TW201607559A - 治療ｓｅｒｐｉｎｃ１相關疾患之方法和組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明係有關一種靶向Serpinc1基因之iRNA(例如，雙股核糖核酸(dsRNA))組成物，及使用此等iRNA(例如，dsRNA)組成物抑制Serpinc1表現及治療罹患Serpinc1-相關疾患(例如，出血疾患，如血友病)之個體之方法。

Description

治療SERPINC1相關疾患之方法和組成物 相關申請案
本申請案主張以下各案之優先權：美國臨時專利申請案案號：61/992,057，申請日2014年5月12日、美國臨時專利申請案案號：62/089,018，申請日2014年12月8日，及美國臨時專利申請案案號：62/102,281，申請日2015年1月12日。上述各專利申請案之完整揭示內容已以引用之方式併入本文中。
本申請案係有關美國臨時專利申請案案號：61/638,952，申請日2012年4月26日、美國臨時專利申請案案號：61/669,249，申請日2012年7月9日、美國臨時專利申請案案號：61/734,573，申請日2012年12月7日、美國專利申請案案號：13/837,129，申請日2013年3月15日、及PCT專利申請案案號：PCT/US2013/038218，申請日2013年4月25日。本申請案亦有關PCT專利申請案案號：PCT/US2012/065601，申請日2012年11月16日。上述各專利申請案之完整揭示內容已以引用之方式併入本文中。
序列表
本申請案包含之序列表已呈ASCII格式電 子檔提交，其完整揭示內容已以引用之方式併入本文中。該於2015年5月11日製作之ASCII複本名稱為121301-01963_SL.txt，檔案大小為124,665位元組。
本發明係有關一種靶向Serpinc1基因之iRNA組成物，及使用此等iRNA組成物抑制Serpinc1表現及治療罹患Serpinc1-相關疾患之個體之方法。
Serpinc1為絲胺酸蛋白酶抑制劑(serpin)超級家族之成員。Serpinc1為一種血漿蛋白酶抑制劑，其抑制凝血酶及凝血系統之其他活化絲胺酸蛋白酶，如因子X、IX、XI、XII及VII，因此調節血液凝結級聯反應。Serpinc1之抗凝血活性因肝素及催化形成凝血酶：抗凝血酶(TAT)複合物之其他相關醣胺基聚醣之存在而加強。
出血疾患不論先天或後天，均係血液凝結不充分之病症。例如，血友病即為一群先天性遺傳出血疾患，其破壞身體控制血液凝結或凝血之能力。血友病A為涉及缺乏功能性凝結因子VIII之隱性X-性聯遺傳疾患，且佔血友病病例之80%。血友病B為涉及缺乏功能性凝結因子IX之隱性X-性聯遺傳疾患。其包含約20%血友病病例。血友病C為涉及缺乏功能性凝結因子XI之體染色體遺傳疾患。血友病C並非完全隱性，因為雜合性個體亦顯示增加出血。
雖然目前仍無法治癒血友病，但可以藉由 定期輸注所缺乏之凝結因子(例如，血友病A之因子VIII)來控制。然而，有些血友病患者會對所接受之置換因子發展出抗體(抑制劑)，因此對置換凝血因子變成不反應。因此，無法適當控制此等個體之出血。
針對例如，因子VIII及其他凝血因子之高效價抑制劑的發展為血友病療法中最嚴重之併發症且使出血之治療極具挑戰性。目前，阻止此等個體出血之唯一策略為使用“旁路製劑”，如第八因子抑制劑旁路活性(FEIBA)及活化重組因子VII(rFVIIa)、血漿分離術、連續因子置換、及免疫耐受療法，其均無法完全有效。因此，相關技藝上需要為患有出血疾患(如血友病)之個體提供替代治療法。
本發明提供一種治療患有可因抑制或降低Serpinc1基因表現而受益之疾患(例如，出血疾患，如血友病)之個體之方法，其係使用iRNA組成物，其作用於RNA誘發靜默複合物(RISC)介導之Serpinc1基因之RNA轉錄物之裂解，以抑制Serpinc1基因之表現。
本發明至少部份基於驚人地發現，極低劑量(例如，比相關技藝所教示之劑量至少低約30倍之劑量)之GalNAc連接雙股RNAi劑(其包含特定化學修飾)顯示抑制Serpinc1表現之極佳效力，並對抑制Serpinc1表現具有優異之持續性。明確言之，低劑量之包括GalNAc配體及正義股與反義股之RNAi劑(其中實質上所有核苷酸均經修 飾)，如本文所示包括在三個連續核苷酸上有三個相同修飾之一個或多個基序(包括在該製劑之裂解位點或接近裂解位點處之一個此等基序)、6個硫代磷酸鍵連(phosphorothioate linkage)、及GalNAc配體之RNAi劑，對靜默Serpinc1基因之活性特別有效且持續。
因此在一項態樣中，本發明提供一種為罹患可因降低Serpinc1表現而受益之疾患之個體預防至少一種症狀之方法。該方法包括對該個體投藥劑量約0.010mg/kg至約0.500mg/kg之雙股RNAi劑，其包含形成雙股區之正義股與反義股，其中該正義股包含至少15個連續核苷酸(其與核苷酸序列SEQ ID NO：1之差異不超過3個核苷酸)，及該反義股包含至少15個連續核苷酸(其與核苷酸序列SEQ ID NO：5之差異不超過3個核苷酸)，其中正義股之實質上所有核苷酸及反義股之實質上所有核苷酸為經修飾之核苷酸，且其中該正義股係接合至附接在3’-終端之配體。
另一項態樣中，本發明提供一種治療罹患可因降低Serpinc1表現而受益之疾患之個體之方法。該方法包括對該個體投藥劑量約0.010mg/kg至約0.500mg/kg之雙股RNAi劑，其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區之正義股與反義股，其中該正義股包含至少15個連續核苷酸(其與核苷酸序列SEQ ID NO：1之差異不超過3個核苷酸)，及該反義股包含至少15個連續核苷酸(其與核苷酸序列SEQ ID NO：5之差異不超過3個核苷酸)，其中正義股 之實質上所有核苷酸及反義股之實質上所有核苷酸為經修飾之核苷酸，且其中該正義股係接合至附接在3’-終端之配體。
一項具體實施例中，正義股之所有核苷酸及反義股之所有核苷酸為經修飾之核苷酸。
另一項具體實施例中，該正義股及該反義股包含互補區，其包含至少15個連續核苷酸(其與表2與表3中任一者所列任一序列之差異不超過3個核苷酸)。
有些具體實施例中，該經修飾之核苷酸係獨立選自下列所成群組：2'-O-甲基修飾之核苷酸、2’-氟修飾之核苷酸、包含5'-硫代磷酸根之核苷酸、及連接膽固醇基衍生物或十二碳烷酸雙癸基醯胺基之末端核苷酸。另一項具體實施例中，該經修飾之核苷酸係選自下列所成群組：2'-去氧-2'-氟修飾之核苷酸、2'-去氧-修飾之核苷酸、鎖核苷酸、非鎖核苷酸、構形限制之核苷酸、限定構象乙基核苷酸、去鹼基核苷酸、2’-胺基-修飾之核苷酸、2’-烷基修飾之核苷酸、2’-O-烯丙基修飾之核苷酸、2’-C-烯丙基修飾之核苷酸、2’-羥基修飾之核苷酸、N-嗎啉基核苷酸、胺基磷酸酯、及包含非天然鹼基之核苷酸。
雙股RNAi劑之另一項具體實施例中，至少一股包含至少1個核苷酸之3’突出。另一項具體實施例中，至少一股包含至少2個核苷酸之3’突出。
本發明另一態樣提供一種為罹患可因降低Serpinc1表現而受益之疾患之個體預防至少一種症狀之方 法。該方法包括對該個體投藥劑量約0.010mg/kg至約0.500mg/kg之雙股RNAi劑，其中該雙股RNAi劑包含互補於反義股之正義股，其中該反義股包含互補於編碼Serpinc1之mRNA之一部分之區，其中各股為約14至約30個核苷酸之長度，其中該雙股RNAi劑係由式(IIIe)代表：正義：5'-Na-YYY-Na-3'反義：3'np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-5' (IIIe)
其中：np.'為2個核苷酸突出，且np'內各核苷酸係經由硫代磷酸鍵連連接相鄰核苷酸；各Na及Na'分別獨立代表包含經修飾或未經修飾或其組合之0-25個核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少2個經不同修飾之核苷酸；YYY及Y'Y'Y'分別獨立代表在三個連續核苷酸上有三個相同修飾之一個基序，且其中該修飾為2'-O-甲基修飾或2'-氟修飾；其中該正義股及該反義股分別獨立在5’-末端包含兩個硫代磷酸鍵連；及其中該正義股係接合於至少一個配體，其中該配體為透過二價或三價之分支連接基附接之一或多種GalNAc衍生物，藉以為該罹患可因降低Serpinc1表現而受益之疾患之個體預防至少一種症狀。
另一項態樣中，本發明提供一種治療罹患 可因降低Serpinc1表現而受益之疾患之個體之方法。該方法包括對該個體投藥劑量約0.010mg/kg至約0.500mg/kg之雙股RNAi劑，其中該雙股RNAi劑包含互補於反義股之正義股，其中該反義股包含互補於編碼Serpinc1之mRNA之一部分之區，其中各股為約14至約30個核苷酸之長度，其中該雙股RNAi劑係由式(IIIe)代表：正義：5'-Na-YYY-Na-3'反義：3'np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-5' (IIIe)
其中：np.'為2個核苷酸突出，且np'內各核苷酸係經由硫代磷酸鍵連連接相鄰核苷酸；各Na及Na'獨立代表包含經修飾或未修飾或其組合之0-25個核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少2個經不同修飾之核苷酸；YYY及Y'Y'Y'分別獨立代表在三個連續核苷酸上有三個相同修飾之一個基序，且其中該修飾為2'-O-甲基修飾或2'-氟修飾；其中該正義股及該反義股分別獨立在5’-末端包含兩個硫代磷酸鍵連；及其中該正義股係接合於至少一個配體，其中該配體為透過二價或三價之分支連接基附接之一或多種GalNAc衍生物，藉以為該罹患可因降低Serpinc1表現而受益之疾患之個體預防至少一種症狀。
一項具體實施例中，該雙股RNAi劑係呈單一劑量或呈兩個或更多個劑量，例如，3、4、5、或6個劑量投藥該個體。
一項具體實施例中，該雙股RNAi劑係一週一次、一個月2次、一個月一次、每6週一次、每2個月一次、或依需要投藥該個體。
該雙股RNAi劑可投藥該個體例如，每週劑量約0.01至約0.5mg/kg、約0.01至約0.4mg/kg、約0.01至約0.3mg/kg、約0.01至約0.2mg/kg、約0.01至約0.1mg/kg、約0.01mg/kg至約0.09mg/kg、約0.01mg/kg至約0.08mg/kg、約0.01mg/kg至約0.07mg/kg、約0.01mg/kg至約0.06mg/kg、約0.01mg/kg至約0.05mg/kg、約0.02至約0.5mg/kg、約0.02至約0.4mg/kg、約0.02至約0.3mg/kg、約0.02至約0.2mg/kg、約0.02至約0.1mg/kg、約0.02mg/kg至約0.09mg/kg、約0.02mg/kg至約0.08mg/kg、約0.02mg/kg至約0.07mg/kg、約0.02mg/kg至約0.06mg/kg、約0.02mg/kg至約0.05mg/kg、約0.03至約0.5mg/kg、約0.03至約0.4mg/kg、約0.03至約0.3mg/kg、約0.03至約0.2mg/kg、約0.03至約0.1mg/kg、約0.03mg/kg至約0.09mg/kg、約0.03mg/kg至約0.08mg/kg、約0.03mg/kg至約0.07mg/kg、約0.03mg/kg至約0.06mg/kg、約0.03mg/kg至約0.05mg/kg、約0.04至約0.5mg/kg、約0.04至約0.4mg/kg、約0.04至約0.3mg/kg、約0.04至約0.2mg/kg、約0.04至約0.1mg/kg、約0.04mg/kg至約0.09 mg/kg、約0.04mg/kg至約0.08mg/kg、約0.04mg/kg至約0.07mg/kg、約0.04mg/kg至約0.06mg/kg、約0.045至約0.45mg/kg、約0.045至約0.4mg/kg、約0.045至約0.3mg/kg、約0.045至約0.2mg/kg、約0.045至約0.1mg/kg、約0.045mg/kg至約0.09mg/kg、約0.045mg/kg至約0.08mg/kg、約0.045mg/kg至約0.07mg/kg、約0.045mg/kg至約0.06mg/kg、約0.05至約0.5mg/kg、約0.05至約0.4mg/kg、約0.05至約0.3mg/kg、約0.05至約0.2mg/kg、約0.05至約0.1mg/kg、約0.05mg/kg至約0.09mg/kg、約0.05mg/kg至約0.08mg/kg、或約0.05mg/kg至約0.07mg/kg，例如，依每週劑量為期1、2、3、4、5、6、7、8週、或更久。
該個體可為人類，如罹患出血疾患，例如，血友病，例如，血友病A、血友病B、或血友病C之人類。
一項具體實施例中，對該個體投藥該雙股RNAi劑會增加血液凝結及/或減少Serpinc1蛋白質累積。
一項具體實施例中，該方法進一步包括測定個體之凝血酶含量。
該雙股RNAi劑可經皮下或靜脈內投藥。
一項具體實施例中，RNAi劑之反義股之實質上所有核苷酸及正義股之實質上所有核苷酸包含選自2’-O-甲基修飾及2’-氟修飾所成群組之修飾。一項具體實施例中，RNAi劑之正義股之所有核苷酸及反義股之所有核苷酸為經修飾之核苷酸。
一項具體實施例中，該YYY基序出現在正義股之裂解位點或接近正義股之裂解位點。
一項具體實施例中，該Y'Y'Y'基序出現在反義股5'-端起之11、12及13位置。
該雙股區可為15-30個核苷酸對之長度、17-23個核苷酸對之長度、17-25個核苷酸對之長度、23-27個核苷酸對之長度、19-21個核苷酸對之長度、或21-23個核苷酸對之長度。
各股可具有15-30個核苷酸、或19-30個核苷酸。
一項具體實施例中，該正義股共具有21個核苷酸，及該反義股共具有23個核苷酸。
一項具體實施例中，該配體為
一項具體實施例中，該配體係附接於正義股之3'端。
一項具體實施例中，該RNAi劑係接合如下圖所示之配體 其中X為O或S。
一項具體實施例中，雙螺旋(duplex)之反義股5'-端之1位置之鹼基對為AU鹼基對。
一項具體實施例中，該RNAi劑為AD-57213((正義(5’至3’)：GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAfL 96(SEQ ID NO：13)；反義(5’至3’)：usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg(SEQ ID NO：14)，其中A、C、G、及U為核糖A、C、G或U；a、c、g、及u為2'-O-甲基(2'-OMe)A、C、G、或U；Af、Cf、Gf或Uf為2'-氟A、C、G或U；及s為硫代磷酸鍵連))。
一項具體實施例中，該製劑係呈醫藥組成物投藥。一項具體實施例中，該RNAi劑係在未經緩衝之溶液(如鹽水或水)中投藥。
另一項具體實施例中，siRNA係使用緩衝溶液(如包含乙酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶穀蛋白、碳酸鹽、或磷酸鹽或其任何組合)之緩衝溶液投藥。一項具體實施例中，該緩衝溶液為磷酸鹽緩衝鹽水溶液(PBS)。
另一項態樣中，本發明提供一種進行本發 明方法之套組。該套組可包括本發明之RNAi劑，及使用說明書，及視需要之用於投藥RNAi劑給個體之手段。
一項態樣中，本發明提供一種為罹患可因降低Serpinc1表現而受益之疾患之個體預防至少一種症狀之方法。該方法包括對該個體投藥(例如，經皮下投藥)劑量約0.015mg/kg至約0.15mg/kg之雙股核糖核酸(RNAi)劑，其中該雙股RNAi劑包含正義股及反義股，反義股包含互補區，其包含至少15個連續核苷酸(其與核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’之差異不超過3個核苷酸)，其中正義股之實質上所有核苷酸及反義股之實質上所有核苷酸為經修飾之核苷酸，且其中該正義股係接合於附接在3’-末端之配體。
另一項態樣中，本發明提供一種治療罹患可因降低Serpinc1表現而受益之疾患之個體之方法。該方法包括對該個體投藥(例如，經皮下投藥)劑量約0.015mg/kg至約0.15mg/kg之雙股核糖核酸(RNAi)劑，其中該雙股RNAi劑包含正義股及反義股，反義股包含互補區，其包含至少15個連續核苷酸(其與核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’之差異不超過3個核苷酸)，其中正義股之實質上所有核苷酸及反義股之實質上所有核苷酸為經修飾之核苷酸，且其中該正義股係接合於附接在3’-末端之配體。
該雙股RNAi劑可投藥該個體兩種或更多種劑量。
一項具體實施例中，該雙股RNAi劑係一週一次投藥該個體。另一項具體實施例中，該雙股RNAi劑係一個月2次投藥該個體。又另一項具體實施例中，該雙股RNAi劑係一個月一次投藥該個體。另一項具體實施例中，該雙股RNAi劑係每6週一次投藥該個體。一項具體實施例中，該雙股RNAi劑係每2個月一次投藥該個體。
一項具體實施例中，該雙股RNAi劑係依每週劑量約0.015mg/kg至約0.125mg/kg投藥該個體。
一項具體實施例中，該雙股RNAi劑係依每週劑量約0.045mg/kg至約0.125mg/kg投藥該個體。另一項具體實施例中，該雙股RNAi劑係依每週劑量約0.075mg/kg至約0.125mg/kg投藥該個體。又另一項具體實施例中，該雙股RNAi劑係依每月劑量約0.015mg/kg至約0.125mg/kg投藥該個體。另一項具體實施例中，該雙股RNAi劑係依每月劑量約0.045mg/kg至約0.125mg/kg投藥該個體。一項具體實施例中，該雙股RNAi劑係依每月劑量約0.075mg/kg至約0.125mg/kg投藥該個體。
一項具體實施例中，雙股RNAi劑係使用緩衝溶液投藥，如包含乙酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶穀蛋白、碳酸鹽、或磷酸鹽或其任何組合之緩衝溶液。一項具體實施例中，該緩衝溶液為磷酸鹽緩衝鹽水溶液(PBS)。
一項具體實施例中，該個體為人類。
該疾患可為出血疾患，如血友病，例如，血友病A、血友病B、或血友病C。
一項具體實施例中，該雙股RNAi劑係經皮下投藥該個體。
一項具體實施例中，正義股之所有核苷酸及反義股之所有核苷酸為經修飾之核苷酸。
一項具體實施例中，該經修飾之核苷酸係分別獨立選自下列所成群組：2'-去氧-2'-氟修飾之核苷酸、2'-去氧-修飾之核苷酸、鎖核苷酸、去鹼基核苷酸、2’-胺基-修飾之核苷酸、2’-烷基-修飾之核苷酸、N-嗎啉基核苷酸、胺基磷酸酯、及包含非天然鹼基之核苷酸。
互補區可為至少17個核苷酸之長度或19個核苷酸之長度。
一項具體實施例中，該互補區之長度為19至21個核苷酸。另一項具體實施例中，該互補區之長度為21至23個核苷酸。
一項具體實施例中，各股之長度不超過30個核苷酸。
該雙股RNAi劑中至少一股可包含至少1個核苷酸之3’突出或至少2個核苷酸之3’突出。
一項具體實施例中，該配體為N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
另一項具體實施例中，該配體為
一項具體實施例中，該RNAi劑係接合如下圖所示之配體 且其中X為O或S。
一項具體實施例中，該X為O。
一項具體實施例中，該互補區係由核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’組成。
一項具體實施例中，該雙股RNAi劑包含由核苷酸序列5’-GGUUAACACCAUUUACUUCAA-3’組成之正義股及由核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’組成之反義股。
一項具體實施例中，該正義股包含5’-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3’(SEQ ID NO：13)及 該反義股包含5’-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3’(SEQ ID NO：14)，其中A、C、G及U為核糖A、C、G或U；a、c、g及u為2'-O-甲基(2'-OMe)A、C、G或U；Af、Cf、Gf或Uf為2'-氟A、C、G或U；及s為硫代磷酸鍵連。
第1A圖至第1D圖為說明單次皮下投藥0.03mg/kg劑量之AD-57213對健康人體之血漿凝血酶產生量之影響圖。
第2A圖及第2B圖為說明單次皮下投藥0.03mg/kg劑量之AD-57213對健康人體之血漿AT3(Serpinc1)蛋白質含量之影響圖。
第3圖為說明經單次皮下投藥0.03mg/kg劑量之AD-57213之健康個體之AT3(Serpinc1)減弱百分比與凝血酶產生量高峰之增加百分比之間的關係圖。
第4圖為說明多重0.015mg/kg、0.045mg/kg、或0.075mg/kg劑量之AD-57213對罹患血友病A或B之人體之血漿AT3(Serpinc1)蛋白質含量之影響圖。
第5A圖為說明多重0.015mg/kg或0.045mg/kg劑量之AD-57213對罹患血友病A或B之人體之凝血酶含量高峰之影響圖。第5B圖為說明多重0.015mg/kg或0.045mg/kg劑量之AD-57213對罹患血友病A或B之人體之凝血酶產生之影響圖，以相對於該組基線值之變化百分比表示。
第6圖為說明多重0.045mg/kg劑量之AD-57213對一 位罹患血友病A之個體(個體101-009)之血塊形成時間及凝血時間之影響圖。
本發明至少一部份係基於驚人地發現之極低劑量(例如，比相關技藝所教示之劑量至少低約30倍之劑量)包含特定化學修飾之GalNAc連接雙股RNAi劑對抑制Serpinc1表現顯示優異之效力，且對抑制Serpinc1表現顯示優異之持續性。明確言之，低劑量之包括GalNAc配體且其中實質上所有核苷酸為經修飾核苷酸之RNAi劑，如本文所示包括在三個連續核苷酸上有三個相同修飾之一個或多個基序(包括在該製劑之裂解位點或接近裂解位點處之一個此等基序)、6個硫代磷酸鍵連、及GalNAc配體之RNAi劑，對靜默Serpinc1基因之活性特別有效且持續。
因此，本發明提供一種為罹患可因抑制或降低Serpinc1基因表現而受益之疾患(例如，Serpinc1-相關疾病，如血友病，例如，血友病A、血友病B、或血友病C)之個體預防至少一種症狀(例如，出血)之方法，其係使用iRNA組成物，其作用於RNA誘發靜默複合物(RISC)介導之Serpinc1基因之RNA轉錄物之裂解。本發明進一步提供一種治療罹患可因抑制或降低Serpinc1基因表現而受益之疾患(例如，出血疾患，如血友病，例如，血友病A、血友病B、或血友病C)之個體之方法，其係使用iRNA組成物，其作用於RNA誘發靜默複合物(RISC)介導之Serpinc1基因之RNA轉錄物之裂解。
下列詳細說明揭示如何製造及使用供抑制Serpinc1基因表現之包含iRNA之組成物，及供治療罹患可因抑制及/或降低此基因表現而受益之疾病與疾患之個體之組成物、用途及方法。
I. 定義
為了更容易了解本發明，首先定義某些術語。此外應注意，不論何時出示之參數數值或數值範圍，其均指該等所出示數值之間之數值與範圍亦為本發明一部份。
本文所採用冠詞“一種”與“一個”係指該文法上主詞為一個(種)或超過一個(種)(亦即至少一個(種))。例如，“一個元素”係指一個元素或超過一個元素，例如，複數個元素。
本文所採用術語“包括”意指片語“包括但不限於”，並可與其交換使用。
本文所採用術語“或”意指“與/或”，並可與其交換使用，除非文中另有說明。
本文所採用“Serpinc1”意指於細胞中表現之特定多肽。Serpinc1亦稱為絲胺酸肽酶抑制劑C型(抗凝血酶；AT)，成員1；抗凝血酶III；AT3；抗凝血酶；及肝素輔因子1。人類Serpinc1 mRNA轉錄物之序列可參見例如，GenBank登錄號GI：254588059(NM_000488；SEQ ID NO：1)。恆河獼猴Serpinc1 mRNA之序列可參見例如，GenBank登錄號GI：157167169(NM_001104583；SEQ ID NO：2)。小鼠Serpinc1 mRNA之序列可參見例如，GenBank 登錄號GI：237874216(NM_080844；SEQ ID NO：3)。大鼠Serpinc1 mRNA之序列可參見例如，GenBank登錄號GI：58865629(NM_001012027；SEQ ID NO：4)。
本文所採用術語“Serpinc1”亦指由Serpinc1基因之天然發生DNA序列變異(如Serpinc1基因中之單一核苷酸多形性)於細胞中表現之特定多肽。已經判別出Serpinc1基因內許多SNP，且可參見例如，NCBI dbSNP(參見例如，www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)。Serpinc1基因內之SNP之非限制性實例可參見NCBI dbSNP登錄號rs677；rs5877；rs5878；rs5879；rs941988；rs941989；rs1799876；rs19637711；rs2008946；及rs2227586。
本文所採用“個體”為動物，如哺乳動物，包括靈長類(如人類)、非人類靈長類(例如，猴子與黑猩猩)、非靈長類(如牛、豬、駱駝、大羊駝、馬、山羊、兔子、綿羊、倉鼠、天竺鼠、貓、狗、大鼠、小鼠、馬與鯨魚)、或鳥類(例如，鴨或鵝)。一項具體實施例中，該個體為人類，如接受治療或判定如本文所說明可因降低Serpinc1表現而受益之疾病、疾患或病症之人類；處於罹患可因降低Serpinc1表現而受益之疾病、疾患或病症之風險之人類；罹患可因降低Serpinc1表現而受益之疾病、疾患或病症之人類；與/或正接受治療可因降低Serpinc1表現而受益之疾病、疾患或病症之人類。
本文所採用術語“治療”或“處理”係指下列有利或所需結果，包括但不限於減輕或緩和一或多種 症狀；降低出血程度；穩定(亦即不惡化)出血狀態；緩和或減緩出血，不論可檢測或不可檢測。“治療”亦可意指比沒有接受治療時之預期存活性延長其存活。
在個體或疾病標記物或症狀中之Serpinc1含量之相關內容中使用之術語“降低”意指在統計上顯著降低此等含量。其可降低例如，至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或更多，且較佳係降至未罹患此等疾患之個體之正常範圍內之可接受程度。
本文所採用“防止”或“預防”當用在可因降低Sertpinc1基因表現而受益之疾病、疾患或其病症時，意指可以降低個體發展出與此等疾病疾患、或病症有關之症狀(例如，如出血之症狀)之可能性。例如，當具有一個或多個出血之危險因子之個體未出現出血或所出現之出血嚴重性比具有相同危險因子但未接受如本文所說明治療法之個體減輕時，即係降低發展出出血之可能性。未發展出疾病、疾患或病症，或所發展出與此等疾病、疾患或病症有關之症狀減輕(例如，針對該疾病或疾患之臨床上可接受指標減輕至少約10%)、或延遲出現後來的症狀(例如，延遲數天、數週、數個月或數年)時，即視為有效預防。
本文所採用術語“出血疾患”為造成血液凝結不良及/或過度出血之疾病或疾患。出血疾患可為先天 性疾患，如血友病或溫韋伯氏疾病(von Willebrand’s disease)，或與以下相關之後天性疾患，例如，散播性血管內凝血、與懷孕相關之子癲症、維生素K缺乏、自體免疫疾患、發炎性腸部疾病、潰瘍性大腸炎、皮膚疾患(例如，乾蘚、天皰瘡)、呼吸疾病(例如，氣喘、慢性阻塞性肺病)、過敏性藥物反應(例如，醫藥所造成，如阿斯匹林、肝素、及殺鼠靈)、糖尿病、急性B型肝炎感染、急性C型肝炎感染、惡性或固體腫瘤(例如，前列腺、肺、大腸、胰臟、胃、膽管、頭與頸、子宮頸、乳房、黑色素瘤、腎臟、及/或血液性惡病質)。一項具體實施例中，該先天性出血疾患為血友病，例如，血友病A、B、或C。一項具體實施例中，罹患先天性出血疾患(例如，血友病)之個體已經對置換凝血療法發展出抑制劑，例如，同種異體抗體抑制劑，本文中稱為“抑制劑個體”。一項具體實施例中，該抑制劑個體罹患血友病A。另一項具體實施例中，該抑制劑個體罹患血友病B。又另一項具體實施例中，該抑制劑個體罹患血友病C。
本文所採用“醫療有效量”意指所包括RNAi劑用量當投藥罹患出血疾患及出血中之個體時，足以治療疾病，例如，減輕、緩解或維持現有疾病或疾病之一或多種症狀。“醫療有效量”可能隨RNAi劑、該製劑之投藥法、該疾病及其嚴重程度、及病史、年齡、體重、家庭病史、基因組態、可能進行之過去或併行之任何治療、及接受治療之個體之其他個人特徵而異。
本文所採用“預防有效量”意指所包括iRNA劑用量當投藥罹患出血疾患但未在出血中之個體，例如，罹患出血疾患且計畫接受手術之個體時，足以預防或緩解疾病或疾病之一或多種症狀。疾病之緩解包括減慢疾病過程或降低後來發展之疾病之嚴重性。“預防有效量”可能隨iRNA劑、該製劑之投藥法、該疾病之嚴重程度、及病史、年齡、體重、家庭病史、基因組態、可能進行之過去或併行之任何治療、及接受治療之個體之其他個人特徵而異。
“醫療有效量”或“預防有效量”亦包括RNAi劑可以在適用於任何治療之合理效益/危險比值所產生某些所需局部或全身性效應時之量。本發明方法所採用iRNA可能投藥足以產生適用於此等治療之合理效益/危險比值之量。
本文所採用片語“醫藥上可接受”係指彼等在完整之醫學判斷下適合與人類個體及動物之組織接觸，且在合理之效益/危險比值不會有過度毒性、刺激性、過敏反應或其他問題或併發症之化合物、材料、組成物與/或劑型。
本文所採用片語“醫藥上可接受之載劑”係指醫藥上可接受之材料、組成物或媒劑，如液態或固態填料、稀釋劑、賦形劑、製造助劑(例如，潤滑劑、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸-鈣或硬脂酸-鋅、或硬脂酸)、或溶劑包埋材料，其涉及從一個器官或身體之一部份攜帶或轉運該 主題化合物至另一個器官或身體之一部份。各載劑必需在可與調配物中其他成份相容之意義上為“可接受”，且對接受治療之個體無害。可作為醫藥上可接受之載劑之某些材料實例包括：(1)糖類，如乳糖、葡萄糖與蔗糖；(2)澱粉，如玉米澱粉與馬鈴薯澱粉；(3)纖維素、與其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素與纖維素乙酸鹽；(4)黃蓍膠粉末；(5)麥芽；(6)明膠；(7)潤滑劑，如硬脂酸鎂、月桂基硫酸鈉與滑石；(8)賦形劑，如可可油與栓劑用蠟；(9)油類，如花生油、玉米籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油與大豆油；(10)甘醇類，如丙二醇；(11)多元醇類，如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、與聚乙二醇；(12)酯類，如油酸乙酯與月桂酸乙酯；(13)洋菜；(14緩衝劑，如氫氧化鎂與氫氧化鋁；(15)藻酸；(16)無熱原水；(17)等滲生理食鹽水；(18)林格氏溶液(Ringer’s solution)；(19)乙醇；(20)pH緩衝液；(21)聚酯類、聚碳酸鹽與/或聚酸酐；(22)體積膨脹劑，如多肽類與胺基酸；(23)血清組份，如血清白蛋白、HDL與LDL；與(24)用於醫藥調配物中之其他無毒性相容物質。
本文所採用“標靶序列”係指在Serpinc1基因轉錄期間所形成mRNA分子之核苷酸序列中之連續部份，包括作為主要轉錄產物之RNA處理產物之mRNA。一項具體實施例中，該序列之標靶部份之長度應為至少足以作為受質之長度，可在或接近Serpinc1基因轉錄期間所形成mRNA分子之核苷酸序列之一部份之位置接受iRNA所主導之裂解。
標靶序列可為約9-36個核苷酸之長度，例如，約15-30個核苷酸之長度。例如，標靶序列可為約15-30個核苷酸、15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、或21-22個核苷酸之長度。上述範圍與長度之間之範圍與長度亦包括為本發明之一部份。
本文所採用術語“包含序列之股”係指包含核苷酸鏈之寡核苷酸，其係採用標準核苷酸命名法之序列說明。
“G”、“C”、“A”、“T”與“U”一般分別代表核苷酸，其分別包含鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸苷與尿嘧啶作為鹼基。然而，咸了解，術語“核糖核苷酸”或“核苷酸”亦指經修飾之核苷酸，如下文中進一步說明，或改用置換部份體(參見例如，表1)。熟悉此相關技術者咸了解，鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤與尿嘧啶可在不會實質上改變該包含帶有此等置換部份體之核苷酸之寡核苷酸鹼基配對性質下改用其他部份體置換。例如，但不限於，包含肌苷作為其鹼基之核苷酸可與包含腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之核苷酸形成鹼基對。因此，如本發明所說明特徵 之dsRNA之核苷酸序列中包含尿嘧啶、鳥嘌呤或腺嘌呤之核苷酸可被包含，例如，肌苷之核苷酸置換。另一項實例中，寡核苷酸中之任何腺嘌呤與胞嘧啶可分別被鳥嘌呤與尿嘧啶置換，與標靶mRNA形成G-U搖擺鹼基對。包含此等置換部份體之序列適合如本發明所說明特徵之組成物與方法。
採用術語“iRNA”、“RNAi劑”、“iRNA劑”、“RNA干擾劑”可交換使用，其意指包含如本文術語所定義之RNA之製劑，其可經由RNA誘發靜默複合物(RISC)途徑介導靶向裂解RNA轉錄物。iRNA透過稱為RNA干擾(RNAi)之過程主導mRNA的序列專一性降解。iRNA調控(例如，抑制)Serpinc1於細胞(例如，個體，如哺乳動物個體之細胞)中之表現。
一項具體實施例中，本發明RNAi劑包括與標靶RNA序列(例如，Serpinc1標靶mRNA序列)交互作用之單股RNA，以主導裂解標靶RNA。在不希望受到理論限制下，咸信經導入至細胞中之長的雙股RNA被稱為Dicer之第III型內切核酸酶分解成siRNA(Sharp等人(2001)Genes Dev.15：485)。Dicer係一種類似核糖核酸酶-III之酵素，處理dsRNA為19至23鹼基對之短的干擾RNA，其特徵在於兩個鹼基之3'突出(Bernstein等人(2001)Nature 409：363)。siRNA隨後併入RNA誘發靜默複合物(RISC)中，其中一或多種解螺旋酶解開siRNA雙螺旋，讓互補反義股導引標靶辨識(Nykanen等人(2001)Cell 107：309)。當與適當標靶 mRNA結合時，RISC內之一或多種內切核酸酶裂解該標靶，誘發靜默(Elbashir等人(2001)Genes Dev.15：188)。因此本發明之一項態樣中係有關一種在細胞內產生之單股RNA(siRNA)，其促進形成RISC複合物，有效於標靶基因(亦即Serpinc1基因)靜默。因此，本文所採用術語“siRNA”亦指上述RNAi。
另一項具體實施例中，RNAi劑可為經導入至細胞或生物體以抑制標靶mRNA之單股siRNA。單股RNAi劑結合RISC內切核酸酶Argonaute 2，然後其裂解標靶mRNA。單股siRNA一般為15至30個核苷酸且經化學修飾。單股siRNA之設計與試驗說明於美國專利案案號8,101,348與Lima等人(2012)Cell 150：883-894，其完整揭示內容已分別以引用之方式併入本文中。本文所說明之任何反義核苷酸序列均可作為本文說明之單股siRNA使用或可採用Lima等人(2012)Cell 150：883-894說明之方法進行化學修飾。
另一項具體實施例中，本發明組成物、用途與方法所使用之“iRNA”係雙股RNA，本文中稱為“雙股RNAi劑”、“雙股RNA(dsRNA)分子”、“dsRNA劑”或“dsRNA”。術語“dsRNA”係指核糖核酸分子之複合物，其具有雙螺旋結構，包含兩個反向平行且實質上互補之核酸股，具有相對於標靶RNA(亦即Serpinc1基因)之“正義”與“反義”取向。某些本發明具體實施例中，雙股RNA(dsRNA)透過轉錄後基因-靜默機制(本文稱為RNA干擾或 RNAi)啟動標靶RNA(例如，mRNA)之降解。
通常，dsRNA分子之各股之大多數核苷酸為核糖核苷酸，但如同本文之詳細說明，各股或兩股亦可包括一個或多個非核糖核苷酸，例如，去氧核糖核苷酸與/或經修飾之核苷酸。此外，本說明書所採用“RNAi劑”可能包括經化學修飾之核糖核苷酸；RNAi劑可能在多重核苷酸上包括實質修飾。
本文所採用術語“經修飾之核苷酸”意指分別獨立具有經修飾之糖部分基團、經修飾之核苷酸間鍵連、與/或經修飾之核鹼基之核苷酸。因此，術語經修飾之核苷酸涵括在核苷酸間鍵連、糖部份基團或核鹼基之取代、加成、或排除例如，官能基或原子。適用於本發明製劑之修飾法包括本文所揭示或相關技藝已知之所有修飾型態。針對本說明書與申請專利範圍之目的，“RNAi劑”包括用於siRNA型分子之任何此等修飾。
雙螺旋區之長度可為容許所需之標靶RNA透過RISC途徑進行專一性降解之任何長度，且可能在約9至36鹼基對之長度範圍內，例如，約15-30鹼基對之長度，例如，約9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、或36鹼基對之長度，如約15-30、15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、 19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、或21-22鹼基對之長度。上示範圍與長度之間之範圍與長度亦包括為本發明之一部份。
形成雙螺旋結構之兩股可能為一個較大RNA分子之不同部份，或其可能為分開之RNA分子。若這兩股為一個較大RNA分子之一部份，且因此在形成該雙螺旋結構之其中一股之3’-端與另一股之5’-端之間利用未中斷之核苷酸鏈連接時，該連接之RNA鏈稱為“髮夾環”。髮夾環可包含至少一個未配對之核苷酸。某些具體實施例中，髮夾環可包含至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少20個、至少23個、或更多個未配對之核苷酸。
若dsRNA之兩個實質上互補股包含在分開之RNA分子時，彼等分子不一定需要但可以共價連接。若這兩股在形成該雙螺旋結構之其中一股之3’-端與另一股之5’-端之間利用除了未中斷之核苷酸鏈以外之其他連接方式共價連接時，該連接結構稱為“連接子”。RNA股可能具有相同或不同數目之核苷酸。鹼基對之最大數目即為dsRNA中最短股之核苷酸數目減去雙螺旋中任何突出後之數目。除了雙螺旋結構外，RNAi亦可包含一個或多個核苷酸突出。
一項具體實施例中，本發明RNAi劑為24-30 個核苷酸之dsRNA，其與標靶RNA序列(例如，Serpinc1標靶mRNA序列)交互作用，以主導標靶RNA之裂解。在不希望受到理論之限制下，經導入至細胞中之長的雙股RNA被稱為Dicer之第III型內切核酸酶分解成siRNA(Sharp等人(2001)Genes Dev.15：485)。Dicer係類似核糖核酸酶-III之酵素，其處理dsRNA為19至23鹼基對之短的干擾型RNA，其特徵在於兩個鹼基之3'突出(Bernstein等人(2001)Nature 409：363)。該等siRNA隨後併入RNA誘發靜默複合物(RISC)中，其中一或多種解螺旋酶解開siRNA雙螺旋，讓該互補反義股導引標靶辨識(Nykanen等人(2001)Cell 107：309)。當與適當標靶mRNA結合時，RISC內之一或多種內切核酸酶裂解標靶而誘發靜默(Elbashir等人(2001)Genes Dev.15：188)。
本文所採用術語“核苷酸突出”係指至少一個未配對之核苷酸從iRNA雙螺旋結構(例如，dsRNA)中突出。例如，當dsRNA中一股之3'-端超出另一股之5'-端，或反之亦然時，即有一個核苷酸突出。dsRNA可包含含有至少一個核苷酸之突出；或者，該突出可包含至少兩個核苷酸、至少三個核苷酸、至少四個核苷酸、至少五個核苷酸或更多個。核苷酸突出可包含或其組成可為核苷酸/核苷類似物，包括去氧核苷酸/核苷。該(等)突出可位於正義股、反義股或其任何組合。此外，突出之核苷酸(群)可出現在dsRNA之反義或正義股之5'-端、3'-端或兩端。
一項具體實施例中，dsRNA之反義股在3’- 端與/或5’-端具有1至10個核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個核苷酸之突出。一項具體實施例中，dsRNA之正義股可在3’-端與/或5’-端具有1至10個核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個核苷酸之突出。另一項具體實施例中，突出中一個或多個核苷酸被核苷硫代磷酸酯置換。
“鈍端”或“鈍末端”意指雙股RNAi劑之末端沒有未配對之核苷酸，亦即沒有核苷酸突出。“鈍末端”之RNAi劑為該dsRNA之整個長度均為雙股，亦即該分子之任一末端均沒有核苷酸突出。本發明RNAi劑包括在一末端具有核苷酸突出之RNAi劑(亦即具有一個突出與一個鈍末端之製劑)之RNAi劑或兩端均具有核苷酸突出之RNAi劑。
術語“反義股”或“導引股”係指iRNA(例如，dsRNA)之該股包括與標靶序列(例如，Serpinc1mRNA)實質上互補之區。本文所採用術語“互補區”係指反義股上與序列(例如，標靶序列，例如，如本文定義之Serpinc1核苷酸序列)實質上互補之區。若當互補區未與標靶序列完全互補時，可能在分子內部或終端區發生錯配。通常，最能忍受之錯配係在終端區內，例如，iRNA之5’-與/或3’-終端之5、4、3、或2個核苷酸內。
本文所採用術語“正義股”或“過客股”係指該iRNA之股包括與如本文術語所定義反義股區實質上互補之區。
本文所採用術語“裂解區”係指位在緊鄰裂解位點之區。裂解位點係在標靶上發生裂解之位點。某些具體實施例中，裂解區在裂解位點之任一末端且緊鄰裂解位點包含三個鹼基。某些具體實施例中，裂解區在裂解位點任一末端且緊鄰裂解位點包含兩個鹼基。某些具體實施例中，裂解位點明確發生於與反義股之核苷酸10與11結合之位點，且裂解區包含核苷酸11、12與13。
除非另有說明，否則當本文採用術語“互補”說明第一核苷酸序列與第二核苷酸序列之關係時，係指包含該第一核苷酸序列之寡核苷酸或聚核苷酸在熟悉此相關技術者咸了解之某些條件下與包含第二核苷酸序列之寡核苷酸或聚核苷酸雜交並形成雙螺旋結構之能力。此等條件可為例如，嚴苛條件，其中嚴苛條件包括：400mM NaCl、40mM PIPES pH 6.4、1mM EDTA，50℃或70℃進行12-16小時，然後洗滌(參見例如，“分子選殖法：實驗室手冊(Molecular Cloning：A Laboratory manual)，Sambrook等人(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press”)。可採用其他條件，如生物體內部可能遇到之生理上相關條件。熟悉此相關技術者均可依據最終雜交核苷酸之用途，決定最適合測試兩個序列之互補性之條件。
iRNA(例如，本文說明之dsRNA)內之互補序列包括包含第一核苷酸序列之寡核苷酸或聚核苷酸與包含第二核苷酸序列之寡核苷酸或聚核苷酸沿著其中一或兩個核苷酸序列之整個長度之鹼基配對。此等序列在本文中可 稱為其彼此“完全互補”。然而，若第一序列相對於本文第二序列稱為“實質上互補”時，則該等兩個序列可能完全互補，或當具有至多30鹼基對之雙螺旋在雜交時，其可能形成一或多對，通常不會有超過5、4、3或2對錯配鹼基，而在與其最終用途(例如，經由RISC途徑抑制基因表現)最相關之條件下仍保留雜交能力。然而，若兩個寡核苷酸之設計在於雜交時形成一個或多個單股突出時，則此等突出不應在決定互補性時視為錯配。例如，包含一個長度為21個核苷酸之寡核苷酸與另一個長度為23個核苷酸之寡核苷酸之dsRNA中，包含一個與該較短寡核苷酸完全互補之21個核苷酸序列之較長寡核苷酸在本發明所說明目的下，仍可稱為“完全互補”。
本文所採用“互補”序列亦可包括非華生-克里克(Watson-Crick)鹼基對及/或由非天然與經修飾之核苷酸形成之鹼基對，或完全由其組成，只要符合上述雜交能力之要求即可。此等非華生-克里克(Watson-Crick)鹼基對包括(但不限於)：G：U搖擺或胡斯坦(Hoogstein)鹼基配對。
本文中有關dsRNA之正義股與反義股之間或iRNA劑之反義股與標靶序列之間鹼基配對之內容所採用之術語“互補”、“完全互補”與“實質上互補”可由其用途之內容中了解。
本文所採用與信使RNA(mRNA)之“至少一部份實質上互補”之聚核苷酸係指該聚核苷酸與所需 mRNA(例如，編碼Serpinc1之mRNA)之連續部份實質上互補。例如，若該序列係與編碼Serpinc1之mRNA之非中斷部份實質上互補時，則該聚核苷酸係與至少一部份Serpinc1 mRNA互補。
因此某些具體實施例中，本文所揭示反義股聚核苷酸係與標靶Serpinc1序列完全互補。其他具體實施例中，本文所揭示反義股聚核苷酸係與標靶Serpinc1序列實質上互補，且包含連續核苷酸序列與核苷酸序列SEQ ID NO：1之完整長度至同等區或SEQ ID NO：1之片段至少約80%互補，如約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%互補。
一項具體實施例中，本發明RNAi劑包括與反義聚核苷酸實質上互補之正義股，該反義股再與標靶Serpinc1序列互補，且其中該正義股聚核苷酸所包含之連續核苷酸序列與核苷酸序列SEQ ID NO：5之完整長度至同等區或SEQ ID NO：5之片段至少約80%互補，如約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%互補。
本發明一項態樣中，本發明方法與組成物所採用之製劑為經由反義抑制機制以抑制標靶mRNA之單股反義RNA分子。單股反義RNA分子係與標靶mRNA內之序列互補。單股反義寡核苷酸可藉由與mRNA進行鹼基 配對，依化學計量方式抑制轉譯，並以物理方式阻斷轉譯機制，參見Dias,N.等人(2002)Mol Cancer Ther 1：347-355。單股反義RNA分子之長度可為約15至約30個核苷酸且具有與標靶序列互補之序列。例如，單股反義RNA分子可能包含選自本文所說明任一種反義序列且具有至少約15、16、17、18、19、20、或更多個連續核苷酸之序列。
本文所採用術語“抑制”可與“降低”、“靜默”、“下調”、“壓制”及其他類似術語交換使用，且包括任何程度之抑制作用。
片語“抑制Serpinc1表現”包括抑制任何Serpinc1基因(如，例如，小鼠Serpinc1基因、大鼠Serpinc1基因、猴Serpinc1基因、或人類Serpinc1基因)及編碼Serpinc1蛋白質之Serpinc1基因之變異體或突變體之表現。
“抑制Serpinc1基因之表現”包括Serpinc1基因之任何抑制程度，例如，至少部份壓制Serpinc1基因之表現，如抑制至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%。
Serpinc1基因之表現可依據與Serpinc1基因表現相關之任何變數來分析，例如，Serpinc1 mRNA含量、 Serpinc1蛋白質含量、或例如，用於測定凝血酶產生潛力之凝血酶：抗凝血酶複合物含量、出血時間、凝血酶原時間(PT)、血小板計數、與/或活化的部分凝血活酶時間(aPTT)。可由其中一或多種變數與對照組含量比較其絕對或相對下降程度，分析抑制性。對照組含量可能為相關技藝上採用之任何型態之對照組含量，例如，投藥前之基線值或由未處理或接受對照物(如，例如，僅使用緩衝劑之對照物或含無活性劑之對照物)處理之類似個體、細胞或檢體所測得之含量。
一項具體實施例中，對Serpinc1基因表現之至少部份壓制性可由從其中Serpinc1基因已轉錄且已接受處理以致抑制Serpinc1基因表現之第一細胞或細胞群中所單離或所檢測之Serpinc1 mRNA相對於實質上與該第一細胞或細胞群相同但未曾接受如此處理之第二細胞或細胞群(對照組細胞)之降低程度來分析。採用下列公式表示抑制程度：
本文所採用片語“細胞與RNAi劑接觸”，如dsRNA，包括依任何可能方式接觸細胞。細胞與RNAi劑之接觸包括細胞於活體外與iRNA接觸或細胞於活體內與iRNA接觸。該接觸可能直接或間接進行。因此，例如，可能由執行該方法之個體讓RNAi劑與細胞進行物理性接 觸，或者，可能讓RNAi劑處於容許或導致其隨後得以接觸細胞之狀態下。
細胞於活體外之接觸法可能為，例如，藉由細胞與RNAi劑培養。細胞於活體內之接觸可能為例如，注射RNAi劑至該細胞所在之組織內或附近，或注射RNAi劑至另一個區域，例如，血流或皮下空間，因此該製劑隨後即可到達希望接觸之細胞所在之組織位置。例如，RNAi劑可能包含及/或可能偶聯配體，例如，GalNAc3，其主導RNAi劑至所需位點，例如，肝臟。亦可能組合活體外與活體內接觸方法。例如，細胞亦可於活體外與RNAi劑接觸，隨後再移植入個體內。
一項具體實施例中，細胞與iRNA之接觸包括藉由促進或有效於接收或吸收至細胞內，而“導入”或“傳遞iRNA至細胞”。可透過無助力之擴散或主動細胞過程，或透過輔劑或裝置，吸收或接收iRNA。可能於活體外與/或活體內導入iRNA至細胞內。例如，於活體內導入iRNA時，將其注射至組織位點或全身性投藥。亦可利用β-葡聚醣傳遞系統於活體內傳遞，如彼等說明於美國專利案案號5,032,401與5,607,677、與美國公開案案號2005/0281781中者，其完整揭示內容已以引用之方式併入本文中。於活體外導入至細胞中之方法包括相關技藝上已知方法，如電穿孔法與脂染法。其他方法說明於下文與/或係相關技藝上已知者。
II. 本發明方法
本發明提供一種醫療與預防方法，其包括對該罹患Serpinc1-相關疾病(例如，出血疾患，例如，血友病(例如，血友病A、血友病B、或血友病C)之個體投藥iRNA劑或包含本發明iRNA劑之醫藥組成物。本發明有些態樣中，該方法進一步包括對該個體投藥另一種醫療劑。
本發明某些具體實施例中，例如，當雙股RNAi劑包括在三個連續核苷酸有三個相同修飾之一個或多個基序(包括在該製劑之裂解位點或接近裂解位點之一個此等基序)、6個硫代磷酸鍵連、及GalNAc配體時，此等製劑之投藥劑量為約0.01至約0.5mg/kg、約0.01至約0.4mg/kg、約0.01至約0.3mg/kg、約0.01至約0.2mg/kg、約0.01至約0.1mg/kg、約0.01mg/kg至約0.09mg/kg、約0.01mg/kg至約0.08mg/kg、約0.01mg/kg至約0.07mg/kg、約0.01mg/kg至約0.06mg/kg、約0.01mg/kg至約0.05mg/kg、約0.02至約0.5mg/kg、約0.02至約0.4mg/kg、約0.02至約0.3mg/kg、約0.02至約0.2mg/kg、約0.02至約0.1mg/kg、約0.02mg/kg至約0.09mg/kg、約0.02mg/kg至約0.08mg/kg、約0.02mg/kg至約0.07mg/kg、約0.02mg/kg至約0.06mg/kg、約0.02mg/kg至約0.05mg/kg、約0.03至約0.5mg/kg、約0.03至約0.4mg/kg、約0.03至約0.3mg/kg、約0.03至約0.2mg/kg、約0.03至約0.1mg/kg、約0.03mg/kg至約0.09mg/kg、約0.03mg/kg至約0.08mg/kg、約0.03mg/kg至約0.07mg/kg、約0.03mg/kg至約0.06mg/kg、約0.03mg/kg至約0.05mg/kg、約0.04至約 0.5mg/kg、約0.04至約0.4mg/kg、約0.04至約0.3mg/kg、約0.04至約0.2mg/kg、約0.04至約0.1mg/kg、約0.04mg/kg至約0.09mg/kg、約0.04mg/kg至約0.08mg/kg、約0.04mg/kg至約0.07mg/kg、約0.04mg/kg至約0.06mg/kg、約0.05至約0.5mg/kg、約0.05至約0.4mg/kg、約0.05至約0.3mg/kg、約0.05至約0.2mg/kg、約0.05至約0.1mg/kg、約0.05mg/kg至約0.09mg/kg、約0.05mg/kg至約0.08mg/kg、或約0.05mg/kg至約0.07mg/kg。上述數值之間之數值與範圍亦為本發明之一部份，例如，RNAi劑可依劑量約0.015mg/kg至約0.45mg/mg投藥該個體。
例如，RNAi劑，例如，呈醫藥組成物之RNAi劑之投藥劑量可為約0.01mg/kg、0.0125mg/kg、0.015mg/kg、0.0175mg/kg、0.02mg/kg、0.0225mg/kg、0.025mg/kg、0.0275mg/kg、0.03mg/kg、0.0325mg/kg、0.035mg/kg、0.0375mg/kg、0.04mg/kg、0.0425mg/kg、0.045mg/kg、0.0475mg/kg、0.05mg/kg、0.0525mg/kg、0.055mg/kg、0.0575mg/kg、0.06mg/kg、0.0625mg/kg、0.065mg/kg、0.0675mg/kg、0.07mg/kg、0.0725mg/kg、0.075mg/kg、0.0775mg/kg、0.08mg/kg、0.0825mg/kg、0.085mg/kg、0.0875mg/kg、0.09mg/kg、0.0925mg/kg、0.095mg/kg、0.0975mg/kg、0.1mg/kg、0.125mg/kg、0.15mg/kg、0.175mg/kg、0.2mg/kg、0.225mg/kg、0.25mg/kg、0.275mg/kg、0.3mg/kg、0.325mg/kg、0.35mg/kg、0.375mg/kg、0.4mg/kg、0.425mg/kg、0.45mg/kg、0.475mg/kg、或約 0.5mg/kg。上述數值之間之數值亦為本發明之一部份。
因此，一項態樣中，本發明提供一種為罹患可因降低Serpinc1表現而受益之疾患(例如，出血疾患，例如，血友病)之個體預防至少一種症狀之方法。該方法包括對該個體投藥預防有效劑量(例如，劑量約0.010mg/kg至約0.500mg/kg)之本發明iRNA劑，例如，dsRNA(例如，包含本發明dsRNA之醫藥組成物)，藉以為該罹患可因降低Serpinc1表現而受益之疾患之個體預防至少一種症狀。
另一項態樣中，本發明提供一種治療罹患可因降低Serpinc1表現而受益之疾患(例如，出血疾患，例如，血友病)之個體之方法，其包括對該個體(例如，人類)投藥醫療有效劑量(例如，劑量約0.010mg/kg至約0.500mg/kg)之靶向Serpinc1基因之iRNA劑或包含靶向Serpinc1基因之iRNA劑之醫藥組成物，藉以治療該罹患可因降低Serpinc1表現而受益之疾患之個體。
另一項態樣中，本發明提供一種以預防有效劑量(例如，劑量約0.010mg/kg至約0.500mg/kg)之本發明iRNA(例如，dsRNA)於為罹患可因降低及/或抑制Serpinc1表現而受益之疾患(如出血疾患，例如，血友病)之個體預防至少一種症狀上之用途。
另一項態樣中，本發明提供一種以預防有效劑量(例如，劑量約0.001mg/kg至約0.500mg/kg)之本發明iRNA劑於製造供為罹患可因降低及/或抑制Serpinc1表現而受益之疾患(如出血疾患，例如，血友病)之個體預防 至少一種症狀之醫藥上之用途。
另一項態樣中，本發明提供一種以醫療有效劑量(例如，劑量約0.010mg/kg至約0.500mg/kg)之本發明iRNA劑於治療個體，例如，罹患可因降低及/或抑制Serpinc1表現而受益之疾患(如出血疾患，例如，血友病)之個體上之用途。
又另一態樣中，本發明提供一種以靶向Serpinc1基因之本發明iRNA劑(例如，dsRNA)或包含醫療有效劑量(例如，劑量約0.010mg/kg至約0.500mg/kg)之靶向Serpinc1基因之iRNA劑之醫藥組成物於製造供治療個體，例如，可因降低及/或抑制Serpinc1表現而受益之個體，如罹患出血疾患(例如，血友病)之個體之醫藥上之用途。
本發明某些具體實施例中，例如，當雙股RNAi劑包含正義股及反義股，該反義股包含互補區，其包含至少15個連續核苷酸(其與核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’之差異不超過3個核苷酸)，其中正義股之實質上所有核苷酸及反義股之實質上所有核苷酸為經修飾之核苷酸，且其中該正義股係接合至附接在3’-終端之配體時，此等製劑之投藥劑量為約0.015mg/kg至約0.15mg/kg、約0.02mg/kg至約0.15mg/kg、0.02mg/kg至約0.15mg/kg、0.03mg/kg至約0.15mg/kg、0.04mg/kg至約0.15mg/kg、0.05mg/kg至約0.15mg/kg、0.06mg/kg至約0.15mg/kg、0.07mg/kg至約0.15mg/kg、0.08mg/kg至 約0.15mg/kg、0.09mg/kg至約0.15mg/kg、0.01mg/kg至約0.15mg/kg、0.015mg/kg至約0.1mg/kg、0.015mg/kg至約0.09mg/kg、0.015mg/kg至約0.08mg/kg、0.015mg/kg至約0.07mg/kg、0.015mg/kg至約0.06mg/kg、0.015mg/kg至約0.05mg/kg、0.015mg/kg至約0.04mg/kg、0.015mg/kg至約0.03mg/kg、0.015mg/kg至約0.02mg/kg、0.045mg/kg至約0.15mg/kg、0.075mg/kg至約0.15mg/kg、0.045mg/kg至約0.1mg/kg、0.075mg/kg至約0.1mg/kg、0.045mg/kg至約0.125mg/kg、或約0.075mg/kg至約0.125mg/kg。
例如，RNAi劑(例如，呈醫藥組成物之RNAi劑)之投藥劑量可為約0.01mg/kg、0.0125mg/kg、0.015mg/kg、0.0175mg/kg、0.02mg/kg、0.0225mg/kg、0.025mg/kg、0.0275mg/kg、0.03mg/kg、0.0325mg/kg、0.035mg/kg、0.0375mg/kg、0.04mg/kg、0.0425mg/kg、0.045mg/kg、0.0475mg/kg、0.05mg/kg、0.0525mg/kg、0.055mg/kg、0.0575mg/kg、0.06mg/kg、0.0625mg/kg、0.065mg/kg、0.0675mg/kg、0.07mg/kg、0.0725mg/kg、0.075mg/kg、0.0775mg/kg、0.08mg/kg、0.0825mg/kg、0.085mg/kg、0.0875mg/kg、0.09mg/kg、0.0925mg/kg、0.095mg/kg、0.0975mg/kg、0.1mg/kg、0.125mg/kg、或0.15mg/kg。上述數值之間之數值亦為本發明之一部份。
因此，本發明在一項態樣中提供一種為罹患可因降低Serpinc1表現而受益之疾患(例如，出血疾患，例如，血友病)之個體預防至少一種症狀之方法。該方法包 括對該個體投藥預防有效劑量(例如，劑量約0.015mg/kg至約0.15mg/kg)之雙股核糖核酸(RNAi)劑，其包含正義股及反義股，該反義股包含互補區，其包含至少15個連續核苷酸(其與核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’之差異不超過3個核苷酸)，其中正義股之實質上所有核苷酸及反義股之實質上所有核苷酸為經修飾之核苷酸，且其中該正義股係接合至附接在3’-終端之配體(例如，包含RNAi劑之醫藥組成物)，藉以為該罹患可因降低Serpinc1表現而受益之疾患之個體預防至少一種症狀。
另一項態樣中，本發明提供一種治療罹患可因降低Serpinc1表現而受益之疾患(例如，出血疾患，例如，血友病)之個體之方法，其包括對個體(例如，人類)投藥醫療有效劑量(例如，劑量約0.010mg/kg至約0.500mg/kg)之雙股核糖核酸(RNAi)劑，其包含正義股及反義股，該反義股包含互補區，其包含至少15個連續核苷酸(其與核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’之差異不超過3個核苷酸)，其中正義股之實質上所有核苷酸及反義股之實質上所有核苷酸為經修飾之核苷酸，且其中該正義股係接合於附接在3’-終端之配體，或投藥包含靶向Serpinc1基因之iRNA劑之醫藥組成物，藉以治療該罹患可因降低Serpinc1表現而受益之疾患之個體。
另一項態樣中，本發明提供一種以預防有效劑量(例如，劑量約0.010mg/kg至約0.1500mg/kg)之雙股核糖核酸(RNAi)劑，其包含正義股及反義股，該反義股 包含互補區，其包含至少15個連續核苷酸(其與核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’之差異不超過3個核苷酸)，其中正義股之實質上所有核苷酸及反義股之實質上所有核苷酸為經修飾之核苷酸，且其中該正義股係接合至附接在3’-終端之配體，為罹患可因降低及/或抑制Serpinc1表現而受益之疾患(例如，出血疾患，例如，血友病)之個體預防至少一種症狀上之用途。
另一項態樣中，本發明提供一種以預防有效劑量(例如，劑量約0.001mg/kg至約0.15mg/kg)之雙股核糖核酸(RNAi)劑，其包含正義股及反義股，該反義股包含互補區，其包含至少15個連續核苷酸(其與核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’之差異不超過3個核苷酸)，其中正義股之實質上所有核苷酸及反義股之實質上所有核苷酸為經修飾之核苷酸，且其中該正義股係接合至附接在3’-終端之配體，於製造為罹患可因降低及/或抑制Serpinc1表現而受益之疾患(例如，出血疾患，例如，血友病)之個體預防至少一種症狀之醫藥上之用途。
另一項態樣中，本發明提供一種以醫療有效劑量(例如，劑量約0.010mg/kg至約0.15mg/kg)之雙股核糖核酸(RNAi)劑，其包含正義股及反義股，該反義股包含互補區，其包含至少15個連續核苷酸(其與核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’之差異不超過3個核苷酸)，其中正義股之實質上所有核苷酸及反義股之實質上所有核苷酸為經修飾之核苷酸，且其中該正義股係接 合至附接在3’-終端之配體，於治療個體，例如，可因降低及/或抑制Serpinc1表現而受益之個體上之用途。
又另一項態樣中，本發明提供一種以本發明靶向Serpinc1基因之iRNA劑(例如，dsRNA)或包含醫療有效劑量(例如，劑量約0.010mg/kg至約0.500mg/kg)之雙股核糖核酸(RNAi)劑(其包含正義股及反義股，該反義股包含互補區，其包含至少15個連續核苷酸(其與核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’之差異不超過3個核苷酸)，其中正義股之實質上所有核苷酸及反義股之實質上所有核苷酸為經修飾之核苷酸，且其中該正義股係接合至附接在3’-末端之配體)之醫藥組成物於製造治療個體(例如，可因降低及/或抑制Serpinc1表現而受益之個體，如罹患出血疾患(例如，血友病)之個體)之醫藥上之用途。
本發明之方法及用途包括投藥本文所說明之組成物，藉以降低標靶Serpinc1基因之表現，如為期約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、或約80天。一項具體實施例中，標靶Serpinc1基因之表現可長期降低，例如，至少約7天或更久，例如，約一週、兩週、三週、約四週、約5週、或約6週、或更久。
可採用相關技藝上已知之任何方法分析基因表現之降低。例如可採用熟悉此相關技術者已知之例如，北方墨點法、qRT-PCR等例行方法之一，測定Serpinc1之mRNA表現量，採用熟悉此相關技術者已知之如西方墨點法、免疫技術等例行方法之一，測定Serpinc1之蛋白質含量，及/或測定Serpinc1之生物活性，如影響與細胞血液凝結機轉有關(或在活體內與血液凝結本身有關)之一或多種分子，來決定Serpinc1表現之降低。一項具體實施例中，使用例如，全血之ROTEM®血栓彈性分析，測定凝血酶產生時間、血塊形成時間與/或凝血時間，以分析Serpinc1表現。
根據本發明方法及用途投藥dsRNA可能降低罹患Serpinc1-相關疾病之患者之此等疾病或疾患之嚴重性、癥兆、症狀與/或標記物。本文中“降低”意指在統計學上顯著降低此等含量。該降低可為例如，至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或約100%。
治療或預防疾病之效力之評估法可為例如，測定疾病進展、疾病消退、症狀嚴重性、出血頻率、疼痛減輕、生活品質、需要維持治療效果時之醫藥劑量、適合該所治療疾病或預防目標之疾病標記物或任何其他可測量之參數值。熟悉此相關技術者均有能力藉由測定其中任一種參數或任何參數組合，來追蹤治療或預防之效力。例如，可能藉由例如，定期追蹤凝血酶：抗凝血酶含量， 來評估出血疾患之治療效力。由後來之讀數與原始之讀數比較，即可指示醫師該治療是否有效。熟悉此相關技術者均有能力藉由測定其中任一種參數或任何參數組合，來追蹤治療或預防之效力。在投藥靶向Serpinc1之iRNA或其醫藥組成物之相關內容中，“有效對抗”出血疾患係指依臨床上適當方式投藥時，可以讓至少統計上顯著比例之患者得到有利效應，如改善症狀、治癒、減輕疾病、延長壽命、改善生活品質或熟悉治療出血疾患與相關病因之醫師通常認定為正向之其他效應。
當一或多種疾病狀態之參數出現統計上顯著改善時，或不會再惡化或發展出原本預期之症狀時，即證實該治療或預防效果。例如，疾病之可測定參數之有利變化為至少10%，較佳為至少20%、30%、40%、50%或更高，表示為有效之治療。針對特定iRNA藥物或該藥物之調配物之藥效亦可採用相關技藝上已知針對該疾病之實驗動物模式來判斷。當採用實驗動物模式時，當觀察到標記物或症狀在統計學上顯著下降時，即證實有治療效力。
或者，可由熟悉此相關診斷技術者依據臨床上可接受之疾病嚴重性量表決定疾病嚴重性之降低，來測定其藥效。採用適當量表測定之任何正向變化結果(例如，減輕疾病嚴重性)均代表使用本文所說明iRNA或iRNA調配物之適當治療。
該iRNA(或包含該iRNA之醫藥組成物)可投藥該個體約一週一次、約一個月2次、約每6週一次、或 約每2個月一次。
雙股iRNA劑可投藥個體一個或多個劑量。例如，雙股iRNA劑可依每週劑量約0.010mg/kg至約0.15mg/kg為期3週，或依每週劑量約0.01125mg/kg至約0.1125mg/kg為期4週，或依每月劑量約0.03mg/kg至約0.3mg/kg一個月一次投藥個體。
一項具體實施例中，該雙股RNAi劑包含正義股及反義股，該反義股包含互補區，其包含至少15個連續核苷酸(其與核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’之差異不超過3個核苷酸)，其中正義股之實質上所有核苷酸及反義股之實質上所有核苷酸為經修飾之核苷酸，且其中該正義股係接合至附接在3’-終端之配體，其係依每週劑量約0.015mg/kg至約0.125mg/kg投藥該個體。
另一項具體實施例中，該雙股RNAi劑包含正義股及反義股，該反義股包含互補區，其包含至少15個連續核苷酸(其與核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’之差異不超過3個核苷酸)，其中正義股之實質上所有核苷酸及反義股之實質上所有核苷酸為經修飾之核苷酸，且其中該正義股係接合至附接在3’-終端之配體，其係依每週劑量約0.045mg/kg至約0.125mg/kg投藥該個體。
又另一項具體實施例中，該雙股RNAi劑包含正義股及反義股，該反義股包含互補區，其包含至少15 個連續核苷酸(其與核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’之差異不超過3個核苷酸)，其中正義股之實質上所有核苷酸及反義股之實質上所有核苷酸為經修飾之核苷酸，且其中該正義股係接合至附接在3’-終端之配體，其係依每週劑量約0.075mg/kg至約0.125mg/kg投藥該個體。
一項具體實施例中，該雙股RNAi劑包含正義股及反義股，該反義股包含互補區，其包含至少15個連續核苷酸(其與核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’之差異不超過3個核苷酸)，其中正義股之實質上所有核苷酸及反義股之實質上所有核苷酸為經修飾之核苷酸，且其中該正義股係接合至附接在3’-終端之配體，其係依每月劑量約0.015mg/kg至約0.125mg/kg投藥該個體。
另一項具體實施例中，該雙股RNAi劑包含正義股及反義股，該反義股包含互補區，其包含至少15個連續核苷酸(其與核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’之差異不超過3個核苷酸)，其中正義股之實質上所有核苷酸及反義股之實質上所有核苷酸為經修飾之核苷酸，且其中該正義股係接合至附接在3’-終端之配體，其係依每月劑量約0.045mg/kg至約0.125mg/kg投藥該個體。
又另一項具體實施例中，該雙股RNAi劑包含正義股及反義股，該反義股包含互補區，其包含至少15 個連續核苷酸(其與核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’之差異不超過3個核苷酸)，其中正義股之實質上所有核苷酸及反義股之實質上所有核苷酸為經修飾之核苷酸，且其中該正義股係接合至附接在3’-終端之配體，其係依每月劑量約0.075mg/kg至約0.125mg/kg投藥該個體。
該投藥法可以重複，例如，定期重複，如每週、雙週(亦即每兩週)為期一個月、兩個月、三個月、四個月、或更久。經過初次療程後，該治療法可以減少投藥頻率。例如，經過每週或雙週投藥為期3個月後，可以每個月重複投藥一次，為期6個月或一年或更久。
因此，有些具體實施例中，RNAi劑之投藥療程包括頻繁投藥之“加載期”，然後為RNAi劑之投藥間隔時間較長之“維持期”。
加載投藥時程與/或維持投藥時程可視需要重複一或多次。重複次數可隨所需達成效果(例如，壓制Serpinc1基因)、與/或達成醫療或預防效果(例如，增加血液凝結、縮短血塊形成時間，與/或縮短凝血時間)而定。
投藥iRNA可使例如，患者之細胞、組織、血液、尿液或其他區間中之Serpinc1含量降低至少約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、 46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或至少約99%或更多。
該iRNA可採用靜脈內輸注投藥，歷時如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或約25分鐘期間。
投藥全劑量之iRNA之前，患者可先接受投藥較小劑量，如輸注5%，並監測不良效應，如過敏反應。另一項實例中，可監測患者之不期望之免疫刺激效應，如細胞激素(例如，TNF-α或INF-α)含量增加。
由於根據本發明組成物或由其製成之醫藥組成物對Serpinc1表現具有抑制效應，因此可提高生活品質。
本發明iRNA可呈“裸”型投藥，或呈“游離iRNA”投藥。裸iRNA係在沒有醫藥組成物之存在下投藥。裸iRNA可含於合適緩衝溶液中。該緩衝溶液可能包含乙酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶穀蛋白、碳酸鹽、或磷酸鹽、或其任何組合。一項具體實施例中，緩衝溶液為磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。可以調整包含iRNA之緩衝溶液之pH與滲透壓，以便適合投藥個體。
或者，本發明iRNA可呈醫藥組成物投藥， 如dsRNA脂質體調配物。
可因降低及/或抑制Serpinc1基因表現而受益之個體為彼等罹患出血疾患，例如，先天性出血疾患或如本文所說明後天性出血疾患之個體。一項具體實施例中，該罹患先天性出血疾患之個體患有血友病，例如，血友病A、B、或C。一項具體實施例中，該罹患先天性出血疾患(例如，血友病)之個體為抑制劑個體(對置換凝血因子變得頑抗之個體)。一項具體實施例中，該抑制劑個體罹患血友病A。另一項具體實施例中，該抑制劑個體罹患血友病B。又另一項具體實施例中，該抑制劑個體罹患血友病C。可因降低及/或抑制Serpinc1基因表現而受益之個體之治療法包括醫療性(例如，依需要，例如，該個體在出血中(自發性出血或因創傷所致之出血)且無法凝血)及預防性(例如，該個體未出血及/或將接受手術)治療。
本發明進一步提供一種使用iRNA或其醫藥組成物之方法及用途，例如，用於治療可因降低及/或抑制Serpinc1表現而受益之個體，例如，罹患出血疾患之個體，其係與其他醫藥及/或其他醫療方法組合，例如，與已知醫藥及/或已知醫療方法(如，例如，彼等目前用於治療此等疾患之方法)組合。
例如，某些具體實施例中，靶向Serpinc1之iRNA係與例如，適用於治療本文所說明出血疾患之製劑組合投藥。例如，適用於治療可因降低Serpinc1表現而受益之個體(例如，罹患出血疾患之個體)之其他醫療劑及 醫療方法包括新鮮冷凍血漿(FFP)；重組FVIIa；重組FIX；FXI濃縮物；含病毒滅活之vWF之FVIII濃縮物；去敏化療法，其可包括大劑量之FVIII或FIX，及類固醇或靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)與環磷醯胺；血漿分離術組合免疫抑制及輸注FVIII或FIX，採用或不採用抗纖維蛋白溶解療法；誘發免疫耐受性(ITI)，採用或不採用免疫抑制療法(例如，環磷醯胺、潑尼松(prednisone)、與/或抗-CD20)；去胺增壓素(desmopressin)乙酸鹽[DDAVP]；抗纖維蛋白溶酶劑，如胺基己酸及傳明酸(tranexamic acid)；活化凝血酶原複合物濃縮物(PCC)；抗血友病劑；皮質類固醇；免疫抑制劑；及雌激素。
iRNA與其他醫療劑及/或治療法可同時投藥及/或在相同組合中投藥，例如，非經腸式，或該其他醫療劑可做為分開組成物之一部份投藥或在分開時間投藥及/或採用相關技藝上已知或本文說明之另一種方法投藥。
一項具體實施例中，本發明提供一種治療罹患出血疾患(例如，血友病)之個體之方法，其係對該個體經皮下投藥化合物AD-57213(正義股：5’-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3’(SEQ ID NO：13)及反義股：5’-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3’(SEQ ID NO：14)，其中A、C、G、及U為核糖A、C、G或U；a、c、g、及u為2'-O-甲基(2'-OMe)A、C、G、或U；Af、Cf、Gf或Uf為2'-氟A、C、G或U；及s為硫代磷酸鍵連)，劑量為約0.010mg/kg至約0.500mg/kg，例如，劑量約0.015 mg/kg至約0.15mg/kg。
III. 用於本發明方法之iRNA
本文說明之方法係使用改良之雙股RNAi劑，其抑制細胞中，如個體(例如，哺乳動物，如罹患Serpinc1-相關疾患(例如，出血疾患，例如，血友病)之人類)之細胞中之Serpinc1基因表現。
因此，本發明提供一種雙股RNAi劑，其具有可於活體內抑制標靶基因(亦即Serpinc1基因)表現之化學修飾。本發明某些態樣中，本發明iRNA之實質上所有核苷酸為經修飾。本發明其他具體實施例中，本發明iRNA之所有核苷酸為經修飾。本發明之iRNA中“實質上所有核苷酸為經修飾”係大部份但不一定全部經修飾，且可包括不超過5、4、3、2、或1個未修飾之核苷酸。
RNAi劑包含正義股及反義股。RNAi劑之各股長度範圍為12-30個核苷酸。例如，各股可為14-30個核苷酸之長度、17-30個核苷酸之長度、19-30個核苷酸之長度、25-30個核苷酸之長度、27-30個核苷酸之長度、17-23個核苷酸之長度、17-21個核苷酸之長度、17-19個核苷酸之長度、19-25個核苷酸之長度、19-23個核苷酸之長度、19-21個核苷酸之長度、21-25個核苷酸之長度、或21-23個核苷酸之長度。
正義股及反義股通常形成雙螺旋雙股RNA(“dsRNA”)，本文中亦稱為“RNAi劑”。RNAi劑之雙螺旋區可為12-30核苷酸對之長度。例如，雙螺旋區可為14-30 核苷酸對之長度、17-30核苷酸對之長度、27-30核苷酸對之長度、17-23核苷酸對之長度、17-21核苷酸對之長度、17-19核苷酸對之長度、19-25核苷酸對之長度、19-23核苷酸對之長度、19-21核苷酸對之長度、21-25核苷酸對之長度、或21-23核苷酸對之長度。另一項實例中，雙螺旋區之長度係選自：15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、及27個核苷酸。
一項具體實施例中，該RNAi劑可在其中一股或兩股之3’-末端、5’-末端、或兩端包含一個或多個突出區與/或封端基團。該突出可為1-6個核苷酸之長度，例如，2-6個核苷酸之長度、1-5個核苷酸之長度、2-5個核苷酸之長度、1-4個核苷酸之長度、2-4個核苷酸之長度、1-3個核苷酸之長度、2-3個核苷酸之長度、或1-2個核苷酸之長度。該突出可由其中一股之長度超過另一股所造成，或由相同長度之兩股交錯造成。該突出可與標靶mRNA形成錯配或其可與所靶向之基因序列互補或可為另一個序列。第一與第二股可以例如，利用外加鹼基聯結形成髮夾型，或利用其他非鹼基連接基連接。
一項具體實施例中，RNAi劑之突出區之核苷酸可彼此分別獨立為經修飾或未經修飾之核苷酸，包括(但不限於)：2’-糖修飾，如2-F、2’-O甲基、胸苷(T)、2'-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(Teo)、2'-O-甲氧基乙基腺苷(Aeo)、2'-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷(m5Ceo)，及其任何其組合。例如，TT可為任一股上任一末端之突出序列。突出 可與標靶mRNA形成錯配，或其可與所靶向之基因序列互補或可為另一個序列。
RNAi劑之正義股、反義股或兩股之5’-或3’-突出可經過磷酸化。有些具體實施例中，突出區(群)包含兩個核苷酸，其在這兩個核苷酸之間具有硫代磷酸酯根，其中這兩個核苷酸可相同或不同。一項具體實施例中，突出存在於正義股、反義股或兩股之3’-末端。一項具體實施例中，此3’-突出存在於反義股上。一項具體實施例中，此3’-突出存在於正義股上。
RNAi劑可能僅包含單一突出，其可強化RNAi之干擾活性，不會影響整體穩定性。例如，單股突出可能位於正義股之3'-終端，或者在反義股之3'-終末端。RNAi亦可能在反義股之5’-末端(或正義股之3’-末端)具有鈍末端，或反之亦然。通常RNAi之反義股在3’-末端具有核苷酸突出，且5’-末端為鈍端。在不希望受到理論限制下，反義股5’-末端之不對稱鈍末端與反義股3’-末端之突出有利於引導該股進入RISC過程。
任何如本發明所說明特徵之核酸均可採用相關技藝上習知之方法合成與/或修飾，如彼等說明於“最新核酸化學方法(Current protocols in nucleic acid chemistry)，Beaucage,S.L.等人(編輯)，John Wiley & Sons,Inc.,New York,NY,USA”，其揭示內容已以引用之方式併入本文中。修飾法包括，例如，末端修飾，例如，5’-末端修飾(磷酸化、接合、反向鍵連)或3’-末端修飾(接合、DNA 核苷酸、反向鍵連等等)；鹼基修飾，例如使用穩定化鹼基、去穩定化鹼基或會與對象之擴張區之鹼基配對之鹼基置換、排除鹼基(去鹼基核苷酸)、或接合鹼基；糖修飾(例如，位於2’-位置或4’-位置)或置換糖；與/或主鏈修飾，包括修飾或置換磷酸二酯鍵連。適用於本文所說明具體實施例之iRNA化合物之明確實例包括(但不限於)：包含經修飾主鏈或沒有天然核苷之間鍵連之RNA。具有經修飾主鏈之RNA特別包括彼等主鏈中沒有磷原子者。針對本說明書之目的及相關技藝上有時候提及者，其核苷間主鏈中沒有磷原子之經修飾RNA亦可視為寡核苷。有些具體實施例中，經修飾之iRNA將在其核苷間主鏈中具有一個磷原子。
經修飾之RNA主鏈包括，例如，硫代磷酸酯、對掌性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯、甲基與其他烷基之膦酸酯(包括膦酸3'-伸烷基酯與對掌性膦酸酯)、次膦酸酯、胺基磷酸酯(包括3'-胺基胺基磷酸酯與胺基烷基胺基磷酸酯)、硫羰基胺基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、與具有正常3'-5'鍵連之硼代磷酸酯、其等之2'-5'-鍵連類似物、及彼等具有反向極性者，其中相鄰之成對核苷單位係依3'-5'連接5'-3'或2'-5'連接5'-2'。亦包括各種不同鹽類、混合鹽類與游離酸型。
教示上述含磷鍵連製法之代表性美國專利案包括但不限於美國專利案案號3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,195；5,188,897；5,264,423； 5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,316；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,625,050；6,028,188；6,124,445；6,160,109；6,169,170；6,172,209；6,239,265；6,277,603；6,326,199；6,346,614；6,444,423；6,531,590；6,534,639；6,608,035；6,683,167；6,858,715；6,867,294；6,878,805；7,015,315；7,041,816；7,273,933；7,321,029；及US Pat RE39464，其完整揭示內容已以引用之方式併入本文中。
其中不包括磷原子之經修飾RNA主鏈所具有之主鏈係由短鏈烷基或環烷基核苷之間鍵連、混合雜原子、及烷基或環烷基核苷間鍵連、或一個或多個短鏈雜原子或雜環核苷間鍵連形成。此等包括彼等具有N-嗎啉基鍵連(一部份從核苷之糖部份體形成)；矽氧烷主鏈；硫醚、亞碸與碸主鏈；甲醯乙醯基(formacetyl)與硫甲醯乙醯基主鏈；亞甲基甲醯乙醯基與硫甲醯乙醯基主鏈；含烯烴主鏈；胺磺酸根主鏈；亞甲基亞胺基及亞甲基肼基主鏈；磺酸根與磺醯胺主鏈；醯胺主鏈；與其他具有混合N、O、S與CH2組成份者。
教示上述寡核苷製法之代表性美國專利案包括但不限於美國專利案案號5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,64,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240； 5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；與5,677,439，其揭示內容已以引用之方式併入本文中。
其他具體實施例中，涵括合適RNA擬似物用於iRNA，其中核苷酸單位之糖與核苷間鍵連(亦即主鏈)二者均被新穎基團置換。該等鹼基單位維持與適當核酸標靶化合物雜交。其中一種寡聚化合物為RNA擬似物，已顯示具有優異之雜交性質，稱為肽核酸(PNA)。PNA化合物中，RNA之糖主鏈被包含醯胺之主鏈(特定言之胺基乙基甘胺酸主鏈)置換。核鹼基則保留並直接或間接結合主鏈之醯胺部份之氮雜態氮原子。教示PNA化合物製法之代表性美國專利案包括但不限於美國專利案案號5,539,082；5,714,331；與5,719,262，其完整揭示內容已以引用之方式併入本文中。適用於本發明iRNA之其他PNA化合物說明於例如，Nielsen等人，Science,1991,254,1497-1500。
如本發明所說明特徵之某些具體實施例包括具有硫代磷酸酯主鏈之RNA與具有雜原子主鏈之寡核苷，特定言之上述美國專利案案號5,489,677之--CH2--NH--CH2-、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[稱為亞甲基(甲基亞胺基)或MMI主鏈]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--及--N(CH3)--CH2--CH2--[其中天然磷酸二酯主鏈係由--O--P--O--CH2--代表]，與上述美國專利案案號5,602,240之醯胺主鏈。有些具體實施例中，如本文所說明特徵之RNA具有上述美國專利案案號5,034,506之N-嗎啉 基主鏈結構。
經修飾之RNA亦可包含一個或多個經取代之糖部份基團。如本文所說明特徵之該等iRNA(例如，dsRNA)包括在2'-位置具有下列其中一項：OH；F；O-、S-、或N-烷基；O-、S-、或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中該烷基、烯基與炔基可為經取代或未經取代之C1至C10烷基或C2至C10烯基與炔基。合適修飾實例包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2).nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、及O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n與m為1至約10。其他具體實施例中，dsRNA在2'-位置包括下列其中一項：C1至C10低碳數烷基、經取代之低碳數烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、雜環烷基、雜環烷芳基、胺基烷基胺基、聚烷基胺基、經取代之矽烷基、RNA裂解基團、報導子基團、嵌入劑、改善iRNA之藥物動力學性質之基團、或改善iRNA之藥效動力學性質之基團、及具有類似性質之其他取代基。某些具體實施例中，該修飾包括2'-甲氧基乙氧基(2'-O--CH2CH2OCH3，亦稱為2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)(Martin等人，Helv.Chim.Acta,1995,78：486-504)，亦即烷氧基-烷氧基。另一種修飾實例為2'-二甲基胺基氧基乙氧基，亦即O(CH2)2ON(CH3)2基團(亦稱為2'-DMAOE，其說明於下文實例中)與2'-二甲基胺基乙氧基乙氧基(相關技藝上亦稱為2'-O-二甲基胺基乙氧基乙基或 2'-DMAEOE)，亦即2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2。
其他修飾包括2'-甲氧基(2'-OCH3)、2'-胺基丙氧基(2'-OCH2CH2CH2NH2)與2'-氟(2'-F)。亦可在iRNA之RNA上其他位置進行類似修飾，特定言之在3'終端核苷酸上糖之3'位置或在2'-5'連接dsRNA與5'終端核苷酸之5'位置。iRNA亦可改具有糖擬似物(如環丁基部份基團)替代呋喃戊糖基糖。教示此等經修飾糖結構製法之代表性美國專利案包括但不限於4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；及5,700,920，其中某些專利案已成為本申請案共同擁有。其完整揭示內容已以引用之方式併入本文中。
iRNA亦包括核鹼基(相關技藝上通常簡稱“鹼基”)修飾或取代。本文所採用“未經修飾”或“天然”核鹼基包括嘌呤鹼基腺嘌呤(A)與鳥嘌呤(G)，與嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)與尿嘧啶(U)。經修飾之核鹼基包括其他合成性與天然核鹼基，如去氧-胸腺嘧啶(dT)、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥基甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤、腺嘌呤與鳥嘌呤之6-甲基與其他烷基衍生物、腺嘌呤與鳥嘌呤之2-丙基與其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶與2-硫胞嘧啶、5-鹵尿嘧啶與胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶與胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶與胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-鹵基、 8-胺基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羥基與其他8-經取代之腺嘌呤與鳥嘌呤、5-鹵基(特定言之5-溴)、5-三氟甲基與其他5-經取代之尿嘧啶與胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤與7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤與8-氮雜腺嘌呤、7-去氮雜鳥嘌呤與7-去氮雜腺嘌呤與3-去氮雜鳥嘌呤與3-去氮雜腺嘌呤。其他核鹼基包括彼等揭示於美國專利案案號3,687,808、彼等揭示於”經修飾之核苷之生化學、生物技術與醫學(Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine),Herdewijn.P編輯，Wiley-VCH，2008”；彼等揭示於”聚合物科學與工程百科全書(The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering),p.858-859,,Kroschwitz,J.L.編輯，John Wiley & Sons,1990”；彼等揭示於Englisch等人之”應用化學(Angewandte Chemie)，國際版，1991,30,613”；與彼等揭示於Sanghvi,YS之”dsRNA研究與應用(dsRNA Research and Applications)，第15章，p.289-302,Crooke,S.T.與Lebleu,B.編輯，CRC Press,1993”。其中某些核鹼基特別適用於提高如本發明所說明特徵之寡聚化合物之結合親和性。此等包括5-經取代之嘧啶、6-氮雜嘧啶與N-2、N-6與O-6經取代之嘌呤，包括2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶與5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已顯示可使核酸雙螺旋穩定性提高0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.、Crooke,S.T.與Lebleu,B.編輯之“dsRNA研究與應用(dsRNA Research and Applications),CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278)”且成為鹼基取代實例，甚至更特別當 與2'-O-甲氧基乙基糖修飾組合時。
教示上述某些經修飾之核鹼基及其他經修飾之核鹼基製法之代表性美國專利案包括但不限於：美國專利案案號3,687,808,4,845,205；5,130,30；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121,5,596,091；5,614,617；5,681,941；5,750,692；6,015,886；6,147,200；6,166,197；6,222,025；6,235,887；6,380,368；6,528,640；6,639,062；6,617,438；7,045,610；7,427,672；及7,495,088，其完整揭示內容已以引用之方式併入本文中。
iRNA之RNA亦可經修飾，以包括一個或多個雙環糖部份基團。“雙環糖”為經兩個原子之橋基修飾之呋喃糖基環。“雙環糖苷”(“BNA”)為具有糖部份基團之核苷，該糖部份基團包含由糖環之兩個碳原子連接之橋基，藉以形成雙環系。某些具體實施例中，該橋基連接糖環之4'-碳與2'-碳。因此，本發明有些具體實施例中可包括iRNA之RNA亦可經修飾，以包括一個或多個鎖核酸(LNA)。鎖核酸為具有經修飾之核糖部份基團之核苷酸，其中該核糖部份基團額外包含連接2'與4'碳之橋基。換言之，LNA為一種包含雙環糖部份基團(其包含4'-CH2-O-2'-橋基)之核苷酸。此結構有效地“封鎖”3'-內部結構構形內之核糖。添加鎖核酸至siRNA中時，已顯示可以提高血清中siRNA穩定性，並降低偏離標靶之效應(Elmen,J.等人 (2005)Nucleic Acids Research 33(1)：439-447；Mook,OR.等人(2007)Mol Canc Ther 6(3)：833-843；Grunweller,A.等人(2003)Nucleic Acids Research 31(12)：3185-3193)。
用於本發明聚核苷酸之雙環核苷實例包括但不限於在4'與2'核糖基環原子之間包含橋基之核苷。某些具體實施例中，本發明反義聚核苷酸劑包括包含4'至2'橋基之一個或多個雙環核苷。此等4'至2'橋連雙環核苷實例包括但不限於4'-(CH2)-O-2'(LNA)；4'-(CH2)-S-2'；4'-(CH2)2-O-2'(ENA)；4'-CH(CH3)-O-2'(亦稱為“拘束性乙基”或“cEt”)及4'-CH(CH2OCH3)-O-2'(及其類似物；參見例如，美國專利案案號7,399,845)；4'-C(CH3)(CH3)-O-2'(及其類似物；參見例如，美國專利案案號8,278,283)；4'-CH2-N(OCH3)-2'(及其類似物；參見例如，美國專利案案號8,278,425)；4'-CH2-O-N(CH3)-2'(參見例如，美國專利公開案案號2004/0171570)；4'-CH2-N(R)-O-2'，其中R為H、C1-C12烷基、或保護基(參見例如，美國專利案案號7,427,672)；4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(參見例如，Chattopadhyaya等人，J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；及4'-CH2-C(-CH2)-2'(及其類似物；參見例如，美國專利案案號8,278,426)。上述各文獻之完整揭示內容已分別以引用之方式併入本文中。
其他教示鎖核酸核苷酸製法之代表性美國專利案及美國專利公告案包括但不限於下述者：美國專利案案號6,268,490；6,525,191；6,670,461；6,770,748； 6,794,499；6,998,484；7,053,207；7,034,133；7,084,125；7,399,845；7,427,672；7,569,686；7,741,457；8,022,193；8,030,467；8,278,425；8,278,426；8,278,283；US 2008/0039618；及US 2009/0012281，其完整揭示內容已分別以引用之方式併入本文中。
上述任何雙環核苷可製成具有一或多種立體化學糖組態，包括例如，α-L-呋喃核糖及β-D-呋喃核糖(參見WO 99/14226)。
iRNA之RNA亦可經修飾，以包括一個或多個拘束性乙基核苷酸。本文所採用“拘束性乙基核苷酸”或“cEt”為一種包含雙環糖部份基團(其含有4'-CH(CH3)-O-2'橋基)之鎖核酸。一項具體實施例中，該拘束性乙基核苷酸係呈S構形，本文稱為“S-cEt”。
本發明iRNA亦可包括一個或多個“限制構形核苷酸”(“CRN”)。CRN係核苷酸類似物，其具有連接核糖之C2’與C4’碳或核糖之C3與-C5'碳之連接基。CRN鎖住核糖環成為穩定之構形，並提高其與mRNA之雜交親合性。該連接基之長度足以讓氧置於最適合穩定性與親和性之位置，因此較少核糖環折皺。
教示上述某些CRN之製法之代表性公開文獻包括但不限於美國專利公開案案號2013/0190383；及PCT公開案WO 2013/036868，上述各文獻之完整揭示內容已分別以引用之方式併入本文中。
本發明iRNA之一個或多個核苷酸亦可包括 經羥甲基取代之核苷酸。“經羥甲基取代之核苷酸”為無環2’-3’-斷鍵(seco)-核苷酸，亦稱為“非鎖核酸”(“UNA”)修飾。
教示UNA製法之代表性美國公告案包括但不限於美國專利案案號8,314,227；及美國專利公開案案號2013/0096289；2013/0011922；及2011/0313020，上述各文獻之完整揭示內容已分別以引用之方式併入本文中。
RNA分子末端之可能穩定化修飾法可包括N-(乙醯基胺基己醯基)-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6-NHAc)、N-(己醯基)-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6)、N-(乙醯基)-4-羥基脯胺醇(Hyp-NHAc)、胸苷-2'-O-去氧胸苷(醚)、N-(胺基己醯基)-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6-胺基)、2-廿二碳烷醯基-尿苷-3"-磷酸酯、反轉鹼基dT(idT)，等等。此修飾法之揭示內容可參見PCT公告案案號WO 2011/005861。
A. 包含本發明基序之經修飾iRNA
本發明某些態樣中，本發明雙股RNAi劑包括依例如，美國臨時申請案案號61/561,710(申請日2011年11月18日)或PCT/US2012/065691(申請日2012年11月16日)之揭示內容進行化學修飾之製劑，其完整揭示內容已以引用之方式併入本文中。
如本文，臨時申請案案號61/561,710及PCT/US2012/065691所示，藉由在RNAi劑之正義股與/或反義股(特定言之在裂解位點或接近裂解位點處)導入在三個連續核苷酸上有三個相同修飾之一個或多個基序，可得到 優異結果。有些具體實施例中，RNAi劑之正義股與反義股可能完全經修飾。導入此等基序會中斷正義與/或反義股上可能存在之修飾型態。RNAi劑可視需要例如，在正義股上接合GalNAc衍生物配體。所得RNAi劑即具有優異之基因靜默活性。
更明確言之，已驚人地發現，當雙股RNAi劑之正義股與反義股為經修飾而在RNAi劑之至少一股之裂解位點或接近裂解位點處具有在三個連續核苷酸上有三個相同修飾之一個或多個基序時，可優異地提高RNAi劑之基因靜默活性。
一項具體實施例中，該RNAi劑為19個核苷酸長度之雙末端鈍端體，其中該正義股包含至少一個在5’末端起之位置7、8、9三個連續核苷酸上具有三個2’-F修飾之基序。反義股包含至少一個在5’末端起之位置11、12、13三個連續核苷酸上具有三個2’-O-甲基修飾之基序。
另一項具體實施例中，該RNAi劑為20個核苷酸長度之雙末端鈍端體，其中該正義股包含至少一個在5’末端起之位置8、9、10三個連續核苷酸上具有三個2’-F修飾之基序。反義股包含至少一個在5’末端起之位置11、12、13三個連續核苷酸上具有三個2’-O-甲基修飾之基序。
又另一項具體實施例中，該RNAi劑為21個核苷酸長度之雙末端鈍端體，其中該正義股包含至少一個在5’末端起之位置9、10、11三個連續核苷酸上具有三個2’-F修飾之基序。反義股包含至少一個在5’末端起之位 置11、12、13三個連續核苷酸上具有三個2’-O-甲基修飾之基序。
一項具體實施例中，該RNAi劑包含21個核苷酸之正義股與23個核苷酸之反義股，其中該正義股包含至少一個在5’末端起之位置9、10、11三個連續核苷酸上具有三個2’-F修飾之基序；反義股包含至少一個在5’末端起之位置11、12、13三個連續核苷酸上具有三個2’-O-甲基修飾之基序，其中RNAi劑之一末端為鈍端，而另一末端包含具有2個核苷酸之突出。較佳係該2個核苷酸突出位在反義股之3’-末端。當該2個核苷酸突出位在反義股之3’-末端時，終端三個核苷酸之間有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鍵連，其中該三個核苷酸中有兩個為突出核苷酸，第三個核苷酸為鄰接該突出核苷酸之配對核苷酸。一項具體實施例中，RNAi劑在正義股5’-末端與反義股5’-末端之兩端之末端三個核苷酸之間另外具有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鍵連。一項具體實施例中，RNAi劑之正義股與反義股中每一個核苷酸(包括作為基序之一部份之核苷酸)為經修飾之核苷酸。一項具體實施例，各殘基係獨立經2’-O-甲基或3’-氟修飾，例如，在交替之基序上。RNAi劑可視需要再包含配體(較佳為GalNAc3)。
一項具體實施例中，該RNAi劑包含正義與反義股，其中RNAi劑包含長度為至少25個及至多29個核苷酸之第一股與長度為至多30個核苷酸之第二股，其具有至少一個自5’末端起位置11、12、13連續三個核苷酸上 三個2’-O-甲基修飾之基序；其中第一股3’末端與第二股5’末端形成鈍末端，且第二股之3’末端比第一股長1至4個核苷酸，其中雙螺旋區之長度為至少25個核苷酸，且第二股與標靶mRNA沿著第二股至少19個核苷酸長度充份互補，當RNAi劑導入至哺乳動物細胞中時，降低標靶基因表現，且其中dicer裂解RNAi劑偏向於產生包含第二股3’末端之siRNA，藉以降低哺乳動物中之標靶基因表現。視需要地，該RNAi劑再包含配體。
一項具體實施例中，該RNAi劑之正義股劑包含至少一個在三個連續核苷酸上有三個相同修飾之基序，其中一個基序出現在正義股之裂解位點處。
一項具體實施例中，該RNAi劑之反義股亦可包含至少一個在三個連續核苷酸上有三個相同修飾之基序，其中一個基序出現在反義股之裂解位點或接近裂解位點處。
對於具有長度為17至23個核苷酸之雙螺旋區之RNAi劑，反義股之裂解位點通常約在自5’-末端起之10、11與12位置。因此，三個相同修飾之基序可能出現在反義股之9、10、11位置；10、11、12位置；11、12、13位置；12、13、14位置；或13、14、15位置，其係從反義股5’-末端起之第一個核苷酸開始計數，或從反義股5’-末端起之雙螺旋區內第一對核苷酸開始計數。反義股中之裂解位點亦可能隨RNAi從5’-末端開始之雙螺旋區長度變化。
RNAi劑之正義股可能在該股之裂解位點包含至少一個在三個連續核苷酸上有三個相同修飾之基序；且反義股可能在該股之裂解位點或接近裂解位點處具有至少一個在三個連續核苷酸上有三個相同修飾之基序。當正義股與反義股形成dsRNA雙螺旋時，正義股與反義股可排比以使正義股上三個核苷酸之一個基序與反義股上三個核苷酸之一個基序具有至少一個核苷酸重疊，亦即正義股上三個核苷酸之至少一個基序與反義股上三個核苷酸之至少一個基序形成鹼基對。或者，至少兩個核苷酸可重疊，或所有三個核苷酸可重疊。
一項具體實施例中，RNAi劑正義股可能包含超過一個在三個連續核苷酸上有三個相同修飾之基序。該第一基序可能出現在該股之裂解位點或接近裂解位點，且該其他基序可能為側翼修飾。本文中術語“側翼修飾”係指出現在該股之另一部份上之基序，其與出現在相同股上之裂解位點或接近裂解位點之基序分開。該側翼修飾係與第一基序相鄰或分隔至少一個或更多個核苷酸。當彼等基序彼此緊鄰時，則該等基序之化學係彼此獨立，且當基序之間分隔一個或多個核苷酸時，則其化學可能相同或不同。可能出現兩個或更多個側翼修飾。例如，當存在兩個側翼修飾時，各側翼修飾可能出現於相對於在該裂解位點或接近裂解位點之第一基序之一末端或在該前導基序之任一側。
如同正義股，RNAi劑之反義股可能包含超 過一個在三個連續核苷酸上有三個相同修飾之基序，其中至少一個基序出現在該股之裂解位點或接近裂解位點。此反義股亦可能包含一個或多個側翼修飾，其排比應類似可能出現在正義股上之側翼修飾。
一項具體實施例中，RNAi劑之正義股或反義股之側翼修飾通常不包括該股之3’-末端、5’-末端或兩末端上第一個或兩個終端核苷酸。
另一項具體實施例中，RNAi劑之正義股或反義股之側翼修飾通常不包括該股之3’-末端、5’-末端或兩末端上雙螺旋區內第一個或兩個配對之核苷酸。
當RNAi劑之正義股與反義股各包含至少一個側翼修飾時，該側翼修飾可能落在雙螺旋區之相同末端，且具有一、二或三個核苷酸重疊。
當RNAi劑之正義股與反義股各包含至少兩個側翼修飾時，正義股與反義股可排比以使分別來自一股之兩個修飾落在雙螺旋區之一末端，具有一、二或三個核苷酸重疊；分別來自一股之兩個修飾落在雙螺旋區之另一末端，具有一、二或三個核苷酸重疊；一股之兩個修飾落在前導基序(lead motif)之每一側，且在雙螺旋區有一、二或三個核苷酸重疊。
一項具體實施例中，RNAi劑之正義股與反義股中每一個核苷酸，包括作為基序之一部份之核苷酸，可為經修飾。各核苷酸可經相同或不同修飾法修飾，其可包括以下一或多種：一個或兩個非連接性磷酸態氧與/或一 個或多個連接性磷酸態氧之改變；核糖組成之改變，例如，核糖上之2'羥基；以“去磷酸”連接基完全置換磷酸酯部份基團；修飾或置換天然鹼基；及置換或修飾核糖-磷酸酯主鏈。
由於核酸為亞單位之聚合物，因此許多修飾會出現在核酸內之重複位置，例如，鹼基或磷酸酯部份基團或磷酸酯部份基團之非連接性O之修飾。有些例子中，將在核酸之所有個別位置進行修飾，但許多例子中並未進行修飾。例如，可能僅在3’或5’終端位置進行修飾，可能僅在一個終端區進行，例如，在一股之終端核苷酸或最後2、3、4、5或10個核苷酸之位置。可能在雙股區、單股區或二者進行修飾。可能僅在RNA之雙股區或可能僅在RNA之單股區進行修飾。例如，在非連接性O位置之硫代磷酸酯修飾可能僅在一個或兩個終端進行、可能僅在終端區進行，例如，在一股之終端核苷酸或最後2、3、4、5、或10個核苷酸位置，或可能在雙股與單股區，特定言之終端進行。5’末端或末端可經磷酸化。
為了例如，加強穩定性，可能在突出中包括特定鹼基，或在單股突出，例如，5’或3’突出或二者包括經修飾之核苷酸或核苷酸替代物。例如，希望在在突出中包括嘌呤核苷酸。某些具體實施例中，3’或5’突出中所有或某些鹼基可經修飾，例如，具有本文所說明之修飾。修飾可包括，例如，可採用相關技藝上已知之修飾在核糖之2’位置上進行修飾，例如，使用去氧核糖核苷酸、2’- 去氧-2’-氟(2’-F)或2’-O-甲基修飾替代核鹼基之核糖；及磷酸酯之修飾，例如，硫代磷酸酯修飾法。突出不一定與標靶序列同源。
一項具體實施例中，正義股與反義股之各殘基獨立經LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-去氧、2’-羥基、或2’-氟修飾。該等股可包含超過一個修飾。一項具體實施例中，正義股與反義股之各殘基獨立經2’-O-甲基或2’-氟修飾。
正義股與反義股上通常出現至少兩種不同修飾。這兩種修飾可能為2’-O-甲基或2’-氟修飾，或其他。
一項具體實施例中，Na與/或Nb包含交替修飾型態。本文所採用術語“交替基序”係指具有一或多種修飾之基序，各修飾係在一股之交替核苷酸上進行。該交替核苷酸可能係指每隔一個核苷酸有一種修飾或每隔三個核苷酸有一種修飾，或類似型態。例如，若A、B與C分別代表核苷酸上一種修飾時，則該交替基序可為“ABABABABABAB…”、“AABBAABBAABB…”、“AABAABAABAAB…”、“AAABAAABAAAB…”、“AAABBBAAABBB…”、或“ABCABCABCABC…”等等。
交替基序中可能包括相同或不同之修飾型態。例如，若A、B、C、D分別代表核苷酸上一種修飾型態時，交替型態(亦即每隔一個核苷酸上之修飾型態)可能相同，但各正義股或反義股之修飾型態可能分別選自交替基序中之數種修飾可能性，如“ABABAB…”、 “ACACAC…”、“BDBDBD…”或“CDCDCD…”，等等。
一項具體實施例中，本發明RNAi劑包含在正義股上交替基序之修飾型態相對於反義股上交替基序之修飾型態為位移。該位移可使正義股核苷酸之經修飾基團對應於反義股核苷酸之經不同修飾之基團，且反之亦然。例如，當正義股與dsRNA雙螺旋中反義股配對時，雙螺旋區內之正義股之交替基序可能始於該股之5’-3’之“ABABAB”，以及反義股之交替基序可能始於該股之5’-3’之“BABABA”。另一項實例中，雙螺旋區內之正義股之交替基序可能始於該股之5’-3’之“AABBAABB”，以及反義股之交替基序可能始於該股之5’-3’之“BBAABBAA”，因此正義股與反義股間之修飾型態為完全或部份位移。
一項具體實施例中，RNAi劑包含在起始正義股上2'-O-甲基修飾與2’-F修飾之交替基序型態相對於在起始反義股上2'-O-甲基修飾與2’-F修飾之交替基序型態具有位移，亦即正義股上之2'-O-甲基修飾之核苷酸與反義股上2'-F修飾之核苷酸形成鹼基配對，且反之亦然。正義股之1-位置可能始於2'-F修飾，及反義股之1-位置可能始於2'-O-甲基修飾。
在正義股與/或反義股上導入在三個連續核苷酸上有三個相同修飾之一個或多個基序，中斷正義股與/或反義股之起始修飾型態。這種在正義與/或反義股中導入在三個連續核苷酸上有三個相同修飾之一個或多個基序而 中斷正義與/或反義股之修飾型態時，驚人地加強針對標靶基因之基因靜默活性。
一項具體實施例中，當在任一股中導入在三個連續核苷酸上有三個相同修飾之基序時，鄰接該基序之核苷酸修飾為不同於該基序修飾之修飾。例如，包含該基序之序列部份為“…NaYYYNb…”，其中“Y”代表在三個連續核苷酸上有三個相同修飾之基序之修飾，及“Na”與“Nb”代表鄰接該基序“YYY”之核苷酸之修飾，其不同於Y之修飾，且其中Na與Nb可為相同或不同修飾。或者，當出現側翼修飾時，Na與/或Nb可能存在或不存在。
RNAi劑可能進一步包含至少一個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯之核苷酸間鍵連。硫代磷酸酯或甲基膦酸酯之核苷酸間鍵連修飾可能出現在正義股或反義股或兩股之股中任何位置之任何核苷酸上。例如，核苷酸間鍵連修飾可能出現在正義股與/或反義股之每一個核苷酸上；各核苷酸間鍵連修飾可能呈交替型態出現在正義股與/或反義股上；或正義股或反義股可能包含呈交替型態之兩種核苷酸間鍵連之修飾。正義股上核苷酸間鍵連之交替修飾型態可能與反義股相同或不同，正義股上核苷酸間鍵連之交替修飾型態相對於反義股上核苷酸間鍵連之交替修飾型態可具有位移。
一項具體實施例中，RNAi在突出區包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯之核苷酸間鍵連修飾。例如，突出區可能包含兩個核苷酸，其在兩個核苷酸之間具有硫代磷 酸酯或甲基膦酸酯之核苷酸間鍵連。亦可能進行核苷酸間鍵連修飾以連接突出核苷酸與雙螺旋區內終端配對之核苷酸。例如，至少2、3、4個或所有突出核苷酸可能利用硫代磷酸酯或甲基膦酸酯之核苷酸間鍵連連接，且可視需要可能有額外的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯之核苷酸間鍵連連接該突出核苷酸與鄰接該突出核苷酸之配對核苷酸。例如，終端三個核苷酸之間可能有至少兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鍵連，三個核苷酸中有兩個為突出核苷酸，第三個為鄰接該突出核苷酸之配對核苷酸。該終端三個核苷酸可在反義股3’-末端、正義股3’-末端、反義股5’-末端、與/或正義股5’-末端。
一項具體實施例中，該2個核苷酸突出係在反義股3’-末端，且終端三個核苷酸之間有兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鍵連，這三個核苷酸中有兩個為突出核苷酸，第三個核苷酸為鄰接該突出核苷酸之配對核苷酸。視需要地，該RNAi劑可再於正義股5’-末端與反義股5’-末端兩個末端，於終端三個核苷酸之間另包含兩個硫代磷酸酯之核苷酸間鍵連。
一項具體實施例中，RNAi劑在雙螺旋內包含與標靶錯配(群)，或其組合。“錯配”可為核苷酸之非典型鹼基配對或典型以外之配對。錯配可能發生於突出區或雙螺旋區。鹼基對可能依據其促進解離或熔解之傾向排序(例如，依據特定配對之結合或解離之自由能，最簡單之方法為在個別核苷酸對基礎上檢視該等成對核苷酸，但亦 可使用相鄰核苷酸或類似分析法)。以促進解離而言：A：U優於G：C；G：U優於G：C；及I：C優於G：C(I=肌苷)。錯配，例如，非典型或典型以外之配對(如本文中其他說明)優於典型(A：T、A：U、G：C)配對；且包括通用鹼基之配對優於典型配對。“通用鹼基”為有能力置換四種正常鹼基(G、C、A、與U)中任一種且不會顯著破壞相鄰鹼基對交互作用之穩定性或破壞所修飾寡核苷酸之所期望功能性生化用途之鹼基。通用鹼基之非限制性實例包括2'-去氧肌苷(次黃嘌呤去氧核苷酸)或其衍生物、硝基唑類似物、及疏水性芳香系非氫鍵鍵結鹼基。
一項具體實施例中，RNAi劑包含雙螺旋區內反義股5’-末端起前1、2、3、4、或5對鹼基中至少一對，其係分別獨立選自：A：U、G：U、I：C，及錯配對，例如，非典型或典型以外之配對或包括通用鹼基之配對，以促進反義股於雙螺旋5’-末端之解離。
一項具體實施例中，雙螺旋區中反義股5’-末端起1位置之核苷酸係選自下列所成群組：A、dA、dU、U、與dT。或者，雙螺旋區中反義股5’-末端起前1、2或3對鹼基中至少一對為AU鹼基對。例如，雙螺旋區中反義股5’-末端起第一對鹼基為AU鹼基對。
另一項具體實施例中，正義股3’-末端之核苷酸為去氧-胸腺嘧啶(dT)。另一項具體實施例中，反義股3’-末端之核苷酸為去氧-胸腺嘧啶(dT)。一項具體實施例中，正義與/或反義股之3’-末端上有去氧-胸腺嘧啶核苷酸 之短序列，例如，兩個dT核苷酸。
一項具體實施例中，正義股序列可如式(I)代表：5'np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3' (I)
其中：i及j分別獨立為0或1；p及q分別獨立為0至6；各Na獨立代表包含0-25個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少2個經不同修飾之核苷酸；各Nb獨立代表包含0-10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列；各np及nq獨立代表突出核苷酸；其中Nb及Y不具有相同修飾；及XXX、YYY及ZZZ分別獨立代表在三個連續核苷酸上有三個相同修飾之一個基序。較佳係YYY為均經2’-F修飾之核苷酸。
一項具體實施例中，該Na與/或Nb包含交替型態修飾。
一項具體實施例中，該YYY基序出現在正義股之裂解位點或接近裂解位點。例如，當RNAi劑具有17-23個核苷酸長度之雙螺旋區時，該YYY基序可出現在正義股之裂解位點或接近裂解位點處(例如，可出現在位置6、7、8，7、8、9，8、9、10，9、10、11，10、11、12，或11、12、13)，其係從5’-末端之第一個核苷酸開始計數； 或視需要地，從雙螺旋區內5’-末端之第一對核苷酸開始計數。
一項具體實施例中，i為1及j為0，或i為0及j為1，或i與j二者均為1。因此正義股由下式代表：5'np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3' (Ib)；5'np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq3' (Ic)；或5'np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3' (Id)。
當正義股由式(Ib)代表時，Nb代表包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。各Na可分別獨立代表包含2-20、2-15、或2-10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
當正義股由式(Ic)代表時，Nb代表包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。各Na可獨立代表包含2-20、2-15、或2-10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
當正義股由式(Id)代表時，各Nb獨立代表包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。較佳為Nb為0、1、2、3、4、5或6。各Na可獨立代表包含2-20、2-15或2-10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
各X、Y與Z可彼此相同或不同。
其他具體實施例中，i為0及j為0，且正義股可由下式代表： 5'np-Na-YYY-Na-nq3' (Ia)。
當正義股由式(Ia)代表時，各Na可獨立代表包含2-20、2-15、或2-10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
一項具體實施例中，RNAi之反義股序列可由式(II)代表：5'nq’-Na'-(Z’Z'Z')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(X'X'X')l-N'a-np'3' (II)
其中：k及l分別獨立為0或1；p’及q’分別獨立為0-6；各Na'獨立代表包含0-25個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少2個經不同修飾之核苷酸；各Nb'獨立代表包含0-10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列；各np'及nq'獨立代表突出核苷酸；其中Nb’及Y’不具有相同修飾；及X'X'X'、Y'Y'Y'及Z'Z'Z'分別獨立代表在三個連續核苷酸上有三個相同修飾之一個基序。
一項具體實施例中，該Na’與/或Nb’包含交替型態之修飾。
Y'Y'Y'基序出現在反義股之裂解位點或接近裂解位點。例如，當RNAi劑之雙螺旋區長度為17-23個核苷酸時，該Y'Y'Y'基序可出現在反義股之位置9、10、11；10、11、12；11、12、13；12、13、14；或13、14、 15，其係從5’-末端之第一個核苷酸開始計數；或可視需要從雙螺旋區內5’-末端之第一對核苷酸開始計數。較佳係該Y'Y'Y'基序出現在位置11、12、13。
一項具體實施例中，Y'Y'Y'基序為全部經2’-OMe修飾之核苷酸。
一項具體實施例中，k為l及1為0，或k為0及l為1，或k與l二者均為1。
因此反義股可由下式代表：5'nq’-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-np’3' (IIb)；5'nq’-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-np’3' (IIc)；或5'nq’-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-Na'-np’3' (IId)。
當反義股由式(IIb)代表時，Nb’代表包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。各Na’獨立代表包含2-20、2-15、或2-10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
當反義股由式(IIc)代表時，Nb’代表包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。各Na’獨立代表包含2-20、2-15或2-10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
當反義股由式(IId)代表時，各Nb’獨立代表包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。各Na’獨立代表包含2-20、2-15或2-10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。較佳為Nb為0、1、2、3、4、5或6。
其他具體實施例中，k為0及l為0，且該反義股可由下式代表：5'np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-nq’3' (Ia)。
當反義股由式(IIa)代表時，各Na’獨立代表包含2-20、2-15或2-10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
各X'、Y'與Z'可彼此相同或不同。
正義股與反義股之各核苷酸可獨立經LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-羥基、或2’-氟修飾。例如，正義股與反義股之各核苷酸係獨立經2’-O-甲基或2’-氟修飾。特定言之，各X、Y、Z、X'、Y'與Z'可代表2’-O-甲基修飾或2’-氟修飾。
一項具體實施例中，當雙螺旋區為21聚體時，RNAi劑之正義股可包含出現在該股9、10與11位置之YYY基序，其係從5’-末端第一個核苷酸開始計數，或可視需要從雙螺旋區內5’-末端第一對核苷酸開始計數；及Y代表2’-F修飾。正義股可另外在雙螺旋區之相反末端包含XXX基序或ZZZ基序作為側翼修飾；及XXX與ZZZ各分別獨立代表2’-OMe修飾或2’-F修飾。
一項具體實施例中，反義股可包含出現在該股之位置11、12、13之Y'Y'Y'基序，其係從5’-末端第一個核苷酸開始計數，或可視需要從雙螺旋區內5’-末端第一對核苷酸開始計數；及Y'代表2’-O-甲基修飾。該反義股可另外在雙螺旋區之相反末端包含X'X'X'基序或Z'Z'Z' 基序作為側翼修飾；及X'X'X'與Z'Z'Z'各分別獨立代表2’-OMe修飾或2’-F修飾。
由上式(Ia)、(Ib)、(Ic)與(Id)中任一式代表之正義股可分別與上式(IIa)、(IIb)、(IIc)與(IId)中任一式代表之反義股形成雙螺旋。
因此，本發明方法所使用之RNAi劑可包含正義股與反義股，每一股具有14至30個核苷酸，該RNAi雙螺旋係如式(III)代表：正義：5'np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3'反義：3'np ’-Na ’-(X’X'X')k-Nb ’-Y'Y'Y'-Nb ’-(Z'Z'Z')l-Na ’-nq ’5' (III)
其中：i、j、k、及l分別獨立為0或1；p、p'、q、及q'分別獨立為0-6；各Na及Na ’分別獨立代表包含0-25個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少2個經不同修飾之核苷酸；各Nb及Nb ’獨立代表包含0-10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列；其中各np’、np、nq’、及nq，其分別可能存在或不存在，獨立代表突出核苷酸；及XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'、及Z'Z'Z'分別獨立代表在三個連續核苷酸上有三個相同修飾之一個基序。
一項具體實施例中，i為0及j為0；或i為1及j為0；或i為0及j為1；或i與j二者均為0；或 i與j二者均為1。另一項具體實施例中，k為0及l為0；或k為1及l為0；k為0及l為1；或k與l二者均為0；或k與l二者均為1。
形成RNAi雙螺旋之正義股與反義股之組合實例包括下式： 正義：5'np-Na-YYY-Na-nq3'反義：3'np ’-Na ’-Y'Y'Y'-Na ’nq ’5' (IIIa)
正義：5'np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3'反義：3'np ’-Na ’-Y'Y'Y'-Nb ’-Z'Z'Z'-Na ’nq ’5' (IIIb)
正義：5'np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq3'反義：3'np ’-Na ’-X'X'X'-Nb ’-Y'Y'Y'-Na ’-nq ’5' (IIIc)
正義：5'np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3'反義：3'np ’-Na ’-X'X'X'-Nb ’-Y'Y'Y'-Nb ’-Z'Z'Z'-Na-nq ’5' (IIId)
正義：5'-Na-YYY-Na-3'反義：3'np ’-Na ’-Y'Y'Y'-Na ’5' (IIIe)
當RNAi劑如式(IIIa)代表時，各Na獨立代表包含2-20、2-15、或2-10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
當RNAi劑如式(IIIb)代表時，各Nb獨立代 表包含1-10、1-7、1-5或1-4個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。各Na獨立代表包含2-20、2-15或2-10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
當RNAi劑如式(IIIc)代表時，各Nb、Nb’獨立代表包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。各Na獨立代表包含2-20、2-15或2-10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。
當RNAi劑如式(IIId)代表時，各Nb、Nb’獨立代表包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。各Na、Na ’獨立代表包含2-20、2-15或2-10個經修飾核苷酸之寡核苷酸序列。各Na、Na’、Nb與Nb ’獨立包含交替型態之修飾。
當RNAi劑如式(IIIe)代表時，各Na及Na'獨立代表包含0-25個經修飾或未修飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少2個經不同修飾之核苷酸。
式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)、與(IIIe)中各X、Y及Z可彼此相同或不同。
當RNAi劑如式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)與(IIIe)代表時，至少一個Y核苷酸可與一個Y'核苷酸形成鹼基對。或者，至少兩個Y核苷酸與對應Y'核苷酸形鹼基對；或所有三個Y核苷酸均與對應Y'核苷酸形成鹼基對。
當RNAi劑如式(IIIb)或(IIId)代表時，至少 一個Z核苷酸可與一個Z'核苷酸形成鹼基對。或者，至少兩個Z核苷酸可與對應Z'核苷酸形成鹼基對；或所有三個Z核苷酸均與對應Z'核苷酸形成鹼基對。
當RNAi劑如式(IIIc)或(IIId)代表時，至少一個X核苷酸可與一個X'核苷酸形成鹼基對。或者，至少兩個X核苷酸可與對應X'核苷酸形成鹼基對；或所有三個X核苷酸均與對應X'核苷酸形成鹼基對。
一項具體實施例中，Y核苷酸上之修飾不同於Y’核苷酸上之修飾，Z核苷酸上之修飾不同於Z’核苷酸上之修飾，及/或X核苷酸上之修飾不同於X’核苷酸上之修飾。
一項具體實施例中，當RNAi劑如式(IIId)代表時，Na修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾。另一項具體實施例中，當RNAi劑如式(IIId)代表時，Na修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾，且np'>0，及至少一個np'係利用硫代磷酸鍵連連接相鄰核苷酸。另一項具體實施例中，當RNAi劑如式(IIId)代表時，該Na修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾，np'>0，及至少一個np'係利用硫代磷酸鍵連連接相鄰核苷酸，且正義股係接合至利用二價或三價之分支連接基附接之一或多種GalNAc衍生物。另一項具體實施例中，當RNAi劑如式(IIId)代表時，該Na修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾，np'>0，及至少一個np'係利用硫代磷酸鍵連連接相鄰核苷酸，正義股包含至少一個硫代磷酸鍵連，且正義股係接合利用二價或三價之分支連接基附接之一或多種GalNAc衍生物。
一項具體實施例中，當RNAi劑如式(IIIa)代表時，Na修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾，np'>0，及至少一個np'係利用硫代磷酸鍵連連接相鄰核苷酸，正義股包含至少一個硫代磷酸鍵連，且正義股係接合至利用二價或三價之分支連接基附接之一或多種GalNAc衍生物。
一項具體實施例中，RNAi劑為包含至少兩個如式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)與(IIIe)代表之雙螺旋之多聚體，其中該雙螺旋係利用連接基連接。該連接基可為可裂解或不可裂解。視需要地，該多聚體進一步包含配體。各雙螺旋可靶向相同基因或兩個不同基因；或各雙螺旋可靶向相同基因上兩個不同標靶位點。
一項具體實施例中，RNAi劑為包含三個、四個、五個、六個或更多個如式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)與(IIIe)代表之雙螺旋之多聚體，其中雙螺旋係利用連接基連接。該連接基可為可裂解或不可裂解。視需要地，該多聚體進一步包含配體。各雙螺旋可靶向相同基因或兩個不同基因；或各雙螺旋可靶向相同基因上兩個不同標靶位點。
一項具體實施例中，兩個如式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)與(IIIe)代表之RNAi劑係在5’末端及其中一個或兩個3’末端彼此連接，且可視需要接合配體。各製劑可靶向相同基因或兩個不同基因；或各製劑可靶向相同基因上兩個不同標靶位點。
各種不同文獻說明之多聚體RNAi劑均可用 於本發明方法。此等文獻包括WO2007/091269、美國專利案案號7858769、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887及WO2011/031520，其完整揭示內容已以引用之方式併入本文中。
包含一或多個碳水化合物部份基團與RNAi劑之接合物之RNAi劑可使一或多種RNAi劑之性質達最佳化。許多例子中，由碳水化合物部份基團附接RNAi劑之經修飾亞單位。例如，dsRNA劑之一個或多個核糖核苷酸亞單位之核糖可被另一個部份基團置換，例如，附接碳水化合物配體之非碳水化合物(較佳為環狀)載劑。依此方式置換亞單位中核糖之核糖核苷酸亞單位在本文中稱為核糖置換修飾亞單位(RRMS)。環狀載劑可能為碳環狀環系(亦即所有環原子均為碳原子)或雜環狀環系(亦即一個或多個環原子可能為雜原子，例如，氮、氧、硫)。該環狀載劑可能為單環狀環系，或可能包含兩個或更多個環，例如，稠合環。環狀載劑可能為完全飽和環系，或其可能包含一個或多個雙鍵。
該配體可能利用載劑附接聚核苷酸。該載劑包括(i)至少一個“主鏈附接點”，較佳為兩個“主鏈附接點”與(ii)至少一個“繫鏈附接點”。本文所採用“主鏈附接點”係指可用於且適於讓載劑進入主鏈(例如，核糖核酸之磷酸根或經修飾磷酸根(例如，含硫)主鏈)中之官能基，例如，羥基，或通常為一個鍵結。有些具體實施例中，“繫鏈附接點”(TAP)係指環狀載劑之組成環原子，例如， 碳原子或雜原子(不同於提供主鏈附接點之原子)，其連接所選定之部份基團。該部份基團可為例如，碳水化合物，例如，單糖、雙醣、參醣、肆醣、寡醣、與多醣。該選定之部份基團可視需要經由穿插之繫鏈連接該環狀載劑。因此該環狀載劑經常包括適合引進或系鏈另一個化學部份體(例如，配體)至組成環之官能基，例如，胺基，或通常提供一個鍵結。
該RNAi劑可能經由載劑接合配體，其中該載劑可為環狀基團或無環基團；較佳為該環狀基團係選自：吡咯啶基、吡唑啉基、吡唑啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、哌啶基、哌基、[1,3]二氧雜環戊烷、唑啶基、異唑啶基、嗎啉基、噻唑啶基、異噻唑啶基、喹啉基、嗒酮基、四氫呋喃基、與萘滿；較佳係該無環基團係選自：絲胺醇主鏈或二乙醇胺主鏈。
某些明確具體實施例中，用於本發明方法之RNAi劑為AD-57213(正義股：5’-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3’(SEQ ID NO：13)及反義股：5’-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3’(SEQ ID NO：14)，其中A、C、G、及U為核糖A、C、G或U；a、c、g、及u為2'-O-甲基(2'-OMe)A、C、G、或U；Af、Cf、Gf或Uf為2'-氟A、C、G或U；及s為硫代磷酸鍵連。
此等製劑進一步包含配體。
配體
本發明雙股RNAi(dsRNA)劑可視需要接合至一個或多 個配體。該等配體可附接至正義股、反義股或兩股之3’-末端、5’-末端或兩末端。例如，配體可接合至正義股。較佳具體實施例中，配體係接合正義股之3’-末端。一項較佳具體實施例中，配體係GalNAc配體。一項特別佳具體實施例中，該配體為GalNAc3：
有些具體實施例中，該配體(例如，GalNAc配體)係附接至該RNAi劑之3'末端。一項具體實施例中，該RNAi劑係接合至配體，例如，如下圖所示之GalNAc配體： 其中X為O或S。一項具體實施例中，X為O。
本發明RNAi劑可與許多種部份體偶聯。較佳部份基團為可以經由穿插之繫鏈直接或間接偶聯(較佳 係共價偶聯)配體。
較佳具體實施例中，併入配體後之分子會改變其分佈、靶向或壽命。較佳具體實施例中，相較於例如，沒有此等配體之物種，該等配體可加強對所選定標靶(例如，對分子、細胞或細胞型態、隔室、受體(例如，細胞或器官隔室)、組織、器官或身體區域)之親和性。對選定之標靶具有加強親和力之配體亦稱為靶向配體。
有些配體具有核內體裂解性質。該核內體裂解性配體促進核內體溶解及/或從核內體轉運本發明組成物或其組份至細胞之細胞質中。核內體裂解性配體可為顯示pH-依賴性膜活性與基因融合性之聚陰離子性肽或肽擬似物。一項具體實施例中，核內體裂解性配體在核內體pH呈現其活性構形。“活性”構形為其中核內體裂解性配體促進核內體溶解及/或從核內體轉運本發明組成物或其組份至細胞之細胞質中之構形。核內體裂解性配體實例包括GALA肽(Subbarao等人之Biochemistry,1987,26：2964-2972)、EALA肽(Vogel等人之J.Am.Chem.Soc.,1996,118：1581-1586)、與其衍生物(Turk等人之Biochem.Biophys.Acta,2002,1559：56-68)。一項具體實施例中，核內體裂解性組份可包含可以隨pH變化而改變價數或質子化之化學基團(例如，胺基酸)。核內體裂解性組份可為線性或分支性。
配體可改善所得天然或經修飾寡核糖核苷酸、或包含本文所說明單體之任何組合與/或天然或經修飾 核糖核苷酸之聚合分子之轉運、雜交、與專一性，且亦可改善核酸酶抗性。
配體通常可包括醫療修飾劑，例如，加強吸收；診斷性化合物或報導子基團(例如，用於追蹤分佈)；交聯劑；及賦予核酸酶抗性之部份基團。其一般實例包括脂質、類固醇、維生素、糖類、蛋白質、肽類、多胺類、與肽擬似物。
配體可包括天然物質，如蛋白質(例如，人類血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、或球蛋白)；碳水化合物(例如，葡聚糖、普藍多醣(pullulan)、幾丁質、幾丁聚醣、菊糖、環糊精、或玻尿酸)；或脂質。配體亦可為重組或合成性分子，如合成性聚合物，例如，合成性聚胺基酸、寡核苷酸(例如，適體)。聚胺基酸實例包括聚離胺酸(PLL)、聚L-天冬胺酸、聚L-麩胺酸等聚胺基酸：苯乙烯-馬來酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-馬來酸酐共聚物、N-(2-羥基丙基)甲基丙烯基醯胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚胺基甲酸酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯基醯胺聚合物、或聚磷腈。多胺實例包括：聚乙烯亞胺、聚離胺酸(PLL)、精胺、精脒、多胺、偽肽-多胺、肽擬似性多胺、樹枝狀多胺、精胺酸、脒、魚精蛋白、陽離子性脂質、陽離子性紫質、多胺之四級鹽、或α螺旋肽。
配體亦可包括靶向基團，例如，細胞或組織靶向製劑，例如，凝集素、醣蛋白、脂質或蛋白質，例 如，結合特定細胞型態(如腎臟細胞)之抗體。靶向基團可為促甲狀腺激素、促黑激素、凝集素、醣蛋白、表面活性蛋白質A、黏蛋白碳水化合物、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基-半乳糖胺、N-乙醯基-葡萄糖胺、多價甘露糖、多價岩藻糖、糖基化聚胺基酸、多價半乳糖、轉鐵蛋白、雙膦酸、聚麩胺酸、聚天冬胺酸、脂質、膽固醇、類固醇、膽汁酸、葉酸鹽、維生素B12、生物素、RGD肽、RGD肽擬似物或適體。
其他配體實例包括染料、嵌入劑(例如，吖啶類)、交聯劑(例如，補骨脂內酯、絲裂黴素C)、紫質(TPPC4、德卟啉(texaphyrin)、撒卟啉(Sapphyrin))、多環狀芳香烴(例如，吩、二氫吩)、人造內切核酸酶或螯合劑(例如，EDTA)、親脂性分子(例如，膽固醇、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、雙氫睾酮、1,3-雙-O(十六碳烷基)甘油、香葉草基氧己基、十六碳烷基甘油、龍腦、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七碳烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油基)石膽酸、O3-(油基)膽烯酸、二甲氧基三苯甲基、或吩噁)與肽接合物(例如，觸足肽(antennopedia)、Tat肽)、烷化劑、磷酸鹽、胺基、氫硫基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚胺基、烷基、經取代之烷基、標記放射性之標記物、酵素、半抗原(例如，生物素)、轉運/吸收促進劑(例如，阿斯匹靈、維生素E、葉酸)、合成性核糖核酸酶(例如，咪唑、雙咪唑、組織胺、咪唑簇集物、吖啶-咪唑接合物、Eu3+四氮雜大環複合物)、二硝基苯基、HRP、或AP。
配體可為蛋白質(例如，醣蛋白)、或肽(例如，對輔配體具有專一親和性之分子)、或抗體(例如，結合特異化細胞型態(如癌細胞、內皮細胞、或骨細胞)之抗體)。配體亦可包括激素與激素受體。其亦可包括非肽物質，如脂質、凝集素、碳水化合物、維生素、輔因子、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基-半乳糖胺、N-乙醯基-葡萄糖胺、多價甘露糖、多價岩藻糖或適體。配體可為例如，脂多醣、p38 MAP激酶之活化劑、或NF-κ B之活化劑。
配體可為例如，可藉由例如，破壞細胞之細胞骨架，例如，破壞細胞之微小管、微絲、與/或中間絲而促進細胞吸收iRNA劑之藥物物質。該藥物可為例如，紫杉醇(taxon)、長春新鹼、長春花鹼、細胞鬆弛素(cytochalasin)、諾考達唑(nocodazole)、促進微絲聚合劑(japlakinolide)、微絲解聚劑(latrunculin A)、毒傘素(phalloidin)、紅海海綿抗菌素(swinholide A)、茚酮衍生物(indanocine)、或邁爾素(myoservin)。
配體可藉由例如，活化發炎反應，提高細胞吸收寡核苷酸。具有此等效力之配體實例包括腫瘤壞死因子α(TNF α)、間白素-1 β、或γ干擾素。
一項態樣中，配體為脂質或基於脂質之分子。此等脂質或基於脂質之分子較佳係與血清蛋白質，例如，人類血清白蛋白(HSA)結合。HSA結合性配體可以讓接合物分佈在標靶組織上，例如，身體之非腎臟標靶組織。例如，該標靶組織可為肝臟，包括肝之實質細胞。其他可 結合HAS之分子亦可作為配體使用。例如，可使用納普生(naproxen)或阿斯匹靈。脂質或基於脂質配體可以(a)提高接合物對降解之抗性，(b)提高靶向或轉運至標靶細胞或細胞膜，與/或(c)可用於調整與血清蛋白質(例如，HAS)之結合性。
基於脂質之配體可用於調節(例如，控制)接合物與標靶組織之結合性。例如，脂質或基於脂質之配體與HAS之結合性越強時，越不容易靶向腎臟，因此越不容易從身體清除。可使用與HAS之結合性較低之脂質或基於脂質配體，讓該接合物靶向腎臟。
一項較佳具體實施例中，該基於脂質之配體會結合HAS。較佳係其與HAS具有充份親和性，以使該接合物較佳係分佈至非腎臟組織。然而，該親和性最好不會太強導致無法逆轉HSA-配體結合性。
另一項較佳具體實施例中，該基於脂質配體與HAS之親和性弱或完全沒有親和性，因此該接合物將會優先分佈至腎臟。除了基於脂質之配體外，亦可改用或額外使用其他靶向腎臟細胞之部份基團。
另一項態樣中，該配體為例如，維生素之部份基團，其可被標靶細胞(例如，增生細胞)吸收。其等特別適用於治療特徵在於不期望之細胞增生之疾患，例如，惡性或非惡性型，例如，癌細胞。維生素實例包括維生素A、E、與K。其他維生素實例包括維生素B群，例如，葉酸、B12、核黃素、生物素、吡哆醛或其他維生素或可 被癌細胞吸收之營養素。亦包括HAS、低密度脂蛋白(LDL)與高密度脂蛋白(HDL)。
另一項態樣中，該配體為細胞滲透劑，較佳為螺旋細胞滲透劑。該製劑較佳為兩親性。該製劑實例為肽，如tat或觸足肽。若該製劑為肽時，其可經修飾，包括肽基擬似物、反轉異構體、非肽或偽肽鍵連，及使用D-胺基酸。該螺旋劑較佳為α-螺旋劑，其較佳具有親脂相與疏脂相。
配體可為肽或肽擬似物。肽擬似物(本文亦稱為寡肽擬似物)為可以折疊成類似天然肽之經界定三度空間結構之分子。該肽或肽擬似部份基團之長度可為約5至50個胺基酸，例如，長度約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸。該肽或肽擬似物可為，例如，細胞滲透肽、陽離子性肽、兩親性肽、或疏水性肽(例如，主要由Tyr、Trp或Phe組成)。肽部份基團可為樹枝狀肽、拘束性肽或交聯肽。或者，肽部份基團可包括疏水性膜轉送序列(MTS)。含疏水性MTS之肽實例為具有下列胺基酸序列之RFGF，其胺基酸序列為AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO：9)。包含疏水性MTS之RFGF類似物(例如，胺基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO：10)亦可作為靶向部份基團。該肽部份基團可為“傳遞”肽，其可攜帶大型極性分子(包括肽、寡核苷酸與蛋白質)穿越細胞膜。例如，已發現來自HIV Tat蛋白質((GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO：11))與果蠅觸足肽(Drosophila antennapedia)蛋白質 (RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO：12))之序列具有作為傳遞肽之功能。肽或肽擬似物可由DNA之隨機序列所編碼，如從噬菌體展示庫或一樹脂球一種化合物(one-bead-one-compound(OBOC))組合庫(Lam等人，Nature,354：82-84,1991)判別之肽。經由併入之單體單位繫鏈至iRNA劑之較佳肽或肽擬似物為靶向細胞之肽，如精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸(RGD)-肽、或RGD擬似物。肽部份基團之長度範圍可為約5個胺基酸至約40個胺基酸。該肽部份基團可具有結構修飾，以提高穩定性或主導構形性質。可採用下文說明之任何結構修飾。可採用RGD肽部份基團靶向腫瘤細胞，如內皮腫瘤細胞或乳癌腫瘤細胞(Zitzmann等人之Cancer Res.,62：5139-43,2002)。RGD肽可促進iRNA劑靶向各種不同其他組織之腫瘤，包括肺、腎臟、脾、或肝臟(Aoki等人之Cancer Gene Therapy 8：783-787,2001)。較佳係該RGD肽促進iRNA劑靶向腎臟。該RGD肽可為線性或環狀，且可經過修飾，例如，糖基化或甲基化，以促進靶向特定組織。例如，糖基化RGD肽可以傳送iRNA劑至表現α vß3之腫瘤細胞(Haubner等人之Jour.Nucl.Med.,42：326-336,2001)。可採用靶向增生細胞中所富集之標記物之肽。例如，包含RGD之肽與肽擬似物可靶向癌細胞，特定言之具有整合素之細胞。因此可使用RGD肽、包含RGD之環狀肽、包括D-胺基酸之RGD肽，及合成性RGD擬似物。除了RGD外，尚可使用靶向整合素配體之其他部份基團。通常可使用此等配體來控制增生之細胞與血管新生作 用。這種配體之較佳接合物係靶向PECAM-1、VEGF或其他癌基因，例如，本文說明之癌基因。
“細胞滲透性肽”可以通透細胞，例如，微生物細胞，如細菌或真菌細胞，或哺乳動物細胞，如人類細胞。可通透微生物細胞之肽可為例如，α-螺旋線性肽(例如，LL-37或Ceropin P1)、包含二硫鍵之肽(例如，α-防禦素(defensin)、β-防禦素或制菌肽(bactenecin))，或僅包含一個或兩個主要胺基酸之肽(例如，PR-39或吲哚抗生肽(indolicidin))。細胞滲透性肽亦可包括核定位訊號(NLS)。例如，細胞滲透性肽可為二部組合之兩親性肽，如MPG，其係衍生自HIV-1 gp41與SV40大型T抗原之NLS之稠合肽功能域(Simeoni等人之Nucl.Acids Res.31：2717-2724,2003)。
一項具體實施例中，靶向肽可為兩親性α-螺旋肽。兩親性α-螺旋肽實例包括，但不限於，天蠶素(cecropins)、鳥蛛毒素(lycotoxins)、鰈魚肽(paradaxins)、蟾蜍抗菌肽(buforin)、CPF、鈴蟾抗菌肽樣(bombinin-like)肽(BLP)、青環海蛇抗菌肽(cathelicidins)、地中海蠟實蠅抗菌肽(ceratotoxins)、柄海鞘(S.clava)肽、盲鰻腸抗微生物肽(HFIAP)、爪蟾抗菌肽(magainines)、東方蛙抗菌肽(brevinins-2)、樹蛙抗菌肽(dermaseptins)、蜂毒肽(melittins)、比目魚抗菌肽(pleurocidin)、H2A肽、爪蟾(Xenopus)肽、抗菌肽(esculentinis)-1、與澳洲蛙活性肽(caerins)。有許多因子被視為較適合維持螺旋完整穩定 性。例如，將利用最大螺旋穩定殘基數(例如，leu、ala或lys)、及利用最小螺旋失穩殘基數(例如，脯胺酸或環狀單體單位)。可考慮使用封端殘基(例如，Gly為N-封端殘基實例)與/或C-末端醯胺化來提供額外H-鍵，以穩定螺旋。帶相反電價且分隔i±3或i±4-位置之殘基之間所形成之鹽橋可提供穩定性。例如，陽離子性殘基如離胺酸、精胺酸、高碳精胺酸、鳥胺酸或組胺酸，可與陰離子殘基如麩胺酸或天冬胺酸形成鹽橋。
肽與肽擬似物配體包括彼等具有天然肽或經修飾肽者，例如，D或L肽；α、β或γ肽；N-甲基肽；氮雜肽；有一個或多個醯胺鍵連(亦即肽鍵連)被一個或多個脲、硫脲、胺甲酸根或磺醯脲鍵連置換之肽；或環狀肽。
靶向配體可為任何可以靶向特定受體之配體。其實例為葉酸鹽、GalNAc、半乳糖、甘露糖、甘露糖-6P、糖聚集物，如GalNAc聚集物、甘露糖聚集物、半乳糖聚集物或適體。聚集物為兩個或多個糖單位之組合。靶向配體亦包括整合素受體配體、趨化激素受體配體、轉鐵蛋白、生物素、血清素受體配體、PSMA、內皮肽、GCPII、體抑素、LDL與HDL配體。配體亦可以核酸為基礎，例如，適體。適體可未經修飾或具有本文所揭示之任何修飾組合。
核內體釋放劑包括咪唑類、聚咪唑或寡咪唑、PEI、肽、基因融合肽、聚羧酸酯、聚陽離子劑、遮蔽之寡或聚陽離子或陰離子、縮醛、聚縮醛、縮酮/聚縮酮、 原酸酯、帶有遮蔽或未遮蔽陽離子或陰離子電價之聚合物、帶有遮蔽或未遮蔽陽離子或陰離子電價之樹枝狀聚合物。
PK調節劑代表藥物動力學調節劑。PK調節劑包括親脂物、膽汁酸、類固醇、磷脂類似物、肽、蛋白質結合劑、PEG、維生素等等。PK調節劑實例包括，但不限於，膽固醇、脂肪酸、膽酸、石膽酸、二烷基甘油酯、二醯基甘油酯、磷脂、鞘脂質、納普生(naproxen)、異布洛芬(ibuprofen)、維生素E、生物素等等。包含許多硫代磷酸鍵連之寡核苷酸亦已知與血清蛋白質結合，因此在主鏈中包含多個硫代磷酸鍵連之短寡核苷酸，例如，約5個鹼基、10個鹼基、15個鹼基或20個鹼基之寡核苷酸亦適合作為本發明之配體(例如，作為PK調節配體)。
此外，結合血清組份(例如，血清蛋白質)之適體亦適合作為本發明之PK調節配體。
其他適合本發明之配體接合物說明於美國專利申請案USSN：10/916,185，申請日2004年8月10日；USSN：10/946,873，申請日2004年9月21日；USSN：10/833,934，申請日2007年8月3日；USSN：11/115,989，申請日2005年4月27日及USSN：11/944,227，申請日2007年11月21日，其揭示內容已基於所有目的以引用之方式完全併入本文中。
當存在兩個或多個配體時，配體可均具有相同性質、均具有不同性質、或有些配體具有相同性質而 其他則具有不同性質。例如，配體可具有靶向性質、具有核內體裂解活性或具有PK調節性質。較佳具體實施例中，所有配體均具有不同性質。
配體可在不同位置偶聯寡核苷酸，例如，3’-末端、5’-末端、與/或內部位置。較佳具體實施例中，該配體係經由穿插之繫鏈(例如，本文說明之載劑)附接寡核苷酸。當併入單體至加長中之股中時，該配體或繫鏈配體可能出現在單體。某些具體實施例中，該配體可在“前體”單體已併入加長中之股中後，經由偶聯“前體”單體而併入加長中之股中。例如，具有如胺基終端繫鏈(亦即沒有結合配體)之單體，例如，TAP-(CH2)nNH2即可併入加長中之寡核苷酸股中。隨後之操作中，亦即在前體單體併入股中後，具有親電子基(例如，五氟苯基酯或醛基)之配體隨即可藉由配體之親電子基與前體單體之繫鏈之終端親核性基偶聯來附接前體單體。
另一項實例中，可併入具有適合參與克里克(Click)化學反應之化學基團之單體，例如，以疊氮化物或炔為終端之系鏈/連接基。隨後操作中，亦即在前體單體併入股中後，具有互補化學基團(例如，炔或疊氮化物)之配體可藉由共同偶聯炔與疊氮化物來附接前體單體。
針對雙股寡核苷酸，配體可附接至一股或兩股。有些具體實施例中，雙股iRNA劑包含經接合至正義股之配體。其他具體實施例中，雙股iRNA劑包含經接合至反義股之配體。
某些具體實施例中，配體可接合至核鹼基、糖部份基團、或核酸分子之核苷間鍵連。與嘌呤核鹼基或其衍生物之接合可能發生在任何位置，包括環內與環外原子。某些具體實施例中，嘌呤核鹼基之2-、6-、7-或8-位置係附接至接合物部份基團。與嘧啶核鹼基或其衍生物之接合可能發生在任何位置。某些具體實施例中，嘧啶核鹼基之2-、5-、與6-位置可經接合物部份基團取代。與核苷之糖部份基團之接合可能發生在任何位置。可附接至接合物部份基團之糖部份基團之碳原子實例包括2’、3’、與5’碳原子。1’-位置亦可附接至接合物部份基團，如無鹼基殘基。核苷間鍵連亦可帶有接合物部份基團。針對包含磷之鍵連(例如，磷二酯、硫代磷酸、二硫代磷酸、胺基磷酸等等)，接合物部份基團可以直接附接磷原子或已與磷原子鍵結之O、N或S原子。針對含胺或醯胺之核苷間鍵連(例如，PNA)，該接合物部份基團可附接至胺或醯胺之氮原子或附接至相鄰碳原子。
RNA干擾領域中任何合適之配體均可使用，但配體通常為碳水化合物，例如，單糖(如GalNAc)、雙醣、參醣、肆醣、多醣。
接合配體至核酸之連接基包括彼等如上述者。例如，該配體可為透過雙價或三價之分支連接基附接之一或多種GalNAc(N-乙醯基葡糖胺)衍生物。
一項具體實施例中，本發明dsRNA係接合至二價與三價之分支連接基，包括式(IV)-(VII)中任一式所 示之結構： 其中：q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B及q5C每次出現時獨立代表0至20，且其中重複單位可相同或相異，P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C每次出現時分別獨立為不存在、分別獨立為CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C每次出現時獨立為不存在、伸烷基、經取代之烷基其中一個或多個亞甲基可為一個或多個O、S、S(O)、SO2、N(RN)、 C(R’)=C(R”)、C≡C或C(O)插入其中或在終端；R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C每次出現時分別獨立為不存在、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH=N-O、、、、，或雜環基；L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B及L5C代表配體；亦即每次出現時分別獨立為單糖(如GalNAc)、雙醣、參醣、肆醣、寡醣或多醣；及Ra為H或胺基酸側鏈。
三價接合GalNAc衍生物特別適用於RNAi劑，供抑制標靶基因之表現，如彼等如式(VII)者： 其中L5A、L5B及L5C代表單糖，如GalNAc衍生物。
接合GalNAc衍生物之合適二價與三價之分支連接基基團包括(但不限於)下列化合物：
教示RNA接合物製法之代表性美國專利案包括，但不限於，美國專利案案號4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717,5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241,5,391,723；5,416,203,5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928及5,688,941；6,294,664；6,320,017；6,576,752；6,783,931；6,900,297；7,037,646；8,106,022，上述各文獻之完整揭示內容已分別以引用之方式併入本文中。
上述化合物不一定所有位置均經一致修飾，事實上可在單一化合物中或甚至在iRNA中之單一核苷上併入超過一個上述修飾。本發明亦包括呈嵌合化合物 之iRNA化合物。
本發明內容中，“嵌合”iRNA化合物或“嵌合體”為包含兩個或更多個化學上獨立區之iRNA化合物，較佳為dsRNA，該各區分別由至少一個單體單位組成，亦即以dsRNA化合物為例，為由核苷酸組成。此等iRNA通常包含至少一個區，其中RNA係經修飾，以致提高iRNA對抗核酸酶降解之抗性，提高細胞吸收性，及/或提高對標靶核酸之結合親和性。iRNA之額外一區可作為可以裂解RNA：DNA或RNA：RNA雜交體之酵素之受質。例如，RNase H為細胞內切核酸酶，其裂解RNA：DNA雙螺旋之RNA股。因此活化RNase H會裂解RNA標靶，藉以大幅加強iRNA抑制基因表現之效力。結果，當採用嵌合性dsRNA時，經常可以採用較短之iRNA得到類似硫代磷酸酯去氧dsRNA與相同標靶區雜交後得到之結果。RNA標靶之裂解作用照例可採用凝膠電泳分析法檢測，且若必要時，可聯合採用相關技藝上已知之核酸雜交技術。
某些例子中，iRNA之RNA可經過非配體基團修飾。許多種非配體分子已與iRNA接合，以加強iRNA之活性、細胞分佈性或細胞吸收性，且進行此等接合法之程序可從科學文獻中取得。此等非配體部份基團包括脂質部份基團，如膽固醇(Kubo,T.等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.,2007,365(1)：54-61；Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86：6553)、膽酸(Manoharan等人，Biorg.Med.Chem.Let.,1994,4：1053)、硫醚，例如，己基-S-三苯甲基 硫醇(Manoharan等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660：306；Manoharan等人，Biorg.Med.Chem.Let.,1993,3：2765)、硫膽固醇(Oberhauser等人，Nucl.Acids Res.,1992,20：533)、脂系鏈，例如，十二碳烷二醇或十一碳烷基(Saison-Behmoaras等人，EMBO J,1991,10：1111；Kabanov等人，FEBS Lett.,1990,259：327；Svinarchuk等人，Biochimie,1993,75：49)、磷脂，例如，二-十六碳烷-消旋性-甘油或1,2-二-O-十六碳烷基-消旋性-甘油基-3-H-膦酸三乙基銨鹽(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.,1995,36：3651；Shea等人，Nucl.Acids Res.,1990,18：3777)、多胺或聚乙二醇鏈(Manoharan等人，Nuclosides & Nuclotides,1995,14：969)、或金剛烷乙酸(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.,1995,36：3651)、棕櫚基部份基團(Mishra等人，Biochim.Biophys.Acta,1995,1264：229)、或十八碳烷基胺或己基胺基-羰基氧基-膽固醇部份基團(Crooke等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277：923)。教示此等RNA接合物製法之代表性美國專利案已如上述。典型接合程序涉及合成在序列之一個或多個位置帶有胺基連接基之RNA。該胺基再與準備接合之分子採用適當偶聯或活化試劑反應。該接合反應可在RNA仍結合在固態擔體上時進行或可在裂解RNA後，在溶液相中進行。採用HPLC法純化RNA接合物，通常產生純接合物。
某些具體實施例中，本發明雙股RNAi劑為AD-57213。
VI. 本發明iRNA之傳遞法
可採用許多不同方式傳遞本發明iRNA至細胞中，例如，個體(如人類個體，例如，有此需要之個體，如罹患出血疾患之個體)之細胞。例如，可能由細胞與本發明iRNA於活體外或活體內接觸，進行傳遞。亦可直接投藥包含iRNA(例如，dsRNA)之組成物給個體，進行活體內傳遞法。或者，可能間接投藥編碼並主導iRNA表現之一或多種載體，進行活體內傳遞。此等替代法更進一步於下文中說明。
通常，本發明iRNA可採用任何傳遞核酸分子之方法(活體外或活體內)(參見例如，Akhtar S.與Julian RL.(1992)Trends Cell.Biol.2(5)：139-144與WO94/02595，其完整揭示內容已以引用之方式併入本文中)。用於活體內傳遞時，要傳遞iRNA分子之考量因素包括例如，在標靶組織中所傳遞分子之生物穩定性、非特異性效應的預防及所傳遞分子之累積。可藉由局部投藥法使iRNA之非特異性效應降至最低，例如，採用直接注射或植入組織中或局部投藥製劑。局部投藥至治療位點時，最大化該製劑之局部濃度，限制該製劑曝露在可能受到製劑傷害且使製劑降解之全身性組織，並可以降低iRNA分子之總投藥劑量。數項研究已顯示，當局部投藥iRNA時，可成功減弱基因產物。例如，在彌猴(cynomolgus monkeys)玻璃體內注射(Tolentino,MJ.，等人(2004)Retina 24：132-138)及在小鼠視網膜下注射(Reich,SJ.，等人(2003)Mol.Vis.9：210-216)，以經眼內傳遞VEGF dsRNA時，均顯示可在老年性黃斑部病變之實驗模式中預防新血管形成。此外，直接在小鼠腫瘤 內注射dsRNA時，可縮小腫瘤體積(Pille,J.，等人(2005)Mol.Ther.11：267-274)，並可延長帶腫瘤小鼠之壽命(Kim,WJ.，等人(2006)Mol.Ther.14：343-350；Li,S.，等人(2007)Mol.Ther.15：515-523)。RNA干擾法亦已顯示可藉由直接注射成功局部傳遞至CNS(Dorn,G.，等人(2004)Nucleic Acids 32：e49；Tan,PH.，等人(2005)Gene Ther.12：59-66；Makimura,H.，等人(2002)BMC Neurosci.3：18；Shishkina,GT.，等人(2004)Neuroscience 129：521-528；Thakker,ER.，等人(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：17270-17275；Akaneya,Y.，等人(2005)J.Neurophysiol.93：594-602)及藉由鼻內投藥至肺部(Howard,KA.，等人(2006)Mol.Ther.14：476-484；Zhang,X.，等人(2004)J.Biol.Chem.279：10677-10684；Bitko,V.，等人(2005)Nat.Med.11：50-55)。全身性投藥iRNA以治療疾病時，RNA可經修飾或改用藥物傳遞系統傳遞；這兩種方法均可預防dsRNA於活體內被內切-與外切-核酸酶快速降解。修飾RNA或醫藥載劑亦可讓iRNA組成物靶向標靶組織，並避免不期望之偏離標靶效應。iRNA分子可採用化學法接合至親脂性基團(如膽固醇)進行修飾，以加強細胞吸收並預防降解。例如，與經接合至親脂性膽固醇部份基團之主導對抗ApoB之iRNA全身注射至小鼠，結果減弱肝與空腸中之apoB mRNA(Soutschek,J.，等人(2004)Nature 432：173-178)。iRNA與適體之接合物已在小鼠攝護腺癌模式中顯示可抑制腫瘤生長，並介導腫瘤消退(McNamara,JO.，等人(2006)Nat.Biotechnol.24：1005-1015)。另一項具體實施 例，可使用藥物傳遞系統(如奈米粒子、樹枝狀物、聚合物、脂質體或陽離子性傳遞系統)傳遞iRNA。帶正電價之陽離子性傳遞系統可促進iRNA分子(帶負電價)之結合性，亦加強在帶負電價之細胞膜上之交互作用，讓細胞有效吸收iRNA。陽離子性脂質、樹枝狀物、或聚合物可與iRNA結合，或誘發形成包埋iRNA之囊泡或微胞(參見例如，Kim SH.，等人(2008)Journal of Controlled Release 129(2)：107-116)。形成囊泡或微胞可在全身投藥時進一步預防iRNA降解。製造及投藥陽離子性-iRNA複合物之方法係熟悉此相關技術者之能力範圍內(參見例如，Sorensen,DR.，等人(2003)J.Mol.Biol 327：761-766；Verma,UN.，等人(2003)Clin.Cancer Res.9：1291-1300；Arnold,AS等人(2007)J.Hypertens.25：197-205，其完整揭示內容已以引用之方式併入本文中)。適用於全身性傳遞iRNA之藥物傳遞系統之某些非限制性實例包括DOTAP(Sorensen,DR.，等人(2003)，如上述文獻；Verma,UN.，等人(2003)，如上述文獻)、寡染胺(Oligofectamine)、“固態核酸脂質粒子”(Zimmermann,TS.，等人(2006)Nature 441：111-114)、心磷脂(cardiolipin)(Chien,PY.等人(2005)Cancer Gene Ther.12：321-328；Pal,A.，等人(2005)Int J.Oncol.26：1087-1091)、聚乙烯亞胺(Bonnet ME.，等人(2008)Pharm.Res.8月16日電子書(Epub ahead of print)；Aigner,A.(2006)J.Biomed.Biotechnol.71659)、Arg-Gly-Asp(RGD)肽類(Liu,S.(2006)Mol.Pharm.3：472-487)、與聚醯胺基胺類(Tomalia,DA.，等人(2007) Biochem.Soc.Trans.35：61-67；Yoo,H.，等人(1999)Pharm.Res.16：1799-1804)。某些具體實施例中，iRNA與環糊精形成複合物，供全身性投藥。iRNA與環糊精之投藥方法與醫藥組成物可參見美國專利案案號7,427,605，其完整揭示內容已以引用之方式併入本文中。
A. 編碼本發明iRNA之載體
靶向Serpinc1基因之iRNA可由經插入DNA或RNA載體中之轉錄單位表現(參見例如，Couture,A等人TIG.(1996),12：5-10；Skillern,A.等人之國際PCT公開案案號WO 00/22113、Conrad之國際PCT公開案案號WO 00/22114、與Conrad之美國專利案案號6,054,299)。該表現可為瞬時性(數小時至數週)或持續性(數週至數個月或更久)，依所採用之特定構築體與標靶組織或細胞型態而定。此等轉殖基因可呈線性構築體、環狀質體、或病毒載體導入，其可為整合或非整合載體。亦可構築該轉殖基因，使其得以呈染色體外質體遺傳(Gassmann等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92：1292)。
iRNA之個別股或兩股可由表現載體上之啟動子轉錄。當希望這兩個分開股可以表現產生例如，dsRNA時，可以將兩個分開之表現載體共同導入(例如，轉染或感染)至標靶細胞中。或者，dsRNA之各個別股可利用均位於相同表現質體上之啟動子轉錄。一項具體實施例中，dsRNA係呈利用連接基聚核苷酸序列連接之反向重複序列聚核苷酸表現，因此dsRNA具有莖與環結構。
iRNA表現載體通常為DNA質體或病毒載體。可採用可與真核生物細胞相容，較佳為彼等與脊椎動物細胞相容之表現載體來製造重組構築體，供表現本文所說明之iRNA。真核生物細胞表現載體係相關技藝上習知，且可從許多商品來源取得。通常，所提供之此等載體包含合宜之限制酶切割位點，供插入所需之核酸節段。可經全身性傳遞iRNA表現載體，如經靜脈內或經肌內投藥、投藥至從患者取出之標靶細胞後再導入至患者體內、或採用可以進入所需標靶細胞中之任何其他方式。
iRNA表現質體可與陽離子性脂質載劑(例如，寡染胺(Oligofectamine)或基於非陽離子性脂質之載劑(例如，Transit-TKOTM)形成複合物轉染至標靶細胞。本發明範圍內亦包括持續一週或更久之多重脂質轉染法，供iRNA介導減弱靶向標靶RNA之不同區。可採用各種不同已知方法追蹤成功導入載體至宿主細胞。例如，瞬時轉染可以標記報導子為訊號，如螢光標記物，如綠色螢光蛋白質(GFP)。採用可讓轉染細胞對特定環境因子(例如，抗體與藥物)具有抗性之標記物(如潮黴素B(hygromycin B)抗性)來確認離體細胞之穩定轉染。
本文所說明方法與組成物可利用之病毒載體系統包括但不限於：(a)腺病毒載體；(b)逆轉錄病毒載體，包括(但不限於)：慢病毒(lentivirus)載體、莫洛尼氏白血病病毒(moloney murine leukemia virus)等等；(c)腺相關病毒載體；(d)單純皰疹病毒載體；(e)SV 40載體；(f)多瘤病 毒載體；(g)乳突病毒載體；(h)小核糖核酸病毒載體；(i)痘病毒載體，如正痘(orthopox)，例如，牛痘病毒載體或鳥痘，例如，金絲雀痘或禽痘；與(j)輔助病毒依賴性或無腸腺病毒。複製缺陷病毒亦有利。不同載體將成為或不成為併入至細胞基因組。若需要時，該構築體可包括用於轉染之病毒序列。或者，該構築體可併入可以進行附加體型複製之載體，例如，EPV與EBV載體。用於iRNA之重組表現之構築體通常需要調節單元，例如，啟動子、加強子等等，以確保iRNA於標靶細胞中之表現。下文將進一步說明有關載體與構築體之其他態樣。
適用於傳遞iRNA之載體包括足以在所需標靶細胞或組織中表現iRNA之調節單元(啟動子、加強子等等)。可選擇該等調節單元來提供組成性或調節/誘發性表現。
可以藉由，例如，利用對某些生理調節劑(例如，循環葡萄糖含量或激素)敏感之誘發性調節序列準確調節iRNA之表現(Docherty等人，1994,FASEB J.8：20-24)。此等適用於細胞中或哺乳動物中控制dsRNA表現之誘發性表現系統包括，例如，利用蛻皮激素、雌激素、黃體酮、四環素、二聚合之化學誘發劑、與異丙基-β-D1-硫代哌喃半乳糖苷(IPTG)之調節作用。熟悉此相關技術者將有能力依據iRNA轉殖基因之計畫用途選擇適當之調節/啟動子序列。
可使用包含編碼iRNA之核酸序列之病毒載 體。例如，可使用逆轉錄病毒載體(參見miller等人，meth.Enzymol.217：581-599(1993))。此等逆轉錄病毒載體包含正確包裹病毒基因組及整合至宿主細胞DNA時所必要之組份。選殖編碼iRNA之核酸序列至一或多種載體中，促進傳遞核酸至患者中。有關逆轉錄病毒載體之更詳細說明可參見例如，Boesen等人之Biotherapy 6：291-302(1994)，其說明使用逆轉錄病毒載體傳遞mdr1基因至造血幹細胞，以便製造更能抵抗化療之幹細胞。其他說明逆轉錄病毒載體於基因療法中用途之參考文獻為：Clowes等人，J.Clin.Invest.93：644-651(1994)；Kiem等人，Blood 83：1467-1473(1994)；Salmons與Gunzberg,Human Gene Therapy 4：129-141(1993)；與Grossman與Wilson,Curr.Opin.In Genetics and Devel.3：110-114(1993)。計畫使用之慢病毒載體包括例如，美國專利案案號6,143,520；5,665,557；與5,981,276所說明之基於HIV之載體，其揭示內容已以引用之方式併入本文中。
亦計畫使用腺病毒來傳遞本發明iRNA。腺病毒為特別值得注意之媒劑，例如，用於傳遞基因至呼吸上皮。腺病毒會自然感染呼吸上皮，在此造成輕度疾病。基於腺病毒之傳遞系統之其他標靶為肝臟、中樞神經系統、內皮細胞、與肌肉。腺病毒之優點在於可以感染非分裂細胞。Kozarsky與Wilson,Current Opinion in Genetics and Development 3：499-503(1993)提出有關基於腺病毒之基因療法之概論。Bout等人，Human Gene Therapy 5：3-10(1994) 證實使用腺病毒載體轉移基因至恒河猴之呼吸上皮。腺病毒於基因療法中之其他用途實例可參見Rosenfeld等人，Science 252：431-434(1991)；Rosenfeld等人，Cell 68：143-155(1992)；Mastrangeli等人，J.Clin.Invest.91：225-234(1993)；PCT公開案WO94/12649；與Wang等人之Gene Therapy 2：775-783(1995)。適合表現如本文所說明特徵之iRNA之AV載體、構築重組AV載體之方法及傳遞載體至標靶細胞之方法說明於Xia H等人(2002),Nat.Biotech.20：1006-101。
亦可使用腺相關病毒(AAV)載體來傳遞本發明iRNA(Walsh等人，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204：289-300(1993)；美國專利案案號5,436,146)。一項具體實施例中，可由具有例如，U6或H1 RNA啟動子或巨細胞病毒(CMV)發動子之重組AAV載體表現iRNA，其係呈兩個分開之互補單股RNA分子。適合表現如本發明所說明特徵之dsRNA之AAV載體、構築重組AV載體之方法及傳遞載體至標靶細胞之方法說明於Samulski R等人(1987),J.Virol.61：3096-3101；Fisher K J等人(1996),J.Virol,70：520-532；Samulski R等人(1989),J.Virol.63：3822-3826；美國專利案案號5,252,479；美國專利案案號5,139,941；國際專利申請案案號WO 94/13788；與國際專利申請案案號WO 93/24641，其完整揭示內容已以引用之方式併入本文中。
另一種適合傳遞本發明iRNA之病毒載體為痘病毒，如牛痘病毒，例如，減毒牛痘，如經修飾之安卡拉(Ankara)病毒(MVA)或NYVAC、鳥痘，如禽痘或金絲雀 痘。
病毒載體之向性可利用外套膜蛋白假性病毒載體或來自其他病毒之其他表面抗原進行修飾，或適當時改用不同病毒外鞘蛋白質取代。例如，慢病毒載體可利用來自水泡性病毒(VSV)、狂犬病、伊波拉(Ebola)、蒙古拉(Mokola)等等之表面蛋白質進行假性處理。AAV載體可經過處理，讓載體表現不同外鞘蛋白質血清型，而靶向不同細胞；參見例如，Rabinowitz J E等人(2002),J Virol 76：791-801，其完整揭示內容已以引用之方式併入本文中。
載體之醫藥製劑中可包括含在可接受之稀釋劑中之載體，或可包括其中已包埋基因傳遞媒劑之緩釋基質。或者，若可從重組細胞(例如，逆轉錄病毒載體)完整產生完整基因傳遞載體時，醫藥製劑可包括產生基因傳遞系統之一或多種細胞。
V. 本發明之醫藥組成物
本發明亦提供一種包含本發明iRNA之醫藥組成物與調配物。
一項具體實施例中，本文提供包含本文說明之iRNA與醫藥上可接受之載劑之醫藥組成物。該包含iRNA之醫藥組成物適用於治療與Serpinc1基因表現或活性相關之疾病或疾患，例如，Serpinc1-相關疾病。此等醫藥組成物係依據傳遞模式調配。其中一項實例為一種調配成以非經腸式傳遞而全身性投藥之組成物，例如，經皮下(SC)或經靜脈內(IV)傳遞。另一項實例為調配成直接傳遞 至腦實質之組成物，例如，採用如連續幫浦輸注至腦內。本發明醫藥組成物可投藥足以抑制Serpinc1基因表現之劑量。
本發明某些具體實施例中，例如，當該醫藥組成物包含之雙股RNAi劑包括在三個連續核苷酸上有三個相同修飾之一個或多個基序(包括在該製劑之裂解位點或接近裂解位點之一個此等基序)、6個硫代磷酸鍵連、及GalNAc配體時，此等組成物之投藥劑量為約0.01至約0.5mg/kg、約0.01至約0.4mg/kg、約0.01至約0.3mg/kg、約0.01至約0.2mg/kg、約0.01至約0.1mg/kg、約0.01mg/kg至約0.09mg/kg、約0.01mg/kg至約0.08mg/kg、約0.01mg/kg至約0.07mg/kg、約0.01mg/kg至約0.06mg/kg、約0.01mg/kg至約0.05mg/kg、約0.02至約0.5mg/kg、約0.02至約0.4mg/kg、約0.02至約0.3mg/kg、約0.02至約0.2mg/kg、約0.02至約0.1mg/kg、約0.02mg/kg至約0.09mg/kg、約0.02mg/kg至約0.08mg/kg、約0.02mg/kg至約0.07mg/kg、約0.02mg/kg至約0.06mg/kg、約0.02mg/kg至約0.05mg/kg、約0.03至約0.5mg/kg、約0.03至約0.4mg/kg、約0.03至約0.3mg/kg、約0.03至約0.2mg/kg、約0.03至約0.1mg/kg、約0.03mg/kg至約0.09mg/kg、約0.03mg/kg至約0.08mg/kg、約0.03mg/kg至約0.07mg/kg、約0.03mg/kg至約0.06mg/kg、約0.03mg/kg至約0.05mg/kg、約0.04至約0.5mg/kg、約0.04至約0.4mg/kg、約0.04至約0.3mg/kg、約0.04至約0.2mg/kg、約0.04至約0.1 mg/kg、約0.04mg/kg至約0.09mg/kg、約0.04mg/kg至約0.08mg/kg、約0.04mg/kg至約0.07mg/kg、約0.04mg/kg至約0.06mg/kg、約0.05至約0.5mg/kg、約0.05至約0.4mg/kg、約0.05至約0.3mg/kg、約0.05至約0.2mg/kg、約0.05至約0.1mg/kg、約0.05mg/kg至約0.09mg/kg、約0.05mg/kg至約0.08mg/kg、或約0.05mg/kg至約0.07mg/kg。上示數值之間之數值與範圍亦包括為本發明之一部份，例如，該RNAi劑投藥該個體之劑量可為約0.015mg/kg至約0.45mg/mg。
例如，該RNAi劑，例如，呈醫藥組成物之RNAi劑之投藥劑量可為約0.01mg/kg、0.0125mg/kg、0.015mg/kg、0.0175mg/kg、0.02mg/kg、0.0225mg/kg、0.025mg/kg、0.0275mg/kg、0.03mg/kg、0.0325mg/kg、0.035mg/kg、0.0375mg/kg、0.04mg/kg、0.0425mg/kg、0.045mg/kg、0.0475mg/kg、0.05mg/kg、0.0525mg/kg、0.055mg/kg、0.0575mg/kg、0.06mg/kg、0.0625mg/kg、0.065mg/kg、0.0675mg/kg、0.07mg/kg、0.0725mg/kg、0.075mg/kg、0.0775mg/kg、0.08mg/kg、0.0825mg/kg、0.085mg/kg、0.0875mg/kg、0.09mg/kg、0.0925mg/kg、0.095mg/kg、0.0975mg/kg、0.1mg/kg、0.125mg/kg、0.15mg/kg、0.175mg/kg、0.2mg/kg、0.225mg/kg、0.25mg/kg、0.275mg/kg、0.3mg/kg、0.325mg/kg、0.35mg/kg、0.375mg/kg、0.4mg/kg、0.425mg/kg、0.45mg/kg、0.475mg/kg、或約0.5mg/kg。上述數值之間之數值亦為本發明之一部份。
本發明某些具體實施例中，例如，當雙股RNAi劑包含正義股及反義股，該反義股包含互補區，其包含至少15個連續核苷酸(其與核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’之差異不超過3個核苷酸)，其中正義股之實質上所有核苷酸及反義股之實質上所有核苷酸為經修飾之核苷酸，且其中該正義股係接合至附接在3’-終端之配體時，此等呈醫藥組成物之製劑之投藥劑量為約0.015mg/kg至約0.15mg/kg、約0.02mg/kg至約0.15mg/kg、0.02mg/kg至約0.15mg/kg、0.03mg/kg至約0.15mg/kg、0.04mg/kg至約0.15mg/kg、0.05mg/kg至約0.15mg/kg、0.06mg/kg至約0.15mg/kg、0.07mg/kg至約0.15mg/kg、0.08mg/kg至約0.15mg/kg、0.09mg/kg至約0.15mg/kg、0.01mg/kg至約0.15mg/kg、0.015mg/kg至約0.1mg/kg、0.015mg/kg至約0.09mg/kg、0.015mg/kg至約0.08mg/kg、0.015mg/kg至約0.07mg/kg、0.015mg/kg至約0.06mg/kg、0.015mg/kg至約0.05mg/kg、0.015mg/kg至約0.04mg/kg、0.015mg/kg至約0.03mg/kg、0.015mg/kg至約0.02mg/kg、0.045mg/kg至約0.15mg/kg、0.075mg/kg至約0.15mg/kg、0.045mg/kg至約0.1mg/kg、0.075mg/kg至約0.1mg/kg、0.045mg/kg至約0.125mg/kg、或約0.075mg/kg至約0.125mg/kg。
例如，該RNAi劑，例如，呈醫藥組成物之RNAi劑之投藥劑量可為約0.01mg/kg、0.0125mg/kg、0.015mg/kg、0.0175mg/kg、0.02mg/kg、0.0225mg/kg、0.025 mg/kg、0.0275mg/kg、0.03mg/kg、0.0325mg/kg、0.035mg/kg、0.0375mg/kg、0.04mg/kg、0.0425mg/kg、0.045mg/kg、0.0475mg/kg、0.05mg/kg、0.0525mg/kg、0.055mg/kg、0.0575mg/kg、0.06mg/kg、0.0625mg/kg、0.065mg/kg、0.0675mg/kg、0.07mg/kg、0.0725mg/kg、0.075mg/kg、0.0775mg/kg、0.08mg/kg、0.0825mg/kg、0.085mg/kg、0.0875mg/kg、0.09mg/kg、0.0925mg/kg、0.095mg/kg、0.0975mg/kg、0.1mg/kg、0.125mg/kg、或0.15mg/kg。上述數值之間之數值亦為本發明之一部份。
包含該iRNA之醫藥組成物可約一週一次、約一個月2次、約每6週一次、或約每2個月一次投藥該個體。
包含該iRNA劑之醫藥組成物可呈一種或多種劑量投藥該個體。例如，某些具體實施例中，包含該雙股iRNA劑之醫藥組成物投藥個體之劑量為每週劑量約0.015mg/kg至約0.15mg/kg為期3週，或每週劑量約0.01125mg/kg至約0.1125mg/kg為期4週，或每月劑量約0.03mg/kg至約0.3mg/kg。其他具體實施例中，包含該雙股iRNA劑之醫藥組成物投藥個體之劑量可為每週劑量約0.015mg/kg至約0.125mg/kg、每週劑量約0.045mg/kg至約0.125mg/kg、或每週劑量約0.075mg/kg至約0.125mg/kg。再另一項具體實施例中，包含該雙股iRNA劑之醫藥組成物投藥個體之劑量可為每月劑量約0.015mg/kg至約0.125mg/kg、每月劑量約0.045mg/kg至約0.125mg/kg、 或每月劑量約0.075mg/kg至約0.125mg/kg。
該醫藥組成物可經靜脈輸注投藥一段時間，如歷經5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、及21、22、23、24、或約25分鐘之期間。投藥法可以重複，例如，定期重複，如每週、雙週(亦即每兩週)、每月、每兩個月、每三個月、每四個月、或更久。經過初次療程後，該治療法可以減少投藥頻率。例如，經過每週或雙週投藥為期3個月後，可以每個月重複投藥一次，為期6個月或一年或更久。
醫藥組成物可以一天投藥一次，或iRNA可在一天內依適當間隔投藥兩個、三個或更多個小劑量，或甚至使用連續輸注或透過控制釋放之調配物傳遞。此時，各小劑量中之iRNA含量必需相對減少，以達到總日劑量。該劑量單位亦可組合以供持續傳遞數天，例如，採用常用之持續釋放調配物，其可歷經數天持續釋放iRNA。持續釋放調配物係相關技藝上已知，且特別適用於在特定位點傳遞該製劑，如可與本發明製劑一起使用。此具體實施例中，該劑量單位包含對應之多重每日劑量。
其他具體實施例中，醫藥組成物之單一劑量可以為長效性，因此下一個劑量可在間隔不超過1、2、3、4、5、6、7、或8週內投藥。本發明有些具體實施例中，本發明醫藥組成物之單一劑量係一個月投藥一次。
熟悉此相關技術者咸了解，某些因素會影響有效治療個體時所需之劑量與投藥時間，包括但不限 於，疾病或疾患之嚴重性、過去之治療、該個體之一般健康與/或年齡、及其他現有疾病。此外，以醫療有效量之組成物治療該個體時，可包括單次治療或連續治療。本發明所包括之個別iRNA可採用習知方法或使用本文說明之適當動物模式，依據活體內試驗估測其有效劑量及活體內半衰期。
小鼠基因學上之進展已產生許多小鼠模式，供探討各種不同人類疾病，如可因降低Serpinc1表現而受益之出血疾患。此等模式可用於活體內測試iRNA，並決定醫療有效劑量。合適小鼠模式係相關技藝上已知，且包括例如，血友病A小鼠模式及血友病B小鼠模式，例如，含有剔除凝結因子基因之小鼠，如彼等說明於Bolliger等人(2010)Thromb Haemost 103：1233-1238、Bi L等人(1995)Nat Genet 10：119-21、Lin等人(1997)Blood 90：3962-6、Kundu等人(1998)Blood 92：168-74、Wang等人(1997)Proc Natl Acad Sci U S A 94：11563-6、及Jin等人(2004)Blood 104：1733。
本發明醫藥組成物可依許多方式投藥，端賴是否需要局部或全身性治療及需要治療之區域而定。投藥法可能為局部(例如，採用穿皮式貼布)、經肺部，例如，吸入或吹入粉劑或氣霧劑，包括利用噴霧器；經氣管內、經鼻內、經表皮與穿皮、經口或非經腸式。非經腸式投藥法包括經靜脈內、經動脈內、經皮下、經腹膜內或經肌內注射或輸注；皮下，例如，經由植入裝置；或經顱內，例 如，經腦實質內、鞘內或腦室內投藥。
iRNA可依靶向方式傳遞到特定組織，如肝臟(例如，肝臟之肝細胞)。
供局部投藥之醫藥組成物與調配物可包括穿皮式貼布、油膏、洗液、乳霜、凝膠、滴劑、栓劑、噴液、液體與粉劑。可能必須或需要使用常用之醫藥載劑、水性、粉狀或油性基質、增稠劑等等。有塗層之保險套、手套等等亦適用。合適之局部調配物包括彼等由如本發明所說明特徵之iRNA與局部傳遞劑(如脂質、脂質體、脂肪酸、脂肪酸酯類、類固醇、螯合劑與界面活性劑)混合者。局部調配物詳細說明於美國專利案案號6,747,014，其揭示內容已以引用之方式併入本文中。
A. 其他調配物
i. 乳液
本發明組成物可製造並調配成乳液。乳液為一種液體呈直徑通常不超過0.1μm之液滴型態勻散在另一種液體中之典型不均相系統(參見例如，Ansel之“醫藥劑型與藥物傳遞系統(Dosage Forms and Drug Delivery Systems)”，Allen,LV.、Popovich NG.與Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(第8版)，New York,NY；Idson述於“醫藥劑型(Parmaceutical Dosage Forms)”,Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,第一冊，p.199；Rosoff述於“醫藥劑型(Parmaceutical Dosage Forms)”,Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988, Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第一冊，p.245；Block述於“醫藥劑型(Parmaceutical Dosage Forms)”,Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第2冊，p.335；Higuchi等人述於“雷氏醫藥學(Remington's Parmaceutical Sciences)”,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.301)。乳液通常為雙相系統，其包含兩個彼此密切混合與分散之不可混溶之液相。通常，乳液可為油包水(w/o)型或水包油(o/w)型。當水相呈小液滴均勻分佈且分散在大體積之油相中時，所得組成物稱為油包水性(w/o)乳液。或者，當油相呈小液滴均勻分佈且分散在大體積之水相中時，所得組成物稱為水包油性(o/w)乳液。乳液中除了分散相外，可再包含其他組份，且活性藥物可呈溶液存在於水相、油相或本身另呈一相。需要時，乳液中亦可包含醫藥賦形劑，如乳化劑、穩定劑、染劑、與抗氧化劑。醫藥乳液亦可為由超過兩相組成之多相乳液，如，例如，以油包水包油性(o/w/o)與水包油包水性(w/o/w)乳液為例。此等複合調配物經常提供單純二元乳液沒有之優點。其中o/w乳液之個別油滴包埋小水滴之多相乳液即構成w/o/w乳液。同樣地，由油滴包埋在於油連續相中穩定化之水球中之系統即提供o/w/o乳液。
乳液之特徵在於很低或沒有熱動力學穩定性。通常，乳液之分散相或不連續相均勻分佈在外相或連續相內，並利用乳化劑或調配物之黏度維持此型式。乳液之任一相可以為半固體或固體，如乳液型油膏基質與乳 霜。其他穩定乳液方式可以使用乳化劑，引進乳液之任一相中。乳化劑可廣義分為四類：合成性界面活性劑、天然乳化劑、吸收基質、與均勻分散之固體(參見例如，Ansel之“醫藥劑型與藥物傳遞系統(Dosage Forms and Drug Delivery Systems)”,Allen,LV.、Popovich NG.與Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(第8版)，New York,NY；Idson述於“醫藥劑型(Parmaceutical Dosage Forms)”,Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第一冊，p.199)。
合成性界面活性劑亦已知為表面活性劑，已廣泛用於乳液之調配物，且已於文獻中說明(參見例如，Ansel之“醫藥劑型與藥物傳遞系統(Dosage Forms and Drug Delivery Systems)”，Allen,LV.、Popovich NG.與Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(第8版)，New York,NY；Rieger述於“醫藥劑型(Parmaceutical Dosage Forms)”,Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第一冊，p.285；Idson述於“醫藥劑型(Parmaceutical Dosage Forms)”,Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988，第一冊，p.199)。界面活性劑通常為兩親性，其包含親水性與疏水性部份。界面活性劑之親水性對疏水性性質之比值稱為親水物/親脂物平衡值(HLB)，係在製備調配物時用於分類及選擇界面活性劑之有利工具。界面活性劑可依據親水性基團性質分成不同類型：非離子性、陰離子性、陽離子性、與 兩親性(參見例如，Ansel之“醫藥劑型與藥物傳遞系統(Dosage Forms and Drug Delivery Systems)”,Allen,LV.、Popovich NG.與Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(第8版)，New York,NY；Rieger述於“醫藥劑型(Parmaceutical Dosage Forms)”,Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第一冊，p.285)。
用於乳液調配物之天然乳化劑包括羊毛脂、蜂蠟、磷脂、卵磷脂與阿拉伯膠。吸收性基質具有親水性性質，因此可吸水形成w/o乳液，但仍保留其半固態堅實度，如無水羊毛脂與親水性石蠟。亦可使用細碎固體作為良好乳化劑，尤其與界面活性劑組合及用於黏性製劑中時。此等包括極性無機固體，如重金屬氫氧化物、非膨脹性黏土，如皂土、矽鎂土、鋰蒙脫石、高嶺土、蒙脫土、膠體矽酸鋁與膠體矽酸鎂鋁、色素、與非極性固體，如碳或三硬脂酸甘油酯。
乳液調配物中亦可包括許多種不同之非乳化材料，其可賦與乳液性質。此等物質包括脂肪、油類、蠟類、脂肪酸、脂肪醇類、脂肪酯類、保濕劑、親水性膠體、防腐劑與抗氧化劑(Block述於“醫藥劑型(Parmaceutical Dosage Forms)”,Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第一冊，p.335；Idson述於“醫藥劑型(Parmaceutical Dosage Forms)”,Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988,Marcel Dekker,Inc., New York,N.Y.，第一冊，p.199)。
親水性膠體或水膠體包括天然膠質與合成性聚合物，如多醣類(例如，阿拉伯膠、洋菜、藻酸、鹿角菜膠、關華豆膠、卡拉膠與黃蓍膠)、纖維素衍生物(例如，羧甲基纖維素與羧丙基纖維素)、與合成性聚合物(例如，卡波姆(carbomers)、纖維素醚與羧乙烯基聚合物)。此等物質於水中分散或膨脹，形成膠體溶液，藉由在分散相之液滴周圍形成強力界面膜並提高外相之黏度，而穩定該乳液。
由於乳液經常包含許多如碳水化合物、蛋白質、固醇類、與磷脂之成份，很容易支持微生物生長，因此此等調配物經常添加防腐劑。常包括於乳液調配物中之防腐劑包括對羥基苯甲酸甲基酯、對羥基苯甲酸丙基酯、四級銨鹽類、氯化芐二甲烴銨、對羥基苯甲酸之酯類、與硼酸。亦經常添加抗氧化劑至乳液調配物中，以防止破壞調配物。所使用之抗氧化劑可為游離基清除劑，如生育酚、沒食子酸烷基酯、丁基化羥基苯甲醚、丁基化羥基甲苯，或還原劑，如抗壞血酸與偏亞硫酸氫鈉，與抗氧化促效劑，如檸檬酸、酒石酸與卵磷脂。
乳液調配物經由皮膚、口、與非經腸式途徑之施用法與其製造方法已有文獻說明(參見例如，Ansel之“醫藥劑型與藥物傳遞系統(Dosage Forms and Drug Delivery Systems)”,Allen,LV.、Popovich NG.與Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(第8版)，New York,NY；Idson述於“醫藥劑型(Parmaceutical Dosage Forms)”, Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y..第一冊，p.199)。用於經口傳遞之乳液調配物因為容易調配，且從吸收效力與生體可用率觀點，已極廣泛使用(參見例如，Ansel之“醫藥劑型與藥物傳遞系統(Dosage Forms and Drug Delivery Systems)”,Allen,LV.、Popovich NG.與Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(第8版)，New York,NY；Rosoff述於“醫藥劑型(Parmaceutical Dosage Forms)”,Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第一冊，p.245；Idson述於“醫藥劑型(Parmaceutical Dosage Forms)”,Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第一冊，p.199)。基於礦物油之緩瀉劑、油溶性維生素與高脂肪營養製劑為常用於呈o/w乳液經口投藥之材料。
ii. 微乳液
本發明一項具體實施例中，iRNA與核酸之組成物係調配成微乳液。微乳液之定義為由水、油與兩親物形成光學上各向同性且熱動力學上穩定之單一液體溶液之系統(參見例如，Ansel之“醫藥劑型與藥物傳遞系統(Dosage Forms and Drug Delivery Systems)”,Allen,LV.、Popovich NG.與Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(第8版)，New York,NY；Rosoff述於“醫藥劑型(Parmaceutical Dosage Forms)”,Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第一冊，p.245)。典型微乳液 為先讓油分散在水性界面活性劑溶液中，然後添加足量之第四組份所形成之系統，通常添加中鏈長醇類，以形成透明系統。因此，微乳液亦稱為兩種不混溶液體之動力學上穩定之各向同性透明分散液，其係利用表面活性分子之界面膜穩定化(Leung與Shah述於：“藥物之控制釋放：聚合物與凝集物系統(Controlled Release of Drugs：Polymers and Aggregate System)”,Rosoff,M，編輯，1989,VCH Publishers,New York,p.185-215)。微乳液通常經由3至5種組份組合製成，其包括油、水、界面活性劑、輔界面活性劑與電解質。該微乳液為油包水(w/o)或水包油(o/w)型端賴所使用油及界面活性劑之性質及界面活性劑分子之極性頭端與烴尾端之結構與幾何堆疊而定(Schott述於“雷氏醫藥學(Remington's Parmaceutical Sciences)”,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.271)。
利用相態圖之現象學方法已有深入研究，且已產生大量知識，讓熟悉此相關技術者了解如何調配微乳液(參見例如，Ansel之“醫藥劑型與藥物傳遞系統(Dosage Forms and Drug Delivery Systems)”,Allen,LV.、Popovich NG.與Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(第8版)，New York,NY；Rosoff述於“醫藥劑型(Parmaceutical Dosage Forms)”,Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第一冊，p.245；Block述於“醫藥劑型(Parmaceutical Dosage Forms)”,Lieberman、Rieger與Banker(編輯)，1988,Marcel Dekker,Inc., New York,N.Y.，第一冊，p.335)。相較於一般乳液，微乳液之優點在於可在自發性形成之熱動力學上穩定之液滴之調配物中溶解水不溶性藥物。
製備微乳液時所使用之界面活性劑包括，但不限於，離子性界面活性劑、非離子性界面活性劑、Brij 96、聚氧乙烯油基醚類、聚甘油脂肪酸酯類、單月桂酸四甘油酯(ML310)、單油酸四甘油酯(MO310)、單油酸六甘油酯(PO310)、五油酸六甘油酯(PO500)、單癸酸十甘油酯(MCA750)、單油酸十甘油酯(MO750)、倍半油酸十甘油酯(SO750)、十油酸十甘油酯(DAO750)，其可單獨使用或與輔界面活性劑組合使用。輔界面活性劑通常為短鏈醇，如乙醇、1-丙醇、與1-丁醇，其藉由滲透入界面活性劑膜，在界面活性劑分子之間產生空隙，因此造成無序膜，而提高界面流動性。然而不需要使用輔界面活性劑亦可製備微乳液，且相關技藝上已知不含醇之可自行乳化之微乳液系統。典型之水相為，但不限於，水、藥物水溶液、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙二醇、與乙二醇之衍生物。該油相可包括，但不限於，下列材料，如Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸酯類、中鏈(C8-C12)單酸-、二酸-、與三酸甘油酯、聚氧乙基化甘油基脂肪酸酯類、脂肪醇類、聚二醇化甘油酯類、飽和聚二醇化C8-C10甘油酯類、植物油與矽酮油類。
從藥物溶解度與加強藥物吸收性之觀點而言，微乳液特別值得注意。已提出基於脂質之微乳液(包括 o/w與w/o)來加強藥物(包括肽)之口服生體可用率(參見例如，美國專利案案號6,191,105；7,063,860；7,070,802；7,157,099；Constantinides等人，Pharmaceutical Research,1994,11,1385-1390；Ritschel之Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.,1993,13,205)。微乳液提供之優點為改善藥物溶解性、保護藥物免於酵素水解、可能基於界面活性劑誘發改變膜流動性與通透性而加強藥物吸收性、容易製備、比固態劑型容易經口投藥、改善臨床效力、及降低毒性(參見例如，美國專利案案號6,191,105；7,063,860；7,070,802；7,157,099；Constantinides等人，Pharmaceutical Researchh,1994,11,1385；Ho等人，J.Pharm.Sci.,1996,85,138-143)。當於環境溫度將微乳液組份組合在一起時，經常可自發性形成微乳液。當調配對熱敏感之藥物、肽、或iRNA時，微乳液特別有利。微乳液亦可在化妝品與醫藥用途上有效地穿皮式傳遞活性組份。預期本發明微乳液組成物與調配物將可促進胃腸道提高iRNA與核酸之全身吸收性，並改善局部細胞吸收iRNA與核酸。
本發明之微乳液亦可包含其他組份與添加劑，如山梨糖醇酐單硬脂酸酯(Grill 3)、聚乙二醇-8-辛酸/癸酸酯(Labrasol)與滲透加強劑，以改善調配物性質，及加強本發明iRNA與核酸之吸收性。本發明微乳液所採用之滲透加強劑可分為1至5大類-界面活性劑、脂肪酸，膽汁鹽類、螯合劑與非螯合性非界面活性劑(Lee等人，“醫療藥物載劑系統之關鍵報告(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)”,1991,p.92)。各類此等物質已於上文中說明。
iii. 微粒子
本發明RNAi劑可併入至粒子，例如，微粒子。微粒子可由噴霧乾燥法產生，但亦可採用其他方法，包括冷凍乾燥、蒸發、流化床乾燥、真空乾燥、或此等技術之組合。
iv. 滲透加強劑
一項具體實施例中，本發明使用各種不同滲透加強劑，讓核酸(特定言之iRNA)有效傳遞至動物皮膚。大多數藥物在溶液中係呈離子化與非離子化型。然而，通常僅有脂質可溶性或親脂性藥物容易通過細胞膜。已發現，若該要通過的膜經過滲透加強劑處理時，即使非親脂性藥物亦可穿過細胞膜。此外，為了協助非親脂性藥物擴散通過細胞膜，滲透加強劑亦可加強親脂性藥物之通透性。
滲透加強劑可分成1至5大類，亦即界面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽類、螯合劑、與非螯合性非界面活性劑(參見例如，Malmsten,M.之“用於藥物傳遞之界面活性劑與聚合物(Surfactants and polymers in drug delivery)”,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee等人之“醫療藥物載劑系統之關鍵報告(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)”,1991,p.92)。上述各類滲透加強劑將更詳細說明於下文中。
界面活性劑(或“表面活性劑”)為一種在溶於水溶液中時可以降低溶液之表面張力或水溶液與另一 種液體之間之界面張力之化學物質，結果將加強iRNA通過黏膜之吸收性。除了膽汁鹽類與脂肪酸外，此等滲透加強劑包括例如，月桂基硫酸鈉、聚氧乙烯-9-月桂基醚與聚氧乙烯-20-鯨蠟基醚(參見例如，Malmsten,M.之“用於藥物傳遞之界面活性劑與聚合物(Surfactants and polymers in drug delivery)”,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee等人之“醫療藥物載劑系統之關鍵報告(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)”,1991,p.92)；與全氟化學乳液，如FC-43.Takahashi等人，J.Pharm.Pharmacol.,1988,40,252)。
可作為滲透加強劑之各種不同脂肪酸與其衍生物包括例如，油酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油單油酸酯(1-單油基-消旋性-甘油)、甘油二月桂酸酯、辛酸、花生四烯酸、甘油1-單癸酸酯、1-十二碳烷基氮雜環庚烷-2-酮、醯基肉鹼、醯基膽鹼、其C1-20烷基酯(例如，甲基酯、異丙基酯與第三丁基酯)、及其單酸-與二酸甘油酯(亦即油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、肉豆蔻酸酯、棕櫚酸酯、硬脂酸酯、亞油酸酯，等等)(參見例如，Touitou,E.等人之“加強藥物傳遞(Enhancement in Drug Delivery)”,CRC Press,Danvers,MA,2006；Lee等人，“醫療藥物載劑系統之關鍵報告(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)”,1991,p.92；Muranishi之“醫療藥物載劑系統之關鍵報告(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)”,1990,7,1-33；El Hariri等人，J.Pharm.Pharmacol.,1992,44,651-654)。
膽汁之生理性角色包括促進脂質與脂溶性維生素分散與吸收(參見例如，Malmsten,M.之“用於藥物傳遞之界面活性劑與聚合物(Surfactants and polymers in drug delivery)”,Informa Health Care,New York,NY,2002；Brunton述於：古曼與奇曼氏(Goodman & Gilman)之“醫療學之藥理基礎(The Pharmacological Basis of Therapeutics)”，第38章，第9版，Hardman等人編輯，McGraw-Hill,New York,1996,pp.934-935)。各種不同天然膽汁鹽類與其合成性衍生物均可作為滲透加強劑。因此術語“膽汁鹽類”包括膽汁之任何天然組份及其任何合成性衍生物。合適膽汁鹽包括例如，膽酸(或其醫藥上可接受之鈉鹽、膽酸鈉)、去氫膽酸(去氫膽酸鈉)、去氧膽酸(去氧膽酸鈉)、葡膽酸(葡膽酸鈉)、甘膽酸(甘膽酸鈉)、去氧甘膽酸(去氧甘膽酸鈉)、牛磺膽酸(牛磺膽酸鈉)、牛磺去氧膽酸(牛磺去氧膽酸鈉)、鵝去氧膽酸(鵝去氧膽酸鈉)、熊去氧膽酸(UDCA)、牛磺-24,25-二氫-褐黴酸鈉(STDHF)、甘胺二氫褐黴酸鈉與聚氧乙烯-9-月桂基醚(POE)(參見例如，Malmsten,M.之“用於藥物傳遞之界面活性劑與聚合物(Surfactants and polymers in drug delivery)”,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee等人之“醫療藥物載劑系統之關鍵報告(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)”,1991,p.92；Swinyard述於：“雷氏醫藥學(Remington's Parmaceutical Sciences)”，第18版，第39章，Gennaro編輯，Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1990,p.782-783；Muranishi之“醫療藥物載劑系統之關鍵報告(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)”,1990,7,1-33；Yamamoto等人，J.Pharm.Exp.Ther.,1992,263,25；Yamashita等人，J.Pharm.Sci.,1990,79,579-583)。
本發明所使用之螯合劑可定義為可讓溶液中金屬離子與其形成複合物而藉以排除之化合物，結果可以藉此加強iRNA通過黏膜之吸收性。螯合劑在本發明中作為滲透加強劑之相關用法中，其附加價值在於亦可作為DNase抑制劑，因為大多數已判斷特徵之DNA核酸酶均需要二價金屬離子，供進行催化作用，因此可被螯合劑抑制(Jarrett,J.Chromatogr.,1993,618,315-339)。合適螯合劑包括但不限於乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、檸檬酸、水楊酸鹽(例如，水楊酸鈉、5-甲氧基水楊酸鹽與高碳香蘭酸鹽)、膠原蛋白之N-醯基衍生物、月桂基醚-9與β-二酮之N-胺基醯基衍生物(烯胺類)(參見例如，Katdare,A.等人之“賦形劑於醫藥、生物技術與藥物傳遞上之發展(Excipient development for pharmaceutical,biotechnology,and drug delivery)”,CRC Press,Danvers,MA,2006；Lee等人，“醫療藥物載劑系統之關鍵報告(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)”,1991,p.92；Muranishi之“醫療藥物載劑系統之關鍵報告(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)”,1990,7,1-33；Buur等人，J.Control Rel.,1990,14,43-51)。
本文所採用非螯合性非界面活性劑滲透加強化合物可定義為已證實沒有顯著螯合劑或界面活性劑活性，但仍可加強iRNA通過消化道黏膜吸收之化合物(參見例如，Muranishi之“醫療藥物載劑系統之關鍵報告(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)”,1990,7,1-33)。此類滲透加強劑包括，例如，不飽和環狀脲類、1-烷基-與1-烯基氮雜環-烷酮類衍生物(Lee等人，“醫療藥物載劑系統之關鍵報告(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)”,1991,p.92)；及非類固醇消炎劑，如雙氯芬酸鈉(diclofenac sodium)、吲哚美辛(indomethacin)與苯丁吡唑酮(phenylbutazone)(Yamashita等人，J.Pharm.Pharmacol.,1987,39,621-626)。
亦可添加可在細胞層級上加強吸收iRNA之製劑至本發明醫藥與其他組成物中。例如，亦已知陽離子性脂質，如微脂體(lipofectin)(Junichi等人，美國專利案案號5,705,188)、陽離子性甘油衍生物、與聚陽離子性分子，如聚離胺酸(Lollo等人，PCT申請案WO 97/30731)可加強細胞吸收dsRNA。可自商品取得之轉染劑實例包括例如，LipofectamineTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、Lipofectamine 2000TM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、293fectinTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、CellfectinTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、DMRIE-CTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、FreeStyleTM MAX(Invitrogen；Carlsbad,CA)、LipofectamineTM 2000 CD (Invitrogen；Carlsbad,CA)、LipofectamineTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、RNAiMAX(Invitrogen；Carlsbad,CA)、OligofectamineTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、OptifectTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、X-tremeGENE Q2轉染劑(Roche；Grenzacherstrasse，瑞士)、DOTAP脂質體轉染劑(Grenzacherstrasse，瑞士)、DOSPER脂質體轉染劑(Grenzacherstrasse，瑞士)、或Fugene(Grenzacherstrasse，瑞士)、Transfectam®試劑(Promega；Madison,WI)、TransFastTM轉染劑(Promega；Madison,WI)、TfxTM-20試劑(Promega；Madison,WI)、TfxTM-50試劑(Promega；Madison,WI)、DreamFectTM(OZ Biosciences；Marseille，法國)、EcoTransfect(OZ Biosciences；Marseille，法國)、TransPass a D1轉染劑(New England Biolabs；Ipswich,MA,USA)、LyoVecTM/LipoGenTM(Invitrogen；San Diego,CA,USA)、PerFectin轉染劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、NeuroPORTER轉染劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、GenePORTER轉染劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、GenePORTER 2轉染劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、Cytofectin轉染劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、BaculoPORTER轉染劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、TroganPORTERTM轉染劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、RiboFect(Bioline；Taunton,MA,USA)、PlasFect(Bioline；Taunton,MA,USA)、UniFECTOR(B-Bridge International；Mountain View,CA,USA)、SureFECTOR(B-Bridge International；Mountain View,CA, USA)，或HiFectTM(B-Bridge International,Mountain View,CA,USA)，等等。
其他可用於加強所投藥核酸之滲透性之製劑包括二醇類如乙二醇與丙二醇、吡咯類如2-吡咯、氮酮類與萜烯類如檸檬烯與薄荷酮。
v. 載劑
某些本發明組成物亦可在調配物中併入載劑化合物。本文所採用“載劑化合物”或“載劑”可指核酸或其類似物，其係惰性(亦即本身沒有生物活性)，但仍可在活體內過程中被辨識為核酸，該過程係藉由例如，降解生物活性核酸或促進其從循環過程中排出，而降低該具有生物活性之核酸之生體可用率。共同投藥核酸與載劑化合物(後者物質通常使用過量)可以大幅降低肝臟、腎臟或其他外循環器官之核酸回收量，可能歸因於載劑化合物與核酸競爭共用受體所致。例如，當與聚肌苷酸、葡聚糖硫酸鹽、聚胞苷酸或4-乙醯胺基-4'異硫氰醯基-芪-2,2'-二磺酸共同投藥時，可減少肝臟組織回收部份硫代磷酸dsRNA(Miyao等人，DsRNA Res.Dev.,1995,5,115-121；Takakura等人，DsRNA & Nucl.Acid Drug Dev.,1996,6,177-183)。
vi. 賦形劑
相對於載劑化合物，“醫藥載劑”或“賦形劑”為供傳遞一或多種核酸至動物體之醫藥上可接受之溶劑、懸浮劑或任何其他醫藥惰性媒劑。賦形劑可呈液態或固態，並依計畫之投藥方式選擇，以在與核酸及指定之醫藥組成物 中其他組份組合時提供所需之填充體積、堅實度等等。典型醫藥載劑包括但不限於，結合劑(例如，預糊化玉米澱粉、聚乙烯吡咯啶酮或羥基丙基甲基纖維素等等)；填料(例如，乳糖與其他糖類、微晶纖維素、果膠、明膠、硫酸鈣、乙基纖維素、聚丙烯酸酯或磷酸氫鈣等等)；潤滑劑(例如，硬脂酸鎂、滑石、矽石、膠體二氧化矽、硬脂酸、硬脂酸金屬鹽、氫化植物油、玉米澱粉、聚乙二醇、苯甲酸鈉、乙酸鈉等等；崩解劑(例如，澱粉、澱粉乙醇酸鈉等等)；與濕化劑(例如，月桂基硫酸鈉等等)。
亦可使用適合非-非經腸式投藥且不會與核酸有不利反應之醫藥上可接受之有機或無機賦形劑來調配本發明組成物。合適之醫藥上可接受之載劑包括，但不限於，水、鹽溶液、醇類、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈澱粉、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、黏性石蠟、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮等等。
供局部投藥核酸之調配物可包括無菌與非無菌水溶液、於常用溶劑(如醇類)中之非水性溶液、或含核酸之液態或固態油基質溶液。溶液中亦可包含緩衝劑、稀釋劑與其他合適添加劑。可使用適合非-非經腸式投藥且不會與核酸有不利反應之醫藥上可接受之有機或無機賦形劑。
合適之醫藥上可接受之賦形劑包括，但不限於，水、鹽溶液、醇、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈澱粉、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、黏性石蠟、羥甲基纖維素、 聚乙烯吡咯啶酮等等。
vii. 其他組份
本發明組成物可再包含醫藥組成物中常用且相關技藝上已建立用量之其他輔助組份。因此，例如，組成物可再包含其他可相容之醫藥活性材料，如例如，止癢劑、收斂劑、局部麻醉藥或消炎劑，或可包含其他適用於物理性調配本發明組成物各種不同劑型之材料，如染劑、調味劑、防腐劑、抗氧化劑、不透明劑、增稠劑與穩定劑。然而，當添加此等材料時，不應不當干擾本發明組成物中組份之生物活性。調配物可經過殺菌，且若需要時，可與不會與調配物之核酸(群)出現不良交互作用之輔劑混合，例如，潤滑劑、防腐劑、穩定劑、濕化劑、乳化劑、影響滲透壓之鹽類、緩衝劑、著色劑、調味劑與/或芳香物質等等。
水性懸浮液可包含提高懸浮液黏度之物質包括，例如，羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇與/或葡聚糖。該懸浮液亦可包含穩定劑。
某些具體實施例中，如本發明所說明特徵之醫藥組成物包括(a)一或多種iRNA化合物與(b)一或多種其功能為非RNAi機制且適用於治療溶血疾患之製劑。此等製劑實例包括，但不限於，消炎劑、抗脂肪變性劑、抗病毒劑與/或抗纖維化劑。此外，亦可使用其他常用於保護肝臟之物質(如水飛薊(silymarin))與本文說明之iRNA組合使用。其他適用於治療肝臟疾病之製劑包括替比夫定(telbivudine)、恩替卡韋(entecavir)與蛋白質酶抑制劑(如特 拉匹韋(telaprevir))與其他揭示於例如，Tung等人之美國申請案公開案號2005/0148548、2004/0167116、及2003/0144217；及Hale等人之美國申請案公開案號2004/0127488。
此等化合物之毒性與醫療效力可採用標準醫藥製程，於細胞培養中或實驗動物中測定，例如，測定LD50(造成50%族群死亡時之劑量)與ED50(有效醫療50%族群時之劑量)。毒性與醫療效應之間之劑量比值即為醫療指數，以LD50/ED50比值表示。以醫療指數高之化合物較佳。
可採用由細胞培養分析法與動物研究得到之數據來調配用於人類之劑量範圍。如本發明所說明特徵之組成物之劑量通常落在包括極低毒性或無毒性之ED50之循環濃度範圍內。劑量可依所採用劑型及所利用之投藥途徑，在此範圍內變化。如本發明所說明特徵之方法所使用任何化合物之醫療有效劑量可先從細胞培養分析法估測。可在動物模式中調配劑量，以使該化合物或若適當時使標靶序列之多肽產物之循環血漿濃度範圍達到(例如，造成多肽濃度降低)包括細胞培養物所決定ISERPINC10(亦即試驗化合物使症狀達到一半最大抑制性時之濃度)在內之範圍。此等資訊可用於更精確決定適用於人類之劑量。可藉由例如，高效液相層析法測定血漿濃度。
除了如上述投藥法外，如本發明所說明特徵之iRNA可與其他已知可有效治療受SERPINC1表現所介 導之病理過程之製劑組合投藥。任何情況下，投藥之醫師均可依據採用相關技藝上已知或本文所說明標準效力測定法所觀察到之結果來調整iRNA之投藥量與投藥時間。
VI. 套組
本發明亦提供一種實施任何本發明方法之套組。此等套組包括一或多種RNAi劑與使用說明書，例如，指示投藥預防或醫療有效量之RNAi劑之說明書。該套組可視需要再包含投藥RNAi劑之手段(例如，注射裝置)、或測定Serpinc1抑制性之手段(例如，測定Serpinc1 mRNA、Serpinc1蛋白質、與/或Serpinc1活性之方式)。此等測定Serpinc1抑制性之手段可能包括從個體取得檢體，如例如，血漿檢體之方式。本發明套組可視需要進一步包含測定醫療有效量或預防有效量之方式。
除非另有說明，否則本文中所有技術與科學術語均如熟悉本發明所屬相關技術者咸了解之相同定義。雖然可在操作或試驗如本發明所說明特徵之iRNA與方法時使用類似或等同如本文所說明之彼等方法與材料，但下文仍將說明合適之方法與材料。本文所述及所有公開文獻、專利申請案、專利案、及其他參考文獻之揭示內容已以引用之方式完全併入本文中。若有衝突時，將以本說明書(包括定義)為準。此外，該等材料、方法、及實例僅供舉例說明，並未加以限制。
實例
實例1：對健康人體投藥單劑AD-57213
由24位健康人類自願者分成3：1組(活性物組：安慰劑組)，接受單一劑量之0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.6mg/kg、或1.0mg/kg之AD-57213(正義(5’至3’)：GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAfL96(SEQ ID NO：13)；反義(5’至3’)：usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg(SEQ ID NO：14))。於投藥後第0、1、2、3、7、10、14、21、28、42、56、及70天收集血漿檢體，以追蹤AT3蛋白質含量、AT3活性、及AT3蛋白質靜默效力持續期。採用ELISA追蹤AT3蛋白質含量，及使用校正自動化凝血酶測定系統(Calibrated Automated Thromboscope)產生凝血酶形成曲線(組織因子=1pM)，追蹤AT3活性程度。計算每位個體之凝血酶峰值相對於投藥前兩個凝血酶峰值之平均值之倍數變化。
沒有嚴重之不良反應，有3位出現之輕度不良反應似乎與所投藥製劑無關，有1位之輕度不良反應(頭痛)可能與所投藥之製劑有關。沒有注射部位反應，且所有個體之身體檢查、生命跡象、及心電圖均在正常限值內。此外，所有個體在研究期間之所有肝功能檢驗、總膽 紅素含量、凝血酶原時間之國際標準化比值(PT/INR)、血小板計數、血紅素含量、及凝血檢驗(亦即部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶原時間(PT)、纖維蛋白原含量、及纖維蛋白D-二聚體含量)均沒有變化，且均在正常限值內。
第1A圖至第1D圖及第2A圖至第2B圖顯示單一劑量之0.03mg/kg之AD-57213造成AT3蛋白質含量降低約20%，且至高降低33%(圖2A及2B)，且相對地降低AT3活性(第1圖A至D)，維持下降超過60天。
第3圖進一步證實AT3減弱與凝血酶形成峰值之間有顯著相關性。明確言之，觀察到凝血酶形成峰值增加高達152%，凝血酶峰值平均值最高增加138%±8.9%(平均值±SEM)。此外，當隨著AT3持續減弱而增加凝血酶形成時，因子VIII或IX之含量仍正常。
實例2：對罹患血友病A或B之人體投藥多重劑量之AD-57213
由3位罹患血友病A(n=2)或B(n=1)之個體接受經皮下投藥每週0.015mg/kg(為期3週)(15微克/kgqw×3)之AD-57213(正義(5’至3’)：GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAfL96(SEQ ID NO：13)；反義(5’至3’)：usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg(SEQ ID NO：14))。由3位罹患血友病A之個體接受經皮下投藥每週0.045mg/kg(為期3週)(45微克/kg qw×3)之AD-57213(正義(5’至3’)：GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAfL96(SEQ ID NO：13)；反義(5’至3’)：usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg(SEQ ID NO：14))。由3位罹患血友病A之個體接受經皮下投藥每週0.075mg/kg(為期3週)(75微克/kg qw×3)之AD-57213(正義(5’至3’)：GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAfL96(SEQ ID NO：13)；反義(5’至3’)：usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfg UfuAfaCfcsasg(SEQ ID NO：14))。
於投藥AD-57213後收集血漿檢體，以追蹤AT3蛋白質含量、AT3活性、及AT3蛋白質靜默效力持續期。採用ELISA追蹤AT3蛋白質含量，及使用校正自動化凝血酶測定系統(Calibrated Automated Thromboscope)產生凝血酶形成曲線(組織因子=1pM)，追蹤AT3活性程度。計算每位個體之凝血酶峰值相對於投藥前兩個凝血酶峰值之平均值之倍數變化。
沒有嚴重之不良反應，沒有中斷，沒有注 射部位反應，且兩組所有個體之身體檢查、生命跡象、及心電圖均在正常限值內。此外，兩組所有個體在研究期間之所有肝功能檢驗與完全血液計數均在正常限值內。此研究期間，兩組之任何個體亦沒有血栓事件發生，且纖維蛋白D-二聚體含量在臨床上沒有顯著增加。
第4圖(圖中上方曲線)顯示每週劑量0.015mg/kg(為期3週)之AD-57213造成AT3減弱最大值平均為29%±12%(平均值±SEM)。大多數個體之AT3減弱最大值達53%，在第35天時出現最低點。第4圖(圖中下方曲線)亦顯示每週劑量0.045mg/kg(為期3週)之AD-57213在第16天時造成AT3減弱平均值為44±6.5%(平均值±SEM；p=0.02)，在第21天時之AT3減弱平均值為64±6.8%(平均值±SEM)，其中68.6%之AT3減弱最大值達70%。此外，圖4亦證實每週劑量0.075mg/kg(為期3週)之AD-57213可以有效減弱AT3蛋白質含量。
評估健康人類自願者(實例1)及罹患血友病A或B之個體之凝血酶形成時，證實每週劑量之AD-57213造成血友病個體之凝血酶形成增加達334%(相對於基線值)，凝血酶形成平均增加112±38%(p<0.05)(相對於基線值)，而此時AT3則減弱50%(第5圖B)。第5圖A證實接受每週劑量投藥AD-57213之血友病A或B個體所達到之最大凝血酶峰值係在正常個體之凝血酶形成量之低範圍內。
來自一位個體(個體101-009)之全血之 ROTEM®血栓彈性分析(參見例如，Young，等人(2013)Blood 121：1944)證實每週投藥0.045mg/kg之AD-57213(為期3週)時，不僅提高凝血酶形成之峰值，而且亦顯著且持續改善全血之凝血形成，此點由血塊形成時間及凝血時間縮短可證實(第6圖)。個體101-009從第2天起即沒有發生出血事件，且持續47天均沒有出血。
<110> 阿尼拉製藥公司(ALNYLAM PHARMACEUTICALS,INC.) 阿基克 雅津(AKINC,AKIN)
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<212> PRT
<213> 人類免疫缺陷病毒
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<212> RNA
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<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
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<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 432
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 433
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 434
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 435
<210> 436
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 436
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<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
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<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
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<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
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<212> RNA
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<223> 人工序列的描述：合成 寡核苷酸
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<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
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<212> RNA
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<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
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<212> RNA
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<212> RNA
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<223>人工序列的描述：合成寡核苷酸
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<212> RNA
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<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 449
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<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 450
<210> 451
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 451
<210> 452
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 452
<210> 453
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 453
<210> 454
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 454
由於本案的圖為實驗結果數據圖，並非本案的代表圖。故本案無指定代表圖。

Claims (79)

  1. 一種於個體預防至少一種症狀之方法，該個體罹患可因降低Serpinc1表現而受益之疾患，該方法包括對該個體投藥劑量約0.010mg/kg至約0.500mg/kg之雙股RNAi劑，其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區之正義股與反義股，其中該正義股包含至少15個連續核苷酸，其與核苷酸序列SEQ ID NO：1之差異不超過3個核苷酸；且該反義股包含至少15個連續核苷酸，其與核苷酸序列SEQ ID NO：5之差異不超過3個核苷酸，其中正義股之實質上所有核苷酸及反義股之實質上所有核苷酸為經修飾之核苷酸，且其中該正義股係接合至附接在3’-終端之配體。
  2. 一種治療個體之方法，該個體罹患可因降低Serpinc1表現而受益之疾患，該方法包括對該個體投藥劑量約0.010mg/kg至約0.500mg/kg之雙股RNAi劑，其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區之正義股與反義股，其中該正義股包含至少15個連續核苷酸，其與核苷酸序列SEQ ID NO：1之差異不超過3個核苷酸；且該反義股包含至少15個連續核苷酸，其與核苷酸序列SEQ ID NO：5之差異不超過3個核苷酸，其中正義股之實質上所有核苷酸及反義股之實質上所有核苷酸為經修飾之核苷酸，且其中該正義股係接合至附接在3’-終端之配體。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中該正義股之所有核苷酸及該反義股之所有核苷酸為經修飾之核苷酸。
  4. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中該正義股及該反義股包含互補區，其包含至少15個連續核苷酸，其與表2與3中任一者所列任何序列之差異不超過3個核苷酸。
  5. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中該經修飾之核苷酸係選自下列所成群組：2'-O-甲基修飾之核苷酸、2’-氟修飾之核苷酸、包含5'-硫代磷酸基之核苷酸、及連接膽固醇基衍生物或十二碳烷酸雙癸基醯胺基之終端核苷酸。進一步具體實施例中，經修飾之核苷酸係選自下列所成群組：2'-去氧-2'-氟修飾之核苷酸、2'-去氧-修飾之核苷酸、鎖核苷酸、去鹼基核苷酸、2’-胺基-修飾之核苷酸、2’-烷基-修飾之核苷酸、2’-O-烯丙基修飾之核苷酸、2’-C-烯丙基修飾之核苷酸、2’-羥基修飾之核苷酸、N-嗎啉基核苷酸、胺基磷酸酯、及包含非天然鹼基之核苷酸。
  6. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中該雙股RNAi劑之至少一股包含至少1個核苷酸之3’突出。
  7. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中該雙股RNAi劑之至少一股包含至少2個核苷酸之3’突出。
  8. 一種於個體預防至少一種症狀之方法，該個體罹患可因降低Serpinc1表現而受益之疾患，該方法包括對該 個體投藥劑量約0.010mg/kg至約0.500mg/kg之雙股RNAi劑，其中該雙股RNAi劑包含與反義股互補之正義股，其中該反義股包含互補於編碼Serpinc1之mRNA之一部分之區，其中各股為約14至約30個核苷酸之長度，其中該雙股RNAi劑係由式(IIIe)代表：正義：5'-Na-YYY-Na-3'反義：3'np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-5' (IIIe)其中：np'為2個核苷酸之突出，且np'內各核苷酸係利用硫代磷酸鍵連連接相鄰核苷酸；各Na及Na'獨立代表包含0至25個經修飾或未修飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少2個經不同修飾之核苷酸；YYY及Y'Y'Y'分別獨立代表在三個連續核苷酸上有三個相同修飾之一個基序，且其中該修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾；其中該正義股及該反義股分別獨立在5’-終端包含兩個硫代磷酸鍵連；及其中該正義股係接合至至少一個配體，其中該配體為透過二價或三價之分支連接基附接之一或多種GalNAc衍生物，藉以為該罹患可因降低Serpinc1表現而受益之疾患之個體預防至少一種症狀。
  9. 一種治療個體之方法，該個體罹患可因降低Serpinc1表現而受益之疾患，該方法包括對該個體投藥劑量約0.010mg/kg至約0.500mg/kg之雙股RNAi劑，其中該雙股RNAi劑包含與反義股互補之正義股，其中該反義股包含互補於編碼Serpinc1之mRNA之一部分之區，其中各股為約14至約30個核苷酸之長度，其中該雙股RNAi劑係由式(IIIe)代表：正義：5'-Na-YYY-Na-3'反義：3'np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-5' (IIIe)其中：np'為2個核苷酸之突出，且np'內各核苷酸係利用硫代磷酸鍵連連接相鄰核苷酸；各Na及Na'獨立代表包含0至25個經修飾或未修飾或其組合之核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包含至少2個經不同修飾之核苷酸；YYY及Y'Y'Y'分別獨立代表在三個連續核苷酸上有三個相同修飾之一個基序，且其中該修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾；其中該正義股及該反義股分別獨立在5’-終端包含兩個硫代磷酸鍵連；及其中該正義股係接合至少一個配體，其中該配體係透過二價或三價之分支連接基附接之一或多種GalNAc衍生物，藉以為該罹患可因降低Serpinc1表現而受益之疾 患之個體預防至少一種症狀。
  10. 如申請專利範圍第1、2、8或9項中任一項所述之方法，其中該雙股RNAi劑係投藥該個體兩種或更多種劑量。
  11. 如申請專利範圍第1、2、8或9項中任一項所述之方法，其中該雙股RNAi劑係一週一次、一個月2次、一個月一次、每6週一次、或每2個月一次投藥該個體。
  12. 如申請專利範圍第1、2、8或9項中任一項所述之方法，其中該雙股RNAi劑係依每週劑量約0.015mg/kg至約0.15mg/kg投藥該個體。
  13. 如申請專利範圍第1、2、8或9項中任一項所述之方法，其中投藥該個體之雙股RNAi劑之劑量為每週劑量約0.01125mg/kg至約0.1125mg/kg。
  14. 如申請專利範圍第1、2、8或9項中任一項所述之方法，其中投藥該個體之雙股RNAi劑之劑量為每週劑量約0.045mg/kg至約0.45mg/kg。
  15. 如申請專利範圍第1、2、8或9項中任一項所述之方法，其中該個體為人類。
  16. 如申請專利範圍第1、2、8或9項中任一項所述之方法，其中該疾患為出血疾患。
  17. 如申請專利範圍第15項所述之方法，其中該出血疾患為血友病。
  18. 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中該血友病為血友病A。
  19. 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中該血友病為 血友病B。
  20. 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中該血友病為血友病C。
  21. 如申請專利範圍第1、2、8或9項中任一項所述之方法，其中對該個體投藥該雙股RNAi劑造成增加血液凝結及/或減少Serpinc1蛋白質累積。
  22. 如申請專利範圍第1、2、8或9項中任一項所述之方法，其進一步包括測定個體之凝血酶含量。
  23. 如申請專利範圍第1、2、8或9項中任一項所述之方法，其中該雙股RNAi劑係經皮下投藥。
  24. 如申請專利範圍第1、2、8或9項中任一項所述之方法，其中該雙股RNAi劑係經靜脈內投藥。
  25. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中該反義股之實質上所有核苷酸及該正義股之實質上所有核苷酸包含選自：2’-O-甲基修飾及2’-氟修飾所成群組之修飾。
  26. 如申請專利範圍第25項所述之方法，其中該正義股之所有核苷酸及該反義股之所有核苷酸為經修飾之核苷酸。
  27. 如申請專利範圍第8或9項所述之方法，其中該YYY基序出現在正義股之裂解位點或接近正義股之裂解位點。
  28. 如申請專利範圍第8或9項所述之方法，其中該Y'Y'Y'基序出現在反義股之5'-末端起之11、12及13位置。
  29. 如申請專利範圍第8或9項所述之方法，其中該雙股區為15至30核苷酸對之長度。
  30. 如申請專利範圍第29項所述之方法，其中該雙股區為17至23核苷酸對之長度。
  31. 如申請專利範圍第29項所述之方法，其中該雙股區為17至25核苷酸對之長度。
  32. 如申請專利範圍第29項所述之方法，其中該雙股區為23至27核苷酸對之長度。
  33. 如申請專利範圍第29項所述之方法，其中該雙股區為19至21核苷酸對之長度。
  34. 如申請專利範圍第29項所述之方法，其中該雙股區為21至23核苷酸對之長度。
  35. 如申請專利範圍第8或9項所述之方法，其中各股具有15至30個核苷酸。
  36. 如申請專利範圍第8或9項所述之方法，其中各股具有19至30個核苷酸。
  37. 如申請專利範圍第8或9項所述之方法，其中該正義股共具有21個核苷酸，且該反義股共具有23個核苷酸。
  38. 如申請專利範圍第1、2、8或9項中任一項所述之方法，其中該配體為
  39. 如申請專利範圍第1、2、8或9項中任一項所述之方法，其中該配體係附接至正義股之3'末端。
  40. 如申請專利範圍第39項所述之方法，其中該RNAi劑係接合至如下所示之配體： 其中X為O或S。
  41. 如申請專利範圍第8或9項所述之方法，其中該雙螺旋之反義股5'-末端1位置之鹼基對為AU鹼基對。
  42. 如申請專利範圍第8或9項所述之方法，其中該RNAi劑為AD-57213。
  43. 如申請專利範圍第1、2、8或9項中任一項所述之方法，其中該RNAi劑係呈醫藥組成物投藥。
  44. 如申請專利範圍第43項所述之方法，其中該RNAi劑 係含在未緩衝之溶液中投藥。
  45. 如申請專利範圍第44項所述之方法，其中該未緩衝之溶液為鹽水或水。
  46. 如申請專利範圍第43項所述之方法，其中該siRNA係使用緩衝溶液投藥。
  47. 如申請專利範圍第46項所述之方法，其中該緩衝溶液包含乙酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶穀蛋白、碳酸鹽、或磷酸鹽或其任何組合。
  48. 如申請專利範圍第47項所述之醫藥組成物，其中該緩衝溶液為磷酸鹽緩衝鹽水溶液(PBS)。
  49. 一種套組，其係於實施如申請專利範圍第1、2、8或9項中任一項所述之方法，該套組包含a)RNAi劑，及b)使用說明書，及c)視需要地，對個體投藥RNAi劑之手段。
  50. 一種於個體預防至少一種症狀之方法，該個體罹患可因降低Serpinc1表現而受益之疾患，該方法包括對該個體投藥劑量約0.015mg/kg至約0.15mg/kg之雙股核糖核酸(RNAi)劑，其中該雙股RNAi劑包含正義股及反義股，該反義股包含互補區，其包含至少15個連續核苷酸，其與核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’之差異不超過3個核苷酸，其中該正義股之實質上所有核苷酸及該反義股之實質上所有核苷酸為經修飾之核 苷酸，且其中該正義股係接合附接在3’-終端之配體。
  51. 一種治療個體之方法，該個體罹患可因降低Serpinc1表現而受益之疾患，該方法包括對該個體投藥劑量約0.015mg/kg至約0.15mg/kg之雙股核糖核酸(RNAi)劑，其中該雙股RNAi劑包含正義股及反義股，該反義股包含互補區，其包含至少15個連續核苷酸，其與核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’之差異不超過3個核苷酸，其中該正義股之實質上所有核苷酸及該反義股之實質上所有核苷酸為經修飾之核苷酸，且其中該正義股係接合至附接在3’-終端之配體。
  52. 如申請專利範圍第50或51項所述之方法，其中該雙股RNAi劑係投藥該個體兩種或更多種劑量。
  53. 如申請專利範圍第50或51項所述之方法，其中該雙股RNAi劑係一週一次、一個月2次、一個月一次、每6週一次、或每2個月一次投藥該個體。
  54. 如申請專利範圍第50或51項所述之方法，其中該雙股RNAi劑係依每週劑量約0.015mg/kg至約0.125mg/kg投藥該個體。
  55. 如申請專利範圍第50或51項所述之方法，其中該雙股RNAi劑之劑量係依每週劑量約0.045mg/kg至約0.125mg/kg投藥該個體。
  56. 如申請專利範圍第50或51項所述之方法，其中該雙股RNAi劑之劑量係依每週劑量約0.075mg/kg至約0.125mg/kg投藥該個體。
  57. 如申請專利範圍第50或51項所述之方法，其中該雙股RNAi劑之劑量係依每月劑量約0.015mg/kg至約0.125mg/kg投藥該個體。
  58. 如申請專利範圍第50或51項所述之方法，其中該雙股RNAi劑之劑量係依每月劑量約0.045mg/kg至約0.125mg/kg投藥該個體。
  59. 如申請專利範圍第50或51項所述之方法，其中該雙股RNAi劑之劑量係依每月劑量約0.075mg/kg至約0.125mg/kg投藥該個體。
  60. 如申請專利範圍第50或51項所述之方法，其中該個體為人類。
  61. 如申請專利範圍第50或51項所述之方法，其中該疾患為出血疾患。
  62. 如申請專利範圍第61項所述之方法，其中該出血疾患為血友病。
  63. 如申請專利範圍第62項所述之方法，其中該血友病為血友病A、血友病B、或血友病C。
  64. 如申請專利範圍第50或51項所述之方法，其中該雙股RNAi劑係經皮下投藥該個體。
  65. 如申請專利範圍第50或51項所述之方法，其中該正義股之所有核苷酸及該反義股之所有核苷酸為經修飾之核苷酸。
  66. 如申請專利範圍第50或51項所述之方法，其中該經修飾之核苷酸係獨立選自下列各組成物之群中：2'-去氧 -2'-氟修飾之核苷酸、2'-去氧-修飾之核苷酸、鎖核苷酸、去鹼基核苷酸、2’-胺基-修飾之核苷酸、2’-烷基-修飾之核苷酸、N-嗎啉基核苷酸、胺基磷酸酯、及包含非天然鹼基之核苷酸。
  67. 如申請專利範圍第50或51項所述之方法，其中該互補區為至少17個核苷酸之長度。
  68. 如申請專利範圍第50或51項所述之方法，其中該互補區為19至21個核苷酸之長度。
  69. 如申請專利範圍第68項所述之方法，其中該互補區為19個核苷酸之長度。
  70. 如申請專利範圍第50或51項所述之方法，其中各股係不超過30個核苷酸之長度。
  71. 如申請專利範圍第50或51項所述之方法，其中至少一股包含至少1個核苷酸之3’突出。
  72. 如申請專利範圍第50或51項所述之方法，其中至少一股包含至少2個核苷酸之3’突出。
  73. 如申請專利範圍第50或51項所述之方法，其中該配體為N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
  74. 如申請專利範圍第50或51項所述之方法，其中該配體為
  75. 如申請專利範圍第74項之方法，其中該RNAi劑係接合至如下所示之配體 且其中X為O或S。
  76. 如申請專利範圍第75項所述之方法，其中該X為O。
  77. 如申請專利範圍第50或51項所述之方法，其中該互補區係由核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’組成。
  78. 如申請專利範圍第50或51項所述之方法，其中該雙股RNAi劑包含由核苷酸序列5’-GGUUAACACCAUUUACUUCAA-3’組成之正義股及由核苷酸序列5’-UUGAAGUAAAUGGUGUUAACCAG-3’組成之反義股。
  79. 如申請專利範圍第78項所述之方法，其中該正義股包含5’-GfsgsUfuAfaCfaCfCfAfuUfuAfcUfuCfaAf-3’(SEQ ID NO：13)，及該反義股包含5’-usUfsgAfaGfuAfaAfuggUfgUfuAfaCfcsasg-3’(SEQ ID NO：14)，其中A、C、G、及U為核糖A、C、G或U；a、c、g、及u為2'-O-甲基(2'-OMe)A、C、G、或U；Af、Cf、Gf或Uf為2'-氟A、C、G或U；及s為硫代磷酸鍵連。
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