CN104105790A - 修饰的RNAi试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明的一个方面涉及能够抑制一种靶基因的表达的双链RNAi(dsRNA)双链体试剂。该dsRNA双链体在一条或两条链中包括一个或多个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序，特别是在该链的裂解位点处或附近。本发明的其他方面涉及包括这些适于治疗用途的dsRNA试剂的药物组合物以及通过给予这些dsRNA试剂来抑制一种靶基因的表达的方法，例如用于治疗各种疾病病症。

Description

修饰的RNAi试剂
相关申请
本申请要求于2011年11月18日提交的美国临时申请号61/561,710的优先权，将该申请的全部内容通过引用特此结合在此。
发明领域
本发明涉及具有有利抑制靶基因表达的特定基序的RNAi双链体试剂以及适于治疗使用的RNAi组合物。额外地，本发明提供了通过给予这些RNAi双链体试剂来抑制靶基因的表达的方法，例如用于治疗各种疾病。
背景
RNA干扰或“RNAi”是一个最初由费尔(Fire)和同事创造的术语，用来描述观察到双链RNAi(dsRNA)可以阻断基因表达(菲尔等人(1998)Nature(自然)391，806-811；Elbashir(艾巴施)等人(2001)Genes Dev.(基因与发育)15，188-200)。短dsRNA在许多有机体(包括脊椎动物)中指导基因特异性的转录后沉默，并且已经为研究基因功能提供了一个新的工具。RNAi由RNA诱导沉默复合体(RISC)介导，RISC是一种破坏与沉默触发物同源的信使RNA的序列特异性多组分核酸酶。已知RISC包含来自双链RNA触发物的短RNA(大约22个核苷酸)，但是这一活性的蛋白组分仍是未知的。
基于RNA干扰(RNAi)的药物开发需要具有良好基因沉默特性的双链RNA(dsRNA)分子。RNAi中的最初步骤是RNA诱导沉默复合体(RISC)的活化，这需要降解dsRNA双链体的有义链。已知有义链作为被在双链体区的中部的Argonaute2裂解的第一RISC底物。有义链的裂解的5′-端和3′-端片段从核酸内切酶Ago2移除后，RISC立刻被反义链活化(Rand(兰德)等人(2005)Cell(细胞)123，621)。
相信当有义链的裂解被抑制时，靶标mRNA的内切核苷酸裂解会受损(Leuschner(洛伊什纳)等人(2006)EMBO Rep.(EMBO报告)，7，314；兰德等人(2005)细胞123，621；Schwarz(施瓦兹)等人(2004)Curr.Biol.(当代生物学)14，787)。洛伊什纳等人证明向有义链中的Ago2裂解位点中掺入2′-O-Me核糖抑制海拉细胞中的RNAi(洛伊什纳等人(2006)EMBO报告，7，314)。用硫代磷酸酯修饰观察到类似效果，这显示在哺乳动物中有效的RNAi也需要有义链的裂解。
Morrissey(莫里西)等人使用了除其他位点和修饰之外还在Ago2裂解位点处包含2′-F修饰的残基的siRNA双链体，并且获得了与未修饰的siRNA相比可相容的沉默(莫里西等人(2005)Hepatology(肝病学)41，1349)。然而，莫里西的修饰不是基序特异性的，例如只要嘧啶残基存在，一个修饰便包括在有义链和反义链上的所有嘧啶上的2′-F修饰，而没有任何选择性；并且因此基于这些教导，有义链的裂解位点处的特异性基序修饰对基因沉默活性是否具有任何实质作用是不确定的。
Muhonen(穆汉恩)等人使用了在有义链或反义链上的Ago2裂解位点处包含两个2′-F修饰的残基的siRNA双链体并且发现这被容忍(穆汉恩等人(2007)Chemistry&Biodiversity(化学与生物多样性)4，858-873)。然而，穆汉恩的修饰也是序列特异性的，例如对于每一具体链而言，穆汉恩仅修饰所有的嘧啶或所有的嘌呤，而没有任何选择性。
Choung(庄)等人使用了包含替代性修饰的siRNA双链体，通过2′-OMe或2′-F、2′-OMe和硫代磷酸酯修饰的不同组合以将血清中的siRNA稳定为Sur10058(庄等人(2006)Biochemical and Biophysical ResearchCommunications(生物化学和生物物理研究通讯)342，919-927)。庄建议为了增加siRNA的稳定性不应该用2′-OMe修饰反义链的裂解位点处的残基。
因此对用于改进siRNA基因治疗的基因沉默疗效的iRNA双链体试剂存在持续的需要。本发明即针对这一需要。
概述
本发明提供了针对任选地结合至至少一个配体的dsRNA试剂的有利抑制靶基因表达的有效的核苷酸或化学基序，以及适于治疗使用的RNAi组合物。
诸位发明人出人意料地发现：在由修饰的有义链和反义链组成的dsRNA试剂的裂解位点处或附近引入一个或多个在三个连续的核苷酸上具有三个相同修饰的基序会增强该dsRNA试剂的基因沉默活性。
在一个方面中，本发明涉及一种能够抑制靶基因的表达的双链RNAi(dsRNA)试剂。该dsRNA试剂包括有义链和反义链，每条链具有14至30个核苷酸。该dsRNA双链体由式(III)表示：
有义链：5′np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3′
反义链：3′np ’-Na ’-(X’X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb ’-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′5′
(III)，
在式(III)中，i、j、k、以及l各自独立地是0或1；p和q各自独立地是0-6；n表示一个核苷酸；每个Na和Na′独立地表示一个包括0-25个被修饰或未被修饰或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包括至少两个不同修饰的核苷酸；每个Nb和Nb′独立地表示一个包括0-10个被修饰或未被修饰或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列；每个np和nq独立地表示一个包括0-6个核苷酸的突出端核苷酸序列；并且XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′、以及Z′Z′Z′各自独立地表示一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序；其中Nb上的修饰不同于Y上的修饰并且Nb′上的修饰不同于Y′上的修饰。至少一个Y核苷酸与其互补Y’核苷酸形成一个碱基对，并且其中Y核苷酸上的修饰不同于Y’核苷酸上的修饰。
每个np和nq独立地表示一个包括0-6个核苷酸的突出端核苷酸序列；每个n和n’表示一个突出端核苷酸；并且p和q各自独立地是0-6。
在另一个方面中，本发明涉及一种能够抑制靶基因的表达的dsRNA试剂。该dsRNA试剂包括有义链和反义链，每条链具有14至30个核苷酸。该有义链包含至少两个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序，其中至少一个基序出现在该链内的裂解位点处或附近并且至少一个基序出现在由至少一个核苷酸在裂解位点处将其与该基序分开的该链的另一个部分处。该反义链包含至少一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序，其中至少一个基序出现在该链内的裂解位点处或附近并且至少一个基序出现在由至少一个核苷酸在裂解位点处或附近将其与该基序分开的该链的另一个部分处。出现在该有义链中的裂解位点处或附近的基序中的修饰不同于出现在该反义链的裂解位点处或附近的基序中的修饰。
在另一个方面中，本发明涉及一种能够抑制靶基因的表达的dsRNA试剂。该dsRNA试剂包括有义链和反义链，每条链具有14至30个核苷酸。该有义链包含至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2′-F修饰的基序，其中至少一个基序出现在该链中的裂解位点处或附近。该反义链在裂解位点处或附近包含至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2′-O-甲基修饰的基序。
在另一个方面中，本发明涉及一种能够抑制靶基因的表达的dsRNA试剂。该dsRNA试剂包括有义链和反义链，每条链具有14至30个核苷酸。该有义链在由5’端起的位置9、10、11处包含至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2′-F修饰的基序。该反义链在由5′端起的位置11、12、13处包含至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2′-O-甲基修饰的基序。
在另一个方面中，本发明进一步提供了一种用于通过皮下或静脉内给予向受试者的特定靶标递送该dsRNA的方法。
详细说明
可以通过向dsRNA试剂的有义链和/或反义链中(特别是在裂解位点处或附近)引入一个或多个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序来获得优越结果。该dsRNA试剂的有义链和反义链否则可以被完全修饰。这些基序的引入中断了该有义链和/或反义链的修饰模式(如果存在的话)。该dsRNA试剂任选地与一种GalNAc衍生物配体例如在该有义链上结合。产生的dsRNA试剂呈现优越的基因沉默活性。
诸位发明人出人意料地发现在dsRNA试剂的至少一条链的裂解位点处或附近具有一个或多个在三个连续的核苷酸上具有三个相同修饰的基序卓越地增强该dsRNA试剂的基因沉默活性。
因此，本发明提供了一种能够抑制靶基因的表达的双链RNAi(dsRNA)试剂。该dsRNA试剂包括有义链和反义链。该dsRNA试剂的每条链可以具有在12-30个核苷酸范围内的长度。例如，每条链可以在14-30个核苷酸长度、17-30个核苷酸长度、25-30个核苷酸长度、27-30个核苷酸长度、17-23个核苷酸长度、17-21个核苷酸长度、17-19个核苷酸长度、19-25个核苷酸长度、19-23个核苷酸长度、19-21个核苷酸长度、21-25个核苷酸长度或21-23个核苷酸长度之间。
该有义链和反义链典型地形成一个双链体dsRNA。dsRNA试剂的双链体区可以具有12-30个核苷酸对长度。例如，该双链体区可以在14-30个核苷酸对长度、17-30个核苷酸对长度、25-30个核苷酸对长度、27-30个核苷酸对长度、17-23个核苷酸对长度、17-21个核苷酸对长度、17-19个核苷酸对长度、19-25个核苷酸对长度、19-23个核苷酸对长度、19-21个核苷酸对长度、21-25个核苷酸对长度或21-23个核苷酸对长度之间。在另一个实例中，该双链体区选自15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26以及27。
在一个实施例中，本发明的dsRNA试剂可以在一条链的3′端或5′端或两端处包含dsRNA试剂的一个或多个突出端区和/或封端基团。突出端可以具有1-6个核苷酸长度，例如2-6个核苷酸长度、1-5个核苷酸长度、2-5个核苷酸长度、1-4个核苷酸长度、2-4个核苷酸长度、1-3个核苷酸长度、2-3个核苷酸长度或1-2个核苷酸长度。这些突出端可以是一条链比另一条链更长的结果，或两条具有相同长度的链交错的结果。该突出端可以与该靶标mRNA形成一个错配，或它可以与靶向的基因序列互补或可以是其他序列。该第一和该第二链还可以例如通过另外的碱基连接以形成一个发夹或通过其他非碱基接头连接。
在一个实施例中，本发明的dsRNA试剂的突出端区中的核苷酸可以各自独立地是一个被修饰或未被修饰的核苷酸，包括但不限于被2′-糖修饰的，例如2-F2′-O甲基、胸苷(T)、2′-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(Teo)、2′-O-甲氧基乙基腺苷(Aeo)、2′-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷(m5Ceo)及其任何组合。例如，TT可以是任一链上的任一端的一个突出端序列。该突出端可以与该靶标mRNA形成一个错配，或它可以与靶向的基因序列互补或可以是其他序列。
本发明的dsRNA试剂的有义链、反义链或两条链处的5′或3′突出端可以被磷酸化。在一些实施例中，该突出端区包含两个在这两个核苷酸之间具有一个硫代磷酸酯的核苷酸，其中这两个核苷酸可以是相同或不同的。在一个实施例中，该突出端存在于有义链、反义链或两条链的3′端处。在一个实施例中，这一3′突出端存在于反义链中。在一个实施例中，这一3′突出端存在于有义链中。
本发明的dsRNA试剂可以仅包括一个单个突出端，它可以加强该dsRNA的干扰活性而不影响其总稳定性。例如，该单链突出端位于有义链的3′末端处，或可替代地，位于反义链的3′末端处。该dsRNA还可以具有一个位于反义链的5′端(或有义链的3′端)处的钝端，或反之亦然。通常，该dsRNA的反义链在3’端处具有一个核苷酸突出端，并且5’端是钝的。虽然不受理论束缚，但该反义链的5′端处的不对称钝端和该反义链的3′端突出端促进引导链加载到RISC过程中。
在一个实施例中，本发明的dsRNA试剂在该dsRNA双链体的两端处还可以具有两个钝端。
在一个实施例中，本发明的dsRNA试剂是一个具有19个nt长度的双端钝物，其中该有义链在由5′端起的位置7、8、9处包含至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2′-F修饰的基序。该反义链在由5’端起的位置11、12、13处包含至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2′-O-甲基修饰的基序。
在一个实施例中，本发明的dsRNA试剂是一个具有20个nt长度的双端钝物，其中该有义链在由5′端起的位置8、9、10处包含至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2′-F修饰的基序。该反义链在由5’端起的位置11、12、13处包含至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2′-O-甲基修饰的基序。
在一个实施例中，本发明的dsRNA试剂是一个具有21个nt长度的双端钝物，其中该有义链在由5′端起的位置9、10、11处包含至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2′-F修饰的基序。该反义链在由5’端起的位置11、12、13处包含至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2′-O-甲基修饰的基序。
在一个实施例中，本发明的dsRNA试剂包括一个21个核苷酸(nt)的有义链和一个23个核苷酸(nt)的反义链，其中该有义链在由5′端起的位置9、10、11处包含至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2′-F修饰的基序；该反义链在由5′端起的位置11、12、13处包含至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2′-O-甲基修饰的基序，其中该dsRNA的一端是钝的，而另一端包括一个2个nt的突出端。优选地，该2个nt的突出端在该反义链的3′端处。任选地，该dsRNA进一步包括一个配体(优选GalNAc3)。
在一个实施例中，本发明的dsRNA试剂包括有义链和反义链，其中：该有义链具有25-30个核苷酸残基长度，其中所述第一链的由5′末端核苷酸(位置1)开始的位置1到23包括至少8个核糖核苷酸；反义链具有36-66个核苷酸残基长度，并且由3′末端核苷酸开始在与有义链的位置1-23配对的位置处包括至少8个核糖核苷酸，以形成一种双链体；其中至少反义链的3′末端核苷酸与有义链未配对，并且多达6个连续3′末端核苷酸与有义链未配对，从而形成一个具有1-6个核苷酸的3′单链突出端；其中反义链的5′末端包括从10-30个与有义链未配对的连续核苷酸，从而形成一个10-30个核苷酸的单链5′突出端；其中当有义链和反义链经比对达到最大互补性时，至少有义链5′末端和3′末端核苷酸与反义链的核苷酸碱基配对，从而在有义链与反义链之间基本上形成一个双链体区；并且当所述双链核酸被引入到一种哺乳动物细胞中时，反义链与一种靶标RNA沿着反义链长度的至少19个核糖核苷酸充分互补以减少靶基因表达；并且其中该有义链包含至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2′-F修饰的基序，其中这些基序中的至少一个出现在裂解位点处或附近。该反义链在裂解位点处或附近包含至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2′-O-甲基修饰的基序。
在一个实施例中，本发明的dsRNA试剂包括有义链和反义链，其中所述dsRNA试剂包括长度是至少25个并且至多29个核苷酸的第一链和长度是至多30个核苷酸、在由5′端起的位置11、12、13处具有至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2′-O-甲基修饰的基序的第二链；其中所述第一链的所述3′端和所述第二链的所述5′端形成一个钝端并且所述第二链在其3′端处比该第一链长1-4个核苷酸，其中该双链体区具有至少25个核苷酸长度，并且当所述dsRNA试剂被引入到一种哺乳动物细胞中时，所述第二链与一种靶标mRNA沿着所述第二链长度的至少19个nt充分互补以减少靶基因表达，并且其中所述dsRNA的dicer裂解优先产生包括所述第二链的所述3′端的一种siRNA，从而减少该哺乳动物中的该靶基因的表达。任选地，该dsRNA试剂进一步包括一种配体。
在一个实施例中，该dsRNA试剂的有义链包含至少一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序，其中这些基序之一出现在该有义链中的裂解位点处。
在一个实施例中，该dsRNA试剂的反义链也可以包含至少一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序，其中这些基序之一出现在该反义链中的裂解位点处或附近。
对于具有17-23个nt长度的一个双链体区的dsRNA试剂而言，该反义链的裂解位点典型地在由5′端起的10、11以及12位周围。因此，具有三个相同修饰的基序可以出现在该反义链的9、10、11位；10、11、12位；11、12、13位；12、13、14位；或13、14、15位处，计数从由该反义链的5′端起的第1个核苷酸开始，或计数从该双链体区内由该反义链的5′端起的第1个配对的核苷酸开始。该反义链中的裂解位点还可以根据该dsRNA的由5′端起的双链体区的长度而变化。
该dsRNA试剂的有义链在该链的裂解位点处包括至少一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序；并且反义链可以在该链的裂解位点处或附近具有至少一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序。当该有义链和该反义链形成一个dsRNA双链体时，该有义链和该反义链可以被如此比对，以使得在该有义链上具有三个核苷酸的一个基序和在该反义链上具有三个核苷酸的一个基序具有至少一个核苷酸重叠，即该有义链中的该基序的三个核苷酸中的至少一个与该反义链中的该基序的三个核苷酸中的至少一个形成一个碱基对。可替代地，来自两条链的基序的至少两个核苷酸可以重叠，或所有三个核苷酸都可以重叠。
在一个实施例中，该dsRNA试剂的有义链包括多于一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序。第一基序应该出现在该链的裂解位点处或附近并且其他基序可以是翼侧修饰。术语“翼侧修饰”在此是指出现在该链的与同一链裂解位点处或附近的基序分开的另一个部分处的一个基序。该翼侧修饰或者与该第一基序相邻，或者由至少一个或多个核苷酸分开。当这些基序彼此紧紧相邻时，这些基序的化学性质不同于彼此，并且当这些基序由一个或多个核苷酸分开时，这些基序的化学性质可以是相同或不同的。可以存在两个或更多个翼侧修饰。例如，当存在两个翼侧修饰时，两个翼侧修饰可以都出现在相对于裂解位点处或附近的第一基序的该双链体区的一端处，或每个翼侧修饰可以出现在第一基序的任一侧上。
如同该有义链，该dsRNA试剂的反义链包括至少两个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序，其中这些基序中的至少一个出现在该链的裂解位点处或附近。这一反义链也可以在一个比对中包含一个或多个与有义链上存在的翼侧修饰类似的翼侧修饰。
在一个实施例中，该dsRNA试剂的有义链、反义链或两条链上的翼侧修饰典型地在该链的3′端、5′端或两端处不包括前一个或两个末端核苷酸。
在另一个实施例中，该dsRNA试剂的有义链、反义链或两条链上的翼侧修饰典型地在该链的3′端、5′端或两端处的双链体区内不包括前一个或两个配对的核苷酸。
当该dsRNA试剂的有义链和反义链各自包含至少一个翼侧修饰时，该翼侧修饰可以落在该双链体区的同一端上，并且具有一个、两个或三个核苷酸的重叠。
当该dsRNA试剂的有义链和反义链各自包含至少两个翼侧修饰时，该有义链和该反义链可以被比对为使得各自来自一条链的两个侧翼修饰落在该双链体区的一端上，具有一个、两个或三个核苷酸的一个重叠；各自来自一条链的两个修饰落在该双链体区的另一端上，具有一个、两个或三个核苷酸的重叠。
在一个实施例中，该dsRNA试剂的有义链和反义链中的每个核苷酸(包括是基序的一部分的核苷酸)可以被修饰。每个核苷酸可以用相同或不同修饰来修饰，该修饰可以包括非键联磷酸酯氧和/或一个或多个键联磷酸酯氧中的一者或两者的一个或多个改变；核糖的一种成分(例如核糖上的2′羟基)的改变；磷酸酯部分经“脱磷酸”接头的大规模置换；一种天然存在的碱基的修饰或置换；以及核糖-磷酸酯主链的置换或修饰。
由于核酸是亚单位的聚合物，因此许多修饰出现在核酸内重复的一个位置处，例如一种碱基或一种磷酸酯部分或一种磷酸酯部分的一个非键联O的修饰。在一些情况下，修饰将出现在该核酸中的全部标的位置处，但在许多情形下它不会这样。举例来说，一个修饰可以仅出现在3′或5′末端位置处，可以仅出现在一个末端区中，例如在一条链的一个末端核苷酸上或最后2个、3个、4个、5个或10个核苷酸中的一个位置处。修饰可以出现在双链区、单链区或两者中。修饰可以仅出现在RNA的双链区中或可以仅出现在RNA的单链区中。例如，一个非键联O位置处的一个硫代磷酸酯修饰可以仅出现在一个或两个末端处，可以仅出现在一个末端区中，例如在一条链的一个末端核苷酸上或最后2个、3个、4个、5个或10个核苷酸中的一个位置处，或可以出现在双链和单链区中特别是末端处。一个或多个5′端可以被磷酸化。
为了增强稳定性，可能的是例如在突出端中包括特定碱基或在单链突出端中(例如在一个5′或3′突出端或两者中)包括被修饰的核苷酸或核苷酸替代物。例如，可以令人希望的是在突出端中包括嘌呤核苷酸。在一些实施例中，一个3′或5′突出端中的全部或一些碱基可以被例如一个在此描述的修饰而修饰。修饰可以包括例如使用核糖的2′位处的修饰与本领域中已知的修饰，例如使用2′-脱氧-2′-氟基(2′-F)或2′-O-甲基修饰的脱氧核糖核苷酸代替核碱基的核糖，以及磷酸酯基中的修饰，例如硫代磷酸酯修饰。突出端不必与该靶序列同源。
在一个实施例中，有义链和反义链的每个残基独立地被LNA、HNA、CeNA、2′-甲氧基乙基、2′-O-甲基、2′-O-烯丙基、2′-C-烯丙基、2′-脱氧、或2′-氟基修饰。这些链可以包含多于一个修饰。在一个实施例中，有义链和反义链的每个残基独立地被2′-O-甲基或2′-氟基修饰。
至少两个不同修饰典型地存在于有义链和反义链上。那两个修饰可以是2′-O-甲基或2′-氟基修饰或其他修饰。
在一个实施例中，有义链和反义链各自包含两个选自2′-O-甲基或2′-氟基的不同修饰的核苷酸。
在一个实施例中，有义链和反义链的每个残基独立地被2′-O-甲基核苷酸、2′-脱氧氟代核苷酸、2′-O-N-甲基乙酰胺基(2′-O-NMA)核苷酸、2′-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2′-O-DMAEOE)核苷酸、2′-O-氨基丙基(2′-O-AP)核苷酸、或2′-ara-F核苷酸修饰。
在一个实施例中，Na和/或Nb包括一种交替模式的修饰。如在此所用，术语“交替基序”或“交替模式”是指具有一个或多个修饰、每个修饰出现在一条链的交替核苷酸上的一种基序。交替核苷酸可以指每隔一个核苷酸一个或每三个核苷酸一个或一种类似模式。例如，如果A、B以及C各自表示对核苷酸的一种类型的修饰，那么交替基序可以是“ABABABABABAB......”、“AABBAABBAABB......”、“AABAABAABAAB......”、“AAABAAABAAAB......”、“AAABBBAAABBB......”或“ABCABCABCABC......”等。
在一个实施例中，Na’和/或Nb’包括一种交替模式的修饰。如在此所用，术语“交替基序”或“交替模式”是指具有一个或多个修饰、每个修饰出现在一条链的交替核苷酸上的一种基序。交替核苷酸可以指每隔一个核苷酸一个或每三个核苷酸一个或一种类似模式。例如，如果A、B以及C各自表示对核苷酸的一种类型的修饰，那么交替基序可以是“ABABABABABAB......”、“AABBAABBAABB......”、“AABAABAABAAB......”、“AAABAAABAAAB......”、“AAABBBAAABBB......”或“ABCABCABCABC......”等。
交替基序中所包含的修饰的类型可以是相同或不同的。例如，如果A、B、C、D各自表示对核苷酸的一种类型的修饰，那么交替模式(即每隔一个核苷酸上的修饰)可以是相同的，但有义链或反义链中的每一者可以选自交替基序内的修饰的若干种可能，例如“ABABAB......”“ACACAC......”、“BDBDBD......”或“CDCDCD......”等。
在一个实施例中，本发明的dsRNA试剂包括：用于有义链上的交替基序的修饰模式相对于用于反义链上的交替基序的修饰模式移位。该移位可以是如此以使得有义链的被修饰的核苷酸组对应于反义链的不同修饰的核苷酸组，并且反之亦然。例如，有义链当与dsRNA双链体中的反义链配对时，该有义链中的交替基序可以从该链的5′-3′从“ABABAB”开始，并且该反义链中的交替基序可以从该双链体区内的该链的3′-5′从“BABABA”开始。作为另一个实例，该有义链中的交替基序可以从该链的5′-3′从“AABBAABB”开始，并且该反义链中的交替基序可以从该双链体区内的该链的3′-5′从“BBAABBAA”开始，以使得在该有义链与该反义链之间存在修饰模式的完全或部分移位。
在一个实施例中，本发明的dsRNA试剂包括：最初有义链上的2′-O-甲基修饰和2′-F修饰的交替基序的模式相对于最初反义链上的2′-O-甲基修饰和2′-F修饰的交替基序的模式具有一个移位，即该有义链上的2′-O-甲基修饰的核苷酸与该反义链上的一个2′-F修饰的核苷酸碱基配对，并且反之亦然。该有义链的1位可以从2′-F修饰开始，并且该反义链的1位可以从2′-O-甲基修饰开始。
将一个或多个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序引入到有义链和/或反义链中断了该有义链和/或该反义链中存在的初始修饰模式。通过将一个或多个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序引入到该有义链和/或反义链而使该有义链和/或反义链的修饰模式的这一中断出人意料地增强了对靶基因的基因沉默活性。
在一个实施例中，当在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序被引入到这些链中的任一者时，紧挨着该基序的核苷酸的修饰是一个不同于该基序的修饰的修饰。例如，包含该基序的序列的一部分是“......NaYYYNb......”，其中“Y”表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的该基序的修饰，并且“Na”和“Nb”表示对紧挨着该基序“YYY”的该核苷酸的不同于Y的修饰的一个修饰，并且其中Na和Nb可以是相同或不同修饰。可替代地，当存在一个翼侧修饰时，Na和/或Nb可以存在或不存在。
本发明的dsRNA试剂可以进一步包括至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联。该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联修饰可以出现在有义链或反义链或两者的链的任何位置中的任何核苷酸上。例如，该核苷酸间键联修饰可以出现在该有义链和/或反义链上的每个核苷酸上；每个核苷酸间键联修饰可以按一种交替模式出现在该有义链或反义链上；或该有义链或反义链可以按一种交替模式包括两个核苷酸间键联修饰。该有义链上的核苷酸间键联修饰的交替模式可以与该反义链相同或不同，并且该有义链上的核苷酸间键联修饰的交替模式可以相对于该反义链上的核苷酸间键联修饰的交替模式具有一个移位。
在一个实施例中，该dsRNA在突出端区中包括该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联修饰。例如，该突出端区包括两个在这两个核苷酸之间具有一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联的核苷酸。还可以作核苷酸间键联修饰以使突出端核苷酸与双链体区内的末端配对的核苷酸键联。例如，至少2个、3个、4个或全部的突出端核苷酸可以通过硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联而键联，并且任选地，可以存在将突出端核苷酸与紧挨着该突出端核苷酸的一个配对的核苷酸键联的另外的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联。例如，在末端三个核苷酸之间可以存在至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键联，其中这三个核苷酸中的两者是突出端核苷酸，并且第三者是紧挨着该突出端核苷酸的一个配对的核苷酸。优选地，这三个末端核苷酸可以在反义链的3′端处。
在一个实施例中，该dsRNA的有义链包括具有由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个磷酸酯核苷酸间键联分开的两个至十个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联的1-10个嵌段，其中这些硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联之一位于该寡核苷酸序列中的任何位置处并且所述有义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯以及磷酸酯核苷酸间键联的任何组合的反义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键联的反义链配对。
在一个实施例中，该dsRNA的反义链包括具有由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个磷酸酯核苷酸间键联分开的两个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联的两个嵌段，其中这些硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联之一位于该寡核苷酸序列中的任何位置处并且所述反义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯以及磷酸酯核苷酸间键联的任何组合的有义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键联的反义链配对。
在一个实施例中，该dsRNA的反义链包括具有由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个磷酸酯核苷酸间键联分开的三个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联的两个嵌段，其中这些硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联之一位于该寡核苷酸序列中的任何位置处并且所述反义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯以及磷酸酯核苷酸间键联的任何组合的有义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键联的反义链配对。
在一个实施例中，该dsRNA的反义链包括具有由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个磷酸酯核苷酸间键联分开的四个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联的两个嵌段，其中这些硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联之一位于该寡核苷酸序列中的任何位置处并且所述反义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯以及磷酸酯核苷酸间键联的任何组合的有义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键联的反义链配对。
在一个实施例中，该dsRNA的反义链包括具有由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个磷酸酯核苷酸间键联分开的五个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联的两个嵌段，其中这些硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联之一位于该寡核苷酸序列中的任何位置处并且所述反义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯以及磷酸酯核苷酸间键联的任何组合的有义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键联的反义链配对。
在一个实施例中，该dsRNA的反义链包括具有由1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个磷酸酯核苷酸间键联分开的六个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联的两个嵌段，其中这些硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联之一位于该寡核苷酸序列中的任何位置处并且所述反义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯以及磷酸酯核苷酸间键联的任何组合的有义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键联的反义链配对。
在一个实施例中，该dsRNA的反义链包括具有由1、2、3、4、5、6、7或8个磷酸酯核苷酸间键联分开的七个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联的两个嵌段，其中这些硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联之一位于该寡核苷酸序列中的任何位置处并且所述反义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯以及磷酸酯核苷酸间键联的任何组合的有义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键联的反义链配对。
在一个实施例中，该dsRNA的反义链包括具有由1、2、3、4、5或6个磷酸酯核苷酸间键联分开的八个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联的两个嵌段，其中这些硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联之一位于该寡核苷酸序列中的任何位置处并且所述反义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯以及磷酸酯核苷酸间键联的任何组合的有义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键联的反义链配对。
在一个实施例中，该dsRNA的反义链包括具有由1、2、3或4个磷酸酯核苷酸间键联分开的九个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联的两个嵌段，其中这些硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联之一位于该寡核苷酸序列中的任何位置处并且所述反义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯以及磷酸酯核苷酸间键联的任何组合的有义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键联的反义链配对。
在一个实施例中，本发明的dsRNA在该有义链和/或反义链的1-10个末端位置中进一步包括一个或多个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联修饰。例如，在该有义链和/或反义链的一端或两端处至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸可以经由硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联而键联。
在一个实施例中，本发明的dsRNA在该有义链和/或反义链各自的1-10个双链体内部区中进一步包括一个或多个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联修饰。例如，在由该有义链的5′端起计数的双链体区的位置8-16处至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸可以经由硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联而键联；该dsRNA在1-10个末端位置中可以任选地进一步包括一个或多个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联修饰。
在一个实施例中，本发明的dsRNA在该有义链的位置1-5中进一步包括一至五个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置18-23中进一步包括一至五个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联修饰(由5’端计数)，并且在该反义链的位置1和2处进一步包括一至五个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置18-23中进一步包括一至五个(由5’端计数)。
在一个实施例中，本发明的dsRNA在该有义链的位置1-5中进一步包括一个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置18-23中进一步包括一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联修饰(由5’端计数)，并且在该反义链的位置1和2处进一步包括一个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置18-23中进一步包括两个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联修饰(由5’端计数)。
在一个实施例中，本发明的dsRNA在该有义链的位置1-5中进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置18-23中进一步包括一个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰(由5’端计数)，并且在该反义链的位置1和2处进一步包括一个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置18-23中进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰(由5’端计数)。
在一个实施例中，本发明的dsRNA在该有义链的位置1-5中进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置18-23中进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰(由5’端计数)，并且在该反义链的位置1和2处进一步包括一个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置18-23中进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰(由5’端计数)。
在一个实施例中，本发明的dsRNA在该有义链的位置1-5中进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置18-23中进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰(由5’端计数)，并且在该反义链的位置1和2处进一步包括一个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置18-23中进一步包括一个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰(由5’端计数)。
在一个实施例中，本发明的dsRNA在该有义链的位置1-5中进一步包括一个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置18-23中进一步包括一个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰(由5’端计数)，并且在该反义链的位置1和2处进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置18-23中进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰(由5’端计数)。
在一个实施例中，本发明的dsRNA在该有义链的位置1-5中进一步包括一个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置18-23中进一步包括一个(由5’端计数)，并且在该反义链的位置1和2处进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置18-23中进一步包括一个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰(由5’端计数)。
在一个实施例中，本发明的dsRNA在位置1-5中进一步包括一个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰(由5’端计数)，并且在该反义链的位置1和2处进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置18-23中进一步包括一个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰(由5’端计数)。
在一个实施例中，本发明的dsRNA在位置1-5中进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰(由5’端计数)，并且在该反义链的位置1和2处进一步包括一个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置18-23中进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰(由5’端计数)。
在一个实施例中，本发明的dsRNA在该有义链的位置1-5中进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置18-23中进一步包括一个(由5’端计数)，并且在该反义链的位置1和2处进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置18-23中进一步包括一个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰(由5’端计数)。
在一个实施例中，本发明的dsRNA在该有义链的位置1-5中进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置18-23中进一步包括一个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰(由5’端计数)，并且在该反义链的位置1和2处进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置18-23中进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰(由5’端计数)。
在一个实施例中，本发明的dsRNA在该有义链的位置1-5中进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置18-23中进一步包括一个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰(由5’端计数)，并且在该反义链的位置1和2处进一步包括一个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置18-23中进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰(由5’端计数)。
在一个实施例中，本发明的dsRNA在该有义链的位置1和2处进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置20和21处进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰(由5’端计数)，并且在该反义链的位置1处进一步包括一个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置21处进一步包括一个(由5’端计数)。
在一个实施例中，本发明的dsRNA在该有义链的位置1处进一步包括一个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置21处进一步包括一个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰(由5’端计数)，并且在该反义链的位置1和2处进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置20和21处进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰(由5’端计数)。
在一个实施例中，本发明的dsRNA在该有义链的位置1和2处进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置21和22处进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰(由5’端计数)，并且在该反义链的位置1处进一步包括一个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置21处进一步包括一个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰(由5’端计数)。
在一个实施例中，本发明的dsRNA在该有义链的位置1处进一步包括一个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置21处进一步包括一个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰(由5’端计数)，并且在该反义链的位置1和2处进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置21和22处进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰(由5’端计数)。
在一个实施例中，本发明的dsRNA在该有义链的位置1和2处进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置22和23处进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰(由5’端计数)，并且在该反义链的位置1处进一步包括一个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置21处进一步包括一个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰(由5’端计数)。
在一个实施例中，本发明的dsRNA在该有义链的位置1处进一步包括一个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置21处进一步包括一个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰(由5’端计数)，并且在该反义链的位置1和2处进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置23和23处进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰(由5’端计数)。
在一个实施例中，本发明的dsRNA试剂在双链体内包括与靶标的一个或多个错配或其组合。该错配可以存在于突出端区或双链体区中。碱基对可以基于其促进解离或熔融的倾向来分等级(例如对于一个具体配对的缔合或解离自由能，最简单的方法是基于一个个别对检查这些对，但也可以使用紧接着的相邻物或类似分析)。就促进解离而言：A：U与G：C相比是优选的；G：U与G：C相比是优选的；并且I：C与G：C相比是优选的(I＝肌苷)。错配(例如非标准的或除标准以外的配对(如在此别处所述))与标准(A：T、A：U、G：C)配对相比是优选的；并且包括一种通用碱基的配对与标准配对相比是优选的。
在一个实施例中，本发明的dsRNA试剂包括双链体区内由反义链的5′端起的前1个、2个、3个、4个或5个碱基对中的至少一个，可以独立地选自下组：A：U、G：U、I：C以及错配的对(例如非标准的或除标准以外的配对)或包括一种通用碱基以促进该双链体的5′端处的该反义链解离的配对。
在一个实施例中，该双链体区内由反义链中的5′端起的1位处的核苷酸选自下组，该组由以下各项组成：A、dA、dU、U以及dT。可替代地，该双链体区内由该反义链的5′端起的前1个、2个或3个碱基对中的至少一个是一个AU碱基对。例如，该双链体区内由该反义链的5′端起的第一个碱基对是一个AU碱基对。
在一个实施例中，有义链序列可以由式(I)表示：
5′np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3′(I)
其中：
i和j各自独立地是0或1；
p和q各自独立地是0-6；
每个Na独立地表示一个包括0-25个被修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包括至少两个不同修饰的核苷酸；
每个Nb独立地表示一个包括0-10个被修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np和nq独立地表示一个突出端核苷酸；
其中Nb和Y不具有相同修饰；并且
XXX、YYY以及ZZZ各自独立地表示一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序。优选地，YYY都是2′-F修饰的核苷酸。
在一个实施例中，Na和/或Nb包括交替模式的修饰。
在一个实施例中，该YYY基序出现在该有义链的裂解位点处或附近。例如，当该dsRNA试剂具有一个17-23个核苷酸对长度的双链体区时，该YYY基序可以出现在该有义链的裂解位点处或附近(例如：可以出现在位置6、7、8，7、8、9，8、9、10，9、10、11，10、11、12或11、12、13处)，计数从由5’端起的第1个核苷酸开始；或任选地，计数在该双链体区内由5′端起的第1个配对的核苷酸处开始。
在一个实施例中，i是l并且j是0，或i是0并且j是1，或i和j都是1。该有义链因此可以由下式表示：
5′np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3′(Ia)；
5′np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq3′(Ib)；或
5′np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3′(Ic)。
当该有义链由式(Ia)表示时，Nb表示一个包括0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个被修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na可以独立地表示一个包括2-20个、2-15个或2-10个被修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当该有义链被表示为式(Ib)时，Nb表示一个包括0-10个、0-7个、0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个被修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na可以独立地表示一个包括2-20个、2-15个或2-10个被修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当该有义链被表示为式(Ic)时，每个Nb独立地表示一个包括0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个被修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。优选地，Nb是0、1、2、3、4、5或6。每个Na可以独立地表示一个包括2-20个、2-15个或2-10个被修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
X、Y以及Z中的每一者可以彼此相同或不同。
在一个实施例中，该dsRNA的反义链序列可以由式(II)表示：
5′nq′-Na′-(Z’Z′Z′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(X′X′X′)l-N′a-np′3′(II)
其中：
k和l各自独立地是0或1；
p和q各自独立地是0-6；
每个Na′独立地表示一个包括0-25个被修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包括至少两个不同修饰的核苷酸；
每个Nb′独立地表示一个包括0-10个被修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np′和nq′独立地表示一个包括0-6个核苷酸的突出端核苷酸；
其中Nb’和Y’不具有相同修饰；
并且
X′X′X′、Y′Y′Y′以及Z′Z′Z′各自独立地表示一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序。
在一个实施例中，Na’和/或Nb’包括交替模式的修饰。
该Y′Y′Y′基序出现在该反义链的裂解位点处或附近。例如，当该dsRNA试剂具有一个17-23个nt长度的双链体区时，该Y′Y′Y′基序可以出现在该反义链的位置9、10、11；10、11、12；11、12、13；12、13、14；或13、14、15处，计数从由5′端起的第1个核苷酸开始；或任选地，计数在该双链体区内由5′端起的第1个配对的核苷酸处开始。优选地，该Y′Y′Y′基序出现在位置11、12、13处。
在一个实施例中，Y′Y′Y′基序都是2′-OMe修饰的核苷酸。
在一个实施例中，k是l并且l是0，或k是0并且l是1，或k和l都是1。
该反义链因此可以由下式表示：
5′nq′-Na′-Z′Z′Z′-Nb′-Y′Y′Y′-Na′-np′3′(IIa)；
5′nq′-Na′-Y′Y′Y′-Nb′-X′X′X′-np′3′(IIb)；或
5′nq′-Na′-Z′Z′Z′-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-X′X′X′-Na′-np′3′(IIc)。
当该反义链由式(IIa)表示时，Nb’表示一个包括0-10个、0-7个、0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个被修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na’独立地表示一个包括2-20个、2-15个或2-10个被修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当该反义链被表示为式(IIb)时，Nb’表示一个包括0-10个、0-7个、0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个被修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na’独立地表示一个包括2-20个、2-15个或2-10个被修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当该反义链被表示为式(IIc)时，每个Nb’独立地表示一个包括0-10个、0-7个、0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个被修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na’独立地表示一个包括2-20个、2-15个或2-10个被修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。优选地，Nb是0、1、2、3、4、5或6。
X′、Y′以及Z′中的每一者可以彼此相同或不同。
该有义链和反义链的每个核苷酸可以独立地被LNA、HNA、CeNA、2′-甲氧基乙基、2′-O-甲基、2′-O-烯丙基、2′-C-烯丙基或2′-氟基修饰。例如，该有义链和反义链的每个核苷酸独立地被2′-O-甲基或2′-氟基修饰。具体而言，每个X、Y、Z、X′、Y′以及Z′可以表示一个2′-O-甲基修饰或一个2′-氟基修饰。
在一个实施例中，当该双链体区具有21个nt时，该dsRNA试剂的有义链包括出现在该链的9、10以及11位处的YYY基序，计数从由5′端起的第1个核苷酸开始，或任选地，计数在该双链体区内由5′端起的第1个配对的核苷酸处开始；并且Y表示2′-F修饰。该有义链可以额外地在该双链体区的相反端处包含XXX基序或ZZZ基序作为翼侧修饰；并且XXX和ZZZ各自独立地表示一个2′-OMe修饰或2′-F修饰。
在一个实施例中，该反义链可以包含出现在该链的位置11、12、13处的Y′Y′Y′基序，计数从由5′端起的第1个核苷酸开始，或任选地，计数在该双链体区内由5′端起的第1个配对的核苷酸处开始；并且Y′表示2′-O-甲基修饰。该反义链可以额外地在该双链体区的相反端处包含X′X′X′基序或Z′Z′Z′基序作为翼侧修饰；并且X′X′X′和Z′Z′Z′各自独立地表示一个2′-OMe修饰或2′-F修饰。
由上式(Ia)、(Ib)以及(Ic)中的任一者表示的有义链分别与由式(IIa)、(IIb)以及(IIc)中的任一者表示的一条反义链形成一种双链体。
因此，该dsRNA试剂可以包括有义链和反义链，每条链具有14到30个核苷酸，该dsRNA双链体由式(III)表示：
有义链：5′np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3′
反义链：3′np′-Na′-(X’X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′5′
(III)
其中：
i、j、k以及l各自独立地是0或1；
p和q各自独立地是0-6；
每个Na和Na′独立地表示一个包括0-25个被修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包括至少两个不同修饰的核苷酸；
每个Nb和Nb′独立地表示一个包括0-10个被修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
其中
每个np’、np、nq’以及nq独立地表示一个突出端核苷酸序列；并且
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′以及Z′Z′Z′各自独立地表示一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序。
在一个实施例中，i是1并且j是0；或i是0并且j是1；或i和j都是1。在另一个实施例中，k是1并且l是0；k是0并且l是1；或k和l都是1。
在一个实施例中，本发明的dsRNA试剂包括有义链和反义链，每条链具有14到30个核苷酸，该dsRNA双链体由式(V)表示：
有义链：5′Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3′
反义链：3′np′-Na′-(X’X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′5′
(V)
其中：
i、j、k以及l各自独立地是0或1；
p和q各自独立地是2；
每个Na和Na′独立地表示一个包括0-25个被修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包括至少两个不同修饰的核苷酸；
每个Nb和Nb′独立地表示一个包括0-10个被修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
其中
每个np’和nq独立地表示一个突出端核苷酸序列；并且
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′以及Z′Z′Z′各自独立地表示一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序。
在一个实施例中，i是1并且j是0；或i是0并且j是1；或i和j都是1。在另一个实施例中，k是1并且l是0；k是0并且l是1；或k和l都是1。
在一个实施例中，本发明的dsRNA试剂包括有义链和反义链，每条链具有14到30个核苷酸，该dsRNA双链体由式(Va)表示：
有义链：5′Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na3′
反义链：3′np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′5′
(Va)
其中：
i、j、k以及l各自独立地是0或1；
p和q各自独立地是2；
每个Na和Na′独立地表示一个包括0-25个被修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包括至少两个不同修饰的核苷酸；
每个Nb和Nb′独立地表示一个包括0-10个被修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
其中
np’表示一个突出端核苷酸序列；并且
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′以及Z′Z′Z′各自独立地表示一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序。
形成一种dsRNA双链体的有义链与反义链的示例性组合包括下式：
5′np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3′
3′np′-Na′-Y′Y′Y′-Nb′-Z′Z′Z′-Na′nq′5′
(IIIa)
5′np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq3′
3′np′-Na′-X′X′X′-Nb′-Y′Y′Y′-Na′-nq′5′
(IIIb)
5′np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3′
3′np′-Na′-X′X′X′-Nb ’-Y′Y′Y′-Nb′-Z′Z′Z′-Na-nq′5′
(IIIc)
当该dsRNA试剂由式(IIIa)表示时，每个Nb和Nb′独立地表示一个包括1-10个、1-7个、1-5个或1-4个被修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na和Na ’独立地表示一个包括2-20个、2-15个或2-10个被修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当该dsRNA试剂被表示为式(IIIb)时，每个Nb和Nb’独立地表示一个包括0-10个、0-7个、0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个被修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na和Na ’独立地表示一个包括2-20个、2-15个或2-10个被修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当该dsRNA试剂被表示为式(IIIc)时，每个Nb和Nb’独立地表示一个包括0-10个、0-7个、0-10个、0-7个、0-5个、0-4个、0-2个或0个被修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na和Na′独立地表示一个包括2-20个、2-15个或2-10个被修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。Na、Na’、Nb以及Nb’中的每一个独立地包括交替模式的修饰。
式(III)、(IIIa)、(IIIb)以及(IIIc)中的X、Y以及Z中的每一者可以彼此相同或不同。
当该dsRNA试剂由式(III)、(IIIa)、(IIIb)或(IIIc)表示时，Y核苷酸中的至少一个可以与Y′核苷酸之一形成一个碱基对。可替代地，Y核苷酸中的至少两者与相对应的Y′核苷酸形成碱基对；或Y核苷酸中的全部三者全部与相对应的Y′核苷酸形成碱基对。
应该理解的是，Na核苷酸与Na’形成碱基对，Nb核苷酸与Nb’形成碱基对，X核苷酸与X’形成碱基对，Y核苷酸与Y’形成碱基对，并且Z核苷酸与Z’形成碱基对。
当该dsRNA试剂由式(IIIa)或(IIIc)表示时，Z核苷酸中的至少一个可以与Z′核苷酸之一形成一个碱基对。可替代地，Z核苷酸中的至少两个与相对应的Z′核苷酸形成碱基对；或Z核苷酸中的全部三个全部与相对应的Z′核苷酸形成碱基对。
当该dsRNA试剂被表示为式(IIIb)或(IIIc)时，X核苷酸中的至少一个可以与X′核苷酸之一形成一个碱基对。可替代地，X核苷酸中的至少两个与相对应的X′核苷酸形成碱基对；或X核苷酸中的全部三个全部与相对应的X′核苷酸形成碱基对。
在一个实施例中，Y核苷酸上的修饰不同于Y′核苷酸上的修饰，Z核苷酸上的修饰不同于Z′核苷酸上的修饰，和/或X核苷酸上的修饰不同于X′核苷酸上的修饰。
在一个实施例中，该dsRNA试剂是一种多聚体，包含至少两个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)或(IIIc)表示的双链体，其中所述双链体由一个接头连接。该接头可以是可裂解或不可裂解的。任选地，所述多聚体进一步包括一个配体。每个dsRNA可以靶向相同基因或两种不同基因；或每个dsRNA可以在两个不同靶标位点处靶向相同基因。
在一个实施例中，该dsRNA试剂是一种多聚体，含有三个、四个、五个、六个或更多个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)或(IIIc)表示的双链体，其中所述双链体由一个接头连接。该接头可以是可裂解或不可裂解的。任选地，所述多聚体进一步包括一个配体。每个dsRNA可以靶向相同基因或两种不同基因；或每个dsRNA可以在两个不同靶标位点处靶向相同基因。
在一个实施例中，两个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)或(IIIc)表示的dsRNA试剂在5′端处键联到彼此，并且3′端中的一者或两者任选地与一个配体结合。每个dsRNA可以靶向相同基因或两种不同基因；或每个dsRNA可以在两个不同靶标位点处靶向相同基因。
不同公开物描述了多聚体siRNA并且全部可以与本发明的dsRNA一起使用。这样的公开物包括WO2007/091269、美国专利号7858769、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887以及WO2011/031520，将其全部内容特此结合。
包含一个或多个碳水化合物部分与一种dsRNA试剂的结合的dsRNA试剂可以优化该dsRNA试剂的一种或多种特性。在许多情况下，该碳水化合物部分将连接到该dsRNA试剂的一个被修饰的亚单位。例如，一种dsRNA试剂的一个或多个核糖核苷酸亚单位的核糖可以被另一个部分(例如一个碳水化合物配体附接至其上的一个非碳水化合物(优选环状)载体)置换。亚单位的核糖已经被如此置换的一种核糖核苷酸亚单位在此被称为一种核糖置换修饰亚单位(RRMS)。一个环状载体可以是一个碳环系统，即全部环原子都是碳原子，或一个杂环系统，即一个或多个环原子可以是一个杂原子，例如氮、氧、硫。该环状载体可以是一个单环系统，或可以包含两个或更多个环，例如稠合环。该环状载体可以是一个充分饱和的环系统，或它可以包含一个或多个双键。
该配体可以经由一个载体附接至该多核苷酸。这些载体包括(i)至少一个“主链附着点”、优选两个“主链附着点”，和(ii)至少一个“系拴附着点”。如在此使用，一个“主链附着点”是指一个官能团(例如一个羟基)，或通常，可用于并且适用于将该载体并入到一种核糖核酸的主链(例如含硫主链)中的一个键(例如磷酸酯或被修饰的磷酸酯)。在一些实施例中，一个“系拴附着点”(TAP)是指该环状载体的连接一个选定部分的一个组成型环原子，例如一个碳原子或一个杂原子(不同于提供一个主链附着点的一个原子)。该部分可以是例如一种碳水化合物，例如单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖以及多糖。任选地，该选定部分通过一个介入系拴物连接到该环状载体。因此，该环状载体将通常包括一个官能团(例如氨基)，或通常，提供适用于将另一个化学实体(例如配体)并入或系拴到组成型环的一个键。
在实施例中，本发明的dsRNA可以经由载体与一种配体结合，其中该载体可以是环基或非环基；优选地，该环基选自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1，3]二氧戊环、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基以及十氢萘；优选地，该非环基选自丝氨醇主链或二乙醇胺主链。
本发明的双链RNA(dsRNA)试剂可以任选地结合至一个或多个配体。该配体可以在3′端、5′端或两端处附接至该有义链、反义链或两条链。例如，该配体可以结合至该有义链，特别是在该有义链的3’端。
配体
多种多样的实体可以偶联到本发明的寡核苷酸。优选的部分是优选地共价直接地或者经由一个介入系拴物间接地偶联的配体。
在优选实施例中，一种配体改变了它所并入的分子的分布、靶向或寿命。在优选实施例中，一种配体例如与缺乏这样一种配体的一个种类相比对一种选定靶标提供了一种增强的亲和力，所选靶标例如是分子、细胞或细胞类型、区室、受体，例如身体的一个细胞区室或器官区室、组织、器官或部位。对一种选定靶标提供增强的亲和力的配体也被称为靶向配体。
一些配体可以具有内体溶解特性。该内体溶解配体促进内体的溶解和/或本发明的组合物或其组分从内体向细胞的细胞质的运载。该内体溶解配体可以是一种显示出pH依赖性膜活性和融合性的多阴离子肽或肽模拟物。在一个实施例中，该内体溶解配体在内体pH下呈现其活性构象。“活性”构象是其中该内体溶解配体促进内体的溶解和/或本发明的组合物或其组分从内体向细胞的细胞质的运载的那种构象。示例性内体溶解配体包括GALA肽(Subbarao(苏巴劳)等人，Biochemistry(生物化学)，1987，26：2964-2972)、EALA肽(Vogel(沃格尔)等人，J.Am.Chem.Soc.(美国化学会志)，1996，118：1581-1586)及其衍生物(Turk(特克)等人，Biochem.Biophys.Acta(生物化学与生物物理学学报)，2002，1559：56-68)。在一个实施例中，该内体溶解组分可以包含将响应于pH变化而经历电荷变化或质子化的一种化学基团(例如一种氨基酸)。该内体溶解组分可以是直链或支链的。
配体可以改进运载、杂交以及特异性特性，并且还可以改进所得天然或被修饰的寡核糖核苷酸或包括在此描述的单体的任何组合的一种聚合分子和/或天然或被修饰的核糖核苷酸的核酸酶抗性。
配体通常可以包括治疗改性剂，例如用于增强摄取；诊断化合物或报道基团，例如用于监测分布；交联剂；以及赋予核酸酶抗性的部分。一般实例包括脂质、类固醇、维生素、糖、蛋白质、肽、多元胺以及肽模拟物。
配体可以包括一种天然存在的物质，如一种蛋白质(例如人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)或球蛋白)；一种碳水化合物(例如一种右旋糖酐、支链淀粉、甲壳质、壳聚糖、菊糖、环糊精或透明质酸)；或一种脂质。该配体还可以是一种重组或合成分子，如一种合成聚合物，例如一种合成聚氨基酸、一种寡核苷酸(例如一种适体)。聚氨基酸的实例包括以下聚氨基酸：聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚膦嗪。多元胺的实例包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、多元胺、假肽-多元胺、肽模拟多元胺、树状多元胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白，阳离子脂质，阳离子卟啉，一种多元胺的季盐或一种α螺旋肽。
配体还可以包括靶向基团，例如，与指定的细胞类型(如肾细胞)结合的细胞或组织靶向剂，例如凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如抗体。一种靶向基团可以是一种促甲状腺激素、促黑激素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白A、粘蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价海藻糖、糖基化的聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸盐、聚谷氨酸盐、聚天冬氨酸盐、一种脂质、胆固醇、一种类固醇、胆汁酸、叶酸盐、维生素B12、生物素、一种RGD肽、一种RGD肽模拟物或一种适体。表2示出了靶向配体及其相关受体的一些实例。
配体的其他实例包括染料、插入剂(例如吖啶)、交联剂(例如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、特沙弗林(texaphyrin)、噻啉(Sapphyrin))、多环芳香族烃(例如吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶或一种螯合剂(例如EDTA)、亲脂性分子，例如胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1，3-双-O(十六基)甘油、香叶氧基己基、十六基甘油、茨醇、薄荷醇、1，3-丙二醇、十七基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)以及肽结合物(例如触足蛋白肽、Tat肽)、烷化剂、磷酸盐、氨基、巯基、PEG(例如PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、被取代的烷基、放射性标记的标记物、酶、半抗原(例如生物素)、运载/吸附促进剂(例如阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶(例如咪唑、双咪唑、组织胺、咪唑簇、吖啶-咪唑结合物、四氮杂大环的Eu3+络合物)、二硝基苯基、HRP或AP。
配体可以是蛋白质，例如糖蛋白，或肽，例如对一种共配体具有一种特异性亲和力的分子，或抗体，例如结合到一种规定细胞类型(如一种癌细胞、内皮细胞或骨细胞)的一种抗体。配体还可以包括激素和激素受体。它们还可以包括非肽类种类，如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价海藻糖或适体。配体可以是例如脂多糖、p38MAP激酶的活化剂，或NF-κB的活化剂。
配体可以是一种例如可以通过破坏细胞的细胞骨架(例如通过破坏细胞微管、微丝和/或中间丝)增加iRNA试剂摄入细胞中的物质，例如药物。药物可以例如是泰素(taxon)、长春新碱、长春碱、松胞菌素、诺考达唑、促微丝聚合剂(japlakinolide)、红海海绵素A、鬼笔环肽、海洋苔藓素(swinholide)A、茚满诺星(indanocine)或myoservin。
该配体可以通过例如活化一种炎症应答来增加寡核苷酸摄取到该细胞中。将具有这种作用的示例性配体包括肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素-1β或γ干扰素。
在一个方面中，该配体是一种脂质或基于脂质的分子。这种脂质或基于脂质的分子优选地结合一种血清蛋白，例如，人血清白蛋白(HSA)。结合HSA的配体允许结合物分布至靶组织，例如，身体的非肾靶组织。例如，该靶组织可以是肝脏，包括肝脏的实质细胞。可以结合HSA的其他分子也可以用作配体。例如，可以使用萘普生或阿司匹林。一种脂质或基于脂质的配体可以(a)增加对结合物降解的抗性，(b)增加靶向或运载到一种靶细胞或细胞膜中，和/或(c)可以用于调节与一种血清蛋白(例如HSA)的结合。
基于脂质的配体可以用来调节(例如，控制)结合物与靶组织的结合。例如，与HSA更强烈结合的脂质或基于脂质的配体将更不可能被靶向肾并且因此较不可能从身体清除。与HSA较不强烈结合的脂质或基于脂质的配体可以用来使结合物靶向肾。
在一个优选实施例中，基于脂质的配体结合HSA。优选地，它以足够的亲和力结合HSA，以使得该结合物将优选地分布至非肾组织。然而，优选的是这种亲和力并不是这样强，从而HSA-配体结合不能逆转。
在另一个优选实施例中，基于脂质的配体微弱或根本不结合HSA，以使得该结合物将优选地分布至肾。作为基于脂质的配体的替代或除它之外，也可以使用靶向肾细胞的其他部分。
在另一个方面，配体是由靶细胞(例如，正在增殖的细胞)摄取的部分，例如，维生素。这些特别可用于治疗以不希望的细胞(例如，恶性或非恶性型，例如，癌细胞)增殖为特征的失调。示例性维生素包括维生素A、E以及K。其他示例性维生素包括B族维生素，例如叶酸、B12、核黄素、生物素、吡哆醛或由癌细胞吸收的其他维生素或营养素。还包括HAS、低密度脂蛋白(LDL)以及高密度脂蛋白(HDL)。
在另一个方面中，该配体是一种细胞渗透剂，优选是一种螺旋细胞渗透剂。优选地，该渗透剂是两亲的。一种示例性剂渗透剂是肽，如tat或触足蛋白。如果该试剂是肽，则它可以是经修饰的，包括肽酰基模拟物、反转异构体、非肽键或假肽键和D-氨基酸的使用。该螺旋试剂优选地是一种优选具有一个亲脂性相和一个疏脂性相的α-螺旋试剂。
该配体可以是一种肽或肽模拟物。一种肽模拟物(在此也称为一种寡肽模拟物)是能够折叠成与一种天然肽类似的一种限定三维结构的一种分子。该肽或肽模拟物部分可以是约5-50个氨基酸长，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。肽或肽模拟物可以例如是细胞渗透肽、阳离子肽、两亲肽或疏水肽(例如，主要由Tyr、Trp或Phe组成)。肽部分可以是树状肽、约束肽或交联肽。在另一个替代方案中，肽部分可以包括疏水性膜转运序列(MTS)。一种含有疏水性MTS的示例性肽是具有氨基酸序列AAVALLPAVLLALLAP的RFGF。含有一个疏水性MTS的一种RFGF类似物(例如氨基酸序列AALLPVLLAAP)也可以是一个靶向部分。该肽部分可以是一种可以携载大极性分子(包括肽、寡核苷酸以及蛋白质)穿过细胞膜的“递送”肽。例如，已经发现来自HIV Tat蛋白(GRKKRRQRRRPPQ)和果蝇触足蛋白(RQIKIWFQNRRMKWKK)的序列能够充当递送肽。一种肽或肽模拟物可以由一个随机DNA序列(如从一个噬菌体展示文库或一珠一化合物(OBOC)组合文库鉴定的一种肽)编码(Lam(拉姆)等人，Nature(自然)，354：82-84，1991)。优选地，经由一个并入的单体单元系拴到一种iRNA试剂的肽或肽模拟物是一种细胞靶向肽，如一种精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽或RGD模拟物。一种肽部分的长度范围可以在从约5个氨基酸到约40个氨基酸。肽部分可以具有结构修饰，如以便增加稳定性或指导构象特性。可以使用下文描述的结构修饰中的任一个。一种RGD肽部分可以用于靶向一种肿瘤细胞，如一种内皮肿瘤细胞或一种乳癌肿瘤细胞(Zitzmann(齐茨曼)等人，Cancer Res.(癌症研究)，62：5139-43，2002)。一种RGD肽可以促进一种iRNA试剂靶向多种其他组织(包括肺、肾、脾脏或肝脏)的肿瘤(青木(Aoki)等人，Cancer Gene Therapy(癌症基因治疗)8：783-787，2001)。优选地，该RGD肽将促进一种iRNA试剂靶向肾。该RGD肽可以是线性的或环状的，并且可以被修饰(例如糖基化或甲基化)以促进靶向特定组织。例如，一种糖基化的RGD肽可以将一种iRNA试剂递送到一种表达αVβ3的肿瘤细胞(Haubner(豪布纳)等人，Jour.Nucl.Med.(核医学杂志)，42：326-336，2001)。可以使用靶向富含增殖细胞的标记物的肽。例如，含有RGD的肽和肽模拟物可以靶向癌细胞，具体而言展现一种整合素的细胞。因此，可以使用RGD肽、含有RGD的环状肽、包括D-氨基酸的RGD肽以及合成性RGD模拟物。除RGD之外，还可以使用靶向整合素配体的其他部分。通常，这类配体可以用来控制正在增殖的细胞和血管生成。这种类型的配体的优选结合物靶向PECAM-1、VEGF或其他癌基因(例如一种在此描述的癌基因)。
一种“细胞渗透肽”能够渗透一种细胞，例如一种微生物细胞，如一种细菌或真菌细胞，或一种哺乳动物细胞，如一种人类细胞。一种微生物细胞渗透肽可以是例如一种α-螺旋线性肽(例如LL-37或Ceropin P1)、一种含有二硫键的肽(例如α-防御素、β-防御素或细菌素)或一种仅含有一种或两种主要氨基酸的肽(例如PR-39或吲哚力西丁(indolicidin))。一种细胞渗透肽还可以包括一个核定位信号(NLS)。例如，一种细胞渗透肽可以是一种两分两亲肽，如MPG，它来源于HIV-1gp41的融合肽结构域和SV40大T抗原的NLS(Simeoni(西梅奥妮)等人，Nucl.Acids Res.(核酸研究)31：2717-2724，2003)。
在一个实施例中，一种靶向肽可以是一种两亲α-螺旋肽。示例性两亲α-螺旋肽包括但不限于，天蚕素、莱科毒素(lycotoxin)、摩西鱼毒肽(paradaxin)、蟾蜍肽抗生素(buforin)、CPF、铃蟾抗菌肽样肽(BLP)、蛇毒抗菌肽(cathelicidin)、角毒素(ceratotoxin)、柄海鞘(S.clava)肽、盲鳗肠道抗菌肽(HFIAP)、爪蟾抗菌肽、brevinins-2、蛙皮抗菌肽(dermaseptin)、蜂毒肽、pleurocidin、H2A肽、非洲爪蟾肽、esculentinis-1以及caerins。许多因素将优选地被认为维持螺旋稳定性的完整性。例如，将使用最大数目的螺旋稳定化残基(例如leu、ala或lys)，并且将使用最小数目的螺旋去稳定化残基(例如脯氨酸或环状单体单元)。将考虑加帽残基(例如Gly是一种示例性N-加帽残基)和/或可以将C-末端酰胺化用于提供一个额外H-键以稳定该螺旋。具有相反电荷、间隔i±3或i±4个位置的残基之间的盐桥的形成可以提供稳定性。例如，阳离子残基(如赖氨酸、精氨酸、高精氨酸、鸟氨酸或组氨酸)可以与阴离子残基谷氨酸盐或天冬氨酸盐形成盐桥。
肽和肽模拟物配体包括以下配体，那些配体具有天然发生的或被修饰的肽，例如D或L肽；α、β或γ肽；N-甲基肽；氮杂肽；具有一个或多个酰胺的肽，即键联被一个或多个脲、硫脲、氨基甲酸酯或磺酰脲键联置换的肽；或环肽。
该靶向配体可以是能够靶向一种特定受体的任何配体。实例是：叶酸盐、GalNAc、半乳糖、甘露糖、甘露糖-6P、糖簇(如GalNAc簇、甘露糖簇、半乳糖簇)或一种适体。一个簇是两个或更多个糖单元的组合。这些靶向配体还包括整合素受体配体、趋化因子受体配体、转铁蛋白、生物素、血清素受体配体、PSMA、内皮素、GCPII、生长抑素、LDL以及HDL配体。这些配体还可以基于核酸，例如一种适体。该适体可以是未被修饰的或具有在此披露的修饰的任何组合。
内体释放剂包括咪唑、聚咪唑或寡咪唑、PEI、肽、融合肽、聚羧酸酯、聚阳离子、掩蔽的寡或聚阳离子或阴离子、缩醛、聚缩醛、缩酮/聚缩酮、原酸酯、具有掩蔽或非掩蔽的阳离子或阴离子电荷的聚合物、具有掩蔽或非掩蔽的阳离子或阴离子电荷的树状聚合物。
PK调节剂代表药代动力学调节剂。PK调节剂包括亲脂体、胆汁酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白结合剂、PEG、维生素等。示例性PK调节剂包括但不限于，胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰基甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生、布洛芬、维生素E、生物素等。还已知包括许多硫代磷酸酯键联的寡核苷酸与血清蛋白结合，因此在主链中包括多个硫代磷酸酯键联的短寡核苷酸(例如约5个碱基、10个碱基、15个碱基或20个碱基的寡核苷酸)作为配体(例如作为PK调节配体)也属于本发明。
另外，结合血清组分(例如血清蛋白)的适体作为PK调节配体也属于本发明。
属于本发明的其他配体结合物描述于以下美国专利申请中：2004年8月10日提交的USSN：10/916,185；2004年9月21日提交的USSN：10/946,873；2007年8月3日提交的USSN：10/833,934；2005年4月27日提交的USSN：11/115,989；以及2007年11月21日提交的USSN：11/944,227，将其出于所有目的通过引用以其全文结合。
当存在两个或更多个配体时，这些配体可以都具有相同特性，都具有不同特性，或一些配体具有相同特性而其他配体具有不同特性。例如，一种配体可以具有靶向特性、具有内体溶解活性或具有PK调节特性。在一个优选实施例中，全部这些配体都具有不同特性。
可以将配体偶联到寡核苷酸的不同位置处，例如3′端、5′端和/或在一个内部位置处。在优选实施例中，将该配体经由一个介入系拴物(例如一个在此描述的载体)附接至这些寡核苷酸。当将一个单体并入正在生长的链中时，该配体或系拴物的配体可以存在于所述单体上。在一些实施例中，可以在已经将一个“前体”单体并入正在生长的链中后，将配体经由偶联到所述“前体”单体来并入。例如，可以将具有例如一个氨基封端的系拴物(即不具有缔合的配体)的一个单体(例如TAP-(CH2)nNH2)并入一条正在生长的寡核苷酸链。在一个随后的操作中，即在将该前体单体并入该链中后，随后可以将一种具有一个亲电基团(例如一个五氟苯酯或醛基)的配体通过将该配体的亲电基团与该前体单体的系拴物的末端亲核基团偶联来附接至该前体单体。
在另一个实例中，可以并入具有一个适用于参与点击化学(ClickChemistry)反应的化学基团的一个单体，例如一个叠氮化物或炔烃封端的系拴物/接头。在一个随后的操作中，即在将该前体单体并入该链中后，可以将一种具有一个互补化学基团(例如一个炔烃或叠氮化物)的配体通过将该炔烃与该叠氮化物偶联在一起来附接至该前体单体。
对于双链寡核苷酸而言，可以将配体附接至一条或两条链。在一些实施例中，一种双链iRNA试剂包含一种与有义链结合的配体。在其他实施例中，一种双链iRNA试剂包含一种与反义链结合的配体。
在一些实施例中，可以将配体与核碱基、糖部分或核酸分子的核苷间键联结合。与嘌呤核碱基或其衍生物的结合可以在任何位置(包括内环和外环原子)处出现。在一些实施例中，将一种嘌呤核碱基的2-、6-、7-或8-位附接至一个结合物部分。与嘧啶核碱基或其衍生物的结合也可以在任何位置处出现。在一些实施例中，可以将一种嘧啶核碱基的2-、5-以及6-位用一个结合物部分取代。与核苷的糖部分的结合可以在任何碳原子处出现。可以被附接至一个结合物部分的一个糖部分的示例性碳原子包括2′、3′以及5′碳原子。还可以将1′位附接至一个结合物部分，如在一个无碱基残基中。核苷间键联还可以具有结合物部分。对于含磷键联(例如磷酸二酯、硫代硫酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酰酯等)而言，可以直接将该结合物部分附接至该磷原子或与该磷原子结合的一个O、N或S原子。对于含胺或酰胺的核苷间键联(例如PNA)而言，可以将该结合物部分附接至该胺或酰胺的氮原子或一个相邻碳原子。
可以使用RNA干扰领域中的任何适合的配体，但该配体典型地是一种碳水化合物，例如单糖(如GalNAc)、二糖、三糖、四糖、多糖。
使该配体与该核酸结合的接头包括以上论述的那些。例如，该配体可以是通过一种二价或三价支链接头附接的一种或多种GalNAc(N-乙酰葡糖胺)衍生物。
在一个实施例中，本发明的dsRNA与一种二价和三价支链接头结合，包括式(IV)-(VII)中的任一者中所示的结构：
其中：
q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B以及q5C对于每次出现独立地表示0-20并且其中该重复单元可以是相同或不同的；
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C对于每次出现各自独立地不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；
Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C对于每次出现独立地是不存在、亚烷基、被取代的亚烷基，其中一个或多个亚甲基可以由以下各项中的一者或多者间杂或封端：O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R’)＝C(R”)、C≡C或C(O)；
R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C对于每次出现各自独立地是不存在、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH＝N-O、 或杂环基；
L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B以及L5C表示配体；即对于每次出现各自独立地是一种单糖(如GalNAc)、二糖、三糖、四糖、寡糖或多糖；并且
Ra是H或氨基酸侧链。
三价结合的GalNAc衍生物特别可用于与RNAi试剂一起用于抑制一种靶基因的表达，如具有式(VII)的那些：
其中L5A、L5B以及L5C表示一种单糖，如GalNAc衍生物。
结合GalNAc衍生物的适合的二价和三价支链接头基团的实例包括但不限于以下化合物：
定义
如在此使用，术语“dsRNA”、“siRNA”和“iRNA试剂”可交换用于可以介导一种靶标RNA(例如mRNA，例如一种编码蛋白质的基因的转录物)的沉默的试剂。为方便起见，这样的mRNA在此也被称为有待被沉默的mRNA。这样的一个基因也称为一个靶基因。通常，有待被沉默的RNA是一个内源基因或病原体基因。另外，除了mRNA以外的RNA(例如tRNA)以及病毒RNA也可以被靶向。
如在此使用，短语“介导RNAi”是指以一种序列特异性方式沉默靶标RNA的能力。尽管不希望被理论所束缚，但是应认为沉默采用了RNAi机制或过程以及一种指导RNA，例如一种具有21至23个核苷酸的siRNA试剂。
如在此使用，“特异可杂交的”和“互补的”是用来指示足够程度的互补性以使得在本发明的化合物与一种靶标RNA分子之间发生稳定且特异性结合的术语。特异性结合需要一个足够程度的互补性以避免寡聚化合物与非靶标序列在特异性结合是所希望的条件下的非特异性结合，即在测定或治疗性处理的情况下的生理条件下或在体外测定的情况下的进行这些测定的条件下。这些非靶标序列典型地至少5个核苷酸不同。
在一个实施例中，本发明的dsRNA试剂与一种靶标RNA(例如一种靶标mRNA)“充分互补”，以使得该dsRNA试剂沉默由该靶标mRNA编码的蛋白质的生产。在另一个实施例中，本发明的该dsRNA试剂与一种靶标RNA“完全互补”，例如该靶标RNA与该dsRNA双链体试剂退火例如以形成一种在具有完全互补性的区域中唯一地由沃森-克里克碱基对组成的杂交体。一种“充分互补的”靶标RNA可以包括一个与一种靶标RNA完全互补的内部区(例如具有至少10个核苷酸)。此外，在一些实施例中，本发明的dsRNA试剂确切地以一个单个核苷酸的区别加以辨别。在这种情况下，如果在(例如具有该单个核苷酸区别的7个核苷酸内)的区域中发现完全互补，则该dsRNA试剂才会介导RNAi。
如在此使用，术语“寡核苷酸”是指一个例如具有少于100、200、300或400个核苷酸长度的核酸分子(RNA或DNA)。
术语“卤基”是指具有氟、氯、溴或碘的任何基团。术语“烷基”是指可以是直链或支链、包含指定数目的碳原子的饱和的及非饱和的非芳香烃链(这些烷基包括但不限于丙基、烯丙基或炔丙基)，这些烷基可任选地插有N、O或S。例如，C1-C10指示该基团中可以具有从1至10个(包括端点)碳原子。术语“烷氧基”是指-O-烷基。术语“亚烷基”是指二价烷基(即，-R-)。术语“亚烷基二氧代”是指具有结构-O-R-O-的二价种类，其中R表示一个亚烷基。术语“氨基烷基”是指被氨基取代的烷基。术语“巯基”是指-SH基团。术语“硫代烷氧基”是指-S-烷基。
术语“芳基”是指6碳单环的或10碳二环的芳香环系统，其中每个环的0、1、2、3或4个原子可以被一个取代基取代。芳基的实例包括苯基、萘基等。术语“芳烷基”(arylalkyl)或术语“芳烷基”(aralkyl)是指被一个芳基取代的烷基。术语“芳基烷氧基”是指被芳基取代的烷氧基。
如在此使用，术语“环烷基”包括具有3至12个碳(例如3至8个碳以及例如3至6个碳)的饱和的及部份非饱和的环烃基团，其中环烷基额外地可以是任选取代的。环烷基包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基以及环辛基。
术语“杂芳基”是指具有1-3个杂原子(如果是单环的)、1-6个杂原子(如果是二环的)或1-9个杂原子(如果是三环的)的芳香族5-8元单环的、8-12元二环的或11-14元三环的环系统，所述杂原子选自O、N或S(例如，如果是单环的、二环的或三环的，分别是碳原子以及1-3个、1-6个或1-9个N、O或S杂原子)，其中每个环的0、1、2、3或4个原子可以被一个取代基取代。杂芳基的实例包括吡啶基、呋喃基(furyl或furanyl)、咪唑基、苯并咪唑基、嘧啶基、苯硫基(thiophenyl)或噻吩基(thienyl)、喹啉基、吲哚基、噻唑基等。术语“杂芳烷基”(heteroarylalkyl)或术语“杂芳烷基”(heteroaralkyl)是指被一个杂芳基取代的烷基。术语“杂芳基烷氧基”是指被杂芳基取代的烷氧基。
术语“杂环基”是指具有1-3个杂原子(如果是单环的)、1-6个杂原子(如果是二环的)或1-9个杂原子(如果是三环的)的非芳香族5-8元单环的、8-12元二环的或11-14元三环的环系统，所述杂原子选自O、N或S(例如，如果是单环的、二环的或三环的，分别是碳原予以及1-3个、1-6个或1-9个N、O或S杂原子)，其中每个环的0、1、2或3个原子可以被一个取代基取代。杂环基的实例包括三唑基、四唑基、哌嗪基、吡咯烷基、二噁烷基、吗啉基、四氢呋喃基等。
术语“氧代”是指一个氧原子，当附接至碳时形成一个羰基，当附接至氮时形成一种N-氧化物，并且当附接至硫时形成亚砜或砜。
术语“酰基”是指烷基羰基、环烷基羰基、芳基羰基、杂环基羰基或杂芳基羰基取代基，其中的任一个可以进一步被取代基取代。
术语“取代的”是指一种给定结构中的一个或多个氢基被规定取代基的基团置换，这些规定取代基包括但不限于：卤基、烷基、烯基、炔基、芳基、杂环基、巯基、烷硫基、芳硫基、烷硫基烷基、芳硫基烷基、烷基磺酰基、烷基磺酰基烷基、芳基磺酰基烷基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、氨基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、卤代烷基、氨基、三氟甲基、氰基、硝基、烷基氨基、芳基氨基、烷基氨基烷基、芳基氨基烷基、氨基烷基氨基、羟基、烷氧基烷基、羧基烷基、烷氧基羰基烷基、氨基羰基烷基、酰基、芳烷氧基羰基、羧酸、磺酸、磺酰基、膦酸、芳基、杂芳基、杂环基以及脂肪族化合物。应该理解的是，该取代基可以进一步被取代。
可裂解的连接基团
一种可裂解的连接基团在细胞外是足够稳定的，但它在进入靶标细胞时被裂解以释放该接头结合在一起的两个部分。在一个优选实施例中，可裂解的连接基团在靶细胞中或第一参比条件下(可以例如将其选择成模拟或代表胞内条件)的裂解比受试者的血液中或第二参比条件(可以例如将其选择成模拟或代表血液或血清中发现的条件)下快至少10倍或更优选地至少100倍。
可裂解的连接基团易于受到裂解因子(例如pH、氧化还原电位或降解分子的存在)的影响。通常，裂解因子在细胞内比在血清或血液中更普遍或以更高水平或活性被发现。此类降解因子的实例包括：氧化还原因子，它们被选择用于特定底物或者无底物特异性，包括例如氧化酶或还原酶或者在细胞中存在的还原因子如硫醇(它可以通过还原作用降解一种可氧化还原裂解的连接基团)；酯酶；内体或可以创造酸性环境的因子，例如形成五或更低的pH的那些；可以通过作为一种广义酸起作用而水解或降解一种酸可裂解的连接基团的酶，肽酶(它可以是底物特异性的)，以及磷酸酶。
一种可裂解的连锁群(例如二硫键)可以对pH敏感。人血清的pH是7.4，而平均的细胞内pH稍低，范围为约7.1-7.3。内体具有更大酸性pH，处于5.5-6.0范围内，并且溶酶体具有在约5.0的甚至更大酸性pH。一些接头将具有在优选的pH处被裂解的可裂解连接基，因而在细胞内部从配体释放阳离子脂质或释放至所需的细胞区室。
接头可以包括一种可被特定酶裂解的可裂解的连接基团。并入接头的可裂解的连接基团的类型可以取决于有待被靶向的细胞。例如，肝靶向配体可以通过一种包括酯基的接头而被连接至一种阳离子脂质。肝细胞富含酯酶，并且因此与不富含酯酶的细胞相比，该接头将在肝细胞中被更有效地裂解。富含酯酶的其他细胞类型包括肺、肾皮质以及睾丸的细胞。
当靶向富含肽酶的细胞类型(例如肝细胞与滑膜细胞)时，可以使用包含肽键的接头。
通常，一种候选的可裂解的连接基团的适合性可以通过测试降解因子(或条件)裂解该候选的连接基团的能力来进行评估。还希望的是也测试该候选的可裂解的连接基团在血液中或当与其他非靶标组织接触时抵抗裂解的能力。因此，可以确定在一个第一条件与一个第二条件之间进行裂解的相对敏感性，其中该第一条件被选择为指示在一个靶细胞中的裂解并且该第二条件被选择为指示在其他组织或生物流体(例如，血液或血清)中的裂解。这些评估可以在无细胞系统中、在细胞中、在细胞培养物中、在器官或组织培养物中或在整个动物中进行。可能有用的是，在无细胞或培养条件下作出初步评价并且通过在完整动物中进一步评价来证实。在优选的实施例中，与血液或血清(或在经选择以模拟胞外条件的体外条件下)相比，可用候选化合物在细胞(或在经选择以模拟胞内条件的体外条件下)中至少2、4、10或100倍地被裂解。
氧化还原可裂解的连接基团
一类可裂解的连接基团是一旦还原或氧化就裂解的氧化还原可裂解的连接基团。还原地可裂解的连接基团的实例是二硫化物连接基团(-S-S-)。为了确定一个候选的可裂解的连接基团是否是一种适合的“还原地可裂解的连接基团”，或者例如是否适于与一种特定的iRNA部分以及特定的靶向剂一起使用，可以参考在此描述的方法。例如，可以通过与二硫苏糖醇(DTT)或本领域内使用的已知试剂的其他还原剂进行孵育来对一个候选者进行评估，这模拟了将在细胞(例如靶细胞)内观察到的裂解速率。还可以在被选择为模拟血液或血清条件的条件下对这些候选者进行评估。在一个优选实施例中，候选化合物在血液中遭裂解最多10％。在优选实施例中，与血液(或在经选择以模拟胞外条件的体外条件下)相比，可用候选化合物在细胞(或在经选择以模拟胞内条件的体外条件下)中至少2、4、10或100倍地降解。可以在被选择为模拟细胞内介质的条件下，使用标准的酶动力学测定来确定候选化合物的裂解速率，并且将其与被选择为模拟胞外介质的条件下的速率相比较。
基于磷酸酯的可裂解的连接基团
基于磷酸酯的可裂解的连接基团由降解或水解该磷酸酯基团的试剂裂解。一种在细胞中裂解磷酸酯基团的试剂的实例是酶，例如细胞中的磷酸酶。基于磷酸酯的连接基团的实例是-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-。优选的实施例是-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-。一个优选的实施例是-O-P(O)(OH)-O-。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评估这些候选者。
酸可裂解的连接基团
酸可裂解的连接基团是在酸性条件下被裂解的连接基团。在优选实施例中，酸可裂解的连接基团在pH为约6.5或更低(例如，约6.0、5.5、5.0或更低)的酸性环境下裂解或由可以充当广义酸的试剂(如酶)裂解。在细胞中，特定的低pH细胞器(例如内体或溶酶体)可以提供一个针对酸可裂解的连接基团的裂解环境。酸可裂解的连接基团的实例包括但不限于腙、酯以及氨基酸的酯。酸可裂解的基团可以具有通式-C＝NN-、C(O)O或-OC(O)。一个优选实施例是当附接至酯(烷氧基基团)的氧的碳是芳基、经取代的烷基或叔烷基(例如二甲基戊基或叔丁基)时。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评估这些候选者。
基于酯的连接基团
基于酯的可裂解的连接基团由酶如细胞中的酯酶和酰胺酶裂解。基于酯的可裂解的连接基团的实例包括但不限于亚烷基、亚烯基以及亚炔基基团的酯。酸可裂解的连接基团具有通式-C(O)O-、或-OC(O)-。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评估这些候选者。
基于肽的裂解基团
基于肽的可裂解的连接基团由酶如细胞中的肽酶和蛋白酶裂解。基于肽的可裂解的连接基团是氨基酸之间形成以产生寡肽(例如，二肽、三肽等)和多肽的肽键。基于肽的可裂解的基团不包括酰胺基团(-C(O)NH-)。酰胺基团可以在任何亚烷基、亚烯基或亚炔基之间形成。肽键是在氨基酸之间形成以产生肽以及蛋白质的特定类型的酰胺键。基于肽的裂解基团通常限于在氨基酸之间形成以产生肽以及蛋白质的肽键(即，酰胺键)，并且不包括整个酰胺官能团。基于肽的可裂解的连接基团具有通式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA和RB是这两个邻接氨基酸的R基团。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评估这些候选者。如在此使用，“碳水化合物”是指以下这样一种化合物，它是一种本身由具有至少6个碳原子的一个或多个单糖单位构成的碳水化合物(其可以是线性的、支链的或环状的)，其中氧、氮或硫原子结合至每一碳原子；或者它是一种具有以下这样的一个碳水化合物部分作为其一部分的化合物，该碳水化合物由具有至少六个碳原子的一个或多个单糖单位构成(其可以是线性的、支链的或环状的)，其中氧、氮或硫原子结合至每一碳原子。代表性碳水化合物包括糖(单糖、二糖、三糖和含有约4-9个单糖单位的寡糖)和多糖如淀粉，糖原，纤维素和多糖树胶。具体单糖包括C5及以上(优选C5-C8)糖；二糖和三糖，包括具有两个或三个单糖单位的糖(优选C5-C8)。
替代性实施例
在另一个实施例中，本发明涉及一种能够抑制靶基因的表达的dsRNA试剂。该dsRNA试剂包括有义链和反义链，每条链具有14至30个核苷酸。该有义链包含至少一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序，其中至少一个基序出现在该反义链中的裂解位点处或附近。在该有义链和反义链中的每个核苷酸已经被修饰。在有义链和反义链上的这些修饰各自独立地包括至少两种不同修饰。
在另一个实施例中，本发明涉及一种能够抑制靶基因的表达的dsRNA试剂。该dsRNA试剂包括有义链和反义链，每条链具有14至30个核苷酸。该有义链包含至少一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序，其中至少一个基序出现在该反义链中的裂解位点处或附近。该反义链包含至少一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序。该反义链的修饰模式相对于该有义链的修饰模式具有一个或多个核苷酸的移位。
在另一个实施例中，本发明涉及一种能够抑制靶基因的表达的dsRNA试剂。该dsRNA试剂包括有义链和反义链，每条链具有14至30个核苷酸。该有义链包含至少两个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序，其中至少一个基序出现在该链内的裂解位点处并且至少一个基序出现在由至少一个核苷酸在裂解位点处将其与该基序分开的该链的另一个部分处。该反义链包含至少一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序，其中至少一个基序出现在该链内的裂解位点处或附近并且至少一个基序出现在由至少一个核苷酸在裂解位点处或附近将其与该基序分开的该链的另一个部分处。
在另一个实施例中，本发明涉及一种能够抑制靶基因的表达的dsRNA试剂。该dsRNA试剂包括有义链和反义链，每条链具有14至30个核苷酸。该有义链包含至少两个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序，其中至少一个基序出现在该链内的裂解位点处并且至少一个基序出现在由至少一个核苷酸在裂解位点处将其与该基序分开的该链的另一个部分处。该反义链包含至少一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序，其中至少一个基序出现在该链内的裂解位点处或附近并且至少一个基序出现在由至少一个核苷酸在裂解位点处或附近将其与该基序分开的该链的另一个部分处。出现在该有义链中的裂解位点处的基序中的修饰不同于出现在该反义链的裂解位点处或附近的基序中的修饰。在另一个实施例中，本发明涉及一种能够抑制靶基因的表达的dsRNA试剂。该dsRNA试剂包括有义链和反义链，每条链具有12至30个核苷酸。该有义链包含至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2′-F修饰的基序，其中至少一个基序出现在该链中的裂解位点处。该反义链包含至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2′-O-甲基修饰的基序。
该有义链可以进一步包括一个或多个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序，其中该一个或多个另外的基序出现在由至少一个核苷酸在裂解位点处将其与该三个2′-F修饰分开的该链的另一个部分处。该反义链可以进一步包括一个或多个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序，其中该一个或多个另外的基序出现在由至少一个核苷酸在裂解位点处将其与该三个2′-O-甲基修饰分开的该链的另一个部分处。具有2′-F修饰的这些核苷酸中的至少一个与具有2′-O-甲基修饰的这些核苷酸之一形成一个碱基对。
在一个实施例中，本发明的dsRNA在缓冲液中给予。
在一个实施例中，在此描述的siRNA化合物可以被配制用于给予给一位受试者。一种被配制的siRNA组合物可以采取多种状态。在一些实例中，该组合物是至少部分结晶、均匀结晶和/或无水的(例如少于80％、50％、30％、20％或10％的水)。在另一个实例中，该siRNA处于水相中，例如处于包括水的一种溶液中。
这些水相或结晶组合物可以被并入一种递送运载体中，例如一种脂质体(特别用于水相)或一种颗粒(例如如一种可以适用于一种结晶组合物的微粒)。通常，如在此描述，该siRNA组合物以与预期给药方法相容的方式配制。例如，在具体实施例中，该组合物通过以下方法中的至少一个来制备：喷雾干燥、冻干、真空干燥、蒸发、流化床干燥或这些技术的一种组合；或与一种脂质一起声处理、冷冻干燥、缩合以及其他自组装。
一种siRNA制剂可以与另一种试剂(例如另一种治疗剂或使siRNA稳定化的一种试剂(例如与siRNA复合以形成iRNP的一种蛋白质))组合配制。再其他试剂包括螯合剂(例如EDTA(例如以去除二价阳离子，如Mg2+))、盐、RNA酶抑制剂(例如一种广泛特异性RNA酶抑制剂，如RNAsin)等。
在一个实施例中，该siRNA制剂包括另一种siNA化合物，例如可以针对一种第二基因或针对相同基因介导RNAi的一种第二siRNA。再其他制剂可以包括至少3种、5种、十种、二十种、五十种或一百种或更多种不同siRNA种类。这样的siRNA可以针对类似数目的不同基因介导RNAi。
在一个实施例中，该siRNA制剂包括至少一种第二治疗剂(例如除一种RNA或一种DNA以外的一种试剂)。例如，一种用于治疗病毒性疾病(如HIV)的siRNA组合物可能包括一种已知的抗病毒剂(如蛋白酶抑制剂或逆转录酶抑制剂)。在另一个实例中，一种用于治疗癌症的siRNA组合物可能进一步包括一种化疗剂。
以下讨论示例性配制品。
脂质体。为了便于阐释，在这一部分很大程度上相对于未修饰的siRNA化合物讨论了配制品、组合物和方法。然而，可以理解的是，可以用其他siRNA化合物(例如，修饰的siRNA)实践这些配制品、组合物和方法，并且这样的实践属于本发明。一种siRNA化合物制剂可以被配制用于在一种膜状分子组装体(例如，脂质体或胶束)中递送，该siRNA化合物是例如一种双链siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如，一种前体，该前体例如一种可以被加工成ssiRNA化合物的较大的siRNA化合物、或一种编码siRNA化合物(例如一种双链siRNA化合物或ssiRNA化合物或其前体)的DNA)。如在此使用，术语“脂质体”是指由两亲脂质组成、以至少一个双层(例如一个双层或多个双层)排列的一种囊泡。脂质体包括具有由一种亲脂性材料和一个水性内部形成的一个膜的单层和多层囊泡。该水性部分包含该siRNA组合物。该亲脂性材料将该水性内部与一个水性外部分离，该水性外部典型地不包括该siRNA组合物，但在一些实例中，它可以包括。脂质体适于将活性成分转移并递送到作用部位。因为该脂质体膜与生物膜结构上类似，所以当脂质体被施用到一种组织时，该脂质体双层与细胞膜的双层融合。随着脂质体与细胞的融合进行，包括该siRNA的内部水性内含物被递送到该细胞中，其中该siRNA可以特异性结合到一种靶标RNA并且可以介导RNAi。在一些情况下，这些脂质体还被特异性靶向以例如将该siRNA指引到特定细胞类型。
包含一种siRNA的脂质体可以通过多种方法制备。在一个实例中，将一种脂质体的脂质组分溶解于一种洗涤剂中以使得形成具有该脂质组分的胶束。例如，该脂质组分可以是一种两亲阳离子脂质或脂质结合物。该洗涤剂可以具有一个高的临界胶束浓度并且可以是非离子的。示例性洗涤剂包括胆酸盐、CHAPS、辛基糖苷、脱氧胆酸盐以及月桂酰基肌氨酸。然后将该siRNA制剂添加到包括该脂质组分的这些胶束。该脂质上的阳离子基团与该siRNA相互作用并且在该siRNA周围缩合以形成一种脂质体。在缩合之后，通过例如透析去除该洗涤剂以产生一种siRNA脂质体制剂。
在必要时，可以在缩合反应期间通过例如控制添加来添加辅助缩合的一种载体化合物。例如，该载体化合物可以是一种除核酸以外的聚合物(例如精胺或亚精胺)。还可以调节pH以促进缩合。
用于生产并入一种多核苷酸/阳离子脂质复合体作为递送运载体的结构组分的稳定的多核苷酸递送运载体的方法的另外说明描述于例如WO96/37194中。脂质体形成还可以包括以下各项中所述的示例性方法中的一个或多个方面：Felgner(费尔格纳)，P.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA(美国国家科学院院刊)8：7413-7417，1987；美国专利号4,897,355；美国专利号5,171,678；Bangham(班厄姆)，等人M.Mol.Biol.(大分子生物学)23：238，1965；Olson(奥尔森)，等人Biochim.Biophys.Acta(生物化学与生物物理学学报)557：9，1979；Szoka(思卓卡)，等人Proc.Natl.Acad.Sci.(国家科学院院刊)75：4194，1978；Mayhew(梅休)，等人Biochim.Biophys.Acta(生物化学与生物物理学学报)775：169，1984；Kim(金姆)，等人Biochim.Biophys.Acta(生物化学与生物物理学学报)728：339，1983；以及Fukunaga(福永)，等人Endocrinol.(内分泌学)115：757，1984。用于制备用作递送运载体的具有适当尺寸的脂质聚集体的常用技术包括声处理和冻融加挤压(参见例如Mayer(迈尔)等人，Biochim.Biophys.Acta(生物化学与生物物理学学报)858：161，1986)。当一贯地小(50到200nm)并且相对均匀的聚集体是所希望的时候，可以使用微流化(梅休(Mayhew)等人，Biochim.Biophys.Acta(生物化学与生物物理学学报)775：169，1984)。这些方法容易适于将siRNA制剂包装到脂质体中。
pH敏感的或带负电的脂质体包埋核酸分子而非与其进行复合。因为核酸分子和脂质都带类似的电，所以发生排斥而非复合体形成。尽管如此，一些核酸分子包埋于这些脂质体的水性内部中。pH敏感的脂质体已经用于将编码胸苷激酶基因的DNA递送至培养中的细胞单层。检测外源基因在该靶细胞中的表达(Zhou(周)等人，Journal of Controlled Release(控制释放杂志)，19(1992)269-274)。
脂质体组合物的一个主要类型还包括磷脂，除了天然衍生的磷脂酰胆碱以外。例如中性脂质体组合物可以形成自二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)。阴离子脂质体组合物通常形成自二肉豆蔻酰磷脂酰甘油，而阴离子融合脂质体主要形成自二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。另一种类型的脂质体组合物形成自磷脂酰胆碱(PC)，例如像大豆PC和蛋PC。另一种类型形成自磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物。
在体外将脂质体引入到细胞中的其他方法的实例包括美国专利号5,283,185；美国专利号5,171,678；WO94/00569；WO93/24640；WO91/16024；Felgner(费尔格纳)，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)269：2550，1994；Nabel(纳贝尔)，Proc.Natl.Acad.Sci.(国家科学院院刊)90：11307，1993；纳贝尔，Human GeneTher.(人类基因疗法)3：649，1992；Gershon(格申)，Biochem.(生物化学)32：7143，1993；以及Strauss(施特劳斯)EMBO J.(欧洲分子生物学学会杂志)11：417，1992。
在一个实施例中，使用阳离子脂质体。阳离子脂质体具有能够与细胞膜融合的优势。尽管非阳离子脂质体不能够如与质膜一般有效地融合，但在体内由巨噬细胞吸收并且可以用于将siRNA递送到巨噬细胞。
脂质体的另外的优势包括：从天然磷脂获得的脂质体是生物相容的且生物可降解的；脂质体可以并入范围广泛的水和脂质可溶性药物；脂质体可以保护其内部区室中的囊封的siRNA免于代谢和降解(Rosoff(罗索夫)，“Pharmaceutical Dosage Forms(药物剂型)”，Lieberman(利伯曼)，Rieger(列赫尔)以及Banker(班克)(编)，1988，第1卷，第245页)。脂质体配制品的制备中的重要考虑因素是脂质表面电荷、囊泡尺寸以及脂质体的水性体积。
一种带正电的合成阳离子脂质N-[1-(2，3-二油烯氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)可以用于形成与核酸自发地相互作用以形成能够与组织培养细胞的细胞膜的带负电的脂质融合的脂质-核酸复合体的小脂质体，从而导致siRNA的递送(关于DOTMA及其与DNA一起的使用的描述，参见例如费尔格纳P.L.等人，美国国家科学院院刊，8：7413-7417，1987和美国专利号4,897,355)。
一种DOTMA类似物1，2-双(油酰氧基)-3-(三甲基氨)丙烷(DOTAP)可以与一种磷脂组合使用以形成复合DNA的囊泡。LipofectinTM(贝塞斯达研究实验室(Bethesda Research Laboratories)，盖瑟斯堡(Gaithersburg)，马里兰州(Md.))是用于将高度阴离子的核酸递送到包括与带负电的多核苷酸自发地相互作用以形成复合体的带正电的DOTMA脂质体的活组织培养细胞中的一种有效试剂。当使用足够的带正电的脂质体时，产生的复合体上的净电荷也是正的。以这种方式制备的带正电的复合体自发附接至带负电的细胞表面，与质膜融合，并且将功能核酸有效地递送到例如组织培养细胞中。另一种可商购的阳离子脂质1，2-双(油酰氧基)-3，3-(三甲基氨)丙烷(“DOTAP”)(宝灵曼公司(Boehringer Mannheim)，印第安纳波利斯(Indianapolis)，印地安那州(Indiana))不同于DOTMA，因为油酰基部分由酯而非醚键联而键联。
其他报道的阳离子脂质化合物包括已经与多种部分结合的那些，包括例如羧基精胺，它已经与两种类型的脂质之一结合并且包括化合物，如5-羧基精胺基甘氨酸二八油酰基酰胺(“DOGS”)(TransfectamTM，普洛麦格(Promega)，麦迪逊(Madison)，威斯康星州(Wisconsin))和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺5-羧基精胺基-酰胺(“DPPES”)(参见例如美国专利号5,171,678)。
另一种阳离子脂质结合物包括脂质与胆固醇的衍生物(“DC-Chol”)，它已经与DOPE组合配制成脂质体(参见Gao(高)，X.和Huang(黄)，L.，Biochim.Biophys.Res.Commun.(生物化学与生物物理学研究通讯)179：280，1991)。通过使聚赖氨酸与DOPE结合而制造的脂质聚赖氨酸已经被报道有效用于在血清存在下的转染(Zhou(周)，X.等人，生物化学与生物物理学学报1065：8，1991)。对于某些细胞系而言，包含结合的阳离子脂质的这些脂质体据说与含有DOTMA的组合物相比展现更低毒性并且提供更有效的转染。其他可商购的阳离子脂质产品包括DMRIE和DMRIE-HP(维考(Vical)，拉乔拉(LaJolla)，加利福尼亚州(California))和脂染胺(DOSPA)(生命技术公司(LifeTechnology，Inc.)，盖瑟斯堡，马里兰)。适于递送寡核苷酸的其他阳离子脂质描述于WO98/39359和WO96/37194中。
脂质体配制品特别适合于局部给予，脂质体呈现若干种优于其他配制品的优势。这样的优势包括与所给予的药物的高全身性吸收相关的副作用减小、在所希望的靶标处所给予的药物的积聚增加以及将siRNA给予到皮肤中的能力。在一些实现方式中，脂质体用于将siRNA递送到表皮细胞并且还增强siRNA渗透到皮组织中，例如到皮肤中。例如，这些脂质体可以局部地施用。已经记录了被配制为脂质体的药物向皮肤的局部递送(参见例如，Weiner(韦纳)等人，Journal of Drug Targeting(药物靶向杂志)，1992，第2卷，405-410和du Plessis(杜普莱西斯)等人，Antiviral Research(抗病毒研究)，18，1992，259-265；Mannino(曼尼诺)，R.J.和Fould-Fogerite(富尔德-富格利特)，S.，Biotechniques(生物技术)6：682-690，1988；Itani(伊塔尼)，T.等人Gene(基因)56：267-276.1987；Nicolau(尼古劳)，C.等人Meth.Enz.(酶学方法)149：157-176，1987；Straubinger(斯特劳宾格)，R.M.和Papahadjopoulos(帕帕哈乔泡洛斯)，D.酶学方法101：512-527，1983；Wang(王)，C.Y和Huang(黄)，美国国家科学院院刊84：7851-7855，1987)。
还检查非离子脂质体系统(特别是包括非离子表面活性剂和胆固醇的系统)以测定其在将药物递送到皮肤中的效用。使用包括Novasome I(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)和Novasome II(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)的非离子脂质体配制品将一种药物递送到小鼠皮肤的真皮中。这样的具有siRNA的配制品适于治疗一种皮肤失调。
包括siRNA的脂质体可以被制得高度可变形。这样的变形性可以使得脂质体能够渗透通过小于脂质体的平均半径的孔隙。例如，传递体是可变形脂质体的一种类型。传递体可以通过将表面边界活化剂(通常是表面活性剂)加入到一种标准脂质体组合物中来制造。包括siRNA的传递体可以例如通过注射皮下递送，从而将siRNA递送到皮肤中的角质细胞。为了跨过完整的哺乳动物皮肤，脂类囊泡必须在合适的经皮梯度的影响下穿过一系列的细孔，每一孔具有小于50nm的直径。另外，归因于脂质特性，这些传递体可以自动优化(适于例如皮肤中的孔隙的形状)、自动修复，并且经常可以到达其靶标而不破碎，并且通常自动负载。
属于本发明的其他配制品描述于以下美国临时申请序列号中：2008年1月2日提交的序列号61/018,616、2008年1月2日提交的序列号61/018,611、2008年3月26日提交的序列号61/039,748、2008年4月22日提交的序列号61/047,087以及2008年5月8日提交的序列号61/051,528中。2007年10月3日提交的PCT申请号PCT/US2007/080331也描述了属于本发明的配制品。
表面活性剂。为了便于阐释，在这一部分很大程度上相对于未修饰的siRNA化合物讨论了配制品、组合物和方法。然而，可以理解的是，可以用其他siRNA化合物(例如，修饰的siRNA化合物)实践这些配制品、组合物和方法，并且这样的实践是在本发明的范围内。表面活性剂在如乳液(包括微乳液)和脂质体的配制品中获得广泛应用(参见上文)。siRNA(或一种前体，例如一种可以被加工为一种siRNA的较大的dsiRNA，或一种编码siRNA或前体的DNA)组合物可以包括一种表面活性剂。在一个实施例中，siRNA被配制为一种包括一种表面活性剂的乳液。对许多不同类型的表面活性剂(天然的与合成的)的特性进行分类与评级的最常见的方法是通过亲水/亲油平衡值(HLB)的使用。亲水基团的性质提供了将配制品中所用的不同表面活性剂分类的最有用手段(列赫尔，“药物剂型”，马塞尔德克尔公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约(New York)，纽约州(NY)，1988，第285页)。
如果表面活性剂分子不是离子化的，那么它被归类为一种非离子表面活性剂。非离子表面活性剂在药物产品中获得广泛应用并且在很宽的pH值范围内是可用的。通常，取决于它们的结构它们的HLB值范围为从2至约18。非离子表面活性剂包括非离子酯，如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、脱水山梨糖醇酯、蔗糖酯以及乙氧基化酯。非离子烷醇酰胺以及醚(例如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇、以及乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物)也被包括在这一类别中。聚氧乙烯表面活性剂是非离子表面活性剂类别的最普遍的成员。
如果表面活性剂分子当它溶解或分散于水中时携载一个负电荷，那么该表面活性剂被归类为阴离子的。阴离子表面活性剂包括羧酸盐(如皂)、酰基乳酸盐、氨基酸的酰胺、硫酸酯(如烷基硫酸酯和乙氧基化烷基硫酸酯)、磺酸盐(如烷基苯磺酸盐、酰基羟乙磺酸盐、酰基牛磺酸盐和磺基琥珀酸盐)以及磷酸盐。阴离子表面活性剂类别的最重要的成员是烷基硫酸酯和皂。
如果表面活性剂分子当它溶解或分散于水中时携载一个正电荷，那么该表面活性剂被归类为阳离子的。阳离子表面活性剂包括季铵盐和乙氧基化胺。季铵盐是这种类别的最常用的成员。
如果表面活性剂分子具有携载一个正电荷或负电荷的能力，那么该表面活性剂被归类为两性的。两性表面活性剂包括丙烯酸衍生物、经取代的烷基酰胺、N-烷基甜菜碱以及磷脂。
已经综述了表面活性剂在药品、配制品以及乳液中的用途(列赫尔，“药物剂型”，马塞尔德克尔公司，纽约，纽约州，1988，第285页)。
胶束和其他膜状配制品。为了便于阐释，在这一部分很大程度上相对于未修饰的siRNA化合物讨论了胶束以及其他配制品、组合物和方法。然而，可以理解的是，可以用其他siRNA化合物(例如，修饰的siRNA化合物)实践这些胶束以及其他配制品、组合物和方法，并且这样的实践属于本发明。一种siRNA化合物组合物可以被提供为一种胶束配制品，该siRNA化合物是例如一种双链siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如，一种前体，该前体例如一种可以被加工成ssiRNA化合物的较大的siRNA化合物、或一种编码siRNA化合物(例如一种双链siRNA化合物或ssiRNA化合物或其前体)的DNA)。“胶束”在此被定义为一种特定类型的分子组装体，其中两亲分子以一种球形结构排列以使得这些分子的全部疏水性部分指向内，使得亲水性部分与周围水相接触。如果环境是疏水性的，那么存在相反排列。
可以通过将siRNA组合物的一种水溶液、一种碱金属C8到C22烷基硫酸盐以及一种胶束形成化合物混合来制备适于通过经皮膜递送的一种混合胶束配制品。示例性胶束形成化合物包括卵磷脂、透明质酸、透明质酸的药学上可接受的盐、乙醇酸、乳酸、甘菊提取物、黄瓜提取物、油酸、亚油酸、亚麻酸、一油精、单油酸酯、单月桂酸酯、琉璃苣籽油、月见草油、薄荷醇、三羟基氧代胆烷基甘氨酸及其药学上可接受的盐、甘油、甘油聚合物、赖氨酸、聚赖氨酸、三油精、聚氧乙烯醚及其类似物、聚多卡醇(polidocanol)烷基醚及其类似物、鹅脱氧胆酸酯、脱氧胆酸酯及其混合物。可以在加入碱金属烷基硫酸盐的同时或之后加入胶束形成化合物。混合胶束将在成分的实质上任何种类混合但有力混合下形成，以便提供较小尺寸的胶束。
在一种方法中，制备一种第一胶束组合物，该胶束组合物包含siRNA组合物和至少碱金属烷基硫酸盐。然后将该第一胶束组合物与至少三种胶束形成化合物混合以形成一种混合胶束组合物。在另一种方法中，通过在有力混合下将siRNA组合物、碱金属烷基硫酸盐以及至少一种胶束形成化合物混合接着添加剩余胶束形成化合物来制备胶束组合物。
可以添加苯酚和/或间甲酚到混合胶束组合物以稳定化该配制品并且防止细菌生长。可替代地，可以将苯酚和/或间甲酚与胶束形成成分一起添加。还可以在该混合胶束组合物形成之后添加一种等渗剂，如甘油。
为了以喷雾形式递送该胶束配制品，可以将该配制品放在一个气雾剂分配器中并且将一种推进剂装入该分配器。在压力下的该推进剂在该分配器中呈液体形式。调节成分的比率以使得水相与推进剂相成为一体，即存在一个相。如果存在两个相，那么必须在例如通过一个定量阀分配一部分内含物之前震荡该分配器。分配的药剂的剂量被从该定量阀以一种精细喷雾形式推进。
推进剂可以包括含氢的氯氟碳化物、含氢的氟碳化合物、二甲醚以及乙醚。在某些实施例中，可以使用HFA134a(1，1，1，2四氟乙烷)。
可以通过相对直接的实验测定必需成分的具体浓度。为了通过口腔吸收，通常希望增加(例如至少双倍或三倍)用于通过注射或通过胃肠道给予的剂量。
颗粒。为了便于阐释，在这一部分很大程度上相对于修饰的siRNA化合物讨论了颗粒、配制品、组合物以及方法。然而，可以理解的是，可以用其他siRNA化合物(例如，未修饰的siRNA化合物)实践这些颗粒、配制品、组合物以及方法，并且这样的实践属于本发明。在另一个实施例中，一种siRNA化合物制剂可以被并入进一种颗粒(例如微颗粒)，该siRNA化合物是例如一种双链siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如，一种前体，该前体例如一种可以被加工成ssiRNA化合物的较大的siRNA化合物、或一种编码siRNA化合物(例如一种双链siRNA化合物或ssiRNA化合物或其前体)的DNA)。微粒可以通过喷雾干燥制造，但也可以通过其他方法(包括冻干、蒸发、流化床干燥、真空干燥或这些技术的一种组合)制造。
药物组合物
本发明的iRNA试剂可以被配制用于药物用途。药学上可接受的组合物包括一个治疗有效量的以上任一实施例中的dsRNA试剂中的一种或多种，单独使用或与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)、赋形剂和/或稀释剂配制在一起。
这些药物组合物可以被专门地配制用于以固体或液体形式给予，包括适于以下的形式：(1)口服给药，例如灌药(水性或非水性溶液或悬浮液)、片剂(例如靶向用于经颊、经舌下以及全身性吸收的片剂)、大丸剂、散剂、颗粒剂、用于施用到舌的糊剂；(2)不经肠给药，例如通过皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射，如例如一种无菌溶液或悬浮液或持续释放的配制品；(3)局部施用，例如以施用到皮肤的一种乳膏、软膏或一种控制释放的贴剂或喷雾剂形式；(4)阴道内或直肠内，例如以子宫托、乳膏或泡沫形式；(5)舌下；(6)经眼；(7)经皮；或(8)经鼻。使用皮下或静脉内方法递送可以是特别有利的。
如在此使用，短语“治疗有效量”意指一种化合物、材料或包括本发明的化合物的组合物的在适用于任何医学治疗的合理效益/风险比下在动物中的细胞的至少一个亚群中有效产生某些所希望的治疗效果的量。
短语“药学上可接受的”在此用以指位于正确医学判断的范围内、适于与人类和动物的组织接触而无过量毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症、与一个合理效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如在此使用，短语“药学上可接受的载体”意指参与将主题化合物从身体的一个器官或部位携载或运载到身体的另一个器官或部位的一种药学上可接受的材料、组合物或运载体，如一种液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如润滑剂、滑石镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌或硬脂酸)或溶剂囊封材料。每种载体必须在与该配制品的其他成分相容并且对患者无害的意义上是“可接受的”。可以充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖以及蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素以及乙酸纤维素；(4)粉末状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠以及滑石(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油以及大豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇以及聚乙二醇；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗生理盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；(22)膨胀剂，如多肽和氨基酸；(23)血清组分，如血清白蛋白、HDL以及LDL；以及(22)药物配制品中所用的其他无毒相容物质。
这些配制品可以方便地以单位剂量形式呈现并且可以通过配药学领域熟知的任何方法进行制备。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将取决于所治疗的宿主、具体给药方式而变化。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常将是产生治疗效果的化合物的量。通常，在百分之百中，这一量将在从约百分之0.1到约百分之九十九、优选从约百分之5到约百分之70、最优选从约百分之10到约百分之30活性成分的范围内。
在某些实施例中，一种本发明的配制品包括一种选自下组的赋形剂，该组由以下各项组成：环糊精、纤维素、脂质体、胶束形成剂(例如胆汁酸)以及聚合载体(例如聚酯和聚酸酐)；以及一种本发明的化合物。在某些实施例中，一种前述配制品使一种本发明的化合物变得经口生物可用。
iRNA试剂制剂可以与另一种试剂(例如另一种治疗剂或使iRNA稳定化的一种试剂(例如与iRNA复合以形成iRNP的一种蛋白质))组合配制。再其他试剂包括螯合剂(例如EDTA(例如以去除二价阳离子，如Mg2+))、盐、RNA酶抑制剂(例如一种广泛特异性RNA酶抑制剂，如RNAsin)等。
制备这些配制品或组合物的方法包括使得一种本发明的化合物与载体以及任选地一种或多种辅助成分缔合的步骤。通常，通过使得一种本发明的化合物与液体载体或细粉状固体载体或两者均匀并且紧密地缔合并且然后(必要时)使产物成形来制备这些配制品。
在一些情况下，为了延长一种药物的作用，令人希望的是减缓该药物从皮下或肌肉内注射的吸收。这可以通过使用具有不良水溶解度的结晶或非晶材料的一种液体悬浮液来实现。药物的吸收速率进而取决于其溶解速率，溶解速率反过来可以取决于晶体尺寸以及晶型。可替代地，不经肠给予的药物形式的延迟吸收通过将该药物溶解或悬浮在油性运载体中来实现。
可以通过从其他药物类推将根据本发明的化合物配制为用于以任何便利方式给药以在人类或兽医学中使用。
术语“治疗(treatment)”旨在还涵盖预防、治疗(therapy)以及治愈。接受这一治疗的患者通常是任何有需要的动物，包括灵长类动物(特别是人类)以及其他哺乳动物，如马、牛、猪和羊；以及家禽和宠物。
双链RNAi试剂体内地产生于细胞中，例如产生自被递送至该细胞中的外源DNA模板。例如，这些DNA模板可以被插入载体中并且被用作基因治疗载体。基因治疗载体可以通过例如静脉内注射、局部给予(美国专利号5,328,470)或通过定向性注射(参见例如Chen(陈)等人(1994)美国国家科学院院刊91：3054-3057)被递送至一个受试者。该基因治疗载体的药物制剂可以包括在一种可接受的稀释剂中的该基因治疗载体，或者可以包括一种该基因递送运载体被嵌入其中的缓释基质。这些DNA模板例如可以包括两个转录单位，一个产生包括了dsRNA试剂的顶链(top strand)的转录物，而一个产生包括了dsRNA试剂的底链(bottom strand)的转录物。当这些模板被转录时，该dsRNA试剂得以产生并且被加工成介导基因沉默的siRNA试剂片段。
递送途径
可以通过多种途径将一种包括iRNA的组合物递送至一位受试者。示例性途径包括：静脉内的、皮下的、局部的、直肠的、肛门的、阴道的、经鼻的、经肺的、经眼的。
可以将本发明的iRNA分子并入适于给予的药物组合物中。这样的组合物典型地包括一种或多种iRNA以及一种药学上可接受的载体。如在此所用，语言“药学上可接受的载体”旨在包括与药物给药相容的任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。将这样的介质和试剂用于药学上活性物质在本领域中是熟知的。除非在任何常规介质或试剂与该活性化合物不相容的情况下，否则涵盖其在这些组合物中的使用。补充性活性化合物也可以并入组合物中。
取决于希望局部还是全身性治疗以及取决于有待治疗的区域，可以将本发明的组合物以多种方式给予。给予可以是局部的(包括经眼的、阴道的、直肠的、鼻内的、经皮的)、口服的或不经肠的。不经肠给予包括静脉滴注，皮下的、腹膜内的或肌肉内的注射，或鞘内的或心室内的给予。
给予的途径与部位可以被选择为增强靶向。例如，为了靶向肌细胞，肌肉内注射进感兴趣的肌肉内将是一种合逻辑的选择。可以通过将iRNA以气雾剂形式给予来靶向肺细胞。可以通过用iRNA包衣一种气囊式导管并且机械地引入DNA来靶向血管内皮细胞。
剂量
在一个方面中，本发明的特征是一种向一位受试者(例如一位人类受试者)给予一种dsRNA试剂(例如一种siRNA试剂)的方法。该方法包括给予一个单位剂量的dsRNA试剂，例如一种siRNA试剂，例如以下双链siRNA试剂：(a)双链部分长14-30个核苷酸(nt)，例如21-23个nt，(b)与一种靶标RNA(例如一种内源或病原体靶标RNA)互补，并且任选地，(c)包括至少一个长1-5个核苷酸的3′突出端。在一个实施例中，该单位剂量小于10mg/kg的体重，或小于10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005或0.00001mg/kg的体重，并且小于200纳摩尔的RNA试剂(例如约4.4x1016个拷贝)/kg的体重，或小于1500、750、300、150、75、15、7.5、1.5、0.75、0.15、0.075、0.015、0.0075、0.0015、0.00075、0.00015纳摩尔的RNA试剂/kg的体重。
该确定的量可以是一个有效治疗或预防一种疾病或失调(例如一种与靶标RNA有关的疾病或失调)的量。该单位剂量例如可以通过注射(例如，静脉内的、皮下的或肌肉内的)、一个吸入剂量或一个局部施用来给予。在一些实施例中，剂量可以小于10、5、2、1或0.1mg/kg的体重。
在一些实施例中，该单位剂量以相比于每天一次不太频繁地给予，例如低于每2、4、8或30天一次。在另一个实施例中，该单位剂量不以一个频率给予(例如，一个不规律的频率)。例如，可以单次给予该单位剂量。
在一个实施例中，以其他传统的治疗形态给予该有效剂量。在一个实施例中，该受试者患有一种病毒感染并且该形态是一种抗病毒剂而非一种dsRNA试剂，例如而非一种siRNA试剂。在另一个实施例中，该受试者患有动脉硬化，而有效剂量的dsRNA试剂(例如，一种siRNA试剂)是例如在手术介入(例如血管成形术)之后组合给予。
在一个实施例中，给予一位受试者一个初始剂量的dsRNA试剂以及一个或多个维持剂量的dsRNA试剂，该dsRNA试剂是例如一种siRNA试剂(例如，一种前体，该前体例如一种可以被加工成siRNA试剂的较大的dsRNA试剂、或一种编码dsRNA试剂(例如一种siRNA试剂或其前体)的DNA)。该维持剂量或这些维持剂量与该初始剂量相比可以是相同或更低的，例如少一半的初始剂量。一种维持方案可以包括用从每天0.01μg到15mg/kg的体重范围内，例如每天10、1、0.1、0.01、0.001或0.00001mg/kg的体重的一个或多个剂量治疗该受试者。例如以至多每2、5、10或30天一次给予该维持剂量。此外，该治疗方案可以持续一段时间，该时间将取决于具体疾病的性质、其严重程度以及该患者的总体病状而变化。在某些实施例中，该剂量可以至多每天一次，例如至多每24、36、48或更多小时一次，例如至多每5或8天一次递送。治疗后，可以针对患者病症的变化并且针对疾病状态的症状的缓解对该患者进行监测。该化合物的剂量可以在该患者不显著响应于当前剂量水平的情况下增加，或者该剂量可以在观测到疾病状态的症状缓解时、在已经消除了疾病状态时或在观测到不希望的副作用时减少。
如在特定情况下适当希望或考虑的，该有效剂量能以一个单个剂量或以两个或更多个剂量给予。如果希望促进重复或频繁输注，那么可能可取的是植入一个递送装置，例如一个泵、半永久性支架(例如静脉内的、腹膜内的、脑池内的或囊内的)或储集器。
在一个实施例中，该组合物包括多个dsRNA试剂种类。在另一个实施例中，该dsRNA试剂种类具有相对于一种天然存在的靶序列与另一个种类不重叠且不相邻的序列。在另一个实施例中，该多个dsRNA试剂种类特异性针对不同的天然存在的靶基因。在另一个实施例中，该dsRNA试剂是等位基因特异性的。
在此描述的本发明的dsRNA试剂能以多种方式给予给哺乳动物，特别是大的哺乳动物，例如非人灵长类动物或人类。
在一个实施例中，该dsRNA试剂(例如一种siRNA试剂)组合物的给予是不经肠的，例如静脉内的(例如，作为一种团注剂或作为一种可扩散的输注)、皮内的、腹膜内的、肌肉内的、囊内的、心室内的、颅内的、皮下的、经粘膜的、经颊的、舌下的、内窥镜的、直肠的、口服的、阴道的、局部的、经肺的、鼻内的、尿道的或经眼的。可以由该受试者或由另一个人(例如，一位医疗服务人员)提供给予。可以按测量的剂量或以递送定量剂量的分配器提供该药剂。下面对选定的递送模式进行更详细地讨论。
本发明提供了用于直肠给予或递送在此描述的dsRNA试剂的方法、组合物以及试剂盒
抑制靶基因表达的方法
本发明的实施例还涉及用于抑制一种靶基因的表达的方法。该方法包括以足够抑制该靶基因的表达的量给予在以上任一实施例中的dsRNA试剂的步骤。
另一方面，本发明涉及一种调节细胞中的一种靶基因的表达的方法，该方法包括向所述细胞提供一种本发明的dsRNA试剂。在一个实施例中，该靶基因选自下组，该组由以下各项组成：因子VII、Eg5、PCSK9、TPX2、apoB、SAA、TTR、RSV、PDGFβ基因、Erb-B基因、Src基因、CRK基因、GRB2基因、RAS基因、MEKK基因、JNK基因、RAF基因、Erk1/2基因、PCNA(p21)基因、MYB基因、JUN基因、FOS基因、BCL-2基因、hepciden、活化蛋白C、细胞周期蛋白D基因、VEGF基因、EGFR基因、细胞周期蛋白A基因、细胞周期蛋白E基因、WNT-1基因、β-连环蛋白基因、c-MET基因、PKC基因、NFKB基因、STAT3基因、生存素基因、Her2/Neu基因、拓扑异构酶I基因、拓扑异构酶IIα基因、在p73基因中的突变、在p21(WAF1/CIP1)基因中的突变、在p27(KIP1)基因中的突变、在PPM1D基因中的突变、在RAS基因中的突变、在小窝蛋白I基因中的突变、在MIB I基因中的突变、在MTAI基因中的突变、在M68基因中的突变、在肿瘤抑制基因中的突变以及在p53肿瘤抑制基因中的突变。
本发明由以下实例进一步展示，这些实例不应被视为进一步限制性的。贯穿本申请引用的所有参考文献、未决专利申请和公开的专利的内容清楚地特此通过引用而结合。
实例
实例1.siRNA双链体的体外筛选
细胞培养和转染：
使人类Hep3B细胞或大鼠H.II.4.E细胞(ATCC，马纳萨斯(Manassas)，维吉尼亚州(VA))在37℃下在5％CO2的氛围中在补充有10％FBS、链霉素以及谷氨酰胺(ATCC)的RPMI(ATCC)中生长到接近汇合，随后通过胰蛋白酶化从板释放。通过添加14.8μl Opti-MEM加0.2μl脂染胺(Lipofectamine)RNAiMax/孔(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德(Carlsbad)加利福尼亚州(CA)，目录号13778-150)到5μl siRNA双链体/孔到一个96孔板中进行转染，并且在室温下孵育15分钟。然后添加不具有抗生素、包含约2x104个Hep3B细胞的80μl完全生长培养基到siRNA混合物。在RNA纯化之前，将细胞孵育24小时或120小时。在10nM和0.1nM最终双链体浓度下进行单个剂量实验，并且使用8、4倍连续稀释用10nM最终双链体浓度的最大剂量进行剂量反应实验。
使用DYNABEADS mRNA分离试剂盒(英杰公司，部件号：610-12)的 总RNA分离：
将细胞收获并溶解于150μl溶解/结合缓冲液中，然后使用一个Eppendorf热混合器在850rpm下混合5分钟(贯穿加工的搅拌速度相同)。添加十微升磁珠和80μl溶解/结合缓冲混合物到一个圆底板中并且混合1分钟。将磁珠使用磁性支座捕获，并且将上清液去除而不干扰珠粒。在去除上清液之后，将溶解的细胞添加到剩余珠粒中并且混合5分钟。在去除上清液之后，将磁珠用150μl洗涤缓冲液A洗涤2次并且混合1分钟。珠粒再次被捕获并且去除上清液。然后将珠粒用150μl洗涤缓冲液B洗涤，捕获，并且去除上清液。接着将珠粒用150μl洗脱缓冲液洗涤，捕获，并且去除上清液。允许珠粒干燥2分钟。在干燥之后，添加50μl洗脱缓中液，并且在70℃下混合5分钟。将珠粒捕获在磁体上持续5分钟。将40μl上清液去除，并且添加到另一个96孔板中。
使用ABI高容量cDNA反转录试剂盒(应用生物系统公司(Applied Biosystems)，福斯特市(Foster City)，加利福尼亚州，目录号4368813)进 行cDNA合成：
以每个反应1μl10X缓冲液、0.4μl25X dNTP、1μl随机引物、0.5μl反转录酶、0.5μl RNA酶抑制剂以及1.6μl H2O的主体混合物添加到5μl总RNA中。使用一个Bio-Rad C-1000或S-1000热循环器(赫苦斯(Hercules)，加利福尼亚州)通过以下步骤产生cDNA：25℃10min，37℃120min，85℃5sec，4℃保持。
实时PCR：
添加2μl cDNA到一个384孔板(罗氏(Roche)目录号04887301001)中的一种主体混合物中，该主体混合物包含0.5μl GAPDH TaqMan探针(应用生物系统公司，目录号4326317E(人类)目录号4308313(啮齿动物))、0.5μl TTR TaqMan探针(应用生物系统公司，目录号HS00174914_ml(人类)目录号Rn00562124_ml(大鼠))以及5μl Lightcycler480探针主体混合物(罗氏目录号04887301001)/孔。在一个罗氏LC480实时PCR机(罗氏)中进行实时PCR。除非另外说明，否则在至少两个独立转染中测试每种双链体，并且一式两份测定每个转染。
为了计算相对倍数变化，将实时数据使用ΔΔCt方法分析，并且相对于用10nM AD-1955转染的细胞或模拟转染的细胞进行的测定进行归一化。使用4参数拟合模型使用XLFit计算IC50，并且将IC50相对于在相同剂量范围内用AD-1955转染的细胞或原初细胞(cell)或相对于其自身最低剂量进行归一化。针对每个个别转染以及组合计算IC50，其中将一个单个IC50拟合到来自两个转染的数据。
本发明的具有不同基序修饰的示例性siRNA双链体的基因沉默的结果示于下表中。
实例2.RNA合成和双链体退火
1.寡核苷酸合成：
在一个AKTAoligopilot合成器或一个ABI394合成器上合成所有寡核苷酸。除非另外规定，否则将可商购的可控孔度玻璃固相支持体(dT-CPG， 普赖姆合成(Prime Synthesis))和具有标准保护基团的RNA亚磷酰胺5′-O-二甲氧基三苯甲基N6-苯甲酰基-2′-叔丁基二甲基硅烷基-腺苷-3′-O-N，N′-二异丙基-2-氰基乙基亚磷酰胺、5′-O-二甲氧基三苯甲基-N4-乙酰基-2′-叔丁基二甲基硅烷基-胞苷-3′-O-N，N′-二异丙基-2-氰基乙基亚磷酰胺、5′-O-二甲氧基三苯甲基-N2-异丁酰基-2′-叔丁基二甲基硅烷基-鸟苷-3′-O-N，N′-二异丙基-2-氰基乙基亚磷酰胺以及5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-叔丁基二甲基硅烷基-尿苷-3′-O-N，N′-二异丙基-2-氰基乙基亚磷酰胺(皮尔斯核酸技术(Pierce NucleicAcids Technologies))用于寡核苷酸合成。2′-F亚磷酰胺，5′-O-二甲氧基三苯甲基-N4-乙酰基-2′-氟代-胞苷-3′-O-N，N′-二异丙基-2-氰基乙基-亚磷酰胺和5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-氟代-尿苷-3′-O-N，N′-二异丙基-2-氰基乙基-亚磷酰胺购自(普洛麦格)。所有亚磷酰胺都以0.2M于乙腈(CH3CN)中的浓度使用，除鸟苷之外，鸟苷以0.2M于10％THF/ANC(v/v)中的浓度使用。使用16分钟的偶联/再循环时间。活化剂是5-乙基硫基四唑(0.75M，美国国际化学公司(American International Chemicals))，对于PO-氧化，使用碘/水/吡啶，并且对于PS-氧化，使用于2，6-二甲基吡啶/ACN(1∶1v/v)中的PADS(2％)。
使用包含相对应的配体的一个固相支持体合成配体结合的链。例如，通过用相对应的碳水化合物固相支持体开始合成来实现在一个序列的3′端处引入一个碳水化合物部分/配体(例如GalNAc)。类似地，通过在胆固醇支持体上开始合成来在3′端处引入一个胆固醇部分。通常，该配体部分经由如先前实例中所述的一个所选系拴物而系拴到反-4-羟基脯氨醇以获得一个羟基脯氨醇-配体部分。该羟基脯氨醇-配体部分然后经由一个琥珀酸酯接头偶联到一个固相支持体，或经由标准亚磷酸化条件转化为亚磷酰胺，以获得所希望的碳水化合物结合物结构单元。从相对应的亚磷酰胺或固相支持体(购自生物研究技术公司(Biosearch Technologies))合成荧光团标记的siRNA。内部制造的负载是38.6微摩尔/克的油烯基石胆酸(GalNAc)3聚合物支持体。还内部制造的负载是42.0微摩尔/克的甘露糖(Man)3聚合物支持体。
除非另外规定，否则通过使相对应的亚磷酰胺在标准亚磷酰胺偶联条件下偶联到正在生长的链来实现所选配体在所希望的位置处，例如在序列的5′端处的结合。0.1M亚磷酰胺于无水CH3CN中的溶液在5-(乙基硫基)-1H-四唑活化剂存在下与固体结合寡核苷酸进行延长的15min偶联。使用标准碘-水如报道(1)那样，或通过用叔丁基过氧化氢/乙腈/水(10∶87∶3)以10min氧化等待时间处理结合寡核苷酸，将核苷酸间亚磷酸酯氧化成磷酸酯。通过使用一种硫转移试剂(如DDTT(购自AM化学(AM Chemicals))、PADS和或博凯奇(Beaucage)试剂)将亚磷酸酯氧化为硫代磷酸酯来引入硫代磷酸酯。内部合成胆固醇亚磷酰胺，并且以0.1M于二氯甲烷中的浓度使用。胆固醇亚磷酰胺的偶联时间是16分钟。
2.去保护-I(核碱基去保护)
在完成合成之后，将支持体转移到一个100ml玻璃瓶(VWR)。将寡核苷酸从该支持体裂解，同时在55℃下用80mL乙醇氨的混合物[氨∶乙醇(3∶1)]使碱基和磷酸酯基团去保护6.5h。将该瓶在冰上简单冷却，并且然后将乙醇氨混合物过滤到一个新的250ml瓶中。将CPG用2×40mL份的乙醇/水(1∶1v/v)洗涤。然后通过旋转蒸发将该混合物的体积减少到约30ml。然后将该混合物在干冰上冷冻，并且在一个speed vac上在真空下干燥。
3.去保护-II(去除2′TBDMS基团)
将经干燥的残余物再悬浮于26ml三乙胺、三乙胺三氢氟化物(TEA.3HF)或吡啶-HF以及DMSO(3∶4∶6)中，并且在60℃下加热90分钟以去除2′位处的叔丁基二甲基硅烷基(TBDMS)基团。然后将该反应用50ml的20mM乙酸钠淬灭，并且将pH调节到6.5，并且储存于冷冻器中直到纯化。
4.分析
将寡核苷酸通过高效液相色谱(HPLC)分析，随后纯化，并且取决于序列和或结合的配体的性质来选择缓冲液和柱。
5.HPLC纯化
将配体结合的寡核苷酸通过反相制备型HPLC纯化。将未结合的寡核苷酸通过在一个内部填充的TSK凝胶柱上阴离子交换HPLC来纯化。缓冲液是10％CH3CN中的20mM磷酸钠(pH8.5)(缓冲液A)和10％CH3CN、1M NaBr中的20mM磷酸钠(pH8.5)(缓冲液B)。将含有全长寡核苷酸的部分合并，脱盐并冻干。将约0.15OD的脱盐的寡核苷酸在水中稀释到150μl，并且然后在专用小瓶中吸取用于CGE和LC/MS分析。最终通过LC-ESMS和CGE分析化合物。
6.siRNA准备
对于siRNA的制备，将等摩尔量的有义链和反义链在1x PBS中在95℃下加热5min并且缓慢冷却至室温。通过HPLC分析证实双链体的完整性。
实例3：TTR siRNA上的不同化学修饰的体外沉默活性
在Hep3B细胞中通过使用脂染胺RNAiMAX进行标准反转染来测定每种被修饰的siRNA的IC50。简言之，通过将5μLOpti-MEM与10μLOpti-MEM加0.5μL脂染胺RNAiMax/孔(英杰公司，卡尔斯巴德加利福尼亚州，目录号13778-150)一起添加到5μLsiRNA双链体/孔到一个96孔板中，并且在室温下孵育15-20分钟来进行反转染。在孵育之后，然后添加100μL不具有抗生素、包含12,000-15,000个Hep3B细胞的完全生长培养基到每个孔中。将细胞在37℃下在5％CO2的氛围中孵育24小时，随后溶解，并且通过bDNA(Quantigene)分析ApoB和GAPDH mRNA。针对IC50测定对从10nM到0.6pM范围内的七种不同的siRNA浓度进行评估，并且将ApoB转染的细胞的ApoB/GAPDH相对于10nM Luc siRNA转染的细胞进行归一化。
缩写 核苷酸
Af 2′-F-腺苷
Cf 2′-F-胞苷
Gf 2′-F-鸟苷
Uf 2′-F-尿苷
A 腺苷
C 胞苷
G 鸟苷
U 尿苷
a 2′-O-甲基腺苷
c 2′-O-甲基胞苷
g 2′-O-甲基鸟苷
u 2′-O-甲基尿苷
dT 2′-脱氧胸苷
s 硫代磷酸酯键
实例4：ANGPTL3siRNA上的不同化学修饰的体外沉默活性
细胞培养和转染
将Hep3B细胞(ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚州)在37℃下在5％CO2的氛围中在补充有10％FBS、链霉素以及谷氨酰胺(ATCC)的RPMI(ATCC)中生长到接近汇合，随后通过胰蛋白酶化从板释放。通过添加14.8μlOpti-MEM加0.2μl脂染胺RNAiMax/孔(英杰公司，卡尔斯巴德加利福尼亚州，目录号13778-150)到5μl siRNA双链体/孔到一个96孔板中进行转染，并且在室温下孵育15分钟。然后将不具有抗生素、包含约2x104个Hep3B细胞的80μl完全生长培养基添加到siRNA混合物。在RNA纯化之前，将细胞孵育24小时或120小时。除非另行说明，否则在10nM与0.1nM最终双链体浓度下进行单个剂量实验，并且在10、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005以及0.00001nM最终双链体浓度下进行剂量反应实验。
使用ABI高容量cDNA反转录试剂盒(应用生物系统公司，福斯特市，加利福尼亚州，目录号4368813)进行cDNA合成
以每个反应2μl10X缓冲液、0.8μl25X dNTP、2μl随机引物、1μl反转录酶、1μl RNA酶抑制剂以及3.2μl H2O的主体混合物添加到10μl总RNA中。使用一个Bio-Rad C-1000或S-1000热循环器(赫苦斯，加利福尼亚州)通过以下步骤产生cDNA：25℃10min，37℃120min，85℃5sec，4℃保持。
实时PCR
添加2μl cDNA到一个384孔板(罗氏，目录号04887301001)中的一种主体混合物中，该主体混合物包含0.5μl GAPDH TaqMan探针(应用生物系统公司，目录号4326317E)、0.5μl ANGPTL TaqMan探针(应用生物系统公司，目录号Hs00205581_m1)以及5μl Lightcycler480探针主体混合物(罗氏，目录号04887301001)/孔。实时PCR是在一个ABI7900HT实时PCR系统(应用生物系统公司)上使用ΔΔCt(RQ)测定来进行。除非在总结表中另外指出，否则在两个独立转染中测试每种双链体，并且一式两份测定每个转染。
为了计算相对倍数变化，将实时数据使用ΔΔCt方法分析，并且相对于用10nM AD-1955转染的细胞或模拟转染的细胞进行的测定进行归一化。使用4参数拟合模型使用XLFit计算IC50，并且将IC50相对于在相同剂量范围内用AD-1955转染的细胞或原初细胞进行归一化或相对于其自身最低剂量进行归一化。用作阴性对照的AD-1955序列靶向荧光素酶并且具有以下序列：
有义链：cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT；
反义链：UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT。
可以将上述不同实施例组合以提供另外的实施例。在本说明书中引用的所有美国专利、美国专利申请公开物、国外专利、国外专利申请以及非专利申请通过引用以其全文结合在此。必要时，可以修改这些实施例的方面，以利用不同专利、申请以及公开物的概念提供又另外的实施例。
可以根据以上详细说明对这些实施例作出这些以及其他改变。通常，在以下权利要求书中，使用的术语不应该被解释为将权利要求书限制为在本说明书中披露的具体实施例而应该将这些权利要求解释为包括所有可能的实施例连同这样的权利要求所要求的等效物的全部范围。因此，权利要求书不被该披露所限制。

Claims (46)

1.一种能够抑制一种靶基因的表达的双链RNAi试剂，包括有义链和反义链，每条链具有14到30个核苷酸，其中该双链体由式(III)表示：
有义链：5′np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3′
反义链：3′np ’-Na ’-(X’X′X′)k-Nb ’-Y′Y′Y′-Nb ’-(Z′Z′Z′)l-Na ’-nq ’5′
(III)
其中：
i、j、k以及l各自独立地是0或1；
p和q各自独立地是0-6；
每个Na和Na′独立地表示一个包括0-25个被修饰或者未被修饰或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包括至少两个不同修饰的核苷酸，每个Nb和Nb′独立地表示一个包括0-10个被修饰或者未被修饰或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np、np ’、nq以及nq ’独立地表示一个包括0-6个核苷酸的突出端核苷酸序列；并且
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′以及Z′Z′Z′各自独立地表示一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序；并且
其中Nb上的该修饰不同于Y上的该修饰并且Nb′上的该修饰不同于Y′上的该修饰。
2.如权利要求1所述的双链RNAi试剂，其中i是1；j是1；或i和j都是1。
3.如权利要求1所述的双链RNAi试剂，其中k是1；l是1；或k和l都是1。
4.如权利要求1所述的双链RNAi试剂，其中该YYY基序出现在该有义链的裂解位点处或附近。
5.如权利要求1所述的双链RNAi试剂，其中该Y′Y′Y′基序出现在该反义链的由5’端起的11、12以及13位处。
6.如权利要求5所述的双链RNAi试剂，其中该Y′是2′-OMe。
7.如权利要求1所述的双链RNAi试剂，其中式(III)被表示为式(IIIa)：
5′np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3′
3′np ’-Na ’-Y′Y′Y′-Nb ’-Z′Z′Z′-Na ’nq ’5′
(IIIa)
其中每个Nb和Nb′独立地表示一个包括1-5个被修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
8.如权利要求1所述的双链RNAi试剂，其中式(III)被表示为式(IIIb)：
5′np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq3′
3′np-Na-X′X′X′-Nb-Y′Y′Y′-Na-nq5′
(IIIb)
其中每个Nb和Nb′独立地表示一个包括1-5个被修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
9.如权利要求1所述的双链RNAi试剂，其中式(III)被表示为式(IIIc)：
5′np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3′
3′np-Na-X′X′X′-Nb-Y′Y′Y′-Nb-Z′Z′Z′-Na-nq5′
(IIIc)
其中每个Nb和Nb′独立地表示一个包括1-5个被修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，并且每个Na和Na′独立地表示一个包括2-10个被修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
10.如权利要求1所述的双链RNAi试剂，其中该双链体区具有17-30个核苷酸对长度。
11.如权利要求10所述的双链RNAi试剂，其中该双链体区具有17-19个核苷酸对长度。
12.如权利要求10所述的双链RNAi试剂，其中该双链体区具有27-30个核苷酸对长度。
13.如权利要求1所述的双链RNAi试剂，其中每条链具有17-30个核苷酸。
14.如权利要求1所述的双链RNAi试剂，其中在这些核苷酸上的这些修饰选自下组，该组由以下各项组成：LNA、HNA、CeNA、2′-甲氧基乙基、2′-O-烷基、2′-O-烯丙基、2′-C-烯丙基、2′-氟基、2′-脱氧及其组合。
15.如权利要求14所述的双链RNAi试剂，其中这些核苷酸被2′-OCH3或2′-F修饰。
16.如权利要求1所述的双链RNAi试剂，进一步包括至少一种配体。
17.如权利要求16所述的双链RNAi试剂，其中该配体是通过一种二价或三价支链接头附接的一种或多种GalNAc衍生物。
18.如权利要求1所述的双链RNAi试剂，其中在这些核苷酸上的这些修饰选自下组，该组由以下各项组成：2′-O-甲基核苷酸、2′-脱氧氟代核苷酸、2′-O-N-甲基乙酰胺基(2′-O-NMA)核苷酸、2′-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2′-O-DMAEOE)核苷酸、2′-O-氨基丙基(2′-O-AP)核苷酸、2′-ara-F及其组合。
19.如权利要求14所述的双链RNAi试剂，其中该配体附接到该有义链的3′端。
20.如权利要求1所述的双链RNAi试剂，进一步包括至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联。
21.如权利要求1所述的双链RNAi试剂，其中在该反义链中的该双链体的5′端的1位处的该核苷酸选自下组，该组由以下各项组成：A、dA、dU、U以及dT。
22.如权利要求1所述的双链RNAi试剂，其中在该双链体的5′端的1位处的该碱基对是一个AU碱基对。
23.如权利要求1所述的双链RNAi试剂，其中这些Y核苷酸包含一个2′-氟基修饰。
24.如权利要求1所述的双链RNAi试剂，其中这些Y′核苷酸包含一个2′-O-甲基修饰。
25.一种能够抑制一种靶基因的表达的双链RNAi试剂，包括有义链和反义链，每条链具有14到30个核苷酸，
其中该有义链包含至少两个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序，所述基序之一出现在该链内的裂解位点处并且所述基序中的至少一个出现在由至少一个核苷酸在该裂解位点处将其与该基序分开的该链的另一个部分处；并且
其中该反义链包含在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的至少第一基序，所述基序之一出现在该链内的裂解位点处或附近并且一个第二基序出现在由至少一个核苷酸将其与该第一基序分开的该链的另一个部分处；
其中出现在该有义链中的裂解位点处的该基序中的修饰不同于出现在该反义链的裂解位点处或附近的该基序中的修饰。
26.如权利要求25所述的双链RNAi试剂，其中出现在该有义链的裂解位点处的这些核苷酸中的至少一个与出现在该反义链的裂解位点处或附近的该基序中的这些核苷酸之一形成一个碱基对。
27.如权利要求25所述的双链RNAi试剂，其中该双链体具有17-30个核苷酸。
28.如权利要求25所述的双链RNAi试剂，其中该双链体具有17-19个核苷酸。
29.如权利要求25所述的双链RNAi试剂，其中每条链具有17-23个核苷酸。
30.如权利要求25所述的双链RNAi试剂，其中在这些核苷酸上的这些修饰选自下组，该组由以下各项组成：LNA、HNA、CeNA、2′-甲氧基乙基、2′-O-烷基、2′-O-烯丙基、2′-C-烯丙基、2′-氟基、2′-脱氧及其组合。
31.如权利要求30所述的双链RNAi试剂，其中在该核苷酸上的这些修饰是2′-OCH3或2′-F。
32.如权利要求31所述的双链RNAi试剂，进一步包括一种附接至该有义链的3′端的配体。
33.一种能够抑制一种靶基因的表达的双链RNAi试剂，包括有义链和反义链，每条链具有14到30个核苷酸，
其中该有义链包含至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2′-F修饰的基序，所述基序之一出现在该链中的裂解位点处或附近；并且
其中该反义链包含至少一个在三个连续核苷酸上具有三个2′-O-甲基修饰的基序，所述基序之一出现在该裂解位点处或附近。
34.如权利要求33所述的双链RNAi试剂，其中该有义链包括一个或多个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序，所述基序出现在由至少一个核苷酸将其与在该裂解位点处的该三个2′-F修饰分开的该链的另一个部分处。
35.如权利要求33所述的双链RNAi试剂，其中该反义链包括一个或多个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序，所述基序出现在由至少一个核苷酸将其与该三个2′-O-甲基修饰分开的该链的另一个部分处。
36.如权利要求33所述的双链RNAi试剂，其中具有一个2′-F修饰的这些核苷酸中的至少一个与具有一个2′-O-甲基修饰的这些核苷酸之一形成一个碱基对。
37.如权利要求33所述的双链RNAi试剂，其中该双链体具有17-30个核苷酸对长度。
38.如权利要求33所述的双链RNAi试剂，其中该双链体具有17-19个核苷酸对长度。
39.如权利要求33所述的双链RNAi试剂，其中每条链具有17-23个核苷酸。
40.如权利要求33所述的双链RNAi试剂，进一步包括一种附接至该有义链的3′端的配体。
41.一种药物组合物，包括单独的或与一种药学上可接受的载体或赋形剂组合的根据以上权利要求中任一项所述的双链RNAi试剂。
42.一种用于抑制一种靶基因的表达的方法，包括以一个足够抑制该靶基因的表达的量给予根据以上权利要求中任一项所述的双链RNAi试剂的步骤。
43.如权利要求42所述的方法，其中通过皮下的或静脉内的给药给予该双链RNAi试剂。
44.一种通过给予所述dsRNA试剂来向一位受试者的特定靶标递送多核苷酸的方法，所述dsRNA试剂由式(III)表示：
有义链：5′np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3′
反义链：3′np′-Na′-(X’X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na ’-nq′5′
(III)
其中：
i、j、k以及l各自独立地是0或1；
p和q各自独立地是0-6；
每个Na和Na′独立地表示一个包括0-25个被修饰或者未被修饰或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包括至少两个不同修饰的核苷酸，每个Nb和Nb′独立地表示一个包括0-10个被修饰或者未被修饰或其组合的核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np、np′、nq以及nq′独立地表示一个包括0-6个核苷酸序列的突出端核苷酸序列；并且
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′以及Z′Z′Z′各自独立地表示一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序；并且
其中Nb上的这些修饰不同于Y上的该修饰并且Nb′上的该修饰不同于Y′上的该修饰。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述给予步骤通过一种包括以下各项的给予手段进行：肌肉内的、支气管内的、胸膜内的、腹膜内的、动脉内的、经淋巴的、静脉内的、皮下的、脑脊髓的或其组合。
46.一种用于向一位受试者的特定靶标递送一种多核苷酸的方法，该方法包括：通过皮下给予将根据权利要求1所述的dsRNA试剂递送进该受试者，以使得该多核苷酸被递送至该受试者的特定靶标。
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