Kim SH,et al(2008)Journal of Controlled Release 129(2)：107-116)。媒介物或微胞之形成進一步防止當全身性投予時該iRNA之降解。製作及投予陽離子-iRNA錯合物之方法完全處於該領域熟練人士之能力範圍內(參見，例如，Sorensen,DR,et al(2003)J.Mol.Biol 327：761-766；Verma,UN,et al(2003)Clin.Cancer Res.9：1291-1300；Arnold,AS et al(2007)J.Hypertens.25：197-205，其皆藉由引用而以其整體併入本文)。可用於iRNA之全身性輸送的藥物輸送系統之一些非限制性實例包括DOTAP(Sorensen,DR.,et al(2003)，同上；Verma,UN,et al(2003)，同上)、「固體 核酸脂質顆粒」(Zimmermann,TS,et al(2006)Nature 441：111-114)、心磷脂(Chien,PY,et al(2005)Cancer Gene Ther.12：321-328；Pal,A,et al(2005)Int J.Oncol.26：1087-1091)、聚伸乙基亞胺(Bonnet ME,et al(2008)Pharm.Res.Aug 16線上提前發行；Aigner,A.(2006)J.Biomed.Biotechnol.71659)、Arg-Gly-Asp(RGD)肽(Liu,S.(2006)Mol.Pharm.3：472-487)及聚醯胺基胺(Tomalia,DA,et al(2007)Biochem.Soc.Trans.35：61-67；Yoo,H.,et al(1999)Pharm.Res.16：1799-1804)。於一些態樣中，iRNA與環糊精形成用於全身性投予之錯合物。投予方法及iRNA與環糊精之醫藥組成物可見於美國專利第7,427,605號，其係藉由引用而以其整體併入本文。
A.編碼本發明之iRNA的載體
靶向TMPRSS6基因之iRNA可從插入至DNA或RNA載體中的轉錄單元表現(參見，例如，Couture,A,et al.,TIG.(1996),12：5-10；Skillern,A,et al.,國際PCT公開第WO 00/22113號；Conrad，國際PCT公開第WO 00/22114號及Conrad，美國專利第6,054,299號)。表現可為瞬時者(幾小時至幾週之層級)或持續者(幾週至幾個月或更久)，取決於所使用之具體構造及標靶組織或細胞類型。此等轉殖基因可作為線性構造體、環狀質體或病毒載體而引入，其可為整合載體或非整合載體。該轉殖基因亦可構造為允許其作為粒線體外質體而被繼承(Gassmann,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92：1292)。
可與本文所述方法及組成物合用之病毒載體系統包括但不限於，(a)腺病毒載體；(b)逆轉錄病毒載體，包括但不限於慢病毒載體、莫洛尼鼠白血病病毒等；(c)腺相關病毒載體；(d)單純皰疹病毒載體；(e)Sv40載體；(f)多瘤病毒載體；(g)乳頭狀瘤病毒載體；(h)小核糖核酸病毒載體；(i)痘病毒載體，諸如 天花例如牛痘病毒載體，或禽痘例如金絲雀痘或雞痘病毒載體；以及(j)幫手依賴性或裸腺病毒載體。複製缺陷病毒亦可為優勢者。不同之載體將變為或不變為併入該細胞之基因體內。若必要，該等構造體可包括用於轉染之病毒序列。替代性地，該構造體可併入能進行附加型複製(episomal replication)之載體例如EPV載體及EBV載體內。用於iRNA之重組表現之構造體通常將會需要調節元件，例如啟動子、增強子等，以確保該iRNA在標靶細胞內之表現。對於載體及構造體所慮及之其他方面係該領域中已知者。
V.本發明之醫藥組成物
本發明亦包括醫藥組成物及配製物，其包括本發明之iRNA。於一個態樣中，本文提供醫藥組成物，其含有如本文所揭示之iRNA及醫藥上可接受之載劑。含有iRNA之醫藥組成物係有用於預防或治療TMPRSS6相關疾患，例如，與鐵過載相關之疾患及/或無效性紅血球生成之疾患。此等醫藥組成物係基於輸送模式而配製。一個實例為組成物經配製為用於經由腸道外輸送之全身性投予，例如，藉由皮下(SC)、肌肉內(IM)或靜脈內(IV)輸送。本發明之醫藥組成物可以足以抑制TMPRSS6基因之表現的劑量投予。
於一些態樣中，本發明之醫藥組成物係無菌。於另一態樣中，本發明之醫藥組成物係無熱原。
本發明之醫藥組成物可以足以抑制TMPRSS6基因之表現的劑量投予。通常，本發明之iRNA的適當劑量將在約0.001至約200.0毫克每公斤接受者體重每天的範圍內，通常在約1至50mg每公斤體重每天的範圍內。典型地，本發明之iRNA的合適劑量將在約0.1mg/kg至約5.0mg/kg之範圍內，諸如約0.3mg/kg及3.0mg/kg。重複劑量方案可包括規則地投予治療量之iRNA，諸 如每3至6個月一次或每年一次。於某些態樣中，iRNA係每個月投予約一次至每六個月投予約一次。
於初始之治療方案後，該治療之實施頻次可降低。治療之持續時間可基於疾病之嚴重程度確定。
於其他態樣中，醫藥組成物之單次劑量可為長效，使得劑量係以不超過1、2、3或4個月之間期投予。於本發明之一些態樣中，本發明之醫藥組成物的單次劑量係約每個月投予一次。於本發明之其他態樣中，本發明之醫藥組成物的單次劑量係每個季(亦即，約每三個月)投予一次。於本發明之其他態樣中，本發明之醫藥組成物的單次劑量係每年投予兩次(亦即，約每六個月投予一次)。
熟練技術人員應知悉，某些因素可影響有效治療受試者所需之劑量及時機，該等因素包括但不限於受試者中存在之疾病、先前之治療、受試者之一般健康情況或年齡、以及存在之其他疾病。此外，使用預防或治療有效量(若適宜)之組成物治療受試者可包括單次治療或一系列治療。
iRNA可以靶向特定組織(例如，幹細胞)之方式輸送。
本發明之醫藥組成物包括但不限於，溶液、乳液及含脂質體之製劑。此等組成物可從多種組分生成，該等組分包括但不限於，預成形之液體、自乳化之固體及自乳化之半固體。製劑包括彼等靶向肝臟者。
可便利地以單位劑型存在的本發明之醫藥製劑，可根據醫藥工業中習知之傳統技術製備。此類技術包括將活性成分與醫藥載劑或賦形劑帶至聯合之步驟。通常，藉由將活性成分與液體載劑均勻地且最終帶至聯合來製備製劑。
A.額外製劑
i.乳液
本發明之組成物可製備且配製為乳液。乳液為一種液體以直徑通常超過0.1μm之液滴形式分散於另一種液體中之典型非均質系統(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Volume 1,p.245；Block in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 2,p.335； Higuchi et al.,in Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.301)。乳液通常為包含彼此緊密混合及分散之兩個不互混液體相之雙相系統。通常，乳液可為油包水(w/o)類或水包油(o/w)類。當水性相經精細切分為小液滴並分散於整塊油性相中時，所得組成物稱為油包水(w/o)乳液。替代性地，當油性相經精細切分為小液滴並分散於整塊水性相中時，所得組成物稱為水包油(o/w)乳液。乳液除了含有分散相及可作為水性相、油性相存在於溶液中或本身作為單獨一相的活性藥物之外，亦可含有額外之組分。如需要，醫藥賦形劑如乳化劑、安定劑、染料及抗氧化劑亦可存在於乳液中。醫藥乳液亦可為由超過兩相構成之多乳液，舉例而言，油包水包油(o/w/o)乳液及水包油包水(w/o/w)乳液。此類複雜製劑經常提供簡單雙相乳液所不具有之某些優點。其中o/w乳液之 個體油滴將小水滴容納在內之多乳液構建w/o/w乳液。同樣，油滴被容納在油性連續相中經安定化之水球內的系統提供o/w/o乳液。
乳液之特徵在於熱力學安定性小或沒有。一般情況下，乳液之分散相或不連續相良好地分散在外部相或連續相中，且透過乳化劑手段或形成黏度之手段維持其形式。其他安定化乳液之手段需要使用可併入乳液之任一相中的乳化劑。廣義上，乳化劑可歸為四類：合成界面活性劑、天然界面活性劑、吸收基質及精細分散之固體(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。
合成界面活性劑，亦稱為表面活性劑，業經廣泛用於乳液製劑中且業經在文獻中回顧(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.285；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,volume 1,p.199)。界面活性劑典型為兩性的且包含親水性部分及疏水性部分。界面活性劑之親水性與疏水性之比率業經定義為親水/親脂平衡(HLB)，且為在製劑之製備中歸類及選擇界面活性劑之有價值的工具。基於其親水性基團之天性，界面活性劑可歸為不同之類別：非離子性、陰離子性、陽離子性及兩性(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.285)。
大量非乳化材料亦包括於乳液配製物中，且對乳液之特性有所貢獻。此等包括脂肪、油類、蠟、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、保濕劑親水性膠體、防腐劑及抗氧化劑(Block,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.335；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。
乳液配製物經由護膚途徑、口服途徑及腸胃外途徑之應用及其製造方法業經在文獻中回顧(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。
ii.微乳液
於本發明之一個態樣中，iRNA及核酸之組成物係配製為微乳液。微乳液可定義為水、油及兩性之系統，其係單一光學各向同性且熱力學安定之溶液(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker (Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245)。典型地，微乳液係藉由下述製備之系統，首先，將油分散於界面活性劑水溶液中，隨後添加足量之第四成分，通常係中等鏈長之醇，以形成透明之系統。因此，微乳液亦業經揭示為兩種不互混液體的熱力學至、各向同性之澄清分散液，該兩種液體係藉由表面活性分子之界面膜予以安定化(Leung and Shah,in：Controlled Release of Drugs：Polymers and Aggregate Systems,Rosoff,M.,Ed.,1989,VCH Publishers,New York,pages 185-215)。
iii.微粒
本發明之iRNA可併入顆粒例如微粒中。微粒可藉由噴霧乾燥生產，但亦可藉由其他方法生產，該等其她方法包括凍乾、蒸發、流動床乾燥、真空乾燥或此等技術之組合。
iv.滲透增強劑
於一個態樣中，本發明採用多種滲透增強劑以實現核酸尤其是iRNA至動物皮膚之有效輸送。大多數藥物以經離子化及未經離子化兩種形式存在於溶液中。惟，一般僅脂溶性或親脂性藥物輕易地跨越細胞膜。業經發現，如果待跨越之細胞膜經滲透增強劑處理，則即便是非親脂性藥物仍能夠跨越該細胞膜。滲透增強劑除了有助於非親脂性藥物跨越細胞膜之擴散之外，亦提升親水性藥物之滲透能力。
滲透增強劑可分類為屬於下述五大類之一：亦即，界面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑及非螯合非界面活性劑(參見，例如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)。上述 類別之滲透增強劑中之各者及其等在製造醫藥組成物及輸送醫藥劑中的用途係本領域中習知者。
v.賦形劑
相較於載劑化合物，「醫藥載劑」或「賦形劑」係醫藥上可接受之溶劑、懸浮劑或其他用於將一種或多種核酸輸送至動物的醫藥上惰性之媒介物。賦形劑可為液體或固體，且當與核酸及給定醫藥組成物之其他組分合併時，係基於所考慮之計劃投予模式而選擇，以提供所欲之體積、一致性等。該劑係本領域中習知者。
vi.其他組分
本發明之組成物可額外地含有常見於醫藥組成物中之其他輔助組分，用量為其等在該領域中常用的水準。因此，舉例而言，該等組成物可含有額外、可相容、醫藥活性之材料如，舉例而言，止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或抗炎劑，或可含有可用於物理上配製多種類型之本發明之組成物的材料諸如染料、芳香劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑及安定劑。惟，當加入此類材料時，此類材料應不過度干擾本發明之組成物之組分的生物活性。該配製物可經無菌化，且若需要，與不與該製劑之核酸進行有害反應的佐劑例如潤滑劑、防腐劑、安定劑、潤濕劑、乳化劑、用於影響滲透壓之鹽類、緩衝劑、著色劑、香味劑及/或芳香物質等混合。
水性懸浮液可含有增加該懸浮液黏度之物質，包括，舉例而言，羧甲基纖維素鈉、山梨醇或聚葡萄糖。懸浮液亦可含有安定劑。
於一些態樣中，本發明提出之醫藥組成物包括：(a)一種或多種iRNA；及(b)一種或多種劑，其藉由非iRNA機制發揮作用且係有用於治療 TMPRSS63相關疾患，例如，與鐵過載相關之疾患及/或無效性紅血球生成之疾患，例如，遺傳性血鐵沉積症、β-地中海型貧血(例如，重度β-地中海型貧血及中度β-地中海型貧血)、真性紅血球增多症、骨髓化生不良症候群、先天性紅血球生成不良性貧血、丙酮酸鹽激酶缺乏、造紅血球性紫質沉著病、帕金森氏症、阿茲海默氏症及共濟失調。
此類化合物之毒性及預防功效可藉由標準醫藥程序在細胞培養物或實驗動物中測定，例如用於測定LD50(將群體之50%致死之劑量)及ED50(對群體之50%治療有效之劑量)。毒性與治療效應之間的劑量比率為治療係數，且其可表現為LD50/ED50之比率。顯現高治療係數之化合物係較佳者。
從細胞培養檢定及動物研究中獲得之資料可用於配製在人體內使用之劑量範圍。本發明提出之組成物的劑量通常處於包括ED50諸如ED80或ED90在內之具低毒性或無毒性之循環濃度範圍內。劑量可依據所採用之劑型及所使用之投予途徑而在此範圍內變動。對於在本發明提出之方法中使用的任意化合物，最初可從細胞培養物檢定中構建預防有效之劑量。劑量可配製為，用於動物模型以達成該化合物或(當適宜時)標靶序列之多肽產物的循環血漿濃度範圍(例如，達成多肽之降低之濃度)，該範圍包括如在細胞培養物中所測定的IC50(亦即，達成對症候之半最大抑制時該測試化合物之濃度)或較高水準之抑制。此資訊可用來更準確地確定可用於人體之劑量。舉例而言，可藉由高效液相色層分析術測量血漿中之水準。
除了其等之投予之外，如上文所檢討，本發明提出的iRNA可與其他已知用於預防或治療TMPRSS6相關疾患(例如，與鐵過載相關之疾患及/或無效性紅細胞生成之疾患)的劑組合投予。在任何情況下，主治醫生皆可基於該 領域中已知或本文所述之標準功效測量方法觀察的結果來確定iRNA給藥的量及時機。
VI.抑制TMPRSS6表現之方法
本發明亦提供抑制TMPRSS6基因在細胞內之表現的方法。該等方法包括使細胞與其量有效抑制TMPRSS6在細胞內之表現的RNAi劑，例如，雙股RNA劑接觸，從而抑制TMPRSS6在細胞內的表現。
細胞與iRNA例如雙股RNA劑的接觸可在活體外或活體內進行。使細胞在活體內與iRNA接觸包括使受試者例如人類受試者體內的細胞或細胞群組與iRNA接觸。接觸細胞的活體外方法與活體內方法之組合亦係可能者。接觸細胞可為直接或間接的，如上文檢討。此外，接觸細胞可經由靶向配體實現，該配體包括本文所接受或本領域中已知的任意配體。於一些態樣中，靶向配體為碳水化合物部分，例如，GalNAc3配體，或將RNAi靶向至所關注之位點的任何其他配體。
如本文中所用，術語「抑制」與「減輕」、「緘默化」、「下調」、「阻抑」及其他類似術語可互換使用，且包括任意量級之抑制。
如本文中所用，片語「抑制TMPRSS6基因之表現」旨在指稱抑制任意TMPRSS6基因(諸如例如，小鼠TMPRSS6 3基因、大鼠TMPRSS6基因、猴TMPRSS6基因或人類TMPRSS6基因)以及編碼TMPRSS6基因之變異體或突變體的表現。因此，在經基因操縱之細胞、細胞群組或生物體之語境下，TMPRSS6基因可為野生型TMPRSS6基因、突變型TMPRSS6基因或基因轉殖TMPRSS6基因。
「抑制TMPRSS6基因之表現」包括對於TMPRSS6基因的任何抑制，例如，對於TMPRSS6基因之表現的至少部分阻抑。TMPRSS6基因之表現可介於任何與TMPRSS6基因表現相關之變量的量級或量級變化來評估，該量級為例如TMPRSS6 mRNA含量或TMPRSS6蛋白含量。TMPRSS6之表現亦可基於組織或血清中之鐵調素mRNA含量、鐵調素蛋白含量或鐵含量來直接評估。該水準可在個別細胞或細胞群組中評估，包括，舉例而言，源自受試者之樣品。應理解，TMPRSS6係主要在肝臟中表現。
抑制可藉由一種或多種與TMPRSS6表現相關之變量的絕對量級或相對量級相較於對照量級的減少來評估。該對照量級可為該領域中使用之任意類型之對照量級，例如給藥前之基線量級，或從未治療或經對照物(例如，僅含緩衝劑之對照物或非活性劑之對照物)治療之類似之受試者、細胞或樣品測得之量級。
於本發明之方法的一些態樣中，TMPRSS6基因之表現被抑制至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%，或抑制到低於該檢定之檢出量級。於一些態樣中，TMPRSS6基因之表現被抑制至少70%。應進一步理解，抑制TMPRSS6在某些組織例如肝臟中之表現而不顯著抑制在其他組織例如腦中之表現可能係所欲者。於一些態樣中，表現水準係使用實施例2中提供之檢定方法以10nM siRNA濃度在適宜之物種匹配細胞株中測定。
於某些態樣中，活體內表現之抑制係藉由在表現人類基因之囓齒動物例如表現該人類標靶基因之AAV感染小鼠中該人類基因基因(亦即，TMPRSS6)的敲除來測定，例如，當以單次劑量例如3mg/kg投予時在RNA表現之最低點確定的敲弱。內源性基因在模型動物系統中之表現的敲弱亦可例如 在投予例如3mg/kg之單次劑量後在RNA表現之最低點確定。當人類基因之核酸序列與模型動物基因足夠接近，使得人類iRNA提供模型動物基因的有效敲弱時，此類系統可用。肝臟中的RNA表現係使用實施例2中提供的PCR方法測定。
對於TMPRSS6基因之表現的抑制可體現為由第一細胞或細胞群組(此類細胞可能存在於，舉例而言，源自受試者之樣品中)所表現的mRNA之量降低，TMPRSS6基因係於該細胞中轉錄，且該細胞已經過治療(例如，藉由使該細胞或細胞群組與本發明之iRNA接觸，或藉由向其體內存在該等細胞之受試者投予本發明之iRNA)，使得相較於第二細胞或細胞群組，TMPRSS6基因係經抑制，該第二細胞或細胞群組實質上與第一細胞或細胞群組相同但未經如此治療(未用iRNA治療或未用靶向所關注之基因的iRNA治療的對照細胞)。於一些態樣中，抑制係藉由實施例2中提供的方法使用10nM siRNA濃度在物種匹配細胞株內評估，且經治療之細胞內的mRNA含量係保險為相對於對照細胞內之mRNA的百分比，使用以下公式：
Figure 111115644-A0202-12-0173-74
於其他態樣中，對於TMPRSS6基因之表現的抑制可在與TMPRSS6基因表現功能性地關聯之參數(例如，來自受試者之血液或血清中的TMPRSS6蛋白含量)降低方面評估。TMPRSS6基因緘默化可以在任何表現TMPRSS6之細胞內且藉由本領域中已知的任何檢定確定，該細胞與表現構建體或為內源性或為異源性。
對於TMPRSS6蛋白之表現的抑制可體現為由受試者樣品中細胞或細胞群組所表現之TMPRSS6蛋白含量(例如，源自受試者之血液樣品中的蛋 白質含量)降低。如上所述，為了評估mRNA阻抑，經治療之細胞或細胞群組中之蛋白質表現量級的抑制可類似地表現為相對於對照細胞或細胞群組內蛋白質含量的百分比，或表現為受試者樣品例如源自其的血液或血漿中蛋白質含量的變化。
可用於評估對於TMPRSS6基因之表現的抑制的對照細胞、細胞群組或受試者樣品包括尚未與本發明之RNAi劑接觸的細胞、細胞群組或受試者樣品。舉例而言，對照細胞、細胞群組或受試者樣品可在用RNAi劑治療受試者(例如，人類或動物受試者)之前源自該受試者或源自經適宜匹配之群體對照。
由細胞或細胞群組表現的TMPRSS6 mRNA含量可使用本領域中已知用於評估mRNA表現的任何方法測定。於一個態樣中，樣品中TMPRSS6表現水準係藉由偵檢經轉錄之多核苷酸或其部分(例如，TMPRSS6基因之mRNA)來測定。RNA可使用RNA提取技術從細胞提取，該等技術包括，舉例而言，使用酸苯酚/異硫氰酸胍提取(RNAzol B；Biogenesis)、RNeasyTM RNA製備套組(Qiagen®)或PAXgeneTM(PreAnalytixTM,Switzerland)。使用核糖核酸雜交的典型檢定格式包括核連綴轉錄檢定(nuclear run-on assay)、RT-PCR、RNase保護檢定、北方印漬術、原位雜交及微陣列分析。
於一些態樣中，TMPRSS6之表現水準係使用核酸探針測定。如本文中所用，術語「探針」指稱能夠選擇性地結合至特定TMPRSS6的任何分子。探針可由本領域熟練人士合成，或源自適宜之生物製劑。探針可特異性地涉及為經標記。可用作探針之分子的示例包括但不限於，RNA、DNA、蛋白質、抗體及有機分子。
單離mRNA可用於雜交或擴增檢定中，該等檢定包括但不限於，南方或北方分析、聚合酶連鎖反應(PCR)分析及探針檢定。一種用於測定mRNA含量的方法涉及使單離mRNA與可雜交至TMPRSS6 mRNA的分子(探針)接觸。於一個態樣中，mRNA係經固定在固體表面並與探針接觸，舉例而言，藉由使單離mRNA在瓊脂糖凝膠電泳並將該mRNA從凝膠轉移到膜諸如硝基纖維素來進行。於替代性態樣中，探針係經固定在固體表面，且使mRNA與探針接觸，舉例而言，在Affymetrix®基因晶片陣列中。熟練技術人員可輕易調整已知mRNA偵檢方法以用於測定TMPRSS6 mRNA之含量。
用於測定樣品中TMPRSS6之表現水準的替代性方法涉及舉例而言樣品中之mRNA的核酸擴增或逆轉錄酶過程(以製備cDNA)，例如，藉由RT-PCR(實驗態樣詳述於Mullis,1987，美國專利第4,683,202號中)、連接酶連鎖反應(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189-193)、自持續序列複製(Guatelli et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878)、轉錄擴增系統(Kwoh et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177)、Q-β複製酶(Lizardi et al.(1988)Bio/Technology 6：1197)、滾環複製(olling circle replication)(Lizardi et al.，美國專利第5,854,033號)或任何其他核酸擴增方法，然後使用本領域熟練人士習知之技術對經擴增之分子進行偵檢。此等偵檢方案尤其有用於偵檢核酸分子，如果此類分子係以非常低的數量存在。於本發明之特定方面，TMPRSS6之表現量級係藉由定量螢光RT-PCR(亦即，TaqManTM系統)測定。於一些態樣中，表現量級係藉由實施例2中提供之方法使用例如10nM siRNA濃度在物種匹配細胞株中測定。
TMPRSS6 mRNA之表現量級可使用膜印漬(諸如在雜交分子中使用者，諸如北方、南方、斑點等)或微孔、樣品管、凝膠、珠或纖維(或包含經結 合之核酸的任何固體支撐物)監測。參見美國專利第5,770,722號、第5,874,219號、第5,744,305號、第5,677,195號及第5,445,934號，其等藉由引用併入本文。TMPRSS6表現量級的測定亦可包含使用溶液中的核酸探針。
於一些態樣中，mRNA表現之量級係使用支鏈DNA(bDNA)檢定或實時PCR(qPCR)評估。此等方法之使用係揭示並例示於本文呈現之實施例中。於一些態樣中，表現量級係藉由實施例2中提供之方法使用10nM siRNA濃度在物種匹配細胞株中測定。
TMPRSS6蛋白表現之量級可使用本領域中已知用於測量蛋白質含量的任何方法測定。此類方法包括，舉例而言，電泳、毛細管電泳、高效液相層析(HPLC)、薄層層析(TLC)、超擴散層析、流體或凝膠沉澱素反應、吸收光譜、比色檢定、分光光度檢定、流式細胞分析技術、免疫擴散(單或雙)、免疫電泳、西方印漬、放射免疫檢定(RIA)、酶聯免疫吸附檢定(ELISAs)、免疫螢光檢定、電化學發光檢定等。
於一些態樣中，本發明之方法的功效係藉由TMPRSS6 mRNA或蛋白質含量之降低(例如，在肝臟生檢中)來評估。
於本發明之方法的一些態樣中，該iRNA係經投予至受試者，使得該iRNA經輸送至該受試者體內之特定位點。TMPRSS6之表現的抑制可使用源自來自受試者體內特定位點之體液或組織(例如，肝臟或血液)之樣品中TMPRSS6 mRNA或TMPRSS6蛋白之含量或含量變化的測量值來評估。
如本文中所用，術語偵檢或測定分析物之含量係理解為意指實施步驟以確定物質例如蛋白質、RNA是否存在。如本文所用，偵檢或測定包括對低於所使用之方法之檢出水準的分析物含量的偵檢或測定。
VII.本發明之預防及治療方法
本發明亦提供使用本發明之iRNA或含有本發明之iRNA的組成物來抑制TMPRSS6之表現，從而預防或治療TMPRSS6相關疾患，例如，與鐵過載相關之疾患及/或無效性紅血球生成之疾患的方法。於本發明之方法中，細胞可在活體內或活體外與siRNA接觸，亦即，細胞可處於受試者體內。
適用於使用本發明之方法治療的細胞可為表現TMPRSS6基因之任何細胞，例如，肝臟細胞。適用於本發明之方法中的細胞可為哺乳動物細胞，例如，靈長動物細胞(諸如人類細胞，包括嵌合非人類動物中的人類細胞，或非靈長動物細胞，例如，猴細胞或黑猩猩細胞)或非靈長動物細胞。於某些態樣中，該細胞為人類細胞，例如人類肝臟細胞。於本發明之方法中，TMPRSS6表現在該細胞中被抑制至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%，或被抑制到低於該檢定之檢出量級的量級。
本發明之活體內方法可包括向受試者投予含有iRNA之組成物，其中該iRNA包括與待向其投予該RNAi劑之哺乳動物之TMPRSS6基因之RNA轉錄物之至少一部分互補的核苷酸序列。該組成物可藉由該領域中已知之任意手段投予，該手段包括但不限於，口服、腹膜內或腸胃外途徑，包括顱內(例如，腦室內、腦實質內及鞘內)、靜脈內、肌肉內、皮下、透皮、氣管(氣溶膠)、鼻內、直腸內及外用(包括頰腔及舌下)投予。於某些態樣中，該組成物係藉由靜脈內輸注或注射投予。於某些態樣中，該組成物係藉由皮下注射投予。於某些態樣中，該組成物係藉由肌肉內注射投予。
一方面，本發明亦提供抑制TMPRSS6基因在哺乳動物中之表現的方法。該等方法包括向該哺乳動物投予包含靶向該哺乳動物體內細胞中之 TMPRSS6基因之dsRNA的組成物並且將哺乳動物維持足以獲得TMPRSS6基因之mRNA轉錄物之降解的時間，從而抑制該細胞內TMPRSS6基因之表現。基因表現之降低可藉由該領域中已知之任意方法及藉由本文中例如實施例2中揭示之方法例如qRT-PCR評估。蛋白質產生之降低可藉由該領域中已知之任意方法例如ELISA評估。於某些態樣中，穿刺肝臟生檢樣品充當組織材料用於監測TMPRSS6基因或蛋白質表現之降低。於其他態樣中，血液樣品充當受試者樣品用於監測TMPRSS6基因或蛋白質表現之降低。
本發明復提供治療有此需要之受試者擬定方法，該受試者為例如經診斷為患有TMPRSS6相關疾患之受試者，該疾患為例如與鐵過載相關之疾患及/或無效性紅血球生成之疾患，例如，遺傳性血鐵沉積症、β-地中海型貧血(例如，重度β-地中海型貧血及中度β-地中海型貧血)、真性紅血球增多症、骨髓化生不良症候群、先天性紅血球生成不良性貧血、丙酮酸鹽激酶缺乏、造紅血球性紫質沉著病、帕金森氏症、阿茲海默氏症及弗里德希氏共濟失調。於一個態樣中，患有TMPRSS6相關疾患之受試者患有遺傳性血鐵沉積症。於另一態樣中，患有TMPRSS6相關疾患之受試者患有β-地中海型貧血。於另一態樣中，患有TMPRSS6相關疾患之受試者患有真性紅血球增多症。
本發明復提供在有此需要之受試者中進行預防的方法。本發明之治療方法包括向受試者，例如將會受益於TMPRSS6表現降低的受試者，投予本發明之iRNA，其形式為預防有效量的靶向TMPRSS6基因之dsRNA或包含靶向TMPRSS6基因之dsRNA之醫藥組成物。
一方面，本發明提供治療患有將會受益於TMPRSS6表現降低之疾患之受試者的方法，該疾患為例如TMPRSS6相關疾病，諸如與鐵過載相關之疾患及 /或無效性紅血球生成之疾患，例如，遺傳性血鐵沉積症、β-地中海型貧血(例如，重度β-地中海型貧血及中度β-地中海型貧血)、真性紅血球增多症、骨髓化生不良症候群、先天性紅血球生成不良性貧血、丙酮酸鹽激酶缺乏、造紅血球性紫質沉著病、帕金森氏症、阿茲海默氏症及弗里德希氏共濟失調。對將會受益於TMPRSS6基因表現降低及/或抑制之受試者的治療包括治療性治療(例如，患者正具有升高之鐵含量)及預防性治療(例如，患者目前不具有升高之鐵含量或患者可能出於發展出升高之鐵含量的風險下)。
本發明之iRNA可作為「游離iRNA」投予。游離iRNA係在醫藥組成物不存在下投予。裸iRNA可處於合適之緩衝溶液中。該緩衝溶液可包含醋酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶榖蛋白、碳酸鹽、磷酸鹽或其任意組合。於一個態樣中，緩衝溶液為磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。含有iRNA之緩衝溶液之pH及滲透壓可經調節，使得其適用於向受試者投予。
替代性地，本發明之iRNA可作為醫藥組成物投予，例如作為dsRNA脂質體製劑投予。
將會受益於TMPRSS6基因表現之抑制的受試者為易患或經診斷為患有TMPRSS6相關疾患之受試者，該疾患諸如與鐵過載相關之疾患及/或無效性紅血球生成之疾患，例如，遺傳性血鐵沉積症、β-地中海型貧血(例如，重度β-地中海型貧血及中度β-地中海型貧血)、真性紅血球增多症、骨髓化生不良症候群、先天性紅血球生成不良性貧血、丙酮酸鹽激酶缺乏、造紅血球性紫質沉著病、帕金森氏症、阿茲海默氏症及弗里德希氏共濟失調。於一個態樣中，該方法包括投予本文提出之組成物，使得標靶TMPRSS6基因之表現減少，諸如對於 每個劑量，持續約1、2、3、4、5、6、1至6、1至3或3至6個月。於某些實施例中，該組成物係每3至6個月投予一次。
於一個態樣中，可用於本文提出之方法及組成物的iRNA特異性地靶向標靶TMPRSS6基因之RNA(原生或經處理的)。使用iRNA抑制此等基因之表現的組成物及方法可如本文中所揭示者製備及實施。
根據本發明之方法投予iRNA可導致TMPRSS6相關疾患的預防或治療，該疾患為例如與鐵過載相關之疾患及/或無效性紅血球生成之疾患，例如，遺傳性血鐵沉積症、β-地中海型貧血(例如，重度β-地中海型貧血及中度β-地中海型貧血)、真性紅血球增多症、骨髓化生不良症候群、先天性紅血球生成不良性貧血、丙酮酸鹽激酶缺乏、造紅血球性紫質沉著病、帕金森氏症、阿茲海默氏症及弗里德希氏共濟失調。可向受試者投予治療量之iRNA，諸如約0.01mg/kg至約200mg/kg。
於一個態樣中，該iRNA可經皮下投予，亦即，藉由皮下注射。於另一態樣中，該iRNA係經靜脈內投予，亦即，藉由靜脈注射。一次或多次注射可用來將所欲之劑量的iRNA輸送至受試者。該注射可在一段時間內重複實施。
該投予可定期重複實施。於某些態樣中，於初始之治療方案後，該治療之實施頻次可降低。重複劑量方案可包括規則地投予治療量之iRNA，如每個月一次至每年一次。於某些態樣中，該iRNA係以約每個月一次至約每三個月一次，或約每三個月一次之約每六個月一次投予。
本發明復提供iRNA劑或其醫藥組成物用於治療將會受益於TMPRSS6基因表現降低及/或抑制之受試者，例如，患有TMPRSS6相關疾病之 受試者的方法及用途，其係與其他藥品及/或其他治療方法合用，例如，與已知之藥品及/或已知之治療方法諸如舉例而言彼等當下用於治療此等病變者合用。
據此，在本發明之一些方面，包括本發明之任一單一iRNA劑的方法復包括向受試者投予一種或多種額外治療劑。
舉例而言，於某些態樣中，靶向TMPRSS6之iRNA係與例如可用於治療與鐵過載相關之疾病的劑組合投予。舉例而言，適用於治療將會受益於TMPRSS6表現降低之受試者，例如患有與鐵過載相關之疾患之受試者的額外劑可包括鐵螯合劑(例如，去鐵胺(desferoxamine))、葉酸、輸血、靜脈切開術、管理潰瘍之劑、增加胎兒血紅素含量之劑(例如，羥基脲)、控制感染之劑(例如，抗生素及抗病毒劑)、治療栓塞狀態之劑或幹細胞或骨髓移植。幹細胞移植可利用來自臍帶，諸如來自親屬例如同胞之幹細胞。示例性鐵螯合劑包括去鐵胺、地拉羅司易解鐵(Exjade)、去鐵酮、維生素E、小麥胚芽油、托可索侖(tocophersolan)及梨果仙人掌黃質(indicaxanthin)。
該iRNA劑及額外治療劑及/或治療可同時投予及/或在同一組合中投予，例如腸胃外投予，或該額外治療劑可作為獨立組成物之一部分或在獨立之時間及/或藉由該領域中已知或本文中揭示之另一方法投予。
VIII.套組
在某些方面，本公開提供套組，其等包括含有siRNA化合物例如雙股siRNA化合物或siRNA化合物(例如，前驅物，例如可經處理為siRNA化合物的較大siRNA化合物，或編碼siRNA化合物例如雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物之DNA，或其前驅物)之醫藥配製物的合適容器。
此類套組包括一種或多種dsRNA劑及使用說明，例如，關於投予預防或治療有效量之dsRNA劑的說明。該dsRNA劑可出於小瓶或預填充之注射器中。該等套組視需要復包含用於投予dsRNA劑之工具(例如，注射裝置，諸如預填充之注射器)或用於測量TMPRSS6之抑制的工具(例如，用於測量TMPRSS6 mRNA、TMPRSS6蛋白及/或TMPRSS6活性之抑制的工具)。此類用於量測TMPRSS6之抑制的工具可包含用於從受試者獲得樣品例如血漿樣品的元件。本發明之套組可視需要復包含用於確定治療有效或預防有效量的工具。
於某些態樣中，醫藥配製物之個別組分可提供在一個容器，例如，小瓶或預填充之注射器中。替代性地，將醫藥配製物之組分獨立地提供在兩個或更多個容器中可能係所欲者，例如，一個容器用於siRNA化合物製劑，且至少另一者用於載劑化合物。該套組可封裝為多種不同組態諸如單個盒子中的一個或多個容器。不溶組分可例如根據與套組一起提供的說明進行組合。該等組分可根據本文所揭示之方法進行組合，例如，以製備並投予醫藥組成物。套組亦可包括輸送裝置。
本發明藉由下列實施例進一步例示性說明，該等實施例不應視為限制。本申請案通篇所引述之全部參考文獻、專利及經公開之專利申請案的整體內容以及非正式序列表及圖式藉由引用併入本文。
實施例
實施例1.iRNA合成
試劑之來源
若本文中未具體給出試劑之來源，則測量試劑可從任何分子生物學用試劑供應商以用於分子生物學應用之品質/純度標準獲得。
siRNA設計
靶向人類跨膜絲胺酸蛋白酶6(TMPRSS6)基因(人類：NCBI refseqID NM_153609.4，NCBI GeneID：164656)之siRNA係使用客製R及Python腳本設計。人類NM_153609.4 REFSEQ mRNA具有3197個鹼基之長度。
未修飾之TMPRSS6基因正義及反義股核苷酸序列的詳細列述顯示在表2、4及6中。經修飾之TMPRSS6基因正義及反義股核苷酸序列的詳細列述顯示在表3、5及7中。
應理解，貫穿本申請案，不帶有十進位之雙鏈體名稱係等效於帶有十進位之雙鏈體名稱，其僅參考該雙鏈體之批號。舉例而言，AD-959917係等效於AD-959917.1。
siRNA合成
siRNA係使用本領域中已知之方法設計、合成及製備。
簡而言之，siRNA序列係以1μmol規格使用Mermade 192合成儀(BioAutomation)以磷醯亞胺化學法在固體支撐物合成。固體支撐物為加載有定制GalNAc配體(3'-GalNAc接合物)之可控孔徑玻璃(500至1000Å)、通用固體支撐物(AM Chemicals)或所關注之第一核苷酸。輔助合成試劑及標準2-氰基乙基磷醯亞胺單體(2'-去氧-2'-氟、2'-O-甲基、RNA、DNA)係獲自Thermo-Fisher(Milwaukee,WI)、Hongene(China)或Chemgenes(Wilmington,MA,USA)。額外磷醯亞胺單體係從供應商購得、內部製備或使用客製合成從各種CMO購得。磷醯亞胺係以100mM之濃度或在乙腈中或在9：1乙腈：DMF中製備且使用5-乙硫基-1H-四唑(ETT，0.25M，在乙腈中)以400s反應時間進行偶合。磷醯亞胺鏈結係使用3-((二甲基胺基-亞甲基)胺基)-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT，獲自 Chemgenes(Wilmington,MA,USA))在無水乙腈/吡啶(9：1 v/v)中之100mM溶液生成。氧化時間為5分鐘。全部序列皆經合成為最終去除DMT基團(「DMT-Off」)。
當固相合成完成時，固體製程之寡核糖核苷酸係用300μL之甲胺(40%水溶液)於室溫在96孔板中處理大約2小時以提供從固體支撐物裂解及全部額外鹼不穩定保護基團的後續去除。對於含有任何以第三丁基二甲基矽基(TBDMS)基團保護之天然核糖核苷酸鏈結(2'-OH)的序列，第二去保護步驟係使用TEA.3HF(三乙胺三鹽酸)實施。向甲胺水溶液中之各寡核苷酸添加200μL的二甲基亞碸(DMSO)及300μL TEA.3HF，並將溶液在60℃溫育大約30分鐘。在溫育之後，使板來至室溫並藉由添加1mL的9：1乙腈：乙醇或1：1乙醇：異丙醇使粗製寡核苷酸沉澱。隨後，將板在4℃離心45分鐘，並在多通道移液管的輔助下小心地傾析上清液。將寡核苷酸球丸重新懸浮於20mM NaOAc中並使用HiTrap歷經篩析管柱(5mL，GE Healthcare)在配備自動進樣器、UV偵檢器、電導度計及級分收集器的Agilent LC系統上進行後續脫鹽。經脫鹽之樣品係收集在96孔板中，隨後藉由LC-MS及UV光譜法進行分析以分別證實物質之身份並對其量進行定量。
單股之雙鏈體化係在Tecan液體處置機器人實施。正義及反義單股係在96孔板中在1x PBS中以等莫耳比率組合至最終濃度為10μM，將板密封，於100℃溫育10分鐘，然後使其歷經2至3小時之時間段緩慢回至室溫。各雙鏈體之濃度及身份得以確認並隨後用於活體外篩選檢定中。
實施例2.活體外篩選方法
細胞培養及384孔轉染
對於轉染，使Hep3b細胞(ATCC，Manassas,VA)在37℃於5% CO2氣氛中在補充有10% FBS(ATCC)的Eagle最低必需培養基(Eagle's Minimum Essential Medium)(Gibco)中生長至接近融合，之後藉由胰蛋白酶解作用從板中釋放。藉由在384孔板的個別孔中，將每孔7.5μl的Opti-MEM加0.1μl的Lipofectamine RNAiMax每孔(Invitrogen,Carlsbad CA.cat# 13778-150)添加到2.5μl的各siRNA雙鏈體中。隨後，於室溫將混合物溫育15分鐘。隨後，將含有~1.5x104個細胞的40μl的不含抗生素之完全生長培養基添加至siRNA混合物中。在RNA純化之前，將細胞溫育24小時。單次劑量實驗係以10nM、1nM及0.1nM最終雙鏈體濃度實施。
使用DYNABEADS mRNA單離套組(Invitrogen TM ，零件號：610-12)進行總RNA單離
細胞係於靜電搖動器上在含有3μL珠的每孔75μl的溶胞/結合緩衝液中溶胞並混合10分鐘。洗滌步驟在Biotek EL406使用磁性板支撐物自動進行。珠係在(以90μL)緩衝液A中洗滌一次，在緩衝液B中洗滌一次，並在緩衝液E中洗滌兩次，其間進行振搖步驟。在最後一次振搖之後，將完全之10μL RT混合物添加至各孔中，如下文所述。
使用ABI高容量cDNA逆轉錄套組(Applied Biosystems,Foster City,CA，Cat #4368813)進行cDNA合成
將1μl10X緩衝液、0.4μl 25X dNTP、1μl隨機引子、0.5μl逆轉錄酶、0.5μl RNase抑制劑及6.6μl之H2O的預混液每反應添加到每孔中。將板密封，在靜電搖動器上振搖10分鐘，隨後於37℃溫育2小時。這之後，將板於80℃振搖8分鐘。
實時PCR
在384孔板(Roche cat # 04887301001)中，將每孔兩微升(μl)之cDNA添加至含有0.5μl之人類GAPDH TaqMan探針(4326317E)、0.5μl人類TMPRSS6、2μl無核酸酶水及5μl Lightcycler480探針預混液的預混液(Roche Cat # 04887301001)中。實時PCR係於LightCycler480實時PCR系統(Roche)中進行。
為了計算相對倍數改變，使用△△Ct方法分析資料並將該資料歸一化至使用以10nM AD-1955轉染之細胞或虛擬轉染之細胞實施的檢定。IC50係使用4參數擬合模型使用XLFit計算，並歸一化至以AD-1955轉染或虛擬轉染之細胞。AD-1955之正義及反義序列為：正義cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT(SEQ ID NO：18)，且反義UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT(SEQ ID NO：19)。
表2、3、6及7中之藥劑在Hep3b細胞中之單次劑量篩選的結果顯示於表8中。
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Figure 111115644-A0202-12-0236-129
實施例3.dsRNA雙鏈體在非人類靈長動物(NHP)中的活體外功效
從上述活體外研究中鑒定的選定之目標雙鏈體係在非人類靈長動物中進行活體內評價。圖1提供研究設計之說明。
特別地，將15隻雄性食蟹獼猴分為5個組，每組3隻，並經皮下投予單次3mg/kg劑量之AD-1556360、單次10mg/kg劑量之AD-1556360、單次3mg/kg劑量之AD-1571158或單次3mg/kg劑量之AD-1571033，或者作為對照之PBS(參見表9)。對於各動物，在第22天、第57天及/或第85天，在禁食12小時後，收集兩個各約100mg之肝臟生檢樣品(每葉一個)。亦在給藥前21天從動物收集肝臟生檢及血清樣品。每週在第1天將1mL血液收集在不具抗凝劑之試管中，以供鐵調素含量、鐵含量、運鐵蛋白飽和度及紅血球(RBC)計數測定。凝結後，將血清分為等量小樣並在-80℃儲存。
藉由RT-QPCR方法提取組織mRNA並分析之。將TMPRSS6mRNA含量與持家基因GAPDH之含量比較。隨後將該等值歸一化至PBS媒介物對照組之平均值。資料係表示為相對於基線值之百分比，並呈現為均值加標準偏差。
使用可自羅氏公司(Roche)商購之套組測定鐵含量及運鐵蛋白飽和度。
顯示於圖2至圖4中之結果表明，全部三種示例性雙鏈體，亦即AD-1556360、AD-1571158及AD-1571033，皆在活體內強效地且持久地抑制TMPRSS6信使RNA之表現(圖2)，皆強效地且持久地降低血漿鐵含量(圖3)，且皆強效地且持久地降低運鐵蛋白飽和量級(圖4)。運鐵蛋白飽和係結合至血清運鐵蛋白之鐵之量的量度，且對應於血清鐵與總鐵結合能力之比率。
Figure 111115644-A0202-12-0237-130
等效物
彼等熟悉本領域者將知悉或能夠使用不超過常規實驗查明等效於本文所揭之具體態樣及方法的多種等效物。此類等效物旨在為以下申請專利範圍之範疇所涵蓋。

Claims (135)

  1. 一種抑制跨膜絲胺酸蛋白酶6(TMPRSS6)在細胞內之表現的雙股核糖核酸(dsRNA)劑跨膜絲胺酸蛋白酶6，其中該dsRNA劑包含形成雙股區域之正義股及反義股，其中該反義股包含與編碼TMPRSS6之mRNA互補的區域，以及其中該互補的區域包含與表2至7中任一者中之任一反義核苷酸序列相異不超過3個核苷酸的至少15個連續核苷酸。
  2. 如請求項1所述之dsRNA劑，其中該dsRNA劑包括包含與表2至7中任一者中之任一正義股核苷酸序列相異不超過三個核苷酸的至少15個連續核苷酸之正義股，以及包含與表2至7中任一者中之任一反義股核苷酸序列相異不超過三個核苷酸的至少15個連續核苷酸之反義股。
  3. 如請求項1所述之dsRNA劑，其中該dsRNA劑包括包含與表2至7中任一者中之任一正義股核苷酸序列相異不超過兩個核苷酸的至少15個連續核苷酸之正義股，以及包含與表2至7中任一者中之任一反義股核苷酸序列相異不超過兩個核苷酸的至少15個連續核苷酸之反義股。
  4. 如請求項1所述之dsRNA劑，其中該dsRNA劑包括包含與表2至7中任一者中之任一正義股核苷酸序列相異不超過一個核苷酸的至少15個連續核苷酸之正義股，以及包含與表2至7中任一者中之任一反義股核苷酸序列相異不超過一個核苷酸的至少15個連續核苷酸之反義股。
  5. 如請求項1所述之dsRNA劑，其中該dsRNA劑包括包含選自由表2至7中任一者中之任一正義股核苷酸序列所組成之群組的核苷酸序列之正義股，以及包含選自由表2至7中任一者中之任一反義股核苷酸序列所組成之群組的核苷酸序列之反義股。
  6. 一種抑制跨膜絲胺酸蛋白酶6(TMPRSS6)在細胞中之表現的雙股核糖核酸(dsRNA)劑跨膜絲胺酸蛋白酶6，其中該dsRNA劑包含形成雙股區域之正義股及反義股，其中該正義股包含與SEQ ID NO：1之核苷酸187至210、227至254、322至363、362至390、398至420、404至429、410至435、439至461、443至467、448至474、460至483、466至488、496至519、519至542、526至548、557至593、641至671、652至676、687至713、725至762、757至794、886至908、921至951、956至987、1051至1082、1233至1269、1279至1313、1313至1341、1327至1351、1415至1439、1447至1480、1464至1486、1486至1509、1559至1589、1571至1595、1579至1609、1707至1735、1738至1764、1806至1828、1864至1886、1934至1966、1967至1991、2008至2031、2015至2043、2042至2072、2287至2311、2297至2354、2336至2361、2360至2384、2416至2438、2481至2510、2496至2527、2526至2558、2665至2693、2693至2719、2707至2729、2799至2821、2851至2874、2971至2999、2981至3006及3155至3195的核苷酸序列中之任一者相異不超過三個核苷酸的至少15個連續核苷酸，並且該反義股包含來自SEQ ID NO：2之相對應核苷酸序列的至少15個連續核苷酸。
  7. 一種抑制跨膜絲胺酸蛋白酶6(TMPRSS6)在細胞中之表現的雙股核糖核酸(dsRNA)劑跨膜絲胺酸蛋白酶6，其中該dsRNA劑包含形成雙股區域之正義股及反義股，其中該正義股包含與SEQ ID NO：1之核苷酸230至252、324至346、560至578、560至582、2338至2360、3163至3185、3169至3191及3172至3194的核苷酸序列中之任一者相異不超過三個核苷酸的至少15個連 續核苷酸，並且該反義股包含來自SEQ ID NO：2之相對應核苷酸序列的至少15個連續核苷酸。
  8. 一種抑制跨膜絲胺酸蛋白酶6(TMPRSS6)在細胞中之表現的雙股核糖核酸(dsRNA)劑跨膜絲胺酸蛋白酶6，其中該dsRNA劑包含形成雙股區域之正義股及反義股，其中該正義股包含與SEQ ID NO：1之核苷酸560至578、2338至2360及3169至3191的核苷酸序列中之任一者相異不超過三個核苷酸的至少15個連續核苷酸，並且該反義股包含來自SEQ ID NO：2之相對應核苷酸序列的至少15個連續核苷酸。
  9. 如請求項1至8中任一項所述之dsRNA劑，其中該反義股包含與選自由AD-1556360、AD-1571158、AD-1571033、AD-1554875、AD-1571160、AD-1555117、AD-1554911及AD-1556915所組成之群組的雙鏈體之反義股核苷酸序列中之任一者相異不超過三個核苷酸的至少15個連續核苷酸。
  10. 如請求項1至9中任一項所述之dsRNA劑，其中該反義股包含與選自由AD-1556360、AD-1571158及AD-1571033所組成之群組的雙鏈體之反義股核苷酸序列中之任一者相異不超過三個核苷酸的至少15個連續核苷酸。
  11. 如請求項1至10中任一項所述之dsRNA劑，其中該dsRNA劑包含至少一個經修飾之核苷酸。
  12. 如請求項1至11中任一項所述之dsRNA劑，其中該正義股之實質上全部核苷酸；該反義股之實質上全部核苷酸包含修飾；或該正義股之實質上全部核苷酸及該反義股之實質上全部核苷酸包含修飾。
  13. 如請求項1至12中任一項所述之dsRNA劑，其中該正義股之全部核苷酸包含修飾；該反義股之全部核苷酸包含修飾；或該正義股之全部核苷酸及該反義股之全部核苷酸包含修飾。
  14. 如請求項11至13中任一項所述之dsRNA劑，其中該經修飾之核苷酸之至少一者係選自由去氧核苷酸、3'-端去氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修飾之核苷酸、2'-氟修飾之核苷酸、2'-去氧修飾之核苷酸、2'-5'-連接至核糖核苷酸(3'-RNA)、鎖定之核苷酸、未鎖定之核苷酸、構形限定之核苷酸、約束之乙基核苷酸、無鹼基之核苷酸、2'-胺基修飾之核苷酸、2'-O-烯丙基修飾之核苷酸、2'-C-烷基修飾之核苷酸、2'-甲氧基乙基修飾之核苷酸、2'-O-烷基修飾之核苷酸、N-嗎啉基核苷酸、胺基磷酸酯、包含非天然鹼基之核苷酸、四氫呋喃修飾之核苷酸、1,5-失水己糖醇修飾之核苷酸、環己烯基修飾之核苷酸、包含5'-硫代磷酸酯基團之核苷酸、包含5'-甲基膦酸酯基團之核苷酸、包含5'-磷酸酯或5'-磷酸酯模擬物之核苷酸、包含乙烯基磷酸酯之核苷酸、二醇核酸(GNA)、二醇核酸S-異構物(S-GNA)、包含2-羥甲基-四氫呋喃-5-磷酸酯之核苷酸、包含2'-去氧胸苷-3'-磷酸酯之核苷酸、包含2'-去氧鳥苷-3'-磷酸酯之核苷酸及連接至膽固醇基衍生物及十二烷酸雙癸基醯胺基團之端核苷酸；及其組合所組成之群組。
  15. 如請求項11至13中任一項所述之dsRNA劑，其中該核苷酸上之修飾係選自由LNA、HNA、CeNA、2'-甲氧基乙基、2'-O-烷基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-氟、2'-去氧、2'-羥基及二醇；及其組合所組成之群組。
  16. 如請求項11至13中任一項所述之dsRNA劑，其中該經修飾之核苷酸之至少一者係選自由去氧-核苷酸、2'-O-甲基修飾之核苷酸、2'-氟修飾 之核苷酸、2'-去氧-修飾之核苷酸、二醇修飾之核苷酸(GNA)、包含2'-磷酸酯之核苷酸及乙烯基-磷酸酯核苷酸；及其組合所組成之群組。
  17. 如請求項1至16中任一項所述之dsRNA劑，其中該雙股區域為19至30個核苷酸對之長度。
  18. 如請求項17所述之dsRNA劑，其中該雙股區域為19至25個核苷酸對之長度。
  19. 如請求項17所述之dsRNA劑，其中該雙股區域為19至23個核苷酸對之長度。
  20. 如請求項17所述之dsRNA劑，其中該雙股區域為23至27個核苷酸對之長度。
  21. 如請求項17所述之dsRNA劑，其中該雙股區域為21至23個核苷酸對之長度。
  22. 如請求項1至21中任一項所述之dsRNA劑，其中各股獨立地為不超過30個核苷酸之長度。
  23. 如請求項1至22中任一項所述之dsRNA劑，其中該正義股為21個核苷酸之長度，且該反義股為不23個核苷酸之長度。
  24. 如請求項1至23中任一項所述之dsRNA劑，其中該互補的區域為至少17個核苷酸之長度。
  25. 如請求項1至24中任一項所述之dsRNA劑，其中該互補的區域為19與23個核苷酸之間的長度。
  26. 如請求項1至25中任一項所述之dsRNA劑，其中該互補的區域為19個核苷酸之長度。
  27. 如請求項1至26中任一項所述之dsRNA劑，其中至少一股包含至少1個核苷酸的3'突出。
  28. 如請求項1至26中任一項所述之dsRNA劑，其中至少一股包含至少2個核苷酸的3'突出。
  29. 如請求項1至28中任一項所述之dsRNA劑，其復包含配體。
  30. 如請求項29所述之dsRNA劑，其中該配體係接合至該dsRNA劑之正義股的3'末端。
  31. 如請求項29所述之dsRNA劑，其中該配體係接合至該dsRNA劑之正義股的5'末端。
  32. 如請求項29至31中任一項所述之dsRNA劑，其中該配體為N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)衍生物。
  33. 如請求項29至32中任一項所述之dsRNA劑，其中該配體為透過單價、二價或三價分支鏈連接子接附的一個或多個GalNAc衍生物。
  34. 如請求項32或33所述之dsRNA劑，其中該配體為
    Figure 111115644-A0202-13-0006-131
  35. 如請求項34所述之dsRNA劑，其中該dsRNA劑係如下述方案所示接合至配體
    Figure 111115644-A0202-13-0007-132
    以及，其中X為O或S。
  36. 如請求項35所述之dsRNA劑，其中X為O。
  37. 如請求項34所述之dsRNA劑，其中該dsRNA劑係如下述方案所示接合至配體
    Figure 111115644-A0202-13-0007-133
  38. 如請求項1至37中任一項所述之dsRNA劑，其中該dsRNA劑復包含至少一個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結。
  39. 如請求項38所述之dsRNA劑，其中該硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結係位於一股之3'-端。
  40. 如請求項39所述之dsRNA劑，其中該股為該反義股。
  41. 如請求項39所述之dsRNA劑，其中該股為該正義股。
  42. 如請求項39所述之dsRNA劑，其中該硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結係位於一股之5'-端。
  43. 如請求項42所述之dsRNA劑，其中該股為該反義股。
  44. 如請求項42所述之dsRNA劑，其中該股為該正義股。
  45. 如請求項38所述之dsRNA劑，其中該硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結係位於一股之5'-端及3'-端兩處。
  46. 如請求項45所述之dsRNA劑，其中該股為該反義股。
  47. 如請求項1至46中任一項所述之dsRNA劑，其包含6至8個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結。
  48. 如請求項1至47中任一項所述之dsRNA劑，其中位於該雙鏈體之反義股之5'-末端位置1的鹼基對為AU鹼基對。
  49. 如請求項1至48中任一項所述之dsRNA劑，其中該正義股包含與5'-GACGCCACGCAUGCUGUGUGU-3'(SEQ ID NO：119)之核苷酸序列相異不超過3個核苷酸的至少17個連續核苷酸。
  50. 如請求項1至49中任一項所述之dsRNA劑，其中該正義股包含與5'-GACGCCACGCAUGCUGUGUGU-3'(SEQ ID NO：119)之核苷酸序列相異不超過3個核苷酸的至少19個連續核苷酸。
  51. 如請求項1至50中任一項所述之dsRNA劑，其中該正義股包含5'-GACGCCACGCAUGCUGUGUGU-3'(SEQ ID NO：119)之核苷酸序列。
  52. 如請求項1至51中任一項所述之dsRNA劑，其中該正義股由5'-GACGCCACGCAUGCUGUGUGU-3'(SEQ ID NO：119)之核苷酸序列組成。
  53. 如請求項1至52中任一項所述之dsRNA劑，其中該反義股包含與5'-ACACACAGCAUGCGUGGCGUCAC-3'(SEQ ID NO：245)之核苷酸序列相異不超過3個核苷酸的至少17個連續核苷酸。
  54. 如請求項1至53中任一項所述之dsRNA劑，其中該反義股包含與5'-ACACACAGCAUGCGUGGCGUCAC-3'(SEQ ID NO：245)之核苷酸序列相異不超過3個核苷酸的至少19個連續核苷酸。
  55. 如請求項1至54中任一項所述之dsRNA劑，其中該反義股包含與5'-ACACACAGCAUGCGUGGCGUCAC-3'(SEQ ID NO：245)之核苷酸序列相異不超過3個核苷酸的至少21個連續核苷酸。
  56. 如請求項1至55中任一項所述之dsRNA劑，其中該反義股包含5'-ACACACAGCAUGCGUGGCGUCAC-3'(SEQ ID NO：245)之核苷酸序列。
  57. 如請求項1至56中任一項所述之dsRNA劑，其中該反義股由5'-ACACACAGCAUGCGUGGCGUCAC-3'(SEQ ID NO：245)之核苷酸序列組成。
  58. 如請求項1至57中任一項所述之dsRNA劑，其中該正義股包含5'-GACGCCACGCAUGCUGUGUGU-3'(SEQ ID NO：119)之核苷酸序列，且該反義股包含5'-ACACACAGCAUGCGUGGCGUCAC-3'(SEQ ID NO：245)之核苷酸序列。
  59. 如請求項1至58中任一項所述之dsRNA劑，其中該正義股與5'-gsascgccacGfCfAfugcugugugu-3'(SEQ ID NO：371)之核苷酸序列相異不超過3個經修飾之核苷酸，其中a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；且s為硫代磷酸酯類鏈結。
  60. 如請求項1至59中任一項所述之dsRNA劑，其中該反義股與5'-asdCsacdAcdAgcaudGcGfuggcgucsasc-3'(SEQ ID NO：497)之核苷酸序列相異不超過3個經修飾之核苷酸，其中a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；其中dA、dG及dC分別為2`-去氧腺苷-3`-磷酸酯、2`-去氧鳥苷-3`-磷酸酯及2`-去氧胞苷-3`-磷酸酯；且s為硫代磷酸酯類鏈結。
  61. 如請求項1至60中任一項所述之dsRNA劑，其中該正義股包含5'-gsascgccacGfCfAfugcugugugu-3'(SEQ ID NO：371)之核苷酸序列，且該反義股包含5'-asdCsacdAcdAgcaudGcGfuggcgucsasc-3'(SEQ ID NO：497)之核苷酸序列，其中a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；其中dA、dG及dC分別為2`-去氧腺苷-3`-磷酸酯、2`-去氧鳥苷-3`-磷酸酯及2`-去氧胞苷-3`-磷酸酯；且s為硫代磷酸酯類鏈結。
  62. 如請求項1至61中任一項所述之dsRNA劑，其中該正義股包含5'-gsascgccacGfCfAfugcuguguguL96-3'(SEQ ID NO：371)之核苷酸序列，且該反義股包含5'-asdCsacdAcdAgcaudGcGfuggcgucsasc-3'(SEQ ID NO：497)之核苷酸序列，其中a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；其中dA、dG及dC分別為2`-去氧腺苷-3`-磷酸酯、2`-去氧鳥苷-3`-磷酸酯及2`-去氧胞苷-3`-磷酸酯；s為硫代磷酸酯類鏈結；且L96為N-[參(GalNAc-烷基)-醯胺基癸醯基)]-4-羥基脯胺醇。
  63. 如請求項1至61中任一項所述之dsRNA劑，其中該正義股包含5'-gsascgccacGfCfAfugcugugugu-3'(SEQ ID NO：371)之核苷酸序列，且該反義股包含5'-asdCsacdAcdAgcaudGcGfuggcgucsasc-3'(SEQ ID NO：497)之核苷酸序 列，其中a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；其中dA、dG及dC分別為2`-去氧腺苷-3`-磷酸酯、2`-去氧鳥苷-3`-磷酸酯及2`-去氧胞苷-3`-磷酸酯；且s為硫代磷酸酯類鏈結，其中該正義股之3'-末端係如下方案所示接合至配體：
    Figure 111115644-A0202-13-0011-134
    以及，其中X為O。
  64. 如請求項1至48中任一項所述之dsRNA劑，其中該正義股包含與5'-CCUUUGGAAUAAAGCUGCCUU-3'(SEQ ID NO：844)之核苷酸序列相異不超過3個核苷酸的至少17個連續核苷酸。
  65. 如請求項1至48及64中任一項所述之dsRNA劑，其中該正義股包含與5'-CCUUUGGAAUAAAGCUGCCUU-3'(SEQ ID NO：844)之核苷酸序列相異不超過3個核苷酸的至少19個連續核苷酸。
  66. 如請求項1至48、64及65中任一項所述之dsRNA劑，其中該正義股包含5'-CCUUUGGAAUAAAGCUGCCUU-3'(SEQ ID NO：844)之核苷酸序列。
  67. 如請求項1至48及64至66中任一項所述之dsRNA劑，其中該正義股由5'-CCUUUGGAAUAAAGCUGCCUU-3'(SEQ ID NO：844)之核苷酸序列組成。
  68. 如請求項1至48及64至67中任一項所述之dsRNA劑，其中該反義股包含與5'-AAGGCAGCUUUAUUCCAAAGGGC-3'(SEQ ID NO：1868)之核苷酸序列相異不超過3個核苷酸的至少17個連續核苷酸。
  69. 如請求項1至48及64至68中任一項所述之dsRNA劑，其中該反義股包含與5'-AAGGCAGCUUUAUUCCAAAGGGC-3'(SEQ ID NO：1868)之核苷酸序列相異不超過3個核苷酸的至少19個連續核苷酸。
  70. 如請求項1至48及64至69中任一項所述之dsRNA劑，其中該反義股包含與5'-AAGGCAGCUUUAUUCCAAAGGGC-3'(SEQ ID NO：1868)之核苷酸序列相異不超過3個核苷酸的至少21個連續核苷酸。
  71. 如請求項1至48及64至70中任一項所述之dsRNA劑，其中該反義股包含5'-AAGGCAGCUUUAUUCCAAAGGGC-3'(SEQ ID NO：1868)之核苷酸序列。
  72. 如請求項1至48及64至71中任一項所述之dsRNA劑，其中該反義股由5'-AAGGCAGCUUUAUUCCAAAGGGC-3'(SEQ ID NO：1868)之核苷酸序列組成。
  73. 如請求項1至48及64至72中任一項所述之dsRNA劑，其中該正義股包含5'-CCUUUGGAAUAAAGCUGCCUU-3'(SEQ ID NO：844)之核苷酸序列，且該反義股包含5'-AAGGCAGCUUUAUUCCAAAGGGC-3'(SEQ ID NO：1868)之核苷酸序列。
  74. 如請求項1至48及64至73中任一項所述之dsRNA劑，其中該正義股與5'-cscsuuugGfaAfUfAfaagcugccuu-3'(SEQ ID NO：2095)之核苷酸序列相異不超過3個經修飾之核苷酸，其中a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；且s為硫代磷酸酯類鏈結。
  75. 如請求項1至48及64至74中任一項所述之dsRNA劑，其中該反義股與5'-asAfsggdCa(G2p)cuuuauUfcCfaaaggsgsc-3'(SEQ ID NO：2324)之核苷酸序列相異不超過3個經修飾之核苷酸，其中a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；其中G2p為鳥苷-2'-磷酸酯；且s為硫代磷酸酯類鏈結。
  76. 如請求項1至48及64至75中任一項所述之dsRNA劑，其中該正義股包含5'-cscsuuugGfaAfUfAfaagcugccuu-3'(SEQ ID NO：2095)之核苷酸序列，且該反義股包含5'-asAfsggdCa(G2p)cuuuauUfcCfaaaggsgsc-3'(SEQ ID NO：2324)之核苷酸序列，其中a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；其中G2p為鳥苷-2'-磷酸酯；且s為硫代磷酸酯類鏈結。
  77. 如請求項1至48及64至76中任一項所述之dsRNA劑，其中該正義股包含5'-cscsuuugGfaAfUfAfaagcugccuuL96-3'(SEQ ID NO：2095)之核苷酸序列，且該反義股包含5'-asAfsggdCa(G2p)cuuuauUfcCfaaaggsgsc-3'(SEQ ID NO：2324)之核苷酸序列，其中a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；其中G2p為鳥苷-2'-磷 酸酯；s為硫代磷酸酯類鏈結；且L96為N-[參(GalNAc-烷基)-醯胺基癸醯基)]-4-羥基脯胺醇。
  78. 如請求項1至48及64至76中任一項所述之dsRNA劑，其中該正義股包含5'-cscsuuugGfaAfUfAfaagcugccuu-3'(SEQ ID NO：2095)之核苷酸序列，且該反義股包含5'-asAfsggdCa(G2p)cuuuauUfcCfaaaggsgsc-3'(SEQ ID NO：2324)之核苷酸序列，其中a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；其中G2p為鳥苷-2'-磷酸酯；s為硫代磷酸酯類鏈結；並且其中該正義股之3'-末端係如下方案所示接合至配體：
    Figure 111115644-A0202-13-0014-135
    以及，其中X為O。
  79. 如請求項1至48中任一項所述之dsRNA劑，其中該正義股包含與5'-UCACCUGCUUCUUCUGGUU-3'(SEQ ID NO：1686)之核苷酸序列相異不超過3個核苷酸的至少17個連續核苷酸。
  80. 如請求項1至48及79中任一項所述之dsRNA劑，其中該正義股包含5'-UCACCUGCUUCUUCUGGUU-3'(SEQ ID NO：1686)之核苷酸序列。
  81. 如請求項1至48、79及80中任一項所述之dsRNA劑，其中該正義股由5'-UCACCUGCUUCUUCUGGUU-3'(SEQ ID NO：1686)之核苷酸序列組成。
  82. 如請求項1至48及79至81中任一項所述之dsRNA劑，其中該反義股包含與5'-AACCAGAAGAAGCAGGUGA-3'(SEQ ID NO：1790)之核苷酸序列相異不超過3個核苷酸的至少17個連續核苷酸。
  83. 如請求項1至48及79至82中任一項所述之dsRNA劑，其中該反義股包含5'-AACCAGAAGAAGCAGGUGA-3'(SEQ ID NO：1790)之核苷酸序列。
  84. 如請求項1至48及79至83中任一項所述之dsRNA劑，其中該反義股由5'-AACCAGAAGAAGCAGGUGA-3'(SEQ ID NO：1790)之核苷酸序列組成。
  85. 如請求項1至48及79至84中任一項所述之dsRNA劑，其中該正義股包含5'-UCACCUGCUUCUUCUGGUU-3'(SEQ ID NO：1686)之核苷酸序列，且該反義股包含5'-AACCAGAAGAAGCAGGUGA-3'(SEQ ID NO：1790)之核苷酸序列。
  86. 如請求項1至48及79至85中任一項所述之dsRNA劑，其中該正義股與5'-UfcAfcCfuGfcUfuCfuUfcUfgGfsusUf-3'(SEQ ID NO：1974)之核苷酸序列相異不超過3個經修飾之核苷酸，其中a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；且s為硫代磷酸酯類鏈結。
  87. 如請求項1至48及79至86中任一項所述之dsRNA劑，其中該反義股與5'-asAfscCfaGfaAfgAfaGfcAfgGfusGfsa-3'(SEQ ID NO：2203)之核苷酸序列相異不超過3個經修飾之核苷酸，其中a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；且s為硫代磷酸酯類鏈結。
  88. 如請求項1至48及79至87中任一項所述之dsRNA劑，其中該正義股包含5'-UfcAfcCfuGfcUfuCfuUfcUfgGfsusUf-3'(SEQ ID NO：1974)之核苷酸序列，且該反義股包含5'-asAfscCfaGfaAfgAfaGfcAfgGfusGfsa-3'(SEQ ID NO：2203)之核苷酸序列，其中a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；且s為硫代磷酸酯類鏈結。
  89. 如請求項1至48及79至88中任一項所述之dsRNA劑，其中該正義股包含5'-Q191sUfcAfcCfuGfcUfuCfuUfcUfgGfsusUf-3'(SEQ ID NO：1974)之核苷酸序列，且該反義股包含5'-asAfscCfaGfaAfgAfaGfcAfgGfusGfsa-3'(SEQ ID NO：2203)之核苷酸序列，其中a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；s為硫代磷酸酯類鏈結；且Q191為N-[參(GalNAc-烷基)-醯胺基十二烷醯基]-(S)-吡咯啶-3-醇-硫代磷酸酯(p-C12-(GalNAc-烷基)3)。
  90. 如請求項1至48及79至88中任一項所述之dsRNA劑，其中該正義股包含5'-UfcAfcCfuGfcUfuCfuUfcUfgGfsusUf-3'(SEQ ID NO：1974)之核苷酸序列，且該反義股包含5'-asAfscCfaGfaAfgAfaGfcAfgGfusGfsa-3'(SEQ ID NO：2203)之核苷酸序列，其中a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C 及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；且s為硫代磷酸酯類鏈結；其中該正義股之5'-末端係如下方案所示接合至配體：
    Figure 111115644-A0202-13-0017-137
  91. 一種細胞，含有如請求項1至90中任一項所述之dsRNA劑。
  92. 一種抑制編碼跨膜絲胺酸蛋白酶6(TMPRSS6)基因之表現的醫藥組成物，包含如請求項1至90中任一項所述之dsRNA劑。
  93. 如請求項92所述之醫藥組成物，其中該dsRNA劑係於非緩衝溶液中。
  94. 如請求項93所述之醫藥組成物，其中該非緩衝溶液為鹽水或水。
  95. 如請求項92所述之醫藥組成物，其中該dsRNA劑係於緩衝溶液中。
  96. 如請求項95所述之藥物組成物，其中該緩衝溶液包含醋酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶榖蛋白、碳酸鹽、磷酸鹽或其任意組合。
  97. 如請求項96所述之藥物組成物，其中該緩衝溶液為磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。
  98. 一種抑制跨膜絲胺酸蛋白酶6(TMPRSS6)基因在細胞中之表現的方法，該方法包含令該細胞接觸如請求項1至90中任一項所述之dsRNA 劑或者如請求項92至97中任一項所述之醫藥組成物，從而抑制TMPRSS6基因在細胞中之表現。
  99. 如請求項98所述之方法，其中該細胞係在受試者內。
  100. 如請求項98所述之方法，其中該受試者為人類。
  101. 如請求項98或100所述之方法，其中該受試者具有TMPRSS6相關疾患。
  102. 如請求項101所述之方法，其中該TMPRSS6相關疾患為與鐵過載相關之疾患及/或無效性紅血球生成之疾患。
  103. 如請求項101所述之方法，其中該TMPRSS6相關疾患係選自由下列所組成之群組：遺傳性血鐵沉積症、β-地中海型貧血、真性紅血球增多症、骨髓化生不良症候群、先天性紅血球生成不良性貧血、丙酮酸鹽激酶缺乏、造紅血球性紫質沉著病、帕金森氏症、阿茲海默氏症及弗里德希氏共濟失調。
  104. 如請求項101所述之方法，其中該TMPRSS6相關疾患為β-地中海型貧血。
  105. 如請求項104所述之方法，其中該β-地中海型貧血為重度地中海型貧血。
  106. 如請求項104所述之方法，其中該β-地中海型貧血為中度地中海型貧血。
  107. 如請求項101所述之方法，其中該TMPRSS6相關疾患為真性紅血球增多症。
  108. 如請求項98至107中任一項所述之方法，其中令該細胞接觸該dsRNA劑抑制TMPRSS6之表現至少50%、60%、70%、80%、90%或95%。
  109. 如請求項98至108中任一項所述之方法，其中抑制TMPRSS6之表現減少該受試者血清中之TMPRSS6蛋白含量至少50%、60%、70%、80%、90%或95%。
  110. 如請求項98至109中任一項所述之方法，其中令該細胞接觸該dsRNA劑接觸增加鐵調素之表現至少50%、60%、70%、80%、90%或95%。
  111. 如請求項98至110中任一項所述之方法，其中增加鐵調素之表現增加該受試者血清中之鐵調素蛋白含量至少50%、60%、70%、80%、90%或95%。
  112. 一種治療患有受益於跨膜絲胺酸蛋白酶6(TMPRSS6)表現降低之疾患之受試者的方法，其包含向該受試者投予治療有效量的如請求項1至48中任一項所述之dsRNA劑或如請求項50至55中任一項所述之醫藥組成物，從而治療該患有受益於TMPRSS6表現降低之疾患之受試者。
  113. 一種預防患有受益於跨膜絲胺酸蛋白酶6(TMPRSS6)表現降低之疾患之受試者中的至少一種症狀的方法，其包含向該受試者投予預防有效量的如請求項1至48中任一項所述之dsRNA劑或如請求項50至55中任一項所述之醫藥組成物，從而預防該患有受益於TMPRSS6表現降低之疾患之受試者中的至少一種症狀。
  114. 如請求項112或113所述之方法，其中該疾患為TMPRSS6相關疾患。
  115. 如請求項114所述之方法，其中該TMPRSS6相關疾患為與鐵過載相關之疾患及/或無效性紅血球生成之疾患。
  116. 如請求項115所述之方法，其中該TMPRSS6相關疾患係選自由遺傳性血鐵沉積症、β-地中海型貧血、真性紅血球增多症、骨髓化生不良症候群、先天性紅血球生成不良性貧血、丙酮酸鹽激酶缺乏、造紅血球性紫質沉著病、帕金森氏症、阿茲海默氏症及弗里德希氏共濟失調所組成之群組。
  117. 如請求項114所述之方法，其中該TMPRSS6相關疾患為β-地中海型貧血。
  118. 如請求項117所述之方法，其中該β-地中海型貧血為重度地中海型貧血。
  119. 如請求項117所述之方法，其中該β-地中海型貧血為中度地中海型貧血。
  120. 如請求項114所述之方法，其中該TMPRSS6相關疾患為真性紅血球增多症。
  121. 如請求項112至120中任一項所述之方法，其中該受試者為人類。
  122. 如請求項112至121中任一項所述之方法，其中向該受試者投予該劑引起鐵含量減少、鐵蛋白含量減少、運鐵蛋白飽和度減少、血紅素含量增加、血容比量級增加及/或TMPRSS6蛋白蓄積減少。
  123. 如請求項112至122中任一項所述之方法，其中該dsRNA劑係以約0.01mg/kg至約50mg/kg之劑量投予該受試者。
  124. 如請求項112至123中任一項所述之方法，其中該dsRNA劑係皮下投予該受試者。
  125. 如請求項112至123中任一項所述之方法，其中該dsRNA劑係靜脈內投予該受試者。
  126. 如請求項112至125中任一項所述之方法，復包含測定來自該受試者之樣品中的TMPRSS6含量。
  127. 如請求項126所述之方法，其中該受試者樣品中的TMPRSS6含量為血液、血清或肝臟樣品中的TMPRSS6蛋白含量。
  128. 如請求項112至127中任一項所述之方法，復包含測定來自該受試者之樣品中的鐵及/或鐵調素之含量。
  129. 如請求項112至128中任一項所述之方法，復包含投予該受試者用於治療TMPRSS6相關疾患的額外治療劑。
  130. 如請求項129所述之方法，其中該額外治療劑為鐵螯合劑。
  131. 如請求項130所述之方法，其中該鐵螯合劑係選自由去鐵酮、去鐵胺及地拉羅司。
  132. 一種套組，包含如請求項1至90中任一項所述之dsRNA劑或如請求項92至97中任一項所述之醫藥組成物。
  133. 一種小瓶，包含如請求項1至90中任一項所述之dsRNA劑或如請求項92至97中任一項所述之醫藥組成物。
  134. 一種注射器，包含如請求項1至90中任一項所述之dsRNA劑或如請求項92至97中任一項所述之醫藥組成物。
  135. 一種RNA誘導型沉默複合物(RISC)，包含如請求項1至90中任一項所述之dsRNA劑之反義股。
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