JP7101748B2 - アンジオテンシノーゲン(AGT)iRNA組成物およびその使用 - Google Patents
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- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity
- C12N2320/51—Methods for regulating/modulating their activity modulating the chemical stability, e.g. nuclease-resistance
Description
本出願は、2014年5月22日出願の米国仮特許出願第62/001,731号、および2014年9月9日出願の米国仮特許出願第62/047978号に基づいて優先権を主張している。上記の各出願の内容全体は、引用により本明細書中に包含される。
本出願は、ASCII形式で電子的に提出され、その全体が引用により本明細書中に包含される配列表を含む。2015年5月18日に作成されたASCIIコピーを、121301-01320_SL.txtと言い、サイズは318,688バイトである。
レニン-アンジオテンシン-アルドステロン系(RAAS)は、血圧の調節に重要な役割を果たしている。RAASカスケードは、腎臓の傍糸球体細胞によるレニンの循環系への放出により始まる。レニン分泌は、遠位尿細管でのNa+の再吸収、β-交感神経刺激、および/または低下した腎臓灌流を含む、幾つかの要因によって刺激される。血漿中の活性型レニンは、アンジオテンシノーゲン(肝臓で産生される)を切断してアンジオテンシンIにし、その後、それは循環して、局所的に発現されたアンジオテンシン変換酵素(ACE)によりアンジオテンシンIIに変換される。RAASにおけるアンジオテンシンIIの作用のほとんどは、アンジオテンシンIIタイプ1受容体(AT1R)へのその結合によって発揮され、増加したNa+再吸収または糸球体濾過比の調節などの、動脈血管収縮作用、尿細管作用および糸球体作用をもたらす。加えて、副腎皮質刺激ホルモン、抗利尿ホルモン、カテコールアミン、エンドセリン、セロトニン、ならびにMg2+およびK+濃度のような他の刺激と共に、AT1R刺激は、アルドステロンの放出を誘導し、順に、腎臓の遠位尿細管におけるNa+およびK+の排出を促進する。
本発明は、アンジオテンシノーゲン(AGT)遺伝子のRNA転写物のRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)が介在する切断に影響するiRNA組成物を提供する。AGT遺伝子は、細胞内、例えば、ヒトなどの対象内の細胞内に存在し得る。
センス:5’ np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3’
アンチセンス:3’ np’-Na’-(X’X’X’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(Z’Z’Z’)l-Na’-nq’ 5’(III)
[式中、i、j、kおよびlは、それぞれ独立して、0または1であり、
p、p’、qおよびq’は、それぞれ独立して、0-6であり、
各NaおよびNa’は、独立して、修飾されているか、または修飾されてないか、またはその組合せのいずれかである0-25個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも2個の異なる修飾ヌクレオチドを含み、
各NbおよびNb’は、独立して、修飾されているか、または修飾されてないか、またはその組合せのいずれかである0-10個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
各np、np’、nqおよびnq’(それらは各々、存在しても、存在しなくてもよい)は、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し、
XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’およびZ’Z’Z’は、それぞれ独立して、3個の連続ヌクレオチドにおける3個の同一の修飾の1つのモチーフを表し、
Nbにおける修飾は、Yにおける修飾とは異なり、Nb’における修飾は、Y’における修飾とは異なり、そして
該センス鎖は、少なくとも1つのリガンドと複合体を形成している。]
で表される、二本鎖RNAi薬を提供する。
センス:5’ np-Na-YYY-Na-nq 3’
アンチセンス:3’ np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-nq’ 5’(IIIa)で表される。
センス:5’ np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’
アンチセンス:3’ np’-Na’-Y’Y’Y’-Nb’-Z’Z’Z’-Na’-nq’ 5’(IIIb)
[式中、各NbおよびNb’は、独立して、1-5個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。]
で表される。
センス:5’ np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3’
アンチセンス:3’ np’-Na’-X’X’X’-Nb’-Y’Y’Y’-Na’-nq’ 5’(IIIc)
[式中、各NbおよびNb’は、独立して、1-5個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。]
で表される。
センス:5’ np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’
アンチセンス:3’ np’-Na’-X’X’X’-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-Z’Z’Z’-Na’-nq’ 5’(IIId)
[式中、各NbおよびNb’は、独立して、1-5個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各NaおよびNa’は、独立して、2-10個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。]
で表される。
センス:5’ np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3’
アンチセンス:3’ np’-Na’-(X’X’X’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(Z’Z’Z’)l-Na’-nq’ 5’(III)
[式中、i、j、kおよびlは、それぞれ独立して、0または1であり、
p、p’、qおよびq’は、それぞれ独立して、0-6であり、
各NaおよびNa’は、独立して、修飾されているか、または修飾されてないか、またはその組合せのいずれかである0-25個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも2個の異なる修飾ヌクレオチドを含み、
各NbおよびNb’は、独立して、修飾されているか、または修飾されてないか、またはその組合せのいずれかである0-10個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
各np、np’、nqおよびnq’(それらは各々、存在しても、存在しなくてもよい)は、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し、
XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’およびZ’Z’Z’は、それぞれ独立して、3個の連続ヌクレオチドにおける3個の同一の修飾の1つのモチーフを表し、該修飾は、2’-O-メチル修飾または2’-フルオロ修飾であり、
Nbにおける修飾は、Yにおける修飾とは異なり、Nb’における修飾は、Y’における修飾とは異なり、そして
該センス鎖は、少なくとも1つのリガンドと複合体を形成している。]
で表される、二本鎖RNAi薬を提供する。
センス:5’ np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3’
アンチセンス:3’ np’-Na’-(X’X’X’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(Z’Z’Z’)l-Na’-nq’ 5’(III)
[式中、i、j、kおよびlは、それぞれ独立して、0または1であり、
各np、np’、nqおよびnq’(それらは各々、存在しても、存在しなくてもよい)は、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し、
p、qおよびq’は、それぞれ独立して、0-6であり、
np’>0であり、少なくとも1つのnp’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに結合しており、
各NaおよびNa’は、独立して、修飾されているか、または修飾されてないか、またはその組合せのいずれかである、0-25個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも2個の異なる修飾ヌクレオチドを含み、
各NbおよびNb’は、独立して、修飾されているか、または修飾されてないか、またはその組合せのいずれかである、0-10個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’およびZ’Z’Z’は、それぞれ独立して、3個の連続ヌクレオチドにおける3個の同一の修飾の1つのモチーフを表し、該修飾は、2’-O-メチル修飾または2’-フルオロ修飾であり、
Nbにおける修飾は、Yにおける修飾とは異なり、Nb’における修飾は、Y’における修飾とは異なり、そして
該センス鎖は、少なくとも1つのリガンドと複合体を形成している。]
で表される、二本鎖RNAi薬を提供する。
センス:5’ np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3’
アンチセンス:3’ np’-Na’-(X’X’X’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(Z’Z’Z’)l-Na’-nq’ 5’(III)
[式中、i、j、kおよびlは、それぞれ独立して、0または1であり、
各np、np’、nqおよびnq’(それらは各々、存在しても、存在しなくてもよい)は、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し、
p、qおよびq’は、それぞれ独立して、0-6であり、
np’>0であり、少なくとも1つのnp’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに結合しており、
各NaおよびNa’は、独立して、修飾されているか、または修飾されてないか、またはその組合せのいずれかである、0-25個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも2個の異なる修飾ヌクレオチドを含み、
各NbおよびNb’は、独立して、修飾されているか、または修飾されてないか、またはその組合せのいずれかである、0-10個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’およびZ’Z’Z’は、それぞれ独立して、3個の連続ヌクレオチドにおける3個の同一の修飾の1つのモチーフを表し、該修飾は、2’-O-メチル修飾または2’-フルオロ修飾であり、
Nbにおける修飾は、Yにおける修飾とは異なり、Nb’における修飾は、Y’における修飾とは異なり、そして
該センス鎖は、少なくとも1つのリガンドと複合体を形成しており、ここで該リガンドは、二価のリンカーまたは三価の分枝状リンカーを介して結合している1個またはそれ以上のGalNAc誘導体である。]
で表される、二本鎖RNAi薬を提供する。
センス:5’ np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3’
アンチセンス:3’ np’-Na’-(X’X’X’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(Z’Z’Z’)l-Na’-nq’ 5’(III)
[式中、i、j、kおよびlは、それぞれ独立して、0または1であり、
各np、np’、nqおよびnq’(それらは各々、存在しても、存在しなくてもよい)は、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し、
p、qおよびq’は、それぞれ独立して、0-6であり、
np’>0であり、少なくとも1つのnp’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに結合しており、
各NaおよびNa’は、独立して、修飾されているか、または修飾されてないか、またはその組合せのいずれかである、0-25個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも2個の異なる修飾ヌクレオチドを含み、
各NbおよびNb’は、独立して、修飾されているか、または修飾されてないか、またはその組合せのいずれかである、0-10個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’およびZ’Z’Z’は、それぞれ独立して、3個の連続ヌクレオチドにおける3個の同一の修飾の1つのモチーフを表し、該修飾は、2’-O-メチル修飾または2’-フルオロ修飾であり、
Nbにおける修飾は、Yにおける修飾とは異なり、Nb’における修飾は、Y’における修飾とは異なり、そして
該センス鎖は、少なくとも1つのホスホロチオエート結合を含み、
該センス鎖は、少なくとも1つのリガンドと複合体を形成しており、ここで該リガンドは、二価のリンカーまたは三価の分枝状リンカーを介して結合している1個またはそれ以上のGalNAc誘導体である。]
で表される、二本鎖RNAi薬を提供する。
センス:5’ np-Na-YYY-Na-nq 3’
アンチセンス:3’ np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-nq’ 5’(IIIa)
[式中、各np、np’、nqおよびnq’(それらは各々、存在しても、存在しなくてもよい)は、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し、
p、qおよびq’は、それぞれ独立して、0-6であり、
np’>0であり、少なくとも1つのnp’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに結合しており、
各NaおよびNa’は、独立して、修飾されているか、または修飾されてないか、またはその組合せのいずれかである、0-25個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも2個の異なる修飾ヌクレオチドを含み、
YYYおよびY’Y’Y’は、それぞれ独立して、3個の連続ヌクレオチドにおける3個の同一の修飾の1つのモチーフを表し、該修飾は、2’-O-メチル修飾または2’-フルオロ修飾であり、
該センス鎖は、少なくとも1つのホスホロチオエート結合を含み、そして
該センス鎖は、少なくとも1つのリガンドと複合体を形成しており、ここで該リガンドは、二価のリンカーまたは三価の分枝状リンカーを介して結合している1個またはそれ以上のGalNAc誘導体である。]
で表される、二本鎖RNAi薬を提供する。
本発明は、アンジオテンシノーゲン(AGT)遺伝子のRNA転写物の、RNA誘導型サイレンシング複合体(RISC)が介在する切断を行う、iRNA組成物を提供する。遺伝子は細胞内、例えば、ヒトのような対象内の細胞内に存在していてよい。
本発明がより容易に理解され得るようにするため、特定の用語を初めに定義する。加えて、パラメーターの値または範囲が記載されているときは、記載された値の中間の値および範囲も本発明の一部であることが意図されることが意図されていることが特記されるべきである。
本発明は、AGT遺伝子発現を阻害するiRNAを提供する。一態様において、iRNA薬は、アンジオテンシノーゲン関連疾患、例えば、高血圧を有するヒトのような、哺乳動物などの対象内の細胞などの細胞内で、AGT遺伝子発現を阻害する二本鎖リボ核酸(dsRNA)分子を含む。dsRNAは、AGT遺伝子発現において形成されるmRNAの少なくとも一部と相補的である、相補性領域を有するアンチセンス鎖を含む。相補性領域は、約30ヌクレオチド以下の長さ(例えば、約30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19または18ヌクレオチド以下の長さ)である。AGT遺伝子を発現する細胞との接触に際して、iRNAは、AGT遺伝子(例えばヒト、霊長動物、非霊長動物、または鳥類のAGT遺伝子)の発現を、例えばPCRまたは分枝状DNA(bDNA)ベースの方法による、または例えばウェスタンブロッティングまたはフローサイトメトリー技術を使用する免疫蛍光分析などのタンパク質ベースの方法によるアッセイで、少なくとも約10%阻害する。
一態様において、本発明のiRNAのRNA、例えば、dsRNAは、未変性であり、例えば当技術分野で公知であり本明細書に記載される、化学修飾および/または結合を含まない。別の態様において、本発明のiRNAのRNA、例えば、dsRNAを化学的に修飾して、安定性またはその他の有益な特性を高める。本発明の任意の態様において、本発明のiRNAの実質的に全てのヌクレオチドは修飾されている。本発明の他の態様において、本発明のiRNAの全てのヌクレオチドは、本発明の修飾iRNAであり、“実質的に全てのヌクレオチドが修飾されている”は、大部分であるが、完全に修飾されておらず、5、4、3、2または1以下の未修飾ヌクレオチドを含み得る。
本発明の任意の面において、本発明の二本鎖RNAi薬には、例えば、2011年11月18日出願の米国仮特許出願第61/561,7108、または2012年11月16日出願のPCT/US2012/065691(それぞれの全体の内容は、引用により本明細書中に包含される)に開示された化学修飾を有する薬剤が含まれる。
5’ np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3’
(I)
式中:
iおよびjは、それぞれ独立して、0または1であり;
pおよびqは、それぞれ独立して、0-6であり;
Naは、それぞれ独立して、0-25個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列であり、各配列は、少なくとも2個の異なる修飾ヌクレオチドを含み;
Nbは、それぞれ独立して、0-10個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列であり;
npおよびnqは、それぞれ独立して、オーバーハングヌクレオチドを示し;
ここで、NbおよびYは、同じ修飾を有さず;そして
XXX、YYYおよびZZZは、それぞれ独立して、3つの連続するヌクレオチド上の3つの同一の修飾の1つのモチーフを示す。好ましくは、YYYは、全て2’-F修飾ヌクレオチドである。
5’ np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’ (Ib);
5’ np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3’ (Ic);または
5’ np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’ (Id)。
X、YおよびZはそれぞれ、互いに同じかまたは異なっていてよい。
5’ np-Na-YYY- Na-nq 3’ (Ia)。
センス鎖が式(Ia)で表されるとき、Naは、それぞれ独立して、2-20、2-15、または2-10個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示し得る。
5’ nq’-Na’-(Z’Z’Z’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(X’X’X’)l-N’a-np’ 3’ (II)
式中:
kおよびlは、それぞれ独立して、0または1であり;
p’およびq’は、それぞれ独立して、0-6であり;
Na’は、それぞれ独立して、0-25個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示し、各配列は、少なくとも2個の異なる修飾ヌクレオチドを含み;
Nb’は、それぞれ独立して、0-10個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示し;
np’およびnq’は、それぞれ独立して、オーバーハングヌクレオチドを示し;
ここで、Nb’およびY’は、同じ修飾を有さず;そして
X’X’X’、Y’Y’Y’およびZ’Z’Z’は、それぞれ独立して、3つの連続するヌクレオチド上の3つの同一の修飾の1つのモチーフを示す。
従って、アンチセンス鎖は以下の式で表され得る:
5’ nq’-Na’-Z’Z’Z’-Nb’-Y’Y’Y’-Na’-np’ 3’ (IIb);
5’ nq’-Na’-Y’Y’Y’-Nb’-X’X’X’-np’ 3’ (IIc);or
5’ nq’-Na’- Z’Z’Z’-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’- X’X’X’-Na’-np’ 3’ (IId)。
5’ np’-Na’-Y’Y’Y’- Na’-nq’ 3’ (Ia)。
X’、Y’およびZ’はそれぞれ、互いに同じかまたは異なっていてよい。
センス:5’ np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3’
アンチセンス:3’ np ’-Na ’-(X’X’X’)k-Nb ’-Y’Y’Y’-Nb ’-(Z’Z’Z’)l-Na ’-nq ’ 5’
(III)
式中:
i、j、kおよびlは、それぞれ独立して、0または1であり;
p、p’、qおよびq’は、それぞれ独立して、0-6であり;
NaおよびNa ’は、それぞれ独立して、0-25個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示し、各配列は、少なくとも2個の異なる修飾ヌクレオチドを含み;
NbおよびNb ’は、それぞれ独立して、0-10個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を示し;
ここで、np’、np、nq’およびnqは(それらは各々、存在しても、存在しなくてもよい)、それぞれ独立して、オーバーハングヌクレオチドを示し;そして
XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’およびZ’Z’Z’は、それぞれ独立して、3つの連続するヌクレオチド上の3つの同一の修飾の1つのモチーフを示す。
5’ np-Na-YYY-Na-nq 3’
3’ np ’-Na ’-Y’Y’Y’-Na ’nq ’ 5’ (IIIa)
5’ np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’
3’ np ’-Na ’-Y’Y’Y’-Nb ’-Z’Z’Z’-Na ’nq ’ 5’ (IIIb)
5’ np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3’
3’ np ’-Na ’-X’X’X’-Nb ’-Y’Y’Y’-Na ’-nq ’ 5’ (IIIc)
5’ np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’
3’ np ’-Na ’-X’X’X’-Nb ’-Y’Y’Y’-Nb ’-Z’Z’Z’-Na-nq ’ 5’ (IIId)。
本発明のiRNAのRNAの別の修飾は、iRNAの活性、細胞分布、または細胞内取り込みを高める、1つまたは複数のリガンド、部分または複合体を、RNAに化学的に連結することを伴う。このような部分としては、コレステロール部分(Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556) などの脂質部分;コール酸(Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060);チオエーテル、例えばベリル-S-トリチルチオール(Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770)、チオコレステロール(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538);脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基(Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54);例えばジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチル-アンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-ホスホネート(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654;Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783)などのリン脂質;ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotide, 1995, 14:969-973);またはアダマンタン酢酸(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36:3651-3654);パルミチル部分(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237);またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ-カルボニルオキシコレステロール部分(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937)が挙げられるが、これに限定されない。
一態様において、リガンドまたは複合体は、脂質または脂質ベースの分子である。このような脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは、例えばヒト血清アルブミン(HSA)などの血清タンパク質と結合する。HSA結合リガンドは、例えば身体の非腎臓標的組織などの標的組織への複合体の分布を可能にする。例えば標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であり得る。HSAに結合し得る他の分子もまた、リガンドとして使用できる。例えばナプロキセンまたはアスピリンが使用できる。脂質または脂質ベースのリガンドは、(a)複合体の分解抵抗性を増大させ得て、(b)標的細胞または細胞膜の標的化またはそれへの輸送を増大させ得て、および/または(c)例えばHSAなどの血清タンパク質の結合を調節するのに使用できる。
別の面において、リガンドは細胞透過剤であり、好ましくはヘリカル(helical)細胞透過剤である。好ましくは、該薬剤は両親媒性である。例示的な薬剤は、tatまたはアンテノペディア(antennopedia)などのペプチドである。該薬剤がペプチドであるとき、それはペプチジル模倣薬、逆転異性体、非ペプチドまたはシュード-ペプチド結合、およびD-アミノ酸の使用を含む、修飾を受け得る。ヘリカル剤は、好ましくは親油性相および疎油性相を有するα-ヘリカル剤である。
本発明の組成物および方法のいくつかの態様において、iRNAオリゴヌクレオチドは、炭水化物をさらに含んでなる。炭水化物共役iRNAは、本明細書に記載の通り、核酸ならびにインビボ治療用途に適する組成物のインビボ送達に有利である。本明細書で用いる“炭水化物”は、各炭素原子に結合する酸素、窒素または硫黄原子を含む少なくとも6個の炭素原子(直鎖、分枝または環状であり得る)を有する、1つまたは複数の単糖単位で構成される炭水化物自体;または、各炭素原子に結合する酸素、窒素またはイオウ原子を含む少なくとも6個の炭素原子(直鎖、分枝または環状であり得る)をそれぞれ有する、1つまたは複数の単糖単位で構成される炭水化物部分をその一部として有する化合物のいずれかである化合物を意味する。代表的な炭水化物としては、糖類(単糖類、二糖類、三糖類、および約4、5、6、7、8、または9個の単糖単位を含有するオリゴ糖類)、およびデンプン、グリコーゲン、セルロース、および多糖類ガムなどの多糖類が挙げられる。特定の単糖類としては、AGTおよび上記(例えば、AGT、C6、C7、またはC8)の糖類が挙げられ;二および三糖類としては、2または3個の単糖単位を有する糖類(例えばC5、C6、C7、またはC8)が挙げられる。
(式XXIII)
(式中、XまたはYの一方はオリゴヌクレオチドであり、他方は水素である)
が挙げられるが、これに限定されない。
ある態様において、本明細書に記載される複合体またはリガンドは、切断可能または切断不可能であり得る、種々のリンカーによって、iRNAオリゴヌクレオチドに結合され得る。
一態様において、切断可能連結基は、還元または酸化に際して切断される酸化還元切断可能連結基である。還元的切断可能連結基の一例は、ジスルフィド連結基(-S-S-)である。切断可能連結基候補が、好適な“還元的切断可能連結基”か、または例えば特定のiRNA部分および特定の標的化物質と共に使用するのに適するかどうかを決定するために、当業者は、本明細書に記載される方法に頼ることができる。例えば候補は、例えば標的細胞などの細胞中で観察される切断速度を模倣する、当技術分野で公知の試薬を使用して、ジチオスレイトール(DTT)、またはその他の還元剤とのインキュベーションによって評価し得る。候補はまた、血液または血清条件を模倣するように選択される条件下で評価し得る。1つの候補化合物は、血中で最大で約10%切断される。他の態様において、有用な候補化合物は、血液(または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下)と比較して、細胞中(または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下)で、少なくとも約2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90または約100倍より迅速に分解される。候補化合物の切断速度は、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下で標準酵素動態アッセイを使用して、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較して決定され得る。
別の態様において、切断可能なリンカーは、リン酸ベースの切断可能連結基を含んでなる。リン酸ベースの切断可能連結基は、リン酸基を分解または加水分解する物質によって切断され得る。細胞中でリン酸基を切断する物質の一例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。リン酸ベースの連結基の例は、-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-である。好ましい態様は、-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-である。好ましい態様は、-O-P(O)(OH)-O-である。これらの候補は、上記のものと類似の方法を用いて評価し得る。
別の態様において、切断可能なリンカーは、酸切断可能連結基を含んでなる。酸切断可能連結基は、酸性条件下で切断される連結基である。好ましい態様において、酸切断可能連結基は、約6.5以下(例えば、約6.0、5.75、5.5、5.25、5.0以下)のpHの酸性環境内において、または一般酸として作用し得る酵素などの物質によって切断される。細胞内では、エンドソームおよびリソソームなどの特定の低pH細胞小器官が、酸切断可能連結基の切断環境を提供し得る。酸切断可能連結基の例としては、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸エステルが挙げられるが、これらに限定されない。酸切断可能基は、一般式-C=NN-、C(O)O、または-OC(O)を有し得る。好ましい態様は、炭素がエステルの酸素に結合する場合(アルコキシ基)は、アリール基、置換アルキル基、またはジメチルペンチルまたはt-ブチルなどの三級アルキル基である。これらの候補は、上記のものと類似の方法を使用して評価し得る。
別の態様において、切断可能なリンカーは、エステルベースの切断可能連結基を含んでなる。エステルベースの切断可能連結基は、細胞内でエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステルベースの切断可能連結基の例としては、アルキレン、アルケニレン、およびアルキニレン基のエステルが挙げられるが、これらに限定されない。エステル切断可能連結基は、一般式-C(O)O-または-OC(O)-を有する。これらの候補は、上記のものと類似の方法を使用して評価し得る。
さらに別の態様において、切断可能なリンカーは、ペプチドベースの切断可能連結基を含んでなる。ペプチドベースの切断可能連結基は、細胞内で、ペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチドベースの切断可能連結基は、アミノ酸の間に形成されて、オリゴペプチド(例えばジペプチド、トリペプチドなど)およびポリペプチドを生じる、ペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能基には、アミド基(-C(O)NH-)は含まれない。アミド基は、あらゆるアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン(alkynelene)間に形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸の間に形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じる特殊なタイプのアミド結合である。ペプチドベースの切断基は、一般的に、アミノ酸の間に形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じるペプチド結合(すなわちアミド結合)に限定され、アミド官能基全体は含まない。ペプチドベースの切断可能連結基は、一般式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-を有し、式中、RAおよびRBは2つの隣接するアミノ酸のR基である。これらの候補は、上記のものと類似の方法を使用して評価し得る。
(式中、XまたはYの一方はオリゴヌクレオチドであり、他方は水素である)
が挙げられるが、これらに限定されない。
q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B、およびq5Cは、独立して、それぞれ0~20の出現を表し、反復単位は、同一であるかまたは異なってよく;
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5Cは、各出現についてそれぞれ独立して、不在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NHまたはCH2Oであり;
Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5Cは、各出現についてそれぞれ独立して、不在、アルキレン、置換アルキレンであり、1つまたは複数のメチレンは、O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R’)=C(R’’)、C≡CまたはC(O)の1つまたは複数によって中断または終結されてよく;
R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5Cは、各出現についてそれぞれ独立して、不在、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH=N-O、
L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5BおよびL5Cはリガンドを表し;すなわち各出現についてそれぞれ独立して、単糖(GalNAcなど)、二糖類、三糖、四糖、オリゴ糖、または多糖類であり;そして、Raは、Hまたはアミノ酸側鎖である)のいずれかで示される構造群より選択される、二価または三価の分枝リンカーと共役する。三価の共役GalNAc誘導体は、式(XXXV)、
などの標的遺伝子の発現を阻害するために、RNAi剤と共に使用するのに特に有用である。
例えば、ヒト対象(例えば、アンジオテン関連疾患または状態を有する対象などの、それを必要とする対象)などの対象内の細胞などの細胞への本発明のiRNAの送達は、いくつかの異なる方法で達成し得る。例えば、送達は、インビトロまたはインビボのどちらかで、細胞を本発明のiRNAに接触させることで実施してもよい。インビボ送達はまた、例えばdsRNAなどのiRNAを含んでなる組成物を対象に投与することで直接実施してもよい。あるいは、インビボ送達は、iRNAをコードして発現を誘導する1つまたは複数のベクターを投与することで、間接的に実施してもよい。これらの代替案は、以下でさらに考察される。
AGT遺伝子を標的化するiRNAは、DNAまたはRNAベクターに挿入された転写単位から発現され得る(例えば、Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al.、国際公開WO00/22113;Conrad、国際公開WO00/22114;およびConrad、米国特許第6,054,299号を参照されたい)。発現は、使用される特定のコンストラクトおよび標的組織または細胞型によって変わり、一過性(数時間から数週間程度)または持続性(数週間から数ヶ月以上)であり得る。これらの導入遺伝子は、組み込み型または非組み込み型ベクターであり得る、直鎖コンストラクト、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入され得る。導入遺伝子はまた、それが染色体外プラスミドとして遺伝するのを可能にするよう構築し得る(Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292)。
本発明は、本発明のiRNAを含む医薬組成物および製剤もまた含む。一態様において、本発明で提供されるのは、本明細書に記載されるiRNAと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。iRNAを含有する医薬組成物は、AGT遺伝子の発現または活性に関連する、疾患または障害を治療するのに有用である。このような医薬組成物は、送達様式に基づいて製剤される。一例としては、例えば皮下(SC)または静脈内(IV)送達による、非経腸送達による、全身投与のために製剤される組成物である。別の例は、例えば連続ポンプ輸液などの脳内点滴による、脳実質内への直接送達のために調合される組成物である。本発明の医薬組成物は、AGT遺伝子発現を阻害するのに十分な投与量で投与してもよい。一般的に、本発明のiRNAの好適な用量は、1日あたり受容者の体重1キログラムあたり、約0.001~約200.0ミリグラムの範囲、一般的に1日あたり体重1キログラムあたり、約1~50mgの範囲である。例えばdsRNAは、単回投与あたり、約0.01mg/kg、約0.05mg/kg、約0.5mg/kg、約1mg/kg、約1.5mg/kg、約2mg/kg、約3mg/kg、約10mg/kg、約20mg/kg、約30mg/kg、約40mg/kg、または約50mg/kgで投与され得る。
本発明の組成物および方法で使用されるiRNAは、例えばリポソームまたはミセルなどの膜様分子アセンブリー内の送達のために製剤し得る。本明細書で用いる用語“リポソーム”は、例えば1つの二重層または複数の二重層などの、少なくとも1つの二重層に配列された両親媒性脂質から構成される小胞を意味する。リポソームは、親油性材料と水性内部から形成される膜を有する、単層膜小胞および多重膜小胞を含む。水性部分は、iRNA組成物を含有する。親油性材料は、水性内部を水性外部から隔離し、水性外部は、一般的にiRNA組成物を含まないが、場合によっては含んでもよい。リポソームは、活性成分の作用部位への移行と送達のために有用である。リポソーム膜は生体膜と構造的に類似するため、リポソームを組織に適用すると、リポソーム性二重層は細胞膜の二重層と融合する。リポソームと細胞の融合が進むにつれて、iRNAを含む内部水性内容物が細胞内に送達され、そこではiRNAが標的RNAに特異的に結合し得て、iRNAを媒介し得る。場合によっては、リポソームもまた特異的に標的化され、例えばiRNAを特定の細胞型に誘導する。
例えば本発明のdsRNAなどのiRNAは、例えばLNPなどの脂質製剤中で完全にカプセル化して、またはその他の核酸-脂質粒子を形成してもよい。
DPPC:ジアルミトイルホスファチジルコリン
PEG-DMG:PEG-ジミリストイルグリセロール(C14-PEG、またはPEG-C14)(平均分子量2000のPEG)
PEG-DSG:PEG-ジスチリルグリセロール(C18-PEG、またはPEG-C18)(平均分子量2000のPEG)
PEG-cDMA:PEG-カルバモイル-1,2-ジミリスチルオキシプロピルアミン(平均分子量2000のPEG)
SNALP(l,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLinDMA))を含んでなる製剤は、2009年4月15日に出願された国際公開WO2009/127060号(引用により本明細書中に包含させる)に記載される。
XTCを含んでなる製剤は、例えば、2009年1月29日に出願された米国仮出願第61/148,366号;2009年3月2日に出願された米国仮出願第61/156,851号;2009年6月10日に出願された米国仮出願第 号;2009年7月24日に出願された米国仮出願第61/228,373号;2009年9月3日に出願された米国仮出願第61/239,686号、および2010年1月29日に出願された国際出願第PCT/US2010/022614号(それらは、引用により本明細書中に包含される)に記載される。
MC3を含んでなる製剤は、例えば、2010年6月10日に出願された米国特許出願公開第2010/0324120号に記載される(その内容全体を引用により本明細書中に包含させる)。
ALNY-100を含む製剤は、例えば、2009年11月10日に出願された、国際出願PCT/US第09/63933号(引用により本明細書中に包含させる)に記載される。
C12-200を含有する製剤は、2009年5月5日に出願された米国仮特許出願第61/175,770号、および2010年5月5日に出願された国際出願PCT/US10/33777号(それらは、引用により本明細書中に包含される)に記載される。
例えば本発明の核酸-脂質粒子で使用されるカチオン性脂質などの化合物のいずれもが、実施例でより詳細に記載される方法を含む、既知の有機合成技術によって調製され得る。他に特記しない限り、全ての置換基は、以下に定義するとおりである。
ある態様において、本発明の核酸脂質粒子は、式A、
(式中、R1およびR2は、独立して、それぞれ置換されていてもよい、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、R3およびR4は、独立して、低級アルキルであるか、またはR3およびR4は、一体となって、置換されていてもよいヘテロ環式環を形成し得る)のカチオン性脂質を使用して製剤される。ある態様において、カチオン性脂質は、XTC(2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン)である。一般に、上の式Aの脂質は、他に特記しない限り、全ての置換基が上で定義されるとおりである、以下の反応スキーム1または2によって作成され得る。
脂質A(式中、R1およびR2は独立して、それぞれ置換されていてもよい、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、R3およびR4は独立して低級アルキルであり、またはR3およびR4は一体となって、置換されていてもよいヘテロ環を形成し得る)は、スキーム1に従って調製され得る。ケトン1および臭化物2は購入するか、または当業者に公知の方法に従って調製し得る。1と2の反応により、ケタール3が得られる。ケタール3をアミン4で処理して、式Aの脂質を得る。式Aの脂質は、式5(式中、Xは、ハロゲン、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などから選択されるアニオン対イオンである)の有機塩によって、対応するアンモニウム塩に変換し得る。
あるいは、ケトン1出発物質は、スキーム2に従って調製され得る。グリニャール試薬6およびシアン化物7は購入するか、または当業者に公知の方法に従って調製され得る。6と7の反応は、ケトン1をもたらす。ケトン1の対応する式Aの脂質への変換は、スキーム1に記載されるとおりである。
DLin-M-C3-DMA(すなわち(6Z,9Z,28Z,31Z)-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル-4-(ジメチルアミノ)ブタン酸)の調製は、次のとおりであった。ジクロロメタン(5mL)中の(6Z,9Z,28Z,31Z)-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-オール(0.53g)、4-N,N-ジメチルアミノ酪酸塩酸塩(0.51g)、4-N,N-ジメチルアミノピリジン(0.61g)、および1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(0.53g)溶液を室温で一晩撹拌した。溶液を希塩酸で洗浄し、続いて希釈炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。無水硫酸マグネシウム上で有機画分を乾燥させ、濾過して、回転蒸発器上で溶媒を除去した。1~5%のメタノール/ジクロロメタン溶出勾配を用いて、残留物をシリカゲルカラム(20g)に通過させた。精製産物を含有する画分を合わせて溶媒を除去し、無色の油状物(0.54g)を得た。
ニ口RBF(1L)内の、200mlの無水THF中のLiAlH4(3.74g、0.09852mol)の撹拌懸濁液に、70mLのTHF中の514(10g、0.04926mol)の溶液を0 0℃において窒素雰囲気下でゆっくり添加した。添加完了後、反応混合物を室温に加温し、次に4時間加熱還流した、反応の進捗は、TLCによってモニターした。反応完了(TLCによる)後、混合物を0 0℃に冷却し、飽和Na2SO4溶液の慎重な添加によってクエンチした。反応混合物を室温で4時間撹拌し、濾過した。残渣をTHFでよく洗浄した。濾液および洗浄液を混合し、400mLのジオキサンおよび26mLの濃HClで希釈して、室温で20分間撹拌した。揮発性(volatilities)を真空下で取り除き、515の塩酸塩を白色固体として得た。収量:7.12g 1H-NMR(DMSO、400MHz):δ=9.34(broad、2H)、5.68(s、2H)、3.74(m、1H)、2.66-2.60(m、2H)、2.50-2.45(m、5H)。
250mLのニ口RBF中、100mLの乾燥DCM中の化合物515の撹拌溶液に、NEt3(37.2mL、0.2669mol)を添加して、窒素雰囲気下で0 0℃に冷却した。50mLの乾燥DCM中、N-(ベンジルオキシ-カルボニルオキシ)-スクシンイミド(20g、0.08007mol)をゆっくり添加後、反応混合物が室温に暖まるまで放置した。反応完了後(TLCにより、2~3時間後)、混合物を1N HCl溶液(1×100mL)および飽和NaHCO3溶液(1×50mL)で連続的に洗浄した。次いで、無水Na2SO4上で有機層を乾燥させ、溶媒を蒸発させて粗製物を得て、それをシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、516を粘着性塊として得た。収量:11g(89%).1H-NMR(CDCl3、400MHz):δ=7.36-7.27(m、5H)、5.69(s、2H)、5.12(s、2H)、4.96(br.、1H)、2.74(s、3H)、2.60(m、2H)、2.30-2.25(m、2H)。LC-MS[M+H]-232.3(96.94%).
室温において、500mLの1口RBF中、シクロペンテン516(5g、0.02164mol)を220mLのアセトンおよび水(10:1)の溶液中に溶解し、それにN-メチルモルホリン-N-オキシド(7.6g、0.06492mol)を添加し、次いでtert-ブタノール中の4.2mLの7.6%OsO4(0.275g、0.00108mol)溶液を添加した。反応完了後(約3時間後)、固体Na2SO3の添加によって混合物をクエンチし、得られた混合物を室温で1.5時間撹拌した。反応混合物をDCM(300mL)で希釈して、水(2×100mL)で洗浄し、次いで飽和NaHCO3(1×50mL)溶液、水(1×30mL)、最後に塩水(1×50mL)で洗浄した。有機相を無水Na2SO4上で乾燥させて、真空中で溶媒を除去した。粗製物のシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製からジアステレオマー混合物を得て、それを予備HPLCによって分離した。収量:-6g粗製。
517A-ピーク-1(白色固体)、5.13g(96%)。1H-NMR(DMSO,400MHz):δ=7.39-7.31(m,5H),5.04(s,2H),4.78-4.73(m,1H),4.48-4.47(d,2H),3.94-3.93(m,2H),2.71(s,3H),1.72-1.67(m,4H).LC-MS-[M+H]-266.3,[M+NH4+]-283.5存在、HPLC-97.86%。立体化学はX線によって確認した。
化合物505の合成について記載されるものと類似の方法を用いて、化合物518を無色の油状物として得た(1.2g、41%)。1H-NMR(CDCl3,400MHz):δ=7.35-7.33(m,4H),7.30-7.27(m,1H),5.37-5.27(m,8H),5.12(s,2H),4.75(m,1H),4.58-4.57(m,2H),2.78-2.74(m,7H),2.06-2.00(m,8H),1.96-1.91(m,2H),1.62(m,4H),1.48(m,2H),1.37-1.25(br m,36H),0.87(m,6H).HPLC-98.65%。
ヘキサン(15mL)中の化合物518(1当量)溶液をTHF中のLAH(1M,2当量)氷冷溶液に、滴下した。添加完了後、混合物を40℃で0.5時間加熱し、次に氷浴上で再度冷却した。混合物を飽和Na2SO4水溶液によって注意深く加水分解し、次にセライトを通して濾過して油状物に濃縮した。カラムクロマトグラフィーから、純粋な519を無色の油状物として得た(1.3g、68%)。13C NMR δ=130.2,130.1(x2),127.9(x3),112.3,79.3,64.4,44.7,38.3,35.4,31.5,29.9(x2),29.7,29.6(x2),29.5(x3),29.3(x2),27.2(x3),25.6,24.5,23.3,226,14.1;エレクトロスプレーMS(+ve):C44H80NO2(M+H)+の分子量、計算値654.6、測定値654.6。
i.エマルジョン
本発明の組成物は、エマルジョンとして調製し製剤され得る。エマルジョンは、一般的に、通常、直径が0.1μmを超える小滴形態で、別の液体中に分散する1種の不均一液体である(例えば、Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi et al., in Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301を参照のこと)。エマルジョンは、密接に混合して互いに分散する、2つの不混和性液体相を含んでなる、二相性システムであることが多い。一般的に、エマルジョンは、油中水型(w/o)または水中油型(o/w)のいずれかであり得る。水性相がバルク油相中に微細分散して、微小滴として分散される場合、得られた組成物は、油中水型(w/o)エマルジョンと称される。あるいは、油性相がバルク水相中に微細分散して、微小滴として分散される場合、得られた組成物は、水中油型(o/w)エマルジョンと称される。エマルジョンは、分散相と、水性相および油性相いずれかの中の溶液として、またはそれ自体が別個の相として存在し得る、活性薬剤とに加えて、さらなる成分を含有し得る。乳化剤、安定化剤、染料、および抗酸化物質などの医薬品賦形剤はまた、必要に応じてエマルジョン中に存在し得る。医薬品エマルジョンはまた、例えば油中水中油型(o/w/o)および水中油中水型(w/o/w)エマルジョンなどの場合、3つ以上の相を含んでなる複数エマルジョンであり得る。このような複合体製剤は、単純な二成分エマルジョンが提供しない、特定の利点を提供することが多い。その中でo/wエマルジョンの個々の油滴が小さな水滴を囲い込む複数エマルジョンは、w/o/wエマルジョンを構成する。同様に、水の小球中に封入されて、油性連続相内で安定化される油滴システムは、o/w/oエマルジョンを提供する。
本発明の一態様において、iRNAと核酸の組成物は、マイクロエマルジョンとして製剤される。マイクロエマルジョンは、単一の光学的に等方性で熱力学的に安定している溶液である、水、油、および両親媒性物質のシステムと定義され得る(例えば、Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245を参照のこと)。一般的に、マイクロエマルジョンは、最初に油を水性界面活性剤溶液に分散して、次に一般に中間鎖長のアルコールである、十分な量の第4の成分を添加し、透明なシステムを形成することで、調製されるシステムである。従って、マイクロエマルジョンは、界面活性分子の界面膜によって安定化された、2つの不混和性液体の熱力学的に安定した等方的に透明な分散体として記述されている(Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215)。マイクロエマルジョンは、通常、油、水、界面活性剤、共界面活性剤、および電解質を含む、3~5成分の組み合わせを通じて調製される。マイクロエマルジョンが、油中水型(w/o)または水中油型(o/w)であるかどうかは、使用される油および界面活性剤の特性と、界面活性剤分子の極性頭部および炭化水素尾部の構造および幾何学的充填とに左右される(Schott, in Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271)。
本発明のiRNA薬は、例えば微粒子などの粒子に組み込まれてもよい。微粒子は、噴霧乾燥によって製造し得るが、それはまた、凍結乾燥、蒸発、流動床乾燥、真空乾燥、またはこれらの技術の組み合わせを含む、その他の方法によって製造してもよい。
一態様において、本発明は、種々の浸透促進剤を用いて、核酸、特にiRNAの動物皮膚への効率的な送達をもたらす。ほとんどの薬剤は、イオン化および非イオン化形態の両方で、溶液中に存在する。しかし通常、脂質可溶性または親油性薬剤のみが、細胞膜を容易に通過する。通過する膜が浸透促進剤で処理されれば、非親油性薬剤でさえも細胞膜を通過し得ることが発見されている。細胞膜横切る非親油性薬剤の拡散を助けるのに加えて、浸透促進剤はまた、親油性薬剤の透過性を高める。
本発明の特定の組成物は、また製剤中に担体化合物が組み込まれる。本明細書で用いる“担体化合物”または“担体”は、不活性(すなわちそれ自体は生物学的活性を有しない)であるが、例えば生物学的に活性の核酸を分解し、またはその循環からの除去を促進することで、生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビリティを低下させる、インビボ過程によって核酸と認識される、核酸またはその類縁体を意味し得る。核酸および担体化合物の、一般的に、後者の物質の過剰量での同時投与は、恐らく通常の受容体に対する担体化合物と核酸間の競合のために、肝臓、腎臓またはその他の循環外貯蔵器で回収される核酸量の実質的低下をもたらし得る。例えば肝臓組織内の部分的ホスホロチオエートdsRNAの回収は、それが、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジック(polycytidic)酸または4-アセトアミド-4’-イソチオシアノ-スチルベン-2,2’-ジスルホン酸と同時投与された場合に、低下し得る(Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183)。
担体化合物とは対照的に、“薬学的担体”または“賦形剤”は、1つまたは複数の核酸を動物に送達するための、薬学的に許容される溶媒、懸濁化剤または任意の他の薬理学的に不活性なビークルである。賦形剤は液体または固体であり得て、核酸および所定の医薬組成物のその他の成分と組み合わせた際に、所望のバルク、粘稠度などを提供するように、計画される投与様式をもとに選択される。一般的な薬学的担体としては、結合剤(例えば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど);充填剤(例えば、ラクトースおよびその他の糖類、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウムなど);潤滑剤(例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、二酸化ケイ素のコロイド、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど);崩壊剤(例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど);および湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど)が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明の組成物は、医薬組成物中に従来法で見られるその他の補助剤成分を、技術分野で確立されたそれらの使用レベルで、さらに含有し得る。従って、例えば組成物は、例えば、痒み止め(antipruritics)、収斂剤(astringent)、局所麻酔薬または抗炎症剤などのさらなる適合性の薬理的に活性な材料を含有することができ、または染料、香味剤、防腐剤、抗酸化剤、乳白剤、濃化剤、および安定化剤などの本発明の組成物の種々の剤形を物理的に製剤する上で有用な追加的材料を含有し得る。しかしこのような材料は、添加した場合に、本発明の組成物の成分の生物学的活性に過度に干渉すべきでない。製剤は滅菌され得て、所望ならば、製剤の核酸(複数可)と有害に相互作用しない、例えば、潤滑剤、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧圧力に影響を及ぼす塩、緩衝液、着色料、香味料および/または芳香族物質などの助剤と混合される。
本発明はまた、本発明のiRNAを含む医薬組成物、または本発明のiRNAを含むベクターを、AGT関連疾患、障害、および/または病状(例えば、高血圧)を有するか、またはそれをを発症し易い対象に投与することを含む、治療法および予防法を提供する。
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実施例1.iRNA合成
試薬供給元
試薬の供給元が本明細書で具体的に示されていない場合、そのような試薬は、分子生物学用途の品質/純度規格の分子生物学用試薬の如何なる供給業者から調達されてもよい。
siRNAデザインを実施して、NCBI遺伝子データベース(www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)でアノテートされた(annotated)ヒト(Homo sapiens)、アカゲザル(カニクイザル;以下、“cyno”と記載)、マウス(Mus musculus)、およびラット(Rattus norvegicus)のAGT転写物を標的とするsiRNAを同定した。デザインは、NCBIからの以下の転写物を使用した:ヒト-NM_000029.3;サル-AB170313.1;マウス-NM_007428.3。アカゲザル転写物は、肝臓由来のcDNAライブラリーから得られた配列を用いて伸長された。高度な霊長動物/齧歯動物配列多様性のために、siRNA二本鎖は、二本鎖整合ヒトおよびサル転写物のみ、およびマウス転写物のみ、を含有するバッチを含むが、これに限定されない、いくつかの別個のバッチでデザインされた。全てのsiRNA二本鎖は、各デザインバッチで考察された、列挙されたヒト転写物およびその他の種の転写物と100%の同一性を共有するようにデザインされた。
全ての可能な19量体(mer)の予測された特異性は、各配列から予測された。次に、7ヌクレオチドよりも長い反復を欠く、候補19量体を選択した。これらの706の候補ヒト/サルsiRNAおよび1815のマウスsiRNAを、pythonスクリプト‘BruteForce.py’中で実装される網羅的な“総当たり攻撃”アルゴリズムを使用する、好適なトランスクリプトーム(ヒト、サルまたはマウスNCBI Refseqセット内のNM_およびXM_recordsセットと定義される)に対する包括的検索で使用した。次にスクリプトは、転写物-オリゴアライメントを解析し、siRNAとあらゆる可能な“オフターゲット”転写物とのミスマッチの配置および数に基づいて、スコアを作成した。オフターゲットスコアを重み付けして、分子の5’末端から2~9位で、siRNAの“シード”領域内の違いを強調した。総当たり攻撃検索からの各オリゴ転写物対には、個々のミスマッチスコアを加算することでミスマッチスコアが与えられ;2~9位のミスマッチは2.8と見なされ、10~11位の切断部位のミスマッチは1.2と見なされ、領域12~19のミスマッチは1.0と見なされた。さらに、3つの異なる各オリゴのシード由来六量体に由来する七量体および八量体の発生頻度を比較することで、オフターゲット予測を実施した。5’開始点に対する2~7位からの六量体を使用して、2つの七量体および1つの八量体を作成した。“七量体1”は、六量体に3’-Aを付加して作製し;“七量体2”は、六量体に5’-Aを付加して作製し;“八量体”は、六量体の5’および3’末端の両方にAを付加して作製した。ヒト、サルまたはマウス3’UTRome(NCBIのRefseqデータベースからのトランスクリプトームの部分配列と定義され、コード領域末端‘CDS’は明確に画定されている)中の八量体および七量体の発生頻度は、予め計算された。八量体発生頻度は、八量体頻度範囲からの中央値を使用して、七量体発生頻度について正規化した。次に((3×正規化八量体数)+(2×七量体2数)+(1×七量体1数))の合計を計算することで、“mirSeedScore”を計算した。
合計117のセンスおよび117のアンチセンス由来ヒト/サルsiRNA19量体オリゴ、および42のセンスおよび42のアンチセンス由来マウスsiRNA19量体オリゴを合成し、GalNAcと複合体形成した二本鎖を形成した。合計38のセンスおよび38のアンチセンス由来ヒト/サル21/23量体オリゴおよび合計26のマウス21/23量体オリゴを合成し、GalNAcと複合体形成した二本鎖を形成した。
b.一般的小規模および中規模RNA合成手順
RNAオリゴヌクレオチドを、標準固相オリゴヌクレオチド合成プロトコルに従って、市販の、ウリジンの5’-O-(4,4’-ジメトキシトリチル)-2’-O-t-ブチルジメチルシリル-3’-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピル)ホスホラミダイトモノマー、4-N-アセチルシチジン、6-N-ベンゾイルアデノシンおよび2-N-イソブチリルグアノシン、および対応する2’-O-メチルおよび2’-フルオロホスホラミダイトを使用して、0.2~500μmolの規模で合成した。アミダイト溶液を、0.1~0.15M濃度で調製し、5-エチルチオ-1H-テトラゾール(アセトニトリル中の0.25~0.6M)をアクティベーターとして使用した。酸化工程のために、合成中に、ルチジン:アセトニトリル(1:1)(v;v)中の0.2Mフェニルアセチルジスルフィド(PADS)、またはピリジン中の0.1M 3-(ジメチルアミノメチレン)アミノ-3H-1,2,4-ジチアゾール-5-チオン(DDTT)を使用して、ホスホロチオエート主鎖の修飾を導入した。合成完了後、配列を固体支持体から切断し、メチルアミンとそれに続くトリエチルアミン・3HFを使用して脱保護し、存在する全ての2’-O-t-ブチルジメチルシリル保護基を除去した。
オリゴヌクレオチド合成のための4,4’-ジメトキシトリチル(DMT)保護一級ヒドロキシ基を保有するY型リンカーと、係留を通じて付着するGalNAcリガンドとが、予め装填された固体支持体を使用して、0.2~500μmolの規模で、GalNAcリガンドと3’末端で複合体形成するオリゴヌクレオチドを合成した。
細胞培養および96ウェル形質移入
37℃および5%CO2雰囲気下で、10%FBS、ストレプトマイシンおよびグルタミン(ATCC)が添加されたイーグルの最少必須培地(ATCC)中で、Hep3B細胞(ATCC,Manassas,VA)をコンフルエント近くまで培養した後、トリプシン処理によってプレートから遊離させた。細胞を洗浄し、0.125×106細胞/mlで再懸濁した。トランスフェクション中、細胞を、1ウェル当たり約20,000細胞で96ウェルプレートに播種した。
37℃で5%CO2雰囲気下で、10%FBS、ストレプトマイシンおよびグルタミン(ATCC(登録商標))が添加されたイーグルの最少必須培地(ATCC(登録商標)中で、Hep3B細胞(ATCC,Manassas,VA)をコンフルエント近くまで培養した後、トリプシン処理によってプレートから遊離させた。細胞を洗浄し、0.125×106細胞/mlで再懸濁した。トランスフェクション中、細胞を、1ウェル当たり約5,000細胞細胞で384ウェルプレートに播種した。
細胞を収集して150μlの溶解/結合緩衝液に溶解し、次いで、Eppendorfサーモミキサーを用いて、850rpmで5分間混合した(混合速度は処理全体にわたり同一であった)。10マイクロリットルの磁性ビーズと80μlの溶解/結合緩衝液混合物を丸底プレートに入れて、1分間混合した。磁性スタンドを使用して磁性ビーズを捕捉し、ビーズをかき乱すことなく上清を除去した。上清を除去した後、溶解細胞を残留ビーズに入れて、5分間混合した。上清を除去した後、磁性ビーズを150μlの洗浄緩衝液Aで2回洗浄して、1分間混合した。ビーズを再度捕捉して、上清を除去した。次にビーズを150μlの洗浄緩衝液Bで洗浄し、捕捉して上清を除去した。次にビーズを150μlの溶出緩衝液で洗浄し、捕捉して上清を除去した。ビーズを2分間乾燥させた。乾燥後、50μlの溶出緩衝液を添加して、70℃で5分間混合した。ビーズを磁石上に5分間捕捉した。40μlの上清を取り出して、別の96ウェルプレートに入れた。
反応あたり、2μlの10×緩衝液、0.8μlの25×dNTP、2μlのランダムプライマー、1μlの逆転写酵素、1μlのRNase阻害剤、および3.2μlのH2Oのマスターミックスを、10μlの全RNAに添加した。cDNAは、以下の工程により、Bio-Rad C-1000またはS-1000サーマルサイクラー(Hercules,CA)を使用して作製した:25℃で10分間、37℃で120分間、85℃で5秒間、4℃で保持。
細胞を50μlの溶解/結合緩衝液に溶解した。磁性ビーズ(Dynabeads)を溶解/結合緩衝液で洗浄し、それに再懸濁した。次いで、1ウェル当たり、2μlのDynabeadsを含む25μlの溶解/結合緩衝液を添加した。Vibratranslator (UnionScientific)の“7”で10分間プレートを振盪後、自動プレート洗浄システムを利用した(Biostackerを備えるBiotek EL406、および磁性捕捉プレート)。次いで、プレートを96ウェルでの方法に記載のものと同様の方法で洗浄した:緩衝液A(90μl)で2回洗浄、緩衝液B(90μl)で1回洗浄、そして緩衝液C(100μl)で2回洗浄。最後の洗浄液をプレートから除去し、cDNA合成を直ちに開始した。
反応あたり、2μlの10×緩衝液、0.8μlの25×dNTP、2μlのランダムプライマー、1μlの逆転写酵素、1μlのRNase阻害剤、および13.2μlのH2Oのマスターミックスを、抽出したRNAおよび磁性ビーズのみを含む384ウェルプレート(総容量20μl)のウェルに添加した。cDNAは、25℃で10分間、37℃で120分間、そして85℃で8分間のインキュベーションにより作製した。
384ウェルプレート(Roche;カタログ番号04887301001)の1ウェルあたり、0.5μlのヒトGAPDH TaqManプローブ(Applied Biosystems;カタログ番号4326317E)、0.5μlのヒトAGT TaqManプローブ(Applied Biosystems;カタログ番号Hs00174854m1)、2μLの核酸不含有水および5μlのLightcycler 480プローブマスター混合物(Roche;カタログ番号04887301001)を含むマスター混合物に、2μlのcDNAを添加した。qPCRをLightCycler 480リアルタイムPCR機(Roche)で行った。相対的な変化倍を計算するために、ΔΔCt法を用いてデータを分析し、10nM AD-1955またはモックでトランスフェクトした細胞を用いて実施したアッセイに対して標準化を行った。IC50値を、XLFitを用いて4パラメーターフィットモデルを用いて計算し、AD-1955またはモックでトランスフェクトした細胞に対して標準化を行った。
センス:cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT (配列番号13)
アンチセンス:UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT (配列番号14)。
完全なゲノムのヒトAGT遺伝子を保持するトランスジェニック雌Sprague-Dawleyラット(例えば、[TGR(hAGT)L1623](例えば、Bohlender J, et al. (1996) Hypertension 27: 535-540 および Bohlender J, et al. (2000) J Am Soc Nephrol 11: 2056-2061を参照のこと))に、遠隔測定により血圧を測定する装置を外科的に移植した。移植術からの回復後、これらのラットを、全ゲノムヒトREN遺伝子を保持するトランスジェニック雄Sprague-Dawleyラット(例えば、[TGR(hREN)L10J](例えば、Bohlender J, et al. (1997) Hypertension 29: 428-434 および Bohlender J, et al. (2000) J Am Soc Nephrol 11: 2056-2061を参照のこと))と交配させた。この交雑のメス子孫(本明細書中、“PEラット”という)は、子癇前症のモデルであり、アルブミン尿および子宮内胎児発育遅延(IUGR)を発症し、そして妊娠13日目辺りに始まる血圧スパイクを有している(例えば、図2A参照)。
AD-60771二本鎖を、実施例2に記載した妊娠中のPEラットにおけるhAGT発現のサイレンシングの能力について試験した。妊娠中のPEラットの下位集団への、10mg/kgのsiRNAを標的とするhAGT(AD-60771)の投与を、妊娠3日目に開始した。肝臓および血液を妊娠21日目に採取し、hAGTおよびrAGTタンパク質およびmRNAのレベルをアッセイし、未処理の、妊娠中のトランスジェニックラット、妊娠中のSprague-Dawleyラットおよび妊娠していないSprague-Dawleyラット中に存在するhAGTおよびrAGTタンパク質およびmRNAのレベルと比較した。これらのアッセイ結果を図9Aおよび9Bに示し、対照の妊娠中のPEラットと比較して、AD-60771で処理した妊娠中のPEラットにおいて、循環AT2の80%の低下および循環hAT1の95%の低下があったことが実証されている。ラットAT2の約45%の減少もまた、対照の妊娠中のPEラットと比較して、AD-60771で処理した妊娠中のPEラットで観察された。肝臓AGT mRNAの95%サイレンシングが、対照の妊娠中のPEラットと比較して、AD-60771で処理した妊娠中のPEラットで観察された。図9Aおよび9Bはまた、妊娠中のPEラットへのAD-60771の投与後に、AT1およびAT2の血清レベルの大幅な減少があったことも実証している。
一連の試験を、強力な肝向性(liver tropism)を有するAAV8発現ベクターからヒトAGT(hAGT)を発現するマウスにおける、hAGTを標的とするノックダウンを評価するために行った。まとめると、マウスに、構成的プロモーターの制御下にhAGTのための発現構築物を含む、1×1011のAAV8粒子を感染させた。感染の2週間後、マウスに、3.0mg/kg、1.0mg/kg、0.3mg/kg、または0.1mg/kgのhAGTを標的とするsiRNA(AD-67327.2またはAD-67335.2)、または対照としてPBS(1群当たり、n=4)を単回投与した。これらの試験で評価される薬剤のヌクレオチド配列を表13に示す。
一連の試験を、強力な肝向性(liver tropism)を有するAAV8発現ベクターからヒトAGT(hAGT)を発現するマウスにおける、hAGTを標的とするノックダウンを評価するために行った。まとめると、マウスに、構成的プロモーターの制御下にhAGTのための発現構築物を含む、1×1011のAAV8粒子を感染させた。AAV8ウイルスでの感染の2週間後、マウスに、1mg/kgのhAGTを標的とするsiRNA、または対照としてPBS(1群当たり、n=3)を単回投与した。これらの試験で評価される二本鎖のヌクレオチド配列を表15に示す。
当業者は、本明細書に記載の特定の態様および方法に対する多くの均等物を認識するか、または常套的な実験のみを用いて確認することが可能である。そのような均等物は、本明細書に添付する特許請求の範囲の範囲内に包含されることが意図される。
Claims (49)
- 細胞内でのアンジオテンシノーゲン(AGT)の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(RNAi)薬であって、ここで、該二本鎖RNAi薬は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖は、5’-UUACUCUCAUUGUGGAUGA-3’(配列番号876)のヌクレオチド配列と1個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも17個の連続ヌクレオチドを含み、
該センス鎖の実質的に全てのヌクレオチドおよび該アンチセンス鎖の実質的に全てのヌクレオチドは、2’-O-メチル修飾ヌクレオチドおよび2’-フルオロ修飾ヌクレオチドからなる群から選択される修飾ヌクレオチドであり、
該二本鎖RNAi薬が、少なくとも1つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合をさらに含み、そして
少なくとも1つの鎖は、1個またはそれ以上のGalNAc誘導体であるリガンドと複合体を形成している、二本鎖RNAi薬。 - 細胞内でのアンジオテンシノーゲン(AGT)発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(RNAi)薬であって、ここで、該二本鎖RNAi薬は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
該センス鎖は、配列番号1のヌクレオチド配列のヌクレオチド635-653のヌクレオチドと1個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも17個の連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号2のヌクレオチド配列の対応する位置からの1個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも17個の連続ヌクレオチドを含み、そして
該センス鎖の実質的に全てのヌクレオチドおよび該アンチセンス鎖の実質的に全てのヌクレオチドは、2’-O-メチル修飾ヌクレオチドおよび2’-フルオロ修飾ヌクレオチドからなる群から選択される修飾ヌクレオチドであり、
該二本鎖RNAi薬が、少なくとも1つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合をさらに含み、そして
少なくとも1つの鎖は、1個またはそれ以上のGalNAc誘導体であるリガンドと複合体を形成している、二本鎖RNAi薬。 - 該センス鎖が、3’末端で結合しているリガンドと複合体を形成している、請求項1または2に記載の二本鎖RNAi薬。
- 該アンチセンス鎖が、5’-UUACUCUCAUUGUGGAUGA-3’(配列番号876)の少なくとも17個の連続ヌクレオチドを含む、請求項1または2に記載の二本鎖RNAi薬。
- 該センス鎖が、5’-UCAUCCACAAUGAGAGUAA-3’(配列番号679)の少なくとも17個の連続ヌクレオチドを含む、請求項1または2に記載の二本鎖RNAi薬。
- 該センス鎖が、5’-UCAUCCACAAUGAGAGUAA-3’(配列番号679)のヌクレオチド配列と1個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも18個の連続ヌクレオチドを含み、該アンチセンス鎖が、5’-UUACUCUCAUUGUGGAUGA-3’(配列番号876)のヌクレオチド配列と1個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも18個の連続ヌクレオチドを含む、請求項1または2に記載の二本鎖RNAi薬。
- 該センス鎖の全てのヌクレオチドおよび該アンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである、請求項1から6のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi薬。
- 少なくとも1つの鎖が、少なくとも1つのヌクレオチドの3’オーバーハングを含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi薬。
- 少なくとも1つの鎖が、少なくとも2つのヌクレオチドの3’オーバーハングを含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi薬。
- 二本鎖領域が、17-23ヌクレオチド対の長さである、請求項1から9のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi薬。
- 二本鎖領域が、17-25ヌクレオチド対の長さである、請求項1から9のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi薬。
- 二本鎖領域が、19-21ヌクレオチド対の長さである、請求項1から9のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi薬。
- 二本鎖領域が、21-23ヌクレオチド対の長さである、請求項1から9のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi薬。
- 各鎖が独立して17-25のヌクレオチド長を有する、請求項1から13のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi薬。
- 各鎖が独立して17-23のヌクレオチド長を有する、請求項1から13のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi薬。
- 1個またはそれ以上のGalNAc誘導体が、二価または三価の分枝状リンカーを介して結合している、請求項1から15のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi薬。
- リガンドがセンス鎖の3’末端に結合している、請求項1から17のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi薬。
- 該ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合が、1つの鎖の3’末端にある、請求項1から19のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi薬。
- 該鎖がアンチセンス鎖である、請求項20に記載の二本鎖RNAi薬。
- 該鎖がセンス鎖である、請求項21に記載の二本鎖RNAi薬。
- 該ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合が、1つの鎖の5’末端にある、請求項1から19のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi薬。
- 該鎖がアンチセンス鎖である、請求項23に記載の二本鎖RNAi薬。
- 該鎖がセンス鎖である、請求項23に記載の二本鎖RNAi薬。
- 該ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合が、1つの鎖の5’末端および3’末端の両方にある、請求項1から19のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi薬。
- 該鎖がアンチセンス鎖である、請求項26に記載の二本鎖RNAi薬。
- 該RNAi薬が、6-8個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項1から19のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi薬。
- 該アンチセンス鎖が、5’末端に2個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合および3’末端に2個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、そして該センス鎖が、5’末端または3’末端のいずれかに少なくとも2個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項28に記載の二本鎖RNAi薬。
- アンチセンス鎖の5’末端の1つの位置の塩基対がAU塩基対である、請求項1から29のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi薬。
- 請求項1-30のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi薬を含む、単離された細胞。
- 請求項1-30のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi薬を含む、アンジオテンシノーゲン(AGT)関連疾患を有する対象を処置する方法に使用するための医薬組成物。
- 二本鎖RNAi薬が非緩衝液中に存在する、請求項32に記載の医薬組成物。
- 該非緩衝液が生理食塩水または水である、請求項33に記載の医薬組成物。
- 該二本鎖RNAi薬が緩衝液中に存在する、請求項32に記載の医薬組成物。
- 該緩衝液が、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、プロラミン、炭酸緩衝液、またはリン酸緩衝液、あるいはこれらの任意の組合せを含む、請求項35に記載の医薬組成物。
- 該緩衝液が、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)である、請求項36に記載の医薬組成物。
- 細胞内でのアンジオテンシノーゲン(AGT)発現を阻害するインビトロ方法であって、
(a)細胞を、請求項1-30のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi薬、または請求項32-37のいずれか一項に記載の医薬組成物と接触させること;そして
(b)工程(a)で製造された細胞を、AGT遺伝子のmRNA転写物が分解されるのに十分な時間維持して、細胞内でのAGT遺伝子の発現を阻害すること
を含む、方法。 - AGT発現が、少なくとも約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約98%または約100%阻害される、請求項38に記載の方法。
- 治療的有効量の、請求項1-30のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi薬、または請求項32-37のいずれか一項に記載の医薬組成物の、アンジオテンシノーゲン(AGT)関連疾患を有する対象の処置のための医薬の製造における、使用。
- 対象がヒトである、請求項40に記載の使用。
- アンジオテンシノーゲン関連疾患が、高血圧、境界域高血圧、原発性高血圧、二次性高血圧、高血圧緊急症、高血圧急迫症、孤立性収縮期高血圧または拡張期高血圧、妊娠関連高血圧、糖尿病性高血圧、治療抵抗性高血圧、難治性高血圧、発作性高血圧、腎血管性高血圧、ゴールドブラット高血圧、眼性高血圧、緑内障、肺高血圧、門脈圧亢進症、体静脈高血圧、収縮期高血圧、不安定高血圧;高血圧性心疾患、高血圧性腎症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、血管障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、慢性心不全、心筋症、糖尿病性心筋症、糸球体硬化症、大動脈狭窄症、大動脈瘤、心内膜線維症、クッシング症候群、および慢性ステロイド療法を含む他のグルココルチコイド過剰状態、褐色細胞腫、レニン腫症候群(reninoma)、続発性アルドステロン症および他のミネラルコルチコイド過剰状態、睡眠時無呼吸症、甲状腺/副甲状腺疾患、心不全、心筋梗塞、狭心症、卒中、真性糖尿病、腎疾患、腎不全、全身性硬化症、子宮内胎児発育遅延(IUGR)、ならびに胎児発育不全からなる群より選択される、請求項40に記載の使用。
- 該二本鎖RNAi薬が皮下投与のためのものである、請求項40に記載の使用。
- 該二本鎖RNAi薬が静脈内投与のためのものである、請求項40に記載の使用。
- 該二本鎖RNAi薬が2以上の用量で投与されるためのものである、請求項40に記載の使用。
- 対象にさらなる治療剤を投与することを含む方法に使用する医薬のためである、請求項40に記載の使用。
- さらなる治療剤が、利尿剤、アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤、アンジオテンシンII受容体アンタゴニスト、β遮断薬、血管拡張薬、カルシウムチャンネル遮断薬、アルドステロンアンタゴニスト、α2-アゴニスト、レニン阻害剤、α遮断薬、末梢作用型アドレナリン作動薬、選択的D1受容体部分アゴニスト、非選択的α-アドレナリンアンタゴニスト、合成したステロイド性の抗ミネラルコルチコイド薬、または上記の何れかの組合せ、および併用剤として製剤された高血圧治療薬からなる群より選択される、請求項46に記載の使用。
- アンジオテンシノーゲン関連疾患が高血圧である、請求項40に記載の使用。
- 高血圧が、境界域高血圧、原発性高血圧、二次性高血圧、高血圧緊急症、高血圧急迫症、孤立性収縮期高血圧または拡張期高血圧、妊娠関連高血圧、糖尿病性高血圧、治療抵抗性高血圧、難治性高血圧、発作性高血圧、腎血管性高血圧、ゴールドブラット高血圧、眼性高血圧、緑内障、肺高血圧、門脈圧亢進症、体静脈高血圧、収縮期高血圧、不安定高血圧;高血圧性心疾患、および高血圧性腎症からなる群より選択される、請求項48に記載の使用。
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