CN117757791A - 具有降低的脱靶效应的修饰的rna试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明的一个方面涉及能够抑制靶基因表达的双链RNA(dsRNA)试剂。该dsRNA分子的反义链包含出现在种子区域的至少一个热去稳定化核苷酸；该dsRNA包含至少四个2'‑氟修饰，并且该dsRNA分子的有义链包含配体，其中该配体是ASGPR配体。本发明的其他方面涉及包含这些适于治疗用途的dsRNA分子的药物组合物以及通过给予这些dsRNA分子来抑制靶基因的表达例如用于治疗各种疾病病症的方法。

Description

具有降低的脱靶效应的修饰的RNA试剂
本申请是申请日为2017年11月22日、申请号为201780084435.0、发明名称为“具有降低的脱靶效应的修饰的RNA试剂”的中国发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求以下项的权益：2016年11月23日提交的美国临时申请号62/425,907、2017年8月22日提交的美国临时申请号62/548,589、和2017年9月21日提交的美国临时申请号62/561,514，这些申请的内容通过引用以其整体结合在此。
技术领域
本发明涉及具有特定基序的RNAi双链体试剂以及适于治疗使用的RNAi组合物，所述特定基序通过减少不希望的脱靶效应有利于抑制靶基因表达。此外，本发明提供了通过给予这些RNAi双链体试剂来抑制靶基因的表达的方法，例如用于治疗各种疾病。
背景技术
RNA干扰或“RNAi”是一个最初由Fire和同事创造的术语，用来描述观察到双链RNAi(dsRNA)可以阻断基因表达(Fire等人(1998)Nature[自然]391，806-811；Elbashir等人(2001)Genes Dev.[基因与发展]15，188-200)。短dsRNA在许多有机体(包括脊椎动物)中指导基因特异性的转录后沉默，并且已经为研究基因功能提供了一个新的工具。RNAi由RNA诱导沉默复合体(RISC)介导，RISC是破坏与沉默触发物同源的信使RNA的序列特异性多组分核酸酶。已知RISC包含来自双链RNA触发物的短RNA(大约22个核苷酸)，但是这一活性的蛋白组分仍是未知的。
siRNA的脱靶效应之一是miRNA样效应-在RNA干扰中的核心效应物的argonaute蛋白将人工引入以诱导RNA干扰的siRNA作为miRNA(微小RNA)处理。(Lam等人(2015)Molecular TherapyNucleic Acids[分子疗法-核酸](2015)4，e252)。miRNA主要通过种子区域(来自5′末端的位置2-9)与用于基因遏制的靶mRNA之间的碱基配对识别靶基因。由siRNA引起的脱靶源自iRNA的加载有RISC的反义链的种子区域与具有一个或多个mRNA的碱基互补性。在若干个研究中已经报道了siRNA中的miRNA样脱靶效应，并且取决于种子区域的序列影响多种基因的表达，并且严重到足以引起基于siRNA的表型筛选中高达30％的阳性命中。此外，在miRNA的情况下，当种子区域与靶之间的相互作用变弱时，它们也被报道通过其3′末端区域内的补偿配对(3′-补偿配对)沉默靶基因，暗示miRNA样脱靶效应可能是由这种机制调节的。
因此，通过明智地应用化学修饰来调节siRNA设计而不损害siRNA基因疗法的基因沉默功效，正在努力消除或降低siRNA的miRNA样脱靶效应。本发明即针对这一努力。
发明内容
本发明提供了dsRNA分子的有效核苷酸或化学基序，其有利于抑制靶基因表达，同时具有降低的脱靶基因沉默效应，以及提供了适用于治疗用途的RNAi组合物。
诸位发明人尤其发现了其中反义链在种子区域(即，在反义链的5′-末端的位置2-9，从5′-末端开始计数)内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰的dsRNA分子以及具有从约40℃至约80℃的范围内的解链温度的dsRNA分子可以比缺乏去稳定化修饰的亲本dsRNA分子在介导RNA干扰方面更有效。
因此，在一个方面，本发明提供了能够抑制靶基因表达的dsRNA分子，该dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，并且其中该反义链在种子区域内(即，在反义链的5′-末端的位置2-9，从5′-末端开始计数)包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且该dsRNA进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或全部九个)：(i)从约40℃至约80℃的解链温度(Tm)；(ii)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(iii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iv)该有义链与配体缀合；(v)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(vi)该有义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vii)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(viii)该dsRNA包含长度为12-40个核苷酸对的双链体区域；以及(ix)在该反义链的5’末端的平端。
在一些实施例中，本发明提供了能够抑制靶基因表达的dsRNA分子，该dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，并且其中该反义链在种子区域内(即，在反义链的5′-末端的位置2-9，优选3-8，从5′-末端开始计数)包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且该dsRNA进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或全部九个)：(i)从约40℃至约80℃的解链温度(Tm)；(ii)该反义链包含6、7、8、9、10、11或12个2’-OMe修饰；(iii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iv)该有义链与配体缀合；(v)该有义链包含6、7、8、9、10、11或12个2’-OMe修饰；(vi)该有义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vii)该dsRNA包含至少1、2、3、4或5个2’-脱氧修饰；(viii)该dsRNA包含长度为12-40个核苷酸对的双链体区域；以及(ix)在该反义链的5’末端的平端。
在一些实施例中，dsRNA具有从约40℃、45℃、50℃、55℃、60℃或65℃范围的下端，以及从约70℃、75℃或80℃范围的上端的解链温度。在一些实施例中，dsRNA具有从约55℃至约70℃范围内的解链温度。在一些实施例中，dsRNA具有从约57℃至约67℃范围内的解链温度。在一些具体的实施例中，dsRNA具有从约60℃至约67℃范围内的解链温度。在一些另外的实施例中，dsRNA具有从约62℃至约66℃范围内的解链温度。
诸位发明人还发现，具有至少60℃的解链温度的dsRNA分子在体内和体外更加有效。因此，在一些实施例中，dsRNA具有至少60℃的解链温度。
诸位发明人还发现，为了使dsRNA分子在体内更有效，在给药后第7天体内(例如在小鼠肝中)必须存在至少40％-50％的反义链。
在另一方面，本发明进一步提供了用于通过皮下或静脉内给药向受试者中的特定靶递送本发明的dsRNA分子的方法。本发明进一步提供了将本发明的dsRNA分子用于通过皮下或静脉内给药将所述药剂递送至受试者中的特定靶的方法。
附图说明
本专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。在请求并支付必要的费用后，官方将会提供带有一幅或多幅彩色附图的本专利或专利申请公开物的副本。
图1显示了本发明的一些示例性去稳定化修饰。
图2显示了反义链中单个(S)-乙二醇核酸(GNA)修饰对体外缀合活性的位置影响。(S)-GNA的单个取代在反义链种子区域(反义链的位置5-8)或反义链种子区域相对面被良好地耐受，但在敏感位置(反义链的位置1和2，以及有义链的位置11和12)不能耐受。
图3显示相对于亲本dsRNA，根据本发明的示例性dsRNA具有等价的中靶活性。
图4显示本发明的示例性dsRNA在高剂量下没有脱靶活性。
图5显示本发明的示例性dsRNA在大鼠肝细胞中具有相当的基因(GO1和TTR)敲低。
图6显示本发明的示例性dsRNA减轻内源性脱靶效应。如所见，两种dsRNA显著减少了由它们各自的亲本dsRNA下调或上调的基因数量。
图7显示根据本发明的示例性dsRNA具有与亲本dsRNA相当的效力。
图8显示根据本发明的示例性dsRNA具有与亲本dsRNA相当的肝积累。
图9显示根据本发明的示例性dsRNA具有与亲本dsRNA相当的中靶活性。
图10显示了以各种浓度给药的示例性dsRNA的临床病理学参数。
图11显示给予本发明的示例性dsRNA时的归一化体重增加和肝/体重比。
图12显示了ΔTm与不同序列的指定位置上的中靶和脱靶活性之间的相关性。蓝色数据点＝中靶活性；红色数据点＝脱靶活性。
图13显示了dsRNA双链体解链温度对体外和体内活性的影响。
图14显示相对于亲本dsRNA，根据本发明的示例性dsRNA具有相当的效力但降低的体外脱靶活性(PMH)。
图15显示相对于亲本dsRNA，示例性dsRNA具有相当的体内(啮齿动物)效力。
图16显示相对于亲本dsRNA(ESC)，使用本发明的示例性dsRNA(ESC+)的大鼠肝毒性减轻。
图17显示相对于亲本dsRNA，根据本发明的示例性dsRNA在体内(大鼠)的治疗指数具有6至8倍的改善。
图18和19显示，在COS萤光素酶系统中，相对于亲本dsRNA(AD-61444(图18)和AD-77407(图19))，根据本发明的示例性dsRNA在相当的浓度下对于中靶活性具有相当的IC50但具有低得多的脱靶活性。
图20显示相对于亲本dsRNA，在根据本发明的示例性位置处用GNA和2′-F取代不会对体内活性产生不利影响。dsRNA的序列列于表9中。
图21显示根据本发明的示例性dsRNA降低了脱靶效应。来自用10nm siRNA转染的Hep3B细胞的RNAseq(16hr处理)。
图22显示相对于亲本dsRNA，根据本发明的示例性dsRNA在不同剂量下在非人灵长类动物中具有相当的单剂量活性。
图23显示了用于体内小鼠研究的研究设计和用于该研究的示例性dsRNA。dsRNA序列的序列列于表9中。
图24和25显示，在COS萤光素酶系统中，相对于亲本dsRNA，根据本发明的示例性dsRNA在相当的浓度下具有对于中靶活性相当的IC50但具有低或没有脱靶活性。
图26和27显示，尽管肝中的积累减少，但根据本发明的示例性dsRNA在肝中具有与亲本dsRNA相当的基因敲低。
图28是(S)-GNA和(R)-GNA的结构的示意图。
图29显示了对于A型和B型的RNA/DNA，以及对于(S)-GNA的骨架-碱基倾角(ηB)和螺旋扭曲值。通过使用简单的反转从(S)-GNA值外推(R)-GNA的值。
图30是使用GNA对siRNA缀合物双链体进行热调节的示意图。
图31是hAgo2的结构的示意图，该hAgo2从PDB文件4W5O改适并使用PyMOL生成。
图32A和32B显示了示例性dsRNA在体内的位置特异性代谢稳定性和代谢稳定性对所得药效学的影响。。
图32C显示与GNA相对的有义链的热稳定性改善了示例性dsRNA的代谢稳定性和效力。
图33是显示含有(S)-GNA的示例性siRNA双链体的热解链(Tm)分析的线图。
图34A-34F显示用两种GNA-T立体异构体修饰的RNA双链体的晶体结构分析。
图35显示了异胞苷和异鸟嘌呤核苷酸的结构及其与“旋转的”GNA-C或GNA-G形成完全互补碱基对的潜力。
图36显示单个(S)-GNA碱基对取代对体外沉默的位置效应。引导链的指定位置处的碱基对被相应的GNA碱基对取代。
图37A和37B是显示用(S)-GNA修饰的siRNA双链体以2.5mg/kg给药在小鼠中敲低TTR的条形图。图37A显示在肝中测量的TTR mRNA水平。图37B显示了在血清中测量的TTR蛋白水平。误差条代表每个群组的SD(n＝3)。只有那些具有统计显著性的比较才能显示在图表中；所有其他都没有显著性，与PBS的所有比较除外，其都是显著的。G＝引导链、P＝随从链。
图38A-38D显示阻断RISC加载减轻肝毒性。图38A描绘了在siRNA的5′末端使用的核苷酸类似物(以防止5′-磷酸化，从而降低RISC加载)的结构。图38B是条形图，该条形图显示在大鼠和小鼠毒性研究中对亲本(RNAi活性)和加帽的(无RNAi活性)GalNAc-siRNA进行肝暴露，如在尸体剖检(nx)时通过茎环RT-qPCR对反义链(AS)评估的。虚垂直线划分了单独进行的研究。图38C显示在尸体剖检时测量的血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平。使用GraphPad Prism 7中的单向ANOVA评估组平均值之间的差异的统计学显著性。ns，不显著；*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001；****，p＜0.0001。图38D是显示在尸体剖检时收集的肝切片的H&E染色的图像。在大鼠中，肝毒性siRNA(本文显示的siRNA-1)具有肝细胞变性(括号区域)、由于库普弗细胞增生和/或白细胞浸润而增加的窦性细胞(#)、单细胞坏死(*)、增加的有丝分裂(∧)、和肝细胞空泡化(箭头)。在小鼠中，肝毒性siRNA(本文显示的siRNA-7)与单细胞坏死相关，并且在大鼠中常见的其他观察结果的发生率和严重性较低。加帽的无RNAi活性的siRNA在两个物种中具有最小的空泡化或没有组织学观察结果。小鼠中存在的细胞质清除由于不完全禁食而与糖原一致，并且不被认为是与测试品相关的。
图39A-39-C显示了在大鼠毒性研究中反义链5′-修饰对毒性GalNAc-siRNA的RNAi活性和肝酶升高的影响。图39A是显示具有或不具有5′-帽的GalNAc-siRNA的肝RISC加载的条形图，如在尸体剖检(nx)时通过茎环RT-qPCR对反义链(AS)评估的。图39B是显示相对于盐水对照组，具有或不具有5′-帽的肝mRNA敲低的条形图，如在尸体剖检时通过RT-qPCR对靶mRNA评估的，并归一化为管家mRNA(18S rRNA)。图39C显示在尸体剖检时测量的用于RISC加载块研究的血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)和总胆红素(TBILI)水平。Q2d，每隔一天给药；iB，反向的脱碱基；Mo，吗啉代；H，5’-脱氧。
图40A-40C显示在大鼠毒性研究中有义链5′-修饰对示例性毒性GalNac-siRNA的肝毒性的影响。图40A是条形图，该条形图显示在大鼠毒性研究中在有义链(SS)的5′末端具有或不具有修饰的毒性GalNAc-siRNA的肝暴露，如在尸体剖检(nx)时通过茎环RT-qPCR对反义链(AS)评估的。图40B显示在尸体剖检时测量的血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平。图40C是显示在尸体剖检时收集的肝切片的H&E染色的图像。毒性siRNA具有由肝细胞变性(括号)、单细胞坏死(*)、与库普弗细胞增生和/或浸润性白细胞一致的增加的窦性细胞(#)、和肝细胞空泡化(箭头)组成的显微镜观察结果。添加有义链帽对观察结果的发生率或严重程度没有影响。Q2d，每隔一天给药；iB，反向的脱碱基；Mo，吗啉代。
图41A-41C显示了5′-修饰对大鼠毒性研究中示例性无毒GalNAc-siRNA的肝毒性的影响。图41A是条形图，该条形图显示在大鼠毒性研究中在有义链和反义链的5′-末端上具有或不具有修饰的无毒GalNAc-siRNA的肝暴露，如在尸体剖检(nx)时通过茎环RT-qPCR对反义链(AS)评估的。图41B显示在尸体剖检时测量的血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平。图41C是显示在尸体剖检时收集的肝切片的H&E染色的图像。在两种情况下，给予具有或不具有5′-帽的已知无毒siRNA导致最小的肝细胞空泡化(箭头)。Q2d，每隔一天给药；iB，反向的脱碱基；Mo，吗啉代。
图42A-42E显示改变siRNA化学修饰不会减轻肝毒性。图42A显示具有相同PS含量和序列的高2'F和低2'F GalNAc-siRNA的化学修饰模式。图42B是条形图，该条形图显示在大鼠和小鼠毒性研究中的肝暴露，如在尸体剖检(nx)时通过茎环RT-qPCR对反义链(AS)评估的。图42C是显示肝RISC加载的条形图，如在尸体剖检时通过茎环RT-qPCR对反义链评估的。图42D显示在尸体剖检时测量的血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平。使用GraphPadPrism 7中的单向ANOVA评估组平均值之间的差异的统计学显著性。ns，不显著；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001。图42E是显示在尸体剖检时收集的肝切片的H&E染色的图像。在大鼠中，高2'F和低2'F siRNA-6化合物均与以下相关：肝细胞变性(括号)、单细胞坏死(*)、与库普弗细胞增生和/或浸润性白细胞一致的增加的窦性细胞(#)、和肝细胞空泡化(箭头)。在小鼠中，观察结果由两种化学修饰模式的单细胞坏死组成。
图43是显示siRNA-6的高2′F形式(48％2′F和52％2′OMe)和低2′F形式(21％2′F和79％2′OMe)的体内效力的条形图。在向C57BL/6雌性小鼠单次皮下注射3mg/kg后，相对于盐水对照组，在第14天和第28天通过针对靶mRNA的RT-qPCR评估肝中靶mRNA敲低，并归一化至管家mRNA(GAPDH)。
图44A-44E显示逆转加载反义链的RISC活性减轻肝毒性。图44A是描述使用REVERSIRTM通过GalNAc-siRNA预防和治疗大鼠毒性的研究设计。图44B是条形图，该条形图显示在大鼠预防(siRNA-1和siRNA-4)或治疗(siRNA-5)毒性研究中的GalNAc-siRNA的肝暴露，如在尸体剖检(nx)时通过茎环RT-qPCR对反义链(AS)评估的。图44C是条形图，该条形图显示有或没有REVERSIRTM处理情况下的肝RISC加载，如在尸体剖检时通过茎环RT-qPCR对反义链评估的。图44D显示在尸体剖检时测量的血清谷氨酸脱氢酶(GLDH)水平。使用GraphPadPrism 7中的单向ANOVA评估组平均值之间的差异的统计学显著性。ns，不显著；*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001；****，p＜0.0001。图44E是显示在尸体剖检时收集的肝切片的H&E染色的图像。单独或与杂乱对照(Ctr)REVERSIRTM一起给予的已知毒性siRNA与以下相关：肝细胞变性(括号)、单细胞坏死(*)、与库普弗细胞增生和/或浸润性白细胞一致的增加的窦性细胞(#)、增加有丝分裂(∧)、胆管增生伴纤维化(+)、和肝细胞空泡化(箭头)。共同给予互补的REVERSIRTM降低了这些观察结果的严重性并且通常限制了它们的分布。
图45是显示REVERSIRTM化合物对大鼠毒性研究中RNAi活性的影响的条形图。相对于盐水对照组，在尸体剖检时通过针对靶mRNA的RT-qPCR评估siRNA-1和siRNA-5的肝中靶mRNA敲低，并归一化为管家mRNA(18S rRNA)。相对于盐水对照组，通过ELISA在尸体剖检时评估siRNA-4的中靶血清蛋白水平。Q2d，每隔一天给药；qw，每周给药。
图46A-46E显示交换种子区域减轻了肝毒性。图46A显示肝毒性和非肝毒性GalNAc-siRNA之间的种子交换的化学结构。图46B是显示在大鼠毒性研究中亲本和种子交换的GalNAc-siRNA的肝暴露的条形图，如尸体剖检(nx)时通过茎环RT-qPCR对反义链(AS)所评估的。图46C是显示肝RISC加载的条形图，如在尸体剖检中通过茎环RT-qPCR对反义链所评估的。图46D显示在尸体剖检时测量的血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平。使用GraphPad Prism 7中的单向ANOVA评估组平均值之间的差异的统计学显著性。ns，不显著；*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001；****，p＜0.0001。图46E是显示在尸体剖检时收集的肝切片的H&E染色的图像。毒性siRNA具有肝细胞变性(括号)、单细胞坏死(*)、与库普弗细胞增生和/或浸润性白细胞一致的增加的窦性细胞(#)、和肝细胞空泡化(箭头)，而无毒性siRNA仅具有最小的空泡化。毒性骨架中的无毒种子与完全无毒的siRNA相当，并且无毒骨架中的毒性种子具有单细胞坏死、增加的窦性细胞和空泡化，但严重程度低于全长毒性化合物。
图47A和47B显示siRNA脱靶在体外和体内富集种子互补性。图47A是描绘了用在10nM四种不同序列的GalNAc-siRNA转染后24小时大鼠肝细胞中全基因表达变化的火山图。图47B是描绘了以50mg/kg皮下给予GalNAc-siRNA后24小时大鼠肝中的全局基因表达变化的火山图。显示了两个亲本GalNAc-siRNA及其用反向的脱碱基(iB)帽封闭的无RNAi活性形式。蓝点，调整的p值≤0.05；红点，调整的p值＞0.05；N＝3只动物/组。使用具有多个测试校正的Wald测试在DESeq2中计算针对倍数变化的调整的p值。使用Fisher精确测试计算种子富集p值。统计学比较，组之间的方差相似。
图48A-48F显示去稳定种子介导的碱基配对使脱靶效应最小化并减轻肝毒性。图48A显示了在示例性毒性siRNA-5的反义链的位置七的热去稳定化乙二醇核酸(GNA)修饰。图48B是描绘在用10nM亲本或GNA修饰的GalNAc-siRNA转染后24小时大鼠肝细胞中全基因表达变化的火山图。N＝3个技术性重复。图48C是显示在大鼠毒性研究中亲本和种子修饰的siRNA-5的肝暴露的条形图，如在尸体剖检(nx)时通过茎环逆转录定量PCR(RT-qPCR)对反义链(AS)所评估的。图48D是显示肝RISC加载的条形图，如在尸体剖检中通过茎环RT-qPCR对反义链所评估的。图48E显示在尸体剖检时测量的血清谷氨酸脱氢酶(GLDH)水平。使用GraphPad Prism7中的单向ANOVA评估组平均值之间的差异的统计学显著性。ns，不显著；*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001；****，p＜0.0001。图48F是显示在尸体剖检时收集的肝切片的H&E染色的图像。毒性亲本siRNA-5具有纤维化(圆圈)、肝细胞变性(括号)、单细胞坏死(*)、增加的有丝分裂(∧)、与库普弗细胞增生和/或浸润性白细胞一致的增加的窦性细胞(#)、和肝细胞空泡化(箭头)，而无毒性siRNA仅具有最小的空泡化。种子GNA修饰的siRNA-5具有变性、单细胞坏死、增加的有丝分裂和空泡化，但发生率和严重程度等级低于亲本siRNA-5N＝4只动物/组；qw，每周给药；GNA，乙二醇核酸。
图49A和49B显示了示例性热去稳定化GNA种子修饰对中靶活性的影响。图49A是显示相对于模拟转染的大鼠肝细胞mRNA敲低的条形图，其是在10nM转染后24小时通过逆转录-定量PCR(RT-qPCR)对靶mRNA进行评估，并归一化为管家mRNA(18SrRNA)。图49B是显示相对于盐水对照组的肝mRNA敲低的条形图，其是在尸体剖检时通过RT-qPCR对靶mRNA进行评估，并归一化为管家mRNA(18S rRNA)。Qw，每周给药；GNA，乙二醇核酸。
图50和51显示了在大鼠肝细胞(图50)和小鼠肝细胞(图51)中靶向TTR的示例性dsRNA(图50)和靶向因子IX(F9)的dsRNA(图51)的IC50曲线。
图52和53显示本发明的示例性dsRNA针对TTR(图52)和F9(图53)减轻内源性脱靶效应。图52显示了体外靶向TTR的dsRNA的脱靶效应的位置特异性降低。图53显示了体外靶向F9的dsRNA的脱靶效应的位置特异性降低。如所见，dsRNA显著减少了由它们各自的亲本dsRNA下调或上调的基因数量。
图54是显示示例性dsRNA情况下靶TTR的敲低的线图，其中示例性dsRNA含有热去稳定化修饰模式3、6、7、和10。可以看出，所有修饰都能够保持与亲本相似的活性。
图55是显示示例性dsRNA情况下靶GO1的敲低的条形图，其中示例性dsRNA含有热去稳定化修饰Mod3、5、6、7、10、和12。可以看出，所有修饰都能够保持与亲本相似的活性。
具体实施方式
诸位发明人尤其已经发现，通过在dsRNA的反义链中的某些位置并入热去稳定化核苷酸，可以降低或抑制dsRNA分子的脱靶效应。通过在反义链中的某些位置处的这些热去稳定化修饰，dsRNA分子能够保留与亲本dsRNA相似的基因沉默活性，同时具有减少的脱靶基因沉默。此外，当与亲本dsRNA相比时，包含这些热去稳定化修饰的dsRNA分子也减少了下调或上调的脱靶基因的数量。
因此，在一方面，本发明提供了能够抑制靶基因表达的双链RNAi(dsRNA)试剂。通常，本发明的dsRNA分子显示高中靶基因沉默，同时减少或最小化脱靶基因沉默和/或毒性。没有限制，本发明的dsRNA分子可以取代dsRNA分子，并且可以用于基于RNA干扰的基因沉默技术(包括但不限于体外或体内应用)。
通常，dsRNA分子包含有义链(也称为随从链)和反义链(也称为引导链)。dsRNA分子的每条链可以从12-40个核苷酸范围内的长度。举例来说，每条链可以在14-40个核苷酸长度、17-37个核苷酸长度、25-37个核苷酸长度、27-30个核苷酸长度、17-23个核苷酸长度、17-21个核苷酸长度、17-19个核苷酸长度、19-25个核苷酸长度、19-23个核苷酸长度、19-21个核苷酸长度、21-25个核苷酸长度或21-23个核苷酸长度之间。没有限制，有义链和反义链可以是相等的长度或不等的长度。
在一些实施例中，反义链的长度是18至35个核苷酸。在一些实施例中，反义链的长度是21-25、19-25、19-21、或21-23个核苷酸。在一些具体的实施例中，反义链的长度是23个核苷酸。与反义链相似，在一些实施例中，有义链的长度可以是18-35个核苷酸。在一些实施例中，有义链的长度是21-25、19-25、19-21或21-23个核苷酸。在一些具体的实施例中，反义链的长度是21个核苷酸。
诸位发明人还发现，为了使dsRNA分子在体内更有效，反义链必须具有一些代谢稳定性。换句话说，为了使dsRNA分子在体内更有效，在给药后一段时间后可能需要在体内存在一定量的反义链。因此，在一些实施例中，在体内给药后第5天，至少40％、例如至少45％、至少50％、至少55％、至少60％.、至少65％、至少70％、至少75％、或至少80％的dsRNA的反义链存在于体内，例如存在于小鼠肝中。在一些实施例中，在体内给药后第6天，至少40％、例如至少45％、至少50％、至少55％、至少60％.、至少65％、至少70％、至少75％、或至少80％的dsRNA的反义链存在于体内，例如存在于小鼠肝中。在一些实施例中，在体内给药后第7天，至少40％、例如至少45％、至少50％、至少55％、至少60％.、至少65％、至少70％、至少75％、或至少80％的dsRNA的反义链存在于体内，例如存在于小鼠肝中。在一些实施例中，在体内给药后第8天，至少40％、例如至少45％、至少50％、至少55％、至少60％.、至少65％、至少70％、至少75％、或至少80％的dsRNA的反义链存在于体内，例如存在于小鼠肝中。在一些实施例中，在体内给药后第9天，至少40％、例如至少45％、至少50％、至少55％、至少60％.、至少65％、至少70％、至少75％、或至少80％的dsRNA的反义链存在于体内，例如存在于小鼠肝中。在一些实施例中，在体内给药后第10天，至少40％、例如至少45％、至少50％、至少55％、至少60％.、至少65％、至少70％、至少75％、或至少80％的dsRNA的反义链存在于体内，例如存在于小鼠肝中。在一些实施例中，在体内给药后第11天，至少40％、例如至少45％、至少50％、至少55％、至少60％.、至少65％、至少70％、至少75％、或至少80％的dsRNA的反义链存在于体内，例如存在于小鼠肝中。在一些实施例中，在体内给药后第12天，至少40％、例如至少45％、至少50％、至少55％、至少60％.、至少65％、至少70％、至少75％、或至少80％的dsRNA的反义链存在于体内，例如存在于小鼠肝中。在一些实施例中，在体内给药后第13天，至少40％、例如至少45％、至少50％、至少55％、至少60％.、至少65％、至少70％、至少75％、或至少80％的dsRNA的反义链存在于体内，例如存在于小鼠肝中。在一些实施例中，在体内给药后第14天，至少40％、例如至少45％、至少50％、至少55％、至少60％.、至少65％、至少70％、至少75％、或至少80％的dsRNA的反义链存在于体内，例如存在于小鼠肝中。在一些实施例中，在体内给药后第15天，至少40％、例如至少45％、至少50％、至少55％、至少60％.、至少65％、至少70％、至少75％、或至少80％的dsRNA的反义链存在于体内，例如存在于小鼠肝中。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，并且其中该反义链在种子区域内(即，在反义链的5′-末端的位置2-9，从5′-末端开始计数)包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且dsRNA具有从约40℃至约80℃的解链温度(Tm)，并且dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vii)该dsRNA包含长度为12-40个核苷酸对的双链体区域；以及(viii)在该反义链的5’末端的平端。在一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。
在一些实施例中，dsRNA分子具有长度为12-40个核苷酸对的双链体区域，其中反义链在种子区域内(即，在反义链的5’-末端的位置2-9，从开始计数5′-末端)包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且dsRNA具有从约40℃至约80℃的Tm，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；以及vii)在该反义链的5’末端的平端。在一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。
在一些实施例中，dsRNA分子具有长度为19、20、21、22或23个核苷酸碱基对的双链体区域，其中反义链含有双链体的至少一个热去稳定化修饰(位于反义链的种子区域，即，在反义链的5’-末端的位置2-9)，并且其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度。在一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。
在一些实施例中，dsRNA分子具有长度为19、20、21、22或23个核苷酸碱基对的双链体区域，其中反义链含有位于反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)的双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且其中dsRNA具有约40℃至约80℃(例如，40℃、50℃、60℃、70℃或80℃)的解链温度。在一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。
在一些具体的实施例中，双链体的热去稳定化修饰在反义链的位置5、6、7、或8(从反义链的5’-末端开始计数)。
在一些具体的实施例中，双链体的热去稳定化修饰在反义链的位置5(从反义链的5’-末端开始计数)。
在一些具体的实施例中，双链体的热去稳定化修饰在反义链的位置6(从反义链的5’-末端开始计数)。
在一些具体的实施例中，双链体的热去稳定化修饰在反义链的位置7(从反义链的5’-末端开始计数)。
在一些具体的实施例中，双链体的热去稳定化修饰在反义链的位置8(从反义链的5’-末端开始计数)。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，并且其中该反义链在种子区域内(即，在反义链的5′-末端的位置2-9，从5′-末端开始计数)包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且反义链进一步包含以下特征中的一个或两个：
(i)2、3、4、5或6个2’-氟修饰；和
(ii)1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；并且
该有义链包含以下特征中的一个、两个、或三个：
(i)与该有义链缀合的配体；
(ii)2、3、4或5个2’-氟修饰；和
(iii)1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键。
在此的一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，并且其中该反义链在从5′-末端开始计数前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且配体与该有义链缀合，并且其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，并且其中该反义链在从5′-末端开始计数前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，配体与该有义链缀合，并且dsRNA包含至少四个2’-氟修饰。在一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中dsRNA包含至少四个2’-氟，其中所述反义链在从5’-末端开始计数的前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，所述有义链包含配体，并且其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度。在此的一些另外的实施例中，配体是ASGPR配体。在一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中所述反义链包含位于从5’-末端开始计数位置4-8中的双链体的至少一个热去稳定化修饰，其中所述有义链包含配体，其中有义链和反义链各自包含至少两个2’-氟修饰，并且其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度。在此的一些另外的实施例中，配体是ASGPR配体。在一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中dsRNA包含至少四个2’-氟，其中所述反义链在从5’-末端开始计数的前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且其中所述有义链包含配体，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中该反义链进一步包含以下特征中的至少两个：(i)双链体的热去稳定化修饰位于该反义链的位置4至8；(ii)至少两个2’-氟修饰；(iii)在核苷酸位置1与2(从5’末端开始计数)之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；并且反义链的长度为18至35个核苷酸。在一些另外的实施例中，配体是ASGPR配体。在一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中dsRNA包含至少四个2’-氟，其中所述反义链在从5’-末端开始计数的前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且其中所述有义链包含配体，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且该有义链具有以下特征中的至少一个：(i)该配体附接至该有义链的任一末端；(ii)有义链包含至少两个2’-氟修饰；以及(iii)该有义链和该反义链显示出足够的互补性以形成跨至少19个核苷酸位置的双链区，并且其中该双链体的热去稳定化修饰位于所述双链区域内。在一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中dsRNA包含至少四个2’-氟，其中所述反义链在从5’-末端开始计数的前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且其中所述有义链包含配体，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中双链体的热去稳定化修饰选自下组，该组由以下组成：
其中B是修饰的或未修饰的核碱基，并且每个结构上的星号代表R、S或外消旋。在一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中所述反义链包含位于从5’-末端开始计数位置4-8中的双链体的至少一个热去稳定化修饰，其中所述有义链包含配体，并且其中有义链和反义链各自包含至少两个2’-氟修饰，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中双链体的热去稳定化修饰选自下组，该组由以下组成：
其中B是修饰的或未修饰的核碱基，并且每个结构上的星号代表R、S或外消旋。在一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中dsRNA包含至少四个2’-氟，其中所述反义链包含位于从反义链的5’-末端开始计数位置7处的双链体的至少一个热去稳定化修饰，其中所述有义链包含配体，并且其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度。在一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中所述反义链包含位于从5’-末端开始计数位置7处的双链体的至少一个热去稳定化修饰，其中所述有义链包含配体，并且其中有义链和反义链各自包含至少两个2’-氟修饰，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中双链体的热去稳定化修饰选自下组，该组由以下组成：
其中B是修饰的或未修饰的核碱基，并且每个结构上的星号代表R、S或外消旋。在一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中dsRNA包含至少四个2’-氟，其中所述反义链在从5’-末端开始计数的前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，其中所述有义链包含配体，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中该配体包含通过二价或三价支链接头附接的一个或多个GalNAc衍生物。在一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中dsRNA包含至少四个2’-氟，其中所述反义链在从5’-末端开始计数的前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且其中所述有义链包含配体，其中dsRNA任选地具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中该配体是以下结构的ASGPR配体：
在一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，包含3或4个2’-氟修饰，并且包含0、1、2或3个硫代磷酸酯核苷酸间键；其中反义链包含3、4、5或6个2’-氟修饰，并且包含2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。在一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，在位置7、10和11或在位置7、9、10和11(从有义链的5’-末端开始计数)处包含2’-氟修饰，并且任选地包含在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中反义链包含3、4、5或6个2’-氟修饰，包含2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。在一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，包含3或4个2’-氟修饰，并且包含0、1、2或3个硫代磷酸酯核苷酸间键；其中反义链在位置2、6、8、9、14或16，或在位置2、6、14或16，或在位置2、14和16处包含2’-氟修饰；并且反义链包含在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。在一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，包含3或4个2’-氟修饰，并且包含0、1、2或3个硫代磷酸酯核苷酸间键；其中反义链在位置2、6、8、9、14或16，或在位置2、6、14或16，或在位置2、14和16处包含2’-氟修饰；并且反义链包含在核苷酸位置21与22之间、在核苷酸位置22与23之间、在核苷酸位置1与2之间、在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。在一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，在位置7、10和11或在位置7、9、10和11(从有义链的5’-末端开始计数)处包含2’-氟修饰，并且任选地包含在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中反义链在位置2、6、8、9、14或16，或在位置2、6、14或16，或在位置2、14和16处包含2’-氟修饰；并且反义链包含在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。在一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸，其中反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，并且其中该至少一个热去稳定化核苷酸位于反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vii)该dsRNA包含长度为18、19、20、21、22、23、24或24个核苷酸对的双链体区域；以及(viii)该dsRNA在该有义链的5’-末端包含平端。在一些具体的实施例中，有义链的长度是19、20或21或22个核苷酸，并且反义链的长度是20、21或22个核苷酸。在一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，在位置7、10和11或在位置7、9、10和11(从有义链的5’-末端开始计数)处包含2’-氟修饰，并且任选地包含在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中反义链在位置2、6、8、9、14或16，或在位置2、6、14或16，或在位置2、14和16处包含2’-氟修饰；并且反义链包含在核苷酸位置21与22之间、在核苷酸位置22与23之间、在核苷酸位置1与2之间、在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。在一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。
在一些实施例中，dsRNA的一个末端是平端并且另一末端具有突出，其中反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，并且其中该至少一个热去稳定化核苷酸位于反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、或全部七个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vii)以及该dsRNA包含长度为12-40个核苷酸对的双链体区域。在一些实施例中，突出位于反义链的3’-末端，并且平端位于反义链的5’-末端。在一些具体的实施例中，突出的长度是2、3或4个核苷酸。在一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。在一些实施例中，dsRNA分子具有长度为19、20、21、22或23个核苷酸碱基对的双链体区域，其中dsRNA的一个末端是平端并且另一末端具有突出，其中反义链含有位于反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)的双链体的至少一个热去稳定化修饰，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、五个或全部六个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；以及(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰，并且任选地，2个核苷酸的突出位于反义链的3’-末端，并且平端位于反义链的5’-末端。在一些实施例中，突出位于反义链的3’-末端，并且平端位于反义链的5’-末端。在一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。在一些实施例中，本发明的dsRNA分子在dsRNA双链体的两端也可以具有两个平端。
在一些实施例中，dsRNA在双链体的两端具有平端，其中反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，并且其中该至少一个热去稳定化核苷酸位于反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、或全部七个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；以及(vii)该dsRNA包含长度为12-40个核苷酸对的双链体区域。在一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。
在一些实施例中，dsRNA分子具有长度为19、20、21、22或23个核苷酸碱基对的双链体区域，并且在双链体的两端具有平端，其中dsRNA的一个末端是平端并且另一末端具有突出，其中反义链含有位于反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)的双链体的至少一个热去稳定化修饰，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、五个或全部六个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；以及(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰。在一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。在一些实施例中，本发明的dsRNA分子包含21个核苷酸(nt)的有义链和23个核苷酸(nt)的反义链，其中该反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸发生在该反义链的种子区域(即，在该反义链的5’-末端的位置2-9)，其中该dsRNA的一个末端是平端，而另一末端包含2个nt的突出，其中该dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；以及(vii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端。优选地，该2个nt的突出在该反义链的3′-末端处。在一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子包含有义链和反义链，其中：该有义链的长度是25-30个核苷酸残基，其中从5′末端核苷酸(位置1)起始，所述有义链的位置1至23包含至少8个核糖核苷酸；该反义链的长度是36-66个核苷酸残基，并且从3′末端核苷酸起始，在这些位置中的至少8核糖核苷酸与有义链的位置1-23配对以形成双链体；其中反义链的至少3′末端核苷酸不与有义链配对，以及高达6个连续的3′末端核苷酸不与有义链配对，从而形成1-6个核苷酸的3′单链突出；其中反义链的5′末端包含从10-30个连续的核苷酸，其不与有义链配对，从而形成10-30个核苷酸单链5′突出；其中当有义链和反义链针对最大互补性对齐时，至少有义链5′末端和3′末端核苷酸与反义链的核苷酸碱基配对，从而在有义链与反义链之间形成基本上双链的区域；当将所述双链核酸引入哺乳动物细胞时，反义链与靶RNA沿着反义链长度的至少19个核糖核苷酸充分互补，以减少靶基因表达；并且其中反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸位于反义链的种子区域(即，反义链的5’-末端的位置2-9)中，并且其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度。例如，热去稳定化核苷酸发生在与有义链的5’-末端的位置14-17相对或互补的位置之间，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；以及(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；以及(vii)该dsRNA包含长度为12-30个核苷酸对的双链体区域。在一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子包含有义链和反义链，其中所述dsRNA分子包含长度为至少25个和至多29个核苷酸的有义链以及长度为至多30个核苷酸的反义链，其中该有义链在从5’末端起的位置11处包含易受酶促降解影响的修饰的核苷酸，其中所述有义链的3’末端和所述反义链的5’末端形成平端，并且所述反义链在其3’末端比有义链长1-4个核苷酸，其中双链体区域的长度是至少25个核苷酸，并且当将所述dsRNA分子引入哺乳动物细胞中时，所述反义链与靶mRNA沿着所述反义链长度的至少19个nt充分互补以减少靶基因表达，并且其中所述dsRNA的dicer切割优选地产生包含所述反义链的所述3’末端的siRNA，从而减少该哺乳动物中靶基因的表达，其中该反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸位于该反义链的种子区域(即，在该反义链的5’-末端的位置2-9)，其中该dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；以及(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；以及(vii)该dsRNA具有长度为12-29个核苷酸对的双链体区域。在一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。
在一些实施例中，反义链包含在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，其中反义链含有位于反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)的双链体的至少一个热去稳定化修饰，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vii)该dsRNA包含长度为12-40个核苷酸对的双链体区域；以及(viii)该dsRNA在反义链的5’-末端具有平端。在一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。
在一些实施例中，反义链包含在核苷酸位置1与2之间、在核苷酸位置2与3之间、在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，其中反义链含有位于反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)的双链体的至少一个热去稳定化修饰，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该有义链与配体缀合；(iii)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(iv)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(v)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vi)该dsRNA包含长度为12-40个核苷酸对的双链体区域；(vii)该dsRNA包含长度为12-40个核苷酸对的双链体区域；以及(viii)该dsRNA在反义链的5’-末端具有平端。在一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。
在一些实施例中，有义链包含在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，其中反义链含有位于反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)的双链体的至少一个热去稳定化修饰，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vii)该dsRNA包含长度为12-40个核苷酸对的双链体区域；以及(viii)该dsRNA在反义链的5’-末端具有平端。在一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。
在一些实施例中，有义链包含在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，反义链包含在核苷酸位置1与2之间、在核苷酸位置2与3之间、在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，其中反义链含有位于反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)的双链体的至少一个热去稳定化修饰，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该有义链与配体缀合；(iii)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(iv)该有义链包含3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(v)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vi)该dsRNA包含长度为12-40个核苷酸对的双链体区域；以及(vii)该dsRNA在反义链的5’-末端具有平端。在一些实施例中，从约40℃至约80℃的Tm是任选的。
在一个方面，本发明提供了能够抑制靶基因表达的dsRNA分子，该dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，并且其中该反义链在种子区域内(即，在反义链的5′-末端的位置2-9，从5′-末端开始计数)包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且该dsRNA进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)：
(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；
(ii)该反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；
(iii)该有义链与配体缀合；
(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；
(v)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；
(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；
(vii)该dsRNA包含长度为12-40个核苷酸对的双链体区域；和
(viii)在该反义链的5’末端的平端。
在一些具体的实施例中，双链体的热去稳定化修饰在反义链的位置7(从反义链的5’-末端开始计数)。
在一些实施例中，双链体的热去稳定化修饰在反义链的位置2、3、4、5、6、8或9(从反义链的5’-末端开始计数)。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，并且其中该反义链在种子区域内(即，在反义链的5′-末端的位置2-9，从5′-末端开始计数)包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且反义链进一步包含以下特征中的一个或两个：
(i)2、3、4、5或6个2’-氟修饰；和
(ii)1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；并且
该有义链包含以下特征中的一个、两个、或三个：
(i)与该有义链缀合的配体；
(ii)2、3、4或5个2’-氟修饰；和
(iii)1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，并且其中该反义链在从5′-末端开始计数前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且配体与该有义链缀合。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，并且其中该反义链在从5′-末端开始计数前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，配体与该有义链缀合，并且dsRNA包含至少四个2’-氟修饰。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中dsRNA包含至少四个2’-氟，其中所述反义链在从5’-末端开始计数的前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且其中所述有义链包含配体。在此的一些另外的实施例中，配体是ASGPR配体。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中所述反义链包含位于从5’-末端开始计数位置4-8中的双链体的至少一个热去稳定化修饰，其中所述有义链包含配体，并且其中该有义链和该反义链各自包含至少两个2’-氟修饰。在此的一些另外的实施例中，配体是ASGPR配体。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中dsRNA包含至少四个2’-氟，其中所述反义链在从5’-末端开始计数的前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且其中所述有义链包含配体，并且其中该反义链进一步包含以下特征中的至少两个：(i)双链体的热去稳定化修饰位于该反义链的位置4至8；(ii)至少两个2’-氟修饰；(iii)在核苷酸位置1与2(从5’末端开始计数)之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；并且反义链的长度为18至35个核苷酸。在一些另外的实施例中，配体是ASGPR配体。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中dsRNA包含至少四个2’-氟，其中所述反义链在从5’-末端开始计数的前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且其中所述有义链包含配体，并且该有义链具有以下特征中的至少一个：(i)该配体附接至该有义链的任一末端；(ii)有义链包含至少两个2’-氟修饰；以及(iii)该有义链和该反义链显示出足够的互补性以形成跨至少19个核苷酸位置的双链区，并且其中该双链体的热去稳定化修饰位于所述双链区域内。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中dsRNA包含至少四个2’-氟，其中所述反义链在从5’-末端开始计数的前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且其中所述有义链包含配体，并且其中双链体的热去稳定化修饰选自下组，该组由以下组成：
其中B是修饰的或未修饰的核碱基，并且每个结构上的星号代表R、S或外消旋。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中所述反义链包含位于从5’-末端开始计数位置4-8中的双链体的至少一个热去稳定化修饰，其中所述有义链包含配体，并且其中有义链和反义链各自包含至少两个2’-氟修饰，并且其中双链体的热去稳定化修饰选自下组，该组由以下组成：
其中B是修饰的或未修饰的核碱基，并且每个结构上的星号代表R、S或外消旋。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中dsRNA包含至少四个2’-氟，其中所述反义链包含位于从反义链的5’-末端开始计数位置7处的双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且其中所述有义链包含配体。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中所述反义链包含位于从5’-末端开始计数位置7处的双链体的至少一个热去稳定化修饰，其中所述有义链包含配体，并且其中有义链和反义链各自包含至少两个2’-氟修饰，并且其中双链体的热去稳定化修饰选自下组，该组由以下组成：
其中B是修饰的或未修饰的核碱基，并且每个结构上的星号代表R、S或外消旋。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中dsRNA包含至少四个2’-氟，其中所述反义链在从5’-末端开始计数的前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且其中所述有义链包含配体，其中该配体包含通过二价或三价支链接头附接的一个或多个GalNAc衍生物。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中dsRNA包含至少四个2’-氟，其中所述反义链在从5’-末端开始计数的前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且其中所述有义链包含配体，其中该配体是以下结构的ASGPR配体：
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，包含3或4个2’-氟修饰，并且包含0、1、2或3个硫代磷酸酯核苷酸间键；其中反义链包含3、4、5或6个2’-氟修饰，包含2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’一末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，在位置7、10和11或在位置7、9、10和11(从有义链的5’-末端开始计数)处包含2’-氟修饰，并且任选地包含在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中反义链包含3、4、5或6个2’-氟修饰，包含2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，包含3或4个2’-氟修饰，并且包含0、1、2或3个硫代磷酸酯核苷酸间键；其中反义链在位置2、6、8、9、14或16，或在位置2、6、14或16，或在位置2、14和16处包含2’-氟修饰；并且反义链包含在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，包含3或4个2’-氟修饰，并且包含0、1、2或3个硫代磷酸酯核苷酸间键；其中反义链在位置2、6、8、9、14或16，或在位置2、6、14或16，或在位置2、14和16处包含2’-氟修饰；并且反义链包含在核苷酸位置21与22之间、在核苷酸位置22与23之间、在核苷酸位置1与2之间、在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，在位置7、10和11或在位置7、9、10和11(从有义链的5’-末端开始计数)处包含2’-氟修饰，并且任选地包含在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中反义链在位置2、6、8、9、14或16，或在位置2、6、14或16，或在位置2、14和16处包含2’-氟修饰；并且反义链包含在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，在位置7、10和11或在位置7、9、10和11(从有义链的5’-末端开始计数)处包含2’-氟修饰，并且任选地包含在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中反义链在位置2、6、8、9、14或16，或在位置2、6、14或16，或在位置2、14和16处包含2’-氟修饰；并且反义链包含在核苷酸位置21与22之间、在核苷酸位置22与23之间、在核苷酸位置1与2之间、在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。
在具体的实施例中，本发明的dsRNA分子包含：
(a)具有以下的有义链：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)附接至3’-末端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价支链接头附接的三个GalNAc衍生物；和
(iii)在位置7、10、和11(从5’末端开始计数)的2’-F修饰；
和
(b)具有以下的反义链：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置2、6至8、9、14、和16(从5’末端开始计数)的2’-F修饰；
(iii)在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间(从5’末端开始计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；和
(iv)在位置7(从5’末端开始计数)的双链体的热去稳定化修饰；
其中该dsRNA分子在该反义链的3’-末端具有两个核苷酸的突出，以及在该反义链的5’-末端具有平端。
在另一个具体的实施例中，本发明的dsRNA分子包含：
(a)具有以下的有义链：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)附接至3’-末端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价支链接头附接的三个GalNAc衍生物；
(iii)在位置7、9、10、和11(从5’末端开始计数)的2’-F修饰；和
(iv)在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间(从5’末端开始计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；
和
(b)具有以下的反义链：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置2、6、14、和16(从5’末端开始计数)的2’-F修饰；
(iii)在核苷酸位置1与2之间、在核苷酸位置2与3之间、在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间(从5’末端开始计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；和
(iv)在位置7(从5’末端开始计数)的双链体的热去稳定化修饰；
其中该dsRNA分子在该反义链的3’-末端具有两个核苷酸的突出，以及在该反义链的5’-末端具有平端。
在另一个具体的实施例中，本发明的dsRNA分子包含：
(a)具有以下的有义链：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)附接至3’-末端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价支链接头附接的三个GalNAc衍生物；
(iii)在位置7、9、10、和11(从5’末端开始计数)的2’-F修饰；和
(iv)在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间(从5’末端开始计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；
和
(b)具有以下的反义链：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置2、14、和16(从5’末端开始计数)的2’-F修饰；
(iii)在核苷酸位置1与2之间、在核苷酸位置2与3之间、在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间(从5’末端开始计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；和
(iv)在位置6或7(从5’末端开始计数)的双链体的热去稳定化修饰；
其中该dsRNA分子在该反义链的3’-末端具有两个核苷酸的突出，以及在该反义链的5’-末端具有平端。
在另一个具体的实施例中，本发明的dsRNA分子包含：
(a)具有以下的有义链：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)附接至3’-末端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价支链接头附接的三个GalNAc衍生物；
(iii)在位置7、9、10、和11(从5’末端开始计数)的2’-F修饰；和
(iv)在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间(从5’末端开始计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；
和
(b)具有以下的反义链：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置2、6、8、9、14、和16(从5’末端开始计数)的2’-F修饰；
(iii)在核苷酸位置1与2之间、在核苷酸位置2与3之间、在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间(从5’末端开始计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；和
(iv)在位置7(从5’末端开始计数)的双链体的热去稳定化修饰；其中该dsRNA分子在该反义链的3’-末端具有两个核苷酸的突出，以及在该反义链的5’-末端具有平端。
在另一个具体的实施例中，本发明的dsRNA分子包含具有以下的反义链：
(i)在位置2、14、和16(从5’末端开始计数)的2’-F修饰；和
(2)在位置6或7(从5’末端开始计数)的双链体的热去稳定化修饰。
在另一个具体的实施例中，本发明的dsRNA分子包含：
(a)具有以下的有义链：
(i)ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价支链接头附接的三个GalNAc衍生物；
(ii)在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间(从5’末端开始计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；
和
(b)具有以下的反义链：
(i)在位置2、14、和16(从5’末端开始计数)的2’-F修饰；
(ii)在位置6或7(从5’末端开始计数)的双链体的热去稳定化修饰；
在另一个具体的实施例中，本发明的dsRNA分子包含：
(a)具有以下的有义链：
(i)附接至3’-末端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价支链接头附接的三个GalNAc衍生物；
(ii)在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间(从5’末端开始计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；
和
(b)具有以下的反义链：
(ii)在位置2、14、和16(从5’末端开始计数)的2’-F修饰；
(iii)在核苷酸位置1与2之间、在核苷酸位置2与3之间、在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间(从5’末端开始计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；和
(iv)在位置6或7(从5’末端开始计数)的双链体的热去稳定化修饰；
其中该dsRNA分子在该反义链的3’-末端具有两个核苷酸的突出，以及在该反义链的5’-末端具有平端。
在一些实施例中，dsRNA分子进一步包含至少一个ASGPR配体。例如，ASGPR配体是通过二价或三价支链接头附接的一个或多个GalNAc衍生物，如：
在一个实例中，ASGPR配体附接至有义链的3’末端。
在一些情况下，在反义链的种子区域(例如，位置2-9，特别地位置3-9)的2’-氟修饰可以不利地影响dsRNA的体内活性，但对dsRNA的体外效力具有最小影响。诸位发明人尤其发现通过去除反义链的种子区域(即，位置2-9，特别地位置3-9，从5’-末端开始计数)的一些或全部2’-氟修饰，此类dsRNA的体内活性可以恢复到与亲本dsRNA相当的水平。
因此，在一些实施例中，本发明提供了能够抑制靶基因表达的dsRNA分子，该dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，并且其中该反义链在种子区域内(即，在反义链的5′-末端的位置2-9，从5′-末端开始计数)包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且该dsRNA进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或全部十个)：(i)从约40℃至约80℃的解链温度(Tm)；(ii)该反义链包含2、3、4、5、6、7、8、9、或10个2’-氟修饰；(iii)该反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iv)该有义链与配体缀合；(v)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(vi)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vii)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(viii)该dsRNA包含长度为12-40个核苷酸对的双链体区域；(ix)在该反义链的5’末端的平端；(x)该有义链包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰。
在一些实施例中，本发明提供了能够抑制靶基因表达的dsRNA分子，该dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，并且其中该反义链在种子区域内(即，在反义链的5′-末端的位置2-9，从5′-末端开始计数)包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且该dsRNA进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或全部十个)：(i)从约40℃至约80℃的解链温度(Tm)；(ii)该反义链包含2、3、4、5、6、7、8、9、或10个2’-氟修饰；(iii)该反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iv)该有义链与配体缀合；(v)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(vi)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vii)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(viii)该dsRNA包含长度为12-40个核苷酸对的双链体区域；(ix)在该反义链的5’末端的平端；以及(x)该有义链包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10各LNA修饰，并且其中在该反义链的位置3-9(从5’-末端开始计数)不存在2’-氟修饰。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，并且其中该反义链在种子区域内(即，在反义链的5′-末端的位置2-9，从5′-末端开始计数)包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且反义链进一步包含以下特征中的一个或两个：(i)2、3、4、5、6、7、8、9或10个2’-氟修饰，其中该反义链在位置3-9(从5’-末端开始计数)不具有2’-氟修饰；以及(ii)1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；并且该有义链包含四个以下特征中的一个、两个、三个：(i)与该有义链缀合的配体；(ii)2、3、4或5个2’-氟修饰；(iii)1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；以及(iv)1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，并且其中该反义链在种子区域内(即，在反义链的5′-末端的位置2-9，从5′-末端开始计数)包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且该反义链进一步包含：(i)2、3、4、5、6、7、8、9或10个2’-氟修饰；以及(ii)1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；并且该有义链包含：1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰，并且其中该有义链任选地包含以下特征中的一个、两个或三个：(i)与该有义链缀合的配体；(ii)2、3、4或5个2’-氟修饰；(iii)1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；以及(iv)1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，并且其中该反义链在种子区域内(即，在反义链的5′-末端的位置2-9，从5′-末端开始计数)包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且该反义链进一步包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中该反义链任选地包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个2’-氟修饰；并且该有义链包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰，并且其中该有义链任选地包含与该有义链缀合的配体，2、3、4或5个2’-氟修饰；和/或1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，并且其中该反义链在种子区域内(即，在反义链的5′-末端的位置2-9，从5′-末端开始计数)包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且该反义链进一步包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中该反义链任选地包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个2’-氟修饰，其条件是在位置3-9(从5’-末端开始计数)不存在2’-氟修饰；并且该有义链包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰，并且其中该有义链任选地包含与该有义链缀合的配体，2、3、4或5个2’-氟修饰；和/或1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，并且其中该反义链在从5′-末端开始计数前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，配体与该有义链缀合，并且dsRNA包含至少四个2’-氟修饰，并且其中在反义链的位置3-9(从5’-末端开始计数)不存在2’-氟修饰。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中dsRNA包含至少四个2’-氟，其中所述反义链在从5’-末端开始计数的前9个核苷酸位置内(包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，所述有义链包含配体，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中在该反义链的位置3-9(从5’-末端开始计数)不存在2’-氟修饰。在此的一些另外的实施例中，配体是ASGPR配体。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中所述反义链包含位于从5’-末端开始计数位置4-8中的双链体的至少一个热去稳定化修饰，其中所述有义链包含配体，其中该有义链和该反义链各自包含至少两个2’-氟修饰，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中在该反义链的位置3-9(从5’-末端开始计数)不存在2’-氟修饰。在此的一些另外的实施例中，配体是ASGPR配体。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中dsRNA包含至少四个2’-氟，其中所述反义链在从5’-末端开始计数的前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且其中所述有义链包含配体，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中该反义链进一步包含以下特征中的至少两个：(i)双链体的热去稳定化修饰位于该反义链的位置4至8；(ii)至少两个2’-氟修饰；(iii)在核苷酸位置1与2(从5’末端开始计数)之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；以及(iv)反义链具有18至35个核苷酸的长度，并且其中在反义链的位置3-9(从5’-末端开始计数)不存在2’-氟修饰。在一些另外的实施例中，配体是ASGPR配体。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中dsRNA包含至少四个2’-氟，其中所述反义链在从5’-末端开始计数的前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且其中所述有义链包含配体，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且该有义链具有以下特征中的至少一个：(i)该配体附接至该有义链的任一末端；(ii)有义链包含至少两个2’-氟修饰；(iii)有义链包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰；以及(iv)该有义链和该反义链显示出足够的互补性以形成跨至少19个核苷酸位置的双链区，其中双链体的热去稳定化修饰位于所述双链区域内，并且其中在该反义链的位置3-9(从5’-末端开始计数)不存在2’-氟修饰。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中所述反义链包含位于从5’-末端开始计数位置4-8中的双链体的至少一个热去稳定化修饰，其中所述有义链包含配体和任选的至少一个LNA修饰，并且其中该有义链和该反义链各自包含至少两个2’-氟修饰，其中在该反义链的位置3-9(从5’-末端开始计数)不存在2’-氟修饰，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中双链体的热去稳定化修饰选自下组，该组由以下组成：
其中B是修饰的或未修饰的核碱基，并且每个结构上的星号代表R、S或外消旋。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中dsRNA包含至少四个2’-氟，其中所述反义链包含位于从反义链的5’-末端开始计数位置5、6或7处的双链体的至少一个热去稳定化修饰，其中在该反义链的位置3-9(从5’-末端开始计数)不存在2’-氟修饰，其中所述有义链包含配体和任选的至少一个LNA修饰，并且其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中所述反义链包含位于从5’-末端开始计数位置5、6或7处的双链体的至少一个热去稳定化修饰，其中所述有义链包含配体和任选的至少一个LNA修饰，并且其中该有义链和该反义链各自包含至少两个2’-氟修饰，其中在该反义链的位置3-9(从5’-末端开始计数)不存在2’-氟修饰，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中双链体的热去稳定化修饰选自下组，该组由以下组成：
其中B是修饰的或未修饰的核碱基，并且每个结构上的星号代表R、S或外消旋。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中dsRNA包含至少四个2’-氟，其中所述反义链在从5’-末端开始计数的前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，其中所述有义链包含配体和任选的至少一个LNA修饰，其中在该反义链的位置3-9(从5’-末端开始计数)不存在2’-氟修饰，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中该配体包含通过二价或三价支链接头附接的一个或多个GalNAc衍生物。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中dsRNA包含至少四个2’-氟，其中所述反义链在从5’-末端开始计数的前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且其中所述有义链包含配体和任选的至少一个LNA修饰，其中在该反义链的位置3-9(从5’-末端开始计数)不存在2’-氟修饰，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，，并且其中配体是以下结构的ASGPR配体：
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，并且任选地包含至少一个LNA修饰，包含3或4个2’-氟修饰，并且包含0、1、2或3个硫代磷酸酯核苷酸间键；其中反义链包含3、4、5或6个2’-氟修饰(其条件是在反义链的位置3-9(从5’-末端开始计数)不存在2’-修饰)，包含2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，在位置7、10和11或在位置7、9、10和11(从有义链的5’-末端开始计数)处包含2’-氟修饰，并且任选地包含在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，并且任选地包含至少一个LNA修饰；其中反义链包含3、4、5或6个2’-氟修饰(其条件是在反义链的位置3-9(从5’-末端开始计数)不存在2’-修饰)，包含2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，包含3或4个2’-氟修饰，包含0、1、2或3个硫代磷酸酯核苷酸间键，并且任选地包含至少一个LNA修饰；其中反义链在位置2、14或16包含2’-氟修饰；并且反义链包含在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，包含3或4个2’-氟修饰，包含至少一个LNA修饰，并且任选地包含0、1、2或3个硫代磷酸酯核苷酸间键；其中反义链在位置2、14或16包含2’-氟修饰；并且反义链包含在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，包含3或4个2’-氟修饰，并且包含0、1、2或3个硫代磷酸酯核苷酸间键，并且任选地包含至少一个LNA修饰；其中反义链在位置2、14或16包含2’-氟修饰；并且反义链包含在核苷酸位置21与22之间、在核苷酸位置22与23之间、在核苷酸位置1与2之间、在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，包含3或4个2’-氟修饰，包含0、1、2或3个硫代磷酸酯核苷酸间键，并且包含至少一个LNA修饰；其中反义链在位置2、14或16包含2’-氟修饰；并且反义链包含在核苷酸位置21与22之间、在核苷酸位置22与23之间、在核苷酸位置1与2之间、在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，在位置7、10和11或在位置7、9、10和11(从有义链的5’-末端开始计数)处包含2’-氟修饰，任选地包含在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，并且任选地包含至少一个LNA修饰；其中反义链在位置2、14或16包含2’-氟修饰；并且反义链包含在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，在位置7、10和11或在位置7、9、10和11(从有义链的5’-末端开始计数)处包含2’-氟修饰，包含至少一个LNA修饰，并且任选地包含在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中反义链在位置2、14或16包含2’-氟修饰；并且反义链包含在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸，其中反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，并且其中该至少一个热去稳定化核苷酸位于反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或全部九个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰，其条件是在该反义链的位置3-9(从5’-末端开始计数)不存在2’-修饰；(ii)该反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vii)该dsRNA包含长度为18、19、20、21、22、23、24或24个核苷酸对的双链体区域；(viii)该dsRNA在该有义链的5’-末端包含平端；以及(ix)该有义链包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰。在一些具体的实施例中，有义链的长度是19、20或21或22个核苷酸，并且反义链的长度是20、21或22个核苷酸。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸，其中反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸以及1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键，并且其中该至少一个热去稳定化核苷酸位于反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)，有义链包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、或全部七个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰，其条件是在该反义链的位置3-9(从5’-末端开始计数)不存在2’-修饰；(ii)该有义链与配体缀合；(iii)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(iv)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(v)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vi)该dsRNA包含长度为18、19、20、21、22、23、24或24个核苷酸对的双链体区域；以及(vii)该dsRNA在该有义链的5’-末端包含平端。在一些具体的实施例中，有义链的长度是19、20或21或22个核苷酸，并且反义链的长度是20、21或22个核苷酸。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，在位置7、10和11或在位置7、9、10和11(从有义链的5’-末端开始计数)包含2’-氟修饰，任选地包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰，并且任选地包含在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中反义链在位置2、9、14或16，或者在位置2、14或16包含2’-氟修饰；并且反义链包含在核苷酸位置21与22之间、在核苷酸位置22与23之间、在核苷酸位置1与2之间、在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，在位置7、10和11或在位置7、9、10和11(从有义链的5’-末端开始计数)包含2’-氟修饰，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LAN修饰，并且任选地包含在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中反义链在位置2、9、14或16，或者在位置2、14或16包含2’-氟修饰；并且反义链包含在核苷酸位置21与22之间、在核苷酸位置22与23之间、在核苷酸位置1与2之间、在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，dsRNA的一个末端是平端并且另一末端具有突出，其中反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，并且其中该至少一个热去稳定化核苷酸位于反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰，其中在位置3-9(从5’-末端开始计数)不存在2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vii)该dsRNA包含长度为12-40个核苷酸对的双链体区域；以及(vii)该有义链包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10各LNA修饰。在一些实施例中，突出位于反义链的3’-末端，并且平端位于反义链的5’-末端。在一些具体的实施例中，突出的长度是2、3或4个核苷酸。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，dsRNA分子具有长度为19、20、21、22或23个核苷酸碱基对的双链体区域，其中dsRNA的一个末端是平端并且另一末端具有突出，其中反义链含有位于反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)的双链体的至少一个热去稳定化修饰，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、五个、六个或全部七个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰，其中在位置3-9(从反义链的5’-末端开始计数)不存在2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；以及(vii)该有义链包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰，并且任选地2个核苷酸的突出位于反义链的3’-末端并且平端位于反义链的5’-末端。在一些实施例中，突出位于反义链的3’-末端，并且平端位于反义链的5’-末端。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子在dsRNA双链体的两端也可以具有两个平端。
在一些实施例中，dsRNA在双链体的两端具有平端，其中反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，并且其中该至少一个热去稳定化核苷酸位于反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰，其中在位置3-9(从反义链的5’-末端开始计数)不存在2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vii)该dsRNA包含长度为12-40个核苷酸对的双链体区域；以及(viii)该有义链包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，dsRNA分子具有长度为19、20、21、22或23个核苷酸碱基对的双链体区域，并且在双链体的两端具有平端，其中dsRNA的一个末端是平端并且另一末端具有突出，其中反义链含有位于反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)的双链体的至少一个热去稳定化修饰，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、五个、六个或全部七个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰，其中在位置3-9(从反义链的5’-末端开始计数)不存在2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；以及(vii)该有义链包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子包含21个核苷酸(nt)的有义链和23个核苷酸(nt)的反义链，其中该反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸发生在该反义链的种子区域(即，在该反义链的5’-末端的位置2-9)，其中该dsRNA的一个末端是平端，而另一末端包含2个nt的突出，其中该dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰，其中在位置3-9(从反义链的5’-末端开始计数)不存在2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端。优选地，该2个nt的突出在反义链的3’-末端；以及(viii)该有义链包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子包含有义链和反义链，其中：该有义链的长度是25-30个核苷酸残基，其中从5′末端核苷酸(位置1)起始，所述有义链的位置1至23包含至少8个核糖核苷酸；该反义链的长度是36-66个核苷酸残基，并且从3′末端核苷酸起始，在这些位置中的至少8核糖核苷酸与有义链的位置1-23配对以形成双链体；其中反义链的至少3′末端核苷酸不与有义链配对，以及高达6个连续的3′末端核苷酸不与有义链配对，从而形成1-6个核苷酸的3′单链突出；其中反义链的5′末端包含从10-30个连续的核苷酸，其不与有义链配对，从而形成10-30个核苷酸单链5′突出；其中当有义链和反义链针对最大互补性对齐时，至少有义链5′末端和3′末端核苷酸与反义链的核苷酸碱基配对，从而在有义链与反义链之间形成基本上双链的区域；当将所述双链核酸引入哺乳动物细胞时，反义链与靶RNA沿着反义链长度的至少19个核糖核苷酸充分互补，以减少靶基因表达；并且其中反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸位于反义链的种子区域(即，反义链的5’-末端的位置2-9)中，并且其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度。例如，热去稳定化核苷酸发生在与有义链的5’-末端的位置14-17相对或互补的位置之间，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰，其中在位置3-9(从反义链的5’-末端开始计数)不存在2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；以及(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vii)该dsRNA包含长度为12-30个核苷酸对的双链体区域；以及该有义链包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子包含有义链和反义链，其中所述dsRNA分子包含长度为至少25个和至多29个核苷酸的有义链以及长度为至多30个核苷酸的反义链，其中该有义链在从5’末端起的位置11处包含易受酶促降解影响的修饰的核苷酸，其中所述有义链的3’末端和所述反义链的5’末端形成平端，并且所述反义链在其3’末端比有义链长1-4个核苷酸，其中双链体区域的长度是至少25个核苷酸，并且当将所述dsRNA分子引入哺乳动物细胞中时，所述反义链与靶mRNA沿着所述反义链长度的至少19个nt充分互补以减少靶基因表达，并且其中所述dsRNA的dicer切割优选地产生包含所述反义链的所述3’末端的siRNA，从而减少该哺乳动物中靶基因的表达，其中该反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸位于该反义链的种子区域(即，在该反义链的5’-末端的位置2-9)，其中该dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰，其中在位置3-9(从反义链的5’-末端开始计数)不存在2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；以及(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vii)该dsRNA具有长度为12-29个核苷酸对的双链体区域；(viii)以及该有义链包含1、2、3、4、5、7、8、9或10个LNA修饰。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，反义链包含在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，其中反义链含有位于反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)的双链体的至少一个热去稳定化修饰，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或全部九个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰，其中在位置3-9(从反义链的5’-末端开始计数)不存在2’-氟修饰；(ii)该反义链包含3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vii)该dsRNA包含长度为12-40个核苷酸对的双链体区域；(viii)该dsRNA在该反义链的5’-末端具有平端；(ix)以及该有义链包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，反义链包含在核苷酸位置1与2之间、在核苷酸位置2与3之间、在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，其中反义链含有位于反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)的双链体的至少一个热去稳定化修饰，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或全部九个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰，其中在位置3-9(从反义链的5’-末端开始计数)不存在2’-氟修饰；(ii)该有义链与配体缀合；(iii)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(iv)该有义链包含l、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(v)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vi)该dsRNA包含长度为12-40个核苷酸对的双链体区域；(vii)该dsRNA包含长度为12-40个核苷酸对的双链体区域；(viii)该dsRNA在该反义链的5’-末端具有平端；以及(ix)以及该有义链包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，有义链包含在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，其中反义链含有位于反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)的双链体的至少一个热去稳定化修饰，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或全部九个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰，其中在位置3-9(从反义链的5’-末端开始计数)不存在2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vii)该dsRNA包含长度为12-40个核苷酸对的双链体区域；(viii)该dsRNA在该反义链的5’-末端具有平端；以及(ix)该有义链包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，有义链包含在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，反义链包含在核苷酸位置1与2之间、在核苷酸位置2与3之间、在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，其中反义链含有位于反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)的双链体的至少一个热去稳定化修饰，其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该有义链与配体缀合；(iii)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰，其中在位置3-9(从反义链的5’-末端开始计数)不存在2’-氟修饰；(iv)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(v)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vi)该dsRNA包含长度为12-40个核苷酸对的双链体区域；(vii)该dsRNA在该反义链的5’-末端具有平端；以及(viii)该有义链包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一个方面，本发明提供了能够抑制靶基因表达的dsRNA分子，该dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，并且其中该反义链在种子区域内(即，在反义链的5′-末端的位置2-9，从5′-末端开始计数)包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且该dsRNA进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或全部九个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰，其中在位置3-9(从5’-末端开始计数)不存在2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vii)该dsRNA包含长度为12-40个核苷酸对的双链体区域；(viii)在该反义链的5’末端的平端；以及(ix)该有义链包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些具体的实施例中，双链体的热去稳定化修饰在反义链的位置5、6或7(从反义链的5’-末端开始计数)。在一些实施例中，双链体的热去稳定化修饰在反义链的位置2、3、4、8或9(从反义链的5’-末端开始计数)。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，并且其中该反义链在种子区域内(即，在反义链的5′-末端的位置2-9，从5′-末端开始计数)包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且反义链进一步包含以下特征中的一个或两个：(i)2、3、4、5或6个2’-氟修饰，其中在位置3-9(从反义链的5’-末端开始计数)不存在2’-修饰；以及(ii)1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；并且该有义链包含以下特征中的一个、两个、三个或四个：(i)与该有义链缀合的配体；(ii)2、3、4或5个2’-氟修饰；(iii)1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；以及(iv)1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，并且其中该反义链在从5′-末端开始计数前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，配体与该有义链缀合，并且dsRNA包含至少四个2’-氟修饰，并且其中在反义链的位置3-9(从反义链的5’-末端开始计数)不存在2’-修饰。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中dsRNA包含至少四个2’-氟，其中所述反义链在从5’-末端开始计数的前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且其中所述有义链包含配体，并且其中在该反义链的位置3-9(从反义链的5’-末端开始计数)不存在2’-修饰。在此的一些另外的实施例中，配体是ASGPR配体。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中所述反义链包含位于从5’-末端开始计数位置4-8中的双链体的至少一个热去稳定化修饰，其中所述有义链包含配体，并且其中该有义链和该反义链各自包含至少两个2’-氟修饰，并且其中在该反义链的位置3-9(从反义链的5’-末端开始计数)不存在2’-修饰。在此的一些另外的实施例中，配体是ASGPR配体。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中dsRNA包含至少四个2’-氟，其中所述反义链在从5’-末端开始计数的前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且其中所述有义链包含配体，并且其中该反义链进一步包含以下特征中的至少两个：(i)双链体的热去稳定化修饰位于该反义链的位置4至8；(ii)至少两个2’-氟修饰，并且其中在该反义链的位置3-9(从反义链的5’-末端开始计数)不存在2’-修饰；(iii)在核苷酸位置1与2(从5’末端开始计数)之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；并且反义链的长度为18至35个核苷酸。在一些另外的实施例中，配体是ASGPR配体。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中dsRNA包含至少四个2’-氟，其中所述反义链在从5’-末端开始计数的前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且其中所述有义链包含配体，并且该有义链具有以下特征中的至少一个：(i)该配体附接至该有义链的任一末端；(ii)有义链包含至少两个2’-氟修饰；(iii)该有义链和该反义链显示足够的互补性以形成跨至少19核苷酸位置的双链区域；(iv)该有义链包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰，并且其中双链体的热去稳定化修饰位于所述双链区域内，并且其中在该反义链的位置3-9(从反义链的5’-末端开始计数)不存在2’-修饰。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中dsRNA包含至少四个2’-氟，其中在该反义链的位置3-9(从反义链的5’-末端开始计数)不存在2’-修饰，其中所述反义链在从5’-末端开始计数的前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且其中所述有义链包含配体，并且其中双链体的热去稳定化修饰选自下组，该组由以下组成：
其中B是修饰的或未修饰的核碱基，并且每个结构上的星号代表R、S或外消旋。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中所述反义链包含位于从5’-末端开始计数位置4-8中的双链体的至少一个热去稳定化修饰，其中所述有义链包含配体，并且其中该有义链和该反义链各自包含至少两个2’-氟修饰，其中在该反义链的位置3-9(从反义链的5’-末端开始计数)不存在2’-修饰，并且其中双链体的热去稳定化修饰选自下组，该组由以下组成：
其中B是修饰的或未修饰的核碱基，并且每个结构上的星号代表R、S或外消旋。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中dsRNA包含至少四个2’-氟，其中在该反义链的位置3-9(从反义链的5’-末端开始计数)不存在2’-修饰，其中所述反义链包含位于从反义链的5’-末端开始计数位置5，6或7处的双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且其中所述有义链包含配体。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中所述反义链包含位于从5’-末端开始计数位置5、6或7处的双链体的至少一个热去稳定化修饰，其中所述有义链包含配体，并且其中该有义链和该反义链各自包含至少两个2’-氟修饰，其中在该反义链的位置3-9(从反义链的5’-末端开始计数)不存在2’-修饰，并且其中双链体的热去稳定化修饰选自下组，该组由以下组成：
其中B是修饰的或未修饰的核碱基，并且每个结构上的星号代表R、S或外消旋。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中dsRNA包含至少四个2’-氟，其中在该反义链的位置3-9(从反义链的5’-末端开始计数)不存在2’-修饰，其中所述反义链在从5’-末端开始计数的前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且其中所述有义链包含配体，其中该配体包含通过二价或三价支链接头附接的一个或多个GalNAc衍生物。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中dsRNA包含至少四个2’-氟，其中在该反义链的位置3-9(从反义链的5’-末端开始计数)不存在2’-修饰，其中所述反义链在从5’-末端开始计数的前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且其中所述有义链包含配体，其中该配体是以下结构的ASGPR配体：
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，包含3或4个2’-氟修饰，并且包含0、1、2或3个硫代磷酸酯核苷酸间键；其中反义链包含3、4、5或6个2’-氟修饰，包含2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，在位置7、10和11或在位置7、9、10和11(从有义链的5’-末端开始计数)处包含2’-氟修饰，任选地包含在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，并且任选地包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰；其中该反义链包含3、4、5或6个2’-氟修饰(其中在该反义链的位置3-9不存在2’-氟修饰)，包含2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，包含3或4个2’-氟修饰，包含0或2个硫代磷酸酯核苷酸间键，并且任选地包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰；其中反义链在位置2、14或16，或者在位置2、14和16包含2’-氟修饰；并且反义链包含在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，包含3或4个2’-氟修饰，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰，并且任选地包含0或2个硫代磷酸酯核苷酸间键；其中反义链在位置2、14或16，或者在位置2、14和16包含2’-氟修饰；并且反义链包含在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，包含3或4个2’-氟修饰，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰，并且包含0、1、2或3个硫代磷酸酯核苷酸间键；其中反义链在位置2、14或16，或者在位置2、14和16包含2’-氟修饰；并且反义链包含在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，包含3或4个2’-氟修饰，包含0、1、2或3个硫代磷酸酯核苷酸间键，并且任选地包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰；其中反义链在位置2、14或16包含2’-氟修饰；并且反义链包含在核苷酸位置21与22之间、在核苷酸位置22与23之间、在核苷酸位置1与2之间、在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，包含3或4个2’-氟修饰，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰，并且任选地包含0、1、2或3个硫代磷酸酯核苷酸间键；其中反义链在位置2、14或16包含2’-氟修饰；并且反义链包含在核苷酸位置21与22之间、在核苷酸位置22与23之间、在核苷酸位置1与2之间、在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，包含3或4个2’-氟修饰，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰，并且包含0、1、2、或3个硫代磷酸酯核苷酸间键；其中反义链在位置2、14或16包含2’-氟修饰；并且反义链包含在核苷酸位置21与22之间、在核苷酸位置22与23之间、在核苷酸位置1与2之间、在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，在位置7、10和11或在位置7、9、10和11(从有义链的5’-末端开始计数)处包含2’-氟修饰，并且任选地包含在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，并且任选地包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰；其中反义链在位置2、14和16包含2’-氟修饰；并且反义链包含在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，在位置7、10和11或在位置7、9、10和11(从有义链的5’-末端开始计数)包含2’-氟修饰，包含在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，并且任选地包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰；其中反义链在位置2、14和16包含2’-氟修饰；并且反义链包含在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，在位置7、10和11或在位置7、9、10和11(从有义链的5’-末端开始计数)包含2’-氟修饰，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰，并且任选地包含在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中反义链在位置2、14和16包含2’-氟修饰；并且反义链包含在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，在位置7、10和11或在位置7、9、10和11(从有义链的5’-末端开始计数)包含2’-氟修饰，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰，并且包含在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中反义链在位置2、14和16包含2’-氟修饰；并且反义链包含在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，在位置7、10和11或在位置7、9、10和11(从有义链的5’-末端开始计数)处包含2’-氟修饰，任选地包含在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，并且任选地包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰；其中反义链在位置2、14或16包含2’-氟修饰；并且反义链包含在核苷酸位置21与22之间、在核苷酸位置22与23之间、在核苷酸位置1与2之间、在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，在位置7、10和11或在位置7、9、10和11(从有义链的5’-末端开始计数)包含2’-氟修饰，包含在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，并且任选地包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰；其中反义链在位置2、14或16包含2’-氟修饰；并且反义链包含在核苷酸位置21与22之间、在核苷酸位置22与23之间、在核苷酸位置1与2之间、在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；其中有义链与配体缀合，在位置7、10和11或在位置7、9、10和11(从有义链的5’-末端开始计数)包含2’-氟修饰，任选地包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个LNA修饰，并且任选地包含在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中反义链在位置2、14或16包含2’-氟修饰；并且反义链包含在核苷酸位置21与22之间、在核苷酸位置22与23之间、在核苷酸位置1与2之间、在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25个核苷酸对的双链体区域；(ii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端；以及(iii)该dsRNA在反义链的3’-末端具有至少两个核苷酸的突出。
在一些实施例中，dsRNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，并且其中该反义链在种子区域内(即，在反义链的5′-末端的位置2-9，从5′-末端开始计数)包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且dsRNA具有从约40℃至约80℃的解链温度(Tm)，并且dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或全部九个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vii)该dsRNA包含长度为12-40个核苷酸对的双链体区域；(viii)在该反义链的5’末端的平端；(ix)其条件是在该反义链的位置3-9(从5’-末端开始计数)不存在2’-氟修饰。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，dsRNA分子具有长度为12-40个核苷酸对的双链体区域，其中反义链在种子区域内(即，在反义链的5’-末端的位置2-9，从开始计数5′-末端)包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且dsRNA具有从约40℃至约80℃的Tm，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；以及vii)在该反义链的5’末端的平端，其条件是在该反义链的位置3-9(从5’-末端开始计数)不存在2’-氟修饰。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。
在一些实施例中，dsRNA分子具有长度为19、20、21、22或23个核苷酸碱基对的双链体区域，其中反义链含有位于反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)中的双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且其中dsRNA具有约40℃至约80℃的解链温度，其条件是在反义链的位置3-9(从5’-末端开始计数)不存在2’-氟修饰。在一些实施例中，约40℃至约80℃的解链温度是任选的。在具体的实施例中，本发明的dsRNA分子包含：
(a)具有以下的有义链：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)附接至3’-末端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价支链接头附接的三个GalNAc衍生物；和
(iii)在位置7、10、和11(从5’末端开始计数)的2’-F修饰；
和
(b)具有以下的反义链：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置2、14和16(从5’末端开始计数)的2’-F修饰；
(iii)在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间(从5’末端开始计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；和
(iv)在位置5、6或7(从5’末端开始计数)的双链体的热去稳定化修饰；
其中该dsRNA分子在该反义链的3’-末端具有两个核苷酸的突出，以及在该反义链的5’-末端具有平端。
在另一个具体的实施例中，本发明的dsRNA分子包含：
(a)具有以下的有义链：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)附接至3’-末端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价支链接头附接的三个GalNAc衍生物；
(iii)在位置7、9、10、和11(从5’末端开始计数)的2’-F修饰；和
(iv)在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间(从5’末端开始计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；
和
(b)具有以下的反义链：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置2、14、和16(从5’末端开始计数)的2’-F修饰；
(iii)在核苷酸位置1与2之间、在核苷酸位置2与3之间、在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间(从5’末端开始计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；和
(iv)在位置5、6或7(从5’末端开始计数)的双链体的热去稳定化修饰；
其中该dsRNA分子在该反义链的3’-末端具有两个核苷酸的突出，以及在该反义链的5’-末端具有平端。
在另一个具体的实施例中，本发明的dsRNA分子包含：
(a)具有以下的有义链：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)附接至3’-末端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价支链接头附接的三个GalNAc衍生物；
(iii)在位置7、9、10、和11(从5’末端开始计数)的2’-F修饰；和
(iv)在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间(从5’末端开始计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；
和
(b)具有以下的反义链：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置2、14、和16(从5’末端开始计数)的2’-F修饰；
(iii)在核苷酸位置1与2之间、在核苷酸位置2与3之间、在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间(从5’末端开始计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；和
(iv)在位置5、6或7(从5’末端开始计数)的双链体的热去稳定化修饰；
其中该dsRNA分子在该反义链的3’-末端具有两个核苷酸的突出，以及在该反义链的5’-末端具有平端。
在另一个具体的实施例中，本发明的dsRNA分子包含：
(a)具有以下的有义链：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)附接至3’-末端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价支链接头附接的三个GalNAc衍生物；
(iii)在位置7、9、10、和11(从5’末端开始计数)的2’-F修饰；和
(iv)至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)LNA修饰；
和
(b)具有以下的反义链：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置2、14、和16(从5’末端开始计数)的2’-F修饰；
(iii)在核苷酸位置1与2之间、在核苷酸位置2与3之间、在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间(从5’末端开始计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；和
(iv)在位置5、6或7(从5’末端开始计数)的双链体的热去稳定化修饰；
其中该dsRNA分子在该反义链的3’-末端具有两个核苷酸的突出，以及在该反义链的5’-末端具有平端。
在另一个具体的实施例中，本发明的dsRNA分子包含：
(a)具有以下的有义链：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)附接至3’-末端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价支链接头附接的三个GalNAc衍生物；
(iii)在位置7、9、10、和11(从5’末端开始计数)的2’-F修饰；和
(iv)在位置1、2和3(从5’末端开始计数)的至少一个(例如，一个、两个或三个)LNA修饰；
和
(b)具有以下的反义链：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置2、14、和16(从5’末端开始计数)的2’-F修饰；
(iii)在核苷酸位置1与2之间、在核苷酸位置2与3之间、在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间(从5’末端开始计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；和
(iv)在位置5、6或7(从5’末端开始计数)的双链体的热去稳定化修饰；
其中该dsRNA分子在该反义链的3’-末端具有两个核苷酸的突出，以及在该反义链的5’-末端具有平端。
在另一个具体的实施例中，本发明的dsRNA分子包含：
(a)具有以下的有义链：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)附接至3’-末端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价支链接头附接的三个GalNAc衍生物；
(iii)在位置7、9、10、和11(从5’末端开始计数)的2’-F修饰；
(iv)至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)LNA修饰；和
(iv)在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间(从5’末端开始计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；
和
(b)具有以下的反义链：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置2、14、和16(从5’末端开始计数)的2’-F修饰；
(iii)在核苷酸位置1与2之间、在核苷酸位置2与3之间、在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间(从5’末端开始计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；和
(iv)在位置5、6或7(从5’末端开始计数)的双链体的热去稳定化修饰；
其中该dsRNA分子在该反义链的3’-末端具有两个核苷酸的突出，以及在该反义链的5’-末端具有平端。
在另一个具体的实施例中，本发明的dsRNA分子包含：
(a)具有以下的有义链：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)附接至3’-末端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价支链接头附接的三个GalNAc衍生物；
(iii)在位置7、9、10、和11(从5’末端开始计数)的2’-F修饰；和
(iv)在位置1、2和3(从5’末端开始计数)的至少一个(例如，一个、两个或三个)LNA修饰；
和
(b)具有以下的反义链：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置2、14、和16(从5’末端开始计数)的2’-F修饰；
(iii)在核苷酸位置1与2之间、在核苷酸位置2与3之间、在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间(从5’末端开始计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；和
(iv)在位置5、6或7(从5’末端开始计数)的双链体的热去稳定化修饰；
其中该dsRNA分子在该反义链的3’-末端具有两个核苷酸的突出，以及在该反义链的5’-末端具有平端。
在另一个具体的实施例中，本发明的dsRNA分子包含：
(a)具有以下的有义链：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)附接至3’-末端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价支链接头附接的三个GalNAc衍生物；
(iii)在位置7、9、10、和11(从5’末端开始计数)的2’-F修饰；
(iv)在位置1、2和3(从5’末端开始计数)的至少一个(例如，一个、两个或三个)LNA修饰；和
(iv)在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间(从5’末端开始计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；
和
(b)具有以下的反义链：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置2、14、和16(从5’末端开始计数)的2’-F修饰；
(iii)在核苷酸位置1与2之间、在核苷酸位置2与3之间、在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间(从5’末端开始计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；和
(iv)在位置5、6或7(从5’末端开始计数)的双链体的热去稳定化修饰；
其中该dsRNA分子在该反义链的3’-末端具有两个核苷酸的突出，以及在该反义链的5’-末端具有平端。
在一些实施例中，有义链和反义链的长度独立地是19、20、21、22、23、24或25个核苷酸，其中反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，并且其中该至少一个热去稳定化核苷酸位于反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vii)该dsRNA包含长度为18、19、20、21、22、23、24或24个核苷酸对的双链体区域；以及(viii)该dsRNA在该有义链的5’-末端包含平端。在一些具体的实施例中，有义链的长度是19、20或21或22个核苷酸，并且反义链的长度是20、21或22个核苷酸。
该有义链和反义链典型地形成一个双链体dsRNA。dsRNA分子的双链体区域的长度可以是12-40个核苷酸对。例如，双链体区域的长度可以在14-40个核苷酸对之间、17-30个核苷酸对之间、在25-35个核苷酸之间、在27-35个核苷酸对之间、在17-23个核苷酸对之间、在17-21个核苷酸对之间、在17-19个核苷酸对之间、在19-25个核苷酸对之间、在19-23个核苷酸对之间、在19-21个核苷酸对之间、在21-25个核苷酸对之间、或在21-23核苷酸对之间。在另一个实例中，双链体区域的长度选自15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、和27个核苷酸对。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子具有长度为12-40核苷酸对的双链体区域，其中反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，并且其中至少一个热去稳定化核苷酸位于反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；以及(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；以及(vii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端。在一些具体的实施例中，双链体区域的长度为18、19、20、21、22或23个核苷酸对。在具体的实施例中，双链体区域的长度为21个核苷酸对。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子在链的3’-末端、或5’-末端、或两端包含dsRNA分子的一个或多个突出区域和/或封端基团。突出的长度可以为1-10个核苷酸、长度为1-6个核苷酸，例如长度为2-6个核苷酸、长度为1-5个核苷酸、长度为2-5个核苷酸、长度为1-4个核苷酸、长度为2-4个核苷酸、长度为1-3个核苷酸、长度为2-3个核苷酸、或长度为1-2个核苷酸。该突出可以是其中一条链比另一条链长的结果，或者是相同长度的两条链交错的结果。该突出可以与该标靶mRNA形成一个错配，或它可以与靶向的基因序列互补或可以是其他序列。第一条链和第二条链也可以例如通过另外的碱基结合形成发夹或通过其他非碱基连接体结合。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子的突出区域中的核苷酸可以各自独立地是被修饰的或未被修饰的核苷酸，这些核苷酸包括但不限于2’-糖修饰的，如2’-氟2’-O-甲基、胸苷(T)、2’-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷、2’-O-甲氧基乙基腺苷、2’-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷、GNA、SNA、hGNA、hhGNA、mGNA、TNA、h’GNA、及其任何组合。例如，TT可以是任一条链的任一端的突出序列。该突出可以与该标靶mRNA形成一个错配，或它可以与靶向的基因序列互补或可以是其他序列。
本发明的dsRNA分子的有义链、反义链或两条链处的5′或3′突出可以被磷酸化。在一些实施例中，突出区含有两个在这两个核苷酸之间具有一个硫代磷酸酯的核苷酸，其中这两个核苷酸可以是相同或不同的。在一些实施例中，突出存在于有义链、反义链或两条链的3’末端处。在一些实施例中，3′-突出存在于反义链中。在一些实施例中，此3’-突出存在于有义链中。
本发明的dsRNA分子可以仅包括一个单突出，其可以加强该dsRNA的干扰活性而不影响其总稳定性。举例来说，该单链突出位于该有义链的3′末端处，或可替代地，位于该反义链的3′末端处。该dsRNA还可以具有一个位于反义链的5′末端(或有义链的3′末端)处的平端，或反之亦然。通常，该dsRNA的反义链在3’末端处具有一个核苷酸的突出，并且5’末端是平的。虽然不受理论束缚，但该反义链的5′末端处的不对称平端和该反义链的3′末端突出促进引导链加载到RISC过程中。例如，单突出包含长度为至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、或十个核苷酸。在一些实施例中，dsRNA在反义链的3’-末端具有2个核苷酸的突出，以及在反义链的5’-末端具有平端。
在一些实施例中，dsRNA的一个末端是平端并且另一末端具有突出，其中反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，并且其中该至少一个热去稳定化核苷酸位于反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、或全部七个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vii)以及该dsRNA包含长度为12-40个核苷酸对的双链体区域。在一些实施例中，突出位于反义链的3’-末端，并且平端位于反义链的5’-末端。在一些具体的实施例中，突出的长度是2、3或4个核苷酸。
在一些实施例中，dsRNA分子具有长度为19、20、21、22或23个核苷酸碱基对的双链体区域，其中dsRNA的一个末端是平端并且另一末端具有突出，其中反义链含有位于反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)的双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、五个或全部六个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；以及(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰，并且任选地，2个核苷酸的突出位于反义链的3’-末端，并且平端位于反义链的5’-末端。在一些实施例中，突出位于反义链的3’-末端，并且平端位于反义链的5’-末端。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子在dsRNA双链体的两端也可以具有两个平端。
在一些实施例中，dsRNA在双链体的两个末端具有平端，其中反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，并且其中该至少一个热去稳定化核苷酸位于反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、或全部七个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；以及(vii)该dsRNA包含长度为12-40个核苷酸对的双链体区域。
在一些实施例中，dsRNA分子具有长度为19、20、21、22或23个核苷酸碱基对的双链体区域并且在双链体的两个末端具有平端，其中dsRNA的一个末端是平端并且另一末端具有突出，其中反义链含有位于反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)的双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、五个或全部六个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；以及(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰。
热去稳定化修饰。
如上所述，通过将热去稳定化修饰并入反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)以减少或抑制脱靶基因沉默，可以优化dsRNA分子用于RNA干扰。诸位发明人已经发现具有反义链的dsRNA具有减少的脱靶基因沉默活性，该反义链在从反义链的5’末端开始计数的前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰。因此，在一些实施例中，反义链在反义链的5’区域的前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个或更多个)热去稳定化修饰。在一些实施例中，双链体的热去稳定化修饰位于位置2-9、或优选地在位置4-8(从反义链的5’-末端开始)。在一些另外的实施例中，双链体的热去稳定化修饰位于位置6、7或8(从反义链的5’-末端开始)。在再一些另外的实施例中，双链体的热去稳定化修饰位于位置7(从反义链的5’-末端开始)。术语“一个或多个热去稳定化修饰”包括导致较低总解链温度(Tm)(优选地，比没有此类一个或多个修饰的dsRNA的Tm低一、二、三或四度的Tm)的dsRNA的一个或多个修饰。在一些实施例中，双链体的热去稳定化修饰位于位置2、3、4、5或9(从反义链的5’-末端开始)。
热去稳定化修饰可以包括但不限于脱碱基修饰；与相对链中相对核苷酸的错配；以及糖修饰，如2’-脱氧修饰或非环核苷酸，例如，解锁的核酸(UNA)或乙二醇核酸(GNA)。
示例的脱碱基修饰包括但不限于以下：
其中R＝H、Me、Et或OMe；R’＝H、Me、Et或OMe；R”＝H、Me、Et或OMe
其中B是修饰的或未修饰的核碱基。
示例的糖修饰包括但不限于以下：
其中B是修饰的或未修饰的核碱基。
在一些实施例中，双链体的热去稳定化修饰选自下组，该组由以下组成：
其中B是修饰的或未修饰的核碱基，并且每个结构上的星号代表R、S或外消旋。
术语“非环核苷酸”是指具有非环核糖的任何核苷酸，例如，其中核苷酸中在核糖碳之间的任何键(例如，C1’-C2’、C2’-C3’、C3’-C4’、C4’-O4’、或C1’-O4’)不存在和/或核糖碳或氧(例如，C1’、C2’、C3’、C4’或O4’)中的至少一个独立地或组合地不存在。在一些实施例中，非环核苷酸或/>其中B是修饰的或未修饰的核碱基，R1和R2独立地是H、卤素、OR3、或烷基；并且R3是H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖。术语“UNA”是指解锁的非环核酸，其中糖的任何键都被移除，而形成解锁的″糖″残基。在一个实例中，UNA也涵盖在C1′-C4′之间的键已被移除的单体(即，C1′及C4′碳间的共价碳-氧-碳键)。在另一个实例中，糖的C2′-C3′键(即C2′和C3′碳之间的共价碳-碳键)被移除(参见Mikhailov等人，Tetrahedron Letters[四面体通讯]，26(17)：2059(1985)；和Fluiter等人，Mol.Biosyst.[分子生物系统]，10：1039(2009)，将其通过引用以其整体结合在此)。非环衍生物提供更大的骨架柔韧性而不影响沃森-克里克配对。非环核苷酸可以经由2’-5’或3’-5’键连接。
术语“GNA”是指乙二醇核酸，其是类似于DNA或RNA的聚合物但其“骨架”的组成不同，其由通过磷酸二酯键连接的重复甘油单元组成：
双链体的热去稳定化修饰可以是热去稳定化核苷酸与dsRNA双链体内相对链中的相对核苷酸之间的错配(即，非互补碱基对)。示例性的错配碱基对包括G：G、G：A、G：U、G：T、A：A、A：C、C：C、C：U、C：T、U：U、T：T、U：T或其组合。本领域已知的其他错配碱基配对也适用于本发明。错配可以发生在核苷酸之间，这些核苷酸是天然存在的核苷酸或修饰的核苷酸，即，错配碱基对可以发生在来自各自核苷酸的核碱基之间，而与核苷酸的核糖上的修饰无关。在某些实施例中，dsRNA分子在错配配对中含有至少一个核碱基，其是2’-脱氧核碱基；例如，有义链中的2’-脱氧核碱基。
在一些实施例中，在反义链的种子区域的双链体的热去稳定化修饰包括与靶mRNA上的互补碱基具有受损的WC H-键合的核苷酸，例如：
在WO 2011/133876(将其通过引用以其整体结合在此)中详细描述了脱碱基核苷酸、非环核苷酸修饰(包括UNA和GNA)、和错配修饰的更多实例。
热去稳定化修饰还可以包括与相对碱基形成氢键的能力被降低或消除的通用碱基，以及磷酸酯修饰。
在一些实施例中，双链体的热去稳定化修饰包括具有非规范碱基的核苷酸，如但不限于具有受损或完全消除的与相对链中的碱基形成氢键的能力的核碱基修饰。已经如在WO 2010/0011895(将其通过引用以其整体结合在此)中所述评估了这些核碱基修饰的dsRNA双链体中心区域的去稳定化。示例性核碱基修饰是：
在一些实施例中，在反义链的种子区域中的双链体的热去稳定化修饰包括与靶mRNA上的碱基互补的一个或多个α-核苷酸，如：
其中R是H、OH、OCH3、F、NH2、NHMe、NMe2或O-烷基
与天然磷酸二酯键相比，已知降低dsRNA双链体的热稳定性的示例性磷酸酯修饰是：
针对R基团的烷基可以是C1-C6烷基。针对R基团的具体的烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、戊基和己基。
在一些实施例中，示例性去稳定化修饰显示在图1中。
除了包含热去稳定化修饰的反义链，dsRNA还可以包含一个或多个稳定化修饰。例如，dsRNA可以包含至少两个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)稳定化修饰。没有限制，稳定化修饰都可以存在于一条链中。在一些实施例中，有义链和反义链两者均包含至少两个稳定化修饰。稳定化修饰可以发生在有义链或反义链的任何核苷酸上。例如，稳定化修饰可以发生在有义链和/或反义链的每个核苷酸上；每个稳定化修饰能以交替模式发生在有义链或反义链上；或者有义链或反义链包含以交替模式的两种稳定化修饰。有义链上的稳定化修饰的交替模式与反义链的相同或不同，并且有义链上的稳定化修饰的交替模式可以相对于反义链上的稳定化修饰的交替模式具有移位。
在一些实施例中，反义链包含至少两个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)稳定化修饰。没有限制，反义链中的稳定化修饰可以存在于任何位置。在一些实施例中，反义链在位置2、6、8、9、14和16(从5’-末端开始)包含稳定化修饰。在一些其他实施例中，反义链在位置2、6、14和16(从5’-末端开始)包含稳定化修饰。在再一些另外的实施例中，反义链在位置2、14和16(从5’-末端开始)包含稳定化修饰。
在一些实施例中，反义链包含与去稳定化修饰邻接的至少一个稳定化修饰。例如，稳定化修饰可以是在去稳定化修饰的5’-末端或3’-末端(即在从去稳定化修饰的位置开始位置-1或+1，)的核苷酸。在一些实施例中，反义链在去稳定化修饰的5’-末端和3’-末端(即从去稳定化修饰的位置开始位置-1和+1)各自包含稳定化修饰。
在一些实施例中，反义链在去稳定化修饰的3’-末端(即，在从去稳定化修饰的位置开始位置+1和+2)包含至少两个稳定化修饰。
在一些实施例中，有义链包含至少两个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)稳定化修饰。没有限制，有义链中的稳定化修饰可以存在于任何位置。在一些实施例中，有义链在位置7、10和11(从5’-末端开始)包含稳定化修饰。在一些其他实施例中，有义链在位置7、9、10和11(从5’-末端开始)包含稳定化修饰。在一些实施例中，有义链在与反义链的位置11、12和15(从反义链的5’-末端开始计数)相对或互补的位置包含稳定化修饰。在一些其他实施例中，有义链在与反义链的位置11、12、13和15(从反义链的5’-末端开始计数)相对或互补的位置包含稳定化修饰。在一些实施例中，有义链包含两个、三个或四个稳定化修饰的嵌段。
在一些实施例中，有义链在与反义链中的双链体的热去稳定化修饰相对或互补的位置不包含稳定化修饰。
示例性热稳定化修饰包括但不限于2’-氟修饰。其他热稳定化修饰包括但不限于LNA。
在一些实施例中，本发明的dsRNA包含至少四个(例如，四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)2’-氟核苷酸。没有限制，2’-氟核苷酸都可以存在于一条链中。在一些实施例中，有义链和反义链两者均包含至少两个2’-氟核苷酸。2’-氟修饰可以发生在有义链或反义链的任何核苷酸上。例如，2’-氟修饰可以发生在有义链和/或反义链的每个核苷酸上；每个2’-氟修饰能以交替模式发生在有义链或反义链上；或者有义链或反义链包含以交替模式的两个2’-氟修饰。有义链上的2’-氟修饰的交替模式与反义链的相同或不同，并且有义链上的2’-氟修饰的交替模式可以相对于反义链上的2’-氟修饰的交替模式具有移位。
在一些实施例中，反义链包含至少两个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)2’-氟核苷酸。没有限制，反义链中的2’-氟修饰可以存在于任何位置。在一些实施例中，反义链在位置2、6、8、9、14和16(从5’-末端开始)包含2’-氟核苷酸。在一些其他实施例中，反义链在位置2、6、14和16(从5’-末端开始)包含2’-氟核苷酸。在再一些另外的实施例中，反义链在位置2、14和16(从5’-末端开始)包含2’-氟核苷酸。
在一些实施例中，反义链包含与去稳定化修饰邻接的至少一个2’-氟核苷酸。例如，2’-氟核苷酸可以是去稳定化修饰的5’-末端或3’-末端(即在从去稳定化修饰的位置开始位置-1或+1)的核苷酸。在一些实施例中，反义链在去稳定化修饰的每个5’-末端和3’-末端(即，在从去稳定化修饰的位置开始位置-1和+1)各自包含2’-氟核苷酸。在一些实施例中，反义链在去稳定化修饰的3’-末端(即，在从去稳定化修饰的位置开始位置+1和+2)包含至少两个2’-氟核苷酸。
在一些实施例中，有义链包含至少两个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)2’-氟核苷酸。没有限制，有义链中的2’-氟修饰可以存在于任何位置。在一些实施例中，反义链在位置7、10和11(从5’-末端开始)包含2’-氟核苷酸。在一些其他实施例中，有义链在位置7、9、10和11(从5’-末端开始)包含2’-氟核苷酸。在一些实施例中，有义链在与反义链的位置11、12和15(从反义链的5’-末端开始计数)相对或互补的位置包含2’-氟核苷酸。在一些其他实施例中，有义链在与反义链的位置11、12、13和15(从反义链的5’-末端开始计数)相对或互补的位置包含2’-氟核苷酸。在一些实施例中，有义链包含两个、三个或四个2’-氟核苷酸的嵌段。
在一些实施例中，有义链在与反义链中的双链体的热去稳定化修饰相对或互补的位置不包含2’-氟核苷酸。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子包含21个核苷酸(nt)的有义链和23个核苷酸(nt)的反义链，其中该反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸发生在该反义链的种子区域(即，在该反义链的5’-末端的位置2-9)，其中该dsRNA的一个末端是平端，而另一末端包含2个nt的突出，并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；以及(vii)该dsRNA在该反义链的5’-末端包含平端。优选地，该2个nt的突出在该反义链的3′-末端处。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子包含有义链和反义链，其中：该有义链的长度是25-30个核苷酸残基，其中从5′末端核苷酸(位置1)起始，所述有义链的位置1至23包含至少8个核糖核苷酸；该反义链的长度是36-66个核苷酸残基，并且从3′末端核苷酸起始，在这些位置中的至少8核糖核苷酸与有义链的位置1-23配对以形成双链体；其中反义链的至少3′末端核苷酸不与有义链配对，以及高达6个连续的3′末端核苷酸不与有义链配对，从而形成1-6个核苷酸的3′单链突出；其中反义链的5′末端包含从10-30个连续的核苷酸，其不与有义链配对，从而形成10-30个核苷酸单链5′突出；其中当有义链和反义链针对最大互补性对齐时，至少有义链5′末端和3′末端核苷酸与反义链的核苷酸碱基配对，从而在有义链与反义链之间形成基本上双链的区域；当将所述双链核酸引入哺乳动物细胞时，反义链与靶RNA沿着反义链长度的至少19个核糖核苷酸充分互补，以减少靶基因表达；并且其中反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸在反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)；例如，热去稳定化核苷酸发生在与有义链的5’-末端的位置14-17相对或互补的位置之间，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；以及(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；以及(vii)该dsRNA包含长度为12-30个核苷酸对的双链体区域。在一些实施例中，本发明的dsRNA分子包含有义链和反义链，其中所述dsRNA分子包含长度为至少25个和至多29个核苷酸的有义链以及长度为至多30个核苷酸的反义链，其中该有义链在从5’末端起的位置11处包含易受酶促降解影响的修饰的核苷酸，其中所述有义链的3’末端和所述反义链的5’末端形成平端，并且所述反义链在其3’末端比有义链长1-4个核苷酸，其中双链体区域的长度是至少25个核苷酸，并且当将所述dsRNA分子引入哺乳动物细胞中时，所述反义链与靶mRNA沿着所述反义链长度的至少19个nt充分互补以减少靶基因表达，并且其中所述dsRNA的dicer切割优选地产生包含所述反义链的所述3’末端的siRNA，从而减少该哺乳动物中靶基因的表达，其中该反义链含有至少一个热去稳定化核苷酸，其中该至少一个热去稳定化核苷酸位于该反义链的种子区域(即，在该反义链的5’-末端的位置2-9)，并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；以及(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；以及(vii)该dsRNA具有长度为12-29个核苷酸对的双链体区域。
在一些实施例中，dsRNA分子的有义链和反义链中的每个核苷酸可以是修饰的。每个核苷酸可能被相同或不同的修饰进行修饰，该相同或不同的修饰可以包括一个或全部两个非连接的磷酸态氧和/或一个或多个连接的磷酸态氧的一种或多种改变；核糖的组成的改变，例如，核糖上的2′羟基的改变；′以“去磷酸”连接体完全置换磷酸酯部分；天然碱基的修饰或置换；以及核糖-磷酸酯骨架的置换或修饰。
由于核酸是亚单位的聚合物，因此许多修饰出现在核酸内重复的位置处，例如碱基或磷酸酯部分、或磷酸酯部分的非连接O的修饰。在一些情况下，该修饰将出现在该核酸中的所有标的位置处，但在许多情形下它不会这样。例如，修饰可以仅出现在3’或5’末端位置处，可以仅出现在末端区域中，例如在一条链的末端核苷酸上或在最后2个、3个、4个、5个或10个核苷酸中的位置处。修饰可以出现在双链区域、单链区域或两者中。修饰可以仅出现在RNA的双链区域中或可以仅出现在RNA的单链区域中。例如，非连接O位置处的硫代磷酸酯修饰可以仅存在于一个或两个末端处，可以仅存在于末端区域中，例如在一条链的末端核苷酸上或最后2个、3个、4个、5个或10个核苷酸中的位置处，或可以存在于双链和单链区域中，特别是在末端处。这个或这些5’末端可以被磷酸化。
为了增强稳定性，可能的是例如在突出中包括特定碱基或在单链突出中(例如，在5’或3’突出或两者中)包括被修饰的核苷酸或核苷酸替代物。例如，可以令人希望的是在突出中包括嘌呤核苷酸。在一些实施例中，3’或5’突出中的全部或一些碱基可以用例如在此描述的修饰进行修饰。这些修饰可以包括，例如，使用具有本领域已知的修饰的核糖的2’位置处的修饰，例如，使用脱氧核糖核苷酸、2’-脱氧-2’-氟(2’-F)或2’-O-甲基修饰替代核碱基的核糖；和磷酸酯基团中的修饰，例如，硫代磷酸酯修饰。突出不一定与靶序列同源。在一些实施例中，有义链和反义链的每个残基独立地被LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-脱氧、或2’-氟基修饰。这些链可以包含超过一个修饰。在一些实施例中，有义链和反义链的每个残基独立地被2’-O-甲基或2’-氟代修饰。应理解，这些修饰是对反义链中的双链体的至少一个热去稳定化修饰的补充。
至少两个不同修饰典型地存在于有义链和反义链上。那两个修饰可以是2’-脱氧、2’-O-甲基或2’-氟修饰、非环核苷酸或其他。在一些实施例中，有义链和反义链各自包含选自2’-O-甲基或2’-脱氧的两个不同修饰的核苷酸。在一些实施例中，有义链和反义链的每个残基独立地被以下修饰：2′-O-甲基核苷酸、2’-脱氧核苷酸、2′-脱氧-2’-氟核苷酸、2′-O-N-甲基乙酰氨基(2′-O-NMA)核苷酸、2′-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2′-O-DMAEOE)核苷酸、2′-O-氨基丙基(2′-O-AP)核苷酸、或2′-ara-F核苷酸。同样，应理解，这些修饰是对反义链中的双链体的至少一个热去稳定化修饰的补充。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子包含交替模式的修饰，特别是在B1、B2、B3、B1’、B2’、B3’、B4’区域。如在此所用，术语“交替基序”或“交替模式”是指具有一个或多个修饰、每个修饰出现在一条链的交替核苷酸上的一种基序。交替核苷酸可以指每隔一个核苷酸一个或每隔两个核苷酸一个、或类似模式。例如，如果A、B以及C各自表示针对核苷酸的一种修饰类型，那么交替基序可以是“ABABABABABAB……”、“AABBAABBAABB……”、“AABAABAABAAB……”、“AAABAAABAAAB……”、“AAABBBAAABBB……”或“ABCABCABCABC……”等。
交替基序中包含的修饰类型可能是相同或不同的。例如，如果A、B、C、D各自表示针对核苷酸的一种修饰类型，那么交替模式(即每隔一个核苷酸上的修饰)可以是相同的，但有义链或反义链中的每一者可以选自交替基序内的修饰的若干种可能，例如“ABABAB……”“ACACAC……”、“BDBDBD……”或“CDCDCD……”等。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子包含用于有义链上的交替基序的修饰模式相对于用于反义链上的交替基序的修饰模式移位。该移位可以是如此，使得有义链的修饰的核苷酸组对应于反义链的被不同地修饰的核苷酸组，并且反之亦然。例如，当有义链与dsRNA双链体中的反义链配对时，有义链中的交替基序可以从该链的5’-3’起由“ABABAB”开始，并且反义链中的交替基序可以在双链体区内从该链的3’-5’起由“BABABA”开始。作为另一个实例，有义链中的交替基序可以从该链的5’-3’起由“AABBAABB”开始，并且反义链中的交替基序可以在双链体区内从该链的3’-5’起由“BBAABBAA”开始，以使得在该有义链与该反义链之间存在修饰模式的完全或部分移位。
本发明的dsRNA分子可以进一步包含至少一个硫代磷酸酯或甲基磷酸酯核苷酸间键。该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰可以存在于有义链或反义链或两者的链的任何位置中的任何核苷酸上。例如，该核苷酸间键修饰可以存在于有义链和/或反义链上的每个核苷酸上；每个核苷酸间键修饰能以交替模式存在于有义链或反义链上；或者有义链或反义链包含交替模式的两个核苷酸间键修饰。该有义链上的核苷酸间键修饰的交替模式可以与该反义链相同或不同，并且该有义链上的核苷酸间键修饰的交替模式可以相对于该反义链上的核苷酸间键修饰的交替模式具有移位。
在一些实施例中，dsRNA分子在突出区中包括该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰。例如，该突出区包括两个在这两个核苷酸之间具有一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的核苷酸。还可以作核苷酸间键修饰以使突出核苷酸与双链体区内的末端配对的核苷酸键。例如，至少2个、3个、4个或所有的突出核苷酸可以通过硫代磷酸酯或甲基磷酸酯核苷酸间键来连接，并且任选地，可以存在将突出核苷酸与紧挨着该突出核苷酸的一个配对的核苷酸连接的另外的硫代磷酸酯或甲基磷酸酯核苷酸间键。例如，在末端三个核苷酸之间可以存在至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中这三个核苷酸中的两个是突出核苷酸，并且第三个是紧挨着该突出核苷酸的配对的核苷酸。优选地，这三个末端核苷酸可以在反义链的3′端处。在一些实施例中，dsRNA分子的有义链包括具有由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个磷酸酯核苷酸间键分开的两个至十个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的1-10个嵌段，其中这些硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键之一位于该寡核苷酸序列中的任何位置处并且所述有义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯以及磷酸酯核苷酸间键的任何组合的反义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施例中，dsRNA分子的反义链包括具有由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个磷酸酯核苷酸间键分开的两个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段j其中这些硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键之一位于该寡核苷酸序列中的任何位置处并且所述反义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯以及磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施例中，dsRNA分子的反义链包括具有由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、或16个磷酸酯核苷酸间键分开的三个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段，其中这些硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键之一位于该寡核苷酸序列中的任何位置处并且所述反义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯以及磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施例中，dsRNA分子的反义链包括具有由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、或14个磷酸酯核苷酸间键分开的四个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段，其中这些硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键之一位于该寡核苷酸序列中的任何位置处并且所述反义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯以及磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施例中，dsRNA分子的反义链包括具有由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12个磷酸酯核苷酸间键分开的五个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段，其中这些硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键之一位于该寡核苷酸序列中的任何位置处并且所述反义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯以及磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施例中，dsRNA分子的反义链包括具有由1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个磷酸酯核苷酸间键分开的六个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段，其中这些硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键之一位于该寡核苷酸序列中的任何位置处并且所述反义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯以及磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施例中，dsRNA分子的反义链包括具有由1、2、3、4、5、6、7、或8个磷酸酯核苷酸间键分开的七个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段，其中这些硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键之一位于该寡核苷酸序列中的任何位置处并且所述反义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯以及磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。在一些实施例中，dsRNA分子的反义链包括具有由1、2、3、4、5或6个磷酸酯核苷酸间键分开的八个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段，其中这些硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键之一位于该寡核苷酸序列中的任何位置处并且所述反义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯以及磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施例中，dsRNA分子的反义链包括具有由1、2、3、或4个磷酸酯核苷酸间键分开的九个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段，其中这些硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键之一位于该寡核苷酸序列中的任何位置处并且所述反义链与包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯以及磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包括硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子在有义链和/或反义链的1-10个末端位置内进一步包括一个或多个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰。例如，在该有义链和/或反义链的一端或两端处至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸可以经由硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键而键。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子在有义链和/或反义链各自的1-10个双链体内部区中进一步包括一个或多个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰。例如，在双链体区域的位置8-16(从有义链的5′末端起计数)，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸可以通过硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键而连接；dsRNA分子在1-10个末端位置中可以任选地进一步包含一个或多个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子在该义链的位置1-5中进一步包含一至五个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23中进一步包含一至五个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰(从5’末端开始计数)，并且在反义链的位置1和2处进一步包含一至五个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23中进一步包含一至五个(从5’末端开始计数)。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子在有义链的位置1-5中进一步包含一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23中进一步包含一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰(从5’末端开始计数)，并且在反义链的位置1和2处进一步包含一个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰以及在位置18-23中进一步包含两个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰(从5’末端开始计数)。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子在有义链的位置1-5中进一步包含两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23中进一步包含一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’末端开始计数)，并且在反义链的位置1和2处进一步包含一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23中进一步包含两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’末端开始计数)。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子在有义链的位置1-5中进一步包含两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23中进一步包含两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’末端开始计数)，并且在反义链的位置1和2处进一步包含一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23中进一步包含两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’末端开始计数)。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子在有义链的位置1-5中进一步包含两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23中进一步包含两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’末端开始计数)，并且在反义链的位置1和2处进一步包含一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23中进一步包含一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’末端开始计数)。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子在有义链的位置1-5中进一步包含一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23中进一步包含一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’末端开始计数)，并且在反义链的位置1和2处进一步包含两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23中进一步包含两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’末端开始计数)。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子在有义链的位置1-5中进一步包含一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23中进一步包含一个(从5’末端开始计数)，并且在反义链的位置1和2处进一步包含两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰以及在位置18-23中进一步包含一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’末端开始计数)。在一些实施例中，本发明的dsRNA分子在有义链的位置1-5内(从5’-末端开始计数)进一步包含一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2进一步包含两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在以及在位置18-23进一步包含一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’-末端开始计数)。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子在有义链的位置1-5内(从5’-末端开始计数)进一步包含两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2进一步包含一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰在以及在位置18-23进一步包含两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’-末端开始计数)。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子在有义链的位置1-5中进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置18-23中进一步包括一个(由5’末端计数)，并且在该反义链的位置1和2处进一步包括两个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰并且在位置18-23中进一步包括一个硫代磷酸酯核苷酸间键联修饰(由5’末端计数)。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子在有义链的位置1-5中进一步包含两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23中进一步包含一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’末端开始计数)，并且在反义链的位置1和2处进一步包含两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23中进一步包含两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’末端开始计数)。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子在有义链的位置1-5中进一步包含两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23中进一步包含一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’末端开始计数)，并且在反义链的位置1和2处进一步包含一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23中进一步包含两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’末端开始计数)。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子在有义链的位置1和2处进一步包含两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置20和21处进一步包含两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’末端开始计数)，并且在反义链的位置1处进一步包含一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置21处进一步包含一个(从5’末端开始计数)。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子在有义链的位置1处进一步包含一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置21处进一步包含一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’末端开始计数)，并且在反义链的位置1和2处进一步包含两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置20和21处进一步包含两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’末端开始计数)。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子在有义链的位置1和2处进一步包含两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置21和22处进一步包含两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’末端开始计数)，并且在反义链的位置1处进一步包含一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置21处进一步包含一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’末端开始计数)。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子在有义链的位置1处进一步包含一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置21处进一步包含一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’末端开始计数)，并且在反义链的位置1和2处进一步包含两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置21和22处进一步包含两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’末端开始计数)。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子在有义链的位置1和2处进一步包含两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置22和23处进一步包含两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’末端开始计数)，并且在反义链的位置1处进一步包含一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置21处进一步包含一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’末端开始计数)。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子在有义链的位置1处进一步包含一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置21处进一步包含一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’末端开始计数)，并且在反义链的位置1和2处进一步包含两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置23和23处进一步包含两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’末端开始计数)。
在一些实施例中，本发明的化合物包含骨架手性中心的模式。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含以Sp构型的至少5个核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含以Sp构型的至少6个核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含以Sp构型的至少7个核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含以Sp构型的至少8个核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含以Sp构型的至少9个核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含以Sp构型的至少10个核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含以Sp构型的至少11个核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含以Sp构型的至少12个核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含以Sp构型的至少13个核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含以Sp构型的至少14个核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含以Sp构型的至少15个核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含以Sp构型的至少16个核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含以Sp构型的至少17个核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含以Sp构型的至少18个核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含以Sp构型的至少19个核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含以Rp构型的不超过8个核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含以Rp构型的不超过7个核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含以Rp构型的不超过6个核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含以Rp构型的不超过5个核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含以Rp构型的不超过4个核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含以Rp构型的不超过3个核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含以Rp构型的不超过2个核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含以Rp构型的不超过1个核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含不超过8个非手性的核苷酸间键(作为非限制性实例，磷酸二酯键)。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含不超过7个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含不超过6个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含不超过5个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含不超过4个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含不超过3个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含不超过2个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含不超过1个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含以Sp构型的至少10个核苷酸间键，以及不超过8个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含以Sp构型的至少11个核苷酸间键，以及不超过7个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含以Sp构型的至少12个核苷酸间键，以及不超过6个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含以Sp构型的至少13个核苷酸间键，以及不超过6个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含以Sp构型的至少14个核苷酸间键，以及不超过5个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，骨架手性中心的通用模式包含以Sp构型的至少15个核苷酸间键，以及不超过4个非手性的核苷酸间键。在一些实施例中，以Sp构型的核苷酸间键任选地是连续的或不连续的。在一些实施例中，以Rp构型的核苷酸间键任选地是连续的或不连续的。在一些实施例中，非手性的核苷酸间键优选地是连续的或不连续的。
在一些实施例中，本发明的化合物包含是立体化学嵌段的嵌段。在一些实施例中，嵌段是Rp嵌段，其中嵌段的每个核苷酸间键是Rp。在一些实施例中，5’-嵌段是Rp嵌段。在一些实施例中，3’-嵌段是Rp嵌段。在一些实施例中，嵌段是Sp嵌段，其中嵌段的每个核苷酸间键是Sp。在一些实施例中，5’-嵌段是Sp嵌段。在一些实施例中，3’-嵌段是Sp嵌段。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含Rp和Sp嵌段两者。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个Rp但不包含Sp嵌段。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个Sp但不包含Rp嵌段。在一些实施例中，提供的寡核苷酸包含一个或多个PO嵌段，其中每个核苷酸间键是以天然磷酸酯键。在一些实施例中，本发明的化合物包含是Sp嵌段的5’-嵌段，其中每个糖部分包含2’-F修饰。在一些实施例中，5’-嵌段是Sp嵌段，其中每个核苷酸间键是修饰的核苷酸间键，并且每个糖部分包含2’-F修饰。在一些实施例中，5’-嵌段是Sp嵌段，其中每个核苷酸间键是硫代磷酸酯键并且每个糖部分包含2’-F修饰。在一些实施例中，5’-嵌段包含4或更多个核苷单元。在一些实施例中，5’-嵌段包含5或更多个核苷单元。在一些实施例中，5’-嵌段包含6或更多个核苷单元。在一些实施例中，5’-嵌段包含7或更多个核苷单元。在一些实施例中，3’-嵌段是Sp嵌段，其中每个糖部分包含2’-F修饰。在一些实施例中，3’-嵌段是Sp嵌段，其中每个核苷酸间键是修饰的核苷酸间键，并且每个糖部分包含2’-F修饰。在一些实施例中，3’-嵌段是Sp嵌段，其中每个核苷酸间键是硫代磷酸酯键并且每个糖部分包含2’-F修饰。在一些实施例中，3’-嵌段包含4个或更多个核苷单元。在一些实施例中，3’-嵌段包含5个或更多个核苷单元。在一些实施例中，3’-嵌段包含6个或更多个核苷单元。在一些实施例中，3’-嵌段包含7个或更多个核苷单元。
在一些实施例中，本发明的化合物在区域内包含一种类型的核苷，或者寡核苷酸之后是特定类型的核苷酸间键(例如，天然磷酸酯键、修饰的核苷酸间键、Rp手性核苷酸间键、Sp手性核苷酸间键等)。在一些实施例中，A之后是Sp。在一些实施例中，A之后是Rp。在一些实施例中，A之后是天然磷酸酯键(PO)。在一些实施例中，U之后是Sp。在一些实施例中，U之后是Rp。在一些实施例中，U之后是天然磷酸酯键(PO)。在一些实施例中，C之后是Sp。在一些实施例中，C之后是Rp。在一些实施例中，C之后是天然磷酸酯键(PO)。在一些实施例中，G之后是Sp。在一些实施例中，G之后是Rp。在一些实施例中，G之后是天然磷酸酯键(PO)。在一些实施例中，C和U之后是Sp。在一些实施例中，C和U之后是Rp。在一些实施例中，C和U之后是天然磷酸酯键(PO)。在一些实施例中，A和G之后是Sp。在一些实施例中，A和G之后是Rp。
在一些实施例中，反义链包含在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，其中反义链含有位于反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)的双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vii)该dsRNA包含长度为12-40个核苷酸对的双链体区域；以及(viii)该dsRNA在反义链的5’-末端具有平端。
在一些实施例中，反义链包含在核苷酸位置1与2之间、在核苷酸位置2与3之间、在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，其中反义链含有位于反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)的双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该有义链与配体缀合；(iii)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(iv)该有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(v)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vi)该dsRNA包含长度为12-40个核苷酸对的双链体区域；(vii)该dsRNA包含长度为12-40个核苷酸对的双链体区域；以及(viii)该dsRNA在反义链的5’-末端具有平端。
在一些实施例中，有义链包含在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，其中反义链含有位于反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)的双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vii)该dsRNA包含长度为12-40个核苷酸对的双链体区域；以及(viii)该dsRNA在反义链的5’-末端具有平端。
在一些实施例中，有义链包含在核苷酸位置1与2之间、以及在核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，反义链包含在核苷酸位置1与2之间、在核苷酸位置2与3之间、在核苷酸位置21与22之间、以及在核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，其中反义链含有位于反义链的种子区域(即，在反义链的5’-末端的位置2-9)的双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该有义链与配体缀合；(iii)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(iv)该有义链包含3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(v)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vi)该dsRNA包含长度为12-40个核苷酸对的双链体区域；以及(vii)该dsRNA在反义链的5’-末端具有平端。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子在双链体内包括与靶的一个或多个错配或其组合。错配可以存在于突出区域或双链体区域中。碱基对可以基于其促进解离或熔融的倾向来分等级(例如对于一个具体配对的缔合或解离自由能，最简单的方法是基于一个个别对检查这些对，但也可以使用紧接着的相邻物或类似分析)。就促进解离而言：A：U优于G：C；G：U优于G：C；且I：C优于G：C(I＝肌苷)。错配，例如，非典型或除典型以外的配对(如本文中其他地方描述的)优于典型(A：T、A：U、G：C)配对；且包括通用碱基的配对优于典型配对。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子包含在反义链的双链体区域内从5’-末端开始的前1、2、3、4、或5个碱基对中的至少一个，这些碱基对独立的选自以下：A：U、G：U、I：C，以及错配配对，例如非规范的配对或除了规范的配对以外的配对或包括通用碱基的配对，以便促进在该双链体的5’末端处的反义链的解离。
在一些实施例中，双链体区域内从反义链中的5’-末端起的1位置处的核苷酸选自下组，该组由以下组成：A、dA、dU、U以及dT。可替代地，从该反义链的5’末端起在该双链体区域内的前1、2或3个碱基对中的至少一个是AU碱基对。例如，从该反义链的5’-末端起在该双链体区域内的第一个碱基对是AU碱基对。
诸位发明人发现，在单链或双链寡核苷酸的任何位置，将4’-修饰的和/或5’-修饰的核苷酸引入二核苷酸的磷酸二酯(PO)键、硫代磷酸酯(PS)键、和/或二硫代磷酸酯(PS2)键的3’-末端可以对核苷酸间键产生立体效应，从而保护或稳定化针对抗核酸酶。
在一些实施例中，在单链或双链siRNA的任何位置，将5’-修饰的核苷引入二核苷酸的3’-末端。例如，在单链或双链siRNA的任何位置，可以将5’-烷基化的核苷引入二核苷酸的3’-末端。核糖的5’位置的烷基基团可以是外消旋的或者手性纯的R或S异构体。示例性5’-烷基化的核苷是5’-甲基核苷。5’-甲基可以是外消旋的或者手性纯的R或S异构体。
在一些实施例中，在单链或双链siRNA的任何位置，将4’-修饰的核苷引入二核苷酸的3’-末端。例如，在单链或双链siRNA的任何位置，可以将4’-烷基化的核苷引入二核苷酸的3’-末端。核糖的4’位置的烷基基团可以是外消旋的或者手性纯的R或S异构体。示例性4’-烷基化的核苷是4’-甲基核苷。4′-甲基可以是外消旋的或者手性纯的R或S异构体。可替代地，在单链或双链siRNA的任何位置，可以将4’-O-烷基化的核苷引入二核苷酸的3’-末端。核糖的4’-O-烷基可以是外消旋的或者手性纯的R或S异构体。示例性4’-O-烷基化的核苷是4’-O-甲基核苷。4’-O-甲基可以是外消旋的或者手性纯的R或S异构体。
在一些实施例中，将5’-烷基化的核苷引入dsRNA的有义链或反义链上的任何位置，并且此类修饰维持或改善dsRNA的效力。5’-烷基可以是外消旋的或者手性纯的R或S异构体。示例性5’-烷基化的核苷是5’-甲基核苷。5′-甲基可以是外消旋的或者手性纯的R或S异构体。
在一些实施例中，将4’-烷基化的核苷引入dsRNA的有义链或反义链上的任何位置，并且此类修饰维持或改善dsRNA的效力。4’-烷基可以是外消旋的或者手性纯的R或S异构体。示例性4’-烷基化的核苷是4’-甲基核苷。4′-甲基可以是外消旋的或者手性纯的R或S异构体。
在一些实施例中，将4’-O-烷基化的核苷引入dsRNA的有义链或反义链上的任何位置，并且此类修饰维持或改善dsRNA的效力。5’-烷基可以是外消旋的或者手性纯的R或S异构体。示例性4’-O-烷基化的核苷是4’-O-甲基核苷。4’-O-甲基可以是外消旋的或者手性纯的R或S异构体。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子可以包含2’-5’键(具有2’-H、2’-OH和2’-OMe并且具有P＝O或P＝S)。例如，2’-5’键修饰可用于促进核酸酶抗性或抑制有义链与反义链的结合，或者可用在有义链的5′末端以避免通过RISC的有义链活化。
在另一个实施例中，本发明的dsRNA分子可以包含L糖(例如，2’-H、2’-OH和2’-OMe的L核糖、L-阿拉伯糖)。例如，这些L糖修饰可用于促进核酸酶抗性或抑制有义链与反义链的结合，或者可用在有义链的5′末端以避免通过RISC的有义链活化。
各种公开物描述了多聚体siRNA，其全部可以与本发明的dsRNA一起使用。这样的公开物包括WO 2007/091269、美国专利号7858769、WO 2010/141511、WO 2007/117686、WO2009/014887以及WO 2011/031520，将其全部内容特此结合。
包含一个或多个碳水化合物部分与dsRNA分子的缀合的dsRNA分子可以优化dsRNA分子的一种或多种特性。在许多情况下，碳水化合物部分将连接到dsRNA分子的被修饰的亚单位。例如，dsRNA分子的一个或多个核糖核苷酸亚单元的核糖可以被另一个部分(例如，碳水化合物配体所附接的非碳水化合物(优选环状)载体)置换。其中亚单位的核糖已被如此置换的核糖核苷酸亚单位在本文中被称为核糖置换修饰亚单位(RRMS)。环状载体可以是碳环环系统(即所有环原子均为碳原子)或杂环环系统(即一个或多个环原子可以是杂原子，例如，氮、氧、硫)。环状载体可以是单环环系统，或可以包含两个或更多个环，例如，稠合环。环状载体可以是完全饱和的环系统，或其可以包含一个或多个双键。
该配体可以通过载体附接到多核苷酸上。这些载体包括(i)至少一个“骨架附接点”、优选两个“骨架附接点”，和(ii)至少一个“系拴附接点”。如在此使用的“骨架附接点”是指官能团(例如羟基基团)，或通常，可供用于并且适用于将该载体结合到核糖核酸的骨架(例如含硫骨架)中的键(例如磷酸酯或修饰的磷酸酯)。在一些实施例中，“系栓附接点”(TAP)是指该环状载体的、连接选择的部分的组成环原子，例如碳原子或杂原子(相异于提供骨架附接点的原子)。该部分可以是例如碳水化合物，例如单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖以及多糖。任选地，该选择的部分通过一个介入系拴物连接到该环状载体上。因此，该环状载体将经常包括一个官能团(例如氨基基团)，或通常提供适用于将另一个化学实体(例如一个配体)结合或系拴到组成型环上的一个键。
在一个实施例中，本发明的dsRNA分子经由载体缀合至配体，其中该载体可以是环基团或无环基团；优选地，该环基团选自：吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑啶基、哌啶基、哌嗪基、[1，3]二氧杂环戊烷、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基、和十氢萘；优选地，无环基团选自：丝氨醇骨架或二乙醇胺骨架。
本发明的双链RNA(dsRNA)分子可以任选地缀合到一个或多个配体上。该配体可以在3’末端、5’末端或两端处附接到有义链、反义链或两条链。例如，该配体可以缀合至该有义链，特别是在该有义链的3’末端。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子被5′磷酸化的或在5′主要末端(5’primeterminu)包含磷酰基类似物。5′-磷酸酯修饰包括与RISC介导的基因沉默相容的修饰。适合的修饰包括：5′-单磷酸酯((HO)2(O)P-O-5′)；5′-二磷酸酯((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5′)；5′-三磷酸酯((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5′)；5′-鸟苷帽(7-甲基化的或非甲基化的)(7m-G-O-5′-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5′)；5′-腺苷帽(Appp)、和任何修饰的或未修饰的核苷酸帽结构(N-O-5′-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5′)；5′-单硫代磷酸酯(硫代磷酸酯；(HO)2(S)P-O-5′)；5′-单二硫代磷酸酯(二硫代磷酸酯；(HO)(HS)(S)P-O-5′)、5′-硫代磷酸酯((HO)2(O)P-S-5′)；任何另外的以下的组合：氧/硫替代的单磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯(例如，5′-α-硫代三磷酸酯、5′-γ-硫代三磷酸酯等)、5′-氨基磷酸酯((HO)2(O)P-NH-5′、(HO)(NH2)(O)P-O-5′))、5′-烷基磷酸酯(R＝烷基＝甲基、乙基、异丙基、丙基等，例如RP(OH)(O)-O-5′-)、5′-烯基磷酸酯(即乙烯基，经取代的乙烯基)、(OH)2(O)P-5′-CH2-))、5′-烷基醚磷酸酯(R＝烷基醚＝甲氧基甲基(MeOCH2-)、乙氧基甲基等，例如RP(OH)(O)-O-5′-)。在一个实例中，修饰可以置于dsRNA分子的反义链中。
配体
多种多样的实体可以偶联到本发明的寡核苷酸。优选的部分是优选地直接地或经由一个介入系栓物间接地共价偶联的配体。
在优选实施例中，一种配体改变了它所并入的分子的分布、靶向或寿命。在优选实施例中，配体例如与缺乏这样配体的种类相比对选定靶提供了增强的亲和力，选定的靶例如是分子、细胞或细胞类型、区室、受体，例如身体的细胞区室或器官区室、组织、器官或区域。对选定靶提供增强的亲和力的配体也被称为靶向配体。
一些配体可以具有内体溶解特性。该内体溶解配体促进内体的溶解和/或本发明的组合物或其组分从内体向细胞的细胞质的运载。该内体溶解配体可以是一种显示出pH依赖性膜活性和融合性的多阴离子肽或肽模拟物。在一些实施例中，内体溶解配体在内体pH下呈现其活性构象。“活性”构象是其中该内体溶解配体促进内体的溶解和/或本发明的组合物或其组分从内体向细胞的细胞质运输的构象。示例性核内体溶解配体包括GALA肽(Subbarao等人，Biochemistry[生物化学]，1987，26：2964-2972，将其通过引用以其整体结合在此)、EALA肽(Vogel等人，J.Am.Chem.Soc.[美国化学学会会志]，1996，118：1581-1586，将其通过引用以其整体结合在此)及其衍生物(Turk等人，Biochem.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学学报]，2002，1559：56-68，将其通过引用以其整体结合在此)。在一些实施例中，内体溶解组分可以包含将响应于pH变化而经历电荷变化或质子化的化学基团(例如，氨基酸)。该内体溶解组分可以是直链或支链的。
配体可以改进运载、杂交以及特异性特性，并且还可以改进所得天然或被修饰的寡核糖核苷酸或包括在此描述的单体的任何组合的一种聚合分子和/或天然或被修饰的核糖核苷酸的核酸酶抗性。
一般配体可以包括例如用于增强摄取的治疗性调节物；例如用于监测分布的诊断性化合物或报告子基团；交联剂；以及赋予核酸酶抗性的部分。一般实例包括脂质、类固醇、维生素、糖、蛋白质、肽、多胺以及肽模拟物。
配体可包括天然存在的物质，例如蛋白质(例如，人类血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如，葡聚糖、支链淀粉、几丁质、壳聚糖、菊糖、环糊精、或玻尿酸)；或脂质。该配体还可以是重组或合成分子，如合成聚合物，例如合成聚氨基酸、寡核苷酸(例如，适体)。聚氨基酸的实例包括以下聚氨基酸：聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯酸-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚磷嗪。多胺的实例包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、聚胺、伪肽-聚胺、拟肽类聚胺、树形分子聚胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、聚胺季盐、或α螺旋肽。
配体也可以包括靶向基团，例如，靶向细胞或组织的药剂，例如，凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如，结合特定细胞类型(例如肾脏细胞)的抗体。靶向基团可以是促甲状腺激素、促黑激素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白A、粘蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价海藻糖、糖基化的聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸盐、聚谷氨酸盐、聚天冬氨酸盐、脂质、胆固醇、类固醇、胆酸、叶酸盐、维生素B12、生物素、RGD肽、RGD肽模拟物或适体。表2示出了靶向配体及其相关受体的一些实例。
配体的其他实例包括染料、嵌入剂(例如吖啶)、交联剂(例如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、德克萨斯卟啉(texaphyrin)、噻啉(Sapphyrin))、多环芳烃(例如吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶或螯合剂(例如EDTA)、亲脂性分子，例如胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1，3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧己基、鲸蜡基甘油、冰片、薄荷醇、1，3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰)石胆酸、O3-(油酰)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基、或吩噁嗪肽缀合物(例如触角足肽、Tat肽)、烷基化剂、磷酸酯、氨基、巯基、PEG(例如PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射标记的标志物、酶、半抗原(例如生物素)、转运/吸收促进剂(例如阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成性核糖核酸酶(例如咪唑、双咪唑、组胺、咪唑聚类、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环类的Eu3+络合物)、二硝基苯基、HRP或AP。
配体可以是蛋白质，例如糖蛋白，或肽，例如对一种共配体具有一种特异性亲和力的分子，或抗体，例如结合一种指定细胞类型(如一种癌细胞、内皮细胞或骨细胞)的一种抗体。配体也可以包括激素和激素受体。它们还可以包括非肽类种类，如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖或适体。该配体可以是例如脂多糖，p38 MAP激酶的激活剂或NF-κB的激活剂。
配体可以是物质例如药物，其可以通过例如破坏细胞的细胞骨架，例如通过破坏细胞的微管、微丝、和/或中间丝来增加细胞中iRNA剂的摄取。该药物可以是例如，紫杉酚(taxon)、长春新碱、长春花碱、细胞松弛素、诺考达唑、促微丝聚合剂(japlakinolide)、拉春库林A、毒伞素、红海海绵素(swinholide A)、茚酮衍生物(indanocine)、或myoservin。
该配体可以通过例如活化一种炎症应答来增加寡核苷酸摄取到该细胞中。将具有这种作用的示例性配体包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-1β或γ干扰素。
在一方面，该配体是一种脂质或基于脂质的分子。这种脂质或基于脂质的分子优选地结合血清蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)。结合HSA的配体允许缀合物分布至靶组织，例如身体的非肾靶组织。例如，该靶组织可以是肝，包括肝的实质细胞。可以结合HSA的其他分子也可以用作配体。例如，可使用萘普生或阿司匹林。脂质或基于脂质的配体可以(a)增加缀合物对降解的抗性，(b)增加靶向或转运至靶细胞或细胞膜中，和/或(c)可以用于调整与血清蛋白(例如，HSA)的结合。
基于脂质的配体可以用来调节(例如，控制)缀合物与靶组织的结合。例如，与HSA更强烈结合的脂质或基于脂质的配体将更不可能靶向肾并且因此较不可能从身体清除。与HSA较不强烈结合的脂质或基于脂质的配体可以用来使缀合物靶向肾。
在优选的实施例中，基于脂质的配体结合HSA。优选地，其结合HSA具有足够的亲和力，这样使得该缀合物将优选地分布至非肾脏组织。然而，优选的是，该亲和力不会太强以致于无法逆转HSA-配体结合。
另一个优选的实施例中，脂质系配体微弱或根本不结合HSA，使得缀合物将优选分布至肾。作为基于脂质的配体的替代或除它之外，还可以使用靶向肾细胞的其他部分。
在另一方面，该配体是由靶细胞(例如正在增殖的细胞)摄取的部分，例如维生素。这些特别有用于治疗特征在于不想要的细胞增殖(例如具有恶性或非恶性类型，例如癌细胞)的障碍。示例性维生素包括维生素A、E和K。其他示例性维生素包括B族维生素，例如叶酸、B12、核黄素、生物素、吡哆醛或由癌细胞吸收的其他维生素或营养素。还包括HAS、低密度脂蛋白(LDL)以及高密度脂蛋白(HDL)。
在另一方面，该配体是细胞渗透剂，优选地是螺旋细胞渗透剂。优选地，该试剂是两亲的。示例性试剂是肽如tat或触角足蛋白。如果该试剂是肽，则它可以被修饰，包括肽酰基模拟物、反转异构体、非肽键或假肽键和D-氨基酸的使用。该螺旋剂优选地是一种α-螺旋剂，该α-螺旋剂优选具有亲脂性相和疏脂性相。
配体可以是肽或肽模拟物。模拟肽(在此亦称为寡肽模拟物)为能够折叠成与天然肽相似的限定三维结构的分子。肽或肽模拟物部分可以是约5-50氨基酸长的，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。肽或肽模拟物可以例如是细胞渗透肽、阳离子肽、两亲肽或疏水肽(例如主要由Tyr、Trp或Phe组成)。肽部分可以是树状肽、约束肽或交联肽。在另一个替代中，该肽部分可以包括疏水性膜转位序列(MTS)。含有疏水性MTS的示例性肽是具有氨基酸序列AAVALLPAVLLALLAP的RFGF。含有疏水性MTS的RFGF类似物(例如氨基酸序列AALLPVLLAAP)也可以是靶向部分。该肽部分可以是“递送”肽，该递送肽可以携带大的极性分子，包括肽、寡核苷酸和跨细胞膜的蛋白质。例如，已经发现来自HIV Tat蛋白(GRKKRRQRRRPPQ)和果蝇触角足蛋白(RQIKIWFQNRRMKWKK)的序列能够充当递送肽。肽或肽模拟物可以通过DNA的随机序列来编码，如从噬菌体展示文库或一珠一化合物(OBOC)组合文库中鉴定的肽(Lam等人，Nature[自然]，354：82-94，1991，将其通过引用以其整体结合在此)。优选地，经由一个并入的单体单元系拴到一种iRNA试剂的肽或肽模拟物是一种细胞靶向肽，如一种精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽或RGD模拟物。肽部分的长度可以在从约5个氨基酸至约40个氨基酸的范围内。肽部分可具有结构修饰，例如使得增加稳定性或引导构形特性。可以利用以下描述的任何结构修饰。RGD肽部分可以用于靶向肿瘤细胞，如内皮肿瘤细胞或乳癌肿瘤细胞(Zitzmann等人，Cancer Res.[癌症研究]，62：5139-43，2002，将其通过引用以其整体结合在此)。RGD肽可以促进iRNA试剂靶向多种其他组织(包括肺、肾、脾或肝)的肿瘤(Aoki等人，Cancer Gene Therapy[癌症基因治疗]8：783-787，2001，将其通过引用以其整体结合在此)。优选地，RGD肽将促进iRNA试剂靶向肾。该RGD肽可以是线性的或环状的，并且可以被修饰(例如糖基化或甲基化)以促进靶向特定组织。例如，糖基化的RGD肽可以递送iRNA剂至表达αVβ3的肿瘤细胞(Haubner等人，Jour.Nucl.Med.[核医学杂志]，42：326-336，2001，将其通过引用以其整体结合在此)。可以使用靶向富含增殖细胞的标志物的肽。例如，含有RGD的肽和肽模拟物可以靶向癌细胞，具体而言展现整合素的细胞。因此，可以使用RGD肽、含有RGD的环状肽、包含D-氨基酸的RGD肽以及合成性RGD模拟物。除了RGD以外，可以使用靶向整合素配体的其他部分。通常，此类配体可以用来控制正在增殖的细胞和血管生成。这种类型的配体的优选缀合物靶向PECAM-1、VEGF或其他癌基因(例如，本文描述的癌基因)。
“细胞渗透肽”能够通透细胞，例如，微生物细胞(如细菌或真菌细胞)或哺乳动物细胞(如人类细胞)。一种微生物细胞渗透肽可以是例如一种α-螺旋线性肽(例如LL-37或Ceropin P1)、一种含有二硫键的肽(例如α-防御素、β-防御素或细菌素)或一种仅含有一种或两种主要氨基酸的肽(例如PR-39或吲哚力西丁(indolicidin))。细胞渗透肽还可以包括核定位信号(NLS)。例如，细胞渗透肽可以是二重两性肽，例如MPG，其来源于HIV-1 gp41的融合肽结构域及SV40大T抗原的NLS(Simeoni等人，Nucl.AcidsRes.[核酸研究]31：2717-2724，2003，将其通过引用以其整体结合在此)。
在一些实施例中，靶向肽可以是两亲α-螺旋肽。示例性两亲α-螺旋肽包括但不限于，天蚕素、莱科毒素(1ycotoxin)、摩西鱼毒肽(paradaxin)、蟾蜍肽抗生素(buforin)、CPF、铃蟾抗菌肽样肽(BLP)、蛇毒抗菌肽(cathelicidin)、角毒素(ceratotoxin)、柄海鞘(S.clava)肽、盲鳗肠道抗菌肽(HFIAP)、爪蟾抗菌肽、brevinins-2、蛙皮抗菌肽(dermaseptin)、蜂毒肽、pleurocidin、H2A肽、非洲爪蟾肽、esculentinis-1以及caerins。许多因素将优选地被认为维持螺旋稳定性的完整性。例如，将使用最大数目的螺旋稳定化残基(例如leu、ala或lys)，并且将使用最小数目的螺旋去稳定化残基(例如脯氨酸或环状单体单元)。将考虑加帽残基(例如Gly是一种示例性N-加帽残基)和/或可以将C-末端酰胺化用于提供一个额外H-键以稳定该螺旋。具有相反电荷、间隔i±3或i±4个位置的残基之间的盐桥的形成可以提供稳定性。例如，阳离子残基(如赖氨酸、精氨酸、高精氨酸、鸟氨酸或组氨酸)可以与阴离子残基谷氨酸盐或天冬氨酸盐形成盐桥。
肽和肽模拟物配体包括具有天然存在的或修饰的肽的那些，例如D或L肽；α，β或γ肽；N-甲基肽；氮杂肽；具有一个或多个酰胺的肽，即，键联被一个或多个脲、硫脲、氨基甲酸酯或磺酰基脲键联置换的肽；或环肽。
该靶向配体可以是能够靶向特定受体的任何配体。实例是：叶酸盐、GalNAc、半乳糖、甘露糖、甘露糖-6P、糖簇(如GalNAc簇、甘露糖簇、半乳糖簇)或适体。一个簇是两个或更多个糖单元的组合。这些靶向配体还包括整合素受体配体、趋化因子受体配体、转铁蛋白、生物素、血清素受体配体、PSMA、内皮素、GCPII、生长抑素、LDL以及HDL配体。这些配体还可以基于核酸，例如适体。该适体可以是未被修饰的或具有在此披露的修饰的任何组合。
内体释放剂包括咪唑、聚咪唑或寡咪唑、PEI、肽、融合肽、聚羧酸酯、聚阳离子、掩蔽的寡或聚阳离子或阴离子、缩醛、聚缩醛、缩酮/聚缩酮、原酸酯、具有掩蔽或非掩蔽的阳离子或阴离子电荷的聚合物、具有掩蔽或非掩蔽的阳离子或阴离子电荷的树状聚合物。
PK调节剂代表药代动力学调节剂。PK调节剂包括亲脂体、胆酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白结合剂、PEG、维生素等。示例性PK调节剂包括但不局限于胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰基甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生、布洛芬、维生素E、生物素等。也已知包含许多硫代磷酸酯键的寡核苷酸可以结合血清蛋白，因此在骨架中包含许多硫代磷酸酯键的短的寡核苷酸(例如，约5个碱基、10个碱基、15个碱基或20个碱基的寡核苷酸)也适用于本发明作为配体(例如，作为PK调节配体)。
另外，结合血清组分(例如血清蛋白)的适体作为PK调节配体也属于本发明。
属于本发明的其他配体缀合物描述在以下美国专利申请中：2004年8月10日提交的USSN：10/916,185；2004年9月21日提交的USSN：10/946,873；2007年8月3日提交的USSN：10/833,934；2005年4月27日提交的USSN：11/115,989以及2007年11月21日提交的USSN：11/944,227；这些专利申请的全部内容出于所有目的通过引用结合。
当存在两个或更多个配体时，这些配体可以都具有相同特性，都具有不同特性，或一些配体具有相同特性而其他配体具有不同特性。例如，配体可以具有靶向特性、具有内体溶解活性或具有PK调节特性。在一个优选实施例中，全部这些配体都具有不同特性。
可以将配体偶联到寡核苷酸的不同位置，例如3’末端、5’末端和/或在内部位置。在优选实施例中，将该配体经由一个介入系栓物(例如在此描述的载体)附接到这些寡核苷酸。当将单体并入正在生长的链中时，该配体或系拴物的配体可以存在于所述单体上。在一些实施例中，可以在已经将“前体”单体并入正在生长的链中后，将配体经由偶联到所述“前体”单体来并入。例如，可以将具有例如氨基封端的系拴物(即不具有缔合的配体)的单体(例如TAP-(CH2)nNH2)并入正在生长的寡核苷酸链。在随后的操作中，即在将该前体单体并入该链中后，随后可以将具有亲电基团(例如五氟苯酯或醛基)的配体通过将该配体的该亲电基团与该前体单体的系栓物的末端亲核基团偶联来附接到该前体单体。
在另一个实例中，可以并入具有适用于参与点击化学(Click Chemistry)反应的化学基团的单体，例如叠氮化物或炔烃封端的系拴物/接头。在随后的操作中，即在将该前体单体并入该链中后，可以将具有互补化学基团(例如炔烃或叠氮化物)的配体通过将该炔烃与该叠氮化物偶联在一起来附接至该前体单体。
对于双链寡核苷酸而言，可以将配体附接到一条或两条链上。在一些实施例中，双链iRNA试剂包含与有义链缀合的配体。在其他实施例中，双链iRNA试剂包含与反义链缀合的配体。
在一些实施例中，可以将配体与核酸分子的核碱基、糖部分或核苷间键合进行缀合。与嘌呤核碱基或其衍生物的缀合可以在任何位置处(包括内环和外环原子)出现。在一些实施例中，将嘌呤核碱基的2-、6-、7-或8-位附接至缀合物部分。与嘧啶核碱基或其衍生物的缀合物也可以在任何位置处出现。在一些实施例中，可以将嘧啶核碱基的2-、5-以及6-位用缀合物部分取代。与核苷的糖部分的缀合可以在任何碳原子处出现。可以被附接至缀合物部分的糖部分的示例性碳原子包括2′、3′以及5′碳原子。还可以将1′位附接至缀合物部分，如在脱碱基残基中。核苷间键还可以具有缀合物部分。对于含磷键(例如磷酸二酯、硫代硫酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酰酯等)而言，可以直接将缀合物部分附接至磷原子或与该磷原子结合的O、N或S原子。对于含胺或酰胺的核苷间键(例如PNA)来说，可以将缀合物部分连接到该胺或酰胺的氮原子或相邻碳原子。
在一些实施例中，配体与有义链缀合。如本文所述的，配体可以在有义链的3’-末端、5’-末端或在内部位置缀合。在一些实施例中，配体缀合到有义链的3’-末端。此外，配体可以与有义链的核碱基、糖部分、或核苷酸间键。
可以使用RNA干扰领域中的任何适合配体，但该配体典型地是碳水化合物，例如单糖(如GalNAc)、二糖、三糖、四糖、多糖。
使该配体与该核酸缀合的接头包括以上论述的那些。例如，配体可以是通过单价、二价或三价支链接头附接的一个或多个GalNAc(N-乙酰葡糖胺)衍生物。
在一些实施例中，本发明的dsRNA与二价和三价支链接头缀合，包括式(IV)-(VII)中的任一种所示的结构：
其中：
q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B以及q5C对于每次出现独立地表示0-20并且其中重复单元可以是相同或不同的；
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T5A、T5B、T5C对于每次出现各自独立地是：不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；
Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C对于每次出现独立地是：不存在、亚烷基、经取代的亚烷基，其中一个或多个亚甲基可以穿插或末端为O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R’)＝C(R”)、C≡C或C(O)中的一个或多个；
R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C对于每次出现各自独立地是：不存在、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH＝N-O、 或杂环基；
L2A、L2B、L3A、L5B、L4A、L4B、L5A、L5B和L5C表示配体；即对于每次出现各自独立地是单糖(例如GalNAc)、二糖、三糖、四糖、寡糖或多糖；并且
Ra是H或氨基酸侧链。
三价缀合的GalNAc衍生物特别可用于与RNAi试剂一起用于抑制靶基因的表达，如具有式(VII)的那些：
其中L5A、L5B和L5C表示单糖，例如GalNAc衍生物。
缀合GalNAc衍生物的适合的二价和三价支链接头基团的实例包括但不限于以下化合物：
/>
/>
定义
如在此使用，术语“dsRNA”、“siRNA”和“iRNA试剂”可交换用于可以介导靶RNA(例如mRNA，例如，编码蛋白质的基因的转录物)的沉默的试剂。为方便起见，这样的mRNA在此也被称为有待被沉默的mRNA。这样的基因也称为靶基因。通常，有待被沉默的RNA是内源基因或病原体基因。另外，除了mRNA以外的RNA(例如tRNA)以及病毒RNA也可以被靶向。
如在此使用，短语“介导RNAi”是指以序列特异性方式沉默靶RNA的能力。尽管不希望被理论所束缚，但是应认为沉默采用了RNAi机制或过程以及指导RNA，例如具有21至23个核苷酸的siRNA试剂。
如在此使用，“特异可杂交的”和“互补的”是用来指示足够程度的互补性以使得在本发明的化合物与靶RNA分子之间发生稳定且特异性结合的术语。特异性结合需要足够程度的互补性以避免寡聚化合物与非靶序列在特异性结合是所希望的条件下的非特异性结合，即在测定或治疗性处理的情况下的生理条件下或在体外测定的情况下的进行这些测定的条件下。这些非靶序列典型地至少5个核苷酸不同。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子与靶RNA(例如，靶mRNA)“充分互补”，以使得dsRNA分子沉默由该靶mRNA编码的蛋白质的生产。在另一个实施例中，本发明的dsRNA分子与靶RNA“完全互补”，例如该靶RNA与该dsRNA双链体试剂退火例如以形成在具有完全互补性的区域中唯一地由沃森-克里克碱基对组成的杂交体。“充分互补的”靶RNA可以包括与靶RNA完全互补的内部区(例如具有至少10个核苷酸)。此外，在一些实施例中，本发明的dsRNA分子确切地以单个核苷酸的区别加以辨别。在这种情况下，如果在(例如具有单个核苷酸区别的7个核苷酸内)的区域中发现完全互补，则dsRNA分子才会介导RNAi。
如在此使用，术语“寡核苷酸”是指例如具有少于100、200、300或400个核苷酸长度的核酸分子(RNA或DNA)。
术语“BNA”是指桥接的核酸，并且通常称为受约束或不可接近的RNA。BNA可以含有5元、6元、或甚至7元桥连的结构，其具有“固定的”C3’-内糖折皱。通常将桥并入核糖的2′-、4′-位置以提供2′、4′-BNA核苷酸(例如，LNA或ENA)。BNA核苷酸的实例包括以下核苷：
术语“LNA”是指锁定的核酸，并且通常称为受约束的或不可接近的RNA。LNA是修饰的RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分用额外的桥(例如，亚甲基桥或乙烯桥)修饰，该额外的桥连接2′羟基与相同核糖的4′碳。例如，桥可以“锁定”3′-内部North)构造中的核糖：
术语“ENA”是指乙烯桥接的核酸，并且通常称为受约束或不可接近的RNA。
“切割位点”在本文中意指靶基因或有义链中的骨架连接，其通过利用iRNA试剂被RISC机制切割。并且靶切割位点区域在切割位点的两侧包含至少一个或至少两个核苷酸。对于有义链，切割位点是有义链中的骨架连接，如果有义链本身是被RNAi机制切割的靶，则其将被切割。可以使用本领域已知的方法确定切割位点，这些方法例如5’-RACE测定，如详细描述在Soutschek等人，Nature[自然](2004)432，173-178，将其通过引用以其整体结合在此。如本领域所熟知的，包含两个长度为21个核苷酸的链(其中所述链形成19个连续的碱基对的双链区域，在3’-末端具有2-核苷酸单链突出)的锥形双链RNAi试剂的切割位点区域，切割位点区域对应于有义链的位置9-12(从5’-末端开始)。
可切割的连接基团
可切割的连接基团在细胞外是足够稳定的，但它在进入靶细胞时被切割以释放该接头将其结合在一起的两个部分。在根据本发明的dsRNA分子的优选实施例中，可切割的连接基团在靶细胞中或第一参比条件下(可以例如将其选择成模拟或代表胞内条件)的切割比受试者的血液中或第二参比条件(可以例如将其选择成模拟或代表血液或血清中发现的条件)下快至少10倍或更优选地至少100倍。
可切割的连接基团易于受到切割因子(例如pH、氧化还原电位或降解分子的存在)的影响。通常，切割因子在细胞内比在血清或血液中更普遍或以更高水平或活性被发现。此类降解剂实例包括：针对特定底物选择的或没有底物特异性的氧化还原剂，包括例如存在于细胞中的氧化性酶或还原性酶或还原剂例如硫醇，其可以通过还原作用降解可经氧化还原切割的连接基团；酯酶；核内体或可以产生酸性环境的试剂，例如，那些产生pH 5或更低的那些；可以水解或降解酸性可切割的连接基团的酶，其作用为普通酸、肽酶(其可以是底物特异性的)和磷酸酶。
可切割连接基团，例如二硫键，可对pH敏感。人血清的pH是7.4，而平均的细胞内pH稍低，在约7.1-7.3范围内。核内体具有在5.5-6.0范围内的更酸性的pH，并且溶酶体具有在5.0左右的甚至更酸性的pH。一些接头将具有在优选的pH处被切割的可切割连接基，因而在细胞内部从配体释放阳离子脂质或释放至所需的细胞区室。
接头可以包括可被具体的酶切割的可切割的连接基团。结合到接头中的可切割的连接基团的类型可以取决于有待靶向的细胞。例如，肝靶向配体可以通过包括酯基的接头而被连接至阳离子脂质。肝细胞富含酯酶，因此该连接体将在肝细胞中的切割比在没有富含酯酶的细胞类型中的切割更加有效率。其他富含酯酶的细胞类型包括肺、肾皮质和睪丸的细胞。
当靶向富含肽酶的细胞类型(例如肝细胞和滑膜细胞)时，可以使用包含肽键的连接体。
通常，通过测试降解剂(或条件)切割候选连接基团的能力来评估该候选的可切割的连接基团的适合性。还令人希望的是，也测试候选的可切割的连接基团在血液中或当与其他非靶组织接触时抵抗切割的能力。因此，可以确定在第一条件与第二条件之间进行切割的相对敏感性，其中该第一条件被选择为指示在一个靶细胞中的切割并且该第二条件被选择为指示在其他组织或生物流体(例如，血液或血清)中的切割。这些评估可以在无细胞系统中、在细胞中、在细胞培养物中、在器官或组织培养物中或在整个动物中进行。可能有用的是，在无细胞或培养条件下作出初步评价并且通过在完整动物中进一步评价来证实。在优选的实施例中，与血液或血清(或在经选择以模拟胞外条件的体外条件下)相比，可用候选化合物在细胞(或在经选择以模拟胞内条件的体外条件下)中至少2、4、10或100倍地被切割。
氧化还原可切割的连接基团
一类可切割的连接基团是氧化还原可切割的连接基团，该氧化还原可切割的连接基团可以用于根据本发明的dsRNA分子中，该氧化还原可切割的连接基团在还原或氧化时被切割。可还原切割的连接基团的实例是二硫化物连接基团(-S-S-)。为了确定候选的可切割连接基团是否是适合的“可还原切割的连接基团”，或例如是否适合于与特定iRNA部分和特定靶向剂一起使用，可以参考在此描述的方法。例如可以通过用二硫苏糖醇(DTT)或本领域中已知的其他使用还原剂的试剂进行孵育来对候选物进行评估，这模拟了会在细胞(例如靶细胞)中观察到的切割速率。还可以在被选择成模拟血液或血清条件的条件下对这些候选物进行评估。在优选实施例中，候选化合物在血液中遭切割最多10％。在优选实施例中，与血液(或在经选择以模拟胞外条件的体外条件下)才目比，可用候选化合物在细胞(或在经选择以模拟胞内条件的体外条件下)中至少2、4、10或100倍地降解。可使用标准酶动力学检测在选择为模拟细胞内介质的条件下并与选择为模拟细胞外介质的条件下比较而确定候选化合物的切割速率。
基于磷酸酯的可切割连接基团
可以在根据本发明的dsRNA分子中使用的基于磷酸酯的可切割连接基团被降解或水解磷酸酯基团的试剂切割。在细胞中切割磷酸酯基团的试剂的实例是酶，例如细胞中的磷酸酶。基于磷酸酯的连接基团的实例是-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-。优选的实施例是-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-。优选实施例是-O-P(O)(OH)-O-。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评估这些候选物。
酸可切割的连接基团
可以用于根据本发明的dsRNA分子的酸可切割连接基团是在酸性条件下被切割的连接基团。在优选实施例中，酸可切割的连接基团在pH为约6.5或更低(例如，约6.0、5.5、5.0或更低)的酸性环境下切割或由可以充当广义酸的试剂(如酶)切割。在细胞中，具体的低pH细胞器(例如核内体或溶酶体)可以提供针对酸可切割的连接基团的切割环境。酸可切割的连接基团的实例包括但不限于腙、酯以及氨基酸的酯。酸可切割的基团可以具有通式-C＝NN-、C(O)O或-OC(O)。优选实施例是当附接到酯(烷氧基基团)的氧的碳是芳基基团、取代的烷基基团或叔烷基基团(如二甲基戊基或叔丁基)时。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评估这些候选物。
基于酯的连接基团
可以在根据本发明的dsRNA分子中使用的基于酯的可切割连接基团被酶(如细胞中的酯酶和酰胺酶)切割。基于酯的可切割的连接基团的实例包括但不限于，亚烷基、亚烯基和亚炔基的酯类。可切割的酯连接基团具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评估这些候选物。
基于肽的切割基团
可以在根据本发明的dsRNA分子中使用的基于肽的可切割连接基团被酶(如细胞中的肽酶和蛋白酶)切割。基于肽的可切割连接基是氨基酸之间形成以产生寡肽(例如，二肽、三肽等)和多肽的肽键。基于肽的可切割的基团不包括酰胺基团(-C(O)NH-)。酰胺基团可以在任何亚烷基、亚烯基或亚炔基之间形成。肽键是为了产生肽和蛋白质而在氨基酸之间形成的一种特别类型的酰胺键。基于肽的切割基团通常限于在产生肽和蛋白质的氨基酸之间形成的肽键(即酰胺键)，且不包括整个酰胺官能基团。基于肽的可切割的连接基团具有通式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA和RB是这两个邻接氨基酸的R基团。可以使用类似于以上描述的那些的方法来评估这些候选物。本文所使用的“碳水化合物”是指其本身由一个或多个具有至少6个碳原子(其可以是线性、分支或环状)且在各个碳原子连接氧、氮或硫原子的单糖单位所构成碳水化合物的化合物；或具有由一个或多个具有至少6个碳原子(其可以是线性、分支或环状)且在各个碳原子上连接氧、氮或硫原子的单糖单位所构成的碳水化合物部分作为其中一部分的化合物。代表性碳水化合物包括糖(单糖、二糖、三糖和含有约4-9个单糖单位的寡糖)和多糖如淀粉，糖原，纤维素和多糖树胶。具体的单糖包括C5及以上(优选C5-C8)糖；二糖和三糖，包括具有两个或三个单糖单位的糖(优选C5-C8)。
本发明进一步涉及如本文所定义的dsRNA分子用于抑制靶基因的表达的用途。在一些实施例中，本发明进一步涉及dsRNA分子用于在体外抑制靶基因的表达的用途。
本发明进一步涉及如本文所定义的dsRNA分子用于抑制受试者中靶基因的表达。受试者可以是任何动物，如哺乳动物，例如小鼠、大鼠、绵羊、牛、狗、猫或人。
在一些实施例中，本发明的dsRNA分子在缓冲液中给予。
在一些实施例中，siRNA化合物可以被配制用于给予至受试者。被配制的siRNA组合物可以采取多种状态。在一些实例中，该组合物是至少部分结晶、均匀结晶和/或无水的(例如少于80％、50％、30％、20％或10％的水)。在另一个实例中，该siRNA处于水相中，例如处于包括水的溶液中。
这些水相或结晶组合物可以被并入递送运载体中，例如脂质体(特别用于水相)或颗粒(例如可以适用于结晶组合物的微颗粒)。通常，如在此描述，该siRNA组合物以与预期给药方法相容的方式配制。例如，在具体的实施例中，通过以下方法的至少一种来制备组合物：喷雾干燥、冻干、真空干燥、蒸发、流化床干燥或这些技术的组合；或与脂质一起声处理、冷冻干燥、缩合以及其他自组装。
siRNA制剂可以与另一种试剂(例如另一种治疗剂或使siRNA稳定化的试剂(例如与siRNA复合以形成iRNP的蛋白质))组合配制。再其他试剂包括螯合剂(例如EDTA(例如以去除二价阳离子，如Mg2+))、盐、RNA酶抑制剂(例如广泛特异性RNA酶抑制剂，如RNAsin)等。
在一些实施例中，siRNA制剂包括另一种siRNA化合物，例如可以针对第二基因或针对相同基因介导RNAi的第二siRNA。再其他制剂可以包括至少3种、5种、十种、二十种、五十种或一百种或更多种不同siRNA种类。这样的siRNA可以针对类似数目的不同基因介导RNAi。
在一些实施例中，siRNA制剂包括至少一种第二治疗剂(例如除RNA或DNA以外的试剂)。例如，用于治疗病毒性疾病(如HIV)的siRNA组合物可能包括已知的抗病毒剂(如蛋白酶抑制剂或逆转录酶抑制剂)。在另一个实例中，用于治疗癌症的siRNA组合物可能进一步包括化疗剂。
以下讨论了可用于给予根据本发明的dsRNA分子的示例性配制品。
脂质体.为了便于阐释，在这一部分很大程度上相对于未修饰的siRNA化合物讨论了配制品、组合物和方法。然而，可以理解的是，可以用其他siRNA化合物(例如，修饰的siRNA)实践这些配制品、组合物和方法，并且这样的实践属于本发明。siRNA化合物制剂可以被配制用于在膜状分子组装体(例如，脂质体或胶束)中递送，该siRNA化合物是例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如，前体，该前体例如可以被加工成ssiRNA化合物的较大的siRNA化合物、或编码siRNA化合物(例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物或其前体)的DNA)。本文所使用的术语“脂质体”是指由在至少一个双层(例如，一个双层或复数个双层)中排列的两亲性脂质构成的囊泡。脂质体包括单层和多层囊泡，其具有由亲脂性材料形成的膜和水性内部。该水性部分包含该siRNA组合物。该亲脂性材料将该水性内部与水性外部分离，该水性外部典型地不包括该siRNA组合物，但在一些实例中，它可以包括。脂质体可用于转运和递送活性成分至作用位点。由于脂质体膜在结构上类似生物膜，因此当应用脂质体至组织时，脂质体双层与细胞膜的双层融合。随着脂质体与细胞的融合进行，包括该siRNA的内部水性内含物被递送到该细胞中，其中该siRNA可以特异性结合到靶RNA并且可以介导RNAi。在一些情况下，这些脂质体还被特异性靶向以例如将该siRNA指引到特定细胞类型。
包含siRNA的脂质体可以通过多种方法制备。在一个实例中，脂质体的脂质成分溶解于洗涤剂中以便与脂质组分形成胶束。例如，脂质组分可以是两亲性阳离子脂质或脂质缀合物。该洗涤剂可以具有高的临界胶束浓度并且可以是非离子的。示例性的洗涤剂包括胆酸盐、CHAPS、辛基葡糖苷、脱氧胆酸盐和月桂酰肌氨酸。然后将该siRNA制剂添加到包括该脂质组分的这些胶束。该脂质上的阳离子基团与该siRNA相互作用并且在该siRNA周围缩合以形成脂质体。在缩合之后，通过例如透析去除该洗涤剂以产生siRNA脂质体制剂。
如果必要，可以在缩合反应期间添加(例如，通过控制添加法)辅助缩合的载体化合物。例如，载体化合物可以是除核酸以外的聚合物(例如，精胺或亚精胺)。还可以调节pH以促进缩合。
用于生产并入多核苷酸/阳离子脂质复合体作为递送运载体的结构组分的稳定的多核苷酸递送运载体的方法的另外说明描述于例如WO 96/37194中。脂质体配制品也可以包括以下文献中描述的示例性方法的一个或多个方面：Felgner，P.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]8：7413-7417，1987；美国专利号4,897,355；美国专利号5,171,678；Bangham等人，M.Mol.Biol.[分子生物学杂志]23：238，1965；Olson等人，Biochim.Biophys.Acta[生物化学生物物理学报]557：9，1979；Szoka等人，Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]75：4194，1978；Mayhew等人，Biochim.Biophys.Acta[生物化学生物物理学报]775：169，1984；Kim等人，Biochim.Biophys.Acta[生物化学生物物理学报]728：339，1983；和Fukunaga等人，Endocrinol.[内分泌学杂志]115：757，1984，将其通过引用以其整体结合在此。用于制备用作递送运载体的具有适当尺寸的脂质聚集体的常用技术包括声处理和冻融加挤压(参见例如Mayer(迈尔)等人.Biochim.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学学报]858：161，1986，将其通过引用以其整体结合在此)。当一贯地小(50到200nm)并且相对均匀的聚集体是所希望的时候，可以使用微流化(Mayhew等人，Biochim.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学学报]775：169，1984，将其通过引用以其整体结合在此)。这些方法容易适于将siRNA制剂包装到脂质体中。
pH敏感的或带负电的脂质体包埋核酸分子而非具有其的复合物。因为核酸分子和脂质都带类似的电，所以发生排斥而非复合体形成。尽管如此，一些核酸分子包埋于这些脂质体的水性内部中。pH敏感的脂质体已经用以将编码胸苷激酶基因的DNA递送到培养物中的细胞单层。检测外源基因在靶细胞中的表达(Zhou等人，Journal of ControlledRelease[控制释放杂志]，19，(1992)269-274，将其通过引用以其整体结合在此)。
一种主要类型的脂质体组合物包括除了天然衍生的磷脂酰胆碱以外的磷脂。中性脂质体组合物可以例如，从二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)形成。阴离子脂质体组合物通常是从二肉豆蔻酰磷脂酰甘油形成，而阴离子基因融合性脂质体主要从二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成。另一种类型的脂质体组合物是从磷脂酰胆碱(PC)形成，如，例如，大豆PC和蛋PC。另一种类型是从磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物形成。
在体外将脂质体引入细胞的其他方法的实例包括美国专利号5,283,185；美国专利号5,171,678；WO 94/00569；WO 93/24640；WO 91/16024；Feigner，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]269：2550，1994；Nabel，Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]90：11307，1993；Nabel，Human Gene Ther.[人类基因疗法]3：649，1992；Gershon，Biochem.[生物化学]32：7143，1993；和Strauss EMBO J.[EMBO杂志]11：417，1992。
在一些实施例中，使用阳离子脂质体。阳离子脂质体的优点在于能够与细胞膜融合。尽管非阳离子脂质体不能够如与质膜一般有效地融合，但在体内由巨噬细胞吸收并且可以用于将siRNA递送到巨噬细胞。
脂质体的另外的优势包括：从天然磷脂获得的脂质体是生物相容的且生物可降解的；脂质体可以并入广泛类型的水溶性和脂溶性药物；脂质体可以保护包封在其内部隔室内的siRNA免于被代谢和降解(Rosoff，在“Parmaceutical Dosage Forms”[药物剂型]，Lieberman，Rieger和Banker(编辑)，1988，第1卷，第245页)。在制备脂质体配制品方面的重要考虑是脂质表面电荷、囊泡大小和脂质体的水性体积。
带正电荷的合成阳离子脂质，N-[1-(2，3-二油烯基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)可以用于形成小脂质体，其与核酸自发地相互作用以形成脂质-核酸复合物，该复合物能够与组织培养细胞的细胞膜的带负电荷脂质融合，从而导致siRNA的递送(关于DOTMA及其与DNA的使用的描述，参见例如，Felgner，P.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA[美国科学院院刊]8：7413-7417，1987以及美国专利号4,897,355，将其通过引用以其整体结合在此)。
DOTMA类似物，1，2-双(油酰氧基)-3-(三甲基氨)丙烷(DOTAP)可以与磷脂组合使用以形成DNA-复合的囊泡。LipofectinTM(贝塞斯达研究实验室，盖瑟斯堡，马里兰州(Bethesda Research Laboratories，Gaithersburg，Md.))是递送高阴离子核酸进入活组织培养细胞中的有效试剂，该活组织培养细胞包含带正电荷的DOTMA脂质体，该DOTMA脂质体与带负电荷的多核苷酸自发地相互作用以形成复合物。当使用带足够正电荷的脂质体时，在所得复合物上的净电荷也带正电荷。以此方式制备的带正电荷的复合物自发地附接至带负电荷的细胞表面，与质膜融合，并且有效地递送功能性核酸至例如组织培养细胞中。另一种可商购的阳离子脂质，1，2-双(油酰氧基)-3，3-(三甲基氨)丙烷(“DOTAP”)(宝灵曼公司，印第安纳波利斯，印第安纳州(Boehringer Mannheim，Indianapolis，Indiana))不同于DOTMA，因为油酰部分是通过酯而非醚键连接。
其他报道的阳离子脂质化合物包括已经与多种部分缀合的那些，包括例如羧基精胺，它已经与两种类型的脂质之一缀合并且包括化合物，如5-羧基精胺基甘氨酸二八油酰基酰胺(“DOGS”)(TransfectamTM，普洛麦格公司(Promega)，麦迪逊(Madison)，威斯康星州(Wisconsin))和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺5-羧基精胺基-酰胺(“DPPES”)(参见例如美国专利号5,171,678)。
另一种阳离子脂质缀合物包括衍生有胆固醇的脂质(“DC-Chol”)，其已与DOPE组合配制到脂质体中(参见Gao，X.和Huang，L.，Biochim.Biophys.Res.Commun.[生物化学和生物物理学研究通讯].179：280，1991)。通过使聚赖氨酸与DOPE缀合而制造的脂质聚赖氨酸已经被报道有效用于在血清存在下的转染(Zhou，X.等人，Biochim.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学学报]1065：8，1991，将其通过引用以其整体结合在此)。对于某些细胞系中，这些包含经缀合的阳离子脂质的脂质体据说比包含DOTMA的组合物展现更低的毒性并提供更有效的转染。其他可商购的阳离子脂质产品包括DMRIE和DMRIE-HP(维卡公司，拉荷亚，加利福尼亚州(Vical，La Jolla，California))和Lipofectamine(DOSPA)(生命科技公司，盖瑟斯堡，马里兰州(Life Technology，Inc.，Gaithersburg，Maryland))。其他适合于递送寡核苷酸的阳离子脂质描述于WO 98/39359和WO 96/37194中。
脂质体配制品特别适合于局部给予，脂质体比其他配制品具有数个优点。这样的优势包括与所给予的药物的高全身性吸收相关的副作用减小、在所希望的靶处所给予的药物的积聚增加以及将siRNA给予到皮肤中的能力。在一些实现方式中，脂质体用于将siRNA递送到表皮细胞并且还增强siRNA渗透到皮组织中，例如到皮肤中。例如，脂质体可以局部应用。将配制为脂质体的药物局部递送至皮肤已有文献描述(参见例如，Weiner等人，Journal of Drug Targeting[药物靶向杂志]1992，第2卷，405-410；以及du Plessis等人，Antiviral Research[抗病毒研究]，18，1992，259-265；Mannino，R.J.和Fould-Fogerite，S.，Biotechniques[生物技术]6：682-690，1988；Itani，T.等人Gene[基因]56：267-276.1987；Nicolau，C.等人Meth.Enz.[酶学方法]149：157-176，1987；Straubinger，R.M.和Papahadjopoulos，D.Meth.Enz.[酶学方法]101：512-527，1983；Wang，C.Y.和Huang，L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]84：7851-7855，1987，将其通过引用以其整体结合在此)。
也曾检测非离子脂质体系统来确定其在递送药物至皮肤方面的用途，特别是包含非离子表面活性剂和胆固醇的系统。使用包含Novasome I(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)和Novasome II(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)的非离子脂质体配制品来递送药物至小鼠皮肤的真皮。这样的具有siRNA的配制品适于治疗一种皮肤失调。
包括siRNA的脂质体可以被制得高度可变形。这样的可变形性可以使得脂质体能够渗透穿过比脂质体平均半径更小的孔。例如，传递体(transfersome)是可变形的脂质体的一种类型。传递体可以通过将表面边缘活化剂(通常为表面活性剂)添加到标准的脂质体组合物中制成。包括siRNA的传递体可以例如通过注射皮下递送，从而将siRNA递送到皮肤中的角质细胞。为了穿过完整的哺乳动物皮肤，脂质囊泡必需在合适的透皮梯度下穿过一系列细孔，每个孔的直径均小于50nm。另外，由于脂质特性，这些传递体可以自动优化(适于例如皮肤中的孔隙的形状)、自动修复，并且可以经常到达其靶而不破碎，并且通常自动负载。
属于本发明的其他配制品描述在2008年1月2日提交的美国临时申请序列号61/018,616；2008年1月2日提交的美国临时申请序列号61/018,611；2008年3月26日提交的美国临时申请序列号61/039,748；2008年4月22日提交的美国临时申请序列号61/047,087以及2008年5月8日提交的美国临时申请序列号61/051,528。2007年10月3日提交的PCT申请号PCT/US 2007/080331也描述了属于本发明的配制品。
有面活性剂.为了便于阐释，在这一部分很大程度上相对于未修饰的siRNA化合物讨论了配制品、组合物和方法。然而，可以理解的是，可以用其他siRNA化合物(例如，修饰的siRNA化合物)实践这些配制品、组合物和方法，并且这样的实践是在本发明的范围内。表面活性剂在如乳液(包括微乳液)和脂质体的配制品中获得广泛应用(参见上文)。siRNA(或前体，例如可以被加工为siRNA的较大的dsiRNA，或编码siRNA或前体的DNA)组合物可以包括表面活性剂。在一些实施例中，siRNA被配制为包括表面活性剂的乳液。对许多不同类型的表面活性剂(包括天然和合成的)的性质分类和分级的最常用的方式是通过使用亲水性/疏水性平衡(HLB)。亲水基团的性质提供了将配制品中所用的不同表面活性剂分类的最有用手段(Rieger，在“Pharmaceutical Dosage Forms[药物剂型]，”Marcel Dekker，Inc.[马塞尔德克尔公司]，纽约，纽约州，1988，第285页)。
如果表面活性剂分子是非离子化，则其被归类于非离子表面活性剂。非离子表面活性剂在药物产品中获得广泛应用并且在很宽的pH值范围内是可用的。通常，其HLB值范围为2至约18，取决于其结构。非离子型表面活性剂包括非离子型酯，例如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、脱水山梨糖醇酯、蔗糖酯以及乙氧基化酯。非离子型烷醇酰胺以及醚(例如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇、以及乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物)也包括在这一类别中。聚氧乙烯表面活性剂是该非离子型表面活性剂类别中最常用的成员。
如果表面活性剂分子当溶解或分散于水中时携带负电荷，则该表面活性剂归类为阴离子。阴离子表面活性剂包括羧酸盐类，例如皂类、酰基乳酸酯、氨基酸的酰基酰胺、硫酸的酯(例如硫酸烷基酯和乙氧基化硫酸烷基酯)、磺酸酯(例如苯磺酸烷基酯、羟乙基磺酸酰基酯、牛磺酸酰基酯和磺基琥珀酸酯)、和磷酸酯。阴离子表面活性剂的最重要成员是硫酸烷基酯和皂类。
如果表面活性剂分子当溶解或分散于水中时携带正电荷，则该表面活性剂归类为阳离子。阳离子表面活性剂包括季铵盐和乙氧基化胺。季铵盐是此类阳离子表面活性剂的最常用成员。
如果表面活性剂分子具有携带正电荷或负电荷的能力，则该表面活性剂归类于两亲性。两亲性表面活性剂包括丙烯酸衍生物、经取代的烷基酰胺、N-烷基甜菜碱和磷脂。
已经综述了表面活性剂在药品、配制品以及乳液中的使用(列赫尔，“药物剂型”，马塞尔德克尔公司，纽约，纽约州，1988，第285页)。
胶束和其他膜状配制品.为了便于阐释，在这一部分很大程度上相对于未修饰的siRNA化合物讨论了胶束以及其他配制品、组合物和方法。然而，可以理解的是，可以用其他siRNA化合物(例如，修饰的siRNA化合物)实践这些胶束以及其他配制品、组合物和方法，并且这样的实践属于本发明。siRNA化合物组合物可以被提供为一种胶束配制品，该siRNA化合物是例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如，前体，例如可以被加工成ssiRNA化合物的较大的siRNA化合物、或编码siRNA化合物(例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物或其前体)的DNA)。本文中“胶束”被定义为一种特别的分子组装类型，其中两亲性分子被排列在球形结构中，这样使得分子的所有疏水性部分均向内，使亲水性部分与周围的水相接触。如果环境是疏水性的，则其排列相反。
适合于通过透皮膜递送的混合胶束配制品可以通过混合siRNA组合物的水性溶液、C8至C22烷基硫酸碱金属盐和胶束形成化合物来制备。示例性胶束形成化合物包括卵磷脂、透明质酸、透明质酸的药学上可接受的盐、乙醇酸、乳酸、洋甘菊萃取物、小黄瓜萃取物、油酸、亚油酸、亚麻酸、单油酸甘油酯、单油酸酯、单月桂酸酯、琉璃苣油、月见草油、薄荷醇、三羟基氧代胆烷基甘氨酸及其药学上可接受的盐、甘油、聚甘油、赖氨酸、聚赖氨酸、三油酸甘油酯、聚氧乙烯醚及其类似物、聚多卡醇烷基醚及其类似物、鹅去氧胆酸盐、去氧胆酸盐、及其混合物。胶束形成性化合物可能与添加烷基硫酸碱金属盐时同时或之后添加。基本上任何种类的成分混合法均可形成混合胶束，但需要充分混合以便提供较小的胶束。
在一种方法中，制备包含siRNA组合物和至少一种烷基硫酸碱金属盐的第一胶束组合物。该第一胶束组合物然后与至少三种胶束形成化合物形成混合的胶束组合物。在另一种方法中，胶束组合物是通过混合siRNA组合物、烷基硫酸碱金属盐和至少一种胶束形成性化合物，然后在充分混合下添加剩余的胶束形成化合物来制备。
可能添加苯酚和/或间甲酚至混合胶束组合物中，以便稳定配制品并保护防止细菌生长。可替代地，苯酚和/或间甲酚可以与胶束形成成分一起添加。也可以在混合胶束组合物形成后添加等渗剂，例如甘油。
对于作为喷雾剂递送胶束配制品，可以将配制品放入气溶胶分配器中，并且在该分配器中填充推进剂。分配器中的推进剂在加压下呈液态。调整成分比例，以致于水相和推进剂相合而为一，即只有一个相。如果出现两个相，必需先摇动分配器，然后再例如，通过计量阀分配一部分内容物。将从计量阀呈细雾推送出分配剂量的药物试剂。
推进剂可以包括含氢的氯氟化碳、含氢的氟碳化合物、二甲醚和二乙醚。在某些实施例中，可以使用HFA 134a(1，1，1，2四氟乙烷)。
必要成分的具体浓度可以通过相当直接的实验确定。对于通过口腔吸收，经常需要增加(例如，至少两倍或三倍)通过注射或经过胃肠道给予的剂量。
颗粒.为了便于阐释，在这一部分很大程度上相对于修饰的siRNA化合物讨论了颗粒、配制品、组合物以及方法。然而，可以理解的是，可以用其他siRNA化合物(例如，未修饰的siRNA化合物)实践这些颗粒、配制品、组合物以及方法，并且这样的实践属于本发明。在另一个实施例中，一种siRNA化合物制剂可以被并入进颗粒(例如微颗粒)，该siRNA化合物是例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如，前体，例可以被加工成ssiRNA化合物的较大的siRNA化合物、或编码siRNA化合物(例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物或其前体)的DNA)。微颗粒可以通过喷雾干燥产生，但是也可以通过其他方法产生，包括冷冻干燥、蒸发、流化床干燥、真空干燥、或这些技术的组合。
药物组合物
本发明的iRNA试剂可以被配制用于药物用途。本发明进一步涉及包含如本文所定义的dsRNA分子的药物组合物。药学上可接受的组合物包含治疗有效量的前述实施例中任一项所述的dsRNA分子中的一种或多种，单独使用或与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)、赋形剂和/或稀释剂配制在一起。
药物组合物可以针对以固体或液体形式给予而进行特别配制，包括适用于以下的那些：(1)口服给予，例如，浸液(drenches)(水性或非水溶液或悬浮液)、片剂(例如针对口腔、舌下和全身吸收的那些)、丸剂、粉剂、颗粒剂、糊剂(应用于舌)；(2)肠胃外给予，例如，通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射(作为例如无菌溶液或悬浮液，或缓释配制品)；(3)局部施用，例如，作为施用于皮肤的乳膏剂、软膏剂或控释贴剂或喷雾；(4)阴道内或直肠内，例如作为阴道栓剂、乳膏剂或泡沫剂；(5)舌下；(6)经眼地；(7)经皮地；或(8)鼻腔。使用皮下或静脉内方法递送可以是特别有利的。
如在此使用，短语“治疗有效量”意指化合物、材料或包括本发明的化合物的组合物的在适用于任何医学治疗的合理效益/风险比下在动物中的细胞的至少一个亚群中有效产生某些所希望的治疗效果的量。
短语“药学上可接受的”在此用以指属于正确医学判断的范围内、适用于与人类和动物的组织接触而无过量毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症、与合理效益/风险比相称的那些化合物、物质、组合物和/或剂型。
如在此所用，短语“药学上可接受的载体”意指参与将标的化合物从身体的器官或部位携载或运载到身体的另一个器官或部位的药学上可接受的物质、组合物或运载体，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如润滑剂、滑石镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌或硬脂酸)或溶剂囊封材料。每种载体必须在与该配制品的其他成分相容并且对患者无害的意义上是“可接受的”。可充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素和它的衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)粉状黄蓍；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，例如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；(9)油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油、以及大豆油；(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇、以及聚乙二醇；(12)酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)褐藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯类、聚碳酸酯类和/或聚酐类；(22)增量剂，例如多肽和氨基酸；(23)血清组分，如血清白蛋白、HDL和LDL；以及(22)在药物配制品中采用的其他无毒相容的物质。
这些配制品可以方便地以单位剂量形式呈现并且可以通过配药学领域熟知的任何方法进行制备。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将取决于所治疗的宿主、具体给药方式而变化。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常将是产生治疗效果的化合物的量。通常，在百分之百中，这一量将在从约百分之0.1到约百分之九十九、优选从约百分之5到约百分之70、最优选从约百分之10到约百分之30活性成分的范围内。
在某些实施例中，本发明的配制品包含赋形剂，该赋形剂选自下组，该组由以下组成：环糊精、纤维素、脂质体、胶束形成剂(例如胆汁酸)和聚合物载体(例如聚酯和聚酸酐)；以及本发明的化合物。在某些实施例中，前述配制品使本发明的化合物变得经口生物可用。
iRNA试剂制剂可以与另一种试剂(例如另一种治疗剂或使iRNA稳定化的试剂(例如与iRNA复合以形成iRNP的蛋白质))组合配制。再其他试剂包括螯合剂(例如EDTA(例如以去除二价阳离子，如Mg2+))、盐、RNA酶抑制剂(例如广泛特异性RNA酶抑制剂，如RNAsin)等。
制备这些配制品或组合物的方法包括使得本发明的化合物与载体以及任选地一种或多种辅助成分缔合的步骤。通常，通过使得本发明的化合物与液体载体或细粉状固体载体或两者均匀并且紧密地缔合并且然后(必要时)使产物成形来制备这些配制品。
在一些情况下，为了延长药物的作用，令人希望的是减缓该药物从皮下或肌肉内注射的吸收。这可以通过使用具有不良水溶解度的结晶或非晶材料的液体悬浮液来实现。药物的吸收速率进而取决于其溶解速率，溶解速率反过来可以取决于晶体尺寸以及晶型。可替代地，肠胃外给予的药物形式的延迟吸收通过将该药物溶解或悬浮在油性运载体中来实现。
可以通过从其他药物类推将根据本发明的化合物配制为用于以任何便利方式给药以在人类或兽医学中使用。
术语“治疗(treatment)”旨在还涵盖预防、治疗(therapy)以及治愈。接受这一治疗的患者通常是任何有需要的动物，包括灵长类动物(特别是人类)以及其他哺乳动物，如马、牛、猪和羊；以及家禽和宠物。
双链RNAi试剂体内地产生于细胞中，例如产生自被递送至该细胞中的外源DNA模板。例如，这些DNA模板可以被插入载体中并且被用作基因治疗载体。基因治疗载体可以通过例如静脉内注射、局部给予(美国专利号5,328,470，将其通过引用以其整体结合在此)或通过定向性注射(参见Chen等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]91：3054-3057，将其通过引用以其整体结合在此)被递送至受试者。该基因治疗载体的药物制剂可以包括在可接受的稀释剂中的该基因治疗载体，或者可以包括该基因递送运载体被嵌入其中的缓释基质。这些DNA模板例如可以包括两个转录单位，一个产生包括了dsRNA分子的顶链(top strand)的转录物，而一个产生包括了dsRNA分子的底链(bottom strand)的转录物。当这些模板被转录时，该dsRNA分子得以产生并且被加工成介导基因沉默的siRNA试剂片段。
递送途径
使用不同的递送途径，可以将如本文所定义的dsRNA分子或包含如本文所定义的dsRNA分子的药物组合物给予至受试者。可以通过多种途径将包括iRNA的组合物递送至受试者。示例性途径包括：静脉内、皮下、局部、经直肠、经肛门、经阴道、经鼻、经肺、经眼。
可以将本发明的iRNA分子和/或dsRNA分子并入适于给予的药物组合物。这样的组合物典型地包括一种或多种iRNA以及药学上可接受的载体。如在此所用，语言“药学上可接受的载体”旨在包括与药物给药相容的任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。将这样的介质和试剂用于药学上活性物质在本领域中是熟知的。除非在任何常规介质或试剂与该活性化合物不相容的情况下，否则涵盖其在这些组合物中的使用。补充性活性化合物也可以并入组合物中。
取决于希望局部还是全身性治疗以及取决于有待治疗的区域，可以将本发明的组合物以多种方式给予。给予可以是局部的(包括经眼的、经阴道、经直肠、鼻内、经皮)、口服的或肠胃外的。肠胃外给予包括静脉滴注，皮下、腹膜内或肌肉内注射，或鞘内或心室内给予。
给予的途径与位点可以被选择为增强靶向。例如，为了靶向肌细胞，肌肉内注射进感兴趣的肌肉内将是合逻辑的选择。可以通过将iRNA以气雾剂形式给予来靶向肺细胞。可以通过用iRNA包衣气囊式导管并且机械地引入DNA来靶向血管内皮细胞。
剂量
在一个方面中，本发明的特征是向受试者(例如人类受试者)给予dsRNA分子(例如，siRNA试剂)的方法。在另一方面，本发明涉及如本文所定义的dsRNA分子，其用于抑制受试者中靶基因的表达。该方法或医学用途包括给予单位剂量的dsRNA分子，例如siRNA试剂，例如以下双链siRNA试剂：(a)双链部分长14-40个核苷酸(nt)，例如21-23个nt，(b)与靶RNA(例如内源或病原体靶RNA)互补，并且任选地，(c)包括至少一个长1-5个核苷酸的3′突出。在一些实施例中，单位剂量小于10mg/kg的体重，或小于10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005或0.00001mg/kg的体重，并且小于200纳摩尔的RNA试剂(例如约4.4x1016个拷贝)/kg的体重，或小于1500、750、300、150、75、15、7.5、1.5、0.75、0.15、0.075、0.015、0.0075、0.0015、0.00075、0.00015纳摩尔的RNA试剂/kg的体重。
该确定的量可以是有效治疗或预防疾病或失调(例如，与靶RNA有关的疾病或失调)的量。该单位剂量例如可以通过注射(例如，静脉内的、皮下的或肌肉内的)、吸入剂量或局部施用来给予。在一些实施例中，剂量可以小于10、5、2、1或0.1mg/kg的体重。
在一些实施例中，该单位剂量以相比于每天一次不太频繁地给予，例如低于每2、4、8或30天一次。在另一个实施例中，该单位剂量不以一个频率给予(例如，不以规律的频率)。例如，可以单次给予该单位剂量。
在一些实施例中，以其他传统的治疗形态给予有效剂量。在一些实施例中，受试者患有病毒感染并且形态是抗病毒剂而非dsRNA试剂，例如不是siRNA试剂。在另一个实施例中，该受试者患有动脉硬化，而有效剂量的dsRNA分子(例如，siRNA试剂)是例如在手术介入(例如血管成形术)之后组合给予。
在一些实施例中，给予受试者初始剂量的dsRNA分子以及一个或多个维持剂量的dsRNA分子，该dsRNA分子是例如siRNA分子(例如，前体，例如可以被加工成siRNA分子的较大的dsRNA分子、或编码dsRNA分子(例如siRNA试剂或其前体)的DNA)。该维持剂量或这些维持剂量与该初始剂量相比可以是相同或更低的，例如少一半的初始剂量。维持方案可以包括用从每天0.01μg到15mg/kg体重范围，例如每天10、1、0.1、0.01、0.001或0.00001mg/kg体重的一个或多个剂量治疗该受试者。例如以至多每2、5、10或30天一次给予该维持剂量。此外，该治疗方案可以持续一段时间，该时间将取决于具体疾病的性质、其严重程度以及该患者的总体病状而变化。在某些实施例中，该剂量可以至多每天一次，例如至多每24、36、48或更多小时一次，例如至多每5或8天一次递送。治疗后，可以针对患者病症的变化并且针对疾病状态的症状的缓解对该患者进行监测。该化合物的剂量可以在该患者不显著响应于当前剂量水平的情况下增加，或者该剂量可以在观测到疾病状态的症状缓解时、在已经消除了疾病状态时或在观测到不希望的副作用时减少。
如在特定情况下适当希望或考虑的，该有效剂量能以单个剂量或以两个或更多个剂量给予。如果希望促进重复或频繁输注，植入递送装置，例如，泵、半永久性支架(例如，静脉内、腹膜内、脑池内或关节囊内)、或储积器可能是可取的。
在一些实施例中，组合物包括多个dsRNA分子种类。在另一个实施例中，dsRNA分子种类具有相对于一种天然存在的靶序列与另一个种类不重叠且不相邻的序列。在另一个实施例中，多个dsRNA分子种类特异性针对不同的天然存在的靶基因。在另一个实施例中，dsRNA分子是等位基因特异性的。
在此描述的本发明的dsRNA分子能以多种方式给予给哺乳动物，特别是大的哺乳动物，例如非人灵长类动物或人类。
在一些实施例中，dsRNA分子(例如siRNA试剂)组合物的给予是肠胃外的，例如静脉内的(例如，作为团注剂或作为可扩散的输注)、皮内的、腹膜内的、肌肉内的、囊内的、心室内的、颅内的、皮下的、经粘膜的、经颊的、舌下的、内窥镜的、经直肠的、口服的、经阴道的、局部的、经肺的、鼻内的、经尿道的或经眼的。可以由该受试者或由另一个人(例如，医疗服务人员)提供给药。可以按测量的剂量或以递送定量剂量的分配器提供该药剂。下面对选定的递送模式进行更详细地讨论。
本发明提供了用于经直肠给予或递送在此描述的dsRNA分子的方法、组合物以及试剂盒。
在具体的实施例中，本发明涉及本发明的dsRNA分子，其用于上文描述的方法中。
抑制靶基因表达的方法
本发明的实施例还涉及用于抑制靶基因的表达的方法。该方法包括以足够抑制该靶基因的表达的量给予在以上任一实施例中的dsRNA分子的步骤。本发明进一步涉及如本文所定义的dsRNA分子用于抑制靶细胞中靶基因的表达的用途。在优选的实施例中，本发明进一步涉及dsRNA分子用于在体外抑制靶细胞中靶基因的表达的用途。
另一方面，本发明涉及调节细胞中的靶基因的表达的方法，该方法包括向所述细胞提供本发明的dsRNA分子。在一些实施例中，靶基因选自下组，该组由以下组成：因子VII、Eg5、PCSK9、TPX2、apoB、SAA、TTR、RSV、PDGFβ基因、Erb-B基因、Src基因、CRK基因、GRB2基因、RAS基因、MEKK基因、JNK基因、RAF基因、Erk1/2基因、PCNA(p21)基因、MYB基因、JUN基因、FOS基因、BCL-2基因、hepciden、活化蛋白C、细胞周期蛋白D基因、VEGF基因、EGFR基因、细胞周期蛋白A基因、细胞周期蛋白E基因、WNT-1基因、β-连环蛋白基因、c-MET基因、PKC基因、NFKB基因、STAT3基因、生存素基因、Her2/Neu基因、拓扑异构酶I基因、拓扑异构酶IIα基因、在p73基因中的突变、在p21(WAF1/CIP1)基因中的突变、在p27(KIP1)基因中的突变、在PPM1D基因中的突变、在RAS基因中的突变、在小窝蛋白I基因中的突变、在MIBI基因中的突变、在MTAI基因中的突变、在M68基因中的突变、在肿瘤抑制基因中的突变以及在p53肿瘤遏制基因中的突变。
在具体的实施例中，本发明涉及本发明的dsRNA分子，其用于上文描述的方法中。
本发明由以下实例进一步展示，这些实例不应被视为是进一步限制性的。贯穿本申请引用的所有参考文献、未决专利申请和公开的专利的内容清楚地特此通过引用而结合。
实例
实例1：siRNA双链体的体外筛选
细胞培养和转染：
使人类Hep3B细胞或大鼠H.II.4.E细胞(ATCC，马纳萨斯(Manassas)，维吉尼亚州(VA))在37℃在5％CO2的氛围中在补充有10％FBS、链霉素以及谷氨酰胺(ATCC)的RPMI(ATCC)中生长到接近汇合，随后通过胰蛋白酶化从板释放。通过添加14.8μL Opti-MEM加0.2μL脂染胺(Lipofectamine)RNAiMax/孔(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德(Carlsbad)加利福尼亚州(CA)，目录号13778-150)到5μL siRNA双链体/孔到一个96孔板中进行转染，并且在室温孵育15分钟。然后添加不具有抗生素、包含约2x104个Hep3B细胞的80μL完全生长培养基到siRNA混合物。在RNA纯化之前将细胞孵育24小时或120小时。在10nM和0.1nM最终双链体浓度下执行单个剂量实验，并且使用8、4倍连续稀释用10nM最终双链体浓度的最大剂量进行剂量反应实验。
使用DYNABEADS mRNA分离试剂盒(英杰公司，部件号：610-12)的总RNA分离：
将细胞收获，并且溶解于150μL溶解/结合缓冲液中，然后使用一个Epp端orf热混合器在850rpm下混合5分钟(贯穿处理的搅拌速度相同)。将10微升磁珠和80μL溶解/结合缓冲液混合物添加至圆底板，并且混合1分钟。使用磁性表座捕获磁珠并且将该上清液移除而不扰动这些珠子。在移出上清液后，将裂解的细胞添加至剩余的磁珠并且混合5分钟。在去除上清液之后，将磁珠用150μL洗涤缓冲液A洗涤2次并且混合1分钟。珠子再次被捕获并且去除上清液。然后将珠子用150μL洗涤缓冲液B洗涤，捕获，并且移除上清液。接着将珠子用150μL洗脱缓冲液洗涤，捕获，并且移除上清液。允许珠子干燥持续2分钟。在干燥之后，添加50μL洗脱缓冲液，并且在70℃混合5分钟。将珠子在磁体上捕获持续5分钟。将40μL上清液移出，并且加入到另一个96孔板。
使用ABI高容量cDNA反转录试剂盒(应用生物系统公司(Applied Biosystems)，福 斯特市(Foster City)，加利福尼亚州，目录号4368813)进行cDNA合成：
以每个反应1μL 10X缓冲液、0.4μL 25X dNTP、1μL随机引物、0.5μL反转录酶、0.5μL RNA酶抑制剂以及1.6μL的H2O的主体混合物添加到5μL总RNA中。使用Bio-Rad C-1000或S-1000热循环仪(Hercules公司，加利福尼亚州)经以下步骤产生cDNA：25℃10min，37℃120min，85℃5s，4℃保持。
实时PCR：
将2μL cDNA添加到384孔板(罗氏公司(Roche)目录号04887301001)中的主体混合物中，该主体混合物含有0.5μL GAPDH TaqMan探针(应用生物系统公司(AppliedBiosystems)目录号4326317E(人类)目录号4308313(啮齿动物))、0.5μL TTR TaqMan探针(应用生物系统公司(Applied Biosystems)目录号HS00174914_m1(人类)目录号Rn00562124_ml(大鼠))以及5μL Lightcycler 480探针主体混合物(罗氏公司(Roche)目录号04887301001)/孔。在罗氏LC 480实时PCR机(罗氏公司(Roche))中进行实时PCR。除非另外说明，否则在至少两个独立转染中测试每种双链体，并且一式两份测定每个转染。
为了计算相对倍数变化，使用ΔΔCt方法分析实时数据，并且将这些数据归一化为利用以下这样的细胞而进行的测定：这些细胞是转染了10nM AD-1955(Luc靶向对照)的细胞，或是模拟转染的细胞。使用4参数拟合模型使用XLFit计算IC50值，并且将IC50值相对于在相同剂量范围内用AD-1955转染的细胞或原初细胞进行归一化或相对于其自身最低剂量进行归一化。对于每个个别转染以及组合计算IC50值，其中将单个IC50拟合到来自两个转染的数据。
本发明的具有不同基序修饰的示例性siRNA双链体的基因沉默的结果示于下表中。
实例2：RNA合成和双重退火
1.寡核苷酸合成：
在AKTA oligopilot合成器或ABI 394合成器上合成所有寡核苷酸。除非另外说明，将以下各项用于寡核苷酸合成：可商购的可控孔度玻璃固相支持体(dT-CPG，原初合成公司(Prime Synthesis))以及具有标准保护基的RNA亚磷酰胺，5’-O-二甲氧三苯甲基N6-苯甲酰基-2’-叔-丁基二甲基甲硅烷基-腺苷-3’-O-N，N’-二异丙基-2-氰乙基亚磷酰胺、5’-O-二甲氧三苯甲基-N4-乙酰基-2’-叔-丁基二甲基甲硅烷基-胞苷-3’-O-N，N’-二异丙基-2-氰乙基亚磷酰胺、5’-O-二甲氧三苯甲基-N2--异丁基-2’-叔-丁基二甲基甲硅烷基-鸟苷-3’-O-N，N’-二异丙基-2-氰乙基亚磷酰胺、以及5’-O-二甲氧三苯甲基-2’-叔-丁基二甲基甲硅烷基-尿苷-3’-O-N，N’-二异丙基-2-氰乙基亚磷酰胺(皮尔斯核酸技术公司(Pierce Nucleic Acids Technologies))。2’-F亚磷酰胺、5’-O-二甲氧三苯甲基-N4-乙酰基-2’-氟-胞苷-3’-O-N，N’-二异丙基-2-氰基乙基-亚磷酰胺以及5’-O-二甲氧三苯甲基-2’-氟-尿苷-3’-O-N，N’-二异丙基-2-氰基乙基-亚磷酰胺购自普洛麦格公司(Promega)。所有亚磷酰胺都以0.2M于乙腈(CH3CN)中的浓度使用，除鸟苷之外，鸟苷以0.2M于10％THF/ACN(v/v)中的浓度使用。使用16分钟的偶联/再循环时间。活化剂是5-乙基硫基四唑(0.75M，美国国际化学(American International Chemicals))，用于PO-氧化，使用碘/水/吡啶，并且用于PS-氧化，使用于2，6-二甲基吡啶/ACN(1∶1v/v)中的PADS(2％)。
使用包含相对应的配体的固相支持体合成配体缀合的链。例如，通过用相对应的碳水化合物固相支持体开始合成来实现在序列的3′末端处引入碳水化合物部分/配体(例如GalNAc)。类似地，通过在胆固醇支持体上开始合成来在3′末端处引入胆固醇部分。一般来说，该配体部分经由如先前实例中所述的所选系栓而系栓到反-4-羟基脯氨醇以获得羟基脯氨醇-配体部分。该羟基脯氨醇-配体部分然后经由琥珀酸酯连接子偶联到固体载体，或经由标准亚磷酸化条件转化为亚磷酰胺，以获得所希望的碳水化合物缀合物构筑嵌段。从相对应的亚磷酰胺或固相支持体(购自生物研究技术公司(Biosearch Technologies))合成荧光团标记的siRNA。内部制造的加载是38.6微摩尔/克的油烯基石胆酸(GalNAc)3聚合物支持体。还内部制造的加载是42.0微摩尔/克的甘露糖(Man)3聚合物支持体。
除非另外规定，否则通过使相对应的亚磷酰胺在标准亚磷酰胺偶联条件下偶联到正在生长的链来实现所选配体在所希望的位置处，例如在序列的5′末端处的缀合。在活化剂5-(乙基硫代)-1H-四唑存在下，延长的15分钟使无水CH3CN中的0.1M亚磷酰胺溶液偶联至固体结合的寡核苷酸。使用标准碘-水如报道(1)那样，或通过用叔丁基过氧化氢/乙腈/水(10∶87∶3)以10分钟氧化等待时间处理缀合寡核苷酸，将核苷酸间亚磷酸酯氧化成磷酸酯。通过使用一种硫转移试剂(如DDTT(购自AM化学(AM Chemicals))、PADS和或博凯奇试剂)将亚磷酸酯氧化为硫代磷酸酯来引入硫代磷酸酯。将胆固醇亚磷酰胺内部合成，并且以0.1M于二氯甲烷中的浓度使用。胆固醇亚磷酰胺的偶联时间是16分钟。
2.去保护-I(核碱基去保护)
在完成合成之后，将载体转移到100ml玻璃瓶(VWR)。将寡核苷酸从该支持体切割，同时在55℃下用80mL乙醇氨的混合物[氨∶乙醇(3∶1)]使碱基和磷酸酯基团去保护6.5h。将瓶在冰上简单冷却，并且然后将乙醇化氨混合物过滤到新的250ml瓶中。将CPG用2x40mL份的乙醇/水(1∶1v/v)洗涤。然后通过旋转蒸发将混合物的体积减少到约30mL。然后将混合物在干冰上冷冻，并且在speed vac上在真空下干燥。
3.去保护II(2′-TBDMS基团的移除)
将经干燥的残余物再悬浮于26mL三乙胺、三乙胺三氢氟化物(TEA.3HF)或吡啶-HF以及DMSO(3∶4∶6)中，并且在60℃加热90分钟以去除2′位处的叔丁基二甲基硅烷基(TBDMS)基团。然后将反应物用50mL 20mM乙酸钠淬灭，并且将pH调节到6.5，并且储存于冷冻器中直到纯化。
4.分析
将寡核苷酸通过高效液相色谱(HPLC)分析，随后纯化，并且取决于序列和或缀合的配体的性质来选择缓冲液和柱。
5.HPLC纯化
将配体缀合的寡核苷酸通过反相制备型HPLC纯化。将未缀合的寡核苷酸通过在内部填充的TSK凝胶柱上阴离子交换HPLC来纯化。缓冲液是10％CH3CN中的20mM磷酸钠(pH8.5)(缓冲液A)和10％CH3CN、1M NaBr中的20mM磷酸钠(pH 8.5)(缓冲液B)。将含有全长寡核苷酸的洗脱份汇集，脱盐，并且冻干。将约0.15OD的脱盐的寡核苷酸在水中稀释到150μL，并且然后在专用小瓶中吸取用于CGE和LC/MS分析。最终通过LC-ESMS和CGE分析化合物。
6.siRNA制备
对于siRNA的制备，将等摩尔量的有义链和反义链在1x PBS中在95℃加热5分钟并且缓慢冷却至室温。通过HPLC分析证实双链体的完整性。
实例3：用一些示例性dsRNA减轻脱靶效应和体内毒性
1.合成和纯化
使用通用或定制支持物以1微摩尔规模在MerMade 192合成器上制备所有寡核苷酸。所有亚磷酰胺以在100％乙腈中100mM或者或9∶1乙腈∶DMF的浓度使用，使用最多2-氰基乙基亚磷酰胺的标准方案，不同之处在于偶联时间延长至400秒。使用以下实现新形成的键的氧化：在9∶1乙腈∶水中的50mM I2溶液以产生磷酸酯键和在9∶1吡啶∶乙腈中的100mMDDTT以产生硫代磷酸酯键。在去三苯甲基合成(trityl-off synthesis)后，将柱与150μL的40％甲胺水溶液一起孵育45分钟，并将溶液通过真空引流到96孔板中。在重复孵育并用新鲜部分的甲胺水溶液引流后，将含有粗寡核苷酸溶液的板密封并在室温下振荡另外60分钟以完全除去所有保护基团。通过向每个孔中添加1.2mL的9∶1乙腈∶EtOH，然后在-20℃孵育过夜，完成粗寡核苷酸的沉淀。然后将板以3000RPM离心45分钟，从每个孔中去除上清液，并将沉淀重悬于950μL的20mM NaOAc水溶液中。最后使用水在GE Hi-Trap脱盐柱(SephadexG25 Superfine)上将每种粗溶液脱盐以洗脱最终的寡核苷酸产物。分别使用ESI-MS和IEXHPLC确认所有的特性和纯度。
2.温度依赖性紫外光谱
熔解研究在配备有热式程序的Beckman DU800分光光度计上的1cm路径长度石英池中的0.33x PBS(3.3mM Na/K磷酸盐缓冲液，pH 7.4，具有46mM NaC1和0.9mM KC1)中以1μM浓度的双链体(由修饰的反义链与互补的未修饰RNA有义链配对组成)进行。每个比色皿含有200μL被125μL轻质矿物油覆盖的样品溶液。在260nm监测解链曲线，其中加热速率为1℃/min，从15℃-90℃。解链温度(Tm)由平滑加热曲线的一阶导数计算，并且报告的值是至少两次独立测量的结果。
3.体外报告子测定
将COS-7细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)的杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’sModified Eagle Medium，DMEM)中在37℃、5％CO2培养。根据制造商的说明，使用2μg/mL脂质体2000(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))，将细胞在96孔板(15,000细胞/孔)中用10ng萤光素酶报告子质粒和以10倍稀释的50fM至50nM siRNA共转染。根据制造商的说明，在转染后48小时收获细胞用于双萤光素酶测定(普洛麦格公司(Promega))。中靶报告子质粒含有与Renilla萤光素酶的3′非翻译(3′UTR)中的反义链单个完全互补的位点。脱靶报告子质粒含有在Renilla萤光素酶的3′UTR中被21-28个核苷酸分开四个串联的种子互补位点＝。将两种质粒共表达的萤火虫萤光素酶作为转染对照。
4.基因表达分析
将冷冻保存的小鼠、大鼠、或人肝细胞(生物再生公司(Bioreclamation))在具有鱼雷抗生素混合物的InVitroGRO CP培养基中在37℃、5％CO2培养。根据制造商的说明，使用2μg/mL脂质体RNAiMAX(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))，将细胞在96孔板(20,000细胞/孔)中用10nM siRNA转染。转染后24小时收获细胞，用于根据制造商的说明用miRNeasy试剂盒(凯杰公司(Qiagen))进行RNA提取，并用于用TruSeq StrandedTotal RNA Library Prep试剂盒(依诺米那公司(Illumina))制备cDNA文库，并在HiSeq或NextSeq500测序仪(依诺米那公司(Illumina))上测序，全部根据制造商的说明。使用fastq-mcf过滤原始RNAseq读数，其中最小平均质量得分为25并且最小剩余长度为36。使用STAR(超快通用RNA-seq校准器)版本2.4.2a将过滤的读数与褐家鼠基因组(Rnor_6.0)进行比对。通过featureCounts版本1.5.0计算唯一对齐的读数。差异基因表达分析通过R包DESeq2版本1.16.1进行。
5.代码可用性
使用以下开源软件包用于RNAseq数据分析。代码在以下位置可获得：
fastq-mcf：https：//github.com/ExpressionAnalysis/ea-utils
STAR校准器：https：//github.com/alexdobin/STAR
featureCounts：http：//subread.sourceforge.net
DESeq2：https：//github.com/mikelove/DESeq2
6.体内小鼠和大鼠研究
所有研究均使用符合当地、州和联邦法规的方案进行，并由阿尔尼拉姆制药公司(Alnylam Pharmaceuticals)的研究机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准。
在小鼠药效学研究中，向雌性C57BL/6小鼠(查尔斯河实验室(Charles RiverLaboratories))在上背部皮下给予单剂量运载体对照(0.9％氯化钠、盐水)或0.5或1mg/kgsiRNA。在第7天或第8天，收集肝，在冷盐水中冲洗，立即在液氮中快速冷冻，并储存在-80℃用于mRNA和siRNA分析。
在大鼠毒性研究中，向雄性Sprague Dawley大鼠(查尔斯河实验室(CharlesRiver Laboratories))在上背部皮下给予三次重复的每周剂量(qw x 3)运载体对照(0.9％氯化钠、盐水)或30mg/kg siRNA。在第16天，收集血清用于临床病理学评估，并且收集肝用于组织病理学评估以及用于mRNA和siRNA分析。
7.mRNA和siRNA定量
根据制造商的说明用miRNeasy试剂盒(凯杰公司(Qiagen))提取RNA，根据制造商的说明用High-Capacity cDNA Reverse Transcription试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))转换成cDNA，并使用LightCycler 480Probes Master(罗氏公司(Roche))在Roche Light Cycler 480II上使用基因特异性Taqman探针(ThermoFisher Scientific)通过定量聚合酶链反应(qPCR)评估mRNA水平。
为了定量对siRNA的暴露，将细胞沉淀重悬浮于含有0.25％Triton X-100的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，在95℃加热10min，在4℃以14,000rpm离心10min，并且根据制造商的说明使用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription试剂盒(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))在上清液上进行逆转录。根据制造商的说明，使用LightCycler480Probes Master(罗氏公司(Roche))在Roche Light Cycler 480II上进行qPCR。
8.评估小鼠的体内稳定性
样品制备：向在室温下解冻的50mg冷冻冻干小鼠肝中添加0.43mL蛋白酶K消化缓冲液。蛋白酶K消化缓冲液由105mM Tris HCl、17.5％Tween 20％、1.26％Triton X-100、50mM CaCl2、3mM EDTA二钠组成(pH 8.0)。然后将样品短暂涡旋(约20秒)并在室温在浴超声波仪中超声处理10分钟。向此溶液中添加20μL蛋白酶K溶液(凯杰公司(Qiagen)，目录号19133)并将样品涡旋5秒。伴随振荡将这些样品在50℃培养3小时。此后，将样品以12,700RPM离心10分钟，从中收集300μL的上清液。将上清液分成三个100μL级分，并转移到96孔板的不同孔中。向这些级分中添加0.9mL的裂解加载缓冲液(Phenomenex，目录号ALO-8579)，调节至pH 5.5，然后添加以0.5ng/mL终浓度的内标寡核苷酸(12mer聚-2′-O-甲基尿苷)。
弱阴离子交换(WAX)固相萃取(SPE)：借助于自动正压歧管(拜泰齐公司(Biotage))在Clarity OTX WAX 96孔板(Phenomenex)上进行SPE。将SPE板用每孔1mL甲醇调节，并且将板用1.9mL平衡缓冲液(50mM乙酸铵、2mM叠氮化钠，pH5.5)洗涤。将样品加载到SPE孔中，并弃去流出物。然后，用1.5mL x 5的洗涤缓冲液(50mM乙酸铵、50∶50水∶乙腈，pH5.5)洗涤吸附剂，并用0.6mL洗脱缓冲液(10mM EDTA、10mM DTT、100mM碳酸氢铵、50∶40∶10水∶ACN∶THF，pH 8.8)将siRNA洗脱到干净的2mL、96深孔板(赛默飞世尔科技公司(Thermoscientific))中。将样品在Turbovap氮气歧管(拜泰齐公司(Biotage))中在40℃和65psi的氮气压力下蒸发至干燥。
LC-MS和数据分析：用40uL LC-MS级水重构样品。将三个重复样品重组至120uL的最终体积并进行LC-MS分析。分析在Thermo QExactive质谱仪上进行，该质谱仪与配备有自动进样器、紫外检测器、和恒温柱室的Dionex Ultimate 3000UPLC偶联。将样品(30μL)在Waters XBridge BEH XP C8、2.5μm、2.1x30mm柱上在80℃进行色谱分离。通过在4.1分钟内以1mL/min的流速的线性梯度(缓冲液A(在水中的16mM三乙胺、200mM 1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇)至35％缓冲液B(甲醇))进行样品洗脱。质谱仪配备有HESIII源并以负离子模式操作。使用与PromassHR软件(Novatia LLC)连接的XCalibur软件(赛默飞世尔科技公司(Thermo scientific))进行数据分析和信号解卷积。
结果
1.体外研究
体外报告子测定的结果总结于表1和2中。如表1中的数据显示，乙醇酸核酸(GNA)修饰的示例性模式(例如在反义链的位置6-7)在体外保留了中靶活性而降低了脱靶活性。
表1：在反义链的位置7的GNA修饰的体外报告子测定数据
将萤光素酶报告子质粒与siRNA共转染到COS-7细胞中，并在48小时进行萤光素酶测定。
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4.体内小鼠和大鼠研究
体内研究的结果总结在表5-7中。如所见，在反义链位置7的GNA修饰保留了体内效力(表5)并减轻了体内毒性(表6和7)。表8显示了在反义链的位置5、6、7和8的各种去稳定化修饰的体外报告子测定数据。
表5：小鼠药效学数据
给小鼠给予1mg/kg(GO1和AAT)或0.5mg/kg(TTR)的单剂量siRNA，并在第7天或第8天评估肝mRNA敲低。
表6：大鼠毒性数据
以每周30mg/kg向大鼠给予三剂量的siRNA，并在最后一剂(第16天)后24小时评估肝功能测试。
表7：大鼠毒性数据
以每周30mg/kg向大鼠给予三剂量的siRNA，并在最后一剂(第16天)后24小时评估肝显微镜肝观察结果。
表8.在反义链的位置5、6、7和8的各种去稳定化修饰的体外报告子测定数据。
值分别代表相对于在肝或循环中在D7的PBS对照，保留的mRNA(GO1)或蛋白质(TTR)的水平。在指定剂量的亲本敲低如下：对于GO1，0.255c±0.167；对于TTR，0.362a±0.162。除非以下上标另有说明，否则所有值代表n＝3只动物的单次实验的结果：a＝2个单独实验的平均值，每个实验有n＝3只动物；b＝3个单独实验的平均值，每个实验有n＝3只动物；c＝4个单独实验的平均值，每个实验有n＝3只动物。修饰如图1所示；Mod 11＝UNA，Mod12＝C3-间隔物。
表9.示例性siRNA的序列
大写、小写和大写粗体下划线字母分别代表对腺苷、胞嘧啶、鸟苷和尿苷的2′-F、2′-OMe和(S)-GNA糖修饰。(L)代表三-N-乙酰半乳糖胺配体。硫代磷酸酯键通过“·”符号表示。
5.体内小鼠稳定性
研究的结果总结在图32A-32C中。如从图32A和32B可见，体内翻译受到反义链的代谢稳定性的影响，其中在肝中保留的全长反义链的量与靶敲低之间存在强相关性。
6.IC50
靶向TTR或F9的示例性dsRNA的研究的结果显示在图50(TTR)和图51(F9)中。
7.其他修饰
含有其他热去稳定化修饰的示例性dsRNA的研究的结果显示在图54和55中。如所见，所有测试的修饰都能够保持与亲本相似的活性。
实例4：乙二醇核酸(GNA)对siRNA结构和功能的影响
siRNA双链体的化学修饰对于以下是必需的：稳定这些分子以对抗核酸酶降解、促进它们摄入细胞、以及影响活性RISC的形成、以及RNAi介导的靶沉默。并入siRNA双链体的某些位置的热去稳定化修饰可以通过在RISC加载期间改善链偏向和/或有义链解离而导致效力增加。在本研究中，在一些示例性siRNA双链体的上下文中，诸位发明人研究了简单三-碳、非环核酸类似物、乙二醇核酸(GNA)。
1.含(S)-GNA的siRNA双链体的热解链(Tm)分析
单个GNA核苷酸并入对siRNA双链体稳定性的结果显示在图33中。将GNA核苷酸并入指定位置的有义链或反义链中任一。蓝色和红色点分别表示A：T和G：C碱基对。测量在0.25x PBS中以1μM的双链体浓度进行。每个数据点是两次测量的平均值。左下方插图显示了在双链体的任何位置并入单个(S)-GNA核苷酸后的解链温度的平均变化(从此分析中排除了突出)。可以看出，GNA并入导致所得双链体的位置依赖性热去稳定化。去稳定的程度主要是核苷酸依赖性；与针对G或C核苷酸的GNA取代相比，而针对A或U核苷酸的导致了显著更小的ΔTM值。
2.含有(S)-和(R)-GNA核苷酸的RNA双链体的晶体结构
用两种GNA-T立体异构体修饰的RNA双链体的晶体结构分析的结果显示在图34A-34F中。在图中，图34A显示了由于在8-mer RNA双链体中并入的GNA-T残基(以绿色突出显示的碳原子)，链内P…P距离的变化。图34B是(S)-GNA-T：RNA-A碱基对的实例，显示GNA核苷酸的旋转核碱基构象(箭头)。图34C显示GNA核苷酸在结构内采用偏转(gauche)和反构象。图34D显示(R)-GNA-T残基比(S)-GNA-T残基更大程度地扭曲RNA双链体和配对的几何结构。在两个12-mer双链体中的(S)-GNA-T(绿色)：RNA-A和(R)-GNA-T(黄色)：RNA-A侧翼的A：U和G：A碱基对的层叠揭示(R)-GNA-T-修饰的12-mer(箭头)中邻近A：U对的扰乱。图34E显示了并入GNA的(S)-异构体和(R)-异构体两者的RNA双链体的整体结构，其突出了磷酸骨架。两种异构体在全RNA结构内被不同地容纳，并且在含(R)-异构体的双链体中产生轻微扭结(箭头)。图34F显示(S)-GNA-T残基可以无缝地并且具有最佳几何结构地取代与人Ago 2.14结合的引导链RNA的位置7的RNA核苷酸。RNA链在与Ile-365相关的位点呈现扭结，并导致核苷酸6和7的碱基的解叠。
可以看出，含有(S)-或(R)-GNA的RNA双链体的晶体结构在双链体结构中表现出乙二醇骨架的柔性，允许GNA-T残基的核碱基采用具有旋转的构象的非规范碱基对。通过用isoC和isoG核苷酸的交叉配对实验进一步支持后一结果(下面讨论)。此外，(R)-异构体并入(优选左手型双链体)导致更强的热去稳定化和整个双链体结构的更大扰动。
3.具有isoC和isoG RNA核苷酸的(S)-GNA的交叉配对
测量了示例性dsRNA中具有isoC和isoG RNA核苷酸的(S)-GNA的热稳定性。结果总结在表10中。isoC和isoG的结构显示在图35中。
表10：异胞苷和异鸟苷核苷酸＊的热解链数据
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*大写粗体下划线字母代表(S)-GNA核苷酸。所有值均为1x PBS缓冲液中2μM双链浓度的两次独立测量的平均值。
4.体外siRNA活性
单个(S)-GNA核苷酸取代对浓度为10nM siRNA的体外沉默活性的位置影响的结果显示在图36中。引导链或随从链的指定位置的核苷酸被相应的GNA核苷酸取代。可以看出，将单个(S)-GNA核苷酸或碱基对并入siRNA双链体的种子区域或补充区域导致相似水平的体外TTR mRNA敲低。
靶向TTR的示例性dsRNA的IC50曲线显示在图50中，并且靶向因子IX(也称为F9)的示例性dsRNA的IC50曲线显示在图51中。
5.体内siRNA活性
以2.5mg/kg给药的(S)-GNA修饰的siRNA双链体的小鼠中TTR的敲低的结果显示在图37A和37B中。在用随从链或引导链中的单个(S)-GNA核苷酸修饰的示例性siRNA情况下，体内基因沉默水平得以维持。使用单个碱基对的(S)-GNA的修饰趋向于较低的效力和作用持续时间。
实例5：通过在啮齿动物毒性研究中筛选RNAi介导的脱靶效应来选择耐受良好的示例性GalNAc-缀合的siRNA
1.实验动物的护理和使用
所有研究均使用符合当地、州和联邦法规的方案进行，并由阿尔尼拉姆制药公司(Alnylam Pharmaceuticals)的研究机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准。将测试品用0.9％NaCl稀释以实现合适的剂量浓度，并在上背部向雄性Sprague Dawley大鼠(6-8周龄)或雄性CD-1小鼠(6-8周龄)皮下给予5mL/kg的计量体积，其中N＝3只动物/组。使用Suite(Xybion)中的分区算法进行随机化，避免组平均体重偏差。研究人员在实验期间或评估结果时不会对组分配不知情。
2.临床病理学
将全静脉血收集到血清分离管(BD Microtainer)中并使其在室温凝结30min，然后在4℃以3,000RPM(1,489g)离心10分钟。然后将血清等分并储存在-80℃直至分析。使用AU400化学分析仪(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter-Brea)，加利福尼亚州，美国)，用贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)、朗道公司(Randox)和Sekisui Diagnostics提供的试剂分析血清化学。使用GraphPad Prism 7中的单向ANOVA评估组平均值之间的差异的统计学显著性。
3.组织病理学
按照阿尔尼拉姆制药公司(Alnylam)标准操作程序对所有动物实施安乐死，并收集感兴趣的组织。在使用TissueTek VIP 6A1(樱花公司(Sakura))进行常规处理之前，将所有组织在10％中性缓冲福尔马林(10％NBF)中固定72小时。修剪组织、包埋到石蜡块中、切成4微米、使用TissueTek Prisma A1D(樱花公司(Sakura))用苏木精和曙红(H&E)染色，并使用TissueTek Glass g2(樱花公司(Sakura))盖上盖玻片。用非盲法肝显微镜检查来自每个肝的两个切片，然后进行盲法评估以确认细微的观察结果。每个组织学观察结果的严重程度等级范围按1-5的等级进行分级，其中1表示最小严重程度并且5表示严重的严重程度。
4.单体和寡核苷酸合成
如先前描述地合成并表征所有寡核苷酸(Nair，J.K.等人J Am Chem Soc[美国化学会志]，136，16958-16961；Schlegel，M.K.，等人JAm Chem Soc[美国化学会志]，139，8537-8546)。从商业来源获得2′F-、2′OMe-和LNA-修饰的腺苷(A)、胞苷(C)、鸟苷(G)、
尿苷(U)的亚磷酰胺单体，以及反向的脱碱基(iB)亚磷酰胺单体。GNA亚磷酰胺单体的合成已经在先前报道(Schlegel，M.K.，等人J Am Chem Soc[美国化学会志]，139，8537-8546，并通过引用结合在此)。在内部合成5′-脱氧-5′-(4-吗啉基)-尿苷、5′-脱氧-5′-(4-吗啉基)-胞苷和5′-脱氧尿苷亚磷酰胺。分别使用ESI-LC/MS和IEX HPLC确认所有寡核苷酸的特性和纯度。此实例中使用的siRNA序列显示在表11中。
表11：用于此实例的示例性siRNA。
大写、小写和大写粗体下划线字母分别代表对腺苷、胞嘧啶、鸟苷和尿苷的2′-F、2′-OMe和(S)-GNA糖修饰。(L)代表三-N-乙酰半乳糖胺配体。琉代磷酸酯键通过“·”符号表示。
5.全肝和Ago2相关siRNA水平的定量
通过茎环逆转录定量PCR(RT-qPCR)(Parmar，R.等人Chembiochem[化学生物化学]，17，985-989)来定量肝和Ago2相关的(RISC加载的)siRNA水平。
6.RNAseq和生物信息学分析
在50mg/kg单剂量GalNAc-siRNA后24小时收集大鼠肝并快速冷冻。根据制造商的说明，使用Lipofectamine RNAiMAX(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))，用10nM GalNAc-siRNA转染大鼠肝细胞(BioreclamationIVT)，并在转染后24小时收获。未检测大鼠肝细胞的支原体污染。将用miRNcasy试剂盒(凯杰公司(Qiagen))提取的RNA用于用TruSeq Stranded Total RNA Library Prep试剂盒(依诺米那公司(Ⅰllumina))cDNA文库制备，并在HiSeq或NextSeq500测序仪上测序(依诺米那公司(Illumina))，全部根据制造商的说明。使用fastq-mcf过滤原始RNAseq读数，其中最小平均质量得分为25并且最小剩余长度为36。使用具有缺省参数的STAR(超快通用RNA-seq校准器)将过滤的读数与褐家鼠基因组(Rnor_6.0)进行比对。通过featureCounts计算唯一对齐的读数。差异基因表达分析通过R包DESeq2进行。
7.代码可用性
将开源DESeq2 R包用于RNAseq数据分析。
结果
1.阻断反义链的RISC加载减轻了肝毒性
有效的RISC加载和小RNAi触发物的活性取决于5′末端单磷酸部分的存在。虽然内源miRNA由于其生物发生而天然含有5′-单磷酸，但外源siRNA被认为依赖于细胞内摄取后激酶的磷酸化。为了表征RISC加载与在啮齿动物毒性研究中用一部分修饰的GalNAc-siRNA观察到的肝毒性的关系(表11)，具有先前确定的肝毒性的双链体的5′-末端被加帽(图38A)，其中三种类型的核苷酸修饰旨在阻止5′-磷酸化，从而阻止RISC加载：5’-反向的脱碱基(iB)、5′-脱氧-5′-(4-吗啉基)、或5’-脱氧核苷酸。这些在RISC加载中有缺陷的加帽siRNA与在先前的短期重复剂量大鼠毒性筛选研究中鉴定为肝毒性的其RNAi活性对应物具有相同的PS、2′OMe、和2′F含量，并在啮齿动物中在具有或不具有预期的中靶活性情况下针对各种靶mRNA设计。
在啮齿动物以毒理学剂量测试阻断RISC加载对肝毒性的影响。大鼠或小鼠每周接受5-9次或每隔一天接受30-100mg/kg的剂量，这表示药理剂量范围的2-3log放大。相对于亲本siRNA，反义链的磷酸化阻断5′-加帽修饰降低了RISC加载(图39A)和靶mRNA敲低(图39B)。在所有研究中，在相同序列和骨架化学的RNAi活性和无RNAi活性siRNA之间肝浓度没有显著差异(图38B)，证实内溶酶体系统和细胞内蛋白质暴露于等量的每个siRNA(无论其RISC负载能力如何)。尽管有相同的肝暴露，但阻断已知肝毒性siRNA的RISC加载消除了肝酶升高(图38C和39C)、以及大多数至所有显微镜肝观察结果(包括小鼠和大鼠的纤维化、单细胞坏死和肝细胞变性(图38D和表12))。重要的是，单独在有义链的5′端(图40A-40C)或无毒工具包GalNAc-siRNA(图41A-41C)上放置阻断RISC加载的修饰对肝酶升高或显微镜肝观察结果(表13和14)没有影响，表明这些5′-帽不太可能影响siRNA的细胞内运输或引入另外的安全责任。
表12：RNAi活性和无RNAi活性GalNAc-siRNA的组织学观察结果
表12显示阻断RISC加载减轻肝毒性。每个组织学观察结果的严重程度等级范围按1-5的等级指示，其中1表示最小严重程度并且5表示严重的严重程度。
表13：用在有义链上具有5′-RISC阻断修饰的GalNAc-siRNA的组织学观察结果
表13显示了在大鼠毒性研究中有义链5′-修饰对毒性GalNAc-siRNA的肝毒性的影响。每个组织学观察结果的严重程度等级范围按1-5的等级指示，其中1表示最小严重程度并且5表示严重的严重程度。iB，反向的脱碱基；Mo，吗啉代。
表14：用在有义链和反义链两者上具有5′-RISC阻断修饰的无毒GalNAc-siRNA的组织学观察结果
表14显示了在大鼠毒性研究中有义链5′-修饰对无毒GalNAc-siRNA的肝毒性的影响。每个组织学观察结果的严重程度等级范围按1-5的等级指示，其中1表示最小严重程度并且5表示严重的严重程度。iB，反向的脱碱基；Mo，吗啉代。
这些研究表明，一部分GalNAc-siRNA的啮齿动物肝毒性依赖于反义链的RISC加载，但与RISC加载的siRNA化学相关机制上游无关，如内溶酶体系统的扰动、或细胞内蛋白不希望地结合至相对疏水的骨架修饰(如PS或2′F)。
2.改变siRNA化学修饰不会减轻肝毒性
为了进一步降低2′F和2′OMe含量对siRNA肝毒性的潜在贡献的风险，在啮齿动物毒性研究中测试了模型肝毒性siRNA的两种差异修饰形式：高2′F形式(48％2′F和52％2′OMe)和低2′F形式(21％2′F和79％2′OMe)(图42A)。两种化合物具有相同的序列和PS含量并保持有效的沉默活性(图43)。将这些化合物经9周在大鼠中以100mg/kg每周给药，并且在小鼠中以200mg/kg给药。用这种频繁的给药范例，肝暴露(图42B)和RISC加载(图42C)在每个研究结束时对于低和高2′-F siRNA是相当的。相似地，肝酶升高(图42D)和显微镜肝观察结果(图42E和表15)与两种啮齿动物物种中此序列中2′-F或2′-OMe修饰的数目无关。这些数据提供了针对作为GalNAc-siRNA的啮齿动物肝毒性背后的驱动因素的siRNA化学修饰的进一步证据。
表15：用具有高或低2′F含量的GalNAc-siRNA的组织学观察结果
表15显示改变siRNA化学修饰不会减轻肝毒性。每个组织学观察结果的严重程度等级范围按1-5的等级指示，其中1表示最小严重程度并且5表示严重的严重程度。
3.逆转加载反义链的RISC活性可减轻肝毒性
由于RISC加载的siRNA化学相关机制上游似乎对啮齿动物的肝毒性没有显著影响，因此重点在于区分RNAi介导的脱靶效应与来自内源RNAi途径的扰动。该策略通过以下来允许siRNA RISC加载：保持siRNA化学和序列不改变但是阻止加载siRNA的RISC与潜在的脱靶mRNA结合。为了实现这一点，在两种类型的大鼠毒性研究中，使用与siRNA反义链互补的GalNAc-缀合的短单链寡核苷酸(称为REVERSIRTM化合物)阻断RISC加载下游的RNAi活性：预防和治疗(图44A)。
在预防研究中，将与肝毒性siRNA的反义链互补的REVERSIRTM分子或具有相同长度和化学组成的对照杂乱REVERSIRTM序列在第一次siRNA剂量前24小时、或者第一次和第二次siRNA剂量前24小时以高药理剂量(3或10mg/kg)预先给药。在治疗研究中，将REVERSIRTM化合物在最后一次siRNA剂量后24小时以高药理剂量(3或10mg/kg)给药。每周(三次)或每隔一天(六次)以30mg/kg给予肝毒性GalNAc-siRNA。互补和杂乱的REVERSIRTM分子均被生物信息学证实展示与任何肝表达的miRNA无法完全互补，这些miRNA可能被REVERSIRTM化合物阻断。
siRNA给予前或siRNA给予后的REVERSIRTM处理降低了中靶敲低(图45)，但不影响肝siRNA水平(图44B)或RISC加载(图44C)。然而，互补的REVERSIRTM化合物(RVR-1、RVR-4或RVR-5)而不是对照、杂乱的REVERSIRTM(Ctr RVR)降低了用它们各自的靶、siRNA-1、siRNA-4、或siRNA-5观察到的肝酶升高(图44D)，并且降低了显微镜肝观察结果的严重程度和发生率(图44E和表16)。单独给予REVERSIRTM化合物没有毒性作用(图44D)。通过部署REVERSIRTM方法，减轻了siRNA诱导的肝毒性，而不影响RISC加载并且不改变siRNA化学。因此，这些数据支持这样的假设：肝毒性是通过反义链介导的RNAi脱靶效应驱动的，而不是通过与内源性RNAi途径或siRNA化学介导的作用竞争RISC复合物。
表16：用或不用靶向反义链的REVERSIRTM化合物处理情况下，GalNAc-siRNA的组织学观察结果
表16显示了逆转加载反义的RISC活性减轻了肝毒性。每个组织学观察结果的严重程度等级范围按1-5的等级指示，其中1表示最小严重程度并且5表示严重的严重程度。
4.交换种子区域减轻了肝毒性
类似于miRNA机制，siRNA的RNAi介导的脱靶效应通常由引导链的种子区域驱动。如果这些效应引起观察到的GalNAc-siRNA的啮齿动物肝毒性，则种子区域而不是核苷酸2-8外的侧翼区域的序列应该是特定序列是否与肝毒性相关的关键决定因素。为了测试此假设，肝毒性siRNA的种子区域被非肝毒性siRNA的种子区域替换而不改变化学修饰模式，反之亦然，其中非肝毒性siRNA的种子区域被肝毒性siRNA的种子区域替换，而不改变化学修饰模式(图46A)。
将两种种子交换的siRNA以及亲本肝毒性和非肝毒性siRNA以30mg/kg每隔一天六次的毒性剂量给予大鼠。所有四种化合物的肝暴露是相当的(图46B)。相对于无毒亲本siRNA或含有无毒种子区域的siRNA，毒性亲本siRNA以及含毒性种子区域的siRNA的RISC加载较低(图46C)。然而，尽管RISC加载水平较低，但这两种siRNA的肝毒性最强，因此反对将对RISC加载的竞争作为肝毒性的主要驱动因素。用无毒种子区域替换毒性种子区域减轻肝酶升高(图46D)和显微镜肝观察结果(图46E和表17)，表明种子区域对于肝毒性是必需的，而siRNA化学几乎没有贡献。另一方面，用毒性种子区域替换无毒种子区域并未完全概括毒性siRNA的肝毒性，但相对于无毒亲本siRNA，确实导致肝酶增加(图46D)和显微镜肝观察结果的严重程度增加(图46E和表17)。这表明虽然脱靶活性需要与反义种子区域的互补性，但siRNA 3′区域也可能有助于脱靶结合和抑制。提供的这些数据进一步支持RNAi介导的、基于种子的脱靶效应，和反对化学介导的或RNAi途径竞争类效应作为大鼠肝毒性的主要驱动因素。
表17：用具有或不具有种子区域交换的GalNAc-siRNA的组织学观察结果
表17显示交换种子区域减轻了肝毒性。每个组织学观察结果的严重程度等级范围按1-5的等级指示，其中1表示最小严重程度并且5表示严重的严重程度。
5.siRNA脱靶富含种子互补
为了证实GalNAc-siRNA可导致与RNAi介导的脱靶效应一致的基因失调，将一系列siRNA转染到大鼠肝细胞中，通过RNA测序(RNAseq)在24小时在超过IC50浓度2-3个log的10nM的“毒理学”剂量评估对转录组的整体效应。下调的转录物富集与反义种子区域(核苷酸2-8)的完全互补性，并且变化幅度通常不超过两倍(图47A和表18)。对于上调的转录物或针对有义链的种子区域没有观察到这种富集模式。在50mg/kg剂量的GalNAc-siRNA之后24小时，在体内在大鼠肝中观察到相似的脱靶谱图特征(图47B)。用含有5′-末端帽的无活性siRNA减少了失调的基因的数量，表明2′F、2′OMe或PS化学和/或其他RISC非依赖性因素对基因失调没有显著贡献，符合啮齿动物毒性研究的结果(图38A-38D)。这些数据进一步支持以下结论：反义链的miRNA样活性(而不是基于siRNA化学的RNAi非依赖性效应)是脱靶基因表达变化的主要驱动因素。
表18：用亲本和种子GNA-修饰的GalNAc-siRNA的组织学观察结果
表18显示去稳定化种子介导的脱靶结合减轻肝毒性。每个组织学观察结果的严重程度等级范围按1-5的等级指示，其中1表示最小严重程度并且5表示严重的严重程度。
6.去稳定化种子介导的脱靶结合的影响
如果种子介导的识别对于GalNAc-siRNA的脱靶驱动的肝毒性是必需的，则降低种子区域与脱靶mRNA的结合亲和力应该具有减轻的作用。为了测试此假设，将热去稳定话GNA核苷酸置于肝毒性siRNA-5序列中的反义链的位置七(图48A)，类似于其他热去稳定化修饰情况下的先前方法。
与种子介导的脱靶活性正在推动基因表达变化的假设一致，当以10nM的高剂量转染到大鼠肝细胞中时，与亲本siRNA相比，在反义链种子区域中并入GNA减少了脱靶特征(图48B)，同时保持中靶活性(图49A)。为了进一步测试脱靶特征的减少是否转化为改善的体内安全性，在以30mg/kg每周给药三次的大鼠毒性研究中测试了这两种相同的siRNA。相对于亲本序列，种子区域中的GNA核苷酸取代不影响中靶mRNA敲低(图49B)、肝暴露(图48C)、或RISC加载(图48D)。然而，种子修饰减轻了肝酶升高(图48E)和显微镜肝观察结果(图48F)。除了提供脱靶效应而非化学毒性或RNAi途径扰动作为肝毒性的主要驱动因素的另外的证据之外，这些数据提供了第一个报道的证据，即种子介导的结合的热去稳定化是选择性降低体内siRNA的脱靶抑制和肝毒性的可行策略。
在本说明书中引用的所有美国专利、美国专利申请公开物、国外专利、国外专利申请以及非专利申请通过引用以其整体结合在此。必要时，可以修改这些实施例的方面，以利用不同专利、申请以及公开物的概念提供又另外的实施例。
可以根据以上详细说明对这些实施例作出这些以及其他改变。通常，在以下权利要求书中，使用的术语不应该被解释为将权利要求书限制为在本说明书中披露的具体实施例而应该将这些权利要求解释为包括所有可能的实施例连同这样的权利要求所要求的等效物的全部范围。因此，权利要求书不被该披露所限制。
实施方式
1.一种能够抑制靶基因表达的双链RNA(dsRNA)分子，该双链RNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中所述反义链在5′区域的前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰或其前体，其中所述有义链包含ASGPR配体。
2.根据实施方式1所述的dsRNA分子，其中该dsRNA包含至少四个2’-氟。
3.根据实施方式2所述的dsRNA分子，其中在该反义链的核苷酸位置3-9处没有2’-氟修饰。
4.根据实施方式1所述的dsRNA分子，该dsRNA分子具有以下特征：
a)该双链体的热去稳定化修饰位于该反义链的5′区域的位置4-8；
b)并且该有义链和反义链的每个包含至少两个2’-氟修饰；和
c1附接至该有义链的任一末端的ASGPR配体。
5.根据实施方式4所述的dsRNA分子，其中在该反义链的核苷酸位置3-9处没有2’-氟修饰。
6.根据实施方式1所述的dsRNA分子，其中该反义链具有以下特征中的至少两个：
a)该双链体修饰的热去稳定化修饰位于该反义链的位置4至8；
b)至少两个2’-氟修饰；
c)在核苷酸位置1与2(从5’末端开始计数)之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；
d)该反义链的长度为18至35个核苷酸。
7.根据实施方式6所述的dsRNA分子，其中在该反义链的核苷酸位置3-9处没有2’-氟修饰。
8.根据实施方式1所述的dsRNA分子，其中该有义链具有以下特征中的至少一个：
a)附接至该有义链的任一末端的ASGPR配体；
b)至少两个2’-氟修饰；
c)该有义链和该反义链显示出足够的互补性以形成跨至少19个核苷酸位置的双链区，并且其中该双链体的热去稳定化修饰位于所述双链区域内。
9.根据实施方式8所述的dsRNA分子，其中在该反义链的核苷酸位置3-9处没有2’-氟修饰。
10.根据实施方式1所述的dsRNA分子，其中该双链体的热去稳定化修饰选自下组，该组由以下组成：
其中B是核碱基。
11.根据实施方式1所述的dsRNA分子，其中该稳定的修饰位于该反义链的位置7。
12.根据实施方式1所述的dsRNA分子，其中该ASGPR配体是通过二价或三价支链接头附接的一个或多个GalNAc衍生物。
13.根据实施方式8所述的dsRNA分子，其中该ASGPR配体是：
14.一种能够抑制靶基因表达的双链RNA分子，该双链RNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中该反义链在5′区域的前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热去稳定化修饰，并且该dsRNA具有从约40℃至约80℃的解链温度。
15.根据实施方式14所述的dsRNA分子，其中该dsRNA具有从约55℃至约67℃的解链温度。
16.根据实施方式1所述的dsRNA分子，其中在给药后第7天，至少50％的该反义链存在于肝中。
17.根据实施方式16所述的dsRNA，其中该dsRNA进一步具有以下特征中的至少一个：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vii)该dsRNA包含长度为12-40个核苷酸对的双链体区域；(viii)在该反义链的5’末端的平端；和(ix)该有义链包含一个或多个LNA修饰。
18.根据实施方式17所述的dsRNA，其中在该反义链的位置3-9处没有2’-氟修饰。
19.根据前述实施方式中任一项所述的dsRNA试剂，其中该有义链具有21个核苷酸，并且该反义链具有23个核苷酸。
20.一种药物组合物，该药物组合物包含单独的或与药学上可接受的载体或赋形剂组合的根据前述实施方式中任一项所述的dsRNA试剂。
21.一种基因沉默试剂盒，该基因沉默试剂盒含有根据前述实施方式中任一项所述的dsRNA分子。
22.一种用于沉默细胞中靶基因的方法，该方法包括将根据实施方式1至14中任一项所述的dsRNA分子引入该细胞中的步骤。
23.根据实施方式22所述的方法，其中将该dsRNA试剂通过皮下或静脉内给药给予。
24.一种用于沉默细胞中靶基因的方法，该方法包括将根据实施方式1至14中任一项所述的dsRNA分子表达到该细胞中的步骤。
25.一种遏制由dsRNA分子的反义链引起的脱靶效应的方法，该方法包括将根据实施方式1至19中任一项所述的dsRNA分子引入细胞中的步骤。
26.一种通过给予根据实施方式1至19中任一项所述的dsRNA试剂将多核苷酸递送至受试者中的特定靶的方法。
27.根据实施方式26所述的方法，其中所述给予步骤通过包括肌肉内、支气管内、胸膜内、腹膜内、动脉内、淋巴、静脉内、皮下、脑脊髓、或其组合的给药方式进行。

Claims (43)

1.一种能够抑制靶基因表达的双链RNA(dsRNA)分子，该双链RNA分子包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰，其中所述反义链在5'区域的前9个核苷酸位置内包含双链体的一个热去稳定化修饰或其前体，其中所述有义链任选地包含配体，并且其中所述热去稳定化修饰是解锁的核酸(UNA)、与所述dsRNA分子内相对链中相对核苷酸的错配、脱碱基修饰或除乙二醇核酸(GNA)之外的非环核苷酸。
2.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中该dsRNA包含至少四个2’-氟。
3.根据权利要求1所述的dsRNA分子，该dsRNA分子具有以下特征：
a)该双链体的热去稳定化修饰位于该反义链的5′区域的位置4-8；
b)该有义链和反义链的每个包含至少两个2’-氟修饰；和
c)附接至该有义链的任一末端的配体。
4.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中该反义链具有以下特征中的至少两个：
a)该双链体的热去稳定化修饰位于该反义链的5'区域的位置4至8；
b)至少两个2’-氟修饰；
c)在从5’末端开始计数的核苷酸位置1与2之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；
d)长度为18至35个核苷酸。
5.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中该有义链具有以下特征中的至少一个：
a)附接至该有义链的任一末端的配体；
b)至少两个2’-氟修饰；
c)该有义链和该反义链显示出足够的互补性以形成跨至少19个核苷酸位置的双链区，并且其中该双链体的热去稳定化修饰位于所述双链区域内。
6.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中所述热去稳定化修饰是解锁的核酸(UNA)。
7.根据权利要求6所述的dsRNA分子，其中所述热去稳定化修饰是
a.其中B是修饰的或未修饰的核碱基，并且R是氢、OH或O-烷基；或者
b.其中B是修饰或未修饰的核碱基，并且R、R’、R”、R”’和R””独立地是氢、OH、甲基、乙基、O-烷基、氨基、甲基氨基或二甲基氨基，每个*是R、S或外消旋。
8.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中所述热去稳定化修饰是与所述dsRNA分子内相对链中相对核苷酸的错配。
9.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中所述热去稳定化修饰是脱碱基修饰。
10.根据权利要求9所述的dsRNA分子，其中所述热去稳定化修饰是其中R、R’和R”独立地是氢、甲基、乙基或OMe。
11.根据权利要求1-6中任一项所述的dsRNA分子，其中所述热去稳定化修饰是非环核苷酸。
12.根据权利要求11所述的dsRNA分子，其中所述热去稳定化修饰是其中B是修饰的或未修饰的核碱基，R1和R2独立地是H、卤素、OR3或烷基；和R3是H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖。
13.根据权利要求1-6中任一项所述的dsRNA分子，其中所述稳定的修饰位于所述反义链的位置5、6、7或8，从5’末端开始计数。
14.根据权利要求13所述的dsRNA分子，其中所述稳定的修饰位于所述反义链的位置5，从5’末端开始计数。
15.根据权利要求13所述的dsRNA分子，其中所述稳定的修饰位于所述反义链的位置6，从5’末端开始计数。
16.根据权利要求13所述的dsRNA分子，其中所述稳定的修饰位于所述反义链的位置7，从5’末端开始计数。
17.根据权利要求13所述的dsRNA分子，其中所述热去稳定化修饰位于所述反义链的位置8。
18.根据权利要求1-16中任一项所述的dsRNA分子，其中所述有义链包含配体。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的dsRNA分子，其中所述配体通过介入接头与所述dsRNA分子共价连接。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的dsRNA分子，其中所述配体是脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)配体。
21.根据权利要求20所述的dsRNA分子，其中该ASGPR配体包含通过二价或三价支链接头附接的一个或多个GalNAc衍生物。
22.根据权利要求21所述的dsRNA分子，其中该ASGPR配体是：
23.根据权利要求1-18中任一项所述的dsRNA分子，其中该配体是蛋白、肽、脂质或药物。
24.根据权利要求23所述的dsRNA分子，其中所述配体是蛋白并且其中所述蛋白是抗体。
25.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中该dsRNA分子进一步具有以下特征中的至少一个：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该有义链与配体缀合；(iv)该有义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该有义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vii)该dsRNA包含长度为12-40个核苷酸对的双链体区域；(viii)在该反义链的5’末端的平端；和(ix)该有义链包含一个或多个LNA修饰。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的dsRNA分子，其中在该反义链的位置3-9处没有2’-氟修饰。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的dsRNA分子，其中所述dsRNA分子的解链温度是约40℃至约80℃。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的dsRNA分子，其中该有义链具有21个核苷酸，并且该反义链具有23个核苷酸。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的dsRNA分子，其中所述有义链包含
(i)在与所述反义链的位置11、12和15相对或互补的位置处的稳定化修饰，从所述反义链的5’末端开始计数；或者
(ii)在与所述反义链的位置11、12、13和15相对或互补的位置处的稳定化修饰，从所述反义链的5’末端开始计数；或者
(iii)两个、三个或四个稳定化修饰的嵌段；
其中所述稳定化修饰不在与所述反义链中双链体的热去稳定修饰相对或互补的位置处。
30.根据权利要求29所述的dsRNA分子，其中所述稳定化修饰是2'-氟修饰。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的dsRNA分子，其中所述有义链和反义链的每个残基，除所述反义链中存在的双链体的至少一个热去稳定化修饰之外，独立地用以下修饰：2'-O-甲基核苷酸、2’-脱氧核苷酸、2′-脱氧-2’-氟核苷酸、2'-O-N-甲基乙酰氨基(2'-O-NMA)核苷酸、2'-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)核苷酸、2'-O-氨基丙基(2'-O-AP)核苷酸或2'-ara-F核苷酸。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的dsRNA分子，其中所述有义链和反义链的每个残基，除所述反义链中存在的双链体的至少一个热去稳定化修饰之外，独立地用以下修饰：2'-O-甲基或2'-氟。
33.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中所述反义链仅在从所述反义链的5’末端开始计数的位置2、14和16处包含2'-氟修饰。
34.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中所述反义链仅在从所述反义链的5’末端开始计数的位置2、6、14和16处包含2'-氟修饰。
35.根据权利要求1所述的dsRNA分子，其中所述反义链仅在从所述反义链的5’末端开始计数的位置2、6、8、9、14和16处包含2'-氟修饰。
36.一种药物组合物，该药物组合物包含单独的或与药学上可接受的载体或赋形剂组合的根据权利要求1-35中任一项所述的dsRNA分子。
37.一种基因沉默试剂盒，该基因沉默试剂盒含有根据权利要求1-35中任一项所述的dsRNA分子。
38.根据权利要求1至35中任一项所述的dsRNA分子，其用于遏制由反义链dsRNA分子引起的脱靶效应的方法中。
39.根据权利要求38所述的方法，其中将该dsRNA分子适用于通过皮下或静脉内给药给予。
40.一种用于沉默细胞中靶基因的体外方法，该方法包括将根据权利要求1-35中任一项所述的dsRNA分子表达到该细胞中的步骤。
41.一种遏制由dsRNA分子的反义链引起的脱靶效应的方法，该方法包括将根据权利要求1-35中任一项所述的dsRNA分子引入细胞中的步骤。
42.根据权利要求1-35中任一项所述的dsRNA分子，其用于将多核苷酸递送至受试者中的特定靶标的方法中。
43.根据权利要求42所述的dsRNA分子，其中所述dsRNA分子适用于通过肌肉内给药、支气管内给药、胸膜内给药、腹膜内给药、动脉内给药、淋巴给药、静脉内给药、皮下给药、脑脊髓给药、或其组合给予。
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