WO2024141031A1 - 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途 - Google Patents
一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途Info
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Abstract
提供了一种能够抑制靶向血管紧张素原AGT基因表达的siRNA，包含分别包含核苷酸序列I和核苷酸序列II的正义链和反义链，核苷酸序列I和核苷酸序列II分别由19个修饰或未修饰的核苷酸组成，核苷酸序列I和核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，核苷酸序列II至少部分地与AGT基因表达的mRNA中的一段核苷酸序列反向互补；按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列II的第3-6个核苷酸中的至少1个为稳定化修饰核苷酸。该siRNA以及包含该siRNA的药物组合物和siRNA缀合物可以有效治疗与AGT基因表达相关的疾病或病症，例如高血压。
Description
本公开涉及一种能够抑制血管紧张素原(AGT)基因表达的核酸和含有该核酸的组合物与缀合物。本公开还涉及这些核酸、组合物与缀合物的制备方法和用途。
血管紧张素原(AGT)也被称为SERPINA8或ANHU，是serpin家族的成员并且是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的组分。RAAS在血压调节中起着关键作用。AGT主要在肝脏中产生，并释放到血液循环中，血浆中的肾素将AGT转化成血管紧张素I，随后通过血管紧张素转化酶(ACE)将血管紧张素I转化成血管紧张素II。血管紧张素II对RAAS的大部分作用是通过其与血管紧张素II的1型受体(AT1R)的结合来发挥的。血管紧张素II是引起血管收缩的肽激素，其进而可以增加血压。血管紧张素II也刺激肾上腺皮质的激素醛固酮的分泌。醛固酮使肾脏增加钠和水的重吸收，导致体内流体体积的增加，进而增加血压。过度血管紧张素II产生和/或AT1R刺激的RAAS失调引起高血压，而高的血压进一步增加了心脏的负担。
高血压是各种疾病、病症和病状的主要危险因素，所述疾病、病症和病状诸如预期寿命缩短、慢性肾病、中风、心肌梗塞、心力衰竭、血管动脉瘤(例如主动脉瘤)、外周动脉疾病、心脏损伤(例如，心脏扩大或肥大)和其他心血管相关疾病、病症和/或病状。此外，已经表明高血压是心血管发病率和死亡率的重要风险因素，占据或构成全部中风病例的62％和所有心脏病病例的49％。
尽管目前抗高血压药物、去肾交感神经术、压力感受器激活疗法、饮食改变和生活方式改变可降低高血压的发生率并减少与高血压相关的疾病、病症和/或病状。然而，超过三分之二的受试者用一种抗压药不能得到控制，因此需要两种或更多种选自不同药物类别的抗压药。由于对依从性的需要和副作用随着用药增加而增加，这进一步降低了血压得到良好控制的受试者的数量。另外，某些抗高血压药物(诸如ACE抑制剂)在患有肾病的高血压患者中是禁忌的，因为它们有可能危及患者的肾功能。
因此，本领域需要替代疗法和/或组合疗法来抑制RAAS途径并治疗高血压。小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)可基于RNA干扰(RNA interference，RNAi)这一机制，以序列特异性的方式抑制或阻断任何感兴趣的目的基因的表达，从而达到治疗疾病的目的。若能从mRNA层面，抑制AGT的生成，降低血压，无疑是治疗高血压理想的治疗手段。
发明内容
为了开发一种能够抑制AGT基因的siRNA，发明人发现，在序列中引入具有稳定化修饰核苷酸的siRNA显示出比对应位置不具有稳定化修饰核苷酸的siRNA显著更高的AGT基因抑制活性和/或更低的脱靶效应。
在一方面，本公开提供了一种siRNA，所述siRNA包含正义链和反义链，所述正义
链包含核苷酸序列I，所述反义链包含核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II均由19个核苷酸组成，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II中的每一个核苷酸均为修饰或未修饰的核苷酸，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，所述核苷酸序列II与第一段核苷酸序列反向互补，所述第一段核苷酸序列为AGT基因表达的mRNA中的一段长度为19个核苷酸的核苷酸序列，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3-6个核苷酸中的至少1个为稳定化修饰核苷酸，所述稳定化修饰核苷酸指核苷酸的核糖2'位羟基被稳定化修饰基团取代的核苷酸，与相应位置的核苷酸为未修饰的核苷酸的siRNA相比，包含所述稳定化修饰核苷酸的siRNA的热稳定性增加，并且所述稳定化修饰基团的空间位阻大于2'-O-甲基。
在另一方面，本公开还提供了一种siRNA，所述siRNA包含正义链和反义链，所述正义链包含核苷酸序列I，所述反义链包含核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II均由19个核苷酸组成，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II中的每一个核苷酸独立地为修饰或未修饰的核苷酸，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，所述核苷酸序列II至少部分地与第一段核苷酸序列反向互补，所述第一段核苷酸序列为AGT基因表达的mRNA中的一段长度为19个核苷酸的核苷酸序列，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3-6个核苷酸中的至少1个为2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸。
在又一方面，本公开还提供了一种药物组合物，该药物组合物含有本公开提供的siRNA以及药学上可接受的载体。
在又一方面，本公开还提供了一种siRNA缀合物，所述siRNA缀合物含有本公开提供的siRNA以及缀合连接至该siRNA的缀合基团，所述缀合基团包含接头和药学上可接受的靶向基团，并且，所述siRNA、所述接头和所述靶向基团依次共价或非共价连接，每个所述靶向基团选自能够和细胞表面受体结合的配体。
在又一方面，本公开还提供了本公开的siRNA、本公开的药物组合物和本公开的siRNA缀合物中的一种或多种在制备用于治疗与AGT基因表达的mRNA水平相关的疾病或者症状的药物中的用途。
在又一方面，本公开还提供了一种治疗与AGT基因表达的mRNA水平相关的疾病或症状的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予有效量的本公开的siRNA、本公开的药物组合物和本公开的siRNA缀合物中的一种或多种。
在又一方面，本公开还提供了一种抑制细胞中AGT基因表达水平的方法，所述方法包括将有效量的本公开的siRNA、本公开的药物组合物和本公开的siRNA缀合物中的一种或多种与所述细胞接触。
在又一方面，本公开还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含本公开的siRNA、本公开的药物组合物和本公开的siRNA缀合物中的一种或多种。
以引用的方式并入
本说明书中提及的所有出版物、专利以及专利申请均以引用的方式并入本文，其程度与每一单独的出版物、专利或专利申请均专门并且单独地以引用的方式并入本文的程度相同。
本公开的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物具有低的脱靶效应、较高的AGT mRNA抑制活性，和/或能够有效治疗与AGT基因表达的mRNA水平相关的疾病或症状。
例如，本公开提供的siRNA缀合物在体外psi-CHECK系统中对脱靶序列的抑制活性，与其序列相同、但不包含稳定化修饰核苷酸的参比缀合物相比，本公开的siRNA缀合物对脱靶目标序列显示出更低的抑制活性，甚至在测试浓度范围内对脱靶目标序列的抑制率始终不高于50％，即本公开的siRNA缀合物具有显著降低的脱靶效应。
又例如，本公开提供的siRNA缀合物在psi-CHECK系统中有很高的目标序列抑制活性，与其序列相同、但不包含稳定化修饰核苷酸的参比缀合物相比，本公开的siRNA缀合物的IC50均下降约50％，即与参比缀合物相比，本公开的缀合物活性提高约1倍，本公开的siRNA缀合物在具有低脱靶效应的同时，还具有显著提高的对目标序列的抑制活性，因此显示出低的毒性和优异的成药前景。
又例如，在体外3nM甚至0.3nM低浓度下，本公开的siRNA缀合物的AGT mRNA抑制率均达到64.0％以上，甚至达到81.0％，且与不含有稳定化修饰核苷酸的参比缀合物相比活性相当甚至提高，显示出良好的抑制AGT mRNA表达的效果。
又例如，本公开提供的siRNA缀合物，在C57BL/6小鼠体内实验中显示出优异的肝细胞中AGT mRNA的抑制率，甚至高达88.36％或者90.42％，显示出优异的抑制活性；SEAP模型小鼠体内实验中，在给予本公开的缀合物后的12天中均表现出优异的AGT mRNA的抑制率，甚至在第8天抑制率达到94.42％，并直至第12天依然表现出很高的AGT mRNA的抑制率，
综上所述，本公开提供的siRNA、药物组合物以及siRNA缀合物能够有效抑制AGT基因的表达，能够有效治疗由AGT基因表达的mRNA水平相关的疾病症状，且表现出低的脱靶效应，具有良好的应用前景。
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是显示了转染50nM浓度的本公开的siRNA缀合物和参比siRNA缀合物后，体外Huh-7人肝癌细胞中的AGT mRNA相对表达水平的柱状图。
图2是显示了转染了3nM和0.3nM浓度的本公开的siRNA缀合物后，体外Huh-7人肝癌细胞中的AGT mRNA相对表达水平的柱状图。
图3是显示了在给予了3mg/kg的本公开的siRNA缀合物后，小鼠体内的AGT mRNA相对表达水平的柱状图。
图4是显示了在给予了3mg/kg的本公开的siRNA缀合物后，SEAP模型小鼠体内的SEAP浓度的随时间变化的折线图。
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
在本公开中，如无其他说明，“靶mRNA”是指AGT mRNA或“AGT基因表达的mRNA”，具体指具有如Genbank注册号NM_001384479.1所示序列的mRNA，“靶基因”即AGT基因是指转录上述AGT mRNA的基因。
定义
在上文及下文中，如无特别说明，大写字母C、G、U、A、T表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸酯亚基连接；P1表示该P1右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸，在一些实施方式中，P1是表示具体修饰的VP、Ps或P，其中，字母组合VP表示该字母组合VP右侧相邻的一个核苷酸为乙烯基磷酸酯(5'-(E)-vinylphosphonate，E-VP)修饰的核苷酸，字母组合Ps表示该字母组合Ps右侧相邻的一个核苷酸为硫代磷酸酯修饰的核苷酸，大写字母P表示该字母P右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸。
在上文及下文中，所述“氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代形成的核苷酸，“非氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物。“核苷酸类似物”指能够在核酸中代替核苷酸，但结构不同于腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的基团。如异核苷酸、桥联的核苷酸(bridged nucleic acid，简称BNA)或无环核苷酸。所述“甲氧基修饰的核苷酸”指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
在本文的上下文中，表述“互补”或“反向互补”可互相替代使用，并具有本领域技术人员周知的含义，即，在双链核酸分子中，一条链的碱基各自与另一条链上的碱基以互补的方式相配对。在DNA中，嘌呤碱基腺嘌呤(A)始终与嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)(或者在RNA中为尿嘧啶(U))相配对；嘌呤碱基鸟嘌呤(C)始终与嘧啶碱基胞嘧啶(G)相配对。每个碱基对都包括一个嘌呤和一个嘧啶。当一条链上的腺嘌呤始终与另一条链上的胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配对，以及鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对时，两条链被认为是彼此相互补的，以及从其互补链的序列中可以推断出该链的序列。与此相应地，“错配”在本领域中意指在双链核酸中，对应位置上的碱基并未以互补的形式配对存在。
在上文及下文中，如无特别说明，“基本上反向互补”是指所涉及的两段核苷酸序列之间存在不多于3个的碱基错配；“实质上反向互补”是指两段核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；“完全反向互补”是指两段核苷酸序列之间不存在碱基错配。
在上文及下文中，特别是在描述本公开的siRNA、药物组合物或siRNA缀合物的制备方法时，除非特别说明，所述核苷单体(nucleoside monomer)是指，根据欲制备的siRNA或siRNA缀合物中核苷酸的种类和顺序，亚磷酰胺固相合成中使用的修饰或未修饰的核苷亚磷酰胺单体(unmodified or modified RNA phosphoramidites，有时RNA phosphoramidites也称为Nucleoside phosphoramidites)。亚磷酰胺固相合成为本领域技术人员所公知的RNA合成中所用的方法。本公开所用的核苷单体均可商购得到。
在上文或下文中，“经取代的”或“被取代的”基团，如经取代的烷基、经取代的烷氧基、经取代的氨基、经取代的脂族基团、经取代的杂脂族基团、经取代的酰基、经取代的芳基或经取代的杂芳基。其中，如无其他说明，“经取代的”或“被取代的”基团是指该基团中的氢原子被一个或多个取代基所替代而形成的基团。例如，“经取代的烷氧基”是指烷氧基中的一个或多个氢原子被取代基所替代而形成的基团。本领域技术人员能够理解，可用于本公开应用的化合物中可以包含各种取代基，只要是该取代基的引入不会影响本公开的功能，能够实现本公开的目的，就可用于本公开。在一些实施方式中，所述取代基选自于由以下基团所组成的组：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、-CN、-NO2、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)。在一些实施方式中，所述取代基是C1-C3烷基、C6-C8芳基、-OC1-C3烷基、-OC1-C3烷基苯基、卤素、-OH、-NH2、-CN或-NO2中的一种。本领域技术人员将理解的是，对于包含一个或多个取代基的任何基团，这些基团不打算引入空间上不切实际、合成上不可行和/或本身不稳定的任何取代或取代模式。
如本文所使用的，“烷基”是指具有指定数量的碳原子的直链和支链，所述数量通常为1至20个碳原子，例如1至10个碳原子，如1至8个或1至6个碳原子。例如，C1-C6烷基包含1至6个碳原子的直链和支链烷基。当提及具有特定数量的碳的烷基残基时，旨在涵盖具有该数量的碳的所有支链和直链形式；因此，例如，“丁基”意味着包括正丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基；“丙基”包括正丙基和异丙基。亚烷基是烷基的子集，指与烷基相同、但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的不饱和支链或直链烷基，所述碳-碳双键是通过从母体烷基的相邻碳原子中除去一分子氢而获得的。该基团可以处于双键的顺式或反式构型。典型的烯基基团包括但不限于：乙烯基；丙烯基，如丙-1-烯-1-基、丙-
1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基(烯丙基)、丙-2-烯-2-基；丁烯基，例如丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1,3-二烯-1-基、丁-1,3-二烯-2-基等等。在某些实施方式中，烯基基团具有2到20个碳原子，而在其他实施方式中，具有2至10个、2至8个或2至6个碳原子。亚烯基是烯基的一个子集，指与烯基相同、但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“炔基”是指具有至少一个碳-碳三键的不饱和支链或直链烷基，所述碳-碳三键是通过从母体烷基的相邻碳原子中除去两分子氢而获得的。典型的炔基基团包括但不限于：乙炔基；丙炔基，如丙-1-炔-1-基，丙-2-炔-1-基；丁炔基，例如丁-1-炔-1-基，丁-1-炔-3-基，丁-3-炔-1-基等。在某些实施方式中，炔基具有2到20个碳原子，而在其他实施方式中，具有2至10、2至8或2至6个碳原子。亚炔基是炔基的一个子集，指的是与炔基相同、但有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“烷氧基”是指通过氧桥连接的指定数量碳原子的烷基，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、2-戊氧基、异戊氧基、新戊氧基、己氧基、2-己氧基、3-己氧基、3-甲基戊氧基等。烷氧基通常具有1至10个、1至8个、1至6个，或1至4个通过氧桥连接的碳原子。
如本文所使用的，“芳基”是指通过从环碳原子中除去氢原子而衍生自芳香族单环或多环烃环系统形成的基团。所述芳香族单环或多环烃环系统仅含有氢和6至18个碳原子的碳，其中所述环系统中的至少一个环是完全不饱和的，即，包含根据Hückel理论的环状、离域的(4n+2)π-电子体系。芳基包括但不限于苯基、芴基和萘基等基团。亚芳基是芳基的子集，指与芳基相同、但具有两个连接点的残基。
“杂芳基”指由3-至18-元芳香环自由基衍生而成的基团，包含2个至17个碳原子和选自氮、氧和硫的1至6个杂原子。如本文所使用的，杂芳基可以是单环、双环、三环或四环系统，其中环系统中的至少一个环是完全不饱和的，即，包含根据Hückel理论的环状离域(4n+2)π-电子体系。杂芳基包括稠环或桥环系统。在一些实施方式中，杂芳基中的杂原子是氧化的杂原子。在一些实施方式中，杂芳基中包含一个或多个氮原子。在一些实施方式中，杂芳基中的氮原子中的一个或多个是季铵化的氮原子。杂芳基通过任何环原子附着至分子的其余部分。杂芳基的实例包括但不限于：氮杂环庚三烯基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并吲哚基、1,3-苯并二噁唑基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并[d]噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1,4]二噁庚英基(benzo[b][1,4]dioxepinyl)、苯并[b][1,4]噁嗪基(benzo[b][1,4]oxazinyl)、1,4-苯并二噁烷基(1,4-benzodioxanyl)、苯并萘并呋喃基、苯并噁唑基、苯并间二氧杂环戊烯基(benzodioxolyl)、苯并二噁英基(benzodioxinyl)、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基、苯并噻吩并[3,2-d]嘧啶基、苯并三唑基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、咔唑基、噌啉基(cinnolinyl)、环戊烷并[d]嘧啶基、6,7-二氢-5H-环戊烷并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6-二氢苯并[h]喹唑啉基(5,6-dihydrobenzo[h]quinazolinyl)、5,6-二氢苯并[h]噌啉基(5,6dihydrobenzo[h]cinnolinyl)、6,7-
二氢-5H-苯并[6,7]环庚烷并[1,2-c]哒嗪基、二苯并呋喃基、二苯并噻吩基、呋喃基、呋喃酮基、呋喃并[3,2-c]吡啶基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]嘧啶基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]哒嗪基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]吡啶基、异噻唑基、咪唑基、吲唑基(indazolyl)、吲哚基、异吲哚基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、异喹啉基、吲哚嗪基(indolizinyl)、异噁唑基、5,8-甲醇-5,6,7,8-四氢喹唑啉基(5,8-methano-5,6,7,8-tetrahydroquinazolinyl)、萘啶基(naphthyridinyl)、1,6-萘啶酮基(1,6-naphthyridinonyl)、噁二唑基、2-氧杂吖庚因基(2-oxoazepinyl)、噁唑基、氧杂环丙烷基(oxiranyl)、5,6,6a,7,8,9,10,10a-八氢苯并[H]喹唑啉基、1-苯基-1H-吡咯基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、酞嗪基(phthalazinyl)、蝶啶基(pteridinyl)、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡唑并[3,4-d]嘧啶基、吡啶基、吡啶并[3,2-d]嘧啶基、吡啶并[3,4-d]嘧啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吡咯基、喹唑啉基、喹喔啉基(quinoxalinyl)、喹啉基、四氢喹啉基、5,6,7,8-四氢喹唑啉基、5,6,7,8-四氢苯并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、6,7,8,9-四氢-5H-环庚烷并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6,7,8-四氢吡啶并[4,5-c]哒嗪基、噻唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、三嗪基、噻吩并[2,3-d]嘧啶基、噻吩并[3,2-d]嘧啶基、噻吩并[2,3-c]吡啶基(thieno[2,3-c]pridinyl)和噻吩基(thiophenyl/thienyl)。
如本文所使用的，“卤素取代基”或“卤代”指氟代、氯代、溴代和碘代，术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
如本文所使用的，“卤代烷基”是指指定数量的氢原子被一个或多个、直至最大允许数量的卤素原子取代的如上述所定义的烷基。卤代烷基的实例包括但不限于三氟甲基、二氟甲基、2-氟乙基和五氟乙基。
在本公开中可以使用各种羟基保护基团。一般来说，保护基团使化学官能团对特定的反应条件不敏感，并且可以在分子中的该官能团上添加以及去除，而不实质上损害分子的其余部分。代表性的羟基保护基团公开于Beaucage等人，Tetrahedron 1992,48,2223-2311，以及Greeneand Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，Chapter 2,2d ed，John Wiley&Sons，New York，1991中，以引用的方式将上述文献各自整体并入本文。在一些实施方式中，保护基团在碱性条件下稳定，但可以在酸性条件下脱除。在一些实施方式中，本文可使用的羟基保护基的非排他性实例包括二甲氧基三苯甲基(DMT)、单甲氧基三苯甲基、9-苯基氧杂蒽-9-基(Pixyl)和9-(对甲氧基苯基)氧杂蒽-9-基(Mox)。在一些实施方式中，本文可使用的羟基保护基的非排他性实例包括Tr(三苯甲基)、MMTr(4-甲氧基三苯甲基)、DMTr(4,4'-二甲氧基三苯甲基)和TMTr(4,4',4”-三甲氧基三苯甲基)。
“受试者”一词，如本文所使用的，指任何动物，例如哺乳动物或有袋动物。本公开的受试者包括但不限于人类、非人灵长类(例如，恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、猪、马、驴、牛、兔、绵羊、大鼠和任何种类的家禽。
如本文所使用的，“治疗”指的是获得有益的或期望的结果的方法，包括但不限于治疗益处。“治疗益处”意味着根除或改善被治疗的潜在障碍。此外，治疗益处通过根除或改善与潜在障碍相关的一个或多个生理症状，从而在受试者中观察到改善而获得，尽管受试者
可能仍然受到潜在障碍的折磨。
本公开所述siRNA或siRNA缀合物中，每个相邻核苷酸之间由磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键连接，磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键中的非桥接氧原子或硫原子带有负电荷，它可以以羟基或巯基的形式存在，羟基或巯基中的氢离子也可以部分或全部被阳离子取代。所述阳离子可以是任意的阳离子，如金属阳离子，铵离子NH4
+，有机铵阳离子中的一种，处于提高溶解性考虑，在一些实施方式中，所述阳离子选自碱金属离子、三级胺形成的铵阳离子和季铵阳离子中的一种或多种。碱金属阳离子可以是K+和/或Na+，三级胺形成的阳离子可以是三乙胺形成的铵离子和/或N,N-二异丙基乙胺形成的铵离子。因此，本公开所述siRNA或siRNA缀合物可以至少部分以盐的形式存在。在一些实施方式中，磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键中的非桥接氧原子或硫原子至少部分与钠离子结合，本公开所述siRNA或siRNA缀合物以钠盐或部分钠盐的形式存在。因此，在提及本公开所述的siRNA或siRNA缀合物，包括但不限于本公开所述的任何结构式表示的siRNA缀合物时，均旨在涵盖该siRNA或siRNA缀合物的钠盐或部分钠盐形式。
本公开的siRNA
在一方面，本公开提供了一种具有较高的AGT基因抑制活性的siRNA。
本公开的siRNA含有核苷酸基团作为基本结构单元，本领域技术人员公知，所述核苷酸基团含有磷酸基团、核糖基团和碱基，在此不再赘述。
本公开的siRNA包含正义链和反义链，所述正义链包含核苷酸序列I，所述反义链包含核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II均由19个核苷酸组成，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II中的每一个核苷酸均为修饰或未修饰的核苷酸，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区,所述核苷酸序列II至少部分地与第一段核苷酸序列反向互补，所述第一段核苷酸序列为AGT mRNA中的一段长度为19个核苷酸的核苷酸序列，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3-6个核苷酸中的至少1个为稳定化修饰核苷酸，所述稳定化修饰核苷酸指核苷酸的核糖2'位羟基被稳定化修饰基团取代的核苷酸，与相应位置的核苷酸为未修饰的核苷酸的siRNA相比，包含所述稳定化修饰的核苷酸siRNA的热稳定性增加，并且所述稳定化修饰基团的空间位阻大于2'-O-甲基。
在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第3个或第5个核苷酸为所述稳定化修饰核苷酸。在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第3-9个核苷酸中不超过2个核苷酸为所述稳定化修饰核苷酸。通过对特定位置处稳定化修饰核苷酸的个数进行限定，本公开的siRNA可获得最佳的药学活性与低的脱靶效应的平衡，同时还具有优异的稳定性。在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第3个和/或第5个核苷酸为所述稳定化修饰核苷酸。在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第3个核苷酸为所述稳定化修饰核苷酸。在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的
第5个核苷酸为所述稳定化修饰核苷酸。
在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中第3-9个核苷酸之外的核苷酸均不是稳定化修饰核苷酸。若核苷酸序列II中在第3-6个核苷酸中的至少1个为稳定化修饰的核苷酸的同时，在第3-9个核苷酸之外包含稳定化修饰核苷酸，可能会显著影响该siRNA的目标序列表达水平的调节能力。
在一些实施方式中，本公开的上下文中“siRNA的热稳定性增加”是指所述siRNA的热解离温度(Tm)升高。在一些实施方式中，“双链siRNA的热稳定性增加”是指siRNA的Tm升高至少0.05℃，在一些实施方式中指升高0.1-6℃，在一些实施方式中指Tm升高0.5-4℃。双链寡核苷酸的热解离温度(melting temperature，Tm)的测量方法是本领域技术人员公知的。在一些实施方式中，Tm值被定义为双链寡核苷酸热变性时吸光度达到最大值的一半时对应的温度值。通过在特定位置包含稳定化修饰核苷酸，本公开的siRNA出人意料地显示出与不包含稳定化修饰核苷酸的siRNA相比更低的脱靶效应。在一些实施方式中，本公开的siRNA还意外地表现出更高的AGT mRNA抑制活性。
在一些实施方式中，每个所述稳定化修饰基团独立地具有-X-R所示的结构，其中，X为O、NR'、S或SiR'2；R是C2-C6烷基、取代的C2-C6烷基、C6-C8芳基、取代的C6-C8芳基中的一种，每个R'独立地是H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C6-C8芳基、取代的C6-C8芳基中的一种，所述取代的C2-C6烷基、取代的C6-C8芳基或取代的C1-C6烷基指C2-C6烷基、C6-C8芳基或C1-C6烷基中的一个或多个氢原子被取代基团取代而形成的基团，所述取代基团选自以下取代基中的一种或多种：C1-C3烷基、C6-C8芳基、C1-C3烷氧基、卤素、氧亚基和硫亚基。注意的是，本公开并非旨在涵盖全部符合上述结构的修饰基团，而仅涉及哪些能够实现siRNA热稳定性增加的稳定化修饰基团，在一些实施方式中，每个所述稳定化修饰基团独立地选自2'-O-甲氧基乙基、2'-O-烯丙基、2'-烯丙基、2'-O-2-N-甲基氨基-2-氧亚基乙基、2'-O-2-N,N-二甲基氨基乙基、2'-O-3-氨基丙基和2'-O-2,4-二硝基苯基中的一种。在一些实施方式中，每个所述稳定化修饰基团均为2'-O-甲氧基乙基。
在另一方面，本公开还提供了一种siRNA，所述siRNA包含正义链和反义链，所述正义链包含核苷酸序列I，所述反义链包含核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II均由19个核苷酸组成，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II中的每一个核苷酸独立地为修饰或未修饰的核苷酸，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，所述核苷酸序列II至少部分地与第一段核苷酸序列反向互补，所述第一段核苷酸序列为AGT mRNA中的一段长度为19个核苷酸的核苷酸序列，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3-6个核苷酸中的至少1个为2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，本公开的siRNA中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第3个或第5个核苷酸为2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸。在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中第3-9个核苷酸中不超过2个核苷酸为2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸。在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷
酸序列II的第2、6、14、16个核苷酸，如果不是2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸的话，为2'-氟代修饰的核苷酸。在一些实施方式中，所述核苷酸序列II中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16个核苷酸，如果不是2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸的话，为2'-氟代修饰的核苷酸，所述核苷酸序列II中的其它核苷酸各自独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种。
在一些实施方式中，所述正义链和反义链长度相同或不同，所述正义链的长度为19-23个核苷酸，所述反义链的长度为19-26个核苷酸，这样，本公开提供的siRNA正义链和反义链的长度比可以是19/19、19/20、19/21、19/22、19/23、19/24、19/25、19/26、20/20、20/21、20/22、20/23、20/24、20/25、20/26、21/20、21/21、21/22、21/23、21/24、21/25、21/26、22/20、22/21、22/22、22/23、22/24、22/25、22/26、23/20、23/21、23/22、23/23、23/24、23/25或23/26。在一些实施方式中，所述siRNA正义链和反义链的长度比为19/21、21/23或23/25。
在一些实施方式中，本公开的具有稳定化修饰核苷酸的siRNA可以是以下第一种至第八种的siRNA，在下文中分别对每一种siRNA进行说明。
第一种siRNA
在一些实施方式中，本公开的siRNA是第一种siRNA。其中，
所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5'-CUGAGAAGAUUGACAGGUZa1-3'(SEQ ID NO:1)；
5'-Za2ACCUGUCAAUCUUCUCAG-3'(SEQ ID NO:2),
其中，所述Za1为U,Za2为A，
并且，所述核苷酸序列I中包含位置对应于Za1的核苷酸Za3，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Za2的核苷酸Za4，所述Za4是所述反义链5'末端的第一个核苷酸。在一些实施方式中，所述第一段核苷酸序列是如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。在本公开的上文与下文中，“位置对应”是指从核苷酸序列相同端起算，处于核苷酸序列中相同的位置，例如，核苷酸序列I的3'端第一个核苷酸是位置对应于SEQ ID NO:1的3'端第1个核苷酸的核苷酸。
在一些实施方式中，所述正义链仅包含核苷酸序列I，所述反义链仅包含核苷酸序列II。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列之间的差异包括Za4位置处的差异，且Za4选自U、G或C。在一些实施方式中，所述Za3是与Za4
互补的核苷酸。在一些实施方式中，本公开siRNA的核苷酸序列中的每个U或者T可任意地相互替换。这些核苷酸差异并不会显著降低siRNA的靶基因抑制能力或者提高siRNA的脱靶效应。而这些包含核苷酸差异的siRNA也在本公开的保护范围之内。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补。在本公开的上文与下文中，所述基本上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于3个碱基的错配；所述实质上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个碱基的错配；所述完全反向互补是指两个核苷酸序列之间没有错配。
在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3-19位的核苷酸与所述第一段核苷酸序列第1-17位的核苷酸完全反向互补。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列II与所述核苷酸序列I完全反向互补，或者按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2个核苷酸与按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2个核苷酸之间存在碱基错配。通过包含该碱基错配，本公开的siRNA对目标基因表达的抑制活性得以进一步提升。在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2个核苷酸为A；按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2个核苷酸选自A、G或C。
在一些实施方式中，所述正义链还含有核苷酸序列III，所述反义链还含有核苷酸序列IV。
在本公开的siRNA中，例如以下第一种siRNA至第八种siRNA中，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV中的每个核苷酸各自独立地为非氟代修饰的核苷酸的一种并且不是所述稳定化修饰核苷酸，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的长度各自为1-4个核苷酸，所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III长度相等，并且所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III实质上反向互补或完全反向互补，所述核苷酸序列III连接在所述核苷酸序列I的5'末端，所述核苷酸序列IV连接在所述核苷酸序列II的3'末端。并且，所述核苷酸序列IV与第二段核苷酸序列实质上反向互补或完全反向互补，该第二段核苷酸序列是指和AGT mRNA中与前述第一段核苷酸序列的5'末端相邻、且长度与所述核苷酸序列IV相同的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列III和IV的长度均为1个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基为G，核苷酸序列IV的碱基为C，所述第二段核苷酸序列的碱基为G；此时，正义链和反义链的长度比为20/20；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为UG，所述核苷酸序列IV的碱基组成为CA，所述第二段核苷酸序列的碱基组成为UG；此时，正义链和反义链的长度比为21/21；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为CUG，所述核苷酸序列IV的碱基组成为CAG，所述第二段核苷酸序列的碱基组成为CUG；此时，正义链和反义链的长度比为22/22；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为GCUG，所述核苷酸序列IV的碱基组成为CAGC，所述第二段核苷酸序列的碱基组成为GCUG；此时，正义链和反义链的长度比为23/23。
在一些实施方式中，核苷酸序列III和核苷酸序列IV完全反向互补，因此，给出了核苷酸序列III的碱基组成，核苷酸碱基IV的碱基组成也就确定了。
第二种siRNA
在一些实施方式中，本公开的siRNA是第二种siRNA，其中所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5'-UCAACUGGAUGAAGAAACZb1-3'(SEQ ID NO:27)；
5'-Zb2GUUUCUUCAUCCAGUUGA-3'(SEQ ID NO:28),
其中Zb1为U,Zb2为A，所述核苷酸序列I中包含位置对应于Zb1的核苷酸Zb3，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Zb2的核苷酸Zb4，所述Zb4是所述反义链5'末端的第一个核苷酸。
在一些实施方式中，所述第一段核苷酸序列是如SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述正义链仅包含核苷酸序列I，所述反义链仅包含核苷酸序列II。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列之间的差异包括Zb4位置处的差异，且Zb4选自U、G或C。在一些实施方式中，所述核苷酸差异为Zb4位置处的差异，且Zb4选自U、G或C。在一些实施方式中，Zb3是与Zb4互补的核苷酸。在一些实施方式中，本公开siRNA的核苷酸序列中的每个U或者T可任意地相互替换。这些核苷酸差异并不会显著降低siRNA的靶基因抑制能力或者提高siRNA的脱靶效应。而这些包含核苷酸差异的siRNA也在本公开的保护范围之内。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补。
在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3-19位的核苷酸与所述第一段核苷酸序列第1-17位的核苷酸完全反向互补。在一些实施方式中，所述核苷酸序列II与所述核苷酸序列I完全反向互补，或者按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2个核苷酸与按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2个核苷酸之间存在碱基错配。通过包含该碱基错配，本公开的siRNA对目标基因表达的抑制活性得以进一步提升。在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2个核苷酸为G；按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2个核苷酸选自G、A或U。
在一些实施方式中，所述正义链还含有核苷酸序列III,所述反义链还含有核苷酸序列IV。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的长度均为1个核苷酸，
所述核苷酸序列III的碱基为C，所述核苷酸序列IV的碱基为G，所述第二段核苷酸序列的碱基为C；此时，正义链和反义链的长度比为20/20；或者，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的长度均为2个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为CC，所述核苷酸序列IV的碱基组成为GG，所述第二段核苷酸序列的碱基组成为CC；此时，正义链和反义链的长度比为21/21；或者，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的长度均为3个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为CCC，所述核苷酸序列IV的碱基组成为GGG，所述第二段核苷酸序列的碱基组成为CCC，此时，正义链和反义链的长度比为22/22；或者，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的长度均为4个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为UCCC，所述核苷酸序列IV的碱基组成为GGGA，所述第二段核苷酸序列的碱基组成为UCCC；此时，正义链和反义链的长度比为23/23。
在一些实施方式中，核苷酸序列III和核苷酸序列IV完全反向互补，因此，给出了核苷酸序列III的碱基组成，核苷酸序列IV的碱基组成也就确定了。
第三种siRNA
在一些实施方式中，本公开的siRNA是第三种siRNA。其中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:53所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:54所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5'-AGGCAAGAACCAGUGUUUZc1-3'(SEQ ID NO:53)；
5'-Zc2AAACACUGGUUCUUGCCU-3'(SEQ ID NO:54),
其中Zc1为A,Zc2为U，所述核苷酸序列I中包含位置对应于Zc1的核苷酸Zc3，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Zc2的核苷酸Zc4，所述Zc4是所述反义链5'末端的第一个核苷酸。
在一些实施方式中，所述第一段核苷酸序列是如SEQ ID NO:53所示的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述正义链仅包含核苷酸序列I，所述反义链仅包含核苷酸序列II。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:53所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:54所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:54所示的核苷酸序列之间的差异包括Zc4位置处的差异，且Zc4选自A、G或C。在一些实施方式中，所述Zc3是与Zc4互补的核苷酸。在一些实施方式中，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:54所示的核苷酸序列之间的差异为Zc4位置处的差异，且Zc4选自A、G或C。在一些实施方式中，本公开siRNA的核苷酸序列中的每个U或者T可任意地相互替换。这些核苷酸差异并不会显著降低siRNA的靶基因抑制能力或者提高siRNA的脱靶效应。而这些包含核苷酸差异的siRNA也在本公开的保护范围之内。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互补、实质
上反向互补或完全反向互补。
在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3-19位的核苷酸与所述第一段核苷酸序列第1-17位的核苷酸完全反向互补。在一些实施方式中，所述核苷酸序列II与所述核苷酸序列I完全反向互补，或者按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2个核苷酸与按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2个核苷酸之间存在碱基错配。通过包含该碱基错配，本公开的siRNA对目标基因表达的抑制活性得以进一步提升。在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2个核苷酸为A；按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2个核苷酸选自A、G或C。
在一些实施方式中，所述正义链还含有核苷酸序列III，所述反义链还含有核苷酸序列IV。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列III和IV的长度均为1个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基为G，核苷酸序列IV的碱基为C，所述第二段核苷酸序列的碱基为G；此时，正义链和反义链的长度比为20/20；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为GG，所述核苷酸序列IV的碱基组成为CC，所述第二段核苷酸序列的碱基组成为GG；此时，正义链和反义链的长度比为21/21；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为GGG，所述核苷酸序列IV的碱基组成为CCC，所述第二段核苷酸序列的碱基组成为GGG；此时，正义链和反义链的长度比为22/22；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为GGGG，所述核苷酸序列IV的碱基组成为CCCC，所述第二段核苷酸序列的碱基组成为GGGG；此时，正义链和反义链的长度比为23/23。
在一些实施方式中，核苷酸序列III和核苷酸序列IV完全反向互补因此，给出了核苷酸序列III的碱基组成，核苷酸碱基IV的碱基组成也就确定了。
第四种siRNA
在一些实施方式中，本公开的siRNA是第四种siRNA。其中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:79所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:80所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5'-GGUUUUAAAAUUAAAGUAZd1-3'(SEQ ID NO:79)；
5'-Zd2UACUUUAAUUUUAAAACC-3'(SEQ ID NO:80),
其中Zd1为U,Zd2为A，所述核苷酸序列I中包含位置对应于Zd1的核苷酸Zd3，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Zd2的核苷酸Zd4，所述Zd4是所述反义链5'末端的第一个核苷酸。
在一些实施方式中，所述第一段核苷酸序列是如SEQ ID NO:79所示的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述正义链仅包含核苷酸序列I，所述反义链仅包含核苷酸序列II。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:79所示的核苷酸序列之间不多
于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:80所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:80所示的核苷酸序列之间的差异包括Zd4位置处的差异，且Zd4选自A、G或C。在一些实施方式中，所述Zd3是与Zd4互补的核苷酸。在一些实施方式中，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:80所示的核苷酸序列之间的差异为Zd4位置处的差异，且Zd4选自U、G或C。在一些实施方式中，本公开siRNA的核苷酸序列中的每个U或者T可任意地相互替换。这些核苷酸差异并不会显著降低siRNA的靶基因抑制能力或者提高siRNA的脱靶效应。而这些包含核苷酸差异的siRNA也在本公开的保护范围之内。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补。
在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3-19位的核苷酸与所述第一段核苷酸序列第1-17位的核苷酸完全反向互补。在一些实施方式中，所述核苷酸序列II与所述核苷酸序列I完全反向互补，或者按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2个核苷酸与按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2个核苷酸之间存在碱基错配。通过包含该碱基错配，本公开的siRNA对目标基因表达的抑制活性得以进一步提升。在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2个核苷酸为U；按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2个核苷酸选自U、G或C。
在一些实施方式中，所述正义链还含有核苷酸序列III，所述反义链还含有核苷酸序列IV。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列III和IV的长度均为1个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基为G，核苷酸序列IV的碱基为C，所述第二段核苷酸序列的碱基为G；此时，正义链和反义链的长度比为20/20；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为UG，所述核苷酸序列IV的碱基组成为CA，所述第二段核苷酸序列的碱基组成为UG；此时，正义链和反义链的长度比为21/21；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为UUG，所述核苷酸序列IV的碱基组成为CAA，所述第二段核苷酸序列的碱基组成为UUG；此时，正义链和反义链的长度比为22/22；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为AUUG，所述核苷酸序列IV的碱基组成为CAAU，所述第二段核苷酸序列的碱基组成为AUUG；此时，正义链和反义链的长度比为23/23。
在一些实施方式中，核苷酸序列III和核苷酸序列IV完全反向互补，因此，给出了核苷酸序列III的碱基组成，核苷酸碱基IV的碱基组成也就确定了。
第五种siRNA
在一些实施方式中，本公开的siRNA是第五种siRNA。其中，
所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:105所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:106所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5'-GUUUCUCCUUGGUCUAAGZe1-3'(SEQ ID NO:105)；
5'-Ze2CUUAGACCAAGGAGAAAC-3'(SEQ ID NO:106),
其中Ze1为U,Ze2为A，所述核苷酸序列I中包含位置对应于Ze1的核苷酸Ze3，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Ze2的核苷酸Ze4，所述Ze4是所述反义链5'末端的第一个核苷酸。
在一些实施方式中，所述第一段核苷酸序列是如SEQ ID NO:105所示的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述正义链仅包含核苷酸序列I，所述反义链仅包含核苷酸序列II。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:105所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:106所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:106所示的核苷酸序列之间的差异包括Ze4位置处的差异，且Ze4选自U、G或C。在一些实施方式中，所述的核苷酸序列之间的差异为Ze4位置处的差异，且Ze4选自U、G或C。在一些实施方式中，所述Ze3是与Ze4互补的核苷酸。在一些实施方式中，本公开siRNA的核苷酸序列中的每个U或者T可任意地相互替换。这些核苷酸差异并不会显著降低siRNA的靶基因抑制能力或者提高siRNA的脱靶效应。而这些包含核苷酸差异的siRNA也在本公开的保护范围之内。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补。
在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3-19位的核苷酸与所述第一段核苷酸序列第1-17位的核苷酸完全反向互补。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列II与所述核苷酸序列I完全反向互补，或者按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2个核苷酸与按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2个核苷酸之间存在碱基错配。通过包含该碱基错配，本公开的siRNA对目标基因表达的抑制活性得以进一步提升。在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2个核苷酸为C；按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2个核苷酸选自C、A或U。
在一些实施方式中，所述正义链还含有核苷酸序列III，所述反义链还含有核苷酸序列IV。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列III和IV的长度均为1个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基为C，核苷酸序列IV的碱基为G，所述第二段核苷酸序列的碱基为C；此时，正义链和反义链的长度比为20/20；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为CC，所述核苷酸序列IV的碱基组成为CC，所述第二段
核苷酸序列的碱基组成为CC；此时，正义链和反义链的长度比为21/21；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为GCC，所述核苷酸序列IV的碱基组成为GGC，所述第二段核苷酸序列的碱基组成为CUG；此时，正义链和反义链的长度比为22/22；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为AGCC，所述核苷酸序列IV的碱基组成为GGCU，所述第二段核苷酸序列的碱基组成为AGCC；此时，正义链和反义链的长度比为23/23。
在一些实施方式中，核苷酸序列III和核苷酸序列IV完全反向互补，因此，给出了核苷酸序列III的碱基组成，核苷酸碱基IV的碱基组成也就确定了。
第六种siRNA
在一些实施方式中，本公开的siRNA是第六种siRNA，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:131所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:132所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5'-GAGGCAAGAACCAGUGUUZf1-3'(SEQ ID NO:131)；
5'-Zf2AACACUGGUUCUUGCCUC-3'(SEQ ID NO:132),
其中Zf1为U,Zf2为A，所述核苷酸序列I中包含位置对应于Zf1的核苷酸Zf3，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Zf2的核苷酸Zf4，所述Zf4是所述反义链5'末端的第一个核苷酸。
在一些实施方式中，所述第一段核苷酸序列是如SEQ ID NO:131所示的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述正义链仅包含核苷酸序列I，所述反义链仅包含核苷酸序列II。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:131所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:132所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:132所示的核苷酸序列之间的差异包括Zf4位置处的差异，且Zf4选自U、G或C。在一些实施方式中，所述核苷酸差异为Zf4位置处的差异，且Zf4选自U、G或C。在一些实施方式中，所述Zf3是与Zf4互补的核苷酸。在一些实施方式中，本公开siRNA的核苷酸序列中的每个U或者T可任意地相互替换。这些核苷酸差异并不会显著降低siRNA的靶基因抑制能力或者提高siRNA的脱靶效应。而这些包含核苷酸差异的siRNA也在本公开的保护范围之内。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补。
在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3-19位的核苷酸与所述第一段核苷酸序列第1-17位的核苷酸完全反向互补。在一些实施方式中，所述核苷酸序列II与所述核苷酸序列I完全反向互补，或者按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2个核苷酸与按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2个核苷酸之间存在碱基错配。通过包含该碱基错配，本公开的siRNA对目标基因
表达的抑制活性得以进一步提升。在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2个核苷酸为A；按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2个核苷酸选自G、A或C。
在一些实施方式中，所述正义链还含有核苷酸序列III,所述反义链还含有核苷酸序列IV。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的长度均为1个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基为G，所述核苷酸序列IV的碱基为C，所述第二段核苷酸序列的碱基为G；此时，正义链和反义链的长度比为20/20；或者，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的长度均为2个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为GG，所述核苷酸序列IV的碱基组成为CC，所述第二段核苷酸序列的碱基组成为GG；此时，正义链和反义链的长度比为21/21；或者，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的长度均为3个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为GGG，所述核苷酸序列IV的碱基组成为CCC，所述第二段核苷酸序列的碱基组成为GGG，此时，正义链和反义链的长度比为22/22；或者，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的长度均为4个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为UGGG，所述核苷酸序列IV的碱基组成为CCCA，所述第二段核苷酸序列的碱基组成为UGGG；此时，正义链和反义链的长度比为23/23。
在一些实施方式中，核苷酸序列III和核苷酸序列IV完全反向互补，因此，给出了核苷酸序列III的碱基组成，核苷酸序列IV的碱基组成也就确定了。
第七种siRNA
在一些实施方式中，本公开的siRNA是第七种siRNA。其中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:157所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:158所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5'-CGACCAGCUUGUUUGUGAZg1-3'(SEQ ID NO:157)；
5'-Zg2UCACAAACAAGCUGGUCG-3'(SEQ ID NO:158),
其中Zg1为A,Zg2为U，所述核苷酸序列I中包含位置对应于Zg1的核苷酸Zg3，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Zg2的核苷酸Zg4，所述Zg4是所述反义链5'末端的第一个核苷酸。
在一些实施方式中，所述第一段核苷酸序列是如SEQ ID NO:157所示的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述正义链仅包含核苷酸序列I，所述反义链仅包含核苷酸序列II。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:157所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:158所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:158所示的核苷酸序列之间的差异包括Zg4位置处的差异，且Zg4选自A、G或C。在一些实施方式中，所述核苷酸序
列核苷酸序列之间的差异为Zg4位置处的差异，且Zg4选自A、G或C。在一些实施方式中，Zg3是与Zg4互补的核苷酸。在一些实施方式中，本公开siRNA的核苷酸序列中的每个U或者T可任意地相互替换。这些核苷酸差异并不会显著降低siRNA的靶基因抑制能力或者提高siRNA的脱靶效应。而这些包含核苷酸差异的siRNA也在本公开的保护范围之内。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补。
在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3-19位的核苷酸与所述第一段核苷酸序列第1-17位的核苷酸完全反向互补。在一些实施方式中，所述核苷酸序列II与所述核苷酸序列I完全反向互补，或者按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2个核苷酸与按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2个核苷酸之间存在碱基错配。通过包含该碱基错配，本公开的siRNA对目标基因表达的抑制活性得以进一步提升，同时脱靶效应出人意料地进一步降低。在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2个核苷酸为U；按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2个核苷酸选自U、G或C。
在一些实施方式中，所述正义链还含有核苷酸序列III，所述反义链还含有核苷酸序列IV。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列III和IV的长度均为1个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基为C，核苷酸序列IV的碱基为G，所述第二段核苷酸序列的碱基为C；此时，正义链和反义链的长度比为20/20；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为AC，所述核苷酸序列IV的碱基组成为GU，所述第二段核苷酸序列的碱基组成为AC；此时，正义链和反义链的长度比为21/21；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为AAC，所述核苷酸序列IV的碱基组成为GUU，所述第二段核苷酸序列的碱基组成为AAC；此时，正义链和反义链的长度比为22/22；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为CAAC，所述核苷酸序列IV的碱基组成为GUUG，所述第二段核苷酸序列的碱基组成为CAAC；此时，正义链和反义链的长度比为23/23。
在一些实施方式中，核苷酸序列III和核苷酸序列IV完全反向互补，因此，给出了核苷酸序列III的碱基组成，核苷酸碱基IV的碱基组成也就确定了。
第八种siRNA
在一些实施方式中，本公开的siRNA是第八种siRNA。其中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:183所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:184所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5'-GUUUGUGAAACAAAAAAGZh1-3'(SEQ ID NO:183)；
5'-Zh2CUUTUUUGUUUCACAAAC-3'(SEQ ID NO:184),
其中Zh1为U,Zh2为A，所述核苷酸序列I中包含位置对应于Zh1的核苷酸Zh3，所述核
苷酸序列II中包含位置对应于Zh2的核苷酸Zh4，所述Zh4是所述反义链5'末端的第一个核苷酸。
在一些实施方式中，所述第一段核苷酸序列是如SEQ ID NO:183所示的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述正义链仅包含核苷酸序列I，所述反义链仅包含核苷酸序列II。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:183所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:184所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:184所示的核苷酸序列之间的差异包括Zh4位置处的差异，且Zh4选自U、G或C。在一些实施方式中，所述核苷酸序列之间的差异为Zh4位置处的差异，且Zh4选自U、G或C。在一些实施方式中，所述Zh3是与Zh4互补的核苷酸。在一些实施方式中，本公开siRNA的核苷酸序列中的每个U或者T可任意地相互替换。这些核苷酸差异并不会显著降低siRNA的靶基因抑制能力或者提高siRNA的脱靶效应。而这些包含核苷酸差异的siRNA也在本公开的保护范围之内。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补。
在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3-19位的核苷酸与所述第一段核苷酸序列第1-17位的核苷酸完全反向互补。在一些实施方式中，所述核苷酸序列II与所述核苷酸序列I完全反向互补，或者按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2个核苷酸与按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2个核苷酸之间存在碱基错配。通过包含该碱基错配，本公开的siRNA对目标基因表达的抑制活性得以进一步提升。在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2个核苷酸为C；按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2个核苷酸选自U、G或A。
在一些实施方式中，所述正义链还含有核苷酸序列III，所述反义链还含有核苷酸序列IV。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列III和IV的长度均为1个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基为U，核苷酸序列IV的碱基为A，所述第二段核苷酸序列的碱基为U；此时，正义链和反义链的长度比为20/20；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为UU，所述核苷酸序列IV的碱基组成为AA，所述第二段核苷酸序列的碱基组成为UU；此时，正义链和反义链的长度比为21/21；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为CUU，所述核苷酸序列IV的碱基组成为AAG，所述第二段核苷酸序列的碱基组成为CUU；此时，正义链和反义链的长度比为22/22；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为GCUU，所述核苷酸序列IV的碱基组成为AAGC，所述第二段核苷酸序列的碱基组成为GCUU；此时，正义链和反义链的长度比为23/23。
在一些实施方式中，核苷酸序列III和核苷酸序列IV完全反向互补，因此，给出了核苷酸序列III的碱基组成，核苷酸碱基IV的碱基组成也就确定了。
以下，对于核苷酸序列V、siRNA中的核苷酸修饰以及修饰序列的描述适用于上述本公开的siRNA，例如第一种siRNA、第二种siRNA、第三种siRNA、第四种siRNA、第五种siRNA、第六种siRNA、第七种siRNA和第八种siRNA。即如果没有特指，下面对siRNA的描述应视为对上述本公开的八种siRNA，例如，如不特别指明具体的siRNA，“所述siRNA还含有核苷酸序列V”的意思是“本公开的siRNA，例如上述第一种siRNA、第二种siRNA、第三种siRNA、第四种siRNA、第五种siRNA、第六种siRNA、第七种siRNA或第八种siRNA还含有核苷酸序列V”。
在一些实施方式中，所述正义链和反义链长度不同，所述反义链还含有核苷酸序列V，核苷酸序列V的每个核苷酸独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种且不是所述稳定化修饰核苷酸(例如，不是2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸)，核苷酸序列V的长度为1至3个核苷酸，连接在所述反义链的3'末端，构成反义链的3'突出端。由此，本公开提供的siRNA正义链和反义链的长度比可以是19/20、19/21、19/22、20/21、20/22、20/23、21/22、21/23、21/24、22/23、22/24、22/25、23/24、23/25或23/26。在一些实施方式中，所述核苷酸序列V的长度为2个核苷酸，由此，本公开提供的siRNA正义链和反义链的长度比可以是19/21、21/23或23/25。
所述核苷酸序列V中的每一个核苷酸可以是任意的核苷酸，为了便于合成并节约成本，在一些实施方式中，所述核苷酸序列V为连续的2个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(dTdT)、连续的2个尿嘧啶核糖核苷酸(UU)；或者，为了提高siRNA反义链与靶mRNA的亲和力，靶核苷酸序列V与第三段核苷酸序列完全反向互补，所述第三段核苷酸序列是指AGT mRNA中与第一段核苷酸序列的5'末端或第二段核苷酸序列的5'末端相邻、且长度与所述核苷酸序列V相等的核苷酸序列。因此，在一些实施方式中，本公开的正义链和反义链的长度之比为19/21或21/23，此时，本公开的siRNA具有更好的mRNA沉默活性。
在一些实施方式中，对于所述第一种siRNA，所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述第三段核苷酸序列的碱基组成是UG。在一些实施方式中，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列：
5'-CUGAGAAGAUUGACAGGUZa3-3'(SEQ ID NO:3)；
5'-Za4ACCUGUCAAUCUUCUCAGCA-3'(SEQ ID NO:4),
其中，所述Za4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Za3选自A、U、G或C，并且Za3是与Za4互补的核苷酸。
在一些实施方式中，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列：
5'-UGCUGAGAAGAUUGACAGGUZa3-3'(SEQ ID NO:5)；
5'-Za4ACCUGUCAAUCUUCUCAGCAGC-3'(SEQ ID NO:6),
其中，所述Za4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Za3选自A、U、G或C，并且Za3是与Za4互补的核苷酸。
在一些实施方式中，对于所述第二种siRNA，所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列，所述第三段核苷酸序列的碱基组成是CC。
在一些实施方式中，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:29所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列：
5'-UCAACUGGAUGAAGAAACZb3-3'(SEQ ID NO:29)；
5'-Zb4GUUUCUUCAUCCAGUUGAGG-3'(SEQ ID NO:30),
其中，所述Zb4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Zb3选自A、U、G或C，并且Zb4是与Zb3互补的核苷酸；
在一些实施方式中，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:31所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:32所示的核苷酸序列：
5'-CCUCAACUGGAUGAAGAAACZb3-3'(SEQ ID NO:31)；
5'-Zb4GUUUCUUCAUCCAGUUGAGGGA-3'(SEQ ID NO:32),
其中，所述Zb4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Zb3选自A、U、G或C，并且Zb4是与Zb3互补的核苷酸。
在一些实施方式中，对于所述第三种siRNA，所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:53所示的核苷酸序列，所述第三段核苷酸序列的碱基组成是GG。在一些实施方式中，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:55所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO:56所示的核苷酸序列：
5'-AGGCAAGAACCAGUGUUUZc3-3'(SEQ ID NO:55)；
5'-Zc4AAACACUGGUUCUUGCCUCC-3'(SEQ ID NO:56),
其中，所述Zc4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Zc3选自A、U、G或C，并且Zc4是与Zc3互补的核苷酸。
在一些实施方式中，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:57所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:58所示的核苷酸序列：
5'-GGAGGCAAGAACCAGUGUUUZc3-3'(SEQ ID NO:57)；
5'-Zc4AAACACUGGUUCUUGCCUCCCC-3'(SEQ ID NO:58),
其中，所述Zc4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Zc3选自A、U、G或C，并且Zc4是与Zc3互补的核苷酸。
在一些实施方式中，对于所述第四种siRNA，所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:79所示的核苷酸序列，所述第三段核苷酸序列的碱基组成是UG。在一些实施方式中，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:81所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID
NO:82所示的核苷酸序列：
5'-GGUUUUAAAAUUAAAGUAZd3-3'(SEQ ID NO:81)；
5'-Zd4UACUUUAAUUUUAAAACCCA-3'(SEQ ID NO:82),
其中，所述Zd4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Zd3选自A、U、G或C，并且Zd4是与Zd3互补的核苷酸。
在一些实施方式中，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:83所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:84所示的核苷酸序列：
5'-UGGGUUUUAAAAUUAAAGUAZd3-3'(SEQ ID NO:83)；
5'-Zd4UACUUUAAUUUUAAAACCCAAU-3'(SEQ ID NO:84),
其中，所述Zd4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Zd3选自A、U、G或C，并且Zd4是与Zd3互补的核苷酸。
在一些实施方式中，对于所述第五种siRNA，所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:105所示的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述第三段核苷酸序列的碱基组成是CC；所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:107所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO:108所示的核苷酸序列：
5'-GUUUCUCCUUGGUCUAAGZe3-3'(SEQ ID NO:107)；
5'-Ze4CUUAGACCAAGGAGAAACGG-3'(SEQ ID NO:108),
其中，所述Ze4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Ze3选自A、U、G或C，并且Ze4是与Ze3互补的核苷酸；
在一些实施方式中，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:109所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:110所示的核苷酸序列：
5'-CGUUUCUCCUUGGUCUAAG Ze3-3'(SEQ ID NO:109)；
5'-Ze4CUUAGACCAAGGAGAAACGGCU-3'(SEQ ID NO:110),
其中，所述Ze4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Ze3选自A、U、G或C，并且Ze4是与Ze3互补的核苷酸。
在一些实施方式中，对于所述第六种siRNA，所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:131所示的核苷酸序列，所述第三段核苷酸序列的碱基组成是GG。在一些实施方式中，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:133所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO:134所示的核苷酸序列：
5'-GAGGCAAGAACCAGUGUUZf3-3'(SEQ ID NO:133)；
5'-Zf4AACACUGGUUCUUGCCUCCC-3'(SEQ ID NO:134),
其中，所述Zf4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Zf3选自A、U、G或C，并且Zf4是与Zf3互补的核苷酸。
在一些实施方式中，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:135所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:136所示的核苷酸序列：
5'-GGGAGGCAAGAACCAGUGUU Zf3-3'(SEQ ID NO:135)；
5'-Ze4AACACUGGUUCUUGCCUCCCCA-3'(SEQ ID NO:136),
其中，所述Zf4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Zf4选自A、U、G或C，并且Zf4是与Zf3互补的核苷酸。
在一些实施方式中，对于所述第七种siRNA，所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:157所示的核苷酸序列，所述第三段核苷酸序列的碱基组成是AC；所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:159所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO:160所示的核苷酸序列：
5'-CGACCAGCUUGUUUGUGAZg3-3'(SEQ ID NO:159)；
5'-Zg4UCACAAACAAGCUGGUCGGU-3'(SEQ ID NO:160),
其中，所述Zg4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Zg3选自A、U、G或C，并且Zg4是与Zg3互补的核苷酸。
在一些实施方式中，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:161所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:162所示的核苷酸序列：
5'-ACCGACCAGCUUGUUUGUGAZg3-3'(SEQ ID NO:161)；
5'-Zg4UCACAAACAAGCUGGUCGGUUG-3'(SEQ ID NO:162),
其中，所述Zg4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Zg3选自A、U、G或C，并且Zg4是与Zg3互补的核苷酸。
在一些实施方式中，对于所述第八种siRNA，所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:183所示的核苷酸序列，所述第三段核苷酸序列的碱基组成是UU。在一些实施方式中，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:185所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:186所示的核苷酸序列：
5'-GUUUGUGAAACAAAAAAGZh3-3'(SEQ ID NO:185)；
5'-Zh4CUUTUUUGUUUCACAAACAA-3'(SEQ ID NO:186),
其中，所述Zh4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Zh3选自A、U、G或C，并且Zh4是与Zh3互补的核苷酸。
在一些实施方式中，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:187所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:188所示的核苷酸序列：
5'-UUGUUUGUGAAACAAAAAAGZh3-3'(SEQ ID NO:187)；
5'-Zh4CUUTUUUGUUUCACAAACAAGC-3'(SEQ ID NO:188),
其中，所述Zh4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Zh3选自A、U、G或C，并且Zh4是与Zh3互补的核苷酸。
如前所述，本公开的siRNA中的核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，在一些实施方式中，本公开的siRNA中的部分或全部核苷酸为修饰的核苷酸，核苷酸基团上的这些修饰不会导致本公开的siRNA抑制AGT基因表达的功能明显削弱或丧失。
在本公开的上下文中，所使用的的术语“修饰的核苷酸”是指核苷酸的核糖基2'位羟基被其他基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物，或者核苷酸上的碱基是经修饰的碱基的核苷酸。所述修饰的核苷酸不会导致siRNA抑制基因表达的功能明显削弱或丧失。例如，可以选择J.K.Watts,G.F.Deleavey,and M.J.Damha,Chemically modified siRNA:tools and applications.Drug Discov Today,2008,13(19-20):842-55中公开的修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16个核苷酸，如果不是所述稳定化修饰核苷酸的话，为2'-氟代修饰的核苷酸。在一些实施方式中，所述核苷酸序列II中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16个核苷酸，如果不是所述稳定化修饰核苷酸的话，为2'-氟代修饰的核苷酸，所述核苷酸序列II中的其它核苷酸各自独立地为非氟代修饰的核苷酸的一种。在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的第7-9个核苷酸为2'-氟代修饰的核苷酸。在一些实施方式中，所述核苷酸序列I中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的第7-9个核苷酸为2'-氟代修饰的核苷酸，所述核苷酸序列I中的其它核苷酸各自独立地为非氟代修饰的核苷酸的一种。本公开的siRNA通过具有上述修饰，能够实现基因表达调节活性和体内稳定性的良好平衡。
在本公开的上下文中，“氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代形成的核苷酸，其具有以下式(7)所示的结构。“非氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸、或核苷酸类似物。
在一些实施方式中，每一个非氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物中的一种。
这些核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸是本领域技术人员所公知的，这些核苷酸可以选自2'-烷氧基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷基修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-经取代的氨基修饰的核苷酸、2'-脱氧核苷酸中的一种。
在一些实施方式中，2'-烷氧基修饰的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸(2'-OMe)，如式(8)所示。在一些实施方式中，2'-氨基修饰的核苷酸(2'-NH2)如式(9)所示。在一些实施方式中，2'-脱氧核苷酸(DNA)如式(10)所示：
本领域技术人员知晓各种对核苷酸的碱基进行修饰的方式。在一些实施方式中，碱基修饰包括但不限于在碱基上增加一个或多个甲基。在一些实施方式中，将胸腺嘧啶(T)
视为碱基经修饰的尿嘧啶(U)的一种。在一些实施方式中，将5-甲基胞嘧啶视为碱基经修饰的胞嘧啶(C)的一种。
核苷酸类似物指能够在核酸中代替核苷酸，但结构不同于腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的基团。在一些实施方式中，核苷酸类似物可以是异核苷酸、桥联的核苷酸(bridged nucleic acid，简称BNA)或无环核苷酸。
BNA是指受约束的或不能接近的核苷酸。BNA可以含有五元环、六元环、或七元环的具有“固定的”C3'-内切糖缩拢的桥联结构。通常将该桥掺入到该核糖的2'-、4'-位处以提供一个2',4'-BNA核苷酸。在一些实施方式中，BNA可以是LNA、ENA、cET BNA等，其中，LNA如式(12)所示，ENA如式(13)所示，cET BNA如式(14)所示：
无环核苷酸是核苷酸的糖环被打开形成的一类核苷酸。在一些实施方式中，无环核苷酸可以是解锁核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)，其中，UNA如式(15)所示，GNA如式(16)所示：
上述式(15)和式(16)中，R选自H、OH或烷氧基(O-烷基)。
异核苷酸是指核苷酸中碱基在核糖环上的位置发生改变而形成的化合物。在一些实施方式中，异核苷酸可以是碱基从核糖环的1'-位移动至2'-位或3'-位而形成的化合物，如式(17)或(18)所示。
上述式(17)-式(18)化合物中，Base表示核酸碱基，例如A、U、G、C或T；R选自H、OH、F或者如上所述的非氟基团。
在一些实施方式中，核苷酸类似物选自异核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA和GNA中的一种。在一些实施方式中，每一个非氟代修饰的核苷酸均为甲氧基修饰的核苷酸，在上文和下文中，所述甲氧基修饰的核苷酸指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
在上文及下文中，“氟代修饰的核苷酸”、“2'-氟修饰的核苷酸”、“核糖基团的2'-羟基被氟取代的核苷酸”和“具有2’-氟代核糖基的核苷酸”意义相同，均指核苷酸的2'-羟基被氟取代，而形成的具有如式(7)所示结构的化合物；“甲氧基修饰的核苷酸”、“2'-甲氧基修饰的核苷酸”、“核糖基团的2'-羟基被甲氧基取代的核苷酸”和“具有2’-甲氧基核糖基的核苷酸”意义相同，均指核苷酸核糖基团的2'-羟基被甲氧基取代而形成的具有如式(8)所示结构的化合物。
在一些实施方式中，其中，所述反义链中不多于3个非氟代修饰的核苷酸为2'-脱氧核苷酸，其余每一个非氟代修饰的核苷酸均为甲氧基修饰的核苷酸；或者，每一个非氟代修饰的核苷酸均为甲氧基修饰的核苷酸；所述甲氧基修饰的核苷酸指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
在一些实施方式中，本公开的包含稳定化修饰核苷酸的siRNA是具有以下修饰的siRNA：按照5'末端到3'末端的方向，在所述正义链中，所述核苷酸序列I的第7、8、9位或者第5、7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；在所述反义链中，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16位或者第2、6、8、9、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中第3位或第5位的核苷酸为稳定化修饰核苷酸，第18位的核苷酸为2'-脱氧核苷酸或甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸。
具有上述修饰的siRNA不仅成本低，而且可使血液中的核糖核酸酶不易切割核酸，由此增加核酸的稳定性，使核酸具有更强的抵抗核酸酶水解的性能。同时，上述修饰并未显著降低siRNA的抑制性能，具有上述修饰的siRNA还具有低的脱靶效应。
在一些实施方式中，本公开提供的所述siRNA为为下表1a-1g中列出的siAGTa1-M1、siAGTa1-M2、siAGTa2-M1、siAGTa2-M2、siAGTb1-M1、siAGTb1-M2、siAGTb2-M1、siAGTb2-M2、AGTc1-M1、siAGTc1-M2、siAGTc2-M1、siAGTc2-M2、AGTd1-M1、siAGTd1-M2、siAGTd2-M1、siAGTd2-M2、siAGTe1-M1、siAGTe1-M2、siAGTe2-M1、siAGTe2-M2、siAGTf1-M1、siAGTf1-M2、siAGTf2-M1、siAGTf2-M2、AGTg1-M1、siAGTg1-M2、siAGTg2-M1、siAGTg2-M2、AGTh1-M1、siAGTh1-M2、siAGTh2-M1或siAGTh2-M2中的一种。。
在一些实施方式中，本公开提供的siRNA的正义链和反义链中至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基中的至少一部分为具有修饰基团的磷酸酯基。在一些实施方式中，
具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯亚基；在一些实施方式中，所述具有修饰基团的磷酸酯基为具有如式(1)所示结构的硫代磷酸酯亚基：
这种修饰能稳定siRNA的双链结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。
在一些实施方式中，本公开提供的siRNA中，硫代磷酸酯亚基连接存在于由以下位置组成的组中的至少一处：正义链或反义链任意一端的第一个和第二个核苷酸之间；正义链或反义链任意一端的第二个和第三个核苷酸之间；或上述的任意组合。在一些实施方式中，硫代磷酸酯亚基连接存在于除正义链5'末端以外的全部上述位置处。在一些实施方式中，硫代磷酸酯亚基连接存在于除正义链3'末端以外的全部上述位置处。在一些实施方式中，硫代磷酸酯亚基连接存在于以下位置中的至少一处：
所述正义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；以及
所述反义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间。
在一些实施方式中，本公开的siRNA为表1a-1h中列出的siAGTa1-M1S、siAGTa1-M2S、siAGTa2-M1S、siAGTa2-M2S、siAGTb1-M1S、siAGTb1-M2S、siAGTb2-M1S、siAGTb2-M2S、AGTc1-M1S、siAGTc1-M2S、siAGTc2-M1S、siAGTc2-M2S、AGTd1-M1S、siAGTd1-M2S、siAGTd2-M1S、siAGTd2-M2S、siAGTe1-M1S、siAGTe1-M2S、siAGTe2-M1S、siAGTe2-M2S、siAGTf1-M1S、siAGTf1-M2S、siAGTf2-M1S、siAGTf2-M2S、siAGTg1-M1S、siAGTg1-M2S、siAGTg2-M1S、siAGTg2-M2S、AGTh1-M1S、siAGTh1-M2S、siAGTh2-M1S或siAGTh2-M2S中的一种。在一些实施方式中，所述siRNA反义链的5'末端核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸。
常用的所述5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸是本领域技术人员所公知的，如5'-磷酸核苷酸可具有如下结构：
再如，Anastasia Khvorova and Jonathan K.Watts,The chemical evolution of oligonucleotide therapies of clinical utility.Nature Biotechnology,2017,35(3):238-48中公开了如下4种5'-磷酸类似物修饰的核苷酸：
其中，R选自H、OH、甲氧基、氟；Base表示核酸碱基，选自A、U、C、G或T。
在一些实施方式中，5'-磷酸核苷酸为式(2)所示的含有5'-磷酸修饰的核苷酸，5'-磷酸类似物修饰的核苷酸为含有乙烯基磷酸酯(5'-(E)-vinylphosphonate，E-VP)修饰的核苷酸，如式(3)所示，或者为硫代磷酸酯修饰的核苷酸，如式(5)所示。
在一些实施方式中，本公开的siRNA为下表1a-1h中列出的siAGTa1-M1P、siAGTa1-M2P、siAGTa2-M1P、siAGTa2-M2P、siAGTb1-M1P、siAGTb1-M2P、siAGTb2-M1P、siAGTb2-M2P、AGTc1-M1P、siAGTc1-M2P、siAGTc2-M1P、siAGTc2-M2P、AGTd1-M1P、siAGTd1-M2P、siAGTd2-M1P、siAGTd2-M2P、siAGTe1-M1P、siAGTe1-M2P、siAGTe2-M1P、siAGTe2-M2P、siAGTf1-M1P、siAGTf1-M2P、siAGTf2-M1P、siAGTf2-M2P、siAGTg1-M1P、siAGTg1-M2P、siAGTg2-M1P、siAGTg2-M2P、siAGTh1-M1P、siAGTh1-M2P、siAGTh2-M1P或siAGTh2-M2P中的一种。本公开的发明人意外发现，这些本公开提供的siRNA不仅具有显著增强的血浆和溶酶体稳定性，还保留很高的靶mRNA抑制活性，并且还具有低的脱靶效应。
本公开提供的siRNA可以通过本领域常规的siRNA制备方法(例如固相合成和液相合成的方法)得到。其中，固相合成已经有商业化订制服务。可以通过使用具有相应修饰的核苷单体来将修饰的核苷酸基团引入本公开所述的siRNA中，制备具有相应修饰的核苷单体的方法及将修饰的核苷酸基团引入siRNA的方法也是本领域技术人员所熟知的。
药物组合物
本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有如上所述的siRNA作为活性成分和药学上可接受的载体。
所述药学上可接受的载体可以是siRNA给药领域常规使用的载体，例如但不限于磁性纳米粒(magnetic nanoparticles，如基于Fe3O4或Fe2O3的纳米粒)、碳纳米管(carbon nanotubes)、介孔硅(mesoporous silicon)、磷酸钙纳米粒(calcium phosphate
nanoparticles)、聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)、聚酰胺型树形高分子(polyamidoamine(PAMAM)dendrimer)、聚赖氨酸(poly(L-lysine)，PLL)、壳聚糖(chitosan)、1,2-二油酰基-3-三甲铵丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，DOTAP)、聚D型或L型乳酸/羟基乙酸共聚物(poly(D&L-lactic/glycolic acid)copolymer，PLGA)、聚(氨乙基乙撑磷酸酯)(poly(2-aminoethyl ethylene phosphate)，PPEEA)和聚(甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯)(poly(2-dimethylaminoethyl methacrylate)，PDMAEMA)以及它们的衍生物中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述药物组合物中，对siRNA和药学上可接受的载体的含量没有特别要求，在一些实施方式中，siRNA与药学上可接受的载体的重量比可以为1:(1-500)，在一些的实施方式中，上述重量比为1:(1-50)。
在一些实施方式中，所述药物组合物中，还可以包含药学上可接受的其它辅料，该辅料可以为本领域常规采用的各种制剂或化合物的一种或多种。例如，所述药学上可接受的其它辅料可以包括pH缓冲液、保护剂和渗透压调节剂中的至少一种。
所述pH缓冲液可以为pH值7.5-8.5的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液和/或pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液，例如可以为pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液。
所述保护剂可以为肌醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖和葡萄糖中的至少一种。以所述药物组合物的总重量为基准，所述保护剂的含量可以为0.01-30重量％。
所述渗透压调节剂可以为氯化钠和/或氯化钾。所述渗透压调节剂的含量使所述药物组合物的渗透压为200-700毫渗摩尔/千克(mOsm/kg)。根据所需渗透压，本领域技术人员可以容易地确定所述渗透压调节剂的含量。在一些实施方式中，所述药物组合物所制成的制剂在给药过程中的剂量会因给药方式的不同而发生调整。
在一些实施方式中，所述药物组合物可以为液体制剂，例如注射液；也可以为冻干粉针剂，实施给药时与液体辅料混合，配制成液体制剂。所述液体制剂可以但不限于用于皮下、肌肉或静脉注射给药，也可以但不限于通过喷雾给药到肺部、或通过喷雾经肺部给药到其它脏器组织(如肝脏)、或通过口服等方式递送所述药物组合物。在一些实施方式中，所述药物组合物通过皮下注射的方式给药。
在一些实施方式中，所述药物组合物可以为脂质体制剂的形式。在一些实施方式中，所述脂质体制剂中使用的药学上可接受的载体包含含胺的转染化合物(下文也可将其称为有机胺)、辅助脂质和/或聚乙二醇化脂质。其中，所述有机胺、辅助脂质和聚乙二醇化脂质可分别选自于中国专利申请CN103380113A(通过引用的方式将其整体并入本文)中所描述的含胺的转染化合物或其药学上可接受的盐或衍生物、辅助脂质和聚乙二醇化脂质中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述有机胺可为中国专利申请CN103380113A中描述的如式(201)所示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
每个X101或X102各自独立地是O、S、N-A或C-A，其中A是氢或C1-C20烃链；
每个Y101或Z101各自独立地是C＝O、C＝S、S＝O、CH-OH或SO2；
每个R101、R102、R103、R104、R105、R106或R107各自独立地是氢，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链脂族基团，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链杂脂族基团，被取代的或未被取代的、支链或直链酰基，被取代的或未被取代的、支链或直链芳基，被取代的或未被取代的、支链或直链杂芳基；
x是1-10的整数；
n是1-3的整数，m是0-20的整数，p是0或1；其中，如果m＝p＝0，则R102是氢；
并且，如果n或m中的至少一个是2，那么R103和在式(201)中的氮形成如式(202)或式(203)所示的结构：
其中，g、e和f各自独立地是1-6的整数，“HCC”代表烃链，且每个*N代表式(201)中的氮原子。
在一些实施方式中，R103是多胺。在其它实施方式中，R103是缩酮。在一些实施方式中，在式(201)中的R101和R102中的每一个独立地是任意的被取代的或未被取代的、支链或直链烷基或烯基，所述烷基或烯基具有3至约20个碳原子，诸如8至约18个碳原子，和0至4个双键，诸如0至2个双键。
在一些实施方式中，如果n和m中的每一个独立地具有1或3的值，那么R103可以是下述式(204)-式(213)中的任一个：
其中，式(204)-式(213)中，g、e和f各自独立地是1-6的整数，每个“HCC”代表烃链，且每个*显示R103与在式(201)中的氮原子的可能连接点，其中在任意*位置上的每个H可以被替换以实现与在式(201)中的氮原子的连接。
其中，式(201)所示化合物可以根据中国专利申请CN103380113A中的描述制备。
在一些实施方式中，所述有机胺为如式(214)所示的有机胺和/或如式(215)所示的有机胺：
所述辅助脂质为胆固醇、胆固醇的类似物和/或胆固醇的衍生物；
所述聚乙二醇化脂质为1,2-二棕榈酰胺-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)]-2000。
在一些实施方式中，所述药物组合物中，所述有机胺、所述辅助脂质和所述聚乙二醇化脂质三者之间的摩尔比为(19.7-80):(19.7-80):(0.3-50)，例如可以为(50-70):(20-40):(3-20)。
在一些实施方式中，由本公开的siRNA与上述含胺的转染试剂形成的药物组合物颗粒具有约30nm至约200nm的平均直径，通常为约40nm至约135nm，更通常地，该脂质体颗粒的平均直径是约50nm至约120nm、约50nm至约100nm、约60nm至约90nm或约70nm至约90nm，例如，该脂质体颗粒的平均直径是约30、40、50、60、70、75、80、85、90、100、110、120、130、140、150或160nm。
在一些实施方式中，由本公开的siRNA与上述含胺的转染试剂形成的药物组合物中，siRNA与全部脂质(例如有机胺、辅助脂质和/或聚乙二醇化脂质)的重量比(重量/重量比)在从约1:1至约1:50、从约1:1至约1:30、从约1:3至约1:20、从约1:4至约1:18、从约1:5至约1:17、从约1:5至约1:15、从约1:5至约1:12、从约1:6至约1:12或从约1:6至约1:10的范围内，例如，本公开的siRNA与全部脂质的重量比为约1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17或1:18。
在一些实施方式中，所述药物组合物在销售时各组分可以独立存在，在使用时可以液体制剂的形式存在。在一些实施方式中，本公开提供的siRNA与上述药学上可接受的载体形成的药物组合物可以按照已知的各种方法制备，只是用本公开提供的siRNA替代现有siRNA即可；在一些实施方式中，可以按照如下方法制备：
将有机胺、辅助脂质和聚乙二醇化脂质按照上述摩尔比悬浮于醇中并混匀得到脂质溶液；醇的用量使得到的脂质溶液的总质量浓度为2-25mg/mL，例如可以为8-18mg/mL。所述醇选自药学上可接受的醇，诸如在室温附近为液体的醇，例如，乙醇、丙二醇、苯甲醇、甘油、聚乙二醇200，聚乙二醇300，聚乙二醇400中的一种或多种，例如可以为乙醇。
将本公开提供的siRNA溶解于缓冲盐溶液中，得到siRNA水溶液。缓冲盐溶液的浓度为0.05-0.5M，例如可以为0.1-0.2M，调节缓冲盐溶液的pH至4.0-5.5，例如可以为5.0-5.2，缓冲盐溶液的用量使siRNA的浓度不超过0.6mg/mL，例如可以为0.2-0.4mg/mL。所述缓冲盐选自可溶性醋酸盐、可溶性柠檬酸盐中的一种或多种，例如可以为醋酸钠和/或醋酸钾。
将脂质溶液和siRNA水溶液混合，将混合后得到的产物在40-60℃孵育至少2分钟，例如可以为5-30分钟，得到孵育后的脂质体制剂。脂质溶液和siRNA水溶液的体积比为1：(2-5)，例如可以为1:4。
将孵育后的脂质体制剂浓缩或稀释，去除杂质，除菌，得到本公开提供的药物组合物，其理化参数为pH值为6.5-8，包封率不低于80％，粒径为40-200nm，多分散指数不高于0.30，渗透压为250-400mOsm/kg；例如理化参数可以为pH值为7.2-7.6，包封率不低于90％，粒径为60-100nm，多分散指数不高于0.20，渗透压为300-400mOsm/kg。
其中，浓缩或稀释可以在去除杂质之前、之后或同时进行。去除杂质的方法可以采用现有各种方法，例如可以使用切相流系统、中空纤维柱，在100K Da条件下超滤，超滤交换溶液为pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)。除菌的方法可以采用现有各种方法，例如可以在0.22μm滤器上过滤除菌。
siRNA缀合物
在另一方面，本公开提供了一种siRNA缀合物，所述siRNA缀合物含有本公开提供的siRNA，以及缀合连接至该siRNA的缀合基团。在一些实施方式中，所述缀合基团包含接头和药学上可接受的靶向基团和/或递送辅助基团，并且，所述siRNA、所述接头和所述靶向基团或者所述递送辅助基团依次共价或非共价连接，每个所述靶向基团选自能够和细胞表面受体结合的配体，每个递送辅助基团选自能够增加所述siRNA缀合物在递送目标器官或组织中的生物相容性的基团。
在本公开的上下文中，除非另有说明，“缀合”是指两个或多个各自具有特定功能的化学部分之间以共价连接的方式彼此连接；相应地，“缀合物”是指该各个化学部分之间通过共价连接而形成的化合物。进一步地，“siRNA缀合物”表示一个或多个具有特定功
能的化学部分共价连接至siRNA上而形成的化合物。siRNA缀合物应根据上下文，理解为多个siRNA缀合物的总称或者某个化学式所表示的siRNA缀合物。在本公开的上下文中，“缀合分子”应当理解为可通过反应缀合至siRNA，最终形成本公开的siRNA缀合物的特定化合物。
一般来说，所述缀合基团包含药学上可接受的至少一个靶向基团，或者进一步还包含接头(linker)，并且，所述siRNA基团、所述接头和所述靶向基团依次连接。在一些实施方式中，所述靶向基团为1-6个。在一些实施方式中，所述靶向基团为2-4个。所述siRNA基团可以非共价或共价缀合至所述缀合基团，例如可以共价缀合至所述缀合基团。siRNA基团与缀合基团的缀合位点可以在siRNA正义链的3'端或5'端，也可在反义链的5'端，还可以在siRNA的内部序列中。在一些实施方式中，所述siRNA与缀合基团的缀合位点在siRNA正义链的3'末端。
在一些实施方式中，所述缀合基团可以连接在核苷酸的磷酸基团、2'-位羟基或者碱基上。在一些实施方式中，所述缀合基团还可以连接在3'-位羟基上，此时核苷酸之间采用2'-5'磷酸二酯键连接。当缀合基团连接在siRNA链的末端时，所述缀合基团通常连接在核苷酸的磷酸基团上；当缀合基团连接在siRNA的内部序列时，所述缀合基团通常连接在核糖糖环或者碱基上。各种连接方式可以参考文献：Muthiah Manoharan et.al.siRNA conjugates carrying sequentially assembled trivalent N-acetylgalactosamine linked through nucleosides elicit robust gene silencing in vivo in hepatocytes.ACS Chemical biology,2015,10(5):1181-7.
靶向基团可经由合适的接头与siRNA基团相连，本领域技术人员可以根据靶向基团的具体类型选择合适的接头。这些接头、靶向基团的种类以及与siRNA的连接方式可参见WO2015006740A2的公开内容，通过引用的方式将其整体内容并入本文。在一些实施方式中，所述siRNA与缀合基团间可以通过酸不稳定的、或可还原的化学键相连，在细胞内涵体的酸性环境下，这些化学键可降解，从而使siRNA基团被释放成为自由状态的siRNA分子。对于不可降解的缀合方式，缀合基团可连接在siRNA基团的正义链，从而尽量降低缀合对siRNA活性的影响。
在一些实施方式中，所述靶向基团可以是siRNA给药领域常规使用的配体，例如WO2009082607A2中描述的各种配体，以引用的方式将其全部公开内容并入本文。
在一些实施方式中，至少一个或每个所述靶向基团选自能够和表达所述AGT基因的细胞表面受体结合的配体。
在一些实施方式中，至少一个或每个所述靶向基团选自能够和哺乳动物肝实质细胞表面受体(ASGPR)结合的配体。在一些实施方式中，每个所述靶向基团独立地为与哺乳动物肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体亲和的配体。在一些实施方式中，每个所述靶向基团独立地为去唾液酸糖蛋白或糖。在一些实施方式中，每个所述靶向基团独立地为去唾液酸糖蛋白，例如去唾液酸血清类枯蛋白(asialoorosomucoid,ASOR)或去唾液酸始球蛋白
(asialofetuin，ASF)。在一些实施方式中，每个所述靶向基团独立地选自D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-三氟乙酰半乳糖胺、N-丙酰半乳糖胺、N-正丁酰半乳糖胺、N-异丁酰半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖、L-4-硫代核糖中的一种。在一些实施方式中，至少一个或每个所述靶向基团为半乳糖或N-乙酰半乳糖胺。在一些实施方式中，本公开的siRNA缀合物中的接头具有如式(301)所示的结构：
其中，k为1-3的整数；
LA具有如式(302)所示的包含酰胺键的结构，LB具有如式(303)所示的包含N-酰基吡咯烷的结构，含有羰基和氧原子，LC为基于羟甲基氨基甲烷、二羟甲基氨基甲烷或三羟甲基氨基甲烷的连接基团；
其中，n302、q302和p302各自独立地为2-6的整数，可选地，n302、q302和p302各自独立地为2或3；n303为4-16的整数，可选地，n303为8-12的整数，表示基团共价连接的位点。
所述接头中，每个LA分别与一个所述靶向基团通过醚键连接，并通过LC部分中羟基的氧原子与LC部分形成醚键而连接；LB通过式(303)中的羰基与LC部分中氨基的氮原子形成酰胺键而连接，并通过式(303)中的氧原子与所述siRNA通过氧原子形成磷酸
酯键或硫代磷酸酯键相连接。
在一些实施方式中，本公开提供的siRNA缀合物具有如式(305)所示的结构：
其中，Nu表示本公开提供的siRNA。
在一些实施方式中，本公开的siRNA缀合物中的接头具有式(306)所示的结构：
其中，n306为0-3的整数，每个p306独立地为1-6的整数，表示基团共价连接的位点；所述连接基团通过由*标出的氧原子与所述靶向基团形成醚键连接；所述连接基团由#标出的氧原子中的至少一个与所述siRNA形成磷酸酯键或硫代磷酸酯键而连接，其余由#标出的氧原子与氢原子连接形成羟基，或者与C1-C3烷基连接形成C1-C3烷氧基；
在一些实施方式中，本公开的siRNA缀合物具有如式(307)所示的结构：
其中，Nu表示本公开提供的siRNA。
在一些实施方式中，本公开的siRNA缀合物具有式(308)所示的结构：
其中，
n1为选自1-3的整数，n3为选自0-4的整数；
每个m1、m2或m3各自独立地为选自2-10的整数；
R10、R11、R12、R13、R14或R15各自独立地为H，或选自于由以下基团所组成的组：C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基以及C1-C10烷氧基；
R3具有式A59所示的结构：
其中，E1为OH、SH或BH2，Nu表示本公开提供的siRNA；
R2是长度为1-20个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其
中R2可任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-CONH(C1-C10烷基苯基)、-CONH2、-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
每个L1独立地是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子可任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)2、C2-C10亚烯基、C2-C10亚炔基、C6-C10亚芳基、C3-C18亚杂环基和C5-C10亚杂芳基；并且其中，L1可选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C1-C10烷基、C6-C10芳基、C5-C10杂芳基、C1-C10卤代烷基、-OC1-C10烷基、-OC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-OH、-OC1-C10卤代烷基、-SC1-C10烷基、-SC1-C10烷基苯基、-C1-C10烷基-SH、-SC1-C10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH2、-C1-C10烷基-NH2、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-NH(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)(C1-C10烷基苯基)、-NH(C1-C10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO2H、-C(O)O(C1-C10烷基)、-CON(C1-C10烷基)(C1-C10烷基)、-CONH(C1-C10烷基)、-CONH2，-NHC(O)(C1-C10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(C1-C10烷基)、-N(C1-C10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C1-C10烷基、-C(O)C1-C10烷基苯基、-C(O)C1-C10卤代烷基、-OC(O)C1-C10烷基、-SO2(C1-C10烷基)、-SO2(苯基)、-SO2(C1-C10卤代烷基)、-SO2NH2、-SO2NH(C1-C10烷基)、-SO2NH(苯基)、-NHSO2(C1-C10烷基)、-NHSO2(苯基)和-NHSO2(C1-C10卤代烷基)；
表示基团共价连接的位点；
M1表示靶向基团，其定义和可选择的范围与上述相同。在一些实施方式中，每个M1独立地选自对哺乳动物肝脏细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体具有亲合力的配体中的一种。
技术人员会理解的是，尽管为了方便起见，L1被定义为线性亚烷基，但是它可能不是线性基团或者名称不同，例如由于上述替换和/或置换而产生的胺或烯基。为了本公开内容的目的，L1的长度是连接两个附着点的链中的原子数。为此目的，将替换所述直链亚烷基的碳原子而得到的环(如亚杂环基或亚杂芳基)计为一个原子。
当M1为对哺乳动物肝脏细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体具有亲合力的配体时，在一
些实施方式中，n1可以是1-3的整数，n3可以是0-4的整数，保证所述缀合物中M1配体的个数至少为2；在一些实施方式中，n1+n3≥2，这样可以使得M1配体的个数至少为3，使得M1配体与肝表面去唾液酸糖蛋白受体更容易结合，进而促进所述缀合物通过内吞作用进入细胞。实验表明，当M1配体的个数大于3个时，M1配体与肝表面去唾液酸糖蛋白受体结合的容易程度增加并不明显，因此，从合成容易程度、结构/工艺成本和递送效率等多方面综合考虑，在一些实施方式中，n1为1-2的整数，n3为0-1的整数，且n1+n3＝2-3。
在一些实施方式中，m1、m2和m3独立地选自2-10的整数时，可以使多个M1配体之间的空间位置适合M1配体与肝表面去唾液酸糖蛋白受体的结合，为了使本公开提供的缀合物更为简单，更容易合成和/或降低成本，在一些实施方式中，m1、m2和m3各自独立地为2-5的整数，在一些实施方式中，m1＝m2＝m3。
本领域技术人员可以理解，当R10、R11、R12、R13、R14和R15各自独立地选自H、C1-C10烷基、C1-C10卤代烷基、以及C1-C10烷氧基中的一种时，不会改变本文公开的缀合物的性质，均可以实现本公开的目的。在一些实施方式中，R10、R11、R12、R13、R14和R15各自独立地选自H、甲基和乙基。在一些实施方式中，R10、R11、R12、R13、R14和R15均为H。
根据本公开提供的siRNA缀合物，R3为式A59所示结构的基团，其中，E1为OH、SH或BH2，基于制备原料易获取性的考虑，在一些实施方式中，E1为OH或SH。
在一些实施方式中，R2的选择是为了实现与含氮骨架上的N原子与A59的连接。在本公开的上下文中，“含氮骨架”是指连接有R10、R11、R12、R13、R14和R15的碳原子与N原子互相连接的链状结构。因此，R2可以是任何能够以适当方式将A59基团连接至含氮骨架上的N原子的连接基团。在一些实施方式中，在通过固相合成的工艺制备本公开的siRNA缀合物的情况下，R2基团中需要同时含有与含氮骨架上的N原子连接的连接位点和与R3中的P原子相连接的连接位点。在一些实施方式中，R2中所述与含氮骨架上的N原子连接的位点与N原子形成酰胺键，所述与R3上的P原子连接的位点与P原子形成磷酸酯键。在一些实施方式中，R2的长度为2-20个原子、或者4-15个原子。在一些实施方式中，R2是B5、B6、B5’或B6’：
其中，表示基团共价键连接的位点。
q2的取值范围可以是1-10的整数，在一些实施方式中，q2为1-5的整数。
L1的作用是将M1配体与含氮骨架上的N连接，为本公开的siRNA缀合物提供靶向功能。在一些实施方式中，L1选自式A1-A26基团中的一种或多种的连接组合。在一些实施方式中，L1选自A1、A4、A5、A6、A8、A10、A11和A13中的一种或多种的连接组合；在一些实施方式中，L1选自A1、A4、A8、A10和A11中至少2个的连接组合；在一些实施方式中，L1选自A1、A8、A10中至少2个的连接组合。
在一些实施方式中，L1的长度可以为3-25个原子，3-20个原子、4-15个原子或5-12个原子。在一些实施方式中是，L1的长度为3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个原子。
在一些实施方式中，j1为2-10的整数，在一些实施方式中，j1为3-5的整数。在一些实施方式中，j2为2-10的整数，在一些实施方式中，j2为3-5的整数。R’为C1-C4的烷基，在一些实施方式中，R’为甲基、乙基和异丙基中的一种。Ra为A27、A28、A29、A30和A31中的一种，在一些实施方式中，Ra为A27或A28。Rb为C1-C5的烷基，在一些实施方式中，Rb为甲基、乙基、异丙基和丁基中的一种。在一些实施方式中，在式A1-A26中各自对j1、j2、R’、Ra、Rb进行选择，以实现M1配体与含氮骨架上的N连接，并使M1配体之间的空间位置更适合M1配体与肝表面去唾液酸糖蛋白受体结合。
在一些实施方式中，本公开的siRNA缀合物具有式(403)、(404)、(405)、(406)、(407)、(408)、(409)、(410)、(411)、(412)、(413)、(414)、(415)、(416)、(417)、(418)、(419)、(420)、(421)或(422)所示的结构：
其中，Nu表示本公开的siRNA。
在一些实施方式中，式A59中的P原子可以连接到siRNA序列中任何可能的位置，例如，式A59中的P原子可以连接到siRNA正义链或反义链的任何一个核苷酸上；在一些实施方式中，式A59中的P原子连接到siRNA正义链的任何一个核苷酸上。在一些实施方式中，式A59中的P原子连接到siRNA正义链或反义链的端部；在一些实施方式中，式A59中的P原子连接到siRNA正义链的端部。所述端部指所述正义链或所述反义链中从其一端起算的前4个核苷酸。在一些实施方式中，式A59中的P原子连接到siRNA正义链或反义链的末端；在一些实施方式中，式A59中的P原子连接到siRNA正义链的3'末端。在连接至siRNA的正义链的上述位置的情况下，本公开提供的缀合物进入细胞后，在解旋时，可以释放出单独的siRNA反义链，以通过RNAi机制抑制靶基因表达。
式A59中的P原子可以连接到siRNA中的核苷酸上任何可能的位置，例如，核苷酸的5'位、核苷酸的2'位、核苷酸的3'位或核苷酸的碱基上。在一些实施方式中，式A59中的P
原子可通过形成磷酸二酯键连接至所述siRNA中的核苷酸的2'位、3'位或5'位。在一些实施方式中，式A59中的P原子连接在siRNA正义链3'末端核苷酸的3'羟基脱氢后形成的氧原子上，或者式A59中的P原子通过取代siRNA正义链中的一个核苷酸的2'-羟基中的氢与核苷酸连接，或者式A59中的P原子通过取代siRNA正义链5'末端核苷酸的5'羟基中的氢与核苷酸连接。
本公开的发明人发现，本公开的siRNA以及含有这些siRNA的siRNA缀合物表现出具有显著提高的血浆中稳定性和低脱靶效应的同时，还表现出较高的AGT mRNA沉默活性。因此，在一些实施方式中，本公开的siRNA可以为表1a-1h中示出的siRNA中的一种。
表1a本公开的第一种siRNA序列
表1b本公开的第二种siRNA序列
表1c本公开的第三种siRNA序列
表1d本公开的第四种siRNA序列
表1e本公开的第五种siRNA序列
表1f本公开的第六种siRNA序列
表1g本公开的第七种siRNA序列
表1h本公开的第八种siRNA序列
其中，大写字母C、G、U、A、T表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸；小写字母d表示该字母d右侧相邻的一个核苷酸为2'-脱氧核苷酸；下划线标出的大写字母S表示该字母S左侧相邻的一个核苷酸为稳定化修饰核苷酸；小写字母s表示该字母s左右两个核苷酸之间为硫代磷酸酯亚基连接；P1表示该P1右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸。在一些实施方式中，S是表示具体的稳定化修饰例如moe，其中，下划线标出的字母组合moe表示在该字母组合moe左侧相邻的一个核苷酸为具有2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸。在一些实施方式中，每个S均是moe。在一些实施方式中，P1是表示具体修饰的VP、Ps或P，其中，字母组合VP表示该字母组合VP右侧相邻的一个核苷酸为乙烯基磷酸酯(5'-(E)-vinylphosphonate，E-VP)修饰的核苷酸，字母组合Ps表示该字母组合Ps右侧相邻的一个核苷酸为硫代磷酸酯修饰的核苷酸，大写字母P表示该字母P右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸。另外，上述表1a-1h中所列的序列中的每个U或者T可任意地相互替换，不会对siRNA的活性或脱靶效应产生明显影响。
本公开siRNA缀合物的制备
上述siRNA缀合物可以通过现有技术中已经详细描述的方法进行合成。例如，WO2015006740A2中详细描述了多种siRNA缀合物的制备方法。也可以通过本领域技术人员熟知的方式，获得本公开的siRNA缀合物。如WO2014025805A1中记载了式(305)所示结构的制备方法，Rajeev等人在ChemBioChem 2015,16,903-908中描述了式(307)所示结构的制备方法。中国专利申请CN110959011A也详细公开了制备式(308)所示的siRNA缀合物的方法。以引用的方式将上述文献内容整体并入本文。
本公开的siRNA缀合物也可以与药学上可接受的其它辅料联用，该辅料可以为本领域常规采用的各种制剂或化合物的一种或多种，详情可参见上文关于本公开的药物组合物的描述。
本公开的siRNA、药物组合物及siRNA缀合物的应用
在一些实施方式中，本公开提供了本公开的siRNA，和/或药物组合物和/或siRNA缀合物在制备用于治疗与AGT基因表达的mRNA水平相关的疾病或症状的药物中的用途。在一些实施方式中，本公开的siRNA，和/或药物组合物和/或siRNA缀合物在制备
用于治疗高血压病的药物中的用途。
在一些实施方式中，本公开提供了一种治疗与AGT基因表达的mRNA水平相关的疾病或症状的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予本公开的siRNA，和/或本公开的药物组合物和/或本公开的siRNA缀合物。在一些实施方式中，所述与AGT基因表达的mRNA水平相关的疾病或症状是高血压病。
在一些实施方式中，本公开还提供了一种抑制细胞中AGT基因水平表达的方法，所述方法包括将有效剂量的本公开的siRNA，和/或药物组合物和/或siRNA缀合物与所述细胞接触。
通过将本公开提供的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物给予有需要的受试者，可以通过对基因表达进行调控的机制达到治疗由细胞中AGT基因的表达而引起的病理状况或疾病的目的。
因此，本公开提供的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物可用于治疗所述病理状况或疾病、或用于制备用于本文所述病理状况或疾病的药物。
本文所使用的术语“给药/给予”是指通过使得至少部分地将siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物定位于期望的位点以产生期望效果的方法或途径，将siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物放置入受试者体内。适于本公开方法的给药途径包括局部给药和全身给药。一般而言，局部给药导致与受试者整个身体相比将更多siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物递送至特定位点；而全身给药导致将所述siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物递送至受试者的基本整个身体。考虑到本公开旨在提供治疗高血压及高血压相关疾病9的手段，且AGT主要在肝脏中产生，在一些实施方式中采用能够将药物递送至肝脏的给药方式。
可通过本领域已知的任何合适途径向受试者给药，所述途径包括但不仅限于：口服或胃肠外途径，如静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、经皮给药、气道给药(气雾剂)、肺部给药、鼻部给药、直肠给药和局部给药(包括口腔含化给药和舌下给药)。给药频率可以是每天、每周、每两周、每三周、每个月、每2个月、每3个月、每半年、或每年1次或多次。
本公开所述的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物的使用剂量可为本领域常规的剂量，所述剂量可以根据各种参数、尤其是受试者的年龄、体重和性别来确定。可在细胞培养或实验动物中通过标准药学程序测定毒性和疗效，例如测定LD50(使50％的群体死亡的致死量)和ED50(在量反应中指能引起50％最大反应强度的剂量，在质反应中，指引起50％实验对象出现阳性反应时的剂量)。可基于由细胞培养分析和动物研究得到的数据得出人用剂量的范围。
在给予本公开所述的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物时，例如，对于雄性或雌性、6-12周龄、体重18-25g的C57BL/6J或C3H/HeNCrlVr小鼠，以所述siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物中的siRNA的量计：对于siRNA与药学上可接受的缀合分
子形成的siRNA缀合物，其siRNA用量可以为0.001-100mg/kg体重，在一些实施方式中为0.01-50mg/kg体重，在进一步的实施方式中为0.05-20mg/kg体重，在更进一步的实施方式中为0.1-15mg/kg体重，在又进一步的实施方式中为0.1-10mg/kg体重。在给予本公开所述的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物时，可优选上述用量。
另外，通过将本公开的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物导入细胞，还可以通过RNAi的机制达到抑制细胞中AGT基因的表达这一目的。
采用本公开提供的方法抑制AGT基因在细胞中表达，所提供的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物中的siRNA的用量是本领域技术人员根据期望获得的效果容易确定的。例如，在一些实施方式中，所提供的siRNA缀合物中的siRNA用量是这样的量：其足以减少靶基因的表达，并导致在靶细胞表面处1pM至1μM、或0.01nM至100nM、或0.05nM至50nM或至约5nM的细胞外浓度。达到该局部浓度所需的量将随各种因素而变化，所述因素包括递送方法、递送部位、在递送部位和靶细胞或组织之间的细胞层的数目、递送是局部还是全身等。在递送部位处的浓度可以显著高于在靶细胞或组织的表面处的浓度。
试剂盒
本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含有效量的本公开提供的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物。
在一些实施方式中，本文所述的试剂盒可在一个容器中提供siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物。在一些实施方式中，本文所述的试剂盒可包含一个提供药学上可接受的赋形剂的容器。在一些实施方式中，所述试剂盒中还可包含其它成分，如稳定剂或防腐剂等。在一些实施方式中，本文所述的试剂盒可在不同于提供本文所述siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物的容器以外的其它容器中包含至少一种其它治疗剂。在一些实施方式中，所述试剂盒可包含用于将siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物与药学上可接受的载体和/或辅料或其它成分(若有的话)进行混合的说明书。
在本公开的试剂盒中，所述siRNA和药学上可接受的载体和/或辅料以及所述药物组合物和/或siRNA缀合物，和/或药学上可接受的辅料可以任何形式提供，例如液体形式、干燥形式或冻干形式。在一些实施方式中，所述siRNA和药学上可接受的载体和/或辅料以及所述药物组合物和/或siRNA缀合物和任选的药学上可接受的辅料基本上纯净和/或无菌。在一些实施方式中，可在本公开的试剂盒中提供无菌水。
下面将通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
实施例
除非特别说明，以下实施例中所用到的试剂、培养基均为市售商品，所用到的核酸电泳、real-time PCR等操作均参照Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))所记载的方法进行。
对于以下实施例中包含siRNA序列的缀合物，除非特别说明，否则获得的均为缀合物
中全部磷酸基团中羟基氢离子被钠离子取代的缀合物的钠盐。
制备例1-13本公开提供的siRNA的合成
按照CN110959011A制备例13所述的制备方法，制备获得了以下表2中的缀合物1-13，区别仅在于，各siRNA缀合物中含有的siRNA的正义链和反义链分别如表2中所示；按照以下表2中编号为缀合物1-13的siRNA的核酸序列，分别合成siRNA的正义链和反义链。使用超纯水(Milli-Q超纯水仪，电阻率18.2MΩ*cm(25℃))将各siRNA缀合物稀释至浓度为0.2mg/mL(以siRNA计)后，利用液质联用仪(LC-MS，Liquid Chromatography-Mass SP1ectrometry，购于Waters公司，型号：LCT Premier)进行分子量检测。实测值与理论值一致，说明所合成的缀合物1-13是目标设计的双链核酸序列。
各个siRNA缀合物分别具有式(403)所示的结构，并且该siRNA缀合物包含的siRNA分别具有表2中缀合物1-13所对应的siRNA序列。
其中，式(403)中的Nu为具有本公开表1中缀合物1-13所对应的siRNA序列的siRNA基团，并且缀合基团连接至siRNA基团正义链3'末端核苷酸的核糖3'位。
对比制备例14-19参比缀合物的合成
按照CN110959011A制备例13所述的制备方法，制备获得了下文表2中编号为参比缀合物14、参比缀合物15、参比缀合物16、参比缀合物17、参比缀合物18和参比缀合物NC的siRNA缀合物，区别仅在于，各参比siRNA缀合物中含有的siRNA的正义链和反义链分别如表2中所示；按照以下表2中编号为参比缀合物14、参比缀合物15、参比缀合物16、参比缀合物17、参比缀合物18和参比缀合物NC的siRNA的核酸序列，分别合成siRNA的正义链和反义链。使用超纯水(Milli-Q超纯水仪，电阻率18.2MΩ*cm(25℃))将各参比siRNA缀合物稀释至浓度为0.2mg/mL(以siRNA计)后，利用液质联用仪(LC-MS，Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，购于Waters公司，型号：LCT Premier)进行分子量检测。实测值与理论值一致，说明所合成的参比缀合物14、参比缀合物15、参比缀合物16、参比缀合物17、参比缀合物18和参比缀合物NC分别具有目标设计的双链核酸序列。
各参比siRNA缀合物具有式(403)所示的结构，并且所包含的siRNA分别具有表2中参比缀合物14、参比缀合物15、参比缀合物16、参比缀合物17、参比缀合物18和
参比缀合物NC所对应的siRNA序列。其中，参比缀合物14是和缀合物1或者缀合物2相比具有基本相同的序列组成、但不包含稳定化修饰核苷酸的siRNA缀合物；参比缀合物15是和缀合物3或者缀合物4相比具有基本相同的序列组成、但不包含稳定化修饰核苷酸的siRNA缀合物；参比缀合物16是和缀合物5或者缀合物6相比具有基本相同的序列组成、但不包含稳定化修饰核苷酸的siRNA缀合物；参比缀合物17是和缀合物7或者缀合物8相比具有基本相同的序列组成、但不包含稳定化修饰核苷酸的siRNA缀合物；参比缀合物18是和缀合物9相比具有基本相同的序列组成、但在对应稳定化修饰核苷酸位置处为未修饰核苷酸的siRNA缀合物；参比缀合物NC是序列与已知的mRNA均不具有显著同源性的阴性对照siRNA缀合物。
表2 siRNA缀合物中的siRNA序列
其中，大写字母C、G、U、A、T表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸；下划线标出的字母组合moe表示该字母组合moe左侧相邻的一个核苷酸为核糖2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸；5mCmoe表示碱基为5-甲基胞嘧啶，且核糖被2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸；小写字母s表示该字母s左右两个核苷酸之间为硫代磷酸酯亚基连接；小写字母d表示该字母d右侧相邻的一个核苷酸为2'-脱氧核苷酸。
称取上述制备的缀合物9和参比缀合物18各25mg，分别用PBS配置成0.02mg/mL的供试品溶液。将供试品溶液置于石英比色(10mm)中。使用Agilent cary 3000UV，设定波长260nm，按照说明书测定Tm值。测得缀合物9的Tm值为67.52℃，参比缀合物18的Tm值为66.92℃，这表明与参比缀合物相比，本公开的具有基本相同的序列组成、但包含稳定化修饰核苷酸的siRNA的Tm增加0.60℃。根据结果可知，如说明书中所述，按照本公开的方式，在siRNA中引入稳定化修饰核苷酸，与对应位置处为未修饰核苷酸的siRNA相比，可以提高双链热解离温度，其Tm值升高。本公开提供的其他未给出Tm值的缀合物具有类似的性质。
实验例1 siRNA缀合物在体外psi-CHECK系统中的脱靶活性
根据Kumico Ui-Tei et.al.,Functional dissection of siRNA sequence by systematic DNA substitution:modified siRNA with a DNA seed arm is a powerful tool for mammalian gene silencing with significantly reduced off-target effect.Nucleic Acids Research,2008.36(7),2136-2151描述的方法，构建检测质粒，将所述检测质粒与待测缀合物共转染至HEK293A细胞中，通过双萤光素酶报告基因的表达水平，来反映siRNA的目标序列抑制活性。具体步骤如下：
[1]构建检测质粒
采用psi-CHECKTM-2(PromegaTM)质粒构建了检测质粒，根据缀合物1、缀合物5和缀合物7分别构建检测质粒，所述质粒中分别含有目标序列，其中缀合物1的目标序列为目标序列1，缀合物5的目标序列为目标序列2，缀合物7的目标序列为目标序列3，。对于待测siRNA缀合物，目标序列如下所示：
目标序列1：
5’-GTAGTCTCCTCGTGACAGGTTTTCCGTAGTCTCCTCGTGACAGGTTTTCCGTAGTCTCCTCGTGACAGGTT-3’
(SEQ ID NO:232)
目标序列2：
5’-TTCTTACCTCCACAGTGTTTATTCCTTCTTACCTCCACAGTGTTTATTCCTTCTTACCTCCACAGTGTTTA-3’
(SEQ ID NO:233)
目标序列3：
5’-GTTTGGGGCCCCTTAAAGTATTTCCGTTTGGGGCCCCTTAAAGTATTTCCGTTTGGGGCCCCTTAAAGTAT-3’
(SEQ ID NO:234)
该目标序列1、目标序列2或目标序列3各自包含3段重复的、与对应待测缀合物中siRNA反义链部分互补的序列、因此待测缀合物对目标序列1-3的抑制效果可反映由于反义链部分互补而导致的脱靶效应的程度。即，抑制效果越高，表示待测缀合物越可能发生脱靶。将目标序列1-3及其互补序列克隆到psi-CHECKTM-2质粒的Xho I/Not I位点。
[2]转染
在添加有10％的胎牛血清(FBS，RMBIO公司)及0.2％体积比的青链霉素双抗(Penicillin-Streptomycin，HyClone公司)的H-DMEM完全培养基(HyClone公司)中，于37℃在含5％CO2/95％空气的培养箱中培养HEK293A细胞(购自南京科百生物技术有限公司)。
将HEK293A细胞以8×103细胞/孔接种于96孔板中，16小时后细胞生长密度达到70％时，吸尽培养孔中完全培养基，每孔加入80μL opti-MEM培养基(GIBCO公司)继续培养1.5小时。
用PBS将上述检测质粒稀释成20μM储存液；用PBS将每一种待测siRNA缀合物分别配制成20μM、4μM、1μM、0.25μM、0.0625μM、0.015625μM、0.003906μM、0.0009765μM、0.0002441μM、0.00006104μM和0.00001526μM(以siRNA缀合物中的siRNA量计)共11个不同浓度的siRNA缀合物工作液。所用siRNA缀合物分别为上述制备获得的缀合物1、缀合物5、缀合物7、参比缀合物14、参比缀合物16和参比缀合物17。
对于每一siRNA缀合物，分别配制1A1-1A11溶液，每份1A1-1A11溶液依次分别含有上述11个浓度的siRNA工作液1μL、检测质粒工作液0.05μL(含检测质粒10ng)和8.95μL的Opti-MEM培养基。
配制1B溶液，每份1B溶液含有0.2μL LipofectamineTM 2000和9.8μL Opti-MEM培养基。
配制1C溶液，每份1C溶液含有检测质粒工作液0.05μL(含检测质粒10ng)和
9.95μL的Opti-MEM培养基。
分别将一份1B溶液与得到的一份每个siRNA缀合物的1A1-1A11溶液混合，分别室温下孵育20min，得到每个siRNA缀合物的转染复合物1X1-1X11。
将一份1B溶液与一份1C溶液混合，分别室温下孵育20min，得到空白转染复合物1Xa。
在培养孔中(均为上述含有HEK293A细胞和80μL Opti-MEM培养基的培养孔，下同)，分别加入每一siRNA缀合物的转染复合物1X1-1X11，均匀混合，加入量为20μL/孔，得到每个siRNA缀合物终浓度分别约为40nM、10nM、2.5nM、0.625nM、0.15625nM、0.03906nM、0.009765nM、0.002441nM、0.0006103nM、0.0001526nM、0.00003815nM(以siRNA缀合物中的siRNA量计)的转染复合物，每个siRNA缀合物的转染复合物1X1-1X11均转染3个培养孔，得到含siRNA缀合物的共转染混合物，记为测试组。
对于每一siRNA缀合物，在另外3个培养孔中，分别加入空白转染复合物1Xa，加入量为20μL/孔，得到不含siRNA缀合物的转染混合物，记为空白对照组。
分别将含siRNA缀合物的共转染混合物和不含siRNA缀合物的转染混合物在培养孔中转染4小时后，每孔补加100μL含20％FBS的H-DMEM完全培养基。将96孔板置于CO2培养箱在37℃、含5v/v％CO2的空气气氛下继续培养24小时。
[3]检测
吸去培养孔中的培养基，每孔加入150μL的Luciferase试剂与H-DMEM混合溶液(体积比1:1)，充分混匀，室温孵育10min后，转移120μL混合液到96孔酶标板上，使用Synergy II多功能酶标仪(BioTek公司)读取96孔酶标板上各培养孔中Firefly的化学发光值(Fir)；再向96孔酶标板上每孔加入60μLStop&试剂，充分混匀，室温孵育10min后，按照读取Fir的排布方式，使用酶标仪读取96孔酶标板上各培养孔中Renilla的化学发光值(Ren)。
计算96孔酶标板上每孔发光比值Ratio＝Ren/Fir，各测试组或对照组的发光比值Ratio(测试)或Ratio(对照)为三个培养孔Ratio的平均值；以对照组的发光比值为基准，对各测试组的发光比值进行归一化，获得Ratio(测试)/Ratio(对照)的比值R，以此表示Renilla报告基因的相对表达水平，即残留活性。siRNA对目标序列的抑制率＝(1-R)×100％。
依据转染了不同浓度的待测siRNA后，HEK293A细胞中Renilla的相对残留活性，利用Graphpad 5.0软件的非线性回归分析功能拟合log(inhibitor)vs.response—Variable slope(four parameters)剂量-效应曲线。
根据拟合的剂量-效应曲线对应的函数，计算待测siRNA靶向目标序列的IC50值，所述函数如下，
式中：
Y是比值R，即Renilla的相对残留活性，
X为转染siRNA浓度的对数值，
Bot是稳态期底部的Y值，
Top是稳态期顶部的Y值，
X'是当Y在底部到顶部之间一半时对应的X值，而HillSlope则是曲线在X'处
的斜率。
由该剂量-效应曲线和对应的函数，确定当Y＝50％时对应的X50值，计算获得各siRNA的脱靶IC50值＝10^X50(nM)，在所测定的浓度范围内，缀合物5的脱靶目标序列抑制率始终未高于50％，即，完全未发生脱靶，IC50值总结于表3中。
表3 siRNA缀合物在psi-CHECK系统中的脱靶IC50
由表3结果可知，本公开的siRNA缀合物显示出与其序列相同、但不包含稳定化修饰核苷酸的参比缀合物相比更高的脱靶IC50，即，本公开的siRNA缀合物具有显著降低的脱靶效应。
实验例2 siRNA缀合物在体外psi-CHECK系统中对在靶目标序列的抑制活性
按照实验例1的方法，测试了缀合物2和参比缀合物14，缀合物3、缀合物4和参比缀合物15，缀合物6和参比缀合物16，缀合物8和参比缀合物17在体外psi-CHECK系统中在靶序列抑制活性。参比缀合物14是和缀合物2相比具有基本相同的序列组成、但不包含稳定化修饰核苷酸的siRNA缀合物；参比缀合物15是和缀合物3、缀合物4相比具有基本相同的序列组成、但不包含稳定化修饰核苷酸的siRNA缀合物，参比缀合物16是和缀合物6相比具有基本相同的序列组成、但不包含稳定化修饰核苷酸的siRNA缀合物，参比缀合物17是和缀合物8相比具有基本相同的序列组成、但不包含稳定化修饰核苷酸的siRNA缀合物。区别仅在于缀合物2、缀合物3、缀合物4、缀合物6、缀合物8分别使用如下所示的目标序列4-7：
缀合物2和参比缀合物14对应以下目标序列4：
5’-TGCTGAGAAGATTGACAGGTT-3’
(SEQ ID NO:235)
缀合物3、缀合物4和参比缀合物15对应以下目标序列5：
5’-CCTCAACTGGATGAAGAAACT-3’
(SEQ ID NO:236)
缀合物6和参比缀合物16对应以下目标序列6：
5’-GGAGGCAAGAACCAGTGTTTA-3’
(SEQ ID NO:237)
缀合物8和参比缀合物17对应以下目标序列7：
5’-TGGGTTTTAAAATTAAAGTAT-3’
(SEQ ID NO:238)
上述目标序列分别包含与对应siRNA缀合物中siRNA反义链完全反向互补的核苷酸序列，因此对目标序列的抑制效果能够反映siRNA对AGTmRNA的抑制效果。
按照实验例1的方法，由该剂量-效应曲线和对应的函数，确定当Y＝50％时对应的X50值，计算获得各siRNA的IC50值＝10^X50(nM)。其结果如下表4所示：
表4 siRNA缀合物在psi-CHECK系统中的IC50
由表4的结果可知，本公开的siRNA缀合物在体外psi-CHECK系统中有很高的目标序列抑制活性。同时，本公开的siRNA缀合物与其序列相同、但不包含稳定化修饰核苷酸的参比缀合物相比，缀合物2、缀合物3、缀合物4、缀合物6和缀合物8的IC50均下降约50％，即与参比缀合物相比，缀合物2、缀合物3、缀合物4、缀合物6和缀合物8活性提高约1倍。
实验例1和实验例2的结果表明，与不含稳定化修饰核苷酸的参比缀合物相比，本公开的siRNA缀合物在具有更低的脱靶效应的同时，还能显著提高对目标序列的抑制活性，表现出优异的成药前景。
实验例3本公开的缀合物在体外(in vitro)的抑制活性
本实验例考察了缀合物2-8和参比制备例2-4中得到的参比缀合物15-4或参比缀合物NC在体外Huh-7细胞中对AGT基因的抑制活性。
具体步骤如下：
[1]细胞培养
使用添加有10％胎牛血清(FBS，RMBIO公司)的DMEM培养基(HyClone公司)，于37℃在含5％CO2/95％空气的培养箱中培养Huh-7人肝癌细胞(购自上海弘顺生物科技有限公司)。
将Huh-7细胞以1.5×105细胞/孔接种于12孔板中，每孔1mL细胞液，培养16h后，吸尽培养孔中培养基，向每孔中另外加入1mL Opti-MEM培养基(GIBCO公司)，继续培养1.5h。
[2]转染
对于每一待测siRNA缀合物，用PBS配制成浓度为20μM(以缀合物中siRNA的量计)的缀合物工作液。所使用的待测siRNA缀合物分别是缀合物3、缀合物4、缀合物5、缀合物6、、缀合物7、缀合物8、参比缀合物14、参比缀合物15、参比缀合物16或参比缀合物NC。
配制3A溶液，每份3A溶液含有3μL缀合物工作液和97μL细胞维持培养基。
配制3B溶液，每份3B溶液含有2μL LipofectamineTM 2000(Invitrogen公司)，和98μL Opti-MEM培养基。
对于每一缀合物，分别将一份3A溶液和一份3B溶液混合得到转染复合物3X1。在培养孔中(均为上述含有Huh-7细胞和1mL Opti-MEM培养基的培养孔，下同)，分别加入每一siRNA缀合物的转染复合物3X1，均匀混合，加入量为200μL/孔，得到浓度为50nM(以siRNA的量计)的转染混合物。每个siRNA缀合物的转染复合物3X1分别转染2个培养孔，得到含siRNA缀合物的转染混合物，记为测试组。
对于参比缀合物NC，分别将一份3A溶液和一份3B溶液混合得到转染复合物5X'。在培养孔中，加入参比缀合物NC的转染复合物3X'，均匀混合，加入量为200μL/孔，得到浓度为50nM(以siRNA的量计)的阴性对照转染复合物。参比缀合物NC的转染复合物3X'转染2个培养孔，得到含参比缀合物NC的转染混合物，记为阴性对照组。
将一份3B溶液与100μL细胞维持培养基混合，得到空白转染混合物3X2。在另外培养孔中，分别加入空白转染混合物3X2，加入量为200μL/孔，得到不含siRNA缀合物的转染混合物，记为空白对照组。
将上述测试组、空白对照组和阴性对照组置于含5％CO2的空气气氛下的培养箱中，在37℃下继续培养24h。
[3]检测
使用离心柱式总RNA抽提试剂盒(购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：B511361-0100)，根据说明书记载的方法分别提取各孔细胞中的总RNA。
对于每孔细胞，分别取1μg总RNA，使用反转录试剂盒GoldenstarTM RT6cDNA Synthesis Kit(购自北京擎科新业生物技术有限公司，货号TSK301M)提供的试剂，其中选取GoldenstarTM Oligo(dT)15作为引物，按试剂盒说明书中反转录操作步骤配置反转录反应体系20μL，对各孔细胞的总RNA进行反转录。反转录的条件为：对于每一反转录反应体系，将反转录反应体系置于70℃孵育10min，然后在42℃孵育30min，最后95℃孵育5min，反应结束后，向反转录反应体系中加入DEPC水80μL，得到含cDNA的溶液。
对于每一反转录反应体系，分别取上述含cDNA的溶液5μL做模板，使用SYBR qPCR SuperMix Plus试剂盒(购自近岸蛋白质科技有限公司，货号E096-01B)提供的试剂配置qPCR反应体系20μL，其中，用于扩增目标基因AGT和内参基因GAPDH的PCR引物序列如表3所示，每条引物的终浓度为10μM。将各qPCR反应体系置于ABI StepOnePlus Real-Time PCR仪上，使用三步法进行扩增，扩增程序为95℃预变性10min，然后95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重复上述变性、退火、延伸的过程共40次后，得到含有扩增了目标基因AGT和内参基因GAPDH的产物W1。产物W1随即依次经过95℃15s，60℃1min，梯度升温至95℃并每0.3℃采集一次荧光信号，95℃15s，实时荧光定量PCR仪分别收集产物W1中目标基因和内参基因GAPDH的溶解曲线，得到目标基因AGT和内参基因GAPDH的Ct值。
表5引物信息
采用比较Ct(ΔΔCt)法，对各测试组中目标基因AGT mRNA的表达水平进行相对定量计算，计算方法如下：
ΔCt(测试组)＝Ct(测试组目标基因)–Ct(测试组内参基因)
ΔCt(对照组)＝Ct(对照组目标基因)–Ct(对照组内参基因)
ΔΔCt(测试组)＝ΔCt(测试组)-ΔCt(对照组平均)
ΔΔCt(对照组)＝ΔCt(对照组)-ΔCt(对照组平均)
其中，ΔCt(对照组平均)是对照组两个培养孔各自的ΔCt(对照组)的算术平均值。从而，测试组和对照组的每一培养孔均对应一个ΔΔCt值。
以对照组平均值为基准，对测试组AGT mRNA的表达水平进行归一化，定义对照组AGT mRNA表达水平平均值为100％，
测试组AGT mRNA相对表达水平＝2-ΔΔCt(测试组)×100％
测试组AGT mRNA抑制率＝(1-测试组AGT mRNA相对表达水平)×100％
图1是显示了转染50nM浓度的本公开的siRNA缀合物和参比siRNA缀合物后，体外Huh-7人肝癌细胞中的AGT mRNA相对表达水平的柱状图。进一步地，各siRNA缀合物对AGT mRNA的抑制活性计算总结于表6中：
表6 siRNA缀合物Huh-7细胞中对AGT mRNA的抑制活性
根据表6或者如图1中的实验结果，可以看出50nM浓度的条件下本公开的siRNA
缀合物和参比缀合物在体外Huh7细胞中均显示出较高的AGT mRNA抑制活性。结果表明，参比缀合物NC对AGT mRNA几乎未显示出抑制效果；本公开的缀合物3-8在50nM浓度时，都具有较好的体外抑制活性，特别是缀合物7，抑制活性高达81％。与其序列相同、但不包含稳定化修饰核苷酸的参比缀合物相比，本公开提供的缀合物对AGT mRNA抑制活性均不低于参比缀合物，并且缀合物4、缀合物5、缀合物6、缀合物7、缀合物8对AGT mRNA抑制活性明显增强。
实验例4本公开的缀合物9-13在体外(in vitro)的抑制活性
本实验例考察了缀合物9-13和参比缀合物NC在体外Huh-7细胞中对AGT mRNA的抑制活性。
按照实验例3的方法，进行细胞培养。
用PBS将每一种待测siRNA缀合物分别配制成1.2μM、0.12μM、0.012μM(以siRNA缀合物中的siRNA量计)的工作液。所使用的待测siRNA缀合物分别是缀合物9、缀合物10、缀合物11、缀合物12、缀合物13和参比缀合物NC。
配制4A溶液，每份4A溶液含有3μL缀合物工作液和97μL细胞维持培养基。
配制4B溶液，每份4B溶液含有2μL LipofectamineTM 2000(Invitrogen公司)，和98μL Opti-MEM培养基。
对于每一缀合物，分别将一份4A溶液和一份4B溶液混合得到转染复合物4X1。
在两个培养孔中(均为上述含有Huh-7细胞和1mL Opti-MEM培养基的培养孔，下同)，分别加入每一siRNA缀合物的转染复合物4X1，均匀混合，加入量为200μL/孔，得到浓度为3nM、0.3nM和0.03nM(以siRNA的量计)的转染混合物，得到含siRNA缀合物的转染混合物，记为测试组。
对于参比缀合物NC，分别将一份4A溶液和一份4B溶液混合得到转染复合物4X2。
在两个培养孔中(均为上述含有Huh-7细胞和1mL Opti-MEM培养基的培养孔，下同)，加入参比缀合物NC的转染复合物4X2，均匀混合，加入量为200μL/孔，得到浓度为3nM(以siRNA的量计)的阴性对照转染复合物，得到含参比缀合物NC的转染混合物，记为阴性对照组。
将一份4B溶液与100μL细胞维持培养基混合，得到空白转染混合物4X0。
在另外两个培养孔中(均为上述含有Huh-7细胞和1mL Opti-MEM培养基的培养孔，下同)，分别加入空白转染混合物4X0，加入量为200μL/孔，得到不含siRNA缀合物的转染混合物，记为空白对照组。
将上述测试组、空白对照组和阴性对照组在培养孔中培养4h后，吸去各培养孔中的上清液，向每孔中加入1mL Opti-MEM培养基，置于CO2培养箱中继续在37℃下培养24h。
采用和实验例3中相同的方法提取各孔细胞中的总RNA和反转录并对各测试组中目标AGT mRNA进行相对定量计算。各个siRNA缀合物在Huh7细胞中对AGT mRNA的
抑制率结果如图2所示。
图2是显示了转染3nM和0.3nM浓度的本公开的siRNA缀合物后，体外Huh-7人肝癌细胞中的AGT mRNA相对表达水平的柱状图。图2的结果表明，在3nM浓度下，缀合物9-13的AGT mRNA抑制率均大于72.6％，在0.3nM的低浓度下，缀合物9-13的AGT mRNA抑制率也达到64.0％以上，显示出优异的抑制AGT mRNA表达的效果。
实验例5 siRNA缀合物在hAGT转基因小鼠体内的活性效果
将制备例9-13制备获得的缀合物9-13用PBS溶解为0.6mg/kg的溶液(以siRNA计)。
将hAGT转基因小鼠(雌性，16-18g重，6-8周龄，由华东理工大学构建转基因动物模型)随机分为6组，每组6只小鼠，分别编号。
以颈背部皮下注射的方式，向每组小鼠分别给予上述siRNA缀合物溶液，给药前称重并记录体重，按体重给药，单次给药容积为5μL/g小鼠体重，计算可知单次给药剂量为3mg/kg。另外向一组每只小鼠分别给予PBS，单次给药体积为5μL/g，作为空白对照组。
以给药时间点作为第1天计算，在给药后第14天取测试组和空白对照组每只小鼠的肝组织，用RNAlater保存。
采用和实验例1中相同的方法提取各孔细胞中的总RNA和反转录并对各测试组中目标基因AGT mRNA进行相对定量计算，区别仅在于，使用的引物信息如下表7所示。结果如图3所示。
表7引物信息
图3是显示了在给予3mg/kg的本公开的siRNA缀合物后，小鼠体内的AGT mRNA相对表达水平的柱状图。由图3的结果可见，与空白对照组相比，给予本公开的siRNA缀合物后，小鼠体内肝细胞中均显示出优异的AGT mRNA的抑制率，其中缀合物12的AGT mRNA抑制率可达88.36％，缀合物9的AGT mRNA抑制率高达90.42％，显示出优异的AGT mRNA抑制活性。
实验例5 siRNA缀合物在hAGT-SEAP模型小鼠体内的活性
将C57BL/6小鼠(雌性，16-18g重，6-8周龄，购自于斯贝福公司)，随机分为6组，每组6只。
用PBS将上述制备的缀合物9、缀合物10、缀合物11、缀合物12以及缀合物13分别配制为0.6mg/mL的溶液(以siRNA计)。SEAP质粒造模前3天给药，以颈背部皮下注射的方式，向每组小鼠分别给予上述siRNA缀合物溶液，给药前称重并记录体重，按体重
给药，单次给药容积为5μL/g小鼠体重，计算可知单次给药剂量为3mg/kg。另外向一组每只小鼠分别给予PBS，单次给药体积为5μL/g，作为空白对照组。
将上述各组C57BL/6小鼠用SEAP质粒在体内进行瞬时转染。该质粒含有插入SEAP(分泌型碱性磷酸酶，购自北京原平皓生物技术有限公司)报告基因的3'UTR内的AGT cDNA序列(Genbank注册号NM_001384479.1)。将SEAP质粒用生理盐水稀释至0.05mg/ml。将上述6组每一只小鼠用异氟烷麻醉后通过眼眶静脉高压注射SEAP质粒，注射时长控制在5-7s左右，注射体积100ul/g。于造模前(-1天)和造模后4天，8天和12天，分别通过眼眶对每只小鼠采血约100ul，37℃温育30min，分离血清后-20℃冻存备检。
根据说明书，通过Phospha‐Light TM SEAP Reporter Gene Assay System(Invitrogen)对上述冻存的血清进行测量。每只动物的血清SEAP水平用空白对照组小鼠的血清样本进行标准化。具体来说，首先，将每只动物在各时间点的SEAP水平除以该动物的治疗前(第-1天)血清SEAP水平，从而确定“针对治疗前标准化”的表达比率。然后通过将每只动物的“针对治疗前标准化”的比率，除以PBS对照组中所有小鼠的平均“针对治疗前标准化”的比率，将在各时间点的表达针对空白对照组进行标准化，获得每只小鼠在各个时间点的SEAP相对表达水平。根据各组小鼠在各个时间点的SEAP相对表达水平的算术平均值S，
siRNA对AGT mRNA的抑制率＝(1-S)×100％。
图4是显示了在给予3mg/kg的本公开的siRNA缀合物后，SEAP模型小鼠体内的SEAP浓度的随时间变化的折线图。由图4显示的结果，按照上述方法计算siRNA对AGT mRNA的抑制率。结果表明，与空白对照组相比，在第4、8和12天，缀合物9-13的SEAP均明显降低。其中，缀合物9在全部测试时间内均表现出特别高的AGT mRNA的抑制率，在第8天抑制率达到94.42％。上述结果表明，本公开的缀合物能够在人AGT转基因小鼠体内显著降低AGT mRNA水平，从而能够治疗AGT mRNA相关疾病、例如高血压症，具有良好的应用前景。
以上详细描述了本公开的一些实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述一些实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
Claims (51)
- 一种siRNA，所述siRNA包含正义链和反义链，所述正义链包含核苷酸序列I，所述反义链包含核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II均由19个核苷酸组成，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II中的每一个核苷酸均为修饰或未修饰的核苷酸，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，所述核苷酸序列II至少部分地与第一段核苷酸序列反向互补，所述第一段核苷酸序列为AGT基因表达的mRNA中的一段长度为19个核苷酸的核苷酸序列，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3-6个核苷酸中的至少1个为稳定化修饰核苷酸，所述稳定化修饰核苷酸指核苷酸的核糖2'位羟基被稳定化修饰基团取代的核苷酸，与相应位置的核苷酸为未修饰的核苷酸的siRNA相比，包含所述稳定化修饰核苷酸的siRNA的热稳定性增加，并且所述稳定化修饰基团的空间位阻大于2'-O-甲基。
- 如权利要求1所述的siRNA，其中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第3个或第5个核苷酸为所述稳定化修饰核苷酸。
- 如权利要求1或2所述的siRNA，其中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中第3-9个核苷酸中不超过2个核苷酸为所述稳定化修饰核苷酸。
- 如权利要求1-3中任意一项所述的siRNA，其中，所述siRNA的热稳定性增加是指所述siRNA的Tm升高，Tm为siRNA的双链热解离温度。
- 如权利要求4所述的siRNA，其中，所述siRNA的热稳定性增加是指所述siRNA的Tm升高至少0.05℃。
- 如权利要求4所述的siRNA，其中，所述siRNA的热稳定性增加是指所述siRNA的Tm升高0.1-6℃。
- 如权利要求4所述的siRNA，其中，所述siRNA的热稳定性增加是指所述siRNA的Tm升高0.5-4℃。
- 如权利要求1-7中任意一项所述的siRNA，其中，每个所述稳定化修饰基团独立地具有-X-R所示的结构，其中，X为O、NR'、S或SiR'2；R是C2-C6烷基、取代的C2-C6烷基、C6-C8芳基、取代的C6-C8芳基中的一种，每个R'独立地是H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C6-C8芳基、取代的C6-C8芳基中的一种，所述取代的C2-C6烷基、取代的C6-C8芳基或 取代的C1-C6烷基是指C2-C6烷基、C6-C8芳基或C1-C6烷基中的一个或多个氢原子被取代基取代而形成的基团，所述取代基选自以下取代基中的一种或多种：C1-C3烷基、C6-C8芳基、C1-C3烷氧基、卤素、氧亚基和硫亚基。
- 如权利要求8所述的siRNA，其中，每个所述稳定化修饰基团独立地选自2'-O-甲氧基乙基、2'-O-烯丙基、2'-烯丙基、2'-O-2-N-甲基氨基-2-氧亚基乙基、2'-O-2-N,N-二甲基氨基乙基、2'-O-3-氨基丙基和2'-O-2,4-二硝基苯基中的一种。
- 如权利要求9所述的siRNA，其中，每个所述稳定化修饰基团为2'-O-甲氧基乙基。
- 如权利要求1-10中任意一项所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5'-CUGAGAAGAUUGACAGGUZa1-3'(SEQ ID NO:1)；
5'-Za2ACCUGUCAAUCUUCUCAG-3'(SEQ ID NO:2),其中，所述Za1为U,Za2为A，所述核苷酸序列I中包含位置对应于Za1的核苷酸Za3，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Za2的核苷酸Za4，所述Za4是所述反义链5'末端的第一个核苷酸；或者，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5'-UCAACUGGAUGAAGAAACZb1-3'(SEQ ID NO:27)；
5'-Zb2GUUUCUUCAUCCAGUUGA-3'(SEQ ID NO:28),其中Zb1为U,Zb2为A，所述核苷酸序列I中包含位置对应于Zb1的核苷酸Zb3，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Zb2的核苷酸Zb4，所述Zb4是所述反义链5'末端的第一个核苷酸；或者，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:53所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:54所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5'-AGGCAAGAACCAGUGUUUZc1-3'(SEQ ID NO:53)；
5'-Zc2AAACACUGGUUCUUGCCU-3'(SEQ ID NO:54),其中Zc1为A,Zc2为U，所述核苷酸序列I中包含位置对应于Zc1的核苷酸Zc3，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Zc2的核苷酸Zc4，所述Zc4是所述反义链5'末端的第一个核苷酸；或者，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:79所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个 核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:80所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5'-GGUUUUAAAAUUAAAGUAZd1-3'(SEQ ID NO:79)；
5'-Zd2UACUUUAAUUUUAAAACC-3'(SEQ ID NO:80),其中Zd1为U,Zd2为A，所述核苷酸序列I中包含位置对应于Zd1的核苷酸Zd3，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Zd2的核苷酸Zd4，所述Zd4是所述反义链5'末端的第一个核苷酸；或者，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:105所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:106所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5'-GUUUCUCCUUGGUCUAAGZe1-3'(SEQ ID NO:105)；
5'-Ze2CUUAGACCAAGGAGAAAC-3'(SEQ ID NO:106),其中Ze1为U,Ze2为A，所述核苷酸序列I中包含位置对应于Ze1的核苷酸Ze3，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Ze2的核苷酸Ze4，所述Ze4是所述反义链5'末端的第一个核苷酸；或者，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:131所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:132所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5'-GAGGCAAGAACCAGUGUUZf1-3'(SEQ ID NO:131)；
5'-Zf2AACACUGGUUCUUGCCUC-3'(SEQ ID NO:132),其中Zf1为U,Zf2为A，所述核苷酸序列I中包含位置对应于Zf1的核苷酸Zf3，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Zf2的核苷酸Zf4，所述Zf4是所述反义链5'末端的第一个核苷酸；或者，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:157所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:158所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5'-CGACCAGCUUGUUUGUGAZg1-3'(SEQ ID NO:157)；
5'-Zg2 UCACAAACAAGCUGGUCG-3'(SEQ ID NO:158),其中Zg1为A,Zg2为U，所述核苷酸序列I中包含位置对应于Zg1的核苷酸Zg3，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Zg2的核苷酸Zg4，所述Zg4是所述反义链5'末端的第一个核苷酸；或者，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:183所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:184所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5'-GUUUGUGAAACAAAAAAGZh1-3'(SEQ ID NO:183)；
5'-Zh2CUUTUUUGUUUCACAAAC-3'(SEQ ID NO:184),其中Zh1为U,Zh2为A，所述核苷酸序列I中包含位置对应于Zh1的核苷酸Zh3，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Zh2的核苷酸Zh4，所述Zh4是所述反义链5'末端的第一个核苷酸。 - 如权利要求11所述的siRNA，其中，所述核苷序列I与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异；或者，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异；或者，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:53所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:54所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异；或者，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:79所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:80所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异；或者，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:105所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:106所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异；或者，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:131所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:132所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异；或者，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:157所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:158所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异；或者，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:183所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:184所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异。
- 如权利要求12所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列之间的差异包括Za4位置处的差异，且Za4选自U、G或C；或者，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列之间的差异包括Zb4位置处的差异，且Zb4选自U、G或C；或者，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:54所示的核苷酸序列之间的差异包括Zc4位 置处的差异，且Zc4选自A、G或C；或者，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:80所示的核苷酸序列之间的差异包括Zd4位置处的差异，且Zd4选自U、G或C；或者，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:106所示的核苷酸序列之间的差异包括Ze4位置处的差异，且Ze4选自U、G或C；或者，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:132所示的核苷酸序列之间的差异包括Zf4位置处的差异，且Zf4选自U、G或C；或者，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:158所示的核苷酸序列之间的差异包括Zg4位置处的差异，且Zg4选自A、G或C；或者，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:184所示的核苷酸序列之间的差异包括Zh4位置处的差异，且Zh4选自U、G或C。
- 如权利要求1-13中任意一项所述的siRNA，其中，所述Za3是与Za4互补的核苷酸；或者所述Zb3是与Zb4互补的核苷酸；或者所述Zc3是与Zc4互补的核苷酸；或者所述Zd3是与Zd4互补的核苷酸；或者所述Ze3是与Ze4互补的核苷酸；或者所述Zf3是与Zf4互补的核苷酸；或者所述Zg3是与Zg4互补的核苷酸；或者所述Zh3是与Zh4互补的核苷酸。
- 如权利要求1-14中任意一项所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列II与所述第一段核苷酸序列基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补；所述基本上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于3个碱基的错配；所述实质上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个碱基的错配；所述完全反向互补是指两个核苷酸序列之间没有错配。
- 如权利要求15所述的siRNA，其中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3-19位的核苷酸与所述第一段核苷酸序列第1-17位的核苷酸完全反向互补。
- 如权利要求16所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列II与所述核苷酸序列I完全反向互补；或者按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2个核苷酸与按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2个核苷酸之间存在碱基错配。
- 如权利要求1-17中任意一项所述的siRNA，其中，所述正义链和反义链长度相同或不同，所述正义链的长度为19-23个核苷酸，反义链的长度为19-26个核苷酸。
- 如权利要求1-18中任意一项所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列II中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第2、6、14、 16个核苷酸，如果不是所述稳定化修饰核苷酸的话，为2'-氟代修饰的核苷酸，所述核苷酸序列II中的其它核苷酸各自独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种。
- 如权利要求1-19中任意一项所述的siRNA，其中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的第7-9个核苷酸为2'-氟代修饰的核苷酸。
- 如权利要求20所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列I中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的第7-9个核苷酸为2'-氟代修饰的核苷酸，所述核苷酸序列I中的其它核苷酸各自独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种。
- 如权利要求1-21中任意一项所述的siRNA，其中，所述正义链还含有核苷酸序列III，所述反义链还含有核苷酸序列IV，所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV的每个核苷酸独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种且不是所述稳定化修饰核苷酸，所述核苷酸序列III的长度为1个、2个、3个或4个核苷酸，所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III长度相等，并且所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III实质上反向互补或完全反向互补，所述核苷酸序列III连接在所述核苷酸序列I的5'末端，所述核苷酸序列IV连接在所述核苷酸序列II的3'末端，并且所述核苷酸序列IV与第二段核苷酸序列实质上反向互补或完全反向互补，该第二段核苷酸序列是指和AGT mRNA中与第一段核苷酸序列的5'末端相邻、且长度与所述核苷酸序列IV相同的核苷酸序列。
- 如权利要求22所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸的差异，并且，所述核苷酸序列III和IV的长度均为1个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基为G，核苷酸序列IV的碱基为C；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为UG，所述核苷酸序列IV的碱基组成为CA；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为CUG，所述核苷酸序列IV的碱基组成为CAG；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为GCUG，所述核苷酸序列IV的碱基组成为CAGC；或者，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸的差异，并且，所述核苷酸序列III和IV的长度均为1个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基为C，核苷酸序列IV的碱基为G；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为CC，所述核苷酸序列IV的碱基组成为GG；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为CCC，所述核苷酸序列IV的碱基组成为GGG；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸，所述核苷酸III的碱基组成为UCCC，所述核苷酸序列IV的碱基组成为 GGGA；或者，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:53所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸的差异，并且，所述核苷酸序列III和IV的长度均为1个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基为G，核苷酸序列IV的碱基为C；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为GG，所述核苷酸序列IV的碱基组成为CC；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为GGG，所述核苷酸序列IV的碱基组成为CCC；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸，所述核苷酸III的碱基组成为GGGG，所述核苷酸序列IV的碱基组成为CCCC；或者，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:79所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸的差异，并且，所述核苷酸序列III和IV的长度均为1个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基为G，核苷酸序列IV的碱基为C；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为UG，所述核苷酸序列IV的碱基组成为CA；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为UUG，所述核苷酸序列IV的碱基组成为CAA；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸，所述核苷酸III的碱基组成为AUUG，所述核苷酸序列IV的碱基组成为CAAU；或者，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:105所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸的差异，并且，所述核苷酸序列III和IV的长度均为1个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基为C，核苷酸序列IV的碱基为G；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为CC，所述核苷酸序列IV的碱基组成为GG；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为GCC，所述核苷酸序列IV的碱基组成为GGC；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸，所述核苷酸III的碱基组成为AGCC，所述核苷酸序列IV的碱基组成为GGCU；或者，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:131所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸的差异，并且，所述核苷酸序列III和IV的长度均为1个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基为G，核苷酸序列IV的碱基为C；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为GG，所述核苷酸序列IV的碱基组成为CC；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为GGG，所述核苷酸序列IV的碱基组成为CCC；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸，所述核苷酸III的碱基组成为UGGG，所述核苷酸序列IV的碱基组成为CCCA；或者，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:157所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸的差异，并且，所述核苷酸序列III和IV的长度均为1个核苷酸，所述核苷酸序列 III的碱基为C，核苷酸序列IV的碱基为G；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为AC，所述核苷酸序列IV的碱基组成为GU；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为AAC，所述核苷酸序列IV的碱基组成为GUU；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸，所述核苷酸III的碱基组成为CAAC，所述核苷酸序列IV的碱基组成为GUUG；或者，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:183所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸的差异，并且，所述核苷酸序列III和IV的长度均为1个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基为U，核苷酸序列IV的碱基为A；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为UU，所述核苷酸序列IV的碱基组成为AA；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基组成为CUU，所述核苷酸序列IV的碱基组成为AAG；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸，所述核苷酸III的碱基组成为GCUU，所述核苷酸序列IV的碱基组成为AAGC。
- 如权利要求1-23中任意一项所述的siRNA，其中所述siRNA还含有寡核苷酸序列V，所述寡核苷酸序列V的每个核苷酸独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种且不是所述稳定化修饰核苷酸，所述核苷酸序列V的长度为1至3个核苷酸，连接在所述反义链的3'末端，从而构成所述反义链的3'突出端。
- 如权利要求24所述的siRNA，其中所述核苷酸序列V的长度为2个核苷酸，并且按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列V为连续的2个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸、连续的2个尿嘧啶核糖核苷酸、或者与第三段核苷酸序列完全反向互补的序列，所述第三段核苷酸序列是指AGT mRNA中与第一段核苷酸序列的5'末端或第二段核苷酸序列的5'末端相邻、并且长度与所述核苷酸序列V相等的核苷酸序列。
- 如权利要求25所述的siRNA，其中，所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述第三段核苷酸序列的碱基组成是UG；或者，所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列，所述第三段核苷酸序列的碱基组成是CC；或者，所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:53所示的核苷酸序列，所述第三段核苷酸序列的碱基组成是GG；或者，所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:79所示的核苷酸序列，所述第三段核苷酸序列的碱基组成是UG；或者，所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:105所示的核苷酸序列，所述第三段核苷酸序列的碱基组成是CC；或者，所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:131所示的核苷酸序列，所述第三段核苷酸序列的碱基组成是GG；或者，所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:157所示的核苷酸序列，所述第三段核苷酸序列的碱基 组成是AC；或者，所述第一段核苷酸序列具有SEQ ID NO:183所示的核苷酸序列，所述第三段核苷酸序列的碱基组成是UU。
- 如权利要求1-26中任意一项所述的siRNA，其中，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列：
5'-CUGAGAAGAUUGACAGGUZa3-3'(SEQ ID NO:3)；
5'-Za4ACCUGUCAAUCUUCUCAGCA-3'(SEQ ID NO:4),其中，所述Za4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Za3选自A、U、G或C，并且Za3是与Za4互补的核苷酸；或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列：
5'-UGCUGAGAAGAUUGACAGGUZa3-3'(SEQ ID NO:5)；
5'-Za4ACCUGUCAAUCUUCUCAGCAGC-3'(SEQ ID NO:6),其中，所述Za4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Za3选自A、U、G或C，并且Za3是与Za4互补的核苷酸；或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:29所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列：
5'-UCAACUGGAUGAAGAAACZb3-3'(SEQ ID NO:29)；
5'-Zb4GUUUCUUCAUCCAGUUGAGG-3'(SEQ ID NO:30),其中，所述Zb4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Zb3选自A、U、G或C，并且Zb4是与Zb3互补的核苷酸；或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:31所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:32所示的核苷酸序列：
5'-CCUCAACUGGAUGAAGAAACZb3-3'(SEQ ID NO:31)；
5'-Zb4GUUUCUUCAUCCAGUUGAGGGA-3'(SEQ ID NO:32),其中，所述Zb4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Zb3选自A、U、G或C，并且Zb4是与Zb3互补的核苷酸；或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:55所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:56所示的核苷酸序列：
5'-AGGCAAGAACCAGUGUUUZc3-3'(SEQ ID NO:55)；
5'-Zc4AAACACUGGUUCUUGCCUCC-3'(SEQ ID NO:56),其中，所述Zc4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Zc3选自A、U、G或C，并且Zc4是与Zc3互补的核苷酸；或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:57所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:58所示的核苷酸序列：
5'-GGAGGCAAGAACCAGUGUUUZc3-3'(SEQ ID NO:57)；
5'-Zc4AAACACUGGUUCUUGCCUCCCC-3'(SEQ ID NO:58),其中，所述Zc4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Zc3选自A、U、G或C，并且Zc4是与Zc3互补的核苷酸；或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:81所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:82所示的核苷酸序列：
5'-GGUUUUAAAAUUAAAGUAZd3-3'(SEQ ID NO:81)；
5'-Zd4UACUUUAAUUUUAAAACCCA-3'(SEQ ID NO:82),其中，所述Zd4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Zd3选自A、U、G或C，并且Zd4是与Zd3互补的核苷酸；或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:83所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:84所示的核苷酸序列：
5'-UGGGUUUUAAAAUUAAAGUAZd3-3'(SEQ ID NO:83)；
5'-Zd4UACUUUAAUUUUAAAACCCAAU-3'(SEQ ID NO:84),其中，所述Zd4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Zd3选自A、U、G或C，并且Zd4是与Zd3互补的核苷酸；或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:107所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:108所示的核苷酸序列：
5'-GUUUCUCCUUGGUCUAAGZe3-3'(SEQ ID NO:107)；
5'-Ze4CUUAGACCAAGGAGAAACGG-3'(SEQ ID NO:108),其中，所述Ze4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Ze3选自A、U、G或C，并且Ze4是与Ze3互补的核苷酸；或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:109所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:110所示的核苷酸序列：
5'-CCGUUUCUCCUUGGUCUAAGZe3-3'(SEQ ID NO:109)；
5'-Ze4CUUAGACCAAGGAGAAACGGCU-3'(SEQ ID NO:110),其中，所述Ze4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Ze3选自A、U、G或C，并且Ze4是与Ze3互补的核苷酸；或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:133所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:134所示的核苷酸序列：
5'-GAGGCAAGAACCAGUGUUZf3-3'(SEQ ID NO:133)；
5'-Zf4AACACUGGUUCUUGCCUCCC-3'(SEQ ID NO:134),其中，所述Zf4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Zf3选自A、U、G或C，并且Zf4是与Zf3互补的核苷酸；或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:135所示的核苷酸序列，所述siRNA 的反义链含有如SEQ ID NO:136所示的核苷酸序列：
5'-GGGAGGCAAGAACCAGUGUUZf3-3'(SEQ ID NO:135)；
5'-Zf4AACACUGGUUCUUGCCUCCCCA-3'(SEQ ID NO:136),其中，所述Zf4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Zf3选自A、U、G或C，并且Zf4是与Zf3互补的核苷酸；或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:159所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:160所示的核苷酸序列：
5'-CGACCAGCUUGUUUGUGAZg3-3'(SEQ ID NO:159)；
5'-Zg4UCACAAACAAGCUGGUCGGU-3'(SEQ ID NO:160),其中，所述Zg4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Zg3选自A、U、G或C，并且Zg4是与Zg3互补的核苷酸；或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:161所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:162所示的核苷酸序列：
5'-ACCGACCAGCUUGUUUGUGAZg3-3'(SEQ ID NO:161)；
5'-Zg4 UCACAAACAAGCUGGUCGGUUG-3'(SEQ ID NO:162),其中，所述Zg4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Zg3选自A、U、G或C，并且Zg4是与Zg3互补的核苷酸；或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:185所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:186所示的核苷酸序列：
5'-GUUUGUGAAACAAAAAAGZh3-3'(SEQ ID NO:185)；
5'-Zh4 CUUTUUUGUUUCACAAACAA-3'(SEQ ID NO:186),其中，所述Zh4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Zh3选自A、U、G或C，并且Zh4是与Zh3互补的核苷酸；或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:187所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:188所示的核苷酸序列：
5'-UUGUUUGUGAAACAAAAAAGZh3-3'(SEQ ID NO:187)；
5'-Zh4 CUUTUUUGUUUCACAAACAAGC-3'(SEQ ID NO:188),其中，所述Zh4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Zh3选自A、U、G或C，并且Zh4是与Zh3互补的核苷酸。 - 如权利要求1-27中任意一项所述的siRNA，其中，每一个非氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸、或核苷酸类似物中的一种。
- 如权利要求1-28中任意一项所述的siRNA，其中，不多于3个非氟代修饰的核苷酸 为2'-脱氧核苷酸，其余每一个非氟代修饰的核苷酸均为甲氧基修饰的核苷酸；或者，每一个非氟代修饰的核苷酸均为甲氧基修饰的核苷酸；所述甲氧基修饰的核苷酸指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
- 如权利要求1-29中任意一项所述的siRNA，其中，所述siRNA为siAGTa1-M1、siAGTa1-M2、siAGTa2-M1、siAGTa2-M2、siAGTb1-M1、siAGTb1-M2、siAGTb2-M1、siAGTb2-M2、AGTc1-M1、siAGTc1-M2、siAGTc2-M1、siAGTc2-M2、AGTd1-M1、siAGTd1-M2、siAGTd2-M1或siAGTd2-M2、siAGTe1-M1、siAGTe1-M2、siAGTe2-M1、siAGTe2-M2、siAGTf1-M1、siAGTf1-M2、siAGTf2-M1、siAGTf2-M2、AGTg1-M1、siAGTg1-M2、siAGTg2-M1、siAGTg2-M2、AGTh1-M1、siAGTh1-M2、siAGTh2-M1或siAGTh2-M2中的一种。
- 如权利要求1-30中任意一项所述的siRNA，其中，所述正义链和所述反义链中至少一条单链的磷酸-糖骨架中的至少1个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基，所述具有修饰基团的磷酸酯基存在于由以下位置组成的组中的至少一处：所述正义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；所述正义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；所述正义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；所述正义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；所述反义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；所述反义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；所述反义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；以及所述反义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间。
- 如权利要求31所述的siRNA，其中，所述siAGTa1-M1S、siAGTa1-M2S、siAGTa2-M1S、siAGTa2-M2S、siAGTb1-M1S、siAGTb1-M2S、siAGTb2-M1S、siAGTb2-M2S、siAGTc1-M1S、siAGTc1-M2S、siAGTc2-M1S、siAGTc2-M2S、AGTd1-M1S、siAGTd1-M2S、siAGTd2-M1S、siAGTd2-M2S、siAGTe1-M1S、siAGTe1-M2S、siAGTe2-M1S、siAGTe2-M2S、siAGTf1-M1S、siAGTf1-M2S、siAGTf2-M1S、siAGTf2-M2S、siAGTg1-M1S、siAGTg1-M2S、siAGTg2-M1S、siAGTg2-M2S、AGTh1-M1S、siAGTh1-M2S、siAGTh2-M1S或siAGTh2-M2S中的一种。
- 如权利要求1-32中任意一项所述的siRNA，其中，所述反义链的5'末端核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸。
- 如权利要求33所述的siRNA，其中，所述siRNA为siAGTa1-M1P、siAGTa1-M2P、siAGTa2-M1P、siAGTa2-M2P、siAGTb1-M1P、siAGTb1-M2P、siAGTb2-M1P、siAGTb2-M2P、siAGTc1-M1P、siAGTc1-M2P、siAGTc2-M1P、siAGTc2-M2P、siAGTd1-M1P、siAGTd1-M2P、siAGTd2-M1P、siAGTd2-M2P、siAGTe1-M1P、siAGTe1-M2P、siAGTe2-M1P、siAGTe2-M2P、siAGTf1-M1P、siAGTf1-M2P、siAGTf2-M1P、siAGTf2-M2P、siAGTg1-M1P、siAGTg1-M2P、siAGTg2-M1P、siAGTg2-M2P、siAGTh1-M1P、siAGTh1-M2P、siAGTh2-M1P或siAGTh2-M2P中的一种。
- 一种siRNA，所述siRNA包含正义链和反义链，所述正义链包含核苷酸序列I，所述反义链包含核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II均由19个核苷酸组成，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II中的每一个核苷酸独立地为修饰或未修饰的核苷酸，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，所述核苷酸序列II至少部分地与第一段核苷酸序列反向互补，所述第一段核苷酸序列为AGT mRNA中的一段长度为19个核苷酸的核苷酸序列，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3-6个核苷酸中的至少1个为2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸。
- 如权利要求35所述的siRNA，其中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第3个或第5个核苷酸为2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸。
- 如权利要求35或36所述的siRNA，其中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中第3-9个核苷酸中不超过2个核苷酸为2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸。
- 如权利要求35-37中任意一项所述的siRNA，其中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16个核苷酸，如果不是2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸的话，为2'-氟代修饰的核苷酸。
- 如权利要求38所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列II中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16个核苷酸，如果不是2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸的话，为2'-氟代修饰的核苷酸，所述核苷酸序列II中的其它核苷酸各自独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种。
- 如权利要求35-39中任意一项所述的siRNA，其中，所述正义链还含有核苷酸序列III，所述反义链还含有核苷酸序列IV，所述核苷酸序列III的每个核苷酸独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种，所述核苷酸序列IV的每个核苷酸独立地为非氟代修饰的核苷酸中的 一种且不是所述稳定化修饰核苷酸，所述核苷酸序列III的长度为1个、2个、3个或4个核苷酸，所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III长度相等，并且所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III实质上反向互补或完全反向互补，所述核苷酸序列III连接在所述核苷酸序列I的5'末端，所述核苷酸序列IV连接在所述核苷酸序列II的3'末端，并且所述核苷酸序列IV与第二段核苷酸序列实质上反向互补或完全反向互补，所述第二段核苷酸序列是指AGT mRNA中与第一段核苷酸序列相邻、且长度与所述核苷酸序列IV相同的核苷酸序列。
- 如权利要求35-40中任意一项所述的siRNA，其中所述siRNA还含有核苷酸序列V，所述核苷酸序列V的每个核苷酸独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种且不是2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸，所述核苷酸序列V的长度为1至3个核苷酸，连接在所述反义链的3'末端，从而构成所述反义链的3'突出端。
- 一种药物组合物，该药物组合物含有如权利要求1-41中任意一项所述的siRNA以及药学上可接受的载体。
- 一种siRNA缀合物，所述siRNA缀合物含有权利要求1-41中任意一项所述的siRNA以及缀合连接至该siRNA的缀合基团，所述缀合基团包含接头和药学上可接受的靶向基团，并且，所述siRNA、所述接头和所述靶向基团依次共价或非共价连接，每个所述靶向基团选自能够和细胞表面受体结合的配体。
- 如权利要求43所述的siRNA缀合物，所述siRNA缀合物为具有式(403)所示的结构的缀合物或其水可溶性盐，其中Nu是siAGTa1-M1S、siAGTa1-M2S、siAGTb1-M1S、siAGTb1-M2S、siAGTc1-M1S、siAGTc1-M2S、siAGTd1-M1S、siAGTd1-M2S、siAGTe1-M1S、siAGTe1-M2S、siAGTf1-M1S、siAGTf1-M2S、siAGTg1-M1S、siAGTg1-M2S、siAGTh1-M1S和siAGTh1-M2S中的一种所示的siRNA形成的siRNA基团，所述缀合基团连接至所述siRNA基团正义链3'末端核苷酸的核糖3'位。
- 如权利要求44所述的siRNA缀合物，其中，所述Nu中的每个所述稳定化修饰核苷酸均为核糖2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸。
- 如权利要求1-41中任意一项所述的siRNA、权利要求42所述的药物组合物和权利要求43-45中任意一项所述的siRNA缀合物中的一种或多种在制备用于治疗与AGT mRNA水平相关的疾病或者症状的药物中的用途。
- 如权利要求46所述的用途，其中所述与AGT基因表达的mRNA水平相关的疾病 或症状是高血压及高血压相关疾病。
- 一种治疗与AGT基因表达的mRNA水平相关的疾病或症状的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予有效量的权利要求1-41中任意一项所述的siRNA、权利要求42所述的药物组合物和权利要求43-45中任意一项所述的siRNA缀合物中的一种或多种。
- 如权利要求48所述的方法，其中，所述与AGT mRNA水平相关的疾病或症状是高血压及高血压相关疾病。
- 一种抑制细胞中AGT基因表达水平的方法，所述方法包括将有效量的权利要求1-41中任意一项所述的siRNA、权利要求42所述的药物组合物和权利要求43-45中任意一项所述的siRNA缀合物中的一种或多种与所述细胞接触。
- 一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1-41中任意一项所述的siRNA、权利要求42所述的药物组合物和权利要求43-45中任意一项所述的siRNA缀合物中的一种或多种。
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