RS57418B1 - Serpina1 irnk sastavi i postupci njihove primene - Google Patents

Serpina1 irnk sastavi i postupci njihove primene

Info

Publication number
RS57418B1
RS57418B1 RS20180778A RSP20180778A RS57418B1 RS 57418 B1 RS57418 B1 RS 57418B1 RS 20180778 A RS20180778 A RS 20180778A RS P20180778 A RSP20180778 A RS P20180778A RS 57418 B1 RS57418 B1 RS 57418B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
nucleotides
rnai agent
antisense strand
nucleotide
Prior art date
Application number
RS20180778A
Other languages
English (en)
Inventor
Alfica Sehgal
Klaus Charisse
Brian Bettencourt
Martin Maier
Kallanthottathil G Rajeev
Gregory Hinkle
Muthiah Manoharan
Original Assignee
Alnylam Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alnylam Pharmaceuticals Inc filed Critical Alnylam Pharmaceuticals Inc
Publication of RS57418B1 publication Critical patent/RS57418B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/712—Nucleic acids or oligonucleotides having modified sugars, i.e. other than ribose or 2'-deoxyribose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/331—Universal or degenerate base
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/332—Abasic residue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/343—Spatial arrangement of the modifications having patterns, e.g. ==--==--==--
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/344—Position-specific modifications, e.g. on every purine, at the 3'-end
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/34—Allele or polymorphism specific uses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity
    • C12N2320/51—Methods for regulating/modulating their activity modulating the chemical stability, e.g. nuclease-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Opis
[0001] Serpina1 kodira alfa-1-antitripsin koji pretežno kompleksuje i inhibira aktivnost neutrofilne elastaze proizvedene od hepatocita, mononuklearnih monocita, alveolarnih makrofaga, enterocita i mijeloidnih ćelija. Pacijenti koji imaju varijacije u jednoj ili obe kopije Serpina1 gena mogu patiti od deficita alfa-1-antitripsina i pod rizikom su od nastanka plućne emfizeme i/ili hroničnog oboljenja jetre zbog veće od normalne aktivnosti elastaze u plućima i jetri.
[0002] Kod pogođenih pacijenata, nedostatak alfa-1-antitripsina je nedostatak funkcionalnog alfa-1-antitripsina divljeg tipa. U nekim slučajevima, pacijent koji ima varijaciju u jednoj ili obe kopije Serpina1 gena nosi null alel. U drugim slučajevima, pacijent koji ima varijaciju u jednoj ili obe kopije Serpina1 gena nosi defektan alel.
[0003] Na primer, pacijent koji ima deficijentni alel od Serpina1, kao što je PIZ alel, može proizvesti neispravne proteine koji se ne mogu pravilno transportovati sa mesta sinteze na mesto delovanja unutar tela. Takvi pacijenti su obično pod rizikom razvoja bolesti pluća i/ili jetre. Pacijenti koji imaju Serpina1 null alel, kao što je PINULL (Granite Falls), obično su samo pod tizikom od razvoja bolesti pluća.
[0004] Bolest jetre koja je posledica deficita alfa-1 antitripsina rezultat je varijanti oblika alfa-1-antistipsina koje se proizvode u ćelijama jetre koji su nepravilno savijeni i zato se ne mogu lako transportovati iz ćelija. Ovo dovodi do nastanka nepravilnog proteina u ćelijama jetre i može uzrokovati jednu ili više bolesti ili poremećaja jetre uključujući, ali ne ograničavajući se na, hroničnu bolest jetre, upalu jetre, cirozu, fibrozu jetre i/ili hepatocelularni karcinom.
[0005] Trenutno postoje veoma ograničene opcije za lečenje pacijenata sa bolestima jetre koje prouzrokuje nedostatak alfa-1-antitripsina, uključujući vakcinaciju protiv hepatitisa, pomoćnu negu i izbegavanje štetnih agenasa (npr., alkohol i NSAID). Iako je na raspolaganju zamenska alfa-1-antitripsin terapija, takvo lečenje nema uticaj na bolesti jetre kod ovih pacijenata, iako transplantacija jetre može biti delotvorna, to je teška, skupa i rizična procedura, a organi jetre nisu lako dostupni.
[0006] Shodno tome, u struci postoji potreba za efikasnim tretmanima za bolesti povezane sa Serpina1, kao što su hronična bolest jetre, upala jetre, ciroza, fibroza jetre i/ili hepatocelularni karcinom.
[0007] Predmetni pronalazak je definisan patentnih zahtevima. Posebno, odnosi se na dvolančani RNKi agens za inhibiranje eksprimiranja Serpina1 u ćeliji,
gde navedeni dvolančani RNKi agens obuhvata smisao lanac i antismisao lanac koji formiraju dvolančanu regiju,
gde navedeni smisao lanac obuhvata barem 15 susednih nukleotida koji se ne razlikuju po više od 3 nukleotida bilo koje nukleotidne sekvence od SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, ili SEQ ID NO:11, i navedeni antismisao lanac obuhvata barem 15 susednih nukleotida koji se ne razlikuju po više od 3 nukleotida bilo koje nukleotidne sekvence od SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, ili SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, ili SEQ ID NO:25,
gde značajno svi nukleotidi navedenog smisao lanca sadrže modifikaciju izabranu iz grupe koju čine 2'-O-metil modifikacija i 2'-fluoro modifikacija,
gde navedeni smisao lanac obuhvata dve fosforotioatne internukleotidne veze na 5'-terminusu,
gde značajno svi nukleotidi navedenog antismisao lanca sadrže modifikaciju izabranu iz grupe koju čine 2'-O-metil modifikacija i 2'-fluoro modifikacija,
gde navedeni antismisao lanac obuhvata dve fosforotioatne internukleotidne veze na 5'-terminusu i dve fosforotioatne internukleotidne veze na 3'-terminusu,
gde je navedeni smisao lanac konjugovan za jedan ili više GalNAc derivat vezan kroz razgranati bivalentni ili trivalentni veznik na 3'-terminusu, gde „značajno svi“ nukleotidi su modifikovani znači da nema više od 5, 4, 3, 2 ili 1 nukleotida koji nisu modifikovani.
[0008] Kao što je detaljnije opisano u nastavku, ovde su opisani sastavi koji sadrže agense, npr., jednolančani i dvolančani polinukleotidi, npr., RNKi agensi, npr., dvolančani iRNK agensi, koji ciljaju Serpina1. Takođe su obelodanjeni postupci koji koriste sastave pronalaska za inhibiranje eksprimiranje Serpina1 i za lečenje bolesti povezanih sa Serpina1, npr., hronično oboljenje jetre, zapaljenje jetre, ciroza, fibroza jetre i/ili hepatocelularni karcinom.
[0009] Shodno tome, u jednom aspektu, predmetno obelodanjenje pruža dvolančane RNKi agense za inhibiranje eksprimiranja Serpina1 u ćeliji. Dvolančani RNKi agensi obuhvataju smisao lanac i antismisao lanac koji formiraju dvolančanu regiju, gde smisao lanac obuhvata barem 15 susednih nukleotida koji se ne razlikuju po više od 3 nukleotida bilo koje nukleotidne sekvence od SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, ili SEQ ID NO:11, i antismisao lanac obuhvata barem 15 susednih nukleotida koji se ne razlikuju po više od 3 nukleotida bilo koje nukleotidne sekvence od SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, ili SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, ili SEQ ID NO:25,
gde su značajno svi nukleotidi smisao lanca i značajno svi nukleotidi antismisao lanca modifikovani nukleotidi, i gde je smisao lanac konjugovan za ligand vezan na 3'-terminusu.
[0010] U jednoj implementaciji, jedna od 3 nukleotidne razlike u nukleotidnoj sekvenci antismisao lanca je nukleotidna neusklađenost u semenskoj regiji antismisao lanca. U jednom otelotvorenju, antismisao lanac sadrži univerzalnu bazu na neusklađenom nukleotidu.
[0011] U jednoj implementaciji, svi nukleotidi smisao lanca i svi nukleotidi antismisao lanca su modifikovani nukleotidi.
[0012] U jednoj implementaciji, smisao i antismisao lanac sadrže regiju komplementarnosti koja obuhvata najmanje 15 susednih nukleotida koji se razlikuju za ne više od 3 nukleotida od bilo koje od sekvenci navedenih u bilo kojoj od Tabela 1, 2, 5, 7, 8 i 9.
[0013] U jednoj implementaciji, bar jedan od modifikovanih nukleotida je izabran iz grupe koju čine 3'-terminalni dezoksi-timin (dT) nukleotid, 2'-O-metil modifikovani nukleotid, 2'-fluoro modifikovani nukleotid, a 2'-dezoksi-modifikovani nukleotid, zaključani nukleotid, abazni nukleotid, 2'-amino-modifikovani nukleotid, 2'-alkil-modifikovani nukleotid, morfolinski nukleotid, fosforamidat, ne-prirodna baza koja sadrži nukleotid, nukleotida koji sadrži 5'-fosforotioatnu grupu, i terminalni nukleotid povezan sa derivatom holesterila ili dodekanoinska kiselina bisdecilamidnom grupom.
[0014] U jednoj implementaciji, najmanje jedan lanac sadrži 3' prepust od najmanje 1 nukleotida.
[0015] U drugoj implementaciji, najmanje jedan lanac sadrži 3' prepust od najmanje 2 nukleotida.
[0016] U drugom aspektu, predmetno obelodanjenje pruža RNKi agense, npr., dvolančane RNKi agense, sposobne za inhibiranje Serpina1 u ćeliji, gde dvolančani RNKi agens obuhvata smisao lanac značajno komplementaran antismisao lancu, gde antismisao lanac obuhvata regiju značajno komplementarnu delu mRNK koji kodira Serpina1, gde je svaki lanac otprilike 14 do oko 30 nukleotidi dugačak, gde je dvolančani RNKi agens predstavljen formulom (III):
Smisao: 5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3'
Antismisao: 3'np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5' (III)
gde:
i, j, k, i l su svaki nezavisno 0 ili 1;
p, p', q, i q' su svaki nezavisno 0-6;
svaki Nai Na' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 0-25 nukleotida koji su bilo modifikovani ili nemodifikovani ili njihove kombinacije, gde svaka sekvenca obuhvata barem dva različito modifikovana nukleotida;
svaki Nbi Nb' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 0-10 nukleotida koji su bilo modifikovani ili nemodifikovani ili njihove kombinacije; svaki np, np', nq, i nq', od kojih svaki može ali ne mora da bude prisutan, nezavisno predstavljaju nespareni nukleotid;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', i Z'Z'Z' svaki nezavisno predstavlja jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida;
modifikacije na Nbrazlikuju se od modifikacija na Y i modifikacije na Nb' razlikuju se od modifikacija na Y'; i
gde je smisao lanac konjugovan na barem jedan ligand.
[0017] U jednoj implementaciji, Na' obuhvata 1-25 nukleotida, i gde je jedan od 1-25 nukleotida na jednom od položaja 2-9 od 5'kraja neusklađen nukleotid. U jednoj implementaciji, neusklađena baza je univerzalna baza.
[0018] U jednoj implementaciji, i je 0; j je 0; i je 1; j je 1; oba od i i j su 0; ili oba od i i j su 1. U drugoj implementaciji, k je 0; l je 0; k je 1; l je 1; oba od k i l su 0; ili oba od k i l su 1.
[0019] U jednoj implementaciji, XXX je komplementaran sa X'X'X', YYY je komplementaran sa Y'Y'Y', i ZZZ je komplementaran sa Z'Z'Z'.
[0020] U jednoj implementaciji, YYY motiv se javlja na ili blizu mesta cepanja smisao lanca.
[0021] U jednoj implementaciji, Y'Y'Y' motiv se javlja na 11, 12 i 13 položajima antismisao lanca od 5'-kraja.
[0022] U jednoj implementaciji, Y' je 2'-O-metil.
[0023] U jednoj implementaciji, formula (III) je predstavljena formulom (IIIa):
smisao: 5' np-Na-YYY-Na-nq3'
antismisao: 3' np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-nq'5' (IIIa).
[0024] U drugoj implementaciji, formula (III) je predstavljena formulom (IIIb):
smisao: 5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3'
antismisao: 3' np'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na'-nq'5' (IIIb) gde svaki Nbi Nb' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 1-5 modifikovana nukleotida.
[0025] In yet another implementation, formula (III) je predstavljena formulom (IIIc): smisao: 5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq3'
antismisao: 3' np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-nq'5' (IIIc) gde svaki Nbi Nb' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 1-5 modifikovana nukleotida.
[0026] U jednoj implementaciji, formula (III) je predstavljena formulom (IIId):
smisao: 5' np-Na-XXX-Nb-Y YY-Nb-ZZZ-Na-nq3'
antismisao: 3' np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na'-nq'5' (IIId) gde svaki Nbi Nb' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 1-5 modifikovanih nukleotida i svaki Nai Na' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 2-10 modifikovana nukleotida.
[0027] U jednoj implementaciji, dvolančana regija je dužine 15-30 nukleotidnih parova. U drugoj implementaciji, dvolančana regija je dužine 17-23 nukleotidnih parova. U još jednoj implementaciji, dvolančana regija je dužine 17-25 nukleotidnih parova. U jednoj implementaciji, dvolančana regija je dužine 23-27 nukleotidnih parova. U drugoj implementaciji, dvolančana regija je dužine 19-21 nukleotidnih parova. U drugoj implementaciji, dvolančana regija je dužine 21-23 nukleotidnih parova. U jednoj implementaciji, svaka ćelija ima 15-30 nukleotida. U sledećem otelotvorenju, svaka ćelija ima 19-30 nukleotida.
[0028] U jednoj implementaciji modifikacije na nukleotidima se biraju iz grupe koju čine LNK, HNA, CeNA, 2'-metoksietil, 2'-O-alkil, 2'-O-alil, 2'-C-alil, 2' -fluoro, 2'-dezoksi, 2'-hidroksil i njihove kombinacije. U drugoj implementaciji, modifikacije na nukleotidima su 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije.
[0029] U jednoj implementaciji, ligand je jedan ili više derivata GalNAc vezanih preko dvovalentnog ili trivalentnog razgranatog veznika. U sledećem otelotvorenju, ligand je
[0030] U jednoj implementaciji, ligand je vezan za 3' kraj smisao lanca.
[0031] U jednoj implementaciji, RNKi agens je konjugovan sa ligandom kao što je prikazano na sledećem šematskom prikazu
gde X je O ili S. U specifičnoj implementaciji, X je O.
[0032] U jednoj implementaciji, agens dalje sadrži najmanje jedan internukleotidnu vezu između fosforotioata ili metilfosfonata.
[0033] U jednoj implementaciji, veza između fosforotioat ili metilfosfonat internukleotida je na 3'-terminusu jednog lanca. U jednoj implementaciji, lanac je antismisao lanac. U drugoj implementaciji, lanac je smisao lanac.
[0034] U jednoj implementaciji, veza između fosforotioata ili metilfosfonata internukleotida je na 5'-terminusu jednog lanca. U jednoj implementaciji, lanac je antismisao lanac. U još jednom otelotvorenju, lanac je smisao lanac.
[0035] U jednoj implementaciji, veza između fosforotioata ili metilfosfonata internukleotida je na oba od 5'- i 3'-terminusa jednog lanca. U jednoj implementaciji, lanac je antismisao lanac.
[0036] U jednoj implementaciji, RNKi agens sadrži 6-8 fosforotioatnih internukleotidnih veza. U jednoj implementaciji, antismisao lanac sadrži dve fosforotioatne internukleotidne veze na 5'-terminusu i dve fosforotioatne internukleotidne veze na 3'-terminusu, i smisao lanac sadrži najmanje dve fosforotioatne internukleotidne veze na bilo kom od 5'-terminusa ili 3'-terminusa.
[0037] U jednoj implementaciji, bazni par na položaju 1 na 5'-kraju antismisao lanca dupleksa je AU bazni par.
[0038] U jednoj implementaciji, Y nukleotidi sadrže 2'-fluoro modifikaciju.
[0039] U jednoj implementaciji, Y' nukleotidi sadrže 2'-O-metil modifikaciju.
[0040] U jednoj implementaciji, p'> 0. U drugom otelotvorenju, p'= 2.
[0041] U jednoj implementaciji, q'=0, p=0, q=0, i p' nespareni nukleotidi su komplementarni ciljanoj mRNI. U drugoj implementaciji, q'=0, p=0, q=0, i p' nespareni nukleotidi nisu komplementarni ciljanoj mRNI.
[0042] U jednoj implementaciji, smisao lanac imaju ukupno 21 nukleotid, a antismisao lanac ima ukupno 23 nukleotida.
[0043] U jednoj implementaciji, bar jedan np' povezan je sa susednim nukleotidom preko fosforotioatne veze.
[0044] U jednoj implementaciji, svi np' povezani su susednim nukleotidima preko fosforotioatnih veza.
[0045] U jednoj implementaciji, RNKi agens je izabran iz grupe RNKi agenasa navedenih u bilo kojoj od Tabela 1, 2, 5, 7, 8 i 9.
[0046] U jednoj implementaciji, RNKi agens je izabran iz grupe koju čine AD-58681, AD-59054, AD-61719, i AD-61444.
U drugom aspektu, predmetni pronalazak pruža dvolančani RNKi agens za inhibiranje eksprimiranja Serpina1 u ćeliji, gde dvolančani RNKi agens obuhvata smisao lanac i antismisao lanac koji formiraju dvolančanu regiju, gde smisao lanac obuhvata barem 15 susednih nukleotida koji se ne razlikuju po više od 3 nukleotida bilo koje nukleotidne sekvence od SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, ili SEQ ID NO:11, i antismisao lanac obuhvata barem 15 susednih nukleotida koji se ne razlikuju po više od 3 nukleotida bilo koje nukleotidne sekvence od SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, ili SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, ili SEQ ID NO:25, gde značajno svi nukleotidi smisao lanca sadrže modifikaciju izabranu iz grupe koju čine 2'-O-metil modifikacija i 2'-fluoro modifikacija, gde smisao lanac obuhvata dve fosforotioatne internukleotidne veze na 5'-terminusu, gde značajno svi nukleotidi antismisao lanca sadrže modifikaciju izabranu iz grupe koju čine 2'-O-metil modifikacija i 2'-fluoro modifikacija, gde antismisao lanac obuhvata dve fosforotioatne internukleotidne veze na 5'-terminusu i dve fosforotioatne internukleotidne veze na 3'-terminusu, gde je smisao lanac konjugovan na jedan ili više GalNAc derivat vezan kroz razgranati bivalentni ili trivalentni veznik na 3'-terminusu, i gde „značajno svi“ nukleotidi su modifikovani znači da nema više od 5, 4, 3, 2 ili 1 nukleotida koji nisu modifikovani.
[0047] U jednom aspektu, jedna od 3 nukleotidne razlike u nukleotidnoj sekvenci antismisao lanca je nukleotidna neusklađenost u semenskoj regiji antismisao lanca. U jednom aspektu, antismisao lanac sadrži univerzalnu bazu na neusklađenom nukleotidu.
[0048] U jednom aspektu, svi nukleotidi pomenutog smisao lancu i svi nukleotidi pomenutog antismisao lanca sadrže modifikaciju.
[0049] U drugom aspektu, predmetno obelodanjenje pruža RNKi agense, npr., dvolančane RNKi agense, sposobne za inhibiranje Serpina1 u ćeliji, gde dvolančani RNKi agens obuhvata smisao lanac značajno komplementaran antismisao lancu, gde antismisao lanac obuhvata regiju značajno komplementarnu delu mRNK koji kodira Serpina1, gde je svaki lanac otprilike 14 do oko 30 nukleotida dugačak, gde je dvolančani RNKi agens predstavljen formulom (III):
smisao: 5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3'
antismisao: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-YY'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5' (III) gde:
i, j, k, i l su svaki nezavisno 0 ili 1;
p, p', q, i q' su svaki nezavisno 0-6;
svaki Nai Na' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 0-25 nukleotida koji su bilo modifikovani ili nemodifikovani ili njihove kombinacije, gde svaka sekvenca obuhvata barem dva različito modifikovana nukleotida;
svaki Nbi Nb' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 0-10 nukleotida koji su bilo modifikovani ili nemodifikovani ili njihove kombinacije;
1
svaki np, np', nq, i nq', od kojih svaki može ali ne mora da bude prisutan nezavisno predstavljaju nespareni nukleotid;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', i Z'Z'Z' svaki nezavisno predstavlja jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, i gde su modifikacije 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije;
modifikacije na Nbrazlikuju se od modifikacija na Y i modifikacije na Nb' razlikuju se od modifikacija na Y'; i
gde je smisao lanac konjugovan na barem jedan ligand.
[0050] U još jednom aspektu, predmetno obelodanjenje pruža RNKi agense, npr., dvolančane RNKi agense, sposobne za inhibiranje Serpina1 u ćeliji, gde dvolančani RNKi agens obuhvata smisao lanac značajno komplementaran antismisao lancu, gde antismisao lanac obuhvata regiju značajno komplementarnu delu mRNK koji kodira Serpina1, gde je svaki lanac otprilike 14 do oko 30 nukleotida dugačak, gde je dvolančani RNKi agens predstavljen formulom (III):
smisao: 5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3'
antismisao: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5' (III) gde:
i, j, k, i l su svaki nezavisno 0 ili 1;
svaki np, nq, i nq', od kojih svaki može ali ne mora da bude prisutan, nezavisno predstavljaju nespareni nukleotid;
p, q, i q' su svaki nezavisno 0-6;
np' >0 i barem jedan np' je vezan za susedni nukleotid putem fosfortioatne veze; svaki Nai Na' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 0-25 nukleotida koji su bilo modifikovani ili nemodifikovani ili njihove kombinacije, gde svaka sekvenca obuhvata barem dva različito modifikovana nukleotida;
svaki Nbi Nb' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 0-10 nukleotida koji su bilo modifikovani ili nemodifikovani ili njihove kombinacije; XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', i Z'Z'Z' svaki nezavisno predstavlja jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, i gde su modifikacije 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije;
modifikacije na Nbrazlikuju se od modifikacija na Y i modifikacije na Nb' razlikuju se od modifikacija na Y'; i
gde je smisao lanac konjugovan na barem jedan ligand.
[0051] U daljem aspektu, predmetno obelodanjenje pruža RNKi agense, npr., dvolančane RNKi agense, sposobne za inhibiranje Serpina1 u ćeliji, gde dvolančani RNKi agens obuhvata smisao lanac značajno komplementaran antismisao lancu, gde antismisao lanac obuhvata regiju značajno komplementarnu delu mRNK koji kodira Serpina1, gde je svaki lanac otprilike 14 do oko 30 nukleotida dugačak, gde je dvolančani RNKi agens predstavljen formulom (III):
smisao: 5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3'
antismisao: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')1-Na'-nq' 5' (III) gde:
i, j, k, i l su svaki nezavisno 0 ili 1;
svaki np, nq, i nq', od kojih svaki može ali ne mora da bude prisutan, nezavisno predstavljaju nespareni nukleotid;
p, q, i q' su svaki nezavisno 0-6;
np' >0 i barem jedan np' je vezan za susedni nukleotid putem fosfortioatne veze; svaki Nai Na' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 0-25 nukleotida koji su bilo modifikovani ili nemodifikovani ili njihove kombinacije, gde svaka sekvenca obuhvata barem dva različito modifikovana nukleotida;
svaki Nbi Nb' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 0-10 nukleotida koji su bilo modifikovani ili nemodifikovani ili njihove kombinacije; XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', i Z'Z'Z' svaki nezavisno predstavlja jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, i gde su modifikacije 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije;
modifikacije na Nbrazlikuju se od modifikacija na Y i modifikacije na Nb' razlikuju se od modifikacija na Y'; i
gde je smisao lanac konjugovan na barem jedan ligand, gde je ligand jedan ili više GalNAc derivat vezan kroz bivalentni ili trivalentni razgranati veznik.
[0052] U drugom aspektu, predmetno obelodanjenje pruža RNKi agense, npr., dvolančane RNKi agense sposobne za inhibiranje Serpina1 u ćeliji, gde dvolančani RNKi agens obuhvata smisao lanac značajno komplementaran antismisao lancu, gde antismisao lanac obuhvata regiju značajno komplementarnu delu mRNK koji kodira Serpina1, gde je svaki lanac otprilike 14 do oko 30 nukleotida dugačak, gde je dvolančani RNKi agens predstavljen formulom (III):
smisao: 5' np-Na-(X XX) i-Nb-Y YY -Nb-(Z ZZ)j-Na-nq, 3'
antismisao: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5' (III) gde:
i, j, k, i l su svaki nezavisno 0 ili 1;
svaki np, nq, i nq', od kojih svaki može ali ne mora da bude prisutan, nezavisno predstavljaju nespareni nukleotid;
p, q, i q' su svaki nezavisno 0-6;
np' >0 i barem jedan np' je vezan za susedni nukleotid putem fosfortioatne veze; svaki Nai Na' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 0-25 nukleotida koji su bilo modifikovani ili nemodifikovani ili njihove kombinacije, gde svaka sekvenca obuhvata barem dva različito modifikovana nukleotida;
svaki Nbi Nb' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 0-10 nukleotida koji su bilo modifikovani ili nemodifikovani ili njihove kombinacije; XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', i Z'Z'Z' svaki nezavisno predstavlja jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, i gde su modifikacije 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije;
modifikacije na Nbrazlikuju se od modifikacija na Y i modifikacije na Nb' razlikuju se od modifikacija na Y';
gde smisao lanac obuhvata barem jedan fosforotioat veznik; i
gde je smisao lanac konjugovan na barem jedan ligand, gde je ligand jedan ili više GalNAc derivat vezan kroz bivalentni ili trivalentni razgranati veznik.
[0053] U još jednom aspektu, predmetno obelodanjenje pruža RNKi agense, npr., dvolančane RNKi agense, sposobne za inhibiranje Serpina1 u ćeliji, gde dvolančani RNKi agens obuhvata smisao lanac značajno komplementaran antismisao lancu, gde antismisao lanac obuhvata regiju značajno komplementarnu delu mRNK koji kodira Serpina1, gde je svaki lanac otprilike 14 do oko 30 nukleotida dugačak, gde je dvolančani RNKi agens predstavljen formulom (III):
smisao: 5' np-Na-YYY-Na-nq3'
antismisao: 3' np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-nq' 5' (IIIa) gde:
svaki np, nq, i nq', od kojih svaki može ali ne mora da bude prisutan, nezavisno predstavljaju nespareni nukleotid;
p, q, i q' su svaki nezavisno 0-6;
1
np' >0 i barem jedan np' je vezan za susedni nukleotid putem fosfortioatne veze; svaki Nai Na' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 0-25 nukleotida koji su bilo modifikovani ili nemodifikovani ili njihove kombinacije, gde svaka sekvenca obuhvata barem dva različito modifikovana nukleotida;
YYY i Y'Y'Y' svaki nezavisno predstavlja jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, i gde su modifikacije 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije; gde smisao lanac obuhvata barem jedan fosforotioat veznik; i
gde je smisao lanac konjugovan na barem jedan ligand, gde je ligand jedan ili više GalNAc derivat vezan kroz bivalentni ili trivalentni razgranati veznik.
[0054] U jednoj implementaciji, Na' obuhvata 1-25 nukleotida, i gde je jedan od 1-25 nukleotida na jednom od položaja 2-9 od 5'kraja neusklađen nukleotid. U jednom otelotvorenju, neusklađena baza je univerzalna baza.
[0055] Predmetno obelodanjivanje takođe pruža ćelije, vektore, ćelije domaćine i farmaceutske sastave koji sadrže dvolančane RNKi agense pronalaska.
[0056] Predmetno obelodanjivanje pruža RNKi agens izabran iz grupe RNKi agensa navedenih u bilo kojoj od Tabela 1, 2, 5, 7, 8 i 9.
[0057] Predmetno obelodanjivanje takođe sadrži sastav koji sadrži modifikovani antismisao polinukleotidni agens. Agens je u stanju da inhibira eksprimiranje Serpina1 u ćeliji i sadrži sekvencu koja je komplementarna sa sekvencom čula izabranom iz grupe sekvenci navedenih u bilo kojoj od Tabela 1, 2, 5, 7, 8 i 9, pri čemu je polinukleotid dužine oko 14 do oko 30 nukleotida.
[0058] U drugom aspektu, predmetni pronalazak pruža in vitro ćeliju koja sadrži dvolančani RNKi agens prema pronalasku.
[0059] U nekim implementacijama, RNKi agens se primenjuje korišćenjem farmaceutskog sastava.
[0060] U poželjnim implementacijama, RNKi agens se primenjuje u rastvoru. U nekim takvim implementacijama, siRNK se primenjuje u nepuferisanom rastvoru. U jednoj implementaciji, siRNK se primenjuje u vodi. U drugim implementacijama, siRNK se daje sa puferisanim rastvorom, kao što je acetatni pufer, citratni pufer, prolaminski pufer, karbonatni pufer ili fosfatni pufer ili bilo koja njihova kombinacija. U nekim otelotvorenjima, puferski rastvor je fosfatom puferisan slani rastvor (PBS).
[0061] U jednoj implementaciji, farmaceutski sastavi dalje sadrže lipidnu formulaciju. U jednom aspektu, predmetno obelodanjivanje pruža postupke inhibiranja eksprimiranja Serpina1 u ćeliji. Postupci uključuju dovođenje u dodir ćelije sa RNKi agensom, npr., dvolančanim RNKi agensom, sastavom, vektorom ili farmaceutskim sastavom pronalaska; i održavanje ćelije proizvedene u koraku (a) tokom vremena dovoljnog za postizanje degradacije transkripta mRNK Serpina1 gena, čime se inhibira eksprimiranje Serpina1 gena u ćeliji.
[0062] U jednoj implementaciji, ćelija je unutar pacijenta.
[0063] U jednoj implementaciji, pacijent je čovek.
[0064] U jednoj implementaciji, Serpina1 eksprimiranje je inhibirano za najmanje oko 30% 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95%.
[0065] U drugom aspektu, predmetno obelodanjivanje pruža postupke lečenja pacijenta koji ima bolest povezanu sa Serpina1. Postupci uključuju davanje pacijentu terapeutski efikasne količine RNKi agensa, npr., dvolančanog RNKi agensa, sastava, vektora ili farmaceutskog sastava pronalaska, čime se tretira pacijent.
[0066] U drugom aspektu, predmetno obelodanjenje pruža postupke tretiranja pacijenta koji ima poremećaj povezan sa Serpina1. Postupci uključuju potkožnu primenu pacijentu terapeutski efikasne količine dvolančanog RNKi agensa, gde dvolančani RNKi agens obuhvata smisao lanac i antismisao lanac koji formiraju dvolančanu regiju, gde smisao lanac obuhvata barem 15 susednih nukleotida koji se ne razlikuju po više od 3 nukleotida bilo koje nukleotidne sekvence od SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, ili SEQ ID NO:11, i antismisao lanac obuhvata barem 15 susednih nukleotida koji se ne razlikuju po više od 3 nukleotida bilo koje nukleotidne sekvence od SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, ili SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21,
1
SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, ili SEQ ID NO:25, gde značajno svi nukleotidi antismisao lanca sadrže modifikaciju izabranu iz grupe koju čine 2'-O-metil modifikacija i 2'-fluoro modifikacija, gde antismisao lanac obuhvata dve fosforotioatne internukleotidne veze na 5'-terminusu i dve fosforotioatne internukleotidne veze na 3'-terminusu,gde značajno svi nukleotidi smisao lanca sadrže modifikaciju izabranu iz grupe koju čine 2'-O-metil modifikacija i 2'-fluoro modifikacija, gde smisao lanac obuhvata dve fosforotioatne internukleotidne veze na 5'-terminusu i, gde je smisao lanac konjugovan na jedan ili više GalNAc derivat vezan kroz razgranati bivalentni ili trivalentni veznik na 3'-terminusu, čime se tretira pacijent.
[0067] U jednoj implementaciji, jedna od 3 nukleotidne razlike u nukleotidnoj sekvenci antismisao lanca je nukleotidna neusklađenost u semenskoj regiji antismisao lanca. U jednoj implementaciji, antismisao lanac sadrži univerzalnu bazu na neusklađenom nukleotidu.
[0068] U jednoj implementaciji, svi nukleotidi smisao lanca i svi nukleotidi antismisao lanca sadrže modifikaciju.
[0069] U jednoj implementaciji, bolest povezana sa Serpina1 je poremećaj jetre, npr., hronično oboljenje jetre, zapaljenje jetre, ciroza, fibroza jetre i/ili hepatocelularni karcinom.
[0070] U jednoj implementaciji, primena agensa RNKi na pacijent dovodi do smanjenja ciroze jetre, fibroze i/ili akupacije Serpina1 proteina u jetri. U drugom otelotvorenju, primena RNKi agensa na pacijentu rezultuje, npr., daljim rezultatima, u smanjenju zapaljenja pluća.
[0071] U jednoj implementaciji, pacijent je čovek.
[0072] U jednoj implementaciji, RNKi agens, npr., dvolančani RNKi agens, je primenjen pri dozi od oko 0,01 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 0,5 mg/kg do oko 50 mg/kg, oko 10 mg/kg do oko 30 mg/kg, oko 10 mg/kg do oko 20 mg/kg, oko 15 mg/kg do oko 20 mg/kg, oko 15 mg/kg do oko 25 mg/kg, oko 15 mg/kg do oko 30 mg/kg, ili oko 20 mg/kg do oko 30 mg/kg.
[0073] U jednoj implementaciji, RNKi agens, npr., dvolančani RNKi agens, je primenjen potkožno ili intravenozno.
1
[0074] U još jednom aspektu, predmetno obelodanjivanje pruža postupke inhibiranja razvoja hepatocelularnog karcinoma kod pacijenta koji ima varijantu nedostatka Serpina1. Postupci uključuju davanje pacijentu terapeutski efikasne količine RNKi agensa, npr., dvolančanog1 RNKi agensa, sastava, vektora ili farmaceutskog sastava pronalaska, čime se inhibira razvoj hepatocelularnog karcinoma kod pacijenta.
[0075] U drugom aspektu, predmetno obelodanjenje pruža postupke inhibiranja razvoja hepatocelularnog karcinoma kod pacijenta koji ima varijantu nedostatka Serpina1. Postupci uključuju potkožnu primenu pacijentu terapeutski efikasne količine dvolančanog RNKi agensa, gde dvolančani RNKi agens obuhvata smisao lanac i antismisao lanac koji formiraju dvolančanu regiju, gde smisao lanac obuhvata barem 15 susednih nukleotida koji se ne razlikuju po više od 3 nukleotida bilo koje nukleotidne sekvence od SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, ili SEQ ID NO:11, i antismisao lanac obuhvata barem 15 susednih nukleotida koji se ne razlikuju po više od 3 nukleotida bilo koje nukleotidne sekvence od SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, ili SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, ili SEQ ID NO:25, gde značajno svi nukleotidi antismisao lanca sadrže modifikaciju izabranu iz grupe koju čine 2'-O-metil modifikacija i 2'-fluoro modifikacija, gde antismisao lanac obuhvata dve fosforotioatne internukleotidne veze na 5'-terminusu i dve fosforotioatne internukleotidne veze na 3'-terminusu, gde značajno svi nukleotidi smisao lanca sadrže modifikaciju izabranu iz grupe koju čine 2'-O-metil modifikacija i 2'-fluoromodifikacija, gde smisao lanac obuhvata dve fosforotioatne internukleotidne veze na 5'-terminusu i, gde je smisao lanac konjugovan na jedan ili više GalNAc derivat vezan kroz razgranati bivalentni ili trivalentni veznik na 3'-terminusu, čime se inhibira razvoj hepatocelularnog karcinoma kod pacijenta koji ima varijantu nedostatka Serpina1.
[0076] U jednoj implementaciji, jedna od 3 nukleotidne razlike u nukleotidnoj sekvenci antismisao lanca je nukleotidna neusklađenost u semenskoj regiji antismisao lanca. U jednoj implementaciji, antismisao lanac sadrži univerzalnu bazu na neusklađenom nukleotidu.
[0077] U jednoj implementaciji, svi nukleotidi smisao lanca i svi nukleotidi antismisao lanca sadrže modifikaciju.
1
[0078] U jednoj implementaciji, pacijent je primat ili glodar. U drugoj implementaciji, pacijent je čovek.
[0079] U jednoj implementaciji, RNKi agens, npr., dvolančani RNKi agens, je primenjen pri dozi od oko 0,01 mg/kg do oko 10 mg/kg ili oko 0,5 mg/kg do oko 50 mg/kg. U drugoj implementaciji, dvolančani RNKi agens je primenjen pri dozi od oko 10 mg/kg do oko 30 mg/kg.
[0080] U jednoj implementaciji, RNKi agens, npr., dvolančani RNKi agens, je primenjen pri dozi od oko 3 mg/kg. U drugoj implementaciji, dvolančani RNKi agens je primenjen pri dozi od oko 10 mg/kg. U još jednoj implementaciji, dvolančani RNKi agens je primenjen pri dozi od oko 0,5 mg/kg dvaput nedeljno. U još jednoj implementaciji, dvolančani RNKi agens je primenjen pri dozi od oko 10 mg/kg svake druge nedelje. U još jednoj implementaciji, dvolančani RNKi agens je primenjen pri dozi od oko 0,5 do oko 1 mg/kg jednom nedeljno.
[0081] U jednoj implementaciji, RNKi agens, npr., dvolančani RNKi agens, je primenjen dvaput nedeljno. U drugoj implementaciji, RNKi agens je primenjen svake druge nedelje.
[0082] U jednoj implementaciji, RNKi agens, npr., dvolančani RNKi agens, je primenjen potkožno ili intravenozno.
[0083] U drugom aspektu, predmetno obelodanjivanje pruža postupke za smanjenje akumulacije nepravilno savijenog Serpina1 u jetri pacijenta koji ima varijantu nedostatka Serpina1. Postupci uključuju davanje pacijentu terapeutski efikasne količine RNKi agensa, npr., dvolančanog RNKi agensa, sastava, vektora ili farmaceutskog sastava pronalaska, čime se smanjuje akumulacija nepravilno savijenog Serpina1 u jetri pacijenta.
[0084] U drugom aspektu, predmetno obelodanjenje pruža postupke za smanjenje akumulacije nepravilno savijenog Serpina1 u jetri pacijent koji ima varijantu nedostatka Serpina1. Postupci uključuju potkožnu primenu pacijentu terapeutski efikasne količine dvolančanog RNKi agensa, gde dvolančani RNKi agens obuhvata smisao lanac i antismisao lanac koji formiraju dvolančanu regiju, gde smisao lanac obuhvata barem 15 susednih nukleotida koji se ne razlikuju po više od 3 nukleotida bilo koje nukleotidne sekvence od SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID
1
NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, ili SEQ ID NO:11, i antismisao lanac obuhvata barem 15 susednih nukleotida koji se ne razlikuju po više od 3 nukleotida bilo koje nukleotidne sekvence od SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, ili SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, ili SEQ ID NO:25, gde značajno svi nukleotidi antismisao lanca sadrže modifikaciju izabranu iz grupe koju čine 2'-O-metil modifikacija i 2'-fluoromodifikacija, gde antismisao lanac obuhvata dve fosforotioatne internukleotidne veze na 5'-terminusu i dve fosforotioatne internukleotidne veze na 3'-terminusu, gde značajno svi nukleotidi smisao lanca sadrže modifikaciju izabranu iz grupe koju čine 2'-O-metil modifikacija i 2'-fluoro modifikacija, gde smisao lanac obuhvata dve fosforotioatne internukleotidne veze na 5'-terminusu i, gde je smisao lanac konjugovan na jedan ili više GalNAc derivat vezan kroz razgranati bivalentni ili trivalentni veznik na 3'-terminusu, čime se smanjuje akumulacija nepravilno savijenog Serpina1 u jetri pacijent koji ima varijantu nedostatka Serpina1.
[0085] U jednoj implementaciji, jedna od 3 nukleotidne razlike u nukleotidnoj sekvenci antismisao lanca je nukleotidna neusklađenost u semenskoj regiji antismisao lanca. U jednoj implementaciji, antismisao lanac sadrži univerzalnu bazu na neusklađenom nukleotidu.
[0086] U jednoj implementaciji, svi nukleotidi smisao lanca i svi nukleotidi antismisao lanca sadrže modifikaciju.
[0087] U jednoj implementaciji, pacijent je primat ili glodar. U drugoj implementaciji, pacijent je čovek.
[0088] U jednoj implementaciji, RNKi agens, npr., dvolančani RNKi agens, je primenjen pri dozi od oko 0,01 mg/kg do oko 10 mg/kg ili oko 0,5 mg/kg do oko 50 mg/kg. U drugoj implementaciji, dvolančani RNKi agens je primenjen pri dozi od oko 10 mg/kg do oko 30 mg/kg.
[0089] U jednoj implementaciji, RNKi agens, npr., dvolančani RNKi agens, je primenjen potkožno ili intravenozno.
1
[0090] Slika 1 je grafikon koji prikazuje in vivo efikasnost i trajanje odgovora za naznačene siRNK kod transgenih miševa koji eksprimiraju Z-AAT oblik ljudskog AAT.
[0091] Slike 2A-2B prikazuju in vivo efikasnost pet siRNK sa niskim vrednostima IC50. Transgeni miševi koji su eksprimirali ljudski Z-AAT alel injektirani su sa 10 mg/kg siRNK dupleksa na dan 0, i serumski ljudski AAT je pratio 21 dan nakon doziranja (Slika 2A). Svaka tačka predstavlja prosek od tri miša, a stubići za greške predstavljaju standardnu devijaciju. Slika 2B prikazuje hAAT nivo mRNK u jetri normalizovanoj za GAPDH za svaku grupu. Stubići predstavljaju prosek, a stubići grešaka predstavljaju standardnu devijaciju.
[0092] Slike 3A-3C prikazuju trajnu AAT supresiju na način koji odgovara dozi. Slika 3A specifično prikazuje krivu efikasnosti koja pokazuje maksimalno smanjenje nivoa u serumu hAAT proteina postignutih u različitim dozama AD-59054 potkožno primenjenim na transgene miševe. Svaka tačka je prosek od tri životinje, a stubići greške predstavljaju standardnu devijaciju. Trajanje obaranja nakon jedne doze AAT siRNK na 0,3, 1, 3 ili 10 mg/kg je prikazano na Slici 3B. Nivoi hAAT su normalizovani u proseku od tri predkrvarenja za svaku životinju. Grupa PBS služi kao kontrola koja odražava varijabilnost nivoa hAAT u serumu. Svaka tačka podataka je proseku od tri životinje, a stubići greške predstavljaju standardnu devijaciju. Na Slici 3C, životinjama je primenjen AD-59054 u dozi od 0,5 mg/kg dva puta nedeljno. Svaka tačka podataka je prosečna relativna vrednost hAAT u serumu od četiri životinje, a stubići greške predstavljaju standardnu devijaciju.
[0093] Slike 4A-4D prikazuju smanjenu incidenciju tumora sa smanjenjem Z-AAT. Slika 4A prikazuje dizajn studije pomoću koga su stari miševi sa fibrotičnom jetrom potkožno dozirani svake druge nedelje (Q2W) sa PBS ili 10 mg/kg siRNK dupleks AD58681 za 11 doza i žrtvovani su 7 dana nakon poslednje doze. Slika 4B prikazuje nivoe hAAT mRNK jetre u kontrolnim i tretiranim grupama. Slika 4C prikazuje nivoe jetre Col1a2 mRNK u kontrolnim i tretiranim grupama. Slika 4D prikazuje nivoe jetre PtPrc mRNK u kontrolnim i tretiranim grupama.
[0094] Slike 5A-5C prikazuju smanjenu incidenciju tumora sa smanjenjem Z-AAT. Uzorci seruma su sakupljeni od miševa tretiranih prema studiji na slici 4A kako bi se pratio stepen hAAT supresije. Slika 5A prikazuje nivo seruma hAAT proteina nakon prve doze. Slika 5B i
2
Slika 5C prikazuju PAS bojenje jetrenih odeljaka dva miša iz istog legla koji su tretirana bilo sa PBS ili AAT siRNK. Tamnije boje predstavljaju globule ili Z-AAT agregate.
[0095] Slika 6 prikazuje in vivo efikasnost naznačenih jedinjenja.
[0096] Slike 7A i 7B su grafikoni koji prikazuju trajanje prenošenja AAT-a u primate koji nisu čovek nakon jedne doze AD-59054, AD-61719 ili AD-61444 u dozi od 1 mg/kg (7A) ili 3 mg/kg (7B). Svaka tačka podataka je u proseku tri životinje, i stubići greške predstavljaju standardnu devijaciju.
[0097] Slika 8A prikazuje nukleotidnu sekvencu Homo sapiens Serpina1, varijanta transkripta 1 (SEQ ID NO:1); Slika 8B prikazuje nukleotidnu sekvencu Homo sapiens Serpina1, varijanta transkripta 3 (SEQ ID NO:2); Slika 8C prikazuje nukleotidnu sekvencu Homo sapiens Serpina1, varijanta transkripta 2 (SEQ ID NO:3); Slika 8D prikazuje nukleotidnu sekvencu Homo sapiens Serpina1, varijanta transkripta 4 (SEQ ID NO:4); Slika 8E prikazuje nukleotidnu sekvencu Homo sapiens Serpina1, varijanta transkripta 5 (SEQ ID NO:5); Slika 8F prikazuje nukleotidnu sekvencu Homo sapiens Serpina1, varijanta transkripta 6 (SEQ ID NO:6); Slika 8G prikazuje nukleotidnu sekvencu Homo sapiens Serpina1, varijanta transkripta 7 (SEQ ID NO:7); Slika 8H prikazuje nukleotidnu sekvencu Homo sapiens Serpina1, varijanta transkripta 8 (SEQ ID NO:8); Slika 8I prikazuje nukleotidnu sekvencu Homo sapiens Serpina1, varijanta transkripta 9 (SEQ ID NO:9); Slika 8J prikazuje nukleotidnu sekvencu Homo sapiens Serpina1, varijanta transkripta 10 (SEQ ID NO:10); Slika 8K prikazuje nukleotidnu sekvencu Homo sapiens Serpina1, varijanta transkripta 11 (SEQ ID NO:11); Slika 8L prikazuje nukleotidnu sekvencu Macaca mulatta Serpina1 (SEQ ID NO:12); Slika 8M prikazuje nukleotidnu sekvencu Macaca mulatta Serpina1, varijanta transkripta 6 (SEQ ID NO:13); Slika 8N prikazuje nukleotidnu sekvencu Macaca mulatta Serpina1, varijanta transkripta 4 (SEQ ID NO:14); Slika 8O prikazuje reverzni komplement od SEQ ID NO:1 (SEQ ID NO:15); Slika 8P prikazuje reverzni komplement od SEQ ID NO:2 (SEQ ID NO:16); Slika 8Q prikazuje reverzni komplement od SEQ ID NO:3 (SEQ ID NO:17); Slika 8R prikazuje reverzni komplement od SEQ ID NO:4 (SEQ ID NO:18); Slika 8S prikazuje reverzni komplement od SEQ ID NO:5 (SEQ ID NO:19); Slika 8T prikazuje reverzni komplement od SEQ ID NO:6 (SEQ ID NO:20); Slika 8U prikazuje reverzni komplement od SEQ ID NO:7 (SEQ ID NO:21); Slika 8V prikazuje reverzni komplement od SEQ ID NO:8 (SEQ ID NO:22); Slika 8W prikazuje reverzni komplement od SEQ ID NO:9 (SEQ ID NO:23); Slika 8X prikazuje reverzni komplement od SEQ ID NO:10 (SEQ ID NO:24); Slika 8Y prikazuje reverzni komplement od SEQ ID NO:11 (SEQ ID NO:25); Slika 8Z prikazuje reverzni komplement od SEQ ID NO:12 (SEQ ID NO:26); Slika 8AA prikazuje reverzni komplement od SEQ ID NO:13 (SEQ ID NO:27); i Slika 8AB prikazuje reverzni komplement od SEQ ID NO:14 (SEQ ID NO:28).
[0098] Predmetno obelodanjivanje pruža sastave koji sadrže agense, npr., jednolančani i dvolančani oligonukleotidi, npr., RNKi agensi, npr., dvolančani iRNK agensi, koji ciljaju Serpina1. Takođe su opisani postupci koji koriste sastave pronalaska za inhibiranje eksprimiranje Serpina1 i za lečenje bolesti povezanih sa Serpina1, kao što su poremećaji jetre, npr., hronično oboljenje jetre, zapaljenje jetre, ciroza, fibroza jetre i/ili hepatocelularni karcinom.
I. Definicije
[0099] Kako bi se ovaj pronalazak mogao lakše razumeti, određeni pojmovi su najpre definisani. Pored toga, treba napomenuti da kad god se navode vrednost ili opseg vrednosti parametra, namera je da vrednosti i opsezi u intervalu sa navedenim vrednostima takođe budu deo ovog pronalaska.
[0100] Oblici jednine se koriste da označe jedan ili više od jednog (tj. najmanje jedan) gramatički objekat. Kao primer, „element“ znači jedan element ili više od jednog elementa, npr., mnoštvo elemenata.
[0101] Izraz „uključujući“ se ovde koristi da označava, i koristi se uzajamno sa izrazom, „uključujući ali ne ograničavajući se na“.
[0102] Izraz „ili“ se ovde koristi da označava i koristi se naizmenično sa izrazom „i/ili“, osim ako kontekst jasno ne ukazuje na drugačije.
[0103] Kad se ovde koristi, „Serpina1“ se odnosi na inhibitor serpin peptidaze, kladus A, član 1 gen ili protein. Serpinal je poznat i kao alfa-1-antitripsin, α-1-antitripsin, AAT, inhibitor proteaze 1, PI, PI1, anti-elastaza i antitripsin.
[0104] Izraz Serpina1 obuhvata ljudski Serpina1, aminokiselinsku i nukleotidnu sekvencu koja se može naći u, na primer, GenBank Accession Nos. GI:189163524 (SEQ ID NO:1), GI:189163525 (SEQ ID NO:2), GI:189163526 (SEQ ID NO:3), GI:189163527 (SEQ ID NO:4), GI:189163529 (SEQ ID NO:5), GI:189163531 (SEQ ID NO:6), GI:189163533 (SEQ ID NO:7), GI:189163535 (SEQ ID NO:8), GI:189163537 (SEQ ID NO:9), GI:189163539 (SEQ ID NO:10), i/ili GI:189163541 (SEQ ID NO:11); Serpina1 rezus majmuna, aminokiselinsku i nukleotidnu sekvencu koja se može naći u, na primer, GenBank Accession Nos. GI:402766667 (SEQ ID NO:12), GI:297298519 (SEQ ID NO:13) i/ili GI: 297298520 (SEQ ID NO:14); mišji Serpina1, aminokiselinsku i nukleotidnu sekvencu koja se može naći u, na primer, GenBank Accession No. GI: 357588423 i/ili GI: 357588426; i pacovski, aminokiselinsku i nukleotidnu sekvencu koja se može naći u, na primer, GenBank Accession Nos. GI: 77020249. Dodatni primeri Serpina1 mRNK sekvence su lako dostupni koristeći, npr., GenBank i OMIM.
[0105] Identifikovano je preko 120 alela Serpina1, i „M“ aleli se smatraju divljim ili „normalnim“ alelom (npr., „PIM1-ALA213“ (takođe poznat kao PI, M1A), „PIM1-VAL213“ (takođe poznati kao PI, MIV), „PIM2“, „PIM3“ i PIM4“). Dodatne varijante mogu da se pronađu u, na primer, A(1)ATVar bazi podataka (pogledati, npr., Zaimidou, S., i dr. (2009) Hum Mutat. 230(3):308-13 i www.goldenhelix.org/A1ATVar).
[0106] Kad se ovde koristi, izraz „alel sa nedostatkom Serpinal“ odnosi se na varijantu alela koja proizvodi proteine koji se ne savijaju pravilno i mogu se agregirati intracelularno i, prema tome, nisu pravilno transportovani sa mesta sinteze u jetri do mesta delovanja u okviru tela.
[0107] Primeri alela sa nedostatkom Serpinal uključuju: „Z alel“, „S alel“, „PIM(Malton) alel“ i „PIM(Procida) alel“.
[0108] Kad se ovde koriste, eksprimira „Z alel“, „PIZ“ i „Z-AAT“ odnose se na varijantu alela od Serpinal u kom se aminokiselina na položaju 342 proteina menja iz glutamina u lizin kao rezultat promene relevantnog kodona od GAG do AAG. Pacijent koji je homozigovan za Z alel može se nazvati „PIZZ“. Z-AAT mutacije čine 95% pacijenata sa Serpinal manjkom i procenjuje se da su prisutni u 100,000 Amerikanaca i oko 3 miliona pojedinaca širom sveta. Z alel dostiže polimorfne frekvencije kod belaca i redak je ili odsutan kod Azijata i crnaca. Homozigotni ZZ fenotip je povezan sa visokim rizikom od emfizema i oboljenja jetre. Z-
2
AAT protein se ne savija pravilno u endoplazmatičnom retikulumu, što dovodi do polimernih linija koje čine agregat i smanjuju sekreciju, elikaciju odgovora nesavijenog proteina, apoptozu, odgovor preopterećenja endoplazmatičkog retikuluma, autofagiju, mitohondrijalni stres i izmenjenu funkciju hepatocita.
[0109] Kad se ovde koriste, eksprimira „PIM(Malton)“ i „M(Malton)-AAT“ odnose se na varijantu alela od Serpinal u kojoj je jedan od susednih ostataka fenilalanina na položaju 51 ili 52 zrelog proteina izbrisan. Brisanje ove aminokiseline skraćuje jedan lanac beta-lista, B6, sprečavajući normalnu obradu i sekreciju u jetri, koja je povezana sa uključivanjem hepatocita i poremećenu sekrecijom proteina iz jetre.
[0110] Kad se ovde koristi, izraz „PIS“ se odnosi na varijantu alela od Serpinal u kojoj se glutaminska kiselina na položaju 264 supstituiše sa valinom. Iako je većina ove varijantne proteina degradirana intracelularno, postoji velika frekvencija alela PIS u populaciji belaca i stoga su heterozigoti jedinjenja sa Z ili null alelom česti.
[0111] Kad se ovde koristi, „ciljana sekvenca“ odnosi se na susedni deo nukleotidne sekvence mRNK molekula formiranog tokom transkripcije Serpinal gena, uključujući mRNK koja je proizvod RNK obrade primarnog proizvoda transkripcije.
[0112] Kad se ovde koristi, izraz „lanac koji obuhvata sekvencu“ odnosi se na oligonukleotid koji sadrži lanac nukleotida koji je opisan u sekvenci koja se pominje korišćenjem standardne nukleotidne nomenklature.
[0113] „G“, „C“, „A“ i „U“ obično predstavljaju nukleotid koji sadrži gvanin, citozin, adenin i uracil kao bazu. „T“ i „dT“ se ovde koriste međusobno zamenljivo i odnose se na dezoksiribonukleotid u kome je nukleobaza timin, npr. dezoksiribotiamin, 2'-dezoksietimidin ili timidin. Međutim, razumeće se da izraz „ribonukleotid“ ili „nukleotid“ ili „dezoksiribonukleotid“ takođe mogu da se odnose na modifikovani nukleotid, kako je dalje detaljno navedeno u nastavku, ili surogat zamenljivi deo. Stručna osoba je sasvim svesna da gvanin, citozin, adenin i uracil mogu biti zamenjeni drugim delovima bez značajnih izmena osobina baznog para oligonukleotida koji sadrži nukleotid koji nosi takav zamenski deo. Na primer, bez ograničenja, nukleotid koji sadrži inozin kao svoju bazu može napraviti bazni par sa nukleotidima koji sadrže adenin, citozin ili uracil. Prema tome, nukleotidi koji sadrže uracil, gvanin ili adenin mogu se zameniti u nukleotidnim sekvencama pronalaska pomoću nukleotida koji sadrži, na primer, inozin. Sekvence koje sadrže takve zamenljive grupe su otelotvorenja pronalaska. eksprimira „iRNK“, „RNKi agens“, „iRNK agens“, „agensi interferencije RNK“ koji se koriste međusobno zamenljivo ovde, odnose se na agens koji sadrži RNK kako je taj izraz definisan ovde, a koji posreduje ciljanom cepanju RNK prepis preko RNK-indukovani kompleks za utišavanje (RISC). iRNK usmerava specifičnu degradaciju mRNK sekvenci kroz proces poznat kao RNK interferencija (RNKi). Modulati iRNK, npr., inhibiraju, eksprimiranje Serpina1 u ćeliji, npr., ćeliji unutar pacijenta, kao što je sisar pacijent.
[0114] U jednoj implementaciji, RNKi agens obelodanjenja uključuje jednolančanu RNK koja je u interakciji sa ciljanom RNK sekvencom, npr., Serpina1 ciljana mRNK sekvenca, kako bi se usmerilo cepanje ciljane RNK. Bez želje da se veže teorijom, veruje se da je duga dvolančana RNK koja se unosi u ćelije razbijena na siRNK pomoću endonukleaze tipa III poznate kao Dicer (Sharp i dr. (2001) Genes Dev.15:485). Dicer, enzim kao što je ribonukleaza-III, procesuira dsRNK u 19-23 bazni par kratke interferišuže RNK sa karakterističnim dvobaznim 3' prepustima (Bernstein, i dr., (2001) Nature 409:363). siRNK se zatim inkorporiraju u RNK-indukovani kompleks za utišavanje (RISC), gde jedna ili više helikataza odmotavaju siRNK dupleks, omogućavajući komplementarnom antismisao lancu da vodi ciljano prepoznavanje (Nykanen, i dr., (2001) Cell 107:309). Nakon vezivanja za odgovarajuću ciljanu mRNK, jedna ili više endonukleaza unutar RISC cepaju cilj da indukuju utišavanje (Elbashir, i dr., (2001) Genes Dev.15:188). Prema tome, u jednom aspektu pronalazak se odnosi na jednolančanu RNK (siRNK) generisanu unutar ćelije i koja promoviše formiranje kompleksa RISC za efekat čišćenja ciljanog gena, tj., Serpinal gena. Shodno tome, izraz „siRNK“ se takođe ovde koristi da se odnosi na RNKi kao što je gore opisano.
[0115] U drugoj implementaciji, RNKi agens može biti jednolančana siRNK koja se unosi u ćeliju ili organizam da inhibira ciljanu mRNK. Jednolančani RNKi agensi se vezuju za RISC endonukleazu Argonaute 2, koja zatim cepa ciljanu mRNK. Jednolančane siRNK su generalno 15-30 nukleotida i hemijski modifikovane. Dizajn i testiranje jednolančanih siRNK su opisani u U.S. Patent No.8,101,348 i u Lima i dr., (2012) Cell 150: 883-894, čiji je celokupan sadržaj ovde uključen referencom. Bilo koja antismisao nukleotidna sekvenca
2
opisana ovde može se koristiti kao jednolančana siRNK kao što je ovde opisano ili kao hemijski modifikovana postupcima opisanim u Lima i dr., (2012) Cell 150;: 883-894.
[0116] U još jednoj implementaciji, ovaj pronalazak pruža molekule jednolančanih antismisao oligonukleotida usmerene na Serpinal. „Molekul jednolančanog antismisao oligonukleotida“ komplementaran je sekvenci unutar ciljane mRNK (tj.., Serpinal). Molekuli jednolančanog antismisao oligonukleotida mogu inhibirati translaciu na stehiometrijski način baznim uparivanjem mRNK i fizičkim ometanjem mehanizma translacije, pogledati Dias, N. i dr., (2002) Mol Cancer Ther 1:347-355. Alternativno, molekuli jednolančanog antismisao oligonukleotida inhibiraju ciljanu mRNK hidridizacijom do cilja i cepanjem mete kroz događaj cepanja RNazeH. Molekul jednolančanog antismisao oligonukleotida može biti od oko 10 do oko 30 nukleotida dugačak i imati sekvencu koja je komplementarna ciljanoj sekvenci. Na primer, molekul jednolančanog antismisao oligonukleotida može sadržati sekvencu koja je najmanje oko 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više susednih nukleotida od bilo koje antismisao nukleotidne sekvence opisane ovde, npr., sekvence date u bilo kojoj od Tabela, 1, 2, 5, 7, 8 ili 9 ili vezuju bilo koju od ciljanih lokacija opisanih ovde. Molekuli jednolančanog antismisao oligonukleotida mogu da sadrže modifikovanu RNK, DNK ili njihovu kombinaciju.
[0117] U drugoj implementaciji, „iRNK“ za upotrebu u sastavima, upotrebe i postupcima pronalaska je dvostruka RNK i ovde se ovde naziva „dvolančani RNKi agens“, „dvolančani vektorski RNK (dsRNK) molekul , „dsRNK agens“ ili „dsRNK“. Izraz „dsRNK“ se odnosi na kompleks molekula ribonukleinske kiseline, koji ima dupleks strukturu koja sadrži dve anti-paralelne i značajno komplementarne ćelije nukleinskih kiselina, koje se nazivaju „smisao“ i „antismisao“ orijentacijama u odnosu na ciljanu RNK, tj., Serpinal gen. U nekim implementacijama, dvostruka RNK (dsRNK) pokreće degradaciju ciljane RNK, npr., mRNK, kroz post-transkripcijski mehanizam za zatezanje gena kad se ovde pominje kao interferencija RNK ili RNKi.
[0118] Uopšteno govoreći, većina nukleotida svake ćelije dsRNK molekula su ribonukleotidi, ali kao što je detaljno opisano, svaki ili oba lanca mogu takođe da uključe jedan ili više neribonukleotida, npr., deozoksiribonukleotida i/ili modifikovanog nukleotida. Pored toga, kad se koristi u ovoj specifikaciji, „RNKi agens“ može uključivati ribonukleotide sa hemijskim modifikacijama; RNKi agens može sadržati značajne modifikacije kod više nukleotida. Takve
2
modifikacije mogu obuhvatiti sve vrste modifikacija opisanih ovde ili poznate u struci. Sve takve modifikacije, kad se koriste u molekulu tipa siRNK, obuhvaćene su „RNKi agensom“ u svrhu ove specifikacije i zahteva.
[0119] Dve ćelije koje formiraju dupleks strukturu mogu biti različiti delovi jednog većeg molekula RNK ili mogu biti odvojeni RNK molekuli. Gde su dve ćelije deo jednog većeg molekula i stoga su povezane neprekidnim lancem nukleotida između 3'-kraja jednog lanca i 5'-kraja odgovarajućeg drugog lanca koji formiraju dupleks strukturu, gde se povezujući RNK lanac naziva „ukosnica petlja“. Tamo gde su dva lanca povezane kovalentno pomoću sredstava koja nisu neprekidni lanac nukleotida između 3'-kraja jedne niti i 5'-kraja odgovarajućeg drugog lanca koji oblikuje dupleks strukturu, povezujuća struktura se naziva „veznik“. RNK lanci mogu imati isti ili različiti broj nukleotida. Maksimalan broj baznih parova je broj nukleotida u najkraćem lancu dsRNK minus bilo koji prepust u prisustvu u dupleksu. Pored strukture dupleksa, RNKi agens može sadržati jedan ili više nesparenih nukleotida.
[0120] U jednoj implementaciji, RNKi agens je dsRNK od 24-30 nukleotida koji je u interakciji sa ciljanom RNK sekvencom, npr., Serpinal ciljana mRNK sekvenca, za usmeravanje cepanja ciljane RNK. Bez želje da se veže teorijom, duga dvolančana RNK koja se unosi u ćelije razdvaja siRNK pomoću endonukleaze tipa III poznate kao Dicer (Sharp i dr. (2001) Genes Dev.15:485). Dicer, enzim poput ribonukleaze-III, obrađuje dsRNK u 19-23 bazni par kratke intervenišuće RNK sa karakterističnim dvobaznim 3' prepustima (Bernstein, i dr., (2001) Nature 409:363). SiRNK se zatim inkorporiraju u RNK-indukovani kompleks za utišavanje (RISC), gde jedna ili više helikataza odmotavaju siRNK dupleks, omogućavajući komplementarnom antismisao lancu da vodi ciljano prepoznavanje (Nykanen, i dr., (2001) Cell 107:309). Nakon vezivanja za odgovarajuću ciljanu mRNK, jedna ili više endonukleaza unutar RISC cepaju cilj da indukuju utišavanje (Elbashir, i dr., (2001) Genes Dev.15:188). Kad se ovde koristi, „nukleotidni prepust“ se odnosi na nesparena nukleotida ili nukleotide koji se izdužuju iz dupleksne strukture RNKi agensa kada se 3'-kraj jednog lanca RNKi agensa proteže preko 5'-kraja drugog lanca , ili obrnuto. „Tupi“ ili „tupi kraj“ znači da na tom kraju dvolančanog RNKi agensa nema nesparenih nukleotida, tj., nema nukleotidnog prepusta. RNKi agensi sa „tupim krajem“ su dsRNK koja je dvolančana u celoj dužini, tj. mema nukleotidnog prepusta na bilo kom kraju molekula. RNKi agensi predmetnog
2
pronalaska uključuju RNKi agense sa nukleotidnim prepustima na jednom kraju (tj., agensi sa jednim prepustom i jednim tupim krajem) ili sa nukleotidnim prepustima na oba kraja.
[0121] Izraz „antismisao lanac“ odnosi se na lanac dvolančanog RNKi agensa koji uključuje regiju koja je u suštini komplementarna sa ciljanom sekvencom (npr., ljudskom Serpinal mRNK). Kad se ovde koristi, izraz „regija komplementarnog dela mRNK koja kodira Serpina1“ odnosi se na regiju antismisao lanca koja je u suštini komplementarni delu Serpina1 mRNK sekvence. Kada regija komplementarnosti nije u potpunosti komplementarna ciljanoj sekvenci, neusklađenosti se najviše tolerišu u terminalnim regijama i, ukoliko su prisutne, i uopšte se nalaze u terminalnoj regiji ili regijama, npr., unutar 8, 7, 6, 5, 4, 3 ili 2 nukleotida 5' i/ili 3' terminusa.
[0122] Kao što je prikazano u radnim primerima u nastavku, iznenađujuće je otkriveno da je pojedinačna nukleotidna neusklađenost u semenskoj regiji antismisao lanca RNKi agenasa koja je ovde prikazana tolerisana za sve baze izuzev C. „Semenska regija“ je regija u antismisao lancu RNKi agensa odgovorna za prepoznavanje ciljane mRNK i odgovara, na primer, nukleotidima 2-8 od 5'kraja antismisao lanca. Nakon kaljenja semenske regije, Argonaute se zatim podvrgava komplementarnim mRNK sekvencama 10 nukleotida od 5' kraja obuhvaćene antismisao lanca do nukleolitičke degradacije, što dovodi do cepanja ciljane mRNK. Shodno tome, u jednom otelotvorenju, antismisao lanac RNKi agensa prema pronalasku sadrži jednu nukleotidnu neusklađenost u semenskoj regiji antismisao lanca, npr., neusklađenost na bilo kom položaju 2-8 od 5'-kraja antismisao lanca.
[0123] Izraz „smisao lanac“, kad se ovde koristi, odnosi se na lanac dsRNK koji uključuje regiju koji je u suštini komplementaran sa regijom antismisao lanca.
[0124] Kad se ovde koristi, izraz „regija cepanja“ odnosi se na regiju koja se nalazi odmah do mesta cepanja. Mesto cepanja je mesto na cilju na kom se dešava cepanje. U nekim implementacijama, regija cepanja obuhvata tri baze na jednom kraju i neposredno je uz mesto cepanja. U nekim implementacijama regija cepanja se sastoji od dve baze na jednom kraju i odmah je uz mesto cepanja. U nekim aspektima, mesto cepanja se specifično javlja na mestu vezanom nukleotidima 10 i 11 antismisao lanca, i regija cepanja sadrži nukleotide 11, 12 i 13.
[0125] Kad se ovde koristi, i osim ako nije drugačije naznačeno, izraz „komplementarno“
2
kada se koristi za opisivanje prve nukleotidne sekvence u odnosu na drugu nukleotidnu sekvencu, odnosi se na sposobnost oligonukleotida ili polinukleotida koji čini prvu nukleotidnu sekvencu da hibridizuje i formira dupleks strukture pod određenim uslovima sa oligonukleotidom ili polinukleotidom koji čini drugu nukleotidnu sekvencu, što će razumeti veštak. Takvi uslovi mogu, na primer, biti strogi uslovi, gde strogi uslovi mogu uključivati: 400 mM NaCl, 40 mM PIPE pH 6,4, 1 mM EDTA, 50oC ili 70oC tokom 12-16 sati, nakon čega sledi pranje. Drugi uslovi, kao što su fiziološki relevantni uslovi koji se mogu naći u organizmu, mogu se primeniti. Na primer, komplementarna sekvenca je dovoljna da omogući da se relevantna funkcija nukleinske kiseline nastavi, npr., RNKi. Iskusna osoba će moći da odredi skup uslova koji su najpogodniji za ispitivanje komplementarnosti dve sekvence u skladu sa konačnom primenom hibridizovanih nukleotida.
[0126] Sekvence mogu biti „potpuno komplementarne“ jedna u odnosu na drugu kada postoji bazno uparivanje nukleotida prve nukleotidne sekvence sa nukleotidima druge nukleotidne sekvence na celoj dužini prve i druge nukleotidne sekvence. Međutim, kada je prva sekvenca označena kao „suštinski komplementarna“ u odnosu na drugu sekvencu ovde, dve sekvence mogu biti potpuno komplementarne, ili one mogu formirati jedan ili više, ali uglavnom ne više od 4, 3 ili 2 neusklađena bazna para pri hibridizaciji, dok zadržavaju sposobnost hibridizacije u uslovima koji su najvažniji za njihovu krajnju primenu. Međutim, kada su dva oligonukleotida dizajnirana da, nakon hibridizacije, formiraju jedan ili više jednolančani prepust, takvi prepusti se ne smatraju neusklađenostima u smislu na određivanje komplementarnosti. Na primer, dsRNK sadrži jedan oligonukleotid dužine 21 nukleotida i drugi oligonukleotid dužine 23 nukleotida, pri čemu duži oligonukleotid sadrži sekvencu od 21 nukleotida koja je u potpunosti komplementarna kraćem oligonukleotidu, ipak može biti označen kao „potpuno komplementaran“ za ciljeve opisane ovde.
[0127] „Komplementarne“ sekvence, kad se ovde koriste, takođe mogu uključiti ili biti u potpunosti formirane od ne-Votson-Krik baznih parova i/ili baznih parova formiranih od neprirodnih i modifikovanih nukleotida, sve dok su ispunjene navedene potrebe za sposobnost hibridizacije. Takvi bazni parovi koji nisu Votson-Krik uključuju, ali nisu ograničeni na, G:U Vobl ili Hugstajn bazno uparivanje.
[0128] eksprimira „komplementarno“, „potpuno komplementarno“ i „suštinski komplementarno“ ovde mogu biti korišćeni u odnosu na bazno usklađivanje između smisao i
2
antismisao lanca dsRNK, ili između antismisao lanca dsRNK i ciljane sekvence, kao što će se razumeti iz konteksta njihove upotrebe.
[0129] Kad se ovde koristi, polinukleotid koji je „bitno komplementaran barem delu“ mesindžer RNK (mRNK) odnosi se na polinukleotid koji je u suštini komplementarn sa susednim delom mRNK od interesa (npr., mRNK koja kodira Serpinal) uključujući 5' UTR, otvoreni okvir za čitanje (ORF) ili 3' UTR. Na primer, polinukleotid je komplementaran sa najmanje jednim delom Serpinal mRNK ako je sekvenca u suštini komplementarna sa neprekidnim delom mRNK koja kodira Serpina1.
[0130] Izraz „inhibiranje“, kad se ovde koristi, naizmenično se upotrebljava sa „smanjenjem“, „utišavanjem“, „regulisanjem“, „potiskivanjem“ i drugim srodnim izrazima i uključuje bilo koji nivo inhibicije.
[0131] Izraz „inhibiranje eksprimiranja Serpina1“, kad se ovde koristi, uključuje inhibiciju eksprimiranja bilo kog Serpina1 gena (kao što je, npr., mišji Serpina1 gen, pacovski Serpina1 gen, majmunski Serpina1 gen ili ljudski serpina1 gen) kao i varijante, (npr., prirodne varijante) ili mutante Serpina1 gena. Prema tome, Serpina1 gen može biti gen Serpina1 divljeg tipa, varijanta Serpina1 gena, mutant Serpina1 gena ili transgeni Serpina1 gena u kontekstu genetički manipulisane ćelije, grupe ćelija ili organizma.
[0132] „Inhibiranje eksprimiranja Serpina1 gena“ uključuje bilo koji nivo inhibicije Serpina1 gena, npr., barem delimičnu supresiju eksprimiranja Serpina1 gena, kao što je inhibiranje barem oko 5%, barem oko 10%, barem oko 15%, barem oko 20%, barem oko 25%, barem oko 30%, barem oko 35%,barem oko 40%, barem oko 45%, barem oko 50%, barem oko 55%, barem oko 60%, barem oko 65%, barem oko 70%, barem oko 75%, barem oko 80%, barem oko 85%, barem oko 90%, barem oko 91%, barem oko 92%, barem oko 93%, barem oko 94%. barem oko 95%, barem oko 96%, barem oko 97%, barem oko 98%, ili barem oko 99%.
[0133] Izraz Serpinal gen može se proceniti na osnovu nivoa bilo koje promenljive koja je povezana sa eksprimiranjem Serpinal gena, npr., Serpina1 nivo mRNK, Serpinal nivo proteina ili nivo AAT u serumu. Inhibiranje se može proceniti smanjenjem apsolutnog ili relativnog nivoa jedne ili više ovih promenljivih u poređenju sa kontrolnim nivoom.
Kontrolni nivo može biti bilo koji tip kontrolnog nivoa koji se koristi u struci, npr., početni nivo pre doze, ili nivo određen od sličnog pacijenta, ćelije ili uzorka koji se ne tretira ili tretira sa kontrolom (kao što su, npr., kontrolni pufer ili kontrolni neaktivni agens).
[0134] Izraz „dovođenje u dodir ćelije sa dvolančanim RNKi agensom“, kad se ovde koristi, uključuje dovođenje u dodir ćelije bilo kojim mogućim agensom. Dovođenje u dodir ćelije sa dvolančanom RNKi agensa uključuje dovođenje u dodir ćelije in vitro sa RNKi agensom ili dovođenje u dodir ćelije in vivo sa RNKi agensom. Dovođenje u dodir može biti direktno ili indirektno. Tako, na primer, RNKi agens može biti stavljen u fizički dodir sa ćelijom od strane pojedinca koji izvodi postupak ili, alternativno, RNKi agens može biti stavljen u situaciju koja će omogućiti ili dovesti do toga da kasnije dođe u dodir sa ćelijom.
[0135] Dovođenje u dodir ćelije in vitro može se učiniti, na primer, inkubiranjem ćelije sa RNKi agensom. dovođenje u dodir ćelije in vivo može se učiniti, na primer, injektiranjem RNKi agensa u tkivo ili u blizinu tkiva u kom se nalazi ćelija, ili injektiranjem RNKi agensa u drugu oblast, krvotok ili potkožni prostor, tako da sredstvo naknadno dođe do tkiva gde se nalazi ćelija koju treba dovesti u dodir. Na primer, RNKi agens može sadržati i/ili biti spojen sa ligandom, npr., GalNAc3 ligand, koji usmerava RNKi agens na mesto od interesa, npr., jetru. Kombinacije in vitro i in vivo postupaka dovođenja u dodir su takođe moguće. U vezi sa postupcima pronalaska, ćelija se može dovesti u dodir i in vitro sa RNKi agensom i naknadno transplantirati u pacijenta.
[0136] „Pacijent“ ili „bolesnik“, kad se ovde koristi, ima za cilj da uključi bilo čoveka ili neljudsku životinju, poželjno sisara, npr., majmuna. Najpoželjnije, pacijent ili bolesnik su čovek.
[0137] „Bolest povezana sa Serpinal“, kad se ovde koristi, ima za cilj uključivanje bilo kojih bolesti, poremećaja ili stanja povezanih sa Serpina1 genom ili proteinima. Takva bolest može biti prouzrokovana, na primer, lošim savijanjem serpina1 proteina, intracelularnom akumulacijom Serpina1 proteina (npr., zloupotreba Serpina1 proteina), viškom proizvodnje Serpina1 proteina, varijantama Serpinal gena, mutacijama Serpina1 gena, abnormalnim cepanjem Serpina1 proteina, abnormalnim interakcijama između Serpina1 i drugih proteina ili drugih endogenih ili egzogenih supstanci. Bolest povezana sa Serpinal može biti bolest jetre i/ili bolest pluća.
1
[0138] „Bolest jetre“, kad se ovde koristi, uključuje bolest, poremećaj ili stanje koje utiču na jetru i/ili njenu funkciju. Poremećaj jetre može biti rezultat akumulacije Serpina1 proteina u jetri i/ili ćelijama jetre. Primeri poremećaja jetre uključuju poremećaje jetre kao rezultat nečega iz grupe koju čine virusne infekcije, parazitske infekcije, genetske predispozicije, autoimune bolesti, izloženosti zračenju, izloženosti hepatotoksičnim jedinjenjima, mehaničke povrede, različiti toksini životne sredine, alkohol, acetaminofen, kombinacija alkohola i acetaminofena, inhalacije anestetici, niacin, hemoterapeutici, antibiotici, analgetici, antiemetici i biljni dodatak kava, i njihove kombinacije.
[0139] Na primer, poremećaj jetre koji se povezuje sa Serpinal nedostatkom može se pojaviti češće kod pacijenata sa jednim ili više kopija određenih alela (npr., PIZ, PiM(Malton) i/ili PIS aleli). Bez želje da se veže terijom, smatra se da aleli povezani sa većim rizikom od razvoja alfa-1 anti-tripsin bolesti jetre kodiraju oblike Serpinal koji su podvrgnuti lošem savijanju i nisu pravilno izlučeni iz hepatocita. Celularni odgovori na ove loše savijene proteine mogu uključivati nesavijeni proteinski odgovor (UPR), degradaciju povezanu sa endoplazmatičkim retikulumom (ERAD), apoptozu, ER režim preopterećenja, autofagiju, mitohondrijalni stres i izmenjenu funkciju hepatocita. Povrede hepatocita mogu dovesti do simptoma kao što su, ali ne ograničavajući se na, upale, holestazu, fibrozu, cirozu, produženu opstruktivnu žuticu, povećane transamineze, portal hipertenziju i/ili hepatocelularni karcinom. Bez želje da se veže terijom, visoko varijabilni klinički tok ove bolesti nagoveštava modifikatore ili „druge hitove“ koji doprinose razvoju simptoma ili napredovanju u ozbiljnosti.
[0140] Na primer, pacijenti sa PIZ alelom mogu biti osetljiviji na infekcije hepatitisa C ili zloupotrebu alkohola i češće razviti poremećaj jetre ako su izloženi takvim faktorima. Pored toga, pacijenti sa cističnom fibrozom (CF) koji nose PIZ alel imaju veći rizik od razvoja teške bolesti jetre sa portalskom hipertenzijom. Nedostatak Serpinal sistema takođe može prouzrokovati ili doprineti razvoju rane pojave emfizema , nekrotizujućeg panikulitisa, bronhiektazisa i/ili produžene neonatalne žutice. Neki pacijenti koji imaju ili su pod tizikom od nedostatka alfa-1-antitripsina identifikovani su skriningom kada imaju članove porodice pogođene nedostatkom alfa-1-antitripsina.
[0141] Primerni poremećaji jetre uključuju, ali se ne ograničavaju na, zapaljenje jetre,
2
hronično oboljenje jetre, cirozu, fibrozu jetre, hepatocelularni karcinom, nekrozu jetre, steatozu, holestatis i/ili smanjenje i/ili gubitak funkcije hepatocita.
[0142] „Ciroza“ je patološko stanje povezano sa hroničnim oštećenjem jetre koje uključuje obilnu fibrozu i regenerativne nodule u jetri.
[0143] „Fibroza“ je proliferacija fibroblasta i formiranje tkiva sa ožiljcima u jetri.
[0144] Izraz „funkcija jetre“ odnosi se na jednu ili više od mnogih fizioloških funkcija koje obavlja jetra. Takve funkcije uključuju, ali nisu ograničene na, regulisanje nivoa šećera u krvi, endokrine regulacije, enzimske sisteme, interkonverziju metabolita (npr., ketonska tela, steroli i steroidi i aminokiseline); proizvodnju krvnih proteina kao što su fibrinogen, serumski albumin i holinesteraza, eritropoetska funkcija, detoksifikacija, formiranje žuči i skladištenje vitamina. Nekoliko testova za ispitivanje funkcije jetre su poznate u struci, uključujući, na primer, merenje alanin amino transferaze (ALT), alkalne fosfataze, bilirubina, protrombina i albumina.
[0145] „Terapeutski efikasna količina“, kad se ovde koristi, ima za cilj da uključi količinu RNKi agensa koja je, kada se daje pacijentu za lečenje bolesti povezane sa Serpinalom, dovoljna da utiče na lečenje bolesti (npr., umanjujući, poboljšavajući ili održavajući postojeću bolest ili jedan ili više simptoma bolesti). „Terapeutski efikasna količina“ može se razlikovati u zavisnosti od RNKi agensa, kako se agens daje, bolesti i njene težine i istorije, starosti, težine, porodične istorije, genetske slike, stadijuma patoloških procesa posredovanih Serpinal eksprimiranje, vrste prethodnih ili istovremenih tretmana, ako ih ima, i drugih individualnih karakteristika pacijenta koji se leči.
[0146] „Profilaktički efikasna količina“, kad se ovde koristi, ima za cilj da uključi količinu RNKi agensa koja, kada se daje pacijentu koji još nije doživeo ili pokazao simptome bolesti povezane sa Serpinalom, ali koji može biti predisponiran na bolest, dovoljna da spreči ili poboljša bolest ili jedan ili više simptoma bolesti. Poboljšanje bolesti uključuje usporavanje toka bolesti ili smanjenje težine kasnijeg razvoja bolesti. „Profilaktički efikasna količina“ može se razlikovati u zavisnosti od RNKi agensa, kako se primenjuje sredstvo, stepen rizika od bolesti i istorija, starost, težina, porodična istorija, genetski sastav, vrste prethodnih ili istovremenih tretmana, ako postoji bilo šta, i drugih individualnih karakteristika pacijenta koji se leči.
[0147] „Terapeutski efikasna količina“ ili „profilaktička efektivna količina“ takođe uključuje količinu RNKi agensa koja daje neki poželjan lokalni ili sistemski efekat u razumnoj razmeri od koristi/rizika koji se primenjuje za bilo koji tretman. RNKi agensi koji se koriste u postupcima predmetnog pronalaska mogu se davati u dovoljnoj količini kako bi se postigao razumni odnos koristi/rizik koji se primenjuje na takav tretman.
[0148] Izraz „uzorak“, kad se ovde koristi, uključuje zbirku sličnih tečnosti, ćelija ili tkiva izolovanih od pacijenta, kao i tečnosti, ćelije ili tkiva prisutni u pacijentu. Primeri bioloških tečnosti uključuju krv, serum i serozalne tečnosti, plazmu, urinu, limfu, cerebrospinalnu tečnost, očne tečnosti, pljuvačku i slično. Uzorci tkiva mogu obuhvatiti uzorke iz tkiva, organa ili lokalizovane regije. Na primer, uzorci mogu biti izvedeni iz određenih organa, delova organa ili fluida ili ćelija unutar tih organa. U određenim otelotvorenjima, uzorci mogu biti izvedeni iz jetre (npr., cela jetra ili određeni segmenti jetre ili određene vrste ćelija u jetri, kao što su, npr., hepatociti). U poželjnim varijantama, „uzorak izveden iz pacijenta“ odnosi se na krv ili plazmu izvučenu od pacijenta. U daljem otelotvorenju, „uzorak izveden iz pacijenta“ odnosi se na tkivo jetre (ili njegove podkomponente) izvedene iz pacijenta.
II. iRNK pronalaska
[0149] Ovde su opisani poboljšani dvolančani RNKi agensi koji inhibiraju eksprimiranje Serpina1 gena u ćeliji, kao što je ćelija unutar pacijenta, npr., sisara, kao što je čovek koji ima bolest povezanu sa Serpina1, npr., bolest jetre, npr., hronično oboljenje jetre, zapaljenje jetre, cirozu, fibrozu jetre i/ili hepatocelularni karcinom.
[0150] Shodno tome, obelodanjivanje pruža dvolančane RNKi agense sa hemijskim modifikacijama koje mogu inhibirati eksprimiranje ciljanog gena (tj., Serpinal gena) in vivo. U određenim aspektima, suštinski svi nukleotidi iRNK pronalaska su modifikovani. U drugim implementacijama, svi nukleotidi iRNK pronalaska su modifikovani. iRNK pronalaska u kojima su „u suštini svi nukleotidi modifikovani“, su u velikoj meri, ali ne u potpunosti, modifikovani, i uključuju ne više od 5, 4, 3, 2 ili 1 neizmenjenih nukleotida.
[0151] RNKi agens obuhvata smisao lanac i antismisao lanac. Svaki lanac RNKi agensa
4
može biti dužine u rasponu od 12-30 nukleotida. Na primer, svaki lanac može biti između 14-30 nukleotida dužine, 17-30 nukleotida dužine, 19-30 nukleotida dužine, 25-30 nukleotida dužine, 27-30 nukleotida dužine, 17-23 nukleotida dužine, 17-21 nukleotida dužine, 17-19 nukleotida dužine, 19-25 nukleotida dužine, 19-23 nukleotida dužine, 19-21 nukleotida dužine, 21-25 nukleotida dužine, ili 21-23 nukleotida dužine.
[0152] Smisao lanac i antismisao lanac obično formiraju dupleks sa dvostrukom vezom RNK („dsRNK“), takođe ovde označen kao „RNKi agens“. Dupleks regija RNKi agensa može biti 12-30 nukleotidnih parova dugačka. Na primer, dupleks regija može biti između 14-30 nukleotidnih parova dugačka, 17-30 nukleotidnih parova dugačka, 27-30 nukleotidnih parova dugačka, 17-23 nukleotidnih parova dugačka, 17-21 nukleotidnih parova dugačka, 17 -19 nukleotidnih parova dugačka, 19-25 nukleotidnih parova dugačka, 19-23 nukleotidnih parova dugačka, 19-21 nukleotidnih parova dugačka, 21-25 nukleotidnih parova dugačka ili 21-23 nukleotidnih parova dugačka. U drugom primeru, regija dupleksa je izabrana od 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 i 27 dužina nukleotida.
[0153] U jednoj implementaciji, RNKi agens može sadržati jednu ili više regiju prepusta i/ili grupe kapica na 3'-kraju, 5'-kraju ili oba kraja jednog ili oba lanca. Prepust može biti dužine 1-6 nukleotida, na primer 2-6 nukleotida dužine, 1-5 nukleotida dužine, 2-5 nukleotida dužine, 1-4 nukleotida dužine, 2-4 nukleotida dužine, 1- 3 nukleotida dužine, 2-3 nukleotida dužine, ili 1-2 nukleotida dužine. Prepusti mogu biti rezultat jednog lanca koji je duži od drugog, ili rezultat dva lanca jednake dužine koja su poremećena. Prepust može da stvori neusklađenost sa ciljanom mRNK ili može biti komplementaran sekvenci gena koja se cilja ili mogu biti druga sekvenca. Prvi i drugi lanac se takođe mogu spojiti, npr., pomoću dodatnih baza za formiranje ukosnica ili drugih ne-baznih veznika.
[0154] U jednoj implementaciji, nukleotidi u regiji prepusta RNKi agensa mogu svaki nezavisno biti modifikovan ili nemodifikovan nukleotid uključujući, ali nisu ograničeni na na 2'-šećer modifikovan, kao što su 2-F, 2'-O-methil, timidin (T), 2'-O-metoksietil-5-metilidridin (Teo), 2'-O-metoksietiladenozin (Aeo), 2'-O-metoksietil-5-metilcitidin (m5Ceo) i sve njihove kombinacije. Na primer, TT može biti prepust sekvenca za bilo koji kraj na bilo kom lancu. Prepust može da stvori neusklađenost sa ciljanom mRNK ili može biti komplementarn sekvenci gena koja se cilja ili može biti druga sekvenca.
[0155] 5'- ili 3'- prepust na smisao lancu, antismisao lancu ili oba lanca RNKi agensa mogu biti fosforilisani. U nekim primenama, prepust regija sadrži dva nukleotida koji imaju fosforotioat između dva nukleotida, gde dva nukleotida mogu biti ista ili različita. U jednoj implementaciji, prepust je prisutan na 3'-kraju smisao lanca, antismisao lancu ili oba lanca. U jednoj implementaciji, ovaj 3'-prepust je prisutan u antismisao lancu. U jednoj implementaciji, ovaj 3'-prepust je prisutan u smisao lancu.
[0156] RNKi agens može sadržati samo jedan prepust, što može ojačati interferencijalnu aktivnost RNKi, bez uticaja na njegovu ukupnu stabilnost. Na primer, jednolančani prepust može se nalaziti na 3'-terminalu kraja smisao lanca ili, alternativno, na 3'-terminalu kraj antismisao lanca. RNKi takođe može imati tupi kraj, koji se nalazi na 5'-kraju antismisao lanca (ili na 3'-kraju smisao lanca) ili obrnuto. Uopšteno govoreći, antismisao lanac RNKi ima nukleotidni prepust na 3'-kraju, a 5'-kraj je tup. Bez želje da se veže teorijom, asimetrični tupi kraj na 5'-kraju antismisao lanca i 3'-kraj prepust antismisao lanca favorizuju postavljanje vodič lanca u RISC proces.
[0157] Bilo koja nukleinska kiselina može se sintetisati i/ili modifikovati postupcima koji su dobro uspostavljeni u struci, kao što su oni opisani u „Current protocols in nucleic acid chemistry,“ Beaucage, S.L. i dr. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA, koji je ovde obuhvaćen referencom. Modifikacije uključuju, na primer, modifikacije krajeva, npr., modifikacije 5'-kraja (fosforilacija, konjugacija, invertirane veze) ili modifikacije 3'-kraja (konjugacija, nukleotidi DNK, inverzne veze, itd.); bazne modifikacije, npr., zamena sa stabilizacionim bazama, destabilizirajuće baze ili baze koje se bazno uparuju sa proširenim repertorom partnera, uklanjanje baza (abaznih nukleotida) ili konjugovanih baza; modifikacije šećera (npr., na položaju 2'-položaja ili 4'-položaju) ili zamene šećera; i/ili kičmene modifikacije, uključujući modifikaciju ili zamenu fosfodiesterskih veza. Specifični primeri iRNK jedinjenja korisni u opisanim otelotvorenjima opisanim ovde uključuju, ali se ne ograničavaju na RNK koja sadrže modifikovane kičme ili nema prirodnih internukleozidnih veza. RNK koji imaju modifikovane kičme uključuju, između ostalog, one koji nemaju atom fosfora u kičmi. U svrhu ove specifikacije i kao što se ponekad navodi u struci, modifikovane RNK koje nemaju atom fosfora u svojoj internukleozidnoj kičmi mogu takođe smatrati oligonukleozidima. U nekim implementacijama, modifikovana iRNK će imati atom fosfora u svojoj internukleozidnoj kičmi.
[0158] Modifikovani RNK kičme uključuju, na primer, fosforotioate, kiralne fosforotioate, fosforoditioate, fosfotriestre, aminoalkilfosfotriestre, metil i druge alkil fosfonate uključujući 3'-alkilen fosfonate i hiralne fosfonate, fosfinate, fosforamidate uključujući 3'-aminofosforamidat i aminoalkilfosforamidate, tionofosforamidate, tionoalkilfosfotriestre i boranofosfate koji imaju normalne 3'-5' veze, njihove 2'-5'-vezane analoge, i oni koji imaju obrnuti polaritet gde su susedni parovi nukleozidnih jedinica povezani 3'-5' za 5'-3' ili 2'-5' za 5'-2'. Uključene su i različite soli, mešovite soli i slobodni kiseli oblici.
[0159] Reprezentativni SAD patenti koji govore o pripremi gore navedenih veza vezanih za fosfor uključuju, ali nisu ograničeni na, U.S. Patent Nos.3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,195; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,316; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,625,050; 6,028,188; 6,124,445; 6,160,109; 6,169,170; 6,172,209; 6, 239,265; 6,277,603; 6,326,199; 6,346,614; 6,444,423; 6,531,590; 6,534,639; 6,608,035; 6,683,167; 6,858,715; 6,867,294; 6,878,805; 7,015,315; 7,041,816; 7,273,933; 7,321,029; i US Pat RE39464.
[0160] Modifikovani nosači RNK koji ne sadrže atom fosfora u njima imaju kičme koje su formirane kratkolančanim alkilnim ili cikloalkilnim internukleozidnim vezama, mešovitim heteroatomima i alkil ili cikloalkil internukleozidnim vezama, ili jednim ili više kratkolančanim heteroatomskim ili heterocikličnim internukleozidnim vezana. To uključuje one koji imaju morfolino veze (delom formirane od šećernog dela nukleozida); siloksanske kičme; sulfid, sulfoksid i sulfon kičme; formacetil i tioformacetil kičme; metilen formacetil i tioformacetil kičme; kičme koje sadrže alken; sulfamat kičme; metilenimino i metilenhidrazino kičme; sulfonat i sulfonamid kičme; amid kičme; i druge sa mešanim N, O, S i CH2sastavnim delovima.
[0161] Reprezentativni SAD patenti koji govore o pripremi gore navedenih oligonukleozida obuhvataju, ali nisu ograničeni na, U.S. Patent Nos.5,034,506; 5,166,315; 5,185,444;
5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,64,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; i, 5,677,439.
[0162] U drugim implementacijama, pogodni RNK mimetici su predviđeni za upotrebu u iRNK, u kojima se i šećer i internukleozidna veza, tj., kičma, nukleotidnih jedinica zamenjuju se novim grupama. Bazne jedinice se održavaju za hibridizaciju sa odgovarajućim ciljanim jedinjenjem nukleinske kiseline. Jedno takvo oligomerno jedinjenje, RNK mimetik za koji se pokazalo da ima izvrsna hibridna svojstva, naziva se peptidnom nukleinskom kiselinom (PNK). U jedinjenjima PNK, šećerna kičma iz RNK zamenjena je kičmom koja sadrži amid, naročito aminoetilglicin kičmom. Nukleobaze su zadržane i vezane su direktno ili indirektno na aza atome azota amidnog dela kičme. Reprezentativni SAD patenti koji govore o pripremi PNK jedinjenja obuhvataju, ali nisu ograničeni na, U.S. Patent Nos.5,539,082; 5,714,331; i 5,719,262. Dodatna PNK jedinjenja pogodna za upotrebu u iRNK pronalaska su opisana, na primer, u Nielsen i dr., Science, 1991, 254, 1497-1500.
[0163] Neke implementacije uključuju RNK sa fosforotioat kičmama i oligonukleozide sa heteroatom kičmama, i posebno --CH2--NH--CH2-, --CH2-N(CH3)--O--CH2--[poznat kao metilen (metilimino) ili MMI kičma], --CH2--O-N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- i --N(CH3)--CH2--CH2--[gde je prirodna fosfodiester kičma predstavljena kao --O--P--O--CH2--] gore navedenog U.S. Patent No.5,489,677, i amid kičme gore navedenog U.S. Patent No.5,602,240. U nekim otelotvorenjima, RNK predstavljen ovde ima strukturu morfolino kičme gore navedenog U.S. Patent No.5,034,506.
[0164] Modifikovan RNK takođe može da sadrži jedan ili više supstituisan šećerni deo. iRNK, npr., dsRNK, predstavljen ovde može da uključi jedno od narednog na 2'-položaju: OH; F; O-, S-, ili N-alkil; O-, S-, ili N-alkenil; O-, S- ili N-alkinil; ili O-alkil-O-alkil, gde alkil, alkenil i alkinil mogu biti supstituisan ili ne supstituisani C1za C10alkil ili C2za C10alkenil i alkinil. Primerne odgovarajuće modifikacije uključuju O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, i O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, gde su n i m od 1 do oko 10. U drugim implementacijama, dsRNK uključuju jedno od narednog na 2' položaju: C1za C10niži alkil, supstituisan niži alkil, alkaril, aralkil, O-alkaril ili O-aralkil, SH, SCH3, OCN, CI, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocikloalkil, heterocikloalkaril, aminoalkilamino, polialkilamino, supstituisan silil, RNK cepajuća grupa, reporter grupa, interkalator, grupa za poboljšanje farmakokinetičkih osobina iRNK ili grupa za poboljšanje farmakodinamičkih svojstava iRNK i drugih supstituenata koji imaju slična svojstva. U nekim otelotvorenjima modifikacija uključuje 2'-metoksietoksi (2'O--CH2CH2OCH3, takođe poznat kao 2'-O-(2-metoksietil) ili 2'-MOE) (Martin i dr., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504) tj., alkoksi-alkoksi grupa. Druga primerna modifikacija je 2'-dimetilaminooksietoksi, tj., O(CH2)2ON(CH3)2grupa, takođe poznata kao 2'-DMAOE, kao što je opisano u dole navedenim primerima, i 2'-dimetilaminoetoksietoksi (takođe poznat u struci kao 2'-O-dimetilaminoetoksietil ili 2'-DMAEOE), tj., 2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2.
[0165] Ostale modifikacije uključuju 2'-metoksi (2'-OCH3), 2'-aminopropoksi (2'-OCH2CH2CH2NH2) i 2'-fluoro (2'-F). Slične modifikacije mogu se vršiti i na drugim položajima na RNK od iRNK, naročito na 3' položaju šećera na 3' terminalnom nukleotidu ili u 2'-5' vezanim dsRNK i na 5' položaju 5' terminalnog nukleotida. iRNK takođe mogu imati šećerne mimetike kao što su ciklobutilne grupe umesto pentofuranozilnog šećera.
Reprezentativni SAD patenti koji govore o pripremi takvih modifikovanih šećernih struktura uključuju, ali nisu ograničeni na, U.S. Pat. Nos.4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; i 5,700,920.
[0166] iRNK može takođe uključiti nukleobazu (često se u struci samo naziva „baza“) modifikacije ili supstitucije. Kad se ovde koristi, „nemodifikovane“ ili „prirodne“ nukleobaze uključuju purinske baze adenin (A) i guanin (G), i pirimidinske baze timin (T), citozin (C) i uracil (U). Modifikovane nukleobaze uključuju i druge sintetičke i prirodne nukleobaze kao što su dezoksi-timin (dT), 5-metilcitozin (5-me-C), 5-hidroksimetil citozin, ksantin, hipoksantin, 2-aminoadenin, 6-metil i drugi alkilni derivati adenina 2-tiotamin i 2-tiocitozin, 5-halouracil i citozin, 5-propinil uracil i citozin, 6-azo uracil, citozin i timin, 5-uracil (pseuduracil), 4-tiouracil, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalkil, 8-hidroksil anal i ostali 8-supstituisani adenini i guanini, 5-halo, posebno 5-bromo, 5-trifluorometil i drugi 5-supstituisani uracili i citozini, 7-metilgvanin i 7-metiladenin, 8-azaguanin i 8-azaadenin, 7-deazagvanin i 7-daazadenin i 3-deazaguanin i 3-deazaadenin. Dalje nukleobaze obuhvataju one obelodanjene u U.S. Pat. br.3,687,808, one obelodanjene u Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008; one obelodanjene u The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, strane 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990, one obelodanjene u Englisch i dr., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, i one obelodanjene u Sanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, strane 289-302, Crooke, S. T. i Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993. Određene od ovih nukleobaza su naročito korisne za povećanje afiniteta vezivanja oligomernih jedinjenja koja su navedena u pronalasku. Ovo uključuje 5-supstituisane pirimidine, 6-azapirimidine i N-2, N-6 i 0-6 supstituisane purine, uključujući 2-aminopropladenin, 5-propinilluracil i 5-propinilcitozin. Pokazano je da 5-metilcitozin supstitucije povećavaju stabilnost dupleksa nukleinske kiseline za 0,6-1,2°C (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp.276-278) i predstavljaju primerne bazne supstitucije, još više u kombinaciji sa 2'-O-metoksietil modifikacijama šećera.
[0167] Reprezentativni SAD patenti koji govore o pripremi nekih od gore pomenutih modifikovanih nukleobaza kao i drugih modifikovanih nukleobaza uključuju, ali nisu ograničeni na, gore pomenute U.S. Patent Nos. 3,687,808, 4,845,205; 5,130,30; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,681,941; 5,750,692; 6,015,886; 6,147,200; 6,166,197; 6,222,025; 6,235,887; 6,380,368; 6,528,640; 6,639,062; 6,617,438; 7,045,610; 7,427,672; i 7,495,088.
[0168] RNK od iRNK se takođe može modifikovati tako da uključuje jednu ili više zaključanih nukleinskih kiselina (LNK). Zaključana nukleinska kiselina je nukleotid koji ima modifikovan ribozni deo gde ribozni deo sadrži dodatni most koji povezuje 2' i 4' ugljenike. Ova struktura efikasno „zaključava“ ribozu u strukturalnoj konformaciji 3'-kraja. Pokazano je da dodavanje zaključanih nukleinskih kiselina u siRNK povećava stabilnost siRNK u serumu i smanjuje efekte van ciljan (Elmen, J. i dr., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. i dr., (2007) Mol Cane Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. i dr., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193).
[0169] Reprezentativni SAD patenti koji govore o pripremi nukleotida zaključanih nukleinskih kiselina uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće: U.S. Patent Nos.6,268,490; 6,670,461; 6,794,499; 6,998,484; 7,053,207; 7,084,125; i 7,399,845.
[0170] Potencijalno stabilizujuće modifikacije na krajevima molekula RNK mogu uključivati N-(acetilaminokaproil)-4-hidroksiprolol (Hip-C6-NHAc), N-(kaproil-4-hidroksiprolol (Hip-C6), N-(acetil-4-hidroksiprolol (Hip-NHAc), timidin-2'-0-dezoksitmidin (eter), N-(aminokaproil)-4-hidroksiprolol (Hip-C6-amino), 2-dokozanoil-uridin-3"-fosfat, invertovanu
4
bazu dT (idT) i druge. Obelodanjenje ove modifikacije se može naći u PCT objava No. WO 2011/005861.
A. Modifikovane iRNK koje sadrže motive pronalaska
[0171] U određenim aspektima, dvolančani RNKi agensi uključuju agense sa hemijskim modifikacijama kao što su obelodanjeni, na primer, u U.S. Provizorna prijava No.
61/561,710, podnesen 18. novembra 2011. ili u PCT/US2012/065691, podnesen 16. novembra 16, 2012.
[0172] Kao što je prikazano ovde i u Provizorna prijava No.61/561,710, superiorni rezultat se može dobiti uvođenjem jednog ili više motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida u smisao lancu i/ili antismisao lancu RNKi agensa, naročito na ili u blizini mesta cepanja. U nekim otelotvorenjima, smisao lanac i antismisao lanac RNKi agensa mogu inače biti potpuno modifikovani. Uvođenje ovih motiva prekida modifikacioni obrazac, ako je prisutan, smisao /ili antismisao lanca. RNKi agens može biti opciono konjugovan sa derivatom liganda GalNAc, na primer, na smisao lancu. Dobijeni agensi RNKi predstavljaju superiornu aktivnost utišavanja gena.
[0173] Preciznije, iznenađujuće je otkriveno da kada se smisao lanac i antismisao lanac dvolančanog RNKi agensa modifikuju da imaju jedan ili više motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida na ili blizu mesta cepanja od najmanje jednog lanca RNKi agensa, aktivnost utišavanja gena RNKi agensa je superiorno poboljšana.
[0174] U jednom otelotvorenju, RNKi agens je tup sa dva kraja i 19 nukleotida dužine, pri čemu smisao lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-F modifikacije na tri uzastopna nukleotida na položajima 7, 8, 9 od 5'kraja. Antismisao lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na položajima 11, 12, 13 od 5'kraja.
[0175] U drugoj implementaciji, RNKi agens je tup sa dva kraja i 20 nukleotida dužine, pri čemu smisao lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-F modifikacije na tri uzastopna nukleotida na položajima 8, 9, 10 od 5'kraja. Antismisao lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na položajima 11, 12, 13 od 5'kraja.
[0176] U još jednoj implementaciji, RNKi agens je tup sa dva kraja i 21 nukleotida dužine, pri čemu smisao lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-F modifikacije na tri uzastopna nukleotida na položajima 9, 10, 11 od 5' kraja. Antismisao lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na položajima 11, 12, 13 od 5'kraja.
[0177] U jednoj implementaciji, RNKi agens obuhvata 21 nukleotidni smisao lanac i 23 nukleotidni antismisao lanac, pri čemu smisao lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-F modifikacije na tri uzastopna nukleotida na položajima 9, 10, 11 od 5'kraja; antismisao lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na položajima 11, 12, 13 od 5'kraja, pri čemu je jedan kraj RNKi agensa tup, dok drugi kraj sadrži 2 nukleotidna prepusta. Poželjno je da se 2 nukleotidna prepusta nalaze na 3'-kraju antismisao lanca. Kada je 2 nukleotidni prepust na 3'-kraju antismisao lanca, mogu biti dve fosforotioatne internukleotidne veze između terminala tri nukleotida, pri čemu su dva od tri nukleotida prepusta, a treći nukleotid je uparen nukleotid pored prepust nukleotida. U jednoj implementaciji, RNKi agens dodatno ima dve fosforotioatne internukleotidne veze između terminala tri nukleotida na oba 5'-kraja smisao lanca i na 5'-kraju antismisao lanca. U jednoj implementaciji, svaki nukleotid u smisao lancu i antismisao lancu RNKi agensa, uključujući i nukleotide koji su deo motiva, su modifikovani nukleotidi. U jednom otelotvorenju svaki ostatak je nezavisno modifikovan sa 2'-O-metilom ili 3'-fluorom, npr., u naizmeničnom motivu. Opciono, RNKi agens dalje sadrži ligand (poželjno GalNAc3).
[0178] U jednoj implementaciji, RNKi agens ima smisao i antismisao lance, pri čemu RNKi agens sadrži prvi lanac koji ima dužinu koja je najmanje 25, a najviše 29 nukleotida, i drugi lanac koji ima dužinu koja je najmanje 30 nukleotida, sa najmanje jednim motivom od tri 2'-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na položaju 11, 12, 13 od 5'kraja; pri čemu 3' kraj prvog lanca i 5' kraj drugog lanca čine tupi kraj, a drugi lanac je 1-4 nukleotida duži na svom 3' kraju od prvog lanca, pri čemu je dupleks regija koja je najmanje 25 nukleotida dužine, i druga lanac je dovoljno komplementaran ciljanoj mRNK uz najmanje 19 nukleotida dužine drugog lanca da smanji eksprimiranje ciljanog gena kada je RNKi agens uveden u sisarsku ćeliju, i pri čemu dicer cepanje RNKi agensa poželjno rezultuje u siRNK koja sadrži 3' kraj drugog lanca, čime se smanjuje eksprimiranje ciljanog gena kod sisara. Opciono, RNKi agens dalje sadrži ligand.
[0179] U jednoj implementaciji, smisao lanac RNKi agensa sadrži najmanje jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, pri čemu se jedan od motiva javlja na mestu cepanja u smisao lanca.
[0180] U jednoj implementaciji, antismisao lanac RNKi agensa može takođe sadržati najmanje jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, gde se jedan od motiva javlja na ili u blizini mesta cepanja u antismisao lancu.
[0181] Za RNKi agens koji ima dupleks regiju od 17 do 23 nukleotida dužine, mesto cepanja antismisao lanca je tipično oko položaja 10, 11 i 12 od 5'-kraja. Tako se mogu pojaviti motivi od tri identične modifikacije na položajima 9, 10, 11; položajima 10, 11, 12; položajima 11, 12, 13; položajima 12, 13, 14; ili položajima 13, 14, 15 antismisao lanca, brojanje počinje od prvog nukleotida od 5'-kraja antismisao lanca, ili brojanje počinje od prvog uparenog nukleotid u dupleks regiji od 5'-kraja antismisao lanca. Mesto cepanja u antismisao lancu se takođe može promeniti prema dužini dupleks regije RNKi od 5'-kraja.
[0182] Smisao lanac RNKi agensa može sadržati najmanje jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida na mestu cepanja lanca; a antismisao lanac može imati najmanje jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida na ili blizu mesta cepanja lanca. Kada smisao lanac i antismisao lanac formiraju dsRNK dupleks, smisao lanac i antismisao lanac mogu biti tako usklađeni da jedan motiv od tri nukleotida na smisao lancu i jedan motiv od tri nukleotida na antismisao lancu koji ima najmanje jedno nukleotidno preklapanje, tj., barem jedan od tri nukleotida motiva u smisao lancu stvara bazni par sa najmanje jednim od tri nukleotida motiva u antismisao lancu. Alternativno, najmanje dva nukleotida se mogu preklapati, ili se sva tri nukleotida mogu preklapati.
[0183] U jednoj implementaciji, smisao lanac RNKi agensa može sadržati više od jednog motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida. Prvi motiv može da se pojavi na ili blizu mesta cepanja lanca, a drugi motivi mogu biti krilne modifikacije. Izraz „krilne modifikacije“ ovde se odnosi na motiv koji se javlja na drugom delu lanca koji je odvojen od motiva na ili u blizini mesta cepanja istog lanca. Krilne modifikacije je ili susedna prvom motivu ili je odvojena najmanje jednim ili više nukleotida. Kada su motivi direktno susedni, onda se hemija motiva razlikuje jedna od druge, a kada su motivi odvojeni jednim ili više nukleotida, tada hemija može biti ista ili različita. Moguće su prisutne dve ili više krilne modifikacije. Na primer, kada su prisutne dve krilne modifikacije, svaka krilne modifikacije
4
može se pojaviti na jednom kraju u odnosu na prvi motiv koji je na ili u blizini mesta cepanja ili na obe strane glavnog motiva.
[0184] Kao i smisao lanac, antismisao lanac RNKi agensa može sadržati više od jednog motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, sa najmanje jednim od motiva koji se javljaju na ili u blizini mesta cepanja lanca. Ova antismisao lanac može takođe sadržati jednu ili više krilne modifikacije u poravnanju sličnom krilnim modifikacijama koje mogu biti prisutne na smisao lancu.
[0185] U jednoj implementaciji, krilne modifikacije na smisao lancu ili antismisao lancu RNKi agensa obično ne uključuje prvih jedan ili dva terminalna nukleotida na 3'-kraju, 5'-kraju ili oba kraja lanca.
[0186] U drugoj implementaciji, krilne modifikacije na smisao lancu ili antismisao lancu RNKi agensa obično ne uključuje prvih jedan ili dva uparena nukleotida u dupleks regiji na 3'-kraju, 5'-kraju ili oba kraja lanca.
[0187] Kada smisao i antismisao lanac RNKi agensa sadrže najmanje jednu krilnu modifikaciju, krilne modifikacije mogu pasti na istom kraju dupleks regije i imaju preklapanje jednog, dva ili tri nukleotida.
[0188] Kada smisao lanac i antismisao lanac RNKi agensa sadrže najmanje dve krilne modifikacije, smisao i antismisao lanac mogu biti tako usklađeni da dve modifikacije, svake od jednog lanca, pada na jedan kraj dupleks regije, koji imaju preklapanje od jednog, dva ili tri nukleotida; dve modifikacije od svake lanca padaju na drugom kraju dupleks regije, koji imaju preklapanje od jednog, dva ili tri nukleotida; dve modifikacije od svakog lanca padaju na svaku stranu glavnog motiva, koji ima preklapanje od jednog, dva ili tri nukleotida u dupleks regiji.
[0189] U jednoj implementaciji, svaki nukleotid u smisao lancu i antismisao lancu RNKi agensa, uključujući i nukleotide koji su deo motiva, mogu se modifikovati. Svaki nukleotid može biti modifikovan sa istom ili različitom modifikacijom koja može uključivati jednu ili više izmena jednog ili oba ne-vezujuća fosfatna kiseonika i/ili jednog ili više vezujućeg fosfatnog kiseonika; izmena sastava riboza šećera, npr., 2'hidroksila na riboza šećeru; sveobuhvatna zamena fosfatnog ostatka sa „defosfo“ veznicima; modifikacija ili zamena prirodne baze; i zamena ili modifikacija riboza-fosfat kičme.
[0190] Pošto su nukleinske kiseline polimeri podjedinica, mnoge od modifikacija se javljaju na položaju koji se ponavlja unutar nukleinske kiseline, npr., modifikaciju baze ili fosfatnog ostatka ili ne vezujućeg O od fosfatnog ostatka. U nekim slučajevima modifikacija će se pojaviti na svim predmetnim položajima u nukleinskoj kiselini, ali u mnogim slučajevima neće. Kao primer, modifikacija se može pojaviti samo na 3' ili 5' terminalnim položajima, može se desiti samo u terminalnoj regiji, npr., na položaju na terminalnom nukleotidu ili na poslednja 2, 3, 4, 5 ili 10 nukleotida lanca. Modifikacija može da se desi u dvolančanoj regiji, jednolančanoj regiji, ili u obe. Modifikacija se može pojaviti samo u dvolančanoj regiji RNK ili se može pojaviti samo u jednolančanoj regiji RNK. Na primer, modifikacija fosforotiata na ne vezujućem O položaju može se pojaviti samo na jednom ili oba termina, može se pojaviti samo u terminalnoj regiji, npr., u položaju na terminalnom nukleotidu ili na poslednja 2, 3, 4, 5 ili 10 nukleotida lanca, ili može da se pojavi u dvolančanim i jednolančanim regijama, naročito na terminima. 5'kraj ili krajevi mogu biti fosforilisani.
[0191] Možda je moguće, npr., kako bi se povećala stabilnost, uključiti određene baze u prepuste ili uključiti modifikovane nukleotida ili nukleotidne surogate, npr., u 5' ili 3' prepust, ili u oba. Na primer, može biti poželjno uključiti purinska nukleotide u prepuste. U nekim otelotvorenjima mogu se modifikovati sve ili neke od baza u u 3' ili 5 prepustima' npr., sa modifikacijom opisanom ovde. Modifikacije mogu uključivati, npr., upotrebu modifikacije na položaju 2' riboza šećera sa modifikacijama koje su poznate u struci, npr., upotreba dezoksiribonukleotida, 2'-dezoksi-2'-fluoro (2'-F) ili 2'-O-metil modifikovan umesto ribošećera nukleobaze, i modifikacije u fosfatnoj grupi, npr., modifikacije fosforotiata.
Prepusti ne moraju biti homologni sa ciljanom sekvencom.
[0192] U jednoj implementaciji, svaki ostatak smisao lanca i antismisao lanca je nezavisno modifikova sa LNK, HNK, CeNA, 2'-metoksietil, 2'-O-metil, 2'-O-alil, 2'-C-alil, 2' -dezoksi, 2'-hidroksil ili 2'-fluoro. Lanci mogu sadržati više od jedne modifikacije. U jednoj implementaciji, svaki ostatak smisao lanca i antismisao lanca je nezavisno modifikovan sa 2'-O-metilom ili 2'-fluorom.
4
[0193] Najmanje dve različite modifikacije obično su prisutne na smisao lancu i antismisao lancu. Ove dve modifikacije mogu biti 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije, ili druge.
[0194] U jednoj implementaciji, Nai/ili Nbobuhvataju modifikacije naizmeničnog šablona. Izraz „naizmenični motiv“ kad se ovde koristi odnosi se na motiv koji ima jednu ili više modifikacija, gde se svaka modifikacija javlja na naizmeničnim nukleotidima jednog lanca. Naizmenični nukleotid može se odnositi na jedan po svakom drugom nukleotidu ili jedan po svaka tri nukleotida, ili sličan obrazac. Na primer, ako A, B i C predstavljaju jednu vrstu modifikacije nukleotida, naizmenični motivi mogu biti „ABABABABABAB...“, „AABBAABBAABB...,“ „AABAABAABAAB...,“ „AAABAAABAAAB.., „AAABBBAAABBB...,“ ili „ABCABCABCABC...,“ itd.
[0195] Tip modifikacija sadržan u naizmeničnom motivu može biti isti ili različit. Na primer, ako od A, B, C, D svaki predstavlja jednu vrstu modifikacije na nukleotidu, naizmenični obrazac, tj., modifikacije na svakom drugom nukleotidu mogu biti iste, ali svaki od smisao lanca ili antismisao lanca može se odabrati iz nekoliko mogućnosti modifikacija unutar naizmeničnog motiva kao što su „ABABAB...“, „ACACAC...“ „BDBDBD...“ ili „CDCDCD...“ itd.
[0196] U jednoj implementaciji, RNKi agens obuhvata modifikacioni obrazac za naizmenični motiv na smisao lancu u odnosu na modikacioni obrazac za naizmenični motiv na antismisao lancu. Smena može biti takva da modifikovana grupa nukleotida smisao lanca odgovara različito modifikovanoj grupi nukleotida antismisao lanca i obrnuto. Na primer, smisao lanca kada su upari sa antismisao lancem u dsRNK dupleksu, naizmenični motiv u smisao lancu može započeti sa „ABABAB“ od 5'-3' od lanca i naizmenični motiv u antismisao lancu može početi sa „BABABA“ od 5'-3' lanca u dupleks regiji. Kao još jedan primer, naizmenični motiv u smisao lancu može početi sa „AABBAABB“ od 5'-3' od lanca i naizmenični motiv u antismisao lancu može početi sa „BBAABBAA“ od 5'-3' od lanca unutar dupleks regije, tako da postoji potpuna ili parcijalna promena modifikacionih obrazaca između smisao i antismisao lanca.
[0197] U jednoj implementaciji, RNKi agens obuhvata obrazac naizmeničnog motiva 2'-O-metil modifikacije i 2'-F modifikacije na smisao lancu, koji u početku imaju promenu u
4
odnosu na obrazac naizmeničnog motiva 2'-O- metil modifikacije i 2'-F modifikaciju na antismisao lancu u početku, tj., 2'-O-metil modifikovan nukleotidu na baznim parovima smisao lanca sa 2'-F modifikovanim nukleotidom na antismisao lancu i obratno. Položaj 1 smisao lanca može početi sa 2'-F modifikacijom, a položaj 1 antismisao lanca može početi sa 2'-O-metil modifikacijom.
[0198] Uvođenje jednog ili više motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida do smisao lanca i/ili antismisao lanca prekida inicijalnu modifikaciju koja je prisutna u smisao lancu i/ili antismisao lancu. Ovaj prekid modifikacionog obrasca smisao lanca i/ili antismisao lanca uvođenjem jednog ili više motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida do smisao lanca i/ili antismisao lanca iznenađujuće povećava aktivnost utišavanja gena za ciljani gen.
[0199] U jednoj implementaciji, kada je motiv tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida uveden u bilo koju od ćelija, modifikacija nukleotida pored motiva je drugačija modifikacija od modifikacije motiva. Na primer, deo sekvence koji sadrži motiv je „...NaYYYNb...“ gde „Y“ predstavlja modifikaciju motiva tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, i „Na“ i „Nb“ predstavljaju modifikaciju nukleotida pored motiva „YYY“ koja je različita od modifikacije Y, i gde je Nai Nbmogu biti iste ili različite modifikacije. Alternativno, Nai/ili Nbmogu biti prisutni ili odsutni kada postoji prisutna krilne modifikacije.
[0200] RNKi agens može dalje da sadrži bar jednu fosforotioatnu ili metilfosfonatnu internukleotidnu vezu. Modifikacija fosfrotioata ili metilfosfonata internukleotidne veze može se pojaviti na bilo kom nukleotidu smisao lanca ili antismisao lanca ili oba lanca u bilo kom položaju lanca. Na primer, modulacija internukleotidne povezanosti može se pojaviti na svakom nukleotidu na smisao lancu i/ili antismisao lancu; svaka modifikacija internukleotidnog vezivanja može se pojaviti u naizmeničnom obrascu na smisao lancu i/ili antismisao lancui; ili smisao lanac ili antismisao lanac mogu sadržati obe modifikacije interkutkotidnog vezivanja u naizmeničnom obrascu. Naizmenični obrazac modifikacije internukleotidnog vezivanja na smisao lancu može biti isti ili različit od antismisaoivne lanca, a naizmenični obrazac modifikovanja internukleotidne veze na smisao lancu može imati promenu u odnosu na naizmenični obrazac internukleotidne modifikacije veze na antismisao lancu.
4
[0201] U jednoj implementaciji, RNKi obuhvata modifikaciju internukleotidne veze fosforotioata ili metilfosfonata u regiji prepusta. Na primer, regija prepusta može sadržati dva nukleotida koji imaju fosforotioatnu ili metilfosfonatnu internukleotidnu vezu između dva nukleotida. Moguće je izvršiti i modifikovanje vezivanja interklukleotida kako bi se vezali nukleotidi prepusta sa terminalnim nukleotidima u okviru dupleks regije. Na primer, najmanje 2, 3, 4 ili svi nukleotidi prepusta mogu biti povezani kroz internukleotidnu vezu između fosforotiata ili metilfosfonata, i opciono, mogu se pojaviti i dodatne fosforotioatne ili metilfosfonatne internukleotidne veze koji povezuju nukleotid prepusta sa uparenim nukleotidom koji je pored nukleotida prepusta. Na primer, može biti najmanje dve fosforotioatne internukleotidne veze između terminala tri nukleotida, u kojima su dva od tri nukleotida nukleotidi prepusta, a treća je upareni nukleotid pored nukleotida prepusta. Ovi terminali tri nukleotida mogu biti na 3'-kraju antismisao lanca, 3'-kraju smisao lanca, 5'-kraju antismisao lanca i/ili 5'kraju antismisao lanca.
[0202] U jednoj implementaciji, 2 nukleotidni prepust je na 3'-kraju antismisao lanca, i postoje dve fosforotioatne internukleotidne veze između terminala tri nukleotida, pri čemu su dva od tri nukleotida nukleotidi prepusta, a treći nukleotid je uparen nukleotid pored nukleotida prepusta. Opciono, RNKi agens može dodatno imati dve fosforotioatne internukleotidne veze između terminala tri nukleotida i na 5'-kraju smisao lanca i na 5'-kraju antismisao lanca.
[0203] U jednoj implementaciji, RNKi agens sadrži neusklađenosti sa ciljem, unutar dupleksa ili njihovih kombinacija. „Neusklađenost“ može biti ne-kanoničko bazno uparivanje ili neko drugo osim kanoničkog uparivanja nukleotida. Neusklađenost se može javiti u regiji prepusta ili regiji dupleksa. Bazni par može biti rangiran na osnovu svoje sklonosti da promoviše disocijaciju ili topljenje (npr., na slobodnoj energiji asocijacije ili disocijacije određenog para, najjednostavnije je ispitati parove pojedinačno, iako se može koristiti i susedna ili slična analiza). U smislu promovisanja disocijacije: A:U je poželjan u odnosu na G:C; G:U je poželjan u odnosu na G:C; i I:C je poželjan i odnosu na G: C (I = inozin). Neusklađenosti, npr., ne-kanonički ili ne-kanonički parovi (kao što je opisano na drugom mestu ovde) poželjnije su u odnosu na kanoničke (A:T, A:U, G:C) parove; i parovi koji uključuju univerzalnu bazu su poželjniji u odnosu na kanoničke parove. „Univerzalna baza“ je baza koja pokazuje sposobnost zamene bilo koje od četiri normalne baze (G, C, A i U) bez
4
značajnog destabilizovanja susednih interakcija baznih parova ili remećenja očekivane funkcionalne biohemijske upotrebe modifikovanog oligonukleotida. Neograničavajući primeri univerzalnih baza uključuju 2'-dezoksiinzin (hipoksantin dezoksinukleotid) ili njegove derivate, analoge nitroazola i hidrofobne aromatične bazične ne-vodonik-vezujuće baze.
[0204] U jednoj implementaciji, RNKi agens sadrži najmanje jedan od prvih 1, 2, 3, 4 ili 5 baznih parova u dupleks regijama od 5'-kraja antismisao lanca koje se nezavisno biraju iz grupe koju čine: A:U , G:U, I:C i neusklađeni parovi, npr., ne-kanonički ili drugi osim kanoničkih parova ili parovi koji uključuju univerzalnu bazu, kako bi se promovisala disocijacija antismisao lanca na 5'-kraju dupleksa.
[0205] U jednoj implementaciji, nukleotid na položaju 1 u dupleks regiji od 5'-kraja u antismisao lancu je izabran iz grupe koju čine A, dA, dU, U i dT. Alternativno, bar jedan od prvih 1, 2 ili 3 baznih parova unutar dupleks regije od 5'-kraja antismisao lanca je AU bazni par. Na primer, prvi bazni par unutar dupleks regije od 5'-kraja antismisao lanca je AU bazni par.
[0206] U drugoj implementaciji, nukleotid na 3'-kraju smisao je dezoksi-timin (dT). U još jednom otelotvorenju, nukleotid na 3'-kraju antismisao lanca je dezoksi-timin (dT). U jednoj implementaciji postoji kratka sekvenca dezoksi-timin nukleotida, na primer, dva dT nukleotida na 3'-kraju smisao lanca i/ili antismisao lanca.
[0207] U jednom otelotvorenju, sekvenca smisao lanca može biti predstavljena formulom (I):
5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3' (I)
gde:
i i j su svaki nezavisno 0 ili 1;
p i q su svaki nezavisno 0-6;
svaki Nanezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 0-25 modifikovan nukleotidi, gde svaka sekvenca obuhvata barem dva različito modifikovana nukleotida;
4
svaki Nbnezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 0-10 modifikovana nukleotida;
svaki npi nqnezavisno predstavlja nukleotid prepusta;
gde Nb i Y nemaju istu modifikaciju; i
XXX, YYY i ZZZ svaki nezavisno predstavlja jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida. Poželjno YYY su svi 2'-F modifikovani nukleotidi.
[0208] U jednoj implementaciji, Nai/ili Nbobuhvataju modifikacije naizmeničnog obrasca.
[0209] U jednoj implementaciji, YYY motiv se javlja na ili blizu mesta cepanja smisao lanca. Na primer, kada RNKi agens ima dupleks regiju o17-23 nukleotida dužine, YYY motiv može da se javi na ili blizu mesta cepanja (npr.: može da se javi na položajima 6, 7, 8, 7, 8, 9, 8, 9, 10, 9, 10, 11, 10, 11,12 ili 11, 12, 13) od - smisao lanca, brojanje počinje od prvog nukleotida, od 5'-kraja; ili opciono, brojanje počinje od prvog uparenog nukleotida unutar dupleks regije, od 5'- kraja.
[0210] U jednoj implementaciji, i je 1 i j je 0, ili i je 0 i j je 1, ili oba od i i j su 1. Smisao lanac stoga može biti predstavljen narednim formulama:
5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3' (Ib);
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq3' (Ic);
ili
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3' (Id).
[0211] Kada je smisao lanac predstavljen formulom (Ib), Nbpredstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovana nukleotida. Svaki Nanezavisno može da predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovana nukleotida.
[0212] Kada je smisao lanac predstavljen kao formula (Ic), Nbpredstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovana nukleotida. Svaki Namože nezavisno da predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovana nukleotida.
[0213] Kada je smisao lanac predstavljen kao formula (Id), svaki Nbnezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovana nukleotida. Poželjno, Nbje 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 svaki Namože nezavisno da predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovana nukleotida.
[0214] Svaki od X, Y i Z može biti isti ili različit od svakog drugog.
[0215] U drugim implementacijama, i je 0 i j je 0, i smisao lanac može biti predstavljen formulom:
5' np-Na-YYY-Na-nq3' (Ia).
[0216] Kada je smisao lanac predstavljen formulom (Ia), svaki Nanezavisno može da predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovana nukleotida.
[0217] U jednom otelotvorenju, sekvenca antismisao lanca od RNKi može biti predstavljena formulom (II):
5' nq'-Na'-(Z'Z'Z')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(X'X'X')l-N'a-np' 3' (II)
gde:
k i l su svaki nezavisno 0 ili 1;
p' i q' su svaki nezavisno 0-6;
svaki Na' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 0-25 modifikovan nukleotidi, gde svaka sekvenca obuhvata barem dva različito modifikovana nukleotida;
svaki Nb' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 0-10 modifikovan nukleotidi;
1
svaki np' i nq' nezavisno predstavlja nukleotid prepusta;
gde Nb' i Y' nemaju istu modifikaciju;
i
X'X'X', Y'Y'Y' i Z'Z'Z' svaki nezavisno predstavlja jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida.
[0218] U jednoj implementaciji, Na' i/ili Nb' obuhvataju modifikacije naizmeničnog obrasca.
[0219] Y'Y'Y' motiv se javlja na ili blizu mesta cepanja od antismisao lanca. Na primer, kada RNKi agens ima dupleks regiju od 17-23 nukleotida dužine, Y'Y'Y' motiv može da se javi na položajima 9, 10, 11;10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14 ; ili 13, 14, 15 od antismisao lanca, gde brojanje počinje od prvog nukleotida, od 5'-kraja; ili opciono, brojanje počinje od prvog uparenog nukleotida unutar dupleks regije, od 5'- kraja. Poželjno, Y'Y'Y' motiv se javlja na položajima 11, 12, 13.
[0220] U jednoj implementaciji, Y'Y'Y' motiv su svi 2'-OMe modifikovani nukleotidi.
[0221] U jednoj implementaciji, k je 1 i l je 0, ili k je 0 i l je 1, ili oba od k i l su 1.
[0222] Antismisao lanac stoga može biti predstavljen narednim formulama:
5' nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-np'3' (IIb);
5' nq'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-np'3' (IIc);
ili
5' nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-Na'-np'3' (IId).
[0223] Kada je antismisao lanac predstavljen formulom (IIb), Nb' predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovana nukleotida. Svaki Na' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovana nukleotida.
2
[0224] Kada je antismisao lanac predstavljen kao formula (IIc), Nb' predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja sadrži 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovana nukleotida. Svaki Na' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovana nukleotida.
[0225] Kada je antismisao lanac predstavljen kao formula (IId), svaki Nb' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovana nukleotida. Svaki Na' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovana nukleotida. Poželjno, Nbje 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6.
[0226] U drugim implementacijama, k je 0 i l je 0 i antismisao lanac može biti predstavljen formulom:
5' np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-nq'3' (Ia).
[0227] Kada je antismisao lanac predstavljen kao formula (IIa), svaki Na' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovana nukleotida.
[0228] Svaki od X', Y' i Z' može biti isti ili različit od svakog drugog.
[0229] Svaki nukleotid smisao lanca i antismisao lanca može biti nezavisno modifikovan sa LNK, HNK, CeNA, 2'-metoksietil, 2'-O-metil, 2'-O-allil, 2'-C- allil, 2'-hidroksil, ili 2'-fluoro. Na primer, svaki nukleotid smisao lanca i antismisao lanca je nezavisno modifikovan sa 2'-O-metil ili 2'-fluoro. Svaki X, Y, Z, X', Y' i Z', Posebno, može da predstavlja 2'-O-metil modifikaciju ili 2'-fluoro modifikaciju.
[0230] U jednoj implementaciji, smisao lanac RNKi agensa može da sadrži YYY motiv koji se javlja na 9, 10 i 11 položajima lanca kada je dupleks regija 21 nt, brojanje počinje od prvog nukleotida od 5'-kraja, ili opciono, brojanje počinje od prvog uparenog nukleotida unutar dupleks regije, od 5'- kraja; i Y predstavlja 2'-F modifikaciju. Smisao lanac može dodatno da sadrži XXX motiv ili ZZZ motive kao krilne modifikacije na suprotnom kraju dupleks regije; i XXX i ZZZ svaki nezavisno predstavlja 2'-OMe modifikaciju ili 2'-F modifikaciju.
[0231] U jednoj implementaciji antismisao lanac može da sadrži Y'Y'Y' motiv koji se javlja na položajima 11, 12, 13 lanca, brojanje počinje od prvog nukleotida od 5'-kraja, ili opciono, brojanje počinje od prvog uparenog nukleotida unutar dupleks regije, od 5'- kraja; i Y' predstavlja 2'-O-metil modifikacija. antismisao lanac može dodatno da sadrži X'X'X' motiv ili Z'Z'Z' motive kao krilne modifikacije na suprotnom kraju dupleks regije; i X'X'X' i Z'Z'Z' svaki nezavisno predstavlja 2'-OMe modifikaciju ili 2'-F modifikaciju.
[0232] Smisao lanac predstavljen bilo kojom od gore navedenih formula (Ia), (Ib), (Ic), i (Id) formira dupleks sa antismisao lancem koji je predstavljen bilo kojom od formula (IIa), (IIb); (IIc), i (IId), respektivno.
[0233] Prema tome, RNKi agensi za primenu u opisanim postupcima mogu da obuhvataju smisao lanac i antismisao lanac, gde svaki lanac ima 14 do 30 nukleotida, RNKi dupleks je predstavljen formulom (III):
gde:
i, j, k, i l su svaki nezavisno 0 ili 1;
p, p', q, i q' su svaki nezavisno 0-6;
svaki Nai Na' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 0-25 modifikovan nukleotidi, gde svaka sekvenca obuhvata barem dva različito modifikovana nukleotida;
svaki Nbi Nb' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 0-10 modifikovan nukleotidi; gde
svaki np', np, nq', i nq, od kojih svaki može ali ne mora da bude prisutan, nezavisno predstavljaju nespareni nukleotid; i
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', i Z'Z'Z' svaki nezavisno predstavlja jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida.
[0234] U jednoj implementaciji, i je 0 i j je 0; ili i je 1 i j je 0; ili i je 0 i j je 1; ili oba od i i j su 0; ili oba od i i j su 1. U drugoj implementaciji, k je 0 i l je 0; ili k je 1 i l je 0; k je 0 i l je 1; ili oba od k i l su 0; ili oba od k i l su 1.
4
[0235] Primerne kombinacije smisao lanca i antismisao lanca koji formiraju RNKi dupleks uključuju formule u nastavku:
[0236] Kada je RNKi agens predstavljen formulom (IIIa), svaki Nanezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovana nukleotida.
[0237] Kada je RNKi agens predstavljen formulom (IIIb), svaki Nbnezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 1-10, 1-7, 1-5 ili 1-4 modifikovana nukleotida. Svaki Nanezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovana nukleotida.
[0238] Kada je RNKi agens predstavljen kao formula (IIIc), svaki Nb, Nb' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovana nukleotida. Svaki Nanezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovana nukleotida.
[0239] Kada je RNKi agens predstavljen kao formula (IIId), svaki Nb, Nb' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili O modifikovana nukleotida. Svaki Na, Na' nezavisno predstavlja oligonukleotidnu sekvencu koja obuhvata 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovana nukleotida. Svaki od Na, Na', Nbi Nb' nezavisno obuhvata modifikacije naizmeničnog obrasca.
[0240] Svaki od X, Y i Z u formulama (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), i (IIId) može biti isti ili različit od svakog drugog.
[0241] Kada je RNKi agens predstavljen formulom (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), i (IIId), barem jedan od Y nukleotida može da formira bazni par sa jednim od Y' nukleotida. Alternativno, barem dva od Y nukleotida formiraju bazne parove sa odgovarajućim Y' nukleotidima; ili sva tri od Y nukleotida svi formiraju bazne parove sa odgovarajućim Y' nukleotidima.
[0242] Kada je RNKi agens predstavljen formulom (IIIb) ili (IIId), barem jedan od Z nukleotida može da formira bazni par sa jednim od Z' nukleotida. Alternativno, barem dva od Z nukleotida formiraju bazne parove sa odgovarajućim Z' nukleotidima; ili sva tri od Z nukleotida svi formiraju bazne parove sa odgovarajućim Z' nukleotidima.
[0243] Kada je RNKi agens predstavljen kao formula (IIIc) ili (IIId), barem jedan od X nukleotida može da formira bazni par sa jednim od X' nukleotida. Alternativno, barem dva od X nukleotida formiraju bazne parove sa odgovarajućim X' nukleotidima; ili sva tri od X nukleotida svi formiraju bazne parove sa odgovarajućim X' nukleotidima.
[0244] U jednoj implementaciji, modifikacija na Y nukleotidu je različit nego modifikacija na Y' nukleotidu, modifikacija na Z nukleotidu je različit nego modifikacija na Z' nukleotidu, i/ili modifikacija na X nukleotidu je različit nego modifikacija na X' nukleotidu.
[0245] U jednoj implementaciji, kada je RNKi agens predstavljen formulom (IIId), Namodifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije. U drugoj implementaciji, kada je RNKi agens predstavljen formulom (IIId), Namodifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije i np' >0 i barem jedan np' je vezan za susedni nukleotid putem fosfortioatne veze. U još jednoj implementaciji, kada je RNKi agens predstavljen formulom (IIId), Namodifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije , np' >0 i barem jedan np' je vezan za susedni nukleotid putem fosfortioatne veze, i smisao lanac je konjugovan na jedan ili više GalNAc derivat vezan kroz bivalentni ili trivalentni razgranati veznik. U drugoj implementaciji, kada je RNKi agens predstavljen formulom (IIId), Namodifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije , np' >0 i barem jedan np' je vezan za susedni nukleotid putem fosfortioatne veze, smisao lanac obuhvata barem jedan fosforotioat veznik, i smisao lanac je konjugovan na jedan ili više GalNAc derivat vezan kroz bivalentni ili trivalentni razgranati veznik.
[0246] U jednoj implementaciji, kada je RNKi agens predstavljen formulom (IIIa), Namodifikacije su 2'-O-metil ili 2'-fluoro modifikacije , np' >0 i barem jedan np' je vezan za susedni nukleotid putem fosfortioatne veze, smisao lanac obuhvata barem jedan fosforotioat veznik, i smisao lanac je konjugovan na jedan ili više GalNAc derivat vezan kroz bivalentni ili trivalentni razgranati veznik.
[0247] U jednoj implementaciji, RNKi agens je multimer koji sadrži barem dva dupleksa predstavljena formulom (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), i (IIId), gde su dupleksi povezani veznikom. Veznik može da bude cepljiv ili necepljiv. Opciono, multimer dalje obuhvata ligand. Svaki od dupleksa može da cilja isti gen ili dva različita gena; ili svaki od dupleksa može da cilja isti gen na dva različita mesta ciljanja.
[0248] U jednoj implementaciji, RNKi agens je multimer koji sadrži tri, četiri, pet, šest ili više dupleksa predstavljena formulom (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), i (IIId), gde su dupleksi povezani veznikom. Veznik može da bude cepljiv ili necepljiv. Opciono, multimer dalje obuhvata ligand. Svaki od dupleksa može da cilja isti gen ili dva različita gena; ili svaki od dupleksa može da cilja isti gen na dva različita mesta ciljanja.
[0249] U jednoj implementaciji, dva RNKi agensa predstavljena formulom (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), i (IIId) su vezana za svaki drugi na 5' kraju, i jedan ili oba 3' kraja, i opciono su konjugovani za ligand. Svaki od agenasa može da cilja isti gen ili dva različita gena; ili svaki od agenasa može da cilja isti gen na dva različita mesta ciljanja.
[0250] Različite publikacije opisuju multimerne RNKi agense koji se mogu koristiti u postupcima pronalaska. Takve publikacije uključuju WO2007/091269, US Patent No.
7858769, WO2010/141511, WO2007/117686, WO2009/014887 i WO2011/031520.
[0251] RNKi agens koji sadrži konjugacije jednog ili više ugljovodonična dela za RNKi agens može optimizovati jedno ili više svojstava RNKi agensa. U mnogim slučajevima, ugljovodonični deo će biti vezan za modifikovanu podjedinicu RNKi agensa. Na primer, ribozni šećer jedne ili više ribonukleotidnih podjedinica dsRNK agensa može se zameniti drugim delom, npr., ne-ugljovodonični (poželjno ciklični) nosač za koji je vezan ugljovodonični ligand. Ribonukleotidna podjedinica u kojoj je ribozni šećer podjedinica tako zamenjena ovde se ovde pominje kao podjedinica za modifikaciju zamene riboze (RRMS). Ciklični nosač može biti karbociklični prstenasti sistem, tj., svi atomi prstena su atomi ugljenika, ili heterociklični prstenasti sistem, tj., jedan ili više atoma prstena mogu biti heteroatom, npr., azot, kiseonik, sumpor. Ciklični nosač može biti monociklični prstenasti sistem ili može sadržati dva ili više prstenova, npr. spojeni prstenovi. Ciklični nosač može biti potpuno zasićeni prstenasti sistem ili može sadržati jednu ili više dvolančanih veza.
[0252] Ligand može biti vezan za polinukleotid preko nosača. Nosači uključuju (i) najmanje jednu „tačku vezivanja kičme“, poželjno dve „tačke vezivanja kičme“ i (ii) najmanje jednu „tačku pričvršćivanja vezivanja.“ „Tačka pričvršćivanja vezivanja“, kad se ovde koristi, odnosi se na funkcionalnu grupu, npr. hidroksil grupu ili generalno dostupnu veza, i koja je pogodna za obuhvatanje nosača u kičmu, npr., fosfata ili modifikovanog fosfata, npr., sumpor, kičma, ribonukleinska kiselina. „Tačka pričvršćivanja vezivanja“ (TAP) u nekim otelotvorenjima odnosi se na sastavni atom prstena cikličkog nosača, npr., atom ugljenika ili heteroatom (koji se razlikuje od atoma koji pruža tačku vezivanja kičme), koji povezuje izabranu grupu. Ostatak može biti, npr., ugljovodonik, npr. monosaharid, disaharid, trisaharid, tetrasaharid, oligosaharid i polisaharid. Opciono, izabrani deo je preko intervenišućeg veznika povezan sa cikličnim nosačem. Dakle, ciklični nosač će često uključivati funkcionalnu grupu, npr., amino grupa ili generalno pruža vezu, pogodnu za uljučivanje ili vezivanje drugog hemijskog entiteta, npr., liganda za konstituetni prsten.
[0253] RNKi agensi mogu biti konjugovani u ligand putem nosača, pri čemu nosač može biti ciklična grupa ili aciklična grupa; Poželjno, ciklična grupa je odabrana od pirolidinila, pirazolinila, pirazolidinila, imidazolinila, imidazolidinila, piperidinila, piperazinila, [1,3] dioksolana, oksazolidinila, izoksazolidinila, morfolinila, tiazolidinila, izotiazolidinila, hinoksalinila, piridazinonila, tetrahidrofurila i dekana; poželjno, aciklična grupa je izabrana od serinolske kičme ili dijetanolaminske kičme.
[0254] U određenim specifičnim implementacijama, RNKi agens za upotrebu u postupcima je agnes izabrano iz grupe agenasa navedenih u bilo kojoj od Tabela 1, 2, 5 i 7.
[0255] Ovi agensi mogu dalje sadržati ligand.
A. Ligandi
[0256] Dvolančani RNK (dsRNK) agensa mogu opciono biti konjugovana sa jednim ili više liganda. Ligand se može pričvrstiti na smisao lanac, antismisao lanac ili na oba lanca, na 3'-kraj, 5'-kraj ili na oba kraja. Na primer, ligand može biti konjugovan na smisao lanac. U poželjnim otelotvorenjima, ligand je konjugovan na 3'-kraj smisao lanca. U jednom poželjnom otelotvorenju, ligand je GalNAc ligand. U posebno poželjnim otelotvorenjima, ligand je GalNAc3:
[0257] U nekim implementacijama, ligand, npr., GalNAc ligand je vezan za 3' kraj RNKi agensa. U jednoj implementaciji, RNKi agens je konjugovan za ligand, npr., GalNAc ligand, kao što je prikazano na sledećoj šemi
gde X je O ili S. U jednoj implementaciji, X je O.
[0258] Širok spektar entiteta može se spojiti sa RNKi agensima predmetnog pronalaska. Poželjni delovi su ligandi, koji su spojeni, poželjno kovalentno, bilo direktno ili indirektno putem intervenišućeg tetra.
[0259] U poželjnim implementacijama, ligand menja distribuciju, ciljanje ili vek trajanja molekula u koji je ugrađen. U poželjnim otelotvorenjima ligand pruža poboljšani afinitet za izabranu metu, npr., molekul, ćelija ili tip ćelija, odeljak, receptor npr., ćelijski ili odeljak organa, tkivo, organ ili regija tela, npr., u poređenju sa vrstom koja nema takav ligand.
Ligandi koji pružaju poboljšani afinitet za izabranu metu takođe se nazivaju ciljajućim ligandima.
[0260] Neki ligandi mogu imati endozomolitička svojstva. Endozomolitički ligandi promovišu lizu endozoma i/ili transporta sastava pronalaska, ili njegovih komponenata, od endozoma do citoplazme ćelije. Endozomolitički ligand može biti polianionski peptid ili peptidomimetik koji pokazuje pH-zavisnu aktivnost membrane i fuzogenost. U jednoj implementaciji, endozomolitički ligand pretpostavlja svoju aktivnu konformaciju kod endozomalnog pH. „Aktivna“ konformacija je ona konformacija u kojoj endozomolitički ligand promoviše lizu endozoma i/ili transporta sastava pronalaska, ili njegovih komponenti, od endozoma do citoplazme ćelije. Primeri endozomolitičkih liganda uključuju GALA peptid (Subbarao i dr., Biochemistry, 1987, 26: 2964-2972), EALA peptid (Vogel i dr., J. Am. Chem. Soc., 1996, 118:1581-1586), i njihovi derivati (Turk i dr., Biochem. Biophys. Acta, 2002, 1559: 56-68). U jednom otelotvorenju, endozomolitička komponenta može sadržati hemijsku grupu (npr., aminokiselina) koja će se podvrgnuti promenama ili protonaciji u odgovoru na promenu pH vrednosti. Endozomolitička komponenta može biti linearna ili razgranata.
[0261] Ligandi mogu poboljšati transport, hibridizaciju i osobine specifičnosti i takođe mogu poboljšati rezistenciju nukleaze nastalog prirodnog ili modifikovanog oligoribonukleotida ili polimernog molekula koji sadrži bilo koju kombinaciju monomera opisanih ovde i/ili prirodnih ili modifikovanih ribonukleotida.
[0262] Ligandi generalno mogu uključivati terapeutske modifikatore, npr., za poboljšanje uzimanja; dijagnostička jedinjenja ili reporter grupe npr., za praćenje distribucije; agense za unakrsno povezivanje; i delove koji omogućavaju rezistenciju na nukleazu. Opšti primeri uključuju lipide, steroide, vitamine, šećere, proteine, peptide, poliamine i peptidne mimike.
[0263] Ligandi mogu uključivati prirodnu supstancu, kao što je protein (npr., ljudski serumski albumin (HSA), lipoprotein niske gustine (LDL), lipoprotein visoke gustine (HDL) ili globulin); ugljovodonik (npr., dekstran, pululan, citin, hitosan, inulin, ciklodekstrin ili hijaluronska kiselina); ili lipid. Ligand može takođe biti rekombinantni ili sintetički molekul, kao što je sintetičkii polimer, npr., sintetička poliaminska kiselina, oligonukleotid (npr., aptamer). Primeri poliaminokiselina uključuju poliaminokiselinu poli-lizin (PLL), poli-L-asparatnu kiselinu, poli-L-glutaminsku kiselinu, stiren-maleinska kiselina anhidrid kopolimer, poli (L-laktid-ko-glikolirani) kopolimer, divinil eter-malein anhidrid kopolimer, N-(2-hidroksipropil) metakrilamid kopolimer (HMPA), polietilenglikol (PEG), polivinil alkohol (PVA), poliuretan, poli (2-etilakrilna kiselina), N-izopropilakrilamidni polimeri ili polifosfazin. Primer poliamina obuhvata: polietilenin, polilizin (PLL), spermin, spermidin, poliamin, pseudopeptid-poliamin, peptidomimetski poliamin, dendrimer poliamin, arginin, amidin, protamin, katjonski lipid, katjonski porfirin, kvaternarnu so poliamin ili alfa spiralno peptid.
[0264] Ligandi takođe mogu uključivati grupe za ciljanje, npr., agens za ciljanje ćelija ili tkiva, npr., lektin, glikoprotein, lipid ili protein, npr., antitelo koja se vezuje za određeni tip ćelije, kao što je ćelija bubrega. Ciljana grupa može biti tirotropin, melanotropin, lektin, glikoprotein, površinski aktivni protein A, mucin ugljovodonik, multivalentna laktoza, multivalentna galaktoza, N-acetil-galaktozamin, multivalentna manoza N-acetilgulukosamina, multivalentna fukoza, glikozilovani poliaminoacidi, multivalentna galaktoza, transferin, bisfosfonat, poliglutamat, poliaspartat, lipid, holesterol, steroid, žučna kiselina, folat, vitamin B12, biotin, RGD peptid, membetik RGD peptida ili aptamer.
[0265] Ostali primeri liganda uključuju boje, interkalirajuće agense (npr., akridini), unakrsne veznije (npr., psoralen, mitomicin C), porfirine (TPPC4, teksapirin, Sapfirin), policiklične aromatične ugljovodonike (npr., fenazin, dihidrofenazin), veštačke endonukleaze ili helator (npr., EDTA), lipofilne molekule, npr., (heksadecil) glicerol, geraniloksiheksil grupa, heksadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propandiol, heptadecil grupa, palmitinska kiselina, miristinska kiselina, O3-(oleoil) litoholna kiselina, O3-(oleoil) holenska kiselina, dimetoksitritel ili fenoksazin) i peptidne konjugate (npr., antennapedia peptid, Tat peptid), agense za alkilovanje, fosfat, amino, merkapto, PEG (npr., PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alkil, supstituisani alkil, radioobeležene markere, enzime, hapten (npr., biotin), facilitatore transporta/apsorpcije (npr., aspirin, vitamin E, folna kiselina), sintetičke ribonukleaze (npr., imidazol, bisimidazol, histamin, imidazol klasteri, akridin-imidazol konjugati, Eu3+ kompleksi tetraazamakrocikla), dinitrofenil, HRP ili AP.
1
[0266] Ligandi mogu biti proteini, npr., glikoproteini ili peptidi, npr., molekuli koji imaju specifičan afinitet za ko-ligand ili antitela npr., antitelo koje se vezuje za određeni tip ćelije kao što je ćelija karcinoma, endotelna ćelija ili koštana ćelija. Ligandi mogu takođe uključivati hormone i receptore hormona. Mogu se takođe uključiti i ne-peptidne vrste, kao što su lipidi, lektini, ugljovodoniki, vitamini, kofaktori, multivalentna laktoza, multivalentna galaktoza, N-acetilgalaktozamin, multivalentna manoza N-acetil-gulukosamina, multivalentna fukoza ili aptameri. Ligand može biti, na primer, lipopolisaharid, aktivator p38 MAP kinaze ili aktivator NF-κB.
[0267] Ligand može biti supstanca, npr., lek, koji može povećati uzimanje iRNK agensa u ćeliju, na primer, remeteći citoskeleton ćelije, npr., prekidajući mikrotubule ćelija, mikrofilamente i/ili srednju filamentu. Lek može biti, na primer, takson, vinkristin, vinblastin, citohalazin, nokodazol, japlakinolid, latrunculin A, faloidin, svinholid A, indanocin ili mioservin.
[0268] Ligand može povećati unošenje oligonukleotida u ćeliju pomoću, na primer, aktiviranja upalnog odgovora. Primeri liganda koji bi imali takav efekat uključuju faktor tumorske nekroze alfa (TNFalpha), interleukin-1 beta ili gama interferon.
[0269] U jednom aspektu, ligand je lipid ili molekul na bazi lipida. Takav lipid ili molekul na bazi lipida poželjno se vezuje serumskim proteinom, npr., ljudskim serum albuminom (HSA). HSA vezujući ligand omogućava distribuciju konjugata u ciljano tkivo, npr., tkivo tela koje nije bubreg. Na primer, ciljano tkivo može biti jetra, uključujući parenhimske ćelije jetre. Ostali molekuli koji mogu vezati HSA mogu se takođe koristiti kao ligandi. Na primer, naproksen ili aspirin se mogu koristiti. Lipid ili lipid zasnovan na ligidu može (a) povećati otpornost na degradaciju konjugata, (b) povećati ciljanje ili transport u ciljanu ćeliju ili ćelijsku membranu, i/ili (c) se može koristiti za prilagođavanje vezivanja za serumski protein , npr., HSA.
[0270] Lipid na bazi liganda se može koristiti za modulaciju, npr., da kontroliše vezivanje konjugata na ciljano tkivo. Na primer, lipid ili ligand na bazi lipida koji se jače vezuje za HSA biće manje verovatno ciljani od strane bubrega i stoga je manje verovatno da će biti
2
očišćen izd tela. Lipid ili ligand na bazi lipida koji se manje vezuje za HSA može se koristiti za ciljanje konjugata do bubrega.
[0271] U poželjnoj implementaciji, ligand na bazi lipida vezuje HSA. Poželjno, vezuje HSA sa dovoljnim afinitetom tako da je konjugat poželjno raspoređen u tkivo koje nije od bubrega. Međutim, poželjno je da afinitet nije toliko jak da vezivanje HSA-liganda ne može biti obrnuto.
[0272] U još jednom poželjnom otelotvorenju, ligand na bazi lipida vezuje HSA slabo ili uopšte ne, tako da je konjugat poželjno distribuiran do bubrega. Druge grupe koje se bave bubrežnim ćelijama mogu se takođe koristiti umesto ili pored liganda na bazi lipida.
[0273] U drugom aspektu, ligand je deo, npr., vitamin, kog uzima ciljana ćelija, npr., proliferirajuća ćelija. One su posebno korisne za lečenje poremećaja koje karakteriše neželjena proliferacija ćelija, npr., malignog ili nemalignog tipa, npr., ćelije raka. Primeri vitamina uključuju vitamin A, E i K. Drugi primerni vitamini uključuju vitamine B, npr., folna kiselina, B12, riboflavin, biotin, piridoksal ili drugi vitamini ili hranjivi materiji uzeti od karcinoma. Uključeni su i HAS, lipoprotein niske gustine (LDL) i lipoprotein visoke gustine (HDL).
[0274] U sledećem aspektu, ligand je agens za propuštanje ćelija, poželjno helični agens za propuštanje ćelija. Poželjno, agens je amfipatičan. Primerni agens je peptid kao što je tat ili antenopedija. Ako je agnes peptid, može se modifikovati, uključujući peptidilmimetičku, invertormu, nepeptidnu ili pseudopeptidnu vezu i upotrebu D-aminokiselina. Helični agens je poželjno alfa-helični agens, koje poželjno ima lipofilnu i lipofobnu fazu.
[0275] Ligand može biti peptid ili peptidomimetik. Peptidomimetik (takođe ovde označen kao oligopeptidomimetik) je molekul sposoban za preklapanje u definisanu trodimenzionalnu strukturu sličnu prirodnom peptidu. Peptidni ili peptidomimetički deo može biti dug oko 5-50 aminokiselina, npr., oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 aminokiselina. Peptid ili peptidomimetik mogu biti, na primer, peptid za propuštanje ćelija, katjonski peptid, amfipatički peptid ili hidrofobni peptid (npr., sastoji se prvenstveno od Tir, Trp ili Phe).
Peptidni deo može biti dendrimerni peptid, ograničeni peptid ili ukršteni peptid. U drugoj alternativi, peptidni deo može obuhvatiti translacijsku sekvencu hidrofobne membrane (MTS). Primerni hidrofobni peptid koji sadrži MT je RFGF koji ima aminokiselinsku sekvencu AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO:29). Analogni RFGF (npr., aminokiselinska sekvenca AALLPVLLAAP (SEQ ID NO:30)) koji sadrži hidrofobni MTS takođe može biti ciljani deo. Peptidni deo može biti peptid „isporuke“ koji može nositi velike polarne molekule uključujući peptide, oligonukleotide i proteine preko ćelijskih membrana. Na primer, utvrđeno je da su sekvence iz proteina HIV Tat (GRKKRRQRRRPPQ, SEQ ID NO:31) i Drosophila Antennapedia proteina (RQIKIWFQNRRMKWKK, SEQ ID NO:32) sposobne da funkcionišu kao peptidi isporuke. Peptid ili peptidomimetik mogu biti kodirani nasumičnom sekvencom DNK, kao što je peptid identifikovan iz biblioteke prikaza faga ili kombinatorijalne biblioteke jedna-perla-jedno-jedinjenje (OBOC) (Lam i dr., Nature, 354:82-84, 1991). Poželjno, peptid ili peptidomimetik vezan za iRNK agens preko obuhvaćene monomerne jedinice je peptid koji cilja na ćelije kao što je arginin-glicin-asparaginska kiselina (RGD)-peptid ili RGD mimik. Peptidni deo može biti dužine od oko 5 aminokiselina do oko 40 aminokiselina. Peptidne grupe mogu imati strukturne modifikacije, kao što je povećanje stabilnosti ili direktnih konformacijskih osobina. Bilo koja od strukturnih modifikacija opisanih dole može biti korišćena. RGD peptidni deo se može koristiti za ciljanje tumorske ćelije, kao što je endotelna tumorska ćelija ili ćelija tumora tumora dojke (Zitzmann i dr., Cancer Res., 62:5139-43, 2002). RGD peptid može olakšati ciljanje iRNK agensa na tumore različitih drugih tkiva, uključujući pluća, bubreg, slezinu ili jetru (Aoki i dr., Cancer Gene Therapy 8:783-787, 2001). Poželjno, RGD peptid će olakšati ciljanje iRNK agensa na bubreg. RGD peptid može biti linearan ili cikličan i može se modifikovati, npr., glikoziliran ili metiliran kako bi se olakšao ciljanje na specifična tkiva. Na primer, glikozilovani RGD peptid može isporučiti iRNK agens u tumorsku ćeliju koja eksprimira αVβ3(Haubner i dr., Jour. Nucl. Med., 42:326-336, 2001). Mogu se koristiti peptidi koji ciljaju markere obogaćene proliferirajućim ćelijama. Na primer, RGD koji sadrži peptide i peptidomimetike može ciljati ćelije raka, posebno ćelije koje imaju integrin. Tako se mogu koristiti RGD peptidi, ciklični peptidi koji sadrže RGD, RGD peptidi koji uključuju D-aminokiseline, kao i sintetički RGD mimici. Pored RGD, mogu se koristiti i druge grupe koje ciljaju integrin ligand. Generalno, takvi ligandi mogu se koristiti za kontrolu proliferacije ćelija i angiogenezu. Poželjni konjugati ove vrste liganda ciljaju PECAM-1, VEGF ili drugi gene kancera, npr., gen tumora opisan ovde.
[0276] „Peptid ćelijskog propuštanja“ je sposoban da propušta ćeliju, npr., mikrobiološku ćeliju, kao što je bakterijska ili gljivična ćelija, ili ćelija sisara, kao što je ćelija čoveka.
4
Mikrobni peptid koji propušta ćelije može biti, na primer, α-helični linearni peptid (npr., LL-37 ili Ceropin P1), peptid koji sadrži disulfidnu vezu (npr., α-defensin, β-defensin ili bakterenin) ili peptid koji sadrži samo jednu ili dve dominantne aminokiseline (npr., PR-39 ili indolistidin). Peptid ćelijskog propuštanja može takođe uključiti signal nuklearne lokalizacije (NLS). Na primer, peptid ćelijskog propuštanja može biti bipartitni amfipatički peptid, kao što je MPG, koji je izveden iz domena fuzionog peptida HIV-1 gp41 i NLS velikog T antigena SV40 (Simeoni i dr., Nucl. Acids Res.31:2717-2724, 2003).
[0277] U jednom aspektu, ciljani peptid može biti amfipatički α-helični peptid. Primeri amfipatičkih α-helikalnih peptida uključuju, ali se ne ograničavaju na, cekropine, likotoksine, paradaksine, buforin, CPF, peptid nalik bombininu (BLP), katetilidine, ceratotoksine, S. clava peptidi, intestinalni antimikrobni peptidi slepulje (HFIAP), magainini , brevinini-2, dermaseptini, melitini, pleurocidin, H2A Peptidi, Ksenopus peptidi, eskulentinis-1 i caerini. Poželjno je uzeti u obzir niz faktora kako bi se održao integritet stabilnosti heliksa. Na primer, biće korišćen maksimalan broj ostataka stabilizacije spirale (npr., leu, ala, ili lys), i biće korišćen minimalan broj ostataka destabilizacije spirale (npr., proline ili ciklične monomerne jedinice. Ostaci za zatvaranje će se uzeti u obzir (na primer, Gly je primerni N-zatvarajući ostatak i/ili se C-terminalna amidacija može koristiti za pružanje dodatne H-veze za stabilizaciju spirale. Formiranje slanih mostova između ostataka sa suprotnim naelektrisanjem, odvojenih sa i ± 3, ili i ± 4 položaja, mogu pružiti stabilnost. Na primer, katjonski ostaci kao što su lizin, arginin, homo-arginin, ornitin ili histidin mogu da formiraju slane mostove pomoću anjonskih ostataka glutamata ili aspartata.
[0278] Peptidni i peptidomimetički ligandi uključuju one koji imaju prirodne ili modifikovane peptide, npr., D ili L peptide; α, β ili γ peptide; N-metil peptide; azapeptide; peptide koji imaju jedan ili više amida, tj., peptid, veze zamenjene sa jednim ili više urea, tiourea, karbamata ili sulfonil urea veza; ili cikličnih peptida.
[0279] Ciljani ligand može biti bilo koji ligand koji je sposoban da cilja određeni receptor. Primeri su: folat, GalNAc, galaktoza, manoza, manoza-6P, klasteri šećera kao što su GalNAc klaster, manozni klaster, galaktozni klaster ili apatamer. Klaster je kombinacija dve ili više jedinica šećera. Usmereni ligandi takođe uključuju ligande receptora integrina, ligande receptora hemokina, transferin, biotin, ligande receptore serotonina, PSMA, endotelin, GCPII, somatostatin, LDL i HDL ligande. Ligandi se takođe mogu bazirati na nukleinskoj kiselini, npr., aptamer. Aptamer može biti nemodifikovan ili može imati bilo koju kombinaciju modifikacija obelodanjenih ovde.
[0280] Agensi za endozomsko oslobađanje uključuju imidazole, poli ili oligoimidazole, PEI, peptide, fuzogene peptide, polikaboksilate, poliakatjone, maskirane oligo ili poli katjone ili anjone, acetale, poliacetale, ketale/poliketale, ortoestre, polimere sa maskiranim ili bez maskiranog katjonskog ili anjonskog naelektrisanja, dendrimere sa maskiranim ili bez maskiranog katjonskog ili anjonskog naelektrisanja.
[0281] PK modulator označava farmakokinetički modulator. Modulatori PK uključuju lipofile, žučne kiseline, steroide, analoge fosfolipida, peptide, agense za vezivanje proteina, PEG, vitamine itd. Primeri PK modulatora uključuju, ali nisu ograničeni na, holesterol, masne kiseline, fosfolipide, sfingolipide, naproksen, ibuprofen, vitamin E, biotin itd. Takođe poznato je da se oligonukleotidi koji sadrže veliki broj fosforotioatnih veza vezuju za serumski protein, a time su i kratki oligonukleotidi, npr., oligonukleotidi od oko 5 baza, 10 baza, 15 baza ili 20 baza, koji sadrže višestruke fosforotioatne veze u kičmi takođe u nadležnosti ovog pronalaska kao ligandi (npr., kao PK modulirajući ligandi).
[0282] Pored toga, aptameri koji vezuju serumske komponente (npr., serumski proteini) takođe su u nadležnosti ovog pronalaska kao PK modulišući ligandi.
[0283] Drugi konjugati liganda koji su u nadležnosti pronalaska opisani su u U.S. patentna prijava USSN:10/916,185, podnesena 10. avgusta 2004,; USSN:10/946,873, podnesena 21. septembra, 2004,; USSN:10/833,934, podnesena 3. avgusta 2007.; USSN:11/115,989 podnesena 27. aprila 2005. i USSN:11/944,227 podnesena 21. novembra 2007.
[0284] Kada su prisutni dva ili više liganda, ligandi mogu svi imati iste osobine, svi imati različite osobine, ili neki ligandi mogu mati iste osobine, dok drugi imaju različite osobine. Na primer, ligand može imati osobine ciljanja, može imati endozomolitičku aktivnost ili imati PK modulirajuće osobine. U poželjnom otelotvorenju, svi ligandi imaju različite osobine.
[0285] Ligandi se mogu povezati sa oligonukleotidima na različitim mestima, na primer, 3'-kraj, 5'-kraj i/ili na unutrašnjem položaju. U poželjnim otelotvorenjima, ligand je vezan za oligonukleotide preko intervenišućeg tetra, npr., nosač koji je opisan ovde. Ligand ili teterski ligand može biti prisutan na monomeru kada je monomer ugrađen u rastuću lanac. U nekim otelotvorenjima, ligand se može uključiti pomoću spajanja na „prekursorski“ monomer nakon što je monomer „prekursora“ ugrađen u rastuću lanac. Na primer, monomer koji ima, npr., teter sa amino terminusom (tj., koji nema povezani ligand), npr., TAP-(CH2)nNH2može biti ugrađeni u rastući lanac oligonukelotida. U narednoj operaciji, tj., nakon inkorporacije prethodnog monomera u vezu, liganda koji ima elektrofilnu grupu, npr., pentafluorofenil estar ili aldehidnu grupu, može se kasnije prikačiti na prekursor monomer spajanjem elektrofilne grupe liganda sa terminalnom nukleofilnom grupom tetra prekursor monomera.
[0286] U drugom primeru, može biti obuhvaćen monomer koji ima hemijsku grupu pogodnu za učestvovanje u Click Chemistry reakciji, npr., azidom ili alkinom završen teter/veznik. U narednoj operaciji, tj., nakon inkorporacije prethodnog monomera u vezu, ligand koji ima komplementarnu hemijsku grupu, npr. alkin ili azid može biti vezan za monomer prekursora spajanjem alkina i azida zajedno.
[0287] Za dvolančane oligonukleotide, ligandi mogu biti pričvršćeni za jedan ili oba lanca. U nekim otelotvorenjima, dvolančani iRNK agens sadrži ligand konjugovan za smisao lanac. U drugim otelotvorenjima, dvolančani iRNK agens sadrži ligand konjugovan za antismisao lancem.
[0288] U nekim otelotvorenjima, ligand može biti konjugovan na nukleobaze, šećerne ostatke ili internukleozidne veze molekula nukleinske kiseline. Konjugacija za purinske nukleobaze ili njihove derivate može se pojaviti na bilo kom položaju uključujući, endociklične i egociklične atome. U nekim otelotvorenjima 2-, 6-, 7- ili 8-položaja purinske nukleobaze su pričvršćeni za konjugatni deo. Konjugovanje na pirimidinske nukleobaze ili njihove derivate takođe se može pojaviti na bilo kom položaju. U nekim otelotvorenjima, položaji 2-, 5- i 6 pirimidinske nukleobaze mogu biti supstituisani sa konjugatnim delom. Konjugovanje sa šećernim ostacima nukleozida može se javiti na bilo kom atomu ugljenika. Primeri atoma ugljenika sa šećernim ostacima koji se mogu vezati za konjugatni deo uključuju 2' , 3' i 5' atoma ugljenika. Položaj 1' se takođe može spojiti sa konjugovanim delom, kao što je u abasičkom ostatku. Internukleozidne veze takođe mogu nositi konjugatne delove. Za veze koje sadrže fosfor (npr., fosfodiester, fosforotioat, fosforoditioat, fosforoamidat i slično), konjugatni deo može biti vezan direktno na atom fosfora ili na atom O, N ili S vezan za atom fosfora. Za internukleozidne veze koje sadrže amin- ili amid (npr., PNK), konjugatni deo može biti vezan za atom azota od amina ili amida ili susednog ugljenikovog atoma.
[0289] Može se koristiti bilo koji pogodan ligand u polju interferencije RNK, iako je ligand uglavnom ugljovodonik npr. monosaharid (kao što je GalNAc), disaharid, trisaharid, tetrasaharid, polisaharid.
[0290] Veznici koji konjuguju ligand u nukleinsku kiselinu uključuju one koji su gore razmatrani. Na primer, ligand može biti jedan ili više GalNAc (N-acetilglukozamin) derivat vezan preko bivalentnog ili trivalentnog razgranatog veznika.
[0291] U jednom otelotvorenju, dsRNK pronalaska je konjugovan za bivalentne i trivalentne razgranate veznike uključujući strukture prikazane na bilo kojoj od formula (IV) - (VII):
gde:
q<2A>, q<2B>, q<3A>, q<3B>, q<4A>, q<4B>, q<5A>, q<5B>i q<5C>predstavljaju nezavisno za svako javljanje 0-20 i gde jedinica koja se ponavlja može be ista ili različita;
P<2A>, P<2B>, P<3A>, P<3B>, P<4A>, P<4B>, P<5A>, P<5B>, P<5C>, T<2A>, T<2B>, T<3A>, T<3B>, T<4A>, T<4B>, T<4A>, T<5B>, T<5C>su svi nezavisno za svako javljanje odsutni, CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH ili CH2O;
Q<2A>, Q<2B>, Q<3A>, Q<3B>, Q<4A>, Q<4B>, Q<5A>, Q<5B>, Q<5C>su nezavisno za svako javljanje odsutni, alkilen, supstituisan alkilen gde jedan ili više metilen može biti prekinut ili završen jednim ili više od O, S, S(O), SO2, N(R<N>), C(R')=C(R"), C≡C ili C(O);
R<2A>, R<2B>, R<3A>, R<3B>, R<4A>, R<4B>, R<5A>, R<5B>, R<5C>su svi nezavisno za svako javljanje odsutni, NH, O, S, CH2C(O)O, CONH NHCH(R<a>)C(O), -CO-CHR<a>-NH-, CO,
ili heterociklil;
L<2A>, L<28>, L<3A>, L<3B>, L<4A>, L<4B>, L<5A>, L<5B>i L<5C>predstavljaju ligand; tj. svi nezavisno za svako javljanje monosaharid (kao što je GalNAc), disaharid, trisaharid, tetrasaharid, oligosaharid, ili polisaharid; i
R<a>je H ili aminokiselinski bočni lanac.
[0292] Trivalentni konjugujući GalNAc derivativi su posebno korisni za primenu sa RNKi agensima za inhibiranje eksprimiranja ciljanog gena, kao što su oni od formula (VII):
gde L<5A>, L<5B>i L<5C>predstavljaju monosaharid, kao što je GalNAc derivat. Primeri odgovarajućih bivalentnih i trivalentnih razgranatih veznik grupa konjugujućih GalNAc derivata uključuju ali nisu ograničeni na, naredna jedinjenja:
[0293] Reprezentativni SAD patenti koji govore o pripremi konjugata RNK uključuju, ali nisu ograničeni na,U.S. Pat. Br..4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 i 5,688,941; 6,294,664; 6,320,017; 6,576,752; 6,783,931; 6,900,297; 7,037,646; 8,106,022.
[0294] Nije neophodno da se svi položaji u datom sastavu ravnomerno modifikuju, i zapravo
1
više od jedne od gore pomenutih modifikacija može se uključiti u jedno jedinjenje ili čak u jedinstveni nukleozid unutar iRNK. Ovaj pronalazak takođe uključuje iRNK jedinjenja koja su himerna jedinjenja.
[0295] „Himerna“ iRNK jedinjenja ili „himere“ u kontekstu ovog pronalaska su iRNK jedinjenja, poželjno dsRNK, koja sadrže dve ili više hemijski različite regije, gde svaku čini najmanje jedna monomerna jedinica, tj., nukleotida u slučaju dsRNK jedinjenja. Ove iRNK obično sadrže bar jednu regiju u kojoj je RNK modifikovana tako da se poveća otpornost iRNK na degradaciju nukleaze, poveća ćelijsko uzimanje i/ili poveća afinitet vezivanja za ciljanu nukleinsku kiselinu. Dodatna regija iRNK može poslužiti kao supstrat za enzime sposobne za cepanje RNK: DNK ili RNK: RNK hibridi. Kao primer, RNaza H je ćelijska endonukleaza koja cepa RNK lanac RNK:DNK dupleksa. Aktivacija RNaza H, dakle, rezultuje cepanjem ciljane RNK, čime se značajno povećava efikasnost iRNK inhibicije eksprimiranje gena. Shodno tome, često se mogu dobiti uporedivi rezultati sa kraćim iRNK kada se koriste himerne dsRNK, u poređenju sa fosforotioatnom dezoksi dsRNK hibridizacijom u istoj ciljanoj regiji. Razbijanje ciljane RNK može se rutinski detektovati gel elektroforezom i, ako je potrebno, srodnim tehnikama hibridizacije nukleinskih kiselina koje su poznate u struci.
[0296] U određenim slučajevima, RNK od iRNK može se modifikovati od strane ne-ligandne grupe. Brojni ne-ligand molekuli su konjugovani sa iRNK kako bi se poboljšala aktivnost, ćelijska distribucija ili ćelijsko uzimanje iRNK, a procedure za izvođenje takvih konjugacija dostupne su u naučnoj literaturi. Takve ne-ligandne grupe uključuju lipidne grupe, kao što su holesterol (Kubo, T. i dr., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61; Letsinger i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), holna kiselina (Manoharan i dr., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), tioeter, npr., heksil-S-tritiltiool (Manoharan i dr., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan i dr., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), tioholesterol (Oberhauser i dr., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), alifatski lanac, npr., dodekandiol ili undecil ostaci (Saison-Behmoaras i dr., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov i dr., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk i dr., Biochimie, 1993, 75:49), fosfolipid, npr., diheksadecil-rac-glicerol ili trietilamonijum 1,2-di-0-heksadecil-rac-glicerol-3-H-fosfonat (Manoharan i dr., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea i dr., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), poliamin ili polietilenglikol lanac (Manoharan i dr., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969) ili adamantan sirćetna kiselina (Manoharan i dr., Tetrahedron Lett., 1995,
2
36:3651), palmitil deo (Mishra i dr., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), ili oktadecilamin ili heksilamino-karbonil-oksiholesterolni ostatak (Crooke i dr., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923). Reprezentativnog patenti Sjedinjenih Država koji govore o pripremi takvih RNK konjugata su navedeni gore. Tipični protokoli konjugacije uključuju sintezu RNK koja nosi aminoveznik na jednom ili više položaja u sekvenci. Amin grupa se zatim reaguje sa molekulom koji se konjuguje korišćenjem odgovarajućeg spajanja ili aktivirajućih reagensa. Reakcija konjugacije može se izvesti ili sa RNK koja se još uvek vezuje za čvrstu podlogu ili nakon cepanja RNK, u fazi rastvora. Prečišćavanje konjugata RNK pomoću HPLC obično daje čisti konjugat.
[0297] Dvolančani RNKi agens prema pronalasku može biti izabran iz grupe koju čine AD-58681, AD-59054, AD-61719 i AD-61444.
III. Isporuka iRNK pronalaska
[0298] Isporuka iRNK agensa pronalaska u ćeliju npr., ćeliju unutar pacijenta, kao što je ljudski pacijent (npr., pacijent kom je to potrebno, kao što je pacijent koji ima poremećaj povezan sa nedostatkom Serpina1, npr., poremećaj jetrenog deficita Serpina1) može se postići na više različitih načina. Na primer, isporuka može biti izvedena dovođenjem u dodir ćelije sa iRNK predmetnog pronalaska in vitro ili in vivo. In vivo isporuka se takođe može izvesti direktno primenom sastava koji sadrži iRNK, npr., dsRNK, pacijentu. Alternativno, in vivo isporuka se može izvršiti indirektno primenjujući jedan ili više vektora koji kodiraju i usmeravaju eksprimiranje iRNK. Ove alternative su razmatrane dalje u nastavku.
[0299] U principu, bilo koji način isporuke molekula nukleinske kiseline (in vitro ili in vivo) može biti prilagođen za upotrebu sa iRNK pronalaska (pogledati npr., Akhtar S. and Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol.2(5):139-144 i WO94/02595, koji je ovde u potpunosti uključen referencom). Za in vivo isporuku, faktori koji treba razmotriti kako bi se isporučili iRNK molekuli uključuju, na primer, biološku stabilnost isporučenog molekula, sprečavanje nespecifičnih efekata i akumulaciju isporučenog molekula u ciljanom tkivu. Nespecifični efekti iRNK mogu se minimizovati lokalnom primenom, na primer, direktnim injektiranjem ili implantacijom u tkivo ili lokalnom primenom sastava. Lokalna primena terapije maksimizuje lokalnu koncentraciju agensa, ograničava izlaganje agensa sistemskim tkivima koja inače može biti oštećena od strane agensa ili mogu da degradiraju agens, i dozvoljava manju ukupnu dozu molekula iRNK koja se primenjuje. Nekoliko studija pokazalo je uspešan knock-down genskih proizvoda kada se iRNK primenjuje lokalno. Na primer, intraokularna isporuka VEGF dsRNK intravitrealnim injekcijama kod majmuna cinomolgus (Tolentino, MJ., et al (2004) Retina 24:132-138) i subretinalne injekcije kod miševa (Reich, SJ., et al (2003) Mol. Vis.9:210-216) su se pokazale da sprečavaju neovaskularizaciju u eksperimentalnom modelu starosne degeneracije makule. Pored toga, direktna intratumoralna injekcija dsRNK kod miševa smanjuje zapreminau tumora (Pille, J., et al (2005) Mol.
Ther,11:267-274) i može produžiti opstanak miševa koji nose tumora (Kim, WJ., et al (2006) Mol. Ther.14:343-350; Li, S., et al (2007) Mol. Ther.15:515-523). RNK interferencija je takođe pokazala uspeh u lokalnoj isporuci CNS direktnom injekcijom (Dorn, G., i dr. (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH., et al (2005) Gene Ther.12:59-66; Makimura, H., et al (2002) BMC Neurosci.3:18; Shishkina, GT., et al (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, ER., et al (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.101:17270-17275; Akaneya,Y., et al (2005) J.
Neurophysiol. 93:594-602) i intranazalnom primenom u pluća (HHoward, KA., et al (2006) Mol. Ther.14:476-484; Zhang, X., et al (2004) J. Biol. Chem. 279:10677-10684; Bitko, V., et al (2005) Nat. Med.11:50-55 ). Za primenju iRNK sistemske terapije za lečenje bolesti, RNK se može modifikovati ili alternativno isporučiti pomoću sistema za davanje leka; oba postupka deluju da spreče brzu degradaciju dsRNK endo- i ekso-nukleaza in vivo.
Modifikacija RNK ili farmaceutskog nosača takođe može dozvoliti ciljanje sastava iRNK u ciljanom tkivu i izbegavati neželjene efekte van cilja. iRNK molekuli se mogu modifikovati hemijskim konjugacijom na lipofilne grupe, kao što je holesterol, radi poboljšanja mobilnog uzimanja i sprečavanja degradacije. Na primer, iRNK usmerena protiv ApoB konjugovanog sa lipofilnom holesterolom, sistemski je injektirana u miševe i rezultuje knock-downom apoB mRNK u jetri i jejunumu (Soutschek, J., et al (2004) Nature 432:173-178). Pokazano je da konjugacija iRNK aptamera inhibira rast tumora i posreduje tumorsku regresiju u mišjem modelu raka prostate (McNamara, JO., et al (2006) Nat. Biotechnol.24:1005-1015). U alternativnom otelotvorenju, iRNK se može isporučiti pomoću sistema za isporuku lekova, kao što je nanočestica, dendrimer, polimer, lipozom ili katjonski sistem isporuke. Pozitivno naelektrisani sistemi katjonske isporuke olakšavaju vezivanje iRNK molekula (negativno naelektrisani), i takođe povećavaju interakcije na negativno naelektrisanoj ćelijskoj membrani kako bi se omogućila efikasna primena iRNK od strane ćelije. Katjonski lipidi, dendrimeri ili polimeri mogu biti vezani za iRNK ili indukovani da formiraju vezikulu ili micelu (pogledati npr., Kim SH., et al (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116) koja obuhvata iRNK. Formiranje vezikula ili micela dodatno sprečava degradaciju iRNK kada se sistemski primenjuje. Postupci za izradu i primenu katjonskih iRNK kompleksa su u unutar veština
4
stručnjaka u oblasti (pogledati npr., Sorensen, DR., et al (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, UN., et al (2003) Clin. Cancer Res.9:1291-1300; Arnold, AS et al (2007) J.
Hypertens. 25:197-205, koji je ovde u potpunosti uključen referencom). Neki neograničavajući primeri sistema za isporuku lekova koji su korisni za sistemsku isporuku iRNK-a uključuju DOTAP (Sorensen, DR., et al (2003), supra; Verma, UN., et al (2003), supra), Oligofektamin, „čvrste čestice čvrste nukleinske kiseline“ (Zimmermann, TS., et al (2006) Nature 441:111-114), kardiolipin (Chien, PY., et al (2005) Cancer Gene Ther.12:321-328; Pal, A., et al (2005) Int J. Oncol.26:1087-1091), polietilenimin (Bonnet ME., et al (2008) Pharm. Res. Aug 16 Epub ahead of print; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol.
71659), Arg-Gly-Asp (RGD) peptides (Liu, S. (2006) Mol. Pharm.3:472-487), i poliamidoamine (Tomalia, DA., et al (2007) Biochem. Soc. Trans.35:61-67; Yoo, H., et al (1999) Pharm. Res.16:1799-1804). U nekim otelotvorenjima, iRNK formira kompleks sa ciklodekstrinom za sistemsku primenu. Postupci za primenu i farmaceutski sastavi iRNK i ciklodekstrina mogu se naći u U.S. Patent No.7,427,605.
A. Vektor kodirane iRNK
[0300] iRNK koja se bavi Serpina1 genom može se eksprimirati od transkripcionih jedinica ubačenih u vektore DNK ili RNK (pogledati, npr., Couture, A, i dr., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., i dr., Međunarodna PCT Objava No. WO 00/22113, Conrad, Međunarodna PCT Objava No. WO 00/22114, i Conrad, U.S. Pat. br.6,054,299). Eksprimiranje može biti prolazano (red veličine sati do nedelja) ili održano (nedelje do meseci, ili duže), u zavisnosti od specifičnog korišćenog konstrukta i tipa ciljanog tkiva ili ćelije. Ovi transgeni mogu se uvesti kao linearni konstrukt, kružni plazmid ili virusni vektor, koji može biti integrišući ili neintegrišući vektor. Transgen takođe može biti konstruisan tako da se dozvoljava da se nasledi kao ekstrakromozomski plazmid (Gassmann, i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).
[0301] Pojedinačni lanac ili lanci iRNK mogu se transkribovati iz promotera na vektor eksprimiranja. Kada se eksprimiraju dva odvojena lanca da generišu, na primer, dsRNK, dva odvojena vektora eksprimiranje se mogu uvesti (npr., transfekcijom ili infekcijom) u ciljanu ćeliju. Alternativno, svaka pojedinačna mreža dsRNK može se transkribovati od strane promotera, koji su oba smeštena na istom plazmidu eksprimiranja. U jednom otelotvorenju, dsRNK se eksprimira kao obrnuti ponovljeni polinukleotidi spojeni sa polinukleotidnom sekvencom veznikom, tako da dsRNK ima strukturu stabla i petlje.
[0302] Vektori eksprimiranja iRNK su uglavnom DNK plazmidi ili virusni vektori. Vektori eksprimiranje koji su kompatibilni sa eukariotskim ćelijama, poželjno onim kompatibilni sa ćelijama kičmenjaka, mogu se koristiti za proizvodnju rekombinantnih konstrukta za eksprimiranje iRNK kao što je ovde opisano. Vektori eksprimiranje eukariotskih ćelija su dobro poznati u struci i dostupni su iz više komercijalnih izvora. Tipično su pruženi takvi vektori koji sadrže pogodna mesta za ograničavanje unošenja željenog segmenta nukleinske kiseline. Isporuka vektora koji eksprimiraju iRNK može biti sistemski, na primer intravenskim ili intramuskularnim primenama, primenom na ciljane ćelije eks-smeštene u pacijenta, praćene ponovnim uvođenjem u pacijenta ili bilo kojim drugim sredstvom koje omogućava unošenje u željenu ciljanu ćeliju.
[0303] Plazmidi eksprimiranje iRNK mogu biti transfektovani u ciljane ćelije kao kompleks sa katjonskim lipidnim nosačima (npr., oligofektamin) ili nosačima na bazi lipida koji nisu katjonski (npr., Transit-TKO™). Pronalazak takođe predviđa višestruke transfekcijama lipida za nukleonidne sekvence posredovane od strane iRNK, koji ciljaju različite regije ciljane RNK tokom perioda od jedne nedelje ili više. Uspešno uvođenje vektora u ćelije domaćine može se pratiti korišćenjem različitih poznatih postupaka. Na primer, transientna transfekcija može biti signalizirana reporterom, kao što je fluorescentni marker, kao što je zeleni fluorescentni protein (GFP). Stabilna transfekcija ćelija ex vivo može se osigurati upotrebom markera koji pružaju transfektovanu ćeliju sa otpornošću na specifične faktore zaštite životne sredine (npr., antibiotici i lekovi), kao što je otpornost na higromicin B.
[0304] Virusni vektorski sistemi koji se mogu koristiti sa postupcima i sastavma opisanim ovde uključuju, ali nisu ograničeni na, (a) adenovirusne vektore; (b) vektore retrovirusa, uključujući, ali nisu ograničeni na, lentiviralne vektore, moloni mišji virus leukemije, itd.; (c) adeno-povezani virusni vektori; (d) vektori virusnog herpes simpleksa; (e) SV 40 vektori; (f) vektori polioma virusa; (g) vektori virusa papilome; (h) vikori pikornavirusa; (i) vektori poksvirusa, kao što su ortopoks, npr., vektori virusa vakcinije ili avipoks, npr. poks kanarinaca ili kokošiji poks; i (j) adenovirus koji zavisi od helpera ili bez gutanja. Virusi sa defektivnom replikacijom takođe mogu biti povoljni. Razni vektori će se, ili neće, uklopiti u genom ćelija. Konstrukcije mogu uključivati virusne sekvence za transfekciju, po želji.
Alternativno, konstrukt se može uključiti u vektore sposobne za epizomsku replikaciju, npr. EPV i EBV vektori. Konstrukti za rekombinantno eksprimiranje iRNK generalno će zahtevati regulatorne elemente, npr., promotere, poboljšivače, itd., kako bi se osiguralo eksprimiranje iRNK u ciljanim ćelijama. Drugi aspekti koje treba uzeti u obzir za vektore i konstrukte su dalje opisani u nastavku.
[0305] Vektori koji su korisni za isporuku iRNK-a uključuju regulatorne elemente (promoter, poboljšivač, itd.) dovoljne za eksprimiranje iRNK u željenoj ciljanoj ćeliji ili tkivu.
Regulatorni elementi mogu biti izabrani tako da pružaju konstitutivno ili regulisani/inducibilno eksprimiranje.
[0306] Eksprimiranje iRNK može se precizno regulisati, na primer, koristeći inducibilnu regulatornu sekvencu koja je osetljiva na određene fiziološke regulatore, npr., cirkulišuće nive glukoze ili hormone (Docherty i dr., 1994, FASEB J.8:20-24). Takvi inducibilni sistemi eksprimiranja, pogodni za kontrolu eksprimiranje dsRNK u ćelijama ili kod sisara, uključuju, na primer, regulaciju od ekdisona, od estrogena, progesterona, tetraciklina, hemijske induktore dimerizacije i izopropil-beta-D1-tiogalaktopiranozida (IPTG). Stručnjak u oblasti je sposoban da izabere odgovarajuću regulatornu/promotersku sekvencu zasnovanu na predviđenoj upotrebi iRNK transgena.
[0307] Virusni vektori koji sadrže sekvence nukleinske kiseline koji kodiraju iRNK mogu se koristiti. Na primer, može se koristiti retrovirusni vektor (pogledati Miller i dr., Meth.
Enzymol. 217:581-599 (1993)). Ovi retrovirusni vektori sadrže komponente neophodne za ispravno pakovanje virusnog gena i integraciju u DNK ćelije domaćine. Nukleinske kiseline koje kodiraju iRNK kloniraju se u jedan ili više vektora, što olakšava isporuku nukleinske kiseline pacijentu. Više detalja o retrovirusnim vektorima može se pronaći, na primer, u Boesen i dr., Biotherapy 6:291-302 (1994), koji opisuje upotrebu retrovirusnog vektora da isporuči mdrl gen na hematopoetske matične ćelije kako bi matične ćelije učinilo otpornijim na hemoterapiju. Druge reference koje ilustruju upotrebu retrovirusnih vektora u genskoj terapiji su: Clowes i dr., J. Clin. Invest.93:644-651 (1994); Kiem i dr., Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons and Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); i Grossman i Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel.3:110-114 (1993). Lentiviralni vektori razmatrani za upotrebu uključuju, na primer, vektore bazirane na HIV-u opisane u U.S. Patent Nos. 6,143,520; 5,665,557; i 5,981,276, koji su ovde uključeni referencom.
[0308] Adenovirusi su takođe razmatrani za upotrebu u isporuci iRNK pronalaska.
Adenovirusi su posebno atraktivni nosači, npr., za isporuku gena respiratornom epitelu.
Adenovirusi prirodno inficiraju respiratorni epitel u kom uzrokuju blagu bolest. Druge mete za sisteme isporučivanja adenovirusa su jetra, centralni nervni sistem, endotelne ćelije i mišići. Adenovirusi imaju prednost jer su sposobni da zaraze ćelije koje se ne dele. Kozarsky and Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993) predstavljaju pregled genetske terapije zasnovane na adenovirusu. Bout i dr., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994) pokazali su upotrebu vektora adenovirusa za prenošenje gena na respiratorni epitel rezus majmuna. Drugi primeri korišćenja adenovirusa u genoj terapiji mogu se naći u Rosenfeld i dr., Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld i dr., Cell 68:143-155 (1992);
Mastrangeli i dr., J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993); PCT Objava WO94/12649; i Wang, i dr., Gene Therapy 2:775-783 (1995). Pogodan AV vektor za eksprimiranje iRNK koja se nalazi u pronalasku, postupak za konstrukciju rekombinantnog AV vektora i postupak za davanje vektora u ciljane ćelije, opisani su u Xia H i dr. (2002), Nat. Biotech.20:1006-1010.
[0309] Vektori adeno-pridruženog virusa (AAV) se takođe mogu koristiti za isporuku iRNK pronalaska (Walsh i dr., Proc. Soc. Exp. Biol. Med.204:289-300 (1993); U.S. Pat. br.
5,436,146). U jednom aspektu, iRNK se može eksprimirati kao dva odvojena, komplementarna jednolančana RNK molekula iz rekombinantnog AAV vektora koji ima, na primer, ili RNK promotere U6 ili HI ili promoter citomegalovirusa (CMV). Pogodni AAV-vektori za eksprimiranje dsRNK prikazanog u pronalasku, postupci za konstrukciju rekombinantnog AV vektora i postupci za isporuku vektora u ciljane ćelije opisani su u Samulski R i dr. (1987), J. Virol.61: 3096-3101; Fisher K J i dr. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R i dr. (1989), J. Virol.63: 3822-3826; U.S. Pat. br.5,252,479; U.S. Pat. br.
5,139,941; International Prijava patenta No. WO 94/13788; i International Prijava patenta No. WO 93/24641, čija su celokupna obelodanjivanja ovde obuhvaćena referencom.
[0310] Drugi virusni vektor koji je pogodan za isporuku iRNK pronalaska je poks virus kao što je virus vakcinije, na primer razblažena vakcinija kao što su modifikovani Ankara virus (MVA) ili NYVAC, avipoks, kao što je kokošiji poks ili poks kanarinaca.
[0311] Tropizam virusnih vektora može se modifikovati pseudotipizacijom vektora sa proteinima koverte ili drugim površinskim antigenom iz drugih virusa ili zamenom različitih virusnih kapsidnih proteina, prema potrebi. Na primer, lentiviralni vektori mogu biti pseudotipirani sa površinskim proteinama iz virusa vezikularnog stomatitisa (VSV), besnila, Ebole, Mokole i slično. AAV vektori se mogu napraviti kako bi se ciljali različite ćelije inžinjeringom vektora za izražavanje različitih serotipova proteina kapsida; pogledati, npr., Rabinowitz J E i dr. (2002), J Virol 76:791-801.
[0312] Farmaceutski sastav vektora može uključiti vektor u prihvatljivom razblaživaču ili može obuhvatiti matricu sa sporim oslobađanjem u kojoj je ubačen nosač za isporuku gena. Alternativno, kad kompletan vektor za dostavu gena može biti proizveden netaknut od rekombinantnih ćelija, npr., retrovirusni vektori, farmaceutski sastav može uključivati jednu ili više ćelija koje proizvode sistem za isporuku gena.
III. Farmaceutska sastavi pronalaska
[0313] Predmetni pronalazak takođe uključuje farmaceutske sastave koji uključuju iRNK pronalaska. U jednoj implementaciji, ovde navedeni, su farmaceutski sastavi koji sadrže iRNK, kako je ovde opisano, i farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutski sastavi koji sadrže iRNK su korisni za lečenje bolesti ili poremećaja povezanih sa eksprimiranjem ili aktivnošću Serpinal gena, npr., poremećaj povezan sa nedostatkom Serpinal, npr., poremećaj jetre sa nedostatkom Serpinal. Takve farmaceutski sastavi su formulisani na osnovu načina isporuke. Jedan primer su sastavi koji su formulisane za sistemsku primenu putem parenteralne isporuke, npr., intravenskom (IV) isporukom. Drugi primer su sastavi koji su formulisane za direktnu isporuku u moždanu parenhimu, npr., infuzijom u mozak, kao što je neprekidna infuzija pumpom.
[0314] Farmaceutski sastavi koji sadrže RNKi agense prema pronalasku mogu biti, na primer, rastvori sa ili bez pufera ili sastavi koji sadrže farmaceutski prihvatljive nosače. Takvi sastavi uključuju, na primer, vodene ili kristalne sastave, lipozomske formulacije, micelarne formulacije, emulzije i vektore genske terapije.
[0315] U opisanom postupku, RNKi agens može biti primenjen u rastvoru. Slobodan RNKi agens se može davati u neupotrebljenom rastvoru, npr. u fiziološkom rastvoru ili u vodi. Alternativno, slobodna siRNK se takođe može primeniti u odgovarajućem puferskom rastvoru. Puferski rastvor može sadržati acetat, citrat, prolamin, karbonat ili fosfat, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U poželjnom otelotvorenju, puferski rastvor je fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom (PBS). pH i osmolarnost puferskog rastvora koji sadrži RNKi agens može se podesiti tako da je pogodan za davanje pacijentu.
[0316] U nekim implementacijama, puferski rastvor dalje sadrži agens za kontrolu osmolarnosti rastvora, tako da osmolarnost drži željenu vrednost, npr., na fiziološke vrednosti ljudske plazme. Rastvori koji se mogu dodati u puferski rastvor za kontrolu osmolarnosti obuhvataju, ali nisu ograničeni na, proteine, peptide, aminokiseline, ne-metabolizovane polimere, vitamine, jone, šećere, metabolite, organske kiseline, lipide ili soli. U nekim otelotvorenjima, agens za kontrolisanje osmolarnosti rastvora je so. U određenim otelotvorenjima, agens za kontrolisanje osmolarnosti rastvora je natrijum hlorid ili kalijum hlorid.
[0317] Farmaceutski sastavi prema pronalasku mogu se primenjivati u dozama koje su dovoljne da inhibiraju eksprimiranje Serpinal gena. Generalno, pogodna doza iRNK pronalaska biće u opsegu od oko 0,001 do oko 200,0 miligrama po kilogramu telesne težine primaoca dnevno, uglavnom u opsegu od oko 1 do 50 mg po kilogramu telesne težine dnevno. Na primer, dsRNK se može primeniti na oko 0,01 mg/kg, oko 0,05 mg/kg, oko 0,5 mg/kg, oko 1 mg/kg, oko 1,5 mg/kg, oko 2 mg/kg, oko 3 mg/kg, oko 10 mg/kg, oko 20 mg/kg, oko 30 mg/kg, oko 40 mg/kg, ili oko 50 mg/kg po pojedinačnoj dozi.
[0318] Na primer, RNKi agens, npr., dsRNK, se može primeniti pri dozi od oko 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, ili oko 10 mg/kg. Vrednosti i opsezi između navedenih vrednosti se takođe smatraju delom ovog pronalaska.
[0319] U drugoj implementaciji, RNKi agens, npr., dsRNK, je primenjen pri dozi od oko 0,1 do oko 50 mg/kg, oko 0,25 do oko 50 mg/kg, oko 0,5 do oko 50 mg/kg, oko 0,75 do oko 50 mg/kg, oko 1 do oko 50 mg/mg, oko 1,5 do oko 50 mg/kb, oko 2 do oko 50 mg/kg, oko 2,5 do oko 50 mg/kg, oko 3 do oko 50 mg/kg, oko 3,5 do oko 50 mg/kg, oko 4 do oko 50 mg/kg, oko 4,5 do oko 50 mg/kg, oko 5 do oko 50 mg/kg, oko 7,5 do oko 50 mg/kg, oko 10 do oko 50 mg/kg, oko 15 do oko 50 mg/kg, oko 20 do oko 50 mg/kg, oko 20 do oko 50 mg/kg, oko 25 do oko 50 mg/kg, oko 25 do oko 50 mg/kg, oko 30 do oko 50 mg/kg, oko 35 do oko 50 mg/kg, oko 40 do oko 50 mg/kg, oko 45 do oko 50 mg/kg, oko 0,1 do oko 45 mg/kg, oko 0,25 do oko 45 mg/kg, oko 0,5 do oko 45 mg/kg, oko 0,75 do oko 45 mg/kg, oko 1 do oko 45 mg/mg, oko 1,5 do oko 45 mg/kb, oko 2 do oko 45 mg/kg, oko 2,5 do oko 45 mg/kg, oko 3 do oko 45 mg/kg, oko 3,5 do oko 45 mg/kg, oko 4 do oko 45 mg/kg, oko 4,5 do oko 45 mg/kg, oko 5 do oko 45 mg/kg, oko 7,5 do oko 45 mg/kg, oko 10 do oko 45 mg/kg, oko 15 do oko 45 mg/kg, oko 20 do oko 45 mg/kg, oko 20 do oko 45 mg/kg, oko 25 do oko 45 mg/kg, oko 25 do oko 45 mg/kg, oko 30 do oko 45 mg/kg, oko 35 do oko 45 mg/kg, oko 40 do oko 45 mg/kg, oko 0,1 do oko 40 mg/kg, oko 0,25 do oko 40 mg/kg, oko 0,5 do oko 40 mg/kg, oko 0,75 do oko 40 mg/kg, oko 1 do oko 40 mg/mg, oko 1,5 do oko 40 mg/kb, oko 2 do oko 40 mg/kg, oko 2,5 do oko 40 mg/kg, oko 3 do oko 40 mg/kg, oko 3,5 do oko 40 mg/kg, oko 4 do oko 40 mg/kg, oko 4,5 do oko 40 mg/kg, oko 5 do oko 40 mg/kg, oko 7,5 do oko 40 mg/kg, oko 10 do oko 40 mg/kg, oko 15 do oko 40 mg/kg, oko 20 do oko 40 mg/kg, oko 20 do oko 40 mg/kg, oko 25 do oko 40 mg/kg, oko 25 do oko 40 mg/kg, oko 30 do oko 40 mg/kg, oko 35 do oko 40 mg/kg, oko 0,1 do oko 30 mg/kg, oko 0,25 do oko 30 mg/kg, oko 0,5 do oko 30 mg/kg, oko 0,75 do oko 30 mg/kg, oko 1 do oko 30 mg/mg, oko 1,5 do oko 30 mg/kb, oko 2 do oko 30 mg/kg, oko 2,5 do oko 30 mg/kg, oko 3 do oko 30 mg/kg, oko 3,5 do oko 30 mg/kg, oko 4 do oko 30 mg/kg, oko 4,5 do oko 30 mg/kg, oko 5 do oko 30 mg/kg, oko 7,5 do oko 30 mg/kg, oko 10 do oko 30 mg/kg, oko 15 do oko 30 mg/kg, oko 20 do oko 30 mg/kg, oko 20 do oko 30 mg/kg, oko 25 do oko 30 mg/kg, oko 0,1 do oko 20 mg/kg, oko 0,25 do oko 20 mg/kg, oko 0,5 do oko 20 mg/kg, oko 0,75 do oko 20 mg/kg, oko 1 do oko 20 mg/mg, oko 1,5 do oko 20 mg/kb, oko 2 do oko 20 mg/kg, oko 2,5 do oko 20 mg/kg, oko 3 do oko 20 mg/kg, oko 3,5 do oko 20 mg/kg, oko 4 do oko 20 mg/kg, oko 4,5 do oko 20 mg/kg, oko 5 do oko 20 mg/kg, oko 7,5 do oko 20 mg/kg, oko 10 do oko 20 mg/kg, ili oko 15 do oko 20 mg/kg. Vrednosti i opsezi između navedenih vrednosti se takođe smatraju delom ovog pronalaska.
[0320] Na primer, RNKi agens, npr., dsRNK, se može primeniti pri dozi od oko 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, ili oko 10 mg/kg. Vrednosti i opsezi između navedenih vrednosti se takođe smatraju delom ovog obelodanjenja.
1
[0321] U drugoj implementaciji, RNKi agens, npr. ,dsRNK, je primenjen pri dozi od oko 0,5 do oko 50 mg/kg, oko 0,75 do oko 50 mg/kg, oko 1 do oko 50 mg/mg, oko 1,5 do oko 50 mg/kg, oko 2 do oko 50 mg/kg, oko 2,5 do oko 50 mg/kg, oko 3 do oko 50 mg/kg, oko 3,5 do oko 50 mg/kg, oko 4 do oko 50 mg/kg, oko 4,5 do oko 50 mg/kg, oko 5 do oko 50 mg/kg, oko 7,5 do oko 50 mg/kg, oko 10 do oko 50 mg/kg, oko 15 do oko 50 mg/kg, oko 20 do oko 50 mg/kg, oko 20 do oko 50 mg/kg, oko 25 do oko 50 mg/kg, oko 25 do oko 50 mg/kg, oko 30 do oko 50 mg/kg, oko 35 do oko 50 mg/kg, oko 40 do oko 50 mg/kg, oko 45 do oko 50 mg/kg, oko 0,5 do oko 45 mg/kg, oko 0,75 do oko 45 mg/kg, oko 1 do oko 45 mg/mg, oko 1,5 do oko 45 mg/kb, oko 2 do oko 45 mg/kg, oko 2,5 do oko 45 mg/kg, oko 3 do oko 45 mg/kg, oko 3,5 do oko 45 mg/kg, oko 4 do oko 45 mg/kg, oko 4,5 do oko 45 mg/kg, oko 5 do oko 45 mg/kg, oko 7,5 do oko 45 mg/kg, oko 10 do oko 45 mg/kg, oko 15 do oko 45 mg/kg, oko 20 do oko 45 mg/kg, oko 20 do oko 45 mg/kg, oko 25 do oko 45 mg/kg, oko 25 do oko 45 mg/kg, oko 30 do oko 45 mg/kg, oko 35 do oko 45 mg/kg, oko 40 do oko 45 mg/kg, oko 0,5 do oko 40 mg/kg, oko 0,75 do oko 40 mg/kg, oko 1 do oko 40 mg/mg, oko 1,5 do oko 40 mg/kb, oko 2 do oko 40 mg/kg, oko 2,5 do oko 40 mg/kg, oko 3 do oko 40 mg/kg, oko 3,5 do oko 40 mg/kg, oko 4 do oko 40 mg/kg, oko 4,5 do oko 40 mg/kg, oko 5 do oko 40 mg/kg, oko 7,5 do oko 40 mg/kg, oko 10 do oko 40 mg/kg, oko 15 do oko 40 mg/kg, oko 20 do oko 40 mg/kg, oko 20 do oko 40 mg/kg, oko 25 do oko 40 mg/kg, oko 25 do oko 40 mg/kg, oko 30 do oko 40 mg/kg, oko 35 do oko 40 mg/kg, oko 0,5 do oko 30 mg/kg, oko 0,75 do oko 30 mg/kg, oko 1 do oko 30 mg/mg, oko 1,5 do oko 30 mg/kb, oko 2 do oko 30 mg/kg, oko 2,5 do oko 30 mg/kg, oko 3 do oko 30 mg/kg, oko 3,5 do oko 30 mg/kg, oko 4 do oko 30 mg/kg, oko 4,5 do oko 30 mg/kg, oko 5 do oko 30 mg/kg, oko 7,5 do oko 30 mg/kg, oko 10 do oko 30 mg/kg, oko 15 do oko 30 mg/kg, oko 20 do oko 30 mg/kg, oko 20 do oko 30 mg/kg, oko 25 do oko 30 mg/kg, oko 0,5 do oko 20 mg/kg, oko 0,75 do oko 20 mg/kg, oko 1 do oko 20 mg/mg, oko 1,5 do oko 20 mg/kb, oko 2 do oko 20 mg/kg, oko 2,5 do oko 20 mg/kg, oko 3 do oko 20 mg/kg, oko 3,5 do oko 20 mg/kg, oko 4 do oko 20 mg/kg, oko 4,5 do oko 20 mg/kg, oko 5 do oko 20 mg/kg, oko 7,5 do oko 20 mg/kg, oko 10 do oko 20 mg/kg, ili oko 15 do oko 20 mg/kg. U jednom otelotvorenju, dsRNK je primenjen pri dozi od oko 10mg/kg do oko 30 mg/kg. Vrednosti i opsezi između navedenih vrednosti se takođe smatraju delom ovog pronalaska.
[0322] Na primer, pacijentima se može primeniti terapeutska količina iRNK, kao što je oko 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8,
2
4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5,14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 20,5, 21, 21,5, 22, 22,5, 23, 23,5, 24, 24,5, 25, 25,5, 26, 26,5, 27, 27,5, 28, 28,5, 29, 29,5, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ili oko 50 mg/kg. Vrednosti i opsezi između navedenih vrednosti se takođe smatraju delom ovog obelodanjenja.
[0323] U određenim implementacijama, na primer, kada sastav obuhvata dsRNK kako je opisano ovde i lipid, pacijentima se može primeniti terapeutska količina iRNK, kao što je oko 0,01 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 0,05 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 0,05 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 0,1 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 0,1 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 0,2 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 0,2 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 0,3 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 0,3 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 0,4 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 0,4 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 0,5 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 0,5 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 1 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 1 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 1,5 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 1,5 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 2 mg/kg do oko oko 2,5 mg/kg, oko 2 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 3 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 3 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 3,5 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 4 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 4,5 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 4 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 4,5 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 5 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 5,5 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 6 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 6,5 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 7 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 7,5 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 8 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 8,5 mg/kg do oko 10 mg/kg, oko 9 mg/kg do oko 10 mg/kg, ili oko 9,5 mg/kg do oko 10 mg/kg. Vrednosti i opsezi između navedenih vrednosti se takođe smatraju delom ovog pronalaska. Na primer, dsRNK se može primeniti pri dozi od oko 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9,9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, ili oko 10 mg/kg. Vrednosti i opsezi između navedenih vrednosti se takođe smatraju delom ovog obelodanjenja.
[0324] U određenim implementacijama, na primer, kada dvolančani RNKi agens uključuje modifikacije (npr., jedan ili više motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, uključujući jedan takav motiv na ili blizu mesta cepanja agensa), šest fosforotioat veza, i ligand, takav agens je primenjen pri dozi od oko 0,01 do oko 0,5 mg/kg, oko 0,01 do oko 0,4 mg/kg, oko 0,01 do oko 0,3 mg/kg, oko 0,01 do oko 0,2 mg/kg, oko 0,01 do oko 0,1 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 0,09 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 0,08 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 0,07 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 0,06 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 0,05 mg/kg, oko 0,02 do oko 0,5 mg/kg, oko 0,02 do oko 0,4 mg/kg, oko 0,02 do oko 0,3 mg/kg, oko 0,02 do oko 0,2 mg/kg, oko 0,02 do oko 0,1 mg/kg, oko 0,02 mg/kg do oko 0,09 mg/kg, oko 0,02 mg/kg do oko 0,08 mg/kg, oko 0,02 mg/kg do oko 0,07 mg/kg, oko 0,02 mg/kg do oko 0,06 mg/kg, oko 0,02 mg/kg do oko 0,05 mg/kg, oko 0,03 do oko 0,5 mg/kg, oko 0,03 do oko 0,4 mg/kg, oko 0,03 do oko 0,3 mg/kg, oko 0,03 do oko 0,2 mg/kg, oko 0,03 do oko 0,1 mg/kg, oko 0,03 mg/kg do oko 0,09 mg/kg, oko 0,03 mg/kg do oko 0,08 mg/kg, oko 0,03 mg/kg do oko 0,07 mg/kg, oko 0,03 mg/kg do oko 0,06 mg/kg, oko 0,03 mg/kg do oko 0,05 mg/kg, oko 0,04 do oko 0,5 mg/kg, oko 0,04 do oko 0,4 mg/kg, oko 0,04 do oko 0,3 mg/kg, oko 0,04 do oko 0,2 mg/kg, oko 0,04 do oko 0,1 mg/kg, oko 0,04 mg/kg do oko 0,09 mg/kg, oko 0,04 mg/kg do oko 0,08 mg/kg, oko 0,04 mg/kg do oko 0,07 mg/kg, oko 0,04 mg/kg do oko 0,06 mg/kg, oko 0,05 do oko 0,5 mg/kg, oko 0,05 do oko 0,4 mg/kg, oko 0,05 do oko 0,3 mg/kg, oko 0,05 do oko 0,2 mg/kg, oko 0,05 do oko 0,1 mg/kg, oko 0,05 mg/kg do oko 0,09 mg/kg, oko 0,05 mg/kg do oko 0,08 mg/kg, ili oko 0,05 mg/kg do oko 0,07 mg/kg. Vrednosti i opsezi između gore navedenih vrednosti se takođe smatraju delom ovog obelodanjenja, npr.,, RNKi agens se može primeniti pacijentu pri dozi od oko 0,015 mg/kg do oko 0,45 mg/mg.
[0325] Na primer, RNKi agens, npr., RNKi agens in farmaceutski sastav, se može primeniti pri dozi od oko 0,01 mg/kg, 0,0125 mg/kg, 0,015 mg/kg, 0,0175 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,0225 mg/kg, 0,025 mg/kg, 0,0275 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,0325 mg/kg, 0,035 mg/kg, 0,0375 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,0425 mg/kg, 0,045 mg/kg, 0,0475 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,0525 mg/kg, 0,055 mg/kg, 0,0575 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,0625 mg/kg, 0,065 mg/kg, 0,0675 mg/kg, 0,07 mg/kg, 0,0725 mg/kg, 0,075 mg/kg, 0,0775 mg/kg, 0,08 mg/kg, 0,0825 mg/kg, 0,085 mg/kg, 0,0875 mg/kg, 0,09 mg/kg, 0,0925 mg/kg, 0,095 mg/kg, 0,0975 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,125 mg/kg, 0,15 mg/kg, 0,175 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,225 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,275 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,325 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,375 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,425 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,475 mg/kg, ili oko 0,5 mg/kg. Vrednosti između gore navedenih vrednosti se takođe smatraju delom ovog obelodanjenja.
4
[0326] Farmaceutski sastav se može davati jednom dnevno, ili se iRNK može primenjivati kao dve, tri ili više pod-doza u odgovarajućim intervalima tokom celog dana ili čak i uz kontinuiranu infuziju ili isporuku putem formulacije sa kontrolisanim oslobađanjem. U tom slučaju, iRNK sadržana u svakoj pod-dozi mora biti odgovarajuće manja kako bi se postigla ukupna dnevna doza. Jedinica za doziranje može se takođe upakovati za isporuku tokom nekoliko dana, npr., koristeći konvencionalnu formulaciju sa produženim oslobađanjem koja pruža produženo oslobađanje iRNK tokom nekoliko dana. Formulacije sa produženim oslobađanjem su dobro poznate u struci i naročito su korisne za isporuku agensa na određeno mesto, kao što se može koristiti sa agensima predmetnog pronalaska. U ovom aspektu, jedinica za doziranje sadrži odgovarajuću višestruku dnevnu dozu.
[0327] U drugim implementacijama, pojedinačna doza farmaceutskog sastava može biti dugotrajna, tako da se naredne doze primenjuju u ne više od 3, 4 ili 5 dana, ili u intervalima od najviše 1, 2, 3 ili 4 nedelje. U nekim otelotvorenjima pronalaska, pojedinačna doza farmaceutskih sastava prema pronalasku se daje jednom nedeljno. U drugim implementacijama, pojedinačna doza farmaceutskih sastav pronalaska se daje dvomesečno.
[0328] Obučeni stručnjaci će razumeti da određeni faktori mogu utiču na doziranje i vreme potrebno za efikasno lečenje pacijenta, uključujući, ali ne ograničavajući se na težinu bolesti ili poremećaja, prethodne tretmane, opšte zdravlje i/ili starost pacijenta i druge prisutne bolesti. Štaviše, lečenje pacijenta sa terapeutski efektivnom količinom sastava može uključiti pojedinačni tretman ili niz tretmana. Procene efikasnih doziranja i in vivo poluživot za pojedinačne iRNK koje su obuhvaćene pronalaskom mogu se napraviti koristeći konvencionalne metodologije ili na osnovu in vivo testiranja korišćenjem odgovarajućeg životinjskog modela, kako je ovde opisano na drugim mestima.
[0329] Napredak u genetici miševa generisao je niz modela miševa za proučavanje različitih ljudskih bolesti, kao što je poremećaj jetre koji bi imao koristi od smanjenja eksprimiranja Serpina1. Takvi modeli se mogu koristiti in vivo testiranje iRNK, kao i za određivanje terapeutski efikasne doze. Pogodni modeli miševa su poznati u struci i uključuju, na primer, miša koji sadrži transgene koji eksprimira ljudski Serpina1.
[0330] Farmaceutski sastavi prema predmetnom pronalasku mogu se davati na više načina u zavisnosti od toga da li je poželjno lokalno ili sistemsko lečenje i površine koja se tretira. primena može biti aktuelna (npr., preko transdermalnog krila), plućna, npr., udisanjem ili insuflacijom praha ili aerosola, uključujući i nebulizator; intratrahealna, intranazalna, epidermalna i transdermalna, oralna ili parenteralna. Parenteralna primena obuhvata intravenoznu, intraarterijalnu, potkožnu, intraperitonealno ili intramuskularnu injekciju ili infuziju; subdermalna, npr., preko implantiranog uređaja; ili intrakranijalna, npr., intraparenhimalna, intratekalna ili intraventrikularna, primena. iRNK se može isporučiti na način da se cilja određeno tkivo, kao što je jetra (npr., hepatociti jetre).
[0331] Farmaceutski sastavi i formulacije za lokalnu primenu mogu uključivati transdermalne flastere, masti, losione, kreme, gelove, kapi, supozitorijume, sprejeve, tečnosti i praškove. Konvencionalni farmaceutski nosači, vodeni, u prahu ili uljne baze, agensi za zgušnjavanje i slično mogu biti neophodni ili poželjni. Obloženi kondomi, rukavice i slično takođe mogu biti korisni. Pogodne topikalne formulacije obuhvataju one u kojima su iRNK koje se nalaze u pronalasku u smeši sa lokalnim agensom za isporuku kao što su lipidi, lipozomi, masne kiseline, estri masnih kiselina, steroidi, helatirajući agensi i surfaktanti. Pogodni lipidi i lipozomi uključuju neutralne (npr., dioleoilfosfatidil DOPE etanolamin, dimriristoilfosfatidil holin DMPC, distearoliphosphatidil choline) negativne (npr., dimirristoilfosfatidil glicerol DMPG) i katjonske (npr., dioleoiltetramethilaminopropil DOTAP i dioleoilphosphatidil ethanolamine DOTMA). iRNK koji se nalaze u pronalasku mogu biti inkapsulirani unutar lipozoma ili mogu formirati komplekse za to, naročito za katjonske lipozome. Alternativno, iRNK se mogu složiti sa lipidima, posebno sa katjonskim lipidima. Pogodne masne kiseline i esteri uključuju ali nisu ograničeni na arahidonsku kiselinu, oleinsku kiselinu, eikozanojsku kiselinu, laurinu kiselinu, kaprilnu kiselinu, kaprinsku kiselinu, miristatnu kiselinu, palmitinsku kiselinu, stearnu kiselinu, linolnu kiselinu, linolensku kiselinu, dikaprat, tricaprat, monoolein, dilaurin, gliceril 1-monokaprat, 1-dodecilazacikloheptan-2-on, acilkarnitin, acilholin ili C1-20alkil estar (na primer, izopropilmistristat IPM), monoglicerid, diglicerid ili njihova farmaceutski prihvatljiva so). Lokalne formulacije su detaljno opisane u U.S. Patent No.6,747,014.
A. iRNK formulacije koje sadrže membranske molekularne sklopove
[0332] iRNK za upotrebu u sastavima i postupcima pronalaska može se formulisati za isporuku u membranskom molekularnom sklopu, npr., lipozom ili micelom. Kad se ovde koristi, izraz „lipozom“ odnosi se na vezikulu sastavljenu od amfifilnih lipida raspoređenih u najmanje jednom dvoslojnu, npr., jednom dvosloju ili mnoštvu dvosloja. Lipozomi uključuju unilamelarne i multilamelarne vezikule koji imaju membranu formiranu od lipofilnog materijala i vodene unutrašnjosti. Vodeni deo sadrži sastav iRNK. Lipofilni materijal izoluje vodenu unutrašnjost od vodene spoljašnosti, koja obično ne uključuje sastav iRNK, iako u nekim primerima to može biti slučaj. Lipozomi su korisni za prenos i isporuku aktivnih sastojaka na mesto delovanja. Pošto je lipozomalna membrana strukturno slična biološkim membranama, kada se lipozomi primenjuju na tkivo, lipozomski dvosloj se spaja sa dvosloje ćelijskih membrana. Kako spajanje lipozoma i ćelija napreduje, unutrašnji vodeni sadržaj koji uključuje iRNK se dostavlja u ćeliju gde se iRNK može specifično vezati za ciljanu RNK i može posredovati RNKi. U nekim slučajevima su i lipozomi posebno ciljani, npr., da usmere iRNK na određene vrste ćelija.
[0333] Lipozom koji sadrži RNKi agens može se pripremiti različitim postupcima. U jednom primeru, lipidna komponenta lipozoma se rastvara u deterdžentu, tako da se micele formiraju sa lipidnom komponentom. Na primer, lipidna komponenta može biti amfipatički katjonski lipidni ili lipidni konjugat. Deterdžent može imati visoko kritičnu koncentraciju micela i može biti nejonski. Primerni deterdženti uključuju holat, CHAPS, oktilglukozid, dezoksiholat i lauroil sarkozin. Priprema RNKi agensa se zatim dodaje na micele koji uključuju lipidnu komponentu. katjonske grupe na lipidu komuniciraju sa RNKi agensom i kondenzuju oko RNKi agensa kako bi se formiralo lipozom. Nakon kondenzacije, deterdžent se uklanja, npr., dijalizom, kako bi se dobio lipozomski sastav RNKi agensa.
[0334] Ako je neophodno, tokom reakcije kondenzacije može se dodati nosač jedinjenje koje pomaže u kondenzaciji, npr., kontrolisanim dodavanjem. Na primer, jedinjenje nosač može biti polimer koji nije nukleinska kiselina (npr., spermin ili spermidin). pH se takođe može prilagoditi kako bi se podstakla kondenzacija.
[0335] Postupci za proizvodnju stabilnih nosača za isporuku polinukleotida, koje uključuju polinukleotidni/katjonski lipidni kompleks kao strukturne komponente nosača za isporuku, dalje su opisane u, na primer, WO 96/37194. Formacija lipozoma može takođe uključiti jedan ili više aspekata primernih postupka opisanih u Felgner, P. L. i dr., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987; U.S. Pat. br.4,897,355; U.S. Pat. br.5,171,678; Bangham, i dr. M. Mol. Biol.23:238, 1965; Olson, i dr. Biochim. Biophys. Acta 557:9, 1979; Szoka, i dr. Proc. Natl. Acad. Sci.75: 4194, 1978; Mayhew, i dr. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984; Kim, i dr. Biochim. Biophys. Acta 728:339, 1983; i Fukunaga, i dr. Endocrinol.115:757, 1984. Uobičajeno korišćene tehnike za pripremu lipidnih agregata odgovarajuće veličine za upotrebu kao nosača za isporuku uključuju sonikaciju i zamrzavanje-otapanje i ekstruziju (pogledati, npr., Mayer, i dr. Biochim. Biophys. Acta 858:161, 1986). Mikrofluidizacija se može koristiti kada je konzistentno mala (50 do 200 nm) i željeni su relativno ravnomerni agregati (Mayhew, i dr. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984). Ovi postupci se lako prilagođavaju pakovanju sastava RNKi u lipozome.
[0336] Lipozomi padaju u dve široke klase. Katjonski lipozomi su pozitivno naelektrisani lipozomi koji komuniciraju sa negativno naelektrisanim molekulima nukleinske kiseline kako bi se formirao stabilan kompleks. Pozitivno naelektrisan kompleks nukleinske kiseline/lipozoma se vezuje za negativno naelektrisanu ćelijsku površinu i internalizuje se u endozomu. Zbog kiselog pH unutar endozoma, lipozomi su pocepani, oslobađajući svoj sadržaj u ćelijsku citoplazmu (Wang i dr., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).
[0337] Lipozomi koji su pH-osetljivi ili negativno-naelektrisani, zarobljavaju nukleinske kiseline umesto da se kompleksiraju sa njima. Pošto su i nukleinska kiselina i lipid slično napunjeni, javlja se odbojnost umesto formacije kompleksa. Ipak, neka nukleinska kiselina je zarobljena unutar vodene unutrašnjosti ovih lipozoma. pH osetljivi lipozomi su korišćeni da daju nukleinske kiseline koje kodiraju timidin-kinazni gen za ćelijske monoslojeve u kulturi. Eksprimiranje egzogenog gena je otkriveno u ciljanim ćelijama (Zhou i dr., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
[0338] Jedan od glavnih tipova lipozomskih sastava uključuje fosfolipide, osim fosfatidilholina iz prirodnih izvora. iNeutralne lipozomski sastavi, na primer, mogu se formirati od dimriristoil fosfatidilholina (DMPC) ili dipalmitoil fosfatidilholina (DPPC). Anjonski lipozomski sastavi se generalno formiraju od dimirristoil fosfatidilglicerola, dok se anjonski fuzogeni lipozomi formiraju prvenstveno od dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE). Druga vrsta lipozomskog sastava formira se od fosfatidilholina (PC), kao što je, na primer, sojin PC i jajni PC. Drugi tip se formira od smeša fosfolipida i/ili fosfatidilholina i/ili holesterola.
[0339] Primeri drugih postupka uvođenja lipozoma u ćelije in vitro i in vivo uključi U.S. Pat.
br. 5,283,185; U.S. Pat. br.5,171,678; WO 94/00569; WO 93/24640; WO 91/16024; Felgner, J. Biol. Chem.269:2550, 1994; Nabel, Proc. Natl. Acad. Sci.90:11307, 1993; Nabel, Human Gene Ther.3:649, 1992; Gershon, Biochem. 32:7143, 1993; i Strauss EMBO J.11:417, 1992.
[0340] Nejonski lipozomalni sistemi su takođe ispitivani kako bi se utvrdila njihova upotreba u isporuci lekova na kožu, posebno sistemi koji sadrže nejonske surfaktante i holesterol. Nejonske lipozomske formulacije koje sadrže Novasome™ I (gliceril dilaurat/holesterol/polioksietilen-10-stearil etar) i Novasome™ II (gliceril distearat/holesterol/polioksietilen-10-stearil etar) su korišćeni da isporuče ciklosporin-A u dermis kože miša. Rezultati su pokazali da su takvi nejonski lipozomalni sistemi efikasni u olakšavanju raspoređivanja ciklosporina A u različite slojeve kože (Hu i dr. S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4(6) 466).
[0341] Lipozomi takođe uključuju „sterički stabilizovane“ lipozome, izraz koji se, kad se ovde koristi, odnosi na lipozome koji sadrže jedan ili više specijalnih lipida, koji, kada su obuhvaćeni u lipozome, rezultuju poboljšanim životnim vekom cirkulacije u odnosu na lipozome koji nemaju takve specijalizovane lipide. Primeri sterikalno stabilizovanih lipozoma su oni u kojima lipidni deo dela lipozoma koji formira vezikule (A) sadrži jedan ili više glikolipid, kao što je monosialogangliosid GM1, ili (B) je derivatizovan sa jednim ili više hidrofilnih polimera, kao što je ostatak polietilenglikola (PEG). Bez želje da se veže konkretnim teorijama, u struci je mišljenje da, bar za sterički stabilizovane lipozome koji sadrže ganglioside, sfingomijelin ili lipidne derivate PEG-a, poboljšani poluživot cirkulacije ovih sterikalno stabilizovanih lipozoma potiče od smanjenog uzimanja u ćelije retikuloendotelijalnog sistema (RES) (Allen i dr., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu i dr., Cancer Research, 1993, 53, 3765).
[0342] Različiti lipozomi koji sadrže jedan ili više glikolipida su poznati u struci.
Papahadjopoulos i dr. (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) izvestili su o sposobnosti monosialogangliosida GM1, galaktokeribrozid sulfata i fosfatidilinositola da poboljšaju poluživot lipozoma u krvi. Ovi nalazi su izloženi od strane Gabizon i dr. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949). U.S. Pat. br.4,837,028 i WO 88/04924, oba za Allen i dr., koji otkrivaju lipozome koji obuhvataju (1) sfingomielin i (2) gangliozid GM1ili estar gelakocerebrozid sulfata. U.S. Pat. br.5,543,152 (Webb i dr.) otkriva lipozome koji sadrže sfingomielin. Lipozomi koji sadrže 1,2-sn-dimiristoilfosfatidilholin su opisani u WO 97/13499 (Lim et al).
[0343] U jednoj implementaciji koriste se katjonski lipozomi. Katjonski lipozomi imaju prednost u tome da se mogu spajati u ćelijsku membranu. Nestacionarni lipozomi, iako nisu u mogućnosti da se efikasno osiguraju sa plazmatskom membranom, uzimaju makrofag in vivo i mogu se koristiti za isporuku RNKi agensa na makrofage.
[0344] Dodatne prednosti lipozoma uključuju: lipozomi dobijeni od prirodnih fosfolipida su biokompatibilni i biorazgradivi; lipozomi mogu uključiti širok raspon lekova koji rastvaraju vodu i lipide; lipozomi mogu zaštititi inkapsulirane RNKi agense u svojim unutrašnjim odeljcima od metabolizma i degradacije (Rosoff, u „Pharmaceutical Dosage Forms,“ Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, volume 1, p.245). Važna razmatranja u pripremi lipozomskih formulacija su zarazni nivo lipida, veličina vesticida i vodena zapremina lipozoma.
[0345] Pozitivno naelektrisani sintetički katjonski lipid, N-[1-(2,3-dioliloksi)propil]-N, N,N-trimetilamonijum hlorid (DOTMA) se može koristiti za formiranje malih lipozoma koji spontano interakiju sa nukleinskom kiselinom kako bi formirali lipid-nukleinska kiselina komplekse koji su sposobni da se spoje sa negativno naelektrisanim lipidima ćelijskih membrana ćelija kulture tkiva, što dovodi do isporuke RNKi agensa (pogledati, na primer, Felgner, P. L. i dr., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987 i U.S. Pat. No.4,897,355 za opis DOTMA i njegovu upotrebu sa DNK).
[0346] DOTMA analog, 1,2-bis(oleoiloksi)-3-(trimetilamonijum) propan (DOTAP) može se koristiti u kombinaciji sa fosfolipidom kako bi se formirali vezivni sastojci za DNK.
Lipofectin™ Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.) je efikasan agens za isporuku visoko anjonskih nukleinskih kiselina u žive ćelije kulture tkiva koje sadrže pozitivno naelektrisane DOTMA lipozome koji spontano interakuju sa negativno naelektrisanim polinukleotidima kako bi formirali komplekse. Kada se koriste dovoljno pozitivno naelektrisani lipozomi, neto naelektrisanje na rezultujućim kompleksima je takođe pozitivno. Pozitivno naelektrisani kompleksi pripremljeni na ovaj način spontano se spajaju sa negativno naelektrisanim ćelijskim površinama, fuzionišu se sa plazmatskom membranom i efikasno isporučuju funkcionalne nukleinske kiseline u, na primer, ćelije kulture tkiva. Još jedan komercijalno dostupan katjonski lipid, 1,2-bis(oleoiloksi)-3,3-(trimetilamonijum) propan („DOTAP“) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) razlikuje se od DOTMA po tome što oleoil ostaci povezuju esterski, umesto etarskim vezama.
[0347] Druga prijavljena katjonska lipidna jedinjenja uključuju ona koji su konjugovana u različite grupe uključujući, na primer, karboksispermin koji je konjugovan sa jednim od dva tipa lipida i uključuje jedinjenja kao što je 5-karboksiperperil glicin dioktoaolojlamid („DOGS“) (Transfectam™, Promega, Madison, Visconsin) i dipalmitoilfosfatidiletanolamin 5-karboksispermil-amid („DPPES“) (pogledati, npr. U.S. Pat. No.5,171,678).
[0348] Drugi katjonski lipidni konjugat uključuje derivatizaciju lipida sa holesterolom („DC-Chol“) koji je formulisan u lipozome u kombinaciji sa DOPE (pogledati, Gao, X. and Huang, L., Biochim. Biophys. Res. Commun. 179:280, 1991). Pokazano je da je lipopolilizin, napravljen od konjugovajućeg polilizina za DOPE, efikasan za transfekciju u prisustvu seruma (Zhou, X. i dr., Biochim. Biophys. Acta 1065:8, 1991). Za određene ćelijske linije, za ove lipozome koji sadrže konjugovane katjonske lipide, navodi se da imaju manju toksičnost i pružaju efikasniju transfekciju nego sastavi koji sadrže DOTMA. Ostali komercijalno dostupni katjonski lipidni proizvodi uključuju DMRIE i DMRIE-HP (Vical, La Jolla, California) i Lipofectamin (DOSPA) (Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland). Drugi katjonski lipidi pogodni za isporuku oligonukleotida su opisani u WO 98/39359 i WO 96/37194.
[0349] Lipozomske formulacije su posebno pogodne za lokalnu primenu, lipozomi predstavljaju nekoliko prednosti u odnosu na druge formulacije. Takve prednosti uključuju smanjene neželjene efekte vezane za visoku sistemsku apsorpciju primenjenog leka, povećanu akumulaciju primenog leka na željenoj meti i mogućnost davanja RNKi agensa u kožu. U nekim primenama, lipozomi se koriste za isporuku RNKi agensa u epidermalne ćelije, a takođe i za povećanje penetracije RNKi agenasa u dermalna tkiva, na primer, u kožu. Na primer, lipozomi se mogu primeniti lokalno. Dokumentovana je lokalna isporuka lekova formulisanih kao lipozomi na kožu (pogledati, npr., Weiner i dr., Journal of Drug Targeting, 1992, vol.2,405-410 and du Plessis i dr., Antiviral Research, 18, 1992, 259-265; Mannino, R. J. and Fould-Fogerite, S., Biotechniques 6:682-690, 1988; Itani, T. i dr. Gene 56:267-276. 1987; Nicolau, C. i dr. Meth. Enz.149:157-176, 1987; Straubinger, R. M. i Papahadjopoulos,
1
D. Meth. Enz.101:512-527, 1983; Wang, C. Y. and Huang, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855, 1987).
[0350] Nejonski lipozomalni sistemi su takođe ispitivani kako bi se utvrdila njihova upotreba u isporuci lekova na kožu, posebno sistemi koji sadrže nejonske surfaktante i holesterol. Nejonske lipozomske formulacije koje sadrže Novasome I (gliceril dilaurat/holesterol/polioksietilen-10-stearil eter) i Novasome II (gliceril distearat/holesterol/polioksietilen-10-stearil eter) su korišćene kako bi se isporučio lek u dermis kože miša. Takve formulacije sa RNKi agensom su korisne za lečenje dermatološkog poremećaja.
[0351] Lipozomi koji uključuju iRNK mogu biti visoko deformabilni. Takva deformabilnost može omogućiti da lipozomi prodre kroz pore koje su manje od prosečnog radijusa lipozoma. Na primer, transferozomi su tip deformabilnih lipozoma. Transferozomi mogu biti napravljeni dodavanjem aktivnih površinskih ivica, obično površinsko aktivnih materija, u standardni lipozomski sastav. Transferozomi koji uključuju RNKi agens mogu se dostaviti, na primer, potkožno infekcijom, kako bi se RNKi agens isporučio keratinocitima u koži. Kako bi se prošlo kroz netaknutu kožu sisara, lipidni vezikuli moraju proći kroz seriju finih pora, od kojih je svaka sa prečnikom manjim od 50 nm, pod uticajem pogodnog transdermalnog gradijenta. Pored toga, zbog osobina lipida, ovi transferozomi mogu biti samo-optimizujući (prilagođavajući se obliku pora, npr., u koži), samo-popravljajući i često mogu postići svoje ciljeve bez fragmentisanja i često se sami ukrcavaju.
[0352] Druge formulacije koje su u nadležnosti ovog pronalasku opisane su u serijskim brojevima provizorne prijave u Sjedinjenim Državama. 61/018,616, podnesena 2. januara, 2008.; 61/018,611, podnesena 2. januara 2008.; 61/039,748, podnesena 26.marta 2008.;
61/047,087, podnesena 22. aprila, 2008. i 61/051,528, podnesena 8. maja 2008. PCT prijava broj PCT/US2007/080331, podnesena 3. oktobra 2007 takođe opisuje formulacije koje su u nadležnosti ovog pronalaska.
[0353] Transferzomi su još jedan tip lipozoma i visoko su deformabilni lipidni agregati koji su atraktivni kandidati za nosača za isporuku lekova. Transferzoi mogu biti opisani kao lipidne kapljice koje su tako visoko deformabilne da lako mogu prodreti kroz pore koje su manji od kapljice. Transferzomi se mogu prilagoditi okruženju u kom se koriste, npr., oni se
2
sami optimizuju (prilagođavajući se obliku pore u koži), sami popravljaju, često dostižu svoje ciljeve bez fragmentacije i često se sami ukrcavaju. kako bi se napravili transferzomi, moguće je dodati površinski aktivator, obično surfakante, u standardni lipozomski sastav. Transferi su korišćeni za isporuku serumskih albumina na kožu. Pokazalo se da transferzomima posredovan serumski albuminin deluje jednako efikasnom kao i potkožna injekcija rastvora koji sadrži serumski albumin.
[0354] Surfaktanti pronalaze široku primenu u formulacijama kao što su emulzije (uključujući mikroemulzije) i lipozome. Najčešći način klasifikacije i rangiranja svojstava mnogih različitih tipova surfakanata, prirodnih i sintetičkih, je korišćenje hidrofilnog/lipofilnog bilansa (HLB). Priroda hidrofilne grupe (poznata i kao „glava“) daje najkorisniji agens za kategorizaciju različitih surfaktanata koji se koriste u formulacijama (Rieger, u Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
[0355] Ako molekul surfaktanta nije jonizovan, klasifikuje se kao nejonski surfaktant.
Nejonski surfaktanti imaju široku primenu u farmaceutskim i kozmetičkim proizvodima i mogu se koristiti u širokom spektru pH vrednosti. U principu, njihove HLB vrednosti se kreću od 2 do oko 18 u zavisnosti od njihove strukture. Nejonski surfaktanti uključuju nejonske estre kao što su estri etilen glikola, esteri propilenglikola, gliceril estri, poligliceril estri, sorbitan estri, estri saharoze i etoksilovani esteri. U ovu klasu su takođe uključeni nejonski alkanolamidi i etri kao što su etoksilati masnih alkohola, propoksilovani alkoholi i etoksilovani/propoksilovani blokovi polimera. Polioksietilen surfaktanti su najpopularniji članovi klase nejonske površinske supstance.
[0356] Ako molekul surfaktanta nosi negativno naelektrisanje kada se rastvara ili raspršava u vodi, surfaktant je klasifikovan kao anjonski. anjonski surfaktanti uključuju karboksilate kao što su sapuni, acil laktilati, acil amidi aminokiselina, estri sumporne kiseline kao što su alkil sulfati i etoksilovani alkil sulfati, sulfonati kao što su alkil benzen sulfonati, acil izetionati, acil taurati i sulfosukcinati i fosfati. Najvažniji članovi klase anjonske tečnosti su alkil sulfati i sapuni.
[0357] Ako molekul surfaktanta nosi pozitivno naelektrisanje kada se rastvara ili raspršuje u vodi, surfaktant je klasifikovan kao katjonski. Katjonski surfaktanti uključuju kvaternarne amonijum soli i etoksilovane amine. Kvaternarne amonijumove soli su najkorišćeniji članovi ove klase.
[0358] Ako molekul surfaktanta ima sposobnost da nosi ili pozitivno ili negativno naelektrisanje, surfaktant je klasifikovan kao amfoteričan. Amfoterički surfaktanti uključuju derivate akrilne kiseline, supstituisane alkilamide, N-alkilbetene i fosfatide.
[0359] Pregledani su surfakanti u proizvodima, formulacijama i emulzijama lekova (Rieger, u Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p.285).
[0360] iRNK za upotrebu u postupcima prema pronalasku može se takođe obezbediti kao micelarna formulacija. „Micele“ su ovde definisane kao posebna vrsta molekularnih sklopova u kojima su amfipatički molekuli raspoređeni u sferičnoj strukturi tako da su svi hidrofobni delovi molekula usmereni ka unutra, ostavljajući hidrofilne delove u dodiru sa okolnom vodenom fazom. Konverzioni aranžman postoji ako je okruženje hidrofobno.
[0361] Mešovita micelarna formulacija pogodna za isporuku preko transdermalnih membrana može se dobiti mešanjem vodenog rastvora siRNK sastava, alkalnog metala C8do C22alkil sulfata i jedinjenja koja formiraju micele. Jedinjenja koja formiraju micele uključuju lecitin, hijaluronsku kiselinu, farmaceutski prihvatljive soli hijaluronske kiseline, glikolnu kiselinu, mlečnu kiselinu, ekstrakt kamilice, ekstrakt krastavaca, oleinsku kiselinu, linolnu kiselinu, linolensku kiselinu, monoolein, monooleate, monolaurate, borage ulje, ulje, mentol, trihidroksi okso holanil glicin i njihove farmaceutski prihvatljive soli, glicerin, poliglicerin, lizin, polilizin, triolein, polioksietilen eteri i njihovi analogi, poliokanol alkil etri i njihovi analozi, njihodeksiholat, dezoksiholat i njihove smeše. Jedinjenja koja formiraju micelu mogu se dodati istovremeno ili nakon dodavanja alkalnog metilalkil sulfata. Mešane micele će se formirati sa suštinski bilo kakvim mešanjem sastojaka, ali snažno mešanje kako bi se obezbedile manje micele.
[0362] U jednom postupku se priprema prvi micelarni sastav koji sadrži siRNK sastav i najmanje alkali metal alkil-sulfonat. Prvi micelarni sastav se zatim pomeša sa najmanje tri formule za formiranje micela kako bi se formirao mešani micelarni sastav. U nekom drugom postupku, micelarni sastav se priprema mešanjem siRNK sastava, alkali metal alkil sulfata i
4
najmanje jednog od jedinjenja koja formiraju micele, nakon čega sledi dodavanje preostalih jedinjenja koja formiraju micele, uz snažno mešanje.
[0363] Fenol i/ili m-krezol se mogu dodati u mešani micelarni sastav kako bi se stabilizovala formulacija i zaštitila od bakterijskog rasta. Alternativno, fenol i/ili m-krezol se mogu dodati sa sastojcima koji stvaraju micele. Izotonični agens, kao što je glicerin, takođe se može dodati nakon formiranja mešovitog micelarnog sastava.
[0364] Za isporuku micelarne formulacije kao sprej, formulacija se može staviti u aerosolni dozator i dispenzer se napuni sa propelantom. Propelant, koji je pod pritiskom, je u tečnom obliku u dozatoru. Koeficijenti sastojaka podešavaju se tako da vodene i propelantne faze postanu jedno, tj., postoji jedna faza. Ako postoje dve faze, neophodno je protresati dispenzer pre raspršivanja dela sadržaja, npr., kroz mereni ventil. Dozirana doza farmaceutskog sredstva se pomera iz merenog ventila u fini sprej.
[0365] Pogonska goriva mogu uključivati hlorofluorougljenike koji sadrže vodonik, fluorokorbone koji sadrže vodonik, dimetil etar i dietil etar. U određenim otelotvorenjima može se koristiti HFA 134a (1,1,1,2-tetrafluoroetan).
[0366] Specifične koncentracije osnovnih sastojaka mogu se odrediti relativno jednostavnom eksperimentisanjem. Za apsorpciju kroz oralne šupljine, često je poželjno povećati, npr., najmanje dvostruko ili trostruko, dozu za injektiranje ili primenu putem gastrointestinalnog trakta.
B. Lipidne čestice
[0367] iRNK, npr., dsRNK u pronalasku mogu biti potpuno inkapsulirani u lipidnoj formulaciji, npr., LNP ili druge čestice nukleinske kiseline i lipida.
[0368] Kad se ovde koristi, izraz „LNP“ odnosi se na stabilnu nukleinska kiselina-lipid česticu. LNP sadrže katjonski lipid, nekatjonski lipid i lipid koji sprečava agregaciju čestice (npr., konjugat PEG-lipida). LNP su izuzetno korisni za sistemske primene, jer imaju produžene životne cirkulacije posle intravenozne (i.v.) injekcije i akumuliraju na distalnim mestima (npr., lokacije fizički odvojene od mesta primene). LNP uključuju „pSPLP“, koji uključuju inkapsuliran kondenzacioni agensa-nukleinska kiselina kompleks, kao što je navedeno u PCT Objava No. WO 00/03683. Čestice prema predmetnom pronalasku tipično imaju srednji prečnik od oko 50 nm do oko 150 nm, tipičnije oko 60 nm do oko 130 nm, tipičnije oko 70 nm do oko 110 nm, najčešće oko 70 nm do oko 90 nm, i značajno su nontoksični. Pored toga, nukleinske kiseline kada su prisutne u nukleinska kiselina-lipid česticama predmetnog pronalaska su otporne u vodenom rastvoru do degradacije sa nukleazom. Nukleinska kiselina-lipid čestice i njihov način pripreme su obelodanjeni u, npr., U.S. Patent Nos.5,976,567; 5,981,501; 6,534,484; 6,586,410; 6,815,432; U.S. Publication No. 2010/0324120 and PCT Objava No. WO 96/40964.
[0369] U jednoj implementaciji odnos lipida i leka (odnos masa/masa) (npr., odnos lipiddsRNK) biće u opsegu od oko 1:1 do oko 50:1, od oko 1:1 do oko 25:1, od oko 3:1 do oko 15:1, od oko 4:1 do oko 10:1, od oko 5:1 do oko 9:1, ili oko 6:1 do oko 9:1. Opsezi koji su između gore navedenih opsega takođe su predviđeni kao deo pronalaska.
[0370] Katojnski lipid može biti, na primer, N,N-dioleil-N,N-dimetilamonijum hlorid (DODAC), N,N-distearil-N,N-dimetilamonijum bromid (DDAB), N-(I -(2,3-dioleoiloksi)propil)-N,N,N-trimetilamonijum hlorid (DOTAP), N-(I -(2,3-dioleiloksi)propil)-N,N,N-trimetilamonijum hlorid (DOTMA), N,N-dimetil-2,3-dioleiloksi)propilamin (DODMA), 1,2-DiLinoleiloksi-N,N-dimetilaminopropan (DLinDMA), 1,2-Dilinoleniloksi-N,N-dimetilaminopropan (DLenDMA), 1,2-Dilinoleilcarbamoiloksi-3-dimetilaminopropan (DLin-C-DAP), 1,2-Dilinolejoksi-3-(dimetilamino)acetoksipropan (DLin-DAC), 1,2-Dilinolejoksi-3-morfolinopropan (DLin-MA), 1,2-Dilinoleoil-3-dimetilaminopropan (DLinDAP), 1,2-Dilinoleiltio-3-dimetilaminopropan (DLin-S-DMA), 1-Linoleoil-2-linoleiloksi-3-dimetilaminopropan (DLin-2-DMAP), l,2-Dilinoleiloksi-3-trimetilaminopropan hlorid so (DLin-TMA.Cl), 1,2-Dilinoleoil-3-trimetilaminopropan hlorid so (DLin-TAP.Cl), 1,2-Dilinoleiloksi-3-(N-metilpiperazino)propan (DLin-MPZ), ili 3-(N,N-Dilinoleilamino)-1,2-propandiol (DLinAP), 3-(N,N-Dioleilamino)-1,2-propandio (DOAP), 1,2-Dilinoleilokso-3-(2-N,N-dimetilamino)etoksipropan (DLin-EG-DMA), 1,2-Dilinoleniloksi-N,N-dimetilaminopropan (DLinDMA), 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioksolan (DLin-K-DMA) ili njihovi analozi, (3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2-di((9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dienil)tetrahidro-3aH-ciklopenta[d][1,3]dioksol-5-amin (ALN100), (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriakonta-6,9,28,31-tetraen-19-il 4-(dimetilamino)butanoat (MC3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(bis(2-hidroksidodecil)amino)etil)(2-hidroksidodecil)amino)etil)piperazin-1-il)etilazanediil)didodekan-2-ol (Tech G1), ili njihova smeša. Katojnski lipid može da obuhvata od oko 20 mol % do oko 50 mol % ili oko 40 mol % ukupnog lipida prisutnog u čestici.
[0371] U drugoj implementaciji, jedinjenje 2,2-dilinolil-4-dimetilaminoetil-[l,3]-dioksolan se može koristiti za pripremu lipid-siRNK nanočestica. Sinteza 2,2-dilinolil-4-dimetilaminoetil-[l, 3]-dioksolana je opisana u provizornoj patentnoj prijavi Sjedinjenih Država 61/107,998 podnesena 23. oktobra 2008.
U jednom aspektu, lipid-siRNK čestica uključuje 40% 2,2-Dilinolil-4-dimetilaminoetil-[l, 3]-dioksolan: 10% DSPC: 40% holesterol: 10% PEG-C-DOMG (molni procenat) sa veličinom čestica 63,0 ± 20 nm i 0,027 siRNK/Lipid odnosom.
[0372] Jonizujabilni/nekatojnski lipid može biti anjonski lipid ili neutralni lipid uključujući, ali ne ograničavajući se na, distearoilfosfatidilholin (DSPC), dioleoilfosfatidilholin (DOPC), dipalmitoilfosfatidilholin (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoil-fosfatidiletanolamin (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilholin (POPC), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamin (POPE), dioleoilfosfatidiletanolamin 4-(N-maleimidometil)-cikloheksan-1-carboksilat (DOPE-mal), dipalmitoil fosfatidil etanolamin (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamin (DMPE), distearoilfosfatidil-etanolamin (DSPE), 16-O-monometil PE, 16-O-dimetil PE, 18-1 -trans PE, 1-stearoil-2-oleoil-fosfatidijetanolamin (SOPE), holesterol, ili njihova smeša. Nekatojnski lipid može biti od oko 5 mol % do oko 90 mol %, oko 10 mol %, ili oko 58 mol % ako je holesterol uključen, od ukupnog lipida prisutnog u čestici.
[0373] Konjugovani lipid koji inhibira agregaciju čestica može biti, na primer, polietilenglikol (PEG)-lipid, uključujući, bez ograničenja, PEG-diacilglicerol (DAG), PEG-dialkiloksipropil (DAA), PEG-fosfolipid, PEG- ceramida (Cer) ili njihove mešavine.
Konjugat PEG-DAA može biti, na primer, PEG-dilaurelokipropil (Ci2), PEG-dimirristiloksipropil (Ci4), PEG-dipalmitiloksipropil (Ci6) ili PEG-disteariloksipropil (C)8). Konjugovani lipid koji sprečava agregaciju čestica može biti od 0 mol % do oko 20 mol % ili oko 2 mol % ukupnog lipida koji je prisutan u čestici.
[0374] U nekim otelotvorenjima nukleinska kiselina-lipid čestica dalje uključuje holesterol u, npr., oko 10 mol % do oko 60 mol % ili oko 48 mol % ukupnog lipida prisutnog u čestici.
[0375] U jednom otelotvorenju, lipidoid ND98 · 4HCl (MV 1487) (pogledati U.S. Prijava patenta No.12/056,230, podnesen 3/26/2008), Holesterol (Sigma-Aldrich) i PEG-Ceramide C16 (Avanti Polar Lipids) mogu se koristiti za pripremu lipid-dsRNK nanočestica (tj., LNP01 čestice). Osnovni rastvori svake u etanolu mogu se pripremiti na sledeći način: ND98, 133 mg/ml; Holesterol, 25 mg/ml, PEG-Ceramide C16, 100 mg/ml. ND98, holesterol i PEG-Ceramide C16 osnovni rastvori se zatim mogu kombinovati u , npr., 42:48:10 molarnom odnosu. Kombinovani lipidni rastvor se može mešati sa vodenom dsRNK (npr., u natrijum acetatu pH 5) tako da je konačna koncentracija etanola oko 35-45%, a konačna koncentracija natrijum-acetata je oko 100-300 mM. Lipid-dsRNK nanočestice obično se spontano formiraju prilikom mešanja. U zavisnosti od željene raspodele veličine čestica, rezultujuća smeša nanočestica može se ekstrudirati kroz polikarbonatnu membranu (npr., 100 nm odsečak) koristeći, na primer, termobrel ekstruder, kao što je Lipex Extruder (Northern Lipids, Inc). U nekim slučajevima, korak ekstrudiranja se može izostaviti. Odstranjivanje etanola i istovremena zamena pufera mogu se postići, na primer, dijalizom ili filtracijom tangencijalnog protoka. Pufer može biti zamenjen sa, na primer, fosfatom puferisanim fiziološkim rastvorom (PBS) na oko pH 7, npr. oko pH 6,9, pH 7,0, oko pH 7,1, oko pH 7,2, oko pH 7,3 ili oko pH 7,4.
[0376] LNP01 formulacije su opisane, npr., u International Application Publication No. WO 2008/042973.
[0377] Dodatni primeri lipid-dsRNK formulacija su opisani u Tabeli A.
Tabela A.
1
Sinteza jonizabilnih/katjonskih lipida
[0378] Bilo koje od jedinjenja, npr., katjonski lipidi i slično, koja se koriste u nukleinska kiselina-lipid česticama prema pronalasku, mogu se pripremiti poznatim tehnikama organske sinteze, uključujući postupke koji su detaljnije opisane u Primerima. Svi supstituenti su kako su definisani u nastavku, osim ako nije drugačije naznačeno.
1 1
[0379] „Alkil“ označava sa ravnim lancem ili razgranat, ne-ciklični ili ciklični, zasićen alifatični ugljovodonik koji sadrži od 1 do 24 atoma ugljenika. Reprezentativni zasićeni alkilni ravnog lanca uključuju metil, etil, n-propil, n-butil, n-pentil, n-heksil i slično; dok zasićeni razgranati alkili uključuju izopropil, sek-butil, izobutil, terc-butil, izopentil i slično. Reprezentativni zasićeni ciklični alkili uključuju ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, cikloheksil i slično; dok nezasićeni ciklični alkili uključuju ciklopentenil i cikloheksenil i slično.
[0380] „Alkenil“ označava alkil, kao što je prethodno definisano, koji sadrži najmanje jednu dvostruku vezu između susednih atoma ugljenika. Alkenili uključuju i cis i trans izomere. Reprezentativni ravni i razgranati alkenili uključuju etilenil, propilenil, 1-butenil, 2-butenil, izobutilenil, 1-pentenil, 2-pentenil, 3-metil-1-butenil, 2-metil-2-butenil, 2,3-dimetil -2-butenil i slično.
[0381] „Alkinil“ označava bilo koji alkil ili alkenil, kao što je prethodno definisano, koji dodatno sadrži najmanje jednu trostruku vezu između susednih ugljenika. Reprezentativni ravni i razgranati alkinili uključuju acetilenil, propinil, 1-butinil, 2-butinil, 1-pentinil, 2-pentilil, 3-metil-1-butinil i slično.
[0382] „Acil“ označava bilo koji alkil, alkenil ili alkinil gde je ugljenik na tački vezivanja supstituisan sa okso grupom, kako je definisano u nastavku. Na primer, -C(=O)alkil, -C(=O)alkenil i -C(=O)alkinil su acil grupe.
[0383] „Heterocikl“ označava 5- do 7-člani monociklični ili 7- do 10-člani biciklični, heterociklični prsten koji je ili zasićen, nezasićen ili aromatičan i koji sadrži od 1 ili 2 heteroatoma nezavisno odabranih od azota, kiseonika i sumpora, i gde heteroatomi azota i sumpora mogu biti opciono oksidovani, a heteroatom azota može biti opciono kvaternizovan, uključujući bicikličke prstenove u kojima je bilo koji od gore navedenih heterocikla spojen sa benzenskim prstenom. Heterocikl može biti vezan preko bilo kog heteroatoma ili ugljenikovog atoma. Heterocikli uključuju heteroarile kao što je definisano u nastavku.
Heterocikli uključuju morfolinil, pirolidinonil, pirolidinil, piperidinil, piperizinil, hidantoinil, valerolaktamil, oksiranil, oksetanil, tetrahidrofuranil, tetrahidropiranil, tetrahidropiridinil,
1 2
tetrahidroprimidinil, tetrahidrotiofenil, tetrahidrotiopiranil, tetrahidropirimidinil, tetrahidrotiofenil, tetrahidrotiopiranil, i slično.
[0384] Izrazi „opciono supstituisani alkil“, „opciono supstituisani alkenil“, „opciono supstituisani alkinil“, „opciono supstituisani alkil“ i „opciono supstituisani heterocikl“ podrazumevaju da je, kada se supstituiše, najmanje jedan atom vodonika zamenjen supstituentom. U slučaju okso supstituenta (=O) dva atoma vodonika se zamenjuju. U tom pogledu supstituenti uključuju okso, halogen, heterocikl, -CN, -ORx, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry, -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx i -SOnNRxRy, pri čemu n je 0, 1 ili 2, Rx i Ry su isti ili različiti i nezavisno su vodonik, alkil ili heterocikl, i svaki od pomenutih alkil i heterocikličnih supstituenata može dalje biti supstituisan sa jedan ili više okso, halogena, -OH, -CN, alkyl, -ORx, heterocikle, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry, -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx i -SOnNRxRy.
[0385] „Halogen“ označava fluoro, hloro, bromo i jodo.
[0386] U nekim primenama, postupci mogu zahtevati upotrebu zaštitnih grupa. Metodologija zaštitnih grupa je dobro poznata stručnjacima (pogledati, na primer, Protective Groups in Organic Synthesis, Green, T.W. i dr., Wiley-Interscience, New York City, 1999). Ukratko, zaštitne grupe u kontekstu ovog pronalaska su svaka grupa koja smanjuje ili eliminiše neželjenu reaktivnost funkcionalne grupe. Zaštitna grupa može biti dodata u funkcionalnu grupu da maskira svoju reaktivnost tokom određenih reakcija, a zatim se uklanja da otkrije prvobitnu funkcionalnu grupu. U nekim otelotvorenjima se koristi „alkoholna zaštitna gruša“. „Alkoholna zaštitna grupa“ je svaka grupa koja smanjuje ili eliminiše neželjenu reaktivnost funkcionalne grupe alkohola. Zaštitne grupe se mogu dodati i ukloniti korišćenjem tehnika koje su dobro poznate u struci.
Sinteza Formule A.
[0387] U nekim implementacijama nukleinska kiselina-lipid čestice prema pronalasku se formulišu pomoću katjonskog lipida formule A:
1
gde su R1 i R2 nezavisno alkil, alkenil ili alkinil, svaki može biti opciono supstituisan, i R3 i R4 su nezavisno niži alkil ili R3 i R4 mogu biti uzeti zajedno kako bi formirali opcionalno supstituisani heterociklični prsten. U nekim otelotvorenjima, katjonski lipid je XTC (2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolan). Generalno, lipid formule A iznad može biti izveden sledećim reakcionim Šemama 1 ili 2, pri čemu su svi supstituenti definisani gore, osim ako nije drugačije naznačeno.
Šema 1
[0388] Lipid A, gde su R1 i R2 nezavisno alkil, alkenil ili alkinil, gde svaki može biti opciono supstituisan, i R3 i R4 su nezavisno niži alkil, ili R3 i R4 mogu biti uzeti zajedno kako bi se formirao opciono supstituisani heterociklični prsten, može se dobiti prema Šemi 1. Keton 1 i bromid 2 mogu se nabaviti ili pripremiti prema postupcima poznatim stručnjacima. Reakcija 1 i 2 daje ketal 3. Tretman ketala 3 sa aminom 4 daje lipide formule A. Lipidi formule A mogu se pretvoriti u odgovarajuću amonijum so sa organskom soli formule 5, gde je X anjonski kontra jon od halogena, hidroksida, fosfata, sulfata ili slično.
1 4
[0389] Alternativno, početni materijal ketona 1 može biti pripremljen prema Šemi 2.
Grignardov reagens 6 i cijanid 7 mogu se nabaviti ili pripremiti prema postupcima poznatim stručnjacima. Reakcija 6 i 7 daje keton 1. Konverzija ketona 1 u odgovarajuće lipide formule A je kao što je opisano u Šemi 1.
Sinteza MC3
[0390] Priprema DLin-M-C3-DMA (tj., (6Z, 9Z, 28Z, 31Z)-heptatriakonta-6,9,28,31-tetraen-19-il 4-(dimetilamino)butanoat) je bila kako sledi. Rastvor (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriakonta-6,9,28,31-tetraen-19-ola (0,53 g), 4-N, hidrohlorida N-dimetilaminobutne kiseline (0,51 g) , N-dimetilaminopiridina (0,61 g) i 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidrohlorid (0,53 g) u dihlorometanu (5 mL) je mešan na sobnoj temperaturi preko noći. Rastvor je ispran razblaženom hlorovodoničnom kiselinom, praćeno razređenim vodenim rastvorom natrijum bikarbonata. Organski fragmenti su osušeni preko anhidrovanog magnezijum sulfata, filtrirani i rastvarač uklonjen na rotovapu. Ostatak je prenesen u kolonu silika gela (20 g) koristeći gradijent eluiranja metanol/dihlorometan sa 1-5%. fragmenti koje sadrže prečišćeni proizvod su kombinovani i rastvarač je uklonjen, što daje bezbojno ulje (0,54 g). Sinteza ALNI-100
[0391] Sinteza ketala 519 [ALNI-100] je izvršena korišćenjem sledeće šeme 3:
1
Sinteza 515
[0392] U mešanu suspenziju LiAlH4 (3,74 g, 0,09852 mol) u 200 ml anhidrovanog THF u RBF sa dva vrata (1L) , dodat je rastvor 514 (10 g, 0,04926 mol) u 70 mL THF polako na 0°C pod atmosferom azota. Posle potpunog dodavanja, reakciona mešavina je zagrejana na sobnoj temperaturi i zatim je zagrevana do refluksa 4 časa. Napredak reakcije je praćen sa TLC. Posle završetka reakcije (pomoću TLC) smeša je ohlađena na 0°C i ugašena pažljivim dodatkom zasićenog rastvora Na2S04. Reakciona smeša je mešana 4 sata na sobnoj temperaturi i odfiltrirana. Ostatak je dobro ispran sa THF. Filtrat i ispiranje su pomešani i razblaženi sa 400 mL dioksana i 26 mL koncentrisanog HCl i mešani 20 minuta na sobnoj temperaturi. Isparljive matorije su uklonjene pod vakuumom kako bi se hidrohloridna so 515 dobila kao bela čvrsta supstanca. Prinos: 7,12 g H-NMR (DMSO, 400 MHz): δ = 9,34 (širok, 2H), 5,68 (s, 2H), 3,74 (m, IH), 2,66-2,60 (m, 2H), 2,50-2,45 , 5H).
Sinteza 516
[0393] U mešani rastvor jedinjenja 515 u 100 mL suvog DCM u 250 mL RBF sa dva vrata, dodat je NEt3 (37,2 mL, 0,2669 mol) i ohlađen je na 0°C u atmosferi azota. Posle sporog dodavanja N-(benziloksi-karboniloksi)-sukcinimida (20 g, 0,08007 mol) u 50 mL suvog DCM, reakciona smeša je ostavljena da se zagreje do sobne temperature. Posle završetka reakcije (2-3 sata TLC) smeša se ispira sukcesivno sa 1N HC1 rastvorom (1 x 100 mL) i zasićenim rastvorom NaHC03 (1 x 50 mL). Organski sloj je zatim osušen preko anhida. Na2S04 i rastvarač su ispareni kako bi se dobio sirovi materijal koji je prečišćen hromatografijom na koloni silika gela kako bi se dobilo 516 kao lepljiva masa. Prinos:11 g (89%). 1H-NMR (CDC13, 400MHz): δ = 7,36-7,27 (m, 5H), 5,69 (s, 2H), 5,12 (s, 2H), 4,96 (br, 1H) m, 2H), 2,30-2,25 (m, 2H). LC-MS [M H]-232,3 (96,94%).
Sinteza 517A i 517B
1
[0394] Ciklopenten 516 (5 g, 0,02164 mol) je rastvoren u rastvoru 220 mL acetona i vode (10:1) u 500 mL RBF sa jednim vratom i dodat je N-metil morfolin-N-oksid (7,6 g, 0,06492 mol), i zatim 4,2 mL 7,6% rastvora OsO4 (0,275 g, 0,00108 mol) u terc-butanolu na sobnoj temperaturi. Posle završetka reakcije (~ 3 sata), smeša je ugašena dodavanjem čvrstog Na2S03 i dobijena smeša je mešana tokom 1,5 sata na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je razblažena sa DCM (300 mL) i isprana vodom (2 x 100 mL) praćeno zasićenim rastvorom NaHC03 (1 x 50 mL), vodom (1 x 30 mL) i konačno sa slanim rastvorom (1 x 50 mL).
Organska faza je osušena preko Na2S04 i rastvarač je uklonjen u vakuumu. Hromatografsko prečišćavanje sirovog gela u koloni silika gela dalo je mešavinu dijastereomera, koji su odvojeni pomoću pripremne HPLC. Prinos: - 6 g sirova
517A - Vrh-1 (bela čvrsta supstanca), 5,13 g (96%).1H-NMR (DMSO, 400MHz): 6 = 7,39-7,31 (m, 5H), 5,04 (s, 2H), 4,78-4,73 (m, IH), 4,48-4,47 (d, 2H), 3,94-3,93 , 2H), 2,71 (s, 3H), 1,72-1,67 (m, 4H). LC-MS -[M H]-266,3, [M NH4 ]- 283,5, HPLC-97,86%.
Sterehemija potvrđena rendgenskim snimkom.
Sinteza 518
[0395] Koristeći proceduru analognu onoj koja je opisana za sintezu jedinjenja 505, dobijeno je jedinjenje 518 (1,2 g, 41%) kao bezbojno ulje. 1H-NMR (CDC13, 400MHz): δ = 7,35-7,33 (m, 4H), 7,30-7,27 (m, IH), 5,37-5,27 (m, 8H), 5,12 (s, 2H) ), 4,58-4,57 (m, 2H), 2,78-2,74 (m, 7H), 2,06-2,00 (m, 8H), 1,96-1,91 (m, 2H), 1,62 (m, 4H) ), 1,37-1,25 (br m, 36H), 0,87 (m, 6H). HPLC-98,65%.
Opšta procedura za sintezu jedinjenja 519
[0396] Rastvor jedinjenja 518 (1 ekvivalent) u heksanu (15 mL) je dodat kapanjem ledeno hladnom rastvoru LAH u THF (1 M, 2 ekvivalent). Posle potpunog dodavanja, smeša je zagrevana na 40°C tokom 0,5 sati, i zatim se ponovo ohladila na ledenom kupatilu. Smeša je pažljivo hidrolizovana zasićenim vodenim Na2S04, zatim filtrirana kroz celit i redukovana na ulje. Kolonska hromatografija obezbedila je čist 519 (1,3 g, 68%) koji je dobijen kao bezbojno ulje.13C NMR δ = 130,2, 130,1 (x2), 127,9 (x3), 112,3, 79,3,64,4, 44,7, 38,3, 35,4, 31,5, 29,9 (x2), 29,7, 29,6 (x2), 29,5 (x3), 29,3 ), 27,2 (x3), 25,6, 24,5, 23,3, 226, 14,1;
Elektrosprej MS (+ ve): Molekulska težina za C44H80NO2 (M H) izračunato 654,6, pronađeno 654,6.
[0397] Formulacije pripremljene bilo standardnim ili postupkom bez ekstruzije, mogu se
1
okarakterisati na slične načine. Na primer, formulacije se obično karakterišu vizuelnim pregledom. One bi trebalo da budu beličasti prozirni rastvor bez agregata ili sedimenta.
Veličina čestica i raspodela veličine lipidnih nanočestica se mogu meriti rasipanjem svetlosti koristeći, na primer, Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, USA). Čestice treba da budu oko 20-300 nm, kao što je 40-100 nm veličine. Distribucija veličine čestica treba da bude unimodalna. Ukupna koncentracija dsRNK u formulaciji, kao i zarobljen fragment, procenjuje se pomoću testa za isključivanje boje. Uzorak formulisane dsRNK može se inkubirati sa RNK-vezujućom bojom, kao što je Ribogreen (Molecular Probes) u prisustvu ili odsustvu formulacije koja prekida surfaktant, npr., 0,5% Triton-X100. Ukupna dsRNK u formulaciji može se odrediti signalom iz uzorka koji sadrži surfaktant, u odnosu na standardnu krivu. Zarobljen fragment se određuje oduzimanjem „slobodnog“ dsRNK sadržaja (kao što je mereno signalom u odsustvu surfaktanta) od ukupnog sadržaja dsRNK. Procenat zarobljenog dsRNK je tipično> 85%. Za LNP formulaciju, veličina čestica je najmanje 30 nm, najmanje 40 nm, najmanje 50 nm, najmanje 60 nm, najmanje 70 nm, najmanje 80 nm, najmanje 90 nm, najmanje 100 nm, najmanje 110 nm i najmanje 120 nm. Odgovarajući opseg je tipično oko 50 nm do oko 110 nm, oko 60 nm do oko 100 nm ili oko 80 nm do oko 90 nm.
[0398] Sastavi i formulacije za oralnu primenu uključuju prahove ili granule, mikročestice, nanočestice, suspenzije ili rastvore u vodi ili ne-vodenim medijumima, kapsulama, kapsulama za gel, vrećicama, tablama ili mini tabletima. Zamućivači, agensi za ukus, razređivači, emulgatori, agensi za disperziju ili veznici mogu biti poželjni. U nekim otelotvorenjima, oralne formulacije su one u kojima se dsRNK koji se nalaze u pronalasku daju u kombinaciji sa jednim ili više surfakantom za poboljšanje penetracije i helatatorima. Pogodni surfaktanti uključuju masne kiseline i/ili njihove estre ili soli, žučne kiseline i/ili njihove soli. Pogodne žučne kiseline/soli uključuju henodezoksiholnu kiselinu (CDCA) i ursodeokihenodezoksiholnu kiselinu (UDCA), holnu kiselinu, dehidroholnu kiselinu, dezoksiholnu kiselinu, gluholnu kiselinu, glikolnu kiselinu, glikodoksikolnu kiselinu, tauroholnu kiselinu, taurodezoksiholnu kiselinu, natrijum tauro-24,25-dihidro-fusidat i natrijum glikodihidrofusidat. Pogodne masne kiseline uključuju arahidonsku kiselinu, undekanojsku kiselinu, oleinska kiselinu, laurinsku kiselinu, kaprilnu kiselinu, kaprinsku kiselinu, miristinsku kiselinu, palmitinsku kiselinu, stearnu kiselinu, linolnu kiselinu, linolensku kiselinu, dikaprat, trikaprat, monoolein, dilaurin, gliceril 1-monokaprat, 1-dodecilazacikloheptan-2-on, acilkarnitin, acilholin ili monoglicerid, diglicerid ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so (npr., natrijum). U nekim otelotvorenjima se koriste kombinacije
1
poboljšivača penetracije, na primer, masne kiseline/soli u kombinaciji sa žučnim kiselinama/solima. Jedna primerna kombinacija je natrijumova so laurinske kiseline, kaprična kiselina i UDCA. Dodatni poboljšivači penetracije uključuju polioksietilen-9-lauril eter, polioksietilen-20-cetil eter. dsRNK koji se nalaze u pronalasku mogu se isporučiti oralno, u granularnom obliku uključujući prskane sušene čestice ili složene kako bi se formirale mikro ili nanočestice. dsRNK kompleksirajući agensi uključuju poliaminokiseline; polimine; poliakrilate; polialkilakrilate, polioksetane, polialkilcianoakrilate; katjonizovane želatine, albumine, skrobove, akrilate, polietilenglikole (PEG) i skrobove; polialkilcianoakrilate; DEAE-derivatizovane polimini, polulane, celuloze i skrobove. Pogodni kompleksirajući agensi obuhvataju hitosan, N-trimetilhitosan, poli-L-lizin, polihistidin, poliornitin, polispermin, protamin, polivinilpiridin, poliiodietilaminometiletilen P (TDAE), poliaminostiren (npr. p-amino), poli(metilcijanoakrilat), poli(etilcijanoakrilat), poli(butilcijanoakrilat), poli(izobutilcijanoakrilat), poli(izoheksilcijanoakrilat), DEAE-heksilakrilat, DEAE-akrilamid, DEAE-albumin i DEAE-dekstran, polimetilakrilat, poliheksilakrilat, poli(D,L-mlečna kiselina), poli(DL-mlečna-ko-glikolna kiselina (PLGA), alginat i polietilenglikol (PEG). Oralne formulacije za dsRNK i njihova priprema su detaljno opisani u U.S. Patent 6,887,906, US Publn. No.20030027780, i U.S. Patent No.6,747,014, od kojih je svaki ovde uključen referencom.
[0399] Sastavi i formulacije za parenteralno, intraparenhimalno (u mozak), intratekalno, intraventrikularno ili intrahepatično primenjivanje mogu uključivati sterilne vodene rastvore koji takođe mogu sadržati pufere, razblaživače i druge pogodne aditive kao što su, ali ne ograničavajući na, poboljšivači penetracije, jedinjenja nosači i drugi farmaceutski prihvatljivi nosači ili ekscipijenti.
[0400] Farmaceutski sastavi uključuju, ali se ne ograničavaju na, rastvore, emulzije i formulacije koje sadrže lipozom. Ovi sastavi mogu se generisati iz različitih komponenti koje uključuju, ali se ne ograničavaju na, prethodno formirane tečnosti, samo-emulgujujuće čvrste materije i samo-emulgujujuće polu-čvrste materije. Posebno su poželjne formulacije koje ciljaju jetru pri lečenju hepatičkih poremećaja kao što je karcinom jetre.
[0401] Farmaceutske formulacije predmetnog pronalaska, koje se pogodno mogu predstaviti u jediničnom doznom obliku, mogu se pripremiti prema konvencionalnim tehnikama koje su dobro poznate u farmaceutskoj industriji. Takve tehnike uključuju korak uključivanja aktivnih
1
sastojaka sa farmaceutskim nosačima ili ekscipijentima. Generalno, formulacije se pripremaju ravnomerno i intimno dovodeći u vezu aktivne sastojke sa tečnim nosačima ili sa fino podeljenim čvrstim nosačima ili sa oba, a zatim, ako je potrebno, oblikovanjem proizvoda.
[0402] Sastavi se mogu formulisati u bilo koji od mnogih mogućih oblika doze kao što su, ali ne ograničavajući se na, tablete, kapsule, gel kapsule, tečni sirupi, meki gelovi, supozitorijumi i klistiri. Sastavi ovog pronalaska se takođe mogu formulisati kao suspenzije u vodenom, ne-vodenom ili mešovitom medijumu. Vodene suspenzije mogu dalje sadržati supstance koje povećavaju viskozitet suspenzije uključujući, na primer, natrijum karboksimetilcelulozu, sorbitol i/ili dekstran. Suspenzija takođe može sadržati stabilizatore.
C. Dodatne formulacije
Emulzije
[0403] Sastavi mogu biti pripremljeni i formulisani kao emulzije. Emulzije su tipično heterogeni sistemi jedne tečnosti raspršeni u drugoj u obliku kapljica koje obično prelaze prečnik od 0,1μm (pogledati npr., Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199; Rosoff, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p.245; Block u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p.335; Higuchi i dr., u Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p.301). Emulzije su često dvofazni sistemi koji sadrže dve nemešajuće faze tečnosti koje se intenzivno mešaju i raspršuju jedna u drugoj. Uopšteno govoreći, emulzije mogu biti voda-u-ulju (v/u) ili ulje-u-vodi (u/v). Kada se vodena faza fino podeli i rasprši kao kapljice u ukupnoj vodenoj fazi, dobijeni sastav se naziva voda-u-ulju (v/u) emulzija. Alternativno, kada je uljana faza fino podeljena i raspršena putem kapljica u vodenoj fazi, dobijeni sastav se naziva ulje-u-vodi (u/v) emulzija. Emulzije mogu da sadrže dodatne komponente pored raspršujućih faza i aktivni lek koji može biti prisutan kao rastvor bilo u vodenoj fazi, uljanoj fazi ili samoj po sebi kao zasebna fazi. Farmaceutski ekscipijenti kao što su emulgatori, stabilizatori, boje i antioksidanti mogu takođe biti prisutni u emulzijama po potrebi.
Farmaceutske emulzije takođe mogu biti višestruke emulzije koje se sastoje od više od dve
11
faze, kao što su, na primer, ulje-u-vodi-u-ulju (u/v/u) i voda-u-ulju-u-vodi (v/u/v) emulzije. Takve kompleksne formulacije često pružaju određene prednosti koje jednostavne binarne emulzije nemaju. Višestruke emulzije u kojima pojedinačne uljne kapljice emulzije u/v sadrže male kapljice vode predstavljaju emulziju v/u/v. Takođe, sistem kapljica ulja zatvoren u globule vode stabilizovan u masnoj kontinualnoj fazi pruža emulziju u/v/u.
[0404] Emulzije su karakterisane sa malo ili bez termodinamičke stabilnosti. Često, raspršena ili diskontinuirana faza emulzije je dobro raspršena u spoljnu ili kontinuiranu fazu i održava se u ovom obliku pomoću emulgatora ili viskoznosti formulacije. Bilo koja od faza emulzije može biti polu-čvrsta ili čvrsta, kao što je slučaj sa masnim bazama i kremama u obliku emulzije. Ostali agense za stabilizaciju emulzija podrazumevaju upotrebu emulgatora koji mogu biti obuhvaćeni u bilo koju fazu emulzije. Emulgatori se široko mogu klasifikovati u četiri kategorije: sintetički surfakanti, prirodni emulgatori, apsorbacione baze i fino raspršene čvrste materije (pogledati npr. Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199).
[0405] Sintetički surfaktanti, takođe poznati kao površinski aktivni agensi, pronašli su široku primenlu u formulaciji emulzija i pregledani su u literaturi (pogledati npr., Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rieger, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.285; Idson, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p.199). Surfaktanti su tipično amfifilni i sadrže hidrofilni i hidrofobni deo. Odnos hidrofilne i hidrofobne prirode surfaktanta nazvan je hidrofilno/lipofilni balans (HLB) i predstavlja važan alat u kategorizaciji i selekciji površinskih aktivnih materija u pripremi formulacija.
Surfaktanti se mogu klasifikovati u različite klase, zasnovane na prirodi hidrofilne grupe: nejonska, anjonska, katjonska i amfoterična (pogledati npr., Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., i Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY Rieger, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285).
[0406] Prirodni emulgatori koji se koriste u formulacijama emulzije uključuju lanolin, pčelinji vosak, fosfatid, lecitin i akaciju. Apsorpcione baze poseduju hidrofilna svojstva tako da mogu da popiju vodu kako bi se formirale emulzije bez oštećenja, ali ipak zadržavaju svoje polučvrste konzistencije, kao što su anhidrirani lanolin i hidrofilni petrolatum. Fino podeljene čvrste supstance su takođe korišćene kao dobri emulgatori posebno u kombinaciji sa surfaktantima i u viskoznim sastavima. Ovo uključuje polarne neorganske čvrste materije, kao što su hidroksidi teških metala, glinice koje ne sadrže bentonit, attapulgite, hektorit, kaolin, montmorilonit, koloidni aluminijum silikat i koloidni magnezijum aluminijum silikat, pigmenti i nepolarne čvrste supstance kao što su ugljenik ili gliceril tristearat.
[0407] Veliki broj ne-emulgovanih materijala takođe su uključeni u formulacije emulzije i doprinose svojstvima emulzija. To uključuje masti, ulja, voskove, masne kiseline, masne alkohole, masne estre, humektante, hidrofilne koloide, konzervanse i antioksidante (Block, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.335; Idson, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199).
[0408] Hidrofilni koloidi ili hidrokoloidi uključuju prirodne gume i sintetičke polimere kao što su polisaharidi (npr. akacija, agar, alginska kiselina, karagenan, guar guma, karaja guma i tragakant), derivati celuloze (na primer, karboksimetilceluloza i karboksipropilceluloza) i sintetički polimeri (na primer, karboneri, etil celuloze i karboksivinil polimeri). Oni se raspršuju ili upadaju u vodu kako bi se formirali koloidni rastvori koji stabilizuju emulzije stvaranjem jakih interfejsnih filmova oko kapljica raspršene faze i povećanjem viskoznosti spoljne faze.
[0409] Pošto emulzije često sadrže niz sastojaka kao što su ugljovodonici, proteini, steroli i fosfatidi koji mogu lako podržavati rast mikroba, ove formulacije često uključuju konzervanse. Najčešće korišćeni konzervansi uključeni u formulacije emulzije uključuju metil paraben, propil paraben, kvaternarne amonijum soli, benzalkonijum hlorid, estre phidroksibenzojske kiseline i borovu kiselinu. Antioksidanti se takođe često dodaju u formulacije emulzije kako bi se sprečilo pogoršanje formulacije. Korišćeni antioksidanti mogu biti slobodni radikali, kao što su tokoferoli, alkil galati, butilovani hidroksianizol, butilovani hidroksitoluen ili redukcioni agensi kao što su askorbinska kiselina i natrijum metabisulfit i antioksidativni sinergisti kao što su limunska kiselina, vinska kiselina i lecitin.
[0410] Primena formulacija emulzije putem dermatoloških, oralnih i parenteralnih puteva i postupka za njihovu proizvodnju pregledana je u literaturi (pogledati npr., Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., i Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199). Formulacije emulzije za oralnu isporuku su vrlo široko korišćene zbog lakoće formulacije, kao i efikasnosti sa stanovišta apsorpcije i biološke dostupnosti (pogledati npr., Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., i Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.245; Idson, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199). Laksativi baze mineralnih ulja, vitamini rastvorljivi u uljima i prehrambeni sastavi sa visokim sadržajem masnih kiselina su među materijalima koji se obično primenjuju kao oralne emulzije.
ii. Mikroemulzije
[0411] U jednoj implementaciji, sastavi iRNK i nukleinskih kiselina formulisane su kao mikroemulzije. Mikroemulzija se može definisati kao sistem vode, ulja i amfila koji je jedini optički izotropni i termodinamički stabilan tečni rastvor (pogledati npr., AAnsel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., i Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.245). Tipično mikroemulzije su sistemi koji se pripremaju najpre raspršivanjem ulja u vodenom rastvoru surfaktanta, a zatim dodavanjem dovoljne količine četvrte komponente, uglavnom internog alkohola dužine lanca, kako bi se formirao transparentan sistem. Stoga, mikroemulzije su takođe opisane kao termodinamički stabilne, izotropski bistre raspršivanja dve neprilagođene tečnosti koje su stabilizovane pomoću interfacijalnih filmova površinsko aktivnih molekula (Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215). Mikroemulzije se obično pripremaju kombinacijom od tri do pet
11
komponenti koje uključuju ulje, vodu, surfaktant, kosurfaktant i elektrolit. Da li je mikroemulzija voda-u-ulju (v/u) ili ulje-u-vodi (u/v) tipa zavisi od karakteristika korišćenog ulja i surfakanta, kao i strukture i geometrijske ambalaže polarne glave i ugljovodoničnih repova molekula surfaktanta (Schott, u Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p.271).
[0412] Fenomenološki pristup koji koristi fazne dijagrame je intenzivno proučavan i dao je sveobuhvatno znanje stručnjaku o tome kako formulisati mikroemulzije (pogledati npr., nsel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., i Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.245; Block, u Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger i Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.335). U poređenju sa konvencionalnim emulzijama, mikroemulzije nude prednost solubilizovanja lekova nerastvorljivih u vodi u formulaciji termodinamički stabilnih kapljica koje se formiraju spontano.
[0413] Surfaktanti koji se koriste za pripremu mikroemulzija uključuju, ali nisu ograničeni na, jonske surfaktante, nejonske surfaktante, Brij 96, polioksietilen oleil etre, estre poliglicerolnih masnih kiselina, tetraglicerol monolaurat (ML310), tetraglicerol monooleat (MO310), heksaglicerol monooleat PO310), heksaglicerol pentaoleat (PO500), dekaglicerol monokaprat (MCA750), dekaglicerol monooleat (MO750), dekaglicerol sekiooleat (SO750), dekaglicerol decaoleat (DAO750), same ili u kombinaciji sa kosurfaktantima. Kosurfaktant, obično alkohol kratkog lanca , kao što su etanol, 1-propanol i 1-butanol, služi za povećanje interfejsne fluidnosti penetrirajući u površinski aktivan film i stoga stvarajući neuređeni film zbog praznog prostora koji se stvara između molekula surfaktanta. Mikroemulzije, međutim, mogu biti pripremljene bez upotrebe kosurfaktanata i poznati su u struci samo-emulgujujući mikroemulzioni sistemi bez alkohola. Vodena faza može biti, ali nije ograničena na, vodu, vodeni rastvor leka, glicerol, PEG300, PEG400, poliglicerol, propilen glikol i derivate etilen glikola. Uljana faza može uključivati, ali nije ograničena na, materijale kao što su Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, estre masnih kiselina, mono, di i tri-gliceride srednjeg lanca (C8-C12), polioksietilovane gliceril estre masnih kiselina, masne alkohole, poliglikolizovane gliceride, zasićene poliglikolizovane C8-C10 gliceride, biljna ulja i silikonska ulja.
[0414] Mikroemulzije su posebno interesantne sa stanovišta solubilizacije leka i povećane apsorpcije lekova. Mikroemulzije na bazi lipida (i u/v i v/u) su predložene kako bi se poboljšala oralna biodostupnost lekova, uključujući i peptide (pogledati npr., U.S. Patent Nos.
6,191,105; 7,063,860; 7,070,802; 7,157,099; Constantinides i dr., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205).
Mikroemulzije pružaju prednosti poboljšane solubilizacije leka, zaštitu leka od enzimske hidrolize, moguće poboljšanja apsorpcije lekova usled promena u tečnosti membrane i propustljivosti membrane, lakoće pripreme, lakoće oralne primene putem čvrstih doznih oblika, poboljšane kliničke potencije i smanjene toksičnosti (pogledati npr., U.S. Patent Nos.
6,191,105; 7,063,860; 7,070,802; 7,157,099; Constantinides i dr., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho i dr., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). Često se mikroemulzije formiraju spontano kada se njihove komponente sjedinjuju na temperaturi okoline. Ovo može biti posebno pogodno kada se formulišu termolabilni lekovi, peptidi ili iRNK. Mikroemulzije su takođe bile efikasne u transdermalnoj isporuci aktivnih komponenati i u kozmetičkim i farmaceutskim primenama. Očekuje se da će mikroemulzioni sastavi i formulacije predmetnog pronalaska olakšati povećanu sistemsku apsorpciju iRNK i nukleinskih kiselina iz gastrointestinalnog trakta, kao i poboljšati lokalnu mobilnu primenu iRNK i nukleinskih kiselina.
[0415] Mikroemulzije prema predmetnom pronalasku takođe mogu da sadrže dodatne komponente i aditive kao što su sorbitan monostearat (Grill 3), Labrasol i poboljšivači penetracije radi poboljšanja svojstava formulacije i povećanja apsorpcije iRNK i nukleinskih kiselina predmetnog pronalaska. Poboljšivači penetracije koji se koriste u mikroemulzijama predmetnog pronalaska mogu se klasifikovati kao da pripadaju jednoj od pet širokih kategorija surfakanti, masne kiseline, žučnih soli, helirajući agensi, i ne-helirajući nesurfaktanti (Lee i dr., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92). Svaka od ovih klasa je gore opisana.
iii. Mikročestice
[0416] RNKi agens pronalaska može biti obuhvaćen u česticu, npr., mikročesticu.
Mikročestice se mogu proizvoditi sprej sušenjem, ali se takođe mogu proizvoditi i drugim postupcima, uključujući liofilizaciju, isparavanje, sušenje u fluidnom sloju, vakuumsko sušenje ili kombinacijom ovih tehnika.
11
iv. Poboljšivači penetracije
[0417] U jednoj implementaciji, korišćeni su različiti poboljšivači penetracije kako bi se efikasno isporučivale nukleinske kiseline, posebno iRNK, na kožu životinja. Većina lekova je prisutna u rastvoru u jonizovanim i nejonizovanim oblicima. Međutim, obično samo lipidni ili lipofilni lekovi lako prolaze ćelijske membrane. Otkriveno je da čak i ne-lipofilni lekovi mogu da prođu ćelijske membrane ukoliko se membrana koja treba da se pređe tretira sa poboljšivačem penetracije. Osim što pomaže u difuziji ne-lipofilnih lekova preko ćelijskih membrana, poboljšanje penetracije povećava i propusnost lipofilnih lekova.
[0418] Poboljšivači penetracije mogu se klasifikovati kao pripadajući jednoj od pet širokih kategorija, tj., surfaktanti, masne kiseline, žučne soli, helirajući agensi i ne-helirajući nesurfaktanti (pogledati npr., Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee i dr., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92). Svaka od gore pomenutih klasa poboljšivača penetracije opisana je detaljnije u nastavku.
[0419] Surfaktanti (ili „površinski aktivni agensi“) su hemijski entiteti koji, kada se rastvore u vodenom rastvoru, redukuju površinski napon rastvora ili međusobne napetosti između vodenog rastvora i druge tečnosti, tako da je apsorpcija iRNK kroz sluznicu poboljšana. Pored žučnih soli i masnih kiselina, ovi poboljšivači penetracije uključuju, na primer, natrijum lauril sulfat, polioksietilen-9-lauril eter i polioksietilen-20-cetil eter) (pogledati npr., Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee i dr., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92); i perfluorohemijske emulzije, kao što je FC-43. Takahashi i dr., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
[0420] Različite masne kiseline i njihovi derivati koji deluju kao poboljšivači penetracije uključuju, na primer, oleinsku kiselinu, laurinsku kiselinu, kaprinsku kiselinu (n-dekanonsku kiselinu), miristatnu kiselinu, palmitinsku kiselinu, stearinsku kiselinu, linolnu kiselinu, linolensku kiselinu, dikaprat, tricaprat, monoolein (1-monooloil-rac-glicerol), dilaurin, kaprilnu kiselinu, arahidonsku kiselinu, glicerol 1-monokaprat, 1-dodecilazacikloheptan-2-on, acilkarnitine, acilholine, njihove C1-20alkil estre (npr., metil, izopropil i t-butil), i njihove mono- i di-gliceride (tj.., oleat, laurat, kaprat, miristat, palmitat, stearat, linoleat, itd.)
11
(pogledati npr., Touitou, E., i dr. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee i dr., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92;
Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri i dr., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
[0421] Fiziološka uloga žuči uključuje olakšavanje raspršivanja i apsorpcije lipida i vitamina rastvorljivih u masti (pogledati npr., Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman i dr. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp.934-935). Različite prirodne žučne soli i njihovi sintetički derivati deluju kao poboljšivači penetracije. Tako izraz „žučne soli“ uključuje bilo koju od prirodno prisutnih komponenti žuči, kao i bilo koji od njihovih sintetičkih derivata. Pogodne žučne soli uključuju, na primer, holnu kiselinu (ili njenu farmaceutski prihvatljivu natrijumovu so, natirjum holat), dehidroholnu kiselinu (natirjum dehidroholat), dezoksiholnu kiselinu (natirjum dezoksiholat), gluholnu kiselinu (natirjum gluholat), gliholnu kiselinu (natirjum glikoholat), glikodezoksiholnu kiselinu (natirjum glikodezoksiholat), tauroholnu kiselinu (natirjum tauroholat), taurodezoksiholnu kiselinu (natirjum taurodezoksiholat), henodezoksiholnu kiselinu (natirjum henodezoksiholat), ursodezoksiholnu kiselinu (UDCA), natirjum tauro-24,25-dihidro-fusidat (STDHF), natirjum glikodihidrofusidat i polioksietilen-9-lauril eter (POE) (pogledati npr., Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee i dr., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, strana 92; Swinyard, Chapter 39 u: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto i dr., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita i dr., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).
[0422] Helirajući agensi, kad se koriste u vezi sa ovim pronalaskom, mogu se definisati kao jedinjenja koja uklanjaju metalne jone iz rastvora formiranjem kompleksa sa njim, tako da se povećava apsorpcija iRNK preko sluznice. Što se tiče njihove upotrebe kao poboljšivači penetracije u ovom pronalasku, helirajući agensi imaju dodatnu prednost jer takođe služe kao inhibitori DNaze, jer najslabije karakterisane DNK nukleaze zahtevaju jon dvovalentnog metala za katalizu i na taj način su inhibirani helirajućim agensima (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Pogodni helirajući agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, dinatrijum etilendiaminetetraacetat (EDTA), limunsku kiselinu, salicilate (na primer, natrijum salicilat,
11
5-metoksisalicilat i homovanilat), N-acil derivate kolagena, lauret-9 i N-amino-acil derivate beta-diketona (enamini) (pogledati npr., Katdare, A. i dr., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee i dr., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur i dr., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).
[0423] Kad se ovde koristi, jedinjenja koja povećavaju penetraciju koja nisu površinski aktivna, mogu se definisati kao jedinjenja koja pokazuju neznačajnu aktivnost kao helirajući agensi ili kao surfaktante, ali ipak povećavaju apsorpciju iRNK kroz alimentarnu sluznicu (pogledati npr., Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Ova klasa poboljšanja penetracije uključuje, na primer, nezasićene ciklične uree, derivate 1-alkila- i 1-alkenilazaciklo-alkanona (Lee i dr., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, strana 92); i nesteroidne protivupalne agense kao što su natrijum diklofenak, indometacin i fenilbutazon (Yamashita i dr., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).
[0424] Agensi koji poboljšavaju uzimanje iRNK na ćelijskom nivou mogu se takođe dodati farmaceutskim i drugim sastavma predmetnog pronalaska. Na primer, za katjonske lipide, kao što je lipofektin (Junichi et al, U.S. Pat. br.5,705,188), katjonske derivate glicerola i polikacijskih molekula, kao što je polilizin (Lollo i dr., PCT Application WO 97/30731), takođe je poznato da poboljšavaju ćelijsko uzimanje dsRNK. Primeri komercijalno dostupnih transfekcionih reagensa uključuju, na primer Lipofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine 2000™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), 293fectin™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Cellfectin™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), DMRIE-C™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), FreeStyle™ MAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine™ 2000 CD (Invitrogen;
Carlsbad, CA), Lipofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), RNAiMAX (Invitrogen;
Carlsbad, CA), Oligofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Optifect™ (Invitrogen;
Carlsbad, CA), X-tremeGENE Q2 transfekcioni reagens (Roche; Grenzacherstrasse, Switzerland), DOTAP Liposomal transfekcioni reagens (Grenzacherstrasse, Switzerland), DOSPER Liposomal transfekcioni reagens (Grenzacherstrasse, Switzerland), or Fugene (Grenzacherstrasse, Switzerland), Transfectam® Reagent (Promega; Madison, WI), TransFast™ transfekcioni reagens (Promega; Madison, WI), Tfx™-20 Reagent (Promega; Madison, WI), Tfx™-50 Reagent (Promega; Madison, WI), DreamFect™ (OZ Biosciences; Marseille, France), EcoTransfect (OZ Biosciences; Marseille, France), TransPass<a>D1
11
transfekcioni reagens (New England Biolabs; Ipswich, MA, USA), LyoVec™/LipoGen™ (Invitrogen; San Diego, CA, USA), PerFectin transfekcioni reagens (Genlantis; San Diego, CA, USA), NeuroPORTER transfekcioni reagens (Genlantis; San Diego, CA, USA), GenePORTER transfekcioni reagens (Genlantis; San Diego, CA, USA), GenePORTER 2 transfekcioni reagens (Genlantis; San Diego, CA, USA), Cytofectin transfekcioni reagens (Genlantis; San Diego, CA, USA), BaculoPORTER transfekcioni reagens (Genlantis; San Diego, CA, USA), TroganPORTER™ transfekcioni reagens (Genlantis; San Diego, CA, USA ), RiboFect (Bioline; Taunton, MA, USA), PlasFect (Bioline; Taunton, MA, USA), UniFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, USA), SureFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, USA), ili HiFect™ (B-Bridge International, Mountain View, CA, USA), između ostalih.
[0425] Ostali agensi mogu se koristiti za poboljšanje penetracije primenom nukleinskih kiselina, uključujući glikole kao što su etilen glikol i propilen glikol, pirolide kao što su 2-pirol, azoni i terpene kao što su limonen i menton.
v. Nosači
[0426] Određeni sastavi predmetnog pronalaska takođe sadrže nosač jedinjenja u formulaciji. Kad se ovde koristi, „nosač jedinjenje“ ili „nosač“ mogu se odnositi na nukleinsku kiselinu ili njen analog, koji je inertan (tj., ne poseduje biološku aktivnost per se), ali je prepoznat kao nukleinska kiselina in vivo procesima koji smanjuju bioraspoloživost nukleinske kiseline koja ima biološku aktivnost, na primer, degradirajući biološki aktivnu nukleinsku kiselinu ili promovisanjem njenog uklanjanja iz cirkulacije. Istovremena primena nukleinske kiseline i nosač jedinjenja, obično sa viškom te druge supstance, može dovesti do značajnog smanjenja količine nukleinske kiseline koja se oporavlja u jetri, bubrezima ili drugim ekstrakcirculatornim rezervoarima, pretpostavlja se zbog konkurencije između nosača jedinjenja i nukleinske kiseline za zajednički receptor. Na primer, oporavak delimično fosforotioatne dsRNK u hepatičnom tkivu može se smanjiti kada se sjedinjuje sa poliinosinskom kiselinom, dekstran sulfatom, policitidnom kiselinom ili 4-acetamido-4'izotiocijan-stilbenom-2,2'-disulfonskom kiselinom (Miyao i dr., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura i dr., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183.
vi. Ekscipijenti
11
[0427] Za razliku od nosač jedinjenja, „farmaceutski nosač“ ili „ekscipijent“ je farmaceutski prihvatljiv rastvarač, suspendujući agens ili bilo koji drugi farmakološki inertan agens za isporuku jedne ili više nukleinskih kiselina životinji. Ekscipijent može biti tečan ili čvrst i odabran je, sa planiranim načinom primene na umu, kako bi se obezbedio željeni opseg, konzistentnost, itd., u kombinaciji sa nukleinskom kiselinom i ostalim komponentama datog farmaceutskog sastava. Tipični farmaceutski nosači uključuju, ali nisu ograničeni na, vezivne agense (npr., preželatizovani skrob kukuruza, polivinilpirolidon ili hidroksipropil metilceluloza, itd.); punila (npr., laktoze i drugi šećeri, mikrokristalna celuloza, pektin, želatin, kalcijum sulfat, etil celuloza, poliakrilati ili kalcijum hidrogenfosfat, itd.); lubrikante (npr., magnezijum stearat, talk, silicijum dioksid, koloidni silicijum dioksid, stearinska kiselina, metalni stearati, hidrogenizovana biljna ulja, kukuruzni skrob, polietilenglikoli, natrijum benzoat, natrijum acetat, itd.); dezintegrante (npr., skrob, natrijum skrobni glikolat, itd.); i agense za vlaženje (npr., natrijum-lauril sulfat, itd).
[0428] Farmaceutski prihvatljivi organski ili neorganski eksipijensi pogodni za neparentralno primenjivanje koje ne reaguju štetno sa nukleinskim kiselinama takođe se mogu koristiti za formulaciju sastava predmetnog pronalaska. Pogodni farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, ali se ne ograničavaju na, vodu, rastvore soli, alkohole, polietilen glikole, želatin, laktozu, amilozu, magnezijum stearat, talk, silikatnu kiselinu, viskozni parafin, hidroksimetilcelulozu, polivinilpirolidon i slično.
[0429] Formulacije za lokalnu primenu nukleinskih kiselina mogu uključivati sterilne i nesterilne vodene rastvore, ne-vodene rastvore u zajedničkim rastvaračima kao što su alkoholi ili rastvori nukleinskih kiselina u bazama tečnog ili čvrstog ulja. Rastvori mogu takođe sadržati pufere, razblaživače i druge pogodne aditive. Mogu se koristiti farmaceutski prihvatljivi organski ili neorganski ekscipijensi pogodni za ne-parenteralnu primenu, koji ne reaguju štetno sa nukleinskim kiselinama.
[0430] Pogodni farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti uključuju, ali se ne ograničavaju na, vodu, rastvore soli, alkohol, polietilen glikole, želatin, laktozu, amilozu, magnezijum stearat, talk, silicijsku kiselinu, viskozni parafin, hidroksimetilcelulozu, polivinilpirolidon i slično.
vii. Ostale komponente
12
[0431] Sastavi mogu dodatno da sadrže i druge komponente koje se konvencionalno nalaze u farmaceutskim sastavima, na svojim nivoima upotrebe standardnim u struci. Tako, na primer, sastavi mogu da sadrže dodatne, kompatibilne, farmaceutski aktivne materijale kao što su, na primer, antipruritici, astringenti, lokalni anestetici ili protivupalni agensi, ili mogu da sadrže dodatne materijale koji su korisni u fizičkom formulisanju različitih doznih oblika sastava prema predmetnom pronalasku, kao što su boje, agensi za ukus, konzervansi, antioksidanti, agensi za raspršivanje, agense za zgušnjavanje i stabilizatori. Međutim, takvi materijali, kada se dodaju, ne bi trebalo da se preterano mešaju u biološke aktivnosti komponenti sastava predmetnog pronalaska. Formulacije mogu biti sterilisane i, ako je poželjno, pomešane sa pomoćnim agensima, npr., lubrikanti, konzervansi, stabilizatori, agensi za vlaženje, emulgatori, soli za uticaj na osmotski pritisak, puferi, boje, arome i/ili aromatične supstance i slično, koji ne interakciju štetno sa nukleinskom kiselinom formulacije.
[0432] Vodene suspenzije mogu sadržati supstance koje povećavaju viskoznost suspenzije uključujući, na primer, natrijum karboksimetilcelulozu, sorbitol i/ili dekstran. Suspenzija takođe može sadržati stabilizatore.
[0433] U nekim primenama farmaceutski sastavi uključuju (a) jedno ili više iRNK jedinjenje i (b) jedan ili više agens koji funkcionišu pomoću mehanizma koji nije RNKi i koji je koristan u lečenju poremećaja krvarenja. Primeri takvih agensa uključuju, ali se ne ograničavaju na protivupalni agens, agens protiv steatoze, anti-virusni i/ili anti-fibrozni agens. Pored toga, druge supstance koje se obično koriste za zaštitu jetre, kao što je silimarin, mogu se takođe koristiti u kombinaciji sa iRNK opisanim ovde. Ostali agensi korisni za lečenje oboljenja jetre uključuju telbivudin, entekavir i inhibitore proteaze kao što su telaprevir i drugi koji su obelodanjeni, na primer, u Tung i dr., U.S. Application Publication Nos. 2005/0148548, 2004/0167116, i 2003/0144217; i u Hale i dr., U.S. objava prijave br. 2004/0127488.
[0434] Toksičnost i terapeutska efikasnost takvih jedinjenja mogu se odrediti standardnim farmaceutskim procedurama u ćelijskim kulturama ili eksperimentalnim životinjama, npr., za određivanje LD50 (doza smrtonosna za 50% populacije) i ED50 (doza terapeutski efikasna kod 50% populacije). Odnos doze između toksičnih i terapijskih efekata je terapeutski indeks i može se eksprimirati kao odnos LD50/ED50. Poželjna su jedinjenja koja pokazuju visoke terapeutske indekse.
[0435] Podaci dobijeni iz analiza ćelijske kulture i studija na životinjama mogu se koristiti za formulisanje palete doziranja za upotrebu kod ljudi. Doziranje sastav prikazani u ovom pronalasku leže u opsegu koncentracija cirkulacije koje uključuju ED50 sa malo ili bez toksičnosti. Doziranje može varirati u ovom opsegu u zavisnosti od upotrebljenog doznog oblika i korišćenog načina primene. Za bilo koje jedinjenje koje se koristi u postupcima opisanim u pronalasku, terapeutski efektivna doza se na početku može proceniti na osnovu analiza ćelijske kulture. Doza se može formulisati u životinjskim modelima kako bi se postigao opseg koncentracije jedinjenja koje cirkuliše u plazmi ili, kada je to primereno, polipeptidnog proizvoda ciljane sekvence (npr., postižući smanjenu koncentraciju polipeptida) koji uključuje IC50(tj., koncentracija test jedinjenja koja postiže polumaksimalnu inhibiciju simptoma), kao što je utvrđeno u ćelijskoj kulturi. Takve informacije mogu se koristiti za preciznije određivanje korisnih doza kod ljudi. Nivoi u plazmi se mogu meriti, na primer, tečnom hromatografijom visokih performansi.
[0436] Pored njihove primene, kao što je prethodno razmatrano, iRNK koji se nalaze u pronalasku mogu se davati u kombinaciji sa drugim poznatim agensima koji su efikasni u tretmanu patoloških procesa posredovanih Serpinal eksprimiranjem. U svakom slučaju, lekar koji je primenjuje može prilagoditi količinu i vreme primene iRNK-a na osnovu rezultata posmatranih korišćenjem standardnih mera efikasnosti poznatih u ovoj oblasti ili opisanih ovde.
IV. Postupci za inhibiranje Serpinal eksprimiranja
[0437] Predmetno obelodanjivanje pruža postupke inhibiranja eksprimiranje Serpinal u ćeliji. Postupci uključuju dovođenje u dodir ćelije sa RNKi agensom, npr., dvolančanim RNKi agensom, u količini koja je efikasna da inhibira eksprimiranje Serpinal u ćeliji, čime se inhibira eksprimiranje Serpinal u ćeliji.
[0438] Dovođenje u dodir ćelije sa dvolančanim RNKi agensom može se uraditi in vitro ili in vivo. Dovođenje u dodir ćelije in vivo sa RNKi agensom uključuje dovođenje u dodir ćelije ili grupe ćelija unutar pacijenta, npr., ljudskog pacijenta, sa RNKi agensom. Moguće su kombinacije in vitro i in vivo postupaka dovođenja u dodir. Dovođenje u dodir može biti direktno ili indirektno, kao što je gore navedeno. Osim toga, dovođenje u dodir ćelije može biti ostvareno preko ciljanog liganda, uključujući bilo koji ligand koji je ovde opisan ili je poznat u struci. U poželjnim implementacijama, ciljani ligand je deo ugljenih hidrata, npr., GalNAc3 liganda ili bilo kog drugog liganda koji usmerava RNKi agensa na mesto od interesa, npr., jetru pacijenta.
[0439] Izraz „inhibirati“, kad se ovde koristi, se međusobno koristi sa „smanjenjem“, „utišavanjem“, „regulisanjem na dole“ i drugim srodnim izrazima, i uključuje bilo koji nivo inhibicije.
[0440] Izraz „inhibiranje Serpina1 eksprimiranja“ ima za cilj da se odnosi na inhibiranje eksprimiranja bilo kog Serpina1 gena (kao što su, npr., mišji Serpina1 gena, pacovski Serpina1 gen, majmunski Serpina1 gen ili ljudski Serpina1 gen), kao i varijante ili mutante Serpina1 gena. Prema tome, Serpina1 gen može biti Serpina1 gen divljeg tipa, mutant Serpina1 gena ili transgeni Serpina1 gen u kontekstu genetički manipulisane ćelije, grupe ćelija ili organizma.
[0441] „Inhibiranje eksprimiranje Serpina1 gena“ uključuje bilo koji nivo inhibicije Serpina1 gena, npr., bar delimičnu supresiju eksprimiranje Serpina1 gena. Eksprimiranje Serpina1 gena može se proceniti na osnovu nivoa ili promene nivoa bilo koje promenljive koja je povezana sa eksprimiranjem Serpina1 gena, npr., Serpina1 mRNK nivo, Serpina1 proteinski nivo ili nivo lipida. Ovaj nivo se može proceniti u pojedinačnoj ćeliji ili u grupi ćelija, uključujući, na primer, uzorak koji se dobija od pacijenta.
[0442] Inhibiranje se može proceniti smanjenjem apsolutnog ili relativnog nivoa jedne ili više promenljivih koje su povezane sa eksprimiranjem Serpina1 u poređenju sa kontrolnim nivoom. Kontrolni nivo može biti bilo koji tip kontrolnog nivoa koji se koristi u struci, npr., početni nivo pre doza ili nivo određen kod sličnog pacijenta, ćelije ili uzorka koji se ne tretira ili se tretira sa kontrolom (kao što su, npr., samo kontrola pufera ili kontrola neaktivnog agensa).
[0443] U nekim implementacijama postupka, eksprimiranje Serpina1 gena je inhibirano za najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30% , najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, kod najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%,
12
najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%. najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, ili najmanje oko 99%.
[0444] Inhibiranje eksprimiranje Serpina1 gena može se manifestovati redukcijom količine mRNK eksprimirane prvom ćelijom ili grupom ćelija (takve ćelije mogu biti prisutne, na primer, u uzorku izvedenom od pacijenta) kod kog se Serpina1 gen transkribuje i koji se tretira ili je tretiran (npr., dovođenje u dodir ćelije ili ćelija sa RNKi agensom pronalaska ili davanjem RNKi agensa pronalaska pacijentu u kom su ćelije prisutne ili su bile prisutne) tako da je eksprimiranje Serpinal gena inhibirano, u poređenju sa drugom ćelijom ili grupom ćelija koje su suštinski identične sa prvom ćelijom ili grupom ćelija, ali koje se ne tretiraju ili nisu bile tretirane (kontrolna ćelija). U poželjnim aspektima, inhibiranje se procenjuje eksprimiranjem nivoa mRNK u tretiranim ćelijama kao procenat nivoa mRNK u kontrolnim ćelijama, koristeći sledeću formulu:
[0445] Alternativno, inhibiranje eksprimiranje Serpina1 gena može biti procenjena u smislu smanjenja parametra koji je funkcionalno povezan sa eksprimiranjem Serpina1 gena, npr., eksprimiranje Serpina1 proteina, kao što su ALT, alkalna fosfataza, bilirubin, protrombin i albumin. Utišavanje Serpina1 genu može se odrediti u bilo kojoj ćeliji koja eksprimira Serpina1, bilo konstitutivno ili genomskim inženjeringom, i bilo kojim analizom poznatom u struci. Jetra je glavno mesto Serpinal eksprimiranja. Ostala značajna mesta eksprimiranja uključuju pluća i creva.
[0446] Inhibiranje eksprimiranja Serpina1 proteina može se manifestovati smanjenjem nivoa Serpina1 proteina koji je eksprimiran od strane ćelije ili grupe ćelija (npr., nivo proteina eksprimiran u uzorku koji je izveden iz pacijenta). Kao što je gore objašnjeno za procenu supresije mRNK, inhibitor nivoa eksprimiranje proteina u tretiranoj ćeliji ili grupi ćelija može se slično eksprimirati kao procenat nivoa proteina u kontrolnoj ćeliji ili grupi ćelija.
[0447] Kontrolna ćelija ili grupa ćelija koje se mogu koristiti za procenu inhibicije eksprimiranje Serpina1 gena uključuje ćeliju ili grupu ćelija koja još nije dovedena u dodir sa RNKi agensom pronalaska. Na primer, kontrolna ćelija ili grupa ćelija mogu biti izvedene od pojedinačnog pacijenta (npr., ljudski ili životinjski pacijent) pre lečenja pacijenta sa RNKi agensom.
[0448] Nivo Serpina1 mRNK koji je eksprimiran od strane ćelije ili grupe ćelija može se odrediti pomoću bilo kog postupka poznatog u struci za procenu eksprimiranje mRNK. U jednom otelotvorenju, nivo eksprimiranje Serpina1 u uzorku se određuje detektovanjem transkribovanog polinukleotida ili njegovog dela, npr., mRNK Serpina1 gena. RNK se može ekstrakovati iz ćelija korišćenjem tehnike ekstrakcije RNK, uključujući, na primer, korišćenje kisele ekstrakcije fenol/gvanidin izotiocianata (RNKzol B, Biogenesis), RNeasy RNK kompleta za pripremu ()) ili PAXgene (PreAnalytix, Switzerland). Tipični oblici analize koji koriste hibridizaciju ribonuklealne kiseline uključuju nuklearne analize, RT-PCR, RNaza testove zaštite (Melton i dr., Nuc. Acids Res.12:7035), Northern blotting, in situ hibridizaciju i analizu mikroorganizama.
[0449] U jednoj implementaciji, nivo eksprimiranje Serpina1 se određuje pomoću sonde nukleinske kiseline. Izraz „sonda“, kad se ovde koristi, odnosi se na bilo koji molekul koji je sposoban za selektivno vezivanje za određeni Serpina1. Sonde mogu biti sintetisane od strane stručnjaka ili izvedene od odgovarajućih bioloških sastava. Sonde mogu biti posebno dizajnirane da budu označene. Primeri molekula koji se mogu koristiti kao sonde uključuju, ali nisu ograničeni na, RNK, DNK, proteine, antitela i organske molekule.
[0450] Izolovana mRNK se može koristiti u hibridizacijskim ili amplifikacionim analizama koje uključuju, ali nisu ograničene na, Southern ili Northern analize, polimerazne lančane reakcije (PCR) i nizove sondi. Jedan postupka za određivanje nivoa mRNK podrazumeva dovođenje u dodir izolovane mRNK sa molekulom nukleinske kiseline (sondom) koji može da hibridizuje do Serpina1 mRNK. U jednom aspektu mRNK se imobilizuje na čvrstu površinu i dovodi u dodir sondom, na primer pokretanjem izolovane mRNK na agaroznom gelu i prenošenjem mRNK iz gela u membranu, kao što je nitroceluloza. U alternativnom otelotvorenju, sonda se imobiliše na čvrstu površinu i mRNK se dovodi u dodir sa sondom, na primer, u Affymetrix nizu čipova gena. Stručnak u oblasti može lako prilagoditi poznate mRNK postupke detekcije za određivanje nivoa Serpina1 mRNK.
[0451] Alternativan postupak za određivanje nivoa eksprimiranje Serpina1 u uzorku uključuje proces amplifikacije nukleinske kiseline i/ili reverzne transkriptaze (za pripremu cDNK), na
12
primer mRNK u uzorku, npr., RT-PCR (eksperimentalno otelotvorenje izloženo u Mullis, 1987, U.S. Pat. br.4,683,202), lančana reakcija ligaze (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193), samoodrživa sekvencijalna replikacija (Guatelli i dr. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), sistem transkripcijskog pojačavanja (Kwoh i dr. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-Beta replikaza (Lizardi i dr. (1988) Bio/Technology 6:1197), replikacija kotrljajućeg kruga (Lizardi i dr., U.S. Pat. br.5,854,033) ili bilo koji drugi postupak amplifikacije nukleinske kiseline, nakon čega sledi detekcija pojačanih molekula korišćenjem tehnika koje su dobro poznate stručnjacima. Ove šeme detekcije su naročito korisne za detekciju molekula nukleinske kiseline ako su takvi molekuli prisutni u vrlo niskim brojevima. U posebnim aspektima pronalaska, nivo eksprimiranja Serpinal određuje se kvantitativnim fluorogenim RT-PCR (tj., TaqMan™ System).
[0452] Nivoi eksprimiranje Serpina1 mRNK mogu se pratiti korišćenjem membranskog blota (kao što se koristi u analizi hibridizacije kao što su Northern, Southern, tačka i slično) ili mikrokomorica, uzoraka cevi, gelova, perli ili vlakana (ili bilo koje čvrste podloge koja sadrži vezane nukleinske kiseline). Pogledati U.S. Pat. Nos. 5,770,722, 5,874,219, 5,744,305, 5,677,195 i 5,445,934. Određivanje nivoa eksprimiranja Serpinal može takođe obuhvatiti korišćenje sondi nukleinske kiseline u rastvoru.
[0453] U poželjnim implementacijama, nivo eksprimiranje mRNK se procenjuje korišćenjem razgranatih DNK (bDNK) testova ili PCR (kPCR) u realnom vremenu. Korišćenje ovih postupka je opisano i prikazano u Primerima koji su ovde predstavljeni.
[0454] Nivo eksprimiranje Serpina1 proteina može se odrediti pomoću bilo kog postupka poznatog u struci za merenje nivoa proteina. Takvi postupci uključuju, na primer, elektroforezu, kapilarnu elektroforezu, tečnu hromatografiju visokih performansi (HPLC), tankoslojnu hromatografiju (TLC), hiperdifuznu hromatografiju, tečnei ili želatinaste precipitin reakcije, apsorpcionu spektroskopiju, kolorimetrijske testove, spektrofotometrijske testove, protočnu citometriju, imunodifuziju (pojedinačna ili dvostruka), imunoelektroforezu, Western bloting, radioimunotest (RIA), enzimski vezani imunosorbentni testovi (ELISA), imunofluorescentne analize, elektrohemiluminiscentne analize i slično.
[0455] Izraz „uzorak“ kad se ovde koristi odnosi se na zbirku sličnih fluida, ćelija ili tkiva izolovanih od pacijenta, kao i fluida, ćelija ili tkiva prisutnih u pacijentu. Primeri bioloških
12
tečnosti uključuju krv, serum i serozalne tečnosti, plazmu, limfu, urin, cerebrospinalnu tečnost, pljuvačku, očne tečnosti i slično. Uzorci tkiva mogu obuhvatiti uzorke iz tkiva, organa ili lokalizovanih regija. Na primer, uzorci mogu biti izvedeni iz određenih organa, delova organa ili fluida ili ćelija unutar tih organa. U određenim otelotvorenjima, uzorci mogu biti izvedeni iz jetre (npr., cela jetra ili određeni segmenti jetre ili određene vrste ćelija u jetri, kao što su, npr., hepatociti). U poželjnim varijantama, „uzorak izveden iz pacijenta“ odnosi se na krv ili plazmu izvađene iz pacijenta. U daljnjim implementacijama, „uzorak izveden iz pacijenta“ odnosi se na tkivo jetre izvedeno od pacijenta.
[0456] U nekim implementacijama postupaka pronalaska, RNKi agens se daje pacijentu tako da je RNKi agens isporučen na određenu lokaciju unutar pacijenta. Inhibiranje eksprimiranja Serpina1 može biti procenjeno pomoću merenja nivoa ili promene nivoa Serpina1 mRNK ili Serpinal proteina u uzorku izvedenom iz tečnosti ili tkiva sa specifičnog mesta unutar pacijenta. U poželjnim implementacijama, mesto je jetra. Mesto takođe može biti podsekcija ili podgrupa ćelija sa bilo kog od prethodno navedenih mesta. Mesto može uključivati i ćelije koje eksprimiraju određeni tip receptora.
V. Postupci za lečenje ili prevenciju bolesti povezanih sa Serpina1
[0457] Predmetno obelodanjivanje takođe pruža postupke za lečenje ili prevenciju bolesti i stanja koje se mogu modulisati regulisanjem eksprimiranja Serpina1 gena. Na primer, ovde opisani sastavi se mogu koristiti za lečenje bolesti povezanih sa Serpina1, kao što su bolesti jetre, npr., hronična bolest jetre, upala jetre, ciroza, fibroza jetre i/ili hepatocelularni karcinom i druga patološka stanja koji mogu biti povezana sa ovim poremećajima, kao što su upala pluća, emfizem i COPD.
[0458] Opisani su i postupci za sprečavanje razvoja hepatocelularnog karcinoma kod pacijenta, npr., pacijenta koji ima varijantu nedostatka Serpina1. Postupci uključuju davanje terapeutski efikasne količini sastava pronalaska pacijentu, čime se inhibira razvoj hepatocelularnog karcinoma kod pacijenta.
[0459] Takođe su opisani postupci i upotreba sastava prema pronalasku za smanjenje akumulacije nepravilno savijenog Serpina1 u jetri pacijenta, npr., pacijenta koji ima varijantu nedostatka Serpina1. Postupci uključuju primenu terapeutski efikasne količini sastava
12
pronalaska pacijentu, čime se smanjuje akumulacija nepravilno savijenog Serpina1 u jetri pacijenta.
[0460] Kad se ovde koristi, „pacijent“ uključuje čoveka ili ne-ljudsku životinju, poželjno kičmenjaka, i poželjnije sisara. Pacijent može uključiti transgeni organizam. Najpoželjnije, pacijent je čovek, kao što je čovek koji pati od, ili ima predispozicije da razvije bolest povezanu sa Serpina1. U jednom aspektu, pacijent koji pati ili ima predispoziciju da razvije bolest povezanu sa Serpina1 ima jedan ili više alel deficijentan za Serpina1, npr., PIZ, PIS ili PIM (Malton) alel.
[0461] iRNK agens prema pronalasku može se davati u kombinaciji sa dodatnim terapeutskim agensom. iRNK agens i dodatni terapeutski agens mogu se davati u kombinaciji u istom sastavu, npr., parenteralno, ili se dodatni terapeutski agens može davati kao deo odvojenog sastava ili drugim postupkom koji je ovde opisan.
[0462] Primeri dodatnih terapeutskih agenasa pogodnih za upotrebu u postupcima uključuju one agense koji su poznati za lečenje poremećaja jetre, kao što je ciroza jetre. Na primer, iRNK agens koji se nalazi u pronalasku može se primeniti, na primer, ursodezoksiholna kiselina (UDCA), imunosupresivni agensi, metotreksat, kortikosteroidi, ciklosporin, kolhicin, antipruritski tretmani, kao što su antihistaminici, holestiramin, kolestipol, rifampin, dronabinol (marinol) i plazmapezeza, profilaktički antibiotici, ultraljubičasto svetlo, suplementi cinka i hepatitis A, vakcina protiv gripa i pneumokoka.
[0463] Postupak eksprimiranja Serpina1 može biti smanjena u produženom trajanju, npr., najmanje jednu nedelju, dve nedelje, tri nedelje ili četiri nedelje ili duže. Na primer, u određenim slučajevima, eksprimiranje Serpina1 gena je potisnuta za najmanje oko 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% ili 55 % pomoću primene iRNK agensa koji je ovde opisan. U nekim implementacijama, Serpina1 gen je potisnut za najmanje oko 60%, 70% ili 80% primenom iRNK agensa. U nekim otelotvorenjima, Serpina1 gen je potisnut za najmanje oko 85%, 90% ili 95% primenom iRNK agensa.
[0464] iRNK agensi predmetnog pronalaska mogu se davati pacijentu koji koristi bilo koji način primene poznat u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na potkožne, intravenozne, intramuskularne, intraokularne, intrabronhijalne, intrapleuralne,
12
intraperitonealne, intraarterijalne, limfne, cerebrospinalne i bilo koje druge njihove kombinacije. U poželjnim otelotvorenjima, iRNK agensi se primenjuju potkožno.
[0465] Primena može biti putem depo injekcije. Depo injekcija može oslobađati iRNK agense na konzistentan način tokom dužeg vremenskog perioda. Stoga, depo injekcija može smanjiti frekvenciju doziranja koja je potrebna da se dobije željeni efekat, npr., željeno inhibiranje Serpina1, ili terapijski ili profilaktički efekat. Depo injekcija može takođe pružiti konzistentnije koncentracije seruma. Depo injekcije mogu uključivati potkožne injekcije ili intramuskularne injekcije. Depo injekcija može biti potkožna injekcija.
[0466] Primena može biti putem pumpe. Pumpa može biti spoljna pumpa ili hirurški implantirana pumpa. U određenim implementacijama, pumpa je potkožno implantirana osmotička pumpa. U drugim implementacijama, pumpa je infuziona pumpa. Infuziona pumpa se može koristiti za intravenozne, potkožne, arterijske ili epiduralne infuzije. U poželjnim otelotvorenjima, infuziona pumpa je potkožna pumpa za infuziju. U drugim otelotvorenjima, pumpa je hirurški implantirana pumpa koja isporučuje RNKi agens u jetru.
[0467] Ostali načini primene su epiduralna, intracerebralna, intracerebroventrikularna, nazalna primena, intraarterijalna, inlanacdijska, intraozna infuzija, intratekalna i intravitrealna i plućna. Način primene može se odabrati na osnovu toga da li je poželjno lokalno ili sistemsko lečenje i na osnovu područja za lečenje. Put i mesto primene mogu biti izabrani da bi poboljšali ciljanje.
[0468] Postupci uključuju primenu iRNK agensa u dozi koja je dovoljna za suzbijanje/smanjenje nivoa Serpina1 mRNK tokom najmanje 5, još poželjnije 7, 10, 14, 21, 25, 30 ili 40 dana; i opciono, primenu druge jedinstvene doze iRNK agensa, pri čemu se druga pojedinačna doza primenjuje najmanje 5, poželjnije 7, 10, 14, 21, 25, 30 ili 40 dana nakon primene prve pojedinačne doze, čime se inhibira eksprimiranje Serpina1 gena kod pacijenta.
[0469] U jednoj implementaciji, doze iRNK agensa pronalaska se primenjuju ne više od jednom na svake četiri nedelje, ne više od jednom na svake tri nedelje, ne više od jednom na svake dve nedelje, ili ne više od jednom nedeljno. U drugoj implementaciji, primene se mogu održavati jedan, dva, tri ili šest meseci, ili godinu dana ili duže.
12
[0470] Generalno, iRNK agens ne aktivira imuni sistem, npr., ne povećava nivoe citokina, kao što su TNF-alfa ili IFN-alfa nivoi. Na primer, kada se meri pomoću analize, kao što je in vitro PBMC test, kao što je ovde opisano, povećanje TNF-alfa ili IFN-alfa nivoa je manje od 30%, 20% ili 10% kontrolnih ćelija tretirani sa kontrolnim iRNK agensom, kao što je iRNK agens koji ne cilja Serpinal.
[0471] Na primer, pacijentu se može davati terapeutska količina iRNK agensa, kao što je 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2,0 mg/kg ili 2,5 mg/kg dsRNK. iRNK agens se može davati intravenskom infuzijom tokom perioda vremena, kao što je tokom 5 minuta, 10 minuta, 15 minuta, 20 minuta ili 25 minuta. Primena se ponavlja, na primer, na redovnoj osnovi, kao što je dvonedeljno (tj., svake dve nedelje) tokom jednog meseca, dva meseca, tri meseca, četiri meseca ili duže.
[0472] Nakon početnog režima lečenja, lečenje se može primenjivati na manje učestaloj osnovi. Na primer, nakon primene dvonedeljno tokom tri meseca, primena se može ponoviti jednom mesečno, šest meseci ili godinu dana ili duže. Upotreba iRNK agensa može smanjiti nivo Serpina1, npr., u ćeliji, tkivu, krvi, urinu, organu (npr., jetri) ili drugom odeljku pacijenta za najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60% %, najmanje 70%, najmanje 80% ili najmanje 90% ili više.
[0473] Pre davanja pune doze iRNK agensa, pacijentima se može davati manja doza i nadgledaju se za štetne efekte, kao što je alergična reakcija ili za povećane nivoe lipida ili krvni pritisak. U drugom primeru, pacijent može biti nadgledan zbog neželjenih imunostimulatornih efekata, kao što je povećani citokin (npr., TNF-alfa ili INF-alfa).
Primerna manja doza je ona koja dovodi do incidencije infuzione reakcije manje od ili jednake 5%.
[0474] Efikasnost lečenja ili prevencije bolesti može se proceniti, na primer merenjem progresije bolesti, remisijom bolesti, ozbiljnošću simptoma, smanjenjem bola, kvalitetom života, dozom lekova koja je potreban kako bi se održao efekat tretmana, nivoom markera bolesti ili bilo kojim drugim merljivim parametrom koji odgovara određenoj bolesti koja se leči ili je ciljana za prevenciju. U okviru je sposobnosti stručnjaka da nadgleda efikasnost
1
tretmana ili prevencije merenjem bilo kog od takvih parametara ili bilo koje kombinacije parametara. Na primer, efikasnost lečenja fibroze jetre ili poboljšanja fibroze jetre može se proceniti, na primer, periodičnim nadgledanjem markera fibroze jetre: a-2-makroglobulin(a-MA), transferin, apolipoprotein Al, hijaluronska kiselina (HA), laminin , N-terminalni procollagen III (PIIINP), 7S kolagen IV (7S-IV), ukupni bilirubin, indirektni bilirubin, alanin aminotransferaza (ALT), aspartat aminotransferaza (AST), AST/ALT, g-glutamil transpeptidaza (GGT) fosfataza (ALP), albumin, albumin/globulin, azot urea u krvi (BUN), kreatinin (Cr), triglicerid, holersterol, lipoprotein visoke gustine i lipoprotein niske gustine i biopsija punkcije jetre. Markeri fibroze jetre mogu se izmeriti i/ili se može izvršiti biopsija jetre pre početka terapije (početno očitavanje), i potom (kasnije očitavanje) tokom režima lečenja.
[0475] Poređenje kasnijih očitavanja sa početnim očitavanjem daje lekaru indikaciju da li je lečenje efikasno. U okviru je sposobnosti stručnjaka da nadgleda efikasnost tretmana ili prevencije merenjem bilo kog od takvih parametara ili bilo koje kombinacije parametara. U vezi sa primenom iRNK agensa koji cilja Serpinal ili njegovog farmaceutsku sastava, „efikasan protiv“ bolesti povezane sa Serpina1, kao što je bolest jetre, npr., stanje hepatične fibroze, ukazuje da primena iRNK agensa pronalaska na klinički odgovarajući način rezultuje pozitivnim efektom najmanje za statistički značajan fragment pacijenata, kao što je poboljšanje simptoma, lečenje, smanjenje opterećenja bolesti, smanjenje mase tumora ili broja ćelija tumora, produženje života, poboljšanje kvaliteta života ili drugi efekat opšte prepoznat kao pozitivan od strane lekara koji su upoznati sa lečenjem oboljenja jetre.
[0476] U postupcima, iRNK agens kao što je ovde opisan može se koristiti za lečenje pojedinaca koji imaju znake, simptome i/ili markere ili su ih dijagnostikovali ili predstavljaju rizik od nastanka bolesti povezane sa Serpina1, kao što je bolest jetre, npr., zapaljenje jetre, ciroza, fibroza jetre i/ili hepatocularni karcinom. Stručnjak u oblasti može lako pratiti znake, simptome i/ili uzročnike takvih poremećaja kod pacijenta koji primaju terapiju pomoću iRNK agensa kao što je ovde opisano, i pratiti smanjenje ovih znakova, simptoma i/ili uzročnika od najmanje 10 % i poželjno do kliničkog nivoa koji predstavlja mali rizik od oboljenja jetre.
[0477] Tretman ili preventivni efekat je očigledan kada postoji statistički značajno poboljšanje u jednom ili više parametara statusa bolesti, ili usled sprečavanja pogoršanja ili razvoja simptoma tamo gde su inače bili predviđeni. Kao primer, povoljna promena od
1 1
najmanje 10% u merljivom parametru bolesti (kao što je opisana funkcija jetre supra), i poželjno najmanje 20%, 30%, 40%, 50% ili više mogu biti indikativni za efikasan tretman. Efikasnost za dati iRNK agens pronalaska ili formulaciju tog iRNK agensa takođe se može proceniti korišćenjem eksperimentalnog modela životinja za datu bolest, kako je poznato u struci. Kada se koristi eksperimentalni model životinja, efikasnost lečenja se dokazuje kada se primećuje statistički značajno smanjenje markera ili simptoma.
[0478] Tretman ili preventivni efekat je takođe evidentan kada se jedan ili više simptoma smanji ili ublaži. Na primer, tretman ili preventiva su efikasni kada se smanji ili ublaži jedno ili više od slabosti, umora, gubitka težine, mučnine, povraćanja, abdominalnog otoka, otoka ekstremiteta, prekomernog svraba i žutice očiju i/ili kože.
[0479] Za određene indikacije, efikasnost se može izmeriti povećanjem nivoa Serpina1 proteina u serumu. Kao primer, povećanje nivoa pravilno savijenih Serpina1 u serumu od najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 50%, najmanje 100%, najmanje 200% više može biti indikativno za efikasan tretman.
[0480] Alternativno, efikasnost se može meriti smanjenjem težine bolesti, koja je određena od strane stručnjaka u oblasti dijagnoze na osnovu klinički prihvaćene skale za procenu jačine bolesti, kao što je samo jedan primer Child-Pugh rezultat (ponekad Child-Turcotte-Pugh rezultat). U ovom primeru, prognoza hronične bolesti jetre, uglavnom ciroze, meri se agregatnim rezultatom od pet kliničkih mera, bilirubina, serumskog albumina, INR, ascita i hepatične encefalopatije. Svakom markeru dodeljuje se vrednost od 1-3, a ukupna vrednost se koristi kako bi se postigao rezultat kategorisan kao A (5-6 poena), B (7-9 poena) ili C (10-15 poena), što može biti u korelaciji sa stopama preživljavanja od jedne i dve godine. Postupci za određivanje i analizu Child-Pugh rezultata su dobro poznati u struci (Farnsworth et al, Am J Surgery 2004188:580-583; Child and Turcotte. Surgery and portal hypertension. In: The liver and portal hypertension. Edited by CG Child. Philadelphia: Saunders 1964:50- 64; Pugh et al, Br J Surg 1973;60:648-52). Efikasnost se može meriti u ovom primeru kretanjem pacijenta od npr. „B“ do „A“. Bilo koja pozitivna promena koja rezultuje, npr., smanjenjem jačine bolesti mereno korišćenjem odgovarajuće skale, predstavlja adekvatan tretman korišćenjem iRNK ili iRNK formulacije kao što je ovde opisano.
[0481] U jednoj implementaciji, RNKi agens je primenjen pri dozi od između oko 0,25
1 2
mg/kg do oko 50 mg/kg, npr., između oko 0,25 mg/kg do oko 0,5 mg/kg, između oko 0,25 mg/kg do oko 1 mg/kg, između oko 0,25 mg/kg do oko 5 mg/kg, između oko 0,25 mg/kg do oko 10 mg/kg, između oko 1 mg/kg do oko 10 mg/kg, između oko 5 mg/kg do oko 15 mg/kg, između oko 10 mg/kg do oko 20 mg/kg, između oko 15 mg/kg do oko 25 mg/kg, između oko 20 mg/kg do oko 30 mg/kg, između oko 25 mg/kg do oko 35 mg/kg, ili između oko 40 mg/kg do oko 50 mg/kg.
[0482] U nekim implementacijama, RNKi agens je primenjen pri dozi od oko 0,25 mg/kg, oko 0,5 mg/kg, oko 1 mg/kg, oko 2 mg/kg, oko 3 mg/kg, oko 4 mg/kg, oko 5 mg/kg, oko 6 mg/kg, oko 7 mg/kg, oko 8 mg/kg, oko 9 mg/kg, oko 10 mg/kg, oko 11 mg/kg, oko 12 mg/kg, oko 13 mg/kg, oko 14 mg/kg, oko 15 mg/kg, oko 16 mg/kg, oko 17 mg/kg, oko 18 mg/kg, oko 19 mg/kg, oko 20 mg/kg, oko 21 mg/kg, oko 22 mg/kg, oko 23 mg/kg, oko 24 mg/kg, oko 25 mg/kg, oko 26 mg/kg, oko 27 mg/kg, oko 28 mg/kg, oko 29 mg/kg, 30 mg/kg, oko 31 mg/kg, oko 32 mg/kg, oko 33 mg/kg, oko 34 mg/kg, oko 35 mg/kg, oko 36 mg/kg, oko 37 mg/kg, oko 38 mg/kg, oko 39 mg/kg, oko 40 mg/kg, oko 41 mg/kg, oko 42 mg/kg, oko 43 mg/kg, oko 44 mg/kg, oko 45 mg/kg, oko 46 mg/kg, oko 47 mg/kg, oko 48 mg/kg, oko 49 mg/kg ili oko 50 mg/kg.
[0483] U određenim implementacijama, na primer, kada dvolančani RNKi agens uključuje modifikacije (npr., jedan ili više motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, uključujući jedan takav motiv na ili blizu mesta cepanja agensa), šest fosforotioatnih veza, i ligand, takav agens je primenjen pri dozi od oko 0,01 do oko 0,5 mg/kg, oko 0,01 do oko 0,4 mg/kg, oko 0,01 do oko 0,3 mg/kg, oko 0,01 do oko 0,2 mg/kg, oko 0,01 do oko 0,1 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 0,09 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 0,08 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 0,07 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 0,06 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 0,05 mg/kg, oko 0,02 do oko 0,5 mg/kg, oko 0,02 do oko 0,4 mg/kg, oko 0,02 do oko 0,3 mg/kg, oko 0,02 do oko 0,2 mg/kg, oko 0,02 do oko 0,1 mg/kg, oko 0,02 mg/kg do oko 0,09 mg/kg, oko 0,02 mg/kg do oko 0,08 mg/kg, oko 0,02 mg/kg do oko 0,07 mg/kg, oko 0,02 mg/kg do oko 0,06 mg/kg, oko 0,02 mg/kg do oko 0,05 mg/kg, oko 0,03 do oko 0,5 mg/kg, oko 0,03 do oko 0,4 mg/kg, oko 0,03 do oko 0,3 mg/kg, oko 0,03 do oko 0,2 mg/kg, oko 0,03 do oko 0,1 mg/kg, oko 0,03 mg/kg do oko 0,09 mg/kg, oko 0,03 mg/kg do oko 0,08 mg/kg, oko 0,03 mg/kg do oko 0,07 mg/kg, oko 0,03 mg/kg do oko 0,06 mg/kg, oko 0,03 mg/kg do oko 0,05 mg/kg, oko 0,04 do oko 0,5 mg/kg, oko 0,04 do oko 0,4 mg/kg, oko 0,04 do oko 0,3 mg/kg, oko 0,04 do oko 0,2 mg/kg, oko 0,04 do oko 0,1 mg/kg, oko 0,04 mg/kg
1
do oko 0,09 mg/kg, oko 0,04 mg/kg do oko 0,08 mg/kg, oko 0,04 mg/kg do oko 0,07 mg/kg, oko 0,04 mg/kg do oko 0,06 mg/kg, oko 0,05 do oko 0,5 mg/kg, oko 0,05 do oko 0,4 mg/kg, oko 0,05 do oko 0,3 mg/kg, oko 0,05 do oko 0,2 mg/kg, oko 0,05 do oko 0,1 mg/kg, oko 0,05 mg/kg do oko 0,09 mg/kg, oko 0,05 mg/kg do oko 0,08 mg/kg, ili oko 0,05 mg/kg do oko 0,07 mg/kg. Vrednosti i opsezi između gore navedenih vrednosti se takođe smatraju delom ovog obelodanjenja, npr.,, RNKi agens se može primeniti pacijentu pri dozi od oko 0,015 mg/kg do oko 0,45 mg/mg.
[0484] Na primer, RNKi agens, npr., RNKi agens u farmaceutskom sastavu, se može primeniti pri dozi od oko 0,01 mg/kg, 0,0125 mg/kg, 0,015 mg/kg, 0,0175 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,0225 mg/kg, 0,025 mg/kg, 0,0275 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,0325 mg/kg, 0,035 mg/kg, 0,0375 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,0425 mg/kg, 0,045 mg/kg, 0,0475 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,0525 mg/kg, 0,055 mg/kg, 0,0575 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,0625 mg/kg, 0,065 mg/kg, 0,0675 mg/kg, 0,07 mg/kg, 0,0725 mg/kg, 0,075 mg/kg, 0,0775 mg/kg, 0,08 mg/kg, 0,0825 mg/kg, 0,085 mg/kg, 0,0875 mg/kg, 0,09 mg/kg, 0,0925 mg/kg, 0,095 mg/kg, 0,0975 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,125 mg/kg, 0,15 mg/kg, 0,175 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,225 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,275 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,325 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,375 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,425 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,475 mg/kg, ili oko 0,5 mg/kg. Vrednosti između gore navedenih vrednosti se takođe smatraju delom ovog obelodanjenja.
[0485] Doza RNKi agensa koja se daje pacijentu može biti prilagođena kako bi se uravnotežili rizici i koristi određene doze, na primer, kako bi se postigao željeni nivo supresije Serpina1 gena(kao što je procenjeno, npr., na osnovu supresije Serpina1 mRNK, eksprimiranja Serpina1 proteina) ili željenog terapijskog ili profilaktičkog efekta, istovremeno izbegavajući neželjene sporedne efekte.
[0486] U nekim implementacijama, RNKi agens se primenjuje u dve ili više doza. Ako se želi da se olakšaju ponovljene ili česte infuzije, može biti preporučljiva implantacija uređaja za isporuku, npr., pumpa, polu-trajni stent (npr., intravenozni, intraperitonealni, intracisternalni ili inlanacpsularni) ili rezervoar. U nekim implementacijama, broj ili količina naknadnih doza zavisi od postizanja željenog efekta, npr., supresija Serpina1 gena ili postizanje terapeutskog ili profilaktičkog efekta, npr., smanjenje simptoma bolesti jetre. U nekim implementacijama, RNKi agens se primenjuje prema rasporedu. Na primer, RNKi agens se može davati jednom nedeljno, dvaput nedeljno, tri puta nedeljno, četiri puta nedeljno ili pet puta nedeljno. U
1 4
nekim otelotvorenjima, raspored uključuje redovno raspoređene primene, npr., po satu, svaka četiri sata, svakih šest sati, svakih osam sati, svakih dvanaest sati, dnevno, svaka 2 dana, svaka 3 dana, svaka 4 dana, svakih 5 dana, nedeljno, dvonedeljno ili mesečno. U drugim implementacijama, raspored uključuje primene koje su usko raspoređene, nakon čega sledi duži vremenski period u kom se agens ne primenjuje. Na primer, raspored može uključivati početni set doza koje se primenjuju u relativno kratkom vremenskom periodu (npr., oko svakih 6 sati, oko svakih 12 sati, oko svaka 24 sata, oko 48 sati, ili oko 72 sata), nakon čega sledi duži vremenski period (npr., oko 1 nedelje, oko 2 nedelje, oko 3 nedelje, oko 4 nedelje, oko 5 nedelja, oko 6 nedelja, oko 7 nedelja ili oko 8 nedelja) tokom kojih se ne primenjuje RNKi. U jednoj implementaciji, RNKi agens se inicijalno primenjuje na sat i kasnije se primenjuje u dužem intervalu (npr., dnevno, nedeljno, dvonedeljno ili mesečno). U drugoj implementaciji, RNKi agens se prvobitno primenjuje dnevno i kasnije se primenjuje u dužem intervalu (npr., nedeljno, dvonedeljno ili mesečno). U određenim implementacijama, duži interval se vremenom povećava ili se određuje na osnovu postizanja željenog efekta. U specifičnoj implementaciji, RNKi agens se primenjuje jednom dnevno tokom prve nedelje, nakon čega sledi nedeljno doziranje počevši od osmog dana primene. U drugoj specifičnoj implementaciji, RNKi agens se primenjuje svakog drugog dana tokom prve nedelje, nakon čega sledi nedeljno doziranje počevši od osmog dana primene.
[0487] U nekim implementacijama, RNKi agens se primenjuje u režimu doziranja koji uključuje „fazu opterećivanja“ blisko raspoređenih primena koje mogu biti praćene „fazom održavanja“, u kojoj se RNKi agens primenjuje u dužim razmacima. U jednoj implementaciji, faza opterećivanja sadrži pet dnevnih primena agensa RNKi tokom prve nedelje. U drugom otelotvorenju, faza održavanja sadrži jednu ili dve nedeljne primene RNKi agensa. U daljem ostvarenju, faza održavanja traje 5 nedelja. U jednoj implementaciji, faza opterećivanja sadrži primenu doze od 2 mg/kg, 1 mg/kg ili 0,5 mg/kg pet puta nedeljno. U drugoj implementaciji, faza održavanja obuhvata primenu doze od 2 mg/kg, 1 mg/kg ili 0,5 mg/kg jednom ili dva puta nedeljno.
[0488] Svaki od ovih rasporeda opciono se može ponoviti za jednu ili više iteracija. Broj iteracija može zavisiti od postizanja željenog efekta, npr., suzbijanje Serpina1 gena i/ili postizanje terapijskog ili profilaktičkog efekta, npr., smanjujući simptoma bolesti povezanih sa Serpina1, npr., bolesti jetre.
1
[0489] Takođe je opisan postupak obučavanja krajnjeg korisnika, npr., negovatelja ili pacijenta, kako da primenjuje iRNK agens koji je ovde opisan. Ovaj postupak uključuje, opciono, pružanje krajnjem korisniku jednu ili više doza iRNK agensa i obučavanje krajnjeg korisnika kako da primenjuje iRNK agens pri režimu koji je ovde opisan, čime se obučava krajnji korisnik.
[0490] Genetska predispozicija igra ulogu u razvoju ciljanih bolesti povezanih sa genima, npr., oboljenje jetre. Stoga, pacijent kom je potrebna siRNK može se identifikovati uzimanjem porodične istorije ili, na primer, skrininga za jedan ili više genetskih markera ili varijanti. Shodno tome, opisan je postupak lečenja pacijenta odabirom pacijenta na osnovu toga što pacijent ima jedan ili više nedostataka Serpina1 ili varijantu gena nedostatka Serpina1, npr., PIZ, PIS ili PIM (Malton) alela. Postupak uključuje davanje pacijentu iRNK agensa u terapeutski efikasnoj količini.
[0491] Pružalac zdravstvene zaštite, kao što je lekar, medicinska sestra ili član porodice, može uzeti u obzir porodičnu istoriju pre nego što propiše ili primeni iRNK agens prema pronalasku. Osim toga, može se izvršiti test da se odredi genotip ili fenotip. Na primer, DNK test se može izvesti na uzorku od pacijenta, npr., uzorak krvi, da se identifikuje Serpina1 genotip i/ili fenotip pre nego što se Serpina1 dsRNK daje pacijentu.
VI. Kompleti
[0492] Takođe su opisani kompleti za korišćenje bilo kog od iRNK agensa i/ili izvođenje bilo kog od postupaka. Takvi kompleti uključuju jedan ili više RNKi agens i uputstva za upotrebu, npr., uputstva za inhibiranje eksprimiranja Serpina1 u ćeliji dovođenje u dodir ćelije sa RNKi agensom u količini koja je efikasna da inhibira eksprimiranje Serpina1. Kompleti mogu opciono dalje da sadrže načine za dovođenje u dodir ćelije sa RNKi agensom (npr., injekcioni uređaj) ili načine za merenje inhibicije Serpina1 (npr., načini za merenje inhibicije Serpina1 mRNK). Takvi načini za merenje inhibicije Serpina1 mogu sadržati načine za dobijanje uzorka od pacijenta, kao što su, npr., uzorak plazme. Kompleti mogu opciono dalje da sadrže načine za davanje RNKi agensa pacijentu ili načine za određivanje terapeutski efikasne ili profilaktički efikasne količine.
[0493] Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni pojmovi kad se ovde koriste
1
imaju isto značenje kao što je obično poznato stručnjaku u oblasti kojoj pripada ovaj pronalazak. Iako postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima opisanim ovde mogu biti korišćeni u praksi ili testiranju iRNK i postupka, u nastavku su opisani odgovarajući postupci i materijali.
PRIMERI
Materijali i postupci
[0494] Sledeći materijali i postupci su korišćeni u Primerima.
siRNK dizajn
[0495] Serpinal gen ima više alternativnih transkripata. siRNK dizajn je izveden kako bi se identifikovale siRNK koje ciljaju sve ljudske i makaki rakojed (Macaca fascicularis; u daljem tekstu „cino“) Serpinal transkripte označene u bazama podataka o genima NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/). Korišćeni su sledeći ljudski transkripti iz NCBI RefSeq kolekcije: Ljudski - NM 000295.4, NM_001002235.2, NM_001002236.2, NM_001127700.1, NM_001127701.1, NM_001127702.1, NM_001127703.1, NM_001127704.1, NM_001127705.1, NM_001127706.1, NM_001127707.1. Za identifikaciju makaki transkripta, rezus majmun (Macaca mulatta) transkript, XM_001099255.2, bio je usklađen sa M. fascicularis genom pomoću Spidey alata za poravnavanje (www.ncbi.nlm.nih.gov/spidey/). Ukupni procenat identičnosti rezus i makaki transkripata bio je 99,6%. Transkript makakija bio je ručno sastavljen kako bi se sačuvali konsenzusna mesta podela i netranslatirane regije kodiranja pune dužini. Dobijeni transkript je dugačak 2064 nukleotida.
[0496] Svi siRNK dupleksi su dizajnirani tako da dele 100% identičnosti sa svim navedenim ljudskim i makaki transkriptima.
[0497] Petstoosamdeset i pet kandidata korišćeno je u sveobuhvatnoj pretrazi protiv ljudskog transkriptoma (definisan kao set zapisa NM_ i XM_ u okviru ljudskog NCBI RefSeq seta). Ukupno 48 smisao (21 mera) i 48 antismisao (23 mera) izvedenih siRNK oligoa su sintetisani i formirani u dupleks. Detaljna lista sekvenci Sepina1 i antismisao nizova prikazana je u Tabelama 1 i 2.
siRNK sinteza
1
I. Opšta procedura sinteze RNK u maloj i srednjoj razmeri
[0498] RNK oligonukleotidi su sintetisani u razmerama između 0,2-500 μmol korišćenjem komercijalno dostupnih 5'-O-(4,4'-dimetoksitritil)-2'-O-t-butildimetilsilil-3'-O-(2-cijanoetil-N,N-diisopropil)fosforamidit monomera od uridina, 4-N-acetilcitidina, 6-N-benzoiladenozina i 2-N-izobutirilguanozina i odgovarajućih 2'-O-metil i 2'-fluoro fosforamidita u skladu sa standardnim protokolima sinteze čvrste faze oligonukleotida. Amiditni rastvori su pripremljeni u koncentraciji 0,1-0,15 M, a kao aktivator korišćen je 5-etiltio-1H-tetrazol (0,25-0,6 M u acetonitrilu). U sintezi su uvedene modifikacije fosforotiatne kime, koristeći 0,2 M fenilacetil disulfid (PADS) u lutidinu: acetonitril (1:1) (v;v) ili 0,1 M 3-(dimetilaminometilen)amino-3H-1,2,4-ditiazol-5-tion (DDTT) u piridinu za korak oksidacije. Posle završetka sinteze, sekvence su otcepljene iz čvrste supstance i uklonjena im je zaštita korišćenjem metilamina praćeno trietilaminom 3HF, kako bi se uklonile prisutne 2'-O-tbutildimetilsilil zaštitne grupe.
[0499] Za razmeru sinteze vage između 5-500 μmol i potpuno 2' modifikovane sekvence (2'-fluoro i/ili 2'-O-metil ili njihove kombinacije) oligonukleotidima je uklonjena zaštita sa 3:1 (v/v) etanolom i koncentrovanim (28-32%) vodenim amonijakom bilo na 35°C tokom 16 sati ili na 55°C tokom 5,5 sati. Pre uklanjanja zaštite amonijakom, oligonukleotidi su tretirani sa 0,5 M piperidinom u acetonitrilu u trajanju od 20 min na čvrstom nosaču. Sirovi oligonukleotidi su analizirani pomoću LC-MS i HPLC-a za izmenu anjona (IEX-HPLC). Prečišćavanje oligonukleotida izvedeno je pomoću IEX HPLC korišćenjem: 20 mM fosfata, 10%-15% ACN, pH = 8,5 (pufer A) i 20 mM fosfata, 10%-15% ACN, 1 M NaBr, pH = 8,5 pufer B). Fragmenti su analizirani za čistoću pomoću analitičke HPLC. Fragmenti koje sadrže proizvod sa odgovarajućom čistoćom su udruženi i koncentrovani na rotacionom isparivaču pre desalinizacije. Uzorci su desalinizovani hromatografijom za isključivanje veličine i liofilizovani do suvoće. Jednake molarne količine smisao i antismisao lanaca su kaljene u 1x PBS puferu za pripremu odgovarajućih siRNK dupleksa.
[0500] Za male razmere (0,2-1 μmol), sinteza je izvedena na MerMade 192 sintezeru u formatu sa 96 komorica. U slučaju potpuno 2'-modifikovanih sekvenci (2'-fluoro i/ili 2'-O-metil ili njihovih kombinacija) oligonukleotidima je uklonjena zaštita korišćenjem metilamina na sobnoj temperaturi tokom 30-60 minuta, nakon čega sledi inkubacija na 60°C za 30 min ili pomoću 3:1 (v/v) etanola i koncentrovanog (28-32%) vodenog amonijaka na sobnoj temperaturi tokom 30-60 minuta, nakon čega sledi inkubacija na 40°C tokom 1,5 sata.
1
Sirovi oligonukleotidi su zatim taloženi u rastvoru acetonitrila: aceton (9:1) i izolovani centrifugiranjem i dekantiranjem supernatanta. Sirova oligonukleotidna peleta je ponovo suspendovana u 20 mM NaOAc puferu i analizirana pomoću LC-MS i HPLC izmene anjona. Sirove oligonukleotidne sekvence desalinizovane su na 96-komoričnim dubokim pločama na 5 mL HiTrap Sephadex G25 koloni (GE Healthcare). U svakoj komorici sakupljeno je oko 1,5 ml uzoraka koji odgovaraju pojedinačnoj sekvenci. Ovi prečišćeni desalinizovani oligonukleotidi analizirani su pomoću LC-MS i anjonske hromatografije. Dupleksi su pripremljeni kalemljenjem sa ekvimolarnim količinama smisao i antismisaonih sekvenci na Tecan robotu. Koncentracija dupleksa je podešena na 10 μM u 1k PBS puferu.
II. Sinteza GalNAc-konjugovanih oligonukleotida za In Vivo analizu
[0501] Oligonukleotidi koji su konjugovani sa GalNAc ligandom na svom 3'-terminusu sintetisani su u razmeri između 0,2-500 μmol koristeći čvrsti nosač prethodno napunjen sa Y-oblikovanim veznikom koji nosi 4,4'-dimetoksitril (DMT)-zaštićenu primarnu hidroksi grupu za sintezu oligonukleotida i GalNAc ligand koji se pričvršćuje preko tetra.
[0502] Za sintezu GalNAc konjugata u razmeri između 5-500 μmol, prethodno navedeni protokol sinteze za RNK pratio je sledeća prilagođavanja: Za sintezu zasnovanu na polistirenu podloga je 5% dihloroacetatna kiselina u toluenu za razdvajanje DMT tokom sinteze. Cepanje iz podloge i uklanjanje zaštite izvedeno je kao što je gore opisano.
Sintetisane sekvence bogate fosforotioatom (obično> 5 forforotioata) sintetisane su bez uklanjanja konačne 5'-DMT grupe („DMT-on“) i, nakon cepanja i uklanjanja zaštite kao što je opisano gore, prečišćene su pomoću HPLC sa reverznom fazom koristeći 50 mM amonijum acetat u vodi (pufer A) i 50 mM amonijum acetat u 80% acetonitirilu (pufer B). Fragmenti su analizirani za čistoću pomoću analitičke HPLC i/ili LC-MS. Fragmenti koji sadrže proizvod sa odgovarajućom čistoćom su udružene i koncentrovani na rotacionom isparivaču. DMT-grupa je uklonjena upotrebom 20% -25% sirćetne kiseline u vodi do završetka. Uzorci su desalirani hromatografijom za isključivanje veličine i liofilizovani do suvog. Jednake molarne količine smisao i antismisao lanca su kaljene u 1x PBS puferu za pripremu odgovarajućih siRNK dupleksa.
[0503] Za sintezu malih razmera GalNAc konjugata (0,2-1 μmol), uključujući sekvence sa višestrukim fosforotioatnim vezama, primenjeni su protokoli opisani za sintezu RNK ili potpuno sekvence koje sadrže 2'-F/2'-OMe na MerMade platformi. Sinteza je izvedena na
1
prethodno upakovanim kolonama koje sadrže GalNAc-funkcionalizovano kontrolisano staklo sa porama.
Sinteza cDNK pomoću ABI cDNK kompleta reverzne transkripcije visokog kapaciteta (Applied Biosystems, Foster City, CA, Cat #4368813)
[0504] Master smeša 2μl 10X pufer, 0,8μl 25Ks dNTPs, 2μl nasumični prajmeri, 1μl reverzne transkriptaze, 1μl inhibitor RNaza i 3,2μl H2O po reakciji je dodata u 10µl ukupne RNK. cDNK je generisana pomoću termičkog ciklusa Bio-Rad C-1000 ili S-1000 (Hercules, CA) kroz sledeće korake: 25°C 10 min, 37°C 120 min, 85°C 5 sekundi, držanje 4°C.
Kultura ćelija i transfekcije
[0505] Hep3B, HepG2 ili HeLa ćelije (ATCC, Manassas, VA) su gajene do blizu konfluencije na 37°C u atmosferi od 5% CO2u preporučenom medijumu (ATCC) dopunjenom sa 10% FBS i glutamina (ATCC) pre nego što se oslobodi od ploče putem tripsinizacije. Za duplekse prikazane u formatu od 96 komorica, transfekcija je izvršena dodavanjem 44,75 μl Opti-MEM plus 0,25 μl Lipofectamin RNAiMax po komorici (Invitrogen, Carlsbad CA. cat # 13778-150) do 5 μl svakog siRNK dupleksa pojedinačnoj komorici na ploči sa 96 komorica. Smeša je zatim inkubirana na sobnoj temperaturi 15 minuta. Pedeset μl kompletnog medijuma za rast bez antibiotika sa ~ 2x10<4>ćelija je zatim dodato u smešu siRNK. Za duplekse prikazane u 384-komoričnom formatu, 5 μl Opti-MEM plus 0,1 μl lipofektamina RNAiMax (Invitrogen, Carlsbad CA. cat # 13778-150) je pomešano sa 5 μl svakog siRNK dupleksa po pojedinačnoj komorici. Smeša je zatim inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta, nakon čega sledi dodavanje 40μl kompletnog rastvarača bez antibiotika koji sadrži ~8x10<3>ćelija. Ćelije su inkubirane 24 sata pre RNK pročišćavanja. Eksperimenti pojedinačne doze su izvedeni na 10 nM i 0,1 nM konačne dupleksne koncentracije i eksperimenti odziva doze su izvršeni na 10, 1,67, 0,27, 0,046, 0,0077, 0,0013, 0,00021, 0,00004 nM konačne dupleksne koncentracije.
Slobodno uzimanje transfekcije
[0506] Pet μl svake GalNac konjugovane siRNK u PBS je kombinovano sa 3X10<4>sveže odmrznutim krioočuvanim hepatocitima Cinomolgus majmuna (In Vitro Technologies-Celsis, Baltimore, MD; lot#JQD) resuspendovanim u 95 μl In Vitro Gro CP medijuma(In Vitro Technologies - Celsis, Baltimore, MD) u svakoj komorici ploče sa 96 komorica, ili 5 siRNK i 45 μl medijuma koji sadrže 1,2x10<3>u formatu ploče sa 384 komorice. Smeša je
14
inkubirana tokom 24 sata na 37°C u atmosferi od 5% CO2. siRNK su testirane u finalnim koncentracijama od 500nM i 10nM.
Ukupna izolacija RNK pomoću DYNABEADS mRNK izolacionog kompleta (Invitrogen, part #: 610-12)
[0507] Ćelije se sakupljaju i liziraju u 150μl pufera za vezivanje/lizu, i zatim se mešaju 5 minuta na 850rpm koristeći Eppendorf Thermomixer (brzina mešanja je bila ista tokom čitavog procesa). Deset mikrolitara magnetnih perli i 80 μl mešavine za lizu/vezivanje su dodati u ploču sa okruglim dnom i mešani 1 minut. Magnetne perle su zarobljene magnetnim postoljem i supernatant je uklonjen bez ometanja perli. Nakon uklanjanja supernatanta, lizirane ćelije su dodate u preostale perle i pomešane 5 minuta. Nakon uklanjanja supernatanta, magnetne perle su isprane 2 puta sa 150μl puferom za ispiranje A i pomešane 1 minut. Perle su ponovo zarobljene i supernatant je uklonjen. Perle su zatim isprane sa 150μl pufera za ispiranje B, zarobljene i supernatant je uklonjen. Perle su nakon toga isprane sa 150μl pufera za eluiranje, zarobljene i supernatant uklonjeni. Perlama je ostavljeno da se osuše 2 minuta. Posle sušenja dodato je 50μl pufera za eluiranje i mešano je 5 minuta na 70°C. Perle su uhvaćene na magnetu 5 minuta. Pedeset μl supernatanta je uklonjeno i dodato u drugu ploču sa 96 komorica.
[0508] U formatu sa 384 komorica, ćelije su lizirane u toku jednog minuta dodavanjem 50μl pufera za lizu/vezivanje. Korišćene su dve μl magnetne perle po komorici. Potrebna zapremina perli je bila alikotirana, uhvaćena na magnetnom postolju, a rastvor za skladištenje perli je uklonjen. Perle su zatim resuspendovane u potrebnoj zapremini pufera za lizu/vezivanje (25μl po komorici) i 25μl suspenzije perli je dodato u lizirane ćelije. Smeša liziranih perli je inkubirana 10 minuta na VibraTransaltoru u postavci # 7 (UnionScientific Corp., Randallstown, MD). Posle toga, perle su zarobljene korišćenjem magnetnog postolja, supernatant je uklonjen, i perle su jednom isprane sa 90 μl pufera A, nakon čega su sledili pojedinačni koraci pranja sa 90 μl pufera B i 100 μl pufera za eluiranje. Perle su natopljene u svakom puferu za pranje u trajanju od ~ 1 minuta (bez mešanja). Posle završnog perioda pranja, perle su resuspendovane u 15μl puferu za eluiranje tokom 5 minuta na 70°C, nakon čega sledi uzimanje perli i uklanjanje supernatanta (do 8μl) za sintezu cDNK i/ili prečišćeno skladištenje RNK (-20°C).
PCR u realnom vremenu
[0509] Dva μl cDNK su dodati u glavnu mešavinu koja sadrži 0,5μl GAPDH TaqMan Probe (Applied Biosystems Cat # 4326317E), 0,5μl SERPINA1 TaqMan Probe (Applied Biosystems cat # Hs00165475_m1) za Hep3B eksperimente ili sa prilagođenim testovima GAPDH i SERPINA1 TaqMan za PCH eksperimente i 5μl Lightcycler 480 probe master mix (Roche Cat # 04887301001) po komorici u 384 komorične ploče (Roche cat # 04887301001). PCR u realnom vremenu je urađeno u Roche LC480 Real Time PCR sistemu (Roche). Svaki dupleks je testiran u najmanje dve nezavisne transfekcije sa po dva biološka replikata, i svaka transfekcija je analizirana u duplikatu.
[0510] Kako bi se izračunao relativni stepen promene, u realnom vremenu se analiziraju podaci korišćenjem ΔΔCt postupka i normalizuju se na testove izvedene pomoću ćelija transfektovanih sa 10nM AD-1955, ili lažno transfektovanih ćelija. Za analizu slobodnog uzimanja podaci su normalizovani na PBS ili GalNAc-1955 (najveća koncentracija korišćena za eksperimentalna jedinjenja) tretiranim ćelijama. IC50su izračunate pomoću modela sa uklapanjem 4 parametra koristeći XLFit i normalizovane na ćelije transfektovane sa AD-1955 u istom opsegu doza, ili na sopstvenu najmanju dozu.
[0511] Smisao i antismisao sekvence od AD-1955 su: SMISAO: 5'-cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT-3'(SEQ ID NO: 33); i ANTISMISAO: 5'-UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT-3'(SEQ ID NO: 40).
[0512] Taqman prajmeri i sonde su kako sledi:
Cynomolgus Serpinal i Gapdh TaqMan prajmeri i sonde:
Serpinal: prednji prajmer: ACTAAGGTCTTCAGCAATGGG (SEQ ID NO:34); reverzni prajmer: GCTTCAGTCCCTTTCTCATCG (SEQ ID NO:35); Taqman sonda:
TGGTCAGCACAGCCTTATGCACG (SEQ ID NO:36)
Gapdh: prednji prajmer: GCATCCTGGGCTACACTGA (SEQ ID NO:37); reverzni prajmer: TGGGTGTCGCTGTTGAAGTC(SEQ ID NO:38); Taqman sonda:
CCAGGTGGTCTCCTCC (SEQ ID NO:39)
Tabela B: Skraćenice nukleotidnih monomera korišćene u predstavljenoj sekvenci nukleinske kiseline.
14
Primer 1. Sinteza GalNAc-konjugovanih oligonukleotida
[0513] Niz siRNK dupleksa koji obuhvataju sekvencu Serpina1 mRNK su dizajnirani, sintetisani i konjugovani sa trivalentnim GalNAc na 3-kraju smisao lanca korišćenjem gore opisanih tehnika. Sekvence ovih dupleksa prikazane su u Tabeli 1. Ove iste sekvence su takođe sintetisane različitim nukleotidnim modifikacijama i konjugovane sa trivalentnim GalNAc. Sekvence modifikovanih dupleksa prikazane su u Tabeli 2.
eencekv nes aovik odifel napin Ser .1elaab T
Primer 2. In Vitro i in Vivo skrining.
[0514] Podgrupa ovih dupleksa procenjena je za efikasnost u ispitivanjima pojedinačnih doza kao što je gore opisano. U Tabeli 3 prikazani su rezultati skrininga pojedinačne doze u primarnim mišjim hepatocitima (Hep3b) transfektovanim sa indikovanim GalNAC konjugovanim modifikovanim iRNK, i rezultati skrininga slobodnog uzimanja pojedinačne doze kod primarnih Cynomolgous hepatocita sa indikovanim GalNAC konjugovanim modifikovanim iRNK . Podaci su izraženi kao deo preostale poruke u odnosu na ćelije tretirane sa AD-1955, ne-ciljajuću kontrolu za Hep3B eksperimente, ili relativno za naivne ćelije za PCH eksperimente.
Tabela 3. Skrining serpinal efikasnosti slobodnim uzimanjem u primarne Hep3b ćelije i u primarne hepatocite Cynomolgous majmuna (PCH).
1
[0515] IC50vrednosti za odabrane duplekse transfekcijom u primarnom Hep3Bare prikazane su u Tabeli 4.
1
Table 4. Serpinal IC50vrednosti za odabrane duplekse transfekcijom u Hep3B ljudsku ćeljsku liniju.
[0516] Procenjen je podskup ovih dupleksa za in vivo efikasnost kod transgenih miševa koji eksprimiraju Z-AAT oblik ljudskog Serpinal (pogledati, npr., Dycaico, i dr. (1988) Science 242:1409-12; Carlson, i dr. (1989) J Clin Invest 83:1183-90; Perfumo, i dr. (1994) Ann Hum Genet. 58:305-20. Ovo je utvrđeni model bolesti jetre povezanih sa nedostatkom AAT.
Ukratko, transgeni miševi su injektirani potkožno sa jednom dozom od 20 mg/kg iRNK navedenih u Tabeli 5 na dan 0. Serum je prikupljen na dane -10, -5, 0, 3, 5, 7, 10 i 17 i količina Serpinal proteina u krvi je određena pomoću ELISA testa specifičnog za čoveka. Rezultati ovih analiza su prikazani na Slici 1. Kao što je prikazano na Slici 1, AD-58681-6PS je bio najefikasniji u smanjenju nivoa Serpinal proteina u serumu kod ovih miševa.
Tabela 5.
1
Primer 3. Efikasnost si-AAT kod transgenih miševa.
[0517] Pet siRNK dupleksa, kako je opisano u prethodnim primerima, sa niskim IC50 vrednostima su testirani in vivo za efikasnost. siRNK dupleksi su injektirani u količini od 10 mg/kg u transgene miševe koji su eksprimirali ljudski Z-AAT alel, uspostavljen model bolesti jetre povezanih sa nedostatkom AAT. Miševi su dozirani na dan 0, a ljudski AAT u serumu je praćen 21 dan nakon doziranja (Slika 2A). Svaka tačka predstavlja prosek od tri miša i stubići za greške predstavljaju standardnu devijaciju. Miševi su žrtvovani 21. dan, i njihove jetre su obrađeni kako bi se izmerili mRNK nivoi. Grafikon pokazuje hAAT mRNK normalizovan do GAPDH za svaku grupu (Slika 2B). Stubići predstavljaju prosek, a stubići greška predstavljaju standardnu devijaciju. Kao što je prikazano na slikama 2A i 2B, AD59054 je bio najefikasniji u smanjenju nivoa hAAT mRNK kod miševa.
Primer 4. Trajna supresija AAT na način koji odgovara dozi.
[0518] Efikasnost siRNK dupleksa AD-59054 u transgenom životinjskom modelu bolesti jetre povezanih sa nedostatkom AAT merena je primenom različitih doza siRNK dupleksa AD-59054 potkožno. Serum je uzet u različitim vremenskim intervalima za merenje nivoa hAAT proteina u serumu korišćenjem ELISA specifičnog za ljudski AAT. Kriva efikasnosti pokazuje maksimalan knock-down postignut u različitim dozama testiranim kod miševa prikazana je na Slici 3A. Svaka tačka je prosek tri životinje, a stubići greške predstavljaju standardnu devijaciju. Trajanje knock-downa nakon jedne doze AAT siRNK na 0,3, 1, 3 ili 10 mg/kg je prikazano na Slici 3B. Svaka tačka podataka je prosek od tri životinje, a stubići greška predstavljaju standardnu devijaciju. Nivoi hAAT su normalizovani kao prosek od tri pred-krvarenja za svaku životinju. siRNK je primenjena u PBS, pa grupa PBS služi kao kontrola koja odražava varijabilnost nivoa hAAT u serumu. Potkožna primena siRNK AAT
1
dovela je do zavisnosti od zavisnosti od inhibicije serumskog hATT, sa maksimalnom inhibicijom od> 95% primećenom u dozi od 3 mg/kg. Jedna doza od 1 mg/kg održala je 40% nivoa hAAT najmanje 15 dana. Životinjama je takođe primenjivan AD-59054 u dozi od 0,5 mg/kg dva puta nedeljno (Slika 3C). Ponovljeno doziranje dovodi do kumulativnog odgovora i preko 90% supresije proteina. Svaka tačka podataka je u proseku četiri životinje, a stubići greška predstavljaju standardnu devijaciju.
Primer 5. Smanjena incidenci tumora sa redukcijom u Z-AAT.
[0519] Transgeni miševi koji eksprimiraju ljudski Z-AAT razvijaju tumore sa starenjem. Ovaj eksperiment je dizajniran da odredi da li hronično doziranje ovih starih miševa sa siRNK pronalaska može smanjiti incidenciju tumora kod miševa. Konkretno, stari miševi (25-46 nedelje stari) sa fibrotskom jetrom su hronično dozirani siRNK dupleksom AD-58681 kako bi se smanjila incidencija tumora jetre. Životinje su potkožno dozirane jednom svake druge nedelje (Q2W) sa PBS ili 10 mg/kg AAT siRNK tokom 11 doza i žrtvovane 7 dana nakon poslednje doze (Slika 4A). Izmereni su nivoi u jetri hAAT mRNK, Col1a2 mRNK i PtPrc mRNK u kontrolnim i tretiranim grupama. AAT siRNK tretirane životinje su pokazale smanjenje hAAT mRNK nivoa veće od 90% (Slika 4B). Col1a2 mRNK je meren kao marker fibroze, a nivoi ovog markera su smanjeni u AAT siRNK tretiranim životinjama (Slika 4C). PtPrc (CD45) mRNK je meren kao marker za prisustvo imunih ćelija (Slika 4D). Ima više infiltracije imunih ćelija kod obolelih jetri i, kao što je prikazano na Slici 4D, nivoi mRNK PtPrc značajno su se smanjivali kada su životinje tretirane sa AAT siRNK.
[0520] Uzorci seruma su sakupljeni nakon prve doze kako bi se nadgledao stepen supresije AAT. Sve ATC siRNK tretirane životinje pokazale su manje od 5% rezidualnog AAT proteina i jedna doza je održavala nivo AAT ispod 80% tokom 14 dana pre nego što je primljena sledeća doza (Slika 5A). Tabela 6 daje zapažanja od životinja u vreme žrtvovanja (dan 132). Transgene životinje kojima je primenjen siRNK dupleks pokazale su smanjenu incidenciju tumora u poređenju sa netretiranim kontrolnim životinjama. Konkretno, četiri od šest životinja tretiranih sa PBS pokazale su tumore u jetri, dok je samo jedan od šest životinja tretirana sa AAT siRNK imala tumor jetre. Vrednost p za razliku u učestalosti tumora izračunata je t-testom od 0,045. Slika 5B i Slika 5C prikazuju PAS bojenje delova jetre od dve životinje iz istog legla tretirane ili sa PBS ili sa AAT siRNK. Tamnije boje predstavljaju globule ili Z-AAT agregate. Ovi podaci ukazuju na to da je siRNK dupleks efikasan kod
1
smanjenja nivoa Z-AAT kod transgenih miševa, a smanjeni nivoi Z-AAT pokazuju fiziološku korist u obliku zdravije jetre.
Tabela 6.
Primer 6. Optimizacija AD-59054
[0521] Kao što je gore opisano, dokazano je da je AD-59054 trajno potiskivao AAT na način koji odgovara dozi in vivo. Međutim, nukleotidna sekvenca AD-59054 obuhvata regiju u mRNI AAT koja uključuje prevladavajući pojedinačni nukleotidni polimorfizam (SNP) (Referentni SNP Accession No.: rs1303 (pogledati, npr., www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP)). Konkretno, lokacija SNP odgovara nukleotidu na položaju 6 (5' do 3') u antismisao lancu AD-59054 (tj., unutar semenske regije AD-59054). Shodno tome, kako neusklađenosti unutar semenske regije može dovesti do efekta osim ciljanja i/ili gubitka efikasnosti, dodatni dupleksi različitih baza na položaju 6 (5' do 3') antismisao lanca su pripremljeni na osnovu sekvence AD- 59054. Ciljana mRNK nosi A koji odgovaraju položaju 6 (5' do 3') antismisao lanca AD-59054. Sekvence ovih dupleksa su date
1 1
u Tabeli 7. Tabela 8 daje sekvence ovih istih dupleksa koje imaju različite hemijske modifikacije i konjugovane su sa trivalentnim GalNAc.
[0522] Ovi modifikovani dupleksi procenjeni su za efikasnost na skriningu za slobodno uzimanje pojedinačnih doza u primarnim mišjim hepatocitima (Hep3B), kako je gore opisano. mRNK Hep3B ćelije nosi C na položaju koja odgovara položaju 6 (5' do 3') antismisao lanca AD-59054. IC50vrednosti za dupleks su prikazane u Tabeli 8. Iznenađujuće, kao što je prikazano tamo, pojedinačna neusklađenost u semenskoj regiji na položaju 6 tolerisana je za sve baze izuzev C.
[0523] Podskup ovih dupleksa takođe je ocenjen za in vivo efikasnost. Transgeni miševi koji eksprimiraju ljudski Z-AAT alel (i imaju A u mRNK koja odgovara položaju 6 (5' do 3') antismisao lanca AD-59054) injektirani su sa 1,0 mg/kg AD-59054, AD -61719, AD-61700, AD-61726 ili AD-61704 na dan 0 i ljudskim AAT serumom, mereno kako je gore opisano, nakon 14 dana nakon doziranja (Slika 6). Svaka tačka predstavlja prosek od tri miša, a stubići greške predstavljaju standardnu devijaciju. Kao što je prikazano na Slici 6, AD-61719 i AD-61704 imaju efekat jednako dobar kao i matični AD-59054.
Tabela 7.
1 2
Primer 7. Vodeća optimizacija AD-59054
[0524] Dodatni dupleksi su pripremljeni na osnovu sekvence AD-59054, uključujući AD-61444. Modifikovana i nemodifikovana smisao i antismisao sekvenca AD-61444 su date u Tabeli 9..
Tabela 9.
1
8. la Tabe
Primer 8. DoziranjeAD-59054, AD-61719 i AD-61444 ne-ljudskim primatima [0525] AD-59054, AD-61719 i AD-61444 su testirani za efikasnost na primatima koji nisu čoveka primenom primatu jedne doze od 1 mg/kg ili 3 mg/kg AD-59054, AD-61719 ili AD-61444. Uzorci seruma su sakupljeni pet dana pre primene, na dan 0, i na danima 3, 7, 10, 15, 20 i 30 nakon primene kako bi se nadgledalo stepen supresije AAT merenjem nivoa u serumu hAAT proteina korišćenjem ELISA specifičnog za ljudski AAT. Nije bilo promena u nivoima citokina ili hemokina u serumu životinja kojim se daje bilo koje od jedinjenja, a reakcije na mestu infekcije ili zdravstveni problemi vezani za lekove nisu povezani sa primenom jedinjenja. Slika 7 pokazuje da pojedinačna doza od 1 mg/kg AD-59054, AD-61719 ili AD-61444 (7A) ili pojedinačna doza od 3 mg/kg AD-59054, AD-61719 ili AD-61444 (7B) rezultuju smanjenju AAT proteina koje je zavisno od doze i dugotrajno.
1
SPISAK SEKVENCI [0526]
1
�
�
1
1
11
12
1
14
�
1
�
1
�
1
11
12
�
14
�
1
�
1
1
1
11
��
1
14
1
1
1
1
�
2
21
22
�
24
�
2
�
2
�
21
21
21
21
21
21
21
22
22
22
22
22
22
22
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
24
24
24
24
24
24
24
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4

Claims (17)

Patentni zahtevi
1. Dvolančani RNKi agens za inhibiranje eksprimiranja Serpina1 u ćeliji, gde navedeni dvolančani RNKi agens obuhvata smisao lanac i antismisao lanac koji formiraju dvolančanu regiju,
gde navedeni smisao lanac obuhvata barem 15 susednih nukleotida koji se ne razlikuju po više od 3 nukleotida bilo koje nukleotidne sekvence od SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, ili SEQ ID NO:11, i navedeni antismisao lanac obuhvata barem 15 susednih nukleotida koji se ne razlikuju po više od 3 nukleotida bilo koje nukleotidne sekvence od SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, ili SEQ ID NO:25,
gde značajno svi nukleotidi navedenog smisao lanca sadrže modifikaciju izabranu iz grupe koju čine 2'-O-metil modifikacija i 2'-fluoro modifikacija,
gde navedeni smisao lanac obuhvata dve fosforotioatne internukleotidne veze na 5'-terminusu,
gde značajno svi nukleotidi navedenog antismisao lanca sadrže modifikaciju izabranu iz grupe koju čine 2'-O-metil modifikacija i 2'-fluoro modifikacija,
gde navedeni antismisao lanac obuhvata dve fosforotioatne internukleotidne veze na 5'-terminusu i dve fosforotioatne internukleotidne veze na 3'-terminusu,
gde je navedeni smisao lanac konjugovan za jedan ili više GalNAc derivat vezan kroz razgranati bivalentni ili trivalentni veznik na 3'-terminusu, gde „značajno svi“ nukleotidi su modifikovani znači da nema više od 5, 4, 3, 2 ili 1 nukleotida koji nisu modifikovani.
2. Dvolančani RNKi agens patentnog zahteva 1, gde je jedna od 3 razlike nukleotida u nukleotid sekvenci antismisao lanca neusklađen nukleotid u semenskoj regiji antismisao lanca.
3. Dvolančani RNKi agens patentnog zahteva 2, gde antismisao lanac obuhvata univerzalnu bazu na neusklađenom nukleotidu.
4. Dvolančani RNKi agens patentnog zahteva 1, gde svi nukleotidi navedenog smisao lanca i svi nukleotidi navedenog antismisao lanca sadrže modifikaciju.
5. In vitro ćelija koji sadrži dvolančani RNKi agens patentnog zahteva 1.
6. Farmaceutski sastav koji obuhvata dvolančani RNKi agens patentnog zahteva 1.
7. Farmaceutski sastav patentnog zahteva 6, gde RNKi agens koji treba da se primeni (a) u nepuferisanom rastvoru,
gde je navedeni nepuferisani rastvor poželjno fiziološki rastvor ili voda; ili
(b) sa puferisanim rastvorom,
gde navedeni puferisani rastvor poželjno obuhvata acetat, citrat, prolamin, karbonat, ili fosfat ili bilo koju njihovu kombinaciju, gde je posebno poželjno da je navedeni puferisani rastvor fosfatni puferisani rastvor (PBS).
8. Postupak inhibiranja eksprimiranja Serpinal u ćeliji, gde postupak obuhvata:
(a) dovođenje u dodir ćelije sa dvolančanim RNKi agensom patentnog zahteva 1 ili farmaceutskim sastavom patentnog zahteva 6 ili 7; i
(b) održavanje ćelije proizvedene u koraku (a) tokom vremena dovoljnog da se dobije degradacija mRNK transkripta Serpinal gena, čime se inhibiranja eksprimiranje Serpinal gena u ćeliji,
gde su isključeni postupci tretmana ljudskog ili životinjskog tela terapijom.
9. Postupak patentnog zahteva 8, gde je eksprimiranje Serpinal inhibirano za barem oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 98%, ili oko 100%.
10. Dvolančani RNKi agens patentnog zahteva 1, ili farmaceutski sastav patentnog zahteva 6 ili 7 za primenu u postupku tretmana pacijenta koji ima bolest povezanu sa Serpinal.
11. Dvolančani RNKi agens patentnog zahteva 1 ili farmaceutski sastav patentnog zahteva 6 ili 7 za primenu u postupku smanjenja akumuliranja nepravilno savijenog Serpinal u jetri pacijenta koji ima varijantu nedostatka Serpina1.
12. RNKi agens ili farmaceutski sastav za primenu patentnog zahteva 11, gde navedeni RNKi agens ili navedeni farmaceutski sastav treba da se primene potkožno.
11
13. RNKi agens ili farmaceutski sastav za primenu patentnog zahteva 12, gde (a) jedna od 3 razlike nukleotida u nukleotidnoj sekvenci antismisao lanca je neusklađen nukleotid u semenskoj regiji antismisao lanca,
gde poželjno antismisao lanac obuhvata univerzalnu bazu na neusklađenom nukleotidu; i/ili
(b) svi nukleotidi navedenog smisao lanca i svi nukleotidi navedenog antismisao lanca sadrže modifikaciju.
14. RNKi agens ili farmaceutski sastav za primenu bilo kog od patentnih zahteva 10 do 13, gde je pacijent primat, glodar, ili čovek.
15. RNKi agens ili farmaceutski sastav za primenu bilo kog od patentnih zahteva 10 do 14, gde dvolančani RNKi agens treba da se primeni pri dozi od oko 0,01 mg/kg do oko 10 mg/kg ili oko 0,5 mg/kg do oko 50 mg/kg, poželjno pri dozi od oko 10 mg/kg do oko 30 mg/kg.
16. RNKi agens ili farmaceutski sastav za primenu patentnog zahteva 15, gde navedeni RNKi agens treba da se primeni
(a) u dve ili više doza; i/ili
(b) dvaput nedeljno, svake druge nedelje, ili u intervalima izabranim iz grupe koju čine jednom svakih oko 12 sati, jednom svaka oko 24 sata, jednom svakih oko 48 sati, jednom svaka oko 72 sata, i jednom svakih oko 96 sati.
17. RNKi agens ili farmaceutski sastav za primenu patentnog zahteva 15, gde dvolančani RNKi agens treba da se primeni potkožno ili intravenozno.
12
RS20180778A 2013-05-22 2014-05-22 Serpina1 irnk sastavi i postupci njihove primene RS57418B1 (sr)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361826125P 2013-05-22 2013-05-22
US201361898695P 2013-11-01 2013-11-01
US201461979727P 2014-04-15 2014-04-15
US201461989028P 2014-05-06 2014-05-06
PCT/US2014/039109 WO2014190137A1 (en) 2013-05-22 2014-05-22 SERPINA1 iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
EP14730051.1A EP2999785B1 (en) 2013-05-22 2014-05-22 Serpina1 irna compositions and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS57418B1 true RS57418B1 (sr) 2018-09-28

Family

ID=51934144

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180778A RS57418B1 (sr) 2013-05-22 2014-05-22 Serpina1 irnk sastavi i postupci njihove primene

Country Status (33)

Country Link
US (5) US9574192B2 (sr)
EP (2) EP3412774A1 (sr)
JP (3) JP6495250B2 (sr)
KR (3) KR102463973B1 (sr)
CN (2) CN113018307A (sr)
AU (2) AU2014268509B2 (sr)
BR (1) BR112015029139B1 (sr)
CA (1) CA2912826A1 (sr)
CL (1) CL2015003441A1 (sr)
CY (1) CY1122159T1 (sr)
DK (1) DK2999785T3 (sr)
DO (1) DOP2015000288A (sr)
EA (1) EA038792B1 (sr)
ES (1) ES2676146T3 (sr)
GT (1) GT201500330A (sr)
HR (1) HRP20181030T1 (sr)
HU (1) HUE038146T2 (sr)
IL (3) IL242637B (sr)
LT (1) LT2999785T (sr)
MX (2) MX379208B (sr)
MY (1) MY176712A (sr)
PE (2) PE20160030A1 (sr)
PL (1) PL2999785T3 (sr)
PT (1) PT2999785T (sr)
RS (1) RS57418B1 (sr)
RU (1) RU2015154721A (sr)
SG (3) SG10201913872XA (sr)
SI (1) SI2999785T1 (sr)
SM (1) SMT201800403T1 (sr)
TW (2) TW201936624A (sr)
UY (2) UY40064A (sr)
WO (1) WO2014190137A1 (sr)
ZA (1) ZA201509252B (sr)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HK1200191A1 (en) 2011-11-18 2015-07-31 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified rnai agents
EP3412774A1 (en) 2013-05-22 2018-12-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serpina1 irna compositions and methods of use thereof
PL3444350T3 (pl) 2013-07-03 2022-03-21 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Sposoby i kompozycje do specyficznego hamowania alfa-1 antytrypsyny przez dwuniciowy rna
MX382901B (es) 2014-05-22 2025-03-13 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones de angiotensinogeno (agt) arni y métodos de uso de las mismas.
TW201620526A (zh) * 2014-06-17 2016-06-16 愛羅海德研究公司 用於抑制α－１抗胰蛋白酶基因表現之組合物及方法
IL316808A (en) 2014-08-20 2025-01-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Modified double-stranded RNA materials and their uses
WO2016037161A2 (en) 2014-09-07 2016-03-10 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions for attenuating gene editing anti-viral transfer vector immune responses
CA2968336C (en) * 2014-12-17 2021-11-23 Proqr Therapeutics Ii B.V. Construct for site directed editing of an adenosine nucleotide in target rna
EP3292201A2 (en) * 2015-05-06 2018-03-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Factor xii (hageman factor) (f12), kallikrein b, plasma (fletcher factor) 1 (klkb1), and kininogen 1 (kng1) irna compositions and methods of use thereof
KR20210157474A (ko) 2015-12-07 2021-12-28 젠자임 코포레이션 Serpinc1-연관 장애의 치료를 위한 방법 및 조성물
WO2018013912A1 (en) * 2016-07-15 2018-01-18 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Anti-arid3a treatments for inflammatory disorders
CN117757791A (zh) * 2016-11-23 2024-03-26 阿尔尼拉姆医药品有限公司 具有降低的脱靶效应的修饰的rna试剂
TW202313978A (zh) 2016-11-23 2023-04-01 美商阿尼拉製藥公司 絲胺酸蛋白酶抑制因子Ａ１ ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
WO2018102397A1 (en) 2016-11-29 2018-06-07 PureTech Health LLC Exosomes for delivery of therapeutic agents
MX2019008252A (es) 2017-01-10 2019-09-06 Arrowhead Pharmaceuticals Inc Agentes de interferencia de acido ribonucleico (iarn) de alfa-1 antitripsina (aat), composiciones que incluyen agentes de iarn aat y metodos de uso.
EP3600345A4 (en) 2017-03-29 2021-01-06 Cornell University OXIDATION-RESISTANT AAT GENE THERAPY
AU2018347583A1 (en) 2017-10-13 2020-05-21 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions for attenuating anti-viral transfer vector IgM responses
WO2019100039A1 (en) * 2017-11-20 2019-05-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serum amyloid p component (apcs) irna compositions and methods of use thereof
TWI851574B (zh) * 2018-05-14 2024-08-11 美商阿尼拉製藥公司 血管收縮素原（ＡＧＴ）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
US12428684B2 (en) * 2018-07-05 2025-09-30 Active Genomes Expressed Diagnostics Corp Methods for detecting and treating a tumorigenic phenotype of the liver
AU2020279101B2 (en) * 2019-05-17 2025-07-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oral delivery of oligonucleotides
WO2020243261A1 (en) 2019-05-28 2020-12-03 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions for attenuated anti-viral transfer vector immune response
WO2021150969A1 (en) * 2020-01-24 2021-07-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. LEUCINE-RICH REPEAT KINASE 2 (LRRK2) iRNA AGENT COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
US20230257745A1 (en) * 2020-07-10 2023-08-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Circular siRNAs
WO2023282704A1 (ko) * 2021-07-08 2023-01-12 올릭스 주식회사 Marc1 유전자를 표적으로 하는 rnai 제제 및 이의 용도
CN117897483A (zh) * 2021-08-25 2024-04-16 戴瑟纳制药公司 用于抑制α-1抗胰蛋白酶表达的组合物和方法
WO2023064367A1 (en) 2021-10-12 2023-04-20 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions for attenuating anti-viral transfer vector igm responses
WO2023172624A1 (en) 2022-03-09 2023-09-14 Selecta Biosciences, Inc. Immunosuppressants in combination with anti-igm agents and related dosing
WO2025219443A1 (en) * 2024-04-19 2025-10-23 Uniqure Biopharma B.V. Nucleic acid for a1at regulation

Family Cites Families (258)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US564562A (en) 1896-07-21 Joseph p
US513030A (en) 1894-01-16 Machine for waxing or coating paper
US1861608A (en) 1929-12-21 1932-06-07 Emerson Electric Mfg Co Fan and means for directing the air current therethrough
US1861108A (en) 1930-01-24 1932-05-31 Eugene O Brace Integral clutch and transmission control
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US3974808A (en) 1975-07-02 1976-08-17 Ford Motor Company Air intake duct assembly
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
US4708708A (en) 1982-12-06 1987-11-24 International Paper Company Method and apparatus for skiving and hemming
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
EP0366685B1 (en) 1987-06-24 1994-10-19 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Nucleoside derivatives
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
WO1989009221A1 (en) 1988-03-25 1989-10-05 University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
FR2645866B1 (fr) 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
NL8901881A (nl) 1989-07-20 1991-02-18 Rockwool Grodan Bv Drainagekoppelelement.
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
EP0497875B1 (en) 1989-10-24 2000-03-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2' modified oligonucleotides
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
CA2029273A1 (en) 1989-12-04 1991-06-05 Christine L. Brakel Modified nucleotide compounds
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US7037646B1 (en) 1990-01-11 2006-05-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5852188A (en) 1990-01-11 1998-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US6783931B1 (en) 1990-01-11 2004-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
WO1991013080A1 (en) 1990-02-20 1991-09-05 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
DE69032425T2 (de) 1990-05-11 1998-11-26 Microprobe Corp., Bothell, Wash. Teststreifen zum Eintauchen für Nukleinsäure-Hybridisierungsassays und Verfahren zur kovalenten Immobilisierung von Oligonucleotiden
US5981276A (en) 1990-06-20 1999-11-09 Dana-Farber Cancer Institute Vectors containing HIV packaging sequences, packaging defective HIV vectors, and uses thereof
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
EP0544824B1 (en) 1990-07-27 1997-06-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
ES2083593T3 (es) 1990-08-03 1996-04-16 Sterling Winthrop Inc Compuestos y metodos para inhibir la expresion de genes.
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
JPH06505704A (ja) 1990-09-20 1994-06-30 ギリアド　サイエンシズ，インコーポレイテッド 改変ヌクレオシド間結合
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
CA2095212A1 (en) 1990-11-08 1992-05-09 Hybridon, Inc. Incorporation of multiple reporter groups on synthetic oligonucleotides
GB9100304D0 (en) 1991-01-08 1991-02-20 Ici Plc Compound
US7015315B1 (en) 1991-12-24 2006-03-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligonucleotides
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
US5283185A (en) 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
ES2103918T3 (es) 1991-10-17 1997-10-01 Ciba Geigy Ag Nucleosidos biciclicos, oligonucleotidos, procedimiento para su obtencion y productos intermedios.
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
DE69233087T2 (de) 1991-11-22 2003-12-24 Affymetrix, Inc. (N.D.Ges.D.Staates Delaware) Verfahren zur Herstellung von Polymerarrays
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US6235887B1 (en) 1991-11-26 2001-05-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation directed by oligonucleotides containing modified pyrimidines
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US6277603B1 (en) 1991-12-24 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
EP1044987B1 (en) 1991-12-24 2006-02-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped 2'-modified oligonucleotides
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
DE4203923A1 (de) 1992-02-11 1993-08-12 Henkel Kgaa Verfahren zur herstellung von polycarboxylaten auf polysaccharid-basis
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
CA2134773A1 (en) 1992-06-04 1993-12-09 Robert J. Debs Methods and compositions for in vivo gene therapy
WO1994000569A1 (en) 1992-06-18 1994-01-06 Genpharm International, Inc. Methods for producing transgenic non-human animals harboring a yeast artificial chromosome
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
WO1994002595A1 (en) 1992-07-17 1994-02-03 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for treatment of animal diseases
US6346614B1 (en) 1992-07-23 2002-02-12 Hybridon, Inc. Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US5783701A (en) 1992-09-08 1998-07-21 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Sulfonamide inhibitors of aspartyl protease
JPH08503855A (ja) 1992-12-03 1996-04-30 ジェンザイム・コーポレイション 嚢胞性線維症に対する遺伝子治療
US5478745A (en) 1992-12-04 1995-12-26 University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
EP0685234B1 (en) 1993-02-19 2000-05-10 Nippon Shinyaku Company, Limited Drug composition containing nucleic acid copolymer
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
AU6449394A (en) 1993-03-30 1994-10-24 Sterling Winthrop Inc. Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them
AU6412794A (en) 1993-03-31 1994-10-24 Sterling Winthrop Inc. Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
US6191105B1 (en) 1993-05-10 2001-02-20 Protein Delivery, Inc. Hydrophilic and lipophilic balanced microemulsion formulations of free-form and/or conjugation-stabilized therapeutic agents such as insulin
US5955591A (en) 1993-05-12 1999-09-21 Imbach; Jean-Louis Phosphotriester oligonucleotides, amidites and method of preparation
US6015886A (en) 1993-05-24 2000-01-18 Chemgenes Corporation Oligonucleotide phosphate esters
US6294664B1 (en) 1993-07-29 2001-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of oligonucleotides
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
JPH09507836A (ja) 1993-11-16 1997-08-12 ジンタ・インコーポレイテッド 非ホスホネート・ヌクレオシジル間結合と混合したキラリティー的に純粋なホスホネート・ヌクレオシジル間結合を有する合成オリゴマー
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5599922A (en) 1994-03-18 1997-02-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide N3'-P5' phosphoramidates: hybridization and nuclease resistance properties
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US6054299A (en) 1994-04-29 2000-04-25 Conrad; Charles A. Stem-loop cloning vector and method
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5543152A (en) 1994-06-20 1996-08-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US6608035B1 (en) 1994-10-25 2003-08-19 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US5665557A (en) 1994-11-14 1997-09-09 Systemix, Inc. Method of purifying a population of cells enriched for hematopoietic stem cells populations of cells obtained thereby and methods of use thereof
US6166197A (en) 1995-03-06 2000-12-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds having pyrimidine nucleotide (S) with 2'and 5 substitutions
ATE327244T1 (de) 1995-03-06 2006-06-15 Isis Pharmaceuticals Inc Verfahren zur synthese von 2'-0-substituierten pyrimidinen und oligomere davon
JPH11508231A (ja) 1995-05-26 1999-07-21 ソマティックス セラピー コーポレイション 安定な脂質／核酸複合体を含む送達ビヒクル
US5545531A (en) 1995-06-07 1996-08-13 Affymax Technologies N.V. Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays
ATE285477T1 (de) 1995-06-07 2005-01-15 Inex Pharmaceutical Corp Herstellung von lipid-nukleinsäure partikeln duch ein hydrophobische lipid-nukleinsäuree komplexe zwischenprodukt und zur verwendung in der gentransfer
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US5858397A (en) 1995-10-11 1999-01-12 University Of British Columbia Liposomal formulations of mitoxantrone
EP0857217B1 (en) 1995-10-16 2005-04-13 Dana-Farber Cancer Institute Novel expression vectors and methods of use
US6160109A (en) 1995-10-20 2000-12-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Preparation of phosphorothioate and boranophosphate oligomers
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
US5858401A (en) 1996-01-22 1999-01-12 Sidmak Laboratories, Inc. Pharmaceutical composition for cyclosporines
US5994316A (en) 1996-02-21 1999-11-30 The Immune Response Corporation Method of preparing polynucleotide-carrier complexes for delivery to cells
US6444423B1 (en) 1996-06-07 2002-09-03 Molecular Dynamics, Inc. Nucleosides comprising polydentate ligands
CA2264592C (en) * 1996-08-27 2012-02-21 University Of Utah Research Foundation Bioconjugates and delivery of bioactive agents
US6576752B1 (en) 1997-02-14 2003-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy functionalized oligomers
US6639062B2 (en) 1997-02-14 2003-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy-modified nucleosidic compounds and oligomeric compounds prepared therefrom
US6172209B1 (en) 1997-02-14 2001-01-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Aminooxy-modified oligonucleotides and methods for making same
US6034135A (en) 1997-03-06 2000-03-07 Promega Biosciences, Inc. Dimeric cationic lipids
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
EP1012331B1 (en) 1997-07-01 2006-03-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the delivery of oligonucleotides via the alimentary canal
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6617438B1 (en) 1997-11-05 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. Oligoribonucleotides with enzymatic activity
US6528640B1 (en) 1997-11-05 2003-03-04 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Synthetic ribonucleic acids with RNAse activity
US6320017B1 (en) 1997-12-23 2001-11-20 Inex Pharmaceuticals Corp. Polyamide oligomers
US6436989B1 (en) 1997-12-24 2002-08-20 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Prodrugs of aspartyl protease inhibitors
AP2000001856A0 (en) 1997-12-24 2000-09-30 Vertex Pharma Prodrugs of aspartyl protease inhibitors.
US7273933B1 (en) 1998-02-26 2007-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for synthesis of oligonucleotides
US7045610B2 (en) 1998-04-03 2006-05-16 Epoch Biosciences, Inc. Modified oligonucleotides for mismatch discrimination
US6531590B1 (en) 1998-04-24 2003-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Processes for the synthesis of oligonucleotide compounds
US6867294B1 (en) 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
WO2000003683A2 (en) 1998-07-20 2000-01-27 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal encapsulated nucleic acid-complexes
AU6298899A (en) 1998-10-09 2000-05-01 Ingene, Inc. Production of ssdna (in vivo)
AU6430599A (en) 1998-10-09 2000-05-01 Cytogenix, Inc. Enzymatic synthesis of ssdna
US6465628B1 (en) 1999-02-04 2002-10-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for the synthesis of oligomeric compounds
US6319946B1 (en) 1999-02-12 2001-11-20 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of aspartyl protease
JP2002537343A (ja) 1999-02-23 2002-11-05 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド 多重粒子製剤
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
AU776362B2 (en) 1999-05-04 2004-09-09 Roche Innovation Center Copenhagen A/S L-ribo-LNA analogues
US6593466B1 (en) 1999-07-07 2003-07-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Guanidinium functionalized nucleotides and precursors thereof
US6147200A (en) 1999-08-19 2000-11-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers
WO2001053307A1 (en) 2000-01-21 2001-07-26 Geron Corporation 2'-arabino-fluorooligonucleotide n3'→p5'phosphoramidates: their synthesis and use
IT1318539B1 (it) 2000-05-26 2003-08-27 Italfarmaco Spa Composizioni farmaceutiche a rilascio prolungato per lasomministrazione parenterale di sostanze idrofile biologicamente
ATE325806T1 (de) 2000-10-04 2006-06-15 Santaris Pharma As Verbesserte synthese von purin-blockierten nukleinsäure-analoga
WO2005078097A2 (en) 2004-02-10 2005-08-25 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING MULTIFUNCTIONAL SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (Multifunctional siNA)
WO2003015698A2 (en) 2001-08-13 2003-02-27 University Of Pittsburgh Application of lipid vehicles and use for drug delivery
US20050137153A1 (en) * 2002-02-20 2005-06-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of alpha-1 antitrypsin (AAT) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US8101348B2 (en) 2002-07-10 2012-01-24 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. RNA-interference by single-stranded RNA molecules
US6878805B2 (en) 2002-08-16 2005-04-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide-conjugated oligomeric compounds
WO2006006948A2 (en) 2002-11-14 2006-01-19 Dharmacon, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY
US8090542B2 (en) 2002-11-14 2012-01-03 Dharmacon Inc. Functional and hyperfunctional siRNA
US9839649B2 (en) * 2002-11-14 2017-12-12 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
DK1661905T3 (da) 2003-08-28 2012-07-23 Takeshi Imanishi Hidtil ukendte syntetiske nukleinsyrer af N-O-krydsbindingstype
US8053232B2 (en) 2004-01-23 2011-11-08 Virxsys Corporation Correction of alpha-1-antitrypsin genetic defects using spliceosome mediated RNA trans splicing
AU2005248147A1 (en) 2004-05-11 2005-12-08 Alphagen Co., Ltd. Polynucleotides for causing RNA interference and method for inhibiting gene expression using the same
JP2008516996A (ja) * 2004-10-19 2008-05-22 レプリコール インコーポレーティッド 抗ウイルス性オリゴヌクレオチド
JP2008537551A (ja) 2005-03-31 2008-09-18 カランド ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド リボヌクレオチドレダクターゼサブユニット２の阻害剤およびその使用
CA2640171C (en) 2006-01-27 2014-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-modified bicyclic nucleic acid analogs
EP1989307B1 (en) 2006-02-08 2012-08-08 Quark Pharmaceuticals, Inc. NOVEL TANDEM siRNAS
KR101221589B1 (ko) 2006-04-07 2013-01-15 이데라 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 Ｔｌｒ７ 및 ｔｌｒ８에 대한 안정화된 면역 조절성 ｒｎａ〔ｓｉｍｒａ〕 화합물
EP2695608B1 (en) 2006-10-03 2016-11-23 Arbutus Biopharma Corporation Lipid containing formulations
JP5737937B2 (ja) 2007-07-09 2015-06-17 イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッドＩｄｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 安定化免疫調節ｒｎａ（ｓｉｍｒａ）化合物
CA2910760C (en) * 2007-12-04 2019-07-09 Muthiah Manoharan Targeting lipids
WO2009134487A2 (en) * 2008-01-31 2009-11-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Optimized methods for delivery of dsrna targeting the pcsk9 gene
WO2009142822A2 (en) 2008-03-26 2009-11-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 2-f modified rna interference agents
CA2721333C (en) 2008-04-15 2020-12-01 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
DK2341943T3 (en) * 2008-09-22 2019-02-25 Dicerna Pharmaceuticals Inc COMPOSITIONS AND METHODS OF SPECIFIC INHIBITION OF DSRNA REPRINT WITH MODIFICATIONS
CN102325534B (zh) 2008-12-18 2016-02-17 戴瑟纳制药公司 延长的dicer酶底物和特异性抑制基因表达的方法
WO2010141511A2 (en) 2009-06-01 2010-12-09 Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. Polynucleotides for multivalent rna interference, compositions and methods of use thereof
CA2764609C (en) 2009-06-10 2018-10-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Improved cationic lipid of formula i
KR20120050429A (ko) * 2009-06-15 2012-05-18 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 Ｐｃｓｋ9 유전자를 표적으로 하는 지질 제형된 ｄｓｒｎａ
US9512164B2 (en) 2009-07-07 2016-12-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide end caps
HRP20150566T1 (hr) 2009-08-27 2015-07-17 Idera Pharmaceuticals, Inc. Kompozicija za inhibiciju ekspresije gena i njegova upotreba
EP2723390B1 (en) 2011-06-23 2017-12-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serpina1 sirnas: compositions of matter and methods of treatment
TWI484183B (zh) * 2011-09-01 2015-05-11 國立成功大學 癌症轉移之評估方法及生物標記、及抑制癌症轉移之ｓｉＲＮＡ化合物
WO2013142514A1 (en) 2012-03-19 2013-09-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for modulating alpha-1-antitrypsin expression
BR112014028644A2 (pt) * 2012-05-16 2017-08-15 Rana Therapeutics Inc Composições e métodos para modulação da expressão de atp2a2
EP3412774A1 (en) 2013-05-22 2018-12-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serpina1 irna compositions and methods of use thereof
PL3444350T3 (pl) 2013-07-03 2022-03-21 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Sposoby i kompozycje do specyficznego hamowania alfa-1 antytrypsyny przez dwuniciowy rna
IL316808A (en) 2014-08-20 2025-01-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Modified double-stranded RNA materials and their uses
TW202313978A (zh) 2016-11-23 2023-04-01 美商阿尼拉製藥公司 絲胺酸蛋白酶抑制因子Ａ１ ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
MX2019008252A (es) 2017-01-10 2019-09-06 Arrowhead Pharmaceuticals Inc Agentes de interferencia de acido ribonucleico (iarn) de alfa-1 antitripsina (aat), composiciones que incluyen agentes de iarn aat y metodos de uso.
US10799808B2 (en) 2018-09-13 2020-10-13 Nina Davis Interactive storytelling kit

Also Published As

Publication number Publication date
UY35582A (es) 2014-10-31
KR20210110397A (ko) 2021-09-07
PE20210921A1 (es) 2021-05-19
LT2999785T (lt) 2018-07-25
KR102463973B1 (ko) 2022-11-07
IL242637B (en) 2019-12-31
SG10201804472YA (en) 2018-07-30
AU2014268509B2 (en) 2020-10-01
EP3412774A1 (en) 2018-12-12
US20180346910A1 (en) 2018-12-06
EP2999785B1 (en) 2018-04-04
TW201936624A (zh) 2019-09-16
KR20160011660A (ko) 2016-02-01
HUE038146T2 (hu) 2018-09-28
SMT201800403T1 (it) 2018-09-13
MY176712A (en) 2020-08-19
IL270666B (en) 2021-07-29
JP2019107029A (ja) 2019-07-04
US20210317452A1 (en) 2021-10-14
PE20160030A1 (es) 2016-02-14
EA038792B1 (ru) 2021-10-20
AU2020286218A1 (en) 2021-01-07
GT201500330A (es) 2019-07-19
US12071619B2 (en) 2024-08-27
US9574192B2 (en) 2017-02-21
BR112015029139A2 (sr) 2017-09-19
MX2021000656A (es) 2021-03-25
JP2021191278A (ja) 2021-12-16
ZA201509252B (en) 2018-12-19
NZ714530A (en) 2021-10-29
CY1122159T1 (el) 2020-07-31
JP2016520312A (ja) 2016-07-14
EA201592223A1 (ru) 2016-04-29
AU2014268509A1 (en) 2015-12-24
PT2999785T (pt) 2018-07-09
US10920223B2 (en) 2021-02-16
PL2999785T3 (pl) 2018-09-28
JP6931015B2 (ja) 2021-09-01
SI2999785T1 (en) 2018-08-31
US10683504B2 (en) 2020-06-16
CL2015003441A1 (es) 2016-08-19
CN113018307A (zh) 2021-06-25
KR20220154244A (ko) 2022-11-21
KR102295648B1 (ko) 2021-08-31
UY40064A (es) 2023-02-28
SG10201913872XA (en) 2020-03-30
US20140350071A1 (en) 2014-11-27
DOP2015000288A (es) 2017-01-31
MX379208B (es) 2025-03-10
US20200080085A1 (en) 2020-03-12
EP2999785A1 (en) 2016-03-30
US20170114342A1 (en) 2017-04-27
HRP20181030T1 (hr) 2018-08-24
CN105408481A (zh) 2016-03-16
US10030244B2 (en) 2018-07-24
RU2015154721A (ru) 2017-06-27
IL284757A (en) 2021-08-31
CN105408481B (zh) 2021-03-30
WO2014190137A1 (en) 2014-11-27
SG11201509712YA (en) 2016-01-28
NZ753769A (en) 2021-10-29
JP6495250B2 (ja) 2019-04-03
HK1221979A1 (en) 2017-06-16
ES2676146T3 (es) 2018-07-17
TW201508005A (zh) 2015-03-01
DK2999785T3 (en) 2018-07-23
BR112015029139B1 (pt) 2022-07-12
CA2912826A1 (en) 2014-11-27
TWI664187B (zh) 2019-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7629946B2 (ja) Ｔｍｐｒｓｓ６ ｉｒｎａ組成物及びその使用方法
US12071619B2 (en) SERPINA1 iRNA compositions and methods of use thereof
EP3204015B1 (en) Compositions and methods for inhibition of hao1 (hydroxyacid oxidase 1 (glycolate oxidase)) gene expression
RS61297B1 (sr) Transtiretinske (ttr) kompozicije irnk i postupci za njihovu primenu u lečenju ili prevenciji bolesti povezanih sa ttr-om
HK40001729A (en) Serpina1 irna compositions and methods of use thereof
NZ753769B2 (en) Serpina1 iRNA compositions and methods of use thereof
HK1221979B (en) Serpina1 irna compositions and methods of use thereof
HK1241287B (en) Compositions and methods for inhibition of hao1 (hydroxyacid oxidase 1 (glycolate oxidase)) gene expression