TW201936624A - 絲胺酸蛋白酶抑制因子Ａ１ ｉＲＮＡ組成物及其使用方法 - Google Patents

絲胺酸蛋白酶抑制因子Ａ１ ｉＲＮＡ組成物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本發明係有關於RNAi試劑，如雙股RNAi試劑，其目標為絲胺酸蛋白酶抑制因子A1(Serpina 1)基因，及利用此RNAi試劑抑制絲胺酸蛋白酶抑制因子A1表現之方法，以及治療患有絲胺酸蛋白酶抑制因子A1相關疾病，如肝臟疾病，之個體之方法。

Description

絲胺酸蛋白酶抑制因子A1 iRNA組成物及其使用方法
本發明係有關於絲胺酸蛋白酶抑制因子A1 iRNA組成物及其使用方法
本申請案主張2013年5月22日提交之第61/826,125號美國臨時專利申請案、2013年11月1日提交之第61/898,695號美國臨時專利申請案、2014年4月15日提交之第61/979,727號美國臨時專利申請案、2014年5月6日提交之第61/989028號美國臨時專利申請案的優先權。本申請案係與2011年11月18日提交之第61/561,710號美國臨時專利申請案、2012年11月16日提交之國際專利申請案第PCT/US2012/065601號相關。各前述申請案之完整內容係以參考方式併入本文。
序列表
本申請案包含序列表，係以ASCII格式電子遞交且其完整內容以參考方式併入本文。該ASCII副本於2014年5月20日產生，命名為121301-00620_SL.txt，其檔案大小為199,204位元(bytes)。
絲胺酸蛋白酶抑制因子A1(Serpina1)編碼alpha-1-抗胰蛋白酶(alpha-1-antitrypsin)，其主要與嗜中性白血球彈性蛋白酶複合且抑制由肝細胞(hepatocytes)、單核細胞(mononuclear monocytes)、肺泡巨噬細胞(alveolar macrophages)、腸細胞(enterocytes)及骨髓細胞(myeloid cells)所製造的嗜中性白血球彈性蛋白酶(neutrophil elastase)活性。具有單一或兩個拷貝(copy)的Serpina1基因變異的個體可能會罹患alpha-1-抗胰蛋白酶缺乏，並且由於其肺臟及肝臟中大於正常之彈性蛋白酶活性，而有發展成肺氣腫及/或慢性肝臟疾病的風險。
受影響的個體中，alpha-1-抗胰蛋白酶的缺乏係指野生型、功能性alpha-1-抗胰蛋白酶的缺乏。某些例子中，具有單一或兩個拷貝之Serpina1基因變異的個體攜帶無效對偶基因(null allele)。其他例子中，具有單一或兩個拷貝之Serpina1基因變異的個體，則攜帶缺陷對偶基因。
舉例而言，具有Serpina1缺陷對偶基因的個體，例如PIZ對偶基因(PIZ allele)，可能製造錯誤折疊的蛋白質，該蛋白質在體內無法正確地從合成位置運輸至作用位置，此種個體通常具有發展成肺臟及/或肝臟疾病之風險。具有Serpina1之無效對偶基因者，例如PINULL(Granite Falls)，則通常僅有發展成肺臟疾病之風險。
由alpha-1-抗胰蛋白酶缺乏引發的肝臟疾 病係為肝臟細胞製造出折疊錯誤且因此無法輕易地運輸出細胞alpha-1-抗胰蛋白酶的變異型式的結果。此導致錯誤折疊的蛋白質累積於肝臟細胞中，而可能造成一或多種肝臟的疾病或失常，包括但不限於，慢性肝臟疾病、肝臟發炎、肝硬化(cirrhosis)、肝纖維化(liver fibrosis)及/或肝癌(hepatocellular carcinoma)。
目前僅有非常有限的選擇用於因alpha-1-抗胰蛋白酶缺乏所引起肝病之患者之治療，包括肝炎疫苗、支持療法及避免侵害性之試劑(如，酒精及非類固醇抗發炎藥物(NSAIDs))。雖然alpha-1-抗胰蛋白酶替代療法是可行的，此治療對該等個體之肝臟疾病不會造成衝擊，此外，雖然肝臟移植可能有效，但是此為困難、昂貴且具風險性的手術，並且肝臟器官無法輕易取得。
因此，在針對Serpina1相關疾病(如慢性肝臟疾病、肝臟發炎、肝硬化、肝纖維化及/或肝癌)之有效治療上有其需求。
如下方更加詳細描述，於此揭露組成物，其包含試劑，如單股及雙股聚核苷酸(polynucleotides)，如RNAi試劑，如雙股iRNA試劑，以Serpina1為目標。亦揭露使用本發明組成物以抑制Serpina1表現之方法及治療Serpina1相關疾病(如慢性肝臟疾病、肝臟發炎、肝硬化、肝纖維化及/或肝癌)之方法。
因此，一方面，本發明提供抑制細胞中 Serpina1表現之雙股RNAi試劑。該雙股RNAi試劑包含形成雙股區域之正義股(sense strand)及反義股(antisense strand)，其中該正義股包含至少15個相鄰核苷酸，其與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、或SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中任一核苷酸序列之差異不超過三個核苷酸，且該反義股包含至少15個相鄰核苷酸，其與SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25中任一核苷酸序列之差異不超過三個核苷酸。其中，實質上該正義股之所有核苷酸及實質上該反義股之所有核苷酸係為經修飾的核苷酸，且其中該正義股係接合至附著於其3'-端的配體。
在一具體實施例中，反義股核苷酸序列中三個核苷酸差異之一係為與該反義股種子區域(seed region)之核苷酸錯配(mismatch)。在一具體實施例中，該反義股包含於該錯配核苷酸上之通用鹼基(universal base)。
在一具體實施例中，該正義股之所有核苷酸及該反義股之所有核苷酸皆為經修飾的核苷酸。
在一具體實施例中，該正義股及該反義股包含互補區，該互補區包含至少15個相鄰核苷酸，其與表1、2、5、7、8及9中任一者所列之任一序列之差異不超 過三個核苷酸。
在一具體實施例中，至少一個經修飾的核苷酸選自由3'-端去氧胸腺嘧啶核苷酸(3'-terminal deoxy-thymine(dT)nucleotide)、2'-O-甲基修飾核苷酸(2'-O-methyl modified nucleotide)、2'-氟修飾核苷酸(2'-fluoro modified nucleotide)、2'-脫氧修飾核苷酸(2'-deoxy-modified nucleotide)、鎖核苷酸(locked nucleotide)、無鹼基核苷酸(abasic nucleotide)、2'-胺基修飾核苷酸(2'-amino-modified nucleotide)、2'-烷基修飾核苷酸(2'-alkyl-modified nucleotide)、N-嗎啉基核苷酸(morpholino nucleotide)、胺基磷酸酯(phosphoramidate)、包含核苷酸之非天然鹼基、包含5’-硫代磷酸酯基團(phosphorothioate group)之核苷酸及連接至膽固醇基衍生物或十二酸-雙癸醯胺基(dodecanoic acid bisdecylamide group)之末端核苷酸所組成之群組。
在一具體實施例中，至少一股包含至少含一個核苷酸的3'端突出(3' overhang)。
在另一具體實施例中，至少一股包含至少含兩個核苷酸的3'端突出。
另一方面，本發明提供RNAi試劑，如雙股RNAi試劑，具有抑制細胞中Serpina1表現之能力。其中該雙股RNAi試劑包含實質上與反義股互補之正義股，其中該反義股包含實質上互補於部分之編碼Serpina1之mRNA之區域，其中各股約14至約30個核苷酸長，其中 該雙股RNAi試劑以式(III)表示：正義股：5'np-Na-(X X X)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3'反義股：3'np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq'5' (III)
其中：i、j、k及l各獨立為0或1；p、p'、q及q'各獨立為0至6；各Na及Na'獨立表示包含0至25個經修飾或未經修飾或其組合之核苷酸的寡核苷酸(oligonucleotide)序列，各序列包含至少兩個經不同修飾的核苷酸；各Nb及Nb'獨立表示包含0至10個經修飾或未經修飾或其組合之核苷酸的寡核苷酸序列；各np、np'、nq及nq'可存在或可不存在，且獨立表示突出核苷酸(overhang nucleotide)；XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'及Z'Z'Z'各自獨立表示三個連續核苷酸上之三個相同修飾的模體(motif)；Nb上的修飾與Y上的修飾不同，且Nb'上的修飾與Y'上的修飾不同；以及其中該正義股係接合於至少一個配體。
在一具體實施例中，Na'包含1至25個核苷酸，且其中位於其5'-末端位置2至9之一個位置的1至25個核苷酸之一者為核苷酸錯配。在一具體實施例中，該錯配鹼基為通用鹼基。
在一具體實施例中，i為0；j為0；i為1； j為1；i及j皆為0；或i及j皆為1。在另一具體實施例中，k為0；l為0；k為1；l為1；k及l皆為0；k及l皆為1。
在一具體實施例中，XXX互補於X'X'X'，YYY互補於Y'Y'Y'且ZZZ互補於Z'Z'Z'。
在一具體實施例中，YYY模體發生在或接近該正義股之剪切位置(cleavage)。
在一具體實施例中，Y'Y'Y'模體發生在該反義股自5'末端之位置11、12及13。
在一具體實施例中，Y'為2'-O-甲基。
在一一具體實施例中，式(III)由式(IIIa)表示：正義股：5'np-Na-YYY-Na-nq3'反義股：3'np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-nq'5' (IIIa)。
在另一具體實施例中，式(III)由式(IIIb)表示：正義股：5'np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3'反義股：3'np'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na'- nq'5' (IIIb)
其中各Nb及Nb'獨立表示包含1至5個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
又另一具體實施例中，式(III)由式(IIIc)表示：正義股：5'np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq3'反義股：3'np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-nq'5' (IIIc)
其中各Nb及Nb'獨立表示包含1至5個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
在一具體實施例中，式(III)由式(IIId)表示：正義股：5'np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3'反義股：3'np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na'-nq'5' (IIId)
其中各Nb及Nb'獨立表示包含1至5個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列且各Na及Na'獨立表示包含2至10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
在一具體實施例中，該雙股區為15至30個核苷酸對長。在另一具體實施例中，該雙股區為17至23個核苷酸對長。又另一具體實施例中，該雙股區為17至25個核苷酸對長。在一具體實施例中，該雙股區為23至27個核苷酸對長。在另一具體實施例中，該雙股區為19至21個核苷酸對長。在另一具體實施例中，該雙股區為21至23個核苷酸對長。在一具體實施例中，各股具有15至30個核苷酸。另一具體實施例中，各股具有19至30個核苷酸。
在一具體實施例中，核苷酸上的修飾係選自由鎖核苷酸(LNA)、去水己糖醇核酸(HNA)、環己烯基核酸(CeNA)、2'-甲氧基乙基(2'-methoxyethyl)、2'-O-烷基、2'-O-烯丙基(2'-O-allyl)、2'-碳-烯丙基、2'-氟、2'-去氧、2'-羥基(2'-hydroxyl)及其組合組成之群組。在另一具體實施例中，核苷酸上的修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾。
在一具體實施例中，該配體為一或多個透 過二價或三價分支連接子附著之N-乙醯葡萄糖胺衍生物(GalNAc derivatives)。在另-一具體實施例中，該配體為：
在一具體實施例中，該配體附著於該正義股之3'末端。
在一具體實施例中，該RNAi試劑接合至配體，如下圖所示：
其中X為氧或硫。在一特定具體實施例中，X為氧。
在一具體實施例中，該試劑進一步包含至少一個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯(methylphosphonate)核苷酸間鍵結。
在一具體實施例中，該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵結係位於一股之3'端。在一具體實施例 中，該股為反義股。在另一具體實施例中，該股為正義股。
在一具體實施例中，該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵結位於一股之5'端。在一具體實施例中，該股為反義股。在另一具體實施例中，該股為正義股。
在一具體實施例中，該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵結位於一股之5'及3'二端。在一具體實施例中，該股為反義股。
在一具體實施例中，該RNAi試劑包含6至8個硫代磷酸酯核苷酸間鍵結。在一具體實施例中，該反義股於其5'-端包含二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵結及於其3'端包含二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵結，以及該正義股於其5'-端或3'-端包含至少兩個硫代磷酸酯核苷酸間鍵結。
在一具體實施例中，該雙股螺旋之反義股5'-末端位置1的鹼基對為AU鹼基對。
在一具體實施例中，該核苷酸Y包含2'-氟修飾。
在一具體實施例中，該核苷酸Y'包含2'-O-甲基修飾。
在一具體實施例中，p'>0，在另一具體實施例中，p'=2。
在一具體實施例中，q'=0，p=0，q=0，以及p'突出核苷酸係互補於該目標mRNA。在另一具體實施例中，q'=0，p=0，q=0，以及p'突出核苷酸係不互補於該目標mRNA。
在一具體實施例中，該正義股共有21個核苷酸及該反義股共有23個核苷酸。
在一具體實施例中，至少一個np'藉由硫代磷酸酯鍵結至相鄰核苷酸。
在一具體實施例中，所有np'藉由硫代磷酸酯鍵結至相鄰核苷酸。
在一具體實施例中，該RNAi試劑係選自由表1、表2、表5、表7、表8及表9中任一表所列之RNAi試劑所組成之群組。
在一具體實施例中，該RNAi試劑係選自由AD-58681、AD-59054、AD-61719及AD-61444組成之群組。
另一方面，本發明提供用於抑制細胞中Serpina1表現之雙股RNAi試劑。該雙股RNAi試劑包含形成雙股區域之正義股及反義股。其中該正義股包含至少15個相鄰核苷酸，其與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5，、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中任一核苷酸序列之差異不超過三個核苷酸，且該反義股包含至少15個相鄰核苷酸，其與SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25中任一核苷酸序列之差 異不超過三個核苷酸。其中，該正義股實質上所有核苷酸皆包含選自由2'-O-甲基修飾及2'-氟修飾組成之群組之修飾，其中該正義股於其5'-端包含二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵結，其中該反義股實質上所有核苷酸皆包含選自由2'-O-甲基修飾及2'-氟修飾組成之群組之修飾，其中該反義股於其5'-端包含二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵結及於其3'-端包含二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵結，以及其中該正義股於其3'-端係接合至一或多個經由二價或三價之分支連接子附著之N-乙醯基葡萄糖胺衍生物。
在一具體實施例中，該反義股核苷酸序列中之三個核苷酸差異之一係為該反義股之種子區域之核苷酸錯配。在一具體實施例中，該反義股包含於該錯配核苷酸之通用鹼基。
在一具體實施例中，該正義股之所有核苷酸及該反義股之所有核苷酸皆包含修飾。
在另一方面，本發明提供RNAi試劑，如雙股RNAi試劑，具有抑制細胞Serpina1表現之能力(本文中亦有譯為能抑制細胞Serpina1表現之情形)，其中該雙股RNAi試劑包含實質上互補於反義股之正義股，其中該反義股包含實質上互補於部分之編碼Serpina1之mRNA之區域，其中各股係約14至約30個核苷酸長，其中該雙股RNAi試劑以式(III)表示： 正義股：5'np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3'反義股：3'np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq'5' (III)
其中：i、j、k及l各獨立為0或1；p、p'、q及q'各獨立為0至6；各Na及Na'獨立表示包含0至25個經修飾或未經修飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少二個經不同修飾的核苷酸；各Nb及Nb'獨立表示包含0至10個經修飾或未經修飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列；各np、np'、nq及nq'可存在或可不存在，且獨立表示突出核苷酸；XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'及Z'Z'Z'各自獨立表示在三個連續核苷酸上之三個相同修飾的模體，且其中該修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾；Nb上的修飾與Y上的修飾不同，且Nb'上的修飾與Y'上的修飾不同；以及其中該正義股係接合於至少一個配體。
又另一一方面，本發明提供RNAi試劑，如雙股RNAi試劑，具有抑制細胞Serpina1表現之能力。其中該雙股RNAi試劑包含實質上與反義股互補之正義股，其中該反義股包含實質上互補於部分之編碼Serpina1之mRNA之區域，其中各股係約14至約30個核苷酸長，其 中該雙股RNAi試劑以式(III)表示：正義股：5'np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3'反義股：3'np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq'5' (III)
其中：i、j、k及l各獨立為0或1；各np、nq及nq'可存在或可不存在，且獨立表示突出核苷酸；p、q及q'各自獨立為0至6；np'>0且至少一個np'經由硫代磷酸酯鍵結連接至相鄰核苷酸；各Na及Na'獨立表示包含0至25個經修飾或未經修飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少兩個經不同修飾的核苷酸；各Nb及Nb'獨立表示包含0至10個經修飾或未經修飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列；XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'及Z'Z'Z'各獨立表示在三個連續核苷酸上之三個相同修飾的模體，且其中該修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾；Nb上的修飾與Y上的修飾不同，且Nb'上的修飾與Y'上的修飾不同；以及其中該正義股係接合於至少一個配體。
在另一方面，本發明提供RNAi試劑，如雙股RNAi試劑，具有抑制細胞Serpina1表現之能力，其中 該雙股RNAi試劑包含實質上互補於反義股之正義股，其中該反義股包含實質上互補於部分之編碼Serpina1之mRNA的區域，其中各股係約14至約30個核苷酸長，其中該雙股RNAi試劑以式(III)表示：正義股：5'np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3'反義股：3'np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq'5' (III)
其中：i、j、k及l各自獨立為0或1；各np、nq及nq'可存在或可不存在，且獨立表示突出核苷酸；p、q及q'各自獨立為0至6；np'>0且至少一個np'經由硫代磷酸酯鍵結連接至相鄰核苷酸；各Na及Na'獨立表示包含0至25個經修飾或未經修飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少兩個經不同修飾的核苷酸；各Nb及Nb'獨立表示包含0至10個經修飾或未經修飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列；XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'及Z'Z'Z'各自獨立表示在三個連續核苷酸上之三個相同修飾的模體，且其中該修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾；Nb上的修飾與Y上的修飾不同，且Nb'上的修飾與Y'上的修飾不同；以及 其中該正義股係接合於至少一個配體，其中該配體為一或多個透過二價或三價分支連接子附著之N-乙醯基葡萄糖胺衍生物。
另一方面，本發明提供RNAi試劑，如雙股RNAi試劑，具有抑制細胞Serpina1表現之能力，其中該雙股RNAi試劑包含實質上互補於反義股之正義股，其中該反義股包含實質上互補於部分之編碼Serpina1之mRNA之區域，其中各股係約14到約30個核苷酸長，其中該雙股RNAi試劑以式(III)表示：正義股：5'np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3'反義股：3'np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq'5' (III)
其中：i、j、k及l各獨立為0或1；各np、nq及nq'可存在或可不存在，且獨立表示突出核苷酸；p、q及q'各自獨立為0至6；np'>0且至少一個np'經由硫代磷酸酯鍵結連接至相鄰核苷酸；各Na及Na'獨立表示包含0至25個經修飾或未經修飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少兩個經不同修飾的核苷酸；各Nb及Nb'獨立表示包含0至10個經修飾或未經修飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列； XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'及Z'Z'Z'各獨立表示在三個連續核苷酸上之三個相同修飾的模體，且其中該修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾；Nb上的修飾與Y上的修飾不同，且Nb'上的修飾與Y'上的修飾不同；其中該正義股包含至少一個硫代磷酸酯鍵結；以及其中該正義股係接合於至少一個配體，其中該配體為一或多個透過二價或三價分支連接子附著之N-乙醯基葡萄糖胺衍生物。
又另一方面，本發明提供RNAi試劑，如雙股RNAi試劑，具有抑制細胞Serpina1表現之能力。其中該雙股RNAi試劑包含實質上互補於反義股之正義股，其中該反義股包含實質上互補於部分之編碼Serpina1之mRNA之區域，其中各股係約14至約30個核苷酸長，其中該雙股RNAi試劑以式(III)表示：正義股：5'np-Na-YYY-Na-nq3'反義股：3'np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-nq'5' (IIIa)
其中：各np、nq及nq'可存在或可不存在，且獨立表示突出核苷酸；p、q及q'各自獨立為0至6；np'>0且至少一個np'經由硫代磷酸酯鍵結連接至相鄰核苷酸；各Na及Na'獨立表示包含0至25個經修飾或未經修 飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少兩個經不同修飾的核苷酸；YYY及Y'Y'Y'各獨立表示在三個連續核苷酸上之三個相同修飾的模體，且其中該修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾；其中該正義股包含至少一個硫代磷酸酯鍵結；以及其中該正義股係接合於至少一個配體，其中該配體為一或多個透過二價或三價分支連接子附著之N-乙醯基葡萄糖胺衍生物。
在一具體實施例中，Na'包含1至25個核苷酸，且其中位在5'端之位置2至9之一個位置的1至25個核苷酸之一者為核苷酸錯配。在一具體實施例中，該錯配鹼基為通用鹼基。
本發明亦提供包含本發明之雙股RNAi試劑的細胞、載體(vectors)、寄主細胞(host cells)及醫藥組成物。
在一具體實施例中，本發明提供選自由表1、2、5、7、8及9任一表中所列之RNAi試劑所組成之群組之RNAi試劑。
本發明亦提供包含經修飾之反義股聚核苷酸試劑之組成物。該試劑具有抑制細胞Serpina1表現之能力並且包含互補於選自由表1、2、5、7、8及9任一表所列序列組成之群組的正義股序列之序列。其中，該聚核苷酸係約14至約30個核苷酸長。
另一方面，本發明提供包含本發明之雙股RNAi試劑之細胞。
在某些具體實施例中，該RNAi試劑係使用醫藥組成物投藥。
在較佳具體實施例中，該RNAi試劑係於溶液中投藥。在部分此等具體實施例中，該siRNA係於非緩衝溶液中投藥。在一具體實施例中，該siRNA係於水中投藥。而在其他具體實施例中，該siRNA係於緩衝溶液中投藥，該緩衝溶液如醋酸鹽緩衝溶液(acetate buffer)、檸檬酸鹽緩衝溶液(citrate buffer)、醇溶蛋白緩衝溶液(prolamine buffer)、碳酸鹽緩衝溶液(carbonate buffer)或磷酸鹽緩衝溶液(phosphate buffer)或其任意組合。在某些具體實施例中，該緩衝溶液為磷酸緩衝鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)。
在一具體實施例中，該醫藥組成物進一步包含脂質劑型。一方面，本發明提供抑制細胞Serpina1表現之方法。該方法包括以RNAi試劑，如本發明之雙股RNAi試劑、組成物、載體或醫藥組成物接觸該細胞；並維持於步驟(a)中所產生之細胞於足夠的時間以達到Serpina1基因之mRNA轉錄之降解，藉此抑制細胞中Serpina1基因之表現。
在一具體實施例中，該細胞係於個體中。
在一具體實施例中，該個體為人類。
在一具體實施例中，Serpina1之表現被抑制 至少約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%。
另一方面，本發明提供治療患有Serpina1相關疾病個體之方法。該方法包括對該個體投藥治療有效含量(therapeutically effective amount)之RNAi試劑，如本發明之雙股RNAi試劑、組成物、載體或醫藥組成物，藉此治療該個體。
另一方面，本發明提供治療患有Serpina1相關疾病個體之方法。該方法包括對該個體以皮下方式投藥治療有效含量之雙股RNAi試劑，其中該雙股RNAi試劑包含形成雙股區域之正義股及反義股，其中該正義股包含至少15個相鄰核苷酸，其與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中任一核苷酸序列之差異不超過三個核苷酸，且該反義股包含至少15個相鄰核苷酸，其與SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25中任一核苷酸序列之差異不超過三個核苷酸，其中實質上所有該反義股之核苷酸包含選自由2'-O-甲基修飾及2'-氟修飾組成之群組之修飾，其中該反義股於其5'-端包含二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵結及於其3'-端包含二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵結，其 中，實質上所有該正義股之核苷酸包含修飾選自由2'-O-甲基修飾及2'-氟修飾組成之群組，其中該正義股於其5'-端包含二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵結以及，其中該正義股係於其3'-端接合至一或多個透過二價或三價分支連接子附著之N-乙醯基葡萄糖胺衍生物，藉此治療該個體。
在一具體實施例中，該反義股核苷酸序列中之三個核苷酸差異之一係為該反義股之種子區域之核苷酸錯配。在一具體實施例中，該反義股包含於該錯配核苷酸上之通用鹼基。
在一具體實施例中，所有該正義股之核苷酸及所有該反義股之核苷酸皆包含修飾。
在一具體實施例中，該Serpina1相關疾病係指肝臟疾病，如慢性肝臟疾病、肝臟發炎、肝硬化、肝纖維化及/或肝癌。
在一具體實施例中，將該RNAi試劑對該個體投藥，導致肝硬化、肝纖維化及/或Serpina1蛋白質累積於肝臟中的減少。在另一具體實施例中，對該個體投藥該RNAi試劑進一步造成肺臟發炎的減少。
在一具體實施例中，該個體為人類。
在一具體實施例中，該RNAi試劑，如雙股RNAi試劑，以約0.01mg/kg至約10mg/kg，約0.5mg/kg至約50mg/kg，約10mg/kg至約30mg/kg，約10mg/kg至約20mg/kg，約15mg/kg至約20mg/kg，約15mg/kg至約25mg/kg，約15mg/kg至約30mg/kg或約20mg/kg至約 30mg/kg的劑量投藥。
在一具體實施例中，該RNAi試劑，如雙股RNAi試劑，以皮下或靜脈方式投藥。
又另一方面，本發明提供抑制具有Serina1缺乏變異個體中肝癌發展之方法。該方法包括對該個體投藥治療有效含量之RNAi試劑，如本發明之雙股RNAi試劑、組成物、載體或醫藥組成物，藉此抑制個體中肝癌之發展。
另一方面，本發明提供抑制具有Serina1缺乏變異個體中肝癌發展之方法。該方法包括對該個體以皮下方式投藥治療有效含量之雙股RNAi試劑，其中該雙股RNAi試劑包含形成雙股區域之正義股及反義股形成，其中該正義股包含至少15個相鄰核苷酸，其與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5，、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中任一核苷酸序列之差異不超過三個核苷酸，且該反義股包含至少15個相鄰核苷酸，其與SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25中任一核苷酸序列之差異不超過三個核苷酸，其中實質上所有該反義股之核苷酸包含選自由2'-O-甲基修飾及2'-氟修飾組成之群組之修飾，其中該反義股於其5'-端包含二個硫代 磷酸酯核苷酸間鍵結及於其3'-端包含二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵結，其中，實質上所有該正義股之核苷酸包含選自由2'-O-甲基修飾及2'-氟修飾組成之群組之修飾，其中該正義股於其5'-端包含二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵結以及，其中該正義股於其3'-端係接合於一或多個透過二價或三價分支連接子附著之N-乙醯基葡萄糖胺衍生物，藉此抑制具有Serina1缺乏變異個體中肝癌發展。
在一具體實施例中，該反義股核苷酸序列中之三個核苷酸差異之一係為該反義股之種子區域之核苷酸錯配。在一具體實施例中，該反義股包含於該錯配核苷酸上之通用鹼基。
在一具體實施例中，所有該正義股之核苷酸及所有該反義股之核苷酸皆包含一個修飾。
在一具體實施例中，該個體為靈長類(primate)或囓齒類(rodent)。在另一具體實施例中，該個體為人類。
在一具體實施例中，該RNAi試劑，如雙股RNAi試劑，以約0.01mg/kg至約10mg/kg，或約0.5mg/kg至約50mg/kg之劑量投藥。在另一具體實施例中，該雙股RNAi試劑係以約10mg/kg至約30mg/kg之劑量投藥。
在一具體實施例中，該RNAi試劑，如雙股RNAi試劑，以約3mg/kg之劑量投藥。在另一具體實施例中，該雙股RNAi試劑以約10mg/kg之劑量投藥。又另一具體實施例中，該雙股RNAi試劑以約0.5mg/kg之劑量每 週投藥兩次。又另一具體實施例中，該雙股RNAi試劑以約10mg/kg每二週一次投藥。又另一具體實施例中，該雙股RNAi試劑以約0.5至約1mg/kg每週一次投藥。
在一具體實施例中，該RNAi試劑，如雙股RNAi試劑，係每週兩次投藥。在另一具體實施例中，該RNAi試劑係每隔一週投藥。
在一具體實施例中，該RNAi試劑，如雙股RNAi試劑，以皮下或靜脈方式投藥。
另一方面，本發明提供減少具有Serpina1缺乏變異個體之肝臟中錯誤折疊之Serpina1累積之方法。該方法包括對該個體投藥治療有效含量之RNAi試劑，如本發明之雙股RNAi試劑、組成物、載體或醫藥組成物，藉此減少該個體肝臟中錯誤折疊之Serpina1之累積。
另一方面，本發明提供減少具有Serpina1缺乏變異個體肝臟中錯誤折疊之Serpina1累積之方法。該方法包括對該個體以皮下方式投藥治療有效含量之雙股RNAi試劑，其中該雙股RNAi試劑包含形成雙股區域之正義股及反義股，其中該正義股包含至少15個相鄰核苷酸，其與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5，、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中任一核苷酸序列之差異不超過三個核苷酸，且該反義股包含至少15個相鄰核苷酸，其與SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25中任一核苷酸序列之差異不超過三個核苷酸，其中實質上所有該反義股之核苷酸包含選自由2'-O-甲基修飾及2'-氟修飾組成之群組之修飾，其中該反義股於其5'-端包含二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵結及於其3'-端包含二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵結，其中，實質上所有該正義股之核苷酸包含選自由2'-O-甲基修飾及2'-氟修飾組成之群組之修飾，其中該正義股於其5'-端包含二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵結以及，其中該正義股於其3'-端係接合於一或多個透過二價或三價之分支連接子附著之N-乙醯基葡萄糖胺衍生物，藉此減少具有Serpina1缺乏變異之個體肝臟中錯誤折疊之Serpina1累積。
在一具體實施例中，該反義股核苷酸序列中之三個核苷酸差異之一係為該反義股之種子區域之核苷酸錯配。在一具體實施例中，其反義股包含於該錯配核苷酸上之通用鹼基。
在一具體實施例中，所有該正義股之核苷酸及所有該反義股之核苷酸皆包含一個修飾。
在一具體實施例中，該個體為靈長類或囓齒類。在另一具體實施例中，該個體為人類。
在一具體實施例中，該RNAi試劑，如雙股RNAi試劑，以約0.01mg/kg至約10mg/kg，或約0.5mg/kg至約50mg/kg之劑量投藥。在另一具體實施例中，該雙股 RNAi試劑以約10mg/kg至約30mg/kg之劑量投藥。
在一具體實施例中，該RNAi試劑，如雙股RNAi試劑，以皮下或靜脈方式投藥。
本發明將利用以下詳細說明及圖示進一步說明。
第1圖係描述於表現Z-AAT型之人類AAT的轉殖鼠中，該等所表示siRNAs之體內功效及反應持續性的圖形。
第2A及2B圖描述五種具有低IC50值之siRNAs之體內功效。於第0天以10mg/kg siRNA雙股螺旋注射於表現人類Z-AAT對偶基因之基因轉殖鼠中，並於投藥後第21天注射人類AAT血清(第2A圖)。各點表示三隻小鼠之平均值且誤差橫槓反應標準偏差。第2B圖說明肝臟中hAAT mRNA含量，各組數據以GAPDH標準化。該長條反應平均值且誤差橫槓反應標準偏差。
第3A至3C圖以劑量反應方式描述持續性AAT抑制。第3A圖具體描述出效應曲線顯示以皮下方式投藥不同劑量之AD-59054時，基因轉殖鼠血清hAAT蛋白質量的最大調降(knock-down)。各點表示三隻動物之平均值且誤差橫槓反應標準偏差。第3B圖顯示以0.3、1、3或10mg/kg投藥單一劑AAT siRNA後之調降續性情形。該hAAT量以各動物之三次前採血(prebleeds)之平均值標準化。該磷酸緩衝鹽溶液組作為控制組以反應血清hAAT量之變化。各 資料點為三隻動物之平均值且誤差橫槓反應標準偏差。第3C圖中，對動物投藥AD-59054劑量為0.5mg/kg，每週兩次。各資料點為四隻動物之相對血清hAAT之平均值且誤差橫槓反應標準偏差。
第4A至4D圖描述隨著Z-AAT降低，腫瘤發生率隨之減少。第4A圖描述該研究設計，其中患有肝纖維化之成齡小鼠以每二週一次(Q2W)皮下方式投藥磷酸緩衝鹽溶液或siRNA雙股螺旋AD58681劑量為10mg/kg，共11劑，於投藥最後一劑後7天犧牲。第4B圖顯示控制組及處理組肝臟中hAA TmRNA量。第4C圖顯示控制組及處理組肝臟中Colla2 mRNA量。第4D圖描述控制組及處理組肝臟中PtPrc mRNA量。
第5A至5C圖描述隨著Z-AAT降低，腫瘤發生率隨之減少。根據第4A圖之研究設計採集處理組小鼠之血清樣本，以監測hAAT之抑制程度。第5A圖描述投藥第一劑後血清hAAT蛋白質量。第5B圖及第5C圖描述經PAS染色之分別以磷酸緩衝鹽溶液或AAT siRNA處理之同窩出生仔畜(littermates)之肝臟切片。其中深色點狀部分表示小球(globules)或Z-AAT聚集(aggregates)。
第6圖描述經組成物治療之體內療效。
第7A及7B圖分別描述對非人類之靈長目投藥單一劑AD-59054、AD-61719或AD-61444劑量為1mg/kg(7A)或3mg/kg(7B)後AAT之調降持續性。各資料點為三動物之平均值且誤差橫槓反應標準偏差。
第8A圖顯示智人(Homo sapiens)Serpina1之核苷酸序列，轉錄變異體1(transcript variant1)(SEQ ID NO：1)；第8B圖顯示智人Serpina1之核苷酸序列，轉錄變異體3(SEQ ID NO：2)；第8C圖顯示智人Serpina1之核苷酸序列，轉錄變異體2(SEQ ID NO：3)；第8D圖顯示智人Serpina1之核苷酸序列，轉錄變異體4(SEQ ID NO：4)；第8E圖顯示智人Serpina1之核苷酸序列，轉錄變異體5(SEQ ID NO：5)；第8F圖顯示智人Serpina1之核苷酸序列，轉錄變異體6(SEQ ID NO：6)；第8G圖顯示智人Serpina1之核苷酸序列，轉錄變異體7(SEQ ID NO：7)；第8H圖顯示智人Serpina1之核苷酸序列，轉錄變異體8(SEQ ID NO：8)；第8I圖顯示智人Serpina1之核苷酸序列，轉錄變異體9(SEQ ID NO：9)；第8J圖顯示智人Serpina1之核苷酸序列，轉錄變異體10(SEQ ID NO：10)；第8K圖顯示智人Serpina1之核苷酸序列，轉錄變異體11(SEQ ID NO：11)；第8L圖顯示恆河獼猴(Macaca mulatta)Serpina1之核苷酸序列(SEQ ID NO：12)；第8M圖顯示恆河獼猴Serpina1之核苷酸序列，轉錄變異體6(SEQ ID NO：13)；第8N圖顯示恆河獼猴Serpina1之核苷酸序列，轉錄變異體4(SEQ ID NO：14)；第8O圖顯示SEQ ID NO：1之反互補序列(reverse complement)(SEQ ID NO；15)；第8P圖顯示SEQ ID NO：2之反互補序列(SEQ ID NO：16)；第8Q圖顯示SEQ ID NO：3之反互補序列(SEQ ID NO：17)；第8R圖顯示SEQ ID NO：4之反互補序列(SEQ ID NO：18)； 第8S圖顯示SEQ ID NO：5之反互補序列(SEQ ID NO：19)；第8T圖顯示SEQ ID NO：6之反互補序列(SEQ ID NO：20)；第8U圖顯示SEQ ID NO：7之反互補序列(SEQ ID NO：21)；第8V圖顯示SEQ ID NO：8之反互補序列(SEQ ID NO：22)；第8W圖顯示SEQ ID NO：9之反互補序列(SEQ ID NO：23)；第8X圖顯示SEQ ID NO：10之反互補序列(SEQ ID NO：24)；第8Y圖顯示SEQ ID NO：11之反互補序列(SEQ ID NO：25)；第8Z圖顯示SEQ ID NO：12之反互補序列(SEQ ID NO：26)；第8AA圖顯示SEQ ID NO：13之反互補序列(SEQ ID NO：27)；以及第8AB圖顯示SEQ ID NO：14之反互補序列(SEQ ID NO：28)。
本發明提供包括試劑之組成物，如單股及雙股寡核苷酸，如RNAi試劑，如雙股iRNA試劑，以Serpina1為目標。亦揭露使用本發明之組成物抑制Serpina1表現之方法及治療Serpina1相關疾病，例如肝臟疾病，如慢性肝臟疾病、肝臟發炎、肝硬化、肝纖維化及/或肝癌之方法。
I. 定義
為了更容易了解本發明，首先定義某些術語。此外，必須注意的是，無論文中所提參數之數值或數值範圍，其係意指該記載之數值或該數值範圍間之值亦為本發明之一部分。
於此所使用之冠詞“一(a/an)”意指“一個或 多於一個”(亦即至少一個)於文中符合語意之物件。舉例而言，“一元素”意指一種元素或多於一種元素，如複數之元素。
於此使用之術語“包括”意指且可替換為用語“包括但不限於”。
除非上下文中明確指示，否則於此使用之術語“或”意指且可替換為術語“及/或”。
於此使用之“絲胺酸蛋白酶抑制因子A1(Serpina 1)”意指絲胺酸蛋白酶抑制因子(serpin)肽酶抑制劑，clade A，member 1基因或蛋白質。Serpina1亦已知為alpha-1-抗胰蛋白酶、α-1-抗胰蛋白酶、AAT、蛋白酶抑制劑1(protease inhibitor 1)、PI、PI1、抗彈性蛋白酶(anti-elastase)及抗胰蛋白酶。
術語“絲胺酸蛋白酶抑制因子A1”包括人類Serpina1，其胺基酸及核苷酸序列可被搜尋於，例如GenBank登錄號(Accession Nos.)GI：189163524(SEQ ID NO：1)、GI：189163525(SEQ ID NO：2)、GI：189163526(SEQ ID NO：3)、GI：189163527(SEQ ID NO：4)、GI：189163529(SEQ ID NO：5)、GI：189163531(SEQ ID NO：6)、GI：189163533(SEQ ID NO：7)、GI：189163535(SEQ ID NO：8)、GI：189163537(SEQ ID NO：9)、GI：189163539(SEQ ID NO：10)及/或GI：189163541(SEQ ID NO：11)；恆河獼猴(rhesus)之Serpina1，其胺基酸及核苷酸序列可被搜尋於，例如，GenBank登錄號GI：402766667(SEQ ID NO： 12)、GI：297298519(SEQ ID NO：13)及/或GI：297298520(SEQ ID NO：14)；小鼠(mouse)之Serpina1，其胺基酸及核苷酸序列可被搜尋於，例如，GenBank登錄號GI：357588423及/或GI：357588426；以及大鼠(rat)，其胺基酸及核苷酸序列可被搜尋於，例如，GenBank登錄號GI：77020249。其餘Serpina1之mRNA序列實例可使用如GenBank及OMIM輕易地取得。
已經鑑定出超過120種Serpina1之對偶基因，“M”對偶基因係被認為野生型或“正常”對偶基因(如“PIM1-ALA213”(亦已知為PI、M1A)、“PIM1-VAL213”(亦已知為PI、MIV)、“PIM2”、“PIM3”及“PIM4”)。其他變異體可搜尋於，例如A(1)ATVar資料庫(參閱Zaimidou,S.,et al.(2009)Hum Mutat.230(3)：308-13及www.goldenhelix.org/A1 ATVar)。
於此使用之術語“Serpina1缺乏對偶基因”意指變異對偶基因，其製造之蛋白質無法正確摺疊及可於細胞內聚集而無法正確地從肝臟的合成位置運輸至體內的作用位置。
例示性Serpina1缺乏對偶基因包括“Z對偶基因”(“Z allele”)、“S對偶基因”(“S allele”)、“PIM(Malton)對偶基因”(“PIM(Malton)allele”)及“PIM(Procida)對偶基因”(“PIM(Procida)allele”)。
在此所使用之術語“Z對偶基因”、“PIZ”及“Z-AAT”意指Serpina1之變異對偶基因，於其中，在蛋白 質之位置342之胺基酸從麩醯胺酸(glutamine)換成離胺酸(lysine)，係由於相對應之密碼子從GAG變為AAG。Z對偶基因之同型組合者可意指為“PIZZ”。Z-AAT突變佔Serpina1缺乏病患中約95%且估計美國有十萬人，而全球約有三百萬人。Z對偶基因於高加索人種(Caucasians)中達到多型性頻率，而於亞洲人(Asians)或黑人(blacks)中罕見於或不存在。同型組合ZZ表現型(phenotype)與高風險之肺氣腫及肝臟疾病相關。Z-AAT蛋白質於內質網(endoplasmic reticulum)中無法正確折疊，導致環圈-褶板聚合體(loop-sheet polymers)，其聚集且減少分泌、未折疊蛋白反應被誘發、細胞凋亡(apoptosis)、內質網超載反應(endoplasmic reticulum overload response)、自噬(autophagy)、粒線體壓力(mitochondrial stress)及肝細胞功能改變。
在此使用之術語“PIM(Malton)”及“M(Malton)-AAT”意指Serpina1之變異對偶基因，於其中，該成熟蛋白(mature protein)之位置51或52之相鄰苯丙胺酸(phenylalanine)殘基之一者被刪除。此胺基酸之刪除使beta-褶板，B6，之一股縮短，阻止了肝臟中正常處理及分泌，其與肝細胞內含物及自肝臟之蛋白質減弱分泌相關。
在此使用之術語“PIS”意指Serpina1之變異對偶基因，其中，位置264之麩胺酸(glutamic acid)被纈胺酸(valine)取代。雖然大多數這類變異蛋白質會在胞內降解，高加索人種中仍有相當高頻率的PIS對偶基因，因此 由Z對偶基因或無效對偶基因組成的異型組合仍十分常見。
在此使用之“目標序列(target sequence)”意指於Serpina1基因轉錄期間所形成之mRNA分子之核苷酸序列之相鄰部分，包括由初始轉錄產物(primary transcription product)之RNA處理(RNA processing)過程中產物的mRNA。
在此所使用術語“包含序列之股”意指包含藉由使用標準核苷酸命名法所稱序列描述之核苷酸鏈之寡核苷酸。
“G”、“C”、“A”及“U”各通常分別表示包含鳥糞嘌呤(guanine)、胞嘧啶(cytosine)、腺嘌呤(adenine)及尿嘧啶(uracil)作為鹼基的核苷酸。“T”及“dT”在此可互相替換且意指去氧核醣核苷酸，其中該鹼基為胸腺嘧啶(thymine)，如去氧核糖胸腺嘧啶、2'-去氧胸苷(2'-deoxythymidine)或胸苷(thymidine)。然而，應可了解此術語“核糖核苷酸(ribonucleotide)”或“核苷酸(nucleotide)”或“去氧核醣核苷酸(deoxyribonucleotide)”亦可指如下進一步詳述之經修飾核苷酸，或代用替換部分(surrogate replacement moiety)。本領域技藝者係明確知悉鳥糞嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤及尿嘧啶可以被其他部分替換而實質上不改變包含帶有這類替換部分之核苷酸的寡核苷酸之鹼基對特性。例如，但不限於此，包含肌苷(inosine)為其鹼基之核苷酸，可以與含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之核苷酸進行 鹼基配對。因此，含尿嘧啶、鳥糞嘌呤或腺嘌呤之核苷酸在本發明之核苷酸序列中可替換為含有如肌苷之核苷酸。包括此等取代部分之序列係本發明之實施例。
在此使用之術語“iRNA”、“RNAi試劑”、“iRNA試劑”、“RNA干擾(interference)試劑”可相互替換，且意指含有如本文中該術語定義之RNA之試劑，且其經由核醣核酸誘導沉默複合體(RNA-induced silencing complex,RISC)途徑調控該RNA轉錄(本)之目標剪切位置。iRNA透過稱為RNA干擾(RNAi)之過程引導mRNA之序列專一性(sequence-specific)降解。該iRNA調節(如抑制)細胞(如個體(如哺乳動物)中之細胞)中Serpina1之表現。
在一具體實施例中，本發明之RNAi試劑包含一段單股RNA，其係與一段目標RNA序列(如Serpina1目標mRNA序列)相互作用，以指引該目標RNA之剪切。不期望受限於理論，一般據信，進入細胞中的長段雙股RNA會因為第三型核酸內切酶，即切酶(Dicer)，而斷成siRNA(短干擾RNA)(Sharp et al.(2001)Genes Dev.15：485)。切酶，係第三型核糖核苷酸水解酶類酵素，將雙股RNA處理成具有二鹼基3'端突出特徵之19至23個鹼基對之siRNA(Bernstein,et al.,(2001)Nature 409：363)。該等siRNAs接著被包含於核醣核酸誘導沉默複合體(RISC)，於此一或多個解旋酶(helicase)展開(unwind)該siRNA之雙股螺旋，使該互補之反義股能夠引導目標辨識位置(Nykanen,et al.,(2001)Cell 107：309)。當結合至適合的目標mRNA 時，RISC中的一或多個核酸內切酶會剪切該目標以誘發沉默(silencing)(Elbashir,et al.,(2001)Genes Dev.15：188)。因此本發明之一面向係關於一種產生於細胞中之單股RNA(siRNA)且其促進RISC複合體之形成以影響該目標基因(即Serpina1基因)沉默。據此，於此使用之術語“siRNA”亦意指如上該RNAi。
在另一具體實施例中，該RNAi試劑可以是一段被引導至細胞或有機體(organism)內的單股siRNA，以抑制目標mRNA。單股RNAi試劑與RISC核酸內切酶Argonaute2結合，並接著剪切該目標mRNA。該單股siRNAs一般為15至30個核苷酸且係經化學修飾。單股siRNAs之設計與測試詳述於美國專利第8,101,348號及Lima et al.,(2012)Cell 150：883-894，其各完整內容特此納入以為參考。於此描述之任一反義核苷酸序列可被用作於此所述之單股siRNA，或如利用Lima et al.,(2012)Cell 150：883-894所述之方法進行化學修飾之單股siRNA。
於又另一具體實施例中，本發明提供以Serpina1作為目標之單股反義寡核苷酸分子。“單股反義寡核苷酸分子”係互補於該目標mRNA(即Serpina1)中之一段序列。單股反義寡核苷酸分子可以化學計量方式抑制轉譯經由與該mRNA鹼基配對及物理上阻擾轉譯機制，參照Dias,N.et al.,(2002)Mol Cancer Ther 1：347-355。或者，該等單股反義寡核苷酸分子經由與該目標雜合及透過核糖核苷酸水解酶H剪切作用來剪切目標以抑制目標mRNA。 該單股反義寡核苷酸分子可為約10到約30個核苷酸長且具有一段序列互補於目標序列。例如，該單股反義寡核苷酸分子可包含至少有約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多選自於此所述之該任一反義核苷酸序列之相鄰核苷酸之序列，如於表1、2、5、7、8或9任一表中所提供之序列或結合任一於此所述之該目標位置序列。該單股反義寡核苷酸分子可包含經修飾之RNA、DNA或其組合。
在另一具體實施例中，於本發明之組成物、用途及方法所使用之“iRNA”係雙股RNA並於此意指“雙股RNAi試劑”、“雙股RNA(dsRNA)分子”、“雙股RNA試劑”或“雙股RNA”。術語“雙股RNA”，意指核糖核苷酸分子之複合物，其具有包含兩反向平行且實質上互補之核酸股的雙股螺旋結構，就目標RNA(即Serpina1基因)而言，意指具有“正義股”及“反義股”方向。在本發明某些具體實施例中，透過轉錄後基因沉默化機制(post-transcriptional gene-silencing mechanism)，雙股RNA觸發目標RNA(如mRNA)之降解，即於此所指之RNA干擾或RNAi。
一般而言，雙股RNA分子中各股的多數核苷酸為核糖核苷酸，但如此處所詳述，各股或雙股亦可包括一或多個非核糖核苷酸，如去氧核糖核苷酸及/或經修飾之核苷酸。此外，於此說明書中所使用之“RNAi試劑”可包括經化學修飾之核糖核苷酸；RNAi試劑可包括於複數核苷酸上之實質修飾。此等修飾可包括於此揭露之所有型式 之修飾或為現有技術中已知之修飾。任何此等修飾，如用於siRNA型式之分子者，係基於本說明書及申請專利範圍之目的而被包含於“RNAi試劑”。
形成雙股螺旋結構之二股可為一個較大RNA分子之不同部分或其可為不同的RNA分子。當該兩股為一個較大分子之部分時，且因而其連接乃經由一段介於一股之3'末端及分別另一股之5'末端之不間斷核苷酸鏈以形成該雙股螺旋結構，該連接之RNA鏈係指“髮夾型結構”(“hairpin loop”)。當該二股係以除了一段介於一股之3'末端及分別另一股之5'末端之不間斷核苷酸鏈以形成該雙股螺旋結構以外的方式共價連接者，該連接結構係指“連接子”(“linker”)。該RNA股可具有相同或不同數量之核苷酸。鹼基對之最大數量係為雙股RNA之最短股之核苷酸數量減去任何存在於雙股螺旋中之突出(overhang)。除了該雙股螺旋結構，RNAi試劑可包含一或多個突出核苷酸(nucleotide overhangs)。
在一具體實施例中，本發明之RNAi試劑係具有24至30個核苷酸之雙股RNA，其與目標RNA序列(如Serpina1目標mRNA序列)相互作用，以指引該目標RNA之剪切。基於不期望受限於理論之前提，進入細胞中的長段雙股RNA會被第三型核酸內切酶(已知為切酶)打斷成siRNA(Sharp et al.(2001)Genes Dev.15：485)。切酶，一種第三型核糖核苷酸水解酶類酵素，將雙股RNA處理成具有二鹼基3'端突出特徵之19至23個鹼基對之siRNAs (Bernstein,et al.,(2001)Nature 409：363)。該等siRNAs接著被包含於核醣核酸誘導沉默複合體(RISC)，於此一或多個解旋酶會展開該siRNA之雙股螺旋，而使該互補之反義股能夠引導目標之辨識(Nykanen,et al.,(2001)Cell 107：309)。當結合至適合的目標mRNA時，RISC中的一或多個核酸內切酶剪切該目標以誘發沉默作用(silencing)(Elbashir,et al.,(2001)Genes Dev.15：188)。
於此使用之“突出核苷酸”係指未配對之核苷酸或突出該RNAi試劑之雙股螺旋結構之核苷酸(當其中一股之3'末端延伸超出另一股之5'末端時，反之亦然)。“鈍端”(“Blunt”或“blunt end”)意指雙股RNAi試劑之末端無未配對之核苷酸，即無突出核苷酸。“鈍端”RNAi試劑係為全長皆為雙股構造之雙股RNA，亦即在該分子之各端均無突出核苷酸。本發明之RNAi試劑包括一端有突出核苷酸之RNAi試劑(即具有一突出端及一鈍端之試劑)或二端皆有突出核苷酸之RNAi試劑。
術語“反義股”意指雙股RNAi試劑中包括實質上互補於目標序列之區域的那股(如人類之Serpina1 mRNA)。於此所用之術語“互補於部分之編碼Serpina1 mRNA之區域”意指於反義股上實質上互補於部分之Serpina1 mRNA序列之區域。當該互補區域不完全互補於該目標序列，該錯配位置於末端區域時最能被容忍，因此若存在該錯配位置，則通常出現在一個或多個末端區域或如於5'端及/或3'端之距末端8、7、6、5、4、3或2個核 苷酸範圍內之區域。
如下演示之運作實施例中，令人驚奇的發現了於此揭露之RNAi試劑中該反義股種子區域中之單一核苷酸錯配可為所有除C之外之鹼基容忍。該“種子區域”係RNAi試劑之反義股中負責辨識該目標mRNA之區域，且相當於，例如反義股5'末端之2至8個核苷酸。該種子區域接合(anneal)後，Argonaute接著使該結合之反義股之互補mRNA序列位於5'末端之10個核苷酸進行核分解降解，導致該目標mRNA之剪切。據此，於一具體實施例中，本發明RNAi試劑之反義股包含一於該反義股之種子區域中之核苷酸錯配，如位於反義股5'端之位置2至8之任一位置之錯配。
於此使用之術語“正義股”意指雙股RNA中包括實質上互補於該反義股區域的那股。
於此使用之術語“剪切區域”意指位在緊鄰於剪切位置之區域。該剪切位置為該目標上發生剪切之位置。某些具體實施例中，該剪切區域於剪切位置之任一端且緊鄰於剪切位置處包含三個鹼基。某些具體實施例中，該剪切區域於剪切位置之任一端且緊鄰於剪切位置處包含兩個鹼基。某些具體實施例中，該剪切位置具體出現在由反義股之核苷酸10及11所約束之位置，且其剪切區域包含核苷酸11、12及13。
於此使用之術語“互補”除非另有註明，當用以描述第一核苷酸序列與第二核苷酸序列之關係時，意指 包含該第一核苷酸序列之寡核苷酸或聚核苷酸，於特定條件下與包含該第二核苷酸序列之寡核苷酸或聚核苷酸雜合及形成雙股螺旋結構之能力，如熟悉本技術領域者所理解。此等條件可為，例如嚴格之條件，其中嚴格條件可包括：400mM氯化鈉、40mM PIPES(pH 6.4)、1mM EDTA、50℃或70℃，持續12至16小時後接著清洗。其他條件，如生理上相關之條件，如可能於有機體內發生者，能夠適用。例如，一段互補序列係足夠使該核酸之相關功能持續進行，如RNAi。熟悉本技術領域者將可按照該雜合核酸之最佳應用決定使兩序列互補測試之最恰當條件設定。
當該第一核苷酸序列之核苷酸與該第二核苷酸序列之核苷酸於該第一及第二核苷酸序列之整體長度上存在鹼基配對時，則該等序列可為相對於彼此「完全互補」。惟，本文中，若第一序列係係指為相對於第二序列「實質上互補」，則兩個序列可為完全互補，或他們可在雜交後形成一個或多個，但通常不超過4個、3個或2個誤配鹼基對，同時保留在與其最終應用最相關之條件下的雜交能力。惟，若兩個寡核苷酸被設計為在雜交後形成一個或多個單股懸垂，則測定互補性時，不應認為此等懸垂為誤配。舉例而言，包含長度為21個核苷酸之一寡核苷酸及長度為23個核苷酸之另一寡核苷酸的dsRNA，其中，該較長之寡核苷酸係包含與該較短之寡核苷酸完全互補之21個核苷酸的的序列，則對於本文所揭示之目的，該dsRNA仍可指為「完全互補」。
於此所使用之“互補”序列亦可包括或完全由非瓦生克立克(non-Watson-Crick)鹼基對及/或非天然及經修飾之核苷酸形成之鹼基對所形成，只要可滿足上述有關其雜合能力之要求即可。此等非瓦生克立克鹼基對包括但不限於鳥糞嘌呤-脲嘧啶搖擺(G：U Wobble)鹼基配對或胡思町(Hoogstein)鹼基配對。
術語“互補”、“完全互補”及“實質上互補”於此可用於有關雙股RNA之正義股與反義股間之鹼基配對或雙股RNA之反義股與目標序列間之鹼基配對，可由上下文意中得知其用意。
於此使用聚核苷酸“實質上互補於至少部分之”傳訊RNA(mRNA)，意指聚核苷酸實質上互補於該令人感興趣之mRNA(如含Serpina1編碼之mRNA)之一段相鄰部分，其包括5'端非轉譯區域(5'UTR)、開讀框(open reading frame,ORF)或3'端非轉譯區域。例如，若聚核苷酸序列實質上互補於含Serpina1編碼mRNA之不中斷部分，則該聚核苷酸互補於至少部分之Serpina1 mRNA。
於此使用術語“抑制”(“inhibiting”)可與“減少”、“沉默”、“向下調控”(“downregulating”)、”壓制”(“suppressing”)及其他近似術語替換，且包括任何程度之抑制。
於此使用之用語“抑制Serpina1之表現”包括抑制任何Serpina1基因之表現(如小鼠之Serpina1基因、大鼠之Serpina1基因、猴子之Serpina1基因或人類之 Serpina1基因)以及其變異體之表現(如自然發生之變異)或Serpina1突變基因之表現。因此，於上下文之基因操控細胞、細胞群或有機體中，該Serpina1基因可以是野生型Serpina1基因、變異Serpina1基因、突變Serpina1基因或基因轉殖之Serpina1基因。
“抑制Serpina1基因之表現”包括任何程度之Serpina1基因之抑制，如至少部分抑制Serpina1基因之表現，例如抑制至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%。
Serpina1基因之表現可根據任何有關於Serpina1基因表現之變數之量來評估，如Serpina1 mRNA含量、Serpina1蛋白質含量或血清AAT含量。抑制可利用一或多個該等變數與控制組之含量相比後之絕對或相對含量之減少來評估。控制組之含量可以為用於現有技術中任何形式之控制組之含量，如投藥前基線量(pre-dose baseline level)或檢測未經處理或以控制組處理(如僅含緩衝溶液之控制組或非活性試劑之控制組)之相近個體、細胞或樣本之含量。
於此使用之用語“以雙股RNAi試劑接觸細 胞”包括以任何可能手段接觸細胞。以雙股RNAi試劑接觸細胞包括於活體外以該RNAi試劑接觸細胞或於體內以RNAi試劑接觸細胞。該接觸可能以直接或間接方式完成。因此，例如，該RNAi試劑可能經由個別操作該方法以物理上接觸該細胞，或者選擇將該RNAi試劑置入將容許或導致其隨後接觸該細胞之環境中。
活體外接觸細胞可能經由如與該RNAi試劑一起培養該細胞之方式完成。體內接觸細胞則可能以其他方式完成，如經由將該RNAi試劑注射入該細胞所在或靠近該細胞之組織或注射該RNAi試劑至他處、血液中或皮下空間，如此該試劑將會隨後抵達該細胞所在之組織中。例如，該RNAi試劑可含有配體及/或與配體耦合(couple)，如N-乙醯基葡萄糖胺配體，其可引導該RNAi試劑至有興趣之部位，如肝臟。組合活體外及體內接觸方式也是可行的。連同本發明之方法，細胞亦可於活體外接觸該RNAi試劑且隨後移植至個體上。
於此所使用之“患者”或“個體”係意指人類或非人類之動物，較佳為哺乳類動物，如猴子，最佳為人類。
於此所使用之“Serpina1相關疾病”意指包括任何與Serpina1基因或蛋白相關之疾病、失常或健康問題。此疾病可能病因為，例如因Serpina1蛋白質錯誤折疊、細胞內Serpina1蛋白質(如錯誤折疊之Serpina1蛋白質)累積、Serpina1蛋白質生產過剩、因Serpina1基因變異、 Serpina1基因突變、因Serpina1蛋白質不正常剪切、因Serpina1與其他蛋白質或其他內生性或外生性物質之不正常交互作用。Serpina1相關疾病可能為肝臟疾病及/或肺臟疾病。
於此所使用之“肝臟疾病”包括影響肝臟及/或其功能之疾病、失常或症候(condition)。肝臟疾病可能是因Serpina1蛋白質累積於肝臟及/或肝臟細胞中所致。肝臟疾病的實例包括由病毒感染、寄生蟲感染、遺傳傾向性、自體免疫性疾病、暴露於輻射、暴露於肝毒性化合物、機械性損傷、多種環境毒素、酒精、乙醯氨酚(acetaminophen)、酒精及乙醯氨酚組合、吸入性麻醉劑、菸鹼酸、化學療劑、抗生素、止痛劑、止吐劑、卡瓦(kava)草藥補充素或其組合所導致之肝臟疾病。
例如，與Serpina1缺乏相關之肝臟疾病較常發生於具有一或多個複本特定對偶基因(如PIZ、PiM(Malton)及/或PIS對偶基因)之個體上。基於不期望受限於理論之前提，一般認為與有高風險發展成alpha-1抗胰蛋白酶肝臟疾病相關之對偶基因，其所編碼之Serpina1構型為錯誤折疊且無法正確地自肝臟細胞中分泌出來。對這些錯誤折疊蛋白質之細胞反應可包括未折疊蛋白質反應(unfolded protein response,UPR)、內質網相關降解(endoplasmic reticulum-associated degradation,ERAD)、細胞凋亡、內質網超載反應、自噬、粒線體壓力及肝細胞功能改變。肝細胞損傷可能導致之症狀例如，但不限於發炎、 膽汁鬱積(cholestasis)、纖維化、肝硬化、稽延性阻塞性黃疸(prolonged obstructive jaundice)、胺基轉移酶(transaminases)增加、肝門脈高壓(portal hypertension)及/或肝癌。基於不期望受限於理論之前提，此疾病之高度變異臨床病程顯示出其修飾性或“二次打擊”(“second hits”)，如發展症狀或嚴重程度之進展之促成因素。
例如，具有PIZ對偶基因之個體可能對C型肝炎(Hepatitis C)感染或酗酒較為敏感，且暴露於該等因子下，較可能發展成肝臟失常。此外，帶有PIZ對偶基因之患有囊腫纖維化(cystic fibrosis,CF)個體，有較高風險因肝門脈高壓而發展成嚴重的肝臟疾病。Serpina1缺乏亦可能導致或促使早發性肺氣腫、壞死性脂層炎(necrotizing panniculitis)、支氣管擴張症(bronchiectasis)及/或新生兒稽延性黃疸(prolonged neonatal jaundice)的發生。某些具有或有風險具有alpha-1-抗胰蛋白酶缺乏之患者，當其具有受alpha-1-抗胰蛋白酶缺乏影響之家族成員時，可藉此篩選而被辨識。
典型的肝臟疾病包括，但不限於肝臟發炎、慢性肝臟疾病、肝硬化、肝纖維化、肝癌、肝臟壞死、脂肪變性(steatosis)、膽汁鬱積及/或肝細胞功能減少及/或喪失。
“肝硬化”為與包括肝臟中廣泛的纖維化及再生性結節(regenerative nodules)之慢性肝臟傷害相關之病理學症狀。
“纖維化”係指肝臟中纖維母細胞(fibroblast)之增殖及瘢痕組織(scar tissue)之形成。
用語“肝臟功能”意指由肝臟執行之許多生理功能中之一或多種，該等功能包括但不限於，調節血糖含量、內分泌調節、酵素系統、轉換代謝產物(如酮體、固醇及類固醇及胺基酸)；製造血球之蛋白質(如血纖維蛋白原、血清白蛋白及膽鹼酯脢)；製造紅血球之功能(erythropoietic function)；去毒；合成膽汁及儲存維生素。現有技術中已知許多測試肝臟功能之檢驗，包含如測量丙胺酸轉胺酶(alanine amino transferase,ALT)、鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)、膽紅素(bilirubin)、凝血酶原(prothrombin)及白蛋白。
於此所用之“治療有效含量”係指包括對患者投藥該劑量之RNAi試劑以治療Serpina1相關疾病時，足以對治療該疾病產生影響(如現存之疾病或該疾病之一或多個症狀之遞減、改善或維持)。“治療有效含量”可能依據該RNAi試劑、投藥試劑之方式、疾病、疾病及其嚴重程度、及待治療之患者的病史、年齡、體重、家族病史、基因結構、由Serpina1表現影響之病理過程階段、先前及聯合治療之形式(若有的話)以及其他個體特徵而有所不同。
於此所用之“預防有效含量”(“Prophylactically effective amount”)係指包括對尚未經歷或顯現Serpina1相關疾病症狀之個體，但該個體可能易患 病，投藥該含量之RNAi試劑時，足以預防或改善該疾病或該疾病之一或多個症狀。改善該疾病包括減緩病程或減少該後發疾病之嚴重性。“預防有效含量”可能依據該RNAi試劑、投藥試劑之方式、疾病的危險程度、及待治療之患者的病史、年齡、體重、家族病史、基因結構、先前及聯合治療之形式(若有的話)以及其他個體特徵而有所不同。
“治療有效含量”或“預防有效含量”也包括在適用於任何治療之合理的險益比下，產生預期的局部或系統性效應之RNAi試劑之含量。使用於本發明之方法之RNAi試劑，可能投藥足夠含量以產生適用於此類治療之合理的險益比。
於此使用之術語“樣本”包括分離自個體之相近液體、細胞或組織之收集，以及存在於個體中之液體、細胞或組織。生物液體之實例包括血液、血清、漿膜液(serosal fluid)、血漿、尿液、淋巴液、腦脊髓液、眼液、唾液及其他類似物。組織樣本可能包括來自組織、器官或局部區域之樣本。例如，樣本可能取自特定器官、器官之部分或該等器官中之液體或細胞。在某些具體實施例中，樣本可自肝臟取出(整個肝臟或肝臟的某部分或肝臟中的某類型細胞，如肝細胞)。在較佳具體實施例中，“自個體取出之樣本”意指自該個體中抽出之血液或血漿。在更進一步之具體實施例中，“自個體取出之樣本”意指該自個體中取出之肝臟組織(或其次組成成分)。
II. 本發明之iRNAs
於此敘述係為改良之雙股RNAi試劑，其抑制細胞中之Serpina1基因表現(如個體(如哺乳類動物)中之細胞)，例如具有Serpina1相關疾病(如肝臟疾病(如慢性肝臟疾病、肝臟發炎、肝硬化、肝纖維化及/或肝細胞癌))之人類。
據此，本發明提供能夠於體內抑制目標基因(即Serpina1基因)之表現之經化學修飾之雙股RNAi試劑。
於本發明之某些面向，實質上本發明之iRNA所有核苷酸皆經過修飾。於本發明之其他具體實施例中，本發明之iRNA所有核苷酸皆經過修飾。本發明之iRNA其“實質上所有核苷酸皆經修飾”係指大多數但非全體皆經修飾，且可包括不超過5、4、3、2或1個未經修飾之核苷酸。
該RNAi試劑包含正義股及反義股。該RNAi試劑之各股可介於12至30個核苷酸長。例如，各股度介於14至30個核苷酸長、17至30個核苷酸長、19至30個核苷酸長、25至30個核苷酸長、27至30個核苷酸長、17至23個核苷酸長、17至21個核苷酸長、17至19個核苷酸長、19至25個核苷酸長、19至23個核苷酸長、19至21個核苷酸長、21至25個核苷酸長或21至23個核苷酸長。
該正義股及反義股通常形成雙股螺旋RNA(“dsRNA”)亦為於此所指之“RNAi試劑”。RNAi試劑之該雙股螺旋區域可能為12至30個核苷酸對長。例如， 該雙股螺旋區域可能介於14至30個核苷酸對長、17至30個核苷酸對長、27至30個核苷酸對長、17至23個核苷酸對長、17至21個核苷酸對長、17至19個核苷酸對長、19至25個核苷酸對長、19至23個核苷酸對長、19至21個核苷酸對長、21至25個核苷酸對長或21至23個核苷酸對長。於另一實例中，該雙股區域為選自由15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26及27個核苷酸長。
於一具體實施例中，該RNAi試劑可包含於其3'末端或5'末端或一或二股之兩端之一或多個突出區域及/或帽蓋基團(capping group)。該突出可為1至6個核苷酸長，例如，2至6個核苷酸長、1至5個核苷酸長、2至5個核苷酸長、1至4個核苷酸長、2至4個核苷酸長、1至3個核苷酸長、2至3個核苷酸長或1至2個核苷酸長。由於一股長於另一股，或相同長度之兩股錯位(stagger)，而導致突出。該突出可與該目標mRNA形成錯配或其可互補於該被靶向之基因序列或可以為其他序列。該第一及第二股亦可接合，如經由額外鹼基以形成髮夾型結構或經由其他非鹼基之連接子。
在一具體實施例中，該RNAi試劑之該突出區域之該核苷酸可以各自獨立為經修飾或未經修飾之核苷酸，包括但不限於2'-糖修飾，如2'-氟，2'-O-甲基胸苷(T)、2'-O甲氧基乙基-5-甲氧基尿苷(2'-O-methoxyethyl-5-methyluridine,Teo)、2'-O-甲氧基乙基腺苷(2'-O-methoxyethyladenosine,Aeo)、2'-O-甲氧基乙基-5-甲基胞 苷(2'-O-methoxyethyl-5-methylcytidine,m5Ceo)及任何其組合。例如，TT可為任一股之任一端之突出序列。該突出可與目標mRNA形成錯配或其可互補於被靶向之基因序列或可以為其他序列。
該RNAi試劑中正義股、反義股或二股之5'或3'端突出可被磷酸化。於某些具體實施例中，該(些)突出區域包含二個核苷酸，該二個核苷酸間具有硫代磷酸酯鍵結，其中該二個核苷酸可為相同或不同。在一具體實施例中，該突出存在於正義股、反義股或二股之3'端。在一具體實施例中，此3'突出存在於反義股。在一具體實施例中，此3'突出存在於正義股。
該RNAi試劑可包含僅單一個突出，其可強化該RNAi之干擾活性，而不影響其整體穩定性。例如，該單股突出可能位於正義股之3'端末端，或者選擇位於反義股之3'端末端。該RNAi亦可具有位於該反義股之5'末端(或該正義股之3'末端)之鈍端，反之亦然。通常，該RNAi之反義股具有一個位於其3'末端之突出核苷酸，且其5'末端為鈍端。基於不期望被理論束縛之前提，該位於反義股之5'末端之不對稱鈍端及反義股3'末端突出係有利於引導股載入RISC過程。
本發明中之任何特色核酸可利用現有技術中已建立之方法人造合成及/或修飾，如描述於“Current protocols in nucleic acid chemistry”,Beaucage,S.L.et al.(Edrs.),John Wiley & Sons,Inc.,New York,NY,USA，特 此納入本文以為參考。修飾包括，例如末端修飾，如5'末端修飾(磷酸化、接合、倒位連接)或3'末端修飾(接合、DNA核苷酸、倒位連接等)；鹼基修飾，如以穩定鹼基取代、以不穩定鹼基取代、或以與擴張組庫(expanded repertoire)之參與者(partners)鹼基配對之發展指令鹼基對之鹼基進行替換、移除鹼基(無鹼基核苷酸)或接合鹼基；糖修飾(如修飾於2'位置或4'位置)或將糖取代；及/或骨架修飾，包括磷酸二酯鍵結之修飾或取代。於此敘述之本發明中有用之iRNA化合物之具體實例，包括但不限於包含修飾骨架或非天然核苷酸間鍵結之RNA。具有修飾骨架之RNAs，尤其包括，其骨架不具有磷原子者。為本說明書之目的，並作為現有技術之參考，其核苷酸間骨架不具有磷原子之經修飾RNAs亦可被視為寡核苷酸。某些具體實施例中，經修飾之iRNA於其核苷酸間骨架中將具有磷原子。
經修飾之RNA骨架包括，例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯(phosphotriesters)、胺基烷基磷酸三酯(aminoalkylphosphotriesters)、甲基及其他烷基膦酸酯(包括3'-伸烷基膦酸酯及手性膦酸酯)、亞磷酸酯(phosphinates)、胺基磷酸酯(phosphoramidates)(包括3’-胺基胺基磷酸酯及胺基烷基胺基磷酸酯)、硫代胺基磷酸酯(thionophosphoramide)、硫代烷基膦酸酯(thionoalkylphosphonate)、硫代烷基磷酸三酯及含有正常3'至5'鍵結、其2'至5'鍵結類似物、以及該等具有反極性 (inverted polarity)之硼代磷酸酯(boranophosphate)，其中該相鄰核苷酸對單元為3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'連接。多種鹽類、混和鹽類及游離酸亦包括於其中。
教授上述含磷鍵結之製備之代表性美國專利，包括但不限於，美國專利號3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,195；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,316；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,625,050；6,028,188；6,124,445；6,160,109；6,169,170；6,172,209；6,239,265；6,277,603；6,326,199；6,346,614；6,444,423；6,531,590；6,534,639；6,608,035；6,683,167；6,858,715；6,867,294；6,878,805；7,015,315；7,041,816；7,273,933；7,321,029；及US Pat RE39464，該各自完整內容特此納入本文以為參考。
不含磷原子之經修飾RNA骨架，其具有由短鏈烷基或環烷基之核苷間鍵結、混合雜原子及烷基或環烷基之核苷間鍵結或一或多個短鏈雜原子或雜環之核苷酸鍵結組成之骨架。此包括該等具有N-嗎啉基鍵結(部分於核苷酸之該糖部分形成者)；矽氧烷骨架；硫化物、亞碸及碸骨架；甲醯基(formacetyl)及硫甲醯基(thioformacetyl)骨架；亞甲基甲醯基及硫甲醯基骨架；含伸烷基之骨架；胺基磺酸酯骨架；亞甲基亞胺基(methyleneimino)及亞甲基肼基(methylenehydrazino)骨架；磺酸酯及磺醯胺骨架；醯胺 骨架；及其他具有混合氮、氧、硫及CH2成分部分。
教授上述寡核苷之製備之代表性美國專利，包括但不限於美國專利號5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,64,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437及5,677,439，該各自完整內容特此納入本文以為參考。
於其他具體實施例中，適合之RNA擬似物可被考慮使用於iRNA中，其中該核苷酸單元中之糖及核苷間鍵結(即其骨架)被替換為新穎之基團。該鹼基單元仍維持可與適當之核酸目標化合物雜合。此寡聚物(已被證實其具有優異之雜合特性之RNA擬似物)，意指如肽核酸(PNA)。於肽核酸化合物中，RNA之該糖骨架被替換為含醯胺之骨架，尤其是胺基乙基甘胺酸骨架。該核酸鹼基仍維持且直接或間接鍵結於該骨架之醯胺部分之(aza)之氮原子上。教授上述肽核酸化合物之製備之代表性美國專利，包括但不限於，美國專利號5,539,082；5,714,331；及5,719,262，該各自完整內容特此納入本文以為參考。此外，適合使用於本發明之iRNA中之其他PNA化合物詳述於，如Nielsen et al.,Science,1991,254,1497-1500。
本發明之某些特色具體實施例，包括具有硫代磷酸酯骨架及具有雜原子骨架之RNAs，該骨幹尤其 是上述參考美國專利號5,489,677之--CH2--NH--CH2-、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[已知為亞甲基(甲基亞胺基)或MMI骨架]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--及--N(CH3)--CH2--CH2--[其中原生(亦有譯為天然之情形)之磷酸二酯骨架以--O--P--O--CH2--表示]；及上述參考之美國專利號5,602,240中之醯胺骨架。某些具體實施例中，其中特色RNA具有上述參考之美國專利號5,034,506中之N-嗎啉基骨架。
經修飾之RNAs亦可包含一或多個經取代之糖部分。於該特色iRNAs，(如dsRNAs)，可於其2'位置包括後述之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基、O-、S-或N-炔基、或O-烷基-O-烷基，其中該烷基、烯基及炔基可為經取代或不經取代之C1-C10烷基或C2-C10烯基及炔基。典型適合之修飾包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2).nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2及O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n及m係自1至約10。於其他具體實施例中，dsRNAs於其2'位置包括後述之一：C1-C10低碳烷基(lower alkyl)、經取代之低碳烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、雜環烷基、砸環烷芳基、胺基烷基胺基、多烷基胺基、經取代之矽基、RNA剪切基團、報導子(reporter)基團、崁入劑(intercalator)、增進iRNA藥物動力學特性之基團、或增進iRNA藥效動力學特性之基團及其他具有相近特性之取 代基。於某些具體實施例中，該修飾包括2'-甲氧基乙氧基(2'-methoxyethoxy)(2'-O--CH2CH2OCH3，亦已知為2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)(Martin et al.,Helv.Chim.Acta,1995,78：486-504)，即烷氧基-烷氧基(alkoxy-alkoxy)基團。另修飾實例為2'-二甲基胺基氧基乙氧基(2'-dimethylaminooxyethoxy)，即O(CH2)2ON(CH3)2基團，亦已知為2'-DMAOE，於此下實例所敘述，2'-二甲基胺基乙氧基乙氧基(2'-dimethylaminoethoxyethoxy)(於現有技術中亦已知為2'-O-二甲基胺基乙氧基乙基或2'-DMAEOE)，即2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2。
其他修飾包括2'-甲氧基(2'-OCH3)、2'-胺基丙氧基(2'-OCH2CH2CH2NH2)及2'-氟(2'-F)。亦可於iRNA中RNA之其他位置製作近似之修飾，尤其於其3'末端核苷酸或於2'-5'連結之dsRNAs之糖之3'位置，及5'末端核苷酸之5'位置。iRNAs亦可具有糖擬似物，如以環丁烷部分替換呋喃戊糖苷糖(pentofuranosyl sugar)。教授上述經修飾之糖結構之製備之代表性美國專利，包括但不限於，美國專利號4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；及5,700,920，其中某些為本發明所共同擁有，前述各自完整內容特此納入本文以為參考。
iRNA亦可包括核酸鹼基(於現有技術中通 常簡稱為“鹼基”)之修飾或取代。如於此所使用“未經修飾”或“天然”核酸鹼基包括嘌呤鹼基：腺嘌呤(A)及鳥糞嘌呤(G)，及嘧啶鹼基：胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。經修飾之核酸鹼基包括其他合成及天然核酸鹼基，如去氧胸腺嘧啶(dT)、5-甲基-胞嘧啶(5-me-C)、5-羥基甲基胞嘧啶(5-hydroxymethyl cytosine)、黃嘌呤(xanthine)、次黃嘌呤(hypoxanthine)、2-胺基腺嘌呤(2-aminoadenine)、腺嘌呤及鳥糞嘌呤之6-甲基及6-其他烷基衍生物、腺嘌呤及鳥糞嘌呤之2-丙基及2-其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶(2-thiouracil)、2-硫胸腺嘧啶及2-硫胞嘧啶、5-鹵素(5-halo)尿嘧啶及5-鹵素胞嘧啶、5-丙炔基(5-propynyl)尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶、6-氮尿嘧啶(6-azo-uracil)、6-氮胞嘧啶及6-氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(偽尿嘧啶，pseudouracil)、4-硫尿嘧啶、腺嘌呤及鳥糞嘌呤之經8-鹵素、8-胺基、8-硫醇基(thiol)、8-硫烷基、8-羥基及其他8-取代基取代者、尿嘧啶及胞嘧啶之經5-鹵素，尤其是5-溴、5-三氟甲基及其他5-取代機取代者、7-甲基鳥糞嘌呤及7-甲基腺嘌呤、8-氮鳥糞嘌呤及8-氮腺嘌呤、7-去氮鳥糞嘌呤(7-deazaguanine)及7-去氮腺嘌呤及3-去氮鳥糞嘌呤及3-去氮腺嘌呤。進一步核酸鹼基包含，該等已揭露於美國專利號3,687,808之核酸鹼基；該等已揭露於Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijn,P.ed.Wiley-VCH,2008之核酸鹼基；該等已揭露於The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,pages 858-859, Kroschwitz,J.L,ed.John Wiley & Sons,1990之核酸鹼基；該等已揭露於Englisch et al.,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613之核酸鹼基及該等已揭露於Sanghvi,YS.,Chapter 15,dsRNA Research and Applications,pages 289-302,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Ed.,CRC Press,1993之核酸鹼基。某些該等核酸鹼基係對提高本發明中特色寡聚合化合物之結合親和性尤其有效。其包括5-取代之嘧啶、6-氮嘧啶及N-2、N-6及O-6取代之嘌呤，包括2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶之取代已顯示於0.6至1.2℃下，可增加核酸雙股螺旋之穩定性(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Eds.,dsRNA Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278)且為典型之鹼基取代，更具體為當其與2'-O-甲氧基乙基之糖修飾結合組合時。
教授某些上述記載之經修飾核酸鹼基以及其他核酸鹼基之製備之代表性美國專利，包括但不限於，上述記載之美國專利號3,687,808；4,845,205；5,130,30；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121,5,596,091；5,614,617；5,681,941；5,750,692；6,015,886；6,147,200；6,166,197；6,222,025；6,235,887；6,380,368；6,528,640；6,639,062；6,617,438；7,045,610；7,427,672；及7,495,088，其各自完整內容特此 納入本文以為參考。
iRNA之該RNA亦可經修飾以包括一或多個鎖核苷酸(LNA)，鎖核苷酸係含有經修飾核糖部分之核苷酸，該核糖部分包含連接其2'及4'碳之額外的架橋。此結構有效地“閉鎖”該核糖於其3'內(3'-endo)結構構型。於siRNA添加鎖核苷酸已被證實可增加siRNA於血清中之穩定性且減少脫靶效應(off-target effects)(Elmen,J.et al.,(2005)Nucleic Acids Research 33(1)：439-447；Mook,OR.et al.,(2007)Mol Canc Ther 6(3)：833-843；Grunweller,A.et al.,(2003)Nucleic Acids Research 31(12)：3185-3193)。
教授鎖核苷酸核苷酸之製備之代表性美國專利，包括但不限於，如下：美國專利號6,268,490；6,670,461；6,794,499；6,998,484；7,053,207；7,084,125；及7,399,845，其各自完整內容特此納入本文以為參考。
該RNA分子末端之潛在穩定性修飾可包括N-(乙醯胺基己醯基)-4-羥基脯胺醇(N-(acetylaminocaproyl)-4-hydroxyprolinol,Hyp-C6-NHAc)、N-己醯-4-羥基脯胺醇(N-(caproyl-4-hydroxyprolinol,Hyp-C6)、N-乙醯基-4-羥基脯胺醇(N-acetyl-4-hydroxyprolinol,Hyp-NHAc)、胸苷-2'-O-去氧胸苷(醚)(thymidine-2'-0-deoxythymidine(ether))、N-(胺基己醯基)-4-羥基脯胺醇(N-(aminocaproyl)-4-hydroxyprolinol,Hyp-C6-胺基)、2-二十烷醯基-尿苷-3"-磷酸酯(2-docosanoyl-uridine-3"-phosphate)、倒位鹼基dT(idT)及其他。此修飾之揭露可於 國際專利申請案號PCT Publication No.WO 2011/005861找到。
A.經修飾之iRNA包含本發明之模體(motifs)本發明之某些方面，本發明之雙股RNAi試劑包括經化學修飾之試劑，揭露如提交於2011年11月18日之美國臨時專利申請案第61/561,710號，或提交於2012年11月16日之國際專利申請案PCT/US2012/065691，其各自完整內容特此納入本文以為參考。
如於此臨時專利申請案第61/561,710號中所顯示，引入一或多個在三個連續核苷酸上具有三個相同修飾之模體於RNAi試劑之正義股及/或反義股可能獲得較好的結果，尤其是位在剪切位置或接近剪切位置。於一些具體實施例中，該RNAi試劑之正義股及反義股可能為或不為完全經修飾。引入該等模體中斷該正義股及/或反義股之修飾模式，若存在。該RNAi試劑可選擇性地接合於N-乙醯葡萄糖胺衍生物配體，如於該正義股上。該因而產生之RNAi試劑呈現出較好之基因沉默活性。
更具體而言，令人驚奇的發現該雙股RNAi試劑之正義股及反義股為經修飾而具有一或多個在三個連續核苷酸上具有三個相同修飾之模體位於或接近該RNAi試劑中至少一股之剪切位置，則該RNAi試劑之基因沉默活性會大幅增加。
於一具體實施例中，該RNAi試劑係為19個核苷酸長之雙端鈍端(bluntmer)，其中該正義股包含至少 一個在三個連續核苷酸上具有三個2'-氟修飾之模體於5'端位置7、8、9。該反義股包含至少一個在三個連續核苷酸上具有三個2'-O-甲基修飾之模體於5'端位置11、12、13。
於另一具體實施例中，該RNAi試劑係為20個核苷酸長之雙端鈍端，其中該正義股包含至少一個在三個連續核苷酸上具有三個2'-氟修飾之模體於5'端位置8、9、10。該反義股包含至少一個在三個連續核苷酸上具有三個2'-O-甲基修飾之模體於5'端位置11、12、13。
又另一具體實施例中，該RNAi試劑係為21個核苷酸長之雙端鈍端，其中該正義股包含至少一個在三個連續核苷酸上具有三個2'-氟修飾之模體於5'端位置9、10、11。該反義股包含至少一個在三個連續核苷酸上具有三個2'-O-甲基修飾之模體於5'端位置11、12、13。
於一具體實施例中，該RNAi試劑包含一段21個核苷酸之正義股及一段23個核苷酸之反義股，其中該正義股包含至少一個在三個連續核苷酸上具有三個2'-氟修飾之模體於5'端位置9、10、11；該反義股包含至少一個在三個連續核苷酸上具有三個2'-O-甲基修飾之模體於5'端位置11、12、13，其中該RNAi試劑之一端為鈍端，而另一端包含2個核苷酸的突出(2 nucleotide overhang)。較佳情況，該2個核苷酸的突出位於該反義股之3'-端。當該2個核苷酸的突出位於該反義股之3'-端，其間可能有二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵結於該端之三個核苷酸間，其中 該三個核苷酸之二個核苷酸為突出，且第三個核苷酸為該突出核苷酸旁之配對核苷酸。在一具體實施例中，該RNAi試劑額外具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵結位於其正義股之5'端及其反義股之5'端之末端三個核苷酸間。於一具體實施例，該RNAi試劑之正義股及反義股之每一個核苷酸，包括該模體之部分中之核苷酸，皆為經修飾之核苷酸。於一具體實施例，各殘基係獨立有2'-O-甲基或3'-氟修飾，如於可輪替模體上。該RNAi試劑可選擇性地，進一步包含配體(較佳為N-乙醯葡萄糖胺)。
在一具體實施例中，該RNAi試劑包含正義股及反義股，其中該RNAi試劑包含第一股為至少25，至多29個核苷酸長且第二股為至多30個核苷酸長並有至少一個在三個連續核苷酸上具有三個2'-O-甲基修飾之模體於5'端位置11、12、13；其中第一股之3'端及第二股之5'端形成一鈍端且第二股於其3'端較該第一股長1至4個核苷酸，其中該雙股螺旋區域至少為25個核苷酸長，且該第二股可充分互補於目標mRNA，沿著該第二股之至少19個核苷酸以減少目標基因表現，當該RNAi試劑被施予入哺乳動物細胞時，且其中該RNAi試劑之剪切酶，較佳為導致siRNA其包含該第二股之3'末端，因此減低哺乳動物中該目標基因之表現。該RNAi試劑可選擇性地進一步包含配體。
在一具體實施例中，該RNAi試劑之正義股包含至少一個在三個連續核苷酸上具有三個相同修飾之模 體，該等模體之一出現位於該正義股之剪切位置。
在一具體實施例中，該RNAi試劑之反義股亦可包含至少一個在三個連續核苷酸上具有三個相同修飾之模體，該等模體之一出現位於或接近該反義股之剪切位置。
對具有雙股螺旋區域為17至23個核苷酸長之RNAi試劑，該反義股之剪切位置通常位於其5'末端之位置10、11及12。因此，該具有三個相同修飾之模體可出現在反義股之位置9、10、11；位置10、11、12；位置11、12、13；位置12、13、14；或位置13、14、15，該計數起始於反義股5'末端之第一個核苷酸，或該計數起始於反義股5'末端雙股螺旋區域中之第一個配對核苷酸。反義股之剪切位置亦可隨該RNAi自5'末端之雙股螺旋區域長度而改變。
該RNAi試劑之正義股可包含至少一個在三個連續核苷酸上具有三個相同修飾之模體於該正義股之剪切位置；且反義股可包含至少一個在三個連續核苷酸上具有三個相同修飾之模體位於或接近該股之剪切位置。當該正義股及反義股形成雙股RNA雙股螺旋時，該正義股及反義股可對齊，以致使正義股上一個三連續核苷酸之模體與反義股上一個三連續核苷酸之模體中，至少有一個核苷酸重疊，即該正義股上該模體之三個核苷酸中之至少一個核苷酸與反義股上該模體之三個核苷酸中之至少一個核苷酸形成一個鹼基對。或者，至少二個核苷酸可重疊，或所 有三個核苷酸可重疊。
在一具體實施例中，該RNAi試劑之正義股可包含多於一個在三個連續核苷酸上具有三個相同修飾之模體。第一個模體可出現位於或接近正義股之剪切位置，其他模體可為相伴修飾模體(wing modification)。術語“相伴修飾模體”於此意指模體出現於該股上其他位置而及位於或接近同股剪切位置之模體分離。該相伴修飾模體為鄰近第一個模體或被至少一或多個核苷酸分離。當該等模體為彼此緊鄰時，該等模體之化學性會彼此有所不同；而當該等模體由至少一或多個核苷酸分離時，其化學性可為相同或不同。可存在二或多個相伴修飾模體。例如，當二個相伴修飾模體存在時，該等相伴修飾模體各自可出現在相對於第一個模體其位於或接近剪切位置之一端或該領導模體(lead motif)之任一側。
如同該正義股，RNAi試劑中之反義股可包含多於一個在三個連續核苷酸上具有三個相同修飾之模體，並該等模體之至少一個出現位於或接近該股之剪切位置。此反義股亦可包含一或多個相伴修飾模體排成一列近似於正義股中可存在之相伴修飾模體。
在一具體實施例中，RNAi試劑中正義股或反義股之相伴修飾模體通常不包括該股之3'末端或5'末端或二端之前一或二端核苷酸。
在另一具體實施例中，RNAi試劑中正義股或反義股之相伴修飾模體通常不包括雙股螺旋構造中該股 之3'末端或5'末端或二端之前一或二個核苷酸對。
當RNAi試劑中正義股或反義股各包含至少一個相伴修飾模體時，該等相伴修飾模體可能落於雙股螺旋區域之同一端，並有一、二或三個核苷酸重疊。
當RNAi試劑之正義股或反義股各包含至少二個相伴修飾模體時，該正義股及反義股可對齊以致使各來自一股上之二個修飾模體落於雙股螺旋區域之一端，並具有一、二或三個核苷酸重疊；各來自一股上之二個修飾模體落於雙股螺旋區域之另一端，並有一、二或三個核苷酸重疊；各來自一股上之二個修飾模體落於該領導模體之兩側，並有一、二或三個核苷酸重疊於該雙股螺旋螺旋區域中。
於一具體實施例中，該RNAi試劑之正義股及反義股之每一個核苷酸，包括該等模體之部分之核苷酸，皆可經修飾。每個核苷酸可各由相同或不同修飾基修飾，包括一或二個非鍵結於磷酸酯上之氧的及/或一或多個對一或多個鍵結於磷酸酯上之氧的一或多個改變；核糖組成之改變，如核糖上2'羥基改變；磷酸部分大量被替換為“脫磷酸”(“dephospho”)連結；以天然存在之鹼基修飾或替換；及核糖磷酸(ribose-phosphate)骨架之替換或修飾。
如核酸作為次單元之聚合物，許多修飾會重複出現在核酸中的位置，如鹼基修飾、或磷酸酯部分，或磷酸酯部分中非鍵結氧。某些案例中，修飾會出現在核酸中的所有位置，但許多案例中則否。以實例而言，修飾 可能僅出現在3'端或5'端位置，可能僅出現在末端區域，如末端之核苷酸或一股的最後2、3、4、5或10個核苷酸位置。修飾可能出現在雙股區域、單股區域或皆出現。修飾可能僅出現在RNA之雙股區域或僅出現在RNA之單股區域。例如，於非鍵結氧位置之硫代磷酸酯修飾可能只出現在一端或二端皆有、可能只出現在末端區域，如末端之核苷酸或一股之最後2、3、4、5或10個核苷酸、或可能只出現在雙股及單股區域，尤其是末端。該或該等5'末端可被磷酸化。
可能因此而增進穩定性、於突出中包括特定鹼基、或包含經修飾核苷酸替代於單股突出中，如於5'或3'端突出或於二端。例如，可期望包含嘌呤核苷酸於突出中。在某些具體實施例中，3'或5'端突出之所有或部分鹼基可為經修飾，如此所述之修飾。修飾可包括，如使用現有技術中已知之修飾於核糖2'位置上之修飾，如使用2'-去氧-2'-氟(2'-F)或2'-O-甲基修飾之去氧核糖核苷酸替換核酸鹼基中核糖；以及磷酸酯基團之修飾，如硫代磷酸酯修飾。突出則無需與該目標序列同似。
在一具體實施例中，正義股及反義股之各殘基係獨立經鎖核苷酸、去水己糖醇核酸、環己烯基核酸、2'-甲氧乙基、2'-O-甲基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-去氧基、2'-羥基或2'-氟基修飾。該等股可包含多於一個修飾。在一具體實施例中，正義股及反義股之各殘基係獨立為2'-O-甲基或2'-氟基修飾。
正義股及反義股上通常存在至少兩個不同修飾。此二修飾可為2'-O-甲基或2'-氟基修飾或其他。
在一具體實施例中，Na及/或Nb包含可輪替模式(alternating pattern)之修飾。於此使用“可輪替模體”意指具有一或多個修飾之模體，各修飾出現於一股之可輪替核苷酸上。該可輪替核苷酸可指每間隔核苷酸的一個或每一個核苷酸的一個或每三個其他的核苷酸，或相近之模式。舉例而言，若A、B及C各自表示核苷酸上之一種修飾，該可輪替模體可為“ABABABABABAB…”、“AABBAABBAABB…”、“AABAABAABAAB…”、“AAABAAABAAAB…”、“AAABBBAAABBB…”或“ABCABCABCABC…”等。
此可輪替模體包含之修飾類型可為相同或不同。例如，若A、B、C、D各自表示核苷酸上一種修飾，該可輪替模式，即每間隔核苷酸上之修飾可為相同，但正義股及反義股各自可從該等可輪替模體，如“ABABAB…”、“ACACAC…”、“BDBDBD…”或“CDCDCD…”等多種修飾之可能性中選擇。
在一具體實施例中，本發明之RNAi試劑包含於正義股中可輪替模體之修飾模式，在相對於反義股中可輪替模體之修飾模式產生些許錯位。該錯位可為正義股之核苷酸修飾群對應至不同的反義股之核苷酸修飾群，反之亦然。例如，當該雙股RNA雙股螺旋中，正義股配對於反義股時，雙股螺旋中之正義股之可輪替模體可能自 該股5'端至3'端起始於“ABABAB”，且反義股之可輪替模體可能自該股5'端至3'端起始於“BABABA”。而另一實例中，雙股螺旋區中正義股之可輪替模體可能自該股5'端至3'端起始於“AABBAABB”，且且反義股之可輪替模體可能自該股5'端至3'端起始於“BBAABBAA”，故此即為正義股及反義股間之完全或部分錯位。
在一具體實施例中，該RNAi試劑包含正義股上起始之2'-O-甲基修飾及2'-氟基修飾可輪替模體模式具有些許錯位相對於反義股上起始之2'-O-甲基修飾及2'-氟基修飾可輪替模體模式，即正義股上之2'-O-甲基修飾核苷酸及反義股上之2'-氟基修飾核苷酸配成鹼基對，反之亦然。正義股上之位置1可起始於2'-氟基修飾，且反義股上之位置1可起始於2'-O-甲基修飾。
引入一或多個在三個連續核苷酸上有三個相同修飾之模體至該正義股及/或反義股中斷該正義股及/或反義股之起始修飾模式。此類因為引入一或多個在三個連續核苷酸上有三個相同修飾之模體至該正義股及/或反義股而導致正義股及/或反義股之修飾模式之中斷出奇地增強了針對目標基因的基因沉默活性。
在一具體實施例中，當在三個連續核苷酸上有三個相同修飾之模體被引入任一股時，該模體旁之核苷酸修飾為不同於該模體修飾之修飾。例如，包含該模體之該序列部分為“...NaYYYNb...”，其中“Y”表示該三個連續核苷酸上有三個相同修飾模體之修飾，而“Na”及“Nb”表 示“YYY”模體旁之核苷酸之修飾，其與Y之修飾不同，且其中Na及Nb可為相同或不同修飾。或者，當有相伴修飾存在時，Na及/或Nb可存在或可不存在。
該RNAi試劑可進一步包含至少一個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵結。該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵結修飾可能出現於正義股或反義股或兩股上任何位置之任意核苷酸。例如，該核苷酸間鍵結修飾可出現在正義股及/或反義股上每一個核苷酸；各核苷酸間鍵結修飾可出現在正義股及/或反義股上之可輪替模式；或正義股或反義股可以輪替模式包含兩種核苷酸間鍵結修飾上。正義股上核苷酸間鍵結修飾之可輪替模式及反義股上核苷酸間鍵結修飾之可輪替模式可為相同或不同，且正義股上核苷酸間鍵結修飾之可輪替模式，相對於反義股上核苷酸間鍵結修飾之可輪替模式可具有些許錯位。
在一具體實施例中，該RNAi包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵結於其突出區域。例如，該突出區域可包含二個核苷酸具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵結於該二個核苷酸間。核苷酸間鍵結修飾亦可作為該突出核苷酸與雙股螺旋區中末端配對核苷酸之鍵結。例如，至少2、3、4或所有突出核苷酸之連結可經由硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵結，且可選擇地，可有額外之硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鍵結將突出核苷酸連結至緊鄰於該突出核苷酸旁之配對核苷酸上。例如，可有至少二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵結於末端之三個核苷酸 間，該三核苷酸中之二個為突出核苷酸，且第三為緊鄰於突出核苷酸旁之配對核苷酸。此末端之三個核苷酸可位於反義股3'末端、正義股3'末端、反義股5'末端、及/或反義股5'末端。
在一具體實施例中，該2個核苷酸的突出位於反義股3'端且有二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵結位於末端三個核苷酸間，其中該三個核苷酸中之二個為突出核苷酸，且第三個核苷酸為緊鄰於突出核苷酸旁之配對核苷酸。可選擇地，該RNAi試劑可額外具有二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵結於正義股5'端及反義股5'端之末端三個核苷酸間。
在一具體實施例中，該RNAi試劑於其雙股螺旋中或於其組合中，包含與目標之錯配(mismatch(es))。“錯配”可為非典型(non-canonical)鹼基配對或其他不同於典型配對之鹼基配對。該錯配可出現於雙股螺旋區域或突出區域。該鹼基對可根據其促進解鏈(dissociating)或融解(melting)之傾向進行排名(如以特定配對之合鏈或解鏈之自由能為基礎，最簡單的途徑係針對個別配對鹼基測試該鹼基對，但亦可利用鄰近鹼基對或其他相似之分析)。以促進解鏈而言，A：U優於G：C；G：U優於G：C；且I：C優於G：C(I=肌苷，inosine)。錯配，如非典型或其他不同於典型配對之鹼基對(如於此他處所敘述)優於典型(A：T,A：U,G：C)配對；且配對包含通用鹼基者優於典型配對。“通用鹼基”係為顯現能力可取代該四種正常鹼基(G,C,A，及U)中任一鹼基而不會嚴重破壞鄰近鹼基對間之交互 作用之穩定性或擾亂該經修飾之寡核苷酸之預期功能性生化能力者。通用鹼基之非限制性實例包括2'-去氧肌苷(2'-deoxyinosine)(次黃嘌呤去氧核苷酸，hypoxanthine deoxynucleotide)或其衍生物、硝基咪唑類似物(nitroazole analogues)及疏水性芳香基非氫鍵鹼基(hydrophobic aromatic non-hydrogen-bonding bases)。
在一具體實施例中，該RNAi試劑包含自反義股5'末端之雙股螺旋區之前1、2、3、4或5鹼基中之對至少一對，其為獨立選自由：A：U、G：U、I：C及錯配鹼基對組成之群組，如非典型或不同於典型鹼基配對或包含通用鹼基之鹼基配對，以促進反義股於雙股螺旋5'末端之解鏈反應。
在一具體實施例中，自反義股5'端之雙股螺旋區中位置1之核苷酸係選自由A、dA、dU、U及dT組成之群組。或者自反義股5'端雙股螺旋區之前1、2或3鹼基對中至少一對為AU鹼基對。例如，自反義股5'端雙股螺旋區之第1對鹼基對係AU鹼基對。
在另一具體實施例中，正義股3'末端之核苷酸係去氧胸腺嘧啶(dT)。在另一具體實施例中，反義股3'末端之核苷酸係去氧胸腺嘧啶(dT)。在一具體實施例中，具有短段去氧胸腺嘧啶核苷酸序列，例如，二個去氧胸腺嘧啶核苷酸於正義股或反義股之3'末端。
在一具體實施例中，該正義股序列可以式(I)表示： 5'np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3' (I)
其中：i及j各自獨立為0或1；p及q各自獨立為0至6；各Na獨立表示包含0至25個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少二個不同經修飾核苷酸；各Nb獨立表示包含0至10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列；各np及nq獨立表示突出核苷酸；其中Nb及Y不具有相同修飾；以及XXX、YYY及ZZZ各自獨立表示一個在三個連續核苷酸上具有三個相同修飾之模體。較佳YYY係所有為2'-氟基修飾核苷酸。
在一具體實施例中，該Na及/或Nb包含可輪替模式之修飾。
在一具體實施例中，該YYY模體出現位於或接近正義股之剪接位置。例如，當該RNAi試劑具有17至23個核苷酸長之雙股螺旋區域時，該YYY模體可出現位於或接近該正義股之剪切位置(如：可出現在位置6、7、8，7、8、9，8、9、10，9、10、11，10、11、12或11、12、13)，該計數起始於5'末端之第1核苷酸；或可選擇地，該計數起始於雙股螺旋區中5'末端之第1對鹼基對。
在一具體實施例中，i為1及j為0，或i為0及j為1，或i及j皆為1。該正義股可因此由下式表示： 5'np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3' (Ib)；5np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq3' (Ic)；或5'np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3' (Id)。
當該正義股以式(Ib)表示時，Nb表示包含0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。各Na獨立可表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
當該正義股以式(Ic)表示時，Nb表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。各Na獨立可表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
當該正義股以式(Id)表示時，各Nb獨立表示包含0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。較佳，Nb為0、1、2、3、4、5或6。各Na可獨立表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸之寡核苷酸序列。
X、Y及Z各可為相同或彼此不同。
在另一具體實施例中，i為0且j為0，並該正義股可由下式表示：5'np-Na-YYY-Na-nq3' (Ia)。
當該正義股由(Ia)表示時，各Na可獨立表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
於一具體實施例中，該RNAi之反義股序列可以式(II)表示：5'nq'-Na'-(Z'Z'Z')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(X'X'X')l-Na'-np'3' (II)
其中：k及l係各自獨立為0或1；p'及q'係各自獨立為0至6；各Na'獨立表示包含0至25個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少二個經不同修飾之核苷酸；各Nb'獨立表示包含0至10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列；各np'及nq'獨立表示突出核苷酸；其中Nb'及Y'不具有相同修飾；以及X'X'X'、Y'Y'Y'及Z'Z'Z'各自獨立表示在三個連續核苷酸上有三個相同修飾之模體。
在一具體實施例中，該Na'及/或Nb'包含可輪替模式修飾。
該Y'Y'Y'模體出現在或接近反義股之剪切位置上。例如，當該RNAi試劑具有17至23個核苷酸長之雙股螺旋區域時，該Y'Y'Y'模體可出現在該反義股之位置9、10、11；10、11、12；11、12、13；12、13、14；或13、14、15，其計數起始於5'末端的第1個核苷酸；或可選擇地，其計數起始於雙股螺旋區中5'末端的第1成對核苷酸。較佳，該Y'Y'Y'模體出現在位置11、12、13。
在一具體實施例中，Y'Y'Y'模體係完全為2'-O-甲基修飾核苷酸。
在一具體實施例中，k為1且l為0，或k為0且l為1，或k及l皆為1。
該反義股可因此以下式表示：5'nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-np'3' (IIb)；5'nq'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-np'3' (IIc)；或5'nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-Na'-np'3' (IId)。
當該反義股以式(IIb)表示時，Nb'表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。各Na'獨立表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
當該反義股以式(IIc)表示時，Nb'表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。各Na'獨立表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
當該反義股以式(IId)表示時，各Nb'獨立表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。各Na'獨立表示2至20、2至15或2至10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。Nb較佳為0、1、2、3、4、5或6。
於另一具體實施例中，k為0且l為0並該反義股可以下式表示： 5'np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-nq'3' (Ia)。
當該反義股以式(IIa)表示時，各Na'獨立表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
各X'、Y'及Z'可為相同或彼此不同。
該正義股及反義股之各核苷酸可為獨立經鎖核苷酸、去水己糖醇核酸、環己烯基核酸、2'-甲氧基乙基、2'-O-甲基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-羥基或2'-氟基修飾。例如，該正義股及反義股之各核苷酸係獨立以2'-O-甲基或2'-氟修飾。尤其，各X、Y、Z、X'、Y'及Z'可表示2'-O-甲基修飾或2'-氟基修飾。
於一具體實施例中，該RNAi試劑之正義股可包含YYY模體出現在該股之9、10及11位置，當雙股螺旋區為21個核苷酸時，其計數起始於自5'末端之第1個核苷酸，或可選擇其計數起始於該雙股螺旋區中5'末端起之第1成對核苷酸；以及Y表示2'-氟基修飾。該正義股可額外包含XXX模體或ZZZ模體作為相伴修飾於該雙股螺旋區之相對(opposite)兩端；以及XXX及ZZZ各自獨立表示2'-O-甲基修飾或2'-氟基修飾。
於一具體實施例中，該反義股可包含Y'Y'Y'模體出現在該股之11、12及13位置，其計數起始於自5'末端之第1個核苷酸，或可選擇其計數起始於該雙股螺旋區中5'末端之第1成對核苷酸；以及Y'表示2'-O-甲基修飾。該反義股可額外包含X'X'X'模體或Z'Z'Z'模體作為相 伴修飾於該雙股螺旋區之相對(opposite)兩端；以及X'X'X'及Z'Z'Z'各自獨立表示2'-O-甲基修飾或2'-氟基修飾。
以上述式(Ia)、(Ib)、(Ic)及(Id)中任一式表示之正義股，與以上述式(IIa)、(IIb)、(IIc)及(IId)中任一式表示之反義股各自形成雙股螺旋。
因此，用於本發明之方法中之RNAi試劑可包含正義股及反義股，各股具有14至30個核苷酸，該RNAi雙股螺旋結構以式(III)表示：正義股：5'np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3'反義股：3'np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq'5' (III)
其中：i、j、k及l係各自獨立為0或1；p、p'、q及q'係各自獨立為0至6；各Na及Na'獨立表示包含0至25個經修飾核酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少兩個經不同修飾之核苷酸；各Nb及Nb'獨立表示包含0至10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列；其中，各np'、np、nq'及nq，可存在或可不存在，並獨立表示突出核苷酸；以及XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'及Z'Z'Z'各自獨立表示在三個連續核苷酸上有三個相同修飾之模體。
於一具體實施例中，i為0且j為0；或i為 1且j為0；或i為0且j為1；或i及j皆為0；或i及j皆為1。於另一具體實施例中，k為0且l為0；或k為1且l為0；k為0且l為1；或k及l皆為0；或k及l皆為1。
該正義股及反義股形成RNAi雙股螺旋之組合範例包括下方式子：5'np-Na-YYY-Na-nq3' 3'np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'nq'5' (IIIa)
5'np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3' 3'np'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na'nq'5' (IIIb)
5'np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq3' 3'np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-nq'5' (IIIc)
5'np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3' 3'np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na'-nq'5' (IIId)
當該RNAi試劑以式(IIIa)表示時，各Na獨立表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
當該RNAi試劑以式(IIIb)表示時，各Nb獨立表示包含1至10、1至7、1至5或1至4個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。各Na獨立表示包含2至20、2至 15或2至10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
當該RNAi試劑以式(IIIc)表示時，各Nb、Nb'獨立表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。各Na獨立表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
當該RNAi試劑以式(IIId)表示時，各Nb、Nb'獨立表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。各Na、Na'獨立表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。Na、Na'、Nb及Nb'各自獨立包含可輪替模式修飾。
於式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)中之各X、Y及Z可為相同或彼此不同。
當該RNAi試劑以式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示時，其至少一個Y核苷酸可與一個Y'核苷酸形成鹼基對。或者，其至少二個Y核苷酸可與對應Y'核苷酸形成鹼基對；或其所有三個Y核苷酸皆與對應Y'核苷酸形成鹼基對。
當該RNAi試劑以式(IIIb)或(IIId)表示時，其至少一個Z核苷酸可與一個Z'核苷酸形成鹼基對。或者，其至少二個Z核苷酸可與對應Z'核苷酸形成鹼基對；或其所有三個Z核苷酸皆與對應Z'核苷酸形成鹼基對。
當該RNAi試劑以式(IIIc)或(IIId)表示時， 其至少一個X核苷酸可與一個X'核苷酸形成鹼基對。或者，其至少二個X核苷酸可與對應X'核苷酸形成鹼基對；或其所有三個X核苷酸皆與對應X'核苷酸形成鹼基對。
於一具體實施例中，該Y核苷酸上之修飾不同於Y'核苷酸上之修飾，該Z核苷酸上之修飾不同於Z'核苷酸上之修飾，及/或該X核苷酸上之修飾不同於X'核苷酸上之修飾。
於一具體實施例中，當該RNAi試劑以式(IIId)表示時，該Na修飾係2'-O-甲基或2'-氟基修飾。於另一具體實施例中，當該RNAi試劑以式(IIId)表示時，該Na修飾係2'-O-甲基或2'-氟基修飾且np'>0且至少一個np'係經由硫代磷酸酯鍵結連結至鄰近核苷酸。又另一具體實施例中，當該RNAi試劑以式(IIId)表示時，該Na修飾係2'-O-甲基或2'-氟基修飾，np'>0且至少一個np'經由硫代磷酸酯鍵結連結之鄰近核苷酸，並且該正義股係接合至一或多個N-乙醯葡萄糖胺衍生物，透過二價或三價分支連接子附著。於另一具體實施例中，當該RNAi試劑以式(IIId)表示時，該Na修飾係2'-O-甲基或2'-氟基修飾，np'>0且至少一個np'經由硫代磷酸酯鍵結連結至鄰近核苷酸，該正義股包含至少一個硫代磷酸酯鍵結，且該正義股係接合至一或多個N-乙醯葡萄糖胺衍生物，透過二價或三價分支連接子附著。
於一具體實施例中，當該RNAi試劑以式(IIIa)表示時，該Na修飾係2'-O-甲基或2'-氟基修飾， np'>0且至少一個np'經由硫代磷酸酯鍵結連結至鄰近核苷酸，該正義股包含至少一個硫代磷酸酯鍵結，且該正義股係接合至一或多個N-乙醯葡萄糖胺衍生物，透過二價或三價分支連接子附著。
於一具體實施例中，該RNAi試劑係多聚體(multimer)包含至少二個以式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示之雙股螺旋結構，其中，該等雙股螺旋結構以連接子連結。該連接子可為可剪切或不可剪切。可選擇地，該多聚體進一步包含配體。該等雙股螺旋各自可靶向相同基因或二不同基因；或該等雙股螺旋各自可靶向相同基因之二個不同目標位置。
於一具體實施例中，該RNAi試劑係多聚體包含三、四、五、六或多個以式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示之雙股螺旋結構，其中該等雙股螺旋結構以連接子連結。該連接子可為可剪切或不可剪切。可選擇地，該多聚體進一步包含配體。該等雙股螺旋結構各自可靶向相同基因或二不同基因；或該等雙股螺旋各自可靶向相同基因之二個不同目標位置。
於一具體實施例中，二個以式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示之RNAi試劑係彼此連結於5'末端或一或二者之3'末端且可選擇與配體接合。該等試劑各自可靶向相同基因或二不同基因；或該等試劑各自可靶向相同基因之二個不同目標位置。
各類發表描述可使用於本發明之方法中之 多聚RNAi試劑。該等發表包括WO2007/091269、美國專利號7858769、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887及WO2011/031520，其各自完整內容特此納入本文以為參考。
包含一或多個醣類(carbonhydrate)部分接合至RNAi試劑之RNAi試劑可優化該RNAi試劑之一或多個特性。許多案例中，醣類部分將會附於該RNAi試劑之修飾次單元上。例如，雙股RNA試劑之一或多個核糖核苷酸次單元之核糖可被另些部分取代，如在非醣類(較佳為環狀(cyclic))載體上附著醣類配體。其次單元之核糖被取代之核糖核苷酸次單元於此意指核糖取代修飾次單元(ribose replacement modification subunit,RRMS)。環狀載體(carrier)可為碳環體系(carbocyclic ring system)，即環上所有原子為碳原子；或雜環體系(heterocyclic ring system)，即環上一或多個原子為雜原子，如氮、氧、硫。該環狀載體可為單環體系(monocyclic ring system)或可包含二或多個環，如稠環。該環狀載體可為完全飽和環體系，或其可包含一或多個雙鍵。
該配體可透過載體附著於聚核苷酸上。該載體包括(i)至少一個“骨架附接點”(“backbone attachment point”)，較佳為二個“骨架附接點”且(ii)至少一個“連繫附接點”(“tethering attachment point”,TAP)。於此所使用“骨架附接點”意指官能基，如羥基或通常為可用於並適合使該載體摻合入骨架中之鍵結，如核糖核苷酸中之磷酸根或經 修飾之磷酸根，如核糖核苷酸中之含硫骨架。“連繫附接點”於某些具體實施例中意指環狀載體中組成物環之原子，如碳原子或雜原子(不同於做為骨架附接點之原子)，連結至選定之部分。該部分可為如醣類、如單醣、雙醣、三醣、四醣、寡醣及聚醣。可選擇地，該選定之部分係利用介於中間之連繫連結至該環狀載體。因此，該環狀載體常包括官能基，如胺基(amino group)，或通常提供適合其他化學物摻合或連繫之鍵結，如組成成分之環上之配體。
該RNAi試劑可經由載體與配體接合，其中該載體可為環狀基團或非環狀基團；較佳，該環狀基團為選自吡咯啶基(pyrrolidinyl)、吡唑啉基(pyrazolinyl)、吡唑啶基(pyrazolidinyl)、咪唑啉基(imidazolinyl)、咪唑啶基(imidazolidinyl)、哌啶(piperidinyl)、哌基(piperazinyl)、1,3-二氧雜環戊基([1,3]dioxolane)、唑啶基(oxazolidinyl)、異唑啶基(isoxazolidinyl)、嗎啉基(morpholinyl)、噻唑啶基(thiazolidinyl)、異噻唑啶基(isothiazolidinyl)、喹啉基(quinoxalinyl)、吡酮基(pyridazinonyl)、四氫呋喃基(tetrahydrofuryl)及十氫萘(decalin)；較佳，該非環狀基團係選自絲胺醇(serinol)骨架或二乙醇胺(diethanolamine)骨架。
於某些特定具體實施例中，本發明中之方法所用之RNAi試劑係為選自由列於表1、2、5及7任一表中所列試劑所組成之群組。
該等試劑可進一步包含配體。
B. 配體
本發明中之雙股RNA試劑可選擇與一或多個配體接合。該配體可附著於正義股、反義股或二股之3'末端、5'末端或二端。例如，該配體可接合於正義股。於較佳具體實施例中，該配體接合至正義股之3'末端。於較佳具體實施例中，該配體為N-乙醯葡萄糖胺配體。於一特定較佳具體實施例中，該配體為GalNAc3：
於某些具體實施例中，該配體，如N-乙醯葡萄糖胺配體，係附著於該RNAi試劑之3'末端。於一具體實施例中，該RNAi試劑係接合至配體，如N-乙醯葡萄糖胺配體，如下簡圖所示
其中，X為氧或硫。於一具體實施例中，X為氧。
各式各樣的實體可與本發明之RNAi試劑連接。較佳部分為配體較佳為共價方式，直接連接或經由介於中間之連繫間接連接。
於一較佳具體實施例中，配體改變與其組合分子之分布情形、靶向或生命期。於較佳具體實施例中，配體提供較強化的親和力針對選定目標，如分子、細胞或細胞種類、隔間(compartment)、受器(receptor)，如，細胞或器官隔間、組織、器官或身體之部位，當例如及缺乏該種配體之種類比較時。配體提供較強化之親和力針對選定之目標亦稱作靶向配體(targeting ligands)。
某些配體可具有核內體溶解(endosomolytic)特性。該等核內體溶解配體促進核內體(endosome)之溶解及/或促進本發明中組成物或其組成分自細胞核內體至細胞質之運輸。該核內體溶解配體可為聚陰離子胜肽(polyanionic peptide)或仿胜肽(peptidomimetic)其顯現出pH相關之膜活性以及膜融合性(fusogenicity)。於一具體實施例中，假定該核內體溶解配體於核內體pH中為其激活構型。“激活”構型係為該構型下核內體溶解配體可促進核內體之溶解及/或促進本發明中組成物或其組成分自細胞核內體至細胞質之運輸。典型的核內體溶解配體包括GALA胜肽(Subbarao et al.,Biochemistry,1987,26：2964-2972)、EALA胜肽(Vogel et al.,J.Am.Chem.Soc.,1996,118：1581-1586)、及其衍生物(Turk et al.,Biochem.Biophys.Acta,2002,1559：56-68)。於一具體實施例中，該核內體 溶解組成物可包含化學基團(如胺基酸)其可忍受電荷之變化或可忍受因應pH變化時之質子化作用。該核內體溶解組成成分可為直鏈或分支。
配體可提升傳輸、雜合及專一性的特性且亦可改善合成的天然或經修飾之寡核甘酸或包含任何於此敘述之單體組合及/或天然或經修飾核苷酸之多聚分子之核酸酶抗性。
配體通常可包括具療效之改良劑，如以增加攝取；用以診斷之化合物或報導基團，如以監測分布；交聯劑(cross-linking agents)；及賦有抗核酸酶之基團。普遍的例子包括脂質、類固醇、維生素、醣類、蛋白質、胜肽、多胺類及胜肽擬似物。
配體可包括天然存在之物質，如蛋白質(如人類血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)或球蛋白)；醣類(如聚葡萄糖、聚三葡萄糖(pullulan)、幾丁質、幾丁聚醣、菊糖(inulin)、環糊精或玻尿酸)；或脂質。該配體亦可為重組或合成之分子，如合成聚合物，如合成之聚胺基酸、寡核苷酸(如適配體(aptamer))。聚胺基酸之例包括：聚離胺酸(polylysine,PLL)、聚L-天冬胺酸(poly L-aspartic acid)、聚L-麩胺酸(poly L-glutamic acid)、苯乙烯-馬來酸酐共聚物(styrene-maleic acid anhydride copolymer)、聚(L-乳交酯-共-乙交酯)共聚物(poly(L-lactide-co-glycolied)copolymer)、二乙烯醚馬來酸酐共聚物(divinyl ether-maleic anhydride copolymer)、N-(2-羥丙基)甲基丙烯醯胺共聚物(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide copolymer,HMPA)、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)、聚氨酯(polyurethane)、聚(乙基丙烯酸)(poly(2-ethylacryllic acid))、N-異丙基丙烯醯胺聚合物(N-isopropylacrylamide polymers)、或聚磷(polyphosphazine)。聚胺類之例包括：聚伸乙亞胺(polyethylenimine)、聚離胺酸、精胺(spermine)、亞精胺(spermidine)、多胺、假肽-多胺(pseudopeptide-polyamine)、仿胜肽多胺、樹狀體多胺(dendrimer polyamine)、精胺酸(arginine)、脒(amidine)、魚精蛋白(protamine)、陽離子性脂質、陽離子性卟啉(cationic porphyrin)、多胺之四級銨鹽或alpha螺旋胜肽。
配體可包括目標基團，如細胞或組織目標試劑，如凝集蛋白、醣蛋白、脂質或蛋白質，如與特定細胞類型(如腎細胞)結合之抗體。目標基團可為促甲狀腺素(thyrotropin)、促黑素(melanotropin)、凝集蛋白、醣蛋白、表面活性劑蛋白A(surfactant protein A)、黏蛋白醣類(Mucin carbohydrate)、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯半乳胺糖(N-acetyl-galactosamine)、N-乙醯葡萄糖胺多價甘露糖、多價果糖、醣化聚胺基酸(glycosylated polyaminoacids)、多價半乳糖、運鐵蛋白(transferrin)、雙膦酸鹽類(bisphosphonate)、聚麩胺酸鹽、聚天冬胺酸鹽、脂質、膽固醇、類固醇、膽酸(bile acid)、葉酸鹽、維生素 B12、生物素(biotin)、RGD胜肽、RGD仿胜肽或適配體(aptamer)。
配體之其他實例包括染劑、崁入劑(如吖啶類(acridines))、交聯劑(如補骨脂素(psoralene)、絲裂黴素C(mitomycin C))、卟啉(TPPC4、德克薩卟啉(texaphyrin)、撒卟啉(Sapphyrin))、多環芳香烴類(如啡(phenazine)、二氫啡)、人工合成之核酸核酸內切酶或螯合劑(如EDTA)、親脂性分子，如膽固醇、膽酸(cholic acid)、金剛烷乙酸(adamantane acetic acid)、1-芘丁酸(1-pyrene butyric acid)、二氫睪固酮(dihydrotestosterone)、1,3-雙-O(十六烷基)甘油(1,3-Bis-O(hexadecyl)glycerol)、香葉基氧基己基團(geranyloxyhexyl group)、十六烷基甘油(hexadecylglycerol)、冰片(borneol)、薄荷醇(menthol)、1,3-丙二醇、十七烷基團(heptadecyl group)、棕櫚酸、肉豆蔻酸(myristic acid)、O3-(油醯基)石膽酸(O3-(oleoyl)lithocholic acid)、O3-(油醯基)膽烯酸(O3-(oleoyl)cholenic acid)、二甲氧基三苯甲基(dimethoxytrityl)、或啡(phenoxazine)及胜肽耦合(如觸角足胜肽(antennapedia peptide)、Tat胜肽)、烷化劑、磷酸鹽、胺基、巰基(mercapto)、PEG(如PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚胺基、烷基、經取代之烷基、放射標定標誌物、酵素、半抗原(haptens)(如生物素)、運輸/吸收輔助劑(facilitators)(如阿斯匹林、維生素E、葉酸)、合成之核苷酸(如咪唑、二咪唑、組織胺、咪唑簇、吖啶-咪唑耦合物、 四氮雜大環銪三價錯合物(Eu3+ complexes of tetraazamacrocycles))、2,4-二硝基苯基、HRP或AP。
配體可為蛋白質，如醣蛋白；或胜肽，如對共配體(co-ligand)或抗體(如結合特定細胞種類如癌細胞、內皮細胞、骨細胞之抗體)具有專一親及力之分子。配體亦可包括激素及激素受體。其亦可包含非胜肽類，如脂質、凝集蛋白、醣類、維生素、輔因子(cofactors)、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯半乳胺糖、N-乙醯葡萄糖胺多價甘露糖、多價果糖、或適配體。該配體可為，例如，酯多醣、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAP kinase)之活化因子或NF-κB之活化因子。
該配體可為物質，如藥物，其可增加iRNA試劑被攝取進入細胞，例如，經由擾亂細胞之細胞骨架、經由擾亂細胞之微管、微絲及/或中間絲。該藥物可為，例如紫杉醇(taxon)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼、細胞弛緩素、諾考達唑(nocodazole)、japlakinolide、拉春庫林(latrunculin A)、鬼傘素(phalloidin)、swinholide A、indanocine、或肌基質蛋白(myoservin)。
該配體可經由如活化發炎反應，以增加寡核苷酸被攝取進入細胞。典型的配體具有此類影響如腫瘤壞死因子alpha(tumor necrosis factor alpha,TNFalpha)、介白素-1(interleukin-1)beta或干擾素gamma(gamma interferon)。
一方面，該配體係脂質或油基(lipid-based) 分子。此類脂質或油基分子較佳結合於血清蛋白質，如人類血清白蛋白。人類血清白蛋白結合配體可使此接合物分布至目標組織，如體內之非腎臟目標組織。例如，該目標組織可為肝臟，包括肝臟實質細胞。其他可結合於人類血清白蛋白之分子亦可作為配體。例如，可使用naproxen或阿斯匹林。脂質或油基配體可(a)增加該接合物降解之抗性；(b)增加靶向或運輸至目標細胞或細胞膜；及/或(c)可被用於調整及血清蛋白質(如人類血清白蛋白)之結合。
油基配體可用於調節，如控制接合物結合於目標組織。例如，結合於人類血清白蛋白越強之脂質或油基配體其越不易被腎臟作為目標，因此越不容易被清出體外。結合於人類血清白蛋白越不強之脂質或油基配體則可被用於靶向針對腎臟之接合物。
於一較佳具體實施例中，該油基配體結合於人類血清白蛋白。較佳，其利用足夠之親和力結合至人類血清白蛋白以至於該接合物可較佳地分布至非腎臟組織。然而，較佳狀況中該親和力不應過強以至於人類血清白蛋白-配體結合為不可逆。
於另一較佳具體實施例中，該油基配體弱結合於人類血清白蛋白或完全不結合，以至於該接合物將較佳地被分布至腎臟。其他靶向腎臟之部分亦可被用於取代或額外添加至該油基配體。
另一方面，該配體係部分，如維生素，其可被目標細胞(如增生細胞)攝取。此對治療特徵為多餘細胞 增生之病症，如惡性或非惡性類型，如癌細胞，尤具效用。典型維生素包括維生素A、E及K。其他典型維生素包括B維生素群，如葉酸、B12、核黃素、生物素、吡哆醛(pyridoxal)或其他可被癌細胞攝取之維生素或營養成分。亦包括HAS、低密度脂蛋白及高密度脂蛋白。
另一方面，該配體係細胞滲透試劑，較佳為螺旋型細胞滲透試劑。較佳，該試劑為兩性(amphipathic)。典型試劑係胜肽，如tat或antennopedia。若該試劑為胜肽，則其可經修飾，包括胜肽擬似物、反轉異構物(invertomers)、非胜肽或偽胜肽鍵結，及使用D-胺基酸。該螺旋型試劑係較佳為alpha-螺旋型試劑，其較佳具有親脂性及疏脂性相。
該試劑可為胜肽或胜肽擬似物。胜肽擬似物(於此亦指寡胜肽擬似物)係具有折疊為類似天然胜肽之三級結構能力之分子。該胜肽或胜肽擬似物部分可為約5至50胺基酸長，如約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50胺基酸長。胜肽或胜肽擬似物可為，例如細胞滲透胜肽、陽離子胜肽、兩性胜肽或疏水性胜肽(如主要包含酪胺酸(Tyr)、色胺酸(Trp)或苯丙胺酸(Phe))。該胜肽基團可為樹狀體胜肽、拘束性胜肽(constrained peptide)或交聯胜肽(crosslinked peptide)。另一選擇中，該胜肽部分可包括疏水膜移位序列(hydrophobic membrane translocation sequence,MTS)。典型包含疏水膜移位序列之胜肽係具有胺基酸序列AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO：29)之 RFGF。包含疏水膜移位序列之RFGF類似物(如胺基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO：30))亦可為目標部分。該胜肽部分可為“遞輸”(“delivery”)胜肽，其可攜帶大型極性分子，包括胜肽、寡核苷酸及蛋白質穿越細胞膜。例如，HIV Tat蛋白質中之序列(GRKKRRQRRRPPQ；SEQ ID NO：31)及果蠅觸角足蛋白(Drosophila Antennapedia protein)(RQIKIWFQNRRMKWKK；SEQ ID NO：32)已被發現具有作為遞輸胜肽功能之能力。胜肽或胜肽擬似物可被DNA之隨機序列編碼，如可被噬菌體表現基因庫或一珠一化合物”(one-bead-one-compound,OBOC)組合物庫辨識之胜肽(Lam et al.,Nature,354：82-84,1991)。較佳，該胜肽或胜肽擬似物經由單體單元聯繫至iRNA試劑者係為目標細胞胜肽，如精胺酸-甘胺酸-天門冬胺酸(arginine-glycine-aspartic acid,RGD)-胜肽，或RGD模擬物。胜肽部分長度範圍可自約5個胺基酸至約40個胺基酸。該胜肽部分可具有結構性修飾，以增加穩定性導向(divect)構型特性。任何敘述如下之結構性修飾皆可實際應用。RGD胜肽部分可用於靶向腫瘤細胞，如內皮細胞或乳房癌細胞(Zitzmann et al.,Cancer Res.,62：5139-43,2002)。RGD胜肽可促進iRNA試劑靶向各式各樣之其他組織之腫瘤，包括肺臟、脾臟或肝臟(Aoki et al.,Cancer Gene Therapy 8：783-787,2001)。較佳，該RGD胜肽將促進iRNA靶向腎臟。RGD胜肽可為直鏈狀或環狀，且可經修飾，如醣化或甲基化以促進靶向至特定組織。例如，醣化RGD胜肽可遞輸iRNA 試劑至腫瘤細胞表現αVß3(Haubner et al.,Jour.Nucl.Med.,42：326-336,2001)。可以使用靶向增生細胞中富含之標誌之胜肽。例如，RGD包含胜肽及胜肽擬似物可靶向癌細胞，尤其細胞顯現整聯蛋白(integrin)。因此，其可使用RGD胜肽、包含RGD之環狀胜肽、包括D-胺基酸之RGD胜肽、以及合成RGD模擬物。除RGD外，可使用目標整聯蛋白配體之其他部分。通常此類配體可用於控制增生細胞及血管新生(angiogenesis)。此類配體之較佳接合物靶向PECAM-1、VEGF或其他癌症基因，如於此敘述之癌症基因。
“細胞穿透胜肽”係能夠穿透細胞，如微生物細胞，如細菌或真菌細胞；或哺乳動物細胞，如人類細胞。微生物細胞穿透胜肽可為，例如α-螺旋型直鏈胜肽(如LL-37或CeropinP1)、包含二硫鍵結之胜肽(如α-防禦素、β-防禦素或抗菌肽(bactenecin))、或僅包含一或二個主要(dominate)胺基酸之胜肽(如PR-39或抗植物病毒肽(indolicidin))。細胞穿透胜肽亦可包括核定位訊號(nuclear localization signal,NLS)。例如，細胞穿透胜肽可為二部(bipartite)兩性胜肽，如MPG，其為衍生自HIV-1 gp41之融合胜肽區及SV40大T抗原(large T antigen)之核定位訊號(Simeoni et al.,Nucl.Acids Res.31：2717-2724,2003)。
在一具體實施例中，目標胜肽可為兩性α-螺旋型胜肽。典型兩性α-螺旋型胜肽包括，但不限於殺菌肽(cecropin)、溶毒肽(lycotoxin)、抗菌肽(paradaxin)、抗菌 肽(buforin)、CPF、類鈴蛙素胜肽(bombinin-like peptide,BLP)、殺菌肽(cathelicidin)、角毒素(ceratotoxin)、柄海鞘(S.clava)胜肽、盲鰻(hagfish)腸道抗菌胜肽(HFIAPs)、爪蟾抗菌肽(magainin)、中國林蛙抗菌肽(brevinins-2)、蛙皮抗菌肽(dermaseptin)、蜂毒肽(melittins)、抗菌肽(pleurocidin)、H2A胜肽、非洲爪蟾(Xenopus)胜肽、黑斑側褶蛙抗菌肽(esculentinis-1)、及蛙皮抗菌肽(caerin)。為了維持螺旋穩定之完整性，有許多因子應被適當考慮。例如，螺旋穩定性殘基可被使用之最大數量(如白胺酸(leu)、丙胺酸(ala)或離胺酸(lys))，以及螺旋去穩定性殘基可被使用之最小數量(如卟啉或環狀單體單元)。該帽蓋殘基可被考慮，例如甘胺酸係為典型N-帽蓋殘基及/或可使用C-端醯胺化以提供額外之氫鍵以穩定該螺旋。具有相反電荷之殘基間形成且由i±3或i±4位置分開之鹽橋，可提供穩定性。例如，陽離子殘基如離胺酸、精胺酸、高精胺酸(homo-arginine)、鳥氨酸(ornithine)或組胺酸可及陰離子殘基如穀胺酸或天門冬胺酸形成鹽橋。
胜肽及胜肽擬似物配體包括其具有天然存在或經修飾胜肽者，如D或L胜肽；α、β或γ胜肽；N-甲基胜肽；吖胜肽；具有一或多個醯胺之胜肽，即其鍵結被一或多個尿素、硫脲(thiourea)、氨基甲酸及/或磺醯尿素取代之胜肽；或環狀胜肽。
該目標配體可為任意能夠靶向特定受器之配體。實例如：葉酸酯、N-乙醯葡萄糖胺酶、半乳糖、甘 露糖、甘露糖-6P、糖簇，如N-乙醯葡萄糖胺酶簇、甘露糖簇、半乳糖簇或適配體。簇(cluster)係指二個或多個糖單元之組合物。該目標配體亦包括整聯蛋白受器配體、趨化介素(Chemokine)受器配體、運鐵蛋白、生物素、血清素受器配體、PSMA、內皮素(endothelin)、GCPII、體抑素(somatostatin)、低密度脂蛋白及高密度脂蛋白配體。該配體亦可以核酸為基礎，如適配體。該適配體可為未修飾或具有任何於此揭示之修飾之組合。
核內體釋放試劑(Endosomal release agents)包括咪唑、聚或寡咪唑、PEIs、胜肽、基因融合(fusogenic)胜肽、聚羧酸酯、聚陽離子(polyacations)、遮蔽寡或聚陽離子或陰離子(masked oligo or poly cations or anions)、縮醛、聚縮醛、縮酮/聚縮酮、原酸酯(orthoesters)、遮蔽或未遮蔽帶正電或帶負電聚合物、遮蔽或未遮蔽帶正電或帶負電樹狀體。
PK調節劑意指藥物動力學調節劑(pharmacokinetic modulator)。PK調節劑包括親脂物、膽汁酸、類固醇、磷脂質類似物、胜肽、蛋白質組合試劑、PEG、維生素等等。典型PK調節劑包括，但不限於膽固醇、脂肪酸、膽酸、石膽酸、二烷基甘油脂(dialkylglyceride)、二醯基甘油脂(diacylglyceride)、磷脂質、神經脂質(sphingolipids)、萘普生(naproxen)、伊布洛芬(ibuprofen)、維生素E、生物素等。包含數個硫代磷酸酯鍵結之寡核苷酸亦已知組合至血清蛋白，因此包含多個硫代磷酸酯鍵結 於其骨架之短段寡核苷酸，如約5個鹼基、10個鹼基、15個鹼基、或20個鹼基，亦可接受作為本發明中之配體(如，作為PK調節劑配體)。
此外，組合至血清組成分(如血清蛋白質)之適配體亦可接受作為本發明中之PK調節劑配體。
於本發明中可接受之其他接合物係敘述提交於2004年8月10日之美國臨時專利申請案USSN：10/916,185；提交於2004年9月21日之USSN：10/946,873；提交於2007年8月3日之USSN：10/833,934；提交於2005年4月27日之USSN：11/115,989及提交於2007年11月21日之USSN：11/944,227，其所有完整內容特於此納入參考用於所有目的。
當二或多個配體存在時，該等配體可所有具有相同特性、所有具有不同特性或某些配體具有相同特性而其他則具有不同特性。例如，配體可具有目標特性、具有核內體溶解特性或具有PK調節特性。在一較佳具體實施例中，所有配體具有不同特性。
配體可被接合至該寡核苷酸於多種不同位置，例如，3'末端、5'末端及/或於中間之位置。在較佳具體實施例中，該配體係經由介於中間之連繫，如於此敘述之載體，連結至該寡核苷酸。該配體或連繫子配體可能存在於一單體上，當該單體併入該擴增股時。某些具體實施例中，該配體可經由接合至“前驅”(“precursor”)單體，當該“前驅”單體已被併入該擴增股後。例如，單體具有，如胺基端 連繫子(即不具有附隨之配體)、如TAP-(CH2)nNH2可能被併入一段擴增之寡核苷酸。於隨後操作程序，即該前驅單體併入該股後，具有親電子基之配體，如五氟苯基酯(pentafluorophenyl ester)或醛基，可隨後利用以該前驅單體之連繫子之終端親核基接合至該配體之親電子基方式附接該前驅單體。
另一實例中，具有適合參與克里克化學反應(Click Chemistry)反應之化學基團之單體可以併入，如疊氮化物(azide)或炔基終端連繫子/連接子。於隨後操作程序，即該前驅單體併入該股後，具有互補化學基團之配體可經由一起接合該炔基及疊氮化物之方式，附接於該前驅單元。
對雙股寡核苷酸而言，配體可附著於一或二股。某些具體實施例中，雙股iRNA試劑包含配體接合至該正義股上。某些具體實施例中，雙股iRNA試劑包含配體接合至該反義股上。
另實例中，具有適合參與連結化學反應之化學基團之單體可被併入如疊氮化物(azide)或炔基終端連繫子/連接子。於隨後操作程序，即該前驅單體併入該股後，具有互補化學基團如疊氮化物或炔基之配體可經由一起耦合該炔基及疊氮化物之方式，附接於該前驅單元。
對雙股寡核苷酸而言，配體可附著於一或二股。某些具體實施例中，雙股iRNA試劑包含配體接合至該正義股上。其他具體實施例中，雙股iRNA試劑包含 配體接合至該反義股上。
某些具體實施例中，配體可接合至核酸鹼基、糖部分或核酸分子間之核苷酸間鍵結。接合至嘌呤核酸鹼基或其衍生物可出現在其任何位置，包括環內或環外之原子。某些具體實施例中，嘌呤核酸鹼基之2-、6-、7-或8-位置係附著至接合部分。接合至嘧啶核酸鹼基或其衍生物可出現在其任何位置。某些具體實施例中，嘧啶核酸鹼基之2-、5-及6-位置可被接合部分取代。接合至核苷酸之糖部分可出現在其任何碳原子上。可被附著至接合部分之糖部分之碳原子實例包括2'、3'及5'碳原子。該1'位置亦可被接合部分附著，例如於無鹼基殘基中。核苷酸間鍵結亦可帶有接合部分。對包含磷之鍵結(如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦醯胺基等)，該接合部分可被直接附著至該磷原子或至接於磷原子上之氧、氮或硫原子。對包含胺基或醯胺基之核苷酸間鍵結(如PNA)，該接合部分可被附著至該胺基或醯胺基之氮原子或至鄰近之碳原子。
於RNA干擾領域中任何適合之配體皆可被使用，雖然該配體通常為醣類，如單醣(如N-乙醯葡萄糖胺)、雙醣、三醣、四醣、多醣。
接合該配體至核酸之連接子包括該等於上述討論者。例如，該配體可為一或多個N-乙醯葡萄糖胺衍生物透過二價或三價分支連接子附著。
於一具體實施例中，本發明中之雙股RNA 係接合至二價或三價之分支連接子包括如式(IV)至(VII)中任一式所示之結構： 其中：q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B及q5C獨立表示各自出現0至20次且其中該重複單元可為相同或不同；每次出現時，P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C係各自獨立，為不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；每次出現時，Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C係獨立為不存在、亞烷基、經取代之亞烷基，其中一或多個亞甲基可被一或多個O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R')=C(R")、C≡C或C(O)插入或終止；R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C係各自獨立每次出現時，為不存在、NH、O、S、CH2、C(O)O、 C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH=N-O、 或雜環基；L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B及L5C表示配體；即次出現時各自獨立為單醣(如N-乙醯葡萄糖胺)、雙醣、三醣、四醣、寡醣或多醣；以及Ra係為氫或胺基酸支鏈。
針對使用RNAi試劑抑制目標基因表現，三價接合N-乙醯葡萄糖胺衍生物係尤其有效，例如，其於式(VII)： 其中L5A、L5B及L5C表示單醣，如N-乙醯葡萄糖胺衍生物。
接合至N-乙醯葡萄糖胺衍生物之適合之二價或三價分支接合子基實例包括，但不限於以下化合物：
相似之美國專利教授RNA接合物之製備方式包括，但不限於美國專利號4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717,5,580,731；5,591,584；5,109,124； 5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928及5,688,941；6,294,664；6,320,017；6,576,752；6,783,931；6,900,297；7,037,646；8,106,022，該各自完整內容特此納入本文以為參考。
指定化合物中所有位置並非必須一律經修飾，且事實上多於一個前述之修飾可併入單一化合物中或iRNA之單一核苷酸中。本發明亦包括iRNA化合物為崁合化合物。
本發明文中之“崁合”(“Chimeric”)iRNA化合物或“嵌合體”(“chimeras”)係iRNA化合物，較佳為雙股RNA，其包含二或多個化學性質不同之區域，其各由至少一個單體單元，以雙股RNA而言，即一個核苷酸，所組成。該等iRNA通常包含至少一區域其中該RNA係經修飾以授 予該iRNA增加之核酸酶降解抗性、增加之細胞攝取及/或增加之對目標核酸組合親及力。該iRNA之額外區域可做為能夠剪切RNA：DNA或RNA：RNA雜合酵素之受質。以實例說明之，RNaseH係一種細胞核酸內切酶，其剪切RNA：DNA雙股螺旋之RNA股。RNaseH之活化，因此導致該RNA目標之剪切，其大幅增加iRNA抑制基因表現之效率。所以，當使用崁合雙股RNA時其較短之iRNA，相比於硫代磷酸酯去氧雙股RNA，兩者雜合至相同之目標區域，可經常取得相似之結果。該RNA試劑之剪切可以凝膠電泳進行常態偵測且，如有需求，可搭配現有技術中已知之核酸雜合技術。
於某些實例中，iRNA中之RNA可經非配體基團修飾。許多非配體分子已接合至iRNA，為了增強其活性、iRNA於細胞中分布或於細胞中攝取，而此類接合物操作流程之執行可於科學文獻中知悉。此類非配體部分包括脂質部分，如膽固醇(Kubo,T.et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.,2007,365(1)：54-61；Letsinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86：6553)、膽酸(Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1994,4：1053)、硫醚，如己基-硫-三苯基甲硫醇(hexyl-S-tritylthiol)(Manoharan et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660：306；Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3：2765)、硫基膽固醇(thiocholesterol)(Oberhauser et al.,Nucl.Acids Res.,1992,20：533)、脂肪族鏈，如十二烷二醇(dodecandiol)或十一 烷基殘基(Saison-Behmoaras et al.,EMBO J.,1991,10：111；Kabanov et al.,FEBS Lett.,1990,259：327；Svinarchuk et al.,Biochimie,1993,75：49)、磷脂質，如i-氧-十六烷基-rac-甘油(i-hexadecyl-rac-glycerol)或三乙基銨1,2-二-氧-十六烷基-rac-甘油-3-氫-膦酸酯(triethylammonium 1,2-di-O-hexadecyl-rac-glycero-3-H-phosphonate)(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36：3651；Shea et al.,Nucl.Acids Res.,1990,18：3777)、多胺或聚乙二醇鏈(Manoharan et al.,Nucleosides & Nucleotides,1995,14：969)或金剛烷乙酸(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36：3651)、棕櫚基團(Mishra et al.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264：229)，或十八烷基胺或己基胺-羰基-氧基膽固醇基團(hexylamino-carbonyl-oxycholesterol moiety)(Crooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277：923)。相似之美國專利教授此類RNA接合之製備已列於上述。典型接合步驟涉及了帶有胺基連接子於其序列上一或多個位置之RNA合成。利用適當之耦合或活化試劑，該胺基團係接續與被接合之分子反應。接合反應可被執行無論該RNA仍接於固體支持物上或該RNA剪切後於溶液相中。以HPLC純化該RNA接合物，通常能提供純化之接合物。
某些具體實施例中，本發明之方法中使用之雙股RNAi試劑係選自由AD-58681、AD-59054、AD-61719及AD-61444組成之群組。
III. 本發明iRNA之遞輸
遞輸本發明iRNA試劑至細胞，如個體中之細胞，可利用許多不同方式達成，其中個體，如人類個體(如其有需求之個體，如具有Serpina1缺乏相關疾病(如Serpina1缺乏肝臟疾病)之個體)。例如，可利用本發明中之iRNA無論於活體外或體內接觸細胞方式執行遞輸。體內遞輸亦可利用投藥包含iRNA之組成物，如雙股RNA，於個體中直接執行。或者，體內遞輸可利用投藥一或多個編碼且導向該iRNA表現之載體(vector)間接執行。這些選擇方式係進一步詳述於下。
一般而言，任何遞輸核酸分子(活體外或體內)之方法可被修改適用於本發明之iRNA。(參照如Akhtar S.and Julian RL.(1992)Trends Cell.Biol.2(5)：139-144及WO94/02595，其完整內容特此納入作為參考)。對體內遞輸而言，為了遞輸iRNA分子應考慮的因子包括，例如，該遞輸分子的生物穩定性、防止非專一性影響及該遞輸分子於目標組織之累積。iRNA之非專一性影響可利用局部投藥方式而降到最小，例如直接注射或植入於組織中或局部投藥製劑。局部投藥至治療位置使該試劑之局部濃度達到最大，限制了該試劑之暴露至系統型組織而可能反而使其被試劑傷害或使試劑被降解，因而允許投藥較低總劑量之該iRNA分子。許多研究已顯示成功減弱(knockdown)基因產物，當局部投藥iRNA時。例如，於老年性黃斑部病變(age-related macular degeneration)試驗模式中，對馬來猴 (cynomolgus monkeys)以眼球玻璃體內注射(Tolentino,MJ.,et al(2004)Retina 24：132-138)及對小鼠以視網膜下注射(Reich,SJ.,et al(2003)Mol.Vis.9：210-216)方式利用眼內遞輸VEGF雙股RNA皆顯示可防止新生血管。此外，對小鼠以直接腫瘤內注射雙股RNA，減小腫瘤體積(Pille,J.,et al(2005)Mol.Ther.11：267-274)且可延長攜帶腫瘤小鼠之存活(Kim,WJ.,et al(2006)Mol.Ther.14：343-350；Li,S.,et al(2007)Mol.Ther.15：515-523)。RNA干擾亦顯示有良好表現，當利用直接注射方式局部遞輸至CNS時(Dorn,G.,et al.(2004)Nucleic Acids 32：e49；Tan,PH.,et al(2005)Gene Ther.12：59-66；Makimura,H.,et al(2002)BMC Neurosci.3：18；Shishkina,GT.,et al(2004)Neuroscience 129：521-528；Thakker,ER.,et al(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：17270-17275；Akaneya,Y.,et al(2005)J.Neurophysiol.93：594-602)以及利用鼻內投藥(intranasal administration)至肺臟時(Howard,KA.,et al(2006)Mol.Ther.14：476-484；Zhang,X.,et al(2004)J.Biol.Chem.279：10677-10684；Bitko,V.,et al(2005)Nat.Med.11：50-55)。對系統性投藥iRNA以治療疾病而言，該RNA可經修飾或選擇以藥物遞輸系統進行遞輸；該等方法皆對防止該雙股RNA被核酸內切酶或外切酶於體內快速降解起作用。該RNA或該醫藥載體之修飾亦能允許該iRNA組成物靶向該目標組織並且避免不欲之脫靶效應。iRNA分子能以化學接合至親脂性基團(如膽固醇)修飾以 增強細胞攝取且防止降解。例如，直接針對ApoB之iRNA接合至親脂性膽固醇部分被系統性注射至小鼠中，結果導致肝臟及空腸之apoB mRNA減弱(Soutschek,J.,et al(2004)Nature 432：173-178)。iRNA接合至適配體已於前列腺癌小鼠模式中顯示抑制腫瘤生長且調節腫瘤衰退(McNamara,JO.,et al(2006)Nat.Biotechnol.24：1005-1015)。於一替代具體實施例中，該iRNA可利用藥物遞輸系統，如奈米粒子、樹狀體、聚合物、脂質體或陽離子遞輸系統，進行遞輸。帶正電之陽離子遞輸系統促進iRNA分子(帶負電)組合且亦增強帶負電細胞膜之交互作用以允許細胞有效率之攝取iRNA。陽離子脂質、樹狀體或聚合物可接至iRNA或形成囊或微胞(參照如Kim SH.,et al(2008)Journal of Controlled Release 129(2)：107-116)以包覆住iRNA。囊或微胞製劑可進一步於系統性投藥時，防止該iRNA被降解。製作及投藥陽離子-iRNA錯合物之方法係為熟悉本技術領域能力者知悉(參照如Sorensen,DR.,et al(2003)J.Mol.Biol 327：761-766；Verma,UN.,et al(2003)Clin.Cancer Res.9：1291-1300；Arnold,AS et al(2007)J.Hypertens.25：197-205，其完整內容特此納入作為參考)。一些可用於iRNA遞輸之藥物遞輸系統之非限制實例包括DOTAP(Sorensen,DR.,et al(2003),supra；Verma,UN.,et al(2003),supra)、Oligofectamine，“固體核酸脂質粒子”(“solid nucleic acid lipid particles”)(Zimmermann,TS.,et al(2006)Nature 441：111-114)、心磷脂(Chien,PY., et al(2005)Cancer Gene Ther.12：321-328；Pal,A.,et al(2005)Int J.Oncol.26：1087-1091)、聚乙烯亞胺(Bonnet ME.,et al(2008)Pharm.Res.Aug 16 Epub ahead of print；Aigner,A.(2006)J.Biomed.Biotechnol.71659)、精胺酸-甘胺酸-天門冬胺酸(Arg-Gly-Asp,RGD)胜肽(Liu,S.(2006)Mol.Pharm.3：472-487)及聚醯亞胺基胺類(Tomalia,DA.,et al(2007)Biochem.Soc.Trans.35：61-67；Yoo,H.,et al(1999)Pharm.Res.16：1799-1804)。於某些具體實施例中，iRNA與環糊精形成錯合物以系統性投藥。iRNA及環糊精之投藥方法及醫藥組成物可見於美國專利號7,427,605，其完整內容特此納入作為參考。
A. 編碼本發明iRNAs之載體
目標Serpina1基因之iRNA可表現自插入DNA或RNA載體之轉錄單元(參照如Couture,A,et al.,TIG.(1996),12：5-10；Skillern,A.,et al.,International PCT Publication No.WO 00/22113,Conrad,International PCT Publication No.WO 00/22114及Conrad,U.S.Pat.No.6,054,299)。表現可為暫時的(大約數小時至數週)或持續的(數週至數個月或更長時間)，取決於該使用之特異性建構及該目標組織或細胞種類。該等轉殖基因(transgenes)可被引入作為直鏈建構、環狀質體(plasmid)或病毒載體，其可為崁入或非崁入載體。該轉殖基因亦可被建構以允許其被作為染色體外質體遺傳(Gassmann,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92：1292)。
iRNA之個別股或二股可被轉錄自表現載體上之啟動子。當分離之兩股係被表現而產生時，例如雙股RNA，二分離之表現載體可被共引入(co-introduced)(如利用轉染或注射)進入目標細胞。或者雙股RNA之各自獨立股可被轉錄自啟動子，其皆位於該相同表現質體上。於一具體實施例中，雙股RNA係被表現為反向重複寡核苷酸以連接子寡核苷酸序列連接，此雙股RNA具有莖-環結構(stem and loop structure)。
iRNA表現載體通常為DNA質體或病毒載體。表現載體，其可與真核細胞共存者，較佳為其可與脊椎動物細胞共存者，能被用於生成為了表現於此該iRNA之重組建構。真核細胞表現載體已被知悉於現有技術中，並可由許多商業來源取得。通常，提供此類載體包含方便的限制酶辨認位置以使期望之核酸片段插入。iRNA表現載體之遞輸可為系統性，如透過靜脈或肌內投藥、透過投藥至自病患移出之目標細胞，接著再引入病人體內或經由任何其他能夠引入至預期目標細胞之方式。
iRNA表現質體可被轉染進入目標細胞，搭配陽離子脂質載體(如Oligofectamine)或非陽離子脂質載體(如Transit-TKOTM)作為錯合物。本發明中亦嚴密考慮在為期一週或更長時間中，針對iRNA-調節減弱目標RNA之不同位置之多種脂質轉染。載體成功引入宿主細胞可以多種已知方法監測，例如，暫時轉染可利用報導子(如螢光標誌、如綠色螢光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP))標幟。 離體細胞穩定轉染可利用標誌其提供該轉染細胞特定環境因子(如抗生素及藥物)抗性，如潮黴素抗性，以做確認。
其可利用於於此該該方法及組成物之病毒載體系統包括，但不限於(a)腺病毒(adenovirus)載體；(b)反轉錄病毒(retrovirus)載體，包括但不限於慢病毒(lentiviral)載體、莫洛尼氏白血病病毒(moloney murine leukemia virus)等；(c)腺相關病毒(adeno-associated virus)載體；(d)疱疹單純型病毒(herpes simplex virus)載體；(e)SV 40載體；(f)多瘤病毒(polyoma virus)載體；(g)乳突病毒(papilloma virus)載體；(h)微小核醣核酸病毒(picornavirus)載體；(i)痘病毒(pox virus)載體，如正痘(orthopox)、如痘瘡病毒(vaccinia virus)載體或鳥類痘病毒(avipox)，如金絲雀痘(canary pox)或雞痘(fowl pox)；以及(j)輔助病毒依賴型或裸腺病毒(helper-dependent or gutless adenovirus)。複製缺陷型病毒(Replication-defective viruses)亦有助益。不同之載體會或不會融合進入細胞之基因體中。該建構結構若需要可包括用來轉染之病毒序列。或者，該建構結構可融入載體中而具有附加型複製(episomal replication)之能力，如EPV及EBV載體。建構iRNA之重組表現一般需要調控元素，如啟動子、增強子等等以確保該iRNA在目標細胞中之表現。其他載體或建構結構應考慮之方面進一步詳述如下。
對iRNA遞輸有效之載體會包括調控元素(啟動子、增強子等)足以使該iRNA於預期之細胞或組織 中表現。該調控元素可被選為提供結構或調控/誘導表現。
該iRNA之表現可被精確調控，例如經由利用對特定生理調控因子如循環葡萄糖濃度或激素敏感之誘導調控序列(Docherty et al.,1994,FASEB J.8：20-24)。此誘導表現系統，適合用於細胞或哺乳動物中控制雙股RNA之表現者，包括例如蛻皮激素、雌激素、黃體固酮、四環素之調控，二聚體作用之化學誘導及異丙基-beta-D1-硫代半乳吡喃糖苷(isopropyl-beta-D1-thiogalactopyranoside,IPTG)誘導。熟習本領域技術者應可基於該iRNA轉殖基因之預定用途，選擇適當之調控/啟動子序列。
包含編碼iRNA之核酸序列之病毒載體可被使用。例如，反轉錄病毒載體可被使用(參照Miller et al.,Meth.Enzymol.217：581-599(1993))。該等反轉錄病毒載體包含必須要件以正確包裝病毒基因體及融入宿主細胞DNA。該編碼iRNA之核酸序列被複製入一或多個載體中，其促進該核酸之遞輸進入患者體中。有關反轉錄病毒載體之更多詳細內容可搜尋於，例如Boesen et al.,Biotherapy 6：291-302(1994)，其敘述使用反轉錄病毒載體遞輸mdr1基因進入造血幹細胞中以使該幹細胞對化學療法更具抗性。其他描述於基因療法中使用反轉錄病毒載體之參考文獻如：Clowes et al.,J.Clin.Invest.93：644-651(1994)；Kiem et al.,Blood 83：1467-1473(1994)；Salmons and Gunzberg,Human Gene Therapy 4：129-141(1993)；以及 Grossman and Wilson,Curr.Opin.in Genetics and Devel.3：110-114(1993)。考慮使用之慢病毒載體包括，例如以HIV為基礎之載體，敘述於美國專利號6,143,520；5,665,557；以及5,981,276，其特此納入作為參考。
腺病毒亦可考慮用於本發明iRNA之遞輸。腺病毒係尤其具有吸引力之載體，如針對遞輸基因至呼吸上皮(respiratory epithelia)。腺病毒天生感染呼吸上皮，導致輕度病徵。其他以腺病毒為基礎遞輸系統之目標為肝臟、中樞神經系統、內皮細胞及肌肉。腺病毒具有能夠感染非分裂中細胞之優點。Kozarsky及Wilson於Current Opinion in Genetics and Development 3：499-503(1993)發表一篇關於以腺病毒為基礎之基因療法之評論。Bout等人於Human Gene Therapy 5：3-10(1994)演示使用腺病毒載體傳遞基因至恆河獼猴(rhesus monkeys)之呼吸上皮。其他於基因療法中使用腺病毒之實例可搜尋於Rosenfeld et al.,Science 252：431-434(1991)；Rosenfeld et al.,Cell 68：143-155(1992)；Mastrangeli et al.,J.Clin.Invest.91：225-234(1993)；PCT Publication WO94/12649；以及Wang,et al.,Gene Therapy 2：775-783(1995)。適合用於表現本發明iRNA之腺病毒載體、建構該重組腺病毒載體之方法及遞輸該載體至目標細胞之方法係描述於Xia H et al.(2002),Nat.Biotech.20：1006-1010。
腺相關病毒(AAV)載體亦可用於遞輸本發明iRNA(Walsh et al.,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204：289- 300(1993)；美國專利號5,436,146)。於一具體實施例中，該iRNA可自具有如U6或H1RNA啟動子或是細胞巨大病毒(cytomegalovirus,CMV)啟動子之重組AAV載體中被表現為二個分離、互補之單股RNA分子。適合用於表現本發明雙股RNA之AAV載體、建構該重組AV載體及遞輸該載體進入目標細胞之方法係描述於Samulski R et al.(1987),J.Virol.61：3096-3101；Fisher K J et al.(1996),J.Virol,70：520-532；Samulski R et al.(1989),J.Virol.63：3822-3826；美國專利號5,252,479；美國專利號5,139,941；國際專利申請案號WO 94/13788；以及國際專利申請案號WO 93/24641，其揭露之完整內容特此納入作為參考。
其他適用於遞輸本發明iRNA之病毒載體為痘病毒，如痘瘡病毒，例如減毒之牛痘，如經修飾的牛痘安卡拉(Modified Virus Ankara,MVA)或NYVAC；或鳥痘，如雞痘或金絲雀痘。
病毒載體之趨性可經假性外套膜蛋白或來自其他病毒之其他表面抗原病毒修飾，或酌情以不同病毒殼蛋白取代。例如，慢病毒載體可被來自水性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)、狂犬病(rabies)病毒、伊波拉病毒(Ebola)、蒙古拉病毒(Mokola)及其他類似病毒之表面蛋白假性外套。AAV載體可被用為靶向不同細胞經由改變載體之基因結構以表現不同之血清型病毒殼蛋白；參照如Rabinowitz J E et al.(2002),J Virol 76：791-801，其 揭露之完整內容特此納入以為參考。
載體之醫藥製劑可包括於可接受稀釋劑中之載體或可包括植入基因遞輸載體之緩釋間質。或者，其完整基因遞輸載體可被重組細胞原封不動地製造，如反轉錄載體，該醫藥製劑可包括一或多個製造基因遞輸系統之細胞。
IV. 本發明之醫藥組成物
本發明中亦包括醫藥組成物及醫藥製劑其包括本發明中之iRNA。於一具體實施例中，於此提供包含iRNA之醫藥組成物，如於此之敘述，以及藥學上可接受的載體。該包含iRNA之醫藥組成物係對用於治療與Serpina1基因之表現或活性有關之疾病或失調，如Serpina1缺乏相關疾病，如Serpina1缺乏肝臟疾病有效。此類醫藥組成物之配方係以遞輸模式為基礎。於實施例中組成物之配方以透過腸外遞輸(如利用靜脈(IV)遞輸)進行系統型投藥。其他例如組成物之配方係直接遞輸進入腦實質體(brain parenchyma)，如利用輸注進入腦部，例如以連續注射幫浦。
該包含本發明RNAi試劑之醫藥組成物，可例如含或不含緩衝液之溶液或包含藥學上可接受載體之組成物。此類組成物包括，例如水相或結晶組成物、微脂粒劑型、微胞劑型、乳劑及基因療法載體。
本發明之方法，該RNAi試劑可於溶液中被投藥。游離RNAi試劑可於非緩衝溶液(如食鹽水或水)中被投藥。或者，該游離siRNA亦可於適當之緩衝溶液中被 投藥。該緩衝溶液可包含醋酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶蛋白、碳酸鹽或磷酸鹽或其任意組成。於一較佳具體實施例中，該緩衝溶液為磷酸緩衝鹽溶液。包含RNAi試劑之緩衝溶液其pH值及滲透性可被調整，以使其適合被投藥至個體中。
於某些具體實施例中，該緩衝溶液進一步包含試劑以控制溶劑之滲透性，以使滲透性可維持在期望值，如在人類血漿之生理值。可被添加於緩衝溶液中以控制其滲透性之溶質，包括但不限於蛋白質、胜肽、胺基酸、非代謝聚合物、維生素、離子、醣類、代謝物、有機酸、脂質或鹽類。於某些具體實施例中，控制該溶液滲透性之試劑為鹽類。於特定具體實施例中，控制該溶液滲透性之試劑為氯化鈉或氯化鉀。
本發明之醫藥組成物可被投藥足夠劑量以抑制Serpina1基因之表現。一般而言，本發明iRNA之適當劑量範圍係每位接受者每天每公斤體重約0.001至約200.0mg，一般為範圍每天每公斤體重約1至50mg。例如，該雙股RNA可被投藥每單次劑量約0.01mg/kg、約0.05mg/kg、約0.5mg/kg、約1mg/kg、約1.5mg/kg、約2mg/kg、約3mg/kg、約10mg/kg、約20mg/kg、約30mg/kg、約40mg/kg或約50mg/kg。
例如，該RNAi試劑，如雙股RNA可被投藥劑量約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、 2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或約10mg/kg。以上所列舉值中間之值及範圍皆為本發明之部分。
於另一具體實施例中，該RNAi試劑，如雙股RNA係被投藥劑量約0.1至約50mg/kg、約0.25至約50mg/kg、約0.5至約50mg/kg、約0.75至約50mg/kg、約1至約50mg/mg、約1.5至約50mg/kb、約2至約50mg/kg、約2.5至約50mg/kg、約3至約50mg/kg、約3.5至約50mg/kg、約4至約50mg/kg、約4.5至約50mg/kg、約5至約50mg/kg、約7.5至約50mg/kg、約10至約50mg/kg、約15至約50mg/kg、約20至約50mg/kg、約20至約50mg/kg、約25至約50mg/kg、約25至約50mg/kg、約30至約50mg/kg、約35至約50mg/kg、約40至約50mg/kg、約45至約50mg/kg、約0.1至約45mg/kg、約0.25至約45mg/kg、約0.5至約45mg/kg、約0.75至約45mg/kg、約1至約45mg/mg、約1.5至約45mg/kb、約2至約45mg/kg、約2.5至約45mg/kg、約3至約45mg/kg、約3.5至約45mg/kg、約4至約45mg/kg、約4.5至約45mg/kg、約5至約45mg/kg、約7.5至約45mg/kg、約10 至約45mg/kg、約15至約45mg/kg、約20至約45mg/kg、約20至約45mg/kg、約25至約45mg/kg、約25至約45mg/kg、約30至約45mg/kg、約35至約45mg/kg、約40至約45mg/kg、約0.1至約40mg/kg、約0.25至約40mg/kg、約0.5至約40mg/kg、約0.75至約40mg/kg、約1至約40mg/mg、約1.5至約40mg/kb、約2至約40mg/kg、約2.5至約40mg/kg、約3至約40mg/kg、約3.5至約40mg/kg、約4至約40mg/kg、約4.5至約40mg/kg、約5至約40mg/kg、約7.5至約40mg/kg、約10至約40mg/kg、約15至約40mg/kg、約20至約40mg/kg、約20至約40mg/kg、約25至約40mg/kg、約25至約40mg/kg、約30至約40mg/kg、約35至約40mg/kg、約0.1至約30mg/kg、約0.25至約30mg/kg、約0.5至約30mg/kg、約0.75至約30mg/kg、約1至約30mg/mg、約1.5至約30mg/kb、約2至約30mg/kg、約2.5至約30mg/kg、約3至約30mg/kg、約3.5至約30mg/kg、約4至約30mg/kg、約4.5至約30mg/kg、約5至約30mg/kg、約7.5至約30mg/kg、約10至約30mg/kg、約15至約30mg/kg、約20至約30mg/kg、約20至約30mg/kg、約25至約30mg/kg、約0.1至約20mg/kg、約0.25至約20mg/kg、約0.5至約20mg/kg、約0.75至約20mg/kg、約1至約20mg/mg、約1.5至約20mg/kb、約2至約20mg/kg、約2.5至約20mg/kg、約3至約20mg/kg、約3.5至約20mg/kg、約4至約20mg/kg、約4.5至約20mg/kg、約5至約20mg/kg、 約7.5至約20mg/kg、約10至約20mg/kg、或約15至約20mg/kg。以上所列舉值中間之值及範圍皆為本發明之部分。
例如，該RNAi試劑，如雙股RNA，可被投藥劑量約0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或約10mg/kg。以上所列舉值中間之值及範圍皆為本發明之部分。
於另一具體實施例中，該RNAi試劑，如雙股RNA係投藥劑量為0.5至約50mg/kg、約0.75至約50mg/kg、約1至約50mg/mg、約1.5至約50mg/kg、約2至約50mg/kg、約2.5至約50mg/kg、約3至約50mg/kg、約3.5至約50mg/kg、約4至約50mg/kg、約4.5至約50mg/kg、約5至約50mg/kg、約7.5至約50mg/kg、約10至約50mg/kg、約15至約50mg/kg、約20至約50mg/kg、約20至約50mg/kg、約25至約50mg/kg、約25至約50 mg/kg、約30至約50mg/kg、約35至約50mg/kg、約40至約50mg/kg、約45至約50mg/kg、約0.5至約45mg/kg、約0.75至約45mg/kg、約1至約45mg/mg、約1.5至約45mg/kb、約2至約45mg/kg、約2.5至約45mg/kg、約3至約45mg/kg、約3.5至約45mg/kg、約4至約45mg/kg、約4.5至約45mg/kg、約5至約45mg/kg、約7.5至約45mg/kg、約10至約45mg/kg、約15至約45mg/kg、約20至約45mg/kg、約20至約45mg/kg、約25至約45mg/kg、約25至約45mg/kg、約30至約45mg/kg、約35至約45mg/kg、約40至約45mg/kg、約0.5至約40mg/kg、約0.75至約40mg/kg、約1至約40mg/mg、約1.5至約40mg/kb、約2至約40mg/kg、約2.5至約40mg/kg、約3至約40mg/kg、約3.5至約40mg/kg、約4至約40mg/kg、約4.5至約40mg/kg、約5至約40mg/kg、約7.5至約40mg/kg、約10至約40mg/kg、約15至約40mg/kg、約20至約40mg/kg、約20至約40mg/kg、約25至約40mg/kg、約25至約40mg/kg、約30至約40mg/kg、約35至約40mg/kg、約0.5至約30mg/kg、約0.75至約30mg/kg、約1至約30mg/mg、約1.5至約30mg/kb、約2至約30mg/kg、約2.5至約30mg/kg、約3至約30mg/kg、約3.5至約30mg/kg、約4至約30mg/kg、約4.5至約30mg/kg、約5至約30mg/kg、約7.5至約30mg/kg、約10至約30mg/kg、約15至約30mg/kg、約20至約30mg/kg、約20至約30mg/kg、約25至約30mg/kg、約0.5至約20mg/kg、約0.75至約 20mg/kg、約1至約20mg/mg、約1.5至約20mg/kb、約2至約20mg/kg、約2.5至約20mg/kg、約3至約20mg/kg、約3.5至約20mg/kg、約4至約20mg/kg、約4.5至約20mg/kg、約5至約20mg/kg、約7.5至約20mg/kg、約10至約20mg/kg或約15至約20mg/kg。於一具體實施例中，該雙股RNA係投藥劑量為約10mg/kg至約30mg/kg。以上所列舉值中間之值及範圍皆為本發明之部分。
例如，個體可被投藥iRNA治療量如約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、31、32、33、34、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或約50mg/kg。以上所列舉值中間之值及範圍皆為本發明之部分。
於特定具體實施例中，例如，當本發明組 成物包含於此該該雙股RNA及脂質時，個體可被投藥iRNA治療量如0.01mg/kg至約5mg/kg、約0.01mg/kg至約10mg/kg、約0.05mg/kg至約5mg/kg、約0.05mg/kg至約10mg/kg、約0.1mg/kg至約5mg/kg、約0.1mg/kg至約10mg/kg、約0.2mg/kg至約5mg/kg、約0.2mg/kg至約10mg/kg、約0.3mg/kg至約5mg/kg、約0.3mg/kg至約10mg/kg、約0.4mg/kg至約5mg/kg、約0.4mg/kg至約10mg/kg、約0.5mg/kg至約5mg/kg、約0.5mg/kg至約10mg/kg、約1mg/kg至約5mg/kg、約1mg/kg至約10.mg/kg、約1.5mg/kg至約5mg/kg、約1.5mg/kg至約10mg/kg、約2mg/kg至約2.5mg/kg、約2mg/kg至約10mg/kg、約3mg/kg至約5mg/kg、約3mg/kg至約10mg/kg、約3.5mg/kg至約5mg/kg、約4mg/kg至約5mg/kg、約4.5mg/kg至約5mg/kg、約4mg/kg至約10mg/kg、約4.5mg/kg至約10mg/kg、約5mg/kg至約10mg/kg、約5.5mg/kg至約10mg/kg、約6mg/kg至約10mg/kg、約6.5mg/kg至約10mg/kg、約7mg/kg至約10mg/kg、約7.5mg/kg至約10mg/kg、約8mg/kg至約10mg/kg、約8.5mg/kg至約10mg/kg、約9mg/kg至約10mg/kg或約9.5mg/kg至約10mg/kg。以上所列舉值中間之值及範圍皆為本發明之部分。
例如，該雙股RNA可被投藥劑量為約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、 2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或約10mg/kg。以上所列舉值中間之值及範圍皆為本發明之部分。
於本發明之特定具體實施例中，例如當雙股RNAi試劑包含修飾(一或多個具有三個相同修飾於三個連續核苷酸上之模體，包括一個此種模體位於或接近該試劑之剪切位置)、六個硫代磷酸酯鍵結及脂質時，此類試劑係被投藥劑量約0.01至約0.5mg/kg、約0.01至約0.4mg/kg、約0.01至約0.3mg/kg、約0.01至約0.2mg/kg、約0.01至約0.1mg/kg、約0.01mg/kg至約0.09mg/kg、約0.01mg/kg至約0.08mg/kg、約0.01mg/kg至約0.07mg/kg、約0.01mg/kg至約0.06mg/kg、約0.01mg/kg至約0.05mg/kg、約0.02至約0.5mg/kg、約0.02至約0.4mg/kg、約0.02至約0.3mg/kg、約0.02至約0.2mg/kg、約0.02至約0.1mg/kg、約0.02mg/kg至約0.09mg/kg、約0.02mg/kg至約0.08mg/kg、約0.02mg/kg至約0.07mg/kg、約0.02mg/kg至約0.06mg/kg、約0.02mg/kg至約0.05mg/kg、約0.03至約0.5mg/kg、約0.03至約0.4 mg/kg、約0.03至約0.3mg/kg、約0.03至約0.2mg/kg、約0.03至約0.1mg/kg、約0.03mg/kg至約0.09mg/kg、約0.03mg/kg至約0.08mg/kg、約0.03mg/kg至約0.07mg/kg、約0.03mg/kg至約0.06mg/kg、約0.03mg/kg至約0.05mg/kg、約0.04至約0.5mg/kg、約0.04至約0.4mg/kg、約0.04至約0.3mg/kg、約0.04至約0.2mg/kg、約0.04至約0.1mg/kg、約0.04mg/kg至約0.09mg/kg、約0.04mg/kg至約0.08mg/kg、約0.04mg/kg至約0.07mg/kg、約0.04mg/kg至約0.06mg/kg、約0.05至約0.5mg/kg、約0.05至約0.4mg/kg、約0.05至約0.3mg/kg、約0.05至約0.2mg/kg、約0.05至約0.1mg/kg、約0.05mg/kg至約0.09mg/kg、約0.05mg/kg至約0.08mg/kg,or about 0.05mg/kg至約0.07mg/kg。以上所列舉值中間之值及範圍皆為本發明之部分，如該RNAi試劑可被投藥該個體，劑量為約0.015mg/kg至約0.45mg/mg。
例如，該RNAi試劑，如醫藥組成物中之RNAi試劑，可被投藥劑量為約0.01mg/kg、0.0125mg/kg、0.015mg/kg、0.0175mg/kg、0.02mg/kg、0.0225mg/kg、0.025mg/kg、0.0275mg/kg、0.03mg/kg、0.0325mg/kg、0.035mg/kg、0.0375mg/kg、0.04mg/kg、0.0425mg/kg、0.045mg/kg、0.0475mg/kg、0.05mg/kg、0.0525mg/kg、0.055mg/kg、0.0575mg/kg、0.06mg/kg、0.0625mg/kg、0.065mg/kg、0.0675mg/kg、0.07mg/kg、0.0725mg/kg、0.075mg/kg、0.0775mg/kg、0.08mg/kg、 0.0825mg/kg、0.085mg/kg、0.0875mg/kg、0.09mg/kg、0.0925mg/kg、0.095mg/kg、0.0975mg/kg、0.1mg/kg、0.125mg/kg、0.15mg/kg、0.175mg/kg、0.2mg/kg、0.225mg/kg、0.25mg/kg、0.275mg/kg、0.3mg/kg、0.325mg/kg、0.35mg/kg、0.375mg/kg、0.4mg/kg、0.425mg/kg、0.45mg/kg、0.475mg/kg或約0.5mg/kg。以上所列舉值中間之值及範圍皆為本發明之部分。
該醫藥組成物之投藥可為每天一次或該iRNA可被投藥二、三或多次次劑量(sub-doses)於一整天中之適當間隔或甚至使用連續注射或以控制釋放劑型遞輸。於此情況下，於各自次劑量中含有之iRNA必須相對較少以達到總單日劑量。當遞輸超過數天時，劑量單位亦可被組合，如使用慣常之持續釋放劑型其可提供iRNA被持續釋放超過數天之週期。持續釋放劑型係熟知於現有技術中且對特定位置之試劑遞輸尤其有效，其適用於本發明之試劑。於此具體實施例中，該劑量單位包括相對多種單日劑量。
於其他具體實施例中，單一劑之醫藥組成物可為持續性，因此接續之藥劑係投藥於不超過3、4或5日間隔或不超過1、2、3或4週間隔。於某些本發明之具體實施例中，單一劑本發明之醫藥組成物係每週投藥一次。本發明之其他具體實施例中，單一劑本發明之醫藥組成物係隔月一次。
熟習本領域技藝者應同意特定因子會影響有效治療個體時所需劑量及時間，包括但不限於疾病或失常之嚴重程度、之前之治療、整體健康狀況及/或個體之年齡，以及其他存在之疾病。此外，以治療有效含量之組成物治療個體包括單次治療或一系列治療。於本發明中個別iRNA之有效劑量及體內半生期之評估可利用慣常方式或以體內試驗為基礎，選用適當之如於此所敘述之動物模式來完成。
小鼠基因體學之進展產生了多種小鼠模式以研究不同的人類疾病，如因絲胺酸蛋白酶抑制因子A1表現減少而產生之肝臟疾病。此種模式生物可被用於體內iRNA試驗，亦可用於決定治療有效劑量。適當之小鼠模式已知於現有技術中且包括，例如包含表現人類絲胺酸蛋白酶抑制因子A1之基因轉殖之小鼠。
本發明之醫藥組成物可以多種方式投藥，取決於預期為局部或系統性治療以及欲治療之部位。投藥方式可為局部投藥，如利用穿皮貼片、透過肺部投藥，如利用粉末或氣膠包括經由霧化器吸入或吹入、透過氣管、鼻內、上皮及經皮、口服或腸外投藥。腸外投藥包括靜脈、動脈、皮下、腹膜內或肌內注射或灌注；真皮下投藥，如透過植入裝置；或顱內，如腦實質、脊髓腔或腦室投藥。該iRNA可利用一種手段被遞輸至特定部位，例如肝臟(如肝臟之肝細胞)。
局部投藥之醫藥組成物及劑型可包括貼 片、藥膏、乳液、乳霜、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧、液體及粉末。慣常醫藥載體、水溶液、粉末或油基、增稠劑及其他相似物可為必需或期望的。經塗覆之保險套、手套或其他類似物亦有效。適當之局部製劑包括其與本發明中該iRNA組合者為摻合物包含局部遞輸系統如脂質、微脂質、脂肪酸、脂肪酸酯類、類固醇、螯合劑以及界面活性劑。適當之脂質及微脂體胞包括中性(如二油醯磷脂醯(dioleoylphosphatidyl,DOPE)乙醇胺、二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼(dimyristoylphosphatidyl choline,DMPC)、二硬脂醯磷脂醯膽鹼(distearolyphosphatidyl choline))、帶負電(如二肉豆蔻醯磷脂醯甘油(dimyristoylphosphatidyl glycerol,DMPG)及帶正電(如二油醯四甲基胺基丙基(dioleoyltetramethylaminopropyl,DOTAP)及二油醯磷脂醯乙醇胺(dioleoylphosphatidyl ethanolamine,DOTMA))。本發明中組合之iRNA可為包覆於微脂質中或可與其形成錯合物，尤其及陽離子微脂質。或者，iRNA可錯合於脂質，尤其及陽離子脂質錯合。適當之脂肪酸及酯質，包括但不限於花生四烯酸(arachidonic acid)、油酸(oleic acid)、花生酸(eicosanoic acid)、月桂酸(lauric acid)、辛酸(caprylic acid)、癸酸(capric acid)、肉豆蔻酸(myristic acid)、棕櫚酸(palmitic acid)、硬脂酸(stearic acid)、亞麻油酸(linoleic acid)、次亞麻油酸(linolenic acid)、二癸酸酯類(dicaprates)、三癸酸酯類(tricaprates)、單油酸甘油酯(monoolein)、甘油二月桂酸酯(dilaurin)、甘油1-單癸酸 (glyceryl 1-monocaprate)、1-十二烷基吖環庚基-2-酮(1-dodecylazacycloheptan-2-one)、醯肉鹼(acylcarnitine)、醯膽鹼(acylcholine)或C1-20烷基酯(如肉豆蔻酸異丙酯(isopropylmyristate,IPM))、單酸甘油酯(monoglyceride)、二酸甘油酯(diglyceride)或其他藥學上可接受之鹽類。局部製劑係詳細揭露於美國專利號6,747,014，其完整內容特此納入以為參考。
A. iRNA製劑包含膜狀分子組裝
用於本發明組成物及方法之iRNA可被製劑為利用膜狀分子組裝遞輸，如微脂質或囊體。於此所用之術語“微脂質”(“liposome”)意指由兩性脂質排列為至少一層的雙層結構，如一雙層或複數脂雙層所組成之囊泡。微脂質包括單層及多層囊泡其具有由親脂性材質及水性之內層組成之膜。該水性部分包含該iRNA組成物。該親脂性材質將水性內層及水性之外部分離，此外部通常不包括該iRNA組成物，但於某些實例中，該外部則可能包括該iRNA組成物。微脂質對傳送及遞輸活性成分至作用位置是有幫助的。因為微脂質膜係結構上相似於生物膜，當微脂質施用於組織時，該微脂質雙層膜與細胞雙層膜融合。當微脂質與細胞融合進行時，內部水性內含物包括該iRNA便遞輸進入細胞，於此該iRNA可專一地組合至目標RNA且可調控RNAi。某些實例中，該微脂質亦為特定靶向，如引導該iRNA至特定細胞種類。
包含RNAi試劑之微脂質可以多種不同方 式製備。於一例中，微脂質之脂質組成係溶解於清潔劑中以使脂質組成分形成微胞(micelles)。例如，該脂質組成分可為兩性陽離子脂質或共軛脂質(lipid conjugate)。該清潔劑可具有高臨界微胞濃度(critical micelle concentration)且可為非離子型。典型清潔劑包括膽酸鹽(cholate)、CHAPS、辛基葡萄糖苷(octylglucoside)、去氧膽酸鹽及十二烷基肌胺酸(lauroyl sarcosine)。該RNAi試劑之製備係接著加入該包含脂質組成分之微胞。脂質上之陽離子會與該RNAi試劑交互作用，且凝結於該RNAi試劑周圍以形成微脂質。凝結之後，利用如透析作用移除清潔劑，以得RNAi試劑之微脂質製備。
若有需求，協助凝結之載體化合物可於凝結反應中添加，如以控制添加。例如，該載體化合物可為核酸(如精胺或亞精胺)以外之聚合物。pH亦可被調整為有利於凝結作用。
製造穩定聚核苷酸遞輸載體之方法，其組合聚核苷酸/陽離子脂質錯合物為該遞輸載體之結構組成係進一步描述於，如WO96/37194，其完整內容特此納入參考。微脂質製劑亦可包括典型方法之一或多種方面，該方法描述於Felgner,P.L.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 8：7413-7417,1987；美國專利號4,897,355；美國專利號5,171,678；Bangham,et al.M.Mol.Biol.23：238,1965；Olson,et al.Biochim.Biophys.Acta 557：9,1979；Szoka,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.75：4194,1978；Mayhew,et al.Biochim.Biophys.Acta 775：169,1984；Kim,et al.Biochim.Biophys.Acta 728：339,1983；以及Fukunaga,et al.Endocrinol.115：757,1984。製備適當大小以供做為遞輸載體之脂質聚合體常用技術包括超音波震盪及凍融加押出方法(freeze-thaw plus extrusion)(參照如Mayer,et al.Biochim.Biophys.Acta 858：161,1986)。微射流作用(Microfluidization)可用於當預期產出一致小型(50至200nm)且相對均勻之聚合體時(Mayhew,et al.Biochim.Biophys.Acta 775：169,1984)。該等方法係可輕易調整以包覆RNAi試劑製劑於微脂質中。
微脂質分為兩大類。陽離子微脂質係帶正電荷之微脂質其與核酸分子之陰離子交互作用以形成穩定之錯合物。而帶正電荷核酸/微脂質錯合物組合至帶負電之細胞表面且被納入為胞內體。由於胞內體中之酸性，該微脂質會破裂，釋放出其內容物至細胞質中(Wang et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,1987,147,980-985)。
pH敏感或帶負電之微脂質包覆核酸而非與其錯合。由於核酸與微脂質攜帶同性電荷，故會發生互斥而非形成錯合物。儘管如此，某些核酸係包覆於微脂質之水性內層中。pH-敏感之微脂質已被用於遞輸含胸苷激酶基因編碼之核酸至培養之細胞單層膜。該外源基因之表現係被偵測於該目標細胞中(Zhou et al.,Journal of Controlled Release,1992,19,269-274)。
微脂質組成物之主要種類包括除了天然衍 生卵磷脂外之磷脂質。中性微脂質組成物，例如可由二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼或二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(dipalmitoyl phosphatidylcholine,DPPC)形成。陰離子微脂質組成物通常由二肉豆蔻醯磷脂醯甘油組成，而陰離子融合微脂質則主要由二油醯磷脂醯乙醇胺組成。微脂質組成物之另些種類係由磷脂醯膽鹼如，大豆磷脂醯膽鹼及蛋黃磷脂醯膽鹼組成。又其他種類則由磷脂質及/或磷脂醯膽鹼及/或膽固醇組成。
其他引導微脂質進入細胞之活體外或體內之方法例包括美國專利號5,283,185；美國專利號5,171,678；WO 94/00569；WO 93/24640；WO 91/16024；Felgner,J.Biol.Chem.269：2550,1994；Nabel,Proc.Natl.Acad.Sci.90：11307,1993；Nabel,Human Gene Ther.3：649,1992；Gershon,Biochem.32：7143,1993；以及Strauss EMBO J.11：417,1992。
非離子型微脂質系統亦已被研究確定其於遞輸藥物至皮膚之用途，特定系統中包含非離子型界面活性劑及膽固醇。非離子型微脂質製劑包含NovasomeTM I(二月桂酸甘油酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬酯醚)及NovasomeTM II(二硬脂酸甘油酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬酯醚)係用於遞輸cyclosporin-A進入小鼠皮膚之真皮。結果指出此類非離子型微脂質系統對促進環孢素A滯留進入皮膚之不同層為有效(Hu et al.S.T.P.Pharma.Sci.,1994,4(6)466)。
微脂質亦包括“立體安定化”(“sterically stabilized”)微脂質，於此所用此術語意指微脂質包含一或多種特化脂質組合於微脂質中，導致增加循環壽命相較於缺乏該等特化脂質之微脂質。立體安定化微脂質之例為微脂質中形成囊胞之脂質部分中有一部分(A)包含一或多個醣脂，如單唾液酸神經節苷脂(monosialoganglioside,GM1)或(B)被一或多個親水聚合物衍生，如聚乙二醇基團。而不期望受限於任何特定理論，現有技術中認為至少立體安定化微脂質包含神經節苷脂、神經鞘磷脂(sphingomyelin)或聚乙二醇衍生脂質，該等立體安定化微脂質增加之循環半生期來自於網狀內皮系統(reticuloendothelial system,RES)細胞減少攝取(Allen et al.,FEBS Letters,1987,223,42；Wu et al.,Cancer Research,1993,53,3765)。
多種包含一或多個醣脂之微脂質已知於現有技術中。Papahadjopoulos等人(Ann.N.Y.Acad.Sci.,1987,507,64)報導了單唾液酸神經節苷脂、半乳糖硫酸腦苷酯(galactocerebroside sulfate)及磷脂醯肌醇(phosphatidylinositol)改善微脂質於血液中半生期之能力。這些發現闡述於Gabizon等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1988,85,6949)。美國專利號：4,837,028及WO 88/04924，以及Allen et al.，揭露了微脂質包含(1)神經鞘磷脂及(2)神經節苷脂GM1或半乳糖硫酸腦苷酯。美國專利號5,543,152(Webb et al.)揭露微脂質包含神經鞘磷脂。微脂質包含1,2-sn-二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼(1,2-sn- dimyristoylphosphatidylcholine)係被揭露於WO 97/13499(Lim et al)。
於一具體實施例中，使用陽離子微脂質。陽離子微脂質具有能夠與細胞膜融合之優點。非陽離子微脂質雖然不能有效率地與質膜融合，但會在體內被巨噬細胞攝取而可用於遞輸RNAi試劑至巨噬細胞。
微脂質地更多優點包括：天然磷脂質取得之微脂質係具有生物可相容性及生物可降解性；微脂質可組合廣泛的水溶性或脂溶性藥物；微脂質可保護被包覆之RNAi試劑於其內部隔間以免被代謝或降解(Rosoff,in“Pharmaceutical Dosage Forms,”Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,volume 1,p.245)。製備微脂質製劑時的重要考量係脂質表面電荷、囊胞尺寸及微脂質中水性的體積。
帶正電荷之合成陽離子脂質，N-[1-(2,3-二油氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride,DOTMA)可用於形成小微脂質而自動與核酸產生交互作用形成脂質-核酸錯合物，其具有與組織培養細胞之細胞膜上帶負電之脂質融合之能力，而致使RNAi試劑被遞輸(見如Felgner,P.L.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 8：7413-7417,1987及美國專利號4,897,355中敘述DOTMA及其與DNA之應用)。
DOTMA類似物，1,2-雙(油醯氧基)-3-(三甲 基胺)丙烷(1,2-bis(oleoyloxy)-3-(trimethylammonia)propane,DOTAP)可用於與磷脂質組合以形成DNA-錯合囊胞。LipofectinTM(Bethesda Research Laboratories,Gaithersburg,Md.)係一種高效試劑用於遞輸高陰離子核酸進入活體組織培養細胞中，其包含帶正電荷之DOTMA微脂質與帶負電之聚核苷酸自動交互作用形成錯合物。當使用足夠之帶正電微脂質時，產生之錯合物之淨電荷亦為正電。以此方法製備之帶正電錯合物自動接附於帶負電之細胞表面，與質膜融合並有效率地遞輸具功能核酸進入，例如組織培養細胞中。其他商業上可取得之陽離子脂質，1,2-雙(油醯氧基)-3,3-(三甲基胺)丙烷(Boehringer Mannheim,Indianapolis,Indiana)與DOTMA不同處為該油醯基係以酯質鍵結，而非醚鍵結。
其他被報導之陽離子脂質化合物包括該等接合至不同部分者，包括例如羧基精胺(carboxyspermine)其接合至兩種脂質之一，且包括化合物如5-羧基精胺基甘胺酸-雙-八油醯基醯胺(5-carboxyspermylglycine dioctaoleoylamide,“DOGS”)(TransfectamTM,Promega,Madison,Wisconsin)及二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺5-羧基精胺基-醯胺(dipalmitoylphosphatidylethanolamine 5-carboxyspermyl-amide,“DPPES”)(參照如美國專利號5,171,678)。
其他陽離子脂質接合包括脂質的膽固醇基衍生物(“DC-Chol”)其已與DOPE組合置入微脂質(見 Gao,X.and Huang,L.,Biochim.Biophys.Res.Commun.179：280,1991)。脂質聚離胺酸(lipopolylysine)，以聚離胺酸接合至DOPE製成，已被報導對血清中轉染有效(Zhou,X.et al.,Biochim.Biophys.Acta 1065：8,1991)。對特定細胞株，該等微脂質包含陽離子脂質接合者，據說顯現出較低毒性且提供較高轉染效率比起含DOTMA之組成物。其他商業上可取得之陽離子脂質產品包括DMRIE及DMRIE-HP(Vical,La Jolla,California)及Lipofectamine(DOSPA)(Life Technology,Inc.,Gaithersburg,Maryland)。其他適合遞輸寡核苷酸之陽離子脂質係描述於WO 98/39359及WO 96/37194。
微脂質製劑尤其適合局部投藥，微脂質擁有多項優勢勝過其他劑型。該等優勢包括減少與投藥藥物全身吸收相關之副作用、增加投藥藥物於預期目標之累積、以及具有投藥RNAi試劑進入皮膚之能力。於某些實施中，微脂質係用於遞輸RNAi試劑至上皮細胞並增強RNAi試劑進入皮膜組織，如進入皮膚，之穿透性。例如，該微脂質可局部施用。以微脂質形式局部遞輸藥物至皮膚已有證明(參照如Weiner et al.,Journal of Drug Targeting,1992,vol.2,405-410及du Plessis et al.,Antiviral Research,18,1992,259-265；Mannino,R.J.and Fould-Fogerite,S.,Biotechniques 6：682-690,1988；Itani,T.et al.Gene 56：267-276.1987；Nicolau,C.et al.Meth.Enz.149：157-176,1987；Straubinger,R.M.and Papahadjopoulos,D.Meth. Enz.101：512-527,1983；Wang,C.Y.and Huang,L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7851-7855,1987).
非離子型微脂質系統亦已經過測試以決定其遞輸藥物至皮膚之能力，尤其是包含非離子型界面活性劑及膽固醇之系統。非離子型微脂質製劑包含Novasome I(甘油二月桂酸酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬酯醚)及Novasome II(甘油二硬脂酸酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬酯醚)係用於遞輸藥物進入小鼠皮膚之真皮。此類含RNAi試劑之製劑係對治療皮膚疾病有效。
包括iRNA之微脂質可被製為可高度變形。此變形能力能夠使該微脂質穿透小於微脂質平均半徑之孔隙。例如，傳遞體(transfersomes)即為一種可變形之微脂質。傳遞體可利用添加表面邊活化劑(surface edge activator)，通常為界面活性劑於標準微脂質組成物中製備。包括RNAi試劑之傳遞體可被遞輸，例如，透過皮下傳染為了遞輸RNAi試劑至皮膚中的角質細胞。為了穿越完整的哺乳動物皮膚，脂質囊胞必定要通過一連串細小的孔隙，其各自直徑小於50nm，於適當的經皮吸收梯度影響下。此外，由於脂質之特性，該等傳遞體可為自行最佳化(self-optimizing)(適應孔隙形狀，如於皮膚)、自行修復以及能夠頻繁地到達其目標而不被分段，且通常為自行裝載(self-loading)。
其他可合理適用於本發明之製劑係描述於美國臨時專利案號61/018,616，提交於2008年1月2日； 61/018,611，提交於2008年1月2日；61/039,748，提交於2008年3月26日；61/047,087，提交於2008年4月22日以及61/051,528，提交於20085月8日。國際專利申請案第PCT/US2007/080331號，提交於2007年10月3日，亦描述可適用於本發明之製劑。
傳遞體係又另一種微脂質類型，且為高度變形脂質聚合體，其為良好之藥物遞輸載體候選者。傳遞體可被描述為油滴，其具有如此高度變形能力以至於能夠輕易穿透小於該油滴之孔隙。傳遞體能夠適應其被應用之環境，如其為自行最佳化(適應皮膚中孔隙之形狀)、自行修復、頻繁地到達其目標而不被分段，且通常為自行裝載。為製備傳遞體，可以添加表面邊活化劑，通常為界面活性劑於標準微脂質組成物中。傳遞體以被用於遞輸血清白蛋白至皮膚。該傳遞體媒介之血清白蛋白遞輸顯示其如同皮下注射包含血清白蛋白之溶劑一般有效率。
介面活性劑發現於製劑中之廣泛應用，如乳化劑(包括微乳化劑)及微脂質。最常用來分類及排序許多不同種類界面活性劑(天然及合成)之方法係利用親水親油均衡(hydrophile/lipophile balance,HLB)。親水團(亦已知為“親水頭”(“head”))之本性，提供分類用於製劑中之不同界面活性劑最有效方法(Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,p.285)。
若介面活性分子為非離子型，則其被分類 為非離子型介面活性劑。非離子型介面活性劑發現於醫藥及化妝產品中之廣泛應用以及可於廣泛pH值中使用。一般而言，取決於其結構，其HLB值介於2至約18。非離子型介面活性劑包括非離子型酯質如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、去水山梨醇酯(sorbitanesters)、蔗糖酯及乙氧基酯。非離子型烷醇醯胺(alkanolamides)及醚類如脂肪醇氧乙烯醚(fatty alcohol ethoxylates)、氧丙烯基醇(propoxylated alcohols)及氧乙烯/氧丙烯基團聯聚合物(blockpolymers)亦包括於此分類中。聚氧乙烯類介面活性劑係非離子型介面活性劑中最普遍者。
若該介面活性劑分子攜帶負電荷，當其溶解或分散於水中時，該介面活性劑則被分類為陰離子。陰離子介面活性劑包括羧酸鹽類如肥皂，醯基乳醯乳酸鹽(acyl lactylates)，胺基酸之醯胺類，硫酸之酯類如烷基硫酸鹽及氧乙烯基烷基硫酸酯，磺酸鹽如烷基苯磺酸鹽、醯基羥乙磺酸鹽(acyl isethionates)、醯基牛磺酸鹽(acyltaurates)及磺基琥珀酸鹽(sulfosuccinates)，以及磷酸鹽。烷基磺酸鹽與肥皂係陰離子型介面活性劑中最普遍者。
若該介面活性分子攜帶正電荷，當其溶解或分散於水中時，該介面活性劑則被分類為陽離子。陽離子介面活性劑包括四級銨鹽類及氧乙烯胺類。四級銨鹽類係此類介面活性劑中最常被使用者。
若該介面活性分子有能力攜帶正電荷或負 電荷，則該介面活性劑被分類為兩性。兩性介面活性劑包括丙烯酸衍生物、經取代之烷基醯胺類、N-烷基甜菜鹼類(N-alkylbetaines)及磷脂酸。
於藥物產品、製劑及於乳劑中使用介面活性劑已被綜述(Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,p.285)。
用於本發明中方法之iRNA亦可提供微胞製劑。“微胞”(“Micelles”)於此定義為特定種類之分子集合體由兩性分子排列為球狀結構，其分子之疏水性部分朝內，留下親水性部分與周圍水相接觸。若環境為疏水性，則以相反排列方式存在。
適合透過經皮薄膜遞輸混合微胞製劑可利用混合siRNA組成物水溶液、C8至C22烷基硫酸鹼金族鹽類及微胞成型化合物來製備。典型的微胞成型化合物包括卵磷脂、玻尿酸、藥學上可接受之玻尿酸鹽類、甘醇酸(glycolicacid)、乳酸、洋甘菊萃取物(chamomile extract)、小黃瓜萃取物(cucumber extract)、油酸、亞麻油酸、次亞麻油酸、單油酸甘油酯、單油酸酯類(monooleates)、單月桂酸酯類(monolaurates)、琉璃苣油(borage oil)、月見草油(evening of primrose oil)、薄荷醇、三羥基側氧基膽氨基乙酸(trihydroxy oxo cholanyl glycine)及其他藥學上可接受之鹽類、甘油、聚甘油、離胺酸、聚離胺酸、三油酸甘油酯(triolein)、聚氧乙烯醚類及其類似物、聚多卡醇(polidocanol)烷基醚類及其類似物、鵝去氧膽酸鹽 (chenodeoxycholate)、去氧膽鹽及其混合物。該微胞成型化合物可於添加烷基硫酸鹼金族鹽類時或於其後添加。混合微胞將會形成於基本上任何種類之組成成分混合時，但劇烈混合會提供較小尺寸之微胞。
在一方法中，第一個微胞組成物被製成，其包含該siRNA組成物及至少該烷基硫酸鹼金族鹽類。第一個微胞組成物係接著與至少三種微胞成型化合物混合以形成混合微胞組成物。在另一方法中，該微胞組成物被製成，利用混合該siRNA組成物、該烷基硫酸鹼金族鹽類及至少一種微胞成型化合物，接著添加其餘微胞成型化合物，搭配劇烈混合。
酚及/或間甲酚(m-cresol)可被添加至該混合微胞組成物以穩定該製劑並避免細菌生長。或者，酚及/或間甲酚可及微胞成型組成成分一起添加。等張溶液如甘油亦可於微胞組成物形成後添加。
為了微胞製劑以噴霧方式遞輸，該製劑可被置於噴霧器中，該噴霧器，該噴霧器配有推進劑。該推進劑於壓力下，係以液態存在於噴霧器中。組成成分之比例係調整以便該水相及推進劑相合而為一，即僅有一相。若有兩相，則必須於，如透過定量閥，噴出部分內容物前搖晃該噴霧器。該藥劑噴出劑量係於自該定量閥中推進之細微噴霧中。
推進劑可包括含氫氯氟碳化物(hydrogen-containing chlorofluorocarbons)、含氫氟碳化物(hydrogen- containing fluorocarbons)、二甲醚及二乙醚。於某些具體實施例中，HFA 134a(1,1,1,2-四氟乙烷(1,1,1,2-tetrafluoroethane))可被使用。
該有效組成成分之特定濃度可利用相對簡單實驗而決定。為了透過口腔吸收，通常期望增加，如至少二或三倍透過注射或透過腸胃道吸收之劑量。
B. 脂質粒子
iRNA，如本發明中之雙股RNA，可完全包覆於脂質製劑中，如LNP或其他核酸-脂質粒子。
如於此所用術語“LNP”意指穩定的核酸-脂質粒子。LNP包含陽離子脂質、非陽離子脂質及避免粒子聚集的脂質(如PEG-脂質接合體)。LNPs係對系統型施用十分有效，如同其顯現延長之循環壽命在靜脈注射後並聚集於末梢位置(如生理上與投藥位置分離之位置)。LNP包括“pSPLP”，其包括被包覆之凝結試劑-核酸錯合物如於PCTPublicationNo.WO00/03683中所說明。本發明中之粒子通常具有平均直徑約50nm至約150nm、更常為約60nm至約130nm、更常為約70nm至約110nm、最常為約70nm至約90nm，並且基本上無毒性。此外，當該核酸存在於本發明中之核酸-脂質粒子時，係為於水溶液中抗核酸酶降解。核酸-脂質粒子及其製備方式係揭露於如美國專利案5,976,567；5,981,501；6,534,484；6,586,410；6,815,432；美國專利申請案號2010/0324120及PCT Publication No.WO 96/40964。
於一具體實施例中，該脂質與藥物比例(質量/質量比)(如脂質對雙股RNA比)係落於範圍自約1：1至約50：1、自約1：1至約25：1、自約3：1至約15：1、自約4：1至約10：1、自約5：1至約9：1或約6：1至約9：1。介於以上所列範圍其中之範圍亦考慮為本發明之一部分。
該陽離子脂質可為，例如，N,N-二油基-N,N-二甲基氯化銨(N,N-dioleyl-N,N-dimethylammonium chloride,DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨(N,N-distearyl-N,N-dimethylammonium bromide,DDAB)、N-((2,3-二油醯氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨(N-(I-(2,3-dioleoyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammonium chloride,DOTAP)、N-(I-(2,3-二油醯氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨(N-(I-(2,3-dioleyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammonium chloride,DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二醯烯氧基)丙胺(N,N-dimethyl-2,3-dioleyloxy)propylamine,DODMA)、1,2-二亞麻油氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(1,2-DiLinoleyloxy-N,N-dimethylaminopropane,DLinDMA)、1,2-二次亞麻油氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(1,2-Dilinolenyloxy-N,N-dimethylaminopropane,DLenDMA)、1,2-二亞麻油胺甲醯氧基-3-二甲基胺基丙烷(1,2-Dilinoleylcarbamoyloxy-3-dimethylaminopropane,DLin-C-DAP)、1,2-二亞麻油氧基-3-(二甲基胺基)乙醯氧基丙烷(1,2-Dilinoleyoxy-3-(dimethylamino) acetoxypropane,DLin-DAC)、1,2-二亞麻油氧基-3-N-嗎啉基丙烷(1,2-Dilinoleyoxy-3-morpholinopropane,DLin-MA)、1,2-二亞油醯基-3-二甲基胺基丙烷(1,2-Dilinoleoyl-3-dimethylaminopropane,DLinDAP)、1,2-二亞油硫基-3-二甲基胺基丙烷(1,2-Dilinoleylthio-3-dimethylaminopropane,DLin-S-DMA)、1-亞油醯基-2-亞油氧基-3-二甲基胺基丙烷(1-Linoleoyl-2-linoleyloxy-3-dimethylaminopropane,DLin-2-DMAP)、1,2-二亞油氧基-3-三甲基胺基丙烷氯化物鹽(1,2-Dilinoleyloxy-3-trimethylaminopropane chloride salt,DLin-TMA.Cl)、1,2-二亞油醯基-3-三甲基胺基丙烷氯化物鹽(1,2-Dilinoleoyl-3-trimethylaminopropane chloride salt,DLin-TAP.Cl)、1,2-二亞油氧基-3-(N-甲基哌)丙烷(1,2-Dilinoleyloxy-3-(N-methylpiperazino)propane,DLin-MPZ)或3-(N,N-二亞油基胺基)-1,2-丙二醇(3-(N,N-Dilinoleylamino)-1,2-propanediol,DLinAP)、3-(N,N-二油基胺基)-1,2-丙二醇(3-(N,N-Dioleylamino)-1,2-propanedio,DOAP)、1,2-二亞麻油側氧基-3-(2-N,N-二甲基胺基)乙氧丙烷(1,2-Dilinoleyloxo-3-(2-N,N-dimethylamino)ethoxypropane,DLin-EG-DMA)、1,2-二亞油醯氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(1,2-Dilinolenyloxy-N,N-dimethylaminopropane,DLinDMA)、2,2-二亞麻油-4-二甲基胺基甲基-[1,3]-二烷(2,2-Dilinoleyl-4-dimethylaminomethyl-[1,3]-dioxolane,DLin-K-DMA)或類似物、(3aR,5s,6aS)-N,N-二 甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯基)四氫-3aH-環戊[d][1,3]二呃基-5-胺((3aR,5s,6aS)-N,N-dimethyl-2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienyl)tetrahydro-3aH-cyclopenta[d][1,3]dioxol-5-amine,ALN100)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七基-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基胺基)丁酸鹽((6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-yl 4-(dimethylamino)butanoate,MC3)、1,1'-(2-(4-(2-((2-(雙(2-羥基十二烷基)胺基)乙基)(2-羥基十二烷基)胺基)1)呱-1-基)乙脲二基)二-十二烷基-2-醇(1,1'-(2-(4-(2-((2-(bis(2-hydroxydodecyl)amino)ethyl)(2-hydroxydodecyl)amino)ethyl)piperazin-1-yl)ethylazanediyl)didodecan-2-ol,Tech G1)或其混合。該陽離子脂質可包含粒子總脂質之約20莫耳百分比至約50莫耳百分比或約40莫耳百分比。
於另一具體實施例中，化合物2,2-二亞麻油基-4-二甲基胺基乙基-[1,3]-二烷(2,2-Dilinoleyl-4-dimethylaminoethyl-[1,3]-dioxolane)可用於製備脂質-siRNA奈米粒子。2,2-二亞麻油基-4-二甲基胺基乙基-[1,3]-二烷之合成係描述於美國臨時專利申請案號61/107,998，提交於2008年10月23日，其完整內容特此納入以為參考。
於一具體實施例中，該脂質-siRNA粒子包括40%2,2--二亞麻油基-4-二甲基胺基乙基-[1,3]-二烷：10% DSPC：40%膽固醇：10% PEG-C-DOMG(莫耳百分比)， 粒子尺寸為63.0±20nm及siRNA/Lipid比值為0.027。
該離子化/非陽離子脂質可為陰離子脂質或中性脂質，包括但不限於二硬脂醯磷脂醯膽鹼(distearoylphosphatidylcholine,DSPC)、二油醯磷脂醯膽鹼(DOPC)、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)、二油醯磷脂醯甘油(DOPG)、二棕櫚醯磷脂醯甘油(DPPG)、二油醯-磷脂醯乙醇胺(DOPE)、棕櫚醯油醯磷脂醯膽鹼(POPC)、棕櫚醯油醯磷脂醯乙醇胺(POPE)、二油醯基-磷脂醯乙醇胺4-(N-馬來醯亞胺基甲基)-環己烷-1-羧酸鹽(dioleoyl-phosphatidylethanolamine4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate,DOPE-mal)、二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻醯磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂醯基-磷脂醯-乙醇胺(DSPE)、16-O-單甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反PE、1-硬脂醯基-2-油醯基-磷脂醯基乙醇胺(SOPE)、膽固醇或其混合物。非陽離子脂質可為粒子中脂質總量之自約5莫耳百分比至約90莫耳百分比、約10莫耳百分比、或如包括膽固醇則為約58莫耳百分比。
抑制粒子聚集之接合脂質可為，例如聚乙二醇(PEG)-脂質包括但不限制於PEG-二醯基甘油(DAG)、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂質、PEG-神經醯胺(Cer)或其混合。PEG-DAA接合體可為例如，PEG-二月桂氧丙基(Ci2)、PEG-二肉豆蔻氧丙基(Ci4)、PEG-二棕櫚氧丙基(Ci6)或PEG-二硬酯氧丙基(C]8)。避免粒子聚集之接合脂質可為粒子中總脂質含量之自0莫耳百分比至約20莫 耳百分比或約2莫耳百分比。
於一些具體實施例中，該核酸-脂質粒子進一步包括膽固醇其佔脂質粒子總量之約10莫耳百分比至約60莫耳百分比或約48莫耳百分比。
於一具體實施例中，該類脂質(lipidoid)ND98‧4HCl(分子量1487)(見美國專利申請案號12/056,230，提交於3/26/2008，其特此納入參考)，膽固醇(Sigma-Aldrich)、及PEG-神經醯胺C16(Avanti Polar Lipids)可用於製備脂質-雙股RNA奈米分子(即LNP01粒子)。各自乙醇儲備溶液可按以下濃度製備：ND98，133mg/ml；膽固醇，25mg/ml，PEG-神經醯胺C16，100mg/ml。ND98、膽固醇及PEG-神經醯胺C16儲備溶液可接著被組合如42：48：10莫耳比例。該組合脂質溶液可與水性雙股RNA(如於醋酸鈉中，pH 5)混合以使乙醇之最終濃度為約35至45%且醋酸鈉之最終濃度為約100至300mM。脂質-雙股RNA奈米粒子通常由於混合而自動形成。取決於預期之粒子大小分布，該產生之奈米粒子混合物可透過聚碳酸酯膜(如100nm截取直徑(cut-off))押出，例如，溫控押出器(thermobarrel extruder)，如Lipex Extruder(Northern Lipids,Inc)。於某些實例中，該押出步驟可被省略。乙醇之去除與同步取代緩衝液可利用如透析或切向流過濾方式達成。緩衝液可取代為，例如磷酸鹽緩衝溶液，約pH 7，如約pH 6.9，約pH 7.0，約pH 7.1，約pH 7.2，約pH 7.3或約pH 7.4。
LNP01製劑細描述如於International Application Publication No.WO 2008/042973，其特此納入參考。
另外脂質-雙股RNA製劑係如表A該。
DSPC：二硬脂醯磷脂醯膽鹼(distearoylphosphatidylcholine)
DPPC：二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(dipalmitoylphosphatidylcholine)
PEG-DMG：PEG-二肉豆蔻醯甘油(PEG-didimyristoyl glycerol)(C14-PEG或PEG-C14)(PEG之平均分子量為2000)
PEG-DSG：PEG-苯乙烯甘油(PEG-distyryl glycerol)(C18-PEG或PEG-C18)(PEG之平均分子量為2000)
PEG-cDMA：PEG-胺甲醯基-1,2-二肉豆蔻氧基丙基胺(PEG-carbamoyl-1,2-dimyristyloxypropylamine)(PEG之平均分子量為2000)
包含LNP(1,2-二亞麻油氧基-N,N-二甲基胺基丙烷，1,2-Dilinolenyloxy-N,N-dimethylaminopropane(DLinDMA))製劑係敘述於International Publication No.WO 2009/127060，提交於2009年4月15日，其特此納入作為參考。
包含XTC製劑係敘述於如U.S.Provisional Serial No.61/148,366，提交於2009年1月29日；U.S.Provisional Serial No.61/156,851，提交於2009年3月2日；U.S.Provisional Serial No.，提交於2009年6月10日；U.S.Provisional Serial No.61/228,373，提交於2009年7月24日；U.S.Provisional Serial No.61/239,686，提交於2009年9月3日及International Application No.PCT/US2010/022614，提交於2010年1月29日，其特此納入參考。
包含MC3製劑係敘述於如U.S.Publication No.2010/0324120，提交於2010年6月10日，其完整內容特此納入參考。
包含ALNY-100製劑係敘述於如國際專利申請案號PCT/US09/63933，提交於2009年11月10日，其特此納入參考。
包含C12-200製劑係敘述於如U.S.Provisional Serial No.61/175,770，提交於2009年5月5日及International Application No.PCT/US10/33777，提交於2010年5月5日May 5,2010，其特此納入參考。
離子化/陽離子脂質之合成
用於本發明中核酸-脂質粒子之任意化合物，如陽離子脂質及該類物質，可利用已知有機合成技術製備，包括於實例中更加詳述之方法。除非另外註明，否則所有取代基皆如以下定義。
「烷基」係意指含有1個至24個碳原子之 直鏈或分支鏈、非環狀或環狀的飽和脂族烴。代表性飽和直鏈烷基係包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基等；而飽和分支鏈烷基係包括異丙基、第二丁基、異丁基、第三丁基、異戊基等。代表性飽和環狀烷基係包括環丙基、環丁基、環戊基、環己基等；而不飽和環狀烷基係包括環戊烯基及環己烯基等。
「烯基」係意指，含有至少一個於相鄰碳原子間之雙鍵的上揭烷基。烯基係包括順式異構物及反式異構物兩者。代表性直鏈及分支鏈烯基係包括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、異丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基等。
「炔基」係意指，額外含有至少一個於相鄰碳原子間之三鍵的上揭烷基或烯基。代表性直鏈及分支鏈炔基係包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基等。
「醯基」係意指，位於接合位點之碳係經側氧基取代的烷基、烯基或炔基，如下述定義者。舉例而言，-C(=O)烷基、-C(=O)烯基、及-C(=O)炔基係醯基。
「雜環」係意指5員至7員單環或7員至10員雙環之雜環，其係飽和、不飽和或芳族，含有1個或2個獨立選自氮、氧及硫的雜原子，以及，其中，氮及硫雜原子可視需要經氧化，且氮雜原子可視需要四級化，「雜環」係包括任意上述雜環稠合至苯環之雙環。雜環可經雜原子 或碳原子接合。雜環係包括下述定義之雜芳基。雜環係包括嗎啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、哌基、乙內醯脲基、戊內醯胺基、環氧乙烷基、氧雜環丁烷基、四氫呋喃基、四氫吡喃基、四氫吡啶基、四氫嘧啶基、四氫噻吩基、四氫噻喃基、四氫嘧啶基、四氫噻吩基、四氫噻喃基等。
術語「視需要經取代之烷基」、「視需要經取代之烯基」、「視需要經取代之炔基」、「視需要經取代之醯基」、及「視需要經取代之雜環」係意指，當經取代時，至少一個氫原子係經取代基替代。於側氧取代基(=O)之例中，兩個氫原子被替代。就此而言，取代基係包括側氧基、鹵素、雜環、-CN、-ORx、-NRxRy、-NRxC(=O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(=O)Rx、-C(=O)ORx、-C(=O)NRxRy、-SOnRx及-SOnNRxRy，其中，n為0、1或2，Rx與Ry係相同或不同，且獨立為氫、烷基或雜環，且該烷基及雜環取代基可各自進一步經側氧基、鹵素、-OH、-CN、alkyl、-ORx、雜環、-NRxRy、-NRxC(=O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(=O)Rx、-C(=O)ORx、-C(=O)NRxRy、-SOnRx及-SOnNRxRy之一者或多者取代。
「鹵素」係意指氟、氯、溴及碘。
於某些態樣中，本發明方法可能需要使用保護基。保護基方法學係熟識該技藝者所習知(參見，舉例而言，Protective Groups in Organic Synthesis,Green,T.W.et al.,Wiley-Interscience,New York City,1999)。簡言之， 本發明內文中之保護基係降低或消除官能基之非所欲反應性的任意基。保護基可加至官能基以遮蔽後者於某些反應中的反應性，並隨後移除該保護基以顯露初始之官能基。於某些態樣中，係使用「醇保護基」。「醇保護基」係減輕或消除醇官能基之非所欲反應性的任意基。保護基可使用該技藝中已知之技術加入及移除。
式A之合成
於某些態樣中，本發明之核酸-脂質顆粒係使用式A之陽離子性脂質配製： 其中，R1與R2係獨立之烷基、烯基或炔基，各自可視需要經取代；以及，R3與R4係獨立為低級烷基，或R3與R4可一起形成視需要經取代之雜環。於某些態樣中，該陽離子脂質係XTC(2,2-二亞麻油基-4-二甲基胺基乙基-[1,3]-二氧雜環戊烷)。通常，上式A之脂質可藉由下述反應式1或2作成，其中，除特別指出者，全部取代基係如上述定義者。
反應式1
脂質A可根據反應式1製備之，其中，R1與R2係獨立為烷基、烯基或炔基，各自可視需要經取代；以及，R3與R4係獨立為低級烷基，或R3與R4可一起形成視需要經取代之雜環。酮1及溴化物2可購買或根據彼等熟識該技藝者已知之方法製備。1與2之反應得到縮酮3。以胺4處理縮酮3，獲得式A之脂質。式A之脂質可經式5之有機鹽處理而轉化為相應之銨鹽，其中，X係選自鹵素、氫氧化物、磷酸鹽、硫酸鹽等之對抗陰離子。
或者，可根據反應式2製備該起始物質酮1。格林試 劑6及氰化物7可購買或根據彼等熟識該技藝者已知之方法製備。6與7之反應得到酮1。酮1至相應式A之脂質的轉化係如反應式1中揭示者。
MC3之合成
DLin-M-C3-DMA(亦即，(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基胺基)丁酸酯)之製備係如下所述。將(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-醇(0.53g)、鹽酸4-N,N-二甲基胺基丁酸(0.51g)、4-N,N-二甲基胺基吡啶(0.61g)及鹽酸1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺(0.53g)於二氯甲烷(5mL)中的溶液於室溫攪拌過夜。以稀鹽酸洗滌該溶液，隨後以稀的碳酸氫鈉水溶液洗滌。有機區分以無水硫酸鎂乾燥，過濾，以旋轉蒸發器移除溶劑。殘質通過矽膠柱(20g)使用1至5%甲醇/二氯甲烷洗脫液梯度洗脫。合併含有經純化產物之區分並移除溶劑，獲得無色油(0.54g)。
ALNY-100之合成
使用下述反應式3施行縮酮519[ALNY-100]之合成：
515之合成
於二頸RBF(1L)中，於0℃氮氣氛圍下，於攪拌下，將514(10g,0.04926mol)於70mL之THF中的溶液緩慢加入LiAlH4(3.74g,0.09852mol)於200ml無水THF中的懸浮液中。完全加入後，將該反應混合物回暖至室溫，隨後加熱至回流4h。藉由TLC監控反應進程。反應完全(藉由TLC)後，將該混合物冷卻至0℃，小心地加入飽和Na2SO4溶液而粹滅反應。將該反應混合物於室溫攪拌4小時並過濾。殘質以THF充分洗滌。混合濾液及洗滌液，並以400mL二烷及26mL濃HCl稀釋，並於室溫攪拌20分鐘。於真空下抽除揮發物，以提供作為白色固體之515鹽酸鹽。產率：7.12g。1H-NMR(DMSO,400MHz)：δ=9.34(broad,2H),5.68(s,2H),3.74(m,1H),2.66-2.60(m,2H),2.50-2.45(m,5H)。
516之合成
於250mL二頸RBF中，於攪拌下，將NEt3(37.2mL,0.2669mol)加入化合物515於100mL乾燥DCM中的溶液中，於氮氣氛下冷卻至0℃。緩慢加入溶解於50mL乾燥DCM中的N-(芐氧基-羰氧基)-琥珀醯亞胺(20g,0.08007mol)之後，令該混合物回暖至室溫。反應完全後(2至3小時，藉由TLC監控)，連續以1N HCl溶液(1×100mL)及飽和NaHCO3溶液(1×50mL)洗滌該混合物。有機層隨後以無水Na2SO4乾燥，蒸發溶劑以得到粗產物，藉由矽膠柱色層分析純化以獲得作為黏性物質之516。產率： 11g(89%)。1H-NMR(CDCl3,400MHz)：δ=7.36-7.27(m,5H),5.69(s,2H),5.12(s,2H),4.96(br.,1H)2.74(s,3H),2.60(m,2H),2.30-2.25(m,2H)。LC-MS[M+H]：232.3(96.94%)。
517A及517B之合成
於室溫，於單頸500mL RBF中，將環戊烯516(5g,0.02164mol)溶解於220mL丙酮與水(10：1)之溶液中，將N-甲基嗎啉-N-氧化物(7.6g,0.06492mol)加入其中，之後加入4.2mL之OsO4(0.275g,0.00108mol)於第三丁醇中的7.6%溶液中。反應完全(約3小時)後，加入固體Na2SO3粹滅該混合物，將所得混合物於室溫攪拌1.5小時。以DCM(300mL)稀釋反應混合物，並先後以水(2×100mL)、飽和NaHCO3(1×50mL)溶液、水(1×30mL)及最後之鹽水(1×50mL)洗滌。有機相以無水Na2SO4乾燥，真空移除溶劑。粗產物經矽膠柱色層分析純化得到非鏡像異構物之混合物，其係藉由製備HPLC分離。產率：約6g粗產物。
517A：Peak-1(白色固體)，5.13g(96%)。1H-NMR(DMSO,400MHz)：δ=7.39-7.31(m,5H),5.04(s,2H),4.78-4.73(m,1H),4.48-4.47(d,2H),3.94-3.93(m,2H),2.71(s,3H),1.72-1.67(m,4H)。LC-MS-[M+H]-266.3，[M+NH4+]-283.5存在，HPLC-97.86%。藉由X-射線證實立體化學。
518之合成
使用與揭示用於合成化合物505之合成者類似的過程，獲得作為無色油之化合物518(1.2g,41%)。1H-NMR (CDCl3,400MHz)：δ=7.35-7.33(m,4H),7.30-7.27(m,1H),5.37-5.27(m,8H),5.12(s,2H),4.75(m,1H),4.58-4.57(m,2H),2.78-2.74(m,7H),2.06-2.00(m,8H),1.96-1.91(m,2H),1.62(m,4H),1.48(m,2H),1.37-1.25(br m,36H),0.87(m,6H)。HPLC-98.65%。
合成化合物519之通常過程
將化合物518(1eq)於己烷(15mL)中的溶液逐滴加入LAH於THF(1M,2eq)之冰冷溶液中。完全加入之後，將該混合物於40℃加熱0.5小時，隨後於冰浴上再次冷卻。以飽和Na2SO4水溶液將該混合物小心地水解，隨後透過矽藻土過濾，並還原為油狀。柱色層分析提供作為無色油而獲得之純519(1.3g,68%)。13C NMR δ=130.2,130.1(x2),127.9(x3),112.3,79.3,64.4,44.7,38.3,35.4,31.5,29.9(x2),29.7,29.6(x2),29.5(x3),29.3(x2),27.2(x3),25.6,24.5,23.3,226,14.1；電灑MS(+ve)：C44H80NO2(M+H)+分子量之計算值為654.6，實測值為654.6。
藉由標準方法或無押出方法製備之製劑可藉由類似模式表徵之。舉例而言，製劑典型係藉由外觀檢查表徵之。其等應為不含凝聚體或沉澱物之發白的半透明溶液。脂質-奈米顆粒之粒徑及粒徑分佈可藉由光散射測量，舉例而言，使用Malvern Zetasizer Nano ZS(Malvern,USA)而量測。顆粒之尺寸應為約20至300nm，如40至100nm。粒徑分佈應係單峰分佈。該製劑中之總dsRNA濃度，以及入陷(entrapped)之分率，係藉由染料排除檢定(dye exclusion assay)評估之。所配製之dsRNA樣本可以結合RNA之染料如Ribogreen(分子探針)於製劑干擾性界面活性劑如0.5% Triton-X100的存在或不存在下培育之。該製劑中之總dsRNA可藉由來自含有該界面活性劑之樣本的訊號，相對於標準曲線測定。入陷之分數係藉由自總dsRNA含量減去「自由」dsRNA含量(藉由不存在界面活性劑下之訊號量測者)而測定。入陷之dsRNA的百分比典型係>85%。對於LNP製劑，顆粒尺寸為至少30nm、至少40nm、至少50nm、至少60nm、至少70nm、至少80nm、至少90nm、至少100nm、至少110nm、and至少120nm。適宜之範圍典型係約至少50nm至約至少110nm、約至少60nm至約至少100nm、或約至少80nm至約至少90nm。
用於口服給藥之組成物及製劑係包括粉末或顆粒、微粒、奈米顆粒、於水或非水介質中的懸浮液或溶液、膠囊劑、凝膠膠囊劑、袋裝劑、片劑或小片劑。增稠劑、芳香劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或黏合劑可為所欲者。於某些態樣中，口服製劑係彼等中，本發明之dsRNA係與一種或多種穿透提升界面活性劑及螯合劑聯合給藥者。適宜之界面活性劑係包括脂肪酸類及/或其酯或鹽、膽汁酸類及/或其鹽。適宜之膽汁酸/鹽係包括鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid)(CDCA)及熊去氧鵝去氧膽酸(ursodeoxychenodeoxycholic acid)(UDCA)、膽酸、去氫膽酸、去氧膽酸、麩胺膽酸(glucholic acid)、甘膽酸(glycholic acid)、去氧甘膽酸(glycodeoxycholic acid)、牛磺膽酸、去 氧牛磺膽酸、牛磺-24,25二氫-褐黴酸鈉及甘二氫褐黴酸鈉(sodium glycodihydrofusidate)。適宜之脂肪酸類係包括花生四烯酸、十一酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻油酸、蘇子油酸、二癸酸酯、三癸酸酯、單油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、1-單癸酸甘油酯、1-十二烷基氮雜環庚-2-酮、乙醯基肉鹼、乙醯基膽鹼、或其單甘油酯、二甘油酯或藥學可接受之鹽(如，鈉鹽)。於某些態樣中，係使用穿透提升劑之組合，舉例而言，脂肪酸/鹽與膽汁酸/鹽之組合。一個例示性組合係月桂酸之鈉鹽、癸酸與UDCA。其他穿透提升劑係包括聚氧伸乙基-9-月桂基醚、聚氧伸乙基-20-鯨蠟基醚。本發明之DsRNA可口服遞送，其形式為顆粒包括噴乾顆粒或與微粒或奈米顆粒形式錯合。DsRNA錯合劑係包括聚胺基酸類；聚亞胺類；聚丙烯酸酯類；聚丙烯酸烷基酯類；聚環氧丙烷類(polyoxethanes)；聚氰基丙烯酸烷基酯類；陽離子化明膠、白蛋白、澱粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(PEG)及澱粉；聚烷基氰基丙烯酸酯類；DEAE-衍生化聚亞胺、短梗霉多糖(pollulan)、纖維素及澱粉。適宜之錯合劑係包括幾丁聚醣、N-三甲基幾丁聚醣、聚-L-離胺酸、聚組胺酸、聚精胺、魚精蛋白、聚乙烯基吡啶、聚硫代二乙基胺基甲基乙烯P(TDAE)、聚胺基苯乙烯(如，對胺基)、聚(氰基丙烯酸甲酯)、聚(氰基丙烯酸乙酯)、聚(氰基丙烯酸丁酯)、聚(氰基丙烯酸異丁酯)、聚(氰基丙烯酸異己酯)、DEAE-甲基丙烯酸酯、DEAE-丙烯酸己酯、DEAE-丙烯醯胺、DEAE-白蛋白 及DEAE-糊精、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸己酯、聚(D,L-乳酸)、聚(DL-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、藻酸酯、及聚乙二醇(PEG)。dsRNA之口服製劑及其製備方法係詳細揭示於第6,887,906號美國專利、第20030027780號美國公開、及第6,747,014號美國專利中，該等專利係各自藉由引用而併入本文。
用於不經腸道給藥、腦實質內給藥(至腦內)、鞘內給藥、心室內給藥或肝內給藥的組成物可包括滅菌水溶液，其亦可含有緩衝劑、稀釋劑及其他適宜之佐劑如，但不限於，穿透提升劑、載劑化合物及其他藥學可接受之載劑或賦形劑。
本發明之藥物組成物係包括，但不限於，溶液、乳液、以及含脂質之製劑。此等組成物可自多種組分產生，該等組分係包括，但不限於，預形成之液體、自乳化之固體及自乳化之半固體。當治療肝臟病症如肝癌時，特佳者係以肝臟為目標之製劑。
本發明之藥物製劑，可以單元劑型便利地存在，可根據藥學工業中習知之傳統技術製備。此等技術係包括將活性成分與藥物載劑或賦形劑聯合的步驟。通常，該等製劑係藉由將活性成分與液體載劑或精細分割之固體載劑或兩者均勻且緊密地結合，隨後，若需要，成形為產品。
本發明之組成物可配製為多種可能劑型之一者，例如，但不限於，片劑、膠囊劑、凝膠膠囊劑、液 體糖漿劑、軟凝膠劑、栓劑、及灌腸劑。本發明之組成物亦可配製為水性、非水性或混合介質中的懸浮液。水性懸浮液可復含有增加該懸浮液之黏度的物質，包括，舉例而言，羧甲基纖維素鈉、山梨醇及/或糊精。該懸浮液亦可含有安定劑。
C. 額外之製劑
乳液
本發明之組成物可製備並配製為乳液。乳液典型係一種液體一般以直徑超過0.1μm之液滴形式分散於另一液體中的非均質系統(參見，如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.),New York,NY；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Volume 1,p.245；Block in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 2,p.335：Higuchi et al.,in Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.301)。通常，乳液係包含兩相緊密混合且分散於彼此中之不互混液體相的雙相系統。通常，乳液可為油包水(w/o)或水包油(o/w)形式。當水相被精細分割 並作為小液滴分散於大體積油相中時，所得組成物稱為油包水(w/o)乳液。或者，當油相被精細分割並作為小液滴分散於大體積水相中時，所得組成物稱為水包油(o/w)乳液。乳液除了含有分散相及可作為溶液存在於水相、油相或其自身作為獨立之相的活性藥物之外，亦可含有額外之組分。若需要，藥學賦形劑如乳化劑、安定劑、染料及抗氧化劑亦可存在於乳液中。藥學乳液亦可為多乳液，其係由超過兩相組成，如，舉例而言，於油包水包油(o/w/o)及水包油包水(w/o/w)乳液之例中。此等復合製劑往往提供簡單兩相乳液不具備的某些優勢。其中o/w乳液之個體油滴封裝小水滴的多乳液係構建w/o/w乳液。同樣，其內封裝有油滴之水珠在油性連續相中被安定化的系統係提供o/w/o乳液。
乳液之特徵係具有極低或不具有熱力學安定性。乳液之分散相或不連續相往往係良好分散於外加相或連續相中，並透過乳化劑或該製劑之黏度的手段維持為此形式。該乳液之每一相可為半固體或固體，如乳液類型之軟膏基底及乳膏的例子。安定化乳液之其他手段需要使用可併入該乳液之任一相的乳化劑。乳化劑可廣義地歸為四類：合成性界面活性劑、天然出現之乳化劑、吸收基質、及精細分散之固體(參見，如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。
合成性界面活性劑，亦認知為表面活性劑，業經於乳液之形成中發現廣泛用途，且業經於文獻中回顧(參見，如，Ansel'sPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.285；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,volume 1,p.199)。界面活性劑典型係兩親性且係包含親水性及疏水性部份。界面活性劑之親水特性與疏水特性之比係稱為親水/親油平衡(HLB)，且於製劑之製備中，係分類並選擇界面活性劑之有價值的工具。界面活性劑可基於親水性基而歸類為不同類別：非離子性、陰離子性、陽離子性及兩性(參見，如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.285).
於乳液製劑中使用之天然出現的乳化劑係 包括羊毛脂、蜂蠟、磷脂、卵磷脂及阿拉伯膠。吸收基質係具有親水性特性，故他們可令水皂化以形成w/o乳液，但仍維持他們的半固體一致性，如無水羊毛脂及親水石蠟油。精細分割之固體亦業經用作良好之乳化劑，尤其是與界面活性劑合用並用於黏性製劑中。此等係包括極性無機固體，如重金屬氫氧化物，非溶脹黏土如膨土、綠坡縷石、水輝石、高嶺土、蒙脫石、膠體矽酸鋁及膠體矽酸鋁鎂，顏料及非極性固體如碳或甘油三硬脂酸酯。
多種非乳化物質亦可包括於乳液之間並對乳液之特性有貢獻。此等係包括脂肪、油、蠟、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、保濕劑、親水性膠體、防腐劑及抗氧化劑(Block,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.335；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。
親水性膠體或水膠體係包括天然出現之膠類及合成性聚合物如多醣類(舉例而言，阿拉伯膠、瓊脂、海藻酸、卡拉膠、瓜爾膠、刺梧桐膠及黃蓍膠)、纖維素衍生物(舉例而言，羧甲基纖維素及羧丙基纖維素)、及合成性聚合物(舉例而言，卡波姆、纖維素醚、及羧乙烯基聚合物)。此等係分散或溶脹於水中，以形成膠體溶液，該溶液藉由環繞分散相液滴之強界面膜以及藉由增加該外加相之黏度而安定化乳液。
由於乳液往往含有大量組分，如可容易地支持微生物生長之碳水化合物類、蛋白質類、固醇類、及磷脂類，此等製劑往往併入防腐劑。通常使用者包括乳液製劑中的防腐劑，包括對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、四級銨鹽、殺藻胺(benzalkonium chloride)、對羥基苯甲酸之酯類、及硼酸。往往亦將抗氧化劑加入乳液製劑中，以防止該製劑之變質。所使用之抗氧化劑可為自由基捕獲劑如生育酚類、沒食子酸烷基酯類、丁基化羥基苯甲醚、丁基化羥基甲苯，或還原劑如抗壞血酸及偏亞硫酸氫鈉，以及抗氧化劑增效劑如檸檬酸、酒石酸及卵磷脂。
乳液製劑之經皮膚、口服及非經腸道途徑之應用及其製造方法業經於文獻中回顧(參見，如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。由於其易於配製以及來自吸收及生物利用性觀點之效能，用於口服遞送之乳液製劑業經非常廣泛地使用(參見，如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker, Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。礦物油系瀉藥、油溶性維生素及高脂肪營養製劑係一般業經作為o/w乳液口服給藥的物質之一。
ii. 微乳液
於本發明之一態樣中，iRNA與核酸之組成物係配製為微乳液。微乳液可定義為水、油及兩親物之系統，其係單一之光學各向同性且熱力學安定之液體溶液(參見，如，Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245)。典型地，微乳液係藉由下述製備之系統：首先將油分散於界面活性劑水溶液中，隨後加入足量之通常為中等鏈長之醇的第四組分，以形成透明之系統。因此，微乳液亦業經揭示為兩種不互混之液體的熱力學安定、各向同性之澄清分散液，其係藉由表面活性分子之界面膜安定化(Leung and Shah,in：Controlled Release of Drugs：Polymers and Aggregate Systems,Rosoff,M.,Ed.,1989,VCH Publishers,New York,pages 185-215)。微乳液一般係藉由將包括油、水、界面活性劑、輔界面活性劑及電解質的三至五種組分組合而製備。該微乳液為油包水 (w/o)或水包油(o/w)類型係取決於所使用之油及界面活性劑的特性以及該等界面活性劑分子之極性頭部與烴尾部的結構及幾何封裝(Schott,in Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.271)。
使用相圖之現象學取徑業經廣泛研究，並令熟識該技藝之人士獲得如何配製微乳液之全面知識(參見，如，Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245；Block,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.335)。相較於傳統乳液，微乳液係提供下述優勢：令水不溶性藥物溶解於自發形成熱力學安定液滴之製劑中。
用於製備微乳液之界面活性劑係包括但不限於，離子性界面活性劑、非離子性界面活性劑、Brij 96、聚氧伸乙基油基醚、聚甘油脂肪酸酯、四甘油單月桂酸酯(ML310)、四甘油單油酸酯(MO310)、六甘油單油酸酯(PO310)、六甘油五油酸酯(PO500)、十甘油單癸酸酯(MCA750)、十甘油單油酸酯(MO750)、十甘油倍半油酸酯(SO750)、十甘油十油酸酯(DAO750)，單獨使用或與輔界面活性劑合用。該輔界面活性劑，通常為短鏈醇如乙醇、1- 丙醇、及1-丁醇，其藉由穿透界面活性劑膜並因此由於界面活性劑分子之間產生空穴空間而創造異常(disordered)膜，從而增加界面流動性。惟，微乳液可不使用輔界面活性劑而製備，且不含醇之自乳化微乳液系統係該技藝中已知者。該水性典型可為，但不限於，水、藥物之水溶液、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙二醇、及乙二醇之衍生物。該油相可包括，但不限於，物質如Captex 300；Captex 355；Capmul MCM；脂肪酸酯類；中鏈(C8-C12)單、二及三甘油酯；聚氧乙基化脂肪酸甘油酯類；脂肪醇類；聚二醇化甘油酯類；飽和聚二醇化C8-C10甘油酯類；植物油類；以及矽油。
自藥物溶解性及提升藥物吸收的觀點來看，微乳液尤係興趣之所在。脂質系微乳液(o/w及w/o兩者)業經被建議用以提升藥物包括肽類之口服生物利用性(參見，如，第6,191,105號、第7,063,860號、第7,070,802號、第7,157,099號美國專利；Constantinides et al.,Pharmaceutical Research,1994,11,1385-1390；Ritschel,Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.,1993,13,205)。微乳液係賦予下述優勢：改善之藥物溶解性、保護藥物不被酵素水解、由於界面活性劑誘發之膜流動性及穿透性改變而可能提升之藥物吸收、易製備、易以固體劑型口服給藥、改善之臨床潛力、及減輕之毒性(參見，如，第6,191,105號、第7,063,860號、第7,070,802號、第7,157,099號美國專利；Constantinides et al.,Pharmaceutical Research,1994, 11,1385；Ho et al.,J.Pharm.Sci.,1996,85,138-143)。通常，當將微乳液之組分於室溫聚集時，可自發形成微乳液。當配製熱不穩定藥物、肽或iRNA時，這尤其具有優勢。在化妝及藥物應用中，微乳液業經有效地進行活性成分之經皮遞送。預期本發明之微乳液組成物及製劑將促進增加自胃腸道對於iRNA及核酸的全身性吸收，並改善對於iRNA及核酸的局部細胞攝取。
本發明之微乳液亦可含有額外之組分及佐劑如去水山梨醇單硬脂酸酯(Grill 3)、Labrasol、及穿透提升劑，以改善該製劑之特性並提升對於本發明之iRNA及核酸的吸收。於本發明之微乳液中使用的穿透提升劑可歸類為屬於五大廣義範疇之一者：界面活性劑類、脂肪酸類、膽汁鹽類、螯合劑類、及非螯合非界面活性劑類(Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)。此等類型之每一者業經揭示如上。
iii. 微粒
本發明之RNAi劑可併入顆粒如微粒中。微粒可藉由噴灑乾燥而製備，但亦可藉由其他方法製備，該等其他方法係包括凍乾、蒸發、流動床乾燥、真空乾燥、或此等技術之組合。
iv. 穿透提升劑
於一態樣中，本發明係採用多種穿透提升劑以影響核酸尤其iRNA有效遞送至動物皮膚。多數藥物係以離子化及非離子化兩種形式存在於溶液中。惟，通常，僅脂溶性 或親脂性藥物輕易地穿過細胞膜。業經發現，若以穿透提升劑處理待穿過之膜，甚至非親脂性藥物亦可穿過細胞膜。除了輔助非親脂性藥物穿過細胞膜之擴散外，穿透提升劑亦提升親脂性藥物的穿透能力。
穿透提升劑可歸類為屬於五大廣義範疇之一者，亦即，界面活性劑類、脂肪酸類、膽汁鹽類、螯合劑類、及非螯合非界面活性劑類(參見，如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)。上述穿透提升劑之每一類型係於下文更詳細揭示之。
界面活性劑(或「表面活性劑」)係化學實體，當將其溶解於水溶液中時，其係降低該溶液之表面張力或該水溶液與另一液體之間的界面張力，結果提升透過黏膜對iRNA的吸收。除了膽汁鹽類及脂肪酸類，此等穿透提升劑係包括，舉例而言，十二烷基硫酸鈉、聚氧伸乙基-9-月桂醚及聚氧伸乙基-20-鯨蠟基醚)(參見，如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)；及全氟化學乳液，如FC-43(Takahashi et al.,J.Pharm.Pharmacol.,1988,40,252).
多種作為穿透提升劑之脂肪酸及其衍生物係包括，舉例而言，油酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉豆蔻 酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻油酸、蘇子油酸、二癸酸酯、三癸酸酯、單油酸甘油酯(1-單油醯基-rac-甘油)、二月桂酸甘油酯、辛酸、花生四烯酸、1-單癸酸甘油酯、1-十二烷基氮雜環庚-2-酮、乙醯基肉鹼、乙醯基膽鹼、其C1-20烷基酯(如，甲酯、異丙酯及第三丁酯)、及其單甘油酯及二甘油酯(如，油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、肉豆蔻酸酯、棕櫚酸酯、硬脂酸酯、亞麻油酸酯等)(參見，如，Touitou,E.,et al.Enhancement in Drug Delivery,CRC Press,Danvers,MA,2006；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92；Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33；El Hariri et al.,J.Pharm.Pharmacol.,1992,44,651-654)。
膽汁之生理學角色係包括促進脂質及脂溶性維生素之分散及吸收(參見，如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Brunton,Chapter 38 in：Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,9th Ed.,Hardman et al.Eds.,McGraw-Hill,New York,1996,pp.934-935)。多種天然膽汁鹽類及其合成性衍生物係作為穿透提升劑。因此，術語「膽汁鹽類」係包括天然出現之膽汁組分的任意者及其合成性衍生物的任意者。適宜之膽汁鹽類係包括，舉例而言，膽酸(或其藥學可接受之鈉鹽，膽酸鈉)、去氫膽酸(去氫膽酸鈉)、去氧膽酸(去氧膽酸鈉)、麩胺膽酸(麩胺膽酸鈉)、甘膽酸(甘膽酸鈉)、去氧甘膽酸(去 氧甘膽酸鈉)、牛磺膽酸(牛磺膽酸鈉)、牛磺去氧膽酸(牛磺去氧膽酸鈉)、鵝去氧膽酸(鵝去氧膽酸鈉)、熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid)(UDCA)、牛磺-24,25-二氫-褐黴酸鈉(STDHF)、甘二氫褐黴酸鈉及聚氧伸乙基-9-月桂醚(POE)(參見，如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,page 92；Swinyard,Chapter 39 In：Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.,Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1990,pages 782-783；Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33；Yamamoto et al.,J.Pharm.Exp.Ther.,1992,263,25；Yamashita et al.,J.Pharm.Sci.,1990,79,579-583)。
螯合劑如與本發明合用者，可定義為下述化合物：藉由與金屬離子形成錯合物而將後者自溶液移除，結果提升透過黏膜對iRNA的吸收者。慮及其在本發明中係用作穿透提升劑，由於多數特徵化DNA核酸酶係需要二價金屬離子用於催化並因此被螯合劑抑制，螯合劑亦具有作為DNase抑制劑之加成優勢(Jarrett,J.Chromatogr.,1993,618,315-339)。適宜之螯合劑係包括，但不限於，乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、檸檬酸、柳酸鹽(如，柳酸鈉、5-甲氧基柳酸鹽及高香蘭酸鹽(homovanilate))、膠原之N-乙醯基衍生物、聚乙二醇單月桂醚(laureth-9)及β-二酮類之 N-胺基乙醯基衍生物(烯胺類)(參見，如，Katdare,A.et al.,Excipient development for pharmaceutical,biotechnology,and drug delivery,CRC Press,Danvers,MA,2006；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,page 92：Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33；Buur et al.,J.Control Rel.,1990,14,43-51)。
本文中，非螯合非界面活性劑之穿透提升化合物可定義為下述化合物：其顯示不顯著之作為螯合劑或界面活性劑的活性，但仍提升透過消化道黏膜對於iRNA的吸收(參見，如，Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33)。這類穿透提升劑係包括，舉例而言，不飽和環狀脲類、1-烷基-及1-烯基氮雜環-烷酮衍生物(Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,page 92)；以及，非甾體消炎劑如雙氯滅痛(diclofenac sodium)、茚甲新(indomethacin)及苯基丁氮酮(phenylbutazone)(Yamashita et al.,J.Pharm.Pharmacol.,1987,39,621-626)。
提升細胞水平之iRNA攝取的劑亦可加入本發明之藥物組成物及其他組成物中。舉例而言，亦已知陽離子性脂質如脂轉染物(lipofectin)(Junichi等人，第5,705,188號美國專利)、陽離子性甘油衍生物、及聚陽離子性分子如聚離胺酸(polylysin)(Lollo等人，第WO 97/30731號世界專利)係提升對於dsRNA之細胞攝取。 可商購之轉染試劑的實例係包括，舉例而言，LipofectamineTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、Lipofectamine 2000TM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、293fectinTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、CellfectinTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、DMRIE-CTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、FreeStyleTM MAX(Invitrogen；Carlsbad,CA)、LipofectamineTM 2000 CD(Invitrogen；Carlsbad,CA)、LipofectamineTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、RNAiMAX(Invitrogen；Carlsbad,CA)、OligofectamineTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、OptifectTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、X-tremeGENE Q2轉染試劑(Roche；Grenzacherstrasse,Switzerland)、DOTAP脂質體轉染試劑(Grenzacherstrasse,Switzerland)、DOSPER脂質體轉染試劑(Grenzacherstrasse,Switzerland)、或Fugene(Grenzacherstrasse,Switzerland)、Transfectam®試劑(Promega；Madison,WI)、TransFastTM轉染試劑(Promega；Madison,WI)、TfxTM-20試劑(Promega；Madison,WI)、TfxTM-50試劑(Promega；Madison,WI)、DreamFectTM(OZ Biosciences；Marseille,France)、EcoTransfect(OZ Biosciences；Marseille,France)、TransPassa D1轉染試劑(New England Biolabs；Ipswich,MA,USA)、LyoVecTM/LipoGenTM(Invitrogen；San Diego,CA,USA)、PerFectin轉染試劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、NeuroPORTER轉染試劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、GenePORTER轉染試劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、GenePORTER 2 轉染試劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、細胞轉染劑(Cytofectin)轉染試劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、BaculoPORTER轉染試劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、TroganPORTERTM轉染試劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、RiboFect(Bioline；Taunton,MA,USA)、PlasFect(Bioline；Taunton,MA,USA)、UniFECTOR(B-Bridge International；Mountain View,CA,USA)、SureFECTOR(B-Bridge International；Mountain View,CA,USA)，或HiFectTM(B-Bridge International,Mountain View,CA,USA)等。
可使用其他劑以提升所給藥之核酸的穿透，包括二醇類如乙二醇及丙二醇、吡咯類如2-吡咯、氮酮類、及萜類如檸檬烯及薄荷酮。
v. 載劑
本發明之某些組成物亦於製劑中合併載劑化合物。本文中，「載劑化合物」或「載劑」可指核酸或其類似物，其係惰性(亦即，自身不具有生物活性)但被體內製程鑒別為核酸，其藉由諸如令生物學活性之核酸降解或促進後者自循環移除而降低具有生物活性之核酸的生物利用性。將核酸與載劑化合物共同給藥，典型係後者過量之方式，可導致自肝臟、腎臟或其他外循環存儲器官中回收之核酸量的實質性降低，咸認是由於該載劑化合物與核酸之間對於一般受體的競爭。舉例而言，當與聚肌苷酸、硫酸糊精、聚胞苷酸(polycytidic acid)或4-乙醯胺基-4'-異硫氰酸酯基- 茋-2,2'-二磺酸共同給藥時，自肝組織回收的部份硫代磷酸酯化之dsRNA可能降低(Miyao et al.,DsRNA Res.Dev.,1995,5,115-121；Takakura et al.,DsRNA & Nucl.Acid Drug Dev.,1996,6,177-183)。
vi. 賦形劑
與載劑化合物相反，「藥學載劑」或「賦形劑」係用於將一種或多種核酸遞送至動物之藥學可接受的溶解、懸浮劑或任意其他藥理學惰性運載劑。當與核酸及給定藥物組成物之其他組分合用時，該賦形劑可為液體或固體，且慮及給藥之計畫模式而選擇，以提供所欲之體積、一致性等。典型之藥學載劑係包括，但不限於，黏合劑(如，預膠化之玉米澱粉、聚乙烯基吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素等)；填料(如，乳糖及其他糖類、微晶纖維素、果膠、明膠、硫酸鈣、乙基纖維素、聚丙烯酸酯類或磷酸氫鈣等)；潤滑劑(如，硬脂酸鎂、滑石、氧化矽、膠體二氧化矽、硬脂酸、金屬硬脂酸鹽、氫化植物油、玉米澱粉、聚乙二醇、苯甲酸鈉、醋酸鈉等)；崩解劑(如，澱粉、羥基乙酸澱粉鈉等)；以及，潤濕劑(如，月桂基硫酸鈉等)。
亦可使用不與核酸發生有害反應之藥學可接受之適用於非經腸道給藥的有機或無機賦形劑來配製本發明之組成物。適宜之藥學可接受之載劑係包括，但不限於，水、鹽溶液、醇類、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈澱粉、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、黏性石蠟、羥甲基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮等。
核酸之局部用製劑可包括滅菌及非滅菌水溶液、於一般溶劑如醇類中之非水溶液、或核酸於液體或固體油基底中之溶液。該等溶液亦可含有緩衝劑、稀釋劑、及其他適宜之佐劑。可使用不與核酸發生有害反應之藥學可接受之適用於非經腸道給藥的有機或無機賦形劑。
適宜之藥學可接受之賦形劑係包括，但不限於，水、鹽溶液、醇類、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈澱粉、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、黏性石蠟、羥甲基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮等。
vii. 其他組分
本發明之組成物可額外地含有其他傳統上於藥物組成物中發現之添加劑組分，其量為該技藝中建立之使用水平。因此，舉例而言，該等組成物可含有額外之相容之藥學活性物質如，舉例而言，止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或消炎劑，或可含有可用於物理性配製本發明之組成物之多種劑型的額外物質如，染料、芳香劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑、及安定劑。惟，當加入此等物質時，其不應過度干擾本發明之組成物的組分。若需要，該等製劑可經滅菌並與輔劑混合，該等輔劑係不與該製劑之核酸進行有害反應者，如潤滑劑、防腐劑、安定劑、潤濕劑、乳化劑、影響滲透壓之鹽、緩衝劑、著色劑、芳香劑及/或芳香物質。
水性懸浮液可含有增加該懸浮液黏度之物質，包括，舉例而言，羧甲基纖維素鈉、山梨醇及/或糊 精。該懸浮液亦可含有安定劑。
於某些態樣中，本發明之藥物組成物係包括(a)一種或多種iRNA化合物，以及(b)一種或多種以非RNAi機制起作用且有用於治療血友病之劑。該等劑之實例係包括，但不限於，消炎劑、抗脂肪變性劑、抗病毒劑、及/或抗纖維變性劑。此外，其他一般用以保護肝臟之物質如水飛薊素(silymarin)亦可用於與本文揭示之iRNA合用。其他用於治療肝病之劑係包括替比夫定(telbivudine)、恩替卡韋(entecavir)、及蛋白酶抑制劑如特拉匹韋(telaprevir)及其他於諸如Tung等人之第2005/0148548號、第2004/0167116號、及第2003/0144217號美國專利申請案中以及Hale等人之第2004/0127488號美國專利申請案中揭示者。
該等化合物之毒性及療效可藉由標準藥學步驟於細胞培養或實驗性動物如用於測定LD50(群落50%致死的劑量)及ED50(對群落50%治療有效的劑量)者中測定。毒性與療效之間的劑量比係治療係數，且其可以LD50/ED50比表示。顯現高治療係數之化合物係較佳者。
自細胞培養檢定及動物研究獲得之數據可用於制定人類所用劑量的範圍。本文指出之本發明之組成物的劑量，通常係處於包括具有低毒或無毒ED50的循環濃度範圍內。該劑量可依據所採用之劑型及所使用之給藥途徑而於此範圍內變動。對於本發明之方法中使用的任意化合物，其治療有效劑量可自細胞培養檢定初始估算。可於動物模型中制定劑量，以達成該化合物之循環血漿濃度 範圍或，當適宜時，目標序列之多肽產物的血漿濃度範圍(如，達成降低之多肽濃度)，該範圍係包括於細胞培養中測定之IC50(亦即，對症候達成一半之最大抑制的測試化合物濃度)。此訊息可用以更精確地測定人類之有用劑量。血漿中之水平可藉由，舉例而言，高效液相色層分析而量測。
除了其如上討論之投藥方式外，本發明中主要之iRNA可與其他已知對Serpina1表現影響發生之病理過程治療有效之試劑組合投藥。任何情況下，投藥藥物之醫治者以使用現有技術已知或於此描述之標準測量藥效方法觀察到之結果為基礎，可調整iRNA投藥之量及時間。
V. 抑制Serpina1表現之方法
本發明提供於細胞中抑制Serpina1表現之方法。該方法包括以有效於細胞中抑制Serpina1表現之量之RNAi試劑，如雙股RNAi試劑，接觸細胞，因此抑制細胞中之Serpina1表現。
以雙股RANi試劑接觸細胞可於活體外或體內完成。體內以該RNAi試劑接觸細胞包括於個體(如人類個體)中以該RNAi試劑接觸一個細胞或一群細胞。組合活體外及體內之接觸方法亦為可行。接觸可為直接或間接，如上述討論。此外，接觸細胞可完成，透過目標配體，包括任何於此描述或現有技術中已知之配體。於一較佳具體實施例中，該目標配體係為醣類部分，如N-乙醯基葡萄糖胺配體，或任何其他將RNAi試劑引導至感興趣位置(如個 體之肝臟)之配體。
於此使用之術語“抑制”係可與“減少”、“沉默”、“向下調節”及其他類似術語取代，並包括任何程度之抑制。
“抑制Serpina1表現”之用語係意指任何Serpina1基因(如小鼠之Serpina1基因、大鼠之Serpina1基因、猴子之Serpian1基因或人類之Serpina1基因)之表現上的抑制以及變異體或Serpina1基因之突變。因此，該Serpina1基因可為野生型Serpina1基因、突變之Serpina1基因或於文中所提之基因操作之細胞、細胞群或器官中轉殖之Serpina1基因。
“抑制Serpina1基因之表現”包括任何程度之Serpina1基因之抑制，如至少部分抑制Serpina1基因之表現。Serpina1基因之表現可根據任何有關於Serpina1基因之變數之表現程度為基準來評估。如Serpina1mRNA表現量、Serpina1蛋白質表現量或脂質表現量。此表現量可評估於個別獨立細胞或一群細胞包括，例如個體中取出之樣本。
抑制可利用一或多個該等變數與控制組之表現量相比後之絕對或相對表現量之減少來評估。控制組表現量可以為現有技術中任何形式控制組表現量，如投藥前基線表現量或檢測未經處理或控制組處理(如僅含緩衝溶液之控制組或非活性試劑控制組)之相近個體、細胞或樣本之表現量。
本發明中方法之某些具體實施例，Serpina1基因之表現量被抑制至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%。
Serpian1基因之表現抑制可利用第一細胞或細胞群(此細胞可能存在於，例如於個體取出之樣本中)，其中Serpina1基因於此轉錄且已被治療(如利用本發明之RNAi試劑接觸該細胞或細胞群，或利用投藥本發明之RNAi試劑至該細胞存在或曾經存在之個體中)相比於第二細胞或細胞群，基本上與第一細胞或細胞群相同，但其不曾被如此治療(控制組細胞或細胞群)之mRNA表現總量減少來證明，以至於Serpina1基因之表現被抑制。於一較佳具體實施例中，該抑制係利用經處理細胞中mRNA表現程度與控制組細胞中mRNA表現程度之百分比評估，使用以下計算式： 或者，Serpina1基因表現之抑制可根據功能上連結至Serpina1基因表現之參數，例如Serpina1蛋白質表現量， 如丙胺酸轉胺酶(ALT)、鹼性磷酸酶、膽紅素、凝血酶原和白蛋白來評估，。Serpina1基因之沉默可被檢測於任何表現Serpina1之細胞中，無論是原本結構或經基因工程重組者並利用任何現有技術中已知之試驗。肝臟係Serpina1表現之主要位置。其他重要之表現位置包括肺臟和腸。
Serpina1蛋白表現之抑制可利用細胞或細胞群所表現之Serpina1蛋白質(如自個體取出之樣本所表現之蛋白質量)減少來證明。如前所解釋之mRNA減少之評估，經處理之細胞或細胞群中蛋白質量之抑制可用相似方式以控制組細胞或細胞群之蛋白質量之百分比表示。
控制組細胞或細胞群可被用於評估Serpina1基因表現之抑制，包括細胞或細胞群其尚未接觸本發明之RNAi試劑。例如，該細胞或細胞群可取自獨立個體(如人類或動物個體)中，在以RNAi試劑治療該個體前。
細胞或細胞群表現之Serpina1mRNA表現量可利用任何現有技術中已知之檢測mRNA表現量之方式來檢測。於一具體實施例中，Serpina1於樣本中之表現量係利用偵測被轉錄之多核苷酸或其部分(如Serpina1基因之mRNA)來檢測。RNA可被萃取自細胞中，利用RNA萃取技術包括，例如使用酸化之酚/異硫氰酸胍(acid phenol/guanidine isothiocyanate)萃取液(RNAzol B；Biogenesis)、RNeasy RNA製備試劑盒(Qiagen)或PAXgene(PreAnalytix,Switzerland)。典型使用核糖核苷酸雜合之試驗形式包括核 轉錄活性試驗(nuclear run-on assays)、反轉錄聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR)、核醣核酸水解酶保護試驗(RNase protection assays)(Melton et al.,Nuc.Acids Res.12：7035)、北方墨點法(Northern blotting)、原位雜合技術(in situ hybridization)及微陣列(microarray)分析。
於一具體實施例中，Serpina1之表現量係使用核酸探針(nucleic acid probe)檢測。於此所使用術語“探針”意指任何分子其能夠選擇性組合至特定Serpina1。探針可被熟習本技術領域知識者合成或自適當之生物製品中獲得。探針可被特定設計為被標誌。可用為探針之分子實例包括，但不限於RNA、DNA、蛋白質、抗體及有機分子。
經分離之mRNA可用於雜合或放大試驗包括，但不限於南方或北方分析、聚合酶鏈鎖反應分析及探針陣列。檢測mRNA量之方法涉及到以核酸分子(探針)接觸該分離之mRNA而使其雜合於Serpina1mRNA。於一具體實施例中，該mRNA係被固定於固體表面上並用探針接觸，例如將該分離RNA跑於瓊脂膠體上並將該mRNA自膠體轉置至膜(如硝化纖維素)上。於一選擇之具體實施例中，該探針係被固定於固體表面並以探針接觸mRNA，例如於Affymetrix基因晶片陣列。熟習技藝者可輕易修改已知之mRNA偵測方法以用於檢測Serpina1 mRNA量。
檢測Serpina1於樣本中之表現量之可選擇方法涉及核酸放大及/或例如樣本中之mRNA之反轉錄酶(以製備cDNA)之過程，如經由反轉錄聚合酶鏈鎖反應(該 實驗具體實施例闡述於Mullis,1987,U.S.Pat.No.4,683,202)、連接酶鏈鎖反應(ligase chain reaction)(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189-193)、自主序列複製系統(self sustained sequence replication)(Guatelli et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878)、轉錄放大系統(transcriptional amplification system)(Kwoh et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177)、Q-Beta複製酶(Q-Beta Replicase)(Lizardi et al.(1988)Bio/Technology 6：1197)、滾環式複製(rolling circle replication)(Lizardi et al.,美國專利號5,854,033)或任何其他核酸放大方法，接著以熟知本技術領域者習知之技術偵測該放大分子。該等偵測流程係尤其對偵測核酸分子有效，若該等分子非常少量存在。於本發明之特別方面，Serpina1之表現量係利用定量螢光反轉錄聚合酶鏈鎖反應(即TaqManTM系統)檢測。
Serpina1 mRNA之表現量可利用轉漬濾膜(如於雜合分析中，如北方、南方、點墨跡及其他類似方法)或微孔盤、樣本管、凝膠、珠球或纖維(或其他任何包含組合核酸之固體支持物)。見美國專利號5,770,722、5,874,219、5,744,305、5,677,195及5,445,934，其特此納入作為參考。Serpina1表現量之檢測亦可包含使用於溶液中之核酸探針。
於一較佳具體實施例中，mRNA1表現之量係利用分支DNA(branched DNA,bDNA)試驗或即時聚合 酶鏈鎖反應(realtimePCR,qPCR)來評估。該等方法之使用係描述並以於此之實例舉例說明。
Serpina1蛋白質表現之量可使用任何現有技術中已知用於測量蛋白質量之方法檢測，這類方法包括，例如電泳法、毛細管電泳法、高效液相層析法(HPLC)、薄層色層分析法(TLC)、超擴散色層分析法(hyperdiffusion chromatography)、流體或凝膠沉澱反應(fluid or gel precipitin reactions)、吸光分析法、比色檢定、分光光度檢定、流動式細胞測量法(flow cytometry)、免疫擴散法(immunodiffusion)(單一或雙向)、免疫電泳法、西方墨點法、放射性免疫分析法(RIA)、酵素組合免疫吸附分析法(ELISAs)、免疫螢光檢定、電化學發光檢定及其他類似方法。
於此使用之術語“樣本”意指分離自個體之相似液體、細胞或組織之收集，以及存在於個體中之液體、細胞或組織。生物液體之實例包括血液、血清、漿膜液、血漿、淋巴、尿液、腦脊髓液、唾液、眼液及其他類似物。組織樣本可包括取自組織、器官或局部區域之樣本。例如，樣本可取自特定器官、器官之部分或該等器官中之液體或細胞。於某些具體實施例中，樣本可取出自肝臟(如整個肝臟或肝臟的某部分或肝臟中的某類型細胞，如肝細胞)。於一較佳具體實施例中，“自個體取出之樣本”意指取自於個體之血液或血漿。在進一步之具體實施例中，“自個體取出之樣本”意指該自個體中取出之肝臟組織。
本發明中之方法之某些具體實施例，該RNAi試劑係被投藥至個體以至於該RNAi試劑可被遞輸至個體中之特定位置。Serpina1表現之抑制可利用測量來自個體中特定部位之液體或組織中取出之樣本之Serpina1mRNA或Serpina1蛋白質之量或量之改變來評估。於一較佳具體實施例中，該位置為肝臟。該位置亦可為來自任一前述位置之細胞之小節或子群。該位置亦可包括表現特定形式受器之細胞。
VI. 治療或預防Serpina1相關疾病之方法
本發明亦提供治療或預防疾病及病情之可調整方法，經由向下調控Serpina1基因表現。例如，於此所敘述之組成物可被用於治療Serpina1相關疾病，如肝臟疾病，如慢性肝臟疾病、肝臟發炎、肝硬化、肝纖維化及/或肝細胞癌，及其他病理狀態其可能與該等疾病相關，如肺臟發炎、肺氣腫及慢性阻塞性肺病(COPD)。
本發明亦提供方法以抑制個體(如具有Serpina1缺乏症變異之個體)中肝細胞癌之發展。該方法包括投藥治療有效含量之本發明組成物至該個體，因此抑制個體中肝細胞癌之發展。
本發明之方法及組成物之使用，其用以減少個體(如具有Serpina1缺乏變異之個體)肝臟中錯誤折疊之Serpina1之累積，亦於本發明中提供。該方法包括投藥治療有效含量之本發明組成物至該個體，因此減少個體肝臟中錯誤折疊之Serpina1之累積。
於此所用之“個體”包括人類或非人類之動物，較佳為脊椎動物，更佳為哺乳類動物。個體可包括基因轉殖生物。較佳情況，該個體為人類，如患有或傾向發生Serpina1相關疾病之個體。於一具體實施例中，該患有或傾向發生Serpina1相關疾病之個體具有一或多個Serpina1缺乏對偶基因，如PIZ、PIS或PIM(Malton)對偶基因。
於本發明進一步之具體實施例中，本發明中之iRNA試劑係與額外之醫療試劑組合後投藥。該iRNA試劑及額外之醫療試劑可被組合於同一組成物中投藥，如腸胃；或該額外之醫療試劑可被作為分離組成物之部分投藥或以其他於此描述之方式。
適合用於本發明之方法中之額外醫療試劑之實例包括該等已知用於治療肝臟疾病(如肝硬化)之試劑。例如，本發明中主要之iRNA試劑可及如熊去氧膽酸(UDCA)、免疫抑制劑、methotrexate、皮質類固醇(corticosteroids)、cyclosporine、colchicine、止癢治療，如抗組織胺類、cholestyramine、colestipol、rifampin、dronabinol(Marinol)及血漿去除法(plasmaphesesis)、預防性抗生素、紫外光、鋅補給品及A型肝炎、流行性感冒及肺炎鏈球菌疫苗被一併投藥。
於本發明之方法之某些具體實施例中，Serpina1表現係減少於一段延長之持續時間，如至少1週、2週、3週或4週或更長。例如，於某些實例中，該Serpina1 基因之表現係由於投藥於此所敘述之iRNA試劑而被抑制至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或55%。於某些具體實施例中，該Serpina1基因係由於投藥於此所敘述之iRNA試劑而被抑制至少約60%、70%或80%。於某些具體實施例中，該Serpina1基因係由於投藥於此所敘述之iRNA試劑而被抑制至少約85%、90%或95%。
本發明之iRNA試劑可被投藥至個體，利用任何現有技術中已知之投藥模式，包括但不限於皮下、靜脈、肌內、眼內、支氣管內、胸膜內、腹膜內、淋巴、腦脊液及其任何組合。於較佳具體實施例中，該iRNA試劑係透過皮下投藥。
某些具體實施例中，該投藥係透過持效注射(depotinjection)。持效注射可以連續方式釋放該iRNA試劑於持續很久之期間。因此，持效注射可減少需要劑量之頻率以獲得期望之效果，如期望之Serpina1之抑制，或醫療或預防性的影響。持效注射亦可提供更一致的血清濃度。持效注射可包括皮下注射或肌內注射。於較佳具體實施例中，該持效注射係皮下注射。
某些具體實施例中，該投藥係透過幫浦。該幫浦可為外部幫浦或手術植入之幫浦。某些具體實施例中，該幫浦係皮下植入滲透壓幫浦。於另一具體實施例中，該幫浦為輸液幫浦。輸液幫浦可用於靜脈、皮下、動脈或硬膜上輸液。於較佳具體實施例中，該輸液幫浦係皮下輸液 幫浦。於另一具體實施例中，該幫浦為手術植入幫浦其遞輸該RNAi試劑至肝臟。
投藥之其他模式包括硬膜上、大腦內、intracerebroventricular、鼻投藥、動脈內、心內、骨內輸液、鞘內及玻璃體內、及肺。該投藥模式可基於期望為局部或系統治療以及欲治療區域而選擇。該投藥路徑及位置可被選擇以增強其靶向。
本發明之方法包括投藥iRNA試劑，足夠抑制/減少Serpina1 mRNA量至少5天，較佳為7、10、14、21、25、30或40天之劑量；以及選擇性地投藥第二單一劑之該iRNA試劑，其中該第二單一劑係投藥於該第一單一劑被投藥後之至少5天，較佳為7、10、14、21、25、30或40天，因此抑制個體中Serpina1基因之表現。
於一具體實施例中，本發明中iRNA試劑之劑量係投藥不超過每四週一次、不超過每三週一次、不超過每二週一次或不超過每一週一次。於另一具體實施例中，該藥劑投藥後可維持1、2、3或6個月或一年或更長時間。
一般而言，該iRNA試劑不觸發免疫系統，如其不增加細胞激素(cytokine)量，如TNF-alpha或IFN-alpha之量。例如，當利用試驗如活體外PBMC試驗進行測量時，如於此所敘述，TNF-alpha或IFN-alpha之增加量比起以控制組iRNA試劑(如不以Serpina1為目標之iRNA試劑)處理之控制組細胞，少於30%、20%或10%。
例如，個體可被投藥治療有效含量之iRNA 試劑，如0.5mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg或2.5mg/kg雙股RNA。該iRNA試劑可利用靜脈輸液持續一段時間投藥，如持續5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘或25分鐘。該投藥重複為，例如有規律性地，如二週一次(每二週)於1個月、2個月、3個月、4個月或更長時間中。
於初始療程後，治療可按照較低頻率實施，例如該初次投藥為二週一次持續三個月，後續投藥可重複每個月一次持續6個月或一年或長時間。該iRNA試劑之投藥可使Serpina1之量，如於細胞中、組織中、血液中、尿液中、器官中(如肝臟)或患者之其他部位中減少至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%或更多。
投藥完整劑量iRNA試劑之前，患者可被投藥較小劑量並監測其副作用，如過敏反應或脂質量或血壓上升。於另實例中，患者可被監測到有不期待發生之免疫刺激影響，如細胞激素(如TNF-alpha或INF-alpha)量增加。典型之較小劑量導致之輸注反應(infusion reaction)之發生率係少於或等於5%。
治療或預防之功效可被評估，例如經由測量疾病病情發展、疾病之緩及、症狀嚴重程度、疼痛減輕、生活品質、維持治療影響之藥物劑量、疾病指標之量或任何可被測量之適用於指定被治療或被靶向以預防之疾病之參數。熟習本技術領域者之能力中，係能良好監測處理或 預防之功效，經由測量任何此類參數或該等參數之組合。例如，治療肝纖維化之功效或肝纖維化之改善可被評估，利用週期性監測肝纖維化指數：a-2-巨球蛋白(a-2-macroglobulin,a-MA)、運鐵蛋白、脂蛋白原Al(apolipoproteinAl)、玻尿酸、層連結蛋白(laminin)、N-端原膠原III(N-terminal procollagen III,PIIINP)、7S膠原IV(7S-IV)、總膽紅素、間接膽紅素、丙胺酸轉胺酶(ALT)、天冬胺酸轉胺酶(AST)、AST/ALT、gamma-麩胺醯轉移脢(g-glutamyl transpeptidase,GGT)、鹼性磷酸酶(ALP)、白蛋白、白蛋白/球蛋白、血液中之尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、肌酐(Cr)、三酸甘油酯、膽固醇、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白及肝臟穿刺活組織檢驗(liver puncture biopsy)。肝纖維化指標可被測量及/或肝臟穿刺活組織檢驗可被操作於治療前(初始讀數)及其後(隨後讀數)於療程中。
隨後讀數與初始讀數之比較提供醫療者該治療是否有效之指示。於熟習本技術領域者之能力中，係能良好監測處理或預防之功效，經由測量任何此類參數或該等參數之組合。與目標Serpina1之iRNA試劑或其組成物之投藥有關，“有效抵抗”Serpina1相關疾病，如肝臟疾病，如肝纖維化疾病，顯示本發明iRNA試劑以適當之臨床方式投藥，導致對至少統計上顯著之部分患者有產生有利之影響，如症狀改善、治癒、疾病負擔減輕、腫瘤體或細胞數量減少、生命延長、生活品質改善或其他一般被熟悉治療肝臟疾病之醫生承認為正面之影響。
本發明之方法中，如於此所敘述之iRNA試劑可被用於治療具有Serpina1相關疾病(如肝臟疾病，如肝臟發炎、肝硬化、肝纖維化及/或肝細胞癌)之跡象、症狀和/或指標之個體；或被診斷患有Serpina1相關疾病之個體；或有罹患Serpina1相關疾病風險之個體。熟習本技術領域者可輕易監測接受於此所敘述之iRNA試劑治療之個體中該等疾病之跡象、症狀及/或指標並檢驗該等跡象、症狀及/或指標減少10%及較佳減少至表示較低肝臟疾病風險之臨床量。
治療或預防之功效係明顯，當一或多個疾病狀態參數有統計上顯著之改善時或當症狀被預測將惡化或將發展失敗時。舉例而言，可測量之疾病參數(如在前敘述之肝臟功能)令人滿意之改變為10%，較佳為至少20%、30%、40%、50%或更多可象徵為有效治療。
本發明中指定之iRNA試劑或該iRNA試劑之製劑之功效亦可利用現有技術中已知之指定疾病實驗動物模式來判斷。當使用實驗動物模式時，治療之功效係利用當指標或症狀有統計上顯著減少被觀察到時來證實。
治療或預防之功效亦為顯著，當一或多個症狀被減少或緩及時。例如，當一或多個虛弱、疲勞、體重減輕、噁心反胃、嘔吐、腹部腫脹、肢體腫脹、過度搔癢及眼及/或皮膚黃疸減少或緩及，治療或預防係為有效。
對某些指示，該功效可利用血清中Serpina1蛋白質增加來測量，舉例而言，正確折疊之Serpina1蛋白 質之血清中量之增加至少10%、至少20%、至少50%、至少100%、至少200%可指可象徵為有效治療。
或者，該功效可被測量，利用熟習本技術領域者基於臨床上被接受之疾病嚴重程度分級診斷之疾病嚴重程度減少，例如此例Child-Pugh氏分類法(Child-Pughscore)(有時稱為Child-Turcotte-Pughscore)。於此例中，慢性肝臟疾病，主要為肝硬化，之病狀診斷係利用五項臨床測量(膽紅素、血清白蛋白、INR、腹水(ascites)及肝性腦病變(hepaticencephalopathy))之累積分來測量。各項指標係配分值為1至3分，且總值用來提供分數之分類為A(5至6分)、B(7至9分)或C(10至15分)，其可及一或二年存活率相關。Child-Pugh分數之決定及分析之方法係熟知於現有技術中(Farnsworth et al,Am J Surgery 2004 188：580-583；Child and Turcotte.Surgery and portal hypertension.In：The liver and portal hypertension.Edited by CG Child.Philadelphia：Saunders 1964：50-64；Pugh et al,Br J Surg 1973；60：648-52)。此實例中，功效可經由患者之移動，如自“B”至“A”而測量。任何由例如利用適當分類方式測量之疾病嚴重程度之減少所引發之正面改變，表示恰當之利用於此所敘述之iRNA或iRNA製劑之治療。
於一具體實施例中，該RNAi試劑被投藥劑量介於約0.25mg/kg至約50mg/kg之間，如介於約0.25mg/kg至約0.5mg/kg之間、介於約0.25mg/kg至約1mg/kg之間、介於約0.25mg/kg至約5mg/kg之間、介於約0.25 mg/kg至約10mg/kg之間、介於約1mg/kg至約10mg/kg之間、介於約5mg/kg至約15mg/kg之間、介於約10mg/kg至約20mg/kg之間、介於約15mg/kg至約25mg/kg之間、介於約20mg/kg至約30mg/kg之間、介於約25mg/kg至約35mg/kg之間、或介於約40mg/kg至約50mg/kg之間。
於一些具體實施例中，該RNAi試劑係投藥劑量約0.25mg/kg、約0.5mg/kg、約1mg/kg、約2mg/kg、約3mg/kg、約4mg/kg、約5mg/kg、約6mg/kg、約7mg/kg、約8mg/kg、約9mg/kg、約10mg/kg、約11mg/kg、約12mg/kg、約13mg/kg、約14mg/kg、約15mg/kg、約16mg/kg、約17mg/kg、約18mg/kg、約19mg/kg、約20mg/kg、約21mg/kg、約22mg/kg、約23mg/kg、約24mg/kg、約25mg/kg、約26mg/kg、約27mg/kg、約28mg/kg、約29mg/kg、30mg/kg、約31mg/kg、約32mg/kg、約33mg/kg、約34mg/kg、約35mg/kg、約36mg/kg、約37mg/kg、約38mg/kg、約39mg/kg、約40mg/kg、約41mg/kg、約42mg/kg、約43mg/kg、約44mg/kg、約45mg/kg、約46mg/kg、約47mg/kg、約48mg/kg、約49mg/kg或約50mg/kg。
於本發明某些具體實施例中，例如，當雙股RNAi試劑包含修飾(如一或多個於三個連續核苷酸上有三個相同修飾之模體，包括一個此類模體位於或接近該試劑之剪切位置)、6個硫代磷酸酯鍵結及配體，此試劑係被投 藥劑量為約0.01至約0.5mg/kg、約0.01至約0.4mg/kg、約0.01至約0.3mg/kg、約0.01至約0.2mg/kg、約0.01至約0.1mg/kg、約0.01mg/kg至約0.09mg/kg、約0.01mg/kg至約0.08mg/kg、約0.01mg/kg至約0.07mg/kg、約0.01mg/kg至約0.06mg/kg、約0.01mg/kg至約0.05mg/kg、約0.02至約0.5mg/kg、約0.02至約0.4mg/kg、約0.02至約0.3mg/kg、約0.02至約0.2mg/kg、約0.02至約0.1mg/kg、約0.02mg/kg至約0.09mg/kg、約0.02mg/kg至約0.08mg/kg、約0.02mg/kg至約0.07mg/kg、約0.02mg/kg至約0.06mg/kg、約0.02mg/kg至約0.05mg/kg、約0.03至約0.5mg/kg、約0.03至約0.4mg/kg、約0.03至約0.3mg/kg、約0.03至約0.2mg/kg、約0.03至約0.1mg/kg、約0.03mg/kg至約0.09mg/kg、約0.03mg/kg至約0.08mg/kg、約0.03mg/kg至約0.07mg/kg、約0.03mg/kg至約0.06mg/kg、約0.03mg/kg至約0.05mg/kg、約0.04至約0.5mg/kg、約0.04至約0.4mg/kg、約0.04至約0.3mg/kg、約0.04至約0.2mg/kg、約0.04至約0.1mg/kg、約0.04mg/kg至約0.09mg/kg、約0.04mg/kg至約0.08mg/kg、約0.04mg/kg至約0.07mg/kg、約0.04mg/kg至約0.06mg/kg、約0.05至約0.5mg/kg、約0.05至約0.4mg/kg、約0.05至約0.3mg/kg、約0.05至約0.2mg/kg、約0.05至約0.1mg/kg、約0.05mg/kg至約0.09mg/kg、約0.05mg/kg至約0.08mg/kg或約0.05mg/kg至約0.07mg/kg。以上所列舉值及範圍中間之值及 範圍皆為本發明之部分，如該RNAi試劑可被投藥至該個體之劑量為約0.015mg/kg至約0.45mg/mg。
例如，該RNAi試劑，如醫藥組成物中之RNAi試劑可被投藥劑量為約0.01mg/kg、0.0125mg/kg、0.015mg/kg、0.0175mg/kg、0.02mg/kg、0.0225mg/kg、0.025mg/kg、0.0275mg/kg、0.03mg/kg、0.0325mg/kg、0.035mg/kg、0.0375mg/kg、0.04mg/kg、0.0425mg/kg、0.045mg/kg、0.0475mg/kg、0.05mg/kg、0.0525mg/kg、0.055mg/kg、0.0575mg/kg、0.06mg/kg、0.0625mg/kg、0.065mg/kg、0.0675mg/kg、0.07mg/kg、0.0725mg/kg、0.075mg/kg、0.0775mg/kg、0.08mg/kg、0.0825mg/kg、0.085mg/kg、0.0875mg/kg、0.09mg/kg、0.0925mg/kg、0.095mg/kg、0.0975mg/kg、0.1mg/kg、0.125mg/kg、0.15mg/kg、0.175mg/kg、0.2mg/kg、0.225mg/kg、0.25mg/kg、0.275mg/kg、0.3mg/kg、0.325mg/kg、0.35mg/kg、0.375mg/kg、0.4mg/kg、0.425mg/kg、0.45mg/kg、0.475mg/kg或約0.5mg/kg。以上所列舉值及範圍中間之值及範圍皆為本發明之部分。
投藥至個體之RNAi試劑之劑量可被調整至特定劑量以平衡其風險及利益，例如，達到Serpina1基因抑制之期望量(以例如基於Serpina1 mRNA抑制、Serpina1蛋白質表現來評估)或期望之醫療或預防影響，同時避免不欲之副作用。
於一些具體實施例中，該RNAi試劑被投藥 二劑或更多。若期望促進重複或頻率性地輸液、遞輸裝置之植入，如幫浦、半永久性支架(semi-permanentstent)(如靜脈、腹膜內、腦池內(intracisternal)或關節囊內)或儲積所為明智的。於一些具體實施例中，後續劑量之數量及總量係根據期望效果之達成以決定，如Serpina1基因之抑制或根據醫藥或預防影響之達成以決定，如肝臟疾病症狀之減少。於一些具體實施例中，該RNAi試劑被按照時間計畫投藥。例如，該RNAi試劑可被投藥一週一次、一週二次、一週三次、一週四次或一週五次。一些具體實施例中，該時間計畫涉及定期間隔投藥，如每小時、每4小時、每6小時、每8小時、每12小時、每天、每2天、每3天、每4天、每5天、每週、每2週或每月。在其他具體實施例中，該時間計畫涉及緊密間隔投藥，接著於較長一段時間中不投藥該試劑。例如，該時間計畫可能是涉及初始設置劑量為投藥於相對短之一對時間(如約每6小時、約每12小時、約每24小時、約每48小時或約每72小時)接著於較長一段時間中(如約1週、約2週、約3週、約4週、約5週、約6週、約7週或約8週)不投藥該試劑。於一具體實施例中，該RNAi試劑起初為每小時投藥且後續依較長時間間隔投藥(如每天、每週、每二週或每月)。於另一具體實施例中，該RNAi試劑起初每天投藥且後續依較長時間間隔投藥(如每週、每二週或每月)。於某些具體實施例，該較長時間間隔隨時間而拉長或根據期望影響之達成而決定。於一特定具體實施例中，該RNAi試劑於第一週被每天投藥， 接著投藥第八天起為改為每週一次。另一特定具體實施例中，該RNAi試劑於第一週被隔天投藥接著投藥第八天起為改為每週一次。
於一些具體實施例中，該RNAi試劑之投藥療程其包括緊密間隔投藥中的“實施階段”(“loading phase”)接著一段“維持階段”(“maintenance phase”)，於此時期該RNAi試劑係以較長時間間隔投藥。於一具體實施例中，該“實施階段”包含第一週中五劑每天投藥該RNAi試劑。於另一具體實施例中，該“維持階段”包含每一或每二週投藥該RNAi試劑。於進一步具體實施例中，該“維持階段”持續五週。於一具體實施例中，該實施階段包含一週內投藥劑量2mg/kg、1mg/kg或0.5mg/kg五次。於另一具體實施例中，該維持階段包含每週一或二次投藥劑量2mg/kg、1mg/kg或0.5mg/kg。
任何該等時間計畫可選擇性被重複依或多個循環。循環之次數可根據期望影響之達成，如Serpina1基因之抑制和/或根據醫藥或預防影響之達成，如Serpina1相關疾病(如肝臟疾病)症狀之減少。
本發明主要之另一方面，教導終端使用者，如照護者或個體，之如何投藥於此所敘述之iRNA試劑之方法。該方法包括，選擇性地，提供終端使用者一或多劑該iRNA試劑，及教導終端使用者以於此所敘述之行程投藥該iRNA試劑，因此教導終端使用者。
基因之患病傾向在目標基因相關疾病，如 肝臟疾病中扮演重要角色。因此需要siRNA之患者可經由家族病史、或例如篩選一或多個基因標誌或變異體來判定。因此，一方面，本發明提供治療患者之方法，經由根據該患者具有一或多個Serpina1基因缺乏及變異體或Serpina1缺乏對偶基因變異，如，PIZ、PIS或PIM(Malton)對偶基因做選擇。該方法包括對個體投藥治療有效含量之iRNA試劑。
健康保健之提供者，如醫生、護士或家族成員，可於開立藥方或投藥本發明中iRNA試劑之前，取得家族病史。此外，亦可進行測試決定基因型或表現型，例如，利用來自患者之樣本，如血液樣本，進行DNA測試以便在投藥Serpina1雙股RNA投藥至該患者前，判斷Serpina1基因型及/或表現型。
VII. 套組(Kits)
本發明亦提供套組以用於使用本發明中之任何iRNA試劑及/或進行本發明中之任何方法。此類套組包括一或多個RNAi試劑及使用操作說明，如經由抑制Serpina1表現有效量之RNAi試劑接觸細胞，以抑制細胞中Serpina1表現之使用操作說明。該套組可選擇性進一步包含以該RNAi試劑接觸該細胞之手段(如注射裝置)，或測量Serpina1抑制之手段(如測量Serpina1 mRNA抑制之手段)。該等測量Serpina1抑制之手段可包含自個體取得樣本，如血漿樣本，之手段。本發明之套組可選擇性進一步包含投藥該RNAi試劑至個體之手段或決定醫療有效量或預防有效含量之手 段。
除非另有定義，否則於此所用之所有技術及科學術語皆及一般本發明所屬之技術領域中具有通常知識者所一般理解之意義相同。儘管可用與於此所敘述相似或相同之方法及材料實施或測試本發明中主要iRNA及方法，但適當之方法及材料將描述如下。於此所提之所有發表、專利申請案、專利及其他參考文獻其完整內容皆特此納入以為參考。存在衝突之情況下，以本說明書，包括其中定義為限制。此外，該等材料、方法及實例僅為了闡明，而非限制本發明。
[實例]
材料與方法
下述之材料與方法係用於實施例中。
siRNA設計
Serpina1基因具有多種替代性之轉錄本。進行siRNA設計以辨別出標把所有註記於NCBI基因資料庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)之人類及馬來猴(Cynomolgus monkey)(Macaca fascicularis；以下稱“cyno”)之Serpina1轉錄本之siRNA。使用下述得自NCBI RefSeq collection之人類轉錄本：Human-NM 000295.4,NM_001002235.2,NM_001002236.2,NM_001127700.1,NM_001127701.1,NM_001127702.1,NM_001127703.1,NM_001127704.1,NM_001127705.1,NM_001127706.1,NM_001127707.1。為了辨認出cyno之轉錄本，使用 Spidey比對工具(www.ncbi.nlm.nih.gov/spidey/)將恆河獼猴(rhesus monkey)(Macaca mulatta)之轉錄本，XM_001099255.2與M.fascicularis之基因體作比對。恆河獼猴及cyno之轉錄本之整體相同百分比為99.6%。cyno之轉錄本係手動組合以保留一致(共有)剪接位置(consensus splice sites)及全長編碼及未轉譯區。所得轉錄本為2064核苷酸長。
所有siRNA雙股螺旋係被設計與全部所列之人類及eyno轉錄本共享100%相同性。
使用了585個候選siRNA對人類轉錄本組(transcriptome)(定義為NCBI參考序列組中NM_及XM_記錄組)進行全面性地搜尋。共合成48個正義股(21mers)及48個反義股(23mers)之衍生siRNA寡核苷酸且其形成雙股螺旋結構。Serpina1之正義及反義股序列之詳細表列係於表1及2。
siRNA合成
I. 一般小及中尺度之RNA合成程序
根據標準固相寡核苷酸合成指引，使用市售可得之尿苷之5'-氧-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2'-O-第三丁基二甲基矽基-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二異丙基)亞磷醯胺單體(5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-O-t-butyldimethylsilyl-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl)phosphoramidite monomers of uridine)、4-N-乙醯基胞苷(4-N-acetylcytidine)、6-N-苯甲醯基腺苷(6-N-benzoyladenosine)及2-N-異丁醯基鳥苷 (2-N-isobutyrylguanosine)及對應之2'-O-甲基及2'-氟亞磷醯胺(phosphoramidites)合成尺度介於0.2至500μmol之RNA寡核苷酸。該亞醯胺(amidite)溶液配置為濃度0.1至0.15M且5-乙硫基-1H-四唑(5-ethylthio-1H-tetrazole)(0.25至0.6M乙腈溶液)係作為活化劑。使用0.2M苯乙醯基二硫化物(phenylacetyl disulfide,PADS)之甲基吡啶：乙腈(1：1)(v：v)溶液或0.1M 3-(二甲胺基亞甲基)胺基-3H-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(3-(dimethylaminomethylene)amino-3H-1,2,4-dithiazole-5-thione,DDTT)之吡啶溶液於氧化步驟，於合成時導入硫代磷酸酯骨架修飾。合成完畢後，該序列係自固體支持物上剪下並以甲胺去保護接著以三乙基胺去保護。3HF移除任何存在之2'-O-第三丁基二甲矽基保護基團。
針對介於5至500μmol之合成尺度且完全2'修飾之序列(2'-氟及/或2'-O-甲基或其組合)，該寡核苷酸以3：1(v/v)乙醇及濃氨水(28-32%)於35℃，16小時或55℃，5.5小時去保護。在以氨水去保護前，該寡核苷酸於固體支持物上以0.5M哌啶之乙腈溶液處理20分鐘。該粗製寡核苷酸以LC-MS及陰離子交換HPLC(anion-exchange HPLC,IEX-HPLC)分析。使用20mM磷酸鹽，10%至15%乙腈(ACN)，pH=8.5(緩衝液A)；及20mM磷酸鹽，10%至15%乙腈，1M溴化鈉，pH=8.5(緩衝液B)之IEX HPLC進行該寡核苷酸的純化。將流出份利用分析級HPLC分析純度。將包含適當純度產物之流出份倒在一起並在脫鹽之 前以旋轉蒸發儀濃縮。該樣本係利用尺寸排阻層析法(size exclusion chromatography)脫鹽並冷凍乾燥。等莫耳濃度量之正義及反義股係於1倍PBS緩衝鹽溶液中黏合(annealed)以製備對應之siRNA雙股螺旋結構。
針對小尺度(0.2至1μmol)之寡核苷酸，以MerMade 192合成裝置於96-孔形式進行合成。於完全2'-修飾序列(2'-氟及/或2'-O-甲基或其組合)，該寡核苷酸以甲胺於室溫下處理30至60分鐘，接著於60℃培養30分鐘；或使用3：1(v/v)乙醇及濃氨水(28-32%)於室溫下處理30至60分鐘，接著於40℃培養1.5小時以去保護。接著，該粗製寡核苷酸於乙腈：丙酮(9：1)溶液中沉澱並藉由離心分離，倒出上清液。該粗製寡核苷酸沉澱小團(pellet)重新懸浮於20mM醋酸鈉緩衝液並以LC-MS及IEX-HPLC分析。該粗製寡核苷酸序列於96-孔盤中以5mL HiTrap Sephadex G25管柱(GE Healthcare)脫鹽。收集各孔中對應獨立序列之約1.5mL樣本，該等該等純化脫鹽之寡核苷酸係以LC-MS及IEX-HPLC分析之。藉由於Tecan robot上黏合等莫耳濃度量之正義及反義股序列來製備雙股螺旋結構。以1倍PBS緩衝鹽溶液調整雙股螺旋結構之濃度至10μM。
II. 用於體內分析之N-乙醯葡萄糖胺-接合寡核苷酸的合成
使用預先載入之附載用於寡核苷酸合成之4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMT)-保護之一級羥基及透過系鏈(tether) 所附接之N-乙醯葡萄糖胺配體之Y-型連接子之固體支持物，合成尺度為介於0.2至500μmol之於其3'端與N-乙醯葡萄糖胺配體接合之寡核苷酸。
針對尺度介於5至500μmol之N-乙醯葡萄糖胺接合物之合成，按照上述RNA合成之指引並做下列調整：對於以聚苯乙烯為基質之合成支持物，於合成時使用5%二氯乙酸之甲苯溶液進行DMT-剪切。如上述方式進行自支持物剪切下來及去保護。富含硫代磷酸酯之序列(通常>5個硫代磷酸酯)之合成不必移除最後之5'-DMT基團(“DMT-on”)，且如上述剪切及去保護後，以使用50mM醋酸銨水溶液(緩衝液A)及50mM醋酸銨之80%乙腈溶液(緩衝液B)之逆相HPLC純化。以分析級HPLC及/或LC-MS分析流出份之純度。將包含適當純度產物之流出份倒在一起並以旋轉蒸發儀濃縮。以20%至25%醋酸水溶液移除該DMT-基團直至完全。該樣本係以尺寸排阻層析法脫鹽並冷凍乾燥。將等莫耳濃度量之正義及反義股於1倍PBS緩衝鹽溶液中黏合(annealed)以製備對應之siRNA雙股螺旋結構。
針對N-乙醯葡萄糖胺接合物之小尺度(0.2至1μmol)合成，包括有多個硫代磷酸酯鍵結之序列，於MerMade平台上應用上述合成RNA或完全包含2'-氟/2'-O-甲基序列之操作流程。於包含GalNAc-功能化之受控孔度玻璃(controlled pore glass)支持物之預填充管柱進行合成。
利用ABI高容量cDNA反轉錄套組(Applied Biosystems,Foster City,CA,Cat #4368813)合成cDNA每反應中，將2μL 10倍緩衝液、0.8μL 25倍去氧核苷三磷酸(dNTPs)、2μL隨機引子(Random primers)、1μL反轉錄酶、1μl RNA分解酶抑制劑及3.2μl水之主要混合液加入10μl總RNA。以Bio-Rad C-1000或S-1000熱循環儀(thermal cycler)(Hercules,CA)經由下列步驟生成cDNA：25℃ 10分鐘，37℃ 120分鐘，85℃ 5秒、4℃維持。
細胞培養及轉染
將Hep3B、HepG2或HeLa細胞(ATCC,Manassas,VA)於37℃，5% CO2大氣條件下，在補充10% FBS及麩醯胺酸(ATCC)之推薦培養基(ATCC)上生長至接近匯聚(confluence)後，以胰蛋白酶水解而自盤中釋出細胞。針對以96-孔形式篩選雙股螺旋結構，係藉由將44.75μL Opti-MEM加上0.25μL Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen,Carlsbad CA.cat # 13778-150)加入至在96-孔盤之每孔中5μL之各siRNA雙股螺旋以進行轉染。接著於室溫下培養該混合物15分鐘。然後將50μL完全不含抗生素且包含約2×04個細胞之完全生長培養基加入該siRNA混合物中。針對以384-孔形式篩選雙股螺旋結構，將5μL Opti-MEM加上0.1μL Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen,Carlsbad CA.cat # 13778-150)與每孔中5μL之各siRNA雙股螺旋混合。接著於室溫下培養該混合物15分鐘再加入40μL不 含抗生素且包含約8×103個細胞之完全生長培養基。於RNA純化前培養細胞24小時。以10nM及0.1nM之最終雙股螺旋濃度進行單一劑量實驗，且以10、1.67、0.27、0.046、0.0077、0.0013、0.00021、0.00004nM之最終雙股螺旋濃度完成劑量反應實驗(dose response experiment)。
自由攝入轉染
將5μL於PBS緩衝鹽溶液中之各N-乙醯葡萄糖胺接合之siRNA與重新懸浮於95μL In Vitro Gro CP培養基(In Vitro Technologies-Celsis,Baltimore,MD)之3×104個新鮮解凍之冷凍保存馬來猴肝細胞(In Vitro Technologies-Celsis,Baltimore,MD；lot#JQD)混合於96-孔盤之各孔中或5μL siRNA及45μL包含1.2×103個細胞之培養基於384-孔盤形式。於37℃，5% CO2大氣條件下培養該混合物24小時。以最終濃度500nM及10nM測試siRNA。
以DYNABEADS mRNA分離套組(Invitrogen,part #：610-12)分離總RNA
收集細胞並於150μL裂解/鍵結(Lysis/Binding)緩衝液中裂解，接著以Eppendorf Thermomixer於850rpm轉速下混合5分鐘(整個過程中皆維持相同速率)。將10μL磁珠(magnetic beads)及80μL Lysis/Binding緩衝液加入圓底盤中並混合1分鐘。以磁性架吸住磁珠，在不擾動磁珠的情況下移除上清液。移除上清液後，將裂解細胞加入該剩餘之磁珠中並混合5分鐘。移除上清液後，將磁珠以150μL清洗緩衝液A清洗二次並混合1分鐘。再次吸住磁珠並移 除上清液。接著以150μL清洗緩衝液B清洗磁珠，吸住磁珠後再次移除上清液。下一步以150μL洗提緩衝液(elution buffer)清洗磁珠，吸住磁珠後移除上清液。使磁珠乾燥2分鐘。乾燥後，加入50μL洗提緩衝液並於70℃混合5分鐘。於磁鐵上吸住磁珠5分鐘。移除50μL上清液並添加至另一96-孔盤中。
針對384-孔盤形式，藉由加入50μL Lysis/Binding緩衝液以裂解該細胞。每孔中使用2μL磁珠。分裝入所需磁珠體積，於磁性架上吸住，移除磁珠儲存溶液。將該等磁珠接著重新懸浮於所需體積之Lysis/Binding緩衝液(每孔25μL)並將25μL磁珠懸浮液加入該裂解細胞中。該裂解物-磁珠混合物於設定#7之VibraTransaltor上(UnionScientific Corp.,Randallstown,MD)培養10分鐘。接著以磁性架吸住磁珠，移除上清液並以90μL緩衝液A清洗磁珠一次，接著以90μL緩衝液B及100μL洗提緩衝液進行單一清洗步驟。將該等磁珠浸泡於各清洗緩衝液中約1分鐘(不涉及混合)。於最後清洗步驟後，將該等磁珠於70℃重新懸浮於15μL洗提緩衝液中5分鐘，接著吸住磁珠並移除上清液(達8μL)以用於cDNA之合成及/或純化RNA之儲存(-20℃)。
即時聚合酶鏈鎖反應
將2μL cDNA加至主要混合液中，該主要混合液於384-孔盤之各孔中包含用於Hep3B實驗之0.5μL GAPDH TaqMan探針(Applied Biosystems Cat #4326317E)、0.5μL 之SERPINA1 TaqMan探針(Applied Biosystems cat # Hs00165475_m1)，或用於PCH實驗之客製化設計之GAPDH及SERPINA1 taqman試驗，以及5μL Lightcycler 480探針主要混合液(Roche Cat #04887301001)(Roche cat # 04887301001)。即時聚合酶鏈鎖反應係於Roche LC480即時聚合酶鏈鎖反應系統中完成(Roche)。以各二生物重複之至少二個獨立轉染測試各雙股螺旋並且各轉染皆進行二重複試驗。
為計算相對倍數改變量，以△△Ct方法分析即時資料，並標準化以供利用10nM AD-1955轉染之細胞或偽(mock)轉染細胞進行測試。針對自由攝入試驗，以PBS或GalNAc-1955(用於實驗化合物之最高濃度)將該數據標準化。以利用XLFit軟體之4參數擬合模式計算IC50，並標準化至以AD-1955轉染之細胞相同劑量範圍，或至其自身最低劑量。
AD-1955之正義及反義股序列為：正義股：5'-cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT-3'(SEQ ID NO：33)；以及反義股：5'-UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT-3'(SEQ ID NO：40)。
使用之Taqman引子及探針係如下：馬來猴Serpina1及Gapdh TaqMan引子及探針：Serpina1：正向引子：ACTAAGGTCTTCAGCAATGGG(SEQ ID NO：34)； 反向引子：GCTTCAGTCCCTTTCTCATCG(SEQ ID NO：35)；Taqman探針：TGGTCAGCACAGCCTTATGCACG(SEQ ID NO：36)；Gapdh：正向引子：GCATCCTGGGCTACACTGA(SEQ ID NO：37)；反向引子：TGGGTGTCGCTGTTGAAGTC(SEQ ID NO：38)；Taqman探針：CCAGGTGGTCTCCTCC(SEQ ID NO：39)
實施例1. N-乙醯葡萄糖胺接合之寡核苷酸合成
使用上述技術，設計、合成一系列跨越Serpina1 mRNA序列之siRNA雙股螺旋，並於其正義股之3端與三價N-乙醯葡萄糖胺接合。該等雙股螺旋之序列係顯示於表1。亦合成該相同序列帶多種核苷酸修飾並將之與三價N-乙醯葡萄糖胺接合。經修飾之雙股螺旋序列係顯示於表2。
實施例2. 活體外及體內篩選
該等雙股螺旋之子集係用於評估上述之單一劑量試驗之功效。表3顯示以所示之N-乙醯葡萄糖胺接合之經修飾iRNA轉染之初代小鼠肝細胞(Hep3b)之單一劑量篩選結果及以所示之N-乙醯葡萄糖胺接合之經修飾iRNA轉染之初代馬來猴肝細胞中(PCH)之單一劑量自由攝入篩選。係以相比於以AD-1955處理之細胞、非標把控制組(Hep3b實驗)，或相比於原始細胞(naïve cells)(PCH實驗中)之剩餘信息之部分表現數據。
初代Hep3 Bare中轉染所選出之雙股螺旋結構之IC50值顯示於表4。
該等雙股螺旋結構之子集係於表現Z-AAT型式之人類Serpina1之基因轉殖鼠(見如Dycaico,et al.(1988)Science 242：1409-12；Carlson,et al.(1989)J Clin Invest 83：1183-90；Perfumo,et al.(1994)Ann Hum Genet.58：305-20)中評估其體內效力。此為AAT-缺乏相關肝臟疾病之已建立模式。簡言之，於第0天以表5所列之單一20mg/kg劑量之iRNAs皮下注射基因轉殖鼠。於第-10、-5、0、3、5、7、10及17天收集血清且係利用人類專一性酵素連結免疫吸附法(human-specific ELISA assay)測定循環Serpina1蛋白含量。分析之結果如第1圖所描述。如第1 圖所指出，AD-58681-6PS對減少小鼠中血清Serpina1蛋白質量最有效。
實施例3. 基因轉殖鼠中si-AAT之功效
如先前實施例所敘述具有低IC50值之五種siRNA雙股螺旋，係於體內測試其效力。該siRNA雙股螺旋以10mg/kg劑量注入表現人類Z-AAT對偶基因之轉殖小鼠，該轉殖小鼠係一種已被建立之AAT-缺乏相關肝臟疾病之模式。該等小鼠於第0天投藥且血清人類AAT於投藥後持續追蹤21天(第2A圖)。各點代表三隻小鼠之平均值，且誤差橫槓反應標準偏差。該等小鼠於第21天犧牲且其肝臟經處理以測量mRNA含量。曲線圖顯示各組之經GAPDH標準化之hAAT mRNA(第2B圖)。圖中長條反應平均值且誤差橫槓反應標準偏差。如第2A及2B圖所示，AD59054對減少小鼠中hAAT mRNA含量最為有效。
實施例4. 以劑量反應方式之持續AAT抑制
藉由皮下方式投藥不同劑量之siRNA雙股螺旋AD-59054以測量siRNA雙股螺旋AD-59054於AAT-缺乏相關肝臟疾病之基因轉殖動物模式中之效力。於不同時間間隔點取出血清並以人類AAT專一性酵素連結免疫吸附法測量血清hAAT蛋白質含量。顯示小鼠中測試之不同劑量所達到之最大調降的效力曲線係描繪於第3A圖中。各點係為三隻動物之平均值，且誤差橫槓代表標準偏差。經投藥單一劑濃度為0.3、1、3或10mg/kg之AAT siRNA後之調降持續時間顯示於第3B圖。各點係為三隻動物之平均值，且誤差橫槓反應標準偏差。將該hAAT含量標準化為以各動物之三次採血前(prebleeds)之平均值。於PBS緩衝鹽溶液中投藥該siRNA，因此PBS緩衝鹽溶液組作為控制組以反應血清hAAT含量之變化。AAT siRNA之皮下投藥導致血清hAAT之劑量依賴抑制，在劑量為3mg/kg時觀察到>95%之最大抑制。單一1mg/kg之劑量維持hAAT之40%含量持續至少15天。亦對動物以0.5mg/kg劑量投藥AD-59054一週二次(第3C圖)。重複投藥導致累積反應，且有超過90%之蛋白質被抑制。各數據點係為四隻動物之平均值，且誤差橫槓反應標準偏差。
實施例5. 隨Z-AAT之減少腫瘤發生率減少
表現人類Z-AAT之基因轉殖鼠隨著年齡發展出腫瘤。 此實驗係被設計以測定對成齡小鼠投藥慢性投藥之本發明siRNA是否能減少小鼠之腫瘤發生率。具體而言，對患有肝臟纖維化成齡小鼠(25至46週齡)慢性投藥siRNA雙股螺旋AD-58681以減少肝臟腫瘤發生率。係經由皮下給予動物PBS緩衝鹽溶液或10mg/kg AAT siRNA每隔週一次(Q2W)，共11劑，並於給予最後一劑後7天犧牲(第4A圖)。測量控制組與處理組之肝臟中hAAT mRNA、Col1a2 mRNA及PtPrc mRNA含量。經AAT siRNA處理之動物顯示出hAAT mRNA含量有高於90%之減少(第4B圖)。測量Col1a2 mRNA以作為纖維化之指標，且於AAT siRNA處理之動物中所減少之此指標含量(第4C圖)。測量PtPrc(CD45)mRNA作為免疫細胞存在之指標(第4D圖)。患病肝臟中會出現較多免疫細胞浸潤現象(infiltration)，而如第4D圖所示，當動物經AAT siRNA處理時，PtPrc mRNA含量顯著地減少。
於第一劑投藥後採集血清樣本以監測AAT抑制程度。所有經AAT siRNA處理之動物顯示低於5%之剩餘AAT蛋白質，且在投藥下一劑之前，單一劑量維持AAT含量低於80%達14天(第5A圖)。表6提供動物犧牲時(第132天)之觀察。投藥該siRNA雙股螺旋之基因轉殖動物與未處理之控制組動物比較時，表現出減少之腫瘤發生率。具體而言，6隻以磷酸緩衝鹽溶液處理之動物中有4隻出現肝臟腫瘤，反之，6隻以AAT siRNA處理之動物中僅有1隻出現肝臟腫瘤。腫瘤發生率差異之p值係利用t- 檢定計算後為0.045。第5B及5C圖顯示以PBS或AAT siRNA處理之同窩出生仔畜之肝臟切片的PAS染色。深色點狀部分表示小球或Z-AAT聚集。該等資料指出siRNA雙股螺旋對減少基因轉殖鼠中之Z-AAT含量有效並且Z-AAT之減少含量在較健康之肝臟型式中顯示其對生理之益處。
實施例6. AD-59054之先導優化(lead optimization)
如上所敘述，AD-59054被證實為以劑量反應方式而在體內長期抑制AAT。然而，AD-59054核苷酸序列跨越AAT mRNA中之區域，其包括普遍的單核苷酸多型性(single nucleotide polymorphism,SNP)(Reference SNPA ccession No.：rs1303(見如www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP))。具體而言，該SNP位置相當於AD-59054反義股之位置6(5'端至3'端)(亦即在AD-59054之種子區域中)。因此，當種子區域中有錯配時可能導致脫靶(off-target)效應及/或損失其效力，在反義股之位置6(5'端至3'端)具有不同鹼基之額外雙股螺旋係根據AD-59054之序列製備。該目標mRNA攜帶一個相當於AD-59054反義股之位置6(5'端至3'端)之A。該等雙股螺旋之序列係提供於表7。表8則提供該等具有多種化學修飾並與三價N-乙醯葡萄糖胺接合之相同雙股螺旋序列。
如上所敘述，於初代小鼠肝細胞中(Hep3B)以單一劑量自由攝入篩選評估該等經修飾之雙股螺旋功效。Hep3B細胞mRNA於相當於AD-59054反義股之位置6(5'端至3'端)之位置攜帶C。雙股螺旋之IC50值係顯示於表8。令人驚奇的是，其中證明於種子區域中之位置6之單一錯配為除了C外之對所有鹼基具耐受性。
該等雙股螺旋之子集亦用於評估體內效力。表現人類Z-AAT對偶基因(及於其相當於AD-59054反義股之位置6(5'端至3'端)之mRNA上具有A)之基因轉殖鼠於第0天被注射1.0mg/kg之AD-59054、AD-61719、AD- 61700、AD-61726或AD-61704且以上述方式測量，於投藥後持續追蹤血清人類AAT14天(第6圖)。各點表示三隻小鼠之平均值且誤差橫槓反應其標準偏差。如第6圖所證實，AD-61719及AD-61704表現如其親代AD-59054一樣好。
實施例7. AD-59054之先導優化
額外之雙股螺旋係根據AD-59054之序列製備，包括AD-61444。AD-61444之經修飾及未經修飾之正義及反義股係提供於表9。
實施例8. 對非人類之靈長類投藥AD-59054、AD-61719及AD-61444
藉由對靈長類投藥單一劑量之1mg/kg或3mg/kg之AD-59054、AD-61719或AD-61444測試AD-59054、AD-61719及AD-61444對非人類靈長類之效力。於投藥前五天、投藥後第0天，及第3、7、10、15、20及30天採集血清樣本，利用人類AAT專一性酵素連結免疫吸附法測量血清hAAT蛋白質含量以監測AAT抑制之程度。被投藥任何該等化合物之動物血清中之細胞激素含量及化學激活素含量沒有改變，且沒有與投藥該等化合物相關之注射部位反應或藥物相關健康疑慮。第7圖顯示單一劑量1mg/kg之AD-59054、AD-61719或AD-61444(第7A圖)或單一劑量之3mg/kg之AD-59054、AD-61719或AD-61444(第7B圖)導致劑量依賴性且持續之AAT蛋白質降低。
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<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<400> 405
<210> 406
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<400> 406
<210> 407
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<400> 407
<210> 408
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<400> 408
<210> 409
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<400> 409
<210> 410
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<400> 410
<210> 411
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<400> 411
<210> 412
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<400> 412
<210> 413
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (6)..(6)
<223> 肌苷
<400> 413
<210> 414
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (6)..(6)
<223> a,c,u或g
<400> 414
<210> 415
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (6)..(6)
<223> a,c,u或g
<400> 415
<210> 416
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
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<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (6)..(6)
<223> a.c,u或g
<400> 416
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
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<223> /註解="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
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<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<400> 419
<210> 420
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<400> 420
<210> 421
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<400> 424
<210> 425
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
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<400> 425
<210> 426
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<400> 426
<210> 427
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<400> 427
<210> 428
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
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<400> 428
<210> 429
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<400> 429
<210> 430
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<400> 430
<210> 431
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<400> 431
<210> 432 <211> 23 <212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<400> 432
<210> 433
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (6)..(6)
<223> 肌苷
<400> 433
<210> 434
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 來源
<223> /註解="組合DNA/RNA 分子的描述：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (6)..(6)
<223> 去氧核糖肌苷
<400> 434
<210> 435
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 來源
<223> /註解="組合DNA/RNA 分子的描述：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (6)..(6)
<223> 去氧核糖肌苷
<400> 435
<210> 436
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /註解="人工序列的描述：合成寡核苷酸"
<220>
<221> 經修飾鹼基
<222> (6)..(6)
<223> 2-羥基甲基-四氫呋喃-4-甲氧基-3-磷酸
<400> 436

Claims (134)

  1. 一種抑制細胞中絲胺酸蛋白酶抑制因子A1表現之雙股RNAi試劑，其中，該雙股RNAi試劑包含正義股及反義股形成之雙股區域，其中，該正義股包含至少15個相鄰核苷酸，該至少15個相鄰核苷酸與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中任一核苷酸序列之差異不超過3個核苷酸，且該反義股包含至少15個相鄰核苷酸，該至少15個相鄰核苷酸與SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25中任一核苷酸序列之差異不超過3個核苷酸，其中，實質上所有該正義股之核苷酸及實質上所有該反義股之核苷酸係為經修飾核苷酸，以及其中，該正義股係接合至附著於3’-端之配體。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之雙股RNAi試劑，其中，該反義股核苷酸序列中之3個核苷酸差異之一者係為該反義股之種子區域中之核苷酸錯配。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之雙股RNAi試劑，其中，該反義股於該錯配核苷酸包含通用鹼基。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之雙股RNAi試劑，其中， 所有該正義股之核苷酸及所有該反義股之核苷酸係經修飾之核苷酸。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之雙股RNAi試劑，其中，該正義股及該反義股包含互補區，該互補區包含至少15個相鄰核苷酸，且該至少15個相鄰核苷酸與表1、2、5、7、8及9中任一者所列之任一序列之差異不超過3個核苷酸。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之雙股RNAi試劑，其中，該經修飾核苷酸之至少一者係選自由3'-端去氧胸腺嘧啶核苷酸(3'-terminal deoxy-thymine(dT)nucleotide)、經2'-O-甲基修飾核苷酸、經2'-氟修飾核苷酸、經2'-去氧修飾核苷酸、鎖核苷酸、無鹼基核苷酸、經2'-胺基修飾核苷酸、經2'-烷基修飾核苷酸、N-嗎啉基核苷酸(morpholino nucleotide)、胺基磷酸酯(phosphoramidate)、包含非天然鹼基之核苷酸、包含5'-硫代磷酸酯基團之核苷酸及連接至膽固醇基衍生物或十二酸雙癸醯胺之末端核苷酸所組成之群組。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之雙股RNAi試劑，其中，至少一股包含至少一個核苷酸之3'突出。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之雙股RNAi試劑，其中，至少一股包含至少二個核苷酸之3'突出。
  9. 一種能抑制細胞中絲胺酸蛋白酶抑制因子A1表現之雙股RNAi試劑，其中，該雙股RNAi試劑包含實質 上互補於反義股之正義股，其中，該反義股包含實質上互補於部分之編碼絲胺酸蛋白酶抑制因子A1之mRNA的區域，其中，各股係約14至約30個核苷酸長，其中，該雙股RNAi試劑係以式(III)表示：正義股：5'n p-N a-(XXX) i-N b-YYY-N b-(ZZZ) j-N a-n q3'反義股：3'n p'-N a'-(X'X'X') k-N b'-Y'Y'Y'-N b'-(Z'Z'Z') l-N a'- (III)n q'5'其中：i、j、k及l係各獨立為0或1；p、p'、q及q'係各獨立為0至6；各N a及N a'獨立表示包含0至25個經修飾或未經修飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少二個經不同修飾之核苷酸；各N b及N b'獨立表示包含0至10個經修飾或未經修飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列；各u p、n p'、n q及n q'可存在或可不存在，並獨立表示突出核苷酸；XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'及Z'Z'Z'各獨立表示三個連續核苷酸上之三個相同修飾之模體；N b上之修飾與Y上之修飾不同且N b'上之修飾與Y'上之修飾不同；以及其中，該正義股係接合至至少一個配體。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之雙股RNAi試劑，其中，N a'包含1至25個核苷酸，且其中位在自5'端之2至 9位置之一位置之該1至25個核苷酸之一者係核苷酸錯配。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之雙股RNAi試劑，包含於該錯配核苷酸之通用鹼基。
  12. 如申請專利範圍第9項所述之雙股RNAi試劑，其中，i為0；j為0；i為1；j為1；i及j皆為0；或i及j皆為1。
  13. 如申請專利範圍第9項所述之雙股RNAi試劑，其中，k為0；l為0；k為1；l為1；k及l皆為0；或k及l皆為1。
  14. 如申請專利範圍第9項所述之雙股RNAi試劑，其中，XXX係互補於X'X'X'，YYY係互補於Y'Y'Y'，以及ZZZ係互補於Z'Z'Z'。
  15. 如申請專利範圍第9項所述之雙股RNAi試劑，其中，該YYY模體出現於或接近該正義股之剪切位置。
  16. 如申請專利範圍第9項所述之雙股RNAi試劑，其中，該Y'Y'Y'模體出現於該反義股5'-端之11、12及13位置。
  17. 如申請專利範圍第16項所述之雙股RNAi試劑，其中，該Y'係2'-O-甲基。
  18. 如申請專利範圍第9項所述之雙股RNAi試劑，其中，式(III)係以式(IIIa)表示：正義股：5'n p-N a-YYY-N a-n q3'反義股：3'n p'-N a'-Y'Y'Y'-N a'-n q'5' (IIIa)。
  19. 如申請專利範圍第9項所述之雙股RNAi試劑，其中，式(III)係以式(IIIb)表示：正義股：5'n p-N a-YYY-N b-ZZZ-N a-n q3'反義股：3'n p'-N a'-Y'Y'Y'-N b'-Z'Z'Z'-N a'-n q'5' (IIIb)其中，各N b及N b'獨立表示包含1至5個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
  20. 如申請專利範圍第9項所述之雙股RNAi試劑，其中，式(III)係以式(IIIc)表示：正義股：5'n p-N a-XXX-N b-YYY-N a-n q3'反義股：3'n p'-N a'-X'X'X'-N b'-Y'Y'Y'-N a'-n q'5' (IIIc)其中，各N b及N b'獨立表示包含1至5個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
  21. 如申請專利範圍第9項所述之雙股RNAi試劑，其中，式(III)係以式(IIId)表示：正義股：5'n p-N a-XXX-N b-YYY-N b-ZZZ-N a-n q3'反義股：3'n p'-N a'-X'X'X'-N b'-Y'Y'Y'-N b'-Z'Z'Z'-N a'- (IIId)n q'5'其中，各N b及N b'獨立表示包含1至5個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列且各N a及N a'獨立表示包含2至10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
  22. 如申請專利範圍第1或9項所述之雙股RNAi試劑，其中，該雙股區域係15至30個核苷酸對長。
  23. 如申請專利範圍第22項所述之雙股RNAi試劑，其中，該雙股區域係17至23個核苷酸對長。
  24. 如申請專利範圍第22項所述之雙股RNAi試劑，其中，該雙股區域係17至25個核苷酸對長。
  25. 如申請專利範圍第22項所述之雙股RNAi試劑，其中，該雙股區域係23至27個核苷酸對長。
  26. 如申請專利範圍第22項所述之雙股RNAi試劑，其中，該雙股區域係19至21個核苷酸對長。
  27. 如申請專利範圍第22項所述之雙股RNAi試劑，其中，該雙股區域係21至23個核苷酸對長。
  28. 如申請專利範圍第1或9項所述之雙股RNAi試劑，其中，各股具有15至30個核苷酸。
  29. 如申請專利範圍第1或9項所述之雙股RNAi試劑，其中，各股具有19至30個核苷酸。
  30. 如申請專利範圍第9項所述之雙股RNAi試劑，其中，該核苷酸上之修飾係選自由鎖核苷酸(LNA)、去水己糖醇核酸(HNA)、環己烯基核酸(CeNA)、2'-甲氧乙基、2'-O-烷基、2'-O-烯丙基、2'-碳-烯丙基、2'-氟、2'-去氧、2'-羥基、及其組合所組成之群組。
  31. 如申請專利範圍第30項所述之雙股RNAi試劑，其中，於該核苷酸上之修飾係2'-O-甲基或2'-氟修飾。
  32. 如申請專利範圍第1或9項所述之雙股RNAi試劑，其中，該配體係一或多個透過二價或三價分支連接子所附著之N-乙醯葡萄糖胺(GalNAc)衍生物。
  33. 如申請專利範圍第1或9項所述之雙股RNAi試劑，其中，該配體係
  34. 如申請專利範圍第1或9項所述之雙股RNAi試劑，其中，該配體係附著於該正義股之3'端。
  35. 如申請專利範圍第34項所述之雙股RNAi試劑，其中，該RNAi試劑係接合至該配體，如下列圖所示 其中，X為氧或硫。
  36. 如申請專利範圍第1或9項所述之雙股RNAi試劑，其中，該試劑進一步包含至少一個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯之核苷酸間鍵結。
  37. 如申請專利範圍第36項所述之雙股RNAi試劑，其中，該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯之核苷酸間鍵結係於一股之3'-端。
  38. 如申請專利範圍第37項所述之雙股RNAi試劑，其 中，該股係該反義股。
  39. 如申請專利範圍第37項所述之雙股RNAi試劑，其中，該股係該正義股。
  40. 如申請專利範圍第36項所述之雙股RNAi試劑，其中，該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯之核苷酸間鍵結係於一股之5'-端。
  41. 如申請專利範圍第40項所述之雙股RNAi試劑，其中，該股係該反義股。
  42. 如申請專利範圍第40項所述之雙股RNAi試劑，其中，該股係該正義股。
  43. 如申請專利範圍第36項所述之雙股RNAi試劑，其中，該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯之核苷酸間鍵結係於一股之5'-及3'-兩端。
  44. 如申請專利範圍第43項所述之雙股RNAi試劑，其中，該股係該反義股。
  45. 如申請專利範圍第36項所述之雙股RNAi試劑，其中，該RNAi試劑包含6至8個硫代磷酸酯之核苷酸間鍵結。
  46. 如申請專利範圍第45項所述之雙股RNAi試劑，其中，該反義股包含二個於5’-端之硫代磷酸酯之核苷酸間鍵結及二個於3’-端之硫代磷酸酯之核苷酸間鍵結，以及該正義股包含至少二個於5’-端或3’-端之硫代磷酸酯之核苷酸間鍵結。
  47. 如申請專利範圍第1或9項所述之雙股RNAi試劑， 其中，該雙股螺旋結構之反義股中5'端位置1之鹼基對為AU鹼基對。
  48. 如申請專利範圍第9項所述之雙股RNAi試劑，其中，該Y核苷酸包含2'-氟修飾。
  49. 如申請專利範圍第9項所述之雙股RNAi試劑，其中，該Y'核苷酸包含2'-O-甲基修飾。
  50. 如申請專利範圍第9項所述之雙股RNAi試劑，其中，p'>0。
  51. 如申請專利範圍第9項所述之雙股RNAi試劑，其中，p'=2。
  52. 如申請專利範圍第51項所述之雙股RNAi試劑，其中，q'=0、p=0、q=0及p'突出核苷酸係互補於該目標mRNA。
  53. 如申請發明專利範圍第51項所述之雙股RNAi試劑，其中q'=0、p=0、q=0及p'突出核苷酸係非互補於該目標mRNA。
  54. 如申請專利範圍第51項所述之雙股RNAi試劑，其中，該正義股共具有21個核苷酸且該反義股共具有23個核苷酸。
  55. 如申請專利範圍第50至54項中任一項所述之雙股RNAi試劑，其中，至少一個n p'係經由硫代磷酸酯鍵結連接至相鄰核苷酸。
  56. 如申請專利範圍第55項所述之雙股RNAi試劑，其中，所有n p'係經由硫代磷酸酯鍵結連接至相鄰核苷 酸。
  57. 如申請專利範圍第1或9項所述之雙股RNAi試劑，其中，該RNAi試劑係選自表1、2、5、7、8及9任一表中所列之RNAi試劑所組成之群組。
  58. 如申請專利範圍第1或7項所述之雙股RNAi試劑，其中，該RNAi試劑係選自由AD-58681、AD-59054、AD-61719及AD-61444所組成群組。
  59. 一種用於抑制細胞中絲胺酸蛋白酶抑制因子A1表現之雙股RNAi試劑，其中，該雙股RNAi試劑包含形成雙股區域之正義股及反義股，其中，該正義股包含至少15個相鄰核苷酸，該至少15個相鄰核苷酸與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中任一核苷酸序列之差異不超過3個核苷酸，且該反義股包含至少15個相鄰核苷酸，該至少15個相鄰核苷酸與SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25中任一核苷酸序列之差異不超過3個核苷酸，其中，實質上所有該正義股之核苷酸皆包含選自 由2'-O-甲基修飾及2'-氟修飾所組成群組之修飾，其中，該正義股於5’-端包含二個硫代磷酸酯之核苷酸間鍵結，其中，實質上所有該反義股之核苷酸皆包含選自由2'-O-甲基修飾及2'-氟修飾所組成群組之修飾，其中，該反義股於5’-端包含二個硫代磷酸酯之核苷酸間鍵結及於3’-端二個硫代磷酸酯核苷酸間鍵結，以及其中，該正義股於3’-端係接合至一或多個透過二價或三價之分支連接子附著之GalNAc衍生物。
  60. 如申請專利範圍第59項所述之雙股RNAi試劑，其中，該反義股核苷酸序列中之3個核苷酸差異之一者係為該反義股之種子區域中之核苷酸錯配。
  61. 如申請專利範圍第60項所述之雙股RNAi試劑，其中，該反義股包含於該錯配核苷酸之通用鹼基。
  62. 如申請專利範圍第59項所述之雙股RNAi試劑，其中，該正義股之所有核苷酸及該反義股之所有核苷酸皆包含修飾。
  63. 一種能抑制細胞中絲胺酸蛋白酶抑制因子A1表現之雙股RNAi試劑，其中該雙股RNAi試劑包含實質上互補於反義股之正義股，其中，該反義股包含實質上互補於部分之編碼絲胺酸蛋白酶抑制因子A1之mRNA的區域，其中，各股長度係約14至約30個核苷酸，其中，該雙股RNAi試劑可以式(III)表示： 正義股：5'n p-N a-(XXX) i-N b-YYY-N b-(ZZZ) j-N a-n q3'反義股：3'n p'-N a'-(X'X'X') k-N b'-Y'Y'Y'-N b'-(Z'Z'Z') l-N a'- (III)n q'5'其中：i、j、k及l係各獨立為0或1；p、p'、q及q'係各獨立為0至6；各N a及N a'獨立表示包含0至25個經修飾或未經修飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少二個經不同修飾之核苷酸；各N b及N b'獨立表示包含0至10個經修飾或未經修飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列；各n p、n p'、n q及n q'，其各可存在或可不存在，並獨立表示突出核苷酸；XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'及Z'Z'Z'各獨立表示在三個連續核苷酸上之三個相同修飾之模體，且其中，該修飾係2'-O-甲基或2'-氟修飾；N b上之修飾與Y上之修飾不同，且N b'上之修飾與Y'上之修飾不同；以及其中，該正義股係接合至至少一個配體。
  64. 一種能抑制細胞中絲胺酸蛋白酶抑制因子A1表現之雙股RNAi試劑，其中，該雙股RNAi試劑包含實質上互補於反義股之正義股，其中，該反義股包含實質上互補於部分之編碼絲胺酸蛋白酶抑制因子A1之mRNA的區域，其中，各股長度係約14至約30個核 苷酸，其中，該雙股RNAi試劑係以式(III)表示：正義股：5'n p-N a-(XXX) i-N b-YYY-N b-(ZZZ) j-N a-n q3'反義股：3'n p'-N a'-(X'X'X') k-N b'-Y'Y'Y'-N b'-(Z'Z'Z') l-N a'- (III)n q'5'其中：i、j、k及l係各獨立為0或1；各n p、n q及n q'，其各可存在或可不存在，並獨立表示突出核苷酸；p、q及q'係各獨立為0至6；n p'>0，且至少一個n p'係經由硫代磷酸酯鍵結連結至相鄰核苷酸；各N a及N a'獨立表示包含0至25個經修飾或未經修飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少二個經不同修飾之核苷酸；各N b及N b'獨立表示包含0至10個經修飾或未經修飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列；XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'及Z'Z'Z'各獨立表示在三個連續核苷酸上之三個相同修飾之模體，且其中，該修飾係2'-O-甲基或2'-氟修飾；N b上之修飾與Y上之修飾不同，且N b'上之修飾與Y'上之修飾不同；以及其中，該正義股係接合至至少一個配體。
  65. 一種能抑制細胞中絲胺酸蛋白酶抑制因子A1表現之雙股RNAi試劑，其中，該雙股RNAi試劑包含實質 上互補於反義股之正義股，其中，該反義股包含實質上互補於部分之編碼絲胺酸蛋白酶抑制因子A1之mRNA的區域，其中，各股長度係約14至約30個核苷酸，其中，該雙股RNAi試劑係以式(III)表示：正義股：5'n p-N a-(XXX) i-N b-YYY-N b-(ZZZ) j-N a-n q3'反義股：3'n p'-N a'-(X'X'X') k-N b'-Y'Y'Y'-N b'-(Z'Z'Z') l- (III)N a'-n q'5'其中：i、j、k及l係各獨立為0或1；各n p、n q及n q'，其各可存在或可不存在，並獨立表示突出核苷酸；p、q及q'係各獨立為0至6；u p'>0，且至少一個n p'係經由硫代磷酸酯鍵結連結至相鄰核苷酸；各N a及N a'獨立表示包含0至25個經修飾或未經修飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少二個經不同修飾之核苷酸；各N b及N b'獨立表示包含0至10個經修飾或未經修飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列；XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'及Z'Z'Z'各獨立表示在三個連續核苷酸上之三個相同修飾之模體，且其中，該修飾係2'-O-甲基或2'-氟修飾；N b上之修飾與Y上之修飾不同，且N b'上之修飾與Y'上之修飾不同；以及 其中，該正義股係接合至至少一個配體，其中，該配體係一或多個透過二價或三價分支連接子附著之N-乙醯葡萄糖胺衍生物。
  66. 一種能抑制細胞中絲胺酸蛋白酶抑制因子A1表現之雙股RNAi試劑，其中，該雙股RNAi試劑包含實質上互補於反義股之正義股，其中，該反義股包含實質上互補於部分之編碼絲胺酸蛋白酶抑制因子A1之mRNA的區域，其中，各股長度係約14至約30個核苷酸，其中，該雙股RNAi試劑係以式(III)表示：正義股：5'n p-N a-(XXX) i-N b-YYY-N b-(ZZZ) j-N a-n q3'反義股：3'n p'-N a'-(X'X'X') k-N b'-Y'Y'Y'-N b'-(Z'Z'Z') l-N a'- (III)n q'5'其中：i、j、k及l係各獨立為0或1；各n p、n q及n q'，其各可存在或可不存在，並獨立表示突出核苷酸；p、q及q'係各獨立為0至6；n p'>0，且至少一個n p'係經由硫代磷酸酯鍵結連結至相鄰核苷酸；各N a及N a'獨立表示包含0至25個經修飾或未經修飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少二個經不同修飾之核苷酸；各N b及N b'獨立表示包含0至10個經修飾或未經修飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列； XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'及Z'Z'Z'各獨立表示在三個連續核苷酸上之三個相同修飾之模體，且其中，該修飾係2'-O-甲基或2'-氟修飾；N b上之修飾與Y上之修飾不同，且N b'上之修飾與Y'上之修飾不同；其中，該正義股包含至少一個硫代磷酸酯鍵結；以及其中，該正義股係接合至至少一個配體，其中，該配體係一或多個透過二價或三價分支連接子附著之N-乙醯葡萄糖胺衍生物。
  67. 一種能抑制細胞中絲胺酸蛋白酶抑制因子A1表現之雙股RNAi試劑，其中，該雙股RNAi試劑包含實質上互補於反義股之正義股，其中，該反義股包含實質上互補於部分之編碼絲胺酸蛋白酶抑制因子A1之mRNA的區域，其中，各股長度係約14至約30個核苷酸，其中，該雙股RNAi試劑係以式(III)表示：正義股：5'n p-N a-YYY-N a-n q3'反義股：3'n p'-N a'-Y'Y'Y'-N a'-n q'5' (IIIa)其中：各n p、n q及n q'，其各可存在或可不存在，並獨立表示突出核苷酸；p、q及q'係各獨立為0至6；n p'>0，且至少一個n p'係經由硫代磷酸酯鍵結連結至相鄰核苷酸； 各N a及N a'獨立表示包含0至25個經修飾或未經修飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少二個經不同修飾之核苷酸；YYY及Y'Y'Y'各獨立表示在三個連續核苷酸上之三個相同修飾之模體，且其中，該修飾係2'-O-甲基或2'-氟修飾；其中，該正義股包含至少一個硫代磷酸酯鍵結；以及其中，該正義股係接合至至少一個配體，其中，該配體係一或多個透過二價或三價分支連接子附著之N-乙醯葡萄糖胺衍生物。
  68. 如申請專利範圍第63至67項任一項所述之雙股RNAi試劑，其中，N a’包含1至25個核苷酸，且其中，位在自5'端2至9位置之一個位置之該1至25個核苷酸之一者係核苷酸錯配。
  69. 如申請專利範圍第68項所述之雙股RNAi試劑，包含於該錯配核苷酸之通用鹼基。
  70. 一種選自表1、2、5、7、8及9任一表中所列之RNAi試劑所組成群組之RNAi試劑。
  71. 一種包含經修飾之反義股聚核苷酸試劑的組成物，其中，該試劑係能抑制細胞中絲胺酸蛋白酶抑制因子A1表現，且該試劑包含互補於選自表1、2、5、7、8及9任一表中所列序列所組成群組之正義股序列的序列，其中，該聚核苷酸長度係約14至約30個核苷酸。
  72. 一種包含如申請專利範圍第1、9、59及63至70項任一項所述之雙股RNAi試劑之載體(vector)。
  73. 一種包含如申請專利範圍第1、9、59及63至70項任一項所述之雙股RNAi試劑之細胞。
  74. 一種包含如申請專利範圍第1、9、59及63至70項任一項所述之雙股RNAi試劑之醫藥組成物。
  75. 如申請專利範圍第74項所述之醫藥組成物，其中，該RNAi試劑係於非緩衝溶液中投藥。
  76. 如申請專利範圍第75項所述之醫藥組成物，其中，該非緩衝溶液係食鹽水或水。
  77. 如申請專利範圍第74項所述之醫藥組成物，其中，該siRNA係於緩衝溶液中投藥。
  78. 如申請專利範圍第77項所述之醫藥組成物，其中，該緩衝溶液包含醋酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶蛋白(prolamine)、碳酸鹽或磷酸鹽溶液或其任意組合。
  79. 如申請專利範圍第78項所述之醫藥組成物，其中，該緩衝溶液為磷酸緩衝鹽溶液。
  80. 一種抑制細胞中絲胺酸蛋白酶抑制因子A1表現之方法，該方法包含：(a)以如申請專利範圍第1、9、59及63至70項任一項所述之雙股RNAi試劑、如申請專利範圍第71項所述之組成物、如申請專利範圍第72項所述之載體或如申請專利範圍第74至79項任一項所述之醫藥組成物接觸該細胞；以及 (b)維持於步驟(a)所產生之細胞一段足夠的時間以獲得絲胺酸蛋白酶抑制因子A1基因之mRNA轉錄本之降解，因此抑制該細胞中絲胺酸蛋白酶抑制因子A1基因之表現。
  81. 如申請專利範圍第80項所述之方法，其中，該細胞於個體內。
  82. 如申請專利範圍第81項所述之方法，其中，該個體係人類。
  83. 如申請專利範圍第80至82項任一項所述之方法，其中，該絲胺酸蛋白酶抑制因子A1之表現係被抑制至少約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約98%或約100%。
  84. 一種治療具有絲胺酸蛋白酶抑制因子A1相關疾病個體之方法，包含投藥該個體治療有效含量之如申請專利範圍第1、9、59及63至70項任一項所述之雙股RNAi試劑、如申請專利範圍第71項所述之組成物、如申請專利範圍第72項所述之載體或如申請專利範圍第74至79項任一項所述之醫藥組成物，因此治療該個體。
  85. 一種治療具有絲胺酸蛋白酶抑制因子A1相關疾病個體之方法，包含皮下投藥該個體治療有效含量之雙股RNAi試劑，其中，該雙股RNAi試劑包含形成雙股區域之正義股及反義股， 其中，該正義股包含至少15個相鄰核苷酸，該至少15個相鄰核苷酸與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11之任一核苷酸序列之差異不超過3個核苷酸，且該反義股包含至少15個相鄰核苷酸，該至少15個相鄰核苷酸與SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25之任一核苷酸序列之差異不超過3個核苷酸，其中，實質上所有該反義股核苷酸皆包含選自由2'-O-甲基修飾及2'-氟修飾所組成群組之修飾，其中，該反義股於5’-端包含二個硫代磷酸酯之核苷酸間鍵結及於3’-端包含二個硫代磷酸酯之核苷酸間鍵結，其中，實質上所有該正義股之核苷酸皆包含選自由2'-O-甲基修飾及2'-氟修飾所組成群組之修飾，其中，該正義股於5’-端包含二個硫代磷酸酯之核苷酸間鍵結，以及其中，該正義股係於3’-端接合至一或多個透過二價或三價分支連接子附著之N-乙醯葡萄糖胺衍生物，因此治療該個體。
  86. 如申請專利範圍第85項所述之方法，其中，該反義股核若酸序列中之3個核苷酸差異之一者係該反義股種子區域中之核苷酸錯配。
  87. 如申請專利範圍第86項所述之方法，其中，該反義股包含於該錯配核苷酸之通用鹼基。
  88. 如申請專利範圍第85項所述之方法，其中，所有該正義股之核苷酸及所有該反義股之核苷酸皆包含修飾。
  89. 如申請專利範圍第84或85項所述之方法，其中，該個體係人類。
  90. 如申請專利範圍第84或85項所述之方法，其中，該絲胺酸蛋白酶抑制因子A1相關疾病係肝臟疾病。
  91. 如申請專利範圍第90項所述之方法，其中，該肝臟疾病係選自由慢性肝臟疾病、肝臟發炎、肝硬化、肝纖維化及/或肝細胞癌所組成群組。
  92. 如申請專利範圍第84或85項所述之方法，其中，該雙股RNAi試劑係以約0.01mg/kg至約10mg/kg或約0.5mg/kg至約50mg/kg之劑量投藥。
  93. 如申請專利範圍第92項所述之方法，其中，該雙股RNAi試劑係以約10mg/kg至約30mg/kg之劑量投藥。
  94. 如申請專利範圍第92項所述之方法，其中，該雙股RNAi試劑係以約3mg/kg之劑量投藥。
  95. 如申請專利範圍第92項所述之方法，其中，該雙股RNAi試劑係以約10mg/kg之劑量投藥。
  96. 如申請專利範圍第92項所述之方法，其中，該雙股RNAi試劑係以約0.5mg/kg之劑量每週二次投藥。
  97. 如申請專利範圍第92項所述之方法，其中，該雙股RNAi試劑含量係以約10mg/kg之劑量每隔一週投藥。
  98. 如申請專利範圍第92項所述之方法，其中，該雙股RNAi試劑含量係以約0.5至1mg/kg之劑量每週一次投藥。
  99. 如申請專利範圍第92項所述之方法，其中，該雙股RNAi試劑係皮下投藥。
  100. 如申請專利範圍第92項所述之方法，其中，該雙股RNAi試劑係靜脈投藥。
  101. 如申請專利範圍第92項所述之方法，其中，該RNAi試劑係以二個或多個劑量投藥。
  102. 如申請專利範圍第101項所述之方法，其中，該RNAi試劑係以選自由約每12小時一次、約每24小時一次、約每48小時一次、約每72小時一次、及約每96小時一次所組成群組之間隔投藥。
  103. 如申請專利範圍第101項所述之方法，其中，該RNAi試劑係以每週二次投藥。
  104. 如申請專利範圍第101項所述之方法，其中，該RNAi試劑係以每隔一週投藥。
  105. 一種於具有絲胺酸蛋白酶抑制因子A1缺乏變異之個體中抑制肝細胞癌發展之方法，其包含對該個體投藥治療有效含量之如申請專利範圍第1、9、59及63至 70項任一項所述之雙股RNAi試劑、如申請專利範圍第71項所述之組成物、如申請專利範圍第72項所述之載體或如申請專利範圍第74至79項任一項所述之醫藥組成物，因此抑制該個體中肝細胞癌之發展。
  106. 一種於具有絲胺酸蛋白酶抑制因子A1缺乏變異個體中抑制肝細胞癌發展之方法，其包含對該個體皮下投藥治療有效含量之雙股RNAi試劑，其中，該雙股RNAi試劑包含形成雙股區域之正義股及反義股，其中，該正義股包含至少15個相鄰核苷酸，且該至少15個相鄰核苷酸與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11之任一核苷酸序列之差異不超過3個核苷酸，且該反義股包含至少15個相鄰核苷酸，且該至少15個相鄰核苷酸與SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25之任一核苷酸序列之差異不超過3個核苷酸，其中，實質上所有該反義股核苷酸皆包含選自由2'-O-甲基修飾及2'-氟修飾所組成群組之修飾，其中，該反義股於5’-端包含二個硫代磷酸酯之核 苷酸間鍵結及於3’-端包含二個硫代磷酸酯之核苷酸間鍵結，其中，實質上所有該正義股核苷酸皆包含選自由2'-O-甲基修飾及2'-氟修飾所組成群組之修飾，其中，該正義股於5’-端包含二個硫代磷酸酯之核苷酸間鍵結，以及其中，該正義股係於3’-端接合於一或多個透過二價或三價分支連接子附著之N-乙醯葡萄糖胺衍生物，因此抑制該具有絲胺酸蛋白酶抑制因子A1缺乏變異個體中肝細胞癌之發展。
  107. 如申請專利範圍第106項所述之方法，其中，該反義股之核苷酸序列中3個核苷酸差異之一者係該反義股種子區域中之核苷酸錯配。
  108. 如申請專利範圍第107項所述之方法，其中，該反義股包含於該錯配核苷酸之通用鹼基。
  109. 如申請專利範圍第106項所述之方法，其中，所有該正義股之核苷酸及所有該反義股之核苷酸皆包含修飾。
  110. 如申請專利範圍第105或106項所述之方法，其中，該個體係靈長類或囓齒類。
  111. 如申請專利範圍第105或106項所述之方法，其中，該個體係人類。
  112. 如申請專利範圍第105或106項所述之方法，其中，該雙股RNAi試劑係以約0.01mg/kg至約10mg/kg或 約0.5mg/kg至約50mg/kg之劑量投藥。
  113. 如申請專利範圍第112項所述之方法，其中，該雙股RNAi試劑係以約10mg/kg至約30mg/kg之劑量投藥。
  114. 如申請專利範圍第112項所述之方法，其中，該RNAi試劑係以二或多個劑量投藥。
  115. 如申請專利範圍第112項所述之方法，其中，該RNAi試劑係以選自由約每12小時一次、約每24小時一次、約每48小時一次、約每72小時一次、及約每96小時一次所組成群組之間隔投藥。
  116. 如申請專利範圍第112項所述之方法，其中，該RNAi試劑係以每週二次投藥。
  117. 如申請專利範圍第112項所述之方法，其中，該RNAi試劑係以每隔一週投藥。
  118. 如申請專利範圍第112項所述之方法，其中，該雙股RNAi試劑係皮下投藥。
  119. 如申請專利範圍第112項所述之方法，其中，該雙股RNAi試劑係靜脈投藥。
  120. 一種於具有絲胺酸蛋白酶抑制因子A1缺乏變異個體之肝臟中減少錯誤折疊絲胺酸蛋白酶抑制因子A1累積之方法，其包含對該個體投藥治療有效含量之如申請專利範圍第1、9、59及63至70項任一項所述之雙股RNAi試劑、如申請專利範圍第71項所述之組成物、如申請專利範圍第72項所述之載體或如申請專 利範圍第74至79項任一項所述之醫藥組成物，因此減少該個體肝臟中錯誤折疊絲胺酸蛋白酶抑制因子A1之累積。
  121. 一種於具有絲胺酸蛋白酶抑制因子A1缺乏變異個體之肝臟中減少錯誤折疊絲胺酸蛋白酶抑制因子A1累積之方法，其包含對該個體皮下投藥治療有效含量之雙股RNAi試劑，其中，該雙股RNAi試劑包含形成雙股區域之正義股及反義股，其中，該正義股包含至少15個相鄰核苷酸，該至少15個相鄰核苷酸與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11之任一核苷酸序列之差異不超過3個核苷酸，且該反義股包含至少15個相鄰核苷酸，該至少15個相鄰核苷酸與SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25之任一核苷酸序列之差異不超過3個核苷酸，其中，實質上所有該反義股核苷酸皆包含選自由2'-O-甲基修飾及2'-氟修飾所組成群組之修飾，其中，該反義股於5’-端包含二個硫代磷酸酯之核 苷酸間鍵結及於3’-端包含二個硫代磷酸酯之核苷酸間鍵結，其中，實質上所有該正義股核苷酸皆包含選自由2'-O-甲基修飾及2'-氟修飾所組成群組之修飾，其中，該正義股於5’-端包含二個硫代磷酸酯之核苷酸間鍵結，以及其中，該正義股係於3’-端接合於一或多個透過二價或三價分支連接子附著之N-乙醯葡萄糖胺衍生物，因此減少該具有絲胺酸蛋白酶抑制因子A1缺乏變異之個體肝臟中錯誤折疊絲胺酸蛋白酶抑制因子A1之累積。
  122. 如申請專利範圍第121項所述之方法，其中，該反義股之核苷酸序列中之3個核苷酸差異之一者係該反義股種子區域中之核苷酸錯配。
  123. 如申請專利範圍第122項所述之方法，其中，該反義股包含於該錯配核苷酸上之通用鹼基。
  124. 如申請專利範圍第121項所述之方法，其中，所有該正義股之核苷酸及所有該反義股之核苷酸皆包含修飾。
  125. 如申請專利範圍第120或121項所述之方法，其中，該個體係靈長類或囓齒類。
  126. 如申請專利範圍第120或121項所述之方法，其中，該個體係人類。
  127. 如申請專利範圍第120或121項所述之方法，其中， 該雙股RNAi試劑含量係以約0.01mg/kg至約10mg/kg或約0.5mg/kg至約50mg/kg之劑量投藥。
  128. 如申請專利範圍第127項所述之方法，其中，該雙股RNAi試劑含量係以約10mg/kg至約30mg/kg之劑量投藥。
  129. 如申請專利範圍第127項所述之方法，其中，該RNAi試劑係以二個或多個劑量投藥。
  130. 如申請專利範圍第127項所述之方法，其中，該RNAi試劑係每週二次投藥。
  131. 如申請專利範圍第127項所述之方法，其中，該RNAi試劑係每隔一週投藥。
  132. 如申請專利範圍第127項所述之方法，其中，該RNAi試劑係以選自由約每12小時一次、約每24小時一次、約每48小時一次、約每72小時一次、及約每96小時一次所組成群組之間隔投藥。
  133. 如申請專利範圍第127項所述之方法，其中，該雙股RNAi試劑係皮下投藥。
  134. 如申請專利範圍第127項所述之方法，其中，該雙股RNAi試劑係靜脈投藥。
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