CN115176007A - 含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)iRNA组合物及其使用方法 - Google Patents

含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)iRNA组合物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及靶向含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)基因的RNAi剂，例如双链RNA(dsRNA)剂。本发明还涉及使用此种RNAi剂以抑制PNPLA3基因表达的方法，以及预防和治疗PNPLA3相关病症的方法，例如非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。

Description

含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)iRNA组合物及其使用 方法
相关申请
本申请主张享有于2019年12月16日提交的美国临时申请第62/948,445号和于2020年6月18日提交的美国临时申请第63/040,602号的优先权。上述每个申请的全部内容通过引用并入本文。
序列表
本申请含有序列表，该序列表已经以ASCII格式用电子方式提交，并且其全部内容通过引用并入本文。所述ASCII副本(创建于12月3日)命名为121301-10620_SL.txt，其大小为1,097,169字节。
背景技术
肝脏中过量的三酸甘油酯的累积被称为肝的脂肪变性(或脂肪肝)，并与不良的代谢后果相关，包含胰岛素抗性和血脂异常。脂肪肝经常可见于过量酒精摄入的患者和患有肥胖症、糖尿病或高脂血症的患者。然而，在没有过量酒精摄入(>10g/天)的情况下，非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)可以发生。NAFLD是指范围很广的一系列肝脏疾病，其可以从单纯性脂肪肝(脂肪变性)进展为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，进展为肝硬化(不可逆的、晚期肝脏瘢痕化)。NAFLD的所有阶段的共同点是脂肪在肝脏细胞(肝细胞)中的积累(脂肪浸润)。
NAFLD谱系自其最简单的阶段(称为单纯性脂肪肝(脂肪变性))开始及进展。单纯性脂肪肝涉及脂肪(三酸甘油酯)在肝脏细胞中的积累，而没有炎症(肝炎)或瘢痕化(纤维化)。NAFLD谱系的下一个阶段及严重度为NASH，其涉及脂肪在肝细胞中的累积以及肝脏的炎症。炎症细胞破坏肝脏细胞(肝细胞的坏死)，并且NASH最终导致肝脏瘢痕化(纤维化)，随后是不可逆的晚期瘢痕化(肝硬化)。由NASH所引起的肝硬化是NAFLD谱系中最后及最严重的阶段。
在2008年，一项利用肝脏的质子磁共振波谱分析以评估肝脂肪含量对个体的全基因体关联研究指出，肝脂肪含量与含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)基因之间有显著关联(参见，例如，Romeo et al.(2008)Nat.Genet.,40(12):1461-1465)。对基因敲入小鼠的研究显示，PNPLA3中的一个序列多态性(rs738409，I148M)的表达导致NAFLD，并且脂滴表面的无催化活性的PNPLA3的累积与肝脏中三酸甘油酯的累积相关(Smagris et al.(2015)Hepatology,61:108-118)。具体而言，PNPLA3的I148M变体与促进纤维化的发展相关，其通过激活hedgehog(Hh)信号转导途径，导致肝星状细胞的活化和增殖以及细胞外基质的过度生成和沉积(Chen et al.(2015)World J.Gastroenterol.,21(3):794-802)。
目前，对NAFLD的治疗是针对体重减轻以及治疗继发性病况，比如胰岛素抗性或血脂异常。迄今为止，尚未有针对NAFLD的药物治疗获得批准。因此，需要针对苦于NAFLD的患者的疗法。
发明内容
本发明提供iRNA组合物，该组合物影响编码含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)的基因的RNA转录本的RNA诱导沉默复合体(RISC)所介导的裂解。含类PATATIN磷脂酶结构域3可能是位于细胞内，例如受试者(比如人类受试者)内的细胞。
在一个方面，本发明提供了一种双链核糖核酸(dsRNA)剂，其用于抑制细胞中含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)的表达，其中dsRNA剂包括形成双链区域的有义链和反义链，其中有义链包括与SEQ ID NO:1的核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19或20个连续核苷酸，并且反义链包括与SEQ ID NO:2的核苷酸序列相异不超过1、2或3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19或20个连续核苷酸。在一个实施方案中，dsRNA剂包括至少一种热不稳定的核苷酸修饰，例如无碱基修饰；双链体(duplex)中与相对核苷酸的错配；以及不稳定的糖修饰，2’-脱氧修饰、无环核苷酸、未锁核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)，例如，反义链包括至少一个热不稳定的核苷酸修饰。
在另一个方面，本发明提供双链核糖核酸(dsRNA)，其用于抑制细胞中含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)的表达，其中该dsRNA包括形成双链区域的有义链和反义链，其中反义链包括编码含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)的mRNA的互补性区域，并且其中该互补性区域包括与表2-11、21、24、27、30、32、33、36、37、49或50中任一者中的任何一个反义核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19或20个连续核苷酸。
在一个方面，本发明提供双链核糖核酸(dsRNA)，其用于抑制细胞中含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)的表达，其中该dsRNA包括形成双链区域的有义链和反义链，其中有义链包括与SEQ ID NO:1核苷酸序列的核苷酸677-721、683-721、773-817、1185-1295、1185-1241、1202-1295、1202-1241、1255-1295、1738-1792、1901-1945、1920-1945、2108-2208、2108-2166、2108-2136、2121-2166、2121-2208、2169-2208、2176-2208、或2239-2265的任何一个核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19或20个连续核苷酸，并且反义链包括来自SEQ ID NO:2的对应核苷酸序列的至少19个连续核苷酸。
在一个方面，本发明提供双链核糖核酸(dsRNA)，其用于抑制细胞中含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)的表达，其中该dsRNA包括形成双链区域的有义链和反义链，其中有义链包括与SEQ ID NO:1核苷酸序列的核苷酸574-596、677-699、683-705、699-721、773-795、795-817、1185-1207、1192-1214、1202-1224、1208-1230、1209-1231、1210-1232、1211-1233、1212-1234、1213-1233、1214-1234、1214-1236、1215-1237、1216-1238、1219-1237、1219-1241、1255-1275、1256-1276、1257-1275、1257-1277、1258-1278、1259-1279、1260-1278、1260-1280、1261-1281、1262-1282、1263-1283、1264-1282、1264-1284、1265-1285、1267-1285、1266-1286、1266-1288、1267-1285、1267-1287、1268-1290、1269-1289、1270-1290、1271-1291、1272-1292、1273-1293、1274-1294、1275-1295、1631-1653、1738-1760、1739-1761、1740-1760、1740-1762、1741-1763、1744-1766、1746-1766、1750-1772、1751-1773、1752-1774、1753-1775、1754-1776、1755-1777、1756-1778、1757-1779、1758-1780、1759-1781、1760-1782、1761-1783、1762-1782、1762-1784、1763-1785、1764-1786、1765-1787、1766-1786、1766-1788、1767-1787、1768-1788、1767-1789、1769-1789、1770-1788、1770-1790、1771-1791、1772-1792、1815-1837、1901-1923、1920-1942、1923-1945、2112-2130、2169-2191、2171-2191、2176-2198、2177-2199、2178-2200、2179-2201、2180-2202、2181-2203、2183-2205、2184-2206、2186-2208、2239-2261、2241-2263、2242-2264、或2243-2265的任何一个核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19或20个连续核苷酸，并且反义链包括来自SEQ ID NO:2的对应核苷酸序列的至少19个连续核苷酸。
在一个实施方案中，反义链包括与选自由下列所组成的组的双链体的反义链核苷酸序列中任何一个相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19或20个连续核苷酸：AD-517197.2、AD-517258.2、AD-516748.2、AD-516851.2、AD-519351.2、AD-519754.2、AD-519828.2、AD-520018.2、AD-520035.2、AD-520062.2、AD-520064.2、AD-520065.2、AD-520067.2、AD-75289.2、AD-520069.2、AD-520099.2、AD-67575.7、AD-520101.2、AD-67605.7、AD-1193323.1、AD-1193344.1、AD-1193350.1、AD-1193365.1、AD-1193379.1、AD-1193407.1、AD-1193421.1、AD-1193422.1、AD-1193429.1、AD-1193437.1、AD-1193443.1、AD-1193471.1、和AD-1193481.1。
在一个实施方案中，反义链包括与选自由下列所组成的组的双链体的反义链核苷酸序列中任何一个相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19或20个连续核苷酸：AD-519345.1、AD-519346.1、AD-519347.1、AD-67554.7、AD-519752.3、AD-1010731.1、AD-1010732.1、AD-519343.1、AD-519344.1、AD-519349.1、AD-519350.1、AD-519753.2、AD-519932.1、AD-519935.2、AD-520018.6、AD-517837.2、AD-805635.2、AD-519329.2、AD-520063.2、AD-519757.2、AD-805631.2、AD-516917.2、AD-516828.2、AD-518983.2、AD-805636.2、AD-519754.7、AD-520062.2、AD-67575.9、AD-518923.3、AD-520053.4、AD-519667.2、AD-519773.2、AD-519354.2、AD-520060.4、AD-520061.4、AD-1010733.2、AD-1010735.2、AD-1193323.1、AD-1193344.1、AD-1193350.1、AD-1193365.1、AD-1193379.1、AD-1193407.1、AD-1193421.1、AD-1193422.1、AD-1193429.1、AD-1193437.1、AD-1193443.1、AD-1193471.1、和AD-1193481.1。
在一个方面，本发明提供双链核糖核酸(dsRNA)，其用于抑制细胞中含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)的表达，其中dsRNA包括形成双链区域的有义链和反义链，其中有义链包括与SEQ ID NO:1的核苷酸1200-1250、1205-1250、11210-1250、1200-1245、1200-1240、1200-1235、1200-1237、1205-1237、1210-1232、1212-1237、1212-1234、1250-1300、1255-1300、1260-1300、1250-1295、1250-1390、1250-1285、1250-1282、1255-1282、1260-1282、1262-1300、1262-1295、1262-1390、和1262-1282的任何一个核苷酸序列相异不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且反义链包括来自SEQ ID NO:2的对应核苷酸序列的至少15个连续核苷酸。
在一个实施方案中，反义链包括与选自下列所组成的组的任何一个双链体的反义链核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19或20个连续核苷酸：AD-519345、AD-1193350、AD-1193365、AD-1193437和AD-519347。
在一个实施方案中，反义链包括与双链体AD-519351的反义链核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19或20个连续核苷酸。
在一个实施方案中，反义链包括与双链体AD-1193350的反义链核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19或20个连续核苷酸。
在一个实施方案中，反义链包括与双链体AD-1193365的反义链核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19或20个连续核苷酸。
在一个实施方案中，反义链包括与双链体AD-1193437的反义链核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19或20个连续核苷酸。
在一个实施方案中，反义链包括与双链体AD-519347的反义链核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19或20个连续核苷酸。
在一个实施方案中，dsRNA剂包括至少一个修饰核苷酸。
在一个实施方案中，有义链的基本所有核苷酸包括修饰；反义链的基本所有核苷酸包括修饰；或者，有义链的基本所有核苷酸和反义链的基本所有核苷酸包括修饰。
在一个实施方案中，有义链的所有核苷酸包括修饰；反义链的所有核苷酸包括修饰；或者，有义链的所有核苷酸和反义链的所有核苷酸包括修饰。
在一个实施方案中，至少一个经修饰核苷酸是选自于由下列所组成的组：脱氧-核苷酸、3'-末端脱氧-胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2′-O-甲基修饰核苷酸、2'-氟基修饰核苷酸、2'-脱氧-修饰核苷酸、锁核苷酸、未锁核苷酸、构象限制核苷酸、约束乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基-修饰核苷酸、2'-O-烯丙基-修饰核苷酸、2'-C-烷基-修饰核苷酸、2'-羟基-修饰核苷酸、2'-甲氧基乙基-修饰核苷酸、2'-O-烷基-修饰核苷酸、吗啉基核苷酸、氨基磷酸酯、包括非天然碱基的核苷酸、四氢哌喃修饰核苷酸、1,5-脱水己糖醇修饰核苷酸、环己烯基修饰核苷酸、包括硫代磷酸基团的核苷酸、包括甲基膦酸基团的核苷酸、包括5'-磷酸的核苷酸、包括5'-磷酸模拟物的核苷酸、热不稳定的核苷酸、二醇修饰核苷酸(GNA)和2-O-(N-甲基乙酰胺)修饰核苷酸；及其组合。
在一个实施方案中，核苷酸上的修饰是选自于由下列所组成的组：LNA、HNA、CeNA、2′-甲氧基乙基、2′-O-烷基、2′-O-烯丙基、2′-C-烯丙基、2′-氟基、2′-脱氧、2′-羟基、和二醇基；及其组合。
在一个实施方案中，至少一个经修饰的核苷酸是选自于由下列所组成的组：脱氧-核苷酸、2'-O-甲基修饰核苷酸、2'-氟基修饰核苷酸、2'-脱氧-修饰核苷酸、二醇修饰核苷酸(GNA)，例如Ggn、Cgn、Tgn或Agn，和乙烯基-膦酸核苷酸；及其组合。
在另一个实施方案中，核苷酸的至少一个修饰为热不稳定的核苷酸修饰。
在一个实施方案中，热不稳定的核苷酸修饰是选自于由下列所组成的组：无碱基修饰；双链体中与对应核苷酸的错配；和不稳定的糖修饰、2’-脱氧修饰、无环核苷酸、未锁核酸(UNA)以及甘油核酸(GNA)。
在一些实施方案中，经修饰核苷酸包括3'-末端脱氧-胸腺嘧啶核苷酸(dT)的短序列。
在一些实施方案中，核苷酸的修饰是2’-O-甲基，GNA和2’-氟基修饰。
在一些实施方案中，dsRNA剂进一步地包括至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键合。在一些实施方案中，dsRNA剂包括6至8个硫代磷酸酯核苷酸间键合。在一个实施方案中，硫代磷酸酯或甲基磷酸酯核苷酸间键合位于一条链的3'-末端。可选的，该链是反义链。在另一个实施方案中，该链是有义链。在相关的实施方案中，硫代磷酸酯或甲基磷酸酯核苷酸间键合是位于一条链的5'-末端。可选的，该链是反义链。在另一个实施方案中，该链是有义链。在另一个实施方案中，硫代磷酸酯或甲基磷酸酯核苷酸间键合既位于一条链的5'-末端，又位于该链的3'-末端。可选的，该链是反义链。在另一个实施方案中，该链是有义链。
双链区域可以是19至30个核苷酸对的长度；19至25个核苷酸对的长度；19至23个核苷酸对的长度；23至27个核苷酸对的长度；或者是21至23个核苷酸对的长度。
在一个实施方案中，每条链独立地不超过30个核苷酸的长度。
在一个实施方案中，有义链的长度是21个核苷酸，并且反义链的长度是23个核苷酸。
互补性区域的长度可以是至少17个核苷酸；长度为19至23个核苷酸；或者，长度为19个核苷酸。
在一个实施方案中，至少一条链包括至少1个核苷酸的3'突出。在另一个实施方案中，至少一条链包括至少2个核苷酸的3'突出。
在一个实施方案中，dsRNA剂进一步地包括配体。
在一个实施方案中，该配体缀合到dsRNA剂的有义链的3'端。
在一个实施方案中，配体是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
在一个实施方案中，配体是经由一价、二价或三价分支接头(branched linker)所附接的一个或多个GalNAc衍生物。
在一个实施方案中，配体为
Figure BDA0003795632600000071
在一个实施方案中，dsRNA剂如以下示意图所示结合到配体
Figure BDA0003795632600000081
并且，其中的X是O或S。
在一个实施方案中，X是O。
在一个实施方案中，dsRNA剂进一步地包括至少一个硫代磷酸酯或甲基磷酸酯核苷酸间键合。
在一个实施方案中，硫代磷酸酯或甲基磷酸酯核苷酸间键合位于一条链的3'-末端，例如，反义链或有义链。
在另一个实施方案中，硫代磷酸酯或甲基磷酸酯核苷酸间键合位于一条链的5'-末端，例如，反义链或有义链。
在一个实施方案中，硫代磷酸酯或甲基磷酸酯核苷酸间键合既位于一条链的5'-末端，又位于该链的3'-末端。在一个实施方案中，该链是反义链。
在一个实施方案中，双链体的反义链的5′-端1位置的碱基对是AU碱基对。
本发明还提供了含有本发明的任何dsRNA剂的细胞，以及包括本发明的任何dsRNA剂的药物组合物。
本发明的药物组合物可以包含在非缓冲溶液(例如盐水或水)中的dsRNA剂，或者本发明的药物组合物可以包含在缓冲溶液中的dsRNA剂，例如包括乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐、或磷酸盐或其任何组合的缓冲溶液；或者磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在一个方面，本发明提供了一种抑制细胞中含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)基因表达的方法。该方法包含使细胞与本发明的任何dsRNA或本发明的任何药物组合物接触，从而抑制细胞中PNPLA3基因的表达。
在一个实施方案中，细胞位于受试者体内，例如人类受试者，例如具有含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)相关病症的受试者，诸如选自于由下列病症所组成的组的含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)相关病症：脂肪肝(脂肪变性)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝脏中脂肪累积、肝脏炎症、肝细胞的坏死、肝脏纤维化、肥胖症、或非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。
在一个实施方案中，细胞与dsRNA剂接触以抑制PNPLA3表达的至少50％、60％、70％、80％、90％、或95％。
在一个实施方案中，抑制PNPLA3的表达以使受试者血清中PNPLA3蛋白水平降低至少50％、60％、70％、80％、90％、或95％。
在一个方面，本发明提供了一种治疗受试者的方法，该受试者患有将受益于含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)表达降低的病症。该方法包含向受试者施用治疗有效量的本发明的任何dsRNA或本发明的任何药物组合物，从而治疗患有将受益于PNPLA3表达降低的病症的受试者。
在另一个方面，本发明提供了一种预防受试者至少一项症状的方法，该受试者患有将受益于含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)表达降低的病症。该方法包含向受试者施用预防有效量的本发明的任何dsRNA或本发明的任何药物组合物，从而预防患有将受益于含PNPLA3表达降低的病症的受试者的至少一项症状。
在一个实施方案中，该病症为一种含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)相关病症，例如，选自于由下列所组成的组的含类PATATIN磷脂酶结构域蛋白3(PNPLA3)相关病症：脂肪肝(脂肪变性)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝脏中脂肪累积、肝脏炎症、肝细胞的坏死、肝脏纤维化、肥胖症、或非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。
在一个实施方案中，PNPLA3相关病症是NAFLD。
在一个实施方案中，受试者是人类。
在一个实施方案中，给受试者施用的dsRNA剂的剂量为约0.01mg/kg至约50mg/kg。
在一个实施方案中，dsRNA剂通过皮下注射施用给受试者。
在一个实施方案中，本发明的方法包含进一步地确定取自受试者的一个样本或多个样本中PNPLA3的水平。
在一个实施方案中，一个(或多个)受试者样本中含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)的水平，是指血液或血清样本中的含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)的蛋白水平。
在特定的一些实施方案中，本发明的方法进一步地包括给受试者施用额外的治疗剂。在一个进一步的实施方案中，额外的治疗剂选自于由下列所组成的组：HMG-CoA还原酶抑制剂、纤维酸盐衍生物(fibrate)、胆汁酸鳌合剂、烟碱酸、抗血小板剂、血管收缩素转化酶抑制剂、血管收缩素II受体拮抗剂、酰基辅酶A(acylCoA)胆固醇乙酰转移酶(ACAT)抑制剂、胆固醇吸收抑制剂、胆固醇酯转蛋白(CETP)抑制剂、微粒体三酸甘油酯转移蛋白(MTTP)抑制剂、胆固醇调节剂、胆汁酸调节剂、过氧化物酶体增殖激活受体(PPAR)激动剂、基因疗法、复合血管保护剂、糖蛋白Ilb/IIIa抑制剂、阿司匹林或类阿司匹林化合物、IBAT抑制剂、角鲨烯合成酶抑制剂、单核细胞趋化蛋白(MCP)-I抑制剂、或鱼油。
本发明还提供了试剂盒，该试剂盒包括本发明的任何dsRNA或本发明的任何药物组合物，以及可选的，使用说明书。
附图说明
图1是显示被皮下施用3mg/kg或10mg/kg单次剂量的所示dsRNA双链体的小鼠体内(每组n＝3)，在给药后第7天或第14天时，人PNPLA3 mRNA水平的图。人PNPLA3 mRNA的水平以相对于用PBS处理的小鼠中所检测到的对照水平来显示。
图2是显示如实施例3中所述的，被皮下施用单次剂量的所示dsRNA双链体的小鼠体内(每组n＝3)，在给药后第7天时，人PNPLA3 mRNA水平的图。人PNPLA3 mRNA的水平以相对于用PBS处理的小鼠中所检测到的对照水平来显示。
图3是显示被皮下施用10mg/kg单次剂量的所示dsRNA双链体的小鼠体内(每组n＝3)，在给药后第7天时，人PNPLA3 mRNA水平的图。人PNPLA3mRNA的水平以相对于用PBS处理的小鼠中所检测到的对照水平来显示。
图4是显示如实施例3中所述的，被皮下施用10mg/kg单次剂量或10mg/kg多次剂量的所示dsRNA双链体的小鼠体内(每组n＝3)，在给药后第7天时，人PNPLA3 mRNA水平的图。人PNPLA3 mRNA的水平以相对于用PBS处理的小鼠中所检测到的对照水平来显示。
图5是显示被皮下施用10mg/kg单次剂量的所示dsRNA双链体的小鼠体内(每组n＝3)，在给药后第7天时，人PNPLA3 mRNA水平的图。人PNPLA3mRNA的水平以相对于用PBS处理的小鼠中所检测到的对照水平来显示。
图6是显示被皮下施用10mg/kg单次剂量的所示dsRNA双链体的小鼠体内(每组n＝3)，在给药后第7天时，人PNPLA3 mRNA水平的图。人PNPLA3mRNA的水平以相对于用PBS处理的小鼠中所检测到的对照水平来显示。
图7是显示被皮下施用10mg/kg单次剂量的所示dsRNA双链体的小鼠体内(每组n＝3)，在给药后第7天时，人PNPLA3 mRNA水平的图。人PNPLA3mRNA的水平以相对于用PBS处理的小鼠中所检测到的对照水平来显示。
具体实施方式
本发明提供iRNA组合物，该组合物影响编码含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)的基因的RNA转录本的RNA诱导沉默复合体(RISC)-介导的裂解。该基因可能是位于细胞内，例如受试者，比如人类受试者的细胞内。使用这些iRNA能在哺乳动物中靶向降解对应的基因(含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)基因)的mRNA。
本发明的iRNA已被设计成靶向人含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)基因，包含在其他哺乳动物物种的含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)直向同源物中所保留的基因部分。不束缚于理论，可以认为前述特性和这些iRNA中的具体靶向位点或具体修饰的组合或次组合赋予本发明的iRNA改善的效力、稳定性、效价强度、耐久性、和安全性。
因此，本发明提供了用于治疗和预防含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)相关病症，例如，脂肪肝(脂肪变性)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝脏中脂肪累积、肝脏炎症、肝细胞的坏死、肝脏纤维化、肥胖症、或非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)的方法，该方法是使用影响PNPLA3基因的RNA转录本的RNA诱导沉默复合体(RISC)-介导的裂解的iRNA组合物。
本发明的iRNA包含RNA链(反义链)，该RNA链具有长度最多为约30个核苷酸或更少的区域，例如，19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24,20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、或21-22个核苷酸的长度，该区域实质上与PNPLA3基因的mRNA转录本的至少一部分互补。
在某些实施方案中，本发明的双链RNAi剂的一条链或双链的长度最多为66个核苷酸，例如，36-66、26-36、25-36、31-60、22-43、27-53个核苷酸的长度，且具有实质上与PNPLA3基因的mRNA转录本的至少一部分互补的至少19个连续核苷酸的区域。在一些实施方案中，具有更长长度的反义链的此类iRNA剂优选地可以包含长度为20-60个核苷酸的第二RNA链(有义链)，其中有义链和反义链形成18-30个连续核苷酸的双链体。
使用本发明iRNA能在哺乳动物中靶向降解对应的基因(PNPLA3基因)的mRNA。使用体外检测，本发明人已经展示靶向PNPLA3基因的iRNA可以有力地介导RNAi，导致PNPLA3基因表达的显著抑制。因此，包含这些iRNA的方法和组合物可用于治疗患有PNPLA3相关病症的受试者，例如，脂肪肝(脂肪变性)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝脏中脂肪累积、肝脏炎症、肝细胞的坏死、肝脏纤维化、肥胖症、或非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。
因此，本发明提供了用于治疗具有将受益于抑制或减低PNPLA3基因表达的病症的受试者的方法和联合疗法，该病症为例如，含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)相关疾病，诸如脂肪肝(脂肪变性)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝脏中脂肪累积、肝脏炎症、肝细胞的坏死、肝脏纤维化、肥胖症、或非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)，是使用影响PNPLA3基因的RNA转录本的RNA诱导沉默复合体(RISC)-介导的裂解的iRNA组合物。
本发明还提供了预防具有将受益于抑制或减低PNPLA3基因的表达的病症的受试者的至少一项症状的方法，该病症为例如，脂肪肝(脂肪变性)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝脏中脂肪累积、肝脏炎症、肝细胞的坏死、肝脏纤维化、肥胖症、或非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。例如，在具有NAFLD的受试者中，本发明的方法可以减轻受试者的至少一项症状，例如，疲劳、虚弱、体重减轻、食欲不振、恶心、腹痛、蜘蛛状血管、泛黄皮肤和眼睛发黄(黄疸)、搔痒、腿部的积液和肿胀(水肿)、腹部肿胀(腹水)和精神错乱。
以下的详细描述将公开如何制备和使用含有抑制PNPLA3基因表达的iRNA的组合物，以及用于治疗受试者的组合物、用途和方法，该受试者将受益于抑制和/或降低PNPLA3基因的表达，例如，易患或已诊断患有PNPLA3相关病症的受试者。
I.定义
为了可以更容易地理解本发明，首先定义某些术语。另外，应当注意，每当列举某参数的值或值的范围时，用意是介于所列举值中间的值和范围也意图成为本发明的一部分。
冠词“a(一)”和“an(一个)”在本文中用于指该冠词的语法对象的一个或多个(即，至少一个)。举例来说，“一个元素”意指一个元素或多于一个元素，例如，多个元素。
术语“包含”在本文中用于指短语“包含但不限于”，并与其可以互换使用。
除非上下文另外明确指出，术语“或”在本文中用于意指术语“和/或”，并与其可以互换使用。例如，“有义链或反义链”应理解为“有义链或反义链，或，有义链和反义链”。
术语“约”在本文中用于指在本领域的典型公差范围内。例如，“约”可以理解为平均值左右约2个标准偏差。在某些实施方案中，约意指±10％。在某些实施方案中，约意指±5％。当“约”出现在一系列数字或一范围之前时，应理解为“约”可以修饰该系列或范围中的每个数字。
从上下文清楚可见，在一个数字或数字系列之前的术语“至少”应理解为包含与术语“至少”相邻的数字，以及可以从逻辑上包含的所有后续数字或整数。例如，核酸分子中核苷酸的数目必须是整数。例如，“21个核苷酸的核酸分子中的至少19个核苷酸”意指19、20或21个核苷酸具有所指的特性。当“至少”出现在一系列数字或一范围之前时，应理解为“至少”可以修饰该系列或范围中的每个数字。
如本文所用，“不多于”或“少于”应理解为与该短语相邻的值和逻辑上更低的值或整数，从上下文逻辑看，直到为零。例如，具有“不多于2个核苷酸”的突出的双链体有2、1，或0个核苷酸突出。当“不多于”出现在一系列数字或一范围之前时，应理解为“不多于”可以修饰该系列或范围中的每个数字。如本文所用，范围包含上限和下限二者。
如本文所用，检测方法可以包含测定存在的分析物的量低于该方法的检测水平。
如果所示靶向位点与有义链或反义链的核苷酸序列间有冲突，则以所示序列为准。
如果序列与其在转录本或其他序列的所示位点间有冲突，则以本说明书中列举的核苷酸序列为准。
如本文所用，“含类PATATIN磷脂酶结构域3”，其与术语“PNPLA3”可以互换使用，是指众编码介导脂肪细胞中的三酰基甘油水解的三酰基甘油脂肪酶的公知的基因。
PNPLA3的示例性核苷酸和氨基酸序列可以在如下序列中找到，例如，GenBank登录号NM_025225.2(智人PNPLA3；SEQ ID NO:1；反向互补，SEQ ID NO:2)；GenBank登录号NM_054088.3(小鼠PNPLA3；SEQ ID NO:3；反向互补，SEQ ID NO:4)；GenBank登录号NM_001282324.1(褐大鼠PNPLA3；SEQ ID NO:5；反向互补，SEQ ID NO:6)；GenBank登录号XM_005567051.1(马来猴PNPLA3，SEQ ID NO:7；反向互补，SEQ ID NO:8)；GenBank登录号XM_001109144.2(恒河猴PNPLA3，SEQ ID NO:9；反向互补，SEQ ID NO:10)；及GenBank登录号XM_005567052.1(马来猴PNPLA3，SEQ ID NO:11；反向互补，SEQ ID NO:12)。
PNPLA3 mRNA序列的其他示例可藉由公共数据库轻松获得，例如，GenBank、UniProt、OMIM、以及猕猴属基因组计划网站。
有关PNPLA3的进一步信息，可参见例如www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/？term＝pnpla3。
自本申请提交之日起，每个上述GenBank登录号和基因数据库号的全部内容在此藉由引用并入本文。
如本文所用，术语PNPLA3，也指PNPLA3基因的变异，包含SNP数据库中所提供的变体。已识别出的PNPLA3基因内的许多序列变异可以在例如NCBI dbSNP和UniProt上找到(参见例如www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/？term＝pnpla3)，其全部内容自本申请提交之日起在此藉由引用并入本文。
如本文所用，“靶序列”是指在PNPLA3基因转录期间所形成的mRNA分子的核苷酸序列的连续部分，包含初级转录产物的RNA加工产物的mRNA。序列的靶部分将至少足够长而可位于PNPLA3基因转录期间所形成的mRNA分子的核苷酸序列的部分或其附近作为iRNA-导向裂解的底物。在一个实施方案中，靶序列位于PNPLA3的蛋白质编码区内。
靶序列可以是约19-36个核苷酸的长度，例如，优选是约19-30个核苷酸的长度。例如，靶序列可以是约19-30个核苷酸，19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、或21-22个核苷酸的长度。在特定的一些实施方案中，靶序列为19-23个核苷酸的长度，可选地为21-23个核苷酸的长度。介于如上列举的范围和长度中间的范围和长度也被认为是本公开的一部分。
如本文所用，术语“包括序列的链”是指包括核苷酸链的寡核苷酸，且该寡核苷酸由参照使用标准核苷酸命名法的序列描述。
一般地，“G”、“C”、“A”、“T”及“U”分别代表含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、及尿嘧啶作为碱基的核苷酸。然而，应理解术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”亦可指修饰过的核苷酸，如下文进一步详述的，或代理替换部分(surrogate replacement moiety)(参见，例如，表1)。所属技术领域者熟知鸟嘌呤、胞嘧啶，腺嘌呤和尿嘧啶可以被其他部分取代，而实质上不改变包括带有此种替换部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对特性。例如，但不限于，包括肌苷作为其碱基的核苷酸可以与含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸进行碱基配对。因此，本发明表征的dsRNA的核苷酸序列中的含有尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以被含有例如肌苷的核苷酸所替换。在另一个实例中，寡核苷酸中任何地方的腺嘌呤和胞嘧啶可以分别被鸟嘌呤和尿嘧啶所替换以形成与靶mRNA的G-U摇摆碱基配对。含有此类替换部分的序列适用于本发明表征的组合物和方法。
术语“iRNA”，“RNAi剂”，“iRNA剂”，“RNA干扰剂”在本文中可以互换使用，是指含有如本文术语所定义之RNA的剂，且该剂通过RNA诱导沉默复合体(RISC)途径介导RNA转录本的靶向裂解。iRNA经由已知为RNA干扰(RNAi)的过程导引mRNA的序列特异性降解。该iRNA调节，例如抑制，PNPLA3基因在细胞(例如受试者(例如哺乳动物受试者)内的细胞)中的表达。
在一个实施方案中，本发明的RNAi剂包含与靶RNA序列(例如PNPLA3靶mRNA序列)相互作用的单链RNA，以指导靶RNA的裂解。不希望被理论束缚，据信被引入细胞中的长双链RNA被称为Dicer的III型核酸内切酶分解成为siRNA(Sharp et al.(2001)Genes Dev.15:485)。Dicer，核酸酶III样酶，将dsRNA加工成19-23个碱基对且具有特征性的二碱基3'突出的短干扰RNA(Bernstein,et al.,(2001)Nature 409:363)。然后将siRNA插入RNA诱导沉默复合体(RISC)中，其中一种或多种解旋酶解开siRNA双链体，使互补的反义链能够引导靶向识别(Nykanen,et al.,(2001)Cell 107:309)。与适当的靶mRNA结合后，RISC内的一种或多种核酸内切酶裂解裂解标靶以诱导沉默过程(Elbashir,et al.,(2001)Genes Dev.15:188)。因此，在一个方面本发明涉及在细胞内所产生的单链RNA(siRNA)，该siRNA促进RISC复合体的形成以实现靶基因，即PNPLA3基因的沉默。因此，术语“siRNA”在本文中也用于指如上所述的iRNA。
在一些实施方案中，RNAi剂可以是被引入细胞或生物中以抑制靶mRNA的单链siRNA(ssRNAi)。单链RNAi剂与RISC核酸内切酶Argonaute 2结合，随后后者裂解靶mRNA。单链siRNA一般为15-30个核苷酸，且经过化学修饰。单链siRNA的设计和测试描述于美国专利第8,101,348号和Lima et al.,(2012)Cell 150:883-894中，这些文献中每个的全部内容通过引用并入本文。本文所述的任何反义核苷酸序列都可用作如本文所述的单链siRNA，或通过Lima et al.,(2012)Cell 150:883-894中所述方法进行化学修饰后再使用。
在一些实施方案中，用于本发明的组合物、用途和方法的“iRNA”是双链RNA，并且在本文中被称作“双链RNA剂”、“双链RNA(dsRNA)分子”、“dsRNA剂”或“dsRNA”。术语“dsRNA”是指具有双链体结构的核糖核酸分子的复合体，该双链体结构包括二条反向平行且基本互补的核酸链，其被称为具有相对于靶RNA(即PNPLA3基因)的“正义”和“反义”的定向。在本发明的某些实施方案中，双链RNA(dsRNA)经由转录后基因沉默机制(本文称为RNA干扰或RNAi)触发靶RNA(例如mRNA)的降解。
通常，dsRNA分子的每条链的大部分核苷酸是核糖核苷酸，但是如本文详细描述的，每条链或双链也可以包含一个或多个非核糖核苷酸，例如，脱氧核糖核苷酸或经修饰核苷酸。此外，如本说明书中所使用的，“iRNA”可包含具有化学修饰的核糖核苷酸；iRNA可以在多个核苷酸上包含实质的修饰。如本文所用，术语“经修饰核苷酸”是指独立地具有经修饰糖部分、经修饰核苷酸间键合、或经修饰核碱基、或上述其任何组合的核苷酸。因此，术语经修饰核苷酸涵盖核苷酸间键合、糖部分、或核苷碱基的例如，官能基或原子的取代、添加或移除。适用于本发明的剂的修饰包含本文公开或本领域已知的所有类型的修饰。出于本说明书和权利要求范围的目的，“iRNA”或“RNAi剂”涵盖用于siRNA类型分子的任何此类修饰。
在此公开的一些实施方案中，如果脱氧核苷酸存在于RNAi剂内则可以被认为构成经修饰核苷酸。
双链体区域可以是允许所期望的靶RNA通过RISC途径特异性降解的任何长度，该长度可以在约19至36个碱基对的长度范围，例如，约19-30个碱基对的长度，例如，约9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、或36个碱基对的长度，诸如约19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24,20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、或21-22个碱基对的长度。在一些实施方案中，双链体区域的长度为19-21个碱基对，例如，21个碱基对的长度。介于如上列举的范围和长度中间的范围和长度也被认为是本公开的一部分。
形成双链体结构的双链可以是一个较大的RNA分子的不同部分，也可以是分离的RNA分子。如果双链是一个较大分子的一部分，并因而通过一条链的3'端与相应另一条链的5'端之间不间断的核苷酸链相连接形成双链体结构，则连接双链的RNA链被称为“发夹环”。发夹环可以包括至少一个未配对的核苷酸。在某些实施方案中，发夹环可以包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、23或更多个未配对的核苷酸。在某些实施方案中，发夹环可以是10个或更少的核苷酸。在某些实施方案中，发夹环可以是8个或更少的未配对核苷酸。在某些实施方案中，发夹环可以是4-10个未配对的核苷酸。在某些实施方案中，发夹环可以是4-8个核苷酸。
如果dsRNA的二条基本互补的链是由分离的RNA分子所构成，则这些分子不必要是共价连接的，但可以是共价连接的。如果双链通过不间断的核苷酸链在一条链的3'端与相应另一条链的5'端之间形成双链体结构以外的方式进行共价连接，则连接结构被称为“接头”。RNA链可以具有相同或不同数目的核苷酸。碱基对的最大数目是dsRNA的最短链中的核苷酸数目减去双链体中存在的任何突出数目。除双链体结构外，RNAi可以包括一个或多个核苷酸突出。在RNAi剂的一个实施方案中，至少一条链包括至少1个核苷酸的3'突出。在另一个实施方案中，至少一条链包括至少2个核苷酸(例如，2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸)的3'突出。在其他实施方案中，RNAi剂的至少一条链包括至少1个核苷酸的5'突出。在特定的一些实施方案中，至少一条链包括至少2个核苷酸(例如，2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸)的5'突出。还是在其他实施方案中，RNAi剂的一条链的3'端和5'端均包括至少1个核苷酸的突出。
在一些实施方案中，本发明的iRNA剂是dsRNA，其每条链包括19-23个核苷酸，其与靶RNA序列，例如PNPLA3基因，相互作用，以导引靶RNA的裂解。
在某些实施方案中，本发明的iRNA是24-30个核苷酸的dsRNA，其与靶RNA序列，例如PNPLA3靶mRNA序列，相互作用，以导引靶RNA的裂解。
如本文所用，术语“核苷酸突出”是指从双链iRNA的双链体结构伸出的至少一个未配对的核苷酸。例如，当dsRNA的一条链的3'端延伸到超出另一条链的5'端时，或反之亦然，则存在一个核苷酸突出。dsRNA可以包括至少一个核苷酸的突出；或者突出可以包括至少两个核苷酸、至少三个核苷酸、至少四个核苷酸、至少五个核苷酸或更多。核苷酸突出可以包括核苷酸/核苷类似物(包含脱氧核苷酸/核苷)或由核苷酸/核苷类似物组成。突出可以位于有义链，反义链或其任何组合上。进一步地，突出的核苷酸可以存在于dsRNA的反义链或有义链的5'端、3'端或二端。
在一个实施方案中，dsRNA的反义链具有1-10个核苷酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸)突出在3'端或5'端。在一个实施方案中，dsRNA的有义链具有1-10个核苷酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸)突出在3'端或5'端。在另一个实施方案中，突出中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸所替换。
在一些实施方案中，dsRNA的反义链具有1-10个核苷酸(例如，0-3、1-3、2-4、2-5、4-10、5-10，例如，1、2、3，4、5、6、7、8、9或10个核苷酸)突出在3'端或5'端。在一个实施方案中，dsRNA的有义链具有1-10个核苷酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸)突出在3'端或5'端。在另一个实施方案中，突出中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸所替换。
在一些实施方案中，dsRNA的反义链具有1-10个核苷酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个核苷酸)突出在3'端或5'端。在一些实施方案中，位于有义链或反义链或二者上的突出，可以包含长度大于10个核苷酸的延伸长度，例如，1-30个核苷酸、2-30个核苷酸、10-30个核苷酸、10-25个核苷酸、10-20个核苷酸、或10-15个核苷酸的长度。在一些实施方案中，延伸的突出位于双链体的有义链。在一些实施方案中，延伸的突出存在于双链体的有义链的3'端。在一些实施方案中，延伸的突出存在于双链体的有义链的5′端。在一些实施方案中，延伸的突出位于双链体的反义链。在一些实施方案中，延伸的突出存在于双链体的反义链的3′端。在一些实施方案中，延伸的突出存在于双链体的反义链的5′端上。在一些实施方案中，延伸的突出中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸所替换。在一些实施方案中，突出包含自我互补的部分，使得突出能够形成在生理条件下稳定的发夹结构。
“钝”或“钝端”意指在双链RNA剂的末端没有未配对的核苷酸，即，没有核苷酸突出。“钝端”双链RNA剂在其整个长度都是双链，即，在其分子的任一端均无核苷酸突出。本发明的RNAi剂包括在一端没有核苷酸突出的RNAi剂(即，有一个突出端和一个钝端的剂)或在任一端均无核苷酸突出的RNAi剂。大多数情况下，此类分子将在其整个长度都是双链的。
术语“反义链”或“引导链”是指iRNA的链，例如，dsRNA，其包含与靶序列(例如，PNPLA3 mRNA)基本互补的区域。
如本文所用，术语“互补性区域”是指反义链上与序列，例如本文所定义的靶序列(例如PNPLA3核苷酸序列)，基本互补的区域。如果互补性区域与靶序列不完全互补，错配可以在分子的内部或末端区域。一般地，最耐受的错配是在末端区域，例如，在iRNA的5’端或3’端的5、4、或3个核苷酸内。在某些实施方案中，本发明的双链RNA剂在反义链包含核苷酸错配。在某些实施方案中，本发明的双链RNA剂的反义链包含不超过4个与靶mRNA的错配，例如，反义链包含4、3、2、1或0个与靶mRNA的错配。在某些实施方案中，本发明的双链RNA剂的反义链包含不超过4个与有义链的错配，例如，反义链包含4、3、2、1或0个与有义链的错配。在某些实施方案中，本发明的双链RNA剂在有义链包含核苷酸错配。在某些实施方案中，本发明的双链RNA剂的有义链包含不超过4个与反义链的错配，例如，有义链包含4、3、2、1或0个与反义链的错配。在某些实施方案中，核苷酸错配是，例如，位于距iRNA的3'端的5、4、3个核苷酸之内。在另一个实施方案中，核苷酸错配，例如，在iRNA剂的3'末端核苷酸中。在某些实施方案中，错配不在种子区域中。
因此，本文所述的RNAi剂可含有与靶序列的一个或多个错配。在一个实施方案中，本文所述的RNAi剂含有不超过3个错配(即，3、2、1或0个错配)。在一个实施方案中，本文所述的RNAi剂含有不超过2个错配。在一个实施方案中，本文所述的RNAi剂含有不超过1个错配。在一个实施方案中，本文所述的RNAi剂含有0个错配。在一些实施方案中，如果RNAi剂的反义链含有与靶序列的错配，则可以任选地将错配限制在距互补性区域的5'端或3'端的最后5个核苷酸内。例如，在此类的实施方案中，对于23个核苷酸的RNAi剂，与PNPLA3基因的区域互补的链，一般在中央的13个核苷酸内不含有任何错配。本文所述的方法或本领域已知的方法可用于确定含有与靶序列的错配的RNAi剂是否可有效抑制PNPLA3基因的表达。考虑有错配的RNAi剂抑制PNPLA3基因表达的效力是重要的，尤其是如果PNPLA3基因中的特定互补性区域已知在群体内具有多态性序列变异。
术语“有义链”或“过客链”如本文所用，是指iRNA的链，其包含与如本文所定义的反义链的区域基本互补的区域。
如本文所用，“基本上所有的核苷酸都经修饰”为大部分地但并非全部地被修饰，并且可以包含不超过5、4、3、2或1个未经修饰的核苷酸。
如本文所用，术语“裂解区域”是指位于紧邻裂解位点的区域。裂解位点是在靶发生裂解的位点。在某些实施方案中，裂解区域包括在裂解位点的任一端且紧邻裂解位点的三个碱基。在某些实施方案中，裂解区域包括在裂解位点的任一端且紧邻裂解位点的两个碱基。在某些实施方案中，裂解位点特异地出现在反义链的核苷酸10和11所结合的位点，而裂解区域包括核苷酸11、12和13。
如本文所用，且除非另有说明，术语“互补的”当用于描述第一核苷酸序列与第二核苷酸序列的关系时，是指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在特定条件下杂交并形成双链体结构的能力，正如所属技术领域人员所理解的那样。此类条件可以是，例如，严格的条件，其中严格条件可以包含：400mMNaCl,40mM PIPES pH 6.4,1mM EDTA,50℃或70℃持续12-16小时然后进行洗涤(参见，例如，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Sambrook,et al.(1989)Cold SpringHarbor Laboratory Press)。也可以应用其他条件，诸如生物体内可能遇到的生理相关条件。按照杂交核苷酸的最终应用，所属技术领域人员将能够确定适合于测试两个序列互补性的条件设置。
iRNA内(例如，本文所述的dsRNA内)的互补的序列包括包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一个或两个核苷酸序列的全长的碱基配对。在本文中这样的两个序列可以被称为彼此“完全互补的”。然而，在本文中如果第一序列相对于第二序列被称为“基本互补的”，这两个序列可以是完全互补的，或者在杂交得到多达30个碱基对的双链体时它们可以形成一个或多个，但是一般不超过5、4、3、或2个错配的碱基对，同时在与其最终应用最相关的条件下(例如，通过RISC路径抑制基因表达)保留了杂交的能力。但是，如果两个寡核苷酸被设计在杂交时，形成一个或多个单链突出，就确定互补性而言此类突出不应被视为错配。例如，包括一个长度为21个核苷酸的寡核苷酸和另一个长度为23个核苷酸的寡核苷酸的dsRNA，其中较长的寡核苷酸包括一个与较短的寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列，出于本文所述的目的仍可以被称为“完全互补的”。
“互补的”序列，如本文所用，也可以包含非Watson-Crick碱基对或由非天然的和经修饰的核苷酸所形成碱基对，或完全由非Watson-Crick碱基对或由非天然的和经修饰的核苷酸所形成碱基对形成，只要满足上述关于它们杂交能力的要求。这类非Watson-Crick碱基对包含，但不限于，G:U摇摆或Hoogstein碱基配对。
本文的术语“互补的”，“完全互补的”和“基本互补的”可用于描述dsRNA的有义链与反义链之间，或双链RNA剂的反义链与靶序列之间的碱基匹配，从其使用的上下文中将可以理解。
如本文所用，与信使RNA(mRNA)“的至少部分是基本互补的”多核苷酸是指与目标mRNA(例如，编码PNPLA3基因的mRNA)的连续部分基本互补的多核苷酸。例如，如果核苷酸序列与编码PNPLA3基因的mRNA的不间断部分是基本互补的，则该多核苷酸与PNPLA3 mRNA的至少一部分是互补的。
因此，在某些实施方案中，本文所公开的反义多核苷酸与靶PNPLA3序列是完全互补的。在其他实施方案中，本文所公开的反义多核苷酸与靶PNPLA3序列是基本互补的，并且包括连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列在其全长上与下列序列的等同区域是至少80％互补的：SEQ ID NO:1、3、5、7、9、或11中的任何一个，或SEQ ID NO:1、3、5、7、9、或11中的任何一个的一片段，诸如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％互补的。
在一些实施方案中，本文所公开的反义多核苷酸与靶PNPLA3序列的片段是基本互补的，并且包括连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列在其全长上与选自如下组的SEQ IDNO:1的片段至少是80％互补：SEQ ID NO:1的核苷酸677-721、683-721、773-817、1185-1295、1185-1241、1202-1295、1202-1241、1255-1295、1738-1792、1901-1945、1920-1945、2108-2208、2108-2166、2108-2136、2121-2166、2121-2208、2169-2208、2176-2208、或2239-2265，诸如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％互补。
在某些实施方案中，本文所公开的反义多核苷酸与靶PNPLA3序列的片段是基本互补的，并且包括连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列在其全长上与选自如下组的SEQ IDNO:1的片段至少是80％互补：SEQ ID NO:1的核苷酸574-596、677-699、683-705、699-721、773-795、795-817、1185-1207、1192-1214、1202-1224、1208-1230、1209-1231、1210-1232、1211-1233、1212-1234、1213-1233、1214-1234、1214-1236、1215-1237、1216-1238、1219-1237、1219-1241、1255-1275、1256-1276、1257-1275、1257-1277、1258-1278、1259-1279、1260-1278、1260-1280、1261-1281、1262-1282、1263-1283、1264-1282、1264-1284、1265-1285、1267-1285、1266-1286、1266-1288、1267-1285、1267-1287、1268-1290、1269-1289、1270-1290、1271-1291、1272-1292、1273-1293、1274-1294、1275-1295、1631-1653、1738-1760、1739-1761、1740-1760、1740-1762、1741-1763、1744-1766、1746-1766、1750-1772、1751-1773、1752-1774、1753-1775、1754-1776、1755-1777、1756-1778、1757-1779、1758-1780、1759-1781、1760-1782、1761-1783、1762-1782、1762-1784、1763-1785、1764-1786、1765-1787、1766-1786、1766-1788、1767-1787、1768-1788、1767-1789、1769-1789、1770-1788、1770-1790、1771-1791、1772-1792、1815-1837、1901-1923、1920-1942、1923-1945、2112-2130、2169-2191、2171-2191、2176-2198、2177-2199、2178-2200、2179-2201、2180-2202、2181-2203、2183-2205、2184-2206、2186-2208、2239-2261、2241-2263、2242-2264、或2243-2265，诸如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％互补。
在某些实施方案中，本文所公开的反义多核苷酸与靶PNPLA3序列的片段是基本互补的，并且包括连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列在其全长上与选自如下组的SEQ IDNO:1的片段至少是80％互补：SEQ ID NO:1的核苷酸1200-1250、1205-1250、11210-1250、1200-1245、1200-1240、1200-1235、1200-1237、1205-1237、1210-1232、1212-1237、1212-1234、1250-1300、1255-1300、1260-1300、1250-1295、1250-1390、1250-1285、1250-1282、1255-1282、1260-1282、1262-1300、1262-1295、1262-1390、和1262-1282，诸如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％互补。
在其他实施方案中，本文所公开的反义多核苷酸与靶PNPLA3序列的片段是基本互补的，并且包括连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列在其全长上与如下序列至少是80％互补：表2-11、21、24、27、30、32、33、36、37、49或50任一者的任一有义链核苷酸序列，或是表2-11、21、24、27、30、32、33、36、37、49或50的任一者的任一有义链核苷酸序列的片段，诸如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或约100％互补。
在一个实施方案中，本公开的RNAi剂包含与反义多核苷酸基本互补的有义链，该反义多核苷酸又反过来与靶PNPLA3序列相同，并且其中有义链多核苷酸包括连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列在其全长上与下列序列的等同区域至少是80％互补的：SEQ ID NO:2、4、6、8、10、或12的核苷酸序列，或是SEQ ID NO:2、4、6、8、10、或12中任一者的片段，诸如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或约100％互补的。
在某些实施方案中，本发明的iRNA包含与反义多核苷酸基本互补的有义链，该反义多核苷酸又反过来与靶PNPLA3序列互补，并且其中有义链多核苷酸包括连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列在其全长上与如下序列至少是80％互补的：表2-11、21、24、27、30、32、33、36、37、49或50的任一者的任一反义链核苷酸序列，或是表2-11、21、24、27、30、32、33、36、37、49或50的任一者的任一反义链核苷酸序列的片段，诸如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或约100％互补的。
在某些实施方案中，有义链和反义链是选自下列任一双链体：AD-517197.2、AD-517258.2、AD-516748.2、AD-516851.2、AD-519351.2、AD-519754.2、AD-519828.2、AD-520018.2、AD-520035.2、AD-520062.2、AD-520064.2、AD-520065.2、AD-520067.2、AD-75289.2、AD-520069.2、AD-520099.2、AD-67575.7、AD-520101.2、AD-67605.7,AD-1193323.1、AD-1193344.1、AD-1193350.1、AD-1193365.1、AD-1193379.1、AD-1193407.1、AD-1193421.1、AD-1193422.1、AD-1193429.1、AD-1193437.1、AD-1193443.1、AD-1193471.1、以及AD-1193481.1。
在一些实施方案中，有义链和反义链是选自下列任一双链体：AD-519345.1、AD-519346.1、AD-519347.1、AD-67554.7、AD-519752.3、AD-1010731.1、AD-1010732.1、AD-519343.1、AD-519344.1、AD-519349.1、AD-519350.1、AD-519753.2、AD-519932.1、AD-519935.2、AD-520018.6、AD-517837.2、AD-805635.2、AD-519329.2、AD-520063.2、AD-519757.2、AD-805631.2、AD-516917.2、AD-516828.2、AD-518983.2、AD-805636.2、AD-519754.7、AD-520062.2、AD-67575.9、AD-518923.3、AD-520053.4、AD-519667.2、AD-519773.2、AD-519354.2、AD-520060.4、AD-520061.4、AD-1010733.2、AD-1010735.2、AD-1193323.1、AD-1193344.1、AD-1193350.1、AD-1193365.1、AD-1193379.1、AD-1193407.1、AD-1193421.1、AD-1193422.1、AD-1193429.1、AD-1193437.1、AD-1193443.1、AD-1193471.1、以及AD-1193481.1。
在一些实施方案中，有义链和反义链是选自下列任一双链体：AD-519345.1、AD-1193350.1、AD-1193365.1、AD-1193437.1、以及AD-519347.1。
在一些实施方案中，有义链和反义链是来自双链体AD-519351。
在一个实施方案中，有义链和反义链是来自双链体AD-1193350。
在一个实施方案中，有义链和反义链是来自双链体AD-1193365。
在一个实施方案中，有义链和反义链是来自双链体AD-1193437。
在一个实施方案中，有义链和反义链是来自双链体AD-519347。
一般地，“iRNA”包含具有化学修饰的核糖核苷酸。这样的修改可以包含本文所公开的或本领域已知的所有类型的修改。为了本说明书和权利要求范围的目的，在dsRNA分子中所使用的任何此类修饰都包括在“iRNA”中。
在本公开的某些实施方案中，如果脱氧核苷酸存在于RNAi剂内则可以认为构成经修饰核苷酸。
在本发明的一个方面，用于本发明的方法和组合物中的剂是单链反义寡核苷酸分子，其通过反义抑制机制而抑制靶mRNA。该单链反义寡核苷酸分子与靶mRNA内的序列是互补的。该单链反义寡核苷酸可以通过与mRNA碱基配对进而从物理上阻碍翻译机制，以化学计量的方式抑制翻译，参见Dias,N.et al.,(2002)Mol Cancer Ther 1:347-355。该单链反义寡核苷酸分子可以为约14至约30个核苷酸的长度，并且具有与靶序列互补的序列。例如，该单链反义寡核苷酸分子可包括来自本文所述反义序列中任一序列的至少约14、15、16、17、18、19、20、或更多个连续核苷酸的序列。
本文所用的短语“使细胞与iRNA接触”，例如dsRNA，包含通过任何可能的方式与细胞接触。使细胞与iRNA接触包含使细胞与iRNA于体外接触或使细胞与iRNA于体内接触。该接触可以直接地或间接地完成。因此，例如，可以通过方法执行人使iRNA与细胞进行物理性接触，或者，可以使iRNA处于允许或导致其随后与细胞接触的情境。
体外接触细胞可以通过，例如，将细胞与iRNA一起孵育来完成。体内接触细胞可以通过，例如，将iRNA注射到细胞所在的组织之中或附近，或者通过将iRNA注射到另一个区域，例如，血流或皮下空间中来完成，从而使该剂将能够随后到达所要接触的细胞所在的组织。例如，iRNA可以含有配体或偶联至配体，例如，GalNAc，该配体会导引iRNA至目的位点，例如，肝脏。体外和体内接触方法的组合也是可能的。例如，细胞也可以在体外与iRNA接触，其后再被移植到受试者体内。
在一些实施方案中，使细胞与iRNA接触包含通过促进或影响细胞的摄取或吸收，而“将(iRNA)引入”或“将iRNA递送进入细胞”。iRNA的吸收或摄取可通过无辅助地扩散或主动的细胞过程，或通过辅助剂或辅助设备来完成。将iRNA引入细胞可以是体外或体内的。例如，对于体内引入，可以将iRNA注射进入组织位点或将其全身施用。体外引入细胞包含本领域已知的方法，例如电穿孔法和脂转染法。更多的方法描述于下文中或在本领域中是已知的。
术语“脂质纳米粒子”或“LNP”是包含脂质层的囊泡，该脂质层封装药物活性分子，例如核酸分子，例如，iRNA或会转录出iRNA的质粒。LNP描述于，例如，美国专利6,858,225、6,815,432、8,158,601、和8,058,069，其全部内容通过引用并入本文。
如本文所用，“受试者”是指内源性地或异源性地表达靶基因的动物，例如哺乳动物，包含灵长类动物(例如人，非人类的灵长动物，例如，猴子和黑猩猩)，非灵长类动物(诸如奶牛、猪、马、山羊、兔子、绵羊、仓鼠、天竺鼠、猫、狗、大鼠或小鼠)或鸟。在一个实施方案中，受试者是人，诸如因疾病或病症正接受治疗或正被评估的人，而该疾病或病症将受益于PNPLA3表达的降低；有患将受益于PNPLA3表达的降低的疾病或病症风险的人，而该疾病或病症将受益于PNPLA3表达的降低；具患有疾病或病症的人，而该疾病或病症将受益于PNPLA3表达的降低；因疾病或病症正接受治疗的人，而该疾病或病症将受益于PNPLA3表达的降低，如本文所述。在某些实施方案中，受试者是女性。在其他实施方案中，受试者是男性。在一个实施方案中，受试者是成人受试者。在另一个实施方案中，受试者是儿童受试者。
如本文所用，术语“(进行)治疗(treating)”和“治疗(过程)(treatment)”是指有益的或期望的结果，诸如减轻少受试者的至少一个PNPLA3相关病症的体征或症状。治疗亦还包括减少一种或多种与不期望的PNPLA3表达相关的体征或症状；减轻不期望的PNPLA3的活化或稳定化的程度；改善或减缓不期望的PNPLA3的活化或稳定化。“治疗(过程)”还可以意味着与没有治疗的预期生存期相比延长生存期。在受试者体内PNPLA3或疾病标记物或疾病症状的水平的上下文中，术语“较低”是指该水平在统计学上的显著降低。例如，降低量可以是，例如，至少10％、15％、20％、25％、30％、％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或更多。在一些实施方案中，降低为至少20％。在一些实施方案中，疾病标记物，例如蛋白质或基因表达水平，降低至少50％。在受试者体内PNPLA3水平的上下文中，“较低”是指优选地降低至无此病症的个体的正常范围内可接受的水平。在一些实施方案中，“较低”是指罹患疾病的受试者的标志物或症状的水平与个体的正常范围内可接受的水平之间的差异减小，例如，肥胖个体与具有正常范围内可接受体重的个体之间的体重降低的水平。
如本文所用，“预防(过程)”或“(进行)预防”，当用于形容疾病、病症或其病况可通过降低PNPLA3基因的表达来治疗或改善时，是指受试者出现与此疾病、病症、或病况相关的症状的可能性的降低，例如，不期望的或过度的PNPLA3表达的症状，例如hedgehog信号转导途径中蛋白质水平升高、脂肪肝(脂肪变性)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝脏中脂肪累积、肝脏炎症、肝细胞的坏死、肝脏纤维化、肥胖症、或非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。发展成例如NAFLD的可能性被降低，例如，具有一个或多个NAFLD风险因子的个体相对于具有相同风险因子并且未接受本文所述的治疗的群体，不发展成NAFLD，或者发展为严重程度较低的NAFLD。未发展疾病、病症或病况，或与此疾病、病症或病况相关症状的发展降低(例如，在该疾病或病症的临床可接受量表降低至少约10％)、或展现出延迟的症状(例如延迟数天、数周、数个月或数年)被认为是有效的预防。
如本文所用，术语“含类PATATIN磷脂酶结构域3相关疾病”或“PNPLA3相关疾病”，是由PNPLA3基因表达或PNPLA3蛋白质产生所引起的或与其相关的疾病或病症。术语“PNPLA3相关疾病”包含将受益于PNPLA3基因表达、复制或蛋白质活性的降低的疾病、病症或病况。PNPLA3相关疾病的非限制性实例包含，例如，脂肪肝(脂肪变性)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝脏中脂肪累积、肝脏炎症、肝细胞的坏死、肝脏纤维化、肥胖症、或非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。在另一个实施方案中，PNPLA3相关疾病是非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。在另一个实施方案中，PNPLA3相关疾病是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。在另一个实施方案中，PNPLA3相关疾病是肝硬化。在另一个实施方案中，PNPLA3相关疾病是胰岛素抗性。在另一个实施方案中，PNPLA3相关疾病不是胰岛素抗性。在一个实施方案中，PNPLA3相关疾病是肥胖症。
在一个实施方案中，PNPLA3相关疾病是非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。如本文所用，“非酒精性脂肪肝疾病”与术语“NAFLD”互换使用，是指如下定义的疾病：每天摄入少于20克酒精，仍存在大血管的脂肪变性。NAFLD是美国最常见的肝脏疾病，通常与胰岛素抗性/二型糖尿病和肥胖症相关。NAFLD表征为脂肪变性、脂肪性肝炎、肝硬化，有时还有肝细胞癌。有关NAFLD的综述文章，请参见Tolman and Dalpiaz(2007)Ther.Clin.Risk.Manag.,3(6):1153-1163，其全部内容通过引用并入本文。
“治疗有效量”，如本文所用，意在包含，当施用给具有PNPLA3相关疾病受试者时，足以实现该疾病治疗的RNAi剂的量(例如，通过减轻、改善或维持现有疾病或一种或更多种疾病症状)。“治疗有效量”可以根据RNAi剂、剂的施用方式、疾病及其严重程度以及待治疗受试者的病史、年龄、体重、家族史、遗传构成、既往治疗或伴随治疗的类型(如果有)、和其他个体特征而变化。
“预防有效量”，如本文所用，意在包含，当施用给具有PNPLA3相关病症受试者时，足以预防或改善该疾病或一种或更多种疾病症状的RNAi剂的量。改善疾病包含减缓该疾病的进程或降低后发疾病的严重程度。“预防有效量”可以根据RNAi剂、剂的施用方式、疾病的风险程度、以及待治疗受试者的病史、年龄、体重、家族史、遗传构成、既往治疗或伴随治疗的类型(如果有)、其他个体特征而变化。
“治疗有效量”或“预防有效量”还包含以适用于任何治疗的合理的效益/风险比率而产生一些预期效果的RNAi剂的量。本发明方法中所使用的iRNA可以足够的剂量施用以产生适用于这种治疗的合理的效益/风险比率。
本文所使用的短语“药学上可接受的”是指，在合理的医学判断范围内，适合用于与人类受试者和动物受试者的组织接触的那些化合物、材料、组合物、或剂型，而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应、或其他问题或并发症，即符合合理的效益/风险比。
本文所用的短语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料，组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如，润滑剂、滑石粉、硬脂酸钙或硬脂酸锌、或硬脂酸)或溶剂封装材料，涉及将受试化合物从一个器官或身体的一部分携带或运输到另一器官或身体的另一部分。每种载体必须是“可接受的”，在与制剂的其他成分兼容并且对被治疗的受试者无害的意义上。这样的载体是本领域已知的。药学上可接受的载体包含用于注射给药的载体。
如本文所用，术语“样本”包含从受试者分离出的相似的体液、细胞或组织的集合，以及存在于受试者体内的体液，细胞或组织的集合。生物学体液的实例包括血液、血清和浆膜液、血浆、脑脊髓液、眼液、淋巴液、尿液、唾液等。组织样本可包含来自组织、器官或局部区域的样本。例如，样本可以源自器官、器官的一部分、或那些器官内的液体或细胞。在一些实施方案中，样本可以来自肝脏(例如，全肝或肝脏的特定区段或肝脏中特定类型的细胞，例如，肝细胞)。在某些实施方案中，“源自受试者的样本”是指从受试者获得的尿液。“源自受试者的样本”可指来自受试者的血液或源自血液的血清或血浆。
II.本发明的iRNA
本发明提供了抑制PNPLA3基因表达的iRNA。在优选的实施方案中，iRNA包含双链核糖核酸(dsRNA)分子，用于抑制PNPLA3基因在细胞中的表达，比如受试者内的细胞，例如哺乳动物，比如易患PNPLA3相关病症(例如高三酸甘油酯血症)的人。dsRNAi剂包含具有互补性区域的反义链，该互补性区域与PNPLA3基因表达时所形成的mRNA的至少一部分是互补的。互补性区域约为19-30个核苷酸的长度(例如，约为30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、或19个核苷酸的长度)。当与表达PNPLA3基因的细胞接触时，经测定iRNA抑制PNPLA3基因(例如，人、灵长类、非灵长类、或大鼠的PNPLA3基因)表达的程度为至少约50％，例如，通过PCR或基于分支DNA(bDNA)的方法，或通过基于蛋白质的方法，诸如通过免疫荧光分析，使用例如，蛋白印迹法或流式细胞术进行测定。在优选的实施方案中，通过本文实施例中所提供的qPCR方法用例如10nM浓度的siRNA在其中提供的适当生物细胞系中确定的表达抑制。在优选的实施方案中，体内表达的抑制是通过敲低在表达人基因的啮齿动物(例如，表达人靶基因的小鼠或AAV(腺相关病毒)感染的小鼠)中的人基因来确定，例如，当以单次剂量给药时，例如，在RNA表达的最低点时以3mg/kg给药。
dsRNA包含二条互补的RNA链，并且在使用dsRNA的条件下杂交形成双链体结构。dsRNA的一条链(反义链)包含互补性区域，该互补性区域与靶序列是基本互补的，并且通常是完全互补的。靶序列可以源自在PNPLA3基因表达期间所形成的mRNA序列。另一条链(有义链)包含与反义链互补的区域，使得双链在适当条件下结合时杂交并形成双链体结构。如本文其他部分所述和本领域已知的，dsRNA所含的互补序列也可以作为单个核酸分子的自身互补区，而非位于分开的寡核苷酸上。
一般地，双链体结构是15到30个碱基对的长度，例如，15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、或21-22个碱基对的长度。在一些优选实施方案中，双链体结构是18到25个碱基对的长度，例如，18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-25、21-24、21-23、21-22、22-25、22-24、22-23、23-25、23-24或24-25个碱基对的长度，例如，19-21个碱基对的长度。介于以上所列举的范围和长度中间的范围和长度也被认为是本公开的一部分。
相似地，靶序列的互补性区域是15到30个核苷酸的长度，例如，15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24,20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、或21-22个核苷酸的长度，例如19-23核苷酸的长度或21-23核苷酸的长度。介于以上所列举的范围和长度中间的范围和长度也被认为是本公开的一部分。
在某些实施方案中，双链体结构是19到30个碱基对的长度。相似地，靶序列的互补性区域是19到30个核苷酸的长度。
在某些实施方案中，dsRNA是约19到约23个核苷酸的长度，或约25到约30个核苷酸的长度。一般地，dsRNA足够长而可作为Dicer酶的底物。例如，在本领域中众所周知，长度长于约21-23个核苷酸的dsRNA可作为Dicer的底物。作为本领域技术人员还认识到，靶向裂解的RNA区域通常会是较大RNA分子(通常是mRNA分子)的一部分。如果有需要，mRNA靶标的一“部分”是mRNA靶标的连续序列，其足够长从而允许其成为RNAi-导向裂解(即，通过RISC途径的裂解)的底物。
本领域技术人员还认识到，双链体区是dsRNA的主要功能部分，例如，约19至约30个碱基对的双链体区域，例如，约19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24,20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、或21-22个碱基对。因此，在一个实施方案中，当其被加工成为靶向所期望用于裂解的RNA的功能性双链体(例如15-30个碱基对)的程度时，则具有多于30个碱基对的双链体区域的RNA分子或多RNA分子的复合体是dsRNA。因此，普通本领域技术人员将认识到在一个实施方案中，miRNA是dsRNA。在另一个实施方案中，dsRNA不是天然存在的miRNA。在另一个实施方案中，通过裂解较大的dsRNA并未在靶细胞中生成用于靶向PNPLA3基因表达的iRNA剂。
如本文所述的dsRNA可以进一步地包含一个或多个单链核苷酸突出，例如1-4、2-4、1-3、2-3、1、2、3、或4个核苷酸(的突出)。具有至少一个核苷酸突出的dsRNA可比起其钝端的对应物具有更好的抑制特性。核苷酸突出可以包括核苷酸/核苷类似物(包含脱氧核苷酸/核苷)或由核苷酸/核苷类似物组成。突出可以位于有义链，反义链或其任何组合上。进一步地，突出的核苷酸可以存在于dsRNA的反义链或有义链的5'端，3'端或两端。
dsRNA可以通过本领域已知的标准方法合成。本发明的双链RNAi化合物可以使用两步法来制备。首先，分别制备双链RNA分子的两条单链。然后，将组成链退火。siRNA化合物的单链可使用溶液相或固相有机合成或两者来制备。有机合成的优点是可以容易地制备包括非天然或修饰过的核苷酸的寡核苷酸链。类似地，本发明的单链寡核苷酸可以使用溶液相或固相有机合成或两者来制备。
在一个方面，本发明的dsRNA包含至少两个核苷酸序列，有义序列和反义序列。有义链选自表2-11、21、24、27、30、32、33、36、37、49或50中任何一表所提供的序列的组，并且有义链的对应反义链选自表2-11、21、24、27、30、32、33、36、37、49或50中任何一表所提供的序列的组。在此方面，两个序列中的一个与该两个序列中的另一个序列是互补的，其中一个序列与在PNPLA3基因表达中生成的mRNA序列是基本互补的。因此，在此方面，dsRNA将包含两个寡核苷酸，其中一个寡核苷酸在表2-11、21、24、27、30、32、33、36、37、49或50的任一表中被描述为有义链，而第二个寡核苷酸在表2-11、21、24、27、30、32、33、36、37、49或50的任一表中被描述为有义链的对应反义链。
在一些实施方案中，dsRNA的基本互补的序列包含在分开的寡核苷酸中。在其他实施方案中，dsRNA的基本互补的序列包含在单个寡核苷酸中。
在一些实施方案中，有义链或反义链是选自下列任一双链体的有义链或反义链：AD-517197.2、AD-517258.2、AD-516748.2、AD-516851.2、AD-519351.2、AD-519754.2、AD-519828.2、AD-520018.2、AD-520035.2、AD-520062.2、AD-520064.2、AD-520065.2、AD-520067.2、AD-75289.2、AD-520069.2、AD-520099.2、AD-67575.7、AD-520101.2、AD-1193323.1、AD-1193344.1、AD-1193350.1、AD-1193365.1、AD-1193379.1、AD-1193407.1、AD-1193421.1、AD-1193422.1、AD-1193429.1、AD-1193437.1、AD-1193443.1、AD-1193471.1、AD-1193481.1或AD-67605.7。
在某些实施方案中，有义链或反义链是选自下列任一双链体的有义链或反义链：AD-519345.1、AD-519346.1、AD-519347.1、AD-67554.7、AD-519752.3、AD-1010731.1、AD-1010732.1、AD-519343.1、AD-519344.1、AD-519349.1、AD-519350.1、AD-519753.2、AD-519932.1、AD-519935.2、AD-520018.6、AD-517837.2、AD-805635.2、AD-519329.2、AD-520063.2、AD-519757.2、AD-805631.2、AD-516917.2、AD-516828.2、AD-518983.2、AD-805636.2、AD-519754.7、AD-520062.2、AD-67575.9、AD-518923.3、AD-520053.4、AD-519667.2、AD-519773.2、AD-519354.2、AD-520060.4、AD-520061.4、AD-1010733.2、AD-1010735.2、AD-1193323.1、AD-1193344.1、AD-1193350.1、AD-1193365.1、AD-1193379.1、AD-1193407.1、AD-1193421.1、AD-1193422.1、AD-1193429.1、AD-1193437.1、AD-1193443.1、AD-1193471.1、或AD-1193481.1。
在某些实施方案中，有义链或反义链是选自下列任一双链体的有义链或反义链：AD-519345.1、AD-1193350.1、AD-1193365.1、AD-1193437.1、和AD-519347.1。
在某些实施方案中，有义链或反义链是选自双链体AD-519351的有义链或反义链。
在一个实施方案中，有义链或反义链是选自双链体AD-1193350的有义链或反义链。
在一个实施方案中，有义链或反义链是选自双链体AD-1193365的有义链或反义链。
在一个实施方案中，有义链或反义链是选自双链体AD-1193437的有义链或反义链。
在一个实施方案中，有义链或反义链是选自双链体AD-519347的有义链或反义链。
应理解，尽管例如表3、5、7、9、11、21、24、27、30、32、36和50中的序列未被描述为经修饰的或缀合的序列，但是本发明的iRNA的RNA，例如本发明的dsRNA，可以包括表2-11、21、24、27、30、32、33、36、37、49或50中任一表所列出的任何一个未修饰的，未缀合的，或与本文所述不同的经修饰的或缀合的序列。换句话说，本发明包括表2-11、21、24、27、30、32、33、36、37、49或50的dsRNA，如本文所述它们是未修饰的、未缀合的、经修饰的、或经缀合的。
本领域技术人员已知，具有约20至23个碱基对，例如21个碱基对，的双链体结构的dsRNA被认为在诱导RNA干扰方面特别有效(Elbashir et al.,EMBO2001,20:6877-6888)。然而，其他人已发现较短或较长的RNA双链体结构也可以是有效的(Chu and Rana(2007)RNA 14:1714-1719；Kim et al.(2005)Nat Biotech23:222-226)。在上述实施方案中，由于表2-11、21、24、27、30、32、33、36、37、49或50中任一表所提供的寡核苷酸序列的自然性质。本文所述的dsRNA可以包含至少一条长度至少为21个核苷酸的链。可以合理预期，具有表2-11、21、24、27、30、32、33、36、37、49或50中任一表的任一序列且在该序列的一端或两端仅减去几个核苷酸的较短的双链体，与上述dsRNA相比可以同样有效。因此，具有来源于表2-11、21、24、27、30、32、33、36、37、49或50中任一表的任一序列的至少19、20、或更多个连续核苷酸的序列的dsRNA，并且其在抑制PNPLA3基因表达的能力方面与包括全长序列的dsRNA的相差不超过5、10、15、20、25、或30％，则该dsRNA被认为在本发明的范围内。
此外，表2-11、21、24、27、30、32、33、36、37、49或50中所提供的RNA识别了PNPLA3转录本中容易受RISC-介导裂解的一个或多个位点。因此，本发明进一步地描述了靶向这些位点之一内的iRNA。如本文所用，如果iRNA促进在该转录本的那个特定位点内的任何地方促进转录本的裂解，则可称该iRNA靶向RNA转录本的特定位点内，。这样的iRNA通常将包含来自表2-11、21、24、27、30、32、33、36、37、49或50中任一表的任一序列的至少约19个连续核苷酸，且该至少约19个连续核苷酸与取自PNPLA3基因中与所选序列相邻的区域的额外的核苷酸序列偶联。
III.本发明的经修饰iRNA
在一些实施方案中，本发明的iRNA的RNA，例如dsRNA，是未修饰的，并且不包括例如本领域已知的和本文所述的化学修饰或缀合。在其他实施方案中，本发明的iRNA的RNA，例如dsRNA，经化学修饰以增强稳定性或其他有益的特性。在本发明的某些实施方案中，本发明的iRNA的基本上所有的核苷酸都经修饰。在本发明的其他实施方案中，iRNA的所有核苷酸或iRNA的基本上所有的核苷酸都被修饰，即，在iRNA的链中存在不超过5、4、3、2或1个未修饰的核苷酸。
本发明中所描述的核酸可以通过本领域已完善建立的方法来合成或修饰，例如在“Current protocols in nucleic acid chemistry”,S.L.et al.(Edrs.),John Wiley&Sons,Inc.,New York,NY,USA中所描述的那些方法，其通过引用并入本文。修饰包含，例如末端修饰，例如5’端修饰(磷酸化、缀合、反向键联)或3’端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向键联等)；碱基修饰，例如，用如下碱基进行替换：稳定碱基、去稳定碱基、与扩展的配偶体库进行碱基配对的碱基、移除碱基(无碱基核苷酸)或经缀合的碱基；糖修饰(例如，在2'-位置或4'-位置)或糖替换；或主链修饰，包含磷酸二酯键的修饰或替换。可用于本文所述的实施方案中的iRNA化合物的具体实例包含，但不限于含有修饰主链的RNA或不含天然核苷间键合的RNA。具有经修饰主链的RNA包含，尤其是，那些在主链中没有磷原子的RNA。为了本说明书的目的，并且如本领域中有时提及的，在其核苷间主链中不具有磷原子的经修饰RNA也可以被认为是寡核苷。在某些实施方案中，经修饰iRNA在其核苷间主链将具有磷原子。
经修饰RNA主链包含，例如硫代磷酸酯，手性硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，磷酸三酯，氨基烷基磷酸三酯，甲基和其他烷基膦酸酯包含3'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯，次膦酸酯，氨基磷酸酯包含3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯，硫羰基氨基磷酸酯，硫羰基烷基膦酸酯，硫羰基烷基磷酸三酯，和具有正常的3'-5'键、2'-5'-链接类似物者的硼代磷酸酯，以及其中相邻的核苷单元对是以3'-5'链接至5'-3'或2'-5'至5'-2'的具有极性反转者。也包含各种盐、混合的盐和游离酸的形式。在本发明的一些实施方案中，本发明的dsRNA剂为游离酸的形式。在本发明的其他实施方案中，本发明的dsRNA剂为盐的形式。在一个实施方案中，本发明的dsRNA剂为钠盐的形式。在一些实施方案中，当本发明的dsRNA剂为钠盐形式时，钠离子作为存在于剂中的基本上所有的磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基团的抗衡离子而存在于剂中。其中基本上所有的磷酸二酯和/或硫代磷酸酯键都具有钠抗衡离子的剂包含不超过5、4、3、2或1个没有钠抗衡离子的磷酸二酯和/或硫代磷酸酯键。在某些实施方案中，当本发明的dsRNA剂为钠盐形式时，钠离子作为剂中存在的所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基团的抗衡离子存在于剂中。
教导制备上述含磷键的代表性美国专利包括但不限于：美国专利3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,195；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,316；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,625,050；6,028,188；6,124,445；6,160,109；6,169,170；6,172,209；6,239,265；6,277,603；6,326,199；6,346,614；6,444,423；6,531,590；6,534,639；6,608,035；6,683,167；6,858,715；6,867,294；6,878,805；7,015,315；7,041,816；7,273,933；7,321,029；以及美国专利RE39464，在此通过引用将其每个专利的全部内容并入本文。
其中不含磷原子的经修饰RNA主链具有由如下物质形成的主链：短链烷基或环烷基核苷间键合、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键合、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键合。这些主链包含具有吗啉键(部分由核苷的糖部分形成)的那些主链；硅氧烷主链；硫化物，亚砜和砜主链；甲酰乙酰基(formacetyl)和硫代甲酰乙酰基主链；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；含烯烃的主链；氨基磺酸主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸盐和磺酰胺主链；酰胺主链；以及具有混合了N、O、S、和CH2组成成分的其他主链。
教导制备上述寡核苷酸的代表性美国专利包括但不限于：美国专利5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,64,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439，在此通过引用将其每个专利的全部内容并入本文。
合适的RNA模拟物预期可用于本文所提供的iRNA，其中核苷酸单元的糖和核苷间键合即主链，均被新基团所替换。碱基单元维持不变以便与适当的核酸靶化合物进行杂交。这样的寡聚化合物被称为肽核酸(PNA)，其中的RNA模拟物已显示出具有良好杂交特性。在PNA化合物中，RNA的糖主链被含有酰胺的主链，特别是氨乙基甘氨酸主链，所替换。核碱基被保留并直接或间接结合到主链之酰胺部分的氮杂氮原子。教示教导制备PNA化合物的代表性美国专利包括但不限于：美国专利5,539,082；5,714,331；和5,719,262，在此通过引用将其每个专利的全部内容并入本文。适用于本发明的iRNA的其他PNA化合物描述于例如Nielsen et al.,Science,1991,254,1497-1500。
本发明描述的一些实施方案包含具有硫代磷酸酯主链的RNA和具有杂原子主链的寡核苷，特别是--CH2--NH--CH2-，--CH2--N(CH3)--O--CH2--[称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链]，--CH2--O--N(CH3)--CH2--，--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--和--N(CH3)--CH2--CH2--[其中原生的磷酸二酯主链表示为--O--P--O--CH2--](以上引用的美国专利5,489,677)，和以上引用的美国专利5,602,240的酰胺主链。在某些实施方案中，本文描述的RNA具有以上引用的美国专利5,034,506的N-吗啉主链结构。
经修饰RNA也可以含有一个或多个取代的糖部分。本文描述的iRNA，例如dsRNA可以在2'-位置包含以下之一：OH；F；O-、S-、或N-烷基；O-、S-、或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中该烷基、烯基和炔基可以是经取代的或未经取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。合适的示例性修饰包含O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2,O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m为1至约10。在其他实施方案中，dsRNA在2'-位置包含以下之一：C1至C10低碳数烷基、经取代的低碳数烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基，SH,SCH3，OCN，Cl，Br，CN，CF3，OCF3，SOCH3，SO2CH3，ONO2，NO2，N3，NH2，杂环烷基，杂环烷芳基，氨基烷基氨基，聚烷基氨基，取代的硅烷基，RNA裂解基团，报导基团，嵌入剂，用于改善iRNA药物代谢动力学特性的基团，或用于改善iRNA药效动力学特性的基团，以及其他具有类似特性的取代基团。在某些实施方案中，修饰包含2'-甲氧基乙氧基(2'-O--CH2CH2OCH3，也称为2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)(Martin et al.,Helv.Chim.Acta,1995,78:486-504)即，烷氧基-烷氧基基团。另一个示例性的修饰是2'-二甲基氨基氧基乙氧基，即，O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2'-DMAOE，如以下本文实施例所述，和2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基(本领域中也称为2'-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2'-DMAEOE)，即，2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2。进一步的示例性修饰包含:5’-Me-2’-F核苷酸，5’-Me-2’-OMe核苷酸，5’-Me-2’-脱氧核苷酸(这三个家族中的R和S异构体)；2’-烷氧基烷基；和2’-NMA(N-甲基乙酰胺)。
其他修饰包含2'-甲氧基(2'-OCH3)、2'-氨基丙氧基(2'-OCH2CH2CH2NH2)和2'-氟基(2'-F)。也可在iRNA的RNA的其他位置进行类似的修饰，特别是3'末端核苷酸的糖的3'位置或2'-5'链接的dsRNA中的糖的3'位置，以及5'末端核苷酸的5'位置。iRNA也可具有糖模拟物比如环丁基部分体来代替戊呋喃糖基糖。教导制备此类修饰糖结构的代表性美国专利包括但不限于：4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；和5,700,920，其中一些是与本申请所共有的。在此通过引用将前面每个专利的全部内容并入本文。
iRNA也可包含核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用，“未修饰的”或“天然的”核碱基包含嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、和尿嘧啶(U)。经修饰核碱基包含其他合成的和天然的核碱基，例如脱氧-胸腺嘧啶(dT)、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基的衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和5-卤代胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶和6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(伪尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-硫醇基、8-硫代烷基、8-羟基以及其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代、特别是5-溴代、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。进一步地核碱基包含：美国专利编号3,687,808中所公开的那些，Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijn,P.ed.Wiley-VCH,2008中所公开的那些；The Concise Encyclopedia OfPolymer Science And Engineering,pages858-859,Kroschwitz,J.L,ed.John Wiley&Sons,1990中所公开的那些，Englisch et al.,Angewandte Chemie,InternationalEdition,1991,30,613中所公开的这些，以及Sanghvi,Y S.,Chapter 15,dsRNA Researchand Applications,pages 289-302,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Ed.,CRC Press,1993中所公开的那些。这些核碱基中的某些对于增加本发明描述的寡聚化合物的结合亲和力特别有用。这些包含5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包含2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已显示5-甲基胞嘧啶的取代将核酸双链体的稳定性提高0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Eds.,dsRNA Researchand Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278)，并且是示例性的碱基取代，甚至更特别是当与2'-O-甲氧基乙基糖修饰结合时。
教导制备上述修饰核碱基以及其他修饰核碱基的代表性美国专利，包括但不限于上面提到的3,687,808,4,845,205；5,130,30；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121,5,596,091；5,614,617；5,681,941；5,750,692；6,015,886；6,147,200；6,166,197；6,222,025；6,235,887；6,380,368；6,528,640；6,639,062；6,617,438；7,045,610；7,427,672；和7,495,088，其每个专利的全部内容在此通过引用并入本文。
iRNA的RNA也可以被修饰以包含一个或多个锁核酸(LNA)。锁核酸是具有经修饰核糖部分的核苷酸，其中的核糖部分包括连接2'和4'碳的额外的桥。此结构有效地将核糖“锁”在3'-内部结构构象中。已显示给siRNA添加锁核酸可增加siRNA在血清中的稳定性，并可降低脱靶效应(Elmen,J.et al.,(2005)Nucleic Acids Research 33(1):439-447；Mook,OR.et al.,(2007)Mol Canc Ther 6(3):833-843；Grunweller,A.et al.,(2003)Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193)。
在某些实施方案中，iRNA的RNA也可以被修饰成为包含一个或多个双环糖部分。“双环糖”是被两个原子间的桥接所修饰的呋喃糖基环。“双环核苷”(“BNA”)是具有糖部分的核苷，且该糖部分包括连接糖环的两个碳原子的桥，从而形成双环的环系统。在一些实施方案中，桥连接糖环的4'-碳和2'-碳。因此，在一些实施方案中本发明的剂可以包括一个或多个锁核酸(LNA)。锁核酸是具有经修饰核糖部分的核苷酸，其中的核糖部分包括连接2'和4'碳的额外的桥。换句话说，LNA是包括双环糖部分的核苷酸，且该双环糖部分包括4'-CH2-O-2'桥。此结构有效地将核糖“锁定”在3'-内部结构构象中。已显示给siRNA添加锁核酸可增加siRNA在血清中的稳定性，并可降低脱靶效应(Elmen,J.et al.,(2005)Nucleic AcidsResearch 33(1):439-447；Mook,OR.et al.,(2007)Mol Canc Ther 6(3):833-843；Grunweller,A.et al.,(2003)Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193)。用于本发明的多核苷酸的双环核苷的实例包含但不限于在4′和2′核糖基环原子之间包含桥的核苷。在一些实施方案中，本发明的反义多核苷酸剂包含一个或多个双环核苷，该双环核苷包括4′至2′的桥。此类4'至2'桥接的双环核苷的实例包括但不限于：4′-(CH2)—O-2′(LNA)；4′-(CH2)—S-2′；4′-(CH2)2—O-2′(ENA)；4′-CH(CH3)—O-2′(也被称为“限制性乙基”或“cEt”)和4′-CH(CH2OCH3)—O-2′(及其类似物；参见例如美国专利7,399,845)；4′-C(CH3)(CH3)—O-2′(及其类似物；参见例如美国专利8,278,283)；4′-CH2—N(OCH3)-2′(及其类似物；参见例如美国专利8,278,425)；4′-CH2—O—N(CH3)-2′(参见例如美国专利公开号2004/0171570)；4′-CH2—N(R)—O-2′,其中R是H,C1-C12烷基,或保护基团(参见例如美国专利7,427,672)；4′-CH2—C(H)(CH3)-2′(参见例如Chattopadhyaya et al.,J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；以及4′-CH2—C(═CH2)-2′(及其类似物；参见例如美国专利8,278,426)。前述各项的全部内容在此通过引用并入本文。
教导制备锁核酸核苷酸的另外的代表性美国专利和美国专利公开，包括但不限于以下：美国专利6,268,490；6,525,191；6,670,461；6,770,748；6,794,499；6,998,484；7,053,207；7,034,133；7,084,125；7,399,845；7,427,672；7,569,686；7,741,457；8,022,193；8,030,467；8,278,425；8,278,426；8,278,283；US2008/0039618；和US 2009/0012281，前述各项的全部内容在此通过引用并入本文。
可以制备具有一种或多种立体化学糖构型，包含例如α-L-呋喃核糖和β-D-呋喃核糖(参见WO 99/14226)的任何前述双环核苷。
iRNA的RNA也可以被修饰成为包含一个或多个限制性乙基核苷酸。如本文所用，“限制性乙基核苷酸”或“cEt”是包括双环糖部分的锁核酸，该双环糖部分包括4'-CH(CH3)-O-2'桥。在一个实施方案中，限制性乙基核苷酸为S构象在本文中称为“S-cEt”。
本发明的iRNA还可以包含一个或多个“构象限制性核苷酸”(“CRN”)。CRN是核苷酸类似物，其带有连接核糖的C2'和C4'碳原子或核糖的C3和-C5'碳原子的接头。CRN将核糖环锁定为稳定的构象并增加了对mRNA的杂交亲和力。接头具有足够的长度以将氧放置在最佳的位置以获得稳定性和亲和力，从而减少核糖环的起皱(puckering)。
教导制备上述CRN的代表性文献包括但不限于：美国专利公开2013/0190383；以及PCT公开WO 2013/036868，每一个文献的全部内容在此通过引用并入本文。
在某些实施方案中，本发明的iRNA包括一种或多种为UNA(未锁核酸)核苷酸的单体。UNA是未锁的无环核酸，其中糖的任何键均已被去除，形成未锁定的“糖”残基。在一个实施例中，UNA也涵盖C1'-C4'之间的键已被去除的单体(即C1'和C4'碳之间的共价碳-氧-碳键)。在另一个实施例中，糖的C2'-C3'键(即C2'和C3'碳之间的共价碳-碳键)已被去除(参见Nuc.Acids Symp.Series,52,133-134(2008)和Fluiter et al.,Mol.Biosyst.,2009,10,1039通过引用并入本文)。
教导制备UNA的代表性美国文献包含但不限于美国专利8,314,227；和美国专利公开2013/0096289；2013/0011922；和2011/0313020，其各项的全部内容在此通过引用并入本文。
潜在的对RNA分子末端的稳定化修饰可以包含N-(乙酰氨基己酰基)-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6-NHAc)、N-(己酰基-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6)、N-(乙酰基-4-羟基脯氨醇(Hyp-NHAc)、胸腺嘧啶-2'-0-脱氧胸腺嘧啶(醚)、N-(氨基己酰基)-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6-amino)、2-二十二碳酰基-尿苷-3"-磷酸、倒置碱基dT(idT)及其他。该修饰的公开可在见PCT公开案WO 2011/005861中找到。
本发明的iRNA的核苷酸的其他修饰包含5’磷酸或5’磷酸模拟物，例如，iRNA的反义链上的5’-末端磷酸或磷酸模拟物。合适的磷酸模拟物在例如美国专利公开案2012/0157511中公开，其全部内容通过引用在此并入本文。
A.经修饰iRNA包括本发明的模体
在本发明的某些方面，本发明的双链RNA剂包含有化学修饰的剂，如例如WO2013/075035中所公开的，其各项的全部内容在此通过引用并入本文。WO2013/075035提供了dsRNAi剂的有义链或反义链中的三个连续核苷酸上的三个相同的修饰模体，特别是在裂解位点处或其附近。在某些实施方案中，dsRNAi剂的有义链和反义链可以被完全修饰。这些模体的引入中断了有义链或反义链的修饰模式，如果存在模式的话。dsRNAi剂可以任选地与GalNAc衍生物配体缀合，例如在有义链上。
更具体地，当双链RNA剂的有义链和反义链被完全修饰成为在dsRNAi的至少一条链的裂解位点处或其附近的三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个或多个模体时，观察到了dsRNAi剂的基因沉默活性。
因此，本发明提供了能够在体内抑制靶基因(即PNPLA3基因)表达的双链RNA剂。RNAi剂包括有义链和反义链。RNAi剂的每条链的长度可以是例如，17-30个核苷酸的长度、25-30个核苷酸的长度、27-30个核苷酸的长度、19-25个核苷酸的长度、19-23个核苷酸的长度、19-21个核苷酸的长度、21-25个核苷酸的长度、或21-23个核苷酸的长度。
有义链和反义链通常形成双链体的双链RNA(“dsRNA”)，本文中也称为“dsRNAi剂”。dsRNAi剂的双链体区域可以是，例如，双链体区域的长度可以是27-30个核苷酸对的长度、19-25个核苷酸对的长度、19-23个核苷酸对的长度、19-21个核苷酸对的长度、21-25个核苷酸对的长度或21-23个核苷酸对的长度。在另一个实例中，双链体区域的长度选自19、20、21、22、23、24、25、26、和27个核苷酸。
在一些实施方案中，dsRNAi剂可以在一条链或两条链的3'端、5'端或两端含有一个或多个突出区域或加帽基团。突出可以独立地为1-6个核苷酸的长度，例如2-6个核苷酸的长度、1-5个核苷酸的长度、2-5个核苷酸的长度、1-4个核苷酸的长度、2-4个核苷酸的长度、1-3个核苷酸的长度、2-3个核苷酸的长度、或1-2个核苷酸的长度。在一些实施方案中，突出区域可以包含如上所述的延伸的突出区域。突出可以是一条链长于另一条链的结果，或是相同长度的双链错开的结果。突出可以与靶mRNA形成错配，或可以与被靶向的基因序列互补或可以是另一个序列。第一链和第二链也可以连接,例如通过另外的碱基以形成发夹，或通过其他非碱基的接头。
在一些实施方案中，dsRNAi剂的突出区域中的核苷酸可以各自独立地是经修饰或未修饰的核苷酸，其包含但不限于，2’-糖修饰，例如2’-氟基、2’-O-甲基、胸苷(T)、2`-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(Teo)、2`-O-甲氧基乙基腺苷(Aeo)、2`-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷(m5Ceo)及其任意组合。
例如，TT可以是任一条链的任一端的突出序列。突出可以与靶mRNA形成错配，或者可以与目标基因序列互补或可以是另一个序列。
dsRNAi剂的有义链、反义链、或双链的5’-或3’-突出可以被磷酸化。在某些实施方案中，一个或多个突出区域含有两个核苷酸，这两个核苷酸之间有硫代磷酸酯，其中两个核苷酸可以相同或不同。在某些实施方案中，突出存在于有义链，反义链或双链的3’-端。在某些实施方案中，该3’-突出存在于反义链。在某些实施方案中，该3’-突出存在于有义链。
dsRNAi剂可以仅含有单个突出，其可强化RNAi的干扰活性，而不影响它的整体稳定性。例如，单链突出可以位于有义链的3'-端，或着，位于反义链的3'-端。RNAi亦可具有钝端，位于反义链的5'-端(或有义链的3'-端)或相反亦然。通常，dsRNAi剂的反义链具有在3'-端的核苷酸突出，并且5'-端为钝端。不希望被理论束缚，反义链的5'-端的不对称钝端和反义链的3'-端突出有利于将引导链加载到RISC过程中。
在一些实施方案中，dsRNAi剂为19个核苷酸长度的双端钝体，其中有义链含有至少一个模体，该模体为在离5'端的7、8、9位置的三个连续核苷酸上的三个2’-氟基修饰。反义链含有至少一个模体，该模体为在离5'端的11、12、13位置的三个连续核苷酸上的三个2’-O-甲基修饰。
在其他的实施方案中，dsRNAi剂为20个核苷酸长度的双端钝体，其中有义链含有至少一个模体，该模体为在离5'端的8、9、10位置的三个连续核苷酸上的三个2’-氟基修饰。反义链含有至少一个模体，该模体为在离5'端的11、12、13位置的三个连续核苷酸上的三个2’-O-甲基修饰。
在其他的实施方案中，dsRNAi剂为21个核苷酸长度的双端钝体，其中有义链含有至少一个模体，该模体为在离5'端的9、10、11位置的三个连续核苷酸上的三个2’-氟基修饰。反义链含有至少一个模体，该模体为在离5'端的11、12、13位置的三个连续核苷酸上的三个2’-O-甲基修饰。
在一些实施方案中，dsRNAi剂包括21个核苷酸的有义链和23个核苷酸的反义链，其中有义链含有至少一个模体，该模体为在离5'端的9、10、11位置的三个连续核苷酸上的三个2’-氟基修饰；该反义链含有至少一个模体，该模体为在离5'端的11、12、13位置的三个连续核苷酸上的三个2’-O-甲基修饰，其中RNAi剂的一端是钝的，而另一端包括2个核苷酸的突出。优选地，该2个核苷酸的突出是在反义链的3’-端。
当前述2个核苷酸的突出位于反义链的3'-端时，则末端三个核苷酸之间可以有两个硫代磷酸酯核苷酸间键合，其中三个核苷酸中的两个是突出核苷酸，而第三个核苷酸是紧邻突出核苷酸的成对的核苷酸。在一个实施方案中，RNAi剂在有义链的5’-端和反义链的5’-端的末端三个核苷酸之间另外具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键合。在一些实施方案中，dsRNAi剂的有义链和反义链中的每个核苷酸，包含作为模体一部分的核苷酸，都是经修饰的核苷酸。在实施方案中，每个残基均独立地被2’-O-甲基或3’-氟基修饰，例如在交替模体中。可选地，dsRNAi剂进一步地包括配体(优选GalNAc3)。
在一些实施方案中，dsRNAi剂包括有义链和反义链。其中有义链是25-30个核苷酸残基的长度，其中从5'末端核苷酸(位置1)开始，第一条链的位置1至23包括至少8个核糖核苷酸；反义链是36-66个核苷酸残基的长度，且从3'末端核苷酸开始，与有义链位置1至23配对而形成双链体的那些位置包括至少8个核糖核苷酸；其中至少反义链的3'末端核苷酸与有义链不配对，并且最多达6个连续的3'末端核苷酸与有义链不配对，从而形成1-6个核苷酸的3'单链突出；其中反义链的5'末端包括来自与有义链不配对的10-30个连续核苷酸，从而形成10-30个核苷酸的单链5'突出；其中当有义链和反义链对齐以达到最大互补性时，至少有义链的5'末端和3'末端的核苷酸与反义链的核苷酸碱基配对，从而在有义链和反义链之间形成基本上是双链体的区域；并且反义链沿着至少反义链的19个核糖核苷酸的长度与靶RNA充分互补的，以在将双链核酸引入哺乳动物细胞时降低靶基因的表达；且其中有义链含有至少一个模体，该模体为三个连续核苷酸上的三个2’-氟基修饰，其中至少一个模体出现在裂解位点或其附近。反义链在裂解位点或其附近含有至少一个模体，该模体为三个连续核苷酸上的三个2’-O-甲基修饰。
在一些实施方案中，dsRNAi剂包括有义链和反义链，其中dsRNAi剂包括长度为至少25且最多29个核苷酸的第一链，和长度最多为30个核苷酸第二链，所述第二链具有至少一个模体，该模体为在离5'端的11、12、13位置的三个连续核苷酸上的三个2’-O-甲基修饰；其中第一链的3'末端和第二链的5'末端形成一钝端，且第二链在其3'末端比第一链长1-4个核苷酸，其中双链体区域至少为25个核苷酸的长度，并且第二链沿着至少第二链的19个核糖核苷酸的长度与靶RNA是足够互补的，以在将RNAi剂引入哺乳动物细胞时降低靶基因的表达，并且其中dsRNAi剂的Dicer裂解优先产生包括第二链的3'-端的siRNA，从而降低了靶基因在哺乳动物中的表达。可选地，dsRNAi剂进一步地包括配体。
在一些实施方案中，dsRNAi剂的有义链含有至少一个在三个连续核苷酸上有三个相同修饰的模体，其中一个模体出现在有义链的裂解位点处。
在一些实施方案中，dsRNAi剂的反义链也可以含有至少一个在三个连续核苷酸上有三个相同修饰的模体，其中一个模体出现在反义链的裂解位点处或裂解位点附近。
对于具有19-23个核苷酸长度的双链体区域的dsRNAi剂，反义链的裂解位点通常位于5'端的10、11和12位置的附近。因此，具有三个相同修饰的模体可以出现在反义链的9、10、11位置；10、11、12位置；11、12、13位置；12、13、14位置；或13、14、15位置，从反义链的5'端的第一个核苷酸开始计数，或者，从双链体区域内从反义链5'端起算的第一个成对的核苷酸开始计数。反义链中的裂解位点也可根据dsRNAi剂从5'端开始的双链体区域的长度而变化。
dsRNAi剂的有义链可在该链的裂解位点处含有至少一个在三个连续的核苷酸上有三个相同修饰的模体；并且反义链可在该链的裂解位点处或裂解位点附近，具有至少一个在三个连续的核苷酸有三个相同修饰的模体。当有义链和反义链形成dsRNA双链体时，有义链和反义链可以如此对齐，以使有义链有三个核苷酸的一个模体和反义链有三个核苷酸的一个模体具有至少一个核苷酸重叠，即，有义链中模体的三个核苷酸中的至少一个与反义链中模体的三个核苷酸中的至少一个形成碱基对。或者，至少两个核苷酸可以重叠，或者所有三个核苷酸都可以重叠。
在某些实施方案中，dsRNAi剂的有义链可以含有多于一个在三个连续核苷酸上有三个相同修饰的模体。第一模体可以出现在链的裂解位点处或裂解位点附近，而其他模体可以是翼修饰。术语“翼修饰(wing modification)”在本文中是指出现在链的另一部分的模体，其与同一条链的裂解位点处或裂解位点附近的模体分离。翼修饰与第一模体相邻，或被至少一个或多个核苷酸分离开。当所述模体彼此紧邻时，则所述模体的化学性质彼此不同，且当所述模体被一个或多个核苷酸分离开时，则化学性质可以相同或不同。两个或更多翼修饰可以存在。例如，当存在两个翼修饰时，每个翼修饰可以发生在相对于位于裂解位点或其附近的第一模体的一端或在主模体(lead motif)的任一侧。
像有义链一样，dsRNAi剂的反义链可含有多于一个在三个连续的核苷酸上有三个相同修饰的模体，至少一个出现在链的裂解位点处或其附近。该反义链也可含有一个或多个翼修饰，其对齐方式类似于有义链上可以存在的翼修饰。
在某些实施方案中，dsRNAi剂的有义链或反义链的翼修饰通常不包含该链3'端、5'端或两端的第一个或前两个末端核苷酸。
在其他实施方案中，dsRNAi剂的有义链或反义链的翼修饰通常不包含该链3'端、5'端或两端的双链体区域内的第一个或前两个已配对的核苷酸。
当dsRNAi剂的有义链和反义链各含有至少一个翼修饰时，该翼修饰可落在双链体区域的相同末端，并具有1、2或3个核苷酸的重叠。
当dsRNAi剂的有义链和反义链各含有至少两个翼修饰时，有义链和反义链可以如此对齐，以使各自来自一条链的两个修饰落在双链体区域的一端，其具有一个、两个或三个核苷酸的重叠；各自来自一条链的两个修饰落在双链体区域的另一端，其具有一个、两个或三个核苷酸的重叠；各自来自一条链的两个修饰落在主模体的二侧，其在双链体区域中具有一个、两个或三个核苷酸的重叠。
在某些实施方案中，dsRNAi剂的有义链和反义链的每一个核苷酸，包含作为模体一部分的核苷酸，都可以是经修饰的。每个核苷酸可以被相同或不同的修饰所修饰，所述修饰可以包含一个或两个非链接的磷酸氧或一个或多个链接的磷酸氧的一种或多种改变；核糖成分的改变，例如核糖2′-羟基的改变；用“去磷酸”接头大规模替换磷酸部分；天然碱基的修饰或替换；以及核糖磷酸主链的替换或修饰。
由于核酸是亚单元的聚合物，许多修饰发生在核酸内重复的位置，例如碱基、磷酸部分、或磷酸部分的非链接O的修饰。在某些情况下，修饰将发生在核酸中所有对象位置，但在许多情况下并不会发生，举个例子，修饰可以仅发生在3’或5’末端位置，可以仅发生在末端区域，例如在末端核苷酸的位置或一条链中的最后2、3、4、5或10个核苷酸的位置。修饰可以发生在双链区域、单链区域、或两者。修饰可以仅发生在RNA的双链区域或仅发生在RNA的单链区域。例如，在非链接O位置的硫代磷酸修饰可以仅发生在一个末端或两个末端，可以仅发生在末端区域，例如在末端核苷酸的位置或一条链的最后2、3、4、5或10个核苷酸的位置，或可以发生在双链区域和单链区域，特别是在末端。5'端或者两个末端可以被磷酸化。
例如为了增强稳定性，可以在突出中包含特定碱基，或者在单链突出中，例如在5’-或3’-突出中或二者中，包含经修饰核苷酸或核苷酸替代物。例如，在突出中包含嘌呤核苷酸是可取的。在一些实施方案中，可以例如利用本文所述的修饰，来修饰3’-或5’-突出中的所有或一些碱基。修饰可以包括，例如，在核糖的2'位置所使用的修饰为本领域已知的修饰，例如，使用了脱氧核糖核苷酸，2’-脱氧-2’-氟基(2’-F)或2’-O-甲基修饰来代替核碱基的核糖，以及磷酸基团的修饰，例如硫代磷酸修饰。突出不需要与靶序列同源。
在某些实施方案中，用LNA、CRN、cET、UNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-脱氧、2’-羟基、或2’-氟基独立地修饰有义链和反义链的每个残基。这些链可以含有多于一个的修饰。在一个实施方案中，有义链和反义链的每个残基都被2’-O-甲基或2’-氟基独立地修饰。
有义链和反义链上通常存在至少二种不同的修饰。这两种修饰可以是2’-O-甲基或2’-氟基修饰，或其他修饰。
在一些实施方案中，Na或Nb包括交替模式的修饰。如本文所用，术语“交替模体”是指具有一个或多个修饰的模体，每个修饰发生在一条链的交替核苷酸上。交替的核苷酸可以指每隔一个核苷酸一个，或每隔三个核苷酸一个，或类似的模式。例如，如果A，B和C分别代表对核苷酸的一种修饰，则交替的模体可以是“ABABABABABAB…”、“AABBAABBAABB…”、“AABAABAABAAB…”、“AAABAAABAAAB…”、“AAABBBAAABBB…”或“ABCABCABCABC…”等。
交替模体中含有的修饰类型可以相同或不同。例如，如果A、B、C、D分别代表核苷酸上的一种修饰类型，则交替模式，即每隔一个核苷酸的修饰，可以是相同的，但是有义链或反义链的每个可以从下列交替的模体内的几种可能的修饰中选择，诸如“ABABAB…”、“ACACAC…”、“BDBDBD…”或“CDCDCD…”等。
在某些实施方案中，本发明的dsRNAi剂包括有义链的交替模体的修饰模式，相对于反义链的交替模体的修饰模式是偏移的。这种偏移可以使得有义链的核苷酸的修饰基团对应于反义链的核苷酸的不同修饰基团，且反之亦然。例如，当有义链与dsRNA双链体中的反义链配对时，在双链体区域内，有义链的交替模体可以从该链的5'到3'以“ABABAB”开始，且反向义链的交替模体可以从该链的5'至3'以“BABABA”开始。作为另一个实例，在双链体区域内，有义链的交替模体可以从该链的5'到3'以“AABBAABB”开始，且反义链的交替模体可以从该链的5'至3'以“BBAABBAA”开始，因此在有义链和反义链之间存在修饰模式的完全或部分的偏移。
在某些实施方案中，dsRNAi剂包括有义链的2'-O-甲基修饰和2’-氟基修饰的交替模体的初始模式具有相对于反义链的2'-O-甲基修饰和2’-氟基修饰的交替模体的初始模式的位移，即有义链的2'-O-甲基修饰核苷酸与反义链的2'-氟基修饰核苷酸碱基配对，且反之亦然。有义链的1位置可以从2'-氟基修饰开始，且反义链的1位置可以从2'-O-甲基修饰开始。
将三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个或多个模体引入到有义链或反义链，中断了有义链或反义链中存在的初始修饰模式。通过将三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个或多个模体引入到有义链或反义链来中断有义或反义链的修饰模式，可以增强针对靶基因的基因沉默活性。
在某些实施方案中，在将三个连续核苷酸上的三个相同修饰的模体引入任何链时，与模体相邻的核苷酸修饰是与模体的修饰不同的修饰。例如，含有模体的序列部分是“…NaYYYNb…”，其中“Y”代表三个连续核苷酸的三个相同修饰的模体的修饰，并且“Na”和“Nb”代表紧邻模体“YYY”的核苷酸的修饰，其不同于Y的修饰，且其中Na和Nb可是相同或不同的修饰。或者，当存在一个翼修饰时，Na或Nb可以存在或不存在。
iRNA可以进一步地包括至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯的核苷酸间键合。硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键合的修饰可以出现在链的任一位置的有义链，反义链或双链的任何核苷酸上。例如，核苷酸间键合修饰可以出现在有义链或反义链的每一个核苷酸上；每个核苷酸间键合修饰可以以交替模式出现在有义链或反义链上；或，有义链或反义链可以含有交替模式的两种核苷酸间键合。有义链的核苷酸间键合修饰的交替模式可以与反义链相同或不同，并且有义链的核苷酸间键合修饰的交替模式相对于反义链的核苷酸间键合修饰的交替模式可以具有偏移。在一个实施方案中，双链RNAi剂包括6-8个硫代磷酸酯核苷酸间键合。在某些实施方案中，反义链包括2个在5’-端的硫代磷酸酯核苷酸间键合和2个在3’-端的硫代磷酸酯核苷酸间键合，并且有义链包括在5’-端或3’-端的至少2个硫代磷酸酯核苷酸间键合。
在某些实施方案中，dsRNAi剂在突出区域包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键合修饰。例如，突出区域可以含有2个的核苷酸，在这2个核苷酸之间具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键合。核苷酸间键合修饰亦可以将突出核苷酸与双链体区域内的末端已配对核苷酸连接起来。例如，至少2、3、4个或全部的突出核苷酸可以通过硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键合连接起来，并且任选地，可以存在连接突出核苷酸与紧邻突出核苷酸的已配对核苷酸的另外的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键合。例如，在末端得三个核苷酸之间可以存在至少2个硫代磷酸酯核苷酸间键合，其中三个核苷酸的两个是突出核苷酸，并且第三个是紧邻突出核苷酸的已配对核苷酸。这些末端的三个核苷酸可以在反义链的3’-端、有义链的3’-端、反义链的5’-端，或有义链的5’-端。
在某些实施方案中，2-核苷酸的突出是在反义链的3’-端，在末端三个核苷酸之间存在2个硫代磷酸酯核苷酸间键合，其中三个核苷酸中的两个是突出核苷酸，并且第三个核苷酸是紧邻突出核苷酸的已配对核苷酸。可选地，dsRNAi剂可以在有义链的5’-端和反义链的5’-端的末端三个核苷酸之间另外具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键合。
在一个实施方案中，dsRNAi剂包括与靶目标的错配，在双链体内的错配，或它们的组合。错配可以发生在突出区域中或双链体区域中。可以基于其促进解离和解链的倾向性将碱基对排序(例如，对于特定配对的结合自由能和解离自由能，最简单的手段是在单个配对的基础上检查该配对，尽管也可使用相邻分析或类似分析)。就促进解离而言：A:U优于G:C；G:U优于G:C；和I:C优于G:C(I＝肌苷)。错配，例如非典型的或典型配对以外的配对(如本文中别处所描述)优于典型的(A:T、A:U、G:C)配对；并且包含通用碱基的配对优于典型的配对。
在一些实施方案中，dsRNAi剂包括从反义链的5’-端的双链体区域内的前1、2、3、4、或5个碱基对中的至少一个，所述碱基对独立地选自如下的组：A:U、G:U、I:C和错配的对，例如非典型的配对或典型配对以外的配对或包含通用碱基的配对，以促进反义链在双链体5’-端的解离。
在一些实施方案中，从反义链的5’-端的双链体区域内的位置1的核苷酸选自A、dA、dU、U、和dT。或者，从反义链的5’-端的双链体区域内的前1、2、或3个碱基对中至少一个是AU碱基对。例如，从反义链的5’-端的双链体区域内的第一个碱基对是AU碱基对。
在其他一些实施方案中，有义链3’-端的核苷酸是脱氧-胸腺嘧啶(dT)或反义链3’-端的核苷酸是脱氧-胸腺嘧啶(dT)。例如，存在脱氧-胸腺嘧啶核苷酸的短序列，例如，在有义链、反义链、或双条链的3’-端的2个dT核苷酸。
在一些实施方案中，有义链序列可以由式(I)来表示：
5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'(I)
其中：
i和j各自独立地为0或1；
p和q各自独立地为0-6；
每个Na独立地表示包括0-25个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包括至少两个不同地经修饰核苷酸；
每个Nb独立地表示包括0-10个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np和nq独立地表示突出核苷酸；
其中Nb和Y不具有相同修饰；并且
XXX、YYY、和ZZZ各自独立地表示在三个连续核苷酸的三个相同修饰的一个模体。优选地，YYY全部是经2’-氟基修饰核苷酸。
在某些实施方案中，Na或Nb包括交替模式的修饰。
在某些实施方案中，YYY模体出现在有义链的裂解位点或其附近。例如，当dsRNAi剂具有长度为17-23个核苷酸的双链体区域时，YYY模体可以出现在有义链的裂解位点(例如：可发生在位置6、7、8；7、8、9；8、9、10；9、10、11；10、11、12；或11、12、13)或其附近，计数从5'-端的第一核苷酸开始；或可选地，计数从5'-端的双链体区域内的第一对核苷酸开始。
在一个实施方案中，i是1且j是0，或i是0且j是1，或i和j都是1。因此，有义链可以以下式所表示：
5'np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'(Ib)；
5'np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3'(Ic)；或
5'np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'(Id).
当有义链是以式(Ib)来表示，Nb表示包括0-10、0-7、0-5、0-4、0-2、或0个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na独立地可表示包括2-20、2-15、或2-10个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
当有义链是以式(Ic)来表示，Nb表示包括0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2、或0个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na可以独立地表示包括2-20、2-15、或2-10个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
当有义链是以式(Id)来表示，每个Nb独立地表示包括0-10、0-7、0-5、0-4、0-2、或0个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。优选地，Nb是0、1、2、3、4、5、或6。每个Na可以独立地表示包括2-20、2-15、或2-10个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
X,Y和Z中的每一个可以与彼此相同或不同。
在其他实施方案中，i是0且j是0，并且有义链可以用此式表示：
5'np-Na-YYY-Na-nq 3'(Ia).
当有义链是以式(Ia)来表示，每个Na可以独立地表示包括2-20、2-15、或2-10个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
在一个实施方案中，RNAi的反义链序列可以用式(II)来表示：
5'nq’-Na′-(Z’Z′Z′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(X′X′X′)l-N′a-np′3'(II)
其中:
k和l各自独立地为0或1；
p’和q’各自独立地为0-6；
每个Na′独立地表示包括0-25个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包括至少2个不同的经修饰核苷酸；
每个Nb′独立地表示包括0-10个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np′和nq′独立地表示突出核苷酸；
其中Nb’和Y’不具有相同的修饰；并且
X具有相同的、Y具有相同的修和Z具有相同的每个独立地表示在三个连续核苷酸的三个相同修饰的一个模体。
在某些实施方案中，Na’或Nb’包括交替模式的修饰。
Y括交替模式的模体出现在反义链的裂解位点或其附近。例如，当dsRNAi剂具有长度为17-23个核苷酸的双链体区域时，Y核苷酸的双链模体可以出现在反义链的位置9、10、11；10、11、12；11、12、13；12、13、14；或13、14、15、计数从5'-端的第一核苷酸开始；或可选地，计数从5'-端的双链体区域内的第一对核苷酸开始。优选地，Y，始区域内的模体出现在位置11、12、13。
在一些实施方案中，Y方案在位置第模体全部是经2’-OMe修饰核苷酸。
在一些实施方案中，k是1且l是0，或k是0且l是1或k和l都是1。
因此，反义链可以如下式所表示：
5'nq’-Na′-Z′Z′Z′-Nb′-Y′Y′Y′-Na′-np’3'(IIb)；
5'nq’-Na′-Y′Y′Y′-Nb′-X′X′X′-np’3'(IIc)；或
5'nq’-Na′-Z′Z′Z′-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-X′X′X′-Na′-np’3'(IId).
当反义链是以式(IIb)来表示，Nb’表示包括0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2、或0个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na’独立地表示包括2-20、2-15、或2-10个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
当反义链是以式(IIc)来表示，Nb’表示包括0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2、或0个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na’独立地表示包括2-20、2-15、或2-10个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
当反义链是以式(IId)来表示，每个Nb’独立地表示包括0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2、或0个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na’独立地表示包括2-20、2-15、或2-10个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。优选地，Nb是0、1、2、3、4、5、或6。
在其他实施方案中，k是0且l是0并且反义链可以用此式表示：
5'np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-nq’3'(Ia).
当反义链是以式(IIa)来表示，每个Na’独立地表示包括2-20、2-15、或2-10个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。X′、Y′修和Z′中的每一个可以与彼此相同或不同。
有义链和反义链中的每个核苷酸可以是独立地用如下基团来修饰：LNA、CRN、UNA、cEt、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-羟基、或2’-氟基。例如，有义链和反义链中的每个核苷酸是独立地用2’-O-甲基或2’-氟基来修饰。每个X、Y、Z、X基、Y基、和Z和，特别地，可以表示2’-O-甲基修饰或2’-氟基修饰。
在某些实施方案中，当双链体区域为21nt(21个核苷酸)时，dsRNAi剂的有义链可以含有在该链位置9、10、和11出现的YYY模体，计数从5'-端的第一核苷酸开始，或可选地，计数从5'-端的双链体区域内的第一对核苷酸开始；并且Y表示2’-氟基修饰。该有义链可以另外含有XXX模体或ZZZ模体作为在双链体区域相对端的翼修饰；并且XXX和ZZZ各自独立地表示2’-OMe修饰或2’-F修饰。
在一些实施方案中，反义链可以含有在该链位置11、12、13出现的Y现的有在e模体，计数从5'-端的第一核苷酸开始，或可选地，计数从5'-端的双链体区域内的第一对核苷酸开始；并且Y表示2’-O-甲基修饰。该反义链可以另外含有X以另外含有的模体或Z体或外含有的模体作为在双链体区域相对端的翼修饰；并且X体作为在双链和Z体作为在双链各自独立地表示2’-OMe修饰或2’-F修饰。
由以上式(Ia)、(Ib)、(Ic)、和(Id)中的任一个所表示的有义链，分别与由式(IIa)、(IIb)、(IIc)、和(IId)中的任一个所表示的反义链，形成一个双链体。
因此，用于本发明之方法中的dsRNAi剂可以包括有义链和反义链，每条链具有14至30个核苷酸，iRNA双链体由式(III)来表示:
有义：5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'
反义：3'np’-Na’-(X’X′X′)k-Nb’-Y′Y′Y′-Nb’-(Z′Z′Z′)l-Na’-nq’5'
(III)
其中：
i、j、k、和l各自独立地是0或1；
p、p0、q、和q和各自独立地是0-6；
每个Na和Na’独立地表示包括0-25个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包括至少2个不同的修饰核苷酸；
每个Nb和Nb’独立地表示包括0-10个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列；
其中每个np’、np、nq’、和nq(每个可以存在或不存在)独立地表示突出核苷酸；并且
XXX、YYY、ZZZ、XZZ表示突、YZZ表示突、和Z和Z表示突出各自独立地表示在三个连续核苷酸的三个相同修饰的一个模体。
在一个实施方案中，i是0且j是0；或i是1且j是0；或i是0且j是1；或i和j都是0；或i和j都是1。在另一个实施方案中，k是0且l是0；或k是1且l是0；k是0且l是1；或k和l都是0；或k和l都是1。
形成iRNA双链体的有义链和反义链的示例性组合包含下式：
5'np-Na-Y Y Y-Na-nq 3'
3'np’-Na’-Y′Y′Y′-Na’nq’5'
(IIIa)
5'np-Na-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3'
3'np’-Na’-Y′Y′Y′-Nb’-Z′Z′Z′-Na’nq’5'
(IIIb)
5'np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Na-nq 3'
3'np’-Na’-X′X′X′-Nb’-Y′Y′Y′-Na’-nq’5'
(IIIc)
5'np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3'
3'np’-Na’-X′X′X′-Nb’-Y′Y′Y′-Nb’-Z′Z′Z′-Na-nq’5'
(IIId)
当dsRNAi剂是以式(IIIa)来表示，每个Na独立地表示包括2-20、2-15、或2-10个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
当dsRNAi剂是以式(IIIb)来表示，每个Nb独立地表示包括1-10、1-7、1-5、或1-4个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na独立地表示包括2-20、2-15、或2-10个修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
当dsRNAi剂是以式(IIIc)来表示，每个Nb、Nb’独立地表示包括0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2、或0个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na独立地表示包括2-20、2-15、或2-10个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。
当dsRNAi剂是以式(IIId)来表示，每个Nb、Nb’独立地表示包括0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2、或0个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na、Na’独立地表示包括2-20、2-15、或2-10个经修饰核苷酸的寡核苷酸序列。Na、Na’、Nb、和Nb’中的每个独立地包括交替模式的修饰。
式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、和(IIId)中的X、Y、和Z的每个可以与彼此相同或不同。
当dsRNAi剂是以式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、和(IIId)来表示，Y核苷酸中的至少一个可以与Y苷酸核苷酸中的一个形成碱基对。或者，Y核苷酸中的至少两个与相应的Y相应核苷酸形成碱基对；或者全部三个Y核苷酸与相应的Y苷酸核苷酸全部形成碱基对。
当dsRNAi剂是以式(IIIb)或(IIId)来表示，Z核苷酸中的至少一个可以与Z苷酸核苷酸中的一个形成碱基对。或者，Z核苷酸中的至少两个与相应的Z相应核苷酸形成碱基对；或者全部三个Z核苷酸与相应的Z苷核苷酸全部形成碱基对。
当dsRNAi剂是以式(IIIc)或(IIId)来表示，X核苷酸中的至少一个可以与X苷酸核苷酸中的一个形成碱基对。或者，X核苷酸中的至少两个与相应的X相核苷酸形成碱基对；或者全部三个X核苷酸与相应的X苷酸核苷酸全部形成碱基对。
在一些实施方案中，Y核苷酸的修饰不同于Y’核苷酸的修饰，Z核苷酸的修饰不同于Z’核苷酸的修饰，或者X核苷酸的修饰不同于X’核苷酸的修饰。
在一些实施方案中，当dsRNAi剂是以式(IIId)来表示，Na修饰是2′-O-甲基或2′-氟基修饰。在其他实施方案中，当RNAi剂是以式(IIId)来表示，Na修饰是2′-O-甲基或2′-氟基修饰，且np′基修饰，且至少一个np′至经由硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接。在其他实施方案中，当RNAi剂是以式(IIId)来表示，Na修饰是2′-O-甲基或2′-氟基修饰，np′基修饰且至少一个np′至经由硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接，并且有义链与通过二价或三价分支接头所附接的一个或多个GalNAc衍生物缀合(如下所述)。在其他实施方案中，当RNAi剂是以式(IIId)来表示，Na修饰是2′-O-甲基或2′-氟基修饰，np′基修饰，并且至少一个np′经由硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸链接，有义链包括至少一个硫代磷酸酯键，并且有义链与通过二价或三价分支接头所附接的一个或多个GalNAc衍生物缀合。
在某些实施方案中，当dsRNAi剂是以式(IIIa)来表示，Na修饰是2′-O-甲基或2′-氟基修饰，np′基修饰，并且至少一个np′经由硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接，有义链包括至少一个硫代磷酸酯键，并且有义链与通过二价或三价分支接头所附接的一个或多个GalNAc衍生物缀合。
在某些实施方案中，dsRNAi剂是含有至少两个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、和(IIId)所表示的双链体的多聚体，其中的双链体通过接头进行连接。该接头可以是可裂解的或不可裂解的。可选地，该多聚体进一步地包括配体。每个双链体可以靶向相同的基因或两个不同的基因；或每个双链体可以在两个不同的靶位点靶向同一基因。
在某些实施方案中，dsRNAi剂是含有三、四、五、六或更多个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、和(IIId)所表示的双链体的多聚体，其中的双链体是由接头所连接。该接头可以是可裂解的或不可裂解的。可选地，该多聚体进一步地包括配体。每个双链体可以靶向相同的基因或两个不同的基因；或每个双链体可以在两个不同的靶位点靶向同一基因。
在一个实施方案中，由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、和(IIId)中的至少一个所表示的两个dsRNAi剂在5’端以及在一个或两个3’端彼此连接，并且可选地与配体缀合。每个剂可以靶向相同的基因或两个不同的基因；或每个剂可以在两个不同的靶位点靶向同一基因。
在一些实施方案中，本发明的RNAi剂可以含有少数含有2’-氟基修饰的核苷酸，例如10个或更少的具有2’-氟基修饰的核苷酸。例如，RNAi剂可以含有10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个具有2’-氟基修饰的核苷酸。在一个具体实施方案中，本发明的RNAi剂含有10个具有2’-氟基修饰的核苷酸，例如4个有义链中的具有2’-氟基修饰的核苷酸和6个反义链中的具有2’-氟基修饰的核苷酸。在另一具体实施方案中，本发明的RNAi剂含有6个具有2’-氟基修饰的核苷酸，例如4个有义链中的具有2’-氟基修饰的核苷酸和2个反义链中的具有2’-氟基修饰的核苷酸。
在其他实施方案中，本发明的RNAi剂可以含有极少数含有2’-氟基修饰的核苷酸，例如2个或更少的含有2’-氟基修饰的核苷酸。例如，RNAi剂可以含有2、1或0个具有2’-氟基修饰的核苷酸。在一个具体实施方案中，本发明的RNAi剂可以含有2个具有2’-氟基修饰的核苷酸，例如，0个有义链中的具有2’-氟基修饰的核苷酸和2个反义链中的具有2’-氟基修饰的核苷酸。
各种出版物描述了可用于本发明之方法中的多聚体iRNA。这样的出版物包含WO2007/091269、美国专利7,858,769、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887,和WO2011/031520，其每个的全部内容通过引用在此并入本文。
在一些实施方案中，本公开的组合物和方法包含如本文所述的RNAi剂的乙烯基膦酸酯(VP)修饰。在示例性的实施方案中，本公开的乙烯基膦酸酯具有如下结构：
Figure BDA0003795632600000551
本公开的乙烯基膦酸酯可以被附接到本公开的dsRNA的反义链或有义链中的一条。在优选实施方案中，本公开的乙烯基膦酸酯被附接到dsRNA的反义链，可选地在dsRNA的反义链的5’端。
乙烯基磷酸酯修饰也预期用于本公开的组合物和方法。一个示例性的乙烯基磷酸酯结构为：
Figure BDA0003795632600000552
如以下更详细描述的，含有缀合到自身的一个或多个糖类部分的iRNA可以优化该iRNA的一个或多个特性。在许多情况下，前述糖类部分将被附接到iRNA的经修饰亚单元。例如，iRNA的一个或多个核糖核苷酸亚单元的核糖可以被替换为另一个部分，例如，附接了糖类配体的非糖类(优选是环状的)载体。其中亚单元的核糖已被如此替换的核糖核苷酸亚单元在本文中被称为核糖替换修饰亚单元(RRMS)。环状载体可以是碳环环系统，即所有环原子都是碳原子，或杂环环系统，即一个或多个环原子可以是杂原子，例如氮、氧、硫。环状载体可以是单环环系统，或可以含有两个或更多个环，例如稠环。环状载体可以是完全饱和的环系统，或者其可以含有一个或多个双键。
配体可以通过载体附接至到多核苷酸上。载体包含(i)至少一个“主链附接点”，优选为两个“主链附接点”和(ii)至少一个“连系附接点(tethering attachment point)”。如本文所用，“主链附接点”是指官能团，例如羟基，或通常是可用于并适用于将载体并入到核糖核酸主链中的键，例如磷酸主链或经修饰磷酸主链，例如含有硫的主链。在一些实施方案中，“连系附接点”(TAP)是指连接选定的部分的环状载体的构成环原子，例如碳原子或杂原子(与提供主链附接点的原子不同)。该部分可以是，例如糖类，例如，单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖或多糖。可选地，选定的部分通过中间连系而被连接至环状载体。因此，环状载体通常将包含官能团，例如氨基，或者通常提供键，其适合于将另一化学实体例如配体并入或连系到构成环。
iRNA可以通过载体与配体缀合，其中的载体可以是环状基团或非环状基团；优选地，该环状基团是选自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊烷、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪壬基、四氢呋喃基和十氢萘；优选地，非环状基团是丝氨醇主链或二乙醇氨主链。
i.热不稳定的修饰
在一些实施方案中，可以通过在反义链的种子区域(即在反义链的5'-端的2-9位置)掺入热不稳定的修饰来优化dsRNA分子的RNA干扰，以降低或抑制脱靶基因沉默。已经发现，具有从反义链的5'端起算的前9个核苷酸位置内包括至少一个双链体的热不稳定的修饰的反义链的dsRNA，具有降低的脱靶基因沉默活性。因此，在某些实施方案中，反义链在其5'区域前9个核苷酸位置内包括至少一个(例如，一、二、三、四、五个或更多个)双链体的热不稳定的修饰。在某些实施方案中，双链体的一个或多个热不稳定的修饰位于从反义链5’-端起的位置2-9，优选为位置4-8。在一些进一步的实施方案中，双链体的热不稳定的修饰位于从反义链5’-端起的位置6、7或8。在一些进一步的实施方案中，双链体的热不稳定的修饰位于从反义链5’-端起的位置7。术语“热不稳定的修饰”包含会使dsRNA具有较低的总体解链温度(Tm)的修饰(优选的Tm比没有此类修饰的dsRNA的Tm低1、2、3或4度)。在某些实施方案中，双链体的热不稳定的修饰位于从反义链的5'端起的位置2、3、4、5或9。
iRNA剂包括有义链和一反义链。每条链具有14至40个核苷酸。RNAi剂可以由式(L)来表示：
Figure BDA0003795632600000571
在式(L)中、B1、B2、B3、B1’、B2’、B3’、和B4’各自独立地为含有选自于由以下所组成的组的修饰的核苷酸：2’-O-烷基、2’-取代烷氧基、2’-取代烷基、2’-卤基、ENA、和BNA/LNA。在一个实施方案中、B1、B2、B3、B1’、B2’、B3’、和B4’都含有2’-OMe修饰。在一个实施方案中、B1、B2、B3、B1’、B2’、B3’、和B4’都含有2’-OMe或2’-F修饰。在一个实施方案中，B1、B2、B3、B1’、B2’、B3’、和B4’中的至少一个含有2'-O-N-甲基乙酰氨基(2'-O-NMA)修饰。
C1为热不稳定的核苷酸，其位于与反义链的种子区域(即在反义链5’-端的位置2-8)相对的位点。例如，C1位于与位于反义链5’-端的位置2-8的核苷酸配对的有义链的位置。在一个实例中，C1位于从有义链5'-端起的位置15。C1核苷酸带有热不稳定的修饰，其可包含无碱基修饰；与双链体中的相对核苷酸的错配；以及糖修饰例如2’-脱氧修饰或无环核苷酸例如，例如未锁核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)。在一个实施方案中，C1具有选自由以下所组成的组的热不稳定的修饰：i)与反义链中的相对核苷酸的错配；ii)无碱基修饰，其选自由以下所组成的组：
Figure BDA0003795632600000572
以及iii)糖修饰，其选自由以下所组成的组：
Figure BDA0003795632600000581
以及
Figure BDA0003795632600000582
，其中B是经修饰或未修饰的核碱基，R1和R2独立地是H、卤素、OR3或烷基；R3为H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖。在一个实施方案中，C1中的热不稳定的修饰是选自由以下所组成的组的错配：G:G、G:A、G:U、G:T、A:A、A:C、C:C、C:U、C:T、U:U、T:T、和U:T；并且可选地，错配对中的至少一个核碱基是2’-脱氧核碱基。在一个实例中，C1中的热不稳定的修饰是GNA或
Figure BDA0003795632600000583
T1、T1’、T2’、和T3’各自独立地表示包括修饰的核甘酸，该修饰提供小于或等于2’-OMe修饰之空间体积的空间体积。空间体积是指修饰的立体效应的总和。确定核苷酸修饰的空间效应的方法是本领域本领域技术人员已知的。该修饰可以位于核苷酸的核糖的2’位置，或为对以下的修饰：非核糖核苷酸、无环核苷酸、或与所述核糖的2’位置类似或等同的核苷酸主链，并且该修饰为核苷酸提供了小于或等于2’-OMe修饰之空间体积的空间体积。例如，T1、T1’、T2’、和T3’各自独立地选自DNA、RNA、LNA、2’-F、和2’-F-5’-甲基。在一个实施方案中，T1是DNA。在一个实施方案中，T1’是DNA,RNA或LNA。在一个实施方案中，T2’是DNA或RNA。在一个实施方案中，T3’是DNA或RNA。
n1、n3、和q1独立地是4至15个核苷酸的长度。
n5、q3、和q7独立地是1-6个核苷酸的长度。
n4、q2、和q6独立地是1-3个核苷酸的长度；或者，n4是0。
q5独立地是0-10个核苷酸的长度。
n2和q4独立地是0-3核苷酸的长度。
或者，n4是0-3核苷酸(s)的长度。
在一个实施方案中，n4可以是0。在一个实例中，n4是0，且q2和q6是1。在另一个实例中，n4是0，且q2和q6是1，具有有义链的位置1-5内(从有义链5’-端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，在位置1和2上的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰以及反义链位置18-23内(从反义链5’-端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。
在一个实施方案中，n4、q2、和q6都是1。
在一个实施方案中，n2、n4、q2、q4、和q6都是1。
在一个实施方案中，当有义链是19-22个核苷酸的长度，C1位于有义链5’-端位置14-17，且n4是1。在一个实施方案中，C1位于有义链5’-端的位置15。
在一个实施方案中，T3’从反义链5’-端位置2开始。在一个实例中，T3’位于反义链5’-端的位置2且q6等于1。
在一个实施方案中，T1’从反义链5’-端位置14开始。在一个实例中，T1’位于反义链5’-端位置14且q2等于1。
在另一个示例性的实施方案中，T3’从反义链5’-端的位置2开始并且T1’从反义链5’-端的位置14开始。在一个实例中，T3’从反义链5’-端的位置2开始且q6等于1和T1’从反义链5’-端的位置14开始且q2等于1。
在一个实施方案中，T1’和T3’是由11个核苷酸的长度分开(即不计入T1’和T3’的核苷酸)。
在一个实施方案中，T1’位于反义链5’-端位置14。在一个实例中，T1’位于反义链5’-端位置14且q2等于1，并且在2’位置的修饰或在非核糖、非环或主链的位置的修饰提供了小于2’-OMe核糖的空间体积。
在一个实施方案中，T3’位于反义链5’-端位置2。在一个实例中，T3’位于反义链5’-端位置2且q6等于1，并且在2’位置的修饰或在非核糖、非环或主链的位置的修饰提供了小于或等于2’-OMe核糖的空间体积。
在一个实施方案中，T1位于有义链的裂解位点。在一个实例中，当有义链是19-22个核苷酸的长度时，T1位于有义链的5’端的位置11，且n2是1。在一个示例性的实施方案中，当有义链是19-22个核苷酸的长度时，T1位于从有义链5’端起位置11的有义链的裂解位点，且n2是1，
在一个实施方案中，T2’从反义链的5’端的位置6开始。在一个实例中，T2’位于从反义链从5’端起的位置6-10，且q4是1。
在一个示例性的实施方案中，当有义链是19-22个核苷酸的长度时，T1位于有义链的裂解位点，例如位于从有义链5’端起的位置11，且n2是1；T1’是位于从反义链5’-端起的位置14且q2等于1，并且T1’的修饰是位于核糖的2’位置或是在非核糖、非环或主链的位置的，该修饰提供了小于2’-OMe核糖的空间体积；T2’位于从反义链5’端起的位置6-10，且q4是1；且T3’位于从反义链5’-端起的位置2且q6等于1，并且对T3’的修饰是在2’位置或在非核糖、非环或主链的位置，该修饰提供了小于或等于2’-OMe核糖的空间体积。
在一个实施方案中,T2’从反义链5’端得位置8开始。在一个实例中，T2’从反义链5’端的位置8开始，且q4是2。
在一个实施方案中，T2’从反义链5’端的位置9开始。在一个实例中，T2’从反义链5’端的位置9开始，且q4是1。
在一个实施方案中，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是1，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是6，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe,且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链的位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。
在一个实施方案中，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是1，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是6，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe,且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是6，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是7，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是6，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是7，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是1，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是6，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是1，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是6，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是5，T2’是2’-F，q4是1，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1；可选地在反义链3’端具有至少2个额外的TT。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是5，T2’是2’-F，q4是1，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1；可选地在反义链3’端具有至少2个额外的TT；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，且q7是1。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F,且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F,且q7是1.
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F,且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。
RNAi剂可包括位于有义链或反义链的5’端的一个含磷基团。该5’端含磷基团可以是5’-端磷酸酯(5’-P)、5’-端硫代磷酸酯(5’-PS)、5’-端二硫代磷酸酯(5’-PS2)、5’-端乙烯基膦酸酯(5’-VP)、5’-端甲基膦酸酯(MePhos)、或5’-脱氧-5’-C-丙二酰基
Figure BDA0003795632600000631
当5’端含磷基团是5’-端乙烯基膦酸酯(5’-VP)时，5’-VP可以是5’-E-VP异构体(即，反式-乙烯基磷酸酯，
Figure BDA0003795632600000632
)，5’-Z-VP异构体(即，顺式-乙烯基磷酸酯，
Figure BDA0003795632600000633
)，或它们的混合物。
在一个实施方案中，RNAi剂在有义链5’端包括含磷基团。在一个实施方案中，RNAi剂在反义链5’端包括含磷基团。
在一个实施方案中，RNAi剂包括5’-P。在一个实施方案中，RNAi剂在反义链中包括5’-P。
在一个实施方案中，RNAi剂包括5’-PS。在一个实施方案中，RNAi剂在反义链中包括5’-PS。
在一个实施方案中，RNAi剂包括5’-VP。在一个实施方案中，RNAi剂在反义链中包括5’-VP。在一个实施方案中，RNAi剂在反义链中包括5’-E-VP。在一个实施方案中，RNAi剂在反义链中包括5’-Z-VP。
在一个实施方案中，RNAi剂包括5’-PS2。在一个实施方案中，RNAi剂在反义链中包括5’-PS2。
在一个实施方案中，RNAi剂包括5’-PS2。在一个实施方案中，RNAi剂在反义链中包括5’-脱氧-5’-C-丙二酰基。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe,，且q7是1。RNAi剂也包括5’-PS。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1。RNAi剂也包括5’-P。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe,，且q7是1。RNAi剂也包括5’-VP。该5’-VP可以是5’-E-VP、5’-Z-VP、或它们的组合。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1。RNAi剂也包括5’-PS2。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1。RNAi剂也包括5’-脱氧-5’-C-丙二酰基。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-P。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-PS。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-VP。该5’-VP可以是5’-E-VP、5’-Z-VP、或它们的组合。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-PS2。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-脱氧-5’-C-丙二酰基。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1。RNAi剂也包括5’-P。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe,且q7是1。dsRNA剂也包括5’-PS。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1。RNAi剂也包括5’-VP。该5’-VP可以是5’-E-VP、5’-Z-VP、或它们的组合。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1。RNAi剂也包括5’-PS2。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1。RNAi剂也包括5’-脱氧-5’-C-丙二酰基。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-P。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-PS。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-VP。该5’-VP可以是5’-E-VP、5’-Z-VP、或它们的组合。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂包括5’-PS2。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-脱氧-5’-C-丙二酰基。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，且q7是1。RNAi剂也包括5’-P。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，且q7是1。RNAi剂也包括5’-PS。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，且q7是1。RNAi剂也包括5’-VP。该5’-VP可以是5’-E-VP、5’-Z-VP、或它们的组合。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，且q7是1。RNAi剂也包括5’-PS2。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，且q7是1。RNAi剂也包括5’-脱氧-5’-C-丙二酰基。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-P。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-PS。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-VP。该5’-VP可以是5’-E-VP、5’-Z-VP、或它们的组合。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-PS2。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-脱氧-5’-C-丙二酰基。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，且q7是1。RNAi剂也包括5’-P。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，且q7是1。RNAi剂也包括5’-PS。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，且q7是1。RNAi剂也包括5’-VP。该5’-VP可以是5’-E-VP、5’-Z-VP、或它们的组合。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，且q7是1。RNAi剂也包括5’-PS2。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，且q7是1。RNAi剂也包括5’-脱氧-5’-C-丙二酰基。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-P。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-PS。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-VP。该5’-VP可以是5’-E-VP、5’-Z-VP、或其组合。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-PS2。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-脱氧-5’-C-丙二酰基。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-P和靶向配体。在一个实施方案中，该5’-P位于反义链5’端，并且该靶向配体位于有义链3’端。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-PS和靶向配体。在一个实施方案中，该5’-PS位于反义链5’端，并且该靶向配体位于有义链3’端。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-VP(例如5’-E-VP、5’-Z-VP、或其组合)，和靶向配体。
在一个实施方案中，5’-VP位于反义链5’端，并且靶向配体位于有义链3’端。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-PS2和靶向配体。在一个实施方案中，该5’-PS2位于反义链5’端，并且该靶向配体位于有义链3’端。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-脱氧-5’-C-丙二酰基和靶向配体。在一个实施方案中，该5’-脱氧-5’-C-丙二酰基位于反义链5’端，并且该靶向配体位于有义链3’端。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-P和靶向配体。在一个实施方案中该5’-P位于反义链5’端，并且该靶向配体位于有义链3’端。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-PS和靶向配体。在一个实施方案中该5’-PS位于反义链5’端，并且该靶向配体位于有义链3’端。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2上的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-VP(例如5’-E-VP、5’-Z-VP、或其组合)和靶向配体。在一个实施方案中，该5’-VP位于反义链5’端，并且该靶向配体位于有义链3’端。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-PS2和靶向配体。在一个实施方案中，该5’-PS2位于反义链5’端，并且该靶向配体位于有义链3’端。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-脱氧-5’-C-丙二酰基和靶向配体。在一个实施方案中，该5’-脱氧-5’-C-丙二酰基位于反义链5’端，并且该靶向配体位于有义链3’端。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-P和靶向配体。在一个实施方案中该5’-P位于反义链5’端，并且该靶向配体位于有义链3’端。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-PS和靶向配体。在一个实施方案中该5’-PS位于反义链5’端，并且该靶向配体位于有义链3’端。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2上的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-VP(例如5’-E-VP、5’-Z-VP、或其组合)和靶向配体。在一个实施方案中，该5’-VP位于反义链5’端，并且该靶向配体位于有义链3’端。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-PS2和靶向配体。在一个实施方案中，该5’-PS2位于反义链5’端，并且该靶向配体位于有义链3’端。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-脱氧-5’-C-丙二酰基和靶向配体。在一个实施方案中，该5’-脱氧-5’-C-丙二酰基位于反义链5’端，并且该靶向配体位于有义链3’端。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-P和靶向配体。在一个实施方案中该5’-P位于反义链5’端，并且该靶向配体位于有义链3’端。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-PS和靶向配体。在一个实施方案中该5’-PS位于反义链5’端，并且该靶向配体位于有义链3’端。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-VP(例如5’-E-VP、5’-Z-VP、或其组合)和靶向配体。在一个实施方案中，该5’-VP位于反义链5’端，并且该靶向配体位于有义链3’端。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F,，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-PS2和靶向配体。在一个实施方案中，该5’-PS2位于反义链5’端，并且该靶向配体位于有义链3’端。
在一个实施方案中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1’是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，且q7是1；具有有义链位置1-5内(从有义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，和在位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰，以及反义链位置18-23内(从反义链5’端开始计数)的两个硫代磷酸酯核苷酸间键合的修饰。RNAi剂也包括5’-脱氧-5’-C-丙二酰基和靶向配体。在一个实施方案中，该5’-脱氧-5’-C-丙二酰基位于反义链5’端，并且该靶向配体位于有义链3’端。
在一个具体的实施方案中，本发明的RNAi剂包括：
(a)有义链，其具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)附接到3’-端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包括通过三价分支接头所附接的三个GalNAc衍生物；以及
(iii)在位置1、3、5、7、9至11、13、17、19、和21的2’-F修饰，和在位置2、4、6、8、12、14至16、18、和20的2’-OMe修饰(从5’端开始计数)；
和
(b)反义链，其具有：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置1、3、5、9、11至13、15、17、19、21、和23的2’-OMe修饰，和在位置2、4、6至8、10、14、16、18、20、和22的2’F修饰(从5’端开始计数)；以及
(iii)核苷酸位置21和22之间以及核苷酸位置22和23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合(从5’端开始计数)；
其中dsRNA剂在反义链3’-端具有两个核苷酸突出，在反义链5’-端具有钝端。
在另一具体实施方案中，本发明的RNAi剂包括：
(a)有义链，其具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)附接到3’-端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包括通过三价分支接头所附接的三个GalNAc衍生物；
(iii)在位置1、3、5、7、9至11、13、15、17、19、和21的2’-F修饰，和在位置2、4、6、8、12、14、16、18、和20的2’-OMe修饰(从5’端开始计数)；以及
(iv)核苷酸位置1和2之间以及核苷酸位置2和3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合(从5’端开始计数)；
和
(b)反义链，其具有：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置1、3、5、7、9、11至13、15、17、19、和21至23的2’-OMe修饰，和在位置2、4、6、8、10、14、16、18、和20的2’F修饰(从5’端开始计数)；以及
(iii)核苷酸位置1和2之间，核苷酸位置2和3之间，核苷酸位置21和22之间，以及核苷酸位置22和23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合(从5’端开始计数)；
其中RNAi剂在反义链3’-端有两个核苷酸突出，在反义链5’-端有钝端。
在另一具体实施方案中，本发明的RNAi剂包括：
(a)有义链，其具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)附接到3’-端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包括通过三价分支接头所附接的三个GalNAc衍生物；
(iii)在位置1至6、8、10、和12至21的2’-OM修饰，在位置7和9的2’-F修饰，以及在位置11的脱氧-核苷酸(例如dT)(从5’端开始计数)；以及
(iv)核苷酸位置1和2之间以及核苷酸位置2和3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合(从5’端开始计数)；
和
(b)反义链，其具有：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置1、3、7、9、11、13、15、17、和19至23的2’-OMe修饰，以及在位置2、4至6、8、10、12、14、16、和18的2’-F修饰(从5’端开始计数)；以及
(iii)核苷酸位置1和2之间，核苷酸位置2和3之间，核苷酸位置21和22之间，以及核苷酸位置22和23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合(从5’端开始计数)；
其中RNAi剂在反义链3’-端有两个核苷酸突出，在反义链5’-端有钝端。
在另一具体实施方案中，本发明的RNAi剂包括：
(a)有义链，其具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)附接到3’-端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包括通过三价分支接头所附接的三个GalNAc衍生物；
(iii)在位置1至6、8、10、12、14、和16至21的2’-OMe修饰，和在位置7、9、11、13、和15的2’-F修饰；以及
(iv)核苷酸位置1和2之间，以及核苷酸位置2和3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合(从5’端开始计数)；
和
(b)反义链，其具有：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置1、5、7、9、11、13、15、17、19、和21至23的2’-OMe修饰，和在位置2至4、6、8、10、12、14、16、18、和20的2’-F修饰(从5’端开始计数)；以及
(iii)核苷酸位置1和2之间，核苷酸位置2和3之间，核苷酸位置21和22之间，以及核苷酸位置22和23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合(从5’端开始计数)；
其中RNAi剂在反义链3’-端有两个核苷酸突出，在反义链5’-端有钝端。
在另一具体实施方案中，本发明的RNAi剂包括：
(a)有义链，其具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)附接到3’-端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包括通过三价分支接头所附接的三个GalNAc衍生物；
(iii)在位置1至9、和12至21的2’-OMe修饰，和在位置10、和11的2’-F修饰；以及
(iv)核苷酸位置1和2之间，以及核苷酸位置2和3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合(从5’端开始计数)；
和
(b)反义链，其具有：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置1、3、5、7、9、11至13、15、17、19、和21至23的2’-OMe修饰，和在位置2、4、6、8、10、14、16、18、和20的2’-F修饰(从5’端开始计数)；以及
(iii)核苷酸位置1和2之间，核苷酸位置2和3之间，核苷酸位置21和22之间，以及核苷酸位置22和23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合(从5’端开始计数)；
其中RNAi剂在反义链3’-端有两个核苷酸突出，在反义链5’-端有钝端。
在另一具体实施方案中，本发明的RNAi剂包括：
(a)有义链，其具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)附接到3’-端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包括通过三价分支接头所附接的三个GalNAc衍生物；
(iii)在位置1、3、5、7、9至11、和13的2’-F修饰，和在位置2、4、6、8、12、和14至21的2’-OMe修饰；以及
(iv)核苷酸位置1和2之间以及核苷酸位置2和3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合(从5’端开始计数)；
和
(b)反义链，其具有：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置1、3、5至7、9、11至13、15、17至19、和21至23的2’-OMe修饰，和在位置2、4、8、10、14、16、和20的2’-F修饰(从5’端开始计数)；以及
(iii)核苷酸位置1和2之间，核苷酸位置2和3之间，核苷酸位置21和22之间，以及核苷酸位置22和23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合(从5’端开始计数)；
其中RNAi剂在反义链3’-端有两个核苷酸突出，在反义链5’-端有钝端。
在另一具体实施方案中，本发明的RNAi剂包括：
(a)有义链，其具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)附接到3’-端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包括通过三价分支接头所附接的三个GalNAc衍生物；
(iii)在位置1、2、4、6、8、12、14、15、17、和19至21的2’-OMe修饰，和在位置3、5、7、9至11、13、16、和18的2’-F修饰；以及
(iv)核苷酸位置1和2之间以及核苷酸位置2和3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合(从5’端开始计数)；
和
(b)反义链，其具有：
(i)25个核苷酸的长度；
(ii)在位置1、4、6、7、9、11至13、15、17、和19至23的2’-OMe修饰，在位置2、3、5、8、10、14、16、和18的2’-F修饰，以及在位置24和25的脱氧-核苷酸(例如dT)(从5’端开始计数)；以及
(iii)核苷酸位置1和2之间，核苷酸位置2和3之间，核苷酸位置21和22之间，以及核苷酸位置22和23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合(从5’端开始计数)；
其中RNAi剂在反义链3’-端有四个核苷酸突出，在反义链5’-端有钝端。
在另一具体实施方案中，本发明的RNAi剂包括：
(a)有义链，其具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)附接到3’-端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包括通过三价分支接头所附接的三个GalNAc衍生物；
(iii)在位置1至6、8、和12至21的2’-OMe修饰，和在位置7、和9至11的2’-F修饰；以及
(iv)核苷酸位置1和2之间以及核苷酸位置2和3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合(从5’端开始计数)；
和
(b)反义链，其具有：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置1、3至5、7、8、10至13、15、和17至23的2’-OMe修饰，和在位置2、6、9、14、和16的2’-F修饰(从5’端开始计数)；以及
(iii)核苷酸位置1和2之间，核苷酸位置2和3之间，核苷酸位置21和22之间，以及核苷酸位置22和23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合(从5’端开始计数)；
其中RNAi剂在反义链3’-端有两个核苷酸突出，在反义链5’-端有钝端。
在另一具体实施方案中，本发明的RNAi剂包括：
(a)有义链，其具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)附接到3’-端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包括通过三价分支接头所附接的三个GalNAc衍生物；
(iii)在位置1至6、8、和12至21的2’-OMe修饰，和位置7、和9至11的2’-F修饰；以及
(iv)核苷酸位置1和2之间以及核苷酸位置2和3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合(从5’端开始计数)；
和
(b)反义链，其具有：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置1、3至5、7、10至13、15、和17至23的2’-OMe修饰，和在位置2、6、8、9、14、和16的2’-F修饰(从5’端开始计数)；以及
(iii)核苷酸位置1和2之间，核苷酸位置2和3之间，核苷酸位置21和22之间，以及核苷酸位置22和23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合(从5’端开始计数)；
其中RNAi剂在反义链3’-端有两个核苷酸突出，在反义链5’-端有钝端。
在另一具体实施方案中，本发明的RNAi剂包括：
(a)有义链，其具有：
(i)19个核苷酸的长度；
(ii)附接到3’-端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包括通过三价分支接头所附接的三个GalNAc衍生物；
(iii)在位置1至4、6、和10至19的2’-OMe修饰，和在位置5、和7至9的2’-F修饰；以及
(iv)核苷酸位置1和2之间以及核苷酸位置2和3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合(从5’端开始计数)；
和
(b)反义链，其具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)在位置1、3至5、7、10至13、15、和17至21的2’-OMe修饰，和在位置2、6、8、9、14、和16的2’-F修饰(从5’端开始计数)；以及
(iii)核苷酸位置1和2之间，核苷酸位置2和3之间，核苷酸位置19和20之间，以及核苷酸位置20和21之间的硫代磷酸酯核苷酸间键合(从5’端开始计数)；其中RNAi剂在反义链3’-端有两个核苷酸突出，在反义链5’-端有钝端。
在一些实施方案中，用于本发明的方法中的iRNA是选自表2-11、21、24、27、30、32、33、36、37、49或50中任一表的剂。这些剂可以进一步地包括配体。
III.与配体缀合的iRNA
本发明的iRNA的RNA的另一种修饰涉及将增强iRNA的活性，细胞分布或细胞摄取(例如进入细胞中)一个或多个配体、部分或缀合物化学连接到iRNA上。这些部分包含但不限于脂质部分，例如胆固醇部分(Letsinger et al.,Proc.Natl.Acid.Sci.USA,1989,86:6553-6556)。在其他的实施方案中，配体是胆酸(Manoharan et al.,Biorg.Med.Chem.Let.,1994,4:1053-1060)，硫醚，例如beryl-S-三苯甲硫醇(Manoharanet al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660:306-309；Manoharan et al.,Biorg.Med.Chem.Let.,1993,3:2765-2770)，巯基胆固醇(Oberhauser et al.,Nucl.AcidsRes.,1992,20:533-538)，脂族链，例如，十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaraset al.,EMBO J,1991,10:1111-1118；Kabanov et al.,FEBS Lett.,1990,259:327-330；Svinarchuk et al.,Biochimie,1993,75:49-54)，磷脂，例如，双-十六烷基-外消旋-甘油或1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-膦酸三乙铵(Manoharan et al.,TetrahedronLett.,1995,36:3651-3654；Shea et al.,Nucl.Acids Res.,1990,18:3777-3783)，多胺或聚乙二醇链(Manoharan et al.,Nucleosides&Nucleotides,1995,14:969-973)，或金刚烷乙酸(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36:3651-3654)，棕榈基部分(Mishraet al.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264:229-237)，或十八烷胺或己胺基-羰基-氧基胆固醇部分(Crooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277:923-937)。
在一些实施方案中，配体会改变其所并入的iRNA剂的分布，靶向或寿命。在优选的实施方案中，配体对选定的靶标提供更高的亲和力，所述靶标为例如分子、细胞或细胞类型，区室例如细胞区室或器官区室，身体的组织、器官或区域，例如与无此配体的种类相比。优选的配体不参与双链体核酸中的双链体配对。
配体可包含天然存在的物质，诸如蛋白质(例如，人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、或球蛋白)；糖类(例如、葡聚糖、普鲁兰多糖、几丁质、壳聚糖、菊糖、环糊精、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、玻尿酸)；或脂质。配体也可是重组或合成的分子，诸如合成的聚合物，例如合成的聚氨基酸。聚氨基酸的实例包含聚氨基酸为：聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物、或聚磷嗪。聚胺的实例包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、聚胺、伪肽-聚胺、拟肽聚胺、树枝状聚胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、聚胺的季盐或α螺旋肽。
配体还可包含与具体细胞类型(例如肾脏细胞)结合的靶向基团，例如细胞靶向剂或组织靶向剂，例如凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如抗体。靶向基团可以是：促甲状腺素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性剂蛋白A、粘蛋白糖类、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰-半乳糖胺、N-乙酰-葡萄糖胺、多价甘露糖、多价海藻糖、糖基化的聚氨基酸、多价半乳糖、运铁蛋白、双膦酸盐、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、脂类、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶酸、维生素B12、维生素A、生物素、或RGD肽或拟RGD肽。在一些实施方案中，配体是多价半乳糖，例如，N-乙酰-半乳糖胺。
配体的其他实例包含染料、嵌入剂(例如吖啶)、交联剂(例如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、texaphyrin、Sapphyrin)、多环芳香烃(例如、吩嗪、二氢吩嗪)、人工的核酸内切酶(例如EDTA)、亲脂性分子、例如、胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基基团、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基基团、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基、或吩恶嗪)和肽缀合物(例如、触角足肽、Tat肽)、烷化剂、磷酸、氨基、硫醇基、PEG(例如、PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代烷基、放射性标记的标记物、酶、半抗原(例如生物素)、转运促进剂/吸收促进剂(例如、阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成的核糖核酸酶(例如、咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环的Eu3+复合物)、二硝基苯基、HRP、或AP。
配体可以是蛋白质，例如糖蛋白，或肽，例如对共配体具有特定亲和力的分子，或抗体，例如结合特定细胞类型(例如肝细胞)的抗体。配体还可以包含激素和激素受体。它们也可以包含非肽类物质，例如脂质、凝集素、糖类、维生素、辅助因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡萄糖胺、多价甘露糖或多价盐还藻糖。配体可以是，例如，脂多糖，p38 MAP激酶的活化剂或NF-κB的活化剂。
配体可以是物质(例如药物)，该物质可以例如通过破坏细胞的细胞骨架(例如通过破坏细胞的微管、微丝或中间丝)来增加细胞对iRNA剂的摄取。该药物可以是例如紫杉醇(taxol)、长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、细胞松弛素(cytochalasin)、诺考达唑(nocodazole)、茉莉素(jasplakinolide)、红海海绵素A(latrunculin A)、鬼笔环肽(phalloidin)、海绵抗菌素(Swinholide A)、茚酮衍生物(indanocine)或迈尔素(myoservin)。
在某些实施方案中，如本文所述附接至iRNA的配体充当药物代谢动力学调节剂(PK调节剂)。PK调节剂包含亲脂性物质、胆汁酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白质结合剂、PEG、维生素等。示例性的PK调节剂包含但不限于胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰基甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生、布洛芬、维生素E、生物素。还已知包括一些硫代磷酸酯键的寡核苷酸与血清蛋白质结合，因此，在主链中包含多个硫代磷酸酯键的短寡核苷酸，例如约5个碱基、10个碱基、15个碱基或20个碱基的寡核苷酸，也适合作为本发明的配体(例如作为PK调节剂配体)。另外，结合血清部分(例如血清蛋白)的适体也适合用作本文所述实施方案中的PK调节剂配体。
本发明的配体-缀合的iRNA可以通过使用具有侧链反应性官能团的寡核苷酸来合成，例如衍生自连接分子与寡核苷酸的附接(如下所述)。该反应性寡核苷酸可以与下列配体直接反应：市售的配体、带有任何一种保护基团的合成配体，或具有附接其上的连接部分的配体。
本发明的缀合物中所使用的寡核苷酸可以通过公知的固相合成技术方便且常规地制备。用于这种合成的设备由包含例如Applied
Figure BDA0003795632600000861
(Foster City,Calif)在内的一些供应商出售。可以额外地或替代地采用本领域已知的用于这种合成的任何其他方法。还已知使用类似的技术来制备其他寡核苷酸，诸如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。
在本发明的配体-缀合的iRNA和带有配体分子的序列特异性连接的核苷中，寡核苷酸和寡核苷可以在合适的DNA合成仪上使用如下物质组装：标准的核苷酸或核苷前体，或已带有连接部分的核苷酸缀合前体或核苷缀合前体，或已带有配体分子或已带有非核苷配体结构单元的配体-核苷酸前体或核苷缀合前体。
当使用已带有连接部分的核苷酸缀合前体时，通常序列特异性链连接的核苷的合成已经完成，然后使配体分子与该连接部分反应而形成与配体缀合的寡核苷酸。在某些实施方案中，本发明的寡核苷酸或连接的核苷由自动合成仪合成，除了使用市售和常用的标准亚磷酰胺和非标准亚磷酰胺之外，还使用衍生自配体-核苷缀合物的亚磷酰胺。
A.脂质缀合物
在一些实施方案中，配体或缀合物是脂质或基于脂质的分子。这样的脂质或基于脂质的分子优选地结合血清蛋白质，例如人血清白蛋白(HSA)。HSA与配体的结合允许缀合物分布至靶组织，例如身体的非肾脏靶组织。例如，靶组织可以是肝脏，包含肝脏的实质细胞。可以结合HSA的其他分子也可用作配体。例如，可使用萘普生或阿司匹林。脂质或基于脂质的配体可(a)增加对缀合物降解的抗性，(b)增加靶向或转运到靶细胞中或细胞膜中，或(c)可用于调节与血清蛋白质(例如，HSA)的结合。
基于脂质的配体可用于抑制，例如控制缀合物与靶组织的结合。例如，与HSA更牢固结合的脂质或基于脂质的配体将不太可能靶向至肾脏，因此也不太可能从体内被清除。与HSA结合较弱的脂质或基于脂质的配体可用于将缀合物靶向至肾脏。
在一些实施方案中，基于脂质的配体结合HSA。优选地，其以足够的亲和力结合HSA，使得缀合物优选地分布至非肾脏组织。然而，优选地，亲和力不至于强到HSA-配体的之结合不能被逆转。
在其他实施方案中，基于脂质的配体与HSA微弱地结合或根本不结合HSA，使得缀合物将优选地分布至肾脏。靶向肾脏细胞的其他部分也可以代替基于脂质的配体进行使用，或与其一同使用。
在另一个方面，配体是被靶细胞(例如增殖细胞)所摄取的部分，例如维生素。这些对于适用于治疗以多余的细胞增殖为特征的疾病，例如恶性或非恶性类型的，例如癌细胞。示例性的维生素包含维生素A、E和K。其他示例性的维生素包含B族维生素，例如叶酸、B12、核黄素、生物素、吡哆醛或其他被靶细胞(诸如肝细胞)所吸收的维生素或营养素。HSA和低密度脂蛋白(LDL)也包含在内。
B.细胞渗透剂
在另一个方面，配体是细胞渗透剂，优选地是螺旋细胞渗透剂。优选地，该试剂是两亲性的。示例性的剂是肽，例如tat或触角足(antennapedia)。如果试剂是肽，则可以是经修饰的，包含肽模拟物，反转异构体，非肽或伪肽键，以及D-氨基酸的使用。螺旋剂优选地是α-螺旋剂，其优选地具有亲脂相和疏脂相。
配体可以是肽或肽模拟物。肽模拟物(在本文中也被称为寡肽模拟物)是一种能够折叠成类似于天然肽的所定义的三维结构的分子。肽和肽模拟物与iRNA试剂的附接可以诸如通过增强细胞识别和吸收来影响iRNA的药物代谢动力学分布。肽或肽模拟物部分可以长约5至50个氨基酸，例如长约5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50个氨基酸。
肽或肽模拟物可以是，例如细胞渗透肽、阳离子肽、两亲性肽或疏水性肽(例如，主要由Tyr，Trp或Phe组成)。肽部分可以是树枝状肽、限制性肽或交联肽。在另一个替代方案中，肽部分可以包含疏水性膜转位序列(MTS)。示例性的含有疏水性MTS的肽是具有氨基酸序列AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO:14)的RFGF。含有疏水性MTS的RFGF类似物(例如，氨基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO:15)也可以是靶向部分。该肽部分可以是“递送”肽，其可以携带包含肽、寡核苷酸和蛋白质的极性大分子横跨细胞膜。例如，已发现来自HIV Tat蛋白的序列(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO:16))和来自果蝇触角足蛋白的序列(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:17))能作为传递肽。肽或肽模拟物可由随机DNA序列编码，诸如从噬菌体显示文库或一珠一化合物(OBOC)组合文库(Lam et al.,Nature,354:82-84,1991)中所鉴别出来的肽。经由并入的单体单元与dsRNA剂连系在一起以达到细胞靶向目的的示例性的肽或肽模拟物为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)-肽，或RGD模拟物。肽部分的长度可以为约5个氨基酸至约40个氨基酸的范围。该肽部分可以具有结构性的修饰，诸如为了增加稳定性或引导构象特性。可以使用以下描述的任何结构性修饰。
用于本发明的组合物和方法中的RGD肽可以是线性或环状的，并且可以经修饰，例如糖基化或甲基化，以促进对具体组织的靶向。含有RGD的肽和肽模拟物可以包含D-氨基酸，以及合成的RGD模拟物。除RGD外，还可以使用靶向整合素配体的其他部分。此配体的优选缀合物靶向PECAM-1或VEGF。
“细胞渗透肽”能够渗透细胞，例如微生物细胞，诸如细菌或真菌细胞，或哺乳动物细胞，诸如人细胞。微生物细胞的渗透肽可以是，例如，α-螺旋线性肽(例如，LL-37或天蚕素P1)、含有二硫键的肽(例如，α-防御素，β-防御素或牛抗菌肽(bactenecin))、或仅含有一个或两个主要氨基酸的肽(例如PR-39或吲哚西丁(indolicidin))。细胞渗透肽也可以包含核定位信号(NLS)。例如，细胞渗透肽可以是二分两亲性肽，诸如MPG，其衍生自HIV-1gp41和SV40大T抗原的NLS的融合肽结构域(Simeoni et al.,Nucl.Acids Res.31:2717-2724,2003)。
C.糖类缀合物
在本发明的组合物和方法的一些实施方案中，iRNA进一步地包括糖类。如本文所述，缀合有糖类的iRNA有利于核酸的体内递送，并且使组合物适合于体内治疗用途。如本文所用，“糖类(carbohydrate)”是指化合物，其本身由一个或多个具有至少6个碳原子的单糖单元组成的糖类(可以是线性的、分支的或环状的)，且每个碳原子都与氧、氮或硫原子键结；或是指化合物，其具有糖类部分体作为其一部分，该糖类部分由一个或多个具有至少6个碳原子的单糖单元组成(可以是线性的、分支的或环状的)，且每个碳原子都与氧、氮或硫原子键结。代表性的糖类包含糖(单糖、二糖、三糖以及含有约4、5、6、7、8或9个单糖单元的寡糖)，和多糖，诸如淀粉、糖原、纤维素和多糖胶。具体的单糖包含C5和以上(例如C5，C6，C7或C8)糖；二糖和三糖包含具有两个或三个单糖单元(例如C5，C6，C7或C8)的糖。
在一些实施方案中，用于本发明的组合物和方法中的糖类缀合物是单糖。
在一些实施方案中，单糖是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。包括一种或多种N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)衍生物的GalNAc缀合物在例如US 8,106,022中被描述，其全部内容在此通过引用并入本文。在某些实施方案中，GalNAc缀合物充当将iRNA靶向到特定细胞的配体。在某些实施方案中，GalNAc缀合物将iRNA靶向到肝细胞，例如通过充当肝脏细胞(例如肝细胞)的去唾液酸糖蛋白受体的配体。
在某些实施方案中，碳水化合物缀合物包括一种或多种GalNAc衍生物。GalNAc衍生物可以通过接头，例如二价或三价分支接头来结合。在一些实施方案中，GalNAc缀合物是被缀合至有义链的3'端。在某些实施方案中，GalNAc缀合物通过接头，例如本文所述的接头，缀合到iRNA剂上(例如，有义链的3'端)。在一些实施方案中，GalNAc缀合物被缀合至有义链的5'端。在某些实施方案中，GalNAc缀合物通过接头，例如本文所述的接头，缀合到iRNA剂上(例如，有义链的5'端)。
在本发明的某些实施方案中，GalNAc或GalNAc衍生物通过单价接头结合至本发明的iRNA剂。在某些实施方案中，GalNAc或GalNAc衍生物通过二价接头结合至本发明的iRNA剂。在本发明的其他实施方案中，GalNAc或GalNAc衍生物通过三价接头结合至本发明的iRNA剂。在本发明的其他实施方案中，GalNAc或GalNAc衍生物通过四价接头结合至本发明的iRNA剂。
在某些实施方案中，本发明的双链RNAi剂包括一个结合到iRNA剂的GalNAc或GalNAc衍生物。在一些实施方案中，本发明的双链RNAi剂包括多个(例如2、3、4、5或6个)GalNAc或GalNAc衍生物，每个GalNAc或GalNAc衍生物都独立地，通过多个单价接头，结合到双链RNAi剂的多个核苷酸上。
在某些实施方案中，例如，当本发明的iRNA剂的双链是一较大分子的一部分，通过一条链3’-端与另一条链5’-端之间的不间断的核苷酸链进行连接而形成发夹环圈，而该发夹环圈包括多个未配对的核苷酸时，发夹环圈内的每个未配对的核苷酸可以独立地包括经单价接头结合的GalNAc或GalNAc衍生物。发夹环圈也可以由双链体的一条链的延伸突出形成。
在某些实施方案中，例如，当本发明的iRNA剂的双链是一较大分子的一部分，且该较大分子是通过一条链3’-端与另一条链5’-端之间的不间断的核苷酸链连接而形成发夹环圈，而该发夹环圈包括多个未配对的核苷酸时，发夹环圈内的每个未配对的核苷酸可以独立地包括经单价接头结合的GalNAc或GalNAc衍生物。发夹环圈也可以由双链体的一条链的延伸突出形成。
在一个实施方案中，用于本发明的组合物和方法中的糖类缀合物选由以下所组成的组：
Figure BDA0003795632600000901
Figure BDA0003795632600000911
Figure BDA0003795632600000921
Figure BDA0003795632600000931
Figure BDA0003795632600000941
Figure BDA0003795632600000942
其中Y是O或S且n是3-6(式XXIV)；
Figure BDA0003795632600000951
其中Y是O或S且n是3-6(式XXV)；
Figure BDA0003795632600000952
Figure BDA0003795632600000953
其中X是O或S(式XXVII)；
Figure BDA0003795632600000961
Figure BDA0003795632600000971
在另一个实施方案中，用于本发明的组合物和方法中的糖类缀合物是单糖。在一个实施方案中，单糖是N-乙酰半乳糖胺，诸如
Figure BDA0003795632600000981
在某些实施方案中，如下方案所示，RNAi剂通过接头被结合到糖类缀合物，其中X是O或S
Figure BDA0003795632600000982
在某些实施方案中，如下所示，RNAi剂被缀合到如表1中所定义的L96：
Figure BDA0003795632600000983
用于本文所述实施方案中的另一代表性糖类缀合物包含但不限于，
Figure BDA0003795632600000991
Figure BDA0003795632600000992
当X或Y中之一为寡核苷酸，另一个为氢。
在某些实施方案中，合适的配体是WO 2019/055633中所公开的配体，其全部内容通过引用在此并入本文。在一个实施方案中，配体包括以下结构：
Figure BDA0003795632600000993
在本发明的某些实施方案中，GalNAc或GalNAc衍生物通过单价接头结合至本发明的iRNA剂。在某些实施方案中，GalNAc或GalNAc衍生物通过二价接头结合至本发明的iRNA剂。在本发明的其他实施方案中，GalNAc或GalNAc衍生物通过三价接头结合至本发明的iRNA剂。
在一个实施方案中，本发明的双链RNAi剂包括一个或多个结合到iRNA剂的GalNAc或GalNAc衍生物。GalNAc可以通过有义链或反义链上的接头结合到任何核苷酸。GalNac可以结合到有义链的5’端，有义链的3'端，反义链的5'端或反义链的3'端。在一个实施方案中，例如，通过三价接头将GalNAc结合至有义链的3'端。
在其他实施方案中，本发明的双链RNAi剂包括多个(例如2、3、4、5或6个)GalNAc或GalNAc衍生物，其每个都独立地通过多个接头(例如单价接头)结合至双链RNAi剂的多个核苷酸。
在某些实施方案中，例如，当本发明的iRNA剂的双链是一个较大分子的一部分，且该较大分子是通过一条链的3’-端与另一条链的5’-端之间的不间断的核苷酸链连接而形成发夹环圈，而该发夹环圈包括多个未配对的核苷酸，发夹环圈内的每个未配对的核苷酸可以独立地包括通过单价接头结合的GalNAc或GalNAc衍生物。
在某些实施方案中，糖类缀合物进一步地包括如上所述的一种或多种另外的配体，诸如但不限于，PK调节剂或细胞渗透肽。
适用于本发明的其他糖类缀合物和接头包含那些在PCT公开案WO 2014/179620和WO 2014/179627中描述的，其各自的全部内容通过引用在此并入本文。
D.接头
在某些实施方案中，本文所述的缀合物或配体可以通过可裂解或不可裂解的各种接头结合至iRNA寡核苷酸。
术语“接头”或“链接基团(linking group)”是指连接化合物的两个部分，例如共价地结合化合物的两个部分。接头通常包括直接键或原子诸如氧或硫，单元例如NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH或原子链，诸如但不限于，取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环基烷基、杂环基烯基、杂环基炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环基烷基、烷基杂环基烯基、烷基杂环基炔基、烯基杂环基烷基、烯基杂环基烯基、烯基杂环基炔基、炔基杂环基烷基、炔基杂环基烯基、炔基杂环基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂芳基，其中一个或多个亚甲基可以被如下基团所中断或终止：O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、或取代的或未取代的杂环基；其中R8是氢、酰基、脂肪族或取代的脂肪族。在一个实施方案中，该接头为约1-24个原子，2-24、3-24、4-24、5-24、6-24、6-18、7-18、8-18、7-17、8-17、6-16、7-17、或8-16原子。
可裂解的链接基团是一种在细胞外足够稳定的基团，但是在进入靶细胞时，该基团被裂解以释放被接头保持在一起的两个部分。在一个优选的实施方案中，在靶细胞中或在第一参考条件下(例如，其可以被选择来模拟或代表细胞内条件)，相比在受试者血液中或在第二参考条件下(例如，其可以被选择来模拟或代表血液或血清中所发现的条件)，所述可裂解的链接基团被裂解的速度至少快约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更高、或至少100倍。
可裂解的链接基团易于受裂解剂的影响，例如pH、氧化还原电位、或降解分子的存在。一般地，与血清或血液相比，裂解剂在细胞内更普遍或以更高的水平或活性存在。这类降解剂的实例包含：为特定底物所选择的氧化还原剂或没有底物特异性的氧化还原剂，包含例如存在于细胞中的氧化酶或还原酶或还原剂，例如硫醇，其能通过还原作用降解可经氧化还原裂解的链接基团；酯酶；能产生酸性环境的胞内体或剂，例如导致pH等于或低于5的那些胞内体或剂；通过充当一般的酸，肽酶(可以是底物特异性的)和磷酸酶来水解或降解酸可裂解的链接基团的酶。
可裂解的链接基团，诸如二硫键可能对pH敏感。人血清的pH值为7.4，而平均的细胞内pH值则略低一些，其范围约为7.1-7.3。胞内体的酸性更高，其范围约为5.5-6.0，而溶酶体的酸性更高，约为5.0。一些接头将具有可裂解的链接基团，其在优选的pH被裂解，从而将阳离子脂质从细胞内的配体释放出来，或将其释放进入所期望的细胞区室内。
接头可包含可被特定酶裂解的可裂解的链接基团。结合到接头中的可裂解的链接基团的类型可以取决于要靶向的细胞。例如，靶向肝的配体可以通过包含酯基团的接头与阳离子脂质连接。肝脏细胞富含酯酶，因此与不富含酯酶的细胞类型相比，该接头在肝细胞中的被裂解效率更高。其他富含酯酶的细胞类型包含肺细胞、肾皮质细胞和睾丸细胞。
当靶向富含肽酶的细胞类型诸如肝脏细胞和滑膜细胞时，可以使用含有肽键的接头。
通常，候选可裂解链接基团的适用性可通过测试降解剂(或条件)裂解候选链接基团的能力来评估。还期望测试候选可裂解链接基团在血液中或与其他非靶组织接触时抵抗裂解的能力。因此，人们可以确定第一条件和第二条件之间的对裂解的相对敏感性，其中选择第一个条件以指示靶细胞中的裂解，而选择第二个条件以指示其他组织或生物液(例如血液或血清)中的裂解。评估可以在无细胞系统中、在细胞中、在细胞培养中、在器官或组织培养中、或在完整动物体内完成。在无细胞或培养条件下进行初步评估，并通过在完整动物体内的进一步评估进行确认，可以是很有用的。在优选的实施方案中，与血液或血清相比(或在被选用以模拟细胞外条件的体外条件下)，有用的候选化合物在细胞中(或在被选用以模拟细胞内条件的体外条件下)的被裂解速度至少快约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100倍。
i.氧化还原可裂解的链接基团
在一些实施方案中，可裂解的链接基团是在还原或氧化时被裂解的可经氧化还原裂解的链接基团。还原性可裂解的链接基团的一个实例是二硫化物链接基团(-S-S-)。可参见本文所述的方法来确定候选可裂解的链接基团是否是合适的“还原性可裂解的链接基团”，或举例来说，是否适合与特定的iRNA部分和特定的靶向剂一起使用。例如，可以通过使用本领域已知的试剂将候选物与二硫苏糖醇(DTT)或其他还原剂一起孵育来对其评估，所述试剂模仿在细胞中，例如靶细胞中，所观察到的裂解速率。候选物还可以在被用以模拟血液或血清条件的条件下评估。在一个实施方案中，候选化合物在血液中的最多被裂解约10％。在其他实施方案中，与血液相比(或在被选用以模拟细胞外条件的体外条件下)，有用的候选化合物在细胞中(或在被选用以模拟细胞内条件的体外条件下)降解速度至少快约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90、或约100倍。可以在选定以模拟细胞内介质的条件下，使用标准酶动力学测定法以确定候选化合物的裂解速率，并与选定以模拟细胞外介质的条件进行比较。
ii.基于磷酸酯的可裂解的链接基团
在其他实施方案中，可裂解的接头包括基于磷酸酯的可裂解的链接基团。基于磷酸酯的可裂解的链接基团是被降解或水解磷酸基团的剂所裂解。在细胞中裂解磷酸基团的剂的实例是酶，例如细胞中的磷酸酯酶。基于磷酸酯的可裂解的链接基团的实例是：-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-。优选的实施方案为：-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、以及-O-P(S)(H)-S-。一个优选的实施方案是-O-P(O)(OH)-O-。可以使用类似于上述方法的方法评估这些候选物。
iii.酸可裂解的链接基团
在其他实施方案中，可裂解的接头包括酸可裂解的链接基团。酸可裂解的链接基团是在酸性条件下被裂解的链接基团。在优选的实施方案中，酸可裂解的链接基团在pH约6.5或更低(例如约6.0、5.5、5.0、或更低)的酸性环境中被裂解，或者，被诸如可用作普通的酸的酶的剂所裂解。在细胞中，具体的低pH细胞器，诸如胞内体和溶酶体，可以为酸可裂解的链接基团提供裂解环境。酸可裂解的链接基团的实例包含但不限于：腙类、酯类，以及氨基酸的酯类。酸可裂解的基团可具有通式-C＝NN-、C(O)O、或-OC(O)。一个优选的实施方案为：与酯(烷氧基)的氧所结合的碳是芳基基团，经取代的烷基基团，或叔烷基基团是诸如二甲基戊基或叔丁基。可以使用类似于上述方法的方法评估这些候选物。
iv.基于酯的可裂解的链接基团
在其他实施方案中，可裂解的接头包括基于酯的可裂解的链接基团。基于酯的可裂解的链接基团通过细胞中的酶，诸如酯酶和酰氨酶，所裂解。基于酯的可裂解的链接基团的实例包含但不限于，亚烷基基团、亚烯基基团和亚炔基基团的酯类。酯可裂解的链接基团具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。可以使用类似于上述方法的方法评估这些候选物。
v.基于肽的可裂解的链接基团
在其他实施方案中，可裂解的接头包括基于肽的可裂解的链接基团。基于肽的可裂解的链接基团是被细胞中的酶，诸如肽酶和蛋白酶，所裂解。基于肽的可裂解的链接基团是在氨基酸之间形成肽键，以产生寡肽(例如，二肽、三肽等)和多肽。基于肽的可裂解的基团不包含酰氨基团(-C(O)NH-)。酰氨基团可在任何亚烷、亚烯或亚炔之间形成。肽键是氨基酸之间所形成的特殊类型的酰氨键，以产生肽和蛋白质。基于肽的可裂解的基团通常限于产生肽和蛋白质的氨基酸之间所形成的肽键(即酰氨键)，而并不包含整个酰氨官能团。基于肽的可裂解的链接基团的通式为-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA和RB是两个相邻氨基酸的R基团。可以使用类似于上述方法的方法评估这些候选物。
在某些实施方案中，本发明的iRNA通过接头与糖类缀合。本发明的组合物和方法的具有接头的iRNA糖类缀合物的非限制性实例包含但不限于，
Figure BDA0003795632600001041
Figure BDA0003795632600001051
Figure BDA0003795632600001052
当X或Y中之一为寡核苷酸，另一个为氢。
在本发明的组合物和方法的某些实施方案中，配体是通过二价或三价分支接头结合的一个或多个“GalNAc”(N-乙酰半乳糖胺)衍生物。
在一个实施方案中，本发明的dsRNA接合至选自式(XLV)至(XLVI)中任一者显示的结构所组成的组的二价或三价分支接头：
Figure BDA0003795632600001061
其中:
q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B和q5C每次出现独立地表示0-20，并且其中的重复单元可以相同或不同；
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C每次出现各自独立地表示：不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；
Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C每次出现独立地表示：不存在、亚烷基、取代的亚烷基，其中一个或多个亚甲基可以被如下一个或多个基团所中断或终止，O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R’)＝C(R”)、C≡C or C(O)；
R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C每次出现各自独立地表示：不存在、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH＝N-O、
Figure BDA0003795632600001062
Figure BDA0003795632600001063
或杂环基；
L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B和L5C代表配体；即每次出现各自独立地表示：单糖(诸如GalNAc)、二糖、三糖、四糖、寡糖、或多糖；并且Ra是H或氨基酸侧链。三价缀合的GalNAc衍生物与RNAi剂一起使用对于抑制靶基因的表达是特别有用的，例如式(XLIX)的那些：
式XLIX
Figure BDA0003795632600001071
其中L5A、L5B和L5C表示单糖，诸如GalNAc衍生物。
合适的缀合GalNAc衍生物的二价或三价分支接头基团的实例，包含但不限于，上面所列举的结构如式II、VII、XI、X、和XIII。
教导RNA缀合物的制备的代表性专利包含但不限于，美国专利4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717,5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928；5,688,941；6,294,664；6,320,017；6,576,752；6,783,931；6,900,297；7,037,646；和8,106,022，在此通过引用将其每个的全部内容并入本文。
给定化合物中的所有位置不需要统一地进行修饰，并且实际上可以将超过一种的上述修饰并入单个化合物中或甚至并入到iRNA的单个核苷。本发明还包含作为嵌合化合物的iRNA化合物。
在本发明的上下文中，“嵌合”iRNA化合物或“嵌合体”，是iRNA化合物，优选为dsRNAi剂，其含有两个或更多个化学上不同的区域，且每个区域由至少一个单体单元组成，即在dsRNA化合物的情况下单体单元为核苷酸。这些iRNA通常含有至少一个区域，其中RNA被修饰以赋予iRNA对核酸酶降解的抵抗力增加、细胞摄取增加、或对靶核酸的结合亲和力增加。iRNA的另一区域可以充当能够裂解RNA:DNA或RNA:RNA杂交物的酶的底物。举例来说，RNase H是裂解RNA:DNA双链体的RNA链的细胞核酸内切酶。因此，RNase H的活化导致RNA靶目标裂解，从而大幅提高了iRNA抑制基因表达的效率。所以当使用嵌合dsRNA时，通常可以用较短的iRNA获得与相同靶区域杂交的硫代磷酸酯脱氧dsRNA相当的结果。RNA靶目标的裂解可以通过凝胶电泳与本领域已知的相关核酸杂交技术(如果需要)联合来常规地检测。
在某些情况下，iRNA的RNA可以由非配体基团所修饰。为了增强iRNA的活性、细胞分布或细胞摄取，已经将一些非配体分子缀合到iRNA上，并且执行此类缀合的过程是在科学文献中可以获得的。此类非配体部分包含脂质部分，诸如胆固醇(Kubo,T.et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.,2007,365(1):54-61；Letsinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86:6553)，胆酸(Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1994,4:1053)，硫醚，例如，己基-S-三苯甲硫醇(Manoharan etal.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660:306；Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3:2765)，巯基胆固醇(Oberhauser et al.,Nucl.Acids Res.,1992,20:533)，脂肪链，例如，十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras et al.,EMBO J.,1991,10:111；Kabanov et al.,FEBS Lett.,1990,259:327；Svinarchuk et al.,Biochimie,1993,75:49)，磷脂，例如，双-十六烷基-外消旋-甘油或1,2-双-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-膦酸三乙铵(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36:3651；Shea et al.,Nucl.AcidsRes.,1990,18:3777)，多氨或聚乙二醇链(Manoharan et al.,Nucleosides&Nucleotides,1995,14:969)，或金刚烷乙酸(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36:3651)，棕榈基部分(Mishra et al.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264:229)，或十八烷胺或己胺基-羰基-氧基胆固醇部分(Crooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277:923)。上面列出了教导制备此类RNA缀合物的代表性美国专利。典型的缀合方案涉及在序列的一个或多个位置带有氨基接头的RNA的合成。然后使用适当的耦合剂或活化剂使氨基基团与将被缀合的分子反应。缀合反应可以用仍与固相支持物结合的RNA来进行，也可以在RNA裂解之后的液相中执行。通过HPLC纯化RNA缀合物通常会得到纯的缀合物。
IV.本发明的iRNA的递送
将本发明的iRNA递送至细胞，例如受试者体内的细胞，诸如人受试者(例如，其中有需要的受试者，例如易患或已诊断患有PNPLA3相关病症例如NAFLD的受试者)可以通过多种不同方式来实现。例如，在体外或在体内使细胞与本发明的iRNA接触来施行递送。体内递送也可以通过给受试者施用包括iRNA(例如dsRNA)的组合物来直接施行。或者，体内递送可以通过施用一种或多种编码并导引iRNA表达的载体来间接施行。这些替代方案会在下面进一步讨论。
一般而言，任何递送核酸分子(体外或体内)的方法均可适用于本发明的iRNA(参见例如Akhtar S.和Julian RL.(1992)Trends Cell.Biol.2(5):139-144以及WO94/02595，其全部内容在此通过引用并入本文)。对于体内递送，为了递送iRNA分子而要考虑的因素包含，例如，所递送的分子的生物稳定性、非特异性效应的防止、以及所递送的分子在靶组织中的积累。也已经显示了通过直接注射而成功将RNA干扰局部递送至CNS(Dorn,G.,et al.(2004)Nucleic Acids32:e49；Tan,PH.,et al(2005)Gene Ther.12:59-66；Makimura,H.,et al(2002)BMC Neurosci.3:18；Shishkina,GT.,et al(2004)Neuroscience 129:521-528；Thakker,ER.,et al(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101:17270-17275；Akaneya,Y.,et al(2005)J.Neurophysiol.93:594-602)。RNA或药物载体的修饰也可以允许将iRNA靶向到靶组织并避免不希望的脱靶效应。iRNA分子可通过化学缀合至亲脂性基团(诸如胆固醇)来进行修饰，以增强细胞摄取并防止降解。例如，将与亲脂性胆固醇部分缀合的针对ApoB的iRNA全身性注射到小鼠中，而导致肝脏和空肠中apoB mRNA的敲低(Soutschek,J.,et al(2004)Nature 432:173-178)。
在一个替代实施方案中，iRNA可以使用药物递送系统诸如纳米粒子、树枝状聚合物、聚合物、脂质体或阳离子递送系统来递送。带正电荷的阳离子递送系统可促进iRNA分子(带负电荷)的结合，并增强在带负电荷的细胞膜处的相互作用从而允许细胞对iRNA的有效摄取。阳离子脂质、树枝状聚合物、或聚合物可与iRNA相结合，或被诱导以形成封装iRNA的囊泡或微胞(micelle)(参见例如，Kim SH,et al(2008)Journal of Controlled Release129(2):107-116)。当进行全身性施用时，囊泡或微胞的形成进一步防止了iRNA的降解。制备和施用阳离子-iRNA复合体的方法完全在本领域技术人员的能力范围内(参见例如，Sorensen,DR,et al(2003)J.Mol.Biol 327:761-766；Verma,UN,et al(2003)Clin.CancerRes.9:1291-1300；Arnold,AS,et al(2007)J.Hypertens.25:197-205，其全部内容在此通过引用并入本文)。可用于iRNA的系统递送的药物递送系统的一些非限制性实例包含DOTAP(Sorensen,DR.,et al(2003),同上；Verma,UN,et al(2003),同上)，“固体核酸脂质粒子”(Zimmermann,TS,et al(2006)Nature441:111-114)，心磷脂(Chien,PY,et al(2005)Cancer Gene Ther.12:321-328；Pal,A,et al(2005)Int J.Oncol.26:1087-1091)，聚乙烯亚氨(Bonnet ME,et al(2008)Pharm.Res.Aug 16电子提前出版；Aigner,A.(2006)J.Biomed.Biotechnol.71659)，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸/Arg-Gly-Asp(RGD)肽(Liu,S.(2006)Mol.Pharm.3:472-487)和聚酰氨基胺(Tomalia,DA,et al(2007)Biochem.Soc.Trans.35:61-67；Yoo,H.,et al(1999)Pharm.Res.16:1799-1804)。在某些实施方案中，iRNA与环糊精形成用于全身给药的复合体。iRNA和环糊精的给药方法及iRNA和环糊精的药物组合物可见于美国专利7,427,605，其全部内容在此通过引用并入本文。
A.编码本发明iRNA的载体
靶向PNPLA3基因的iRNA可以从插入到DNA或RNA载体中的转录单位表达(参见例如Couture,A,et al.,TIG.(1996),12:5-10；Skillern,A,et al.,国际PCT公开号WO 00/22113,Conrad,国际PCT公开号WO 00/22114,和Conrad,美国专利No.6,054,299)。取决于所用的具体构建体和靶组织或细胞类型，表达可以是瞬时的(数小时至数周的级别)或持续的(数周至数月或更长)。此类转基因可以以线性构建体、环状质粒、或病毒载体引入，其可以是整合载体或非整合载体。还可以构建转基因以允许其作为染色体外质粒而遗传(Gassmann,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92:1292)。
可以用于本文所述的方法和组合物的病毒性载体系统包含但不限于：(a)腺病毒载体；(b)逆转录病毒载体，包含但不限于慢病毒载体，莫罗尼鼠白血病病毒载体等；(c)腺相关病毒载体；(d)单纯疱疹病毒载体；(e)SV 40载体；(f)多瘤病毒载体；(g)乳头状瘤病毒载体；(h)小核糖核酸病毒载体；(i)痘病毒载体，诸如正痘病毒，例如牛痘病毒载体或鸟类痘病毒，例如金丝雀痘或鸡痘；以及(j)辅助病毒依赖型腺病毒或裸腺病毒。复制缺陷型病毒也可能是有利的。不同的载体将并入或不并入细胞的基因组中。如果需要，构建体可以包含用于转染的病毒性序列。或者，可将构建体并入到能够进行附加型复制的载体中，例如EPV载体和EBV载体。用于iRNA的重组表达的构建体将通常需要调节组件，例如启动子、增强子等，以确保iRNA在靶细胞中的表达。对于载体和构建体需考虑的其他方面是本领域已知的。
V.本发明的药物组合物
本发明还包含含有本发明的iRNA的药物组合物和制剂。在一个实施方案中，本文提供了含有如本文所述的iRNA和药学上可接受的载体的药物组合物。含有iRNA的药物组合物可用于预防或治疗PNPLA3相关的病症，例如高三酸甘油酯血症。此药物组合物是根据递送方式而配制的。一个实例是配制用于全身性给药的组合物，该施用是经由肠道外递送，例如通过皮下(SC)、肌内(IM)或静脉内(IV)递送。本发明的药物组合物可以以足以抑制PNPLA3基因表达的剂量施用。
在某些实施方案中，本发明的药物组合物是无菌的。在另一个实施方案中，本发明的药物组合物是无热原的。
可以以足以抑制PNPLA3基因表达的剂量施用本发明的药物组合物。通常，适当剂量的本发明的iRNA将在每天约0.001至约200.0毫克/每千克受体体重的范围，通常在每天约1至50毫克/每千克体重的范围。通常，本发明的iRNA的合适剂量将在约0.1mg/kg至约5.0mg/kg的范围，优选约0.3mg/kg至约3.0mg/kg。重复剂量的给药方案可以包含定期施用治疗量的iRNA，诸如每月、每3-6个月一次、或每年一次。在一些实施方案中，约每月一次至约每六个月一次施用iRNA。
在初始治疗给药方案之后，可以相对不频繁地施用治疗。治疗的持续时间可以根据疾病的严重程度来确定。
在其他实施方案中，单剂量的药物组合物可以是长效的，以使得多剂量以不超过1、2、3或4个月的间隔来施用。在一些本发明的实施方案中，单剂量的本发明药物组合物约每月施用一次。在其他本发明的实施方案中，单剂量的本发明药物组合物每季施用一次(即，约每三个月一次)。在其他本发明的实施方案中，单剂量的本发明药物组合物每年施用两次(即，约每六个月一次)。
本领域技术人员将理解，某些因素可以影响有效治疗受试者所需的剂量和时间，包含但不限于：受试者体内存在的突变，以前的治疗，受试者的总体健康状况或年龄，以及其他现有疾病。此外，用适当的预防或治疗有效量的组合物治疗受试者，可以包含单次治疗或一系列治疗。
可以用靶向特定组织(例如肝细胞)的方式递送iRNA。
本发明的药物组合物包含但不限于，溶液、乳液、和含有脂质体的制剂。这些组合物可以由多种组分产生，该组分包含但不限于，预制液体、自乳化固体、和自乳化半固体。制剂包含那些靶向肝脏的制剂。
本发明的药物制剂，其可以方便地以单位剂型形式存在，可以根据制药工业中众所周知的常规技术来制备。此类技术包含将活性成分与药物载体或赋形剂结合的步骤。通常，通过将活性成分与液体载体均匀地且紧密地结合在一起来制备制剂。
A.其他的制剂
i.乳液
本发明的组合物可以被制备并配制成乳液。乳液通常是非均质系统，其中一种液体以通常直径超过0.1μm的液滴形式分散在另一种液体中(参见例如，Ansel'sPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,和Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,inPharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(Eds),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Volume1,p.245；Block in Pharmaceutical DosageForms,Lieberman,Rieger和Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 2,p.335；Higuchi et al.,inRemington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.301)。乳液通常是双相系统，其包括两个彼此紧密混合和分散的不混溶的液相。通常，乳液可以是油包水型(w/o)或水包油型(o/w)。当水相被细分并分散为微小的小滴而分散到大体积油相中时，所得的组合物称为油包水(w/o)乳液。或者，当油相被细分并分散为微小的小滴而分散到大体积水相时，所得的组合物称为水包油(o/w)乳液。乳液除了分散相外，还可以含有其他成分，而活性药物则可以以溶液形式存在于水相，油相中，或以其本身作为独立相而存在。乳液中还可以根据需要添加药用赋形剂，如乳化剂、稳定剂、染料、和抗氧化剂。药物乳液也可以是包括超过两个相的复合乳液，诸如在油包水包油(o/w/o)和水包油包水(w/o/w)乳液的情况下。这种复杂的制剂通常提供简单的二元乳液所没有的某些优势。复合乳液其中o/w乳液的各个油滴包封小水滴而构成w/o/w乳液。同样，一个油滴被包封在稳定存在于油性连续相中的水球内的系统提供了o/w/o乳液。
乳液的特征在于极低或不具备热力学稳定性。通常，乳液的分散相或不连续相很好地分散在外相或连续相中，并通过乳化剂的手段或制剂的粘度保持这种形式。稳定乳液的其他方法需要使用可掺入乳液任一相中的乳化剂。乳化剂大致可分为四类：合成表面活性剂、天然乳化剂、吸收基剂和精细分散的固体(参见例如,Ansel's PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,in PharmaceuticalDosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,NewYork,N.Y.,volume 1,p.199)。
合成表面活性剂，也称为表面活性剂，已在乳液的制剂中有广泛的适用性，并已有文献中对其的综述(参见例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,和Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rieger,in Pharmaceutical DosageForms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.285；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),MarcelDekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,volume 1,p.199)。表面活性剂通常是两亲性的，且包括亲水部分和疏水部分。表面活性剂的亲水性与疏水性之比已被命名为亲水/亲脂平衡(HLB)，并且是在分类和制剂的制备中选择表面活性剂的有价值的工具。表面活性剂可以基于亲水基团的性质分为不同的类别：非离子性、阴离子性、阳离子性和两亲性的(参见例如，Ansel'sPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(8th ed.),NewYork,NY Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.285)。
乳液制剂中还包含多种非乳化材料，其有助于乳液的性能。这些包含脂肪、油、蜡、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、保湿剂、亲水胶体、防腐剂和抗氧化剂(Block,in PharmaceuticalDosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.335；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。
经皮肤、口服和肠胃外途径的乳液制剂的应用，以及其制造方法，已有文献的综述(参见例如，Ansel′s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,和Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。
ii.微乳液
在本发明的一个实施方案中，iRNA和核酸的组合物被配制成微乳液。微乳液可以定义为水、油和两亲物组成的系统，该系统是单一光学各向同性和热力学稳定的液体溶液(参见例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms AND Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,和Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rosoff,in Pharmaceutical DosageForms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245)。典型地，微乳液是通过如下制备而得的系统：首先将油分散在表面活性剂水溶液中，然后添加足够量的第四组分，通常是中等链长的醇，以形成透明的系统。因此，微乳液也被描述为两种不混溶液体的热力学稳定的、各向同性的透明分散液，而所述两种不混溶液体是通过表面活性分子的界面膜得以稳定(Leung and Shah,in:Controlled Release of Drugs:Polymers andAggregate Systems,Rosoff,M.,Ed.,1989,VCH Publishers,New York,pages185-215)。
iii.微粒
本发明的iRNA可以掺入颗粒，例如微粒中。微粒可以通过喷雾干燥来产生，但是也可以通过其他方法来产生，包括冷冻干燥法、蒸发法、流体床干燥法、真空干燥法或这些技术的组合。
iv.渗透增强剂
在一个实施方案中，本发明使用各种渗透增强剂来实现核酸，特别是iRNA，向动物皮肤的有效递送。大多数药物以离子化和非离子化的形式存在于溶液中。然而，通常仅脂溶性或亲脂性药物容易穿过细胞膜。已经发现，如果用渗透增强剂处理待穿过的膜，即使非亲脂性药物也可以穿过细胞膜。除了帮助非亲脂性药物的跨细胞膜扩散外，渗透增强剂还可以提高亲脂性药物的通透性。
渗透增强剂可被归类为五大类别之一，即表面活性剂、脂肪酸、胆盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂(see e.g.,Malmsten,M.Surfactants and polymers in drugdelivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee et al.,Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)。上述每类渗透增强剂以及它们在药物组合物的制造和药剂递送中的作用是本领域众所周知的。
v.赋形剂
与载体化合物相反，“药物载体”或“赋形剂”是用于将一种或多种核酸递送给动物的药学上可接受的溶剂、悬浮剂、或任何其他药理学上惰性的媒介。赋形剂可以是液体或固体，并可以根据所计划的给药方式进行选择，以便在将其与核酸和给定药物组合物的其他组分结合时提供所期望的容积、稠度等。此种试剂是本领域众所周知的。
vi.其他组分
本发明的组合物还可以，按其本领域确定的使用量级，另外含有在药物组合物中常规找到的其他辅助组分。因此，例如，该组合物可以含有另外的、兼容的、药物活性材料，诸如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或者可以含有用于在物理上配制本发明组合物各种剂形的其他物质，诸如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，添加这些材料时，不应过分地干扰本发明组合物之组分的生物活性。可以对制剂进行灭菌，如果需要，还可以与辅助剂混合，例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂或芳香族物质等，以及其他类似的不会与制剂的核酸有害地相互作用的物质。
水性悬浮液可含有增加悬浮液黏度的物质，包含例如羧甲基纤维素钠，山梨糖醇或葡聚糖。悬浮液也可以含有稳定剂。
在某些实施方案中，本发明特征的药物组合物包含(a)一种或多种iRNA和(b)一种或多种通过非-iRNA机制起作用的剂，该剂可用于治疗PNPLA3相关病症，例如NAFLD。
这类化合物的毒性和预防效力可通过标准药学过程在细胞培养物或实验动物体内来确定，例如用于确定LD50(对群体的50％致死的剂量)和ED50(对群体的50％有效预防的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，其可以表示为LD50/ED50的比。展现出高治疗指数的化合物是优选的。
从细胞培养测定法和动物研究中获得的数据可用于配制用于人类的剂量范围。本文中本发明特征的组合物的剂量通常位于具有低毒性或无毒性的循环浓度范围内(该范围包含ED50，优选ED80或ED90)。剂量可以在此范围内变化，取决于所采用的剂型和所使用的给药途径。对于用于本发明特征的方法中的任何化合物，可以首先从细胞培养测定中估计预防有效量。可以在动物模型中配制剂量，以取得化合物的循环血浆浓度范围或，当适当时，取得靶序列的多肽产物的循环血浆浓度范围(例如实现降低的多肽浓度)，其包含IC50(即，达成症状的半-最大抑制的试验化合物浓度)或如在细胞培养物中所确定的更高水平的抑制。此类信息可用于更准确地确定对人体的有用剂量。可以例如通过高效液相层析测量血浆中的水平。
如上所述，除了它们的施用之外，本发明提出的iRNA可以与用于预防或治疗PNPLA3相关病症(例如NAFLD)的其他已知剂组合施用。在任何情况下，给药医师可以基于使用本领域已知或本文所述的效力的标准测量方法所观察到的结果来调节iRNA给药的量和时间。
VI.抑制PNPLA3表达的方法
本发明还提供了抑制PNPLA3基因在细胞中表达的方法。该方法包含使细胞与有效抑制细胞中PNPLA3表达的量的RNAi剂例如双链RNA剂接触，从而抑制细胞中PNPLA3的表达。
使细胞与iRNA接触，例如双链RNA剂，可以在体外或体内完成。在体内使细胞与iRNA接触包含使受试者(例如人类受试者)体内的细胞或细胞群与iRNA接触。细胞接触的体外和体内方法的组合也是可以的。如上所述，细胞的接触可以是直接或间接的。此外，细胞的接触可以经由靶向配体来实现，所述靶向配体包含本文所述或本领域已知的任何配体。在优选的实施方案中，靶向配体是糖类部分，例如GalNAc3配体，或将RNAi剂引导至目标位点的任何其他配体。
本文所用的术语“抑制”与“减少”，“沉默”，“下调”，“压制”和其他类似术语互换使用，并且包含任何水平的抑制。
短语“抑制PNPLA3的表达”是指抑制任何PNPLA3基因(诸如，小鼠PNPLA3基因、大鼠PNPLA3基因、猴PNPLA3基因、或人PNPLA3基因)以及PNPLA3基因的变体或突变体的表达。因此，在基因操纵的细胞、细胞群或生物体的脉络中，PNPLA3基因可以是野生型PNPLA3基因、突变的PNPLA3基因、或转基因的PNPLA3基因。
“抑制PNPLA3基因的表达”包含对PNPLA3基因任何水平的抑制，例如，至少部分压制PNPLA3基因的表达。可以基于与PNPLA3基因表达相关的任何变量的水平、或水平变化(例如，PNPLA3 mRNA水平或PNPLA3蛋白质水平)来评估PNPLA3基因的表达。该水平可以在单个细胞或一组细胞包含例如，源自受试者的样本中评估。可以理解，PNPLA3主要在肝脏中表达，但也在脑、胆囊、心脏和肾脏中表达，并存在于循环中。
可以通过与对照水平相比，与PNPLA3表达相关的一个或多个变量的绝对或相对水平的降低来评估抑制作用。对照水平可以是本领域中使用的任何类型的对照水平，例如给药前的基线水平，或从未处理或经对照(例如，仅缓冲液对照或无活性剂对照)处理的相似的受试者、细胞、或样本中所确定的水平。
在本发明方法的一些实施方案中，PNPLA3基因的表达被抑制至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％、或低于测定的检测水平。在优选的实施方案中，PNPLA3基因的表达被抑制至少70％。还应理解，可能需要在某些组织例如肝脏中抑制PNPLA3表达，而在其他组织例如大脑中并不显著抑制PNPLA3表达。在优选的实施方案中，使用实施例2中提供的测定方法在合适的物种匹配细胞系中以10nM siRNA的浓度确定了表达水平。
在一些实施方案中，体内表达的抑制是通过在表达人类基因的啮齿动物(例如，表达人类靶基因(即PNPLA3)的AAV-感染的小鼠)中人基因的敲低来确定，例如，当以单次剂量给药时，例如，在RNA表达的最低点时以3mg/kg给药。还可以，例如在RNA表达最低点时，以例如3mg/kg单剂量给药后，确定模型动物系统中内源基因表达的敲低。当人类基因和模型动物基因的核酸序列足够接近而使得人类iRNA提供对模型动物基因的有效敲低时，这样的系统是有用的。使用实施例2中提供的PCR方法确定肝脏中的RNA表达。
PNPLA3基因表达的抑制可通过第一细胞或第一组细胞(这种细胞可以存在于例如源自受试者的样本中)所表达的mRNA量的降低来证明，在该(组)细胞中PNPLA3基因已被转录，并且已处理(例如，通过使该(组)细胞与本发明的iRNA接触，或通过向细胞所在或曾所在的受试者施用本发明的iRNA)以使得，同与第一(组)细胞实质上相同但未经过如此处理的第二(组)细胞(对照细胞：未经iRNA处理，或未经靶向目标基因的iRNA处理)相比，PNPLA3基因的表达受到抑制。在优选的实施方案中，通过实施例2中提供的方法，使用在物种匹配的细胞系中的10nM siRNA浓度，并且将经处理的细胞中的mRNA水平表达为相对于对照细胞中的mRNA水平的百分比，来评估抑制，使用以下式：
Figure BDA0003795632600001181
在其他实施方案中，可以根据与PNPLA3基因表达功能上相关的参数(例如来自受试者的血液或血清中的PNPLA3蛋白质水平)的降低来评估对PNPLA3基因表达的抑制。PNPLA3基因沉默可以通过本领域已知的任何测定方法，在任何表达PNPLA3的细胞中确定，无论是内源的PNPLA3或来自表达构建体的异源PNPLA3。
PNPLA3蛋白质表达的抑制可通过细胞或细胞群或受试者样本中所表达的PNPLA3蛋白质水平(例如，源自受试者的血液样本中的蛋白质水平)的降低来证明。如上所述，为了评估mRNA的压制，在经处理的细胞或细胞群中蛋白质表达水平的抑制可以类似地表达为对照细胞或细胞群中蛋白质水平的百分比，或受试者样本(例如源自其的血液或血清)中蛋白质水平的变化。
可以用于评估对PNPLA3基因表达抑制的对照细胞、细胞群或受试者样本，包含尚未与本发明的RNAi剂接触的细胞、细胞群、或受试者。例如，对照细胞、细胞群或受试者样本可源自在用RNAi剂对受试者治疗之前的单个受试者(例如，人类或动物受试者)或适当的匹配群体对照。
可以使用本领域已知的评估mRNA表达的任何方法来确定细胞或细胞群所表达的PNPLA3 mRNA的水平。在一种实施方案中，通过检测转录的多核苷酸，或其部分，例如PNPLA3基因的mRNA来确定样本中PNPLA3的表达水平。可以从细胞中提取RNA，使用如下RNA提取技术，包含例如，酸性苯酚/异硫氰酸胍提取(RNAzol B；Biogenesis)，RNeasyTM RNA制备试剂盒
Figure BDA0003795632600001182
或PAXgeneTM(PreAnalytixTM,瑞士)。典型测定形式使用核糖核酸杂交，其包含核转录活性测定、RT-PCR、RNase保护分析、northern印迹法、原位杂交和微阵列分析。
在某些实施方案中，使用核酸探针确定PNPLA3的表达水平。如本文所用，术语“探针”是指能够选择性地结合至具体PNPLA3的任何分子。探针可以由本领域技术人员合成，或衍生自适当的生物制品。探针可以被特别设计为被标记的。可用作探针的分子的实例包含但不限于，RNA、DNA、蛋白质、抗体、和有机分子。
经分离的mRNA可用于杂交或扩增测定，包含但不限于，Southern分析或northern分析、聚合酶链反应(PCR)分析和探针阵列。确定mRNA水平的一种方法涉及将经分离的mRNA与可以与PNPLA3 mRNA杂交的核酸分子(探针)接触。在一个实施方案中，mRNA被固定在固体表面并与探针接触，例如通过在琼脂糖凝胶把分离的mRNA跑胶并将mRNA从凝胶转移到膜如硝化纤维。在一个替代实施方案中，将探针固定在固体表面并且使mRNA与探针接触，例如，在
Figure BDA0003795632600001191
基因芯片阵列中。本领域技术人员可以容易地将已知的mRNA检测方法以用于确定PNPLA3 mRNA的水平。
确定样本中PNPLA3表达水平的另一种方法涉及例如样本中mRNA的核酸扩增或逆转录酶(以制备cDNA)的过程，例如，通过RT-PCR(实验实施方案载于Mullis,1987,美国专利No.4,683,202)，连接酶链式反应(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:189-193)，自主序列复制(Guatelli等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874-1878)，转录扩增系统(Kwoh等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173-1177)，Q-Beta复制酶(Lizardi等(1988)Bio/Technology6:1197)，滚环式复制(Lizardi et al.,美国专利No.5,854,033)或任何其他核酸扩增方法，然后使用本领域技术人员熟知的技术检测扩增的分子。如果此类核酸分子以非常低的数量存在，则这些检测方案对于核酸分子的检测特别有用。在本发明的特定方面，PNPLA3的表达水平是通过定量荧光RT-PCR(即TaqManTM系统)确定。在优选的实施方案中，在物种匹配的细胞系中，通过实施例2中提供的方法使用例如10nM siRNA浓度来确定表达水平。
PNPLA3 mRNA的表达水平可使用如下方法监测：膜印迹法(诸如用于杂交分析，诸如Southern印迹、northern印迹、斑点印迹等)，或微孔、试样管、凝胶、珠子或纤维(或任何包括结合的核酸的固体支持物)。参见美国专利5,770,722、5,874,219、5,744,305、5,677,195和5,445,934，其在此通过引用并入本文。PNPLA3表达水平的确定还可包括在溶液中使用核酸探针。
在优选的实施方案中，使用分支DNA(bDNA)测定法或实时PCR(qPCR)评估mRNA表达的水平。在本文提出的实施例中描述和举例说明了这些方法的使用。在优选的实施方案中，在物种匹配的细胞系中，通过实施例2中提供的方法使用10nM siRNA浓度来确定表达水平。
可以使用本领域已知的用于测量蛋白质水平的任何方法来确定PNPLA3蛋白质表达的水平。这些方法包含，例如，电泳、毛细管电泳、高效液相层析(HPLC)、薄层层析(TLC)、超扩散层析、液体或凝胶沉淀素反应、吸收光谱分析、比色测定、分光光度测定、流式细胞仪、免疫扩散(单次或二次)、免疫电泳、蛋白印迹法、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定、电化学发光测定、以及其他类似的。
在某些实施方案中，本发明方法的效力是通过PNPLA3 mRNA或蛋白质水平的降低来评估(例如，在肝活组织切片检查中)。
在本发明方法的一些实施方案中，将iRNA施用给受试者以使得iRNA被递送至受试者体内的具体位点。对PNPLA3表达的抑制可通过测量样本中PNPLA3 mRNA或PNPLA3蛋白质的水平或水平变化来评估，该样本来自受试者体内具体部位的体液或组织(例如，肝脏或血液)。
如本文所用，术语“检测或确定分析物的水平”应理解为是指执行步骤以确定材料(例如蛋白质、RNA)是否存在。如本文所用，检测或确定的方法包含检测或确定低于所用方法检测水平的分析物水平。
VII.本发明的预防和治疗方法
本发明还提供了使用本发明的iRNA或含有本发明的iRNA的组合物以抑制PNPLA3表达，从而预防或治疗与PNPLA3相关病症，例如，脂肪肝(脂肪变性)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝脏中脂肪累积、肝脏炎症、肝细胞的坏死、肝脏纤维化、肥胖症、或非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。在本发明的方法中，细胞可以在体外或在体内与siRNA接触，即，细胞可以在受试者内。
适用于使用本发明的方法治疗的细胞可以是表达PNPLA3基因的任何细胞，例如，肝脏细胞、脑细胞、胆囊细胞、心脏细胞、或肾细胞，但优选是肝脏细胞。适用于本发明的方法的细胞可以是哺乳动物细胞，例如，灵长类动物细胞(诸如人类细胞，包含嵌合非人类动物中的人类细胞，或非人类灵长类动物细胞，例如猴子细胞或黑猩猩细胞)，或非灵长类细胞。在一些实施方案中，该细胞是人类细胞，例如人类肝脏细胞。在本发明的方法中，细胞中PNPLA3的表达被至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％抑制，或抑制到低于测定的检测水平。
本发明的体内方法可以包含给受试者施用含有iRNA的组合物，其中iRNA包含与接受RNAi剂施用的哺乳动物的PNPLA3基因的RNA转录本至少一部分互补的核苷酸序列。该组合物可以通过本领域已知的任何方式施用，包含但不限于口服、腹腔内、或肠胃外途径，包含颅内(例如，脑室内、实质内、和鞘内)、静脉内、肌内、皮下、经皮、气道(气溶胶)、鼻腔、直肠和局部(包括颊和舌下)施用。在一些实施方案中，组合物通过静脉输注或注射施用。在一些实施方案中，组合物通过皮下注射施用。在一些实施方案中，组合物通过肌内注射施用。
在一个方面，本发明还提供了抑制哺乳动物体内PNPLA3基因表达的方法。该方法包含向哺乳动物施用包括靶向哺乳动物细胞中的PNPLA3基因的dsRNA的组合物，并将该哺乳动物维持足够长时间以得到PNPLA3基因的mRNA转录本的降解，从而抑制细胞中PNPLA3基因的表达。基因表达的降低的评估可用本领域已知的任何方法和本文中例如实施例2所述方法，例如qRT-PCR。蛋白质产生的减少可以通过本领域已知的任何方法例如ELISA来评估。在一些实施方案中，肝穿刺活检样本用作监测PNPLA3基因或蛋白质表达降低的组织材料。在其他实施方案中，血液样本用作监测PNPLA3蛋白质表达降低的受试者样本。
本发明进一步提供了在有需要的受试者中的治疗方法，例如，被诊断为患有PNPLA3相关病症的受试者，所述PNPLA3相关病症诸如，脂肪肝(脂肪变性)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝脏中脂肪累积、肝脏炎症、肝细胞的坏死、肝脏纤维化、肥胖症、或非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。
本发明进一步提供了在有需要的受试者中的预防方法。本发明的治疗方法包含将本发明的iRNA，以预防有效量的靶向PNPLA3基因的iRNA或以预防有效量的包括靶向PNPLA3基因的iRNA的药物组合物，施用给受试者，例如将受益于PNPLA3表达降低的受试者。
在一个方面，本发明提供了对患有将受益于PNPLA3表达减低的疾病的受试者的治疗方法，例如，与PNPLA3相关的疾病，诸如慢性纤维炎性肝病(例如，癌症，例如，肝细胞癌、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝脏炎症、肝细胞的坏死、肝脏纤维化和非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。在一个实施方案中，所述慢性纤维炎性肝病是NASH。
在一个方面，本发明提供了本发明的双链核糖核酸(dsRNA)，该双链核糖核酸用于治疗患有将受益于含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)表达减低的病症的受试者的方法。
在另一个方面，本发明提供了本发明的双链核糖核酸(dsRNA)，该双链核糖核酸用于预防患有将受益于含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)表达减低的病症的受试者至少一项症状的方法。
在一个方面，本发明提供了本发明的双链核糖核酸(dsRNA)在制造用于治疗患有将受益于含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)表达减低的受试者的病症的药剂中的用途。
在另一个方面，本发明提供了本发明的双链核糖核酸(dsRNA)在制造用于预防患有将受益于含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)表达减低的病症的受试者至少一项症状的药剂中的用途。
在一个实施方案中，所述药剂以约0.01mg/kg至约50mg/kg的剂量施用。
在一个实施方案中，所述病症是PNPLA3相关疾病。
在一个实施方案中，PNPLA3相关疾病选自由下述所组成的组：脂肪肝(脂肪变性)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝脏中脂肪累积、肝脏炎症、肝细胞的坏死、肝脏纤维化、肥胖症、或非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。
如本文所用，如本文所用，“非酒精性脂肪肝疾病”与术语“NAFLD”互换使用，是指如下定义的疾病：每天摄入少于20克酒精，仍存在大血管脂肪变性。NAFLD是美国最常见的肝脏疾病，通常与胰岛素抵抗/二型糖尿病和肥胖症相关。NAFLD表现为脂肪变性、脂肪性肝炎、肝硬化，有时还有肝细胞癌。有关NAFLD的综述文章，请参见Tolman and Dalpiaz(2007)Ther.Clin.Risk.Manag.,3(6):1153-1163，其全部内容通过引用并入本文。
如本文所用，术语“脂肪变性”，“肝脂肪变性”和“脂肪肝疾病”是指三酸甘油酯和其他脂肪在肝脏细胞中的积累。
如本文所用，术语“非酒精性脂肪性肝炎”或“NASH”是指由肝脏中脂肪堆积所引起肝脏炎症和的损害。NASH是一组被称为非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)的病况的一部分。NASH类似于酒精性肝病，但发生在很少或不喝酒的人中。NASH的主要特征是肝脏中的脂肪，以及炎症和损伤。大多数患有NASH的人感觉良好，并且不知道自己有肝脏问题。然而，NASH可能是严重的，并可能导致肝硬化，其中肝脏永久性受损并瘢痕化，无法再正常工作。通常首先怀疑NASH是发现某人的血常规检查所包含的肝脏检验有升高，诸如丙氨酸转氨酶(ALT)或天冬氨酸转氨酶(AST)。当进一步评估未发现明显的肝病原因(诸如药物、病毒性肝炎或过量饮酒)并且肝脏的X射线或影像学检查显示脂肪时，则怀疑是NASH。肝脏活组织检查是证明NASH诊断并将其与单纯性脂肪肝分开的唯一方法。
如本文所用，组织学上定义的术语“肝硬化”是以肝纤维化和正常肝结构转变为结构异常结节为特征的弥漫性肝过程。
本发明的iRNA可以作为“游离iRNA”施用。在没有药物组合物时施用游离iRNA。裸露的iRNA可以在合适的缓冲溶液中。该缓冲溶液可以包括乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐、或磷酸盐，或其任何组合。在一个实施方案中，缓冲溶液是磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)。可以调节含有iRNA的缓冲溶液的pH和渗透压，以使其适合于施用给受试者。
或者，本发明的iRNA可以作为药物组合物而施用，诸如dsRNA脂质体制剂。
受益于PNPLA3基因表达抑制的受试者是易患有或已诊断患有PNPLA3相关病症的受试者，所述PNPLA3相关病症诸如脂肪肝(脂肪变性)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝脏中脂肪累积、肝脏炎症、肝细胞的坏死、肝脏纤维化、肥胖症、或非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。
在一个实施方案中，该方法包含施用本文所述的组合物，以使得靶标PNPLA3基因的表达降低，诸如约每1、2、3、4、5、6、1-6、1-3、或3-6个月施用一个剂量。在一些实施方案中，该组合物每3-6个月施用一次。
优选地，可用于本文所述的方法和组合物的iRNA特异性地靶向靶标PNPLA3基因的RNA(原始的或经加工)。使用iRNA抑制这些基因表达的组合物和方法可以如本文所述制备和施行。
根据本发明方法施用iRNA可以预防或治疗PNPLA3相关病症，例如，脂肪肝(脂肪变性)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝脏中脂肪累积、肝脏炎症、肝细胞的坏死、肝脏纤维化、肥胖症、或非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。
可以给受试者施用治疗量的iRNA，诸如约0.01mg/kg至约200mg/kg。
iRNA优选皮下施用，即通过皮下注射。可以使用一次或多次注射将所需剂量的iRNA递送给受试者。可以在一段时间内重复注射。
所述施用可以定期重复。在一些实施方案中，在初始治疗给药方案之后，可以相对不频繁地施用治疗。重复剂量的给药方案可以包含定期施用治疗量的iRNA，诸如每月一次至每年一次。在一些实施方案中，施用iRNA为约每月一次至约每三个月一次，或约每三个月一次至约每六个月一次。
本发明进一步提供了iRNA剂或其药物组合物，与其他药物和/或其他治疗方法(例如与已知药物和/或已知治疗方法，诸如，例如当前用于治疗这些病症的方法)的组合，用于治疗将受益于降低和/或抑制PNPLA3基因表达的受试者(例如具有PNPLA3相关疾病的受试者)的方法和用途。
因此，在本发明的一些方面，包含单一的本发明的iRNA剂的方法和用途，进一步包含向受试者施用一种或多种另外的治疗剂。
iRNA剂和另外的治疗剂和/或治疗可以同时施用和/或以同一组合施用，例如肠胃外施用，或者另外的治疗剂可以作为分开的组合物的一部分施用，或在分开的时间施用，和/或通过本领域已知或本文描述的另一种方法施用。
其他治疗剂的实例包含那些已知可治疗高三酸甘油酯血症和由其引起，与其相关或为其后果的其他疾病的治疗剂。此类剂的实例包含但不限于，HMG-CoA还原酶抑制剂(例如，他汀类药物)，纤维酸盐衍生物，胆汁酸鳌合剂，烟碱酸，抗血小板剂，血管收缩素转化酶抑制剂，血管收缩素II受体拮抗剂(例如洛沙坦钾，如Merck&Co.′s
Figure BDA0003795632600001241
)，酰基辅酶A胆固醇乙酰转移酶(ACAT)抑制剂，胆固醇吸收抑制剂，胆固醇酯转蛋白(CETP)抑制剂，微粒体三酸甘油酯转移蛋白(MTTP)抑制剂，胆固醇调节剂，胆汁酸调节剂，过氧化物酶体增殖活化受体(PPAR)激动剂，基因疗法，复合血管保护剂(例如,AGI-1067,来自Atherogenics)，糖蛋白Ilb/IIIa抑制剂，阿司匹林或类阿司匹林化合物，IBAT抑制剂(例如,S-8921,来自Shionogi)，角鲨烯合成酶抑制剂，单细胞趋化蛋白(MCP)-I抑制剂，或鱼油。示例性的HMG-CoA还原酶抑制剂包含，阿托伐他汀(Pfizer′s
Figure BDA0003795632600001251
/Tahor/Sortis/Torvast/Cardyl)，普伐他汀(Bristol-Myers Squibb′s Pravachol,Sankyo′s Mevalotin/Sanaprav)，辛伐他汀(Merck′s
Figure BDA0003795632600001252
/Sinvacor,Boehringer Ingelheim′s Denan,Banyu′s Lipovas)，洛伐他汀(Merck′s Mevacor/Mevinacor,Bexal′s Lovastatina,Cepa；Schwarz Pharma′sLiposcler)，氟伐他汀(Novartis′
Figure BDA0003795632600001253
/Locol/Lochol,Fujisawa′sCranoc,Solvay'sDigaril)，瑞舒伐他汀(Bayer′s Lipobay/GlaxoSmithKline's Baycol)，瑞舒伐他汀(AstraZeneca's
Figure BDA0003795632600001254
)，以及匹伐他汀(itavastatin/risivastatin)(Nissan Chemical,Kowa Kogyo,Sankyo,and Novartis)。示例性的纤维酸盐衍生物包含例如，本那非泊(例如，Roche's
Figure BDA0003795632600001255
Kissei's Bezatol)，克氯吩贝(例如，Wyeth's
Figure BDA0003795632600001256
)，非诺贝特(例如，Fournier's Lipidil/Lipantil,Abbott's
Figure BDA0003795632600001257
Takeda's Lipantil,generics)，健菲布脂(例如，Pfizer's Lopid/Lipur)和环丙贝特(Sanofi-Synthelabo's
Figure BDA0003795632600001258
)。示例性的胆汁酸隔离剂包含例如，销胆氨(Bristol-Myers Squibb's
Figure BDA0003795632600001259
and Questran LightTM)，可丽丝特博(例如，Pharmacia's Colestid)，以及考来维仑(Genzyme/Sankyo′s WelCholTM)。示例性的烟碱酸疗法包含例如，速释制剂，诸如Aventis′Nicobid,Upsher-Smith′s Niacor,Aventis'Nicolar,以及Sanwakagaku′s Perycit。烟碱酸延释制剂包含例如，Kos Pharmaceuticals′Niaspan和Upsher-Smith's SIo-Niacin。示例性的抗血小板剂包含例如，阿司匹林(例如，拜耳的阿司匹林)，氯吡格雷(Sanofi-Synthelabo/Bristol-Myers Squibb's Plavix)，以及梯可匹定(例如，Sanofi-Synthelabo's Ticlid和Daiichi's Panaldine)。与靶向PNPLA3的dsRNA组合使用的其他阿司匹林样化合物包含例如，Asacard(缓释阿司匹林，来自Pharmacia)和Pamicogrel(Kanebo/Angelini Ricerche/CEPA)。示例性的血管收缩素转化酶抑制剂包含例如，雷米普利(例如，Aventis'Altace)和依那普利(例如，Merck&Co.'sVasotec)。示例性的酰基辅酶胆固醇乙酰基转移酶(ACAT)抑制剂包含例如，阿伐麦布(Pfizer)，依鲁麦布(BioMsrieux Pierre Fabre/Eli Lilly)，CS-505(Sankyo和Kyoto)，以及SMP-797(Sumito)。示例性的胆固醇吸收抑制剂包含例如，依泽替米贝(Merck/Schering-Plough Pharmaceuticals
Figure BDA00037956326000012510
)和帕马苷(Pfizer)。示例性的CETP抑制剂包含例如，Torcetrapib(也称CP-529414，Pfizer)，JTT-705(日本烟草)，以及CETi-I(AvantImmunotherapeutics)。示例性的微粒体三酸甘油酯转移蛋白(MTTP)抑制剂包含例如，应普他派(implitapide)(Bayer)，R-103757(Janssen)，和CP-346086(Pfizer)。其他示例性的胆固醇调节剂包含例如，NO-1886(Otsuka/TAP Pharmaceutical)，CI-1027(Pfizer)，和WAY-135433(Wyeth-Ayerst)。
示例性的胆汁酸调节剂包含例如，HBS-107(Hisamitsu/Banyu)，Btg-511(BritishTechnology Group)，BARI-1453(Aventis)，S-8921(Shionogi)，SD-5613(Pfizer)，和AZD-7806(AstraZeneca)。示例性的过氧化物酶体增殖活化受体(PPAR)激动剂包含例如，替格列札(tesaglitazar)(AZ-242)(AstraZeneca)，奈格列酮(Netoglitazone)(MCC-555)(Mitsubishi/Johnson&Johnson)，GW-409544(Ligand Pharniaceuticals/GlaxoSmithKline)，GW-501516(Ligand Pharniaceuticals/GlaxoSmithKline)，LY-929(Ligand Pharmaceuticals和Eli Lilly)，LY-465608(Ligand Pharmaceuticals和EliLilly)，LY-518674(Ligand Pharmaceuticals和Eli Lilly)，和MK-767(Merck和Kyorin)。示例性的基因疗法包含例如，AdGWEGF 121.10(GenVec)，ApoAl(UCB Pharma/GroupeFournier)，EG-004(Trinam)(Ark Therapeutics)，和ATP结合匣运输蛋白-Al(ABCA1)(CVTherapeutics/Incyte、Aventis、Xenon)。示例性的糖蛋白Ilb/IIIa抑制剂包含例如，洛昔非班(roxifiban)(也称DMP754，Bristol-Myers Squibb)，更托非班(Merck KGaA/Yamanouchi)，和克洛吗非班(Cromafiban)(Millennium Pharmaceuticals)。示例性的角鲨烯合成酶抑制剂包含例如，BMS-1884941(Bristol-Myers Squibb)，CP-210172(Pfizer)，CP-295697(Pfizer)，CP-294838(Pfizer)，和TAK-475(Takeda)。示例性的MCP-I抑制剂为例如，RS-504393(Roche Bioscience)。抗-动脉粥样硬化剂BO-653(ChugaiPharmaceuticals)，和烟碱酸衍生物Nyclin(Yamanouchi Pharmacuticals)也适合与本发明提出的dsRNA组合施用。适用于与靶向PNPLA3的dsRNA一起给药的示例性的组合疗法包含例如，advicor(烟碱酸/洛伐他汀来自Kos Pharmaceuticals)，氨氯地平/阿托伐他汀(Pfizer)，和依泽替米贝/辛伐他汀(例如，
Figure BDA0003795632600001261
10/10、10/20、10/40、和10/80片来自Merck/Schering-Plough Pharmaceuticals)。适用于与靶向PNPLA3的dsRNA组合施用的治疗高三酸甘油酯血症的剂包含例如，洛伐他汀，烟碱酸-
Figure BDA0003795632600001262
缓释片剂(AndrxLabs)，洛伐他汀-
Figure BDA0003795632600001267
片剂(Pfizer)，氨氯地平，阿托伐他汀钙-
Figure BDA0003795632600001266
片剂(AstraZeneca)，瑞舒伐他汀钙-
Figure BDA0003795632600001263
胶囊(Novartis)，氟伐他汀钠-
Figure BDA0003795632600001265
(Reliant,Novartis)，氟伐他汀钠-
Figure BDA0003795632600001268
片剂(Parke-Davis)，阿托伐他汀钙-
Figure BDA00037956326000012611
胶囊(Gate)，Niaspan缓释片剂(Kos)，烟碱酸Pravachol片剂(Bristol-MyersSquibb)，普伐他汀钠-
Figure BDA0003795632600001269
片剂(Abbott)，非诺贝特-
Figure BDA00037956326000012610
10/10片剂(Merck/Schering-Plough Pharmaceuticals)，依泽替米贝，辛伐他汀-WelCholTM片剂(Sankyo),考来维仑盐酸-
Figure BDA0003795632600001271
片剂(Schering)，依泽替米贝-
Figure BDA0003795632600001272
片剂(Merck/Schering-PloughPharmaceuticals)，和依泽替米贝-
Figure BDA0003795632600001273
片剂(Merck)。
在某些实施方案中，本发明提出的iRNA可以与下列药剂一起施用，例如：吡哆醇，一种ACE抑制剂(血管收缩素转化酶抑制剂)，例如，贝那普利(Lotensin)；血管收缩素II受体的拮抗剂(ARB)(例如，洛沙坦钾，如Merck&Co.'s
Figure BDA0003795632600001274
)，例如，坎地沙坦(Atacand)；HMG-CoA还原酶抑制剂(例如，他汀类)；钙结合剂，例如，纤维素磷酸钠(Calcibind)；利尿剂，例如，噻嗪类利尿剂，诸如氢氯苯噻(Microzide)；胰岛素增敏剂，诸如PPARγ激动剂吡格列酮，glp-1r激动剂，诸如利拉鲁肽(liraglutatide)、维生素E、SGLT2抑制剂、DPPIV抑制剂，以及肾脏/肝脏移植；或上述任何一种的组合。
在一个实施方案中，iRNA剂是与依泽替米贝/辛伐他汀组合(例如，
Figure BDA0003795632600001275
(Merck/Schering-Plough Pharmaceuticals))一起组合施用。在一个实施方案中，将iRNA剂施用给患者，然后将另外的治疗剂使用给患者(反之亦然)。在另一个实施方案中，iRNA剂与所述另外的治疗剂是同时施用的。
iRNA剂和另外的治疗剂和/或治疗可以同时和/或以同一组合施用，例如肠胃外给药，或所述另外的治疗剂可以作为分开的组合物的一部分或在分开的时间和/或通过本领域已知或本文描述的另一种方法施用。
在一个实施方案中，iRNA剂是与依泽替米贝/辛伐他汀组合(例如，
Figure BDA0003795632600001276
(Merck/Schering-Plough Pharmaceuticals))一起组合施用。在一个实施方案中，将iRNA剂施用给患者，然后将另外的治疗剂使用给患者(反之亦然)。在另一个实施方案中，iRNA剂与所述另外的治疗剂是同时施用的。
iRNA剂和另外的治疗剂和/或治疗可以在同时和/或以同一组合施用，例如肠胃外给药，或所述另外的治疗剂可以作为分开的组合物的一部分或在分开的时间和/或通过本领域已知或本文描述的另一种方法施用。
VIII.试剂盒
在某些方面，本公开提供了试剂盒，其包含合适的容器，该容器含有siRNA化合物的药物制剂，该siRNA化合物为例如双链siRNA化合物，或siRNA化合物(例如前体，例如较大的siRNA化合物，其可被加工成siRNA化合物或编码siRNA化合物的DNA，该siRNA化合物为例如双链siRNA化合物，或ssiRNA化合物，或其前体)。
此类试剂盒包含一种或多种dsRNA剂和使用说明，例如预防有效量或治疗有效量的dsRNA剂的施用说明。dsRNA剂可以在小瓶或预先填充的注射器中。试剂盒可以可选地进一步包括用于施用dsRNA剂的构件(例如注射装置，诸如预先填充的注射器)，或用于测量对PNPLA3的抑制的构件(例如，用于测量对PNPLA3 mRNA，PNPLA3蛋白质，和/或PNPLA3活性的抑制的构件)。用于测量对PNPLA3的抑制的这种构件可以包括用于从受试者中获得样本(例如血浆样本)的构件。本发明的试剂盒可以可选地进一步包括用于确定治疗有效量或预防有效量的构件。
在某些实施方案中，药物制剂的各个组分可以在一个容器中提供，例如小瓶或预先填充的注射器。或者，可能需要在两个或更多个容器中分别提供药物制剂的组分，例如，一个容器用于siRNA化合物制备，和至少另一个用于载剂化合物。试剂盒可以以多种不同的构型包装，诸如在单个盒子中的一个或多个容器。不同的组分可以例如根据试剂盒所提供的说明进行组合。可以根据本文所述的方法将各组分组合，例如以制备和施用药物组合物。该试剂盒还可以包括递送装置。
本发明通过以下实施例进一步说明，这些实施例不应被解释为限制性的。在本申请中所引用的所有参考文献、专利和已公开专利申请的全部内容，以及非正式的序列表和附图，在此通过引用并入本文。
实施例
实施例1.iRNA合成
试剂的来源
如果本文中没有具体给出试剂来源，可以从任何分子生物学试剂供应商处获得用于分子生物学的质量/纯度标准的此类试剂。
siRNA设计
使用自定义的R和Python脚本设计了靶向人类含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)基因(人类：NCBI refseqID NM_025225.2；NCBI GeneID:80339)的siRNA。人类NM_025225.2REFSEQ mRNA，具有2805个碱基的长度。
未修饰的PNPLA3有义链和反义链的核苷酸序列的详细列表如表2、4、6、8、和10所示。经修饰PNPLA3有义链和反义链的核苷酸序列的详细列表如表3、5、7、9、11、21、24、27、和30所示。
应当理解，在整个申请中，不带小数的双链体名称等同于带小数的双链体名称，该小数仅为双链体的批次号。例如，AD-959917等同于AD-959917.1。
siRNA合成
使用本领域已知的方法设计，合成和制备siRNA。
简而言之，使用Mermade 192 synthesizer(BioAutomation)合成仪在固相支持物上用亚磷酰胺以1μmol的规格化学合成siRNA序列。固相支持物是受控的孔径玻璃
Figure BDA0003795632600001291
其载有：定制的GalNAc配体(3’-GalNAc缀合物)、通用固相支持物(AMChemicals)或感兴趣的第一个核苷酸。辅助合成试剂和标准的2-氰乙基亚磷酰胺单体(2’-脱氧-2’-氟基,2’-O-甲基,RNA,DNA)购自Thermo-Fisher(Milwaukee,WI,美国)，Hongene(中国)，或Chemgenes(Wilmington,MA,美国)。其他亚磷酰胺单体可从商业供货商处获得、内部制备或使用各个CMO提供的定制合成来获得。在乙腈或9:1乙腈:DMF中制备100mM的浓度的亚磷酰胺，并使用5-乙硫基-1H-四唑(ETT,0.25M在乙腈中)偶联，其反应时间为400秒。使用100mM 3-((二甲基氨基-亚甲基)氨基)-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT,从Chemgenes(Wilmington,MA,美国)获得)在无水乙腈/吡啶(9:1体积/体积)中生成硫代磷酸酯键。氧化反应的时间为5分钟。所有序列的合成都具有最后的移除DMT基团(“DMT去除”)。
固相合成完成后，将固相支持的寡核糖核苷酸在96孔板中于室温用300μL of甲氨(40％水溶液)处理约2小时，以从固相支持物上裂解并且随后去除所有其他碱不稳定的保护基团。对于含有任何被叔丁基二甲基硅烷基(TBDMS)所保护的天然核糖核苷酸键(2’-OH)的序列，使用TEA.3HF(三乙氨三氟化氢)进行第二次去保护步骤。向每个寡核苷酸的甲氨水溶液中加入200μL二甲基亚砜(DMSO)和300μL TEA.3HF，并将该溶液在60℃温育约30分钟。温育后，使板达到室温，并通过添加1mL的9:1乙腈:乙醇或1:1乙醇:异丙醇以沉淀粗制寡核苷酸。然后将板在4℃离心45分钟，并藉助多通道移液器小心地倾倒出上清液。将寡核苷酸沉淀物重悬于20mM NaOAc中，然后在装有自动进样器、UV检测器、导电计和馏分收集器的Agilent LC系统上使用HiTrap尺寸排阻柱(5mL,GE Healthcare)脱盐。将脱盐后的样本收集在96孔板中，然后分别通过LC-MS和UV光谱测定法以确认其身份并定量材料。
在Tecan液体处理机器人上进行单链的双链体化。将有义单链和反义单链以等摩尔比混合，以达到在96孔板中的1×PBS中为10μM的终浓度，将板密封，在100℃温育10分钟，然后使其在2-3小时内缓慢恢复至室温。确认每个双链体的浓度和身份，然后将其用于体外的筛选分析。
实施例2.体外的筛选方法
Hep3B细胞培养和384-孔转染
使Hep3b细胞(ATCC,Manassas,VA)在37℃和5％CO2气氛的条件下，在添加了10％FBS(ATCC)的Eagle’s Minimum Essential培养基(Gibco)中生长到接近汇合，然后通过胰蛋白酶化使其从板上释放。如下进行转染：在96孔板的每一单个孔内，加入5μl每种siRNA双链体，再加入14.8μl Opti-MEM加上0.2μlLipofectamine RNAiMax(Invitrogen,CarlsbadCA.cat#13778-150)。然后将混合物在室温温育15分钟。然后将含有约2×104个Hep3B细胞的不含抗生素的80μl完全生长培养基加入siRNA混合物中。在RNA纯化之前，将细胞温育24小时。在10nM和0.1nM的最终双链体浓度下进行单剂量实验，并在10nM to 128pM范围内使用8×5-倍连续稀释进行了剂量反应实验。
总RNA的分离-使用DYNABEAD mRNA分离试剂盒(InvitrogenTM,part#:610-12)
将细胞在每孔的含有3μL珠子的75μL裂解/结合缓冲液中裂解，并在静电振荡器上混合10分钟。在Biotek EL406上使用磁性板支架自动进行清洗步骤。将珠子在缓冲液A中清洗(以90μL)一次，在缓冲液B中清洗一次，以及在缓冲液E中清洗两次，并且在每两次清洗之间都有抽吸步骤。最终一次抽吸之后，将完整的10μL RT混合物加到每个孔中，如下所述。
cDNA的合成-使用ABI高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems,FosterCity,CA,Cat#4368813)
每孔中加入主混合液，每个反应的主混合液含有：1μl 10×缓冲液，0.4μl 25×dNTPs，1μl随机引物，0.5μl逆转录酶，0.5μl RNase抑制剂和6.6μl H2O。将板密封，在静电振荡器上搅动10分钟，然后在37摄氏度温育2小时。然后将板在80摄氏度搅动8分钟。
实时PCR
将2微升(μl)cDNA加入384孔板的每孔中的主混合液，所述主混合液含有：0.5μl人GAPDH TaqMan探针(4326317E)，0.5μl人PNPLA3，2μl无核酸酶的水以及5μl Lightcycler480探针主混合物(Roche Cat#04887301001)。实时PCR是在LightCycler 480实时PCR系统(Roche)中完成。
为了计算相对倍数变化，使用ΔΔCt方法分析数据，并将其相对于使用被10nMAD-1955转染的细胞或模拟转染的细胞所进行的测定归一化。使用一采用XLFit的4参数拟合模型来计算IC50，并将其相对于被AD-1955转染的细胞或模拟转染的细胞归一化。AD-1955的有义链和反义链的序列为：有义cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT(SEQ ID NO:18)以及反义UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT(SEQ ID NO:19)。
体外的双-荧光素酶和内源筛选测定
Cos-7细胞(ATCC,Manassas,VA)在37℃和5％CO2气氛的条件下，在添加了10％FBS的DMEM(ATCC)中生长到接近汇合，然后通过胰蛋白酶消化使其从板上释放。在50nM、10nM、1nM、和0.1nM进行单剂量实验。用含有3’非翻译区(UTR)的质粒实现了siRNA和psiCHECK2-PNPLA3(GenBank登录号NM_025225.2)质粒的转染。如下进行转染：每孔加入5μL siRNA双链体和5μL(5ng)psiCHECK2质粒，以及每孔4.9μL Opti-MEM加上0.1μL Lipofectamine 2000(Invitrogen,Carlsbad CA.cat#13778-150)，然后在室温温育15分钟。然后将混合物添加到重悬于35μL新鲜的完全培养基的细胞中。将经转染的细胞在37℃和5％CO2气氛中温育。
siRNA和psiCHECK2质粒转染后48小时；测量了萤火虫(转染对照)荧光素酶和海肾(融合到PNPLA3目标序列)荧光素酶。首先，从细胞中去除培养基。然后，通过向每个孔中加入20μL与培养基体积相等的
Figure BDA0003795632600001311
荧光素酶试剂并混合来测量萤火虫荧光素酶的活性。将该混合物在室温温育30分钟，然后在Spectramax(Molecular Devices)测量发光(500nm)以检测萤火虫荧光素酶的信号。通过向每个孔中加入20μL室温的
Figure BDA0003795632600001312
Stop&
Figure BDA0003795632600001313
试剂来测量海肾荧光素酶的活性，并将板温育10-15分钟，然后再次测量发光以确定海肾荧光素酶的信号。
Figure BDA0003795632600001314
Stop&
Figure BDA0003795632600001315
试剂淬灭萤火虫荧光素酶的信号，并保持海肾荧光素酶反应的发光。通过将每个孔内的海肾(PNPLA3)信号相对萤火虫(对照)信号归一化来确定siRNA活性。然后，相对于用相同载体转染但未用siRNA处理或用非靶向siRNA处理细胞，评估siRNA活性的大小。所有转染均以n＝4完成。
细胞培养和转染
转染细胞的过程如下：在384孔板的每一孔内，加入5μL siRNA双链体，再加入4.9μL Opti-MEM加上0.1μL RNAiMAX(Invitrogen,Carlsbad CA.cat#13778-150)，并且每个siRNA双链体重复实验4次，然后在室温温育15分钟。然后将40μL含有约5×103个细胞的培养基加入到前述siRNA混合物中。将细胞温育24小时后进行RNA纯化。实验在50nM、10nM、1nM、和0.1nM进行。转染实验在Cos7细胞中进行。
总RNA的分离-使用DYNABEAD mRNA分离试剂盒
在BioTek-EL406平台使用DYNABEAD(Invitrogen,cat#61012)，采用自动化方案以分离RNA。简而言之，将70μL裂解/结合缓冲液和10μL含有3μL磁珠的裂解缓冲液添加到含有细胞的平板中。将板在室温在电磁振荡器上温育10分钟，然后捕获磁珠并除去上清液。然后用150μL清洗缓冲液A清洗结合到珠子的RNA 2次，以及用清洗缓冲液B清洗一次。然后用150μL洗脱缓冲液清洗珠子，重新捕获并去除上清液。
cDNA的合成-使用ABI高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems,FosterCity,CA,Cat#4368813)
向上述分离的RNA加入10μL主混合液，每个反应的主混合液含有：1μL10×缓冲液，0.4μL 25×dNTPs，1μL 10×随机引物，0.5μL逆转录酶，0.5μL RNase抑制剂和6.6μL H2O。将板密封，混合，并在室温在电磁振荡器上温育10分钟，然后在37℃温育2小时。
实时PCR
将2μL cDNA加入384孔板的每孔中的主混合液，所述主混合液含有：0.5μL人或小鼠GAPDH TaqMan探针(ThermoFisher cat 4352934E or 4351309)，0.5μL适当的PNPLA3探针(可商购，例如来自Thermo Fisher)以及5μLLightcycler 480探针主混合物(Roche Cat#04887301001)。实时PCR是在LightCycler 480实时PCR系统(Roche)完成。每个双链体均测试了N＝4次，并将数据相对于非靶向的对照siRNA所转染的细胞归一化。为了计算相对倍数变化，使用ΔΔCt方法分析了实时数据，并将其相对于使用被非靶向的对照siRNA所转染的细胞所执行的测定归一化。
表12显示了表2和表3中所列出的dsRNA剂在Cos7细胞中的筛选结果。表13显示了表4和表5中所列出的dsRNA剂在Cos7细胞中的筛选结果。表14显示了表4和表5中所列出的dsRNA剂在Hep3B细胞中的筛选结果。表15显示了表6和表7中所列出的dsRNA剂在Cos7细胞中的筛选结果。表16显示了表8和表9中所列出的dsRNA剂在Cos7细胞中的筛选结果。表17显示了表8和表9中所列出的dsRNA剂在Hep3B细胞中的筛选结果。表18显示了表10和表11中所列出的dsRNA剂在Cos7细胞中的筛选结果。表19显示了表10和表11中所列出的dsRNA剂在Hep3B细胞中的筛选结果。
表1.核酸序列表示法中所使用的核苷酸单体的缩写。应该理解的是，当存在于寡核苷酸中时，这些单体通过5'-3'-磷酸二酯键相互链接。
Figure BDA0003795632600001331
Figure BDA0003795632600001341
Figure BDA0003795632600001351
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Figure BDA0003795632600001691
表12.Cos-7细胞中的PNPLA3单剂量筛选(人双-荧光素酶psiCHECK2载体)
Figure BDA0003795632600001701
Figure BDA0003795632600001711
Figure BDA0003795632600001721
Figure BDA0003795632600001731
表13.Cos-7细胞中的PNPLA3单剂量筛选(人双-荧光素酶psiCHECK2载体)
Figure BDA0003795632600001732
Figure BDA0003795632600001741
表14.Hep3B细胞中的PNPLA3单剂量筛选
Figure BDA0003795632600001742
Figure BDA0003795632600001751
Figure BDA0003795632600001761
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表15.Cos-7细胞中的PNPLA3单剂量筛选(人双-荧光素酶psiCHECK2载体)
Figure BDA0003795632600001782
Figure BDA0003795632600001791
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Figure BDA0003795632600001811
Figure BDA0003795632600001821
表16.Cos-7细胞中的PNPLA3单剂量筛选(人双-荧光素酶psiCHECK2载体)
Figure BDA0003795632600001831
Figure BDA0003795632600001841
Figure BDA0003795632600001851
Figure BDA0003795632600001861
表17.Hep3B细胞中的PNPLA3单剂量筛选
Figure BDA0003795632600001862
Figure BDA0003795632600001871
Figure BDA0003795632600001881
Figure BDA0003795632600001891
表18.Cos-7细胞中的PNPLA3单剂量筛选(人双-荧光素酶psiCHECK2载体)
Figure BDA0003795632600001901
Figure BDA0003795632600001911
表19.Hep3B细胞中的PNPLA3单剂量筛选
Figure BDA0003795632600001912
Figure BDA0003795632600001921
实施例3.在小鼠中的dsRNA双链体的体内筛选
从上述体外研究中鉴别出的感兴趣的双链体在体内进行了评估。特别地，在给药前第14天，通过静脉内施用编码人PNPLA3的腺相关病毒8(AAV8)载体的2×1011个病毒颗粒，以转导野生型小鼠(C57BL/6)。特别地，给小鼠施用了编码人PNPLA3 mRNA的开放阅读框和3’UTR的AAV8，称为NM_025225.2(AAV8-TBG-PI-PNPLA3)。
在第0天，一组共三只小鼠被皮下施用单次3mg/kg剂量或单次10mg/kg剂量的目标剂或PBS对照。表20提供了处理组，而表21提供了感兴趣的双链体的有义链和反义链的经修饰核苷酸序列。在给药后第7天或第14天处死动物，收集肝脏样本并在液态氮中速冻。提取组织mRNA并通过RT-QPCR方法对其分析。
将人PNPLA3 mRNA水平与持家基因GAPDH进行了比较。然后将数值归一化到PBS媒剂对照组的平均值。数据表示为基线值的百分比，并呈现为平均值加上标准偏差。表22中所列出并在图1中所显示的结果表明，所测试的示例性双链体剂有效降低了体内人PNPLA3信使RNA的水平。
表20.
Figure BDA0003795632600001931
Figure BDA0003795632600001941
表21.
Figure BDA0003795632600001942
Figure BDA0003795632600001951
表22.
Figure BDA0003795632600001952
从上述体外研究中鉴别出的其他的感兴趣的双链体也在体内进行了评估。特别地，在给药前第14天，通过静脉内施用编码人PNPLA3的腺相关病毒8(AAV8)载体的2x1011个病毒颗粒，以转导野生型小鼠(C57BL/6)。特别地，给小鼠施用了编码人PNPLA3 mRNA的开放阅读框和3’UTR的AAV8，称为NM_025225.2(AAV8.-TBG-PI-PNPLA3)。
在第0天，0时间，一组共三只小鼠被皮下施用单次3mg/kg剂量的目标剂(AD-517258.2除外)，约1小时后再用7mg/kg的剂量对其施用在0时间所施用的相同剂，或者在第0天的0时间施用PBS对照。施用AD-517258.2的小鼠仅在在第0天的0时间以单次3mg/kg剂量对其施用。表20提供了经处理组，而表21提供了感兴趣的双链体的有义链和反义链的修饰核苷酸序列。在给药后第7天处死动物，收集肝脏样本并在液氮中速冻。提取组织mRNA并通过RT-QPCR方法对其分析。
将人PNPLA3 mRNA水平与持家基因GAPDH进行了比较。然后将数值归一化到PBS媒剂对照组的平均值。数据表示为基线值的百分比，并呈现为平均值加上标准偏差。表25中所列出并在图2中所显示的结果表明，所测试的示例性双链体剂有效降低体内人PNPLA3信使RNA的水平。
表23.
Figure BDA0003795632600001961
Figure BDA0003795632600001971
Figure BDA0003795632600001981
表24.
Figure BDA0003795632600001982
Figure BDA0003795632600001991
表25.
Figure BDA0003795632600002001
从上述体外研究中鉴别出的其他的感兴趣的双链体也在体内进行了AAV滴度研究的评估。特别地，在给药前第14天，通过静脉内施用编码人PNPLA3的腺相关病毒8(AAV8)载体的2×1011、2×1010、2×109、或2×108个病毒颗粒，以转导野生型小鼠(C57BL/6)。特别地，给小鼠施用了编码部分人PNPLA3 mRNA的开放阅读框和3’UTR的AAV8，称为NM_025225.2(AAV8.-TBG-PI-PNPLA3)。
在第0天的0时间，一组共三只小鼠被皮下施用单次10mg/kg剂量的目标剂或PBS对照。表26提供了经处理组，而表27提供了感兴趣的双链体的有义链和反义链的修饰核苷酸序列。在给药后第7天处死动物，收集肝脏样本并在液态氮中速冻。提取组织mRNA并通过RT-QPCR方法对其分析。
将人PNPLA3 mRNA水平与持家基因GAPDH进行了比较。然后将数值归一化到PBS媒剂对照组的平均值。数据表示为基线值的百分比，并呈现为平均值加上标准偏差。表28中所列出并在图3中所显示的结果表明，所测试的示例性双链体剂有效降低体内人PNPLA3信使RNA的水平。
表26.
Figure BDA0003795632600002011
Figure BDA0003795632600002021
Figure BDA0003795632600002031
表27.
Figure BDA0003795632600002032
表28.
Figure BDA0003795632600002033
Figure BDA0003795632600002041
从上述体外研究中鉴别出的其他的感兴趣的双链体也在体内进行了评估。特别地，在给药前第14天，通过静脉内施用编码人PNPLA3的腺相关病毒8(AAV8)载体的2×1011个(对应2.4×1013个基因组拷贝/毫升)病毒颗粒，以转导野生型小鼠(C57BL/6)。特别地，给小鼠施用了编码部分人PNPLA3 mRNA的AAV8，编码人PNPLA3 mRNA的开放阅读框和3’UTR，称为NM_025225.2(AAV8.-TBG-PI-PNPLA3)。
在第0天，对每种目标剂，一组共三只小鼠被皮下施用单次10mg/kg剂量的目标剂或PBS对照。另一组共三只小鼠，对每种目标剂，在第0天被皮下施用单次10mg/kg剂量的目标剂或PBS对照，随后在第1天施用10mg/kg剂量的剂。第三组共三只小鼠，对每种目标剂，在第0天被皮下施用单次10mg/kg剂量的目标剂或PBS对照，随后在第1天施用10mg/kg剂量的剂，以及进一步的在第2天施用10mg/kg剂量的剂。表29提供了经处理组，而表30提供了感兴趣的双链体的有义链和反义链的修饰核苷酸序列。在施用最后一剂的7天后处死动物，收集肝脏样本并在液态氮中速冻。提取组织mRNA并通过RT-QPCR方法对其分析。
将人PNPLA3 mRNA水平与持家基因GAPDH进行了比较。然后将数值归一化到PBS媒剂对照组的平均值。数据表示为基线值的百分比，并呈现为平均值加上标准偏差。表31中所列出并在图4中所显示的结果表明，所测试的示例性双链体剂有效降低体内人PNPLA3信使RNA的水平。
表29.
Figure BDA0003795632600002051
Figure BDA0003795632600002061
表30.
双链体ID 寡核苷酸ID 链 核苷酸序列5’到3’ SEQ ID NO:
AD-520018.2 A-1001193.1 正义 gsasuaacCfuUfGfAfcuacuaaaauL96 1796
A-1003737.1 反义 asUfsuuuAfgUfAfgucaAfgGfuuaucsasu 1797
AD-519351.2 A-999855.1 正义 asgsgauaAfuGfUfCfuuauguaauuL96 1798
A-1003070.1 反义 asAfsuuaCfaUfAfagacAfuUfauccusasa 1799
AD-519754.2 A-1000664.1 正义 gsasgcugAfgUfUfGfguuuuaugauL96 1800
A-1003473.1 反义 asUfscauAfaAfAfccaaCfuCfagcucsasg 1801
AD-520062.2 A-1001282.1 正义 ascscuuuUfuCfAfCfcuaacuaaauL96 1802
A-1003781.1 反义 asUfsuuaGfuUfAfggugAfaAfaaggusgsu 1803
表31.
Figure BDA0003795632600002071
Figure BDA0003795632600002081
实施例4.其他的dsRNA双链体的设计，合成和体外筛选
使用本领域已知的和以上实施例1中所述的方法设计、合成、和制备其他的siRNA。
表32显示了其他的未修饰的PNPLA3有义链和反义链的核苷酸序列的详细列表。表33显示了经修饰PNPLA3有义链和反义链的核苷酸序列的详细列表。
为了进行转染，将细胞(ATCC,Manassas,VA)在37℃和5％CO2气氛的条件下，在添加了10％FBS(ATCC)的Eagle’s Minimum Essential培养基(Gibco)中生长到接近汇合，然后通过胰蛋白酶化使其从板上释放。如下进行转染：在384孔板的每一单个孔内，加入2.5μl每种siRNA双链体，再加入7.5μl Opti-MEM加上0.1μl Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen,Carlsbad CA.cat#13778-150)。然后将混合物在室温温育15分钟。然后将含有约1.5×104个Hep3B细胞的40μl不含抗生素的完全生长培养基加入siRNA混合物中。在RNA纯化之前，将细胞温育24小时。在50nM、10nM、1nM、和0.1nM的最终双链体浓度进行单一剂量实验。
使用DYNABEAD分离总RNA。简而言之，将细胞在每孔的含有3μL珠子的10μl裂解/结合缓冲液中裂解，并在静电振荡器上混合10分钟。在Biotek EL406上使用磁性板支架自动进行清洗步骤。将珠子在缓冲液A中清洗(以3μL)一次，在缓冲液B中清洗一次，以及在缓冲液E中清洗两次，并且在每两次清洗之间都有抽吸步骤。最终一次抽吸之后，将完整的12μLRT混合物加到每个孔中，如下所述。
对于cDNA的合成，在每孔中加入每个反应的主混合液，包括：1.5μl 10×缓冲液，0.6μl 25×dNTPs，1.5μl随机引物，0.75μl逆转录酶，0.75μl RNase抑制剂和9.9μl H2O。将板密封，在静电振荡器上搅动10分钟，然后在37摄氏度温育2小时。然后将板在80摄氏度搅动8分钟。
如上所述进行RT-qPCR，并如上所述计算相对倍数变化。
表34显示了表32和33中所列出的dsRNA剂在Hep3B细胞中的转染测定的结果。表35显示了表32和33中所列出的dsRNA剂在初代食蟹猴肝细胞(primary cynomolgushepatocyte,PCH)中的转染测定的结果。
Figure BDA0003795632600002101
Figure BDA0003795632600002111
Figure BDA0003795632600002121
Figure BDA0003795632600002131
Figure BDA0003795632600002141
Figure BDA0003795632600002151
Figure BDA0003795632600002161
Figure BDA0003795632600002171
Figure BDA0003795632600002181
Figure BDA0003795632600002191
Figure BDA0003795632600002201
Figure BDA0003795632600002211
表34.Hep3B细胞中的PNPLA3单剂量筛选
Figure BDA0003795632600002221
Figure BDA0003795632600002231
Figure BDA0003795632600002241
Figure BDA0003795632600002251
Figure BDA0003795632600002261
表35.初代食蟹猴肝细胞(PCH)中的PNPLA3单剂量筛选
Figure BDA0003795632600002262
Figure BDA0003795632600002271
Figure BDA0003795632600002281
Figure BDA0003795632600002291
Figure BDA0003795632600002301
Figure BDA0003795632600002311
实施例5.结构-活性关系分析
基于实施例4中的体外分析，进行了结构-活性关系(SAR)分析。特别是，设计、合成、并在体外和体内分析了其他的双链体。
使用本领域已知的和如上所述的方法设计、合成和制备siRNA。使用这些siRNA在Hep3B和PCH细胞中进行如上所述的体外筛选分析。
表36显示了未修饰的PNPLA3有义链和反义链的核苷酸序列的详细列表。表37显示了经修饰的PNPLA3有义链和反义链的核苷酸序列的详细列表。
表38显示了表36和37中所列出的dsRNA剂在Hep3B细胞中的转染测定的结果。表39显示了表36和37中所列出的dsRNA剂在初代食蟹猴肝细胞(PCH)中的转染测定的结果。
Figure BDA0003795632600002331
Figure BDA0003795632600002341
Figure BDA0003795632600002351
Figure BDA0003795632600002361
Figure BDA0003795632600002371
Figure BDA0003795632600002381
Figure BDA0003795632600002391
Figure BDA0003795632600002401
表38.Hep3B细胞中的PNPLA3单剂量筛选
Figure BDA0003795632600002411
Figure BDA0003795632600002421
Figure BDA0003795632600002431
表39.初代食蟹猴肝细胞(PCH)中的PNPLA3单剂量筛选
Figure BDA0003795632600002432
Figure BDA0003795632600002441
Figure BDA0003795632600002451
Figure BDA0003795632600002461
实施例6.小鼠中dsRNA双链体的体内筛选
从上述体外SAR研究中鉴别出的感兴趣的双链体也在体内进行了评估。特别地，在给药前第14天，通过静脉内施用编码人PNPLA3的腺相关病毒8(AAV8)载体的2×1010个病毒颗粒，以转导野生型小鼠(C57BL/6)。特别地，给小鼠施用了编码部分人PNPLA3 mRNA的AAV8，编码人PNPLA3 mRNA的开放阅读框和3’UTR，称为NM_025225.2(AAV8-TBG-PI-PNPLA3)。
在第0天，一组共三只小鼠被皮下施用单次10mg/kg剂量的目标剂或PBS对照。表40提供了处理组，而表41提供了感兴趣的双链体。在给药后第7天后处死动物，收集肝脏样本并在液氮中速冻。提取肝脏mRNA并通过RT-QPCR方法对其分析。
将人PNPLA3 mRNA水平与持家基因GAPDH进行了比较。然后将数值归一化到PBS媒剂对照组的平均值。数据表示为基线值的百分比，并呈现为平均值加上标准偏差。表42中所列出并在图5中所显示的结果表明，所测试的示例性双链体剂有效降低体内人PNPLA3信使RNA的水平。
表40.处理组别
Figure BDA0003795632600002481
表41.感兴趣的双链体
Figure BDA0003795632600002482
Figure BDA0003795632600002491
表42.
双链体 剩余信息的％ SD
PBS第7天 100.83 7.41
未经处理第7天 76.79 26.41
AD-519346.1 20.93 7.32
AD-67554.7 24.35 11.53
AD-520018.6(+CTL) 24.99 1.97
AD-519350.1 25.42 2.79
AD-519347.1 25.76 8.01
AD-519349.1 28.37 10.58
AD-519345.1 29.15 8.28
AD-519753.2 36.95 13.35
AD-519752.3 39.67 5.40
AD-519343.1 39.81 12.85
AD-519932.1 40.63 1.38
AD-1010732.1 42.63 4.42
AD-1010731.1 42.89 5.68
AD-519935.2 50.93 8.55
AD-519344.1 59.71 22.61
从上述体外SAR研究中鉴别出的其他的感兴趣的双链体也在体内进行了评估。特别地，在给药前第14天，通过静脉内施用编码人PNPLA3的腺相关病毒8(AAV8)载体的2×1010个病毒颗粒，以转导野生型小鼠(C57BL/6)。特别地，给小鼠施用了编码人PNPLA3 mRNA的全长转录本的AAV8，称为NM_025225.2(AAV8-TBG-PI-PNPLA3)。
在第0天，一组共三只小鼠被皮下施用单次10mg/kg剂量的目标剂或PBS对照。表43提供了处理组，而表44提供了感兴趣的双链体。在给药后第7天后处死动物，收集肝脏样本并在液态氮中速冻。提取肝脏mRNA并通过RT-QPCR方法对其分析。
将人PNPLA3 mRNA水平与持家基因GAPDH进行了比较。然后将数值归一化到PBS媒剂对照组的平均值。数据表示为基线值的百分比，并呈现为平均值加上标准偏差。表45中所列出并在图6中所显示的结果表明，所测试的示例性双链体剂有效降低体内人PNPLA3信使RNA的水平。
表43.处理组别
Figure BDA0003795632600002501
Figure BDA0003795632600002511
表44.感兴趣的双链体
双链体ID NM_025225.2中的范围
AD-517837.2 1901-1923
AD-805635.2 2182-2200
AD-519329.2 1192-1214
AD-520063.2 2179-2201
AD-519757.2 1744-1766
AD-805631.2 1267-1285
AD-516917.2 795-817
AD-516828.2 677-699
AD-518983.2 773-795
AD-805636.2 1219-1237
AD-519754.7 1741-1763
AD-520062.2 2178-2200
表45.
Figure BDA0003795632600002522
Figure BDA0003795632600002531
从上述体外SAR研究中鉴别出的其他的感兴趣的双链体也在体内进行了评估。特别地，在给药前第14天，通过静脉内施用编码人PNPLA3的腺相关病毒8(AAV8)载体的2×1010个病毒颗粒，以转导野生型小鼠(C57BL/6)。特别地，给小鼠施用了编码人PNPLA3 mRNA的开放阅读框和3’UTR的AAV8，其被引用为NM_025225.2，被称为AAV8-TBG-PI-PNPLA3。
在第0天，一组共三只小鼠被皮下施用单次10mg/kg剂量的目标剂或PBS对照。表46提供了处理组，而表47提供了感兴趣的双链体。在给药后第7天后处死动物，收集肝脏样本并在液态氮中速冻。提取肝脏mRNA并通过RT-QPCR方法对其分析。
将人PNPLA3 mRNA水平与持家基因GAPDH进行了比较。然后将数值归一化到PBS媒剂对照组的平均值。数据表示为基线值的百分比，并呈现为平均值加上标准偏差。表48中所列出并在图7中所显示的结果表明，所测试的示例性双链体剂有效降低体内人PNPLA3信使RNA的水平。
表46.处理组别
Figure BDA0003795632600002532
Figure BDA0003795632600002541
Figure BDA0003795632600002551
表47.感兴趣的双链体
双链体ID NM_025225.2中的范围
AD-67575.9 2241-2263
AD-518923.3 683-705
AD-520053.4 2169-2191
AD-519667.2 1631-1653
AD-519773.2 1760-1782
AD-519354.2 1219-1241
AD-520060.4 2176-2198
AD-520061.4 2177-2199
AD-520062.9 2178-2200
AD-520063.5 2179-2201
AD-1010733.2 2114-2136
AD-1010735.2 2121-2143
AD-520018.4(+CTL) 2108-2130
表48.
Figure BDA0003795632600002553
Figure BDA0003795632600002561
实施例7.其他的dsRNA双链体的设计、合成和体外筛选
使用本领域已知的和以上在实施例1中所述的方法设计、合成、和制备其他的siRNA。
表49显示了其他的未修饰的PNPLA3有义链和反义链核苷酸序列的详细列表。表50显示了经修饰PNPLA3有义链和反义链核苷酸序列的详细列表。
通过自由摄取和转染执行其他剂的单剂量筛选。
对于自由摄取，通过将2.5μl siRNA双链体添加到96孔板的每一孔内进行实验。然后，将含有约1.5×104个初代食蟹猴肝细胞(PCH)的完全生长培养基(47.5μl)加入到siRNA中。在RNA纯化和RT-qPCR之前，将细胞温育48小时。在500nM、100nM、10nM、和1nM的最终双链体浓度进行了单剂量实验。
为了转染，将Hep3B细胞(ATCC,Manassas,VA)在37℃和5％CO2气氛的条件下，在添加了10％FBS(ATCC)的Eagle’s Minimum Essential培养基(Gibco)中生长到接近汇合，然后通过胰蛋白酶化使其从板上释放。如下进行转染：在384孔板的每一单个孔内，加入2.5μl每种siRNA双链体，再加入7.5μl Opti-MEM加上0.1μl Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen,Carlsbad CA.cat#13778-150)。然后将混合物在室温温育15分钟。然后将含有约1.5×104个Hep3B细胞的40μl不含抗生素的完全生长培养基加入siRNA混合物中。在RNA纯化之前，将细胞温育24小时。在50nM、10nM、1nM、和0.1nM的最终双链体浓度执行了单一剂量实验。
使用DYNABEAD分离总RNA。简而言之，将细胞在每孔的含有3μL珠子的10μl裂解/结合缓冲液中裂解，并在静电振荡器混合10分钟。在Biotek EL406上使用磁性板支架自动进行清洗步骤。将珠子在缓冲液A中清洗(以3μL)一次，在缓冲液B中清洗一次，以及在缓冲液E中清洗两次，并且在每两次清洗之间都有抽吸步骤。最终一次抽吸之后，将完整的12μL RT混合物加到每个孔中，如下所述。
对于cDNA的合成，每孔中加入每个反应的主混合液，包括：1.5μl 10×缓冲液，0.6μl 25×dNTPs，1.5μl随机引物，0.75μl逆转录酶，0.75μl RNase抑制剂和9.9μl H2O。将板密封，在静电振荡器上搅动10分钟，然后在37℃温育2小时。然后将板在80℃搅动8分钟。
如上所述执行RT-qPCR，并如上所述计算相对倍数变化。
表51显示了表49和50中所列出的dsRNA剂在Hep3B细胞中的转染测定的结果。表52显示了表49和50中所列出的dsRNA剂在初代食蟹猴肝细胞(PCH)中的自由摄取实验的结果。
Figure BDA0003795632600002581
Figure BDA0003795632600002591
Figure BDA0003795632600002601
Figure BDA0003795632600002611
Figure BDA0003795632600002621
Figure BDA0003795632600002631
Figure BDA0003795632600002641
Figure BDA0003795632600002651
Figure BDA0003795632600002661
Figure BDA0003795632600002671
Figure BDA0003795632600002681
Figure BDA0003795632600002691
Figure BDA0003795632600002701
Figure BDA0003795632600002711
表51.Hep3B细胞中的PNPLA3单剂量筛选(PNPLA3 mRNA剩余的％)
Figure BDA0003795632600002721
Figure BDA0003795632600002731
Figure BDA0003795632600002741
Figure BDA0003795632600002751
Figure BDA0003795632600002761
Figure BDA0003795632600002771
Figure BDA0003795632600002781
表52.初代食蟹猴肝细胞(PCH)中的PNPLA3单剂量筛选(自由摄取)(PNPLA3mRNA剩余的％)
Figure BDA0003795632600002782
Figure BDA0003795632600002791
Figure BDA0003795632600002801
Figure BDA0003795632600002811
Figure BDA0003795632600002821
Figure BDA0003795632600002831
Figure BDA0003795632600002841
本发明的实施方案
在一个方面，本发明提供了一种双链核糖核酸(dsRNA)剂，其用于抑制细胞中含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)的表达，其中dsRNA剂包括形成双链区域的有义链和反义链，其中有义链包括与SEQ ID NO:1的核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19或20个连续核苷酸，并且反义链包括与SEQ ID NO:2的核苷酸序列相异不超过1、2或3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19或20个连续核苷酸。在一个实施方案中，dsRNA剂包括至少一种热不稳定的核苷酸修饰，例如无碱基修饰；双链体中与相对核苷酸的错配；以及不稳定的糖修饰，2’-脱氧修饰，无环核苷酸，未锁核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)，例如，反义链包括至少一个热不稳定的核苷酸修饰。
在另一个方面，本发明提供了一种双链核糖核酸(dsRNA)，其用于抑制细胞中含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)的表达，其中所述dsRNA包括形成双链区域的有义链和反义链，其中反义链包括编码含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)的mRNA的互补性区域，并且其中该互补性区域包括与表2-11、21、24、27、30、32、33、36、37、49或50中任一者的任何一个反义核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19或20个连续核苷酸。
在一个方面，本发明提供了一种双链核糖核酸(dsRNA)，其用于抑制细胞中含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)的表达，其中所述dsRNA包括形成双链区域的有义链和反义链，其中有义链包括与SEQ ID NO:1核苷酸序列中的核苷酸677-721、683-721、773-817、1185-1295、1185-1241、1202-1295、1202-1241、1255-1295、1738-1792、1901-1945、1920-1945、2108-2208、2108-2166、2108-2136,2121-2166、2121-2208、2169-2208、2176-2208、或2239-2265中的任何一个核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19或20个连续核苷酸，并且反义链包括来自SEQ ID NO:2的对应核苷酸序列的至少19个连续核苷酸。
在一个方面，本发明提供了一种双链核糖核酸(dsRNA)，其用于抑制细胞中含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)的表达，其中所述dsRNA包括形成双链区域的有义链和反义链，其中有义链包括与SEQ ID NO:1核苷酸序列中的核苷酸574-596、677-699、683-705、699-721、773-795、795-817、1185-1207、1192-1214、1202-1224、1208-1230、1209-1231、1210-1232、1211-1233、1212-1234、1213-1233、1214-1234、1214-1236、1215-1237、1216-1238、1219-1237、1219-1241、1255-1275、1256-1276、1257-1275、1257-1277、1258-1278、1259-1279、1260-1278、1260-1280、1261-1281、1262-1282、1263-1283、1264-1282、1264-1284、1265-1285、1267-1285、1266-1286、1266-1288、1267-1285、1267-1287、1268-1290、1269-1289、1270-1290、1271-1291、1272-1292、1273-1293、1274-1294、1275-1295、1631-1653、1738-1760、1739-1761、1740-1760、1740-1762、1741-1763、1744-1766、1746-1766、1750-1772、1751-1773、1752-1774、1753-1775、1754-1776、1755-1777、1756-1778、1757-1779、1758-1780、1759-1781、1760-1782、1761-1783、1762-1782、1762-1784、1763-1785、1764-1786、1765-1787、1766-1786、1766-1788、1767-1787、1768-1788、1767-1789、1769-1789、1770-1788、1770-1790、1771-1791、1772-1792、1815-1837、1901-1923,1920-1942,1923-1945、2112-2130、2169-2191、2171-2191、2176-2198,2177-2199,2178-2200、2179-2201,2180-2202、2181-2203、2183-2205、2184-2206、2186-2208、2239-2261、2241-2263、2242-2264、或2243-2265中的任何一个核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19或20个连续核苷酸，并且反义链包括来自SEQ ID NO:2的对应核苷酸序列的至少19个连续核苷酸。
在一个实施方案中，反义链包括与选自由下列所组成的组的任何一个双链体的反义链核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19或20个连续核苷酸：AD-517197.2、AD-517258.2、AD-516748.2、AD-516851.2、AD-519351.2、AD-519754.2、AD-519828.2、AD-520018.2、AD-520035.2、AD-520062.2、AD-520064.2、AD-520065.2、AD-520067.2、AD-75289.2、AD-520069.2、AD-520099.2、AD-67575.7、AD-520101.2、AD-67605.7、AD-1193323.1、AD-1193344.1、AD-1193350.1、AD-1193365.1、AD-1193379.1、AD-1193407.1、AD-1193421.1、AD-1193422.1、AD-1193429.1、AD-1193437.1、AD-1193443.1、AD-1193471.1、和AD-1193481.1。
在一个实施方案中，反义链包括与选自自由下列所组成的组中任何一个双链体的反义链核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19或20个连续核苷酸：AD-519345.1、AD-519346.1、AD-519347.1、AD-67554.7、AD-519752.3、AD-1010731.1、AD-1010732.1、AD-519343.1、AD-519344.1、AD-519349.1、AD-519350.1、AD-519753.2、AD-519932.1、AD-519935.2、AD-520018.6、AD-517837.2、AD-805635.2、AD-519329.2、AD-520063.2、AD-519757.2、AD-805631.2、AD-516917.2、AD-516828.2、AD-518983.2、AD-805636.2、AD-519754.7、AD-520062.2、AD-67575.9、AD-518923.3、AD-520053.4、AD-519667.2、AD-519773.2、AD-519354.2、AD-520060.4、AD-520061.4、AD-1010733.2、AD-1010735.2、AD-1193323.1、AD-1193344.1、AD-1193350.1、AD-1193365.1、AD-1193379.1、AD-1193407.1、AD-1193421.1、AD-1193422.1、AD-1193429.1、AD-1193437.1、AD-1193443.1、AD-1193471.1、和AD-1193481.1。
在一个方面，本发明提供了一种双链核糖核酸(dsRNA)，其用于抑制细胞中含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)的表达，其中dsRNA包括形成双链区域的有义链和反义链，其中有义链包括与SEQ ID NO:1核苷酸序列中的核苷酸1200-1250、1205-1250、11210-1250、1200-1245、1200-1240、1200-1235、1200-1237、1205-1237、1210-1232、1212-1237、1212-1234、1250-1300、1255-1300、1260-1300、1250-1295、1250-1390、1250-1285、1250-1282、1255-1282、1260-1282、1262-1300、1262-1295、1262-1390、和1262-1282中的任何一个核苷酸序列相异不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且反义链包括来自SEQ IDNO:2的对应核苷酸序列的至少15个连续核苷酸。
在一个实施方案中，反义链包括与选自下列所组成的组的任何一个双链体的反义链核苷酸序列相异不超过0、1、2或3个核苷酸至少15个，例如15、16、17、18、19或20个连续核苷酸：AD-519345、AD-1193350、AD-1193365、AD-1193437和AD-519347。
在一个实施方案中，反义链包括与双链体AD-519351的反义链核苷酸序列的任何一个相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19或20个连续核苷酸。
在一个实施方案中，反义链包括与双链体AD-1193350的反义链核苷酸序列的任何一个相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19或20个连续核苷酸。
在一个实施方案中，反义链包括与双链体AD-1193365的反义链核苷酸序列的任何一个相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19或20个连续核苷酸。
在一个实施方案中，反义链包括与双链体AD-1193437的反义链核苷酸序列的任何一个相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19或20个，连续核苷酸。
在一个实施方案中，反义链包括与双链体AD-519347的反义链核苷酸序列的任何一个相异不超过0、1、2或3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19或20个连续核苷酸
在一个实施方案中，dsRNA剂包括至少一个经修饰核苷酸。
在一个实施方案中，有义链的基本所有核苷酸包括修饰；反义链的基本所有核苷酸包括修饰；或者，有义链的基本所有核苷酸和反义链的基本所有核苷酸包括修饰。
在一个实施方案中，有义链的所有核苷酸包括修饰；反义链的所有核苷酸包括修饰；或者，有义链的所有核苷酸和反义链的所有核苷酸包括修饰。
在一个实施方案中，至少一个经修饰核苷酸是选自于由下列所组成的群组：脱氧-核苷酸、3'-末端脱氧-胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修饰核苷酸、2'-氟基修饰核苷酸、2'-脱氧-修饰核苷酸、锁核苷酸、未锁核苷酸、构象限制核苷酸、约束乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基-修饰核苷酸、2'-O-烯丙基-修饰核苷酸、2'-C-烷基-修饰核苷酸、2'-羟基-修饰核苷酸、2'-甲氧基乙基-修饰核苷酸、2'-O-烷基-修饰核苷酸、吗啉基核苷酸、氨基磷酸酯、包括非天然碱基的核苷酸、四氢哌喃修饰核苷酸、1,5-脱水己糖醇修饰核苷酸、环己烯基修饰核苷酸、包括硫代磷酸基团的核苷酸、包括甲基膦酸基团的核苷酸、包括5'-磷酸的核苷酸、包括5'-磷酸模拟物的核苷酸、热不稳定的核苷酸、二醇修饰核苷酸(GNA)和2-O-(N-甲基乙酰氨)修饰核苷酸；及其组合。
在一个实施方案中，核苷酸上的修饰是选自于由下述所组成的组：LNA、HNA、CeNA、2′-甲氧基乙基、2′-O-烷基、2′-O-烯丙基、2′-C-烯丙基、2′-氟基、2′-脱氧、2′-羟基、和二醇基；及其组合。
在一个实施方案中，至少一个修饰核苷酸是选自于由下列所组成的组：脱氧-核苷酸、2'-O-甲基修饰核苷酸、2'-氟基修饰核苷酸、2'-脱氧-修饰核苷酸、二醇修饰核苷酸(GNA)，例如Ggn、Cgn、Tgn或Agn，和，乙烯基-膦酸核苷酸；及其组合。
在另一个实施方案中，至少一个核苷酸的修饰为热不稳定的核苷酸修饰。
在一个实施方案中，热不稳定的核苷酸修饰是选自于由下列所组成的组：无碱基修饰；双链体中与相对核苷酸的错配；和不稳定的糖修饰，2’-脱氧修饰，无环核苷酸，未锁核酸(UNA)以及甘油核酸(GNA)。
在一些实施方案中，经修饰核苷酸包括3'-末端脱氧-胸腺嘧啶核苷酸(dT)的短序列。
在一些实施方案中，核苷酸的修饰是2’-O-甲基，GNA和2’-氟基修饰。
在一些实施方案中，dsRNA剂进一步地包括至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键合。在一些实施方案中，dsRNA剂包括6-8个硫代磷酸酯核苷酸间键合。在一个实施方案中，硫代磷酸酯或甲基磷酸酯核苷酸间键合位于一条链的3'-末端。可选的，该链是反义链。在另一个实施方案中，该链是有义链。在相关的实施方案中，硫代磷酸酯或甲基磷酸酯核苷酸间键合位于一条链的5'-末端。可选的，该链是反义链。在另一个实施方案中，该链是有义链。在另一个实施方案中，硫代磷酸酯或甲基磷酸酯核苷酸间键合既位于一条链的5'-末端，又位于该链的3'-末端。可选的，该链是反义链。在另一个实施方案中，该链是有义链。
双链区域可以是19-30个核苷酸对的长度；19-25个核苷酸对的长度；19-23个核苷酸对的长度；23-27个核苷酸对的长度；或者是21-23个核苷酸对的长度。
在一个实施方案中，每条链独立地不超过30个核苷酸的长度。
在一个实施方案中，有义链的长度是21个核苷酸，并且反义链的长度是23个核苷酸。
互补性区域的长度可以是至少17个核苷酸；长度是19至23个核苷酸；或者，长度是19个核苷酸。
在一个实施方案中，至少一条链包括至少1个核苷酸的3'突出。在另一个实施方案中，至少一条链包括至少2个核苷酸的3'突出。
在一个实施方案中，dsRNA剂进一步地包括配体。
在一个实施方案中，该配体缀合到dsRNA剂的有义链的3'端。
在一个实施方案中，配体是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
在一个实施方案中，配体是通过一价、二价或三价分支接头所附接的一个或多个GalNAc衍生物。
在一个实施方案中，配体为
Figure BDA0003795632600002901
在一个实施方案中，dsRNA剂如以下示方案所示被缀合到配体
Figure BDA0003795632600002902
并且，其中的X是O或S。
在一个实施方案中，X是O。
在一个实施方案中，dsRNA剂进一步地包括至少一个硫代磷酸酯或甲基磷酸酯核苷酸
间键合。
在一个实施方案中，硫代磷酸酯或甲基磷酸酯核苷酸间键合位于一条链的3'-末端，例如，反义链或有义链。
在另一个实施方案中，硫代磷酸酯或甲基磷酸酯核苷酸间键合位于一条链的5'-末端，例如，反义链或有义链。
在一个实施方案中，硫代磷酸酯或甲基磷酸酯核苷酸间键合既位于一条链的5'-末端，又位于该链的3'-末端。在一个实施方案中，该链是反义链。
在一个实施方案中，位于双链体之反义链的5′-端1位置的碱基对是AU碱基对。
本发明还提供了含有本发明的任何dsRNA剂的细胞，以及包括本发明的任何dsRNA剂的药物组合物。
本发明的药物组合物可以包含在非缓冲溶液(例如盐水或水)中的dsRNA剂，或者本发明的药物组合物可以包含在缓冲溶液中的dsRNA剂，例如包括乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐、或磷酸盐或其任何组合的缓冲溶液；或者磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在一个方面，本发明提供了一种抑制细胞中含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)基因表达的方法。该方法包含使细胞与本发明的任何dsRNA或本发明的任何药物组合物接触，从而抑制细胞中PNPLA3基因的表达。
在一个实施方案中，细胞位于受试者体内，例如人类受试者，例如具有含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)相关病症的受试者，诸如选自于由下列病症所组成的群组的含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)相关病症：脂肪肝(脂肪变性)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝脏中脂肪累积、肝脏炎症、肝细胞的坏死、肝脏纤维化、肥胖症、或非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。
在一个实施方案中，使细胞与dsRNA剂接触以抑制PNPLA3表达的至少50％、60％、70％、80％、90％、或95％。
在一个实施方案中，抑制PNPLA3的表达以使受试者血清中PNPLA3蛋白质水平降低至少50％、60％、70％、80％、90％、或95％。
在一个方面，本发明提供了一种治疗受试者的方法，该受试者所罹患的病症将受益于含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)表达的降低。该方法包含向受试者施用治疗有效量的本发明的任何dsRNA或本发明的任何药物组合物，从而治疗患有将受益于PNPLA3表达降低的病症的受试者。
在另一个方面，本发明提供了一种预防受试者至少一项症状的方法，该受试者所罹患病症将受益于含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)表达的降低。该方法包含向受试者施用预防有效量的本发明的任何dsRNA或本发明的任何药物组合物，从而预防患有将受益于含PNPLA3表达降低的病症的受试者至少一项症状。
在一个实施方案中，该病症为一种含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)相关病症，例如，含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)相关病症选自于由下列病症所组成的群组：脂肪肝(脂肪变性)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，肝硬化，肝脏中脂肪累积，肝脏炎症，肝细胞的坏死，肝脏纤维化，肥胖症，或非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。
在一个实施方案中，PNPLA3相关病症是NAFLD。
在一个实施方案中，受试者是人。
在一个实施方案中，给受试者施用的dsRNA剂的一次剂量为约0.01mg/kg至约50mg/kg。
在一个实施方案中，dsRNA剂通过皮下注射施用给受试者。
在一个实施方案中，本发明的方法包含进一步地确定取自受试者的一个或多个样本中PNPLA3的水平。
在一个实施方案中，一个(或多个)受试者样本中含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)的水平，是指血液或血清样本中的含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)的蛋白水平。
在一些实施方案中，本发明的方法进一步地包括给受试者施用额外的治疗剂。在一个进一步的实施方案中，额外的治疗剂选自于由下列物质所组成的组：HMG-CoA还原酶抑制剂，纤维酸盐衍生物，胆汁酸鳌合剂，烟碱酸，抗血小板剂，血管收缩素转化酶抑制剂，血管收缩素II受体的拮抗剂，酰基辅酶胆固醇乙酰转移酶(ACAT)抑制剂，胆固醇吸收抑制剂，胆固醇酯转蛋白(CETP)抑制剂，微粒体三酸甘油酯转移蛋白(MTTP)抑制剂，胆固醇调节剂，胆汁酸调节剂，过氧化物酶体增殖激活受体(PPAR)激动剂，基因疗法，复合血管保护剂，糖蛋白Ilb/IIIa抑制剂，阿司匹林或类阿司匹林化合物，IBAT抑制剂，角鲨烯合成酶抑制剂，单核细胞趋化蛋白(MCP)-I抑制剂，或鱼油。
本发明还提供了试剂盒，该试剂盒包括本发明的任何dsRNA或本发明的任何药物组合物，以及可选的，使用说明书。
等效物
仅使用常规的实验法，本领域技术人员将知悉或能够确认许多与本文所述的具体实施方案和方法等效的实施方案和方法。此类等效物意在被如下权利要求的范围所涵盖。

Claims (73)

1.一种用于抑制细胞中含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)的表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括形成双链区域的有义链和反义链，其中所述反义链包括编码PNPLA3的mRNA的互补性区域，并且其中所述互补性区域包括与表2-11、21、24、27、30、32、33、36、37、49或50中任一者中的任何一个反义核苷酸序列相异不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
2.一种用于抑制细胞中含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)的表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括形成双链区域的有义链和反义链，其中所述有义链包括与SEQID NO:1的核苷酸677-721、683-721、773-817、1185-1295、1185-1241、1202-1295、1202-1241、1255-1295、1738-1792、1901-1945、1920-1945、2108-2208、2108-2166、2108-2136、2121-2166、2121-2208、2169-2208、2176-2208、或2239-2265的任何一个核苷酸序列相异不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且所述反义链包括来自SEQ ID NO:2的对应核苷酸序列的至少15个连续核苷酸。
3.一种用于抑制细胞中含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)的表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括形成双链区域的有义链和反义链，其中所述有义链包括与SEQID NO:1的核苷酸574-596、677-699、683-705、699-721、773-795、795-817、1185-1207、1192-1214、1202-1224、1208-1230、1209-1231、1210-1232、1211-1233、1212-1234、1213-1233、1214-1234、1214-1236、1215-1237、1216-1238、1219-1237、1219-1241、1255-1275、1256-1276、1257-1275、1257-1277、1258-1278、1259-1279、1260-1278、1260-1280、1261-1281、1262-1282、1263-1283、1264-1282、1264-1284、1265-1285、1267-1285、1266-1286、1266-1288、1267-1285、1267-1287、1268-1290、1269-1289、1270-1290、1271-1291、1272-1292、1273-1293、1274-1294、1275-1295、1631-1653、1738-1760、1739-1761、1740-1760、1740-1762、1741-1763、1744-1766、1746-1766、1750-1772、1751-1773、1752-1774、1753-1775、1754-1776、1755-1777、1756-1778、1757-1779、1758-1780、1759-1781、1760-1782、1761-1783、1762-1782、1762-1784、1763-1785、1764-1786、1765-1787、1766-1786、1766-1788、1767-1787、1768-1788、1767-1789、1769-1789、1770-1788、1770-1790、1771-1791、1772-1792、1815-1837、1901-1923、1920-1942、1923-1945、2112-2130、2169-2191、2171-2191、2176-2198、2177-2199、2178-2200、2179-2201、2180-2202、2181-2203、2183-2205、2184-2206、2186-2208、2239-2261、2241-2263、2242-2264、或2243-2265的任何一个核苷酸序列相异不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且所述反义链包括来自SEQ ID NO:2的对应核苷酸序列的至少15个连续核苷酸。
4.如权利要求1至3中任一项所述的dsRNA剂，其中所述反义链包括与选自由下列所组成的组的双链体的反义链核苷酸序列中的任何一个相异不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸：AD-517197.2、AD-517258.2、AD-516748.2、AD-516851.2、AD-519351.2、AD-519754.2、AD-519828.2、AD-520018.2、AD-520035.2、AD-520062.2、AD-520064.2、AD-520065.2、AD-520067.2、AD-75289.2、AD-520069.2、AD-520099.2、AD-67575.7、AD-520101.2、AD-1193323.1、AD-1193344.1、AD-1193350.1、AD-1193365.1、AD-1193379.1、AD-1193407.1、AD-1193421.1、AD-1193422.1、AD-1193429.1、AD-1193437.1、AD-1193443.1、AD-1193471.1、AD-1193481.1和AD-67605.7。
5.如权利要求1至3中任一项所述的dsRNA剂，其中所述反义链包括与选自由下列所组成的组的双链体的反义链核苷酸序列中的任何一个相异不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸：AD-519345.1、AD-519346.1、AD-519347.1、AD-67554.7、AD-519752.3、AD-1010731.1、AD-1010732.1、AD-519343.1、AD-519344.1、AD-519349.1、AD-519350.1、AD-519753.2、AD-519932.1、AD-519935.2、AD-520018.6、AD-517837.2、AD-805635.2、AD-519329.2、AD-520063.2、AD-519757.2、AD-805631.2、AD-516917.2、AD-516828.2、AD-518983.2、AD-805636.2、AD-519754.7、AD-520062.2、AD-67575.9、AD-518923.3、AD-520053.4、AD-519667.2、AD-519773.2、AD-519354.2、AD-520060.4、AD-520061.4、AD-1010733.2和AD-1010735.2。
6.一种用于抑制细胞中含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)的表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括形成双链区域的有义链和反义链，其中所述有义链包括与SEQID NO:1的核苷酸1200-1250、1205-1250、11210-1250、1200-1245、1200-1240、1200-1235、1200-1237、1205-1237、1210-1232、1212-1237、1212-1234、1250-1300、1255-1300、1260-1300、1250-1295、1250-1390、1250-1285、1250-1282、1255-1282、1260-1282、1262-1300、1262-1295、1262-1390、和1262-1282的核苷酸序列中的任何一个相异不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且所述反义链包括来自SEQ ID NO:2的对应核苷酸序列的至少15个连续核苷酸。
7.如权利要求1至6中任一项所述的dsRNA剂，其中所述反义链包括与选自于由AD-519351、AD-519345、AD-1193350、AD-1193365、AD-1193437和AD-519347所组成的组中的双链体的反义链核苷酸序列中的任何一个相异不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
8.如权利要求1至7中任一项所述的dsRNA剂，其中所述dsRNA剂包括至少一个经修饰核苷酸。
9.如权利要求1至8中任一项所述的dsRNA剂，其中所述有义链的基本所有核苷酸包括修饰；所述反义链的基本所有核苷酸包括修饰；或者，所述有义链的基本所有核苷酸和所述反义链的基本所有核苷酸包括修饰。
10.如权利要求1至9中任一项所述的dsRNA剂，其中所述有义链的所有核苷酸包括修饰；所述反义链的所有核苷酸包括修饰；或者，所述有义链的所有核苷酸和所述反义链的所有核苷酸包括修饰。
11.如权利要求8至10中任一项所述的dsRNA剂，其中至少一个所述经修饰核苷酸选自于由以下所组成的组：脱氧-核苷酸、3'-末端脱氧-胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修饰核苷酸、2'-氟基修饰核苷酸、2'-脱氧-修饰核苷酸、锁核苷酸、未锁核苷酸、构象限制核苷酸、约束乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基-修饰核苷酸、2'-O-烯丙基-修饰核苷酸、2'-C-烷基-修饰核苷酸、2'-羟基-修饰核苷酸、2'-甲氧基乙基-修饰核苷酸、2'-O-烷基-修饰核苷酸、吗啉基核苷酸、氨基磷酸酯、包括非天然碱基的核苷酸、四氢哌喃修饰核苷酸、1,5-脱水己糖醇修饰核苷酸、环己烯基修饰核苷酸、包括硫代磷酸基团的核苷酸、包括甲基膦酸基团的核苷酸、包括5'-磷酸的核苷酸、包括5'-磷酸模拟物的核苷酸、热不稳定的核苷酸、二醇修饰核苷酸(GNA)和2-O-(N-甲基乙酰氨)修饰核苷酸；及其组合。
12.如权利要求8至10中任一项所述的dsRNA剂，其中所述核苷酸上的修饰选自于由下述所组成的组：LNA、HNA、CeNA、2′-甲氧基乙基、2′-O-烷基、2′-O-烯丙基、2′-C-烯丙基、2′-氟基、2′-脱氧、2′-羟基、和二醇基；及其组合。
13.如权利要求8至10中任一项所述的dsRNA剂，其中至少一个所述经修饰核苷酸选自于由下述所组成的组：脱氧-核苷酸、2'-O-甲基修饰核苷酸、2'-氟基修饰核苷酸、2'-脱氧-修饰核苷酸、二醇修饰核苷酸(GNA)、和乙烯基-膦酸核苷酸；及其组合。
14.如权利要求8至10中任一项所述的dsRNA剂，其中所述核苷酸上的至少一个修饰为热不稳定的核苷酸修饰。
15.如权利要求14所述的dsRNA剂，其中所述热不稳定的核苷酸修饰选自于由下述所组成的组：无碱基修饰、所述双链体中与相对核苷酸的错配、和不稳定的糖修饰、2’-脱氧修饰、无环核苷酸、未锁核酸(UNA)以及甘油核酸(GNA)。
16.如权利要求1至15中任一项所述的dsRNA剂，其中所述双链区域的长度为19-30个核苷酸对。
17.如权利要求16所述的dsRNA剂，其中所述双链区域的长度为19-25个核苷酸对。
18.如权利要求16所述的dsRNA剂，其中所述双链区域的长度为19-23个核苷酸对。
19.如权利要求16所述的dsRNA剂，其中所述双链区域的长度为23-27个核苷酸对。
20.如权利要求16所述的dsRNA剂，其中所述双链区域的长度为21-23个核苷酸对。
21.如权利要求1至20中任一项所述的dsRNA剂，其中每条链的长度独立地为不超过30个核苷酸。
22.如权利要求1至21中任一项所述的dsRNA剂，其中所述有义链的长度为21个核苷酸，并且所述反义链的长度为23个核苷酸。
23.如权利要求1至22中任一项所述的dsRNA剂，其中所述互补性区域的长度为至少17个核苷酸。
24.如权利要求1至23中任一项所述的dsRNA剂，其中所述互补性区域的长度为19至23个核苷酸。
25.如权利要求1至24中任一项所述的dsRNA剂，其中所述互补性区域的长度为19个核苷酸。
26.如权利要求1至25中任一项所述的dsRNA剂，其中至少一条链包括至少1个核苷酸的3'突出端。
27.如权利要求1至25中任一项所述的dsRNA剂，其中至少一条链包括至少2个核苷酸的3'突出端。
28.如权利要求1至27中任一项所述的dsRNA剂，进一步地包括配体。
29.如权利要求28所述的dsRNA剂，其中所述配体与所述dsRNA剂的有义链的3'末端缀合。
30.如权利要求28或29所述的dsRNA剂，其中所述配体是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
31.如权利要求28至30中任一项所述的dsRNA剂，其中所述配体是通过一价、二价或三价分支接头所附接的一个或多个GalNAc衍生物。
32.如权利要求30或31所述的dsRNA剂，其中所述配体为
Figure FDA0003795632590000051
33.如权利要求32所述的dsRNA剂，其中所述dsRNA剂如以下示意图所示缀合到所述配体
Figure FDA0003795632590000052
并且，其中的X是O或S。
34.如权利要求33所述的dsRNA剂，其中所述X是O。
35.如权利要求1至34中任一项所述的dsRNA剂，其中所述dsRNA剂进一步包括至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键合或甲基磷酸酯核苷酸间键合。
36.如权利要求35所述的dsRNA剂，其中所述硫代磷酸酯核苷酸间键合或甲基磷酸酯核苷酸间键合位于一条链的3'-末端。
37.如权利要求36所述的dsRNA剂，其中所述链是所述反义链。
38.如权利要求36所述的dsRNA剂，其中所述链是所述有义链。
39.如权利要求35所述的dsRNA剂，其中所述硫代磷酸酯核苷酸间键合或甲基膦酸酯核苷酸间键合位于一条链的5'-末端。
40.如权利要求39所述的dsRNA剂，其中所述链是所述反义链。
41.如权利要求39所述的dsRNA剂，其中所述链是所述有义链。
42.如权利要求35所述的dsRNA剂，其中所述硫代磷酸酯核苷酸间键合或甲基膦酸酯核苷酸间键合位于一条链的5'-末端及3'-末端两端。
43.如权利要求42所述的dsRNA剂，其中所述链是所述反义链。
44.如权利要求1至43中任一项所述的dsRNA剂，其中位于所述双链体的反义链的5′-末端的第1位的碱基对是AU碱基对。
45.一种细胞，含有如权利要求1至44中任一项所述的dsRNA剂。
46.一种用于抑制编码含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)的基因的表达的药物组合物，其包含如权利要求1至44中任一项所述的dsRNA剂。
47.如权利要求46所述的药物组合物，其中dsRNA剂在非缓冲溶液中。
48.如权利要求47所述的药物组合物，其中所述非缓冲溶液是盐水或水。
49.如权利要求46所述的药物组合物，其中所述dsRNA剂在缓冲溶液中。
50.如权利要求49所述的药物组合物，其中所述缓冲溶液包括乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐、或磷酸盐或其任何组合。
51.如权利要求50所述的药物组合物，其中所述缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
52.一种抑制细胞中含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)基因的表达的方法，所述方法包括使所述细胞与如权利要求1至44中任一项所述的dsRNA剂或如权利要求48至51中任一项所述的药物组合物接触，从而抑制所述细胞中所述PNPLA3基因的表达。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述细胞位于受试者体内。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述受试者是人。
55.如权利要求52所述的方法，其中所述受试者患有PNPLA3相关病症。
56.如权利要求55项所述的方法，其中所述PNPLA3相关病症选自于由下述所组成的组：脂肪肝(脂肪变性)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝脏中脂肪累积、肝脏炎症、肝细胞坏死、肝脏纤维化、肥胖症、以及非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。
57.如权利要求52至56中任一项所述的方法，其中使所述细胞与所述dsRNA剂接触以将PNPLA3表达抑制至少50％、60％、70％、80％、90％、或95％。
58.如权利要求52至57中任一项所述的方法，其中抑制PNPLA3表达使所述受试者的血清中PNPLA3蛋白水平降低至少50％、60％、70％、80％、90％、或95％。
59.一种治疗患有将受益于含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)表达降低的病症的受试者的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1至44中任一项所述的dsRNA剂或如权利要求46至51中任一项所述的药物组合物，从而治疗所述患有将受益于PNPLA3表达降低的病症的受试者。
60.一种预防患有将受益于含类PATATIN磷脂酶结构域3(PNPLA3)表达降低的病症的受试者的至少一个症状的方法，包括向所述受试者施用预防有效量的如权利要求1至44中任一项所述的dsRNA剂或如权利要求46至51中任一项所述的药物组合物，从而预防所述患有将受益于PNPLA3表达降低的病症的受试者的至少一个症状。
61.如权利要求59或60所述的方法，其中所述病症是PNPLA3相关病症。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述PNPLA3相关病症选自于由下述所组成的组：脂肪肝(脂肪变性)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化、肝脏中脂肪累积、肝脏炎症、肝细胞坏死、肝脏纤维化、肥胖症、以及非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。
63.如权利要求61所述的方法，其中所述PNPLA3相关病症是NAFLD。
64.如权利要求61所述的方法，其中所述受试者是人。
65.如权利要求59或60所述的方法，其中向所述受试者施用所述剂导致PNPLA3蛋白累积的减少。
66.如权利要求59至65中任一项所述的方法，其中所述dsRNA剂以约0.01mg/kg至约50mg/kg的剂量施用给所述受试者。
67.如权利要求59至66中任一项所述的方法，其中所述dsRNA剂通过皮下方式施用给所述受试者。
68.如权利要求59至67中任一项所述的方法，进一步包括确定来自所述受试者的一个样本或多个样本中的PNPLA3的水平。
69.如权利要求68所述的方法，其中所述一个或多个受试者样本中的PNPLA3的水平是指一个或多个血液或血清样本中的PNPLA3蛋白水平。
70.如权利要求59至69中任一项所述的方法，进一步包括向所述受试者施用额外的用于治疗PNPLA3相关病症的治疗剂。
71.一种试剂盒，其包括如权利要求1至44中任一项所述的dsRNA剂或如权利要求46至51中任一项所述的药物组合物。
72.一种小瓶，其包括如权利要求1至44中任一项所述的dsRNA剂或如权利要求46至51中任一项所述的药物组合物。
73.一种注射器，其包括如权利要求1至44中任一项所述的dsRNA剂或如权利要求46至51中任一项所述的药物组合物。
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