CN117651769A - β连环蛋白（CTNNB1）iRNA组合物和其使用方法 - Google Patents

β连环蛋白（CTNNB1）iRNA组合物和其使用方法 Download PDF

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A·阿金克
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Abstract

本发明涉及靶向β连环蛋白(CTNNB1)基因的RNAi药剂，例如双链RNA(dsRNA)药剂。本发明还涉及使用此类RNAi药剂来抑制CTNNB1基因的表达的方法，并且涉及预防和治疗CTNNB1相关病症，例如癌症，例如肝细胞癌的方法。

Description

β连环蛋白(CTNNB1)iRNA组合物和其使用方法
相关申请交叉引用
本申请要求于2021年7月23日提交的美国临时申请第63/224,901号和于2021年12月27日提交的美国临时申请第63/293,851号的优先权的权益。前述申请中的每个申请的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
Wnt/β连环蛋白信号传导通路是一种已知涉及胚胎发育、组织稳态和多种人类疾病的进化上保守的多功能通路。此通路的异常激活导致β连环蛋白在细胞核中累积，并且促进许多癌基因如c-Myc和细胞周期蛋白D-1的转录。因此，它导致若干种癌症的致癌作用和肿瘤进展，包含肝细胞癌、结肠癌、胰腺癌、肺癌和卵巢癌(Khramtsov AI等人,《美国病理学杂志(Am JPathol.)》2010；176:2911–2920；Tao J等人,《胃肠病学(Gastroenterology.)》2014；147:690–701；Kobayashi M等人,《英国癌症杂志(Br J Cancer.)》2000；82:1689–1693；Damsky WE等人,《癌细胞(Cancer Cell.)》2011；20:741–754；Gekas C等人,《白血病(Leukemia.)》2016；30:2002–2010)。
β连环蛋白由CTNNB1基因编码，是一种多功能蛋白，在生理稳态中起重要作用。β连环蛋白既作为转录共调节因子，又作为用于细胞内粘附的衔接蛋白。Wnt是由19种用于调节β连环蛋白依赖性(规范Wnt)信号通路和非依赖性(非规范Wnt)信号通路两者的糖蛋白组成的家族的β连环蛋白的主要调节因子(van Ooyen A,Nusse R.《细胞(Cell.)》1984；39:233–240)。
在规范Wnt通路中，Dsh、β连环蛋白、糖原合成酶激酶3β(GSK3β)、结肠腺瘤性息肉病(APC)、AXIN和T细胞因子(TCF)/淋巴增强因子(LEF)已被确定为规范Wnt通路的信号转导子，其中β连环蛋白是核心分子(Behrens J等人,《自然(Nature.)》1996；382:638–642；Peifer M等人,《发育生物学(Dev Biol.)》1994；166:543–556；Rubinfeld B等人,《科学(Science.)》1996；272:1023–1026；Yost C等人,《基因与发育(Genes Dev.)》1996；10:1443–1454)。在缺乏Wnt配体的情况下，β连环蛋白通过泛素蛋白酶体系统(UPS)保持在低水平，这导致β连环蛋白的泛素化和蛋白酶体降解。在Wnt激活或Wnt组分的基因突变时，β连环蛋白在细胞质中累积，并且然后易位到细胞核中。因此，它与其它蛋白质如LEF-1/TCF4结合，以组织特异性方式促进靶基因如Jun、c-Myc和细胞周期蛋白D-1的转录，其中大多数编码癌蛋白。因此，β连环蛋白的异常高表达导致包含癌症的各种疾病。
另外，β连环蛋白的高水平细胞质表达和核定位也诱导肿瘤发生特性并且促进癌细胞增殖和存活(Valkenburg KC等人,《癌症(Cancers)》(巴塞尔(Basel))2011；3:2050–2079)。此外，β连环蛋白通过抑制T细胞应答促进肿瘤的发展(Hong Y等人,《癌症研究(Cancer Res.)》2015；75:656-665)。
目前对癌症的治疗包含手术、放疗和化疗。然而，这些方法不是完全有效的，并且可能导致严重的副作用。因此，本领域需要对患有CTNNB1相关病症(如癌症，例如肝细胞癌)的受试者进行替代性治疗。
发明内容
本发明提供了iRNA组合物，所述组合物影响对编码β连环蛋白(CTNNB1)的基因的RNA转录物的RNA诱导的沉默复合物(RISC)介导的切割。CTNNB1基因可以在细胞内，例如受试者(如人受试者)体内的细胞。本发明还提供了使用本发明的所述iRNA药剂组合物用于抑制CTNNB1基因的表达和/或用于治疗将受益于抑制或减少CTNNB1基因的表达的受试者的方法，所述受试者例如患有或易于患有CTNNB1相关病症，例如癌症，例如肝细胞癌的受试者。
因此，一方面，本发明提供了一种用于抑制细胞中的β连环蛋白(CTNNB1)的表达的双链核糖核酸(dsRNA)药剂，其中所述dsRNA药剂包括形成双链区的有义链和反义链，其中所述有义链包括与SEQ ID NO:1的核苷酸序列相差不超过0个、1个、2个或3个核苷酸的至少15个例如15个、16个、17个、18个、19个或20个连续核苷酸，并且所述反义链包括与SEQ IDNO:2的核苷酸序列的对应部分相差不超过1个、2个或3个核苷酸的至少15个例如15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个或23个连续核苷酸。
另一方面，本发明提供了一种用于抑制细胞中的β连环蛋白(CTNNB1)的表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中dsRNA包括形成双链区的有义链和反义链，其中所述反义链包括与编码CTNNB1的mRNA互补的区，并且其中所述互补区包括与表2、表3、表5或表6中的任一个表中的任一个反义核苷酸序列相差不超过0个、1个、2个或3个核苷酸的至少15个例如15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个或23个连续核苷酸。
在一个实施例中，所述dsRNA药剂包括有义链和反义链，所述有义链包括与表2、表3、表5或表6中的任一个表中的有义链的核苷酸序列中的任一个核苷酸序列相差不超过核苷酸的至少15个例如15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个连续核苷酸，所述反义链包括与表2、表3、表5或表6中的任一个表中的反义链的核苷酸序列中的任一个核苷酸序列相差不超过两个核苷酸的至少15个例如15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或23个连续核苷酸。
在一个实施例中，所述dsRNA药剂包括有义链和反义链，所述有义链包括与表2、表3、表5或表6中的任一个表中的有义链的核苷酸序列中的任一个核苷酸序列相差不超过一个核苷酸的至少15个例如15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个连续核苷酸，所述反义链包括与表2、表3、表5或表6中的任一个表中的反义链的核苷酸序列中的任一个核苷酸序列相差不超过一个核苷酸的至少15个例如15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个或23个连续核苷酸。
在一个实施例中，所述dsRNA药剂包括有义链和反义链，所述有义链包括选自由表2、表3、表5和表6中的任一个表中的有义链的核苷酸序列中的任一个核苷酸序列组成的组的核苷酸序列或由其组成，所述反义链包括选自由表2、表3、表5和表6中的任一个表中的反义链的核苷酸序列中的任一个核苷酸序列组成的组的核苷酸序列或由其组成。
在一个实施例中，所述dsRNA药剂包括有义链和反义链，所述有义链包括在其整个长度上与表2、表3、表5或表6中的任一个表中的有义链的核苷酸序列中的任一个核苷酸序列具有至少85％，例如85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸序列同一性的连续核苷酸序列，所述反义链包括在其整个长度上与表2、表3、表5或表6中的任一个表中的反义链的核苷酸序列中的任一个核苷酸序列具有至少85％，例如85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸序列同一性的连续核苷酸序列。
一方面，本发明提供了一种用于抑制细胞中的β连环蛋白(CTNNB1)的表达的双链核糖核酸(dsRNA)药剂，其中所述dsRNA药剂包括形成双链区的有义链和反义链，其中所述有义链包括与SEQ ID NO:1的核苷酸603-625；1489-1511；或1739-1761的任一个核苷酸序列相差不超过三个例如3个、2个、1个或0个核苷酸的至少15个例如15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个连续核苷酸，并且所述反义链包括与SEQ ID NO:2的对应核苷酸序列相差不超过三个例如3个、2个、1个或0个核苷酸的至少15个例如15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个或23个连续核苷酸。
在一个实施例中，所述反义链包括与选自由以下组成的组的双链体的任一个反义链核苷酸序列相差不超过三个核苷酸的至少15个连续核苷酸：AD-1548393、AD-1548488和AD-1548459。
在一个实施例中，所述dsRNA药剂包括至少一种经修饰的核苷酸。
在一个实施例中，所述有义链的基本上所有核苷酸都是经修饰的核苷酸；所述反义链的基本上所有核苷酸都是经修饰的核苷酸；或者所述有义链的基本上所有核苷酸和所述反义链的基本上所有核苷酸都是经修饰的核苷酸。
在一个实施例中，所述有义链的所有核苷酸都是经修饰的核苷酸；所述反义链的所有核苷酸都是经修饰的核苷酸；或者所述有义链的所有核苷酸和所述反义链的所有核苷酸都是经修饰的核苷酸。
在一个实施例中，所述经修饰的核苷酸中的至少一种经修饰的核苷酸选自由以下组成的组：脱氧核苷酸、3'末端脱氧胸苷(dT)核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、锁定核苷酸、解锁核苷酸、构象限制性核苷酸、约束乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、2'-C-烷基修饰的核苷酸、2'-羟基修饰的核苷酸、2'-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包括核苷酸的非天然碱基、四氢吡喃修饰的核苷酸、1,5-脱水己糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包括硫代磷酸酯基的核苷酸、包括甲基膦酸酯基的核苷酸、包括5'-磷酸酯的核苷酸、包括5'-磷酸酯模拟物的核苷酸、热不稳定核苷酸、乙二醇修饰的核苷酸(GNA)、包括2'磷酸酯的核苷酸和2-O-(N-甲基乙酰胺)修饰的核苷酸；以及其组合。
在一个实施例中，所述经修饰的核苷酸中的至少一种经修饰的核苷酸选自由以下组成的组：LNA、HNA、CeNA、2′-甲氧基乙基、2′-O-烷基、2′-O-烯丙基、2′-C-烯丙基、2′-氟、2′-脱氧、2'-羟基和乙二醇；以及其组合。
在一个实施例中，至少一个所述经修饰的核苷酸选自由以下组成的组：脱氧核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、乙二醇修饰的核苷酸(GNA)，例如Ggn、Cgn、Tgn或Agn、具有2'磷酸酯的核苷酸，例如G2p、C2p、A2p或U2p、包括硫代磷酸酯基的核苷酸以及膦酸乙烯酯核苷酸；以及其组合。
在另一个实施例中，所述经修饰的核苷酸中的至少一种经修饰的核苷酸是用热不稳定核苷酸修饰来修饰的核苷酸。
在一个实施例中，所述热不稳定核苷酸修饰选自由以下组成的组：无碱基修饰；与所述双链体中的相对核苷酸的错配；不稳定糖修饰、2'-脱氧修饰、无环核苷酸、解锁核酸(UNA)和甘油核酸(GNA)。
在一些实施例中，所述经修饰的核苷酸包括3'末端脱氧胸苷核苷酸(dT)的短序列。
在一些实施例中，所述dsRNA药剂进一步包括至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施例中，所述dsRNA药剂包括6个至8个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一个实施例中，所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯的核苷酸间键位于一条链的3'末端处。任选地，所述链是所述反义链。在另一个实施例中，所述链是所述有义链。在一个相关实施例中，所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键位于一条链的5'末端处。任选地，所述链是所述反义链。在另一个实施例中，所述链是所述有义链。在另一个实施例中，所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键位于一条链的5'和3'末端两者处。任选地，所述链是所述反义链。在另一个实施例中，所述链是所述有义链。
双链区可以是长度是19个至30个核苷酸对；长度是19个至25个核苷酸对；长度是19个至23个核苷酸对；长度是23个至27个核苷酸对；或长度是21个至23个核苷酸对。
在一个实施例中，每条链的长度独立地不超过30个核苷酸。
在一个实施例中，所述有义链的长度是21个核苷酸，并且所述反义链的长度是23个核苷酸。
所述互补区可以是长度是至少17个核苷酸；长度是19个至23个核苷酸；或长度是19个核苷酸。
在一个实施例中，至少一条链包括至少1个核苷酸的3'突出端。在另一个实施例中，至少一条链包括至少2个核苷酸的3'突出端。
在一个实施例中，所述dsRNA药剂进一步包括配体。
在一个实施例中，所述配体与所述dsRNA药剂的所述有义链的3'端缀合。
在一个实施例中，所述配体是N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
在一个实施例中，所述配体是通过单价、二价或三价支链接头连接的一种或多种GalNAc衍生物。
在一个实施例中，所述配体是
在一个实施例中，所述dsRNA药剂与所述配体缀合，如以下示意图所示
并且其中X是O或S。
在一个实施例中，所述X是O。
在一个实施例中，所述dsRNA药剂进一步包括至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。
在一个实施例中，所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键位于一条链，例如，所述反义链或所述有义链的3'末端处。
在另一个实施例中，所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键位于一条链，例如，所述反义链或所述有义链的5'末端处。
在一个实施例中，所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键位于一条链的5'末端和3'末端两者处。在一个实施例中，所述链是反义链。
在一个实施例中，在所述双链体的所述反义链的5′-端的1位置处的碱基对是AU碱基对。
在一个实施例中，所述反义链包括与核苷酸序列5'-UTUCGAAUCAATCCAACAGUAGC-3'相差不超过3个例如3个、2个、1个或0个核苷酸的至少15个例如15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个或23个连续核苷酸。
在一个实施例中，所述有义链包括与核苷酸序列5'-UACUGUUGGAUUGAUUCGAAA-3'相差不超过3个例如3个、2个、1个或0个核苷酸的至少15个例如15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个连续核苷酸，并且所述反义链包括与核苷酸序列5'-UTUCGAAUCAATCCAACAGUAGC-3'相差不超过3个例如3个、2个、1个或0个核苷酸的至少15个例如15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个或23个连续核苷酸。
在一个实施例中，所述反义链包括核苷酸序列5'-UTUCGAAUCAATCCAACAGUAGC-3'。
在一个实施例中，所述有义链包括核苷酸序列5'-UACUGUUGGAUUGAUUCGAAA-3'，并且所述反义链包括核苷酸序列5'-UTUCGAAUCAATCCAACAGUAGC-3'。
在一个实施例中，所述有义链与核苷酸序列5'-usascuguugGfAfUfugauucgasasa-3'相差不超过4个例如4个、3个、2个、1个或0个碱基，并且所述反义链与核苷酸序列5'-VPudTucdGadAucaadTcCfaacaguasgsc-3'相差不超过4个例如4个、3个、2个、1个或0个碱基，其中a、g、c和u分别是2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf分别是2'-氟A、G、C和U；s是硫代磷酸酯键；VP是乙烯基膦酸酯；dT是2'-脱氧胸苷-3'-磷酸酯；dG是2'-脱氧鸟苷-3'-磷酸酯；并且dA是2'-脱氧腺苷-3'-磷酸酯。
一方面，本发明提供了一种用于抑制细胞中的β连环蛋白(CTNNB1)的表达的双链RNA(dsRNA)药剂，所述dsRNA药剂包括有义链和反义链，所述有义链包括核苷酸序列5'-usascuguugGfAfUfugauucgasasa-3'，所述反义链包括核苷酸序列5'-VPudTucdGadAucaadTcCfaacaguasgsc-3'，
其中a、g、c和u分别是2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf分别是2'-氟A、G、C和U；s是硫代磷酸酯键；VP是乙烯基膦酸酯；dT是2'-脱氧胸苷-3'-磷酸酯；dG是2'-脱氧鸟苷-3'-磷酸酯；并且dA是2'-脱氧腺苷-3'-磷酸酯。
在一个实施例中，所述dsRNA药剂进一步包括配体。
本发明还提供了含有本发明的任何dsRNA药剂的细胞和包括本发明任何dsRNA药剂的药物组合物。
本发明的药物组合物可以包含在未缓冲的溶液，例如，盐水或水中的dsRNA药剂，或本发明的药物组合物可以包含在缓冲溶液中的所述dsRNA药剂，例如，包括以下的缓冲溶液：乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐或其任何组合；或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
一方面，本发明提供了一种用于抑制编码β连环蛋白(CTNNB1)的基因的表达的药物组合物，所述药物组合物包括根据权利要求1至47中任一项所述的dsRNA药剂以及脂质。
在一个实施例中，所述脂质是阳离子脂质。
在一个实施例中，所述阳离子脂质包括一个或多个可生物降解基团。
在一个实施例中，所述脂质包括以下结构：
在一个实施例中，所述药物组合物包括：
(a)
(b)胆固醇；
(c)DSPC；以及
(d)PEG-DMG。
在一个实施例中，所述DSPC、胆固醇和PEG-DMG分别以50:12:36:2的摩尔比存在。
一方面，本发明提供了一种用于抑制编码β连环蛋白(CTNNB1)的基因的表达的药物组合物，所述药物组合物包括用于抑制编码β连环蛋白(CTNNB1)的基因的表达的dsRNA药剂以及脂质，所述dsRNA药剂包括形成双链区的有义链和反义链，其中所述反义链包括与核苷酸序列5'-UTUCGAAUCAATCCAACAGUAGC-3'相差不超过3个例如3个、2个、1个或0个核苷酸的至少15个例如15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个或23个连续核苷酸。
在一个实施例中，所述有义链包括与核苷酸序列5'-UACUGUUGGAUUGAUUCGAAA-3'相差不超过3个例如3个、2个、1个或0个核苷酸的至少15个例如15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个连续核苷酸，并且所述反义链包括与核苷酸序列5'-UTUCGAAUCAATCCAACAGUAGC-3'相差不超过3个例如3个、2个、1个或0个核苷酸的至少15个例如15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个或23个连续核苷酸。
在一个实施例中，所述反义链包括核苷酸序列5'-UTUCGAAUCAATCCAACAGUAGC-3'。
在一个实施例中，所述有义链包括核苷酸序列5'-UACUGUUGGAUUGAUUCGAAA-3'，并且所述反义链包括核苷酸序列5'-UTUCGAAUCAATCCAACAGUAGC-3'。
在一个实施例中，所述有义链与核苷酸序列5'-usascuguugGfAfUfugauucgasasa-3'相差不超过4个例如4个、3个、2个、1个或1个碱基，并且所述反义链与核苷酸序列5'-VPudTucdGadAucaadTcCfaacaguasgsc-3'相差不超过4个例如4个、3个、2个、1个或0个碱基，其中a、g、c和u分别是2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf分别是2'-氟A、G、C和U；s是硫代磷酸酯键；VP是乙烯基膦酸酯；dT是2'-脱氧胸苷-3'-磷酸酯；dG是2'-脱氧鸟苷-3'-磷酸酯；并且dA是2′-脱氧腺苷-3'-磷酸酯。
在一个实施例中，所述脂质包括以下结构：
在一个实施例中，所述药物组合物包括：
(a)
(b)胆固醇；
(c)DSPC；以及
(d)PEG-DMG。
在一个实施例中，所述DSPC、胆固醇和PEG-DMG分别以50:12:36:2的摩尔比存在。
一方面，本发明提供了一种抑制细胞中的β连环蛋白(CTNNB1)基因的表达的方法。所述方法包含使所述细胞与本发明的任何dsRNA或本发明的任何药物组合物接触，由此抑制所述细胞中所述CTNNB1基因的表达。
在一个实施例中，所述细胞在受试者体内，例如人受试者，例如患有β连环蛋白(CTNNB1)相关病症如癌症，例如肝细胞癌的受试者。
在某些实施例中，所述CTNNB1表达被抑制至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一个实施例中，抑制CTNNB1的表达使所述受试者血清中的CTNNB1蛋白水平降低至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。
一方面，本发明提供了一种治疗患有将受益于β连环蛋白(CTNNB1)表达减少的病症的受试者的方法。所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的本发明的任何dsRNA或本发明的任何药物组合物，由此治疗患有将受益于CTNNB1表达减少的病症的所述受试者。
另一方面，本发明提供了一种预防患有将受益于β连环蛋白(CTNNB1)表达减少的病症的受试者的至少一种症状的方法。所述方法包含向所述受试者施用预防有效量的本发明的任何dsRNA或本发明的任何药物组合物，由此预防患有将受益于CTNNB1表达减少的病症的所述受试者的至少一种症状。
在某些实施例中，所述病症是β连环蛋白(CTNNB1)相关病症，例如癌症。
在一些实施例中，所述CTNNB1相关病症是肝细胞癌。
在某些实施例中，向所述受试者施用所述dsRNA药剂使所述受试者的CTNNB1蛋白累积减少。
在另外的方面，本发明还提供了抑制受试者的CTNNB1表达的方法。所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的本文所提供的任何dsRNA，由此抑制所述受试者的CTNNB1的表达。
在一个实施例中，所述受试者是人。
在一个实施例中，所述dsRNA药剂以约0.01mg/kg至约50mg/kg的剂量向所述受试者施用。
在一个实施例中，向所述受试者皮下施用所述dsRNA药剂。
在一个实施例中，向所述受试者静脉内施用所述dsRNA药剂。
在一个实施例中，本发明的方法进一步包含确定来自所述受试者的样品中的CTNNB1的水平。
在一个实施例中，所述受试者样品中的CTNNB1的水平是血液或血清或肝组织样品中的CTNNB1蛋白水平。
在某些实施例中，本发明的方法进一步包括向所述受试者施用另外的治疗剂。
在某些实施例中，所述另外的治疗剂选自由以下组成的组：化学治疗剂、生长抑制剂、抗血管生成剂、抗赘生物组合物以及任何前述物质的组合。
本发明还提供了包括本发明的任一dsRNA或本发明的任一药物组合物的试剂盒，以及任选地使用说明书。在一个实施例中，本发明提供了一种用于进行抑制细胞中的CTNNB1基因的表达的方法的试剂盒，所述方法通过使细胞与抑制所述细胞中的CTNNB1表达有效量的本发明的双链RNAi药剂接触来进行。所述试剂盒包括RNAi药剂和使用说明书，以及任选地将所述RNAi药剂施用于受试者的方法。
本发明进一步提供了RNA诱导的沉默复合物(RISC)，所述RISC包括本发明的任何dsRNA药剂的反义链。
附图说明
图1A是描绘了在给药后第5天、第15天和第29天静脉内施用单剂量0.1mg/kg或0.3mg/kg AD-1548393的效果的曲线图。示出了相对于给药前CTNNB1 mRNA水平的剩余CTNNB1 mRNA的百分比。
图1B是描绘了在给药后第5天、第15天和第29天静脉内施用单剂量0.1mg/kg或0.3mg/kg AD-1548459的效果的曲线图。示出了相对于给药前CTNNB1 mRNA水平的剩余CTNNB1 mRNA的百分比。
图1C是描绘了在给药后第5天、第15天和第29天静脉内施用单剂量0.1mg/kg或0.3mg/kg AD-1548488的效果的曲线图。示出了相对于给药前CTNNB1 mRNA水平的剩余CTNNB1 mRNA的百分比。
具体实施方式
本发明提供了iRNA组合物，所述组合物影响对β连环蛋白(CTNNB1)基因的RNA转录物的RNA诱导的沉默复合物(RISC)介导的切割。所述基因可以在细胞内，例如受试者(如人)体内的细胞。这些iRNA的使用使得能够在哺乳动物中靶向降解对应基因(CTNNB1)的mRNA。
本发明的iRNA被设计为靶向人β连环蛋白(CTNNB1)基因，包含在其它哺乳动物物种的CTNNB1直系同源物中保守的基因部分。不旨在受理论的限制，据信上述特性和特定靶位点的组合或子组合或这些iRNA的特定修饰赋予本发明的iRNA改进的功效、稳定性、效力、耐久性和安全性。
因此，本发明提供了用于使用iRNA组合物治疗和预防β连环蛋白(CTNNB1)相关病症，例如癌症，例如肝细胞癌的方法，所述iRNA组合物影响对CTNNB1基因的RNA转录物的RNA诱导的沉默复合物(RISC)介导的切割。
本发明的iRNA包含RNA链(反义链)，其具有长度至多是约30个核苷酸或更少的区域，例如19个至30个、19个至29个、19个至28个、19个至27个、19个至26个、19个至25个、19个至24个、19个至23个、19个至22个、19个至21个、19个至20个、20个至30个、20个至29个、20个至28个、20个至27个、20个至26个、20个至25个、20个至24个、20个至23个、20个至22个、20个至21个、21个至30个、21个至29个、21个至28个、21个至27个、21个至26个、21个至25个、21个至24个、21个至23个或21个至22个核苷酸，所述区域与CTNNB1基因的mRNA转录物的至少一部分基本互补。
在某些实施例中，本发明的双链RNAi药剂的一条或两条链的长度至多是66个核苷酸，例如36个至66个、26个至36个、25个至36个、31个至60个、22个至43个、27个至53个核苷酸，具有与CTNNB1基因的mRNA转录物的至少一部分基本互补的至少19个连续核苷酸的区域。在一些实施例中，此类具有较长长度的反义链的iRNA药剂可以例如包含长度是20个至60个核苷酸的第二RNA链(有义链)，其中有义链和反义链形成18个至30个连续核苷酸的双链体。
本发明的iRNA的使用使得能够在哺乳动物中靶向降解对应基因(CTNNB1基因)的mRNA。使用体外测定，本发明人已经证明靶向CTNNB1基因的iRNA可以有效地介导RNAi，从而显著抑制CTNNB1基因的表达。因此，包含这些iRNA的方法和组合物可用于治疗患有CTNNB1相关病症(例如，癌症，例如肝细胞癌)的受试者。
因此，本发明提供了用于使用iRNA组合物治疗患有将受益于抑制或减少CTNNB1基因的表达的病症(例如β连环蛋白(CTNNB1)相关疾病，如癌症，例如肝细胞癌)的受试者的方法和组合疗法，所述iRNA组合物影响对CTNNB1基因的RNA转录物的RNA诱导的沉默复合物(RISC)介导的切割。
本发明还提供了用于预防患有将受益于抑制或减少CTNNB1基因的表达的病症(例如癌症，例如肝细胞癌)的受试者的至少一种症状的方法。
以下详细描述公开了如何制备和使用含有iRNA的组合物来抑制CTNNB1基因的表达，以及用于治疗将受益于CTNNB1基因的表达的抑制和/或减少的受试者的组合物、用途和方法，例如易感或被诊断为CTNNB1相关病症的受试者。
I.定义
为了更容易理解本发明，首先定义某些术语。另外，应该注意的是，每当引用参数的值或值的范围时，意图是所引用的值中间的值和范围也旨在是本发明的一部分。
冠词“一个(a)”和“一种(an)”在本文中用于指代所述冠词的语法宾语中的一个或多于一个(即，至少一个)。举例来说，“要素”是指一个要素或多于一个要素，例如，多个要素。
术语“包含”在本文中用于意指短语“包含但不限于”，并且可与之互换使用。
除非上下文另外清楚地指出，否则术语“或”在本文中用于意指术语“和/或”，并且可与之互换使用。例如，“有义链或反义链”被理解为“有义链或反义链或有义链和反义链”。
术语“约”在本文中用于意指在本领域的典型公差范围内。例如，“约”可以被理解为平均值的约2个标准偏差。在某些实施例中，约意指±10％。在某些实施例中，约意指±5％。当“约”出现在一系列数字或范围之前时，应当理解“约”可以修饰所述系列或范围中的数字中的每个数字。
一个数或一系列数之前的术语“至少”、“不少于”或“或更多”应理解为包含与术语“至少”相邻的数，以及逻辑上可以包含的所有后续数或整数，如从上下文中可以清楚地看出的。例如，核酸分子中的核苷酸数量必须是整数。例如，“21个核苷酸的核酸分子中的至少19个核苷酸”意指19个、20个或21个核苷酸具有所指示的特性。当“至少”出现在一系列数字或范围之前时，应当理解，“至少”可以修饰所述系列或范围中的数字中的每个数字。
如本文所使用的，“不超过”或“或更少”被理解为与短语相邻的值和逻辑较低的值或整数，从上下文来看是逻辑的到零。例如，具有“不超过2个核苷酸”的突出端的双链体具有2个、1个或0个核苷酸突出端。当“不超过”出现在一系列数字或范围之前时，应当理解，“不超过”可以修饰所述系列或范围中的数字中的每个数字。如本文所使用的，范围包含上限和下限两者。
如本文所使用的，检测方法可以包含确定存在的分析物的量低于所述方法的检测水平。
在指示的靶位点与有义链或反义链的核苷酸序列之间发生冲突的情况下，指示的序列优先。
在序列与其在转录物或其它序列上的指示位点之间发生冲突的情况下，以说明书中所述的核苷酸序列为准。
如本文所使用的，“β连环蛋白”可与术语“CTNNB1”互换使用，是指钙粘蛋白介导的细胞-细胞粘附系统中的结构蛋白，并且也被称为Wnt信号传导通路的关键转录激活因子。Wnt/β连环蛋白信号传导通路，也被称为经典Wnt信号传导通路，是参与如增殖、分化、凋亡、迁移、侵袭和组织稳态等多种生理过程的保守的信号传导轴(Choi B等人,《细胞报告(CellRep.)》2020；31(5):107540)。Wnt/β连环蛋白级联失调导致一些实体瘤和血液系统恶性肿瘤如血细胞癌(HCC)的发生和发展(Ge X等人《血液学与肿瘤学杂志(Journal ofhematology&oncology.)》2010；3:33；He S等人,《生物医学与药物治疗(BiomedPharmacother.)》2020；132:110851；Gajos-Michniewicz A等人,《国际分子科学杂志(IntJ Mol Sci)》2020,21(14)；Suzuki T等人,《胃肠病学与肝病学杂志(J GastroenterolHepatol.)》2002；17:994-1000)。事实上，β连环蛋白通过刺激肿瘤细胞增殖和降低细胞粘附系统的活性在促进肿瘤进展中发挥重要作用，并且与不良预后相关，尤其是在低分化HCC患者中(Inagawa S等人,《临床癌症研究(Clin Cancer Res.)》2002；8:450-456)。CTNNB1也被称连环蛋白β、犰狳蛋白、NEDSDV；MRD19；或EVR7。
人CTNNB1 mRNA转录物的序列可以在例如以下中找到：GenBank登录号GI:1519314571(NM_001904.4；SEQ ID NO:1；反向补体，SEQ ID NO:2)。小鼠CTNNB1 mRNA的序列可以在例如以下中找到：GenBank登录号GI:260166638(NM_007614.3；SEQ ID NO:3；反向补体，SEQ ID NO:4)。大鼠CTNNB1 mRNA的序列可以在例如以下中找到：GenBank登录号GI:46048608(NM_053357.2；SEQ ID NO:5；反向补体，SEQ ID NO:6)。食蟹猴CTNNB1 mRNA的序列可以在例如以下中找到：GenBank登录号GI:985482040(NM_001319394.1；SEQ ID NO:7；反向补体，SEQ ID NO:8)。恒河猴CTNNB1 mRNA的序列可以在例如以下中找到：GenBank登录号GI:383872646(NM_001257918.1；SEQ ID NO:9；反向补体，SEQ ID NO:10)。
通过公开可用数据库例如GenBank、UniProt、OMIM和Macaca基因组计划网站可以很容易地获得CTNNB1 mRNA序列的另外的实例。
关于CTNNB1的另外的信息可以在例如www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/？term＝CTNNB1找到。
截至提交本申请之日，上述GenBank登录号和基因数据库号中的每一个的全部内容通过引用并入本文。
如本文所使用的，术语CTNNB1也指CTNNB1基因的变型，包含SNP数据库中提供的变体。CTNNB1基因内的许多序列变型已经被鉴定，并且可以在例如NCBI dbSNP和UniProt中找到(参见例如，www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/？term＝CTNNB1，截至提交本申请之日，其全部内容通过引用并入本文。
如本文所使用的，“靶序列”是指在CTNNB1基因转录期间形成的mRNA分子的核苷酸序列的连续部分，包含作为初级转录产物的RNA加工产物的mRNA。在一个实施例中，序列的靶部分将至少足够长，以在CTNNB1基因转录期间形成的mRNA分子的核苷酸序列的该部分处或附近用作iRNA定向切割的底物。
靶序列的长度可以是约19个至36个核苷酸，例如长度是约19个至30个核苷酸。例如，靶序列的长度可以是约19-30个核苷酸、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个核苷酸。在某些实施例中，靶序列的长度是19个至23个核苷酸，任选地长度是21个至23个核苷酸。上述范围和长度中间的范围和长度也被认为是本公开的一部分。
如本文所使用的，术语“包括序列的链”是指包括核苷酸链的寡核苷酸，所述核苷酸链通过使用标准核苷酸命名法指代的序列描述。
“G”、“C”、“A”、“T”和“U”通常分别代表含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶作为碱基的核苷酸。然而，可以理解的是，术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”也可以指经修饰的核苷酸，如下文进一步详述的，或替代的替代部分(参见例如，表1)。本领域技术人员清楚地知道，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可以被其它部分取代，而不会实质性改变包括含有此类替代部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对特性。例如但不限于，包括肌苷作为其碱基的核苷酸可以与含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸碱基配对。因此，在本发明特征的dsRNA的核苷酸序列中，含有尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以被含有例如肌苷的核苷酸取代。在另一个实例中，寡核苷酸中任何位置的腺嘌呤和胞嘧啶都可以分别被鸟嘌呤和尿嘧啶取代，以与靶mRNA形成G-U摆动碱基配对。含有此类取代部分的序列适用于本发明特征的组合物和方法。
如本文可互换使用的术语“iRNA”、“RNAi药剂”、“iRNA药剂”和“RNA干扰剂”是指含有如本文所定义的RNA的药剂，并且其通过RNA诱导的沉默复合物(RISC)通路介导RNA转录物的靶向切割。iRNA通过一种称为RNA干扰(RNAi)的过程指导mRNA的序列特异性降解。iRNA调节，例如抑制细胞中的CTNNB1基因的表达，例如受试者(如哺乳动物受试者)体内的肝脏细胞。
在一个实施例中，本发明的RNAi药剂包含单链RNA，其与靶RNA序列(例如，CTNNB1靶mRNA序列)相互作用以引导靶RNA的切割。不希望受理论束缚，据信引入细胞中的长双链RNA被称为Dicer的III型核酸内切酶分解为siRNA(Sharp等人,(2001)《基因与发育(GenesDev)》15:485)。Dicer，即核糖核酸酶-III样酶使用特性两个碱基3'突出端将dsRNA加工成19个至23个碱基对短干扰RNA(Bernstein等人,(2001)《自然》409:363)。然后将siRNA掺入到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，其中一种或多种解旋酶解开siRNA双链体，从而使互补的反义链能够指导靶识别(Nykanen等人,(2001)《细胞》107:309)。在与适当的靶mRNA结合后，RISC内的一种或多种核酸内切酶切割靶以诱导沉默(Elbashir等人,(2001)《基因与发育》15:188)。因此，一方面，本发明涉及在细胞内产生的单链RNA(siRNA)，并且其促进RISC复合物的形成以影响靶基因，即CTNNB1基因的沉默。因此，术语“siRNA”在本文中也用于指如上所述的iRNA。
在某些实施例中，RNAi药剂可以是单链siRNA(ssRNAi)，其被引入细胞或生物体中以抑制靶mRNA。单链RNAi药剂与RISC核酸内切酶Argonaute 2结合，然后所述核酸内切酶切割靶mRNA。单链siRNA通常是15个至30个核苷酸，并且经过化学修饰。单链siRNA的设计和测试在美国专利第8,101,348号和Lima等人,(2012)《细胞》150:883-894中进行了描述，所述文献中每一个的全部内容通过引用并入本文。本文所描述的任何反义核苷酸序列可以作为本文所描述的单链siRNA使用，或通过Lima等人,(2012)《细胞》150:883-894中所描述的方法进行化学修饰。
在某些实施例中，用于本发明的组合物、用途和方法的“iRNA”是双链RNA，并且在本文中称为“双链RNA药剂”、“双链RNA(dsRNA)分子”、“dsRNA药剂”或“dsRNA”。术语“dsRNA”是指核糖核酸分子的复合物，具有双链体结构，所述双链体结构包括两条反平行且基本上互补的核酸链，相对于靶RNA(即，CTNNB1基因)具有“有义”和“反义”取向。在本发明的一些实施例中，双链RNA(dsRNA)通过本文中称为RNA干扰或RNAi的转录后基因沉默机制触发靶RNA(例如，mRNA)的降解。
一般而言，dsRNA分子的每条链的大多数核苷酸是核糖核苷酸，但如本文详细描述的，每条链或两条链也可以包含一种或多种非核糖核苷酸，例如脱氧核糖核苷酸或经修饰的核苷酸。另外，如本说明中所使用的，“iRNA”可以包含具有化学修饰的核糖核苷酸；iRNA可以包含在多个核苷酸处的实质性修饰。如本文所使用的，术语“经修饰的核苷酸”是指独立地具有经修饰的糖部分、经修饰的核苷酸间键或经修饰的核碱基或其任何组合的核苷酸。因此，术语经修饰的核苷酸涵盖对核苷间键、糖部分或核碱基的取代、添加或去除，例如官能团或原子。适用于本发明的药剂的修饰包含本文所公开的或本领域已知的所有类型的修饰。出于本说明书和权利要求的目的，如在siRNA类型分子中使用的，任何此类修饰都被“iRNA”或“RNAi药剂”涵盖。
在本公开的某些实施例中，如果存在于RNAi药剂内，则包含脱氧核苷酸可以被认为构成经修饰的核苷酸。
双链体区可以是允许通过RISC通路特异性降解期望的靶RNA的任何长度，并且所述长度可以在约19个至36个碱基对的范围内，例如约，长度是19个至30个碱基对，例如，长度是约9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个或36个碱基对，如约长度是19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24,20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个碱基对。在某些实施例中，双链体区的长度是19个至21个碱基对，例如，长度是21个碱基对。上述范围和长度中间的范围和长度也被认为是本公开的一部分。
形成双链体结构的两条链可以是一个较大RNA分子的不同部分，或其可以是单独的RNA分子。如果这两条链是一个较大分子的一部分，并且因此在一条链的3'端和形成双链体结构的相应的另一条链的5'端之间通过不间断的核苷酸链连接，则连接的RNA链被称为“发夹环”。发夹环可以包括至少一个未配对的核苷酸。在一些实施例中，发夹环可以包括至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、23个或更多个未配对的核苷酸。在一些实施例中，发夹环可以是10个或更少个核苷酸。在一些实施例中，发夹环可以是8个或更少个未配对的核苷酸。在一些实施例中，发夹环可以是4个至10个未配对的核苷酸。在一些实施例中，发夹环可以是4个至8个核苷酸。
在dsRNA的两条基本互补的链由单独的RNA分子构成的情况下，那些分子不必但可以共价连接。当两条链通过除一条链的3'端与形成双链体结构的相应的另一条链的5'端之间的不间断核苷酸链以外的其它方式共价连接时，连接结构被称为“接头”。RNA链可以具有相同或不同数量的核苷酸。碱基对的最大数量是dsRNA的最短链中的核苷酸数量减去双链体中存在的任何突出端。除了双链体结构外，RNAi可以包括一个或多个核苷酸突出端。在RNAi药剂的一个实施例中，至少一条链包括至少1个核苷酸的3'突出端。在另一个实施例中，至少一条链包括至少2个核苷酸的3'突出端，例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个核苷酸。在其它实施例中，RNAi药剂的至少一条链包括至少1个核苷酸的5'突出端。在某些实施例中，至少一条链包括至少2个核苷酸的5'突出端，例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个核苷酸。在其它实施例中，RNAi药剂的一条链的3'端和5′端两者都包括至少1个核苷酸的突出端。
在某些实施例中，本发明的iRNA药剂是dsRNA，其每条链包括19个至23个核苷酸，其与靶RNA序列，例如CTNNB1基因相互作用，以直接切割靶RNA。
在一些实施例中，本发明的iRNA是24个至30个核苷酸的dsRNA，其与靶RNA序列，例如CTNNB1靶mRNA序列相互作用以引导靶RNA的切割。
如本文所使用的，术语“核苷酸突出端”是指从双链iRNA的双链体结构突出的至少一个未配对的核苷酸。例如，当dsRNA的一条链的3'端延伸超过另一条链的5'端时，或者反之亦然，则存在核苷酸突出端。dsRNA可以包括至少一个核苷酸的突出端；可替代地，突出端可以包括至少两个核苷酸、至少三个核苷酸、至少四个核苷酸、至少五个核苷酸或更多。核苷酸突出端可以包括以下或由以下组成：核苷酸/核苷类似物，包含脱氧核苷酸/核苷。突出端可以在有义链、反义链或其任何组合上。此外，突出端的核苷酸可以存在于dsRNA的反义链或有义链的5'端、3'端或两端上。
在一个实施例中，dsRNA的反义链在3'端或5'端处的突出端具有1个至10个核苷酸，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸。在一个实施例中，dsRNA的有义链在3'端或5'端处的突出端具有1个至10个核苷酸，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸。在另一个实施例中，突出端中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸盐替代。
在某些实施例中，dsRNA的反义链在3′端或5'端处的突出端具有1个至10个核苷酸，例如，0个至3个、1个至3个、2个至4个、2个至5个、4个至10个、5个至10个，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸。在一个实施例中，dsRNA的有义链在3'端或5'端处的突出端具有1个至10个核苷酸，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸。在另一个实施例中，突出端中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸盐替代。
在某些实施例中，dsRNA的反义链在3'端或5′端处的突出端具有1个至10个核苷酸，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸。在某些实施例中，有义链或反义链或两者上的突出端可以包含长度长于10个核苷酸的延伸长度，例如长度是1个至30个核苷酸、2个至30个核苷酸，10个至30个核酸、10个至25个核苷酸、10个至20个核苷酸或10个至15个核苷酸。在某些实施例中，延伸的突出端在双链体的有义链上。在某些实施例中，在双链体的有义链的3'端上存在延伸的突出端。在某些实施例中，在双链体的有义链的5'端上存在延伸的突出端。在某些实施例中，延伸的突出端在双链体的反义链上。在某些实施例中，在双链体的反义链的3'端上存在延伸的突出端。在某些实施例中，在双链体的反义链的5'端上存在延伸的突出端。在某些实施例中，延伸的突出端中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸盐替代。在某些实施例中，突出端包含自互补部分，使得突出端能够形成在生理条件下稳定的发夹结构。
“钝”或“钝端”意指在双链RNA药剂的末端没有未配对的核苷酸，即没有核苷酸突出端。“钝端”双链RNA药剂在其整个长度上是双链的，即在分子的任一端都没有核苷酸突出端。本发明的RNAi药剂包含在一端没有核苷酸突出端(即具有一个突出端和一个钝端的药剂)或在两端都没有核苷酸突出端的RNAi药剂。最常见的此类分子将在其整个长度上是双链的。
术语“反义链”或“引导链”是指iRNA的链，例如dsRNA，其包含与靶序列(例如，CTNNB1 mRNA)基本互补的区域。
如本文所使用的，术语“互补区”是指反义链上与本文所定义的序列(例如靶序列，例如CTNNB1核苷酸序列)基本互补的区域。在互补区与靶序列不完全互补的情况下，错配可以处于分子的内部或末端区中。通常，最可容忍的错配在末端区，例如在iRNA的5'-或3'端的5个、4个或3个核苷酸内。在一些实施例中，本发明的双链RNA药剂包含反义链中的核苷酸错配。在一些实施例中，本发明的双链RNA药剂的反义链包含与靶mRNA的不超过4个错配，例如，反义链包含与靶mRNA的4个、3个、2个、1个或0个错配。在一些实施例中，本发明的反义链双链RNA药剂包含与有义链的不超过4个错配，例如，反义链包含与有义链的4个、3个、2个、1个或0个错配。在一些实施例中，本发明的双链RNA药剂包含有义链中的核苷酸错配。在一些实施例中，本发明的双链RNA药剂的有义链包含与反义链的不超过4个错配，例如，有义链包含与反义链的4个、3个、2个、1个或0个错配。在一些实施例中，核苷酸错配在例如距离iRNA的3'端5个、4个、3个核苷酸内。在另一个实施例中，核苷酸错配在例如在iRNA药剂的3'末端核苷酸中。在一些实施例中，错配不在种子区中。
因此，如本文所描述的RNAi药剂可以含有与靶序列的一个或多个错配。在一个实施例中，如本文所描述的RNAi药剂含有不超过3个错配(即，3个、2个、1个或0个错配)。在一个实施例中，如本文所描述的RNAi药剂含有不超过2个错配。在一个实施例中，如本文所描述的RNAi药剂含有不超过1个错配。在一个实施例中，如本文所描述的RNAi药剂含有0个错配。在某些实施例中，如果RNAi药剂的反义链含有与靶序列的错配，则错配可以任选地被限制在距互补区的5'-或3'端的最后5个核苷酸内。例如，在此类实施例中，对于23个核苷酸的RNAi药剂，与CTNNB1基因的区域互补的链通常在中心13个核苷酸内不含有任何错配。本文所描述的方法或本领域已知的方法可以用于确定含有与靶序列的错配的RNAi药剂是否有效抑制CTNNB1基因的表达。考虑具有错配的RNAi药剂在抑制CTNNB1基因表达方面的功效很重要，特别是如果已知CTNNB1基因中的特定互补区在群体内具有多态性序列变异。
如本文所使用的，术语“有义链”或“随从链”是指包含与如本文所定义的术语的反义链的区域基本互补的区域的iRNA链。
如本文所使用的，“基本所有核苷酸都是经修饰的”在很大程度上但不是完全为经修饰的，并且可以包含不超过5个、4个、3个、2个或1个未经修饰的核苷酸。
如本文所使用的，术语“切割区”是指紧邻切割位点的区域。切割位点是靶上发生切割的位点。在一些实施例中，切割区在切割位点的任一端上并紧邻切割位点包括三个碱基。在一些实施例中，切割区在切割位点的任一端上并紧邻切割位点包括两个碱基。在一些实施例中，切割位点特异性地出现在反义链的核苷酸10和11结合的位点处，并且切割区包括核苷酸11、12和13。
如本文所使用的，并且除非另外指明，否则术语“互补”当用于相对于第二核苷酸序列描述第一核苷酸序列时是指包括第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些条件下与包括第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并且形成双链体结构的能力，如技术人员将理解的。例如，此类条件可以是严格条件，其中严格条件可以包含：400mM NaCl，40mMPIPES，pH6.4，1mM EDTA，50℃或70℃，持续12小时至16小时，然后洗涤(参见例如，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,Sambrook等人,(1989)冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press))。可以应用其它条件，如生物体内部可能遇到的生理学上相关的条件。技术人员将能够根据杂交核苷酸的最终应用确定最适合于两个序列的互补性测试的条件集。
iRNA内(例如，如本文所描述的dsRNA内)的互补序列包含包括第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包括第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一个或两个核苷酸序列的全长上的碱基配对。此类序列在本文中可以被称为彼此“完全互补”。然而，当第一序列在本文中被称为相对于第二序列“基本互补”时，这两个序列可以是完全互补的，或其可以形成一个或多个，但通常不超过5个、4个、3个或2个杂交后错配的碱基对用于至多30个碱基对的双链体，同时保留在与其最终应用最相关的条件下杂交的能力，例如体外或体内抑制基因表达。然而，在两个寡核苷酸被设计以在杂交时形成一个或多个单链突出端的情况下，此类突出端不应视为相对于互补性的确定的错配。例如，包括一个长度是21个核苷酸的寡核苷酸和另一个长度是23个核苷酸的寡核苷酸的dsRNA，其中较长的寡核苷酸包括与较短的寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列，仍可以被称为出于本文所描述的目的“完全互补”。
如本文所使用的，“互补”序列还可以包含非沃森-克里克碱基对(non-Watson-Crick base pair)或由非天然和经修饰的核苷酸形成的碱基对，或完全由其形成，只要满足关于其杂交能力的以上要求即可。此类非沃森-克里克碱基对包含但不限于G:U摆动碱基配对或胡斯坦碱基配对(Hoogsteen base pairing)。
本文中的术语“互补”、“完全互补”和“基本互补”可以相对于dsRNA的有义链和反义链之间的碱基匹配，或两个寡核苷酸或多核苷酸(如双链RNA药剂的反义链和靶序列)之间的碱基匹配使用，如根据其使用的上下文所理解的。
如本文所使用的，与信使RNA(mRNA)的“至少部分基本上互补”的多核苷酸是指与所关注的mRNA(例如，编码CTNNB1基因的mRNA)的连续部分基本上互补的多核苷酸。例如，如果序列与编码CTNNB1基因的mRNA的不间断部分基本上互补，则多核苷酸与CTNNB1 mRNA的至少一部分互补。
因此，在一些实施例中，本文所公开的反义多核苷酸与靶CTNNB1序列完全互补。在其它实施例中，本文所公开的反义多核苷酸与靶CTNNB1序列基本互补，并且包括连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列在其完整长度上与SEQ ID NO:1、3、5、7或9中任一个的核苷酸序列或SEQ ID NO:1、3、5、7或9中任一个的片段的等效区域至少80％互补，如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％互补。
在其它实施例中，本文所公开的反义多核苷酸与靶CTNNB1序列基本上互补，并且包括连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列在其完整长度上与表2、3、5或6中的任一个的任一个中的任一个有义链核苷酸序列，或表2、3、5或6中的任一个中的任一个有义链核苷酸序列的片段至少约80％互补，如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％互补。
在一个实施例中，本公开的RNAi药剂包含与反义多核苷酸基本互补的有义链，所述反义多核酸反过来与靶CTNNB1序列相同，并且其中所述有义链多核苷酸包括连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列在其完整长度上与SEQ ID NO:2、4、6、8或10的核苷酸序列，或SEQ ID NO:2、4、6、8或10中的任一个的片段的等效区至少约80％互补，如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％互补。
在一些实施例中，本发明的iRNA包含与反义多核苷酸基本互补的有义链，所述反义多核酸进而与靶CTNNB1序列互补，并且其中所述有义链多核苷酸包括连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列在其完整长度上与表2、表3、表5或表6中的任一个表的任一个中的任一个反义链核苷酸序列或表2、表3、表5或表6中的任一个表中的任一个反义链核苷酸序列的片段至少约80％互补，如约85％、约90％、约91％、约92％，约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％互补。
一般而言，“iRNA”包含具有化学修饰的核糖核苷酸。此类修饰可以包含本文所公开的或本领域已知的所有类型的修饰。出于本说明书和权利要求的目的，如在dsRNA分子中使用的，任何此类修饰都被“iRNA”涵盖。
在本公开的某些实施例中，如果存在于RNAi药剂内，则包含脱氧核苷酸可以被认为构成经修饰的核苷酸。
在本发明的一方面，用于本发明的方法和组合物的药剂是通过反义抑制机制抑制靶mRNA的单链反义寡核苷酸分子。单链反义寡核苷酸分子与靶mRNA内的序列互补。单链反义寡核苷酸可以通过与mRNA的碱基配对和物理阻断翻译机制，以化学计量的方式抑制翻译，参见Dias,N.等人,(2002)《分子癌症治疗学(Mol Cancer Ther)》1:347-355。单链反义寡核苷酸分子的长度可以是约14个至约30个核苷酸，并且具有与靶序列互补的序列。例如，单链反义寡核苷酸分子可以包括与本文所描述的任一种反义序列至少约14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个连续核苷酸的序列。
如本文所使用的，短语“使细胞与iRNA(如dsRNA)接触”包含通过任何可能的方式接触细胞。使细胞与iRNA接触包含使细胞在体外与iRNA接触或使细胞在体内与iRNA接触。可以直接或间接地进行接触。因此，例如可以通过执行所述方法的个体使iRNA与细胞物理接触，或可替代地，可以使iRNA处于允许或使其随后与细胞接触的情况。
体外接触细胞可以通过例如将细胞与iRNA一起温育来进行。体内接触细胞可以通过例如将iRNA注射到细胞所在的组织中或其附近，或通过将iRNA注射到另一个区域中，例如血流或皮下空间，使得药剂随后到达待接触细胞所在的组织来进行。例如，iRNA可以含有配体(例如，GalNAc)或与配体偶联，所述配体将iRNA引导到所关注的位点，例如肝脏。体外和体内接触方法的组合也是可能的。例如，细胞也可以与iRNA体外接触，并且随后移植到受试者体内。
在某些实施例中，使细胞与iRNA接触包含通过促进或影响细胞的摄取或吸收来“引入”或“将iRNA递送到细胞中”。iRNA的吸收或摄取可以通过无辅助的扩散或活性细胞过程发生，或通过辅助剂或装置发生。将iRNA引入细胞中可以是体外的或体内的。例如，对于体内引入，可以将iRNA注射到组织部位中或全身施用。体外引入细胞包含本领域已知的方法，如电穿孔和脂质转染。另外的方法在下文中描述或在本领域中是已知的。
术语“阳离子脂质”包含具有一个或两个脂肪酸或脂肪族链和一个含有头基的氨基酸的脂质，所述头基可以在生理pH下质子化以形成阳离子脂质。在一些实施例中，阳离子脂质被称为“氨基酸缀合阳离子脂质”。
术语“可生物降解的阳离子脂质”是指在阳离子脂质的脂质部分(例如疏水链)的中部或远侧部分具有一个或多个可生物降解基团的阳离子脂质。在阳离子脂质中掺入可生物降解基团导致在将活性药物成分递送到目标区后，阳离子脂质从体内更快地代谢和清除。
术语“脂质纳米颗粒”或“LNP”是包括脂质层的囊泡，所述脂质层封装药物活性分子，如核酸分子，例如iRNA或从其转录iRNA的质粒。LNP在例如美国专利第6,858,225号、第6,815,432号、第8,158,601号和第8,058,069号中进行了描述，所述美国专利的全部内容特此通过引用并入本文。
如本文所使用的，“受试者”是内源性或异源性表达靶基因的动物，如哺乳动物，包含灵长类动物(如人、非人灵长类动物，例如猴子和黑猩猩)、非灵长类动物(如牛、猪、马、山羊、兔子、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠或小鼠)或鸟类。在一个实施例中，受试者是人，如正在治疗或评估将受益于CTNNB1表达减少的疾病或病症的人；处于疾病或病症风险中的人，所述疾病或病症将受益于CTNNB1表达减少；患有将受益于CTNNB1表达减少的疾病或病症的人；或正在治疗将受益于如本文所描述的CTNNB1表达减少的疾病或病症的人。在一些实施例中，受试者是女性人类。在其它实施例中，受试者是男性人类。在一个实施例中，受试者是成年受试者。在另一个实施例中，受试者是儿科受试者。
如本文所使用的，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指有益或期望的结果，如减少受试者的CTNNB1相关病症的至少一种体征或症状。治疗还包含减少与不期望的CTNNB1表达相关的一种或多种体征或症状；减轻不期望的CTNNB1激活或稳定的程度；改善或缓和不期望的CTNNB1激活或稳定。“治疗”也可以意指与没有治疗的预期存活期相比，延长存活期。
在受试者或疾病标志物或症状中CTNNB1水平的上下文中，术语“较低”是指此类水平在统计学上显著降低。降低可以是例如至少10％、15％、20％、25％、30％、％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在某些实施例中，降低是至少20％。在某些实施例中，疾病标志物，例如蛋白质或基因表达水平的降低是至少50％。受试者的CTNNB1水平的“较低”是降低到没有此类病症的个体的正常范围内的被接受的水平。在某些实施例中，“较低”是患有疾病的受试者的标志物或症状的水平与个体在正常范围内接受的水平之间的差异的降低。术语“较低”也可以用于使疾病或病状的症状正常化，即将患有CTNNB1相关病症的受试者的水平与未患有CTNNB1相关病症的正常受试者的水平之间的差异减小。如本文所使用的，如果疾病与症状的升高值相关，“正常”被认为是正常的上限。如果疾病与症状的下降值相关，“正常”被认为是正常的下限。
如本文所使用的，“预防(prevention)”或“预防(preventing)”，当用于指疾病、病症或其病状时，可以通过减少CTNNB1基因的表达来治疗或改善，是指减少受试者发展与此类疾病、病症或病症相关的症状(例如，CTNNB1相关病症，例如癌症，例如肝细胞癌的症状)的可能性。未能发展出疾病、病症或病状，或与此类疾病、病症或病状相关的症状发展减少(例如，在该疾病或病症的临床接受的量表上至少减少约10％)，或延迟症状的表现(例如，几天、几周、几个月或几年)被认为是有效的预防。
如本文所使用的，术语“β连环蛋白相关病症”或“CTNNB1相关病症”是由CTNNB1基因表达或CTNNB1蛋白产生引起或与之相关的疾病或病症。术语“CTNNB1相关病症”包含将受益于CTNNB1基因表达、复制或蛋白质活性降低的疾病、病症或病状。在一些实施例中，所述CTNNB1相关病症是癌症，例如肝细胞癌。
术语“癌症”在本文中是指一组表现出异常高水平增殖和生长的细胞。癌症可以是良性的(也被称为良性肿瘤)、恶性前期的或恶性的。癌细胞可以是实体癌细胞或白血病癌细胞。术语“癌症生长”在本文中用于指包括癌症的导致癌症的大小或程度的相应增加的一种或多种细胞的增殖或生长。
癌症的实例包含但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤、骨髓瘤和白血病。在一些实施例中，癌症包括实体瘤癌症。在其它实施例中，癌症包括基于血液的癌症，例如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。此类癌症的更具体的非限制性实例包含鳞状细胞癌、小细胞肺癌、垂体癌、食道癌、星形细胞瘤、软组织肉瘤、非小细胞肺癌(包含鳞状非小细胞肺癌)、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(livercancer)、膀胱癌、肝癌(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌(endometrialcarcinoma)或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肾细胞癌、肝细胞癌、肝母细胞癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、脑癌、子宫内膜癌(endometrial cancer)、睾丸癌、胆管癌、胆囊癌、胃癌、黑色素瘤和各种类型的头颈癌(包含头颈鳞状细胞癌)。
在一些实施例中，所述CTNNB1相关病症是肝细胞癌(HCC)。如本文所使用的，术语“肝细胞癌”是指一种主要类型的原发性肝癌和一种在病因学上与病毒因子相关的罕见人类肿瘤。乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)的慢性感染与全球约80％的病例有关(Wang W等人,《胃肠病学杂志(J Gastroenterol.)》2017年4月；52(4):419-431)。已知与细胞增殖、凋亡、代谢、剪接和细胞周期有关的基因突变和信号转导通路的异常激活有助于HCC的发展。具体地，已知Wnt/β连环蛋白信号传导通路在高达50％的HCC中被激活(Lee JM等人《癌症通讯(CancerLett.)》2014年2月1日；343(1):90-7；Vilchez V等人,《世界胃肠病学杂志(World J Gastroenterol.)》2016年1月14日；22(2):823-32)。Wnt/β-catenin通路调节多种细胞过程，这些过程涉及HCC的启动、生长、存活、迁移、分化和凋亡(Wang Z等人,《分子与临床肿瘤学(Mol Clin Oncol.)》2015年7月；3(4):936-940)。在这些肿瘤中已经鉴定出β连环蛋白的突变，并且β连环蛋白突变也被证明影响HCC的预后。(Prange W等人《病理学杂志(J Pathol.)》2003；201:250–259；Torbenson M等人《美国临床病理学杂志(Am JClin Pathol.)》2004；122:377-382)。
如本文所使用的，“治疗有效量”旨在包含当向患有CTNNB1相关病症的受试者施用时足以影响疾病的治疗(例如，通过减少、改善或维持现有疾病或一种或多种疾病症状)的RNAi药剂的量。“治疗有效量”可能因RNAi药剂、药剂如何施用、疾病和其严重程度以及病史、年龄、体重、家族史、基因组成、先前或伴随治疗的类型(如果有的话)以及待治疗受试者的其它个体特征而异。
如本文所使用的，“预防有效量”旨在包含当向患有CTNNB1相关病症的受试者施用时足以预防或改善疾病或所述疾病的一种或多种症状的RNAi药剂的量。改善疾病包含减缓疾病的进程或降低后期发展的疾病的严重程度。“预防有效量”可能因RNAi药剂、药剂如何施用、疾病的风险程度以及病史、年龄、体重、家族史、基因组成、先前或伴随治疗的类型(如果有的话)以及待治疗患者的其它个体特征而异。
“治疗有效量”或“预防有效量”还包含一定量的RNAi药剂，所述药剂以适用于任何治疗的合理收益/风险比产生一些期望的效果。本发明的方法中采用的iRNA可以以足够的量施用，以产生适用于此类治疗的合理益处/风险比。
短语“药学上可接受的”在本文中用于指在正确医学判断的范围内适合于与人受试者和动物受试者的组织接触使用而不会产生过多毒性、刺激、过敏应答或其它问题或并发症的、与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物或剂型。
如本文所使用的，短语“药学上可接受的载剂”是指药学上可接受的材料、组合物或媒剂，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如，润滑剂、滑石镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌、或硬脂酸)、或溶剂封装材料(涉及将主题化合物从身体的一个器官或部分携带或运送到身体的另一个器官或部分)。在与调配物的其它成分相容并且对被治疗的受试者无害的意义上来讲，每种载剂必须是“可接受的”。此类载剂在本领域中是已知的。药学上可接受的载剂包含用于通过注射施用的载剂。
如本文所使用的，术语“样品”包含从受试者分离的类似流体、细胞或组织的集合，以及受试者体内存在的流体、细胞和组织。生物流体的实例包含血液、血清和浆膜流体、血浆、脑脊液、眼流体、淋巴、尿液、唾液等。组织样品可以包含来自组织、器官或局部区域的样品。例如，样品可以源自特定的器官、器官的一部分或这些器官内的液体或细胞。在某些实施例中，样品可以源自肝脏(例如，整个肝脏或肝脏的某些部分或肝脏中的某些类型的细胞，例如，肝细胞)。在一些实施例中，“源自受试者的样品”是指从受试者获得的尿液。“源自受试者的样品”可以指源自受试者的血液或血源性血清或血浆。
II.本发明的iRNA
本发明提供了抑制CTNNB1基因的表达的iRNA。在某些实施例中，iRNA包含双链核糖核酸(dsRNA)分子，用于抑制细胞(如受试者(例如，哺乳动物，如易患CTNNB1相关病症例如癌症例如肝细胞癌的人)体内的细胞)中CTNNB1基因的表达。dsRNAi药剂包含具有互补区的反义链，所述互补区与在CTNNB1基因的表达中形成的mRNA的至少一部分互补。互补区的长度是约19个至30个核苷酸(例如，长度是约30个、29个、28个、27个、26个、25个、24个、23个、22个、21个、20个或19个核苷酸)。
在与表达CTNNB1基因的细胞接触时，iRNA抑制CTNNB1基因(例如，人、灵长类动物、非灵长类动物或大鼠CTNNB1基因)的表达至少约50％，如通过例如PCR或基于支链DNA(bDNA)的方法或通过基于蛋白质的方法(如通过免疫荧光分析，使用例如蛋白质印迹或流式细胞术技术)所测定的。在某些实施例中，通过本文实例中提供的qPCR方法，在其中提供的合适的生物体细胞系中，用例如10nM浓度的siRNA确定表达的抑制。在某些实施例中，体内表达的抑制是通过在表达人基因的啮齿类动物，例如表达人靶基因的小鼠或AAV感染的小鼠中敲低人基因来确定的，例如，当以单剂量施用时，例如在RNA表达的最低点以3mg/kg施用。
dsRNA包含两条互补并且在将使用dsRNA的条件下杂交以形成双链体结构的RNA链。dsRNA的一条链(反义链)包含与靶序列基本上互补且通常完全互补的互补区。靶序列可以源自在CTNNB1基因的表达期间形成的mRNA的序列。另一条链(有义链)包含与反义链互补的区，使得两条链在适当条件下组合时杂交并形成双链体结构。如本文中其它地方所描述且如本领域已知的，dsRNA的互补序列相对于位于单独寡核苷酸上还可以作为单一核酸分子的自身互补区被包含在内。
通常，双链体结构的长度是至少15个至30个碱基对，例如，长度是15个至29个、15个至28个、15个至27个、15个至26个、15个至25个、15个至24个、15个至23个、15个至22个、15个至21个、15个至20个、15个至19个、15个至18个、15个至17个、18个至30个、18个至29个、18个至28个、18个至27个、18个至26个、18个至25个、18个至24个、18个至23个、18个至22个、18个至21个、18个至20个、19个至30个、19个至29个、19个至28个、19个至27个、19个至26个、19个至25个、19个至24个、19个至23个、19个至22个、19个至21个、19个至20个、20个至30个、20个至29个、20个至28个、20个至27个、20个至26个、20个至25个、20个至24个、20个至23个、20个至22个、20个至21个、21个至30个、21个至29个、21个至28个、21个至27个、21个至26个、21个至25个、21个至24个、21个至23个或21个至22个碱基对。在某些实施例中，双链体结构的长度是18个至25个碱基对，例如，长度是18个至25个、18个至24个、18个至23个、18个至22个、18个至21个、18个至20个、19个至25个、19个至24个、19个至23个、19个至22个、19个至21个、19个至20个、20个至25个、20个至24,20个至23个、20个至22个、20个至21个、21个至25个、21个至24个、21个至23个、21个至22个、22个至25个、22个至24个、22个至23个、23个至25个、23个至24个或24个至25个碱基对，例如长度是19个至21个碱基对。上述范围和长度中间的范围和长度也被认为是本公开的一部分。
类似地，与靶序列互补的区域的长度是15个至30个核苷酸，例如，长度是15个至29个、15个至28个、15个至27个、15个至26个、15个至25个、15个至24个、15个至23个、15个至22个、15个至21个、15个至20个、15个至19个、15个至18个、15个至17个、18个至30个、18个至29个、18个至28个、18个至27个、18个至26个、18个至25个、18个至24个、18个至23个、18个至22个、18个至21个、18个至20个、19个至30个、19个至29个、19个至28个、19个至27个、19个至26个、19个至25个、19个至24个、19个至23个、19个至22个、19个至21个、19个至20个、20个至30个、20个至29个、20个至28个、20个至27个、20个至26个、20个至25个、20个至24个、20个至23个、20个至22个、20个至21个、21个至30个、21个至29个、21个至28个、21个至27个、21个至26个、21个至25个、21个至24个、21个至23个或21个至22个核苷酸，例如长度是19个至23个核苷酸或长度是21个至23个核苷酸。上述范围和长度中间的范围和长度也被认为是本公开的一部分。
在一些实施例中，双链体结构的长度是19个至30个碱基对。类似地，与靶序列互补的区域的长度是19个至30个核苷酸。
在一些实施例中，dsRNA的长度是约19个至约23个核苷酸，或长度是约25个至约30个核苷酸。一般而言，dsRNA足够长以用作Dicer酶的底物。例如，本领域众所周知，长度超过约21个至23个核苷酸的dsRNA可以用作Dicer的底物。如普通技术人员还将认识到的，靶向切割的RNA的区域通常将是较大RNA分子的部分，通常是mRNA分子。在相关情况下，mRNA靶的一“部分”是mRNA靶的连续序列，其长度足以使其成为RNAi定向切割(即通过RISC通路切割)的底物。
本领域技术人员也将认识到双链体区是dsRNA的主要功能部分，例如约19个至约30个碱基对(例如，约19个至30个、19个至29个、19个至28个、19个至27个、19个至26个、19个至25个、19个至24个、19个至23个、19个至22个、19个至21个、19个至20个、20个至30个、20个至29个、20个至28个、20个至27个、20个至26个、20个至25个、20个至24,20个至23个、20个至22个、20个至21个、21个至30个、21个至29个、21个至28个、21个至27个、21个至26个、21个至25个、21个至24个、21个至23个或21个至22个碱基对)的双链体区。因此，在一个实施例中，在其被加工成靶向所需RNA进行切割的例如15个至30个碱基对的功能性双链体的程度上，具有大于30个碱基对的双链体区的RNA分子或RNA分子复合物是dsRNA。因此，普通技术人员将认识到，在一个实施例中，miRNA是dsRNA。在另一个实施例中，dsRNA不是天然存在的miRNA。在另一个实施例中，可用于靶向CTNNB1基因表达的iRNA药剂不是通过切割较大的dsRNA在靶细胞中产生的。
如本文所描述的dsRNA可以进一步包含一个或多个单链核苷酸突出端，例如，1个至4个、2个至4个、1个至3个、2个至3个、1个、2个、3个或4个核苷酸。具有至少一个核苷酸突出端的dsRNA相对于其钝端对应物具有更好的抑制特性。核苷酸突出端可以包括以下或由以下组成：核苷酸/核苷类似物，包含脱氧核苷酸/核苷。突出端可以在有义链、反义链或其任何组合上。此外，突出端的核苷酸可以存在于dsRNA的反义链或有义链的5'端、3'端或两端上。
dsRNA可以通过本领域已知的标准方法合成。本发明的双链RNAi化合物可以使用两步程序制备。首先，单独制备双链RNA分子的单个链。然后，对组分链进行退火。siRNA化合物的单个链可以使用溶液相或固相有机合成或两者制备。有机合成提供的优点是可以容易地制备包括非天然或经修饰的核苷酸的寡核苷酸链。类似地，本发明的单链寡核苷酸可以使用溶液相或固相有机合成或两者制备。
一方面，本发明的dsRNA包含至少两个核苷酸序列，有义序列和反义序列。有义链选自由表2、表3、表5和表6中任一个表中提供的序列组成的组，并且所述有义链的对应的反义链选自由表2、表3、表5和表6中的任一个表中的序列组成的组。在这方面，两个序列中的一个序列与两个序列中的另一个序列互补，其中所述序列中的一个序列与在CTNNB1基因表达中产生的mRNA序列基本上互补。因此，在这方面，dsRNA将包含两个寡核苷酸，其中一个寡核苷酸在表2、表3、表5或表6中的任一个表中被描述为有义链，并且第二个寡核苷酸被描述为表2、表3、表5或表6中的任一个表中的有义链的对应反义链。
在某些实施例中，dsRNA的基本互补序列包含在分离的寡核苷酸上。在其它实施例中，dsRNA的基本互补序列包含在单个寡核苷酸上。
应当理解，尽管表2中的序列没有被描述为经修饰的或缀合的序列，但本发明的iRNA的RNA，例如本发明的dsRNA可以包括表2、表3、表5或表6中的任一个表中所述的未修饰、未缀合或与其中所述的不同的修饰或缀合的序列中的任一个。换言之，本发明涵盖表2、表3、表5或表6的dsRNA，其是未修饰、未缀合、经修饰的或缀合的，如本文所描述的。例如，尽管表5中所示的本发明的药剂的有义链与L96配体缀合，但这些药剂可以如本文所描述是未经缀合的。
本领域技术人员充分了解，具有约20个至23个碱基对(例如，21个碱基对)的双链体结构的dsRNA已被誉为在诱导RNA干扰方面特别有效(Elbashir等人,《欧洲分子生物学组织杂志(EMBO)》2001,20:6877-6888)。然而，其它人已经发现，较短或较长的RNA双链体结构也可以是有效的(Chu和Rana(2007)《RNA》14:1714-1719；Kim等人,(2005)《自然生物技术(Nat Biotech)》23:222-226)。在上述实施例中，由于表2、表3、表5或表6中任一个表中提供的寡核苷酸序列的性质，本文所描述的dsRNA可以包含至少一条长度是最少21个核苷酸的链。可以合理地预期，与上述dsRNA相比，具有表2、表3、表5或表6中任一个表的序列中的任一个在一端或两端仅减去很少核苷酸的较短的双链体可以类似地有效。因此，具有源自表2、表3、表5或表6中的任一个表的序列中的任一个序列的至少19个、20个或更多个连续核苷酸的序列的dsRNA，并且其抑制CTNNB1基因表达的能力与包括完整序列的dsRNA相差不超过约5％、10％、15％、20％、25％或30％的抑制，被认为在本发明的范围内。
另外，表2、表3、表5或表6中提供的RNA鉴定了CTNNB1转录物中对RISC介导的切割敏感的位点。因此，本发明的进一步特征在于靶向在这些位点之一内的iRNA。如本文所使用的，如果iRNA促进转录物在所述特定位点内任何位置的切割，则iRNA被称为靶向RNA转录物的特定位点内。此类iRNA通常包含来自表2、表3、表5或表6中的任一个表中提供的序列中的任一个的至少约19个连续核苷酸，其与取自CTNNB1基因中所选序列的连续区域的另外的核苷酸序列偶联。
III.本发明的经修饰的iRNA
在某些实施例中，本发明的iRNA的RNA，例如dsRNA，是未修饰的，并且不包括例如本领域已知的和本文所描述的化学修饰或缀合。在其它实施例中，本发明的iRNA的RNA，例如dsRNA被化学修饰以增强稳定性或其它有益特性。在本发明的某些实施例中，本发明的iRNA的基本上所有核苷酸都被修饰。在本发明的其它实施例中，iRNA的所有核苷酸或iRNA的基本上所有核苷酸被修饰，即在iRNA的链中存在不超过5个、4个、3个、2个或1个未修饰的核苷酸。
本发明特征的核酸可以通过本领域公认的方法合成或修饰，例如“核酸化学中的当前实验方案(Current protocols in nucleic acid chemistry),”Beaucage,S.L等人,(编辑),美国纽约州纽约的约翰威利父子公司(John Wiley&Sons,Inc.,New York,NY,USA)中描述的那些方法，所述方法特此通过引用并入本文。修饰包含例如端修饰，例如5'端修饰(磷酸化、缀合、反向连接等)、3'端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向连接等)；碱基修饰，例如，用稳定碱基、去稳定碱基或与扩展的伙伴库碱基配对的碱基替换、去除碱基(无碱基核苷酸)或缀合的碱基；糖修饰(例如，在2'位置或4'位置处)或糖的置换；或主链修饰，包含磷酸二酯键的修饰或置换。可用于本文所描述的实施例的iRNA化合物的具体实例包含但不限于含有经修饰的主链或不含天然核苷间键的RNA。除此之外，具有经修饰的主链的RNA包含在主链中不具有磷原子的那些。出于本说明书的目的，并且如本领域中有时提及的，在其核苷间主链中不具有磷原子的经修饰的RNA也可以被视为寡核苷。在一些实施例中，经修饰的iRNA将在其核苷间主链中具有磷原子。
经修饰的RNA主链包含例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包含3'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、氨基磷酸酯(包含3'-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酸胺酯)、硫代羰基磷酰胺酯、硫代羰基烷基膦酸酯、硫代羰基烷基磷酸三酯、以及具有正常3'-5'键的硼烷磷酸酯、这些酯的2′-5′连接类似物、以及具有反向极性的那些酯，其中相邻对的核苷单位以3′-5′至5′-3′或2′-5′至5′-2'连接。也包含了各种盐、混合盐和游离酸形式。在本发明的一些实施例中，本发明的dsRNA药剂是游离酸形式。在本发明的其它实施例中，本发明的dsRNA药剂是盐形式。在一个实施例中，本发明的dsRNA药剂是钠盐形式。在某些实施例中，当本发明的dsRNA药剂为钠盐形式时，钠离子作为药剂中存在的基本上所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基的抗衡离子存在于药剂中。其中基本上所有的磷酸二酯和/或硫代磷酸酯键都具有钠抗衡离子的药剂包含不超过5个、4个、3个、2个或1个不具有钠抗衡离子的磷酸二酯键和/或硫代磷酸酯键。在一些实施例中，当本发明的dsRNA药剂为钠盐形式时，钠离子作为药剂中存在的所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基的抗衡离子存在于药剂中。
教导制备上述含磷键的代表性美国专利包含但不限于美国专利第3,687,808号；第4,469,863号；第4,476,301号；第5,023,243号；第5,177,195号；第5,188,897号；第5,264,423号；第5,276,019号；第5,278,302号；第5,286,717号；第5,321,131号；第5,399,676号；第5,405,939号；第5,453,496号；第5,455,233号；第5,466,677号；第5,476,925号；第5,519,126号；第5,536,821号；第5,541,316号；第5,550,111号；第5,563,253号；第5,571,799号；第5,587,361号；第5,625,050号；第6,028,188号；第6,124,445号；第6,160,109号；第6,169,170号；第6,172,209号；第6,239,265号；第6,277,603号；第6,326,199号；第6,346,614号；第6,444,423号；第6,531,590号；第6,534,639号；第6,608,035号；第6,683,167号；第6,858,715号；第6,867,294号；第6,878,805号；第7,015,315号；第7,041,816号；第7,273,933号；第7,321,029号；以及美国专利RE39464，所述美国专利中的每一个的全部内容特此通过引用并入本文。
其中不包含磷原子的经修饰的RNA主链具有由以下形成的主链：短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键。这些包含具有吗啉代键的那些(部分地由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；含烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；和其它具有混合的N、O、S和CH2组分部分的主链。
教导制备上述寡核苷的代表性美国专利包含但不限于美国专利第5,034,506号；第5,166,315号；第5,185,444号；第5,214,134号；第5,216,141号；第5,235,033号；第5,64,562号；第5,264,564号；第5,405,938号；第5,434,257号；第5,466,677号；第5,470,967号；第5,489,677号；第5,541,307号；第5,561,225号；第5,596,086号；第5,602,240号；第5,608,046号；第5,610,289号；第5,618,704号；第5,623,070号；第5,663,312号；第5,633,360号；第5,677,437号；以及第5,677,439号，所述美国专利中的每一个的全部内容特此通过引用并入本文。
考虑在本文提供的iRNA中使用合适的RNA模拟物，其中核苷酸单元的糖和核苷间键，即主链被新基团替代。维持碱基单元以与适当的核酸靶化合物杂交。一种此类寡聚化合物(其中已示出具有极佳杂交特性的RNA模拟物)被称作肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，RNA的糖主链被含酰胺的主链替代，尤其是氨基乙基甘氨酸主链。核碱基被保留并且直接或间接地与主链的酰胺部分的氮杂氮原子结合。教导PNA化合物的制备的代表性美国专利包含但不限于美国专利第5,539,082号；第5,714,331号；以及第5,719,262号，所述美国专利中的每一个的全部内容特此通过引用并入本文。适用于本发明iRNA的另外的PNA化合物在例如Nielsen等人,《科学》,1991,254,1497-1500中进行了描述。
本发明特征的一些实施例包含具有硫代磷酸酯主链的RNA和具有杂原子主链的寡核苷，特别是上文引用的美国专利第5,489,677号的--CH2--NH--CH2-、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链]，--CH2--O--N(CH3)--CH2--,--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--和--N(CH3)--CH2--CH2--，以及上文引用的美国专利第5,602,240号的酰胺主链。在一些实施例中，本文特征的RNA具有上文引用的美国专利第5,034,506号的吗啉代主链结构。天然磷酸二酯骨架可以表示为O-P(O)(OH)-OCH2-。
经修饰的RNA还可以包括一个或多个经取代的糖部分。本文特征的iRNA，例如dsRNA可以在2'位置处包含以下之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是经取代的或未经取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。示例性合适的修饰包含O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2).nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m是1至约10。在其它实施例中，dsRNA在2'位置处包含以下之一：C1至C10低级烷基、经取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、经取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报告基团、嵌入子、用于改善iRNA的药代动力学特性的基团、或用于改善iRNA的药效动力学特性的基团以及具有类似特性的其它取代基。在一些实施例中，修饰包含2'-甲氧基乙氧基(2'-O--CH2CH2OCH3)，也称为2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE(Martin等人,《瑞士化学学报(Helv.Chim.Acta)》,1995,78:486-504)，即烷氧基-烷氧基基团。另一个示例性修饰是2'-二甲氨基氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2'-DMAOE，如下文实例中描述的，以及2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域中也称为2'-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2'-DMAEOE)，即2'-O--CH2--O--CH2--N(CH3)2。另外的示例性修饰包含：5'-Me-2'-F核苷酸、5'-Me-2'-OMe核苷酸、5'-Me-2'-脱氧核苷酸(这三个家族中的R和S异构体两者)；2'-烷氧基烷基；以及2'-NMA(N-甲基乙酰胺)。
其它修饰包含2'-甲氧基(2'-OCH3)、2'-氨基丙氧基(2'-OCH2CH2CH2NH2)和2'-氟(2'-F)。类似修饰也可以在iRNA的RNA上的其它位置处进行，特别是糖在3'末端核苷酸上的3'位置或在2'-5'连接的dsRNA和5'末端核苷酸的5'位置上。iRNA也可以具有糖模拟物，如替代戊呋喃糖基糖的环丁基部分。教导制备此类经修饰的糖结构的代表性美国专利包含但不限于美国专利第4,981,957号；第5,118,800号；第5,319,080号；第5,359,044号；第5,393,878号；第5,446,137号；第5,466,786号；第5,514,785号；第5,519,134号；第5,567,811号；第5,576,427号；第5,591,722号；第5,597,909号；第5,610,300号；第5,627,053号；第5,639,873号；第5,646,265号；第5,658,873号；第5,670,633号；以及第5,700,920号，其中某些是本申请共有的。上述各项的全部内容特此通过引用并入本文。
iRNA还可以包含核碱基(在本领域中通常被简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所使用的，“未经修饰的”或“天然”核碱基包含嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的核碱基包含其它合成和天然核碱基，如脱氧胸苷(dT)、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤基、8-氨基、8-硫基、8-硫烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤基，具体地5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。另外的核碱基包含美国专利第3,687,808号中公开的那些，在《生物化学、生物技术和医学中经修饰的核苷(Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology andMedicine)》,Herdewijn,P.编辑Wiley-VCH出版社(Wiley-VCH),2008年中公开的那些；在《聚合物科学与工程化简明百科全书(The Concise Encyclopedia Of Polymer ScienceAnd Engineering)》,第858-859页,Kroschwitz,J.L编辑约翰威利父子公司,1990中公开的那些，Englisch等人,《化学应用国际版(Angewandte Chemie,International Edition)》,1991,30,613中公开的那些，以及Sanghvi,Y S.,第15章,《dsRNA研究与应用(dsRNAResearch and Applications)》,第289-302页,Crooke，S.T.和Lebleu,B.编辑,CRC出版社(CRC Press),1993中公开的那些。这些核碱基中的某些核碱基对提高本发明特征的寡聚化合物的结合亲和力特别有用。这些包含5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包含2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已经示出5-甲基胞嘧啶取代使核酸双链体稳定性提高0.6℃至1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.和Lebleu,B.编辑,《dsRNA研究与应用》,CRC出版社,波卡拉顿(Boca Raton),1993，第276-278页)，并且是示例性碱基取代，甚至更具体地在与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。
教导制备某些上述经修饰的核碱基以及其它经修饰的核碱基的代表性美国专利包含但不限于上述美国专利第3,687,808号、第4,845,205号；第5,130,30号；第5,134,066号；第5,175,273号；第5,367,066号；第5,432,272号；第5,457,187号；第5,459,255号；第5,484,908号；第5,502,177号；第5,525,711号；第5,552,540号；第5,587,469号；第5,594,121号、5,596,091号；第5,614,617号；第5,681,941号；第5,750,692号；第6,015,886号；第6,147,200号；第6,166,197号；第6,222,025号；第6,235,887号；第6,380,368号；第6,528,640号；第6,639,062号；第6,617,438号；第7,045,610号；第7,427,672号；以及第7,495,088号，所述美国专利中的每一个的全部内容特此通过引用并入本文。
在一些实施例中，本公开的RNAi药剂也可以被修饰以包含一个或多个双环糖部分。“双环糖”是由两个碳(无论是相邻的或是非相邻的)桥接形成的环修饰的呋喃糖基环。“双环核苷”(“BNA”)是一种具有糖部分的核苷，搜书糖部分包括通过桥接糖环的两个碳(无论是相邻的或是非相邻的)而形成的环，由此形成双环系统。在某些实施例中，桥任选地通过2'-无环氧原子连接糖环的4'-碳和2'-碳。因此，在一些实施例中，本发明的药剂可以包含一种或多种锁定核酸(LNA)。锁定核酸是具有经修饰的核糖部分的核苷酸，其中核糖部分包括连接2'和4'碳的额外桥。换言之，LNA是包括双环糖部分的核苷酸，所述双环糖部分包括4'-CH2-O-2'桥。这种结构有效地将核糖“锁定”在3'-内结构构象中。向siRNA中添加锁定核酸已被证明可增加血清中的siRNA稳定性，并且减少脱靶效应(Elmen，J.等人,(2005)《核酸研究》33(1):439-447；Mook,OR.等人,(2007)《分子癌症治疗学》6(3):833-843；Grunweller,A.等人,(2003)《核酸研究》31(12):3185-3193)。用于本发明的苷酸的双环核苷的实例包含但不限于包括4'和2'核糖基环原子之间的桥的核苷。在某些实施例中，本发明的反义多核苷酸药剂包含一种或多种包括4'至2'桥的双环核苷。
锁核苷可以由以下结构表示(省略立体化学)，
其中B是核碱基或经修饰的核碱基，并且L是将核糖环的2'-碳与4′-碳连接的连接基团。此类4'至2'桥接的双环核苷的实例包含但不限于4′-(CH2)—O-2'(LNA)；4'-(CH2)—S-2'；4'-(CH2)2—O-2'(ENA)；4'-CH(CH3)—O-2′(也称为“约束乙基”或“cEt”)和4'-CH(CH2OCH3)—O-2'(以及其类似物；参见例如美国专利第7,399,845号)；4'-C(CH3)(CH3)—O-2'(以及其类似物；参见例如美国专利第8,278,283号)；4′-CH2—N(OCH3)-2'(以及其类似物；参见例如美国专利第8,278,425号)；4'-CH2—O—N(CH3)-2‘(参见例如美国专利公开第2004/0171570号)；4'-CH2—N(R)—O-2'，其中R是H、C1-C12烷基或氮保护基团(参见例如美国专利第7,427,672号)；4'-CH2—C(H)(CH3)-2'(参见例如Chattopadhyaya等人,《有机化学杂志(J.Org.Chem.)》,2009,74,118-134)；以及4'-CH2—C(＝CH2)-2'(以及其类似物；参见例如，美国专利第8,278,426号)。上述各项的全部内容特此通过引用并入本文。
教导制备锁定核酸核苷酸的其它代表性美国专利和美国专利公开包含但不限于以下：美国专利第6,268,490号；第6,525,191号；第6,670,461号；第6,770,748号；第6,794,499号；第6,998,484号；第7,053,207号；第7,034,133；7,084,125号；第7,399,845号；第7,427,672号；第7,569,686号；第7,741,457号；第8,022,193号；第8,030,467号；第8,278,425号；第8,278,426号；第8,278,283号；US2008/0039618；以及US2009/0012281，所述美国专利中的每一个的全部内容特此通过引用并入本文。
可以制备具有一种或多种立体化学糖构型的任何前述双环核苷，包含例如α-L-呋喃核糖和β-D-呋喃核糖(参见WO 99/14226)。
iRNA的RNA也可以被修饰以包含一个或多个约束乙基核苷酸。如本文所使用的，“约束乙基核苷酸”或“cEt”为包括包含4'-CH(CH3)-O-2'桥(即前述结构中的L)的双环糖部分的锁定核酸。在一个实施例中，约束乙基核苷酸处于本文中称为“S-cEt”的S构象。
本发明的iRNA还可以包含一个或多个“构象限制性核苷酸”(“CRN”)。CRN是具有连接核糖的C2'和C4'碳或核糖的C3和-C5'碳的接头的核苷酸类似物。CRN将核糖环锁定为稳定的构象，并且增加对mRNA的杂交亲和力。接头具有足够的长度以将氧放置在稳定性和亲和力的最佳位置，从而导致较少的核糖环褶皱。
教导上述某些CRN的制备的代表性出版物包含但不限于美国专利公开第2013/0190383号；以及PCT公开WO 2013/036868，所述文献中的每一个的全部内容特此通过引用并入本文。
在一些实施例中，本发明的iRNA包括一种或多种为UNA(解锁核酸)核苷酸的单体。UNA是未锁定的无环核酸，其中糖的任何键都已被去除，形成未锁定的“糖”残基。在一个实例中，UNA还涵盖C1'-C4'之间的键已被去除的单体(即C1'与C4'碳之间的共价碳-氧-碳键)。在另一个实例中，糖的C2'-C3'键(即C2'与C3'碳之间的共价碳-碳键)已被去除(参见《核酸研讨会丛刊(Nuc.Acids Symp.Series)》,52,133-134(2008)和Fluiter等人,《分子生物系统(Mol.Biosyst.)》,2009,10,1039，特此通过引用并入)。
教导UNA的制备的代表性美国公开包含但不限于美国专利第8,314,227号；以及美国专利公开第2013/0096289号；第2013/0011922号；和第2011/0313020号，所述文献中的每一个的全部内容特此通过引用并入本文。
对RNA分子末端的潜在稳定修饰可以包含N-(乙酰氨基己酰基)-4-羟脯氨醇(Hyp-C6-NHAc)、N-(己酰基-4-羟脯氨醇)(Hyp-C6)、N-(乙酰基-4-羟脯氨醇)(Hyp-NHAc)、胸苷-2'-0-脱氧胸苷(醚)、N-(氨基己酰基)-4-羟脯氨醇(Hyp-C6-氨基)、2-二十二烷酰基-尿苷-3"-磷酸酯、反向碱基dT(idT)等。此修饰的公开内容可以在PCT公开第WO 2011/005861号中找到。
本发明的iRNA的核苷酸的其它修饰包含5'磷酸酯或5'磷酸酯模拟物，例如iRNA的反义链上的5'末端磷酸酯或磷酸酯模拟物。合适的磷酸酯模拟物公开于例如美国专利公开第2012/0157511号中，所述美国专利公开的全部内容通过引用并入本文。
A.包括本发明的基序的经修饰的iRNA
在本发明的某些方面，本发明的双链RNA药剂包含具有化学修饰的药剂，如在例如WO2013/075035中公开的，所述文献中的每一个的全部内容通过引用并入本文。如本文和WO2013/075035所示，通过将在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个或多个基序引入dsRNAi药剂的有义链或反义链，特别是在切割位点处或附近，可以获得优异的结果。在一些实施例中，dsRNAi药剂的有义链和反义链可以以其它方式被完全修饰。这些基序的引入中断了有义或反义链的修饰模式(如果存在的话)。dsRNAi药剂可以任选地与GalNAc衍生物配体缀合，例如在有义链上。
更具体地，当双链RNA药剂的有义链和反义链被完全修饰为在dsRNAi药剂的至少一条链的切割位点处或附近的三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个或多个基序时，观察到dsRNAi药剂的基因沉默活性。
因此，本发明提供了能够在体内抑制靶基因(即CTNNB1基因)的表达的双链RNA药剂。RNAi药剂包括有义链和反义链。RNAi药剂的每条链可以是，例如，长度是17个至30个核苷酸、长度是25个至30个核苷酸、长度是27个至30个核苷酸、长度是19个至25个核苷酸、长度是19个至23个核苷酸、长度是19个至21个核苷酸、长度是21个至25个核苷酸或长度是21个至23个核苷酸。
有义链和反义链通常形成双链体双链RNA(“dsRNA”)，本文也称为“dsRNAi药剂”。dsRNAi药剂的双链体区可以是，例如，双链体区的长度可以是27个至30个核苷酸对、长度是19个至25个核苷酸对、长度是19个至23个核苷酸对、长度是19个至21个核苷酸对、长度是21个至25个核苷酸对或长度是21个至23个核苷酸对。在另一个实例中，双链体区的长度选自19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个和27个核苷酸。
在某些实施例中，dsRNAi药剂可以在一条或两条链的3'端、5'端或两端含有一个或多个突出端区或封端基团。突出端的长度可以独立地是1个至6个核苷酸，例如长度是2个至6个核苷酸、长度是1个至5个核苷酸、长度是2个至5个核苷酸、长度是1个至4个核苷酸、长度是2个至4个核苷酸、长度是1个至3个核苷酸、长度是2个至3个核苷酸或长度是1个至2个核苷酸。在某些实施例中，突出端区可以包含如上提供的延伸的突出端区。突出端可以是一条链比另一条链长的结果，或是两条相同长度的链交错的结果。突出端可以与靶mRNA形成错配，或其可以与被靶向的基因序列互补，或可以是另一个序列。第一链和第二链也可以连接，例如通过另外的碱基形成发夹，或通过其它非碱基接头。
在某些实施例中，dsRNAi药剂的突出端区中的核苷酸可以各自独立地是经修饰或未经修饰的核苷酸，包含但不限于2'-糖修饰的，如2'-F、2'-O-甲基、胸苷(T)、2`-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(Teo)、2`-O-甲氧基乙基腺苷(Aeo)、2`-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷(m5Ceo)以及其任何组合。
例如，TT可以是任一条链上任一端的突出端序列。突出端可以与靶mRNA形成错配，或其可以与被靶向的基因序列互补，或可以是另一个序列。
dsRNAi药剂的有义链、反义链或两条链上的5'-或3'-突出端可以被磷酸化。在一些实施例中，突出端区含有在两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯的两个核苷酸，其中两个核苷酸可以是相同的或不同的。在一些实施例中，突出端存在于有义链、反义链或两条链的3'端处。在一些实施例中，这种3'-突出端存在于反义链中。在一些实施例中，这种3'-突出端存在于有义链中。
dsRNAi药剂可能只含有单个突出端，这可以增强RNAi的干扰活性，而不会影响其整体稳定性。例如，单链突出端可以位于有义链的3'端处，或可替代地，位于反义链的3'端处。RNAi也可能具有平端，位于反义链的5'端(即，有义链的3'端)处，或反之亦然。通常，dsRNAi药剂的反义链在3'端处有核苷酸突出端，并且5'端是钝的。虽然不希望受理论的束缚，但反义链5'端的不对称钝端和反义链3'端突出端有利于引导链装载到RISC过程中。
在某些实施例中，dsRNAi药剂是长度是19个核苷酸的双端钝化剂，其中所述有义链在从5'端开始的位置7、8、9处的三个连续核苷酸上含有三个2'-F修饰的至少一个基序。反义链在从5'端开始的位置11、12和13处的三个连续核苷酸上含有三个2'-O-甲基修饰的至少一个基序。
在其它实施例中，dsRNAi药剂是长度是20个核苷酸的双端钝化剂，其中所述有义链在从5'端开始的位置8、9和10处的三个连续核苷酸上含有三个2'-F修饰的至少一个基序。反义链在从5'端开始的位置11、12和13处的三个连续核苷酸上含有三个2'-O-甲基修饰的至少一个基序。
在又其它实施例中，dsRNAi药剂是长度是21个核苷酸的双端钝化剂，其中所述有义链在从5'端开始的位置9、10、11处的三个连续核苷酸上含有三个2'-F修饰的至少一个基序。反义链在从5'端开始的位置11、12和13处的三个连续核苷酸上含有三个2'-O-甲基修饰的至少一个基序。
在某些实施例中，dsRNAi药剂包括21个核苷酸的有义链和23个核苷酸的反义链，其中所述有义链在从5'端开始的位置9、10和11处的三个连续核苷酸上含有三个2'-F修饰的至少一个基序；所述反义链在从5'端开始的位置11、12和13处的三个连续核苷酸上含有三个2'-O-甲基修饰的至少一个基序，其中所述RNAi药剂的一端是钝的，而另一端包括2核苷酸突出端。在一个实施例中，2核苷酸突出端位于反义链的3'端处。
当2核苷酸突出端位于反义链的3'端处时，在末端三个核苷酸之间可能存在两个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中所述三个核苷酸中的两个是突出端核苷酸，并且第三个核苷酸是紧挨着突出端核苷酸的配对核苷酸。在一个实施例中，RNAi药剂在有义链的5'端和反义链的5'端两者的末端三个核苷酸之间另外具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键。在某些实施例中，dsRNAi药剂的有义链和反义链中的每个核苷酸，包含为基序一部分的核苷酸，都是经修饰的核苷酸。在某些实施例中，每个残基用2'-O-甲基或3'-氟独立地修饰，例如在交替的基序中。任选地，dsRNAi药剂进一步包括配体(如GalNAc3)。
在某些实施例中，dsRNAi药剂包括有义链和反义链，其中所述有义链的长度是25个至30个核苷酸残基，其中从第一链的5'末端核苷酸(位置1)位置1至23开始，包括至少8个核糖核苷酸；反义链的长度是36个至66个核苷酸残基，并且从3'末端核苷酸开始，在与有义链的位置1至23配对以形成双链体的位置中包括至少8个核糖核苷酸；其中至少反义链的3'末端核苷酸与有义链不配对，并且至多6个连续3'末端核苷酸与有义链不配对，由此形成1个至6个核苷酸的3'单链突出端；其中反义链的5'末端包括10个至30个与有义链不配对的连续核苷酸，由此形成10个至30个核苷酸单链5'突出端；其中当有义链和反义链比对以获得最大互补性时，至少有义链5'末端和3'末端核苷酸与反义链的核苷酸碱基配对，由此在有义链与反义链之间形成基本上双链的区域；并且反义链沿着反义链长度的至少19个核糖核苷酸与靶RNA充分互补，以在将双链核酸引入哺乳动物细胞时减少靶基因表达；并且其中所述有义链含有在三个连续核苷酸上的三个2'-F修饰的至少一个基序，其中至少一个所述基序出现在切割位点处或附近。反义链在切割位点处或其附近的三个连续核苷酸上含有三个2'-O-甲基修饰的至少一个基序。
在某些实施例中，dsRNAi药剂包括有义链和反义链，其中dsRNAi药剂包括长度是至少25个和最多29个核苷酸的第一链和长度是最多30个核苷酸的第二链，在从5'端起的位置11、12、13处的三个连续核苷酸上具有三个2'-O-甲基修饰的至少一个基序；其中所述第一链的3'端和所述第二链的5'端形成钝端，并且所述第二链在其3'端处比所述第一链长1个至4个核苷酸，其中所述双链体区的长度是至少25个核苷酸，并且所述第二链沿着所述第二链长度的至少19个核苷酸与靶mRNA充分互补，以在将所述RNAi药剂引入哺乳动物细胞中时减少靶基因表达，并且其中所述dsRNAi药剂的Dicer切割产生包括所述第二链的3'端的siRNA，由此减少所述靶基因在哺乳动物中的表达。任选地，dsRNAi药剂进一步包括配体。
在某些实施例中，dsRNAi药剂的有义链含有在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的至少一个基序，其中一个基序出现在有义链中的切割位点处。
在某些实施例中，dsRNAi药剂的反义链也可以含有在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的至少一个基序，其中一个基序出现在反义链中的切割位点处或附近。
对于具有长度是19个至23个核苷酸的双链体区的dsRNAi药剂，反义链的切割位点通常在距离5'端的10、11和12位置附近。因此，三个相同修饰的基序可以出现在反义链的9、10、11位置；10、11、12位置；11、12、13位置；12、13、14位置；或13、14、15个位置，计数从反义链的5'端的第一个核苷酸开始，或计数从反义链的5'端双链体区内的第一个配对核苷酸开始。反义链中的切割位点也可以根据dsRNAi药剂的双链体区从5'端开始的长度而改变。
dsRNAi药剂的有义链可以在链的切割位点处的三个连续核苷酸上含有三个相同修饰的至少一个基序；并且反义链可以在链的切割位点处或附近的三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的至少一个基序。当有义链和反义链形成dsRNA双链体时，有义链与反义链可以如此排列，使得有义链上的三个核苷酸的一个基序与反义链上的三个核酸的一个基序具有至少一个核苷酸重叠，即有义链中的基序的三个核苷酸中的至少一个与反义链中基序的三个核苷酸中的至少一个形成碱基对。可替代地，至少两个核苷酸可以重叠，或所有三个核苷酸都可以重叠。
在一些实施例中，dsRNAi药剂的有义链可以含有在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的多于一个的基序。第一个基序可以出现在链的切割位点处或附近，并且其它基序可以是翼修饰。本文中的术语“翼修饰”是指出现在链的另一部分处的基序，所述部分在同一链的切割位点处或附近与基序分离。翼修饰要么与第一基序相邻，或被至少一个或多个核苷酸分开。当基序彼此紧邻时，则基序的化学性质彼此不同，并且当基序由一个或多个核苷酸分开时，化学性质可以相同或不同。可能存在两个或更多个翼修饰。例如，当存在两个翼修饰时，每个翼修饰可以出现在相对于第一基序的一端，所述第一基序位于切割位点处或附近，或在前导基序的任一侧。
与有义链一样，dsRNAi药剂的反义链可以含有在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的多于一个基序，其中至少一个基序出现在链的切割位点处或附近。此反义链还可以含有与可能存在于有义链上的翼修饰相似的排列的一个或多个翼修饰。
在一些实施例中，dsRNAi药剂的有义链或反义链上的翼修饰通常不包含链的3'端、5'端或两端处的第一个或前两个末端核苷酸。
在其它实施例中，dsRNAi药剂的有义链或反义链上的翼修饰通常不包含链的3'端、5'端或两端处双链体区内的第一个或前两个配对核苷酸。
当dsRNAi药剂的有义链和反义链各自含有至少一个翼修饰时，翼修饰可以落在双链体区的同一端，并且具有一个、两个或三个核苷酸的重叠。
当dsRNAi药剂的有义链和反义链各自含有至少两个翼修饰时，有义链和反义链可以如此排列，使得各自来自一条链的两个修饰落在双链体区的一端，具有一个、两个或三个核苷酸的重叠；各自来自一条链的两个修饰落在双链体区的另一端，具有一个、两个或三个核苷酸的重叠；两个修饰一条链落在前导基序的每一侧，在双链体区中具有一个、两个或三个核苷酸的重叠。
在一些实施例中，dsRNAi药剂的有义链和反义链中的每个核苷酸，包含为基序一部分的核苷酸，可以是经修饰的。每个核苷酸可以用相同或不同的修饰进行修饰，所述修饰可以包含一个或两个非连接磷酸酯氧或一个或多个连接磷酸酯氧的一种或多种改变；核糖的成分的改变，例如，核糖上的2′-羟基的改变；用“去磷酸”接头大规模取代磷酸酯部分；天然存在的碱基的修饰或替换；以及核糖-磷酸酯主链的替换或修饰。
由于核酸是亚基的聚合物，许多修饰发生在核酸内重复的位置，例如碱基或磷酸酯部分的修饰，或磷酸酯部分的非连接O。在一些情况下，修饰将发生在核酸中的所有主体位置，但在许多情况下不会。例如，修饰可以仅发生在3'-或5'末端位置，可以仅发生于末端区域，例如，在末端核苷酸上的位置处或在链的最后2个、3个、4个、5个或10个核苷酸中。修饰可以发生在双链区、单链区或两者中。修饰可以只发生在RNA的双链区中，或可以只发生于RNA的单链区中。例如，非连接O位置处的硫代磷酸酯修饰可以仅发生在一个或两个末端处，可以仅发生于末端区中，例如，在末端核苷酸上的位置处或在链的最后2个、3个、4个、5个或10个核苷酸中，或可以发生在双链和单链区中，特别是在末端处。一个或多个5'端可以被磷酸化。
例如，为增强稳定性，可以在突出端中包含特定的碱基，或在单链突出端中，例如在5'-或3'-突出端中或在两者中包含经修饰的核苷酸或核苷酸替代物。例如，在突出端中包含嘌呤核苷酸是期望的。在一些实施例中，3'-或5'-突出端中的所有或一些碱基可以被修饰，例如，通过本文所描述的修饰。修饰可以包含，例如使用本领域已知的修饰在核糖糖的2'位置处的修饰，例如，用脱氧核糖核苷酸、2'-脱氧-2'-氟(2'-F)或2'-O-甲基修饰代替核碱基的核糖，以及磷酸酯基团的修饰，例如硫代磷酸酯修饰。突出端不需要与靶序列同源。
在一些实施例中，有义链和反义链的每个残基独立地用LNA、CRN、cET、UNA、HNA、CeNA、2'-甲氧基乙基、2'-O-甲基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-脱氧、2'-羟基或2'-氟修饰。链可以含有多于一种修饰。在一个实施例中，有义链和反义链的每个残基独立地用2'-O-甲基或2'-氟修饰。
在有义链和反义链上通常存在至少两种不同的修饰。这两种修饰可以是2'-O-甲基或2'-氟修饰，或其它修饰。
在某些实施例中，Na或Nb包括交替模式的修饰。如本文所使用的，术语“交替基序”是指具有一个或多个修饰的基序，每个修饰发生在一条链的交替核苷酸上。交替核苷酸可以指每隔一个核苷酸一个或每三个核苷酸一个，或类似的模式。例如，如果A、B和C各自表示核苷酸的一种修饰类型，则交替基序可以是“ABABABABABAB…”、“AABBAABBAABB…”、“AABAABAABAAB…”、“AAABAAABAAAB…”、“AAABBBAAABBB…”或“ABCABCABCABC…”等。
包含在交替基序中的修饰的类型可以是相同的或不同的。例如，如果A、B、C、D各自表示核苷酸上的一种修饰类型，则交替模式，即每隔一个核苷酸上的修饰可以是相同的，但每个有义链或反义链可以选自交替基序内的若干种修饰可能性，如“ABABAB…”、“ACACAC…”、“BDBDBD…”或“CDCDCD…”等。
在一些实施例中，本发明的dsRNAi药剂包括相对于反义链上的交替基序的修饰模式，有义链上交替基序的修饰模式发生了偏移。所述偏移可以使得有义链的核苷酸的经修饰的基团对应于反义链的核苷酸的不同经修饰的基团，并且反之亦然。例如，有义链当与dsRNA双链体中的反义链配对时，有义链中的交替基序可以从链的5'到3'以“ABABAB”开始，并且反义链中的交替基序可以在双链体区内从链的5'到3'以“BABABA”开始。作为另一个实例，有义链中的交替基序可以从链的5'到3'以“AABBAABB”开始，并且反义链中的交替基序在双链体区内可以从链5'到3'以“BBAABBAA”开始，因此在有义链与反义链之间存在修饰模式的完全或部分转移。
在一些实施例中，dsRNAi药剂包括2'-O-甲基修饰和2'-F修饰的交替基序在有义链上的模式最初相对于反义链上2'-O-甲基修饰和2'-F修饰的交替基序的模式具有偏移，即有义链碱基上的2'-O-甲基修饰的核苷酸与反义链上的2'-F修饰的核苷酸配对，并且反之亦然。有义链的1位置可以从2'-F修饰开始，并且反义链的1位置可以从2'-O-甲基修饰开始。
将在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个或多个基序引入有义链或反义链中断了存在于有义链或者反义链中的初始修饰模式。通过将在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个或多个基序引入有义链或反义链来中断有义链或反义链的修饰模式，可以增强针对靶基因的基因沉默活性。
在一些实施例中，当三个连续核苷酸上的三个相同修饰的基序被引入任何链时，基序旁边的核苷酸的修饰是与基序的修饰不同的修饰。例如，含有基序的序列部分是“…NaYYYNb…”，其中“Y”表示对三个连续核苷酸上的三个相同修饰的基序的修饰，并且“Na”和“Nb”表示对基序“YYY”旁边的核苷酸的不同于Y的修饰的修饰，并且其中Na和Nb可以是相同或不同的修饰。可替代地，当存在翼修饰时，Na或Nb可以存在或不存在。
iRNA可以进一步包括至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰可以发生在链的任何位置中的有义链、反义链或两条链的任何核苷酸上。例如，核苷酸间键修饰可以发生在有义链或反义链上的每个核苷酸上；每个核苷酸间键修饰可以在有义链或反义链上以交替模式发生；或有义链或反义链可以以交替模式含有两种核苷酸间键修饰。有义链上的核苷酸间键修饰的交替模式可以与反义链相同或不同，并且有义链上核苷酸间键修饰的交替模式可以相对于反义链上核苷酸间键的交替模式具有偏移。在一个实施例中，双链RNAi药剂包括6个至8个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施例中，反义链在5'端处包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键，并且在3'端处包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键，并且有义链在5'端或3'端处包括至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，dsRNAi药剂包括突出端区中的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰。例如，突出端区可以含有两个核苷酸，所述两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。还可以进行核苷酸间键修饰，以将突出端核苷酸与双链体区内的末端配对核苷酸连接。例如，至少2个、3个、4个或所有突出端核苷酸可以通过硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键连接，并且任选地，可以存在另外的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核酸间连接，将突出端核苷酸与紧挨着突出端核苷酸的配对核苷酸连接。例如，在末端三个核苷酸之间可能存在至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中三个核苷酸中的两个是突出端核苷酸，并且第三个是与突出端核苷酸相邻的配对核苷酸。这些末端三个核苷酸可以位于反义链的3'端、有义链的3'端、反义链5'端或反义链5'端。
在一些实施例中，2-核苷酸突出端位于反义链的3'端处时，并且在末端三个核苷酸之间有两个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中所述三个核苷酸中的两个是突出端核苷酸，并且第三个核苷酸是紧挨着突出端核苷酸的配对核苷酸。任选地，dsRNAi药剂在有义链的5'端和反义链的5'端两者的末端三个核苷酸之间可以另外具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键。
在一个实施例中，dsRNAi药剂包括与靶标、在双链体内或其组合的错配。所述错配可能发生在突出端区或双链体区中。碱基对可以基于其促进解离或熔化的倾向进行排序(例如，根据特定配对的缔合或离解的自由能，最简单的方法是在单个配对的基础上检查配对，尽管也可以使用下一个临近点或类似分析)。在促进解离方面：A:U优于G:C；G:U优于G:C；并且I:C优于G:C(I＝肌苷)。错配，例如非规范或规范外配对(如本文其它地方所述)优于规范(A:T、A:U、G:C)配对；并且包含通用碱基的配对优于规范配对。
在某些实施例中，dsRNAi药剂在反义链5'端的双链体区内包括前1个、2个、3个、4个或5个碱基对中的至少一个，所述双链体区独立地选自：A：U、G:U、I:C和错配对，例如非规范或规范外配对或包含通用碱基的配对，以促进双链体的5'端处反义链的解离。
在某些实施例中，反义链中从5'端开始的双链体区内1位置处的核苷酸选自A、dA、dU、U和dT。可替代地，从反义链的5'端开始的双链体区内的前1个、2个或3个碱基对中的至少一个是AU碱基对。例如，从反义链5'端起的双链体区内的第一个碱基对是AU碱基对。
在其它实施例中，有义链的3'端处的核苷酸是脱氧胸苷(dT)，或反义链的3'端处的核苷酸是脱氧胸苷(dT)。例如，存在脱氧胸苷核苷酸的短序列，例如，在有义链、反义链或两条链的3'端上有两个dT核苷酸。
在某些实施例中，有义链序列可以由式(I)表示：
5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3' (I)
其中：
i和j各自独立地是0或1；
p和q各自独立地是0至6；
每个Na独立地表示包括0个至25个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包括至少两个不同修饰的核苷酸；
每个Nb独立地表示包括0个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np和nq独立地表示突出端核苷酸；
其中Nb和Y不具有相同的修饰；并且
XXX、YYY和ZZZ各自独立地表示在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个基序。在一个实施例中，YYY是所有2'-F修饰的核苷酸。
在一些实施例中，Na或Nb包括交替模式的修饰。
在一些实施例中，YYY基序出现在有义链的切割位点处或附近。例如，当dsRNAi药剂具有长度是17个至23个核苷酸的双链体区时，YYY基序可以出现在有义链的切割位点处或附近(例如，可以出现在位置6、7、8；7、8、9；8、9、10；9、10、11；10、11、12；或11、12、13处)，计数从第一个核苷酸开始，从5'端开始；或任选地，计数从5'端开始，从双链体区内的第一配对核苷酸开始。
在一个实施例中，i是1并且j是0，或者i是0并且j是1，或i和j两者都是1。因此，有义链可以由下式表示：
5'np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'(Ib)；
5'np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3'(Ic)；或
5'np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'(Id)。
当有义链由式(Ib)表示时，Nb表示包括0个至10个、0个至7个、0个至5个、0个至4个、0个至2个或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na可以独立地表示包括2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当有义链表示为式(Ic)时，Nb表示包括0个至10个、0个至7个、0个至10个、0个至7个、0个至5个、0个至4个、0个至2个或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na可以独立地表示包括2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当有义链表示为式(Id)时，每个Nb独立地表示包括0个至10个、0个至7个、0个至5个、0个至4个、0个至2个或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。在一个实施例中，Nb是0、1、2、3、4、5或6。每个Na可以独立地表示包括2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
X、Y和Z中的每一个可以彼此相同或不同。
在其它实施例中，i是0并且j是0，并且有义链可以由下式表示：
5'np-Na-YYY-Na-nq 3'(Ia)。
当有义链由式(Ia)表示时，每个Na可以独立地表示包括2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
在一个实施例中，RNAi的反义链序列可以由式(II)表示：
5'nq'-Na'-(Z'Z'Z')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(X'X'X')l-N'a-np'3'(II)
其中：
k和l各自独立地是0或1；
p'和q'各自独立地是0至6；
每个Na'独立地表示包括0个至25个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包括至少两个不同修饰的核苷酸；
每个Nb'独立地表示包括0个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np'和nq'独立地表示突出端核苷酸；
其中Nb'和Y'不具有相同的修饰；并且
X'X'X'、Y'Y'Y'和Z'Z'Z'各自独立地表示在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个基序。
在一些实施例中，Na'或Nb'包括交替模式的修饰。
Y'Y'Y'基序出现在反义链的切割位点处或附近。例如，当dsRNAi药剂具有长度是17个至23个核苷酸的双链体区时，Y'Y'Y'基序可以出现在反义链的位置9、10、11；10、11、12；11、12、13；12、13、14；或13、14、15处，计数从第一个核苷酸开始，从5'端开始；或任选地，计数从5'端开始，从双链体区内的第一配对核苷酸开始。在一个实施例中，Y'Y'Y'基序出现在位置11、12、13处。
在某些实施例中，Y'Y'Y'基序全部是2'-OMe修饰的核苷酸。
在某些实施例中，k是1并且l是0，或k是0并且l是1，或k和l两者都是1。
因此，反义链可以由下式表示：
5'nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-np'3'(IIb)；
5'nq'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-np'3'(IIc)；或
5'nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-Na'-np'3'(IId)。
当反义链表示由式(IIb)表示时，Nb'表示包括0个至10个、0个至7个、0个至10个、0个至7个、0个至5个、0个至4个、0个至2个或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na'独立地表示包括2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当反义链表示为式(IIc)时，Nb表示包括0个至10个、0个至7个、0个至10个、0个至7个、0个至5个、0个至4个、0个至2个或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na'独立地表示包括2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当反义链表示为式(IId)时，每个Nb'独立地表示包括0个至10个、0个至7个、0个至10个、0个至7个、0个至5个、0个至4个、0个至2个或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na'独立地表示包括2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。在一个实施例中，Nb是0、1、2、3、4、5或6。
在其它实施例中，k是0并且l是0，并且反义链可以由下式表示：
5'np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-nq'3'(Ia)。
当反义链表示为式(IIa)时，每个Na'独立地表示包括2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
X'、Y'和Z'中的每一个可以彼此相同或不同。
有义链和反义链的每个核苷酸可以独立地用LNA、CRN、UNA、cEt、HNA、CeNA、2'-甲氧基乙基、2'-O-甲基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-羟基或2'-氟修饰。例如，有义链和反义链的每个核苷酸独立地用2'-O-甲基或2'-氟修饰。特别地，每个X、Y、Z、X'、Y'和Z'可以表示2'-O-甲基修饰或2'-氟修饰。
在一些实施例中，当双链体区是21nt时，dsRNAi药剂的有义链可以含有出现在链的9、10和11位置处的YYY基序，计数从5'端的第一个核苷酸开始，或任选地，计数从5'端的双链体区内的第一配对核苷酸开始；并且Y表示2'-F修饰。有义链可以另外含有XXX基序或ZZZ基序作为在双链体区的相对端处的翼修饰；并且XXX和ZZZ各自独立地表示2'-OMe修饰或2'-F修饰。
在一些实施例中，反义链可以含有出现在链的11、12、13位处的Y′Y′Y′基序，计数从5'端的第一个核苷酸开始，或任选地，计数从5'端的双链体区内的第一配对核苷酸开始；并且Y表示2'-O-甲基修饰。反义链可以另外含有X′X′X′基序或Z′Z′Z′基序作为在双链体区的相对端处的翼修饰；并且X′X′X′和Z′Z′Z′各自独立地表示2'-OMe修饰或2'-F修饰。
由上述式(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)中的任一个表示的有义链与分别由式(IIa)、(IIb)、(IIc)和(IId)中的任一个表示的反义链形成双链体。
因此，用于本发明方法的dsRNAi药剂可以包括有义链和反义链，每条链具有14个至30个核苷酸，iRNA双链体由式(III)表示：
有义：5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'
反义：3'np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq'5'
(III)
其中：
i、j、k和l各自独立地是0或1；
p、p′、q和q′各自独立地是0至6；
每个Na和Na'独立地表示包括0个至25个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包括至少两个不同修饰的核苷酸；
每个Nb和Nb'独立地表示包括0个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
其中每个可能存在或不存在的np'、np、nq'和nq独立地表示突出端核苷酸；并且
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′和Z′Z′Z′各自独立地表示在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个基序。
在一个实施例中，i是0并且j是0；或i是1并且j是0；或i是0并且j是1；或i和j两者都是0；或i和j两者都是1。在另一个实施例中，k是0并且l是0；或k是1并且l是0；k是0并且l是1；或k和l两者都是0；或k和l两者都是1。
形成iRNA双链体的有义链和反义链的示例性组合包含下式：
5'np-Na-Y Y Y-Na-nq 3'
3'np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'nq'5'
(IIIa)
5'np-Na-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3'
3'np'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na'nq'5'
(IIIb)
5'np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Na-nq 3'
3'np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-nq'5'
(IIIc)
5'np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3'
3'np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na-nq'5'
(IIId)
当dsRNAi药剂由式(IIIa)表示时，每个Na独立地表示包括2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当dsRNAi药剂由式(IIIb)表示时，每个Nb独立地表示包括1个至10个、1个至7个、1个至5个或1个至4个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na独立地表示包括2个至20个、2个至15个或2个至10个经饰修的核苷酸的寡核苷酸序列。
当dsRNAi药剂表示为式(IIIc)时，每个Nb、Nb'独立地表示包括0个至10个、0个至7个、0个至10个、0个至7个、0个至5个、0个至4个、0个至2个或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na独立地表示包括2个至20个、2个至15个或2个至10个经饰修的核苷酸的寡核苷酸序列。
当dsRNAi药剂表示为式(IIId)时，每个Nb、Nb'独立地表示包括0个至10个、0个至7个、0个至10个、0个至7个、0个至5个、0个至4个、0个至2个或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na、Na'独立地表示包括2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。Na、Na'、Nb和Nb'中的每一个独立地包括交替模式的修饰。
式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)中的X、Y和Z中的每一个可以彼此相同或不同。
当dsRNAi药剂由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示时，至少一个Y核苷酸可以与至少一个Y′核苷酸形成碱基对。可替代地，至少两个Y核苷酸与对应的Y′核苷酸形成碱基对；或所有三个Y核苷酸都与相应的Y′核苷酸形成碱基对。
当dsRNAi药剂由式(IIIb)或(IIId)表示时，至少一个Z核苷酸可以与一个Z′核苷酸形成碱基对。可替代地，至少两个Z核苷酸与对应的Z′核苷酸形成碱基对；或所有三个Z核苷酸都与相应的Z′核苷酸形成碱基对。
当dsRNAi药剂表示为式(IIIc)或(IIId)时，至少一个X核苷酸可以与一个X′核苷酸形成碱基对。可替代地，至少两个X核苷酸与对应的X′核苷酸形成碱基对；或所有三个X核苷酸都与相应的X′核苷酸形成碱基对。
在某些实施例中，Y核苷酸上的修饰不同于Y'核苷酸上的修饰，Z核苷酸上的修饰不同于Z'核苷酸上的修饰，或X核苷酸上的修饰不同于X'核苷酸上的修饰。
在某些实施例中，当dsRNAi药剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰。在其它实施例中，当RNAi药剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰，并且np'>0，并且至少一个np'通过硫代磷酸酯键与相邻核苷酸a连接。在又其它实施例中，当RNAi药剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰，并且np′>0，并且至少一个np′通过硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接，并且有义链与通过二价或三价支链接头(下文描述的)连接的一种或多种GalNAc衍生物缀合。在其它实施例中，当RNAi药剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰，并且np′>0，并且至少一个np′通过硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接，有义链包括至少一个硫代磷酸键，并且有义链与通过二价或三价支链接头连接的一种或多种GalNAc衍生物缀合。
在一些实施例中，当dsRNAi药剂由式(IIIa)表示时，Na修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰，并且np′>0，并且至少一个np′通过硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接，有义链包括至少一个硫代磷酸键，并且有义链与通过二价或三价支链接头连接的一种或多种GalNAc衍生物缀合。
在一些实施例中，dsRNAi药剂是含有至少两个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的双链体的多聚体，其中所述双链体通过接头连接。接头可以是可切割的或不可切割的。任选地，多聚体进一步包括配体。每个双链体可以靶向相同的基因或两个不同的基因；或每个双链体可以靶向两个不同的靶位点处的相同的基因。
在一些实施例中，dsRNAi药剂是含有三个、四个、五个、六个或更多个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的双链体的多聚体，其中所述双链体通过接头连接。接头可以是可切割的或不可切割的。任选地，多聚体进一步包括配体。每个双链体可以靶向相同的基因或两个不同的基因；或每个双链体可以靶向两个不同的靶位点处的相同的基因。
在一个实施例中，由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)中的至少一个表示的两种dsRNAi药剂在5'端处以及一个或两个3'处彼此连接，并且任选地与配体缀合。每种药剂可以靶向相同的基因或两个不同的基因；或每种药剂可以靶向两个不同的靶位点处的相同的基因。
在某些实施例中，本发明的RNAi药剂可以含有少量含有2'-氟修饰的核苷酸，例如，10个或更少个具有2'-氟修饰的核苷酸。例如，RNAi药剂可以含有10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个、1个或0个具有2'-氟修饰的核苷酸。在具体实施例中，本发明的RNAi药剂含有10个具有2'-氟修饰的核苷酸，例如，4个在有义链中具有2'-氟修饰的核苷酸和6个在反义链中具有2'-氟修饰的核苷酸。在另一个具体实施例中，本发明的RNAi药剂含有6个具有2'-氟修饰的核苷酸，例如，4个在有义链中具有2'-氟修饰的核苷酸和2个在反义链中具有2'-氟修饰的核苷酸。
在其它实施例中，本发明的RNAi药剂可以含有超低量的含有2'-氟修饰的核苷酸，例如，2个或更少个含有2'-氟修饰的核苷酸。例如，RNAi药剂可以含有具有2'-氟修饰的0个核苷酸中的2个、1个。在具体实施例中，RNAi药剂可以含有2个具有2'-氟修饰的核苷酸，例如，0个在有义链中具有2-氟修饰的核苷酸和2个在反义链中具有2'-氟修饰的核苷酸。
各种出版物描述了可以用于本发明的方法的多聚体iRNA。此类出版物包含WO2007/091269、美国专利第7,858,769号、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887和WO2011/031520，所述文献中的每一个的全部内容特此通过引用并入本文。
在某些实施例中，本公开的组合物和方法包含如本文所描述的RNAi药剂的膦酸乙烯酯(VP)修饰。在示例性实施例中，本公开的5'乙烯基膦酸酯修饰的核苷酸具有以下结构：
其中X是O或S；
R是氢、羟基、氟或C1-20烷氧基(例如，甲氧基或正十六烷氧基)；
R5'是＝C(H)-P(O)(OH)2，并且C5'碳与R5'之间的双键处于E或Z方向(例如，E方向)；并且
B是核碱基或经修饰的核碱基，任选地其中B是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
本公开的膦酸乙烯酯可以与本公开的dsRNA的反义链或有义链连接。在某些实施例中，本公开的膦酸乙烯酯与dsRNA的反义链连接，任选地在dsRNA反义链的5'端处。
膦酸乙烯酯修饰也设想用于本公开的组合物和方法。示例性乙烯基膦酸酯结构包含前述结构，其中R5'是＝C(H)-OP(O)(OH)2，并且C5'碳与R5'之间的双键处于E或Z方向(例如，E方向)。
如下文更详细描述的，含有一个或多个碳水化合物部分与iRNA的缀合的iRNA可以优化iRNA的一个或多个特性。在许多情况下，碳水化合物部分将与iRNA的经修饰的亚基连接。例如，iRNA的一个或多个核糖核苷酸亚基的核糖糖可以被另一个部分替代，例如，与碳水化合物配体连接的非碳水化合物(如环状)载剂。其中亚基的核糖糖已经被如此替代的核糖核苷酸亚基在本文中被称为核糖替代修饰亚基(RRMS)。环状载剂可以是碳环系统，即所有环原子都是碳原子，或杂环系统，即一个或多个环原子可以是杂原子，例如氮、氧、硫。环状载剂可以是单环系统，或可以含有两个或多个环，例如稠环。环状载剂可以是完全饱和的环系统，或其可以含有一个或多个双键。
配体可以通过载剂与多核苷酸连接。载剂包含(i)至少一个“主链连接点”，如两个“骨干连接点”以及(ii)至少一个“系链连接点”。如本文所使用的，“主链连接点”是指官能团，例如羟基，或通常是可用于并适合将载剂结合到主链中的键，例如核糖核酸的磷酸酯或经修饰的磷酸酯(例如，含硫)主链。在一些实施例中，“系链连接点”(TAP)是指连接所选部分的环状载剂的组成环原子，例如碳原子或杂原子(不同于提供主链连接点的原子)。所述部分可以是例如碳水化合物，例如单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖或多糖。任选地，所选择的部分通过中间系链与环状载剂连接。因此，环状载剂将通常包含官能团，例如氨基，或通常提供适合于另一个化学实体(例如，组成环的配体)的结合或系留的键。
iRNA可以通过载剂与配体缀合，其中载剂可以是环状基团或无环基团。在一个实施例中，环状基团选自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪壬基、四氢呋喃基和十氢化萘。在一个实施例中，无环基团是丝氨酸醇主链或二乙醇胺主链PCT/US12/068491。
i.热不稳定修饰
在某些实施例中，可以通过在反义链的种子区掺入热不稳定修饰来优化dsRNA分子的RNA干扰。如本文所使用的,“种子区”意指参考链的5'端的位置2-9或参考链的5'端的位置2-8。例如，可以将热不稳定修饰掺入反义链的种子区，以减少或抑制脱靶基因沉默。
术语“热不稳定修饰”包含将导致dsRNA的总熔融温度(Tm)低于没有此类修饰的dsRNA的Tm的修饰。例如，热不稳定修饰可以将dsRNA的Tm降低1℃至4℃，如一摄氏度、二摄氏度、三摄氏度或四摄氏度。并且，术语“热不稳定核苷酸”是指含有一个或多个热不稳定修饰的核苷酸。
已经发现，具有反义链的dsRNA具有降低脱靶基因沉默活性的作用，所述反义链包括前9个核苷酸位置内的双链体的至少一个热不稳定修饰，从所述反义链的5'端开始计数。因此，在一些实施例中，反义链在反义链的5'区的前9个核苷酸位置内包括至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个或更多个)双链体的热不稳定修饰。在一些实施例中，双链体的一个或多个热不稳定修饰位于从反义链5'端起的位置2至9处，如位置4至8。在一些另外的实施例中，双链体的热不稳定修饰位于从反义链的5'端起的位置6、7或8处。在仍一些另外的实施例中，双链体的热不稳定修饰位于从反义链的5'端起的位置7处。在一些实施例中，双链体的热不稳定修饰位于从反义链的5'端起的位置2、3、4、5或9处。
iRNA药剂包括有义链和反义链，每条链具有14个至40个核苷酸。RNAi药剂可以由式(L)表示：
在式(L)中，B1、B2、B3、B1'、B2'、B3'和B4'各自独立地是含有选自由以下组成的组的修饰的核苷酸：2'-O-烷基、2'-取代的烷氧基、2'-取代的烷基、2'-卤基、ENA和BNA/LNA。在一个实施例中，B1、B2、B3、B1'、B2'、B3'和B4'各自含有2'-OMe修饰。在一个实施例中，B1、B2、B3、B1'、B2'、B3'和B4'各自含有2'-OMe或2'-F修饰。在一个实施例中，B1、B2、B3、B1'、B2'、B3'和B4'中的至少一个含有2'-O-N-甲基乙酰氨基(2'-O-NMA、2'O-CH2C(O)N(Me)H)修饰。
C1是一种热不稳定核苷酸，位于与反义链的种子区相对的位点(即位于反义链的5'端的位置2至8位处或参考链的5'端的位置2至9位处)处。例如，C1位于有义链的一个位置处，所述位置与反义链的5'端的位置2至8处的核苷酸配对。在一个实例中，C1位于从有义链的5'端起的位置15处。C1核苷酸具有热不稳定修饰，所述热不稳定修饰可以包含无碱基修饰；与双链体中的相对核苷酸的错配；以及糖修饰，如2'-脱氧修饰或无环核苷酸，例如解锁核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)。在一个实施例中，C1具有选自由以下组成的组的热不稳定修饰：i)与反义链中的相对核苷酸的错配；ii)选自由以下组成的组的无碱基修饰：
以及iii)选自由以下组成的组的糖修饰：
其中B是经修饰或未修饰的核碱基，R1和R2独立地是H、卤素、OR3或烷基；并且R3是H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖。在一个实施例中，C1中的热不稳定修饰是选自由以下组成的组的错配：G:G、G:A、G:U、G:T、A:A、A:C、C:C、C:U、C:T、U:U、T:T和U:T；并且任选地，错配对中的至少一个核碱基是2'-脱氧核碱基。在一个实例中，C1中的热不稳定修饰是GNA或/>
T1、T1'、T2'和T3'各自独立地表示包括修饰的核苷酸，所述修饰为核苷酸提供小于或等于2'-OMe修饰的空间体积的空间体积。空间体积是指修饰的空间效应的总和。用于确定核苷酸修饰的空间效应的方法是本领域技术人员已知的。修饰可以在核苷酸的核糖糖的2'位置处，或对非核糖核苷酸、无环核苷酸的修饰，或与核糖糖的2'位置相似或等效的核苷酸的主链，并且为核苷酸提供小于或等于2'-OMe修饰的空间体积的空间体积。例如，T1、T1'、T2'和T3'各自独立地选自DNA、RNA、LNA、2'-F和2'-F-5'-甲基。在一个实施例中，T1是DNA。在一个实施例中，T1'是DNA、RNA或LNA。在一个实施例中，T2'是DNA或RNA。在一个实施例中，T3'是DNA或RNA。
n1、n3和q1的长度独立地是4个至15个核苷酸。
n5、q3和q7的长度独立地是1个至6个核苷酸。
n4、q2和q6的长度独立地是1个至3个核苷酸；可替代地，n4是0。
q5的长度独立地是0个至10个核苷酸。
n2和q4的长度独立地是0个至3个核苷酸。
可替代地，n4的长度是0个至3个核苷酸。
在一个实施例中，n4可以是0。在一个实例中，n4是0，并且q2和q6是1。在另一个实例中，n4是0，并且q2和q6是1，在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在一个实施例中，n4、q2和q6各自是1。
在一个实施例中，n2、n4、q2、q4和q6各自是1。
在一个实施例中，当有义链的长度是19个至22个核苷酸，并且n4是1时，C1位于有义链的5'端的位置14至17处。在一个实施例中，C1位于有义链的5'端的位置15处
在一个实施例中，T3'从反义链的5'端的位置2处开始。在一个实例中，T3'位于从反义链的5'端起的位置2处，并且q6等于1。
在一个实施例中，T1'从反义链的5'端的位置14处开始。在一个实例中，T1'位于从反义链的5'端起的位置14处，并且q2等于1。
在一个示例性实施例中，T3'从反义链的5'端中的位置2开始，并且T1'从反义链的5'端中的位置14开始。在一个实例中，T3'从反义链的5'端中的位置2开始，并且q6等于1，并且T1'从反义链的5'端中的位置14开始，并且q2等于1。
在一个实施例中，T1'和T3'以11个核苷酸的长度分开(即不计数T1'和T3'核苷酸)。
在一个实施例中，T1'位于从反义链的5'端起的位置14处。在一个实例中，T1'位于从反义链的5'端起的位置14处，并且q2等于1，并且修饰位于2'位置处或提供比2'-OMe核糖更少的空间体积的非核糖、无环或主链中的位置处。
在一个实施例中，T3'位于从反义链的5'端起的位置2处。在一个实例中，T3'位于从反义链的5'端起的位置2处，并且q6等于1，并且修饰位于2'位置处或提供比2'-OMe核糖更少或相等的空间体积的非核糖、无环或主链中的位置处。
在一个实施例中，T1位于有义链的切割位点处。在一个实例中，当有义链的长度是19个至22个核苷酸，并且n2是1时，T1位于从有义链的5'端起的位置11处。在一个示例性实施例中，当有义链长度是19个至22个核苷酸，并且n2是1时，T1位于从有义链的5'端起的位置11处的有义链切割位点处，
在一个实施例中，T2'从反义链的5'端的位置6处开始。在一个实例中，T2'位于从反义链的5'端起的位置6至10处，并且q4是1。
在一个示例性实施例中，当有义链长度是19个至22个核苷酸，并且n2是1时，T1位于有义链的切割位点处，例如，在从有义链的5'端起的位置11处；T1'位于从反义链的5'端起的位置14处，并且q2等于1，并且对T1'的修饰位于核糖糖的2'位置处，或位于提供比2'-OMe核糖更少的空间体积的非核糖、无环或主链中位置处；T2'位于从反义链的5'端起的位置6至10处，并且q4是1；并且T3'位于从反义链的5'端起的位置2处，并且q6等于1，并且对T3'的修饰位于2'位置处或提供比2'-OMe核糖更少或相等的空间体积的非核糖、无环或主链中的位置处。
在一个实施例中，T2'从反义链的5'端的位置8处开始。在一个实例中，T2'从反义链的5'端的位置8开始，并且q4是2。
在一个实施例中，T2'从反义链的5'端的位置9处开始。在一个实例中，T2'位于从反义链的5'端起的位置9处，并且q4是1。
在一个实施例中，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是1，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是6，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-OMe，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在一个实施例中，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是1，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是6，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-OMe，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是2'，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是5，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-OMe，并且q7是1。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是2，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是5，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-OMe，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是6，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是7，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是2'，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是5，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-OMe，并且q7是1。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是6，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是7，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是2，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是5，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-OMe，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是1，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是6，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-OMe，并且q7是1。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是1，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是6，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-OMe，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是5，T2'是2'-F，q4是1，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是5，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-OMe，并且q7是1；任选地在反义链的3'端具有至少2个另外的TT。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是5，T2'是2'-F，q4是1，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是5，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-OMe，并且q7是1；任选地在反义链的3'端具有至少2个另外的TT；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5′端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在一个实施例中，B1是2′-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2′-F，q2是1，B2′是2′-OMe或2′-F，q3是4，q4是0，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是7，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-OMe，并且q7是1。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2′-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1′是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2′-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，q4是0，B3′是2′-OMe或2'-F，q5是7，T3′是2′-F，q6是1，B4′是2'-OMe，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从5′端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在一个实施例中，B1是2′-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是2′，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是5，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-F，并且q7是1。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1′是2′-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是2，B3′是2'-OMe或2'-F，q5是5，T3'是2'-F，q6是1，B4′是2′-F，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2′-OMe，n3是7，n4是0，B3是2′OMe，n5是3，B1′是2′-OMe或2′-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，q4是0，B3'是2'-OMe或2′-F，q5是7，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-F，并且q7是1。
在一个实施例中，B1是2′-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，q4是0，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是7，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-F，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
RNAi药剂可以在有义链或反义链的5'端包括含磷基团。5'端含磷基团可以是5'端磷酸酯(5'-P)、5'端硫代磷酸酯(5'-PS)、5-'端硫代磷酸二酯(5'-PS2)、5'端乙烯基膦酸酯(5'-VP)、5'端甲基膦酸酯(MePhos)或5'-脱氧-5'-C-丙二酰()。当5'端含磷基团是5'端基乙烯基膦酸酯(5'-VP)时，5'-VP可以是5'-E-VP异构体(即反式乙烯基膦酸酯/>)、5'-Z-VP异构体(即顺式乙烯基磷酸酯/>)或其混合物。
在一个实施例中，RNAi药剂包括在有义链的5'端处的含磷基团。在一个实施例中，RNAi药剂包括在反义链的5'端处的含磷基团。
在一个实施例中，RNAi药剂包括5'-P。在一个实施例中，RNAi药剂包括反义链中的5'-P。
在一个实施例中，RNAi药剂包括5'-PS。在一个实施例中，RNAi药剂包括在反义链中的5'-PS。
在一个实施例中，RNAi药剂包括5'-VP。在一个实施例中，RNAi药剂包括在反义链中的5'-VP。在一个实施例中，RNAi药剂包括在反义链中的5'-E-VP。在一个实施例中，RNAi药剂包括在反义链中的5'-Z-VP。
在一个实施例中，RNAi药剂包括5'-PS2。在一个实施例中，RNAi药剂包括在反义链中的5'-PS2。
在一个实施例中，RNAi药剂包括5'-PS2。在一个实施例中，RNAi药剂包括在反义链中的5'-脱氧-5'-C-丙二酰。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是2'，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是5，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-OMe，并且q7是1。RNAi药剂还包括5'-PS。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'OMe，n5是3，B1′是2′-OMe或2'-F，q1是9，T1′是2′-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2′-F，q3是4，T2′是2′-F，q4是2′，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是5，T3'是2′-F，q6是1，B4′是2′-OMe，并且q7是1。RNAi药剂还包括5′-P。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'OMe，n5是3，B1′是2′-OMe或2'-F，q1是9，T1′是2′-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2′-F，q3是4，T2′是2′-F，q4是2′，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是5，T3'是2′-F，q6是1，B4′是2′-OMe，并且q7是1。RNAi药剂还包括5′-VP。5'-VP可以是5'-E-VP、5'-Z-VP或其组合。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是2'，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是5，T3'是2′-F，q6是1，B4′是2′-OMe，并且q7是1。RNAi药剂还包括5'-PS2。
在一个实施例中，B1是2′-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是2'，B3'是2'-OMe或2′-F，q5是5，T3′是2′-F，q6是1，B4'是2'-OMe，并且q7是1。RNAi药剂还包括5'-脱氧-5'-C-丙二酰。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是2，B3′是2'-OMe或2′-F，q5是5，T3′是2′-F，q6是1，B4′是2'-OMe，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5′端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5′端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-P。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是2，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是5，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-OMe，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-PS。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是2，B3'是2'-OMe或2′-F，q5是5，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-OMe，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-VP。5'-VP可以是5'-E-VP、5′-Z-VP或其组合。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1′是2′-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是2，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是5，T3′是2'-F，q6是1，B4'是2'-OMe，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-PS2。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2′-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2′-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是2，B3'是2'-OMe或2′-F，q5是5，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-OMe，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-脱氧-5'-C-丙二酰。
在一个实施例中，B1是2′-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，q4是0，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是7，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2′-OMe，并且q7是1。RNAi药剂还包括5'-P。
在一个实施例中，B1是2′-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，q4是0，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是7，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-OMe，并且q7是1。dsRNA药剂还包括5'-PS。
在一个实施例中，B1是2′-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，q4是0，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是7，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-OMe，并且q7是1。RNAi药剂还包括5'-VP。5'-VP可以是5'-E-VP、5'-Z-VP或其组合。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，q4是0，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是7，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-OMe，并且q7是1。RNAi药剂还包括5'-PS2。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2′-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，q4是0，B3′是2′-OMe或2'-F，q5是7，T3′是2′-F，q6是1，B4′是2′-OMe，并且q7是1。RNAi药剂还包括5′-脱氧-5′-C-丙二酰。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2′-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1′是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，q4是0，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是7，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-OMe，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-P。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2′-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，q4是0，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是7，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-OMe，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-PS。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1′是2′-OMe或2′-F，q1是9，T1'是2′-F，q2是1，B2′是2′-OMe或2′-F，q3是4，q4是0，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是7，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-OMe，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-VP。5'-VP可以是5'-E-VP、5'-Z-VP或其组合。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，q4是0，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是7，T3'是2'-F，q6是1，B4′是2'-OMe，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-PS2。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2′-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1′是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2′-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，q4是0，B3′是2′-OMe或2′-F，q5是7，T3′是2′-F，q6是1，B4′是2′-OMe，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从5′端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从5′端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5′-脱氧-5′-C-丙二酰。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2′-OMe，n3是7，n4是0，B3是2′OMe，n5是3，B1′是2′-OMe或2′-F，q1是9，T1′是2′-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2′-F，q3是4，T2′是2′-F，q4是2'，B3′是2′-OMe或2′-F，q5是5，T3′是2′-F，q6是1，B4'是2'-F，并且q7是1。RNAi药剂还包括5'-P。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是2'，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是5，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-F，并且q7是1。RNAi药剂还包括5'-PS。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是2'，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是5，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-F，并且q7是1。RNAi药剂还包括5'-VP。5'-VP可以是5'-E-VP、5'-Z-VP或其组合。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是2'，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是5，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-F，并且q7是1。dsRNAi RNA药剂还包括5'-PS2。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是2'，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是5，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-F，并且q7是1。RNAi药剂还包括5'-脱氧-5'-C-丙二酰。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是2，B3'是2'-OMe或2′-F，q5是5，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-F，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5′端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-P。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2′-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2′-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是2，B3′是2′-OMe或2'-F，q5是5，T3'是2'-F，q6是1，B4′是2′-F，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-PS。
在一个实施例中，B1是2′-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是2，B3′是2'-OMe或2'-F，q5是5，T3'是2'-F，q6是1，B4′是2′-F，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-VP。5'-VP可以是5′-E-VP、5'-Z-VP或其组合。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2′-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是2，B3′是2′-OMe或2'-F，q5是5，T3'是2'-F，q6是1，B4′是2′-F，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-PS2。
在一个实施例中，B1是2′-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是2，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是5，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-F，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5′-脱氧-5′-C-丙二酰。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'OMe，n5是3，B1′是2′-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2′-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，q4是0，B3′是2′-OMe或2'-F，q5是7，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-F，并且q7是1。RNAi药剂还包括5'-P。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'OMe，n5是3，B1′是2′-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2′-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，q4是0，B3′是2′-OMe或2'-F，q5是7，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-F，并且q7是1。RNAi药剂还包括5′-PS。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'OMe，n5是3，B1′是2′-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2′-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，q4是0，B3′是2′-OMe或2'-F，q5是7，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-F，并且q7是1。RNAi药剂还包括5'-VP。5'-VP可以是5'-E-VP、5'-Z-VP或其组合。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，q4是0，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是7，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-F，并且q7是1。RNAi药剂还包括5'-PS2。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，q4是0，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是7，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-F，并且q7是1。RNAi药剂还包括5'-脱氧-5'-C-丙二酰。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，q4是0，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是7，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-F，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-P。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，q4是0，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是7，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-F，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-PS。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，q4是0，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是7，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-F，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-VP。5'-VP可以是5'-E-VP、5'-Z-VP或其组合。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，q4是0，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是7，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-F，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-PS2。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，q4是0，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是7，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-F，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-脱氧-5'-C-丙二酰。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是2，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是5，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-OMe，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-P和靶向配体。在一个实施例中，5'-P位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链的3'端处。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是2，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是5，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-OMe，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-PS和靶向配体。在一个实施例中，5'-PS位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链的3'端处。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是2，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是5，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-OMe，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-VP(例如，5'-E-VP、5'-Z-VP或其组合)以及靶向配体。
在一个实施例中，5'-VP位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链的3'端处。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是2，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是5，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-OMe，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-PS2和靶向配体。在一个实施例中，5'-PS2位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链的3'端处。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是2，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是5，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-OMe，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-脱氧-5'-C-丙二酰和靶向配体。在一个实施例中，5'-脱氧-5'-C-丙二酰位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链的3'端处。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，q4是0，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是7，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-OMe，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-P和靶向配体。在一个实施例中，5'-P位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链的3'端处。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，q4是0，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是7，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-OMe，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-PS和靶向配体。在一个实施例中，5'-PS位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链的3'端处。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，q4是0，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是7，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-OMe，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-VP(例如，5'-E-VP、5'-Z-VP或其组合)以及靶向配体。在一个实施例中，5'-VP位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链的3'端处。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，q4是0，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是7，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-OMe，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-PS2和靶向配体。在一个实施例中，5'-PS2位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链的3'端处。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，q4是0，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是7，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-OMe，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-脱氧-5'-C-丙二酰和靶向配体。在一个实施例中，5'-脱氧-5'-C-丙二酰位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链的3'端处。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是2，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是5，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-F，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-P和靶向配体。在一个实施例中，5'-P位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链的3'端处。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是2，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是5，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-F，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-PS和靶向配体。在一个实施例中，5'-PS位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链的3'端处。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是2，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是5，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-F，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-VP(例如，5'-E-VP、5'-Z-VP或其组合)以及靶向配体。在一个实施例中，5'-VP位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链的3'端处。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是2，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是5，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-F，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-PS2和靶向配体。在一个实施例中，5'-PS2位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链的3'端处。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是2，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是5，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-F，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-脱氧-5'-C-丙二酰和靶向配体。在一个实施例中，5'-脱氧-5'-C-丙二酰位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链的3'端处。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，q4是0，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是7，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-F，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-P和靶向配体。在一个实施例中，5'-P位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链的3'端处。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，q4是0，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是7，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-F，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-PS和靶向配体。在一个实施例中，5'-PS位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链的3'端处。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，q4是0，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是7，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-F，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-VP(例如，5'-E-VP、5'-Z-VP或其组合)以及靶向配体。在一个实施例中，5'-VP位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链的3'端处。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，q4是0，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是7，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-F，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-PS2和靶向配体。在一个实施例中，5'-PS2位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链的3'端处。
在一个实施例中，B1是2'-OMe或2'-F，n1是8，T1是2'F，n2是3，B2是2'-OMe，n3是7，n4是0，B3是2'-OMe，n5是3，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，q4是0，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是7，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-F，并且q7是1；在有义链的位置1至5(从有义链的5'端开始计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在位置1和2处有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置18至23(从反义链的5'端开始计数)内有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。RNAi药剂还包括5'-脱氧-5'-C-丙二酰和靶向配体。在一个实施例中，5'-脱氧-5'-C-丙二酰位于反义链的5'端处，并且靶向配体位于有义链的3'端处。
在一个特定实施例中，本发明的RNAi药剂包括：
(a)有义链，所述有义链具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)与3'端连接的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包括通过三价支链接头连接的三种GalNAc衍生物；以及
(iii)位置1、3、5、7、9至11、13、17、19和21处的2'-F修饰，以及位置2、4、6、8、12、14至16、18和20处的2'-OMe修饰(从5'端开始计数)；
以及
(b)反义链，所述反义链具有：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)位置1、3、5、9、11至13、15、17、19、21和23处的2'-OMe修饰，以及位置2、4、6至8、10、14、16、18、20和22处的2'F修饰(从5'端开始计数)；以及
(iii)核苷酸位置21与22之间以及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
其中dsRNA药剂在反义链的3'端处具有两个核苷酸突出端，并且在反义链的5'端处具有钝端。
在另一个特定实施例中，本发明的RNAi药剂包括：
(a)有义链，所述有义链具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)与3'端连接的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包括通过三价支链接头连接的三种GalNAc衍生物；
(iii)位置1、3、5、7、9至11，13、15、17、19和21处的2'-F修饰，以及位置2、4、6、8、12、14、16、18和20处的2'-OMe修饰(从5'端开始计数)；以及
(iv)核苷酸位置1与2之间以及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
以及
(b)反义链，所述反义链具有：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)位置1、3、5、7、9、11至13、15、17、19以及21至23处的2'-OMe修饰，以及位置2、4、6、8、10、14、16、18和20处的2'F修饰(从5'端开始计数)；以及
(iii)核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间以及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
其中RNAi药剂在反义链的3'端处具有两个核苷酸突出端，并且在反义链的5'端处具有钝端。
在另一个特定实施例中，本发明的RNAi药剂包括：
(a)有义链，所述有义链具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)与3'端连接的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包括通过三价支链接头连接的三种GalNAc衍生物；
(iii)位置1至6、8、10以及12至21处的2'-OMe修饰，位置7和9处的2'-F修饰，以及位置11处的脱氧核苷酸(例如，dT)(从5'端开始计数)；以及
(iv)核苷酸位置1与2之间以及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
以及
(b)反义链，所述反义链具有：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)位置1、3、7、9、11、13、15、17以及19至23处的2'-OMe修饰，以及位置2、4至6、8、10、12、14、16和18处的2'-F修饰(从5'端开始计数)；以及
(iii)核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间以及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
其中RNAi药剂在反义链的3'端处具有两个核苷酸突出端，并且在反义链的5'端处具有钝端。
在另一个特定实施例中，本发明的RNAi药剂包括：
(a)有义链，所述有义链具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)与3'端连接的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包括通过三价支链接头连接的三种GalNAc衍生物；
(iii)位置1至6、8、10、12、14以及16至21处的2'-OMe修饰，以及位置7、9、11、13和15处的2'-F修饰；以及
(iv)核苷酸位置1与2之间以及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
以及
(b)反义链，所述反义链具有：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)位置1、5、7、9、11、13、15、17、19以及21至23处的2'-OMe修饰，以及位置2至4、6、8、10、12、14、16、18和20处的2'-F修饰(从5'端开始计数)；以及
(iii)核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间以及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
其中RNAi药剂在反义链的3'端处具有两个核苷酸突出端，并且在反义链的5'端处具有钝端。
在另一个特定实施例中，本发明的RNAi药剂包括：
(a)有义链，所述有义链具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)与3'端连接的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包括通过三价支链接头连接的三种GalNAc衍生物；
(iii)位置1至9和12至21处的2'-OMe修饰，以及位置10和11处的2'-F修饰；以及
(iv)核苷酸位置1与2之间以及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
以及
(b)反义链，所述反义链具有：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)位置1、3、5、7、9、11至13、15、17、19以及21至23处的2'-OMe修饰，以及位置2、4、6、8、10、14、16、18和20处的2'-F修饰(从5'端开始计数)；以及
(iii)核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间以及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
其中RNAi药剂在反义链的3'端处具有两个核苷酸突出端，并且在反义链的5'端处具有钝端。
在另一个特定实施例中，本发明的RNAi药剂包括：
(a)有义链，所述有义链具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)与3'端连接的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包括通过三价支链接头连接的三种GalNAc衍生物；
(iii)位置1、3、5、7、9至11和13处的2'-F修饰，以及位置2、4、6、8、12以及14至21处的2'-OMe修饰；以及
(iv)核苷酸位置1与2之间以及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
以及
(b)反义链，所述反义链具有：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)位置1、3、5至7、9、11至13、15、17至19以及21至23处的2'-OMe修饰，以及位置2、4、8、10、14、16和20处的2'-F修饰(从5'端开始计数)；以及
(iii)核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间以及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
其中RNAi药剂在反义链的3'端处具有两个核苷酸突出端，并且在反义链的5'端处具有钝端。
在另一个特定实施例中，本发明的RNAi药剂包括：
(a)有义链，所述有义链具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)与3'端连接的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包括通过三价支链接头连接的三种GalNAc衍生物；
(iii)位置1、2、4、6、8、12、14、15、17以及19至21处的2'-OMe修饰，以及位置3、5、7、9至11、13、16和18处的2'-F修饰；以及
(iv)核苷酸位置1与2之间以及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
以及
(b)反义链，所述反义链具有：
(i)25个核苷酸的长度；
(ii)位置1、4、6、7、9、11至13、15、17以及19至23处的2'-OMe修饰、位置2、3、5、8、10、14、16和18处的2'-F修饰，以及位置24和25处的脱氧核苷酸(例如，dT)(从5'端开始计数)；以及
(iii)核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间以及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
其中RNAi药剂在反义链的3'端处具有四个核苷酸突出端，并且在反义链的5'端处具有钝端。
在另一个特定实施例中，本发明的RNAi药剂包括：
(a)有义链，所述有义链具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)与3'端连接的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包括通过三价支链接头连接的三种GalNAc衍生物；
(iii)位置1至6、8和12至21处的2'-OMe修饰，以及位置7和9至11处的2'-F修饰；以及
(iv)核苷酸位置1与2之间以及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
以及
(b)反义链，所述反义链具有：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)位置1、3至5、7、8、10至13、15以及17至23处的2'-OMe修饰，以及位置2、6、9、14和16处的2'-F修饰(从5'端开始计数)；以及
(iii)核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间以及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
其中RNAi药剂在反义链的3'端处具有两个核苷酸突出端，并且在反义链的5'端处具有钝端。
在另一个特定实施例中，本发明的RNAi药剂包括：
(a)有义链，所述有义链具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)与3'端连接的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包括通过三价支链接头连接的三种GalNAc衍生物；
(iii)位置1至6、8和12至21处的2'-OMe修饰，以及位置7和9至11处的2'-F修饰；以及
(iv)核苷酸位置1与2之间以及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
以及
(b)反义链，所述反义链具有：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)位置1、3至5、7、10至13、15以及17至23处的2'-OMe修饰，以及位置2、6、8、9、14和16处的2'-F修饰(从5'端开始计数)；以及
(iii)核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间以及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
其中RNAi药剂在反义链的3'端处具有两个核苷酸突出端，并且在反义链的5'端处具有钝端。
在另一个特定实施例中，本发明的RNAi药剂包括：
(a)有义链，所述有义链具有：
(i)19个核苷酸的长度；
(ii)与3'端连接的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包括通过三价支链接头连接的三种GalNAc衍生物；
(iii)位置1至4、6和10至19处的2'-OMe修饰，以及位置5和7至9处的2'-F修饰；以及
(iv)核苷酸位置1与2之间以及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
以及
(b)反义链，所述反义链具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)位置1、3至5、7、10至13、15以及17至21处的2'-OMe修饰，以及位置2、6、8、9、14和16处的2'-F修饰(从5'端开始计数)；以及
(iii)核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置19与20之间以及核苷酸位置20与21之间的硫代磷酸酯核苷酸间键(从5'端开始计数)；
其中RNAi药剂在反义链的3'端处具有两个核苷酸突出端，并且在反义链的5'端处具有钝端。
在某些实施例中，用于本发明的方法的iRNA是选自表2、表3、表5或表6中任一个表中列出的药剂的药剂。这些药剂可以进一步包括配体。
III.与配体缀合的iRNA
本发明的iRNA的RNA的另一种修饰涉及将一种或多种配体、部分或缀合物与iRNA化学连接，所述一种或多种配体、部分或缀合物增强iRNA的活性、细胞分布或细胞摄取(例如，进入细胞)。此类部分包含但不限于脂质部分，如胆固醇部分(Letsinger等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acid.Sci.USA)》,1989,86:6553-6556)。在其它实施例中，配体是胆酸(Manoharan等人,《生物有机与药物化学快报(Biorg.Med.Chem.Let)》,1994,4:1053-1060)，硫醚，例如，绿柱石-S-三苯基甲硫醇(Manoharan等人,《纽约科学院年鉴(Ann.N.Y.Acad.Sci.)》,1992,660:306-309；Manoharan等人,《生物有机与药物化学快报》,1993,3:2765-2770)，硫代胆固醇(Oberhauser等人,《核酸研究》,1992,20:533-538)，脂肪族链，例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人,《欧洲分子生物学组织杂志》,1991,10:1111-1118；Kabanov等人,《FEBS快报(FEBS Lett.)》,1990,259:327-330；Svinarchuk等人,《生物化学(Biochimie)》,1993,75:49-54)，磷脂，例如二十六烷基-rac-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-膦酸酯(Manoharan等人,《四面体快报(Tetrahedron Lett.)》,1995,36:3651-3654；Shea等人,《核酸研究》,1990,18:3777-3783)，磷脂、多胺或聚乙二醇链(Manoharan等人,《核苷与核苷酸(Nucleosides&Nucleotides)》,1995,14:969-973)或金刚烷乙酸(Manoharan等人,《四面体快报》,1995,36:3651-3654)，棕榈基部分(Mishra等人,《生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)》,1995,1264:229-237)，或十八胺或己基氨基-羰基氧基胆固醇部分(Crooke等人,《药理和实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther)》,1996,277:923-937)。
在某些实施例中，配体改变其掺入的iRNA药剂的分布、靶向或寿命。在一些实施例中，例如，与不存在此类配体的物种相比，配体为选定靶标(例如，分子、细胞或细胞类型)、区室(例如，细胞或器官区室、组织、器官或身体区)提供增强的亲和力。在一些实施例中，配体不参与双链体核酸中的双链体配对。
配体可以包含天然存在的物质，如蛋白质(例如，人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如，葡聚糖、支链淀粉、几丁质、壳聚糖、菊粉、环糊精、N-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰基半乳糖胺或透明质酸)；或脂质。配体也可以是重组分子或合成分子，如合成聚合物，例如合成聚氨基酸。聚氨基酸的实例包含聚氨基酸，即聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚膦嗪。多胺的实例包含：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、多胺、假肽-多胺、拟肽多胺、树枝状多胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、多胺的季盐或α螺旋肽。
配体还可以包含靶向基团，例如细胞或组织靶向剂，例如凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如与特定细胞类型(如肾细胞)结合的抗体。靶向基团可以是促甲状腺素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性剂蛋白A、粘蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化多氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸酯、聚谷氨酸酯、聚天冬氨酸酯、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶酸、维生素B12、维生素A、生物素或RGD肽或RGD肽模拟物。在某些实施例中，配体是多价半乳糖，例如，N-乙酰基-半乳糖胺。
配体的其它实例包含染料、嵌入剂(例如，吖啶)、交联剂(例如，补骨脂烯、丝裂霉素C(mitomycin C))、卟啉(TPPC4、德克萨斯卟啉(texaphyrin)、扩环卟啉(Sapphyrin))、多环芳香族烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如，EDTA)、亲脂性分子(例如，胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)、肽缀合物(例如，触角足突变肽、Tat肽)、烷化剂、磷酸盐、氨基、巯基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、经取代的烷基、放射性标记的标志物、酶、半抗原(例如，生物素)、转运/吸收促进剂(例如，阿司匹林(aspirin)、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环化合物的Eu3+络合物)、二硝基苯基、HRP或AP。
配体可以是蛋白质(例如，糖蛋白)或肽(例如，对共配体具有特异性亲和力的分子)或抗体(例如，与特定细胞类型，如肝细胞结合的抗体)。配体还可以包含激素和激素受体。配体还可以包含非肽物质，如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖或多价岩藻糖。配体可以是例如脂多糖、p38MAP激酶的激活剂或NF-κB的激活剂。
配体可以是物质，例如药物，其可以例如通过破坏细胞的细胞骨架，例如通过破坏细胞的微管、微丝或中间丝来增加iRNA药剂摄取到细胞中。药物可以是例如紫杉醇(taxol)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、细胞松弛素(cytochalasin)、诺考达唑(nocodazole)、杰斯内酯(japlakinolide)、拉春库林A(latrunculin A)、毒伞素(phalloidin)、斯文赫利A(swinholide A)、印丹诺辛(indanocine)或麦司文(myoservin)。
在一些实施例中，与如本文所描述的iRNA连接的配体充当药代动力学调节剂(PK调节剂)。PK调节剂包含亲脂性物质、胆汁酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白质结合剂、PEG、维生素等。示例性PK调节剂包含但不限于胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰基甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生(naproxen)、布洛芬(ibuprofen)、维生素E、生物素。还已知包括许多硫代磷酸酯键的与血清蛋白结合的寡核苷酸，因此在主链中包括多个硫代磷酸酯键的短寡核苷酸(例如，具有约5个碱基、10个碱基、15个碱基或20个碱基的寡核苷酸)也适于本发明作为配体(例如，作为PK调节配体)。另外，与血清组分(例如，血清蛋白)结合的适体也适于用作本文所描述的实施例中的PK调节配体。
本发明的配体缀合的iRNA可以通过使用具有侧反应功能的寡核苷酸来合成，如源自连接分子连接到寡核苷酸上的寡核苷酸(如下文所描述的)。这种反应性寡核苷酸可以直接与可商购获得的配体、合成的带有多种保护基团中的任一种的配体、或具有与其连接的连接部分的配体反应。
本发明的缀合物中使用的寡核苷酸可以通过众所周知的固相合成技术方便且常规地制备。用于此类合成的设备由若干个供应商销售，例如，包含Applied(加利福尼亚州福斯特市(Foster City,Calif.))。可以另外或可替代地采用本领域已知的用于此类合成的任何其它方法。使用类似技术来制备其它寡核苷酸(如硫代磷酸酯和烷基化的衍生物)也是已知的。
在本发明的配体缀合的iRNA和带有序列特异性连接的核苷的配体分子中，寡核苷酸和寡核苷可以利用标准核苷酸或核苷前体或已经带有连接部分的核苷酸或核苷缀合物前体、已经带有配体分子的配体-核苷酸或核苷缀合物前体或带有构建块的非核苷配体组装在合适的DNA合成器上。
当使用已经带有连接部分的核苷酸缀合物前体时，通常完成序列特异性连接核苷的合成，并且然后配体分子与连接部分反应以形成配体缀合的寡核苷酸。在一些实施例中，本发明的寡核苷酸或连接的核苷通过自动合成器合成，使用源自配体-核苷缀合物的磷脒以及可商购获得的和常规用于寡核苷酸合成的标准磷脒和非标准磷酰胺。
A.脂质缀合物
在某些实施例中，配体或缀合物是脂质或基于脂质的分子。
在一个实施例中，此类脂质或基于脂质的分子与血清蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)结合。HSA结合配体允许缀合物分布到靶组织，例如身体的非肾靶组织。例如，靶组织可以是肝，包含肝的实质细胞。可以与HSA结合的其它分子也可以用作配体。例如，可以使用萘普生或阿司匹林。脂质或基于脂质的配体可以(a)增加对缀合物降解的抗性，(b)增加靶向或转运到靶细胞或细胞膜中，或(c)可以用于调节与血清蛋白，例如HSA的结合HSA。
基于脂质的配体可以用于抑制(例如，控制)缀合物与靶组织的结合。例如，更强地与HSA结合的脂质或基于脂质的配体将较不可能被靶向到肾脏，并且因此较不可能从身体清除。较不强烈地与HSA结合的脂质或基于脂质的配体可以用于将缀合物靶向到肾脏。
在某些实施例中，基于脂质的配体与HSA结合。在一个实施例中，其以足够的亲和力与HSA结合，使得缀合物将分布到非肾组织。然而，优选的是亲和力不要强到HSA配体结合不能被逆转。
在其它实施例中，基于脂质的配体与HSA结合很弱或根本不结合。在一个实施例中，缀合物将被分配到肾脏。靶向到肾细胞的其它部分也可以代替基于脂质的配体或除其之外使用。
另一方面，配体是被靶细胞(例如，增殖细胞)摄取的部分，例如维生素。这些对于治疗以不期望的细胞增殖为特征的疾病特别有用，例如恶性或非恶性类型的疾病，例如癌细胞。示例性维生素包含维生素A、E和K。包含的其它示例性维生素是B族维生素，例如叶酸、B12、核黄素、生物素、吡哆醛或被靶细胞(如肝细胞)摄取的其它维生素或营养素。还包含HSA和低密度脂蛋白(LDL)。
B.细胞渗透剂
另一方面，配体是细胞渗透剂，如螺旋细胞渗透剂。在一个实施例中，药剂是两亲性的。示例性药剂是肽，如tat或触角足突变肽。如果药剂是肽，那么其可以被修饰，包含肽基模拟物、反演体、非肽或假肽键和使用D-氨基酸。在一个实施例中，螺旋剂是α螺旋剂，其具有亲脂性和疏脂性相。
配体可以是肽或肽模拟物。肽模拟物(在本文中也称为寡肽模拟物)是能够折叠成类似于天然肽的所定义三维结构的分子。肽和肽模拟物与iRNA药剂的连接可能影响iRNA的药代动力学分布，如通过增强细胞识别和吸收。肽或肽模拟物部分的长度可以是约5个至50个氨基酸，例如约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个氨基酸长。
肽或肽模拟物可以是例如细胞渗透肽、阳离子肽、两亲性肽或疏水肽(例如，主要由Tyr、Trp或Phe组成)。肽部分可以是树状体肽、约束肽或交联肽。在另一个替代方案中，肽部分可以包含疏水性膜易位序列(MTS)。示例性疏水性含MTS肽是具有氨基酸序列AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO:14)的RFGF。含疏水性MTS的RFGF类似物(例如，氨基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO:15))也可以是靶向部分。肽部分可以是“递送”肽，所述肽可以携带包含肽、寡核苷酸和蛋白质在内的大极性分子穿过细胞膜。例如，已发现来自HIV Tat蛋白(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO:16)和果蝇触角足突变蛋白(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ IDNO:17))的序列能够充当递送肽。肽或肽模拟物可以由DNA的随机序列编码，如从噬菌体展示文库或一珠一化合物(OBOC)组合文库中鉴定的肽(Lam等人,《自然》,354:82-84,1991)。为了细胞靶向目的，通过掺入的单体单元与dsRNA药剂连接的肽或肽模拟物的实例是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)-肽或RGD模拟物。肽部分的长度可以在约5个氨基酸至约40个氨基酸的范围内。肽部分可以具有结构修饰，如增加稳定性或直接构象特性。可以使用下面描述的任何结构修饰。
用于本发明的组合物和方法的RGD肽可以是线性或环状的，并且可以被修饰，例如糖基化或甲基化，以促进靶向特定组织。含有RGD的肽和肽二聚体可以包含D-氨基酸以及合成的RGD模拟物。除了RGD，还可以使用靶向整合素配体的其它部分，例如PECAM-1或VEGF。
“细胞渗透肽”能够渗透细胞，例如微生物细胞(如细菌或真菌细胞)或哺乳动物细胞(如人细胞)。微生物细胞渗透肽可以是例如α-螺旋线性肽(例如，LL-37或Ceropin P1)、含二硫键的肽(例如，α-防御素、β-防御素或细菌素)或仅含有一个或两个主要氨基酸的肽(例如，PR-39或吲哚西丁(indolicidin))。细胞渗透肽还可以包含核定位信号(NLS)。例如，细胞渗透肽可以是二分两亲性肽，如MPG，其源自HIV-1gp41的融合肽结构域和SV40大T抗原的NLS(Simeoni等人,《核酸研究》,31:2717-2724,2003)。
C.碳水化合物缀合物
在本发明的组合物和方法的一些实施例中，iRNA进一步包括碳水化合物。碳水化合物缀合的iRNA对于核酸的体内递送以及适于如本文所描述的体内治疗用途的组合物而言是有利的。如本文所使用的，“碳水化合物”是指化合物，所述化合物是碳水化合物，所述碳水化合物本身由一个或多个单糖单元构成，所述单糖单元具有至少6个碳原子(可以是直链、支链或环状)，其中氧、氮或硫原子与每个碳原子结合；或是具有碳水化合物部分作为其部分的化合物，所述碳水化合物部分由一个或多个单糖单元构成，每个单糖单元具有至少六个碳原子(可以是直链、支链或环状)，其中氧、氮或硫原子与每个碳原子结合。代表性碳水化合物包含糖(单糖、二糖、三糖和含有约4个、5个、6个、7个、8个或9个单糖单元的寡糖)和多糖如淀粉、糖原、纤维素和多糖胶。特定单糖包含C5及以上(例如，C5、C6、C7或C8)糖；二糖和三糖包含具有两个或三个单糖单元(例如，C5、C6、C7或C8)的糖。
在某些实施例中，用于本发明的组合物和方法的碳水化合物缀合物是单糖。
在某些实施例中，单糖是N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。包括一种或多种N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)衍生物的GalNAc缀合物在例如US 8,106,022中进行了描述，所述文献的完整内容特此通过引用的方式并入本文。在一些实施例中，GalNAc缀合物用作将iRNA靶向特定细胞的配体。在一些实施例中，GalNAc缀合物将iRNA靶向肝细胞，例如通过充当肝细胞(例如，肝细胞(hepatocyte))的去唾液酸糖蛋白受体的配体。
在一些实施例中，碳水化合物缀合物包括一种或多种GalNAc衍生物。GalNAc衍生物可以通过接头连接，例如二价或三价支链接头。在一些实施例中，GalNAc缀合物与有义链的3'端缀合。在一些实施例中，GalNAc缀合物通过接头，例如本文所描述的接头与iRNA药剂缀合(例如，与有义链的3′端)。在一些实施例中，GalNAc缀合物与有义链的5′端缀合。在一些实施例中，GalNAc缀合物通过接头，例如本文所描述的接头与iRNA药剂缀合(例如，与有义链的5′端)。
在本发明的某些实施例中，GalNAc或GalNAc衍生物通过单价接头与本发明的iRNA药剂连接。在一些实施例中，GalNAc或GalNAc衍生物通过二价接头与本发明的iRNA药剂连接。在本发明的又其它实施例中，GalNAc或GalNAc衍生物通过三价接头与本发明的iRNA药剂连接。在本发明的其它实施例中，GalNAc或GalNAc衍生物通过四价接头与本发明的iRNA药剂连接。
在某些实施例中，本发明的双链RNAi药剂包括与iRNA药剂连接的一种GalNAc或GalNAc衍生物。在某些实施例中，本发明的双链RNAi药剂包括多个(例如，2个、3个、4个、5个或6个)GalNAc或GalNAc衍生物，每个所述衍生物通过多个单价接头独立地与双链RNAi药剂的多个核苷酸连接。
在一些实施例中，例如，当本发明的iRNA药剂的两条链是一个较大分子的一部分时，所述较大分子由一条链的3′端和相应的另一条链的5′端之间的不间断核苷酸链连接，形成包括多个未配对核苷酸的发夹环，发夹环内的每个未配对核苷酸可以独立地包括通过单价接头连接的GalNAc或GalNAc衍生物。发夹环也可以由双链体的一条链中的延伸突出端形成。
在一些实施例中，例如，当本发明的iRNA药剂的两条链是一个较大分子的一部分时，所述较大分子由一条链的3′端和相应的另一条链的5′端之间的不间断核苷酸链连接，形成包括多个未配对核苷酸的发夹环，发夹环内的每个未配对核苷酸可以独立地包括通过单价接头连接的GalNAc或GalNAc衍生物。发夹环也可以由双链体的一条链中的延伸突出端形成。
在一个实施例中，用于本发明的组合物和方法的碳水化合物缀合物选自由以下组成的组：
/>
/>
/>
/>
其中Y是O或S，并且n是3至6(式XXIV)；/>
其中Y是O或S，并且n是3至6(式XXV)；
其中X是O或S(式XXVII)；/>
/>
以及
在另一个实施例中，用于本发明的组合物和方法的碳水化合物缀合物是单糖。在一个实施例中，单糖是N-乙酰基半乳糖胺，如
在一些实施例中，RNAi药剂通过接头与碳水化合物缀合物连接，如以下示意图所示，其中X是O或S。
在一些实施例中，RNAi药剂与如表1中定义的L96缀合，并且如下所示：
用于本文所描述的实施例中的另一代表性碳水化合物缀合物包含但不限于：
(式XXXVI)，当X或Y中的一个是寡核苷酸时，另一个是氢。
在一些实施例中，合适的配体是WO 2019/055633中公开的配体，所述文献的全部内容通过引用并入本文。在一个实施例中，配体包括以下结构：
在本发明的某些实施例中，GalNAc或GalNAc衍生物通过单价接头与本发明的iRNA药剂连接。在一些实施例中，GalNAc或GalNAc衍生物通过二价接头与本发明的iRNA药剂连接。在本发明的又其它实施例中，GalNAc或GalNAc衍生物通过三价接头与本发明的iRNA药剂连接。
在一个实施例中，本发明的双链RNAi药剂包括与iRNA药剂连接的一种或多种GalNAc或GalNAc衍生物。GalNAc可以通过有义链或反义链上的接头与任何核苷酸连接。GalNac可以与有义链的5′端、有义链的3′端、反义链的5′端或反义链的3′端连接。在一个实施例中，GalNAc例如通过三价接头与有义链的3′端连接。
在其它实施例中，本发明的双链RNAi药剂包括多个(例如，2个、3个、4个、5个或6个)GalNAc或GalNAc衍生物，每个所述衍生物通过多个接头(例如，单价接头)独立地与双链RNAi药剂的多个核苷酸连接。
在一些实施例中，例如，当本发明的iRNA药剂的两条链是一个较大分子的一部分时，所述较大分子由一条链的3′端和相应的另一条链的5′端之间的不间断核苷酸链连接，形成包括多个未配对核苷酸的发夹环，发夹环内的每个未配对核苷酸可以独立地包括通过单价接头连接的GalNAc或GalNAc衍生物。
在一些实施例中，碳水化合物缀合物进一步包括一个或多个如上文所描述的另外的配体，如但不限于PK调节剂或细胞渗透肽。
适用于本发明的另外的碳水化合物缀合物和接头包含PCT公开第WO 2014/179620号和第WO 2014/179627号中所描述的那些，所述文献中的每一个的全部内容通过引用并入本文。
D.接头
在一些实施例中，本文所描述的缀合物或配体可以通过各种接头与iRNA寡核苷酸连接，所述接头可以是可切割的或不可切割的。
术语“接头”或“连接基团”意指连接化合物两部分的有机部分，例如，共价连接化合物的两部分。接头通常包括直接键或原子，如氧或硫；单元，如NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH或原子链，如但不限于经取代的或未经取代的烷基、经取代的或未经取代的烯基、经取代的或未经取代的炔基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环烷基、杂环烯基、杂环炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳烷基、烷基芳烯基、烷基芳炔基、烯基芳烷基、烯基芳烯基、烯基芳炔基、炔基芳烷基、炔基芳烯基、炔基芳炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环烷基、烷基杂环烯基、烷基杂环炔基、烯基杂环烷基、烯基杂环烯基、烯基杂环炔基、炔基杂环烷基、炔基杂环烯基、炔基杂环炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂芳基，所述一个或多个亚甲基可以被以下中断或封端：O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、经取代的或未经取代的芳基、经取代的或未经取代的杂芳基或经取代的或未经取代的杂环基；其中R8是氢、酰基、脂肪族或经取代的脂肪族。在一个实施例中，接头是约1个至24个原子、2个至24个、3个至24个、4个至24个、5个至24个、6个至24个、6个至18个、7个至18个、8个至18个、7个至17个、8个至17个、6个至16个、7个至17个或8个至16个原子。
可切割连接基团是在细胞外部充分稳定的连接基团，但其在进入靶细胞之后切割以释放接头保持在一起的两个部分。在示例性实施例中，可切割连接基团在靶细胞中或在第一参考条件下(其可以例如被选择以模拟或代表细胞内条件)的切割是在受试者的血液中或在第二参考条件下(其可以例如被选择以模拟或代表在血液或血清中发现的条件)的切割速度的至少约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更多，或至少100倍。
可切割连接基团易受切割剂(例如，pH、氧化还原电位或降解分子的存在)影响。一般来说，切割剂在细胞内部比在血清或血液中更普遍，或以更高的水平或活性找到。此类降解剂的实例包含：针对特定底物选择的或不具有底物特异性的氧化还原剂，包含例如存在于细胞中的氧化或还原酶或还原剂，如硫醇，所述氧化或还原酶或还原剂可以通过还原降解氧化还原可切割连接基团；酯酶；可以产生酸性环境的核内体或药剂，例如产生pH是五或更低的那些核内体或药剂；可以通过充当广义酸、肽酶(其可以是底物特异性的)和磷酸酶来水解或降解酸可切割连接基团的酶。
可切割键基团，如二硫键可能对pH敏感。人血清的pH是7.4，而细胞内pH的平均值略低，范围是约7.1-7.3。核内体具有更酸性的pH，范围是5.5-6.0，并且溶酶体具有甚至更酸性的pH，是约5.0。一些接头将具有可切割连接基团，所述连接基团在所选pH下切割，由此从细胞内的配体释放阳离子脂质，或释放到细胞的期望的区室中。
接头可以包含可由特定酶切割的可切割连接基团。并入到接头中的可切割连接基团的类型可以取决于所靶向的细胞。例如，肝脏靶向配体可以通过包含酯基的接头与阳离子脂质连接。肝细胞富含酯酶，并且因此接头在肝细胞中将比在非富含酯酶的细胞类型中更高效地切割。其它富含酯酶的细胞类型包含肺、肾皮质和睾丸中的细胞。
当靶向富含肽酶的细胞类型，如肝细胞和滑膜细胞时，可以使用含有肽键的接头。
一般来说，可以通过测试降解剂(或条件)切割候选连接基团的能力来评价候选可切割连接基团的适合性。还将期望测试候选可切割连接基团抵抗在血液中或当与其它非靶组织接触时切割的能力。因此，可以确定第一条件与第二条件之间对切割的相对易感性，其中选择第一条件以指示靶细胞中的切割，并且选择第二条件以指示其它组织或生物流体，例如血液或血清中的切割。评价可以在无细胞系统、在细胞、在细胞培养物、在器官或组织培养物或在整只动物中进行。在无细胞或培养条件下进行初始评价并且通过在整只动物中进一步评价来确认可以是有用的。在某些实施例中，有用的候选化合物在细胞中(或在被选择以模拟细胞内条件的体外条件下)的切割是在血液或血清中(或在被选择以模拟细胞外条件的体外条件下)的切割速度的至少约2倍、4倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。
i.氧化还原可切割连接基团
在某些实施例中，可切割连接基团是在还原或氧化时切割的氧化还原可切割连接基团。还原性可切割连接基团的实例是二硫化物连接基团(-S-S-)。为了确定候选可切割连接基团是否是合适的“还原性可切割连接基团”，或例如是否适合与特定iRNA部分和特定靶向剂一起使用，可以参考本文所描述的方法。例如，可以通过使用本领域已知的试剂与二硫苏糖醇(DTT)或其它还原剂一起温育来评估候选物，这模拟将在细胞(例如，靶细胞)中观察到的切割速率。候选物还可以在被选择以模拟血液或血清条件的条件下评价。在一个中，候选化合物在血液中被切割至多约10％。在其它实施例中，有用的候选化合物在细胞中(或在被选择以模拟细胞内条件的体外条件下)的降解是在血液中(或在被选择以模拟细胞外条件的体外条件下)的切割速度的至少约2倍、4倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或约100倍。候选化合物的切割速率可以使用标准酶动力学测定在被选择以模拟细胞内介质的条件下确定并且与被选择以模拟细胞外介质的条件进行比较。
ii.基于磷酸酯的可切割连接基团
在其它实施例中，可切割接头包括基于磷酸酯的可切割连接基团。基于磷酸酯的可切割连接基团被降解或水解磷酸酯基团的药剂切割。细胞中使磷酸酯基团切割的药剂的实例为细胞中的酶，如磷酸酶。基于磷酸酯的连接基团的实例是-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-，其中Rk在每次出现时可以独立地是C1-C20烷基、C1-C20卤代烷基、C6-C10芳基或C7-C12芳烷基。示例性实施例包含-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-和-O-P(S)(H)-S-。在某些实施例中，基于磷酸酯的连接基团是-O-P(O)(OH)-O-。可以使用与上文所描述的方法类似的方法来评价这些候选物。
iii.酸可切割连接基团
在其它实施例中，可切割接头包括基于酸可切割连接基团。酸可切割连接基团是在酸性条件下被切割的连接基团。在某些实施例中，酸可切割连接基团在pH是约6.5或更低(例如，约6.0、5.5、5.0或更低)的酸性环境中或通过可以充当广义酸的药剂，如酶被切割。在细胞中，特定低pH细胞器，如核内体和溶酶体可以提供酸可切割连接基团的切割环境。酸可切割连接基团的实例包含但不限于腙、酯和氨基酸的酯。酸可切割基团可以具有通式-C＝NN-、C(O)O或-OC(O)。示例性实施例是与酯的氧连接的碳(烷氧基)是芳基、经取代的烷基或叔烷基，如二甲基戊基或叔丁基。可以使用与上文所描述的方法类似的方法来评价这些候选物。
iv.基于酯的连接基团
在其它实施例中，可切割接头包括基于酯的可切割连接基团。基于酯的可切割连接基团通过细胞中的酶，如酯酶和酰胺酶切割。基于酯的可切割连接基团的实例包含但不限于亚烷基、亚烯基和亚炔基的酯。酯可切割连接基团具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。可以使用与上文所描述的方法类似的方法来评价这些候选物。
v.基于肽的切割基团
在又其它实施例中，可切割接头包括基于肽的可切割连接基团。基于肽的可切割连接基团通过细胞中的酶，如肽酶和蛋白酶切割。基于肽的可切割连接基团是在氨基酸之间形成以产生寡肽(例如，二肽、三肽等)和多肽的肽键。基于肽的可切割基团不包含酰胺基(-C(O)NH-)。酰胺基可以在任何亚烷基、亚烯基或亚炔基之间形成。肽键是在氨基酸之间形成以产生肽和蛋白质的特殊类型的酰胺键。基于肽的切割基团通常限于在产生肽和蛋白质的氨基酸之间形成的肽键(即酰胺键)并且不包含整个酰胺官能团。基于肽的可切割连接基团具有通式–NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA和RB是两个相邻氨基酸的R基团。可以使用与上文所描述的方法类似的方法来评价这些候选物。
在一些实施例中，本发明的iRNA通过接头与碳水化合物缀合。iRNA碳水化合物缀合物与本发明的组合物和方法的接头的非限制性实例包含但不限于：
/>
以及
(式XLIV)，当X或Y中的一个是寡核苷酸时，另一个是氢。
在本发明的组合物和方法的某些实施例中，配体是通过二价或三价支链接头连接的一个或多个“GalNAc”(N-乙酰基半乳糖胺)衍生物。
在一个实施例中，本发明的dsRNA与二价或三价支链接头缀合，所述二价或三价支链接头选自由式(XLV)至(XLVI)中任一项所示的结构组成的组：
/>
其中：
q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B和q5C在每次出现时独立地表示0-20，并且其中重复单元可以相同或不同；
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C在每次出现时各自独立地是不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；
Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C在每次出现时独立地是不存在、亚烷基、经取代的亚烷基，其中一个或多个亚甲基可以被以下中的一个或多个中断或封端：O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R')＝C(R”)、C≡C或C(O)；
R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C每次出现时各自独立地是不存在、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH＝N-O、 或杂环基；
L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B和L5C表示配体；即每次出现时各自独立地是单糖(如GalNAc)、二糖、三糖、四糖、寡糖或多糖；并且Ra是H或氨基酸侧链。三价缀合的GalNAc衍生物特别适用于与RNAi药剂一起使用以抑制靶基因的表达，如式(XLIX)的表达：
其中L5A、L5B和L5C表示单糖，如GalNAc衍生物。
适合的缀合GalNAc衍生物的二价和三价支链接头基团的实例包含但不限于上文所提及的式II、式VII、式XI、式X和式XIII的结构。
教导RNA缀合物的制备的代表性美国专利包含但不限于美国专利第4,828,979号；第4,948,882号；第5,218,105号；第5,525,465号；第5,541,313号；第5,545,730号；第5,552,538号；第5,578,717号、第5,580,731号；第5,591,584号；第5,109,124号；第5,118,802号；第5,138,045号；第5,414,077号；第5,486,603号；第5,512,439号；第5,578,718号；第5,608,046号；第4,587,044号；第4,605,735号；第4,667,025号；第4,762,779号；第4,789,737号；第4,824,941号；第4,835,263号；第4,876,335号；第4,904,582号；第4,958,013号；第5,082,830号；第5,112,963号；第5,214,136号；第5,082,830号；第5,112,963号；第5,214,136号；第5,245,022号；第5,254,469号；第5,258,506号；第5,262,536号；第5,272,250号；第5,292,873号；第5,317,098号；第5,371,241号、第5,391,723号；第5,416,203号、第5,451,463号；第5,510,475号；第5,512,667号；第5,514,785号；第5,565,552号；第5,567,810号；第5,574,142号；第5,585,481号；第5,587,371号；第5,595,726号；第5,597,696号；第5,599,923号；第5,599,928号；第5,688,941号；第6,294,664号；第6,320,017号；第6,576,752号；第6,783,931号；第6,900,297号；第7,037,646号；以及第8,106,022号，所述美国专利中的每一个的全部内容特此通过引用并入本文。
不需要均匀地修饰给定化合物中的所有位置，并且事实上，可以将上述修饰中的多于一个修饰并入单一化合物中或甚至iRNA内的单个核苷处。本发明还包含作为嵌合化合物的iRNA化合物。
在本发明的上下文中，“嵌合”iRNA化合物或“嵌合体”是iRNA化合物，如dsRNAi药剂，其含有两个或更多个化学上不同的区，每个区由至少一个单体单元构成，即在dsRNA化合物的情况下的核苷酸。这些iRNA通常含有至少一个区，其中RNA被修饰以赋予iRNA增加的对核酸酶降解的抗性、增加的细胞摄取或增加的对靶核酸的结合亲和力。iRNA的另外的区可以作为能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂交体的酶的底物。举例来说，RNase H是细胞核酸内切酶，所述细胞核酸内切酶切割RNA:DNA双链体的RNA链。因此，RNase H的激活使RNA靶标切割，由此大大增强iRNA抑制基因表达的效率。因此，与杂交到同一靶标区的硫代磷酸酯脱氧dsRNA相比，当使用嵌合dsRNA时，使用更短的iRNA通常可以获得相当的结果。可以通过凝胶电泳和必要时本领域已知的相关核酸杂交技术常规检测RNA靶标的切割。
在某些情况下，iRNA的RNA可以被非配体基团修饰。许多非配体分子已与iRNA缀合以增强iRNA的活性、细胞分布或细胞摄取，并且进行此类缀合的程序可在科学文献中获得。此类非配体部分已经包含脂质部分，如胆固醇(Kubo，T.等人,《生物化学和生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)》,2007,365(1):54-61；Letsinger等人,《美国国家科学院院刊》,1989,86:6553)，胆酸(Manoharan等人,《生物有机与药物化学快报》,1994,4:1053)，硫醚，例如，己基-S-三苯基甲硫醇(Manoharan等人,《纽约科学学术年报》,1992,660:306；Manoharan等人,《生物有机与药物化学快报》,1993,3:2765)，硫代胆固醇(Oberhauser等人,《核酸研究》,1992,20:533)，脂肪族链，例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人,《欧洲分子生物学组织杂志》,1991,10:111；Kabanov等人,《FEBS快报》,1990,259:327；Svinarchuk等人,《生物化学》,1993,75:49)，磷脂，例如二-十六烷基-rac-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan等人,《四面体快报》,1995,36:3651；Shea等人,《核酸研究》,1990,18:3777)，磷脂、多胺或聚乙二醇链(Manoharan等人,《核苷与核苷酸》,1995,14:969)或金刚烷乙酸(Manoharan等人,《四面体快报》,1995,36:3651)，棕榈基部分(Mishra等人,《生物化学与生物物理学报》,1995,1264:229)，或十八胺或己基氨基-羰基-羰基氧基胆固醇部分(Crooke等人,《药理和实验治疗学杂志》,1996,277:923)。上面列出了教导制备此类RNA缀合物的代表性美国专利。典型的缀合方案涉及合成在序列的一个或多个位置处具有氨基接头的RNA。随后使用适当偶联试剂或激活试剂使氨基与所缀合的分子反应。缀合反应可以在RNA仍与固相载体结合的情况下或在RNA切割之后在溶液相中进行。通过HPLC纯化RNA缀合物通常产生纯缀合物。
IV.本发明的iRNA的递送
将本发明的iRNA递送到细胞，例如受试者(如人受试者(例如，有需要的受试者，如易受CTNNB1相关病症(例如，癌症，例如肝细胞癌)影响或被诊断患有所述病症的受试者))体内的细胞可以通过多种不同方式实现。例如，可以通过在体外或体内使细胞与本发明的iRNA接触来进行递送。还可以通过向受试者施用包括iRNA的组合物(例如，dsRNA)直接进行体内递送。可替代地，体内递送可以通过施用一种或多种编码和引导iRNA的表达的载体间接进行。下文将进一步讨论这些替代方案。
通常，任何递送核酸分子的方法(体外或体内)都可以适于与本发明的iRNA一起使用(参见例如，Akhtar S.和Julian RL.(1992)《细胞生物学趋势(Trends Cell.Biol.)》2(5):139-144和WO94/02595，所述文献通过全文引用的方式并入本文)。对于体内递送，为递送iRNA分子需要考虑的因素包含例如，递送的分子的生物稳定性、非特异性效应的预防以及递送的分子在靶组织中的积累。RNA干扰也显示出通过直接注射局部递送到CNS的成功(Dorn,G.等人,(2004)《核酸》32:e49；Tan,PH.等人(2005)《基因疗法(Gene Ther.)》12:59-66；Makimura,H.等人(2002)《BMC神经科学(BMC Neurosci.)》3:18；Shishkina,GT.等人(2004)《神经科学(Neuroscience)》129:521-528；Thakker,ER.等人(2004)《美国国家科学院院刊》101:17270-17275；Akaneya,Y.等人(2005)《神经生理学杂志(J.Neurophysiol.)》93:594-602)。RNA或药物载剂的修饰也可以允许iRNA靶向靶组织，并且避免不期望的脱靶效应。iRNA分子可以通过与亲脂性基团(如胆固醇)的化学缀合进行修饰，以增强细胞摄取并防止降解。例如，将针对与亲脂性胆固醇部分缀合的ApoB的iRNA全身注射到小鼠体内，并且引起肝脏和空肠两者中apoB mRNA的敲低(Soutschek,J.等人(2004)《自然》432:173-178)。
在替代性实施例中，可以使用药物递送系统(如纳米颗粒、树状物、聚合物、脂质体或阳离子递送系统)递送iRNA。带正电荷的阳离子递送系统促进(带负电荷的)iRNA分子的结合并且还在带负电荷的细胞膜增强相互作用以允许细胞高效地摄取iRNA。阳离子脂质、树状物或聚合物可以与iRNA结合或被诱导以形成包裹iRNA的囊泡或胶束(参见例如，KimSH等人(2008)《控释杂志(Journal of Controlled Release)》129(2):107-116)。当全身施用时，囊泡或胶束的形成进一步防止iRNA的降解。用于制备和施用阳离子iRNA复合物的方法完全在本领域技术人员的能力范围内(参见例如，Sorensen,DR等人(2003)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol)》327:761-766；Verma,UN等人(2003)《临床癌症研究》9:1291-1300；Arnold,AS等人(2007)《神经生理学杂志(J.Hypertens.)》25:197-205，所述文献通过全文引用的方式并入本文)。可用于iRNA的全身递送的药物递送系统的一些非限制性实例包含DOTAP(Sorensen,DR.等人(2003),同上；Verma,UN等人(2003),同上)，“固体核酸脂质颗粒(solid nucleic acid lipid particles)”(Zimmermann,TS等人(2006)《自然》441:111-114)，心磷脂(Chien,PY等人(2005)《癌症基因疗法(Cancer Gene Ther.)》12:321-328；Pal,A等人(2005)《国际肿瘤学杂志(Int J.Oncol.)》26:1087-1091)，聚乙烯亚胺(BonnetME等人(2008)《药学研究(Pharm.Res)》8月16日印刷前的电子出版物；Aigner,A.(2006)《生物医学与生物技术杂志(J.Biomed.Biotechnol.)》71659)，Arg-Gly-Asp(RGD)肽(Liu,S.(2006)《分子药物学(Mol.Pharm.)》3:472-487)以及聚酰胺型胺(Tomalia,DA等人(2007)《生化学会会刊(Biochem.Soc.Trans.)》35:61-67；Yoo,H.等人(1999)《药学研究》16:1799-1804)。在一些实施例中，iRNA与环糊精形成用于全身施用的复合物。施用方法以及iRNA和环糊精的药物组合物可以在美国专利第7,427,605号中找到，所述美国专利通过全文引用的方式并入本文。本公开的某些方面涉及减少细胞中CTNNB1基因表达的方法，包括使所述细胞与本公开的双链RNAi药剂接触。在一个实施例中，细胞是肝细胞，任选地肝细胞。在一个实施例中，所述细胞是肝外细胞。
A.本发明的载体编码的iRNA
靶向CTNNB1基因的iRNA可以从插入DNA或RNA载体的转录单元表达(参见例如，Couture,A等人,《TIG.》(1996),12:5-10；Skillern,A等人,国际PCT公开第WO 00/22113号，Conrad,国际PCT公开第WO 00/22114号，以及Conrad,美国专利第6,054,299号)。表达可以是瞬时的(数小时至数周的数量级)或持续的(数周至数月或更长)，这取决于所使用的特定构建体和靶组织或细胞类型。这些转基因可以作为线性构建体、环状质粒或病毒载体引入，其可以是整合或非整合载体。还可以构建转基因以允许其作为染色体外质粒遗传(Gassmann等人,《美国国家科学院院刊》(1995)92:1292)。
可以与本文所描述的方法和组合物一起使用的病毒载体系统包含但不限于(a)腺病毒载体；(b)逆转录病毒载体，包含但不限于慢病毒载体、莫罗尼鼠白血病病毒(moloneymurine leukemia virus)等；(c)腺相关病毒载体；(d)单纯性疱疹病毒载体；(e)SV 40载体；(f)多瘤病毒载体；(g)乳头瘤病毒载体；(h)小核糖核酸病毒载体；(i)痘病毒载体，如正痘(例如，牛痘病毒载体)或禽痘(例如，金丝雀痘或禽痘)；以及(j)辅助依赖性或无肠腺病毒。复制缺陷病毒也可能是有利的。不同的载体将或不会被并入到细胞的基因组中。如果期望，构建体可以包含用于转染的病毒序列。可替代地，构建体可以被并入能够附加型复制的载体中，例如EPV和EBV载体。用于重组表达iRNA的构建体将通常需要调节元件，例如启动子、增强子等，以确保iRNA在靶细胞中的表达。对于载体和构建体要考虑的其它方面是本领域已知的。
V.本发明的药物组合物
本发明还包含药物组合物和调配物，所述药物组合物和调配物包含本发明的iRNA。在一个实施例中，本文提供了药物组合物，所述药物组合物包含如本文所描述的iRNA以及药学上可接受的载剂。含有iRNA的药物组合物可用于预防或治疗CTNNB1相关病症，例如癌症，例如肝细胞癌。
此类药物组合物基于递送模式调配。一个实例是调配通过肠胃外递送，例如通过皮下(SC)、肌内(IM)或静脉内(IV)递送用于全身施用的组合物。本发明的药物组合物可以以足以抑制CTNNB1基因的表达的剂量施用。
在一些实施例中，本发明的药物组合物是无菌的。在另一个实施例中，本发明的药物组合物是不含热原的。
本发明的药物组合物可以以足以抑制CTNNB1基因的表达的剂量施用。通常，本发明的iRNA的合适剂量的范围将是约0.001至约200.0毫克/受体的千克体重/天，通常范围是约1至50毫克/千克体重/天。通常，本发明的iRNA的合适剂量将在约0.1mg/kg至约5.0mg/kg的范围内，如约0.3mg/kg和约3.0mg/kg。重复剂量方案可以包含定期施用治疗量的iRNA，如每月、每3个月至6个月一次或每年一次。在某些实施例中，iRNA是约每月一次至约每六个月一次施用。
在初始治疗方案之后，可以在不太频繁的基础上施用治疗。治疗的持续时间可以基于疾病的严重程度来确定。
在其它实施例中，单剂量的药物组合物可以是持久的，使得剂量以不超过1个月、2个月、3个月或4个月的间隔施用。在本发明的一些实施例中，单剂量的本发明药物组合物约每月施用一次。在本发明的其它实施例中，每季度(即约每三个月)施用单剂量的本发明药物组合物。在本发明的其它实施例中，每年施用两次(即约每六个月一次)单剂量的本发明的药物组合物。
本领域技术人员将理解，某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量和时间安排，所述因素包含但不限于受试者中存在的突变、之前的治疗、所述受试者的总体健康或年龄以及存在的其它疾病。此外，用预防或治疗有效量的组合物(视情况而定)治疗受试者可以包含单次治疗或系列治疗。
取决于期望局部治疗还是全身治疗以及待治疗的区域，可以以许多方式施用本公开的药物组合物。施用可以是局部(包含眼科、阴道、直肠、鼻内、透皮)、口服或肠胃外。肠胃外施用包含静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；皮下(例如，通过植入的装置)；或颅内(例如，通过实质内、鞘内或心室内施用)。
iRNA可以以靶向特定组织(如肝脏)的方式递送。
用于局部施用的药物组合物和调配物可以包含透皮贴剂、软膏、乳液、霜剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉剂。常规的药物载剂、水性基质、粉末或油性基质、增稠剂等可以是必要的或期望的。带涂层的避孕套、手套等也可以是有用的。合适的局部调配物包含其中本公开特征的RNAi药剂与局部递送剂，如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂混合的那些调配物。合适的脂质和脂质体包含中性的(例如，二油酰磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、负性的(例如，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和阳离子的(例如，二油酰四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰磷脂酰乙醇胺DOTMA)。本公开特征的RNAi药剂可以被封装在脂质体中或可以与其形成复合物，具体地与阳离子脂质体。可替代地，RNAi药剂可以与脂质复合，具体地与阳离子脂质复合。合适的脂肪酸和酯包含但不限于花生四烯酸、油酸、二十烷酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸、三癸酸、单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱或C1-20烷基酯(例如，肉豆蔻酸异丙酯IPM)、甘油单酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐。局部调配物详细描述于US 6,747,014中，所述文献通过引用并入本文。
在一个实施例中，通过局部施用途径，在药物组合物中将本发明的双链RNA药剂siRNA施用于细胞。
在一个实施例中，所述药物组合物可以包含与局部递送药剂混合的siRNA化合物。局部递送药剂可以是多个微小囊泡。微小囊泡可以是脂质体。在一些实施例中，脂质体是阳离子脂质体。
在另一个实施例中，dsRNA药剂与局部渗透促进剂混合。在一个实施例中，局部渗透促进剂是脂肪酸。脂肪酸可以是花生四烯酸、十一烷酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸、三癸酸、单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱或C1-10烷基酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐。
在另一个实施例中，局部渗透促进剂是胆汁盐。胆汁盐可以是胆酸、脱氢胆酸、脱氧胆酸、葡糖胆酸、甘氨胆酸、甘氨脱氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、熊去氧胆酸、牛磺-24,25-二氢-夫西地酸钠、甘氨二氢夫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚或其药学上可接受的盐。
在另一个实施例中，渗透促进剂是螯合剂。螯合剂可以是EDTA、柠檬酸、水杨酸盐、胶原的N-酰基衍生物、月桂醇聚醚-9、β-二酮的N-氨基酰基衍生物或其混合物。
在另一个实施例中，渗透促进剂是表面活性剂，例如离子或非离子表面活性剂。表面活性剂可以是十二烷基硫酸钠、聚氧乙烯-9-十二烷基醚、聚氧乙烯-20-十六烷基醚、全氟化学乳液或其混合物。
在另一个实施例中，渗透促进剂可以选自由以下组成的组：不饱和环状脲、1-烷基-酮、1-烯基氮杂环-烷酮、甾体抗炎药以及其混合物。在另一个实施例中，渗透促进剂可以是乙二醇、吡咯、氮酮或萜烯。
一方面，本发明的特征在于一种药物组合物，其包含可注射剂型的siRNA化合物，例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如，前体，例如可以加工成ssiRNA化合物的较大siRNA化合物，或编码siRNA化合物的DNA，例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物，或其前体)的药物调配物的合适容器。在一个实施例中，所述药物组合物的可注射剂型包含无菌水溶液或分散体和无菌粉末。在一些实施例中，无菌溶液可以包含稀释剂，如水；盐水溶液；不挥发油、聚乙二醇、甘油或丙二醇。
本发明的iRNA分子可以掺入药物组合物中。此类组合物通常包含一种或多种iRNA和药学上可接受的载剂。如本文所使用的，语言“药学上可接受的载剂”旨在包含与细胞例如肝脏细胞的药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂以及吸附延迟剂等。此类介质和药剂用于药学活性物质的用途是本领域众所周知的。除了任何常规介质或药剂与活性化合物不相容的情况之外，设想介质或药剂在组合物中的使用。补充的活性化合物也可以并入所述组合物中。
本发明的药物组合物包含但不限于溶液、乳液和含有脂质体的调配物。这些组合物可以由多种组分产生，所述组分包含但不限于预成型液体、自乳化固体和自乳化半固体。调配物包含靶向肝脏的调配物。
本发明的药物调配物可以方便地以单位剂型存在，可以根据制药工业中众所周知的常规技术制备。此类技术包含使活性成分与药物载剂或赋形剂缔合的步骤。通常，通过将活性成分与液体载剂均匀且紧密地缔合来制备调配物。
本发明特征的iRNA可以被封装在脂质体中或可以与其形成复合物，具体地与阳离子脂质体。可替代地，iRNA可以与脂质复合，具体地与阳离子脂质复合。合适的脂肪酸和酯包含但不限于花生四烯酸、油酸、二十烷酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸、三癸酸、单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱或C1-20烷基酯(例如，肉豆蔻酸异丙酯IPM)、甘油单酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐。局部调配物详细描述于美国专利第6,747,014号中，所述美国专利通过引用并入本文。
A.包括膜分子组装体的iRNA调配物
用于本发明的组合物和方法的iRNA可以被调配成以膜分子组装体(例如，脂质体或胶束)形式递送。如本文所使用的，术语“脂质体”是指由排列在至少一个双层中(例如，一个双层或多个双层)的两亲性脂质组成的囊泡。脂质体包含具有由亲脂性材料形成的膜和水性内部的单层和多层囊泡。水性部分含有iRNA药剂组合物。亲脂性材料将水性内部与水性外部分离，所述水性外部通常不包含iRNA组合物，尽管在一些实例中其可以。脂质体可用于将活性成分转移和递送到作用位点。由于脂质体膜在结构上与生物膜相似，当脂质体应用于组织时，脂质体双层与细胞膜的双层融合。随着脂质体和细胞融合的进展，包含iRNA的内部水性内容物被递送到细胞中，其中iRNA可以与靶RNA特异性结合并可以介导RNAi。在一些情况下，脂质体也被特异性靶向，例如将iRNA引导到特定的细胞类型。
含有RNAi药剂的脂质体可以通过多种方法制备。在一个实例中，脂质体的脂质组分溶解在洗涤剂中，从而与脂质组分形成胶束。例如，脂质组分可以是两亲性阳离子脂质或脂质缀合物。洗涤剂可以具有高临界胶束浓度，并且可以是非离子的。示例性洗涤剂包含胆酸盐、CHAPS、辛基葡糖苷、脱氧胆酸盐和肌氨酸月桂酰酯。然后将RNAi药剂制剂添加到包含脂质组分的胶束中。脂质上的阳离子基团与RNAi药剂相互作用，并且在RNAi药剂周围缩合以形成脂质体。缩合后，例如通过透析去除洗涤剂，以产生RNAi药剂的脂质体制剂。
如果需要，可以在缩合反应期间，例如通过控制添加来添加有助于缩合的载剂化合物。例如，载剂化合物可以是除核酸以外的聚合物(例如，精胺或亚精胺)。pH也可以调整以利于冷凝。
在例如WO 96/37194中进一步描述了用于产生稳定的多核苷酸递送媒剂的方法，所述媒剂合并了多核苷酸/阳离子脂质复合物作为递送媒剂的结构组分，所述文献的全部内容通过引用并入本文。脂质体形成也可以包含以下中描述的示例性方法的一个或多个方面：Felgner,P.L.等人,《美国国家科学院院刊》8:7413-7417,1987；美国专利第4,897,355号；美国专利第5,171,678号；Bangham等人,《分子分子生物学方法》23:238,1965；Olson等人,《生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)》557:9,1979；Szoka等人,《美国国家科学院院刊》75:4194,1978；Mayhew等人,《生物化学与生物物理学报》775:169,1984；Kim等人,《生物化学与生物物理学报》728:339,1983；以及Fukunaga等人,《内分泌学(Endocrinol.)》115:757,1984。用于制备用作递送媒剂的合适大小的脂质聚集体的常用技术包含超声处理和冻融加挤压(参见例如，Mayer等人,《生物化学与生物物理学报》858:161,1986)。当期望持续较小(50nm至200nm)且相对均匀的聚集体时，可以使用微流体化(Mayhew等人,《生物化学与生物物理学报》775:169,1984)。这些方法很容易适用于将RNAi药剂制剂包装到脂质体中。
脂质体分为两个广泛的类别。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，其与带负电荷的核酸分子相互作用以形成稳定的复合物。带正电荷的核酸/脂质体复合物与带负电荷的细胞表面结合并且内化于核内体中。由于核内体中的酸性pH，脂质体破裂，从而将其内容物释放到细胞质中(Wang等人,《生物化学与生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)》,1987,147,980-985)。
对pH敏感的或带负电荷的脂质体截留核酸而不是与其复合。由于核酸和脂质两者均带有类似的电荷，所以会出现排斥而非复合物形成。然而，一些核酸包埋于这些脂质体的水性内部内。对pH敏感的脂质体已被用于将编码胸苷激酶基因的核酸递送到培养中的细胞单层。在靶细胞中检测到外源基因的表达(Zhou等人,《控制释放杂志》,1992,19,269-274)。
一种主要类型的脂质体组合物包含除天然来源的磷脂酰胆碱之外的磷脂。中性脂质体组合物例如可以由二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)形成。阴离子脂质体组合物通常由二肉豆蔻酰磷脂酰甘油形成，而阴离子融合脂质体主要由二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成。另一种类型的脂质体组合物由磷脂酰胆碱(PC)形成，例如大豆PC和鸡蛋PC。另一种类型由磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物形成。
在体外和体内将脂质体引入到细胞中的其它方法的实例包含美国专利第5,283,185号；美国专利第5,171,678号；WO 94/00569；WO 93/24640；WO 91/16024；Felgner,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》269:2550,1994；Nabel,《美国国家科学院院刊》90:11307,1993；Nabel,《人类基因疗法(Human Gene Ther.)》3:649,1992；Gershon,《生物化学杂志(Biochem.)》32:7143,1993；以及Strauss《欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)》11:417,1992。
还对非离子脂质体系统进行了检查，以确定其在向皮肤递送药物中的效用，特别是包括非离子表面活性剂和胆固醇的系统。使用包括NovasomeTM I(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)和NovasomeTMII(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)的非离子脂质体调配物将环孢菌素A(cyclosporin-A)递送到小鼠皮肤的真皮中。结果表明，此类非离子脂质体系统在促进环孢菌素A沉积到皮肤的不同层中是有效的(Hu等人,S.T.P.制药科学(S.T.P.Pharma.Sci.)》,1994,4(6)466)。
脂质体还包含“空间稳定的”脂质体，如本文所使用的，所述术语是指包括一种或多种特殊脂质的脂质体，当掺入脂质体中时，相对于缺乏此类特殊脂质的脂质体，所述脂质体导致提高的循环寿命。空间稳定的脂质体的实例是其中脂质体(A)的囊泡形成脂质部分的一部分包括一种或多种糖脂，如单唾液酸神经节苷脂GM1，或(B)用一种或多种亲水性聚合物衍生的脂质体，如聚乙二醇(PEG)部分。尽管不希望受到任何特定理论的束缚，但本领域认为，至少对于含有神经节苷脂、鞘磷脂或PEG衍生的脂质的空间稳定的脂质体，这些空间稳定的脂质体的增强的循环半衰期源自减少进入网状内皮系统(RES)的细胞的摄取(Allen等人,《FEBS快报》,1987,223,42；Wu等人,《癌症研究》,1993,53,3765)。
包括一种或多种糖脂的各种脂质体是本领域已知的。Papahadjopoulos等人(《纽约科学学术年鉴》,1987,507,64)报道了单唾液酸神经节苷脂GM1、硫酸半乳糖脑苷酯和磷脂酰肌醇改善脂质体血液半衰期的能力。这些发现在以下中进行了阐述：Gabizon等人,(《美国国家科学院院刊》,1988,85,6949)。Allen等人的美国专利第4,837,028号和WO 88/04924两者中公开了脂质体，其包括(1)鞘磷脂和(2)神经节苷脂GM1或硫酸半乳糖脑苷酯。美国专利第5,543,152号(Webb等人)公开了包括鞘磷脂的脂质体。WO 97/13499(Lim等人)中公开了包括1,2-sn-二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的脂质体。
在一个实施例中，使用阳离子脂质体。阳离子脂质体具有能够与细胞膜融合的优点。非阳离子脂质体尽管不能与质膜有效融合，但在体内被巨噬细胞吸收，并且可以用于向巨噬细胞递送RNAi药剂。
脂质体的另外的优点包含：从天然磷脂中获得的脂质体具有生物相容性且可生物降解；脂质体可以掺入多种水溶性和脂溶性药物；脂质体可以保护其内部区室中封装的RNAi药剂免受代谢和降解(Rosoff,《药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)》，Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,第1卷,第245页)。制备脂质体调配物的重要考虑因素是脂质表面电荷、囊泡大小和脂质体的水性体积。
带正电的合成阳离子脂质N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)可以用于形成小脂质体，所述小脂质体与核酸自发相互作用以形成脂质-核酸复合物，所述复合物能够与组织培养细胞的细胞膜的带负电荷的脂质融合，导致RNAi药剂的递送(参见例如，Felgner,P.L.等人,《美国国家科学院院刊》8:7413-7417,1987以及美国专利第4,897,355号关于DOTMA和其与DNA的使用的描述)。
DOTMA类似物，1,2-双(油酰基氧基)-3-(三甲基氨)丙烷(DOTAP)可以与磷脂组合使用，以形成DNA络合囊泡。LipofectinTM(马里兰州盖瑟斯堡的贝特斯达研究实验室(Bethesda Research Laboratories,Gaithersburg,Md.))是一种用于将高阴离子核酸递送到活组织培养细胞中的有效药剂，所述细胞包括带正电荷的DOTMA脂质体，所述脂质体与带负电荷的多核苷酸自发相互作用以形成复合物。当使用足够的带正电荷的脂质体时，所得复合物上的净电荷也是正的。以这种方式制备的带正电荷的复合物自发地与带负电荷的细胞表面连接，与质膜融合，并且有效地将功能性核酸递送到例如组织培养细胞中。另一种可商购获得的阳离子脂质，1,2-双(油酰基氧基)-3,3-(三甲基氨)丙烷(“DOTAP”)(印第安纳州印第安纳波利斯的宝灵曼公司(Boehringer Mannheim,Indianapolis,Indiana))与DOTMA的不同之处在于，油酰基部分通过酯而不是醚键连接。
其它报道的阳离子脂质化合物包含与多种部分缀合的那些，包含例如与两种类型的脂质之一缀合的羧精胺，并且包含如5-羧基精胺基甘氨酸二十八烷基酰胺(“DOGS”)(TransfectamineTM，威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega,Madison,Wisconsin))和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺5-羧基精酰基-酰胺(“DPPES”)等化合物(参见例如，美国专利第5,171,678号)。
另一种阳离子脂质缀合物包含脂质与胆固醇的衍生化(“DC-Chol”)，其已与DOPE组合调配成脂质体(参见，Gao,X.和Huang,L.,《生物化学与生物物理研究通讯》179:280,1991)。据报道，通过将聚赖氨酸与DOPE缀合制备的脂聚赖氨酸在血清存在下对转染有效(Zhou,X.等人,《生物化学与生物物理学报》1065:8,1991)。对于某些细胞系，这些含有缀合的阳离子脂质的脂质体据说表现出比所述含有DOTMA的组合物更低的毒性并提供更有效的转染。其它可商购获得的阳离子脂质产品包含DMRIE和DMRIE-HP(加利福尼亚州拉荷亚市的Vical公司(Vical,La Jolla,California))和Lipofectamine(DOSPA)(马里兰州盖瑟斯堡的生命技术有限公司(Life Technology,Inc.,Gaithersburg,Maryland))。WO 98/39359和WO 96/37194中描述了适用于递送寡核苷酸的其它阳离子脂质。
脂质体调配物特别适合局部施用，脂质体呈现出超过其它调配物的若干个优点。此类优点包含减少了与施用的药物的高全身吸收相关的副作用，增加了施用的药物在期望的靶标的累积，以及将RNAi药剂施用到皮肤中的能力。在一些实施例中，脂质体用于将RNAi药剂递送到表皮细胞，并且还用于增强RNAi药剂向真皮组织中的渗透，例如到皮肤中。例如，脂质体可以局部应用。已经记载了将调配成脂质体的药物局部递送到皮肤(参见例如，Weiner等人,《药物靶向杂志(Journal of Drug Targeting)》,1992,第2,405-410卷和duPlessis等人,《抗病毒研究(Antiviral Research)》,18,1992,259-265；Mannino,R.J.和Fould-Fogerite,S.,《生物技术(Biotechniques)》6:682-690,1988；Itani,T.等人《基因(Gene)》56:267-276,1987；Nicolau,C.等人《酶学方法(Meth.Enz.)》149:157-176,1987；Straubinger,R.M.和Papahadjopoulos,D.《酶学方法》101:512-527,1983；Wang,C.Y.和Huang,L.,《美国国家科学院院刊》84:7851-7855,1987)。
还对非离子脂质体系统进行了检查，以确定其在向皮肤递送药物中的效用，特别是包括非离子表面活性剂和胆固醇的系统。使用包括Novasome I(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)和Novasome II(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)的非离子脂质体调配物将药物递送到小鼠皮肤的真皮中。具有RNAi药剂的此类调配物可用于治疗皮肤病学病症。
包含iRNA的脂质体可以被制成高度可变形的。此类可变形性可以使脂质体渗透穿过小于脂质体平均半径的孔。例如，传递体是一类可变形的脂质体。传递体可以通过在标准脂质体组合物中添加表面边缘激活剂(通常是表面活性剂)来制备。包含RNAi药剂的传递体可以例如通过感染皮下递送，以便将RNAi药剂递送到皮肤中的角质细胞。为了穿过完整的哺乳动物皮肤，脂质囊泡必须在适当的透皮梯度的影响下穿过一系列直径小于50nm的细孔。另外，由于脂质特性，这些传递体可以自我优化(适应孔的形状，例如皮肤中的孔)、自我修复，并且可以经常在不碎裂的情况下达到其靶标，并且经常自我装载。
适用于本发明的其它调配物在以下中进行了描述：于2008年1月2日提交的美国临时申请序列号61/018,616；于2008年1月2日提交的61/018,611；于2008年3月26日提交的61/039,748；于2008年4月22日提交的61/047,087和于2008年5月8日提交的61/051,528。于2007年10月3日提交的PCT申请第PCT/US2007/080331号也描述了适用于本发明的调配物。
传递体是又另一种类型的脂质体，并且是高度可变形的脂质聚集体，是药物递送媒剂的有吸引力的候选者。传递体可以被描述为脂滴，其可高度可变形，使得其很容易渗透穿过比液滴小的孔。传递体能够适应其使用的环境，例如其是自我优化的(适应皮肤中孔的形状)、自我修复的，经常在不碎裂的情况下达到其靶标，并且经常自我装载。为了制备传递体，可以向标准脂质体组合物添加表面边缘激活剂，通常是表面活性剂。传递体已被用于将血清白蛋白递送到皮肤。传递体介导的血清白蛋白的递送已被证明与皮下注射含有血清白蛋白的溶液一样有效。
表面活性剂广泛应用于调配物中，如乳液(包含微乳液)和脂质体。对许多不同类型的表面活性剂(天然和合成两者)的特性进行分类和排序的最常见方式是通过使用亲水/亲脂平衡(HLB)。亲水基团(也称为“头”)的性质为调配物中使用的不同表面活性剂的分类提供了最有用的方法(Rieger,《药物剂型》,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司(MarcelDekker,Inc.,New York,N.Y.),1988,第285页)。
如果表面活性剂分子未离子化，则将其归类为非离子表面活性剂。非离子表面活性剂在药物和化妆品中有着广泛的应用，并且可用于多种pH值。通常，根据其结构，其HLB值的范围是2至约18。非离子表面活性剂包含非离子酯，如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、脱水山梨醇酯、蔗糖酯和乙氧基化酯。非离子烷醇酰胺和醚，如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇和乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物也包含在此类别中。聚氧乙烯表面活性剂是非离子表面活性剂类别中最受欢迎的成员。
如果表面活性剂分子在溶解或分散在水中时带有负电荷，则表面活性剂被分类为阴离子。阴离子表面活性剂包含羧酸酯，如皂类、酰基乳酸酯、氨基酸的酰基酰胺、硫酸酯，如烷基硫酸酯和乙氧基化烷基硫酸酯，磺酸酯，如烷基苯磺酸酯、酰基异硫辛酸酯、酰基牛磺酸酯和磺基琥珀酸酯，以及磷酸酯。阴离子表面活性剂类别中最重要的成员是烷基硫酸酯和皂类。
如果表面活性剂分子在溶解或分散在水中时带有正电荷，则表面活性剂被分类为阳离子。阳离子表面活性剂包含季铵盐和乙氧基化胺。季铵盐是此类别化合物中使用最多的成员。
如果表面活性剂分子具有携带正电荷或负电荷的能力，则表面活性剂被归类为两性。两性表面活性剂包含丙烯酸衍生物、经取代的烷基酰胺、N-烷基甜菜碱和磷脂。
对表面活性剂在药物产品、调配物和乳液中的应用进行了综述(Rieger,《药物剂型》,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,1988,第285页)。
用于本发明的方法中的iRNA也可以作为胶束调配物提供。“胶束”在本文中被定义为特定类型的分子组装体，其中两亲性分子以球形结构排列，使得分子的所有疏水部分向内，使亲水部分与周围的水相接触。如果环境是疏水的，则存在相反的排列。
适合通过透皮膜递送的混合胶束调配物可以通过混合siRNA组合物的水溶液、碱金属C8至C22烷基硫酸酯与胶束形成化合物来制备。示例性胶束形成化合物包含卵磷脂、透明质酸、透明质酸的药学上可接受的盐、乙醇酸、乳酸、洋甘菊提取物、黄瓜提取物、油酸、亚油酸、亚麻酸、单油酸甘油酯、单油酸酯、琉璃苣油、月见草油、薄荷醇、三羟基氧代胆酸基甘氨酸以及其药学上可接受的盐、甘油、聚甘油、赖氨酸、聚赖氨酸、三油酸甘油酯、聚氧乙烯醚以及其类似物、聚多卡醇烷基醚以及其类似物、鹅脱氧胆酸酯、脱氧胆酸酯以及其混合物。胶束形成化合物可以在添加碱金属烷基硫酸酯的同时或之后添加。基本上任何种类的成分混合都会形成混合的胶束，但为了提供更小大小的胶束而剧烈混合。
在一种方法中，制备含有siRNA组合物和至少碱金属烷基硫酸酯的第一胶束组合物。然后将第一胶束组合物与至少三种胶束形成化合物混合以形成混合的胶束组合物。在另一种方法中，通过将siRNA组合物、碱金属烷基硫酸酯和至少一种胶束形成化合物混合，然后在剧烈混合的情况下添加剩余的胶束形成化合物来制备胶束组合物。
苯酚和/或间甲酚可以添加到混合的胶束组合物中，以稳定调配物并防止细菌生长。可替代地，苯酚和/或间甲酚可以与胶束形成成分一起添加。在形成混合的胶束组合物之后，也可以添加等渗剂，如甘油。
为了将胶束调配物作为喷雾递送，可以将所述调配物放入气溶胶分配器中，并且在分配器中装入推进剂。处于压力下的推进剂在分配器中呈液体形式。调节成分的比率，使水相和推进剂相成为一个相，即有一个相。如果有两个相，则有必要在分配一部分内容物之前摇动分配器，例如通过计量阀。分配的剂量的药剂以精细喷雾的形式从计量阀推进。
推进剂可以包含含氢氯氟烃、含氢氟碳化合物、二甲醚和二乙醚。在某些实施例中，可以使用HFA 134a(1,1,1,2四氟乙烷)。
基本成分的具体浓度可以通过相对简单的实验来确定。为了通过口腔吸收，通常期望通过注射或通过胃肠道施用增加剂量，例如至少两倍或三倍。
B.脂质颗粒
本发明中的iRNA，例如dsRNA，可以完全包封在脂质调配物，例如LNP中，例如形成SPLP、pSPLP、SNALP或其它核酸-脂质颗粒。
如本文所使用的，术语“SNALP”是指稳定的核酸-脂质颗粒，包含SPLP。如本文所使用的，术语“SPLP”是指包括封装在脂质囊泡内的质粒DNA的核酸-脂质颗粒。SNALP和SPLP通常包括阳离子脂质、非阳离子脂质和防止颗粒聚集的脂质(例如，PEG-脂质缀合物)。SNALP和SPLP对于全身应用非常有用，因为其在静脉内(i.v.)注射后表现出延长的循环寿命并在远隔位点(例如，与施用位点物理分离的位点)累积。SPLP包含“pSPLP”，其包含PCT公开第WO00/03683号中所述的封装的缩合剂-核酸复合物。本发明的颗粒的平均直径通常是约50nm至约150nm、更通常地是约60nm至约130nm、更通常地是约70nm至约110nm、最通常地是约70nm至约90nm，并且基本上无毒。另外，核酸当存在于本发明的核酸-脂质颗粒中时在水溶液中抵抗核酸酶的降解。核酸-脂质颗粒以及其制备方法在例如以下中公开：美国专利第5,976,567号；第5,981,501号；第6,534,484号；第6,586,410号；第6,815,432号；美国专利公开第2010/0324120号和PCT公开第WO 96/40964号。
在一个实施例中，脂质与药物的比率(质量/质量比)(例如，脂质与dsRNA的比率)将在约1:1至约50:1、约1:1至约25:1、约3:1至约15:1、约4:1至约10:1、约5:1至约9:1或约6:1至约9:1的范围内。上述范围中间的范围也被认为是本发明的一部分。
例如，所述阳离子脂质可以是N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1-(2,3-二油基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油酰氧基)丙基胺(DODMA)、1,2-二亚油酰氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二油烯氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、1,2-二烷基氨基甲酰氨基甲酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二烷基氨基甲酰氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二烷基氨基甲酰氧基-3-吗啉丙烷(DLin-MA)、1,2-二氢油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二氢油酰基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰基-2-亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二氢油酰氧基-3-三甲氨基丙烷氯盐(DLin-TMA.Cl)、1,2-二氢油酰-3-三甲氨基丙烷氯盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二氢油酰氧基-3-(N-甲基哌嗪)丙烷(DLin-MPZ)、或3-(N,N-二油基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二油基氧代-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、1,2-二油烯氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、2,2-二苯基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊烷(DLin-K-DMA)或其类似物、(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八烷基-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊烯[d][1,3]二噁醇-5-胺(ALN100)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-庚三烯-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸甲酯(MC3)、1,1'-(2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基氮杂二基)二十二烷-2-醇(Tech G1)或其组合。阳离子脂质可以占颗粒中存在的总脂质的约20mol％至约50mol％或约40mol％。
在另一个实施例中，化合物2,2-二油烯基-4-二甲氨基乙基-[1,3]-二氧戊环可以用于制备脂质-siRNA纳米颗粒。2,2二油烯基-4-二甲氨基乙基-[1,3]-二氧戊环的合成描述于2008年10月23日提交的美国临时专利申请第61/107,998号中，所述美国临时专利申请通过引用并入本文。
在一个实施例中，脂质-siRNA颗粒包含40％2,2-二油烯基-4-二甲氨基乙基-[1,3]-二氧戊环:10％DSPC:40％胆固醇:10％PEG-C-DOMG(摩尔百分比)，其中粒度是63.0±20nm，siRNA/脂质比是0.027。
可电离/非阳离子脂质可以是阴离子脂质或中性脂质，包含但不限于二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸盐(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、胆固醇或其混合物。非阳离子脂质可以是颗粒中存在的总脂质的约5mol％至约90mol％、约10mol％或约58mol％(如果包含胆固醇的话)。
抑制颗粒聚集的缀合脂质可以是例如聚乙二醇(PEG)-脂质，包含但不限于PEG-二酰基甘油(DAG)、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)或其混合物。PEG-DAA缀合物可以是例如PEG-二月桂酰氧基丙基(Ci2)、PEG-二肉豆蔻酰氧基丙基(Ci4)、PEG-二棕榈酰氧基丙基(Ci6)或PEG-二硬脂酰氧基丙基(C)8 。防止颗粒聚集的缀合脂质可以是颗粒中存在的总脂质的0mol％至约20mol％或约2mol％。
在一些实施例中，核酸-脂质颗粒进一步包含胆固醇，例如占颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约60mol％或约48mol％。
在一个实施例中，脂质ND98·4HCl(MW 1487)(参见2008年3月26日提交的美国专利申请第12/056,230号，其通过引用并入本文)、胆固醇(西格玛-奥德里奇公司)和PEG-神经酰胺C16(两代情极性脂质)可以用于制备脂质-dsRNA纳米颗粒(即，LNP01颗粒)。
在本发明的某些实施例中，适用于本发明组合物的合适阳离子脂质是美国专利第9,061,063号和PCT公开第WO 2013/086354号中描述的那些，这些文献的全部内容通过引用并入本文。在一些实施例中，合适的阳离子脂质包含一个或多个可生物降解基团。可生物降解基团包含一个或多个在生物环境中，例如在生物体、器官、组织、细胞或细胞器中可以经历键断裂反应的键。含有可生物降解键的官能团包含例如酯、二硫醇和肟。当施用于受试者时，生物降解可能是影响化合物从体内清除的因素。生物降解可以在基于细胞的测定中测量，其中将包含阳离子脂质的调配物暴露于细胞，并且在不同时间点取样。可以从细胞中提取脂质部分，并且通过LC-MS进行分离和分析。根据LC-MS数据，可以测量生物降解速率(例如t1/2值)。阳离子脂质包括可生物降解基团。
在一个实施例中，本文所描述的任何实施例的阳离子脂质的体内半衰期(t1/2)(例如，在肝、脾或血浆中)小于约3小时，如小于约2.5小时、小于约2小时、小于约1.5小时、小于约1小时、小于约0.5小时或小于约0.25小时。阳离子脂质优选地保持完整，或具有足以形成稳定的脂质纳米颗粒的半衰期，所述脂质纳米颗粒有效地将期望的活性药物成分(例如，核酸)递送到其靶标，但之后迅速降解以最小化对受试者的任何副作用。例如，在小鼠中，阳离子脂质在脾脏中的t1/2优选地是约1至约7小时。
在另一个实施例中，本文所描述的任何实施例的含有一个或多个可生物降解基团的阳离子脂质的体内半衰期(t1/2)(例如，在肝、脾或血浆中)小于不含一个或多个可生物降解基团的相同阳离子脂质的体内半衰期的约10％(例如，小于约7.5％、小于约5％、小于约2.5％)。
代表性阳离子脂质包含但不限于：
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在一个优选的实施例中，阳离子脂质是
在某些实施例中，本发明的dsRNA药剂与阳离子脂质，
例如二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇(Chol)和1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)一起调配。在一个实施例中，
:DSPC:Chol:PEG-DMG的比率分别是约50:12:36:2。
本发明包含本文所描述的阳离子脂质的游离形式，以及其药学上可接受的盐和立体异构体。阳离子脂质可以是胺阳离子脂质的质子化盐。术语“游离形式”是指呈非盐形式的胺阳离子脂质。游离形式可以通过用合适的稀碱水溶液如稀NaOH水溶液、碳酸钾、氨和碳酸氢钠处理盐来再生。
本发明的阳离子脂质的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法由本发明的含有碱性或酸性部分的阳离子脂质合成。通常，碱性阳离子脂质的盐通过离子交换色谱或通过游离碱与化学计量的量或与过量的期望成盐无机或有机酸在合适的溶剂或各种溶剂组合中反应来制备。类似地，酸性化合物的盐是通过与适当的无机或有机碱反应形成的。
因此，本发明的阳离子脂质的药学上可接受的盐包含通过碱性速溶阳离子脂质与无机或有机酸反应形成的本发明的阳离子脂质的无毒盐。例如，无毒盐包含那些衍生自如以下无机酸的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；以及由如以下有机酸制备的盐：乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨环、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙基磺酸和三氟乙酸(TFA)。
当本发明的阳离子脂质是酸性时，合适的“药学上可接受的盐”是指由药学上可接受的无毒碱(包含无机碱和有机碱)制备的盐。衍生自无机碱的盐包含铝、铵、钙、铜、铁、亚铁、锂、镁、正锰盐、亚锰、钾、钠和锌。在一个实施例中，碱选自铵、钙、镁、钾和钠。衍生自药学上可接受的有机无毒碱的盐包含伯胺、仲胺和叔胺、取代胺，包含天然存在的取代胺，环状胺和碱性离子交换树脂的盐，如精氨酸、甜菜碱、咖啡碱、胆碱、Ν,Ν1-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、还原葡糖胺、葡萄糖胺、组氨酸、海巴明、异丙胺、赖氨酸、甲葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺和氨丁三醇。
还应注意的是，本发明的阳离子脂质可能是内盐或两性离子，因为在生理条件下，化合物中的去质子化酸性部分，如羧基，可能是阴离子的，并且然后这种电荷可能与质子化或烷基化碱性部分，如季氮原子的阳离子电荷在内部平衡。
C.另外的调配物
i.乳液
本发明的组合物可以制备并调配成乳液。乳液通常是一种液体以液滴的形式分散在另一种液体中的非均相系统，通常直径超过0.1μm(参见例如，《安塞尔的药物剂型和药物递送系统(Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)》,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,纽约州纽约的利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins,New York,NY)(第8版)；Idson,《药物剂型(Pharmaceutical Dosage Forms)》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司(Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.),第1卷,第199页；Rosoff,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第245页；Block,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第2卷,第335页；Higuchi等人,《雷明顿药物科学(Remington'sPharmaceutical Sciences)》,宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(Mack PublishingCo.,Easton,Pa.),1985,第301页)。乳液通常是两相系统，包括两个相互紧密混合和分散的不混溶液相。通常，乳液可以是油包水(w/w)或水包油(w/w)类型。当水相被精细地分成微小的液滴并分散到本体油相中时，所得到的组合物被称为油包水(w/o)乳液。可替代地，当油相被精细地分成微小的液滴并分散到本体水相中时，所得到的组合物被称为水包油(o/w)乳液。除了分散相和活性药物之外，乳液还可以含有另外的组分，所述活性药物可以以溶液的形式存在于水相、油相中或其本身作为单独的相。药物赋形剂，如乳化剂、稳定剂、染料和抗氧化剂也可以根据需要存在于乳液中。药物乳液也可以是包含多于两相的多种乳液，例如在油包水包油(o/w/o)和水包油包水(w/o/w)乳液的情况下。此类复杂的调配物通常提供简单的二元乳液所没有的某些优点。其中o/w乳液的单个油滴包围小水滴的多重乳液构成w/o/w乳液。类似地，包围在油状连续相中稳定的水滴中的油滴系统提供o/w/o乳液。
乳液的特征在于几乎没有或没有热力学稳定性。通常，乳液的分散或不连续相很好地分散到外部或连续相中，并且通过乳化剂或调配物的粘度维持这种形式。稳定乳液的其它方法需要使用可以并入乳液任一相中的乳化剂。乳化剂可以大致分为四类：合成表面活性剂、天然存在的乳化剂、吸收碱和精细分散的固体(参见例如，《安塞尔的药物剂型和药物递送系统》,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,纽约州纽约的利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(第8版)；Idson,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第199页)。
已发现合成表面活性剂(也称为表面活性药剂)在乳液调配物中具有广泛的适用性，并且已在文献中进行了综述(参见例如，《安塞尔的药物剂型和药物递送系统》,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,纽约州纽约的利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(第8版)；Rieger,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第285页；Idson,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第199页)。表面活性剂通常是两亲性的，并且包括亲水性和疏水性部分。表面活性剂的亲水性与疏水性的比率被称为亲水/亲脂平衡(HLB)，并且是在调配物的制备中对表面活性剂进行分类和选择的有价值的工具。表面活性剂可以基于亲水基团的性质分为不同的类别：非离子、阴离子、阳离子和两性(参见例如，Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,纽约州纽约的利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(第8版)；Rieger,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第285页)。
乳液调配物中还包含多种非乳化材料，并且有助于乳液的特性。这些包含脂肪、油、蜡、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酸酯、保湿剂、亲水胶体、防腐剂和抗氧化剂(Block,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第335页；Idson,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第199页)。
乳液调配物通过皮肤、口服和肠胃外通路的应用以及其制造方法已经在文献中进行了综述(参见例如，《安塞尔的药物剂型和药物递送系统》,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,纽约州纽约的利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(第8版)；Idson,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第199页)。
ii.微乳液
在本发明的一个实施例中，iRNA和核酸的组合物被调配为微乳液。微乳液可以定义为水、油和两亲物的系统，其是单一的光学各向同性和热力学稳定的液体溶液(参见例如，Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,纽约州纽约的利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(第8版)；Rosoff,《药物剂型》,Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,纽约州纽约的马塞尔德克尔公司,第1卷,第245页)。通常，微乳液是通过首先将油分散在表面活性剂水溶液中，并且然后添加足量的第四组分(通常是中链长醇)以形成透明系统而制备的系统。因此，微乳液也被描述为两种不混溶液体的热力学稳定、各向同性透明的分散体，所述两种不混溶液体通过表面活性分子的界面膜来稳定(Leung和Shah,《药物的控制释放：聚合物和聚集系统(Controlled Release of Drugs:Polymers and AggregateSystems)》,Rosoff,M.编辑,1989,纽约的VCH出版社(VCH Publishers,New York),第185-215页)。
iii.微颗粒
本发明的iRNA可以掺入到颗粒中，例如微颗粒中。微颗粒可以通过喷雾干燥生产，但也可以通过其它方法生产，包含冻干、蒸发、流化床干燥、真空干燥或这些技术的组合。
iv.渗透促进剂
在一个实施例中，本发明使用各种渗透促进剂来实现核酸，特别是iRNA到动物皮肤的有效递送。大多数药物以电离和非电离两种形式存在于溶液中。然而，通常只有脂溶性或亲脂性药物容易穿过细胞膜。已经发现，如果用渗透促进剂处理待穿过的膜，即使是非亲脂性药物也可以穿过细胞膜。除了有助于非亲脂性药物穿过细胞膜的扩散外，渗透促进剂还可以增强亲脂性药物的渗透性。
渗透促进剂可以分为五大类之一，即表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂(参见例如，Malmsten,M.《药物递送中的表面活性剂和聚合物(Surfactants and polymers in drug delivery)》,纽约州纽约的Informa医疗健康公司(Informa Health Care,New York,NY),2002；Lee等人,《治疗药物载剂系统的关键综述(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)》,1991,第92页)。上述每一类渗透促进剂及其在制造药物组合物和递送药剂中的用途在本领域是众所周知的。
v.赋形剂
与载剂化合物相比，“药物载剂”或“赋形剂”是药学上可接受的溶剂、悬浮剂或任何其它用于将一种或多种核酸递送到动物的药理学惰性媒剂。赋形剂可以是液体的或固体的并且在考虑计划的施用方式的情况下被选择，以便在与核酸和给定药物组合物的其它组分组合时提供期望的体积、一致性等。此类药剂在本领域中是众所周知的。
vi.其它组分
本发明的组合物可以另外含有在药物组合物中常规存在的其它附属组分，处于其现有技术确定的使用水平。因此，例如，组合物可以含有另外的相容性药物活性材料，例如，止痒药、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或者可以含有可用于物理调配本发明的组合物的各种剂型的另外的材料，如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、不透明剂、增稠剂和稳定剂。然而，此类材料，在添加时，不应该不适当地干扰本发明的组合物的成分的生物活性。调配物可以进行灭菌，并且如果期望的话，可以与不与所述调配物的核酸有害地相互作用的助剂，例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲液、着色剂、调味剂或芳香物质等混合。
含水悬浮液可以含有增加悬浮液粘度的物质，包含例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或右旋糖酐。悬浮液也可以含有稳定剂。
在一些实施例中，本发明特征的药物组合物包含(a)一种或多种iRNA和(b)通过非iRNA机制发挥作用并且可用于治疗CTNNB13相关病症例如癌症的一种或更多种药剂。
此类化合物的毒性和预防功效可以通过细胞培养物或实验动物中的标准制药程序测定，例如，用于确定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(对50％群体预防有效的剂量)。毒性作用与治疗效果之间的剂量比为治疗指数并且所述治疗指数可以被表示为比率LD50/ED50。表现出高治疗指数的化合物是优选的。
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于调配用于在人中使用的剂量范围。本发明中本文特征的组合物的剂量通常在包含ED50(如ED80或ED90)的循环浓度范围内，几乎没有或没有毒性。根据所采用的剂型和所利用的施用通路，剂量可以在此范围内变化。对于本发明特征的方法中使用的任何化合物，预防有效剂量可以最初根据细胞培养测定估计。可以在动物模型中调配剂量，以达到化合物的循环血浆浓度范围，或者在适当的情况下，达到靶序列的多肽产物的循环血浆浓度范围(例如，实现多肽浓度的降低)，所述范围包含细胞培养中确定的IC50或更高水平的抑制(即达到症状的一半最大抑制的测试化合物的浓度)。可以使用此类信息来更精确地确定人体中的有用剂量。可以测量血浆中的水平，例如通过高效液相层析。
除了其施用之外，如上文所讨论的，本发明特征的iRNA可以与用于预防或治疗CTNNB1相关病症例如癌症的其它已知药剂组合施用。在任何情况下，施用医师可以基于使用本领域已知或本文所描述的功效的标准测量观察到的结果来调节iRNA施用的量和时间。
VI.用于抑制CTNNB1表达的方法
本发明还提供了抑制细胞中的CTNNB1基因的表达的方法。所述方法包含将细胞与RNAi药剂，例如双链RNA药剂接触，所述药剂的量有效地抑制细胞中CTNNB1的表达，由此抑制细胞中的CTNNB1的表达。在本公开的一些实施例中，CTNNB1基因的表达在肝脏(例如，肝细胞)中被优先抑制。
细胞与iRNA，例如双链RNA药剂的接触可以在体外或体内进行。使细胞与iRNA体内接触包含使受试者(例如，人受试者)体内的细胞或细胞组与iRNA接触。体外和体内接触细胞方法的组合也是可能的。如上文所讨论的，接触细胞可以是直接的或间接的。此外，接触细胞可以通过靶向配体实现，包含本文所描述的或本领域已知的任何配体。在一些实施例中，靶向配体是碳水化合物部分，例如GalNAc3配体，或将RNAi药剂引导到所关注的位点的任何其它配体。
如本文所使用的，术语“抑制(inhibiting)”可以与“减少”、“沉默”、“下调”、“抑制(suppressing)”和其它类似术语互换使用，并且包含任何水平的抑制。
短语“抑制CTNNB1的表达”旨在是指抑制任何CTNNB1基因(例如，小鼠CTNNB1 3基因、大鼠CTNNB1基因、猴CTNNB1基因或人CTNNB1基因)以及CTNNB1基因的变体或突变体的表达。因此，在基因操纵的细胞、细胞组或生物体的背景下，CTNNB1基因可以是野生型CTNNB1基因、突变体CTNNB1基因或转基因CTNNB1基因。
“抑制CTNNB1基因的表达”包含对CTNNB1基因的任何水平的抑制，例如至少部分抑制CTNNB1基因的表达。可以基于与CTNNB1基因表达相关的任何变量的水平或水平变化来评估CTNNB1基因的表达，例如CTNNB1mRNA水平或CTNNB1蛋白水平。应理解，CTNNB1主要表达在肝脏中。
CTNNB1的表达也可以基于与CTNNB1基因表达相关的其它变量间接评估，例如，β连环蛋白在细胞质中的表达水平、β连环蛋白的核定位、或某些靶基因如Jun、c-Myc和细胞周期蛋白D-1或在β连环蛋白转录控制下的其它癌基因的表达。
可以通过与对照水平相比与CTNNB1表达相关的一个或多个变量的绝对或相对水平的降低来评估抑制。对照水平可以是本领域中使用的任何类型的对照水平，例如，给药前基线水平，或从未经治疗或用对照(例如，仅缓冲液对照或无活性药剂对照)治疗的类似受试者、细胞或样品中确定的水平。
在本发明的方法的一些实施例中，CTNNB1基因的表达被抑制至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，或低于测定的检测水平。在一些实施例中，CTNNB1基因的表达被抑制至少70％。应进一步理解，在某些组织中(例如，肝脏中)抑制CTNNB1表达，而在其它组织(例如，脑)中不显著抑制表达可能是期望的。在一些实施例中，使用实例2中提供的测定方法在合适的物种匹配的细胞系中以10nM siRNA浓度确定表达水平。
在某些实施例中，体内表达的抑制是通过在表达人基因的啮齿类动物，例如表达人靶基因(即CTNNB1)的AAV感染的小鼠中敲低人基因来确定的，e.g.例如，当以单剂量施用时，例如在RNA表达的最低点以3mg/kg施用。模型动物系统中内源性基因表达的敲低也可以确定，例如，在RNA表达的最低点以例如3mg/kg施用单剂量后。当人基因和模型动物基因的核酸序列足够接近使得人iRNA提供模型动物基因有效敲低时，此类系统是有用的。使用实例2中提供的PCR方法确定肝脏中的RNA表达。
CTNNB1基因表达的抑制可以通过第一细胞或细胞组(例如，此类细胞可以存在于源自受试者的样品中)表达的mRNA的量的减少来表现，在所述细胞或细胞组中，CTNNB1基因被转录并且已经被处理(例如，通过使一个或多个细胞与本发明的iRNA接触，或通过向存在或曾经存在所述细胞的受试者施用本发明的iRNA)，从而与基本上与第一细胞或细胞组相同但尚未如此处理的第二细胞或细胞组(未用iRNA处理或未用靶向所关注的基因的iRNA处理的对照细胞)相比，CTNNB1基因的表达受到抑制。在一些实施例中，通过实例2中提供的方法评估抑制，使用10nM siRNA浓度在物种匹配的细胞系中，并且使用下式将处理的细胞中的mRNA水平表达为对照细胞中mRNA水平的百分比：
在其它实施例中，可以根据与CTNNB1基因表达功能性相关的参数(例如，来自受试者的血液或血清中的CTNNB1蛋白水平)的降低来评估CTNNB1基因表达的抑制。CTNNB1基因沉默可以在任何表达CTNNB1的细胞中确定，无论是内源性的还是来自表达构建体的异源性的，并且通过本领域已知的任何测定。
CTNNB1蛋白的表达的抑制可以通过细胞或细胞组或受试者样品中(例如，源自受试者的血样中的蛋白质水平)表达的CTNNB1蛋白水平的降低来表现。如上文所解释的，为了评估mRNA抑制，处理的细胞或细胞组中蛋白质表达水平的抑制可以类似地表达为对照细胞或细胞组中蛋白质水平的百分比，或表达为受试者样品(例如，源自其的血液或血清)中蛋白质水平变化。
可以用于评估CTNNB1基因的表达的抑制的对照细胞、细胞组或受试者样品包含尚未与本发明的RNAi药剂接触的细胞、细胞组或受试物样品。例如，在用RNAi药剂或适当匹配的群体对照治疗受试者之前，对照细胞、细胞组或受试者样品可以源自个体受试者(例如，人或动物受试者)。
细胞或细胞组表达的CTNNB1 mRNA的水平可以使用本领域已知的用于评估mRNA表达的任何方法来确定。在一个实施例中，通过检测转录的多核苷酸或其部分，例如CTNNB1基因的mRNA来确定样品中CTNNB1的表达水平。可以使用RNA提取技术从细胞中提取RNA，包含例如使用酸酚/异硫氰酸胍提取(RNAzol B；生物起源公司(Biogenesis))、RNeasyTM RNA制备试剂盒()或PAXgeneTM(瑞士的PreAnalytixTM)。利用核糖核酸杂交的典型分析形式包含核运行测定、RT-PCR、RNase保护测定、northern印迹、原位杂交和微阵列分析。
在一些实施例中，使用核酸探针确定CTNNB1的表达水平。如本文所使用的，术语“探针”是指能够与特定CTNNB1选择性地结合的任何分子。探针可以由本领域技术人员合成，或源自适当的生物制剂。探针可以专门设计成被标记。可以用作探针的分子的实例包含但不限于RNA、DNA、蛋白质、抗体和有机分子。
分离的mRNA可以用于杂交或扩增测定，包含但不限于Southern分析或northern分析、聚合酶链式反应(PCR)分析和探针阵列。一种用于确定mRNA水平的方法涉及将分离的mRNA与可以与CTNNB1 mRNA杂交的核酸分子(探针)接触。在一个实施例中，mRNA被固定在固体表面上并与探针接触，例如通过在琼脂糖凝胶上运行分离的mRNA并将mRNA从凝胶转移到膜，如硝酸纤维素。在替代性实施例中，探针固定在固体表面上，并且mRNA与探针接触，例如，在基因芯片阵列中。本领域技术人员可以容易地将已知的mRNA检测方法用于确定CTNNB1 mRNA的水平。
用于确定样品中CTNNB1的表达水平的替代性方法涉及样品中例如mRNA的核酸扩增或逆转录酶(以制备cDNA)的过程，例如通过RT-PCR(Mullis,1987,美国专利第4,683,202号中所述的实验实施例)、连接酶链式反应(Barany(1991)《美国国家科学院院刊》88:189-193)、自持序列复制(Guatelli等人(1990)《美国国家科学院院刊》87:1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh等人(1989)《美国国家科学院院刊》86:1173-1177)、Q-β复制酶(Lizardi等人(1988)《生物/技术(Bio/Technology)》6:1197)、滚环复制(Lizardi等人,美国专利第5,854,033号)或任何其它核酸扩增方法，然后使用本领域技术人员众所周知的技术检测扩增的分子。如果此类核酸分子以非常低的数量存在，则这些检测方案对于检测核酸分子特别有用。在本发明的特定方面，CTNNB1的表达水平通过定量荧光RT-PCR(即TaqManTM系统)确定。在一些实施例中，通过实例2中提供的方法，使用例如10nM siRNA浓度，在物种匹配的细胞系中确定表达水平。
CTNNB1 mRNA的表达水平可以使用膜印迹(如用于杂交分析，如northern、Southern、斑点等)或微孔、样品管、凝胶、珠或纤维(或任何包括结合核酸的固相载体)来监测。参见美国专利第5,770,722号、第5,874,219号、第5,744,305号、第5,677,195号和第5,445,934号，所述美国专利通过引用并入本文。CTNNB1表达水平的确定也可以包括在溶液中使用核酸探针。
在一些实施例中，使用支链DNA(bDNA)测定或实时PCR(qPCR)来评估mRNA表达的水平。这些方法的使用在本文给出的实例中进行了描述和例示。在一些实施例中，通过实例2中提供的方法，使用例如10nM siRNA浓度，在物种匹配的细胞系中确定表达水平。
CTNNB1蛋白表达水平可以使用本领域已知的任何用于测量蛋白质水平的方法来确定。此类方法包含，例如，电泳、毛细管电泳、高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法(TLC)、超扩散色谱法、流体或凝胶沉淀反应、吸收光谱法、比色测定、分光光度测定、流式细胞术、免疫扩散(单或双)、免疫电泳、蛋白质印迹、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定、电化学发光测定等。
在一些实施例中，通过CTNNB1 mRNA或蛋白质水平的降低(例如，在肝活检中)来评估本发明的方法的功效。
在一些实施例中，可以通过检测或监测肿瘤形成的减少来监测本发明方法的功效。如本文所使用的，减少肿瘤包含受试者的组织内的肿瘤的大小、数量或严重程度的任何减少，或肿瘤形成的预防或减少，这可以使用本领域已知的任何方法在体外或体内进行评估。
在本发明的方法的一些实施例中，向受试者施用iRNA，从而将iRNA递送到受试者体内的特定位点。CTNNB1表达的抑制可以使用源自受试者体内特定部位(例如，肝脏或血液)的流体或组织的样品中CTNNB1 mRNA或CTNNB1蛋白的水平或水平变化的测量来评估。
如本文所使用的，术语检测或确定分析物的水平被理解为执行步骤以确定是否存在材料(例如，蛋白质、RNA)。如本文所使用的，检测或确定的方法包含检测或确定低于所使用的方法的检测水平的分析物水平。
VII.本发明的预防和治疗方法
本发明还提供了使用本发明的iRNA或含有本发明的iRNA的组合物来抑制CTNNB1的表达的方法，由此预防或治疗CTNNB1相关病症，例如癌症，例如肝细胞癌。在本发明的方法中，细胞可以在体外或体内与siRNA接触，即细胞可以在受试者体内。
适用于使用本发明的方法进行处理的细胞可以是表达CTNNB1基因的任何细胞，例如肝脏细胞。适用于本发明的方法的细胞可以是哺乳动物细胞，例如灵长类动物细胞(如人细胞，包含嵌合非人动物中的人细胞，或非人灵长类动物细胞，例如猴细胞或黑猩猩细胞)或非灵长类动物细胞。在某些实施例中，细胞是人细胞，例如人肝细胞。在本发明的方法中，CTNNB1在细胞中的表达被抑制至少50、55、60、65、70、75、80、85、90或95，或抑制到低于测定的检测水平的水平。
本发明的体内方法可包含向受试者施用含有iRNA的组合物，其中所述iRNA包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与待施用RNAi药剂的哺乳动物的CTNNB1基因的RNA转录物的至少一部分互补。所述组合物可以通过本领域已知的任何方式施用，所述方式包含但不限于口服、腹膜内或胃肠外途径，包含颅内(例如，脑室内、实质内和鞘内)、静脉内、肌肉内、皮下、经皮、气道(气雾剂)、鼻、直肠、眼内(例如，眼周、结膜、腱下、前房内、玻璃体内、眼内、前或后巩膜旁、视网膜下、结膜下、球后或管内注射)、静脉内、肌肉内、皮下、经皮、气道(气雾剂)和局部(包含口腔和舌下)施用。
在某些实施例中，组合物通过静脉输注或注射施用。在某些实施例中，组合物通过皮下注射施用。在某些实施例中，组合物通过肌内注射施用。
可以基于是否期望局部或全身治疗以及基于待治疗的区域来选择施用模式。可以选择施用的通路和位点来增强靶向。
一方面，本发明还提供了用于抑制哺乳动物的CTNNB1基因的表达的方法。所述方法包含向哺乳动物施用包括靶向哺乳动物的细胞中的CTNNB1基因的dsRNA的组合物，并且维持哺乳动物足够的时间以获得CTNNB1基因的mRNA转录物的降解，由此抑制细胞中CTNNB1基因的表达。基因表达的减少可以通过本领域已知的任何方法和通过本文所描述的(例如，实例2中)方法(例如，qRT-PCR)来评估。蛋白质产生的减少可以通过本领域已知的任何方法来评估，例如ELISA。在某些实施例中，穿刺肝活检样品用作组织材料，用于监测CTNNB1基因或蛋白质表达的减少。在其它实施例中，血样用作用于监测CTNNB1蛋白表达减少的受试者样品。
本发明进一步提供了治疗有需要的受试者的方法，例如被诊断患有CTNNB1相关病症(如癌症，例如肝细胞癌)的受试者。
本发明进一步提供了在有需要的受试者中进行预防的方法。本发明的治疗方法包含将本发明的iRNA以预防有效量的靶向CTNNB1基因的dsRNA或包括靶向CTNNB1基因的dsRNA的药物组合物向受试者施用，例如将受益于CTNNB1表达减少的受试者。
一方面，本发明提供了治疗患有将受益于CTNNB1表达减少的病症的受试者的方法，所述病症例如CTNNB1相关病症，如癌症，例如肝细胞癌。
将受益于CTNNB1基因表达的减少和/或抑制的受试者的治疗包含治疗性治疗(例如，受试者患有癌症)和预防性治疗(例如，受试者未患有癌症或受试者可能有风险患上癌症)。
在一些实施例中，所述CTNNB1相关病症是癌症。癌症的实例包含但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤、骨髓瘤和白血病。在一些实施例中，癌症包括实体瘤癌症。在其它实施例中，癌症包括基于血液的癌症，例如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。此类癌症的更具体的非限制性实例包含鳞状细胞癌、小细胞肺癌、垂体癌、食道癌、星形细胞瘤、软组织肉瘤、非小细胞肺癌(包含鳞状非小细胞肺癌)、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肾细胞癌、肝细胞癌、肝母细胞癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、脑癌、子宫内膜癌、睾丸癌、胆管癌、胆囊癌、胃癌、黑色素瘤和各种类型的头颈癌(包含头颈鳞状细胞癌)。
在一些实施例中，所述CTNNB1相关病症是肝细胞癌。
在一些实施例中，将RNAi药剂以有效抑制受试者的细胞中的CTNNB1表达的量施用于受试者。抑制受试者的细胞中的CTNNB1表达的有效量可以使用上述方法进行评估，包含涉及评估CTNNB1 mRNA、CTNNB1蛋白或相关变量(如肿瘤形成)的抑制的方法。
本发明的iRNA可以作为“游离iRNA”施用。在不存在药物组合物的情况下施用游离iRNA。裸露的iRNA可以在合适的缓冲溶液中。缓冲溶液可以包括乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐，或其任何组合。在一个实施例中，缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。可以调节含有iRNA的缓冲溶液的pH和渗透压，使得其适合向受试者施用。
可替代地，本发明的iRNA可以作为药物组合物，如dsRNA脂质体调配物施用。
受益于CTNNB1基因表达抑制的受试者是易患或被诊断患有CTNNB1相关病症的受试者，所述病症如癌症，例如肝细胞癌。在一个实施例中，所述方法包含施用本文特征的组合物，使得靶CTNNB1基因的表达降低，如每剂量约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1个月至6个月、1个月至3个月或3个月至6个月。在某些实施例中，组合物每3个月至6个月施用一次。
在一个实施例中，可用于本文特征的方法和组合物的iRNA特异性靶向靶CTNNB1基因的RNA(初级或加工的)。使用iRNA抑制这些基因的表达的组合物和方法可以如本文所描述的制备和进行。
根据本发明的方法施用iRNA可以使得预防或治疗CTNNB1相关病症(例如，癌症，例如肝细胞癌)。可以向受试者施用治疗量的iRNA，如约0.01mg/kg至约200mg/kg。
在一个实施例中，皮下施用iRNA，即通过皮下注射。一次或多次注射可用于向受试者递送期望剂量的iRNA。注射可以在一个时间段内重复进行。
可以定期重复施用。在某些实施例中，在初始治疗方案之后，可以在不太频繁的基础上施用治疗。重复剂量方案可以包含定期施用治疗量的iRNA，如每月一次至每年一次。在某些实施例中，iRNA约每月施用一次至约每三个月施用一次，或约每三个月施用一次至约每六个月施用一次。
本发明还提供了iRNA药剂或其药物组合物用于治疗将受益于CTNNB1基因表达的减少和/或抑制的受试者(例如，患有CTNNB1相关病症的受试者)的方法和用途，其与其它药物和/或其它治疗方法组合，例如，与已知药物和/或已知治疗方法组合，例如目前用于治疗这些病症的那些药物或治疗方法。
因此，在本发明的一些方面，包含本发明的iRNA药剂的施用的方法进一步包含向受试者施用一种或多种另外的治疗剂。
例如，在某些实施例中，靶向CTNNB1的iRNA与例如可用于治疗CTNNB1相关病症的药剂组合施用。用于治疗CTNNB1相关病症(例如，癌症)的示例性另外的治疗剂和治疗可以包含手术、化疗、放疗或施用一种或多种另外抗癌剂，如化学治疗剂、生长抑制剂、抗血管生成剂和/或抗赘生物组合物。可以与本发明的iRNA组合使用的抗癌剂、化学治疗剂、生长抑制剂、抗血管生成剂和抗赘生物组合物的非限制性实例如下。
“化学治疗剂”是指可用于治疗癌症的化学化合物。化学治疗剂的实例包含但不限于如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclosphosphamide)等烷化剂；如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)等烷基磺酸盐；如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)等氮杂环丙烷；乙烯亚胺和甲基胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基密胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲密胺(trimethylolomelamine)；番蒸枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括合成的类似物拓扑替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；卡利他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素(cryptophycin)(具体地是念珠藻素1和念珠藻素8)；尾海兔素(dolastatin)；多卡米星(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥类nitrogen mustard)，如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlomaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲洛磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶芥(uracil mustard)；亚硝基脲如卡莫司汀(carmustine)、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，如烯二炔类抗生素(例如，卡奇霉素(calicheamicin)，尤其是卡奇霉素γ1I和卡奇霉素ωI1(参见例如，《应用化学英文国际版(Chem Intl.Ed.Engl.)》,33:183-186(1994))；达内霉素(dynemicin)，包含达内霉素A；二膦酸盐类(bisphosphonate)，如氯屈膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团(neocarzinostatin chromophore)和相关的色素蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素(cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、/>多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星和脱氧多柔比星(deoxydoxorubicin))、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、马塞罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)，如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素类(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，如氨甲蝶呤(methotrexate)和5-氟脲嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸(denopterin)、氨甲蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺素如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；百垂布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elfomithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓(gallium nitrate)；羟基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登醇(maytansinoid)如美坦辛(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；/>多糖复合物(俄勒冈州尤金市JHS天然产品公司(JHS Natural Products,Eugene,OR))；雷佐生(razoxane)；根瘤毒素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine))；尿烷(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；盖克托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派(thiotepa)；紫杉烷(taxoids)例如/>紫杉醇(paclitaxel)(新泽西州普林斯顿的百时美施贵宝肿瘤学(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.))、/>无聚氧乙烯蓖麻油、白蛋白工程化的紫杉醇纳米颗粒调配物(伊利诺斯州绍姆贝格的美国制药伙伴公司(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Illinois))以及/>多烯紫杉醇(法国安东尼的罗纳普朗克乐安公司(Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France))；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；/>吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；氨甲蝶呤；铂类似物如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin)；长春花碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；诺肖林(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(开普拓(Camptosar)，CPT-11)(包括伊立替康与5-FU和亚叶酸的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲酸如视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)；康普瑞汀(combretastatin)；甲酰四氢叶酸(leucovorin)(LV)；奥沙利铂(oxabplatin)，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；减少细胞增殖的PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR(例如，埃罗替尼(erlotinib)/>)和VEGF-A的抑制剂以及上述中的任何一种的药物可接受的盐、酸或衍生物。
另外的非限制性示例性化学治疗剂包含用于调节或抑制激素对癌症的作用的抗激素剂，如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包含他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、酮昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和/>托瑞米芬(toremifene)；抑制酶芳香酶的芳香酶抑制剂，其调节肾上腺中雌激素的产生例如，4(5)-咪唑、氨鲁米特、/>醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、依西美坦(exemestane)、福美司坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、伏氯唑(vorozole)、/>来曲唑(letrozole)和/>阿那曲唑(anastrozole)；以及抗雄激素如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制与异常细胞增殖有关的信号传导通路中的基因表达的那些例如，PKC-α、Ralf和H-Ras；核酶如VEGF表达抑制剂(例如，/>核酶)和HER2表达抑制剂；疫苗如基因疗法疫苗例如，疫苗、/>疫苗和/>疫苗；/>rIL-2；/>拓扑异构酶1抑制剂；/>rmRH；以及上述中的任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
在一些实施例中，本发明的iRNA可以进一步与基于吉西他滨的化学疗法一起施用，其中施用一种或多种包含吉西他滨或包含吉西他滨和nab-紫杉醇的化学治疗剂。在一些此类实施例中，本发明的iRNA可以与至少一种选自吉西他滨、nab-紫杉醇、白细胞介素(亚叶酸)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、伊立替康和奥沙利铂的化学治疗剂一起施用。FOLFIRINOX是一种化学治疗方案，包括白细胞介素、5-FU、伊立替康(如脂质体伊立替康注射液)和奥沙利铂。在一些实施例中，本发明的iRNA可以进一步与基于吉西他滨的化学疗法一起施用。在一些实施例中，本发明的iRNA可以进一步与至少一种选自以下的药剂一起施用：(a)吉西他滨；(b)吉西他滨和nab-紫杉醇；以及(c)FOLFIRINOX。在一些实施例中，所述至少一种药剂是吉西他滨。在一些此类实施例中，要治疗的癌症是胰腺癌。
“抗血管生成剂”或“血管生成抑制剂”是指直接或间接抑制血管生成、血管发生或不期望的血管通透性的小分子量的物质、多核苷酸(包含例如抑制性RNA(RNAi或siRNA))、多肽、分离的蛋白质、重组蛋白质、抗体或缀合物或其融合蛋白。应当理解，抗血管生成剂包含与血管生成因子或其受体的血管生成活性结合或阻断其的那些药剂。例如，抗血管生成剂可以是针对血管生成剂的抗体或其它拮抗剂例如，VEGF-A(例如，贝伐单抗(bevacizumab))或VEGF-A受体(例如，KDR受体或Flt-1受体)的抗体、抗PDGFR抑制剂如/>(甲磺酸伊马替尼)、阻断VEGF受体信号传导的小分子(例如，PTK787/ZK2284、SU6668、/>/SU11248(苹果酸舒尼替尼(sunitinib malate))、AMG706或例如国际专利申请WO 2004/113304中描述的那些)。抗血管生成剂还包含天然血管生成抑制剂，例如血管抑制素、内皮抑制素等。参见例如，Klagsbrun和D'Amore(1991)《生理学年度评论(Annu.Rev.Physiol.)》53:217-39；Streit和Detmar(2003)《癌基因(Oncogene)》22:3172-3179(例如，表3列出了恶性黑色素瘤的抗血管生成疗法)；Ferrara和Alitalo(1999)《自然医学(Nature Medicine)》5(12):1359-1364；Tonini等人(2003)《癌基因》22:6549-6556(例如，表2列出了已知的抗血管生成因子)；以及Sato(2003)《国际临床肿瘤学杂志(Int.J.Clin.Oncol.)》8:200-206(例如，表1列出了临床试验中使用的抗血管生成药剂)。
如本文所使用的，“生长抑制剂”是指在体外或体内抑制细胞(如表达VEGF的细胞)生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的细胞(如表达VEGF的细胞)的百分比的一种。生长抑制剂的实例包含但不限于阻断细胞周期进程(在S期以外的地方)的药剂，如诱导G1阻滞和M期阻滞的药剂。经典的M期阻断剂包含长春花(长春新碱和长春花碱)、紫杉烷和拓扑异构酶II抑制剂，如多柔比星、表柔比星、柔红霉素、依托泊苷和博莱霉素。那些阻滞G1的药剂也会溢出到S期阻滞例如，DNA烷化剂如他莫昔芬、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪、氮芥、顺铂、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和ara-C。另外的信息可见于Mendelsohn和Israel,编辑,《癌症分子基础(The Molecular Basis of Cancer)》,第1章,Murakami等人的标题为“细胞周期调节、致癌基因和抗肿瘤药物(Cell cycle regulation,oncogenes,and antineoplastic drugs)”(桑德斯出版社(W.B.Saunders),费城,1995)，例如第13页。紫杉烷(紫杉醇和多西他赛)是均衍生自紫杉的抗癌药物。衍生自欧洲紫杉的多西他赛(罗纳普朗克制药公司(Rhone-Poulenc Rorer))是紫杉醇的半合成类似物(/>百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb))。紫杉醇和多西他赛促进微管蛋白二聚体的微管组装并通过防止解聚来稳定微管，这导致抑制了细胞的有丝分裂。
术语“抗赘生物组合物”指包括至少一种活性治疗剂的可用于治疗癌症的组合物。治疗剂的实例包含但不限于例如化学治疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂、放射治疗中使用的药剂、抗血管生成剂、癌症免疫治疗剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂和治疗癌症的其它药剂，例如抗HER-2抗体、抗CD20抗体、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如，酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂(例如，埃罗替尼(Tarceva)、血小板衍生生长因子抑制剂(例如，(甲磺酸伊马替尼)、COX-2抑制剂(例如，塞来昔布)、干扰素、细胞因子、与以下靶标ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA或VEGF受体中的一个或多个结合的拮抗剂(例如，中和抗体)以及其它生物活性和有机化学药剂等。它们的组合也包含在本发明中。
在一些实施例中，靶向CTNNB1的iRNA与例如用于治疗肝细胞癌(HCC)的药剂组合施用，所述药剂例如但不限于索拉非尼。
iRNA药剂和另外的治疗剂可以同时和/或以相同的组合施用，例如肠胃外，或另外的治疗剂可以作为单独的组合物的一部分或在单独的时间施用和/或通过本领域已知或本文所描述的另一种方法施用。
iRNA药剂和另外的治疗剂和/或治疗可以同时和/或以相同的组合施用，例如肠胃外，或另外的治疗剂可以作为单独的组合物的一部分或在单独的时间施用和/或通过本领域已知或本文所描述的另一种方法施用。
VIII.试剂盒
在某些方面，本公开提供了试剂盒，所述试剂盒包含含有siRNA化合物(例如，双链siRNA化合物或siRNA化合物(例如，前体，例如可以加工成ssiRNA化合物的较大siRNA化合物，或编码siRNA化合物的DNA，例如双链siRNA化合物或siRNA化合物，或其前体))的药物调配物的合适容器。
此类试剂盒包含一种或多种dsRNA药剂和使用说明书，例如，施用预防或治疗有效量的dsRNA药剂的说明书。dsRNA药剂可以在小瓶或预先填充注射管中。试剂盒可以任选地进一步包括用于施用dsRNA药剂的装置(例如，注射装置，如预填充注射器)，或用于测量CTNNB1的抑制的装置(例如，用于测量CTNNB1 mRNA、CTNNB1蛋白和/或CTNNB1活性的抑制的装置)。用于测量CTNNB1的抑制的此类装置可以包括用于从受试者获得样品(例如，血浆样品)的装置。本发明的试剂盒可以任选地进一步包括用于确定治疗有效量或预防有效量的装置。
在某些实施例中，药物调配物的各个组分可以提供在一个容器中，例如小瓶或预填充注射管。可替代地，可能期望在两个或更多个容器中单独提供药物调配物的组分，例如，一个容器用于siRNA化合物制剂，并且至少另一个用于载剂化合物。试剂盒可以包装在许多不同的配置中，如单个盒子中的一个或多个容器。可以将不同的组分组合，例如根据随试剂盒提供的说明书。这些组分可以根据本文所描述的方法进行组合，例如，以制备和施用药物组合物。试剂盒还可以包含递送装置。
本发明通过以下实例进一步说明，所述实例不应被解释为限制性的。在本申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的全部内容以及非正式序列表和附图特此通过引用并入本文。
实例
实例1：iRNA合成
试剂来源
在本文没有具体给出药剂来源的情况下，此类试剂可以从任何分子生物学试剂供应商处获得，其质量/纯度标准适用于分子生物学。
siRNA设计
靶向人β连环蛋白(CTNNB1)基因(人：NCBI refseqID NM_001904.4，NCBI GeneID：1499)的siRNA是使用定制R和Python脚本设计的。人NM_001904.4REFSEQ mRNA的长度是3661个碱基。
未经修饰的CTNNB1有义和反义链核苷酸序列的详细列表在表2中示出。经修饰的CTNNB1有义和反义链核苷酸序列的详细列表在表3中示出。
应理解，在整个应用程序中，没有小数的双链体名称等效于具有仅引用双链体的批号的具有小数的双链体名称。例如，AD-959917等效于AD-959917.1。
siRNA合成
使用本领域已知的方法设计、合成并制备了siRNA。
简而言之，siRNA序列是使用Mermade 192合成器(生物自动化公司(BioAutomation))在1μmol的规模上合成的，所述合成器在固相载体上具有亚磷酰胺化学。固相载体是受控孔玻璃()，装载有定制的GalNAc配体(3'-GalNAc缀合物)、通用固相载体(AM Chemicals(AM化学公司))或所关注的第一核苷酸。辅助合成试剂和标准2-氰基乙基亚磷酰胺单体(2'-脱氧-2'-氟、2'-O-甲基、RNA、DNA)从赛默飞世尔公司(ThermoFisher)(威斯康星州密尔沃基(Milwaukee,WI))、兆维科技发展有限公司(Hongene)(中国(China))或Chemgenes公司(Chemgenes)(美国马萨诸塞州威尔明顿(Wilmington,MA,USA))获得。另外的亚磷酰胺单体从商业供应商处采购，在内部制备，或使用来自各种CMO的定制合成采购。在乙腈或9:1乙腈:DMF中以100mM的浓度制备亚磷酰胺，并且使用5-乙基硫代-1H-四唑(ETT，0.25M于乙腈中)以400秒的反应时间偶联。使用3-((二甲基氨基-亚甲基)氨基)-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT，从Chemgenes公司(美国马萨诸塞州威尔明顿)获得)于无水乙腈/吡啶(9:1v/v)中的100mM溶液产生硫代磷酸酯键。氧化时间是5分钟。所有序列都是在最后去除DMT基团的情况下合成的(“DMT-Off”)。
固相合成完成后，用300μL的甲胺(40％水溶液)在室温下在96孔板中处理固相支持的寡核糖核苷酸大约2小时，以从固相载体中切割，并且随后去除所有另外的碱不稳定保护基。对于含有用叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)基团保护的任何天然核糖核苷酸键(2'-OH)的序列，使用TEA.3HF(三乙基胺三氢氟酸盐)进行第二次脱保护步骤。向甲胺水溶液中的每个寡核苷酸溶液中添加200μL的二甲基亚砜(DMSO)和300μL TEA.3HF，并且将溶液在60℃下温育大约30分钟。温育后，使板达到室温，并且通过添加1mL的9:1乙腈:乙醇或1:1乙醇:异丙醇沉淀粗寡核苷酸。然后将板在4℃下离心45分钟，并且在多通道移液管的帮助下小心倾析上清液。将寡核苷酸颗粒重悬于20mM NaOAc中，并且随后在配备有自动进样器、UV检测器、电导率计和级分收集器的Agilent LC系统上使用HiTrap尺寸排除柱(5mL，通用电气医疗集团(GE Healthcare))脱盐。在96孔板中收集脱盐样品，并且然后通过LC-MS和UV光谱法进行分析，以分别证实材料的同一性和定量。
在Tecan液体处理机器人上进行单链的双面折叠。在96孔板中，将有义和反义单链以等摩尔比组合到1x PBS中的最终浓度10μM，将板密封，在100℃下温育10分钟，并且随后允许其在2小时至3小时内缓慢恢复到室温。证实每个双链体的浓度和同一性，并且然后用于体外筛选测定。
实例2：体外筛选方法
细胞培养和384孔转染
Hep3b细胞(弗吉尼亚州马纳萨斯的美国菌种保藏中心(ATCC，Manassas，VA))在37℃下5％CO2的气氛中，在补充有10％FBS(ATCC)的Eagle最低必需培养基(吉博科公司(Gibco))中生长至接近汇合，然后通过胰蛋白酶消化从板中释放。转染是通过将7.5μl的Opti-MEM加0.1μl的Lipofectamine RNAiMax每孔(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen，Carlsbad CA.)，目录号13778-150)添加到2.5μl的每种siRNA双链体到384孔板中的单个孔中来进行的。然后将混合物在室温下温育15分钟。然后将四十μl不含抗生素的含有约1.5×104个细胞的完全生长培养基添加到siRNA混合物中。在RNA纯化之前将细胞温育24小时。在10nM、1nM和0.1nM的最终双链体浓度下进行单剂量实验。
使用DYNABEADS mRNA分离试剂盒(InvitrogenTM，部件#:610-12)的总RNA分离
将细胞裂解在每孔含有3μL珠的75μl裂解/结合缓冲液中，并且在静电振荡器上混合10分钟。洗涤步骤在Biotek EL406上使用磁性板支撑件进行自动化。在缓冲液A中将珠洗涤一次(在90μL中)，在缓冲液B中洗涤一次，并在缓冲液E中洗涤两次，其间有抽吸步骤。在最终抽吸之后，将完整的10μL RT混合物添加到每个孔中，如下文所描述的。
使用ABI高容量cDNA逆转录试剂盒(加利福尼亚州福斯特市的应用生物系统公司(Applied Biosystems，Foster City，CA)，目录号4368813)进行cDNA合成
每个反应每个孔添加1μl 10X缓冲液、0.4μl 25X dNTP、1μl随机引物、0.5μl逆转录酶、0.5μl RNase抑制剂和6.6μl H2O的主混合物。将板密封，在静电振荡器上搅拌10分钟，然后在37℃下温育2小时。在此之后，将板在80℃下搅拌8分钟。
实时PCR
将两微升(μl)的cDNA添加到384孔板(罗氏公司(Roche)，目录号04887301001)中每孔含有0.5μl人GAPDH TaqMan探针(4326317E)、0.5μl人CTNNB1、2μl无核酸酶水和5μlLightcycler 480探针主混合物(罗氏公司，目录号04887301001)的主混合物中。实时PCR是在LightCycler480实时PCR系统(罗氏公司)中进行的。
为了计算相对倍数变化，使用ΔΔCt方法分析数据，并且将其相对于用10nM AD-1955转染的细胞或模拟转染的细胞进行的测定归一化。使用XLFit的4参数拟合模型计算IC50，并且将其相对于用AD-1955转染或模拟转染的细胞归一化。AD-1955的有义序列和反义序列是：有义：cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT和反义UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT。
表2和表3中的药剂在Hep3b细胞中的单剂量筛选结果在表4中示出。
表1：用于核酸序列表示的核苷酸单体的缩略语。应理解，当这些单体存在于寡核苷酸中时，通过5'-3'-磷酸二酯键相互连接；并且应理解，当核苷酸含有2'-氟修饰时，则氟替换亲本核苷酸中该位置处的羟基(即，其是2'-脱氧-2'-氟核苷酸)。
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表4：Hep3b细胞中的单剂量筛选
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实例3:靶向人β连环蛋白(CTNNB1)的另外的双链体
靶向人β连环蛋白(CTNNB1)基因(人：NCBI refseqID NM_001904.4，NCBI GeneID：1499)的另外的siRNA是如上文所描述设计和合成的。10nM、1nM和01.nM的单剂量筛选在Hep3B细胞中进行，如上文所描述。
另外的未经修饰的CTNNB1有义和反义链核苷酸序列的详细列表在表5中示出。另外的经修饰的CTNNB1有义和反义链核苷酸序列的详细列表在表6中示出。
表5和表6中的药剂在Hep3B细胞中的单剂量筛选结果在表7中示出。
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表7:Hep3b细胞中的单剂量筛选
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实例4:非人元类动物的CTNNB1siRNA的体内评估
评估从上述体外分析中鉴定的双链体在体内抑制CTNNB1表达的能力。简而言之，双链体被调配在包括可生物降解脂质(例如，阳离子脂质)的脂质颗粒中，并且被静脉内施用于非人灵长类动物。
具体地，双链体AD-167990(阴性对照)、AD-1548393、AD-1548488和AD-1548459分别与具有以下结构的阳离子脂质和比率分别是50:12:36:2的DSPC/Chol/PEG-DMG组合。
在给药前-10天，获得经皮穿刺肝活检，并且如上文所描述确定CTNNB1mRNA的水平。
在第0天，向食蟹猴静脉内施用单剂量0.1mg/kg或0.3mg/kg的脂质调配的双链体，并且在第5天、第15天和第29天，获得经皮针肝活检，并且如上文所描述确定CTNNB1 mRNA的水平。研究设计在下表8中提供。
如在图1A-1C中所示，在0.1mg/kg和0.3mg/kg时，所有三种双链体都有效地抑制了CTNNB1表达。
表8:研究设计
等效形式
本领域技术人员会认识到或能够使用不超过例行实验确定本文所描述的具体实施例和方法的许多等效形式。此类等效形式旨在被涵盖在以下权利要求书的范围内。
非正式序列表
SEQ ID NO:1
>NM_001904.4智人连环蛋白β1(CTNNB1)，转录变体1，mRNA
SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:1的反向补体
SEQ ID NO:3
>NM_007614.3小家鼠连环蛋白(钙粘蛋白相关蛋白)β1(Ctnnb1)，转录变体1，mRNA
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SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:3的反向补体
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SEQ ID NO:5
>NM_053357.2大家鼠连环蛋白β1(Ctnnb1)，mRNA
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SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:5的反向补体
SEQ ID NO:7
>NM_001319394.1食蟹猴连环蛋白β1(CTNNB1)，mRNA
/>
SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:7的反向补体
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SEQ ID NO:9
>NM_001257918.1恒河猴连环蛋白β1(CTNNB1)，mRNA
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SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:9的反向补体
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Claims (94)

1.一种用于抑制细胞中的β连环蛋白(CTNNB1)的表达的双链核糖核酸(dsRNA)药剂，其中所述dsRNA药剂包括形成双链区的有义链和反义链，其中所述反义链包括与编码CTNNB1的mRNA互补的区，并且其中所述互补区包括与表2、表3、表5和表6中的任一个表中的任一个反义核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
2.一种用于抑制细胞中的β连环蛋白(CTNNB1)的表达的双链核糖核酸(dsRNA)药剂，其中所述dsRNA药剂包括形成双链区的有义链和反义链，其中所述有义链包括与SEQ ID NO:1的核苷酸603-625、1489-1511或1739-1761的核苷酸序列中的任一个核苷酸序列相差不超过三个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且所述反义链包括与SEQ ID NO:2的对应核苷酸序列相差不超过三个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的dsRNA药剂，其中所述反义链包括与选自由以下组成的组的双链体的任一个反义链核苷酸序列相差不超过三个核苷酸的至少15个连续核苷酸：
AD-1548393、AD-1548488和AD-1548459。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述dsRNA药剂包括至少一个经修饰的核苷酸。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述有义链的基本上所有核苷酸都是经修饰的核苷酸；所述反义链的基本上所有核苷酸都是经修饰的核苷酸；或者所述有义链的基本上所有核苷酸和所述反义链的基本上所有核苷酸都是经修饰的核苷酸。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述有义链的所有核苷酸都是经修饰的核苷酸；所述反义链的所有核苷酸都是经修饰的核苷酸；或者所述有义链的所有核苷酸和所述反义链的所有核苷酸都是经修饰的核苷酸。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述经修饰的核苷酸中的至少一种经修饰的核苷酸选自由以下组成的组：脱氧核苷酸、3'末端脱氧胸苷(dT)核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、锁定核苷酸、解锁核苷酸、构象限制性核苷酸、约束乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、2'-C-烷基修饰的核苷酸、2'-羟基修饰的核苷酸、2'-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包括核苷酸的非天然碱基、四氢吡喃修饰的核苷酸、1,5-脱水己糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包括硫代磷酸酯基的核苷酸、包括甲基膦酸酯基的核苷酸、包括5'-磷酸酯的核苷酸、包括5'-磷酸酯模拟物的核苷酸、热不稳定核苷酸、乙二醇修饰的核苷酸(GNA)、包括2'磷酸酯的核苷酸和2-O-(N-甲基乙酰胺)修饰的核苷酸；以及其组合。
8.根据权利要求4至6中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述经修饰的核苷酸中的至少一种经修饰的核苷酸选自由以下组成的组：LNA、HNA、CeNA、2′-甲氧基乙基、2′-O-烷基、2′-O-烯丙基、2′-C-烯丙基、2′-氟、2′-脱氧、2'-羟基和乙二醇；以及其组合。
9.根据权利要求4至6中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述经修饰的核苷酸中的至少一种经修饰的核苷酸选自由以下组成的组：脱氧核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、乙二醇修饰的核苷酸(GNA)、包括2'磷酸酯的核苷酸、包括硫代磷酸酯基的核苷酸和乙烯基膦酸酯核苷酸；以及其组合。
10.根据权利要求4至6中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述经修饰的核苷酸中的至少一种经修饰的核苷酸是用热不稳定核苷酸修饰来修饰的核苷酸。
11.根据权利要求10所述的dsRNA药剂，其中所述热不稳定核苷酸修饰选自由以下组成的组：无碱基修饰；与所述双链体中的相对核苷酸的错配；不稳定糖修饰、2'-脱氧修饰、无环核苷酸、解锁核酸(UNA)和甘油核酸(GNA)。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述双链区的长度是19个至30个核苷酸对。
13.根据权利要求12所述的dsRNA药剂，其中所述双链区的长度是19个至25个核苷酸对。
14.根据权利要求12所述的dsRNA药剂，其中所述双链区的长度是19个至23个核苷酸对。
15.根据权利要求12所述的dsRNA药剂，其中所述双链区的长度是23个至27个核苷酸对。
16.根据权利要求12所述的dsRNA药剂，其中所述双链区的长度是21个至23个核苷酸对。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的dsRNA药剂，其中每条链的长度独立地不超过30个核苷酸。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述有义链的长度是21个核苷酸，并且所述反义链的长度是23个核苷酸。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述互补区的长度是至少17个核苷酸。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述互补区的长度介于19个与23个核苷酸之间。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述互补区的长度是19个核苷酸。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的dsRNA药剂，其中至少一条链包括至少1个核苷酸的3'突出端。
23.根据权利要求1至21中任一项所述的dsRNA药剂，其中至少一条链包括至少2个核苷酸的3'突出端。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的dsRNA药剂，其进一步包括配体。
25.根据权利要求24所述的dsRNA药剂，其中所述配体与所述dsRNA药剂的所述有义链的3'端缀合。
26.根据权利要求24或25所述的dsRNA药剂，其中所述配体是N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述配体是通过单价、二价或三价支链接头连接的一种或多种GalNAc衍生物。
28.根据权利要求26或27所述的dsRNA药剂，其中所述配体是
29.根据权利要求28所述的dsRNA药剂，其中所述dsRNA药剂与所述配体缀合，如以下示意图所示
并且其中X是O或S。
30.根据权利要求29所述的dsRNA药剂，其中所述X是O。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述dsRNA药剂进一步包括至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。
32.根据权利要求31所述的dsRNA药剂，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键位于一条链的3'末端处。
33.根据权利要求32所述的dsRNA药剂，其中所述链是所述反义链。
34.根据权利要求32所述的dsRNA药剂，其中所述链是所述有义链。
35.根据权利要求31所述的dsRNA药剂，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键位于一条链的5'末端处。
36.根据权利要求35所述的dsRNA药剂，其中所述链是所述反义链。
37.根据权利要求35所述的dsRNA药剂，其中所述链是所述有义链。
38.根据权利要求31所述的dsRNA药剂，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键位于一条链的5'末端和3'末端两者处。
39.根据权利要求38所述的dsRNA药剂，其中所述链是所述反义链。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的dsRNA药剂，其中在所述双链体的所述反义链的5′端的1位置处的碱基对是AU碱基对。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述反义链包括与核苷酸序列5'-UTUCGAAUCAATCCAACAGUAGC-3'相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
42.根据权利要求1至40中任一项所述的dsRNA药剂，其中所述有义链包括与核苷酸序列5'-UACUGUUGGAUUGAUUCGAAA-3'相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且所述反义链包括与核苷酸序列5'-UTUCGAAUCAATCCAACAGUAGC-3'相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
43.根据权利要求41或42所述的dsRNA药剂，其中所述反义链包括核苷酸序列5'-UTUCGAAUCAATCCAACAGUAGC-3'。
44.根据权利要求41或42所述的dsRNA药剂，其中所述有义链包括核苷酸序列5'-UACUGUUGGAUUGAUUCGAAA-3'，并且所述反义链包括核苷酸序列5'-UTUCGAAUCAATCCAACAGUAGC-3'。
45.根据权利要求44所述的dsRNA药剂，其中所述有义链与核苷酸序列5'-usascuguugGfAfUfugauucgasasa-3'相差不超过4个碱基，并且所述反义链与核苷酸序列5'-VPudTucdGadAucaadTcCfaacaguasgsc-3'相差不超过4个碱基，
其中a、g、c和u分别是2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf分别是2'-氟A、G、C和U；s是硫代磷酸酯键；VP是乙烯基膦酸酯；dT是2'-脱氧胸苷-3'-磷酸酯；dG是2'-脱氧鸟苷-3'-磷酸酯；并且dA是2'-脱氧腺苷-3'-磷酸酯。
46.一种用于抑制细胞中的β连环蛋白(CTNNB1)的表达的双链RNA(dsRNA)药剂，所述dsRNA药剂包括有义链和反义链，所述有义链包括核苷酸序列5'-usascuguugGfAfUfugauucgasasa-3'，所述反义链包括核苷酸序列5'-VPudTucdGadAucaadTcCfaacaguasgsc-3'，
其中a、g、c和u分别是2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf分别是2'-氟A、G、C和U；s是硫代磷酸酯键；VP是乙烯基膦酸酯；dT是2'-脱氧胸苷-3'-磷酸酯；dG是2'-脱氧鸟苷-3'-磷酸酯；并且dA是2'-脱氧腺苷-3'-磷酸酯。
47.根据权利要求46所述的dsRNA药剂，其进一步包括配体。
48.一种细胞，其含有根据权利要求1至47中任一项所述的dsRNA药剂。
49.一种用于抑制编码β连环蛋白(CTNNB1)的基因的表达的药物组合物，所述药物组合物包括根据权利要求1至47中任一项所述的dsRNA药剂以及药学上可接受的载剂。
50.根据权利要求49所述的药物组合物，其中dsRNA药剂在未缓冲的溶液中。
51.根据权利要求50所述的药物组合物，其中所述未缓冲的溶液是盐水或水。
52.根据权利要求49所述的药物组合物，其中所述dsRNA药剂在缓冲溶液中。
53.根据权利要求52所述的药物组合物，其中所述缓冲溶液包括乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐，或其任何组合。
54.根据权利要求53所述的药物组合物，其中所述缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
55.一种用于抑制编码β连环蛋白(CTNNB1)的基因的表达的药物组合物，所述药物组合物包括根据权利要求1至47中任一项所述的dsRNA药剂以及脂质。
56.根据权利要求55所述的药物组合物，其中所述脂质是阳离子脂质。
57.根据权利要求56所述的药物组合物，其中所述阳离子脂质包括一个或多个可生物降解基团。
58.根据权利要求57所述的药物组合物，其中所述脂质包括以下结构：
59.根据权利要求58所述的药物组合物，其包括：
(a)
(b)胆固醇；
(c)DSPC；以及
(d)PEG-DMG。
60.根据权利要求59所述的药物组合物，其中所述DSPC、胆固醇和PEG-DMG分别以50:12:36:2的摩尔比存在。
61.一种药物组合物，其包括用于抑制编码β连环蛋白(CTNNB1)的基因的表达的dsRNA药剂以及脂质，所述dsRNA药剂包括形成双链区的有义链和反义链，其中所述反义链包括与核苷酸序列5'-UTUCGAAUCAATCCAACAGUAGC-3'相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
62.根据权利要求61所述的药物组合物，其中所述有义链包括与核苷酸序列5'-UACUGUUGGAUUGAUUCGAAA-3'相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且所述反义链包括与核苷酸序列5'-UTUCGAAUCAATCCAACAGUAGC-3'相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
63.根据权利要求61或62所述的药物组合物，其中所述反义链包括核苷酸序列5'-UTUCGAAUCAATCCAACAGUAGC-3'。
64.根据权利要求61或62所述的药物组合物，其中所述有义链包括核苷酸序列5'-UACUGUUGGAUUGAUUCGAAA-3'，并且所述反义链包括核苷酸序列5'-UTUCGAAUCAATCCAACAGUAGC-3'。
65.根据权利要求64所述的药物组合物，其中所述有义链与核苷酸序列5'-usascuguugGfAfUfugauucgasasa-3'相差不超过4个碱基，并且所述反义链与核苷酸序列5'-VPudTucdGadAucaadTcCfaacaguasgsc-3'相差不超过4个碱基，
其中a、g、c和u分别是2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C和U；Af、Gf、Cf和Uf分别是2'-氟A、G、C和U；s是硫代磷酸酯键；VP是乙烯基膦酸酯；dT是2'-脱氧胸苷-3'-磷酸酯；dG是2'-脱氧鸟苷-3'-磷酸酯；并且dA是2'-脱氧腺苷-3'-磷酸酯。
66.根据权利要求61至65中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质包括以下结构：
67.根据权利要求66所述的药物组合物，其包括：
(a)
(b)胆固醇；
(c)DSPC；以及
(d)PEG-DMG。
68.根据权利要求66所述的药物组合物，其中所述DSPC、胆固醇和PEG-DMG分别以50:12:36:2的摩尔比存在。
69.一种抑制细胞中的β连环蛋白(CTNNB1)基因的表达的方法，所述方法包括使所述细胞与根据权利要求1至47中任一项所述的dsRNA药剂或根据权利要求49至68中任一项所述的药物组合物接触，由此抑制所述细胞中的所述CTNNB1基因的表达。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述细胞在受试者体内。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述受试者是人。
72.根据权利要求70所述的方法，其中所述受试者患有CTNNB1相关病症。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述CTNNB1相关病症是癌症。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述癌症是肝细胞癌。
75.根据权利要求69至74中任一项所述的方法，其中使所述细胞与所述dsRNA药剂接触将CTNNB1的表达抑制了至少50％、60％、70％、80％、90％或95％。
76.根据权利要求69至75中任一项所述的方法，其中抑制CTNNB1的表达使所述受试者的血清中的CTNNB1蛋白水平降低了至少50％、60％、70％、80％、90％或95％。
77.一种治疗患有将受益于β连环蛋白(CTNNB1)表达减少的病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至47中任一项所述的dsRNA药剂或根据权利要求49至68中任一项所述的药物组合物，由此治疗患有所述将受益于CTNNB1表达减少的病症的所述受试者。
78.一种预防患有将受益于β连环蛋白(CTNNB1)表达减少的病症的受试者的至少一种症状的方法，所述方法包括向所述受试者施用预防有效量的根据权利要求1至47中任一项所述的dsRNA药剂或根据权利要求49至68中任一项所述的药物组合物，由此预防患有所述将受益于CTNNB1表达减少的病症的所述受试者的至少一种症状。
79.根据权利要求77或78所述的方法，其中所述病症是CTNNB1相关病症。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述CTNNB1相关病症是癌症。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述癌症是肝细胞癌。
82.根据权利要求79或80所述的方法，其中所述受试者是人。
83.根据权利要求79至82中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用所述dsRNA药剂使所述受试者的CTNNB1蛋白累积减少。
84.根据权利要求79至83中任一项所述的方法，其中所述dsRNA药剂以约0.01mg/kg至约50mg/kg的剂量施用于所述受试者。
85.根据权利要求79至84中任一项所述的方法，其中所述dsRNA药剂皮下施用于所述受试者。
86.根据权利要求79至84中任一项所述的方法，其中所述dsRNA药剂静脉内施用于所述受试者。
87.根据权利要求79至86中任一项所述的方法，其进一步包括确定来自所述受试者的样品中的CTNNB1的水平。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述受试者样品中的CTNNB1的水平是血液或血清或肝组织样品中的CTNNB1蛋白水平。
89.根据权利要求79至88中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用用于治疗CTNNB1相关病症的另外的治疗剂。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述另外的治疗剂选自由以下组成的组：化学治疗剂、生长抑制剂、抗血管生成剂、抗赘生物组合物以及前述中任一项的组合。
91.一种试剂盒，其包括根据权利要求1至47中任一项所述的dsRNA药剂或根据权利要求49至68中任一项所述的药物组合物。
92.一种小瓶，其包括根据权利要求1至47中任一项所述的dsRNA药剂或根据权利要求49至68中任一项所述的药物组合物。
93.一种注射器，其包括根据权利要求1至47中任一项所述的dsRNA药剂或根据权利要求49至68中任一项所述的药物组合物。
94.一种RNA诱导的沉默复合物(RISC)，其包括根据权利要求1至47所述的dsRNA药剂中的任何一种的反义链。
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