BR112016026950B1 - Agente de ácido ribonucleico (rnai) de fita dupla, seus usos e composição farmacêutica - Google Patents

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Satyanarayana KUCHIMANCHI
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Abstract

COMPOSIÇÕES DE RNAI PARA ANGIOTENSINOGÊNIO (AGT) E MÉTODOS DE USO DAS MESMAS. A presente invenção refere-se a agentes de RNAi, por exemplo, agentes de RNAi de filamento duplo, que se direcionam ao gene do angiotensinogênio (AGT), e métodos de uso de tais agentes de RNAi para inibir expressão de AGT e métodos de tratamento de indivíduos tendo um distúrbio associado a AGT, por exemplo, hipertensão.

Description

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados
[001] O presente pedido reivindica o benefício de prioridade para o Pedido de Patente Provisório US 62/001,731, depositado em 22 de maio de 2014, e Pedido de Patente Provisório US 62/047,978, depositado em 9 de setembro de 2014. Os conteúdos de cada um dos pedidos acima em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência.
Listagem de Sequência
[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência que foi eletronicamente apresentada em formato ASCII e é aqui incorporada a título de referência em sua totalidade. A cópia ASCII, criada em 18 de maio de 2015, é chamada 121301-01320_SL.txt e tem 318.688 bytes de tamanho.
Antecedentes da Invenção
[003] O sistema renina-angiotensina-aldosterona (RAAS) desempenha um papel crucial na regulagem de pressão sanguínea. A cascata de RAAS começa com a liberação de renina pelas células justaglomerulares do rim para a circulação. A secreção de renina é estimulada por vários fatores, incluindo carga de Na+ no túbulo distal, estimulação e-simpática e/ou perfusão renal reduzida. A renina ativa no plasma cliva angiotensinogênio (produzido pelo fígado) em angiotensina I, que é então convertida pela enzima de conversão de angiotensina em circulação e localmente expressa (ACE) em angiotensina II. A maioria dos efeitos de angiotensina II sobre o RAAS é exercido por sua ligação a receptores de angiotensina II tipo 1 (AT1R), levando à vasoconstrição arterial, efeitos tubulares e glomerulares, tal como reabsorção de Na+ aumentada ou modulação de taxa de filtragem glomerular. Ainda, junto com outros estímulos tais como adrenocorticotropina, hormônio antidiurético, catecolaminas, endotelina, serotonina e níveis de Mg2+ e K+, estimulação de AT1R leva à liberação de aldosterona que, por sua vez, promove excreção de Na+ e K+ no túbulo convoluto distal renal.
[004] Desregulagem do RAAS levando a, por exemplo, produção de angiotensina II excessiva e/ou estimulação de AT1R resulta em hipertensão que pode levar a, por exemplo, estresse oxidativo aumentado, promoção de inflamação, hipertrofia e fibrose no coração, rins e artérias e resulta em, por exemplo, fibrose ventricular esquerda, remodelagem arterial e glomeruloesclerose.
[005] A hipertensão é a doença controlável, mais prevalente, em países desenvolvidos, afetando 20-50% de populações adultas. Ela é um principal fator de risco para várias doenças, distúrbios e condições tais como expectativa de vida menor, doença renal crônica, acidente vascular cerebral, infarto do miocárdio, falência cardíaca, aneurismas (por exemplo, aneurisma aórtico), doença da artéria periférica, dano cardíaco (por exemplo, aumento do coração ou hipertrofia) e outras doenças, distúrbios e/ou condições cardiovasculares relacionados. Ainda, a hipertensão foi mostrada ser um fator de risco importante para morbidez e mortalidade cardiovasculares sendo responsável por, ou contribuindo para, 62% de todos os acidentes vasculares cerebrais e 49% de todos os casos de doença cardíaca.
[006] Apesar do número de fármacos anti-hipertensivos disponíveis para tratamento de hipertensão, mais de dois terços de indivíduos não são controlados com um agente anti-hipertensivo e requerem dois ou mais agentes anti-hipertensivos selecionados de classes de fármaco diferentes. Isto reduz mais o número de indivíduos com pressão sanguínea controlada uma vez que a obediência e efeitos colaterais aumentam com aumento da medicação.
[007] Desta maneira, há uma necessidade na técnica de terapias alternativas e terapias de combinação para indivíduos tendo uma doença associada à angiotensina.
Sumário da Invenção
[008] A presente invenção provê composições de iRNA que afetam a clivagem mediada por complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) de transcritos de RNA de um gene de angiotensinogênio (AGT). O agente AGT pode estar dentro de uma célula, por exemplo, uma célula dentro de um indivíduo, tal como um ser humano.
[009] A presente invenção também provê métodos e terapias para tratamento de um indivíduo tendo um distúrbio que se beneficiaria da inibição ou redução da expressão de um gene AGT, por exemplo, uma doença associada a angiotensinogênio, tal como hipertensão, usando composições de iRNA que afetam a clivagem mediada pelo complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) de transcritos de RNA de um gene AGT para inibição da expressão de um gene AGT.
[0010] Desta maneira, em um aspecto, a presente invenção provê agentes de ácido ribonucleico de fita dupla (RNAi) para inibição da expressão de angiotensinogênio (AGT), que compreende uma fita senso e uma fita antissenso formando uma região de fita dupla, onde a fita senso compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos diferindo em não mais do que 3 nucleotídeos da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1 e da fita antissenso compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos diferindo em não mais do que 3 nucleotídeos da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2, onde substancialmente todos dos nucleotídeos da fita senso e substancialmente todos dos nucleotídeos da fita antissenso são nucleotídeos modificados, e onde a fita senso é conjugada a um ligante ligado ao terminal 3’. Em uma modalidade, todos dos nucleotídeos da fita senso e todos dos nucleotídeos da fita antissenso são nucleotídeos modificados.
[0011] Em um outro aspecto, a presente invenção provê agentes de ácido ribonucleico de fita dupla (RNAi) para inibição da expressão de angiotensinogênio (AGT), que compreende uma fita senso e uma fita antissenso formando uma região de fita dupla, onde a fita senso compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos diferindo em não mais do que 3 nucleotídeos dos nucleotídeos 2801-2101; 803-843; 834859; 803-859; 803-875; 834-875; 847-875; 1247-1271; 1566-1624; 1570-1624; 1584-1624; 1584-1624; 1584-1621; 2035-2144; 2070-2144; 2070-2103; 2201-2223; 2227-2360; 2227-2304; 2290-2318; 2304-2350; 2304-2326; 2320-2342; 2333-2360; 2333-2358; 485-503; 517-535; 560578; 635-653; 803-821; 814-832; 822-840; 825-843; 834-852; 837-855; 841-859; 855-873; 967-985; 1247-1265; 1248-1266; 1249-1267; 12511269; 1253-1271; 1566-1584; 1570-1588; 1572-1590; 1574-1592; 15841602; 1587-1605; 1591-1609; 1592-1610; 1595-1613; 1601-1619; 16021620; 1605-1623; 1729-1747; 1738-1756; 1739-1757; 1741-1769; 17671785; 1810-1828; 1827-1845; 1880-1989; 1892-1914; 1894-1914;1894- 2012; 2035-2053; 2046-2064; 2057-2075; 2070-2088; 2072-2090; 20782096; 2078-2107; 2078-2011; 2080-2098; 2081-2099; 2081-2104; 20812011; 2082-2100; 2084-2102; 2084-2011; 2090-2108; 2100-2118; 21112129; 2124-2142; 2125-2143; 2167-2185; 2179-2197; 2201-2219; 22022220; 2203-2221; 2204-2222; 2227-2245; 2230-2248; 2234-2252; 22442264; 2255-2273; 2266-2284; 2268-2286; 2270-2288; 2279-2297; 22812299; 2283-2301; 2284-2302; 2285-2303; 2286-2304; 2288-2306; 22902308; 2291-2309; 2291-2311; 2291-2318; 2291-2315; 2292-2310; 22942312; 2296-2314; 2299-2317; 2304-2322; 2304-2329; 2306-2324; 23072325; 2309-2327; 2309-2329; 2309-2342; 2309-2350; 2309-2358; 23142332; 2316-2334; 2317-2335; 2320-2338; 2321-2339; 2323-2341; 23252343; 2326-2344; 2328-2346; 2329-2347; 2331-2349; 2333-2351; 23342352; 2335-2353; 2339-2357; 2340-2358; ou 2341-2359 da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1 e a fita antissenso compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos diferindo em não mais do que 3 nucleotídeos dos nucleotídeos na posição correspondente da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:2 de maneira que a fita antissenso é substancialmente complementar aos pelo menos 15 nucleotídeos contíguos na fita senso. Em certas modalidades, substancialmente todos os nucleotídeos da fita senso são nucleotídeos modificados. Em outras modalidades, substancialmente todos dos nucleotídeos da fita antissenso são nucleotídeos modificados. Em ainda outras modalidades, substancialmente todos dos nucleotídeos de ambas as fitas são nucleotídeos modificados. Em uma modalidade, todos dos nucleotídeos da fita senso e todos dos nucleotídeos da fita antissenso são nucleotídeos modificados. Em uma modalidade, a fita senso é conjugada a um ligante ligado ao terminal 3’. Em uma modalidade, a fita senso compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos diferindo em não mais do que 3 nucleotídeos de nucleotídeos 2801-2101 da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1 e a fita antissenso compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos diferindo em não mais do que 3 nucleotídeos dos nucleotídeos na posição correspondente da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2 de maneira que a fita antissenso é substancialmente complementar aos pelo menos 15 nucleotídeos contíguos na fita senso.
[0012] Em um aspecto, a presente invenção provê agentes de ácido ribonucleico de fita dupla (RNAi) para inibição da expressão de angiotensinogênio (AGT), que compreendem uma fita senso e uma fita antissenso formando uma região de fita dupla, onde a fita senso compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos dos nucleotídeos 803-843; 834-859; 803-859; 1247-1271; 1566-1624; 1570-1624; 15841624; 1584-1624; 1584-1621; 2035-2144; 2070-2144; 2070-2103; 22012223; 2227-2360; 2227-2304; 2290-2318; 2304-2350; 2304-2326; 23202342; 2333-2360; 2333-2358; 485-503; 517-535; 560-578; 635-653; 803-821; 814-832; 822-840; 825-843; 834-852; 837-855; 841-859; 855- 873; 967-985; 1247-1265; 1248-1266; 1249-1267; 1251-1269; 1253- 1271; 1566-1584; 1570-1588; 1572-1590; 1574-1592; 1584-1602; 1587- 1605; 1591-1609; 1592-1610; 1595-1613; 1601-1619; 1602-1620; 1605- 1623; 1729-1747; 1738-1756; 1739-1757; 1741-1769; 1767-1785; 1810- 1828; 1827-1845; 1880-1989; 1894-2012; 2035-2053; 2046-2064; 2057- 2075; 2070-2088; 2072-2090; 2078-2096; 2080-2098; 2081-2099; 2082- 2100; 2084-2102; 2090-2108; 2100-2118; 2111-2129; 2124-2142; 2125- 2143; 2167-2185; 2179-2197; 2201-2219; 2202-2220; 2203-2221; 2204- 2222; 2227-2245; 2230-2248; 2234-2252; 2244-2264; 2255-2273; 2266- 2284; 2268-2286; 2270-2288; 2279-2297; 2281-2299; 2283-2301; 2284- 2302; 2285-2303; 2286-2304; 2288-2306; 2290-2308; 2291-2309; 2292- 2310; 2294-2312; 2296-2314; 2299-2317; 2304-2322; 2306-2324; 2307- 2325; 2309-2327; 2314-2332; 2316-2334; 2317-2335; 2320-2338; 2321- 2339; 2323-2341; 2325-2343; 2326-2344; 2328-2346; 2329-2347; 2331- 2349; 2333-2351; 2334-2352; 2335-2353; 2339-2357; 2340-2358; ou 2341-2359 da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1 e a fita antissenso compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos diferindo em não mais do que 3 nucleotídeos dos nucleotídeos na posição correspondente da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:2 de maneira que a fita antissenso é substancialmente complementar a pelo menos 15 nucleotídeos contíguos na fita senso. Em certas modalidades, substancialmente todos dos nucleotídeos da fita senso são nucleotídeos modificados. Em outras modalidades, substancialmente todos dos nucleotídeos da fita antissenso são nucleotídeos modificados. Em ainda outras modalidades, substancialmente todos dos nucleotídeos de ambas as fitas são nucleotídeos modificados. Em uma modalidade, a fita senso é conjugada a um ligante ligado no terminal 3’.
[0013] Em uma modalidade, a fita senso e a fita antissenso compreendem uma região de complementaridade que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos diferindo em não mais do que 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências antissenso listadas em qualquer uma das Tabelas 3, 4, 7, 8, 11, 13 e 15. Por exemplo, em certas modalidades, a fita senso e a fita antissenso compreendem uma região de complementaridade que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos diferindo em não mais do que 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências antissenso dos dúplexes AD-52433.1, AD-52438.1, AD-52439.1, AD-52445.1, AD-52449.1, AD-52451.1, AD- 52456.1, AD-52457.1, AD-52462.1, AD-52463.1, AD-52469.1, AD- 52474.1, AD-55976.1, AD-55978.1, AD-55979.1, AD-55980.1, AD- 55981.1, AD-55982.1, AD-55983.1, AD-55984.1, AD-55987.1, AD- 55988.1, AD-55989.1, AD-55990.1, AD-55991.1, AD-55994.1, AD- 55995.1, AD-55996.1, AD-55999.1, AD-56000.1, AD-56001.1, AD- 56002.1, AD-56003.1, AD-56006.1, AD-56007.1, AD-56008.1, AD- 56009.1, AD-56011.1, AD-56012.1, AD-56013.1, AD-56016.1, AD- 56017.1, AD-56019.1, AD-56020.1, AD-56021.1, AD-56022.1, AD- 56024.1, AD-56026.1, AD-56027.1, AD-56029.1, AD-56030.1, AD- 56031.1, AD-56032.1, AD-56035.1, AD-56039.1, AD-56041.1, AD- 56043.1, AD-56044.1, AD-56047.1, AD-56048.1, AD-56051.1, AD- 56053.1, AD-56054.1, AD-56059.1, AD-56062.1, AD-56065.1, AD- 56066.1, AD-60770.1, AD-60771.1, AD-60776.1, AD-60777.1, AD- 60778.1, AD-60779.1, AD-60780.1, AD-60781.1, AD-60783.1, AD- 60784.1, AD-60785.1, AD-60788.1, AD-60789.1, AD-60791.1, AD- 60793.1, AD-60795.1, AD-60798.1, AD-60801.1, AD-67903.1, AD- 67906.1, AD-67923.1, AD-67924.1, AD-67925.1, AD-67926.1, AD- 67935.1, AD-67965.1, AD-67994.1, AD-67995.1, AD-67996.1, AD- 68017.1, AD-68022.1, AD-68035.1, AD-68036.1, AD-68037.1, AD- 68084.2, AD-68085.2, AD-68086.2, AD-68087.2, AD-68090.2, AD- 68091.2, AD-68092.2, AD-68093.2, AD-68116.1, AD-68117.1, AD- 68118.1, AD-68124.1, AD-68125.1, ou AD-68126.1. Em certas modalidades, a fita senso e a fita antissenso compreendem uma região de complementaridade que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos da região de complementaridade de qualquer um dos dúplexes AD-52433.1, AD-52438.1, AD-52439.1, AD-52445.1, AD- 52449.1, AD-52451.1, AD-52456.1, AD-52457.1, AD-52462.1, AD- 52463.1, AD-52469.1, AD-52474.1, AD-55976.1, AD-55978.1, AD- 55979.1, AD-55980.1, AD-55981.1, AD-55982.1, AD-55983.1, AD- 55984.1, AD-55987.1, AD-55988.1, AD-55989.1, AD-55990.1, AD- 55991.1, AD-55994.1, AD-55995.1, AD-55996.1, AD-55999.1, AD- 56000.1, AD-56001.1, AD-56002.1, AD-56003.1, AD-56006.1, AD- 56007.1, AD-56008.1, AD-56009.1, AD-56011.1, AD-56012.1, AD- 56013.1, AD-56016.1, AD-56017.1, AD-56019.1, AD-56020.1, AD- 56021.1, AD-56022.1, AD-56024.1, AD-56026.1, AD-56027.1, AD- 56029.1, AD-56030.1, AD-56031.1, AD-56032.1, AD-56035.1, AD- 56039.1, AD-56041.1, AD-56043.1, AD-56044.1, AD-56047.1, AD- 56048.1, AD-56051.1, AD-56053.1, AD-56054.1, AD-56059.1, AD- 56062.1, AD-56065.1, AD-56066.1, AD-60770.1, AD-60771.1, AD- 60776.1, AD-60777.1, AD-60778.1, AD-60779.1, AD-60780.1, AD- 60781.1, AD-60783.1, AD-60784.1, AD-60785.1, AD-60788.1, AD- 60789.1, AD-60791.1, AD-60793.1, AD-60795.1, AD-60798.1, AD- 60801.1, AD-67903.1, AD-67906.1, AD-67923.1, AD-67924.1, AD- 67925.1, AD-67926.1, AD-67935.1, AD-67965.1, AD-67994.1, AD- 67995.1, AD-67996.1, AD-68017.1, AD-68022.1, AD-68035.1, AD- 68036.1, AD-68037.1, AD-68084.2, AD-68085.2, AD-68086.2, AD- 68087.2, AD-68090.2, AD-68091.2, AD-68092.2, AD-68093.2, AD- 68116.1, AD-68117.1, AD-68118.1, AD-68124.1, AD-68125.1 ou AD- 68126.1.
[0014] Em uma modalidade, a fita antissenso compreende uma região de complementaridade que compreende pelo menos 15 nucleotídeos não modificados contíguos diferindo em não mais do que 3 nucleotídeos da sequência de nucleotídeo antissenso de AD-67327 (5’- AUUAGAAGAAAAGGUGGGAGACU-3’; SEQ ID NO:537). Em uma outra modalidade, a região de complementaridade consiste na sequência de nucleotídeo não modificada antissenso de AD-67327 (5’- AUUAGAAGAAAAGGUGGGAGACU-3’; SEQ ID NO:537). Em uma modalidade, o dsRNA compreende uma fita senso consistindo na sequência de nucleotídeo de 5’-UCUCCCACCUUUUCUUCUAAU-3’ (SEQ ID NO:499) e uma fita antissenso consistindo na sequência de nucleotídeo de 5’-UUAGAAGAAAAGGUGGGAGACU-3’ (SEQ ID NO:537). Em uma modalidade, o agente de RNAi de fita dupla compreende a sequência de nucleotídeo modificada de AD-67327 (5’- uscsucccAfcCfUfUfuucuucuaau-3’; SEQ ID NO:1037 e 5’- asUfsuagAfagaaaagGfuGfggagascsu-3’; SEQ ID NO:1038.
[0015] Em algumas modalidades, o(s) nucleotídeo(s) modificado(s) é independentemente selecionado do grupo consistindo em um nucleotídeo 2’-O-metila modificado, um nucleotídeo 2’-flúor modificado, um nucleotídeo compreendendo um grupo 5’-fosforotioato e um nucleotídeo terminal ligado a um derivado de colesterila ou um grupo bisdecilamida do ácido dodecanoico. Em modalidades adicionais, o nucleotídeo modificado é selecionado do grupo consistindo em um nucleotídeo 2’-desoxi-2’-flúor modificado, um nucleotídeo 2’-desóxi modificado, um nucleotídeo bloqueado, um nucleotídeo não bloqueado, um nucleotídeo conformacionalmente restrito, um nucleotídeo de etila restrito, um nucleotídeo abásico, um nucleotídeo 2’-amino modificado, um nucleotídeo 2’-alquila modificado, um nucleotídeo 2’-O-alila modificado, um nucleotídeo 2’-C-alila modificado, um nucleotídeo 2’- hidroxila modificado, um nucleotídeo de morfolino, um fosforamidato, um nucleotídeo compreendendo base não natural.
[0016] Em uma outra modalidade do agente de RNAi de fita dupla, pelo menos um a fita compreende uma saliência 3’ de pelo menos 1 nucleotídeo. Em uma outra modalidade, pelo menos um a fita compreende uma saliência 3’ de pelo menos 2 nucleotídeos.
[0017] Em um outro aspecto, a presente invenção provê agentes de RNAi, por exemplo, agentes de ácido ribonucleico de fita dupla (RNAi) capazes de inibição da expressão de angiotensinogênio (AGT) em uma célula, onde o agente de RNAi de fita dupla compreende uma fita senso complementar a uma fita antissenso, e a fita antissensoonde a fita antissenso compreende uma região complementar à parte de um mRNA codificando AGT, onde cada a fita é de cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos de comprimento, onde o agente de RNAi de fita dupla é representado pela fórmula (III): senso: 5' np -Na -(X X X) i-Nb -Y Y Y -Nb -(Z Z Z)j-Na- nq 3' antissenso: 3' np‘-Na‘-(X‘X‘X‘)k-Nb‘-Y‘Y‘Y‘-Nb‘-(Z‘Z‘Z‘)rNa- nq‘ 5' (III) onde: i, j, k e l são cada um independentemente 0 ou 1; p, p’, q e q‘ são cada um independentemente 0-6;
[0018] cada Na e Na‘ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 0-25 nucleotídeos que são ou modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos diferentemente modificados;
[0019] cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 0-10 nucleotídeos que são ou modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos;
[0020] cada np, np\ nq, e nq\ cada um deles pode ou não estar presente, representa independentemente um nucleotídeo de saliência ;
[0021] XXX, YYY, ZZZ, X‘X‘X‘, Y‘Y‘Y‘ e Z‘Z‘Z‘ representam cada um independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos;
[0022] modificações em Nb diferem da modificação em Y e modificação em Nb’ diferem da modificação em Y’; e
[0023] onde a fita senso é conjugada a pelo menos um ligante.
[0024] Em uma modalidade, i é 0; j é 0; i é 1; j é 1; ambos i e j são 0; ou ambos i e j são 1. Em uma outra modalidade, k é 0; l é 0; k é 1; l é 1; ambos k e l são 0; ou ambos k e l são 1.
[0025] Em uma modalidade, XXX é complementar a X’X’X’, YYY é complementar a Y‘Y‘Y‘, e ZZZ é complementar a Z’Z’Z’.
[0026] Em uma modalidade, o motivo YYY ocorre no ou próximo do sítio de clivagem da fita senso.
[0027] Em uma outra modalidade, o motivo Y’Y’Y’ ocorre nas posições 11, 12 e 13 da fita antissenso da extremidade 5’.
[0028] Em uma modalidade, Y’ é 2’-O-metila.
[0029] Em uma modalidade, a fórmula (III) é representada pela fórmula (IIIa):senso: 5' np -Na -Y Y Y -Na - nq 3' antissenso: 3‘ np‘-Na‘- Y’Y’Y’- Na’- nq‘ 5‘ (IIIa).
[0030] Em uma outra modalidade, a fórmula (III) é representada pela fórmula (IIIb): senso: 5' np -Na -Y Y Y -Nb -Z Z Z -Na - nq 3' antissenso: 3‘ np‘-Na‘- Y’Y’Y’-Nb’-Z’Z’Z’- Na’- nq’ 5‘ (IIIb)
[0031] onde cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 1-5 nucleotídeos modificados.
[0032] Em ainda uma outra modalidade, a fórmula (III) é representada pela fórmula (IIIc): senso: 5‘ np -Na -X X X -Nb -Y Y Y -Na - nq 3‘ antissenso: 3' np’-Na’- X’X’X’-Nb’- Y’Y’Y’- Na’- nq’ 5' (IIIc)
[0033] onde cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 1-5 nucleotídeos modificados.
[0034] Em uma modalidade adicional, a fórmula (III) é representada pela fórmula (IIId): senso: 5' np -Na -X X X- Nb -Y Y Y -Nb -Z Z Z -Na - nq 3' antissenso: 3' np‘-Na‘- X’X’X’- Nb‘-Y‘Y‘Y‘-Nb‘-Z‘Z‘Z‘- Na’- nq‘ 5‘ (IIId)
[0035] onde cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 1-5 nucleotídeos modificados e cada Na e Na’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 2-10 nucleotídeos modificados.
[0036] Em uma modalidade, a região de fita dupla é de 15-30 pares de nucleotídeo de comprimento. Em uma outra modalidade, a região de fita dupla é de 17-23 pares de nucleotídeo de comprimento. Em ainda uma outra modalidade, a região de fita dupla é de 17-25 pares de nucleotídeo de comprimento. Em uma modalidade adicional, a região de fita dupla é de 23-27 pares de nucleotídeo de comprimento. Em uma outra modalidade, a região de fita dupla é de 19-21 pares de nucleotídeo de comprimento. Em uma outra modalidade, a região de fita dupla é de 19-23 pares de nucleotídeo de comprimento. Em uma outra modalidade, a região de fita dupla é de 21-23 pares de nucleotídeo de comprimento. Em ainda uma outra modalidade, cada a fita tem 15-30 nucleotídeos. Em ainda uma outra modalidade, cada a fita tem 19-30 nucleotídeos.
[0037] Em uma modalidade, as modificações nos nucleotídeos são selecionadas do grupo consistindo em LNA, UNA, CRN, cEt, HNA, CeNA, 2'-metoxietila, 2'-O-alquila, 2'-O-alila, 2'-C-alila, 2'-flúor, 2'- desóxi, 2’-hidroxila e combinações dos mesmos. Em uma outra modalidade, as modificações nos nucleotídeos são modificações de 2’- O-metila ou 2’-flúor.
[0038] Em uma modalidade, o ligante é um ou mais derivados de GalNAc ligados através de um ligante ramificado bivalente ou trivalente. Em uma outra modalidade, o ligante é
Figure img0001
[0039] Em uma modalidade, o ligante é ligado à extremidade 3’ da fita senso.
[0040] Em uma outra modalidade, o agente de RNAi é conjugada ao ligante como mostrado no esquema que segue
Figure img0002
onde X é O ou S. Em uma modalidade específica, X é O.
[0041] Em uma modalidade, o agente compreende ainda pelo menos uma ligação internucleotídeo de fosforotioato ou metilfosfonato.
[0042] Em uma modalidade adicional, a ligação internucleotídeo de fosforotioato ou metilfosfonato está no terminal 3’ de um a fita. Em uma outra modalidade, a fita é a fita antissenso. Em uma outra modalidade, a fita é a fita senso.
[0043] Em uma modalidade, a ligação internucleotídeo de fosforotioato ou metilfosfonato está no terminal 5’ de um a fita. Em uma outra modalidade, a fita é a fita antissenso. Em uma modalidade adicional, a fita é a fita senso.
[0044] Em uma modalidade, a ligação internucleotídeo de fosforotioato ou metilfosfonato está em ambos os terminais 5’ e 3’ da fita. Em uma outra modalidade, a fita é a fita antissenso.
[0045] Em uma outra modalidade, o agente de RNAi de fita dupla compreende 6-8 ligações internucleotídeo de fosforotioato. Em uma modalidade adicional, a fita antissenso compreende duas ligações internucleotídeo de fosforotioato no terminal 5’ e duas ligações internucleotídeo de fosforotioato no terminal 3’, e o segunda fita compreende pelo menos duas ligações internucleotídeo de fosforotioato ou no terminal 5’ ou no terminal 3’ da fita senso.
[0046] Em uma modalidade, o par de base na posição 1 da extremidade 5’ da fita antissenso do dúplex é um par de base AU. Em uma outra modalidade, os nucleotídeos Y contêm uma modificação 2’- flúor. Em uma modalidade adicional, os nucleotídeos Y’ contêm uma modificação 2’-O-metila.
[0047] Em uma modalidade, p’>0. Em uma outra modalidade, p’=2. Em uma modalidade adicional, q’=0, p=0, q=0 e nucleotídeos de saliência p’ são complementares ao mRNA alvo. Em uma modalidade adicional, q’=0, p=0, q=0 e nucleotídeos de saliência p’ são não complementares ao mRNA alvo.
[0048] Em uma modalidade, a fita senso tem um total de 21 nucleotídeos e a fita antissenso tem um total de 23 nucleotídeos.
[0049] Em uma outra modalidade, o pelo menos um np’ é ligado a um nucleotídeo vizinho através de uma ligação fosforotioato. Em uma modalidade adicional, todos os np’ são ligados a nucleotídeos vizinhos através de ligações fosforotioato.
[0050] Em uma outra modalidade, o agente de RNAi é selecionado do grupo de agentes de RNAi listados em qualquer uma das Tabelas 3, 4, 7, 8, 11, 13 e 15.
[0051] Em um aspecto, a presente invenção provê agentes ácido ribonucleico de fita dupla (RNAi) para inibição da expressão de angiotensinogênio (AGT). Os agentes de RNAi de fita dupla incluem uma fita senso e uma fita antissenso formando uma região de fita dupla, onde a fita senso compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos diferindo em não mais do q eu 3 nucleotídeos da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1 e a fita antissenso compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos diferindo em não mais do que 3 nucleotídeos da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2, onde substancialmente todos dos nucleotídeos da fita senso compreendem uma modificação selecionada do grupo consistindo em uma modificação 2’-O-metila e uma modificação 2’-flúor, onde a fita senso compreende duas ligações internucleotídeo fosforotioato no terminal 5’, onde substancialmente todos dos nucleotídeos da fita antissenso compreendem uma modificação selecionada do grupo consistindo em uma modificação 2’-O-metila e uma modificação 2’-flúor, onde fita antissenso compreende duas ligações internucleotídeo fosforotioato no terminal 5’ e duas ligações internucleotídeo fosforotioato no terminal 3’, e onde a fita senso é conjugada a um ou mais derivados de GalNAc ligados através de um ligante bivalente ou trivalente ramificado no terminal 3’.
[0052] Em uma modalidade, todos os nucleotídeos da fita senso e todos dos nucleotídeos da fita antissenso compreendem uma modificação.
[0053] Em um outro aspecto, a presente invenção provê agentes de RNAi, por exemplo, agentes de ácido ribonucleico de fita dupla (RNAi) capazes de inibição da expressão de AGT (angiotensinogênio) em uma célula, onde o agente de RNAi de fita dupla compreende uma fita senso complementar a uma fita antissenso, e a fita antissensoonde a fita antissenso compreende uma região complementar à parte de um mRNA codificando AGT, onde cada a fita é de cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos de comprimento, onde o agente de RNAi de fita dupla é representado pela fórmula (III): senso: 5' np -Na -(X X X) i-Nb -Y Y Y -Nb -(Z Z Z)j-Na- nq 3' antissenso: 3' np‘-Na‘-(X‘X‘X‘)k-Nb‘-Y‘Y‘Y‘-Nb‘-(Z‘Z‘Z‘)rNa- nq‘ 5' (III) onde: i, j, k e l são cada um independentemente 0 ou 1; p, p’, q e q‘ são cada um independentemente 0-6; cada Na e Na‘ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 0-25 nucleotídeos que são ou modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos diferentemente modificados;
[0054] cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 0-10 nucleotídeos que são ou modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos;
[0055] cada np, np\ nq, e nq\ cada um deles pode ou não estar presente, representa independentemente um nucleotídeo de saliência ;
[0056] XXX, YYY, ZZZ, X‘X‘X‘, Y‘Y‘Y‘ e Z‘Z‘Z‘ representam cada um independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos; e onde as modificações são modificações 2’-O-metila ou 2’-flúor;
[0057] modificações em Nb diferem da modificação em Y e modificação em Nb’ diferem da modificação em Y’; e
[0058] onde a fita senso é conjugada a pelo menos um ligante.
[0059] Em ainda um outro aspecto, a presente invenção prove agentes de RNAi, por exemplo, agentes ácido ribonucleico de fita dupla (RNAi) capazes de inibição da expressão de angiotensinogênio (AGT) em uma célula, onde o agente de RNAi de fita dupla compreende uma fita senso complementar a uma fita antissenso, e a fita antissensoonde a fita antissenso compreende uma região complementar à parte de um mRNA codificando AGT, onde cada a fita é de cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos de comprimento, onde o agente de RNAi de fita dupla é representado pela fórmula (III):senso: 5' np -Na -(X X X) i-Nb -Y Y Y -Nb -(Z Z Z)j-Na- nq 3' antissenso: 3' np‘-Na‘-(X‘X‘X‘)k-Nb‘-Y‘Y‘Y‘-Nb‘-(Z‘Z‘Z‘)rNa- nq‘ 5' (III) onde:
[0060] i, j, k e l são cada um independentemente 0 ou 1;
[0061] cada np, np‘, nq, e nq‘, cada um deles pode ou não estar presente, representa independentemente um nucleotídeo de saliência ;
[0062] p, q e q’ são cada um independentemente 0-6 ;
[0063] np’ > 0 e pelo menos um np’ é ligado a um nucleotídeo vizinho através de uma ligação fosforotioato ;
[0064] cada Na e Na‘ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 0-25 nucleotídeos que são ou modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos diferentemente modificados;
[0065] cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 0-10 nucleotídeos que são ou modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos;
[0066] XXX, YYY, ZZZ, X‘X‘X‘, Y‘Y‘Y‘ e Z‘Z‘Z‘ representam cada um independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, e onde as modificações são modificações 2’-O-metila ou 2’-flúor;
[0067] modificações em Nb diferem da modificação em Y e modificação em Nb’ diferem da modificação em Y’; e
[0068] onde a fita senso é conjugada a pelo menos um ligante.
[0069] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê agentes de RNAi, por exemplo, ácido ribonucleico de fita dupla (agente de RNAi), capazes de inibição da expressão de angiotensinogênio (AGT) em uma célula, onde o agente de RNAi de fita dupla compreende uma fita senso complementar a uma fita antissenso, e a fita antissensoonde a fita antissenso compreende uma região complementar à parte de um mRNA codificando AGT, onde cada a fita é de cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos de comprimento, onde o agente de RNAi de fita dupla é representado pela fórmula (III): senso: 5' np -Na -(X X X) i-Nb -Y Y Y -Nb -(Z Z Z)j -Na - nq 3' antissenso: 3' np‘-Na‘-(X‘X‘X‘)k-Nb‘-Y‘Y‘Y‘-Nb‘-(Z‘Z‘Z‘)rNa- nq‘ 5' (III) onde:
[0070] i, j, k e l são cada um independentemente 0 ou 1;
[0071] cada np, nq e nq’, cada um deles pode ou não estar presente,representa independentemente um nucleotídeo de saliência;
[0072] p, q e q‘ são cada um independentemente 0-6;
[0073] np’>0 e pelo menos um np’ é ligado a um nucleotídeo vizinho através de uma ligação fosforotioato;
[0074] cada Na e Na’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 0-25 nucleotídeos que ou são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos diferentemente modificados;
[0075] cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 0-10 nucleotídeos que ou são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos;
[0076] XXX, YYY, ZZZ, X‘X‘X‘, Y‘Y‘Y‘ e Z‘Z‘Z‘ cada um representa independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, e onde as modificações são modificações de 2’-O-metila ou 2’-flúor;
[0077] modificações em Nb diferem da modificação em Y e modificações em Nb’ diferem da modificação em Y’; e
[0078] onde a fita senso é conjugada a pelo menos um ligante, onde o ligante é um ou mais derivados de GalNAc ligados através de um ligante ramificado bivalente ou trivalente.
[0079] Em um outro aspecto, a presente invenção provê agentes de RNAi, por exemplo, agentes ácido ribonucleico de fita dupla (RNAi) capazes de inibição da expressão de angiotensinogênio (AGT) em uma célula, onde o agente de RNAi de fita dupla compreende uma fita senso complementar a uma fita antissenso, e a fita antissensoonde a fita antissenso compreende uma região complementar à parte de um mRNA codificando AGT, onde cada a fita é de cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos de comprimento, onde o agente de RNAi de fita dupla é representado pela fórmula (III):senso: 5' np -Na -(X X X) i-Nb -Y Y Y -Nb -(Z Z Z)j -Na - nq 3' antissenso: 3' np‘-Na‘-(X‘X‘X‘)k-Nb‘-Y‘Y‘Y‘-Nb‘-(Z‘Z‘Z‘)rNa- nq‘ 5' (III) onde:
[0080] i, j, k e l são cada um independentemente 0 ou 1;
[0081] cada np, nq e nq‘, cada um deles pode ou não estar presente, representa independentemente um nucleotídeo de saliência ;
[0082] p, q e q’ são cada um independentemente 0-6 ;
[0083] np’ > 0 e pelo menos um np’ é ligado a um nucleotídeo vizinho através de uma ligação fosforotioato ;
[0084] cada Na e Na‘ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 0-25 nucleotídeos que são ou modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos diferentemente modificados;
[0085] cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 0-10 nucleotídeos que são ou modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos;
[0086] XXX, YYY, ZZZ, X’X’X’, Y’Y’Y’ e Z’Z’Z’ representam cada um independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, e onde as modificações são modificações de 2’-O-metila ou 2’-flúor;
[0087] modificações em Nb diferem da modificação em Y e modificação em Nb’ diferem da modificação em Y’;
[0088] onde a fita senso compreende pelo menos uma ligação fosforotioato; e
[0089] onde a fita senso é conjugada a pelo menos um ligante, onde o ligante é um ou mais derivados de GalNAc ligados através de um ligante ramificado bivalente ou trivalente.
[0090] Em ainda um outro aspecto, a presente invenção provê agentes de RNAi, por exemplo, agente ácido ribonucleico de fita dupla (RNAi), capazes de inibição da expressão de angiotensinogênio (AGT) em uma célula, onde o agente de RNAi de fita dupla compreende uma fita senso complementar a uma fita antissenso, e a fita antissensoonde a fita antissenso compreende uma região complementar à parte de um mRNA codificando AGT, onde cada a fita é de cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos de comprimento, onde o agente de RNAi de fita dupla é representado pela fórmula (III): senso: 5' np -Na -Y Y Y - Na- nq 3' antissenso: 3‘ np‘-Na‘- Y’Y’Y’- Na’- nq‘ 5' (Illa) onde:
[0091] cada np, nq e nq\ cada um dos quais pode estar ou não presente, representa independentemente um nucleotídeo de saliência;
[0092] p, q e q‘ são cada um independentemente 0-6;
[0093] np‘ >0 e pelo menos um np‘ é ligado a um nucleotídeo vizinho através de uma ligação fosforotioato ;
[0094] cada Na e Na’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 0-25 nucleotídeos que são ou modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos diferentemente modificados ;
[0095] YYY e Y’Y’Y’ representam cada um independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, e onde as modificações são modificações de 2’-O-metila ou 2’-flúor;
[0096] onde a fita senso compreende pelo menos uma ligação fosforotioato; e
[0097] onde a fita senso é conjugada a pelo menos um ligante, onde o ligante é um ou mais derivados de GalNAc ligados através de um ligante ramificado bivalente ou trivalente.
[0098] Em um outro aspecto, a presente invenção provê um agente de RNAi de fita dupla compreendendo os agentes de RNAi listados em qualquer uma das Tabelas 3, 4, 7, 8, 11, 13 e 15.
[0099] Em um outro aspecto, a presente invenção provê uma composição compreendendo um agente polinucleotídeo antissenso, onde o agente é capaz de inibição da expressão de angiotensinogênio (AGT) em uma célula e compreende uma sequência complementar a uma sequência senso selecionada do grupo de sequências listadas nas Tabelas 3, 4, 7, 8, 11, 13 e 15, onde o polinucleotídeo é de cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos de comprimento.
[00100] A presente invenção também provê células, vetores, células hospedeiro e composições farmacêuticas compreendendo os agentes de RNAi de fita dupla da invenção.
[00101] Em uma modalidade, uma célula contém o agente de RNAi de fita dupla.
[00102] Em algumas modalidades, o agente de RNAi de fita dupla ou a composição compreendendo o agente polinucleotídeo antissenso é administrado usando uma composição farmacêutica.
[00103] Em uma modalidade, as composições farmacêuticas da invenção compreende uma formulação de lipídeo tal como XTC ou MC3.
[00104] Em modalidades preferidas, o agente de RNAi de fita dupla é administrado em uma solução. Em algumas modalidades, o agente de RNAi de fita dupla é administrado em uma solução não tamponada. Em uma outra modalidade, a solução não tamponada é salina ou água. Em uma outra modalidade, o agente de RNAi de fita dupla é administrado com uma solução tampão. Em ainda uma outra modalidade, a solução tampão compreende acetato, citrato, prolamina, carbonato ou fosfato ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a solução tampão é solução salina tamponada com fosfato (PBS).
[00105] Em um outro aspecto, a presente invenção provê métodos de inibição de expressão de angiotensina (AGT) em uma célula. Os métodos incluem contato da célula com o agente de RNAi de fita dupla, uma composição farmacêutica, uma composição compreendendo um agente de polinucleotídeo antissenso modificado ou um vetor compreendendo o agente de RNAi e mantendo a célula produzida por um tempo suficiente para obter degradação do transcrito de mRNA de um gene AGT, desta maneira inibindo a expressão do gene AGT na célula.
[00106] Em uma modalidade, a célula está dentro de um indivíduo. Em uma modalidade adicional, o indivíduo é um ser humano. Em uma modalidade adicional, o indivíduo sofre de uma doença associada à angiotensina.
[00107] Em uma modalidade, a expressão de AGT é inibida em pelo menos cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 98% ou cerca de 100%.
[00108] Em uma modalidade, a fita senso compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos diferindo em não mais do que 3 nucleotídeos dos nucleotídeos 2801-2101; 803-843; 834-859; 803-859; 803-875; 834- 875; 847-875; 1247-1271; 1566-1624; 1570-1624; 1584-1624; 1584- 1624; 1584-1621; 2035-2144; 2070-2144; 2070-2103; 2201-2223; 2227- 2360; 2227-2304; 2290-2318; 2304-2350; 2304-2326; 2320-2342; 2333- 2360; 2333-2358; 485-503; 517-535; 560-578; 635-653; 803-821; 814- 832; 822-840; 825-843; 834-852; 837-855; 841-859; 855-873; 967-985; 1247-1265; 1248-1266; 1249-1267; 1251-1269; 1253-1271; 1566-1584; 1570-1588; 1572-1590; 1574-1592; 1584-1602; 1587-1605; 1591-1609; 1592-1610; 1595-1613; 1601-1619; 1602-1620; 1605-1623; 1729-1747; 1738-1756; 1739-1757; 1741-1769; 1767-1785; 1810-1828; 1827-1845; 1880-1989; 1892-1914; 1894-1914;1894-2012; 2035-2053; 2046-2064; 2057-2075; 2070-2088; 2072-2090; 2078-2096; 2078-2107; 2078-2011; 2080-2098; 2081-2099; 2081-2104; 2081-2011; 2082-2100; 2084-2102; 2084-2011; 2090-2108; 2100-2118; 2111-2129; 2124-2142; 2125-2143; 2167-2185; 2179-2197; 2201-2219; 2202-2220; 2203-2221; 2204-2222; 2227-2245; 2230-2248; 2234-2252; 2244-2264; 2255-2273; 2266-2284; 2268-2286; 2270-2288; 2279-2297; 2281-2299; 2283-2301; 2284-2302; 2285-2303; 2286-2304; 2288-2306; 2290-2308; 2291-2309; 2291-2311; 2291-2318; 2291-2315; 2292-2310; 2294-2312; 2296-2314; 2299-2317; 2304-2322; 2304-2329; 2306-2324; 2307-2325; 2309-2327; 2309-2329; 2309-2342; 2309-2350; 2309-2358; 2314-2332; 2316-2334; 2317-2335; 2320-2338; 2321-2339; 2323-2341; 2325-2343; 2326-2344; 2328-2346; 2329-2347; 2331-2349; 2333-2351; 2334-2352; 2335-2353; 2339-2357; 2340-2358; ou 2341-2359 da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:1.
[00109] Em um outro aspecto, a presente invenção provê métodos de tratamento de um indivíduo tendo um distúrbio associado a angiotensinogênio (AGT) compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente de RNAi de fita dupla, uma composição compreendendo um agente polinucleotídeo antissenso modificado, ou uma composição farmacêutica compreendendo o agente de RNAi de fita dupla, desta maneira tratando o indivíduo.
[00110] Em um outro aspecto, a presente invenção provê métodos de tratamento de um indivíduo tendo um distúrbio associado a angiotensinogênio (AGT) que inclui administrar subcutaneamente ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ácido ribonucleico de fita dupla (agente de RNAi), onde o agente de RNAi de fita dupla compreende uma fita senso e uma fita antissenso formando uma região de fita dupla, onde a fita senso compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos diferindo em não mais do que 3 nucleotídeos da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:1 e a fita antissenso compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos diferindo em não mais do que 3 nucleotídeos da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:2, onde substancialmente todos dos nucleotídeos da fita antissenso compreendem uma modificação selecionada do grupo consistindo em uma modificação de 2’-O-metila e uma modificação de 2’-flúor, e a fita antissensoonde a fita antissenso compreende duas ligações internucleotídeo fosforotioato no terminal 5’ e duas ligações internucleotídeo fosforotioato no terminal 3’, onde substancialmente todos dos nucleotídeos da fita senso compreendem uma modificação selecionada do grupo consistindo em uma modificação de 2’-O-metila e uma modificação de 2’-flúor, onde a fita senso compreende duas ligações internucleotídeo fosforotioato no terminal 5’ e onde a fita senso é conjugada a um ou mais derivados de GalNAc ligados através de um ligante bivalente ou trivalente ramificado no terminal 3’.
[00111] Em uma modalidade, todos dos nucleotídeos da fita senso e todos dos nucleotídeos da fita antissenso compreendem uma modificação.
[00112] Em um outro aspecto, a presente invenção provê métodos de tratamento de um indivíduo tendo um distúrbio associado a angiotensinogênio (AGT) que inclui administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ácido ribonucleico de fita dupla (agente de RNAi), onde o agente de RNAi de fita dupla compreende uma fita senso e uma fita antissenso formando uma região de fita dupla, onde a fita senso compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos diferindo em não mais do que 3 nucleotídeos dos nucleotídeos 2801-2101; 803-843; 834-859; 803-859; 803-875; 834875; 847-875; 1247-1271; 1566-1624; 1570-1624; 1584-1624; 15841624; 1584-1621; 2035-2144; 2070-2144; 2070-2103; 2201-2223; 2227- 2360; 2227-2304; 2290-2318; 2304-2350; 2304-2326; 2320-2342; 2333 2360; 2333-2358; 485-503; 517-535; 560-578; 635-653; 803-821; 814-832; 822-840; 825-843; 834-852; 837-855; 841-859; 855-873; 967-985 2309-2342; 2309-2350; 2309-2358; 2314-2332; 2316-2334; 2317-2335; 2320-2338; 2321-2339; 2323-2341; 2325-2343; 2326-2344; 2328-2346; 2329-2347; 2331-2349; 2333-2351; 2334-2352; 2335-2353; 2339-2357; 2340-2358; ou 2341-2359 da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:1 e a fita antissenso compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos diferindo em não mais do que 3 nucleotídeos dos nucleotídeos na posição correspondente da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:2 de maneira que a fita antissenso é substancialmente complementar aos pelo menos 15 nucleotídeos contíguos na fita senso. Em certas modalidades, substancialmente todos dos nucleotídeos da fita senso são nucleotídeos modificados. Em outras modalidades, substancialmente todos dos nucleotídeos da fita antissenso são nucleotídeos modificados. Em ainda outras modalidades, substancialmente todos dos nucleotídeos de ambas as fitas são nucleotídeos modificados. Em uma modalidade, todos dos nucleotídeos da fita senso e todos dos nucleotídeos da fita antissenso são nucleotídeos modificados. Em uma modalidade, a fita senso é conjugada a um ligante ligado ao terminal 3’.
[00113] Em um outro aspecto, a presente invenção provê métodos de tratamento de um indivíduo tendo um distúrbio associado a angiotensinogênio (AGT) que inclui administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ácido ribonucleico de fita dupla (agente de RNAi), onde o agente de RNAi de fita dupla compreende uma fita senso e uma fita antissenso formando uma região de fita dupla, onde a fita senso compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos dos nucleotídeos 803-843; 834-859; 803-859; 1247-1271; 1566-1624; 1570-1624; 1584-1624; 1584-1624; 1584-1621; 2035-2144; 2070-2144; 2070-2103; 2201-2223; 2227-2360; 2227-2304; 2290-2318; 2304-2350; 2304-2326; 2320-2342; 2333-2360; 2333-2358; 485-503; 517-535; 560-578; 635-653; 803-821; 814-832; 822-840; 825-843; 834-852; 837-855; 841-859; 855-873; 967-985; 1247-1265; 1248-1266; 1249-1267; 1251-1269; 1253-1271; 1566-1584; 1570-1588; 1572-1590; 1574-1592; 1584-1602; 1587-1605; 1591-1609; 1592-1610; 1595-1613; 1601-1619; 1602-1620; 1605-1623; 1729-1747; 1738-1756; 1739-1757; 1741-1769; 1767-1785; 1810-1828; 1827-1845; 1880-1989; 1894-2012; 2035-2053; 2046-2064; 2057-2075; 2070-2088; 2072-2090; 2078-2096; 2080-2098; 2081-2099; 2082-2100; 2084-2102; 2090-2108; 2100-2118; 2111-2129; 2124-2142; 2125-2143; 2167-2185; 2179-2197; 2201-2219; 2202-2220; 2203-2221; 2204-2222; 2227-2245; 2230-2248; 2234-2252; 2244-2264; 2255-2273; 2266-2284; 2268-2286; 2270-2288; 2279-2297; 2281-2299; 2283-2301; 2284-2302; 2285-2303; 2286-2304; 2288-2306; 2290-2308; 2291-2309; 2292-2310; 2294-2312; 2296-2314; 2299-2317; 2304-2322; 2306-2324; 2307-2325; 2309-2327; 2314-2332; 2316-2334; 2317-2335; 2320-2338; 2321-2339; 2323-2341; 2325-2343; 2326-2344; 2328-2346; 2329-2347; 2331-2349; 2333-2351; 2334-2352; 2335-2353; 2339-2357; 2340-2358; ou 2341-2359 da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1 e a fita antissenso compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos dos nucleotídeos na posição correspondente da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2, de maneira que a fita antissenso é substancialmente complementar aos pelo menos 15 nucleotídeos contíguos na fita senso. Em certas modalidades, substancialmente todos dos nucleotídeos da fita senso são nucleotídeos modificados. Em outras modalidades, substancialmente todos dos nucleotídeos da fita antissenso são nucleotídeos modificados. Em ainda outras modalidades, substancialmente todos dos nucleotídeos de ambas as fitas são nucleotídeos modificados. Em uma modalidade, a fita senso é conjugada a um ligante ligado ao terminal 3’.
[00114] Em uma modalidade, o indivíduo é um ser humano.
[00115] Em uma modalidade, a doença associada a angiotensinogênio é selecionada do grupo consistindo em hipertensão, hipertensão limítrofe, hipertensão primária, hipertensão secundária, emergência hipertensiva, urgência hipertensiva, hipertensão sistólica ou diastólica isolada, hipertensão associada à gravidez, hipertensão diabética, hipertensão resistente, hipertensão refratária, hipertensão paroxismal, hipertensão renovascular, hipertensão de Goldblatt, hipertensão ocular, glaucoma, hipertensão pulmonar, hipertensão portal, hipertensão venosa sistêmica, hipertensão sistólica, hipertensão lábil; doença cardíaca hipertensiva, nefropatia hipertensiva, aterosclerose, arteriosclerose, vasculopatia, nefropatia diabética, retinopatia diabética, falência cardíaca crônica, cardiomiopatia, miopatia cardíaca diabética, glomeruloesclerose, coarctação da aorta, aneurisma aórtico, fibrose ventricular, síndrome de Cushing e outros estados de excesso de glucocorticoide incluindo terapia esteroide crônica, feocromocitoma, reninoma, aldosteronismo secundário e outros estados de excesso mineralocorticoide, apneia do sono, doença da tireoide/paratireoide, falência cardíaca, infarto do miocárdio, angina, acidente vascular cerebral, diabetes mellitus, doença renal, falência renal, esclerose sistêmica, restrição de crescimento intrauterino (IUGR) e restrição de crescimento fetal.
[00116] Em uma outra modalidade, a doença associada a angiotensinogênio é selecionada do grupo consistindo em hipertensão, doença cardíaca hipertensiva, nefropatia hipertensiva, hipertensão associada à gravidez, aterosclerose, arteriosclerose, doença renal crônica, glomeruloesclerose, coarctação da aorta, aneurisma aórtico, fibrose ventricular, síndrome de Cushing e outros estados de excesso glucocorticoide incluindo terapia esteroide crônica, feocromocitoma, aldosteronismo primário e outro estados de excesso mineralocorticoide, apneia do sono, doença da tireoide/paratireoide, falência cardíaca, infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral, diabetes mellitus, falência renal e esclerose sistêmica.
[00117] Em uma modalidade, a doença associada a angiotensinogênio é hipertensão associada à gravidez (por exemplo, hipertensão induzida por gravidez, pré-eclâmpsia e eclâmpsia) e administração de um iRNA da invenção a um indivíduo resulta em uma diminuição em pressão sanguínea materna; uma diminuição em albuminuria materna; um aumento em peso da unidade uteroplacental; um aumento em peso fetal; normalização da razão de cérebro:fígado fetal; uma diminuição em expressão de mRNA de AGT no fígado materno e nenhum aumento significante em expressão de mRNA de hAGT na placenta; um aumento em tamanho da placenta geral; um aumento no tamanho da placenta vilosa; nenhuma mudança significante no tamanho do trofospôngio da placenta; uma redução na razão de expressão de mRNA de sFLT1:PLGF no rim materno; uma redução na razão de níveis de sFLT1:PLGF no soro; e/ou uma diminuição no nível de anticorpos agonísticos para AT1.
[00118] Em uma modalidade, o agente de RNAi de fita dupla é administrado em uma dose de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 10 mg/kg ou cerca de 0,5 mg/kg a cerca de 50 mg/kg. Em uma modalidade preferida, o agente de RNAi de fita dupla é administrado em uma dose de cerca de 10 mg/kg, cerca de 30 mg/kg ou cerca de 3,0 mg/kg. Em uma modalidade, o agente de RNAi de fita dupla é administrado em uma dose de cerca de 10 mg/kg. Em uma modalidade, o agente de RNAi de fita dupla é administrado em uma dose de cerca de 0,5 mg/kg duas vezes por semana. Em uma outra modalidade, o agente de RNAi de fita dupla é administrado em uma dose de cerca de 10 mg/kg semana sim semana não. Em uma outra modalidade, o agente de RNAi de fita dupla é administrado em uma dose de cerca de 0,5-1,0 mg/kg uma vez por semana. Em uma outra modalidade, o agente de RNAi é administrado mais ou menos uma vez por semana, uma vez por mês, uma vez a cada dois meses ou um trimestralmente (isto é, uma vez a cada três meses) em uma dose de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 5,0 mg/kg.
[00119] Em uma modalidade, o agente de RNAi de fita dupla é administrado subcutaneamente ou intravenosamente.
[00120] Em uma modalidade, o agente de RNAi é administrado em duas ou mais doses.
[00121] Em uma modalidade, o agente de RNAi é administrado em intervalos selecionados do grupo consistindo em uma vez a cada cerca de 12 horas, uma vez a cada cerca de 24 horas, uma vez a cada cerca de 48 horas, uma vez a cada cerca de 72 horas e uma vez a cada cerca de 96 horas.
[00122] Em uma modalidade, o agente de RNAi é administrado duas vezes por semana.
[00123] Em uma modalidade, ao gente RNAi é administrado semana sim semana não.
[00124] Em certas modalidades o agente de RNAi é administrado uma vez por mês.
[00125] Em certas modalidades, o agente de RNAi é administrado mês sim mês não.
[00126] Em certas modalidades, o agente de RNAi é administrado uma vez por trimestre (isto é, a cada três meses).
[00127] Em ainda uma outra modalidade, os métodos compreendem ainda administração ao indivíduo de um agente terapêutico adicional. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é selecionado do grupo consistindo em um diurético, um inibidor de enzima de conversão de angiotensina (ACE), um antagonista de receptor de angiotensina II, um beta-bloqueador, um vasodilatador, um bloqueador de canal de cálcio, um antagonista de aldosterona, um agonista de alfa2, um inibidor de renina, um alfa-bloqueador, um agente adrenérgico de ação periférica, um agonista parcial de receptor D1 seletivo, um antagonista alfa-adrenérgico não seletivo, um agente antimineralocorticoide esteroidal, sintético, ou uma combinação de qualquer um dos acima, e um agente terapêutico para hipertensão formulado como uma combinação de agentes.
Breve Descrição dos Desenhos
[00128] A Figura 1 é um esquema do sistema de renina- angiotensina-aldosterona (RAAS) incluindo uma indicação dos vários pontos no sistema que têm sido os alvos para intervenção terapêutica (de Zaman e outros (2002) Nat Rev Drug Disc 1:621).
[00129] A Figura 2A é um gráfico mostrando a redução em pressão sanguínea arterial média em ratos-fêmeas transgênicas grávidas seguindo administração de AD-60771.
[00130] A Figura 2B é um gráfico mostrando redução de albumina no soro em ratos-fêmeas transgênicas grávidas seguindo administração de AD-60771.
[00131] A Figura 3A é um gráfico mostrando peso unitário uteroplacentário aumentado seguindo administração materna de AD- 60771 demonstrando a melhora em resultado fetal seguindo administração materna de AD-60771.
[00132] A Figura 3B é um gráfico mostrando peso fetal aumentado seguindo administração materna de AD-60771 demonstrando a melhora em resultado fetal seguindo administração materna de AD-60771.
[00133] A Figura 3C é um gráfico mostrando uma razão de cérebro:fígado fetal normalizada seguindo administração materna de AD-60771 demonstrando a melhora de resultado fetal seguindo administração materna de AD-60771.
[00134] A Figura 4A é um gráfico mostrando redução de mRNA de hAGT no fígado materno seguindo administração de AD-60771 demonstrando q eu o iRNA não entra na barreira placentária.
[00135] A Figura 4B é um gráfico mostrando que não há nenhuma redução significante de mRNA de hAGT na placenta demonstrando que o iRNA não entra na barreira placentária.
[00136] A Figura 5 é um gráfico mostrando a exposição de tecido do fígado materno, placenta e fígado fetal a AD-60771.
[00137] A Figura 6A é uma seção placentária de uma fêmea de rato do tipo selvagem grávida imunoistoquimicamente tingida para citoqueratina.
[00138] A Figura 6B é uma seção placentária de uma fêmea de rato grávida PE grávida não tratada imunoistoquimicamente tingida para citoqueratina.
[00139] A Figura 6C é uma seção placentária de uma fêmea de rato PE grávida administrada com AD-60771 imunoistoquimicamente tingida para citoqueratina.
[00140] A Figura 6D é um gráfico mostrando o tamanho do triângulo mesometrial de uma fêmea de rato PE grávida administrada com AD- 60771 e uma fêmea de rato PE grávida não tratada.
[00141] A Figura 6E é um gráfico mostrando o tamanho do trofospôngio de uma fêmea de rato PE grávida administrada com AD- 60771 e uma fêmea de rato grávida não tratada.
[00142] A Figura 6F é um gráfico mostrando o tamanho da placenta de uma fêmea de rato PE grávida administrada com AD-60771 e uma fêmea de rato PE grávida não tratada.
[00143] A Figura 6G é um gráfico mostrando o tamanho do labirinto de fêmeas de rato PE grávidas administradas com AD-60771 e uma fêmea de rato PE grávida não tratada.
[00144] A Figura 7A é um gráfico mostrando uma redução na quantidade de mRNA do fator antiangiogênico sFLT1 no rim materno seguindo administração de AD-60771.
[00145] A Figura 7B é um gráfico mostrando uma redução na quantidade de mRNA do fator angiogênico PLGF no rim materno seguindo administração de AD-60771.
[00146] A Figura 7C é um gráfico mostrando uma redução na quantidade de mRNA do fator antiangiogênico sFLT1 na placenta seguindo administração materna de AD-60771.
[00147] A Figura 7D é um gráfico mostrando uma redução na quantidade de mRNA do fator angiogênico PLGF na placenta seguindo administração materna de AD-60771.
[00148] A Figura 8 é um gráfico mostrando a redução em níveis de AT1-AA em fêmeas de rato PE administradas com AD-60771 como avaliado pelo impacto de AT1-AA isolado de fêmeas de rato PE controle e fêmeas de rato PE grávidas sobre a taxa de batimento espontânea de cardiomiócitos de rato neonatal.
[00149] A Figura 9A é um gráfico mostrando a redução em níveis de Angiotensina II no soro (Ang 2-10) em fêmeas de rato PE grávidas administradas com AD-60771 comparado com fêmeas de rato PE não grávidas e comparado com fêmeas de ratos Sprague-Dawley controle grávidas.
[00150] A Figura 9B é um gráfico mostrando a redução em níveis de AGT humano no soro (hAGT) e AGT de rato (rAGT) em fêmeas de rato PE grávidas administradas com AD-60771 comparado com fêmeas de rato PE não grávidas comparado com fêmeas de ratos Sprague-Dawley controle grávidas.
Descrição Detalhada da Invenção
[00151] A presente invenção provê composições de iRNA que realizam a clivagem mediada por complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) de transcritos de RNA de um gene da angiotensina (AGT). O gene pode estar dentro de uma célula, por exemplo, uma célula dentro de um indivíduo, tal como um ser humano.
[00152] A presente invenção também provê métodos para tratamento de um indivíduo tendo um distúrbio que se beneficiaria da inibição ou redução da expressão de um gene de AGT, por exemplo, uma doença associada a angiotensinogênio, tal como hipertensão ou hipertensão associada à gravidez, usando composições de iRNA que realizam a clivagem mediada por complexo de silenciamento induzido por RNA de transcritos de RNA de um gene de AGT.
[00153] Os iRNAs da invenção incluem um a fita de RNA (a fita antissenso) tendo uma região que é cerca de 30 nucleotídeos ou menos de comprimento, por exemplo, 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 1525, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 1829, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 1930, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19 20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 2021, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 ou 21-22 nucleotídeos de comprimento, região que é substancialmente complementar a pelo menos parte de um transcrito de mRNA de um gene de AGT. Em certas modalidades, os iRNAs da invenção incluem um a fita de RNA (a fita antissenso) que pode incluir comprimentos mais longos, por exemplo, até 66 nucleotídeos, por exemplo, 36-66, 26-36, 25-36, 31-60, 22-43, 27-53 nucleotídeos de comprimento com uma região de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos que é substancialmente complementar a pelo menos parte de um transcrito de mRNA de um gene AGT. Estes iRNAs com os a fitas antissenso de comprimento maior incluem um segunda fita de RNA (a fita senso) de 20-60 nucleotídeos de comprimento onde os a fitas senso e antissenso formam um dúplex de 18-30 nucleotídeos contíguos. O uso desses iRNAs permite a degradação direcionada de mRNAs do gene correspondente (gene de AGT) em mamíferos. Dosagens muito baixas de iRNAs da invenção, em particular, podem ser especificamente e eficientemente mediar interferência de RNA (RNAi), resultando em inibição significante de expressão do gene correspondente (gene de AGT). Usando ensaios in vitro e in vivo, os presentes inventores demonstraram que iRNAs se direcionando a um gene da angiotensina podem mediar RNAi, resultando em inibição significante de expressão de AGT, bem como reduzindo os sintomas associados com uma doença associada com angiotensinogênio, tal como hipertensão associada com gravidez (por exemplo, hipertensão induzida por gravidez, pré- eclâmpsia e eclâmpsia). Desta maneira, os métodos e composições incluindo estes iRNAs são úteis para tratamento de um indivíduo tendo uma doença associada a angiotensinogênio, tal como hipertensão.
[00154] A descrição detalhada que segue revela como fazer e usar composições contendo iRNAs para inibir a expressão de um gene da angiotensina bem como composições, usos e métodos para tratamento de indivíduos tendo doenças e distúrbios que se beneficiariam da inibição e/ou redução da expressão de AGT.
I. Definições
[00155] A fim de que a presente invenção possa ser compreendida mais prontamente, certos termos são primeiro definidos. Ainda, deve ser notado que sempre que um valor ou faixa de valores de um parâmetro é mencionado, é pretendido que os valores e faixas intermediários aos valores mencionados sejam também parte da presente invenção.
[00156] Os artigos "um" e "uma" são usados aqui para se referir a um ou mais de um (isto é, a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, "um elemento" significa um elemento ou um ou mais de um elemento, por exemplo, uma pluralidade de elementos.
[00157] O termo "incluindo" é usado aqui para significar, e é usado intercomutavelmente com, a expressão "incluindo, mas não limitado a".
[00158] O termo "ou" é usado aqui para significar, e é usado intercomutavelmente com, o termo "e/ou", a menos que o contexto dite claramente o contrário.
[00159] O termo "cerca de" é usado aqui para significar dentro das faixas típicas de tolerâncias na técnica. Como aqui usado, "angiotensinogênio", usado intercomutavelmente com o termo "AGT", se refere aos gene e polipeptídeo bem conhecidos, também conhecidos na técnica como Inibidor de Serpina Peptidase, Clade A, Membro 8; Alfa-1 Antiproteinase; Antitripsina; SERPINA8; Angiotensina I; Serpina A8; Angiotensina II; Alfa-1 Angiotensinogênio antiproteinase; antitripsina; pre-angiotensinogen2; ANHU; Inibidor de Serina Proteinase; e Inibidor de Cisteína Proteinase.
[00160] O termo "AGT" inclui AGT humano, cujos aminoácido e sequência de codificação completa podem ser encontrados no, por exemplo, No. de Acesso GenBank. GI:188595658 (NM_000029.3; SEQ ID NO:1); Macaca fascicularis AGT, cujos aminoácido e sequência de codificação completa podem ser encontrados no, por exemplo, No. de Acesso GenBank GI: 90075391 (AB170313.1: SEQ ID NO:3); AGT de camundongo (Mus musculus), cujos aminoácido e sequência de codificação completa podem ser encontrados no, por exemplo, No. de Acesso GenBank GI: 113461997 (NM_007428.3; SEQ ID NO:5); e AGT de rato (Rattus norvegicus), cujos aminoácido e sequência de codificação completa podem ser encontrados no, por exemplo, No. de Acesso GenBank GI:51036672 (NM_134432; SEQ ID NO:7).
[00161] Exemplos adicionais de sequências de mRNA de AGT estão prontamente disponíveis usando bancos de dados publicamente disponíveis, por exemplo, GenBank, UniProt, OMIM e o web site do projeto do genoma Macaca.
[00162] O termo "AGT", como aqui usado, se refere também a variações de sequência de DNA de ocorrência natural do gene de AGT, tal como um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) no gene de AGT. SNPs exemplares podem ser encontrados no banco de dados dbSNP disponível em www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp- _ref.cgi?geneId=183. Exemplos não limitantes de variações de sequência dentro do gene de AGT incluem, por exemplo, aqueles descritos na Patente U.S. 5.589.584, cujos conteúdos em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência. Por exemplo, variações de sequência dentro do gene AGT podem incluir como um C^T na posição -532 (com relação ao sítio de início de transcrição); a G^A na posição -386; um G^A na posição -218; um C^T na posição -18; um G^A e um A^C na posição -6 e -10; um C^T na posição +10 (não traduzido); um C^T na posição +521 (T174M); um T^C na posição +597 (P199P); um T^C na posição +704 (M235T; vide também, por exemplo, Reference SNP (refSNP) Cluster Report: rs699, disponível em www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP); um A^G na posição +743 (Y248C); um C>T na posição +813 (N271N); um G>A na posição +1017 (L339L); um C^A na posição +1075 (L359M); e/ou um G^A na posição +1162 (V388M).
[00163] Como aqui usado, "sequência alvo" se refere a uma porção contígua da sequência de nucleotídeo de uma molécula de mRNA formada durante a transcrição de um gene de AGT, incluindo mRNA que é um produto de processamento de RNA de um produto de transcrição primária. Em uma modalidade, a porção alvo da sequência será pelo menos longa o suficiente para servir como um substrato para clivagem direcionada a iRNA em ou próximo desta porção da sequência de nucleotídeo de uma molécula de mRNA formada durante a transcrição de um gene de AGT.
[00164] A sequência alvo pode ser de a partir de cerca de 9-36 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, cerca de 15-30 nucleotídeos de comprimento. Por exemplo, a sequência alvo pode ser de a partir de cerca de 15-30 nucleotídeos, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30,18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20,19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21,19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 ou 21-22 nucleotídeos de comprimento. Os intermediários de faixas e comprimentos para as faixas e comprimentos mencionados acima são também compreendidos como sendo parte da invenção.
[00165] Como aqui usado, o termo "fita compreendendo uma sequência" se refere a um oligonucleotídeo compreendendo uma cadeia de nucleotídeos que é descrita pela sequência referida ao uso da nomenclatura de nucleotídeo padrão.
[00166] "G," "C," "A," "T" e "U" cada um geralmente significam umnucleotídeo que contém guanina, citosina, adenina, timidina e uracila como uma base, respectivamente. No entanto, será compreendido que o termo "ribonucleotídeo" ou "nucleotídeo" pode também se referir a um nucleotídeo modificado, como detalhado mais abaixo, ou uma porção de substituição suplente (vide, por exemplo, Tabela 2). O versado na técnica saberá que guanina, citosina, adenina e uracila podem ser substituídas por outras porções sem alterar substancialmente as propriedades de emparelhamento de base de um oligonucleotídeo compreendendo um nucleotídeo compreendendo tal porção de substituição. Por exemplo, sem limitação, um nucleotídeo compreendendo inosina como sua base pode ser emparelhado na base com nucleotídeos contendo adenina, citosina ou uracila. Desta maneira, nucleotídeos contendo uracila, guanina ou adenina podem ser substituídos nas sequências de nucleotídeo de dsRNA caracterizadas na invenção por um nucleotídeo contendo, por exemplo, inosina. Em um outro exemplo, adenina e citosina em qualquer ponto no oligonucleotídeo pode ser substituída com guanina e uracila, respectivamente para formar emparelhamento de base G-U Wobble com o mRNA alvo. Sequências contendo tais porções de substituição são adequadas para as composições e métodos caracterizados na invenção.
[00167] Os termos "iRNA", "agente de RNAi", "agente de iRNA", "agente de interferência de RNA", como aqui usado intercomutavelmente, podem se referir a um agente que contém RNA como o termo é aqui definido, e que faz a mediação da clivagem direcionada de um transcrito de RNA através de um curso de complexo de silenciamento de RNA (RISC). iRNA direciona a degradação específica de sequência de mRNA através de um processo conhecido como interferência de RNA (RNAi). O iRNA modula, por exemplo, inibe, a expressão de AGT em uma célula, por exemplo, uma célula dentro de um indivíduo, tal como um indivíduo mamífero.
[00168] Em uma modalidade, um agente de RNAi da invenção inclui um RNA de fita simples que interage com uma sequência de RNA alvo, por exemplo, uma sequência de mRNA alvo de AGT, para direcionar a clivagem do RNA alvo. Sem desejar ser limitado pela teoria acredita-se que RNA de fita dupla longo introduzido em células seja quebrado em siRNA por uma endonuclease Tipo III conhecida como Dicer (Sharp e outros (2001) Genes Dev. 15:485). Dicer, uma enzima tipo ribonuclease- III, processa o dsRNA em RNAs de interferência curtos de 19-23 pares de base com sobreposições de 3’ de duas bases características (Bernstein, e outros, (2001) Nature 409:363). Os siRNAs são então incorporados em um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) onde uma ou mais helicases desenrolam o dúplex de siRNA, permitindo que a fita antissenso complementar guie reconhecimento alvo (Nykanen, e outros, (2001) Cell 107:309). Quando da ligação ao mRNA alvo apropriado, uma ou mais endonucleases dentro do RISC clivam o alvo para induzir silenciamento (Elbashir, e outros, (2001) Genes Dev. 15:188). Desta maneira, em um aspecto a invenção refere- se a um RNA de fita simples (siRNA) gerado dentro de uma célula e que promove a formação de um complexo de RISC para realizar silenciamento do gene alvo, isto é, um gene de AGT. Desta maneira, o termo "siRNA" é também usado aqui para se referir a um RNAi como descrito acima.
[00169] Em certas modalidades, o agente de RNAi pode ser um siRNA de fita simples (ssRNAi) que é introduzido em uma célula ou organismo para inibir um mRNA alvo. Agentes de RNAi de fita simples se ligam à endonuclease de RISC, Argonauta 2, que então cliva o mRNA alvo. Os siRNAs de fita simples são geralmente de 15-30 nucleotídeos e são quimicamente modificados. O projeto e o teste de siRNAs de fita simples são descritos na Patente U.S. No. 8.101. 348 e Lima e outros (2012) Cell 150: 150:883-894, cujos conteúdos em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência. Qualquer uma das sequências de nucleotídeo antissenso descritas aqui pode ser usada como um siRNA de fita simples como aqui descrito ou como quimicamente modificado pelos métodos descritos em Lima e outros (2012) Cell 150:883-894.
[00170] Em uma outra modalidade, um "iRNA" para uso nas composições, usos e métodos da invenção é um RNA de fita dupla e é referido aqui como um "agente de RNAi de fita dupla", "molécula de RNA de fita dupla (dsRNA)", "agente de dsRNA" ou "dsRNA". O termo "dsRNA" se refere a um complexo de moléculas de ácido ribonucleico tendo uma estrutura dúplex compreendendo dois a fitas de ácido nucleico antiparalelos e substancialmente complementares, referidos como tendo orientações de "senso" e "antissenso" com relação a um RNA alvo, isto é, um gene de AGT. Em algumas modalidades da invenção, um RNA de fita dupla (dsRNA) dispara a degradação de um RNA alvo, por exemplo, um mRNA, através de um mecanismo de silenciamento de gene pós-transcripcional referido aqui como interferência de RNA ou RNAi.
[00171] Em geral, a maioria dos nucleotídeos de cada a fita de uma molécula de dsRNA são ribonucleotídeos, mas como descrito em detalhes aqui, cada um de ambas as fitas pode incluir também um ou mais não ribonucleotídeos, por exemplo, um desoxirribonucleotídeo e/ou um nucleotídeo modificado. Ainda, como usado no presente relatório, um "agente de RNAi" pode incluir ribonucleotídeos com modificações químicas; um agente de RNAi pode incluir modificações substanciais em nucleotídeos múltiplos. Como aqui usado, o termo "nucleotídeo modificado" se refere a um nucleotídeo tendo, independentemente, uma porção açúcar modificada, uma ligação internucleotídeo modificada e/ou uma nucleobase modificada. Desta maneira, o termo nucleotídeo modificado compreende substituições, adições ou remoção de, por exemplo, um grupo ou átomo funcional, a ligações internucleosídeo, porções de açúcar ou nucleobase. As modificações adequadas para uso nos agentes da invenção incluem todos os tipos de modificações revelados aqui ou conhecidos na técnica. Quaisquer tais modificações, como usado em uma molécula do tipo siRNA, são compreendidos por "agente de RNAi" para os propósitos do presente relatório descritivo e reivindicações.
[00172] A maioria dos nucleotídeos de cada a fita de uma molécula de dsRNA pode ser de ribonucleotídeos, mas como descrito em detalhes aqui, cada um ou ambas as fitas podem também incluir um ou mais não ribonucleotídeos, por exemplo, um desoxirribonucleotídeo e/ou um nucleotídeo modificado. Ainda, como usado no presente pedido, um "agente de RNAi" pode incluir ribonucleotídeos com modificações químicas; um agente de RNAi pode incluir modificações substanciais em nucleotídeos múltiplos. Como aqui usado, o termo "nucleotídeo modificado" se refere a um nucleotídeo tendo, independentemente, uma porção de açúcar modificada, uma ligação internucleotídeo modificada e/ou nucleobase modificada. Desta maneira, o termo nucleotídeo modificado compreende substituições, adições ou remoção de, por exemplo, um grupo ou átomo funcional, para ligações internucleosídeo, porções de açúcar ou nucleobases. As modificações adequadas para uso nos agentes da invenção incluem todos os tipos de modificações revelados aqui ou conhecidos na técnica. Qualquer uma de tais modificações, como usado em uma molécula do tipo siRNA, é compreendida pelo "agente de RNAi" para os propósitos do presente pedido e reivindicações.
[00173] A região de dúplex pode ser de qualquer comprimento que permita degradação específica de um RNA alvo desejado através de um curso de RISC, e pode variar de a partir de cerca de 9 a 36 pares de base de comprimento, por exemplo, cerca de 15-30 pares de base de comprimento, por exemplo, cerca de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 pares de base de comprimento, tal como cerca de 15-30, 15-29, 1528, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 1518, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 1822, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 1923, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 2024,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 2124, 21-23 ou 21-22 pares de base de comprimento. Intermediários de faixas e comprimentos para as faixas e comprimentos mencionados acima são também compreendidos como sendo parte da invenção.
[00174] Os dois a fitas formando a estrutura de dúplex podem ser porções diferentes de uma molécula de RNA maior, ou eles podem ser moléculas de RNA separadas. Onde os dois a fitas são parte de uma molécula maior, e então são conectados por uma cadeia ininterrupta de nucleotídeos entre a extremidade 3’ de um a fita e a extremidade 5’ do respectivo outra fita formando a estrutura de dúplex, a cadeia de RNA de conexão é referida como uma "alça grampo-de-cabelo". Uma alça grampo-de-cabelo compreende pelo menos um nucleotídeo não emparelhado. Em algumas modalidades, a alça grampo-de-cabelo pode compreender pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 23 ou mais nucleotídeos não emparelhados.
[00175] Onde os dois a fitas substancialmente complementares de um dsRNA são compreendidos por moléculas de RNA separadas, estas moléculas não precisam, mas podem ser, covalentemente conectadas. Onde os dois a fitas estão conectados covalentemente por meio que não uma cadeia ininterrupta de nucleotídeos entre a extremidade 3’ de um a fita e a extremidade 5’ do respectivo outra fita formando a estrutura de dúplex, a estrutura de conexão é referida como um "ligante". Os a fitas de RNA podem ter o mesmo número de nucleotídeos ou diferente. O número máximo de pares de base é o número de nucleotídeos na fita mais curto do dsRNA menos quaisquer sobreposições que estejam presentes no dúplex. Em adição à estrutura de dúplex, um RNAi pode compreender uma ou mais sobreposições de nucleotídeo.
[00176] Em certas modalidades, um agente de RNAi da invenção é um dsRNA, cuja fita compreende cada 19-23 nucleotídeos, que interage com uma sequência de RNA alvo, por exemplo, um gene de AGT, sem desejar ser limitado pela teoria, RNA de fita dupla longo introduzido em células é quebrado em siRNA por uma endonuclease Tipo III conhecida como Dicer (Sharp e outros (2001) Genes Dev. 15:485). Dicer, uma enzima tipo ribonuclease-III, processa o dsRNA em RNAs de interferência curtos de 19-23 pares de base com sobreposições de 3’ de duas bases características (Bernstein e outros, (2001) Nature 409:363). Os siRNAs são então incorporados a um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) onde uma ou mais helicase desenrolam o dúplex de siRNA, permitindo que a fita antissenso complementar guie o reconhecimento de alvo (Nykanen, e outros, (2001) Cell 107:309). Quando da ligação ao mRNA alvo apropriado, uma ou mais endonucleases dentro do RISC clivam o alvo para induzir silenciamento (Elbashir, e outros, (2001) Genes Dev. 15:188).
[00177] Em uma modalidade, um agente de RNAi da invenção é um dsRNA de 24-30 nucleotídeos que interage com uma sequência de RNA alvo, por exemplo, uma sequência de mRNA alvo de AGT, para direcionar a clivagem do RNA alvo. Sem desejar ser limitado pela teoria, RNA de fita dupla longo introduzido em células é quebrado em siRNA por uma endonuclease do Tipo III conhecida como Dicer (Sharp e outros (2001) Genes Dev. 15:485). Dicer, uma enzima do tipo ribonuclease III, processa o dsRNA em RNAs de interferência curtos de 19-23 pares de base com sobreposições de 3’ de duas bases características (Bernstein, e outros, (2001) Nature 409:363). Os siRNAs são então incorporados a um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) onde uma ou mais helicases desenrolam o dúplex de siRNA, permitindo que a fita antissenso complementar guie reconhecimento alvo (Nykanen, e outros, (2001) Cell 107:309). Quando da ligação ao mRNA alvo apropriado, uma ou mais endonucleases dentro do RISC clivam o alvo para induzir silenciamento (Elbashir e outros, (2001) Genes Dev. 15:188).
[00178] Como aqui usado, o termo "saliência de nucleotídeo" (nucleotide overhang) se refere a pelo menos um nucleotídeo não pareado que sobressai da estrutura de dúplex de um iRNA, por exemplo, um dsRNA. Por exemplo, quando uma extremidade 3’ de uma a fita de um dsRNA se estende além da extremidade 5’ da outra fita, ou vice-versa, há uma saliência de nucleotídeo. Um dsRNA pode compreender uma saliência de pelo menos um nucleotídeo; alternativamente a saliência pode compreender pelo menos dois nucleotídeos, pelo menos três nucleotídeos, pelo menos quatro nucleotídeos, pelo menos cinco nucleotídeos ou mais. Uma saliência de nucleotídeo pode compreender ou consistir em um análogo de nucleotídeo/nucleosídeo, incluindo um desoxinucleotídeo/nucleosídeo. A(s) saliência(ões) pode(m) estar na fita senso, na fita antissenso ou qualquer combinação dos mesmos. Ainda, o(s) nucleotídeo(s) de uma saliência podem estar presentes na extremidade 5’, extremidade 3’ ou ambas as extremidades ou de uma fita antissenso ou senso de um dsRNA.
[00179] Em uma modalidade, a fita antissenso de um dsRNA tem uma saliência de 1-10 nucleotídeos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos, na extremidade 3’ e/ou na extremidade 5’. Em uma modalidade, a fita senso de um dsRNA tem uma saliência de 1-10 nucleotídeos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos, na extremidade 3’ e/ou na extremidade 5’. Em certas modalidades, a saliência na fita senso e na fita antissenso, ou ambos, pode incluir comprimentos estendidos maiores do que 10 nucleotídeos, por exemplo, 1-30 nucleotídeos, 2-30 nucleotídeos, 10-30 nucleotídeos ou 10-15 nucleotídeos de comprimento. Em certas modalidades, uma saliência estendida está na fita senso do dúplex. Em certas modalidades, uma saliência estendida está presente na extremidade 3’ da fita senso do dúplex. Em certas modalidades, uma saliência estendida está presente na extremidade 5’ da fita senso do dúplex. Em certas modalidades, uma saliência estendida está na fita antissenso do dúplex. Em certas modalidades, uma saliência estendida está presente na extremidade 3’ da fita antissenso do dúplex. Em certas modalidades, uma saliência estendida está presente na extremidade 5’ da fita antissenso do dúplex. Em certas modalidades, um ou mais dos nucleotídeos na saliência são substituídos com um trifosfato de nucleosídeo.
[00180] "Cego" ou "extremidade cega" significa que não há quaisquer nucleotídeos não emparelhados na extremidade do agente de RNAi de fita dupla, isto é, nenhuma saliência de nucleotídeo. Um agente de RNAi de "extremidade cega" é um dsRNA que é de fita dupla em todo o seu comprimento, isto é, nenhuma saliência de nucleotídeo em nenhuma extremidade da molécula. Os agentes de RNAi da invenção incluem agentes de RNAi com sobreposições de nucleotídeo em uma extremidade (isto é, agentes com uma saliência e uma extremidade cega) ou com sobreposições de nucleotídeo em ambas as extremidades.
[00181] O termo "a fita antissenso" ou "a fita de orientação" se refere aa fita de um iRNA, por exemplo, um dsRNA, que inclui uma região que é substancialmente complementar a uma sequência alvo, por exemplo, um mRNA de AGT. Como aqui usado, o termo "região de complementaridade" se refere à região da fita antissenso que é substancialmente complementar a uma sequência, por exemplo, uma sequência alvo, por exemplo, uma sequência de nucleotídeo de AGT, como aqui definido. Onde a região de complementaridade não é totalmente complementar à sequência alvo, as incompatibilidades podem estar nas regiões interna ou terminais da molécula. Em geral, as incompatibilidades mais toleradas estão nas regiões terminais, por exemplo, dentro de 5, 4, 3 ou 2 nucleotídeos do terminal 5’ e/ou 3’ do iRNA.
[00182] O termo "a fita senso" ou "a fita passageiro" como aqui usado se refere aa fita de um iRNA que inclui uma região que é substancialmente complementar a uma região da fita antissenso como o termo que é definido aqui.
[00183] Como aqui usado, o termo "região de clivagem" se refere a uma região que está localizada imediatamente adjacente ao sítio de clivagem. O sítio de clivagem é o sítio no alvo no qual a clivagem ocorre. Em algumas modalidades, a região de clivagem compreende três bases em qualquer extremidade do, e imediatamente adjacente ao, sítio de clivagem. Em algumas modalidades, a região de clivagem compreende duas bases em qualquer extremidade do, e imediatamente adjacente ao, sítio de clivagem. Em algumas modalidades, o sítio de clivagem ocorre especificamente no sítio ligado por nucleotídeos 10 e 11 da fita antissenso e a região de clivagem compreende nucleotídeos 11, 12 e 13.
[00184] Como aqui usado, e a menos que de outro modo indicado, o termo "complementaridade", quando usado para descrever uma primeira sequência de nucleotídeo com relação a uma segunda sequência de nucleotídeo, se refere à habilidade de um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo compreendendo a primeira sequência de nucelotídeo em hibridizar e formar uma estrutura de dúplex sob certas condições com um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo compreendendo a segunda sequência de nucleotídeo, como será compreendido pelo versado na técnica. Tais condições podem, por exemplo, ser condições adstringentes, onde condições adstringentes podem incluir: NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6,4, EDTA 1 mM, 50° C ou 70° C por 12-16 horas seguido por lavagem (vide, por exemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook e outros (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Outras condições, tais como as condições fisiologicamente relevantes como pode ser encontrado dentro de um organismo, podem ser aplicar. O versado na técnica será capaz de determinar o conjunto de condições mais apropriadas para um teste de complementaridade de duas sequências de acordo com a última aplicação dos nucleotídeos hibridizados.
[00185] Sequências complementares dentro de um iRNA, por exemplo, dentro de um dsRNA como descrito aqui, incluem emparelhamento de base do oligonucleotídeo ou polinucleotídeo compreendendo uma primeira sequência de nucleotídeo com um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo compreendendo uma segunda sequência de nucleotídeo em todo o comprimento de uma ou ambas as sequências de nucleotídeo. Tais sequências podem ser referidas como "totalmente complementares" com relação umas às outras aqui. No entanto, onde uma primeira sequência é referida como "substancialmente complementar" com relação a uma segunda sequência aqui, as duas sequências podem ser totalmente complementares, ou elas podem formar uma ou mais, mas geralmente não mais do que 5, 4, 3 ou 2 pares de base incompatíveis quando da hibridização para um dúplex de até 30 pares de base, enquanto retendo a habilidade em hibridizar sob as condições mais relevantes para sua última aplicação, por exemplo, inibição de expressão de gene através de um curso de RISC. No entanto, onde dois oligonucleotídeos forem projetados para formar, quando da hibridização, uma ou mais sobreposições de fita simples, tais sobreposições não devem ser consideradas como incompatibilidades com relação à determinação de complementaridade. Por exemplo, um dsRNA compreendendo um oligonucleotídeo de 21 nucleotídeos de comprimento e um outro oligonucleotídeo de 23 nucleotídeos de comprimento, onde o oligonucleotídeo mais longo compreende uma sequência de 21 nucleotídeos que é totalmente complementar ao oligonucleotídeo mais curto, pode ser ainda referido como "totalmente complementar" para os propósitos descritos aqui.
[00186] Sequências "complementares", como aqui usado, podem também incluir, ou ser formadas totalmente de, pares de base não- Watson-Crick e/ou pares de base formados de nucleotídeos não naturais e modificados, contanto que as necessidades acima com relação à sua habilidade em hibridizar sejam satisfeitas. Tais pares de base não-Waston-Crick incluem, mas não estão limitados a, emparelhamento de base G:U Wobble ou Hoogstein.
[00187] Os termos "complementar", "totalmente complementar" e "substancialmente complementar" aqui podem ser usados com relação à compatibilidade de base entre a fita senso e a fita antissenso de um dsRNA, ou entre a fita antissenso de um agente iRNA e uma sequência alvo, como será compreendido a partir do contexto de seu uso.
[00188] Como aqui usado, um polinucleotídeo que é "substancialmente complementar a pelo menos parte de" um RNA mensageiro (mRNA) se refere a um polinucleotídeo que é substancialmente complementar a uma porção contígua do mRNA de interesse (por exemplo, um mRNA codificando AGT). Por exemplo, um polinucleotídeo é complementar a pelo menos uma parte de um mRNA de AGT se a sequência for substancialmente complementar a uma porção não interrompida de um mRNA codificando AGT.
[00189] Desta maneira, em algumas modalidades, os polinucleotídeos de fita antissenso revelados aqui são totalmente complementares à sequência de AGT alvo. Em outras modalidades, os polinucleotídeos de fita antissenso revelados aqui são substancialmente complementares à sequência de AGT alvo e compreendem uma sequência de nucleotídeo contígua que é pelo menos mais ou menos 80% complementar em todo o seu comprimento à região equivalente da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:1, ou um fragmento de SEQ ID NO:1, tal como cerca de 85%, cerca de 90% ou cerca de 95% complementar.
[00190] Em uma modalidade, um agente de RNAi da invenção inclui uma fita senso que é substancialmente complementar a um polinucleotídeo antissenso que, por sua vez, é complementar a uma sequência de AGT alvo, e onde o polinucleotídeo de fita senso compreende uma sequência de nucleotídeo contígua que é pelo menos cerca de 80% complementar em todo o seu comprimento à região equivalente da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:2, ou um fragmento de qualquer uma de SEQ ID NO:2, tal como cerca de 85%, cerca de 90% ou cerca de 95% de complementaridade.
[00191] Em geral, a maioria dos nucleotídeos de cada a fita são ribonucleotídeos, mas como descrito em detalhes aqui, cada um ou ambas as fitas podem também incluir um ou mais não ribonucleotídeos, por exemplo, um desoxirribonucleotídeo e/ou um nucleotídeo modificado. Ainda, um "iRNA" pode incluir ribonucleotídeos com modificações clínicas. Tais modificações podem incluir todos os tipos de modificações revelados aqui ou conhecidos na técnica. Quaisquer tais modificações, como usado em uma molécula de iRNA, são compreendidas por "iRNA" para os propósitos do presente pedido e reivindicações.
[00192] Em um aspecto da invenção, um agente para uso nos métodos e composições da invenção é uma molécula de RNA antissenso de fita simples que inibe um mRNA alvo através de um mecanismo de inibição antissenso. A molécula de RNA antissenso de fita simples é complementar a uma sequência dentro do mRNA alvo. Os oligonucleotídeos antissenso de fita simples podem inibir tradução de uma maneira estequiométrica através de emparelhamento de base com o mRNA e obstruindo fisicamente o maquinário de tradução, vide Dias, N. e outros, (2002) Mol Cancer Ter 1:347-355. A molécula de RNA antissenso de fita simples pode ser de cerca de 15 a cerca de 30 nucleotídeos de comprimento e tem uma sequência que é complementar a uma sequência alvo. Por exemplo, a molécula de RNA antissenso de fita simples pode compreender uma sequência que é pelo menos cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais nucleotídeos contíguos de qualquer uma das sequências antissenso descritas aqui.
[00193] O termo "inibir", como aqui usado, é usado intercomutavelmente com "reduzir", "silenciar", "sub-regular", suprimir" e outros termos similares, e inclui qualquer nível de inibição.
[00194] A expressão "inibição da expressão de um AGT", como aqui usado, inclui inibição de expressão de qualquer gene de AGT (tal como, por exemplo, um gente de AGT de camundongo, um gene de AGT de rato, um gene de AGT de macaco ou um gene de AGT humano) bem como variantes ou mutantes de um gene de AGT que codifica uma proteína de AGT.
[00195] "Inibição de expressão de um gene de AGT" inclui qualquer nível de inibição de um gene de AGT, por exemplo, pelo menos supressão parcial da expressão de um gene de AGT, tal como uma inibição em pelo menos cerca de 20%. Em certas modalidades, inibição é de pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99%.
[00196] A expressão de um gene de AGT pode ser avaliada com base no nível de qualquer variável associada com expressão de gene de AGT, por exemplo, nível de mRNA de AGT ou nível de proteína de AGT. Inibição pode ser avaliada através de uma diminuição em um nível absoluto ou relativo de uma ou mais dessas variáveis comparado com um nível controle. O nível controle pode ser qualquer tipo de nível controle que é utilizado na técnica, por exemplo, um nível de linha de base de pré-dose, ou um nível determinado a partir de um indivíduo, célula ou amostra similar que é não tratado ou tratado com um controle (tal como, por exemplo, tampão apenas controle ou controle de agente inativo).
[00197] Em uma modalidade, supressão pelo menos parcial da expressão de um gene de AGT é avaliada através de uma redução na quantidade de mRNA de AGT que pode ser isolado de ou detectado em uma primeira célula ou grupo de células onde um gente de AGT é transcrito e que foi ou foram tratados de maneira que a expressão de um gene AGT é inibida, comparado com uma segunda célula ou grupo de células substancialmente idêntico à primeira célula ou grupo de células, mas que não foi ou foram então tratados (células controle). O grau de inibição pode ser expresso em termos de
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[00198] A expressão "contatando uma célula com um agente de RNAi", tal como um dsRNA, como aqui usado, inclui contato de uma célula através de qualquer meio possível. Contato de uma célula com um agente de RNAi inclui contato de uma célula in vitro com o iRNA ou contato de uma célula in vivo com o iRNA. O contato pode ser feito diretamente ou indiretamente. Desta maneira, por exemplo, o agente de RNAi pode ser posto em contato físico com a célula através da realização individual do método, ou alternativamente, o agente de RNAi pode ser posto em uma situação que permitirá ou fará com que ele entre em contato subsequentemente com a célula.
[00199] Contato de uma célula in vitro pode ser feito, por exemplo, através da incubação da célula com o agente de RNAi. Contato de uma célula in vivo pode ser feito, por exemplo, através de injeção do agente de RNAi em ou próximo do tecido onde a célula está localizada, ou através de injeção do agente de RNAi em uma outra área, por exemplo, a corrente sanguínea ou o espaço subcutâneo, de maneira que o agente atingirá subsequentemente o tecido onde a célula a ser contatada está localizada. Por exemplo, o agente de RNAi pode conter e/ou ser acoplado a um ligante, por exemplo, GalNAc3, que direciona o agente de RNAi para um sítio de interesse, por exemplo, o fígado. Combinações de contato de métodos in vitro e in vivo também são possíveis. Por exemplo, uma célula pode ser também contatada in vitro com um agente de RNAi e subsequentemente transplantada em um indivíduo.
[00200] Em uma modalidade, contato de uma célula com um iRNA inclui "introdução" ou "administração do iRNA na célula" através de facilitação ou realização de absorção na célula. Absorção de um iRNA pode ocorrer através de processos de difusão ou celulares ativos sem auxílio, ou através de agentes ou dispositivos auxiliares. Introdução de um iRNA em uma célula pode ser in vitro e/ou in vivo. Por exemplo, para introdução in vivo, iRNA pode ser injetado em um sítio de tecido ou administrado sistemicamente. Administração in vivo pode também ser feita através de um sistema de administração beta-glucano, tais como aqueles descritos nas Patentes U.S. Nos. 5.032.401 e 5.607.677 e Publicação U.S. No. 2005/0281781, cujos conteúdos em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência. Introdução in vitro em uma célula inclui métodos conhecidos na técnica tais como eletroporação e lipofecção. Abordagens adicionais são descritas abaixo e/ou são conhecidas na técnica.
[00201] O termo "nanopartícula de lipídeo" ou "LNP" é uma vesícula compreendendo uma camada de lipídeo encapsulando uma molécula farmaceuticamente ativa, tal como uma molécula de ácido nucleico, por exemplo, um iRNA ou um plasmídeo do qual um iRNA é transcrito. LNPs são descritos nas, por exemplo, Patentes US. Nos. 6.858.225, 6.815.432, 8.158.601 e 8.058.069, cujos conteúdos em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência.
[00202] Como aqui usado, um "indivíduo" é um animal, tal como um mamífero, incluindo um primata (tal como um ser humano, um primata não humano, por exemplo, um macaco, e um chimpanzé), um não primata (tal como uma vaca, um porco, um camelo, uma lhama, um cavalo, uma cabra, um coelho, uma ovelha, um hamster, um porquinho- da-índia, um gato, um cachorro, um rato, um camundongo, um cavalo e uma baleia), ou uma ave (por exemplo, um pato ou um ganso). Em uma modalidade, o indivíduo é um ser humano, tal como um ser humano sendo tratado ou avaliado quanto a uma doença, distúrbio ou condição que se beneficiaria da redução em expressão de AGT; um ser humano sob risco de uma doença, distúrbio ou condição que se beneficiaria da redução em expressão de AGT; um ser humano tendo uma doença, distúrbio ou condição que se beneficiaria de redução em expressão de AGT; e/ou ser um ser humano tratado para uma doença, distúrbio ou condição que se beneficiaria de redução em expressão de AGT como descrito aqui.
[00203] Como aqui usado, os termos "tratar" e "tratamento" se referem a um resultado benéfico ou desejado incluindo, mas não limitado a, alívio ou melhora de um ou mais sintomas associados com expressão de AGT indesejada, por exemplo, ativação de receptor de angiotensina II tipo 1 (AT1R) (por exemplo, hipertensão, doença renal crônica, acidente vascular cerebral, infarto do miocárdio, falência cardíaca, aneurismas, doença da artéria periférica, doença cardíaca, estresse oxidativo aumentado, por exemplo, formação de superóxido aumentada, inflamação, vasoconstrição, retenção de sódio e água, perda de potássio e magnésio, supressão de renina, hipertrofia de miócito e músculo liso, síntese de colágeno aumentada, estimulação de fibrose vascular, miocardial e renal, taxa e força aumentadas de contrações cardíacas, taxa cardíaca alterada, por exemplo, arritmia aumentada, estimulação de inibição de ativador de plasminogênio 1 (PAI1), ativação do sistema nervoso simpático e secreção de endotelina aumentada), sintomas de hipertensão associada à gravidez (por exemplo, pré-eclâmpsia e eclampsia), incluindo, mas não limitado a, restrição de crescimento intrauterino (IUGR) ou restrição de crescimento fetal, sintomas associados com hipertensão maligna, sintomas associados com hiperaldosteronismo; diminuição do grau de ativação de AT1R indesejada; estabilização (isto é, não piora) do estado de ativação de AT1R crônica; melhora ou paliativo de ativação de AT1R indesejada (por exemplo, hipertensão, doença renal crônica, acidente vascular cerebral, infarto do miocárdio, falência cardíaca, aneurismas, doença da artéria periférica, doença cardíaca, estresse oxidativo aumentado, por exemplo, formação de superóxido aumentada, inflamação, vasoconstrição, retenção de sódio e água, perda de potássio e magnésio, supressão de renina, hipertrofia de miócito e músculo liso, síntese de colágeno aumentada, estimulação de fibrose vascular, miocardial e renal, taxa e força aumentadas de contrações cardíacas, taxa cardíaca alterada, por exemplo, arritmia aumentada, estimulação de inibidor de ativador de plasminogênio 1 (PAI1), ativação do sistema nervoso simpático e secreção de endotelina aumentada) seja detectáveis ou não detectáveis. "Tratamento" também pode significar prolongamento da sobrevivência comparado com sobrevivência esperada na ausência de tratamento.
[00204] O termo "inferior" no contexto do nível de AGT em um indivíduo ou um marcador ou sintoma de doença se refere a uma diminuição estatisticamente significante em tal nível. A diminuição pode ser, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mais e é preferivelmente para menos para um nível aceito dentro da faixa de normal para um indivíduo sem tal distúrbio.
[00205] Como aqui usado, "prevenção" ou "prevenir", quando usado em referência a uma doença, distúrbio ou condição do mesmo, que se beneficiaria de uma redução em expressão de um gene de AGT, se refere a uma redução na probabilidade que um indivíduo vá desenvolver um sintoma associado com tal doença, distúrbio ou condição, por exemplo, um sintoma de ativação de AT1R indesejada, tais como hipertensão, doença renal crônica, acidente vascular cerebral, infarto do miocárdio, falência cardíaca, aneurismas, doença da artéria periférica, doença cardíaca, estresse oxidativo aumentado, por exemplo, formação de superóxido aumentada, inflamação, vasoconstrição, retenção de sódio e água, perda de potássio e magnésio, supressão de renina, hipertrofia de miócito e músculo liso, síntese de colágeno aumentada, estimulação de fibrose vascular, miocardial e renal, taxa e força aumentadas de contrações cardíacas, taxa cardíaca alterada, por exemplo, arritmia aumentada, estimulação de inibidor de ativador de plasminogênio 1 (PAI1), ativação do sistema nervoso simpático e secreção de endotelina aumentada. A probabilidade de desenvolvimento, por exemplo, de hipertensão, é reduzida, por exemplo, quando um indivíduo tendo um ou mais fatores de risco para uma hipertensão ou falha em desenvolver hipertensão ou desenvolve hipertensão com menos severidade com relação a uma população tendo os mesmos fatores de risco e não recebendo tratamento como descrito aqui. A falha em desenvolver uma doença, distúrbio ou condição, ou a redução no desenvolvimento de um sintoma associado com tal doença, distúrbio ou condição (por exemplo, em pelo menos cerca de 10% em uma escala clinicamente aceitável para esta doença ou distúrbio), ou a exibição de sintomas retardados (por exemplo, em dias, semanas, meses ou anos), é considerada prevenção eficaz.
[00206] Como aqui usado, o termo "doença associada a angiotensinogênio" ou "doença associada a AGT" é uma doença ou distúrbio que é causado por, ou associado com, ativação do sistema renina-angiotensina-aldosterona (RAAS), ou uma doença ou distúrbio cujos sintomas ou cuja progressão respondem à inativação de RAAS. O termo "doença associada a angiotensinogênio" inclui uma doença, distúrbio ou condição que se beneficiaria da redução em expressão de AGT. Tais doenças são tipicamente associadas com pressão sanguínea alta. Exemplos não limitantes de doenças associadas a angiotensinogênio incluem hipertensão, por exemplo, hipertensão limítrofe (também conhecida como pré-hipertensão), hipertensão primária (também conhecida como hipertensão essencial ou hipertensão idiopática), hipertensão secundária (também conhecida como hipertensão inessencial), emergência hipertensiva (também conhecida como hipertensão maligna), urgência hipertensiva, hipertensão sistólica ou diastólica isolada, hipertensão associada à gravidez (por exemplo, pré-eclâmpsia, eclâmpsia e pré-eclâmpsia pós- parto), hipertensão diabé-tica, hipertensão resistente, hipertensão refratária, hipertensão paroxismal, hipertensão renovascular (também conhecida como hipertensão renal), hipertensão de Goldblatt, hipertensão ocular, glaucoma, hipertensão pulmonar, hipertensão portal, hipertensão venosa sistêmica, hipertensão sistólica, hipertensão lábil; doença cardíaca hipertensiva, nefropatia hipertensiva, aterosclerose, arteriosclerose, vasculopatia (incluindo doença vascular periférica), nefropatia diabética, retinopatia diabética, falência cardíaca crônica, cardiomiopatia, miopatia cardíaca diabética, glomeruloesclerose, coarctação da aorta, aneurisma aórtico, fibrose ventricular, síndrome de Cushing e outros estados de excesso de glucocorticoide incluindo terapia esteroide crônica, feocromocitoma, reninoma, aldosteronismo secundário e outros estados de excesso mineralocorticoide, apneia do sono, doença da tireoide/paratireoide, falência cardíaca (por exemplo, disfunção sistólica ventricular esquerda), infarto do miocárdio, angina, acidente vascular cerebral, diabetes mellitus (por exemplo, nefropatia diabética), doença renal, por exemplo, doença renal crônica ou nefropatia diabética opcionalmente no contexto de gravidez, falência renal, por exemplo, falência renal crônica, disfunção cognitiva (tal como Alzheimer) e esclerose sistêmica (por exemplo, crise renal escleroderma). Em certas modalidades, doença associada a AGT inclui restrição de crescimento intrauterino (IUGR) ou restrição de crescimento fetal.
[00207] Com base na média de leituras de pressão sanguínea estabelecidas que são medidas apropriadamente durante duas ou mais visitas ao consultório, um indivíduo tendo uma pressão sanguínea normal é um tendo uma pressão sistólica de cerca de 900-119 mmHg (cerca de 12-15,9 kPa (kN/m2)) e uma pressão diastólica de cerca de 60-79 mmHg (cerca de 8,0-10,5 kPa (kN/m2)); um indivíduo tendo hipertensão é um tendo uma pressão sistólica de cerca de 120-139 mmHg (cerca de 16,1-18,5 kPa (kN/m2)) e uma pressão diastólica de cerca de 60-79 mmHg (cerca de 8,0-10,5 kPa (kN/m2)); um indivíduo tendo hipertensão (por exemplo, hipertensão em Estágio 1) é um tendo pressão sistólica de cerca de 140-159 mmHg (cerca de 18,7-21,2 kPa (kN/m2)) e uma pressão diastólica de cerca de 90-99 mmHg (cerca de 12,0-13,2 kPa (kN/m2)); e um indivíduo tendo hipertensão (por exemplo, hipertensão de Estágio II) é um tendo uma pressão sistólica de cerca de >160 mmHg (cerca de >21,3 kPa (kN/m2)) e uma pressão diastólica de cerca de >100 mmHg (cerca de >13.3 kPa (kN/m2)). Indivíduos com pressão sanguínea acima de 130/80 mmHg junto com diabetes Tipo 1 ou Tipo 2, ou doença renal, são considerados como tendo hipertensão.
[00208] Em uma modalidade, uma doença associada a angiotensinogênio é principalmente hipertensão. "Hipertensão primária" é um resultado de causas ambientais ou genéticas (por exemplo, um resultado de nenhuma causa médica de base óbvia).
[00209] Em uma modalidade, uma doença associada a angiotensinogênio é hipertensão secundária. "Hipertensão secundária" tem um distúrbio de base não identificável que podem ser de múltiplas etiologias, incluindo causas renais, vasculares e endócrinas, por exemplo, doença parenquimal renal (por exemplo, rins policísticos, doença glomerular ou intersticial), doença vascular renal (por exemplo, estenose da artéria renal, displasia fibromuscular), distúrbios endócrinos (por exemplo, excesso de adrenocorticosteroide ou mineralocorticoides, feocromocitoma, hipertiroidismo ou hipotireoidismo, excesso de hormônio do crescimento, hiperparatiroidismo), coarctação da aorta ou uso de contraceptivo oral.
[00210] Em uma modalidade, uma doença associada a angiotensinogênio é uma emergência hipertensiva, por exemplo, hipertensão maligna e hipertensão acelerada. "Hipertensão acelerada" é pressão sanguínea severamente elevada (isto é, igual a maior do que uma sistólica de 180 mmHg ou diastólica de 110 mmHg) com dano direto a um ou mais órgãos finais. A pressão sanguínea deve ser reduzida imediatamente para prevenir mais dano a órgão. "Hipertensão maligna" é pressão sanguínea severamente elevada (isto é, igual a ou maior do que uma sistólica de 180 mmHg ou diastólica de 110 mmHg) com dano direto a um ou mais órgãos finais e papiledema. A pressão sanguínea deve ser reduzida imediatamente para prevenir mais dano a órgão. Dano a órgão final neurológico devido à pressão sanguínea não controlada pode incluir encefalopatia hipertensiva, acidente vascular cerebral/infarto cerebral hemorragia subaraquinoide e/ou hemorragia intracranial. Dano a órgão final cardiovascular pode incluir isquemia/infarto do miocárdio, disfunção ventricular esquerda aguda, edema pulmonar agudo e/ou dissecação aórtica. Outros sistemas de órgão podem ser também afetados por hipertensão não controlada, que pode levar à falência/insuficiência renal, retinopatia, eclampsia ou anemia hemolítica microangiopática.
[00211] Em uma modalidade, uma doença associada a angiotensinogênio é uma urgência hipertensiva. "Urgência hipertensiva" é pressão sanguínea severamente elevada (isto é, igual a ou maior do que uma sistólica de 180 mmHg ou diastólica de 110 mmHg) sem nenhum dano direto a um ou mais órgãos. A pressão sanguínea pode ser diminuída com segurança dentro de algumas horas.
[00212] Em uma modalidade, uma doença associada a angiotensinogênio é hipertensão associada à gravidez, por exemplo, hipertensão crônica de gravidez, hipertensão gestacional, pré- eclâmpsia, eclampsia, pré-eclâmpsia superposta à hipertensão crônica, síndrome de HELLP e hipertensão gestacional (também conhecida como hipertensão transiente de gravidez, hipertensão crônica identificada na última metade da gravidez e hipertensão induzida pela gravidez (PIH)). Um indivíduo tendo "hipertensão crônica de gravidez" é um tendo uma pressão sanguínea excedendo 140/90 mm Hg antes da gravidez ou antes da 20a semana de gestação. "Hipertensão gestacional" ou "hipertensão induzida pela gravidez" se refere à hipertensão com início na última parte da gravidez (>20a semana de gestação) sem quaisquer outras características de pré-eclâmpsia, e seguido por normalização da pressão sanguínea após o parto. "Pré- eclâmpsia" leve é definida como a presença de hipertensão (pressão sanguínea >140/90 mm Hg) em duas ocasiões, pelo menos com seis horas de intervalo, mas sem evidência de dano a órgão final, em uma mulher que era normotensiva antes da 20a semana de gestação. Em um indivíduo com hipertensão essencial preexistente, pré-eclâmpsia é diagnosticada se a pressão sanguínea sistólica tiver aumentado em 30 mm Hg ou se a pressão diastólica tiver aumentado em 15 mm Hg. "Pré- eclâmpsia severa" é definida como a presença de 1 dos sintomas ou sinais que seguem na presença de pré-eclâmpsia; uma pressão sanguínea sistólica de 160 mm Hg ou maior ou pressão sanguínea diastólica de 110 mm Hg ou maior em duas ocasiões, pelo menos seis horas de intervalo; proteinúria de mais de 5 g em uma coleta de 24 horas ou mais de 3+ em duas amostras de urina aleatórias coletadas pelo menos com vinte e quatro horas de intervalo, edema pulmonar ou cianose, oliguria (<400 mL em 24 horas), cefaleias persistentes, dor epigástrica e/ou função hepática prejudicada, trombocitopenia, oligoidrâmnio, crescimento fetal diminuído ou abrupção placentária. "Eclâmpsia" é definida como convulsões que não podem ser atribuíveis a outras causas em uma mulher com pré-eclâmpsia. "Síndrome de HELLP" (também conhecida como gestose de edema-proteinúria- hipertensão tipo B) é Hemólise, níveis de Enzima Hepática elevados e níveis de Plaqueta baixos em uma pessoa grávida.
[00213] Em uma modalidade, uma doença associada a angiotensinogênio é hipertensão resistente. "Hipertensão resistente" é pressão sanguínea que permanece acima do objetivo (por exemplo 140/90 mmHg) apesar do uso concomitante de três agentes anti- hipertensivos de classes diferentes, um dos quais é um diurético tiazida. Os indivíduos cuja pressão sanguínea é controlada com quatro ou mais medicações são também considerados ter hipertensão resistente.
[00214] "Quantidade terapeuticamente eficaz", como aqui usado, pretende incluir a quantidade de um agente de RNAi que, quando administrado a um indivíduo tendo uma doença associada a angiotensinogênio, é suficiente para realizar tratamento da doença (por exemplo, através da diminuição, melhora ou manutenção da doença existente ou um ou mais sintomas de doença). A "quantidade terapeuticamente eficaz" pode variar dependendo do agente de RNAi, como o agente é administrado, a doença e sua severidade e a história, idade, peso, história familiar, maquiagem genética, os tipos de tratamentos precedentes ou concomitantes, se algum, e outras características individuais do indivíduo a ser tratado.
[00215] "Quantidade profilaticamente eficaz", como aqui usado, pretende incluir a quantidade de iRNA que, quando administrada a um indivíduo tendo uma doença associada a angiotensinogênio, é suficiente para prevenir ou melhorar a doença ou um ou mais sintomas da doença em um indivíduo suscetível à doença, isto é, mais provável sofrer da doença do que aqueles na população geral devido a um ou mais fatores, por exemplo, idade, peso, gravidez. Melhora da doença inclui deixar mais lento o curso da doença ou redução da severidade de doença de desenvolvimento posterior. A "quantidade profilaticamente eficaz" pode variar dependendo do iRNA, como o agente é administrado, o grau de risco da doença, e a história, idade, peso, história familiar, maquiagem genética, os tipos de tratamentos precedentes ou concomitantes, se algum, e outras características individuais do paciente a ser tratado.
[00216] Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade profilaticamente eficaz" também inclui uma quantidade de um agente de RNAi que produz algum efeito local ou sistêmico desejado em uma razão benefício/risco razoável aplicável a qualquer tratamento. iRNA empregado nos métodos da presente invenção pode ser administrado em uma quantidade suficiente para produzir uma razão benefício/risco razoável aplicável a tal tratamento.
[00217] A expressão "farmaceuticamente aceitável" é empregada aqui para se referir aqueles compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagem que são, dentro do escopo de julgamento médico importante, adequados para uso em contato com os tecidos de indivíduos humanos e indivíduos animais sem toxidez, irritação, resposta alérgica excessiva ou outro problema ou complicação, comensurado com uma razão de benefício/risco razoável.
[00218] A expressão "veículo farmaceuticamente aceitável" conforme aqui usado significa um material, composição ou veículo farmaceuticamente aceitável, tal como uma carga, diluente, excipiente, auxiliar de fabricação líquido ou sólido (por exemplo, lubrificante, estearato de magnésio, cálcio ou zinco de talco ou ácido esteárico), ou material de encapsulação de solvente, envolvido no carreamento ou transporte do composto objeto de um órgão, ou porção do corpo, para um outro órgão, ou porção do corpo. Cada veículo deve ser "aceitável" no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não prejudicial para o indivíduo sendo tratado. Alguns exemplos de materiais que podem servir como veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose; (2) amidos, tais como amido de milho e amido de batata; (3) celulose, e seus derivados, tais como carboximetil celulose de sódio, etil celulose e acetato de celulose; (4) tragacanto em pó; (5) malte; (6) gelatina; (7) agentes lubrificantes, tais como acetato de magnésio, lauril sulfato de sódio e talco; (8) excipientes, tais como manteiga de cacau e ceras de supositório; (9) óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de açafrão, óleo de sésamo, óleo de oliva, óleo de milho e óleo de soja; (10) glicóis, tal como propileno glicol; (11) polióis, tais como glicerina, sorbitol, manitol e polietileno glicol; (12) ésteres, tais como oleato de etila e laurato de etila; (13) ágar; (14) agentes de tamponamento, tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; (15) ácido algínico; (16) água livre de pirógeno; (17) solução salina isotônica; (18) solução de Ringer; (19) álcool de etila; (20) soluções tamponadas com pH; (21) poliésteres, policarbonatos e/ou polianidridos; (22) agentes de volume, tais como polipeptídeos e aminoácidos; (23) componente do soro, tais como albumina do soro, HDL e LDL; e (22) outras substâncias compatíveis não tóxicas empregadas em formulações farmacêuticas.
[00219] O termo "amostra", como usado aqui, inclui uma coleção de fluidos, células ou tecidos similares isolados de um indivíduo, bem como fluidos, células ou tecidos presentes dentro de um indivíduo. Exemplos de fluidos biológicos incluem sangue, soro e fluidos serosais, plasma, fluido cerebroespinhal, fluidos oculares, linfa, urina, saliva e similar. Amostras de tecido podem incluir amostras de tecidos, órgãos ou regiões localizadas. Por exemplo, amostras podem ser derivadas de órgãos particulares, partes de órgãos ou fluidos ou células dentro desses órgãos. Em certas modalidades, as amostras podem ser derivadas do fígado (por exemplo, fígado inteiro ou certos segmentos de fígado ou certos tipos de células no fígado, tais como, por exemplo, hepatócitos). Em algumas modalidades, uma "amostra derivada de um indivíduo" se refere a sangue ou plasma retirado do indivíduo.
II. iRNAs da Invenção
[00220] A presente invenção provê iRNAs que inibem a expressão de um gene de AGT. Em uma modalidade, agente iRNA inclui moléculas de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibição da expressão de um gene de AGT em uma célula, tal como uma célula dentro de um indivíduo, por exemplo, um mamífero, tal como um ser humano tendo uma doença associada a angiotensinogênio, por exemplo, hipertensão. O dsRNA inclui uma fita antissenso tendo uma região de complementaridade que é complementar a pelo menos uma parte de um mRNA formado na expressão de um gene de AGT. A região de complementaridade é de cerca de 30 nucleotídeos ou menos de comprimento (por exemplo, cerca de 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19 ou 18 nucleotídeos ou menos de comprimento). Quando do contato com uma célula expressando o gene AGT, o iRNA inibe a expressão do gene de AGT (por exemplo, um gene de AGT humano, de primata, um não primata ou uma ave) em pelo menos cerca de 10% como ensaiado através de, por exemplo, um método baseado em PCR ou DNA ramificado (bDNA), ou através de um método baseado em proteína, tal como através de análise de imunofluorescência usando, por exemplo, técnicas de western blotting ou citometria de fluxo.
[00221] Um dsRNA inclui dois a fitas de RNA que são complementares e hibridizam para formar uma estrutura de dúplex sob condições onde o dsRNA será usado. Um a fita de um dsRNA (a fita antissenso) inclui uma região de complementaridade que é substancialmente complementar, e geralmente totalmente complementar, a uma sequência alvo. A sequência alvo pode ser derivada da sequência de um mRNA formado durante a expressão de um gene de AGT. O outra fita (a fita senso) inclui uma região que é complementar aa fita antissenso, de maneira que os dois a fitas hibridizam e formam uma estrutura de dúplex quando combinados sob condições adequadas. Como descrito em um outro ponto aqui e como conhecido na técnica, as sequências complementares de um dsRNA podem também estar contidas como regiões autocomplementares de uma molécula de ácido nucleico única, oposto a estarem em oligonucleotídeos separados.
[00222] Em geral, a estrutura de dúplex está entre 15 e 30 pares de base de comprimento, por exemplo, entre 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 ou 21-22 pares de base de comprimento. Intermediários de faixas e comprimentos para as faixas e comprimentos mencionados acima são também compreendidos como sendo parte da invenção.
[00223] Similarmente, a região de complementaridade para a sequência alvo está entre 15 e 30 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, entre 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 ou 21-22 nucleotídeos de comprimento. Intermediários de faixas e comprimentos para as faixas e comprimentos mencionados acima são também compreendidos como sendo parte da invenção.
[00224] Em algumas modalidades, o dsRNA é de cerca de 15 a cerca de 20 nucleotídeos de comprimento, cerca de 25 a cerca de 30 nucleotídeos de comprimento ou cerca de 15 a cerca de 23 nucleotídeos de comprimento. Em geral, o dsRNA é longo o suficiente para servir como um substrato para a enzima Dicer. Por exemplo, é bem conhecido na técnica que dsRNAs mais longos do que cerca de 21-23 nucleotídeos de comprimento podem servir como substratos para Dicer. Como o versado comum na técnica também reconhecerá, a região de um RNA direcionado para clivagem será mais frequentemente parte de uma molécula de RNA maior, frequentemente uma molécula de mRNA. Onde relevante, uma "parte" de um alvo de mRNA é uma sequência contínua de um alvo de mRNA de comprimento suficiente para permitir que ele seja um substrato para clivagem direcionada a RNAi (isto é, clivagem através de um curso de RISC).
[00225] Um versado na técnica também reconhecerá que a região de dúplex é uma porção funcional primária de dsRNA, por exemplo, uma região de dúplex de cerca de 9 a 36 pares de base, por exemplo, cerca de 10-36, 11-36, 12-36, 13-36, 14-36, 15-36, 9-35, 10-35, 11-35, 12-35, 13-35, 14-35, 15-35, 9-34, 10-34, 11-34, 12-34, 13-34, 14-34, 15-34, 933, 10-33, 11-33, 12-33, 13-33, 14-33, 15-33, 9-32, 10-32, 11-32, 12-32, 13-32, 14-32, 15-32, 9-31, 10-31, 11-31, 12-31, 13-32, 14-31, 15-31, 1530, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 1520, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 1824, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 1925, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 2026, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 2126, 21-25, 21-24, 21-23 ou 21-22 pares de base. Desta maneira, em uma modalidade, até o ponto que ele se torne processado para um dúplex funcional de, por exemplo, 15-30 pares de base, que se direcione a um RNA desejado para clivagem, uma molécula de RNA ou complexo de moléculas de RNA tendo uma região de dúplex maior do que 30 pares de base é um dsRNA. Desta maneira, um versado comum na técnica reconhecerá que em uma modalidade, um miRNA é um dsRNA. Em uma outra modalidade, um dsRNA não é um miRNA de ocorrência natural. Em uma outra modalidade, um agente iRNA útil para se direcionar à expressão de AGT não é gerado na célula alvo por clivagem de um dsRNA maior.
[00226] Um dsRNA como aqui descrito pode incluir ainda uma ou mais sobreposições de nucleotídeo de fita simples, por exemplo, 1, 2, 3 ou 4 nucleotídeos. dsRNAs tendo pelo menos uma saliência de nucleotídeo podem ter propriedades inibidoras inesperadamente superiores com relação às suas contrapartes de extremidade cega. Uma saliência de nucleotídeo pode compreender ou consistir em um análogo de nucleotídeo/nucleosídeo, incluindo um desoxinucleotídeo/nucleosídeo. A(s) saliência(ões) pode estar na fita senso, na fita antissenso ou qualquer combinação dos mesmos. Ainda, o(s) nucleotídeo(s) de uma saliência pode estar presente na extremidade 5’, extremidade 3’ ou ambas as extremidades de uma fita antissenso ou senso de um dsRNA. Como aqui discutido, sobreposições estendidas de até 30 nucleotídeos de comprimento são também compreendidas em várias modalidades da invenção.
[00227] Um dsRNA pode ser sintetizado através de métodos padrão conhecidos na técnica como discutido adicionalmente abaixo, por exemplo, através do uso de um sintetizador de DNA automático, tal como os comercialmente disponíveis da, por exemplo, Biosearch, Applied Biosystems®, Inc.
[00228] Compostos iRNA da invenção podem ser preparados usando um procedimento de duas etapas. Primeiro, os a fitas individuais da molécula de RNA de fita dupla são preparados separadamente. Então, os a fitas componentes são anelados. Os a fitas individuais do composto siRNA podem ser preparados usando síntese orgânica de fase de solução ou fase sólida ou ambas. Síntese orgânica oferece a vantagem que os a fitas de oligonucleotídeo compreendendo nucleotídeos não naturais ou modificados podem ser facilmente preparados. Oligonucleotídeos de fita simples da invenção podem ser preparados usando síntese orgânica de fase de solução ou fase sólida ou ambas.
[00229] Em um aspecto, um dsRNA da invenção inclui pelo menos duas sequências de nucleotídeo, uma sequência senso e uma sequência antissenso. A fita senso é selecionado do grupo de sequências provido em qualquer uma das Tabelas 3, 4, 7, 8, 11, 13 e 15, e a fita antissenso correspondente da fita senso é selecionado do grupo de sequências de qualquer uma das Tabelas 3, 4, 7, 8, 11, 13 e 15. Neste aspecto, uma das duas sequências é complementar à outra das duas sequências, com uma das sequências sendo substancialmente complementares a uma sequência de um mRNA gerado na expressão de um gene de AGT. Desta maneira, neste aspecto, um dsRNA incluirá dois oligonucleotídeos, onde um oligonucleotídeo é descrito como a fita senso em qualquer uma das Tabelas 3, 4, 7, 8, 11, 13 e 15, e o segundo oligonucleotídeo é descrito como a fita antissenso correspondente da fita senso em qualquer uma das Tabelas 3, 4, 7, 8, 11, 13 e 15. Em uma modalidade, as sequências substancialmente complementares do dsRNA estão contidas em oligonucleotídeos separados. Em uma outra modalidade, as sequências substancialmente complementares do dsRNA estão contidas em um oligonucleotídeo único.
[00230] Será compreendido que, embora algumas das sequências nas Tabelas 3, 4, 7, 8, 11, 13 e 15 sejam descritas como sequências modificadas e/ou conjugadas, o RNA do iRNA da invenção, por exemplo, um dsRNA da invenção, pode compreender qualquer uma das sequências mostradas nas Tabelas 3, 4, 7, 8, 11, 13 e 15 que é não modificada, não conjugada e/ou modificada e/ou conjugada diferentemente do descrito aqui.
[00231] Em um outro aspecto, um ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) da invenção para inibição de expressão de angiotensinogênio compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma fita senso e uma fita antissenso, onde a fita senso compreende a sequência de nucleotídeo de uma fita senso nas Tabelas 3, 4, 7, 8, 11, 13 e 15 e a fita antissenso compreende a sequência de nucleotídeo da fita antissenso correspondente nas Tabelas 3, 4, 7, 8, 11, 13 e 15.
[00232] O versado na técnica está ciente que dsRNAs tendo uma estrutura de dúplex de cerca de 20 a 23 pares de base, por exemplo, 21, pares de base foram considerados particularmente eficazes na indução de interferência de RNA (Elbashir e outros, EMBO 2001, 20:6877-6888). No entanto, outros constataram que estruturas de dúplex de RNA mais curtas ou mais longas podem ser também eficazes (Chu e Rana (2007) RNA 14:1714-1719; Kim e outros (2005) Nat Biotech 23:222-226). Nas modalidades descritas acima, em virtude da natureza das sequências de oligonucleotídeo providas em qualquer uma das Tabelas 3, 4, 7, 8, 11, 13 e 15, dsRNAs descritos aqui podem incluir pelo menos um a fita de um comprimento de minimamente 21 nucleotídeos. Pode ser esperado razoavelmente que dúplexes mais curtos tendo uma das sequências de qualquer uma das Tabelas 3, 4, 7, 8, 11, 13 e 15 menos apenas alguns nucleotídeos em uma ou ambas as extremidades possam ser similarmente eficazes comparado com os dsRNAs descritos acima. Desta maneira, dsRNAs tendo uma sequência de pelo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais nucleotídeos contíguos derivados de uma das sequências de qualquer uma das Tabelas 3, 4, 7, 8, 11, 13 e 15, e diferindo em sua habilidade em inibir a expressão de um gene de AGT em não mais do que cerca de 5, 10, 15, 20, 25 ou 30% de inibição de um dsRNA compreendendo a sequência integral, são compreendidos estar dentro do escopo da presente invenção.
[00233] Ainda, os RNAs providos em qualquer uma das Tabelas 3, 4, 7, 8, 11, 13 e 15 identificam um sítio(s) em um transcrito de AGT que é suscetível à clivagem mediada por RISC. Desta maneira, a presente invenção refere-se ainda a iRNAs que se direcionam dentro de um desses sítios. Como aqui usado, iRNA é dito se direcionar dentro de um sítio particular de um transcrito de RNA se o iRNA promover clivagem do transcrito em qualquer ponto dentro deste sítio particular. Tal iRNA incluirá geralmente pelo menos cerca de 15 nucleotídeos contíguos de uma das sequências providas em qualquer uma das Tabelas 3, 4, 7, 8, 11, 13 e 15 acoplados a sequências de nucleotídeos adicionais obtidas da região contígua à sequência selecionada em um gene de AGT.
[00234] Embora uma sequência alvo seja de geralmente 15-30 nucleotídeos de comprimento, há uma ampla variação em adequabilidade de sequências particulares nesta faixa para direcionamento da clivagem de qualquer dado RNA alvo. Vários pacotes de software e as instruções mostradas aqui proveem orientação para a identificação de sequências alvo ótimas para qualquer alvo de gene dado, mas uma abordagem empírica pode também ser usada onde uma "janela" ou "máscara" de um dado tamanho (como um exemplo não limitante, 21 nucleotídeos) é literalmente ou figurativamente (incluindo, por exemplo, in silico) posta na sequência de RNA alvo para identificar sequências na faixa de tamanho que pode servir como sequências alvo. Ao mover a "janela" de sequências progressivamente um nucleotídeo a montante ou a jusante de uma localização de sequência alvo inicial, a próxima sequência alvo potencial pode ser identificada, até que o conjunto completo de sequências possíveis seja identificado para qualquer tamanho de alvo selecionado dado. Este processo, acoplado à síntese sistemática e teste das sequências identificadas (usando ensaios como descrito aqui ou como conhecido na técnica) para identificar aquelas sequências que têm desempenho ótimo pode identificar aquelas sequências de RNA que, quando direcionadas com um agente de iRNA, fazem a mediação da melhor inibição de expressão de gene alvo. Desta maneira, embora as sequências identificadas, por exemplo, em qualquer uma das Tabelas 3, 4, 7, 8, 11, 13 e 15 representem sequências alvo eficazes, é compreendido que otimização adicional de eficiência de inibição pode ser obtida ao "mover a janela" progressivamente um nucleotídeo a montante ou a jusante das dadas sequências para identificar sequências com características de inibição iguais ou melhores.
[00235] Ainda, é compreendido que para qualquer sequência identificada, por exemplo, em qualquer uma das Tabelas 3, 4, 7, 8, 11, 13 e 15, otimização adicional poderia ser obtida sistematicamente ou adicionando ou removendo nucleotídeos para gerar sequências mais longas ou mais curtas e teste daquelas sequências geradas ao mover uma janela do tamanho mais longo ou mais curto para cima ou para baixo do RNA alvo a partir deste ponto. Novamente, acoplamento desta abordagem à geração de novos alvos candidatos com teste quanto à eficácia de iRNAs com base naquelas sequências alvo em um ensaio de inibição como conhecido na técnica e/ou como descrito aqui pode levar a aperfeiçoamentos adicionais na eficiência de inibição. Ainda, tais sequências otimizadas podem ser ajustadas através da, por exemplo, introdução de nucleotídeos modificados com aqui escrito ou como conhecido na técnica, adição ou mudanças em saliência, ou outras modificações como conhecido na técnica e/ou discutido aqui para otimizar mais a molécula (por exemplo, aumentando a estabilidade no soro ou meia-vida em circulação, aumentando a estabilidade térmica, aumentando a administração à transmembrana, direcionando a um local ou tipo de célula particular, aumentando a interação com enzimas de curso de silenciamento, aumentando a liberacao a partir de endossomos) como um inibidor de expressão.
[00236] Um iRNA como aqui descrito pode conter uma ou mais incompatibilidades com a sequência alvo. Em uma modalidade, um iRNA como aqui descrito não contém mais do que 3 incompatibilidades. Se a fita antissenso do iRNA contiver incompatibilidades com uma sequência alvo, é preferível que a área de incompatibilidade não esteja localizada no centro da região de complementaridade. Se a fita antissenso do iRNA contiver incompatibilidades com a sequência alvo, é preferível que a incompatibilidade seja restrita para estar dentro dos últimos 5 nucleotídeos a partir ou da extremidade 5’ ou 3’ da região de complementaridade. Por exemplo, para um agente de iRNA de 23 nucleotídeos a fita que é complementar a uma região de um gene de AGT geralmente não contém nenhuma incompatibilidade dentro dos 13 nucleotídeos centrais. Os métodos descritos aqui ou métodos conhecidos na técnica podem ser usados para determinar se um iRNA contendo uma incompatibilidade com uma sequência alvo é eficaz na inibição da expressão de um gene de AGT. Consideração da eficácia de iRNAs com incompatibilidades em inibição da expressão de um gene de AGT é importante, especialmente se a região particular de complementaridade em um gene de AGT for conhecida ter variação de sequência polimórfica dentro da população.
III. iRNAs Modificados da Invenção
[00237] Em uma modalidade, o RNA do iRNA da invenção, por exemplo, um dsRNA, é não modificado e não compreende, por exemplo, modificações e/ou conjugações químicas conhecidas na técnica e descritas aqui. Em uma outra modalidade, o RNA de um iRNA da invenção, por exemplo, um dsRNA, é quimicamente modificado para aumentar a estabilidade ou outras características benéficas. Em certas modalidades da invenção, substancialmente todos dos nucleotídeos de um iRNA da invenção são modificados. Em uma outra modalidade da invenção, todos dos nucleotídeos de um iRNA da invenção são iRNAs modificados da invenção onde "substancialmente todos dos nucleotídeos são modificados" são muito, mas não totalmente, modificados e podem incluir não mais do que 5, 4, 3, 2 ou 1 nucleotídeos não modificados.
[00238] Os ácidos nucleicos destacados na invenção podem ser sintetizados e/ou modificados através de métodos bem estabelecidos na técnica, tais como aqueles descritos em "Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. e outros (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA, que é aqui incorporado a título de referência. Modificações incluem, por exemplo, modificações de extremidade, por exemplo, modificações de extremidade 5’ (fosforilação, conjugação, ligações invertidas) ou modificações de extremidade 3’ (conjugação, nucleotídeos de DNA, ligações invertidas, etc); modificações de base, por exemplo, substituição com bases de estabilização, bases de desestabilização ou bases que emparelham em base com um repertório expandido de contrapartes, remoção de bases (nucleotídeos abásicos) ou bases conjugadas; modificações de açúcar (por exemplo, na posição 2’ ou posição 4’) ou substituição do açúcar; e/ou modificações de estrutura principal, incluindo modificação ou substituição das ligações fosfodiéster. Exemplos específicos de compostos iRNA úteis nas modalidades descritas aqui incluem, mas não estão limitados a, RNAs contendo estruturas principais modificadas ou quaisquer ligações internucleosídeo naturais. RNAs tendo estruturas principais modificadas incluem, dentre outros, aqueles que não têm um átomo de fósforo na estrutura principal. Para os propósitos do presente pedido, e como algumas vezes referido na técnica, RNAs modificados que não têm um átomo de fósforo em sua estrutura principal internucleosídeo podem também ser considerados oligonucleosídeos. Em algumas modalidades, um iRNA modificado terá um átomo de fósforo em sua estrutura principal internucleosídeo.
[00239] Estruturas principais de RNA modificado incluem, por exemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirais, fosforoditioatos, fosforotriésteres, aminoalquilfosforotriésteres, fosfonato de metila e outros de alquila incluindo fosfonatos de 3’-alquileno e fosfonato quirais, fosfinatos, fosforamidatos incluindo 3’-amino fosforamidato e aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres e boranofosfatos tendo ligações 3’-5’, análogos 2’-5’ ligados destes e aqueles tendo polaridade invertida onde os pares adjacentes de unidades nucleosídeo são ligados 3’-5’ a 5’-3’ ou 2’-5’ a 5’-2’. Vários sais, sais mistos e formas de ácido livre são também incluídos.
[00240] As Patentes U.S. representativas que ensinam a preparação das ligações contendo fósforo acima incluem, mas não estão limitadas a, Patentes U.S. Nos. 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.195; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.316; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; 5.625.050; 6.028.188; 6.124.445; 6.160.109; 6.169.170; 6.172.209; 6.239.265; 6.277.603; 6.326.199; 6.346.614; 6.444.423; 6.531.590; 6.534.639; 6.608.035; 6.683.167; 6.858.715; 6.867.294; 6.878.805; 7.015.315; 7.041.816; 7.273.933; 7.321.029; e Pat US RE39464, cujos conteúdos em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência.
[00241] Estruturais principais de RNA modificado que não incluem um átomo de fósforo nela têm estruturas principais que são formadas por ligações internucleosídeo de alquila ou cicloalquila de cadeia curta, heteroátomos misturados e ligações internucleosídeo de alquila ou cicloalquila, ou uma ou mais ligações internucleosídeo heteroaromáticas ou heterocíclicas de cadeia curta. Estas incluem aquelas tendo ligações morfolino (formadas em parte da porção açúcar do nucleosídeo); estruturas principais de siloxana; estruturas principais de sulfeto, sulfóxido e sulfona; estruturas principais de formacetila e tioformacetila; estruturas principais de metileno formacetila e tioformacetila; estruturas principais contendo alceno; estruturas principais de sulfamato; estruturas principais de metilenoimino e metilenoidrazino; estruturas principais de sulfonato e sulfonamida; estruturas principais de amida; e outras tendo partes componentes N, O, S e CH2 mistas.
[00242] Patentes U.S. representativas que ensinam a preparação dos oligonucleosídeos acima incluem, mas não estão limitadas a, Patentes U.S. Nos. 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.64.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; e 5.677.439, cujos conteúdos de cada uma em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência.
[00243] Em outras modalidades, miméticos de RNA adequados são compreendidos para uso em iRNAs, onde ambos o açúcar e a ligação internucleosídeo, isto é, a estrutura principal, das unidades nucleotídeo são substituídos com grupos novos. As unidades de base são mantidas para hibridização com um composto alvo de ácido nucleico apropriado. Um composto oligomérico do tipo, um mimético de RNA que foi mostrado ter excelentes propriedades de hibridização, é referido como um ácido nucleico de peptídeo (PNA). Em compostos PNA, a estrutura principal de açúcar de um RNA é substituída com uma estrutura contendo amida, em particular uma estrutura principal de aminoetilglicina. As nucleobases são retidas e são ligadas diretamente ou indiretamente a átomos de nitrogênio aza da porção amida da estrutura principal. Patentes U.S. representativas que ensinam a preparação de compostos PNA incluem, mas não estão limitadas a, Patentes U.S. Nos. 5.539.082; 5.714.331; e 5.719.262, cujos conteúdos em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência. Compostos PNA adicionais adequados para uso nos iRNAs da invenção são descrito, por exemplo, em Nielsen e outros, Science, 1991, 254, 1497-1500.
[00244] Algumas modalidades destacadas na invenção incluem RNAs com estruturas principais de fosforotioato e oligonucleosídeos com estruturas principais de heteroátomo, e em particular --CH2--NH-- CH2-, --CH2--N(CH3)--O--CH2--[conhecida como estrutura principal de metileno (metilimino) ou MMI], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)- -N(CH3)--CH2-- e --N(CH3)--CH2--CH2--[onde a estrutura principal de fosfodiéster é representada como --O--P--O--CH2--] da Patente U.S. No. 5.489.677 referida acima e as estruturas principais de amida da Patente U.S. No. 5.602.240 acima referida. Em algumas modalidades, os RNAs destacados aqui têm estruturas principais de morfolino da Patente U.S. No. 5.034.506 mencionada acima.
[00245] RNAs modificados também podem conter uma ou mais porções açúcar substituídas. Os iRNAs, por exemplo, dsRNAs, destacados aqui podem incluir um dos que seguem na posição 2’: OH; F; O-, S- ou N-alquila; O-, S- ou N-alquenila; O-, S- ou N-alquinila; ou O- alquila-O-alquila, onde as alquila, alquenila e alquinila podem ser C1 a C10 alquila ou C2 a C10 alquenila e alquinila substituídas ou não substituídas. Modificações exemplares adequadas incluem O[(CH2)nO] mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2) nCH3, O(CH2)nONH2 e O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, onde n e m são de a partir de 1 a cerca de 10. Em outras modalidades, dsRNAs incluem um dos que seguem na posição 2’: C1 a C10 alquila inferior, alquila inferior substituída, alcarila, aralquila, O-alcarila ou O-aralquila, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquila, heterocicloalcarila, aminoalquilamino, polialquilamino, silila substituída um grupo de clivagem de RNA, um grupo repórter, um intercalador, um grupo para aperfeiçoamento das propriedades farmacocinéticas de um iRNA, ou um grupo para aperfeiçoamento das propriedades farmacodinâmicas de um iRNA, ou outros substituintes tendo propriedades similares. Em algumas modalidades, a modificação inclui 2'-metoxietóxi (2'-O--CH2CH2OCH3, também conhecido como 2'-O-(2- metoxietila) ou 2'-MOE) (Martin e outros, Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504) i.e., um grupo alcóxi-alcóxi. Uma outra modificação exemplar é 2’-dimetoxiaminooxietóxi, isto é, um grupo O(CH2)2ON(CH3)2, também conhecido como 2’-DMAOE, como descrito nos exemplos abaixo, e 2’-dimetilaminoetoxietóxi (também conhecido na técnica como 2’-O-dimetilaminoetoxietila ou 2’-DMAEOE), isto é, 2'- O--CH2--O--CH2--N(CH2)2. Modificações exemplares adicionais incluem: nucleotídeos 5’-Me-2’-F, nucleotídeos 5’-Me-2’-OMe, 5’-Me- 2’-desoxinucleotídeos, (ambos isômeros R e S nessas três famílias); 2’- alcoxialquila; e 2’-NMA (N-metilacetamida).
[00246] Outras modificações incluem 2'-metóxi (2'-OCH3), 2'- aminopropóxi (2'-OCH2CH2CH2NH2) e 2'-flúor (2'-F). Modificações similares podem ser também feitas em outras posições no RNA de um iRNA, particularmente na posição 3’ do açúcar no nucleotídeo terminal 3’ ou nos dsRNAs ligados 2’-5’ e na posição 5’ do nucleotídeo 5’ terminal. iRNAs podem também ter miméticos de açúcar tais como porções ciclobutila no lugar de açúcar pentofuranosila. Patentes U.S. representativas que ensinam a preparação de tais estruturas de açúcar modificadas incluem, mas não estão limitadas a, Pat. U.S. No. 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; e 5.700.920, certas delas são de propriedade comum do presente pedido. Os conteúdos em sua totalidade de cada uma das acima são aqui incorporados a título de referência.
[00247] Um iRNA pode também incluir modificações ou substituições de nucleobase (frequentemente referidas na técnica simplesmente como "base"). Como aqui usado, nucleobases "não modificadas" ou "naturais" incluem as bases de purina adenina (A) e guanina (G) e as bases de pirimidina timina (T), citosina (C) e uracila (U). Nucleobases modificadas incluem outras nucleobases sintéticas e naturais tais como desoxi-timina (dT), 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metila e outros derivados de alquila de adenina e guanina, 2-propila e outros derivados de alquila de adenina e guanina, 2-tiouracila, 2-tiotimina e 2-tiocitosina, 5-halouracila e citosina, 5-propinil uracila e citosina, 6-azo uracila, citosina e timina, 5-uracila (pseudouracila), 4-tiouracila, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8- tioalquila, 8-hidroxila e outras adeninas e guaninas 8-substituídas, 5- halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluormetila e outras uracilas e citosinas 5-substituídas, 7-metilguanina e 7-metiladenina, 8-azaguanina e 8-azaadenina, 7-desazaguanina e 7-desazadenina e 3- desazaguanina e 3-desazaadenina. Nucleobases adicionais incluem aquelas reveladas na Patente U.S. No. 3.687.808, aquelas reveladas em Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008; aquelas reveladas na Te Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990, aquelas reveladas por Englisch e outros, Angewandte Chemie, Edição Internacional, 1991, 30, 613, e aquelas reveladas por Sanghvi, Y. S., Capítulo 15, dsRNA Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S. T. e Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993. Certas dessas nucleobases são particularmente úteis para aumento da afinidade de ligação dos compostos oligoméricos destacados na invenção. Estas incluem pirimidinas 5-substituidas, 6-azapirimidinas e purinas N-2, N-6 e 0-6 substituídas, incluindo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracila e 5- propinilcitosina. Substituições de 5-metilcitosina foram mostradas aumentar a estabilidade de dúplex de ácido nucleico em 0,6-1,2° C (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. e Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) e são substituições de base exemplares, ainda mais particularmente quando combinadas com modificações de açúcar de 2’-O-metoxietila.
[00248] Patentes U.S. representativas que ensinam a preparação de certas das nucleobases modificadas mencionadas acima bem como outras nucleobases modificadas incluem, mas não estão limitadas a, as Patentes U.S. Nos. 3.687.808. 4.845.205; 5.130.30; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121. 5.596.091; 5.614.617; 5.681.941; 5.750.692; 6.015.886; 6.147.200; 6.166.197; 6.222.025; 6.235.887; 6.380.368; 6.528.640; 6.639.062; 6.617.438; 7.045.610; 7.427.672; e 7.495.088 mencionadas acima, cujos conteúdos em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência.
[00249] O RNA de um iRNA pode ser também modificado para incluir um ou mais ácidos nucleicos bloqueados (LNA). Um ácido nucleico bloqueado é um nucleotídeo tendo uma porção ribose modificada onde a porção ribose compreende uma ponte extra conectando os carbonos 2’ e 4’. Esta estrutura efetivamente "bloqueia" a ribose na conformação estrutura 3’-endo. A adição de ácidos nucleicos bloqueados a siRNAs foi mostrada aumentar a estabilidade de siRNA em soro, e reduzir os efeitos fora do alvo (Elmen, J. e outros, (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. e outros, (2007) Mol Canc Ter 6(3):833-843; Grunweller, A. e outros, (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185- 3193).
[00250] Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo da invenção compreende um ou mais monômeros que são nucleotídeos UNA (ácido nucleico não bloqueado). UNA é acido nucleico acíclico não bloqueado, onde qualquer uma das ligações do açúcar foi removida, formando um resíduo de "açúcar" não bloqueado. Em um exemplo, UNA também compreende monômero com ligações entre C1’-C4’ que foram removidas (isto é, a ligação carbono-oxigênio-carbono covalente entre os carbonos C1’ e C4’). Em um outro exemplo, a ligação C2’-C3’ (isto é, a ligação carbono-carbono covalente entre os carbonos C2’ e C3’) do açúcar foi removida (vide Nuc. Acids Symp. Series, 52, 133-134 (2008) e Fluiter e outros, Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039 aqui incorporados a título de referência).
[00251] O RNA de um iRNA pode ser também modificado para incluir uma ou mais porções de açúcar bicíclico. Um "açúcar bicíclico" é um anel furanosila modificado pela formação de ponte de dois átomos. Um "nucleosídeo bicíclico" ("BNA") é um nucleosídeo tendo uma porção açúcar compreendendo uma ponte conectando dois átomos de carbono do anel de açúcar, desta maneira formando um sistema de anel bicíclico. Em certas modalidades, a ponte conecta o 4’-carbono e o 2’- carbono do anel açúcar. Desta maneira, em algumas modalidades, um agente da invenção pode incluir um ou mais ácidos nucleicos bloqueados (LNA). Um ácido nucleico bloqueado é um nucleotídeo tendo uma porção ribose modificada onde a porção ribose compreende uma ponte extra conectando os carbonos 2’ e 4’. Em outras palavras, um LNA é um nucleotídeo compreendendo uma porção açúcar bicíclica compreendendo uma ponte 4’-CH2-O-2’. A estrutura efetivamente "bloqueia" a ribose na conformação estrutura 3’-endo. A adição de ácidos nucleicos bloqueados a siRNAs foi mostrada aumentar a estabilidade de siRNA em soro, e reduzir os efeitos fora do alvo (Elmen, J. e outros, (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR e outros, (2007) Mol Canc Ter 6(3):833-843; Grunweller, A. e outros, (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193). Exemplos de nucleosídeos bicíclicos para uso nos polinucleotídeos da invenção incluem, sem limitação, nucleosídeos compreendendo uma ponte entre os átomos do anel 4’ e 2’ ribosila. Em certas modalidades, os agentes de polinucleotídeo antissenso da invenção incluem um ou mais nucleosídeos bicíclicos compreendendo uma ponte 4’ para 2’. Exemplos de tais nucleosídeos bicíclicos em ponte 4’ para 2’ incluem, mas não estão limitados a, 4’ -(CH2)—O-2‘ (LNA); 4’ -(CH2)—S-2‘ ; 4’ - (CH2)2—O-2‘ (ENA); 4’ -CH(CH3)—O-2‘ (também referida como "etila restrita" ou "cEt") e 4‘ -CH(CH2OCH3)—O-2‘ (e seus análogos; vide, por exemplo, Pat. U.S. No. 7,399,845); 4‘ -C(CH3)(CH3)—O-2‘ (e seus análogos; vide, por exemplo, Pat. U.S. No. 8,278,283); 4‘ -CH2— N(OCH3)-2‘ (e seus análogos; vide, por exemplo, Pat. U.S. No. 8,278,425); 4‘ -CH2—O—N(CH3)-2‘ (e seus análogos; vide, por exemplo, Pat. U.S. No.2004/0171570); 4’ -CH2—N(R)—O-2‘ , onde R é H, C1-C12 alquila ou um grupo de proteção (vide, por exemplo, Patente U.S. No. 7,427,672); 4’ -CH2—C(H)(CH3)-2‘ (vide, por exemplo, Chattopadhyaya e outros, J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); e 4‘ - CH2—C(=CH2)-2‘ (e seus análogos; vide, por exemplo, Pat. U.S. No. 8,278,426). Os conteúdos de cada um em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência.
[00252] Patentes U.S. e Publicações de Patente U.S. representativas adicionais que ensinam a preparação de nucleotídeos de ácido nucleico bloqueados incluem, mas não estão limitadas a, as que seguem: 6.268.490; 6.525.191; 6.670.461; 6.770.748; 6.794.499; 6.998.484; 7.053.207; 7.034.133;7.084.125; 7.399.845; 7.427.672; 7.569.686; 7.741.457; 8.022.193; 8.030.467; 8.278.425; 8.278.426; 8.278.283; US 2008/0039618; e US 2009/0012281, cujos conteúdos em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência.
[00253] Qualquer um dos nucleosídeos bicíclicos acima pode ser preparado tendo uma ou mais configurações de açúcar estereoquímicas incluindo, por exemplo, α-L-ribofuranose e β-D-ribofuranose (vide WO 99/14226).
[00254] O RNA de um iRNA pode ser também modificado para incluir um ou mais nucleotídeos de etila restritos. Como aqui usado, um "nucleotídeo de etila restrito" ou "cEt" é um ácido nucleico bloqueado compreendendo uma porção açúcar bicíclico compreendendo uma ponte 4’-CH(CH3)-O-2’. Em uma modalidade, um nucleotídeo de etila restrito está na conformação S referida aqui como "S-cEt".
[00255] Um iRNA da invenção também pode incluir um ou mais "nucleotídeos conformacionalmente restritos" ("CRN"). CRN são análogos de nucleotídeo com um ligante conectando os carbonos C2’ e C4’ de ribose ou os carbonos C3 e C5’ de ribose. CRN bloqueia o anel de ribose em uma conformação estável e aumenta a afinidade de hibridização com mRNA. O ligante é de comprimento suficiente para pôr o oxigênio em uma posição ótima para estabilidade e afinidade resultando em menos contração do anel de ribose.
[00256] Publicações representativas que ensinam a preparação de certos dos CNR mencionados acima incluem, mas não estão limitadas a, Publicação de Patente U.S. No. 2013/0190383; e Publicação PCT WO 2013/036868, cujos conteúdos em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência.
[00257] Um ou mais dos nucleotídeos de um iRNA da invenção também podem incluir um nucleotídeo substituído com hidroximetila.Um "nucleotídeo substituído com hidroximetila" é um 2’-3’-seco- nucleotídeo acíclico, também referido como uma modificação de "ácido nucleico não bloqueado" ("UNA").
[00258] Publicações U.S. representativas que ensinam a preparação de UNA incluem, mas não estão limitadas a, Patente U.S. No. 8.314.227; e Publicações de Patente U.S. Nos. 2013/0096289; 2013/0011922; e 2011/0313020, os conteúdos de cada um em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência.
[00259] Modificações potencialmente estabilizadoras para as extremidades de moléculas de RNA podem incluir N- (acetilaminocaproil)-4-hidroxiprolinol (Hyp-C6-NHAc), N-(caproil-4- hidroxiprolinol (Hyp-C6), N-(acetil-4-hidroxiprolinol (Hyp-NHAc), timidina-2'-O-desoxitimidina (éter), N-(aminocaproil)-4-hidroxiprolinol (Hyp-C6-amino), 2-docosanoil-uridina-3"- fosfato, base dT(idT) invertida e outros. A descrição desta modificação pode ser encontrada na Publicação PCT No. WO 2011/005861.
[00260] Outras modificações dos nucleotídeos de um iRNA da invenção incluem 5’ fosfato ou imitação de 5’ fosfato, por exemplo, um fosfato 5’-terminal ou imitação de fosfato na fita antissenso de um agente de RNAi. Imitações de fosfato adequadas são reveladas na, por exemplo, Publicação de Patente US No. 2012/0157511, cujos conteúdos em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência.
A. iRNAs Modificados Compreendendo Motivos da Invenção
[00261] Em certos aspectos da invenção, os agentes de RNAi de fita dupla da invenção incluem agentes com modificações químicas como revelado, por exemplo, no Pedido de Patente Provisório U.S. No. 61/561.710, depositado em 18 de novembro de 2011, ou no PCT/US2012/065691, depositado em 16 de novembro de 2012, os conteúdos de cada um em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência.
[00262] Como mostrado aqui e no Pedido de Patente Provisório No. 61/561.710 ou Pedido PCT No. PCT/US2012/065691, um resultado superior pode ser obtido através da introdução de um ou mais motivos de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos em uma fita senso e/ou a fita antissenso de um agente de RNAi, particularmente no ou próximo do sítio de clivagem. Em algumas modalidades, a fita senso e a fita antissenso do agente de RNAi podem ser de outro modo completamente modificados. A introdução desses motivos interrompe o padrão de modificação, se presente, da fita senso e/ou antissenso. O agente de RNAi pode ser opcionalmente conjugada com um ligante derivado de GalNAc, por exemplo, no mesma fita. Os agentes de RNAi resultantes apresentam atividade de silenciamento de gene superior.
[00263] Mais especificamente, foi surpreendentemente constatado que quando a fita senso e a fita antissenso do agente de RNAi de fita dupla são completamente modificados para ter um ou mais motivos de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos ou no ou próximo do sítio de clivagem de pelo menos um a fita de um agente de RNAi, a atividade de silenciamento de gene do agente de RNAi foi superiormente aumentada.
[00264] Desta maneira, a invenção provê agentes de RNAi de fita dupla capazes de inibição da expressão de um gene alvo (isto é, gene de angiotensinogênio (AGT)) in vivo. O agente de RNAi compreende uma fita senso e uma fita antissenso. Cada a fita do agente de RNAi pode variar de 12-30 nucleotídeos de comprimento. Por exemplo, cada a fita pode estar entre 14-30 nucleotídeos de comprimento, 17-30 nucleotídeos de comprimento, 25-30 nucleotídeos de comprimento, 2730 nucleotídeos de comprimento, 17-23 nucleotídeos de comprimento, 17-21 nucleotídeos de comprimento, 17-19 nucleotídeos de comprimento, 19-25 nucleotídeos de comprimento, 19-23 nucleotídeos de comprimento, 19-21 nucleotídeos de comprimento, 21-25 nucleotídeos de comprimento ou 21-23 nucleotídeos de comprimento.
[00265] A fita senso e a fita antissenso tipicamente formam um RNA de fita dupla dúplex ("dsRNA"), também referido aqui como um "agente de RNAi". A região de dúplex de um agente de RNAi pode ser de 12-30 pares de nucleotídeo de comprimento. por exemplo, a região de dúplex pode estar entre 14-30 pares de nucleotídeo de comprimento, 17-30 pares de nucleotídeo de comprimento, 27-30 pares de nucleotídeo de comprimento, 17-23 pares de nucleotídeo de comprimento, 17-21 pares de nucleotídeo de comprimento, 17-19 pares de nucleotídeo de comprimento, 19-25 pares de nucleotídeo de comprimento, 19-23 pares de nucleotídeo de comprimento, 19- 21 pares de nucleotídeo de comprimento, 21-25 pares de nucleotídeo de comprimento ou 21-23 pares de nucleotídeo de comprimento. Em um outro exemplo, a região de dúplex é selecionada de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 e 27 nucleotídeos de comprimento.
[00266] Em uma modalidade, o agente de RNAi pode conter uma ou mais regiões de saliência e/ou grupos de capeamento na extremidade 3’, extremidade 5’ ou ambas as extremidades de um ou ambas as fitas. A saliência pode ser de 1-6 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, 2-6 nucleotídeos de comprimento, 1-5 nucleotídeo de comprimento, 2-5 nucleotídeos de comprimento, 1-4 nucleotídeo de comprimento, 2-4 nucleotídeos de comprimento, 1-3 nucleotídeo de comprimento, 2-3 nucleotídeos de comprimento ou 1-2 nucleotídeo de comprimento. As sobreposições podem ser o resultado de um a fita sendo maior do que o outro, ou o resultado de dois a fitas do mesmo comprimento estando desnivelados. A saliência pode formar uma incompatibilidade com o mRNA alvo ou ela pode ser complementar às sequências de gene sendo direcionadas ou pode ser uma outra sequência. Como aqui discutido, a saliência estendida de até 30 nucleotídeos de comprimento é também compreendida em várias modalidades da invenção. Os primeiro e segunda fitas podem ser também unidos, por exemplo, por bases adicionais para formar um grampo-de-cabelo, ou por outros ligantes não base.
[00267] Em uma modalidade, os nucleotídeos na região de saliência do agente de RNAi podem ser cada um independentemente um nucleotídeo modificado ou não modificado incluindo, mas não limitado a 2’-açúcar modificado, tal como 2-F, 2’-O-metila, timidina (T), 2’-O- metoxietila-5-metiluridina (Teo), 2’-O-metoxietiladenosina (Aeo), 2’-O- metoxietil-5-metilcitidina (m5Ceo) e qualquer combinações dos mesmos. Por exemplo, TT pode ser uma sequência de saliência para qualquer extremidade em qualquer a fita. A saliência pode formar uma incompatibilidade com o mRNA alvo ou ela pode ser complementar às sequências de gene sendo direcionadas ou pode ser uma outra sequência.
[00268] As sobreposições 5’ ou 3’ na fita senso, a fita antissenso ou ambas as fitas do agente de RNAi podem ser fosforiladas. Em algumas modalidades, a(s) região(ões) de saliência contém dois nucleotídeos tendo um fosforotioato entre os dois nucleotídeos, onde os dois nucleotídeos podem ser iguais ou diferentes. Em uma modalidade, a saliência está presente na extremidade 3’ da fita senso, a fita antissenso ou ambas as fitas. Em uma modalidade, esta saliência 3’ está presente na fita antissenso. Em uma modalidade, esta saliência 3’ está presente na fita senso.
[00269] O agente de RNAi pode conter apenas uma saliência, que pode reforçar a atividade de interferência do RNAi, sem afetar sua estabilidade geral. Por exemplo, a saliência de fita simples pode estar localizada no terminal 3’ da fita senso ou, alternativamente, no terminal 3’ da fita antissenso. O RNAi pode também ter uma extremidade cega, localizada na extremidade 5’ da fita antissenso (ou na extremidade 3’ da fita senso) ou vice-versa. Em geral, a fita antissenso do RNAi tem uma saliência de nucleotídeo na extremidade 3’, e a extremidade 5’ é cega. Embora não desejando ser limitado pela teoria, a extremidade cega assimétrica na extremidade 5’ da fita antissenso e saliência na extremidade 3’ da fita antissenso favorecem o carregamento da fita guia para o processo RISC.
[00270] Em uma modalidade, o agente de RNAi é um bluntmer de extremidade dupla de 19 nucleotídeos de comprimento, onde a fita senso contém pelo menos um motivo de três modificações 2’-F nos três nucleotídeos consecutivos nas posições 7, 8, 9 da extremidade 5’. A fita antissenso contém pelo menos um motivo de três modificações de 2’- O-metila em três nucleotídeos consecutivos nas posições 11, 12, 13 da extremidade 5’.
[00271] Em uma outra modalidade, o agente de RNAi é um bluntmer de extremidade dupla de 20 nucleotídeos de comprimento, onde a fita senso contém pelo menos um motivo de três modificações 2’-F em três nucleotídeos consecutivos nas posições 8, 9, 10 da extremidade 5’. A fita antissenso contém pelo menos um motivo de três modificações de 2’-O-metila em três nucleotídeos consecutivos nas posições 11, 12, 13 da extremidade 5’.
[00272] Em uma outra modalidade, o agente de RNAi é um bluntmer de extremidade dupla de 21 nucleotídeos de comprimento, onde a fita senso contém pelo menos um motivo de três modificações 2’-F em três nucleotídeos consecutivos nas posições 9, 10, 11 da extremidade 5’. A fita antissenso contém pelo menos um motivo de três modificações de 2’-O-metila em três nucleotídeos consecutivos nas posições 11, 12, 13 da extremidade 5’.
[00273] Em uma modalidade, o agente de RNAi compreende uma fita senso de 21 nucleotídeos e uma fita antissenso de 23 nucleotídeos, onde a fita senso contém pelo menos um motivo de três modificações de 2’-F em três nucleotídeos consecutivos nas posições 9, 10, 11 da extremidade 5’; a fita antissenso contém pelo menos um motivo de três modificações de 2’-O-metila em três nucleotídeos consecutivos nas posições 11, 12, 13 da extremidade 5’, onde uma extremidade do agente de RNAi é cega, enquanto a outra extremidade compreende uma saliência de 2 nucleotídeos. Preferivelmente, a saliência de 2 nucleotídeos está na extremidade 3’ da fita antissenso.
[00274] Quando a saliência de 2 nucleotídeos está na extremidade 3’ da fita antissenso, pode haver duas ligações internucleotídeo de fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais, onde dois dos três nucleotídeos são os nucleotídeos de saliência, e o terceiro nucleotídeo é um nucleotídeo emparelhado próximo do nucleotídeo de saliência. Em uma modalidade, o agente de RNAi tem ainda duas ligações internucleotídeo de fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais em ambas a extremidade 5’ da fita senso e na extremidade 5’ da fita antissenso. Em uma modalidade, cada nucleotídeo na fita senso e na fita antissenso do agente de RNAi, incluindo os nucleotídeos que são parte dos motivos, são nucleotídeos modificados. Em uma modalidade, cada resíduo é independentemente modificado com uma 2’-O-metila ou 3’-fluor, por exemplo, em um motivo alternado. Opcionalmente, o agente de RNAi compreende ainda um ligante (preferivelmente GalNAc3).
[00275] Em uma modalidade, o agente de RNAi compreende uma fita senso e um de antissentido, onde a fita senso é de 25-30 resíduos de nucleotídeo de comprimento, onde partindo do nucleotídeo 5’ terminal (posição 1) as posições 1 a 23 do primeira fita compreendem pelo menos 8 ribonucleotídeos; a fita antissenso é de 36-66 resíduos de nucleotídeo de comprimento, e partindo do nucleotídeo 3’ terminal, compreende pelo menos 8 ribonucleotídeos nas posições emparelhadas com as posições 1-23 da fita senso para formar um dúplex; onde pelo menos o nucleotídeo 3’ terminal da fita antissenso não está emparelhado com a fita senso, e até 6 nucleotídeos 3’ terminais consecutivos não estão emparelhados com a fita senso, desta maneira formando uma saliência de fita simples 3’ de 1-6 nucleotídeos; onde o terminal 5’ da fita antissenso compreende de a partir de 10-30 nucleotídeos consecutivos que não estão emparelhados com a fita senso, desta maneira formando uma saliência 5’ de fita simples de 1030 nucleotídeos; onde pelo menos os nucleotídeos terminais 5’ e terminais 3’ de fita senso estão emparelhados na base com nucleotídeos de fita antissenso quanda fitas senso e antissenso são alinhados para complementaridade máxima, desta maneira formando uma região substancialmente duplexada entre os a fitas senso e antissenso; e a fita antissenso é suficientemente complementar a um RNA alvo ao longo de pelo menos 19 ribonucleotídeos de comprimento de fita antissenso para reduzir a expressão de gene alvo quando o ácido nucleico de fita dupla é introduzido em uma célula de mamífero; e onde a fita senso contém pelo menos um motivo de três modificações de 2’- F em três nucleotídeos consecutivos, onde pelo menos um dos motivos ocorre no ou próximo do sítio de clivagem. A fita antissenso contém pelo menos um motivo de três modificações de 2’-O-metila em três nucleotídeos consecutivos no ou próximo do sítio de clivagem.
[00276] Em uma modalidade, o agente de RNAi compreende fitas senso e antissenso, onde o agente de RNAi compreende um primeira fita tendo um comprimento que é pelo menos de 25 e no máximo 29 nucleotídeos e um segunda fita tendo um comprimento que é no máximo de 30 nucleotídeos com pelo menos um motivo de três modificações de 2’-O-metila em três nucleotídeos consecutivos na posição 11, 12, 13 da extremidade 5’; onde a extremidade 3’ do primeira fita e a extremidade 5’ do segunda fita formam uma extremidade cega e o segunda fita é 14 nucleotídeos mais longo em sua extremidade 3’ do que o primeira fita, onde a região de dúplex que é de pelo menos 25 nucleotídeos de comprimento, e o segunda fita é suficientemente complementar ao mRNA ao longo de pelo menos 19 nucleotídeos do segundo comprimento de fita para reduzir expressão de gene alvo quando o agente de RNAi é introduzido em uma célula de mamífero, e onde a clivagem de dicer do agente de RNAi resulta preferivelmente em um siRNA compreendendo a extremidade 3’ do segunda fita, desta maneira reduzindo a expressão do gene alvo no mamífero. Opcionalmente, o agente de RNAi compreende ainda um ligante.
[00277] Em uma modalidade, a fita senso do agente de RNAi contém pelo menos um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, onde um dos motivos ocorre no sítio de clivagem na fita senso.
[00278] Em um modalidade, a fita antissenso do agente de RNAi pode também conter pelo menos um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, onde um dos motivos ocorre no ou próximo do sítio de clivagem na fita antissenso.
[00279] Para um agente de RNAi tendo uma região de dúplex de 1723 nucleotídeos de comprimento, o sítio de clivagem da fita antissenso é tipicamente ao redor das posições 10, 11 e 12 da extremidade 5’. Desta maneira os motivos de três modificações idênticas pode ocorrer nas posições 9, 10, 11; posições 10, 11, 12; posições 11, 12, 13; posições 12, 13, 14; ou posições 13, 14, 15 da fita antissenso, a conta começando do 1° nucleotídeo da extremidade 5’ da fita antissenso ou a conta começando do 1° nucleotídeo emparelhado dentro da região de dúplex da extremidade 5’ da fita antissenso. O sítio de clivagem na fita antissenso pode também mudar de acordo com o comprimento da região de dúplex do RNAi da extremidade 5’.
[00280] A fita senso do agente de RNAi pode conter pelo menos um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos no sítio de clivagem da fita; e a fita antissenso pode ter pelo menos um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos no ou próximo do sítio de clivagem da fita. Quando a fita senso e a fita antissenso formam um dúplex de dsRNA, a fita senso e a fita antissenso podem ser então alinhados de maneira que um motivo dos três nucleotídeos na fita senso e um motivo dos três nucleotídeos na fita antissenso têm pelo menos uma saliência de nucleotídeo, isto é, pelo menos um dos três nucleotídeos do motivo na fita senso forma um par de base com pelo menos um dos três nucleotídeos do motivo na fita antissenso. Alternativamente, pelo menos dois nucleotídeos podem se sobrepor, ou todos os três nucleotídeos podem se sobrepor.
[00281] Em uma modalidade, a fita senso do agente de RNAi pode conter mais de um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos. O primeiro motivo pode ocorrer no ou próximo do sítio de clivagem da fita e os outros motivos podem ser uma modificação de asa. O termo "modificação de asa" se refere aqui a um motivo ocorrendo em uma outra porção da fita que é separada do motivo no ou próximo do sítio de clivagem do mesma fita. A modificação de asa é ou adjacente ao primeiro motivo ou é separada por pelo menos um ou mais nucleotídeos. Quando os motivos são imediatamente adjacentes uns aos outros então as químicas dos motivos são distintas umas das outras e quando os motivos são separados por um ou mais nucleotídeos então as químicas podem ser iguais ou diferentes. Duas ou mais modificações de asa podem estar presentes. Por exemplo, quando duas modificações de asa estão presentes, cada modificação de asa pode ocorrer em uma extremidade com relação ao primeiro motivo que está no ou próximo do sítio de clivagem em qualquer lado do motivo principal.
[00282] Tal como a fita senso, a fita antissenso do agente de RNAi pode conter mais de um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, com pelo menos um dos motivos ocorrendo em ou próximo do sítio de clivagem da fita. Este a fita antissenso pode também conter uma ou mais modificações de asa em um alinhamento similar às modificações de asa que podem estar presentes na fita senso.
[00283] Em uma modalidade, a modificação de asa na fita senso ou a fita antissenso do agente de RNAi tipicamente não inclui o primeiro ou os dois nucleotídeos terminais na extremidade 3’, extremidade 5’ ou ambas as extremidades da fita.
[00284] Em uma outra modalidade, a modificação de asa na fita senso ou a fita antissenso do agente de RNAi tipicamente não inclui o primeiro ou os dois nucleotídeos emparelhados dentro da região de dúplex na extremidade 3’, extremidade 5’ ou ambas as extremidades da fita.
[00285] Quando a fita senso e a fita antissenso do agente de RNAi contêm cada um pelo menos uma modificação de asa, as modificações de asa podem cair na mesma extremidade da região de dúplex, e ter uma saliência de um, dois ou três nucleotídeos.
[00286] Quando a fita senso e a fita antissenso do agente de RNAi contêm cada um pelo menos duas modificações de asa, a fita senso e a fita antissenso podem ser então alinhados que duas modificações cada uma de um a fita caem em uma extremidade da região de dúplex, tendo uma saliência de um, dois ou três nucleotídeos; duas modificações cada uma de um a fita caem na outra extremidade da região de dúplex, tendo uma saliência de um, dois ou três nucleotídeos; duas modificações de um a fita caem em cada lado do motivo principal, tendo uma saliência de um, dois ou três nucleotídeos na região de dúplex.
[00287] Em uma modalidade, cada nucleotídeo na fita senso e a fita antissenso do agente de RNAi, incluindo os nucleotídeos que são parte dos motivos, pode ser modificado. Cada nucleotídeo pode ser modificado com a mesma modificação ou uma diferente que pode incluir uma ou mais alteração de um ou ambos dos oxigênios de fosfato de não ligação e/ou de um ou mais dos oxigênios de fosfato de ligação; alteração de um constituinte do açúcar ribose, por exemplo, da 2’ hidroxila no açúcar ribose; substituição em grande quantidade da porção fosfato com ligantes "defosfo"; modificação ou substituição de uma base de ocorrência natural; e substituição ou modificação da estrutura principal de ribose-fosfato.
[00288] Como ácidos nucleicos são polímeros de subunidades, muitas das modificações ocorrem em uma posição que é repetida dentro de um ácido nucleico, por exemplo, uma modificação de uma base, ou uma porção fosfato, ou um O de não ligação de uma porção fosfato. Em alguns casos a modificação ocorrerá em todas das posições objeto no ácido nucleico, mas em muitos casos não. A título de exemplo, uma modificação pode ocorrer apenas em uma posição terminal 3’ ou 5’, pode apenas ocorrer em uma região terminal, por exemplo, em uma posição em um nucleotídeo terminal ou nos últimos nucleotídeos 2, 3, 4, 5 ou 10 de um a fita. Uma modificação pode ocorrer em uma região de fita dupla, uma região de fita simples ou em ambas. Uma modificação pode ocorrer apenas na região de fita dupla de um RNA ou pode ocorrer apenas em uma região de fita simples de um RNA. Por exemplo, uma modificação de fosforotioato em uma posição O de não ligação pode apenas ocorrer em um ou ambos os terminais, pode apenas ocorre em uma região terminal, por exemplo, em uma posição em um nucleotídeo terminal ou nos últimos 2, 3, 4, 5 ou 10 nucleotídeos de um a fita, ou pode ocorrer em regiões de fita dupla ou a fita simples, particularmente em terminais. A extremidade ou extremidades 5’ podem ser fosforiladas.
[00289] Pode ser possível, por exemplo, aumentar a estabilidade, incluir bases particulares em sobreposições, ou incluir nucleotídeos modificados ou substitutos de nucleotídeo, em sobreposições de fita simples, por exemplo, em uma saliência 5’ ou 3’, ou em ambos. Por exemplo, pode ser desejável incluir nucleotídeos de purina em sobreposições. Em algumas modalidades todas ou algumas das bases em uma saliência 3’ ou 5’ podem ser modificadas, por exemplo, com uma modificação descrita aqui. Modificações podem incluir, por exemplo, o uso de modificações na posição 2’ do açúcar ribose com modificações que são conhecidas na técnica, por exemplo, o uso de desoxirribonucleotídeos, 2’-desoxi-2’-fluor (2’-F) ou 2’-O-metila modificados ao invés do açúcar ribose da nucleobase, e modificações no grupo fosfato, por exemplo, modificações de fosforotioato. As sobreposições não precisam ser homólogas à sequência alvo.
[00290] Em uma modalidade, cada resíduo da fita senso e a fita antissenso é independentemente modificado com LNA, CRN, cET, UNA, HNA, CeNA, 2’-metoxietila, 2’-O-metila, 2’-O-alila, 2’-C-alila, 2’- desoxi, 2’-hidroxila ou 2’-flúor. Os a fitas podem conter mais de uma modificação. Em uma modificação, cada resíduo da fita senso e da fita antissenso é independentemente modificado com 2’-O-metila ou 2’- flúor.
[00291] Pelo menos duas modificações diferentes estão tipicamente presentes na fita senso e a fita antissenso. Estas duas modificações podem ser as modificações de 2’-O-metila ou 2’-flúor ou outras.
[00292] Em uma modalidade, o Na e/ou Nb compreende modificações de um padrão alternado. O termo "motivo alternado" como aqui usado se refere a um motivo tendo uma ou mais modificações, cada modificação ocorrendo em nucleotídeos alternados de um a fita. O nucleotídeo alternado pode se referir a um por cada outro nucleotídeo ou um por cada três nucleotídeos, ou um padrão similar. Por exemplo, se A, B e C representarem, cada um, um tipo de modificação no nucleotídeo, o motivo alternado pode ser "AABBAABBAABB...," "AABAABAABAAB...," "AAABAAABAAAB...," "AAABBBAAABBB...,"ou "ABCABCABCABC...," etc.
[00293] O tipo de modificações contidas no motivo alternado pode ser igual ou diferente. Por exemplo, se A, B, C, D cada um representar um tipo de modificação no nucleotídeo, o padrão de alternação, isto é, modificações em nucleotídeo sim nucleotídeo não, pode ser igual, mas cada um da fita senso ou a fita antissenso pode ser selecionado de várias possibilidades de modificações dentro do motivo alternado tal "ABABAB.", "ACACAC." "BDBDBD." ou "CDCDCD.," etc.
[00294] Em uma modalidade, o agente de RNAi da invenção que compreende o padrão de modificação para o motivo de alternação na fita senso com relação ao padrão de modificação para o motivo de alternação na fita antissenso é mudado. A mudança pode ser tal de maneira que o grupo modificado de nucleotídeos da fita senso corresponde a um grupo diferentemente modificado de nucleotídeos da fita antissenso e vide versa. Por exemplo, a fita senso quando emparelhado com a fita antissenso no dúplex de dsRNA, o motivo de alternação na fita senso pode começar com "ABABAB" de 5’-3’ da fita e o motivo de alternação na fita antissenso pode começar com "BABABA" de 5’-3’ da fita com a região de dúplex. Como um outro exemplo, o motivo de alternação na fita senso pode começar com "AABBAABB" DE 5’-3’ da fita e do motivo de alternação na fita senso pode começar com "BBAABBAA" de 5’-3’ da fita dentro da região de dúplex, de maneira que há uma mudança completa ou parcial dos padrões de modificação entre a fita senso e a fita antissenso.
[00295] Em uma modalidade, o agente de RNAi que compreende o padrão do motivo de alternação de modificação de 2’-O-metila e modificação de 2’-F na fita senso incialmente tem uma mudança com relação ao padrão do motivo de alternação de modificação de 2’-O- metila e modificação de 2’-F na fita antissenso inicialmente, isto é, o nucleotídeo modificado com 2’-O-metila na fita senso emparelha em base com um nucleotídeo modificado com 2’-F na fita antissenso e vice- versa. A posição 1 da fita senso pode começar com a modificação 2’-F e a posição 1 da fita antissenso pode começar com a modificação de 2’- O-metila.
[00296] A introdução de um ou mais motivos de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos na fita senso e/ou a fita antissenso interrompe o padrão de modificação inicial presente na fita senso e/ou a fita antissenso. Esta interrupção do padrão de modificação da fita senso e/ou antissentido através da introdução de um ou mais motivos de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos para os a fitas senso e/ou antissenso aumenta surpreendentemente a atividade de silenciamento de gene para o gene alvo.
[00297] Em uma modalidade, quando o motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos é introduzido em qualquer um dos a fitas, a modificação do nucleotídeo próximo ao motivo é uma modificação diferente da modificação do motivo. Por exemplo, a porção da sequência contendo o motivo é "...NaYYYNb...," onde "Y" representa a modificação do motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos e "Na" e "Nb" representam uma modificação no nucleotídeo próximo do motivo "YYY" que é diferente da modificação de Y, e onde Na e Nb podem ser modificações iguais ou diferentes. Alternativamente, Na e/ou Nb pode estar presente ou ausente quando há uma modificação de asa presente.
[00298] O agente de RNAi pode compreender ainda pelo menos uma ligação internucleotídeo de fosforotioato ou metilfosfonato. A modificação de ligação internucleotídeo de fosforotioato ou metilfosfonato pode ocorrer em qualquer nucleotídeo da fita senso ou a fita antissenso ou ambas as fitas em qualquer posição da fita. Por exemplo, a modificação da ligação internucleotídeo pode ocorrer em cada nucleotídeo na fita senso e/ou a fita antissenso; cada modificação de ligação internucleotídeo pode ocorrer em um padrão alternado na fita senso e/ou a fita antissenso; ou a fita senso ou a fita antissenso pode conter ambas as modificações de ligação internucleotídeo em um padrão alternado. O padrão de alternação da modificação de ligação internucleotídeo na fita senso pode ser igual ou diferente da fita antissenso, e o padrão de alternação da modificação de ligação internucleotídeo na fita senso pode ter uma mudança com relação ao padrão de alternação da modificação de ligação internucleotídeo na fita antissenso. Em uma modalidade, um agente de RNAi de fita dupla compreende 6-8 ligações internucleotídeo de fosforotioato. Em uma modalidade, a fita antissenso compreende duas ligações internucleotídeo de fosforotioato no terminal 5’ e duas ligações internucleotídeo de fosforotioato no terminal 3’ e a fita senso compreende pelo menos duas ligações internucleotídeo de fosforotioato ou no terminal 5’ ou no terminal 3’.
[00299] Em uma modalidade, o RNAi compreende uma modificação de ligação internucleotídeo de fosforotioato ou metilfosfonato na região de saliência. Por exemplo, a região de saliência pode conter dois nucleotídeos tendo uma ligação internucleotídeo de fosforotioato ou metilfosfonato entre os dois nucleotídeos. Modificações de ligação internucleotídeo podem também ser feitas para ligar os nucleotídeos de saliência com os nucleotídeos terminais emparelhados dentro da região de dúplex. Por exemplo, pelo menos 2, 3, 4 ou todos os nucleotídeos de saliência podem ser ligados através de ligação internucleotídeo de fosforotioato ou metilfosfonato, e, opcionalmente, pode haver ligações internucleotídeo de fosforotioato ou metilfosfonato adicionais ligando o nucleotídeo de saliência com um nucleotídeo emparelhado que está próximo do nucleotídeo de saliência. Por exemplo, pode haver pelo menos duas ligações internucleotídeo de fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais, onde dois dos três nucleotídeos são nucleotídeos de saliência e o terceiro é um nucleotídeo emparelhado próximo do nucleotídeo de saliência. Estes três nucleotídeos terminais podem estar na extremidade 3’ da fita antissenso, na extremidade 3’ da fita senso, na extremidade 5’ da fita antissenso e/ou na extremidade 5’ da fita antissenso.
[00300] Em uma modalidade, a saliência de 2 nucleotídeos está na extremidade 3’ da fita antissenso, e há duas ligações internucleotídeo de fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais, onde dois dos três nucleotídeos são os nucleotídeos de saliência, e o terceiro nucleotídeo é um nucleotídeo emparelhado próximo do nucleotídeo de saliência. Opcionalmente, o agente de RNAi pode ter ainda duas ligações internucleotídeo de fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais em ambas as extremidades 5’ da fita senso e na extremidade 5’ da fita antissenso.
[00301] Em uma modalidade, o agente de RNAi compreende incompatibilidade(s) com o alvo, dentro do dúplex, ou suas combinações. A incompatibilidade pode ocorrer na região de saliência ou na região de dúplex. O par de base pode ser classificado com base em sua propensão a promover dissociação ou fusão (por exemplo, na energia livre de associação ou dissociação de um emparelhamento particular, a abordagem mais simples é examinar os pares em uma base em par individual, embora o vizinho próximo ou análise similar possa ser usada). Em termos de promoção de dissociação: A:U é preferido com relação a G:C; G:U é preferido com relação a G:C; e I:C é preferido com relação a G:C (I=inosina). Incompatibilidades, por exemplo, emparelhamentos não canônicos ou outros que não canônicos (como descrito em um outro ponto aqui) são preferidos com relação a emparelhamentos canônicos (A:T, A:U, G:C); e emparelhamentos que incluem uma base universal são preferidos com relação a emparelhamentos canônicos.
[00302] Em uma modalidade, o agente de RNAi compreende pelo menos um dos primeiros 1, 2, 3, 4 ou 5 pares de base dentro das regiões de dúplex a partir da extremidade 5’ da fita antissenso independentemente selecionados do grupo de: A:U, G:U, I:C, e pares incompatíveis, por exemplo, emparelhamentos não canônicos ou outros que não canônicos ou emparelhamentos que incluem uma base universal, para promover a dissociação da fita antissenso na extremidade 5’ do dúplex.
[00303] Em uma modalidade, o nucleotídeo na posição 1 dentro da região de dúplex da extremidade 5’ na fita antissenso é selecionado do grupo consistindo em A, dA, dU, U e dT. Alternativamente, pelo menos um do primeiro 1, 2 ou 3 par de base dentro da região de dúplex da extremidade 5’ da fita antissenso é um par de base AU. Por exemplo, o primeiro par de base dentro da região de dúplex da extremidade 5’ da fita antissenso é um par de base AU.
[00304] Em uma outra modalidade, o nucleotídeo na extremidade 3’ da fita senso é desoxitimidina (dT). Em uma outra modalidade, o nucleotídeo na extremidade 3’ da fita antissenso é desoxi-timina (dT). Em uma modalidade, há uma sequência curta de nucleotídeos de desoxi-timina, por exemplo, dois nucleotídeos dT na extremidade 3’ da fita senso e/ou antissenso.
[00305] Em uma modalidade, a sequência de fita senso pode ser representada pela fórmula (I):5' np-Na-(X X X )i-Nb-Y Y Y -Nb-(Z Z Z )j-Na-nq 3' (I) onde :
[00306] i e j são cada um independentemente 0 ou 1 ;
[00307] p e q são cada um independentemente 0-6 ;
[00308] cada Na representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 0-25 nucleotídeos modificados, cada sequência comrpeendendo pelo menos dois nucleotidoes diferentemente modificados ;
[00309] cada Nb representa independentemente uma sequência de oligonucleotideo comrpeendendo 0-10 nucleotídeos modificados ;
[00310] cada np e nq representa independentemente um nucleotídeo de saliência ;
[00311] onde Nb e Y não têm a mesma modificação ; e
[00312] XXX, YYY e ZZZ cada um representa independentemente um motivo de tres modificações identicas em tres nucleotídeos consecutivos. Preferivelmente, YYY são todos nucleotíeos modificados 2’-F.
[00313] Em uma modalidade, o Na e/ou Nb compreende modificações de padrão de alternação.
[00314] Em uma modalidade, o motivo YYY ocorre no ou próximo do sítio de clivagem da fita senso. Por exemplo, quando o agente de RNAi tem uma região de dúplex de 17-23 nucleotídeos de comprimento, o motivo YYY pode ocorrer no ou na vizinhança do sítio de clivagem (por exemplo, pode ocorrer nas posições 6, 7, 8, 7, 8, 9, 8, 9, 10, 9, 10, 11, 10, 11,12 ou 11, 12, 13) - da fita senso, a contagem começando do 1 ° nucleotídeo, da extremidade 5’; ou opcionalmente, a contagem começando no 1° nucleotídeo emparelhado dentro da região de dúplex, da extremidade 5’.
[00315] Em uma modalidade, i é 1 e j é 0 ou i é 0 e j é 1 ou ambos i e j são 1. A fita senso pode então ser representado pelas fórmulas que seguem: 5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Ib); 5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3' (Ic); ou 5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Id).
[00316] Quando a fita senso é representado pela fórmula (Ib), Nb representa uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 0-10, 0- 7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na pode representar independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 2-20, 2-15 ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00317] Quando a fita senso é representado como fórmula (Ic), Nb representa uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 0-10, 07, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na pode representar independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 2-20, 2-15 ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00318] Quando a fita senso é representado como fórmula (Id), cada Nb representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Preferivelmente, Nb é 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Cada Na pode representar independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 2-20, 2-15 ou 2-10 nucleotídeos modificados. Cada um de X, Y e Z pode ser igual ou diferente um do outro.
[00319] Em outras modalidades, i é 0 e j é 0, e o mesma fita senso pode ser representado pela fórmula: 5' np-Na-YYY- Na-nq 3' (Ia).
[00320] Quando a fita senso é representado pela fórmula (Ia), cada Na pode independentemente representar uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 2-20, 2-15 ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00321] Em uma modalidade, a sequência de fita antissenso do RNAi pode ser representada pela fórmula (II):5' nq‘-Na‘-(Z’Z‘Z‘)k-Nb‘-Y‘Y‘Y‘-Nb‘-(X‘X‘X‘)rN‘a-np‘ 3' (II) onde:
[00322] k e l são cada um independentemente 0 ou 1;
[00323] p’ e q’ são cada um independentemente 0-6;
[00324] cada Na‘ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 0-25 nucleotídeos modificados, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos diferentemente modificados;
[00325] cada Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 0-10 nucleotídeos modificados;
[00326] cada np‘ e nq‘ representa independentemente um nucleotide de saliência;
[00327] onde Nb’ e Y’ não têm a mesma modificação; e
[00328] X‘X‘X‘, Y’Y’Y’ e Z‘Z‘Z‘ cada um representa independentemente um motive de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos.
[00329] Em uma modalidade, o Na’ e/ou Nb’ compreendem modificações de padrão de alternação.
[00330] O motivo Y’Y’Y’ ocorre no ou próximo do sítio de clivagem da fita antissenso. Por exemplo, quando o agente de RNAi tem uma região de dúplex de 17-23 nucleotídeos de comprimento, o motivo Y’Y’Y’ pode ocorrer nas posições 9, 10, 11;10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14; ou 13, 14, 15 da fita antissenso, com a contagem começando do 1° nucleotídeo, da extremidade 5’; ou opcionalmente, a contagem começando como o 1° nucleotídeo emparelhado dentro da região de dúplex da extremidade 5’. Preferivelmente, o motivo Y’Y’Y’ ocorre nas posições 11, 12, 13.
[00331] Em uma modalidade, o motivo Y’Y’Y’ são todos nucleotídeos modificados com 2’-OMe.
[00332] Em uma modalidade, k é 1 e l é 0 ou k é 0 e l é 1 ou ambos k e l são 1.
[00333] A fita antissenso pode então ser representado pelas fórmulas que seguem: 5‘ nq’-Na’-Z’Z’Z’-Nb’-Y’Y’Y’-Na’-np’ 3‘ (IIb); 5‘ nq’-Na’-Y’Y’Y’-Nb’-X’X’X’-np’ 3‘ (IIc); ou 5‘ nq‘-Na‘- Z‘Z‘Z‘-Nb‘-Y‘Y‘Y‘-Nb‘- X’X’X’-Na’-np’ 3‘ (IId).
[00334] Quando a fita antissenso é representado pela fórmula (IIb), Nb’ representa uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 010, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 2-20, 2-15 ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00335] Quando a fita antissenso é representado como fórmula (IIc), Nb’ representa uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 010, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 2-20, 2-15 ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00336] Quando a fita antissenso é representado como fórmula (IId), cada Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 2-20, 2-15 ou 2-10 nucleotídeos modificados. Preferivelmente, Nb é 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
[00337] Em outras modalidades, k é 0 e l é 0 e a fita antissenso pode ser representado pela fórmula: 5' np’-Na’-Y’Y’Y’- Na’-nq’ 3' (Ia).
[00338] Quando a fita antissenso é representado como fórmula (IIa), cada Na’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 2-20, 2-15 ou 2-10 nucleotídeos modificados. Cada um de X’, Y’ e Z’ pode ser igual ou diferente um do outro.
[00339] Cada nucleotídeo da fita senso e a fita antissenso pode ser independentemente modificado com LNA, CRN, UNA, cEt, HNA, CeNA, 2’-metoxietila, 2’-O-metila, 2’-O-alila, 2’-C- alila, 2’-hidroxila ou 2’-flúor. Por exemplo, cada nucleotídeo da fita senso e da fita antissenso é independentemente modificado com 2’-O-metila ou 2’-flúor. Cada X, Y, Z, X’, Y’ e Z’, em particular, pode representar uma modificação de 2’-O- metila ou uma modificação de 2’-flúor.
[00340] Em uma modalidade, a fita senso do agente de RNAi pode conter motivo YYY ocorrendo nas posições 9, 10 e 11 da fita quando a região de dúplex é de 21 nt, a contagem começando a partir do 1° nucleotídeo da extremidade 5’ ou, opcionalmente, a contagem começando como o 1° nucleotídeo emparelhado dentro da região de dúplex, da extremidade 5’; e Y representa modificação de 2’-F. A fita senso pode conter ainda motivo XXX ou motivos ZZZ como modificações de asa na extremidade oposta da região de dúplex; e XXX e ZZZ representam cada um independentemente um modificação de 2’- OMe ou modificação de 2’-F.
[00341] Em uma modalidade a fita antissenso pode conter motivo Y’Y’Y’ ocorrendo nas posições 11, 12, 13 da fita, a contagem começando a partir do 1° nucleotídeo da extremidade 5’ ou, opcionalmente, a contagem começando no 1° nucleotídeo emparelhado dentro da região de dúplex, da extremidade 5’; e Y’ representa modificação de 2’-O-metila. A fita antissenso pode conter ainda motivo X’X’X’ ou motivos Z’Z’Z’ como modificações de asa na extremidade oposta da região de dúplex; e X’X’X’ e Z’Z’Z’ cada um representa independentemente uma modificação de 2’-Ome ou modificação de 2’- F.
[00342] A fita senso representado por qualquer uma das fórmulas (Ia), (Ib), (Ic) e (Id) forma um dúplex com uma fita antissenso sendo representado por qualquer uma das fórmulas (IIa), (IIb), (IIc) e (IId), respectivamente.
[00343] Desta maneira, os agentes de RNAi para uso nos métodos da invenção podem compreender uma fita senso e uma fita antissenso, cada a fita tendo 14 a 30 nucleotídeos, o dúplex de RNAi representado pela fórmula (III): senso: 5' np -Na-(X X X)i -Nb- Y Y Y -Nb -(Z Z Z)j-Na-nq 3' antissenso: 3' np-Na-(X’X‘X‘)k-Nb-Y‘Y‘Y‘-Nb-(Z‘Z‘Z‘)rNa-nq 5' (III) pq onde:
[00344] i, j, k e l são cada um independentemente 0 ou 1;
[00345] p, p\ q e q‘ são cada um independentemente 0-6;
[00346] cada Na e Na’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 0-25 nucleotídeos modificados, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos diferentemente modificados;
[00347] cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 0-10 nucleotídeos modificados;
[00348] onde cada np’, np, nq’, e nq, cada um deles pode estar ou não presente, representa independentemente um nucleotídeo de saliência; e
[00349] XXX, YYY, ZZZ, X‘X‘X‘, Y‘Y‘Y‘ e Z‘Z‘Z‘ representa cada um independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos.
[00350] Em uma modalidade, i é 0 e j é 0; ou i é 1 e j é 0; ou i é 0 e j é 1; ou ambos i e j são 0; ou ambos i e j são 1. Em uma outra modalidade, k é 0 e l é 0; ou k é 1 e l é 0; k é 0 e l é 1; ou ambos k e l são 0; ou ambos k e l são 1.
[00351] Combinações exemplares da fita senso e a fita antissenso formando um dúplex de RNAi incluem as fórmulas abaixo: 5' np- Na-Y Y Y -Na-nq 3' ’ ’ ’’ 3 np-Na-YYY -Na nq 5 (IIIa) 5' np-Na-Y Y Y -Nb -Z Z Z -Na-nq 3' ’ ’ ’ ’’ 3 np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na nq 5 (IIIb) 5' np-Na- X X X -Nb -Y Y Y - Na-nq 3' ’’ ’ ’’ 3 np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 5 (IIIc) 5' np-Na-X X X -Nb-Y Y Y -Nb- Z Z Z -Na-nq 3' ’’ ’ ’ ’ 3 np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 5 (IIId)
[00352] Quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIIa), cada Na representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 2-20, 2-15 ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00353] Quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIIb), cada Nb representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 1-10, 1-7, 1-5 ou 1-4 nucleotídeos modificados. Cada Na representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 2-20, 2-15 ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00354] Quando o agente de RNAi é representado como fórmula (IIIc), cada Nb, Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 2-20, 2-15 ou 2-10 nucleotídeos modificados.
[00355] Quando o agente de RNAi é representado como fórmula (IIId), cada Nb, Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na, Na’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeo compreendendo 2-20, 2-15 ou 2-10 nucleotídeos modificados. Cada um de Na, Na’, Nb e Nb’ compreende independentemente modificações de padrão de alternação.
[00356] Cada um de X, Y e Z nas fórmulas (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) e (IIId) pode ser igual ou diferente um do outro.
[00357] Quando o agente de RNAi é representado pelas fórmulas (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) e (IIId), pelo menos um dos nucleotídeos podem formar um par de base com um dos nucleotídeos Y’. Alternativamente, pelo menos dois dos nucleotídeos Y formam pares de base com os nucleotídeos Y’ correspondentes; ou todos os três dos nucleotídeos Y todos formam pares de base com os nucleotídeos Y’ correspondentes.
[00358] Quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIIb) ou (IIId), pelo menos um dos nucleotídeos Z pode formar um par de base com um dos nucleotídeos Z. Alternativamente, pelo menos dois dos nucleotídeos Z formam pares de base com os nucleotídeos Z’; ou todos os tres dos nucleotídeos Z formam pares de base com os nucleotídeos Z’ correspondentes.
[00359] Quando agente de RNAi é representado como fórmula (IIIc) ou (IIId), pelo menos um dos nucleotídeos Z pode formar um par de base com um dos nucleotídeos X’. Alternativamente, pelo menos dois dos nucleotídeos X formam pares de base com os nucleotídeos X’ correspondentes; ou todos os três dos nucleotídeos X todos formam pares de base com os nucleotídeos X’ correspondentes.
[00360] Em uma modalidade, a modificação no nucleotídeo Y é diferente da modificação no nucleotídeo Y’, a modificação no nucleotídeo Z é diferente da modificação no nucleotídeo Z’ e/ou a modificação no nucleotídeo X é diferente da modificação no nucleotídeo X’.
[00361] Em uma modalidade, quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIId), as modificações de Na são modificações de 2’-O-metila ou 2’-flúor. Em uma outra modalidade, quando o agente de RNAi é representa pela fórmula (IIId), as modificações de Na são modificações de 2’-O-metila ou 2’-flúor e n'p > 0 e pelo menos um np’ é ligado a um nucleotídeo vizinho através de uma ligação de fosforotioato. Em ainda uma outra modalidade, quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIId), as modificações de Na são modificações de 2’-O-metila ou 2’-flúor, np’ >0 e pelo menos um np’ é ligado a um nucleotídeo vizinho através de ligação fosforotioato, e a fita senso é conjugada a um ou mais derivados de GalNAc ligados através de um ligante bivalente ou trivalente ramificado (descrito abaixo). Em uma outra modalidade, quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIId), as modificações de Na são modificações de 2’-O-metila ou 2’-flúor, np’ >0 e pelo menos um np’ é ligado a um nucleotídeo vizinho através de ligação fosforotioato, a fita senso compreendendo pelo menos uma ligação fosforotioato, e a fita senso é conjugada a um ou mais derivados de GalNAc ligados através de um ligante bivalente ou trivalente ramificado.
[00362] Em uma modalidade, quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIIa), as modificações de Na são modificações de 2’-O-metila ou 2’-flúor, np‘ >0 e pelo menos um np‘ é ligado a um nucleotídeo vizinho através de ligação fosforotioato, a fita senso compreende pelo menos uma ligacao fosforotioato e a fita senso é conjugada a um ou mais derivados de GalNAc ligados através de um ligante bivalente ou trivalente ramificado.
[00363] Em uma modalidade, o agente de RNAi é um multímero contendo pelo menos dois dúplexes representados pelas fórmulas (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) e (IIId), onde os dúplexes são conectados por um ligante. O ligante pode ser clivável ou não clivável. Opcionalmente, o multímero compreende ainda um ligante. Cada um dos dúplexes pode se direcionar ao mesmo gene ou dois genes diferentes; ou cada um dos dúplexes pode se direcionar ao mesmo gene em dois sítios alvo diferentes.
[00364] Em uma modalidade, o agente de RNAi é um multímero contendo três, quatro, cinco, seis ou mais dúplexes representados pelas fórmulas (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) e (IIId), onde os dúplexes estão conectados por um ligante. O ligante pode ser clivável ou não clivável. Opcionalmente, o multímero compreende ainda um ligante. Cada um dos dúplexes pode se direcionar ao mesmo gene ou dois genes diferentes; ou cada um dos dúplexes pode se direcionar ao mesmo gene em dois sítios alvo diferentes.
[00365] Em uma modalidade, dois agentes de RNAi representados pelas fórmulas (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) e (IIId) são ligados uns aos outros na extremidade 5’ e uma ou ambas das extremidades 3’ e são opcionalmente conjugadas a um ligante. Cada um dos agentes pode se direcionar ao mesmo gene ou dois genes diferentes; ou cada um dos agentes pode se direcionar ao mesmo gene em dois sítios alvo diferentes.
[00366] Várias publicações descrevem agentes de RNAi multiméricos que podem ser usados nos métodos da invenção. Tais publicações incluem WO2007/091269, Patente U.S. No. 7858769, WO2010/141511, WO2007/117686, WO2009/014887 e WO2011/031520, os conteúdos de cada um são aqui incorporados a título de referência.
[00367] Como descrito em mais detalhes abaixo, o agente de RNAi que contém conjugações de uma ou mais porções carboidrato a um agente de RNAi pode otimizar uma ou mais propriedades do agente de RNAi. Em muitos casos, a porção carboidrato será ligada a uma subunidade modificada do agente de RNAi. Por exemplo, o açúcar ribose de uma ou mais subunidades de ribonucleotídeo de um agente dsRNA pode ser substituído com uma outra porção, por exemplo, um veículo não carboidrato (preferivelmente cíclico) ao qual é ligado um ligante de carboidrato. Uma subunidade ribonucleotídeo onde o açúcar ribose da subunidade foi então substituído é referida aqui como uma subunidade de modificação de substituição de ribose (RRMS). Um veículo cíclico pode ser um sistema de anel carbocíclico, isto é, todos os átomos no anel são átomos de carbono, ou um sistema de anel heterocíclico, isto é, um ou mais átomos no anel podem ser um heteroátomo, por exemplo, nitrogênio, oxigênio, enxofre. O veículo cíclico pode ser um sistema de anel monocíclico ou pode conter dois ou mais anéis, por exemplo, anéis fundidos. O veículo cíclico pode ser um sistema de anel totalmente saturado ou ele pode conter uma ou mais ligações duplas.
[00368] O ligante pode ser ligado ao polinucleotídeo através de um veículo. Os veículos incluem (i) pelo menos um "ponto de ligação de estrutura principal", preferivelmente dois "pontos de ligação de estrutura principal" e (ii) pelo menos um "ponto de ligação de ancoragem". Um ponto de ligação de estrutura principal" como usado aqui se refere a um grupo funcional, por exemplo, um grupo hidroxila ou, geralmente, uma ligação disponível para, e que é adequada para, incorporação ao veículo na estrutura principal, por exemplo, o fosfato, ou fosfato modificado, por exemplo, enxofre contendo, estrutura principal, de um ácido ribonucleico. Um "ponto de ligação de ancoragem" (TAP) em algumas modalidades se refere a um átomo de anel constituinte do veículo cíclico, por exemplo, um átomo de carbono ou um heteroátomo (distinto de um átomo que provê um ponto de ligação de estrutura principal), que conecta uma porção selecionada. A porção pode ser, por exemplo, um carboidrato, por exemplo, monossacarídeo, dissacarídeo, trissacarídeo, tetrassacarídeo, oligossacarídeo e polissacarídeo. Opcionalmente, a porção selecionada é conectada por uma ancoragem de intervenção ao veículo cíclico. Desta maneira, o veículo cíclico incluirá frequentemente um grupo funcional, por exemplo, um grupo amino, ou geralmente provê uma ligação, que é adequada para incorporação ou ancoragem de uma outra entidade química, por exemplo, um ligante ao anel constituinte.
[00369] Os agentes de RNAi podem ser conjugadas a um ligante através de um veículo, onde o veículo pode ser grupo cíclico ou grupo acíclico; preferivelmente o grupo cíclico é selecionado de pirrolidinila, pirazolinila, pirazolidinila, imidazolidinila, imidazolidinila, piperidinila, piperazinila, [1,3]dioxolano, oxazolidinila, isoxazolidinila, morfolinila, tiazolidinila, isotiazolidinila, quinoxalinila, piridazinonila, tetrai-hdrofurila e decalina; preferivelmente, o grupo acíclico é selecionado de estrutura principal de serinol ou estrutura principal de dietanolamina.
[00370] Em certas modalidades específicas, o agente de RNAi para uso nos métodos da invenção é um agente selecionado do grupo de agentes listados em qualquer uma das Tabelas 3, 4, 7, 8, 11, 13 e 15. Estes agentes podem compreender ainda um ligante.
IV. iRNAs Conjugados a Ligantes
[00371] Uma outra modificação do RNA de um iRNA da invenção envolve ligar quimicamente ao RNA um ou mais ligantes, porções ou conjugados que aumentam a atividade, distribuição celular ou absorção celular do iRNA. Tais porções incluem, mas não estão limitadas a, porções lipídeo tal como uma porção colesterol (Letsinger e outros, Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556), ácido cólico (Manoharan e outros, Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060), um tioéter, por exemplo, beril-S-tritiltiol (Manoharan e outros, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan e outros, Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770), um tiocolesterol (Oberhauser e outros, Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538), uma cadeia alifática, por exemplo, resíduos dodecanodiol ou undecila (Saison-Behmoaras e outros, EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov e outros, FEBS Lett., 1990, 259:327330; Svinarchuk e outros, Biochimie, 1993, 75:49-54), um fosfolipídeo, por exemplo, di-hexadecil-rac-glicerol ou 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero- 3-fosfonato de trietil-amônio (Manoharan e outros, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea e outros, Nucl. Acids Res., 1990, 18:37773783), uma poliamina ou uma cadeia de polietileno glicol (Manoharan e outros, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973), ou ácido acético adamantano (Manoharan e outros, Tetrahedron Lett., 1995,36:3651-3654), uma porção palmitila (Mishra e outros, Biochim. Biofys. Acta, 1995, 1264:229-237) ou uma porção octadecilamina ou hexilamino-carboniloxicolesterol (Crooke e outros, J. Farmacol. Exp. Ter., 1996, 277:923-937).
[00372] Em uma modalidade, um ligante altera a distribuição, direcionamento ou tempo de vida de um agente iRNA ao qual ele é incorporado. Em modalidades preferidas um ligante provê uma afinidade maior com um alvo selecionado, por exemplo, célula ou tipo de célula, compartimento, por exemplo, um celular ou outro compartimento de órgão, tecido, órgão ou região do corpo como, por exemplo, comparado com uma espécie ausente tal como ligante. Ligantes preferidos não participarão em emparelhamento de dúplex em um ácido nucleico duplexado.
[00373] Os ligantes podem incluir uma substância de ocorrência natural, tal como uma proteína (por exemplo, albumina de soro humano (HSA), lipoproteína de baixa densidade (LDL) ou globulina); carboidrato (por exemplo, um dextrano, pululano, quitina, quitosana, inulina, ciclodextrina, N-acetilgalactosamina ou ácido hialurônico); ou um lipídeo. O ligante também pode ser uma molécula recombinante ou sintética, tal como um polímero sintético, por exemplo, um poliamino ácido sintético. Exemplos de poliamino ácidos incluem poliamino ácidos é uma polilisina (PLL), ácido poli L-aspártico, ácido poli L-glutâmico, copolímero de estireno-anidrido de ácido maleico, copolímero de poli(L- lactídeo-co-glicolídeo), copolímero de éter de divinila-anidrido maleico, copolímero de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HMPA), polietileno glicol (PEG), álcool de polivinila (PVA), poliuretana, ácido poli(2- etilacrílico), polímeros de isopropilacrilamida ou polifosfazina. Exemplo de poliaminas incluem: polietilenoimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, pseudopeptídeo-poliamina, poliamina peptidomimética, poliamina de dendrímero, arginina, amidina, protamina, lipídeo catiônico, porfirina catiônica, sal quaternário de uma poliamina ou um peptídeo alfa helical.
[00374] Ligantes podem também incluir grupos de direcionamento, por exemplo, um agente de direcionamento a célula ou tecido, por exemplo, uma lectina, glicoproteína, lipídeo ou proteína, por exemplo, um anticorpo, que se liga a um tipo de célula especificado tal como uma célula do rim. Um grupo de direcionamento pode ser uma tirotropina, melanotropina, lectina, glicoproteína, proteína tensoativa A, carboidrato mucina, lactose multivalente, galactose multivalente, N-acetil- galactosamina, manose multivalente de N-acetil-glucosamina, fucose multivalente, poliaminoácidos glicosilados, galactose multivalente, transferrina, bifosfonato, poliglutamato, poliaspartato, um lipídeo, colesterol, um esteroide, ácido da bile, folato, vitamina B12, vitamina A, biotina ou um peptídeo RGD ou mimético de peptídeo RGD.
[00375] Outros exemplos de ligantes incluem corantes, agentes de intercalação (por exemplo, acridinas), reticulantes (por exemplo, psoraleno, mitomicina C), porfirinas (TPPC4, texafirina, Safirina), hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (por exemplo, fenazina, diidrofenazina), endonucleases artificiais (por exemplo, EDTA), moléculas lipofílicas, por exemplo, colesterol, ácido cólico, ácido acético adamantano, ácido 1-pireno butírico, diidrotestosterona, 1,3-Bis- O(hexadecil)glicerol, grupo geraniloxieila, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecila, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido O3-(oleoil)litocólico, ácido O3-(oleoil)colênico, dimetoxitritila ou fenoxazina) e conjugados de peptídeo (por exemplo, peptídeo antennapedia, peptídeo Tat), agentes de alquilação, fosfato, amino, mercapto, PEG (por exemplo, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alquila, alquila substituída, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos (por exemplo, biotina), facilitadores de transporte/absorção (por exemplo, aspirina, vitamina E, ácido fólico), ribonuclease sintéticas (por exemplo, imidazol, bisimidazol, histamina, agrupamentos imidazol, conjugados de acridina-imidazol, complexo Eu3+ de tetra-azamacrociclos), dinitrofenil, HRP ou AP.
[00376] Ligantes podem ser proteínas, por exemplo, glicoproteínas, ou peptídeos, por exemplo, moléculas tendo uma afinidade específica com um co-ligante, ou anticorpos, por exemplo, um anticorpo que se liga a um tipo de célula especificado tal como uma célula hepática. Ligantes podem também incluir hormônios e receptores de hormônio. Eles podem também incluir espécies não peptídicas, tais como lipídeos, lectinas, carboidratos, vitaminas, cofatores, lactose multivalente, galactose multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil-glucosamina, manose multivalente ou fucose multivalente. O ligante pode ser, por exemplo, um lipopolissacarídeo, um ativador de p38 MAP cinase ou um ativador de NF-KB.
[00377] O ligante pode ser uma substância, por exemplo, um fármaco, que pode aumentar a absorção do agente iRNA na célula, por exemplo, através de rompimento do citoesqueleto da célula, por exemplo, através de rompimento dos microtúbulos da célula, microa fitas e/ou a fitas intermediários. O fármaco pode ser, por exemplo, taxon, vincristina, vimblastina, citocalasina, nocodazol, japlakinolida, latrunculina A, faloidina, swinholida A, indanocina ou mioservina.
[00378] Em algumas modalidades, um ligante ligado a um iRNA como descrito aqui age como um modulador farmacocinético (modulador PK). Moduladores PK incluem lipófilos, ácidos da bile, esteroides, análogos de fosfolipídeo, peptídeos, agentes de ligação de proteína, PEG, vitaminas, etc. Moduladores PK exemplares incluem, mas não estão limitados a, colesterol, ácidos graxos, ácido cólico, ácido litocólico, dialquilglicerídeos, diacilglicerídeo, fosfolipídeos, esfingolipídeos, naproxeno, ibuprofeno, vitamina E, biotina, etc. Oligonucleotídeos que compreendem várias ligações fosforotioato são também conhecidos se ligar à proteína no soro, desta maneira oligonucleotídeos curtos, por exemplo, oligonucleotídeos de cerca de 5 bases, 10 bases, 15 bases ou 20 bases, compreendendo múltiplas de ligações fosforotioato na estrutura principal são também condescendentes à presente invenção como ligantes (por exemplo, como ligantes de modulação de PK). Ainda, aptâmeros que se ligam a componentes no soro (por exemplo, proteínas no soro) são também adequados para uso como ligantes de modulação de PK nas modalidades descritas aqui.
[00379] Oligonucleotídeos conjugados a ligante da invenção podem ser sintetizados através do uso de um oligonucleotídeo que carrega uma funcionalidade reativa pendente, tal como aquela derivada da ligação de uma molécula ligante no oligonucleotídeo (descrito abaixo). Este oligonucleotídeo reativo pode ser reagido diretamente com ligantes comercialmente disponíveis, ligantes que são sintetizados carregando qualquer um de uma variedade de grupos de proteção, ou ligantes que têm uma porção de ligação ligada a eles.
[00380] Os oligonucleotídeos usados nos conjugados da presente invenção podem ser convenientemente e rotineiramente feitos através das técnicas bem conhecidas de síntese de fase sólida. Equipamento para tal síntese é vendido por vários vendedores incluindo, por exemplo, Applied Biosystems (Foster City, Calif.). Quaisquer outros meios para tal síntese conhecidos na técnica podem ainda ou alternativamente ser empregados. É também conhecido usar técnicas similares para preparar outros oligonucleotídeos, tais como os fosforotioato e derivados alquilados.
[00381] Nos oligonucleotídeos conjugados a ligante e nucleosídeos ligados específicos de sequência carregando molécula ligante da presente invenção, os oligonucleotídeos e oligonucleosídeos podem ser montados em um sintetizador de DNA adequado utilizando precursores de nucleotídeo ou nucleosídeo padrão, ou precursores conjugados de nucleotídeo ou nucleosídeo que já carregam a porção de ligação, precursores de conjugado ligante-nucleotídeo ou nucleosídeo que já carregam a molécula ligante, ou blocos de formação carregando ligante não nucleosídeo.
[00382] Quando usando precursores conjugados a nucleotídeo que já carregam uma porção de ligação, a síntese dos nucleosídeos ligados específicos de sequência é tipicamente completada, e a molécula de ligante é então reagida com a porção de ligação para formar o oligonucleotídeo conjugado a ligante. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos ou nucleosídeos ligados da presente invenção são sintetizados por um sintetizador automático usando fosforamiditas derivadas de conjugados de ligante-nucleosídeo em adição às fosforamiditas padrão e fosforamiditas não padrão que estão comercialmente disponíveis e rotineiramente usadas em síntese de oligonucleotídeo.
A. Conjugados de Lipídeo
[00383] Em uma modalidade, o ligante ou conjugado é um lipídeo ou molécula à base de lipídeo. Tal lipídeo ou molécula à base de lipídeo se liga preferivelmente a uma proteína no soro, por exemplo, albumina do soro humano (HSA). Um ligante de ligação a HSA permite distribuição do conjugado a um tecido alvo, por exemplo, um tecido alvo de não rim do corpo. Por exemplo, o tecido alvo pode ser o fígado, incluindo células parenquimais do fígado. Outras moléculas que podem se ligar a HSA também pode ser usadas como ligantes. Por exemplo, naproxeno ou aspirina pode ser usado. Um lipídeo ou ligante à base de lipídeo pode (a) aumentar a resistência à degradação do conjugado, (b) aumentar o direcionamento ou transporte para uma célula alvo ou membrana celular e/ou (c) pode ser usado para ajustar ligação a uma proteína do soro, por exemplo, HSA.
[00384] Um ligante à base de lipídeo pode ser usado para inibir, por exemplo, controlar a ligação do conjugado a um tecido alvo. Por exemplo, um ligante de lipídeo ou à base de lipídeo que se liga a HSA mais fortemente será menos provável de ser direcionado ao rim e desta maneira menos provável de ser eliminado do corpo. Um ligante de lipídeo ou à base de lipídeo que se liga a HSA menos fortemente pode ser usado para direcionar o conjugado ao rim.
[00385] Em uma modalidade preferida, o ligante à base de lipídeo se liga a BSA. Preferivelmente, ele se liga a HSA com uma afinidade suficiente de maneira que o conjugado será preferivelmente distribuído a um tecido não do rim. No entanto, é preferido que a afinidade não seja tão forte que a ligação ao ligante de HSA não possa ser revertida.
[00386] Em uma outra modalidade preferida, os ligantes à base de lipídeo se ligam a HSA fracamente ou não se ligam de modo algum, de maneira que o conjugado será preferivelmente distribuído para o rim. Outras porções que se direcionam às células do rim também podem ser usadas no lugar de ou em adição ao ligante à base de lipídeo.
[00387] Em um outro aspecto, o ligante é uma porção, por exemplo, uma vitamina, que é absorvido por uma célula alvo, por exemplo, uma célula em proliferação. Estes são particularmente úteis para tratamento de distúrbios caracterizados por proliferação de célula indesejada, por exemplo, do tipo maligno ou não maligno, por exemplo, células de câncer. Vitaminas exemplares incluem vitaminas A, E e K. Outras vitaminas exemplares incluem vitamina B, por exemplo, ácido fólico, B12, riboflavina, biotina, pirodoxal ou outras vitaminas ou nutrientes absorvidos por células alvo tais como células do fígado. Estão também incluídos HSA e lipoproteína de baixa densidade (LDL).
B. Agentes de Permeação de Célula
[00388] Em um outro aspecto, o ligante é um agente de permeação de célula, preferivelmente um agente de permeação de célula helical.Preferivelmente, o agente é anfifático. Um agente exemplar é um peptídeo como tat ou antennopedia. Se o agente por um peptídeo, ele pode ser modificado, incluindo um peptidilmimético, invertômeros, ligações não peptídeo ou pseudo-peptídeo e uso de D-aminoácidos. O agente helical é preferivelmente um agente alfa-helical, que tem preferivelmente uma fase lipofílica e uma lipofóbica.
[00389] O ligante pode ser um peptídeo ou peptidomimético. Um peptidomimético (também aqui referido como um oligopeptidomimético) é uma molécula capaz de se dobrar em uma estrutura tridimensional definida similar a um peptídeo natural. A ligação de peptídeo e peptidomiméticos a agentes iRNA pode afetar a distribuição farmacocinética do iRNA, tal como através do aumento de reconhecimento e absorção celular. A porção de peptídeo ou peptidomimético pode ser de cerca de 5-50 aminoácidos de comprimento, por exemplo, cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 aminoácidos de comprimento.
[00390] Um peptídeo ou peptidomimético pode ser, por exemplo, um peptídeo de permeação de célula, peptídeo catiônico, peptídeo anfifático ou peptídeo hidrofóbico (por exemplo, consistindo principalmente em Tyr, Trp ou Fe). A porção de peptídeo pode ser um peptídeo dendrímero, peptídeo restrito ou peptídeo reticulado. Em uma outra alternativa, a porção de peptídeo pode incluir uma sequência de translocação de membrana hidrofóbica (MTS). Um peptídeo contendo MTS hidrofóbico exemplar é RFGF tendo a sequência de aminoácido AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 9). Um análogo de RFGF (por exemplo, sequência de aminoácido AALLPVLLAAP (SEQ ID NO: 10) contendo um MTS hidrofóbico também pode ser uma porção de direcionamento. A porção de peptídeo pode ser um peptídeo de "administração", que pode carregar moléculas polares grandes incluindo peptídeos, oligonucleotídeos e proteína através das membranas celulares. Por exemplo, sequências da proteína Tat HIV (GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 11) e a proteína Antennapedia de Drosophila (RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 12) foram verificadas ser capazes de funcionar como peptídeos de administração. Um peptídeo ou peptidomimético pode ser codificado por uma sequência aleatória de DNA, tal como um peptídeo identificado de uma biblioteca de exibição de fago, ou biblioteca combinatorial de uma-conta-um- composto (OBOC) (Lam e outros, Nature, 354:82-84, 1991). Exemplos de um peptídeo ou peptidomimético ancorado a um agente dsRNA através de uma unidade de monômero incorporada para propósitos de direcionamento celular é um peptídeo de arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) ou mimético de RGD. Uma porção de peptídeo pode variar em comprimento de a partir de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos. As porções de peptídeo podem ter uma modificação estrutural, tal como para aumentar a estabilidade ou direcionar propriedades conformacionais. Qualquer uma das modificações estruturais descritas abaixo pode ser utilizada.
[00391] Um peptídeo RGD para uso nas composições e métodos da invenção pode ser linear ou cíclico, e pode ser modificado, por exemplo, glicosilado ou metilado, para facilitar direcionamento a um tecido(s) específico(s). Peptídeos e peptidomiméticos contendo RGD podem incluir D-aminoácidos, bem como miméticos de RGD sintéticos. Em adição a RGD, podem ser usadas porções que se direcionam ao ligante de integrina. Conjugados preferidos deste ligante se direcionam a PECAM-1 ou VEGF.
[00392] Um "peptídeo de permeação de célula" é capaz de permeação de uma célula, por exemplo, uma célula microbiana, tal como uma célula bacteriana ou fúngica, ou uma célula de mamífero, tal como uma célula humana. Um peptídeo de permeação de célula microbiana pode ser, por exemplo, um peptídeo linear α-helical (por exemplo, LL-37 ou Ceropin P1), um peptídeo contendo ligação dissulfeto (por exemplo, α-defensina, β-defensina ou bactenecina) ou um peptídeo contendo apenas um ou dois aminoácidos dominantes (por exemplo, PR-39 ou indolicidina). Um peptídeo de permeação de célula pode também incluir um sinal de localização nuclear (NLS). Por exemplo, um peptídeo de permeação de célula pode ser um peptídeo anfifático bipartido, tal como MPG, que é derivado do domínio de peptídeo de fusão de HIV-1 gp41 e do NLS de antígeno T grande SV40 (Simeoni e outros, Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003).
C. Conjugados de Carboidrato
[00393] Em algumas modalidades das composições e métodos da invenção, um oligonucleotídeo de iRNA compreende ainda um carboidrato. O iRNA conjugado a carboidrato é vantajoso para a administração in vivo de ácidos nucleicos, bem como composições adequadas para uso terapêutico in vivo, como aqui descrito. Como aqui usado, "carboidrato" se refere a um composto que é ou um carboidrato per se formado de uma ou mais unidades monossacarídeo tendo pelo menos 6 átomos de carbono (que podem ser lineares, ramificados ou cíclicos) com um átomo de oxigênio, nitrogênio ou enxofre ligado a cada átomo de carbono; ou um composto tendo como uma parte do mesmo uma porção carboidrato feita de uma ou mais unidades monossacarídeo cada uma tendo pelo menos seis átomos de carbono (que podem ser lineares, ramificados ou cíclicos), com um átomo de oxigênio, nitrogênio ou enxofre ligados a cada átomo de carbono. Carboidratos representativos incluem os açúcares (mono-, di-, tri- e oligossacarídeos contendo de a partir de cerca de 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 unidades monossacarídeo) e polissacarídeos tais como amidos, glicogênio, celulose e gomas de polissacarídeo. Monossacarídeos específicos incluem AGT e açúcares acima (por exemplo, AGT, C6, C7 ou C8); die trissacarídeos incluem açúcares tendo duas ou três unidades monossacarídeo (por exemplo, AGT, C6, C7 ou C8).
[00394] Em uma modalidade, um conjugado de carboidrato para uso nas composições e métodos da invenção é um monossacarídeo. Em uma modalidade, o monossacarídeo é uma N-acetilgalactosamina, tal como
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[00395] Em uma outra modalidade, um conjugado de carboidrato para uso nas composições e métodos da invenção é selecionado do grupo consistindo em:
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[00396] Um outro conjugado de carboidrato representativo para uso nas modalidades descritas aqui inclui, mas não está limitado a,
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(Fórmula XXIII), quando um de X ou Y é um oligonucleotídeo, o outro é um hidrogênio.
[00397] Em algumas modalidades, o conjugado de carboidrato compreende ainda um ou mais ligantes adicionais como acima descrito tais como, mas não limitado a, um modulador PK e/ou um peptídeo de permeação de célula.
[00398] Conjugados de carboidrato adicionais (e ligantes) adequados para uso na presente invenção incluem aqueles descritos nas Publicações PCT Nos. WO 2014/179620 e WO 2014/179627, os conteúdos em sua totalidade de cada um são aqui incorporados a título de referência.
D. Ligantes
[00399] Em algumas modalidades, o conjugado ou ligante descrito aqui pode ser ligado a um oligonucleotídeo de iRNA com vários ligantes que podem ser cliváveis ou não cliváveis.
[00400] O termo "ligante" ou "grupo de ligação" significa uma porção orgânica que conecta duas partes de um composto, por exemplo, liga covalentemente duas partes de um composto. Os ligantes tipicamente compreendem uma ligação direta ou um átomo tal como oxigênio ou enxofre, uma unidade tal como NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH ou uma cadeia de átomos, tal como, mas não limitado a, alquila substituída ou não substituída, alquenila substituída ou não substituída, alquinila substituída ou não substituída, arilalquila, arilalquenila, arilalquinila, heteroarilalquila, heteroarilalquenila, heteroarilalquinila, heterociclilalquila, heterociclilalquenila, heterociclilalquinila, arila, heteroarila, heterociclila, cicloalquila, cicloalquenila, alquilarilalquila, alquilarilalquenila, alquilarilalquinila, alquenilarilalquila,alquenilarilalquenila, alquenilarilalquinila, alquinilarilalquila, alquinilarilalquenila, alquinilarilalquinila, alquileteroarilalquila, alquileteroarilalquenila, alquileteroarilalquinila, alquenileteroarilalquila, alquenileteroarilalquenila, alquenileteroarilalquinila,alquinileteroarilalquila, alquinileteroarilalquenila,alquinileteroarilalquinila, alquileterociclilalquila, alquileterociclilalquenila, alquileterociclilalquinila, alquenileterociclilalquila,alquenileterociclilalquenila, alquenileterociclilalquinila,alquinileterociclilalquila, alquinileterociclilalquenila,alquinileterociclilalquinila, alquilarila, alquenilarila, alquinilarila, alquileteroarila, alquenileteroarila, alquinileteroarila, em que um ou mais metilenos podem ser interrompidos ou terminados por O, S, S(O), SO2, N(R8), C(O), arila substituída ou não substituída, heteroarila substituída ou não substituída, heterocíclico substituído ou não substituído; onde R8 é hidrogênio, acila, alifático ou alifático substituído. Em uma modalidade, o ligante tem entre cerca de 1-24 átomos, 2-24, 3-24, 4-24, 5-24, 6-24, 6-18, 7-18, 8-18 átomos, 7-17, 8-17, 6-16, 7-16 ou 8-16 átomos.
[00401] Um grupo de ligação clivável é um que é suficientemente estável fora da célula, mas que quando da entrada em uma célula alvo é clivado para liberar as duas partes do ligante que ele está unindo. Em uma modalidade preferida, o grupo de ligação clivável é clivado pelo menos cerca de 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes ou mais, ou pelo menos cerca de 100 vezes mais rápido em uma célula alvo ou sob uma primeira condição de referência (que podem, por exemplo, ser selecionadas para imitar ou representar condições intracelulares) do que no sangue de um indivíduo, ou sob uma segunda condição de referência (que pode, por exemplo, ser selecionada para imitar ou representar condicoes encontradas no sangue ou soro).
[00402] Grupos de ligação cliváveis são suscetíveis a agentes de clivagem, por exemplo, pH, potencial redox ou a presença de moléculas degradantes. Em geral, agentes de clivagem são mais prevalentes ou encontrados em níveis ou atividades maiores dentro das células do que em soro ou sangue. Exemplos de tais agentes degradantes incluem: agentes redox que são selecionados para substratos particulares ou que não têm nenhuma especificidade de substrato incluindo, por exemplo, enzimas oxidativas ou redutoras ou agentes redutores tais como mercaptano, presentes em células, que podem degradar um grupo de ligação clivável redox através de redução; esterases; endossomos ou agentes que podem criar um ambiente ácido, por exemplo, aqueles que resultam em um pH de cinco ou menos; enzimas que podem hidrolisar ou degradar um grupo de ligação clivável ácido agindo como um ácido geral, peptidases (que podem ser específicas de substrato) e fosfatases.
[00403] Um grupo ligante clivável, tal como uma ligação dissulfeto, pode ser suscetível a pH. O pH do soro humano é 7,4, enquanto o pH intracelular médio é ligeiramente menor, variando de cerca de 7,1-7,3. Endossomos têm um pH mais ácido, na faixa de 5,5-6,0, e lisossomos têm um pH ainda mais ácido em torno de 5,0. Alguns ligantes terão um grupo de ligação clivável que é clivado em um pH preferido, desta maneira liberando um lipídeo catiônico do ligante dentro da célula, ou para o compartimento desejado da célula.
[00404] Um ligante pode incluir um grupo de ligação clivável que é clivável por uma enzima particular. O tipo de grupo de ligação clivável incorporado a um ligante pode depender da célula a ser direcionada. Por exemplo, um ligante de direcionamento ao fígado pode ser ligado a um lipídeo catiônico através de um ligante que inclui um grupo éster. Células do fígado são ricas em esterases e, desta maneira, o ligante será clivado mais eficientemente em células do fígado do que em tipos de célula que não são ricas em esterase. Outros tipos de célula ricos em esterases incluem células do pulmão, córtex renal e testículos.
[00405] Os ligantes que contêm ligações de peptídeo podem sr usados quando se direcionando a tipos de célula ricos em peptidases, tais como células do fígado e sinoviócitos.
[00406] Em geral, a adequabilidade de um grupo de ligação clivável candidato pode ser avaliada através do teste da habilidade de um agente de degradação (ou condição) em clivar o grupo de ligação candidato. Será também desejável testar o grupo de ligação clivável candidato quanto à habilidade em resistir à clivagem no sangue ou quando em contato com outro tecido não alvo. Desta maneira, pode ser determinada a susceptibilidade relativa para clivagem entre uma primeira e uma segunda condição, onde a primeira é selecionada para ser indicativa de clivagem em uma célula alvo e a segunda é selecionada para ser indicativa de clivagem em outros tecidos ou fluidos biológicos, por exemplo, sangue ou soro. As avaliações podem ser realizadas em sistemas livres de célula, em células, em cultura de célula, em cultura de órgão ou tecido ou em animais inteiros. Pode ser útil fazer avaliações iniciais em condições livres de célula ou cultura e confirmar através de avaliações adicionais em animais inteiros. Em modalidades preferidas, compostos candidatos úteis são clivados pelo menos cerca de 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou cerca de 100 vezes mais rápido na célula (ou sob condições in vitro selecionadas para imitar condicoes intracelulares) comparado com sangue ou soro (ou sob condições in vitro selecionadas para imitar condições extracelulares).
i. Grupos de ligação cliváveis redox
[00407] Em uma modalidade, um grupo de ligação clivável é um grupo de ligação clivável redox que é clivado quando da redução ou oxidação. Um exemplo de grupo de ligação redutivamente clivável é um grupo de ligação dissulfeto (-S-S-). Para determinar se um grupo de ligação clivável candidato é um "grupo de ligação redutivamente clivável" adequado ou, por exemplo, é adequado para uso com uma porção iRNA particular e agente de direcionamento particular métodos descritos aqui podem ser procurados. Por exemplo, um candidato pode ser avaliado através de incubação com ditiotreitol (DTT) ou outro agente de redução usando reagentes conhecidos na técnica, que imitam a taxa de clivagem que seria observada em uma célula, por exemplo, uma célula alvo. Os candidatos também podem ser avaliados sob condições que são selecionadas para imitar condições do sangue ou soro. Em uma, os compostos candidatos são clivados em no máximo cerca de 10% no sangue. Em outras modalidades, compostos candidatos úteis são degradados pelo menos cerca de 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou cerca de 100 vezes mais rápido na célula (ou sob condições in vitro selecionadas para imitar condições intracelulares) comparado com sangue (ou sob condições in vitro selecionadas para imitar condições extracelulares). A taxa de clivagem de compostos candidatos pode ser determinada usando ensaios cinéticos de enzima padrão sob condições escolhidas para imitar meios intracelulares e comparado a condições escolhidas imitar meios extracelulares.
ii. Grupos de ligação cliváveis à base de fosfato
[00408] Em uma outra modalidade, um ligante clivável compreende um grupo de ligação clivável à base de fosfato. Um grupo de ligação clivável à base de fosfato é clivado por agentes que degradam ou hidrolisam o grupo fosfato. Um exemplo de um agente que cliva grupos fosfato em células são enzimas tais como fosfatases em células. Exemplos de grupos de ligação à base de fosfato são -O-P(O)(ORk)-O- , -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)- S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)- O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, - O-P(S)(Rk)-S-. Modalidades preferidas são -O-P(O)(OH)-O-, -O- P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S- P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O- P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S- . Estes candidatos podem ser avaliados usando métodos análogos àqueles descritos acima.
iii. Grupos de ligação cliváveis ácidos
[00409] Em uma outra modalidade, um ligante clivável compreende um grupo de ligação clivável ácido. Um grupo de ligação clivável ácido é um grupo de ligação que é clivado sob condições ácidas. Em modalidades preferidas grupos de ligação cliváveis ácidos são clivados em um ambiente ácido com um pH de cerca de 6,5 ou menos (por exemplo, cerca de 6,0, 5,75, 5,5, 5,25, 5,0 ou menor) ou por agentes tais como enzimas que podem agir como um ácido geral. Em uma célula, organelas de pH baixo específicas, tais como endossomos e lisossomos, podem prover um ambiente de clivagem para grupos de ligação cliváveis ácidos. Exemplos de grupos de ligação cliváveis ácidos incluem, mas não estão limitados a, hidrazonas, ésteres e ésteres de aminoácidos. Grupos cliváveis ácidos podem ter a fórmula geral -C=NN- , C(O)O ou -OC(O). Uma modalidade preferida é quando o carbono ligado ao oxigênio do éster (o grupo alquila) é um grupo arila, grupo alquila substituído ou grupo alquila terciário tal como dimetil pentila ou t-butila. Estes candidatos podem ser avaliados usando métodos análogos àqueles descritos acima.
iv. Grupos de ligação à base de éster
[00410] Em uma outra modalidade, um ligante clivável compreende um grupo de ligação clivável à base de éster. Um grupo de ligação clivável à base de éster é clivado por enzimas tais como esterases e amidases em células. Exemplos de grupos de ligação cliváveis à base de éster incluem, mas não estão limitados a, ésteres de grupos alquileno, alquenileno e alquinileno. Grupos de ligação cliváveis de éster têm a fórmula geral -C(O)O- ou -OC(O)-. Estes candidatos podem ser avaliados usando métodos análogos àqueles descritos acima.
v. Grupos de clivagem à base de peptídeo
[00411] Em ainda uma outra modalidade, um ligante clivável compreende um grupo de ligação clivável à base de peptídeo. Um grupo de ligação clivável à base de peptídeo é clivado por enzimas tais como peptidases e proteases em células. Grupos de ligação cliváveis à base de peptídeo são ligações de peptídeo formadas entre aminoácidos para fornecer oligopeptídeos (por exemplo, dipeptídeos, tripeptídeo, etc) e polipeptídeos. Grupos cliváveis à base de peptídeo não incluem o grupo amida (-C(O)NH-). O grupo amida pode ser formado entre um alquileno, alquenileno ou alquinileno. Uma ligação de peptídeo é um tipo especial de ligação amida formada entre aminoácidos para fornecer peptídeos e proteínas. O grupo de clivagem à base de peptídeo é geralmente limitado à ligação de peptídeo (isto é, a ligação de amida) formada entre aminoácidos fornecendo peptídeos e proteínas e não inclui o grupo amida funcional inteiro. Grupos de ligação cliváveis à base de peptídeo têm a fórmula geral - NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-, onde RA e RB são os grupos R dos dois aminoácidos adjacentes. Esses candidatos podem ser avaliados usando métodos análogos àqueles descritos acima.
[00412] Em uma modalidade, um iRNA da invenção é conjugado a um carboidrato através de um ligante. Exemplos não limitantes de conjugados de carboidrato de iRNA com ligantes das composições e métodos da invenção incluem, mas não estão limitados a,
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quando um de X ou Y é um oligonucleotídeo, o outro é um hidrogênio.
[00413] Em certas modalidades das composições e métodos da invenção, um ligante é um ou mais derivados de "GalNAc" (N- acetilgalactosamina) ligados através de um ligante ramificado bivalente ou trivalente.
[00414] Em uma modalidade, um dsRNA da invenção é conjugado a um ligante ramificado bivalente ou trivalente selecionado do grupo de estruturas mostradas em qualquer uma das fórmulas (XXXII) - (XXXV): Fórmula XXXII Fórmula XXXIII
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onde:
[00415] q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B e q5C representam independentemente para cada ocorrência 0-20 e onde a unidade de repetição pode ser igual ou diferente;
[00416] P2A, P2B, P3A, P3B, P4A, P4B, P5A, P5B, P5C, T2A, T2B, T3A, T3B, T4A, T4B, T4A, T5B, T5C são cada um independentemente para cada ocorrência ausentes, CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH ou CH2O;
[00417] Q2A, Q2B, Q3A, Q3B, Q4A, Q4B, Q5A, Q5B, Q5C são independentemente para cada ocorrência ausentes, alquileno, alquileno substituído onde um ou mais metilenos podem ser interrompidos ou terminados por um ou mais de O, S, S(O), SO2, N(RN), C(R’)=C(R’’), C=C ou C(Q);
[00418] R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5C são cada um independentemente for cada ocorrência ausentes, NH, O, S, CH2, C(O)O, C(O)NH, NHCH(Ra)C(O), -C(O)-CH(Ra)-NH-, CO, CH=N-O,
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heterociclila;
[00419] L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B e L5C representam o ligante; i.e. cada um independentemente para cada ocorrência um monossacarídeo (tal como GalNAc), dissacarídeo, trissacarídeo, tetrassacarídeo, oligossacarídeo ou polissacarídeo; e Ra é H ou cadeia lateral de aminoácido. Derivados de GalNAc de conjugação trivalente são particularmente úteis para uso com agentes de RNAi para inibição da expressão de um gene alvo, tais como aqueles de fórmula (XXXV):
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[00420] onde L5A, L5B e L5C representam um monossacarídeo, tal como derivado de GalNAc. (pág.84)
[00421] Exemplos de grupos ligantes ramificados bivalentes e trivalentes conjugando derivados de GalNAc incluem, mas não estão limitados a, as estruturas mencionadas acima como fórmulas II, VII, XI, X e XIII.
[00422] Patentes U.S. representativas que ensinam a preparação de conjugados de RNA incluem, mas não estão limitadas a, Pat. U.S. Nos.5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 e 5.688.941; 6.294.664; 6.320.017; 6.576.752; 6.783.931; 6.900.297; 7.037.646; 8.106.022, os conteúdos de cada um em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência.
[00423] Não é necessário que todas as posições em um dado composto sejam uniformemente modificadas, e de fato mais de uma das modificações mencionadas acima pode ser incorporada em um composto único ou até mesmo em um nucleosídeo único dentro de um iRNA. A presente invenção inclui também compostos iRNA que são compostos quiméricos.
[00424] Compostos iRNA "quiméricos" ou "quimeras", no contexto da presente invenção, são compostos iRNA, preferivelmente dsRNA, que contêm duas ou mais regiões quimicamente distintas, cada uma formada de pelo menos uma unidade de monômero, isto é, um nucleotideo no caso de um composto dsRNA. Estes iRNAs tipicamente contêm pelo menos uma região onde o RNA é modificado de maneira a conferir ao iRNA resistência aumentada à degradação por nuclease, absorção nuclear aumentada e/ou afinidade de ligação aumentada com um ácido nucleico alvo. Uma região adicional do iRNA pode servir como um substrato para enzimas capazes de clivar híbridos de RNA:DNA ou RNA:RNA. A título de exemplo, RNase H é uma endonuclease celular que cliva a fita de RNA de um dúplex de RNA:DNA. Ativação de RNase H, desta maneira, resulta em clivagem do alvo de RNA, desta maneira aumentando muito a eficiência de inibição de iRNA de expressão de gene. Consequentemente, resultados comparáveis podem ser frequentemente obtidos com iRNAs mais curtos quando dsRNAs quiméricos são usados, comparado a dsRNAs de desoxi fosforotioato hibridizando para a mesma região alvo. Clivagem do alvo de RNA pode ser rotineiramente detectada através de eletroforese em gel e, se necessário, técnicas de hibridização de ácido nucleico associadas conhecidas na arte.
[00425] Em certos casos, o RNA de um iRNA pode ser modificado por um grupo não ligante. Várias moléculas não ligante foram conjugadas a iRNAs a fim de aumentar a atividade, distribuição celular ou absorção celular do iRNA, e procedimentos para realização de tais conjugações estão disponíveis na literatura científica. Tais porções não ligante incluem porções de lipídeo, tais como colesterol (Kubo, T. e outros, Biochem. Biofys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61; Letsinger e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), ácido cólico (Manoharan e outros, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), um tioéter, por exemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan e outros, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan e outros, Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), um tiocolesterol (Oberhauser e outros, Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), uma cadeia alifática, por exemplo, dodecanodiol ou resíduos undecila (Saison-Behmoaras e outros, EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov e outros, FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk e outros, Biochimie, 1993, 75:49), um fosfolipídeo, por exemplo, por exemplo, di-hexadecil-rac-glicerol ou 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3- H-fosfonato de trietilamônio (Manoharan e outros, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea e outros, Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), uma poliamina ou uma cadeia de polietileno glicol (Manoharan e outros, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969) ou ácido acético adamantano (Manoharan e outros, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), uma porção palmitila (Mishra e outros, Biochim. Biofys. Acta, 1995, 1264:229) ou uma porção octadecilamina ou hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke e outros, J. Farmacol. Exp. Ter., 1996, 277:923). Patentes dos Estados Unidos representativas que ensinam a preparação de tais conjugados de RNA foram listadas acima. Protocolos de conjugação típicos envolvem a síntese de um RNAs carregando um ligante amino em uma ou mais posições da sequência. O grupo amino é então reagido com a molécula sendo conjugada usando reagentes de acoplamento ou ativação apropriados. A reação de conjugação pode ser realizada ou com o RNA ainda ligado ao apoio sólido ou seguindo clivagem do RNA, em fase de solução. Purificação do conjugado de RNA através de HPLC tipicamente fornece o conjugado puro.
V. Administração de um iRNA da Invenção
[00426] A administração de um iRNA da invenção a uma célula, por exemplo, uma célula dentro de um indivíduo, tal como um indivíduo humano (por exemplo, um indivíduo com necessidade do mesmo, tal como um indivíduo tendo uma doença ou condição associada a angiotensinogênio) pode ser obtida de várias maneiras diferentes. Por exemplo, administração pode ser realizada através de contato de uma célula com um iRNA da invenção ou in vitro ou in vivo. Administração in vivo pode ser também realizada diretamente através da administração de uma composição compreendendo um iRNA, por exemplo, um dsRNA, a um indivíduo. Alternativamente, administração in vivo pode ser realizada indiretamente através da administração de um ou mais vetores que codificam e direcionam a expressão do iRNA. Essas alternativas são discutidas mais abaixo.
[00427] Em geral, qualquer método de administração de uma molécula de ácido nucleico (in vitro ou in vivo) pode ser adaptado para uso com um iRNA da invenção (vide, por exemplo, Akhtar S. e Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139-144 e WO94/02595, que são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade). Para administração in vivo, fatores a considerar a fim de administrar uma molécula de iRNA incluem, por exemplo, estabilidade biológica da molécula administrada, prevenção de efeitos não específicos e acúmulo da molécula administrada no tecido alvo. Os efeitos não específicos de um iRNA podem ser minimizados através de administração local, por exemplo, através de administração direta ou implante em um tecido ou administração tópica da preparação. Administração local a um sítio de tratamento maximiza concentração local do agente, limita a exposição do agente a tecidos sistêmicos que podem ser de outro modo prejudicados pelo agente ou que podem degradar o agente, e permite uma dose total menor da molécula de iRNA a ser administrada. Vários estudos mostraram inativação bem sucedida de produtos de gene quando um iRNA é administrado localmente. Por exemplo, administração intraocular de um dsRNA de VEGF através de injeção intravítrea em macacos Cynomolgus (Tolentino, M.J. e outros (2004) Retina 24:132-138) e injeções sub-retinais em camundongos (Reich, S.J. e outros (2003) Mol. Vis. 9:210-216) mostraram ambas prevenir neovascularização em um modelo experimental de degeneração macular relacionada com a idade. Ainda, injeção intratumoral direta de um dsRNA em camundongos reduz o volume do tumor (Pille, J. e outros (2005) Mol. Ter.11:267-274) e pode prolongar a sobrevivência de camundongos carregando tumor (Kim, W.J. e outros (2006) Mol. Ter. 14:343-350; Li, S. e outros (2007) Mol. Ter. 15:515-523). Interferência de RNA também mostrou sucesso com administração local ao SNC através de injeção direta (Dorn, G. e outros (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, P.H. e outros (2005) Gene Ter. 12:59-66; Makimura, H. e outros (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, G.T. e outros (2004) Neuroscience 129:521-528; Takker, E.R. e outros (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-17275; Akaneya, Y. e outros (2005) J. Neurofysiol. 93:594-602) e aos pulmões através de administração intranasal (Howard, K.A. e outros (2006) Mol. Ter. 14:476-484; Zhang, X. e outros (2004) J. Biol. Chem. 279:10677-10684; Bitko, V. e outros (2005) Nat. Med. 11:50-55). Para administração de um iRNA sistemicamente para o tratamento de uma doença, o RNA pode ser modificado ou alternativamente administrado usando um sistema de administração de fármaco; ambos os métodos agem para prevenir a degradação rápida do dsRNA por endo- e exo-nucleases in vivo. Modificação, do RNA ou do veículo farmacêutico pode também permitir direcionamento da composição de iRNA ao tecido alvo e evita efeitos fora do alvo indesejáveis. Moléculas de iRNA podem ser modificadas através de conjugação química a grupos lipofílicos tal como colesterol para aumentar a absorção celular e prevenir degradação. Por exemplo, um iRNA direcionado contra ApoB conjugado a uma porção colesterol lipofílica foi injetado sistemicamente em camundongos e resultou em inativação de mRNA de apoB em ambos os fígado e jejuno (Soutschek, J. outros (2004) Nature 432:173-178). Conjugação de um iRNA a um aptâmero foi mostrada inibir crescimento de tumor e mediar regressão de tumor em um modelo de camundongo de cancer de próstata (McNamara, J.O. e outros (2006) Nat. Biotechnol. 24:1005-1015). Em uma modalidade alternativa, o iRNA pode ser administrado usando sistemas de administração de fármaco tal como uma nanopartícula, um dendrímero, um polímero, lipossomos ou um sistema de administração catiônico. Sistemas de administração catiônicos positivamente carregados facilitam ligação de uma molécula de iRNA (negativamente carregada) e também aumentam interações na membrana celular negativamente carregada para permitir absorção eficiente de um iRNA pela célula. Lipídeos catiônicos, dendrímeros ou polímeros podem ou ser ligados a um iRNA ou induzir para formar uma vesícula ou micela (vide, por exemplo, Journal of Controlled Release 129(2):107-116) que encerra um iRNA. A formação de vesículas ou micelas previne mais degradação do iRNA quando administrado sistemicamente. Métodos para fabricação e administração de complexos de iRNA catiônicos estão dentro das habilidades de um versado na técnica (vide, por exemplo, Sorensen, D.R. e outros (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, U.N. e outros (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, A.S. e outros (2007) J. Hypertens. 25:197-205, que são aqui incorporadas a título de referência em sua totalidade). Alguns exemplos não limitantes de sistemas de administração de fármaco úteis para administração sistêmica de iRNAs inclui DOTAP (Sorensen, D.R. e outros (2003), supra; Verma, UN. e outros (2003), supra), Oligofectamina, "solid nucleic acid lipid particles" (Zimmermann, T.S. e outros (2006) Nature 441:111-114), cardiolipina (Chien, PY. e outros (2005) Cancer Gene Ter. 12:321-328; Pal, A. e outros (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091), polietilenoimina (Bonnet, M. E. e outros (2008) Farm. Res. 16 de Agosto Epub ahead of print; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), peptídeos Arg-Gly-Asp (RGD) (Liu, S. (2006) Mol. Farm. 3:472-487) e poliamidoaminas (Tomalia, D.A. e outros (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H. e outros (1999) Farm. Res. 16:1799-1804). Em algumas modalidades, um iRNAs forma um complexo com ciclodextrina para administração sistêmica. Métodos para administração e composições farmacêuticas de iRNAs e ciclodextrinas podem ser encontrados na Patente U.S. No. 7.427.605, que é aqui incorporada a título de referência em sua totalidade.
A. iRNAs codificados em vetor da Invenção
[00428] iRNA se direcionando ao gene AGT pode ser expresso a partir de unidades de transcrição inseridas em vetores de DNA ou RNA (vide, por exemplo, Couture, A. e outros, TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A. e outros, Publicação PCT Internacional No. WO 00/22113, Conrad, Publicação PCT Internacional No. WO 00/22114 e Conrad, Pat. U.S. No. 6.054.299). A expressão pode ser transiente (da ordem de horas a semanas) ou sustentada (semanas a meses o mais), dependendo do construto específico usado e do tecido ou tipo de célula alvo. Estes transgenes podem ser introduzidos como um construto linear, um plasmídeo circular ou um vetor viral, que podem ser um vetor de integração ou não integração. O transgene também pode ser construído para permitir que ele seja herdado como um plasmídeo extracromossomal (Gassmann e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).
[00429] A fita ou a fitas individuais de um iRNA podem ser transcritos a partir de um promotor em um vetor de expressão. Onde dois a fitas separados devem ser expressos para gerar, por exemplo, um dsRNA, dois vetores de expressão separados podem ser co-introduzidos (por exemplo, através de transfecção ou infecção) em uma célula alvo. Alternativamente, cada a fita individual de um dsRNA pode ser transcrito por promotores ambos localizados no mesmo plasmídeo de expressão. Em uma modalidade, um dsRNA é expresso como polinucleotídeos de repetição invertidos unidos por uma sequência de polinucleotídeo ligante de maneira que o dsRNA tem uma estrutura haste e alça.
[00430] Vetores de expressão de iRNA são geralmente plasmídeos de DNA ou vetores virais. Vetores de expressão compatíveis com células eucarióticas, preferivelmente aqueles compatíveis com células de vertebrado, podem ser usados para produzir construtos recombinantes para a expressão de um iRNA como descrito aqui. Vetores de expressão de célula eucariótica são bem conhecidos na técnica e estão disponíveis de várias fontes comerciais. Tipicamente, tais vetores são providos contendo sítios de restrição convenientes para inserção do segmento de ácido nucleico desejado. Administração de vetores de expressão de iRNA pode ser sistêmica, tal como através de administração intravenosa ou intramuscular, através da administração a células alvo explantadas do paciente seguido por reintrodução no paciente, ou através de quaisquer outros meios que permitam a introdução em uma célula alvo desejada.
[00431] Plasmídeos de expressão de iRNA podem ser transfectados em células alvo como um complexo com veículos de lipídeo catiônicos (por exemplo, Oligofectamina) ou veículos baseados em lipídeo não catiônicos (por exemplo, Transit-TKO®). Transfecções de lipídeo múltiplas para inativações mediadas por iRNA se direcionando a regiões diferentes de um RNA alvo durante um período de uma semana ou mais são também compreendidas pela invenção. Introdução bem sucedida de vetores em células hospedeiro pode ser monitorada usando vários métodos conhecidos. Por exemplo, transfecção transiente pode ser sinalizada com um repórter, tal como um marcador fluorescente, tal como Proteína Verde Fluorescente (GFP). Transfecção estável de células ex vivo pode ser assegurada usando marcadores que proveem a célula transfectada com resistência a fatores ambientais específicos (por exemplo, antibióticos e fármacos), tal como resistência à higromicina B.
[00432] Sistemas de vetor viral que podem ser utilizados com os métodos e composições descritos aqui incluem, mas não estão limitados a, (a) vetores de adenovírus; (b) vetores de retrovírus incluindo, mas não limitado a, vetores lentivirais, vírus da leucemia de murino moloney, etc; (c) vetores de vírus adenoassociado; (d) vetores do vírus herpes simplex; (e) vetores de SV 40; (f) vetores do vírus polioma; (g) vetores de papiloma vírus; (h) vetores de picornavírus; (i) vetores de pox vírus tal como um ortopox, por exemplo, vetores do vírus vaccínia ou avipox, por exemplo, canary pox ou fowl pox; e (j) um adenovírus dependente de auxiliar ou gutless. Vírus defeituosos em replicação podem ser também vantajosos. Vetores diferentes se tornarão ou não incorporados ao genoma das células. Os construtos podem incluir sequências virais para transfecção, se desejado. Alternativamente, o construto pode ser incorporado a vetores capazes de replicação epissomal, por exemplo, vetores de EPV e EBV. Construtos para a expressão recombinante de um iRNA requererão elementos reguladores, por exemplo, promotores, aumentadores, etc, para assegurar a expressão do iRNA em células alvo. Outros aspectos para considerar vetores e construtos são descritos adicionalmente abaixo.
[00433] Vetores úteis para a administração de um iRNA incluirão elementos reguladores (promotor, aumentador, etc) suficientes para expressão do iRNA na célula ou tecido alvo desejado. Os elementos reguladores podem ser escolhidos para prover expressão ou constitutiva ou regulada/induzível.
[00434] Expressão do iRNA pode ser regulada precisamente, por exemplo, usando uma sequência reguladora induzível que é sensível a certos reguladores fisiológicos, por exemplo, níveis de glicose em circulação, ou hormônios (Docherty e outros, 1994, FASEB J. 8:20-24). Tais sistemas de expressão induzíveis, adequados para o controle de expressão de dsRNA em células ou em mamíferos, incluem, por exemplo, regulagem por ecdisona, por estrogênio, progesterona, tetraciclina, indutores químicos de dimerização e isopropil-beta-D1- tiogalactopiranosídeo (IPTG). Um versado na técnica seria capaz de escolher a sequência reguladora/promotora apropriada com base no uso pretendido do transgene de iRNA.
[00435] Vetores virais que contêm sequências de ácido nucleico codificando um iRNA podem ser usados. Por exemplo, um vetor retroviral pode ser usado (vide Miller e outros, Met. Enzymol. 217:581599 (1993)). Os vetores retrovirais contêm os componentes necessários para o empacotamento correto do genoma viral e integração ao DNA da célula hospedeiro. As sequências de ácido nucleico codificando um iRNA são clonadas em um ou mais vetores, que facilitam a administração do ácido nucleico em um paciente. Mais detalhes sobre vetores retrovirais podem ser encontrados, por exemplo, em Boesen e outros, Bioterapy 6:291-302 (1994), que descreve o uso de um vetor retroviral para administrar o gene mdr1 a células-tronco hematopoiéticas a fim de tornar as células-tronco mais resistentes à quimioterapia. Outras referências ilustrando o uso de vetores retrovirais em terapia de gene são: Clowes e outros, J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994); Kiem e outros, Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons e Gunzberg, Human Gene Terapy 4:129-141 (1993); e Grossman e Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993). Vetores lentivirais compreendidos para uso incluem, por exemplo, os vetores baseados em HIV descritos nas Patentes U.S. Nos. 6.143.520; 5.665.557; e 5.981.276, que são aqui incorporadas a título de referência.
[00436] Adenovírus são também compreendidos para uso em administração de iRNAs da invenção. Adenovírus são veículos especialmente atraentes, por exemplo, para administração de genes aos epitélios respiratórios. Adenovírus infectam naturalmente epitélios respiratórios onde eles causam uma doença leve. Outros alvos para sistemas de administração à base de adenovírus são fígado, o sistema nervoso central, células endoteliais e músculo. Adenovírus têm a vantagem que são capazes de infectar células de não divisão. Kozarsky e Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993) apresenta uma revisão de terapia de gene baseada em adenovirus. Bout e outros, Human Gene Terapy 5:3-10 (1994) demonstraram o uso de vetores de adenovírus para transferência de genes para os epitélios respiratórios de macacos rhesus. Outros casos do uso de adenovírus em terapia de gene podem ser encontrados em Rosenfeld e outros, Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld e outros, Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli e outros, J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993); Publicação PCT WO94/12649; e Wang e outros, Gene Terapy 2:775-783 (1995). Um vetor AV adequado para expressão de um iRNA apresentado na invenção, um método para construção do vetor de AV recombinante e um método para administração do vetor em células alvo são descritos em Xia H e outros (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010.
[00437] Vetores de vírus adenoassociado (AAV) podem ser também usados para administrar um iRNA da invenção (Walsh e outros, Proc.Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993); Pat. U.S. No. 5.436.146). Em uma modalidade, o iRNA pode ser expresso como duas moléculas de RNA de fita simples complementares, separadas, de um vetor de AAV recombinante tendo, por exemplo, ou os promotores de RNA U6 ou H1 ou o promotor do citomegalovírus (CMV). Vetores de AAV adequados para expressão do dsRNA apresentado na invenção, métodos para construção do vetor de AV recombinante e métodos para administração dos vetores em células alvo são descritos em Samulski R e outros (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher, K. J. e outros (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski, R. e outros (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; Pat. U.S. No. 5.252.479; Pat. U.S. No. 5.139.941; Pedido de Patente Internacional No. WO 94/13788; e Pedido de Patente Internacional No. WO 93/24641, cujos relatórios descritivos em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência.
[00438] Um outro vetor viral adequado para administração de um iRNA da invenção é um pox vírus tal como um vírus vaccínia, por exemplo, um vaccínia atenuado tal como Vírus Ankara Modificado (MVA) ou NYVAC, um avipox tal como fowl pox ou canary pox.
[00439] O tropismo de vetores virais pode ser modificado através de pseudotipificação dos vetores com proteínas envelope ou outros antígenos de superfície de outros vírus ou substituindo proteínas do capsídeo virais diferentes, como apropriado. Por exemplo, vetores lentivirais podem ser pseudotipificados com proteínas de superfície de vírus da estomatite vesicular (VSV), raiva, Ebola, Mokola e similar. Vetores AAV podem ser feitos para se direcionar a células diferentes através de engenharia dos vetores para expressar sorotipos de proteína do capsídeo diferentes; vide, por exemplo, Rabinowitz, J. E. e outros (2002), J. Virol. 76:791-801, cujo relatório descritivo em sua totalidade é aqui incorporado a título de referência.
[00440] A preparação farmacêutica de um vetor pode incluir o vetor em um diluente aceitável ou pode incluir uma matriz de liberação lenta onde o veículo de administração de gene é incrustrado. Alternativamente, onde o vetor de administração completo pode ser produzido intacto das células recombinantes, por exemplo, vetores retrovirais, a preparação farmacêutica podem incluir uma ou mais células que produzem o sistema de administração de gene.
VI. Composições Farmacêuticas da Invenção
[00441] A presente invenção inclui também composições e formulações farmacêuticas que incluem os iRNAs da invenção. Em uma modalidade, são providas aqui composições farmacêuticas contendo um iRNA, como aqui descrito, e um veículo farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas contendo o iRNA são úteis para tratamento de uma doença ou distúrbio associado com a expressão ou atividade de um gene AGT. Tais composições farmacêuticas são formuladas com base no modo de administração. Um exemplo são composições que são formuladas para administração sistêmica através de administração parenteral, por exemplo, através de administração subcutânea (SC) ou intravenosa (IV). Um outro exemplo são composições que são formuladas para administração direta ao parênquima cerebral, por exemplo, através de infusão no cérebro, tal como infusão com bomba contínua. As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas em dosagens suficientes para inibir expressão de um gene de AGT. Em geral, uma dose adequada de um iRNA da invenção estará na faixa de cerca de 0,001 a cerca de 200,0 miligramas por quilograma de peso corporal do recipiente por dia, geralmente na faixa de cerca de 1 a 50 mg por quilograma de peso corporal por dia. Por exemplo, o dsRNA pode ser administrado em cerca de 0,01 mg/kg, cerca de 0,05 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 1,5 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 20 mg/kg, cerca de 30 mg/kg, cerca de 40 mg/kg ou cerca de 50 mg/kg por dose única.
[00442] Por exemplo, o dsRNA pode ser administrado em uma dose de cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou cerca de 10 mg/kg. Intermediários de valores e faixas para os valores mencionados também são pretendidos ser parte da invenção.
[00443] Em uma outra modalidade, o dsRNA é administrado em uma dose de cerca de 0,1 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 0,25 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 0,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 0,75 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 1 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 1,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 2 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 2,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 3 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 3,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 4 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 4,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 7,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 10 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 15 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 25 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 25 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 30 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 35 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 40 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 45 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 0,1 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,25 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,75 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 1 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 1,5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 2 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 2,5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 3 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 3,5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 4 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 4,5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 7,5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 10 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 15 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 25 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 25 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 30 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 35 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 40 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,1 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,25 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,75 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 1 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 1,5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 2 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 2,5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 3 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 3,5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 4 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 4,5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 7,5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 10 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 15 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 25 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 25 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 30 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 35 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,1 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,25 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,75 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 1 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 1,5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 2 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 2,5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 3 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 3,5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 4 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 4,5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 7,5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 10 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 15 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 25 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,1 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 0,25 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 0,5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 0,75 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 1 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 1,5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 2 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 2,5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 3 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 3,5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 4 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 4,5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 7,5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 10 a cerca de 20 mg/kg ou cerca de 15 a cerca de 20 mg/kg. Intermediários de valores e faixas para os valores mencionados também são pretendidos ser parte da invenção.
[00444] Por exemplo, o dsRNA pode ser administrado em uma dose de cerca de 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou cerca de 10 mg/kg. Intermediários de valores e faixas para os valores mencionados também são pretendidos ser parte da invenção.
[00445] Em uma outra modalidade, o dsRNA é administrado em uma dose de cerca de 0,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 0,75 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 1 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 1,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 2 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 2,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 3 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 3,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 4 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 4,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 7,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 10 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 15 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 25 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 25 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 30 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 35 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 40 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 45 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 0,5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,75 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 1 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 1,5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 2 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 2,5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 3 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 3,5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 4 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 4,5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 7,5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 10 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 15 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 25 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 25 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 30 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 35 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 40 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,75 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 1 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 1,5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 2 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 2,5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 3 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 3,5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 4 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 4,5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 7,5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 10 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 15 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 25 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 25 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 30 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 35 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,75 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 1 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 1,5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 2 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 2,5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 3 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 3,5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 4 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 4,5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 7,5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 10 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 15 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 25 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 0,75 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 1 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 1,5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 2 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 2,5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 3 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 3,5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 4 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 4,5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 7,5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 10 a cerca de 20 mg/kg ou cerca de 15 a cerca de 20 mg/kg. Em uma modalidade, o dsRNA é administrado em uma dose de cerca de 10mg/kg a cerca de 30 mg/kg. Intermediários de valores e faixas para os valores mencionados também são pretendidos ser parte da invenção.
[00446] Por exemplo, os indivíduos podem ser administrados, por exemplo, subcutaneamente ou intravenosamente, com uma quantidade terapêutica única de iRNA, tal como cerca de 0,1, 0,125, 0,15, 0,175, 0,2, 0,225, 0,25, 0,275, 0,3, 0,325, 0,35, 0,375, 0,4, 0,425, 0,45, 0,475, 0,5, 0,525, 0,55, 0,575, 0,6, 0,625, 0,65, 0,675, 0,7, 0,725, 0,75, 0,775, 0,8, 0,825, 0,85, 0,875, 0,9, 0,925, 0,95, 0,975, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 20,5, 21, 21,5, 22, 22,5, 23, 23,5, 24, 24,5, 25, 25,5, 26, 26,5, 27, 27,5, 28, 28,5, 29, 29,5, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou cerca de 50 mg/kg. Intermediários de valores e faixas para os valores mencionados também são pretendidos ser parte da invenção.
[00447] Em algumas modalidades, os indivíduos são administrados, por exemplo, subcutaneamente ou intravenosamente, com doses múltiplas de uma quantidade terapêutica de iRNA, tal como uma dose de cerca de 0,1, 0,125, 0,15, 0,175, 0,2, 0,225, 0,25, 0,275, 0,3, 0,325, 0,35, 0,375, 0,4, 0,425, 0,45, 0,475, 0,5, 0,525, 0,55, 0,575, 0,6, 0,625, 0,65, 0,675, 0,7, 0,725, 0,75, 0,775, 0,8, 0,825, 0,85, 0,875, 0,9, 0,925, 0,95, 0,975, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 20,5, 21, 21,5, 22, 22,5, 23, 23,5, 24, 24,5, 25, 25,5, 26, 26,5, 27, 27,5, 28, 28,5, 29, 29,5, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou cerca de 50 mg/kg. Um regime de multidose pode incluir administração de uma quantidade terapêutica de iRNA diariamente, tal como por dois dias, três dias, quatro dias, cinco dias, seis dias, sete dias ou mais.
[00448] Em outras modalidades, os indivíduos são administrados, por exemplo, subcutaneamente ou intravenosamente, com uma dose repetida de uma quantidade terapêutica de iRNA, tal como uma dose de cerca de 0,1, 0,125, 0,15, 0,175, 0,2, 0,225, 0,25, 0,275, 0,3, 0,325, 0,35, 0,375, 0,4, 0,425, 0,45, 0,475, 0,5, 0,525, 0,55, 0,575, 0,6, 0,625, 0,65, 0,675, 0,7, 0,725, 0,75, 0,775, 0,8, 0,825, 0,85, 0,875, 0,9, 0,925, 0,95, 0,975, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 20,5, 21, 21,5, 22, 22,5, 23, 23,5, 24, 24,5, 25, 25,5, 26, 26,5, 27, 27,5, 28, 28,5, 29, 29,5, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou cerca de 50 mg/kg. Um regime de dose repetida pode incluir administração de uma quantidade terapêutica de iRNA em uma base regular, tal como dia sim dia não, a cada três dias, a cada quatro dias, duas vezes por semana, uma vez por semana, semana sim semana não ou uma vez por mês. Em certas modalidades, o iRNA é administrado mais ou menos uma vez por mês a cerca de uma vez por trimestre (isto é, mais ou menos a cada três meses).
[00449] Após um regime de tratamento inicial, os tratamentos podem ser administrados em uma base menos frequente.
[00450] Em certas modalidades, por exemplo, quando uma composição da invenção compreende um dsRNA como descrito aqui e um lipídeo, os indivíduos podem ser administrados com uma quantidade terapêutica de iRNA, tal como cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,2 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,2 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,3 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,3 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,4 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,4 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 1,5 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 1,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 2 mg/kg a cerca de cerca de 2,5 mg/kg, cerca de 2 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 3 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 3 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 3,5 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 4 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 4,5 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 4 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 4,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 5,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 6 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 6,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 7 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 7,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 8 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 8,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 9 mg/kg a cerca de 10 mg/kg ou cerca de 9,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Intermediários de valores e faixas para os valores mencionados também são pretendidos ser parte da invenção.
[00451] Por exemplo, o dsRNA pode ser administrado em uma dose de cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou cerca de 10 mg/kg. Intermediários de valores e faixas para os valores mencionados também são pretendidos ser parte da invenção.
[00452] Em certas modalidades da invenção, por exemplo, quando um agente RNAi de fita dupla inclui uma modificação (por exemplo, um ou mais motivos de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos), incluindo um motivo do tipo em ou próximo do sítio de clivagem do agente, seis ligações fosforotioato, e um ligante, de maneira que um agente é administrado em uma dose de cerca de 0,01 a cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 0,4 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 0,3 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 0,2 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 0,09 mg/kg, cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 0,08 mg/kg, cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 0,07 mg/kg, cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 0,06 mg/kg, cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 0,05 mg/kg, cerca de 0,02 a cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 0,02 a cerca de 0,4 mg/kg, cerca de 0,02 a cerca de 0,3 mg/kg, cerca de 0,02 a cerca de 0,2 mg/kg, cerca de 0,02 a cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,02 mg/kg a cerca de 0,09 mg/kg, cerca de 0,02 mg/kg a cerca de 0,08 mg/kg, cerca de 0,02 mg/kg a cerca de 0,07 mg/kg, cerca de 0,02 mg/kg a cerca de 0,06 mg/kg, cerca de 0,02 mg/kg a cerca de 0,05 mg/kg, cerca de 0,03 a cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 0,03 a cerca de 0,4 mg/kg, cerca de 0,03 a cerca de 0,3 mg/kg, cerca de 0,03 a cerca de 0,2 mg/kg, cerca de 0,03 a cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,03 mg/kg a cerca de 0,09 mg/kg, cerca de 0,03 mg/kg a cerca de 0,08 mg/kg, cerca de 0,03 mg/kg a cerca de 0,07 mg/kg, cerca de 0,03 mg/kg a cerca de 0,06 mg/kg, cerca de 0,03 mg/kg a cerca de 0,05 mg/kg, cerca de 0,04 a cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 0,04 a cerca de 0,4 mg/kg, cerca de 0,04 a cerca de 0,3 mg/kg, cerca de 0,04 a cerca de 0,2 mg/kg, cerca de 0,04 a cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,04 mg/kg a cerca de 0,09 mg/kg, cerca de 0,04 mg/kg a cerca de 0,08 mg/kg, cerca de 0,04 mg/kg a cerca de 0,07 mg/kg, cerca de 0,04 mg/kg a cerca de 0,06 mg/kg, cerca de 0,05 a cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 0,05 a cerca de 0,4 mg/kg, cerca de 0,05 a cerca de 0,3 mg/kg, cerca de 0,05 a cerca de 0,2 mg/kg, cerca de 0,05 a cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 0,09 mg/kg, cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 0,08 mg/kg ou cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 0,07 mg/kg. Intermediários de valores e faixas para os valores mencionados também são pretendidos ser parte da invenção, por exemplo, o agente RNAi pode ser administrado ao indivíduo em uma dose de cerca de 0,015 mg/kg a cerca de 0,45 mg/kg.
[00453] Por exemplo, o agente RNAi, por exemplo, agente RNAi em uma composição farmacêutica, pode ser administrado em uma dose de cerca de 0,01 mg/kg, 0,0125 mg/kg, 0,015 mg/kg, 0,0175 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,0225 mg/kg, 0,025 mg/kg, 0,0275 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,0325 mg/kg, 0,035 mg/kg, 0,0375 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,0425 mg/kg, 0,045 mg/kg, 0,0475 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,0525 mg/kg, 0,055 mg/kg, 0,0575 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,0625 mg/kg, 0,065 mg/kg, 0,0675 mg/kg, 0,07 mg/kg, 0,0725 mg/kg, 0,075 mg/kg, 0,0775 mg/kg, 0,08 mg/kg, 0,0825 mg/kg, 0,085 mg/kg, 0,0875 mg/kg, 0,09 mg/kg, 0,0925 mg/kg, 0,095 mg/kg, 0,0975 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,125 mg/kg, 0,15 mg/kg, 0,175 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,225 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,275 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,325 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,375 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,425 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,475 mg/kg ou cerca de 0,5 mg/kg. Intermediários de valores para os valores mencionados acima também são pretendidos ser parte da presente invenção.
[00454] A composição farmacêutica pode ser administrada através de infusão intravenosa durante um período de tempo, tal como um período de mais de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 e 21, 22, 23, 24 ou cerca de 25 minutos. A administração pode ser repetida, por exemplo, em uma base regular, tal como semanalmente, duas vezes por semana (isto é, a cada duas semanas), por um mês, dois meses, três meses, quatro meses ou mais. Após um regime de tratamento inicial, os tratamentos podem ser administrados em uma base menos frequente. Por exemplo, após administração semanalmente ou duas vezes por semana por três meses, administração pode ser repetida uma vez por mês, por seis meses ou um ano ou mais.
[00455] A composição farmacêutica pode ser administrada através de administração subcutânea.
[00456] A composição farmacêutica pode ser administrada uma vez por dia ou o iRNA pode ser administrado como duas, três ou mais subdoses em intervalos apropriados durante ou dia ou até mesmo usando infusão contínua ou administração através de uma formulação de liberação controlada. Neste caso, o iRNA contido em cada subdose deve ser correspondentemente menor a fim de obter a dosagem diária total. A unidade de dosagem pode ser também composta para administração durante vários dias, por exemplo, usando uma formulação de liberação sustentada convencional que provê liberação sustentada do iRNA durante um período de vários dias. Formulações de liberação sustentada são bem conhecidas na técnica e são particularmente úteis para administração de agentes em um sítio particular, tal como poderia ser usado com os agentes da presente invenção. Nesta modalidade, a unidade de dosagem contém um múltiplo correspondente da dose diária. Uma dose maior pode ser administrada inicialmente (isto é, uma dose de carga), seguido por uma dosagem menor por um período de tempo prolongado.
[00457] Em outras modalidades, uma dose única das composições farmacêuticas pode ser de longa duração, de maneira que doses subsequentes são administradas em intervalos de não mais do que 3, 4 ou 5 dias, ou em intervalos de não mais do que 1, 2, 3 ou 4 semanas. Em algumas modalidades da invenção, uma dose única das composições farmacêuticas da invenção é administrada uma vez por semana. Em outras modalidades da invenção, uma dose única da composição farmacêutica da invenção é administrada duas vezes por mês. Em certas modalidades, o iRNA é administrado mais ou menos uma vez por mês a cerca de uma vez por trimestre (isto é, mais ou menos uma vez a cada três meses).
[00458] A composição farmacêutica pode ser administrada por um período de tempo indefinido, por exemplo, em um indivíduo sofrendo pressão sanguínea elevada devido à obesidade, ou durante o momento que a causa de um nível elevado de AGT está presente, por exemplo, durante pressão sanguínea alta induzida por gravidez.
[00459] O versado na técnica compreenderá que certos fatores podem influenciar a dosagem e o momento requerido para tratar efetivamente um indivíduo, incluindo a, mas não limitado a, severidade da doença ou distúrbio, tratamentos anteriores, a saúde geral e/ou idade do indivíduo e outras doenças presentes. Além disso, tratamento de um indivíduo com uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição pode incluir um tratamento único ou uma série de tratamentos. Estimativas de dosagens eficazes e meias-vidas in vivo para os iRNAs individuais compreendidos pela invenção podem ser feitas usando metodologias convencionais ou com base no teste in vivo usando um modelo animal apropriado, como descrito em outro ponto aqui.
[00460] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas de várias maneiras dependendo de se o tratamento local ou sistêmico é desejado e da área a ser tratada. Administração pode ser tópica (por exemplo, através de um emplastro transdermal), pulmonar, por exemplo, através de inalação ou insuflação de pós ou aerossóis, incluindo por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidermal e transdermal, oral ou parenteral. Administração parenteral inclui injeção ou infusão intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular; subdermal, por exemplo, através de um dispositivo implantado; ou intracranial, por exemplo, através de administração intraparenquimal, intratecal ou intraventricular.
[00461] O iRNA pode ser administrado de uma maneira a se direcionar a um tecido particular, tal como o fígado (por exemplo, os hepatócitos do fígado).
[00462] Composições e formulações farmacêuticas para administração tópica podem incluir emplastros transdermais, unguentos, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, sprays, líquidos e pós. Veículos farmacêuticos, bases aquosas, em pó ou oleosas, espessantes e similar convencionais podem ser necessários ou desejáveis. Preservativos revestidos, luvas e similar também podem ser úteis. Formulações tópicas adequadas incluem aquelas onde os iRNAs apresentados na invenção estão em mistura com um agente de administração tópica tais como lipídeos, lipossomos, ácidos graxos, ésteres de ácido graxo, agentes de quelação e tensoativos. Lipídeos e lipossomos adequados incluem neutros (por exemplo, dioleoilfosfatidil DOPE etanolamina, dimiristoilfosfatidil colina DMPC, diestearoilfosfatidil colina), negativos (por exemplo, dimiristoilfosfatidil glicerol DMPG) e catiônicos (por exemplo, dioleoiltetrametilaminopropil DOTAP e dioleoilfosfatidil etanolamina DOTMA). iRNAs apresentados na invenção podem ser encapsulados dentro de lipossomos ou podem formar complexos com os mesmos, em particular com lipossomos catiônicos. Alternativamente, iRNAs podem ser complexados com lipídeos, em particular com lipídeos catiônicos. Ácidos graxos e ésteres adequados incluem, mas não estão limitados a, ácido araquidônico, ácido oleico, ácido eicosanoico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolênico, dicaprato, tricaprato, mono-oleína, dilaurina, 1- monocaprato de glicerila, 1-dodecilazacicloeptan-2-ona, uma acilcarnitina, uma acilcolina ou um éster de C1-20 alquila (por exemplo, isopropilmiristato IPM), monoglicerídeo, diglicerídeo ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo). Formulações tópicas são descritas em detalhes na Patente U.S. No. 6.747.014, que é aqui incorporada a título de referência.
A. Formulações de iRNA Compreendendo Montagens Moleculares membranosas
[00463] Um iRNA para uso nas composições e métodos da invenção pode ser formulado para administração em montagem molecular membranosa, por exemplo, um lipossomo ou uma micela. Como aqui usado, o termo "lipossomo" se refere a uma vesícula composta de lipídeos anfifílicos dispostos em pelo menos uma bicamada, por exemplo, uma bicamada ou uma pluralidade de bicamadas. Lipossomas incluem vesículas unilamelares e multilamelares que têm uma membrana formada de um material lipofílico e um interior aquoso. A porção aquosa contém a composição de iRNA. O material lipofílico isola o interior aquoso de um exterior aquoso, que tipicamente não inclui a composição de iRNA, embora em alguns exemplos possa incluir. Os lipossomos são uteis para a transferência e administração de ingredientes ativos ao sítio de ação. Devido ao fato da membrana lipossomal ser estruturalmente similar a membranas biológicas, quando lipossomos são aplicados a um tecido, a bicamada lipossomal funde com a bicamada das membranas celulares. Conforme a fusão do lipossomo e célula progride, os teores aquosos internos que incluem o iRNA são administrados à célula onde o iRNA pode se ligar especificamente a um RNA alvo e pode mediar iRNA. Em alguns casos os lipossomos são também especificamente direcionados, por exemplo, para direcionar o iRNA a tipos particulares de célula.
[00464] Um lipossomo contendo um agente iRNA pode ser preparado através de uma variedade de métodos. Em um exemplo, o componente lipídeo de um lipossomo é dissolvido em um detergente de maneira que micelas são formadas com o componente lipídeo. Por exemplo, o componente lipídeo pode ser um lipídeo catiônico anfifático ou conjugado de lipídeo. O detergente pode ter uma concentração de micela crítica alta e pode ser não iônico. Detergentes exemplares incluem colato, CHAPS, octilglucosídeo, desoxicolato e lauril sarcosina. A preparação de agente iRNA é então adicionada às micelas que incluem o componente lipídeo. Os grupos catiônicos no lipídeo interagem com o agente iRNA e condensam ao redor do agente iRNA para formar um lipossomo. Após condensação, o detergente é removido, por exemplo, através de diálise, para fornecer uma preparação lipossomal de agente iRNA.
[00465] Se necessário um composto veículo que auxilia em condensação pode ser adicionado durante a reação de condensação, por exemplo, através de adição controlada. Por exemplo, o composto veículo pode ser um polímeroso outro que não um ácido nucleico (por exemplo, espermina ou espermidina). O pH pode também ser ajustado para favorecer a condensação.
[00466] Métodos para produção de veículos de administração de polinucleotídeo, que incorporam um complexo de polinucleotídeo/lipídeo catiônico como componentes estruturais do veículo de administração, são descritos adicionalmente no, por exemplo, WO 96/37194, cujos conteúdos em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência. Formação de lipossomo pode também incluir um ou mais aspectos de métodos exemplares descritos em Felgner, P. L. e outros, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987; Pat. U.S. No. 4.897.355; Pat. U.S. No. 5.171.678; Bangham e outros M. Mol. Biol. 23:238, 1965; Olson e outros Biochim. Biofys. Acta 557:9, 1979; Szoka e outros Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 4194, 1978; Mayhew e outros Biochim. Biofys. Acta 775:169, 1984; Kim e outros Biochim. Biofys. Acta 728:339, 1983; e Fukunaga e outros Endocrinol. 115:757, 1984. Técnicas comumente usadas para preparação de agregados de lipídeo de tamanho apropriado para uso como veículos de administração incluem sonificação e congelamento- descongelamento mais extrusão (vide, por exemplo, Mayer, e outros Biochim. Biofys. Acta 858:161, 1986). Microfluidização pode ser usada quando agregados consistentemente pequenos (50 a 200 nm) e relativamente uniformes são desejados (Mayhew e outros Biochim. Biofys. Acta 775:169, 1984).
[00467] Os lipossomos se encaixam em duas classes amplas. Lipossomos catiônicos são lipossomos positivamente carregados que interagem com as moléculas de ácido nucleico negativamente carregadas para formar um complexo estável. O complexo de ácido nucleico/lipossomo positivamente carregado se liga à superfície celular negativamente carregada e é internalizado em um endossomo. Devido ao pH ácido dentro do endossomo, os lipossomos são rompidos, liberando seus teores no citoplasma celular (Wang e outros, Biochem. Biofys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).
[00468] Lipossomos que são sensíveis ao pH ou negativamente carregados aprisionam ácidos nucleicos ao invés de complexar com eles. Uma vez que ambos o ácido nucleico e o lipídeo são similarmente carregados, repulsão ao invés de formação de complexo ocorre. Não obstante, um pouco de ácido nucleico é aprisionado no interior aquoso desses lipossomos. Lipossomos sensíveis ao pH foram usados para administrar ácidos nucleicos codificando o gene da timidina cinase a monocamadas de célula em cultura. Expressão do gene exógeno foi detectada nas células-alvo (Zhou e outros, Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
[00469] Um tipo principal de composição lisossomal inclui fosfolipídeos que não fosfatidilcolina naturalmente derivada. Composições de lipossomo neutras, por exemplo, podem ser formadas de dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC) ou dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC). Composições de lipossomo aniônicas são geralmente formadas de dimiristoil fosfatidilglicerol, enquanto lipossomos fusogênicos aniônicos são formados principalmente de dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE). Um outro tipo de composição lipossomal é formado de fosfatidilcolina (PC) tal como, por exemplo, PC de soja e PC de ovo. Um outro tipo é formado de misturas de fosfolipídeo e/ou fosfatidilcolina e/ou colesterol.
[00470] Exemplos de outros métodos para introduzir lipossomos em células in vitro e in vivo incluem Pat. U.S. No. 5.283.185; Pat. U.S. No. 5.171.678; WO 94/00569; WO 93/24640; WO 91/16024; Felgner, J. Biol. Chem. 269:2550, 1994; Nabel, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:11307, 1993; Nabel, Human Gene Ter. 3:649, 1992; Gershon, Biochem. 32:7143, 1993; e Strauss EMBO J. 11:417, 1992.
[00471] Sistemas lipossomais não iônicos foram também examinados para determinar sua utilidade na administração de fármacos à pele, em particular sistemas compreendendo tensoativo não iônico e colesterol. Formulações lipossomais não iônicas compreendendo Novasome® I (dilaurato de glicerina/colesterol/polioxietileno-10-estearil éter) e Novasome® II (diestearato de glicerila/colesterol/polioxietileno-10-estearil éter) foram usadas para administrar ciclosporina-A na derme de pele de camundongo. Os resultados indicaram que tais sistemas lipossomais não iônicos foram eficazes na facilitação da deposição de ciclosporina A em camadas diferentes da pele (Hu e outros S.T.P.Farma. Sci., 1994, 4(6) 466).
[00472] Lipossomos podem também incluir lipossomos "estericamente estabilizados", um termo que, como aqui usado, se refere a lipossomos compreendendo um o mais lipídeos especializados que, quando incorporados a lipossomos, resultam em tempos de vida em circulação aumentados com relação a lipossomos sem tais lipídeos especializados. Exemplos de lipossomos estericamente estabilizados são aqueles onde parte da porção de lipídeo de formação de vesícula do lipossomo (A) compreende um ou mais glicolipídeos, tal como monossialogangliosídeo GM1 ou (B) é derivatizada com um ou mais polímeros hidrofílicos, tal como uma porção de polietileno glicol (PEG). Embora não desejando ser limitado por nenhuma teoria particular, é pensado na técnica que, pelo menos para lipossomos estericamente estabilizados contendo gangliosídeos, esfingomielina ou lipídeos derivatizados de PEG, a meia-vida em circulação aumentada desses lipossomos estericamente estabilizados deriva de uma absorção reduzida em células do sistema reticuloendotelial (RES) (Allen e outros, FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu e outros, Cancer Research, 1993, 53, 3765).
[00473] Vários lipossomos compreendendo um ou mais glicolipídeos são conhecidos na técnica. Papahadjopoulos e outros (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) relataram a habilidade de monossialogangliosídeo GM1, sulfato de galactocerebrosídeo e fosfatidilinositol em aperfeiçoar as meias-vidas no sangue de lipossomos. Estas constatações foram apresentadas por Gabizon e outros (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949). Pat. U.S. No. 4.837.028 e WO 88/04924, ambos para Allen e outros, revelam lipossomos compreendendo (1) esfingomielina e (2) o gangliosídeo GM1 ou um éster de sulfato de galactocerebrosídeo. A Pat. U.S. No. 5.543.152 (Webb e outros) revela lipossomos compreendendo esfingomielina. Lipossomos compreendendo 1,2-sn- dimiristoilfosfatidilcolina são revelados no WO 97/13499 (Lim e outros).
[00474] Em uma modalidade, lipossomos catiônicos são usados. Lipossomos catiônicos possuem a vantagem de serem capazes de fundir à membrana celular. Lipossomos não catiônicos, embora não sendo capazes de fundir tão eficientemente com a membrana plasmática, são absorvidos por macrófagos in vivo e podem ser usados para administrar agentes iRNA a macrófagos.
[00475] Vantagens adicionais de lipossomos incluem: lipossomos obtidos de fosfolipídeos naturais são biocompatíveis e biodegradáveis; lipossomos podem incorporar uma ampla faixa de fármacos solúveis em água e lipídeo; lipossomos podem proteger agentes iRNA encapsulados em seus compartimentos internos de metabolismo e degradação (Rosoff, em "Pharmaceutical Dosage Forms," Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, volume 1, p. 245). Considerações importantes na preparação de formulações de lipossomo são carga de superfície de lipídeo, tamanho da vesícula e o volume aquoso dos lipossomos.
[00476] Um lipídeo catiônico sintético positivamente carregado, cloreto de N-[1-(2,3-dioleilóóxi)propil]-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA), pode ser usado para formar lipossomos pequenos que interagem espontaneamente com ácido nucleico para formar complexos de lipídeo-ácido nucleico que são capazes de fundir com os lipídeos negativamente carregados das membranas celulares de células de cultura de tecido, resultando em administração de agente iRNA (vide,por exemplo, Felgner, P. L. e outros, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:74137417, 1987 e Pat. U.S. No. 4.897.355 para uma descrição de DOTA e seu uso com DNA).
[00477] Um análogo de DOTMA, 1,2-bis(oleoilóóxi)-3- (trimetilamônio)propano (DOTAP), pode ser usado em combinação com um fosfolipídeo para formar vesículas de complexação de DNA. Lipofectin® Betesda Research Laboratories, Gaitersburg, Md.) é um agente eficaz para a administração de ácidos nucleicos altamente aniônicos em células de cultura de tecido vivo que compreendem lipossomos de DOTA positivamente carregados que interagem espontaneamente com polinucleotídeos negativamente carregados para formar complexos. Quando lipossomos positivamente carregados suficientes são usados, a carga líquida nos complexos resultantes é também positiva. Complexos positivamente carregados preparados desta maneira se ligam espontaneamente a superfícies de célula negativamente carregadas, fundem com a membrana plasmática e eficientemente administram ácidos nucleicos funcionais em, por exemplo, células de cultura de tecido. Um outro lipídeo catiônico comeroscialmente disponível, 1,2-bis(oleoilóóxi)-3,3-(trimetilamônio)propano ("DOTAP") (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) difere de DOTA pelo fato que as porções oleoíla são ligadas por ligações éster, ao invés de éter.
[00478] Outros compostos de lipídeo catiônico relatados incluem aqueles que foram conjugados a uma variedade de porções incluindo, por exemplo, carboxiespermina que foi conjugada a um de dois tipos de lipídeos e inclui compostos tais como 5-carboxiespermilglicina dioctaoleoilamida ("DOGS") (Transfectam®, Promega, Madison, Wisconsin) e dipalmitoilfosfatidiletanolamina 5-carboxiespermil-amida ("DPPES") (vide, por exemplo, Pat. U.S. No. 5.171.678).
[00479] Um outro conjugado de lipídeo catiônico inclui derivatização do lipídeo com colesterol ("DC-Chol") que foi formulado em lipossomos em combinação com DOPE (vide, Gao, X. e Huang, L., Biochim. Biofys. Res. Commun. 179:280, 1991). Lipopolilisina, feita através da conjugação de polilisina a DOPE, foi relatada ser eficaz para transfecção na presença de soro (Zhou, X. e outros, Biochim. Biofys. Acta 1065:8, 1991). Para certas linhagens de célula, esses lipossomos contendo lipídeos catiônicos conjugados são ditos exibir toxidez menor e proveem transfecção mais eficiente do que as composições contendo DOTMA. Outros produtos de lipídeo catiônicos comeroscialmente disponíveis incluem DMRIE e DMRIE-HP (Vical, La Jolla, California) e Lipofectamina (DOSPA) (Life Technology, Inc., Gaitersburg, Maryland). Outros lipídeos catiônicos adequados para a administração de oligonucleotídeos são descritos no WO 98/39359 e WO 96/37194.
[00480] Formulações lipossomais são particularmente adequadas para administração tópica, lipossomos apresentam várias vantagens com relação a outras formulações. Tais vantagens incluem efeitos colaterais reduzidos relacionados com absorção sistêmica do fármaco administrado, acúmulo aumentado do fármaco administrado no alvo desejado e habilidade em administrar agente de iRNA à pele. Em algumas implementações, lipossomos são usados para administração de gente iRNA a células epidermais e também aumentar a penetração de agente iRNA em tecidos dermais, por exemplo, na pele. Por exemplo, os lipossomos podem ser aplicados topicamente. Administração tópica de fármacos formulados como lipossomos à pele foi documentada (vide, por exemplo, Weiner e outros, Journal of Drug Targeting, 1992, vol. 2,405-410 e du Plessis e outros, Antiviral Research, 18, 1992, 259-265; Mannino, R. J. e Fould-Fogerite, S., Biotechniques 6:682-690, 1988; Itani, T. e outros Gene 56:267-276. 1987; Nicolau, C. e outros Met. Enz. 149:157-176, 1987; Straubinger, R. M. e Papahadjopoulos, D. Met. Enz. 101:512-527, 1983; Wang, C. Y. e Huang, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855, 1987).
[00481] Sistemas lipossomais não iônicos foram também examinados para determinar sua utilidade na administração de fármacos à pele, em particular sistemas compreendendo tensoativos não iônicos e colesterol. Formulações lipossomais não iônicas compreendendo Novasome I (dilaurato de glicerila/colesterol/polioxietileno-10-estearil éter) e Novasome II (diestearato de glicerila/colesterol/polioxietileno-10-estearil éter) foram usadas para administrar um fármaco à derme de pele de camundongo. Tais formulações com agente iRNA são úteis para tratamento de um distúrbio dermatológico.
[00482] Lipossomos que incluem iRNA podem ser feitos altamente deformáveis. Tal deformabilidade pode permitir que os lipossomos penetrem através do poro que são menores do que o raio médio do lipossomo. Por exemplo, transfersomas são um tipo de lipossomos deformáveis. Transfersomas podem ser feitos através da adição de ativadores de borda de superfície, geralmente tensoativos, a uma composição lipossomal padrão. Transfersomas que incluem agente iRNA podem ser administrados, por exemplo, subcutaneamente através de infecção a fim de administrar agente iRNA a queratinócitos na pele. A fim de cruzar a pele do mamífero intactas, vesículas de lipídeo devem passar por uma série de poros finos, cada um com um diâmetro de menos do que 50 nm, sob a influência de um gradiente transdermal adequado. Ainda, devido às propriedades do lipídeo, esses transfersomas podem ser de auto-otimização (adaptativos ao formato de poros, por exemplo, na pele), autorreparação e podem frequente atingir seus alvos sem fragmentação, e frequentemente autocarregáveis.
[00483] Outras formulações condescendentes à presente invenção são descritas nos pedidos de patente provisórios dos Estados Unidos Nos. de Série 61/018.616, depositado em 2 de janeiro de 2008; 61/018.611, depositado em 2 de janeiro de 2008; 61/039.748, depositado em 26 de março de 2008; 61/047.087, depositado em 22 de abril de 2008 e 61/051.528, depositado em 8 de maio de 2008. O Pedido de Patente PCT No. PCT/US2007/080331, depositado em 3 de outubro de 2007, também descreve formulações que são condescendentes à presente invenção.
[00484] Transfersomas são ainda um outro tipo de lipossomos, e são agregados de lipídeo altamente deformáveis que são candidatos atraentes para veículos de administração de fármaco. Transfersomas podem ser descritos como gotículas de lipídeo que são tão altamente transformáveis que elas são facilmente capazes de penetrar através dos poros que são menores do que a gotícula. Transfersomas são adaptáveis ao ambiente onde eles são usados, por exemplo, eles são de auto-otimização (adaptativos ao formato de poros na pele), autorreparadores, frequentemente atingem seus alvos sem fragmentação, e frequentemente de autocarregamento. Para fazer transfersomas é possível adicionar ativadores de borda de superfície, geralmente tensoativos, a uma composição lipossomal padrão. Transfersomas foram usados para administrar albumina do soro à pele. A administração mediada por transfersoma de albumina do soro foi mostrada ser tão eficaz quanto injeção subcutânea de uma solução contendo albumina do soro.
[00485] Tensoativos encontram ampla aplicação em formulações tais como emulsões (incluindo microemulsões) e lipossomos. O meio mais comum de classificação das propriedades dos muitos tipos diferentes de tensoativos, ambos naturais e sintéticos, é através do uso do equilíbrio hidrófilo/lipófilo (HLB). A natureza do grupo hidrofílico (também conhecido como a "cabeça") provê o meio mais útil para categorização dos tensoativos diferentes usados em formulações (Rieger, em "Pharmaceutical Dosage Forms", Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
[00486] Se a molécula de tensoativo não for ionizada, ela é classificada como um tensoativo não iônico. Tensoativos não iônicos encontram ampla aplicação em produtos farmacêuticos e cosméticos e são úteis em uma ampla faixa de valores de pH. Em geral seus valores de HLB variam de 2 a cerca de 18 dependendo da sua estrutura. Tensoativos não iônicos incluem ésteres não iônicos tais como ésteres de etileno glicol, ésteres de propileno glicol, ésteres de glicerila, ésteres de poliglicerila, ésteres de sorbitano, ésteres de sacarose e ésteres etoxilados. Alcanolamidas não iônicas e ésteres tais como etoxilatos de álcool graxo, álcoois propoxilados e polímeros em bloco etoxilados/propoxilados são também incluídos nesta classe. Os tensoativos de polioxietileno são os membros mais populares da classe de tensoativo não iônico.
[00487] Se a molécula de tensoativo carregar uma carga negativa quando ela é dissolvida ou dispersa em água, o tensoativo é classificado como aniônico. Tensoativos aniônicos incluem carboxilatos tais como sopas, lactilatos de acila, acil amidas de aminoácidos, ésteres de ácido sulfúrico tais como sulfatos de alquila e sulfatos de alquila etoxilados, sulfonatos tais como sulfonatos de alquil benzeno, isetionatos de acila, tauratos e sulfossuccinato de acila e fosfatos. Os membros mais importantes da classe de tensoativo aniônico são os sulfatos de alquila e os sabões.
[00488] Se a molécula de tensoativo carregar uma carga positiva quando ela é dissolvida ou dispersa em água, o tensoativo é classificado como catiônico. Tensoativos catiônicos incluem sais de amônio quaternário e aminas etoxiladas. Os sais de amônio quaternários são os membros mais usados desta classe.
[00489] Se a molécula de tensoativo tiver a habilidade em carregar uma carga positiva ou negativa, o tensoativo é classificado como anfotérico. Tensoativos anfotéricos incluem derivados de ácido acrílico, alquilamidas substituídas, N-alquilbetaínas e fosfatídeos.
[00490] O uso de tensoativos em produtos de fármaco, formulações e em emulsões foi revisto (Rieger, em "Pharmaceutical Dosage Forms", Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
[00491] O iRNA para uso nos métodos da invenção pode também ser provido como formulações micelares. "Micelas" são definidas aqui como um tipo particular de montagem molecular onde moléculas anfipáticas são dispostas em uma estrutura esférica de maneira que todas as porções hidrofóbicas das moléculas são direcionadas para dentro, deixando as porções hidrofílicas em contato com a fase aquosa circundante. A disposição contrária existe se o ambiente for hidrofóbico.
[00492] Uma formulação micelar mista adequada para administração através de membranas transdermais pode ser preparada misturando uma solução aquosa da composição de siRNA, um sulfato de C8 a C22 alquila de metal alcalino e compostos de formação de micela. Compostos de formação de micela exemplares incluem lecitina, ácido hialurônico, sais farmaceuticamente aceitáveis de ácido hialurônico, ácido glicólico, extrato de camomila, extrato de pepino, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolênico, mono-oleína, mono-oleato, monolaurato, óleo de borragem, óleo de prímula da manhã, mentol, tri- hidróxi oxo colanil glicina e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, glicerina, poliglicerina, lisina, polilisina, trioleína, éteres de polioxietileno e análogos dos mesmos, alquil éteres de polidocanol e análogos dos mesmos, quenodesoxicolato, desoxicolato e misturas dos mesmos. Os compostos de formação de micela podem ser adicionados ao mesmo tempo ou após adição do sulfato de alquila de metal alcalino. Micelas mistas se formação com substancialmente qualquer tipo de mistura dos ingredientes, mas mistura vigorosa a fim de prover micelas de tamanho menor.
[00493] Em um método uma primeira composição micelar é preparada, a qual contém a composição de siRNA e pelo menos o sulfato de alquila de metal alcalino. A primeira composição micelar é então misturada com pelo menos três compostos de formação de micela para formar uma composição micelar mista. Em um outro método, a composição micelar é preparada misturando a composição de siRNA, o sulfato de alquila de metal alcalino e pelo menos um dos compostos de formação de micela, seguido pela adição dos compostos de formação de micela restantes, com mistura vigorosa.
[00494] Fenol e/ou m-cresol pode ser adicionado à composição micelar mista para estabilizar a formulação e proteger contra crescimento bacteriano. Alternativamente, fenol e/ou m-cresol pode ser adicionado com os ingredientes de formação de micela. Um agente isotônico tal como glicerina pode ser também adicionado após formação da composição micelar mista.
[00495] Para administração da formulação micelar como um spray, a formulação pode ser posta em um aplicador aerossol e o aplicador é carregado com um propelente. O propelente, que está sob pressão, está em forma líquido no aplicador. As razões dos ingredientes são ajustadas de maneira que as fases aquosas e propelentes se tornam uma, isto é, há apenas uma fase. Se houver duas fases, é necessário agitar o aplicador antes da aplicação de uma porção dos teores, por exemplo, através de uma válvula medida. A dose aplicada de agente farmacêutico é propelida a partir da válvula medida em um spray fino.
[00496] Propelentes podem incluir clorofluorcarbonos contendo hidrogênio, fluorcarbonos contendo hidrogênio, éter de dimetila e éter de dietila. Em certas modalidades, HFA 134a (1,1,1,2-tetrafluoretano) pode ser usado.
[00497] As concentrações específicas dos ingredientes essenciais podem ser determinadas através de experimentação relativamente direta. Para absorção através das cavidades orais, é frequentemente desejável aumentar, por exemplo, pelo menos duplicar ou triplicar, a dosagem para através de injeção ou administração através do trato gastrintestinal.
B. Partículas de lipídeo
[00498] iRNAs, por exemplo, dsRNAs da invenção podem ser totalmente encapsulados em uma formulação de lipídeo, por exemplo, uma LNP, ou outra partícula de ácido nucleico-lipídeo.
[00499] Como aqui usado, o termo "LNP" se refere a uma partícula de ácido nucleico-lipídeo estável. LNPs contêm tipicamente um lipídeo catiônico, um lipídeo não catiônico e um lipídeo que previne agregação da partícula (por exemplo, um conjugado de PEG-lipídeo). LNPs são extremamente úteis para aplicações sistêmicas, uma vez que elas exibem tempos de vida em circulação estendidos seguindo injeção intravenosa (i.v.) e acumulam em sítios distais (por exemplo, sítios fisicamente separados do sítio de administração). LNPs incluem "pSPLP", que inclui um complexo de agente de condensação encapsulado-ácido nucleico como mostrado na Publicação PCT No. WO 00/03683. As partículas da presente invenção têm tipicamente um diâmetro médio de cerca de 50 nm a cerca de 150 nm, mais tipicamente cerca de 60 nm a cerca de 130 nm, mais tipicamente cerca de 70 nm a cerca de 110 nm, sobretudo tipicamente cerca de 70 nm a cerca de 90 nm, e são substancialmente não tóxicos. Ainda, os ácidos nucleicos quando presentes nas partículas de ácido nucleico-lipídeo da presente invenção são resistentes em solução aquosa à degradação com uma nuclease. Partículas de ácido nucleico-lipídeo e seu método de preparação são reveladas nas, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5.976.567; 5.981.501; 6.534.484; 6.586.410; 6.815.432; Publicação U.S. No. 2010/0324120 e Publicação PCT No. WO 96/40964.
[00500] Em uma modalidade, a razão de lipídeo para fármaco (razão massa/massa) (por exemplo, razão de lipídeo para dsRNA) estará na faixa de a partir de cerca de 1:1 a cerca de 50:1, de a partir de cerca de 1:1 a cerca de 25:1, de a partir de cerca de 3:1 a cerca de 15:1, de a partir de cerca de 4:1 a cerca de 10:1, de a partir de cerca de 5:1 a cerca de 9:1 ou cerca de 6:1 a cerca de 9:1. Intermediários para faixas para as faixas mencionadas acima são também compreendidos como sendo parte da invenção.
[00501] O lipídeo catiônico pode ser, por exemplo, cloreto de N,N- dioleil-N,N-dimetilamônio (DODAC), brometo de N,N-distearil-N,N- dimetilamônio (DDAB), cloreto de N-(I -(2,3- dioleoilóxi)propil)-N,N,N- trimetilamônio (DOTAP), cloreto de N-(I -(2,3- dioleilóxi)propil)-N,N,N- trimetilamônio (DOTMA), N,N-dimetil-2,3- dioleilóxi)propilamina (DODMA), 1,2-DiLinoleilóxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), l,2- Dilinolenilóxi-N,N-dimetilaminopropano (DLenDMA), 1,2- Dilinoleilcarbamoilóxi-3-dimetilaminopropano (DLin-C-DAP), 1,2- Dilinoleióxi-3-(dimetilamino)acetoxipropano (DLin-DAC), 1,2-Dilinoleióxi-3-morfolinopropano (DLin-MA), 1,2-Dilinoleoil-3- dimetilaminopropano (DLinDAP), 1,2-Dilinoleiltio-3-dimetilaminopropano (DLin-S-DMA), 1-Linoleoil-2-linoleilóxi-3- dimetilaminopropano (DLin-2-DMAP), Sal de cloreto de 1,2-dilinoleilóxi- 3-trimetilaminopropano (DLin-TMA.Cl), Sal de cloreto de 1,2-dilinoleoil- 3-trimetilaminopropano (DLin-TAP.Cl), 1,2-Dilinoleilóxi-3-(N- metilpiperazino)propano (DLin-MPZ) ou 3-(N,N-Dilinoleilamino)-1,2- propanodiol (DLinAP), 3-(N,N-Dioleilamino)-1,2-propanodiol (DOAP), 1,2-Dilinoleiloxo-3-(2-N,N-dimetilamino)etoxipropano (DLin-EG-DMA), 1,2-Dilinolenilóxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 2,2-Dilinoleil-4- dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA) ou análogos dos mesmos, (3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12- dienil)tetra-hidro-3aH-ciclopenta[d][1,3]dioxol-5-amina (ALN100),(6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-il 4-(dimetilamino)butanoato (MC3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(bis(2-hidroxidodecil)amino)etil)(2-hidroxidodecil)amino)etil)piperazin-1- il)etilazanediil)didodecan-2-ol (Tech G1) ou uma mistura dos mesmos. O lipídeo catiônico pode compreender de a partir de cerca de 20% em mol a cerca de 50% em mol ou cerca de 40% em mol do lipídeo total presente na partícula.
[00502] Em uma outra modalidade, o composto 2,2-Dilinoleil-4- dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano é descrito na no pedido de patente provisório dos Estados Unidos númeroso 61/107.998 depositado em 23 de outubro de 2008, o qual é aqui incorporado a título de referência.
[00503] Em uma modalidade, a partícula de lipídeo-siRNA 40% 2,2- Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano: 10% DSPC: 40% Colesterol: 10% PEG-C-DOMG (por cento em mol) com um tamanho de partícula de 63,0 ± 20 nm e uma Razão de siRNA/Lipídeo 0,027.
[00504] O lipídeo ionizável/não catiônico pode ser um lipídeo aniônico ou um lipídeo neutro incluindo, mas não limitado a, diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina (POPE), dioleoil- fosfatidiletanolamina4-(N-maleimidometil)-cicloexano-l-carboxilato (DOPE-mal), dipalmitoil fosfatidil etanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), distearoil-fosfatidil-etanolamina (DSPE), 16-O-monometil PE, 16-O-dimetil PE, 18-1 -trans PE, 1 -estearoil- 2-oleoil- fosfatidietanolamina (SOPE), colesterol ou uma mistura dos mesmos. O lipídeo não catiônico pode ser de a partir de cerca de 5% em mol a cerca de 90% em mol, cerca de 10% em mol ou cerca de 58% em mol se colesterol foi incluído, do lipídeo total presente na partícula.
[00505] O lipídeo conjugado que inibe agregação de partículas pode ser, por exemplo, um lipídeo de polietilenoglicol (PEG) incluindo, sem limitação, um PEG-diacilglicerol (DAG), um PEG-dialquiloxipropila (DAA), um PEG-fosfolipídeo, um PEG-ceramida (Cer) ou uma mistura dos mesmos. O conjugado de PEG-DAA pode ser, por exemplo, um PEG-dilauriloxipropila (Ci2), um PEG-dimiristiloxipropila (Ci4), um PEG- dipalmitiloxipropila (Ci6) ou um PEG-diesteariloxipropila (Ci8). O lipídeo conjugado que previne agregação de partículas pode ser de a partir de 0% em mol a cerca de 20% em mol ou cerca de 2% em mol do lipídeo total presente na partícula.
[00506] Em algumas modalidades, a partícula de ácido nucleico- lipídeo inclui ainda colesterol em, por exemplo, cerca de 10% em mol a cerca de 60% em mol ou cerca de 48% em mol do lipídeo total presente na partícula.
[00507] Em uma modalidade, o lipidoide ND98-4HCI (MW 1487) (vide Pedido de Patente U.S. No. 12/056.230, depositado em 26/03/2008, que é aqui incorporado a título de referência), Colesterol (Sigma-Aldrich) e PEG-Ceramida C16 (Avanti Polar Lipids) podem ser usados para preparar nanopartículas de lipídeo-dsRNA (i.e., partículas de LNP01). Soluções de estoque de cada em etanol podem ser preparadas como segue: ND98, 133 mg/mL; Colesterol, 25 mg/mL, PEG-Ceramida C16, 100 mg/mL. As soluções de estoque de ND98, Colesterol e PEG- Ceramida C16 podem então ser combinadas em uma razão molar de, por exemplo, 42:48:10. A solução de lipídeo combinada pode ser misturada com dsRNA aquoso (por exemplo, em acetato de sódio pH 5) de maneira que a concentração final de etanol seja cerca de 35-45% e a concentração de acetato de sódio final seja cerca de 100-300 mM. Nanopartículas de lipídeo-dsRNA tipicamente se formam espontaneamente quando da mistura. Dependendo da distribuição de tamanho de partícula desejada, a mistura de nanopartícula resultante pode ser extrudada através de uma membrana de policarbonato (por exemplo, corte de 100 nm) usando, por exemplo, um extrusor do tipo termobarril, tal como um Lipex Extruder (Nortern Lipids, Inc.). Em alguns casos, a etapa de extrusão pode ser omitida. Remoção de etanol e simultânea troca de tampão podem ser realizadas através de, por exemplo, diálise ou filtragem de fluxo tangencial. O tampão pode ser trocado com, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato (PBS) em pH de cerca de 7, por exemplo, pH de cerca de 6,9, pH de cerca de 7,0, pH de cerca de 7,1, pH de cerca de 7,2, pH de cerca de 7,3 ou pH de cerca de 7,4.
Figure img0017
[00508] Formulações LNP01 são descritas, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente Internacional No. WO 2008/042973, que é aqui incorporada a título de referência.
[00509] Formulações de lipídeo-dsRNA exemp Isômeroso I ND98 o descritas na Tabela 1.
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Figure img0019
Figure img0020
[00510] DSPC: distearoilfosfatid
[00511] DPPC: dipalmitoilfosfati
[00512] PEG-DMG: PEG-dimiristoil C14) (PEG com um peso molecular méd ilcolina dilcolina glicerol (C14-PEG ou PEG- io de 2000)
[00513] PEG-DSG: PEG-distiril glicerol (C18-PEG ou PEG-C18) (PEG com um peso molecular médio de 2000)
[00514] PEG-cDMA: PEG-carbamoil-1,2-dimiristiloxipropilamina (PEG com um peso molecular médio de 2000)
[00515] SNALP Formulações compreendendo (1,2-Dilinolenilóxi- N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA)) são descritos na Publicação Internacional No. WO2009/127060, depositada em 15 de abril de 2009, que é aqui incorporada a título de referência.
[00516] Formulações compreendendo XTC são descritas, por exemplo, no Pedido Provisório U.S. No. de Série 61/148.366 depositado em 29 de janeiro de 2009; Pedido de Patente U.S. Provisório No. de Série 61/156.851, depositado em 2 de março de 2009; Pedido de Patente Provisório U.S. No. de Série depositado em 10 de junho de 2009; Pedido de Patente U.S. Provisório No. de Série 61/228.373, depositado em 24 de julho de 2009; Pedido de Patente U.S. Provisório No. de Série 61/239.686, depositado em 3 de setembro de 2009 e Pedido de Patente Internacional No. PCT/US2010/022614, depositado em 29 de janeiro de 2010, que são aqui incorporados a título de referência.
[00517] Formulações compreendendo MC3 são descritas, por exemplo, na Publicação U.S. No. 2010/0324120, depositada em 10 de junho de 2010, cujos conteúdos em sua totalidade são aqui incorporados a título de referência.
[00518] Formulações compreendendo ALNY-100 são descritas, por exemplo, no Pedido de patente internacional númeroso PCT/US09/63933, depositado em 10 de novembro de 2009, que é aqui incorporado a título de referência.
[00519] Formulações compreendendo C12-200 são descritas no Pedido de patente provisório U.S. No. de Série 61/175.770, depositado em 5 de maio de 2009 e Pedido de Patente Internacional No. PCT/US10/33777, depositado em 5 de maio do e 2010, que são aqui incorporados a título de referência.
Síntese de lipídeos ionizáveis/catiônicos
[00520] Qualquer um dos compostos, por exemplo, lipídeos catiônicos e similar, usados nas partículas de ácido nucleico-lipídeo da invenção pode ser preparado através de técnicas de síntese orgânica conhecidas, incluindo os métodos descritos em mais detalhes nos Exemplos. Todos os substituintes são como definido abaixo a menos que de outro modo indicado.
[00521] "Alquila" significa um hidrocarboneto alifático saturado, de cadeia reta ou ramificada, não cíclico ou cíclico, contendo de 1 a 24 átomos de carbono. Alquilas de cadeia reta saturada representativas incluem metila, etila, n-propila, n-butila, n-pentila, n-hexila e similar; enquanto alquilas ramificadas saturadas incluem isopropila, sec-butila, isobutila, terc-butila, isopentila e similar. Alquilas cíclicas saturadas representativas incluem ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, cicloexila e similar; enquanto alquilas cíclicas insaturadas incluem ciclopentenila e cicloexenila, e similar.
[00522] "Alquenila" significa uma alquila, como acima definido, contendo pelo menos uma ligação dupla entre átomos de carbono adjacentes. Alquenilas incluem ambos isômeros cis e trans. Alquenilas de cadeia reta e ramificadas representativas incluem etilenila, propilenila, 1-butenila, 2-butenila, isobutilenila, 1-pentenila, 2-pentenila, 3-metil-1-butenila, 2-metil-2-butenila, 2,3-dimetil-2-butenila e similar.
[00523] "Alquinila" significa qualquer alquila ou alquenila, como acima definido, que contém ainda pelo menos uma ligação tripla entre carbonos adjacentes. Alquinilas de cadeia reta e ramificadas representativas incluem acetilenila, propinila, 1-butinila, 2-butinila, 2- pentinila, 2-pentinila, 3-metil-1-butinila e similar.
[00524] "Acila" significa uma alquila, alquenila ou alquinila onde o carbono no ponto de ligação é substituído com um grupo oxo, como definido abaixo. Por exemplo, -C(=O)alquila, -C(=O)alquenila e - C(=O)alquinila são grupos acila.
[00525] "Heterociclo" significa um anel heterocíclico monocíclico de 5 a 7 membros, ou bicíclico de 7 a 10 membros, que é ou saturado, insaturado ou aromático e que contém 1 ou 2 heteroátomos independentemente selecionados de nitrogênio, oxigênio e enxofre, e onde os heteroátomos de nitrogênio e enxofre podem ser opcionalmente oxidados, e o heteroátomo de nitrogênio pode ser opcionalmente quaternizado, incluindo anéis bicíclicos onde qualquer um dos heterociclos acima é fundido a um anel benzeno. O heterociclo pode ser ligado através de qualquer heteroátomo ou átomo de carbono. Heterociclos incluem heteroarilas como definido abaixo. Heterociclos incluem morfolinila, pirrolidinonila, pirrolidinila, piperidinila, piperizinila, hidantoinila, valerolactamil, oxiranila, oxetanila, tetra-hidrofuranila, tetra- hidropiranila, tetra-hidropiridinila, tetra-hidropirimidinila, tetra- hidrotiofenila, tetra-hidrotiopiranila, tetra-hidropirimidinila, tetra- hidrotiofenila, tetra-hidrotiopiranila e similar.
[00526] Os termos "alquila opcionalmente substituída", "alquenila opcionalmente substituída", "alquinila opcionalmente substituída", "acila opcionalmente substituída" e "heterociclo opcionalmente substituído" significa que, quando substituídos, pelo menos um átomo de hidrogênio é substituído com um substituinte. No caso de um substituinte oxo (=O) dois átomos de hidrogênio são substituídos. Com relação a isso, substituintes incluem oxo, halogênio, heterociclo, -CN, - ORx, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry, -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)ORx, -C( =O)NRxRy, -SOnRx e -SOnNRxRy, onde n é 0, 1 ou 2, Rx e Ry são iguais ou diferentes e independentemente hidrogênio, alquila ou heterociclo, e cada um dos ditos substituintes alquila e heterociclo pode ser ainda substituído com um ou mais de oxo, halogênio,-OH, -CN, alquila, -ORx,heterociclo, -NRxRy, -NRxC(=O)Ry, -NRxSO2Ry, -C(=O)Rx, -C(=O)O Rx, -C(=O)NRxRy, -SOnRx e -SOnNRxRy.
[00527] "Halogênio" significa flúor, cloro, bromo e iodo.
[00528] Em algumas modalidades, os métodos da invenção podem requerer o uso de grupos de proteção. Metodologia de grupo de proteção é bem conhecida daqueles versados na técnica (vide, por exemplo, Protective Groups in Organic Syntesis, Green, T.W. e outros, Wiley-Interscience, New York City, 1999). Em suma, grupos de proteção dentro do contexto da presente invenção são qualquer grupo que reduza ou elimine reatividade indesejada de um grupo funcional. Um grupo de proteção pode ser adicionado a um grupo funcional para mascarar sua reatividade durante certas reações e então removido para revelar o grupo funcional original. Em algumas modalidades, um "grupo de proteção de álcool" é usado. Um "grupo de proteção de álcool" é qualquer grupo que diminua ou elimine reatividade indesejada de um grupo funcional álcool. Grupos de proteção podem ser adicionados e removidos usando técnicas bem conhecidas na arte.
Síntese de Fórmula A
[00529] Em algumas modalidades, partículas de ácido nucleico- lipídeo da invenção são formuladas usando um lipídeo catiônico de fórmula A:
Figure img0021
[00530] em que R1 e R2 são independentemente alquila, alquenila ou alquinila, cada um pode ser opcionalmente substituído, e R3 e R4 são independentemente alquila inferior ou R3 e R4 podem ser unidos para formar um anel heterocíclico opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, o lipídeo catiônico é XTC (2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil- [1,3]-dioxolano). Em geral, o lipídeo de fórmula A acima pode ser feito através dos Esquemas de Reação 1 e 2 que seguem, onde todos os substituintes são como acima definido a menos que de outro modo indicado.Esquema 1
Figure img0022
[00531] O lipídeo A, onde R1 e R2 são independentemente alquila, alquenila ou alquinila, pode ser cada um opcionalmente substituído, e R3 e R4 são independentemente alquila inferior ou R3 e R4 podem ser unidos para formar um anel heterocíclico opcionalmente substituído, pode ser preparado de acordo com o Esquema 1. Cetona 1 e bromo 2 podem ser comprados ou preparados de acordo com métodos conhecidos daqueles de habilidade comum na técnica. A reação de 1 e 2 fornece cetal 3. O tratamento de cetal 3 com amina 4 fornece lipídeos de fórmula A. Os lipídeos de fórmula A podem ser convertidos no sal de amônio correspondente com um sal orgânico de fórmula 5, onde X é um contra íon de ânion selecionado de halogênio, hidróxido, fosfato, sulfato ou similar.Esquema 2
Figure img0023
[00532] Alternativamente, o material de partida da cetona 1 pode ser preparado de acordo com o Esquema 2. Reagente Grignard 6 e cianida 7 podem ser comprados ou preparados de acordo com métodos conhecidos daqueles de habilidade comum na técnica. A reação de 6 e 7 fornece cetona 1. Conversão de cetona nos lipídeos correspondentes de fórmula A é como descrito no Esquema 1.
Síntese de MC3
[00533] Preparação de DLin-M-C3-DMA (isto é, (6Z,9Z,28Z,31Z)- heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-il 4-(dimetilamino)butanoato) foi como segue. Uma solução de (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta- 6,9,28,31-tetraen-19-ol (0,53 g), cloridrato do ácido 4-N,N- dimetilaminobutírico (0,51 g), 4-N,N-dimetilaminopiridina (0,61g) e cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (0,53 g) em diclorometano (5 mL) foi agitada em temperatura ambiente de um dia para o outro. A solução foi lavada com ácido clorídrico diluído seguido por bicarbonato de sódio aquoso diluído. As frações orgânicas foram secas em sulfato de magnésio anidro, filtradas e o solvente removido em um rotovap. O resíduo foi passado por uma coluna de sílica gel (20 g) usando um gradiente de eluição de metanol/diclorometano 1-5%. Frações contendo o produto purificado foram combinadas e o solvente removido, fornecendo um óleo incolor (0,54 g).
Síntese de ALNY-10
[00534] Síntese de cetal 519 [ALNY-100] foi realizada usando o esquema 3 que segue:
Figure img0024
Síntese de 515
[00535] A uma suspensão agitada de LiaAlH4 (3,74 g, 0,09852 mol) em 200 mL de TF anidro em um RBF de dois gargalos (1L) foi adicionada uma solução de 514 (10 g, 0,04926 mol) em 70 mL de TF lentamente a 0oC sob atmosfera de nitrogênio. Após adição completa, a mistura de reação foi aquecida para a temperatura ambiente e então aquecida para refluxo por 4 horas. Progresso da reação foi monitorado através de TLC. Após término da reação (através de TLC) a mistura foi esfriada para 0oC e extinta com adição cuidadosa de solução de Na2SO4 saturada. A mistura de reação foi agitada por 4 horas em temperatura ambiente e filtrada. O resíduo foi bem lavado com TF. O filtrado e lavagens foram misturados e diluídos com 400 mL de dioxana e 26 mL de HCl conc. e agitado por 20 minutos em temperatura ambiente. Os voláteis foram retirados sob vácuo para fornecer o sal de cloridrato de 515 como um sólido branco. Rendimento: 7,12 g. 1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ= 9,34 (amplo, 2H), 5,68 (s, 2H), 3,74 (m, 1H), 2,66-2,60 (m, 2H), 2,50-2,45 (m, 5H).
Síntese de 516
[00536] A uma solução agitada de composto 515 em 100 mL de DCM seco em um RBF de dois gargalos de 250 mL foi adicionado NEt3 (37,2 mL, 0,2669 mol) e esfriado para 0o C sob atmosfera de nitrogênio. Após uma adição lenta de N-(benzilóxi-carbonilóxi)-succinimida (20 g, 0,08007 mol) em 50 mL de DCM seco, a mistura de reação foi deixada aquecer para a temperatura ambiente. Após término da reação (2-h através de TLC) a mistura foi lavada sucessivamente com solução de HCl 1N (1 x 100 mL) e solução de NaHCO3 saturada (1 x 50 mL). A camada orgânica foi então seca em Na2SO4 anidro e o solvente foi evaporado para fornecer material bruto que foi purificado através de cromatografia de coluna de sílica gel para fornecer 516 como massa pegajosa. Rendimento: 11 g (89%). 1H-NMR (CDCl3, 400MHz): δ = 7,36-7,27(m, 5H), 5,69 (s, 2H), 5,12 (s, 2H), 4,96 (amplo, 1H) 2,74 (s, 3H), 2,60(m, 2H), 2,30-2,25(m, 2H), LC-MS [M+H] -232,3 (96,94%).
Síntese de 517A e 517B
[00537] O ciclopenteno 516 (5 g, 0,02164 mol) foi dissolvido em uma solução de 220 mL de acetona e água (10:1) em um RBF de 500 mL de gargalo único e a ele foi adicionado N-metil morfolino-N-óxido (7,6 g, 0,06492 mol) seguido por 4,2 mL de solução 7,6% de OsO4 (0,275 g, 0,00108 mol) em terc-butanol em temperatura ambiente. Após término da reação (~3 h), a mistura foi extinta com adição de Na2SO3 sólido e a mistura resultante foi agitada por 1,5 h em temperatura ambiente. A mistura de reação foi diluída com DCM (300 mL) e lavada com água (2 x 100 mL) seguido por solução de NaHCO3 saturada (1 x 50 mL), água (1 x 30 mL) e finalmente com salmoura (1 x 50 mL). A fase orgânica foi seca em Na2SO4 anidro e o solvente foi removido a vácuo. Purificação cromatográfica em coluna de sílica gel do material bruto forneceu uma mistura de diastereômeros, que foram separados através de HPLC preparativa. Rendimento: - 6 g brutos.
[00538] 517A - Pico-1 (sólido branco), 5,13 g (96%). 1H-NMR (DMSO, 400MHz): δ= 7,39-7,31(m, 5H), 5,04(s, 2H), 4,78-4,73 (m, 1H), 4,48-4,47(d, 2H), 3,94-3,93(m, 2H), 2,71(s, 3H), 1,72- 1,67(m, 4H), LC- MS - [M+H]-266,3, [M+NH4 +]-283,5 presente, HPLC-97,86%. Estereoquímica confirmada através de raio X.
Síntese de 518
[00539] Usando um procedimento análogo àquele descrito para a síntese de composto 505, o composto 518 (1,2 g, 41%) foi obtido como um óleo incolor. 1H-NMR (CDCl3, 400MHz): δ= 7,35-7,33(m, 4H), 7,30- 7,27(m, 1H), 5,37-5,27(m, 8H), 5,12(s, 2H), 4,75(m,1H), 4,58- 4,57(m,2H), 2,78-2,74(m,7H), 2,06-2,00(m,8H), 1,96-1,91(m, 2H), 1,62(m, 4H), 1,48(m, 2H), 1,37-1,25(m amplo, 36H), 0,87(m, 6H), HPLC- 98,65%.
Procedimento Geral para Síntese do Composto 519
[00540] Uma solução de composto 518 (1 eq.) em hexano (15 mL) foi adicionada de uma maneira em gotas a uma solução gelada de LAH em TF (1 M, 2 eq.). Após adição completa, a mistura foi aquecida a 40° C durante 0,5 h, então novamente esfriada em um banho gelado. A mistura foi cuidadosamente hidrolisada com Na2SO4 aquoso saturado, então filtrada em celite e reduzida para um óleo. Cromatografia de coluna proveu o 519 puro (1,3 g, 68%) que foi obtido como um óleo incolor. 13C NMR δ = 130,2, 130,1 (x2), 127,9 (x3), 112,3, 79,3, 64,4, 44,7, 38,3, 35,4, 31,5, 29,9 (x2), 29,7, 29,6 (x2), 29,5 (x3), 29,3 (x2), 27,2 (x3), 25,6, 24,5, 23,3, 226, 14,1; Eletropulverização MS (+ve): Peso molecular para C44H80NO2 (M + H)+ Calc. 654,6. Encontrado 654,6.
[00541] Formulações preparadas ou através do método padrão ou livre de extrusão podem ser caracterizadas de maneiras similares. Por exemplo, as formulações são tipicamente caracterizadas através de inspeção visual. Elas devem ser soluções transluzentes esbranquiçadas livres de agregados ou sedimento. O tamanho de partícula e distribuição de tamanho de partícula de nanopartículas de lipídeo podem ser medidos através de difração de luz usando, por exemplo, um Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, USA). As partículas devem ser de mais ou menos 20-300 nm, tal como 40-100 nm de tamanho. A distribuição de tamanho de partícula deve ser unimodal. A concentração de dsRNA total na formulação, bem como a fração aprisionada, é estimada usando um ensaio de exclusão de corante. Uma amostra do dsRNA formulado pode ser incubada com um corante de ligação a RNA, tal como Ribogreen (Molecular Probes) na presença ou ausência de um tensoativo de rompimento de formulação, por exemplo, Triton-X100 0,5%. O dsRNA total na formulação pode ser determinado através do sinal a partir da amostra contendo o tensoativo, com relação a uma curva padrão. A fração aprisionada é determinada subtraindo o teor de dsRNA "livre" (conforme medido através do sinal na ausência de tensoativo) do teor de dsRNA total. O dsRNA aprisionado percentual é tipicamente >85%. Para formulação de SNALP, o tamanho de partícula é pelo menos 30 nm, pelo menos 40 nm, pelo menos 50 nm, pelo menos 60 nm, pelo menos 70 nm, pelo menos 80 nm, pelo menos 90 nm, pelo menos 100 nm, pelo menos 110 nm e pelo menos 120 nm. A faixa adequada é tipicamente cerca de pelo menos 50 nm a cerca de pelo menos 110 nm, cerca de pelo menos 60 nm a cerca de pelo menos 100 nm ou cerca de pelo menos 80 nm a cerca de pelo menos 90 nm.
[00542] Composições e formulações para administração oral incluem pós ou grânulos, micropartículas, nanopartículas, suspensões ou soluções em água ou meio não aquoso, cápsulas, cápsulas de gel, sachês, comprimidos ou minicomprimidos. Espessantes, agentes saborizantes, diluentes, emulsificantes, auxiliares de dispersão ou ligantes podem ser desejáveis. Em algumas modalidades, formulações orais são aquelas onde dsRNAs apresentados na invenção são administrados em conjunto com um ou mais tensoativos potencializadores de penetração e quelantes. Tensoativos adequados incluem ácidos graxos e/ou ésteres ou sais dos mesmos, ácidos da bile e/ou sais dos mesmos. Ácidos/sais de bile adequados incluem ácido quenodesoxicólico (CDCA) e ácido ursodesoxiquenodesoxicólico (UDCA), ácido cólico, ácido desidrocólico, ácido desoxicólico, ácido glucólico, ácido glicólico, ácido glicodesoxicólico, ácido taurocólico, ácido taurodesoxicólico, tauro-24,25-di-hidro-fusidato de sódio e glicodi- hidrofusidato de sódio. Ácidos graxos adequados incluem ácido araquidônico, ácido undecanoico, ácido oleico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolênico, dicaprato, tricaprato, mono-oleína, dilaurina, 1-monocaprato de glicerila, 1-dodecilazacicloeptan-2-ona, uma acilcarnitina, uma acilcolina ou um monoglicerídeo, um diglicerídeo ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo (por exemplo, sódio). Em algumas modalidades, combinações de aumentadores de penetração são usadas, por exemplo, ácidos graxos/ácidos em combinação com ácidos/sais de bile. Uma combinação exemplar é sal de sódio de ácido láurico, ácido cáprico e UDCA. Aumentadores de penetração adicionais incluem polioxietileno-9-lauril éter, polioxietileno- 20-cetil éter. dsRNAs apresentados na invenção podem ser administrados oralmente, em forma granular incluindo partículas secas pulverizadas ou complexados para formar micro ou nanopartículas. Agentes de complexação de dsRNA incluem poliaminoácidos; poli- imidas; poliacrilatos; polialquilacrilatos, polioxetanos;polialquilcianoacrilatos; gelatinas cationizadas, albuminas, amidos, acrilatos, polietilenoglicóis (PEG) e amidos; polialquilcianoacrilatos; poli- iminas derivatizadas de DEAE, pululanos, celuloses e amidos. Agentes de complexação adequados incluem quitosana, N-trimetilquitosana, poli-L-lisina, poli-histidina, poliornitina, poliesperminas, protamina, polivinilpirina, politiodietilaminometiletileno P(TDAE), poliaminoestireno (por exemplo, p-amino), poli(metilcianoacrilato), poli(etilcianoacrilato), poli(butilcianoacrilato), poli(isobutilcianoacrilato),poli(isoexilcianoacrilato), DEAE-metacrilato, DEAE-hexilacrilato, DEAE- acrilamida, DEAE-albumina e DEAE-dextrano, polimetilacrilato, poliexilacrilato, poli(D,L-ácido láctico), poli(DL-ácido láctico-co-glicólico (PLGA), alginato e polietileno glicol (PEG). Formulações orais para dsRNAs e sua preparação são descritas em detalhes na Patente U.S. 6.887.906, Publicação US No. 20030027780 e Patente U.S. No. 6.747.014, cada uma delas é aqui incorporada a título de referência.
[00543] Composições e formulações para administração parenteral, intraparenquimal (ao cérebro), intratecal, intraventricular ou intra- hepática podem incluir soluções aquosas estéreis que podem conter também tampões, diluentes e outros aditivos adequados tais como, mas não limitado a, aumentadores de penetração, compostos veículos e outros veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[00544] Composições farmacêuticas da presente invenção incluem, mas não estão limitadas a, soluções, emulsões e formulações contendo lipossomo. Estas composições podem ser geradas a partir de uma variedade de componentes que incluem, mas não estão limitados a, líquidos pré-formados, sólidos autoemulsificantes e semissólidos autoemulsificantes. Particularmente preferidas são formulações que se direcionam ao fígado quando tratando distúrbios hepáticos tal como carcinoma hepático.
[00545] As formulações farmacêuticas da presente invenção, que podem ser convenientemente apresentadas em forma de dosagem unitária, podem ser preparadas de acordo com técnicas convencionais bem conhecidas na indústria farmacêutica. Tais técnicas incluem a etapa de trazer em associação os ingredientes ativos com o(s) veículo(es) ou excipiente(s) farmacêutico(s). Em geral, as formulações são preparadas trazendo em associação uniformemente e intimamente os ingredientes ativos com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos e, então, se necessário, moldagem do produto.
[00546] As composições da presente invenção podem ser formuladas em qualquer uma de muitas formas de dosagem possíveis tais como, mas não limitado a, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, xaropes líquidos, géis moles, supositórios e enemas. As composições da presente invenção também podem ser formuladas como suspensões em meios aquosos, não aquosos ou mistos. Suspensões aquosas podem conter ainda substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, sorbitol e/ou dextrano. A suspensão pode também conter estabilizadores.
C. Formulações Adicionais i. Emulsões
[00547] As composições da presente invenção podem ser preparadas e formuladas como emulsões. Emulsões são tipicamente sistemas heterogêneos de um líquido disperso em um outro na forma de gotículas geralmente excedendo 0,1 μm de diâmetro (vide, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG. e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8t ed.), New York, NY; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi e outros, em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301). Emulsões são frequentemente sistemas bifásicos compreendendo duas fases líquidas não miscíveis intimamente misturadas e dispersas uma com a outra. Em geral, as emulsões podem ser ou a variedade água-em-óleo (a/o) ou a óleo-em- água (o/a). Quando a fase aquosa é finamente dividida em e dispersa como gotas minúsculas em uma fase oleosa volumosa, a composição resultante é chamada uma emulsão água-em-óleo (a/o). Alternativamente, quando uma fase de óleo é finamente dividida em e dispersa como gotas minúsculas em uma fase aquosa volumosa, a composição resultante é chamada uma emulsão óleo-em-água (o/a). Emulsões podem conter mais componentes em adição às fases dispersas, e o fármaco ativo que pode estar presente como uma solução ou na fase aquosa, fase oleosa ou sozinho como uma fase separada. Excipientes farmacêuticos tais como emulsificantes, estabilizantes, corantes e antioxidantes podem também estar presentes em emulsões conforme necessário. Emulsões farmacêuticas podem ser também emulsões múltiplas que são compreendidas de mais de duas fases tais como, por exemplo, no caso emulsões de óleo-em-água-em-óleo (o/a/o) e água-em-óleo-em-água (a/o/a). Tais formulações complexas frequentemente proveem certas vantagens que emulsões binárias simples não. Emulsões múltiplas onde gotículas oleosas individuais de uma emulsão o/a encerram gotas de água pequenas constituem uma emulsão a/o/a. Da mesma maneira um sistema de gotículas de óleo encerradas em glóbulos de água estabilizados em uma fase contínua oleosa provê uma emulsão o/a/o.
[00548] Emulsões são caracterizadas por pouca ou nenhuma estabilidade termodinâmica. Frequentemente, a fase dispersa ou descontínua da emulsão é bem dispersa na fase externa ou contínua e mantida nesta forma por meio de emulsificantes ou da viscosidade da formulação. Qualquer uma das fases da emulsão pode ser um semissólido ou um sólido, como é o caso de bases de unguento do estilo emulsão e cremes. Outros meios de estabilização de emulsões compreende o uso de emulsificantes que podem ser incorporados à qualquer fase da emulsão. Emulsificantes podem ser classificados amplamente em quatro categorias: tensoativos sintéticos, emulsificantes de ocorrência natural, bases de absorção e sólidos finamente dispersos (vide, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG. E Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), New York, NY; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).
[00549] Tensoativos sintéticos, também conhecidos como agentes tensoativos, encontraram ampla aplicabilidade na formulação de emulsões e foram revistos na literatura (vide, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG. e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), New York, NY; Rieger, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199). Os tensoativos são tipicamente anfifílicos e compreendem uma porcao hidrofílica e uma hidrofóbica. A razão da natureza hidrofílica para a hidrofóbica do tensoativo foi chamada o equilíbrio hidrófilo/lipófilo (HLB) e é uma ferramenta valiosa na categorização e seleção de tensoativos na preparação de formulações.Tensoativos podem ser classificados em classes diferentes com base na natureza do grupo hidrofílico: não iônico, aniônico, catiônico e anfotérico (vide, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG. e Ansel H.C., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), New York, NY Rieger, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285).
[00550] Emulsificantes de ocorrência natural usados em formulações de emulsão incluem lanolina, cera de abelha, fosfatídeos, lecitina e acácia. Bases de absorção possuem propriedades hidrofílicas de maneira que elas podem absorver água para formar emulsões a/o ainda retendo suas consistências semissólidas, tal como lanolina anida e petrolato hidrofílico. Sólidos finamente divididos também têm sido usados como bons emulsificantes especialmente em combinação com tensoativos e em preparações viscosas. Estes incluem sólidos inorgânicos polares, tais como hidróxidos de metal pesado, argilas não incháveis tais como bentonita, atapulgita, hectorita, caulim, montmorilonita, silicato de alumínio coloidal e silicato de magnésio alumínio coloidal, pigmentos e sólidos não polares tais como triestearato de carbono ou glicerila.
[00551] Uma grande variedade de materiais não emulsificantes está também incluída em formulações de emulsão e contribui para as propriedades de emulsões. Estes incluem gorduras, óleos, ceras, ácidos graxos, álcoois graxos, ésteres graxos, umectantes, coloides hidrofílicos, conservantes e antioxidantes (Block, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).
[00552] Coloides hidrofílicos ou hidrocoloides incluem gomas de ocorrência natural e polímeros sintéticos tais como polissacarídeos (por exemplo, acácia, guar, ácido algínico, carragenina, goma guar, goma caraya e tragacanto), derivados de celulose (por exemplo, carboximetilcelulose e carboxipropilcelulose) e polímeros sintéticos (por exemplo, polímeros de carbômeroso, éteres de celulose e carboxivinila). Esses dispersam ou incham em água para formar soluções coloidais que estabilizam emulsões através da formação de películas interfaciais fortes ao redor das gotículas de fase dispersa e através do aumento da viscosidade da fase externa.
[00553] Uma vez que emulsões frequentemente contêm vários ingredientes tais como carboidratos, proteínas, esteróis e fosfatídeos que podem apoiar prontamente o crescimento de micróbios, estas formulações frequentemente incorporam conservantes. Conservantes comumente usados incluídos em formulações de emulsão incluem metil parabeno, propil parabeno, sais de amônio quaternário, cloreto de benzalcônio, ésteres de ácido p-hidroxibenzoico e ácido bórico. Antioxidantes são também comumente adicionados a formulações de emulsão para prevenir deterioração da formulação. Antioxidantes usados podem ser sequestrantes de radical livre tais como tocoferóis, galatos de alquila, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado ou agentes de redução tais como ácido ascórbico e metabissulfito de sódio e antioxidantes sinérgicos tais como ácido cítrico, ácido tartárico e lecitina.
[00554] A aplicação de formulações de emulsão através de vias dermatológica, oral e parenteral e métodos para sua fabricação foram revistos na literatura (vide, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG. e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8t ed.), New York, NY; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). Formulações de emulsão para administração oral têm sido amplamente usadas devido à facilidade de formulação, bem como eficácia a partir de um ponto de vista de absorção e biodisponibilidade (vide, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8t ed.), New York, NY; Rosoff, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). Laxantes à base de óleo mineral, vitaminas solúveis em óleo e preparações nutritivas com alto teor de gordura estão dentre os materiais que têm sido comumente administrados oralmente como emulsões o/a.
ii. Microemulsões
[00555] Em uma modalidade da presente invenção, as composições de iRNAs e ácidos nucleicos são formuladas como microemulsões. Uma microemulsão pode ser definida como um sistema de água, óleo e anfifilo que é uma solução líquida opticamente isotrópica e termodinamicamente estável (vide, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG. e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8t ed.), New York, NY; Rosoff, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245). Tipicamente, microemulsões são sistemas que são preparados primeiro dispersando um óleo em uma solução tensoativa aquosa e então adicionando uma quantidade suficiente de um quarto componente, geralmente um álcool de comprimento de cadeia intermediária para formar um sistema transparente. Desta maneira, microemulsões foram também descritas como dispersões termodinamicamente estáveis, isotropicamente transparentes, de dois líquidos não miscíveis que são estabilizados por películas interfaciais ou moléculas tensoativas (Leung e Shah, em: Controlled Release of Drugs: Polymeros and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215). Microemulsões são geralmente preparadas através de uma combinação de três a cinco componentes que incluem óleo, água, tensoativo, cotensoativo e eletrólito. Se a microemulsão é do tipo água-em-óleo (a/o) ou óleo-em-água (o/a) depende das propriedades do óleo e do tensoativo usados e da estrutura e empacotamento polar das cabeças polares e caudas de hidrocarbonetos das moléculas de tensoativo (Schott, em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271).
[00556] A abordagem fenomenológica utilizando diagramas de fase foi extensivamente estudada e forneceu um conhecimento compreensivo, a um versado na técnica, de como formular microemulsões (vide, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG. e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), New York, NY; Rosoff, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Block, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335). Em comparação com emulsões convencionais, microemulsões oferecem a vantagem de solubilização de fármacos insoluveis em água em uma formulação de gotículas termodinamicamente estáveis que são espontaneamente formadas.
[00557] Tensoativos usados na preparação de microemulsões incluem, mas não estão limitados a, tensoativos iônicos, tensoativos não iônicos, Brij 96, oleil éteres de polioxietileno, ésteres de ácido graxo de poliglicerol, monolaurato de tetraglicerol (ML310), mono-oleato de tetraglicerol (MO310), mono-oleato de hexaglicerol (PO310), pentaoleato de hexaglicerol (PO500), monocaprato de decaglicerol (MCA750), mono-oleato de decaglicerol (MO750), sesquioleato de decaglicerol (SO750), decaoleato de decaglicerol (DAO750), sozinho ou em combinação com cotensoativos. O cotensoativo, geralmente um álcool de cadeia curta tal como etano, 1-propanol e 1-butanol, serve para aumentar a fluidez interfacial através da penetração na película tensoativa e consequentemente criando uma película desordenada devido ao espaço vazio gerado entre moléculas tensoativas. Microemulsões podem, no entanto, ser preparadas sem o uso de cotensoativos e sistemas de microemulsão autoemulsificantes livres de álcool são conhecidos na técnica. A fase aquosa pode ser tipicamente, mas não é limitada a, água, uma solução aquosa do fármaco, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceróis, propileno glicóis e derivados de etileno glicol. A fase de óleo pode incluir, mas não é limitada a, materiais tais como Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, ésteres de ácido graxo, mono-, di- e triglicerídeos de cadeia média (C8-C12), ésteres de ácido graxo de glicerila polioxietilados, álcoois graxos, glicerídeos poliglicolisados, glicerídeos C8-C10 poliglicosilados saturados, óleos vegetais e óleo de silicone.
[00558] Microemulsões são particularmente de interesse a partir do ponto de vista de solubilização de fármaco e a absorção aumentada de fármacos. Microemulsões à base de lipídeo (ambas o/a e a/o) foram propostas para aumentar a biodisponibilidade oral de fármacos, incluindo peptídeos (vide, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 6.191.105; 7.063.860; 7.070.802; 7.157.099; Constantinides e outros,Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Met. Find. Exp. Clin. Farmacol., 1993, 13, 205). Microemulsões dão vantagens de solubilização de fármaco aperfeiçoada, proteção do fármaco de hidrólise enzimática, possível aumento de absorção de fármaco devido a alterações induzidas por tensoativo em fluidez e permeabilidade de membrana, facilidade de preparação, facilidade de administração oral com relação a formas de dosagem sólidas, potência clínica aperfeiçoada e toxidez menor (vide, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 6.191.105; 7.063.860; 7.070.802; 7.157.099; Constantinides e outros, Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho e outros, J. Farm. Sci., 1996, 85, 138-143). Frequentemente microemulsões podem se formar espontaneamente quando seus componentes são reunidos em temperatura ambiente. Isto pode ser particularmente vantajoso quando formulando fármacos termolábeis, peptídeos ou iRNAs. Microemulsões também têm sido eficazes na administração transdermal de componentes ativos em ambas as aplicações cosmética e farmacêutica. É esperado que as composições e formulações de microemulsão da presente invenção facilitem a absorção sistêmica aumentada de iRNAs e ácidos nucleicos a partir do trato gastrintestinal, bem como aperfeiçoar a absorção celular local de iRNAs e ácidos nucleicos.
[00559] As microemulsões da presente invenção podem também conter mais componentes e aditivos tais como monoestearato de sorbitano (Grill 3), Labrasol e aumentadores de penetração para aperfeiçoar as propriedades da formulação e aumentar a absorção dos iRNAs e ácidos nucleicos da presente invenção. Aumentadores de penetração usados nas microemulsões da presente invenção podem ser classificados como pertencentes a um de cinco categorias amplas - tensoativos, ácidos graxos, sais da bile, agentes de quelação e não tensoativos de não quelação (Lee e outros, Critical Reviews in Terapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Cada uma dessas classes foi discutida acima.
iii. Micropartículas
[00560] Um agente iRNA da presente invenção pode ser incorporado a uma partícula, por exemplo, uma micropartícula. Micropartículas podem ser produzidas através de secagem por pulverização, mas podem também ser produzidas através de outros métodos incluindo liofilização, evaporação, secagem de leito fluido, secagem a vácuo ou uma combinação dessas técnicas.
iv. Aumentadores de Penetração
[00561] Em uma modalidade, a presente invenção emprega vários aumentadores de penetração para realizar a administração eficiente de ácidos nucleicos, particularmente iRNAs, à pele de animais. A maioria dos fármacos está presente em solução em ambas as formas ionizadas e não ionizadas. No entanto, geralmente apenas fármacos solúveis em lipídeo ou lipofílicos cruzam prontamente as membranas celulares. Foi constatado que até mesmo fármacos não lipofílicos podem cruzar membranas celulares se a membrana a ser cruzada for tratada com um aumentador de penetração. Em adição a auxiliar na difusão de fármacos não lipofílicos através de membranas celulares, aumentadores de penetração também aumentam a permeabilidade de fármacos lipofílicos.
[00562] Aumentadores de penetração podem ser classificados como pertencentes a uma de cinco categorias amplas, isto é, tensoativos, ácidos graxos, sais de bile, agentes de quelação e não tensoativos de não quelação (vide, por exemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymeros in drug delivery, Informa Healt Care, New York, NY, 2002; Lee e outros, Critical Reviews in Terapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92). Cada uma das classes de aumentadores de penetração mencionadas acima é descrita abaixo em mais detalhes.
[00563] Tensoativos (ou "agentes tensoativos") são entidades químicas que, quando dissolvidas em uma solução aquosa, reduzem a tensão da superfície da solução ou a tensão interfacial entre a solução aquosa e um outro líquido, com o resultado que absorção de iRNAs através da mucosa é aumentada. Em adição a sais de bile e ácidos graxos, estes aumentadores de penetração incluem, por exemplo, lauril sulfato de sódio, polioxietileno-9-lauril éter e polioxietileno-20-cetil éter) (vide, por exemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymeros in drug delivery, Informa Healt Care, New York, NY, 2002; Lee e outros, Critical Reviews in Terapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92); e emulsões perfluorquímicas, tal como FC-43. Takahashi e outros, J. Farm. Farmacol., 1988, 40, 252).
[00564] Vários ácidos graxos e seus derivados que agem como aumentadores de penetração incluem, por exemplo, ácido oleico, ácido láurico, ácido cáprico (ácido n-decanoico), ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolênico, dicaprato, tricaprato, mono-oleína (1-mono-oleoil-rac-glicerol), dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidônico, 1-monocaprato de glicerol, 1- dodecilazacicloeptano-2-na, acilcarnitinas, acilcolinas, ésteres de C1-20 alquila dos mesmos (por exemplo, metila, isopropila e t-butila) e mono- e di-glicerídeos dos mesmos (isto é, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc) (vide, por exemplo, Touitou, E. e outros Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee e outros, Critical Reviews in Terapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Terapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri e outros, J. Farm. Farmacol., 1992, 44, 651-654).
[00565] O papel fisiológico de biles inclui a facilitação de dispersão e absorção de lipídeos e vitaminas solúveis em gordura (vide, por exemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymeros in drug delivery, Informa Healt Care, New York, NY, 2002; Brunton, Capítulo 38 em: Goodman & Gilman's Te Farmacological Basis of Terapeutics, 9° Ed., Hardman e outros Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935). Vários sais de bile naturais, e seus derivados sintéticos, agem como aumentadores de penetração. Desta maneira, o termo "sais de bile" inclui qualquer um dos componentes de ocorrência natural de bile bem como qualquer um de seus derivados sintéticos. Sais de bile adequados incluem, por exemplo, ácido cólico (ou seu sal de sódio farmaceuticamente aceitável, colato de sódio), ácido desidrocólico (desidrocolato de sódio), ácido desoxicólico (desoxicolato de sódio), ácido glucólico (glucolato de sódio), ácido glicólico (glicocolato de sódio), ácido glicodesoxicólico (glicodesoxicolato de sódio), ácido taurocólico (taurocolato de sódio), ácido taurodesoxicólico (taurodesoxicolato de sódio), ácido quenodesoxicólico (quenodesoxicolato de sódio), ácido ursodesoxicólico (UDCA), tauro- 24,25-di-hidro-fusidato de sódio (STDHF), glicodi-hidrofusidato de sódio e polioxietileno-9-lauril éter (POE) (vide, por exemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymeros in drug delivery, Informa Healt Care, New York, NY, 2002; Lee e outros, Critical Reviews in Terapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Swinyard, Capítulo 39 Em: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, páginas 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Terapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto e outros, J. Farm. Exp. Ter., 1992, 263, 25; Yamashita e outros, J. Farm. Sci., 1990, 79, 579-583).
[00566] Agentes de quelação, como usado em conexão com a presente invenção, podem ser definidos como compostos que removem íons metálicos de solução através de formação de complexos com os mesmos, com o resultado que absorção de iRNAs através da mucosa é aumentada. Com relação ao seu uso como aumentadores de penetração na presente invenção, agentes de quelação têm a vantagem adicional de também servir como inibidores de DNase, uma vez que a maioria das nucleases de DNA caracterizadas requer um íon de metal divalente para catálise e então são inibidas por agentes de quelação (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Agentes de quelação adequados incluem, mas não estão limitados a, etilenodiaminotetraacetaot dissódico (EDTA), ácido cítrico, salicilatos (por exemplo, salicilato de sódio, 5-metoxisalicilato e homovalinato), derivados de N-acila de colágeno, lauret-9 e derivados de N-amino acila de beta dicetonas (enaminas) (vide, por exemplo, Katdare, A. e outros, Excipient development for Pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee e outros, Critical Reviews in Terapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Terapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur e outros, J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).
[00567] Como aqui usado, compostos aumentadores de penetração não tensoativos não quelantes podem ser definidos como compostos que demonstram atividade insignificante como agentes de quelação ou como tensoativos, mas que, não obstante, aumentam a absorção de iRNAs através da mucosa alimentar (vide, por exemplo, Muranishi, Critical Reviews in Terapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Esta classe de aumentadores de penetração inclui, por exemplo, ureias cíclicas insaturadas, derivados de 1-alquil- e 1-alquenilazaciclo- alcanona (Lee e outros, Critical Reviews in Terapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92); e agentes anti-inflamatórios não esteroidais tais como diclofenaco sódico, indometacina e fenilbutazona (Yamashita e outros, J. Farm. Farmacol., 1987, 39, 621-626).
[00568] Agentes que aumentam a absorção de iRNAs no nível celular também podem ser adicionados às composições farmacêuticas e outras da presente invenção. Por exemplo, lipídeos catiônicos, tal como lipofectina (Junichi e outros, Patente U.S. No. 5.705.188), derivados de glicerol catiônicos) e moléculas policatiônicas, tal como polilisina (Lollo e outros, Pedido de Patente PCT WO 97/30731), são também conhecidos aumentar a absorção celular de dsRNAs. Exemplos de reagentes de transfecção comeroscialmente disponíveis incluem, por exemplo, Lipofectamine® (Invitrogen®; Carlsbad, CA), Lipofectamine 2000® (Invitrogen®; Carlsbad, CA), 293fectin® (Invitrogen®; Carlsbad, CA), Cellfectin® (Invitrogen®; Carlsbad, CA), DMRIE-C® (Invitrogen®; Carlsbad, CA), FreeStyle® MAX (Invitrogen®; Carlsbad, CA), Lipofectamine® 2000 CD (Invitrogen®; Carlsbad, CA), Lipofectamine® (Invitrogen®; Carlsbad, CA), iRNAMAX (Invitrogen®; Carlsbad, CA), Oligofectamine® (Invitrogen®; Carlsbad, CA), Optifect® (Invitrogen®; Carlsbad, CA), X-tremeGENE Q2 Transfection Reagent (Roche; Grenzacherstrasse, Suíça), DOTAP Liposomal Transfection Reagent (Grenzacherstrasse, Suíça), DOSPER Liposomal Transfection Reagent (Grenzacherstrasse, Suíça) ou Fugene (Grenzacherstrasse, Suíça), Transfectam® Reagent (Promega®; Madison, WI), TransFast™ Transfection Reagent (Promega®; Madison, WI), Tfx®-20 Reagent (Promega®; Madison, WI), Tfx®-50 Reagent (Promega®; Madison, WI), DreamFect® (OZ Biosciences; Marseille, França), EcoTransfect (OZ Biosciences; Marseille, França), TransPassa D1 Transfection Reagent (New England Biolabs®; Ipswich, MA, USA), LyoVec®/LipoGen® (Invitrogen®; San Diego, CA, USA), PerFectin Transfection Reagent (Genlantis®; San Diego, CA, USA), NeuroPORTER® Transfection Reagent (Genlantis®; San Diego, CA, USA), GenePORTER® Transfection reagent (Genlantis®; San Diego, CA, USA), GenePORTER® 2 Transfection reagent (Genlantis®; San Diego, CA, USA), Cytofectin Transfection Reagent (Genlantis®®; San Diego, CA, USA), BaculoPORTER® Transfection Reagent (Genlantis®; San Diego, CA, USA), TroganPORTER® transfection Reagent (Genlantis®; San Diego, CA, USA ), RiboFect (Bioline®; Taunton, MA, USA), PlasFect (Bioline®; Taunton, MA, USA), UniFECTOR (B-Bridge International®; Mountain View, CA, USA), SureFECTOR (B-Bridge International®; Mountain View, CA, USA) ou HiFect® (B-Bridge International®, Mountain View, CA, USA), dentre outros.
[00569] Outros agentes podem ser utilizados para aumentar a penetração dos ácidos nucleicos administrados, incluindo glicóis tais como etileno glicol e propileno glicol, pirróis tais como 2-pirrol, azonas e terpenos tais como limoneno e mentona.
v. Veículos
[00570] Certas composições da presente invenção também incorporam compostos veículos na formulação. Como aqui usado, "composto veículo" ou "veículo" pode se referir a um ácido nucleico, ou análogo do mesmo, que é inerte (isto é, não possui atividade biológica per se), mas é reconhecido como um ácido nucleico através de processos in vivo que reduzem a biodisponibilidade de um ácido nucleico tendo atividade biológica através de, por exemplo, degradação do ácido nucleico biologicamente ativo ou promoção de sua remoção da circulação. A coadministração de um ácido nucleico e um composto veículo, tipicamente com um excesso da última substância, pode resultar em uma redução substancial da quantidade de ácido nucleico recuperado no fígado, rim ou outro reservatório extracirculatório, presumivelmente devido à competição entre o composto veículo e o ácido nucleico para um receptor comum. Por exemplo, a recuperação de um dsRNA parcialmente fosforotioato em tecido hepático pode ser reduzida quando ele é co-administrado com ácido poli-inosínico, sulfato de dextrano, ácido policitídico ou ácido 4-acetamido-4’-isotiociano- estilbeno-2,2’-dissulfônico (Miyao e outros, DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura e outros, DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183.
vi. Excipientes
[00571] Em contraste com um composto veículo, um "veículo farmacêutico" ou "excipiente" é um solvente, agente de suspensão ou qualquer outro veículo farmacologicamente inerte farmaceuticamente aceitável para administração de um ou mais ácidos nucleicos a um animal. O excipiente pode ser líquido ou sólido e é selecionado, com a maneira planejada de administração em mente, de maneira a prover o volume, consistência, etc., desejado, quando combinado com um ácido nucleico e os outros componentes de uma dada composição farmacêutica. Veículos farmacêuticos típicos incluem, mas não estão limitado a, agentes de ligação (por exemplo, amido de milho pré- gelatinizado, polivinilpirrolidona ou hidroxipropil metilcelulose, etc.); cargas (por exemplo, lactose e outros açúcares, celulose microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de cálcio, etil celulose, poliacrilatos ou hidrogeno fosfato de cálcio, etc.); lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco, sílica, dióxido de silício coloidal, ácido esteárico, estearato metálico, óleos vegetais hidrogenados, amido de milho, polietileno glicóis, benzoato de sódio, acetato de sódio, etc.); desintegrantes (por exemplo, amido, amido glicolato de sódio, etc.); e agentes umectantes (por exemplo, lauril sulfato de sódio, etc.).
[00572] Excipientes orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis adequados para administração não parenteral que não reagem de maneira prejudicial com ácidos nucleicos também podem ser usados para formular as composições da presente invenção. Veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, mas não estão limitados a, água, soluções salinas, álcoois, polietileno glicóis, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulose, polivinilpirrolidona e similar.
[00573] Formulações para administração tópica de ácidos nucleicos podem incluir soluções aquosas estéreis e não estéreis, soluções não aquosas em solventes comuns tais como álcoois, ou soluções dos ácidos nucleicos em bases de óleo líquidas ou sólidas. As soluções podem também conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados. Excipientes orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis adequados para administração não parenteral que não reagem de modo prejudicial com ácidos nucleicos podem ser usados.
[00574] Excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, mas não estão limitados a, água, soluções salinas, álcool, polietileno glicóis, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulose, polivinilpirrolidona e similar.
vii. Outros Componentes
[00575] As composições da presente invenção podem ainda conter outros componentes adjuntos convencionalmente encontrados em composições farmacêuticas, em seus níveis de uso estabelecidos na técnica. Desta maneira, por exemplo, as composições podem conter materiais adicionais, compatíveis, farmaceuticamente ativos, tais como, por exemplo, antipruríticos, adstringentes, anestésicos locais ou agentes anti-inflamatórios ou podem conter materiais adicionais úteis em formular fisicamente várias formas de dosagem das composições da presente invenção, tais como corantes, agentes saborizantes, conservantes, antioxidantes, opacificante, agentes de espessamento e estabilizantes. No entanto, tais materiais, quando adicionados, não devem interferir de modo indevido com as atividades biológicas dos componentes das composições da presente invenção. As formulações podem ser esterilizadas e, se desejado, misturadas com agentes auxiliares, por exemplo, lubrificantes, conservantes, estabilizadores, agentes umectantes, emulsificantes, sais para influenciamento da pressão osmótica, tampões, corantes, aromatizantes e/ou substâncias aromáticas e similar que não interagem de modo prejudicial com o(s) ácido(s) nucleico(s) da formulação.
[00576] Suspensões aquosas podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, sorbitol e/ou dextrano. A suspensão pode também conter estabilizantes.
[00577] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas apresentadas na invenção incluem (a) um ou mais compostos iRNA e (b) um ou mais agentes que funcionam através de um mecanismo de não iRNA e que são úteis em tratamento de um distúrbio hemolítico. Exemplos de tais agentes incluem, mas não estão limitados a, um agente anti-inflamatório, um agente anti-esteatose, agente antiviral e/ou antifibrose. Ainda, outras substâncias geralmente usadas para proteger o fígado, tal como silimarina, podem ser também usadas em conjunto com os iRNAs descritos aqui. Outros agentes úteis para tratamento de doenças do fígado incluem telbivudina, entecavir e inibidores de protease tais como telaprevir e outros revelados, por exemplo, em Tung e outros, Pedidos de Patente U.S. Nos. 2005/0148548, 2004/0167116 e 2003/0144217; e em Hale e outros, Pedido de Patente U.S. Publicado No. 2004/0127488.
[00578] Toxidez e eficácia terapêutica de tais compostos podem ser determinadas através de procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de célula ou animais experimentais, por exemplo, para determinação da LD50 (a dose letal para 50% da população) e da ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão de dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e ele pode ser expresso como a razão LD50/ED50. Compostos que exibem índices terapêuticos altos são preferidos.
[00579] Os dados obtidos a partir de ensaios de cultura de célula e estudos animais podem ser usados em formulação de uma faixa de dosagem para uso em humanos. A dosagem de composições apresentadas aqui na invenção se encontra geralmente dentro de uma faixa de concentrações de circulação que inclui a ED50 com pouca ou nenhuma toxidez. A dosagem pode variar dentro desta faixa dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração utilizada. Para qualquer composto usado nos métodos apresentados na invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura de célula. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir uma faixa de concentração em circulação no plasma do composto ou, quando apropriado, do produto de polipeptídeo de uma sequência-alvo (por exemplo, atingindo uma concentração menor do polipeptídeo) que inclui a IC50 (isto é, a concentração do composto de teste que atinge uma inibição metade-máximo de sintomas) conforme determinado em cultura de célula. Tal informação pode ser usada para determinar com mais precisa doses úteis em humanos. Os níveis em plasma podem ser medidos, por exemplo, através de cromatografia líquida de alto desempenho.
[00580] Em adição à sua administração, como acima discutido, os iRNAs apresentados na invenção podem ser administrados em combinação com outros agentes conhecidos eficazes em tratamento de processos patológicos mediados por expressão de AGT. Em qualquer caso, o médico que realiza a administração pode ajustar a quantidade e o momento de administração de iRNA com base nos resultados observados usando medidas padrão de eficácia conhecidas na técnica ou descritas aqui.
VII. Métodos da Invenção
[00581] A presente invenção provê métodos terapêuticos e profiláticos que incluem administração a um indivíduo tendo, ou propenso a desenvolver, uma doença, distúrbio e/ou condição associado a AGT (por exemplo, hipertensão), composições farmacêuticas compreendendo um agente iRNA ou vetor compreendendo um iRNA da invenção.
[00582] Em um aspecto, a presente invenção provê métodos de tratamento de um indivíduo tendo um distúrbio que se beneficiaria da redução em expressão de AGT, por exemplo, uma doença associada a AGT, por exemplo, hipertensão, por exemplo, hipertensão limítrofe (também conhecida como pré-hipertensão), hipertensão primária (também conhecida como hipertensão essencial ou hipertensão idiopática), hipertensão secundária (também conhecida como hipertensão inessencial), emerosgência hipertensiva (também conhecida como hipertensão maligna), urgência hipertensiva, hipertensão sistólica ou diastólica isolada, hipertensão associada à gravidez (por exemplo, pré-eclâmpsia, eclâmpsia e pré-eclâmpsia pós- parto), hipertensão diabé-tica, hipertensão resistente, hipertensão refratária, hipertensão paroxismal, hipertensão renovascular (também conhecida como hipertensão renal), hipertensão de Goldblatt, hipertensão ocular, glaucoma, hipertensão pulmonar, hipertensão portal, hipertensão venosa sistêmica, hipertensão sistólica, hipertensão lábil; doença cardíaca hipertensiva, nefropatia hipertensiva, aterosclerose, arteriosclerose, vasculopatia (incluindo doença vascular periférica), nefropatia diabética, retinopatia diabética, falência cardíaca crônica, cardiomiopatia, miopatia cardíaca diabética, glomerosuloesclerose, coarctação da aorta, aneurisma aórtico, fibrose ventricular, síndrome de Cushing e outros estados de excesso de glucocorticoide incluindo terapia esteroide crônica, feocromocitoma, reninoma, aldosteronismo secundário e outros estados de excesso de mineralocorticoide, apneia do sono, doença da tireoide/paratireoide, falência cardíaca (por exemplo, disfunção sistólica ventricular esquerda), infarto do miocárdio, angina, acidente vascular cerebral, diabetes mellitus (por exemplo, nefropatia diabética), doença renal, por exemplo, doença renal crônica ou nefropatia diabética opcionalmente no contexto de gravidez, falência renal, por exemplo, falência renal crônica, disfunção cognitiva (tal como Alzheimeros) e esclerose sistêmica (por exemplo, crise renal escleroderma). Em certas modalidades, doença associada a AGT inclui restrição de crescimento intrauterino (IUGR) ou restrição de crescimento fetal. Os métodos de tratamento (e usos) da invenção incluem administração ao indivíduo, por exemplo, um humano, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente iRNA se direcionando a um gente AGT ou uma composição farmacêutica compreendendo um agente iRNA se direcionando a um gene AGT, desta maneira tratando o indivíduo tendo um distúrbio que se beneficiaria da redução em expressão de AGT.
[00583] Em um aspecto, a invenção provê métodos de prevenção de pelo menos um sintoma em um indivíduo tendo um distúrbio que se beneficiaria da redução em expressão de AGT, por exemplo, uma doença associada a AGT, por exemplo, hipertensão, por exemplo, hipertensão limítrofe (também conhecida como pré-hipertensão), hipertensão primária (também conhecida como hipertensão essencial ou hipertensão idiopática), hipertensão secundária (também conhecida como hipertensão inessencial), emerosgência hipertensiva (também conhecida como hipertensão maligna), urgência hipertensiva, hipertensão sistólica ou diastólica isolada, hipertensão associada à gravidez (por exemplo, pré-eclâmpsia, eclâmpsia e pré-eclâmpsia pós- parto), hipertensão diabética, hipertensão resistente, hipertensão refratária, hipertensão paroxismal, hipertensão renovascular (também conhecida como hipertensão renal), hipertensão de Goldblatt, hipertensão ocular, glaucoma, hipertensão pulmonar, hipertensão portal, hipertensão venosa sistêmica, hipertensão sistólica, hipertensão lábil; doença cardíaca hipertensiva, nefropatia hipertensiva, aterosclerose, arteriosclerose, vasculopatia (incluindo doença vascular periférica), nefropatia diabética, retinopatia diabética, falência cardíaca crônica, cardiomiopatia, miopatia cardíaca diabética, glomerosuloesclerose, coarctação da aorta, aneurisma aórtico, fibrose ventricular, síndrome de Cushing e outros estados de excesso de glucocorticoide incluindo terapia esteroide crônica, feocromocitoma, reninoma, aldosteronismo secundário e outros estados de excesso de mineralocorticoide, apneia do sono, doença da tireoide/paratireoide, falência cardíaca (por exemplo, disfunção sistólica ventricular esquerda), infarto do miocárdio, angina, acidente vascular cerebral, diabetes mellitus (por exemplo, nefropatia diabética), doença renal, por exemplo, doença renal crônica ou nefropatia diabética opcionalmente no contexto de gravidez, falência renal, por exemplo, falência renal crônica, disfunção cognitiva (tal como Alzheimeros) e esclerose sistêmica (por exemplo, crise renal escleroderma). Em certas modalidades, doença associada a AGT inclui restrição de crescimento intrauterino (IUGR) ou restrição de crescimento fetal. Os métodos incluem administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente iRNA, por exemplo, dsRNA, ou vetor da invenção, desta maneira prevenindo pelo menos um sintoma no indivíduo tendo um distúrbio que se beneficiaria da redução em expressão de AGT.
[00584] Em um outro aspecto, a presente invenção provê usos de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente iRNA da invenção para tratamento de um indivíduo, por exemplo, um indivíduo que se beneficiaria de uma redução e/ou inibição de expressão de AGT.
[00585] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê usos de um agente iRNA, por exemplo, um dsRNA, da invenção se direcionando a um gene AGT ou composição farmacêutica compreendendo um agente iRNA se direcionando a um gene AGT na fabricação de um medicamento para tratamento de um indivíduo, por exemplo, um indivíduo que se beneficiaria de uma redução e/ou inibição de expressão de AGT, tal como um indivíduo tendo um distúrbio que se beneficiaria da redução em expressão de AGT, por exemplo, uma doença associada a AGT, por exemplo, hipertensão, por exemplo, hipertensão limítrofe (também conhecida como pré-hipertensão), hipertensão primária (também conhecida como hipertensão essencial ou hipertensão idiopática), hipertensão secundária (também conhecida como hipertensão inessencial), emerosgência hipertensiva (também conhecida como hipertensão maligna), urgência hipertensiva, hipertensão sistólica ou diastólica isolada, hipertensão associada à gravidez (por exemplo, pré-eclâmpsia, eclâmpsia e pré-eclâmpsia pós- parto), hipertensão diabé-tica, hipertensão resistente, hipertensão refratária, hipertensão paroxismal, hipertensão renovascular (também conhecida como hipertensão renal), hipertensão de Goldblatt, hipertensão ocular, glaucoma, hipertensão pulmonar, hipertensão portal, hipertensão venosa sistêmica, hipertensão sistólica, hipertensão lábil; doença cardíaca hipertensiva, nefropatia hipertensiva, aterosclerose, arteriosclerose, vasculopatia (incluindo doença vascular periférica), nefropatia diabética, retinopatia diabética, falência cardíaca crônica, cardiomiopatia, miopatia cardíaca diabética, glomerosuloesclerose, coarctação da aorta, aneurisma aórtico, fibrose ventricular, síndrome de Cushing e outros estados de excesso de glucocorticoide incluindo terapia esteroide crônica, feocromocitoma, reninoma, aldosteronismo secundário e outros estados de excesso de mineralocorticoide, apneia do sono, doença da tireoide/paratireoide, falência cardíaca (por exemplo, disfunção sistólica ventricular esquerda), infarto do miocárdio, angina, acidente vascular cerebral, diabetes mellitus (por exemplo, nefropatia diabética), doença renal, por exemplo, doença renal crônica ou nefropatia diabética opcionalmente no contexto de gravidez, falência renal, por exemplo, falência renal crônica, disfunção cognitiva (tal como Alzheimeros) e esclerose sistêmica (por exemplo, crise renal escleroderma). Em certas modalidades, doença associada a AGT inclui restrição de crescimento intrauterino (IUGR) ou restrição de crescimento fetal.
[00586] Em um outro aspecto, a invenção provê usos de um iRNA, por exemplo, um dsRNA, da invenção para prevenção de pelo menos um sintoma em um indivíduo sofrendo de um distúrbio que se beneficiaria de uma redução e/ou inibição de expressão de AGT, tal como uma doença associada a AGT, por exemplo, hipertensão, por exemplo, hipertensão limítrofe (também conhecida como pré- hipertensão), hipertensão primária (também conhecida como hipertensão essencial ou hipertensão idiopática), hipertensão secundária (também conhecida como hipertensão inessencial), emerosgência hipertensiva (também conhecida como hipertensão maligna), urgência hipertensiva, hipertensão sistólica ou diastólica isolada, hipertensão associada à gravidez (por exemplo, pré-eclâmpsia, eclâmpsia e pré-eclâmpsia pós-parto), hipertensão diabética, hipertensão resistente, hipertensão refratária, hipertensão paroxismal, hipertensão renovascular (também conhecida como hipertensão renal), hipertensão de Goldblatt, hipertensão ocular, glaucoma, hipertensão pulmonar, hipertensão portal, hipertensão venosa sistêmica, hipertensão sistólica, hipertensão lábil; doença cardíaca hipertensiva, nefropatia hipertensiva, aterosclerose, arteriosclerose, vasculopatia (incluindo doença vascular periférica), nefropatia diabética, retinopatia diabética, falência cardíaca crônica, cardiomiopatia, miopatia cardíaca diabética, glomerosuloesclerose, coarctação da aorta, aneurisma aórtico, fibrose ventricular, síndrome de Cushing e outros estados de excesso de glucocorticoide incluindo terapia esteroide crônica, feocromocitoma, reninoma, aldosteronismo secundário e outros estados de excesso de mineralocorticoide, apneia do sono, doença da tireoide/paratireoide, falência cardíaca (por exemplo, disfunção sistólica ventricular esquerda), infarto do miocárdio, angina, acidente vascular cerebral, diabetes mellitus (por exemplo, nefropatia diabética), doença renal, por exemplo, doença renal crônica ou nefropatia diabética opcionalmente no contexto de gravidez, falência renal, por exemplo, falência renal crônica, disfunção cognitiva (tal como Alzheimeros) e esclerose sistêmica (por exemplo, crise renal escleroderma). Em certas modalidades, doença associada a AGT inclui restrição de crescimento intrauterino (IUGR) ou restrição de crescimento fetal.
[00587] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê usos de um agente iRNA da invenção na fabricação de um medicamento para prevenção de pelo menos um sintoma em um indivíduo sofrendo de um distúrbio que se beneficiaria de uma redução e/ou inibição de expressão de AGT, tal como uma doença associada a AGT, por exemplo, hipertensão, por exemplo, hipertensão limítrofe (também conhecida como pré-hipertensão), hipertensão primária (também conhecida como hipertensão essencial ou hipertensão idiopática), hipertensão secundária (também conhecida como hipertensão inessencial), emerosgência hipertensiva (também conhecida como hipertensão maligna), urgência hipertensiva, hipertensão sistólica ou diastólica isolada, hipertensão associada à gravidez (por exemplo, pré-eclâmpsia, eclâmpsia e pré-eclâmpsia pós-parto), hipertensão diabética, hipertensão resistente, hipertensão refratária, hipertensão paroxismal, hipertensão renovascular (também conhecida como hipertensão renal), hipertensão de Goldblatt, hipertensão ocular, glaucoma, hipertensão pulmonar, hipertensão portal, hipertensão venosa sistêmica, hipertensão sistólica, hipertensão lábil; doença cardíaca hipertensiva, nefropatia hipertensiva, aterosclerose, arteriosclerose, vasculopatia (incluindo doença vascular periférica), nefropatia diabética, retinopatia diabética, falência cardíaca crônica, cardiomiopatia, miopatia cardíaca diabética, glomerosuloesclerose, coarctação da aorta, aneurisma aórtico, fibrose ventricular, síndrome de Cushing e outros estados de excesso de glucocorticoide incluindo terapia esteroide crônica, feocromocitoma, reninoma, aldosteronismo secundário e outros estados de excesso de mineralocorticoide, apneia do sono, doença da tireoide/paratireoide, falência cardíaca (por exemplo, disfunção sistólica ventricular esquerda), infarto do miocárdio, angina, acidente vascular cerebral, diabetes mellitus (por exemplo, nefropatia diabética), doença renal, por exemplo, doença renal crônica ou nefropatia diabética opcionalmente no contexto de gravidez, falência renal, por exemplo, falência renal crônica, disfunção cognitiva (tal como Alzheimeros) e esclerose sistêmica (por exemplo, crise renal escleroderma). Em certas modalidades, doença associada a AGT inclui restrição de crescimento intrauterino (IUGR) ou restrição de crescimento fetal.
[00588] Em uma modalidade, um agente iRNA se direcionando a AGT é administrado a um indivíduo tendo uma doença associada a AGT de maneira que os níveis de AGT, por exemplo, em uma célula, tecido, sangue ou outro tecido ou fluido do indivíduo são reduzidos em pelo menos cerca de 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%,43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%,55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 62%, 64%, 65%, 66%,67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%,79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%,91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou pelo menos cerca de 99% ou mais quando o agente dsRNA é administrado ao indivíduo. Em modalidades preferidas, o nível de AGT é reduzido em pelo menos 20%.
[00589] Os métodos e usos da invenção incluem administração de uma composição descrita aqui de maneira que a expressão do gene AGT alvo é diminuída, tal como por cerca de 1, 2, 3, 4 5, 6, 7, 8, 12, 16, 18, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76 ou cerca de 80 horas. Em uma modalidade, a expressão do gene AGT alvo é diminuída por uma duração prolongada, por exemplo, pelo menos cerca de duas, três, quatro, cinco, seis, sete dias ou mais, por exemplo, cerca de uma semana, duas semanas, três semanas ou cerca de quatro semanas ou mais.
[00590] Administração do dsRNA de acordo com os métodos e usos da invenção pode resultar em uma redução da severidade, sinais, sintomas e/ou marcadores de tais doenças ou distúrbios em um paciente com uma doença associada a AGT. Por "redução" neste contexto quer dizer uma diminuição estatisticamente significante em tal nível. A redução pode ser, por exemplo, pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou cerca de 100%. Em modalidades preferidas, o nível de AGT é reduzido em pelo menos 20%.
[00591] Eficácia de tratamento ou prevenção de doença pode ser avaliada, por exemplo, através da medição da progressão da doença, remissão da doença, severidade do sintoma, redução em dor, qualidade de vida, dose de uma medicação requerida para sustentar um efeito de tratamento, nível de um marcador de doença ou qualquer outro parâmetro mensurável apropriado para uma dada doença sendo tratada ou como alvo de prevenção. Está dentro da habilidade de um versado na técnica monitorar eficácia de tratamento ou prevenção através da medição de qualquer um de tais parâmetros, ou qualquer combinação de parâmetros. Por exemplo, eficácia de tratamento de hipertensão por dislipidemia pode ser avaliada através de, por exemplo, monitoramento periódico da pressão sanguínea. Comparação das últimas leituras com as leituras iniciais provê ao médico uma indicação de se o tratamento é eficaz. Está dentro da habilidade de um versado na técnica monitorar a eficácia de tratamento ou prevenção através da medição de qualquer um de tais parâmetros, ou qualquer combinação de parâmetros. Em conexão com a administração de um iRNA de direcionamento a AGT ou composições farmacêuticas dos mesmos, "eficaz contra" uma doença associada a AGT indica que administração de uma maneira clinicamente apropriada resulta em um efeito benéfico para pelo menos uma fração estatisticamente significante de pacientes, tal como melhora de sintomas, uma cura, uma redução em doença, prolongamento da vida, melhora em qualidade de vida ou outro efeito geralmente reconhecido como positivo por médicos e familiares com tratamento de uma doença associada a AGT e causas relacionadas.
[00592] Um efeito de tratamento ou preventivo é evidente quando há uma melhora estatisticamente significante em um ou mais parâmetros de estado de doença, ou por uma falha em piora ou desenvolvimento de sintomas onde eles seriam de outro modo antecipados. Como um exemplo, uma mudança favorável de pelo menos 10% em um parâmetro de doença mensurável, e preferivelmente pelo menos 20%, 30%, 40%, 50% ou mais pode ser indicativo de tratamento eficaz. Eficácia para um dado fármaco ou formulação de iRNA deste fármaco pode ser também julgada usando um modelo animal experimental para a dada doença como conhecido na técnica. Quando usando um modelo animal experimental, eficácia de tratamento é evidenciada quando uma redução estatisticamente significante em um marcador ou sintoma é observada. Modelos animais adequados de uma doença associada a angiotensinogênio, por exemplo, hipertensão, incluem, por exemplo, modelos genéticos de hipertensão, por exemplo, camundongo BF/2, ratos espontaneamente hipertensos (SHRs), ratos sensíveis a sal Dahl (DS), ratos transgênicos TGR(mREN2)27 onde renina renal endógena foi suprimida e ratos hipertensos limítrofes (BHR), modelos experimentalmente induzidos de hipertensão, por exemplo, modelos experimentalmente induzidos de hipertensão renal no modelo Goldblatt de hipertensão experimental renal-induzida, modelos de nefrectomia subtotal e hipertensão induzida por angiotensinogênio II (vide, por exemplo, Dornal e Silva (2011) J. Biosci. 36:731). Modelos animais adequados de hipertensão associada à gravidez incluem, por exemplo, modelos genéticos, por exemplo, camundongos hipertensos limítrofes (por exemplo, camundongos BF/5), ratos e/ou camundongos carregando um transgene codificando renina humana e um transgene codificando angiotensinogênio humano, e modelos experimentalmente induzidos, por exemplo, modelos de infusão de sFlt-1, modelos induzidos por AT1-AA, modelos de pressão por perfusão uteroplacental reduzida (RUPP) (vide, por exemplo, McCarty e outros (2011) Placenta 32:413-419).
[00593] Os indivíduos podem ser administrados com uma quantidade terapêutica de iRNA, tal como cerca de 0,01 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,15 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,55 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,65 mg/kg, 0,7 mg/kg, 0,75 mg/kg, 0,8 mg/kg, 0,85 mg/kg, 0,9 mg/kg, 0,95 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,6 mg/kg, 1,7 mg/kg, 1,8 mg/kg, 1,9 mg/kg, 2,0 mg/kg, 2,1 mg/kg, 2,2 mg/kg, 2,3 mg/kg, 2,4 mg/kg, 2,5 mg/kg de dsRNA, 2,6 mg/kg de dsRNA, 2,7 mg/kg de dsRNA, 2,8 mg/kg de dsRNA, 10 mg/kg de dsRNA, 15 mg/kg de dsRNA, 20 mg/kg de dsRNA, 25 mg/kg de dsRNA, 30 mg/kg de dsRNA, 35 mg/kg de dsRNA, 40 mg/kg de dsRNA, 45 mg/kg de dsRNA ou cerca de 50 mg/kg de dsRNA. Intermediários de valores e faixas para os valores mencionados também pretendem ser parte da presente invenção.
[00594] Em certas modalidades, por exemplo, quando uma composição da invenção compreende um dsRNA como descrito aqui e um lipídeo, os indivíduos podem ser administrados com uma quantidade terapêutica de iRNA, tal como cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,2 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,2 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,3 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,3 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,4 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,4 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 1,5 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 1,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 2 mg/kg a cerca de 2,5 mg/kg, cerca de 2 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 3 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 3 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 3,5 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 4 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 4,5 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, cerca de 4 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 4,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 5,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 6 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 6,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 7 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 7,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 8 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 8,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 9 mg/kg a cerca de 10 mg/kg ou cerca de 9,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Intermediários de valores e faixas para os valores mencionados também pretendem ser parte da presente invenção.
[00595] Por exemplo, o dsRNA pode ser administrado em uma dose de cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou cerca de 10 mg/kg. Intermediários de valores e faixas para os valores mencionados também pretendem ser parte da presente invenção.
[00596] Em outras modalidades, por exemplo, quando uma composição da invenção compreende um dsRNA como descrito aqui e uma N-acetilgalactosamina, os indivíduos podem ser administrados com uma quantidade terapêutica de iRNA, tal como uma dose de cerca de 0,1 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 0,25 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 0,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 0,75 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 1 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 1,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 2 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 2,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 3 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 3,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 4 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 4,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 7,5 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 10 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 15 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 25 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 25 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 30 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 35 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 40 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 45 a cerca de 50 mg/kg, cerca de 0,1 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,25 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,75 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 1 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 1,5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 2 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 2,5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 3 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 3,5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 4 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 4,5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 7,5 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 10 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 15 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 25 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 25 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 30 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 35 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 40 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,1 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,25 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,75 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 1 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 1,5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 2 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 2,5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 3 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 3,5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 4 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 4,5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 7,5 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 10 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 15 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 25 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 25 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 30 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 35 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,1 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,25 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,75 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 1 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 1,5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 2 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 2,5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 3 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 3,5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 4 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 4,5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 7,5 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 10 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 15 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 20 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 25 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,1 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 0,25 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 0,5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 0,75 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 1 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 1,5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 2 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 2,5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 3 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 3,5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 4 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 4,5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 7,5 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 10 a cerca de 20 mg/kg ou cerca de 15 a cerca de 20 mg/kg. Em uma modalidade, quando uma composição da invenção compreende um dsRNA como aqui descrito e uma N-acetilgalactosamina, os indivíduos podem ser administrados com uma quantidade terapêutica de cerca de 10 a cerca de 30 mg/kg de dsRNA. Intermediários de valores e faixas para os valores mencionados também pretendem ser parte da presente invenção.
[00597] Por exemplo, indivíduos podem ser administrados com uma quantidade terapêutica de iRNA, tal como cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 20,5, 21, 21,5, 22, 22,5, 23, 23,5, 24, 24,5, 25, 25,5, 26, 26,5, 27, 27,5, 28, 28,5, 29, 29,5, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou cerca de 50 mg/kg. Intermediários de valores e faixas para os valores mencionados também pretendem ser parte da presente invenção.
[00598] Em certas modalidades da invenção, por exemplo, quando um agente RNAi inclui uma modificação (por exemplo, um ou mais motivos de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos), incluindo um motivo do tipo no ou próximo do sítio de clivagem do agente, seis ligações fosforotioato, e um ligante, tal agente é administrado em uma dose de cerca de 0,01 a cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 0,4 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 0,3 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 0,2 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 0,09 mg/kg, cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 0,08 mg/kg, cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 0,07 mg/kg, cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 0,06 mg/kg, cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 0,05 mg/kg, cerca de 0,02 a cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 0,02 a cerca de 0,4 mg/kg, cerca de 0,02 a cerca de 0,3 mg/kg, cerca de 0,02 a cerca de 0,2 mg/kg, cerca de 0,02 a cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,02 mg/kg a cerca de 0,09 mg/kg, cerca de 0,02 mg/kg a cerca de 0,08 mg/kg, cerca de 0,02 mg/kg a cerca de 0,07 mg/kg, cerca de 0,02 mg/kg a cerca de 0,06 mg/kg, cerca de 0,02 mg/kg a cerca de 0,05 mg/kg, cerca de 0,03 a cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 0,03 a cerca de 0,4 mg/kg, cerca de 0,03 a cerca de 0,3 mg/kg, cerca de 0,03 a cerca de 0,2 mg/kg, cerca de 0,03 a cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,03 mg/kg a cerca de 0,09 mg/kg, cerca de 0,03 mg/kg a cerca de 0,08 mg/kg, cerca de 0,03 mg/kg a cerca de 0,07 mg/kg, cerca de 0,03 mg/kg a cerca de 0,06 mg/kg, cerca de 0,03 mg/kg a cerca de 0,05 mg/kg, cerca de 0,04 a cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 0,04 a cerca de 0,4 mg/kg, cerca de 0,04 a cerca de 0,3 mg/kg, cerca de 0,04 a cerca de 0,2 mg/kg, cerca de 0,04 a cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,04 mg/kg a cerca de 0,09 mg/kg, cerca de 0,04 mg/kg a cerca de 0,08 mg/kg, cerca de 0,04 mg/kg a cerca de 0,07 mg/kg, cerca de 0,04 mg/kg a cerca de 0,06 mg/kg, cerca de 0,05 a cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 0,05 a cerca de 0,4 mg/kg, cerca de 0,05 a cerca de 0,3 mg/kg, cerca de 0,05 a cerca de 0,2 mg/kg, cerca de 0,05 a cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 0,09 mg/kg, cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 0,08 mg/kg ou cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 0,07 mg/kg. Intermediários de valores e faixas para os valores mencionados também pretendem ser parte da presente invenção, por exemplo, o agente RNAi pode ser administrado ao indivíduo em uma dose de cerca de 0,015 mg/kg a cerca de 0,45 mg/kg.
[00599] Por exemplo, o agente RNAi, por exemplo, agente RNAi em uma composição farmacêutica, pode ser administrado em uma dose de cerca de 0,01 mg/kg, 0,0125 mg/kg, 0,015 mg/kg, 0,0175 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,0225 mg/kg, 0,025 mg/kg, 0,0275 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,0325 mg/kg, 0,035 mg/kg, 0,0375 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,0425 mg/kg, 0,045 mg/kg, 0,0475 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,0525 mg/kg, 0,055 mg/kg, 0,0575 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,0625 mg/kg, 0,065 mg/kg, 0,0675 mg/kg, 0,07 mg/kg, 0,0725 mg/kg, 0,075 mg/kg, 0,0775 mg/kg, 0,08 mg/kg, 0,0825 mg/kg, 0,085 mg/kg, 0,0875 mg/kg, 0,09 mg/kg, 0,0925 mg/kg, 0,095 mg/kg, 0,0975 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,125 mg/kg, 0,15 mg/kg, 0,175 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,225 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,275 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,325 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,375 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,425 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,475 mg/kg ou cerca de 0,5 mg/kg. Intermediários de valores para os valores mencionados também pretendem ser parte da presente invenção.
[00600] O iRNA pode ser administrado através de infusão intravenosa durante um período de tempo, tal como um período de mais de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou cerca de 25 minutos. A administração pode ser repetida, por exemplo, em uma base regular, tal como semanalmente, duas vezes por semana (isto é, a cada duas semanas) por um mês, dois meses, três meses, quatro meses ou mais. Após um regime de tratamento inicial, os tratamentos podem ser administrados em uma base menos frequente. Por exemplo, após administração semanalmente ou duas vezes por semana por três meses, administração pode ser repetida uma vez por mês, por seis meses ou um ano ou mais.
[00601] Administração do iRNA pode reduzir níveis de AGT, por exemplo, em uma célula, tecido, sangue, urina ou outro compartimento do paciente em pelo menos cerca de 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%,24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%,36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%,48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%,60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%,72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%,84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou pelo menos cerca de 99% ou mais.
[00602] Antes da administração de uma dose inteira do iRNA, os pacientes podem ser administrados com uma dose menor, tal como uma infusão de 5%, e monitorados quanto a efeitos adversos, tal como uma reação alérgica. Em um outro exemplo, o paciente pode ser monitorado quanto a efeitos imunoestimuladores indesejados, tais como níveis de citocina aumentados (por exemplo, TNF-alfa ou INF-alfa).
[00603] Devido aos efeitos inibidores sobre expressão de AGT, uma composição de acordo com a invenção ou uma composição farmacêutica preparada a partir da mesma pode aumentar a qualidade de vida.
[00604] Um iRNA da invenção pode ser administrado em forma "nua", onde o agente iRNA modificado ou não modificado é diretamente suspenso em solvente tampão aquoso ou adequado, como um "iRNA livre". Um iRNA livre é administrado na ausência de uma composição farmacêutica. O iRNA livre pode estar em uma solução tampão adequada. A solução tampão pode compreender acetato, citrato, prolamina, carbonato ou fosfato ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, a solução tampão é solução salina tamponada com fosfato (PBS). O pH e a osmolaridade da solução tampão contendo o iRNA podem ser ajustados de maneira que ela seja adequada para administração a um indivíduo.
[00605] Alternativamente, um iRNA da invenção pode ser administrado como uma composição farmacêutica, tal como uma formulação lipossomal de dsRNA.
[00606] Os indivíduos que se beneficiariam de uma redução e/ou inibição de expressão de gene de AGT são aqueles tendo uma doença ou distúrbio associado a AGT como aqui descrito.
[00607] Tratamento de um indivíduo que se beneficiaria de uma redução e/ou inibição de expressão de gene AGT inclui tratamentos terapêutico e profilático.
[00608] A invenção provê ainda métodos e usos de um agente iRNA ou uma composição farmacêutica do mesmo para tratamento de um indivíduo que se beneficiaria da redução e/ou inibição de expressão de AGT, por exemplo, um indivíduo tendo uma doença associada a AGT, em combinação com outros agentes farmacêuticos e/ou outros métodos terapêuticos, por exemplo, com agentes farmacêuticos e/ou métodos terapêuticos conhecidos tais como, por exemplo, aqueles que são atualmente empregados para tratamento destes distúrbios. Por exemplo, em certas modalidades, um iRNA de direcionamento a AGT é administrado em combinação com, por exemplo, um agente útil em tratamento de uma doença associada a AGT como descrito em outro ponto aqui. Por exemplo, agentes terapêuticos e métodos terapêuticos adicionais adequados para tratamento de um indivíduo que se beneficiaria da redução em expressão de AGT, por exemplo, um indivíduo tendo uma doença associada a AGT, incluem angioplastia, bypass aortorrenal, desenervação renal, angioplastia renal transluminal percutânea (PTRA) e stenting, revascularização cirúrgica, desenervação simpática renal baseada em cateter e remoção cirúrgica de feocromocitoma ou reninoma, adrenalectomia, tratamento com um diurético, por exemplo, diurético tipo tiazida, por exemplo, clorotiazida, hidroclorotiazida, clortalidona, metolazona e indapamida, um diurético poupador de potássio, tais como triamtereno e amilorida, um diurético de alça, por exemplo, furosemida, torsemida, ácido etacrínico e bumetanida; um inibidor da enzima de conversão de angiotensina (ACE), por exemplo, fosinopril, captopril, ramipril, enalapril, lisinopril e quinapril; um antagonista de receptor de angiotensina II (também conhecido como um bloqueador do receptor de angiotensina), por exemplo, losartana, valsartana, olmesartana, eprosartana e azilsartana; um beta-bloqueador; tal como um beta-bloqueador seletivo para beta-1, por exemplo, atenolol, metoprolol, propranolol, bisoprolol e timolol, um beta-bloqueador de receptor alfa-1, por exemplo, labetalol, esmolol e carvedilol, um beta-bloqueador simpatomimético intrínseco, por exemplo, acebutolol e pindolol; um vasodilatador, por exemplo, hidralazina, minoxidil, nitroprussida de sódio e nitroglicerina; um bloqueador de canal de cálcio, por exemplo, nifedipina, clevidipina, amlodipina, felodipina, diltiazem, nicardipina e verapamil; um antagonista de aldosterona, tal como um antagonista de aldosterona seletivo, por exemplo, eplerenona e espironolactona; um agonista de alfa2, tal como um agonista de alfa2 de ação central, por exemplo, metildopa, clonidina e guanfacina, um inibidor de renina, por exemplo, alisquireno; um alfa-bloqueador, por exemplo, prazosina, terazosina e doxazosina; um agente adrenérgico de ação periférica, por exemplo, reserpina; um agonista parcial de receptor D1 seletivo, por exemplo, mesilato de fenoldopam; um antagonista alfa-adrenérgico não seletivo, por exemplo, fentolamina; um agente antimineralocorticoide esteroidal, por exemplo, espironolactona ou uma combinação de qualquer um dos acima; e um agente terapêutico formulado como uma combinação de agentes, por exemplo, uma combinação de amlodipina/benazepril (Lotrel), amlodipina/olmesartana (Azor), amlodipina/telmisartana (Twinsta), amlodipina/valsartana (Exforge), amlodipina/valsartana/hidroclorotiazida (Exforge HCT), amlodipina/alisquireno (Tekamlo), amlodipina/alisquireno/hidroclorotiazida (Amturnide),olmesartana/amlodipina/hidroclorotiazida (Tribenzor),trandolapril/verapamil (Tarka), benazepril/hidroclorotiazida (Lotensin HCT), captopril/hidroclorotiazida (Capozide), enalapril/hidroclorotiazida (Vaseretic), fosinopril/hidroclorotiazida, lisinopril/hidroclorotiazida (Prinzide, Zestoretic), moexipril/hidroclorotiazida (Uniretic), quinapril/hidroclorotiazida (Accuretic), candesartana/hidroclorotiazida (Atacand HCT), eprosartana/hidroclorotiazida (Teveten HCT), irbesartana/hidroclorotiazida (Avalide), losartana/hidroclorotiazida (Hizaar), olmesartana/hidroclorotiazida (Benicar HCT), telmisartana/hidroclorotiazida (Micardis HCT),valsartana/hidroclorotiazida (Diovan HCT), atenolol/clortalidona (Tenoretic), bisoprolol/hidroclorotiazida (Ziac), metoprolol/hidroclorotiazida (Lopressor HCT),nadolol/bendroflumetiazide (Corzide), propranolol/hidroclorotiazida, alisquireno/hidroclorotiazida (Tekturna HCT), clonidina/clortalidona (Clorpres), espironolactona/hidroclorotiazida (Aldactazide), triamtereno/hidroclorotiazida (Diazide, Maxzide),metildopa/hidroclorotiazida e amiloride/hidroclorotiazida ou outros agentes terapêuticos para tratamento de uma doença associada a AGT.
[00609] O agente iRNA e um agente e/ou tratamento terapêutico adicional podem ser administrados ao mesmo tempo e/ou na mesma combinação, por exemplo, parenteralmente, ou o agente terapêutico adicional pode ser administrado como parte de uma composição separada ou em momentos separados e/ou através de um outro método conhecido na técnica ou descrito aqui.
[00610] A presente invenção também provê métodos de uso de um agente iRNA da invenção e/ou uma composição contendo um agente iRNA da invenção para reduzir e/ou inibir expressão de AGT em uma célula. Em outros aspectos, a presente invenção provê um iRNA da invenção e/ou uma composição compreendendo um iRNA da invenção para uso na redução e/ou inibição de expressão de AGT em uma célula. Em ainda outros aspectos, uso de um iRNA da invenção e/ou uma composição compreendendo um iRNA da invenção para a fabricação de um medicamento para redução e/ou inibição de expressão de AGT em uma célula é provido.
[00611] Os métodos e usos incluem contato da célula com um iRNA, por exemplo, um dsRNA, da invenção e manutenção da célula por um tempo suficiente para obter degradação do transcrito de mRNA de um agente AGT, desta maneira inibindo expressão do gene de AGT na célula.
[00612] Redução em expressão de gene pode ser avaliada através de quaisquer métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, uma redução na expressão de AGT pode ser determinada através da determinação do nível de expressão de mRNA de AGT usando métodos de rotina para um versado comum na técnica, por exemplo, nortern blotting, qRT-PCR, através da determinação do nível de proteína de AGT usando métodos de rotina para um versado comum na técnica, tais como Western blotting, técnicas imunológicas, métodos de citometria de fluxo, ELISA e/ou através da determinação de uma atividade biológica de AGT.
[00613] Nos métodos e usos da invenção, a célula pode ser contatada in vitro ou in vivo, isto é, a célula pode estar dentro de um indivíduo.
[00614] Uma célula adequada para tratamento usando os métodos da invenção pode ser qualquer célula que expresse um gene de AGT. Uma célula adequada para uso nos métodos e usos da invenção pode ser uma célula de mamífero, por exemplo, uma célula de primata (tal como uma célula humana ou uma célula de primata não humano, por exemplo, uma célula de macaco ou uma célula de chimpanzé), uma célula de não primata (tal como uma célula de vaca, uma célula de porco, uma célula de camelo, uma célula de lhama, uma célula de cavalo, uma célula de cabra, uma célula de coelho, uma célula de ovelha, uma célula de hamster, uma célula de porquinho-da-índia, uma célula de gato, uma célula de cachorro, uma célula de rato, uma célula de camundongo, uma célula de leão, uma célula de tigre, uma célula de urso ou uma célula de búfalo), uma célula de ave (por exemplo, uma célula de pato ou uma célula de ganso) ou uma célula de baleia. Em uma modalidade, a célula é uma célula humana, por exemplo, uma célula de fígado humana.
[00615] Expressão de AGT pode ser inibida na célula em pelo menos cerca de 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%,29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%,41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%,53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%,65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%,77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%,89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou cerca de 100%. Em modalidades preferidas, o nível de AGT é reduzido em pelo menos 20%.
[00616] Os métodos e usos in vivo da invenção podem incluir administração a um indivíduo de uma composição contendo um iRNA, onde o iRNA inclui uma sequência de nucleotideo que é complementar a pelo menos uma parte de um transcrito de RNA do gene de AGT do mamífero a ser tratado. Quando o organismo a ser tratado é um humano, a composição pode ser administrada através de qualquer meio conhecido na técnica incluindo, mas não limitado a, vias subcutâneas, intravenosas, orais, intraperitoneais ou parenterais, incluindo administrações intracranial (por exemplo, intraventricular, intraparenquimal e intratecal), intramuscular, transdermal, vias áreas (aerossol), nasal, retal e tópica (incluindo bucal e sublingual). Em certas modalidades, as composições são administradas através de infusão ou injeção subcutânea ou intravenosa.
[00617] Em algumas modalidades, a administração é através de uma injeção depósito. Uma injeção depósito pode liberar o iRNA de uma maneira consistente durante um período de tempo prolongado. Desta maneira, uma injeção depósito pode reduzir a frequência de dosagem necessária para obter um efeito desejado, por exemplo, uma inibição desejada de AGT, ou um efeito terapêutico ou profilático. Uma injeção depósito pode também prover concentrações no soro mais consistentes. Injeções depósito podem incluir injeções subcutâneas ou injeções intramusculares. Em modalidades preferidas, a injeção depósito é uma injeção subcutânea.
[00618] Em algumas modalidades, a administração é através de uma bomba. A bomba pode ser uma bomba externa ou uma bomba cirurgicamente implantada. Em certas modalidades, a bomba é uma bomba osmótica subcutaneamente implantada. Em outras modalidades, a bomba é uma bomba de infusão. Uma bomba de infusão pode ser usada para infusões intravenosas, subcutâneas, arteriais ou epidurais. Em modalidades preferidas, a bomba de infusão é uma bomba de infusão subcutânea. Em outras modalidades, a bomba é uma bomba cirurgicamente implantada que administra o iRNA ao fígado.
[00619] Uma dose maior pode ser administrada inicialmente (isto é, uma dose de carga), seguido por uma dosagem menor por um período de tempo prolongado.
[00620] O modo de administração pode ser escolhido com base em se o tratamento local ou sistêmico é desejado e com base na área a ser tratada. A via e sítio de administração podem ser escolhidos para aumentar o direcionamento.
[00621] Em um aspecto, a presente invenção também provê métodos para inibição da expressão de um gene AGT em um mamífero, por exemplo, um humano. A presente invenção também provê uma composição compreendendo um iRNA, por exemplo, um dsRNA, que se direciona a um gene AGT em uma célula de um mamífero para uso na inibição da expressão do gene de AGT no mamífero. Em um outro aspecto, a presente invenção provê uso de um iRNA, por exemplo, um dsRNA, que se direciona a um gene de AGT em uma célula de um mamífero na fabricação de um medicamento para inibição da expressão do gene de AGT no mamífero.
[00622] Os métodos e usos incluem administração ao mamífero, por exemplo, um humano, de uma composição compreendendo um iRNA, por exemplo, um dsRNA, que se direciona a um gene de AGT em uma célula do mamífero e mantendo o mamífero por um tempo suficiente para obter degradação do transcrito de mRNA do gene de AGT, desta maneira inibindo expressão do gene de AGT no mamífero.
[00623] Redução em expressão de gene pode ser avaliada em amostra de sangue periférico do indivíduo administrado com iRNA através de quaisquer métodos conhecidos na técnica, por exemplo, qRT-PCR, descritos aqui. Redução em produção de proteína pode ser avaliada através de quaisquer métodos conhecidos na técnica e através de métodos, por exemplo, ELISA ou Western blotting, descritos aqui. Em uma modalidade, uma amostra de biópsia de fígado de punção serve como o material de tecido para monitoramento da redução em gene de AGT e/ou expressão de proteína. Em uma outra modalidade, uma amostra de sangue serve como o material de tecido para monitoramento da redução em gene de AGT e/ou expressão de proteína.
[00624] Em uma modalidade, verificação de clivagem mediada por RISC de alvo in vivo seguindo administração de agente iRNA é feita através da realização de 5’-RACE ou modificações do protocolo como conhecido na técnica (Lasham A e outros, (2010) Nucleic Acid Res., 38 (3) p-e19) (Zimmerosmann e outros (2006) Nature 441: 111-4).
[00625] A presente invenção é ainda ilustrada pelos exemplos que seguem que não devem ser considerados como limitantes. Os conteúdos em sua totalidade de todas as referências, patentes e pedidos de patente publicados mencionados em todo o presente pedido, bem como as Figuras e a Listagem de Sequência, são aqui incorporados a título de referência.
EXEMPLOS Exemplo 1. Síntese de iRNA Fonte de reagentes
[00626] Onde a fonte de um reagente não é especificamente dada aqui, tal reagente pode ser obtido de qualquer fornecedor de reagentes para biologia molecular em um padrão de qualidade/pureza para aplicação em biologia molecular.
Transcritos
[00627] Projeto de siRNA foi realizado para identificar siRNAs se direcionando a transcritos de AGT humanos (Homo sapiens), macaco Cynomolgus (Macaca fascicularis; daqui em diante "cyno"), camundongo (Mus musculus) e rato (Rattus norvegicus) anotados no banco de dados NCBI Gene (www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/). O projeto usou os transcritos que seguem de NCBI: Humano - NM_000029.3; Macaco - AB170313.1; Camundongo - NM_007428.3. O transcrito de macaco Cynomolgus foi estendido usando sequência obtida de uma biblioteca de cDNA derivada do fígado. Devido à alta divergência de sequência de primata/roedor, dúplexes de siRNA foram projetados em bateladas separadas, incluindo, mas não limitado a, bateladas contendo dúplexes com compatibilidade de transcritos humanos e macaco apenas e transcrito de camundongo apenas. Todos os dúplexes de siRNA foram projetados, os quais compartilhavam 100% de identidade com o transcrito humano listado e transcritos de outra espécie considerados em cada batelada projetada.
Projeto, Especificidade e Previsão de Eficácia de siRNA
[00628] A especificidade prevista de todos os 19meros possíveis foi prevista de cada sequência. 19meros candidatos foram então selecionados, os quais não tinham repetições mais longas do que sete nucleotídeos. Esses 706 siRNAs de humano/camundongo e 1815 de camundongo candidatos foram usados em pesquisas compreensivas contra os transcriptomas apropriados (definido como o conjunto de registros NM_ e XM_ dentro dos conjuntos NCBI Refseq de humano, macaco ou camundongo) usando um algoritmo de "força bruta" exaustivo implementado em pyton script ‘BruteForce.py’. O script em seguida analisou os alinhamentos transcrito-oligo para gerar uma classificação com base na posição e númeroso de incompatibilidades entre o siRNA e qualquer transcrito "fora do alvo" potencial. A classificação fora do alvo foi ponderada para enfatizar diferenças na "região de semente" de siRNAs, nas posições 2-9 da extremidade 5’ da molécula. Cada par de oligo-transcrito da pesquisa de força bruta recebeu uma classificação de incompatibilidade somando as classificações de incompatibilidade individuais; incompatibilidades na posição 2-9 foram contadas como 2,8, incompatibilidades nas posições 10-11 do sítio de clivagem foram contadas como 1,2 e incompatibilidades na região 12-19 contadas como 1,0. Uma previsão fora do alvo adicional foi realizada comparando a frequência de heptâmeros e octâmeros derivados de 3 hexâmetros derivados de semente, distintos, de cada oligo. Os hexâmetros das posições 2-7 com relação ao início 5’ são usados para criar 2 heptâmeros e um octâmeroso. "Heptâmeroso1" foi criado através da adição de uma 3’ A ao hexâmetro; "heptâmeroso2" foi criado adicionando uma 5’ A ao hexâmeroso; o octâmeroso foi criado adicionando um A a ambas as extremidades 5’ e 3’ do hexâmeroso. A frequência de octâmeros e heptâmeros na 3’UTRome de humano, macaco ou camundongo (definida como a subsequência do transcriptoma do banco de dados Refseq do NCBI onde a extremidade da região de codificação, a ‘CDS’, é claramente definida) foi pré-calculada. A frequência de octâmeroso foi normalizada para a frequência de heptâmeros usando o valor mediano da faixa de frequências de octâmeroso. Um "mirSeedScore" foi então calculado através do cálculo da soma de ((3 X contagem de octômeroso normalizada) + (2 X contagem de hetpâmeroso2) + (1 X contagem de heptâmeroso1)).
[00629] Ambas as fitas de siRNA foram designados a uma categoria de especificidade de acordo com as classificações calculadas: uma classificação acima de 3 qualifica como altamente específico, igual a 3 como específico e entre 2,2 e 2,8 como moderadamente específico. Os dúplexes foram classificados pela especificidade da fita de antissenso. Dúplexes de conjuntos de humano/macaco e camundongo cujos oligos de antissenso não tinham GC na primeira posição, não tinham G em ambas as posições 13 e 14, e tinha 3 ou mais Us ou As na região de semente (características de dúplexes com eficácia prevista alta) foram selecionados.
[00630] Dúplexes conjugados a GalNAc candidatos, 21 e 23 nucleotídeos de comprimento nos a fitas de senso e antissenso, respectivamente, foram projetados estendendo 19meros de antissenso quatro nucleotídeos adicionais na direção 3’ (preservando a complementaridade perfeita com o transcrito alvo). A fita de senso foi especificado como o complemento reverso dos primeiros 21 nucleotídeos dos 23meros de antissenso. Foram selecionados dúplexes que mantinham compatibilidades perfeitas com todos os transcritos de espécie selecionados em todos os 23 nucleotídeos.
Seleção de sequência de siRNA
[00631] Um total de 117 oligos de 19meros de siRNA de humano/macaco derivados de senso e 117 de antissenso e de camundongo derivados de 42 de senso e 42 de antissenso foi sintetizado e formado em dúplexes conjugados a GalNAc. Um total de 38 oligos de 21/23meros de humano/camundongo derivados de senso e 38 derivados de antissenso e um total de 26 oligos de 21/23meros de camundongo foi sintetizado e formado em dúplexes de conjugado GalNAC.
[00632] Uma lista detalhada das sequências de fita de senso e antissenso de AGT de 19meros não modificadas é mostrada na Tabela 3.
[00633] Uma lista detalhada de sequências de fita de senso e antissenso de AGT de 19meros modificadas é mostrada na Tabela 4.
[00634] Uma lista detalhada das sequências de fita de senso e antissenso de AGT de 21/23meros não modificadas é mostrada na Tabela 7.
[00635] Uma lista detalhada das sequências de fita de senso e antissenso de AGT e 21/23meros modificadas é mostrada na Tabela 8.
[00636] Uma lista detalhada de sequências de fita de senso e antissenso de AGT de 19meros não modificadas é mostrada na Tabela 11.
[00637] Uma lista detalhada de sequências de fita de antissenso de AGT de 21/23meros não modificadas é mostrada na Tabela 13.
[00638] Uma lista detalhada das sequências de fita de senso e antissenso de AGT de 21/23meros modificadas é mostrada na Tabela 15.
Síntese de siRNA Procedimento de Síntese de RNA de Escalas Pequena e Média Geral
[00639] Oligonucleotídeos de RNA são sintetizados em escalas entre 0,2-500 μmol usando monômeros de 5’-O-(4,4’-dimetoxitritil)-2’-O-t- butildimetilsilil-3’-O-(2-cianoetil-N,N-di-isopropil)fosforamidita deuridina, 4-N-acetilcitidina, 6-N-benzoiladenosina e 2-N-isobutirilguanosina e as 2’-O-metil e o 2’-flúor fosforamiditas correspondentes de acordo com protocolos de síntese de oligonucleotídeo de fase sólida padrão. As soluções de amidita são preparadas em concentração de 0,1-0,15 M e 5-etiltio-1H-tetrazol (0,250,6 M em acetonitrila) é usado como o ativador. Modificações de estrutura principal de fosforotioato são introduzidas durante síntese usando dissulfeto de fenilacetila 0,2 M (PADS) em lutidina:acetonitrila (1:1) (v:v) ou 3-(dimetilaminometileno) amino-3H-1,2,4-ditiazol-5-tiona 0,1 M (DDTT) em piridina para a etapa de oxidação. Após término de síntese, as sequências são clivadas do apoio sólido e desprotegidas usando metilamina seguido por trietilamina.3HF para remover quaisquer grupos de proteção de 2’-O-t-butildimetilsilila presentes.
[00640] Para escalas de síntese entre 5-500 μmol e sequências integralmente modificadas 2’ (2’-flúor e/ou 2’-O-metila ou combinações das mesmas) os oligonucleotídeos são desprotegidos usando 3:1 de etanol (v/v) e amônia aquosa concentrada (28-32%) ou a 35° C por 16 h ou 55° C por 5,5 h. Antes da desproteção com amônia os oligonucleotídeos são tratados com piperidina 0,5 M em acetonitrila por 20 min no apoio sólido. Os oligonucleotídeos brutos são analisados através de LC-MS e HPLC de troca de ânion (IEX-HPLC). Purificação dos oligonucleotídeos é realizada através de IEX HPLC usando: fosfato 20 mM, ACN 10%-15%, pH = 8,5 (tampão A) e fosfato 20 mM, ACN 10%-15%, NaBr 1 M, pH = 8,5 (tampão B). As frações são analisadas quanto à pureza através de HPLC analítica. As frações contendo produto com pureza adequada são agrupadas e concentradas em um evaporador giratório antes da dessalinização. As amostras são dessalinizadas através de cromatografia de exclusão de tamanho e liofilizadas até secagem. Quantidades molares iguais de fitas de senso e antissenso são aneladas em tampão 1x PBS para preparar os dúplexes de siRNA correspondentes.
[00641] Para escalas pequenas (0,2-1 μmol), síntese é realizada em um sintetizador MerMade 192 em um formato de 96 cavidades. No caso de sequências totalmente modificadas 2’ (2’-flúor e/ou 2’-O-metila ou combinações das mesmas) os oligonucleotídeos são desprotegidos usando metilamina em temperatura ambiente por 30-60 min seguido por incubação a 60° C por 30 min ou usando 3:1 (v/v) de etanol e amônia aquosa concentrada (28-32%) em temperatura ambiente por 30-60 min seguido por incubação a 40° C por 1,5 hora. Os oligonucleotídeos brutos são então precipitados em uma solução de acetonitrila:acetona (9:1) e isolados através de centrifugação e decantação do sobrenadante. O pélete de oligonucleotídeo bruto é ressuspenso em tampão de NaOAc 20 mM e analisado através de LC-MS e HPLC de troca de ânion. As sequências de oligonucleotídeo brutas são dessalinizadas em placas de 96 cavidades fundas em uma coluna HiTrap Sefadex G25 de 5 mL (GE Healtcare). Em cada cavidade amostras de cerca de 1,5 mL correspondendo a uma sequência individual são coletadas. Estes oligonucleotídeos dessalinizados purificados são analisados através de LC-MS e cromatografia de troca de ânion. Dúplexes são preparados através de anelamento de quantidades equimolares de sequências de senso e antissenso em um robô Tecan. A concentração de dúplexes é ajustada para 10 μM em tampão 1x PBS.
Síntese de Oligonucleotídeos Conjugados a GalNAc para Análise In vivo
[00642] Oligonucleotídeos conjugados com ligante GalNAc em seu terminal 3’ são sintetizados em escalas entre 0,2-500 μmol usando um apoio sólido pré-carregado com um ligante em formato de Y carregando um grupo hidróxi primário protegido com 4,4’-dimetoxitritila (DMT) para síntese de oligonucleotídeo e um ligante GalNAc ligado através de uma âncora.
[00643] Para síntese de conjugados de GalNAc nas escalas entre 5500 μmol, o protocolo de síntese acima para RNA é seguido com as adaptações que seguem: para síntese à base de poliestireno apoios de ácido dicloroacético 5% em tolueno são usados para clivagem de DMT durante síntese. Clivagem a partir do apoio e desproteção são realizadas como acima descrito. Sequências ricas em fosforotioato (geralmente > 5 fosforotioatos) são sintetizadas sem remoção do grupo 5’-DMT final ("DMT-on") e, após clivagem e desproteção como acima descrito, purificadas através de HPLC de fase reversa usando acetato de amônio 50 mM em água (tampão A) e acetato de amônio 50 mM em acetonitrila 80% (tampão B). As frações são analisadas quanto à pureza através de HPLC analítica e/ou LC-MS. As frações contendo produto com pureza adequada são agrupadas e concentradas em um evaporador giratório. O grupo DMT é removido usando ácido acético 20%-25% em água até o término. As amostras são dessalinizadas através de cromatografia de exclusão de tamanho e liofilizadas até secagem. Quantidades molares iguais de fitas de senso e antissenso são aneladas em tampão 1x PBS para preparar os dúplexes de siRNA correspondentes.
[00644] Para síntese em escala pequena de conjugados de GalNAc (0,2-1 μmol), incluindo sequências com ligações fosforotioato múltiplas, os protocolos descritos acima para síntese de RNA ou sequências contendo 2’-F/2’-O integralmente em plataforma MerosMade são aplicados. Síntese é realizada em colunas pré-empacotadas contendo apoio de vidro de poro controlado funcionalizado com GalNAc.
Exemplo 2. Avaliação in vitro de dúplexes de siRNA Cultura de célula e transfecções em 96 cavidades
[00645] Células Hep3B (ATCC, Manassas, VA) foram cultivadas próximo da confluência a 37° C em uma atmosfera de CO2 5% em Meio Essencial Mínimo da Eagle (ATCC) suplementado com FBS 10%, estreptomicina e glutamina (ATCC) antes de serem liberadas da placa através de tripnização. As células foram lavadas e ressuspensas a 0,125 x 106 células/mL. Durante as transfecções, as células foram plaqueadas em uma placa de 96 cavidades com cerca de 2.000 células por cavidade.
[00646] Transfecção foi realizada adicionando 14,8 μL de Opti-MEM mais 0,2 μL de Lipofectamine RNAiMax por cavidade (Invitrogen®, Carlsbad CA. Númeroso de catálogo 13778-150) a 5 μL de cada dúplex de siRNA a uma cavidade individual em uma placa de 96 cavidades. A mistura foi então incubada em temperatura ambiente por 20 minutos. Oitenta μL de meio de crescimento completo sem antibiótico contendo o númeroso de célula apropriado foram então adicionados à mistura de siRNA. As células foram incubadas por 24 horas antes da purificação de RNA.
[00647] Experimentos de dose única foram realizados a 10 nM e 0,01 nM de concentração de dúplex final. Os experimentos de resposta de dose foram feitos a 1,67, 0,28, 0,046, 0,0077, 0,0013, 0,00021, 0,000036 nM de concentração de dúplex final.
Cultura de célula e transfecções de 384 cavidades
[00648] Células Hep3B (ATCC, Manassas, VA) foram cultivadas para próximo da confluência a 37° C em uma atmosfera de CO2 5% em Meio Essencial Mínimo da Eagle (ATCC®) suplementado com FBS 10%, estreptomicina e glutamina (ATCC®) antes de serem liberadas da placa através de tripnização. As células foram lavadas e ressuspensas a 0,125 x 106 células/mL. Durante as transfecções, as células foram plaqueadas em uma placa de 384 cavidades com cerca de 5.000 células por cavidade.
[00649] Transfecção foi realizada adicionando 4,9 μL de Opti-MEM mais 0,1 μL de Lipofectamine RNAiMax por cavidade (Invitrogen®, Carlsbad CA. Número de catálogo 13778-150) a 5 μL de cada dúplex de siRNA a uma cavidade individual em uma placa de 96 cavidades. A mistura foi então incubada em temperatura ambiente por 20 minutos. Quarenta μL de meio de crescimento completo sem antibiótico contendo o número de célula apropriado foram então adicionados à mistura de siRNA. As células foram incubadas por 24 horas antes da purificação de RNA.
[00650] Experimentos de dose única foram realizados a 10 nM e 0,01 nM de concentração de dúplex final. Experimentos de resposta de dose foram feitos em 10, 1,67, 0,28, 0,046, 0,0077, 0,0013, 0,00021, 0,000036 nM de concentração de dúplex final.
Isolamento de RNA total usando Estojo de Isolamento de mRNA DYNABEADS (Invitrogen®, No. part: 610-12) - Isolamento em 96 cavidades
[00651] As células foram coletadas e lisadas em 150 μL de Tampão de Lise/Ligação, então misturadas por cinco minutos a 850 rpm usando um Eppendorf Termomixer (a velocidade de mistura era a mesma durante todo o processo). Dez microlitros de contas magnéticas e 80 μL de mistura de Tampão de Lise/Ligação foram adicionados a uma placa de fundo redondo e misturados por 1 minuto. Contas magnéticas foram capturadas usando apoio magnético e o sobrenadante foi removido sem perturbar as contas. Após remoção do sobrenadante, as células lisadas foram adicionadas às contas restantes e misturadas por 5 minutos. Após remoção do sobrenadante, as contas magnéticas foram lavadas 2 vezes com 150 μL de Tampão de Lavagem A e misturadas por 1 minuto. As contas foram capturadas novamente e sobrenadante removido. As contas foram então lavadas com 150 μL de Tampão de Lavagem B, capturadas e sobrenadante foi removido. As contas foram em seguida lavadas com 150 μL de Tampão de Eluição, capturadas e sobrenadante removido. As contas foram deixadas secar por 2 minutos. Após secagem, 50 μL de Tampão de Eluição foram adicionados e misturados por 5 minutos a 70° C. As contas foram capturadas em ímã por 5 minutos. Quarenta μL de sobrenadante foram removidos e adicionados a uma outra placa de 96 cavidades.
Síntese de cDNA usando Estojo de transcrição reversa de cDNA de capacidade alta ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, No. Cat. 4368813)
[00652] Uma mistura máster de 2 μL de Tampão 10X, 0,8 μL de 25X dNTPs, 2 μL de Iniciadores aleatórios, 1 μL de Transcriptase Reversa, 1 μL de inibidor de RNase e 3,2 μL de H2O por reação foram adicionados a 10 μL de RNA total. cDNA foi gerado usando um ciclizador térmico Bio-Rad C-1000 ou S-1000 (Hércules, CA) através das etapas que seguem: 25°C 10 min, 37°C 120 min, 85°C 5 seg, apoio 4°C.
Isolamento de RNA total usando Estojo de Isolamento de mRNA DYNABEADS (Invitrogen®, No. part: 610-12) - Extração em 384 cavidades
[00653] As células foram lisadas em 50 μL de Tampão de Lise/Ligação. Dynabeads magnéticas foram lavadas em Tampão de Lise/Ligação e ressuspensas no mesmo. 25 μL de Tampão de Lise/Ligação contendo 2 μL de Dynabeads foram então adicionados por cavidade. Após agitar as placas por 10 minutos em "7" em um Vibratranslator (UnionScientific), um sistema de lavagem de placa automático foi utilizado (Biotek EL406 com Biostaker e placa de captura magnética). As placas foram então lavadas de uma maneira similar àquela descrita para o processo de 96 cavidades; duas vezes com tampão A (90 μL), uma vez com tampão B (90 μL) e duas vezes com tampão C (100 μL). A última lavada foi removida da placa e síntese de cDNA começou imediatamente.
Síntese de cDNA usando estojo de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, No. Cat 4368813)
[00654] Uma mistura máster de 2 μL de 10X Tampão, 0,8 μL de 25X dNTPS, 2 μL de Iniciadores aleatórios, 1 μL de Transcriptase Reversa, 1 μL de Inibidor de RNase e 13,2 μL de H2O por reação foi adicionada às cavidades de uma placa de 384 cavidades contendo apenas RNA extraído e contas magnéticas (volume total de 20 μL). cDNA foi gerado através de incubação a 25° C por 10 min, 37° C por 120 min e 85° C por 8 minutos.
PCR em Tempo real:
[00655] Dois μL de cDNA foram adicionados a uma mistura máster contendo 0,5 μL de Sonda TaqMan GAPDG humana (Applied Biosystems No. Cat. 4326317E) e 0,5 μL de Sonda TaqMan AGT humana (Applied Biosystems No. Cat. Hs00174854m1), 2 μL de água livre de nuclease e 5 μL de mistura master de sonda Lightcycler (No. Cat. Roche 04887301001) por cavidade em uma placa de 384 cavidades (No. cat. Roche 04887301001). qPCR foi realizada em uma máquina de PCR de tempo real LightCycler 480 (Roche). Para calcular as alterações no aumento médio relativas, os dados foram analisados usando o método ΔΔCt e normalizados para ensaios realizados com células transfectadas com 10 nM de AD-1955 ou células falso- transfectadas. As IC50s foram calculadas usando um modelo de ajuste de 4 parâmetros usando XLFit e normalizadas para células transfectadas com AD-1955 ou falso-transfectadas.
[00656] As sequências de senso e antissenso de AD-1955 são: SENSO: cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT (SEQ ID NO:13) ANTISSENSO: UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT (SEQ ID NO:14).
[00657] A Tabela 5 mostra os resultados de uma avaliação de dose única em células Hep3B transfectadas usando o método de 96 cavidades com os iRNAs de AGT de 19meros indicados. Os dados são expressos como porcentagem de mRNA restante com relação a células não tratadas.
[00658] A Tabela 6 mostra a resposta de dose de células Hep3B transfectadas usando o método de 96 cavidades com os iRNAs de AGT de 19meros indicados. Os valores de IC50 indicados representam os valores de IC50 relativos a células não tratadas.
[00659] A Tabela 9 mostra os resultados de uma avaliação de dose única em células Hep3B transfectadas usando o método de 384 cavidades com os iRNAs de AGT conjugados de 21/23meros indicado. Os dados são expressos como porcentagem de mRNA restante com relação a células não tratadas.
[00660] A Tabela 10 mostra a reposta de dose de células Hep3B transfectadas usando o método de 384 cavidades com os iRNAs de AGT conjugados de 21/23meros indicados. Os valores de IC50 indicados representam os valores de IC50 com relação a células não tratadas.
[00661] A Tabela 12 mostra os resultados de uma avaliação de dose única em células Hep3B transfectadas usando o método de 96 cavidades com os iRNAs de AGT de 19meros indicados. Os dados são expressos como porcentagem de mRNA restante com relação a células não tratadas.
[00662] A Tabela 14 mostra os resultados de uma avaliação de resposta de dose, dose única, de inativação de hAGT com os iRNAs de AGT conjugados de 21/23meros indicados em camundongos infectados com um vetor de AAV expressando hAGT.
[00663] A Tabela 16 mostra os resultados de uma avaliação de resposta de dose, dose única, de inativação de hAGT com os iRNAs de AGT conjugados de 21/23meros indicados em camundongos infectados com um vetor de AAV expressando hAGT.Tabela 2. Abreviações de monômeros de nucleotídeo usados em representação de sequência de ácido nucleico. Será compreendido que estes monômeros, quando presentes em um oligonucleotídeo, são mutuamente ligados por ligações 5’-3’-fosfodiéster
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Tabela 10 – Dados de IC50 de AGT em Células Hep3B (21/23meros)
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Exemplo 2. Silenciamento de AGT In vivo - Melhora de Sequelas de Pré-eclâmpsia
[00664] Fêmeas de ratos Sprague-Dawley transgênicos carregando o gene de AGT humano genômico completo (por exemplo, [TGR(hAGT)L1623] (vide, por exemplo, Bohlender J. e outros (1996) Hypertension 27: 535-540 e Bohlender J. e outros (2000) J. Am. Soc. Nephrol. 11: 2056-2061)) foram cirurgicamente implementadas com um dispositivo para medição da pressão sanguínea através de telemetria. Subsequente à recuperação do procedimento, estes ratos foram acasalados com ratos Sprague-Dawley machos transgênicos carregando o gene de REN humano genômico inteiro (por exemplo, [TGR(hREN)L10J] (vide, por exemplo, Bohlender J. e outros (1997) Hypertension 29: 428-434 e Bohlender J. e outros (2000) J. Am. Soc. Nephrol. 11: 2056-2061)). A progênie fêmea deste cruzamento (referida aqui como "ratos PE") são um modelo de pré-eclâmpsia e desenvolveram albuminuria e restrição de crescimento intrauterino (IUGR) e têm pico de pressão sanguínea começando mais ou menos no dia gestacional 13 (vide, por exemplo, Figura 2A).
[00665] Começando no dia 3 de gestação, um subconjunto de fêmeas de ratos PE grávidas foi administrado com 10 mg/kg de siRNA se direcionando a hAGT (AD-60771). Um segundo subconjunto de fêmeas de ratos PE grávidas foi deixado sem tratamento como um controle. A dosagem continuou a cada três dias até o dia 15 de gestação. As fêmeas de ratos PE foram sacrificadas mais ou menos no dia 19 de gestação e amostras de sangue e tecido foram coletadas das mães e dos fetos.
[00666] A pressão sanguínea materna foi monitorada durante o experimento através de dispositivos cirurgicamente implementados para medição da pressão sanguínea através de telemetria. A Figura 2A mostra que seguindo a administração de AD-60771, a pressão sanguínea arterial materna foi significantemente diminuída. Ainda, conforme determinado através de análise ELISA de albumina no soro, albuminuria materna foi significantemente reduzida seguindo administração de AD-60771 (Figura 2B). Essas duas condições são os sinais de pré-eclâmpsia. A pressão sanguínea reduzida reduz os eventos cardiovasculares associados com a doença, enquanto albuminuria reduzida é indicativa de função renal melhor.
[00667] Pré-eclâmpsia está também associada com tamanho reduzido da placenta, possivelmente relacionado à perfusão pobre. Como um resultado da condição, crescimento fetal é prejudicado. Seguindo a administração materna de AD-60771, no entanto, o peso unitário uteroplacentário (Figura 3A) e peso fetal (Figura 3B) foram aumentados, e houve normalização da razão de cérebro:fígado fetal (Figura 3C), todos indicativos de desenvolvimentos placentário e fetal mais normais.
[00668] Conforme determinado através de análise RT-qPCR de expressão de mRNA de hAGT em fígado e placenta maternos, foi mostrado que, embora haja silenciamento substancial de hAGT no fígado materno (Figura 4A), não houve nenhum silenciamento significante na placenta (Figura 4B). Isto indica uma falta de penetração do iRNA na placenta.
[00669] Ainda, análise de quatro amostras de fígado maternas, quatro amostras de placenta e oito amostras de fígado fetal demonstrou que a exposição do fígado fetal ao iRNA foi cerca de 1,2 ng de siRNA/g (abaixo do limite de detecção, 1,3 ng siRNA/g tecido) de tecido e que exposição do fígado materno ao iRNA foi cerca de 265 vezes maior do que a exposição da placenta ao iRNA (Figura 5). Esta exposição foi determinada por qPCR de haste-alça, como descrito anteriormente (vide, por exemplo, Landesman, Y. e outros (2010) Silence 1:16.
[00670] Desta maneira, tratamento materno com um iRNA de direcionamento a hAGT é superior a tratamento materno com inibidores de renina-angiotensina de molécula pequena, tais como inibidores de ACE, e bloqueadores de receptor de angiotensina, uma vez que esses compostos cruzam a placenta e são fetotóxicos.
[00671] Como a placenta age como o canal para nutrientes para o feto, e remoção de produtos de eliminação do feto, sua composição é crítica. Desta maneira, patologia placentária foi avaliada (isto é, através da medição da área de fatias de tecido imunoistoquimicamente tingidas com citoqueratina). A Figura 6 demonstra que embora a porção materna da placenta (o triângulo mesometrial; Figura 6D) e o trofospôngio (uma camada uniforme de células que são precursoras de trofoblastos diferenciados; Figura 6E) não tenham sido modificados pela administração de AD-60771, o tamanho geral da placenta foi aumentado (Figuras 6B, 6C e 6F e Figura 6A para referência). Em particular, o tamanho do labirinto, que é o sítio de troca nutricional entre sangue fetal e materno, foi aumentado pelo tratamento materno com AD-60771 (Figura 6G).
[00672] A tirosina cinase-1 tipo fms solúvel antiangiogênica (sFLT1) e o fator de crescimento placentário angiogênico (PLGF), que são regulados por angiotensinas, desempenham um papel-chave em pré- eclâmpsia, sendo liberados da placenta para a corrente sanguínea materna e causando disfunção endotelial. sFlt-1 é liberado em grande quantidade da placenta para a corrente sanguínea materna e causa a disfunção endotelial. PLGF é derivado placentário, e promove angiogênese. A razão de sFlt-1:PLGF é diagnóstico, com uma sFlt- 1:PLGF maior associada com doença mais severa.
[00673] Avaliação da expressão de mRNA e PLGF através de análise RT-qPCR demonstrou que os níveis de ambos sFLT1 e PLGF foram significantemente reduzidos em rim materno (Figuras 7a e 7B, respectivamente), mas permaneceram sem modificação na placenta (Figuras 7C e 7D, respectivamente) seguindo administração materna de AD-60771. No entanto, como sFlt-1 foi reduzido para um grau maior do que PLGF no rim materno, a razão de sFlt-1:PLGF no soro pode ser melhorada.
[00674] Autoanticorpos agonísticos para o receptor de angiotensina II tipo I (AT1) foram identificados em mulheres pré-eclâmpticas. Quando roedores grávidos são expostos a autoanticorpos AT1, uma síndrome do tipo pré-eclâmpsia se desenvolve. Como ativação de AT1 está associada com efeitos vasopressores bem como secreção de aldosterona e produção de sFlt-1, redução de autoanticorpos AT1 seria esperada reduzir o fenótipo pré-eclâmptico. Desta maneira, o nível de produção de autoanticorpos agonísticos para o receptor de AT1 (AT1- AA) pode ser também avaliado através de biocromatografia e bioensaio subsequente de anticorpos isolados. Os níveis de AT1-AA foram medidos como foi descrito (vide, por exemplo, Dechend e outros (2005) Hypertension 45:742-746) através da avaliação do impacto de anticorpos AT1-AA purificados, isolados, sobre a taxa de batida espontânea de cardiomiócitos de rato neonatal. A Figura 8 demonstra que há uma diminuição significante no nível de AT1-AA seguindo administração de AD-60771 a fêmeas de ratos PE grávidas.
Exemplo 3. Silenciamento de AGT In vivo em um Modelo de Rato Transgênico de Pré-eclâmpsia
[00675] O dúplex de AD-60771 foi testado quanto à sua habilidade em silenciar expressão de hAGT em fêmeas de ratos PE grávidas, descrito no exemplo anterior. Começando no dia 3 de gestação, um subconjunto de fêmeas de ratos PE grávidas foi administrado com 10 mg/kg de siRNA se direcionando a hAGT (AD-60771). Fígado e sangue foram coletados no dia gestacional 21 e os níveis de proteínas hAGT e rAGT e mRNA foram ensaiados e comparados com os níveis de proteína hAGT e rAGT e mRNA presentes em fêmeas de ratos PE transgênicas grávidas, não tratadas, fêmeas de rato Sprague-Dawley grávidas e fêmeas de ratos Sprague-Dawley não grávidas. Os resultados destes ensaios são mostrados nas Figuras 9A e 9B e demonstram que houve uma redução de 80% de AT2 em circulação e uma redução de 95% de hAT1 em circulação nas fêmeas de ratos PE grávidas com AD-60771 comparado com as fêmeas de ratos PE grávidas controle. Uma redução de cerca de 45% de AT2 de rato foi também observada nas fêmeas de ratos PE grávidas tratadas com AD- 60771 comparado com fêmeas de ratos PE grávidas controle. Um silenciamento de 95% de mRNA de AGT hepático foi observado em fêmeas de ratos PE grávidas tratadas com AD-60771 comparado com fêmeas de ratos PE grávidas controle. As Figuras 9A e 9B também demonstram que houve uma redução significante no nível no soro de AT1 e AT2 seguindo administração de AD-60771 a fêmeas de ratos PE grávidas.
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Exemplo 4: Silenciamento de AGT In vivo em um camundongo expressando hAGT
[00676] Uma série de experimentos foi realizada para avaliar inativação direcionada de hAGT em camundongos expressando AGT humano (hAGT) de um vetor de expressão de AAV8 que tem tropismo de fígado forte. Em suma, os camundongos foram infectados com 1 x 1011 partículas de AAV8 contendo um construto de expressão para hAGT sob o controle de um promotor constitutivo. Duas semanas após infecção, os camundongos foram administrados com uma dose única de 3,0 mg/kg, 1,0 mg/kg, 0,3 mg/kg ou 0,1 mg/kg de um siRNA de direcionamento a hAGT (AD-67327.2 ou AD-67335.2) ou PBS como um controle (n=4 por grupo). As sequências de nucleotideo dos agentes avaliados nestes experimentos são providas na Tabela 13.Tabela 13. Sequências de fita de Senso e Antissenso Modificadas de dsRNAs de AGT (21/23meros)
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[00677] Nos dias 0, 3, 7 e 14, após administração dos agentes, amostras de sangue foram coletadas e soro foi preparado para determinar o nível de expressão de mRNA de hAGT com relação ao nível antes da sangria de hAGT. Os resultados desses experimentos são mostrados na Tabela 14. Tabela 14. Avaliação de dose-resposta de dose única em camundongos expressando hAGT
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Exemplo 5: Silenciamento de AGT In vivo em um camundongo expressando hAGT
[00678] Uma série de experimentos foi realizada para avaliar inativação direcionada de hAGT em camundongos expressando hAGT de um vetor de expressão de AAV8 que tem tropismo de fígado forte. Em suma, os camundongos foram infectados com 1 x 1011 partículas de AAV8 contendo um construto de expressão para hAGT sob o controle de um promotor constitutivo. Duas semanas após infecção com o vírus de AAV8, os camundongos foram administrados com uma dose única de 1 mg/kg de um siRNA de direcionamento a hAGT ou PBS como um controle (n=3 por grupo). As sequências de nucleotideo dos dúplexes avaliados nestes experimentos são providas na Tabela 14.Tabela 15: Sequências de fita de Senso e Antissenso Modificadas de dsRNAs de AGT (21/23meros)
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[00679] Sete dias após administração dos agentes, amostras de sangue foram coletadas e soro foi preparado para determinar o nível de expressão de mRNA de hAGT com relação ao nível de pré-sangria de hAGT. Os resultados destes experimentos são providos na Tabela 16. Tabela 16. Avaliação de dose-resposta de dose única de hAGT em camundongos expressando hAGT
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EQUIVALENTES
[00680] Aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes para as modalidades e métodos específicos descritos aqui. Tais equivalentes pretendem ser compreendidos pelo escopo das reivindicações que seguem.

Claims (23)

1. Agente de ácido ribonucleico (RNAi) de fita dupla para inibição da expressão de angiotensinogênio (AGT) em uma célula, caracterizado pelo fato de que o dito agente de RNAi de fita dupla compreende uma fita senso e uma fita antissenso formando uma região de fita dupla, sendo que que a fita senso compreende pelo menos 17 nucleotídeos contíguos de 5'-UCAUCCACAAUGAGAGUAA-3 '(SEQ ID NO: 679 e a fita antissenso compreende pelo menos 17 nucleotídeos contíguos da sequência de nucleotídeos 5’- UUACUCUCAUUGUGGAUGA-3’ (SEQ ID NO:876), sendo que a fita senso apresenta 17-23 nucleotídeos de comprimento e a fita antissenso apresenta 17-25 nucleotídeos de comprimento, sendo que substancialmente todos os nucleotídeos da fita senso e substancialmente todos os nucleotídeos da fita antissenso são nucleotídeos modificados selecionado dentre o grupo que consiste em nucleotídeos modificados 2'-O-metila e nucleotídeos modificados 2'- fluoro, sendo que a fita senso compreende duas ligações internucleotídicas de fosforotioato no terminal 5', sendo que a fita antissenso compreende duas ligações internucleotídicas fosforotioato no terminal 5' e duas ligações internucleotídicas fosforotioato no terminal 3', e sendo que a fita senso é conjugada a um ou mais derivados de GalNAc ligados através de um ligante bivalente ou trivalente ramificado no terminal 3'.
2. Agente de RNAi de fita dupla, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que todos dos nucleotídeos do dita fita senso e todos dos nucleotídeos do dita fita antissenso são nucleotídeos modificados.
3. Agente de RNAi de fita dupla, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos um a fita compreende uma saliência 3’ de pelo menos 1 nucleotídeo.
4. Agente de RNAi de fita dupla, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que pelo menos um a fita compreende uma saliência 3’ de pelo menos 2 nucleotídeos.
5. Agente de RNAi de fita dupla, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a região de fita dupla é de 17-23 pares de nucleotídeo de comprimento.
6. Agente de RNAi de fita dupla, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a região de fita dupla é de 19-21 pares de nucleotídeo de comprimento.
7. Agente de RNAi de fita dupla, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a região de fita dupla é de 21-23 pares de nucleotídeo de comprimento.
8. Agente de RNAi de fita dupla, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que cada a fita é de 19-30 nucleotídeos de comprimento.
9. Agente de RNAi de fita dupla, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o ligante é:
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10. Agente de RNAi de fita dupla, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o agente de RNAi é conjugada ao ligante como mostrado no esquema que segue
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onde X é O ou S.
11. Agente de RNAi de fita dupla, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o par de base na posição 1 da extremidade 5’ da fita antissenso é um par de base AU.
12. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o agente de RNAi de fita dupla como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.
13. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o agente de RNAi de fita dupla está presente em uma solução não tamponada.
14. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a dita solução não tamponada é salina ou água.
15. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o dito agente de RNAi de fita dupla está presente em uma solução tampão.
16. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a dita solução tampão compreende acetato, citrato, prolamina, carbonato ou fosfato ou qualquer combinação dos mesmos.
17. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a dita solução tampão é solução salina tamponada com fosfato (PBS).
18. Uso de um agente como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de uma célula, composição ou vetor utilizado para inibir expressão de angiotensinogênio (AGT).
19. Uso de um agente de RNAi de fita dupla, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de uma composição farmacêutica, como definida em qualquer uma das reivindicações 12 a 17, para o tratamento de uma doença associada a angiotensinogenio em um indivíduo.
20. Uso, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é humano.
21. Uso, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que a doença associada ao angiotensinogênio é a hipertensão.
22. Uso, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a hipertensão é selecionada a partir do grupo que consiste em hipertensão limítrofe, hipertensão primária, hipertensão secundária, emergência hipertensiva, urgência hipertensiva, hipertensão sistólica ou diastólica isolada, hipertensão associada à gravidez, diabético hipertensão, hipertensão resistente, hipertensão refratária, hipertensão paroxística, hipertensão renovascular, hipertensão de Goldblatt, hipertensão ocular, glaucoma, hipertensão pulmonar, hipertensão portal, hipertensão venosa sistêmica, hipertensão sistólica, hipertensão lábil; doença cardíaca hipertensiva e nefropatia hipertensiva.
23. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22, caracterizado pelo fato de que o agente de RNAi de fita dupla é administrado ao indivíduo por via subcutânea.
BR112016026950-0A 2014-05-22 2015-05-22 Agente de ácido ribonucleico (rnai) de fita dupla, seus usos e composição farmacêutica BR112016026950B1 (pt)

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