WO2023284763A1 - 双链寡核苷酸、含双链寡核苷酸的组合物与缀合物及制备方法和用途 - Google Patents

双链寡核苷酸、含双链寡核苷酸的组合物与缀合物及制备方法和用途 Download PDF

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WO2023284763A1
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nucleotide
double
stranded oligonucleotide
nucleotides
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梁子才
张鸿雁
高山
李海涛
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苏州瑞博生物技术股份有限公司
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    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing

Definitions

  • the present disclosure relates to a double-stranded oligonucleotide with reduced off-target effects and pharmaceutical compositions and oligonucleotide conjugates containing the double-stranded oligonucleotide.
  • the present disclosure also relates to methods of preparation and use of these double-stranded oligonucleotides, pharmaceutical compositions and oligonucleotide conjugates.
  • the present disclosure provides a double-stranded oligonucleotide comprising a sense strand and an antisense strand, the sense strand comprising nucleotide sequence I, and the antisense strand comprising Nucleotide sequence II, the nucleotide sequence I and the nucleotide sequence II are both composed of 19 nucleotides, each core of the nucleotide sequence I and the nucleotide sequence II Nucleotides are modified or unmodified nucleotides, the nucleotide sequence I and the nucleotide sequence II are at least partly reverse complementary to form a double-stranded region, and the nucleotide sequence II is at least partly with the second nucleotide sequence A nucleotide sequence is reverse complementary, and the first nucleotide sequence is a 19-nucleotide nucleotide sequence in the mRNA expressed by the target gene; according to the sequence from the 5' end to the 3' end direction, at
  • the present disclosure also provides a pharmaceutical composition, which contains the double-stranded oligonucleotide provided in the present disclosure and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present disclosure also provides a method for treating and/or preventing diseases or symptoms related to the mRNA level of target gene expression, the method comprising administering the double-stranded oligosaccharide of the present disclosure to a subject in need thereof.
  • Nucleotides, pharmaceutical compositions and/or oligonucleotide conjugates are provided.
  • the present disclosure also provides a kit comprising the double-stranded oligonucleotide, the pharmaceutical composition and/or the oligonucleotide conjugate of the present disclosure.
  • the double-stranded oligonucleotides, pharmaceutical compositions and/or oligonucleotide conjugates of the present disclosure have good stability, high target gene expression regulation activity, and low off-target effects.
  • the details are as follows.
  • the liver weight hardly increased, and showed significantly lower hepatic steatosis and inflammation than the reference Toxic responses than siRNA conjugates.
  • the siRNA conjugates provided by the present disclosure have an inhibition rate of off-target target sequences of no higher than 25% in the in vitro siCHECK system, showing significant Lower off-target effects.
  • mice at a dose of 30 mg/kg, in mice administered with the siRNA conjugate of the present disclosure, hepatic steatosis showed a toxic response close to that of the blank control group, and significantly lower than that of the blank control group.
  • mice administered a reference conjugate that did not contain a stabilizing modified nucleotide For another example, in mice given the siRNA conjugate of the present disclosure at a dose of 100 mg/kg, the blood biochemical indicators were significantly reduced, and there was no obvious abnormality compared with the blank control group; and compared with the reference siRNA conjugate, given Mice given the siRNA conjugates of the present disclosure did not show more than moderate inflammatory cell infiltration and necrosis, and showed significantly lower toxicity in histopathology. For another example, even at a high dose of 300 mg/kg, there was no significant difference in serum ALT compared with the blank control group, and 6 of the mice given the reference conjugate showed inflammation in histopathological sections.
  • the expression inhibition rate of the target sequence is at least 38.92nM, up to 67.54%; at a concentration of 0.1nM, the expression inhibition rate of the target sequence is at least 84.73%, up to 89.35%; meanwhile, The level of target sequence inhibitory activity was comparable to that of the reference siRNA conjugate that did not contain the stabilizing modified nucleotide.
  • the siRNA conjugate of the present disclosure has high target sequence inhibitory activity in the in vitro siCHECK system, with an IC 50 between 6.89-8.55pM; at the same time, it is identical to the rest of the sequence but does not contain stabilizing modified nucleotides
  • the reference conjugate has close target inhibitory activity.
  • Figure 1 is a histogram of the relative expression level of HBV mRNA in primary liver cells of 44Bri mice after transfection of siRNA of the present disclosure and reference siRNA respectively.
  • Fig. 2 is a histogram of relative expression levels of HBV mRNA in primary liver cells of 44Bri mice after free intake of siRNA conjugates of the present disclosure or reference siRNA conjugates and reference siRNA NC.
  • 3A and 3B are scatter plots of the relative expression levels of HBV mRNA in the liver of 44Bri mice after administration of different concentrations of siRNA conjugates of the present disclosure or reference siRNA conjugates and PBS, respectively.
  • 8A and 8B are line graphs showing the changes in serum TG levels or serum CHO levels over time after administration of siRNA conjugates of the present disclosure, reference siRNA conjugates or PBS, respectively.
  • Figures 9A and 9B are line graphs showing changes in serum TG levels or serum CHO levels over time after administration of siRNA conjugates of the present disclosure or PBS, respectively.
  • the expressions "complementary” or “reverse complementary” can be used interchangeably and have the meaning known to those skilled in the art, that is, in a double-stranded nucleic acid molecule, the bases of one strand are each linked to the bases of the other strand. The bases on the base pair up in a complementary fashion.
  • the purine base adenine (A) is always paired with the pyrimidine base thymine (T) (or uracil (U) in RNA);
  • the purine base guanine (C) is always paired with the pyrimidine base Cytosine (G) is paired.
  • Each base pair consists of a purine and a pyrimidine.
  • the double-stranded oligonucleotide is siRNA
  • the mRNA expressed by the target gene is selected from the mRNA expressed by the hepatitis B virus gene (HBV) and the mRNA expressed by the angiopoietin-like protein 3 (ANGPTL3) gene.
  • the present disclosure also provides a second double-stranded oligonucleotide, the double-stranded oligonucleotide comprises a sense strand and an antisense strand, and each nucleotide of the sense strand and the antisense strand All are modified nucleotides, wherein, the sense strand comprises nucleotide sequence I, the antisense strand comprises nucleotide sequence II, and both the nucleotide sequence I and the nucleotide sequence II are composed of Composed of 19 nucleotides, the nucleotide sequence I and the nucleotide sequence II are at least partially reverse-complementary to form a double-stranded region, and the nucleotide sequence II is at least partially connected to the first nucleotide sequence The sequence is reverse complementary, and the first nucleotide sequence is a 19-nucleotide nucleotide sequence in the mRNA expressed by the target gene; according to the direction from the 5
  • P1 is VP, Ps or P representing a specific modification
  • the letter combination VP indicates that the adjacent nucleotide on the right side of the letter combination VP is vinyl phosphate (5'-(E)- Vinylphosphonate, E-VP) modified nucleotides
  • the letter combination Ps indicates that the adjacent nucleotide on the right side of the letter combination Ps is a phosphorothioate modified nucleotide
  • the capital letter P indicates that the right side of the letter P is the same
  • the adjacent nucleotide is a 5'-phosphate nucleotide.
  • each U in the above sequence can be replaced by T, and this replacement will not significantly reduce the gene expression regulation activity and/or off-target effect inhibition ability of the double-stranded oligonucleotide.
  • the cation is selected from one or more of alkali metal ions, ammonium cations formed from tertiary amines, and quaternary ammonium cations.
  • the alkali metal ions may be K + and/or Na +
  • the cations formed by tertiary amines may be ammonium ions formed by triethylamine and/or ammonium ions formed by N,N-diisopropylethylamine.
  • the double-stranded oligonucleotides or oligonucleotide conjugates described in the present disclosure may exist at least in part in the form of a salt.
  • the blood stability of the double-stranded oligonucleotides of the present disclosure can be further improved, their targeting, solving In vivo delivery problems of double-stranded oligonucleotides of the present disclosure, etc.
  • carriers or conjugated molecules that can impart or improve targeting will be very beneficial, which will greatly improve the efficiency of double-stranded oligonucleotides in regulating the expression of target genes and reduce potential side effects.
  • the double-stranded oligonucleotides also need to be able to function at the target site, that is, the encapsulation/conjugation of the carrier or conjugated molecules cannot affect the double-stranded oligonucleotides.
  • the activity of the acid itself (for example, in the case where the double-stranded oligonucleotide is siRNA, cannot affect the RNAi machinery that siRNA is loaded into the cell, ie the RISC complex).
  • these targeting carriers or conjugated molecules are also required to have good biocompatibility and as low toxicity as possible.
  • the methods of the present disclosure can significantly reduce off-target effects of double-stranded oligonucleotides.
  • the method of the present disclosure significantly reduces the off-target effect of the double-stranded oligonucleotide while maintaining the target gene expression regulation ability of the double-stranded oligonucleotide.
  • the substitution is made to the 3rd or 5th nucleotide in the antisense strand in a 5' end to 3' end direction.
  • the substitutions are made to no more than 2 nucleotides of the 3rd to 9th nucleotides in the antisense strand in a 5' end to 3' end direction.
  • the double-stranded oligonucleotide obtained according to the method of the present disclosure can achieve an optimal balance between pharmaceutical activity and low off-target effects.
  • the substitution is made to the 3rd and/or 5th nucleotide in the antisense strand in a 5' end to 3' end direction.
  • the substitution is also performed on one of the 4th, 7th or 9th nucleotides of the antisense strand.
  • the definitions and selection ranges of the stabilizing modified nucleotides and stabilizing modifying groups are as described above.
  • the methods of the present disclosure comprise performing one of the following substitutions on the antisense strand in the direction from the 5' end to the 3' end:
  • the pharmaceutical composition there is no special requirement on the content of the double-stranded oligonucleotide and the pharmaceutically acceptable carrier.
  • the double-stranded oligonucleotide and the pharmaceutically acceptable carrier The weight ratio of the carrier can be 1:(1-500), and in some embodiments, the above weight ratio is 1:(1-50).
  • the pharmaceutical composition may also contain other pharmaceutically acceptable excipients, which may be one or more of various preparations or compounds routinely used in the art.
  • the other pharmaceutically acceptable excipients may include at least one of a pH buffer, a protective agent and an osmotic pressure regulator.
  • the protective agent may be at least one of inositol, sorbitol, sucrose, trehalose, mannose, maltose, lactose and glucose. Based on the total weight of the pharmaceutical composition, the content of the protective agent may be 0.01-30% by weight.
  • the osmotic pressure regulator may be sodium chloride and/or potassium chloride.
  • the content of the osmotic pressure regulator makes the osmotic pressure of the pharmaceutical composition 200-700 milliosmol/kg (mOsm/kg). According to the desired osmotic pressure, those skilled in the art can easily determine the content of the osmotic pressure regulator.
  • the dosage of the preparation made from the pharmaceutical composition will be adjusted due to different administration methods during administration.
  • the organic amine can be a compound represented by formula (201) or a pharmaceutically acceptable salt thereof described in Chinese patent application CN103380113A:
  • R 103 is a polyamine. In other embodiments, R 103 is a ketal. In some embodiments, each of R 101 and R 102 in formula (201) is independently any substituted or unsubstituted, branched or straight chain alkyl or alkenyl, the alkyl A radical or alkenyl group has 3 to about 20 carbon atoms, such as 8 to about 18 carbon atoms, and 0 to 4 double bonds, such as 0 to 2 double bonds.
  • R 103 can be any of the following formulas (204)-(213):
  • each "HCC” represents a hydrocarbon chain
  • each * shows that R 103 is the same as in formula (201) Possible points of attachment of the nitrogen atom in , where each H at any * position can be replaced to achieve attachment to the nitrogen atom in formula (201).
  • the organic amine is an organic amine shown in formula (214) and/or an organic amine shown in formula (215):
  • the amount of alcohol is such that the total mass concentration of the obtained lipid solution is 2-25mg/mL, For example, it can be 8-18 mg/mL.
  • the alcohol is selected from pharmaceutically acceptable alcohols, such as alcohols that are liquid around room temperature, for example, ethanol, propylene glycol, benzyl alcohol, glycerin, polyethylene glycol 200, polyethylene glycol 300, polyethylene glycol 400 One or more of, for example, can be ethanol.
  • the lipid solution and the double-stranded oligonucleotide aqueous solution are mixed, and the mixed product is incubated at 40-60° C. for at least 2 minutes, for example, 5-30 minutes, to obtain an incubated liposome preparation.
  • the volume ratio of lipid solution and double-stranded oligonucleotide aqueous solution is 1:(2-5), for example, it can be 1:4.
  • the present disclosure provides an oligonucleotide conjugate comprising the double-stranded oligonucleotide provided by the present disclosure or the double-stranded oligonucleotide obtained according to the method of the present disclosure. Nucleotides, and a conjugating group that is conjugated to the double-stranded oligonucleotide.
  • the conjugation group comprises a linker and a pharmaceutically acceptable targeting group and/or a delivery assisting group, and the double-stranded oligonucleotide, the linker and the target
  • the targeting group or the delivery auxiliary group is sequentially connected covalently or non-covalently, each targeting group is selected from ligands capable of binding to cell surface receptors, and each delivery auxiliary group is selected from ligands capable of increasing The biocompatible group of the oligonucleotide conjugate in the delivery target organ or tissue.
  • conjugate means that two or more chemical moieties each having a specific function are covalently linked to each other; accordingly, a “conjugate” is Refers to the compound formed by covalent linkage between the various chemical moieties.
  • oligonucleotide conjugate refers to a compound formed by covalently linking one or more chemical moieties with specific functions to an oligonucleotide. The oligonucleotide conjugate should be understood as a general term of multiple oligonucleotide conjugates or an oligonucleotide conjugate represented by a certain chemical formula according to the context.
  • the conjugation group comprises at least one targeting group and an optional linker that is pharmaceutically acceptable, and the double-stranded oligonucleotide, the linker and the targeting The groups are linked sequentially.
  • the double-stranded oligonucleotide molecule A1 may be non-covalently or covalently conjugated to the conjugating group, for example may be covalently conjugated to the conjugating group.
  • the conjugation site of the double-stranded oligonucleotide and the conjugate group can be at the 3' or 5' end of the sense strand of the double-stranded oligonucleotide, or at the 5' end of the antisense strand, or at the double-stranded oligonucleotide's sense strand. in the internal sequence of the chain oligonucleotide.
  • the conjugation site between the double-stranded oligonucleotide and the conjugating group is at the 3' end of the sense strand of the double-stranded oligonucleotide.
  • the conjugate group can be attached to the phosphate group, the 2'-position hydroxyl group or the base of the nucleotide. In some embodiments, the conjugate group can be connected to the hydroxyl group at the 3'-position, and at this time, the nucleotides are connected by 2'-5' phosphodiester bonds.
  • the conjugate group is usually connected to the phosphate group of the nucleotide; when the conjugate group is connected to the double-stranded oligonucleotide For internal sequences, the conjugating group is usually attached to the ribose sugar ring or the base.
  • the targeting group can be connected to the double-stranded oligonucleotide molecule through a suitable linker, and those skilled in the art can select a suitable linker according to the specific type of the targeting group.
  • suitable linker those skilled in the art can select a suitable linker according to the specific type of the targeting group.
  • the types of these linkers, targeting groups and connection methods with double-stranded oligonucleotides can be found in the disclosure of WO2015006740A2, the entire contents of which are incorporated herein by reference.
  • the targeting group can be a ligand routinely used in the field of double-stranded oligonucleotide administration, such as various ligands described in WO2009082607A2, the entire disclosure of which is incorporated by reference This article.
  • At least one or each of the targeting groups is selected from ligands capable of binding to cell surface receptors expressing the target gene.
  • At least one or each of the targeting groups is selected from ligands capable of binding to receptors on the surface of mammalian liver parenchymal cells.
  • each of said targeting groups is independently a ligand that has an affinity for an asialoglycoprotein receptor on the surface of mammalian liver cells.
  • each of said targeting groups is independently an asialoglycoprotein or a sugar.
  • each of the targeting groups is independently selected from D-mannopyranose, L-mannopyranose, D-arabinose, D-xylofuranose, L-xylofuranose, D- - Glucose, L-glucose, D-galactose, L-galactose, ⁇ -D-mannofuranose, ⁇ -D-mannose furanose, ⁇ -D-mannopyranose, ⁇ -D-mannopyranose , ⁇ -D-glucopyranose, ⁇ -D-glucopyranose, ⁇ -D-glucopyranose, ⁇ -D-glucofuranose, ⁇ -D-fructofuranose, ⁇ -D-fructopyranose, ⁇ -D- Galactopyranose, ⁇ -D-galactopyranose, ⁇ -D-galactofuranose, ⁇ -D-galactofuranose, glucosamine, sialic acid
  • the linker in the oligonucleotide conjugates of the present disclosure has a structure as shown in formula (301):
  • k is an integer of 1-3;
  • L A has a structure containing an amide bond as shown in formula (302)
  • L B has a structure containing N-acylpyrrolidine as shown in formula (303), containing carbonyl and oxygen atoms
  • LC is based on hydroxymethyl Linking groups for aminomethane, dimethylolaminomethane or trishydroxymethylaminomethane;
  • n 302 , q 302 and p 302 are each independently an integer of 2-6, optionally, n 302 , q 302 and p 302 are each independently 2 or 3; n 303 is an integer of 4-16, which can be Optionally, n 303 is an integer of 8-12, Indicates the site where the group is covalently attached.
  • the oligonucleotide conjugates provided by the present disclosure have a structure as shown in formula (305):
  • Nu represents the double-stranded oligonucleotide provided by the present disclosure, or the double-stranded oligonucleotide obtained according to the method of the present disclosure.
  • the linker in the oligonucleotide conjugates of the present disclosure has the structure shown in formula (306):
  • n 306 is an integer of 0-3, and each p 306 is independently an integer of 1-6, Indicates the site where the group is covalently attached;
  • the linking group is connected by an ether bond with the targeting group through the oxygen atom marked by *;
  • the linking group is connected by at least one of the oxygen atoms marked by # One is connected to the double-stranded oligonucleotide by forming a phosphate bond or a phosphorothioate bond, and the rest is connected to a hydrogen atom with an oxygen atom marked by # to form a hydroxyl group, or to a C 1 -C 3 alkyl group to form a C 1 -C 3 alkoxy;
  • Nu represents the double-stranded oligonucleotide provided by the present disclosure, or the double-stranded oligonucleotide obtained according to the method of the present disclosure.
  • the oligonucleotide conjugates of the present disclosure have the structure shown in formula (308):
  • n1 is an integer selected from 1-3, and n3 is an integer selected from 0-4;
  • Each m1, m2 or m3 is independently an integer selected from 2-10;
  • R 10 , R 11 , R 12 , R 13 , R 14 or R 15 are each independently H, or are selected from the group consisting of the following groups: C 1 -C 10 alkyl, C 1 -C 10 haloalkane and C 1 -C 10 alkoxy;
  • R 3 has the structure shown in formula A59:
  • E 1 is OH, SH or BH 2
  • Nu represents the double-stranded oligonucleotide provided by the present disclosure, or the double-stranded oligonucleotide obtained according to the method of the present disclosure
  • n1 is an integer of 1-2
  • n3 is an integer of 0-1
  • n1+n3 2-3.
  • the spatial position between a plurality of M1 ligands can be suitable for the M1 ligand and the liver surface asialoglycoprotein receptor
  • R 10 , R 11 , R 12 , R 13 , R 14 and R 15 are each independently selected from H, C 1 -C 10 alkyl, C 1 -C 10 haloalkyl, and C
  • R 10 , R 11 , R 12 , R 13 , R 14 , and R 15 are each independently selected from H, methyl, and ethyl.
  • R 10 , R 11 , R 12 , R 13 , R 14 , and R 15 are all H.
  • R 3 is a group with the structure shown in formula A59, wherein E 1 is OH, SH or BH 2 , based on the consideration of the availability of raw materials for preparation, in some embodiments In, E 1 is OH or SH.
  • R2 is selected to achieve linkage to N and A59 on the nitrogen-containing backbone.
  • nitrogen-containing skeleton refers to a chain structure in which carbon atoms connected with R 10 , R 11 , R 12 , R 13 , R 14 and R 15 are connected to N.
  • R2 may be any linking group capable of linking the A59 group to the N on the nitrogen - containing backbone in an appropriate manner.
  • the R2 group needs to contain both the linking site connected to the N on the nitrogen-containing backbone and the Linkage site for P phase linkage in R3 .
  • R 2 is B5, B6, B5' or B6':
  • the value range of q 2 may be an integer of 1-10, and in some embodiments, q 2 is an integer of 1-5.
  • L1 is selected from a linked combination of one or more of the groups of formulas A1-A26.
  • L 1 is selected from the connection combination of one or more of A1, A4, A5, A6, A8, A10, A11 and A13; in some embodiments, L 1 is selected from A1, A4, A connection combination of at least 2 of A8, A10, and A11; in some embodiments, L1 is selected from a connection combination of at least 2 of A1, A8, and A10.
  • an oligonucleotide conjugate of the present disclosure has the formula (403), (404), (405), (406), (407), (408), (409), (410), (411), (412), (413), (414), (415), (416), (417), (418), (419), (420), (421) or (422) structure:
  • P in Formula A59 is connected to the end of the double-stranded oligonucleotide sense strand or the antisense strand; in some embodiments, P in Formula A59 is connected to the double-stranded oligonucleotide sense strand the end of. The terminus refers to the first 4 nucleotides counted from one end of the sense strand or the antisense strand. In some embodiments, P in Formula A59 is connected to the end of the double-stranded oligonucleotide sense strand or the antisense strand; in some embodiments, P in Formula A59 is connected to the end of the double-stranded oligonucleotide sense strand. 3' end.
  • P in formula A59 can be connected to any possible position on the nucleotide in the double-stranded oligonucleotide, for example, the 5' position of the nucleotide, the 2' position of the nucleotide, the 3' position of the nucleotide or nucleotide bases.
  • P in formula A59 can be linked to the 2' position, the 3' position or the 5' position of the nucleotides in the double-stranded oligonucleotide by forming a phosphodiester bond.
  • the P in the formula A59 is connected to the oxygen atom formed after the dehydrogenation of the 3' hydroxyl of the 3' terminal nucleotide of the sense strand of the double-stranded oligonucleotide, or the P in the formula A59 is replaced by a double-stranded
  • the hydrogen in the 2'-hydroxyl group of one nucleotide in the sense strand of the oligonucleotide is attached to the nucleotide, or P in formula A59 is replaced by the 5'-terminal nucleotide of the sense strand of the double-stranded oligonucleotide. 'The hydrogen in the hydroxyl group is attached to the nucleotide.
  • the double-stranded oligonucleotide contained in the oligonucleotide conjugate of the present disclosure may be siRNA, and in this case, the oligonucleotide conjugate of the present disclosure is also referred to as siRNA conjugate.
  • the double-stranded oligonucleotides comprised by the oligonucleotide conjugates of the present disclosure can be, for example, siRNAs listed in Table 1. Oligonucleotide conjugates containing these siRNAs exhibited low off-target effects and high mRNA inhibitory activity of target gene expression.
  • oligonucleotide conjugates can be synthesized by methods that have been described in detail in the prior art.
  • WO2015006740A2 describes the preparation methods of various siRNA conjugates in detail.
  • the oligonucleotide conjugates of the present disclosure can also be obtained by means well known to those skilled in the art.
  • the preparation method of the structure represented by formula (305) is described in WO2014025805A1
  • the preparation method of the structure represented by formula (307) is described by Rajeev et al. in ChemBioChem 2015, 16, 903-908.
  • Chinese patent application CN110959011A also discloses in detail the method for preparing the oligonucleotide conjugate represented by formula (308).
  • the contents of the above documents are incorporated herein in their entirety by reference.
  • the oligonucleotide conjugates of the present disclosure can also be used in combination with other pharmaceutically acceptable adjuvants.
  • the adjuvants can be one or more of various preparations or compounds routinely used in the art. For details, please refer to the above-mentioned Description of the pharmaceutical compositions of the present disclosure.
  • the present disclosure provides double-stranded oligonucleotides provided by the present disclosure, double-stranded oligonucleotides obtained according to the methods of the present disclosure, pharmaceutical compositions and/or oligonucleotide conjugates for use in Use in medicines for treating and/or preventing diseases or symptoms associated with target gene expression mRNA levels.
  • the specific gene is a gene abnormally expressed in hepatocytes.
  • the specific gene is an endogenous gene expressed in the liver.
  • the specific gene is a gene of a pathogen that propagates in the liver.
  • the specific gene is a gene expressed in lung epithelial cells.
  • the specific gene is a gene expressed in the central nervous system. In some embodiments, the specific gene is a gene expressed in tumor cells. In some embodiments, the mRNA expressed by the target gene is selected from one of the mRNAs transcribed from the following genes: ACE2, AGT, ANGPTL3, ApoA, ApoB, ApoC, AR, ASK1, C3, C5, Col1A1, CTGF , Ebola, FOXO1, FTO, FVII, FXI, FXII, GCGR, HBV, HCV, HSD, p53, PCSK9, PNP, PLG, PKK, KNG, RAGE, RPTOR, SARS-CoV-2, SCD1, SCNN1A, SOD1, STAT3 , TIMP-1, TMPRSS6, XO.
  • the mRNA expressed by the target gene is selected from the mRNA expressed by the hepatitis B virus gene (HBV), the mRNA expressed by the angiopoietin-like protein 3 (ANGPTL3) gene, or the mRNA expressed by the apolipoprotein C3 (ApoC3) gene mRNA.
  • the disease or symptom associated with the mRNA level of target gene expression is chronic liver disease, hepatitis, liver fibrotic disease, liver proliferative disease and/or dyslipidemia.
  • the disease or symptom associated with the mRNA level of target gene expression is hepatitis B or dyslipidemia.
  • the dyslipidemia is hypercholesterolemia, hypertriglyceridemia, or atherosclerosis.
  • the present disclosure provides a method for treating and/or preventing diseases or symptoms related to the mRNA level of target gene expression, the method comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of the present disclosure provides The double-stranded oligonucleotide, the double-stranded oligonucleotide obtained according to the method of the present disclosure, the pharmaceutical composition and/or the oligonucleotide conjugate.
  • the mRNA expressed by the target gene is selected from one of the mRNAs transcribed from the following genes: ACE2, AGT, ANGPTL3, ApoA, ApoB, ApoC, AR, ASK1, C3, C5, Col1A1, CTGF , Ebola, FOXO1, FTO, FVII, FXI, FXII, GCGR, HBV, HCV, HSD, p53, PCSK9, PNP, PLG, PKK, KNG, RAGE, RPTOR, SARS-CoV-2, SCD1, SCNN1A, SOD1, STAT3 , TIMP-1, TMPRSS6, XO.
  • the mRNA expressed by the target gene is selected from the mRNA expressed by the hepatitis B virus gene (HBV), the mRNA expressed by the angiopoietin-like protein 3 (ANGPTL3) gene, or the mRNA expressed by the apolipoprotein C3 (ApoC3) gene mRNA.
  • the disease or symptom associated with the mRNA level of target gene expression is chronic liver disease, hepatitis, liver fibrotic disease, liver proliferative disease and/or dyslipidemia.
  • the disease or symptom associated with the mRNA level of target gene expression is hepatitis B or dyslipidemia.
  • the dyslipidemia is hypercholesterolemia, hypertriglyceridemia, or atherosclerosis.
  • the conjugates provided by the present disclosure can also be used to treat other liver diseases, including diseases characterized by unwanted cell proliferation, blood diseases, metabolic diseases and diseases characterized by inflammation.
  • a proliferative disease of the liver may be a benign or malignant disease, such as cancer, hepatocellular carcinoma (HCC), liver metastases, or hepatoblastoma.
  • a hematological or inflammatory disease of the liver may be a disease involving coagulation factors, complement mediated inflammation or fibrosis. Metabolic disorders of the liver include dyslipidemia and irregularities in glucose regulation.
  • the disease is treated by administering one or more double-stranded oligonucleotides with high homology to gene sequences involved in the disease.
  • the mRNA expressed by the target gene is selected from one of the mRNAs transcribed from the following genes: ACE2, AGT, ANGPTL3, ApoA, ApoB, ApoC, AR, ASK1, C3, C5, Col1A1, CTGF, Ebola , FOXO1, FTO, FVII, FXI, FXII, GCGR, HBV, HCV, HSD, p53, PCSK9, PNP, PLG, PKK, KNG, RAGE, RPTOR, SARS-CoV-2, SCD1, SCNN1A, SOD1, STAT3, TIMP -1, TMPRSS6, XO.
  • the regulation refers to inhibiting the expression of the target gene in the cell
  • the mRNA expressed by the target gene is selected from the mRNA expressed by the hepatitis B virus gene (HBV), the expression of the angiopoietin-like protein 3 (ANGPTL3) gene mRNA or mRNA expressed by apolipoprotein C3 (ApoC3) gene.
  • HBV hepatitis B virus gene
  • ANGPTL3 angiopoietin-like protein 3
  • ApoC3 apolipoprotein C3
  • the double-stranded oligonucleotide provided by the present disclosure, the double-stranded oligonucleotide obtained according to the method of the present disclosure, the pharmaceutical composition and/or the oligonucleotide conjugate can be used to prevent and/or treat the pathology Condition or disease, or for the manufacture of a medicament for the prevention and/or treatment of a pathological condition or disease as described herein.
  • administration/administration refers to an action by causing at least partly positioning a double-stranded oligonucleotide, a pharmaceutical composition and/or an oligonucleotide conjugate at a desired site to produce a desired effect.
  • Routes of administration suitable for the methods of the present disclosure include topical and systemic administration.
  • topical administration results in delivery of more double-stranded oligonucleotides, pharmaceutical compositions and/or oligonucleotide conjugates to a specific site compared to the subject's entire body; whereas systemic administration results in The double-stranded oligonucleotide, pharmaceutical composition and/or oligonucleotide conjugate is delivered to substantially the entire body of the subject.
  • the doses of double-stranded oligonucleotides, pharmaceutical compositions and/or oligonucleotide conjugates described in the present disclosure can be conventional doses in the art, and the doses can be based on various parameters, especially the subjects. determined by age, weight and sex. Toxicity and efficacy can be determined by standard pharmaceutical procedures in cell culture or experimental animals, such as determining the LD50 (the dose that causes 50% of the population to die) and the ED50 (the dose that can cause 50% of the maximum response intensity in quantitative response, and in quantitative response). Middle refers to the dose that causes 50% of the test subjects to have a positive reaction).
  • a range of dosage for use in humans can be derived based on the data obtained from cell culture assays and animal studies.
  • the cells are hepatocytes.
  • the hepatocytes may be cells selected from hepatoma cell lines such as Hep3B, HepG2, Huh7, etc. or isolated primary hepatocytes, in some embodiments, primary hepatocytes.
  • the present disclosure provides a kit comprising the double-stranded oligonucleotide provided by the present disclosure, the double-stranded oligonucleotide obtained according to the method of the present disclosure, a pharmaceutical composition and/or an oligonucleotide conjugate compound.
  • kits described herein may provide a double-stranded oligonucleotide, a pharmaceutical composition, and/or a conjugate in one container.
  • a kit described herein may comprise a container providing a pharmaceutically acceptable excipient.
  • the kit may also contain other components, such as stabilizers or preservatives.
  • the kits described herein may comprise at least one additional therapeutic agent in a container other than the container in which the double-stranded oligonucleotides, pharmaceutical compositions, and/or conjugates described herein are provided .
  • the double-stranded oligonucleotide and the pharmaceutically acceptable carrier and/or adjuvant and the pharmaceutical composition and/or conjugate, and/or the pharmaceutically acceptable adjuvant can be Provided in any form, eg liquid form, dry form or lyophilized form.
  • the double-stranded oligonucleotide and pharmaceutically acceptable carrier and/or adjuvant and the pharmaceutical composition and/or conjugate and optional pharmaceutically acceptable adjuvant are substantially pure and/or sterile.
  • sterile water can be provided in kits of the present disclosure.
  • the siRNA, the pharmaceutical composition comprising siRNA, and the siRNA conjugate in these embodiments are also referred to as the siRNA of the present disclosure, the pharmaceutical composition of the present disclosure, and the siRNA conjugate of the present disclosure. compound.
  • the double-stranded oligonucleotide of the present disclosure can only be siRNA, on the contrary, the double-stranded oligonucleotide can be other variants disclosed herein or known to those skilled in the art, such as small activating RNA ( saRNA) and so on.
  • compositions comprising siRNA, and siRNA conjugates
  • other double-stranded oligonucleotides will be used alone, or to form pharmaceutical compositions and/or oligonucleotides described in the present disclosure.
  • Acid conjugates function similarly.
  • reagents and medium used in the following examples are commercially available, and the operations such as nucleic acid electrophoresis and real-time PCR used are all referred to in Molecular Cloning (Cold Spring Harbor LBboratory Press (1989)). method to proceed.
  • the uppercase letters C, G, U, A, and T represent the base composition of nucleotides;
  • the lowercase letter m indicates that the adjacent nucleotide on the left side of the letter m is a methoxy-modified nucleotide;
  • the lowercase letter f indicates that the nucleotide adjacent to the left of the letter f is a fluorinated nucleotide;
  • the underlined lowercase letter combination moe indicates that the nucleotide adjacent to the left of the letter combination is ribose 2'-O -Methoxyethyl-modified nucleotides;
  • a lowercase letter s indicates that there is a phosphorothioate linkage between the two nucleotides to the left and right of the letter s.
  • the sense and antisense strands corresponding to the siRNAs numbered as reference siRNA1, reference siRNA2, and NC in Table 2 were synthesized by solid-phase synthesis method. Use DEPC water to dissolve the obtained equimolar sense strand and antisense strand respectively, and then anneal to obtain the reference siRNA, coded as NC.
  • the uppercase letters C, G, U, A, and T represent the base composition of nucleotides;
  • the lowercase letter m indicates that the adjacent nucleotide on the left side of the letter m is a methoxy-modified nucleotide;
  • the lowercase letter f indicates that the nucleotide adjacent to the left of the letter f is a fluorinated nucleotide;
  • the underlined letter combination moe indicates that the nucleotide adjacent to the left of the letter combination moe is ribose 2'-O -Methoxyethyl-modified nucleotides;
  • the lowercase letter s indicates that the two nucleotides on the left and right of the letter s are connected by a phosphorothioate group, and
  • VP indicates that the nucleotide on the right side of the letter VP is 5' - Vinyl phosphate modified nucleotides;
  • P indicates that the one nucleotide to the right
  • Each of the above-prepared conjugate 5, conjugate 19, reference conjugate 10 and reference conjugate 11 was prepared as a 0.02 mg/mL solution with 1 ⁇ PBS buffer as the test product solution.
  • the double-strand thermal dissociation temperature Tm was calculated from the first derivative of the temperature-absorbance curve according to the specification of the spectrophotometer. Tm value and ⁇ Tm value result are shown in following table 4:
  • ⁇ Tm value (conjugate to be tested) Tm (conjugate to be tested) - Tm (reference conjugate 10);
  • ⁇ Tm value (conjugate to be tested) Tm (conjugate to be tested) - Tm (reference conjugate 11).
  • the double-stranded oligonucleotide comprising a stabilized modified nucleotide of the present disclosure and its conjugate have a higher double-stranded thermal dissociation temperature.
  • modified siRNA with a DNA seed arm is a powerful tool for mammalian gene silencing with significantly reduced off-target effect.
  • Nucleic Acids Research, 6(708) In the method described in 2136-2151, a detection plasmid is constructed, and the detection plasmid and the siRNA to be tested are co-transfected into HEK293A cells, and the target sequence inhibitory activity of the siRNA is reflected by the expression level of the dual luciferase reporter gene. Specific steps are as follows:
  • a detection plasmid was constructed using psiCHECK TM -2 (Promega TM ) plasmid, which contained a target sequence 1, ie, the siRNA target sequence.
  • the target sequence 1 is as follows:
  • the target sequence 1 is the complete complementary sequence of the detected siRNA antisense strand, so the inhibitory effect of each siRNA on the target sequence 1 can reflect the inhibitory ability of the detected siRNA to target gene expression.
  • the target sequence 1 and its complementary sequence were cloned into the Xho I/Not I site of the psiCHECK TM -2 plasmid.
  • fetal bovine serum FBS, Hyclone Company
  • penicillin-streptomycin Penicillin-Streptomycin, Gibco, Invitrogen Company
  • DMEM complete medium Hyclone Company
  • siRNAs Use DEPC water to dilute the above detection plasmid into 200ng/ ⁇ L detection plasmid working solution; use DEPC water to prepare each siRNA in the following siRNAs to 4000nM, 1000nM, 250nM, 62.5nM, 15.625nM, 3.91nM, 0.977nM, 0.244nM, 0.061nM, 0.0153nM and 0.0038nM siRNA working solution with 11 different concentrations, the siRNA used are siRNA1, siRNA2, siRNA3, siRNA4 prepared above and reference siRNA1, reference siRNA2 respectively.
  • each 2A1-2A11 solution contains 1 ⁇ L of siRNA working solution of the above 11 concentrations, 0.05 ⁇ L of detection plasmid working solution (including 10 ng of detection plasmid) and 10 ⁇ L of Opti-MEM culture solution. base.
  • each 2B solution contains 0.2 ⁇ L LipofectamineTM 2000 and 10 ⁇ L Opti-MEM medium.
  • each 2C solution contains 0.05 ⁇ L of detection plasmid working solution (containing 10 ng of detection plasmid) and 10 ⁇ L of Opti-MEM medium.
  • each siRNA transfection complex 2X1-2X11 were transfected into 3 culture wells to obtain co-transfection containing siRNA The mixture is recorded as the test group.
  • siRNA For each siRNA, 2 ⁇ 12 transfection complexes were added to the other 3 culture wells in an amount of 20 ⁇ L/well to obtain a transfection mixture without siRNA, which was recorded as a blank control group.
  • the co-transfection mixture containing siRNA and the co-transfection mixture without siRNA were respectively transfected in culture wells for 4 hours, and 100 ⁇ L of H-DMEM complete medium containing 20% FBS was added to each well.
  • the 96-well plate was placed in a CO 2 incubator to continue culturing for 24 hours.
  • the function is as follows,
  • Y is the ratio R, the relative residual activity of Renilla
  • Primary mouse liver cells were extracted from fresh liver tissue of 44Bri mice, and the density of primary mouse liver cells was adjusted to 2 ⁇ 105 cells in Opti-MEM (1X) medium (GIBCO, Cat. No. 31985-070) /mL to obtain mouse liver primary cell suspension. Then, the obtained mouse liver primary cell suspensions were respectively added to different culture wells of the 12-well plate, and the mouse liver primary cells were inoculated into the culture wells. The volume of primary mouse liver cell suspension added was 0.5 mL/well, and the number of primary mouse liver cells was 1 ⁇ 10 5 cells/well.
  • Each 4A solution contains 1.5 ⁇ L of the above siRNA working solution and 50 ⁇ L of Opti-MEM medium in turn.
  • the siRNA of the present disclosure shows excellent HBV mRNA inhibitory activity in 44Bri mouse primary liver cells, and at the siRNA concentration of 50nM, the HBV mRNA inhibitory rate is at least 73.92%, the highest can be reached 77.58%, and showed HBV mRNA inhibitory activity comparable to that of the corresponding reference siRNA1 that did not include stabilizing modified nucleotides.
  • the target sequence inhibitory activity of the reference siRNA2 with stabilizing modified nucleotides at the 2-position of the antisense strand was greatly reduced, and the HBV mRNA inhibition rate was only 36.31%.
  • Primary mouse liver cells were extracted from fresh liver tissue of 44Bri mice, and the density of primary mouse liver cells was adjusted to 1 ⁇ 105 cells in Opti-MEM (1X) medium (GIBCO, Cat. No. 31985-070) /mL to obtain mouse liver primary cell suspension. Then, the obtained mouse liver primary cell suspensions were respectively added to different culture wells of the 12-well plate, and the mouse liver primary cells were inoculated into the culture wells. The volume of the primary mouse liver cell suspension added was 1 mL/well, and the number of primary mouse liver cells was 1 ⁇ 10 5 cells/well.
  • Opti-MEM (1X) medium GIBCO, Cat. No. 31985-070
  • siRNA conjugate working solutions 4 ⁇ M (calculated as siRNA) siRNA conjugate working solutions, and the siRNA conjugates used are conjugate 5, conjugate 6 or reference than conjugate 4.
  • the reference siRNA NC was formulated into a 4 ⁇ M reference siRNA NC working solution.
  • siRNA conjugate working solution or the reference siRNA NC working solution of each conjugate to the different culture wells of mouse liver primary cell suspension mentioned above, mix evenly, and add 2.5 ⁇ L/well, each A siRNA conjugate or reference siRNA NC were transfected into 3 culture wells respectively to obtain a transfection mixture containing siRNA (calculated as siRNA, with a final concentration of 10 nM), which was recorded as the test group.
  • the mouse liver primary cell suspension in the other 3 culture wells was recorded as the blank control group.
  • Each transfection mixture containing siRNA and the blank control group were placed in an incubator containing 5% CO 2 and incubated at 37° C. for 24 h.
  • TRIZOL purchased from SIGMA, product number T9424 was used to extract the total RNA in the cells in each well according to the method described in the manual to obtain an aqueous solution of total RNA.
  • the reverse transcription conditions are: for each reverse transcription reaction system, incubate the reverse transcription reaction system at 50°C for 50 minutes, then incubate at 85°C for 5 minutes, and finally incubate at 4°C for 5 minutes. Add 80 ⁇ L of DEPC water to the system to obtain a solution containing cDNA.
  • each reverse transcription reaction system takes 5 ⁇ L of the above cDNA-containing solution as a template, use The reagents provided by the SYBR qPCR SuperMix Plus kit (purchased from Nearshore Protein Technology Co., Ltd., Cat. No. E096-01B) were used to prepare 15 ⁇ L of qPCR reaction system. 6, the final concentration of each primer was 0.25 ⁇ M.
  • SYBR qPCR SuperMix Plus kit purchased from Nearshore Protein Technology Co., Ltd., Cat. No. E096-01B
  • the final concentration of each primer was 0.25 ⁇ M.
  • Each qPCR reaction system was placed on an ABI StepOnePlus Real-Time PCR instrument and amplified using a three-step method. The amplification program was pre-denaturation at 95°C for 10 minutes, followed by denaturation at 95°C for 30s, annealing at 60°C for 25s, and extension at 72°C for 25s.
  • Figure 2 is a histogram of the relative expression levels of HBV mRNA in primary hepatocytes of 44Bri mice after free intake of conjugate 5, conjugate 6 or reference conjugate 4 and reference siRNA NC. Further, the inhibition rate of each siRNA conjugate or reference siRNA NC to HBV mRNA is summarized in Table 8.
  • Hepatitis B virus surface antigen diagnostic kit (enzyme-linked immunoassay) (Shanghai Kehua Biology) was used to detect the serum HbsAg content of 44Bri mice according to the method recorded in the instructions, and the mice with S/COV>10 were selected and randomly grouped (both Male), 5 mice in each group, numbered respectively, administered the conjugate 5, Conjugate 6 or reference conjugate 4, the siRNA conjugates were provided in the form of 1 ⁇ PBS solution containing 0.2mg/ml or 0.02mg/ml (calculated as siRNA) of siRNA conjugates respectively, and the administration volumes were 5ml/kg; each of the other two groups of mice was given 1 ⁇ PBS, and the administration volume was 5ml/kg, serving as a blank control group.
  • RNA later (Sigma Aldrich); 1mL Trizol (Sigma Company) was added to each liver tissue. ), crushed 3 times in a Tissuelyset II automatic tissue homogenizer, each time for 30s, to obtain liver tissue homogenate, add 0.2mL chloroform to it, and let it stand for 3min. Centrifuge at 12,000 rpm for 10 min at 4°C, and take 0.4 mL of the supernatant. Add 0.5mL isopropanol to the supernatant and let it stand at room temperature for 10min.
  • RNA in the liver tissue of each mouse take 10.5 ⁇ L of total RNA aqueous solution containing 1 ⁇ g of total RNA, use the reverse transcription kit Reverse Transcription System (purchased from Promega, Cat. No. A3500), and reverse The recording operation steps were prepared as 20 ⁇ L of reverse transcription reaction system, and the total RNA was reverse transcribed.
  • the reverse transcription conditions are: for each reverse transcription reaction system, incubate the reverse transcription reaction system at 42°C for 30 minutes, then incubate at 95°C for 5 minutes, and finally incubate at 4°C for 5 minutes. Add 80 ⁇ L of DEPC water to the recording reaction system to obtain a solution containing cDNA.
  • each reverse transcription reaction system takes 5 ⁇ L of the above cDNA-containing solution as a template, and use the reagents provided by the SYBR select Master Mix kit (Applied biosystem company) to prepare 20 ⁇ L of a qPCR reaction system, which is used to amplify the target gene HBV
  • the PCR primer sequences of X and the internal reference gene GAPDH are shown in Table 6, and the final concentration of each primer is 0.25 ⁇ M.
  • Each qPCR reaction system was placed on the ABI StepOnePlus Real-Time PCR instrument and amplified using a three-step method.
  • the amplification program was pre-denaturation at 95°C for 10 minutes, followed by denaturation at 95°C for 30s, annealing at 60°C for 30s, and extension at 72°C for 30s. After repeating the above-mentioned processes of denaturation, annealing and extension a total of 40 times, a product W containing amplified target gene HBV X and internal reference gene GAPDH was obtained. Product W was then incubated at 95°C for 1min, 55°C for 30s, and 95°C for 30s. The real-time fluorescent quantitative PCR instrument collected the melting curves of the target gene HBV X and the internal reference gene GAPDH in the product W respectively, and obtained the target gene HBV X and the internal reference gene GAPDH. Ct value.
  • Figure 3A and Figure 3B are respectively given 1mg/kg or 0.1mg/kg (calculated as siRNA) conjugate 5, conjugate 6 or reference conjugate 4 and PBS, the relative HBV mRNA in the liver of 44Bri mice Scatterplot of expression levels.
  • PBS represents the blank control group.
  • the inhibition rate of each siRNA conjugate to HBV mRNA is summarized in Table 9.
  • the siRNA conjugates of the present disclosure exhibit excellent HBV mRNA inhibitory effects in mice, and at a dose of 0.1 mg/kg, the HBV mRNA inhibitory rate is at least 63.18%. At a dose of 1 mg/kg, the HBV mRNA inhibition rate could even be as high as 96.31%, and showed an HBV mRNA inhibitory activity comparable to that of the corresponding reference conjugate 4 that did not include stabilizing modified nucleotides.
  • % and the preceding numbers represent the percentage difference between the corresponding index and the reference blank control group.
  • ⁇ stands for increase.
  • ⁇ 5.43% means that the liver weight increased by 5.43% compared with the blank control group.
  • the siRNA conjugates of the present disclosure can effectively reduce the liver toxicity caused by off-target effects, so in the preparation of drugs for the treatment and/or prevention of HBV diseases or symptoms Shows significantly higher safety and has excellent development prospects.
  • Figure 4 shows that the free intake of conjugate 5, conjugate 6, conjugate 22, conjugate 23, reference conjugate 4, reference conjugate 10, reference conjugate 12, reference Histogram of relative expression levels of HBV mRNA in primary hepatocytes of 44Bri mice after conjugate 13 or reference siRNA NC. Further, the inhibition rate of each siRNA conjugate or reference siRNA NC to HBV mRNA is summarized in Table 11.
  • siRNA conjugates 5, 6, 22 and 23 of the present disclosure showed excellent HBV mRNA inhibitory activity in 44Bri mouse primary liver cells, and at a siRNA concentration of 10 nM, HBV The mRNA inhibition rate was at least 78.47%, up to 85.97%, and the HBV mRNA inhibition activity was comparable to that of the reference conjugate 4, and significantly higher than that of the reference conjugates 10, 12 and 13.
  • the corresponding position in reference conjugate 4 is a non-stabilizing modified nucleotide
  • the corresponding position in reference conjugate 10 is an unmodified nucleotide
  • reference conjugates 12 and 13 are on the antisense strand In addition to the 3-9 position in the direction of the 5'-3' end, it also contains stabilizing modified nucleotides.
  • each mouse in the test group and the blank control group was subjected to orbital blood collection.
  • the blood collection volume was 0.6 mL. Centrifuge at 3000rpm for 15min to obtain serum.
  • concentration of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) in serum was further detected by PM1P000/3 automatic serum biochemical analyzer (SABA, Italy). See Figure 6A and Figure 6B for the results.
  • PBS represents a blank control group.
  • Figure 6A and Figure 6B are the scatter points of ALT and AST concentrations in mouse serum after administration of 30 mg/kg of Conjugate 9, Conjugate 10, Reference Conjugate 5, Reference Conjugate 15 or PBS, respectively picture. It can be seen from Figure 6A and Figure 6B that, compared with the blank control group, after administration of the reference conjugate 5 that does not contain stabilized modified nucleotides, serum ALT and AST concentrations increased; while administration of the siRNA conjugate of the present disclosure After the siRNA conjugate, the serum ALT and AST concentrations were comparable to those of the blank control group, indicating that the siRNA conjugate of the present disclosure has low liver toxicity.
  • the concentrations of ALT and AST in mouse serum were significantly increased, indicating that the The reference conjugate may produce higher hepatotoxicity.
  • mice were sacrificed and dissected, preserved in 10% neutral buffered formalin fixative, and pathological sections were made. The severity of hepatic steatosis in the pathological sections was evaluated and graded, and a relative comparison was made.
  • mice given the reference conjugate 5 that did not contain stabilized modified nucleotides 4 mice exhibited severe hepatocyte degeneration, which was manifested by extensive liver tissue.
  • the cytoplasm of the cells was loose, and many hepatocytes were balloon-like degeneration, the cells were swollen, and the cytoplasm was vacuolated.
  • One mouse showed moderate hepatocyte degeneration. There was vacuolar degeneration, tiny round vacuoles were seen in the cytoplasm, a small number of local hepatocytes were necrotic, and the nuclei were condensed or fragmented.
  • One mouse showed mild hepatocyte degeneration, specifically manifested as more hepatocyte Hepatic steatosis was more severe than that in the blank control group.
  • mice given the reference conjugate 15 containing a stabilizing modified nucleotide only at the 7th position of the 5'-3' end of the antisense strand showed severe hepatic steatosis,
  • mice administered with siRNA conjugate 9 of the present disclosure 2 mice showed moderate hepatic steatosis, 3 mice showed mild hepatic steatosis, and no severe or severe hepatocyte degeneration was observed.
  • mice administered with siRNA conjugate 10 of the present disclosure 3 mice showed moderate hepatic steatosis, 2 mice showed mild hepatic steatosis, and no severe or severe hepatocyte degeneration was seen.
  • Mice administered the conjugates of the present disclosure exhibited a lower degree of hepatic steatosis compared to the reference conjugate.
  • the siRNA conjugates of the present disclosure can effectively reduce the liver toxicity caused by off-target effects, so in the preparation of drugs for the treatment and/or prevention of HBV diseases or symptoms Shows significantly higher safety and has excellent development prospects.
  • the in vitro siCHECK system was used to detect conjugate 11, conjugate 12, conjugate 13, conjugate 14, conjugate 15, conjugate 16, reference conjugate 6, reference Compared the inhibitory activity of conjugate 7, reference conjugate 8 or reference siRNA NC on the target sequence in the in vitro siCHECK system.
  • fetal bovine serum FBS, Hyclone Company
  • penicillin-streptomycin Penicillin-Streptomycin, Gibco, Invitrogen Company
  • DMEM complete medium Hyclone Company
  • each 12A1-12A3 solution contains 1 ⁇ L of the siRNA conjugate working solution or reference siRNA NC working solution of the above three concentrations respectively, and detect 0.05 ⁇ L of plasmid working solution (containing 10 ng of detection plasmid) and 10 ⁇ L of Opti-MEM medium.
  • each 12B solution contains 0.2 ⁇ L Lipofectamine TM 2000 and 10 ⁇ L Opti-MEM medium.
  • each 12C solution contains 0.05 ⁇ L of detection plasmid working solution (containing 10 ng of detection plasmid) and 10 ⁇ L of Opti-MEM medium.
  • each siRNA conjugate or reference siRNA NC in the culture well, add the transfection complex 12X1-12X3 of each siRNA conjugate or reference siRNA NC respectively, mix evenly, and the addition amount is 20 ⁇ L/well, and obtain the final transfection complex of each siRNA conjugate or reference siRNA NC Transfection complexes with concentrations of about 0.1nM, 0.03nM and 0.01nM (calculated as siRNA), each siRNA conjugate or reference siRNA NC transfection complex 12X1-12X3 respectively transfected 3 culture wells, Obtain the co-transfection mixture containing siRNA conjugate or reference siRNA NC, which is recorded as the test group.
  • transfection complex 12X4 For each siRNA conjugate or reference siRNA NC, in the other 3 culture wells, add transfection complex 12X4 respectively, the addition amount is 20 ⁇ L/well, to obtain the transfection mixture without siRNA, which is recorded as the blank control group .
  • the co-transfection mixture containing siRNA and the co-transfection mixture without siRNA were respectively transfected in culture wells for 4 hours, and 100 ⁇ L of H-DMEM complete medium containing 20% FBS was added to each well.
  • the 96-well plate was placed in a CO 2 incubator to continue culturing for 24 hours.
  • the luminescence ratio Ratio Ratio (test) or Ratio (control) of each test group or control group is the average value of three culture wells Ratio; The ratio was used as the benchmark, and the luminescence ratio of each test group was normalized to obtain the ratio R of Ratio (test)/Rati (control), which represented the relative expression level of the Renilla reporter gene, that is, the residual activity.
  • the inhibition rate of each siRNA conjugate or reference siRNA NC to the target sequence 4 (1-R) ⁇ 100%.
  • Figure 7 is a histogram of the relative expression level of the target sequence 4 in the in vitro siCHECK system after co-transfection of the plasmid containing the target sequence 4 and the siRNA conjugate to be tested or the reference siRNA NC. Further, the expression inhibition rate of target sequence 4 by each siRNA conjugate or reference siRNA NC is summarized in Table 13.
  • the siRNA conjugates provided by the present disclosure have high target sequence inhibitory activity in the siCHECK system in vitro.
  • the expression inhibition rate of target sequence 4 is at least 38.92nM, up to 67.54%; at a concentration of 0.1nM, the expression inhibition rate of target sequence 4 is at least 84.73%, up to 89.35%.
  • it has a level of target sequence inhibitory activity close to that of reference conjugate 6, reference conjugate 7 or reference conjugate 8 that does not contain stabilizing modified nucleotides.
  • the inhibitory activity of Conjugate 11, Conjugate 12 and Reference Conjugate 6 in the in vitro siCHECK system was tested, the only difference being that Conjugate 11, Conjugate 12 or Reference Conjugate Conjugate 6 was used instead of the tested siRNA for detection;
  • the target sequence used in the detection plasmid was the following target sequence 5; 0.0370 ⁇ M, 0.0123 ⁇ M, 0.00412 ⁇ M, 0.00137 ⁇ M, 0.000457 ⁇ M, 0.000152 ⁇ M, 0.0000508 ⁇ M and 0.0000169 ⁇ M siRNA conjugate working solution with 11 different concentrations (all calculated as siRNA).
  • This target sequence 5 is the exact complement of the antisense strand of the siRNA in each conjugate tested.
  • siRNA conjugates of the present disclosure have high target sequence inhibitory activity in the in vitro siCHECK system, with IC 50 between 6.89-8.55 pM.
  • reference conjugate 6 which is identical to the rest of the sequence but does not contain stabilizing modified nucleotides, has an inhibitory activity close to that of the target sequence.
  • mice Human APOC3 transgenic mice Tg(APOC3)3707Bres (purchased from Jackson Laboratory, USA) with serum TG content > 2 mmol/L were selected for random grouping, with 6 mice in each group, half male and half male. Conjugate 12, reference conjugate 6 and PBS blank control were administered to each group of mice respectively. All animals were dosed according to their body weight, and administered in a single subcutaneous injection. The dosage of each siRNA conjugate (based on the amount of siRNA) was 3 mg/kg and 1 mg/kg of mouse body weight, and the administration volume was 5 ml. /kg. Each siRNA conjugate was provided in PBS aqueous solution, and the concentration that the conjugate should be prepared was calculated according to the dosage and volume of administration. Each of the mice in the other group was given 1 ⁇ PBS with a volume of 5 ml/kg, serving as a blank control group.
  • mice given reference conjugate 6 that does not contain stabilized modified nucleotides showed significant changes in blood biochemical indicators.
  • a high dose of 300mg/Kg female The concentrations of ALT and AST in mice increased by 212% and 36%, respectively.
  • the concentrations of ALT and AST in female mice given the conjugate 12 of the present disclosure only increased by 130% and 32%, respectively, compared with the reference conjugate 6, the concentration of ALT decreased significantly; No increase in the concentration of ALT and AST was found in the mice of the conjugate 11 of the present disclosure, and compared with the reference conjugate 6, the degree of change in blood biochemical indicators was significantly reduced.
  • the inhibitory IC 50 of conjugate 11 to target sequence 5 was 11.3pM, and the inhibitory rates to target sequence 6, 7 or 8 were less than 50% in all tested siRNA concentration ranges, that is, neither Off-target occurred; the inhibitory IC50 of conjugate 13 to target sequence 5 was 4.50pM, and the inhibition rate to target sequence 9, 10 or 11 was less than 50% in all tested siRNA concentration ranges, that is, no off-target occurred.
  • the siRNA conjugates of the present disclosure can effectively reduce the hepatotoxicity caused by off-target effects, so it is used in the preparation of drugs for the treatment and/or prevention of dyslipidemia-related diseases or symptoms. Drugs show significantly higher safety and have excellent development prospects.
  • siRNA conjugates used were conjugate 13, and the dosage of each siRNA conjugates ( The amount of siRNA) is 9 mg/kg, 3 mg/kg, 1 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.1 mg/kg or 0.05 mg/kg of mouse body weight, and the administration volume is 5 ml/kg.
  • the amount of siRNA is 9 mg/kg, 3 mg/kg, 1 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.1 mg/kg or 0.05 mg/kg of mouse body weight, and the administration volume is 5 ml/kg.
  • Each siRNA conjugate was provided in PBS aqueous solution, and the concentration that the conjugate should be prepared was calculated according to the dosage and volume of administration.
  • the administration time point was recorded as day 1, and blood was collected from the orbital venous plexus of mice on days 1, 8, 15, 22, 29, 36, 43, 50, 57 and 64 to detect the level of TG in serum. The results are shown in Figure 10.
  • mice Tg(APOC3)3707Bres purchased from Jackson Laboratory, USA
  • serum TG content > 2 mmol/L were selected for random grouping, with 8 mice in each group, half male and half male.
  • Conjugate 13, Conjugate 17 and PBS blank control were administered to each group of mice respectively. All animals were dosed according to their body weight, and administered in a single subcutaneous injection.
  • the dosage of each siRNA conjugate (based on the amount of siRNA) was 3 mg/kg and 1 mg/kg of mouse body weight, and the administration volume was 5 ml. /kg.
  • Each siRNA conjugate was provided in PBS aqueous solution, and the concentration that the conjugate should be prepared was calculated according to the dosage and volume of administration.
  • Each of the mice in the other group was given 1 ⁇ PBS with a volume of 5 ml/kg, serving as a blank control group.
  • the administration time point was recorded as the first day, and blood was collected from the orbital venous plexus of the mice on the 1st, 8th, 15th, 22nd, 29th, 36th, and 43rd days, 100 ⁇ L each time. After blood collection was left at room temperature for 30 minutes, it was centrifuged at 3000 rpm for 15 minutes at 4°C to obtain serum. Further use PM1P000/3 automatic serum biochemical analyzer (SABA, Italy) to detect the content of total cholesterol (CHO) and triglyceride (TG) in serum.
  • SABA automatic serum biochemical analyzer
  • Inhibition rate of blood lipid level (1-blood lipid content of test group after administration/blood lipid content of test group before administration) ⁇ 100%.
  • blood lipid refers to total cholesterol (CHO) or triglyceride (TG).
  • Conjugate 13 and Conjugate 17 were dissolved in PBS to a 30 mg/ml solution (calculated as siRNA conjugate).
  • ICR mice half male and half female, weighing 18-22 g, 5-6 weeks old, purchased from Speiford Co., Ltd.
  • mice half male and half female
  • the above-mentioned siRNA conjugate solution was administered to each mouse, and the administration volume was 10 mL/kg, as a test group; in addition, PBS was administered to each of a group of mice, and The drug volume was 10mL/kg, which was used as a blank control group.
  • the administration time point was recorded as day 1, and blood was collected from the orbital venous plexus of mice on days 1, 8, 15, and 22, 100 ⁇ L each time. After blood collection was left at room temperature for 30 minutes, it was centrifuged at 3000 rpm for 15 minutes at 4°C to obtain serum. Further use PM1P000/3 automatic serum biochemical analyzer (SABA, Italy) to detect the content of total cholesterol (CHO) and triglyceride (TG) in serum.
  • SABA automatic serum biochemical analyzer
  • Standardized blood lipid level (blood lipid content of the test group after administration/blood lipid content of the test group before administration) ⁇ 100%.
  • Inhibition rate of blood lipid level (1-blood lipid content of test group after administration/blood lipid content of test group before administration) ⁇ 100%.
  • blood lipid refers to total cholesterol (CHO) or triglyceride (TG).
  • FIG. 13A and 13B are line graphs showing changes in serum TG levels or serum CHO levels over time after administration of siRNA conjugates of the present disclosure, reference siRNA conjugates or PBS, respectively. Further, after administration of the siRNA conjugate of the present disclosure, the serum TG inhibition rate and serum CHO inhibition rate of mice at each time point are summarized in the following Table 21A and Table 21B:
  • test group Reference conjugate 8 Conjugate 15
  • Conjugate 16 dose 100mg/kg 100mg/kg 100mg/kg ALT 420% 116% 118% AST 126% - 32%
  • % and the preceding figures represent the difference between the concentration of alanine aminotransferase (ALT) or aspartate aminotransferase (AST) in the mouse serum and the concentration in the serum of the blank control group, and the difference with the concentration of the blank control group Percentage of concentration in group serum.
  • 420% in Table 22 means that the concentration of alanine aminotransferase in mice administered with reference conjugate 8 at 100 mg/Kg was 420% higher than that in the blank control group.
  • mice given the reference conjugate 8 that does not contain stabilized modified nucleotides showed obvious changes in blood biochemical indicators, and the concentration of ALT increased by 420%.
  • the concentration of AST increased by 126%.
  • the concentration of ALT was only increased by 116% and 118%, respectively, and the concentration of AST was only increased by 32%, showing significantly decreased blood biochemical indicators.
  • mice given the conjugate 15 of the present disclosure only 2 mice showed mild hepatocyte inflammatory response, showing a small amount of inflammatory cell infiltration, and no moderate or above inflammatory response and necrosis.
  • mice given the conjugate 16 of the present disclosure only one mouse showed a mild hepatocyte inflammatory response, and no more than moderate inflammatory response and necrosis.
  • conjugates 15 and 16 exhibited significantly lower toxic responses.
  • the siRNA conjugates of the present disclosure can effectively reduce the hepatotoxicity caused by off-target effects, so it is used in the preparation of drugs for the treatment and/or prevention of dyslipidemia-related diseases or symptoms. Drugs show significantly higher safety and have excellent development prospects.
  • the target sequence 12 is a nucleotide sequence in the mRNA expressed by the human AMGPTL3 gene targeted by the detected siRNA, so the inhibitory effect of each siRNA conjugate on the target sequence 12 can reflect the siRNA in the detected siRNA conjugate Inhibition of target gene expression.
  • the target sequence 12 and its complementary sequence were cloned into the Xho I/Not I site of the psiCHECK TM -2 plasmid.
  • Figure 14 is a histogram of the relative expression level of the target sequence 12 in the in vitro siCHECK system after co-transfection of the plasmid containing the target sequence 12 and the siRNA conjugate to be tested or the reference siRNA NC. Further, the expression inhibition rate of target sequence 12 by each siRNA conjugate or reference siRNA NC is summarized in Table 23.
  • Table 23 The expression inhibition rate of target sequence 12 in the in vitro siCHECK system
  • the siRNA conjugates provided by the present disclosure have high target sequence inhibitory activity in the siCHECK system in vitro.
  • the expression inhibition rate of the target sequence is at least 51.56nM, up to 58.76%; at a concentration of 0.1nM, the expression inhibition rate of the target sequence can reach 87.92-88.84%.
  • it has a similar level of target sequence inhibitory activity compared to the reference conjugate 9 which does not contain stabilizing modified nucleotides.
  • the off-target sequence inhibitory activity of siRNA conjugates in the in vitro siCHECK system was determined, the only difference being that conjugate 18, conjugate 19, conjugate 20, conjugate 21.
  • the reference conjugate 9 or the reference conjugate 11 is determined instead of the tested siRNA conjugate; and, the target sequence used is the target sequence 12 or the target sequence 13 as shown below:
  • the target sequence 13 contains a nucleotide sequence complementary to the antisense strand of the siRNA in the siRNA conjugate to be tested, so the inhibitory effect of each siRNA conjugate on the target sequence 13 can reflect the degree of off-target effect. That is, the higher the inhibitory effect, the more likely the siRNA conjugate is off-target. On the other hand, the ratio of the inhibitory effect of each siRNA conjugate on target sequence 12 to the inhibitory effect on target sequence 13 can reflect the relative off-target tendency of the siRNA conjugate. The less likely off-target occurs, the lower the possibility of off-target toxicity when the same level of drug efficacy is obtained.
  • each siRNA conjugate containing stabilized modified nucleotides of the present disclosure not only The inhibitory activity against the on-target target sequence 12 was comparable or significantly higher, and all showed significantly lower off-target effects.
  • the ratio of off-target IC 25 /on-target IC 25 was at least 499, even as high as 2100, indicating that the same or similar
  • the off-target effect of the siRNA conjugates of the present disclosure is lower than that of the reference conjugate when the desired drug effect is obtained, so that the preparation of a drug for inhibiting ANGPTL3 that is more effective and less toxic due to off-target effects applications have shown excellent potential.
  • mice C57BL/6 mice (6-8 weeks old, purchased from Speyford Company) with serum TG content > 2 mmol/L were selected for random grouping, with 5 mice in each group, all of which were female.
  • Conjugate 18, Conjugate 19, Reference Conjugate 9 and PBS blank control were administered to each group of mice respectively. All animals were dosed according to their body weight, and administered in a single subcutaneous injection. The dose of each siRNA conjugate (based on the amount of siRNA) was 3 mg/kg mouse body weight, and the administration volume was 5 ml/kg. Each siRNA conjugate is provided in PBS aqueous solution, and the concentration that the conjugate should be prepared is calculated according to the dosage and volume of administration. Each of the other group of mice was given 1 ⁇ PBS with a volume of 5 ml/kg, serving as a blank control group.
  • RNA later Sigma Aldrich
  • 1 mL Trizol Sigma Company
  • Trizol Sigma Company
  • liver tissue homogenate to which 0.2mL chloroform was added, mixed evenly and allowed to stand for 10min.
  • Centrifuge at 12,000 rpm for 10 min at 4°C, and take 0.4 mL of the supernatant. Add 0.5mL isopropanol to the supernatant and let it stand at room temperature for 10min.
  • RNA concentration was determined with NANO DROP 2000 (Thermo Company) according to the method described in the manual.
  • RNA of the liver tissue of each mouse take the total RNA aqueous solution containing 1 ⁇ g total RNA respectively, the solution volume is 1000 ⁇ L/RNA concentration (ng/ ⁇ L), use the reverse transcription kit Reverse Transcription System (purchased from TSINGKE company) According to the reverse transcription operation steps in the kit instruction manual, 20 ⁇ L of reverse transcription reaction system was prepared, and the total RNA was reverse transcribed.
  • the reverse transcription conditions are: for each reverse transcription reaction system, incubate the reverse transcription reaction system at 42°C for 30 minutes, then incubate at 95°C for 5 minutes, and finally incubate at 4°C for 5 minutes. Add 80 ⁇ L of DEPC water to the recording reaction system to obtain a solution containing cDNA.
  • each reverse transcription reaction system 5 ⁇ L of the above cDNA-containing solution was used as a template, and 20 ⁇ L of the qPCR reaction system was prepared using the reagents provided by the 2 ⁇ Ultra SYBR Mixture (with ROX) kit (purchased from Beijing Kangwei Century Company).
  • the PCR primer sequences used to amplify the target gene mANGPTL3 and the internal reference gene mGAPDH are shown in Table 25, and the final concentration of each primer is 0.25 ⁇ M.
  • Each qPCR reaction system was placed on the ABI StepOnePlus Real-Time PCR instrument and amplified using a three-step method.
  • the amplification program was pre-denaturation at 95°C for 10 minutes, followed by denaturation at 95°C for 30s, annealing at 60°C for 30s, and extension at 72°C for 30s. After repeating the above-mentioned denaturation, annealing, and extension processes for a total of 40 times, a product W containing amplified target gene mANGPTL3 and internal reference gene mGAPDH was obtained. The product W was then incubated at 95°C for 1 min, 55°C for 30 s, and 95°C for 30 s.
  • the real-time fluorescent quantitative PCR instrument collected the melting curves of the target gene mANGPTL3 and the internal reference gene mGAPDH in the product W respectively, and obtained the Ct of the target gene mANGPTL3 and the internal reference gene mGAPDH. value.
  • the siRNA conjugates of the present disclosure exhibit excellent mANGPTL3 mRNA inhibitory effects in mice, and at a dose of 3 mg/kg, the inhibitory rate of mANGPTL3 mRNA is at least 70%, and can even be as high as 95%, and showed comparable or even higher mANGPTL3 mRNA inhibitory activity than the corresponding reference conjugate 9 that did not include stabilizing modified nucleotides.
  • % and the preceding figures represent the difference between the concentration of alanine aminotransferase (ALT) or aspartate aminotransferase (AST) in the mouse serum and the concentration in the serum of the blank control group, and the difference with the concentration of the blank control group Percentage of concentration in group serum.
  • the concentration of ALT in the serum of male mice and female mice given reference conjugate 9 that does not contain stabilized modified nucleotides increased by 630% and 840%, respectively
  • the concentrations of AST increased by 114% and 145%, respectively.
  • the concentration of ALT in the serum of male mice and female mice given the conjugate 18 of the present disclosure was only increased by 25.6% and 101%, and the concentration of AST was only increased by 10.8% and 37.0%, respectively.
  • mice given the reference conjugate 9 4 mice showed severe hepatocyte degeneration, which was specifically manifested as a large number of balloon-like degeneration of hepatocytes in the tissue, with swelling of the cells and centered nuclei.
  • Cytoplasmic vacuolization 2 cases showed severe hepatocyte degeneration, specifically manifested as extensive hepatocyte ballooning degeneration in the tissue, cell swelling, centered nucleus, and cytoplasmic vacuolation.
  • mice given the conjugate 18 of the present disclosure 3 mice showed mild hepatocyte degeneration, which was manifested in the integrity of tissue lobules, tight arrangement of hepatocytes, loose cytoplasm of a small number of hepatocytes, and no severe hepatocyte degeneration. or very severe hepatocellular degeneration.
  • the siRNA conjugates of the present disclosure can effectively reduce the hepatotoxicity caused by off-target effects, so it is used in the preparation of drugs for the treatment and/or prevention of dyslipidemia-related diseases or symptoms. Drugs show significantly higher safety and have excellent development prospects.

Abstract

提供一种能够调节目标基因表达水平的双链寡核苷酸，包含正义链和反义链，所述正义链和反义链分别包含由19个修饰或未修饰的核苷酸组成的核苷酸序列I或核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，所述核苷酸序列II至少部分地与目标基因表达的mRNA中的一段核苷酸序列反向互补；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3-6个核苷酸中的至少1个为稳定化修饰核苷酸，并且所述核苷酸序列II中第3-9个核苷酸之外的核苷酸均不是稳定化修饰核苷酸。提供的双链寡核苷酸以及包含该双链寡核苷酸的药物组合物和缀合物可以有效治疗和/或预防与目标基因表达相关的疾病或病症，并具有降低的脱靶效应。

Description

双链寡核苷酸、含双链寡核苷酸的组合物与缀合物及制备方法和用途 技术领域
本公开涉及一种具有降低的脱靶效应的双链寡核苷酸和含有该双链寡核苷酸的药物组合物与寡核苷酸缀合物。本公开还涉及这些双链寡核苷酸、药物组合物与寡核苷酸缀合物的制备方法和用途。
背景技术
双链寡核苷酸作为药物活性成分已为公众所知。近年来，在双链寡核苷酸成药方面取得了相当程度的进展。
在双链寡核苷酸的成药研究中，重要的副作用甚至毒性相关的效果之一是脱靶效应。一方面，本领域中一直在努力开发合成同时具有良好的药学活性和低的脱靶效应的双链寡核苷酸，如何获得在这两方面符合需求的双链寡核苷酸在本领域中仍需要进一步深入探索；另一方面，许多临床前药学研究中显示出优异药学活性的双链寡核苷酸由于其脱靶效应产生的毒性而难以用于实际药物研发，因此如何降低双链寡核苷酸的脱靶效应，在本领域中仍然存在重大的实际需求。
发明内容
为了开发一种在具有良好的药学活性的同时，还显示出降低的脱靶效应的双链寡核苷酸，并且开发一种降低双链寡核苷酸的脱靶效应的方法，发明人经过反复研究和实验，出人意料地发现，在序列特定位置处具有稳定化修饰核苷酸的双链寡核苷酸在基本保持药学活性的同时，还具有比对应位置未修饰的双链寡核苷酸显著更低的脱靶效应。从而，发明人作出如下发明：
在一方面，本公开提供了一种双链寡核苷酸，所述双链寡核苷酸包含正义链和反义链，所述正义链包含核苷酸序列I，所述反义链包含核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II均由19个核苷酸组成，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II中的每一个核苷酸为修饰或未修饰的核苷酸，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，所述核苷酸序列II至少部分地与第一段核苷酸序列反向互补，所述第一段核苷酸序列为目标基因表达的mRNA中的一段长度为19个核苷酸的核苷酸序列；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3-6个核苷酸中的至少1个为稳定化修饰核苷酸，并且所述核苷酸序列II中第3-9个核苷酸之外的核苷酸均不是稳定化修饰核苷酸，所述稳定化修饰核苷酸指核苷酸的核糖2'位羟基被稳定化修饰基团取代的核苷酸，与相应位置的核苷酸为未修饰的核苷酸的双链寡核苷酸相比，包含所述稳定化修饰核苷酸的双链寡核苷酸的热稳定性增加，并且所述稳定化修饰基团的空间位阻大于2'-O-甲基。
在另一方面，本公开提供了一种双链寡核苷酸，所述双链寡核苷酸包含正义链和反义链，所述正义链和反义链的每一个核苷酸均为修饰的核苷酸，其中， 所述正义链包含核苷酸序列I，所述反义链包含核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II均由19个核苷酸组成，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，所述核苷酸序列II至少部分地与第一段核苷酸序列反向互补，所述第一段核苷酸序列为目标基因表达的mRNA中的一段长度为19个核苷酸的核苷酸序列；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的第7-9个核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述核苷酸序列I其他位置的每个核苷酸独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16个核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述核苷酸序列II其他位置的每个核苷酸独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3个和/或第5个核苷酸是2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸。
在又一方面，本公开还提供了一种药物组合物，该药物组合物含有本公开提供的双链寡核苷酸以及药学上可接受的载体。
在又一方面，本公开还提供了一种寡核苷酸缀合物，所述寡核苷酸缀合物含有本公开提供的双链寡核苷酸以及缀合连接至该双链寡核苷酸的缀合基团，所述缀合基团包含接头和药学上可接受的靶向基团和/或递送辅助基团，并且，所述双链寡核苷酸、所述接头和所述靶向基团或者所述递送辅助基团依次共价或非共价连接，每个所述靶向基团选自能够和细胞表面受体结合的配体，每个递送辅助基团选自能够增加所述寡核苷酸缀合物在递送目标器官或组织中的生物相容性的基团。
在又一方面，本公开还提供了本公开的双链寡核苷酸、药物组合物和/或寡核苷酸缀合物在制备用于治疗和/或预防与目标基因表达的mRNA水平相关的疾病或症状的药物中的用途。
在又一方面，本公开还提供了一种治疗和/或预防与目标基因表达的mRNA水平相关的疾病或症状的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予本公开的双链寡核苷酸、药物组合物和/或寡核苷酸缀合物。
在又一方面，本公开还提供了一种调节细胞中目标基因表达水平的方法，所述方法包括将有效量的本公开的双链寡核苷酸、药物组合物和/或寡核苷酸缀合物与所述细胞接触。
另外，本公开还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含本公开的双链寡核苷酸、药物组合物和/或寡核苷酸缀合物。
以引用的方式并入
本说明书中提及的所有出版物、专利以及专利申请均以引用的方式并入本文，其程度与每一单独的出版物、专利或专利申请均专门并且单独地以引用的方式并入本文的程度相同。
有益效果
本公开的双链寡核苷酸、药物组合物和/或寡核苷酸缀合物具有良好的稳 定性，较高的目标基因表达调节活性，并且具有低的脱靶效应。具体说明如下。
第一，本公开的双链寡核苷酸、药物组合物和/或寡核苷酸缀合物可在体外或体内具有更低的脱靶效应和/或由于脱靶效应导致的毒性反应。例如，本公开提供的siRNA在体外siCHECK系统中对脱靶目标序列抑制率始终不高于25％，与不包含稳定化修饰核苷酸的参比siRNA相比显示出显著更低的脱靶效应。又例如，在大鼠中，给予30mg/kg的剂量下，给予本公开的siRNA缀合物的大鼠中，肝重几乎不增加，并且在在肝脂肪变性和炎症方面显示出明显低于参比siRNA缀合物的毒性反应。又例如，本公开提供的siRNA缀合物在体外siCHECK系统中对脱靶目标序列抑制率始终不高于25％，与不包含稳定化修饰核苷酸的参比siRNA缀合物相比显示出显著更低的脱靶效应。又例如，在小鼠中，给予30mg/kg的剂量下，给予本公开的siRNA缀合物的小鼠中，在肝脂肪变性方面显示出与空白对照组相接近的毒性反应，并显著低于给予不包含稳定化修饰核苷酸的参比缀合物的小鼠显示的肝脂肪变性。又例如，在以100mg/kg剂量给予本公开的siRNA缀合物的小鼠中，血生化指标显著降低，与空白对照组相比无明显异常；并且与参比siRNA缀合物相比，给予了本公开siRNA缀合物的小鼠没有出现中度以上的炎性细胞浸润和坏死，在组织病理学中显示出显著更低的毒性反应。又例如，即使在300mg/kg的高剂量下，血清ALT与空白对照组相比也没有显著差别，并且与给予了参比缀合物的小鼠中6只均在组织病理切片中显示出炎细胞浸润的相比，施用了本公开的缀合物的小鼠仅有3只出现炎细胞浸润，出现炎细胞浸润的小鼠数量明显降低。又例如，本公开的siRNA缀合物具有低的脱靶效应，在体外siCHECK系统中，本公开的siRNA缀合物显示出优异的目标序列在靶抑制活性，IC50值为4.50pM-11.3pM，同时，在全部测试siRNA浓度范围内对脱靶目标序列的抑制率均不足50％，表现出低的脱靶效应。又例如，在以300mg/kg的高剂量在连续三周内每周给予本公开的siRNA缀合物的小鼠中，血清ALT和AST浓度与空白对照组水平相当；进一步地，在病理切片中，给予本公开的siRNA缀合物的小鼠中在肝脂肪变性和炎症方面同样显示出与空白对照组相接近的反应，没有显著异常，表明本公开的siRNA缀合物具有很低的肝毒性。又例如，与不包含稳定化修饰核苷酸的参比siRNA缀合物相比，本公开的siRNA缀合物不仅对在靶目标序列的抑制活性相当或显著更高，还均显示出显著更低的脱靶效应，脱靶IC 25/在靶IC 25的比值至少为499，甚至高达2100。又例如，与给予参比siRNA缀合物的小鼠相比，以100mg/kg剂量给予本公开的siRNA缀合物的小鼠中，血生化指标显著降低，与空白对照组保持接近的水平；并且在组织病理学中显示出显著更低的毒性反应，多数小鼠中未发现异常，而仅有部分小鼠出现轻度的肝细胞变性。
第二，本公开的双链寡核苷酸、药物组合物和/或寡核苷酸缀合物在体外细胞实验中显示出优异的目标基因表达调节活性。例如，本公开的双链寡核苷酸是siRNA时，本公开提供的siRNA在体外siCHECK系统中很高的目标序列抑制活性，IC 50在0.0022-0.0086nM之间，同时，与不包含稳定化修饰核苷酸的 参比siRNA具有接近的目标序列抑制活性。又例如，本公开提供的siRNA在44Bri小鼠原代肝细胞中显示出优异的HBV mRNA抑制活性，在50nM的siRNA浓度下，HBV mRNA抑制率至少为73.92％，最高可达77.58％，并显示出与对应不包括稳定化修饰核苷酸的参比siRNA相当的HBV mRNA抑制活性。又例如，本公开的siRNA缀合物在44Bri小鼠原代肝细胞中显示出优异的HBV mRNA抑制活性，在10nM的siRNA浓度下，HBV mRNA抑制率至少为81.29％，最高可达93.06％，并显示出与对应不包括稳定化修饰核苷酸的参比缀合物4相当的HBV mRNA抑制活性。又例如，本公开的siRNA缀合物在44Bri小鼠原代肝细胞中显示出优异的HBV mRNA抑制活性，在10nM的siRNA浓度下，HBV mRNA抑制率至少为70.14％，最高可达85.97％，并显示出与对应不包括稳定化修饰核苷酸的参比siRNA缀合物相当的HBV mRNA抑制活性；并且与对应位置是未修饰核苷酸的参比siRNA缀合物相比，HBV mRNA抑制活性出人意料地均有显著增加，最高可增加22.99％。又例如，本公开提供的siRNA缀合物在体外siCHECK系统中有很高的目标序列抑制活性。在0.01nM的低浓度下，至少有38.92nM的目标序列表达抑制率，最高可达67.54％；在0.1nM的浓度下，目标序列表达抑制率至少为84.73％，最高可达89.35％；同时，与不包含稳定化修饰核苷酸的参比siRNA缀合物具有接近的目标序列抑制活性水平。又例如，本公开的siRNA缀合物在体外siCHECK系统中有很高的目标序列抑制活性，IC 50在6.89-8.55pM之间；同时，与其余序列相同、但不包含稳定化修饰核苷酸的参比缀合物具有接近的目标序列抑制活性。又例如，本公开的siRNA缀合物在体外siCHECK系统中显示出高的目标序列抑制活性，IC 50为49.8pM。又例如，本公开提供的siRNA缀合物在体外siCHECK系统中有很高的目标序列抑制活性。在0.01nM的低浓度下，至少有51.56nM的目标序列表达抑制率，最高可达58.76％；在0.1nM的浓度下，目标序列表达抑制率可达87.92-88.84％。同时，与不包含稳定化修饰核苷酸的参比siRNA缀合物相比，具有接近的目标序列抑制活性水平。
第三，本公开的双链寡核苷酸、药物组合物和/或寡核苷酸缀合物可在体内具有更高的稳定性和/或更高的活性。例如，本公开的双链寡核苷酸是siRNA时，本公开的siRNA缀合物在小鼠体内显示出优异的HBV mRNA抑制效果，在0.1mg/kg的剂量下，HBV mRNA抑制率至少为63.18％，在1mg/kg的剂量下，HBV mRNA抑制率甚至可高达96.31％，并且显示出与对应不包括稳定化修饰核苷酸的参比siRNA缀合物相当的HBV mRNA抑制活性。又例如，本公开的siRNA缀合物在小鼠体内显示出优异的HBV mRNA抑制效果，在0.1mg/kg的剂量下，HBV mRNA抑制率至少为44.88％，在1mg/kg的剂量下，HBV mRNA抑制率甚至可高达84.25％，并且显示出与相同浓度下对应不包括稳定化修饰核苷酸的参比siRNA缀合物相当的HBV mRNA抑制活性。又例如，在给药后不同时间点，本公开的siRNA缀合物能够明显降低小鼠血清中的TG和CHO水平，并显示出与对应不包括稳定化修饰核苷酸的参比siRNA缀合物相近的血脂水平降低效果。特别是，在3mg/kg的剂量下，本公开的siRNA缀合物在长达50天的全部给药时间内始终显示出很高的血脂TG降低效果， 最高抑制率可达90.2％。又例如，在给药后不同时间点，本公开的siRNA缀合物能够明显降低小鼠血清中的TG和CHO水平，并显示出与对应不包括稳定化修饰核苷酸的参比siRNA缀合物相近的血脂水平降低效果。特别是，在3mg/kg以及1mg/kg的剂量下，本公开的siRNA缀合物在长达50天的全部给药时间内始终显示出很高的血脂TG降低效果，最高抑制率可达92.0％。又例如，在给药后不同时间点，不同浓度的本公开的siRNA缀合物均能够降低小鼠血清中的TG水平，特别是，在9mg/kg的给药剂量下，仅给药一次，本公开的siRNA缀合物就能在64天的长时间内始终保持TG水平抑制率大于50％，且抑制率最高可达89.5％，显示出优异的血脂抑制能力。又例如，在给药后不同时间点，本公开的siRNA缀合物能够明显降低小鼠血清中的TG和CHO水平。并且在实验期间的43天时间内始终保持较高的抑制效果；特别是，3mg/kg剂量的本公开的siRNA缀合物均显示出优异的小鼠血脂抑制效果，血清TG的最大抑制率均高于88％；血清CHO的最大抑制率为51.18％-57.41％。又例如，在给药后不同时间点，本公开的siRNA缀合物能够明显降低小鼠血清中的TG和CHO水平，并且在实验期间的22天时间内始终保持较高的抑制效果，并且显示出与对应不包括稳定化修饰核苷酸的参比siRNA缀合物相近的血脂水平降低效果。又例如，本公开的siRNA缀合物在小鼠体内显示出优异的目标基因表达的mRNA抑制效果，在3mg/kg的剂量下，目标基因表达的mRNA抑制率至少为70％，甚至可高达95％，并且显示出与对应不包括稳定化修饰核苷酸的参比siRNA缀合物相当甚至更高的目标基因表达的mRNA抑制活性。
由此说明，本公开提供的双链寡核苷酸、药物组合物以及寡核苷酸缀合物能够具有显著更低的脱靶效应以及由于脱靶效应引起的毒性反应，同时还能够在体内外有效调节目标基因的表达水平，因此可在具有显著更高的安全性的同时，有效治疗和/或预防由目标基因表达的mRNA水平相关的疾病症状，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为分别转染了本公开的siRNA和参比siRNA后，44Bri小鼠原代肝细胞中HBV mRNA相对表达水平的柱状图。
图2为分别自由摄取了本公开的siRNA缀合物或参比siRNA缀合物以及参比siRNA NC后，44Bri小鼠原代肝细胞中HBV mRNA相对表达水平的柱状图。
图3A和图3B为分别给予了不同浓度的本公开的siRNA缀合物或参比siRNA缀合物以及PBS后，44Bri小鼠肝内HBV mRNA相对表达水平的散点图。
图4为分别自由摄取了本公开的siRNA缀合物或参比siRNA缀合物以及参比siRNA NC后，44Bri小鼠原代肝细胞中HBV mRNA相对表达水平的柱状图。
图5为分别给予了本公开的siRNA缀合物或参比siRNA缀合物以及PBS后，44Bri小鼠肝内HBV mRNA相对表达水平的散点图。
图6A和图6B分别是分别给予了本公开的siRNA缀合物或参比siRNA缀合物以及PBS后，小鼠血清中ALT和AST浓度的散点图。
图7是共转染包含目标序列的质粒和siRNA缀合物或参比siRNA NC后，体外siCHECK系统中目标序列相对表达水平的柱状图。
图8A和图8B分别为显示给予本公开的siRNA缀合物、参比siRNA缀合物或PBS后，血清TG水平或血清CHO水平随时间变化的折线图。
图9A和图9B分别为显示给予本公开的siRNA缀合物或PBS后，血清TG水平或血清CHO水平随时间变化的折线图。
图10为显示给予不同浓度的本公开的siRNA缀合物或PBS后，血清TG水平随时间变化的折线图。
图11A和图11B分别为显示给予本公开的siRNA缀合物或PBS后，血清TG水平或血清CHO水平随时间变化的折线图。
图12A和图12B分别是连续三周内每周给予300mg/kg本公开的siRNA缀合物或PBS后，小鼠血清中ALT和AST浓度的散点图。
图13A和图13B分别为显示给予本公开的siRNA缀合物、参比siRNA缀合物或PBS后，血清TG水平或血清CHO水平随时间变化的折线图。
图14是共转染包含目标序列的质粒和siRNA缀合物或参比siRNA NC后，体外siCHECK系统中目标序列相对表达水平的柱状图。
图15为分别给予了本公开的siRNA缀合物或参比siRNA缀合物以及PBS后，C57BL/6小鼠肝内mANGPTL3 mRNA相对表达水平的散点图。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
在本公开中，如无其他说明，HBV基因是指乙型肝炎病毒(HBV)的病毒基因，例如具有如Genbank注册号NC_003977.2所示序列的基因，HBV mRNA是指由上述HBV基因转录的mRNA；APOC3 mRNA是指具有如Genbank注册号NM_000040.3所示序列的mRNA，APOC3基因是指转录上述APOC3mRNA的基因；ANGPTL3 mRNA是指具有如Genbank注册号NM_014495.4所示序列的mRNA，ANGPTL3基因是指转录上述ANGPTL3 mRNA的基因。
定义
在上文及下文中，如无特别说明，大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接；P1表示该P1右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸，在一些实施方式中，P1是表示具体修饰的VP、Ps或P，其中，字母组合VP表示该字母组合VP右侧相邻的一个核苷酸为乙烯基磷酸酯(5'-(E)-vinylphosphonate，E-VP)修饰的核苷酸，字母组合Ps表示该字母组合Ps右侧 相邻的一个核苷酸为硫代磷酸酯修饰的核苷酸，大写字母P表示该字母P右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸。
在上文及下文中，所述“氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代形成的核苷酸，“非氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物。“核苷酸类似物”指能够在核酸中代替核苷酸，但结构不同于腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的基团。如异核苷酸、桥联的核苷酸(bridged nucleic acid，简称BNA)或无环核苷酸。所述“甲氧基修饰的核苷酸”指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
在本文的上下文中，表述“互补”或“反向互补”可互相替代使用，并具有本领域技术人员周知的含义，即，在双链核酸分子中，一条链的碱基各自与另一条链上的碱基以互补的方式相配对。在DNA中，嘌呤碱基腺嘌呤(A)始终与嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)(或者在RNA中为尿嘧啶(U))相配对；嘌呤碱基鸟嘌呤(C)始终与嘧啶碱基胞嘧啶(G)相配对。每个碱基对都包括一个嘌呤和一个嘧啶。当一条链上的腺嘌呤始终与另一条链上的胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配对，以及鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对时，两条链被认为是彼此相互补的，以及从其互补链的序列中可以推断出该链的序列。与此相应地，“错配”在本领域中意指在双链核酸中，对应位置上的碱基并未以互补的形式配对存在。
在上文及下文中，如无特别说明，“基本上反向互补”是指所涉及的两段核苷酸序列之间存在不多于3个的碱基错配；“实质上反向互补”是指两段核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；“完全反向互补”是指两段核苷酸序列之间不存在碱基错配。
在上文及下文中，特别是在描述本公开的双链寡核苷酸、药物组合物或寡核苷酸缀合物的制备方法时，除非特别说明，所述核苷单体(nucleoside monomer)是指，根据欲制备的双链寡核苷酸或寡核苷酸缀合物中核苷酸的种类和顺序，亚磷酰胺固相合成中使用的修饰或未修饰的核苷亚磷酰胺单体(unmodified or modified RNA phosphoramidites，有时RNA phosphoramidites也称为Nucleoside phosphoramidites)。亚磷酰胺固相合成为本领域技术人员所公知的RNA合成中所用的方法。本公开所用的核苷单体均可商购得到。
本领域技术人员将理解的是，对于包含一个或多个取代基的任何基团，这些基团不打算引入空间上不切实际、合成上不可行和/或本身不稳定的任何取代或取代模式。
如本文所使用的，“烷基”是指具有指定数量的碳原子的直链和支链，所述数量通常为1至20个碳原子，例如1至10个碳原子，如1至8个或1至6个碳原子。例如，C 1-C 6烷基包含1至6个碳原子的直链和支链烷基。当提及具有特定数量的碳的烷基残基时，旨在涵盖具有该数量的碳的所有支链和直链形式；因此，例如，“丁基”意味着包括正丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基；“丙基”包括正丙基和异丙基。亚烷基是烷基的子集，指与烷基相同、但具有两个连接 点的残基。
如本文所使用的，“烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的不饱和支链或直链烷基，所述碳-碳双键是通过从母体烷基的相邻碳原子中除去一分子氢而获得的。该基团可以处于双键的顺式或反式构型。典型的烯基基团包括但不限于：乙烯基；丙烯基，如丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基(烯丙基)、丙-2-烯-2-基；丁烯基，例如丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1,3-二烯-1-基、丁-1,3-二烯-2-基等等。在某些实施方式中，烯基基团具有2到20个碳原子，而在其他实施方式中，具有2至10个、2至8个或2至6个碳原子。亚烯基是烯基的一个子集，指与烯基相同、但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“炔基”是指具有至少一个碳-碳三键的不饱和支链或直链烷基，所述碳-碳三键是通过从母体烷基的相邻碳原子中除去两分子氢而获得的。典型的炔基基团包括但不限于：乙炔基；丙炔基，如丙-1-炔-1-基，丙-2-炔-1-基；丁炔基，例如丁-1-炔-1-基，丁-1-炔-3-基，丁-3-炔-1-基等。在某些实施方式中，炔基具有2到20个碳原子，而在其他实施方式中，具有2至10、2至8或2至6个碳原子。亚炔基是炔基的一个子集，指的是与炔基相同、但有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“烷氧基”是指通过氧桥连接的指定数量碳原子的烷基，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、2-戊氧基、异戊氧基、新戊氧基、己氧基、2-己氧基、3-己氧基、3-甲基戊氧基等。烷氧基通常具有1至10个、1至8个、1至6个，或1至4个通过氧桥连接的碳原子。
如本文所使用的，“芳基”是指通过从环碳原子中除去氢原子而衍生自芳香族单环或多环烃环系统形成的基团。所述芳香族单环或多环烃环系统仅含有氢和6至18个碳原子的碳，其中所述环系统中的至少一个环是完全不饱和的，即，包含根据Hückel理论的环状、离域的(4n+2)π-电子体系。芳基包括但不限于苯基、芴基和萘基等基团。亚芳基是芳基的子集，指与芳基相同、但具有两个连接点的残基。
“杂芳基”指由3-至18-元芳香环自由基衍生而成的基团，包含2个至17个碳原子和选自氮、氧和硫的1至6个杂原子。如本文所使用的，杂芳基可以是单环、双环、三环或四环系统，其中环系统中的至少一个环是完全不饱和的，即，包含根据Hückel理论的环状离域(4n+2)π-电子体系。杂芳基包括稠环或桥环系统。在一些实施方式中，杂芳基中的杂原子是氧化的杂原子。在一些实施方式中，杂芳基中包含一个或多个氮原子。在一些实施方式中，杂芳基中的氮原子中的一个或多个是季铵化的氮原子。杂芳基通过任何环原子附着至分子的其余部分。杂芳基的实例包括但不限于：氮杂环庚三烯基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并吲哚基、1,3-苯并二噁唑基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并[d]噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1,4]二噁庚英基(benzo[b][1,4]dioxepinyl)、苯并 [b][1,4]噁嗪基(benzo[b][1,4]oxazinyl)、1,4-苯并二噁烷基(1,4-benzodioxanyl)、苯并萘并呋喃基、苯并噁唑基、苯并间二氧杂环戊烯基(benzodioxolyl)、苯并二噁英基(benzodioxinyl)、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基、苯并噻吩并[3,2-d]嘧啶基、苯并三唑基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、咔唑基、噌啉基(cinnolinyl)、环戊烷并[d]嘧啶基、6,7-二氢-5H-环戊烷并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6-二氢苯并[h]喹唑啉基(5,6-dihydrobenzo[h]quinazolinyl)、5,6-二氢苯并[h]噌啉基(5,6dihydrobenzo[h]cinnolinyl)、6,7-二氢-5H-苯并[6,7]环庚烷并[1,2-c]哒嗪基、二苯并呋喃基、二苯并噻吩基、呋喃基、呋喃酮基、呋喃并[3,2-c]吡啶基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]嘧啶基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]哒嗪基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]吡啶基、异噻唑基、咪唑基、吲唑基(indazolyl)、吲哚基、异吲哚基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、异喹啉基、吲哚嗪基(indolizinyl)、异噁唑基、5,8-甲醇-5,6,7,8-四氢喹唑啉基(5,8-methano-5,6,7,8-tetrahydroquinazolinyl)、萘啶基(naphthyridinyl)、1,6-萘啶酮基(1,6-naphthyridinonyl)、噁二唑基、2-氧杂吖庚因基(2-oxoazepinyl)、噁唑基、氧杂环丙烷基(oxiranyl)、5,6,6a,7,8,9,10,10a-八氢苯并[H]喹唑啉基、1-苯基-1H-吡咯基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、酞嗪基(phthalazinyl)、蝶啶基(pteridinyl)、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡唑并[3,4-d]嘧啶基、吡啶基、吡啶并[3,2-d]嘧啶基、吡啶并[3,4-d]嘧啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吡咯基、喹唑啉基、喹喔啉基(quinoxalinyl)、喹啉基、四氢喹啉基、5,6,7,8-四氢喹唑啉基、5,6,7,8-四氢苯并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、6,7,8,9-四氢-5H-环庚烷并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6,7,8-四氢吡啶并[4,5-c]哒嗪基、噻唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、三嗪基、噻吩并[2,3-d]嘧啶基、噻吩并[3,2-d]嘧啶基、噻吩并[2,3-c]吡啶基(thieno[2,3-c]pridinyl)和噻吩基(thiophenyl/thienyl)。
在本公开中可以使用各种羟基保护基团。一般来说，保护基团使化学官能度对特定的反应条件不敏感，并且可以在分子中的该官能度上添加以及去除，而不实质上损害分子的其余部分。代表性的羟基保护基团公开于Beaucage等人，Tetrahedron 1992,48,2223-2311，以及Greeneand Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，Chapter 2,2d ed，John Wiley & Sons，New York，1991中，以引用的方式将上述文献各自整体并入本文。在一些实施方式中，保护基团在碱性条件下稳定，但可以在酸性条件下脱除。在一些实施方式中，本文可使用的羟基保护基的非排他性实例包括二甲氧基三苯甲基(DMT)、单甲氧基三苯甲基、9-苯基氧杂蒽-9-基(Pixyl)和9-(对甲氧基苯基)氧杂蒽-9-基(Mox)。在一些实施方式中，本文可使用的羟基保护基的非排他性实例包括Tr(三苯甲基)、MMTr(4-甲氧基三苯甲基)、DMTr(4,4'-二甲氧基三苯甲基)和TMTr(4,4',4”-三甲氧基三苯甲基)。
“受试者”一词，如本文所使用的，指任何动物，例如哺乳动物或有袋动物。本公开的受试者包括但不限于人类、非人灵长类(例如，恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、猪、马、驴、牛、兔、绵羊、大鼠和任何种类的家禽。
如本文所使用的，“治疗”指的是获得有益的或期望的结果的方法，包括但不限于治疗益处。“治疗益处”意味着根除或改善被治疗的潜在障碍。此外，治疗益处通过根除或改善与潜在障碍相关的一个或多个生理症状，从而在受试者中观察到改善而获得，尽管受试者可能仍然受到潜在障碍的折磨。
如本文所使用的“预防”指获得有益或期望的结果的方法，包括但不限于预防性益处。为了获得“预防性益处”，可将双链寡核苷酸、药物组合物或寡核苷酸缀合物给予有罹患特定疾病风险的受试者，或给予报告疾病的一种或多种生理症状的受试者，即便可能该疾病的诊断尚未作出。
第一种双链寡核苷酸
在一方面，本公开提供了第一种能够调节基因表达、且具有低的脱靶效应的双链寡核苷酸。
本公开的第一种双链寡核苷酸含有核苷酸基团作为基本结构单元，本领域技术人员公知，所述核苷酸基团含有磷酸基团、核糖基团和碱基，在此不再赘述。
CN102140458B公开了一种特异性抑制HBV基因的siRNA，并对该siRNA的多种化学修饰策略进行了研究。该研究发现，不同修饰策略会对siRNA的稳定性、生物活性及细胞毒性等指标产生截然不同的影响。在该研究中，证实了7种有效的修饰方式，与未经修饰的siRNA相比，其中一种修饰方式所得的siRNA在提高血液稳定性的同时，还保持了与未经修饰的siRNA基本相当的抑制活性。然而，该研究中并未提及脱靶效应问题。
本公开的双链寡核苷酸包含正义链和反义链，所述正义链包含核苷酸序列I，所述反义链包含核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II均由19个核苷酸组成，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II中的每一个核苷酸为修饰或未修饰的核苷酸，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，所述核苷酸序列II至少部分地与第一段核苷酸序列反向互补，所述第一段核苷酸序列为目标基因表达的mRNA中的一段长度为19个核苷酸的核苷酸序列；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3-6个核苷酸中的至少1个为稳定化修饰核苷酸，并且所述核苷酸序列II中第3-9个核苷酸之外的核苷酸均不是稳定化修饰核苷酸，所述稳定化修饰核苷酸指核苷酸的核糖2'位羟基被稳定化修饰基团取代的核苷酸，与相应位置的核苷酸为未修饰的核苷酸的双链寡核苷酸相比，包含所述稳定化修饰核苷酸的双链寡核苷酸的热稳定性增加，并且所述稳定化修饰基团的空间位阻大于2'-O-甲基。
在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第3个或第5个核苷酸为所述稳定化修饰核苷酸。在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第3-9个核苷酸中不超过2个核苷酸为所述稳定化修饰核苷酸。通过对特定位置处稳定化修饰核苷酸的个数进行限定，本公开的双链寡核苷酸可获得最佳的药学活性与低脱靶效应的平衡， 同时还具有优异的稳定性。在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第3个和/或第5个核苷酸为所述稳定化修饰核苷酸。在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第3个和/或第5个核苷酸为所述稳定化修饰核苷酸，且第4个、第7个、第9个核苷酸中的一个也为所述稳定化修饰核苷酸。
在一些实施方式中，本公开的双链寡核苷酸中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3个和第9个核苷酸为所述稳定化修饰核苷酸；或者，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第5个和第7个核苷酸为所述稳定化修饰核苷酸；或者，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第5个和第9个核苷酸为所述稳定化修饰核苷酸。
本公开的双链寡核苷酸中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中第3-9个核苷酸之外的核苷酸均不是稳定化修饰核苷酸。若核苷酸序列II中在第3-6个核苷酸中的至少1个为稳定化修饰核苷酸的同时，在第3-9个核苷酸之外包含稳定化修饰核苷酸，可能会显著影响该双链寡核苷酸的目标序列表达水平的调节能力。
在一些实施方式中，“双链寡核苷酸的热稳定性增加”是指所述双链寡核苷酸的热解离温度Tm升高。在一些实施方式中，“双链寡核苷酸的热稳定性增加”是指所述双链寡核苷酸的热解离温度Tm升高至少0.05℃，在一些实施方式中指升高0.1-6℃，在一些实施方式中指升高0.5-4℃。不受理论解释限制地，通过在特定位置包含稳定化修饰核苷酸，本公开的双链寡核苷酸中反义链与目标基因表达的mRNA结合能力基本不受影响，而与脱靶目标mRNA之间的结合显著降低，从而降低甚至消除脱靶效应。
在一些实施方式中，每个所述稳定化修饰基团独立地具有-X-R所示的结构，其中，X为O、NR'、S或SiR' 2；R是C 2-C 6烷基、取代的C 2-C 6烷基、C 6-C 8芳基、取代的C 6-C 8芳基中的一种，每个R'独立地是H、C 1-C 6烷基、取代的C 1-C 6烷基、C 6-C 8芳基、取代的C 6-C 8芳基中的一种，所述取代的C 2-C 6烷基或取代的C 6-C 8芳基是指C 2-C 6烷基或C 6-C 8芳基上的一个或多个氢原子被取代基取代而形成的基团，所述取代基各自独立地选自以下取代基中的一种或多种：C 1-C 3烷基、C 6-C 8芳基、C 1-C 3烷氧基、卤素、氧亚基和硫亚基。注意的是，本公开并非旨在涵盖全部符合上述结构的修饰基团，而仅涉及那些能够实现双链寡核苷酸热稳定性增加的稳定化修饰基团。在一些实施方式中，每个所述稳定化修饰基团独立地选自2'-O-甲氧基乙基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-O-2-N-甲基氨基-2-氧亚基乙基、2'-O-2-N,N-二甲基氨基乙基、2'-O-3-氨基丙基和2'-O-2,4-二硝基苯基中的一种。在一些实施方式中，每个所述稳定化修饰基团均为2'-O-甲氧基乙基。
在一些实施方式中，本公开的双链寡核苷酸中，所述核苷酸序列II与所述第一段核苷酸序列基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补。在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第2-19位的核苷酸与所述第一段核苷酸序列第1-18位的核苷酸完全反向互补。
在一些实施方式中，本公开的双链寡核苷酸中，所述核苷酸序列II与所述核苷酸序列I基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补。在一些实施方式中，所述核苷酸序列II与所述核苷酸序列I完全反向互补，或者按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2个核苷酸与按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2个核苷酸之间存在碱基错配。通过包含该碱基错配，可在保持低的脱靶效应的同时，进一步提升本公开的双链寡核苷酸的目标基因表达调节活性。
在一些实施方式中，本公开的双链寡核苷酸中，所述正义链还含有核苷酸序列III，所述反义链还含有核苷酸序列IV，所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV的每个核苷酸独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种且不是所述稳定化修饰核苷酸，所述核苷酸序列III的长度为1个、2个、3个或4个核苷酸，所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III长度相等，并且所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III实质上反向互补或完全反向互补，所述核苷酸序列III连接在所述核苷酸序列I的5'末端，所述核苷酸序列IV连接在所述核苷酸序列II的3'末端，并且所述核苷酸序列IV与第二段核苷酸序列实质上反向互补或完全反向互补，该第二段核苷酸序列是指和目标基因表达的mRNA中与第一段核苷酸序列相邻、且长度与所述核苷酸序列IV相同的核苷酸序列。从而，本公开的双链寡核苷酸可具有19-23个核苷酸长度的双链互补区。
在一些实施方式中，本公开的双链寡核苷酸还含有核苷酸序列V，所述核苷酸序列V的每个核苷酸独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种且不是所述稳定化修饰核苷酸，所述核苷酸序列V的长度为1至3个核苷酸，连接在所述反义链的3'末端，从而构成所述反义链的3'突出端。这样，本公开提供的双链寡核苷酸的正义链和反义链的长度之比可以是19/19、19/20、19/21、19/22、20/20、20/21、20/22、20/23、21/21、21/22、21/23、21/24、22/22、22/23、22/24、22/25、23/23、23/24、23/25或23/26。在一些实施方式中，所述核苷酸序列V的长度为2个核苷酸，并且按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列V为连续的2个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(dTdT)、连续的2个尿嘧啶核糖核苷酸(UU)、或者与第三段核苷酸序列完全反向互补，所述第三段序列是指目标基因表达的mRNA中与第一段核苷酸序列或第二段核苷酸序列在5'末端相邻、并且长度与所述核苷酸序列V相等的核苷酸序列。因此，在一些实施方式中，本公开的双链寡核苷酸的正义链和反义链各自具有19/21个核苷酸或21/23个核苷酸长度，此时，本公开的双链寡核苷酸具有更好的目标基因表达调节活性。
如前所述，本公开的双链寡核苷酸中，每个核苷酸均是修饰或未修饰的核苷酸。在本公开的上下文中，所使用的术语“修饰的核苷酸”是指核苷酸的核糖基2'位羟基被其他基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物，或者核苷酸上的碱基是经修饰的碱基的核苷酸。所述修饰的核苷酸不会导致双链寡核苷酸调节基因表达的功能明显削弱或丧失。例如，可以选择J.K.Watts等人，Chemically modified siRNA:tools and applications.Drug Discov Today，2008，13(19-20):842-55中公开的修饰的核苷酸。在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向， 所述核苷酸序列II的第2、6、14、16个核苷酸为2'-氟代修饰的核苷酸，或者，所述核苷酸序列II的第2、14、16个核苷酸为2'-氟代修饰的核苷酸，且所述核苷酸序列II的第6个核苷酸为稳定化修饰核苷酸。在一些实施方式中，所述核苷酸序列II中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16个核苷酸为2'-氟代修饰的核苷酸，所述核苷酸序列II中的其它核苷酸各自独立地为非氟代修饰的核苷酸的一种。在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的第7-9个核苷酸为2'-氟代修饰的核苷酸。在一些实施方式中，所述核苷酸序列I中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的第7-9个核苷酸为2'-氟代修饰的核苷酸，所述核苷酸序列I中的其它核苷酸各自独立地为非氟代修饰的核苷酸的一种。本公开的双链寡核苷酸通过具有上述修饰，能够实现基因表达调节活性和体内稳定性的良好平衡。
在本公开的上下文中，“氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代形成的核苷酸，其具有以下式(7)所示的结构。“非氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸、或核苷酸类似物。在一些实施方式中，每一个非氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物中的一种。
这些核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸是本领域技术人员所公知的，这些核苷酸可以选自2'-烷氧基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷基修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-经取代的氨基修饰的核苷酸、2'-脱氧核苷酸中的一种。
在一些实施方式中，2'-烷氧基修饰的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸(2'-OMe)，如式(8)所示。在一些实施方式中，2'-氨基修饰的核苷酸(2'-NH 2)如式(9)所示。在一些实施方式中，2'-脱氧核苷酸(DNA)如式(10)所示：
Figure PCTCN2022105340-appb-000001
核苷酸类似物指能够在核酸中代替核苷酸，但结构不同于腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的基团。在一些实施方式中，核苷酸类似物可以是异核苷酸、桥联的核苷酸(bridged nucleic acid，简称BNA)或无环核苷酸。
BNA是指受约束的或不能接近的核苷酸。BNA可以含有五元环、六元环、或七元环的具有“固定的”C3'-内切糖缩拢的桥联结构。通常将该桥掺入到该核糖的2'-、4'-位处以提供一个2'，4'-BNA核苷酸。在一些实施方式中，BNA可以是LNA、ENA、cET BNA等，其中，LNA如式(12)所示，ENA如式(13)所示，cET BNA如式(14)所示：
Figure PCTCN2022105340-appb-000002
无环核苷酸是核苷酸的糖环被打开形成的一类核苷酸。在一些实施方式中，无环核苷酸可以是解锁核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)，其中，UNA如式(15)所示，GNA如式(16)所示：
Figure PCTCN2022105340-appb-000003
上述式(15)和式(16)中，R选自H、OH或烷氧基(O-烷基)。
异核苷酸是指核苷酸中碱基在核糖环上的位置发生改变而形成的化合物。在一些实施方式中，异核苷酸可以是碱基从核糖环的1'-位移动至2'-位或3'-位而形成的化合物，如式(17)或(18)所示。
上述式(17)-式(18)化合物中，Base表示核酸碱基，例如A、U、G、C或T；R选自H、OH、F或者如上所述的非氟基团。
Figure PCTCN2022105340-appb-000004
在一些实施方式中，核苷酸类似物选自异核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA和GNA中的一种。在一些实施方式中，每一个非氟代修饰的核苷酸均为甲氧基修饰的核苷酸，在上文和下文中，所述甲氧基修饰的核苷酸指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
在上文及下文中，“氟代修饰的核苷酸”、“2'-氟修饰的核苷酸”、“核糖基团的2'-羟基被氟取代的核苷酸”和“具有2'-氟代核糖基的核苷酸”意义相同，均指核苷酸的2'-羟基被氟取代，而形成的具有如式(7)所示结构的化合物；“甲氧基修饰的核苷酸”、“2'-甲氧基修饰的核苷酸”、“核糖基团的2'-羟基被甲氧基取代的核苷酸”和“具有2'-甲氧基核糖基的核苷酸”意义相同，均指核苷酸核糖基团的2'-羟基被甲氧基取代而形成的具有如式(8)所示结构的化合物。
在一些实施方式中，本公开的双链寡核苷酸是具有以下修饰的双链寡核苷酸：按照5'末端到3'末端的方向，在所述正义链中，所述核苷酸序列I的第7、8、9位或者第5、7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其 余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；在所述反义链中，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16位或者第2、6、8、9、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中第3位或第5位的核苷酸为稳定化修饰核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸。
具有上述修饰的双链寡核苷酸不仅成本低，而且可使血液中的核糖核酸酶不易切割双链寡核苷酸，由此增加双链寡核苷酸的稳定性，使其具有更强的抵抗核酸酶水解的性能。同时，上述修饰的双链寡核苷酸具有较高的调节目标基因表达的活性。
在一些实施方式中，本公开提供的双链寡核苷酸的正义链和反义链中至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基中的至少1个为具有修饰基团的磷酸酯基。在一些实施方式中，具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基；在一些实施方式中，所述具有修饰基团的磷酸酯基为具有如式(121)所示结构的硫代磷酸酯基：
Figure PCTCN2022105340-appb-000005
这种修饰能稳定双链寡核苷酸的双链结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。
在一些实施方式中，所述双链寡核苷酸中，所述具有修饰基团的磷酸酯基存在于由以下位置所组成的组中的至少一处：
所述正义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；以及
所述反义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间。
在一些实施方式中，所述反义链的5'末端核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸。常用的所述5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸是本领域技术人员所公知的，如5'-磷酸核苷酸可具有如下结构：
Figure PCTCN2022105340-appb-000006
再如，Anastasia Khvorova and Jonathan K.Watts，The chemical evolution of oligonucleotide therapies of clinical utility.Nature Biotechnology，2017， 35(3):238-48中公开了如下4种5'-磷酸类似物修饰的核苷酸：
Figure PCTCN2022105340-appb-000007
其中，R选自H、OH、甲氧基、氟；Base表示核酸碱基，选自A、U、C、G或T。
在一些实施方式中，5'-磷酸核苷酸为式(2)所示的含有5'-磷酸修饰的核苷酸，5'-磷酸类似物修饰的核苷酸为含有乙烯基磷酸酯(5'-(E)-vinylphosphonate，E-VP)修饰的核苷酸，如式(3)所示，或者为硫代磷酸酯修饰的核苷酸，如式(5)所示。
本公开的双链寡核苷酸可以是各种调解基因表达的双链寡核苷酸。在一些实施方式中，可以是抑制或下调基因表达的双链寡核苷酸，如siRNA；在一些实施方式中，可以是激活或上调基因表达的双链寡核苷酸，例如，saRNA。
采用本公开修饰方案的双链寡核苷酸出人意料地提高了在血液中的稳定性、提高了在溶酶体中的稳定性、并且在具有低的脱靶效应的同时，还显示出优异的目标基因表达调节活性。
本公开提供的修饰的双链寡核苷酸、药物组合物和寡核苷酸缀合物可以用于调节各种基因异常表达，治疗各种由于基因异常表达引起的病理状况或疾病。这些基因可以是人体或动物体内各种内源性基因，也可以是在人体或动物体内繁殖的病原体基因。可以根据目标基因表达的mRNA设计和制备具有特定核苷酸序列和所述修饰方案的双链寡核苷酸。在一些实施方式中，所述目标基因表达的mRNA选自以下基因转录的mRNA中的一种：ACE2、AGT、ANGPTL3、ApoA、ApoB、ApoC、AR、ASK1、C3、C5、Col1A1、CTGF、Ebola、FOXO1、FTO、FVII、FXI、FXII、GCGR、HBV、HCV、HSD、p53、PCSK9、PNP、PLG、PKK、KNG、RAGE、RPTOR、SARS-CoV-2、SCD1、SCNN1A、SOD1、STAT3、TIMP-1、TMPRSS6、XO。在一些实施方式中，所述双链寡核苷酸是siRNA，所述目标基因表达的mRNA选自乙型肝炎病毒基因(HBV)表达的mRNA、血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)基因表达的mRNA或者载脂蛋白C3(ApoC3)基因表达的mRNA。
第二种双链寡核苷酸
在另一方面，本公开还提供了第二种双链寡核苷酸，所述双链寡核苷酸包含正义链和反义链，所述正义链和反义链的每一个核苷酸均为修饰的核苷酸，其中，所述正义链包含核苷酸序列I，所述反义链包含核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II均由19个核苷酸组成，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，所述核苷酸序列II至少 部分地与第一段核苷酸序列反向互补，所述第一段核苷酸序列为目标基因表达的mRNA中的一段长度为19个核苷酸的核苷酸序列；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的第7-9个核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述核苷酸序列I其他位置的每个核苷酸独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16个核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述核苷酸序列II其他位置的每个核苷酸独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3个和/或第5个核苷酸是2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸。在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第4个、第7个和第9个核苷酸中的一个也是2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸，所述核苷酸序列II中每个其他所述非氟代修饰取代基的空间位阻不大于2'-O-甲基。
在一些实施方式中，本公开的第二种双链寡核苷酸中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3个和/或第5个核苷酸具有核糖2'-O-甲氧基乙基修饰；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3个和第9个核苷酸具有核糖2'-O-甲氧基乙基修饰；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第5个和第7个核苷酸具有核糖2'-O-甲氧基乙基修饰；或者，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第5个和第9个核苷酸具有核糖2'-O-甲氧基乙基修饰。在一些实施方式中，所述核苷酸序列II中的其他核苷酸均不具有核糖2'-O-甲氧基乙基修饰。
具有上述修饰的双链寡核苷酸可在具有低的脱靶效应的同时，还显示出优异的目标基因表达的mRNA水平调节调节效果。
在一些实施方式中，本公开的第二种双链寡核苷酸中，所述核苷酸序列II与所述第一段核苷酸序列基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补。在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第2-19位的核苷酸与所述第一段核苷酸序列第1-18位的核苷酸完全反向互补。
在一些实施方式中，本公开的第二种双链寡核苷酸中，所述核苷酸序列II与所述核苷酸序列I基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补。在一些实施方式中，所述核苷酸序列II与所述核苷酸序列I完全反向互补，或者按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2个核苷酸与按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2个核苷酸之间存在碱基错配。通过包含该碱基错配，可在保持低的脱靶效应的同时，进一步提升本公开的双链寡核苷酸的目标基因表达调节活性。
进一步地，以上本公开的第一种双链寡核苷酸中，对核苷酸序列III、4和/或5的描述，以及对具有修饰基团的磷酸酯基和/或反义链的5'末端核苷酸等的描述，同样也适用于本公开的第二种双链寡核苷酸。
在一些实施方式中，本公开的双链寡核苷酸例如可以为表1中示出的siRNA中的一种：
表1 本公开的siRNA序列
Figure PCTCN2022105340-appb-000008
Figure PCTCN2022105340-appb-000009
其中，大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸；下划线标出的大写字母 S表示该字母 S左侧相邻的一个核苷酸为稳定化修饰核苷酸，小写字母s表示该字母左右两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接；P1表示该P1右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸。在一些实施方式中， S是表示具体的稳定化修饰例如 moe，其中，下划线标出的字母组合 moe表示在该字母组合 moe左侧相邻的一个核苷酸为具有2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸。在一些实施方式中，P1是表示具体修饰的VP、Ps或P，其中，字母组合VP表示该字母组合VP右侧相邻的一个核苷酸为乙烯基磷酸酯(5'-(E)-vinylphosphonate，E-VP)修饰的核苷酸，字母组合Ps表示该字母组合Ps右侧相邻的一个核苷酸为硫代磷酸酯修饰的核苷酸，大写字母P表示该字母P右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸。并且，上述序列中的每个U均可被T替换，该替换不会显著降低双链寡核苷酸的基因表达调节活性和/或脱靶效应抑制能力。
本公开所述的双链寡核苷酸以及如下所述的药物组合物或寡核苷酸缀合物中，每个相邻核苷酸之间由磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键连接，磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键中的非桥接氧原子或硫原子带有负电荷，它可以以羟基或巯基的形式存在，羟基或巯基中的氢离子也可以部分或全部被阳离子取代。所述阳离子可以是任意的阳离子，如金属阳离子，铵离子NH 4 +，有机铵阳离子中的一种。出于提高溶解性考虑，在一种实施方式中，所述阳离子选自碱金属离子、三级胺形成的铵阳离子和季铵阳离子中的一种或多种。碱金属离子可以是K +和/或Na +，三级胺形成的阳离子可以是三乙胺形成的铵离子和/或N，N-二异丙基乙胺形成的铵离子。因此，本公开所述的双链寡核苷酸或寡核苷酸缀合物可以至少部分以盐的形式存在。在一种方式中，磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键中的非桥接氧原子或硫原子至少部分与钠离子结合，本公开所述的双链寡核苷酸或寡核苷酸缀合物以钠盐或部分钠盐的形式存在。
本公开提供的双链寡核苷酸可以通过本领域常规的双链寡核苷酸制备方法(例如固相合成和液相合成的方法)得到。其中，固相合成已经有商业化订 制服务。可以通过使用具有相应修饰的核苷单体来将修饰的核苷酸基团引入本公开所述的双链寡核苷酸中，制备具有相应修饰的核苷单体的方法及将修饰的核苷酸基团引入双链寡核苷酸的方法也是本领域技术人员所熟知的。
本领域技术人员清楚知晓的是，可以通过使用具有相应修饰的核苷单体来将修饰的核苷酸基团引入本公开所述的双链寡核苷酸中。制备具有相应修饰的核苷单体的方法及将修饰的核苷酸基团引入双链寡核苷酸的方法也是本领域技术人员所熟知的。所有修饰的核苷单体均可以商购得到或者采用已知方法制备得到。
本公开提供的修饰的双链寡核苷酸可以单独使用，或者与药学上可接受的载体形成药物组合物，或者与缀合分子结合形成寡核苷酸缀合物，或者其他的形式。将有效量的所述双链寡核苷酸、所述药物组合物或寡核苷酸缀合物与细胞接触，以调节目标基因的表达，或者将所述双链寡核苷酸、所述药物组合物或缀合物给与受试者，调节目标基因的表达，达到治疗与目标基因表达水平相关的病理状况或疾病的目的。
可通过与合适的载体形成药物组合物或与合适的缀合分子形成寡核苷酸缀合物，来进一步改善本公开的双链寡核苷酸的血液稳定性、提高其靶向性、解决本公开双链寡核苷酸的体内递送问题等。对于双链寡核苷酸，能够赋予或者提高靶向性的载体或缀合分子将是十分有利的，这会极大提高双链寡核苷酸调节目标基因表达的效率并降低潜在的副作用。进而，在引入靶向性的载体或缀合分子后，双链寡核苷酸还需要能够在靶位点发挥作用，即，载体或缀合分子的包裹/缀合不能影响双链寡核苷酸本身的活性(例如在双链寡核苷酸是siRNA的情况下，不能影响siRNA装载入细胞内的RNAi机器，即RISC复合物)。此外，对于这些靶向载体或缀合分子，还要求其具有良好的生物相容性和尽量低的毒性。
所述药物组合物可以系统性地分布于身体的各个部位或者具有靶向性地富集于身体的特定部位。所述缀合物一般具有靶向性，可以根据靶基因在人体、动物体内的表达分布适应性地改变缀合分子的类型，以达到将所述双链寡核苷酸递送到相关部位的目的，例如，缀合分子可以是靶向肝脏、肺脏、肾脏或癌细胞的缀合分子。
降低脱靶效应的方法
在另一方面，本公开还提供一种降低双链寡核苷酸脱靶效应的方法，所述双链寡核苷酸包含正义链和反义链，所述脱靶效应是指所述双链寡核苷酸调节目标基因表达的mRNA之外的其它mRNA的表达水平的效果，所述方法包括将所述反义链5'-3'方向的第3-6个核苷酸中的至少1个替换为本公开所述的稳定化修饰核苷酸。
通过进行所述替换，本公开的方法可显著降低双链寡核苷酸的脱靶效应。在一些实施方式中，本公开的方法在保持双链寡核苷酸的目标基因表达调节能力的同时，显著降低双链寡核苷酸的脱靶效应。在一些实施方式中，按照5'末 端到3'末端的方向，对所述反义链中的第3个或第5个核苷酸进行所述替换。在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，对反义链中的第3-9个核苷酸中的不多于2个核苷酸进行所述替换。通过对特定位置处稳定化修饰核苷酸的个数进行限定，根据本公开的方法获得的双链寡核苷酸可获得最佳的药学活性与低脱靶效应的平衡。在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，对反义链中的第3个和/或第5个核苷酸进行所述替换。在一些实施方式中，还对所述反义链第4个、第7个或第9个核苷酸中的1个进行所述替换。
在本公开的方法中，所述稳定化修饰核苷酸和稳定化修饰基团的定义和选择范围如前所述。
在一些实施方式中，本公开的方法包括按照5'末端到3'末端的方向，对所述反义链进行以下替换中的一种：
将第3个和/或第5个核苷酸替换为稳定化修饰核苷酸；
将第3个和第9个核苷酸替换为稳定化修饰核苷酸；
将第5个和第7个核苷酸替换为稳定化修饰核苷酸；或者
将第5个和第9个核苷酸替换为稳定化修饰核苷酸。
在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，对所述反义链中的第3-9个核苷酸以外的核苷酸不进行所述替换。
在一些实施方式中，本公开的方法还进一步包括将所述双链寡核苷酸的正义链中与反义链中按照5'末端到3'末端的方向的第2个核苷酸位置对应的核苷酸替换为与反义链中该第2个核苷酸错配的核苷酸。此时，根据本公开的方法获得的双链寡核苷酸在具有降低的脱靶效应的同时，还显示出进一步提高的目标基因表达调节活性。
药物组合物
在另一方面，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本公开提供的双链寡核苷酸或根据本公开的方法获得的双链寡核苷酸，以及药学上可接受的载体。
所述药学上可接受的载体可以是双链寡核苷酸给药领域常规使用的载体，例如但不限于磁性纳米粒(magnetic nanoparticles，如基于Fe 3O 4或Fe 2O 3的纳米粒)、碳纳米管(carbon nanotubes)、介孔硅(mesoporous silicon)、磷酸钙纳米粒(calcium phosphate nanoparticles)、聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)、聚酰胺型树形高分子(polyamidoamine(PAMAM)dendrimer)、聚赖氨酸(poly(L-lysine)，PLL)、壳聚糖(chitosan)、1，2-二油酰基-3-三甲铵丙烷(1，2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，DOTAP)、聚D型或L型乳酸/羟基乙酸共聚物(poly(D&L-lactic/glycolic acid)copolymer，PLGA)、聚(氨乙基乙撑磷酸酯)(poly(2-aminoethyl ethylene phosphate)，PPEEA)和聚(甲基丙烯酸-N，N-二甲氨基乙酯)(poly(2-dimethylaminoethyl methacrylate)，PDMAEMA)以及它们的衍生物中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述药物组合物中，对双链寡核苷酸和药学上可接受的载体的含量没有特别要求，在一些实施方式中，双链寡核苷酸与药学上可接受的载体的重量比可以为1:(1-500)，在一些的实施方式中，上述重量比为1:(1-50)。
在一些实施方式中，所述药物组合物中，还可以包含药学上可接受的其它辅料，该辅料可以为本领域常规采用的各种制剂或化合物的一种或多种。例如，所述药学上可接受的其它辅料可以包括pH缓冲液、保护剂和渗透压调节剂中的至少一种。
所述pH缓冲液可以为pH值7.5-8.5的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液和/或pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液，例如可以为pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液。
所述保护剂可以为肌醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖和葡萄糖中的至少一种。以所述药物组合物的总重量为基准，所述保护剂的含量可以为0.01-30重量％。
所述渗透压调节剂可以为氯化钠和/或氯化钾。所述渗透压调节剂的含量使所述药物组合物的渗透压为200-700毫渗摩尔/千克(mOsm/kg)。根据所需渗透压，本领域技术人员可以容易地确定所述渗透压调节剂的含量。在一些实施方式中，所述药物组合物所制成的制剂在给药过程中的剂量会因给药方式的不同而发生调整。
在一些实施方式中，所述药物组合物可以为液体制剂，例如注射液；也可以为冻干粉针剂，实施给药时与液体辅料混合，配制成液体制剂。所述液体制剂可以但不限于用于皮下、肌肉或静脉注射给药，也可以但不限于通过喷雾给药到肺部、或通过喷雾经肺部给药到其它脏器组织(如肝脏)、或通过口咽吸入、或鼻腔给药等方式递送所述药物组合物。在一些实施方式中，所述药物组合物用于喷雾给药。
在一些实施方式中，所述药物组合物可以为脂质体制剂的形式。在一些实施方式中，所述脂质体制剂中使用的药学上可接受的载体包含含胺的转染化合物(下文也可将其称为有机胺)、辅助脂质和/或聚乙二醇化脂质。其中，所述有机胺、辅助脂质和聚乙二醇化脂质可分别选自于中国专利申请CN103380113A(通过引用的方式将其整体并入本文)中所描述的含胺的转染化合物或其药学上可接受的盐或衍生物、辅助脂质和聚乙二醇化脂质中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述有机胺可为中国专利申请CN103380113A中描述的如式(201)所示的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure PCTCN2022105340-appb-000010
其中：
X 101和X 102各自独立地是O、S、N-A或C-A，其中A是氢或C 1-C 20烃链；
Y 101和Z 101各自独立地是C＝O、C＝S、S＝O、CH-OH或SO 2；
R 101、R 102、R 103、R 104、R 105、R 106和R 107各自独立地是氢，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链脂族基团，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链杂脂族基团，被取代的或未被取代的、支链或直链酰基，被取代的或未被取代的、支链或直链芳基，被取代的或未被取代的、支链或直链杂芳基；
x是1-10的整数；
n是1-3的整数，m是0-20的整数，p是0或1；其中，如果m＝p＝0，则R 102是氢；
并且，如果n或m中的至少一个是2，那么R 103和在式(201)中的氮形成如式(202)或式(203)所示的结构：
Figure PCTCN2022105340-appb-000011
其中，g、e和f各自独立地是1-6的整数，“HCC”代表烃链，且每个*N代表式(201)中的氮原子。
在一些实施方式中，R 103是多胺。在其它实施方式中，R 103是缩酮。在一些实施方式中，在式(201)中的R 101和R 102中的每一个独立地是任意的被取代的或未被取代的、支链或直链烷基或烯基，所述烷基或烯基具有3至约20个碳原子，诸如8至约18个碳原子，和0至4个双键，诸如0至2个双键。
在一些实施方式中，如果n和m中的每一个独立地具有1或3的值，那么R 103可以是下述式(204)-式(213)中的任一个：
Figure PCTCN2022105340-appb-000012
其中，式(204)-式(213)中，g、e和f各自独立地是1-6的整数，每个“HCC”代表烃链，且每个*显示R 103与在式(201)中的氮原子的可能连接点，其中在任意*位置上的每个H可以被替换以实现与在式(201)中的氮原子的连接。
本领域技术人员可以通过任何合理的方法获得式(201)所示的化合物。在一些实施方式中，式(201)所示化合物可以根据中国专利申请CN103380113A中的描述制备。
在一些实施方式中，所述有机胺为如式(214)所示的有机胺和/或如式(215)所示的有机胺：
Figure PCTCN2022105340-appb-000013
Figure PCTCN2022105340-appb-000014
所述辅助脂质为胆固醇、胆固醇的类似物和/或胆固醇的衍生物；
所述聚乙二醇化脂质为1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)]-2000。
在一些实施方式中，所述药物组合物中，所述有机胺、所述辅助脂质和所述聚乙二醇化脂质三者之间的摩尔比为(19.7-80):(19.7-80):(0.3-50)，例如可以为(50-70):(20-40):(3-20)。
在一些实施方式中，由本公开的双链寡核苷酸与上述含胺的转染试剂形成的药物组合物颗粒具有约30nm至约200nm的平均直径，通常为约40nm至约135nm，更通常地，该脂质体颗粒的平均直径是约50nm至约120nm、约50nm至约100nm、约60nm至约90nm或约70nm至约90nm，例如，该脂质体颗粒的平均直径是约30、40、50、60、70、75、80、85、90、100、110、120、130、140、150或160nm。
在一些实施方式中，由本公开的双链寡核苷酸与上述含胺的转染试剂形成的药物组合物中，双链寡核苷酸与全部脂质(例如有机胺、辅助脂质和/或聚乙二醇化脂质)的重量比(重量/重量比)在从约1:1至约1:50、从约1:1至约1:30、从约1:3至约1:20、从约1:4至约1:18、从约1:5至约1:17、从约1:5至约1:15、从约1:5至约1:12、从约1:6至约1:12或从约1:6至约1:10的范围内，例如，本公开的双链寡核苷酸与全部脂质的重量比为约1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17或1:18。
在一些实施方式中，所述药物组合物在销售时各组分可以独立存在，在使用时可以液体制剂的形式存在。在一些实施方式中，本公开提供的双链寡核苷酸与上述药学上可接受的载体形成的药物组合物可以按照已知的各种方法制备，只是用本公开提供的双链寡核苷酸替代现有双链寡核苷酸即可；在一些实施方式中，可以按照如下方法制备：
将有机胺、辅助脂质和聚乙二醇化脂质按照上述摩尔比悬浮于醇中并混匀得到脂质溶液；醇的用量使得到的脂质溶液的总质量浓度为2-25mg/mL，例如可以为8-18mg/mL。所述醇选自药学上可接受的醇，诸如在室温附近为液体的醇，例如，乙醇、丙二醇、苯甲醇、甘油、聚乙二醇200，聚乙二醇300，聚乙二醇400中的一种或多种，例如可以为乙醇。
将本公开提供的双链寡核苷酸溶解于缓冲盐溶液中，得到双链寡核苷酸水 溶液。缓冲盐溶液的浓度为0.05-0.5M，例如可以为0.1-0.2M，调节缓冲盐溶液的pH至4.0-5.5，例如可以为5.0-5.2，缓冲盐溶液的用量使双链寡核苷酸的浓度不超过0.6mg/mL，例如可以为0.2-0.4mg/mL。所述缓冲盐选自可溶性醋酸盐、可溶性柠檬酸盐中的一种或多种，例如可以为醋酸钠和/或醋酸钾。
将脂质溶液和双链寡核苷酸水溶液混合，将混合后得到的产物在40-60℃孵育至少2分钟，例如可以为5-30分钟，得到孵育后的脂质体制剂。脂质溶液和双链寡核苷酸水溶液的体积比为1:(2-5)，例如可以为1:4。
将孵育后的脂质体制剂浓缩或稀释，去除杂质，除菌，得到本公开提供的药物组合物，其理化参数为pH值为6.5-8，包封率不低于80％，粒径为40-200nm，多分散指数不高于0.30，渗透压为250-400mOsm/kg；例如理化参数可以为pH值为7.2-7.6，包封率不低于90％，粒径为60-100nm，多分散指数不高于0.20，渗透压为300-400mOsm/kg。
其中，浓缩或稀释可以在去除杂质之前、之后或同时进行。去除杂质的方法可以采用现有各种方法，例如可以使用切相流系统、中空纤维柱，在100K Da条件下超滤，超滤交换溶液为pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)。除菌的方法可以采用现有各种方法，例如可以在0.22μm滤器上过滤除菌。
寡核苷酸缀合物
在另一方面，本公开提供了一种寡核苷酸缀合物，该寡核苷酸缀合物含有本公开提供的双链寡核苷酸或根据本公开的方法获得的双链寡核苷酸，以及缀合连接至该双链寡核苷酸的缀合基团。在一些实施方式中，所述缀合基团包含接头和药学上可接受的靶向基团和/或递送辅助基团，并且，所述双链寡核苷酸、所述接头和所述靶向基团或者所述递送辅助基团依次共价或非共价连接，每个所述靶向基团选自能够和细胞表面受体结合的配体，每个递送辅助基团选自能够增加所述寡核苷酸缀合物在递送目标器官或组织中的生物相容性的基团。
在本公开的上下文中，除非另有说明，“缀合”是指两个或多个各自具有特定功能的化学部分之间以共价连接的方式彼此连接；相应地，“缀合物”是指该各个化学部分之间通过共价连接而形成的化合物。进一步地，“寡核苷酸缀合物”表示一个或多个具有特定功能的化学部分共价连接至寡核苷酸上而形成的化合物。寡核苷酸缀合物应根据上下文，理解为多个寡核苷酸缀合物的总称或者某个化学式所示的寡核苷酸缀合物。在本公开的上下文中，“缀合分子”应当理解为可通过反应缀合至寡核苷酸，最终形成本公开的寡核苷酸缀合物的特定化合物。
一般来说，所述缀合基团包含药学上可接受的至少一个靶向基团和任选的接头(linker)，并且，所述双链寡核苷酸、所述接头和所述靶向基团依次连接。在一种实施方式中，所述靶向基团为1-6个。在一种实施方式中，所述靶向基团为2-4个。所述双链寡核苷酸分子A1可以非共价或共价缀合至所述缀合基团，例如可以共价缀合至所述缀合基团。双链寡核苷酸与缀合基团的缀合位点可以在双链寡核苷酸正义链的3'端或5'端，也可在反义链的5'端，还可以在双 链寡核苷酸的内部序列中。在一些具体的实施方式中，所述双链寡核苷酸与缀合基团的缀合位点在双链寡核苷酸正义链的3'末端。
在一些实施方式中，所述缀合基团可以连接在核苷酸的磷酸基团、2'-位羟基或者碱基上。在一些实施方式中，所述缀合基团可以连接在3'-位羟基上，此时核苷酸之间采用2'-5'磷酸二酯键连接。当缀合基团连接在双链寡核苷酸链的末端时，所述缀合基团通常连接在核苷酸的磷酸基团上；当缀合基团连接在双链寡核苷酸的内部序列时，所述缀合基团通常连接在核糖糖环或者碱基上。各种连接方式可参考：Muthiah Manoharan et.al.siRNA conjugates carrying sequentially assembled trivalent N-acetylgalactosamine linked through nucleosides elicit robust gene silencing in vivo in hepatocytes.ACS Chemical biology,2015,10(5):1181-7.
在一些实施方式中，所述双链寡核苷酸与缀合基团间可以通过酸不稳定的、或可还原的化学键相连，在细胞内涵体的酸性环境下，这些化学键可降解，从而使双链寡核苷酸成为自由状态。对于不可降解的缀合方式，缀合基团可连接至双链寡核苷酸的正义链，从而尽量降低缀合对双链寡核苷酸活性的影响。
靶向基团可经由合适的接头与双链寡核苷酸分子相连，本领域技术人员可以根据靶向基团的具体类型选择合适的接头。这些接头、靶向基团的种类以及与双链寡核苷酸的连接方式可参见WO2015006740A2的公开内容，通过引用的方式将其整体内容并入本文。
在一些实施方式中，所述靶向基团可以是双链寡核苷酸给药领域常规使用的配体，例如WO2009082607A2中描述的各种配体，以引用的方式将其全部公开内容并入本文。
在一些实施方式中，至少一个或每个所述靶向基团选自能够和表达所述目标基因的细胞表面受体结合的配体。
在一些实施方式中，至少一个或每个所述靶向基团选自能够和哺乳动物肝实质细胞表面受体结合的配体。在一些实施方式中，每个所述靶向基团独立地为与哺乳动物肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体亲和的配体。在一些实施方式中，每个所述靶向基团独立地为去唾液酸糖蛋白或糖。在一些实施方式中，每个所述靶向基团独立地选自D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-三氟乙酰半乳糖胺、N-丙酰半乳糖胺、N-正丁酰半乳糖胺、N-异丁酰半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代- 6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖、L-4-硫代核糖中的一种。在一些实施方式中，至少一个或每个所述靶向基团为半乳糖或N-乙酰半乳糖胺。
在一些实施方式中，至少一个或每个所述靶向基团选自能够和肺上皮细胞表面受体结合的配体。在一些实施方式中，每个所述靶向基团选自于靶向整合素αvβ6的基团或靶向整合素αvβ3的基团。在一些实施方式中，每个所述靶向基团独立地为多肽或小分子配体。
在一些实施方式中，至少一个或每个所述递送辅助基团选自能够增加所述寡核苷酸缀合物在中枢神经系统中的生物相容性的基团。在一些实施方式中，至少一个或每个所述递送辅助基团选自亲脂性分子。在一些实施方式中，每个所述递送辅助基团是C 5-C 18直链烃基或甾类化合物。
在一些实施方式中，本公开的寡核苷酸缀合物中的接头具有如式(301)所示的结构：
Figure PCTCN2022105340-appb-000015
其中，k为1-3的整数；
L A具有如式(302)所示的包含酰胺键的结构，L B具有如式(303)所示的包含N-酰基吡咯烷的结构，含有羰基和氧原子，L C为基于羟甲基氨基甲烷、二羟甲基氨基甲烷或三羟甲基氨基甲烷的连接基团；
Figure PCTCN2022105340-appb-000016
其中，n 302、q 302和p 302各自独立地为2-6的整数，可选地，n 302、q 302和p 302各自独立地为2或3；n 303为4-16的整数，可选地，n 303为8-12的整数，
Figure PCTCN2022105340-appb-000017
表示基团共价连接的位点。
所述接头中，每个L A分别与一个所述靶向基团通过醚键连接，并通过L C部分中羟基的氧原子与L C部分形成醚键而连接；L B通过式(303)中的羰基与L C部分中氨基的氮原子形成酰胺键而连接，并通过式(303)中的氧原子与所述双链寡核苷酸通过氧原子形成磷酸酯键或硫代磷酸酯键相连接。
在一些实施方式中，本公开提供的寡核苷酸缀合物具有如式(305)所示的 结构：
Figure PCTCN2022105340-appb-000018
其中，Nu表示本公开提供的双链寡核苷酸，或者根据本公开的方法获得的双链寡核苷酸。
在一些实施方式中，本公开的寡核苷酸缀合物中的接头具有式(306)所示的结构：
Figure PCTCN2022105340-appb-000019
其中，n 306为0-3的整数，每个p 306独立地为1-6的整数，
Figure PCTCN2022105340-appb-000020
表示基团共价连接的位点；所述连接基团通过由*标出的氧原子与所述靶向基团形成醚键连接；所述连接基团由#标出的氧原子中的至少一个与所述双链寡核苷酸形成磷酸酯键或硫代磷酸酯键而连接，其余由#标出的氧原子与氢原子连接形成羟基，或者与C 1-C 3烷基连接形成C 1-C 3烷氧基；
在一些实施方式中，本公开的寡核苷酸缀合物具有如式(307)所示的结构：
Figure PCTCN2022105340-appb-000021
其中，Nu表示本公开提供的双链寡核苷酸，或者根据本公开的方法获得的双链寡核苷酸。
在一些实施方式中，本公开的寡核苷酸缀合物具有式(308)所示的结构：
Figure PCTCN2022105340-appb-000022
其中，
n1为选自1-3的整数，n3为选自0-4的整数；
每个m1、m2或m3各自独立地为选自2-10的整数；
R 10、R 11、R 12、R 13、R 14或R 15各自独立地为H，或选自于由以下基团所组成的组：C 1-C 10烷基、C 1-C 10卤代烷基以及C 1-C 10烷氧基；
R 3具有式A59所示的结构：
Figure PCTCN2022105340-appb-000023
其中，E 1为OH、SH或BH 2，Nu表示本公开提供的双链寡核苷酸，或者根据本公开的方法获得的双链寡核苷酸；
R 2是长度为1-20个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O) 2、C 2-C 10亚烯基、C 2-C 10亚炔基、C 6-C 10亚芳基、C 3-C 18亚杂环基和C 5-C 10亚杂芳基；并且其中R 2可任选地具有由以下基团所组成的组中的任 何一个或多个的取代基：C 1-C 10烷基、C 6-C 10芳基、C 5-C 10杂芳基、C 1-C 10卤代烷基、-OC 1-C 10烷基、-OC 1-C 10烷基苯基、-C 1-C 10烷基-OH、-OC 1-C 10卤代烷基、-SC 1-C 10烷基、-SC 1-C 10烷基苯基、-C 1-C 10烷基-SH、-SC 1-C 10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH 2、-C 1-C 10烷基-NH 2、-N(C 1-C 10烷基)(C 1-C 10烷基)、-NH(C 1-C 10烷基)、-N(C 1-C 10烷基)(C 1-C 10烷基苯基)、-NH(C 1-C 10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO 2H、-C(O)O(C 1-C 10烷基)、-CON(C 1-C 10烷基)(C 1-C 10烷基)、-CONH(C 1-C 10烷基)、-CONH 2、-NHC(O)(C 1-C 10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C 1-C 10烷基)C(O)(C 1-C 10烷基)、-N(C 1-C 10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C 1-C 10烷基、-C(O)C 1-C 10烷基苯基、-C(O)C 1-C 10卤烷基、-OC(O)C 1-C 10烷基、-SO 2(C 1-C 10烷基)、-SO 2(苯基)、-SO 2(C 1-C 10卤代烷基)、-SO 2NH 2、-SO 2NH(C 1-C 10烷基)、-SO 2NH(苯基)、-NHSO 2(C 1-C 10烷基)、-NHSO 2(苯基)和-NHSO 2(C 1-C 10卤代烷基)；
每个L 1独立地是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子任选地被选自于以下基团所组成的组中的任何一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O) 2、C 2-C 10亚烯基、C 2-C 10亚炔基、C 6-C 10亚芳基、C 3-C 18亚杂环基和C 5-C 10亚杂芳基；并且其中，L 1可任选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C 1-C 10烷基、C 6-C 10芳基、C 5-C 10杂芳基、C 1-C 10卤代烷基、-OC 1-C 10烷基、-OC 1-C 10烷基苯基、-C 1-C 10烷基-OH、-OC 1-C 10卤代烷基、-SC 1-C 10烷基、-SC 1-C 10烷基苯基、-C 1-C 10烷基-SH、-SC 1-C 10卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH 2、-C 1-C 10烷基-NH 2、-N(C 1-C 10烷基)(C 1-C 10烷基)、-NH(C 1-C 10烷基)、-N(C 1-C 10烷基)(C 1-C 10烷基苯基)、-NH(C 1-C 10烷基苯基)、氰基、硝基、-CO 2H、-C(O)O(C 1-C 10烷基)、-CON(C 1-C 10烷基)(C 1-C 10烷基)、-CONH(C 1-C 10烷基)、-CONH 2，-NHC(O)(C 1-C 10烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C 1-C 10烷基)C(O)(C 1-C 10烷基)、-N(C 1-C 10烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C 1-C 10烷基、-C(O)C 1-C 10烷基苯基、-C(O)C 1-C 10卤烷基、-OC(O)C 1-C 10烷基、-SO 2(C 1-C 10烷基)、-SO 2(苯基)、-SO 2(C 1-C 10卤代烷基)、-SO 2NH 2、-SO 2NH(C 1-C 10烷基)、-SO 2NH(苯基)、-NHSO 2(C 1-C 10烷基)、-NHSO 2(苯基)和-NHSO 2(C 1-C 10卤代烷基)；
Figure PCTCN2022105340-appb-000024
表示基团共价连接的位点；
M 1表示靶向基团，其定义和可选择的范围与上述相同。在一些实施方式中，每个M 1独立地选自对哺乳动物肝脏细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体具有亲合力的配体中的一种。
技术人员会理解的是，尽管为了方便起见，L 1被定义为线性烷基，但是它可能不是线性基团或者名称不同，例如由于上述替换和/或置换而产生的胺或烯基。为了本公开内容的目的，L 1的长度是连接两个附着点的链中的原子数。为此目的，将替换所述直链亚烷基的碳原子而得到的环(如亚杂环基或亚杂芳基)计为一个原子。
当M 1为对哺乳动物肝脏细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体具有亲合力的配体时，在一些实施方式中，n1可以是1-3的整数，n3可以是0-4的整数，保 证所述缀合物中M 1配体的个数至少为2；在一些实施方式中，n1+n3≥2，这样可以使得M 1配体的个数至少为3，使得M 1配体与肝表面去唾液酸糖蛋白受体更容易结合，进而促进所述缀合物通过内吞作用进入细胞。实验表明，当M 1配体的个数大于3个时，M 1配体与肝表面去唾液酸糖蛋白受体结合的容易程度增加并不明显，因此，从合成容易程度、结构/工艺成本和递送效率等多方面综合考虑，在一些实施方式中，n1为1-2的整数，n3为0-1的整数，且n1+n3＝2-3。
在一些实施方式中，m1、m2和m3独立地选自2-10的整数时，可以使多个M 1配体之间的空间位置适合M 1配体与肝表面去唾液酸糖蛋白受体的结合，为了使本公开提供的缀合物更为简单，更容易合成和/或降低成本，在一些实施方式中，m1、m2和m3各自独立地为2-5的整数，在一些实施方式中，m1＝m2＝m3。
本领域技术人员可以理解，当R 10、R 11、R 12、R 13、R 14和R 15各自独立地选自H、C 1-C 10烷基、C 1-C 10卤代烷基、以及C 1-C 10烷氧基中的一种时，不会改变本文公开的缀合物的性质，均可以实现本公开的目的。在一些实施方式中，R 10、R 11、R 12、R 13、R 14和R 15各自独立地选自H、甲基和乙基。在一些实施方式中，R 10、R 11、R 12、R 13、R 14和R 15均为H。
根据本公开提供的寡核苷酸缀合物，R 3为式A59所示结构的基团，其中，E 1为OH、SH或BH 2，基于制备原料易获取性的考虑，在一些实施方式中，E 1为OH或SH。
在一些实施方式中，R 2的选择是为了实现与含氮骨架上的N与A59的连接。在本公开的上下文中，“含氮骨架”是指连接有R 10、R 11、R 12、R 13、R 14和R 15的碳原子与N互相连接的链状结构。因此，R 2可以是任何能够以适当方式将A59基团连接至含氮骨架上的N的连接基团。在一些实施方式中，在通过固相合成的工艺制备本公开的寡核苷酸缀合物的情况下，R 2基团中需要同时含有与含氮骨架上的N连接的连接位点和与R 3中的P相连接的连接位点。在一些实施方式中，R 2中所述与含氮骨架上的N连接的位点与N形成酰胺键，所述与R 3上的P连接的位点与P形成磷酸酯键。在一些实施方式中，R 2是B5、B6、B5’或B6’：
Figure PCTCN2022105340-appb-000025
Figure PCTCN2022105340-appb-000026
其中，
Figure PCTCN2022105340-appb-000027
表示基团共价键连接的位点。
q 2的取值范围可以是1-10的整数，在一些实施方式中，q 2为1-5的整数。
L 1的作用是将M 1配体与含氮骨架上的N连接，为本公开的寡核苷酸缀合物提供靶向功能。在一些实施方式中，L 1选自式A1-A26基团中的一种或多种的连接组合。在一些实施方式中，L 1选自A1、A4、A5、A6、A8、A10、A11和A13中的一种或多种的连接组合；在一些实施方式中，L 1选自A1、A4、A8、A10和A11中至少2个的连接组合；在一些实施方式中，L 1选自A1、A8、A10中至少2个的连接组合。
Figure PCTCN2022105340-appb-000028
Figure PCTCN2022105340-appb-000029
在一些实施方式中，L 1的长度可以为3-25个原子，3-20个原子、4-15个原子或5-12个原子。在一些实施方式中是，L 1的长度为3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个原子。
在一些实施方式中，j1为2-10的整数，在一些实施方式中，j1为3-5的整数。在一些实施方式中，j2为2-10的整数，在一些实施方式中，j2为3-5的整数。R’为C1-C4的烷基，在一些实施方式中，R’为甲基、乙基和异丙基中的一种。Ra为A27、A28、A29、A30和A31中的一种，在一些实施方式中，Ra为A27或A28。Rb为C1-C5的烷基，在一些实施方式中，Rb为甲基、乙基、异丙基和丁基中的一种。在一些实施方式中，在式A1-A26中各自对j1、j2、R’、Ra、Rb进行选择，以实现M 1配体与含氮骨架上的N连接，并使M 1配体之间的空间位置更适合M 1配体与肝表面去唾液酸糖蛋白受体结合。
Figure PCTCN2022105340-appb-000030
在一些实施方式中，本公开的寡核苷酸缀合物具有式(403)、(404)、(405)、(406)、(407)、(408)、(409)、(410)、(411)、(412)、(413)、(414)、(415)、(416)、(417)、(418)、(419)、(420)、(421)或(422)所示的结构：
Figure PCTCN2022105340-appb-000031
Figure PCTCN2022105340-appb-000032
Figure PCTCN2022105340-appb-000033
Figure PCTCN2022105340-appb-000034
Figure PCTCN2022105340-appb-000035
Figure PCTCN2022105340-appb-000036
在一些实施方式中，式A59中的P可以连接到双链寡核苷酸序列中任何可能的位置，例如，式A59中的P可以连接到双链寡核苷酸正义链或反义链的任何一个核苷酸上；在一些实施方式中，式A59中的P连接到双链寡核苷酸正义链的任何一个核苷酸上。在一些实施方式中，式A59中的P连接到双 链寡核苷酸正义链或反义链的端部；在一些实施方式中，式A59中的P连接到双链寡核苷酸正义链的端部。所述端部指所述正义链或所述反义链中从其一端起算的前4个核苷酸。在一些实施方式中，式A59中的P连接到双链寡核苷酸正义链或反义链的末端；在一些实施方式中，式A59中的P连接到双链寡核苷酸正义链的3'末端。在连接至双链寡核苷酸的正义链的上述位置的情况下，本公开提供的缀合物进入细胞后，在解旋时，可以释放出单独的双链寡核苷酸反义链，以调节靶基因表达。
式A59中的P可以连接到双链寡核苷酸中的核苷酸上任何可能的位置，例如，核苷酸的5'位、核苷酸的2'位、核苷酸的3'位或核苷酸的碱基上。在一些实施方式中，式A59中的P可通过形成磷酸二酯键连接至所述双链寡核苷酸中的核苷酸的2'位、3'位或5'位。在一些实施方式中，式A59中的P连接在双链寡核苷酸正义链3'末端核苷酸的3'羟基脱氢后形成的氧原子上，或者式A59中的P通过取代双链寡核苷酸正义链中的一个核苷酸的2'-羟基中的氢与核苷酸连接，或者式A59中的P通过取代双链寡核苷酸正义链5'末端核苷酸的5'羟基中的氢与核苷酸连接。
在一些实施方式中，本公开的寡核苷酸缀合物包含的双链寡核苷酸可以是siRNA，此时本公开的寡核苷酸缀合物也称为siRNA缀合物。在一些实施方式中，本公开的寡核苷酸缀合物包含的双链寡核苷酸可以是例如表1中列出的siRNA。包含这些siRNA的寡核苷酸缀合物表现出低的脱靶效应和高的目标基因表达的mRNA抑制活性。
本公开寡核苷酸缀合物的制备
上述寡核苷酸缀合物可以通过现有技术中已经详细描述的方法进行合成。例如，WO2015006740A2中详细描述了多种siRNA缀合物的制备方法。在双链寡核苷酸是siRNA的情况下，也可以通过本领域技术人员熟知的方式，获得本公开的寡核苷酸缀合物。如WO2014025805A1中记载了式(305)所示结构的制备方法，Rajeev等人在ChemBioChem 2015,16,903-908中描述了式(307)所示结构的制备方法。中国专利申请CN110959011A也详细公开了制备式(308)所示的寡核苷酸缀合物的方法。以引用的方式将上述文献内容整体并入本文。
本公开的寡核苷酸缀合物也可以与药学上可接受的其它辅料联用，该辅料可以为本领域常规采用的各种制剂或化合物的一种或多种，详情可参见上文关于本公开的药物组合物的描述。
本公开的双链寡核苷酸、药物组合物及寡核苷酸缀合物的应用
在一些实施方式中，本公开提供了本公开提供的双链寡核苷酸、根据本公开的方法获得的双链寡核苷酸、药物组合物和/或寡核苷酸缀合物在用于治疗和/或预防与目标基因表达的mRNA水平相关的疾病或症状的药物中的用途。在一些实施方式中，所述特定基因是肝细胞中异常表达的基因。在一些实施方式中，所述特定基因是肝脏中表达的内源性基因。在一些实施方式中，所述特定基因是在肝脏中繁殖的病原体基因。在一些实施方式中，所述特定基因是肺 上皮细胞中表达的基因。在一些实施方式中，所述特定基因是中枢神经系统中表达的基因。在一些实施方式中，所述特定基因是肿瘤细胞中表达的基因。在一些实施方式中，所述所述目标基因表达的mRNA选自以下基因转录的mRNA中的一种：ACE2、AGT、ANGPTL3、ApoA、ApoB、ApoC、AR、ASK1、C3、C5、Col1A1、CTGF、Ebola、FOXO1、FTO、FVII、FXI、FXII、GCGR、HBV、HCV、HSD、p53、PCSK9、PNP、PLG、PKK、KNG、RAGE、RPTOR、SARS-CoV-2、SCD1、SCNN1A、SOD1、STAT3、TIMP-1、TMPRSS6、XO。在一些实施方式中，所述目标基因表达的mRNA选自乙型肝炎病毒基因(HBV)表达的mRNA、血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)基因表达的mRNA或者载脂蛋白C3(ApoC3)基因表达的mRNA。在一些实施方式中，所述与目标基因表达的mRNA水平相关的疾病或症状是慢性肝病、肝炎、肝纤维化疾病、肝增生性疾病和/或血脂异常。在一些实施方式中，所述与目标基因表达的mRNA水平相关的疾病或症状是乙型肝炎或血脂异常。在一些实施方式中，所述血脂异常为高胆固醇血症、高甘油三酯血症或动脉粥样硬化。
在一些实施方式中，本公开提供了一种治疗和/或预防与目标基因表达的mRNA水平相关的疾病或症状的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予有效量的本公开提供的双链寡核苷酸、根据本公开的方法获得的双链寡核苷酸、药物组合物和/或寡核苷酸缀合物。在一些实施方式中，所述所述目标基因表达的mRNA选自以下基因转录的mRNA中的一种：ACE2、AGT、ANGPTL3、ApoA、ApoB、ApoC、AR、ASK1、C3、C5、Col1A1、CTGF、Ebola、FOXO1、FTO、FVII、FXI、FXII、GCGR、HBV、HCV、HSD、p53、PCSK9、PNP、PLG、PKK、KNG、RAGE、RPTOR、SARS-CoV-2、SCD1、SCNN1A、SOD1、STAT3、TIMP-1、TMPRSS6、XO。在一些实施方式中，所述目标基因表达的mRNA选自乙型肝炎病毒基因(HBV)表达的mRNA、血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)基因表达的mRNA或者载脂蛋白C3(ApoC3)基因表达的mRNA。在一些实施方式中，所述与目标基因表达的mRNA水平相关的疾病或症状是慢性肝病、肝炎、肝纤维化疾病、肝增生性疾病和/或血脂异常。在一些实施方式中，所述与目标基因表达的mRNA水平相关的疾病或症状是乙型肝炎或血脂异常。在一些实施方式中，所述血脂异常为高胆固醇血症、高甘油三酯血症或动脉粥样硬化。
在一些实施方式中，本公开提供的缀合物也可以用于治疗其他肝脏疾病，包括以不需要的细胞增殖为特征的疾病、血液疾病、代谢疾病和以炎症为特征的疾病。肝脏的增殖疾病可以是良性或恶性疾病，例如癌症、肝细胞癌(HCC)、肝转移或肝母细胞瘤。肝脏血液学或炎症疾病可以是涉及凝血因子、补体介导的炎症或纤维化的疾病。肝脏的代谢疾病包括血脂异常和葡萄糖调节的不规则性。在一个实施方案中，通过施用一种或多种具有与参与疾病的基因序列高度同源的双链寡核苷酸来治疗所述疾病。
在一些实施方式中，本公开提供了一种调节细胞中目标基因表达水平的方法，所述方法包括将有效量的本公开提供的双链寡核苷酸、根据本公开的方法 获得的双链寡核苷酸、药物组合物和/或寡核苷酸缀合物与所述细胞接触。在一些实施方式中，所述目标基因表达的mRNA选自以下基因转录的mRNA中的一种：ACE2、AGT、ANGPTL3、ApoA、ApoB、ApoC、AR、ASK1、C3、C5、Col1A1、CTGF、Ebola、FOXO1、FTO、FVII、FXI、FXII、GCGR、HBV、HCV、HSD、p53、PCSK9、PNP、PLG、PKK、KNG、RAGE、RPTOR、SARS-CoV-2、SCD1、SCNN1A、SOD1、STAT3、TIMP-1、TMPRSS6、XO。在一些实施方式中，所述调节是指抑制细胞中目标基因表达，所述目标基因表达的mRNA选自乙型肝炎病毒基因(HBV)表达的mRNA、血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)基因表达的mRNA或者载脂蛋白C3(ApoC3)基因表达的mRNA。
通过将本公开提供的双链寡核苷酸、根据本公开的方法获得的双链寡核苷酸、药物组合物和/或寡核苷酸缀合物给予有需要的受试者，可以通过对基因表达进行调控的机制达到预防和/或治疗由细胞中特定基因的表达而引起的病理状况或疾病的目的。因此，本公开提供的双链寡核苷酸、根据本公开的方法获得的双链寡核苷酸、药物组合物和/或寡核苷酸缀合物可用于预防和/或治疗所述病理状况或疾病、或用于制备用于预防和/或治疗本文所述病理状况或疾病的药物。
本文所使用的术语“给药/给予”是指通过使得至少部分地将双链寡核苷酸、药物组合物和/或寡核苷酸缀合物定位于期望的位点以产生期望效果的方法或途径，将双链寡核苷酸、药物组合物和/或寡核苷酸缀合物放置入受试者体内。适于本公开方法的给药途径包括局部给药和全身给药。一般而言，局部给药导致与受试者整个身体相比将更多双链寡核苷酸、药物组合物和/或寡核苷酸缀合物递送至特定位点；而全身给药导致将所述双链寡核苷酸、药物组合物和/或寡核苷酸缀合物递送至受试者的基本整个身体。
可通过本领域已知的任何合适途径向受试者给药，所述途径包括但不仅限于：口服或胃肠外途径，如静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、经皮给药、气道给药(气雾剂)、肺部给药、鼻部给药、直肠给药和局部给药(包括口腔含化给药和舌下给药)。给药频率可以是每天、每周、每两周、每三周、每个月或每年1次或多次。
本公开所述的双链寡核苷酸、药物组合物和/或寡核苷酸缀合物的使用剂量可为本领域常规的剂量，所述剂量可以根据各种参数、尤其是受试者的年龄、体重和性别来确定。可在细胞培养或实验动物中通过标准药学程序测定毒性和疗效，例如测定LD50(使50％的群体致死的剂量)和ED50(在量反应中指能引起50％最大反应强度的剂量，在质反应中，指引起50％实验对象出现阳性反应时的剂量)。可基于由细胞培养分析和动物研究得到的数据得出人用剂量的范围。
在给予本公开所述的双链寡核苷酸、药物组合物和/或寡核苷酸缀合物时，例如，对于雄性或雌性、6-12周龄、体重18-25g的C57BL/6J或C3H/HeNCrlVr小鼠，以所述双链寡核苷酸、药物组合物和/或寡核苷酸缀合物中的双链寡核苷 酸的量计：对于双链寡核苷酸与药学上可接受的缀合分子形成的寡核苷酸缀合物，其双链寡核苷酸用量可以为0.001-100mg/kg体重，在一些实施方式中为0.01-50mg/kg体重，在进一步的实施方式中为0.05-20mg/kg体重，在更进一步的实施方式中为0.1-15mg/kg体重，在又进一步的实施方式中为0.1-10mg/kg体重。在给予本公开所述的双链寡核苷酸、药物组合物和/或寡核苷酸缀合物时，可优选上述用量。
另外，通过将本公开的双链寡核苷酸、药物组合物和/或寡核苷酸缀合物导入特定基因异常表达的细胞，还可以通过基因表达调控的机制达到抑制细胞中该特定基因的表达这一目的。在一些实施方式中，所述细胞为肝细胞。在一些实施方式中，所述肝细胞可以是选自Hep3B、HepG2、Huh7等肝癌细胞系的细胞或分离的原代肝细胞，在一些实施方式中为原代肝细胞。
采用本公开提供的方法抑制特定基因在细胞中表达，所提供的双链寡核苷酸、药物组合物和/或寡核苷酸缀合物中的双链寡核苷酸的用量是本领域技术人员根据期望获得的效果容易确定的。例如，在一些实施方式中，所述双链寡核苷酸、药物组合物和/或寡核苷酸缀合物是siRNA缀合物，所提供的siRNA缀合物中的siRNA用量是这样的量：其足以减少靶基因的表达，并导致在靶细胞表面处1pM至1μM、或0.01nM至100nM、或0.05nM至50nM或至约5nM的细胞外浓度。达到该局部浓度所需的量将随各种因素而变化，所述因素包括递送方法、递送部位、在递送部位和靶细胞或组织之间的细胞层的数目、递送是局部还是全身等。在递送部位处的浓度可以显著高于在靶细胞或组织的表面处的浓度。
试剂盒
本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含本公开提供的双链寡核苷酸、根据本公开的方法获得的双链寡核苷酸、药物组合物和/或寡核苷酸缀合物。
在一些实施方式中，本文所述的试剂盒可在一个容器中提供双链寡核苷酸、药物组合物和/或缀合物。在一些实施方式中，本文所述的试剂盒可包含一个提供药学上可接受的赋形剂的容器。在一些实施方式中，所述试剂盒中还可包含其它成分，如稳定剂或防腐剂等。在一些实施方式中，本文所述的试剂盒可在不同于提供本文所述双链寡核苷酸、药物组合物和/或缀合物的容器以外的其它容器中包含至少一种其它治疗剂。在一些实施方式中，所述试剂盒可包含用于将双链寡核苷酸、药物组合物和/或缀合物与药学上可接受的载体和/或辅料或其它成分(若有的话)进行混合的说明书。
在本公开的试剂盒中，所述双链寡核苷酸和药学上可接受的载体和/或辅料以及所述药物组合物和/或缀合物，和/或药学上可接受的辅料可以任何形式提供，例如液体形式、干燥形式或冻干形式。在一些实施方式中，所述双链寡核苷酸和药学上可接受的载体和/或辅料以及所述药物组合物和/或缀合物和任选的药学上可接受的辅料基本上纯净和/或无菌。在一些实施方式中，可在本公开的试剂盒中提供无菌水。
下面将通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
不希望受到限制地，在下面的实施方式和关于本公开的药物组合物和/或寡核苷酸缀合物中的双链寡核苷酸是小干扰RNA(siRNA)的示例性实施方式的实施例中进一步详细描述了本发明。在这种情况下，本公开的双链寡核苷酸、药物组合物以及寡核苷酸缀合物分别是siRNA、包含siRNA的药物组合物以及siRNA缀合物。在本公开的上下文中，为了便于描述，这些实施方式中的siRNA、包含siRNA的药物组合物以及siRNA缀合物也被称为本公开的siRNA、本公开的药物组合物以及本公开的siRNA缀合物。这并不意味着本公开的双链寡核苷酸只能是siRNA，相反，双链寡核苷酸可以是本文所公开的或本领域技术人员已知的其它变体，如小激活RNA(saRNA)等。可以设想，基于对siRNA、包含siRNA的药物组合物以及siRNA缀合物的详细说明，其它双链寡核苷酸将在单独使用、或形成本公开所述的药物组合物和/或寡核苷酸缀合物时类似地起到作用。
实施例
除非特别说明，以下实施例中所用到的试剂、培养基均为市售商品，所用到的核酸电泳、real-time PCR等操作均参照Molecular Cloning(Cold Spring Harbor LBboratory Press(1989))所记载的方法进行。
制备例1-4 本公开提供的siRNA的合成
按照WO2019105418(A1)中制备例1记载的方法，通过固相合成方法分别合成表2中所列的siRNA序列，区别仅在于，使用DEPC水溶解等摩尔表2中相互互补的正义链和反义链，随后退火得到本公开提供的siRNA1-siRNA4，其序列如表2所示。
表2 siRNA序列
Figure PCTCN2022105340-appb-000037
Figure PCTCN2022105340-appb-000038
其中，大写字母C、G、U、A、T表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸；下划线标出的小写字母组合 moe表示该字母组合左侧相邻的一个核苷酸为核糖2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸；小写字母s表示该字母s左右两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接。
对比制备例1-3参比siRNA的合成
按照WO2019105418(A1)中制备例1记载的方法，通过固相合成方法分别合成了表2中siRNA编号为参比siRNA1、参比siRNA2和NC的siRNA对应的正义链和反义链。使用DEPC水，分别溶解得到的等摩尔的正义链和反义链，随后退火得到参比siRNA，编号为NC。
制备例5-23本公开提供的siRNA缀合物的合成
按照CN110959011A制备例1所述的制备方法，制备获得了以下表3中的缀合物6-24，区别仅在于，各siRNA缀合物中含有的siRNA的正义链和反义链分别如表3中所示；对于核酸序列中具有；按照以下表3中编号为缀合物5-缀合物23的siRNA的核酸序列，分别合成siRNA的正义链和反义链。使用超纯水(Milli-Q超纯水仪，电阻率18.2MΩ*cm(25℃))将各siRNA缀合物稀释至浓度为0.2mg/mL(以siRNA计)后，利用液质联用仪(LC-MS，Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，购于Waters公司，型号：LCT Premier)进行分子量检测。实测值与理论值一致，说明所合成的缀合物5-23是目标设计的双链核酸序列。各个siRNA缀合物分别具有式(403)所示的结构，并且 该siRNA缀合物包含的siRNA分别具有表3中缀合物5-23所对应的siRNA序列。
表3 siRNA缀合物中的siRNA序列
Figure PCTCN2022105340-appb-000039
Figure PCTCN2022105340-appb-000040
Figure PCTCN2022105340-appb-000041
Figure PCTCN2022105340-appb-000042
其中，大写字母C、G、U、A、T表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸；下划线标出的字母组合 moe表示该字母组合moe左侧相邻的一个核苷酸为核糖2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸；小写字母s表示该字母s左右两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接，VP表示该字母VP右侧的一个核苷酸为5'-乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸；P表示该字母P右侧的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸。
对比制备例4-15参比siRNA缀合物的合成
按照CN110959011A制备例1所述的制备方法，制备获得了以下表3中编号为参比缀合物4-15的参比siRNA缀合物，区别仅在于，各参比siRNA缀合 物中含有的siRNA的正义链和反义链分别如表3中所示；按照以下表3中编号为参比缀合物4-15的siRNA的核酸序列，分别合成siRNA的正义链和反义链。使用超纯水(Milli-Q超纯水仪，电阻率18.2MΩ*cm(25℃))将各参比siRNA缀合物稀释至浓度为0.2mg/mL(以siRNA计)后，利用液质联用仪(LC-MS，Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，购于Waters公司，型号：LCT Premier)进行分子量检测。实测值与理论值一致，说明所合成的参比缀合物4-15分别具有目标设计的双链核酸序列。各参比siRNA缀合物具有式(403)所示的结构，并且所包含的siRNA分别具有表3中参比缀合物4-15所对应的siRNA序列。
实验例1 双链热解离温度Tm的测定
用1×PBS缓冲液将上述制备的缀合物5、缀合物19、参比缀合物10和参比缀合物11中的每一个分别配制为0.02mg/mL的溶液，作为供试品溶液。在配备有热式程序的Agilent cary300UV分光光度计上的10mm路径长度石英比色皿中加入供试品溶液，在260nm波长下监测温度-吸光率曲线，其中加热速率为0.5℃/min，自20.0℃起始升温至95℃。双链热解离温度Tm按照分光光度计说明书由温度-吸光率曲线的一阶导数计算获得。Tm值和ΔTm值结果如以下表4所示：
表4 双链热解离温度Tm
缀合物 Tm(℃) ΔTm(℃)
参比缀合物10 65.02 0
缀合物5 66.07 1.05
参比缀合物11 67.27 0
缀合物19 71.22 3.95
其中，对于缀合物5和参比缀合物10，
ΔTm值(待测缀合物)＝Tm(待测缀合物)-Tm(参比缀合物10)；
对于缀合物19和参比缀合物11，
ΔTm值(待测缀合物)＝Tm(待测缀合物)-Tm(参比缀合物11)。
根据表4的结果可知，与相同位置为未修饰的核苷酸的情况相比，本公开的包含稳定化修饰核苷酸的双链寡核苷酸及其缀合物具有更高的双链热解离温度。
实验例2 siRNA在体外siCHECK系统中的抑制活性
根据Kumico Ui-Tei等人,Functional dissection of siRNA sequence by systematic DNA substitution:modified siRNA with a DNA seed arm is a powerful tool for mammalian gene silencing with significantly reduced off-target effect.Nucleic Acids Research,2008.36(7),2136-2151描述的方法，构建检测质粒，将所述检测质粒与待测siRNA共转染至HEK293A细胞中，通过双萤光素酶报告 基因的表达水平，来反映siRNA的目标序列抑制活性。具体步骤如下：
[1]构建检测质粒
采用psiCHECK TM-2(Promega TM)质粒构建了检测质粒，所述质粒中含有一个目标序列1，即siRNA靶序列。对于待测siRNA，目标序列1如下所示：
Figure PCTCN2022105340-appb-000043
该目标序列1是所检测的siRNA反义链的完全互补序列，因此各siRNA对目标序列1的抑制效果可反映所检测的siRNA的目标基因表达的抑制能力。将目标序列1及其互补序列克隆到psiCHECK TM-2质粒的Xho I/Not I位点。
[2]转染
在添加有20％的胎牛血清(FBS，Hyclone公司)及0.2体积％的青链霉素双抗(Penicillin-Streptomycin，Gibco，Invitrogen公司)的DMEM完全培养基(Hyclone公司)中，于37℃在含5％CO 2/95％空气的培养箱中培养HEK293A细胞(购自南京科佰生物科技有限公司)。
将HEK293A细胞以8×10 3细胞/孔接种于96孔板中，16小时后细胞生长密度达到70-80％时，吸尽培养孔中H-DMEM完全培养基，每孔加入80μL Opti-MEM培养基(GIBCO公司)继续培养1.5小时。
用DEPC化水将上述检测质粒稀释成200ng/μL的检测质粒工作液；用DEPC化水将下面的siRNA中的每一个siRNA分别配制成4000nM、1000nM、250nM、62.5nM、15.625nM、3.91nM、0.977nM、0.244nM、0.061nM、0.0153nM和0.0038nM共11种不同浓度的siRNA工作液，所用siRNA分别为上述制备获得的siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4和参比siRNA1、参比siRNA2。
对于每一siRNA，分别配制2A1-2A11溶液，每份2A1-2A11溶液依次分别含有上述11个浓度的siRNA工作液1μL、检测质粒工作液0.05μL(含检测质粒10ng)和10μL的Opti-MEM培养基。
配制2B溶液，每份2B溶液含有0.2μL LipofectamineTM 2000和10μL Opti-MEM培养基。
配制2C溶液，每份2C溶液含有检测质粒工作液0.05μL(含检测质粒10ng)和10μL的Opti-MEM培养基。
分别将一份2B溶液与得到的一份每个siRNA的2A1-2A11溶液混合，分别室温下孵育20min，得到每个siRNA的转染复合物2X1-2X11。
将一份2B溶液与一份2C溶液混合，分别室温下孵育20min，得到空白转染复合物2X12
在培养孔中，分别加入每一siRNA的转染复合物2X1-2X11，均匀混合，加入量为20μL/孔，得到每个siRNA终浓度分别约为40nM、10nM、2.5nM、0.625nM、0.15625nM、0.0391nM、0.00977nM、0.00244nM、0.00061nM、0.000153nM和0.000038nM的转染复合物，每个siRNA的转染复合物2X1-2X11分别转染3个培养孔，得到含siRNA的共转染混合物，记为测试组。
对于每一siRNA，在另外3个培养孔中，分别加入转染复合物2X12，加入量为20μL/孔，得到不含siRNA的转染混合物，记为空白对照组。
分别将含siRNA的共转染混合物和不含siRNA的共转染混合物在培养孔中转染4小时后，每孔补加100μL含20％FBS的H-DMEM完全培养基。将96孔板置于CO 2培养箱继续培养24小时。
[3]检测
吸去培养孔中的培养基，每孔加入150μL的
Figure PCTCN2022105340-appb-000044
Luciferase试剂与H-DMEM混合溶液(体积比1:1)，充分混匀，室温孵育10min后，转移120μL混合液到96孔酶标板上，使用Synergy II多功能酶标仪(BioTek公司)读取96孔酶标板上各培养孔中Firefly的化学发光值(Fir)；再向96孔酶标板上每孔加入60μL
Figure PCTCN2022105340-appb-000045
Stop&
Figure PCTCN2022105340-appb-000046
试剂，充分混匀，室温孵育10min后，按照读取Fir的排布方式，使用酶标仪读取96孔酶标板上各培养孔中Renilla的化学发光值(Ren)。
计算96孔酶标板上每孔发光比值Ratio＝Ren/Fir，各测试组或对照组的发光比值Ratio(测试)或Ratio(对照)为三个培养孔Ratio的平均值；以对照组的发光比值为基准，对各测试组的发光比值进行归一化，获得Ratio(测试)/Rati(对照)的比值R，以此表示Renilla报告基因的相对表达水平，即残留活性。siRNA对目标序列的抑制率＝(1-R)×100％。
依据转染了不同浓度的待测siRNA后，HEK293A细胞中Renilla的相对残留活性，利用Graphpad 5.0软件的非线性回归分析功能拟合log(inhibitor)vs.response—Variable slope(four parameters)剂量-效应曲线。
根据拟合的剂量-效应曲线对应的函数，计算待测siRNA靶向目标序列的IC 50值，所述函数如下，
Figure PCTCN2022105340-appb-000047
式中：
Y是比值R，即Renilla的相对残留活性，
X为转染siRNA浓度的对数值，
Bot是稳态期底部的Y值，
Top是稳态期顶部的Y值，
X'是当Y在底部到顶部之间一半时对应的X值，而HillSlope则是曲线在X'处的斜率。
由该剂量-效应曲线和对应的函数，确定当Y＝50％时对应的X 50值，计算获得各siRNA的IC 50值＝10^X 50(nM)，IC 50值总结于表5中。
表5 siRNA的IC 50
siRNA编号 IC 50
siRNA1 0.0029nM
siRNA2 0.0086nM
siRNA3 0.0022nM
siRNA4 0.0022nM
参比siRNA1 0.0036nM
参比siRNA2 0.2851nM
由上述表5的结果可知，本公开提供的siRNA在体外siCHECK系统中有很高的目标序列抑制活性，IC 50在0.0022-0.0086nM之间。同时，与不包含稳定化修饰核苷酸的参比siRNA1具有接近的目标序列抑制活性；特别是，siRNA1、siRNA3和siRNA4的IC50值低于参比siRNA1，显示出更高的目标序列抑制效果。与此相对，按照5'端-3'端方向，仅在反义链2位具有稳定化修饰核苷酸的参比siRNA2的目标序列抑制活性大大降低，其IC 50值是参比siRNA1以及本公开的siRNA的接近33倍、甚至100倍以上。
实验例3 siRNA在体外siCHECK系统中的脱靶序列抑制活性
按照实验例2的方法，检测了siRNA3和参比siRNA1在体外siCHECK系统中的脱靶序列抑制活性。区别仅在于，所采用的目标序列为如下所示的目标序列2：
Figure PCTCN2022105340-appb-000048
该目标序列2仅有部分序列与待测siRNA的反义链互补，因此各siRNA对目标序列2的抑制效果可反映脱靶效应的程度。即，抑制效果越高，该siRNA越可能发生脱靶。
由剂量-效应曲线和对应的函数，确定当Y＝75％时对应的X 75值，计算获得各siRNA的脱靶IC 25值＝10^X 75(nM)。经测量与计算，参比siRNA1的脱靶效应IC25值为1.6255nM，而siRNA3在检测的全部浓度范围内均未发生脱靶，Y始终高于75％。可见，与参比siRNA相比，本公开的siRNA显示出显著更低的脱靶效应。
实验例4 siRNA在小鼠原代肝细胞中的靶mRNA抑制活性
HBV转基因小鼠C57BL/6J-Tg(A1b1HBV)44Bri/J购自北京大学医学部实验动物科学部，于实验前选择S/COV>10的小鼠进行试验，以下简称为44Bri小鼠。
从44Bri小鼠新鲜肝组织中提取获得小鼠肝原代细胞，在Opti-MEM(1X)培养基(GIBCO公司，货号31985-070)中调整小鼠肝原代细胞密度至2×10 5细胞/mL，得到小鼠肝原代细胞悬液。随后在12孔板的不同培养孔中分别加入得到的小鼠肝原代细胞悬液，将小鼠肝原代细胞接种到培养孔中。加入小鼠肝原代细胞悬液的体积为0.5mL/孔，小鼠肝原代细胞数量为1×10 5细胞/孔。
用DEPC化水将下面的siRNA中的每一个siRNA分别配制成20μM的siRNA工作液，所用siRNA分别为siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4、参 比siRNA1、参比siRNA2、参比siRNANC。
配制4A溶液，对于每一个siRNA,分别配制4A溶液，每份4A溶液依次含有上述siRNA工作液1.5μL和Opti-MEM培养基50μL。
配制4B溶液，每份4B溶液含有1μL Lipofectamine TM 2000和50μL Opti-MEM培养基。
分别将一份4B溶液与得到的每个siRNA的4A溶液混合，分别室温下孵育20min，得到每个siRNA的转染复合物4X。
将一份4B溶液与Opti-MEM培养基50μL混合，室温下孵育20min，得到转染复合物4X’。
在培养孔中，分别加入每一个siRNA的转染复合物4X，均匀混合，加入量为98μL/孔，得到每个siRNA终浓度分别约为50nM的转染复合物，每个siRNA的转染复合物4X分别转染3个培养孔，得到含siRNA的转染混合物，记为测试组。
在另外3个培养孔中，分别加入转染复合物4X’，加入量为98μL/孔，得到不含siRNA的转染混合物，记为空白对照组。
将每一含siRNA的转染混合物和不含siRNA的转染混合物分别在不同的培养孔中转染4h后，每孔补加1ml添加20％FBS的H-DMEM完全培养基。将24孔板置于CO 2培养箱在37℃下继续培养24h。
随后，使用TRIZOL(购自SIGMA公司，货号T9424)根据说明书记载的方法提取各孔细胞中的总RNA。，得到总RNA水溶液
对于每孔细胞，分别取包含1μg总RNA的总RNA水溶液，使用反转录试剂盒Goldenstar TM RT6 cDNA Synthesis Kit(购自北京擎科新业生物技术有限公司，货号TSK301M)提供的试剂，其中选取Goldenstar TM Oligo(dT) 17作为引物，按试剂盒说明书中反转录操作步骤配置反转录反应体系20μL，对各孔细胞的总RNA进行反转录。反转录的条件为：对于每一反转录反应体系，将反转录反应体系置于50℃孵育50min，然后85℃孵育5min，最后4℃孵育5min，反应结束后，向反转录反应体系中加入DEPC水80μL，得到含cDNA的溶液。
对于每一反转录反应体系，分别取上述含cDNA的溶液5μL做模板，使用
Figure PCTCN2022105340-appb-000049
SYBR qPCR SuperMix Plus试剂盒(购自近岸蛋白质科技有限公司，货号E096-01B)提供的试剂配制qPCR反应体系15μL，其中，用于扩增目标基因HBV X和内参基因mGAPDH的PCR引物序列如表6所示，每条引物的终浓度为0.25μM。将各qPCR反应体系置于ABI StepOnePlus Real-Time PCR仪上，使用三步法进行扩增，扩增程序为95℃预变性10min，然后95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重复上述变性、退火、延伸的过程共40次后，得到含有扩增了目标基因HBV X和内参基因mGAPDH的产物W。产物W随即依次经过95℃1min，55℃30s，95℃30s的孵育，实时荧光定量PCR仪分别收集产物W中目标基因HBV X和内参基因mGAPDH的溶解曲线，得 到目标基因HBV X和内参基因mGAPDH的Ct值。
表6 引物序列信息
Figure PCTCN2022105340-appb-000050
采用比较Ct(ΔΔCt)法，对各测试组中目标基因HBV的相对表达水平和抑制率进行相对定量计算，计算方法如下：
ΔCt(测试组)＝Ct(测试组目标基因)–Ct(测试组内参基因)
ΔCt(对照组)＝Ct(对照组目标基因)–Ct(对照组内参基因)
ΔΔCt(测试组)＝ΔCt(测试组)-ΔCt(对照组平均)
ΔΔCt(对照组)＝ΔCt(对照组)-ΔCt(对照组平均)
其中，ΔCt(对照组平均)是对照组三个培养孔各自的ΔCt(对照组)的算术平均值。从而，测试组和对照组的每一培养孔均对应一个ΔΔCt值。
以对照组为基准，对测试组HBV mRNA的表达水平进行归一化，定义空白对照组HBV mRNA表达水平为100％，
测试组HBV mRNA相对表达水平＝2 -ΔΔCt(测试组)×100％
测试组HBV mRNA抑制率＝(1-测试组HBV mRNA相对表达水平)×100％
图1为分别转染了siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4、参比siRNA1、参比siRNA2、参比siRNA NC后，44Bri小鼠原代肝细胞中HBV mRNA相对表达水平的柱状图。进一步地，各siRNA对HBV mRNA的抑制率总结于表7中。
表7 小鼠原代肝细胞中HBV mRNA的抑制
Figure PCTCN2022105340-appb-000051
由图1和表7的结果可见，本公开的siRNA在44Bri小鼠原代肝细胞中显示出优异的HBV mRNA抑制活性，在50nM的siRNA浓度下，HBV mRNA抑制率至少为73.92％，最高可达77.58％，并显示出与对应不包括稳定化修饰 核苷酸的参比siRNA1相当的HBV mRNA抑制活性。与此相对，按照5'端-3'端方向，仅在反义链2位具有稳定化修饰核苷酸的参比siRNA2的目标序列抑制活性大大降低，HBV mRNA抑制率仅有36.31％。
实验例5 siRNA缀合物在小鼠原代肝细胞中的靶mRNA抑制活性
HBV转基因小鼠C57BL/6J-Tg(A1b1HBV)44Bri/J购自北京大学医学部实验动物科学部，于实验前选择S/COV>10的小鼠进行试验，以下简称为44Bri小鼠。
从44Bri小鼠新鲜肝组织中提取获得小鼠肝原代细胞，在Opti-MEM(1X)培养基(GIBCO公司，货号31985-070)中调整小鼠肝原代细胞密度至1×10 5细胞/mL，得到小鼠肝原代细胞悬液。随后在12孔板的不同培养孔中分别加入得到的小鼠肝原代细胞悬液，将小鼠肝原代细胞接种到培养孔中。加入小鼠肝原代细胞悬液的体积为1mL/孔，小鼠肝原代细胞数量为1×10 5细胞/孔。
用DEPC化水将下面的siRNA缀合物中的每一个分别配制成4μM(以siRNA计)的siRNA缀合物工作液，所用siRNA缀合物分别为缀合物5、缀合物6或参比缀合物4。将参比siRNA NC配制成4μM的参比siRNA NC工作液。
在不同上述加入小鼠肝原代细胞悬液培养孔中，分别加入每个缀合物的siRNA缀合物工作液或参比siRNA NC工作液，均匀混合，加入量为2.5μL/孔，每一siRNA缀合物或参比siRNA NC分别转染3个培养孔，得到含siRNA(以siRNA计，终浓度为10nM)的转染混合物，记为测试组。将另外3个培养孔中的小鼠肝原代细胞悬液记为空白对照组。
将每一含siRNA的转染混合物和空白对照组置于含5％CO 2的培养箱中，在37℃下继续培养24h。
随后，使用TRIZOL(购自SIGMA公司，货号T9424)根据说明书记载的方法提取各孔细胞中的总RNA，得到总RNA水溶液。
对于每孔细胞，分别取包含1μg总RNA的总RNA水溶液，使用反转录试剂盒Goldenstar TM RT6 cDNA Synthesis Kit(购自北京擎科新业生物技术有限公司，货号TSK301M)提供的试剂，其中选取Goldenstar TM Oligo(dT) 17作为引物，按试剂盒说明书中反转录操作步骤配置反转录反应体系20μL，对各孔细胞的总RNA进行反转录。反转录的条件为：对于每一反转录反应体系，将反转录反应体系置于50℃孵育50min，然后85℃孵育5min，最后4℃孵育5min，反应结束后，向反转录反应体系中加入DEPC水80μL，得到含cDNA的溶液。
对于每一反转录反应体系，分别取上述含cDNA的溶液5μL做模板，使用
Figure PCTCN2022105340-appb-000052
SYBR qPCR SuperMix Plus试剂盒(购自近岸蛋白质科技有限公司，货号E096-01B)提供的试剂配制qPCR反应体系15μL，其中，用于扩增目标基因HBV X和内参基因GAPDH的PCR引物序列如表6所示，每条引物的终浓度为0.25μM。将各qPCR反应体系置于ABI StepOnePlus Real-Time PCR仪 上，使用三步法进行扩增，扩增程序为95℃预变性10min，然后95℃变性30s，60℃退火25s，72℃延伸25s，重复上述变性、退火、延伸的过程共40次后，得到含有扩增了目标基因HBV X和内参基因GAPDH的产物W。产物W随即依次经过95℃1min，55℃30s，95℃30s的孵育，实时荧光定量PCR仪分别收集产物W中目标基因HBV X和内参基因GAPDH的溶解曲线，得到目标基因HBV X和内参基因GAPDH的Ct值。
按照实验例4记载的方法，由Ct值计算自由摄取各siRNA缀合物后，小鼠原代肝细胞中HBV mRNA的相对表达水平和抑制率。结果如图2所示。
图2为分别自由摄取了缀合物5、缀合物6或参比缀合物4以及参比siRNA NC后，44Bri小鼠原代肝细胞中HBV mRNA相对表达水平的柱状图。进一步地，各siRNA缀合物或参比siRNA NC对HBV mRNA的抑制率总结于表8中。
表8 小鼠原代肝细胞中HBV mRNA的抑制
Figure PCTCN2022105340-appb-000053
由图2和表8的结果可见，本公开的siRNA缀合物在44Bri小鼠原代肝细胞中显示出优异的HBV mRNA抑制活性，在10nM的siRNA浓度下，HBV mRNA抑制率至少91.77％；特别是，缀合物5在小鼠原代肝细胞中的HBV mRNA抑制率可达93.06％，显示出与对应不包括稳定化修饰核苷酸的参比缀合物4基本相当的HBV mRNA抑制活性。
实验例6 siRNA缀合物在小鼠体内(in vivo)对HBV mRNA的抑制
使用乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)(上海科华生物)按照说明书记载的方法检测44Bri小鼠血清HbsAg含量，选取S/COV>10的小鼠，随机分组(均为雄性)，每组5只小鼠，分别编号，以皮下注射的方式，向每只小鼠分别以1mg/kg或0.1mg/kg小鼠体重的剂量(以siRNA计)给予缀合物5、缀合物6或参比缀合物4，siRNA缀合物分别以含0.2mg/ml或0.02mg/ml(以siRNA计)的siRNA缀合物的1×PBS溶液形式提供，给药体积均为5ml/kg；向另外2组小鼠中的每一只给予1×PBS，给药体积均为5ml/kg，作为空白对照组。
以给药时间点作为第1天计算，在第8天处死动物，分别收集每只小鼠的肝脏组织，用RNA later(Sigma Aldrich公司)保存；向每份肝组织中加入1mL Trizol(Sigma公司)，在Tissuelyset II型全自动组织匀浆仪中破碎3次，每次30s，获得肝组织匀浆，向其中加入0.2mL氯仿，静置3min。在4℃下以12000 rpm离心10min，取0.4mL上清。向上清中加入0.5mL异丙醇，室温下静置10min。4℃下以12000rpm离心10min，弃去上清。向沉淀中加入1mL乙醇洗涤沉淀，4℃下以12000rpm离心5min，弃去上清。沉淀中加入70μL DEPC化水，得到提取的总RNA溶液。
对于每一小鼠的肝脏组织总RNA，分别取包含1μg总RNA的总RNA水溶液10.5μL，使用反转录试剂盒Reverse Transcription System(购自Promega公司，货号A3500)，按试剂盒说明书中反转录操作步骤配制为反转录反应体系20μL，对总RNA进行反转录。反转录的条件为：对于每一反转录反应体系，将反转录反应体系置于42℃孵育30min，然后于95℃孵育5min，最后于4℃孵育5min，反应结束后，向反转录反应体系中加入DEPC水80μL，得到含cDNA的溶液。
对于每一反转录反应体系，分别取上述含cDNA的溶液5μL做模板，使用SYBR select Master Mix试剂盒(Applied biosystem公司)提供的试剂配制qPCR反应体系20μL，其中，用于扩增目标基因HBV X和内参基因GAPDH的PCR引物序列如表6所示，每条引物的终浓度为0.25μM。将各qPCR反应体系置于ABI StepOnePlus Real-Time PCR仪上，使用三步法进行扩增，扩增程序为95℃预变性10min，然后95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重复上述变性、退火、延伸的过程共40次后，得到含有扩增了目标基因HBV X和内参基因GAPDH的产物W。产物W随即依次经过95℃1min，55℃30s，95℃30s的孵育，实时荧光定量PCR仪分别收集产物W中目标基因HBV X和内参基因GAPDH的溶解曲线，得到目标基因HBV X和内参基因GAPDH的Ct值。
按照实验例4记载的方法，由Ct值计算给予各siRNA缀合物后，小鼠体内肝组织中HBV mRNA的相对表达水平和抑制率。结果如图3A和图3B所示。
图3A和图3B为分别给予了1mg/kg或0.1mg/kg(以siRNA计)缀合物5、缀合物6或参比缀合物4以及PBS后，44Bri小鼠肝内HBV mRNA相对表达水平的散点图。图3A和图3B中，PBS表示空白对照组。进一步地，各siRNA缀合物对HBV mRNA的抑制率总结于表9中。
表9 小鼠体内HBV mRNA的抑制
Figure PCTCN2022105340-appb-000054
由图3A、图3B和表9可知，本公开的siRNA缀合物在小鼠体内显示出优异的HBV mRNA抑制效果，在0.1mg/kg的剂量下，HBV mRNA抑制率至少为63.18％，在1mg/kg的剂量下，HBV mRNA抑制率甚至可高达96.31％，并且显示出与对应不包括稳定化修饰核苷酸的参比缀合物4相当的HBV mRNA抑制活性。
实验例7 siRNA缀合物在大鼠中的毒性效果
将缀合物5、缀合物6、参比缀合物4和参比缀合物14分别用PBS溶解为6mg/ml的溶液(以siRNA缀合物计)。将SD大鼠(均为雄性，0.22-0.28kg重，5-7周龄，购自于维通利华公司)随机分组，每组5只大鼠，分别编号。以颈背部皮下注射的方式，向每只大鼠分别给予上述siRNA缀合物溶液，给药体积均为5mL/kg，作为测试组；另外向一组大鼠中的每只分别给予PBS，给药体积均为5mL/kg，作为空白对照组。
以给药时间点作为第1天计算，在第15天处死测试组和空白对照组的每只大鼠并进行剖检，对肝脏进行称重并基于空白对照组进行归一化，在10％中性缓冲福尔马林固定液中保存并制作病理切片，大体剖检和肝重的结果参见表10。对病理切片中，肝脂肪变性和炎症的严重程度进行评价分级并作相对比较。
表10 siRNA缀合物在大鼠中毒性效果
Figure PCTCN2022105340-appb-000055
表10中，％及前面的数字代表相应指标与参比空白对照组的百分比的差值。“↑”代表增加。例如，↑5.43％指的是肝重参比空白对照组增加了5.43％。
由表10结果可知，给予不包含缀合物的参比缀合物4和参比缀合物14的大鼠分别增加高达81.31％和84.03％，显示出明显的肝重增加。进一步地，并在大体剖检中显示出较为明显的肝变黄、肿大。而给予缀合物5和缀合物6的大鼠肝重仅分别增加5.45％和3.45％，在大体剖检中与空白对照组相比未见明显异常。
病理切片结果显示，给予参比缀合物4的大鼠中有3例出现了重度以上的肝脂肪变性和轻度或中度的肝脏炎症，具体表现为组织中肝细胞广泛重度脂肪变性，胞质内可见数量不等、大小不等的圆形空泡，少量肝细胞重度肿胀，胞质淡染，静脉周围可见少量炎性细胞浸润。给予仅在反义链5'-3'端方向第7位包含稳定化修饰核苷酸的参比缀合物14的所有大鼠均显示出极重度的肝脂肪 变性和轻度或中度的肝脏炎症，具体表现为组织中肝细胞广泛重度脂肪变性，胞质内可见数量不等、大小不等的圆形空泡，小叶内可见几处炎性细胞小灶性浸润或门静脉周围偶见炎性细胞浸润，少量肝细胞重度肿胀，胞质淡染。
而给予缀合物5的大鼠中，有4只仅发现轻度的脂肪变性，具体表现为肝细胞排列紧密，界限清晰，少量肝细胞轻度脂肪变性，胞质内可见微小圆形空泡，另外1只未发现脂肪变性，且全部大鼠中均未发现明显肝脏炎症；给予缀合物6的大鼠中，2只大鼠的脂肪变性程度为轻度，具体表现为肝细胞排列紧密，界限清晰，部分肝细胞轻度脂肪变性，胞质内可见圆形空泡，3只大鼠的脂肪变性程度为中度，具体表现为肝细胞排列紧密，界限清晰，较多肝细胞轻度脂肪变性，胞质内可见圆形空泡，且全部大鼠中均未发现明显肝脏炎症。
上述结果表明，与参比缀合物相比，本公开的siRNA缀合物能够有效降低由于脱靶效应导致的肝毒性反应，因此在制备用于HBV疾病或症状的治疗和/或预防的药物方面显示出显著更高的安全性，具有优异的开发前景。
实验例8 siRNA缀合物在体外siCHECK系统中的脱靶序列抑制活性
按照实验例2记载的方法，对siRNA缀合物在体外siCHECK系统中的脱靶序列抑制活性进行了测定，区别仅在于，以缀合物5、缀合物6、缀合物7、缀合物8、缀合物22、缀合物23、参比缀合物4、参比缀合物10、参比缀合物12或参比缀合物13代替所测试的siRNA进行测定；并且，所采用的目标序列为如下所示的目标序列3：
Figure PCTCN2022105340-appb-000056
该目标序列3中有多段序列与待测siRNA缀合物中的siRNA反义链部分互补，因此各siRNA缀合物对目标序列3的抑制效果可反映脱靶效应的程度。即，抑制效果越高，该siRNA缀合物越可能发生脱靶。
由剂量-效应曲线和对应的函数，确定当Y＝50％时对应的X 50值，计算获得各siRNA缀合物的脱靶IC 50值＝10^X 50(nM)。
其结果，参比缀合物4的脱靶IC 50值为218.085pM，参比缀合物10的脱靶IC 50值为202.581pM，即，这两个参比siRNA缀合物在该脱靶IC 50以上的浓度时发生显著脱靶；与此相比，缀合物22的脱靶IC 50值为555.240pM，显著高于参比siRNA缀合物；特别是，其余各siRNA缀合物在全部测试浓度范围内的Renilla的相对残留活性始终高于50％，其中，缀合物5、缀合物6、缀合物7、缀合物8和缀合物23的Renilla的相对残留活性最低依次为55.65％、71.42％、71.38％、65.47％、67.84％，即，上述siRNA缀合物均未发生脱靶。可见，与不包含稳定化修饰核苷酸的参比缀合物4、参比缀合物10相比，包含稳定化修饰核苷酸的各siRNA缀合物均显示出显著更低的脱靶效应。
实验例9 siRNA缀合物在小鼠原代肝细胞中的靶mRNA抑制活性
按照实验例5记载的方法，对siRNA缀合物在小鼠原代肝细胞中的靶mRNA抑制活性进行了测定，区别仅在于，以缀合物5、缀合物6、缀合物22、缀合物23、参比缀合物4、参比缀合物10、参比缀合物12、参比缀合物13或参比siRNA NC代替所测试的siRNA缀合物进行测定，每一缀合物、参比缀合物或参比siRNA NC在2个培养孔中进行实验。结果如图4所示。
图4为分别自由摄取了缀合物5、缀合物6、缀合物22、缀合物23、参比缀合物4、参比缀合物10、参比缀合物12、参比缀合物13或参比siRNA NC后，44Bri小鼠原代肝细胞中HBV mRNA相对表达水平的柱状图。进一步地，各siRNA缀合物或参比siRNA NC对HBV mRNA的抑制率总结于表11中。
表11 小鼠原代肝细胞中HBV mRNA的抑制
Figure PCTCN2022105340-appb-000057
由图4和表11的结果可见，本公开的siRNA缀合物5、6、22和23在44Bri小鼠原代肝细胞中显示出优异的HBV mRNA抑制活性，在10nM的siRNA浓度下，HBV mRNA抑制率至少为78.47％，最高可达85.97％，HBV mRNA抑制活性与参比缀合物4活性相当，并且明显高于参比缀合物10、12和13。其中，参比缀合物4中对应位置为非稳定化修饰的核苷酸，参比缀合物10中对应位置是未修饰的核苷酸，参比缀合物12和13在反义链5'-3'端方向第3-9位之外还包含稳定化修饰核苷酸。
实验例10 siRNA缀合物在小鼠体内(in vivo)对HBV mRNA的抑制
按照实验例6记载的方法对siRNA缀合物在小鼠体内对HBV mRNA的抑制效果进行测试，区别仅在于，以缀合物10或参比缀合物5代替所使用的siRNA缀合物进行测试。结果如图5所示。
图5为分别给予了1mg/kg或0.1mg/kg(以siRNA计)缀合物10或参比缀合物5以及PBS后，44Bri小鼠肝内HBV mRNA相对表达水平的散点图。图中PBS表示空白对照组。进一步地，各siRNA缀合物对HBV mRNA的抑制率总结于表12中。
表12 小鼠体内HBV mRNA的抑制
Figure PCTCN2022105340-appb-000058
由图5和表12可知，本公开的siRNA缀合物在小鼠体内显示出优异的HBV mRNA抑制效果，在0.1mg/kg的剂量下，HBV mRNA抑制率至少为46.26％，特别是，在1mg/kg的剂量下，缀合物10在小鼠体内的HBV mRNA抑制率甚至可高达84.25％，显示出与相同浓度下对应不包括稳定化修饰核苷酸的参比缀合物5相近的HBV mRNA抑制活性。
实验例11 siRNA缀合物在小鼠中的毒性效果
将缀合物9、缀合物10、参比缀合物5和参比缀合物15分别用PBS溶解为3mg/ml的溶液(以siRNA缀合物计)。将ICR小鼠(雌雄各半，18-22g重，5-6周龄，购自于斯贝福公司)随机分组，每组6只小鼠(雌雄各半)，分别编号。以颈背部皮下注射的方式，向每只小鼠分别给予上述siRNA缀合物溶液，给药体积均为10mL/kg，作为测试组；另外向一组小鼠中的每只分别给予PBS，给药体积均为10mL/kg，作为空白对照组。
以给药时间点作为第1天计算，在第15天对测试组和空白对照组的每只小鼠进行眼眶采血，采血量为0.6mL，采血后在37℃下孵育60min后，在4℃下，3000rpm转速离心15min获得血清。进一步使用PM1P000/3全自动血清生化仪(SABA，意大利)检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的浓度。结果参见图6A、图6B。图中，PBS表示空白对照组。
图6A和图6B分别是给予30mg/kg的缀合物9、缀合物10、参比缀合物5、参比缀合物15或PBS后，小鼠血清中ALT和AST浓度的散点图。由图6A和图6B可见，与空白对照组相比，给予不包含稳定化修饰核苷酸的参比缀合物5后，血清ALT和AST浓度有所升高；而给予本公开的siRNA缀合物后，血清ALT和AST浓度与空白对照组水平相当，表明本公开的siRNA缀合物具有低的肝毒性。另一方面，给予仅在反义链5'-3'端方向第7位包含稳定化修饰核苷酸的参比缀合物15后，小鼠血清ALT和AST的浓度显著升高，表明该参比缀合物可能产生更高的肝毒性。
进一步地，在第15天采血后，处死小鼠并进行剖检，在10％中性缓冲福尔马林固定液中保存并制作病理切片。对病理切片中，肝脂肪变性的严重程度进行评价分级，并作相对比较。
病理切片结果显示，与空白对照相比，给予不包含稳定化修饰核苷酸的参 比缀合物5的小鼠中，4只小鼠表现出重度肝细胞变性，具体表现为组织广泛可见肝细胞胞质疏松，较多肝细胞气球样变性，细胞肿胀，胞质呈空泡状，1只小鼠表现出中度肝细胞变性，具体表现为大量肝细胞胞质疏松淡染，部分肝细胞伴有空泡变性，胞质内可见微小的圆形空泡，局部少量肝细胞坏死，胞核固缩或碎裂，1只小鼠表现出轻度肝细胞变性，具体表现为较多肝细胞胞质疏松淡染，显示出比空白对照组更为严重的肝脂肪变性。
与空白对照相比，给予仅在反义链5'-3'端方向第7位包含稳定化修饰核苷酸的参比缀合物15的小鼠中，2只表现出重度肝脂肪变性，4只表现出了中度肝脂肪变性，也显示出比空白对照组的小鼠中严重的肝脂肪变性。
给予本公开的siRNA缀合物9的小鼠中，2只表现出中度肝脂肪变性，3只表现出轻度肝脂肪变性，未见重度或以上的肝细胞变性。给予本公开的siRNA缀合物10的小鼠中，3只表现出中度肝脂肪变性，2只表现出轻度肝脂肪变性，未见重度或以上的肝细胞变性。相比参比缀合物，给予本公开的缀合物的小鼠表现出更低的肝脂肪变性程度。
上述结果表明，与参比缀合物相比，本公开的siRNA缀合物能够有效降低由于脱靶效应导致的肝毒性反应，因此在制备用于HBV疾病或症状的治疗和/或预防的药物方面显示出显著更高的安全性，具有优异的开发前景。
实验例12 siRNA缀合物在体外siCHECK系统中的抑制活性
本实验例中，采用体外siCHECK系统，检测了缀合物11、缀合物12、缀合物13、缀合物14、缀合物15、缀合物16、参比缀合物6、参比缀合物7、参比缀合物8或参比siRNA NC在体外siCHECK系统中对目标序列的抑制活性。
[1]构建检测质粒
采用psiCHECK TM-2(Promega TM)质粒构建了检测质粒，所述质粒中含有一个目标序列4，即siRNA靶序列。对于待测siRNA缀合物，目标序列4如下所示：
Figure PCTCN2022105340-appb-000059
该目标序列4是所检测的siRNA靶向的人ApoC3基因表达的mRNA中的一段核苷酸序列，因此各siRNA缀合物对目标序列4的抑制效果可反映所检测的siRNA缀合物中siRNA的目标基因表达的抑制能力。将目标序列4及其互补序列克隆到psiCHECK TM-2质粒的Xho I/Not I位点。
[2]转染
在添加有20％的胎牛血清(FBS，Hyclone公司)及0.2体积％的青链霉素双抗(Penicillin-Streptomycin，Gibco，Invitrogen公司)的DMEM完全培养基(Hyclone公司)中，于37℃在含5％CO 2/95％空气的培养箱中培养HEK293A细胞(购自南京科佰生物科技有限公司)。
将HEK293A细胞以8×10 3细胞/孔接种于96孔板中，16小时后细胞生长密度达到70-80％时，吸尽培养孔中H-DMEM完全培养基，每孔加入80μL Opti-MEM培养基(GIBCO公司)继续培养1.5小时。
用DEPC化水将上述检测质粒稀释成200ng/μL的检测质粒工作液；用DEPC化水将下面的siRNA缀合物中的每一个或者参比siRNA NC分别配制成10nM、3nM、1nM共3种不同浓度(以siRNA计)的siRNA缀合物工作液或参比siRNA NC工作液，所用siRNA缀合物分别为上述制备获得的缀合物11、缀合物12、缀合物13、缀合物14、缀合物15、缀合物16、参比缀合物6、参比缀合物7、参比缀合物8。
对于每一siRNA缀合物或参比siRNA NC，分别配制12A1-12A3溶液，每份12A1-12A3溶液依次分别含有上述3个浓度的siRNA缀合物工作液或参比siRNA NC工作液1μL、检测质粒工作液0.05μL(含检测质粒10ng)和10μL的Opti-MEM培养基。
配制12B溶液，每份12B溶液含有0.2μL Lipofectamine TM 2000和10μL Opti-MEM培养基。
配制12C溶液，每份12C溶液含有检测质粒工作液0.05μL(含检测质粒10ng)和10μL的Opti-MEM培养基。
分别将一份12B溶液与得到的一份每个siRNA缀合物或参比siRNA NC的12A1-12A3溶液混合，分别在室温下孵育20min，得到每个siRNA缀合物或参比siRNA NC的转染复合物12X1-12X3。
将一份12B溶液与一份12C溶液混合，在室温下孵育20min，得到空白转染复合物12X4
在培养孔中，分别加入每一siRNA缀合物或参比siRNA NC的转染复合物12X1-12X3，均匀混合，加入量为20μL/孔，得到每个siRNA缀合物或参比siRNA NC终浓度分别约为0.1nM、0.03nM和0.01nM(以siRNA计)的转染复合物，每个siRNA缀合物或参比siRNA NC的转染复合物12X1-12X3分别转染3个培养孔，得到含siRNA缀合物或参比siRNA NC的共转染混合物，记为测试组。
对于每一siRNA缀合物或参比siRNA NC，在另外3个培养孔中，分别加 入转染复合物12X4，加入量为20μL/孔，得到不含siRNA的转染混合物，记为空白对照组。
分别将含siRNA的共转染混合物和不含siRNA的共转染混合物在培养孔中转染4小时后，每孔补加100μL含20％FBS的H-DMEM完全培养基。将96孔板置于CO 2培养箱继续培养24小时。
[3]检测
吸去培养孔中的培养基，每孔加入150μL的
Figure PCTCN2022105340-appb-000060
Luciferase试剂与H-DMEM混合溶液(体积比1:1)，充分混匀，室温孵育10min后，转移120μL混合液到96孔酶标板上，使用Synergy II多功能酶标仪(BioTek公司)读取96孔酶标板上各培养孔中Firefly的化学发光值(Fir)；再向96孔酶标板上每孔加入60μL
Figure PCTCN2022105340-appb-000061
Stop&
Figure PCTCN2022105340-appb-000062
试剂，充分混匀，室温孵育10min后，按照读取Fir的排布方式，使用酶标仪读取96孔酶标板上各培养孔中Renilla的化学发光值(Ren)。
计算96孔酶标板上每孔发光比值Ratio＝Ren/Fir，各测试组或对照组的发光比值Ratio(测试)或Ratio(对照)为三个培养孔Ratio的平均值；以对照组的发光比值为基准，对各测试组的发光比值进行归一化，获得Ratio(测试)/Rati(对照)的比值R，以此表示Renilla报告基因的相对表达水平，即残留活性。各siRNA缀合物或参比siRNA NC对目标序列4的抑制率＝(1-R)×100％。
各siRNA缀合物或参比siRNA NC的目标序列4抑制效果参见图7。图7是共转染包含目标序列4的质粒和待测siRNA缀合物或参比siRNA NC后，体外siCHECK系统中目标序列4相对表达水平的柱状图。进一步地，各siRNA缀合物或参比siRNA NC对目标序列4的表达抑制率总结于表13中。
表13 体外siCHECK系统中目标序列4的表达抑制率
Figure PCTCN2022105340-appb-000063
根据图7和表13的结果可知，本公开提供的siRNA缀合物在体外siCHECK系统中有很高的目标序列抑制活性。在0.01nM的低浓度下，至少有38.92nM 的目标序列4表达抑制率，最高可达67.54％；在0.1nM的浓度下，目标序列4表达抑制率至少为84.73％，最高可达89.35％。同时，与不包含稳定化修饰核苷酸的参比缀合物6、参比缀合物7或参比缀合物8具有接近的目标序列抑制活性水平。
实验例13 siRNA缀合物在体外siCHECK系统中的抑制活性
按照实验例2的方法，测试了缀合物11、缀合物12和参比缀合物6在体外siCHECK系统中的抑制活性，区别仅在于，以缀合物11、缀合物12或参比缀合物6代替所测试的siRNA进行检测；检测质粒中使用的目标序列为以下目标序列5；以及用DEPC化水将每一个siRNA缀合物分别配制成1.00μM、0.330μM、0.110μM、0.0370μM、0.0123μM、0.00412μM、0.00137μM、0.000457μM、0.000152μM、0.0000508μM和0.0000169μM共11个不同浓度(均以siRNA计算)的siRNA缀合物工作液。
目标序列5：
Figure PCTCN2022105340-appb-000064
该目标序列5是所测试的各缀合物中siRNA反义链的完全互补序列。
测得的IC 50值总结于表14中。
表14 siRNA缀合物在pscheck系统中的IC 50
缀合物编号 IC 50
缀合物11 8.55pM
缀合物12 6.89pM
参比缀合物6 6.68pM
由表14的结果可知，本公开的siRNA缀合物在体外siCHECK系统中有很高的目标序列抑制活性，IC 50在6.89-8.55pM之间。同时，与其余序列相同、但不包含稳定化修饰核苷酸的参比缀合物6具有接近的目标序列抑制活性。
实验例14 siRNA缀合物在小鼠体内(in vivo)对血脂的降低效果
选取血清TG含量>2mmol/L的人APOC3转基因小鼠Tg(APOC3)3707Bres(购自美国Jackson实验室)进行随机分组，每组6只，雌雄各半。分别向每组小鼠给予缀合物12、参比缀合物6以及PBS空白对照。所有动物根据体重计算药量，采用皮下注射方式单次给药，各siRNA缀合物的给药剂量(以siRNA的量计)为3mg/kg和1mg/kg小鼠体重，给药体积为5ml/kg。各siRNA缀合物分别以PBS水溶液提供，根据给药剂量和给药体积，换算出缀合物应配制的浓度。向另外1组小鼠中的每一只给予1×PBS，给药体积为5ml/kg，作为空白对照组。
以给药时间点记为第1天，在第1、9、15、22、29、36、50天分别对小鼠眼眶静脉丛取血，每次100μL。采血后在室温下放置30min后，在4℃下， 3000rpm转速离心15min获得血清。进一步使用PM1P000/3全自动血清生化仪(SABA，意大利)检测血清中总胆固醇(CHO)和甘油三酯(TG)的含量。
标准化的血脂水平＝(给药后测试组血脂含量/给药前测试组血脂含量)×100％。
血脂水平的抑制率＝(1-给药后测试组血脂含量/给药前测试组血脂含量)×100％。
其中，血脂是指总胆固醇(CHO)或甘油三酯(TG)。
图8A和图8B分别为显示给予本公开的siRNA缀合物、参比siRNA缀合物或PBS后，血清TG水平或血清CHO水平随时间变化的折线图。进一步地，各时间点的血清TG抑制率和血清CHO抑制率归纳于以下表15A和表15B中：
表15A siRNA缀合物在转基因小鼠中的血清TG抑制率
Figure PCTCN2022105340-appb-000065
表15B siRNA缀合物在转基因小鼠中的血清CHO抑制率
Figure PCTCN2022105340-appb-000066
图8A、图8B以及表15A、15B的结果表明，在给药后不同时间点，缀合物12能够明显降低小鼠血清中的TG和CHO水平，并显示出与对应不包括稳定化修饰核苷酸的参比缀合物6相近的血脂水平降低效果。特别是，在3mg/kg的剂量下，缀合物12在长达50天的全部给药时间内始终显示出很高的血脂TG降低效果，最高抑制率可达90.2％。
实验例15 siRNA缀合物在小鼠中的毒性效果
将缀合物11、缀合物12和参比缀合物6分别用PBS溶解为10mg/ml和30mg/ml的溶液(以siRNA缀合物计)。将ICR小鼠(雌雄各半，18-22g重，5-6周龄，购自于斯贝福公司)随机分组，分别编号。对于每一浓度的每一缀合物，分组为2周组和4周组两组动物，每组6只小鼠(雌雄各半)。以颈背 部皮下注射的方式，向每只小鼠分别给予上述siRNA缀合物溶液，给药体积均为10mL/kg，作为测试组；另外向2组小鼠中的每只分别给予PBS，给药体积均为10mL/kg，分别作为空白对照组的2周组或4周组。
以给药时间点作为第1天计算，在第15天分别对测试组和空白对照组的2周组中的6只小鼠进行眼眶采血，在第29天分别对测试组和空白对照组的4周组中的6只小鼠进行眼眶采血，采血量均为0.6mL，采血后在37℃下孵育60min后，在4℃下，3000rpm转速离心15min获得血清。进一步使用PM1P000/3全自动血清生化仪(SABA，意大利)检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的浓度，并与空白对照组进行对照，结果参见表16的记载。进一步地，在第15天采血后，处死300mg/kg浓度缀合物2周组的6只小鼠并进行剖检，分别在10％中性缓冲福尔马林固定液中保存并制作病理切片。对病理切片中，炎细胞浸润和肝细胞坏死的严重程度进行评价分级并作相对比较。
其中，ALT:M:37％表示雄性小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶平均值比空白对照组高出37％；(M：1级1/3)表示全部3只雄性小鼠中有1只显示出了轻度反应，(F：3级3/3)表示全部3只雌性小鼠均显示出了重度反应，以此类推。“-”表示无明显异常，“N/A”表示未测试
表16 给予siRNA缀合物的小鼠中血生化及肝组织病理学结果
Figure PCTCN2022105340-appb-000067
表16中，F代表雌性小鼠，％及前面的数字代表小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)或天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的浓度与空白对照组血清中浓度的差值，与空白对照组血清中浓度的百分比。例如，表16中的F：212％代表以300mg/Kg给予了参比缀合物6的雌性小鼠体内的丙氨酸氨基转移酶的浓度比空白对照组高出212％。
由表16结果可知，与空白对照相比，给予不包含稳定化修饰核苷酸的参比缀合物6的小鼠显示出明显的血生化指标变化，在300mg/Kg的高剂量下，雌性小鼠体内ALT和AST的浓度分别升高了212％和36％。相同剂量下，给予本公开的缀合物12的雌性小鼠体内ALT和AST的浓度仅分别升高了130％和32％，相较于参比缀合物6，ALT的浓度明显下降；给予本公开的缀合物11的小鼠体内均未发现ALT和AST浓度升高，相较于参比缀合物6，血生化指标变化程度显著下降。
病理切片的结果显示，与空白对照相比，给予不包含稳定化修饰核苷酸的参比缀合物6的小鼠显示出明显的肝炎症反应，6只小鼠均出现炎性细胞浸润。 而给予缀合物11的小鼠中仅有3只小鼠显示出炎性细胞浸润。给予缀合物12的小鼠中仅有3只出现炎性细胞浸润。与参比缀合物相比，本公开的缀合物在组织病理学方面出现炎性细胞浸润的小鼠数量也显著减少。
上述结果表明，与参比缀合物相比，本公开的siRNA缀合物能够有效降低由于脱靶效应导致的肝毒性反应，因此在制备用于血脂异常相关疾病或症状的治疗和/或预防的药物方面显示出显著更高的安全性，具有优异的开发前景。
实验例16 siRNA缀合物在体外siCHECK系统中的抑制活性
按照实验例13的方法，测试了缀合物11和缀合物13在体外siCHECK系统中的脱靶序列抑制活性。区别仅在于，以缀合物11或缀合物13代替所测试的siRNA缀合物进行检测；对于缀合物11，所使用的目标序列是目标序列5，或分别采用如下所示的目标序列6-8代替目标序列5；对于缀合物13，所使用的目标序列是目标序列5，或分别采用如下所示的目标序列9-11代替目标序列5：
目标序列6：
Figure PCTCN2022105340-appb-000068
目标序列7：
Figure PCTCN2022105340-appb-000069
目标序列8：
Figure PCTCN2022105340-appb-000070
目标序列9：
Figure PCTCN2022105340-appb-000071
目标序列10：
Figure PCTCN2022105340-appb-000072
目标序列11：
Figure PCTCN2022105340-appb-000073
其中，目标序列5中包含缀合物11和缀合物13中siRNA反义链的完全互补序列，因此缀合物11或13对目标序列5抑制的效果可反映缀合物11或13的ApoC3 mRNA抑制活性；目标序列6中包含与缀合物11中siRNA反义链部分互补的序列、目标序列7中包含缀合物11中siRNA正义链的完全互补序列，目标序列8中包含与缀合物11中siRNA正义链部分互补的序列，因此缀合物11对目标序列6、7或8的抑制效果可反映脱靶效应的程度。即，抑制效果越高，缀合物11越可能发生脱靶。类似地，目标序列9中包含与缀合物13中siRNA反义链部分互补的序列、目标序列10中包含缀合物13中siRNA正义链的完全互补序列，目标序列11中包含与缀合物13中siRNA正义链部分互补的序列，因此缀合物13对目标序列9、10或11的抑制效果可反映脱靶效应的程度。即，抑制效果越高，缀合物13越可能发生脱靶。
其结果，体外siCHECK系统中，缀合物11对目标序列5的抑制IC 50为11.3pM，对目标序列6、7或8在全部测试siRNA浓度范围内抑制率均不足 50％，即，均未发生脱靶；缀合物13对目标序列5的抑制IC 50为4.50pM，对目标序列9、10或11在全部测试siRNA浓度范围内抑制率均不足50％，即，均未发生脱靶。
可见，在体外siCHECK系统中，本公开的siRNA缀合物显示出优异的目标序列在靶抑制活性，IC50值为4.50pM-11.3pM；同时，本公开的siRNA缀合物具有低的脱靶效应。
实验例17 siRNA缀合物在小鼠体内(in vivo)对血脂的降低效果
按照实验例14的方法，检测了siRNA缀合物在小鼠体内对血脂的降低效果，区别仅在于，所使用的siRNA缀合物为缀合物13或缀合物14。结果如图9A和图9B所示。
图9A和图9B分别为显示给予本公开的siRNA缀合物或PBS后，血清TG水平或血清CHO水平随时间变化的折线图。进一步地，各时间点的血清TG抑制率和血清CHO抑制率归纳于以下表17A和表17B中：
表17A siRNA缀合物在转基因小鼠中的血清TG抑制率
Figure PCTCN2022105340-appb-000074
表17B siRNA缀合物在转基因小鼠中的血清CHO抑制率
Figure PCTCN2022105340-appb-000075
图9A、图9B以及表17A、17B的结果表明，在给药后不同时间点，缀合物13和缀合物14能够明显降低小鼠血清中的TG和CHO水平。特别是，在3mg/kg以及1mg/kg的剂量下，缀合物14在长达50天的全部给药时间内均始终显示出很高的血脂TG降低效果，最高抑制率可达92.0％。
实验例18 siRNA缀合物在小鼠中的毒性效果
按照实验例15的方法，对siRNA缀合物在小鼠中的毒性效果进行了验证， 区别仅在于，使用缀合物13和参比缀合物7进行试验，每一缀合物分别用PBS溶解为10mg/ml的溶液(以siRNA缀合物计)，2周组和4周组(在表18中分别标记为D15组和D29组)每组各3只小鼠，均为雄性。即，测试了100mg/kg剂量下，缀合物13和参比缀合物7在小鼠中的毒性效果。结果参见表18的记载。
表18 给予siRNA缀合物的小鼠中血生化结果
Figure PCTCN2022105340-appb-000076
表18中，％及前面的数字代表小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)或天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的浓度与空白对照组血清中浓度的差值，与空白对照组血清中浓度的百分比。
由表18结果可知，与空白对照相比，与空白对照相比，给予不包含稳定化修饰核苷酸的参比缀合物7的小鼠显示出明显的血生化指标变化，在给药后第15天，血清中ALT和AST的浓度分别升高了71％和54％，在给药后第29天,血清中ALT和AST的浓度分别升高了118％和94％。而以相同剂量给予缀合物13的小鼠中未见血清中ALT和AST浓度升高。本公开的缀合物13显示出显著更低的血生化指标。
上述结果表明，与参比缀合物相比，本公开的siRNA缀合物能够有效降低由于脱靶效应导致的肝毒性反应，因此在制备用于血脂异常相关疾病或症状的治疗和/或预防的药物方面显示出显著更高的安全性，具有优异的开发前景。
实验例19 siRNA缀合物在小鼠体内(in vivo)对血脂的降低效果
按照实验例14的方法，检测了siRNA缀合物在小鼠体内对血脂的降低效果，区别仅在于，所使用的siRNA缀合物为缀合物13，各siRNA缀合物的给药剂量(以siRNA的量计)为9mg/kg、3mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg、0.25mg/kg、0.1mg/kg或0.05mg/kg小鼠体重，给药体积为5ml/kg。各siRNA缀合物分别以PBS水溶液提供，根据给药剂量和给药体积，换算出缀合物应配制的浓度。以给药时间点记为第1天，在第1、8、15、22、29、36、43、50、57和64天分别对小鼠眼眶静脉丛取血检测血清中TG水平。结果如图10所示。
图10为显示给予不同浓度的缀合物13或PBS后，血清TG水平随时间变化的折线图。进一步地，各时间点的血清TG抑制率归纳于以下表19中：
表19 siRNA缀合物在转基因小鼠中的血清TG抑制率
Figure PCTCN2022105340-appb-000077
图10和表19的结果表明，在给药后不同时间点，不同浓度的缀合物13均能够降低小鼠血清中的TG水平，特别是，在9mg/kg的给药剂量下，仅给药一次，本公开的siRNA缀合物就能在64天的长时间内始终保持TG水平抑制率大于50％，且抑制率最高可达89.5％，显示出优异的血脂抑制能力。
实验例20 siRNA缀合物在体外siCHECK系统中的抑制活性
按照实验例13的方法，测试了缀合物17在体外siCHECK系统中的抑制活性，区别仅在于，以缀合物17代替所测试的siRNA缀合物进行检测。其结果，缀合物17在体外siCHECK系统中显示出高的目标序列抑制活性，IC 50为49.8pM。
实验例21 siRNA缀合物在小鼠体内(in vivo)对血脂的降低效果
选取血清TG含量>2mmol/L的人APOC3转基因小鼠Tg(APOC3)3707Bres(购自美国Jackson实验室)进行随机分组，每组8只，雌雄各半。分别向每组小鼠给予缀合物13、缀合物17以及PBS空白对照。所有动物根据体重计算药量，采用皮下注射方式单次给药，各siRNA缀合物的给药剂量(以siRNA的量计)为3mg/kg和1mg/kg小鼠体重，给药体积为5ml/kg。各siRNA缀合物分别以PBS水溶液提供，根据给药剂量和给药体积，换算出缀合物应配制的浓度。向另外1组小鼠中的每一只给予1×PBS，给药体积为5ml/kg，作为空白对照组。
以给药时间点记为第1天，在第1、8、15、22、29、36、43天分别对小鼠眼眶静脉丛取血，每次100μL。采血后在室温下放置30min后，在4℃下，3000rpm转速离心15min获得血清。进一步使用PM1P000/3全自动血清生化仪(SABA，意大利)检测血清中总胆固醇(CHO)和甘油三酯(TG)的含量。
标准化的血脂水平＝(给药后测试组血脂含量/给药前测试组血脂含量)×100％。
血脂水平的抑制率＝(1-给药后测试组血脂含量/给药前测试组血脂含 量)×100％。
其中，血脂是指总胆固醇(CHO)或甘油三酯(TG)。
图11A和图11B分别为显示给予本公开的siRNA缀合物或PBS后，血清TG水平或血清CHO水平随时间变化的折线图。进一步地，给予本公开的siRNA缀合物后，各时间点的小鼠血清TG抑制率和血清CHO抑制率归纳于以下表20A和表20B中：
表20A siRNA缀合物在转基因小鼠中的血清TG抑制率
Figure PCTCN2022105340-appb-000078
表20B siRNA缀合物在转基因小鼠中的血清CHO抑制率
Figure PCTCN2022105340-appb-000079
分析图11A、图11B以及表20A、表20B的结果可知，在给药后不同时间点，缀合物13和缀合物17能够明显降低小鼠血清中的TG和CHO水平。并且在实验期间的43天时间内始终保持较高的抑制效果。特别是，3mg/kg剂量的缀合物13和缀合物17均显示出优异的小鼠血脂抑制效果，血清TG的最大抑制率均高于88％；血清CHO的最大抑制率分别为51.18％和57.41％。上述结果表明，本公开的siRNA缀合物能够在长时间内有效降低血脂水平，在制备用于血脂异常相关疾病或症状的治疗和/或预防的药物方面显示出优异的开发前景。
实验例22 siRNA缀合物在小鼠中的毒性效果
将缀合物13和缀合物17分别用PBS溶解为30mg/ml的溶液(以siRNA缀合物计)。将ICR小鼠(雌雄各半，18-22g重，5-6周龄，购自于斯贝福公司)随机分组，每组10只小鼠(雌雄各半)，分别编号。以颈背部皮下注射的方式，向每只小鼠分别给予上述siRNA缀合物溶液，给药体积均为10mL/kg，作为测试组；另外向一组小鼠中的每只分别给予PBS，给药体积均为10mL/kg，作为空白对照组。
以首次给药时间点作为第1天计算，在第8天和15天分别对每只小鼠重 复给药，所使用的siRNA缀合物溶液(或PBS)浓度和给药体积与首次给药相同。在第16天对测试组和空白对照组的每只小鼠进行眼眶采血，采血量为0.6mL，采血后在37℃下孵育60min后，在4℃下，3000rpm转速离心15min获得血清。进一步使用PM1P000/3全自动血清生化仪(SABA，意大利)检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的浓度。结果参见图12A、图12B。
图12A和图12B分别是连续三周内每周给予300mg/kg本公开的siRNA缀合物或PBS后，小鼠血清中ALT和AST浓度的散点图。由图12A和图12B可见，与空白对照组相比，给予本公开的siRNA缀合物后，血清ALT和AST浓度与空白对照组水平相当，表明本公开的siRNA缀合物具有很低的肝毒性。
进一步地，在采血后，处死小鼠并进行剖检，在10％中性缓冲福尔马林固定液中保存并制作病理切片。病理切片显示，给予本公开的siRNA缀合物3或缀合物5的小鼠，在肝脂肪变性和炎症方面均显示出与空白对照组相接近的反应，没有显著异常。同样表明本公开的siRNA缀合物具有很低的肝毒性。同样表明本公开的siRNA缀合物具有很低的肝毒性。
上述结果表明，本公开的siRNA缀合物能够有效降低由于脱靶效应导致的肝毒性反应，因此在制备用于血脂异常相关疾病或症状的治疗和/或预防的药物方面显示出显著更高的安全性，具有优异的开发前景。
实验例23 siRNA缀合物在小鼠体内(in vivo)对血脂的降低效果
选取血清TG含量>2mmol/L的人APOC3转基因小鼠Tg(APOC3)3707Bres(购自美国Jackson实验室)进行随机分组，每组6只，雌雄各半。分别向每组小鼠给予缀合物15、缀合物16、参比缀合物8以及PBS空白对照。所有动物根据体重计算药量，采用皮下注射方式单次给药，各siRNA缀合物的给药剂量(以siRNA的量计)为3mg/kg和1mg/kg小鼠体重，给药体积为5ml/kg。各siRNA缀合物分别以PBS水溶液提供，根据给药剂量和给药体积，换算出缀合物应配制的浓度。向另外1组小鼠中的每一只给予1×PBS，给药体积为5ml/kg，作为空白对照组。
以给药时间点记为第1天，在第1、8、15、22天分别对小鼠眼眶静脉丛取血，每次100μL。采血后在室温下放置30min后，在4℃下，3000rpm转速离心15min获得血清。进一步使用PM1P000/3全自动血清生化仪(SABA，意大利)检测血清中总胆固醇(CHO)和甘油三酯(TG)的含量。
标准化的血脂水平＝(给药后测试组血脂含量/给药前测试组血脂含量)×100％。
血脂水平的抑制率＝(1-给药后测试组血脂含量/给药前测试组血脂含量)×100％。
其中，血脂是指总胆固醇(CHO)或甘油三酯(TG)。
图13A和图13B分别为显示给予本公开的siRNA缀合物、参比siRNA缀 合物或PBS后，血清TG水平或血清CHO水平随时间变化的折线图。进一步地，给予本公开的siRNA缀合物后，各时间点的小鼠血清TG抑制率和血清CHO抑制率归纳于以下表21A和表21B中：
表21A siRNA缀合物在转基因小鼠中的血清TG抑制率
Figure PCTCN2022105340-appb-000080
表21B siRNA缀合物在转基因小鼠中的血清CHO抑制率
Figure PCTCN2022105340-appb-000081
图13A、图13B以及表21A、表21B的结果表明，在给药后不同时间点，缀合物15和缀合物16能够明显降低小鼠血清中的TG和CHO水平。并且在实验期间的22天时间内始终保持较高的抑制效果，并显示出与对应不包括稳定化修饰核苷酸的参比缀合物8相近的血脂水平降低效果。
特别是，3mg/kg剂量的缀合物15和缀合物16均显示出优异的小鼠血脂抑制效果，血清TG的最大抑制率均高于92％；血清CHO的最大抑制率分别为57..5％和54.9％。上述结果表明，本公开的siRNA缀合物能够在长时间内有效降低血脂水平，在制备用于血脂异常相关疾病或症状的治疗和/或预防的药物方面显示出优异的开发前景。
实验例24 siRNA缀合物在小鼠中的毒性效果
按照实验例11的方法，对siRNA缀合物在小鼠中的毒性效果进行了验证，区别仅在于，使用缀合物15、缀合物16和参比缀合物8进行试验，每一缀合物分别用PBS溶解为10mg/ml的溶液(以siRNA缀合物计)。所有小鼠在第 8天取血清并剖检。即，测试了100mg/kg剂量下，缀合物15、缀合物16和参比缀合物8在小鼠中的毒性效果。结果参见表22的记载。
表22 给予siRNA缀合物的小鼠中血生化结果
实验组 参比缀合物8 缀合物15 缀合物16
剂量 100mg/kg 100mg/kg 100mg/kg
ALT 420％ 116％ 118％
AST 126％ - 32％
表22中，％及前面的数字代表小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)或天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的浓度与空白对照组血清中浓度的差值，与空白对照组血清中浓度的百分比。例如，表22中的420％代表以100mg/Kg给予了参比缀合物8的小鼠体内的丙氨酸氨基转移酶的浓度比空白对照组高出420％。
从表22中的结果可知，与空白对照相比，给予不包含稳定化修饰核苷酸的参比缀合物8的小鼠显示出明显的血生化指标变化，ALT的浓度升高了420％，AST的浓度升高了126％。给予本公开的siRNA缀合物15或16的小鼠中，ALT的浓度只分别升高了116％和118％，AST的浓度只升高了32％，显示出显著降低的血生化指标。
病理切片的结果显示，与空白对照相比，给予不包含稳定化修饰核苷酸的参比缀合物8的6只小鼠，有1只出现中度肝细胞炎症反应，具体表现为其肝小叶可见弥漫性少量炎性细胞浸润，肝窦中纤维细胞弥漫性增生，有3只出现轻度肝细胞炎症反应，局部肝小叶中可见炎性细胞小灶状浸润，1只出现局部肝小叶炎性坏死，个别肝细胞点状坏死。而给予本公开的缀合物15的小鼠中，仅有2只小鼠显示出轻度肝细胞炎症反应，表现为少量炎性细胞浸润，没有中度以上的炎症反应和坏死。给予本公开的缀合物16的小鼠中，仅有1只小鼠显示出轻度肝细胞炎症反应，没有中度以上的炎症反应和坏死。与参比缀合物8相比，缀合物15和16表现出显著更低的毒性反应。
上述结果表明，与参比缀合物相比，本公开的siRNA缀合物能够有效降低由于脱靶效应导致的肝毒性反应，因此在制备用于血脂异常相关疾病或症状的治疗和/或预防的药物方面显示出显著更高的安全性，具有优异的开发前景。
实验例25 siRNA缀合物在体外siCHECK系统中的抑制活性
按照实验例12的方法，对siRNA缀合物在体外siCHECK系统中的抑制活性进行了检测，区别仅在于，以缀合物18、缀合物19或参比缀合物9代替实验例12中测试的siRNA缀合物进行测试，并且，所使用的目标序列为以下目标序列12：
目标序列12：
Figure PCTCN2022105340-appb-000082
该目标序列12是所检测的siRNA靶向的人AMGPTL3基因表达的mRNA中的一段核苷酸序列，因此各siRNA缀合物对目标序列12的抑制效果可反映所检测的siRNA缀合物中siRNA的目标基因表达的抑制能力。将目标序列12及其互补序列克隆到psiCHECK TM-2质粒的Xho I/Not I位点。
各siRNA缀合物或参比siRNA NC的目标序列12抑制效果参见图14。图14是共转染包含目标序列12的质粒和待测siRNA缀合物或参比siRNA NC后，体外siCHECK系统中目标序列12相对表达水平的柱状图。进一步地，各siRNA缀合物或参比siRNA NC对目标序列12的表达抑制率总结于表23中。
表23 体外siCHECK系统中目标序列12的表达抑制率
Figure PCTCN2022105340-appb-000083
根据图14和表23的结果可知，本公开提供的siRNA缀合物在体外siCHECK系统中有很高的目标序列抑制活性。在0.01nM的低浓度下，至少有51.56nM的目标序列表达抑制率，最高可达58.76％；在0.1nM的浓度下，目标序列表达抑制率可达87.92-88.84％。同时，与不包含稳定化修饰核苷酸的参比缀合物9相比，具有接近的目标序列抑制活性水平。
实验例26 siRNA缀合物在体外siCHECK系统中的脱靶序列抑制活性
按照实验例2记载的方法，对siRNA缀合物在体外siCHECK系统中的脱靶序列抑制活性进行了测定，区别仅在于，以缀合物18、缀合物19、缀合物20、缀合物21、参比缀合物9或参比缀合物11代替所测试的siRNA缀合物进行测定；并且，所采用的目标序列为目标序列12或如下所示的目标序列13：
Figure PCTCN2022105340-appb-000084
该目标序列13中包含与待测siRNA缀合物中的siRNA反义链部分互补的核苷酸序列，因此各siRNA缀合物对目标序列13的抑制效果可反映脱靶效应的程度。即，抑制效果越高，该siRNA缀合物越可能发生脱靶。另一方面，通过各siRNA缀合物对目标序列12的抑制效果与对目标序列13的抑制效果的比值，可以反应该siRNA缀合物的相对脱靶趋势，该比值越高，siRNA缀合物相对越不易发生脱靶，获得同等水平药效时发生脱靶导致的毒性的可能性就越低。
对于目标序列12，由剂量-效应曲线和对应的函数，确定当Y＝75％时对应的X 75值，计算获得各siRNA缀合物的在靶IC 25值＝10^X 25(nM)。
对于目标序列13，由剂量-效应曲线和对应的函数，确定当Y＝75％时对应的X 75值，计算获得各siRNA缀合物的脱靶IC 25值＝10^X 25(nM)。
并且，计算各siRNA缀合物的脱靶IC 25/在靶IC 25的比值。上述结果总结于表24中：
表24 siRNA缀合物在siCHECK系统中的脱靶序列抑制活性
缀合物编号 在靶IC 25(nM) 脱靶IC 25(nM) 在靶IC 25/脱靶IC 25比值
缀合物18 0.0090 4.5995 511
缀合物19 0.0052 10.9176 2100
缀合物20 0.0155 12.9020 832
缀合物21 0.0044 2.1935 499
参比缀合物9 0.0119 2.0137 169
参比缀合物11 0.5833 16.195 28
由表24的结果可见，与不包含稳定化修饰核苷酸的参比缀合物9、参比缀合物11相比，本公开的包含稳定化修饰核苷酸的各siRNA缀合物不仅对在靶目标序列12的抑制活性相当或显著更高，还均显示出显著更低的脱靶效应，脱靶IC 25/在靶IC 25的比值至少为499，甚至高达2100，表明在获得相同或相近的期望药效时，本公开的siRNA缀合物的脱靶效应比参比缀合物更低，从而在制备用于更有效、且由脱靶效应导致的毒性更低的用于抑制ANGPTL3的药物的应用中显示出优异的潜力。
实验例27 siRNA缀合物在小鼠体内(in vivo)对ANGPTL3 mRNA的降低效果
选取血清TG含量>2mmol/L的C57BL/6小鼠(6-8周龄，购自斯贝福公司)进行随机分组，每组5只，均为雌性。分别向每组小鼠给予缀合物18、缀合物19、参比缀合物9以及PBS空白对照。所有动物根据体重计算药量，采用皮下注射方式单次给药，各siRNA缀合物的给药剂量(以siRNA的量计)为3mg/kg小鼠体重，给药体积为5ml/kg。各siRNA缀合物分别以PBS水溶液提供，根据给药剂量和给药体积，换算出缀合物应配制的浓度。向另外1组小鼠中的每一只给予1×PBS，给药体积为5ml/kg，作为空白对照组。
以给药时间点记为第1天，在第15天处死动物，分别收集每只小鼠的肝脏组织，用RNA later(Sigma Aldrich公司)保存；向每份肝组织中加入1mL Trizol(Sigma公司)，在Tissuelyset II型全自动组织匀浆仪中破碎3次，每次30s，获得肝组织匀浆，向其中加入0.2mL氯仿，混匀静置10min。在4℃下以12000rpm离心10min，取0.4mL上清。向上清中加入0.5mL异丙醇，室温下静置10min。4℃下以12000rpm离心10min，弃去上清。向沉淀中加入1mL75％乙醇洗涤沉淀，4℃下以12000rpm离心5min，弃去上清。沉淀中加入70μL DEPC化水，得到提取的总RNA溶液。以NANO DROP 2000(Thermo公司)按照说明书记载的方法测定RNA浓度。
对于每一小鼠的肝脏组织总RNA，分别取包含1μg总RNA的总RNA水溶液，溶液体积为1000μL/RNA浓度(ng/μL)，使用反转录试剂盒Reverse Transcription System(购自TSINGKE公司)，按试剂盒说明书中反转录操作步骤配制为反转录反应体系20μL，对总RNA进行反转录。反转录的条件为：对于每一反转录反应体系，将反转录反应体系置于42℃孵育30min，然后于95℃孵育5min，最后于4℃孵育5min，反应结束后，向反转录反应体系中加入DEPC水80μL，得到含cDNA的溶液。
对于每一反转录反应体系，分别取上述含cDNA的溶液5μL做模板，使用2×Ultra SYBR Mixture(with ROX)试剂盒(购自北京康为世纪公司)提供的试剂配制qPCR反应体系20μL，其中，用于扩增目标基因mANGPTL3和内参基因mGAPDH的PCR引物序列如表25所示，每条引物的终浓度为0.25μM。将各qPCR反应体系置于ABI StepOnePlus Real-Time PCR仪上，使用三步法进行扩增，扩增程序为95℃预变性10min，然后95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重复上述变性、退火、延伸的过程共40次后，得到含有扩增了目标基因mANGPTL3和内参基因mGAPDH产物W。产物W随即依次经过95℃1min，55℃30s，95℃30s的孵育，实时荧光定量PCR仪分别收集产物W中目标基因mANGPTL3和内参基因mGAPDH的溶解曲线，得到目标基因mANGPTL3和内参基因mGAPDH的Ct值。
表25 引物序列信息
Figure PCTCN2022105340-appb-000085
采用比较Ct(ΔΔCt)法，对各测试组中目标基因mANGPTL3的相对表达水平和抑制率进行相对定量计算，计算方法如下：
ΔCt(测试组)＝Ct(测试组目标基因)–Ct(测试组内参基因)
ΔCt(对照组)＝Ct(对照组目标基因)–Ct(对照组内参基因)
ΔΔCt(测试组)＝ΔCt(测试组)-ΔCt(对照组平均)
ΔΔCt(对照组)＝ΔCt(对照组)-ΔCt(对照组平均)
其中，ΔCt(对照组平均)是对照组5只小鼠各自的ΔCt(对照组)的算术平均值。从而，测试组和对照组的每一小鼠均对应一个ΔΔCt值。
以对照组为基准，对测试组mANGPTL3 mRNA的表达水平进行归一化， 定义空白对照组mANGPTL3 mRNA表达水平为100％，
测试组mANGPTL3 mRNA相对表达水平＝2 -ΔΔCt(测试组)×100％
测试组mANGPTL3 mRNA抑制率＝(1-测试组mANGPTL3 mRNA相对表达水平)×100％
结果示于图15中。图15为分别给予了3mg/kg(以siRNA计)缀合物18、缀合物19或参比缀合物9以及PBS后，C57BL/6小鼠肝内mANGPTL3 mRNA相对表达水平的散点图。进一步地，各siRNA缀合物对mANGPTL3 mRNA的抑制率总结于表26中。
表26 小鼠体内mANGPTL3 mRNA的抑制
Figure PCTCN2022105340-appb-000086
由图15和表26的结果可知，本公开的siRNA缀合物在小鼠体内显示出优异的mANGPTL3 mRNA抑制效果，在3mg/kg的剂量下，mANGPTL3 mRNA抑制率至少为70％，甚至可高达95％，并且显示出与对应不包括稳定化修饰核苷酸的参比缀合物9相当甚至更高的mANGPTL3 mRNA抑制活性。
实验例28 siRNA缀合物在小鼠中的毒性效果
按照实验例11的方法，对siRNA缀合物在小鼠中的毒性效果进行了验证，区别仅在于，使用缀合物18和参比缀合物9进行试验，每一缀合物分别用PBS溶解为10mg/ml的溶液(以siRNA缀合物计)。即，测试了100mg/kg剂量下，缀合物18和参比缀合物9在小鼠中的毒性效果。结果参见表27的记载。
表27 给予siRNA缀合物的小鼠中血生化结果
Figure PCTCN2022105340-appb-000087
表27中，％及前面的数字代表小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)或天 门冬氨酸氨基转移酶(AST)的浓度与空白对照组血清中浓度的差值，与空白对照组血清中浓度的百分比。
由表27结果可知，与空白对照相比，给予不包含稳定化修饰核苷酸的参比缀合物9的雄性小鼠和雌性小鼠血清中的ALT浓度分别增加了630％和840％，AST的浓度分别增加了114％和145％。而给予了本公开的缀合物18的雄性小鼠和雌性小鼠血清中ALT的浓度仅分别增加了25.6％和101％，AST的浓度仅分别增加了10.8％和37.0％。相较于参比缀合物9，表现出显著降低的血生化指标变化。
病理切片结果显示，给予参比缀合物9的小鼠中，4只小鼠出现了重度的肝细胞变性，具体表现为组织中可见较大量的肝细胞气球样变性，细胞肿胀，核居中，胞质空泡化，2只出现了极重度的肝细胞变性，具体表现为组织中可见广泛的肝细胞气球样变性，细胞肿胀，核居中，胞质空泡化。给予本公开的缀合物18的小鼠中，3只小鼠出现了轻度的肝细胞变性，具体表现为，组织小叶结构完整，肝细胞排列紧密，少量肝细胞胞质疏松，未见重度或极重度的肝细胞变性。
上述结果表明，与参比缀合物相比，本公开的siRNA缀合物能够有效降低由于脱靶效应导致的肝毒性反应，因此在制备用于血脂异常相关疾病或症状的治疗和/或预防的药物方面显示出显著更高的安全性，具有优异的开发前景。
以上详细描述了本公开的一些实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述一些实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims (62)

  1. 一种双链寡核苷酸，所述双链寡核苷酸包含正义链和反义链，所述正义链包含核苷酸序列I，所述反义链包含核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II均由19个核苷酸组成，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II中的每一个核苷酸为修饰或未修饰的核苷酸，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，所述核苷酸序列II至少部分地与第一段核苷酸序列反向互补，所述第一段核苷酸序列为目标基因表达的mRNA中的一段长度为19个核苷酸的核苷酸序列；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3-6个核苷酸中的至少1个为稳定化修饰核苷酸，并且所述核苷酸序列II中第3-9个核苷酸之外的核苷酸均不是稳定化修饰核苷酸，所述稳定化修饰核苷酸指核苷酸的核糖2'位羟基被稳定化修饰基团取代的核苷酸，与相应位置的核苷酸为未修饰的核苷酸的双链寡核苷酸相比，包含所述稳定化修饰核苷酸的双链寡核苷酸的热稳定性增加，并且所述稳定化修饰基团的空间位阻大于2'-O-甲基。
  2. 如权利要求1所述的双链寡核苷酸，其中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第3个或第5个核苷酸为所述稳定化修饰核苷酸。
  3. 如权利要求1或2所述的双链寡核苷酸，其中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第3-9个核苷酸中不超过2个核苷酸为所述稳定化修饰核苷酸。
  4. 如权利要求3所述的双链寡核苷酸，其中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第3个和/或第5个核苷酸为所述稳定化修饰核苷酸；可选地，第4个、第7个或第9个核苷酸中的一个也为所述稳定化修饰核苷酸。
  5. 如权利要求3所述的双链寡核苷酸，其中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3个和第9个核苷酸为所述稳定化修饰核苷酸；或者
    按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第5个和第7个核苷酸为所述稳定化修饰核苷酸；或者
    按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第5个和第9个核苷酸为所述稳定化修饰核苷酸。
  6. 如权利要求1-5中任意一项所述的双链寡核苷酸，其中，所述双链寡核苷酸的热稳定性增加是指所述双链寡核苷酸的热解离温度Tm升高。
  7. 如权利要求6所述的双链寡核苷酸，其中，所述双链寡核苷酸的热稳定 性增加是指所述双链寡核苷酸的热解离温度Tm升高至少0.05℃。
  8. 如权利要求6所述的双链寡核苷酸，其中，所述双链寡核苷酸的热稳定性增加是指所述双链寡核苷酸的热解离温度Tm升高0.1-6℃。
  9. 如权利要求6所述的双链寡核苷酸，其中，所述双链寡核苷酸的热稳定性增加是指所述双链寡核苷酸的热解离温度Tm升高0.5-4℃。
  10. 如权利要求1-9中任意一项所述的双链寡核苷酸，其中，每个所述稳定化修饰基团独立地具有-X-R所示的结构，其中，X为O、NR'、S或SiR' 2；R是C 2-C 6烷基、取代的C 2-C 6烷基、C 6-C 8芳基、取代的C 6-C 8芳基中的一种，每个R'独立地是H、C 1-C 6烷基、取代的C 1-C 6烷基、C 6-C 8芳基、取代的C 6-C 8芳基中的一种，所述取代的C 2-C 6烷基或取代的C 6-C 8芳基是指C 2-C 6烷基或C 6-C 8芳基上的一个或多个氢原子被取代基取代而形成的基团，所述取代基各自独立地选自以下取代基中的一种或多种：C 1-C 3烷基、C 6-C 8芳基、C 1-C 3烷氧基、卤素、氧亚基和硫亚基。
  11. 如权利要求10所述的双链寡核苷酸，其中，每个所述稳定化修饰基团独立地选自2'-O-甲氧基乙基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-O-2-N-甲基氨基-2-氧亚基乙基、2'-O-2-N,N-二甲基氨基乙基、2'-O-3-氨基丙基和2'-O-2,4-二硝基苯基中的一种。
  12. 如权利要求11所述的双链寡核苷酸，其中，每个所述稳定化修饰基团为2'-O-甲氧基乙基。
  13. 如权利要求1-12中任意一项所述的双链寡核苷酸，其中，所述核苷酸序列II与所述第一段核苷酸序列基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补。
  14. 如权利要求13所述的双链寡核苷酸，其中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第2-19位的核苷酸与所述第一段核苷酸序列第1-18位的核苷酸完全反向互补。
  15. 如权利要求1-14中任意一项所述的双链寡核苷酸，其中，所述核苷酸序列II与所述核苷酸序列I基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补。
  16. 如权利要求15所述的双链寡核苷酸，其中，所述核苷酸序列II与所述核苷酸序列I完全反向互补，或者按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸 序列II中的第2个核苷酸与按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2个核苷酸之间存在碱基错配。
  17. 如权利要求1-16中任意一项所述的双链寡核苷酸，其中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16个核苷酸为2'-氟代修饰的核苷酸，或者，所述核苷酸序列II的第2、14、16个核苷酸为2'-氟代修饰的核苷酸，且所述核苷酸序列II的第6个核苷酸为稳定化修饰核苷酸。
  18. 如权利要求17所述的双链寡核苷酸，其中，所述核苷酸序列II中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16个核苷酸为2'-氟代修饰的核苷酸，所述核苷酸序列II中的其它核苷酸各自独立地为非氟代修饰的核苷酸的一种。
  19. 如权利要求1-18中任意一项所述的双链寡核苷酸，其中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的第7-9个核苷酸为2'-氟代修饰的核苷酸。
  20. 如权利要求19所述的双链寡核苷酸，其中，所述核苷酸序列I中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的第7-9个核苷酸为2'-氟代修饰的核苷酸，所述核苷酸序列I中的其它核苷酸各自独立地为非氟代修饰的核苷酸的一种。
  21. 如权利要求1-20中任意一项所述的双链寡核苷酸，其中，所述正义链还含有核苷酸序列III，所述反义链还含有核苷酸序列IV，所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV的每个核苷酸独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种且不是所述稳定化修饰核苷酸，所述核苷酸序列III的长度为1个、2个、3个或4个核苷酸，所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III长度相等，并且所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III实质上反向互补或完全反向互补，所述核苷酸序列III连接在所述核苷酸序列I的5'末端，所述核苷酸序列IV连接在所述核苷酸序列II的3'末端，并且所述核苷酸序列IV与第二段核苷酸序列实质上反向互补或完全反向互补，该第二段核苷酸序列是指和目标基因表达的mRNA中与第一段核苷酸序列相邻、且长度与所述核苷酸序列IV相同的核苷酸序列。
  22. 如权利要求1-21中任意一项所述的双链寡核苷酸，其中，所述双链寡核苷酸还含有核苷酸序列V，所述核苷酸序列V的每个核苷酸独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种且不是所述稳定化修饰核苷酸，所述核苷酸序列V的长度为1至3个核苷酸，连接在所述反义链的3'末端，从而构成所述反义链的3'突出端。
  23. 如权利要求22所述的双链寡核苷酸，其中，所述核苷酸序列V的长 度为2个核苷酸，并且按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列V为连续的2个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸、连续的2个尿嘧啶核糖核苷酸、或者与第三段核苷酸序列完全反向互补，所述第三段序列是指目标基因表达的mRNA中与第一段核苷酸序列或第二段核苷酸序列相邻、并且长度与所述核苷酸序列V相等的核苷酸序列。
  24. 如权利要求1-23中任意一项所述的双链寡核苷酸，其中，每一个非氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物中的一种。
  25. 如权利要求1-24中任意一项所述的双链寡核苷酸，其中，每一个非氟代修饰的核苷酸均为甲氧基修饰的核苷酸，所述甲氧基修饰的核苷酸指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
  26. 如权利要求1-25中任意一项所述的双链寡核苷酸，其中，所述正义链和所述反义链中至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基中的至少1个为具有修饰基团的磷酸酯基，所述具有修饰基团的磷酸酯基存在于由以下位置所组成的组中的至少一处：
    所述正义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
    所述正义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
    所述正义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
    所述正义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
    所述反义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
    所述反义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
    所述反义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；以及
    所述反义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间。
  27. 如权利要求1-26中任意一项所述的双链寡核苷酸，其中，所述反义链的5'末端核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸。
  28. 如权利要求1-27中任意一项所述的双链寡核苷酸，其中，所述双链寡核苷酸是saRNA或siRNA。
  29. 如权利要求1-28中任意一项所述的双链寡核苷酸，其中，所述目标基因表达的mRNA选自以下基因转录的mRNA中的一种：ACE2、AGT、ANGPTL3、ApoA、ApoB、ApoC、AR、ASK1、C3、C5、Col1A1、CTGF、Ebola、FOXO1、FTO、FVII、FXI、FXII、GCGR、HBV、HCV、HSD、p53、PCSK9、PNP、PLG、PKK、KNG、RAGE、RPTOR、SARS-CoV-2、SCD1、SCNN1A、SOD1、STAT3、TIMP-1、TMPRSS6、XO。
  30. 如权利要求1-29中任意一项所述的双链寡核苷酸，其中，所述双链寡 核苷酸是siRNA，所述目标基因表达的mRNA选自乙型肝炎病毒基因(HBV)表达的mRNA、血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)基因表达的mRNA或者载脂蛋白C3(ApoC3)基因表达的mRNA。
  31. 如权利要求30所述的双链寡核苷酸，其中，所述双链寡核苷酸为以下siRNA中的一种：siRNAa1、siRNAa2、siRNAa3、siRNAa4、siRNAa5、siRNAa6、siRNAa7、siRNAa8、siRNAa9、siRNAa10、siRNAb11、siRNAb12、siRNAb13、siRNAb14、siRNAb15、siRNAb16、siRNAc17、siRNAc18、siRNAc19、siRNAc20、siRNAc21、siRNAa22、siRNAa23。
  32. 一种双链寡核苷酸，所述双链寡核苷酸包含正义链和反义链，所述正义链和反义链的每一个核苷酸均为修饰的核苷酸，其中，所述正义链包含核苷酸序列I，所述反义链包含核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II均由19个核苷酸组成，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，所述核苷酸序列II至少部分地与第一段核苷酸序列反向互补，所述第一段核苷酸序列为目标基因表达的mRNA中的一段长度为19个核苷酸的核苷酸序列；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的第7-9个核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述核苷酸序列I其他位置的每个核苷酸独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16个核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述核苷酸序列II其他位置的每个核苷酸独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种，并且
    按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3个和/或第5个核苷酸是2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸。
  33. 如权利要求32所述的双链寡核苷酸，其中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第4个、第7个和第9个核苷酸中的一个是2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸，所述核苷酸序列II中每个其他所述非氟代修饰取代基的空间位阻不大于2'-O-甲基。
  34. 如权利要求32或33所述的双链寡核苷酸，其中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3个和/或第5个核苷酸具有核糖2'-O-甲氧基乙基修饰；
    按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第3个和第9个核苷酸具有核糖2'-O-甲氧基乙基修饰；
    按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第5个和第7个核苷酸具有核糖2'-O-甲氧基乙基修饰；或者
    按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第5个和第9个核苷酸具有核糖2'-O-甲氧基乙基修饰。
  35. 如权利要求32-34中任意一项所述的双链寡核苷酸，其中，所述核苷酸序列II与所述第一段核苷酸序列基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补。
  36. 如权利要求35所述的双链寡核苷酸，其中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的第2-19位的核苷酸与所述第一段核苷酸序列第1-18位的核苷酸完全反向互补。
  37. 如权利要求32-36中任意一项所述的双链寡核苷酸，其中，所述核苷酸序列II与所述核苷酸序列I基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补。
  38. 如权利要求37所述的双链寡核苷酸，其中，所述核苷酸序列II与所述核苷酸序列I完全反向互补，或者按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II中的第2个核苷酸与按照3'末端到5'末端的方向，所述核苷酸序列I中的第2个核苷酸之间存在碱基错配。
  39. 如权利要求32-38中任意一项所述的双链寡核苷酸，其中，所述正义链还含有核苷酸序列III，所述反义链还含有核苷酸序列IV，所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV的每个核苷酸独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种且不是所述稳定化修饰核苷酸，所述核苷酸序列III的长度为1个、2个、3个或4个核苷酸，所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III长度相等，并且所述核苷酸序列IV和所述核苷酸序列III实质上反向互补或完全反向互补，所述核苷酸序列III连接在所述核苷酸序列I的5'末端，所述核苷酸序列IV连接在所述核苷酸序列II的3'末端，并且所述核苷酸序列IV与第二段核苷酸序列实质上反向互补或完全反向互补，该第二段核苷酸序列是指和目标基因表达的mRNA中与第一段核苷酸序列相邻、且长度与所述核苷酸序列IV相同的核苷酸序列。
  40. 如权利要求32-39中任意一项所述的双链寡核苷酸，其中，所述双链寡核苷酸还含有核苷酸序列V，所述核苷酸序列V的每个核苷酸独立地为非氟代修饰的核苷酸中的一种且不是所述稳定化修饰核苷酸，所述核苷酸序列V的长度为1至3个核苷酸，连接在所述反义链的3'末端，从而构成所述反义链的3'突出端。
  41. 如权利要求40所述的双链寡核苷酸，其中，所述核苷酸序列V的长度为2个核苷酸，并且按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列V为连续的2个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸、连续的2个尿嘧啶核糖核苷酸、或者与第三段核苷酸序列完全反向互补，所述第三段序列是指目标基因表达的mRNA中与第一段核苷酸序列或第二段核苷酸序列相邻、并且长度与所述核苷酸序列V 相等的核苷酸序列。
  42. 如权利要求32-41中任意一项所述的双链寡核苷酸，其中，每一个非氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物中的一种。
  43. 如权利要求32-42中任意一项所述的双链寡核苷酸，其中，每一个所述非氟代修饰的核苷酸均为甲氧基修饰的核苷酸，所述甲氧基修饰的核苷酸指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
  44. 如权利要求32-43中任意一项所述的双链寡核苷酸，其中，所述正义链和所述反义链中至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基中的至少1个为具有修饰基团的磷酸酯基，所述具有修饰基团的磷酸酯基存在于由以下位置所组成的组中的至少一处：
    所述正义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
    所述正义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
    所述正义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
    所述正义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
    所述反义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
    所述反义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
    所述反义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；以及
    所述反义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间。
  45. 如权利要求32-44中任意一项所述的双链寡核苷酸，其中，所述反义链的5'末端核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸。
  46. 如权利要求32-45中任意一项所述的双链寡核苷酸，其中，所述双链寡核苷酸是saRNA或siRNA。
  47. 如权利要求32-46中任意一项所述的双链寡核苷酸，其中，所述目标基因表达的mRNA选自以下基因转录的mRNA中的一种：ACE2、AGT、ANGPTL3、ApoA、ApoB、ApoC、AR、ASK1、C3、C5、Col1A1、CTGF、Ebola、FOXO1、FTO、FVII、FXI、FXII、GCGR、HBV、HCV、HSD、p53、PCSK9、PNP、PLG、PKK、KNG、RAGE、RPTOR、SARS-CoV-2、SCD1、SCNN1A、SOD1、STAT3、TIMP-1、TMPRSS6、XO。
  48. 如权利要求32-47中任意一项所述的双链寡核苷酸，其中，所述双链寡核苷酸是siRNA，所述目标基因表达的mRNA选自乙型肝炎病毒基因(HBV)表达的mRNA、血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)基因表达的mRNA或者载脂蛋白C3(ApoC3)基因表达的mRNA。
  49. 一种药物组合物，该药物组合物含有权利要求1-48中任意一项所述的双链寡核苷酸以及药学上可接受的载体。
  50. 一种寡核苷酸缀合物，所述寡核苷酸缀合物含有权利要求1-48中任意一项所述的双链寡核苷酸以及缀合连接至该双链寡核苷酸的缀合基团，所述缀合基团包含接头和药学上可接受的靶向基团和/或递送辅助基团，并且，所述双链寡核苷酸、所述接头和所述靶向基团或者所述递送辅助基团依次共价或非共价连接，每个所述靶向基团选自能够和细胞表面受体结合的配体，每个递送辅助基团选自能够增加所述寡核苷酸缀合物在递送目标器官或组织中的生物相容性的基团。
  51. 权利要求1-48中任意一项所述的双链寡核苷酸、和/或权利要求49所述的药物组合物和/或权利要求50所述的寡核苷酸缀合物在制备用于治疗和/或预防与目标基因表达的mRNA水平相关的疾病或症状的药物中的用途。
  52. 如权利要求51所述的用途，其中，所述目标基因表达的mRNA选自以下基因转录的mRNA中的一种：ACE2、AGT、ANGPTL3、ApoA、ApoB、ApoC、AR、ASK1、C3、C5、Col1A1、CTGF、Ebola、FOXO1、FTO、FVII、FXI、FXII、GCGR、HBV、HCV、HSD、p53、PCSK9、PNP、PLG、PKK、KNG、RAGE、RPTOR、SARS-CoV-2、SCD1、SCNN1A、SOD1、STAT3、TIMP-1、TMPRSS6、XO。
  53. 如权利要求51或52所述的用途，其中，所述目标基因表达的mRNA选自乙型肝炎病毒基因(HBV)表达的mRNA、血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)基因表达的mRNA或者载脂蛋白C3(ApoC3)基因表达的mRNA。
  54. 如权利要求51-53中任意一项所述的用途，其中，所述与目标基因表达的mRNA水平相关的疾病或症状是乙型肝炎或血脂异常。
  55. 一种治疗和/或预防与目标基因表达的mRNA水平相关的疾病或症状的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予权利要求1-48中任意一项所述的双链寡核苷酸、和/或权利要求49所述的药物组合物和/或权利要求50所述的寡核苷酸缀合物。
  56. 如权利要求55所述的方法，其中，所述目标基因表达的mRNA选自以下基因转录的mRNA中的一种：ACE2、AGT、ANGPTL3、ApoA、ApoB、ApoC、AR、ASK1、C3、C5、Col1A1、CTGF、Ebola、FOXO1、FTO、FVII、FXI、FXII、GCGR、HBV、HCV、HSD、p53、PCSK9、PNP、PLG、PKK、KNG、RAGE、RPTOR、SARS-CoV-2、SCD1、SCNN1A、SOD1、STAT3、TIMP-1、 TMPRSS6、XO。
  57. 如权利要求55或56所述的方法，其中，所述目标基因表达的mRNA选自乙型肝炎病毒基因(HBV)表达的mRNA、血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)基因表达的mRNA或者载脂蛋白C3(ApoC3)基因表达的mRNA。
  58. 如权利要求55-57中任意一项所述的方法，其中，所述与目标基因表达的mRNA水平相关的疾病或症状是乙型肝炎或血脂异常。
  59. 一种调节细胞中目标基因表达水平的方法，所述方法包括将有效量的权利要求1-48中任意一项所述的双链寡核苷酸、和/或权利要求49所述的药物组合物和/或权利要求50所述的寡核苷酸缀合物与所述细胞接触。
  60. 如权利要求59所述的方法，其中，所述目标基因表达的mRNA选自以下基因转录的mRNA中的一种：ACE2、AGT、ANGPTL3、ApoA、ApoB、ApoC、AR、ASK1、C3、C5、Col1A1、CTGF、Ebola、FOXO1、FTO、FVII、FXI、FXII、GCGR、HBV、HCV、HSD、p53、PCSK9、PNP、PLG、PKK、KNG、RAGE、RPTOR、SARS-CoV-2、SCD1、SCNN1A、SOD1、STAT3、TIMP-1、TMPRSS6、XO。
  61. 如权利要求59或60所述的方法，其中，所述调节是指抑制细胞中目标基因表达，所述目标基因表达的mRNA选自乙型肝炎病毒基因(HBV)表达的mRNA、血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)基因表达的mRNA或者载脂蛋白C3(ApoC3)基因表达的mRNA。
  62. 一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1-48中任意一项所述的双链寡核苷酸、和/或权利要求49所述的药物组合物和/或权利要求50所述的寡核苷酸缀合物。
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