KR102295648B1 - ＳＥＲＰＩＮＡ1 ｉＲＮＡ 조성물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

ＳＥＲＰＩＮＡ1 ｉＲＮＡ 조성물 및 이의 사용 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102295648B1
KR102295648B1 KR1020157036053A KR20157036053A KR102295648B1 KR 102295648 B1 KR102295648 B1 KR 102295648B1 KR 1020157036053 A KR1020157036053 A KR 1020157036053A KR 20157036053 A KR20157036053 A KR 20157036053A KR 102295648 B1 KR102295648 B1 KR 102295648B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
delete delete
rnai agent
nucleotides
stranded rnai
strand
Prior art date
Application number
KR1020157036053A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20160011660A (ko
Inventor
알피카 세갈
클라우스 채리스
브라이언 베텐코트
마틴 마이어
칼란토타틸 지. 라지브
그레고리 힌클
무티아 마노하란
Original Assignee
알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 filed Critical 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드
Priority to KR1020217026982A priority Critical patent/KR102463973B1/ko
Publication of KR20160011660A publication Critical patent/KR20160011660A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102295648B1 publication Critical patent/KR102295648B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/712—Nucleic acids or oligonucleotides having modified sugars, i.e. other than ribose or 2'-deoxyribose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/331—Universal or degenerate base
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/332—Abasic residue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/343—Spatial arrangement of the modifications having patterns, e.g. ==--==--==--
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/344—Position-specific modifications, e.g. on every purine, at the 3'-end
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/34—Allele or polymorphism specific uses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity
    • C12N2320/51—Methods for regulating/modulating their activity modulating the chemical stability, e.g. nuclease-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised

Abstract

본 발명은 Serpina1 유전자를 표적하는 RNAi 작용제, 예를 들어 이중 가닥 RNAi 작용제, 및 Serpina1의 발현을 억제하기 위한 이러한 RNAi 작용제의 사용 방법, 및 Serpina1과 연관된 질병, 예를 들어, 간 장애를 가진 피검자의 치료 방법에 관한 것이다.

Description

ＳＥＲＰＩＮＡ1 ｉＲＮＡ 조성물 및 이의 사용 방법{SERPINA1 iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF}
관련 출원
본 출원은 2013년 5월 22일에 출원된 미국 가출원 제61/826,125호, 2013년 11월 1일에 출원된 미국 가출원 제61/898,695호, 2014년 4월 15일에 출원된 미국 가출원 제61/979,727호 및 2014년 5월 6일에 출원된 미국 가출원 제61/989028호의 우선권을 주장한다. 본 출원은 2011년 11월 18일에 출원된 미국 가출원 제61/561,710호 및 2012년 11월 16일에 출원된 제PCT/US2012/065601호에 관한 것이다. 상기 출원들 각각의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되고, 본원에 전체 내용이 참조로서 포함되는 서열 목록을 포함한다. 2014년 5월 20일에 생성된 상기 ASCII 카피는 121301-00620_SL.txt로 명명되어 있으며, 199,204 바이트 크기이다.
Serpina1은 주로 간세포, 단핵성 단핵구, 폐포 대식세포, 장세포(enterocyte) 및 골수세포에 의해 생성되는 호중성 엘라스타제와 복합체를 이루어 이의 활성을 억제하는 알파-1-항트립신이다. Serpina1 유전자의 하나의 복사체 또는 두 복사체 모두에 변이를 가진 피검자는 알파-1-항트립신 결핍에 걸릴 수 있으며, 폐 및 간에서 정상보다 높은 엘라스타제 활성으로 인해 폐기종 및/또는 만성 간 질병이 발병할 위험에 있다.
영향은 받는 피검자에서, 알파-1-항트립신의 결핍은 야생형의 기능성 알파-1-항트립신의 결핍이다. 일부 경우에, Serpina1 유전자의 하나의 복사체 또는 두 복사체 모두에 변이를 가진 피검자는 무효 대립유전자(null allele)를 운반하고 있다. 다른 경우에, Serpina1 유전자의 하나의 복사체 또는 두 복사체 모두에 변이를 가진 피검자는 결핍 대립유전자(deficient allele)를 운반하고 있다.
예를 들어, PIZ 대립유전자와 같은 Serpina1의 결핍 대립유전자를 가진 피검자는, 합성 부위로부터 신체 내 작용 부위로 적절하게 수송될 수 없는 미스폴딩된(misfolded) 단백질을 생성할 수 있다. 이러한 피검자는 전형적으로, 폐 질병 및/또는 간 질병이 발병할 위험에 있다. PINULL(그래나이트 폴스(Granite Falls))과 같은 Serpina1 무효 대립유전자를 가진 피검자는 전형적으로 폐 질병만 발병할 위험에 있다.
알파-1 항트립신 결핍으로 인한 폐 질병은, 미스폴딩되어 세포 밖으로 쉽게 수송되지 않는, 간세포에서 생성되는 알파-1-항트립신의 변이형의 결과이다. 이로써, 미스폴딩된 단백질이 간세포에 구축하게 되며, 만성 간 질병, 간 염증, 간경변, 간 섬유증 및/또는 간세포 암종을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 하나 이상의 간 질병 또는 간 장애를 유발할 수 있다.
알파-1-항트립신 결핍으로 인한 간 질병을 가진 환자의 치료를 위한 옵션은 현재 간염 백신접종, 지지 치료(supportive care) 및 유해 작용제(injurious agent)(예, 알코올 및 NSAIDs)의 회피를 포함하여, 매우 한정되어 있다. 대체 알파-1-항트립신 치료법이 이용가능하지만, 이러한 치료는 이들 피검자에서 간 질병에는 영향을 미치지 못하며, 간 이식이 효과적일 수 있지만, 이는 어렵고, 비용이 많이 들며, 위험한 수술이고, 간 장기는 쉽게 입수되지 않는다.
이에, 당해 기술분야에 만성 간 질병, 간 염증, 간경변, 간 섬유증 및/또는 간세포 암종과 같은 Serpina1-연관 질병의 효과적인 치료법이 요구되는 실정이다.
하기에 보다 상세히 기술되는 바와 같이, 본 발명은 Serpina1을 표적으로 하는 작용제, 예를 들어 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 및 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 RNAi 작용제, 예를 들어 이중 가닥 iRNA 작용제를 포함하는 조성물을 개시한다. 본 발명은 또한, Serpina1 발현을 억제하고, Serpina1과 연관된 질병, 예를 들어, 만성 간 질병, 간 염증, 간경변, 간 섬유증 및/또는 간세포 암종을 치료하기 위한 본 발명의 조성물의 사용 방법을 개시한다.
이에, 일 양태에서, 본 발명은 세포에서 Serpina1의 발현을 억제하는 이중 가닥 RNAi 작용제를 제공한다. 이중 가닥 RNAi 작용제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 센스 가닥은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 또는 SEQ ID NO:11의 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나와 비교 시 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한, 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드(contiguous nucleotide)를 포함하며, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 또는 SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 또는 SEQ ID NO:25의 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나와 비교 시 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한, 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하며,
센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드들과 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드들은 변형된 뉴클레오타이드들이고,
센스 가닥은 3'-말단에 부착된 리간드에 콘쥬게이트된다.
일 실시형태에서, 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열에서 3개 뉴클레오타이드 차이 중 1개는 안티센스 가닥의 시드 영역(seed region)에 존재하는 뉴클레오타이드 미스매치이다. 일 실시형태에서, 안티센스 가닥은 미스매칭된 뉴클레오타이드에 유니버셜 염기(universal base)를 포함한다.
일 실시형태에서, 센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드들 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드들은 변형된 뉴클레오타이드들이다.
일 실시형태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 표 1, 표 2, 표 5, 표 7, 표 8 및 표 9 중 임의의 하나에 열거된 서열 중 임의의 하나와 비교 시, 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드들을 포함하는 상보성 영역을 포함한다.
일 실시형태에서, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드는 3'-말단 데옥시-티민(dT) 뉴클레오타이드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드, 2'-플루오로 변형된 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-변형된 뉴클레오타이드, 잠금(locked) 뉴클레오타이드, 무염기성(abasic) 뉴클레오타이드, 2'-아미노-변형된 뉴클레오타이드, 2'-알킬-변형된 뉴클레오타이드, 모르폴리노 뉴클레오타이드, 포스포라미데이트, 비천연 염기를 포함하는 뉴클레오타이드, 5'-포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오타이드, 및 콜레스테릴 유도체 또는 도데칸산 비스데실아미드기에 연결된 말단 뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 3' 오버행을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 2개의 뉴클레오타이드의 3' 오버행을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포에서 Serpina1의 발현을 억제할 수 있는 RNAi 작용제, 예를 들어 이중 가닥 RNAi 작용제를 제공하며, 여기서, 이중 가닥 RNAi 작용제는 안티센스 가닥에 실질적으로 상보적인 센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥은 Serpina1을 인코딩하는 mRNA의 부분에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하고, 각각의 가닥은 길이가 약 14개 내지 약 30개의 뉴클레오타이드들이고, 이중 가닥 RNAi 작용제는 화학식 (III)으로 표시된다:
Figure 112015124918061-pct00001
상기 식에서,
i, j, k 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이며;
p, p', q 및 q'는 각각 독립적으로 0 내지 6이며;
Na 및 Na'는 각각 독립적으로 변형되거나, 비변형되거나 또는 이들의 조합인 0개 내지 25개의 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오타이드를 포함하며;
Nb 및 Nb'는 각각 독립적으로 변형되거나, 비변형되거나 또는 이들의 조합인 0개 내지 10개의 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내며;
np, np', nq 및 nq'는 각각이 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 각각 독립적으로 오버행 뉴클레오타이드를 나타내며;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 하나의 모티프를 나타내며,
Nb 상의 변형은 Y 상의 변형과 상이하며, Nb' 상의 변형은 Y' 상의 변형과 상이하고;
센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 콘쥬게이트된다.
일 실시형태에서, Na'는 1개 내지 25개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 5' 말단으로부터 위치 2 내지 9 중 하나에 존재하는 1개 내지 25개의 뉴클레오타이드 중 1개는 뉴클레오타이드 미스매치이다. 일 실시형태에서, 미스매칭된 염기는 유니버셜 염기이다.
일 실시형태에서, i는 0이거나; j는 0이거나; i는 1이거나; j는 1이거나; i 및 j 둘 모두는 0이거나; i 및 j 둘 모두는 1이다. 다른 실시형태에서, k는 0이거나; l은 0이거나; k는 1이거나; l은 1이거나; k 및 l 둘 모두는 0이거나; k 및 l 둘 모두는 1이다.
일 실시형태에서, XXX는 X'X'X'에 상보적이며, YYY는 Y'Y'Y'에 상보적이고, ZZZ는 Z'Z'Z'에 상보적이다.
일 실시형태에서, YYY 모티프는 센스 가닥의 절단 부위에 또는 그 근처에 존재한다.
일 실시형태에서, Y'Y'Y' 모티프는 5'-말단으로부터 안티센스 가닥의 11, 12 및 13 위치에 존재한다.
일 실시형태에서, Y'는 2'-O-메틸이다.
일 실시형태에서, 화학식 (III)은 화학식 (IIIa)로 표시된다:
Figure 112015124918061-pct00002
.
다른 실시형태에서, 화학식 (III)은 화학식 (IIIb)로 표시된다:
Figure 112015124918061-pct00003
상기 식에서,
Nb 및 Nb'는 각각 독립적으로 1개 내지 5개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
또 다른 실시형태에서, 화학식 (III)은 화학식 (IIIc)로 표시된다:
Figure 112015124918061-pct00004
상기 식에서,
Nb 및 Nb'는 각각 독립적으로 1개 내지 5개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
일 실시형태에서, 화학식 (III)은 화학식 (IIId)로 표시된다:
Figure 112015124918061-pct00005
상기 식에서,
Nb 및 Nb'는 각각 독립적으로 1개 내지 5개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내며, Na 및 Na'는 각각 독립적으로 2개 내지 10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
일 실시형태에서, 이중 가닥 영역은 길이가 15개 내지 30개의 뉴클레오타이드 쌍이다. 다른 실시형태에서, 이중 가닥 영역은 길이가 17개 내지 23개의 뉴클레오타이드 쌍이다. 또 다른 실시형태에서, 이중 가닥 영역은 길이가 17개 내지 25개의 뉴클레오타이드 쌍이다. 일 실시형태에서, 이중 가닥 영역은 길이가 23개 내지 27개의 뉴클레오타이드 쌍이다. 다른 실시형태에서, 이중 가닥 영역은 길이가 19개 내지 21개의 뉴클레오타이드 쌍이다. 다른 실시형태에서, 이중 가닥 영역은 길이가 21개 내지 23개의 뉴클레오타이드 쌍이다. 일 실시형태에서, 각각의 가닥은 15개 내지 30개의 뉴클레오타이드를 가진다. 일 실시형태에서, 각각의 가닥은 19개 내지 30개의 뉴클레오타이드를 가진다.
일 실시형태에서, 뉴클레오타이드 상의 변형은 LNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-알킬, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-플루오로, 2'-데옥시, 2'-히드록실 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 뉴클레오타이드 상의 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이다.
일 실시형태에서, 리간드는 2가 또는 3가 분지형 링커를 통하여 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체이다. 다른 실시형태에서, 리간드는
Figure 112015124918061-pct00006
이다.
일 실시형태에서, 리간드는 센스 가닥의 3' 말단에 부착된다.
일 실시형태에서, RNAi 작용제는 하기의 도식에 나타낸 바와 같이 리간드에 콘쥬게이트된다:
Figure 112015124918061-pct00007
상기 식에서,
X는 O 또는 S이다. 특정 실시형태에서, X는 O이다.
일 실시형태에서, 상기 작용제는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간(internucleotide) 결합을 더 포함한다.
일 실시형태에서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합은 하나의 가닥의 3'-말단에 존재한다. 일 실시형태에서, 상기 가닥은 안티센스 가닥이다. 다른 실시형태에서, 상기 가닥은 센스 가닥이다.
일 실시형태에서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합은 하나의 가닥의 5'-말단에 존재한다. 일 실시형태에서, 상기 가닥은 안티센스 가닥이다. 다른 실시형태에서, 상기 가닥은 센스 가닥이다.
일 실시형태에서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합은 하나의 가닥의 5'-말단 및 3'-말단 둘 모두에 존재한다. 일 실시형태에서, 상기 가닥은 안티센스 가닥이다.
일 실시형태에서, RNAi 작용제는 6개 내지 8개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합을 포함한다. 일 실시형태에서, 안티센스 가닥은 5'-말단에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 및 3'-말단에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합을 포함하며, 센스 가닥은 5'-말단 또는 3'-말단에 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합을 포함한다.
일 실시형태에서, 듀플렉스의 안티센스 가닥의 5'-말단의 1 위치에서의 염기쌍은 AU 염기쌍이다.
일 실시형태에서, Y 뉴클레오타이드는 2'-플루오로 변형을 포함한다.
일 실시형태에서, Y' 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 변형을 포함한다.
일 실시형태에서, p'는 0 초과이다. 다른 실시형태에서, p'는 2이다.
일 실시형태에서, q'는 0이고, p는 0이며, q는 0이고, p'개 오버행 뉴클레오타이드는 표적 mRNA에 상보적이다. 다른 실시형태에서, q'는 0이고, p는 0이며, q는 0이고, p'개 오버행 뉴클레오타이드는 표적 mRNA에 비-상보적이다.
일 실시형태에서, 센스 가닥은 총 21개의 뉴클레오타이드를 가지며, 안티센스 가닥은 총 23개의 뉴클레오타이드를 가진다.
일 실시형태에서, 적어도 하나의 np'가 포스포로티오에이트 결합을 통해 인접 뉴클레오타이드에 연결된다.
일 실시형태에서, 모든 np'는 포스포로티오에이트 결합을 통해 인접 뉴클레오타이드에 연결된다.
일 실시형태에서, RNAi 작용제는 표 1, 표 2, 표 5, 표 7, 표 8 및 표 9 중 임의의 하나에 열거된 RNAi 작용제들로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, RNAi 작용제는 AD-58681, AD-59054, AD-61719 및 AD-61444로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 양태에서, 본 발명은 세포에서 Serpina1의 발현을 억제하는 이중 가닥 RNAi 작용제를 제공한다. 이중 가닥 RNAi 작용제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며,
센스 가닥은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10 또는 SEQ ID NO:11의 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나와 비교 시 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한, 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하며, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 또는 SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 또는 SEQ ID NO: 25의 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나와 비교 시 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한, 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하며,
센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드들은 2'-O-메틸 변형 및 2'-플루오로 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형을 포함하며,
센스 가닥은 5'-말단에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합을 포함하며,
안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드들은 2'-O-메틸 변형 및 2'-플루오로 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형을 포함하며,
안티센스 가닥은 5'-말단에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 및 3'-말단에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합을 포함하며,
센스 가닥은 3'-말단에서 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체에 콘쥬게이트된다.
일 실시형태에서, 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열에서 3개 뉴클레오타이드 중 1개는 안티센스 가닥의 시드 영역에 존재하는 뉴클레오타이드 미스매치이다. 일 실시형태에서, 안티센스 가닥은 미스매칭된 뉴클레오타이드에 유니버셜 염기를 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드들 및 상기 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이들은 변형을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 세포에서 Serpina1의 발현을 억제할 수 있는 RNAi 작용제, 예를 들어 이중 가닥 RNAi 작용제를 제공하며, 이중 가닥 RNAi 작용제는 안티센스 가닥에 실질적으로 상보적인 센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥은 Serpina1을 인코딩하는 mRNA의 부분에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하고, 각각의 가닥은 길이가 약 14개 내지 약 30개의 뉴클레오타이드들이고, 이중 가닥 RNAi 작용제는 화학식 (III)으로 표시된다:
Figure 112015124918061-pct00008
상기 식에서,
i, j, k 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p, p', q 및 q'는 각각 독립적으로 0 내지 6이며;
Na 및 Na'는 각각 독립적으로 변형되거나, 비변형되거나, 또는 이들의 조합인 0개 내지 25개의 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오타이드를 포함하며;
Nb 및 Nb'는 각각 독립적으로 변형되거나, 비변형되거나, 또는 이들의 조합인 0개 내지 10개의 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고;
np, np', nq 및 nq'는 각각이 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 각각 독립적으로 오버행 뉴클레오타이드를 나타내고;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 하나의 모티프를 나타내며, 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고;
Nb 상의 변형은 Y 상의 변형과 상이하고, Nb' 상의 변형은 Y' 상의 변형과 상이하며;
센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 콘쥬게이트된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포에서 Serpina1의 발현을 억제할 수 있는 RNAi 작용제, 예를 들어 이중 가닥 RNAi 작용제를 제공하며, 이중 가닥 RNAi 작용제는 안티센스 가닥에 실질적으로 상보적인 센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥은 Serpina1을 인코딩하는 mRNA의 부분에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하고, 각각의 가닥은 길이가 약 14개 내지 약 30개의 뉴클레오타이드들이고, 이중 가닥 RNAi 작용제는 화학식 (III)으로 표시된다:
Figure 112015124918061-pct00009
상기 식에서,
i, j, k 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
np, nq 및 nq'는 각각이 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 각각 독립적으로 오버행 뉴클레오타이드를 나타내고;
p, q 및 q'는 각각 독립적으로 0 내지 6이며;
np'는 0 초과이고, 적어도 하나의 np'는 포스포로티오에이트 결합을 통해 인접 뉴클레오타이드에 연결되며;
Na 및 Na'는 각각 독립적으로 변형되거나, 비변형되거나, 또는 이들의 조합인 0개 내지 25개의 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오타이드를 포함하며;
Nb 및 Nb'는 각각 독립적으로 변형되거나, 비변형되거나, 또는 이들의 조합인 0개 내지 10개의 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 하나의 모티프를 나타내며, 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고;
Nb 상의 변형은 Y 상의 변형과 상이하고, Nb' 상의 변형은 Y' 상의 변형과 상이하며;
센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 콘쥬게이트된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 세포에서 Serpina1의 발현을 억제할 수 있는 RNAi 작용제, 예를 들어 이중 가닥 RNAi 작용제를 제공하며, 이중 가닥 RNAi 작용제는 안티센스 가닥에 실질적으로 상보적인 센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥은 Serpina1을 인코딩하는 mRNA의 부분에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하고, 각각의 가닥은 길이가 약 14개 내지 약 30개의 뉴클레오타이드들이고, 이중 가닥 RNAi 작용제는 화학식 (III)으로 표시된다:
Figure 112015124918061-pct00010
상기 식에서,
i, j, k 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
np, nq 및 nq'는 각각이 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 각각 독립적으로 오버행 뉴클레오타이드를 나타내고;
p, q 및 q'는 각각 독립적으로 0 내지 6이며;
np'는 0 초과이고, 적어도 하나의 np'는 포스포로티오에이트 결합을 통해 인접 뉴클레오타이드에 연결되며;
Na 및 Na'는 각각 독립적으로 변형되거나, 비변형되거나, 또는 이들의 조합인 0개 내지 25개의 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오타이드를 포함하며;
Nb 및 Nb'는 각각 독립적으로 변형되거나, 비변형되거나, 또는 이들의 조합인 0개 내지 10개의 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 하나의 모티프를 나타내며, 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고;
Nb 상의 변형은 Y 상의 변형과 상이하고, Nb' 상의 변형은 Y' 상의 변형과 상이하며;
센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 콘쥬게이트되고, 리간드는 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체이다.
다른 양태에서, 본 발명은 세포에서 Serpina1의 발현을 억제할 수 있는 RNAi 작용제, 예를 들어 이중 가닥 RNAi 작용제를 제공하며, 이중 가닥 RNAi 작용제는 안티센스 가닥에 실질적으로 상보적인 센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥은 Serpina1을 인코딩하는 mRNA의 부분에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하고, 각각의 가닥은 길이가 약 14개 내지 약 30개의 뉴클레오타이드들이고, 이중 가닥 RNAi 작용제는 화학식 (III)으로 표시된다:
Figure 112015124918061-pct00011
상기 식에서,
i, j, k 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
np, nq 및 nq'는 각각이 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 각각 독립적으로 오버행 뉴클레오타이드를 나타내고;
p, q 및 q'는 각각 독립적으로 0 내지 6이며;
np'는 0 초과이고, 적어도 하나의 np'는 포스포로티오에이트 결합을 통해 인접 뉴클레오타이드에 연결되며;
Na 및 Na'는 각각 독립적으로 변형되거나, 비변형되거나, 또는 이들의 조합인 0개 내지 25개의 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오타이드를 포함하며;
Nb 및 Nb'는 각각 독립적으로 변형되거나, 비변형되거나, 또는 이들의 조합인 0개 내지 10개의 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 하나의 모티프를 나타내며, 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고;
Nb 상의 변형은 Y 상의 변형과 상이하고, Nb' 상의 변형은 Y' 상의 변형과 상이하며;
센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 포함하고;
센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 콘쥬게이트되고, 리간드는 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포에서 Serpina1의 발현을 억제할 수 있는 RNAi 작용제, 예를 들어 이중 가닥 RNAi 작용제를 제공하며, 이중 가닥 RNAi 작용제는 안티센스 가닥에 실질적으로 상보적인 센스 가닥을 포함하며, 안티센스 가닥은 Serpina1을 인코딩하는 mRNA의 부분에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하고, 각각의 가닥은 길이가 약 14개 내지 약 30개의 뉴클레오타이드들이고, 이중 가닥 RNAi 작용제는 화학식 (III)으로 표시된다:
Figure 112015124918061-pct00012
상기 식에서,
np, nq 및 nq'는 각각이 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 각각 독립적으로 오버행 뉴클레오타이드를 나타내고;
p, q 및 q'는 각각 독립적으로 0 내지 6이며;
np'는 0 초과이고, 적어도 하나의 np'는 포스포로티오에이트 결합을 통해 인접 뉴클레오타이드에 연결되며;
Na 및 Na'는 각각 독립적으로 변형되거나, 비변형되거나, 또는 이들의 조합인 0개 내지 25개의 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오타이드를 포함하며;
YYY 및 Y'Y'Y'는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 하나의 모티프를 나타내고, 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이며;
센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 포함하고;
센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 콘쥬게이트되고, 리간드는 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체이다.
일 실시형태에서, Na'는 1개 내지 25개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 5' 말단으로부터 위치 2 내지 9 중 하나에 존재하는 1개 내지 25개의 뉴클레오타이드 중 1개는 뉴클레오타이드 미스매치이다. 일 실시형태에서, 미스매칭된 염기는 유니버셜 염기이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 이중 가닥 RNAi 작용제를 포함하는 세포, 벡터, 숙주 세포 및 약학적 조성물을 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 표 1, 표 2, 표 5, 표 7, 표 8 및 표 9 중 임의의 하나에 열거된 RNAi 작용제의 군으로부터 선택되는 RNAi 작용제를 제공한다.
본 발명은 또한, 변형된 안티센스 폴리뉴클레오타이드 작용제를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 작용제는 세포에서 Serpina1의 발현을 억제할 수 있고, 표 1, 표 2, 표 5, 표 7, 표 8 및 표 9 중 임의의 하나에 열거된 서열들의 군으로부터 선택되는 센스 서열에 상보적인 서열을 포함하며, 폴리뉴클레오타이드는 길이가 약 14개 내지 약 30개의 뉴클레오타이드이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 이중 가닥 RNAi 작용제를 함유하는 세포를 제공한다.
일부 실시형태에서, RNAi 작용제는 약학적 조성물을 이용하여 투여된다.
바람직한 실시형태에서, RNAi 작용제는 용액 중에서 투여된다. 일부 이러한 실시형태에서, siRNA는 비완충 용액 중에서 투여된다. 일 실시형태에서, siRNA는 수 중에서 투여된다. 다른 실시형태에서, siRNA는 완충 용액, 예를 들어, 아세트산염 완충제, 시트르산염 완충제, 프롤라민 완충제, 탄산염 완충제 또는 인산염 완충제 또는 그들의 임의의 조합과 함께 투여된다. 일부 실시형태에서, 완충 용액은 인산염 완충 식염수(PBS)이다.
일 실시형태에서, 약학적 조성물은 지질 제형을 더 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 세포에서 Serpina1 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 본 방법은, 세포를 본 발명의 RNAi 작용제, 예를 들어 이중 가닥 RNAi 작용제, 조성물, 벡터 또는 약학적 조성물과 접촉시키는 단계; 및 단계 (a)에서 제조된 세포를, Serpina1 유전자의 mRNA 전사물을 분해시키기에 충분한 시간 동안 유지시킴으로써, 세포에서 Serpina1 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 세포는 피검자 내에 존재한다.
일 실시형태에서, 피검자는 인간이다.
일 실시형태에서, Serpina1 발현은 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 억제된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 Serpina1과 연관된 질병을 가진 피검자의 치료 방법을 제공한다. 본 방법은 본 발명의 RNAi 작용제, 예를 들어 이중 가닥 RNAi 작용제, 조성물, 벡터 또는 약학적 조성물을 치료적 유효량으로 피검자에게 투여함으로써, 피검자를 치료하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 Serpina1과 연관된 장애를 가진 피검자의 치료 방법을 제공한다. 본 방법은 이중 가닥 RNAi 작용제를 치료적 유효량으로 피검자에게 피하 투여함으로써, 피검자를 치료하는 단계를 포함하며,
여기서, 이중 가닥 RNAi 작용제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며,
센스 가닥은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10 또는 SEQ ID NO:11의 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나와 비교 시 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한, 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하며, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 또는 SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 또는 SEQ ID NO: 25의 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나와 비교 시 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한, 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하며,
안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드들은 2'-O-메틸 변형 및 2'-플루오로 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형을 포함하며,
안티센스 가닥은 5'-말단에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 및 3'-말단에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합을 포함하며,
센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드들은 2'-O-메틸 변형 및 2'-플루오로 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형을 포함하며,
센스 가닥은 5'-말단에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합을 포함하고,
센스 가닥은 3'-말단에서 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체에 콘쥬게이트된다.
일 실시형태에서, 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열에서 3개 뉴클레오타이드 중 1개는 안티센스 가닥의 시드 영역에 존재하는 뉴클레오타이드 미스매치이다. 일 실시형태에서, 안티센스 가닥은 미스매칭된 뉴클레오타이드에 유니버셜 염기를 포함한다.
일 실시형태에서, 센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드들 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이들은 변형을 포함한다.
일 실시형태에서, Serpina1과 연관된 질병은 간 장애, 예를 들어, 만성 간 질병, 간 염증, 간경변, 간 섬유증 및/또는 간세포 암종이다.
일 실시형태에서, RNAi 작용제의 피검자에의 투여는 간경변, 간 섬유증 및/또는 간에서의 Serpina1 단백질 축적을 감소시킨다. 다른 실시형태에서, RNAi 작용제의 피검자에의 투여는 예를 들어, 추가로 폐 염증을 저하시킨다.
일 실시형태에서, 피검자는 인간이다.
일 실시형태에서, RNAi 작용제, 예를 들어 이중 가닥 RNAi 작용제는 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.5 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 약 15 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 약 15 mg/kg 내지 약 25 mg/kg, 약 15 mg/kg 내지 약 30 mg/kg 또는 약 20 mg/kg 내지 약 30 mg/kg의 용량으로 투여된다.
일 실시형태에서, RNAi 작용제, 예를 들어 이중 가닥 RNAi 작용제는 피하 또는 정맥내 투여된다.
보다 다른 양태에서, 본 발명은 Serpina1 결핍 변이체를 가진 피검자에서 간세포 암종의 발병을 억제하는 방법을 제공한다. 본 방법은 본 발명의 RNAi 작용제, 예를 들어 이중 가닥 RNAi 작용제, 조성물, 벡터 또는 약학적 조성물을 치료적 유효량으로 피검자에게 투여함으로써, 피검자에서 간세포 암종의 발병을 억제하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 Serpina1 결핍 변이체를 가진 피검자에서 간세포 암종의 발병을 억제하는 방법을 제공한다. 본 방법은, 이중 가닥 RNAi 작용제를 치료적 유효량으로 피검자에게 피하 투여함으로써, Serpina1 결핍 변이체를 가진 피검자에서 간세포 암종의 발병을 억제하는 단계를 포함하는 방법이며, 이중 가닥 RNAi 작용제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 센스 가닥은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10 또는 SEQ ID NO:11의 뉴클레오타이드 서열 중 하나와 비교 시 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한, 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 또는 SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 또는 SEQ ID NO: 25의 뉴클레오타이드 서열 중 하나와 비교 시 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한, 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하며, 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드들은 2'-O-메틸 변형 및 2'-플루오로 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형을 포함하며, 안티센스 가닥은 5'-말단에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 및 3'-말단에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합을 포함하고, 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드들은 2'-O-메틸 변형 및 2'-플루오로 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형을 포함하며, 센스 가닥은 5'-말단에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합을 포함하며, 센스 가닥은 3'-말단에서 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체에 콘쥬게이트된다.
일 실시형태에서, 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열에서 3개 뉴클레오타이드 중 1개는 안티센스 가닥의 시드 영역에 존재하는 뉴클레오타이드 미스매치이다. 일 실시형태에서, 안티센스 가닥은 미스매칭된 뉴클레오타이드에 유니버셜 염기를 포함한다.
일 실시형태에서, 센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드들 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드들은 변형을 포함한다.
일 실시형태에서, 피검자는 영장류 또는 설치류이다. 또 다른 실시형태에서, 피검자는 인간이다.
일 실시형태에서, RNAi 작용제, 예를 들어 이중 가닥 RNAi 작용제는 약 0.01　mg/kg 내지 약 10 mg/kg 또는 약 0.5 mg/kg 내지 약 50 mg/kg의 용량으로 투여된다. 다른 실시형태에서, 이중 가닥 RNAi 작용제는 약 10 mg/kg 내지 약 30 mg/kg의 용량으로 투여된다.
일 실시형태에서, RNAi 작용제, 예를 들어, 이중 가닥 RNAi 작용제는 약 3 mg/kg의 용량으로 투여된다. 다른 실시형태에서, 이중 가닥 RNAi 작용제는 약 10 mg/kg의 용량으로 투여된다. 보다 또 다른 실시형태에서, 이중 가닥 RNAi 작용제는 약 0.5 mg/kg의 용량으로 1주일에 2회 투여된다. 보다 다른 실시형태에서, 이중 가닥 RNAi 작용제는 약 10 mg/kg의 용량으로 격주로 투여된다. 보다 다른 실시형태에서, 이중 가닥 RNAi 작용제는 약 0.5 mg/kg 내지 약 1 mg/kg의 용량으로 1주일에 1회 투여된다.
일 실시형태에서, RNAi 작용제, 예를 들어, 이중 가닥 RNAi 작용제는 1주일에 2회 투여된다. 다른 실시형태에서, RNAi 작용제는 격주로 투여된다.
일 실시형태에서, RNAi 작용제, 예를 들어 이중 가닥 RNAi 작용제는 피하 또는 정맥내 투여된다.
다른 양태에서, 본 발명은 Serpina1 결핍 변이체를 가진 피검자의 간에서 미스폴딩된 Serpina1의 축적을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 방법은, 본 발명의 RNAi 작용제, 예를 들어 이중 가닥 RNAi 작용제, 조성물, 벡터 또는 약학적 조성물을 치료적 유효량으로 피검자에게 투여함으로써, 피검자의 간에서 미스폴딩된 Serpina1의 축적을 감소시키는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 Serpina1 결핍 변이체를 가진 피검자의 간에서 미스폴딩된 Serpina1의 축적을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 방법은, 이중 가닥 RNAi 작용제를 치료적 유효량으로 피검자에게 피하 투여함으로써, Serpina1 결핍 변이체를 가진 피검자의 간에서 미스폴딩된 Serpina1의 축적을 감소시키는 단계를 포함하는 방법이며, 이중 가닥 RNAi 작용제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 센스 가닥은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 또는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10 또는 SEQ ID NO:11의 뉴클레오타이드 서열 중 하나와 비교 시 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한, 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하고, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, 또는 SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 또는 SEQ ID NO: 25의 뉴클레오타이드 서열 중 하나와 비교 시 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한, 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하며, 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드들은 2'-O-메틸 변형 및 2'-플루오로 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형을 포함하며, 안티센스 가닥은 5'-말단에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 및 3'-말단에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합을 포함하고, 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드들은 2'-O-메틸 변형 및 2'-플루오로 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형을 포함하며, 센스 가닥은 5'-말단에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합을 포함하며, 센스 가닥은 3'-말단에서 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체에 콘쥬게이트된다.
일 실시형태에서, 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열에서 3개 뉴클레오타이드 중 1개는 안티센스 가닥의 시드 영역에 존재하는 뉴클레오타이드 미스매치이다. 일 실시형태에서, 안티센스 가닥은 미스매칭된 뉴클레오타이드에 유니버셜 염기를 포함한다.
일 실시형태에서, 센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드들과 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드들은 변형을 포함하다.
일 실시형태에서, 피검자는 영장류 또는 설치류이다. 다른 실시형태에서, 피검자는 인간이다.
일 실시형태에서, RNAi 작용제, 예를 들어, 이중 가닥 RNAi 작용제는 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 또는 약 0.5 mg/kg 내지 약 50 mg/kg의 용량으로 투여된다. 다른 실시형태에서, 이중 가닥 RNAi 작용제는 약 10 mg/kg 내지 약 30 mg/kg의 용량으로 투여된다.
일 실시형태에서, RNAi 작용제, 예를 들어, 이중 가닥 RNAi 작용제는 피하 또는 정맥내 투여된다.
본 발명은 하기의 상세한 설명 및 도면에 의해 더욱 예시된다.
도 1은 Z-AAT 형태의 인간 AAT를 발현하는 형질전환 마우스(transgenic mice)에서, 지시된 siRNA에 대한 반응의 생체 내 효능 및 기간을 도시한 그래프이다.
도 2a 내지 도 2b는 낮은 IC50 값을 가진 5가지 siRNA의 생체 내 효능을 도시한 것이다. 제0일에 인간 Z-AAT 대립유전자를 발현하는 형질전환 마우스에 10 mg/kg siRNA 듀플렉스를 주사하고, 투여 후 21일 동안 혈청 인간 AAT를 투여하였다(도 2a). 각 지점은 3마리의 마우스의 평균을 나타내며, 오차 막대는 표준 편차를 반영한다. 도 2b는 각 군에 대해 GAPDH로 정규화된, 간 내 hAAT mRNA 수준을 도시한 것이다. 막대는 평균을 반영하고, 오차 막대는 표준 편차를 반영한다.
도 3a 내지 도 3c는 지속적인(durable) AAT 저해를 용량 반응성 방식으로 도시한 것이다. 도 3a는, 혈청 hAAT 단백질 수준의 최대 녹다운을 보여주는 효능 곡선은 형질전환 마우스에 피하 투여된 AD-59054의 상이한 농도에서 달성되었음을 구체적으로 도시한 것이다. 각 지점은 3마리 동물의 평균이며, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg 또는 10 mg/kg에서 AAT siRNA의 단일 투여 후, 녹다운 기간을 도 3b에 도시한다. hAAT 수준을 각 동물에 대한 3개의 프리블리드(prebleed)의 평균으로 정규화하였다. PBS 그룹은 혈청 hAAT 수준의 가변성을 반영하는 대조군으로서 작용한다. 각 데이터 지점은 3마리 동물의 평균이며, 오차 막대는 표준 편차를 반영한다. 도 3c에서, 동물에 AD-59054를 0.5 mg/kg의 용량으로 1주일에 2회 투여하였다. 각 데이터 지점은 4마리 동물의 상대적인 혈청 hAAT의 평균이며, 오차 막대는 표준 편차를 반영한다.
도 4a 내지 도 4d는 Z-AAT의 감소와 더불어, 감소된 종양 발병을 도시한 것이다. 도 4a는, 간 섬유증을 가진 나이 든 마우스에 PBS 또는 10 mg/kg siRNA 듀플렉스 AD58681을 2주일에 1회(Q2W) 총 11회 피하 투여하고, 마지막 투여 후 7일째에 안락사시킨 연구 설계를 도시한 것이다. 도 4b는 대조군 및 치료군에서 hAAT mRNA의 간 수준을 도시한 것이다. 도 4c는 대조군 및 치료군에서 Col1a2 mRNA의 간 수준을 도시한 것이다. 도 4d는 대조군 및 치료군에서 PtPrc mRNA의 간 수준을 도시한 것이다.
도 5a 내지 도 5c는 Z-AAT의 감소와 더불어, 감소된 종양 발병을 도시한 것이다. hAAT 저해의 정도를 모니터링하기 위해, 혈청 표본을 도 4a의 연구 설계에 따라 처리한 마우스로부터 수집하였다. 도 5a는 최초 투여 후 혈청 hAAT 단백질 수준을 도시한 것이다. 도 5b 및 도 5c는 PBS 또는 AAT siRNA로 처리한 2마리의 한배새끼(littermate)로부터 간 섹션의 PAS 염색을 도시한 것이다. 더 짙은 색상의 점들은 소구체(globule) 또는 Z-AAT 응집물을 나타낸다.
도 6은 지시된 화합물의 생체 내 효능을 도시한 것이다.
도 7a 내지 도 7b는 AD-59054, AD-61719 또는 AD-61444를 1 mg/kg(7a) 또는 3 mg/kg(7b)의 용량으로 단일 투여 후, 비-인간 영장류에서 AAT의 녹다운의 기간을 도시한 그래프이다. 각 데이터 지점은 3마리 동물의 평균이며, 오차 막대는 표준 편차를 반영한다.
도 8a는 호모 사피엔스 Serpina1, 전사물 변이체 1의 뉴클레오타이드 서열(SEQ ID NO:1)을 도시한 것이며; 도 8b는 호모 사피엔스 Serpina1, 전사물 변이체 3의 뉴클레오타이드 서열(SEQ ID NO:2)을 도시한 것이며; 도 8c는 호모 사피엔스 Serpina1, 전사물 변이체 2의 뉴클레오타이드 서열(SEQ ID NO:3)을 도시한 것이며; 도 8d는 호모 사피엔스 Serpina1, 전사물 변이체 4의 뉴클레오타이드 서열(SEQ ID NO:4)을 도시한 것이며; 도 8e는 호모 사피엔스 Serpina1, 전사물 변이체 5의 뉴클레오타이드 서열(SEQ ID NO:5)을 도시한 것이며; 도 8f는 호모 사피엔스 Serpina1, 전사물 변이체 6의 뉴클레오타이드 서열(SEQ ID NO:6)을 도시한 것이며; 도 8g는 호모 사피엔스 Serpina1, 전사물 변이체 7의 뉴클레오타이드 서열(SEQ ID NO:7)을 도시한 것이며; 도 8h는 호모 사피엔스 Serpina1, 전사물 변이체 8의 뉴클레오타이드 서열(SEQ ID NO:8)을 도시한 것이며; 도 8i는 호모 사피엔스 Serpina1, 전사물 변이체 9의 뉴클레오타이드 서열(SEQ ID NO:9)을 도시한 것이며; 도 8j는 호모 사피엔스 Serpina1, 전사물 변이체 10의 뉴클레오타이드 서열(SEQ ID NO:10)을 도시한 것이며; 도 8k는 호모 사피엔스 Serpina1, 전사물 변이체 11의 뉴클레오타이드 서열(SEQ ID NO:11)을 도시한 것이며; 도 8l는 마카카 물라타(Macaca mulatta) Serpina1의 뉴클레오타이드 서열(SEQ ID NO:12)을 도시한 것이며; 도 8m은 마카카 물라타 Serpina1, 전사물 변이체 6의 뉴클레오타이드 서열(SEQ ID NO:13)을 도시한 것이며; 도 8n은 마카카 물라타 Serpina1, 전사물 변이체 4의 뉴클레오타이드 서열(SEQ ID NO:14)을 도시한 것이며; 도 8o은 SEQ ID NO:1의 역보체(reverse complement)(SEQ ID NO:15)를 도시한 것이며; 도 8p는 SEQ ID NO:2의 역보체(SEQ ID NO:16)를 도시한 것이며; 도 8q는 SEQ ID NO:3의 역보체(SEQ ID NO:17)를 도시한 것이며; 도 8r은 SEQ ID NO:4의 역보체(SEQ ID NO:18)를 도시한 것이며; 도 8s는 SEQ ID NO:5의 역보체(SEQ ID NO:19)를 도시한 것이며; 도 8t는 SEQ ID NO:6의 역보체(SEQ ID NO:20)를 도시한 것이며; 도 8u는 SEQ ID NO:7의 역보체(SEQ ID NO:21)를 도시한 것이며; 도 8v는 SEQ ID NO:8의 역보체(SEQ ID NO:22)를 도시한 것이며; 도 8w는 SEQ ID NO:9의 역보체(SEQ ID NO:23)를 도시한 것이며; 도 8x는 SEQ ID NO:10의 역보체(SEQ ID NO:24)를 도시한 것이며; 도 8y는 SEQ ID NO:11의 역보체(SEQ ID NO:25)를 도시한 것이며; 도 8z는 SEQ ID NO:12의 역보체(SEQ ID NO:26)를 도시한 것이며; 도 8aa는 SEQ ID NO:13의 역보체(SEQ ID NO:27)를 도시한 것이고; 도 8ab는 SEQ ID NO:14의 역보체(SEQ ID NO:28)를 도시한 것이다.
본 발명은 Serpina1을 표적으로 하는 작용제, 예를 들어 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 및 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어 RNAi 작용제, 예를 들어 이중 가닥 iRNA 작용제를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, Serpina1 발현을 억제하고, Serpina1과 연관된 질병, 예를 들어 간 장애, 예컨대 만성 간 질병, 간 염증, 간경변, 간 섬유증 및/또는 간세포 암종을 치료하기 위한 본 발명의 조성물의 사용 방법을 개시한다.
I. 정의
본 발명이 더 용이하게 이해될 수 있도록, 특정 용어들을 우선 정의한다. 또한, 매개변수의 값 또는 값의 범위가 인용될 때마다, 인용된 값에 중간인 값 및 범위도 본 발명의 부분으로 의도된다는 것을 유의하여야 한다.
관사 "a" 및 "an"은 관사의 문법적 대상의 하나 또는 하나를 초과하는(예, 적어도 하나)을 지칭하는 것으로 본원에서 사용된다. 예를 들자면, "하나의 구성요소"는 하나의 구성요소 또는 하나를 초과하는 구성요소, 예컨대, 복수개의 구성요소들을 의미한다.
"포함하는"이라는 용어는 "포함하지만 여기에 한정되지 않는"이라는 어구를 의미하는 것으로 본원에서 사용되고, 상기 어구와 교환가능하게 사용된다.
"또는"이라는 용어는 문맥이 명백히 달리 표시하지 않으면, "및/또는"이라는 용어를 의미하는 것으로 본원에서 사용되고, 상기 용어와 교환가능하게 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, "Serpina1"은 세르핀 펩티다제 저해제(serpin peptidase inhibitor), 클레이드 A(clade A), 멤버 1 유전자 또는 단백질을 지칭한다. Serpina1은 또한, 알파-1-항트립신, α-1-항트립신, AAT, 프로테아제 저해제 1, PI, PI1, 항엘라스타제 및 항트립신으로도 알려져 있다.
용어 Serpina1은, 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열이 예를 들어, 진뱅크 등록 번호 GI:189163524(SEQ ID NO:1), GI:189163525(SEQ ID NO:2), GI:189163526(SEQ ID NO:3), GI:189163527(SEQ ID NO:4), GI:189163529(SEQ ID NO:5), GI:189163531(SEQ ID NO:6), GI:189163533(SEQ ID NO:7), GI:189163535(SEQ ID NO:8), GI:189163537(SEQ ID NO:9), GI:189163539(SEQ ID NO:10) 및/또는 GI:189163541(SEQ ID NO:11)에서 확인될 수 있는 인간 Serpina1; 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열이 예를 들어, 진뱅크 등록 번호 GI:402766667(SEQ ID NO:12), GI:297298519(SEQ ID NO:13) 및/또는 GI: 297298520(SEQ ID NO:14)에서 확인될 수 있는 레서스(rhesus) Serpina1; 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열이 예를 들어, 진뱅크 등록 번호 GI:357588423 및/또는 GI:357588426에서 확인될 수 있는 마우스 Serpina1; 및 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열이 예를 들어, 진뱅크 등록 번호 GI:77020249에서 확인될 수 있는 래트를 포함한다. Serpina1 mRNA 서열의 부가적인 예들은 예를 들어, GenBank 및 OMIM을 이용하여 쉽게 입수가능하다.
Serpina1의 120개가 넘는 대립유전자들이 확인되었으며, "M" 대립유전자는 야생형 또는 "정상" 대립유전자(예, "PIM1-ALA213"(PI, M1A로도 알려져 있음), "PIM1-VAL213"(PI, MIV로도 알려져 있음), "PIM2", "PIM3" 및 "PIM4")로서 간주된다. 부가적인 변이체는 예를 들어, A(1)ATVar 데이터베이스(예, 문헌[Zaimidou, S., et al. (2009) Hum Mutat. 230(3):308-13] 및 www.goldenhelix.org/A1ATVar 참조)에서 찾을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "Serpina1 결핍 대립유전자"는, 적절하게 폴딩되지 않고 세포내에서 응집될 수 있으며, 따라서 간에서의 합성 부위에서 신체 내의 작용 부위로 적절하게 수송되지 않는 단백질을 생성하는 변이체 대립유전자를 지칭한다.
예시적인 Serpina1 결핍 대립유전자로는 "Z 대립유전자", "S 대립유전자", "PIM(Malton) 대립유전자" 및 "PIM(Procida) 대립유전자"를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "Z 대립유전자", "PIZ" 및 "Z-AAT"는, 관련 코돈(relevant codon)이 GAG에서 AAG로 변한 결과 단백질의 위치 342의 아미노산이 글루타민에서 리신으로 변한, Serpina1의 변이체 대립유전자를 지칭한다. Z 대립유전자에 대해 동형인 피검자는 "PIZZ"로 지칭될 수 있다. Z-AAT 돌연변이는 Serpina1 결핍 환자의 95%에서 나타나며, 100,000명의 미국인 및 세계적으로 약 3백만명에 존재하는 것으로 추정된다. Z 대립유전자는 백인에서 다형 빈도(polymorphic frequency)에 달하며, 아시아인과 흑인에서는 드물거나 존재하지 않는다. 동형 ZZ 표현형은 기종(emphysema) 및 간 질병 둘 다의 고위험과 연관있다. Z-AAT 단백질은 소포체에서 올바르게 폴딩되지 않아, 응집되고, 분비, 비폴딩된 단백질 반응의 유도, 세포자살, 소포체 과부하 반응, 자식작용(autophagy), 미토콘드리아 스트레스 및 간세포 기능의 변경을 감소시키는 루프-시트 중합체를 초래한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "PIM(Malton)" 및 "M(Malton)-AAT"는, 성숙 단백질의 위치 51 또는 52에서 인접한 페닐알라닌 잔기 중 하나가 결실된, Serpina1의 변이체 대립유전자를 지칭한다. 이 아미노산 하나의 결실은 베타-시트인 B6의 한 가닥을 단축시키고, 간에서 정상적인 가공 및 분비를 방지하며, 이는 간세포 함입(inclusion) 및 간으로부터 단백질의 손상된 분비와 연관 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "PIS"는 위치 264에서 글루탐산이 발린으로 치환된, Serpina1의 변이체 대립유전자를 지칭한다. 이 변이체 단백질 대부분은 세포내에서 분해되지만, PIS 대립유전자는 백인 집단에서 고 빈도로 존재하며, 따라서, Z 또는 무효 대립유전자를 가진 화합물 이형 접합체는 자주 존재한다.
본원에 사용된 바와 같이, "표적 서열"은 일차 전사 산물의 RNA 가공의 산물인 mRNA를 포함하여, Serpina1 유전자의 전사 동안에 형성된 mRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열의 연속 부분을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "서열을 포함하는 가닥"은 표준 뉴클레오타이드 명명법을 이용하여 지칭되는 서열에 의해 기술되는 뉴클레오타이드의 사슬을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다.
"G", "C", "A" 및 "U" 각각은 염기로서 구아닌, 시토신, 아데닌 및 우라실 각각을 포함하는 뉴클레오타이드를 일반적으로 나타낸다. "T" 및 "dT"는 본원에 교환가능하게 사용되며, 핵염기가 티민, 예를 들어, 데옥시리보티민, 2'-데옥시티미딘 또는 티미딘인 데옥시리보뉴클레오타이드를 말한다. 그러나, "리보뉴클레오타이드" 또는 "뉴클레오타이드" 또는 "데옥시리보뉴클레오타이드"라는 용어는 하기에 더욱 상술된 바와 같이 변형 뉴클레오타이드, 또는 대리 대체 모이어티(surrogate replacement moiety)를 지칭할 수도 있다는 것을 알 것이다. 당업자는 구아닌, 시토신, 아데닌 및 우라실이 이러한 대체 모이어티를 보유하는 뉴클레오타이드를 포함하여, 올리고뉴클레오타이드의 염기 짝지음 성질을 실질적으로 변경시키지 않으면서 기타 모이어티에 의해 대체될 수 있다는 것을 충분히 인지한다. 예를 들어, 제한 없이, 염기로서 이노신을 포함하는 뉴클레오타이드는 아데닌, 시토신 또는 우라실을 포함하는 뉴클레오타이드와 염기쌍을 이룰 수 있다. 따라서, 우라실, 구아닌 또는 아데닌을 포함하는 뉴클레오타이드는 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 내에서, 예를 들어, 이노신을 포함하는 뉴클레오타이드에 의해 대체될 수 있다. 이러한 대체 모이어티를 포함하는 서열은 본 발명의 실시형태이다. 본원에 교환가능하게 사용된 바와 같이, 용어 "iRNA", "RNAi 작용제", "iRNA 작용제", "RNA 간섭제"는 상기 용어가 본원에 정의된 바와 같은 RNA를 포함하고, RNA-유발성 침묵화 복합체(RISC) 경로를 통하여 RNA 전사물의 표적된 절단을 매개하는 작용제를 지칭한다. iRNA는 RNA 간섭(RNAi)으로 알려진 공정을 통해 mRNA의 서열-특이적 분해를 지시한다. iRNA는 세포, 예컨대, 포유류 피검자와 같은 피검자 내의 세포 내에서 Serpina1의 발현을 조절, 예컨대, 억제한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 RNAi 작용제는 표적 RNA 서열, 예컨대, Serpina1 표적 mRNA 서열과 상호작용하여, 표적 RNA의 절단을 지시하는 단일 가닥 RNA를 포함한다. 이론에 구속되지 않으면서, 세포로 도입된 긴 이중 가닥 RNA는 다이서(Dicer)(문헌[Sharp 등, (2001) Genes Dev. 15:485])로 알려진 III형 엔도뉴클레아제에 의하여 siRNA로 분해되는 것으로 여겨진다. 리보뉴클레아제-III-유사 효소인 다이서는 dsRNA를 특징적인 두 개 염기 3' 오버행들을 갖는 19 내지 23 염기쌍 단 간섭 RNA로 처리한다(문헌[Bernstein 등, (2001) Nature 409:363]). 이후, siRNA는 RNA-유발성 침묵화 복합체(RISC)로 포함되어, 여기서 하나 이상의 헬리카제는 siRNA 듀플렉스를 풀어내어, 상보적 안티센스 가닥이 표적 인식을 안내할 수 있도록 한다(문헌[Nykanen 등, (2001) Cell 107:309]). 적절한 표적 mRNA에 결합시에, RISC 내의 하나 이상의 엔도뉴클레아제는 표적을 절단시켜 침묵화를 유도한다(문헌[Elbashir 등, (2001) Genes Dev.15:188]). 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 세포 내에 발생되고, 표적 유전자, 즉, Serpina1 유전자의 침묵화를 일으키는 RISC 복합체의 형성을 촉진하는 단일 가닥 RNA(siRNA)에 관한 것이다. 따라서, "siRNA"라는 용어는 상술한 RNAi를 지칭하는 것으로 본원에서 사용되기도 한다.
다른 실시형태에서, RNAi 작용제는 표적 mRNA를 억제하기 위해 세포 또는 유기체로 도입되는 단일 가닥 siRNA일 수 있다. 단일 가닥 RNAi 작용제는 RISC 엔도뉴클레아제 아르고노트(argonaute) 2에 결합하며, 이는 이어서 표적 mRNA를 절단한다. 단일 가닥 siRNA는 일반적으로 15개 내지 30개의 뉴클레오타이드이며, 화학적으로 변형된다. 단일 가닥 siRNA의 설계 및 시험은 미국 특허 제8,101,348호 및 문헌[Lima 등, (2012) Cell 150: 883-894]에 기술되어 있으며, 그 각각의 전체 내용은 본원에 참조로서 포함된다. 본원에 기술된 안티센스 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 것은 본원에 기술된 바와 같은, 또는 문헌[Lima 등, (2012) Cell 150;:883-894]에 기술된 방법에 의해 화학적으로 변형된 바와 같은 단일 가닥 siRNA로서 사용될 수 있다.
보다 다른 실시형태에서, 본 발명은 Serpina1을 표적으로 하는 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오타이드 분자를 제공한다. "단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오타이드 분자"는 표적 mRNA(즉, Serpina1) 내의 서열에 상보적이다. 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오타이드 분자는 mRNA에 염기쌍을 형성하고, 번역 기구를 물리적으로 방해함으로써 화학양론적 방식으로 번역을 억제할 수 있으며, 문헌[Dias, N. 등, (2002) Mol Cancer Ther 1:347-355]를 참조한다. 대안적으로, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오타이드 분자는 표적에 혼성화하고, RNaseH 절단을 통해 표적을 절단함으로써, 표적 mRNA를 억제한다. 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오타이드 분자는 길이가 약 10개 내지 약 30개의 뉴클레오타이드일 수 있으며, 표적 서열에 상보적인 서열을 가진다. 예를 들어, 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오타이드 분자는 본원에 기술된 안티센스 뉴클레오타이드 서열 중 하나, 예를 들어, 표 1, 표 2, 표 5, 표 7, 표 8 및 표 9 중 임의의 하나에 제공되는 서열로부터 적어도 약 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 그 이상의 인접 뉴클레오타이드인 서열을 포함할 수 있거나, 본원에 기술된 표적 부위들 중 임의의 부위에 결합할 수 있다. 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오타이드 분자는 변형된 RNA, DNA 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 조성물, 용도 및 방법에 이용되는 "iRNA"는 이중-가닥 RNA이며, 본원에서 "이중 가닥 RNAi 작용제", "이중-가닥 RNA(dsRNA) 분자", "dsRNA 작용제", 또는 "dsRNA"로 지칭된다. "dsRNA"라는 용어는 표적 RNA, 즉, Serpina1 유전자에 대하여 "센스" 및 "안티센스" 배향성을 갖는 것으로 지칭된, 2 개의 반평행(anti-parallel) 및 실질적으로 상보적인 핵산 가닥들을 포함하는 듀플렉스 구조를 갖는, 리보핵산 분자들의 복합체를 지칭한다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 이중-가닥 RNA(dsRNA)는 본원에서 RNA 간섭 또는 RNAi로 지칭되는 전사 후 유전자-침묵화 메커니즘을 통해 표적 RNA, 예컨대, mRNA의 분해를 촉발한다.
일반적으로, dsRNA 분자의 각각의 가닥의 뉴클레오타이드의 대부분은 리보뉴클레오타이드이나, 본원에 상세히 기술된 바와 같이, 각각의 또는 둘 모두의 가닥은 또한 하나 이상의 비-리보뉴클레오타이드, 예를 들어, 데옥시리보뉴클레오타이드 및/또는 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 게다가, 본 명세서에 사용된 바와 같이, "RNAi 작용제"는 화학적 변형을 갖는 리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며; RNAi 작용제는 다수의 뉴클레오타이드에서 실질적인 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 본원에 개시된 또는 업계에 공지된 모든 유형의 변형을 포함할 수 있다. siRNA 형 분자에 사용되는 바와 같은 임의의 이러한 변형은 명세서 및 특허청구범위의 목적을 위한 "RNAi 작용제"에 포함된다.
듀플렉스 구조를 형성하는 두 개의 가닥들은 하나의 더 큰 RNA 분자의 상이한 부분들일 수 있거나, 개별 RNA 분자들일 수 있다. 두 개 가닥들이 하나의 더 큰 분자의 부분이며, 따라서 듀플렉스 구조를 형성하는 하나의 가닥의 3'-말단 및 각각의 나머지 가닥의 5'-말단 사이의 뉴클레오타이드들의 비-단속(non-interrupted) 사슬에 의하여 연결되는 경우에, 연결 RNA 사슬은 "헤어핀 루프"로 지칭된다. 두 개 가닥들이 듀플렉스 구조를 형성하는 하나의 가닥의 3'-말단 및 각각의 나머지 가닥의 5'-말단 사이의 뉴클레오타이드들의 비-단속 사슬이 아닌 수단에 의하여 공유적으로 연결되는 경우에, 연결 구조는 "링커"로 지칭된다. RNA 가닥들은 동일하거나 상이한 수의 뉴클레오타이드들을 가질 수 있다. 염기 쌍들의 최대수는 dsRNA의 최단 가닥에 존재하는 뉴클레오타이드들의 수에서 듀플렉스에 존재하는 임의의 오버행들을 차감한 숫자이다. 듀플렉스 구조에 더하여, RNAi 작용제는 하나 이상의 뉴클레오타이드 오버행들을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 RNAi 작용제는 표적 RNA 서열, 예를 들어, Serpina1 표적 mRNA 서열과 상호작용하여 표적 RNA의 절단을 지시하는 24 내지 30개의 뉴클레오타이드의 dsRNA이다. 이론에 구속되지 않으면서, 세포 내로 도입된 긴 이중 가닥 RNA는 다이서로 공지된 II형I 엔도뉴클레아제에 의해 siRNA로 분해된다(문헌[Sharp 등 (2001) Genes Dev. 15:485]). 리보뉴클레아제-III-유사 효소인 다이서는 dsRNA를 특징적인 2개 염기 3' 오버행을 갖는 19 내지 23개 염기 쌍의 단 간섭 RNA로 처리한다(문헌[Bernstein, 등, (2001) Nature 409:363]). 이어서, siRNA는 RNA-유발성 침묵화 복합체(RISC) 내로 혼입되고, 여기서 하나 이상의 헬리카제가 siRNA 듀플렉스를 풀어내어, 상보적 안티센스 가닥이 표적 인식을 안내할 수 있게 한다(문헌[Nykanen, 등, (2001) Cell 107:309]). 적절한 표적 mRNA에 결합 시, RISC 내의 하나 이상의 엔도뉴클레아제는 표적을 절단하여 침묵화를 유도한다(문헌[Elbashir, 등, (2001) Genes Dev. 15:188]). 본원에 사용된 "뉴클레오타이드 오버행"은 RNAi 작용제의 한 가닥의 3'-말단이 나머지 가닥의 5'-말단을 벗어나 연장하거나 그 반대인 경우 RNAi 작용제의 듀플렉스 구조로부터 돌출하는 쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드들을 지칭한다. "평활성" 또는 "평활성 말단인"은 이중 가닥 RNAi 작용제의 말단에서 쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드들이 없다, 즉, 뉴클레오타이드 오버행이 없다는 것을 의미한다. "평활성 말단인" RNAi 작용제는 그의 전체 길이에 걸쳐 이중 가닥인, 즉, 분자의 어느 하나의 말단에 뉴클레오타이드 오버행이 없는 dsRNA이다. 본 발명의 RNAi 작용제는 하나의 말단에 뉴클레오타이드 오버행이 있거나(즉, 하나의 오버행 및 하나의 평활성 말단이 있는 작용제) 둘 모두의 말단에 뉴클레오타이드 오버행이 있는 RNAi 작용제를 포함한다.
"안티센스 가닥"이라는 용어는 표적 서열(예를 들어, 인간 Serpina1 mRNA)에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 이중 가닥 RNAi 작용제의 가닥을 지칭한다. 본원에 사용된 "트랜스티레틴(transthyretin)을 암호화하는 mRNA의 부분에 실질적으로 상보적인 영역"이라는 용어는 Serpina1 mRNA 서열의 부분에 대하여 실질적으로 상보적인 안티센스 가닥 상의 영역을 지칭한다. 상보성의 영역이 표적 서열에 대하여 완전히 상보적이지 않은 경우에, 미스매치들은 말단 영역에서 가장 허용되며, 존재한다면, 말단 영역 또는 영역들 내, 예를 들어, 5' 및/또는 3' 말단의 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개의 뉴클레오타이드 내에 있다.
하기 작업 실시예에서 언급되는 바와 같이, 본원에 개시된 RNAi 작용제의 안티센스 가닥의 시드 영역에서의 단일 뉴클레오타이드 미스매치는 C를 제외한 모든 염기들에 대해 내성이었음이 놀랍게도 발견되었다. "시드 영역"은 표적 mRNA의 인지에 관여하는 RNAi 작용제의 안티센스 가닥 내의 영역으로서, 예를 들어, 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 뉴클레오타이드 2 내지 8에 상응한다. 시드 영역이 어닐링된 후, 아르고노트는 혼입된 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 상보적인 mRNA 서열 10개 뉴클레오타이드를 뉴클레오타이드 분해처리하여, 표적 mRNA의 절단을 초래한다. 이에, 일 실시형태에서, 본 발명의 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 안티센스 가닥의 시드 영역에 하나의 뉴클레오타이드 미스매치, 즉, 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2 내지 8 중 하나에 미스매치를 포함한다.
본원에 사용된 "센스 가닥"이라는 용어는 안티센스 가닥의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 dsRNA의 가닥을 지칭한다.
본원에 사용된 "절단 영역"이라는 용어는 절단 부위에 바로 인접하여 위치한 영역을 지칭한다. 절단 부위는 절단이 발생하는 표적상의 부위이다. 일부 실시형태에서, 절단 영역은 절단 부위의 어느 하나의 말단에, 그리고 그에 바로 인접한 3개의 염기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 절단 영역은 절단 부위의 어느 하나의 말단에, 그리고 그에 바로 인접한 2개의 염기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 절단 부위는 구체적으로 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 10 및 11에 의해 결합된 부위에 존재하며, 절단 영역은 뉴클레오타이드 11, 12 및 13을 포함한다.
본원에 사용되고 달리 지시되지 않으면, 제2 뉴클레오타이드 서열과 관련하여 제1 뉴클레오타이드 서열을 기술하는데 이용될 때 "상보적"이라는 용어는 당업자가 이해하는 바와 같이, 특정 조건 하에서 혼성화하여 상기 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 듀플렉스 구조를 형성하는 상기 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 능력을 지칭한다. 이러한 조건은 예를 들어, 가혹한 조건일 수 있는데, 가혹한 조건은 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 50℃ 또는 70℃에서 12시간 내지 16시간 이후에 세척을 포함할 수 있다. 유기체 내에서 직면할 수 있는 생리학적으로 적절한 조건과 같은 기타 조건이 적용될 수 있다. 예를 들어, 상보적 서열은 핵산의 관련 기능, 예를 들어, RNAi가 진행되게 하기에 충분하다. 당업자는 혼성화된 뉴클레오타이드의 최종적인 적용에 따른 2개 서열들의 상보성의 시험에 대해 가장 적절한 조건들의 세트를 결정할 수 있을 것이다.
서열은 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열의 전체 길이에 걸쳐 제1 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드와 제2 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드의 염기-짝지음이 존재하는 경우, 서로에 대하여 "완전 상보적(fully complementary)"일 수 있다. 그러나, 제1 서열이 본원에서 제2 서열에 대하여 "실질적으로 상보적"으로 지칭되는 경우, 상기 두 서열들은 완전 상보적일 수 있거나, 이들의 최종적인 적용에 대하여 가장 적절한 조건하에서 혼성화할 수 있는 능력을 유지하면서, 혼성화 시 하나 이상이지만, 일반적으로 4, 3 또는 2개 이하의 미스매치된 염기쌍들을 형성할 수 있다. 그러나, 2개의 올리고뉴클레오타이드들이 혼성화 시에 하나 이상의 단일 가닥 오버행들을 형성하도록 설계되는 경우, 그러한 오버행들은 상보성의 결정에 대하여 미스매치로 간주되지 않는다. 예를 들어, 길이가 21개의 뉴클레오타이드들인 하나의 올리고뉴클레오타이드 및 길이가 23개의 뉴클레오타이드들인 다른 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 dsRNA는 길이가 더 긴 올리고뉴클레오타이드가 길이가 더 짧은 올리고뉴클레오타이드에 대하여 완전 상보적인 21 개의 뉴클레오타이드들의 서열을 포함하는 경우, 본원에 기술된 목적을 위해 "완전 상보적"으로도 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 "상보적" 서열은 그들이 혼성화할 수 있는 능력에 대하여 상기 요구사항이 충족되는 한, 비-천연 및 변형 뉴클레오타이드로부터 형성된 비-왓슨-크릭 염기쌍들 및/또는 염기쌍들을 포함하기도 하거나 완전히 이들로부터 형성될 수도 있다. 이러한 비-왓슨-크릭 염기쌍들은 G:U 워블(Wobble) 또는 후그스타인(Hoogstein) 염기 짝지음을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
본원에서 "상보적", "완전 상보적" 및 "실질적으로 상보적"이라는 용어들은 이들의 이용의 맥락에서 이해될 수 있는 바와 같이, dsRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 사이, 또는 dsRNA의 안티센스 가닥 및 표적 서열 사이의 염기 매칭에 대하여 이용될 수 있다.
본원에 사용된, 전령 RNA(mRNA)의 "적어도 일부에 실질적으로 상보적"인 폴리뉴클레오타이드는 5' UTR, 전사해독틀(open reading frame; ORF) 또는 3' UTR을 포함하여, 관심 대상의 mRNA(예, Serpina1을 인코딩하는 mRNA)의 연속 부분에 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 예를 들어, 서열이 Serpina1을 인코딩하는 mRNA의 비-단속 부분에 실질적으로 상보적이라면 폴리뉴클레오타이드는 Serpina1 mRNA의 적어도 일부분에 상보적이다.
본원에 사용된 "억제하는"이라는 용어는 "감소하는", "침묵화하는", "하향조절하는", "저해하는" 및 기타 유사 용어와 교환가능하게 이용되며, 임의의 수준의 억제를 포함한다.
본원에 사용된 "Serpina1의 발현을 억제하는"이라는 어구는 임의의 Serpina1 유전자(예, 마우스 Serpina1 유전자, 래트 Serpina1 유전자, 원숭이 Serpina1 유전자 또는 인간 Serpina1 유전자와 같은) 뿐만 아니라 Serpina1 유전자의 변이체(예를 들어, 자연 발생 변이체) 또는 돌연변이체의 발현의 억제를 포함한다. 따라서, Serpina1 유전자는 유전자 조작된 세포, 세포의 그룹 또는 유기체의 맥락에서 야생형 Serpina1 유전자, 변이체 Serpina1 유전자, 돌연변이 Serpina1 유전자 또는 형질전환 Serpina1 유전자일 수 있다.
"Serpina1 유전자의 발현을 억제하는"은 Serpina1 유전자의 임의의 수준의 억제, 예컨대, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 억제와 같은, Serpina1 유전자의 발현의 적어도 부분적 저해를 포함한다.
Serpina1 유전자의 발현은 Serpina1 유전자 발현과 연관된 임의의 변수의 수준, 예컨대, Serpina1 mRNA 수준, Serpina1 단백질 수준 또는 혈청 AAT 수준에 기초하여 측정될 수 있다. 억제는 대조군 수준과 비교하여 이러한 변수들 중 하나 이상의 절대 또는 상대 수준의 감소에 의하여 측정될 수 있다. 대조군 수준은 업계에 활용되는 임의의 형태의 대조군 수준, 예컨대, 투여전(pre-dose) 기저 수준, 또는 (예, 완충제 유일 대조군 또는 비활성화 작용제 대조군과 같은) 대조군으로 처리 또는 미처리된 유사한 피검자, 세포 또는 표본으로부터 결정된 수준일 수 있다.
본원에 사용된, "세포를 이중 가닥 RNAi 작용제와 접촉시키는 단계"라는 어구는 임의의 가능한 수단에 의하여 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 세포를 이중 가닥 RNAi 작용제와 접촉시키는 단계는 세포를 시험관 내에서 RNAi 작용제와 접촉시키는 단계 또는 세포를 생체 내에서 RNAi 작용제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 접촉시키는 단계는 직접적으로 또는 간접적으로 수행될 수 있다. 따라서, 예를 들어, RNAi 작용제는 방법을 수행하는 개인에 의하여 세포와 물리적으로 접촉하게 될 수 있거나, 대안적으로, RNAi 작용제를 이후에 세포와 접촉시키도록 하거나 접촉시키도록 유도하는 상황에 둘 수 있다.
세포를 시험관 내에서 접촉시키는 단계는 예를 들어, 세포를 RNAi 작용제와 함께 배양함으로써 수행될 수 있다. 세포를 생체 내에서 접촉시키는 단계는 예를 들어, RNAi 작용제를 세포가 위치하는 조직으로 또는 조직 근처에 주입하거나, RNAi 작용제가 이후에 접촉될 세포가 위치하는 조직에 도달하도록 RNAi 작용제를 다른 구역, 예컨대, 혈류 또는 피하 공간으로 주입함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, RNAi 작용제는 RNAi 작용제를 관심 대상인 부위, 예컨대, 간으로 향하게 하는 리간드, 예컨대, GalNAc3 리간드를 함유하고/함유하거나 결합될 수 있다. 시험관 내 및 생체 내 접촉 방법의 조합도 가능하다. 본 발명의 방법과 관련하여, 세포는 RNAi 작용제와 시험관 내에서 접촉되고, 이후 피검자로 이식될 수도 있다.
본원에 사용된 "환자" 또는 "피검자"는 인간 또는 비인간 동물, 바람직하게는 포유류, 예를 들어 원숭이를 포함하고자 한다. 가장 바람직하게는, 피검자 또는 환자는 인간이다.
본원에 사용된 바와 같이, "Serpina1과 연관된 질병"은 Serpina1 유전자 또는 단백질과 연관된 임의의 질병, 장애 또는 질환을 포함하고자 한다. 이러한 질병은 예를 들어, Serpina1 단백질의 미스폴딩, Serpina1 단백질(예, 미스폴딩된 Serpina1 단백질)의 세포내 축적, Serpina1 단백질의 과량 생산, Serpina1 유전자 변이체, Serpina1 유전자 돌연변이, Serpina1 단백질의 비정상적인 절단, Serpina1과 다른 단백질 또는 다른 내인성 또는 외인성 성분들 간의 비정상적인 상호작용에 의해 유발될 수 있다. Serpina1과 연관된 질병은 간 질병 및/또는 폐 질병일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "간 질병"은 간 및/또는 간 기능에 영향을 미치는 질병, 장애 또는 질환을 포함한다. 간 장애는 간 및/또는 간세포에서 Serpina1 단백질이 축적된 결과일 수 있다. 간 장애의 예로는, 바이러스 감염, 기생충 감염, 유전적 소인, 자가면역 질병, 방사선 노출, 간독성 화합물에의 노출, 기계적 손상, 다양한 환경적 독소들, 알코올, 아세트아미노펜, 알코올과 아세트아미노펜의 조합, 흡입 마취제, 니아신, 화학치료제, 항생제, 진통제, 구토방지제, 약초 보충 카바(herbal supplement kava) 및 이들의 조합으로 인한 간 장애를 포함한다.
예를 들어, Serpina1 결핍과 연관된 간 장애는 소정의 대립유전자(예, PIZ, PiM(Malton) 및/또는 PIS 대립유전자)의 하나 이상의 복사체를 가진 피검자에서 보다 자주 발생할 수 있다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 알파-1 항트립신 간 질병의 보다 큰 발병 위험과 연관된 대립유전자는 미스폴딩되며 간세포로부터 적절하게 분비되지 않는 Serpina1의 형태를 인코딩하는 것으로 생각된다. 이들 미스폴딩된 단백질에 대한 세포성 반응은 비폴딩된 단백질 반응(UPR), 소포체-연관 분해(ERAD), 세포자살, ER 과부하 반응, 자식작용, 미토콘드리아 스트레스 및 변경된 간세포 기능을 포함할 수 있다. 간세포 손상은 비제한적인 예로, 염증, 담즙분비중지(cholestasis), 섬유증, 간경변, 연장된 폐색성 황달(prolonged obstructive jaundice), 증가된 트랜스아미나제, 문맥압항진(portal hypertension) 및/또는 간세포 암종과 같은 증상을 초래할 수 있다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이 질병의 매우 가변적인 임상적 경로는 증상의 발병 또는 중증으로의 진행에 기여하는 인자로서 변형제 또는 "제2 히트(second hit)"임을 암시한다.
예를 들어, PIZ 대립유전자를 가진 피검자는 간염 C 감염 또는 알코올 남용에 보다 민감하며, 이러한 인자들에 노출되는 경우 간 장애가 발병할 가능성이 더 클 수 있다. 부가적으로, PIZ 대립유전자를 가진 낭포성 섬유증(CF) 피검자는 문맥압항진과 더불어 중증의 간 질병이 발병할 위험이 더 높다. Serpina1의 결핍은 또한, 조기 발생 기종, 괴사성 지방층염(necrotizing panniculitis), 기관지 확장(bronchiectasis) 및/또는 연장된 신생아 황달의 발병을 유발하거나 기여할 수도 있다. 알파-1-항트립신이 결핍되거나 결핍될 위험이 있는 일부 환자들은 알파-1-항트립신 결핍에 걸린 가족 구성원을 가진 경우, 스크리닝에 의해 확인된다.
예시적인 간 장애로는, 간 염증, 만성 간 질병, 간경변, 간 섬유증, 간세포 암종, 간 괴사, 지방증, 담즙분비중지 및/또는 간세포 기능의 감소 및/또는 소실을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
"간경변"은 간에서 광범위한 섬유증 및 재생성 결절을 포함하는 만성 간 손상과 연관된 병리학적 질환이다.
"섬유증"은 간에서 섬유아세포의 증식 및 흉터 조직의 형성이다.
표현 "간 기능"은 간에 의해 수행되는 많은 생리학적 기능들 중 하나 이상을 지칭한다. 이러한 기능으로는, 혈당 수준의 조절, 내분비 조절, 효소 시스템, 대사물질(예, 케톤체, 스테롤, 스테로이드 및 아미노산)의 상호전환; 혈액 단백질, 예컨대 피브리노겐, 혈청 알부민 및 콜린에스터라제의 제조, 적혈구생성 기능, 해독, 담즙산 형성 및 비타민 저장을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 간 기능을 검사하기 위한 몇몇 시험들은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 알라닌 아미노 트랜스퍼라제(ALT), 알칼리 포스파타제, 빌리루빈, 프로트롬빈 및 알부민의 측정을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료적 유효량"은 Serpina1 관련 질병을 치료하기 위해 환자에게 투여되는 경우, (예, 기존 질병 또는 질병의 하나 이상의 증상을 감소시키거나, 완화시키거나, 유지시킴으로써) 질병의 치료를 가져오는데 충분한, RNAi 작용제의 양을 포함하고자 한다. "치료적 유효량"은 있다고 하면 RNAi 작용제, 작용제의 투여 방법, 질병 및 그 중증도 및 치료대상인 환자의 병력, 연령, 체중, 가족력, 유전적 구성, Serpina1 발현에 의해 매개되는 병적 과정의 단계, 선행 또는 동반 치료의 유형, 및 기타 개인적 특성에 따라 달라질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "예방적 유효량"은 아직 Serpina1-관련 질병의 증상을 경험하거나 나타내지 않지만 질병에 걸리기 쉬울 수 있는 피검자에게 투여되는 경우, 질병 또는 질병의 하나 이상의 증상을 방지하거나 완화시키는데 충분한, RNAi 작용제의 양을 포함하고자 한다. 질병의 완화는 질병의 과정을 지연시키거나 이후-발전하는 질병의 중증도를 감소시키는 것을 포함한다. "예방적 유효량"은 있다고 하면 RNAi 작용제, 작용제의 투여 방법, 질병의 위험도 및 치료대상인 환자의 병력, 연령, 체중, 가족력, 유전적 구성, 선행 또는 동반 치료의 유형, 및 기타 개인적 특성에 따라 달라질 수 있다.
"치료적 유효량" 또는 "예방적 유효량"은 임의의 치료에 적용될 수 있는 합당한 이득/위험율에서 일부 원하는 국소 또는 전신 효과를 생성하는 RNAi 작용제의 양도 포함한다. 본 발명의 방법에 채용되는 RNAi 작용제는 그러한 치료에 적용될 수 있는 합당한 이득/위험율을 생성하는데 충분한 양으로 투여될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "표본"이라는 용어는 피검자 내에 존재하는 유체, 세포 또는 조직뿐만 아니라 피검자로부터 분리된 유사한 유체, 세포 또는 조직의 집합을 포함한다. 생물학적 유체의 예는 혈액, 혈청 및 장막 유체(serosal fluid), 혈장, 소변, 림프, 뇌척수액, 안 유체(ocular fluid), 타액 등을 포함한다. 조직 표본은 조직, 기관 또는 국소화된 영역으로부터 나온 표본을 포함할 수 있다. 예를 들어, 표본은 특정 기관, 기관의 부분 또는 그러한 기관 내의 유체 또는 세포로부터 유래될 수 있다. 특정 실시형태에서, 표본은 간(예, 전 간(whole liver) 또는 간의 특정 분절 또는 예컨대, 간세포와 같이 간 내의 특정 유형의 세포)으로부터 유래될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, "피검자로부터 유래된 표본"은 피검자로부터 뽑은 혈액 또는 혈장을 지칭한다. 추가의 실시형태에서, "피검자로부터 유래된 표본"은 피검자로부터 유래된 간 조직(또는 그의 하위 구성요소)을 지칭한다.
II. 본 발명의 iRNA
본 발명은 세포, 예를 들어 피검자, 예를 들어 Serpina1과 연관된 질병, 예를 들어, 간 질병, 예를 들어 만성 간 질병, 간 염증, 간경변, 간 섬유증 및/또는 간세포 암종을 가진 인간과 같은 포유류 내의 세포에서 Serpina1 유전자의 발현을 억제하는 개선된 이중 가닥 RNAi 작용제를 기술한다.
따라서, 본 발명은 생체 내에서 표적 유전자(즉, Serpina1 유전자)의 발현을 억제할 수 있는 화학적 변형을 가진 이중-가닥 RNAi 작용제를 제공한다. 본 발명의 소정의 양태에서, 본 발명의 iRNA의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드들은 변형된다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 본 발명의 iRNA의 모든 뉴클레오타이드들은 변형된다. "실질적으로 모든 뉴클레오타이들이 변형된" 본 발명의 iRNA는 완전히는 아니지만 대체로 변형된 것이며, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 비변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
RNAi 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다. RNAi 작용제의 각각의 가닥은 길이가 12개 내지 30개의 뉴클레오타이드들 범위일 수 있다. 예를 들어, 각각의 가닥은 길이가 14개 내지 30개의 뉴클레오타이드들, 길이가 17개 내지 30개의 뉴클레오타이드들, 길이가 19개 내지 30개의 뉴클레오타이드들, 길이가 25개 내지 30개의 뉴클레오타이드들, 길이가 27개 내지 30개의 뉴클레오타이드들, 길이가 17개 내지 23개의 뉴클레오타이드들, 길이가 17개 내지 21개의 뉴클레오타이드들, 길이가 17개 내지 19개의 뉴클레오타이드들, 길이가 19개 내지 25개의 뉴클레오타이드들, 길이가 19개 내지 23개의 뉴클레오타이드들, 길이가 19개 내지 21개의 뉴클레오타이드들, 길이가 21개 내지 25개의 뉴클레오타이드들, 또는 길이가 21개 내지 23개의 뉴클레오타이드들일 수 있다.
센스 가닥 및 안티센스 가닥은 전형적으로 본원에서 "RNAi 작용제"로도 지칭되는 듀플렉스 이중 가닥 RNA("dsNRA")를 형성한다. RNAi 작용제의 듀플렉스 영역은 길이가 12개 내지 30개의 뉴클레오타이드 쌍일 수 있다. 예를 들어, 듀플렉스 영역은 길이가 14개 내지 30개의 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 17개 내지 30개의 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 27개 내지 30개의 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 17개 내지 23개의 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 17개 내지 21개의 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 17개 내지 19개의 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 19개 내지 25개의 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 19개 내지 23개의 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 19개 내지 21개의 뉴클레오타이드 쌍, 길이가 21개 내지 25개의 뉴클레오타이드 쌍, 또는 길이가 21개 내지 23개의 뉴클레오타이드 쌍일 수 있다. 다른 예에서, 듀플렉스 영역은 길이가 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개 및 27개의 뉴클레오타이드들로부터 선택된다.
일 실시형태에서, RNAi 작용제는 하나 또는 둘 모두의 가닥의 3' 말단, 5' 말단 또는 양 말단에 하나 이상의 오버행 영역 및/또는 캡핑기(capping group)를 포함할 수 있다. 오버행은 길이가 1개 내지 6개의 뉴클레오타이드들, 예를 들어 길이가 2개 내지 6개의 뉴클레오타이드들, 길이가 1개 내지 5개의 뉴클레오타이드들, 길이가 2개 내지 5개의 뉴클레오타이드들, 길이가 1개 내지 4개의 뉴클레오타이드들, 길이가 2개 내지 4개의 뉴클레오타이드들, 길이가 1개 내지 3개의 뉴클레오타이드들, 길이가 2개 내지 3개의 뉴클레오타이드들, 또는 길이가 1개 내지 2개의 뉴클레오타이드들일 수 있다. 오버행은 하나의 가닥이 다른 가닥보다 더 길어서 생기는 것이거나, 또는 동일한 길이의 가닥 2개가 서로 엇갈려서 생기는 것일 수 있다. 오버행은 표적 mRNA와 미스매치를 형성할 수 있거나, 또는 오버행은 표적된 유전자 서열과 상보적일 수 있거나 또는 다른 서열일 수 있다. 제1 가닥과 제2 가닥은 또한, 예를 들어, 추가의 염기에 의해 결합되어 헤어핀을 형성할 수 있거나, 또는 다른 비-염기 링커에 의해 결합될 수 있다.
일 실시형태에서, RNAi 작용제의 오버행 영역 내의 뉴클레오타이드는 각각 독립적으로, 2'-당 변형, 예를 들어, 2-F, 2'-O-메틸, 티미딘(T), 2'-O-메톡시에틸-5-메틸우리딘(Teo), 2'-O-메톡시에틸아데노신(Aeo), 2'-O-메톡시에틸-5-메틸시티딘(m5Ceo), 및 이들의 임의의 조합을 포함하나 이들에 한정되지 않는 변형 또는 비변형된 뉴클레오타이드일 수 있다. 예를 들어, TT는 어느 한 가닥 상의 어느 한 말단에 대한 오버행 서열일 수 있다. 오버행은 표적 mRNA와 미스매치를 형성할 수 있거나, 또는 오버행은 표적된 유전자 서열과 상보적일 수 있거나 또는 다른 서열일 수 있다.
RNAi 작용제의 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 양 가닥 모두에 있는 5' 또는 3' 오버행은 인산화될 수 있다. 일부 실시형태들에서, 오버행 영역(들)은 2개의 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트를 가지는 2개의 뉴클레오타이드를 포함하며, 2개의 뉴클레오타이드는 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 일 실시형태에서, 오버행은 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 양 가닥의 3'-말단에 존재한다. 일 실시형태에서, 이러한 3'-오버행은 안티센스 가닥에 존재한다. 일 실시형태에서, 이러한 3'-오버행은 센스 가닥에 존재한다.
RNAi 작용제는, RNAi의 전체적인 안정성에 영향을 미치지 않으면서 이의 간섭 활성을 강화할 수 있는 단일 오버행만을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일-가닥 오버행은 센스 가닥의 3'-말단 말단에 위치하거나, 또는 다르게는, 안티센스 가닥의 3'-말단 말단에 위치할 수 있다. RNAi는 또한, 안티센스 가닥의 5'-말단 (또는 센스 가닥의 3'-말단)에 위치하거나 또는 그 반대로 위치하는 평활성 말단을 가질 수 있다. 일반적으로, RNAi의 안티센스 가닥은 3'-말단에 뉴클레오타이드 오버행을 가지며, 5'-말단이 평활성이다. 이론에 구속되지 않으면서, 안티센스 가닥의 5'-말단 및 안티센스 가닥의 3'-말단 오버행에서의 비대칭적 평활성 말단은 길잡이 가닥이 RISC 공정으로 로딩되는 것을 돕는다.
본 발명에서 특정화되는 임의의 핵산은 참조로서 본 명세서에 포함된 문헌["Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA]에 기술된 것과 같은 당해 기술분야에서 잘 구축된 방법에 의해 합성 및/또는 변형될 수 있다. 변형은 예를 들어, 말단 변형, 예를 들어, 5'-말단 변형(인산화, 콘쥬게이션, 역결합(inverted linkage)) 또는 3'-말단 변형(콘쥬게이션, DNA 뉴클레오타이드, 역결합 등); 염기 변형, 예를 들어, 안정화 염기, 탈안정화 염기, 또는 파트너의 확장된 레퍼토리를 가진 염기쌍을 가진 염기로의 대체, 염기의 제거(무염기성 뉴클레오타이드) 또는 콘쥬게이트된 염기; (예를 들어, 2'-위치 또는 4'-위치에서) 당 변형 또는 당의 대체; 및/또는 포스포로디에스테르 결합의 변형 또는 대체를 포함하는 골격 변형을 포함한다. 본원에 기술된 실시형태에 유용한 iRNA 화합물의 구체적인 예로는, 변형된 골격을 함유하는 RNA 또는 천연 뉴클레오사이드간(internucleoside) 결합을 함유하지 않는 RNA를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 변형된 골격을 가진 RNA는 특히, 골격에 인 원자를 가지지 않는 것들을 포함한다. 본 명세서의 목적을 위해, 그리고 종종 당업계에서 참조되는 바와 같이, 이들의 뉴클레오사이드간 골격에 인 원자를 가지지 않는 변형된 RNA는 또한, 올리고뉴클레오사이드인 것으로 간주될 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 iRNA는 이의 뉴클레오사이드간 골격에 인 원자를 가질 것이다.
변형된 RNA 골격은 예를 들어, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 포스포네이트 및 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포라미데이트 및 아미노알킬포스포라미데이트를 포함하는 포스포라미데이트, 티오노포스포라미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상적인 3'-5' 결합, 이들의 2'-5'-결합된 유사체를 가진 보라노포스페이트, 및 역극성(inverted polarity)을 가진 것들을 포함하며, 여기서, 뉴클레오사이드 유닛의 인접한 쌍들은 3'-5' 내지 5'-3'으로 결합되거나 또는 2'-5' 내지 5'-2'으로 결합된다. 다양한 염, 혼합형 염 및 유리산 형태들 또한, 포함된다.
상기 인-함유 결합의 제조를 교시하고 있는 대표적인 미국 특허로는, 미국 특허 제3,687,808호; 제4,469,863호; 제4,476,301호; 제5,023,243호; 제5,177,195호; 제5,188,897호; 제5,264,423호; 제5,276,019호; 제5,278,302호; 제5,286,717호; 제5,321,131호; 제5,399,676호; 제5,405,939호; 제5,453,496호; 제5,455,233호; 제5,466,677호; 제5,476,925호; 제5,519,126호; 제5,536,821호; 제5,541,316호; 제5,550,111호; 제5,563,253호; 제5,571,799호; 제5,587,361호; 제5,625,050호; 제6,028,188호; 제6,124,445호; 제6,160,109호; 제6,169,170호; 제6,172,209호; 제6, 239,265호; 제6,277,603호; 제6,326,199호; 제6,346,614호; 제6,444,423호; 제6,531,590호; 제6,534,639호; 제6,608,035호; 제6,683,167호; 제6,858,715호; 제6,867,294호; 제6,878,805호; 제7,015,315호; 제7,041,816호; 제7,273,933호; 제7,321,029호; 및 미국 특허 제RE39464호를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니며, 이들 각각의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함된다.
인 원자를 포함하지 않는 변형된 RNA 골격은, 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오사이드간 결합에 의해 형성되는 골격, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오사이드간 결합에 의해 형성되는 골격, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로사이클릭 뉴클레오사이드간 결합에 의해 형성되는 골격을 가진다. 이들은 모르폴리노 결합(뉴클레오사이드의 당 부위로부터 부분적으로 형성됨)을 가진 것; 실록산 골격; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 알켄-함유 골격; 설파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 골격; 설포네이트 및 설폰아미드 골격; 아미드 골격; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 가진 것들을 포함한다.
상기 올리고뉴클레오사이드의 제조를 교시하고 있는 대표적인 미국 특허로는, 미국 특허 제5,034,506호; 제5,166,315호; 제5,185,444호; 제5,214,134호; 제5,216,141호; 제5,235,033호; 제5,64,562호; 제5,264,564호; 제5,405,938호; 제5,434,257호; 제5,466,677호; 제5,470,967호; 제5,489,677호; 제5,541,307호; 제5,561,225호; 제5,596,086호; 제5,602,240호; 제5,608,046호; 제5,610,289호; 제5,618,704호; 제5,623,070호; 제5,663,312호; 제5,633,360호; 제5,677,437호; 및 5,677,439호를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니며, 이들 각각의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함된다.
다른 실시형태에서, 적합한 RNA 모방체는 iRNA에 사용될 것이 고려되며, 이 모방체에서 당 및 뉴클레오사이드간 결합 둘 다, 즉, 뉴클레오타이드 유닛의 골격이 신규 기로 대체되어 있다. 염기 유닛은 적절한 핵산 표적 화합물과 혼성화를 위해 유지된다. 우수한 혼성화 특성을 가진 것으로 나타난 RNA 모방체인 하나의 이러한 올리고머 화합물은 펩티드 핵산(PNA)으로 지칭된다. PNA 화합물에서, RNA의 당 골격은 아미드-함유 골격, 특히 아미노에틸글리신 골격으로 대체된다. 뉴클레오염기는 유지되며, 골격의 아미드 부위의 아자 질소 원자에 직접 또는 간접적으로 결합된다. PNA 화합물의 제조를 교시하고 있는 대표적인 미국 특허로는, 미국 특허 제5,539,082호; 제5,714,331호; 및 제5,719,262호를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니며, 이들 각각의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함된다. 본 발명의 iRNA에 사용되기에 적합한 부가적인 PNA 화합물은 예를 들어, 문헌[Nielsen 등, Science, 1991, 254, 1497-1500]에 기술되어 있다.
본 발명에서 특정화되는 일부 실시형태는 포스포로티오에이트 골격을 가진 RNA 및 헤테로원자 골격을 가진 올리고뉴클레오사이드를 포함하며, 특히 상기 참조된 미국 특허 제5,489,677호의 --CH2--NH--CH2-, --CH2--N(CH3)--O--CH2--[메틸렌 (메틸이미노) 또는 MMI 골격으로 공지되어 있음], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- 및 --N(CH3)--CH2--CH2--[여기서, 천연 포스포로디에스테르 골격은 --O--P--O--CH2--로 표시됨], 및 상기 참조된 미국 특허 제5,602,240호의 아미드 골격을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에서 특정화되는 RNA는 상기 참조된 미국 특허 제5,034,506호의 모르폴리노 골격 구조를 가진다.
변형된 RNA는 또한, 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 함유할 수 있다. 본원에서 특정화되는 iRNA, 예를 들어, dsRNA는 2'-위치에, OH; F; O-알킬, S-알킬 또는 N-알킬; O-알케닐, S-알케닐 또는 N-알케닐; O-알키닐, S-알키닐 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬 중 하나를 포함할 수 있으며, 여기서, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환 또는 비치환된 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있다. 예시적인 적합한 변형은 O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2) nCH3, O(CH2)nONH2 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2를 포함하며, 여기서, n 및 m은 1 내지 약 10이다. 다른 실시형태에서, dsRNA는 2' 위치에, C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알카릴, 아랄킬, O-알카릴 또는 O-아랄킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단 기, 리포터 기, 인터칼레이터(intercalator), iRNA의 약물동력학적 특성을 개선하기 위한 기, 또는 iRNA의 약력학적 특성을 개선하기 위한 기, 및 유사한 특성을 가진 다른 치환기들 중 하나를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형은 2'-메톡시에톡시(2'-O--CH2CH2OCH3, 또한, 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로도 공지되어 있음)(문헌[Martin 등, Helv . Chim . Acta, 1995, 78:486-504]), 즉, 알콕시-알콕시 기를 포함한다. 또 다른 예시적인 변형은 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉, 본원 하기의 실시예에서 기술된 바와 같이 2'-DMAOE로도 공지되어 있는 O(CH2)2ON(CH3)2 기, 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시(당업계에 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE로도 공지되어 있음), 즉, 2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2이다.
다른 변형은 2'-메톡시(2'-OCH3), 2'-아미노프로폭시(2'-OCH2CH2CH2NH2) 및 2'-플루오로(2'-F)를 포함한다. 유사한 변형은 iRNA의 RNA 상의 다른 위치, 특히, 3' 말단 뉴클레오타이드 상의 당의 3' 위치 또는 2'-5' 결합된 dsRNA, 및 5' 말단 뉴클레오타이드의 5' 위치에서 이루어질 수 있다. iRNA는 펜토푸라노실 당 대신에 사이클로부틸 모이어티와 같은 당 모방체를 가질 수 있다. 이러한 변형된 당 구조의 제조를 교시하고 있는 대표적인 미국 특허로는, 미국 특허 제4,981,957호; 제5,118,800호; 제5,319,080호; 제5,359,044호; 제5,393,878호; 제5,446,137호; 제5,466,786호; 제5,514,785호; 제5,519,134호; 제5,567,811호; 제5,576,427호; 제5,591,722호; 제5,597,909호; 제5,610,300호; 제5,627,053호; 제5,639,873호; 제5,646,265호; 제5,658,873호; 제5,670,633호; 및 제5,700,920호를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니며, 이들 중 소정의 특허는 본 출원과 공동 소유된다. 이들 각각의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함된다.
iRNA는 또한, 뉴클레오염기(당업계에서 종종 단순히 "염기"로서 지칭됨) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "비변형된" 또는 "천연" 뉴클레오염기는 퓨린 염기인 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 피리미딘 염기인 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)을 포함한다. 변형된 뉴클레오염기는 다른 합성 뉴클레오염기 및 천연 뉴클레오염기, 예컨대 데옥시-티민(dT), 5-메틸시토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌과 구아닌의 6-메틸 유도체 및 다른 알킬 유도체, 아데닌과 구아닌의 2-프로필 유도체 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 아날 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-다아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다. 추가적인 뉴클레오염기는 미국 특허 제3,687,808호에 개시된 것들; 문헌[Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008]에 개시된 것들; 문헌[The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990]에 개시된 것들, 문헌[Englisch 등, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613]에 개시된 것들 및 문헌[Sanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993]에 개시된 것들을 포함한다. 이들 중 소정의 뉴클레오염기는 특히, 본 발명에서 특정화되는 올리고머 화합물의 결합 친화성을 증가시키는 데 유용하다. 이들로는, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함하여 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘, 및 N-2 치환된 퓨린, N-6 치환된 퓨린 및 0-6 치환된 퓨린을 포함한다. 5-메틸시토신 치환은 핵산 듀플렉스 안정성을 0.6℃ 내지 1.2℃에 의해 증가시키는 것으로 나타났으며(문헌[Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278]), 보다 더 특히 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합 시, 예시적인 염기 치환이다.
소정의 상기 언급된 변형된 뉴클레오염기뿐만 아니라 다른 변형된 뉴클레오염기의 제조를 교시하고 있는 대표적인 미국 특허로는, 상기 언급된 미국 특허 제3,687,808호; 제4,845,205호; 제5,130,30호; 제5,134,066호; 제5,175,273호; 제5,367,066호; 제5,432,272호; 제5,457,187호; 제5,459,255호; 제5,484,908호; 제5,502,177호; 제5,525,711호; 제5,552,540호; 제5,587,469호; 제5,594,121, 5,596,091호; 제5,614,617호; 제5,681,941호; 제5,750,692호; 제6,015,886호; 제6,147,200호; 제6,166,197호; 제6,222,025호; 제6,235,887호; 제6,380,368호; 제6,528,640호; 제6,639,062호; 제6,617,438호; 제7,045,610호; 제7,427,672호; 및 제7,495,088호를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니며, 이들 각각의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함된다.
iRNA의 RNA는 또한, 하나 이상의 잠금(locked) 핵산(LNA)을 포함하도록 변형될 수 있다. 잠금 핵산은 변형된 리보스 모이어티를 가진 뉴클레오타이드이며, 여기서, 리보스 모이어티는 2' 탄소와 4' 탄소를 연결하는 여유분의 가교를 포함한다. 이러한 구조는 3'-엔도 구조 형태에서 리보스를 효과적으로 "잠근다(lock)". 잠금 핵산의 siRNA에의 첨가는 혈청에서 siRNA 안정성을 증가시키며, 표적외(off-target) 효과를 감소시키는 것으로 나타났다(문헌[Elmen, J. 등, (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. 등, (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. 등, (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193]).
잠금 핵산 뉴클레오타이드의 제조를 교시하고 있는 대표적인 미국 특허로는, 하기의 미국 특허 제6,268,490호; 제6,670,461호; 제6,794,499호; 제6,998,484호; 제7,053,207호; 제7,084,125호; 및 제7,399,845호를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니며, 이들 각각의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함된다.
RNA 분자의 말단에 대한 잠재적으로 안정화시키는 변형은 N-(아세틸아미노카프로일)-4-하이드록시프롤리놀(Hyp-C6-NHAc), N-(카프로일-4-하이드록시프롤리놀(Hyp-C6), N-(아세틸-4-하이드록시프롤리놀(Hyp-NHAc), 티미딘-2'-0-데옥시티미딘(에테르), N-(아미노카프로일)-4-하이드록시프롤리놀(Hyp-C6-아미노), 2-도코사노일-우리딘-3"-포스페이트, 역염기(inverted base) dT(idT) 등을 포함할 수 있다. 이러한 변형의 개시내용은 PCT 공개 제WO 2011/005861호에서 확인할 수 있다.
A. 본 발명의 모티프를 포함하는 변형된 iRNA
본 발명의 소정의 양태에서, 본 발명의 이중 가닥 RNAi 작용제는 2011년 11월 18일에 출원된 미국 가출원 제61/561,710호 또는 2012년 11월 16일에 출원된 제PCT/US2012/065691호에 개시되어 있으며, 이들 각각의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함된다.
본원과 가출원 제61/561,710호에서 도시된 바와 같이, 우수한 결과는 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 동일한 변형의 하나 이상의 모티프를 RNAi 작용제의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥에, 특히 절단 부위나 절단 부위 근처에서 도입함으로써 수득될 수 있다. 일부 실시형태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 달리 표시되지 않으면 완전히 변형될 수 있다. 이들 모티프의 도입은, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 변형 패턴이 존재하는 경우 이 패턴을 방해한다. RNAi 작용제는 선택적으로, 예를 들어 센스 가닥 상의 GalNAc 유도체 리간드와 콘쥬게이트될 수 있다. 생성되는 RNAi 작용제는 우수한 유전자 침묵화 활성을 제시한다.
보다 상세하게는, 놀랍게도, 이중 가닥 RNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥이, RNAi 작용제의 적어도 하나의 가닥의 절단 부위 또는 그 근처에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 동일한 변형의 하나 이상의 모티프를 가지도록 변형되는 경우, RNAi 작용제의 유전자 침묵화 활성은 우수하게 증진되었음이 발견되었다.
일 실시형태에서, RNAi 작용제는 길이가 19개의 뉴클레오타이드들인 이중 말단 블런트머(bluntmer)이며, 센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 7, 8, 9에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 2'-F 변형이 있는 모티프를 적어도 하나 포함한다. 안티센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 11, 12, 13에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 2'-O-메틸 변형이 있는 모티프를 적어도 하나 포함한다.
다른 실시형태에서, RNAi 작용제는 길이가 20개의 뉴클레오타이드들인 이중 말단 블런트머이며, 센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 8, 9, 10에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 2'-F 변형이 있는 모티프를 적어도 하나 포함한다. 안티센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 11, 12, 13에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 2'-O-메틸 변형이 있는 모티프를 적어도 하나 포함한다.
다른 실시형태에서, RNAi 작용제는 길이가 21개의 뉴클레오타이드들인 이중 말단 블런트머이며, 센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 9, 10, 11에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 2'-F 변형이 있는 모티프를 적어도 하나 포함한다. 안티센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 11, 12, 13에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 2'-O-메틸 변형이 있는 모티프를 적어도 하나 포함한다.
일 실시형태에서, RNAi 작용제는 21개의 뉴클레오타이드 센스 가닥 및 23개의 뉴클레오타이드 안티센스 가닥을 포함하며, 센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 9, 10, 11에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 2'-F 변형이 있는 모티프를 적어도 하나 포함하며; 안티센스 가닥은 5' 말단으로부터 위치 11, 12, 13에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 2'-O-메틸 변형이 있는 모티프를 적어도 하나 포함하고, RNAi 작용제의 하나의 말단은 평활성인 한편, 다른 말단은 2개의 뉴클레오타이드 오버행을 포함한다. 바람직하게는, 2개의 뉴클레오타이드 오버행은 안티센스 가닥의 3'-말단에 존재한다. 2개의 뉴클레오타이드 오버행이 안티센스 가닥의 3'-말단에 존재하는 경우, 3개의 말단 뉴클레오타이드 사이에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합이 존재할 수 있으며, 3개의 뉴클레오타이드 중 2개는 오버행 뉴클레오타이드이고, 제3 뉴클레오타이드는 오버행 뉴클레오타이드 바로 옆의 쌍을 이루는 뉴클레오타이드이다. 일 실시형태에서, RNAi 작용제는 추가로 센스 가닥의 5'-말단 및 안티센스 가닥의 5'-말단 둘 모두에서 3개의 말단 뉴클레오타이드들 사이에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합을 가진다. 일 실시형태에서, 모티프의 일부인 뉴클레오타이드를 포함하는 RNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 내의 모든 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드이다. 일 실시형태에서, 각 잔기는 예를 들어, 교대 모티프에서, 독립적으로 2'-O-메틸 또는 3'-플루오로로 변형된다. 선택적으로, RNAi 작용제는 리간드(바람직하게는 GalNAc3)를 더 포함한다.
일 실시형태에서, RNAi 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, RNAi 작용제는 적어도 25개, 최대 29개의 뉴클레오타이드인 길이를 갖는 제1 가닥, 및 5' 말단으로부터 위치 11, 12, 13에서 3개의 연속적인 뉴클레오타이드 상에 3개의 2'-O-메틸 변형이 있는 모티프를 적어도 하나 갖는 최대 30개의 뉴클레오타이드인 길이를 갖는 제2 가닥을 포함하고; 제1 가닥의 3' 말단 및 제2 가닥의 5' 말단은 평활성 말단을 형성하며, 제2 가닥은 그의 3' 말단에서 제1 가닥보다 1 내지 4개의 뉴클레오타이드가 더 길고, 듀플렉스 영역은 길이가 적어도 25개의 뉴클레오타이드들인 영역이며, 제2 가닥은 제2 가닥 길이의 적어도 19개의 뉴클레오타이드를 따라, RNAi 작용제가 포유류 세포 내로 도입되는 경우 표적 유전자 발현을 감소시키기 위해 충분히 표적 mRNA에 상보적이고, RNAi 작용제의 다이서 절단은 제2 가닥의 3' 말단을 포함하는 siRNA를 야기하여, 포유류에서 표적 유전자의 발현을 감소시킨다. 선택적으로, RNAi 작용제는 리간드를 더 포함한다.
일 실시형태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥은 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 모티프를 적어도 하나 포함하며, 모티프 중 하나는 센스 가닥의 절단 부위에 존재한다.
일 실시형태에서, RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 모티프를 적어도 하나 포함할 수 있으며, 모티프 중 하나는 안티센스 가닥의 절단 부위에서 또는 그 근처에서 발생하기도 한다.
길이가 17개 내지 23개의 뉴클레오타이드들인 듀플렉스 영역을 가지는 RNAi 작용제에서, 안티센스 가닥의 절단 부위는 전형적으로 5'-말단으로부터 대략 위치 10, 11 및 12 주변에 존재한다. 따라서, 3개의 동일한 변형이 있는 모티프는 안티센스 가닥의 위치 9, 10, 11; 위치 10, 11, 12; 위치 11, 12, 13; 위치 12, 13, 14; 또는 위치 13, 14, 15에 존재할 수 있으며, 계수는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 제1 뉴클레오타이드로부터 시작하거나, 또는 계수는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터의 듀플렉스 영역 내의 쌍을 이루는 제1 뉴클레오타이드로부터 시작한다. 안티센스 가닥의 절단 부위는 또한, 5'-말단으로부터 RNAi의 듀플렉스 영역의 길이에 따라 변할 수도 있다.
RNAi 작용제의 센스 가닥은, 가닥의 절단 부위에서, 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 모티프를 적어도 하나 포함할 수 있으며; 안티센스 가닥은 가닥의 절단 부위에 또는 그 근처에, 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 모티프를 적어도 하나 가질 수 있다. 센스 가닥과 안티센스 가닥이 dsRNA 듀플렉스를 형성하는 경우, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 또한, 센스 가닥 상의 3개의 뉴클레오타이드가 있는 하나의 모티프와 안티센스 가닥 상의 3개의 뉴클레오타이드가 있는 하나의 모티프가 적어도 하나의 뉴클레오타이드 중첩을 가지도록, 즉, 센스 가닥의 모티프의 3개의 뉴클레오타이드 중 적어도 하나가 안티센스 가닥의 모티프의 3개의 뉴클레오타이드 중 적어도 하나와 염기쌍을 형성하도록, 정렬될 수 있다. 다르게는, 적어도 2개의 뉴클레오타이드가 중첩될 수 있거나, 3개 모두의 뉴클레오타이드가 중첩될 수 있다.
일 실시형태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥은 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 모티프를 하나 초과해서 포함할 수 있다. 제1 모티프는 가닥의 절단 부위에 또는 그 근처에 존재할 수 있으며, 다른 모티프는 윙(wing) 변형일 수 있다. 본원에서, "윙 변형"이라는 용어는 동일한 가닥의 절단 부위의 또는 그 근처의 모티프로부터 분리된, 가닥의 다른 부위에 존재하는 모티프를 지칭한다. 윙 변형은 제1 모티프에 인접해 있거나, 또는 적어도 하나 이상의 뉴클레오타이드에 의해 분리된다. 모티프가 서로 바로 인접해 있는 경우 모티프의 화학적 성질은 서로 구별되며, 모티프가 하나 이상의 뉴클레오타이드에 의해 분리되어 있는 경우 모티프의 화학적 성질은 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 2개 이상의 윙 변형이 존재할 수 있다. 예를 들어, 2개의 윙 변형이 존재하는 경우, 각각의 윙 변형은 절단 부위에 또는 그 근처에 존재하는 제1 모티프에 대해 하나의 말단에서 또는 선도 모티프의 어느 하나의 측에 존재할 수 있다.
센스 가닥처럼, RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 모티프를 1개 초과하여 포함할 수 있으며, 모티프 중 적어도 하나는 가닥의 절단 부위에 또는 그 근처에 존재한다. 이러한 안티센스 가닥은 또한, 센스 가닥에 존재할 수 있는 윙 변형과 유사한 정렬의 윙 변형을 하나 이상 포함할 수도 있다.
일 실시형태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 윙 변형은 전형적으로, 가닥의 3'-말단, 5'-말단 또는 양 말단 모두에서 1개 또는 2개의 제1 말단 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
다른 실시형태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 윙 변형은 전형적으로, 가닥의 3'-말단, 5'-말단 또는 양 말단 모두에서 듀플렉스 영역 내에 1개 또는 2개의 쌍을 이루는 제1 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
RNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 적어도 하나의 윙 변형을 포함하는 경우, 윙 변형은 듀플렉스 영역의 동일한 말단에 존재할 수 있으며, 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오타이드의 중첩을 가진다.
RNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 적어도 2개의 윙 변형을 포함하는 경우, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은, 하나의 가닥의 2개의 변형이 각각 듀플렉스 영역의 하나의 말단에 존재하고, 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오타이드의 중첩을 갖거나; 하나의 가닥의 2개의 변형이 각각 듀플렉스 영역의 다른 말단에 존재하고, 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오타이드 중첩을 갖거나; 하나의 가닥의 2개의 변형이 선도 모티프의 각각의 측에 존재하고, 듀플렉스 영역에서 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오타이드의 중첩을 갖도록 정렬될 수도 있다.
일 실시형태에서, 모티프의 일부인 뉴클레오타이드를 포함하는 RNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 내의 모든 뉴클레오타이드는 변형될 수 있다. 각각의 뉴클레오타이드는, 비-연결 포스페이트 산소 중 하나 또는 둘다 및/또는 연결 포스페이트 산소 중 하나 이상의 변경; 리보스 당의 구성성분, 예를 들어, 리보스 당의 2'-히드록실의 변경; 포스페이트 모이어티의 "데포스포" 링커로의 대체; 자연 발생 염기의 변형 또는 대체; 및 리보스-포스페이트 골격의 대체 또는 변형을 하나 이상 포함할 수 있는 동일하거나 상이한 변형으로 변형될 수 있다.
핵산이 하위단위의 중합체이기 때문에, 다수의 변형들은 핵산에서 반복되는 위치에서 발생하며, 이는 예를 들어, 염기, 또는 포스페이트 모이어티, 또는 포스페이트 모이어티의 비-연결 O의 변형이다. 일부 경우에, 변형은 핵산의 모든 대상 위치에서 발생할 것이지만, 많은 경우 그렇지 않을 것이다. 예를 들어, 변형은 3' 또는 5' 말단 위치에서만 발생할 수 있으며, 가닥의 말단 영역, 예를 들어 말단 뉴클레오타이드 상의 위치, 또는 마지막 2개, 3개, 4개, 5개 또는 10개의 뉴클레오타이드에서 발생할 수 있다. 변형은 이중 가닥 영역, 단일 가닥 영역, 또는 두 영역 모두에서 발생할 수 있다. 변형은 RNA의 이중 가닥 영역에서만 발생할 수 있거나, 또는 RNA의 단일 가닥 영역에서만 발생할 수 있다. 예를 들어, 비-연결 O 위치에서의 포스포로티오에이트 변형은 한쪽 말단 또는 양 말단 모두에서만 발생할 수 있거나, 가닥의 말단 영역, 예를 들어, 말단 뉴클레오타이드 상의 위치 또는 마지막 2개, 3개, 4개, 5개 또는 10개의 뉴클레오타이드에서만 발생할 수 있거나, 또는 이중 가닥 및 단일 가닥 영역, 특히 말단에서 발생할 수 있다. 5' 말단 또는 말단들은 인산화될 수 있다.
예를 들어, 안정성을 증대시키거나, 오버행에 특정 염기들을 포함하거나, 또는 단일 가닥 오버행, 예를 들어 5' 또는 3' 오버행 또는 둘 다에 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 대리물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 오버행에 퓨린 뉴클레오타이드를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시형태에서, 3' 또는 5' 오버행 내의 염기들 중 모두 또는 일부는 변형되는데, 예를 들어, 본원에서 기술된 변형으로 변형될 수 있다. 변형으로는, 예를 들어, 업계에 공지된 변형을 가지는 리보스 당의 2' 위치에서의 변형의 사용, 예를 들어, 핵염기의 리보당 대신에 변형된 데옥시리보뉴클레오타이드, 2'-데옥시-2'-플루오로(2'-F) 또는 2'-O-메틸의 사용, 및 포스페이트 기에서의 변형, 예를 들어, 포스포로티오에이트 변형이 포함될 수 있다. 오버행은 표적 서열과 상동성일 필요가 없다.
일 실시형태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 잔기는 독립적으로 LNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-데옥시, 2'-히드록실 또는 2'-플루오로로 변형된다. 가닥은 변형을 하나 초과해서 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 잔기는 각각 독립적으로 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로로 변형된다.
적어도 2개의 상이한 변형은 전형적으로, 센스 가닥 및 안티센스 가닥에 존재한다. 그들 2개의 변형들은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형, 또는 그외의 변형일 수 있다.
일 실시형태에서, Na 및/또는 Nb는 교대 패턴의 변형을 포함한다. 본원에서 사용되는, "교대 모티프"라는 용어는 하나 이상의 변형을 갖는 모티프를 지칭하며, 각각의 변형은 하나의 가닥의 교대 뉴클레오타이드에서 발생한다. 교대 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 2개마다 하나, 또는 뉴클레오타이드 3개마다 하나 또는 유사한 패턴을 지칭할 수 있다. 예를 들어, A, B 및 C가 각각 뉴클레오타이드에 대한 하나의 유형의 변형을 나타내는 경우, 교대 모티프는 "ABABABABABAB...", "ABBAABBAABB...", "AABAABAABAAB...", "AAABAAABAAAB...", "AAABBBAAABBB..." 또는 "ABCABCABCABC..." 등일 수 있다.
교대 모티프에 포함되는 변형의 유형은 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 예를 들어, A, B, C, D가 각각 뉴클레오타이드 상에서 하나의 유형의 변형을 나타내는 경우, 교대 패턴, 즉 2개의 뉴클레오타이드마다의 변형은 동일할 수 있지만, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 각각 교대 모티프 예컨대 "ABABAB...", "ACACAC...", "BDBDBD..." 또는 "CDCDCD..." 등에서의 몇몇 가능한 변형으로부터 선택될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 RNAi 작용제는, 안티센스 가닥에서의 교대 모티프에 대한 변형 패턴에 비하여 이동된, 센스 가닥에서의 교대 모티프에 대한 변형 패턴을 포함한다. 이 이동은, 센스 가닥의 뉴클레오타이드의 변형된 기가 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드의 상이하게 변형된 기에 상응하도록 이루어질 수 있으며, 그 반대이기도 하다. 예를 들어, 센스 가닥이 dsRNA 듀플렉스에서 안티센스 가닥과 쌍을 이루는 경우, 센스 가닥의 교대 모티프는 가닥의 5'-3'으로부터 "ABABAB"로 시작할 수 있으며, 안티센스 가닥의 교대 모티프는 듀플렉스 영역의 가닥의 5'-3'으로부터 "BABABA"로부터 시작할 수 있다. 또 대안적으로서, 센스 가닥의 교대 모티프는 가닥의 5'-3'으로부터 "AABBAABB"로 시작할 수 있으며, 안티센스 가닥의 교대 모티프는 듀플렉스 영역 내의 가닥의 5'-3'으로부터 "BBAABBAA"로 시작하여, 센스 가닥과 안티센스 가닥 간의 변형 패턴의 완전하거나 또는 부분적인 이동이 존재하도록 할 수 있다.
일 실시형태에서, RNAi 작용제는 처음의 안티센스 가닥 상의 2'-O-메틸 변형 및 2'-F 변형의 교대 모티프의 패턴에 대해 이동을 갖는 처음의 센스 가닥 상의 2'-O-메틸 변형 및 2'-F 변형의 교대 모티프의 패턴을 포함하며, 즉, 센스 가닥 상의 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥 상의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드와 염기쌍을 이루며 또 그 반대이기도 하다. 센스 가닥의 위치 1은 2'-F 변형으로 시작할 수 있으며, 안티센스 가닥의 위치 1은 2'-O-메틸 변형으로 시작할 수 있다.
3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 모티프 하나 이상을 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥에 도입하는 것은, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥에 존재하는 초기 변형 패턴을 방해한다. 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 모티프 하나 이상을 센스 및/또는 안티센스 가닥에 도입함으로써 센스 및/또는 안티센스 가닥의 변형 패턴을 방해하는 것은 놀랍게도, 표적 유전자에 대한 유전자 침묵화 활성을 증대시킨다.
일 실시형태에서, 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 모티프가 임의의 가닥에 도입되는 경우, 모티프의 옆에 있는 뉴클레오타이드의 변형은 모티프의 변형과 상이한 변형이다. 예를 들어, 모티프를 포함하는 서열의 부분은 "...NaYYYNb...,"로서, "Y"는 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 모티프의 변형을 나타내며, "Na" 및 "Nb"는 Y의 변형과 상이한 모티프 "YYY"의 옆에 있는 뉴클레오타이드의 변형을 나타내며, Na 및 Nb는 동일하거나 또는 상이한 변형일 수 있다. 다르게는, Na 및/또는 Nb는 윙 변형이 존재하는 경우 존재하거나 또는 부재할 수 있다.
RNAi 작용제는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합을 더 포함할 수 있다. 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합 변형은 가닥의 임의의 위치에서, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 또는 둘 모두의 가닥의 임의의 뉴클레오타이드에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드간 결합 변형은 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드에서 발생할 수 있거나; 각각의 뉴클레오타이드간 결합 변형은 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 교대 패턴으로 발생할 수 있거나; 또는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 교대 패턴에서 뉴클레오타이드간 결합 변형 둘 다를 포함한다. 센스 가닥에서의 뉴클레오타이드간 결합 변형의 교대 패턴은 안티센스 가닥과 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 센스 가닥에서의 뉴클레오타이드간 결합 변형의 교대 패턴은 안티센스 가닥에서의 뉴클레오타이드간 결합 변형의 교대 패턴에 대해 이동을 가질 수 있다.
일 실시형태에서, RNAi는 오버행 영역에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합 변형을 포함한다. 예를 들어, 오버행 영역은 2개의 뉴클레오타이드 간에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합을 가지는 2개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드간 결합 변형은 또한, 듀플렉스 영역 내의 쌍을 이루는 말단 뉴클레오타이드와 오버행 뉴클레오타이드를 연결하도록 만들어질 수 있다. 예를 들어, 적어도 2, 3, 4개 또는 모든 오버행 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합을 통해 연결될 수 있으며, 선택적으로, 오버행 뉴클레오타이드의 옆에 존재하는 쌍을 이루는 뉴클레오타이드와 오버행 뉴클레오타이드를 연결하는 부가적인 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합이 존재할 수 있다. 예를 들어, 3개의 말단 뉴클레오타이드 간에는 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합이 존재할 수 있으며, 3개의 뉴클레오타이드 중 2개는 오버행 뉴클레오타이드이며, 제3 뉴클레오타이드는 오버행 뉴클레오타이드 옆의 쌍을 이루는 뉴클레오타이드이다. 이들 3개의 말단 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 3'-말단, 센스 가닥의 3'-말단, 안티센스 가닥의 5'-말단 및/또는 안티센스 가닥의 5' 말단에 존재할 수 있다.
일 실시형태에서, 2개의 뉴클레오타이드 오버행은 안티센스 가닥의 3'-말단에 존재하며, 3개의 말단 뉴클레오타이드 사이에는 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합이 존재하고, 3개의 뉴클레오타이드 중 2개는 오버행 뉴클레오타이드이며, 제3 뉴클레오타이드는 오버행 뉴클레오타이드 옆의 쌍을 이루는 뉴클레오타이드이다. 선택적으로, RNAi 작용제는 추가로 센스 가닥의 5'-말단과 안티센스 가닥의 5'-말단 둘 모두에서 3개의 말단 뉴클레오타이드 간에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합을 가질 수 있다.
일 실시형태에서, RNAi 작용제는 듀플렉스 내에서 표적과의 미스매치(들), 또는 이들의 조합을 포함한다. "미스매치"는 뉴클레오타이드의 비-원형 염기 짝지음 또는 원형 짝지음이 아닌 것일 수 있다. 미스매치는 오버행 영역 또는 듀플렉스 영역에서 발생할 수 있다. 염기쌍은 해리 또는 용융을 촉진하는 특성을 토대로 순위가 매겨질 수 있다(예를 들어, 특정 짝지음의 회합 또는 해리의 자유 에너지를 토대로, 가장 간단한 방법은 개별 쌍 기준으로 쌍을 시험하는 것이지만, 다음의 인접한 또는 유사한 분석이 또한 사용될 수 있음). 해리의 촉진 면에서, A:U는 G:C보다 바람직하며; G:U는 G:C보다 바람직하고; I:C는 G:C보다 바람직하다(I=이노신). 미스매치, 예를 들어, 비-원형(canonical) 또는 원형 짝지음 이외의 짝지음(전술한 바와 같음)은 원형(A:T, A:U, G:C) 짝지음보다 바람직하며; 보편적인 염기를 포함하는 짝지음이 원형 짝지음보다 바람직하다. "유니버셜 염기"는, 인접한 염기쌍 상호작용을 유의하게 불안정화시키기 않거나 변형된 올리고뉴클레오타이드의 예상된 기능적인 생화학적 용도를 방해하지 않으면서, 4개의 정상적인 염기(G, C, A 및 U) 중 임의의 염기를 대체하는 능력을 나타내는 염기이다. 유니버셜 염기의 비제한적 예로는, 2'-데옥시이노신 (하이포크산틴 데옥시뉴클레오타이드) 또는 이의 유도체, 니트로아졸 유사체 및 소수성 방향족 비-수소-결합 염기를 포함한다.
일 실시형태에서, RNAi 작용제는 듀플렉스의 5' 말단에서 안티센스 가닥의 해리를 촉진하기 위해, 독립적으로 A:U, G:U, I:C, 및 미스매칭된 쌍, 예를 들어, 비-원형 또는 원형 짝지음 이외의 짝지음 또는 보편적인 염기를 포함하는 짝지음의 군으로부터 선택되는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내에 처음의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 염기쌍 중 적어도 하나를 포함한다.
일 실시형태에서, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 위치 1의 뉴클레오타이드는 A, dA, dU, U, 및 dT로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다르게는, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 처음 1개, 2개 또는 3개의 염기쌍 중 적어도 하나는 AU 염기쌍이다. 예를 들어, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 처음의 염기쌍은 AU 염기쌍이다.
다른 실시형태에서, 센스 가닥의 3' 말단에 있는 뉴클레오타이드는 데옥시-티민(dT)이다. 다른 실시형태에서, 안티센스 가닥의 3' 말단에 있는 뉴클레오타이드는 데옥시-티민(dT)이다. 일 실시형태에서, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 3' 말단에는 짧은 데옥시-티민 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 2개의 dT 뉴클레오타이드가 존재한다.
일 실시형태에서, 센스 가닥 서열은 화학식 (I)로 표시될 수 있다:
Figure 112015124918061-pct00013
상기 식에서,
i 및 j는 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p 및 q는 각각 독립적으로 0 내지 6이며;
Na는 각각 독립적으로 0개 내지 25개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오타이드를 포함하며;
Nb는 각각 독립적으로 0개 내지 10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고;
np 및 nq는 각각 독립적으로 오버행 뉴클레오타이드를 나타내며;
Nb 및 Y는 동일한 변형을 갖지 않고;
XXX, YYY 및 ZZZ는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 하나의 모티프를 나타낸다. 바람직하게는, YYY는 모든 2'-F 변형 뉴클레오타이드이다.
일 실시형태에서, Na 및/또는 Nb는 교대 패턴의 변형을 포함한다.
일 실시형태에서, YYY 모티프는 센스 가닥의 절단 부위에 또는 그 근처에 존재한다. 예를 들어, RNAi 작용제가 17개 내지 23개의 뉴클레오타이드 길이의 듀플렉스 영역을 갖는 경우, YYY 모티프는 센스 가닥의 절단 부위에 또는 그 근처에 존재할 수 있으며(예를 들어, 위치 6, 7, 8, 7, 8, 9, 8, 9, 10, 9, 10, 11, 10, 11, 12 또는 11, 12, 13에서 발생할 수 있음), 계수는 5'-말단으로부터 제1 뉴클레오타이드에서 시작하거나; 또는 선택적으로, 계수는 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 쌍을 이루는 제1 뉴클레오타이드에서 시작한다.
일 실시형태에서, i는 1이고 j는 0이거나, 또는 i는 0이고 j는 1이거나, 또는 i 및 j는 둘다 1이다. 따라서, 센스 가닥은 하기 식으로 표시될 수 있다:
Figure 112015124918061-pct00014
센스 가닥이 화학식 (Ib)로 표시되는 경우, Nb는 0개 내지 10개, 0개 내지 7개, 0개 내지 5개, 0개 내지 4개, 0개 내지 2개 또는 0개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. Na는 각각 독립적으로 2개 내지 20개, 2개 내지 15개, 또는 2개 내지 10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낼 수 있다.
센스 가닥이 화학식 (Ic)로 표시되는 경우, Nb는 0개 내지 10개, 0개 내지 7개, 0개 내지 10개, 0개 내지 7개, 0개 내지 5개, 0개 내지 4개, 0개 내지 2개 또는 0개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. Na는 각각 독립적으로 2개 내지 20개, 2개 내지 15개, 또는 2개 내지 10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낼 수 있다.
센스 가닥이 화학식 (Id)로 표시되는 경우, Nb는 각각 독립적으로 0개 내지 10개, 0개 내지 7개, 0개 내지 5개, 0개 내지 4개, 0개 내지 2개 또는 0개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 바람직하게는, Nb는 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다. Na는 각각 독립적으로, 2개 내지 20개, 2개 내지 15개, 또는 2개 내지 10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낼 수 있다.
X, Y 및 Z는 각각 서로 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
다른 실시형태에서, i는 0이고, j는 0이며, 센스 가닥은 하기 식으로 표시될 수 있다:
Figure 112015124918061-pct00015
센스 가닥이 화학식 (Ia)로 표시되는 경우, Na는 각각 독립적으로 2개 내지 20개, 2개 내지 15개 또는 2개 내지 10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낼 수 있다.
일 실시형태에서, RNAi의 안티센스 가닥 서열은 화학식 (II)로 표시될 수 있다:
Figure 112015124918061-pct00016
상기 식에서,
k 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p' 및 q'는 각각 독립적으로 0 내지 6이며;
Na'는 각각 독립적으로 0개 내지 25개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오타이드를 포함하며;
Nb'는 각각 독립적으로 0개 내지 10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고;
np' 및 nq'는 각각 독립적으로 오버행 뉴클레오타이드를 나타내며;
Nb' 및 Y'는 동일한 변형을 갖지 않고;
X'X'X', Y'Y'Y' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 하나의 모티프를 나타낸다.
일 실시형태에서, Na' 및/또는 Nb'는 교대 패턴의 변형을 포함한다.
Y'Y'Y' 모티프는 안티센스 가닥의 절단 부위에 또는 그 근처에 존재한다. 예를 들어, RNAi 작용제가 17개 내지 23개의 뉴클레오타이드 길이의 듀플렉스 영역을 갖는 경우, Y'Y'Y' 모티프는 안티센스 가닥의 위치 9, 10, 11; 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14; 또는 13, 14, 15에 존재할 수 있으며, 계수는 5'-말단으로부터 제1 뉴클레오타이드에서 시작하거나; 또는 선택적으로, 계수는 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 쌍을 이루는 제1 뉴클레오타이드에서 시작한다. 바람직하게는, Y'Y'Y' 모티프는 위치 11, 12, 13에 존재한다.
일 실시형태에서, Y'Y'Y' 모티프는 모두 2'-OMe 변형 뉴클레오타이드이다.
일 실시형태에서, k는 1이고 l은 0이거나, 또는 k는 0이고 l은 1이거나, 또는 k 및 l은 둘 모두 1이다.
따라서, 안티센스 가닥은 하기 식으로 표시될 수 있다:
Figure 112015124918061-pct00017
안티센스 가닥이 화학식 (IIb)로 표시되는 경우, Nb'는 0개 내지 10개, 0개 내지 7개, 0개 내지 10개, 0개 내지 7개, 0개 내지 5개, 0개 내지 4개, 0개 내지 2개 또는 0개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. Na'는 각각 독립적으로 2개 내지 20개, 2개 내지 15개, 또는 2개 내지 10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
안티센스 가닥이 화학식 (IIc)로 표시되는 경우, Nb'는 0개 내지 10개, 0개 내지 7개, 0개 내지 10개, 0개 내지 7개, 0개 내지 5개, 0개 내지 4개, 0개 내지 2개 또는 0개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. Na'는 각각 독립적으로 2개 내지 20개, 2개 내지 15개, 또는 2개 내지 10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
안티센스 가닥이 화학식 (IId)로 표시되는 경우, Nb'는 각각 독립적으로 0개 내지 10개, 0개 내지 7개, 0개 내지 10개, 0개 내지 7개, 0개 내지 5개, 0개 내지 4개, 0개 내지 2개 또는 0개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. Na'는 각각 독립적으로, 2개 내지 20개, 2개 내지 15개, 또는 2개 내지 10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 바람직하게는 Nb는 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
다른 실시형태에서, k는 0이고, l은 0이며, 안티센스 가닥은 하기 식으로 표시될 수 있다:
Figure 112015124918061-pct00018
.
안티센스 가닥이 화학식 (IIa)로 표시되는 경우, Na'는 각각 독립적으로 2개 내지 20개, 2개 내지 15개 또는 2개 내지 10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
X', Y' 및 Z'는 각각 서로 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
센스 가닥 및 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드는 각각 독립적으로 LNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-히드록실, 또는 2'-플루오로로 변형될 수 있다. 예를 들어, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로, 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로로 변형된다. 특히, 각각의 X, Y, Z, X', Y' 및 Z'는 2'-O-메틸 변형 또는 2'-플루오로 변형을 나타낼 수 있다.
일 실시형태에서, RNAi 작용제의 센스 가닥은 듀플렉스 영역이 21개의 뉴클레오타이드인 경우 가닥의 위치 9, 10 및 11에 존재하는 YYY 모티프를 포함할 수 있으며, 계수는 5'-말단으로부터 제1 뉴클레오타이드에서 시작하거나, 또는 선택적으로, 계수는 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 쌍을 이루는 제1 뉴클레오타이드에서 시작하고; Y는 2'-F 변형을 나타낸다. 센스 가닥은 추가로 듀플렉스 영역의 반대쪽 말단에 XXX 모티프 또는 ZZZ 모티프를 윙 변형으로서 포함할 수 있으며; XXX 및 ZZZ은 각각 독립적으로 2'-OMe 변형 또는 2'-F 변형을 나타낸다.
일 실시형태에서, 안티센스 가닥은 가닥의 위치 11, 12 및 13에 존재하는 Y'Y'Y' 모티프를 포함할 수 있으며, 계수는 5'-말단으로부터 제1 뉴클레오타이드에서 시작하거나, 또는 선택적으로, 계수는 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 쌍을 이루는 제1 뉴클레오타이드에서 시작하며; Y'는 2'-O-메틸 변형을 나타낸다. 안티센스 가닥은 부가적으로, 듀플렉스 영역의 반대쪽 말단에 X'X'X' 모티프 또는 Z'Z'Z' 모티프를 윙 변형으로서 포함하며; X'X'X' 및 Z'Z'Z'은 각각 독립적으로 2'-OMe 변형 또는 2'-F 변형을 나타낸다.
상기 화학식 (Ia), (Ib), (Ic) 및 (Id) 중 어느 하나로 표시되는 센스 가닥은 각각 화학식 (IIa), (IIb), (IIc) 및 (IId) 중 어느 하나로 표시되는 안티센스 가닥과 듀플렉스를 형성한다.
따라서, 본 발명의 방법에 이용하기 위한 RNAi 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함할 수 있으며, 각각의 가닥은 14 내지 30개의 뉴클레오타이드를 가지며, RNAi 듀플렉스는 화학식 (III)으로 표시된다:
Figure 112015124918061-pct00019
상기 식에서,
i, j, k 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p, p', q 및 q'는 각각 독립적으로 0 내지 6이며;
Na 및 Na'는 각각 독립적으로 0개 내지 25개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오타이드를 포함하며;
Nb 및 Nb'는 각각 독립적으로 0개 내지 10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고;
np', np, nq' 및 nq는 각각이 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 각각 독립적으로 오버행 뉴클레오타이드를 나타내고;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형이 있는 하나의 모티프를 나타낸다.
일 실시형태에서, i는 0이고, j는 0이거나; i는 1이고, j는 0이거나; i는 0이고, j는 1이거나; i 및 j 둘 모두는 0이거나; i 및 j 둘 모두는 1이다. 다른 실시형태에서, k는 0이고, l은 0이거나; k는 1이고, l은 0이거나; k는 0이고, l은 1이거나; k 및 l 둘 모두는 0이거나; k 및 l 둘 모두는 1이다.
RNAi 듀플렉스를 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 예시적인 조합은 하기의 식을 포함한다:
Figure 112015124918061-pct00020
RNAi 작용제가 화학식 (IIIa)로 표시되는 경우, Na는 각각 독립적으로 2개 내지 20개, 2개 내지 15개 또는 2개 내지 10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
RNAi 작용제가 화학식 (IIIb)로 표시되는 경우, Nb는 각각 독립적으로 1 내지 10개, 1 내지 7개, 1개 내지 5개 또는 1 내지 4개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. Na는 각각 독립적으로 2개 내지 20개, 2개 내지 15개 또는 2개 내지 10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
RNAi 작용제가 화학식 (IIIc)로 표시되는 경우, Nb, Nb'는 각각 독립적으로 0개 내지 10개, 0개 내지 7개, 0개 내지 10개, 0개 내지 7개, 0개 내지 5개, 0개 내지 4개, 0개 내지 2개 또는 0개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. Na는 각각 독립적으로 2개 내지 20개, 2개 내지 15개 또는 2개 내지 10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
RNAi 작용제가 화학식 (IIId)로 표시되는 경우, Nb, Nb'는 각각 독립적으로 0개 내지 10개, 0개 내지 7개, 0개 내지 10개, 0개 내지 7개, 0개 내지 5개, 0개 내지 4개, 0개 내지 2개 또는 0개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. Na, Na'는 각각 독립적으로 2개 내지 20개, 2개 내지 15개 또는 2개 내지 10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. Na, Na', Nb 및 Nb'는 각각 독립적으로 교대 패턴의 변형을 포함한다.
식 (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) 및 (IIId)에서 X, Y 및 Z의 각각은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
RNAi 작용제가 화학식 (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) 및 (IIId)로 표시되는 경우, Y 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 Y' 뉴클레오타이드 중 하나와 염기쌍을 형성할 수 있다. 대안적으로, Y 뉴클레오타이드 중 적어도 2개는 상응하는 Y' 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성하거나; Y 뉴클레오타이드 중 3개 모두는 상응하는 Y' 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성한다.
RNAi 작용제가 화학식 (IIIb) 또는 (IIId)로 표시되는 경우, Z 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 Z' 뉴클레오타이드 중 하나와 염기쌍을 형성할 수 있다. 대안적으로, Z 뉴클레오타이드 중 적어도 2개는 상응하는 Z' 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성하거나; Z 뉴클레오타이드 중 3개 모두는 상응하는 Z' 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성한다.
RNAi 작용제가 화학식 (IIIc) 또는 (IIId)로 표시되는 경우, X 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 X' 뉴클레오타이드 중 하나와 염기쌍을 형성할 수 있다. 대안적으로, X 뉴클레오타이드 중 적어도 2개는 상응하는 X' 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성하거나; X 뉴클레오타이드 중 3개 모두는 상응하는 X' 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성한다.
일 실시형태에서, Y 뉴클레오타이드 상의 변형은 Y' 뉴클레오타이드 상의 변형과 상이하고/거나, Z 뉴클레오타이드 상의 변형은 Z' 뉴클레오타이드 상의 변형과 상이하고/거나, X 뉴클레오타이드 상의 변형은 X' 뉴클레오타이드 상의 변형과 상이하다.
일 실시형태에서, RNAi 작용제가 화학식 (IIId)로 표시되는 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이다. 다른 실시형태에서, RNAi 작용제가 (IIId)로 표시되는 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고, np'는 0 초과이며, 적어도 하나의 np'는 포스포로티오에이트 결합을 통해 인접 뉴클레오타이드에 연결된다. 또 다른 실시형태에서, RNAi 작용제가 화학식 (IIId)로 표시되는 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고, np'는 0 초과이며, 적어도 하나의 np'는 포스포로티오에이트 결합을 통해 인접 뉴클레오타이드에 연결되고, 센스 가닥은 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체에 콘쥬게이트된다. 다른 실시형태에서, RNAi 작용제가 화학식 (IIId)로 표시되는 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고, np'는 0 초과이며, 적어도 하나의 np'는 포스포로티오에이트 결합을 통해 인접 뉴클레오타이드에 연결되고, 센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 포함하고, 센스 가닥은 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체에 콘쥬게이트된다.
일 실시형태에서, RNAi 작용제가 화학식 (IIIa)로 표시되는 경우, Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고, np'는 0 초과이며, 적어도 하나의 np'는 포스포로티오에이트 결합을 통해 인접 뉴클레오타이드에 연결되고, 센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 포함하고, 센스 가닥은 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체에 콘쥬게이트된다.
일 실시형태에서, RNAi 작용제는 화학식 (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) 및 (IIId)로 표시되는 적어도 2개의 듀플렉스를 함유하는 다량체이며, 상기 듀플렉스들은 링커에 의해 연결된다. 링커는 절단가능하거나 비-절단가능할 수 있다. 선택적으로, 상기 다량체는 리간드를 더 포함한다. 듀플렉스 각각은 동일한 유전자 또는 2개의 상이한 유전자를 표적할 수 있거나; 또는 듀플렉스 각각은 2개의 상이한 표적 부위에서 동일한 유전자를 표적할 수 있다.
일 실시형태에서, RNAi 작용제는 화학식 (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) 및 (IIId)로 표시되는 3, 4, 5, 6개 이상의 듀플렉스를 함유하는 다량체이며, 상기 듀플렉스들은 링커에 의해 연결된다. 링커는 절단가능하거나 비-절단가능할 수 있다. 선택적으로, 상기 다량체는 리간드를 더 포함한다. 듀플렉스 각각은 동일한 유전자 또는 2개의 상이한 유전자를 표적할 수 있거나; 또는 듀플렉스 각각은 2개의 상이한 표적 부위에서 동일한 유전자를 표적할 수 있다.
일 실시형태에서, 화학식 (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) 및 (IIId)로 표시되는 2개의 RNAi 작용제들은 5' 말단에서 서로 연결되며, 3' 말단 중 하나 또는 둘 모두는 리간드에 선택적으로 콘쥬게이트된다. 작용제 각각은 동일한 유전자 또는 2개의 상이한 유전자를 표적할 수 있거나; 또는 작용제 각각은 2개의 상이한 표적 부위에서 동일한 유전자를 표적할 수 있다.
다양한 공개문헌은 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 다량체 RNAi 작용제를 기술한다. 이러한 공개문헌은 제WO2007/091269호, 미국 특허 제7858769호, 제WO2010/141511호, 제WO2007/117686호, 제WO2009/014887호 및 제WO2011/031520호를 포함하며, 그들 각각의 전체 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
RNAi 작용제로의 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 콘쥬게이션을 포함하는 RNAi 작용제는 RNAi 작용제의 하나 이상의 특성을 최적화할 수 있다. 많은 경우에, 탄수화물 모이어티는 RNAi 작용제의 변형된 서브유닛에 부착될 것이다. 예를 들어, dsRNA 작용제의 하나 이상의 리보뉴클레오타이드 서브유닛의 리보스 당은 다른 모이어티, 예를 들어, 탄수화물 리간드가 부착되는 비-탄수화물(바람직하게는 시클릭) 캐리어로 대체될 수 있다. 서브유닛의 리보스 당이 대체된 리보뉴클레오타이드 서브유닛은 본원에서, 리보스 대체 변형 서브유닛(RRMS)으로 지칭된다. 시클릭 캐리어는 카르보시클릭 고리계일 수 있으며, 즉 모든 고리 원자들이 탄소 원자 또는 헤테로시클릭 고리계일 수 있으며, 즉, 하나 이상의 고리 원자는 예를 들어, 질소, 산소, 황과 같은 헤테로원자일 수 있다. 시클릭 캐리어는 모노시클릭 고리계일 수 있거나, 또는 2개 이상의 고리, 예를 들어, 융합 고리를 포함할 수 있다. 시클릭 캐리어는 완전히 포화된 고리계일 수 있거나, 또는 하나 이상의 이중 결합을 포함할 수 있다.
리간드는 캐리어를 통해 폴리뉴클레오타이드에 부착될 수 있다. 캐리어로는, (i) 적어도 하나의 "골격 부착점", 바람직하게는 2개의 "골격 부착점", 및 (ii) 적어도 하나의 "테터링(tehtering) 부착점"이 포함된다. 본원에 사용된, "골격 부착점"은 히드록실기와 같은 기능기, 또는 일반적으로 골격, 예를 들어, 리보핵산의 포스페이트, 또는 변형된 포스페이트, 예를 들어, 황 함유 골격으로의 캐리어의 혼입에 적절하며 이에 이용가능한 결합을 포함한다. 일부 실시형태에서, "테터링 부착점"(TAP)은 선택된 모이어티를 연결하는 (골격 부착점을 제공하는 원자와 구별되는) 탄소 원자 또는 헤테로원자와 같은 시클릭 캐리어의 구성원 고리 원자를 지칭한다. 모이어티는, 예를 들어, 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류, 올리고당류 및 다당류와 같은 탄수화물일 수 있다. 선택적으로, 선택된 모이어티는 개재 테터링에 의해 시클릭 캐리어로 연결된다. 따라서, 시클릭 캐리어는 종종 아미노기와 같은 기능기를 포함하거나, 또는 일반적으로 구성분 고리로의 리간드와 같은 다른 화학적 엔터티(entity)의 혼입 또는 테터링에 적절한 결합을 제공한다.
RNAi 작용제는 캐리어를 통해 리간드에 콘쥬게이트될 수 있으며, 캐리어는 시클릭기 또는 비-시클릭기일 수 있으며; 바람직하게는, 시클릭기는 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔란, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸릴 및 데칼린으로부터 선택되며; 바람직하게는, 비-시클릭기는 세리놀 골격 또는 디에탄올아민 골격으로부터 선택된다.
소정의 구체적인 실시형태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 RNAi 작용제는 표 1, 표 2, 표 5 및 표 7 중 임의의 하나에 열거된 작용제들의 군으로부터 선택되는 작용제이다.
이들 작용제는 리간드를 더 포함할 수 있다.
A. 리간드
본 발명의 이중-가닥 RNA(dsRNA) 작용제는 선택적으로 하나 이상의 리간드에 콘쥬게이트될 수 있다. 리간드는 3'-말단, 5'-말단 또는 양 말단에서 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 양 가닥 모두에 부착될 수 있다. 예를 들어, 리간드는 센스 가닥에 콘쥬게이트될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 콘쥬게이트될 수 있다. 바람직한 하나의 실시형태에서, 리간드는 GalNAc 리간드이다. 특히 바람직한 실시형태에서, 리간드는 GalNAc3이다:
Figure 112015124918061-pct00021
일부 실시형태에서, 리간드, 예를 들어, GalNAc 리간드는 RNAi 작용제의 3' 말단에 부착된다. 일 실시형태에서, RNAi 작용제는 하기의 개략도에 나타낸 바와 같이, 리간드, 예를 들어, GalNAc 리간드에 콘쥬게이트된다:
Figure 112015124918061-pct00022
상기 식에서,
X는 O 또는 S이다. 일 실시형태에서, X는 O이다.
매우 다양한 엔터티들이 본 발명의 RNAi 작용제에 결합될 수 있다. 바람직한 모이어티는 리간드이며, 이는 직접적으로 또는 개입 테터(tether)를 통해 간접적으로 결합되고, 바람직하게는 공유 결합되어 있다.
바람직한 실시형태에서, 리간드는, 그것이 혼입되는 분자의 분포, 표적화 또는 수명을 변경한다. 바람직한 실시형태에서, 리간드는 선택된 표적, 예를 들어, 분자, 세포 또는 세포 유형, 신체의 구획, 수용체, 예를 들어, 세포 또는 기관 구획, 조직, 기관 또는 영역에 대해, 이런 리간드가 존재하지 않는 화학종과 비교하여, 향상된 친화성을 제공한다. 선택된 표적에 대해 향상된 친화성을 제공하는 리간드는 또한, 표적 리간드로도 명명된다.
일부 리간드들은 엔도좀용해 특성을 가질 수 있다. 엔도좀용해성 리간드는 엔도좀의 용해 및/또는 세포의 엔도좀에서 세포질로의 본 발명의 조성물 또는 이의 구성성분의 수송을 촉진한다. 엔도좀용해성 리간드는 pH-의존성 막활성 및 융합성을 나타내는 폴리음이온성 펩티드 또는 펩티도미메틱일 수 있다. 일 구현예에서, 엔도좀용해성 리간드는 엔도좀의 pH에서 이의 활성 형태를 취한다. "활성" 형태란, 엔도좀용해성 리간드가 엔도좀의 분쇄 및/또는 세포의 엔도좀에서 세포질로의 본 발명의 조성물 또는 이의 구성성분의 수송을 촉진하는 형태이다. 예시적인 엔도좀용해성 리간드로는, GALA 펩티드(문헌[Subbarao 등, Biochemistry, 1987, 26: 2964-2972]), EALA 펩티드(문헌[Vogel 등, J. Am. Chem. Soc., 1996, 118: 1581-1586]), 및 이들의 유도체(문헌[Turk 등, Biophys . Acta, 2002, 1559: 56-68])가 포함된다. 일 실시형태에서, 엔도좀용해성 구성성분은 pH 변화에 반응하여 전하의 변화 또는 양성자화를 겪을 화학적 기(예를 들어, 아미노산)를 포함할 수 있다. 엔도좀용해성 구성성분은 선형 또는 분지형일 수 있다.
리간드들은 수송, 혼성화, 및 특이성을 향상시킬 수 있으며, 또한 생성되는 천연 또는 변형된 올리고리보뉴클레오타이드, 또는 본원에서 기술되는 단량체 및/또는 천연 또는 변형된 리보뉴클레오타이드의 조합을 포함하는 중합체성 분자의 뉴클레아제 내성을 향상시킬 수 있다.
리간드들은 일반적으로, 예를 들어 흡수 증대를 위한 치료적 변형제; 예를 들어 분포를 모니터링하기 위한 진단 화합물 또는 리포터 기; 가교제; 및 뉴클레아제-내성 부여 모이어티를 포함할 수 있다. 일반적인 예로는, 지질, 스테로이드, 비타민, 당, 단백질, 펩티드, 폴리아민, 및 펩티드 의태물이 포함된다.
리간드는 단백질(예, 인간 혈청 알부민(HSA), 저밀도 리포단백질(LDL), 고밀도 리포단백질(HDL) 또는 글로불린); 탄수화물(예, 덱스트란, 풀루란, 키틴, 키토산, 이눌린, 시클로덱스트린, 또는 히알루론산); 또는 지질과 같은 자연 발생 물질을 포함할 수 있다. 리간드는 재조합 또는 합성 분자, 예를 들어, 합성 중합체, 예컨대, 합성 폴리아미노산, 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 압타머)일 수도 있다. 폴리아미노산의 예는 폴리리신(PLL), 폴리 L-아스파르트산, 폴리 L-글루탐산, 스티렌-말레산 무수물 공중합체, 폴리(L-락티드-코-글리콜리드) 공중합체, 디비닐 에테르-말레산 무수물 공중합체, N-(2-히드록시프로필)메타크릴아미드 공중합체(HMPA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리우레탄, 폴리(2-에틸아크릴산), N-이소프로필아크릴아미드 중합체, 또는 폴리포스파진을 포함한다. 폴리아민의 예는: 폴리에틸렌이민, 폴리리신(PLL), 스페르민, 스페르미딘, 폴리아민, 슈도펩티드-폴리아민, 펩티도미메틱 폴리아민(peptidomimetic polyamine), 덴드리머 폴리아민, 아르기닌, 아미딘, 프로타민, 양이온성 지질, 양이온성 포르피린, 폴리아민의 4차 염, 또는 알파 헬리칼 펩티드를 포함한다.
리간드는 표적기, 예컨대, 세포 또는 조직 표적 작용제, 예컨대, 렉틴, 글리코단백질, 지질 또는 단백질, 예컨대, 신장 세포와 같은 특정된 세포 유형과 결합하는 항체를 포함할 수도 있다. 표적기는 갑상선 자극 호르몬, 멜라노트로핀, 렉틴, 글리코단백질, 계면활성제 단백질 A, 뮤신 탄수화물, 다가 락토오스, 다가 갈락토오스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민 다가 만노오스, 다가 푸코오스, 글리코실화 폴리아미노산, 다가 갈락토오스, 트랜스페린, 비스포스포네이트, 폴리글루타메이트, 폴리아스파르테이트, 지질, 콜레스테롤, 스테로이드, 담즙산, 폴레이트, 비타민 B12, 비오틴, RGD 펩티드, RGD 펩티드 의태물 또는 압타머일 수 있다.
리간드의 다른 예는 염료, 삽입성 작용제(예, 아크리딘), 가교제(예, 소랄렌, 미토마이신 C), 포르피린(TPPC4, 텍사피린, 사피린), 다환 방향족 탄화수소(예, 페나진, 디하이드로페나진), 인공 엔도뉴클레아제 또는 킬레이트제(chelator)(예, EDTA), 친지방성 분자, 예컨대, 콜레스테롤, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 제라닐옥시헥실기, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실기, 팔미트산, 미리스틱산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜레닉산(cholenic acid), 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진)및 펩티드 콘쥬게이트(예, 안테나페디아 펩티드, Tat 펩티드), 알킬화 작용제, 포스페이트, 아미노, 메르캅토, PEG(예, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, 폴리아미노, 알킬, 치환된 알킬, 방사선표지 마커, 효소, 합텐(예, 비오틴), 수송/흡수 촉진제(예, 아스피린, 비타민 E, 엽산), 합성 리보뉴클레아제(예, 이미다졸, 비스이미다졸, 히스타민, 이미다졸 클러스터, 아크리딘-이미다졸 콘쥬게이트, 테트라아자마크로사이클의 Eu3+ 복합체), 디니트로페닐, HRP, 또는 AP를 포함한다.
리간드는 단백질, 예컨대, 글리코단백질, 또는 펩티드, 예컨대, 공-리간드에 대한 특정 친화도를 갖는 분자, 또는 항체, 예컨대, 암세포, 내피 세포 또는 골 세포와 같은 특정된 세포 유형과 결합하는 항체일 수 있다. 리간드는 호르몬 및 호르몬 수용체를 포함할 수도 있다. 이들은 비-펩티드성 화학종, 예를 들어, 지질, 렉틴, 탄수화물, 비타민, 보조인자, 다가 락토오스, 다가 갈락토오스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민 다가 만노오스, 다가 푸코오스 또는 압타머를 포함할 수도 있다. 리간드는 예를 들어, 리포다당류, p38 MAP 키나아제의 활성화제 또는 NF-κB의 활성화제일 수 있다.
리간드는 예컨대, 세포의 미소관, 미세섬유 및/또는 중간 필라멘트를 파열시킴으로써 세포의 세포골격을 파열시킴으로써 예컨대, iRNA 작용제의 세포로의 흡수를 증가시킬 수 있는 약물과 같은 물질일 수 있다. 약물은 예를 들어, 탁손, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 사이토칼라신, 노코다졸, 자플라키놀리데(japlakinolide), 라트룬쿨린 A, 팔로이딘, 스윈홀리데(swinholide) A, 인다노신 또는 미오세르빈일 수 있다.
리간드는 예를 들어, 염증 반응을 활성화시킴으로써 올리고뉴클레오타이드의 세포로의 흡수를 증가시킬 수 있다. 이런 효과를 가지는 예시적인 리간드로는, 종양 괴사 인자 알파(TNF알파), 인터루킨-1 베타, 또는 감마 인터페론이 포함된다.
일 양태에서, 리간드는 지질 또는 지질계 분자이다. 그러한 지질 또는 지질계 분자는 바람직하게는 혈청 단백질, 예컨대, 인간 혈청 알부민(HSA)과 결합한다. HSA 결합 리간드는 표적 조직, 예컨대, 신체의 비-신장 표적 조직으로 콘쥬게이트의 분포가 이루어지도록 한다. 예를 들어, 표적 조직은 간의 실질 세포를 포함하는 간일 수 있다. HSA와 결합할 수 있는 기타 분자들은 리간드로 이용될 수도 있다. 예를 들어, 나프록센 또는 아스피린을 이용할 수 있다. 지질 또는 지질계 리간드는 (a) 콘쥬게이트의 분해에 대한 내성을 증가시키고/거나, (b) 표적 세포 또는 세포막으로 표적 또는 수송을 증가시키고/거나 (c) 혈청 단백질, 예컨대, HSA로의 결합을 조정하는데 이용될 수 있다.
지질계 리간드는 콘쥬게이트의 표적 조직으로의 결합을 조절, 예컨대, 제어하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, HSA에 더 강하게 결합하는 지질 또는 지질계 리간드는 신장에 표적될 가능성이 적을 것이며, 따라서 신체로부터 제거될 가능성이 적을 것이다. HSA와 덜 강하게 결합하는 지질 또는 지질계 리간드는 신장에 콘쥬게이트를 표적하는데 이용될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 지질계 리간드는 HSA와 결합한다. 바람직하게는, 콘쥬게이트가 바람직하게는 비-신장 조직으로 분포되도록 충분한 친화도로 HSA와 결합한다. 그러나, 친화도는 HSA-리간드 결합이 반전될 수 없도록 강하지 않은 것이 바람직하다.
다른 바람직한 실시형태에서, 지질계 리간드는 콘쥬게이트가 바람직하게는 신장으로 분포되도록 HSA와 약하게 결합하거나 전혀 결합하지 않는다. 신장 세포에 표적하는 기타 모이어티들은 지질계 리간드 대신에 또는 이에 더하여 이용될 수도 있다.
다른 양태에서, 리간드는 모이어티, 예컨대, 표적 세포, 예컨대, 증식하는 세포에 의하여 흡수되는 비타민이다. 이들은 예컨대, 악성 또는 비-악성 형태, 예컨대, 암 세포의 원하지 않는 세포 증식을 특징으로 하는 질환을 치료하는데 특히 유용하다. 예시적인 비타민은 비타민 A, E 및 K를 포함한다. 기타 예시적인 비타민은 비타민 B, 예컨대, 엽산, B12, 리보플라빈, 비오틴, 피리독살 또는 암 세포에 의하여 취해지는 비타민 또는 영양분을 포함한다. HSA, 저밀도 리포단백질(LDL) 및 고밀도 리포단백질(HDL)도 포함된다.
다른 양태에서, 리간드는 세포-침투제, 바람직하게는 헬리칼 세포-침투제이다. 바람직하게는, 작용제는 양친매성이다. 예시적인 작용제는 태트(tat) 또는 안테노페디아와 같은 펩티드이다. 작용제가 펩티드이면, 펩티딜미메틱(peptidylmimetic), 인베르토머(invertomer), 비-펩티드 또는 슈도-펩티드 연결 및 D-아미노산의 이용을 포함하여 변형될 수 있다. 헬리칼 작용제는 바람직하게는 친유상 및 소유상을 갖는, 바람직하게는 알파-헬릭칼 작용제이다.
리간드는 펩티드 또는 펩티도미메틱(peptidomimetic)일 수 있다. 펩티도미메틱(본원에서 올리고펩티도미메틱이라고도 함)은 천연 펩티드와 유사한 정의된 3-차원 구조로 접힐 수 있는 분자이다. 펩티드 또는 펩티도미메틱 모이어티는 길이가 약 5개 내지 50개 아미노산들, 예컨대, 길이가 약 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개 또는 50개 아미노산들일 수 있다. 펩티드 또는 펩티도미메틱은 예를 들어, 세포 침투 펩티드, 양이온 펩티드, 양친매성 펩티드 또는 소수성 펩티드(예, 주로 Tyr, Trp 또는 Phe로 구성됨)일 수 있다. 펩티드 모이어티는 덴드리머 펩티드, 구속성 펩티드 또는 교차결합성 펩티드일 수 있다. 다른 대안에 있어서, 펩티드 모이어티는 소수성 막 전좌 서열(MTS)을 포함할 수 있다. 예시적인 소수성 MTS-함유 펩티드는 아미노산 서열 AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO:29)를 갖는 RFGF이다. 소수성 MTS를 포함하는 RFGF 유사체(예, 아미노산 서열 AALLPVLLAAP (SEQ ID NO:30))는 표적 모이어티일 수도 있다. 펩티드 모이어티는 세포막을 가로지르는 펩티드, 올리고뉴클레오타이드 및 단백질을 포함하는 더 큰 극성 분자들을 운반할 수 있는 "전달" 펩티드일 수 있다. 예를 들어, HIV Tat 단백질(GRKKRRQRRRPPQ; SEQ ID NO:31) 및 드로소필라 안테나페디아 단백질(RQIKIWFQNRRMKWKK; SEQ ID NO:32) 유래의 서열들은 전달 펩티드로서 기능할 수 있다는 것이 발견되었다. 펩티드 또는 펩티도미메틱은 파지-표시 라이브러리 또는 알갱이당-한 분자(one-bead-one) 화합물(OBOC) 조합 라이브러리로부터 동정된 펩티드와 같은 DNA의 임의적 서열에 의하여 인코딩될 수 있다(문헌[Lam 등., Nature, 354:82-84, 1991]). 바람직하게는, 혼입된 단량체 단위를 통해 iRNA 작용제에 테터링된 펩티드 또는 펩티도미메틱은 세포 표적화 펩티드, 예를 들어, 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD)-펩티드 또는 RGD 의태물이다. 펩티드 모이어티는 길이가 약 5개 아미노산들 내지 약 40개 아미노산들에 이를 수 있다. 펩티드 모이어티는 안정성을 증가시키거나 형태적 특성을 지시하는 것과 같은 구조적 변형을 가질 수 있다. 하기에 기술된 구조적 변형들 중 어느 하나가 활용될 수 있다. RGD 펩티드 모이어티는 내피 종양 세포 또는 유방암 종양 세포와 같은 종양 세포를 표적하는 데 사용될 수 있다(문헌[Zitzmann 등, Cancer Res., 62:5139-43, 2002]). RGD 펩티드는 iRNA 작용제를 폐, 신장, 비장 또는 간을 비롯한 기타 다양한 조직의 종양으로 표적하는 것을 촉진할 수 있다(문헌[Aoki 등, Cancer Gene Therapy 8:783-787, 2001]). 바람직하게는, RGD 펩티드는 iRNA 작용제를 신장에 표적하는 것을 촉진할 것이다. RGD 펩티드는 선형 또는 환형일 수 있으며, 특정 조직으로의 표적을 촉진하기 위해 글리코실화되거나 또는 메틸화되는 것과 같이 변형될 수 있다. 예를 들어, 글리코실화된 RGD 펩티드는 iRNA 작용제를 ανβ3를 발현하는 종양 세포에 전달할 수 있다(문헌[Haubner 등, Jour. Nucl. Med., 42:326-336, 2001]). 증식하는 세포에 농화된 마커를 표적하는 펩티드가 사용될 수 있다. 예를 들어, RGD 함유 펩티드 및 펩티도미메틱은 암세포, 특히 인테그린을 제시하는 세포를 표적할 수 있다. 따라서, 당업자는 RGD 펩티드, RGD 함유 시클릭 펩티드, D-아미노산을 포함하는 RGD 펩티드, 뿐만 아니라 합성 RGD 의태물을 사용할 수 있다. RGD에 더하여, 당업자는 인테그린 리간드를 표적하는 기타 모이어티를 사용할 수 있다. 일반적으로, 이런 리간드는 증식 세포 및 혈관신생을 조절하는 데 사용될 수 있다. 리간드의 이런 유형의 바람직한 콘쥬게이션은, PECAM-1, VEGF, 또는 기타 암 유전자, 예를 들어, 본원에서 기술된 암 유전자를 표적한다.
"세포 투과 펩티드"는 세포, 예컨대, 박테리아성 또는 진균 세포와 같은 미생물 세포, 또는 인간 세포와 같은 포유류 세포를 투과할 수 있다. 미생물 세포-투과 펩티드는 예를 들어, α-헬리칼 선형 펩티드(예, LL-37 또는 세로핀 P1), 디설파이드 결합-함유 펩티드(예, α-디펜신(defensin), β-디펜신 또는 박테네신), 또는 하나 또는 두 개의 우세한 아미노산만을 포함하는 펩티드(예, PR-39 또는 인도리시딘)일 수 있다. 세포 투과 펩티드는 핵 위치 신호(NLS)를 포함할 수도 있다. 예를 들어, 세포 투과 펩티드는 HIV-1 gp41 및 SV40 대형 T 항원의 NLS의 융합 펩티드 도메인으로부터 유래된 MPG와 같은 이분 양친매성 펩티드(bipartite amphipathic peptide)일 수 있다(문헌[Simeoni 등, Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003]).
일 실시형태에서, 표적화 펩티드는 양친매성 α-헬리칼 펩티드일 수 있다. 예시적인 양친매성 α-헬리칼 펩티드로는, 세크로핀(cecropin), 라이코톡신(lycotoxin), 파라닥신(paradaxin), 부포린(buforin), CPF, 봄비닌-유사(bombinin-like) 펩티드(BLP), 카텔리시딘(cathelicidin), 세라토톡신(ceratotoxin), S. 클라바(S. clava) 펩티드, 하그피쉬 장 항균 펩티드(hagfish intestinal antimicrobial peptide)(HFIAP), 마가이닌(magainine), 브레비닌-2(brevinin-2), 데르마셉틴(dermaseptin), 멜리틴(melittin), 플레우로시딘(pleurocidin), H2A 펩티드, 제노푸스(Xenopus) 펩티드, 에스쿨렌티니스-1(esculentinis-1), 및 캐린(caerin)이 포함되나, 이로 한정되지 않는다. 다수의 인자들이 바람직하게는, 헬릭스 안정성의 무결성(integrity)을 유지하는 것으로 여겨질 수 있다. 예를 들어, 최대 수의 헬릭스 안정화 잔기가 이용될 것이며(예를 들어, leu, ala, 또는 lys), 최소 수의 헬릭스 탈안정화 잔기가 이용될 것이다(예를 들어, 프롤린, 또는 시클릭 단량체성 단위). 캡핑 잔기가 고려될 것이며, 예를 들어, Gly은 예시적인 N-캡핑 잔기이고/거나 C-말단 아미드화가 사용되어 헬릭스를 안정화시키기 위한 여분의 H-결합을 제공할 수 있다. i±3, 또는 i±4 위치에 의해 분리된, 반대 전하를 가진 잔기들 간의 염 다리의 형성은 안정성을 제공할 수 있다. 예를 들어, 리신, 아르기닌, 호모-아르기닌, 오르니틴 또는 히스티딘과 같은 양이온성 잔기는 음이온성 잔기인 글루탐산염 또는 아스파르트산염과 염 다리를 형성할 수 있다.
펩티드 및 펩티도미메틱 리간드는, 자연 발생 펩티드 또는 변형된 펩티드, 예를 들어, D 또는 L 펩티드; α, β, 또는 γ 펩티드; N-메틸 펩티드; 아자펩티드; 하나 이상의 아미드를 가지는 펩티드, 즉, 하나 이상의 우레아, 티오우레아, 카르바메이트, 또는 설포닐 우레아 결합으로 대체된 연결을 가진 펩티드; 또는 시클릭 펩티드를 가진 것들을 포함한다.
표적화 리간드는 특정 수용체를 표적할 수 있는 임의의 리간드일 수 있다. 예로는, 엽산염, GalNAc, 갈락토오스, 만노오스, 만노오스-6P, GalNAc 클러스터, 만노오스 클러스터, 갈락토오스 클러스터와 같은 당의 클러스터, 또는 압타머이다. 클러스터는 당 단위 2개 이상의 조합이다. 표적화 리간드는 또한, 인테그린 수용체 리간드, 케모카인 수용체 리간드, 트랜스페린, 비오틴, 세로토닌 수용체 리간드, PSMA, 엔도텔린, GCPII, 소마토스타틴, LDL 및 HDL 리간드를 포함한다. 리간드는 또한, 압타머와 같은 핵산을 기재로 할 수 있다. 압타머는 비변형될 수 있거나, 또는 본원에서 개시되는 임의의 변형의 조합을 가질 수 있다.
엔도좀 방출제로는, 이미다졸, 폴리이미다졸 또는 올리고이미다졸, PEI, 펩티드, 융합성 펩티드, 폴리카르복실레이트, 폴리아양이온, 마스킹된(masked) 올리고 또는 폴리 양이온 또는 음이온, 아세탈, 폴리아세탈, 케탈/폴리케탈, 오르토에스테르, 마스킹 또는 비-마스킹된 양이온성 또는 음이온성 전하를 가진 중합체, 마스킹 또는 비-마스킹된 양이온성 또는 음이온성 전하를 가진 덴드리머가 포함된다.
PK 조절제는 약동학적 조절제를 나타낸다. PK 조절제로는, 친유성제(lipophile), 담즙산, 스테로이드, 인지질 유사체, 펩티드, 단백질 결합제, PEG, 비타민 등이 포함된다. 예시적인 PK 조절제로는, 콜레스테롤, 지방산, 콜산, 리토콜릭산, 디알킬글리세라이드, 디아실글리세라이드, 인지질, 스핑고지질, 나프록센, 이부프로펜, 비타민 E, 비오틴 등이 포함되나, 이로 한정되지 않는다. 다수의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 또한 혈청 단백질에 결합하는 것으로 알려져 있으며, 따라서 골격에서 복수 개의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 약 5개 염기, 10개 염기, 15개 염기 또는 20개 염기의 올리고뉴클레오타이드와 같은 짧은 올리고뉴클레오타이드는 또한, 본 발명에서 리간드로서(예를 들어, PK 조절 리간드로서) 부합된다.
또한, 혈청 구성성분(예를 들어, 혈청 단백질)에 결합하는 압타머는 또한, 본 발명에서 PK 조절 리간드로서 부합된다.
본 발명에 부합되는 다른 리간드 콘쥬게이트는, 2004년 8월 10일에 출원된 미국 특허 출원 USSN: 10/916,185호; 2004년 9월 21일에 출원된 USSN: 10/946,873호; 2007년 8월 3일에 출원된 USSN: 10/833,934호; 2005년 4월 27일에 출원된 USSN: 11/115,989호 및 2007년 11월 21일에 출원된 USSN: 11/944,227호에 기술되어 있으며, 이들은 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함되어 있다.
2개 이상의 리간드가 존재하는 경우, 리간드는 모두 동일한 특성을 갖거나, 모두 상이한 특성들을 가질 수 있거나, 또는 일부 리간드들은 동일한 특성들을 가지는 한편 다른 것들은 상이한 특성들을 가진다. 예를 들어, 리간드는 표적화 특성을 가지거나, 엔도좀용해성 활성을 가지거나, 또는 PK 조절 특성을 가질 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 리간드들은 모두 상이한 특성들을 가진다.
리간드는 3' 말단, 5' 말단, 및/또는 내부 위치와 같은 다양한 위치에서 올리고뉴클레오타이드에 결합될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 리간드는 본원에서 기술되는 캐리어와 같은 개재 테터를 통해 올리고뉴클레오타이드에 부착된다. 리간드 또는 테터링된 리간드는, 단량체가 성장중인 가닥에 혼입되는 경우, 상기 단량체 상에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 리간드는, "전구체" 단량체가 성장중인 가닥에 혼입된 후에, 상기 "전구체" 단량체로의 결합을 통해 혼입될 수 있다. 예를 들어, 아미노-말단 테터를 가진(즉, 회합된 리간드를 가지지 않는) 단량체, 예를 들어, TAP-(CH2)nNH2는 성장중인 올리고뉴클레오타이드 가닥에 혼입될 수 있다. 후속적인 작업에서, 즉, 전구체 단량체를 가닥에 혼입시킨 후, 친전자성 기를 가지는 리간드, 예를 들어, 펜타플루오로페닐 에스테르 또는 알데하이드 기는 후속해서, 리간드의 친전자성 기를 전구체 단량체의 테터의 말단 친핵성 기와 결합시킴으로써 전구체 단량체에 부착될 수 있다.
다른 예에서, 클릭 화학 반응에 참여하는데 적절한 화학적 기를 가지는 단량체, 예를 들어, 아자이드 또는 알카인 말단 테터/링커가 혼입될 수 있다. 후속적인 작업에서, 즉, 전구체 단량체를 가닥에 혼입시킨 후, 알카인 또는 아자이드와 같은 상보적인 화학적 기를 가지는 리간드는 알카인 및 아자이드를 함께 결합시킴으로써 전구체 단량체에 부착될 수 있다.
이중 가닥 올리고뉴클레오타이드의 경우, 리간드는 한쪽 가닥 또는 양쪽 가닥에 부착될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이중-가닥 iRNA 작용제는 센스 가닥에 콘쥬게이트된 리간드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 이중-가닥 iRNA 작용제는 안티센스 가닥에 콘쥬게이트된 리간드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 리간드는 핵산 분자의 핵염기, 당 모이어티, 또는 뉴클레오시드간 결합에 콘쥬게이트될 수 있다. 퓨린 핵염기 또는 이의 유도체에의 콘쥬게이션은 엔도시클릭 원자 및 엑소시클릭 원자를 비롯한 임의의 위치에서 발생할 수 있다. 일부 실시형태에서, 퓨린 핵염기의 2-위치, 6-위치, 7-위치, 또는 8-위치는 콘쥬게이트 모이어티에 부착된다. 피리미딘 핵염기 또는 이의 유도체에의 콘쥬게이션은 임의의 위치에서 발생할 수도 있다. 일부 실시형태에서, 피리미딘 핵염기의 2-위치, 5-위치, 및 6-위치는 콘쥬게이트 모이어티로 치환될 수 있다. 뉴클레오시드의 당 모이어티에의 콘쥬게이션은 임의의 탄소 원자에서 발생할 수 있다. 콘쥬게이트 모이어티에 부착될 수 있는 당 모이어티의 예시적인 탄소 원자는 2', 3', 및 5' 탄소 원자를 포함한다. 1' 위치는 또한, 무염기(무염기성) 잔기에서와 같이 콘쥬게이트 모이어티에 부착될 수도 있다. 뉴클레오시드간 결합은 또한, 콘쥬게이트 모이어티를 가질 수 있다. 인-함유 결합의 경우(예를 들어, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오테이트, 포스포로아미데이트 등), 콘쥬게이트 모이어티는 인 원자에 직접 부착되거나, 또는 인 원자에 결합된 O, N, 또는 S 원자에 부착될 수 있다. 아민-함유 또는 아미드-함유 뉴클레오시드간 결합(예를 들어, PNA)의 경우, 콘쥬게이트 모이어티는 아민 또는 아미드의 질소 원자 또는 인접한 탄소 원자에 부착될 수 있다.
RNA 간섭 분야에서 임의의 적절한 리간드가 사용될 수 있지만, 리간드는 전형적으로 탄수화물, 예를 들어 단당류(예컨대 GalNAc), 이당류, 삼당류, 사당류, 다당류이다.
리간드를 핵산에 콘쥬게이트시키는 링커로는 전술한 것들이 포함된다. 예를 들어, 리간드는, 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc (N-아세틸글루코사민) 유도체일 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 dsRNA는 화학식 (IV) 내지 식 (VII) 중 임의의 것에 나타낸 구조들을 포함하는 2가 및 3가 분지형 링커에 콘쥬게이트된다:
Figure 112015124918061-pct00023
상기 식에서,
q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B 및 q5C는 각각 독립적으로 각각의 경우 0 내지 20을 나타내고, 반복 단위는 동일하거나 또는 상이할 수 있으며;
P2A, P2B, P3A, P3B, P4A, P4B, P5A, P5B, P5C, T2A, T2B, T3A, T3B, T4A, T4B, T4A, T5B, T5C는 각각 독립적으로 각각의 경우 부재이거나, CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH 또는 CH2O이고;
Q2A, Q2B, Q3A, Q3B, Q4A, Q4B, Q5A, Q5B, Q5C는 각각 독립적으로 각각의 경우 부재이거나, 알킬렌, 치환된 알킬렌이며, 하나 이상의 메틸렌은 O, S, S(O), SO2, N(RN), C(R')=C(R"), C≡C 또는 C(O) 중 하나 이상에 의해 중단되거나 또는 종결될 수 있으며;
R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5C는 각각 독립적으로 각각의 경우 부재이거나, NH, O, S, CH2, C(O)O, C(O)NH, NHCH(Ra)C(O), -C(O)-CH(Ra)-NH-, CO, CH=N-O,
Figure 112015124918061-pct00024
,
Figure 112015124918061-pct00025
,
Figure 112015124918061-pct00026
,
Figure 112015124918061-pct00027
,
Figure 112015124918061-pct00028
, 또는 헤테로시클릴이며;
L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B 및 L5C는 리간드; 즉, 각각 독립적으로 각각의 경우 단당류(예컨대 GalNAc), 이당류, 삼당류, 사당류, 올리고당류, 또는 다당류를 나타내고;
Ra는 H 또는 아미노산 측쇄이다.
3가 콘쥬게이팅 GalNAc 유도체, 예를 들어, 식 (VII)의 것은 특히, 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제와 함께 이용하기에 특히 유용하다:
Figure 112015124918061-pct00029
상기 식에서,
L5A, L5B 및 L5C는 단당류, 예를 들어, GalNAc 유도체를 나타낸다. GalNAc 유도체를 콘쥬게이트시키는 적절한 2가 및 3가 분지형 링커 기의 예에는 하기의 화합물이 포함되나 이들에 한정되지 않는다:
Figure 112015124918061-pct00030
Figure 112015124918061-pct00031
Figure 112015124918061-pct00032
RNA 콘쥬게이트의 제조를 교시하고 있는 대표적인 미국 특허로는, 미국 특허 제4,828,979호; 제4,948,882호; 제5,218,105호; 제5,525,465호; 제5,541,313호; 제5,545,730호; 제5,552,538호; 제5,578,717, 5,580,731호; 제5,591,584호; 제5,109,124호; 제5,118,802호; 제5,138,045호; 제5,414,077호; 제5,486,603호; 제5,512,439호; 제5,578,718호; 제5,608,046호; 제4,587,044호; 제4,605,735호; 제4,667,025호; 제4,762,779호; 제4,789,737호; 제4,824,941호; 제4,835,263호; 제4,876,335호; 제4,904,582호; 제4,958,013호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,245,022호; 제5,254,469호; 제5,258,506호; 제5,262,536호; 제5,272,250호; 제5,292,873호; 제5,317,098호; 제5,371,241, 5,391,723호; 제5,416,203, 5,451,463호; 제5,510,475호; 제5,512,667호; 제5,514,785호; 제5,565,552호; 제5,567,810호; 제5,574,142호; 제5,585,481호; 제5,587,371호; 제5,595,726호; 제5,597,696호; 제5,599,923호; 제5,599,928 and 5,688,941호; 제6,294,664호; 제6,320,017호; 제6,576,752호; 제6,783,931호; 제6,900,297호; 제7,037,646호; 제8,106,022호를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니며, 이의 각각의 전체 내용은 참조로서 본 명세서에 포함된다.
주어진 화합물에서 모든 위치들은 일정하게 변형될 필요는 없으며, 사실상 상기 변형들 중 1개 초과는 단일 화합물에 혼입될 수 있거나 심지어 iRNA 내의 단일 뉴클레오타이드에 혼입될 수 있다. 본 발명은 또한, 키메라 화합물인 iRNA 화합물을 포함한다.
본 발명의 맥락에서 "키메라" iRNA 화합물 또는 "키메라"는 iRNA 화합물, 바람직하게는 dsRNA이며, 이는 2개 이상의 화학적으로 구별되는 영역들을 함유하고, 이 영역은 각각 적어도 하나의 단량체 유닛, 즉, dsRNA 화합물의 경우 뉴클레오타이드로 구성된다. 이들 iRNA는 전형적으로 적어도 하나의 영역을 함유하며, 여기서, RNA는 뉴클레아제 분해에 대한 증가된 내성, 증가된 세포 포착 및/또는 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화성을 iRNA에 부여하도록 변형된다. iRNA의 부가적인 영역은 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 하이브리드를 절단할 수 있는 효소에 대한 기질로서 작용할 수 있다. 예로서, RNase H는 RNA:DNA 듀플렉스의 RNA 가닥을 절단하는 세포성 엔도뉴클레아제이다. 따라서, RNase H의 활성화는 RNA 표적을 절단하며, 이로써, 유전자 발현의 iRNA 억제 효율을 크게 증대시킨다. 결과적으로, 키메라 dsRNA가 사용되는 경우, 동일한 표적 영역에 혼성화하는 포스포로티오에이트 데옥시 dsRNA와 비교하여, 보다 짧은 iRNA를 사용해도 유사한 결과가 종종 수득될 수 있다. RNA 표적의 절단은 통상적으로 젤 전기영동에 의해 검출될 수 있으며, 필요에 따라 당업계에 공지된 연관된 핵산 혼성화 기술에 의해서도 검출될 수 있다.
소정의 경우, iRNA의 RNA는 비-리간드 기에 의해 변형될 수 있다. 많은 비-리간드 분자들은 iRNA의 활성, 세포 분포 또는 세포 포착을 증대시키기 위해 iRNA에 콘쥬게이트되어 왔으며, 이러한 콘쥬게이션을 수행하는 절차는 과학 문헌들에서 입수가능하다. 이러한 비-리간드 모이어티는 지질 모이어티, 예컨대 콜레스테롤(문헌[Kubo, T. et al., Biochem . Biophys . Res. Comm., 2007, 365(1):54-61; Letsinger et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 1989, 86:6553]), 담즙산(문헌[Manoharan et al., Bioorg . Med . Chem . Lett., 1994, 4:1053]), 티오에테르, 예를 들어 헥실-S-트리틸티올(문헌[Manoharan et al., Ann. N.Y . Acad . Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg . Med . Chem . Let., 1993, 3:2765]), 티오콜레스테롤(문헌[Oberhauser et al., Nucl . Acids Res., 1992, 20:533]), 지방족 사슬, 예를 들어 도데칸디올 또는 운데실 잔기(문헌[Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49]), 인지질, 예를 들어 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트(문헌[Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl . Acids Res., 1990, 18:3777]), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(문헌[Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969]) 또는 아다만탄 아세트산(문헌[Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651]), 팔미틸 모이어티(문헌[Mishra et al., Biochim . Biophys . Acta, 1995, 1264:229]) 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 모이어티(문헌[Crooke et al., J. Pharmacol. Exp . Ther., 1996, 277:923])를 포함하였다. 이러한 RNA 콘쥬게이트의 제조를 교시하고 있는 대표적인 미국 특허들은 상기 열거되어 있다. 전형적인 콘쥬게이션 프로토콜은 서열의 하나 이상의 위치에서 아미노링커를 가진 RNA의 합성을 수반한다. 그런 다음, 아미노기는 적절한 커플링 또는 활성화 시약을 사용하여 콘쥬게이트되는 분자와 반응한다. 콘쥬게이션 반응은 여전히 고체 지지체에 결합되어 있는 RNA와 함께 수행되거나, 액상에서 RNA의 절단 후에 수행될 수 있다. HPLC에 의한 RNA 콘쥬게이트의 정제에 의해, 전형적으로 순수한 콘쥬게이트가 수득된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 이중 가닥 RNAi 작용제는 AD-58681, AD-59054, AD-61719 및 AD-61444로 이루어진 군으로부터 선택된다.
III. 본 발명의 iRNA의 전달
본 발명의 iRNA 작용제의 세포, 예컨대, 인간 피검자와 같은 피검자(예, Serpina1 결핍과 연관된 장애, 예를 들어, Serpina1 결핍 간 장애를 가진 피검자와 같이 iRNA 작용제를 필요로 하는 피검자) 내의 세포로의 전달은 수많은 상이한 방법으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 전달은 세포를 본 발명의 iRNA와 시험관 내 또는 생체 내에서 접촉시킴으로써 수행될 수 있다. 생체 내 전달은 iRNA, 예컨대, dsRNA를 포함하는 조성물을 피검자에게 투여함으로써 직집적으로 수행될 수도 있다. 대안적으로, 생체 내 전달은 iRNA를 인코딩하고 그의 발현을 지시하는 하나 이상의 벡터를 투여함으로써 간접적으로 수행될 수 있다. 이러한 대안은 하기에서 더 토의된다.
일반적으로, (시험관 내 또는 생체 내에서) 핵산 분자를 전달하는 임의의 방법은 본 발명의 iRNA와의 이용을 위해 적합하게 할 수 있다(예, 본원에서 그 전체가 참조로 포함되어 있는, 문헌[Akhtar S. and Julian RL., (1992) Trends Cell. Biol . 2(5):139-144] 및 WO94/02595 참조). 생체 내 전달을 위해, iRNA 분자를 전달하기 위해 고려하는 인자는 예를 들어, 전달된 분자의 생물학적 안정성, 비-특이적 효과의 방지 및 표적 조직 내에서 전달된 분자의 축적을 포함한다. iRNA의 비-특이적인 효과는 예를 들어, 조직으로의 직접 주사 또는 이식에 의해 또는 제제를 국소적으로 투여함으로써 국소 투여에 의하여 최소화될 수 있다. 치료 부위로의 국소 투여는 작용제의 국소 농도를 최대화하고, 다르게는 작용제에 의하여 해를 입을 수 있거나 작용제를 분해할 수 있는 전신 조직으로의 작용제의 노출을 제한하며, iRNA 분자의 더 낮은 총 용량이 투여될 수 있도록 한다. 몇몇 연구에 따르면, iRNA가 국소적으로 투여되는 경우 유전자 생성물의 성공적인 녹다운(knockdown)을 보였다. 예를 들어, 시노몰구스 원숭이 내에 유리체내 주사(문헌[Tolentino, MJ. 등, (2004) Retina 24:132-138]) 및 마우스 내의 망막하 주사(문헌[Reich, SJ. 등. (2003) Mol . Vis . 9:210-216])에 의한 VEGF dsRNA의 안구 내 전달은 양쪽 모두 연령-관련 황반 변성의 실험적 모델에서 신혈관신생을 방지하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 마우스들 내로 dsRNA의 직접적인 종양 내 주사는 종양 부피를 감소시키고(문헌[Pille, J. 등(2005) Mol . Ther .11:267-274]), 종양 보유 마우스들의 생존을 연장시킬 수 있다(문헌[Kim, WJ. 등, (2006) Mol . Ther .14:343-350; Li, S. 등, (2007) Mol . Ther .15:515-523]). RNA 간섭은 직접 주사에 의하여 CNS에(문헌[Dorn, G. 등, (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH. 등, (2005) Gene Ther .12:59-66; Makimura, H. 등(2002) BMC Neurosci . 3:18; Shishkina, GT., 등. (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, ER., 등 (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.101:17270-17275; Akaneya,Y., 등 (2005) J. Neurophysiol . 93:594-602]) 그리고 비강 내 투여에 의하여 허파에(문헌[Howard, KA. 등, (2006) Mol . Ther.14:476-484; Zhang, X. 등, (2004) J. Biol . Chem . 279:10677-10684; Bitko, V. 등, (2005) Nat. Med .11:50-55]) 국소 전달이 성공하는 것도 보였다. 질병의 치료를 위해 iRNA를 전신으로 투여하기 위하여, RNA가 변형되거나 약물 전달 시스템을 이용하여 대안적으로 전달될 수 있으며; 양쪽 방법은 생체 내 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제에 의하여 dsRNA의 급속한 분해를 방지하는 작용을 한다. RNA 또는 약학적 담체의 변형으로 iRNA 조성물이 표적 조직으로 표적되도록 할 수도 있으며, 바람직하지 않은 비표적 효과를 회피할 수 있다. iRNA 분자는 콜레스테롤과 같은 친지방성기로의 화학적 콘쥬게이션에 의하여 변형되어 세포 흡수를 향상시키고 분해를 방지할 수 있다. 예를 들어, 친지방성 콜레스테롤 모이어티에 콘쥬게이트된 ApoB에 대하여 지시된 iRNA는 마우스들에게 전신으로 주사되어 간 및 공장 내에서 apoB mRNA의 녹다운을 일어나게 하였다(문헌[Soutschek, J. 등, (2004) Nature 432:173-178]). iRNA의 압타머로의 콘쥬게이션은 전립선암의 마우스 모델 내에서 종양 성장을 억제하고 종양 퇴화를 조정하는 것이 밝혀졌다(문헌[McNamara, JO. 등, (2006) Nat. Biotechnol . 24:1005-1015]). 대안적인 일 실시형태에서, iRNA는 나노입자, 덴드리머, 중합체, 리포솜 또는 양이온성 전달 시스템과 같은 약물 전달 시스템을 이용하여 전달될 수 있다. 양으로 대전된 양이온성 전달 시스템은 iRNA 분자(음으로 대전됨)의 결합을 용이하게 하고, 음으로 대전된 세포막에서의 상호작용을 향상시켜 세포에 의하여 iRNA의 효율적인 흡수를 가능하게도 한다. 양이온 지질, 덴드리머 또는 중합체는 iRNA에 결합될 수 있거나 유도되어 iRNA를 둘러싸는 소낭 또는 미셀을 형성할 수 있다(예, 문헌[Kim SH. 등, (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116] 참조). 소낭 또는 미셀의 형성은 iRNA가 전신으로 투여되는 경우 iRNA의 분해를 더 방지한다. 양이온성 iRNA 복합체를 제조하고 투여하는 방법은 충분히 당업자의 능력 내에 있다(예, 그 전체가 본원에서 참조로 포함되어 있는 문헌[Sorensen, DR., 등 (2003) J. Mol . Biol 327:761-766; Verma, UN. 등, (2003) Clin . Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, AS 등, (2007) J. Hypertens. 25:197-205] 참조). iRNA의 전신 전달에 유용한 약물 전달 시스템의 일부 비-한정 예는 DOTAP(Sorensen, DR., 등 (2003), 상기; Verma, UN. 등, (2003), 상기), 올리고펙타민, "고체 핵산 지질 입자"(문헌[Zimmermann, TS. 등, (2006) Nature 441:111-114]), 카르디올리핀(문헌[Chien, PY. 등, (2005) Cancer Gene Ther.12:321-328; Pal, A. 등, (2005) Int J. Oncol . 26:1087-1091]), 폴리에틸렌이민(문헌[Bonnet ME. 등, (2008) Pharm . Res. Aug 16 Epub ahead of print; Aigner, A. (2006) J. Biomed . Biotechnol . 71659]), Arg-Gly-Asp (RGD) 펩티드(문헌[Liu, S. (2006) Mol . Pharm . 3:472-487]), 및 폴리아미도아민(문헌[Tomalia, DA. 등, (2007) Biochem . Soc . Trans. 35:61-67; Yoo, H. 등, (1999) Pharm . Res.16:1799-1804])을 포함한다. 일부 실시형태에서, iRNA는 전신 투여를 위해 시클로덱스트린과 복합체를 형성한다. iRNA 및 시클로덱스트린의 투여 방법 및 약학적 조성물은 그 전체가 본원에 참조로 포함되어 있는, 미국 특허 제7,427,605호에서 찾을 수 있다.
A. 본 발명의 벡터 인코딩된 iRNA
Serpina1 유전자를 표적하는 iRNA는 DNA 또는 RNA 벡터로 삽입된 전사 단위로부터 발현될 수 있다(예, 문헌[Couture, A, 등, TIG . (1996), 12:5-10]; Skillern, A., 등, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 00/22113호, Conrad, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 00/22114호, 및 Conrad, 미국 특허 제6,054,299호 참조). 발현은 이용된 특이적인 컨스트럭트(construct) 및 표적 조직 또는 세포 유형에 따라 일시적(수시간 내지 수주) 또는 지속적(수주 내지 수개월 이상)일 수 있다. 이러한 이식 유전자는 통합 또는 비-통합 벡터일 수 있는 선형 컨스트럭트, 원형 플라스미드, 또는 바이러스성 벡터로 도입될 수 있다. 이식 유전자는 염색체외 플라스미드로서 유전될 수 있도록 구성될 수도 있다(문헌[Gassmann 등, Proc . Natl . Acad . Sci. USA (1995) 92:1292]).
iRNA의 개별 가닥 또는 가닥들은 발현 벡터 상의 프로모터로부터 전사될 수 있다. 2개의 개별 가닥들이 발현되어 예를 들어, dsRNA를 발생시킬 경우, 2개의 개별 발현 벡터는 표적 세포로 (예, 형질감염(transfection) 또는 감염에 의하여) 공-도입(co-introduced)될 수 있다. 대안적으로, dsRNA의 각 개별 가닥은 둘 모두가 동일한 발현 플라스미드 상에 위치되어 있는 프로모터들에 의하여 전사될 수 있다. 일 실시형태에서, dsRNA는 링커 폴리뉴클레오타이드 서열에 의하여 합쳐진 역반복(inverted repeat) 폴리뉴클레오타이드로 발현되어 dsRNA는 줄기 및 루프 구조를 가진다.
iRNA 발현 벡터는 일반적으로 DNA 플라스미드 또는 바이러스성 벡터이다. 진핵 세포와 양립하는 발현 벡터, 바람직하게는 척추동물 세포와 양립하는 발현 벡터는 본원에 기술된 바와 같이 iRNA의 발현을 위한 재조합 컨스트럭트를 생성하는데 이용될 수 있다. 진핵 세포 발현 벡터는 업계에 주지되어 있으며 수많은 상업적 원천으로부터 이용 가능하다. 통상적으로, 원하는 핵산 세그먼트의 삽입을 위한 간편한 제한 부위를 포함하는 그러한 벡터가 제공된다. iRNA 발현 벡터의 전달은 정맥 내 또는 근육 내 투여에 의하거나, 환자로부터 빼낸 표적 세포에 투여하고 이후 환자에 재도입하거나 소기의 표적 세포로 도입하도록 하는 기타 수단에 의해서와 같이 전신적일 수 있다.
iRNA 발현 플라스미드는 양이온성 지질 담체(예, 올리고펙타민) 또는 비-양이온성 지질계 담체(예, Transit-TKOTM)와의 복합체로서 표적 세포에 형질감염될 수 있다. 일 주일 이상의 기간에 걸쳐 표적 RNA의 상이한 영역을 표적하는 iRNA-매개 녹다운에 대한 복수의 지질 형질감염도 본 발명에 의하여 고려된다. 숙주 세포로 벡터를 성공적으로 도입하는 것은 다양한 알려진 방법을 이용하여 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 일시 형질감염은 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 형광 마커와 같은 리포터로 표시될 수 있다. 생체 외에서 세포의 안정된 형질감염은 하이그로마이신 B 내성과 같이, 특정 환경 요인(예, 항생제 및 약물)에 내성을 갖는 형질감염된 세포를 제공하는 마커를 이용하여 확보할 수 있다.
본원에 기술된 방법 및 조성물을 이용하여 활용될 수 있는 바이러스성 벡터 시스템은 (a) 아데노바이러스 벡터; (b) 렌티바이러스성 벡터, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 등을 포함하지만 여기에 한정되지 않는 레트로바이러스 벡터; (c) 아데노-연관 바이러스 벡터; (d) 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터; (e) SV 40 벡터; (f) 폴리오마 바이러스 벡터; (g) 유두종 바이러스 벡터; (h) 피코르나바이러스 벡터; (i) 오르토폭스(orthopox)와 같은 수두 바이러스 벡터, 예컨대, 우두 바이러스 벡터 또는 조류두, 예컨대, 카나리아 수두 또는 계두; 및 (j) 헬퍼(helper)-종속 또는 무력화(gutless) 아데노바이러스를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 복제-결함 바이러스도 유리할 수 있다. 상이한 벡터가 세포 게놈으로 혼입되거나 혼입되지 않을 수 있다. 컨스트럭트는 원한다면, 형질감염용 바이러스성 서열들을 포함할 수 있다. 대안적으로, 컨스트럭트는 에피솜의 복제가 가능한 벡터, 예컨대, EPV 및 EBV 벡터로 혼입될 수 있다. iRNA의 재조합 발현용 컨스트럭트는 일반적으로 표적 세포 내에서 iRNA의 발현을 확보하는데 조절 요소들, 예컨대, 프로모터, 인헨서 등을 필요로 할 것이다. 벡터 및 컨스트럭트에 대하여 고려되는 기타 양태는 하기에 더 기술된다.
iRNA의 전달에 유용한 벡터는 소기의 표적 세포 또는 조직 내에서 iRNA의 발현에 충분한 조절 요소들(프로모터, 인헨서 등)을 포함할 것이다. 조절 요소들을 선택하여 구성적 또는 조절된/유도성 발현을 제공할 수 있다.
iRNA의 발현은 예를 들어, 특정한 생리학적 조절제, 예컨대, 순환하는 포도당 수준 또는 호르몬에 민감한 유도성 조절 서열을 이용함으로써 정확히 조절될 수 있다(Docherty 등, 1994, FASEB J. 8:20-24). 세포 내 또는 포유류 내에서 dsRNA 발현의 조절에 적당한 그러한 유도성 발현 시스템은 예를 들어, 엑디손, 에스트로겐, 프로게스테론, 테트라시클린, 이합체화의 화학적 유도체 및 이소프로필-베타-D1-티오갈락토피라노시드(IPTG)에 의한 조절을 포함한다. 당업자는 iRNA 이식 유전자의 의도된 이용을 기초로 하여 적절한 조절/프로머터 서열을 선택할 수 있게 된다.
iRNA를 인코딩하는 핵산 서열들을 포함하는 바이러스성 벡터를 이용할 수 있다. 예를 들어, 레트로바이러스성 벡터를 이용할 수 있다(문헌[Miller 등, Meth . Enzymol. 217:581-599 (1993)] 참조). 이러한 레트로바이러스성 벡터는 바이러스성 게놈의 올바른 패키징 및 숙주 세포 DNA로의 통합에 필요한 구성요소들을 포함한다. iRNA를 인코딩하는 핵산 서열들은 환자에로의 핵산의 전달을 용이하게 하는 하나 이상의 벡터로 클로닝된다. 레트로바이러스성 벡터에 대한 더 상세한 사항은 예를 들어, 줄기 세포를 화학요법에 더 내성이 있게 하기 위하여 조혈 줄기 세포로 mdr1 유전자를 전달하는 레트로바이러스성 벡터의 사용을 기술하는 문헌[Boesen 등, Biotherapy 6:291-302 (1994)]에서 찾을 수 있다. 유전자 요법에서 레트로바이러스성 벡터의 사용을 예시하는 기타 참조문헌은 다음과 같다: 문헌[Clowes 등, J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994); Kiem 등, Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons and Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); 및 Grossman and Wilson, Curr. Opin . in Genetics and Devel . 3:110-114 (1993)]. 사용이 고려되는 렌티바이러스성 벡터는 예를 들어, 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제6,143,520호; 제5,665,557호; 및 제5,981,276호에 기술된 HIV계 벡터를 포함한다.
아데노바이러스는 본 발명의 iRNA의 전달에 사용이 고려되기도 한다. 아데노바이러스는 예컨대, 유전자를 호흡성 상피(respiratory epithelia)에 전달하기에 특히 매력적인 운반체이다. 아데노바이러스는 호흡성 상피를 자연적으로 감염시키는데, 여기서 아데노바이러스는 가벼운 질병을 유발한다. 아데노바이러스계 전달 시스템에 대한 기타 표적은 간, 중추 신경계, 내피 세포 및 근육이다. 아데노바이러스는 비분할 세포를 감염시킬 수 있는 장점을 가진다. 문헌[Kozarsky and Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993)]은 아데노바이러스계 유전자 요법의 리뷰를 제시한다. 문헌[Bout 등, Human Gene Therapy 5:3-10 (1994)]은 레서스 원숭이의 호흡성 상피에 유전자를 전달하는 아데노바이러스 벡터의 사용을 보여주었다. 유전자 요법에서 아데노바이러스의 사용의 다른 경우는 문헌[Rosenfeld 등, Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld 등, Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli 등, J. Clin . Invest. 91:225-234 (1993)]; PCT 출원 공개번호 WO94/12649; 및 문헌[Wang 등, Gene Therapy 2:775-783 (1995)]에서 찾을 수 있다. 본 발명에 특징된 iRNA를 발현하기 위한 적당한 AV 벡터, 재조합 AV 벡터를 구성하는 방법 및 벡터를 표적 세포로 전달하는 방법은 문헌[Xia H 등 (2002), Nat. Biotech. 20:1006-1010]에 기술되어 있다.
아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터는 본 발명의 iRNA을 전달하는데 이용될 수도 있다(문헌[Walsh 등, Proc . Soc . Exp . Biol . Med . 204:289-300 (1993)]; 미국 특허 제5,436,146호). 일 실시형태에서, iRNA는 예를 들어, U6 또는 H1 RNA 프로모터, 또는 거대세포바이러스(CMV) 프로모터를 갖는 재조합 AAV 벡터로부터 유래한 2개의 분리된 상보적인 단일-가닥 RNA 분자로 발현될 수 있다. 본 발명에서 특징된 dsRNA를 발현하는데 적당한 AAV 벡터, 재조합 AV 벡터를 구성하는 방법 및 벡터를 표적 세포로 전달하는 방법은 그 전체 개시가 본원에 참조로 포함되어 있는, 문헌[Samulski R 등 (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J 등 (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R 등 (1989), J. Virol. 63: 3822-3826]; 미국 특허 제5,252,479호; 미국 특허 제5,139,941호; 국제 특허 출원 제WO 94/13788호; 및 국제 특허 출원 제WO 93/24641호에 기술되어 있다.
본 발명의 iRNA 전달에 적당한 다른 바이러스성 벡터는 우두 바이러스와 같은 수두 바이러스, 예를 들어, 변형된 바이러스 앙카라(MVA) 또는 NYVAC와 같은 약독화된 우두, 계두 또는 카나리아 수두와 같은 조류두이다.
바이러스성 벡터의 친화성(tropism)은 벡터를 다른 바이러스로부터 유래한 외피 단백질(envelope protein) 또는 다른 표면 항원으로 슈도타이핑(pseudotyping)하거나 적절히, 상이한 바이러스성 캡시드 단백질(viral capsid protein)을 치환함으로써 변형될 수 있다. 예를 들어, 렌티바이러스성 벡터는 수포성 구내염 바이러스(VSV), 광견병, 에볼라, 모콜라 등으로부터 유래한 표면 단백질로 슈도타이프될 수 있다. AAV 벡터는 벡터를 상이한 캡시드 단백질 혈청형을 발현하도록 조작(engineering)함으로써 상이한 세포를 표적하도록 할 수 있으며; 예컨대, 그 전체 개시가 본원에 참조로 포함되어 있는 문헌[Rabinowitz J E 등. (2002), J Virol 76:791-801]을 참조한다.
벡터의 약학적 제제는 허용 가능한 희석제 내에서 벡터를 포함할 수 있거나, 유전자 전달 운반체가 심어져 있는 서방성 매트릭스를 포함할 수 있다. 대안적으로, 완전한 유전자 전달 벡터가 재조합 세포, 예컨대, 레트로바이러스성 벡터로부터 손상되지 않고 생성될 수 있는 경우에, 약학적 제제는 유전자 전달 시스템을 생성하는 하나 이상의 세포들을 포함할 수 있다.
III. 본 발명의 약학적 조성물
본 발명은 본 발명의 iRNA를 포함하는 약학적 조성물 및 제형도 포함한다. 일 실시형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 iRNA 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다. iRNA를 함유하는 약학적 조성물은 Serpina1 유전자의 발현 또는 활성과 연관된 연관 질병 또는 장애, 예컨대 Serpina1 결핍과 연관된 장애, 예를 들어 Serpina1 결핍 간 장애를 치료하는 데 유용하다. 그러한 약학적 조성물은 전달의 방식에 기초하여 제형화된다. 일례는 비경구 전달을 통한, 예컨대, 정맥 내(IV) 전달에 의한 전신 투여용으로 제형화되는 조성물이다. 다른 예는 예컨대, 연속 펌프 주입에 의한 것과 같이, 뇌로의 주입에 의한 뇌실질로의 직접 전달을 위해 제형화되는 조성물이다.
본 발명의 RNAi 작용제를 포함하는 약학적 조성물은 예를 들어, 완충제가 있거나 그것이 없는 용액, 또는 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물일 수 있다. 이러한 조성물은 예를 들어, 수성 또는 결정질 조성물, 리포솜 제형, 미셀 제형, 에멀젼 및 유전자 요법 벡터를 포함한다.
본 발명의 방법에서, RNAi 작용제는 용액 중에서 투여될 수 있다. 유리 RNAi 작용제는 비완충 용액 중에서, 예를 들어, 염수 중에서 또는 수 중에서 투여될 수 있다. 대안적으로, 유리 siRNA는 또한 적절한 완충 용액 중에서 투여될 수 있다. 완충 용액은 아세테이트, 시트레이트, 프롤라민, 카보네이트, 또는 포스페이트 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 완충 용액은 인산염 완충 식염수(PBS)이다. RNAi 작용제를 함유하는 완충 용액의 pH 및 오스몰농도는 그것이 피검자로의 투여에 적절하도록 조정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 완충 용액은 오스몰농도가 요망되는 값으로, 예를 들어, 인간 혈장의 생리적 값으로 유지되도록, 용액의 오스몰농도를 조절하기 위한 작용제를 더 포함한다. 오스몰농도를 조절하기 위하여 완충 용액에 첨가될 수 있는 용질은 단백질, 펩티드, 아미노산, 비-대사된 중합체, 비타민, 이온, 당, 대사물질, 유기산, 지질 또는 염을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 용액의 오스몰농도를 조절하기 위한 작용제는 염이다. 특정 실시형태에서, 용액의 오스몰농도를 조절하기 위한 작용제는 염화나트륨 또는 염화칼륨이다.
본 발명의 약학적 조성물은 Serpina1 유전자의 발현을 억제하는데 충분한 투여량으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 iRNA의 적당한 용량은 일당 수여자의 체중 kg당 약 0.001 밀리그램 내지 약 200.0 밀리그램의 범위에 있으며, 일반적으로 일당 체중 kg당 약 1 내지 50 mg의 범위에 있을 것이다. 예를 들어, dsRNA는 단일 용량당 약 0.01 mg/kg, 약 0.05 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 1.5 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 40 mg/kg, 또는 약 50 mg/kg으로 투여될 수 있다.
예를 들어, RNAi 작용제, 예를 들어, dsRNA는 약 0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.6 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1 mg/kg, 1.1 mg/kg, 1.2 mg/kg, 1.3 mg/kg, 1.4 mg/kg, 1.5 mg/kg, 1.6 mg/kg, 1.7 mg/kg, 1.8 mg/kg, 1.9 mg/kg, 2 mg/kg, 2.1 mg/kg, 2.2 mg/kg, 2.3 mg/kg, 2.4 mg/kg, 2.5 mg/kg, 2.6 mg/kg, 2.7 mg/kg, 2.8 mg/kg, 2.9 mg/kg, 3 mg/kg, 3.1 mg/kg, 3.2 mg/kg, 3.3 mg/kg, 3.4 mg/kg, 3.5 mg/kg, 3.6 mg/kg, 3.7 mg/kg, 3.8 mg/kg, 3.9 mg/kg, 4 mg/kg, 4.1 mg/kg, 4.2 mg/kg, 4.3 mg/kg, 4.4 mg/kg, 4.5 mg/kg, 4.6 mg/kg, 4.7 mg/kg, 4.8 mg/kg, 4.9 mg/kg, 5 mg/kg, 5.1 mg/kg, 5.2 mg/kg, 5.3 mg/kg, 5.4 mg/kg, 5.5 mg/kg, 5.6 mg/kg, 5.7 mg/kg, 5.8 mg/kg, 5.9 mg/kg, 6 mg/kg, 6.1 mg/kg, 6.2 mg/kg, 6.3 mg/kg, 6.4 mg/kg, 6.5 mg/kg, 6.6 mg/kg, 6.7 mg/kg, 6.8 mg/kg, 6.9 mg/kg, 7 mg/kg, 7.1 mg/kg, 7.2 mg/kg, 7.3 mg/kg, 7.4 mg/kg, 7.5 mg/kg, 7.6 mg/kg, 7.7 mg/kg, 7.8 mg/kg, 7.9 mg/kg, 8 mg/kg, 8.1 mg/kg, 8.2 mg/kg, 8.3 mg/kg, 8.4 mg/kg, 8.5 mg/kg, 8.6 mg/kg, 8.7 mg/kg, 8.8 mg/kg, 8.9 mg/kg, 9 mg/kg, 9.1 mg/kg, 9.2 mg/kg, 9.3 mg/kg, 9.4 mg/kg, 9.5 mg/kg, 9.6 mg/kg, 9.7 mg/kg, 9.8 mg/kg, 9.9 mg/kg 또는 약 10 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 인용된 값에 중간인 값 및 범위도 본 발명의 부분으로 의도된다.
다른 실시형태에서, RNAi 작용제, 예를 들어, dsRNA는 약 0.1 내지 약 50 mg/kg, 약 0.25 내지 약 50 mg/kg, 약 0.5 내지 약 50 mg/kg, 약 0.75 내지 약 50 mg/kg, 약 1 내지 약 50 mg/mg, 약 1.5 내지 약 50 mg/kb, 약 2 내지 약 50 mg/kg, 약 2.5 내지 약 50 mg/kg, 약 3 내지 약 50 mg/kg, 약 3.5 내지 약 50 mg/kg, 약 4 내지 약 50 mg/kg, 약 4.5 내지 약 50 mg/kg, 약 5 내지 약 50 mg/kg, 약 7.5 내지 약 50 mg/kg, 약 10 내지 약 50 mg/kg, 약 15 내지 약 50 mg/kg, 약 20 내지 약 50 mg/kg, 약 20 내지 약 50 mg/kg, 약 25 내지 약 50 mg/kg, 약 25 내지 약 50 mg/kg, 약 30 내지 약 50 mg/kg, 약 35 내지 약 50 mg/kg, 약 40 내지 약 50 mg/kg, 약 45 내지 약 50 mg/kg, 약 0.1 내지 약 45 mg/kg, 약 0.25 내지 약 45 mg/kg, 약 0.5 내지 약 45 mg/kg, 약 0.75 내지 약 45 mg/kg, 약 1 내지 약 45 mg/mg, 약 1.5 내지 약 45 mg/kb, 약 2 내지 약 45 mg/kg, 약 2.5 내지 약 45 mg/kg, 약 3 내지 약 45 mg/kg, 약 3.5 내지 약 45 mg/kg, 약 4 내지 약 45 mg/kg, 약 4.5 내지 약 45 mg/kg, 약 5 내지 약 45 mg/kg, 약 7.5 내지 약 45 mg/kg, 약 10 내지 약 45 mg/kg, 약 15 내지 약 45 mg/kg, 약 20 내지 약 45 mg/kg, 약 20 내지 약 45 mg/kg, 약 25 내지 약 45 mg/kg, 약 25 내지 약 45 mg/kg, 약 30 내지 약 45 mg/kg, 약 35 내지 약 45 mg/kg, 약 40 내지 약 45 mg/kg, 약 0.1 내지 약 40 mg/kg, 약 0.25 내지 약 40 mg/kg, 약 0.5 내지 약 40 mg/kg, 약 0.75 내지 약 40 mg/kg, 약 1 내지 약 40 mg/mg, 약 1.5 내지 약 40 mg/kb, 약 2 내지 약 40 mg/kg, 약 2.5 내지 약 40 mg/kg, 약 3 내지 약 40 mg/kg, 약 3.5 내지 약 40 mg/kg, 약 4 내지 약 40 mg/kg, 약 4.5 내지 약 40 mg/kg, 약 5 내지 약 40 mg/kg, 약 7.5 내지 약 40 mg/kg, 약 10 내지 약 40 mg/kg, 약 15 내지 약 40 mg/kg, 약 20 내지 약 40 mg/kg, 약 20 내지 약 40 mg/kg, 약 25 내지 약 40 mg/kg, 약 25 내지 약 40 mg/kg, 약 30 내지 약 40 mg/kg, 약 35 내지 약 40 mg/kg, 약 0.1 내지 약 30 mg/kg, 약 0.25 내지 약 30 mg/kg, 약 0.5 내지 약 30 mg/kg, 약 0.75 내지 약 30 mg/kg, 약 1 내지 약 30 mg/mg, 약 1.5 내지 약 30 mg/kb, 약 2 내지 약 30 mg/kg, 약 2.5 내지 약 30 mg/kg, 약 3 내지 약 30 mg/kg, 약 3.5 내지 약 30 mg/kg, 약 4 내지 약 30 mg/kg, 약 4.5 내지 약 30 mg/kg, 약 5 내지 약 30 mg/kg, 약 7.5 내지 약 30 mg/kg, 약 10 내지 약 30 mg/kg, 약 15 내지 약 30 mg/kg, 약 20 내지 약 30 mg/kg, 약 20 내지 약 30 mg/kg, 약 25 내지 약 30 mg/kg, 약 0.1 내지 약 20 mg/kg, 약 0.25 내지 약 20 mg/kg, 약 0.5 내지 약 20 mg/kg, 약 0.75 내지 약 20 mg/kg, 약 1 내지 약 20 mg/mg, 약 1.5 내지 약 20 mg/kb, 약 2 내지 약 20 mg/kg, 약 2.5 내지 약 20 mg/kg, 약 3 내지 약 20 mg/kg, 약 3.5 내지 약 20 mg/kg, 약 4 내지 약 20 mg/kg, 약 4.5 내지 약 20 mg/kg, 약 5 내지 약 20 mg/kg, 약 7.5 내지 약 20 mg/kg, 약 10 내지 약 20 mg/kg, 또는 약 15 내지 약 20 mg/kg의 용량으로 투여된다. 인용된 값에 중간인 값 및 범위도 본 발명의 부분으로 의도된다.
예를 들어, RNAi 작용제, 예를 들어, dsRNA는 약 0.01 mg/kg, 0.02 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.04 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.06 mg/kg, 0.07 mg/kg, 0.08 mg/kg, 0.09 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.6 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1 mg/kg, 1.1 mg/kg, 1.2 mg/kg, 1.3 mg/kg, 1.4 mg/kg, 1.5 mg/kg, 1.6 mg/kg, 1.7 mg/kg, 1.8 mg/kg, 1.9 mg/kg, 2 mg/kg, 2.1 mg/kg, 2.2 mg/kg, 2.3 mg/kg, 2.4 mg/kg, 2.5 mg/kg, 2.6 mg/kg, 2.7 mg/kg, 2.8 mg/kg, 2.9 mg/kg, 3 mg/kg, 3.1 mg/kg, 3.2 mg/kg, 3.3 mg/kg, 3.4 mg/kg, 3.5 mg/kg, 3.6 mg/kg, 3.7 mg/kg, 3.8 mg/kg, 3.9 mg/kg, 4 mg/kg, 4.1 mg/kg, 4.2 mg/kg, 4.3 mg/kg, 4.4 mg/kg, 4.5 mg/kg, 4.6 mg/kg, 4.7 mg/kg, 4.8 mg/kg, 4.9 mg/kg, 5 mg/kg, 5.1 mg/kg, 5.2 mg/kg, 5.3 mg/kg, 5.4 mg/kg, 5.5 mg/kg, 5.6 mg/kg, 5.7 mg/kg, 5.8 mg/kg, 5.9 mg/kg, 6 mg/kg, 6.1 mg/kg, 6.2 mg/kg, 6.3 mg/kg, 6.4 mg/kg, 6.5 mg/kg, 6.6 mg/kg, 6.7 mg/kg, 6.8 mg/kg, 6.9 mg/kg, 7 mg/kg, 7.1 mg/kg, 7.2 mg/kg, 7.3 mg/kg, 7.4 mg/kg, 7.5 mg/kg, 7.6 mg/kg, 7.7 mg/kg, 7.8 mg/kg, 7.9 mg/kg, 8 mg/kg, 8.1 mg/kg, 8.2 mg/kg, 8.3 mg/kg, 8.4 mg/kg, 8.5 mg/kg, 8.6 mg/kg, 8.7 mg/kg, 8.8 mg/kg, 8.9 mg/kg, 9 mg/kg, 9.1 mg/kg, 9.2 mg/kg, 9.3 mg/kg, 9.4 mg/kg, 9.5 mg/kg, 9.6 mg/kg, 9.7 mg/kg, 9.8 mg/kg, 9.9 mg/kg 또는 약 10 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 인용된 값에 중간인 값 및 범위도 본 발명의 부분으로 의도된다.
다른 실시형태에서, RNAi 작용제, 예를 들어, dsRNA는 약 0.5 내지 약 50 mg/kg, 약 0.75 내지 약 50 mg/kg, 약 1 내지 약 50 mg/mg, 약 1.5 내지 약 50 mg/kb, 약 2 내지 약 50 mg/kg, 약 2.5 내지 약 50 mg/kg, 약 3 내지 약 50 mg/kg, 약 3.5 내지 약 50 mg/kg, 약 4 내지 약 50 mg/kg, 약 4.5 내지 약 50 mg/kg, 약 5 내지 약 50 mg/kg, 약 7.5 내지 약 50 mg/kg, 약 10 내지 약 50 mg/kg, 약 15 내지 약 50 mg/kg, 약 20 내지 약 50 mg/kg, 약 20 내지 약 50 mg/kg, 약 25 내지 약 50 mg/kg, 약 25 내지 약 50 mg/kg, 약 30 내지 약 50 mg/kg, 약 35 내지 약 50 mg/kg, 약 40 내지 약 50 mg/kg, 약 45 내지 약 50 mg/kg, 약 0.5 내지 약 45 mg/kg, 약 0.75 내지 약 45 mg/kg, 약 1 내지 약 45 mg/mg, 약 1.5 내지 약 45 mg/kb, 약 2 내지 약 45 mg/kg, 약 2.5 내지 약 45 mg/kg, 약 3 내지 약 45 mg/kg, 약 3.5 내지 약 45 mg/kg, 약 4 내지 약 45 mg/kg, 약 4.5 내지 약 45 mg/kg, 약 5 내지 약 45 mg/kg, 약 7.5 내지 약 45 mg/kg, 약 10 내지 약 45 mg/kg, 약 15 내지 약 45 mg/kg, 약 20 내지 약 45 mg/kg, 약 20 내지 약 45 mg/kg, 약 25 내지 약 45 mg/kg, 약 25 내지 약 45 mg/kg, 약 30 내지 약 45 mg/kg, 약 35 내지 약 45 mg/kg, 약 40 내지 약 45 mg/kg, 약 0.5 내지 약 40 mg/kg, 약 0.75 내지 약 40 mg/kg, 약 1 내지 약 40 mg/mg, 약 1.5 내지 약 40 mg/kb, 약 2 내지 약 40 mg/kg, 약 2.5 내지 약 40 mg/kg, 약 3 내지 약 40 mg/kg, 약 3.5 내지 약 40 mg/kg, 약 4 내지 약 40 mg/kg, 약 4.5 내지 약 40 mg/kg, 약 5 내지 약 40 mg/kg, 약 7.5 내지 약 40 mg/kg, 약 10 내지 약 40 mg/kg, 약 15 내지 약 40 mg/kg, 약 20 내지 약 40 mg/kg, 약 20 내지 약 40 mg/kg, 약 25 내지 약 40 mg/kg, 약 25 내지 약 40 mg/kg, 약 30 내지 약 40 mg/kg, 약 35 내지 약 40 mg/kg, 약 0.5 내지 약 30 mg/kg, 약 0.75 내지 약 30 mg/kg, 약 1 내지 약 30 mg/mg, 약 1.5 내지 약 30 mg/kb, 약 2 내지 약 30 mg/kg, 약 2.5 내지 약 30 mg/kg, 약 3 내지 약 30 mg/kg, 약 3.5 내지 약 30 mg/kg, 약 4 내지 약 30 mg/kg, 약 4.5 내지 약 30 mg/kg, 약 5 내지 약 30 mg/kg, 약 7.5 내지 약 30 mg/kg, 약 10 내지 약 30 mg/kg, 약 15 내지 약 30 mg/kg, 약 20 내지 약 30 mg/kg, 약 20 내지 약 30 mg/kg, 약 25 내지 약 30 mg/kg, 약 0.5 내지 약 20 mg/kg, 약 0.75 내지 약 20 mg/kg, 약 1 내지 약 20 mg/mg, 약 1.5 내지 약 20 mg/kb, 약 2 내지 약 20 mg/kg, 약 2.5 내지 약 20 mg/kg, 약 3 내지 약 20 mg/kg, 약 3.5 내지 약 20 mg/kg, 약 4 내지 약 20 mg/kg, 약 4.5 내지 약 20 mg/kg, 약 5 내지 약 20 mg/kg, 약 7.5 내지 약 20 mg/kg, 약 10 내지 약 20 mg/kg, 또는 약 15 내지 약 20 mg/kg의 용량으로 투여된다. 일 실시형태에서, dsRNA는 약 10 mg/kg 내지 약 30 mg/kg의 용량으로 투여된다. 인용된 값에 중간인 값 및 범위도 본 발명의 부분으로 의도된다.
예를 들어, 피검자는 iRNA의 치료량, 예컨대 약 0.5 mg/kg, 0.6 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1 mg/kg, 1.1 mg/kg, 1.2 mg/kg, 1.3 mg/kg, 1.4 mg/kg, 1.5 mg/kg, 1.6 mg/kg, 1.7 mg/kg, 1.8 mg/kg, 1.9 mg/kg, 2 mg/kg, 2.1 mg/kg, 2.2 mg/kg, 2.3 mg/kg, 2.4 mg/kg, 2.5 mg/kg, 2.6 mg/kg, 2.7 mg/kg, 2.8 mg/kg, 2.9 mg/kg, 3 mg/kg, 3.1 mg/kg, 3.2 mg/kg, 3.3 mg/kg, 3.4 mg/kg, 3.5 mg/kg, 3.6 mg/kg, 3.7 mg/kg, 3.8 mg/kg, 3.9 mg/kg, 4 mg/kg, 4.1 mg/kg, 4.2 mg/kg, 4.3 mg/kg, 4.4 mg/kg, 4.5 mg/kg, 4.6 mg/kg, 4.7 mg/kg, 4.8 mg/kg, 4.9 mg/kg, 5 mg/kg, 5.1 mg/kg, 5.2 mg/kg, 5.3 mg/kg, 5.4 mg/kg, 5.5 mg/kg, 5.6 mg/kg, 5.7 mg/kg, 5.8 mg/kg, 5.9 mg/kg, 6 mg/kg, 6.1 mg/kg, 6.2 mg/kg, 6.3 mg/kg, 6.4 mg/kg, 6.5 mg/kg, 6.6 mg/kg, 6.7 mg/kg, 6.8 mg/kg, 6.9 mg/kg, 7 mg/kg, 7.1 mg/kg, 7.2 mg/kg, 7.3 mg/kg, 7.4 mg/kg, 7.5 mg/kg, 7.6 mg/kg, 7.7 mg/kg, 7.8 mg/kg, 7.9 mg/kg, 8 mg/kg, 8.1 mg/kg, 8.2 mg/kg, 8.3 mg/kg, 8.4 mg/kg, 8.5 mg/kg, 8.6 mg/kg, 8.7 mg/kg, 8.8 mg/kg, 8.9 mg/kg, 9 mg/kg, 9.1 mg/kg, 9.2 mg/kg, 9.3 mg/kg, 9.4 mg/kg, 9.5 mg/kg, 9.6 mg/kg, 9.7 mg/kg, 9.8 mg/kg, 9.9 mg/kg, 10 mg/kg, 10.5 mg/kg, 11 mg/kg, 11.5 mg/kg, 12 mg/kg, 12.5 mg/kg, 13 mg/kg, 13.5 mg/kg, 14 mg/kg, 14.5 mg/kg, 15 mg/kg, 15.5 mg/kg, 16 mg/kg, 16.5 mg/kg, 17 mg/kg, 17.5 mg/kg, 18 mg/kg, 18.5 mg/kg, 19 mg/kg, 19.5 mg/kg, 20 mg/kg, 20.5 mg/kg, 21 mg/kg, 21.5 mg/kg, 22 mg/kg, 22.5 mg/kg, 23 mg/kg, 23.5 mg/kg, 24 mg/kg, 24.5 mg/kg, 25 mg/kg, 25.5 mg/kg, 26 mg/kg, 26.5 mg/kg, 27 mg/kg, 27.5 mg/kg, 28 mg/kg, 28.5 mg/kg, 29 mg/kg, 29.5 mg/kg, 30 mg/kg, 31 mg/kg, 32 mg/kg, 33 mg/kg, 34 mg/kg, 34 mg/kg, 35 mg/kg, 36 mg/kg, 37 mg/kg, 38 mg/kg, 39 mg/kg, 40 mg/kg, 41 mg/kg, 42 mg/kg, 43 mg/kg, 44 mg/kg, 45 mg/kg, 46 mg/kg, 47 mg/kg, 48 mg/kg, 49 mg/kg 또는 약 50 mg/kg를 투여받을 수 있다. 인용된 값에 중간인 값 및 범위도 본 발명의 부분으로 의도된다.
소정의 실시형태에서, 예를 들어, 본 발명의 조성물이 본원에 기술된 바와 같은 dsRN 및 지질을 포함하는 경우, 피검자는 iRNA를 치료량으로, 예컨대 0.01 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.2 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 0.2 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.3 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 0.3 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.4 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 0.4 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.5 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 0.5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 1.5 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 1.5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 2 mg/kg 내지 약 2.5 mg/kg, 약 2 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 3 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 3 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 3.5 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 4 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 4.5 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 4 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 4.5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 5.5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 6 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 6.5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 7 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 7.5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 8 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 8.5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 9 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 또는 약 9.5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg으로 투여받을 수 있다. 인용된 값에 중간인 값 및 범위도 본 발명의 부분으로 의도된다.
예를 들어, dsRNA는 약 0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.6 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1 mg/kg, 1.1 mg/kg, 1.2 mg/kg, 1.3 mg/kg, 1.4 mg/kg, 1.5 mg/kg, 1.6 mg/kg, 1.7 mg/kg, 1.8 mg/kg, 1.9 mg/kg, 2 mg/kg, 2.1 mg/kg, 2.2 mg/kg, 2.3 mg/kg, 2.4 mg/kg, 2.5 mg/kg, 2.6 mg/kg, 2.7 mg/kg, 2.8 mg/kg, 2.9 mg/kg, 3 mg/kg, 3.1 mg/kg, 3.2 mg/kg, 3.3 mg/kg, 3.4 mg/kg, 3.5 mg/kg, 3.6 mg/kg, 3.7 mg/kg, 3.8 mg/kg, 3.9 mg/kg, 4 mg/kg, 4.1 mg/kg, 4.2 mg/kg, 4.3 mg/kg, 4.4 mg/kg, 4.5 mg/kg, 4.6 mg/kg, 4.7 mg/kg, 4.8 mg/kg, 4.9 mg/kg, 5 mg/kg, 5.1 mg/kg, 5.2 mg/kg, 5.3 mg/kg, 5.4 mg/kg, 5.5 mg/kg, 5.6 mg/kg, 5.7 mg/kg, 5.8 mg/kg, 5.9 mg/kg, 6 mg/kg, 6.1 mg/kg, 6.2 mg/kg, 6.3 mg/kg, 6.4 mg/kg, 6.5 mg/kg, 6.6 mg/kg, 6.7 mg/kg, 6.8 mg/kg, 6.9 mg/kg, 7 mg/kg, 7.1 mg/kg, 7.2 mg/kg, 7.3 mg/kg, 7.4 mg/kg, 7.5 mg/kg, 7.6 mg/kg, 7.7 mg/kg, 7.8 mg/kg, 7.9 mg/kg, 8 mg/kg, 8.1 mg/kg, 8.2 mg/kg, 8.3 mg/kg, 8.4 mg/kg, 8.5 mg/kg, 8.6 mg/kg, 8.7 mg/kg, 8.8 mg/kg, 8.9 mg/kg, 9 mg/kg, 9.1 mg/kg, 9.2 mg/kg, 9.3 mg/kg, 9.4 mg/kg, 9.5 mg/kg, 9.6 mg/kg, 9.7 mg/kg, 9.8 mg/kg, 9.9 mg/kg 또는 약 10 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 인용된 값에 중간인 값 및 범위도 본 발명의 부분으로 의도된다.
본 발명의 소정의 실시형태에서, 예를 들어 이중 가닥 RNAi 작용제가 변형(예를 들어, 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 동일한 변형의 하나 이상의 모티프(작용제의 절단 부위 또는 그 근처에서 이러한 모티프를 포함하는 것을 포함함)), 6개의 포스포로티오에이트 결합, 및 리간드를 포함하는 경우, 이러한 작용제는 약 0.01 mg/kg 내지 약 0.5 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 0.4 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 0.3 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 0.2 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 0.1 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 0.09 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 0.08 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 0.07 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 0.06 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 0.05 mg/kg, 약 0.02 mg/kg 내지 약 0.5 mg/kg, 약 0.02 mg/kg 내지 약 0.4 mg/kg, 약 0.02 mg/kg 내지 약 0.3 mg/kg, 약 0.02 mg/kg 내지 약 0.2 mg/kg, 약 0.02 mg/kg 내지 약 0.1 mg/kg, 약 0.02 mg/kg 내지 약 0.09 mg/kg, 약 0.02 mg/kg 내지 약 0.08 mg/kg, 약 0.02 mg/kg 내지 약 0.07 mg/kg, 약 0.02 mg/kg 내지 약 0.06 mg/kg, 약 0.02 mg/kg 내지 약 0.05 mg/kg, 약 0.03 mg/kg 내지 약 0.5 mg/kg, 약 0.03 mg/kg 내지 약 0.4 mg/kg, 약 0.03 mg/kg 내지 약 0.3 mg/kg, 약 0.03 mg/kg 내지 약 0.2 mg/kg, 약 0.03 mg/kg 내지 약 0.1 mg/kg, 약 0.03 mg/kg 내지 약 0.09 mg/kg, 약 0.03 mg/kg 내지 약 0.08 mg/kg, 약 0.03 mg/kg 내지 약 0.07 mg/kg, 약 0.03 mg/kg 내지 약 0.06 mg/kg, 약 0.03 mg/kg 내지 약 0.05 mg/kg, 약 0.04 mg/kg 내지 약 0.5 mg/kg, 약 0.04 mg/kg 내지 약 0.4 mg/kg, 약 0.04 mg/kg 내지 약 0.3 mg/kg, 약 0.04 mg/kg 내지 약 0.2 mg/kg, 약 0.04 mg/kg 내지 약 0.1 mg/kg, 약 0.04 mg/kg 내지 약 0.09 mg/kg, 약 0.04 mg/kg 내지 약 0.08 mg/kg, 약 0.04 mg/kg 내지 약 0.07 mg/kg, 약 0.04 mg/kg 내지 약 0.06 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 0.5 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 0.4 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 0.3 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 0.2 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 0.1 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 0.09 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 0.08 mg/kg 또는 약 0.05 mg/kg 내지 약 0.07 mg/kg의 용량으로 투여된다. 인용된 값에 중간인 값 및 범위도 본 발명의 부분으로 의도되며, 예를 들어, RNAi 작용제는 약 0.015 mg/kg 내지 약 0.45 mg/mg의 용량으로 피검자에게 투여될 수 있다.
예를 들어, RNAi 작용제, 예를 들어, 약학적 조성물 내의 RNAi 작용제는 약 0.01 mg/kg, 0.0125 mg/kg, 0.015 mg/kg, 0.0175 mg/kg, 0.02 mg/kg, 0.0225 mg/kg, 0.025 mg/kg, 0.0275 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.0325 mg/kg, 0.035 mg/kg, 0.0375 mg/kg, 0.04 mg/kg, 0.0425 mg/kg, 0.045 mg/kg, 0.0475 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.0525 mg/kg, 0.055 mg/kg, 0.0575 mg/kg, 0.06 mg/kg, 0.0625 mg/kg, 0.065 mg/kg, 0.0675 mg/kg, 0.07 mg/kg, 0.0725 mg/kg, 0.075 mg/kg, 0.0775 mg/kg, 0.08 mg/kg, 0.0825 mg/kg, 0.085 mg/kg, 0.0875 mg/kg, 0.09 mg/kg, 0.0925 mg/kg, 0.095 mg/kg, 0.0975 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.125 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.175 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.225 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.275 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.325 mg/kg, 0.35 mg/kg, 0.375 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.425 mg/kg, 0.45 mg/kg, 0.475 mg/kg 또는 약 0.5 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 상기 인용된 값에 중간인 값 및 범위도 본 발명의 부분으로 의도된다.
약학적 조성물은 매일 1회 투여될 수 있거나 iRNA는 하루 전체에 걸쳐 적절한 간격으로 2, 3 또는 그 이상의 하부 용량으로 또는 심지어 연속 주입 또는 방출 제어 제형(controlled release formulation)을 통한 전달을 이용하여 투여될 수 있다. 그러한 경우, 각각의 하부-용량에 포함된 iRNA는 총 일간 투여량을 달성하기 위하여 이에 상응하게 더 적어야 한다. 투여량 단위는 예컨대, 며칠간의 기간에 걸쳐 iRNA의 지속 방출을 제공하는 종래 지속 방출 제형을 이용하여 며칠간에 걸쳐서 전달되기 위해 배합될 수도 있다. 지속 방출 제형은 업계에 주지되어 있으며, 본 발명의 작용제와 함께 이용될 수 있는 바와 같이, 특정 부위에서 작용제의 전달을 위해 특히 유용하다. 이 실시형태에서, 투여량 단위는 일간 용량의 상응하는 배수를 포함한다.
다른 실시형태에서, 단일 용량의 약학적 조성물은 장기적으로 지속하여, 이후 용량은 3일, 4일 또는 5일 간격 이하, 또는 1주, 2주, 3주 또는 4주 간격 이하로 투여된다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 단일 용량의 본 발명의 약학적 조성물은 주 1회 투여된다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 단일 용량의 본 발명의 약학적 조성물은 2개월마다 투여된다.
당업자는 질병 또는 질환의 중증도, 이전 치료, 피검자의 일반 건강 및/또는 연령 및 기타 현재 질병을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는 특정 인자는 피검자를 효과적으로 치료하는데 필요한 투여량 및 타이밍(timing)에 영향을 줄 수 있다는 것을 알 것이다. 또한, 피검자를 치료적 유효량의 조성물로 치료하는 것은 단일 치료 또는 일련의 치료를 포함할 수 있다. 본 발명에 포함되는 개별 iRNA들에 대한 효과적인 투여량 및 생체 내 반감기의 측정은 본원의 어디에선가 기술된 바와 같이, 종래 방법론을 이용하거나 적절한 동물 모델을 이용한 생체 내 시험을 기초로 하여 이루어질 수 있다.
마우스 유전학의 진보로 인하여 Serpina1의 발현 감소로 이득을 보는 간 장애와 같은, 다양한 인간 질병의 연구에 대한 수많은 마우스 모델들을 생성하였다. 그러한 모델은 치료적 유효 용량의 결정뿐만 아니라 iRNA의 생체 내 시험을 위해 이용될 수 있다. 적당한 마우스 모델은 업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 인간 Serpina1을 발현하는 이식 유전자를 함유하는 마우스를 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 국소 또는 전신 치료를 요하는지 여부 및 치료될 부위에 따라 수많은 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 (예, 경피 패치에 의한) 국소, 폐, 예컨대, 분무기에 의하는 것을 비롯하여 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 통기(insufflation)에 의하고; 기관삽관, 비강 내, 표피 및 경피, 경구 또는 비경구일 수 있다. 비경구 투여는 정맥 내, 동맥 내, 피하, 복막 내 또는 근육 내 주사 또는 주입; 피하, 예컨대, 이식된 장치를 통한; 또는 두개 내, 예컨대, 뇌실질 내, 척수강 내 또는 뇌실 내 투여를 포함한다. iRNA는 간(예, 간의 간세포)과 같은 특정 조직을 표적하는 방식으로 전달될 수 있다.
국소 투여를 위한 약학적 조성물 및 제형은 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 젤, 드롭, 좌약, 스프레이, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 종래 약학적 담체, 수성, 분말 또는 유성 베이스(oily base), 증점제 등은 필요하거나 바람직할 수 있다. 코팅된 콘돔, 장갑 등도 유용할 수 있다. 적당한 국소 제형으로는 본 발명에서 특징된 iRNA가 지질, 리포솜, 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, 킬레이트제 및 계면활성제와 같은 국소 전달 작용제와 혼합되어 있는 것들을 포함한다. 적당한 지질 및 리포솜으로는 중성(예, 디올레오일포스파티딜 DOPE 에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜 콜린 DMPC, 디스테아로일포스파티딜 콜린), 음성(예, 디미리스토일포스파티딜 글리세롤 DMPG) 및 양이온성(예, 디올레오일테트라메틸아미노프로필 DOTAP 및 디올레오일포스파티딜 에탄올아민 DOTMA)이 포함된다. 본 발명에서 특징된 iRNA는 리포솜 내에서 캡슐화될 수 있거나 거기에, 특히 양이온성 리포솜에 복합체를 형성할 수 있다. 대안적으로, iRNA는 지질, 특히 양이온성 지질에 복합될 수 있다. 적당한 지방산 및 에스테르는 아라키돈산, 올레산, 에이코산산, 라우르산, 카프릴산, 카프르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인, 디라우린, 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자시클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린, 또는 C1-20 알킬 에스테르(예, 이소프로필미리스테이트 IPM), 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 국소 제형은 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제6,747,014호에 상세히 기술되어 있다.
A. 막 분자 어셈블리를 포함하는 iRNA 제형
본 발명의 조성물 및 방법에 이용되는 iRNA는 막 분자 어셈블리, 예컨대, 리포솜 또는 미셀 내에서 전달을 위해 제형화될 수 있다. 본원에서 사용된 "리포솜"이라는 용어는 적어도 하나의 이중층, 예컨대, 하나의 이중층 또는 복수개의 이중층내에서 배열된 양친매성 지질로 구성된 소낭을 지칭한다. 리포솜은 친지방성 물질로부터 형성된 막 및 수성 내부를 갖는 단일층상 또는 다중층상 소낭을 포함한다. 수성 부분은 iRNA 조성물을 포함한다. 친지방성 물질은 비록 일부 예들에서는 포함할 수 있어도, 통상적으로는 iRNA 조성물을 포함하지 않는 수성 외부로부터 수성 내부를 분리한다. 리포솜은 작용 부위로의 활성 성분의 수송 및 전달에 유용하다. 리포솜막은 생물학적 막과 구조적으로 유사하기 때문에, 리포솜이 조직에 적용되는 경우, 리포솜 이중층이 세포막의 이중층과 융합한다. 리포솜 및 세포의 융합이 진행됨에 따라, iRNA를 포함하는 내부 수성 내용물이 세포로 전달되며, 여기서, iRNA는 표적 RNA와 특이적으로 결합할 수 있고 RNAi를 매개할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 리포솜도 특이적으로 표적되어, 예컨대, iRNA를 특정 세포 유형으로 지시한다.
RNAi 작용제를 포함하는 리포솜은 다양한 방법에 의하여 제조될 수 있다. 일례에서, 리포솜의 지질 구성성분은 미셀이 지질 구성성분으로 형성되도록 세제에 용해된다. 예를 들어, 지질 구성성분은 양친매성 양이온성 지질 또는 지질 콘쥬게이트일 수 있다. 세제는 높은 임계 미셀 농도를 가질 수 있으며, 비이온성일 수 있다. 예시적인 세제는 콜산염, CHAPS, 옥틸글루코시드, 데옥시콜산염 및 라우로일 사르코신을 포함한다. 이후 RNAi 작용제 제제는 지질 구성성분을 포함하는 미셀에 첨가된다. 지질상의 양이온기는 RNA 작용제와 상호작용하고 RNAi 작용제 주위에서 응축하여 리포솜을 형성한다. 응축 이후에는, 세제는 예컨대, 투석에 의하여 제거되어 RNAi 작용제의 리포솜 제제를 산출한다.
필요하면, 응축을 보조하는 담체 화합물은 응축 반응 동안에 예컨대, 조절된 첨가에 의하여 첨가될 수 있다. 예를 들어, 담체 화합물은 핵산 이외의 중합체(예, 스페르민 또는 스페르미딘)일 수 있다. 또한, pH는 조절되어 응축을 유리하게도 할 수 있다.
전달 운반체의 구조적 구성성분으로서 폴리뉴클레오타이드/양이온 지질 복합체를 포함하는 안정한 폴리뉴클레오타이드 전달 운반체를 생성하는 방법은 예컨대, 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함되어 있는 WO 96/37194호에 더 기술되어 있다. 리포솜 형성은 문헌[Felgner, P. L. 등, Proc . Natl . Acad . Sci ., USA 8:7413-7417, 1987]; 미국 특허 제4,897,355호; 미국 특허 제5,171,678호; 문헌[Bangham, 등 M. Mol . Biol. 23:238, 1965; Olson, 등 Biochim . Biophys . Acta 557:9, 1979; Szoka, 등 Proc . Natl . Acad . Sci. 75: 4194, 1978; Mayhew, 등 Biochim . Biophys . Acta 775:169, 1984; Kim, 등 Biochim . Biophys . Acta 728:339, 1983; 및 Fukunaga, 등 Endocrinol . 115:757, 1984]에 기술된 예시적인 방법의 하나 이상의 양태를 포함할 수도 있다. 전달 운반체로서 이용되는데 적당한 크기의 지질 응집체를 제조하는 흔히 이용되는 기법은 초음파처리 및 동결-해동 플러스 압출(freeze-thaw plus extrusion)을 포함한다(예, 문헌[Mayer 등, Biochim . Biophys . Acta 858:161, 1986] 참조). 일관되게 작고(50 내지 200 nm) 및 상대적으로 균일한 응집체를 원하는 경우 미세유동화를 이용할 수 있다(문헌[Mayhew 등, Biochim . Biophys . Acta 775:169, 1984]). 이러한 방법은 RNAi 작용제 제제를 리포솜으로 패키징하도록 용이하게 개조된다.
리포솜은 2개의 광범위한 종류에 속한다. 양이온성 리포솜은 음으로 대전된 핵산 분자와 상호작용하여 안정한 복합체를 형성하는 양으로 대전된 리포솜이다. 양으로 대전된 핵산/리포솜 복합체는 음으로 대전된 세포 표면과 결합하고 엔도솜에 내재된다. 엔도솜 내의 산성 pH로 인하여, 리포솜은 파열되어 그 내용물을 세포 세포질로 방출한다(문헌[Wang 등, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985]).
pH-민감성 또는 음으로 대전된 리포솜은 핵산과 복합하기 보다는 핵산을 트래핑한다. 핵산 및 지질이 유사하게 대전되기 때문에, 복합체 형성보다는 반발력이 발생한다. 그럼에도 불구하고, 일부 핵산이 이러한 리포솜의 수성 내부 내에서 트래핑된다. pH-민감성 리포솜은 배양되는 세포 단일층들로 티미딘 키나아제 유전자를 인코딩하는 핵산을 전달하는데 이용되어 왔다. 외인성 유전자의 발현은 표적 세포에서 검출되었다(문헌[Zhou 등, Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274]).
리포솜 조성물의 하나의 중요한 유형은 천연-유래 포스파티딜콜린이 아닌 인지질을 포함한다. 중성 리포솜 조성물은, 예를 들어, 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC) 또는 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC)으로부터 형성될 수 있다. 음이온성 리포솜 조성물은 일반적으로 디미리스토일 포스파티딜글리세롤로부터 형성되는 반면에, 음이온성 융합성 리포솜은 주로 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)으로부터 형성된다. 다른 유형의 리포솜 조성물은 예를 들어, 대두 PC 및 계란 PC와 같이 포스파티딜콜린(PC)으로부터 형성된다. 다른 유형은 인지질 및/또는 포스파티딜콜린 및/또는 콜레스테롤의 혼합물로부터 형성된다.
시험관 내 및 생체 내에서 세포로 리포솜을 도입하는 다른 방법의 예는 미국 특허 제5,283,185호; 미국 특허 제5,171,678호; WO 94/00569호; WO 93/24640호; WO 91/16024호; 문헌[Felgner, J. Biol . Chem . 269:2550, 1994]; Nabel, Proc . Natl. Acad . Sci . 90:11307, 1993; Nabel, Human Gene Ther . 3:649, 1992; Gershon, Biochem. 32:7143, 1993; 및 Strauss, EMBO J.11:417, 1992]를 포함한다.
비이온성 리포솜 시스템, 특히, 비이온성 계면활성제 및 콜레스테롤을 포함하는 시스템도 피부로의 약물의 전달에 있어서 그 유용성을 결정하기 위해 조사되었다. Novasome™ I(글리세릴 디라우레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르) 및 Novasome™ II(글리세릴 디스테아레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르)를 포함하는 비이온성 리포솜 제형을 이용하여 마우스 피부의 진피로 시클로스포린-A를 전달하였다. 결과에 따르면 그러한 비이온성 리포솜 시스템은 시클로스포린-A의 피부의 상이한 층들로의 침착을 촉진시키는데 효과적이었다(문헌[Hu 등, S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4(6) 466]).
리포솜은 "입체적으로 안정화된" 리포솜도 포함하는데, 본원에 사용된 이 용어는 하나 이상의 특수화된 지질이 리포솜으로 혼입되는 경우, 그러한 특수화된 지질이 부족한 리포솜과 비교하여 순환 수명을 향상시키는 결과를 갖는 하나 이상의 특수화된 지질을 포함하는 리포솜을 지칭한다. 입체적으로 안정화된 리포솜의 예로는 리포솜의 소낭-형성 지질 부분(A)의 일부가 모노시알로강글리오시드 GM1 등과 같은 하나 이상의 글리코지질을 포함하거나 (B)가 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티와 같은 하나 이상의 친수성 중합체로 유도체화되는 것들이다. 어느 특정한 이론에 구속되려 하지 않으면서, 적어도 강글리오시드, 스핑고미엘린 또는 PEG-유도체화 지질을 포함하는 입체적으로 안정화된 리포솜에 대하여, 이러한 입체적으로 안정화된 리포솜의 향상된 순환 반감기는 세망내피계통(RES)의 세포로의 감소된 흡수로부터 유래한다고 업계에서 간주된다(문헌[Allen 등, FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu 등, Cancer Research, 1993, 53, 3765]).
하나 이상의 글리코지질을 포함하는 다양한 리포솜이 업계에 알려져 있다. Papahadjopoulos 등(문헌[Ann. N.Y . Acad . Sci., 1987, 507, 64])은 모노시알로강글리오시드 GM1, 갈락토세레브로시드 설페이트 및 포스파티딜리노시톨이 리포솜의 혈액 반감기를 향상시키는 능력을 보고하였다. 이러한 발견은 Gabizon 등(문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949])에 의하여 상세히 설명되었다. 양쪽 모두가 Allen 등에 속하는 미국 특허 제4,837,028호 및 국제 특허 출원 번호 WO 88/04924호는 스핑고미엘린을 포함하는 리포솜(1) 및 강글리오시드 GM1 또는 갈락토세레브로시드 설페이트 에스테르를 포함하는 리포솜(2)을 개시한다. 미국 특허 제5,543,152호(Webb 등)는 스핑고미엘린을 포함하는 리포솜을 개시한다. 1,2-sn-디미리스토일포스파티딜콜린을 포함하는 리포솜은 국제 특허 출원 제WO 97/13499호(Lim 등)에 개시되어 있다.
일 실시형태에서, 양이온성 리포솜이 이용된다. 양이온성 리포솜은 세포막으로 융합할 수 있는 이점을 가진다. 비-양이온성 리포솜은 비록 원형질막과 효율적으로 융합할 수 없다고 하더라도 생체 내에서 대식세포들에 의하여 취해지고, RNAi 작용제를 대식세포들로 전달하기 위해 이용될 수 있다.
리포솜의 다른 이점은 다음을 포함한다; 천연 인지질로부터 얻은 리포솜은 생물학적 적합성 및 생물분해성이 있고; 리포솜은 광범위한 물 및 지질 용해성 약물이 혼입될 수 있고; 리포솜은 그 내부 격실에 있는 캡슐화된 RNAi 작용제를 물질 대사 및 분해로부터 보호할 수 있다(문헌[Rosoff, in "Pharmaceutical Dosage Forms," Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, volume 1, p. 245]). 리포솜 제형의 제조에 있어서 중요한 고려사항은 리포솜의 지질 표면 전하, 소낭 크기 및 수성 부피이다.
양으로 대전된 합성 양이온성 지질인 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA)를 이용하여 핵산과 자발적으로 상호작용하는 작은 리포솜을 형성하여 조직 배양 세포의 세포막의 음으로 대전된 지질과 융합할 수 있는 지질-핵산 복합체를 형성하여, RNAi 작용제의 전달이 이루어질 수 있다(예, 문헌[Felgner, P. L. 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 8:7413-7417, 1987] 및 DOTMA의 설명 및 DNA와의 그 용도에 대한 미국 특허 제4,897,355호 참조).
DOTMA 유사체인 1,2-비스(올레오일옥시)-3-(트리메틸암모니아)프로판(DOTAP)을 인지질과 병용하여 DNA-복합 소낭을 형성할 수 있다. LipofectinTM(Bethesda Research Laboratories, 게이더스버그, 메릴랜드)은 고도의 음이온성 핵산을 음으로 대전된 폴리뉴클레오타이드와 자발적으로 상호작용하는 양으로 대전된 DOTMA 리포솜을 포함하는 살아있는 조직 배양 세포로 전달하여 복합체를 형성하는데 효과적인 작용제이다. 충분히 양으로 대전된 리포솜을 이용하는 경우, 이로 인해 생성된 복합체 상의 순전하 또한 양이다. 이런 식으로 제조된 양으로 대전된 복합체는 음으로 대전된 세포 표면에 자발적으로 부착하고, 원형질막과 융합하며, 기능적 핵산을 예를 들어, 조직 배양 세포로 효율적으로 전달한다. 다른 상업적으로 허용 가능한 양이온성 지질, 1,2-비스(올레오일옥시)-3,3-(트리메틸암모니아)프로판("DOTAP")(Boehringer Mannheim, 인디아나폴리스, 인디아나)은 올레오일 모이어티들이 에테르 연결보다는 에스테르에 의하여 연결된다는 점에서 DOTMA와 상이하다.
다른 보고된 양이온성 지질 화합물은 예를 들어, 두가지 유형의 지질 중 하나에 콘쥬게이트되고 5-카르복시스페르밀글리신 디옥타올레오일아미드("DOGS")(Transfectam™, Promega, 매디슨, 위스콘신) 및 디팔미토일포스파티딜에탄올아민 5-카르복시스페르밀-아미드("DPPES")와 같은 화합물을 포함하는 카르복시스페르민을 포함하는 다양한 모이어티들에 콘쥬게이트된 것들을 포함한다(예, 미국 특허 제5,171,678호 참조).
다른 양이온성 지질 콘쥬게이트는 DOPE와 조합되어 리포솜으로 제형화되는 콜레스테롤("DC-Chol")과 지질의 유도체화를 포함한다(문헌[Gao, X. and Huang, L., Biochim . Biophys . Res. Commun .179:280, 1991] 참조). 폴리리신을 DOPE에 콘쥬게이트하여 제조되는 지질폴리리신(lipopolylysine)은 혈청의 존재하에 형질감염에 대하여 유효한 것으로 보고되었다(문헌[Zhou, X. 등, Biochim . Biophys . Acta 1065:8, 1991]). 특정 세포주에 대하여, 콘쥬게이트된 양이온성 지질을 포함하는 이러한 리포솜은 DOTMA-함유 조성물보다 더 낮은 독성을 보이며 더 효율적인 형질감염을 제공하는 것으로 전해진다. 기타 상업적으로 이용 가능한 양이온성 지질 생성물은 DMRIE 및 DMRIE-HP(Vical, 라 졸라, 캘리포니아) 및 리포펙타민(DOSPA)(Life Technology, Inc., 게이더스버그, 메릴랜드)을 포함한다. 올리고뉴클레오타이드의 전달에 적합한 기타 양이온성 지질은 WO 98/39359호 및 WO 96/37194호에 기술되어 있다.
리포솜 제형은 국소 투여에 특히 적합하며, 리포솜은 기타 제형보다 더 몇몇 장점을 제시한다. 그러한 장점은 투여된 약물의 높은 전신 흡수에 관한 감소된 부작용, 소기의 표적에서 투여된 약물의 증가된 축적 및 피부로 RNAi 작용제를 투여할 수 있는 능력을 포함한다. 일부 구체예들에 있어서, 리포솜은 RNAi 작용제를 상피 세포로 전달하는데 이용되며, 또한, RNAi 작용제의 피부 조직, 예컨대, 피부로의 투과를 향상시키기 위해서 이용된다. 예를 들어, 리포솜은 국소적으로 도포될 수 있다. 리포솜으로 제형화되는 약물의 피부로의 국소 전달은 문서화되었다(예, 문헌[Weiner 등, Journal of Drug Targeting, 1992, vol. 2,405-410] 및 문헌[du Plessis 등, Antiviral Research, 18, 1992, 259-265; Mannino, R. J. and Fould-Fogerite, S., Biotechniques 6:682-690, 1988; Itani, T. 등 Gene 56:267-276. 1987; Nicolau, C. 등 Meth. Enz. 149:157-176, 1987; Straubinger, R. M. and Papahadjopoulos, D. Meth. Enz. 101:512-527, 1983; Wang, C. Y. and Huang, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855, 1987] 참조).
비이온성 리포솜 시스템, 특히, 비이온성 계면활성제 및 콜레스테롤을 포함하는 시스템도 피부로의 약물의 전달에 있어서 그 유용성을 결정하기 위해 조사되었다. Novasome I(글리세릴 디라우레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르) 및 Novasome II(글리세릴 디스테아레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르)를 포함하는 비이온성 리포솜 제형을 이용하여 마우스 피부의 표피로 약물을 전달하였다. RNAi 작용제와의 그러한 제형은 피부 질환을 치료하는데 유용하다.
iRNA를 포함하는 리포솜은 고도로 변형가능하게 할 수 있다. 그러한 변형가능함은 리포솜이 리포솜의 평균 반경보다 더 작은 기공을 통과하도록 할 수 있다. 예를 들어, 트랜스퍼솜은 변형가능한 리포솜의 일 유형이다. 트랜스퍼솜은 표면단 활성화제, 통상적으로 계면활성제를 표준 리포솜 조성물에 첨가함으로써 제조될 수 있다. RNAi 작용제를 포함하는 트랜스퍼솜은 예를 들어, RNAi 작용제를 피부 내에서 케라틴 생성 세포로 전달하기 위하여 감염에 의하여 피하적으로 전달될 수 있다. 무손상 포유류의 피부를 가로지르기 위하여, 지질 소낭은 적당한 경피 구배의 영향 하에서 각각의 직경이 50 nm 미만인 일련의 미세 기공들을 통과하여야 한다. 또한, 지질 특성으로 인하여, 이러한 트랜스퍼솜은 자가-최적화하고(예, 피부 내의 기공의 형상에 적응됨), 자가-복구할 수 있으며, 종종 단편화하지 않고 그 표적에 도달하며 자주 자가-로딩(loading)할 수 있다.
본 발명에 부합하는 기타 제형은 2008년 1월 2일에 출원된 미국 가출원 계열 번호 61/018,616호; 2008년 1월 2일에 출원된 61/018,611호; 2008년 3월 26일에 출원된 61/039,748호; 2008년 4월 22일에 출원된 61/047,087호 및 2008년 5월 8일에 출원된 61/051,528호에 기술되어 있다. 2007년 10월 3일에 출원된 PCT 출원 번호 PCT/US2007/080331호도 본 발명에 부합하는 제형을 기술한다.
트랜스퍼솜은 또 다른 유형의 리포솜이며, 약물 전달 운반체에 대한 매력적인 후보인 고도로 변형가능한 지질 응집체이다. 트랜스퍼솜은 고도로 변형가능하여 소적보다 더 작은 기공을 용이하게 침투할 수 있는 지질 소적으로 기술될 수 있다. 트랜스퍼솜은 이들이 이용되는 환경에 적응될 수 있으며, 예컨대, 이들은 자가-최적화하고(피부 내의 기공의 형상에 적응됨), 자가-복구하며, 종종 단편화하지 않고 그 표적에 도달하며 자주 자가-로딩한다. 트랜스퍼솜을 제작하기 위하여, 표면단-활성화제, 통상적으로 계면활성제를 표준 리포솜 조성물에 첨가하는 것이 가능하다. 트랜스퍼솜은 피부에 혈청 알부민을 전달하는데 이용되어 왔다. 혈청 알부민의 트랜스퍼솜-매개 전달은 혈청 알부민을 포함하는 용액의 피하 주사만큼 유효하다고 밝혀져 있다.
계면활성제는 (마이크로에멀젼을 포함하는) 에멀젼 및 리포솜과 같은 제형에서 광범위한 응용이 있다. 천연 및 합성인 많은 상이한 유형의 계면활성제의 특성을 분류하고 등급화하는 가장 흔한 방법은 친수성/친지방성 균형(HLB)의 이용에 의한 것이다. ("머리"로도 알려진) 친수성기의 특성은 제형에서 이용되는 상이한 계면활성제를 범주로 나누는 가장 유용한 수단을 제공한다(문헌[Rieger, Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285]에서).
계면활성제 분자가 이온화되지 않으면, 이는 비이온성 계면활성제로 분류된다. 비이온성 계면활성제는 약학적 및 화장료 제품에서 광범위한 응용이 있으며 넓은 범위의 pH 값에 걸쳐 사용할 수 있다. 일반적으로, 그 HLB 값은 그 구조에 따라 2 내지 약 18에 이른다. 비이온성 계면활성제는 에틸렌 글리콜 에스테르, 프로필렌 글리콜 에스테르, 글리세릴 에스테르, 폴리글리세릴 에스테르, 소르비탄 에스테르, 수크로스 에스테르 및 에톡실화된 에스테르와 같은 비이온성 에스테르를 포함한다. 지방 알코올 에톡실레이트, 프로폭실화된 알코올 및 에톡실화/프로폭실화 블록 중합체와 같은 비이온성 알칸올아미드 및 에테르도 이 분류에 포함된다. 폴리옥시에틸렌 계면활성제는 비이온성 계면활성제 클래스의 가장 인기있는 요소이다.
만약 계면활성제 분자가 물에 용해되거나 분산되는 경우 음전하를 보유한다면, 계면활성제는 비이온성으로 분류된다. 음이온성 계면활성제는 비누와 같은 카브록실레이트, 아실 락틸레이트, 아미노산의 아실 아미드, 알킬 설페이트 및 에톡실화 알킬 설페이트와 같은 황산의 에스테르, 알킬 벤젠 설포네이트와 같은 설포네이트, 아실 이세티오네이트, 아실 타우레이트 및 설포석시네이트 및 포스페이트를 포함한다. 음이온성 계면활성제 클래스의 가장 중요한 요소는 알킬 설페이트 및 비누이다.
만약 계면활성제 분자가 물에 용해되거나 분산되는 경우 양전하를 보유한다면, 계면활성제는 양이온성으로 분류된다. 양이온성 계면활성제는 4급 암모늄 염 및 에톡실화 아민을 포함한다. 4급 암모늄 염은 이 클래스의 가장 많이 이용되는 요소이다.
만약 계면활성제 분자가 양전하 또는 음전하를 보유하는 능력을 가진다면, 계면활성제는 양쪽성으로 분류된다. 양쪽성 계면활성제는 아크릴산 유도체, 치환된 알킬아미드, N-알킬베타인 및 포스파티드를 포함한다.
계면활성제를 약물 제품, 제형 및 에멀젼에 이용하는 것을 검토하였다(문헌[Rieger, Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285]에서).
본 발명의 방법에 이용되는 iRNA는 미셀 제형으로 제공될 수도 있다. "미셀"은 분자의 모든 소수성 부분들이 안으로 향하게 되어, 친수성 부분들이 주위의 수상과 접촉하도록, 양친매성 분자들이 구형 구조로 배열되어 있는 특정 유형의 분자 어셈블리로서 본원에 정의되어 있다. 환경이 소수성이면 반대 배열이 존재한다.
경피막을 통한 전달에 적당한 혼합된 미셀 제형은 siRNA 조성물, 알칼리 금속 C8 내지 C22 알킬 설페이트 및 미셀 형성 화합물의 수용액을 혼합함으로써 제조될 수 있다. 예시적인 미셀 형성 화합물은 레시틴, 히알루론산, 히알루론산의 약학적으로 허용 가능한 염, 글리콜산, 락트산, 카모마일 추출물, 오이 추출물, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 모노올레인, 모노올리에이트, 모노라우레이트, 보라지유, 달맞이꽃유, 멘톨, 트리히드록시 옥소 콜라닐 글리신 및 그 약학적으로 허용 가능한 염, 글리세린, 폴리글리세린, 리신, 폴리리신, 트리올레인, 폴리옥시에틸렌 에테르 및 그 유사체, 폴리도카놀 알킬 에테르 및 그 유사체, 케노데옥시콜산염, 데옥시콜산염, 및 그 혼합물을 포함한다. 미셀 형성 화합물은 알칼리 금속 알킬 설페이트와 동시에 또는 이의 첨가 이후에 첨가될 수 있다. 혼합된 미셀은 더 작은 크기의 미셀을 제공하기 위하여 실질적으로 임의의 성분과 혼합하지만 격렬한 혼합으로 형성될 것이다.
하나의 방법에 있어서, siRNA 조성물 및 적어도 알칼리 금속 알킬 설페이트를 포함하는 제1 미셀 조성물이 제조된다. 이후 제1 미셀 조성물은 적어도 3개의 미셀 형성 혼합물과 혼합되어 혼합된 미셀 조성물을 형성한다. 다른 방법에 있어서, 미셀 조성물은 siRNA 조성물, 알칼리 금속 알킬 설페이트 및 미셀 형성 화합물들 중 적어도 하나를 혼합한 이후, 나머지 미셀 형성 화합물들을 격렬히 혼합하면서 첨가함으로써 제조된다.
페놀 및/또는 m-크레솔은 혼합된 미셀 조성물에 첨가되어 제형을 안정화시키고 세균 성장에 대항하여 보호할 수 있다. 대안적으로, 페놀 및/또는 m-크레솔은 미셀 형성 성분들과 함께 첨가될 수 있다. 글리세린과 같은 등장제는 혼합된 미셀 조성물을 형성한 이후에 첨가될 수도 있다.
미셀 제형을 스프레이로 전달하기 위하여, 제형은 에어로졸 분배기로 들어갈 수 있고, 분배기는 추진제로 충진된다. 압력 하에 있는 추진제는 분배기 내에서 액체 형태이다. 성분들의 비율은 수상 및 추진제상이 하나가 되도록, 즉, 하나의 상이 존재하도록, 조정된다. 2가지 상들이 존재한다면, 예컨대, 계량 밸브를 통해 내용물의 일부를 분배하기 전에 분배기를 흔들 필요가 있다. 약학 제제의 분배된 용량은 미세한 스프레이의 계량 밸브로부터 추진된다.
추진제는 수소-함유 염화불화탄소, 수소-함유 불화탄소, 디메틸 에테르 및 디에틸 에테르를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, HFA 134a(1,1,1,2 테트라플루오로에탄)를 이용할 수 있다.
필수 성분들의 특정 농도는 상대적으로 간단한 실험에 의하여 측정될 수 있다. 구강을 통한 흡수를 위해, 주사를 통한 투약량 또는 위장관을 통한 투여를 예컨대, 적어도 2배 또는 3배 증가시키는 것이 종종 바람직하다.
B. 지질 입자
iRNA, 예컨대, 본 발명의 dsRNA는 지질 제형, 예컨대, LNP 또는 기타 핵산-지질 입자 내에 완전히 캡슐화된다.
본원에 사용된 "LNP"라는 용어는 안정한 핵산-지질 입자를 지칭한다. LNP는 양이온성 지질, 비양이온성 지질 및 입자의 응집을 방지하는 지질(예, PEG-지질 콘쥬게이트)을 포함한다. LNP는 이들이 정맥 내(i.v.) 주사 이후에 순환 수명이 연장된 것을 보이며, 원위(예, 투여 부위로부터 물리적으로 분리된 부위들)에서 축적되기 때문에 전신적인 응용에 극히 유용하다. LNP는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 00/03683호에서 설명된 캡슐화된 축합제-핵산 복합체를 포함하는 "pSPLP"를 포함한다. 본 발명의 입자는 통상적으로 약 50 nm 내지 약 150 nm, 더 통상적으로는 약 60 nm 내지 약 130 nm, 더 통상적으로는 약 70 nm 내지 약 110 nm, 가장 통상적으로는 약 70 nm 내지 약 90 nm의 평균 직경을 가지며, 실질적으로는 비독성이다. 또한, 핵산이 본 발명의 핵산-지질 입자 내에 존재하는 경우, 핵산은 수용액 내에서 뉴클레아제로 분해되는 것에 내성이 있다. 핵산-지질 입자 및 그 제조 방법은 예컨대, 미국 특허 제5,976,567호; 제5,981,501호; 제6,534,484호; 제6,586,410호; 제6,815,432호; 미국 특허 출원 공개 제2010/0324120호 및 국제 특허 출원 공개 제WO 96/40964호에 개시되어 있다.
일 실시형태에서, 지질 대 약물 비율(질량/질량 비율)(예, 지질 대 dsRNA 비율)은 약 1:1 내지 약 50:1, 약 1:1 내지 약 25:1, 약 3:1 내지 약 15:1, 약 4:1 내지 약 10:1, 약 5:1 내지 약 9:1, 또는 약 6:1 내지 약 9:1의 범위에 있을 것이다. 상기 인용된 범위에 중간인 범위도 본 발명의 일부로 고려된다.
양이온성 지질은 예를 들어, N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드(DDAB), N-(I-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP), N-(I-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), N,N-디메틸-2,3-디올레일옥시)프로필아민(DODMA), 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLenDMA), 1,2-디리놀레일카르바모일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-C-DAP), 1,2-디리놀레이옥시-3-(디메틸아미노)아세톡시프로판(DLin-DAC), 1,2-디리놀레이옥시-3-모르폴리노프로판(DLin-MA), 1,2-디리놀레오일-3-디메틸아미노프로판(DLinDAP), 1,2-디리놀레일티오-3-디메틸아미노프로판(DLin-S-DMA), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLin-2-DMAP), 1,2-디리놀레일옥시-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TMA.Cl), 1,2-디리놀레오일-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염(DLin-TAP.Cl), 1,2-디리놀레일옥시-3-(N-메틸피페라지노)프로판(DLin-MPZ), 또는 3-(N,N-디리놀레일아미노)-1,2-프로판디올(DLinAP), 3-(N,N-디올레일아미노)-1,2-프로판디오(DOAP), 1,2-디리놀레일옥소-3-(2-N,N-디메틸아미노)에톡시프로판(DLin-EG-DMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-DMA) 또는 그 유사체, (3aR,5s,6aS)-N,N-디메틸-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)테트라하이드로-3aH-시클로펜타[d][1,3]디옥솔-5-아민(ALN100), (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트(MC3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(비스(2-히드록시도데실)아미노)에틸)(2-히드록시도데실)아미노)에틸)피페라진-1-일)에틸아자네디일)디도데칸-2-올(Tech G1), 또는 그 혼합물일 수 있다. 양이온 지질은 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 20 몰% 내지 약 50 몰% 또는 약 40 몰%로 포함될 수 있다.
다른 실시형태에서, 화합물 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란을 이용하여 지질-siRNA 나노입자를 제조할 수 있다. 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란의 합성은 본원에 참조로 포함된 2008년 10월 23일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/107,998호에 기술되어 있다.
일 실시형태에서, 지질-siRNA 입자는 63.0 ± 20 nm의 입자 크기 및 0.027 siRNA/지질 비율을 갖는 40% 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란: 10% DSPC: 40% 콜레스테롤: 10% PEG-C-DOMG(몰 퍼센트)를 포함한다.
이온화가능/비-양이온성 지질은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복실레이트(DOPE-말), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일-포스파티딜-에탄올아민(DSPE), 16-O-모노메틸 PE, 16-O-디메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티디에탄올아민(SOPE), 콜레스테롤, 또는 그 혼합물을 포함하지만, 여기에 한정되지 않은 음이온성 지질 또는 중성 지질일 수 있다. 비양이온성 지질은 콜레스테롤이 포함된다면, 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 5 몰% 내지 약 90 몰%, 약 10 몰% 또는 약 58 몰%일 수 있다.
입자의 응집을 억제하는 콘쥬게이트된 지질은 예를 들어, PEG-디아실글리세롤(DAG), PEG-디알킬옥시프로필(DAA), PEG-인지질, PEG-세라미드(Cer) 또는 이들의 혼합물을 포함하지만 여기에 한정되지 않는 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질일 수 있다. PEG-DAA 콘쥬게이트는 예를 들어, PEG-디라우릴옥시프로필(Ci2), PEG-디미리스틸옥시프로필(Ci4), PEG-디팔미틸옥시프로필(Ci6), 또는 PEG-디스테아릴옥시프로필(C18)일 수 있다. 입자의 응집을 방지하는 콘쥬게이트 지질은 입자 내에 존재하는 총 지질의 0 몰% 내지 약 20 몰% 또는 약 2 몰%일 수 있다.
일부 실시형태에서, 핵산-지질 입자는 콜레스테롤을 입자 내에 존재하는 총 지질의 예컨대, 약 10 몰% 내지 약 60 몰% 또는 약 48 몰%로 더 포함한다.
일 실시형태에서, 리피도이드(lipidoid) ND98·4HCl (분자량 1487)(본원에서 참조로 포함되어 있는 2008년 3월 26일에 출원된 미국 특허 출원 번호 12/056,230 호 참조), 콜레스테롤(Sigma-Aldrich) 및 PEG-세라미드 C16(Avanti Polar Lipids)을 이용하여 지질-dsRNA 나노입자(즉, LNP01 입자)를 제조할 수 있다. 각각이 에탄올 내에 용해된 스톡 용액은 하기와 같이 제조될 수 있다: ND98, 133 mg/ml; 콜레스테롤, 25 mg/ml, PEG-세라미드 C16, 100 mg/ml. ND98, 콜레스테롤 및 PEG-세라미드 C16 스톡 용액은 이후 예컨대, 42:48:10 몰 비율로 조합될 수 있다. 조합된 지질 용액은 최종 에탄올 농도가 약 35 내지 45%이고 최종 아세트산 나트륨 농도가 약 100 내지 300 mM가 되도록 수성 dsRNA(예, 아세트산 나트륨 pH 5에서)와 혼합될 수 있다. 지질-dsRNA 나노입자는 통상적으로 혼합시에 자발적으로 형성된다. 소기의 입자 크기 분포에 따라, 이로 생성된 나노입자 혼합물은 예를 들어, Lipex Extruder(Northern Lipids, Inc)와 같은 열배럴 압출기(thermobarrel extruder)를 이용하여 폴리카보네이트막(예, 100 nm 컷-오프(cut-off))을 통해 압출될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 압출 단계는 생략될 수 있다. 에탄올 제거 및 동시적인 완충제 교환은 예를 들어, 투석 또는 접선 유동 여과에 의하여 달성될 수 있다. 완충제은 예를 들어, 인산염 완충 식염수(PBS)와 약 pH 7, 예컨대, 약 pH 6.9, 약 pH 7.0, 약 pH 7.1, 약 pH 7.2, 약 pH 7.3 또는 약 pH 7.4에서 교환될 수 있다.
Figure 112015124918061-pct00033
LNP01 제형은 예컨대, 본원에 참조로 포함된 국제 출원 공개 번호 WO 2008/042973호에 기술되어 있다.
추가의 예시적인 지질-dsRNA 제형은 하기 표 A에 기술되어 있다.
표 A.
Figure 112015124918061-pct00034
Figure 112015124918061-pct00035
DSPC: 디스테아로일포스파티딜콜린
DPPC: 디팔미토일포스파티딜콜린
PEG-DMG: PEG-디디미리스토일 글리세롤(C14-PEG, 또는 PEG-C14) (평균 2000의 몰 wt의 PEG)
PEG-DSG: PEG-디스티릴 글리세롤(C18-PEG, 또는 PEG-C18) (평균 2000의 몰 wt의 PEG)
PEG-cDMA: PEG-카르바모일-1,2-디미리스틸옥시프로필아민(평균 2000의 몰 wt의 PEG)
LNP(1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA))를 포함하는 제형은 본원에 참조로 포함된 2009년 4월 15일에 출원된 국제 공개 번호 WO2009/127060 호에 기술되어 있다.
XTC를 포함하는 제형은 예컨대, 본원에 참조로 포함된, 2009년 1월 29일에 출원된 미국 가출원 계열 번호 61/148,366 호; 2009년 3월 2일에 출원된 미국 가출원 계열 번호 61/156,851 호; 2009년 6월 10일에 출원된 미국 가출원 계열 번호; 2009년 7월 24일에 출원된 미국 가출원 계열 번호 61/228,373 호; 2009년 9월 3일에 출원된 미국 가출원 계열 번호 61/239,686 호 및 2010년 1월 29일에 출원된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2010/022614 호에 기술되어 있다.
MC3을 포함하는 제형은 예컨대, 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된, 2010 년 6월 10일에 출원된 미국 특허 공개 번호 2010/0324120 호에 기술되어 있다.
ALNY-100을 포함하는 제형은 예컨대, 본원에 참조로 포함된, 2009년 11월 10일에 출원된 국제 특허 출원 번호 PCT/US09/63933 호에 기술되어 있다.
C12-200을 포함하는 제형은 본원에 참조로 포함된, 2009년 5월 5일에 출원된 미국 가출원 계열 번호 61/175,770 호 및 2010년 5월 5일에 출원된 국제 출원 번호 PCT/US10/33777 호에 기술되어 있다.
이온화가능/양이온성 지질의 합성
본 발명의 핵산-지질 입자에 사용된 화합물들 중 어느 하나는, 예컨대, 양이온성 지질 등은 실시예에 더 상세히 기술된 방법을 포함하는 알려진 유기 합성 기법에 의하여 제조될 수 있다. 모든 치환기는 달리 지시되지 않으면 하기에 정의된 바와 같다.
"알킬"은 직쇄 또는 분지쇄, 비고리형 또는 고리형인 탄소 원자 1 내지 24 개를 포함하는 포화 지방족 탄화수소를 의미한다. 대표적인 포화 직쇄 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸, n-헥실 등을 포함하는 반면에, 포화된 분지쇄 알킬은 이소프로필, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, 이소펜틸 등을 포함한다. 대표적인 포화 고리형 알킬은 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 등을 포함하는 반면에, 불포화된 고리형 알킬은 시클로펜테닐 및 시클로헥세닐 등을 포함한다.
"알케닐"은 상기에 정의된 바와 같이, 인접 탄소 원자들 사이의 적어도 하나의 이중 결합을 포함하는 알킬을 의미한다. 알케닐은 시스 및 트랜스 이성질체 양쪽 모두를 포함한다. 대표적인 직쇄 및 분지쇄 알케닐은 에틸레닐, 프로필레닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 이소부틸레닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 3-메틸-1-부테닐, 2-메틸-2-부테닐, 2,3-디메틸-2-부테닐 등을 포함한다.
"알키닐"은 상기에 정의된 바와 같이, 인접 탄소들 사이의 적어도 하나의 3중 결합을 더 포함하는 임의의 알킬 또는 알케닐을 의미한다. 대표적인 직쇄 및 분지쇄 알키닐은 아세틸레닐, 프로피닐, 1-부티닐, 2-부티닐, 1-펜티닐, 2-펜티닐, 3-메틸-1 부티닐 등을 포함한다.
"아실"은 임의의 알킬, 알케닐 또는 알키닐을 의미하며, 부착 지점에서의 탄소가 하기에 정의된 바와 같이 옥소기로 치환된다. 예를 들어, -C(=O)알킬, -C(=O)알케닐, 및 -C(=O)알키닐은 아실기이다.
"헤테로사이클"은 포화, 불포화 또는 방향족이며, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2 개의 헤테로원자를 포함하는 5원 내지 7원 모노사이클릭, 또는 7원 내지 10원 바이사이클릭 헤테로사이클릭 고리를 의미하며, 상기 헤테로사이클들 중 어느 하나는 벤젠 고리로 융합되는 바이사이클릭 고리를 포함하여, 질소 및 황 헤테로원자는 선택적으로 산화될 수 있고, 질소 헤테로원자는 선택적으로 사원화(quaternized)될 수 있다. 헤테로사이클은 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자를 통하여 부착될 수 있다. 헤테로사이클은 하기에 정의된 바와 같은 헤테로아릴을 포함한다. 헤테로사이클은 모르폴리닐, 피롤리디노닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페리지닐, 히단토이닐, 발레로락타밀, 옥시라닐, 옥세타닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로피리디닐, 테트라하이드로피리미디닐, 테트라하이드로티오페닐, 테트라하이드로티오피라닐, 테트라하이드로피리미디닐, 테트라하이드로티오페닐, 테트라하이드로티오피라닐 등을 포함한다.
"선택적으로 치환된 알킬", "선택적으로 치환된 알케닐", "선택적으로 치환된 알키닐", "선택적으로 치환된 아실" 및 "선택적으로 치환된 헤테로사이클"이라는 용어는 치환되는 경우, 적어도 하나의 수소 원자가 치환기로 대체되는 것을 의미한다. 옥소 치환기(=O)의 경우, 2 개의 수소 원자들이 대체된다. 이런 점에 있어서, 치환기는 옥소, 할로겐, 헤테로사이클, -CN, -ORx, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry, -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx 및 -SOnNRxRy을 포함하며, n은 0, 1 또는 2이고, Rx 및 Ry은 동일하거나 상이하고 독립적으로 수소, 알킬 또는 헤테로사이클이며, 상기 알킬 및 헤테로사이클 치환기들의 각각은 옥소, 할로겐, -OH, -CN, 알킬, -ORx, 헤테로사이클, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry, -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx 및 -SOnNRxRy 중 하나 이상으로 더 치환될 수 있다.
"할로겐"은 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 의미한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 보호기의 사용을 필요로 할 수 있다. 보호기 방법론은 당업자에게 주지되어 있다(예를 들어, 문헌[Protective Groups in Organic Synthesis, Green, T.W. 등, Wiley-Interscience, New York City, 1999] 참조). 요컨대, 본 발명의 문맥 내에서 보호기는 기능기의 원하지 않은 반응성을 감소시키거나 제거하는 임의의 기이다. 보호기는 기능기에 첨가되어 특정 반응 도중에 그 반응성을 감추고, 이후 제거되어 최초 기능기를 드러낼 수 있다. 일부 실시형태에서, "알코올 보호기"가 사용된다. "알코올 보호기"는 알코올 기능기의 원하지 않는 반응성을 감소시키거나 제거하는 임의의 기이다. 보호기는 업계에 주지된 기법을 이용하여 첨가되고 제거될 수 있다.
화학식 A의 합성
일부 실시형태에서, 본 발명의 핵산-지질 입자는 식 A의 양이온성 지질을 이용하여 공식화된다:
Figure 112015124918061-pct00036
여기서, R1 및 R2는 독립적으로 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 각각은 선택적으로 치환될 수 있으며, R3 및 R4는 독립적으로 저급 알킬이거나 R3 및 R4는 함께 취하여 선택적으로 치환된 헤테로사이클릭 고리를 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 XTC(2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란)이다. 일반적으로, 상기 화학식 A의 지질은 달리 지시되지 않으면 모든 치환기가 상기 정의된 바와 같은, 하기 반응식 1 또는 2에 의하여 제조될 수 있다.
반응식 1
Figure 112015124918061-pct00037
R1 및 R2는 독립적으로 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 각각이 선택적으로 치환될 수 있으며, R3 및 R4는 독립적으로 저급 알킬이거나, R3 및 R4는 함께 취하여 선택적으로 치환된 헤테로사이클릭 고리를 형성할 수 있는 지질 A는 반응식 1에 따라 제조될 수 있다. 케톤 1 및 브롬화물 2는 구입되거나 당업자에게 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 1 및 2의 반응으로 케탈 3을 산출한다. 케탈 3을 아민 4로 처리하면 식 A의 지질을 산출한다. 식 A의 지질은 식 5의 유기염을 갖는 해당 암모늄 염으로 변환될 수 있으며, X는 할로겐, 수산화물, 포스페이트, 설페이트 등으로부터 선택된 음이온 반대 이온이다.
반응식 2
Figure 112015124918061-pct00038
대안적으로, 케톤 1 시작 물질은 반응식 2에 따라 제조될 수 있다. 그리냐르 시약 6 및 시안화물 7은 구입되거나 당업자에게 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 6 및 7의 반응은 케톤 1을 산출한다. 케톤 1의 식 A의 해당 지질로의 변환은 반응식 1에 기술된 바와 같다.
MC3의 합성
DLin-M-C3-DMA(즉, (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노)부타노에이트)의 제조는 다음과 같다. 디클로로메탄(5 mL)에 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-올(0.53 g), 4-N,N-디메틸아미노부티르산 염산염(0.51 g), 4-N,N-디메틸아미노피리딘(0.61 g) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(0.53 g)을 용해시킨 용액을 실온에서 하룻밤 동안 교반시켰다. 용액은 묽은 염산으로 세척하고 묽은 수성 중탄산 나트륨으로 세척하였다. 유기 분획을 무수 황산 마그네슘 상에서 건조하고, 여과하며 용매를 로타베이퍼(rotavap) 상에서 제거하였다. 잔사는 1 내지 5% 메탄올/디클로로메탄 용리 구배를 이용하여 실리카 겔 칼럼(20 g)으로 통과시켰다. 정제된 생성물을 포함하는 분획을 조합하고 용매를 제거하여 무색의 오일(0.54 g)을 산출하였다.
ALNY-100의 합성
케탈 519[ALNY-100]의 합성은 하기 반응식 3을 이용하여 수행되었다:
Figure 112015124918061-pct00039
515의 합성
2 구 RBF(1 L) 내의 200 ml 무수 THF에 LiAlH4 (3.74 g, 0.09852 mol)의 교반된 현탁액에 THF 70 mL에 514(10 g, 0.04926 mol)을 용해시킨 용액을 0℃의 질소 분위기 하에서 천천히 첨가하였다. 완전히 첨가한 이후에, 반응 혼합물을 실온으로 가온하고 이후 4시간 동안 환류 가열하였다. 반응의 진행은 TLC로 모니터링하였다. (TLC에 의한) 반응의 완료 이후에, 혼합물은 0℃로 냉각하였으며, 포화 Na2SO4 용액을 조심스럽게 첨가하여 ??칭하였다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하고 여별하였다. 잔사를 THF로 충분히 세척하였다. 여과액 및 세척액을 혼합하고, 400 mL 디옥산 및 26 mL의 진한 HCl로 희석하고, 실온에서 20 분 동안 교반하였다. 휘발 성분들을 진공 하에서 제거하여 백색 고체로서 515의 염산염을 생성하였다. 수율: 7.12 g 1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ= 9.34 (broad, 2H), 5.68 (s, 2H), 3.74 (m, 1H), 2.66-2.60 (m, 2H), 2.50-2.45 (m, 5H).
516의 합성
250 mL 2 구 RBF 내의 100 mL 무수 DCM에 화합물 515를 용해시킨 교반된 용액에 NEt3(37.2 mL, 0.2669 mol)을 첨가하고 질소 분위기 하에서 0℃로 냉각하였다. N-(벤질옥시-카르보닐옥시)-숙신이미드(20 g, 0.08007 mol)를 50 mL 무수 DCM에 천천히 첨가한 이후에, 반응 혼합물을 실온으로 가온하였다. (TLC에 의하여 2시간 내지 3시간) 반응을 완료한 이후에, 혼합물을 1 N HCl 용액(1 x 100 mL) 및 포화 NaHCO3 용액(1 x 50 mL)으로 연속적으로 세척하였다. 이후, 유기층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고 용매를 증발시켜 미정제 물질을 생성하고, 이를 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의하여 정제하여 끈적한 덩어리로서 516을 얻었다. 수율: 11g (89%). 1H-NMR (CDCl3, 400MHz): δ = 7.36-7.27(m, 5H), 5.69 (s, 2H), 5.12 (s, 2H), 4.96 (br., 1H) 2.74 (s, 3H), 2.60(m, 2H), 2.30-2.25(m, 2H). LC-MS [M+H] -232.3 (96.94%).
517A 및 517B의 합성
시클로펜텐 516(5g, 0.02164 mol)을 단일 구 500 mL RBF 내의 220 mL 아세톤 및 물(10:1)의 용액에 용해시키고, 여기에 N-메틸 모르폴린-N-옥사이드(7.6 g, 0.06492 mol)를 첨가하고, 실온에서 tert-부탄올에 용해시킨 OsO4(0.275 g, 0.00108 mol)의 7.6% 용액 4.2 mL를 첨가하였다. 반응(약 3시간)을 완료한 이후에, 혼합물을 고체 Na2SO3를 첨가하여 ??칭하고, 이로 생성된 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM(300 mL)로 희석시키고 물(2 x 100 mL)로 세척하고, 이후 포화 NaHCO3(1 x 50 mL) 용액, 물(1 x 30 mL)로 세척하고, 마지막으로 염수(1 x 50 mL)로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 용매를 진공 중에 제거하였다. 미정제 물질의 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 정제로 부분 입체 이성질체의 혼합물을 생성하였고, 이를 예비 고성능 액체 크로마토그래피로 분리하였다. 수율: - 6 g 미정제
517A - 피크-1 (백색 고체), 5.13 g (96%). 1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ= 7.39-7.31(m, 5H), 5.04(s, 2H), 4.78-4.73 (m, 1H), 4.48-4.47(d, 2H), 3.94-3.93(m, 2H), 2.71(s, 3H), 1.72-1.67(m, 4H). LC-MS - [M+H]-266.3, [M+NH4 +]-283.5 존재, HPLC-97.86%. 입체화학을 X-선으로 확인하였다.
518의 합성
화합물 505의 합성에 대해 기술된 절차와 유사한 절차를 이용하여, 무색 오일로서 화합물 518(1.2 g, 41%)을 얻었다. 1H-NMR (CDCl3, 400MHz): δ= 7.35-7.33(m, 4H), 7.30-7.27(m, 1H), 5.37-5.27(m, 8H), 5.12(s, 2H), 4.75(m,1H), 4.58-4.57(m,2H), 2.78-2.74(m,7H), 2.06-2.00(m,8H), 1.96-1.91(m, 2H), 1.62(m, 4H), 1.48(m, 2H), 1.37-1.25(br m, 36H), 0.87(m, 6H). HPLC-98.65%.
화합물 519의 합성을 위한 일반 절차
헥산(15 mL)에 화합물 518(1 당량)을 용해시킨 용액을 LAH를 THF(1 M, 2 당량)에 용해시킨 냉각된 용액에 적하 방식으로 첨가하였다. 완전히 첨가한 이후에, 혼합물을 40℃에서 0.5시간에 걸쳐서 가열하고, 이후 얼음조상에서 다시 냉각시켰다. 혼합물을 포화 수성 Na2SO4으로 조심스럽게 가수분해시키고 이후 셀라이트를 통해 여과시키고, 오일이 되게 하였다. 칼럼 크로마토그래피로 인하여 순수한 519(1.3 g, 68%)가 제공되고, 순수한 519는 무색 오일로 수득되었다. 13C NMR δ = 130.2, 130.1 (x2), 127.9 (x3), 112.3, 79.3, 64.4, 44.7, 38.3, 35.4, 31.5, 29.9 (x2), 29.7, 29.6 (x2), 29.5 (x3), 29.3 (x2), 27.2 (x3), 25.6, 24.5, 23.3, 226, 14.1; 전기분무 MS (+ve): C44H80NO2 (M + H)+에 대한 분자량 계산값. 654.6, 실제값 654.6.
표준 또는 무압출(extrusion-free) 방법에 의해 제조된 제형은 유사한 방식으로 특징될 수 있다. 예를 들어, 제형은 통상적으로 육안 검사에 의해 특징된다. 이들은 응집체 또는 침전물이 없는 약간 흰색의 반투명 용액이어야 한다. 지질-나노입자의 입자 크기 및 입자 크기 분포는 예를 들어, 맬번 제타사이저 나노 ZS(맬번, 미국)을 이용하여 광산란에 의하여 측정될 수 있다. 입자는 크기가 40 내지 100 nm인 것과 같이 약 20 내지 300 nm이어야 한다. 입자 크기 분포는 단봉형이어야 한다. 트랩된 분율뿐만 아니라 제형 내의 총 dsRNA 농도는 염색 배제 분석법을 이용하여 추정한다. 제형화된 dsRNA의 표본은 예컨대, 0.5% 트리톤-X100과 같은 계면활성제를 파열시키는 제형의 존재 또는 부재 하에 리보그린(Molecular Probes)과 같은 RNA-결합 염료와 함께 배양될 수 있다. 제형 내의 총 dsRNA는 표준 곡선에 대하여 계면활성제를 포함하는 표본으로부터 나온 신호에 의하여 결정될 수 있다. 트랩된 분율은 (계면활성제의 부재 하의 신호에 의해 측정되는 바와 같이) 총 dsRNA 함량으로부터 "유리(free)" dsRNA 함량을 차감함으로써 결정된다. 트랩된 dsRNA 퍼센트는 통상적으로 85%를 초과한다. LNP 제형에 대하여, 입자 크기는 적어도 30 nm, 적어도 40 nm, 적어도 50 nm, 적어도 60 nm, 적어도 70 nm, 적어도 80 nm, 적어도 90 nm, 적어도 100 nm, 적어도 110 nm, 및 적어도 120 nm이다. 적당한 범위는 통상적으로 약 적어도 50 nm 내지 약 적어도 110 nm, 약 적어도 60 nm 내지 약 적어도 100 nm, 또는 약 적어도 80 nm 내지 약 적어도 90 nm이다.
경구 투여용 조성물 및 제형은 분말 또는 과립, 마이크로미립자, 나노미립자, 물 또는 비수성 매질 내의 현탁액 또는 용액, 캡슐, 젤 캡슐, 향낭, 정제 또는 미니정제를 포함한다. 증점제, 풍미제, 희석제, 유화제, 분산 조제 또는 결합제는 바람직할 수 있다. 일부 실시형태에서, 경구 제형은 본 발명에서 특징된 dsRNA가 하나 이상의 침투 향상제 계면활성제 및 킬레이트제와 함께 투여되는 경구 제형이다. 적당한 계면활성제는 지방산 및/또는 이들의 에스테르 또는 염, 이들의 담즙산 및/또는 염을 포함한다. 적당한 담즙산/염은 케노데옥시콜산(CDCA) 및 우르소데옥시케노데옥시콜산(UDCA), 콜산, 데하이드로콜산, 데옥시콜산, 글루콜산, 글리콜산, 글리코데옥시콜산, 타우로콜산, 타우로데옥시콜산, 나트륨 타우로-24,25-디하이드로-푸시데이트 및 나트륨 글리코디하이드로푸시데이트를 포함한다. 적당한 지방산은 아라키돈산, 운데칸산, 올레산, 라우르산, 카프릴산, 카프르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인, 디라우린, 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자시클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린, 또는 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 그 약학적으로 허용 가능한 염(예, 나트륨)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 담즙산/염과 조합된 지방산/염과 같은 침투 향상제의 조합이 이용된다. 예시적인 일 조합은 라우르산, 카프르산 및 UDCA의 나트륨 염이다. 다른 침투 향상제는 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르를 포함한다. 본 발명에서 특징된 dsRNA는 스프레이된 건조 입자를 포함하여 과립 형태로 경구적으로 전달되거나 복합화되어 마이크로 또는 나노입자를 형성할 수 있다. dsRNA 복합화제는 폴리아미노산; 폴리이민; 폴리아크릴레이트; 폴리알킬아크릴레이트, 폴리옥세탄, 폴리알킬시아노아크릴레이트; 양이온화 젤라틴, 알부빈, 전분, 아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 전분; 폴리알킬시아노아크릴레이트; DEAE-유도체화된 폴리이민, 풀루란, 셀룰로오스 및 전분을 포함한다. 적당한 복합화제는 키토산, N-트리메틸키토산, 폴리-L-라이신, 폴리히스티딘, 폴리오르니틴, 폴리스페르민, 프로타민, 폴리비닐피리딘, 폴리티오디에틸아미노메틸에틸렌 P(TDAE), 폴리아미노스티렌(예, p-아미노), 폴리(메틸시아노아크릴레이트), 폴리(에틸시아노아크릴레이트), 폴리(부틸시아노아크릴레이트), 폴리(이소부틸시아노아크릴레이트), 폴리(이소헥실시아노아크릴레이트), DEAE-메타크릴레이트, DEAE-헥실아크릴레이트, DEAE-아크릴아미드, DEAE-알부민 및 DEAE-덱스트란, 폴리메틸아크릴레이트, 폴리헥실아크릴레이트, 폴리(D,L-락트산), 폴리(DL-락틱-코-글리콜산(PLGA), 알기네이트, 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 포함한다. dsRNA용 경구 제형 및 그 제제는 그 각각이 본원에 참조로 포함된, 미국 특허 제6,887,906호, 미국 특허 공개 제20030027780호 및 미국 특허 제6,747,014호에 상세히 기술되어 있다.
비경구, (뇌로의) 실질세포 내, 척수강 내, 뇌실 내 또는 간 내 투여용 조성물 및 제형은 완충제, 희석제, 및 침투 향상제, 담체 화합물 및 기타 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제와 같은, 그러나 여기에 한정되지 않은 기타 적당한 첨가제도 포함할 수 있는 살균 수용액을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 용액, 에멀젼 및 리포솜-함유 제형을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 이 조성물은 사전형성된 액체, 자가-유화 고체 및 자가-유화 반고체를 포함하지만, 여기에 한정되지 않은 다양한 성분으로부터 생성될 수 있다. 간 암종과 같은 간 질환을 치료하는 경우 간을 표적하는 제형이 특히 바람직하다.
단위 제형으로 간편하게 제시될 수 있는, 본 발명의 약학적 제제는 제약 업계에 주지된 종래 기법에 따라 제조될 수 있다. 그러한 기법으로는 활성 성분을 약학적 담체(들) 또는 부형제(들)과 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 활성 성분을 액체 담체 또는 미세 분할된 고체 담체 또는 양쪽 모두와 균일하고 밀접하게 회합시키고 이후 필요하다면, 생성물을 형상화함으로써 제조된다.
본 발명의 조성물은 정제, 캡슐, 젤 캡슐, 액체 시럽, 연질 젤, 좌약 및 관장제와 같은, 그러나 여기에 한정되지 않은 수많은 가능한 제형 중 어느 하나로 제형화될 수 있다. 본 발명의 조성물은 수성, 비수성 또는 혼합 매질 내의 현탁액으로 제형화될 수도 있다. 수성 현탁액은 예를 들어, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 포함하는 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 더 포함할 수 있다. 현탁액은 안정화제를 포함할 수도 있다.
C. 추가 제형
i. 에멀젼
본 발명의 조성물은 에멀젼으로 제조 및 제형화될 수 있다. 에멀젼은 통상적으로 직경이 보통 0.1 μm를 초과하는 소적의 형태로 하나의 액체를 다른 액체에 분산시킨 이종 시스템이다(예, 문헌[Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8판), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi 등, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301] 참조). 에멀젼은 종종 서로 밀접하게 혼합되고 분산된 2개의 혼합되지 않는 액체상을 포함하는 2상계이다. 일반적으로, 에멀젼은 유중수(w/o) 또는 수중유(o/w) 종류일 수 있다. 수상이 크기가 큰 유상으로 미세하게 분할되고 미세한 소적으로 분산되는 경우, 이로 인한 조성물은 유중수(w/o) 에멀젼이라고 불린다. 대안적으로, 유상이 크기가 큰 수상으로 미세하게 분할되고 미세한 소적으로 분산되는 경우, 이로 인한 조성물은 수중유(o/w) 에멀젼이라고 불린다. 에멀젼은 분산된 상 및 수상, 유상의 용액으로 또는 분리상으로서 자체적으로 존재할 수 있는 활성 약물에 더하여 추가적인 성분을 포함할 수 있다. 유화제, 안정화제, 염료 및 항산화제와 같은 약학적 부형제는 필요하다면 에멀젼에 존재할 수도 있다. 약학적 에멀젼은 예를 들어, 유중수중유(o/w/o) 및 수중유중수(w/o/w) 에멀젼의 경우에서와 같이 2 상을 초과하여 구성된 다중 에멀젼일 수도 있다. 그러한 복합체 제형은 종종 단순 2상 에멀젼이 제공하지 않는 특정 장점을 제공한다. o/w 에멀젼의 개별 유성 소적이 작은 물 소적을 둘러싸는 복수의 에멀젼들은 w/o/w 에멀젼을 구성한다. 마찬가지로, 유성 연속상 내에 안정화된 물의 소구체립에 둘러싸인 유성 소적의 시스템은 o/w/o 에멀젼을 제공한다.
에멀젼은 열역학적 안정성이 거의 없거나 열역학적 안정성이 전혀 없는 것에 의하여 특징된다. 종종, 에멀젼의 분산되거나 불연속적 상은 외부 또는 연속상으로 잘 분산되며, 유화제의 이용을 통하거나 제형의 점도를 통해 이 형태로 유지된다. 에멀젼의 상 중 어느 하나는 에멀젼-스타일 연고 베이스 및 크림의 경우에서 처럼, 반고체 또는 고체일 수 있다. 에멀젼을 안정화시키는 다른 수단은 에멀젼의 어느 상으로 포함될 수 있는 유화제의 이용을 수반한다. 유화제는 합성 계면활성제, 자연발생적 유화제, 흡수 베이스 및 미세하게 분산된 고체의 4 개 카테고리로 넓게 분류될 수 있다(예, 문헌[Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8판), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199] 참조).
표면 활성제라고도 알려진 합성 계면활성제는 에멀젼의 제형에서 광범위한 적용가능성을 찾으며 문헌에서 검토되었다(예, 문헌[Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8판), New York, NY; Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199] 참조). 계면활성제는 통상적으로 양친매성이며 친수성 및 소수성 부분을 포함한다. 계면활성제의 친수성 대 소수성의 비율은 친수성/친지방성 균형(HLB)라고 칭하며 제형의 제조에서 계면활성제를 분류하고 선택하는데 있어서 가치있는 도구이다. 계면활성제는 친수성기의 성질에 기초하여 상이한 클래스로 분류될 수 있다: 비이온성, 음이온성, 양이온성 및 양쪽성(예, 문헌[Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8판), New York, NY Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285에서 참조).
에멀젼 제형에 이용되는 자연발생적 유화제는 라놀린, 밀랍, 인지질, 레시틴 및 아카시아를 포함한다. 흡수 베이스는 친수성을 소지하여, 이들이 물을 흡수하여 w/o 에멀젼을 형성하지만, 무수 라놀린 및 친수성 광유(petrolatum)와 같은 이들의 반고체 연경도(consistencies)를 유지할 수 있다. 미세하게 분할된 고체는 특히 계면활성제와의 조합에서, 그리고 점성 제제에 있어서 양호한 유화제로서 이용되기도 한다. 이것은 중금속 수산화물과 같은 극성 무기 고체, 벤토나이트, 아타풀자이트, 헥토라이트, 고령토, 몬모릴로나이트, 콜로이드성 알루미늄 실리케이트 및 콜로이드성 마그네슘 알루미늄 실리케이트와 같은 비-팽윤성 점토, 안료 및 탄소 또는 글리세릴 트리스테아레이트와 같은 비극성 고체를 포함한다.
대단히 다양한 비-유화 물질들도 에멀젼 제형에 포함되며 에멀젼의 특성에 기여한다. 이들은 지방, 오일, 왁스, 지방산, 지방 알코올, 지방 에스테르, 보습제, 친수성 콜로이드, 보존제 및 항산화제를 포함한다(문헌[Block, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199]).
친수성 콜로이드 또는 수성콜로이드는 다당류(예를 들어, 아카시아, 아가, 알긴산, 카라기난, 구아검, 카라야검 및 트라가칸트), 셀룰로오스 유도체(예를 들어, 카르복시메틸셀룰로오스 및 카르복시프로필셀룰로오스) 및 합성 중합체(예를 들어, 카르보머, 셀룰로오스 에테르 및 카르복시비닐 중합체)와 같은 자연발생적 검 및 합성 중합체를 포함한다. 이들은 물에서 분산하거나 팽창하여 분산된 상의 소적 주위에 강한 계면 필름을 형성하고 외부상의 점도를 증가시킴으로써 에멀젼을 안정화시키는 콜로이드성 용액을 형성한다.
에멀젼은 종종 미생물의 성장을 용이하게 지지할 수 있는 탄수화물, 단백질, 스테롤 및 인지질과 같은 많은 성분을 포함하기 때문에, 이러한 제형은 종종 보존제를 포함한다. 에멀젼 제형에 포함되는 흔히 이용되는 보존제는 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 4급 암모늄 염, 염화 벤잘코늄, p-히드록시벤조산의 에스테르 및 붕산을 포함한다. 항산화제도 에멀젼 제형에 흔히 추가되어 제형의 열화를 방지한다. 이용된 항산화제는 토코페롤과 같은 유리 라디칼 스캐빈저, 알킬 갈레이트, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 또는 아스코르브산 및 메타중아황산 나트륨과 같은 환원제, 및 시트르산, 주석산 및 레시틴과 같은 항산화 상승제일 수 있다.
피부, 경구 및 비경구 경로를 통한 에멀젼 제형의 응용 및 그 제조법은 문헌에서 되었다(예, 문헌[Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8 판), New York, NY; Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199] 참조). 경구 전달용 에멀젼 제형은 흡수 및 생물이용도 관점에서 효능뿐만 아니라 제형의 용이성으로 인하여 매우 광범위하게 이용되었다(예, 문헌[Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8 판), New York, NY; Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245에서; Idson, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p.199] 참조). 광유 베이스 완하제, 유용성 비타민 및 고지방 영양 제제는 o/w 에멀젼으로 경구로 흔히 투여되는 물질들이다.
ii. 마이크로에멀젼
본 발명의 일 실시형태에서, iRNA 및 핵산의 조성물은 마이크로에멀젼으로 제형화된다. 마이크로에멀젼은 단일 광학적 등방성이며 열역학적으로 안정한 액체 용액인 물, 기름 및 양친매성 물질의 시스템으로 정의될 수 있다(예, 문헌[Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8 판), New York, NY; Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245] 참조). 통상적으로 마이크로에멀젼은 우선 오일을 수성 계면활성제 용액에 분산시킨 후 일반적으로, 중간 사슬-길이 알코올인 제4 성분의 충분량을 첨가하여 투명 시스템을 형성하여 제조되는 시스템이다. 그러므로, 마이크로에멀젼은 표면-활성 분자의 계면 필름에 의하여 안정화된 2 개의 비혼화성 액체의 열역학적으로 안정하고 등방성으로 맑은 분산액으로 기술되었다(문헌[Leung and Shah, Controlled Release of Drugs에서: 중합체s and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215]). 마이크로에멀젼은 오일, 물, 계면활성제, 공계면활성제 및 전해질을 포함하는 3 내지 5 개의 성분의 조합을 통해 흔히 제조된다. 마이크로에멀젼이 유중수(w/o) 또는 수중유(o/w) 형인지의 여부는 이용된 오일 및 계면활성제의 성질에 의존하며, 계면활성제 분자의 극성 머리 및 탄화수소 꼬리의 구조 및 기하학적인 패킹에 의존한다(문헌[Schott, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271]).
상 다이아그램을 활용하는 현상학적 접근법은 광범위하게 연구되었으며, 마이크로에멀젼을 제형화하는 방법의 폭넓은 지식을 당업자에게 부여하였다(예, 문헌[Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8 판), New York, NY; Rosoff, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245에서; Block, Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335] 참조). 종래 에멀젼과 비교하여, 마이크로에멀젼은 자발적으로 형성되는 열역학적으로 안정한 소적의 제형에 있어서 수-불용성 약물을 가용화하는 장점을 제공한다.
마이크로에멀젼의 제조에 이용되는 계면활성제는 이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, Brij 96, 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르, 폴리글리세롤 지방산 에스테르, 테트라글리세롤 모노라우레이트(ML310), 테트라글리세롤 모노올리에이트(MO310), 헥사글리세롤 모노올리에이트(PO310), 헥사글리세롤 펜타올리에이트(PO500), 데카글리세롤 모노카프레이트(MCA750), 데카글리세롤 모노올리에이트(MO750), 데카글리세롤 세퀴올리에이트(SO750), 데카글리세롤 데카올리에이트(DAO750)를 단독으로 또는 공계면활성제와 조합하여 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 에탄올, 1-프로판올 및 1-부탄올과 같은 주로 단쇄 알코올인 공계면활성제는 계면활성제 분자들 사이에서 발생된 빈 공간으로 인하여 계면활성제 필름으로 침투하고 그에 따라 무질서한 필름을 생성함으로써 계면 유동성을 증가시키는 역할을 한다. 그러나, 마이크로에멀젼은 업계에 알려진 공계면활성제 및 무알코올 자가-유화 마이크로에멀젼 시스템의 이용 없이 제조될 수 있다. 수상은 통상적으로는 물, 약물의 수용액, 글리세롤, PEG300, PEG400, 폴리글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜의 유도체일 수 있지만, 여기에 한정되지 않는다. 유상은 Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, 지방산 에스테르, 중간 사슬 (C8-C12) 모노, 디, 및 트리-글리세리드, 폴리옥시에틸화 글리세릴 지방산 에스테르, 지방 알코올, 폴리글리콜화 글리세리드, 포화 폴리글리콜화 C8-C10 글리세리드, 식물성유 및 실리콘유와 같은 물질을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
마이크로에멀젼은 약물 용해화 및 약물의 향상된 흡수의 관점에서 특히 관심의 대상이 된다. (o/w 및 w/o)인 지질계 마이크로에멀젼은 펩티드를 포함하는, 약물의 경구 생물이용도를 향상시키는 것으로 제안되었다(예, 미국 특허 제6,191,105호; 제7,063,860호; 제7,070,802호; 제7,157,099호; 문헌[Constantinides 등, Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205] 참조). 마이크로에멀젼은 개선된 약물 용해화, 약물을 효소적 가수분해로부터 보호, 막 유동성 및 침투성에서 계면활성제-유도된 변경으로 인한 약물 흡수의 가능한 향상, 제조의 용이성, 고체 제형에 비해 경구 투여의 용이성, 개선된 임상적 역가 및 감소된 독성의 장점을 부여한다(예, 미국 특허 제6,191,105호; 제7,063,860호; 제7,070,802호; 제7,157,099호; 문헌[Constantinides 등, Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho 등, J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143] 참조). 종종, 마이크로에멀젼은 그 구성성분들이 주위 온도에서 함께 도입되는 경우 자발적으로 형성될 수 있다. 이는 불안정성 약물, 펩티드 또는 iRNA를 제형화하는 경우 특히 장점이 될 수 있다. 마이크로에멀젼은 화장품 및 약학적 응용에 있어서 활성 성분들의 경피적 전달에서 효과적이기도 하다. 본 발명의 마이크로에멀젼 조성물 및 제형은 iRNA 및 핵산의 국소 세포 흡수를 개선시킬뿐 아니라, 위장관으로부터 iRNA 및 핵산의 증가된 전신 흡수를 촉진할 것이라고 기대된다.
본 발명의 마이크로에멀젼은 소르비탄 모노스테아레이트(Grill 3), 라브라졸(Labrasol), 및 침투 향상제와 같은 추가적인 구성성분 및 첨가제도 함유하여 제형의 특성을 개선시키고 본 발명의 iRNA 및 핵산의 흡수를 향상시킬 수 있다. 본 발명의 마이크로에멀젼에 이용된 침투 향상제는 다섯 개의 광범위한 범주- 계면활성제, 지방산, 담즙산염, 킬레이트제 및 비킬레이트 비계면활성제 중 하나에 속하는 것으로 분류될 수 있다(문헌[Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92]). 이들 클래스의 각각은 상기에서 토의되었다.
iii. 미세입자
본 발명의 RNAi 작용제는 입자, 예컨대, 미세입자로 포함될 수 있다. 미세입자는 스프레이-건조에 의하여 생성될 수 있지만, 동결 건조, 증발, 유동층 건조, 진공 건조 또는 이 기법들의 조합을 포함하는 기타 방법에 의하여 생성될 수도 있다.
iv. 침투 향상제
일 실시형태에서, 본 발명은 다양한 침투 향상제를 채용하여 동물의 피부에 핵산, 특히 iRNA를 효율적으로 전달한다. 대부분의 약물들은 이온화 및 비이온화 형태 양쪽 모두로 용액 내에 존재한다. 그러나, 주로 지질 용해성 또는 친지방성 약물은 세포막을 용이하게 관통한다. 심지어 비친지방성 약물은 관통되는 막이 침투 향상제로 처리되면 세포막을 관통할 수 있다는 것을 알게 되었다. 세포막을 통과하여 비친지방성 약물의 확산을 돕는 것뿐만 아니라, 침투 향상제는 친지방성 약물의 침투성도 향상시킨다.
침투 향상제는 다섯 개의 광범위한 범주, 즉, 계면활성제, 지방산, 담즙산염, 킬레이트제 및 비킬레이트 비계면활성제 중 하나에 속하는 것으로 분류될 수 있다(예, 문헌[Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92] 참조). 상기 언급된 침투 향상제의 클래스들의 각각은 하기에 더 상세히 기술된다.
계면활성제(또는 "표면-활성제")는 수용액에 용해되는 경우, 용액의 표면 장력 또는 수용액 및 다른 액체 사이의 계면 장력을 감소시켜 점막을 통해 iRNA의 흡수가 향상되는 화학적 실체이다. 담즙산염 및 지방산에 더하여, 이러한 침투 향상제는 예를 들어, 나트륨 라우릴 설페이트, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르 및 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르(예, 문헌[Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92] 참조); 및 FC-43과 같은 수소를 불소로 치환한 화합물의 에멀젼을 포함한다(문헌[Takahashi 등, J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252]).
침투 향상제로 작용하는 다양한 지방산 및 이들의 유도체는 예를 들어, 올레산, 라우르산, 카프르산(n-데카노산), 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인(1-모노올레오일-락-글리세롤), 디라우린, 카프릴산, 아라키돈산, 글리세롤 1-모노카프레이트, 1-도데실아자시클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린, 이의 C1-20 알킬 에스테르(예, 메틸, 이소프로필 및 t-부틸), 및 이의 모노글리세리드 및 디글리세리드(즉, 올리에이트, 라우레이트, 카프레이트, 미리스테이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 리놀리에이트 등)을 포함한다(예, 문헌[Touitou, E., 등. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri 등, J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654] 참조).
담즙의 생리학적 역할은 지질 및 지용성 비타민의 분산 및 흡수의 촉진을 포함한다(예, 문헌[Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman 등. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935] 참조). 다양한 천연 담즙산염 및 이들의 합성 유도체는 침투 향상제로서 작용한다. 따라서, "담즙산염"이라는 용어는 담즙의 합성 유도체 중 어느 하나뿐만 아니라 담즙의 자연발생적 구성성분중 어느 하나를 포함한다. 적당한 담즙산염은 예를 들어, 콜산(또는 그 약학적으로 허용 가능한 나트륨염, 나트륨 콜레이트), 디하이드로콜린산(나트륨 디하이드로콜레이트), 데옥시콜린산(나트륨 데옥시콜레이트), 글루콜산(나트륨 글루콜레이트), 글리콜산(나트륨 글리콜레이트), 글리코데옥시콜린산(나트륨 글리코데옥시콜레이트), 타우로콜린산(나트륨 타우로콜레이트), 타우로데옥시콜산(나트륨 타우로데옥시콜레이트), 케노데옥시콜린산(나트륨 케노데옥시콜레이트), 우르소데옥시콜산(UDCA), 나트륨 타우로-24,25-디하이드로-푸시데이트(STDHF), 나트륨 글리코디하이드로푸시데이트 및 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르(POE) (예, 문헌[Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 판, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto 등, J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita 등, J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583] 참조)를 포함한다.
본 발명과 연관하여 이용되는 킬레이트제는 금속 이온과 함께 복합체를 형성함으로써 용액으로부터 금속 이온을 제거하여 점막을 통해 iRNA의 흡수가 향상시키는 화합물로 정의될 수 있다. 본 발명에서 침투 향상제로의 이용에 대하여, 킬레이트제는 대부분의 특징이되는 DNA 뉴클레아제는 촉매작용에 대한 2가 금속 이온을 필요로 하며, 따라서 킬레이트제에 의하여 억제되므로 DNase 억제제로서도 작용하는 추가 장점을 가진다(문헌[Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339]). 적당한 킬레이트제는 디소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트(EDTA), 시트르산, 살리실레이트(예, 나트륨 살리실레이트, 5-메톡시살리실레이트 및 호모바닐레이트), 콜라겐의 N-아실 유도체, 라우레스-9 및 베타-디케톤의 N-아미노 아실 유도체(엔아민)를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다(예, 문헌[Katdare, A. 등, Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee 등, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur 등, J. Control Rel., 1990, 14, 43-51] 참조).
본원에 사용된 바와 같이, 비킬레이트 비계면활성제 침투 향상 화합물은 킬레이트제로서 또는 계면활성제로서 현저하지 않은 활성을 보이지만, 그럼에도 불구하고 영양 점막(alimentary mucosa)를 통해 iRNA의 흡수를 향상시키는 화합물로 정의될 수 있다(예, 문헌[Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33] 참조). 이러한 클래스의 침투 향상제는 예를 들어, 불포화 사이클릭 요소, 1-알킬- 및 1-알케닐아자시클로-알칸온 유도체(Lee 등, 문헌[Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92]); 및 디클로페낙 나트륨, 인도메타신 및 페닐부타존과 같은 비스테로이드성 소염제(문헌[Yamashita 등, J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626])를 포함한다.
세포 수준에서 iRNA의 흡수를 향상시키는 작용제는 본 발명의 약학적 조성물 및 기타 조성물에 첨가될 수도 있다. 예를 들어, 리포펙틴(Junichi 등, 미국 특허 제5,705,188호)과 같은 양이온성 지질, 양이온성 글리세롤 유도체 및 폴리리신(Lollo 등, PCT 출원 WO 97/30731호)과 같은 폴리양이온성 분자는 dsRNA의 세포 흡수를 향상시키는 것으로 알려져 있기도 하다. 상업적으로 이용 가능한 형질감염 시약의 예는 예를 들어, 다른 것들 중에서, Lipofectamine™(Invitrogen; 칼즈배드, 캘리포니아), Lipofectamine 2000™(Invitrogen; 칼즈배드, 캘리포니아), 293fectin™(Invitrogen; 칼즈배드, 캘리포니아), Cellfectin™(Invitrogen; 칼즈배드, 캘리포니아), DMRIE-C™(Invitrogen; 칼즈배드, 캘리포니아), FreeStyle™ MAX(Invitrogen; 칼즈배드, 캘리포니아), Lipofectamine™ 2000 CD(Invitrogen; 칼즈배드, 캘리포니아), Lipofectamine™(Invitrogen; 칼즈배드, 캘리포니아), RNAiMAX(Invitrogen; 칼즈배드, 캘리포니아), Oligofectamine™(Invitrogen; 칼즈배드, 캘리포니아), Optifect™(Invitrogen; 칼즈배드, 캘리포니아), X-tremeGENE Q2 형질감염 시약(Roche; 그렌짜허스트라쎄, 스위스), DOTAP 리포솜 형질감염 시약(그렌짜허스트라쎄, 스위스), DOSPER 리포솜 형질감염 시약(그렌짜허스트라쎄, 스위스), 또는 Fugene(그렌짜허스트라쎄, 스위스), Transfectam
Figure 112015124918061-pct00040
시약(Promega; 매디슨, 위스콘신), TransFast™ 형질감염 시약(Promega; 매디슨, 위스콘신), Tfx™-20 시약(Promega; 매디슨, 위스콘신), Tfx™-50 시약(Promega; 매디슨, 위스콘신), DreamFect™(OZ Biosciences; 마르세유, 프랑스), EcoTransfect(OZ Biosciences; 마르세유, 프랑스), TransPassª D1 형질감염 시약(New England Biolabs; 입시치, 메사추세츠주, 미국), LyoVec™/LipoGen™(Invitrogen; 샌디에고, 캘리포니아, 미국), PerFectin 형질감염 시약(Genlantis; 샌디에고, 캘리포니아, 미국), NeuroPORTER 형질감염 시약(Genlantis; 샌디에고, 캘리포니아, 미국), GenePORTER 형질감염 시약(Genlantis; 샌디에고, 캘리포니아, 미국), GenePORTER 2 형질감염 시약(Genlantis; 샌디에고, 캘리포니아, 미국), Cytofectin 형질감염 시약(Genlantis; 샌디에고, 캘리포니아, 미국), BaculoPORTER 형질감염 시약(Genlantis; 샌디에고, 캘리포니아, 미국), TroganPORTER™ 형질감염 시약(Genlantis; 샌디에고, 캘리포니아, 미국), RiboFect(Bioline; 톤턴, 메사추세츠주, 미국), PlasFect(Bioline; 톤턴, 메사추세츠주, 미국), UniFECTOR(B-Bridge International; 마운틴 뷰, 캘리포니아, 미국), SureFECTOR(B-Bridge International; 마운틴 뷰, 캘리포니아, 미국), 또는 HiFect™(B-Bridge International, 마운틴 뷰, 캘리포니아, 미국)을 포함한다.
기타 작용제를 활용하여 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜, 2-피롤과 같은 피롤, 아존 및 리모넨 및 멘톤과 같은 테르펜을 포함하여, 투여된 핵산의 침투를 향상시킬 수 있다.
v. 담체
본 발명의 특정 조성물은 제형에 담체 화합물도 포함한다. 본원에 사용된 "담체 화합물" 또는 "담체"는 비활성(즉, 그 자체로 생물학적 활성을 가지지 않음)이지만, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 핵산을 분해하거나 순환으로부터 이의 제거를 촉진함으로써 생물학적 활성을 갖는 핵산의 생물이용도를 감소시키는 생체 내 공정에 의하여 핵산으로 인지되는 핵산 또는 이의 유사체를 지칭할 수 있다. 통상적으로 담체 화합물이 과잉으로 있는, 핵산 및 담체 화합물의 공투여로 인해 아마도 공통의 수용체에 대한 담체 화합물 및 핵산 사이의 경쟁으로 인하여, 간, 신장 또는 기타 특별한 순환 조수(extracirculatory reservoirs) 내에서 회수된 핵산의 양의 실질적인 감소로 이어질 수 있다. 예를 들어, 간 조직 내에서 부분적으로 포스포로티오에이트 dsRNA의 회수는 폴리이노신산, 덱스트란 설페이트, 폴리시티드산 또는 4-아세트아미도-4'이소티오시아노-스틸벤-2,2'-디설폰산과 함께 공투여되는 경우, 감소될 수 있다(문헌[Miyao 등, DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura 등, DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183]).
vi. 부형제
담체 화합물과 달리, "약학적 담체" 또는 "부형제"는 약학적으로 허용 가능한 용매, 현탁제 또는 하나 이상의 핵산을 동물에게 전달하기 위한 임의의 기타 약리적 비활성 운반체이다. 부형제는 액체 또는 고체일 수 있으며, 선택되어 염두에 둔 계획된 투여 방식으로 핵산 및 주어진 약학적 조성물의 기타 구성성분들과 조합되는 경우 소기의 벌크, 연경도 등을 제공하게 된다. 통상적인 약학적 담체는 결합체(예, 사전에 젤라틴화한 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 등); 충진제(예, 락토오스 및 기타 당, 마이크로결정질 셀룰로오스, 펙틴, 젤라틴, 칼슘 설페이트, 에틸 셀룰로오스, 폴리아크릴레이트 또는 칼슘 수소 포스페이트 등); 윤활제(예, 스테아르산 마그네슘, 활석, 실리카, 콜로이드성 이산화 실리콘, 스테아르산, 금속성 스테아레이트, 수소화 식물성유, 옥수수 전분, 폴리에틸렌 글리콜, 벤조산 나트륨, 아세트산 나트륨 등); 붕해제(예, 전분, 전분 글리콜산 나트륨 등); 및 습윤제(예, 황산 나트륨 라우릴 등)을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
핵산과 유해하게 반응하지 않는, 비경구가 아닌 투여에 적당한 약학적으로 허용 가능한 유기 또는 무기 부형제를 이용하여 본 발명의 조성물을 제형화할 수도 있다. 적당한 약학적으로 허용 가능한 담체는 물, 염 용액, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토오스, 아밀로오스, 스테아르산 마그네슘, 활석, 규산, 점성 파라핀, 히드록시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
핵산의 국소 투여용 제형은 살균 및 비살균 수용액, 알코올과 같은 통상적인 용매의 비수성 용액 또는 액체 또는 고체 베이스에서의 핵산의 용액을 포함할 수 있다. 용액은 완충제, 희석제 및 기타 적당한 첨가제도 포함할 수 있다. 핵산과 유해하게 반응하지 않는 비경구가 아닌 투여에 적당한 약학적으로 허용 가능한 유기 또는 무기 부형제가 이용될 수 있다.
적당한 약학적으로 허용 가능한 부형제는 물, 염 용액, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토오스, 아밀로오스, 스테아르산 마그네슘, 활석, 규산, 점성 파라핀, 히드록시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
vii. 기타 구성요소
본 발명의 조성물은 약학적 조성물에서 종래 발견되는 기타 부가 구성요소를 업계에 확립된 이용 수준에서 추가적으로 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 조성물은 예를 들어, 항소양제, 수렴제, 국소 마취제 또는 소염제와 같은 추가의 융합성인 약학적으로 활성인 물질을 포함할 수 있거나, 염료, 풍미제, 보존제, 항산화제, 불투명화제, 증점제 및 안정화제와 같이, 본 발명의 조성물의 다양한 제형을 물리적으로 제형화하는데 유용한 추가적인 물질을 포함할 수 있다. 그러나, 그러한 물질은 첨가되는 경우, 본 발명의 조성물의 구성성분의 생물학적 활성을 과도하게 방해해서는 안 된다. 제형은 살균될 수 있으며, 원한다면, 제형의 핵산(들)과 유해하게 반응하지 않는, 예컨대, 윤활제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 주기 위한 염, 완충제, 착색제, 풍미 및/또는 방향 물질 등과 같은 보조제와 혼합될 수 있다.
수성 현탁액은 예를 들어, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 포함하는 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 포함할 수 있다. 현탁액은 안정화제를 포함할 수도 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명에서 특징된 약학적 조성물은 (a) 하나 이상의 iRNA 화합물 및 (b) 비-RNAi 메커니즘에 의하여 기능하고 출혈 질환을 치료하는데 유용한 하나 이상의 작용제를 포함한다. 그러한 작용제의 예는 소염제, 항-지방증제, 항-바이러스제 및/또는 항-섬유증제를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 또한, 실리마린과 같이 간을 보호하는데 흔히 이용되는 기타 물질은 본원에 기술된 iRNA와 연계하여 이용될 수도 있다. 간 질병을 치료하는데 유용한 기타 작용제는 텔비부딘, 엔테카비르 및 텔라프레비어와 같은 프로테아제 억제제 및 예를 들어, Tung 등, 미국 출원 공개 제2005/0148548호, 제2004/0167116호 및 제2003/0144217호; 및 Hale 등, 미국 출원 공개 제2004/0127488호에 기술된 기타 작용제를 포함한다.
그러한 화합물의 독성 및 치료학적 효능은 예컨대, LD50(개체군의 50%까지 치사하는 용량) 및 ED50(개체군의 50%에서 치료학적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위해, 세포 배양 또는 실험 동물에 있어서 표준 약학적 절차에 의하여 결정될 수 있다. 독성 및 치료적 효과 사이의 용량 비율은 치료 지수이며, 이는 LD50/ED50의 비율로 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 보이는 화합물이 바람직하다.
세포 배양 분석법 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 투여량의 범위를 인간용으로 제형화하는데 이용될 수 있다. 본 발명에서 특징된 조성물의 투여량은 일반적으로 독성이 거의 없거나 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 투여량은 채용된 제형 및 활용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다. 본 발명에서 특징된 방법에 이용된 임의의 화합물에 대하여, 치료학적 유효 용량은 세포 배양 분석법으로부터 최초로 추정될 수 있다. 용량은, 상기 화합물의 순환 혈장 농도 범위, 또는 적절한 경우 세포 배양에서 결정된 바와 같이 IC50(즉, 증상의 절반-최대 억제를 달성하는 시험 화합물의 농도)를 포함하는 표적 서열의 폴리펩티드 생성물의 순환 혈장 농도 범위를 달성하도록(예, 감소된 농도의 폴리펩티드를 달성) 동물 모델 내에서 제형화될 수 있다. 그러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 더 정확하게 결정하는데 이용될 수 있다. 혈장 수준은 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의하여 측정될 수 있다.
상기에서 토의된 바와 같이, 이의 투여뿐만 아니라, Serpina1 발현에 의해 매개되는 병적 과정의 치료에 효과적인 기타 알려진 작용제와 조합되어 투여될 수 있다. 좌우간, 투여하는 의사는 업계에 알려지거나 본원에 기술된 효능의 표준 척도를 이용하여 관찰된 결과에 기초하여 iRNA 투여의 양 및 타이밍을 조정할 수 있다.
IV. Serpina1 발현의 억제 방법
본 발명은 세포에서의 Serpina1의 발현의 억제 방법을 제공한다. 본 방법은 세포를 세포에서 Serpina1의 발현을 억제하기 위한 유효량의 RNAi 작용제, 예를 들어 이중 가닥 RNAi 작용제와 접촉시켜, 세포에서 Serpina1의 발현을 억제하는 단계를 포함한다.
세포를 이중 가닥 RNAi 작용제와 접촉시키는 단계는 시험관 내 또는 생체 내에서 행해질 수 있다. 세포를 생체 내에서 RNAi 작용제와 접촉시키는 단계는 피검자, 예를 들어, 인간 피검자 내의 세포 또는 세포의 군을 RNAi 작용제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 시험관 내 및 생체 내 접촉 방법의 조합도 또한 가능하다. 접촉시키는 단계는 상술된 바와 같이 직접적 또는 간접적일 수 있다. 또한, 세포를 접촉시키는 단계는 본원에 기술되거나 당업계에 공지되어 있는 임의의 리간드를 포함하는 표적화 리간드를 통해 달성될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 표적화 리간드는 탄수화물 모이어티, 예를 들어, GalNAc3 리간드 또는 RNAi 작용제를 관심 대상 부위, 예를 들어, 피검자의 간으로 유도하는 임의의 다른 리간드이다.
본원에 사용되는, "억제하는"이라는 용어는 "감소시키는", "침묵화하는", "하향조절하는" 및 기타 유사 용어와 교환가능하게 이용되며, 임의의 수준의 억제를 포함한다.
"Serpina1의 발현을 억제하는"이라는 어구는 임의의 Serpina1 유전자(예, 마우스 Serpina1 유전자, 래트 Serpina1 유전자, 원숭이 Serpina1 유전자 또는 인간 Serpina1 유전자와 같은) 뿐만 아니라 Serpina1 유전자의 변이체 또는 돌연변이체의 발현의 억제를 지칭하는 의도이다. 따라서, Serpina1 유전자는 유전자 조작된 세포, 세포의 그룹 또는 유기체의 맥락에서 야생형 Serpina1 유전자, 돌연변이 Serpina1 유전자 또는 형질전환 Serpina1 유전자일 수 있다.
"Serpina1 유전자의 발현을 억제하는"은 Serpina1 유전자의 임의의 수준의 억제, 예를 들어, Serpina1 유전자의 발현의 적어도 부분적인 저해를 포함한다. Serpina1 유전자의 발현은 Serpina1 유전자 발현과 연관된 임의의 변수의 수준, 예컨대, Serpina1 mRNA 수준, Serpina1 단백질 수준, 또는 지질 수준 또는 그 수준의 변화에 기초하여 측정될 수 있다. 이러한 수준은 예를 들어, 피검자로부터 유래된 표본을 포함하는 개별 세포 또는 세포의 군에서 측정될 수 있다.
억제는 대조군 수준과 비교하여 Serpina1 발현과 관련된 하나 이상의 변수들의 절대 또는 상대 수준의 감소에 의하여 측정될 수 있다. 대조군 수준은 업계에 활용되는 임의의 형태의 대조군 수준, 예컨대, 투여전 기저 수준, 또는 (예, 완충제 유일 대조군 또는 비활성 작용제 대조군과 같은) 대조군으로 처리 또는 미처리된 유사한 피검자, 세포 또는 표본으로부터 결정된 수준일 수 있다.
본 발명의 방법의 일부 실시형태들에서, Serpina1 유전자의 발현은 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 억제된다.
Serpina1 유전자의 발현의 억제는 제1 세포 또는 세포의 군(이러한 세포는 예를 들어, 피검자로부터 유래된 표본에 존재할 수 있음)에 의해 발현되는 mRNA의 양의 감소에 의해 나타날 수 있으며, 여기서, Serpina1 유전자가 전사되고, (예를 들어, 세포 또는 세포들을 본 발명의 RNAi 작용제와 접촉시키거나, 본 발명의 RNAi 작용제를 상기 세포가 존재하거나 존재하였던 피검자에게 투여함으로써) 제1 세포 또는 세포들의 군과 실질적으로 동일하지만, 그렇게 처리되지 않은 제2 세포 또는 세포들의 군(대조군 세포들)과 비교하여, Serpina1 유전자의 발현이 억제되도록 처리된다. 바람직한 실시형태에서, 억제는 처리된 세포에서 mRNA의 수준을 하기의 식을 이용하여 대조군 세포에서의 mRNA의 수준의 백분율로서 표현함으로써 측정된다:
Figure 112015124918061-pct00041
대안적으로, Serpina1 유전자의 발현의 억제는 기능적으로 Serpina1 유전자 발현, 예를 들어 Serpina1 단백질 발현과 관련된 매개변수, 예컨대 ALT, 알칼리 포스파타제, 빌리루빈, 프로트롬빈 및 알부민의 감소의 면에서 측정될 수 있다. Serpina1 유전자 침묵화는 구성적으로 또는 게놈 조작에 의해, 그리고 업계에 공지되어 있는 임의의 분석에 의해 Serpina1을 발현하는 임의의 세포에서 결정될 수 있다. 간은 주요 Serpina1 발현 부위이다. 기타 유의미한 발현 부위는 폐 및 장(intestine)을 포함한다.
Serpina1 단백질의 발현의 억제는 세포 또는 세포의 군에 의해 발현되는 Serpina1 단백질의 수준(예를 들어, 피검자로부터 유래된 표본에 의해 발현되는 Serpina1 단백질의 수준)의 감소에 의해 나타날 수 있다. mRNA 억제의 측정에 대하여 상기 설명된 바와 같이, 처리된 세포 또는 세포의 군에서의 단백질 발현 수준의 억제는 대조군 세포 또는 세포의 군에서의 단백질의 수준의 백분율로서 유시하게 표현될 수 있다.
Serpina1 유전자의 발현의 억제를 측정하기 위해 사용될 수 있는 대조군 세포 또는 세포의 군은 본 발명의 RNAi 작용제와 접촉된 적이 없는 세포 또는 세포의 군을 포함한다. 예를 들어, 대조군 세포 또는 세포의 군은 피검자를 RNAi 작용제로 처리하기 전에 개별 피검자(예를 들어, 인간 또는 동물 피검자)로부터 유래될 수 있다.
세포 또는 세포의 군에 의해 발현되는 Serpina1 mRNA의 수준은 mRNA 발현을 측정하기 위한 업계에 공지되어 있는 임의의 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, 표본에서의 Serpina1의 발현 수준은 전사된 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 부분, 예를 들어, Serpina1 유전자의 mRNA를 검출함으로써 결정된다. RNA는 예를 들어, 산 페놀/구아니딘 이소티오시아네이트 추출(RNAzol B; Biogenesis), RNeasy RNA 제조 키트(Qiagen) 또는 PAXgene(PreAnalytix, 스위스)을 이용하는 것을 포함하는 RNA 추출 기술을 이용하여 세포로부터 추출될 수 있다. 리보핵산 혼성화를 이용하는 전형적인 분석 형식은 핵 런-온 분석(nuclear run-on assay), RT-PCR, RNase 보호 분석(문헌[Melton 등, Nuc. Acids Res. 12:7035]), 노던 블롯팅(Northern blotting), 동소 혼성화(in situ hybridization) 및 마이크로어레이 분석을 포함한다.
일 실시형태에서, Serpina1의 발현 수준은 핵산 탐침을 이용하여 결정된다. 본원에 사용된, "탐침"이라는 용어는 특정 Serpina1에 선택적으로 결합할 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 탐침은 당업자에 의해 합성되거나, 적절한 생물학적 제제로부터 유래될 수 있다. 탐침은 특이적으로 표지되도록 설계될 수 있다. 탐침으로 사용될 수 있는 분자의 예에는 RNA, DNA, 단백질, 항체 및 유기 분자가 포함되나, 이들에 한정되지 않는다.
분리된 mRNA는 서던(Southern) 또는 노던 분석, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 분석 및 탐침 분석을 포함하나 이들에 한정되지 않는 혼성화 또는 증폭 분석에서 사용될 수 있다. mRNA 수준의 결정을 위한 하나의 방법은 분리된 mRNA를 Serpina1 mRNA에 혼성화할 수 있는 핵산 분자(탐침)와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, mRNA는 예를 들어, 아가로스 겔 위에 분리된 mRNA를 전개시키고, mRNA를 겔로부터 막, 예를 들어 니트로셀룰로오스로 옮김으로써, 고체 표면상에서 고정되고, 탐침과 접촉한다. 대안적 실시형태에서, 탐침(들)은 고체 표면에 고정되고, 예를 들어, 아피매트릭스(Affymetrix) 유전자 칩 어레이에서 mRNA가 탐침(들)과 접촉된다. 당업자는 Serpina1 mRNA의 수준을 측정하는데 이용하기 위한 공지된 mRNA 검출방법들을 쉽게 적응시킬 수 있다.
표본 내의 Serpina1의 발현 수준을 측정하기 위한 대안적 방법은 예를 들어, RT-PCR(Mullis의 미국 특허 제4,683,202호 (1987)에 개시된 실험예), 리가아제 연쇄반응(문헌[Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193]), 자립 서열복제(문헌[Guatelli 등 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878]), 전사 증폭 시스템(문헌[Kwoh 등 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177]), Q-베타 복제효소(문헌[Lizardi 등 (1988) Bio/Technology 6:1197]), 회전환 복제(Lizardi 등, 미국 특허 제5,854,033호), 또는 임의의 다른 핵산 증폭 방법 후, 당업자에게 잘 알려진 기술들을 사용한 증폭된 분자의 검출에 의해, 표본 내 mRNA의 핵산 증폭 과정 및/또는 (cDNA를 제조하기 위한) 역전사효소를 포함한다. 이러한 분자들이 매우 적은 수로 존재한다면, 상기 검출 계획들이 핵산 분자들을 검출하는데 특히 유용하다. 본 발명의 특정 양태에서, Serpina1의 발현수준은 정량적 형광원 RT-PCR(즉, TaqManTM 시스템)에 의해 측정된다.
Serpina1 mRNA의 발현 수준은 막 블롯(예를 들어, 노던, 서던, 도트 등과 같은 혼성화 분석법에 사용됨) 또는 마이크로웰, 표본 튜브, 젤, 비드 또는 섬유(또는 결합 핵산을 포함하는 임의의 고체 지지체)를 이용하여 모니터링될 수 있다. 미국 특허 제5,770,722호, 제5,874,219호, 제5,744,305호, 제5,677,195호 및 제5,445,934호를 참조하며, 이는 이후에 본원에 포함된다. Serpina1 발현 수준의 측정은 용액내 핵산 탐침을 이용하는 것을 포함할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, mRNA 발현 수준은 분지형 DNA(bDNA) 분석법 또는 실시간 PCR(qPCR)을 이용하여 측정된다. 상기 방법들의 용도는 본원에 설명되고, 실시예에 예시되어 있다.
Serpina1 단백질 발현 수준은 단백질 수준의 측정 분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 상기 방법들은 예를 들어, 전기영동법, 모세관 전기영동법, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 박막 크로마토그래피(TLC), 고분산(hyperdiffusion) 크로마토그래피, 유체 또는 겔 침강반응, 흡수 분광법, 비색분석법, 분광분석법, 유동세포 분석법, 면역확산법(단일 또는 이중), 면역전기영동법, 웨스턴 블롯팅, 방사면역분석법(RIA), 효소-결합된 면역흡착 분석법(ELISA), 면역형광 분석법, 전기화학발광 분석법 등을 포함한다.
본원에 사용된 "표본"이라는 용어는 피검자 내에 존재하는 유체, 세포 또는 조직뿐만 아니라 피검자로부터 분리된 유사한 유체, 세포 또는 조직의 집합을 지칭한다. 생물학적 유체의 예는 혈액, 혈청 및 장막 유체, 혈장, 림프, 소변, 뇌척수액, 타액, 안 유체 등을 포함한다. 조직 표본은 조직, 기관 또는 국소화된 영역으로부터 나온 표본을 포함할 수 있다. 예를 들어, 표본은 특정 기관, 기관의 부분 또는 그러한 기관 내의 유체 또는 세포로부터 유래될 수 있다. 특정 실시형태에서, 표본은 간(예, 전 간(whole liver) 또는 간의 특정 분절 또는 예컨대, 간세포와 같이 간 내의 특정 유형의 세포)으로부터 유래될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, "피검자로부터 유래된 표본"은 피검자로부터 뽑은 혈액 또는 혈장을 지칭한다. 추가의 실시형태에서, "피검자로부터 유래된 표본"은 피검자로부터 유래된 간 조직을 지칭한다.
본 발명의 방법의 일부 실시형태에서, RNAi 작용제는 RNAi 작용제가 피검자 내의 특정 부위에 전달되도록 피검자에게 투여된다. Serpina1의 발현의 억제는 피검자 내의 특정 부위로부터의 유체 또는 조직으로부터 유래된 표본에서 Serpina1 mRNA 또는 Serpina1 단백질의 수준 또는 그의 수준의 변화의 측정을 이용하여 측정될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 상기 부위는 간이다. 상기 부위는 또한 전술된 부위 중 임의의 것으로부터의 세포의 세부항목 또는 하위그룹일 수도 있다. 또한, 상기 부위는 특정 수용체 유형을 발현하는 세포를 포함할 수 있다.
V. Serpina1과 연관된 질병의 치료 또는 예방 방법
본 발명은 또한, Serpina1 유전자 발현을 하향조절함으로써 조정될 수 있는 질병 및 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 예를 들어, 본원에 기술된 조성물은 Serpina1과 연관된 질병, 예컨대 간 질병, 예를 들어, 만성 간 질병, 간 염증, 간경변, 간 섬유증 및/또는 간세포 암종, 및 폐 염증, 기종 및 COPD와 같이 이들 장애와 연관될 수 있는 다른 병리학적 질환의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 피검자, 예를 들어 Serpina1 결핍 변이체를 가진 피검자에서, 간세포 암종의 발병을 억제하는 방법을 제공한다. 본 방법은, 본 발명의 조성물을 피검자에게 치료적 유효량으로 투여함으로써, 피검자에서 간세포 암종의 발병을 억제하는 단계를 포함한다.
피검자, 예를 들어 Serpina1 결핍 변이체를 가진 피검자의 간에서 미스폴딩된 Serpina1의 축적을 감소시키기 위한 본 발명의 방법 및 조성물의 용도 또한, 본 발명에 의해 제공된다. 본 방법은, 본 발명의 조성물을 피검자에게 치료적 유효량으로 투여함으로써, 피검자의 간에서 미스폴딩된 Serpina1의 축적을 감소시키는 단계를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "피검자"는 인간 또는 비인간 동물, 바람직하게는 척추동물, 보다 바람직하게는 포유류를 포함한다. 피검자는 형질전환 유기체를 포함할 수 있다. 가장 바람직하게는, 피검자는 인간, 예를 들어 Serpina1과 연관된 질병을 앓고 있거나, 이것이 발생하기 쉬운 인간이다. 일 실시형태에서, Serpina1과 연관된 질병을 앓고 있거나 발병되기 쉬운 피검자는 하나 이상의 Serpina1 결핍 대립유전자, 예를 들어 PIZ, PIS 또는 PIM(Malton) 대립유전자를 가진다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, 본 발명의 iRNA 작용제는 부가적인 치료제와 조합하여 투여된다. iRNA 작용제 및 부가적인 치료제는 동일한 조성물에서 조합되어 예를 들어 비경구적으로 투여될 수 있거나, 부가적인 치료제는 개별 조성물의 일부로서 또는 본원에 기술된 또 다른 방법에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 부가적인 치료제의 예로는, 간경변과 같은 간 장애를 치료하는 것으로 알려진 작용제를 포함한다. 예를 들어, 본 발명에서 특징지어지는 iRNA 작용제는 예를 들어, 우르소데옥시담즙산(UDCA), 면역저하제, 메토트렉세이트, 코르티코스테로이드, 사이클로스포린, 콜히친, 진양 치료제(antipruritic treatment), 예컨대 항히스타민, 콜레스티라민(cholestyramine), 콜레스티폴(colestipol), 리팜핀(rifampin), 드로나비놀(dronabinol)(마리놀(Marinol)) 및 플라스마페세시스(plasmaphesesis), 예방용 항생제, 자외선, 아연 보조제 및 간염 A 백신접종, 독감 백신접종 및 폐렴구균 백신접종과 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 방법의 일부 실시형태에서, Serpina1 발현은 연장된 기간, 예를 들어, 적어도 1주, 2주, 3주 또는 4주 또는 그 이상 동안 감소된다. 예를 들어, 소정의 경우에서, Serpina1 유전자의 발현은 본원에 기술된 iRNA 작용제의 투여에 의해 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 55% 저해된다. 일부 실시형태에서, Serpina1 유전자는 iRNA 작용제의 투여에 의해 적어도 약 60%, 70% 또는 80% 저해된다. 일부 실시형태에서, Serpina1 유전자는 iRNA 작용제의 투여에 의해 적어도 약 85%, 90% 또는 95% 저해된다.
본 발명의 iRNA 작용제는 피하, 정맥 내, 근육 내, 안구 내, 기관지 내, 흉막 내, 복강 내, 동맥 내, 림프, 뇌척수 및 그들의 임의의 조합을 포함하나 이들에 한정되지 않는 업계에 공지되어 있는 임의의 투여 방식을 이용하여 피검자에게 투여될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, iRNA 작용제는 피하 투여된다.
일부 실시형태에서, 투여는 데포 주사를 통한 것이다. 데포 주사는 오랜 시간에 걸쳐서 일관된 방식으로 iRNA 작용제를 방출할 수 있다. 따라서, 데포 주사는 소기의 효과, 예컨대, Serpina1의 소기의 억제 또는 치료적 또는 예방적 효과를 얻는데 필요한 투여의 빈도를 감소시킬 수 있다. 데포 주사는 더 일관적인 혈청 농도를 제공할 수도 있다. 데포 주사는 피하 주사 또는 근육 내 주사를 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 데포 주사는 피하 주사이다.
일부 실시형태에서, 투여는 펌프를 통한 것이다. 펌프는 외부 펌프 또는 외과적으로 이식된 펌프일 수 있다. 특정 실시형태에서, 펌프는 피하로 이식된 삼투 펌프이다. 기타 실시형태에서, 펌프는 주입 펌프이다. 주입 펌프는 정맥 내, 피하, 동맥 또는 경막외 주입용으로 이용될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 주입 펌프는 피하 주입 펌프이다. 기타 실시형태에서, 펌프는 RNAi 작용제를 간에 전달하는 외과적으로 이식된 펌프이다.
기타 투여 양식은 경막외, 뇌내, 뇌실내, 비강 투여, 동맥내, 심장내, 골내 주입, 경막내 및 유리체내 및 폐를 포함한다. 투여의 양식은 국소 또는 전신 치료가 요망되는지의 여부에 기초하여 그리고 치료되는 부분에 기초하여 선택될 수 있다. 투여의 경로 및 부위는 표적하는 것을 향상시키기 위해 선택될 수 있다.
본 발명의 방법은 예를 들어, 적어도 5일, 더욱 바람직하게는 7일, 10일, 14일, 21일, 25일, 30일 또는 40일 동안 Serpina1 mRNA의 수준을 저해/저하시키기에 충분한 용량의 iRNA 작용제를 투여하는 단계; 및 선택적으로, 단일 용량의 제2 iRNA 작용제를 투여하여, 피검자에서 Serpina1 유전자의 발현을 억제하는 단계로서, 제2 단일 용량을 제1 단일 용량을 투여하고 적어도 5일, 더욱 바람직하게는 7일, 10일, 14일, 21일, 25일, 30일 또는 40일 후에 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 iRNA 작용제의 용량은 매 4주 1회 이하, 매 3주 1회 이하, 매 2주 1회 이하, 또는 매 1주 1회 이하로 투여된다. 다른 실시형태에서, 투여를 1, 2, 3 또는 6개월, 또는 1년 이상 유지할 수 있다.
일반적으로, iRNA 작용제는 면역계를 활성화시키지 않으며, 예컨대 TNF-알파 또는 IFN-알파 수준과 같은 시토카인 수준을 증가시키지 않는다. 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 시험관 내 PBMC 분석과 같은 분석에 의해 측정하는 경우, TNF-알파 또는 IFN-알파 수준의 증가는 대조군 iRNA 작용제, 예컨대 Serpina1을 표적으로 하지 않는 iRNA 작용제로 처리한 대조군 세포의 30%, 20% 또는 10% 미만이다.
예를 들어, 피검자에는 치료량의 iRNA 작용제, 예를 들어, 0.5 mg/kg, 1.0 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2.0 mg/kg 또는 2.5 mg/kg의 dsRNA를 투여할 수 있다. iRNA 작용제는 소정의 기간에 걸쳐, 예를 들어, 5분, 10분, 15분, 20분 또는 25분 기간에 걸쳐 정맥내 주입에 의해 투여될 수 있다. 투여는 예를 들어, 규칙적으로 예를 들어, 한달, 두달, 세달, 네달 이상 동안에 격주로(즉, 2 주 마다) 반복된다.
최초 치료 요양법 이후에, 치료는 덜 빈번하게 투여될 수 있다. 예를 들어, 세달 동안 격주로 투여한 이후에, 투여는 여섯달 또는 1년 이상 동안 한달에 1회 반복될 수 있다. iRNA 작용제의 투여로 인해 예컨대, 환자의 세포, 조직, 혈액, 소변, 기관(예, 간) 또는 다른 격실 내에서 Serpina1 수준이 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 또는 그 이상 감소할 수 있다.
iRNA 작용제의 전체 용량을 투여하기 이전에, 환자는 더 적은 용량을 투여받을 수 있으며, 알레르기 반응과 같은 불리한 효과에 대하여 또는 상승된 지질 수준 또는 혈압에 대하여 모니터링될 수 있다. 다른 예에 있어서, 환자는 증가된 시토킨(예, TNF-알파 또는 INF-알파) 수준과 같이 원하지 않는 면역자극 효과에 대하여 모니터링될 수 있다. 보다 적은 용량의 예는, 5% 이하의 주입 반응을 초래하는 용량이다.
질병의 치료 또는 예방 효능은 예를 들어, 질병 진행, 질병 경감, 증상 중증도, 통증 감소, 삶의 질, 치료 효과를 지속하는 데 필요한 약제의 용량, 질병 마커의 수준, 또는 치료 또는 예방을 목적으로 하는 해당 질병에 적절한 임의의 다른 측정가능한 매개변수를 측정함으로써 평가될 수 있다. 이러한 매개변수 중 임의의 하나 또는 매개변수들의 임의의 조합을 측정함으로써 치료 또는 예방 효능을 모니터링하는 것은 당업자의 능력에 달려 있다. 예를 들어, 간 섬유증의 치료 또는 간 섬유증의 완화 효능은 예를 들어 간 섬유증 마커: a-2-마크로글로불린(a-MA), 트랜스페린, 아포리포단백질A1, 히알루론산(HA), 라미닌, N-말단 프로콜라겐 III(PIIINP), 7S 콜라겐 IV (7S-IV), 총 빌리루빈, 간접 빌리루빈, 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST), AST/ ALT, g-글루타밀 트랜스펩티다제(GGT), 알칼리 포스파타제(ALP), 알부민, 알부민/글로불린, 혈액 요소성 질소(blood urea nitrogen; BUN), 크레아틴(Cr), 트리글리세라이드, 콜레스테롤, 고밀도 리포단백질 및 저밀도 리포단백질 및 간 파열 생검(liver puncture biopsy)을 주기적으로 모니터링함으로써 평가될 수 있다. 치료 전(초기 판독) 및 후속적으로 치료 요양법 동안에(후기 판독), 간 섬유증 마커는 측정될 수 있고/있거나 간 파열 생검은 수행될 수 있다.
초기 판독과 후기 판독의 비교는 의사에게 해당 치료가 효과적인지에 대한 지표를 제공한다. 이러한 매개변수 중 임의의 하나 또는 매개변수들의 임의의 조합을 측정함으로써 치료 또는 예방 효능을 모니터링하는 것은 당업자의 능력에 달려 있다. Serpina1을 표적으로 하는 iRNA 작용제 또는 이의 약학적 조성물의 투여와 관련하여, Serpina1과 연돤된 질병, 예컨대 간 질병, 예를 들어 간 섬유증 질환"에 대한 유효량"은, 본 발명의 iRNA 작용제를 임상적으로 적절한 방식으로 투여하는 것이, 적어도 통계학적으로 유의한 환자 비율에 대해 유익한 효과, 예컨대 증상의 개선, 치유, 질병 부하의 감소, 종양 덩어리 또는 세포수의 감소, 수명 연장, 삶의 질 개선, 또는 일반적으로 간 질병의 치료에 익숙한 의사에 의해 긍정적인 것으로 인지되는 다른 효과를 발휘함을 가리킨다.
본 발명의 방법에서, 본원에 기술된 바와 같은 iRNA 작용제는, Serpina1과 연관된 질병, 예컨대 간 질병, 예를 들어 간 염증, 간경변, 간 섬유증 및/또는 감세포 암종의 징후, 증상 및/또는 마커를 가진 개체, 이러한 질병을 진단받은 개체, 또는 이러한 질병에 걸릴 위험이 있는 개체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 당업자는 본원에 기술된 바와 같은 iRNA 작용제를 사용한 치료를 받는 피검자에서 이러한 장애의 징후, 증상 및/또는 마커를 쉽게 모니터링할 수 있으며, 이들 징후, 증상 및/또는 마커의 적어도 10%의 감소, 바람직하게는 간 질병의 저 위험도를 나타내는 임상적 수준으로의 감소를 쉽게 모니터링할 수 있다.
치료 또는 방지 효과는 질병 상태의 하나 이상의 매개변수들에 있어서 통계적으로 유의한 개선이 있거나, 달리 예상되는 증상을 악화시키거나 진전시키지 않는 것에 의해 명백해진다. 일례로, 질병(예, 상기 기술된 간 기능)의 측정가능한 매개변수에 있어서 적어도 10%의 바람직한 변화 및 바람직하게는, 적어도 20%, 30%, 40%, 50% 이상은 효과적인 치료를 나타낼 수 있다. 주어진 본 발명의 iRNA 작용제 또는 그러한 iRNA 작용제 제형에 대한 효능은 업계에 알려진 바와 같이 주어진 질병에 대하여 실험적 동물 모델을 이용하여 판단될 수도 있다. 실험적 동물 모델을 이용하는 경우, 치료의 효능은 마커 또는 증상에 있어서 통계적으로 유의한 감소가 관찰되는 경우 입증된다.
치료 또는 예방 효과는 또한, 하나 이상의 증상이 감소 또는 완화된 경우에도 명백하다. 예를 들어, 치료 또는 예방은 쇠약, 피로, 체중 손실, 메스꺼움, 구토, 복부 팽만, 사지 부기(extremity swelling), 과도한 가려움증, 및 눈 및/또는 피부의 황달이 감소 또는 완화된 경우에 효과적이다.
소정의 지표에 있어서, 효능은 혈청내 Serpina1 단백질 수준의 증가에 의해 측정될 수 있다. 일례로, 적절하게 폴딩된 Serpina1의 혈청 수준의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 200% 이상의 증가는 효과적인 치료의 지표일 수 있다.
대안적으로, 효능은 임상적으로 허용된 질병 중증도 등급화 척도, 일례로서 차일드-푸 점수(Child-Pugh score)(종종 차일드-터코트-푸 점수(Child-Turcotte-Pugh score))에 기초하여 진단 분야의 당업자에 의해 확인되는 바와 같이 질병 중증도의 감소에 의해 측정될 수 있다. 이 실시예에서, 만성 간 질병, 주로 간경변의 예후는 5가지 임상적 측정인 빌리루빈, 혈청 알부민, INR, 복수(ascites) 및 간성 뇌증(hepatic encephalopathy)의 누계 점수에 의해 측정된다. 각각의 마커는 1 내지 3의 값으로 지정되며, 총 값은 A(5점 내지 6점), B(7점 내지 9점) 또는 C(10점 내지 15점)로서 분류되는 점수를 제공하는 데 사용되며, 이 점수는 1년 생존율 및 2년 생존율로 보정될 수 있다. 차일드-푸 점수의 결정 및 분석 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(문헌[Farnsworth et al, Am J Surgery 2004 188:580-583; Child and Turcotte. Surgery and portal hypertension. In: The liver and portal hypertension. Edited by CG Child. Philadelphia: Saunders 1964:50- 64; Pugh et al, Br J Surg 1973;60:648-52]). 효능은 이 실시예에서 환자가 예를 들어, "B"에서 "A"로 이동함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 적절한 척도를 사용하여 측정되는 질병 중증도의 약화를 초래하는 임의의 긍정적인 변화는 본원에 기술된 바와 같은 iRNA 또는 iRNA 제형을 사용한 적절한 치료를 나타낸다.
일 실시형태에서, RNAi 작용제는 약 0.25 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 예를 들어, 약 0.25 mg/kg 내지 약 0.5 mg/kg, 약 0.25 mg/kg 내지 약 1 mg/kg, 약 0.25 mg/kg 내지 약 5 mg/kg, 약 0.25 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg, 약 10 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 약 15 mg/kg 내지 약 25 mg/kg, 약 20 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 약 25 mg/kg 내지 약 35 mg/kg 또는 약 40 mg/kg 내지 약 50 mg/kg의 용량으로 투여된다.
일부 실시형태에서, RNAi 작용제는 약 0.25 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 7 mg/kg, 약 8 mg/kg, 약 9 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 11 mg/kg, 약 12 mg/kg, 약 13 mg/kg, 약 14 mg/kg, 약 15 mg/kg, 약 16 mg/kg, 약 17 mg/kg, 약 18 mg/kg, 약 19 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 21 mg/kg, 약 22 mg/kg, 약 23 mg/kg, 약 24 mg/kg, 약 25 mg/kg, 약 26 mg/kg, 약 27 mg/kg, 약 28 mg/kg, 약 29 mg/kg, 30 mg/kg, 약 31 mg/kg, 약 32 mg/kg, 약 33 mg/kg, 약 34 mg/kg, 약 35 mg/kg, 약 36 mg/kg, 약 37 mg/kg, 약 38 mg/kg, 약 39 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 41 mg/kg, 약 42 mg/kg, 약 43 mg/kg, 약 44 mg/kg, 약 45 mg/kg, 약 46 mg/kg, 약 47 mg/kg, 약 48 mg/kg, 약 49 mg/kg 또는 약 50 mg/kg의 용량으로 투여된다.
본 발명의 소정의 실시형태에서, 예를 들어 이중 가닥 RNAi 작용제가 변형(예를 들어, 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 동일한 변형의 하나 이상의 모티프(작용제의 절단 부위 또는 그 근처에 이러한 모티프를 하나 포함함)), 6개의 포스포로티오에이트 결합 및 리간드를 포함하는 경우, 이러한 작용제는 약 0.01 mg/kg 내지 약 0.5 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 0.4 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 0.3 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 0.2 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 0.1 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 0.09 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 0.08 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 0.07 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 0.06 mg/kg, 약 0.01 mg/kg 내지 약 0.05 mg/kg, 약 0.02 mg/kg 내지 약 0.5 mg/kg, 약 0.02 mg/kg 내지 약 0.4 mg/kg, 약 0.02 mg/kg 내지 약 0.3 mg/kg, 약 0.02 mg/kg 내지 약 0.2 mg/kg, 약 0.02 mg/kg 내지 약 0.1 mg/kg, 약 0.02 mg/kg 내지 약 0.09 mg/kg, 약 0.02 mg/kg 내지 약 0.08 mg/kg, 약 0.02 mg/kg 내지 약 0.07 mg/kg, 약 0.02 mg/kg 내지 약 0.06 mg/kg, 약 0.02 mg/kg 내지 약 0.05 mg/kg, 약 0.03 mg/kg 내지 약 0.5 mg/kg, 약 0.03 mg/kg 내지 약 0.4 mg/kg, 약 0.03 mg/kg 내지 약 0.3 mg/kg, 약 0.03 mg/kg 내지 약 0.2 mg/kg, 약 0.03 mg/kg 내지 약 0.1 mg/kg, 약 0.03 mg/kg 내지 약 0.09 mg/kg, 약 0.03 mg/kg 내지 약 0.08 mg/kg, 약 0.03 mg/kg 내지 약 0.07 mg/kg, 약 0.03 mg/kg 내지 약 0.06 mg/kg, 약 0.03 mg/kg 내지 약 0.05 mg/kg, 약 0.04 mg/kg 내지 약 0.5 mg/kg, 약 0.04 mg/kg 내지 약 0.4 mg/kg, 약 0.04 mg/kg 내지 약 0.3 mg/kg, 약 0.04 mg/kg 내지 약 0.2 mg/kg, 약 0.04 mg/kg 내지 약 0.1 mg/kg, 약 0.04 mg/kg 내지 약 0.09 mg/kg, 약 0.04 mg/kg 내지 약 0.08 mg/kg, 약 0.04 mg/kg 내지 약 0.07 mg/kg, 약 0.04 mg/kg 내지 약 0.06 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 0.5 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 0.4 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 0.3 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 0.2 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 0.1 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 0.09 mg/kg, 약 0.05 mg/kg 내지 약 0.08 mg/kg 또는 약 0.05 mg/kg 내지 약 0.07 mg/kg의 용량을 투여된다. 인용된 값에 중간인 값 및 범위도 본 발명의 부분으로 의도되며, 예를 들어, RNAi 작용제는 약 0.015 mg/kg 내지 약 0.45 mg/mg의 용량으로 피검자에게 투여될 수 있다.
예를 들어, RNAi 작용제, 예를 들어, 약학적 조성물 내의 RNAi 작용제는 약 0.01 mg/kg, 0.0125 mg/kg, 0.015 mg/kg, 0.0175 mg/kg, 0.02 mg/kg, 0.0225 mg/kg, 0.025 mg/kg, 0.0275 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.0325 mg/kg, 0.035 mg/kg, 0.0375 mg/kg, 0.04 mg/kg, 0.0425 mg/kg, 0.045 mg/kg, 0.0475 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.0525 mg/kg, 0.055 mg/kg, 0.0575 mg/kg, 0.06 mg/kg, 0.0625 mg/kg, 0.065 mg/kg, 0.0675 mg/kg, 0.07 mg/kg, 0.0725 mg/kg, 0.075 mg/kg, 0.0775 mg/kg, 0.08 mg/kg, 0.0825 mg/kg, 0.085 mg/kg, 0.0875 mg/kg, 0.09 mg/kg, 0.0925 mg/kg, 0.095 mg/kg, 0.0975 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.125 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.175 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.225 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.275 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.325 mg/kg, 0.35 mg/kg, 0.375 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.425 mg/kg, 0.45 mg/kg, 0.475 mg/kg 또는 약 0.5 mg/kg의 용량을 투여될 수 있다. 상기 인용된 값에 중간인 값 및 범위도 본 발명의 부분으로 의도된다.
피검자에게 투여되는 RNAi 작용제의 용량은 원하는 수준의 Serpina1 유전자 저해(예를 들어, Serpina1 mRNA 저해, Serpina1 단백질 발현에 기초하여 측정됨) 또는 원하는 치료적 또는 예방적 효과를 얻기 위해 특정 용량의 위험 및 이익의 균형을 맞춤과 동시에 원치않는 부작용을 피하기 위해 조정될 수 있다.
일부 실시형태에서, RNAi 작용제는 둘 또는 그 이상의 투여량으로 투여된다. 반복된 또는 빈번한 주입을 용이하게 하길 원한다면, 전달 장치, 예를 들어 펌프, 반-영구적 스텐트(예를 들어, 정맥내, 복강내, 수조내 또는 관절내), 또는 저장소(reservoir)의 이식이 바람직하다. 일부 실시형태에서, 차후 투여량의 수 또는 양은 원하는 효과의 달성, 예를 들어 Serpina1 유전자의 저해, 또는 치료적 또는 예방적 효과의 달성, 예를 들어 간 질병의 증상의 감소에 의존한다. 일부 실시형태에서, RNAi 작용제는 스케쥴에 따라 투여된다. 예를 들어, RNAi 작용제는 1주일에 1회, 1주일에 2회, 1주일에 3회, 1주일에 4회, 또는 1주일에 5회 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 스케쥴은 규칙적으로 간격을 둔 투여, 예를 들어 1시간마다, 4시간마다, 6시간마다, 8시간마다, 12시간마다, 매일, 2일마다, 3일마다, 4일마다, 5일마다, 매주, 격주로 또는 매월로 간격을 둔 투여를 포함한다. 다른 실시형태에서, 스케쥴은 자주 투여한 후, 장시간동안 작용제를 투여하지 않는 것을 포함한다. 예를 들어, 스케쥴은 비교적 짧은 시간내에(예를 들어, 약 6시간마다, 약 12시간마다, 약 24시간마다, 약 48시간마다 또는 약 72시간마다) 투여되고, 그 후 장시간동안(예를 들어, 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 약 6주, 약 7주 또는 약 8주) RNAi 작용제가 투여되지 않는 초기 투여셋트를 포함한다. 한 실시형태에서, RNAi 작용제는 초기에 1시간마다 투여되며, 그 이후에는 더 긴 간격으로(예를 들어, 매일, 1주일마다, 격주로 또는 매월) 투여된다. 다른 실시형태에서, RNAi 작용제는 초기에 매일 투여되며, 그 이후에는 더 긴 간격으로(예를 들어, 매주, 격주, 또는 매월) 투여된다. 특정 실시형태에서, 더 긴 간격은 시간이 지남에 따라 늘어나거나, 또는 원하는 효과의 달성에 기초하여 결정된다. 특정 실시형태에서, RNAi 작용제는 제1 주 동안 매일 1회 투여되며, 그후 8일째 투여일에 매주 투여를 시작한다. 다른 특정 실시형태에서, RNAi 작용제는 제1 주 동안 하루 걸러 투여되며, 그후 8일째 투여일에 매주 투여를 시작한다.
일부 실시형태에서, RNAi 작용제는 가까이 이격된 "로딩기"의 투여를 포함하며 "유지기"로 이어질 수 있는 투여 요양법으로 투여되며, RNAi 작용제는 보다 길게 이격된 간격으로 투여된다. 일 실시형태에서, 로딩기는 제1 주 동안 RNAi 작용제의 5회의 매일의 투여를 포함한다. 다른 실시형태에서, 유지기는 RNAi 작용제의 주 1회 또는 2회의 투여를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 유지기는 5주 동안 지속된다. 일 실시형태에서, 로딩기는 2 mg/kg, 1 mg/kg 또는 0.5 mg/kg의 용량으로 1주일에 5회 투여하는 것을 포함한다. 다른 실시형태에서, 유지기는 2 mg/kg, 1 mg/kg 또는 0.5 mg/kg의 용량으로 1주일에 1회 또는 2회 투여하는 것을 포함한다.
이들 스케쥴 중 임의의 스케쥴은 선택적으로 1회 이상 반복될 수 있다. 반복 횟수는 원하는 효과, 예를 들어 Serpina1 유전자의 저해 및/또는 치료 효과나 예방 효과의 달성, 예를 들어 Serpina1과 연관된 질병, 예를 들어 간 질병의 증상 감소에 따라 다를 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 최종 사용자, 예컨대 돌보미 또는 피검자에게 본원에 기재된 iRNA 작용제를 투여하는 방식에 대한 지시 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다. 이 방법에는 선택적으로 iRNA 작용제의 하나 이상의 용량을 최종 사용자에게 제공하고, 최종 사용자에게 본원에 기재된 요양법으로 iRNA 작용제를 투여하도록 지시하여 최종 사용자에게 지침을 주는 것이 포함된다.
유전적 소인은 표적 유전자와 연관된 질병, 예를 들어 간 질병의 발병에 역할을 한다. 따라서, siRNA가 필요한 환자는 가족력을 조사하거나, 예를 들어 하나 이상의 유전적 마커 또는 변이체를 스크리닝함으로써 확인될 수 있다. 이에, 일 양태에서, 본 발명은, 환자는 Serpina1 결핍 또는 Serpina1 결핍 유전자 변이체, 예를 들어 PIZ, PIS 또는 PIM(Malton) 대립유전자 중 하나 이상을 가진다는 점에 기초하여 환자를 선별함으로써, 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은, iRNA 작용제를 치료적 유효량으로 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
의사, 간호사와 같은 의료인 또는 가족 구성원은 본 발명의 iRNA 작용제의 처방 또는 투여 전에 가족력을 조사할 수 있다. 또한, 유전형 또는 표현형을 확인하기 위한 시험을 수행할 수 있다. 예를 들어, Serpina1 dsRNA를 환자에게 투여하기 전, Serpina1의 유전형 및/또는 표현형을 확인하기 위해, 환자의 표본, 예를 들어 혈액 표본에서 DNA 시험을 수행할 수 있다.
VI. 키트
본 발명은 또한, 본 발명의 방법 중 임의의 것을 수행하고/수행하거나 iRNA 작용제를 이용하기 위한 키트들을 제공한다. 상기 키트들은 1개 또는 그 이상의 RNAi 작용제(들) 및 사용설명서, 예를 들어 세포를 Serpina1 발현 억제에 효과적인 양으로 RNAi 작용제(들)과 접촉시킴으로써, 세포내 Serpina1 발현을 억제하기 위한 설명서를 포함한다. 키트는 세포를 RNAi 작용제와 접촉시키기 위한 수단(예를 들어, 주사장치), 또는 Serpina1 억제를 측정하기 위한 수단(예를 들어, Serpina1 mRNA의 억제 측정 수단)을 선택적으로 더 포함할 수 있다. Serpina1 억제를 측정하기 위한 상기 수단들은 혈장 표본과 같은 피검자로부터 표본을 얻기 위한 수단을 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 피검자에게 RNAi 작용제(들)를 투여하기 위한 수단 또는 치료적 유효량 또는 예방적 유효량을 측정하기 위한 수단을 선택적으로 더 포함할 수 있다.
달리 정의되지 않으면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에 기술된 방법 및 물질과 유사하거나 균등한 방법 및 물질이 본 발명에 특징된 iRNA 및 방법의 실제 또는 시험에 이용될 수 있다고 하더라도, 적당한 방법 및 물질은 하기에 기술되어 있다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 그 전체가 참고로 포함된다. 상충이 있는 경우, 정의를 포함하여, 본 명세서가 우세할 것이다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 예시적인 것일 뿐이며 한정되는 의도는 아니다.
실시예
재료 및 방법
하기의 재료 및 방법을 실시예에서 이용하였다.
siRNA 설계
Serpina1 유전자는 다수의 대체 전사물을 가진다. NCBI 유전자 데이터베이스 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)에서 주석화된 모든 인간 및 시노몰구스 원숭이(마카카 파스시쿨라리스(Macaca fascicularis); 이하 "시노") Serpina1 전사물을 표적으로 하는 siRNA를 확인하기 위해, siRNA 설계를 수행하였다. NCBI RefSeq 수집물 유래의 하기 전사물을 사용하였다: 인간 - NM 000295.4, NM_001002235.2, NM_001002236.2, NM_001127700.1, NM_001127701.1, NM_001127702.1, NM_001127703.1, NM_001127704.1, NM_001127705.1, NM_001127706.1, NM_001127707.1. 시노 전사물을 확인하기 위해, 레서스(rhesus) 원숭이(마카카 물 라타(Macaca mulatta)) 전사물인 XM_001099255.2를 스파이디 정렬 툴(Spidey alignment tool)(www.ncbi.nlm.nih.gov/spidey/)을 사용하여 M. 파스시쿨라리스(M. fascicularis) 게놈에 정렬하였다. 레서스 전사물 및 시노 전사물의 총 일치성%는 99.6%였다. 일치(consensus) 스플라이스 부위 및 전장 코딩 및 비번역 영역을 보존하기 위해, 시노 전사물을 수동-어셈블리(hand-assemble)하였다. 생성되는 전사물의 길이는 2064개 뉴클레오타이드였다.
모든 siRNA 듀플렉스들은, 모든 열거된 인간 전사물 및 시노 전사물과 100% 일치성을 공유하도록 설계하였다.
585개 후보 siRNA를 인간 전사물에 대한 포괄적인 연구에 사용하였다(인간 NCBI Refseq 세트에서 NM_ and XM_ 기록 세트로서 정의됨). 총 48개 센스(21량체) 및 48개 안티센스(23량체) 유래의 siRNA 올리고를 합성하고, 듀플렉스로 형성하였다. Sepina1 센스 가닥 서열 및 안티센스 가닥 서열의 상세한 목록은 표 1 및 표 2에 나타낸다.
siRNA 합성
I. 일반적인 소규모 및 중간 규모의 RNA 합성 절차
표준 고체상 올리고뉴클레오타이드 합성 프로토콜에 따라, 우리딘, 4-N-아세틸시티딘, 6-N-벤조일아데노신 및 2-N-이소부티릴구아노신의 상업적으로 입수가능한 5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-t-부틸디메틸실릴-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필)포스포로아미다이트 단량체 및 상응하는 2'-O-메틸 및 2'-플루오로 포스포로아미다이트를 사용하여 0.2 μmol 내지 500 μmol 사이의 척도에서 RNA 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. 아미다이트 용액을 0.1 M 내지 0.15 M 농도에서 제조하고, 5-에틸티오-1H-테트라졸(아세토니트릴 중 0.25M 내지 0.6 M)을 활성자로서 사용하였다. 포스포로티오에이트 골격 변형을, 합성 동안에 루티딘:아세토니트릴(1:1)(v:v) 중 0.2 M 페닐아세틸 디설파이드(PADS)를 사용하거나 산화 단계의 경우 피리딘 중 0.1 M 3-(디메틸아미노메틸렌) 아미노-3H-1,2,4-디티아졸-5-티온(DDTT)을 사용하여 도입하였다. 합성 완료 후, 서열을 고체 지지체로부터 절단하고, 메틸아민과 이어서 트리에틸아민.3HF를 사용하여 탈보호하여, 존재하는 임의의 2'-O-t-부틸디메틸실릴 보호기를 제거하였다.
5 μmol 내지 500 μmol의 합성 척도 및 완전히 2' 변형된 서열(2'-플루오로 및/또는 2'-O-메틸 또는 이들의 조합)의 합성의 경우, 올리고뉴클레오타이드를 3:1 (v/v) 에탄올 및 농축된 (28-32%) 수성 암모니아를 35℃에서 16시간 또는 55℃에서 5.5시간 동안 사용하여 탈보호하였다. 암모니아 탈보호 전에, 올리고뉴클레오타이드를 고체 지지체 상에서 20분 동안 아세토니트릴 중 0.5 M 피페리딘으로 처리하였다. 미정제 올리고뉴클레오타이드를 LC-MS 및 음이온-교환 HPLC(IEX-HPLC)에 의해 분석하였다. 올리고뉴클레오타이드의 정제는, 20 mM 포스페이트, 10% 내지 15% ACN, pH = 8.5(완충제 A) 및 20 mM 포스페이트, 10% 내지 15% ACN, 1 M NaBr, pH = 8.5(완충제 B)를 사용하여 IEX HPLC에 의해 수행하였다. 분석용 HPLC에 의해 분획의 순도를 분석하였다. 적합한 순도를 가진 생성물-함유 분획을 풀링(pooling)하고, 탈염 전에 회전식 증발기에서 농축시켰다. 표본을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 탈염시키고, 동결 건조하였다. 동일 몰량의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 1x PBS 완충제에서 어닐링하여, 상응하는 siRNA 듀플렉스를 제조하였다.
작은 척도(0.2 μmol 내지 1 μmol)의 경우, 96웰 포맷의 MerMade 192 합성기에서 합성을 수행하였다. 완전히 2'-변형된 서열(2'-플루오로 및/또는 2'-O-메틸 또는 이들의 조합)의 경우, 올리고뉴클레오타이드를, 메틸아민을 사용하여 실온에서 30분 내지 60분 동안 탈보호한 다음 60℃에서 30분 동안 인큐베이션하거나, 3:1(v/v) 에탄올 및 농축된(28% 내지 32%) 수성 암모니아를 사용하여 실온에서 30분 내지 60분 동안 탈보호한 다음 40℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 미정제 올리고뉴클레오타이드를 아세토니트릴:아세톤(9:1)의 용액에서 석출하고, 원심분리에 의해 분리한 다음, 상층액을 경사분리하였다. 미정제 올리고뉴클레오타이드 펠렛을 20 mM NaOAc 완충제에 재현탁하고, LC-MS 및 음이온 교환 HPLC에 의해 분석하였다. 미정제 올리고뉴클레오타이드 서열을 5 mL HiTrap Sephadex G25 컬럼(GE Healthcare) 상에서 96 딥(deep) 웰 플레이트에서 탈염시켰다. 각 웰에서, 개별 서열에 상응하는 약 1.5 mL 표본을 수집하였다. 이들 정제되고 탈염된 올리고뉴클레오타이드를 LC-MS 및 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 듀플렉스를 Tecan 로봇 상에서 동일 몰량의 센스 서열 및 안티센스 서열을 어닐링함으로써 제조하였다. 듀플렉스의 농도를 1x PBS 완충제에서 10 μM로 조정하였다.
II. 생체 내 분석용 GalNAc - 콘쥬게이트된 올리고뉴클레오타이드의 합성
3'-말단에서 GalNAc 리간드와 콘쥬게이트된 올리고뉴클레오타이드를, 올리고뉴클레오타이드 합성용 4,4'-디메톡시트리틸(DMT)-보호된 일차 하이드록시기를 가진 Y-형 링커로 미리 로딩된 고체 지지체, 및 테터(tether)를 통해 부착된 GalNAc 리간드를 사용하여 0.2 μmol 내지 500 μmol의 척도에서 합성하였다.
5 μmol 내지 500 μmol의 척도에서 GalNAc 콘쥬게이트를 합성하기 위해, RNA용 상기 합성 프로토콜을 하기의 개량에 따라 수행하였다: 폴리스티렌계 합성 지지체의 경우, 톨루엔 중 5% 디클로로아세트산을 합성 동안에 DMT-절단에 사용하였다. 지지체로부터의 절단 및 탈보호를 상기 기술된 바와 같이 수행하였다. 포스포로티오에이트가 풍부한 서열(통상 포스포로티오에이트가 5개 초과로 존재함)은, 최종 5'-DMT 기("DMT-온(on)")의 제거 없이, 상기 기술된 바와 같이 절단 및 탈보호 후 합성하였으며, 수중 50 mM 암모늄 아세테이트(완충제 A) 및 80% 아세토니트릴 중 50 mM 암모늄아세테이트(완충제 B)를 사용한 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 분획의 순도를 분석적 HPLC 및/또는 LC-MS에 의해 분석하였다. 적합한 순도를 가진 생성물-함유 분획을 풀링하고, 회전식 증발기에서 농축시켰다. 완료 시까지, DMT-기를 수중 20% 내지 25% 아세트산을 사용하여 제거하였다. 표본을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 탈염시키고, 동결 건조하였다. 동일 몰량의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 1x PBS 완충제에서 어닐링하여, 상응하는 siRNA 듀플렉스를 제조하였다.
다수의 포스포로티오에이트 결합을 가진 서열을 포함하여 GalNAc 콘쥬게이트(0.2 μmol 내지 1 μmol)의 소규모 합성의 경우, MerMade 플랫폼 상에서의 RNA 또는 완전히 2'-F/2'-OMe-함유 서열의 합성을 위한 상기 기술된 프로토콜을 적용하였다. 합성은, GalNAc-관능화된 조절된 기공 유리 지지체를 함유하는 프리-패킹된(pre-packed) 컬럼 상에서 수행하였다.
ABI 고용량 cDNA 역전사 키트 (Applied Biosystems , 포스터 시티 , 캘리포니아, Cat # 4368813)을 이용한 cDNA 합성
반응마다 2 ㎕ 10X 완충제, 0.8 ㎕ 25× dNTP, 2 ㎕ 랜덤 프라이머, 1 ㎕ 역전사효소, 1 ㎕ RNase 억제제 및 3.2 ㎕ H2O의 마스터 믹스를 10 ㎕의 전체 RNA에 첨가하였다. cDNA를 하기 단계들을 통해 Bio-Rad C-1000 또는 S-1000 열 사이클러(허큘레스, 캘리포니아)를 이용하여 생성하였다: 25℃ 10분, 37℃ 120분, 85℃ 5 초, 4℃ 유지.
세포 배양 및 형질감염:
Hep3B, HepG2 또는 HeLa 세포(ATCC, 머내서스, 버지니아)를 트립신처리에 의하여 플레이트로부터 방출시키기 전에 10% FBS 및 글루타민(ATCC)이 보충된 권고 배지(ATCC) 내에서 5% CO2의 분위기 하에 37℃에서 컨플루언스(confluence) 근처까지 성장시켰다. 96-웰 포맷에서 스크리닝되는 듀플렉스의 경우, 형질감염은, 웰(Invitrogen, 칼스배드 캘리포니아 카탈로그 번호 13778-150)당 Opti-MEM 44.75 ㎕ 및 리포펙타민 RNAiMax 0.25 ㎕를 96-웰 플레이트 내에 개개의 웰 당 각각의 siRNA 듀플렉스 5 ㎕에 첨가하여 수행하였다. 그런 다음, 혼합물을 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 약 2 x104개 세포를 함유하는 항생제-무함유 완전 성장 배지 50 ㎕를 siRNA 혼합물에 첨가하였다. 384-웰 포맷에서 스크리닝되는 듀플렉스의 경우, Opti-MEM 5 ㎕ + 리포펙타민 RNAiMax 0.1 ㎕(Invitrogen, Carlsbad CA. cat # 13778-150)를 개별 웰 당 각각의 siRNA 듀플렉스 5 ㎕와 혼합하였다. 그런 다음, 혼합물을 실온에서 15분 동안 인큐베이션한 후, 약 8 x103개 세포를 함유하는 항생제-무함유 완전 성장 배지 40 ㎕를 첨가하였다. 세포를 RNA 정제 전 24시간 동안 인큐베이션하였다. 단일 용량 실험을 10 nM 및 0.1 nM 최종 듀플렉스 농도에서 수행하고, 용량 반응 실험을 10 nM, 1.67 nM, 0.27 nM, 0.046 nM, 0.0077 nM, 0.0013 nM, 0.00021 nM, 0.00004 nM의 최종 듀플렉스 농도에서 수행하였다.
자유 섭취 형질감염
PBS에서 각각의 GalNac 콘쥬게이트된 siRNA 5 ㎕를 96-웰 플레이트의 각 웰에서 In Vitro Gro CP 배지(In Vitro Technologies- Celsis, 볼티모어, 메릴랜드) 95 ㎕에 재현탁된, 3X104개의 방금 해동시킨 동결보존된 시노몰구스 원숭이 간세포(In Vitro Technologies- Celsis, 볼티모어, 메릴랜드; lot#JQD)와 조합하거나, 384웰 플레이트 포맷의 경우 5 ㎕ siRNA를 1.2x103개 세포를 함유하는 45 ㎕ 배지와 조합하였다. 혼합물을 37℃, 5% CO2의 분위기에서 약 24시간 동안 인큐베이션하였다. siRNA를 500 nM 및 10 nM의 최종 농도에서 시험하였다.
DYNABEADS mRNA 분리 키트 ( Invitrogen , part #: 610- 12)를 사용한 총 RNA 분 리
세포를 수집하고, 파쇄/결합 완충제 150 ㎕에서 파쇄한 다음, 플랫폼 쉐이커를 이용하여 850 rpm에서 5분 동안 혼합하였다(혼합 속도는 전 과정 동안 동일하였음). 자기 비드 10 ㎕ 및 파쇄/결합 완충제 혼합물 80 ㎕를 둥근 바닥 플레이트에 첨가하고, 1분 동안 혼합하였다. 자기 비드를 자기 스탠드를 이용하여 포착하고, 비드를 어지럽히지 않으면서 상층액을 제거하였다. 상층액 제거 후, 파쇄된 세포를 잔여 비드에 첨가하고, 5분 동안 혼합하였다. 상층액 제거 후, 자기 비드를 세정 완충제 A 150 ㎕로 2회 세정하고, 1분 동안 혼합하였다. 비드를 다시 포착하였고, 상층액을 제거하였다. 그런 다음, 비드를 세정 완충제 B 150 ㎕로 세정하고, 포착하고, 상층액을 제거하였다. 이후, 비드를 용출 완충제 150 ㎕로 세정하고, 포착하고, 상층액을 제거하였다. 비드를 2분 동안 건조되도록 놔두었다. 건조 후, 용출 완충제 50 ㎕를 첨가하고, 70℃에서 5분 동안 혼합하였다. 비드를 자석 상에서 5분 동안 포착하였다. 상층액 50 ㎕를 제거하고, 또 다른 96웰 플레이트에 첨가하였다.
384-웰 포맷의 경우, 세포를 1분 동안 파쇄한 다음, 파쇄/결합 완충제 50 ㎕ 를 첨가하였다. 웰 당 2 ㎕의 자기 비드를 사용하였다. 비드를 필요한 부피만큼 분취하고, 자기 스탠드 상에서 포착한 다음, 비드 저장 용액을 제거하였다. 그런 다음, 비드를 필요한 부피의 파쇄/결합 완충제(웰 당 25 ㎕)에 재현탁하고, 비드 현탁액 25 ㎕를 파쇄된 세포에 첨가하였다. 파쇄물-비드 혼합물을 세팅 #7 (UnionScientific Corp., 란달스타운, 메릴랜드)에서 VibraTransaltor 상에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 후속해서, 비드를 자기 스탠드를 사용하여 포착하고, 상층액을 제거한 다음, 비드를 90 ㎕ 완충제 A로 1회 세정하고, 90 ㎕ 완충제 B 및 100 ㎕ 용출 완충제를 사용하여 단일 세정 단계를 수행하였다. 비드를 각각의 세정 완충제에 약 1분 동안 침지시켰다(혼합은 수반되지 않음). 최종 세정 단계 후, 비드를 15 ㎕ 용출 완충제에 70℃에서 5분 동안 재현탁한 다음, cDNA 합성 및/또는 정제된 RNA 저장(-20℃)을 위해 비드 포착 및 상층액 제거(8 ㎕까지)를 수행하였다.
실시간 PCR
cDNA 2 ㎕를 384 웰 플레이트(Roche cat # 04887301001) 내에서 웰 당 0.5 ㎕의 GAPDH TaqMan 탐침(Applied Biosystems Cat #4326317E), Hep3B 실험용 0.5 ㎕의 SERPINA1 TaqMan 탐침(Applied Biosystems cat # Hs00165475_m1) 또는 PCH 실험용의 맞춤 설계된 GAPDH 및 SERPINA1 taqman 분석법 및 5 ㎕의 라이트사이클러(Lightcycler) 480 탐침 마스터 믹스(Roche Cat #04887301001)를 포함하는 마스터 믹스에 첨가하였다. 실시간 PCR은 Roche LC480 Real Time PCR 시스템(Roche)에서 수행하였다. 각각의 듀플렉스는 각각 2개의 생물학적 복제물을 이용한 적어도 2가지 독립된 형질감염에서 시험하였으며, 각각의 형질감염을 2벌로 분석하였다.
상대적 배수 변화를 계산하기 위하여, 실시간 데이터를 ΔΔCt 방법을 이용하여 분석하였으며, 10 nM AD-1955로 형질감염된 세포 또는 모의 형질감염된 세포로 수행된 분석법에 정규화시켰다. 자유 섭취 분석법의 경우, 데이터를 PBS 또는 GalNAc-1955(실험 화합물에 사용된 최고 농도)로 처리된 세포로 정규화하였다. IC50을 동일한 용량 범위에서 AD-1955로 형질감염시킨 세포로 정규화하거나, 이 자체의 최저 용량으로 정규화하였다.
AD-1955의 센스 및 안티센스 서열은 다음과 같다: 센스: 5'-cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT-3' (SEQ ID NO: 33); 및 안티센스: 5'-UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT-3' (SEQ ID NO: 40).
사용된 Taqman 프라이머 및 탐침은 하기와 같다:
시노몰구스 Serpina1 및 Gapdh TaqMan 프라이머 및 탐침:
Serpina1: 정방향 프라이머: ACTAAGGTCTTCAGCAATGGG (SEQ ID NO:34); 역방향 프라이머: GCTTCAGTCCCTTTCTCATCG (SEQ ID NO:35); Taqman 탐침: TGGTCAGCACAGCCTTATGCACG (SEQ ID NO:36)
Gapdh: 정방향 프라이머: GCATCCTGGGCTACACTGA (SEQ ID NO:37); 역방향 프라이머: TGGGTGTCGCTGTTGAAGTC(SEQ ID NO:38); Taqman 탐침: CCAGGTGGTCTCCTCC (SEQ ID NO:39)
표 B : 핵산 서열표에서 사용되는 뉴클레오타이드 단량체의 약어
Figure 112015124918061-pct00042
Figure 112015124918061-pct00043
실시예 1. GalNAc - 콘쥬게이트된 올리고뉴클레오타이드의 합성
Serpina1 mRNA 서열을 스패닝(spanning)하는 일련의 siRNA 듀플렉스를 상기 기술된 기법을 사용하여 설계하고, 합성한 다음, 센스 가닥의 3' 말단에서 3가 GalNAc와 콘쥬게이션하였다. 이들 듀플렉스의 서열을 표 1에 나타낸다. 이들 동일한 서열을 또한, 다양한 뉴클레오타이드 변형을 이용하여 합성하고, 3가 GalNAc와 콘쥬게이션하였다. 변형된 듀플렉스의 서열을 표 2에 나타낸다.
표 1. Serpina1 비변형된 서열
Figure 112015124918061-pct00044
Figure 112015124918061-pct00045
Figure 112015124918061-pct00046
Figure 112015124918061-pct00047
표 2. Serpina1 - 변형된 서열
Figure 112015124918061-pct00048
Figure 112015124918061-pct00049
Figure 112015124918061-pct00050
Figure 112015124918061-pct00051
실시예 2. 시험관 내 및 생체 내 스크리닝.
이들 듀플렉스의 하위세트를 상기 기술된 바와 같은 단일 용량 분석법에서 효능에 대해 평가하였다. 표 3은, 지시된 GalNAC 콘쥬게이트된 변형된 iRNA로 형질감염된 원발성 마우스 간세포(Hep3b)에서 단일 용량 스크린의 결과, 및 지시된 GalNAC 콘쥬게이트된 변형된 iRNA를 가진 원발성 시노몰구스 간세포(PCH)에서 단일 용량 자유 섭취 스크린의 결과를 나타낸 것이다. 데이터를, AD-1955로 처리한 세포, Hep3B 실험용의 비-표적화 대조군, 또는 PCH 실험용의 네이브(naive) 세포에 대한 잔류하는 전령의 분획으로서 표현된다.
표 3. 원발성 Hep3b 세포 및 원발성 시노몰구스 원숭이 간세포(PCH)에서 자율적인 섭취에 의한 Serpina1 효능 스크린
Figure 112015124918061-pct00052
Figure 112015124918061-pct00053
원발성 Hep3B에서 형질감염에 의한, 선별된 듀플렉스에 대한 IC50 값을 표 4에 나타낸다.
표 4. Hep3b 인간 세포주에서 형질감염에 의한, 선별된 듀플렉스에 대한 Serpina1 IC50 값
Figure 112015124918061-pct00054
이들 듀플렉스의 하위세트를, Z-AAT 형태의 인간 Serpina1을 발현하는 형질전환 마우스에서 생체 내 효능에 대해 평가하였다(예, 문헌[Dycaico, et al. (1988) Science 242:1409-12; Carlson, et al. (1989) J Clin Invest 83:1183-90; Perfumo, et al. (1994) Ann Hum Genet. 58:305-20] 참조). 이는 AAT-결핍과 연관된 간 질병의 구축된 모델이다. 간략하게는, 제0일에, 형질전환 마우스에 표 5에 열거된 단일 20 mg/kg 용량의 iRNA를 피하 주사하였다. 혈청을 제-10일, 제-5일, 제0일, 제3일, 제5일, 제7일, 제10일 및 제17일에 수집하고, 순환하는 Serpina1 단백질의 양을 인간-특이적인 ELISA 분석법을 사용하여 확인하였다. 이들 분석의 결과를 도 1에 도시한다. 도 1에 지시된 바와 같이, AD-58681-6PS는 이들 마우스에서 혈청 Serpina1 단백질을 감소시키는 데 가장 효과적이었다.
표 5.
Figure 112015124918061-pct00055
실시예 3. 형질전환 마우스에서 si - AAT의 효능
상기 실시예에 기술된 바와 같이 IC50 값이 낮은 5가지 siRNA 듀플렉스에 대해, 생체 내 효능을 시험하였다. siRNA 듀플렉스를, AAT-결핍과 연관된 간 질병의 구축된 모델인 인간 Z-AAT 대립유전자를 발현하는 형질전환 마우스에 10 mg/kg에서 주사하였다. 제0일에 마우스에 투여를 하고, 투여 후 21일 동안 혈청 인간 AAT를 투여하였다(도 2a). 각각의 지점은 3마리 마우스의 평균을 나타내고, 오차 막대는 표준 편차를 반영한다. 제21일에 마우스를 안락사시키고, 간을 처리하여 mRNA 수준을 측정하였다. 그래프는 각각의 그룹에 대한 GAPDH로 정규화한 hAAT mRNA를 보여준다(도 2b). 막대는 평균을 반영하고, 오차 막대는 표준 편차를 반영한다. 도 2a 및 도 2b에서 지시된 바와 같이, AD59054는 마우스에서 hAAT mRNA 수준을 감소시키는 데 가장 효과적이었다.
실시예 4. 용량 반응적 방식으로 지속적인 AAT 저해.
AAT-결핍과 연관된 간 질병의 형질전환 동물 모델에서 siRNA 듀플렉스 AD-59054의 효능을, 상이한 용량의 siRNA 듀플렉스 AD-59054를 피하 투여함으로써 측정하였다. 혈청을 상이한 시간 간격을 두고 채집하여, 인간 AAT 특이적인 ELISA를 사용하여 혈청 hAAT 단백질 수준을 측정하였다. 마우스에서 시험된 상이한 용량에서 달성된 최대 녹다운을 보여주는 효능 곡선을 도 3a에 도시한다. 각각의 지점은 3마리 동물의 평균이고, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg 또는 10 mg/kg에서 AAT siRNA의 단일 투여 후 녹다운의 기간을 도 3b에 도시한다. 각각의 데이터 지점은 3마리 동물의 평균이고, 오차 막대는 표준 편차를 반영한다. hAAT 수준을 각각의 동물에 대한 3개의 프리블리드의 평균으로 정규화하였다. siRNA를 PBS에서 투여하였으며, 그래서 PBS 그룹은 혈청 hAAT 수준의 가변성을 반영하는 대조군으로서 작용한다. AAT siRNA의 피하 투여는 혈청 hATT를 용량-의존적인 방식으로 억제하였으며, 95%를 초과하는 최대 억제는 3 mg/kg의 용량에서 관찰되었다. 1 mg/kg의 단일 용량은 hAAT의 40% 수준을 적어도 15일 동안 유지하였다. 또한, 동물에게 AD-59054를 0.5 mg/kg의 용량으로 1주일에 2회 투여하였다(도 3c). 반복 투여는 누적 반응을 초래하며, 90% 초과의 단백질 저해를 초래한다. 각각의 데이터 지점은 4마리 동물의 평균이고, 오차 막대는 표준 편차를 반영한다.
실시예 5. Z- AAT의 감소와 더불어 종양 발병의 저하.
형질전환 인간 Z-AAT를 발현하는 마우스는 나이가 듦에 따라 종양을 발병한다. 이 실험은, 이들 노령의 마우스에게 본 발명의 siRNA를 만성 투여하면 마우스에서 종양 발병을 저하할 수 있는지 확인하기 위해 설계하였다. 구체적으로는, 간 종양 발병을 저하하기 위해, 간 섬유증을 가진 노령의 마우스(25주령 내지 46주령)에게 siRNA 듀플렉스 AD-58681을 만성 투여하였다. 동물에게 PBS 또는 10 mg/kg AAT siRNA를 2주일에 1회(Q2W) 총 11회의 투여 동안 피하 투여하고, 마지막 투여 후 7일째에 안락사시켰다(도 4a). 대조군 및 치료군에서 hAAT mRNA, Col1a2 mRNA 및PtPrc mRNA의 간 수준을 측정하였다. AAT siRNA로 치료를 받은 동물은 hAAT mRNA 수준이 90% 넘게 저하된 것을 보여주었다(도 4b). Col1a2 mRNA를 섬유증 마커로서 측정하였으며, 이 마커의 수준은 AAT siRNA로 치료를 받은 동물에서 저하되었다(도 4c). PtPrc(CD45) mRNA를 면역 세포의 존재에 대한 마커로서 측정하였다(도 4d). 도 4d에 도시된 바와 같이, 질병에 걸린 간에는 보다 많은 수의 면역 세포가 침윤되어 있으며, 동물이 AAT siRNA로 치료를 받은 경우, PtPrc mRNA 수준은 상당히 저하되었다.
AAT 저해의 정도를 모니터링하기 위해, 최초 투여 후 혈청 표본을 수집하였다. AAT siRNA로 치료를 받은 모든 동물들은 5% 미만의 잔류 AAT 단백질을 보여주었으며, 단일 용량은 다음 용량을 투여하기 전에 14일 동안 AAT 수준을 80%보다 낮게 유지시켰다(도 5a). 표 6은 안락사 시점(제132일)에서 동물의 관찰 결과를 제공한다. siRNA 듀플렉스를 투여한 형질전환 동물은 비처리된 대조군 동물과 비교한 경우, 저하된 종양 발병을 나타내었다. 구체적으로는, PBS로 치료한 6마리의 동물 중 4마리는 간 종양을 나타낸 반면, AAT siRNA로 치료한 6마리의 동물 중 1마리만이 간 종양을 나타내었다. 종양 발병의 차이에 대한 p 값은 t-시험에 의해 0.045인 것으로 계산되었다. 도 5b 및 도 5c는 PBS 또는 AAT siRNA로 치료한 2마리의 한배새끼의 간 섹션의 PAS 염색을 도시한 것이다. 더 짙은 색상의 점들은 소구체 또는 Z-AAT 응집물을 나타낸다. 이들 데이터는, siRNA 듀플렉스가 형질전환 마우스에서 Z-AAT 수준을 감소시키는 데 효과적이며, Z-AAT의 감소된 수준은 더 건강한 간 형태로 생리학적 이득을 보여줌을 가리킨다.
표 6.
Figure 112015124918061-pct00056
Figure 112015124918061-pct00057
실시예 6. AD-59054의 리드 최적화(lead optimization)
상기 기술된 바와 같이, AD-59054는 생체 내에서 AAT를 용량-반응적인 방식으로 지속적으로 저해하는 것으로 나타났다. 그러나, AD-59054의 뉴클레오타이드 서열은, 일반적인 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)(참조 SNP 등록 번호: rs1303(예, www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP 참조))을 포함하는 AAT mRNA의 영역을 스패닝한다. 구체적으로는, SNP 위치는 AD-59054의 안티센스 가닥의 위치 6(5' -> 3')(즉, AD-59054의 시드 영역 내)의 뉴클레오타이드에 상응한다. 이에, 시드 영역 내의 미스매치가 표적외 효과 및/또는 효능의 손실을 초래할 수 있기 때문에, 안티센스 가닥의 위치 6(5' -> 3')에서 다양한 염기들을 가진 부가적인 듀플렉스를 AD-59054의 서열에 기초하여 제조하였다. 표적 mRNA는 AD-59054의 안티센스 가닥의 위치 6(5' -> 3')에 상응하는 A를 운반한다. 이들 듀플렉스의 서열은 표 7에 제공된다. 표 8은 다양한 화학적 변형들을 가지며 3가 GalNAc와 콘쥬게이트된 이들 동일한 듀플렉스의 서열을 제공한다.
이들 변형된 듀플렉스의 효능을, 상기 기술된 바와 같이 원발성 마우스 간세포(Hep3B)에서 단일 용량 자유 섭취 스크린에서 평가하였다. Hep3B 세포 mRNA는 AD-59054의 안티센스 가닥의 위치 6(5' -> 3')에 상응하는 위치에서 C를 운반한다. 듀플렉스에 대한 IC50 값을 표 8에 나타낸다. 놀랍게도, 언급된 바와 같이, 위치 6에서 시드 영역 내의 단일 미스매치는 C를 제외하고 모든 염기들에 대해 내성이었다.
이들 듀플렉스의 하위세트를 또한, 생체 내 효능에 대해 평가하였다. 제0일에, 인간 Z-AAT 대립유전자를 발현하는(및 AD-59054의 안티센스 가닥의 위치 6(5' -> 3')에 상응하는 mRNA에서 A를 가진) 형질전환 마우스에게 AD-59054, AD-61719, AD-61700, AD-61726 또는 AD-61704를 1.0 mg/kg의 용량으로 주사하고, 상기 기술된 바와 같이 측정되는 혈청 인간 AAT를 투약 후 14일 동안 주사하였다(도 6). 각각의 지점은 3마리 마우스의 평균을 나타내며, 오차 막대는 표준 편차를 반영한다. 도 6에서 언급되는 바와 같이, AD-61719 및 AD-61704는 부모 AD-59054처럼 양호하게 거동한다.
표 7.
Figure 112015124918061-pct00058
실시예 7. AD-59054의 리드 최적화
부가적인 듀플렉스를, AD-61444를 포함하여 AD-59054의 서열에 기초하여 제조하였다. AD-61444의 변형된 센스 서열과 변형된 안티센스 서열 및 비변형된 센스 서열과 비변형된 안티센스 서열을 표 9에 제공한다.
표 9.
Figure 112015124918061-pct00059
표 8.
Figure 112015124918061-pct00060
실시예 8. AD-59054, AD-61719 및 AD-61444의 비-인간 영장류에의 투약
AD-59054, AD-61719 및 AD-61444의 효능은, AD-59054, AD-61719 또는 AD-61444를 1 mg/kg 또는 3 mg/kg의 단일 용량으로 영장류에게 투여함으로써 비-인간 영장류에서 시험하였다. 인간 AAT 특이적인 ELISA를 사용하여 혈청 hAAT 단백질 수준을 측정함으로써 AAT 저해의 정도를 모니터링하기 위해, 투여 전 5일째, 투여 후 제0일, 제3일, 제7일, 제10일, 제15일, 제20일 및 제30일에 혈청 표본을 수집하였다. 임의의 화합물이 투여된 동물의 혈청에서 사이토카인 또는 케모카인 수준의 변화는 없었으며, 주사 부위 반응 또는 약물과 관련된 건강상의 문제는 화합물의 투여와 연관이 없었다. 도 7은, 1 mg/kg의 AD-59054, AD-61719 또는 AD-61444의 단일 용량(7a) 또는 3 mg/kg의 AD-59054, AD-61719 또는 AD-61444의 단일 용량(7b)은 AAT 단백질을 용량 의존적이며 지속적으로 저하함을 보여준다.
SEQUENCE LISTING <110> ALNYLAM PHARMACEUTICALS, INC. <120> SERPINA1 IRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF <130> 121301-00620 <150> US 61/826,125 <151> 2013-05-22 <150> US 61/898,695 <151> 2013-11-01 <150> US 61/979,727 <151> 2014-04-15 <150> US 61/989,028 <151> 2014-05-06 <160> 436 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 3220 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 acaatgactc ctttcggtaa gtgcagtgga agctgtacac tgcccaggca aagcgtccgg 60 gcagcgtagg cgggcgactc agatcccagc cagtggactt agcccctgtt tgctcctccg 120 ataactgggg tgaccttggt taatattcac cagcagcctc ccccgttgcc cctctggatc 180 cactgcttaa atacggacga ggacagggcc ctgtctcctc agcttcaggc accaccactg 240 acctgggaca gtgaatcgac aatgccgtct tctgtctcgt ggggcatcct cctgctggca 300 ggcctgtgct gcctggtccc tgtctccctg gctgaggatc cccagggaga tgctgcccag 360 aagacagata catcccacca tgatcaggat cacccaacct tcaacaagat cacccccaac 420 ctggctgagt tcgccttcag cctataccgc cagctggcac accagtccaa cagcaccaat 480 atcttcttct ccccagtgag catcgctaca gcctttgcaa tgctctccct ggggaccaag 540 gctgacactc acgatgaaat cctggagggc ctgaatttca acctcacgga gattccggag 600 gctcagatcc atgaaggctt ccaggaactc ctccgtaccc tcaaccagcc agacagccag 660 ctccagctga ccaccggcaa tggcctgttc ctcagcgagg gcctgaagct agtggataag 720 tttttggagg atgttaaaaa gttgtaccac tcagaagcct tcactgtcaa cttcggggac 780 accgaagagg ccaagaaaca gatcaacgat tacgtggaga agggtactca agggaaaatt 840 gtggatttgg tcaaggagct tgacagagac acagtttttg ctctggtgaa ttacatcttc 900 tttaaaggca aatgggagag accctttgaa gtcaaggaca ccgaggaaga ggacttccac 960 gtggaccagg tgaccaccgt gaaggtgcct atgatgaagc gtttaggcat gtttaacatc 1020 cagcactgta agaagctgtc cagctgggtg ctgctgatga aatacctggg caatgccacc 1080 gccatcttct tcctgcctga tgaggggaaa ctacagcacc tggaaaatga actcacccac 1140 gatatcatca ccaagttcct ggaaaatgaa gacagaaggt ctgccagctt acatttaccc 1200 aaactgtcca ttactggaac ctatgatctg aagagcgtcc tgggtcaact gggcatcact 1260 aaggtcttca gcaatggggc tgacctctcc ggggtcacag aggaggcacc cctgaagctc 1320 tccaaggccg tgcataaggc tgtgctgacc atcgacgaga aagggactga agctgctggg 1380 gccatgtttt tagaggccat acccatgtct atcccccccg aggtcaagtt caacaaaccc 1440 tttgtcttct taatgattga acaaaatacc aagtctcccc tcttcatggg aaaagtggtg 1500 aatcccaccc aaaaataact gcctctcgct cctcaacccc tcccctccat ccctggcccc 1560 ctccctggat gacattaaag aagggttgag ctggtccctg cctgcatgtg actgtaaatc 1620 cctcccatgt tttctctgag tctccctttg cctgctgagg ctgtatgtgg gctccaggta 1680 acagtgctgt cttcgggccc cctgaactgt gttcatggag catctggctg ggtaggcaca 1740 tgctgggctt gaatccaggg gggactgaat cctcagctta cggacctggg cccatctgtt 1800 tctggagggc tccagtcttc cttgtcctgt cttggagtcc ccaagaagga atcacagggg 1860 aggaaccaga taccagccat gaccccaggc tccaccaagc atcttcatgt ccccctgctc 1920 atcccccact cccccccacc cagagttgct catcctgcca gggctggctg tgcccacccc 1980 aaggctgccc tcctgggggc cccagaactg cctgatcgtg ccgtggccca gttttgtggc 2040 atctgcagca acacaagaga gaggacaatg tcctcctctt gacccgctgt cacctaacca 2100 gactcgggcc ctgcacctct caggcacttc tggaaaatga ctgaggcaga ttcttcctga 2160 agcccattct ccatggggca acaaggacac ctattctgtc cttgtccttc catcgctgcc 2220 ccagaaagcc tcacatatct ccgtttagaa tcaggtccct tctccccaga tgaagaggag 2280 ggtctctgct ttgttttctc tatctcctcc tcagacttga ccaggcccag caggccccag 2340 aagaccatta ccctatatcc cttctcctcc ctagtcacat ggccataggc ctgctgatgg 2400 ctcaggaagg ccattgcaag gactcctcag ctatgggaga ggaagcacat cacccattga 2460 cccccgcaac ccctcccttt cctcctctga gtcccgactg gggccacatg cagcctgact 2520 tctttgtgcc tgttgctgtc cctgcagtct tcagagggcc accgcagctc cagtgccacg 2580 gcaggaggct gttcctgaat agcccctgtg gtaagggcca ggagagtcct tccatcctcc 2640 aaggccctgc taaaggacac agcagccagg aagtcccctg ggcccctagc tgaaggacag 2700 cctgctccct ccgtctctac caggaatggc cttgtcctat ggaaggcact gccccatccc 2760 aaactaatct aggaatcact gtctaaccac tcactgtcat gaatgtgtac ttaaaggatg 2820 aggttgagtc ataccaaata gtgatttcga tagttcaaaa tggtgaaatt agcaattcta 2880 catgattcag tctaatcaat ggataccgac tgtttcccac acaagtctcc tgttctctta 2940 agcttactca ctgacagcct ttcactctcc acaaatacat taaagatatg gccatcacca 3000 agccccctag gatgacacca gacctgagag tctgaagacc tggatccaag ttctgacttt 3060 tccccctgac agctgtgtga ccttcgtgaa gtcgccaaac ctctctgagc cccagtcatt 3120 gctagtaaga cctgcctttg agttggtatg atgttcaagt tagataacaa aatgtttata 3180 cccattagaa cagagaataa atagaactac atttcttgca 3220 <210> 2 <211> 3199 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 tgggcaggaa ctgggcactg tgcccagggc atgcactgcc tccacgcagc aaccctcaga 60 gtcctgagct gaaccaagaa ggaggagggg gtcgggcctc cgaggaaggc ctagccgctg 120 ctgctgccag gaattccagg ttggaggggc ggcaacctcc tgccagcctt caggccactc 180 tcctgtgcct gccagaagag acagagcttg aggagagctt gaggagagca ggaaaggaca 240 atgccgtctt ctgtctcgtg gggcatcctc ctgctggcag gcctgtgctg cctggtccct 300 gtctccctgg ctgaggatcc ccagggagat gctgcccaga agacagatac atcccaccat 360 gatcaggatc acccaacctt caacaagatc acccccaacc tggctgagtt cgccttcagc 420 ctataccgcc agctggcaca ccagtccaac agcaccaata tcttcttctc cccagtgagc 480 atcgctacag cctttgcaat gctctccctg gggaccaagg ctgacactca cgatgaaatc 540 ctggagggcc tgaatttcaa cctcacggag attccggagg ctcagatcca tgaaggcttc 600 caggaactcc tccgtaccct caaccagcca gacagccagc tccagctgac caccggcaat 660 ggcctgttcc tcagcgaggg cctgaagcta gtggataagt ttttggagga tgttaaaaag 720 ttgtaccact cagaagcctt cactgtcaac ttcggggaca ccgaagaggc caagaaacag 780 atcaacgatt acgtggagaa gggtactcaa gggaaaattg tggatttggt caaggagctt 840 gacagagaca cagtttttgc tctggtgaat tacatcttct ttaaaggcaa atgggagaga 900 ccctttgaag tcaaggacac cgaggaagag gacttccacg tggaccaggt gaccaccgtg 960 aaggtgccta tgatgaagcg tttaggcatg tttaacatcc agcactgtaa gaagctgtcc 1020 agctgggtgc tgctgatgaa atacctgggc aatgccaccg ccatcttctt cctgcctgat 1080 gaggggaaac tacagcacct ggaaaatgaa ctcacccacg atatcatcac caagttcctg 1140 gaaaatgaag acagaaggtc tgccagctta catttaccca aactgtccat tactggaacc 1200 tatgatctga agagcgtcct gggtcaactg ggcatcacta aggtcttcag caatggggct 1260 gacctctccg gggtcacaga ggaggcaccc ctgaagctct ccaaggccgt gcataaggct 1320 gtgctgacca tcgacgagaa agggactgaa gctgctgggg ccatgttttt agaggccata 1380 cccatgtcta tcccccccga ggtcaagttc aacaaaccct ttgtcttctt aatgattgaa 1440 caaaatacca agtctcccct cttcatggga aaagtggtga atcccaccca aaaataactg 1500 cctctcgctc ctcaacccct cccctccatc cctggccccc tccctggatg acattaaaga 1560 agggttgagc tggtccctgc ctgcatgtga ctgtaaatcc ctcccatgtt ttctctgagt 1620 ctccctttgc ctgctgaggc tgtatgtggg ctccaggtaa cagtgctgtc ttcgggcccc 1680 ctgaactgtg ttcatggagc atctggctgg gtaggcacat gctgggcttg aatccagggg 1740 ggactgaatc ctcagcttac ggacctgggc ccatctgttt ctggagggct ccagtcttcc 1800 ttgtcctgtc ttggagtccc caagaaggaa tcacagggga ggaaccagat accagccatg 1860 accccaggct ccaccaagca tcttcatgtc cccctgctca tcccccactc ccccccaccc 1920 agagttgctc atcctgccag ggctggctgt gcccacccca aggctgccct cctgggggcc 1980 ccagaactgc ctgatcgtgc cgtggcccag ttttgtggca tctgcagcaa cacaagagag 2040 aggacaatgt cctcctcttg acccgctgtc acctaaccag actcgggccc tgcacctctc 2100 aggcacttct ggaaaatgac tgaggcagat tcttcctgaa gcccattctc catggggcaa 2160 caaggacacc tattctgtcc ttgtccttcc atcgctgccc cagaaagcct cacatatctc 2220 cgtttagaat caggtccctt ctccccagat gaagaggagg gtctctgctt tgttttctct 2280 atctcctcct cagacttgac caggcccagc aggccccaga agaccattac cctatatccc 2340 ttctcctccc tagtcacatg gccataggcc tgctgatggc tcaggaaggc cattgcaagg 2400 actcctcagc tatgggagag gaagcacatc acccattgac ccccgcaacc cctccctttc 2460 ctcctctgag tcccgactgg ggccacatgc agcctgactt ctttgtgcct gttgctgtcc 2520 ctgcagtctt cagagggcca ccgcagctcc agtgccacgg caggaggctg ttcctgaata 2580 gcccctgtgg taagggccag gagagtcctt ccatcctcca aggccctgct aaaggacaca 2640 gcagccagga agtcccctgg gcccctagct gaaggacagc ctgctccctc cgtctctacc 2700 aggaatggcc ttgtcctatg gaaggcactg ccccatccca aactaatcta ggaatcactg 2760 tctaaccact cactgtcatg aatgtgtact taaaggatga ggttgagtca taccaaatag 2820 tgatttcgat agttcaaaat ggtgaaatta gcaattctac atgattcagt ctaatcaatg 2880 gataccgact gtttcccaca caagtctcct gttctcttaa gcttactcac tgacagcctt 2940 tcactctcca caaatacatt aaagatatgg ccatcaccaa gccccctagg atgacaccag 3000 acctgagagt ctgaagacct ggatccaagt tctgactttt ccccctgaca gctgtgtgac 3060 cttcgtgaag tcgccaaacc tctctgagcc ccagtcattg ctagtaagac ctgcctttga 3120 gttggtatga tgttcaagtt agataacaaa atgtttatac ccattagaac agagaataaa 3180 tagaactaca tttcttgca 3199 <210> 3 <211> 3513 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 tgggcaggaa ctgggcactg tgcccagggc atgcactgcc tccacgcagc aaccctcaga 60 gtcctgagct gaaccaagaa ggaggagggg gtcgggcctc cgaggaaggc ctagccgctg 120 ctgctgccag gaattccagg ttggaggggc ggcaacctcc tgccagcctt caggccactc 180 tcctgtgcct gccagaagag acagagcttg aggagagctt gaggagagca ggaaagggcg 240 gcagtaagtc ttcagcatca ggcattttgg ggtgactcag taaatggtag atcttgctac 300 cagtggaaca gccactaagg attctgcagt gagagcagag ggccagctaa gtggtactct 360 cccagagact gtctgactca cgccaccccc tccaccttgg acacaggacg ctgtggtttc 420 tgagccaggt acaatgactc ctttcgcagc ctcccccgtt gcccctctgg atccactgct 480 taaatacgga cgaggacagg gccctgtctc ctcagcttca ggcaccacca ctgacctggg 540 acagtgaatc gacaatgccg tcttctgtct cgtggggcat cctcctgctg gcaggcctgt 600 gctgcctggt ccctgtctcc ctggctgagg atccccaggg agatgctgcc cagaagacag 660 atacatccca ccatgatcag gatcacccaa ccttcaacaa gatcaccccc aacctggctg 720 agttcgcctt cagcctatac cgccagctgg cacaccagtc caacagcacc aatatcttct 780 tctccccagt gagcatcgct acagcctttg caatgctctc cctggggacc aaggctgaca 840 ctcacgatga aatcctggag ggcctgaatt tcaacctcac ggagattccg gaggctcaga 900 tccatgaagg cttccaggaa ctcctccgta ccctcaacca gccagacagc cagctccagc 960 tgaccaccgg caatggcctg ttcctcagcg agggcctgaa gctagtggat aagtttttgg 1020 aggatgttaa aaagttgtac cactcagaag ccttcactgt caacttcggg gacaccgaag 1080 aggccaagaa acagatcaac gattacgtgg agaagggtac tcaagggaaa attgtggatt 1140 tggtcaagga gcttgacaga gacacagttt ttgctctggt gaattacatc ttctttaaag 1200 gcaaatggga gagacccttt gaagtcaagg acaccgagga agaggacttc cacgtggacc 1260 aggtgaccac cgtgaaggtg cctatgatga agcgtttagg catgtttaac atccagcact 1320 gtaagaagct gtccagctgg gtgctgctga tgaaatacct gggcaatgcc accgccatct 1380 tcttcctgcc tgatgagggg aaactacagc acctggaaaa tgaactcacc cacgatatca 1440 tcaccaagtt cctggaaaat gaagacagaa ggtctgccag cttacattta cccaaactgt 1500 ccattactgg aacctatgat ctgaagagcg tcctgggtca actgggcatc actaaggtct 1560 tcagcaatgg ggctgacctc tccggggtca cagaggaggc acccctgaag ctctccaagg 1620 ccgtgcataa ggctgtgctg accatcgacg agaaagggac tgaagctgct ggggccatgt 1680 ttttagaggc catacccatg tctatccccc ccgaggtcaa gttcaacaaa ccctttgtct 1740 tcttaatgat tgaacaaaat accaagtctc ccctcttcat gggaaaagtg gtgaatccca 1800 cccaaaaata actgcctctc gctcctcaac ccctcccctc catccctggc cccctccctg 1860 gatgacatta aagaagggtt gagctggtcc ctgcctgcat gtgactgtaa atccctccca 1920 tgttttctct gagtctccct ttgcctgctg aggctgtatg tgggctccag gtaacagtgc 1980 tgtcttcggg ccccctgaac tgtgttcatg gagcatctgg ctgggtaggc acatgctggg 2040 cttgaatcca ggggggactg aatcctcagc ttacggacct gggcccatct gtttctggag 2100 ggctccagtc ttccttgtcc tgtcttggag tccccaagaa ggaatcacag gggaggaacc 2160 agataccagc catgacccca ggctccacca agcatcttca tgtccccctg ctcatccccc 2220 actccccccc acccagagtt gctcatcctg ccagggctgg ctgtgcccac cccaaggctg 2280 ccctcctggg ggccccagaa ctgcctgatc gtgccgtggc ccagttttgt ggcatctgca 2340 gcaacacaag agagaggaca atgtcctcct cttgacccgc tgtcacctaa ccagactcgg 2400 gccctgcacc tctcaggcac ttctggaaaa tgactgaggc agattcttcc tgaagcccat 2460 tctccatggg gcaacaagga cacctattct gtccttgtcc ttccatcgct gccccagaaa 2520 gcctcacata tctccgttta gaatcaggtc ccttctcccc agatgaagag gagggtctct 2580 gctttgtttt ctctatctcc tcctcagact tgaccaggcc cagcaggccc cagaagacca 2640 ttaccctata tcccttctcc tccctagtca catggccata ggcctgctga tggctcagga 2700 aggccattgc aaggactcct cagctatggg agaggaagca catcacccat tgacccccgc 2760 aacccctccc tttcctcctc tgagtcccga ctggggccac atgcagcctg acttctttgt 2820 gcctgttgct gtccctgcag tcttcagagg gccaccgcag ctccagtgcc acggcaggag 2880 gctgttcctg aatagcccct gtggtaaggg ccaggagagt ccttccatcc tccaaggccc 2940 tgctaaagga cacagcagcc aggaagtccc ctgggcccct agctgaagga cagcctgctc 3000 cctccgtctc taccaggaat ggccttgtcc tatggaaggc actgccccat cccaaactaa 3060 tctaggaatc actgtctaac cactcactgt catgaatgtg tacttaaagg atgaggttga 3120 gtcataccaa atagtgattt cgatagttca aaatggtgaa attagcaatt ctacatgatt 3180 cagtctaatc aatggatacc gactgtttcc cacacaagtc tcctgttctc ttaagcttac 3240 tcactgacag cctttcactc tccacaaata cattaaagat atggccatca ccaagccccc 3300 taggatgaca ccagacctga gagtctgaag acctggatcc aagttctgac ttttccccct 3360 gacagctgtg tgaccttcgt gaagtcgcca aacctctctg agccccagtc attgctagta 3420 agacctgcct ttgagttggt atgatgttca agttagataa caaaatgttt atacccatta 3480 gaacagagaa taaatagaac tacatttctt gca 3513 <210> 4 <211> 3236 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 tgggcaggaa ctgggcactg tgcccagggc atgcactgcc tccacgcagc aaccctcaga 60 gtcctgagct gaaccaagaa ggaggagggg gtcgggcctc cgaggaaggc ctagccgctg 120 ctgctgccag gaattccagg ttggaggggc ggcaacctcc tgccagcctt caggccactc 180 tcctgtgcct gccagaagag acagagcttg aggagagctt gaggagagca ggaaaggtgg 240 gacattgctg ctgctgctca ctcagttcca caggacaatg ccgtcttctg tctcgtgggg 300 catcctcctg ctggcaggcc tgtgctgcct ggtccctgtc tccctggctg aggatcccca 360 gggagatgct gcccagaaga cagatacatc ccaccatgat caggatcacc caaccttcaa 420 caagatcacc cccaacctgg ctgagttcgc cttcagccta taccgccagc tggcacacca 480 gtccaacagc accaatatct tcttctcccc agtgagcatc gctacagcct ttgcaatgct 540 ctccctgggg accaaggctg acactcacga tgaaatcctg gagggcctga atttcaacct 600 cacggagatt ccggaggctc agatccatga aggcttccag gaactcctcc gtaccctcaa 660 ccagccagac agccagctcc agctgaccac cggcaatggc ctgttcctca gcgagggcct 720 gaagctagtg gataagtttt tggaggatgt taaaaagttg taccactcag aagccttcac 780 tgtcaacttc ggggacaccg aagaggccaa gaaacagatc aacgattacg tggagaaggg 840 tactcaaggg aaaattgtgg atttggtcaa ggagcttgac agagacacag tttttgctct 900 ggtgaattac atcttcttta aaggcaaatg ggagagaccc tttgaagtca aggacaccga 960 ggaagaggac ttccacgtgg accaggtgac caccgtgaag gtgcctatga tgaagcgttt 1020 aggcatgttt aacatccagc actgtaagaa gctgtccagc tgggtgctgc tgatgaaata 1080 cctgggcaat gccaccgcca tcttcttcct gcctgatgag gggaaactac agcacctgga 1140 aaatgaactc acccacgata tcatcaccaa gttcctggaa aatgaagaca gaaggtctgc 1200 cagcttacat ttacccaaac tgtccattac tggaacctat gatctgaaga gcgtcctggg 1260 tcaactgggc atcactaagg tcttcagcaa tggggctgac ctctccgggg tcacagagga 1320 ggcacccctg aagctctcca aggccgtgca taaggctgtg ctgaccatcg acgagaaagg 1380 gactgaagct gctggggcca tgtttttaga ggccataccc atgtctatcc cccccgaggt 1440 caagttcaac aaaccctttg tcttcttaat gattgaacaa aataccaagt ctcccctctt 1500 catgggaaaa gtggtgaatc ccacccaaaa ataactgcct ctcgctcctc aacccctccc 1560 ctccatccct ggccccctcc ctggatgaca ttaaagaagg gttgagctgg tccctgcctg 1620 catgtgactg taaatccctc ccatgttttc tctgagtctc cctttgcctg ctgaggctgt 1680 atgtgggctc caggtaacag tgctgtcttc gggccccctg aactgtgttc atggagcatc 1740 tggctgggta ggcacatgct gggcttgaat ccagggggga ctgaatcctc agcttacgga 1800 cctgggccca tctgtttctg gagggctcca gtcttccttg tcctgtcttg gagtccccaa 1860 gaaggaatca caggggagga accagatacc agccatgacc ccaggctcca ccaagcatct 1920 tcatgtcccc ctgctcatcc cccactcccc cccacccaga gttgctcatc ctgccagggc 1980 tggctgtgcc caccccaagg ctgccctcct gggggcccca gaactgcctg atcgtgccgt 2040 ggcccagttt tgtggcatct gcagcaacac aagagagagg acaatgtcct cctcttgacc 2100 cgctgtcacc taaccagact cgggccctgc acctctcagg cacttctgga aaatgactga 2160 ggcagattct tcctgaagcc cattctccat ggggcaacaa ggacacctat tctgtccttg 2220 tccttccatc gctgccccag aaagcctcac atatctccgt ttagaatcag gtcccttctc 2280 cccagatgaa gaggagggtc tctgctttgt tttctctatc tcctcctcag acttgaccag 2340 gcccagcagg ccccagaaga ccattaccct atatcccttc tcctccctag tcacatggcc 2400 ataggcctgc tgatggctca ggaaggccat tgcaaggact cctcagctat gggagaggaa 2460 gcacatcacc cattgacccc cgcaacccct ccctttcctc ctctgagtcc cgactggggc 2520 cacatgcagc ctgacttctt tgtgcctgtt gctgtccctg cagtcttcag agggccaccg 2580 cagctccagt gccacggcag gaggctgttc ctgaatagcc cctgtggtaa gggccaggag 2640 agtccttcca tcctccaagg ccctgctaaa ggacacagca gccaggaagt cccctgggcc 2700 cctagctgaa ggacagcctg ctccctccgt ctctaccagg aatggccttg tcctatggaa 2760 ggcactgccc catcccaaac taatctagga atcactgtct aaccactcac tgtcatgaat 2820 gtgtacttaa aggatgaggt tgagtcatac caaatagtga tttcgatagt tcaaaatggt 2880 gaaattagca attctacatg attcagtcta atcaatggat accgactgtt tcccacacaa 2940 gtctcctgtt ctcttaagct tactcactga cagcctttca ctctccacaa atacattaaa 3000 gatatggcca tcaccaagcc ccctaggatg acaccagacc tgagagtctg aagacctgga 3060 tccaagttct gacttttccc cctgacagct gtgtgacctt cgtgaagtcg ccaaacctct 3120 ctgagcccca gtcattgcta gtaagacctg cctttgagtt ggtatgatgt tcaagttaga 3180 taacaaaatg tttataccca ttagaacaga gaataaatag aactacattt cttgca 3236 <210> 5 <211> 3532 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 tgggcaggaa ctgggcactg tgcccagggc atgcactgcc tccacgcagc aaccctcaga 60 gtcctgagct gaaccaagaa ggaggagggg gtcgggcctc cgaggaaggc ctagccgctg 120 ctgctgccag gaattccagg ttggaggggc ggcaacctcc tgccagcctt caggccactc 180 tcctgtgcct gccagaagag acagagcttg aggagagctt gaggagagca ggaaaggtgg 240 gacattgctg ctgctgctca ctcagttcca cagggcggca gtaagtcttc agcatcaggc 300 attttggggt gactcagtaa atggtagatc ttgctaccag tggaacagcc actaaggatt 360 ctgcagtgag agcagagggc cagctaagtg gtactctccc agagactgtc tgactcacgc 420 caccccctcc accttggaca caggacgctg tggtttctga gccagcagcc tcccccgttg 480 cccctctgga tccactgctt aaatacggac gaggacaggg ccctgtctcc tcagcttcag 540 gcaccaccac tgacctggga cagtgaatcg acaatgccgt cttctgtctc gtggggcatc 600 ctcctgctgg caggcctgtg ctgcctggtc cctgtctccc tggctgagga tccccaggga 660 gatgctgccc agaagacaga tacatcccac catgatcagg atcacccaac cttcaacaag 720 atcaccccca acctggctga gttcgccttc agcctatacc gccagctggc acaccagtcc 780 aacagcacca atatcttctt ctccccagtg agcatcgcta cagcctttgc aatgctctcc 840 ctggggacca aggctgacac tcacgatgaa atcctggagg gcctgaattt caacctcacg 900 gagattccgg aggctcagat ccatgaaggc ttccaggaac tcctccgtac cctcaaccag 960 ccagacagcc agctccagct gaccaccggc aatggcctgt tcctcagcga gggcctgaag 1020 ctagtggata agtttttgga ggatgttaaa aagttgtacc actcagaagc cttcactgtc 1080 aacttcgggg acaccgaaga ggccaagaaa cagatcaacg attacgtgga gaagggtact 1140 caagggaaaa ttgtggattt ggtcaaggag cttgacagag acacagtttt tgctctggtg 1200 aattacatct tctttaaagg caaatgggag agaccctttg aagtcaagga caccgaggaa 1260 gaggacttcc acgtggacca ggtgaccacc gtgaaggtgc ctatgatgaa gcgtttaggc 1320 atgtttaaca tccagcactg taagaagctg tccagctggg tgctgctgat gaaatacctg 1380 ggcaatgcca ccgccatctt cttcctgcct gatgagggga aactacagca cctggaaaat 1440 gaactcaccc acgatatcat caccaagttc ctggaaaatg aagacagaag gtctgccagc 1500 ttacatttac ccaaactgtc cattactgga acctatgatc tgaagagcgt cctgggtcaa 1560 ctgggcatca ctaaggtctt cagcaatggg gctgacctct ccggggtcac agaggaggca 1620 cccctgaagc tctccaaggc cgtgcataag gctgtgctga ccatcgacga gaaagggact 1680 gaagctgctg gggccatgtt tttagaggcc atacccatgt ctatcccccc cgaggtcaag 1740 ttcaacaaac cctttgtctt cttaatgatt gaacaaaata ccaagtctcc cctcttcatg 1800 ggaaaagtgg tgaatcccac ccaaaaataa ctgcctctcg ctcctcaacc cctcccctcc 1860 atccctggcc ccctccctgg atgacattaa agaagggttg agctggtccc tgcctgcatg 1920 tgactgtaaa tccctcccat gttttctctg agtctccctt tgcctgctga ggctgtatgt 1980 gggctccagg taacagtgct gtcttcgggc cccctgaact gtgttcatgg agcatctggc 2040 tgggtaggca catgctgggc ttgaatccag gggggactga atcctcagct tacggacctg 2100 ggcccatctg tttctggagg gctccagtct tccttgtcct gtcttggagt ccccaagaag 2160 gaatcacagg ggaggaacca gataccagcc atgaccccag gctccaccaa gcatcttcat 2220 gtccccctgc tcatccccca ctccccccca cccagagttg ctcatcctgc cagggctggc 2280 tgtgcccacc ccaaggctgc cctcctgggg gccccagaac tgcctgatcg tgccgtggcc 2340 cagttttgtg gcatctgcag caacacaaga gagaggacaa tgtcctcctc ttgacccgct 2400 gtcacctaac cagactcggg ccctgcacct ctcaggcact tctggaaaat gactgaggca 2460 gattcttcct gaagcccatt ctccatgggg caacaaggac acctattctg tccttgtcct 2520 tccatcgctg ccccagaaag cctcacatat ctccgtttag aatcaggtcc cttctcccca 2580 gatgaagagg agggtctctg ctttgttttc tctatctcct cctcagactt gaccaggccc 2640 agcaggcccc agaagaccat taccctatat cccttctcct ccctagtcac atggccatag 2700 gcctgctgat ggctcaggaa ggccattgca aggactcctc agctatggga gaggaagcac 2760 atcacccatt gacccccgca acccctccct ttcctcctct gagtcccgac tggggccaca 2820 tgcagcctga cttctttgtg cctgttgctg tccctgcagt cttcagaggg ccaccgcagc 2880 tccagtgcca cggcaggagg ctgttcctga atagcccctg tggtaagggc caggagagtc 2940 cttccatcct ccaaggccct gctaaaggac acagcagcca ggaagtcccc tgggccccta 3000 gctgaaggac agcctgctcc ctccgtctct accaggaatg gccttgtcct atggaaggca 3060 ctgccccatc ccaaactaat ctaggaatca ctgtctaacc actcactgtc atgaatgtgt 3120 acttaaagga tgaggttgag tcataccaaa tagtgatttc gatagttcaa aatggtgaaa 3180 ttagcaattc tacatgattc agtctaatca atggataccg actgtttccc acacaagtct 3240 cctgttctct taagcttact cactgacagc ctttcactct ccacaaatac attaaagata 3300 tggccatcac caagccccct aggatgacac cagacctgag agtctgaaga cctggatcca 3360 agttctgact tttccccctg acagctgtgt gaccttcgtg aagtcgccaa acctctctga 3420 gccccagtca ttgctagtaa gacctgcctt tgagttggta tgatgttcaa gttagataac 3480 aaaatgttta tacccattag aacagagaat aaatagaact acatttcttg ca 3532 <210> 6 <211> 3340 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 tgggcaggaa ctgggcactg tgcccagggc atgcactgcc tccacgcagc aaccctcaga 60 gtcctgagct gaaccaagaa ggaggagggg gtcgggcctc cgaggaaggc ctagccgctg 120 ctgctgccag gaattccagg ttggaggggc ggcaacctcc tgccagcctt caggccactc 180 tcctgtgcct gccagaagag acagagcttg aggagagctt gaggagagca ggaaaggtgg 240 gacattgctg ctgctgctca ctcagttcca cagcagcctc ccccgttgcc cctctggatc 300 cactgcttaa atacggacga ggacagggcc ctgtctcctc agcttcaggc accaccactg 360 acctgggaca gtgaatcgac aatgccgtct tctgtctcgt ggggcatcct cctgctggca 420 ggcctgtgct gcctggtccc tgtctccctg gctgaggatc cccagggaga tgctgcccag 480 aagacagata catcccacca tgatcaggat cacccaacct tcaacaagat cacccccaac 540 ctggctgagt tcgccttcag cctataccgc cagctggcac accagtccaa cagcaccaat 600 atcttcttct ccccagtgag catcgctaca gcctttgcaa tgctctccct ggggaccaag 660 gctgacactc acgatgaaat cctggagggc ctgaatttca acctcacgga gattccggag 720 gctcagatcc atgaaggctt ccaggaactc ctccgtaccc tcaaccagcc agacagccag 780 ctccagctga ccaccggcaa tggcctgttc ctcagcgagg gcctgaagct agtggataag 840 tttttggagg atgttaaaaa gttgtaccac tcagaagcct tcactgtcaa cttcggggac 900 accgaagagg ccaagaaaca gatcaacgat tacgtggaga agggtactca agggaaaatt 960 gtggatttgg tcaaggagct tgacagagac acagtttttg ctctggtgaa ttacatcttc 1020 tttaaaggca aatgggagag accctttgaa gtcaaggaca ccgaggaaga ggacttccac 1080 gtggaccagg tgaccaccgt gaaggtgcct atgatgaagc gtttaggcat gtttaacatc 1140 cagcactgta agaagctgtc cagctgggtg ctgctgatga aatacctggg caatgccacc 1200 gccatcttct tcctgcctga tgaggggaaa ctacagcacc tggaaaatga actcacccac 1260 gatatcatca ccaagttcct ggaaaatgaa gacagaaggt ctgccagctt acatttaccc 1320 aaactgtcca ttactggaac ctatgatctg aagagcgtcc tgggtcaact gggcatcact 1380 aaggtcttca gcaatggggc tgacctctcc ggggtcacag aggaggcacc cctgaagctc 1440 tccaaggccg tgcataaggc tgtgctgacc atcgacgaga aagggactga agctgctggg 1500 gccatgtttt tagaggccat acccatgtct atcccccccg aggtcaagtt caacaaaccc 1560 tttgtcttct taatgattga acaaaatacc aagtctcccc tcttcatggg aaaagtggtg 1620 aatcccaccc aaaaataact gcctctcgct cctcaacccc tcccctccat ccctggcccc 1680 ctccctggat gacattaaag aagggttgag ctggtccctg cctgcatgtg actgtaaatc 1740 cctcccatgt tttctctgag tctccctttg cctgctgagg ctgtatgtgg gctccaggta 1800 acagtgctgt cttcgggccc cctgaactgt gttcatggag catctggctg ggtaggcaca 1860 tgctgggctt gaatccaggg gggactgaat cctcagctta cggacctggg cccatctgtt 1920 tctggagggc tccagtcttc cttgtcctgt cttggagtcc ccaagaagga atcacagggg 1980 aggaaccaga taccagccat gaccccaggc tccaccaagc atcttcatgt ccccctgctc 2040 atcccccact cccccccacc cagagttgct catcctgcca gggctggctg tgcccacccc 2100 aaggctgccc tcctgggggc cccagaactg cctgatcgtg ccgtggccca gttttgtggc 2160 atctgcagca acacaagaga gaggacaatg tcctcctctt gacccgctgt cacctaacca 2220 gactcgggcc ctgcacctct caggcacttc tggaaaatga ctgaggcaga ttcttcctga 2280 agcccattct ccatggggca acaaggacac ctattctgtc cttgtccttc catcgctgcc 2340 ccagaaagcc tcacatatct ccgtttagaa tcaggtccct tctccccaga tgaagaggag 2400 ggtctctgct ttgttttctc tatctcctcc tcagacttga ccaggcccag caggccccag 2460 aagaccatta ccctatatcc cttctcctcc ctagtcacat ggccataggc ctgctgatgg 2520 ctcaggaagg ccattgcaag gactcctcag ctatgggaga ggaagcacat cacccattga 2580 cccccgcaac ccctcccttt cctcctctga gtcccgactg gggccacatg cagcctgact 2640 tctttgtgcc tgttgctgtc cctgcagtct tcagagggcc accgcagctc cagtgccacg 2700 gcaggaggct gttcctgaat agcccctgtg gtaagggcca ggagagtcct tccatcctcc 2760 aaggccctgc taaaggacac agcagccagg aagtcccctg ggcccctagc tgaaggacag 2820 cctgctccct ccgtctctac caggaatggc cttgtcctat ggaaggcact gccccatccc 2880 aaactaatct aggaatcact gtctaaccac tcactgtcat gaatgtgtac ttaaaggatg 2940 aggttgagtc ataccaaata gtgatttcga tagttcaaaa tggtgaaatt agcaattcta 3000 catgattcag tctaatcaat ggataccgac tgtttcccac acaagtctcc tgttctctta 3060 agcttactca ctgacagcct ttcactctcc acaaatacat taaagatatg gccatcacca 3120 agccccctag gatgacacca gacctgagag tctgaagacc tggatccaag ttctgacttt 3180 tccccctgac agctgtgtga ccttcgtgaa gtcgccaaac ctctctgagc cccagtcatt 3240 gctagtaaga cctgcctttg agttggtatg atgttcaagt tagataacaa aatgtttata 3300 cccattagaa cagagaataa atagaactac atttcttgca 3340 <210> 7 <211> 3495 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 tgggcaggaa ctgggcactg tgcccagggc atgcactgcc tccacgcagc aaccctcaga 60 gtcctgagct gaaccaagaa ggaggagggg gtcgggcctc cgaggaaggc ctagccgctg 120 ctgctgccag gaattccagg ttggaggggc ggcaacctcc tgccagcctt caggccactc 180 tcctgtgcct gccagaagag acagagcttg aggagagctt gaggagagca ggaaagggcg 240 gcagtaagtc ttcagcatca ggcattttgg ggtgactcag taaatggtag atcttgctac 300 cagtggaaca gccactaagg attctgcagt gagagcagag ggccagctaa gtggtactct 360 cccagagact gtctgactca cgccaccccc tccaccttgg acacaggacg ctgtggtttc 420 tgagccagca gcctcccccg ttgcccctct ggatccactg cttaaatacg gacgaggaca 480 gggccctgtc tcctcagctt caggcaccac cactgacctg ggacagtgaa tcgacaatgc 540 cgtcttctgt ctcgtggggc atcctcctgc tggcaggcct gtgctgcctg gtccctgtct 600 ccctggctga ggatccccag ggagatgctg cccagaagac agatacatcc caccatgatc 660 aggatcaccc aaccttcaac aagatcaccc ccaacctggc tgagttcgcc ttcagcctat 720 accgccagct ggcacaccag tccaacagca ccaatatctt cttctcccca gtgagcatcg 780 ctacagcctt tgcaatgctc tccctgggga ccaaggctga cactcacgat gaaatcctgg 840 agggcctgaa tttcaacctc acggagattc cggaggctca gatccatgaa ggcttccagg 900 aactcctccg taccctcaac cagccagaca gccagctcca gctgaccacc ggcaatggcc 960 tgttcctcag cgagggcctg aagctagtgg ataagttttt ggaggatgtt aaaaagttgt 1020 accactcaga agccttcact gtcaacttcg gggacaccga agaggccaag aaacagatca 1080 acgattacgt ggagaagggt actcaaggga aaattgtgga tttggtcaag gagcttgaca 1140 gagacacagt ttttgctctg gtgaattaca tcttctttaa aggcaaatgg gagagaccct 1200 ttgaagtcaa ggacaccgag gaagaggact tccacgtgga ccaggtgacc accgtgaagg 1260 tgcctatgat gaagcgttta ggcatgttta acatccagca ctgtaagaag ctgtccagct 1320 gggtgctgct gatgaaatac ctgggcaatg ccaccgccat cttcttcctg cctgatgagg 1380 ggaaactaca gcacctggaa aatgaactca cccacgatat catcaccaag ttcctggaaa 1440 atgaagacag aaggtctgcc agcttacatt tacccaaact gtccattact ggaacctatg 1500 atctgaagag cgtcctgggt caactgggca tcactaaggt cttcagcaat ggggctgacc 1560 tctccggggt cacagaggag gcacccctga agctctccaa ggccgtgcat aaggctgtgc 1620 tgaccatcga cgagaaaggg actgaagctg ctggggccat gtttttagag gccataccca 1680 tgtctatccc ccccgaggtc aagttcaaca aaccctttgt cttcttaatg attgaacaaa 1740 ataccaagtc tcccctcttc atgggaaaag tggtgaatcc cacccaaaaa taactgcctc 1800 tcgctcctca acccctcccc tccatccctg gccccctccc tggatgacat taaagaaggg 1860 ttgagctggt ccctgcctgc atgtgactgt aaatccctcc catgttttct ctgagtctcc 1920 ctttgcctgc tgaggctgta tgtgggctcc aggtaacagt gctgtcttcg ggccccctga 1980 actgtgttca tggagcatct ggctgggtag gcacatgctg ggcttgaatc caggggggac 2040 tgaatcctca gcttacggac ctgggcccat ctgtttctgg agggctccag tcttccttgt 2100 cctgtcttgg agtccccaag aaggaatcac aggggaggaa ccagatacca gccatgaccc 2160 caggctccac caagcatctt catgtccccc tgctcatccc ccactccccc ccacccagag 2220 ttgctcatcc tgccagggct ggctgtgccc accccaaggc tgccctcctg ggggccccag 2280 aactgcctga tcgtgccgtg gcccagtttt gtggcatctg cagcaacaca agagagagga 2340 caatgtcctc ctcttgaccc gctgtcacct aaccagactc gggccctgca cctctcaggc 2400 acttctggaa aatgactgag gcagattctt cctgaagccc attctccatg gggcaacaag 2460 gacacctatt ctgtccttgt ccttccatcg ctgccccaga aagcctcaca tatctccgtt 2520 tagaatcagg tcccttctcc ccagatgaag aggagggtct ctgctttgtt ttctctatct 2580 cctcctcaga cttgaccagg cccagcaggc cccagaagac cattacccta tatcccttct 2640 cctccctagt cacatggcca taggcctgct gatggctcag gaaggccatt gcaaggactc 2700 ctcagctatg ggagaggaag cacatcaccc attgaccccc gcaacccctc cctttcctcc 2760 tctgagtccc gactggggcc acatgcagcc tgacttcttt gtgcctgttg ctgtccctgc 2820 agtcttcaga gggccaccgc agctccagtg ccacggcagg aggctgttcc tgaatagccc 2880 ctgtggtaag ggccaggaga gtccttccat cctccaaggc cctgctaaag gacacagcag 2940 ccaggaagtc ccctgggccc ctagctgaag gacagcctgc tccctccgtc tctaccagga 3000 atggccttgt cctatggaag gcactgcccc atcccaaact aatctaggaa tcactgtcta 3060 accactcact gtcatgaatg tgtacttaaa ggatgaggtt gagtcatacc aaatagtgat 3120 ttcgatagtt caaaatggtg aaattagcaa ttctacatga ttcagtctaa tcaatggata 3180 ccgactgttt cccacacaag tctcctgttc tcttaagctt actcactgac agcctttcac 3240 tctccacaaa tacattaaag atatggccat caccaagccc cctaggatga caccagacct 3300 gagagtctga agacctggat ccaagttctg acttttcccc ctgacagctg tgtgaccttc 3360 gtgaagtcgc caaacctctc tgagccccag tcattgctag taagacctgc ctttgagttg 3420 gtatgatgtt caagttagat aacaaaatgt ttatacccat tagaacagag aataaataga 3480 actacatttc ttgca 3495 <210> 8 <211> 3492 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 tgggcaggaa ctgggcactg tgcccagggc atgcactgcc tccacgcagc aaccctcaga 60 gtcctgagct gaaccaagaa ggaggagggg gtcgggcctc cgaggaaggc ctagccgctg 120 ctgctgccag gaattccagg ttggaggggc ggcaacctcc tgccagcctt caggccactc 180 tcctgtgcct gccagaagag acagagcttg aggagagctt gaggagagca ggaaagggcg 240 gcagtaagtc ttcagcatca ggcattttgg ggtgactcag taaatggtag atcttgctac 300 cagtggaaca gccactaagg attctgcagt gagagcagag ggccagctaa gtggtactct 360 cccagagact gtctgactca cgccaccccc tccaccttgg acacaggacg ctgtggtttc 420 tgagccagcc tcccccgttg cccctctgga tccactgctt aaatacggac gaggacaggg 480 ccctgtctcc tcagcttcag gcaccaccac tgacctggga cagtgaatcg acaatgccgt 540 cttctgtctc gtggggcatc ctcctgctgg caggcctgtg ctgcctggtc cctgtctccc 600 tggctgagga tccccaggga gatgctgccc agaagacaga tacatcccac catgatcagg 660 atcacccaac cttcaacaag atcaccccca acctggctga gttcgccttc agcctatacc 720 gccagctggc acaccagtcc aacagcacca atatcttctt ctccccagtg agcatcgcta 780 cagcctttgc aatgctctcc ctggggacca aggctgacac tcacgatgaa atcctggagg 840 gcctgaattt caacctcacg gagattccgg aggctcagat ccatgaaggc ttccaggaac 900 tcctccgtac cctcaaccag ccagacagcc agctccagct gaccaccggc aatggcctgt 960 tcctcagcga gggcctgaag ctagtggata agtttttgga ggatgttaaa aagttgtacc 1020 actcagaagc cttcactgtc aacttcgggg acaccgaaga ggccaagaaa cagatcaacg 1080 attacgtgga gaagggtact caagggaaaa ttgtggattt ggtcaaggag cttgacagag 1140 acacagtttt tgctctggtg aattacatct tctttaaagg caaatgggag agaccctttg 1200 aagtcaagga caccgaggaa gaggacttcc acgtggacca ggtgaccacc gtgaaggtgc 1260 ctatgatgaa gcgtttaggc atgtttaaca tccagcactg taagaagctg tccagctggg 1320 tgctgctgat gaaatacctg ggcaatgcca ccgccatctt cttcctgcct gatgagggga 1380 aactacagca cctggaaaat gaactcaccc acgatatcat caccaagttc ctggaaaatg 1440 aagacagaag gtctgccagc ttacatttac ccaaactgtc cattactgga acctatgatc 1500 tgaagagcgt cctgggtcaa ctgggcatca ctaaggtctt cagcaatggg gctgacctct 1560 ccggggtcac agaggaggca cccctgaagc tctccaaggc cgtgcataag gctgtgctga 1620 ccatcgacga gaaagggact gaagctgctg gggccatgtt tttagaggcc atacccatgt 1680 ctatcccccc cgaggtcaag ttcaacaaac cctttgtctt cttaatgatt gaacaaaata 1740 ccaagtctcc cctcttcatg ggaaaagtgg tgaatcccac ccaaaaataa ctgcctctcg 1800 ctcctcaacc cctcccctcc atccctggcc ccctccctgg atgacattaa agaagggttg 1860 agctggtccc tgcctgcatg tgactgtaaa tccctcccat gttttctctg agtctccctt 1920 tgcctgctga ggctgtatgt gggctccagg taacagtgct gtcttcgggc cccctgaact 1980 gtgttcatgg agcatctggc tgggtaggca catgctgggc ttgaatccag gggggactga 2040 atcctcagct tacggacctg ggcccatctg tttctggagg gctccagtct tccttgtcct 2100 gtcttggagt ccccaagaag gaatcacagg ggaggaacca gataccagcc atgaccccag 2160 gctccaccaa gcatcttcat gtccccctgc tcatccccca ctccccccca cccagagttg 2220 ctcatcctgc cagggctggc tgtgcccacc ccaaggctgc cctcctgggg gccccagaac 2280 tgcctgatcg tgccgtggcc cagttttgtg gcatctgcag caacacaaga gagaggacaa 2340 tgtcctcctc ttgacccgct gtcacctaac cagactcggg ccctgcacct ctcaggcact 2400 tctggaaaat gactgaggca gattcttcct gaagcccatt ctccatgggg caacaaggac 2460 acctattctg tccttgtcct tccatcgctg ccccagaaag cctcacatat ctccgtttag 2520 aatcaggtcc cttctcccca gatgaagagg agggtctctg ctttgttttc tctatctcct 2580 cctcagactt gaccaggccc agcaggcccc agaagaccat taccctatat cccttctcct 2640 ccctagtcac atggccatag gcctgctgat ggctcaggaa ggccattgca aggactcctc 2700 agctatggga gaggaagcac atcacccatt gacccccgca acccctccct ttcctcctct 2760 gagtcccgac tggggccaca tgcagcctga cttctttgtg cctgttgctg tccctgcagt 2820 cttcagaggg ccaccgcagc tccagtgcca cggcaggagg ctgttcctga atagcccctg 2880 tggtaagggc caggagagtc cttccatcct ccaaggccct gctaaaggac acagcagcca 2940 ggaagtcccc tgggccccta gctgaaggac agcctgctcc ctccgtctct accaggaatg 3000 gccttgtcct atggaaggca ctgccccatc ccaaactaat ctaggaatca ctgtctaacc 3060 actcactgtc atgaatgtgt acttaaagga tgaggttgag tcataccaaa tagtgatttc 3120 gatagttcaa aatggtgaaa ttagcaattc tacatgattc agtctaatca atggataccg 3180 actgtttccc acacaagtct cctgttctct taagcttact cactgacagc ctttcactct 3240 ccacaaatac attaaagata tggccatcac caagccccct aggatgacac cagacctgag 3300 agtctgaaga cctggatcca agttctgact tttccccctg acagctgtgt gaccttcgtg 3360 aagtcgccaa acctctctga gccccagtca ttgctagtaa gacctgcctt tgagttggta 3420 tgatgttcaa gttagataac aaaatgttta tacccattag aacagagaat aaatagaact 3480 acatttcttg ca 3492 <210> 9 <211> 3510 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 tgggcaggaa ctgggcactg tgcccagggc atgcactgcc tccacgcagc aaccctcaga 60 gtcctgagct gaaccaagaa ggaggagggg gtcgggcctc cgaggaaggc ctagccgctg 120 ctgctgccag gaattccagg ttggaggggc ggcaacctcc tgccagcctt caggccactc 180 tcctgtgcct gccagaagag acagagcttg aggagagctt gaggagagca ggaaagggcg 240 gcagtaagtc ttcagcatca ggcattttgg ggtgactcag taaatggtag atcttgctac 300 cagtggaaca gccactaagg attctgcagt gagagcagag ggccagctaa gtggtactct 360 cccagagact gtctgactca cgccaccccc tccaccttgg acacaggacg ctgtggtttc 420 tgagccaggt acaatgactc ctttcgcctc ccccgttgcc cctctggatc cactgcttaa 480 atacggacga ggacagggcc ctgtctcctc agcttcaggc accaccactg acctgggaca 540 gtgaatcgac aatgccgtct tctgtctcgt ggggcatcct cctgctggca ggcctgtgct 600 gcctggtccc tgtctccctg gctgaggatc cccagggaga tgctgcccag aagacagata 660 catcccacca tgatcaggat cacccaacct tcaacaagat cacccccaac ctggctgagt 720 tcgccttcag cctataccgc cagctggcac accagtccaa cagcaccaat atcttcttct 780 ccccagtgag catcgctaca gcctttgcaa tgctctccct ggggaccaag gctgacactc 840 acgatgaaat cctggagggc ctgaatttca acctcacgga gattccggag gctcagatcc 900 atgaaggctt ccaggaactc ctccgtaccc tcaaccagcc agacagccag ctccagctga 960 ccaccggcaa tggcctgttc ctcagcgagg gcctgaagct agtggataag tttttggagg 1020 atgttaaaaa gttgtaccac tcagaagcct tcactgtcaa cttcggggac accgaagagg 1080 ccaagaaaca gatcaacgat tacgtggaga agggtactca agggaaaatt gtggatttgg 1140 tcaaggagct tgacagagac acagtttttg ctctggtgaa ttacatcttc tttaaaggca 1200 aatgggagag accctttgaa gtcaaggaca ccgaggaaga ggacttccac gtggaccagg 1260 tgaccaccgt gaaggtgcct atgatgaagc gtttaggcat gtttaacatc cagcactgta 1320 agaagctgtc cagctgggtg ctgctgatga aatacctggg caatgccacc gccatcttct 1380 tcctgcctga tgaggggaaa ctacagcacc tggaaaatga actcacccac gatatcatca 1440 ccaagttcct ggaaaatgaa gacagaaggt ctgccagctt acatttaccc aaactgtcca 1500 ttactggaac ctatgatctg aagagcgtcc tgggtcaact gggcatcact aaggtcttca 1560 gcaatggggc tgacctctcc ggggtcacag aggaggcacc cctgaagctc tccaaggccg 1620 tgcataaggc tgtgctgacc atcgacgaga aagggactga agctgctggg gccatgtttt 1680 tagaggccat acccatgtct atcccccccg aggtcaagtt caacaaaccc tttgtcttct 1740 taatgattga acaaaatacc aagtctcccc tcttcatggg aaaagtggtg aatcccaccc 1800 aaaaataact gcctctcgct cctcaacccc tcccctccat ccctggcccc ctccctggat 1860 gacattaaag aagggttgag ctggtccctg cctgcatgtg actgtaaatc cctcccatgt 1920 tttctctgag tctccctttg cctgctgagg ctgtatgtgg gctccaggta acagtgctgt 1980 cttcgggccc cctgaactgt gttcatggag catctggctg ggtaggcaca tgctgggctt 2040 gaatccaggg gggactgaat cctcagctta cggacctggg cccatctgtt tctggagggc 2100 tccagtcttc cttgtcctgt cttggagtcc ccaagaagga atcacagggg aggaaccaga 2160 taccagccat gaccccaggc tccaccaagc atcttcatgt ccccctgctc atcccccact 2220 cccccccacc cagagttgct catcctgcca gggctggctg tgcccacccc aaggctgccc 2280 tcctgggggc cccagaactg cctgatcgtg ccgtggccca gttttgtggc atctgcagca 2340 acacaagaga gaggacaatg tcctcctctt gacccgctgt cacctaacca gactcgggcc 2400 ctgcacctct caggcacttc tggaaaatga ctgaggcaga ttcttcctga agcccattct 2460 ccatggggca acaaggacac ctattctgtc cttgtccttc catcgctgcc ccagaaagcc 2520 tcacatatct ccgtttagaa tcaggtccct tctccccaga tgaagaggag ggtctctgct 2580 ttgttttctc tatctcctcc tcagacttga ccaggcccag caggccccag aagaccatta 2640 ccctatatcc cttctcctcc ctagtcacat ggccataggc ctgctgatgg ctcaggaagg 2700 ccattgcaag gactcctcag ctatgggaga ggaagcacat cacccattga cccccgcaac 2760 ccctcccttt cctcctctga gtcccgactg gggccacatg cagcctgact tctttgtgcc 2820 tgttgctgtc cctgcagtct tcagagggcc accgcagctc cagtgccacg gcaggaggct 2880 gttcctgaat agcccctgtg gtaagggcca ggagagtcct tccatcctcc aaggccctgc 2940 taaaggacac agcagccagg aagtcccctg ggcccctagc tgaaggacag cctgctccct 3000 ccgtctctac caggaatggc cttgtcctat ggaaggcact gccccatccc aaactaatct 3060 aggaatcact gtctaaccac tcactgtcat gaatgtgtac ttaaaggatg aggttgagtc 3120 ataccaaata gtgatttcga tagttcaaaa tggtgaaatt agcaattcta catgattcag 3180 tctaatcaat ggataccgac tgtttcccac acaagtctcc tgttctctta agcttactca 3240 ctgacagcct ttcactctcc acaaatacat taaagatatg gccatcacca agccccctag 3300 gatgacacca gacctgagag tctgaagacc tggatccaag ttctgacttt tccccctgac 3360 agctgtgtga ccttcgtgaa gtcgccaaac ctctctgagc cccagtcatt gctagtaaga 3420 cctgcctttg agttggtatg atgttcaagt tagataacaa aatgtttata cccattagaa 3480 cagagaataa atagaactac atttcttgca 3510 <210> 10 <211> 3303 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 tgggcaggaa ctgggcactg tgcccagggc atgcactgcc tccacgcagc aaccctcaga 60 gtcctgagct gaaccaagaa ggaggagggg gtcgggcctc cgaggaaggc ctagccgctg 120 ctgctgccag gaattccagg ttggaggggc ggcaacctcc tgccagcctt caggccactc 180 tcctgtgcct gccagaagag acagagcttg aggagagctt gaggagagca ggaaagcagc 240 ctcccccgtt gcccctctgg atccactgct taaatacgga cgaggacagg gccctgtctc 300 ctcagcttca ggcaccacca ctgacctggg acagtgaatc gacaatgccg tcttctgtct 360 cgtggggcat cctcctgctg gcaggcctgt gctgcctggt ccctgtctcc ctggctgagg 420 atccccaggg agatgctgcc cagaagacag atacatccca ccatgatcag gatcacccaa 480 ccttcaacaa gatcaccccc aacctggctg agttcgcctt cagcctatac cgccagctgg 540 cacaccagtc caacagcacc aatatcttct tctccccagt gagcatcgct acagcctttg 600 caatgctctc cctggggacc aaggctgaca ctcacgatga aatcctggag ggcctgaatt 660 tcaacctcac ggagattccg gaggctcaga tccatgaagg cttccaggaa ctcctccgta 720 ccctcaacca gccagacagc cagctccagc tgaccaccgg caatggcctg ttcctcagcg 780 agggcctgaa gctagtggat aagtttttgg aggatgttaa aaagttgtac cactcagaag 840 ccttcactgt caacttcggg gacaccgaag aggccaagaa acagatcaac gattacgtgg 900 agaagggtac tcaagggaaa attgtggatt tggtcaagga gcttgacaga gacacagttt 960 ttgctctggt gaattacatc ttctttaaag gcaaatggga gagacccttt gaagtcaagg 1020 acaccgagga agaggacttc cacgtggacc aggtgaccac cgtgaaggtg cctatgatga 1080 agcgtttagg catgtttaac atccagcact gtaagaagct gtccagctgg gtgctgctga 1140 tgaaatacct gggcaatgcc accgccatct tcttcctgcc tgatgagggg aaactacagc 1200 acctggaaaa tgaactcacc cacgatatca tcaccaagtt cctggaaaat gaagacagaa 1260 ggtctgccag cttacattta cccaaactgt ccattactgg aacctatgat ctgaagagcg 1320 tcctgggtca actgggcatc actaaggtct tcagcaatgg ggctgacctc tccggggtca 1380 cagaggaggc acccctgaag ctctccaagg ccgtgcataa ggctgtgctg accatcgacg 1440 agaaagggac tgaagctgct ggggccatgt ttttagaggc catacccatg tctatccccc 1500 ccgaggtcaa gttcaacaaa ccctttgtct tcttaatgat tgaacaaaat accaagtctc 1560 ccctcttcat gggaaaagtg gtgaatccca cccaaaaata actgcctctc gctcctcaac 1620 ccctcccctc catccctggc cccctccctg gatgacatta aagaagggtt gagctggtcc 1680 ctgcctgcat gtgactgtaa atccctccca tgttttctct gagtctccct ttgcctgctg 1740 aggctgtatg tgggctccag gtaacagtgc tgtcttcggg ccccctgaac tgtgttcatg 1800 gagcatctgg ctgggtaggc acatgctggg cttgaatcca ggggggactg aatcctcagc 1860 ttacggacct gggcccatct gtttctggag ggctccagtc ttccttgtcc tgtcttggag 1920 tccccaagaa ggaatcacag gggaggaacc agataccagc catgacccca ggctccacca 1980 agcatcttca tgtccccctg ctcatccccc actccccccc acccagagtt gctcatcctg 2040 ccagggctgg ctgtgcccac cccaaggctg ccctcctggg ggccccagaa ctgcctgatc 2100 gtgccgtggc ccagttttgt ggcatctgca gcaacacaag agagaggaca atgtcctcct 2160 cttgacccgc tgtcacctaa ccagactcgg gccctgcacc tctcaggcac ttctggaaaa 2220 tgactgaggc agattcttcc tgaagcccat tctccatggg gcaacaagga cacctattct 2280 gtccttgtcc ttccatcgct gccccagaaa gcctcacata tctccgttta gaatcaggtc 2340 ccttctcccc agatgaagag gagggtctct gctttgtttt ctctatctcc tcctcagact 2400 tgaccaggcc cagcaggccc cagaagacca ttaccctata tcccttctcc tccctagtca 2460 catggccata ggcctgctga tggctcagga aggccattgc aaggactcct cagctatggg 2520 agaggaagca catcacccat tgacccccgc aacccctccc tttcctcctc tgagtcccga 2580 ctggggccac atgcagcctg acttctttgt gcctgttgct gtccctgcag tcttcagagg 2640 gccaccgcag ctccagtgcc acggcaggag gctgttcctg aatagcccct gtggtaaggg 2700 ccaggagagt ccttccatcc tccaaggccc tgctaaagga cacagcagcc aggaagtccc 2760 ctgggcccct agctgaagga cagcctgctc cctccgtctc taccaggaat ggccttgtcc 2820 tatggaaggc actgccccat cccaaactaa tctaggaatc actgtctaac cactcactgt 2880 catgaatgtg tacttaaagg atgaggttga gtcataccaa atagtgattt cgatagttca 2940 aaatggtgaa attagcaatt ctacatgatt cagtctaatc aatggatacc gactgtttcc 3000 cacacaagtc tcctgttctc ttaagcttac tcactgacag cctttcactc tccacaaata 3060 cattaaagat atggccatca ccaagccccc taggatgaca ccagacctga gagtctgaag 3120 acctggatcc aagttctgac ttttccccct gacagctgtg tgaccttcgt gaagtcgcca 3180 aacctctctg agccccagtc attgctagta agacctgcct ttgagttggt atgatgttca 3240 agttagataa caaaatgttt atacccatta gaacagagaa taaatagaac tacatttctt 3300 gca 3303 <210> 11 <211> 3300 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 tgggcaggaa ctgggcactg tgcccagggc atgcactgcc tccacgcagc aaccctcaga 60 gtcctgagct gaaccaagaa ggaggagggg gtcgggcctc cgaggaaggc ctagccgctg 120 ctgctgccag gaattccagg ttggaggggc ggcaacctcc tgccagcctt caggccactc 180 tcctgtgcct gccagaagag acagagcttg aggagagctt gaggagagca ggaaagcctc 240 ccccgttgcc cctctggatc cactgcttaa atacggacga ggacagggcc ctgtctcctc 300 agcttcaggc accaccactg acctgggaca gtgaatcgac aatgccgtct tctgtctcgt 360 ggggcatcct cctgctggca ggcctgtgct gcctggtccc tgtctccctg gctgaggatc 420 cccagggaga tgctgcccag aagacagata catcccacca tgatcaggat cacccaacct 480 tcaacaagat cacccccaac ctggctgagt tcgccttcag cctataccgc cagctggcac 540 accagtccaa cagcaccaat atcttcttct ccccagtgag catcgctaca gcctttgcaa 600 tgctctccct ggggaccaag gctgacactc acgatgaaat cctggagggc ctgaatttca 660 acctcacgga gattccggag gctcagatcc atgaaggctt ccaggaactc ctccgtaccc 720 tcaaccagcc agacagccag ctccagctga ccaccggcaa tggcctgttc ctcagcgagg 780 gcctgaagct agtggataag tttttggagg atgttaaaaa gttgtaccac tcagaagcct 840 tcactgtcaa cttcggggac accgaagagg ccaagaaaca gatcaacgat tacgtggaga 900 agggtactca agggaaaatt gtggatttgg tcaaggagct tgacagagac acagtttttg 960 ctctggtgaa ttacatcttc tttaaaggca aatgggagag accctttgaa gtcaaggaca 1020 ccgaggaaga ggacttccac gtggaccagg tgaccaccgt gaaggtgcct atgatgaagc 1080 gtttaggcat gtttaacatc cagcactgta agaagctgtc cagctgggtg ctgctgatga 1140 aatacctggg caatgccacc gccatcttct tcctgcctga tgaggggaaa ctacagcacc 1200 tggaaaatga actcacccac gatatcatca ccaagttcct ggaaaatgaa gacagaaggt 1260 ctgccagctt acatttaccc aaactgtcca ttactggaac ctatgatctg aagagcgtcc 1320 tgggtcaact gggcatcact aaggtcttca gcaatggggc tgacctctcc ggggtcacag 1380 aggaggcacc cctgaagctc tccaaggccg tgcataaggc tgtgctgacc atcgacgaga 1440 aagggactga agctgctggg gccatgtttt tagaggccat acccatgtct atcccccccg 1500 aggtcaagtt caacaaaccc tttgtcttct taatgattga acaaaatacc aagtctcccc 1560 tcttcatggg aaaagtggtg aatcccaccc aaaaataact gcctctcgct cctcaacccc 1620 tcccctccat ccctggcccc ctccctggat gacattaaag aagggttgag ctggtccctg 1680 cctgcatgtg actgtaaatc cctcccatgt tttctctgag tctccctttg cctgctgagg 1740 ctgtatgtgg gctccaggta acagtgctgt cttcgggccc cctgaactgt gttcatggag 1800 catctggctg ggtaggcaca tgctgggctt gaatccaggg gggactgaat cctcagctta 1860 cggacctggg cccatctgtt tctggagggc tccagtcttc cttgtcctgt cttggagtcc 1920 ccaagaagga atcacagggg aggaaccaga taccagccat gaccccaggc tccaccaagc 1980 atcttcatgt ccccctgctc atcccccact cccccccacc cagagttgct catcctgcca 2040 gggctggctg tgcccacccc aaggctgccc tcctgggggc cccagaactg cctgatcgtg 2100 ccgtggccca gttttgtggc atctgcagca acacaagaga gaggacaatg tcctcctctt 2160 gacccgctgt cacctaacca gactcgggcc ctgcacctct caggcacttc tggaaaatga 2220 ctgaggcaga ttcttcctga agcccattct ccatggggca acaaggacac ctattctgtc 2280 cttgtccttc catcgctgcc ccagaaagcc tcacatatct ccgtttagaa tcaggtccct 2340 tctccccaga tgaagaggag ggtctctgct ttgttttctc tatctcctcc tcagacttga 2400 ccaggcccag caggccccag aagaccatta ccctatatcc cttctcctcc ctagtcacat 2460 ggccataggc ctgctgatgg ctcaggaagg ccattgcaag gactcctcag ctatgggaga 2520 ggaagcacat cacccattga cccccgcaac ccctcccttt cctcctctga gtcccgactg 2580 gggccacatg cagcctgact tctttgtgcc tgttgctgtc cctgcagtct tcagagggcc 2640 accgcagctc cagtgccacg gcaggaggct gttcctgaat agcccctgtg gtaagggcca 2700 ggagagtcct tccatcctcc aaggccctgc taaaggacac agcagccagg aagtcccctg 2760 ggcccctagc tgaaggacag cctgctccct ccgtctctac caggaatggc cttgtcctat 2820 ggaaggcact gccccatccc aaactaatct aggaatcact gtctaaccac tcactgtcat 2880 gaatgtgtac ttaaaggatg aggttgagtc ataccaaata gtgatttcga tagttcaaaa 2940 tggtgaaatt agcaattcta catgattcag tctaatcaat ggataccgac tgtttcccac 3000 acaagtctcc tgttctctta agcttactca ctgacagcct ttcactctcc acaaatacat 3060 taaagatatg gccatcacca agccccctag gatgacacca gacctgagag tctgaagacc 3120 tggatccaag ttctgacttt tccccctgac agctgtgtga ccttcgtgaa gtcgccaaac 3180 ctctctgagc cccagtcatt gctagtaaga cctgcctttg agttggtatg atgttcaagt 3240 tagataacaa aatgtttata cccattagaa cagagaataa atagaactac atttcttgca 3300 <210> 12 <211> 1321 <212> DNA <213> Macaca mulatta <400> 12 caggacaatg ccatcttctg tctcatgggg cgtcctcctg ctggcaggcc tgtgctgcct 60 gctccccggc tctctggctg aggatcccca gggagatgct gcccagaaga cggatacatc 120 ccaccatgat caggaccacc caaccctcaa caagatcacc cccagcctgg ctgagttcgg 180 cttcagccta taccgccagc tggcacacca gtccaacagc accaatatct tcttctcccc 240 agtgagcatc gctacagcct ttgcaatgct ctccctgggg accaaggctg acactcacag 300 tgaaatcctg gagggcctga atttcaacgt cacggagatt ccggaggctc aggtccatga 360 aggcttccag gaactcctcc ataccctcaa caagccagac agccagctcc agctgaccac 420 cggcaacggc ctgttcctca acaagagcct gaaggtagtg gataagtttt tggaggatgt 480 caaaaaactg taccactcag aagccttctc tgtcaacttt gaggacaccg aagaggccaa 540 gaaacagatc aacaattacg tggagaagga aactcaaggg aaaattgtgg atttggtcaa 600 ggagcttgac agagacacag tttttgctct ggtgaattac atcttcttta aaggcaaatg 660 ggagagaccc tttgacgttg aggccaccaa ggaagaggac ttccacgtgg accaggcgac 720 caccgtgaag gtgcccatga tgaggcgttt aggcatgttt aacatctacc actgtgagaa 780 gctgtccagc tgggtgctgc tgatgaaata cctgggcaat gccaccgcca tcttcttcct 840 gcctgatgag gggaaactgc agcacctgga aaatgaactc acccatgata tcatcaccaa 900 gttcctggaa aatgaaaaca gcaggtctgc caacttacat ttacccagac tggccattac 960 tggaacctat gatctgaaga cagtcctggg ccacctgggt atcactaagg tcttcagcaa 1020 tggggctgac ctctcgggga tcacggagga ggcacccctg aagctctcca aggccgtgca 1080 taaggctgtg ctgaccatcg atgagaaagg gactgaagct gctggggcca tgtttttaga 1140 ggccataccc atgtctattc cccccgaggt caagttcaac aaaccctttg tcttcttaat 1200 gattgaacaa aataccaagt ctcccctctt catgggaaaa gtggtgaatc ccacccagaa 1260 ataactgcct gtcactcctc agcccctccc ctccatccct ggccccctcc ctgaatgaca 1320 t 1321 <210> 13 <211> 2064 <212> DNA <213> Macaca mulatta <400> 13 gcccagtctt gtgtctgcct ggcaatgggc aaggcccctt cctgcccaag ctccccgccc 60 ctccccaacc tattgcctcc gccacccgcc acccgaggcc aacttcctgg gtgggcagga 120 actgggccct gtgcccaggg cgtgcactgc ctccacgcag caaccctcag agtactgagc 180 tgagcaaagg aggaggaggg gatcagcact ctgaggaagg cctagccact gctgctgcca 240 ggaattccag ggcggcatca gtcttcagca tcaggcattt cggggtgaat tagtaaatgg 300 tagatcttgc taccagtgga acagccgcta aggattctgc agtgagagca gagggccagc 360 aaagtggtac tctcccagcg actggctgac tcacgccacc ccctccacct tggacgcagg 420 acactgtggt ttctgagcca ggtacaatga ctccttttgg tacgtgcagt ggaggctgta 480 tgctgctcag gcagagcgtc cggacagcgt gggcgggcga ctcagcgccc agcctgtgaa 540 cttagtccct gtttgctcct ccggtaactg gggtgatctt ggttaatatt caccagcagc 600 ctcccccgtt gcccctctgc acccactgct taaatacgga caaggacagg gctctgtctc 660 ctcagcctca ggcaccacca ctgacctggg acggtgaatc gacaatgcca tcttctgtct 720 catggggcgt cctcctgctg gcaggcctgt gctgcctgct ccccggctct ctggctgagg 780 atccccaggg agatgctgcc cagaagacgg atacatccca ccatgatcag gaccacccaa 840 ccctcaacaa gatcaccccc agcctggctg agttcggctt cagcctatac cgccagctgg 900 cacaccagtc caacagcacc aatatcttct tctccccagt gagcatcgct acagcctttg 960 caatgctctc cctggggacc aaggctgaca ctcacagtga aatcctggag ggcctgaatt 1020 tcaacgtcac ggagattccg gaggctcagg tccatgaagg cttccaggaa ctcctccata 1080 ccctcaacaa gccagacagc cagctccagc tgaccaccgg caacggcctg ttcctcaaca 1140 agagcctgaa ggtagtggat aagtttttgg aggatgtcaa aaaactgtac cactcagaag 1200 ccttctctgt caactttgag gacaccgaag aggccaagaa acagatcaac aattacgtgg 1260 agaaggaaac tcaagggaaa attgtggatt tggtcaagga gcttgacaga gacacagttt 1320 ttgctctggt gaattacatc ttctttaaag gcaaatggga gagacccttt gacgttgagg 1380 ccaccaagga agaggacttc cacgtggacc aggcgaccac cgtgaaggtg cccatgatga 1440 ggcgtttagg catgtttaac atctaccact gtgagaagct gtccagctgg gtgctgctga 1500 tgaaatacct gggcaatgcc accgccatct tcttcctgcc tgatgagggg aaactgcagc 1560 acctggaaaa tgaactcacc catgatatca tcaccaagtt cctggaaaat gaaaacagca 1620 ggtctgccaa cttacattta cccagactgg ccattactgg aacctatgat ctgaagacag 1680 tcctgggcca cctgggtatc actaaggtct tcagcaatgg ggctgacctc tcggggatca 1740 cggaggaggc acccctgaag ctctccaagg ccgtgcataa ggctgtgctg accatcgatg 1800 agaaagggac tgaagctgct ggggccatgt ttttagaggc catacccatg tctattcccc 1860 ccgaggtcaa gttcaacaaa ccctttgtct tcttaatgat tgaacaaaat accaagtctc 1920 ccctcttcat gggaaaagtg gtgaatccca cccagaaata actgcctgtc actcctcagc 1980 ccctcccctc catccctggc cccctccctg aatgacatta aagaagggtt gagctggtcc 2040 ctgcctgcgt gtgtgactgc aaac 2064 <210> 14 <211> 1608 <212> DNA <213> Macaca mulatta <400> 14 tcttgtgtct gcctggcaat gggcaaggcc ccttcctgcc caagctcccc gcccctcccc 60 aacctattgc ctccgccacc cgccacccga ggccaacttc ctgggtgggc aggaactggg 120 ccctgtgccc agggcgtgca ctgcctccac gcagcaaccc tcagagtact gagctgagca 180 aaggaggagg aggggatcag cactctgagg aaggcctagc cactgctgct gccaggaatt 240 ccaggacaat gccatcttct gtctcatggg gcgtcctcct gctggcaggc ctgtgctgcc 300 tgctccccgg ctctctggct gaggatcccc agggagatgc tgcccagaag acggatacat 360 cccaccatga tcaggaccac ccaaccctca acaagatcac ccccagcctg gctgagttcg 420 gcttcagcct ataccgccag ctggcacacc agtccaacag caccaatatc ttcttctccc 480 cagtgagcat cgctacagcc tttgcaatgc tctccctggg gaccaaggct gacactcaca 540 gtgaaatcct ggagggcctg aatttcaacg tcacggagat tccggaggct caggtccatg 600 aaggcttcca ggaactcctc cataccctca acaagccaga cagccagctc cagctgacca 660 ccggcaacgg cctgttcctc aacaagagcc tgaaggtagt ggataagttt ttggaggatg 720 tcaaaaaact gtaccactca gaagccttct ctgtcaactt tgaggacacc gaagaggcca 780 agaaacagat caacaattac gtggagaagg aaactcaagg gaaaattgtg gatttggtca 840 aggagcttga cagagacaca gtttttgctc tggtgaatta catcttcttt aaaggcaaat 900 gggagagacc ctttgacgtt gaggccacca aggaagagga cttccacgtg gaccaggcga 960 ccaccgtgaa ggtgcccatg atgaggcgtt taggcatgtt taacatctac cactgtgaga 1020 agctgtccag ctgggtgctg ctgatgaaat acctgggcaa tgccaccgcc atcttcttcc 1080 tgcctgatga ggggaaactg cagcacctgg aaaatgaact cacccatgat atcatcacca 1140 agttcctgga aaatgaaaac agcaggtctg ccaacttaca tttacccaga ctggccatta 1200 ctggaaccta tgatctgaag acagtcctgg gccacctggg tatcactaag gtcttcagca 1260 atggggctga cctctcgggg atcacggagg aggcacccct gaagctctcc aaggccgtgc 1320 ataaggctgt gctgaccatc gatgagaaag ggactgaagc tgctggggcc atgtttttag 1380 aggccatacc catgtctatt ccccccgagg tcaagttcaa caaacccttt gtcttcttaa 1440 tgattgaaca aaataccaag tctcccctct tcatgggaaa agtggtgaat cccacccaga 1500 aataactgcc tgtcactcct cagcccctcc cctccatccc tggccccctc cctgaatgac 1560 attaaagaag ggttgagctg gtccctgcct gcgtgtgtga ctgcaaac 1608 <210> 15 <211> 3220 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 tgcaagaaat gtagttctat ttattctctg ttctaatggg tataaacatt ttgttatcta 60 acttgaacat cataccaact caaaggcagg tcttactagc aatgactggg gctcagagag 120 gtttggcgac ttcacgaagg tcacacagct gtcaggggga aaagtcagaa cttggatcca 180 ggtcttcaga ctctcaggtc tggtgtcatc ctagggggct tggtgatggc catatcttta 240 atgtatttgt ggagagtgaa aggctgtcag tgagtaagct taagagaaca ggagacttgt 300 gtgggaaaca gtcggtatcc attgattaga ctgaatcatg tagaattgct aatttcacca 360 ttttgaacta tcgaaatcac tatttggtat gactcaacct catcctttaa gtacacattc 420 atgacagtga gtggttagac agtgattcct agattagttt gggatggggc agtgccttcc 480 ataggacaag gccattcctg gtagagacgg agggagcagg ctgtccttca gctaggggcc 540 caggggactt cctggctgct gtgtccttta gcagggcctt ggaggatgga aggactctcc 600 tggcccttac cacaggggct attcaggaac agcctcctgc cgtggcactg gagctgcggt 660 ggccctctga agactgcagg gacagcaaca ggcacaaaga agtcaggctg catgtggccc 720 cagtcgggac tcagaggagg aaagggaggg gttgcggggg tcaatgggtg atgtgcttcc 780 tctcccatag ctgaggagtc cttgcaatgg ccttcctgag ccatcagcag gcctatggcc 840 atgtgactag ggaggagaag ggatataggg taatggtctt ctggggcctg ctgggcctgg 900 tcaagtctga ggaggagata gagaaaacaa agcagagacc ctcctcttca tctggggaga 960 agggacctga ttctaaacgg agatatgtga ggctttctgg ggcagcgatg gaaggacaag 1020 gacagaatag gtgtccttgt tgccccatgg agaatgggct tcaggaagaa tctgcctcag 1080 tcattttcca gaagtgcctg agaggtgcag ggcccgagtc tggttaggtg acagcgggtc 1140 aagaggagga cattgtcctc tctcttgtgt tgctgcagat gccacaaaac tgggccacgg 1200 cacgatcagg cagttctggg gcccccagga gggcagcctt ggggtgggca cagccagccc 1260 tggcaggatg agcaactctg ggtggggggg agtgggggat gagcaggggg acatgaagat 1320 gcttggtgga gcctggggtc atggctggta tctggttcct cccctgtgat tccttcttgg 1380 ggactccaag acaggacaag gaagactgga gccctccaga aacagatggg cccaggtccg 1440 taagctgagg attcagtccc ccctggattc aagcccagca tgtgcctacc cagccagatg 1500 ctccatgaac acagttcagg gggcccgaag acagcactgt tacctggagc ccacatacag 1560 cctcagcagg caaagggaga ctcagagaaa acatgggagg gatttacagt cacatgcagg 1620 cagggaccag ctcaaccctt ctttaatgtc atccagggag ggggccaggg atggagggga 1680 ggggttgagg agcgagaggc agttattttt gggtgggatt caccactttt cccatgaaga 1740 ggggagactt ggtattttgt tcaatcatta agaagacaaa gggtttgttg aacttgacct 1800 cgggggggat agacatgggt atggcctcta aaaacatggc cccagcagct tcagtccctt 1860 tctcgtcgat ggtcagcaca gccttatgca cggccttgga gagcttcagg ggtgcctcct 1920 ctgtgacccc ggagaggtca gccccattgc tgaagacctt agtgatgccc agttgaccca 1980 ggacgctctt cagatcatag gttccagtaa tggacagttt gggtaaatgt aagctggcag 2040 accttctgtc ttcattttcc aggaacttgg tgatgatatc gtgggtgagt tcattttcca 2100 ggtgctgtag tttcccctca tcaggcagga agaagatggc ggtggcattg cccaggtatt 2160 tcatcagcag cacccagctg gacagcttct tacagtgctg gatgttaaac atgcctaaac 2220 gcttcatcat aggcaccttc acggtggtca cctggtccac gtggaagtcc tcttcctcgg 2280 tgtccttgac ttcaaagggt ctctcccatt tgcctttaaa gaagatgtaa ttcaccagag 2340 caaaaactgt gtctctgtca agctccttga ccaaatccac aattttccct tgagtaccct 2400 tctccacgta atcgttgatc tgtttcttgg cctcttcggt gtccccgaag ttgacagtga 2460 aggcttctga gtggtacaac tttttaacat cctccaaaaa cttatccact agcttcaggc 2520 cctcgctgag gaacaggcca ttgccggtgg tcagctggag ctggctgtct ggctggttga 2580 gggtacggag gagttcctgg aagccttcat ggatctgagc ctccggaatc tccgtgaggt 2640 tgaaattcag gccctccagg atttcatcgt gagtgtcagc cttggtcccc agggagagca 2700 ttgcaaaggc tgtagcgatg ctcactgggg agaagaagat attggtgctg ttggactggt 2760 gtgccagctg gcggtatagg ctgaaggcga actcagccag gttgggggtg atcttgttga 2820 aggttgggtg atcctgatca tggtgggatg tatctgtctt ctgggcagca tctccctggg 2880 gatcctcagc cagggagaca gggaccaggc agcacaggcc tgccagcagg aggatgcccc 2940 acgagacaga agacggcatt gtcgattcac tgtcccaggt cagtggtggt gcctgaagct 3000 gaggagacag ggccctgtcc tcgtccgtat ttaagcagtg gatccagagg ggcaacgggg 3060 gaggctgctg gtgaatatta accaaggtca ccccagttat cggaggagca aacaggggct 3120 aagtccactg gctgggatct gagtcgcccg cctacgctgc ccggacgctt tgcctgggca 3180 gtgtacagct tccactgcac ttaccgaaag gagtcattgt 3220 <210> 16 <211> 3199 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 tgcaagaaat gtagttctat ttattctctg ttctaatggg tataaacatt ttgttatcta 60 acttgaacat cataccaact caaaggcagg tcttactagc aatgactggg gctcagagag 120 gtttggcgac ttcacgaagg tcacacagct gtcaggggga aaagtcagaa cttggatcca 180 ggtcttcaga ctctcaggtc tggtgtcatc ctagggggct tggtgatggc catatcttta 240 atgtatttgt ggagagtgaa aggctgtcag tgagtaagct taagagaaca ggagacttgt 300 gtgggaaaca gtcggtatcc attgattaga ctgaatcatg tagaattgct aatttcacca 360 ttttgaacta tcgaaatcac tatttggtat gactcaacct catcctttaa gtacacattc 420 atgacagtga gtggttagac agtgattcct agattagttt gggatggggc agtgccttcc 480 ataggacaag gccattcctg gtagagacgg agggagcagg ctgtccttca gctaggggcc 540 caggggactt cctggctgct gtgtccttta gcagggcctt ggaggatgga aggactctcc 600 tggcccttac cacaggggct attcaggaac agcctcctgc cgtggcactg gagctgcggt 660 ggccctctga agactgcagg gacagcaaca ggcacaaaga agtcaggctg catgtggccc 720 cagtcgggac tcagaggagg aaagggaggg gttgcggggg tcaatgggtg atgtgcttcc 780 tctcccatag ctgaggagtc cttgcaatgg ccttcctgag ccatcagcag gcctatggcc 840 atgtgactag ggaggagaag ggatataggg taatggtctt ctggggcctg ctgggcctgg 900 tcaagtctga ggaggagata gagaaaacaa agcagagacc ctcctcttca tctggggaga 960 agggacctga ttctaaacgg agatatgtga ggctttctgg ggcagcgatg gaaggacaag 1020 gacagaatag gtgtccttgt tgccccatgg agaatgggct tcaggaagaa tctgcctcag 1080 tcattttcca gaagtgcctg agaggtgcag ggcccgagtc tggttaggtg acagcgggtc 1140 aagaggagga cattgtcctc tctcttgtgt tgctgcagat gccacaaaac tgggccacgg 1200 cacgatcagg cagttctggg gcccccagga gggcagcctt ggggtgggca cagccagccc 1260 tggcaggatg agcaactctg ggtggggggg agtgggggat gagcaggggg acatgaagat 1320 gcttggtgga gcctggggtc atggctggta tctggttcct cccctgtgat tccttcttgg 1380 ggactccaag acaggacaag gaagactgga gccctccaga aacagatggg cccaggtccg 1440 taagctgagg attcagtccc ccctggattc aagcccagca tgtgcctacc cagccagatg 1500 ctccatgaac acagttcagg gggcccgaag acagcactgt tacctggagc ccacatacag 1560 cctcagcagg caaagggaga ctcagagaaa acatgggagg gatttacagt cacatgcagg 1620 cagggaccag ctcaaccctt ctttaatgtc atccagggag ggggccaggg atggagggga 1680 ggggttgagg agcgagaggc agttattttt gggtgggatt caccactttt cccatgaaga 1740 ggggagactt ggtattttgt tcaatcatta agaagacaaa gggtttgttg aacttgacct 1800 cgggggggat agacatgggt atggcctcta aaaacatggc cccagcagct tcagtccctt 1860 tctcgtcgat ggtcagcaca gccttatgca cggccttgga gagcttcagg ggtgcctcct 1920 ctgtgacccc ggagaggtca gccccattgc tgaagacctt agtgatgccc agttgaccca 1980 ggacgctctt cagatcatag gttccagtaa tggacagttt gggtaaatgt aagctggcag 2040 accttctgtc ttcattttcc aggaacttgg tgatgatatc gtgggtgagt tcattttcca 2100 ggtgctgtag tttcccctca tcaggcagga agaagatggc ggtggcattg cccaggtatt 2160 tcatcagcag cacccagctg gacagcttct tacagtgctg gatgttaaac atgcctaaac 2220 gcttcatcat aggcaccttc acggtggtca cctggtccac gtggaagtcc tcttcctcgg 2280 tgtccttgac ttcaaagggt ctctcccatt tgcctttaaa gaagatgtaa ttcaccagag 2340 caaaaactgt gtctctgtca agctccttga ccaaatccac aattttccct tgagtaccct 2400 tctccacgta atcgttgatc tgtttcttgg cctcttcggt gtccccgaag ttgacagtga 2460 aggcttctga gtggtacaac tttttaacat cctccaaaaa cttatccact agcttcaggc 2520 cctcgctgag gaacaggcca ttgccggtgg tcagctggag ctggctgtct ggctggttga 2580 gggtacggag gagttcctgg aagccttcat ggatctgagc ctccggaatc tccgtgaggt 2640 tgaaattcag gccctccagg atttcatcgt gagtgtcagc cttggtcccc agggagagca 2700 ttgcaaaggc tgtagcgatg ctcactgggg agaagaagat attggtgctg ttggactggt 2760 gtgccagctg gcggtatagg ctgaaggcga actcagccag gttgggggtg atcttgttga 2820 aggttgggtg atcctgatca tggtgggatg tatctgtctt ctgggcagca tctccctggg 2880 gatcctcagc cagggagaca gggaccaggc agcacaggcc tgccagcagg aggatgcccc 2940 acgagacaga agacggcatt gtcctttcct gctctcctca agctctcctc aagctctgtc 3000 tcttctggca ggcacaggag agtggcctga aggctggcag gaggttgccg cccctccaac 3060 ctggaattcc tggcagcagc agcggctagg ccttcctcgg aggcccgacc ccctcctcct 3120 tcttggttca gctcaggact ctgagggttg ctgcgtggag gcagtgcatg ccctgggcac 3180 agtgcccagt tcctgccca 3199 <210> 17 <211> 3513 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 tgcaagaaat gtagttctat ttattctctg ttctaatggg tataaacatt ttgttatcta 60 acttgaacat cataccaact caaaggcagg tcttactagc aatgactggg gctcagagag 120 gtttggcgac ttcacgaagg tcacacagct gtcaggggga aaagtcagaa cttggatcca 180 ggtcttcaga ctctcaggtc tggtgtcatc ctagggggct tggtgatggc catatcttta 240 atgtatttgt ggagagtgaa aggctgtcag tgagtaagct taagagaaca ggagacttgt 300 gtgggaaaca gtcggtatcc attgattaga ctgaatcatg tagaattgct aatttcacca 360 ttttgaacta tcgaaatcac tatttggtat gactcaacct catcctttaa gtacacattc 420 atgacagtga gtggttagac agtgattcct agattagttt gggatggggc agtgccttcc 480 ataggacaag gccattcctg gtagagacgg agggagcagg ctgtccttca gctaggggcc 540 caggggactt cctggctgct gtgtccttta gcagggcctt ggaggatgga aggactctcc 600 tggcccttac cacaggggct attcaggaac agcctcctgc cgtggcactg gagctgcggt 660 ggccctctga agactgcagg gacagcaaca ggcacaaaga agtcaggctg catgtggccc 720 cagtcgggac tcagaggagg aaagggaggg gttgcggggg tcaatgggtg atgtgcttcc 780 tctcccatag ctgaggagtc cttgcaatgg ccttcctgag ccatcagcag gcctatggcc 840 atgtgactag ggaggagaag ggatataggg taatggtctt ctggggcctg ctgggcctgg 900 tcaagtctga ggaggagata gagaaaacaa agcagagacc ctcctcttca tctggggaga 960 agggacctga ttctaaacgg agatatgtga ggctttctgg ggcagcgatg gaaggacaag 1020 gacagaatag gtgtccttgt tgccccatgg agaatgggct tcaggaagaa tctgcctcag 1080 tcattttcca gaagtgcctg agaggtgcag ggcccgagtc tggttaggtg acagcgggtc 1140 aagaggagga cattgtcctc tctcttgtgt tgctgcagat gccacaaaac tgggccacgg 1200 cacgatcagg cagttctggg gcccccagga gggcagcctt ggggtgggca cagccagccc 1260 tggcaggatg agcaactctg ggtggggggg agtgggggat gagcaggggg acatgaagat 1320 gcttggtgga gcctggggtc atggctggta tctggttcct cccctgtgat tccttcttgg 1380 ggactccaag acaggacaag gaagactgga gccctccaga aacagatggg cccaggtccg 1440 taagctgagg attcagtccc ccctggattc aagcccagca tgtgcctacc cagccagatg 1500 ctccatgaac acagttcagg gggcccgaag acagcactgt tacctggagc ccacatacag 1560 cctcagcagg caaagggaga ctcagagaaa acatgggagg gatttacagt cacatgcagg 1620 cagggaccag ctcaaccctt ctttaatgtc atccagggag ggggccaggg atggagggga 1680 ggggttgagg agcgagaggc agttattttt gggtgggatt caccactttt cccatgaaga 1740 ggggagactt ggtattttgt tcaatcatta agaagacaaa gggtttgttg aacttgacct 1800 cgggggggat agacatgggt atggcctcta aaaacatggc cccagcagct tcagtccctt 1860 tctcgtcgat ggtcagcaca gccttatgca cggccttgga gagcttcagg ggtgcctcct 1920 ctgtgacccc ggagaggtca gccccattgc tgaagacctt agtgatgccc agttgaccca 1980 ggacgctctt cagatcatag gttccagtaa tggacagttt gggtaaatgt aagctggcag 2040 accttctgtc ttcattttcc aggaacttgg tgatgatatc gtgggtgagt tcattttcca 2100 ggtgctgtag tttcccctca tcaggcagga agaagatggc ggtggcattg cccaggtatt 2160 tcatcagcag cacccagctg gacagcttct tacagtgctg gatgttaaac atgcctaaac 2220 gcttcatcat aggcaccttc acggtggtca cctggtccac gtggaagtcc tcttcctcgg 2280 tgtccttgac ttcaaagggt ctctcccatt tgcctttaaa gaagatgtaa ttcaccagag 2340 caaaaactgt gtctctgtca agctccttga ccaaatccac aattttccct tgagtaccct 2400 tctccacgta atcgttgatc tgtttcttgg cctcttcggt gtccccgaag ttgacagtga 2460 aggcttctga gtggtacaac tttttaacat cctccaaaaa cttatccact agcttcaggc 2520 cctcgctgag gaacaggcca ttgccggtgg tcagctggag ctggctgtct ggctggttga 2580 gggtacggag gagttcctgg aagccttcat ggatctgagc ctccggaatc tccgtgaggt 2640 tgaaattcag gccctccagg atttcatcgt gagtgtcagc cttggtcccc agggagagca 2700 ttgcaaaggc tgtagcgatg ctcactgggg agaagaagat attggtgctg ttggactggt 2760 gtgccagctg gcggtatagg ctgaaggcga actcagccag gttgggggtg atcttgttga 2820 aggttgggtg atcctgatca tggtgggatg tatctgtctt ctgggcagca tctccctggg 2880 gatcctcagc cagggagaca gggaccaggc agcacaggcc tgccagcagg aggatgcccc 2940 acgagacaga agacggcatt gtcgattcac tgtcccaggt cagtggtggt gcctgaagct 3000 gaggagacag ggccctgtcc tcgtccgtat ttaagcagtg gatccagagg ggcaacgggg 3060 gaggctgcga aaggagtcat tgtacctggc tcagaaacca cagcgtcctg tgtccaaggt 3120 ggagggggtg gcgtgagtca gacagtctct gggagagtac cacttagctg gccctctgct 3180 ctcactgcag aatccttagt ggctgttcca ctggtagcaa gatctaccat ttactgagtc 3240 accccaaaat gcctgatgct gaagacttac tgccgccctt tcctgctctc ctcaagctct 3300 cctcaagctc tgtctcttct ggcaggcaca ggagagtggc ctgaaggctg gcaggaggtt 3360 gccgcccctc caacctggaa ttcctggcag cagcagcggc taggccttcc tcggaggccc 3420 gaccccctcc tccttcttgg ttcagctcag gactctgagg gttgctgcgt ggaggcagtg 3480 catgccctgg gcacagtgcc cagttcctgc cca 3513 <210> 18 <211> 3236 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 tgcaagaaat gtagttctat ttattctctg ttctaatggg tataaacatt ttgttatcta 60 acttgaacat cataccaact caaaggcagg tcttactagc aatgactggg gctcagagag 120 gtttggcgac ttcacgaagg tcacacagct gtcaggggga aaagtcagaa cttggatcca 180 ggtcttcaga ctctcaggtc tggtgtcatc ctagggggct tggtgatggc catatcttta 240 atgtatttgt ggagagtgaa aggctgtcag tgagtaagct taagagaaca ggagacttgt 300 gtgggaaaca gtcggtatcc attgattaga ctgaatcatg tagaattgct aatttcacca 360 ttttgaacta tcgaaatcac tatttggtat gactcaacct catcctttaa gtacacattc 420 atgacagtga gtggttagac agtgattcct agattagttt gggatggggc agtgccttcc 480 ataggacaag gccattcctg gtagagacgg agggagcagg ctgtccttca gctaggggcc 540 caggggactt cctggctgct gtgtccttta gcagggcctt ggaggatgga aggactctcc 600 tggcccttac cacaggggct attcaggaac agcctcctgc cgtggcactg gagctgcggt 660 ggccctctga agactgcagg gacagcaaca ggcacaaaga agtcaggctg catgtggccc 720 cagtcgggac tcagaggagg aaagggaggg gttgcggggg tcaatgggtg atgtgcttcc 780 tctcccatag ctgaggagtc cttgcaatgg ccttcctgag ccatcagcag gcctatggcc 840 atgtgactag ggaggagaag ggatataggg taatggtctt ctggggcctg ctgggcctgg 900 tcaagtctga ggaggagata gagaaaacaa agcagagacc ctcctcttca tctggggaga 960 agggacctga ttctaaacgg agatatgtga ggctttctgg ggcagcgatg gaaggacaag 1020 gacagaatag gtgtccttgt tgccccatgg agaatgggct tcaggaagaa tctgcctcag 1080 tcattttcca gaagtgcctg agaggtgcag ggcccgagtc tggttaggtg acagcgggtc 1140 aagaggagga cattgtcctc tctcttgtgt tgctgcagat gccacaaaac tgggccacgg 1200 cacgatcagg cagttctggg gcccccagga gggcagcctt ggggtgggca cagccagccc 1260 tggcaggatg agcaactctg ggtggggggg agtgggggat gagcaggggg acatgaagat 1320 gcttggtgga gcctggggtc atggctggta tctggttcct cccctgtgat tccttcttgg 1380 ggactccaag acaggacaag gaagactgga gccctccaga aacagatggg cccaggtccg 1440 taagctgagg attcagtccc ccctggattc aagcccagca tgtgcctacc cagccagatg 1500 ctccatgaac acagttcagg gggcccgaag acagcactgt tacctggagc ccacatacag 1560 cctcagcagg caaagggaga ctcagagaaa acatgggagg gatttacagt cacatgcagg 1620 cagggaccag ctcaaccctt ctttaatgtc atccagggag ggggccaggg atggagggga 1680 ggggttgagg agcgagaggc agttattttt gggtgggatt caccactttt cccatgaaga 1740 ggggagactt ggtattttgt tcaatcatta agaagacaaa gggtttgttg aacttgacct 1800 cgggggggat agacatgggt atggcctcta aaaacatggc cccagcagct tcagtccctt 1860 tctcgtcgat ggtcagcaca gccttatgca cggccttgga gagcttcagg ggtgcctcct 1920 ctgtgacccc ggagaggtca gccccattgc tgaagacctt agtgatgccc agttgaccca 1980 ggacgctctt cagatcatag gttccagtaa tggacagttt gggtaaatgt aagctggcag 2040 accttctgtc ttcattttcc aggaacttgg tgatgatatc gtgggtgagt tcattttcca 2100 ggtgctgtag tttcccctca tcaggcagga agaagatggc ggtggcattg cccaggtatt 2160 tcatcagcag cacccagctg gacagcttct tacagtgctg gatgttaaac atgcctaaac 2220 gcttcatcat aggcaccttc acggtggtca cctggtccac gtggaagtcc tcttcctcgg 2280 tgtccttgac ttcaaagggt ctctcccatt tgcctttaaa gaagatgtaa ttcaccagag 2340 caaaaactgt gtctctgtca agctccttga ccaaatccac aattttccct tgagtaccct 2400 tctccacgta atcgttgatc tgtttcttgg cctcttcggt gtccccgaag ttgacagtga 2460 aggcttctga gtggtacaac tttttaacat cctccaaaaa cttatccact agcttcaggc 2520 cctcgctgag gaacaggcca ttgccggtgg tcagctggag ctggctgtct ggctggttga 2580 gggtacggag gagttcctgg aagccttcat ggatctgagc ctccggaatc tccgtgaggt 2640 tgaaattcag gccctccagg atttcatcgt gagtgtcagc cttggtcccc agggagagca 2700 ttgcaaaggc tgtagcgatg ctcactgggg agaagaagat attggtgctg ttggactggt 2760 gtgccagctg gcggtatagg ctgaaggcga actcagccag gttgggggtg atcttgttga 2820 aggttgggtg atcctgatca tggtgggatg tatctgtctt ctgggcagca tctccctggg 2880 gatcctcagc cagggagaca gggaccaggc agcacaggcc tgccagcagg aggatgcccc 2940 acgagacaga agacggcatt gtcctgtgga actgagtgag cagcagcagc aatgtcccac 3000 ctttcctgct ctcctcaagc tctcctcaag ctctgtctct tctggcaggc acaggagagt 3060 ggcctgaagg ctggcaggag gttgccgccc ctccaacctg gaattcctgg cagcagcagc 3120 ggctaggcct tcctcggagg cccgaccccc tcctccttct tggttcagct caggactctg 3180 agggttgctg cgtggaggca gtgcatgccc tgggcacagt gcccagttcc tgccca 3236 <210> 19 <211> 3532 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 tgcaagaaat gtagttctat ttattctctg ttctaatggg tataaacatt ttgttatcta 60 acttgaacat cataccaact caaaggcagg tcttactagc aatgactggg gctcagagag 120 gtttggcgac ttcacgaagg tcacacagct gtcaggggga aaagtcagaa cttggatcca 180 ggtcttcaga ctctcaggtc tggtgtcatc ctagggggct tggtgatggc catatcttta 240 atgtatttgt ggagagtgaa aggctgtcag tgagtaagct taagagaaca ggagacttgt 300 gtgggaaaca gtcggtatcc attgattaga ctgaatcatg tagaattgct aatttcacca 360 ttttgaacta tcgaaatcac tatttggtat gactcaacct catcctttaa gtacacattc 420 atgacagtga gtggttagac agtgattcct agattagttt gggatggggc agtgccttcc 480 ataggacaag gccattcctg gtagagacgg agggagcagg ctgtccttca gctaggggcc 540 caggggactt cctggctgct gtgtccttta gcagggcctt ggaggatgga aggactctcc 600 tggcccttac cacaggggct attcaggaac agcctcctgc cgtggcactg gagctgcggt 660 ggccctctga agactgcagg gacagcaaca ggcacaaaga agtcaggctg catgtggccc 720 cagtcgggac tcagaggagg aaagggaggg gttgcggggg tcaatgggtg atgtgcttcc 780 tctcccatag ctgaggagtc cttgcaatgg ccttcctgag ccatcagcag gcctatggcc 840 atgtgactag ggaggagaag ggatataggg taatggtctt ctggggcctg ctgggcctgg 900 tcaagtctga ggaggagata gagaaaacaa agcagagacc ctcctcttca tctggggaga 960 agggacctga ttctaaacgg agatatgtga ggctttctgg ggcagcgatg gaaggacaag 1020 gacagaatag gtgtccttgt tgccccatgg agaatgggct tcaggaagaa tctgcctcag 1080 tcattttcca gaagtgcctg agaggtgcag ggcccgagtc tggttaggtg acagcgggtc 1140 aagaggagga cattgtcctc tctcttgtgt tgctgcagat gccacaaaac tgggccacgg 1200 cacgatcagg cagttctggg gcccccagga gggcagcctt ggggtgggca cagccagccc 1260 tggcaggatg agcaactctg ggtggggggg agtgggggat gagcaggggg acatgaagat 1320 gcttggtgga gcctggggtc atggctggta tctggttcct cccctgtgat tccttcttgg 1380 ggactccaag acaggacaag gaagactgga gccctccaga aacagatggg cccaggtccg 1440 taagctgagg attcagtccc ccctggattc aagcccagca tgtgcctacc cagccagatg 1500 ctccatgaac acagttcagg gggcccgaag acagcactgt tacctggagc ccacatacag 1560 cctcagcagg caaagggaga ctcagagaaa acatgggagg gatttacagt cacatgcagg 1620 cagggaccag ctcaaccctt ctttaatgtc atccagggag ggggccaggg atggagggga 1680 ggggttgagg agcgagaggc agttattttt gggtgggatt caccactttt cccatgaaga 1740 ggggagactt ggtattttgt tcaatcatta agaagacaaa gggtttgttg aacttgacct 1800 cgggggggat agacatgggt atggcctcta aaaacatggc cccagcagct tcagtccctt 1860 tctcgtcgat ggtcagcaca gccttatgca cggccttgga gagcttcagg ggtgcctcct 1920 ctgtgacccc ggagaggtca gccccattgc tgaagacctt agtgatgccc agttgaccca 1980 ggacgctctt cagatcatag gttccagtaa tggacagttt gggtaaatgt aagctggcag 2040 accttctgtc ttcattttcc aggaacttgg tgatgatatc gtgggtgagt tcattttcca 2100 ggtgctgtag tttcccctca tcaggcagga agaagatggc ggtggcattg cccaggtatt 2160 tcatcagcag cacccagctg gacagcttct tacagtgctg gatgttaaac atgcctaaac 2220 gcttcatcat aggcaccttc acggtggtca cctggtccac gtggaagtcc tcttcctcgg 2280 tgtccttgac ttcaaagggt ctctcccatt tgcctttaaa gaagatgtaa ttcaccagag 2340 caaaaactgt gtctctgtca agctccttga ccaaatccac aattttccct tgagtaccct 2400 tctccacgta atcgttgatc tgtttcttgg cctcttcggt gtccccgaag ttgacagtga 2460 aggcttctga gtggtacaac tttttaacat cctccaaaaa cttatccact agcttcaggc 2520 cctcgctgag gaacaggcca ttgccggtgg tcagctggag ctggctgtct ggctggttga 2580 gggtacggag gagttcctgg aagccttcat ggatctgagc ctccggaatc tccgtgaggt 2640 tgaaattcag gccctccagg atttcatcgt gagtgtcagc cttggtcccc agggagagca 2700 ttgcaaaggc tgtagcgatg ctcactgggg agaagaagat attggtgctg ttggactggt 2760 gtgccagctg gcggtatagg ctgaaggcga actcagccag gttgggggtg atcttgttga 2820 aggttgggtg atcctgatca tggtgggatg tatctgtctt ctgggcagca tctccctggg 2880 gatcctcagc cagggagaca gggaccaggc agcacaggcc tgccagcagg aggatgcccc 2940 acgagacaga agacggcatt gtcgattcac tgtcccaggt cagtggtggt gcctgaagct 3000 gaggagacag ggccctgtcc tcgtccgtat ttaagcagtg gatccagagg ggcaacgggg 3060 gaggctgctg gctcagaaac cacagcgtcc tgtgtccaag gtggaggggg tggcgtgagt 3120 cagacagtct ctgggagagt accacttagc tggccctctg ctctcactgc agaatcctta 3180 gtggctgttc cactggtagc aagatctacc atttactgag tcaccccaaa atgcctgatg 3240 ctgaagactt actgccgccc tgtggaactg agtgagcagc agcagcaatg tcccaccttt 3300 cctgctctcc tcaagctctc ctcaagctct gtctcttctg gcaggcacag gagagtggcc 3360 tgaaggctgg caggaggttg ccgcccctcc aacctggaat tcctggcagc agcagcggct 3420 aggccttcct cggaggcccg accccctcct ccttcttggt tcagctcagg actctgaggg 3480 ttgctgcgtg gaggcagtgc atgccctggg cacagtgccc agttcctgcc ca 3532 <210> 20 <211> 3340 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 tgcaagaaat gtagttctat ttattctctg ttctaatggg tataaacatt ttgttatcta 60 acttgaacat cataccaact caaaggcagg tcttactagc aatgactggg gctcagagag 120 gtttggcgac ttcacgaagg tcacacagct gtcaggggga aaagtcagaa cttggatcca 180 ggtcttcaga ctctcaggtc tggtgtcatc ctagggggct tggtgatggc catatcttta 240 atgtatttgt ggagagtgaa aggctgtcag tgagtaagct taagagaaca ggagacttgt 300 gtgggaaaca gtcggtatcc attgattaga ctgaatcatg tagaattgct aatttcacca 360 ttttgaacta tcgaaatcac tatttggtat gactcaacct catcctttaa gtacacattc 420 atgacagtga gtggttagac agtgattcct agattagttt gggatggggc agtgccttcc 480 ataggacaag gccattcctg gtagagacgg agggagcagg ctgtccttca gctaggggcc 540 caggggactt cctggctgct gtgtccttta gcagggcctt ggaggatgga aggactctcc 600 tggcccttac cacaggggct attcaggaac agcctcctgc cgtggcactg gagctgcggt 660 ggccctctga agactgcagg gacagcaaca ggcacaaaga agtcaggctg catgtggccc 720 cagtcgggac tcagaggagg aaagggaggg gttgcggggg tcaatgggtg atgtgcttcc 780 tctcccatag ctgaggagtc cttgcaatgg ccttcctgag ccatcagcag gcctatggcc 840 atgtgactag ggaggagaag ggatataggg taatggtctt ctggggcctg ctgggcctgg 900 tcaagtctga ggaggagata gagaaaacaa agcagagacc ctcctcttca tctggggaga 960 agggacctga ttctaaacgg agatatgtga ggctttctgg ggcagcgatg gaaggacaag 1020 gacagaatag gtgtccttgt tgccccatgg agaatgggct tcaggaagaa tctgcctcag 1080 tcattttcca gaagtgcctg agaggtgcag ggcccgagtc tggttaggtg acagcgggtc 1140 aagaggagga cattgtcctc tctcttgtgt tgctgcagat gccacaaaac tgggccacgg 1200 cacgatcagg cagttctggg gcccccagga gggcagcctt ggggtgggca cagccagccc 1260 tggcaggatg agcaactctg ggtggggggg agtgggggat gagcaggggg acatgaagat 1320 gcttggtgga gcctggggtc atggctggta tctggttcct cccctgtgat tccttcttgg 1380 ggactccaag acaggacaag gaagactgga gccctccaga aacagatggg cccaggtccg 1440 taagctgagg attcagtccc ccctggattc aagcccagca tgtgcctacc cagccagatg 1500 ctccatgaac acagttcagg gggcccgaag acagcactgt tacctggagc ccacatacag 1560 cctcagcagg caaagggaga ctcagagaaa acatgggagg gatttacagt cacatgcagg 1620 cagggaccag ctcaaccctt ctttaatgtc atccagggag ggggccaggg atggagggga 1680 ggggttgagg agcgagaggc agttattttt gggtgggatt caccactttt cccatgaaga 1740 ggggagactt ggtattttgt tcaatcatta agaagacaaa gggtttgttg aacttgacct 1800 cgggggggat agacatgggt atggcctcta aaaacatggc cccagcagct tcagtccctt 1860 tctcgtcgat ggtcagcaca gccttatgca cggccttgga gagcttcagg ggtgcctcct 1920 ctgtgacccc ggagaggtca gccccattgc tgaagacctt agtgatgccc agttgaccca 1980 ggacgctctt cagatcatag gttccagtaa tggacagttt gggtaaatgt aagctggcag 2040 accttctgtc ttcattttcc aggaacttgg tgatgatatc gtgggtgagt tcattttcca 2100 ggtgctgtag tttcccctca tcaggcagga agaagatggc ggtggcattg cccaggtatt 2160 tcatcagcag cacccagctg gacagcttct tacagtgctg gatgttaaac atgcctaaac 2220 gcttcatcat aggcaccttc acggtggtca cctggtccac gtggaagtcc tcttcctcgg 2280 tgtccttgac ttcaaagggt ctctcccatt tgcctttaaa gaagatgtaa ttcaccagag 2340 caaaaactgt gtctctgtca agctccttga ccaaatccac aattttccct tgagtaccct 2400 tctccacgta atcgttgatc tgtttcttgg cctcttcggt gtccccgaag ttgacagtga 2460 aggcttctga gtggtacaac tttttaacat cctccaaaaa cttatccact agcttcaggc 2520 cctcgctgag gaacaggcca ttgccggtgg tcagctggag ctggctgtct ggctggttga 2580 gggtacggag gagttcctgg aagccttcat ggatctgagc ctccggaatc tccgtgaggt 2640 tgaaattcag gccctccagg atttcatcgt gagtgtcagc cttggtcccc agggagagca 2700 ttgcaaaggc tgtagcgatg ctcactgggg agaagaagat attggtgctg ttggactggt 2760 gtgccagctg gcggtatagg ctgaaggcga actcagccag gttgggggtg atcttgttga 2820 aggttgggtg atcctgatca tggtgggatg tatctgtctt ctgggcagca tctccctggg 2880 gatcctcagc cagggagaca gggaccaggc agcacaggcc tgccagcagg aggatgcccc 2940 acgagacaga agacggcatt gtcgattcac tgtcccaggt cagtggtggt gcctgaagct 3000 gaggagacag ggccctgtcc tcgtccgtat ttaagcagtg gatccagagg ggcaacgggg 3060 gaggctgctg tggaactgag tgagcagcag cagcaatgtc ccacctttcc tgctctcctc 3120 aagctctcct caagctctgt ctcttctggc aggcacagga gagtggcctg aaggctggca 3180 ggaggttgcc gcccctccaa cctggaattc ctggcagcag cagcggctag gccttcctcg 3240 gaggcccgac cccctcctcc ttcttggttc agctcaggac tctgagggtt gctgcgtgga 3300 ggcagtgcat gccctgggca cagtgcccag ttcctgccca 3340 <210> 21 <211> 3495 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 tgcaagaaat gtagttctat ttattctctg ttctaatggg tataaacatt ttgttatcta 60 acttgaacat cataccaact caaaggcagg tcttactagc aatgactggg gctcagagag 120 gtttggcgac ttcacgaagg tcacacagct gtcaggggga aaagtcagaa cttggatcca 180 ggtcttcaga ctctcaggtc tggtgtcatc ctagggggct tggtgatggc catatcttta 240 atgtatttgt ggagagtgaa aggctgtcag tgagtaagct taagagaaca ggagacttgt 300 gtgggaaaca gtcggtatcc attgattaga ctgaatcatg tagaattgct aatttcacca 360 ttttgaacta tcgaaatcac tatttggtat gactcaacct catcctttaa gtacacattc 420 atgacagtga gtggttagac agtgattcct agattagttt gggatggggc agtgccttcc 480 ataggacaag gccattcctg gtagagacgg agggagcagg ctgtccttca gctaggggcc 540 caggggactt cctggctgct gtgtccttta gcagggcctt ggaggatgga aggactctcc 600 tggcccttac cacaggggct attcaggaac agcctcctgc cgtggcactg gagctgcggt 660 ggccctctga agactgcagg gacagcaaca ggcacaaaga agtcaggctg catgtggccc 720 cagtcgggac tcagaggagg aaagggaggg gttgcggggg tcaatgggtg atgtgcttcc 780 tctcccatag ctgaggagtc cttgcaatgg ccttcctgag ccatcagcag gcctatggcc 840 atgtgactag ggaggagaag ggatataggg taatggtctt ctggggcctg ctgggcctgg 900 tcaagtctga ggaggagata gagaaaacaa agcagagacc ctcctcttca tctggggaga 960 agggacctga ttctaaacgg agatatgtga ggctttctgg ggcagcgatg gaaggacaag 1020 gacagaatag gtgtccttgt tgccccatgg agaatgggct tcaggaagaa tctgcctcag 1080 tcattttcca gaagtgcctg agaggtgcag ggcccgagtc tggttaggtg acagcgggtc 1140 aagaggagga cattgtcctc tctcttgtgt tgctgcagat gccacaaaac tgggccacgg 1200 cacgatcagg cagttctggg gcccccagga gggcagcctt ggggtgggca cagccagccc 1260 tggcaggatg agcaactctg ggtggggggg agtgggggat gagcaggggg acatgaagat 1320 gcttggtgga gcctggggtc atggctggta tctggttcct cccctgtgat tccttcttgg 1380 ggactccaag acaggacaag gaagactgga gccctccaga aacagatggg cccaggtccg 1440 taagctgagg attcagtccc ccctggattc aagcccagca tgtgcctacc cagccagatg 1500 ctccatgaac acagttcagg gggcccgaag acagcactgt tacctggagc ccacatacag 1560 cctcagcagg caaagggaga ctcagagaaa acatgggagg gatttacagt cacatgcagg 1620 cagggaccag ctcaaccctt ctttaatgtc atccagggag ggggccaggg atggagggga 1680 ggggttgagg agcgagaggc agttattttt gggtgggatt caccactttt cccatgaaga 1740 ggggagactt ggtattttgt tcaatcatta agaagacaaa gggtttgttg aacttgacct 1800 cgggggggat agacatgggt atggcctcta aaaacatggc cccagcagct tcagtccctt 1860 tctcgtcgat ggtcagcaca gccttatgca cggccttgga gagcttcagg ggtgcctcct 1920 ctgtgacccc ggagaggtca gccccattgc tgaagacctt agtgatgccc agttgaccca 1980 ggacgctctt cagatcatag gttccagtaa tggacagttt gggtaaatgt aagctggcag 2040 accttctgtc ttcattttcc aggaacttgg tgatgatatc gtgggtgagt tcattttcca 2100 ggtgctgtag tttcccctca tcaggcagga agaagatggc ggtggcattg cccaggtatt 2160 tcatcagcag cacccagctg gacagcttct tacagtgctg gatgttaaac atgcctaaac 2220 gcttcatcat aggcaccttc acggtggtca cctggtccac gtggaagtcc tcttcctcgg 2280 tgtccttgac ttcaaagggt ctctcccatt tgcctttaaa gaagatgtaa ttcaccagag 2340 caaaaactgt gtctctgtca agctccttga ccaaatccac aattttccct tgagtaccct 2400 tctccacgta atcgttgatc tgtttcttgg cctcttcggt gtccccgaag ttgacagtga 2460 aggcttctga gtggtacaac tttttaacat cctccaaaaa cttatccact agcttcaggc 2520 cctcgctgag gaacaggcca ttgccggtgg tcagctggag ctggctgtct ggctggttga 2580 gggtacggag gagttcctgg aagccttcat ggatctgagc ctccggaatc tccgtgaggt 2640 tgaaattcag gccctccagg atttcatcgt gagtgtcagc cttggtcccc agggagagca 2700 ttgcaaaggc tgtagcgatg ctcactgggg agaagaagat attggtgctg ttggactggt 2760 gtgccagctg gcggtatagg ctgaaggcga actcagccag gttgggggtg atcttgttga 2820 aggttgggtg atcctgatca tggtgggatg tatctgtctt ctgggcagca tctccctggg 2880 gatcctcagc cagggagaca gggaccaggc agcacaggcc tgccagcagg aggatgcccc 2940 acgagacaga agacggcatt gtcgattcac tgtcccaggt cagtggtggt gcctgaagct 3000 gaggagacag ggccctgtcc tcgtccgtat ttaagcagtg gatccagagg ggcaacgggg 3060 gaggctgctg gctcagaaac cacagcgtcc tgtgtccaag gtggaggggg tggcgtgagt 3120 cagacagtct ctgggagagt accacttagc tggccctctg ctctcactgc agaatcctta 3180 gtggctgttc cactggtagc aagatctacc atttactgag tcaccccaaa atgcctgatg 3240 ctgaagactt actgccgccc tttcctgctc tcctcaagct ctcctcaagc tctgtctctt 3300 ctggcaggca caggagagtg gcctgaaggc tggcaggagg ttgccgcccc tccaacctgg 3360 aattcctggc agcagcagcg gctaggcctt cctcggaggc ccgaccccct cctccttctt 3420 ggttcagctc aggactctga gggttgctgc gtggaggcag tgcatgccct gggcacagtg 3480 cccagttcct gccca 3495 <210> 22 <211> 3492 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 tgcaagaaat gtagttctat ttattctctg ttctaatggg tataaacatt ttgttatcta 60 acttgaacat cataccaact caaaggcagg tcttactagc aatgactggg gctcagagag 120 gtttggcgac ttcacgaagg tcacacagct gtcaggggga aaagtcagaa cttggatcca 180 ggtcttcaga ctctcaggtc tggtgtcatc ctagggggct tggtgatggc catatcttta 240 atgtatttgt ggagagtgaa aggctgtcag tgagtaagct taagagaaca ggagacttgt 300 gtgggaaaca gtcggtatcc attgattaga ctgaatcatg tagaattgct aatttcacca 360 ttttgaacta tcgaaatcac tatttggtat gactcaacct catcctttaa gtacacattc 420 atgacagtga gtggttagac agtgattcct agattagttt gggatggggc agtgccttcc 480 ataggacaag gccattcctg gtagagacgg agggagcagg ctgtccttca gctaggggcc 540 caggggactt cctggctgct gtgtccttta gcagggcctt ggaggatgga aggactctcc 600 tggcccttac cacaggggct attcaggaac agcctcctgc cgtggcactg gagctgcggt 660 ggccctctga agactgcagg gacagcaaca ggcacaaaga agtcaggctg catgtggccc 720 cagtcgggac tcagaggagg aaagggaggg gttgcggggg tcaatgggtg atgtgcttcc 780 tctcccatag ctgaggagtc cttgcaatgg ccttcctgag ccatcagcag gcctatggcc 840 atgtgactag ggaggagaag ggatataggg taatggtctt ctggggcctg ctgggcctgg 900 tcaagtctga ggaggagata gagaaaacaa agcagagacc ctcctcttca tctggggaga 960 agggacctga ttctaaacgg agatatgtga ggctttctgg ggcagcgatg gaaggacaag 1020 gacagaatag gtgtccttgt tgccccatgg agaatgggct tcaggaagaa tctgcctcag 1080 tcattttcca gaagtgcctg agaggtgcag ggcccgagtc tggttaggtg acagcgggtc 1140 aagaggagga cattgtcctc tctcttgtgt tgctgcagat gccacaaaac tgggccacgg 1200 cacgatcagg cagttctggg gcccccagga gggcagcctt ggggtgggca cagccagccc 1260 tggcaggatg agcaactctg ggtggggggg agtgggggat gagcaggggg acatgaagat 1320 gcttggtgga gcctggggtc atggctggta tctggttcct cccctgtgat tccttcttgg 1380 ggactccaag acaggacaag gaagactgga gccctccaga aacagatggg cccaggtccg 1440 taagctgagg attcagtccc ccctggattc aagcccagca tgtgcctacc cagccagatg 1500 ctccatgaac acagttcagg gggcccgaag acagcactgt tacctggagc ccacatacag 1560 cctcagcagg caaagggaga ctcagagaaa acatgggagg gatttacagt cacatgcagg 1620 cagggaccag ctcaaccctt ctttaatgtc atccagggag ggggccaggg atggagggga 1680 ggggttgagg agcgagaggc agttattttt gggtgggatt caccactttt cccatgaaga 1740 ggggagactt ggtattttgt tcaatcatta agaagacaaa gggtttgttg aacttgacct 1800 cgggggggat agacatgggt atggcctcta aaaacatggc cccagcagct tcagtccctt 1860 tctcgtcgat ggtcagcaca gccttatgca cggccttgga gagcttcagg ggtgcctcct 1920 ctgtgacccc ggagaggtca gccccattgc tgaagacctt agtgatgccc agttgaccca 1980 ggacgctctt cagatcatag gttccagtaa tggacagttt gggtaaatgt aagctggcag 2040 accttctgtc ttcattttcc aggaacttgg tgatgatatc gtgggtgagt tcattttcca 2100 ggtgctgtag tttcccctca tcaggcagga agaagatggc ggtggcattg cccaggtatt 2160 tcatcagcag cacccagctg gacagcttct tacagtgctg gatgttaaac atgcctaaac 2220 gcttcatcat aggcaccttc acggtggtca cctggtccac gtggaagtcc tcttcctcgg 2280 tgtccttgac ttcaaagggt ctctcccatt tgcctttaaa gaagatgtaa ttcaccagag 2340 caaaaactgt gtctctgtca agctccttga ccaaatccac aattttccct tgagtaccct 2400 tctccacgta atcgttgatc tgtttcttgg cctcttcggt gtccccgaag ttgacagtga 2460 aggcttctga gtggtacaac tttttaacat cctccaaaaa cttatccact agcttcaggc 2520 cctcgctgag gaacaggcca ttgccggtgg tcagctggag ctggctgtct ggctggttga 2580 gggtacggag gagttcctgg aagccttcat ggatctgagc ctccggaatc tccgtgaggt 2640 tgaaattcag gccctccagg atttcatcgt gagtgtcagc cttggtcccc agggagagca 2700 ttgcaaaggc tgtagcgatg ctcactgggg agaagaagat attggtgctg ttggactggt 2760 gtgccagctg gcggtatagg ctgaaggcga actcagccag gttgggggtg atcttgttga 2820 aggttgggtg atcctgatca tggtgggatg tatctgtctt ctgggcagca tctccctggg 2880 gatcctcagc cagggagaca gggaccaggc agcacaggcc tgccagcagg aggatgcccc 2940 acgagacaga agacggcatt gtcgattcac tgtcccaggt cagtggtggt gcctgaagct 3000 gaggagacag ggccctgtcc tcgtccgtat ttaagcagtg gatccagagg ggcaacgggg 3060 gaggctggct cagaaaccac agcgtcctgt gtccaaggtg gagggggtgg cgtgagtcag 3120 acagtctctg ggagagtacc acttagctgg ccctctgctc tcactgcaga atccttagtg 3180 gctgttccac tggtagcaag atctaccatt tactgagtca ccccaaaatg cctgatgctg 3240 aagacttact gccgcccttt cctgctctcc tcaagctctc ctcaagctct gtctcttctg 3300 gcaggcacag gagagtggcc tgaaggctgg caggaggttg ccgcccctcc aacctggaat 3360 tcctggcagc agcagcggct aggccttcct cggaggcccg accccctcct ccttcttggt 3420 tcagctcagg actctgaggg ttgctgcgtg gaggcagtgc atgccctggg cacagtgccc 3480 agttcctgcc ca 3492 <210> 23 <211> 3510 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 tgcaagaaat gtagttctat ttattctctg ttctaatggg tataaacatt ttgttatcta 60 acttgaacat cataccaact caaaggcagg tcttactagc aatgactggg gctcagagag 120 gtttggcgac ttcacgaagg tcacacagct gtcaggggga aaagtcagaa cttggatcca 180 ggtcttcaga ctctcaggtc tggtgtcatc ctagggggct tggtgatggc catatcttta 240 atgtatttgt ggagagtgaa aggctgtcag tgagtaagct taagagaaca ggagacttgt 300 gtgggaaaca gtcggtatcc attgattaga ctgaatcatg tagaattgct aatttcacca 360 ttttgaacta tcgaaatcac tatttggtat gactcaacct catcctttaa gtacacattc 420 atgacagtga gtggttagac agtgattcct agattagttt gggatggggc agtgccttcc 480 ataggacaag gccattcctg gtagagacgg agggagcagg ctgtccttca gctaggggcc 540 caggggactt cctggctgct gtgtccttta gcagggcctt ggaggatgga aggactctcc 600 tggcccttac cacaggggct attcaggaac agcctcctgc cgtggcactg gagctgcggt 660 ggccctctga agactgcagg gacagcaaca ggcacaaaga agtcaggctg catgtggccc 720 cagtcgggac tcagaggagg aaagggaggg gttgcggggg tcaatgggtg atgtgcttcc 780 tctcccatag ctgaggagtc cttgcaatgg ccttcctgag ccatcagcag gcctatggcc 840 atgtgactag ggaggagaag ggatataggg taatggtctt ctggggcctg ctgggcctgg 900 tcaagtctga ggaggagata gagaaaacaa agcagagacc ctcctcttca tctggggaga 960 agggacctga ttctaaacgg agatatgtga ggctttctgg ggcagcgatg gaaggacaag 1020 gacagaatag gtgtccttgt tgccccatgg agaatgggct tcaggaagaa tctgcctcag 1080 tcattttcca gaagtgcctg agaggtgcag ggcccgagtc tggttaggtg acagcgggtc 1140 aagaggagga cattgtcctc tctcttgtgt tgctgcagat gccacaaaac tgggccacgg 1200 cacgatcagg cagttctggg gcccccagga gggcagcctt ggggtgggca cagccagccc 1260 tggcaggatg agcaactctg ggtggggggg agtgggggat gagcaggggg acatgaagat 1320 gcttggtgga gcctggggtc atggctggta tctggttcct cccctgtgat tccttcttgg 1380 ggactccaag acaggacaag gaagactgga gccctccaga aacagatggg cccaggtccg 1440 taagctgagg attcagtccc ccctggattc aagcccagca tgtgcctacc cagccagatg 1500 ctccatgaac acagttcagg gggcccgaag acagcactgt tacctggagc ccacatacag 1560 cctcagcagg caaagggaga ctcagagaaa acatgggagg gatttacagt cacatgcagg 1620 cagggaccag ctcaaccctt ctttaatgtc atccagggag ggggccaggg atggagggga 1680 ggggttgagg agcgagaggc agttattttt gggtgggatt caccactttt cccatgaaga 1740 ggggagactt ggtattttgt tcaatcatta agaagacaaa gggtttgttg aacttgacct 1800 cgggggggat agacatgggt atggcctcta aaaacatggc cccagcagct tcagtccctt 1860 tctcgtcgat ggtcagcaca gccttatgca cggccttgga gagcttcagg ggtgcctcct 1920 ctgtgacccc ggagaggtca gccccattgc tgaagacctt agtgatgccc agttgaccca 1980 ggacgctctt cagatcatag gttccagtaa tggacagttt gggtaaatgt aagctggcag 2040 accttctgtc ttcattttcc aggaacttgg tgatgatatc gtgggtgagt tcattttcca 2100 ggtgctgtag tttcccctca tcaggcagga agaagatggc ggtggcattg cccaggtatt 2160 tcatcagcag cacccagctg gacagcttct tacagtgctg gatgttaaac atgcctaaac 2220 gcttcatcat aggcaccttc acggtggtca cctggtccac gtggaagtcc tcttcctcgg 2280 tgtccttgac ttcaaagggt ctctcccatt tgcctttaaa gaagatgtaa ttcaccagag 2340 caaaaactgt gtctctgtca agctccttga ccaaatccac aattttccct tgagtaccct 2400 tctccacgta atcgttgatc tgtttcttgg cctcttcggt gtccccgaag ttgacagtga 2460 aggcttctga gtggtacaac tttttaacat cctccaaaaa cttatccact agcttcaggc 2520 cctcgctgag gaacaggcca ttgccggtgg tcagctggag ctggctgtct ggctggttga 2580 gggtacggag gagttcctgg aagccttcat ggatctgagc ctccggaatc tccgtgaggt 2640 tgaaattcag gccctccagg atttcatcgt gagtgtcagc cttggtcccc agggagagca 2700 ttgcaaaggc tgtagcgatg ctcactgggg agaagaagat attggtgctg ttggactggt 2760 gtgccagctg gcggtatagg ctgaaggcga actcagccag gttgggggtg atcttgttga 2820 aggttgggtg atcctgatca tggtgggatg tatctgtctt ctgggcagca tctccctggg 2880 gatcctcagc cagggagaca gggaccaggc agcacaggcc tgccagcagg aggatgcccc 2940 acgagacaga agacggcatt gtcgattcac tgtcccaggt cagtggtggt gcctgaagct 3000 gaggagacag ggccctgtcc tcgtccgtat ttaagcagtg gatccagagg ggcaacgggg 3060 gaggcgaaag gagtcattgt acctggctca gaaaccacag cgtcctgtgt ccaaggtgga 3120 gggggtggcg tgagtcagac agtctctggg agagtaccac ttagctggcc ctctgctctc 3180 actgcagaat ccttagtggc tgttccactg gtagcaagat ctaccattta ctgagtcacc 3240 ccaaaatgcc tgatgctgaa gacttactgc cgccctttcc tgctctcctc aagctctcct 3300 caagctctgt ctcttctggc aggcacagga gagtggcctg aaggctggca ggaggttgcc 3360 gcccctccaa cctggaattc ctggcagcag cagcggctag gccttcctcg gaggcccgac 3420 cccctcctcc ttcttggttc agctcaggac tctgagggtt gctgcgtgga ggcagtgcat 3480 gccctgggca cagtgcccag ttcctgccca 3510 <210> 24 <211> 3303 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 tgcaagaaat gtagttctat ttattctctg ttctaatggg tataaacatt ttgttatcta 60 acttgaacat cataccaact caaaggcagg tcttactagc aatgactggg gctcagagag 120 gtttggcgac ttcacgaagg tcacacagct gtcaggggga aaagtcagaa cttggatcca 180 ggtcttcaga ctctcaggtc tggtgtcatc ctagggggct tggtgatggc catatcttta 240 atgtatttgt ggagagtgaa aggctgtcag tgagtaagct taagagaaca ggagacttgt 300 gtgggaaaca gtcggtatcc attgattaga ctgaatcatg tagaattgct aatttcacca 360 ttttgaacta tcgaaatcac tatttggtat gactcaacct catcctttaa gtacacattc 420 atgacagtga gtggttagac agtgattcct agattagttt gggatggggc agtgccttcc 480 ataggacaag gccattcctg gtagagacgg agggagcagg ctgtccttca gctaggggcc 540 caggggactt cctggctgct gtgtccttta gcagggcctt ggaggatgga aggactctcc 600 tggcccttac cacaggggct attcaggaac agcctcctgc cgtggcactg gagctgcggt 660 ggccctctga agactgcagg gacagcaaca ggcacaaaga agtcaggctg catgtggccc 720 cagtcgggac tcagaggagg aaagggaggg gttgcggggg tcaatgggtg atgtgcttcc 780 tctcccatag ctgaggagtc cttgcaatgg ccttcctgag ccatcagcag gcctatggcc 840 atgtgactag ggaggagaag ggatataggg taatggtctt ctggggcctg ctgggcctgg 900 tcaagtctga ggaggagata gagaaaacaa agcagagacc ctcctcttca tctggggaga 960 agggacctga ttctaaacgg agatatgtga ggctttctgg ggcagcgatg gaaggacaag 1020 gacagaatag gtgtccttgt tgccccatgg agaatgggct tcaggaagaa tctgcctcag 1080 tcattttcca gaagtgcctg agaggtgcag ggcccgagtc tggttaggtg acagcgggtc 1140 aagaggagga cattgtcctc tctcttgtgt tgctgcagat gccacaaaac tgggccacgg 1200 cacgatcagg cagttctggg gcccccagga gggcagcctt ggggtgggca cagccagccc 1260 tggcaggatg agcaactctg ggtggggggg agtgggggat gagcaggggg acatgaagat 1320 gcttggtgga gcctggggtc atggctggta tctggttcct cccctgtgat tccttcttgg 1380 ggactccaag acaggacaag gaagactgga gccctccaga aacagatggg cccaggtccg 1440 taagctgagg attcagtccc ccctggattc aagcccagca tgtgcctacc cagccagatg 1500 ctccatgaac acagttcagg gggcccgaag acagcactgt tacctggagc ccacatacag 1560 cctcagcagg caaagggaga ctcagagaaa acatgggagg gatttacagt cacatgcagg 1620 cagggaccag ctcaaccctt ctttaatgtc atccagggag ggggccaggg atggagggga 1680 ggggttgagg agcgagaggc agttattttt gggtgggatt caccactttt cccatgaaga 1740 ggggagactt ggtattttgt tcaatcatta agaagacaaa gggtttgttg aacttgacct 1800 cgggggggat agacatgggt atggcctcta aaaacatggc cccagcagct tcagtccctt 1860 tctcgtcgat ggtcagcaca gccttatgca cggccttgga gagcttcagg ggtgcctcct 1920 ctgtgacccc ggagaggtca gccccattgc tgaagacctt agtgatgccc agttgaccca 1980 ggacgctctt cagatcatag gttccagtaa tggacagttt gggtaaatgt aagctggcag 2040 accttctgtc ttcattttcc aggaacttgg tgatgatatc gtgggtgagt tcattttcca 2100 ggtgctgtag tttcccctca tcaggcagga agaagatggc ggtggcattg cccaggtatt 2160 tcatcagcag cacccagctg gacagcttct tacagtgctg gatgttaaac atgcctaaac 2220 gcttcatcat aggcaccttc acggtggtca cctggtccac gtggaagtcc tcttcctcgg 2280 tgtccttgac ttcaaagggt ctctcccatt tgcctttaaa gaagatgtaa ttcaccagag 2340 caaaaactgt gtctctgtca agctccttga ccaaatccac aattttccct tgagtaccct 2400 tctccacgta atcgttgatc tgtttcttgg cctcttcggt gtccccgaag ttgacagtga 2460 aggcttctga gtggtacaac tttttaacat cctccaaaaa cttatccact agcttcaggc 2520 cctcgctgag gaacaggcca ttgccggtgg tcagctggag ctggctgtct ggctggttga 2580 gggtacggag gagttcctgg aagccttcat ggatctgagc ctccggaatc tccgtgaggt 2640 tgaaattcag gccctccagg atttcatcgt gagtgtcagc cttggtcccc agggagagca 2700 ttgcaaaggc tgtagcgatg ctcactgggg agaagaagat attggtgctg ttggactggt 2760 gtgccagctg gcggtatagg ctgaaggcga actcagccag gttgggggtg atcttgttga 2820 aggttgggtg atcctgatca tggtgggatg tatctgtctt ctgggcagca tctccctggg 2880 gatcctcagc cagggagaca gggaccaggc agcacaggcc tgccagcagg aggatgcccc 2940 acgagacaga agacggcatt gtcgattcac tgtcccaggt cagtggtggt gcctgaagct 3000 gaggagacag ggccctgtcc tcgtccgtat ttaagcagtg gatccagagg ggcaacgggg 3060 gaggctgctt tcctgctctc ctcaagctct cctcaagctc tgtctcttct ggcaggcaca 3120 ggagagtggc ctgaaggctg gcaggaggtt gccgcccctc caacctggaa ttcctggcag 3180 cagcagcggc taggccttcc tcggaggccc gaccccctcc tccttcttgg ttcagctcag 3240 gactctgagg gttgctgcgt ggaggcagtg catgccctgg gcacagtgcc cagttcctgc 3300 cca 3303 <210> 25 <211> 3300 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 tgcaagaaat gtagttctat ttattctctg ttctaatggg tataaacatt ttgttatcta 60 acttgaacat cataccaact caaaggcagg tcttactagc aatgactggg gctcagagag 120 gtttggcgac ttcacgaagg tcacacagct gtcaggggga aaagtcagaa cttggatcca 180 ggtcttcaga ctctcaggtc tggtgtcatc ctagggggct tggtgatggc catatcttta 240 atgtatttgt ggagagtgaa aggctgtcag tgagtaagct taagagaaca ggagacttgt 300 gtgggaaaca gtcggtatcc attgattaga ctgaatcatg tagaattgct aatttcacca 360 ttttgaacta tcgaaatcac tatttggtat gactcaacct catcctttaa gtacacattc 420 atgacagtga gtggttagac agtgattcct agattagttt gggatggggc agtgccttcc 480 ataggacaag gccattcctg gtagagacgg agggagcagg ctgtccttca gctaggggcc 540 caggggactt cctggctgct gtgtccttta gcagggcctt ggaggatgga aggactctcc 600 tggcccttac cacaggggct attcaggaac agcctcctgc cgtggcactg gagctgcggt 660 ggccctctga agactgcagg gacagcaaca ggcacaaaga agtcaggctg catgtggccc 720 cagtcgggac tcagaggagg aaagggaggg gttgcggggg tcaatgggtg atgtgcttcc 780 tctcccatag ctgaggagtc cttgcaatgg ccttcctgag ccatcagcag gcctatggcc 840 atgtgactag ggaggagaag ggatataggg taatggtctt ctggggcctg ctgggcctgg 900 tcaagtctga ggaggagata gagaaaacaa agcagagacc ctcctcttca tctggggaga 960 agggacctga ttctaaacgg agatatgtga ggctttctgg ggcagcgatg gaaggacaag 1020 gacagaatag gtgtccttgt tgccccatgg agaatgggct tcaggaagaa tctgcctcag 1080 tcattttcca gaagtgcctg agaggtgcag ggcccgagtc tggttaggtg acagcgggtc 1140 aagaggagga cattgtcctc tctcttgtgt tgctgcagat gccacaaaac tgggccacgg 1200 cacgatcagg cagttctggg gcccccagga gggcagcctt ggggtgggca cagccagccc 1260 tggcaggatg agcaactctg ggtggggggg agtgggggat gagcaggggg acatgaagat 1320 gcttggtgga gcctggggtc atggctggta tctggttcct cccctgtgat tccttcttgg 1380 ggactccaag acaggacaag gaagactgga gccctccaga aacagatggg cccaggtccg 1440 taagctgagg attcagtccc ccctggattc aagcccagca tgtgcctacc cagccagatg 1500 ctccatgaac acagttcagg gggcccgaag acagcactgt tacctggagc ccacatacag 1560 cctcagcagg caaagggaga ctcagagaaa acatgggagg gatttacagt cacatgcagg 1620 cagggaccag ctcaaccctt ctttaatgtc atccagggag ggggccaggg atggagggga 1680 ggggttgagg agcgagaggc agttattttt gggtgggatt caccactttt cccatgaaga 1740 ggggagactt ggtattttgt tcaatcatta agaagacaaa gggtttgttg aacttgacct 1800 cgggggggat agacatgggt atggcctcta aaaacatggc cccagcagct tcagtccctt 1860 tctcgtcgat ggtcagcaca gccttatgca cggccttgga gagcttcagg ggtgcctcct 1920 ctgtgacccc ggagaggtca gccccattgc tgaagacctt agtgatgccc agttgaccca 1980 ggacgctctt cagatcatag gttccagtaa tggacagttt gggtaaatgt aagctggcag 2040 accttctgtc ttcattttcc aggaacttgg tgatgatatc gtgggtgagt tcattttcca 2100 ggtgctgtag tttcccctca tcaggcagga agaagatggc ggtggcattg cccaggtatt 2160 tcatcagcag cacccagctg gacagcttct tacagtgctg gatgttaaac atgcctaaac 2220 gcttcatcat aggcaccttc acggtggtca cctggtccac gtggaagtcc tcttcctcgg 2280 tgtccttgac ttcaaagggt ctctcccatt tgcctttaaa gaagatgtaa ttcaccagag 2340 caaaaactgt gtctctgtca agctccttga ccaaatccac aattttccct tgagtaccct 2400 tctccacgta atcgttgatc tgtttcttgg cctcttcggt gtccccgaag ttgacagtga 2460 aggcttctga gtggtacaac tttttaacat cctccaaaaa cttatccact agcttcaggc 2520 cctcgctgag gaacaggcca ttgccggtgg tcagctggag ctggctgtct ggctggttga 2580 gggtacggag gagttcctgg aagccttcat ggatctgagc ctccggaatc tccgtgaggt 2640 tgaaattcag gccctccagg atttcatcgt gagtgtcagc cttggtcccc agggagagca 2700 ttgcaaaggc tgtagcgatg ctcactgggg agaagaagat attggtgctg ttggactggt 2760 gtgccagctg gcggtatagg ctgaaggcga actcagccag gttgggggtg atcttgttga 2820 aggttgggtg atcctgatca tggtgggatg tatctgtctt ctgggcagca tctccctggg 2880 gatcctcagc cagggagaca gggaccaggc agcacaggcc tgccagcagg aggatgcccc 2940 acgagacaga agacggcatt gtcgattcac tgtcccaggt cagtggtggt gcctgaagct 3000 gaggagacag ggccctgtcc tcgtccgtat ttaagcagtg gatccagagg ggcaacgggg 3060 gaggctttcc tgctctcctc aagctctcct caagctctgt ctcttctggc aggcacagga 3120 gagtggcctg aaggctggca ggaggttgcc gcccctccaa cctggaattc ctggcagcag 3180 cagcggctag gccttcctcg gaggcccgac cccctcctcc ttcttggttc agctcaggac 3240 tctgagggtt gctgcgtgga ggcagtgcat gccctgggca cagtgcccag ttcctgccca 3300 <210> 26 <211> 1321 <212> DNA <213> Macaca mulatta <400> 26 atgtcattca gggagggggc cagggatgga ggggaggggc tgaggagtga caggcagtta 60 tttctgggtg ggattcacca cttttcccat gaagagggga gacttggtat tttgttcaat 120 cattaagaag acaaagggtt tgttgaactt gacctcgggg ggaatagaca tgggtatggc 180 ctctaaaaac atggccccag cagcttcagt ccctttctca tcgatggtca gcacagcctt 240 atgcacggcc ttggagagct tcaggggtgc ctcctccgtg atccccgaga ggtcagcccc 300 attgctgaag accttagtga tacccaggtg gcccaggact gtcttcagat cataggttcc 360 agtaatggcc agtctgggta aatgtaagtt ggcagacctg ctgttttcat tttccaggaa 420 cttggtgatg atatcatggg tgagttcatt ttccaggtgc tgcagtttcc cctcatcagg 480 caggaagaag atggcggtgg cattgcccag gtatttcatc agcagcaccc agctggacag 540 cttctcacag tggtagatgt taaacatgcc taaacgcctc atcatgggca ccttcacggt 600 ggtcgcctgg tccacgtgga agtcctcttc cttggtggcc tcaacgtcaa agggtctctc 660 ccatttgcct ttaaagaaga tgtaattcac cagagcaaaa actgtgtctc tgtcaagctc 720 cttgaccaaa tccacaattt tcccttgagt ttccttctcc acgtaattgt tgatctgttt 780 cttggcctct tcggtgtcct caaagttgac agagaaggct tctgagtggt acagtttttt 840 gacatcctcc aaaaacttat ccactacctt caggctcttg ttgaggaaca ggccgttgcc 900 ggtggtcagc tggagctggc tgtctggctt gttgagggta tggaggagtt cctggaagcc 960 ttcatggacc tgagcctccg gaatctccgt gacgttgaaa ttcaggccct ccaggatttc 1020 actgtgagtg tcagccttgg tccccaggga gagcattgca aaggctgtag cgatgctcac 1080 tggggagaag aagatattgg tgctgttgga ctggtgtgcc agctggcggt ataggctgaa 1140 gccgaactca gccaggctgg gggtgatctt gttgagggtt gggtggtcct gatcatggtg 1200 ggatgtatcc gtcttctggg cagcatctcc ctggggatcc tcagccagag agccggggag 1260 caggcagcac aggcctgcca gcaggaggac gccccatgag acagaagatg gcattgtcct 1320 g 1321 <210> 27 <211> 2064 <212> DNA <213> Macaca mulatta <400> 27 gtttgcagtc acacacgcag gcagggacca gctcaaccct tctttaatgt cattcaggga 60 gggggccagg gatggagggg aggggctgag gagtgacagg cagttatttc tgggtgggat 120 tcaccacttt tcccatgaag aggggagact tggtattttg ttcaatcatt aagaagacaa 180 agggtttgtt gaacttgacc tcggggggaa tagacatggg tatggcctct aaaaacatgg 240 ccccagcagc ttcagtccct ttctcatcga tggtcagcac agccttatgc acggccttgg 300 agagcttcag gggtgcctcc tccgtgatcc ccgagaggtc agccccattg ctgaagacct 360 tagtgatacc caggtggccc aggactgtct tcagatcata ggttccagta atggccagtc 420 tgggtaaatg taagttggca gacctgctgt tttcattttc caggaacttg gtgatgatat 480 catgggtgag ttcattttcc aggtgctgca gtttcccctc atcaggcagg aagaagatgg 540 cggtggcatt gcccaggtat ttcatcagca gcacccagct ggacagcttc tcacagtggt 600 agatgttaaa catgcctaaa cgcctcatca tgggcacctt cacggtggtc gcctggtcca 660 cgtggaagtc ctcttccttg gtggcctcaa cgtcaaaggg tctctcccat ttgcctttaa 720 agaagatgta attcaccaga gcaaaaactg tgtctctgtc aagctccttg accaaatcca 780 caattttccc ttgagtttcc ttctccacgt aattgttgat ctgtttcttg gcctcttcgg 840 tgtcctcaaa gttgacagag aaggcttctg agtggtacag ttttttgaca tcctccaaaa 900 acttatccac taccttcagg ctcttgttga ggaacaggcc gttgccggtg gtcagctgga 960 gctggctgtc tggcttgttg agggtatgga ggagttcctg gaagccttca tggacctgag 1020 cctccggaat ctccgtgacg ttgaaattca ggccctccag gatttcactg tgagtgtcag 1080 ccttggtccc cagggagagc attgcaaagg ctgtagcgat gctcactggg gagaagaaga 1140 tattggtgct gttggactgg tgtgccagct ggcggtatag gctgaagccg aactcagcca 1200 ggctgggggt gatcttgttg agggttgggt ggtcctgatc atggtgggat gtatccgtct 1260 tctgggcagc atctccctgg ggatcctcag ccagagagcc ggggagcagg cagcacaggc 1320 ctgccagcag gaggacgccc catgagacag aagatggcat tgtcgattca ccgtcccagg 1380 tcagtggtgg tgcctgaggc tgaggagaca gagccctgtc cttgtccgta tttaagcagt 1440 gggtgcagag gggcaacggg ggaggctgct ggtgaatatt aaccaagatc accccagtta 1500 ccggaggagc aaacagggac taagttcaca ggctgggcgc tgagtcgccc gcccacgctg 1560 tccggacgct ctgcctgagc agcatacagc ctccactgca cgtaccaaaa ggagtcattg 1620 tacctggctc agaaaccaca gtgtcctgcg tccaaggtgg agggggtggc gtgagtcagc 1680 cagtcgctgg gagagtacca ctttgctggc cctctgctct cactgcagaa tccttagcgg 1740 ctgttccact ggtagcaaga tctaccattt actaattcac cccgaaatgc ctgatgctga 1800 agactgatgc cgccctggaa ttcctggcag cagcagtggc taggccttcc tcagagtgct 1860 gatcccctcc tcctcctttg ctcagctcag tactctgagg gttgctgcgt ggaggcagtg 1920 cacgccctgg gcacagggcc cagttcctgc ccacccagga agttggcctc gggtggcggg 1980 tggcggaggc aataggttgg ggaggggcgg ggagcttggg caggaagggg ccttgcccat 2040 tgccaggcag acacaagact gggc 2064 <210> 28 <211> 1608 <212> DNA <213> Macaca mulatta <400> 28 gtttgcagtc acacacgcag gcagggacca gctcaaccct tctttaatgt cattcaggga 60 gggggccagg gatggagggg aggggctgag gagtgacagg cagttatttc tgggtgggat 120 tcaccacttt tcccatgaag aggggagact tggtattttg ttcaatcatt aagaagacaa 180 agggtttgtt gaacttgacc tcggggggaa tagacatggg tatggcctct aaaaacatgg 240 ccccagcagc ttcagtccct ttctcatcga tggtcagcac agccttatgc acggccttgg 300 agagcttcag gggtgcctcc tccgtgatcc ccgagaggtc agccccattg ctgaagacct 360 tagtgatacc caggtggccc aggactgtct tcagatcata ggttccagta atggccagtc 420 tgggtaaatg taagttggca gacctgctgt tttcattttc caggaacttg gtgatgatat 480 catgggtgag ttcattttcc aggtgctgca gtttcccctc atcaggcagg aagaagatgg 540 cggtggcatt gcccaggtat ttcatcagca gcacccagct ggacagcttc tcacagtggt 600 agatgttaaa catgcctaaa cgcctcatca tgggcacctt cacggtggtc gcctggtcca 660 cgtggaagtc ctcttccttg gtggcctcaa cgtcaaaggg tctctcccat ttgcctttaa 720 agaagatgta attcaccaga gcaaaaactg tgtctctgtc aagctccttg accaaatcca 780 caattttccc ttgagtttcc ttctccacgt aattgttgat ctgtttcttg gcctcttcgg 840 tgtcctcaaa gttgacagag aaggcttctg agtggtacag ttttttgaca tcctccaaaa 900 acttatccac taccttcagg ctcttgttga ggaacaggcc gttgccggtg gtcagctgga 960 gctggctgtc tggcttgttg agggtatgga ggagttcctg gaagccttca tggacctgag 1020 cctccggaat ctccgtgacg ttgaaattca ggccctccag gatttcactg tgagtgtcag 1080 ccttggtccc cagggagagc attgcaaagg ctgtagcgat gctcactggg gagaagaaga 1140 tattggtgct gttggactgg tgtgccagct ggcggtatag gctgaagccg aactcagcca 1200 ggctgggggt gatcttgttg agggttgggt ggtcctgatc atggtgggat gtatccgtct 1260 tctgggcagc atctccctgg ggatcctcag ccagagagcc ggggagcagg cagcacaggc 1320 ctgccagcag gaggacgccc catgagacag aagatggcat tgtcctggaa ttcctggcag 1380 cagcagtggc taggccttcc tcagagtgct gatcccctcc tcctcctttg ctcagctcag 1440 tactctgagg gttgctgcgt ggaggcagtg cacgccctgg gcacagggcc cagttcctgc 1500 ccacccagga agttggcctc gggtggcggg tggcggaggc aataggttgg ggaggggcgg 1560 ggagcttggg caggaagggg ccttgcccat tgccaggcag acacaaga 1608 <210> 29 <211> 16 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: RFGF peptide" <400> 29 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 1 5 10 15 <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: RFGF analogue peptide" <400> 30 Ala Ala Leu Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Pro 1 5 10 <210> 31 <211> 13 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 31 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 10 <210> 32 <211> 16 <212> PRT <213> Drosophila sp. <400> 32 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 33 cuuacgcuga guacuucgat t 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 34 actaaggtct tcagcaatgg g 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 35 gcttcagtcc ctttctcatc g 21 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe" <400> 36 tggtcagcac agccttatgc acg 23 <210> 37 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 37 gcatcctggg ctacactga 19 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 38 tgggtgtcgc tgttgaagtc 20 <210> 39 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic probe" <400> 39 ccaggtggtc tcctcc 16 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 40 ucgaaguacu cagcguaagt t 21 <210> 41 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 41 guccaacagc accaauaucu u 21 <210> 42 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 42 guccaacagc accaauaucu u 21 <210> 43 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 43 uaaugauuga acaaaauacc a 21 <210> 44 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 44 uaaugauuga acaaaauacc a 21 <210> 45 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 45 cuucuuaaug auugaacaaa a 21 <210> 46 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 46 cuucuuaaug auugaacaaa a 21 <210> 47 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 47 auugaacaaa auaccaaguc u 21 <210> 48 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 48 auugaacaaa auaccaaguc u 21 <210> 49 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 49 uucuuaauga uugaacaaaa u 21 <210> 50 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 50 uucuuaauga uugaacaaaa u 21 <210> 51 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 51 caaacccuuu gucuucuuaa u 21 <210> 52 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 52 caaacccuuu gucuucuuaa u 21 <210> 53 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 53 ugucuucuua augauugaac a 21 <210> 54 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 54 ugucuucuua augauugaac a 21 <210> 55 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 55 caccuggaaa augaacucac c 21 <210> 56 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 56 caccuggaaa augaacucac c 21 <210> 57 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 57 uuuugcucug gugaauuaca u 21 <210> 58 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 58 uuuugcucug gugaauuaca u 21 <210> 59 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 59 acccuuuguc uucuuaauga u 21 <210> 60 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 60 acccuuuguc uucuuaauga u 21 <210> 61 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 61 uugaacaaaa uaccaagucu c 21 <210> 62 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 62 uugaacaaaa uaccaagucu c 21 <210> 63 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 63 guucaacaaa cccuuugucu u 21 <210> 64 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 64 guucaacaaa cccuuugucu u 21 <210> 65 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 65 aaauaccaag ucuccccucu u 21 <210> 66 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 66 aaauaccaag ucuccccucu u 21 <210> 67 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 67 uuuuugcucu ggugaauuac a 21 <210> 68 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 68 uuuuugcucu ggugaauuac a 21 <210> 69 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 69 aguucaacaa acccuuuguc u 21 <210> 70 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 70 aguucaacaa acccuuuguc u 21 <210> 71 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 71 aaugauugaa caaaauacca a 21 <210> 72 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 72 aaugauugaa caaaauacca a 21 <210> 73 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 73 uacuggaacc uaugaucuga a 21 <210> 74 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 74 uacuggaacc uaugaucuga a 21 <210> 75 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 75 acauuaaaga aggguugagc u 21 <210> 76 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 76 acauuaaaga aggguugagc u 21 <210> 77 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 77 aaaauugugg auuuggucaa g 21 <210> 78 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 78 aaaauugugg auuuggucaa g 21 <210> 79 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 79 auuacuggaa ccuaugaucu g 21 <210> 80 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 80 auuacuggaa ccuaugaucu g 21 <210> 81 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 81 cacaguuuuu gcucugguga a 21 <210> 82 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 82 cacaguuuuu gcucugguga a 21 <210> 83 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 83 uuaaagaagg guugagcugg u 21 <210> 84 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 84 uuaaagaagg guugagcugg u 21 <210> 85 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 85 agugagcauc gcuacagccu u 21 <210> 86 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 86 agugagcauc gcuacagccu u 21 <210> 87 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 87 aaggagcuug acagagacac a 21 <210> 88 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 88 aaggagcuug acagagacac a 21 <210> 89 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 89 guggauaagu uuuuggagga u 21 <210> 90 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 90 guggauaagu uuuuggagga u 21 <210> 91 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 91 gauugaacaa aauaccaagu c 21 <210> 92 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 92 gauugaacaa aauaccaagu c 21 <210> 93 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 93 gcucuccaag gccgugcaua a 21 <210> 94 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 94 gcucuccaag gccgugcaua a 21 <210> 95 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 95 accuggaaaa ugaacucacc c 21 <210> 96 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 96 accuggaaaa ugaacucacc c 21 <210> 97 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 97 gggaccaagg cugacacuca c 21 <210> 98 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 98 gggaccaagg cugacacuca c 21 <210> 99 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 99 gccauguuuu uagaggccau a 21 <210> 100 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 100 gccauguuuu uagaggccau a 21 <210> 101 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 101 ccuggaaaau gaacucaccc a 21 <210> 102 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 102 ccuggaaaau gaacucaccc a 21 <210> 103 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 103 aagaggccaa gaaacagauc a 21 <210> 104 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 104 aagaggccaa gaaacagauc a 21 <210> 105 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 105 ggcaaauggg agagacccuu u 21 <210> 106 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 106 ggcaaauggg agagacccuu u 21 <210> 107 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 107 ugggaaaagu ggugaauccc a 21 <210> 108 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 108 ugggaaaagu ggugaauccc a 21 <210> 109 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 109 ggggaccaag gcugacacuc a 21 <210> 110 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 110 ggggaccaag gcugacacuc a 21 <210> 111 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 111 gacauuaaag aaggguugag c 21 <210> 112 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 112 gacauuaaag aaggguugag c 21 <210> 113 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 113 ggccauguuu uuagaggcca u 21 <210> 114 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 114 ggccauguuu uuagaggcca u 21 <210> 115 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 115 uuccugccug augaggggaa a 21 <210> 116 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 116 uuccugccug augaggggaa a 21 <210> 117 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 117 cucuccaagg ccgugcauaa g 21 <210> 118 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 118 cucuccaagg ccgugcauaa g 21 <210> 119 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 119 agcucuccaa ggccgugcau a 21 <210> 120 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 120 agcucuccaa ggccgugcau a 21 <210> 121 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 121 uccuggaggg ccugaauuuc a 21 <210> 122 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 122 uccuggaggg ccugaauuuc a 21 <210> 123 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 123 uuggucaagg agcuugacag a 21 <210> 124 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 124 uuggucaagg agcuugacag a 21 <210> 125 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 125 uuuggucaag gagcuugaca g 21 <210> 126 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 126 uuuggucaag gagcuugaca g 21 <210> 127 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 127 uccccaguga gcaucgcuac a 21 <210> 128 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 128 uccccaguga gcaucgcuac a 21 <210> 129 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 129 aagauauugg ugcuguugga cug 23 <210> 130 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 130 aagauauugg ugcuguugga cug 23 <210> 131 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 131 ugguauuuug uucaaucauu aag 23 <210> 132 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 132 ugguauuuug uucaaucauu aag 23 <210> 133 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 133 uuuuguucaa ucauuaagaa gac 23 <210> 134 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 134 uuuuguucaa ucauuaagaa gac 23 <210> 135 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 135 agacuuggua uuuuguucaa uca 23 <210> 136 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 136 agacuuggua uuuuguucaa uca 23 <210> 137 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 137 auuuuguuca aucauuaaga aga 23 <210> 138 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 138 auuuuguuca aucauuaaga aga 23 <210> 139 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 139 auuaagaaga caaaggguuu guu 23 <210> 140 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 140 auuaagaaga caaaggguuu guu 23 <210> 141 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 141 uguucaauca uuaagaagac aaa 23 <210> 142 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 142 uguucaauca uuaagaagac aaa 23 <210> 143 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 143 ggugaguuca uuuuccaggu gcu 23 <210> 144 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 144 ggugaguuca uuuuccaggu gcu 23 <210> 145 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 145 auguaauuca ccagagcaaa aac 23 <210> 146 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 146 auguaauuca ccagagcaaa aac 23 <210> 147 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 147 aucauuaaga agacaaaggg uuu 23 <210> 148 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 148 aucauuaaga agacaaaggg uuu 23 <210> 149 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 149 gagacuuggu auuuuguuca auc 23 <210> 150 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 150 gagacuuggu auuuuguuca auc 23 <210> 151 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 151 aagacaaagg guuuguugaa cuu 23 <210> 152 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 152 aagacaaagg guuuguugaa cuu 23 <210> 153 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 153 aagaggggag acuugguauu uug 23 <210> 154 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 154 aagaggggag acuugguauu uug 23 <210> 155 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 155 uguaauucac cagagcaaaa acu 23 <210> 156 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 156 uguaauucac cagagcaaaa acu 23 <210> 157 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 157 agacaaaggg uuuguugaac uug 23 <210> 158 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 158 agacaaaggg uuuguugaac uug 23 <210> 159 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 159 uugguauuuu guucaaucau uaa 23 <210> 160 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 160 uugguauuuu guucaaucau uaa 23 <210> 161 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 161 uucagaucau agguuccagu aau 23 <210> 162 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 162 uucagaucau agguuccagu aau 23 <210> 163 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 163 agcucaaccc uucuuuaaug uca 23 <210> 164 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 164 agcucaaccc uucuuuaaug uca 23 <210> 165 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 165 cuugaccaaa uccacaauuu ucc 23 <210> 166 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 166 cuugaccaaa uccacaauuu ucc 23 <210> 167 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 167 cagaucauag guuccaguaa ugg 23 <210> 168 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 168 cagaucauag guuccaguaa ugg 23 <210> 169 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 169 uucaccagag caaaaacugu guc 23 <210> 170 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 170 uucaccagag caaaaacugu guc 23 <210> 171 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 171 accagcucaa cccuucuuua aug 23 <210> 172 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 172 accagcucaa cccuucuuua aug 23 <210> 173 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 173 aaggcuguag cgaugcucac ugg 23 <210> 174 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 174 aaggcuguag cgaugcucac ugg 23 <210> 175 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 175 ugugucucug ucaagcuccu uga 23 <210> 176 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 176 ugugucucug ucaagcuccu uga 23 <210> 177 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 177 auccuccaaa aacuuaucca cua 23 <210> 178 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 178 auccuccaaa aacuuaucca cua 23 <210> 179 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 179 gacuugguau uuuguucaau cau 23 <210> 180 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 180 gacuugguau uuuguucaau cau 23 <210> 181 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 181 uuaugcacgg ccuuggagag cuu 23 <210> 182 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 182 uuaugcacgg ccuuggagag cuu 23 <210> 183 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 183 gggugaguuc auuuuccagg ugc 23 <210> 184 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 184 gggugaguuc auuuuccagg ugc 23 <210> 185 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 185 gugaguguca gccuuggucc cca 23 <210> 186 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 186 gugaguguca gccuuggucc cca 23 <210> 187 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 187 uauggccucu aaaaacaugg ccc 23 <210> 188 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 188 uauggccucu aaaaacaugg ccc 23 <210> 189 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 189 ugggugaguu cauuuuccag gug 23 <210> 190 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 190 ugggugaguu cauuuuccag gug 23 <210> 191 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 191 ugaucuguuu cuuggccucu ucg 23 <210> 192 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 192 ugaucuguuu cuuggccucu ucg 23 <210> 193 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 193 aaagggucuc ucccauuugc cuu 23 <210> 194 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 194 aaagggucuc ucccauuugc cuu 23 <210> 195 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 195 ugggauucac cacuuuuccc aug 23 <210> 196 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 196 ugggauucac cacuuuuccc aug 23 <210> 197 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 197 ugagugucag ccuugguccc cag 23 <210> 198 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 198 ugagugucag ccuugguccc cag 23 <210> 199 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 199 gcucaacccu ucuuuaaugu cau 23 <210> 200 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 200 gcucaacccu ucuuuaaugu cau 23 <210> 201 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 201 auggccucua aaaacauggc ccc 23 <210> 202 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 202 auggccucua aaaacauggc ccc 23 <210> 203 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 203 uuuccccuca ucaggcagga aga 23 <210> 204 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 204 uuuccccuca ucaggcagga aga 23 <210> 205 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 205 cuuaugcacg gccuuggaga gcu 23 <210> 206 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 206 cuuaugcacg gccuuggaga gcu 23 <210> 207 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 207 uaugcacggc cuuggagagc uuc 23 <210> 208 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 208 uaugcacggc cuuggagagc uuc 23 <210> 209 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 209 ugaaauucag gcccuccagg auu 23 <210> 210 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 210 ugaaauucag gcccuccagg auu 23 <210> 211 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 211 ucugucaagc uccuugacca aau 23 <210> 212 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 212 ucugucaagc uccuugacca aau 23 <210> 213 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 213 cugucaagcu ccuugaccaa auc 23 <210> 214 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 214 cugucaagcu ccuugaccaa auc 23 <210> 215 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 215 uguagcgaug cucacugggg aga 23 <210> 216 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 216 uguagcgaug cucacugggg aga 23 <210> 217 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 217 guccaacagc accaauaucu u 21 <210> 218 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 218 guccaacagc accaauaucu u 21 <210> 219 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 219 uaaugauuga acaaaauacc a 21 <210> 220 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 220 uaaugauuga acaaaauacc a 21 <210> 221 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 221 cuucuuaaug auugaacaaa a 21 <210> 222 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 222 cuucuuaaug auugaacaaa a 21 <210> 223 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 223 auugaacaaa auaccaaguc u 21 <210> 224 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 224 auugaacaaa auaccaaguc u 21 <210> 225 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 225 uucuuaauga uugaacaaaa u 21 <210> 226 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 226 uucuuaauga uugaacaaaa u 21 <210> 227 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 227 caaacccuuu gucuucuuaa u 21 <210> 228 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 228 caaacccuuu gucuucuuaa u 21 <210> 229 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 229 ugucuucuua augauugaac a 21 <210> 230 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 230 ugucuucuua augauugaac a 21 <210> 231 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 231 caccuggaaa augaacucac c 21 <210> 232 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 232 caccuggaaa augaacucac c 21 <210> 233 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 233 uuuugcucug gugaauuaca u 21 <210> 234 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 234 uuuugcucug gugaauuaca u 21 <210> 235 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 235 acccuuuguc uucuuaauga u 21 <210> 236 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 236 acccuuuguc uucuuaauga u 21 <210> 237 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 237 uugaacaaaa uaccaagucu c 21 <210> 238 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 238 uugaacaaaa uaccaagucu c 21 <210> 239 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 239 guucaacaaa cccuuugucu u 21 <210> 240 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 240 guucaacaaa cccuuugucu u 21 <210> 241 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 241 aaauaccaag ucuccccucu u 21 <210> 242 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 242 aaauaccaag ucuccccucu u 21 <210> 243 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 243 uuuuugcucu ggugaauuac a 21 <210> 244 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 244 uuuuugcucu ggugaauuac a 21 <210> 245 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 245 aguucaacaa acccuuuguc u 21 <210> 246 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 246 aguucaacaa acccuuuguc u 21 <210> 247 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 247 aaugauugaa caaaauacca a 21 <210> 248 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 248 aaugauugaa caaaauacca a 21 <210> 249 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 249 uacuggaacc uaugaucuga a 21 <210> 250 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 250 uacuggaacc uaugaucuga a 21 <210> 251 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 251 acauuaaaga aggguugagc u 21 <210> 252 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 252 acauuaaaga aggguugagc u 21 <210> 253 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 253 aaaauugugg auuuggucaa g 21 <210> 254 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 254 aaaauugugg auuuggucaa g 21 <210> 255 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 255 auuacuggaa ccuaugaucu g 21 <210> 256 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 256 auuacuggaa ccuaugaucu g 21 <210> 257 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 257 cacaguuuuu gcucugguga a 21 <210> 258 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 258 cacaguuuuu gcucugguga a 21 <210> 259 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 259 uuaaagaagg guugagcugg u 21 <210> 260 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 260 uuaaagaagg guugagcugg u 21 <210> 261 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 261 agugagcauc gcuacagccu u 21 <210> 262 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 262 agugagcauc gcuacagccu u 21 <210> 263 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 263 aaggagcuug acagagacac a 21 <210> 264 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 264 aaggagcuug acagagacac a 21 <210> 265 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 265 guggauaagu uuuuggagga u 21 <210> 266 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 266 guggauaagu uuuuggagga u 21 <210> 267 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 267 gauugaacaa aauaccaagu c 21 <210> 268 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 268 gauugaacaa aauaccaagu c 21 <210> 269 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 269 gcucuccaag gccgugcaua a 21 <210> 270 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 270 gcucuccaag gccgugcaua a 21 <210> 271 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 271 accuggaaaa ugaacucacc c 21 <210> 272 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 272 accuggaaaa ugaacucacc c 21 <210> 273 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 273 gggaccaagg cugacacuca c 21 <210> 274 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 274 gggaccaagg cugacacuca c 21 <210> 275 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 275 gccauguuuu uagaggccau a 21 <210> 276 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 276 gccauguuuu uagaggccau a 21 <210> 277 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 277 ccuggaaaau gaacucaccc a 21 <210> 278 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 278 ccuggaaaau gaacucaccc a 21 <210> 279 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 279 aagaggccaa gaaacagauc a 21 <210> 280 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 280 aagaggccaa gaaacagauc a 21 <210> 281 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 281 ggcaaauggg agagacccuu u 21 <210> 282 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 282 ggcaaauggg agagacccuu u 21 <210> 283 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 283 ugggaaaagu ggugaauccc a 21 <210> 284 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 284 ugggaaaagu ggugaauccc a 21 <210> 285 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 285 ggggaccaag gcugacacuc a 21 <210> 286 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 286 ggggaccaag gcugacacuc a 21 <210> 287 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 287 gacauuaaag aaggguugag c 21 <210> 288 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 288 gacauuaaag aaggguugag c 21 <210> 289 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 289 ggccauguuu uuagaggcca u 21 <210> 290 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 290 ggccauguuu uuagaggcca u 21 <210> 291 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 291 uuccugccug augaggggaa a 21 <210> 292 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 292 uuccugccug augaggggaa a 21 <210> 293 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 293 cucuccaagg ccgugcauaa g 21 <210> 294 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 294 cucuccaagg ccgugcauaa g 21 <210> 295 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 295 agcucuccaa ggccgugcau a 21 <210> 296 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 296 agcucuccaa ggccgugcau a 21 <210> 297 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 297 uccuggaggg ccugaauuuc a 21 <210> 298 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 298 uccuggaggg ccugaauuuc a 21 <210> 299 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 299 uuggucaagg agcuugacag a 21 <210> 300 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 300 uuggucaagg agcuugacag a 21 <210> 301 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 301 uuuggucaag gagcuugaca g 21 <210> 302 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 302 uuuggucaag gagcuugaca g 21 <210> 303 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 303 uccccaguga gcaucgcuac a 21 <210> 304 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 304 uccccaguga gcaucgcuac a 21 <210> 305 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 305 aagauauugg ugcuguugga cug 23 <210> 306 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 306 aagauauugg ugcuguugga cug 23 <210> 307 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 307 ugguauuuug uucaaucauu aag 23 <210> 308 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 308 ugguauuuug uucaaucauu aag 23 <210> 309 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 309 uuuuguucaa ucauuaagaa gac 23 <210> 310 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 310 uuuuguucaa ucauuaagaa gac 23 <210> 311 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 311 agacuuggua uuuuguucaa uca 23 <210> 312 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 312 agacuuggua uuuuguucaa uca 23 <210> 313 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 313 auuuuguuca aucauuaaga aga 23 <210> 314 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 314 auuuuguuca aucauuaaga aga 23 <210> 315 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 315 auuaagaaga caaaggguuu guu 23 <210> 316 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 316 auuaagaaga caaaggguuu guu 23 <210> 317 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 317 uguucaauca uuaagaagac aaa 23 <210> 318 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 318 uguucaauca uuaagaagac aaa 23 <210> 319 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 319 ggugaguuca uuuuccaggu gcu 23 <210> 320 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 320 ggugaguuca uuuuccaggu gcu 23 <210> 321 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 321 auguaauuca ccagagcaaa aac 23 <210> 322 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 322 auguaauuca ccagagcaaa aac 23 <210> 323 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 323 aucauuaaga agacaaaggg uuu 23 <210> 324 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 324 aucauuaaga agacaaaggg uuu 23 <210> 325 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 325 gagacuuggu auuuuguuca auc 23 <210> 326 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 326 gagacuuggu auuuuguuca auc 23 <210> 327 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 327 aagacaaagg guuuguugaa cuu 23 <210> 328 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 328 aagacaaagg guuuguugaa cuu 23 <210> 329 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 329 aagaggggag acuugguauu uug 23 <210> 330 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 330 aagaggggag acuugguauu uug 23 <210> 331 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 331 uguaauucac cagagcaaaa acu 23 <210> 332 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 332 uguaauucac cagagcaaaa acu 23 <210> 333 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 333 agacaaaggg uuuguugaac uug 23 <210> 334 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 334 agacaaaggg uuuguugaac uug 23 <210> 335 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 335 uugguauuuu guucaaucau uaa 23 <210> 336 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 336 uugguauuuu guucaaucau uaa 23 <210> 337 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 337 uucagaucau agguuccagu aau 23 <210> 338 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 338 uucagaucau agguuccagu aau 23 <210> 339 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 339 agcucaaccc uucuuuaaug uca 23 <210> 340 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 340 agcucaaccc uucuuuaaug uca 23 <210> 341 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 341 cuugaccaaa uccacaauuu ucc 23 <210> 342 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 342 cuugaccaaa uccacaauuu ucc 23 <210> 343 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 343 cagaucauag guuccaguaa ugg 23 <210> 344 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 344 cagaucauag guuccaguaa ugg 23 <210> 345 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 345 uucaccagag caaaaacugu guc 23 <210> 346 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 346 uucaccagag caaaaacugu guc 23 <210> 347 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 347 accagcucaa cccuucuuua aug 23 <210> 348 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 348 accagcucaa cccuucuuua aug 23 <210> 349 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 349 aaggcuguag cgaugcucac ugg 23 <210> 350 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 350 aaggcuguag cgaugcucac ugg 23 <210> 351 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 351 ugugucucug ucaagcuccu uga 23 <210> 352 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 352 ugugucucug ucaagcuccu uga 23 <210> 353 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 353 auccuccaaa aacuuaucca cua 23 <210> 354 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 354 auccuccaaa aacuuaucca cua 23 <210> 355 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 355 gacuugguau uuuguucaau cau 23 <210> 356 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 356 gacuugguau uuuguucaau cau 23 <210> 357 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 357 uuaugcacgg ccuuggagag cuu 23 <210> 358 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 358 uuaugcacgg ccuuggagag cuu 23 <210> 359 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 359 gggugaguuc auuuuccagg ugc 23 <210> 360 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 360 gggugaguuc auuuuccagg ugc 23 <210> 361 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 361 gugaguguca gccuuggucc cca 23 <210> 362 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 362 gugaguguca gccuuggucc cca 23 <210> 363 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 363 uauggccucu aaaaacaugg ccc 23 <210> 364 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 364 uauggccucu aaaaacaugg ccc 23 <210> 365 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 365 ugggugaguu cauuuuccag gug 23 <210> 366 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 366 ugggugaguu cauuuuccag gug 23 <210> 367 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 367 ugaucuguuu cuuggccucu ucg 23 <210> 368 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 368 ugaucuguuu cuuggccucu ucg 23 <210> 369 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 369 aaagggucuc ucccauuugc cuu 23 <210> 370 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 370 aaagggucuc ucccauuugc cuu 23 <210> 371 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 371 ugggauucac cacuuuuccc aug 23 <210> 372 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 372 ugggauucac cacuuuuccc aug 23 <210> 373 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 373 ugagugucag ccuugguccc cag 23 <210> 374 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 374 ugagugucag ccuugguccc cag 23 <210> 375 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 375 gcucaacccu ucuuuaaugu cau 23 <210> 376 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 376 gcucaacccu ucuuuaaugu cau 23 <210> 377 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 377 auggccucua aaaacauggc ccc 23 <210> 378 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 378 auggccucua aaaacauggc ccc 23 <210> 379 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 379 uuuccccuca ucaggcagga aga 23 <210> 380 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 380 uuuccccuca ucaggcagga aga 23 <210> 381 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 381 cuuaugcacg gccuuggaga gcu 23 <210> 382 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 382 cuuaugcacg gccuuggaga gcu 23 <210> 383 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 383 uaugcacggc cuuggagagc uuc 23 <210> 384 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 384 uaugcacggc cuuggagagc uuc 23 <210> 385 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 385 ugaaauucag gcccuccagg auu 23 <210> 386 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 386 ugaaauucag gcccuccagg auu 23 <210> 387 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 387 ucugucaagc uccuugacca aau 23 <210> 388 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 388 ucugucaagc uccuugacca aau 23 <210> 389 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 389 cugucaagcu ccuugaccaa auc 23 <210> 390 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 390 cugucaagcu ccuugaccaa auc 23 <210> 391 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 391 uguagcgaug cucacugggg aga 23 <210> 392 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 392 uguagcgaug cucacugggg aga 23 <210> 393 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 393 guccaacagc accaauaucu u 21 <210> 394 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 394 aagauauugg ugcuguugga cug 23 <210> 395 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 395 guccaacagc accaauaucu u 21 <210> 396 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 396 aagauauugg ugcuguugga cug 23 <210> 397 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 397 guccaacagc accaauaucu u 21 <210> 398 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 398 aagauauugg ugcuguugga cug 23 <210> 399 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 399 guccaacagc accaauaucu u 21 <210> 400 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 400 aagauauugg ugcuguugga cug 23 <210> 401 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 401 cuucuuaaug auugaacaaa a 21 <210> 402 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 402 cuucuuaaug auugaccaaa a 21 <210> 403 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 403 cuucuuaaug auugaucaaa a 21 <210> 404 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 404 cuucuuaaug auugagcaaa a 21 <210> 405 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 405 cuucuuaaug auugaccaaa a 21 <210> 406 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 406 cuucuuaaug auugaccaaa a 21 <210> 407 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 407 cuucuuaaug auugaacaaa a 21 <210> 408 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 408 cuucuuaaug auugaacaaa a 21 <210> 409 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 409 uuuuguucaa ucauuaagaa gac 23 <210> 410 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 410 uuuuggucaa ucauuaagaa gac 23 <210> 411 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 411 uuuugaucaa ucauuaagaa gac 23 <210> 412 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 412 uuuugcucaa ucauuaagaa gac 23 <210> 413 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> Inosine <400> 413 uuuugnucaa ucauuaagaa gac 23 <210> 414 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> a, c, u or g <400> 414 uuuugnucaa ucauuaagaa gac 23 <210> 415 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> a, c, u or g <400> 415 uuuugnucaa ucauuaagaa gac 23 <210> 416 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> a, c, u or g <400> 416 uuuugnucaa ucauuaagaa gac 23 <210> 417 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 417 cuucuuaaug auugaacaaa a 21 <210> 418 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 418 cuucuuaaug auugaacaaa a 21 <210> 419 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 419 uuuuguucaa ucauuaagaa gac 23 <210> 420 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 420 uuuuguucaa ucauuaagaa gac 23 <210> 421 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 421 cuucuuaaug auugaacaaa a 21 <210> 422 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 422 cuucuuaaug auugaccaaa a 21 <210> 423 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 423 cuucuuaaug auugaucaaa a 21 <210> 424 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 424 cuucuuaaug auugagcaaa a 21 <210> 425 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 425 cuucuuaaug auugaccaaa a 21 <210> 426 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 426 cuucuuaaug auugaccaaa a 21 <210> 427 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 427 cuucuuaaug auugaacaaa a 21 <210> 428 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 428 cuucuuaaug auugaacaaa a 21 <210> 429 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 429 uuuuguucaa ucauuaagaa gac 23 <210> 430 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 430 uuuuggucaa ucauuaagaa gac 23 <210> 431 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 431 uuuugaucaa ucauuaagaa gac 23 <210> 432 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 432 uuuugcucaa ucauuaagaa gac 23 <210> 433 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> Inosine <400> 433 uuuugnucaa ucauuaagaa gac 23 <210> 434 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> Deoxyriboinosine <400> 434 uuuugnucaa ucauuaagaa gac 23 <210> 435 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> Deoxyriboinosine <400> 435 uuuugnucaa ucauuaagaa gac 23 <210> 436 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> 2-hydroxymethyl-tetrahydrofurane-4-methoxy-3-phosphate <400> 436 uuuugnucaa ucauuaagaa gac 23

Claims (134)

  1. 세포에서 세르핀 펩티다제 저해제, 클레이드 A, 멤버 1 (serpin peptidase inhibitor, clade A, member 1; Serpina1)의 발현을 억제하는 이중 가닥 RNAi 작용제로서,
    상기 이중 가닥 RNAi 작용제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며,
    상기 안티센스 가닥은 5'-UUUUGUUCAAUCAUUAAGAAGAC-3' (SEQ ID NO: 419)의 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한, 적어도 19개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하며,
    상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥은 각각 독립적으로 길이가 19 내지 25개의 뉴클레오타이드들이고,
    상기 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드들은 2'-O-메틸 변형 및 2'-플루오로 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형을 포함하며,
    상기 센스 가닥은 5'-말단에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합을 포함하며,
    상기 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드들은 2'-O-메틸 변형 및 2'-플루오로 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형을 포함하며,
    상기 안티센스 가닥은 5'-말단에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 및 3'-말단에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합을 포함하고,
    상기 센스 가닥은 3'-말단에서 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체에 콘쥬게이트되는, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열에서 3개 뉴클레오타이드 차이들 중 1개는 상기 안티센스 가닥의 시드 영역(seed region)에 존재하는 뉴클레오타이드 미스매치인, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  3. 제2항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 미스매치된 뉴클레오타이드에 유니버셜 염기(universal base)를 포함하는, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  4. 제1항에 있어서, 상기 센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드들 및 상기 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드들은 변형을 포함하는, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  5. 제1항의 이중 가닥 RNAi 작용제를 포함하는 시험관내(in vitro) 세포.
  6. 제1항의 이중 가닥 RNAi 작용제를 포함하는, Serpina1 결핍 변이체-관련 간 장애(liver disorder)를 갖는 환자를 치료하기 위한, 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 이중 가닥 RNAi 작용제는 비완충 용액 중에 존재하는, 약학적 조성물.
  8. 세포에서 Serpina1 발현을 억제하는 시험관내 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 세포를, 제1항의 이중 가닥 RNAi 작용제 또는 제6항 또는 제7항의 약학적 조성물과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 단계 (a)에서 수득된 세포를, Serpina1 유전자의 mRNA 전사물을 분해시키기에 충분한 시간 동안 유지시킴으로써, 세포에서 Serpina1 유전자의 발현을 억제하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, Serpina1 발현이 적어도 30% 억제되는, 방법.
  10. 제1항에 있어서, Serpina1 결핍 변이체-관련 간 질환(liver disease)을 갖는 환자의 치료 방법에 사용하기 위한, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  11. 제1항에 있어서, Serpina1 결핍 변이체-관련 간 질환을 갖는 환자의 간에서 미스폴딩된(misfolded) Serpina1의 축적을 감소시키는 방법에 사용하기 위한, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 환자가 영장류, 설치류 또는 인간인, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  15. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 이중 가닥 RNAi 작용제는 0.01 mg/kg 내지 10 mg/kg 또는 0.5 mg/kg 내지 50 mg/kg의 용량으로 투여되는, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  16. 제15항에 있어서, 상기 이중 가닥 RNAi 작용제는 2회 이상의 용량으로 투여되는, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  17. 제15항에 있어서, 상기 이중 가닥 RNAi 작용제는 피하내로 투여되는, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  18. 세포에서 세르핀 펩티다제 저해제, 클레이드 A, 멤버 1 (Serpina1)의 발현을 억제하는 이중 가닥 RNAi 작용제로서,
    상기 이중 가닥 RNAi 작용제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며,
    상기 안티센스 가닥은 5'-UUUUGUUCAAUCAUUAAGAAGAC-3' (SEQ ID NO: 419)의 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한, 적어도 19개의 인접 뉴클레오타이드들을 포함하며,
    상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥은 각각 독립적으로 길이가 19 내지 25개의 뉴클레오타이드들이고,
    상기 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드들 및 상기 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드들은 변형된 뉴클레오타이드들이며,
    적어도 하나의 가닥은 리간드에 콘쥬게이트되는, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  19. 제18항에 있어서, 상기 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열에서 3개 뉴클레오타이드 차이들 중 1개는 상기 안티센스 가닥의 시드 영역(seed region)에 존재하는 뉴클레오타이드 미스매치인, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  20. 제19항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 미스매치된 뉴클레오타이드에 유니버셜 염기를 포함하는, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드들 및 상기 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드들은 변형된 뉴클레오타이드들인, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  22. 제18항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오타이드들은 3'-말단 데옥시-티민(dT) 뉴클레오타이드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드, 2'-플루오로 변형된 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-변형된 뉴클레오타이드, 잠금(locked) 뉴클레오타이드, 무염기성(abasic) 뉴클레오타이드, 2'-아미노-변형된 뉴클레오타이드, 2'-알킬-변형된 뉴클레오타이드, 모르폴리노 뉴클레오타이드, 포스포라미데이트, 비천연 염기를 포함하는 뉴클레오타이드, 5'-포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오타이드, 및 콜레스테릴 유도체 또는 도데칸산 비스데실아미드기에 연결된 말단 뉴클레오타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  23. 제18항에 있어서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 1개의 뉴클레오타이드의 3' 오버행을 포함하는, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  24. 제18항에 있어서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 2개의 뉴클레오타이드들의 3' 오버행을 포함하는, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  25. 제18항에 있어서, 상기 이중 가닥 영역은 길이가 19 내지 23개 뉴클레오타이드 쌍인, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  26. 제18항에 있어서, 상기 센스 가닥은 길이가 21개 뉴클레오타이드들이고, 상기 안티센스 가닥은 길이가 23개 뉴클레오타이드들인, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  27. 제18항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드들 상의 변형은 LNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-알킬, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-플루오로, 2'-데옥시, 2'-히드록실 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  28. 제27항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드들 상의 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형인, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  29. 제18항에 있어서, 상기 리간드는 2가 또는 3가 분지형 링커를 통하여 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체인, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  30. 제29항에 있어서, 상기 리간드는
    Figure 112021009895468-pct00117

    인, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  31. 제30항에 있어서, 상기 리간드는 상기 센스 가닥의 3' 말단에 부착된, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  32. 제31항에 있어서, 상기 RNAi 작용제는 하기의 도식에 나타낸 바와 같이 상기 리간드에 콘쥬게이트되는, 이중 가닥 RNAi 작용제.
    Figure 112021009895468-pct00118

    상기 도식에서,
    X는 O 또는 S이다.
  33. 제32항에 있어서, X는 O인, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  34. 제18항에 있어서, 상기 작용제는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간(internucleotide) 결합을 추가로 포함하는, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  35. 제34항에 있어서, 상기 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합은 하나의 가닥의 3'-말단에 존재하는, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  36. 제35항에 있어서, 상기 가닥은 안티센스 가닥인, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  37. 제35항에 있어서, 상기 가닥은 센스 가닥인, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  38. 제34항에 있어서, 상기 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합은 하나의 가닥의 5'-말단에 존재하는, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  39. 제38항에 있어서, 상기 가닥은 안티센스 가닥인, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  40. 제38항에 있어서, 상기 가닥은 센스 가닥인, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  41. 제34항에 있어서, 상기 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합은 하나의 가닥의 5'-말단 및 3'-말단 모두에 존재하는, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  42. 제41항에 있어서, 상기 가닥은 안티센스 가닥인, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  43. 제34항에 있어서, 상기 RNAi 작용제는 6개 내지 8개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합을 포함하는, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  44. 제43항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 5'-말단에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 및 3'-말단에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합을 포함하고, 상기 센스 가닥은 5'-말단 또는 3'-말단에 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합을 포함하는, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  45. 제1항 또는 제18항에 있어서, 듀플렉스의 안티센스 가닥의 5'-말단의 1 위치에서의 염기쌍은 AU 염기쌍인, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  46. 제1항 또는 제18항에 있어서, 상기 안티센스 가닥은 5'-UUUUGUUCAAUCAUUAAGAAGAC-3' (SEQ ID NO: 419)의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  47. 제1항 또는 제18항에 있어서, 상기 센스 가닥은 5'-CUUCUUAAUGAUUGAACAAAA-3' (SEQ ID NO: 417)의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 5'-UUUUGUUCAAUCAUUAAGAAGAC-3' (SEQ ID NO: 419)의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  48. 제1항 또는 제18항에 있어서, 상기 센스 가닥은 5'- csusucuuaauGfAfuugaacaaaa-3' (SEQ ID NO: 418) 의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 5'-usUfsuUfgUfuCfaAfucaUfuAfaGfaAfgsasc-3' (SEQ ID NO: 420)의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며,
    여기서 a, g, c 및 u는 각각 2'-O-메틸(2'-OMe) A, G, C 및 U이고; Af, Gf, Cf 및 Uf는 각각 2'-플루오로 A, G, C 및 U이고; s는 포스포로티오에이트 결합인, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  49. 제48항에 있어서, 리간드를 추가로 포함하는, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  50. 제48항에 있어서, 상기 센스 가닥은 5'-csusucuuaauGfAfuugaacaaaaL96-3' (SEQ ID NO: 418) 의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지고, 상기 안티센스 가닥은 5'-usUfsuUfgUfuCfaAfucaUfuAfaGfaAfgsasc-3' (SEQ ID NO: 420)의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지며,
    여기서 a, g, c 및 u는 각각 2'-O-메틸(2'-OMe) A, G, C 및 U이고; Af, Gf, Cf 및 Uf는 각각 2'-플루오로 A, G, C 및 U이고; s는 포스포로티오에이트 결합이고; L96은 N-[트리스(GalNAc-알킬)-아미도도데카노일)]-4-하이드록시프롤리놀인, 이중 가닥 RNAi 작용제.
  51. 제7항에 있어서, 상기 비완충 용액은 염수 또는 물인, 약학적 조성물.
  52. 제6항에 있어서, 상기 RNAi 작용제는 완충 용액 중에 존재하는, 약학적 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 상기 완충 용액은 아세테이트, 시트레이트, 프롤라민, 카보네이트, 또는 포스페이트 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 약학적 조성물.
  54. 제52항에 있어서, 상기 완충 용액은 포스페이트 완충 식염수 (PBS)인, 약학적 조성물.
  55. 제6항에 있어서, Serpina1 결핍 변이체-관련 간 질환을 갖는 환자의 치료 방법에 사용하기 위한, 약학적 조성물.
  56. 제6항에 있어서, Serpina1 결핍 변이체-관련 간 질환을 갖는 환자의 간에서 미스폴딩된 Serpina1의 축적을 감소시키는 방법에 사용하기 위한, 약학적 조성물.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 환자가 인간인, 약학적 조성물.
  58. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 이중 가닥 RNAi 작용제는 0.01 mg/kg 내지 10 mg/kg 또는 0.5 mg/kg 내지 50 mg/kg의 용량으로 투여되는, 약학적 조성물.
  59. 제58항에 있어서, 상기 이중 가닥 RNAi 작용제는 2회 이상의 용량으로 투여되는, 약학적 조성물.
  60. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 이중 가닥 RNAi 작용제는 피하내로 투여되는, 약학적 조성물.
  61. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 간 장애는 만성 간 질환, 간 염증, 간경변, 간 섬유증 및 간세포 암종으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
  62. 제57항에 있어서, 상기 인간 환자는 하나 이상의 Serpina1 Z 대립유전자를 갖는, 약학적 조성물.
  63. 삭제
  64. 삭제
  65. 삭제
  66. 삭제
  67. 삭제
  68. 삭제
  69. 삭제
  70. 삭제
  71. 삭제
  72. 삭제
  73. 삭제
  74. 삭제
  75. 삭제
  76. 삭제
  77. 삭제
  78. 삭제
  79. 삭제
  80. 삭제
  81. 삭제
  82. 삭제
  83. 삭제
  84. 삭제
  85. 삭제
  86. 삭제
  87. 삭제
  88. 삭제
  89. 삭제
  90. 삭제
  91. 삭제
  92. 삭제
  93. 삭제
  94. 삭제
  95. 삭제
  96. 삭제
  97. 삭제
  98. 삭제
  99. 삭제
  100. 삭제
  101. 삭제
  102. 삭제
  103. 삭제
  104. 삭제
  105. 삭제
  106. 삭제
  107. 삭제
  108. 삭제
  109. 삭제
  110. 삭제
  111. 삭제
  112. 삭제
  113. 삭제
  114. 삭제
  115. 삭제
  116. 삭제
  117. 삭제
  118. 삭제
  119. 삭제
  120. 삭제
  121. 삭제
  122. 삭제
  123. 삭제
  124. 삭제
  125. 삭제
  126. 삭제
  127. 삭제
  128. 삭제
  129. 삭제
  130. 삭제
  131. 삭제
  132. 삭제
  133. 삭제
  134. 삭제
KR1020157036053A 2013-05-22 2014-05-22 ＳＥＲＰＩＮＡ1 ｉＲＮＡ 조성물 및 이의 사용 방법 KR102295648B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020217026982A KR102463973B1 (ko) 2013-05-22 2014-05-22 ＳＥＲＰＩＮＡ1 ｉＲＮＡ 조성물 및 이의 사용 방법

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361826125P 2013-05-22 2013-05-22
US61/826,125 2013-05-22
US201361898695P 2013-11-01 2013-11-01
US61/898,695 2013-11-01
US201461979727P 2014-04-15 2014-04-15
US61/979,727 2014-04-15
US201461989028P 2014-05-06 2014-05-06
US61/989,028 2014-05-06
PCT/US2014/039109 WO2014190137A1 (en) 2013-05-22 2014-05-22 SERPINA1 iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217026982A Division KR102463973B1 (ko) 2013-05-22 2014-05-22 ＳＥＲＰＩＮＡ1 ｉＲＮＡ 조성물 및 이의 사용 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160011660A KR20160011660A (ko) 2016-02-01
KR102295648B1 true KR102295648B1 (ko) 2021-08-31

Family

ID=51934144

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217026982A KR102463973B1 (ko) 2013-05-22 2014-05-22 ＳＥＲＰＩＮＡ1 ｉＲＮＡ 조성물 및 이의 사용 방법
KR1020227038298A KR20220154244A (ko) 2013-05-22 2014-05-22 ＳＥＲＰＩＮＡ1 ｉＲＮＡ 조성물 및 이의 사용 방법
KR1020157036053A KR102295648B1 (ko) 2013-05-22 2014-05-22 ＳＥＲＰＩＮＡ1 ｉＲＮＡ 조성물 및 이의 사용 방법

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217026982A KR102463973B1 (ko) 2013-05-22 2014-05-22 ＳＥＲＰＩＮＡ1 ｉＲＮＡ 조성물 및 이의 사용 방법
KR1020227038298A KR20220154244A (ko) 2013-05-22 2014-05-22 ＳＥＲＰＩＮＡ1 ｉＲＮＡ 조성물 및 이의 사용 방법

Country Status (33)

Country Link
US (5) US9574192B2 (ko)
EP (2) EP2999785B1 (ko)
JP (3) JP6495250B2 (ko)
KR (3) KR102463973B1 (ko)
CN (2) CN105408481B (ko)
AU (2) AU2014268509B2 (ko)
BR (1) BR112015029139B1 (ko)
CA (1) CA2912826A1 (ko)
CL (1) CL2015003441A1 (ko)
CY (1) CY1122159T1 (ko)
DK (1) DK2999785T3 (ko)
DO (1) DOP2015000288A (ko)
EA (1) EA038792B1 (ko)
ES (1) ES2676146T3 (ko)
GT (1) GT201500330A (ko)
HK (1) HK1221979A1 (ko)
HR (1) HRP20181030T1 (ko)
HU (1) HUE038146T2 (ko)
IL (3) IL242637B (ko)
LT (1) LT2999785T (ko)
MX (1) MX2021000656A (ko)
MY (1) MY176712A (ko)
PE (2) PE20210921A1 (ko)
PL (1) PL2999785T3 (ko)
PT (1) PT2999785T (ko)
RS (1) RS57418B1 (ko)
RU (1) RU2015154721A (ko)
SG (3) SG10201804472YA (ko)
SI (1) SI2999785T1 (ko)
TW (2) TW201936624A (ko)
UY (1) UY35582A (ko)
WO (1) WO2014190137A1 (ko)
ZA (1) ZA201509252B (ko)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA201490993A1 (ru) * 2011-11-18 2014-09-30 Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. МОДИФИЦИРОВАННЫЕ СРЕДСТВА РНКи
KR102463973B1 (ko) 2013-05-22 2022-11-07 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 ＳＥＲＰＩＮＡ1 ｉＲＮＡ 조성물 및 이의 사용 방법
US9458457B2 (en) 2013-07-03 2016-10-04 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the specific inhibition of alpha-1 antitrypsin by double-stranded RNA
JP6811094B2 (ja) 2014-05-22 2021-01-13 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． アンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）ｉＲＮＡ組成物およびその使用
TW201620526A (zh) 2014-06-17 2016-06-16 愛羅海德研究公司 用於抑制α－１抗胰蛋白酶基因表現之組合物及方法
NZ767118A (en) 2014-08-20 2024-02-23 Alnylam Pharmaceuticals Inc Modified double-stranded rna agents
CA2957737A1 (en) 2014-09-07 2016-03-10 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions for attenuating gene expression modulating anti-viral transfer vector immune responses
EP3386518A1 (en) 2015-12-07 2018-10-17 Genzyme Corporation Methods and compositions for treating a serpinc1-associated disorder
WO2018013912A1 (en) * 2016-07-15 2018-01-18 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Anti-arid3a treatments for inflammatory disorders
TWI788312B (zh) * 2016-11-23 2023-01-01 美商阿尼拉製藥公司 絲胺酸蛋白酶抑制因子Ａ１ ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
AU2017368050A1 (en) 2016-11-29 2019-06-20 Puretech Lyt, Inc. Exosomes for delivery of therapeutic agents
WO2018132432A1 (en) 2017-01-10 2018-07-19 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Alpha-1 antitrypsin (aat) rnai agents, compositions including aat rnai agents, and methods of use
WO2018183705A1 (en) * 2017-03-29 2018-10-04 Cornell University Oxidation-resistant aat gene therapy
JP7427584B2 (ja) 2017-10-13 2024-02-05 セレクタ バイオサイエンシーズ インコーポレーテッド 抗ウイルス導入ベクターｉｇｍ応答を減弱化するための方法および組成物
WO2019100039A1 (en) * 2017-11-20 2019-05-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serum amyloid p component (apcs) irna compositions and methods of use thereof
TW202016304A (zh) 2018-05-14 2020-05-01 美商阿尼拉製藥公司 血管收縮素原（ＡＧＴ）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
US20230026916A1 (en) * 2018-07-05 2023-01-26 Active Genomes Expressed Diagnostics, Inc Viral Oncogene Influences and Gene Expression Patterns as Indicators of Early Tumorigenesis
US20200390718A1 (en) 2019-05-28 2020-12-17 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions for attenuated anti-viral transfer vector immune response
US20230107967A1 (en) * 2021-08-25 2023-04-06 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting alpha-1 antitrypsin expression
WO2023064367A1 (en) 2021-10-12 2023-04-20 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions for attenuating anti-viral transfer vector igm responses
US20230357437A1 (en) 2022-03-09 2023-11-09 Selecta Biosciences, Inc. Immunosuppressants in combination with anti-igm agents and related dosing

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050137153A1 (en) 2002-02-20 2005-06-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of alpha-1 antitrypsin (AAT) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
WO2010148013A2 (en) 2009-06-15 2010-12-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated dsrna targeting the pcsk9 gene
WO2012178033A2 (en) * 2011-06-23 2012-12-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serpina1 sirnas: compositions of matter and methods of treatment

Family Cites Families (254)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US564562A (en) 1896-07-21 Joseph p
US513030A (en) 1894-01-16 Machine for waxing or coating paper
US1861608A (en) 1929-12-21 1932-06-07 Emerson Electric Mfg Co Fan and means for directing the air current therethrough
US1861108A (en) 1930-01-24 1932-05-31 Eugene O Brace Integral clutch and transmission control
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US3974808A (en) 1975-07-02 1976-08-17 Ford Motor Company Air intake duct assembly
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
US4708708A (en) 1982-12-06 1987-11-24 International Paper Company Method and apparatus for skiving and hemming
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
AU598946B2 (en) 1987-06-24 1990-07-05 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Nucleoside derivatives
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
JPH03503894A (ja) 1988-03-25 1991-08-29 ユニバーシィティ　オブ　バージニア　アランミ　パテンツ　ファウンデイション オリゴヌクレオチド　ｎ‐アルキルホスホラミデート
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
FR2645866B1 (fr) 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
NL8901881A (nl) 1989-07-20 1991-02-18 Rockwool Grodan Bv Drainagekoppelelement.
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
EP0942000B1 (en) 1989-10-24 2004-06-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-Modified oligonucleotides
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
CA2029273A1 (en) 1989-12-04 1991-06-05 Christine L. Brakel Modified nucleotide compounds
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5852188A (en) 1990-01-11 1998-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US7037646B1 (en) 1990-01-11 2006-05-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US6783931B1 (en) 1990-01-11 2004-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
AU7579991A (en) 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
EP0455905B1 (en) 1990-05-11 1998-06-17 Microprobe Corporation Dipsticks for nucleic acid hybridization assays and methods for covalently immobilizing oligonucleotides
US5981276A (en) 1990-06-20 1999-11-09 Dana-Farber Cancer Institute Vectors containing HIV packaging sequences, packaging defective HIV vectors, and uses thereof
BR9106702A (pt) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Inc Analogo de oligonucleotideos e processos para modular a producao de uma proteina por um organismo e para tratar um organismo
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
IL99066A (en) 1990-08-03 1996-01-31 Sterling Winthrop Inc Nuclease-resistant compounds containing oligonucleotide sequences having either or both of the ends, and preparations containing them
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
JPH06505704A (ja) 1990-09-20 1994-06-30 ギリアド　サイエンシズ，インコーポレイテッド 改変ヌクレオシド間結合
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
CA2095212A1 (en) 1990-11-08 1992-05-09 Sudhir Agrawal Incorporation of multiple reporter groups on synthetic oligonucleotides
GB9100304D0 (en) 1991-01-08 1991-02-20 Ici Plc Compound
US7015315B1 (en) 1991-12-24 2006-03-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligonucleotides
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
US5283185A (en) 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
DE59208572D1 (de) 1991-10-17 1997-07-10 Ciba Geigy Ag Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
WO1993009668A1 (en) 1991-11-22 1993-05-27 Affymax Technology N.V. Combinatorial strategies for polymer synthesis
US6235887B1 (en) 1991-11-26 2001-05-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation directed by oligonucleotides containing modified pyrimidines
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US6277603B1 (en) 1991-12-24 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
ATE204879T1 (de) 1991-12-24 2001-09-15 Isis Pharmaceuticals Inc Antisense oligonukleotide
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
DE4203923A1 (de) 1992-02-11 1993-08-12 Henkel Kgaa Verfahren zur herstellung von polycarboxylaten auf polysaccharid-basis
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
AU4528493A (en) 1992-06-04 1994-01-04 Regents Of The University Of California, The In vivo gene therapy with intron-free sequence of interest
NZ253943A (en) 1992-06-18 1997-01-29 Genpharm Int Transfering polynucleotides into eukaryotic cells using co-lipofection complexes of a cationic lipid and the polynucleotide
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
WO1994002595A1 (en) 1992-07-17 1994-02-03 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for treatment of animal diseases
US6346614B1 (en) 1992-07-23 2002-02-12 Hybridon, Inc. Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US5783701A (en) 1992-09-08 1998-07-21 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Sulfonamide inhibitors of aspartyl protease
EP0673431A1 (en) 1992-12-03 1995-09-27 Genzyme Corporation Gene therapy for cystic fibrosis
US5478745A (en) 1992-12-04 1995-12-26 University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
WO1994018987A1 (en) 1993-02-19 1994-09-01 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Drug composition containing nucleic acid copolymer
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
ATE155467T1 (de) 1993-03-30 1997-08-15 Sanofi Sa Acyclische nucleosid analoge und sie enthaltende oligonucleotidsequenzen
AU6412794A (en) 1993-03-31 1994-10-24 Sterling Winthrop Inc. Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
US6191105B1 (en) 1993-05-10 2001-02-20 Protein Delivery, Inc. Hydrophilic and lipophilic balanced microemulsion formulations of free-form and/or conjugation-stabilized therapeutic agents such as insulin
US5955591A (en) 1993-05-12 1999-09-21 Imbach; Jean-Louis Phosphotriester oligonucleotides, amidites and method of preparation
US6015886A (en) 1993-05-24 2000-01-18 Chemgenes Corporation Oligonucleotide phosphate esters
US6294664B1 (en) 1993-07-29 2001-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of oligonucleotides
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
EP0729474A4 (en) 1993-11-16 1998-10-21 Genta Inc SYNTHETIC OLIGOMERS THAT HAVE CHIRALITY-PURE PHOSPHONATE INTERNUCLEOSIDYL BINDINGS MIXED WITH NON-PHOSPHONATE INTERNUKLEOSIDYL BINDINGS
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5599922A (en) 1994-03-18 1997-02-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide N3'-P5' phosphoramidates: hybridization and nuclease resistance properties
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US6054299A (en) 1994-04-29 2000-04-25 Conrad; Charles A. Stem-loop cloning vector and method
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5543152A (en) 1994-06-20 1996-08-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US6608035B1 (en) 1994-10-25 2003-08-19 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US5665557A (en) 1994-11-14 1997-09-09 Systemix, Inc. Method of purifying a population of cells enriched for hematopoietic stem cells populations of cells obtained thereby and methods of use thereof
US6166197A (en) 1995-03-06 2000-12-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds having pyrimidine nucleotide (S) with 2'and 5 substitutions
EP0813539B1 (en) 1995-03-06 2006-05-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Improved process for the synthesis of 2'-o-substituted pyrimidines and oligomeric compounds therefrom
WO1996037194A1 (en) 1995-05-26 1996-11-28 Somatix Therapy Corporation Delivery vehicles comprising stable lipid/nucleic acid complexes
IL122290A0 (en) 1995-06-07 1998-04-05 Inex Pharmaceuticals Corp Lipid-nucleic acid complex its preparation and use
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US5545531A (en) 1995-06-07 1996-08-13 Affymax Technologies N.V. Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays
US5858397A (en) 1995-10-11 1999-01-12 University Of British Columbia Liposomal formulations of mitoxantrone
WO1997014809A2 (en) 1995-10-16 1997-04-24 Dana-Farber Cancer Institute Novel expression vectors and methods of use
US6160109A (en) 1995-10-20 2000-12-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Preparation of phosphorothioate and boranophosphate oligomers
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
US5858401A (en) 1996-01-22 1999-01-12 Sidmak Laboratories, Inc. Pharmaceutical composition for cyclosporines
US5994316A (en) 1996-02-21 1999-11-30 The Immune Response Corporation Method of preparing polynucleotide-carrier complexes for delivery to cells
US6444423B1 (en) 1996-06-07 2002-09-03 Molecular Dynamics, Inc. Nucleosides comprising polydentate ligands
EP1007533B1 (en) * 1996-08-27 2005-06-22 University Of Utah Research Foundation Bioconjugates and delivery of bioactive agents
US6639062B2 (en) 1997-02-14 2003-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy-modified nucleosidic compounds and oligomeric compounds prepared therefrom
US6172209B1 (en) 1997-02-14 2001-01-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Aminooxy-modified oligonucleotides and methods for making same
US6576752B1 (en) 1997-02-14 2003-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy functionalized oligomers
US6034135A (en) 1997-03-06 2000-03-07 Promega Biosciences, Inc. Dimeric cationic lipids
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US6887906B1 (en) 1997-07-01 2005-05-03 Isispharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the delivery of oligonucleotides via the alimentary canal
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6528640B1 (en) 1997-11-05 2003-03-04 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Synthetic ribonucleic acids with RNAse activity
US6617438B1 (en) 1997-11-05 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. Oligoribonucleotides with enzymatic activity
US6320017B1 (en) 1997-12-23 2001-11-20 Inex Pharmaceuticals Corp. Polyamide oligomers
US6436989B1 (en) 1997-12-24 2002-08-20 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Prodrugs of aspartyl protease inhibitors
EP1042280A2 (en) 1997-12-24 2000-10-11 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Prodrugs of aspartyl protease inhibitors
US7273933B1 (en) 1998-02-26 2007-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for synthesis of oligonucleotides
US7045610B2 (en) 1998-04-03 2006-05-16 Epoch Biosciences, Inc. Modified oligonucleotides for mismatch discrimination
US6531590B1 (en) 1998-04-24 2003-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Processes for the synthesis of oligonucleotide compounds
US6867294B1 (en) 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
CA2335393C (en) 1998-07-20 2008-09-23 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal encapsulated nucleic acid-complexes
CA2345936A1 (en) 1998-10-09 2000-04-20 Ingene, Inc. Production of ssdna in a cell
AU6430599A (en) 1998-10-09 2000-05-01 Cytogenix, Inc. Enzymatic synthesis of ssdna
US6465628B1 (en) 1999-02-04 2002-10-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for the synthesis of oligomeric compounds
TWI260322B (en) 1999-02-12 2006-08-21 Vertex Pharma Inhibitors of aspartyl protease
WO2000050050A1 (en) 1999-02-23 2000-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Multiparticulate formulation
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
NZ514348A (en) 1999-05-04 2004-05-28 Exiqon As L-ribo-LNA analogues
US6593466B1 (en) 1999-07-07 2003-07-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Guanidinium functionalized nucleotides and precursors thereof
US6147200A (en) 1999-08-19 2000-11-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers
WO2001053307A1 (en) 2000-01-21 2001-07-26 Geron Corporation 2'-arabino-fluorooligonucleotide n3'→p5'phosphoramidates: their synthesis and use
IT1318539B1 (it) 2000-05-26 2003-08-27 Italfarmaco Spa Composizioni farmaceutiche a rilascio prolungato per lasomministrazione parenterale di sostanze idrofile biologicamente
DE60119562T2 (de) 2000-10-04 2007-05-10 Santaris Pharma A/S Verbesserte synthese von purin-blockierten nukleinsäure-analoga
US7063860B2 (en) 2001-08-13 2006-06-20 University Of Pittsburgh Application of lipid vehicles and use for drug delivery
US8101348B2 (en) 2002-07-10 2012-01-24 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. RNA-interference by single-stranded RNA molecules
US6878805B2 (en) 2002-08-16 2005-04-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide-conjugated oligomeric compounds
EP2314691A3 (en) 2002-11-14 2012-01-18 Dharmacon, Inc. Fuctional and hyperfunctional siRNA
WO2006006948A2 (en) 2002-11-14 2006-01-19 Dharmacon, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY
US9839649B2 (en) * 2002-11-14 2017-12-12 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
AU2005212433B2 (en) 2003-05-23 2010-12-16 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using multifunctional short interfering nucleic acid (multifunctional sINA)
DK1661905T3 (da) 2003-08-28 2012-07-23 Takeshi Imanishi Hidtil ukendte syntetiske nukleinsyrer af N-O-krydsbindingstype
WO2005070948A1 (en) 2004-01-23 2005-08-04 Intronn, Inc. Correction of alpha-1-antitrypsin genetic defects using spliceosome mediated rna trans splicing
EP1752536A4 (en) 2004-05-11 2008-04-16 Alphagen Co Ltd POLYNUCLEOTIDE CAUSING RNA INTERFERENCE AND METHOD OF REGULATING GENE EXPRESSION WITH THE USE OF THE SAME
AU2005297376A1 (en) * 2004-10-19 2006-04-27 Replicor Inc. Antiviral oligonucleotides
DK1866414T3 (da) 2005-03-31 2012-04-23 Calando Pharmaceuticals Inc Inhibitorer af ribonukleotidreduktase-underenhed 2 og anvendelser deraf.
PL2314594T3 (pl) 2006-01-27 2014-12-31 Isis Pharmaceuticals Inc Zmodyfikowane w pozycji 6 analogi bicykliczne kwasów nukleinowych
US8362229B2 (en) 2006-02-08 2013-01-29 Quark Pharmaceuticals, Inc. Tandem siRNAS
JP5761911B2 (ja) 2006-04-07 2015-08-12 イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッドＩｄｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｔｌｒ７およびｔｌｒ８に対する安定化免疫調節ｒｎａ（ｓｉｍｒａ）化合物
MX2009003548A (es) 2006-10-03 2009-04-15 Alnylam Pharmaceuticals Inc Formulaciones que contienen lipidos.
US8188261B2 (en) 2007-07-09 2012-05-29 Idera Pharmaceuticals, Inc. Stabilized immune modulatory RNA (SIMRA) compounds
WO2009082607A2 (en) 2007-12-04 2009-07-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Targeting lipids
EP2245039A4 (en) * 2008-01-31 2012-06-06 Alnylam Pharmaceuticals Inc OPTIMIZED METHODS FOR EXPORING DSRNA TO TARGET THE PCSK9 GEN
US20110130440A1 (en) 2008-03-26 2011-06-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Non-natural ribonucleotides, and methods of use thereof
WO2009127060A1 (en) 2008-04-15 2009-10-22 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
ES2708944T3 (es) * 2008-09-22 2019-04-12 Dicerna Pharmaceuticals Inc Composiciones y métodos para la inhibición específica de la expresión de genes por DSRNA que tenga modificaciones
CA3151965A1 (en) * 2008-12-18 2010-07-15 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Extended dicer substrate agents and methods for the specific inhibition of gene expression
ES2804764T3 (es) 2009-06-01 2021-02-09 Halo Bio Rnai Therapeutics Inc Polinucleótidos para la interferencia de ARN multivalente, composiciones y métodos de uso de los mismos
SI3431076T1 (sl) 2009-06-10 2022-04-29 Arbutus Biopharma Corporation Izboljšana lipidna formulacija
US9512164B2 (en) 2009-07-07 2016-12-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide end caps
ES2646097T3 (es) 2009-08-27 2017-12-12 Idera Pharmaceuticals, Inc. Composición para inhibir la expresión de genes y sus usos
TWI484183B (zh) * 2011-09-01 2015-05-11 Univ Nat Cheng Kung 癌症轉移之評估方法及生物標記、及抑制癌症轉移之ｓｉＲＮＡ化合物
US9340784B2 (en) 2012-03-19 2016-05-17 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for modulating alpha-1-antitrypsin expression
US10174323B2 (en) * 2012-05-16 2019-01-08 The General Hospital Corporation Compositions and methods for modulating ATP2A2 expression
KR102463973B1 (ko) 2013-05-22 2022-11-07 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 ＳＥＲＰＩＮＡ1 ｉＲＮＡ 조성물 및 이의 사용 방법
US9458457B2 (en) 2013-07-03 2016-10-04 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the specific inhibition of alpha-1 antitrypsin by double-stranded RNA
NZ767118A (en) 2014-08-20 2024-02-23 Alnylam Pharmaceuticals Inc Modified double-stranded rna agents
WO2018132432A1 (en) 2017-01-10 2018-07-19 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Alpha-1 antitrypsin (aat) rnai agents, compositions including aat rnai agents, and methods of use
US10799808B2 (en) 2018-09-13 2020-10-13 Nina Davis Interactive storytelling kit

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050137153A1 (en) 2002-02-20 2005-06-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of alpha-1 antitrypsin (AAT) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
WO2010148013A2 (en) 2009-06-15 2010-12-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated dsrna targeting the pcsk9 gene
WO2012178033A2 (en) * 2011-06-23 2012-12-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serpina1 sirnas: compositions of matter and methods of treatment

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Alnylam Pharmaceuticals,

Also Published As

Publication number Publication date
TW201936624A (zh) 2019-09-16
LT2999785T (lt) 2018-07-25
US10683504B2 (en) 2020-06-16
JP2016520312A (ja) 2016-07-14
CL2015003441A1 (es) 2016-08-19
TW201508005A (zh) 2015-03-01
ZA201509252B (en) 2018-12-19
NZ714530A (en) 2021-10-29
JP6495250B2 (ja) 2019-04-03
RS57418B1 (sr) 2018-09-28
CN105408481A (zh) 2016-03-16
AU2014268509A1 (en) 2015-12-24
MY176712A (en) 2020-08-19
GT201500330A (es) 2019-07-19
PL2999785T3 (pl) 2018-09-28
US10030244B2 (en) 2018-07-24
JP2021191278A (ja) 2021-12-16
ES2676146T3 (es) 2018-07-17
EA201592223A1 (ru) 2016-04-29
US20200080085A1 (en) 2020-03-12
BR112015029139B1 (pt) 2022-07-12
DK2999785T3 (en) 2018-07-23
WO2014190137A1 (en) 2014-11-27
SG10201913872XA (en) 2020-03-30
PE20160030A1 (es) 2016-02-14
HRP20181030T1 (hr) 2018-08-24
CY1122159T1 (el) 2020-07-31
TWI664187B (zh) 2019-07-01
SG10201804472YA (en) 2018-07-30
US20170114342A1 (en) 2017-04-27
CN113018307A (zh) 2021-06-25
SI2999785T1 (en) 2018-08-31
RU2015154721A (ru) 2017-06-27
US9574192B2 (en) 2017-02-21
PT2999785T (pt) 2018-07-09
US10920223B2 (en) 2021-02-16
IL242637B (en) 2019-12-31
KR20220154244A (ko) 2022-11-21
KR20210110397A (ko) 2021-09-07
CN105408481B (zh) 2021-03-30
PE20210921A1 (es) 2021-05-19
EP3412774A1 (en) 2018-12-12
US20180346910A1 (en) 2018-12-06
HUE038146T2 (hu) 2018-09-28
HK1221979A1 (zh) 2017-06-16
AU2020286218A1 (en) 2021-01-07
US20210317452A1 (en) 2021-10-14
AU2014268509B2 (en) 2020-10-01
DOP2015000288A (es) 2017-01-31
EP2999785B1 (en) 2018-04-04
BR112015029139A2 (ko) 2017-09-19
EA038792B1 (ru) 2021-10-20
JP2019107029A (ja) 2019-07-04
US20140350071A1 (en) 2014-11-27
MX2021000656A (es) 2021-03-25
CA2912826A1 (en) 2014-11-27
KR20160011660A (ko) 2016-02-01
IL284757A (en) 2021-08-31
SG11201509712YA (en) 2016-01-28
IL270666B (en) 2021-07-29
KR102463973B1 (ko) 2022-11-07
JP6931015B2 (ja) 2021-09-01
EP2999785A1 (en) 2016-03-30
NZ753769A (en) 2021-10-29
UY35582A (es) 2014-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10683504B2 (en) Serpina1 iRNA compositions and methods of use thereof
US10935917B2 (en) Serpina1 siRNAs: compositions of matter and methods of treatment
KR102365809B1 (ko) Ｔｍｐｒｓｓ6 조성물 및 이의 사용 방법
KR102389968B1 (ko) 케토헥소키나제(ＫＨＫ) ｉＲＮＡ 조성물 및 그의 사용 방법
AU2015330726B2 (en) Compositions and methods for inhibition of HAO1 (hydroxyacid oxidase 1 (glycolate oxidase)) gene expression
KR102139918B1 (ko) ＳＥＲＰＩＮＣ1 ｉＲＮＡ 조성물 및 그의 이용 방법
RU2761667C2 (ru) КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ iRNA SERPINA1 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant