ES2646097T3 - Composición para inhibir la expresión de genes y sus usos - Google Patents
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Abstract
Un compuesto basado en oligonucleótidos que comprende dos oligonucleótidos antisentido monocatenarios unidos en sus extremos 5', en donde, el compuesto basado en oligonucleótidos tiene dos extremos 3' accesibles.
Description
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DESCRIPCION
Composicion para inhibir la expresion de genes y sus usos Antecedentes de la invencion Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a los compuestos, las composiciones y los metodos de uso para la inhibicion de la expresion y/o actividad de genes o para diagnosticar, tratar y/o prevenir enfermedades y/o afecciones que responden a la inhibicion de la expresion y/o la actividad de genes.
Resumen de la tecnica relacionada
Un enfoque para inhibir la expresion de genes es la tecnologfa antisentido o la inhibicion del RNA (RNAi). Estos enfoques hacen uso de la union espedfica de la secuencia de oligonucleotidos en base a DNA y/o RNA para seleccionar objetivos de mRNA, microRNA, preRNA o RNA mitocondrial o y la inhibicion de la traduccion que resulta de estos. Esta inhibicion en base a oligonucleotidos de la traduccion y, al final, la expresion de genes es el resultado de uno o mas mecanismos celulares, que pueden incluir, pero no se limitan a (i) el bloqueo directo (esterico) de la traduccion, (ii) la inhibicion mediada por RNasa H, y (iii) la inhibicion mediada por RNAi (por ejemplo, RNA interferente corto (siRNA), microRNA (miRNA), RNAi dirigido por DNA (ddRNAi) y RNAi monocatenario (ssRNAi)).
La historia de la tecnologfa antisentido ha revelado que aunque la determinacion de oligonucleotidos antisentido que se unen al mRNA es relativamente sencillo, la optimizacion de los oligonucleotidos antisentido que tienen potencial verdadero para inhibir la expresion de genes y, por lo tanto, ser buenos candidatos clmicos, no lo es. Como consecuencia, si un enfoque en base a oligonucleotidos para que la regulacion negativa de la expresion de genes tenga exito, es necesario optimizar los oligonucleotidos antisentido que logren este resultado con la maxima eficiencia. Tales oligonucleotidos antisentido optimizados podnan usarse solos o junto con otras composiciones profilacticas y/o terapeuticas.
Dado que Zamecnik y Stephenson publicaron la primera demostracion de usar oligonucleotidos antisentido como un medio para inhibir la traduccion de protemas virales(ZemecnikyStephenson (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 285-288), ha existido un gran interes en utilizar compuestos basados en oligonucleotidos para inhibir la expresion de genes. Estos esfuerzos iniciales utilizaron oligodesoxirribonucleotidos u oligorribonucleotidos, no modificados, monocatenarios (Agrawal y otros (1992) Ann. NY Acad. Sci. 660:2-10), que son intrmsecamente inestables in vivo, para unirse al mRNA in vivo y crear un molde de RNA bicatenario para la degradacion enzimatica o RNAasa. Se hicieron esfuerzos posteriores para determinar la utilidad de los oligodesoxirribonucleotidos que incorporaban enlaces fosforotioato y/o metilfosfonato resistentes a las nucleasas (Agrawal y otros (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:70797083; Metelev&Agrawal US 5,652,355; Metelev&Agrawal US 6,143,881; Matsukura y otros (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84:7706).
Otra clase de moleculas en base a RNA que inhiben la expresion de genes se denominan ribozimas. Las ribozimas forman estructuras de tallo lazo y se unen a un objetivo de RNA para mediar su escision directamente (Cech, T. (1990) Ann. Rev. Biochem. 59:543). Las ribozimas se unen selectivamente al RNA objetivo y catalizan una esterificacion trans o una reaccion de hidrolisis para escindir enlaces de fosfodiester espedficos en el rNa monocatenario. Si se introduce en las celulas, las ribozimas tienen el potencial de unirse al mRNA objetivo e inhibir la traduccion de ese mRNA. Como con las tecnologfas antisentido monocatenarias, la estabilidad y la actividad de las ribozimas se han mejorado a traves de la incorporacion de ciertas modificaciones qrnmicas en la estructura de la ribozima (GoodchildUS 6,204,027; Goodchild Us 6,573,072). Aunque las tecnologfas de oligonucleotidos antisentido y ribozima continuan avanzando, se estan realizando descubrimientos con otras tecnologfas en base a oligonucleotidos.
En base a los descubrimientos pioneros de Fire y Mello (Fire y otros (1998) Nature, 391:806-811), los esfuerzos se han dirigido hacia las tecnologfas de interferencia de RNA (RNAi) (por ejemplo, RNA interferente corto (siRNA), microRNA (miRNA), RNAi dirigido por DNA (ddRNAi) y RNAi monocatenario (ssRNAi)) en sistemas de marnfferos. El RNAi se refiere al proceso de inhibicion postranscripcional de la expresion de genes mediante el uso de oligonucleotidos cortos que se disenan para hibridar con objetivos de mRNA espedficos (Fire y otros (1998) Nature 391:806-811; Zamore y otros (2000) Cell, 101:25-33). En el caso del siRNA, las moleculas de RNA bicatenario, cortas, utilizan la maquinaria enzimatica celular para escindir moleculas de RNA objetivo homologas. (Rana (2007) Nature Rev. Mol. Cell. Biol. 8:2336). Las tecnologfas de RNAi bicatenario se basan en la administracion o expresion de RNA bicatenario (dsRNA), que una vez dentro de la celula, se une por una enzima llamada dicer y se escinde en 21-23 nucleotidos. El complejo dicer- dsRNA resultante se administra e interactua con un complejo que contiene Argonauta de protemas referido como complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). Se cree que el RISC esta presente en las celulas para descomponer catalfticamente moleculas de mRNA espedficas. El dsRNA una vez unido mediante el RISC, se desenrolla lo que resulta en un complejo ssRNA-RISC, que puede hibridarse con el mRNA objetivo. Una vez que se hibrida, el complejo RISC descompone el mRNA. En algunos casos, los procesos espedficos de dsRNA de dicer se han
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eludido mediante el uso de composiciones de RNAi monocatenario (ssRNAi) que interactuan directamente con el RISC para lograr la inhibicion de la expresion de genes (Holen y otros (2003) Nuc. Acids Res. 31:2401-2407). A pesar que las tecnologfas RNAi son capaces de unirse selectivamente al mRNA objetivo, se ha reconocido ademas, que dichas moleculas inducen estimulacion inmune no espedfica a traves de la interaccion con el TLR3 (Kleinman y otros, (2008) Nature 452:591-597; De Veer et. al. (2005) Immun. Cell Bio. 83:224-228; Kariko y otros (2004) J. Immunol. 172:65456549). Esta activacion inmune no espedfica ha originado dudas sobre la utilidad de las tecnologfas RNAi como agentes farmaceuticos.
A pesar de que cada una de las tecnologfas en base a el antisentido se han usado con cierto exito, como resultado de basarse en oligonucleotidos, cada una de estas tecnologfas tiene el problema inherente de ser inestable in vivo y tener el potencial de producir efectos fuera del objetivo, por ejemplo, la estimulacion inmune no intencionada (Agrawal & Kandimalla (2004) Nature Biotech. 22:1533-1537). En el caso del dsRNA, estos oligonucleotidos parecen tener el problema adicional de la administracion ineficaz in vivo a las celulas (Medarova y otros (2007) NatureMed. 13:372-377). A pesar de los muchos ensayos clmicos de candidatos a farmacos de oligonucleotidos antisentido, solo uno de dichos compuestos ha sido aprobado como farmaco por la FDA. Este compuesto antisentido se aprobo para tratar el CMV, pero nunca se comercializo como producto. Ademas, ninguna ribozima o candidato de farmaco siRNA aun no se ha aprobado por la FDA.
Los enfoques para optimizar cada una de estas tecnologfas se han centrado en abordar la bioestabilidad, el reconocimiento del objetivo (por ejemplo, la permeabilidad celular, la termoestabilidad) y la actividad in vivo. A menudo, estos han representado consideraciones competitivas. Por ejemplo, los oligonucleotidos antisentido tradicionales utilizaron enlaces internucleotfdicos de ester de fosfato, que demostraron ser demasiado inestables biologicamente para ser eficaces. De este modo, hubo un enfoque en la modificacion de los oligonucleotidos antisentido para hacerlos mas estables biologicamente. Los primeros enfoques se centraron en modificar los enlaces internucleotfdicos para hacerlos mas resistentes a la degradacion por nucleasas celulares. Estos enfoques condujeron al desarrollo de oligonucleotidos antisentido que tienen una variedad de enlaces internucleotfdicos no naturales, tales como fosforotioato, metilfosfonato (Sarin y otros (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:7448-7451), y enlaces en base a peptidos. (Matsukura y otros (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84:7706; Agrawal y otros (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:7079-7083; Miller (1991) Bio-Technology 9:358). Sin embargo, estas modificaciones causaron que las moleculas disminuyeran su especificidad objetivo y produjeran actividades biologicas no deseadas.
Enfoques posteriores para mejorar la estabilidad y conservar la especificidad y la actividad biologica utilizo oligonucleotidos de cadena principal mixtos que contienen enlaces internucleotfdicos fosfodiester y fosforotioato. Esta cadena principal mixta dio lugar a oligonucleotidos que conservaron o mejoraron su estabilidad biologica en comparacion con los oligonucleotidos con enlaces fosfodiester solamente (Agrawal y otros (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:1401-1405; Publicacion de la Patente de Estados Unidos num. 20010049436). A lo largo de la investigacion de los oligonucleotidos, se ha reconocido que estas moleculas son susceptibles in vivo a la degradacion por exonucleasas, y que la degradacion primaria se produce a partir del extremo 3' de la molecula (Shaw y otros (1991) Nucleic Acids Res. 19:747-750; Temsamani y otros (1993) Analytical Bioc. 215:54-58). Mientras que, los enfoques para evitar esta actividad exonucleasa han utilizado (i) estructuras de remate en los extremos 5' y/o 3' (Tesamani y otros (1992) Ann. NY Acad. Sci. 660:318-320; Temsamani y otros (1993) Antisense Res. Dev. 3:277-284; Tang y otros (1993) Nucl. Acids Res. 20:2729-2735), (ii) enlaces de dos o mas oligonucleotidos a traves de enlaces 5'-3', 5'-2, 2'-3', 3'-2' o 3'-3' entre las moleculas (Agrawal y otros US6,489,464), (iii) oligonucleotidos auto hibridantes que se doblan sobre sf mismos en el extremo 3', lo que crea una horquilla y elimina el punto de acceso para que comience la actividad 3'-exonucleasa (Tang y otros (1993) Nucl. Acids Res. 20:2729-2735), o (iv)incorporar RNA en la molecula de oligonucleotido, creando de este modo una molecula hfbrida de RNA/DNA (Metelev y otros (1994) Bioorg. Med. Chem. Lett. 4:2929-2934; Metelev US 5,652,355; Metelev & Agrawal US 6,143,881; Metelev & Agrawal US 6,346,614; Metelev & Agrawal US 6,683,167, Metelev & Agrawal US 7,045,609).
Otros enfoques para mejorar la estabilidad y conservar la especificidad y la actividad biologica de los oligonucleotidos antisentido utilizaron la formacion de triplex, oligonucleotidos de polipirimidina que se unen al DNA bicatenario u objetivos de RNA. Los oligonucleotidos de polipirimidina pueden unirse al DNA duplex en la muesca principal a traves de enlaces de hidrogeno de Hoogsteen y forman estructuras triplex que contienen una polipurina y dos cadenas de polipirimidina con tripletes de base T:A-T y C:G-C+ (Moser, H.E. and Dervan, P.B. (1987) Science 238, 645-650; Cooney, et al (1988) Science 241, 456-459). Los triplexes intramoleculares se forman ademas cuando las cadenas de homopurina y homopirimidina del DNA se fusionan y repliegan (Vasqueza, K.M. and Wilson, J. H. (1998) Trends Bioche. Sci. 23, 4-9). La presencia de una tercer cadena introduce severas restricciones en la flexibilidad del DNA, cambiando su capacidad de reconocer protemas espedficas a lo largo de la muesca principal (Shields, G.C., y otros (1997) Am. Chem. Soc., 119, 7463 -7469; Jimenez-Garcia, E., y otros (1998) J. Biol. Chem. 273, 24640-24648, que resulta en una inhibicion de la transcripcion y, al final, la reduccion de la expresion de genes. Los oligonucleotidos que pueden unirse espedficamente a la secuencia al DNA o RNA bicatenario pueden actuar como reguladores transcripcionales/traduccionales y ofrecer una estrategia prometedora de antfgeno/antisentido para controlar la regulacion de la expresion de genes (Giovannangeli, C. and Helene, C. (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 413; Giovannangeli, C., y otros (1996) Biochemistry 35, 10539; Maher, L.J., y otros (1992) Biochemistry 31, 70). Sin embargo, las condiciones para formar triplexes estables son problematicas debido al reconocimiento limitado de las
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bases y las condiciones de pH acido no fisiologicas requeridas para la protonacion de las citosinas en los oligonucleotidos formadores de triplex.
En un intento de formar tales triplexes estables, se han descrito los oligonucleotidos de polipirimidina con polaridad invertida unidos a traves de un conector (es decir, una secuencia que tiene la polaridad 5'^3' seguida de otra secuencia con polaridad 3'^5', o viceversa)(Froehler, US5,399,676; Froehler US5,527,899; Froehler US5,721,218). En dichos oligonucleotidos de polaridad invertida, la secuencia en un lado de la inversion se une a la cadena de polipurina de un duplex de acuerdo con el codigo de helice triple y la secuencia en el otro lado se unira al sitio de polipurina localizado adyacente en la cadena opuesta del duplex (Diagrama 1A). De esta manera, el reconocimiento de la helice triple puede extenderse por cambiar el reconocimiento de una cadena del duplex a la otra y luego de nuevo, si se desea, y ese estiramiento de la secuencia objetivo esta disponible. Ademas, estos oligonucleotidos pueden formar ademas lazos D con el duplex como se muestra en el Diagrama 1B. En esta situacion, la region de la primera polaridad puede formar triplex, aunque la parte invertida desplaza una seccion de una cadena del duplex para dar lugar a un duplex sustituto en la region relevante. Como los oligonucleotidos en sentido contrario son capaces de una actividad de union duplex significativa, estos oligonucleotidos pueden ser utiles para inactivar la enfermedad que causa y el DNA o RNA indeseable que estan en forma duplex. Sin embargo, la composicion de las moleculas esta limitada a las secuencias de polipirimidina dirigidas a los sitios de polipurina del RNA o el DNA bicatenario.
. Ill Enlace de hidrogeno de Watson Crick
_ Cadena de polipurina \ Enlace dehidrogmo de Hoogsteen
■ Cadena de polipirimidina / j / Enlace de hidrogeno de Hoogsteen Reverso
Diagrama 1. Formas deunion de los oligonucleotidos con polaridad invertida formas de Triplex en sentido contrario 'A) y lazos D (B).
Alternativamente, se han desarrollado estrategias para dirigir el DNA y el RNA monocatenario mediante la formacion de la helice triple. Uno de los enfoques es dirigir las cadenas simples de DNA o RNA de polipirimidina con oligonucleotidos formadores de triplex de plegado con polaridad invertida (Kandimalla, E.R., y otros (1995) J. Am. Chem. Soc. 117, 64166417; Kandimalla, E.R., y Agrawal, S. (1996) Biochemistry 35, 15332). En tales oligonucleotidos formadores de triplex de plegado, se une un oligonucleotido de polipirimidina y su cadena de polipurina complementaria a traves de la union 3'-3' o la union 5'-5'. Tales oligonucleotidos que contienen secuencias complementarias unidas a traves de enlaces 3'-3' o 5'-5' forman duplex de cadena paralelas a traves de Hoogsteen o apareamiento de bases Hoogsteen inversa. Cuando una cadena de polipirimidina complementaria esta disponible, forman estructuras helicoidales triples (Diagrama 2).
mmmm
:kk
-'bl.V*J-
I I I Enlace de hidrogeno de Watson Crick
Cadena de poll pun na.
\ Enlace de hidrogeno de Hoogsteen
Cadena de poupinnu dina
*f* Enlace de hidrogeno de Hoogsteen Reverso
Diagrama 2. Formas de ho rq nil las de cadenas paralelas de oligonucleotidos que contienen
cadenas de pur in as y pirnmdinas urn das co valent entente ya sea al extreme 3"-3' o al 5-5
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La patente num. WO 2009/023819 A2 describe los antagonistas de oligonucleotidos del receptor Toll-like 9 (TLR9). La patente num. WO 00/58330 A2 describe los oligonucleotidos pseudodclicos que comprenden un oligonucleotido funcional y un oligonucleotido protector que es complementary al extremo terminal 3'- o 5'- del oligonucleotido funcional.
A pesar de los esfuerzos considerables, los esfuerzos para mejorar la estabilidad y conservar el reconocimiento del objetivo, sin efectos fuera del objetivo, no han producido generalmente oligonucleotidos que pudieran evidenciar la utilidad clmica. De este modo, las tecnologfas en base al antisentido existentes dejan abierto el desaffo de crear compuestos que sean estables biologicamente, espedficos para el objetivo y eficaces inhibidores de la expresion de genes. Por lo tanto, se necesitan nuevos enfoques.
Breve resumen de la invencion
El alcance de la presente invencion se define en las reivindicaciones anexas. Se describen ademas los compuestos, las composiciones y los metodos utiles para modular la expresion de genes mediante el uso de compuestos basados en oligonucleotidos que comprenden dos o mas oligonucleotidos antisentido monocatenarios que estan unidos a traves de sus extremos 5' para permitir la presencia de dos o mas extremos 3' accesibles, que efectivamente inhiben o disminuyen la expresion de genes. Sorprendentemente, los presentes inventores han descubierto que dichos compuestos de oligonucleotidos son mas eficaces que los oligonucleotidos antisentido no unidos.
Se describen, en un primer aspecto, compuestos basados en oligonucleotidos sinteticos nuevos que comprenden dos o mas oligonucleotidos que son complementarios a una o mas secuencias de mRNA, en donde los oligonucleotidos estan unidos a traves de sus extremos 5' para permitir la presencia de dos o mas extremos 3' accesibles e hibridan espedficamente para inhibir la expresion de una o mas secuencias de mRNA.
Se describen ademas, en un segundo aspecto, composiciones farmaceuticas. Estas composiciones pueden comprender cualquier compuesto basado en oligonucleotidos sinteticos de acuerdo con el primer aspecto en un portador farmaceutica o fisiologicamente aceptable.
Se describe ademas, en un tercer aspecto, un metodo para inhibir la expresion de genes, el metodo que comprende poner en contacto una celula con un compuesto basado en oligonucleotidos sintetico de acuerdo con el primer aspecto.
Se describe ademas, en un cuarto aspecto, un metodo para inhibir la expresion de genes en un mairnfero, el metodo que comprende administrar al mamffero un compuesto en base oligonucleotidos sintetico de acuerdo con el primer aspecto.
Se describe ademas, en un quinto aspecto, un metodo para inhibir una respuesta mediada por el TLR, mediada por Bcl- 2, mediada por EGFR, mediada por mdm2, mediada por MyD88, mediada por PCSK9, mediada por survivina o mediada por VEGF en un mamffero a traves de la administracion de un compuesto basado en oligonucleotidos sinteticos de acuerdo con el primer aspecto, en donde, los oligonucleotidos son complementarios a una o mas secuencias de ARNm de TLR, Bcl-2, EGFR, mdm2, MyD88, PCSK9, survivina o VEGF.
Se describe ademas, en un sexto aspecto, un metodo para inhibir la respuesta mediada por el TLR, mediada por Bcl-2, mediada por EGFR, mediada por mdm2, mediada por MyD88, mediada por PCSK9, mediada por survivina o mediada por VEGF en un mamffero aunque la administracion de un compuesto basado en oligonucleotidos sinteticos de acuerdo con el primer aspecto, en donde, los oligonucleotidos son complementarios a una o mas secuencias de mRNA de TLR, Bcl-2, EGFR, mdm2, MyD88, PCSK9, survivina o VEGF en combinacion con un antagonista de la actividad de la protema del TLR, EGFR, mdm2, MyD88, PCSK9, survivina o VEGF.
Se describen ademas, en un septimo aspecto, los metodos para inhibir la expresion de genes en un mam^era, tales metodos que comprenden administrar al mamffero un compuesto basado en oligonucleotidos descrito en la presente. En algunas modalidades, el mamffero es un humano. En algunas modalidades preferidas, el compuesto basado en oligonucleotidos se administra a un mamffero que necesita inhibir su respuesta inmune.
Se describen ademas, en un octavo aspecto, los metodos para tratar terapeuticamente a un paciente que tiene una enfermedad o trastorno, tales metodos comprenden, administrar al paciente un compuesto basado en oligonucleotidos descrito en la presente, en una cantidad eficaz terapeuticamente. En diferentes modalidades, la enfermedad o el trastorno a tratar es el cancer, un trastorno autoinmune, enfermedad infecciosa, inflamacion de las vfas respiratorias, trastornos inflamatorios, trastorno de la piel, alergia, asma o una enfermedad causada por un patogeno. Los patogenos incluyen, sin limitarse a, bacterias, parasitos, hongos, virus, viroides y priones.
Se describen ademas, en un noveno aspecto, los metodos para prevenir una enfermedad o trastorno, tales metodos comprenden, administrar a un sujeto en riesgo de desarrollar la enfermedad o el trastorno un compuesto basado en oligonucleotido descrito en la presente en una cantidad efectiva farmaceuticamente. En diferentes modalidades, la enfermedad o el trastorno que se previene es el cancer, un trastorno autoinmune, inflamacion de las vfas respiratorias,
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trastornos inflamatorios, enfermedad infecciosa, alergia, asma o una enfermedad causada por un patogeno. Los patogenos incluyen, sin limitarse a, bacterias, parasitos, hongos, virus, viroides y priones.
Se describe ademas, en un decimo aspecto, un metodo para prevenir o tratar un trastorno, tal metodo comprende aislar las celulas capaces de producir citocinas o quimiocinas que incluyen, pero no se limitan a, celulas inmunes, celulas T reguladoras, celulas B, PBMCs, pDCs y celulas linfoides; cultivar tales celulas en condiciones de cultivo celular estandar, tratar dichas celulas ex vivo con un compuesto basado en oligonucleotidos de acuerdo con el primer aspecto, tal que las celulas aisladas produzcan o secreten niveles disminuidos de citoquinas o quimiocinas y administrar o readministrar las celulas tratadas a un paciente que necesita terapia para inhibir citocinas y/o quimiocinas para la prevencion y/o el tratamiento de la enfermedad. Este aspecto estana de acuerdo con las tecnicas de inmunoterapia celular adoptiva estandar para producir celulas inmunes activadas.
Se describe ademas, en un undecimo aspecto, una composicion que comprende un compuesto de acuerdo con el primer aspecto y una o mas vacunas, antigenos, anticuerpos, agentes citotoxicos, agentes quimioterapeuticos (tanto quimioterapia tradicional como terapias dirigidas modernas), inhibidores de quinasas, alergenos, antibioticos, agonistas, antagonistas, oligonucleotidos antisentido, ribozimas, moleculas de RNAi, moleculas de siRNA, moleculas de miRNA, aptameros, protemas, vectores de terapia de genes, vacunas de DNA, adyuvantes, moleculas coestimuladoras o las combinaciones de estos.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1A es un esquema sintetico para la smtesis lineal de oligonucleotidos antisentido de la invencion. DMTr = 4,4'- dimetoxitritilo; CE = cianoetilo.
La figura 1B es un esquema sintetico para la smtesis paralela de oligonucleotidos antisentido de la invencion. DMTr = 4,4'-dimetoxitritilo; CE = cianoetilo.
Las Figuras 2A y 2B representan la actividad antisentido de los oligonucleotidos antisentido ejemplares de acuerdo con la invencion en celulas HEK293 que expresan el TLR9 murino. Los datos demuestran la capacidad de los oligonucleotidos antisentido, de acuerdo con la invencion, para inhibir la actividad agonista del TLR9 en celulas cultivadas y tratadas de acuerdo con el Ejemplo 2.
La Figura 2C representa la actividad antisentido de los oligonucleotidos antisentido ejemplares de acuerdo con la invencion, en celulas HEK293 que expresan el TLR7 murino. Los datos demuestran la capacidad de los oligonucleotidos antisentido, de acuerdo con la invencion, para inhibir la actividad agonista del TLR7 en celulas cultivadas y tratadas de acuerdo con el Ejemplo 2.
La Figura 2D representa la actividad antisentido de los oligonucleotidos antisentido ejemplares de acuerdo con la invencion, en celulas HEK293 que expresan MyD88 murino. Los datos demuestran la capacidad de los oligonucleotidos antisentido de acuerdo con la invencion, para inhibir la actividad agonista de MyD88 en celulas cultivadas y tratadas de acuerdo con el Ejemplo 2.
La Figura 3 representa la actividad antisentido de los oligonucleotidos antisentido ejemplares de acuerdo con la invencion en esplenocitos de raton. Los datos demuestran la capacidad de los oligonucleotidos antisentido de acuerdo con la invencion, para inhibir la traduccion del mRNA del TLR9, o la smtesis de protemas, en esplenocitos tratados de acuerdo con el Ejemplo 2.
La Figura 4 representa la actividad antisentido de oligonucleotidos antisentido ejemplares de acuerdo con la invencion en PBMCs humanas. Los datos demuestran la capacidad de los oligonucleotidos antisentido de acuerdo con la invencion, para inhibir la traduccion del mRNA del tLR9, o la smtesis de protemas, en PBMCs humanas tratadas de acuerdo con el Ejemplo 2.
Las Figuras 5A y 5B representan la actividad de los oligonucleotidos antisentido ejemplares de acuerdo con la invencion, para inhibir la IL12 inducida por el TLR9 despues de la administracion in vivo de acuerdo con el Ejemplo 3. Los datos demuestran que la administracion de un oligonucleotido antisentido del TLR9 ejemplar de acuerdo con la invencion, puede provocar una regulacion negativa de la expresion del TLR9 in vivo e impedir la induccion de la IL12 por un agonista del TLR9. Generalmente, los datos demuestran la capacidad de un oligonucleotido antisentido del TLR9 de acuerdo con la invencion, para inhibir la induccion de citocinas proinflamatorias por un agonista del TLR9.
La Figura 5C describe la duracion de la actividad in vivo de los oligonucleotidos antisentido ejemplares de acuerdo con la invencion, para inhibir la IL12 inducida por MyD88 despues de la administracion in vivo de acuerdo con el Ejemplo 3. Los datos demuestran que la administracion de un oligonucleotido antisentido MyD88 ejemplar de acuerdo con la invencion, puede provocar una regulacion negativa de la expresion de MyD88 in vivo e impedir la induccion de la IL12 por un agonista del TLR9 durante una duracion mas larga ya sean los oligonucleotidos antisentido lineales u oligonucleotidos antisentido unidos 3'-3'. Generalmente, los datos demuestran la capacidad de un oligonucleotido
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antisentido MyD88 de acuerdo con la invencion, para inhibir la induccion de citocinas proinflamatorias por un agonista del TLR.
La Figura 6 representa la actividad de los oligonucleotidos antisentido ejemplares de acuerdo con la invencion, para inhibir la IL12 inducida por el TLR9 de una manera dependiente de la dosis despues de la administracion in vivo de acuerdo con el Ejemplo 3. Los datos demuestran que la administracion in vivo de un oligonucleotido antisentido del TLR9 de acuerdo con la invencion, puede provocar una regulacion negativa de la expresion del TLR9 in vivo de una manera dependiente de la dosis y prevenir la induccion de la IL12 por un agonista del TLR9. Generalmente, los datos demuestran la capacidad de un oligonucleotido antisentido del TLR9 de acuerdo con la invencion, para inhibir selectivamente la induccion de citocinas proinflamatorias por un agonista del TLR9.
La Figura 7 representa la actividad de oligonucleotidos antisentido ejemplares de acuerdo con la invencion, para inhibir la IL12 inducida por el TLR9 de una manera dependiente del tiempo despues de la administracion in vivo de acuerdo con el Ejemplo 3. Los datos demuestran que la administracion in vivo de un oligonucleotido antisentido del TLR9 de acuerdo con la invencion, puede provocar una regulacion negativa de la expresion del TLR9 in vivo de una manera dependiente del tiempo y prevenir la induccion de la IL12 por un agonista del TLR9 durante un penodo de tiempo prolongado. Generalmente, los datos demuestran la capacidad de un oligonucleotido antisentido del TLR9 de acuerdo con la invencion, para inhibir la induccion de citocinas proinflamatorias por un agonista del TLR9 de una manera dependiente del tiempo.
Las Figuras 8A, 8B, 8C representan la actividad antisentido de los oligonucleotidos antisentido ejemplares de acuerdo con la invencion, en celulas J774 murinas. Los datos demuestran la capacidad de los oligonucleotidos antisentido de acuerdo con la invencion, para inhibir el mRNA del TLR9, la transcripcion, la traduccion o la smtesis de protemas, en las celulas murinas J774 tratadas de acuerdo con el Ejemplo 2.
La Figura 8D representa la actividad antisentido de los oligonucleotidos antisentido ejemplares de acuerdo con la invencion, en celulas HeLa humanas. Los datos demuestran la capacidad de los oligonucleotidos antisentido de acuerdo con la invencion, para inhibir la transcripcion del mRNA de VEGF en celulas HeLa humanas tratadas de acuerdo con el Ejemplo 2.
La Figura 9 representa la actividad antisentido de los oligonucleotidos antisentido ejemplares de acuerdo con la invencion, en celulas B humanas. Los datos demuestran la capacidad de los oligonucleotidos antisentido de acuerdo con la invencion, para inhibir la traduccion del mRNA del TLR9 o la smtesis de protemas en celulas B humanas tratadas de acuerdo con el Ejemplo 2.
La Figura 10 representa la actividad antisentido de los oligonucleotidos antisentido ejemplares de acuerdo con la invencion, en pDCs humanos. Los datos demuestran capacidad de los oligonucleotidos antisentido de acuerdo con la invencion, para inhibir la traduccion del mRNA del TLR9, o la smtesis de protemas, en pDCs humanos tratados de acuerdo con el Ejemplo 2.
La Figura 11 representa la actividad de los oligonucleotidos antisentido ejemplares de acuerdo con la invencion, para inhibir la IL12 inducida por el TLR9 despues de la administracion in vivo de acuerdo con el Ejemplo 3. Los datos demuestran que la administracion in vivo de un oligonucleotido antisentido del TLR9 ejemplar de acuerdo con la invencion, puede provocar una regulacion negativa de la expresion del TLR9 in vivo e impedir la induccion de la IL12 por un agonista del TLR9. Generalmente, los datos demuestran la capacidad de un oligonucleotido antisentido del TLR9 de acuerdo con la invencion, para inhibir la induccion de citocinas proinflamatorias por un agonista del TLR9.
La Figura 12 representa la actividad antisentido de los oligonucleotidos antisentido ejemplares de acuerdo con la invencion, en celulas HEK293 que expresan el TLR7 de raton. Los datos demuestran la capacidad de los oligonucleotidos antisentido, de acuerdo con la invencion, para inhibir la actividad agonista del TLR7 en celulas cultivadas y tratadas de acuerdo con el Ejemplo 2.
La Figura 13 representa la union selectiva y la escision de oligonucleotidos antisentido ejemplares de acuerdo con la invencion tratados de acuerdo con el Ejemplo 4. En la Figura 13, el Carril 1 es el sustrato solo; el Carril 2 es la nucleasa T1; el carril 3 es 5'-AAUGCUUgUcUGUGCAGUCC-3' (sec. con num. de ident. 28); el Carril 4 es 5'- AAUGCUUGUCUGUGCAGUCC-X-CCUGACGUGUCUGUUCGUAA-5'; el Carril 5 es 3'-
CCUGACGUGUCUGUUCGUAA-X-AAUGCUUGUCUGUGCAGUCC-3' (sec. con num. de ident. 21); el Carril 6 es 5'-
AAUGCUUGUCUGUGCAGUCC-AAUGCUUGUCUGUGCAGUCC-3'; el Carril 7 es 5'-
CUGUCoAoAoAoUoGoCoUoUoGoUoCoUoGoUoGoCoAoGoUoCoCoACGAU-3' (sec. con num. de ident. 29);el Carril 8 es dsRNA; y el Carril 9 es DNA antisentido de 20 mer; en donde, todas las secuencias tienen cadena de fosforotioato excepto donde se indica con una "o" (enlace fosfodiester); los nucleotidos subrayados indican 2'-O-metilribonucleotidos. Los datos demuestran que los oligonucleotidos de acuerdo con la invencion, proporcionan una estructura optima para la union y la escision por protemas y enzimas asociadas con la inhibicion mediada por RNAi de la expresion de genes.
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Descripcion detallada de las modalidades preferidas
La invencion se relaciona con el uso terapeutico y profilactico de los oligonucleotidos antisentido nuevos para la regulacion negativa de la expresion de genes. Tales moleculas son utiles, por ejemplo, para proporcionar composiciones para la modulacion de la expresion de genes o para tratar y/o prevenir enfermedades y/o afecciones que sean capaces de responder a la modulacion de la expresion de genes en pacientes, sujetos, animales u organismos.
Las patentes y publicaciones citadas en la presente reflejan el nivel del conocimiento en la tecnica. Cualquier conflicto entre las ensenanzas de estas patentes y las publicaciones y esta especificacion se resolvera a favor de este ultimo.
Los objetos de la presente invencion, las caractensticas diferentes de estos, asf como la invencion en sf misma, pueden entenderse mas completamente a partir de la siguiente descripcion, cuando se leen junto con las figuras adjuntas, en los que los siguientes terminos tienen el significado atribuido.
El termino"2'-O-sustituido" significa la sustitucion de la posicion 2' de la porcion de la pentosa con un grupo alquilo inferior-O- que contiene 1-6 atomos de carbono saturados o insaturados (por ejemplo, pero sin limitarse a, 2'-O-metilo), o con un grupo -O-arilo o alilo que tiene 2-6 atomos de carbono, en donde dicho grupo alquilo, arilo o alilo puede estar no sustituido o puede estar sustituido, (por ejemplo, con grupos 2'-O-metoxietilo, etoxi, metoxi, halo, hidroxilo, trifluorometilo, ciano, nitro, acilo, aciloxi, alcoxi, carboxilo, carbalcoxilo o amino); o con un grupo hidroxilo, amino o halo, pero no con un grupo 2'-H. En algunas modalidades, los oligonucleotidos de la invencion incluyen cuatro o cinco nucleotidos de 2'-O-alquilo en su extremo 5', y/o cuatro o cinco nucleotidos de 2'-O-alquilo en su terminal 3'.
El termino "3'", cuando se usa direccionalmente, se refiere generalmente a una region o posicion en un polinucleotido u oligonucleotido 3'(hacia el extremo 3' del nucleotido) desde otra region o posicion en el mismo polinucleotido u oligonucleotido.
El termino "extremo 3' '' se refiere generalmente al terminal 3' de los oligonucleotidos componentes. "Dos o mas oligonucleotidos unidos en sus extremos 3' "se refiere generalmente a un enlace entre los nucleotidos del terminal 3' de los oligonucleotidos que pueden estar directamente a traves de grupos hidroxilo 5', 3' o 2', o indirectamente, a traves de un enlace no nucleotidico. Tales enlaces pueden ser ademas a traves de un nucleosido, utilizando ambas posiciones hidroxilo 2' y 3' del nucleosido. Tales enlaces pueden utilizar ademas un azucar funcionalizado o nucleobase de un nucleotido terminal 3'.
El termino " 5'", cuando se usa direccionalmente, se refiere generalmente a una region o posicion en un polinucleotido u oligonucleotido 5'(hacia el extremo 5' del nucleotido) desde otra region o posicion en el mismo polinucleotido u oligonucleotido.
El termino "extremo 5'" se refiere generalmente al nucleotido terminal 5' de los oligonucleotidos componentes. "Dos o mas oligonucleotidos antisentido monocatenarios unidos en sus extremos 5' " se refieren generalmente a un enlace entre los nucleotidos terminales 5' de los oligonucleotidos que pueden estar directamente a traves de grupos hidroxilo 5', 3' o 2', o indirectamente, a traves de un conector no nucleotidico. Tales enlaces pueden ser ademas a traves de un nucleosido, utilizando ambas posiciones hidroxilo 2' y 3' del nucleosido. Tales enlaces pueden utilizar ademas un azucar funcionalizado o nucleobase de un nucleotido terminal 5'.
El termino "aproximadamente" significa generalmente que el numero exacto no es cntico. De este modo, los oligonucleotidos que tienen uno o dos residuos de nucleosidos menos, o de uno a varios residuos de nucleosidos adicionales se contemplan como equivalentes de cada una de las modalidades descritas anteriormente.
El termino "accesible" significa generalmente cuando se relaciona con un compuesto de acuerdo con la invencion, que la parte relevante de la molecula puede reconocerse por los componentes celulares necesarios para provocar una respuesta pretendida al compuesto.
} El termino "agonista" se refiere generalmente a una sustancia que se une a un receptor de una celula e induce una respuesta. Un agonista a menudo imita la accion de una sustancia de origen natural, como un ligando.
El termino "antagonista" se refiere generalmente a una sustancia que atenua los efectos de un agonista o ligando.
El termino "inflamacion de las vfas respiratorias" incluye generalmente, sin limitarse a, la inflamacion en el tracto respiratorio causada por alergenos, que incluye el asma.
El termino "alergeno" se refiere generalmente a un antfgeno o porcion antigenica de una molecula, una protema normalmente, que provoca una respuesta alergica tras la exposicion a un sujeto. Tfpicamente, el sujeto es alergico al alergeno, como se indica, por ejemplo, por la prueba de roncha y reflejo o cualquier metodo conocido en la tecnica. Una molecula se dice que es un alergeno, incluso si solo un pequeno subconjunto de sujetos presenta una respuesta inmune alergica (por ejemplo, IgE) tras la exposicion a la molecula.
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El termino "alergia" incluye generalmente, sin limitarse a, alergias a los alimentos, alergias respiratorias y alergias en la piel.
El termino "antigeno" se refiere generalmente a una sustancia que se reconoce y se une selectivamente por un anticuerpo o por un receptor de antigeno de celulas T. Los antigenos pueden incluir, pero no se limitan a, peptidos, protemas, Kpidos, carbohidratos, nucleosidos, nucleotidos, acidos nucleicos y las combinaciones de estos. Los antigenos pueden ser naturales o sinteticos e inducen generalmente una respuesta inmune espedfica para ese antigeno.
El termino "trastorno autoinmune" se refiere generalmente a trastornos en los cuales el antfgeno "auto" se somete a un ataque del sistema inmunitario. Dicho termino incluye, sin limitarse a, lupus eritematoso, esclerosis multiple, diabetes mellitus tipo I, smdrome del intestino irritable, enfermedad de Chron, artritis reumatoide, shock septico, alopecia universal, encefalomielitis diseminada aguda, enfermedad de Addison, espondilitis anquilosante, smdrome de anticuerpos antifosfolfpidos, anemia hemolttica autoinmune, hepatitis autoinmune, penfigoideampolloso, enfermedad de Chagas, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, enfermedad de hidro, dermatomiositis, endometriosis, smdrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, smdrome de Guillain Barre, enfermedad de Hashimoto, hidradenitis supurativa, trombocitopenia purpura idiopatica, cistitis intersticial, morfea, miastenia gravis, narcolepsia, neuromiotoma, penfigo, anemia perniciosa, polimiositis, cirrosis biliar primaria, esquizofrenia, smdrome de Sjogren, arteritis temporal ("arteritis de celulas gigantes"), vasculitis, vitiligo, vulvodinia y granulomatosis de Wegener, asma autoinmune, shock septico y psoriasis.
El termino "inestabilidad biologica" se refiere generalmente a la capacidad de una molecula para degradarse y subsiguientemente inactivarse in vivo. Para los oligonucleotidos, dicha degradacion resulta de la actividad de la exonucleasa y/o de la actividad de la endonucleasa, en donde la actividad de la exonucleasa se refiere a la escision de nucleotidos del extremo 3' o 5' de un oligonucleotido, y la actividad de la endonucleasa se refiere a la escision de los enlaces fosfodiester en posiciones distintas a los extremos del oligonucleotido.
El termino "cancer" se refiere generalmente, sin limitarse a, cualquier crecimiento o tumor maligno causado por la proliferacion y/o la division celular anormal o no controlada. El cancer puede aparecer en humanos y/o marnfferos y pueden surgir en todos y cada uno de los tejidos. El tratamiento de un paciente que tiene cancer puede incluir la administracion de un compuesto, la formulacion farmaceutica o vacuna de acuerdo con la invencion, de manera que se afecta la proliferacion y/o la division celular anormal o no controlada, o la metastasis.
El termino "portador" incluye generalmente cualquier excipiente, diluyente, carga, sal, tampon, estabilizante, solubilizante, aceite, lfpido, vesmula que contiene lfpidos, microesferas, encapsulacion liposomal u otro material para usarse en formulaciones farmaceuticas. Se entendera que las caractensticas del portador, excipiente o diluyente dependeran de la via de administracion para una aplicacion particular. La preparacion de formulaciones aceptables farmaceuticamente que contienen estos materiales se describe, por ejemplo, en Remington'sPharmaceuticalSciences, 18va Edicion, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990.
El termino "coadministracion" o "coadministrado" se refiere generalmente a la administracion de al menos dos sustancias diferentes suficientemente cercanas en el tiempo para modular una respuesta inmune. La coadministracion se refiere a la administracion simultanea, asf como a un orden temporal espaciado de hasta varios dfas de diferencia, de al menos dos sustancias diferentes en cualquier orden, ya sea en una dosis unica o en dosis separadas.
El termino "en combinacion con" significa generalmente administrar una composicion en base a oligonucleotidos de acuerdo con la invencion y otro agente util para tratar la enfermedad o condicion que no elimina la actividad del compuesto en el curso del tratamiento de un paciente. Dicha administracion puede realizarse en cualquier orden, que incluye la administracion simultanea, asf como ordenada por espacio temporalmente de algunos segundos hasta varios dfas de diferencia. Tal tratamiento de combinacion puede incluir ademas mas de una sola administracion del compuesto de acuerdo con la invencion y/o independientemente del otro agente. La administracion del compuesto de acuerdo con la invencion y el otro agente puede ser por la misma o por diferentes vfas.
El termino "individuo" o "sujeto" o "paciente" se refiere generalmente a un marnffero, como un humano.
El termino "inhibidor de la quinasa" se refiere generalmente a moleculas que antagonizan o inhiben la senalizacion celular dependiente de la fosforilacion y/o las vfas de crecimiento en una celula. Los inhibidores de la quinasa pueden ser de origen natural o sinteticos e incluyen moleculas pequenas que tienen el potencial de administrarse como terapeuticos orales. Los inhibidores de la quinasa tienen la capacidad de inhibir rapida y espedficamente la activacion de las moleculas de la quinasa objetivo. Las protemas quinasas son objetivos de farmacos atractivos, en parte porque regulan una amplia variedad de vfas de senalizacion y el crecimiento e incluyen muchas protemas diferentes. Mientras que, tienen un gran potencial en el tratamiento de enfermedades que implican la senalizacion de la quinasa, que incluyen el cancer, enfermedades cardiovasculares, trastornos inflamatorios, diabetes, degeneracion macular y trastornos neurologicos. Un ejemplo no limitante de un inhibidor de la quinasa es el sorafenib.
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El termino "sfntesis lineal" se refiere generalmente a una sfntesis que comienza en un extremo de un oligonucleotido y progresa linealmente hacia el otro extremo. La sfntesis lineal permite la incorporacion de unidades monomericas identicas o no identicas (en terminos de longitud, composicion base y/o modificaciones qufmicas incorporadas) en un oligonucleotido.
El termino "mamffero" esta expresamente destinado a incluir animales vertebrados de sangre caliente, que incluyen, sin limitarse a, humanos, primates no humanos, ratas, ratones, gatos, perros, caballos, ganado vacuno, cerdos, ovejas y conejos.
El termino "nucleosido" se refiere generalmente a compuestos que consisten en un azucar, generalmente ribosa, desoxirribosa, pentosa, arabinosa o hexosa, y una base de purina o pirimidina.
El termino "nucleotido" se refiere generalmente a un nucleosido que comprende un grupo que contiene fosforo unido al azucar.
El termino "nucleosido modificado" o "derivado de nucleotido" generalmente es un nucleosido que incluye una base heterocfclica modificada, una porcion del azucar modificado o cualquier combinacion de estos. En algunas modalidades, el nucleosido modificado o el derivado de nucleotido es un nucleosido de pirimidina o purina no natural, como se describe en la presente. A los fines de la invencion, puede usarse indistintamente el nucleosido modificado o el derivado de nucleotido, un analogo de pirimidina o purina o pirimidina o purina que no se produce naturalmente y se refiere a un nucleosido que incluye una base que no se produce naturalmente y/o una porcion de azucar que no se produce naturalmente. A los fines de la invencion, una base se considera que no es natural si no es guanina, citosina, adenina, timina o uracilo y un azucar se considera no natural si no es p-ribo-furanosido o 2'-deoxiribo-furanosido.
El termino "oligonucleotido modificado", como se utiliza en la presente descripcion, describe un oligonucleotido en el que al menos dos de sus nucleotidos estan unidos covalentemente a traves de un enlace sintetico, es decir, un enlace distinto de un enlace fosfodiester entre el extremo 5' de un nucleotido y el extremo 3' de otro nucleotido en el que el fosfato del nucleotido 5' se ha reemplazado con cualquier cantidad de grupos qufmicos. El termino "oligonucleotido modificado" incluye ademas acidos nucleicos 2'-O, 4'-C-metileno-b-D-ribofuranosilo, acidos nucleicos de arabinosa, acidos nucleicos de arabinosa sustituidos, acidos nucleicos de hexosa, acidos nucleicos peptfdicos, morfolino y oligonucleotidos que tienen al menos un nucleotido con una base y/o azucar modificada, tal como un 2'-O-sustituido, una 5-metilcitosina y/o un ribonucleotido 3'-O-sustituido.
El termino "acido nucleico" incluye una region genomica o una molecula de RNA transcrita a partir de ella. En algunas modalidades, el acido nucleico es mRNA.
El termino "conector" se refiere generalmente a cualquier porcion que puede unirse a un oligonucleotido por medio de un enlace covalente o no covalente a traves de un azucar, una base o la cadena principal. El enlace no covalente puede ser, sin limitarse a, interacciones electrostaticas, interacciones hidrofobicas, interacciones de apilamiento n, enlaces de hidrogeno y las combinaciones de estos. Los ejemplos no limitantes de este enlace no covalente incluyen el apareamiento de bases Watson Crick, el apareamiento de bases Hoogsteen y el apilamiento de bases. El conector puede usarse para unir dos o mas nucleosidos o puede unirse al nucleotido terminal 5' y/o 3' en el oligonucleotido. Dicho conector puede ser un conector no nucleotfdico o un conector nucleosido.
El termino "conector no nucleotfdico" se refiere generalmente a una porcion qufmica, que no es un enlace directamente entre dos nucleotidos que pueden unirse a un oligonucleotido mediante enlace covalente o no covalente. Preferentemente, dicho conector no nucleotido es de aproximadamente 2 angstroms a aproximadamente 200 angstroms de longitud, y puede estar en una orientacion cis o trans.
El termino "enlace internucleotfdico" se refiere generalmente a un enlace qufmico para unir dos nucleosidos a traves de sus azucares (por ejemplo, 3'-3', 2'-3', 2'-5', 3'-5', 5'-5') que consiste en un atomo de fosforo y un grupo cargado o neutral (por ejemplo, fosfodiester, fosforotioato, fosforoditioato o metilfosfonato) entre nucleosidos adyacentes.
El termino "oligonucleotido" se refiere a un polinucleosido formado a partir de una pluralidad de unidades nucleosidas unidas, que pueden incluir, por ejemplo, desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos, nucleotidos sinteticos o naturales, fosfodiester o enlaces modificados, bases naturales o bases modificadas, azucares naturales o azucares modificados, o las combinaciones de estos componentes. Las unidades nucleosidas pueden ser parte de virus, bacterias, restos celulares ocomposiciones en base a oligonucleotidos (por ejemplo, siRNA y microRNA). Tales oligonucleotidos pueden obtenerse ademas a partir de fuentes de acido nucleico existentes, que incluyen la genomica o cDNA, pero se producen preferentemente mediante metodos sinteticos. En ciertas modalidades, cada unidad de nucleosido incluye una base heterocfclica y una pentofuranosilo, trehalosa, arabinosa, nucleosido sustituido 2'-desoxi-2', arabinosa sustituida 2'- desoxi-2', arabinosa sustituida 2'-O o un grupo de azucar hexosa. Los residuos de nucleosido pueden acoplarse entre sf mediante cualquiera de los numerosos enlaces internucleosfdicos conocidos. Tales enlaces de internucleosidos incluyen, sin limitarse a, fosfodiester, fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, alquilfosfonato, alquilfosfonotioato, fosfotriester, fosforamidato, siloxano, carbonato, carboalcoxi, acetamidato, carbamato, morfolino, borano, tioeter,
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fosforamidato de union, metilenfosfonato de union, fosforotioato de union y enlaces internucleosidos de sulfona. El termino "oligonucleotido" incluye ademas polinucleosidos que tienen uno o mas enlaces intemucleosfdicosestereo espedficos (por ejemplo, enlaces (Rp)- o(Sp)- fosforotioato, alquilfosfonato o fosfotriester). Como se utiliza en la presente descripcion, los terminos "oligonucleotido" y "dinucleotido" estan expresamente destinados a incluir polinucleosidos y dinucleosidos que tienen cualquier enlace internucleosido, que comprenden o no un grupo fosfato. En ciertas modalidades ejemplares, estos enlaces internucleosidos pueden ser enlaces fosfodiester, fosforotioato o fosforoditioato, o las combinaciones de estos. En modalidades ejemplares, los nucleotidos de los oligonucleotidos sinteticos estan unidos por al menos un enlace internucleotfdico fosforotioato. Los enlaces fosforotioato pueden ser enantiomeros Rp y Sp mixtos, o pueden ser estereo regulares o estereo regulares sustancialmente en cualquiera de las formas Rp o Sp (ver, Iyer y otros (1995) TetrahedronAsymmetry 6:1051-1054). En ciertas modalidades, uno o mas de los oligonucleotidos dentro de las composiciones antisentido de la invencion, contienen uno o mas acidos nucleicos 2'- 0,4'-C-metileno-b-D -ribofuranosilo, en donde, la ribosa se modifica con un enlace entre los carbonos 2' y 4', que fija la ribosa en la conformacion estructural 3'-endo.
La frase "un oligonucleotido que es complementario a una secuencia de RNA monocatenario" y similares, significan que el oligonucleotido forma un numero suficiente de enlaces de hidrogeno a traves de las interacciones de Watson Crick de sus nucleobases con nucleobases de la secuencia de RNA monocatenario para formar una doble helice con la secuencia de RNA monocatenario bajo condiciones fisiologicas. Esto esta en contraste con los oligonucleotidos que forman una triple helice con un DNA o RNA bicatenario a traves del enlace de hidrogeno Hoogsteen.
El termino "complementario" pretende significar un oligonucleotido que se une a la secuencia de acido nucleico bajo condiciones fisiologicas, por ejemplo, mediante el apareamiento de bases de Watson Crick (interaccion entre el oligonucleotido y el acido nucleico monocatenario) o mediante el apareamiento de bases de Hoogsteen (interaccion entre el oligonucleotido y el acido nucleico bicatenario) o por cualquier otro medio, que incluye en el caso de un oligonucleotido, la union al RNA y causa la formacion de pseudoknot. La union por Watson Crick o el apareamiento de bases de Hoogsteen bajo condiciones fisiologicas se mide como una cuestion practica observando la interferencia con la funcion de la secuencia de acido nucleico.
El termino "peptido" se refiere generalmente a oligomeros o polfmeros de aminoacidos que son de longitud y composicion suficientes para afectar a una respuesta biologica, por ejemplo, la produccion de anticuerpos o la actividad de citocinas, ya sea o no el peptido un hapteno. El termino "peptido" puede incluir aminoacidos modificados (ya sean o no de origen natural), donde dichas modificaciones incluyen, pero no se limitan a, fosforilacion, glicosilacion, pegilacion, lipidizacion y metilacion.
El termino "farmaceuticamente aceptable" significa un material no toxico que no interfiere con la eficacia de un compuesto de acuerdo con la invencion o la actividad biologica de un compuesto de acuerdo con la invencion.
El termino "fisiologicamente aceptable" se refiere a un material no toxico que es compatible con un sistema biologico tal como una celula, cultivo celular, tejido u organismo. Preferentemente, el sistema biologico es un organismo vivo, tal como un marnffero, particularmente un ser humano.
El termino "cantidad efectiva profilacticamente" se refiere generalmente a una cantidad suficiente para prevenir o reducir el desarrollo de un efecto biologico no deseado.
El termino "cantidad efectiva terapeuticamente" o "cantidad efectiva farmaceuticamente" se refiere generalmente a una cantidad suficiente para afectar el efecto biologico deseado, tal como un resultado beneficioso, que incluye, sin limitarse a, la prevencion, disminucion, mejora o eliminacion de los signos o smtomas de una enfermedad o trastorno. De este modo, la cantidad total de cada componente activo de la composicion o metodo farmaceutico es suficiente para mostrar un beneficio significativo para el paciente, por ejemplo, pero sin limitarse a, la curacion de condiciones cronicas caracterizadas por la estimulacion inmune. De este modo, una "cantidad efectiva farmaceuticamente " dependera del contexto en el que se administre. Una cantidad efectiva farmaceuticamente puede administrarse en una o mas administraciones profilacticas o terapeuticas. Cuando se aplica a un ingrediente activo individual, administrado solo, el termino se refiere a ese ingrediente solo. Cuando se aplica a una combinacion, el termino se refiere a las cantidades combinadas de los ingredientes activos que resultan en el efecto terapeutico, ya sea administrado en combinacion, en serie o simultaneamente.
El termino "tratamiento" se refiere generalmente a un enfoque destinado a obtener un resultado beneficioso o deseado, que puede incluir aliviar los smtomas o retrasar o mejorar la progresion de la enfermedad.
El termino "expresion de genes" se refiere generalmente al proceso mediante el cual se usa la informacion de un gen en la smtesis de un producto genico funcional, que puede ser una protema. El proceso puede implicar la transcripcion, el empalme del RNA, la traduccion y la modificacion postraduccional de una protema, y puede incluir mRNA, preRNA, RNA ribosomal y otros moldes para la smtesis de protemas.
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En un primer aspecto, la invencion proporciona compuestos basados en oligonucleotidos nuevos que comprenden dos oligonucleotidos antisentido monocatenarios unidos en sus extremos 5', en donde los compuestos tienen dos extremos 3' accesibles. El enlace en los extremos 5' de los oligonucleotidos componentes es independiente de los otros enlaces oligonucleotfdicos y puede estar directamente a traves de grupos hidroxilo 5', 3' o 2', o indirectamente, a traves de un conector no nucleotidico o un nucleosido, utilizando cualquiera las posiciones hidroxilo 2 'o 3' del nucleosido. Los enlaces pueden utilizar ademas un azucar funcionalizado o nucleobase de un nucleotido terminal 5'.
Los compuestos basados en oligonucleotidos de acuerdo con la invencion, comprenden dos secuencias identicas o diferentes conjugadas en sus extremos 5'-5' a traves de un conector fosfodiester, fosforotioato o no nucleosido (Diagrama 3). Dichos compuestos comprenden de 15 a 27 nucleotidos que son complementarios a porciones espedficas de objetivos de mRNA de interes para la regulacion negativa antisentido del producto genico. Los compuestos basados en oligonucleotidos de acuerdo con la invencion que comprenden secuencias identicas son capaces de unirse a un mRNA espedfico mediante interacciones de enlace de hidrogeno de Watson Crick e inhibir la expresion de la protema (Diagrama 3). Los compuestos basados en oligonucleotidos de acuerdo con la invencion que comprenden diferentes secuencias son capaces de unirse a dos o mas regiones diferentes de uno o mas objetivos de mRNA e inhibir la expresion de la protema. Tales compuestos se componen de secuencias de heteronucleotidos complementarias al mRNA objetivo y forman estructuras duplex estables a traves de enlaces de hidrogeno de Watson Crick. Sorprendentemente, dichas secuencias que contienen dos extremos 3' libres (antisentido unido a los 5'-5') son inhibidores de la expresion de genes mas potentes que aquellos que contienen un solo extremo 3' libre o un extremo 3' no libre.
Los compuestos basados en oligonucleotidos de acuerdo con la invencion, son utiles en el tratamiento y/o la prevencion de enfermedades, en donde, la inhibicion de una expresion de genes sena beneficiosa. Los compuestos basados en oligonucleotidos de acuerdo con la invencion incluyen, pero no se limitan a, oligonucleotidos antisentido que comprenden nucleotidos de origen natural, nucleotidos modificados, oligonucleotidos modificados y/o oligonucleotidos modificados de cadena principal. Sin embargo, los oligonucleotidos antisentido que inhiben la traduccion de protemas codificadas por mRNA pueden producir efectos biologicos indeseados, que incluyen pero no se limitan a, la actividad antisentido insuficiente, biodisponibilidad inadecuada, farmacocinetica o farmacodinamica suboptima, estimulacion inmune no intencionada, actividad fuera del objetivo e inestabilidad biologica. El diseno optimo de un oligonucleotido antisentido de acuerdo con la invencion requiere muchas consideraciones mas alla del diseno simple de una molecula que es complementaria a la secuencia de RNA objetivo. De este modo, la preparacion de oligonucleotidos antisentido de acuerdo con la invencion tiene la intencion de incorporar los cambios necesarios para limitar la interferencia de la estructura secundaria con la actividad antisentido, mejorar la especificidad objetivo del oligonucleotido, minimizar la interaccion con factores de union o competitivos (por ejemplo, protemas), optimizar la absorcion celular, la biodisponibilidad, la farmacocinetica y la farmacodinamica y/o inhibir, prevenir o suprimir la activacion de las celulas inmunes.
La estructura general de los compuestos basados en oligonucleotidos de la invencion puede describirse mediante la siguiente formula.
3'-Nn...N1N2N3N4-5'-L-5'-N8N7N6N5...Nm-3' (Formula I)
En donde, L es un conector de nucleotidos o un conector de no nucleotido; N1-N8, en cada aparicion, es independientemente un nucleotido o un derivado de nucleotido; Nm y Nn, en cada aparicion, es independientemente un nucleotido o un derivado de nucleotido; y en donde, m y n son independientemente numeros de 0 a aproximadamente 40. Los conectores no nucleotfdicos representativos se exponen en la Tabla 1.
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Tabla 1: Conectores No Nucleotidicos Representativos
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HO
OH
cis-1,3,5-Tri(hidroximetil)ciclohexano
1,3-Di(hidroxipropoxi)-2-hidroxilpropano
H
1,3,5,-Trihidroxil-benceno
O OH
OH
2-Desoxi-D-ribosa
3,5,-Di(hidroximetil)fenol
1,3,5,-Tri(hidroximetil)benceno
1,2,
4-Trihidroxil-benceno
D-Galactoal
1,6-anhidro-p-D-Glucosa
4,
6-Nitropirogalol
2
1,3,5-Tris(2-hidroxietil)-Acido cianurico
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Acido galico
3,5,7-Trihidroxiflavona
- Etilenglicol
- 1,5-Pentanodiol
- YY OH OH
- 1,3-Propanodiol
- 2,4-Pentanodiol
OH
1,2-Propanodiol
1,4-Butanodiol
OH
1,6-Hexanodiol
OH
1,2-Hexanodiol
1,3-Butanodiol
OH
1,5-Hexanodiol
OH
2,3-Butanodiol
OH
2,5-Hexanodiol
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- OH
- 1,4-Butanodiol
- ho/'n/'ns/\/\oh
- ho'^N/^'oh ^nh2
- 1,7-Heptanodiol
- 2-(1-Aminopropil)-1,3-propanodiol
- 1,8-Octanodiol
- OH
- HO — OH
- 1,2-Octanodiol
- 1,2-Dideoxirribosa
- 1,9-Nonanodiol
- 1,12-Dodecanodiol
- HO O ^
- Trietilenglicol
- Tetraetilenglicol
- Hexaetilenglicol
En algunas modalidades, el conector de molecula pequena es el glicerol o un homologo del glicerol de la formula HO- (CH2)o-CH(OH)-(CH2)p-OH, en donde, o y p independientemente sonnumeros enteros de 1 a aproximadamente 6, de 1 a aproximadamente 4 o de 1 a aproximadamente 3. En algunas otras modalidades, el conector de molecula pequena es un derivado de 1,3-diamino-2-hidroxipropano. Algunos de esos derivados tienen la formula
HO-(CH2)m-C(O)NH-CH2-CH(OH)-cH2-NHC(O)-(CH2)m-OH, en donde, m es un entero de 0 a aproximadamente 10, de 0 a aproximadamente 6, de 2 a aproximadamente 6 o de 2 a aproximadamente 4.
Se describen ademas conectores no nucleotidos que permiten la union de mas de dos compuestos basados en oligonucleotidos. Por ejemplo, el glicerol conector de molecula pequena tiene tres grupos hidroxilo a los que dichos oligonucleotidos pueden unirse covalentemente. Algunos compuestos basados en oligonucleotidos descritos en la
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presente, por lo tanto, comprenden dos o mas oligonucleotidos unidos a un conector nucleotido o no nucleotido. Tales oligonucleotidos se denominan "ramificados".
Los compuestos basados en oligonucleotidos descritos en la presente, pueden comprender al menos dos oligonucleotidos antisentido unidos con dos o mas extremos 3' libres. Algunas de las formas en las que pueden vincularse dos o mas oligonucleotidos se muestran en la Tabla 2.
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En ciertas modalidades de las Formulas II y/o V, L es un conector o un enlace de nucleotidos y el Dominio A y/o el Dominio B son oligonucleotidos antisentido que se disenan para hibridar selectivamente con la misma secuencia de RNA objetivo o diferentes secuencias de RNA objetivo.
En ciertas modalidades de las Formulas II, III, IV o V, L es un conector y el Dominio A y/o el Dominio B y/o el Dominio C son oligonucleotidos antisentido que se disenan para hibridar selectivamente con la misma secuencia de RNA objetivo o diferentes secuencias de RNA objetivo. Por ejemplo, en una modalidad, el Dominio A y/o el Dominio B y/o el Dominio C de las formulas II y/o III son oligonucleotidos antisentido que estan disenados para hibridar selectivamente con la misma secuencia de RNA objetivo. En esta modalidad, el Dominio A y/o el Dominio B y/o el Dominio C pueden disenarse para hibridar con la misma region en la secuencia de RNA objetivo o con diferentes regiones de la misma secuencia del RNA objetivo.
En una modalidad adicional, el Dominio A, el Dominio B y el Dominio C son independientemente oligonucleotidos en base a RNA o DNA. En ciertos aspectos de esta modalidad, los oligonucleotidos comprenden oligonucleotidos de cadena principal mixtos.
En otra modalidad, uno o mas del Dominio A y/o el Dominio B y/o el Dominio C de la Formula IV es un oligonucleotido antisentido que se disena para hibridar selectivamente con una secuencia de RNA objetivo y uno o mas del Dominio restante A y/o el Dominio B y/o el Dominio C es un oligonucleotido antisentido que se disena para hibridar selectivamente con una secuencia de RNA objetivo diferente.
En otras modalidades, uno o mas del Dominio A, Dominio B o Dominio C de la Formula IV es un antagonista de una superficie celular o receptor intracelular. En ciertas modalidades, el antagonista es un antagonista del TLR.
En otra modalidad, uno o mas del Dominio A y/o el Dominio B y/o el Dominio C de la Formula II, III, IV y/o V es un oligonucleotido en base a RNA hibridado con un oligonucleotido en base a RNA complementario tal que el dominio comprende una molecula de siRNA.
Los oligonucleotidos componentes de compuestos basados en oligonucleotidos de la invencion tienen al menos 14 nucleotidos de longitud, pero preferentemente son de 15 a 40 nucleotidos de longitud, preferentemente de 20 a 30 nucleotidos de longitud. De este modo, los oligonucleotidos componentes de los compuestos basados en oligonucleotidos de la invencion pueden ser independientemente 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 nucleotidos de longitud. Estos oligonucleotidos pueden prepararse por metodos reconocidos en la tecnica tales como la qrnmica de fosforamidato o H-fosfonato que puede llevarse a cabo manualmente o mediante un sintetizador automatico. Los enfoques sinteticos representativos se muestran en las Figuras 1A y 1B. Los oligonucleotidos antisentido sinteticos de la invencion pueden modificarse ademas de varias maneras sin comprometer su capacidad para hibridarse con el mRNA. Tales modificaciones pueden incluir al menos un enlace internucleotfdico del oligonucleotido que es un alquilfosfonato, fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, ester de fosfato, alquilfosfonotioato, fosforamidato, carbamato, carbonato, fosfato hidroxilo, acetamidato o ester carboximetilo o una combinacion de estos y otros enlaces internucleotfdicos entre el extremo 5'de un nucleotido y el extremo 3' de otro nucleotido en el que el enlace fosfodiester del nucleotido 5' se ha reemplazado con cualquier cantidad de grupos qrnmicos.
Los oligonucleotidos antisentido sinteticos de la invencion pueden comprender combinaciones de enlaces internucleotfdicos. Por ejemplo, la patente de los EE.UU. num. 5,149,797 describe oligonucleotidos quimericos tradicionales que tienen una region central de fosforotioato interpuesta entre regiones de flanqueo de metilfosfonato o fosforamidato. Ademas, la patente de los EE.UU. num. 5,652,356 describe oligonucleotidos quimericos "invertidos" que comprenden una o mas regiones de oligonucleotidos no ionicos (por ejemplo, enlaces alquilfosfonato y/o fosforamidato y/o internucleosido de fosfotriester) flanqueados por una o mas regiones de oligonucleotido fosforotioato. Diferentes oligonucleotidos antisentido sinteticos con enlaces internucleotfdicos modificados pueden prepararse de acuerdo con los metodos estandares. En ciertas modalidades, los enlaces de fosforotioato pueden mezclar enantiomeros Rp y Sp, o pueden hacerse estereo regulares o sustancialmente estereo regulares en cualquiera de las formas Rp o Sp.
Otras modificaciones de los compuestos basados en oligonucleotidos de la invencion incluyen aquellos que estan internos o al final de la molecula de oligonucleotido e incluyen adiciones a la molecula de los enlaces de fosfato internucleosido, tales como el colesterol, colesterilo o la diamina compuestos con diferentes cantidades de residuos de carbono entre los grupos amino y las modificaciones terminales de ribosa, desoxirribosa y fosfato que se escinden o se entrecruzan en las cadenas opuestas o en enzimas asociadas u otras protemas que se unen al genoma. Los ejemplos de tales oligonucleotidos modificados incluyen oligonucleotidos con una base y/o azucar modificados tales como 2'-O, 4'-C-metilen-b-D-ribofuranosilo, o arabinosa en lugar de ribosa, o un oligonucleotido 3', 5' sustituido que tiene un azucar que, en sus posiciones 3' y 5', esta unido a un grupo qrnmico que no es un grupo hidroxilo (en su posicion 3') y que no es un grupo fosfato (en su posicion 5').
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Otros ejemplos de modificaciones a los azucares de los compuestos basados en oligonucleotidos de la invencion, incluyen modificaciones en la posicion 2' del resto de la ribosa que incluyen, pero no se limitan al, 2'-O-sustituido con un grupo -0-alquilo que contiene 1-6 atomos de carbono saturados o insaturados, o con un grupo -O-arilo u -O-alilo que tiene 2-6 atomos de carbono, en donde, dicho grupo -O-alquilo, -O-arilo u -O-alilo pueden estar no sustituidos o puede estar sustituidos, por ejemplo, con grupos halo, hidroxilo, trifluorometilo, ciano, nitro, acilo, aciloxi, alcoxi, carboxi, carbalcoxilo o amino. Ninguna de estas sustituciones pretende excluir la presencia de otros residuos que tienen un grupo 2'-hidroxilo nativo en el caso de la ribosa o 2' H- en el caso de la desoxirribosa.
Los compuestos basados en oligonucleotidos de acuerdo con la invencion, pueden comprender uno o mas ribonucleotidos. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos num. 5,652,355 describe oligonucleotidos tubridos tradicionales que tienen regiones de ribonucleotidos 2'-O-sustituidos que flanquean una region central del DNA. La Patente de Estados Unidos num. 5,652,356 describe un oligonucleotido tubrido "invertido" que incluye un oligonucleotido que comprende una region de RNA 2'-O-sustituida (o 2' OH, no sustituida) que se encuentra entre dos regiones de oligodesoxirribonucleotidos, una estructura que es invertida en relacion con los oligonucleotidos tubridos "tradicionales". Los ejemplos no limitantes de oligonucleotidos utiles particularmente de la invencion, tienen ribonucleotidos 2'-O alquilados en sus terminales 3', 5' o 3' y 5', con al menos cuatro, y en algunas modalidades ejemplares cinco, nucleotidos contiguos siendo asf modificados. Los ejemplos no limitantes de los grupos 2'-O-alquilados incluyen 2'-O- metilo, 2'-O-etilo, 2'-O-propilo, 2'-O-butilos y 2'-O-metoxi-etilo.
Los compuestos basados en oligonucleotidos de la invencion pueden sintetizarse convenientemente mediante el uso de un sintetizador automatico y el enfoque de fosforamidita como se representa esquematicamente en la Figura 1B, y se describe adicionalmente en el Ejemplo 1. En algunas modalidades, los compuestos basados en oligonucleotidos de la invencion se sintetizan mediante un enfoque de smtesis lineal (ver la Figura 1A).
Un modo alternativo de smtesis es la "smtesis paralela", en la que la smtesis procede externa de una porcion del enlace central (ver la Figura 1). Un conector adjunto de soporte solido puede usarse para la smtesis paralela, como se describe en la patente de los EE.UU. num 5,912,332. Alternativamente, puede usarse un soporte solido universal (como el vidrio porosado controlado adjunto de fosfato).
La smtesis paralela de los compuestos basados en oligonucleotidos de la invencion tiene varias ventajas sobre la smtesis lineal: (1) la smtesis paralela permite la incorporacion de unidades monomericas identicas; (2) a diferencia de la smtesis lineal, ambas (o todas) las unidades monomericas se sintetizan al mismo tiempo, por lo tanto, el numero de las etapas sinteticas y el tiempo requerido para la smtesis es el mismo que el de una unidad monomerica; y (3) la reduccion en las etapas sinteticas mejora la pureza y el rendimiento del producto de oligorribonucleotido modulador inmune final.
Al final de la smtesis mediante ya sea la smtesis lineal o protocolos de smtesis paralelos, los compuestos basados en oligonucleotidos de la invencion pueden desprotegerse convenientemente con una solucion de amomaco concentrada o como lo recomienda el proveedor de fosforamidita, si se incorpora un nucleosido modificado. Los compuestos basados en oligonucleotidos del producto se purifican preferentemente mediante HPLC de fase inversa, destritacion, desalinizado y dializado.
Una lista no limitante de los compuestos basados en oligonucleotidos descritos en la presente se muestra en la sec. con num. de ident. 1 a traves de la sec. con num. de ident. 175 en la Tabla 3 a continuacion. Como se muestra en la Tabla 3, los compuestos basados en oligonucleotidos tienen enlaces de fosforotioato (PS), pero pueden incluir ademas enlaces fosfodiester (o). Aquellos con experiencia en la tecnica reconoceran, sin embargo, que pueden incluirse otros enlaces en base a porciones de fosfodiester o no fosfodiester.
Claims (16)
- 51015202530354045505560Reivindicaciones1. Un compuesto basado en oligonucleotidos que comprende dos oligonucleotidos antisentido monocatenarios unidos en sus extremos 5', en donde, el compuesto basado en oligonucleotidos tiene dos extremos 3' accesibles.
- 2. El compuesto basado en oligonucleotidos de la reivindicacion 1, en donde los oligonucleotidos tienen independientemente 15 a 40 nucleotidos de longitud.
- 3. El compuesto basado en oligonucleotidos de la reivindicacion 1, en donde, los oligonucleotidos estan unidos entre sf a traves de un enlace de nucleotidos o a traves de un conector no nucleotidico.
- 4. El compuesto basado en oligonucleotidos de la reivindicacion 1, en donde, los oligonucleotidos comprenden uno o mas ribonucleotidos, desoxirribonucleotidos, acidos nucleicos cerrados, nucleotidos de azucar arabino o una combinacion de estos.
- 5. El compuesto basado en oligonucleotidos de la reivindicacion 1, en donde, al menos uno de los oligonucleotidos se modifica.
- 6. El compuesto basado en oligonucleotidos de la reivindicacion 5, en donde, el oligonucleotido modificado tiene al menos un enlace internucleotfdico seleccionado del grupo que consiste en conector alquilfosfonato, fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato y no nucleotidico.
- 7. El compuesto basado en oligonucleotidos de la reivindicacion 5, en donde, el oligonucleotido modificado comprende al menos un nucleotido sustituido con 2'-O seleccionado del grupo que consiste en 2'-O-metilo, 2'-O- metoxi, 2'-O-etoxi, 2'-O -metoxietilo, 2'-O-alquilo, 2'-O-arilo y 2'-O-alilo.
- 8. El compuesto basado en oligonucleotidos de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde, cada uno de los oligonucleotidos son complementarios a diferentes secuencias de RNA monocatenario.
- 9. Una composicion que comprende un compuesto basado en oligonucleotidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y un portador aceptable fisiologicamente.
- 10. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 9, que comprende ademas una o mas vacunas, antfgenos, anticuerpos, agentes citotoxicos, alergenos, antibioticos, agonista del TLR, antagonista del TLR, moleculas de siRNA, moleculas de miRNA, oligonucleotidos antisentido, aptameros, protemas, peptidos, vectores de terapia de genes, vacunas de DNA, adyuvantes, moleculas coestimuladoras o las combinaciones de estos.
- 11. El compuesto basado en oligonucleotidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para usarse en la inhibicion de la expresion de genes.
- 12. El compuesto basado en oligonucleotidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para usarse en un metodo para tratar terapeuticamente un mairnfero que tiene una enfermedad o trastorno mediado por una o mas protemas, en donde, al menos uno de los oligonucleotidos es complementario al RNA monocatenario que codifica la o mas protemas.
- 13. El compuesto basado en oligonucleotido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para usarse en un metodo para prevenir una enfermedad o el trastorno mediado por una o mas protemas en un mamffero en riesgo de desarrollar la enfermedad o el trastorno, en donde, al menos uno de los oligonucleotidos es complementario al RNA monocatenario que codifica la o las protemas.
- 14. El compuesto basado en oligonucleotidos para usarse de acuerdo con la reivindicacion 12 o 13, en donde la enfermedad o el trastorno se selecciona del cancer, un trastorno autoinmune, inflamacion de las vfas respiratorias, trastornos inflamatorios, enfermedad infecciosa, trastornos de la piel, alergia, asma, infeccion bacteriana, viral o fungica o una enfermedad causada por un patogeno.
- 15. El compuesto basado en oligonucleotidos para usarse de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, que se administrara junto con una o mas vacunas, antfgenos, anticuerpos, agentes citotoxicos, alergenos, antibioticos, agonista del TLR, antagonista del TLR, moleculas de siRNA, moleculas de miRNA, oligonucleotidos antisentido, aptameros, protemas, peptidos, vectores de terapia de genes, vacunas de DNA, adyuvantes, moleculas coestimuladoras o las combinaciones de estos.Sintesis Linealde Oligonucleotidosi.O-N3*-4ConectorTT-fosforaniiditasdesproteccionS’3ILO-N3MConectDr
imagen1 3’fosforaimditasimagen2 Collectorfosforamiditaimagen3 ODMTrimagen4 CEO' N(W»r)2S’- fn sfcn a mid iraOOMTrimagen5 3"-isoporte solido unido al nucleosidoimagen6 S'-fosforamiditasimagen7 desproteccionCEO^pUWr)7VDMTiO5'ifosforaniiditaimagen8 DMTrO5’-isoporte solido unido al nucleosido=As‘ - 3'SintesisParalela de OligonucleotidosO N -^r*- 0~N.X5'- Conectorn (Q-tK~vyConector 5'-fosforamiditas fosforamiditaDesproteccion3-=30< — S=5-&,, . I ’— 1 DesproteccionConector y-fosforamiditas- ODMTr & 0 CEO'^Nfl-Prfe 3* fosforamidita
- CEO.p.Nfl-Prk Vs DMTrO S‘-fosforamidita
- OOMTr °'"o 3'-:soporte solido unido al nucleosido
- o-° ^!r“ DMTrO 5Vsoporte solido unido al nucleosido
- ODMTr <Sy>'ODMTr 0 P CEO' ^NP-Prfe Conector fosforamidita
- ODMTr '^y^OOMTr 0"O Soporte solido unido al conector
Incremento de vk» tn la actiridad de NF-*BInbibicion de la actividad del TLRP16 -imagen9 Nfedio Agonista AS1 AS213 Compuesto solo a 10 ugmL □ 0.01 ug mL AS + 10 jig/mL Agonista del TLR9 ES 1.0 ug.mL AS + 10 (ig/mL Agonista del 1LR9 ■ 10.0 ug/mL AS + 10 ug/mL Agonista del TLR9Activacion NF-kB {% Agonista TLR9)imagen10 300imagen11 Sec. con num. de ident. 30imagen12 Sec. con num. de ident. 31imagen13 Sec. con niim. de ident, 32Activation nf-kB (% Agonista TLR7)100 SO 60 40 20 0Sec. con num, Sec. con mini, S ec. c on num.de ident:, 33 de ident. 34 de ident. 35imagen14 Activation nf-kB {% Agonista TLR9)90 ]imagen15 S ec. c on mini. Sec. con num. S ec. c on mini,de ident. 36 deident.37 de idem. 38imagen16 PBS AS1 AS?.(SO p g/mU (SO p g.'m L)imagen17 A$1 AE2imagen18 imagen19 imO sclo Agonista Agonista Agonisfca URBASltTlRS TLHSAS2+ TLTO T(.|?9 AS3 t TLWimagen20 imagen21 Sec. con niim. Sec. con uum. Sec. con num. deident. 32 deident. 30 deident. 31imagen22 Figu ra 5CASec. con num.de ident. 36Sec. con num. de ident. 3Sec. con num. de ident. 3840 ■Dia5imagen23 F^ura 7Inhibicion in Viro dela Expresion y Actividad delTLR9~omp.it sto1 S£imagen24 T.-mpo±mcolzquierdoAaorista 'Tiftj Colecaiaimagen25 24a96hrs 2fn3s>pu»s 0.25 mg/kg TIP9 s.c Agoristaflancocwschoimagen26 imagen27 Agonist*Agonistsimagen28 5Figuia 8BInhibit: ion de la Expresion ddmENA delTLR9imagen29 0J ■1 07 'S ’5 Oi ■<* *as 0,3 *■ , - 0.1 U-------Sec. con niim. de ident. 32
imagen30 Sec. con mini, de ident. 30j j 1 pQ/wLimagen31 Sec. can mini, de ident. 31Sec. con mini, de idem, 32Sec. con Sec. conmini, de mini, deident. 30 idem, 31PBSimagen32 Expresionimagen33 LipofectamlnaSec. con mini, de ident. 3 9Sec. cent mini, de ident. 40Sec. con mini, de ident. 41imagen34 PBS AS+ ASS(50 pe/ml) (SOjLgfrn'li)imagen35 imagen36 % InhibitionInhibicion de la E\presion v Actividad delTLR7120imagen37 solo0 0.01 ■ 0.1 01 a 1Qimagen38 3 « HI S ?S' * 2n w $Eo-tre-a;*■&j?O=3isB'X 4I *a fO 3£ Sr Im S3Sti&I*'PotJC5J*■>5TJe
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