CN114686482A

CN114686482A - 一种核酸、含有该核酸的药物组合物与siRNA缀合物及制备方法和用途

Info

Publication number: CN114686482A
Application number: CN202111631597.6A
Authority: CN
Inventors: 梁子才; 张鸿雁; 高山; 邓静娜
Original assignee: Suzhou Ruibo Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Ruibo Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-12-29
Filing date: 2021-12-28
Publication date: 2022-07-01

Abstract

本公开提供了一种抑制嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)基因表达的siRNA，含有该siRNA的药物组合物和siRNA缀合物。所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，该siRNA含有正义链和反义链，所述正义链含有核苷酸序列I，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，所述反义链含有核苷酸序列II，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异。本公开提供的siRNA、药物组合物和siRNA缀合物，可以有效治疗和/或预防尿酸代谢异常或者尿酸代谢异常引发的疾病或生理状况。

Description

一种核酸、含有该核酸的药物组合物与siRNA缀合物及制备方法和用途

技术领域

本公开涉及一种能够抑制嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)基因表达的核酸和含有该核酸的药物组合物与siRNA缀合物。本公开还涉及该核酸、药物组合物与siRNA缀合物的制备方法和用途。

背景技术

痛风是一种与嘌呤代谢紊乱和/或尿酸排泄减少所致的高尿酸血症直接相关的疾病。痛风自古就是一些国家的常见病，第二次世界大战后，随着各国经济的发展，其患病率在全球呈逐年升高的趋势，且有年轻化的趋势。目前在中国痛风患者就有1200万。

嘌呤核苷磷酸化酶(Purine Nucleotide Phosphorylase，PNP)是治疗痛风的关键靶点之一。通过抑制PNP表达，能够有效抑制次黄嘌呤、鸟嘌呤的产生，进而减少尿酸产生，从而达到缓解痛风疾病进程并逆转病情的目的。通过抑制PNP基因的表达，能够在细胞水平上对尿酸代谢异常引发的疾病、特别是高尿酸血症以及痛风进行预防和治疗。小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)可基于RNA干扰(RNA interference，RNAi)这一机制，以序列特异性的方式抑制或阻断任何感兴趣的目的基因的表达，从而达到治疗疾病的目的。

开发抑制PNP基因表达和治疗尿酸代谢异常引发的疾病的siRNA药物的关键之一在于寻找合适的siRNA及其修饰以及有效的递送系统。

发明内容

本公开的发明人意外发现，具有本公开提供的如下siRNA及其修饰序列能够特异性地抑制PNP基因的表达，含有该siRNA的组合物或siRNA缀合物能够特异性地靶向肝脏，从而可以抑制肝脏中PNP基因的表达，实现尿酸代谢异常引发的疾病的治疗或预防，从而完成了本公开。

在一些实施方式中，本公开提供了第一种能够抑制PNP基因表达的siRNA，该siRNA含有正义链和反义链，所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中，所述正义链含有一段核苷酸序列I，所述反义链含有一段核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，其中，所述核苷酸序列I与SEQID NO:1所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQID NO:2所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：

5'-CUAAAUCACCAGAGACCAZ₁-3'(SEQ ID NO:1)；

5'-Z₂UGGUCUCUGGUGAUUUAG-3'(SEQ ID NO:2)，

其中，Z₁为A，Z₂为U，所述核苷酸序列I中包含位置对应于Z₁的核苷酸Z₃，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Z₂的核苷酸Z₄，所述Z₄是所述反义链5'末端的第一个核苷酸。

在一些实施方式中，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有本公开的siRNA和药学上可接受的载体。

在一些实施方式中，本公开提供了一种siRNA缀合物，所述siRNA缀合物含有本公开提供的siRNA以及缀合连接至该siRNA的缀合基团。

在一些实施方式中，本公开提供了本公开的siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物在制备用于治疗和/或预防由尿酸代谢异常或者尿酸代谢异常引发的疾病或生理状况的药物中的用途。

在一些实施方式中，本公开提供了一种治疗和/或预防尿酸代谢异常或者尿酸代谢异常引发的疾病或生理状况的方法，所述方法包括将有效量的本公开的siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物给予有需要的受试者。

在一些实施方式中，本公开提供了一种抑制肝细胞中PNP基因表达的方法，该方法包括将有效量的本公开的siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物与所述肝细胞接触。

在一些实施方式中，本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有本公开的siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物。

有益效果

本公开提供的siRNA、药物组合物和siRNA缀合物具有良好的稳定性，较高的PNPmRNA抑制活性，较低的脱靶效应，和/或能显著治疗或缓解痛风症状。

本公开提供的siRNA、药物组合物或siRNA缀合物在体外细胞实验中显示出优异的靶mRNA抑制活性。

例如，本公开提供的siRNA在体外psiCHECH系统中显示出较高的目标序列抑制活性，特别是在0.1nM的siRNA浓度下，本公开的siRNA具有高达92.38％的目标序列抑制率。

又例如，本公开提供的siRNA缀合物在SMMC-7721细胞中显示出较高的PNP mRNA抑制率，IC₅₀值为0.692nM。本公开提供的siRNA缀合物在50nM浓度下在SMMC-7721细胞中显示出较高的PNP mRNA抑制率，达到84.89％，本公开提供的siRNA缀合物在Huh7细胞中显示出较高的PNP mRNA抑制率，达到73.82％。本公开提供的siRNA缀合物在猴原代肝细胞中显示出较高的PNP mRNA抑制率，在50nM浓度下达到76.79％。

此外，试验结果表明，本公开提供的siRNA、药物组合物或siRNA缀合物可在体内具有更高的稳定性并且未显示出明显脱靶效应。

综上所述，本公开提供的siRNA、药物组合物以及siRNA缀合物能够抑制PNP基因的表达，有效治疗和/或预防尿酸代谢异常或者尿酸代谢异常引发的疾病或生理状况，尤其是高尿酸血症和/或通风症状，具有良好的应用前景。

本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

图1显示了转染了不同浓度的缀合物1后，体外SMMC-7721细胞中的PNP mRNA相对表达水平拟合的剂量-效应曲线和由此计算得到的IC₅₀值。

图2是转染了不同浓度缀合物1或对比缀合物NC1后，猴原代肝细胞中PNP mRNA相对表达水平的柱状图。

具体实施方式

以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

在本公开中，PNP mRNA是指具有Genbank注册号为NM_000270.3所示序列的mRNA。进一步地，若无其它说明，本公开中所使用的术语“靶基因”是指转录上述PNP mRNA的基因，术语“靶mRNA”是指上述PNP mRNA。

定义

在上文及下文中，如无特别说明，大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接；P1表示该P1右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸，大写字母P表示该字母P右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸。

在上文及下文中，所述“氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代形成的核苷酸，“非氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物。“核苷酸类似物”指能够在核酸中代替核苷酸，但结构不同于腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的基团。如异核苷酸、桥联的核苷酸(bridged nucleic acid，简称BNA)或无环核苷酸。所述“甲氧基修饰的核苷酸”指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。

在本文的上下文中，表述“互补”和“反向互补”可互相替代使用，并具有本领域技术人员周知的含义，即，在双链核酸分子中，一条链的碱基各自与另一条链上的碱基以互补的方式相配对。在DNA中，嘌呤碱基腺嘌呤(A)始终与嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)(或者在RNA中为尿嘧啶(U))相配对；嘌呤碱基鸟嘌呤(C)始终与嘧啶碱基胞嘧啶(G)相配对。每个碱基对都包括一个嘌呤和一个嘧啶。当一条链上的腺嘌呤始终与另一条链上的胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配对，以及鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对时，两条链被认为是彼此相互补的，以及从其互补链的序列中可以推断出该链的序列。与此相应地，“错配”在本领域中意指在双链核酸中，对应位置上的碱基并未以互补的形式配对存在。

在上文及下文中，如无特别说明，“基本上反向互补”是指所涉及的两段核苷酸序列之间存在不多于3个的碱基错配；“实质上反向互补”是指两段核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；“完全反向互补”是指两段核苷酸序列之间不存在碱基错配。

在上文及下文中，一个核苷酸序列与另外一个核苷酸序列存在“核苷酸差异”，是指前者与后者相比，相同位置的核苷酸的碱基种类发生了改变，例如，在后者中一个核苷酸碱基为A时，在前者的相同位置处的对应核苷酸碱基为U、C、G或者T的情况下，认定为两个核苷酸序列之间在该位置处存在核苷酸差异。在一些实施方式中，以无碱基核苷酸或其等同物代替原位置的核苷酸时，也可认为在该位置处产生了核苷酸差异。

在上文及下文中，特别是在描述本公开的siRNA、药物组合物或siRNA缀合物的制备方法时，除非特别说明，所述核苷单体(nucleoside monomer)指，根据欲制备的siRNA或siRNA缀合物中核苷酸的种类和顺序，亚磷酰胺固相合成中使用的修饰或未修饰的核苷亚磷酰胺单体(unmodified or modified RNA phosphoramidites，有时RNAphosphoramidites也称为Nucleoside phosphoramidites)。亚磷酰胺固相合成为本领域技术人员所公知的RNA合成中所用的方法。本公开所用的核苷单体均可商购得到。

在本公开的上下文中，除非另有说明，“缀合”是指两个或多个各自具有特定功能的化学部分之间以共价连接的方式彼此连接；相应地，“缀合物”是指该各个化学部分之间通过共价连接而形成的化合物。进一步地，“siRNA缀合物”表示一个或多个具有特定功能的化学部分共价连接至siRNA上而形成的化合物。siRNA缀合物应根据上下文，理解为多个siRNA缀合物的总称或者某个化学式所示的siRNA缀合物。在本公开的上下文中，“缀合分子”应当理解为可通过反应缀合至siRNA，最终形成本公开的siRNA缀合物的特定化合物。

在上文或下文中，取代的基团，如取代的烷基、取代的烷氧基、取代的氨基、取代的脂族基团、取代的杂脂族基团、取代的酰基、取代的芳基或取代的杂芳基。其中，如无其他说明，“取代的”基团是指该基团中的氢原子被一个或多个取代基所替代而形成的基团。例如，“取代的烷氧基”是指烷氧基中的一个或多个氢原子被取代基所替代而形成的基团。本领域技术人员能够理解，可用于本公开应用的化合物中可以包含各种取代基，只要是该取代基的引入不会影响本公开的功能，能够实现本公开的目的，就可用于本公开。在一些实施方式中，所述取代基选自于由以下基团所组成的组：C₁-C₁₀烷基、C₆-C₁₀芳基、C₅-C₁₀杂芳基、C₁-C₁₀卤代烷基、-OC₁-C₁₀烷基、-OC₁-C₁₀烷基苯基、-C₁-C₁₀烷基-OH、-OC₁-C₁₀卤代烷基、-SC₁-C₁₀烷基、-SC₁-C₁₀烷基苯基、-C₁-C₁₀烷基-SH、-SC₁-C₁₀卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH₂、-C₁-C₁₀烷基-NH₂、-N(C₁-C₁₀烷基)(C₁-C₁₀烷基)、-NH(C₁-C₁₀烷基)、-N(C₁-C₁₀烷基)(C₁-C₁₀烷基苯基)、-NH(C₁-C₁₀烷基苯基)、氰基、硝基、-CO₂H、-C(O)O(C₁-C₁₀烷基)、-CON(C₁-C₁₀烷基)(C₁-C₁₀烷基)、-CONH(C₁-C₁₀烷基)、-CONH₂，-NHC(O)(C₁-C₁₀烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C₁-C₁₀烷基)C(O)(C₁-C₁₀烷基)、-N(C₁-C₁₀烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C₁-C₁₀烷基、-C(O)C₁-C₁₀烷基苯基、-C(O)C₁-C₁₀卤代烷基、-OC(O)C₁-C₁₀烷基、-SO₂(C₁-C₁₀烷基)、-SO₂(苯基)、-SO₂(C₁-C₁₀卤代烷基)、-SO₂NH₂、-SO₂NH(C₁-C₁₀烷基)、-SO₂NH(苯基)、-NHSO₂(C₁-C₁₀烷基)、-NHSO₂(苯基)和-NHSO₂(C₁-C₁₀卤代烷基)。在一些实施方式中，所述取代基是C₁-C₃烷基、C₆-C₈芳基、-OC₁-C₃烷基、-OC₁-C₃烷基苯基、卤素、-OH、-NH₂、氰基或硝基中的一种。本领域技术人员将理解的是，对于包含一个或多个取代基的任何基团，这些基团不打算引入空间上不切实际、合成上不可行和/或本身不稳定的任何取代或取代模式。

如本文所使用的，“烷基”是指具有指定数量的碳原子的直链和支链，所述数量通常为1至20个碳原子，例如1至10个碳原子，如1至8个或1至6个碳原子。例如，C₁-C₆烷基包含1至6个碳原子的直链和支链烷基。当提及具有特定数量的碳的烷基残基时，旨在涵盖具有该数量的碳的所有支链和直链形式；因此，例如，“丁基”意味着包括正丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基；“丙基”包括正丙基和异丙基。亚烷基是烷基的子集，指与烷基相同、但具有两个连接点的残基。

如本文所使用的，“烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的不饱和支链或直链烷基，所述碳-碳双键是通过从母体烷基的相邻碳原子中除去一分子氢而获得的。该基团可以处于双键的顺式或反式构型。典型的烯基基团包括但不限于：乙烯基；丙烯基，如丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基(烯丙基)、丙-2-烯-2-基；丁烯基，例如丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1,3-二烯-1-基、丁-1,3-二烯-2-基等等。在某些实施方式中，烯基基团具有2到20个碳原子，而在其他实施方式中，具有2至10个、2至8个或2至6个碳原子。亚烯基是烯基的一个子集，指与烯基相同、但具有两个连接点的残基。

如本文所使用的，“炔基”是指具有至少一个碳-碳三键的不饱和支链或直链烷基，所述碳-碳三键是通过从母体烷基的相邻碳原子中除去两分子氢而获得的。典型的炔基基团包括但不限于：乙炔基；丙炔基，如丙-1-炔-1-基，丙-2-炔-1-基；丁炔基，例如丁-1-炔-1-基，丁-1-炔-3-基，丁-3-炔-1-基等。在某些实施方式中，炔基具有2到20个碳原子，而在其他实施方式中，具有2至10、2至8或2至6个碳原子。亚炔基是炔基的一个子集，指的是与炔基相同、但有两个连接点的残基。

如本文所使用的，“烷氧基”是指通过氧桥连接的指定数量碳原子的烷基，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、2-戊氧基、异戊氧基、新戊氧基、己氧基、2-己氧基、3-己氧基、3-甲基戊氧基等。烷氧基通常具有1至10个、1至8个、1至6个，或1至4个通过氧桥连接的碳原子。

如本文所使用的，“芳基”是指通过从环碳原子中除去氢原子而衍生自芳香族单环或多环烃环系统形成的基团。所述芳香族单环或多环烃环系统仅含有氢和6至18个碳原子的碳，其中所述环系统中的至少一个环是完全不饱和的，即，包含根据Hückel理论的环状、离域的(4n+2)π-电子体系。芳基包括但不限于苯基、芴基和萘基等基团。亚芳基是芳基的子集，指与芳基相同、但具有两个连接点的残基。

如本文所使用的，“卤素取代基”或“卤代”指氟代、氯代、溴代或碘代，术语“卤素”包括氟、氯、溴或碘。

如本文所使用的，“卤代烷基”是指指定数量的碳原子被一个或多个、直至最大允许数量的卤素原子取代的如上述所定义的烷基。卤代烷基的实例包括但不限于三氟甲基、二氟甲基、2-氟乙基或五氟乙基。

“杂环基”是指稳定的3-至18-元非芳香族环基，包含2-12个碳原子和1-6个杂原子，所述杂原子选自氮、氧或硫。除非说明书中另有说明，杂环基是单环、双环、三环或四环系统，可包括稠环或桥环系统。在一些实施方式中，杂环基中的杂原子是氧化的杂原子。在一些实施方式中，杂环基中包含一个或多个氮原子。在一些实施方式中，杂环基中的氮原子中的一个或多个是季铵化的氮原子。杂环基是部分饱和或完全饱和的。杂环基可以通过任何环原子连接至分子的其余部分。此类杂环基的实例包括但不限于：二噁烷基、噻吩基[1,3]二硫酰基(thienyl[1,3]dithianyl)、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧杂哌嗪基、2-氧杂哌啶基、2-氧杂吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三硫酰基(trithianyl)、四氢吡喃基、硫代吗啉基(thiomorpholinyl)、硫杂吗啉基(thiamorpholinyl)、1-氧代硫吗啉基(1-oxo-thiomorpholinyl)和1,1-二氧代硫吗啉基(1,1-dioxo-thiomorpholinyl)。亚杂环基是杂环基的子集，指与杂环基相同、但具有两个连接点的残基。“杂芳基”指由3-至18-元芳香环自由基衍生而成的基团，包含2个至17个碳原子和选自氮、氧和硫的1至6个杂原子。如本文所使用的，杂芳基可以是单环、双环、三环或四环系统，其中环系统中的至少一个环是完全不饱和的，即，包含根据Hückel理论的环状离域(4n+2)π-电子体系。杂芳基包括稠环或桥环系统。在一些实施方式中，杂芳基中的杂原子是氧化的杂原子。在一些实施方式中，杂芳基中包含一个或多个氮原子。在一些实施方式中，杂芳基中的氮原子中的一个或多个是季铵化的氮原子。杂芳基通过任何环原子附着至分子的其余部分。杂芳基的实例包括但不限于：氮杂环庚三烯基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并吲哚基、1,3-苯并二噁唑基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并[d]噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1,4]二噁庚英基(benzo[b][1,4]dioxepinyl)、苯并[b][1,4]噁嗪基(benzo[b][1,4]oxazinyl)、1,4-苯并二噁烷基(1,4-benzodioxanyl)、苯并萘并呋喃基、苯并噁唑基、苯并间二氧杂环戊烯基(benzodioxolyl)、苯并二噁英基(benzodioxinyl)、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基、苯并噻吩并[3,2-d]嘧啶基、苯并三唑基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、咔唑基、噌啉基(cinnolinyl)、环戊烷并[d]嘧啶基、6,7-二氢-5H-环戊烷并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6-二氢苯并[h]喹唑啉基(5,6-dihydrobenzo[h]quinazolinyl)、5,6-二氢苯并[h]噌啉基(5,6dihydrobenzo[h]cinnolinyl)、6,7-二氢-5H-苯并[6,7]环庚烷并[1,2-c]哒嗪基、二苯并呋喃基、二苯并噻吩基、呋喃基、呋喃酮基、呋喃并[3,2-c]吡啶基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]嘧啶基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]哒嗪基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]吡啶基、异噻唑基、咪唑基、吲唑基(indazolyl)、吲哚基、异吲哚基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、异喹啉基、吲哚嗪基(indolizinyl)、异噁唑基、5,8-甲醇-5,6,7,8-四氢喹唑啉基(5,8-methano-5,6,7,8-tetrahydroquinazolinyl)、萘啶基(naphthyridinyl)、1,6-萘啶酮基(1,6-naphthyridinonyl)、噁二唑基、2-氧杂吖庚因基(2-oxoazepinyl)、噁唑基、氧杂环丙烷基(oxiranyl)、5,6,6a,7,8,9,10,10a-八氢苯并[H]喹唑啉基、1-苯基-1H-吡咯基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、酞嗪基(phthalazinyl)、蝶啶基(pteridinyl)、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡唑并[3,4-d]嘧啶基、吡啶基、吡啶并[3,2-d]嘧啶基、吡啶并[3,4-d]嘧啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基(quinoxalinyl)、喹啉基、四氢喹啉基、5,6,7,8-四氢喹唑啉基、5,6,7,8-四氢苯并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、6,7,8,9-四氢-5H-环庚烷并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6,7,8-四氢吡啶并[4,5-c]哒嗪基、噻唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、三嗪基、噻吩并[2,3-d]嘧啶基、噻吩并[3,2-d]嘧啶基、噻吩并[2,3-c]吡啶基(thieno[2,3-c]pridinyl)和噻吩基(thiophenyl/thienyl)。亚杂芳基是杂芳基的子集，指与杂芳基相同、但具有两个连接点的残基。

在本公开中可以使用各种羟基保护基团。一般来说，保护基团使化学官能团对特定的反应条件不敏感，并且可以在分子中的该官能团上添加以及去除，而不实质上损害分子的其余部分。代表性的羟基保护基团公开于Beaucage等人，Tetrahedron 1992,48,2223-2311，以及Greene and Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，Chapter 2,2ded，John Wiley&Sons，New York，1991中，以引用的方式将上述文献各自整体并入本文。在一些实施方式中，保护基团在碱性条件下稳定，但可以在酸性条件下脱除。在一些实施方式中，本文可使用的羟基保护基的非排他性实例包括二甲氧基三苯甲基(DMT)、单甲氧基三苯甲基、9-苯基氧杂蒽-9-基(Pixyl)或9-(对甲氧基苯基)氧杂蒽-9-基(Mox)。在一些实施方式中，本文可使用的羟基保护基的非排他性实例包括Tr(三苯甲基)、MMTr(4-甲氧基三苯甲基)、DMTr(4,4'-二甲氧基三苯甲基)或TMTr(4,4',4”-三甲氧基三苯甲基)。

“受试者”一词，如本文所使用的，指任何动物，例如哺乳动物或有袋动物。本公开的受试者包括但不限于人类、非人灵长类(例如，恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、猪、马、驴、牛、绵羊、大鼠、兔或任何种类的家禽。

如本文所使用的，“治疗”是指获得有益的或期望的结果的方法，包括但不限于治疗益处。“治疗益处”意味着根除或改善被治疗的潜在障碍。此外，治疗益处通过根除或改善与潜在障碍相关的一个或多个生理症状，从而在受试者中观察到改善而获得，尽管受试者可能仍然受到潜在障碍的折磨。

如本文所使用的，“预防”是指获得有益或期望的结果的方法，包括但不限于预防性益处。为了获得“预防性益处”，可将siRNA、siRNA缀合物或药物组合物给予有罹患特定疾病风险的受试者，或给予报告疾病的一种或多种生理症状的受试者，即便可能该疾病的诊断尚未作出。

在一方面，本公开提供了一种能够抑制PNP基因表达的siRNA。

本公开的siRNA含有核苷酸基团作为基本结构单元，本领域技术人员公知，所述核苷酸基团含有磷酸基团、核糖基团和碱基，在此不再赘述。

所述siRNA含有正义链和反义链，所述第一种siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中，所述正义链含有一段核苷酸序列I，所述反义链含有一段核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，其中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：

5'-CUAAAUCACCAGAGACCAZ₁-3'(SEQ ID NO:1)；

5'-Z₂UGGUCUCUGGUGAUUUAG-3'(SEQ ID NO:2)，

其中，Z₁为A，Z₂为U；

所述核苷酸序列I中包含位置对应于Z₁的核苷酸Z₃，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Z₂的核苷酸Z₄，所述Z₄是所述反义链5'末端的第一个核苷酸。

在上文与下文中，“位置对应”是指从核苷酸序列相同端起算，处于核苷酸序列中相同的位置。例如，核苷酸序列I的3'端第1个核苷酸是位置对应于SEQ ID NO:1的3'端第1个核苷酸的核苷酸。

在一些实施方式中，所述正义链仅包含核苷酸序列I，所述反义链仅包含核苷酸序列II。

在一些实施方式中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异。

在一些实施方式中，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列之间的核苷酸差异包括Z₄位置处的差异，且Z₄选自A、C或G。在一些实施方式中，所述核苷酸差异为Z₄位置处的差异，Z₄选自A、C或G。在一些实施方式中，Z₃是与Z₄互补的核苷酸。具有上述核苷酸差异的siRNA具有较高的靶mRNA抑制能力，而这些包含核苷酸差异的siRNA也在本公开的保护范围之内。

在一些实施方式中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补；所述基本上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于3个的碱基错配；所述实质上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；完全反向互补是指两个核苷酸序列之间没有碱基错配。

在一些实施方式中，核苷酸序列I是SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，核苷酸序列II是SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列：

5'-CUAAAUCACCAGAGACCAZ₃-3'(SEQ ID NO:3)；

5'-Z₄UGGUCUCUGGUGAUUUAG-3'(SEQ ID NO:4)，

其中，所述Z₄是反义链5'末端的第一个核苷酸，Z₃选自A、U、G或C，并且Z₄是与Z₃互补的核苷酸；在一些实施方式中，Z₃为A，Z₄为U。

在一些实施方式中，所述正义链还含有核苷酸序列III，所述反义链还含有核苷酸序列IV，核苷酸序列III和核苷酸序列IV长度各自为1-4个核苷酸；所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV长度相等并且实质上反向互补或者完全反向互补；所述核苷酸序列III连接在所述核苷酸序列I的5'末端，所述核苷酸序列IV连接在所述核苷酸序列II的3'末端。在一些实施方式中，所述核苷酸序列IV与第二段核苷酸序列实质上反向互补或者完全反向互补，该第二段核苷酸序列是指和靶mRNA中与由SEQ ID NO:1表示的核苷酸序列的5'末端相邻、且长度与所述核苷酸序列IV相同的核苷酸序列。

在一些实施方式中，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的长度均为1个核苷酸，核苷酸序列III的碱基为U，核苷酸序列IV的碱基为A；此时，正义链和反义链的长度比为20/20；或者，核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基组成为AU，核苷酸序列IV的碱基组成为AU；此时，正义链和反义链的长度比为21/21；或者，核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基组成为UAU，核苷酸序列IV的碱基组成为AUA；此时，正义链和反义链的长度比为22/22；或者，核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基组成为UUAU，核苷酸序列IV的碱基组成为AUAA；此时，正义链和反义链的长度比为23/23。在一些实施方式中，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的长度为2个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基组成为AU，核苷酸序列IV的碱基组成为AU；此时，正义链和反义链的长度比为21/21。

在一些实施方式中，核苷酸序列III和核苷酸序列IV完全反向互补，因此，给出了核苷酸序列III的碱基，核苷酸序列IV的碱基也就确定了。

在一些实施方式中，所述正义链和反义链长度不同，所述反义链还含有核苷酸序列V，核苷酸序列V的长度为1至3个核苷酸，连接在所述反义链的3'末端，构成反义链的3'突出端。由此，本公开提供的siRNA正义链和反义链的长度比可以是19/20、19/21、19/22、20/21、20/22、20/23、21/22、21/23、21/24、22/23、22/24、22/25、23/24、23/25或23/26。在一些实施方式中，所述核苷酸序列V的长度为2个核苷酸，由此，本公开提供的siRNA正义链和反义链的长度比可以是19/21、21/23或23/25。

所述核苷酸序列V中的每一个核苷酸可以是任意的核苷酸，为了便于合成并节约合成成本，所述核苷酸序列V为连续的2个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(dTdT)或连续的2个尿嘧啶核糖核苷酸(UU)；或者，为了提高siRNA反义链与靶mRNA的亲和力，核苷酸序列V与靶mRNA的相应位置的核苷酸互补。因此，在一些实施方式中，本公开的siRNA的正义链和反义链的长度之比为19/21或21/23，此时，本公开的siRNA具有更好的靶mRNA沉默活性。

靶mRNA的相应位置的核苷酸是指与靶mRNA的第三段核苷酸序列在5'末端相邻的核苷酸或核苷酸序列，该第三段核苷酸序列是与核苷酸序列II实质上反向互补或完全反向互补，或者与核苷酸序列II和核苷酸序列IV构成的核苷酸序列实质上反向互补或完全反向互补的那段核苷酸序列。

在一些实施方式中，对于所述第一种siRNA，所述siRNA的正义链含有如SEQ IDNO:5所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列：

5'-CUAAAUCACCAGAGACCAZ₃-3'(SEQ ID NO:5)；

5'-Z₄UGGUCUCUGGUGAUUUAGAU-3'(SEQ ID NO:6)；

或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列：

5'-AUCUAAAUCACCAGAGACCAZ₃-3'(SEQ ID NO:7)；

5'-Z₄UGGUCUCUGGUGAUUUAGAUAA-3'(SEQ ID NO:8)；

其中，所述Z₄是反义链5'末端的第一个核苷酸，Z₃选自A、U、G或C，并且Z₄是与Z₃互补的核苷酸。

在一些实施方式中，本公开所述siRNA为表1中列出的siPNa1或siPNa2。

如前所述，本公开的siRNA中的核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸。在一些实施方式中，本公开的siRNA中的每个核苷酸均为未经修饰的核苷酸；在一些实施方式中，本公开的siRNA中的部分或全部核苷酸为修饰的核苷酸，核苷酸基团上的这些修饰不会导致本公开的siRNA抑制PNP基因表达的功能明显削弱或丧失。

在一些实施方式中，本公开的siRNA至少含有1个修饰的核苷酸。在本公开的上下文中，所使用的术语“修饰的核苷酸”是指核苷酸的核糖基2'位羟基被其他基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物，或者具有经修饰的碱基的核苷酸。所述修饰的核苷酸不会导致siRNA抑制基因表达的功能明显削弱或丧失。例如，可以选择J.K.Watts,G.F.Deleavey,andM.J.Damha,Chemically modified siRNA:tools and applications.Drug Discov Today,2008,13(19-20):842-55中公开的修饰的核苷酸。

在一些实施方式中，本公开提供的siRNA的正义链或所述反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基；换句话说，所述正义链和所述反义链中至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基和/或核糖基的至少一部分为具有修饰基团的磷酸酯基和/或具有修饰基团的核糖基。

在一些实施方式中，所述正义链和/或所述反义链中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸。在一些实施方式中，本公开提供的siRNA的正义链和所述反义链中的每一个核苷酸独立地为氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸。

本公开的发明人惊奇地发现，本公开所述的siRNA在动物实验中获得了血浆中稳定性和基因沉默效率的高度平衡。

在一些实施方式中，所述氟代修饰的核苷酸位于核苷酸序列I和核苷酸序列II中，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的至少第7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的至少第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸。

在一些实施方式中，所述氟代修饰的核苷酸位于核苷酸序列I和核苷酸序列II中，所述核苷酸序列I中氟代修饰的核苷酸不多于5个，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的至少第7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸；所述核苷酸序列II中氟代修饰的核苷酸不多于7个，并且，所述核苷酸序列II的至少第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸。

在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，在所述正义链中，所述核苷酸序列I的第7、8、9位或者5、7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，在所述反义链中，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16位或者2、6、8、9、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸。

在本公开的上下文中，“氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代形成的核苷酸，其具有以下式(7)所示的结构。“非氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸、或核苷酸类似物。在一些实施方式中，每一个非氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物中的一种。

这些核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸是本领域技术人员所公知的，这些核苷酸可以选自2'-烷氧基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷基修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-经取代的氨基修饰的核苷酸、2'-脱氧核苷酸中的一种。

在一些实施方式中，2'-烷氧基修饰的核苷酸为2'-甲氧基(2'-OMe)修饰的核苷酸，如式(8)所示。在一些实施方式中，2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸，例如可以是2'-O-甲氧基乙基(2'-MOE)修饰的核苷酸，如式(9)所示。在一些实施方式中，2'-氨基(2'-NH₂)修饰的核苷酸如式(10)所示。在一些实施方式中，2'-脱氧核苷酸(DNA)如式(11)所示：

核苷酸类似物指能够在核酸中代替核苷酸，但结构不同于腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的基团。在一些实施方式中，核苷酸类似物可以是异核苷酸、桥联的核苷酸或无环核苷酸。

桥联的核苷酸(bridged nucleic acid，简称BNA)是指受约束的或不能接近的核苷酸。BNA可以含有五元环、六元环、或七元环的具有“固定的”C3'-内切糖缩拢的桥联结构。通常将该桥掺入到该核糖的2'-、4'-位处以提供一个2',4'-BNA核苷酸。在一些实施方式中，BNA可以是LNA、ENA、cET BNA等，其中，LNA如式(12)所示，ENA如式(13)所示，cET BNA如式(14)所示：

无环核苷酸是核苷酸的糖环被打开形成的一类核苷酸。在一些实施方式中，无环核苷酸可以是解锁核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)，其中，UNA如式(15)所示，GNA如式(16)所示：

上述式(15)和式(16)中，R选自H、OH或烷氧基(O-烷基)。

异核苷酸是指核苷酸中碱基在核糖环上的位置发生改变而形成的化合物。在一些实施方式中，异核苷酸可以是碱基从核糖环的1'-位移动至2'-位或3'-位而形成的化合物，如式(17)或(18)所示。

上述式(17)-式(18)化合物中，Base表示核酸碱基，例如A、U、G、C或T；R选自H、OH、F或者如上所述的非氟基团。

在一些实施方式中，核苷酸类似物选自异核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA和GNA中的一种。在一些实施方式中，每一个非氟代修饰的核苷酸均为甲氧基修饰的核苷酸，在上文和下文中，所述甲氧基修饰的核苷酸指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。

在上文及下文中，“氟代修饰的核苷酸”、“2'-氟修饰的核苷酸”、“核糖基团的2'-羟基被氟取代的核苷酸”和“具有2'-氟代核糖基的核苷酸”意义相同，均指核苷酸的2'-羟基被氟取代，而形成的具有如式(7)所示结构的化合物；“甲氧基修饰的核苷酸”、“2'-甲氧基修饰的核苷酸”、“核糖基团的2'-羟基被甲氧基取代的核苷酸”和“具有2'-甲氧基核糖基的核苷酸”意义相同，均指核苷酸核糖基团的2'-羟基被甲氧基取代而形成的具有如式(8)所示结构的化合物。

在一些实施方式中，本公开的siRNA是具有以下修饰的siRNA：按照5'末端到3'末端的方向，在所述正义链中，所述核苷酸序列I的第7、8、9位或者第5、7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；在所述反义链中，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16位或者第2、6、8、9、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸。

在一些实施方式中，本公开的siRNA是具有以下修饰的siRNA：按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的正义链中核苷酸序列I的第5、7、8和9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，siRNA的正义链的其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的反义链中核苷酸序列II的第2、6、8、9、14和16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，siRNA的反义链其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；

或者，按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的正义链中核苷酸序列I的第5、7、8和9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，siRNA的正义链的其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的反义链中核苷酸序列II的第2、6、14和16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，siRNA的反义链其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；

或者，按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的正义链中核苷酸序列I的第7、8和9位的核苷酸为-氟代修饰的核苷酸，siRNA的正义链的其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的反义链中核苷酸序列II的第2、6、14和16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，siRNA的反义链其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸。

在一些实施方式中，本公开提供的siRNA为表1中列出的siPNa1-M1、siPNa2-M1、siPNa1-M2、siPNa2-M2、siPNa1-M3或siPNa2-M3中的任意一种。

具有上述修饰的siRNA不仅成本低，而且可使血液中的核糖核酸酶不易切割核酸，由此增加核酸的稳定性，使核酸具有更强的抵抗核酸酶水解的性能。同时，上述修饰的siRNA具有较高的靶mRNA抑制活性。

在一些实施方式中，本公开提供的siRNA的正义链和反义链中至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基中的至少一部分为具有修饰基团的磷酸酯基。在一些实施方式中，具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基；在一些实施方式中，所述具有修饰基团的磷酸酯基为具有如式(1)所示结构的硫代磷酸酯基：

这种修饰能稳定siRNA的双链结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。

在一些实施方式中，本公开提供的siRNA中，硫代磷酸酯基连接存在于由以下位置组成的组中的至少一处：正义链或反义链任意一端的第一个和第二个核苷酸之间；正义链或反义链任意一端的第二个和第三个核苷酸之间；或上述的任意组合。在一些实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于除正义链5'末端以外的全部上述位置处。在一些实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于除正义链3'末端以外的全部上述位置处。在一些实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于以下位置中的至少一处：

所述正义链的5'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；

所述正义链的5'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；

所述正义链的3'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；

所述正义链的3'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；

所述反义链的5'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；

所述反义链的5'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；

所述反义链的3'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；以及

所述反义链的3'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间。

在一些实施方式中，本公开提供的siRNA为表1中列出的siPNa1-M1S、siPNa2-M1S、siPNa1-M2S、siPNa2-M2S、siPNa1-M3S或siPNa2-M3S中的任意一种。

在一些实施方式中，所述siRNA反义链的5'末端核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸。

常用的所述5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸是本领域技术人员所公知的，如5'-磷酸核苷酸可具有如下结构：

再如，Anastasia Khvorova and Jonathan K.Watts,The chemical evolutionof oligonucleotide therapies of clinical utility.Nature Biotechnology,2017,35(3):238-48中公开了如下4种5'-磷酸类似物修饰的核苷酸：

其中，R选自H、OH、甲氧基、氟；Base表示核酸碱基，选自A、U、C、G或T。

在一些实施方式中，5'-磷酸核苷酸为式(2)所示的含有5'-磷酸修饰的核苷酸，5'-磷酸类似物修饰的核苷酸为含有乙烯基磷酸酯(5'-(E)-vinylphosphonate，E-VP)修饰的核苷酸，如式(3)所示，或者为硫代磷酸酯修饰的核苷酸，如式(5)所示。

在一些实施方式中，本公开提供的siRNA为表1中列出的siPNa1-M1P1、siPNa2-M1P1、siPNa1-M2P1、siPNa2-M2P1、siPNa1-M3P1、siPNa2-M3P1、siPNa1-M1SP1、siPNa2-M1SP1、siPNa1-M2SP1、siPNa2-M2SP1、siPNa1-M3SP1或siPNa2-M3SP1中的任意一种。

本公开的发明人意外发现，本公开提供的上述siRNA不仅具有显著增强的血浆和溶酶体稳定性，还显示出较高的靶mRNA抑制活性。

本公开提供的siRNA可以通过本领域常规的siRNA制备方法(例如固相合成和液相合成的方法)得到。其中，固相合成已经有商业化订制服务。可以通过使用具有相应修饰的核苷单体来将修饰的核苷酸基团引入本公开所述的siRNA中，制备具有相应修饰的核苷单体的方法及将修饰的核苷酸基团引入siRNA的方法也是本领域技术人员所熟知的。

药物组合物

本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有如上所述的siRNA作为活性成分和药学上可接受的载体。

所述药学上可接受的载体可以是siRNA给药领域常规使用的载体，例如但不限于磁性纳米粒(magnetic nanoparticles，如基于Fe₃O₄或Fe₂O₃的纳米粒)、碳纳米管(carbonnanotubes)、介孔硅(mesoporous silicon)、磷酸钙纳米粒(calcium phosphatenanoparticles)、聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)、聚酰胺型树形高分子(polyamidoamine(PAMAM)dendrimer)、聚赖氨酸(poly(L-lysine)，PLL)、壳聚糖(chitosan)、1,2-二油酰基-3-三甲铵丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，DOTAP)、聚D型或L型乳酸/羟基乙酸共聚物(poly(D&L-lactic/glycolic acid)copolymer，PLGA)、聚(氨乙基乙撑磷酸酯)(poly(2-aminoethyl ethylene phosphate)，PPEEA)和聚(甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯)(poly(2-dimethylaminoethylmethacrylate)，PDMAEMA)以及它们的衍生物中的一种或多种。

所述药物组合物中，对siRNA和药学上可接受的载体的含量没有特别要求，可以是各组分常规的含量。在一些实施方式中，siRNA与药学上可接受的载体的重量比可以为1:(1-500)，在一些的实施方式中，上述重量比为1:(1-50)。

在一些实施方式中，所述药物组合物中，还可以包含药学上可接受的其它辅料，该辅料可以为本领域常规采用的各种制剂或化合物的一种或多种。例如，所述药学上可接受的其它辅料可以包括pH缓冲液、保护剂和渗透压调节剂中的至少一种。

所述pH缓冲液可以为pH值7.5-8.5的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液和/或pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液，例如可以为pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液。

所述保护剂可以为肌醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖和葡萄糖中的至少一种。以所述药物组合物的总重量为基准，所述保护剂的含量可以为0.01-30重量％。

所述渗透压调节剂可以为氯化钠和/或氯化钾。所述渗透压调节剂的含量使所述药物组合物的渗透压为200-700毫渗摩尔/千克(mOsm/kg)。根据所需渗透压，本领域技术人员可以容易地确定所述渗透压调节剂的含量。

在一些实施方式中，所述药物组合物可以为液体制剂，例如注射液；也可以为冻干粉针剂，实施给药时与液体辅料混合，配制成液体制剂。所述液体制剂可以但不限于用于皮下、肌肉或静脉注射给药，也可以但不限于通过喷雾给药到肺脏、或通过喷雾经肺脏给药到其它脏器组织(如肝脏)。在一些实施方式中，所述药物组合物用于静脉注射给药。

在一些实施方式中，所述药物组合物可以为脂质体制剂的形式。在一些实施方式中，所述脂质体制剂中使用的药学上可接受的载体包含含胺的转染化合物(下文也可将其称为有机胺)、辅助脂质和/或聚乙二醇化脂质。其中，所述有机胺、辅助脂质和聚乙二醇化脂质可分别选自于CN103380113A(通过引用的方式将其整体并入本文)中所描述的含胺的转染化合物或其药学上可接受的盐或衍生物、辅助脂质和聚乙二醇化脂质中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述有机胺可为CN103380113A中描述的如式(201)所示的化合物或其药学上可接受的盐：

其中：

每个X₁₀₁或X₁₀₂各自独立地是O、S、N-A或C-A，其中A是氢或C₁-C₂₀烃链；

每个Y₁₀₁或Z₁₀₁各自独立地是C＝O、C＝S、S＝O、CH-OH或SO₂；

每个R₁₀₁、R₁₀₂、R₁₀₃、R₁₀₄、R₁₀₅、R₁₀₆或R₁₀₇各自独立地是氢，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链脂族基团，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链杂脂族基团，被取代的或未被取代的、支链或直链酰基，被取代的或未被取代的、支链或直链芳基，被取代的或未被取代的、支链或直链杂芳基；

x是1-10的整数；

n是1-3的整数，m是0-20的整数，p是0或1；其中，如果m＝p＝0，则R₁₀₂是氢；

并且，如果n或m中的至少一个是2，那么R₁₀₃和在式(201)中的氮形成如式(202)或式(203)所示的结构：

其中，g、e或f各自独立地是1-6的整数，“HCC”代表烃链，且每个*N代表式(201)中的氮原子。

在一些实施方式中，R₁₀₃是多胺。在其它实施方式中，R₁₀₃是缩酮。在一些实施方式中，在式(201)中的R₁₀₁和R₁₀₂中的每一个独立地是任意的被取代的或未被取代的、支链或直链烷基或烯基，所述烷基或烯基具有3至约20个碳原子，诸如8至约18个碳原子，和0至4个双键，诸如0至2个双键。

在一些实施方式中，如果n和m中的每一个独立地具有1或3的值，那么R₁₀₃可以是下述式(204)-式(213)中的任一个：

其中，式(204)-式(213)中，g、e和f各自独立地是1-6的整数，每个“HCC”代表烃链，且每个*显示R₁₀₃与在式(201)中的氮原子的可能连接点，其中在任意*位置上的每个H可以被替换以实现与在式(201)中的氮原子的连接。

其中，式(201)所示化合物可以根据CN103380113A中的描述制备。

在一些实施方式中，所述有机胺为如式(214)所示的有机胺和/或如式(215)所示的有机胺：

所述辅助脂质为胆固醇、胆固醇的类似物和/或胆固醇的衍生物；

所述聚乙二醇化脂质为1,2-二棕榈酰胺-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)]-2000。

在一些实施方式中，所述药物组合物中，所述有机胺、所述辅助脂质和所述聚乙二醇化脂质三者之间的摩尔比为(19.7-80)：(19.7-80)：(0.3-50)，例如可以为(50-70)：(20-40)：(3-20)。

在一些实施方式中，由本公开的siRNA与上述含胺的转染试剂形成的药物组合物颗粒具有约30nm至约200nm的平均直径，通常为约40nm至约135nm，更通常地，该脂质体颗粒的平均直径是约50nm至约120nm、约50nm至约100nm、约60nm至约90nm或约70nm至约90nm，例如，该脂质体颗粒的平均直径是约30、40、50、60、70、75、80、85、90、100、110、120、130、140、150或160nm。

在一些实施方式中，由本公开的siRNA与上述含胺的转染试剂形成的药物组合物中，siRNA与全部脂质(例如有机胺、辅助脂质和/或聚乙二醇化脂质)的重量比(重量/重量比)在从约1:1至约1:50、从约1:1至约1:30、从约1:3至约1:20、从约1:4至约1:18、从约1:5至约1:17、从约1:5至约1:15、从约1:5至约1:12、从约1:6至约1:12或从约1:6至约1:10的范围内，例如，本公开的siRNA与全部脂质的重量比为约1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17或1:18。

在一些实施方式中，所述药物组合物在销售时各组分可以独立存在，在使用时可以液体制剂的形式存在。在一些实施方式中，本公开提供的siRNA与上述药学上可接受的载体形成的药物组合物可以按照已知的各种方法制备，只是用本公开提供的siRNA替代现有siRNA即可；在一些实施方式中，可以按照如下方法制备：

将有机胺、辅助脂质和聚乙二醇化脂质按照上述摩尔比悬浮于醇中并混匀得到脂质溶液；醇的用量使得到的脂质溶液的总质量浓度为2-25mg/mL，例如可以为8-18mg/mL。所述醇选自药学上可接受的醇，诸如在室温附近为液体的醇，例如，乙醇、丙二醇、苯甲醇、甘油、聚乙二醇200，聚乙二醇300，聚乙二醇400中的一种或多种，例如可以为乙醇。

将本公开提供的siRNA溶解于缓冲盐溶液中，得到siRNA水溶液。缓冲盐溶液的浓度为0.05-0.5M，例如可以为0.1-0.2M，调节缓冲盐溶液的pH至4.0-5.5，例如可以为5.0-5.2，缓冲盐溶液的用量使siRNA的浓度不超过0.6mg/mL，例如可以为0.2-0.4mg/mL。所述缓冲盐选自可溶性醋酸盐、可溶性柠檬酸盐中的一种或多种，例如可以为醋酸钠和/或醋酸钾。

将脂质溶液和siRNA水溶液混合，将混合后得到的产物在40-60℃孵育至少2分钟，例如可以为5-30分钟，得到孵育后的脂质体制剂。脂质溶液和siRNA水溶液的体积比为1：(2-5)。

将孵育后的脂质体制剂浓缩或稀释，去除杂质，除菌，得到本公开提供的药物组合物，其理化参数为pH值为6.5-8，包封率不低于80％，粒径为40-200nm，多分散指数不高于0.30，渗透压为250-400mOsm/kg；例如理化参数可以为pH值为7.2-7.6，包封率不低于90％，粒径为60-100nm，多分散指数不高于0.20，渗透压为300-400mOsm/kg。

其中，浓缩或稀释可以在去除杂质之前、之后或同时进行。去除杂质的方法可以采用现有各种方法，例如可以使用切相流系统、中空纤维柱，在100K Da条件下超滤，超滤交换溶液为pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)。除菌的方法可以采用现有各种方法，例如可以在0.22μm滤器上过滤除菌。

siRNA缀合物

本公开提供了一种siRNA缀合物，所述siRNA缀合物含有上述siRNA以及缀合连接至该siRNA的缀合基团。

一般来说，所述缀合基团包含药学上可接受的至少一个靶向基团，或者进一步还包含接头(linker)，并且，所述siRNA、所述接头和所述靶向基团依次连接。在一些实施方式中，所述靶向基团为1-6个。在一些实施方式中，所述靶向基团为2-4个。所述siRNA分子可以非共价或共价缀合至所述缀合基团，例如可以共价缀合至所述缀合基团。siRNA与缀合基团的缀合位点可以在siRNA正义链的3'端或5'端，也可在反义链的5'端，还可以在siRNA的内部序列中。在一些实施方式中，所述siRNA与缀合基团的缀合位点在siRNA正义链的3'末端。

在一些实施方式中，所述缀合基团可以连接在核苷酸的磷酸基团、2'-位羟基或者碱基上。在一些实施方式中，所述缀合基团还可以连接在3'-位羟基上，此时核苷酸之间采用2'-5'磷酸二酯键连接。当缀合基团连接在siRNA链的末端时，所述缀合基团通常连接在核苷酸的磷酸基团上；当缀合基团连接在siRNA的内部序列时，所述缀合基团通常连接在核糖糖环或者碱基上。各种连接方式可以参考文献：Muthiah Manoharan et.al.siRNAconjugates carrying sequentially assembled trivalent N-acetylgalactosaminelinked through nucleosides elicit robust gene silencing in vivo inhepatocytes.ACS Chemical biology,2015,10(5):1181-7.

在一些实施方式中，所述siRNA与缀合基团间可以通过酸不稳定的、或可还原的化学键相连，在细胞内涵体的酸性环境下，这些化学键可降解，从而使siRNA成为自由状态。对于不可降解的缀合方式，缀合基团可连接在siRNA的正义链，从而尽量降低缀合对siRNA活性的影响。

在一些实施方式中，所述药学上可接受的靶向基团可以是siRNA给药领域常规使用的配体，例如WO2009082607A2中描述的各种配体，以引用的方式将其全部公开内容并入本文。

在一些实施方式中，所述药学上可接受的靶向基团可以选自以下靶向分子或其衍生物形成的配体中的一种或多种：亲脂分子，例如胆固醇、胆汁酸、维生素(例如维生素E)、不同链长的脂质分子；聚合物，例如聚乙二醇；多肽，例如透膜肽；适配体；抗体；量子点；糖类，例如乳糖、聚乳糖、甘露糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)；叶酸(folate)；肝实质细胞表达的受体配体，例如去唾液酸糖蛋白、去唾液酸糖残基、脂蛋白(如高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等)、胰高血糖素、神经递质(如肾上腺素)、生长因子、转铁蛋白等。

在一些实施方式中，所述的每个配体独立地选自一个能够与细胞表面受体结合的配体。在一些实施方式中，至少一个配体是能够与肝细胞表面受体结合的配体。在一些实施方式中，至少一个配体是能够与哺乳动物细胞表面受体结合的配体。在一些实施方式中，至少一个配体是能够与人肝细胞表面受体结合的配体。在一些实施方式中，至少一个配体是能够与肝表面去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)结合的配体。这些配体的种类为本领域技术人员所公知，其作用一般是与靶细胞表面的特异性受体相结合，介导与配体连接的siRNA递送至靶细胞。

在一些实施方式中，所述药学上可接受的靶向基团可以是与哺乳动物肝细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)结合的任意一种配体。在一些实施方式中，每个配体独立地为去唾液酸糖蛋白，例如去唾液酸血清类粘蛋白(asialoorosomucoid，ASOR)或去唾液酸胎球蛋白(asialofetuin，ASF)。在一些实施方式中，所述配体为糖或糖的衍生物。

在一些实施方式中，至少一个配体是糖。在一些实施方式中，每个配体均是糖。在一些实施方式中，至少一个配体是单糖、多糖、修饰的单糖、修饰的多糖或糖衍生物。在一些实施方式中，至少一个所述配体可以是单糖，双糖或三糖。在一些实施方式中，至少有一个配体是修饰的糖。在一些实施方式中，每一个配体均为修饰的糖。在一些实施方式中，每个配体均独立地选自多糖、修饰的多糖、单糖、修饰的单糖、多糖衍生物或单糖衍生物。在一些实施方式中，每一个或至少一个配体选自于由以下糖所组成的组：葡萄糖及其衍生物、甘露聚糖及其衍生物、半乳糖及其衍生物、木糖及其衍生物、核糖及其衍生物、岩藻糖及其衍生物、乳糖及其衍生物、麦芽糖及其衍生物，阿拉伯糖及其衍生物、果糖及其衍生物和唾液酸。

在一些实施方式中，每个所述配体可独立地选自D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-阿拉伯糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡糖胺、唾液酸、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-三氟乙酰半乳糖胺、N-丙酰半乳糖胺、N-正丁酰半乳糖胺、N-异丁酰半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰胺基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖或L-4-硫代核糖。所述配体的其它选择可参见例如CN105378082A的记载，以引用的方式将其全部公开内容并入本文。

在一些实施方式中，所述siRNA缀合物中药学上可接受的靶向基团可以是半乳糖或N-乙酰半乳糖胺，其中，半乳糖或N-乙酰半乳糖胺分子可以是一价、二价、三价、四价。应当理解的是，这里所述的一价、二价、三价、四价分别指siRNA分子与含有作为靶向基团的半乳糖或N-乙酰半乳糖胺分子的缀合基团形成siRNA缀合物后，该siRNA缀合物中siRNA分子与半乳糖或N-乙酰半乳糖胺分子的摩尔比为1:1、1:2、1:3或1:4。在一些实施方式中，所述药学上可接受的靶向基团是N-乙酰半乳糖胺。在一些实施方式中，当本公开所述的siRNA与含有N-乙酰半乳糖胺的缀合基团缀合时，N-乙酰半乳糖胺分子是三价或四价。在一些实施方式中，当本公开所述的siRNA与含有N-乙酰半乳糖胺的缀合基团缀合时，N-乙酰半乳糖胺分子是三价。

靶向基团可经由合适的接头与siRNA分子相连，本领域技术人员可以根据靶向基团的具体类型选择合适的接头。这些接头、靶向基团的种类以及与siRNA的连接方式，可参见WO2015006740A2的公开内容，通过引用的方式将其整体内容并入本文。

在一些实施方式中，当所述靶向基团为N-乙酰半乳糖胺时，合适的接头可以为如式(301)所示的结构：

其中，

k为1-3的整数；

L^A为具有如式(302)所示结构的包含酰胺键的链状部分，每个所述L^A分别与一个所述靶向基团和所述L^C部分通过醚键相连接：

L^B为具有如式(303)所示结构的包含N-酰基吡咯烷的链状部分，所述链状部分具有羰基和氧原子，与所述L^C部分通过羰基形成酰胺键相连接，与所述siRNA通过氧原子形成磷酸酯键相连接：

L^C为基于羟甲基氨基甲烷、二羟甲基氨基甲烷或三羟甲基氨基甲烷的2-4价连接基团，所述L^C经由氧原子与各个所述L^A部分通过醚键相连接，并且经由氮原子与所述L^B部分通过酰胺键相连接。

在一些实施方式中，当n＝3，L^C为基于三羟甲基氨基甲烷的4价连接基团时，由作为接头的-(L^A)₃三羟甲基氨基甲烷-L^B-连接N-乙酰半乳糖胺分子和siRNA分子所形成的siRNA缀合物，其结构如下式(304)所示：

式中，双螺旋结构表示siRNA。

同样，siRNA与缀合基团的缀合位点可以在siRNA正义链的3'端或5'端，也可在反义链的5'端，还可以在siRNA的内部序列中。

在一些实施方式中，本公开所述siRNA的正义链3'末端通过接头-(L^A)₃三羟甲基氨基甲烷-L^B-与三个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)分子共价缀合，得到siRNA分子与GalNAc分子的摩尔比为1:3的siRNA缀合物，下文也可将其称为(GalNAc)₃-siRNA，其结构如下式(305)所示：

其中，双螺旋结构表示所述siRNA，并且所述接头连接至所述siRNA的正义链3'末端。

在一些实施方式中，当所述靶向基团为N-乙酰半乳糖胺时，合适的接头可以为如式(306)所示的结构：

其中，

l为0-3的整数；

^*表示接头上通过醚键与靶向基团连接的位点；

^#表示接头上通过磷酸酯键与siRNA连接的位点。

在一些实施方式中，当l＝2时，所述siRNA缀合物具有如式(307)所示的结构：

在一些实施方式中，所述siRNA缀合物具有如式(308)所示的结构：

其中：

n1为选自1-3的整数，n3为选自0-4的整数；

每个m1、m2或m3各自独立地为选自2-10的整数；

R₁₀、R₁₁、R₁₂、R₁₃、R₁₄或R₁₅各自独立地为H，或选自于由以下基团所组成的组：C₁-C₁₀烷基、C₁-C₁₀卤代烷基以及C₁-C₁₀烷氧基；

R₃为式A59所示结构的基团：

其中，E₁为OH、SH或BH₂，Nu为本公开的siRNA；

R₂是长度为1-20个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子可选地被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)₂、C₂-C₁₀亚烯基、C₂-C₁₀亚炔基、C₆-C₁₀亚芳基、C₃-C₁₈亚杂环基和C₅-C₁₀亚杂芳基；并且其中，R₂可选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C₁-C₁₀烷基、C₆-C₁₀芳基、C₅-C₁₀杂芳基、C₁-C₁₀卤代烷基、-OC₁-C₁₀烷基、-OC₁-C₁₀烷基苯基、-C₁-C₁₀烷基-OH、-OC₁-C₁₀卤代烷基、-SC₁-C₁₀烷基、-SC₁-C₁₀烷基苯基、-C₁-C₁₀烷基-SH、-SC₁-C₁₀卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH₂、-C₁-C₁₀烷基-NH₂、-N(C₁-C₁₀烷基)(C₁-C₁₀烷基)、-NH(C₁-C₁₀烷基)、N(C₁-C₁₀烷基)(C₁-C₁₀烷基苯基)、NH(C₁-C₁₀烷基苯基)、氰基、硝基、-CO₂H、-C(O)O(C₁-C₁₀烷基)、-CON(C₁-C₁₀烷基)(C₁-C₁₀烷基)、-CONH(C₁-C₁₀烷基)、-CONH₂，-NHC(O)(C₁-C₁₀烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C₁-C₁₀烷基)C(O)(C₁-C₁₀烷基)、-N(C₁-C₁₀烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C₁-C₁₀烷基、-C(O)C₁-C₁₀烷基苯基、-C(O)C₁-C₁₀卤烷基、-OC(O)C₁-C₁₀烷基、-SO₂(C₁-C₁₀烷基)、-SO₂(苯基)、-SO₂(C₁-C₁₀卤代烷基)、-SO₂NH₂、-SO₂NH(C₁-C₁₀烷基)、-SO₂NH(苯基)、-NHSO₂(C₁-C₁₀烷基)、-NHSO₂(苯基)和-NHSO₂(C₁-C₁₀卤代烷基)；

每个L₁是长度为1-70个碳原子的直链亚烷基，其中一个或多个碳原子可选地被选自于以下基团所组成的组中的一个或多个所替换：C(O)、NH、O、S、CH＝N、S(O)₂、C₂-C₁₀亚烯基、C₂-C₁₀亚炔基、C₆-C₁₀亚芳基、C₃-C₁₈亚杂环基和C₅-C₁₀亚杂芳基；并且其中，L₁可选地具有由以下基团所组成的组中的任何一个或多个的取代基：C₁-C₁₀烷基、C₆-C₁₀芳基、C₅-C₁₀杂芳基、C₁-C₁₀卤代烷基、-OC₁-C₁₀烷基、-OC₁-C₁₀烷基苯基、-C₁-C₁₀烷基-OH、-OC₁-C₁₀卤代烷基、-SC₁-C₁₀烷基、-SC₁-C₁₀烷基苯基、-C₁-C₁₀烷基-SH、-SC₁-C₁₀卤代烷基、卤素取代基、-OH、-SH、-NH₂、-C₁-C₁₀烷基-NH₂、-N(C₁-C₁₀烷基)(C₁-C₁₀烷基)、-NH(C₁-C₁₀烷基)、N(C₁-C₁₀烷基)(C₁-C₁₀烷基苯基)、NH(C₁-C₁₀烷基苯基)、氰基、硝基、-CO₂H、-C(O)O(C₁-C₁₀烷基)、-CON(C₁-C₁₀烷基)(C₁-C₁₀烷基)、-CONH(C₁-C₁₀烷基)、-CONH₂，-NHC(O)(C₁-C₁₀烷基)、-NHC(O)(苯基)、-N(C₁-C₁₀烷基)C(O)(C₁-C₁₀烷基)、-N(C₁-C₁₀烷基)C(O)(苯基)、-C(O)C₁-C₁₀烷基、-C(O)C₁-C₁₀烷基苯基、-C(O)C₁-C₁₀卤烷基、-OC(O)C₁-C₁₀烷基、-SO₂(C₁-C₁₀烷基)、-SO₂(苯基)、-SO₂(C₁-C₁₀卤代烷基)、-SO₂NH₂、-SO₂NH(C₁-C₁₀烷基)、-SO₂NH(苯基)、-NHSO₂(C₁-C₁₀烷基)、-NHSO₂(苯基)和-NHSO₂(C₁-C₁₀卤代烷基)。

在一些实施方式中，L₁可选自于由A1-A26基团或其任意组合所组成的组，其中A1-A26的结构和定义如下所示：

其中，j1为1-20的整数；j2为1-20的整数；

R'为C₁-C₁₀烷基；

Ra选自式A27-A45基团或其任意组合所组成的组：

Rb为C₁-C₁₀烷基；

表示基团共价连接的位点。

技术人员会理解的是，尽管为了方便起见，L₁被定义为线性亚烷基，但是它可能不是线性基团或者名称不同，例如由于上述替换和/或取代而产生的胺或烯基。为了本公开内容的目的，L₁的长度是连接两个连接点的链中的原子数。为此目的，将替换所述直链亚烷基的碳原子而得到的环(如亚杂环基或亚杂芳基)计为一个原子。

M₁表示靶向基团，其定义和可选择的范围与上述靶向基团相同。在一些实施方式中，每个M₁独立地选自对哺乳动物肝脏细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体具有亲合力的配体中的一种。

当M₁为对哺乳动物肝脏细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体具有亲合力的配体时，在一些实施方式中，n1可以是1-3的整数，n3可以是0-4的整数，保证所述siRNA缀合物中M₁靶向基团的个数至少为2；在一些实施方式中，n1+n3≥2，这样可以使得M₁靶向基团的个数至少为3，从而使得M₁靶向基团与肝表面去唾液酸糖蛋白受体更容易结合，进而促进所述siRNA缀合物通过内吞作用进入细胞。实验表明，当M₁靶向基团的个数大于3个时，M₁靶向基团与肝表面去唾液酸糖蛋白受体结合的容易程度增加并不明显，因此，从合成容易程度、结构/工艺成本和递送效率等多方面综合考虑，在一些实施方式中，n1为1-2的整数，n3为0-1的整数，且n1+n3＝2-3。

在一些实施方式中，每个m1、m2或m3各自独立地选自2-10的整数时，可以使多个M₁靶向基团之间的空间位置适合M₁靶向基团与肝表面去唾液酸糖蛋白受体的结合，为了使本公开提供的siRNA缀合物更为简单，更容易合成和/或降低成本，在一些实施方式中，每个m1、m2或m3各自独立地为2-5的整数，在一些实施方式中，m1＝m2＝m3。

本领域技术人员可以理解，当R₁₀、R₁₁、R₁₂、R₁₃、R₁₄或R₁₅各自独立地选自H、C₁-C₁₀烷基、C₁-C₁₀卤代烷基、以及C₁-C₁₀烷氧基中的一种时，不会改变本公开的siRNA缀合物的性质，均可以实现本公开的目的。在一些实施方式中，R₁₀、R₁₁、R₁₂、R₁₃、R₁₄或R₁₅各自独立地选自H、甲基或乙基。在一些实施方式中，R₁₀、R₁₁、R₁₂、R₁₃、R₁₄和R₁₅均为H。

R₃为式A59所示结构的基团，其中，E₁为OH、SH或BH₂，基于制备原料易获取性的考虑，在一些实施方式中，E₁为OH或SH。

R₂的选择是为了实现与含氮骨架上的N原子与A59的连接。在本公开的上下文中，“含氮骨架”是指连接有R₁₀、R₁₁、R₁₂、R₁₃、R₁₄和R₁₅的碳原子与N原子互相连接的链状结构。因此，R₂可以是任何能够以适当方式将A59基团连接至含氮骨架上的N原子的连接基团。在一些实施方式中，在通过固相合成的工艺制备式(308)所示的siRNA缀合物的情况下，R₂基团中需要同时含有与含氮骨架上的N原子连接的连接位点和与R₃中的P原子相连接的连接位点。在一些实施方式中，R₂的长度为4-15个碳原子。在一些实施方式中，R₂中所述与含氮骨架上的N原子连接的位点与N原子形成酰胺键，所述与R₃上的P原子连接的位点与P原子形成磷酸酯键；在一些实施方式中，R₂可以是B5、B6、B5'或B6'：

其中，

表示基团共价连接的位点。

q₂的取值范围可以是1-10的整数，在一些实施方式中，q₂为1-5的整数。

L₁的作用是将M₁靶向基团与含氮骨架上的N连接，为式(308)所示的siRNA缀合物提供肝靶向功能。在一些实施方式中，L₁选自式A1-A26基团中的一种或多种的连接组合。在一些实施方式中，L₁选自A1、A4、A5、A6、A8、A10、A11和A13中的一种或多种的连接组合。在一些实施方式中，L₁选自A1、A4、A8、A10和A11中至少2个的连接组合。在一些实施方式中，L₁选自A1、A8、A10中至少2个的连接组合。

在一些实施方式中，L₁的长度可以为3-25个原子，3-20个原子、4-15个原子或5-12个原子。在一些实施方式中，L₁的长度为3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个原子。

在一些实施方式中，j1为2-10的整数，在一些实施方式中，j1为3-5的整数。在一些实施方式中，j2为2-10的整数，在一些实施方式中，j2为3-5的整数。R'为C₁-C₄烷基，在一些实施方式中，R'为甲基、乙基和异丙基中的一种。Ra为A27、A28、A29、A30和A31中的一种，在一些实施方式中，Ra为A27或A28。Rb为C₁-C₅烷基，在一些实施方式中，Rb为甲基、乙基、异丙基和丁基中的一种。在一些实施方式中，在式A1-A26中各自对j1、j2、R'、Ra、Rb进行选择，以实现M₁靶向基团与含氮骨架上的N原子连接，并使M₁靶向基团之间的空间位置更适合M₁靶向基团与肝表面去唾液酸糖蛋白受体结合。

在一些实施方式中，该siRNA缀合物具有式(403)、(404)、(405)、(406)、(407)、(408)、(409)、(410)、(411)、(412)、(413)、(414)、(415)、(416)、(417)、(418)、(419)、(420)、(421)或(422)所示的结构：

在一些实施方式中，式A59中的P原子可以连接到siRNA序列中任何可能的位置，例如，式A59中的P原子可以连接到siRNA正义链或反义链的任何一个核苷酸上；在一些实施方式中，式A59中的P原子连接到siRNA正义链的任何一个核苷酸上。在一些实施方式中，式A59中的P原子连接到siRNA正义链或反义链的端部；在一些实施方式中，式A59中的P原子连接到siRNA正义链的端部。所述端部指所述正义链或所述反义链中从其一端起算的前4个核苷酸。在一些实施方式中，式A59中的P原子连接到siRNA正义链或反义链的末端；在一些实施方式中，式A59中的P原子连接到siRNA正义链的3'末端。在连接至siRNA的正义链的上述位置的情况下，式(308)所示的siRNA缀合物进入细胞后，在解旋时，可以释放出单独的siRNA反义链，以阻断PNP mRNA翻译蛋白质的过程，抑制PNP基因表达。

在一些实施方式中，式A59中的P原子可以连接到siRNA中的核苷酸上任何可能的位置，例如，核苷酸的5'位、核苷酸的2'位、核苷酸的3'位或核苷酸的碱基上。在一些实施方式中，式A59中的P原子可通过形成磷酸二酯键连接至所述siRNA中的核苷酸的2'位、3'位或5'位。在一些实施方式中，式A59中的P原子连接在siRNA正义链3'末端核苷酸的3'羟基脱氢后形成的氧原子上(此时，A59中的P原子也可以看作是siRNA中含有的磷酸基团中的P原子)，或者式A59中的P原子通过取代siRNA正义链中的一个核苷酸的2'-羟基中的氢与核苷酸连接，或者式A59中的P原子通过取代siRNA正义链5'末端核苷酸的5'羟基中的氢与核苷酸连接。

本公开的发明人意外发现，本公开的siRNA缀合物在具有显著提高的血浆中稳定性、低脱靶效应的同时，还表现出较高的PNP mRNA沉默活性，而且还具有较高的血尿酸浓度抑制作用。在一些实施方式中，本公开的siRNA可以为表1中示出的siRNA中的一种。含有这些siRNA的siRNA缀合物表现出更高的PNP mRNA沉默活性。

表1本公开的siRNA序列

其中，大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸；小写字母s表示该字母左右两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接；P1表示该P1右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸。在一些实施方式中，P1是表示具体修饰的VP、Ps或P，其中，字母组合VP表示该字母组合VP右侧相邻的一个核苷酸为乙烯基磷酸酯(5'-(E)-vinylphosphonate，E-VP)修饰的核苷酸，字母组合Ps表示该字母组合Ps右侧相邻的一个核苷酸为硫代磷酸酯修饰的核苷酸，大写字母P表示该字母P右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸。

本公开所述siRNA或siRNA缀合物中，每个相邻核苷酸之间由磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键连接，磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键中的非桥接氧原子或硫原子带有负电荷，它可以以羟基或巯基的形式存在，羟基或巯基中的氢离子也可以部分或全部被阳离子取代。所述阳离子可以是任意的阳离子，如金属阳离子，铵离子NH₄ ⁺，有机铵阳离子中的一种。出于提高溶解性考虑，在一些实施方式中，所述阳离子选自碱金属离子、三级胺形成的铵阳离子和季铵阳离子中的一种或多种。碱金属离子可以是K⁺和/或Na⁺，三级胺形成的阳离子可以是三乙胺形成的铵离子和/或N,N-二异丙基乙胺形成的铵离子。因此，本公开所述siRNA或siRNA缀合物可以至少部分以盐的形式存在。在一些实施方式中，磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键中的非桥接氧原子或硫原子至少部分与钠离子结合，本公开所述siRNA或siRNA缀合物以钠盐或部分钠盐的形式存在。因此，在提及本公开所述的siRNA或siRNA缀合物，包括但不限于本公开所述的任何结构式表示的siRNA缀合物时，均旨在涵盖该siRNA或siRNA缀合物的钠盐或部分钠盐形式。

本领域技术人员清楚知晓的是，可以通过使用具有相应修饰的核苷单体来将修饰的核苷酸基团引入本公开所述的siRNA中。制备具有相应修饰的核苷单体的方法及将修饰的核苷酸基团引入siRNA的方法也是本领域技术人员所熟知的。所有修饰的核苷单体均可以商购得到或者采用已知方法制备得到。

本公开siRNA缀合物的制备

上述siRNA缀合物可以通过现有技术中已经详细描述的方法进行合成。例如，WO2015006740A2中详细描述了多种siRNA缀合物的制备方法。通过本领域技术人员熟知的方式，获得本公开的siRNA缀合物。如WO2014025805A1中记载了式(305)所示结构的制备方法，Rajeev等人在ChemBioChem 2015,16,903-908中描述了式(307)所示结构的制备方法。WO2020233651A1也详细公开了式(308)所示的siRNA缀合物的制备方法。以引用的方式将上述文献内容整体并入本文。

本公开的siRNA缀合物也可以与药学上可接受的其它辅料联用，该辅料可以为本领域常规采用的各种制剂或化合物的一种或多种，详情可参见上文关于本公开的药物组合物的描述。

本公开的siRNA、药物组合物及siRNA缀合物的应用

在一些实施方式中，本公开提供了本公开的siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物在制备用于治疗和/或预防尿酸代谢异常或尿酸代谢异常的引发的疾病或生理状况的药物中的用途。

在一些实施方式中，本公开提供了一种预防和/或治疗尿酸代谢异常的或尿酸代谢异常的引发的疾病或生理状况的方法，该方法包括将有效量的本公开的siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物给予有需要的受试者。

通过将本公开的siRNA活性成分给予有需要的受试者，可以通过RNA干扰的机制达到预防和/或治疗尿酸代谢异常或尿酸代谢异常的引发的疾病或生理状况的目的。因此，本公开的siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物可用于预防和/或治疗尿酸代谢异常或尿酸代谢异常的引发的疾病或生理状况，或用于制备用于预防和/或治疗尿酸代谢异常或尿酸代谢异常的引发的疾病或生理状况的药物。

在一些实施方式中，所述尿酸代谢异常引发的疾病或生理状况指高尿酸血症或痛风症，通常表现为血液中尿酸的水平提高以及由该提高的血尿酸水平而直接导致的关节剧烈疼痛、活动不便等症状。

本文所使用的术语“给药/给予”是指通过使得至少部分地将本公开的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物定位于期望的位点以产生期望效果的方法或途径，将本公开的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物放置入受试者体内。适于本公开方法的给药途径包括局部给药和全身给药。一般而言，局部给药导致与受试者体循环相比将更多siRNA缀合物递送至特定位点；而全身给药导致将本公开的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物递送至受试者的体循环。考虑到本公开旨在提供预防和/或治疗痛风的手段，在一些实施方式中采用能够将药物递送至肝脏的给药方式。

可通过本领域已知的任何合适途径向受试者给药，所述途径包括但不仅限于：口服或胃肠外途径，如静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、经皮给药、气道给药(气雾剂)、肺部给药、鼻部给药、直肠给药和局部给药(包括口腔含化给药和舌下给药)。给药频率可以是每天、每周、每两周、每三周、每个月、每两个月、每三个月、每半年或每年1次或多次。

本公开所述的siRNA、药物组合物或siRNA缀合物的使用剂量可为本领域常规的剂量，所述剂量可以根据各种参数、尤其是受试者的年龄、体重和性别来确定。可在细胞培养或实验动物中通过标准药学程序测定毒性和疗效，例如测定LD₅₀(使50％的群体死亡的致死剂量)和ED₅₀(在量反应中指能引起50％最大反应强度的剂量，在质反应中指能引起50％实验对象出现阳性反应时的剂量)。可基于由细胞培养分析和动物研究得到的数据得出人用剂量的范围。

在给予本公开所述的siRNA、药物组合物、和/或siRNA缀合物时，例如，对于雄性或雌性、6-12周龄、体重18-25g的C57BL/6J小鼠，以siRNA的量计：(i)对于siRNA缀合物，其siRNA用量可以为0.001-100mg/kg体重，在一些实施方式中为0.01-50mg/kg体重，在一些实施方式中为0.05-20mg/kg体重，另一些实施方式中为0.1-15mg/kg体重，另一些实施方式中为0.1-10mg/kg体重；(ii)对于siRNA与药学上可接受的载体形成的药物组合物，其siRNA用量可以为0.001-50mg/kg体重，在一些实施方式中为0.01-10mg/kg体重，在一些实施方式中为0.05-5mg/kg体重，在一些实施方式中为0.1-3mg/kg体重。

在一些实施方式中，本公开提供了一种抑制肝细胞中PNP基因表达的方法，该方法包括将有效量的本公开的siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物与所述肝细胞接触，将本公开的siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物导入所述肝细胞，通过RNA干扰的机制达到抑制肝细胞中PNP基因表达的目的。所述肝细胞可以选自SMMC-7721、HepG2、Huh7等肝癌细胞系或分离的肝原代细胞。在一些实施方式中，所述细胞为SMMC-7721肝癌细胞。

采用本公开提供的方法抑制PNP基因在细胞中表达，所提供的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物中的siRNA用量一般是这样的量：其足以减少靶基因的表达，并导致在靶细胞表面处1pM至1μM、或0.01nM至100nM、或0.05nM至50nM或0.05nM至约5nM的细胞外浓度。达到该局部浓度所需的量将随各种因素而变化，所述因素包括递送方法、递送部位、在递送部位和靶细胞或组织之间的细胞层的数目、递送途径(局部还是全身)等。在递送部位处的浓度可以显著高于在靶细胞或组织的表面处的浓度。

试剂盒

本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含有效量的本公开的siRNA、药物组合物和siRNA缀合物的至少一种。

在一些实施方式中，本文所述的试剂盒可在一个容器中提供siRNA。在一些实施方式中，本文所述的试剂盒可包含一个提供药学上可接受的赋形剂的容器。在一些实施方式中，所述试剂盒中还可包含其它成分，如稳定剂或防腐剂等。在一些实施方式中，本文所述的试剂盒可在不同于提供本文所述的siRNA的容器以外的其它容器中包含至少一种其它治疗剂。在一些实施方式中，所述试剂盒可包含用于将siRNA与药学上可接受的载体和/或辅料或其它成分(若有的话)进行混合的说明书。

在本公开的试剂盒中，所述siRNA和药学上可接受的载体和/或辅料以及所述siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物，和/或药学上可接受的辅料可以任何形式提供，例如液体形式、干燥形式或冻干形式。在一些实施方式中，所述siRNA和药学上可接受的载体和/或辅料以及所述药物组合物和/或siRNA缀合物和可选的药学上可接受的辅料基本上纯净和/或无菌。在一些实施方式中，可在本公开的试剂盒中提供无菌水。

下面将通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。

实施例

除非特别说明，以下实施例中所用到的试剂、培养基均为市售商品，所用到的核酸电泳、real-time PCR等操作均参照Molecular Cloning(Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989))所记载的方法进行。

SMMC-7721细胞(广州吉妮欧生物科技有限公司)用含有10％的胎牛血清(FBS，HyClone公司)及0.2％体积的青链霉素双抗(Penicillin-Streptomycin，HyClone)的H-DMEM完全培养基(HyClone公司)于37℃下在含5％CO₂/95％空气的培养箱中培养。

Huh7细胞(广州吉妮欧生物科技有限公司)用含有10％的胎牛血清(FBS，Hyclone公司)及0.2体积％的青链霉素双抗(Penicillin-Streptomycin，HyClone)的H-DMEM完全培养基(Hyclone公司)于37℃下在含5％CO₂/95％空气的培养箱中培养。

本公开合成的针对PNP基因的siRNA、siRNA缀合物或作为阴性对照的siRNA、siRNA缀合物转染细胞时，使用Lipofectamine^TM2000(Invitrogen)或INTERFERin(Polyplus)作为转染试剂，具体操作参照制造商提供的说明书。

若无其它说明，以下提供的试剂比例均按体积比(v/v)计算。

制备例1缀合物1的制备

本制备例合成了缀合物1。按照WO2020233651A1公开的实施例部分“缀合物1”的制备方法，制备获得了以下表3中的缀合物1，区别仅在于，缀合物1中含有的siRNA的正义链和反义链分别如表3中所示；按照以下表3中编号为L10-siPNa1M1S的siRNA的核酸序列，分别合成siRNA的正义链和反义链。使用超纯水(Milli-Q超纯水仪，电阻率18.2MΩ*cm(25℃))将缀合物1稀释至浓度为0.2mg/mL(以siRNA计)后，利用液质联用仪(LC-MS，LiquidChromatography-Mass Spectrometry，购于Waters公司，型号：LCT Premier)进行分子量检测。实测值与理论值一致，说明所合成的缀合物1是目标设计的双链核酸序列。缀合物1具有式(403)所示的结构，并且该siRNA缀合物包含的siRNA具有表3中缀合物1所对应的siRNA序列。

制备例2：缀合物NC1和缀合物NC2的制备

采用与制备例1相同的方法，合成了缀合物NC1和缀合物NC2。不同的是：1)所述siRNA分别为表3中所示的对应于缀合物NC1和缀合物NC2的序列；2)当目标序列中在反义链5'-末端第一个核苷酸处具有5-磷酸时，按照固相亚磷酰胺法制备反义链的过程中，在连接反义链最后一个核苷单体后，再经脱保护、偶联、盖帽、氧化四步反应将CPR-I单体(苏州吉玛，货号Cat#13-2601-XX)连接至反义链5'末端，形成5'-磷酸酯修饰。缀合物NC1和缀合物NC2为参比siRNA缀合物。

该连接中，使用的脱保护、偶联、盖帽、氧化反应条件，切割和脱保护，纯化与脱盐条件与合成正义链相同。按照上述方法同样地对所合成的缀合物进行了分子量检测。实测值与理论值一致，说明所合成的缀合物NC1和缀合物NC2是目标设计的双链核酸序列。表3列出了siRNA缀合物编号和siRNA序列组成。

表3 siRNA缀合物

其中，大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸；小写字母s表示该字母s左右两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接；大写字母P表示该字母P右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸。

制备例3合成siRNA序列

通过固相合成方法分别合成表4中所列的siRNA序列，使用DEPC水，分别溶解等摩尔的表4中相互互补的正义链和反义链，随后退火得到本公开提供的siRNA1和参比siRNANC1。

表4 siRNA序列

其中，大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸；小写字母s表示该字母s左右两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接。参比siRNA NC1的序列是与PNP mRNA无同源性的阴性对照序列。

在上述本公开的siRNA缀合物或siRNA制备完成后，冻干为固体粉末保存备用。在使用时，可使用例如注射用水、生理盐水(NS)、磷酸缓冲液(PB)或者磷酸盐缓冲液(PBS)等将其重新溶解为所需浓度的溶液使用。

实验例1本公开的siRNA在psiCHECK系统中的目标序列抑制活性

用添加20％的胎牛血清(FBS，Hyclone公司)及0.2体积％的青链霉素双抗(Penicillin-Streptomycin，HyClone)的H-DMEM完全培养基(Hyclone公司)于37℃在含5％CO₂/95％空气的培养箱中培养HEK293A细胞(购自南京科佰生物科技有限公司)。

采用psiCHECK^TM-2(Promega^TM)质粒构建检测质粒，每个检测质粒含有一个目标序列，即siRNA靶序列。对于待评价的siRNA，目标序列分别如下所示：

siRNA1的目标序列为：

ATCTAAATCACCAGAGACCAA(SEQ ID NO:75)

该目标序列为PNP mRNA的序列片段。

参比siRNA NC1的目标序列为SEQ ID NO:75所示的序列。

将目标序列克隆到psiCHECK^TM-2质粒的Xho I/Not I位点。

将HEK293A细胞以8×10³细胞/孔接种于96孔板中，16h后细胞生长密度达到70-80％时，吸尽培养孔中H-DMEM完全培养基，每孔加入80μl Opti-MEM培养基(GIBCO公司)继续培养1.5h。

对于每一siRNA，用DEPC水将对应的检测质粒稀释成200ng/μl的检测质粒工作液。对于每一siRNA，用siRNA和DEPC水配制成浓度(以siRNA计)分别为10nM、3nM和1nM的siRNA工作液。

对于每一个siRNA，配制5A1溶液，每份5A1溶液含有浓度为10nM的siRNA工作液1μl、检测质粒工作液0.05μl(含检测质粒10ng)和10μl的Opti-MEM培养基。

对于每一个siRNA，配制5A2溶液，每份5A2溶液含有浓度为3nM的siRNA工作液1μl、检测质粒工作液0.05μl(含检测质粒10ng)和10μl的Opti-MEM培养基。

对于每一个siRNA，配制5A3溶液，每份5A3溶液含有浓度为1nM的siRNA工作液1μl、检测质粒工作液0.05μl(含检测质粒10ng)和10μl的Opti-MEM培养基。

配制5B溶液，每份5B溶液含有0.2μl Lipofectamine^TM2000和10μl Opti-MEM培养基。

配制5C溶液，每份5C溶液含有检测质粒工作液0.05μl(含检测质粒10ng)和10μl的Opti-MEM培养基。

对于每一个siRNA，分别将一份5B溶液与一份5A1溶液、一份5A2溶液、一份5A3溶液溶液混合，室温下孵育20min，分别得到转染复合物5X1、5X2、5X3，将一份5B溶液与一份5C溶液混合，室温下孵育20min得到转染复合物5X4。

对于每一个siRNA，在三个培养孔中，分别加入转染复合物5X1，均匀混合，加入量为20μl/孔，得到siRNA终浓度约为0.1nM的含siRNA的共转染混合物，记为测试组1。

对于每一个siRNA，在另外三个培养孔中，分别加入转染复合物5X2，均匀混合，加入量为20μl/孔，得到siRNA终浓度约为0.03nM的含siRNA的共转染混合物，记为测试组2。

对于每一个siRNA，在另外三个培养孔中，分别加入转染复合物5X3，均匀混合，加入量为20μl/孔，得到siRNA终浓度约为0.01nM的含siRNA的共转染混合物，记为测试组3。

在另外三个培养孔中，分别加入转染复合物5X4，得到不含siRNA的转染混合物，加入量为20μl/孔，记为对照组。

将含siRNA的共转染混合物和不含siRNA的转染混合物分别在培养孔中转染4h后，每孔补加100μl含20％FBS的H-DMEM完全培养基。将96孔板置于37℃下5％CO₂/95％空气的培养箱中继续培养24h。

吸去培养孔中的培养基，每孔加入150μl的

Luciferase试剂与H-DMEM混合溶液(体积比1:1)，充分混合均匀，室温孵育10min后，转移120μl混合液到96孔酶标板的每个孔上，使用Synergy II多功能酶标仪(BioTek公司)读取96孔酶标板上各培养孔中Firefly的化学发光值(Fir)；再向每孔加入60μl

Stop&

试剂，充分混合均匀，室温孵育10min后，按照读取Fir的排布方式，使用酶标仪读取96孔酶标板上各培养孔中Renilla的化学发光值(Ren)。

计算每孔发光比值Ratio＝Ren/Fir，各测试组或对照组的发光比值Ratio(测试)或Ratio(对照)为三个培养孔Ratio的平均值；以对照组的发光比值为基准，对各测试组的发光比值进行归一化，获得Ratio(测试)/Ratio(对照)的比值R，以此表示Renilla报告基因的表达水平，即残留活性。目标序列的抑制率＝(1-R)×100％。

表5示出了在HEK293A细胞中分别转染了siRNA1或NC1后，siRNA对目标序列的抑制率。

表5 siRNA在HEK293A细胞中对目标序列的抑制率

结果表明，本公开的siRNA1在体外psiCHECK系统中显示出较高的目标序列抑制活性，特别是在0.1nM的siRNA浓度下，siRNA1具有高达92.38％的目标序列抑制率，表明本公开的siRNA显示出良好的抑制PNP mRNA的效果。

实验例2缀合物1在SMMC-7721细胞中对PNP mRNA的IC₅₀测定

本实验例通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR)的方法，检测转染了不同浓度的缀合物1后，SMMC-7721细胞中PNP mRNA相对表达水平，测定缀合物1对PNPmRNA的IC₅₀值。

将SMMC-7721细胞以5×10⁴细胞/孔接种于24孔板中，16h后细胞生长密度达到70-80％时，吸尽培养孔中H-DMEM完全培养基，每孔加入500μl Opti-MEM培养基(GIBCO公司)继续培养1.5h。

用DEPC化水将每一siRNA缀合物分别配制为100μM、20μM、4μM、0.8μM、0.16μM、0.032μM、0.0064μM和0.00128μM(以siRNA计算)共8种不同浓度的siRNA缀合物工作液，所用siRNA缀合物均为缀合物1。

对于缀合物1，分别配制1A1-1A8溶液，每份1A1-1A8溶液依次含有上述8个浓度的siRNA缀合物工作液3μL和Opti-MEM培养基50μl。

配制1B溶液，每份1B溶液含有1μl Lipofectamine^TM2000和50μl Opti-MEM培养基。

分别将一份1B溶液与得到的缀合物1的1A1-1A8的溶液混合，分别在室温下孵育20min，得到缀合物1的转染复合物1X1-1X8。

将一份1B溶液与Opti-MEM培养基50μL混合，室温下孵育20min，得到转染复合物1X’。

在上述培养SMMC-7721细胞的培养孔中，分别加入上述转染复合物1X1-1X8中的一种，均匀混合，加入量为100μL/孔，得到siRNA缀合物终浓度(以siRNA计)分别为500nM、100nM、20nM、4nM、0.8nM、0.16nM、0.032nM及0.0064nM的转染混合物。每个siRNA缀合物的转染复合物分别转染2个培养孔。得到含本公开的siRNA缀合物的转染混合物，记为测试组。

在另外两个培养孔中，分别加入转染复合物1X’，加入量为100μL/孔，得到不含siRNA缀合物的转染混合物，记为对照组。

将上述测试组和对照组的转染混合物在培养孔中转染4h后，每孔补加1ml含20％FBS的H-DMEM完全培养基。将24孔板置于CO₂培养箱继续培养24h。

随后，使用RNAVzol(购自威格拉斯生物技术(北京)有限公司，货号N002)根据说明书描述的方法提取各孔细胞中的总RNA。

对于每孔细胞，分别取1μg总RNA，使用反转录试剂盒GoldenstarTM RT6cDNASynthesis Kit(购自北京擎科新业生物技术有限公司，货号TSK301M)提供的试剂，其中选取GoldenstarTM Oligo(dT)17作为引物，按试剂盒说明书中反转录操作步骤配制反转录反应体系20μl，对细胞的总RNA进行反转录。反转录的条件为：将反转录反应体系置于50℃孵育50min，然后85℃孵育5min，最后4℃孵育30s，反应结束后，向各反转录反应体系加入DEPC水80μl，得到含cDNA的溶液。

对于每一反转录反应体系，分别取上述含cDNA的溶液5μl做模板，使用

SYBR qPCR SuperMix Plus试剂盒(购自近岸蛋白质科技有限公司，货号E096-01B)提供的试剂配置qPCR反应体系20μl，其中，用于扩增目标基因PNP和内参基因GAPDH的PCR引物序列如表6所示，每条引物的终浓度为0.25μM。将各qPCR反应体系置于ABIStepOnePlus Real-Time PCR仪上，使用三步法进行扩增，扩增程序为95℃预变性10min，然后95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重复上述变性、退火、延伸的过程共40次后，得到含有扩增了目标基因PNP和内参基因GAPDH的产物W。产物W随即依次经过95℃15s，60℃1min，95℃15s的孵育，实时荧光定量PCR仪分别收集产物W中目标基因PNP和内参基因GAPDH的溶解曲线，得到目标基因PNP和内参基因GAPDH的Ct值。

表6：引物信息

采用比较Ct(ΔΔCt)法，对各测试组中目标基因PNP进行相对定量计算，计算方法如下：

ΔCt(测试组)＝Ct(测试组目标基因)–Ct(测试组内参基因)

ΔCt(对照组)＝Ct(对照组目标基因)–Ct(对照组内参基因)

ΔΔCt(测试组)＝ΔCt(测试组)-ΔCt(对照组平均)

ΔΔCt(对照组)＝ΔCt(对照组)-ΔCt(对照组平均)

其中，ΔCt(对照组平均)是对照组两个培养孔各自的ΔCt(对照组)的算术平均值。从而，测试组和对照组的每一培养孔均对应一个ΔΔCt值。

以对照组为基准，对测试组PNP mRNA的表达水平进行归一化，定义对照组PNPmRNA表达水平为100％。

测试组PNP mRNA相对表达水平＝2^{-ΔΔCt(测试组)}×100％

利用Graphpad 5.0软件log(inhibitor)vs.response—Variable slope功能来拟合所述剂量-效应曲线，根据剂量-效应曲线计算各siRNA缀合物对PNP mRNA的IC₅₀值。具体来说，拟合获得的剂量-效应曲线符合以下计算公式：

式中：

Y是各测试组mRNA相对表达水平，

X为对应测试组所使用的siRNA终浓度的对数值，

Bot是稳态期底部的Y值，

Top是稳态期顶部的Y值，

X'是拟合获得的当Y在底部到顶部之间一半时的X值，而HillSlope则是拟合获得的曲线在X'处的斜率。

由该剂量-效应曲线和对应的计算公式，确定当Y＝50％时对应的X₅₀值，计算获得各siRNA的IC₅₀值＝10^X₅₀(nM)。

图1依次为依据转染了不同浓度的缀合物1后，SMMC-7721细胞中PNP mRNA相对表达水平拟合的剂量-效应曲线。其中以siRNA浓度的对数值(lg nM)为横坐标，以PNP mRNA相对表达水平(％)为纵坐标，每个圆点代表2个复孔中PNP mRNA相对表达水平的平均值。

缀合物1对PNP mRNA的IC₅₀值总结于表7中。

表7：siRNA缀合物的IC₅₀

由图1以及表7的结果可知，本公开提供的siRNA缀合物在体外SMMC-7721细胞中有很高的抑制PNP mRNA的活性，IC₅₀为0.692nM。

实验例3siRNA缀合物在SMMC-7721细胞中对PNP mRNA表达量的抑制效率检测

将SMMC-7721细胞以7.5×10⁴细胞/孔接种于24孔板中，16h后细胞生长密度达到70-80％时，吸尽培养孔中H-DMEM完全培养基，每孔加入500μl Opti-MEM培养基(GIBCO公司)继续培养1.5h。

用DEPC化水将下面的siRNA缀合物中的每一个分别配制成10μM的siRNA缀合物工作液，所用siRNA缀合物分别为L10-siPNa1M1S和阴性对照L10-NC2。

配制2A溶液，对于每一个siRNA缀合物，分别配制2A溶液，每份2A溶液依次含有上述10μM浓度的siRNA缀合物工作液3μl和Opti-MEM培养基50μl。

配制2B溶液，每份2B溶液含有1μl Lipofectamine^TM2000和50μl Opti-MEM培养基。

分别将一份2B溶液与得到的每个siRNA的2A溶液混合，分别室温下孵育20min，得到每个siRNA缀合物的转染复合物2X。

将一份2B溶液与Opti-MEM培养基50μl混合，室温下孵育20min，得到转染复合物2X’。

在培养孔中，分别加入每一个转染复合物2X，均匀混合，加入量为100μl/孔，得到每个siRNA缀合物终浓度分别约为50nM(以siRNA计)的转染复合物，每个转染复合物2X分别转染2个培养孔，得到含siRNA缀合物的转染混合物，记为测试组。

在另外2个培养孔中，分别加入转染复合物2X’，加入量为100μl/孔，得到不含siRNA缀合物的转染混合物，记为空白对照组。

将含siRNA缀合物的转染混合物和不含siRNA缀合物的转染混合物在培养孔中转染4h后，每孔补加1ml含20％FBS的H-DMEM完全培养基。将24孔板置于CO₂培养箱继续培养24h。

随后，使用RNAVzol(购自威格拉斯生物技术(北京)有限公司，货号N002)根据说明书记载的方法提取各孔细胞中的总RNA。

对于每孔细胞，分别取1μg总RNA，使用反转录试剂盒GoldenstarTM RT6cDNASynthesis Kit(购自北京擎科新业生物技术有限公司，货号TSK301M)提供的试剂，其中选取GoldenstarTM Oligo(dT)17作为引物，按试剂盒说明书中反转录操作步骤配置反转录反应体系20μl，对各孔细胞的总RNA进行反转录。反转录的条件为：对于每一反转录反应体系，将反转录反应体系置于50℃孵育50min，然后85℃孵育5min，最后4℃孵育30s，反应结束后，向反转录反应体系中加入DEPC水80μl，得到含cDNA的溶液。

SYBR qPCR SuperMix Plus试剂盒(购自近岸蛋白质科技有限公司，货号E096-01B)提供的试剂配置qPCR反应体系20μl，其中，用于扩增目标基因PNP和内参基因GAPDH的PCR引物序列如表4所示，每条引物的终浓度为0.25μM。将各qPCR反应体系置于ABIStepOnePlus Real-Time PCR仪上，使用三步法进行扩增，扩增程序为在95℃预变性10min，然后在95℃变性30s，在60℃退火30s，在72℃延伸30s，重复上述变性、退火、延伸的过程共40次后，得到含有扩增了目标基因PNP和内参基因GAPDH的产物W。产物W随即依次经过95℃15s，60℃1min，95℃15s的孵育，通过实时荧光定量PCR仪分别测定获得产物W中目标基因PNP和内参基因GAPDH的溶解曲线，得到目标基因PNP和内参基因GAPDH的Ct值。采用比较Ct(ΔΔCt)法，对各测试组中目标基因PNP进行相对定量计算，计算方法如下：

ΔCt(测试组)＝Ct(测试组目标基因)–Ct(测试组内参基因)

ΔCt(对照组)＝Ct(对照组目标基因)–Ct(对照组内参基因)

ΔΔCt(测试组)＝ΔCt(测试组)-ΔCt(对照组平均)

ΔΔCt(对照组)＝ΔCt(对照组)-ΔCt(对照组平均)

以对照组为基准，对测试组PNP mRNA的表达水平进行归一化，定义空白对照组PNPmRNA表达水平为100％，

测试组PNP mRNA相对表达水平＝2^{-ΔΔCt(测试组)}×100％

测试组PNP mRNA抑制率＝(1-测试组PNP mRNA相对表达水平)×100％

各siRNA对PNP mRNA的抑制率总结于表8中。对于同一测试组siRNA，mRNA抑制率是两个培养孔测定的测试组PNP mRNA抑制率的算术平均值。

表8：SMMC-7721细胞中PNP mRNA的抑制率

siRNA缀合物	编号	mRNA抑制率％
			缀合物1	L10-siPNa1M1S	84.89
缀合物NC2	L10-NC2	-6.85

由表8的结果可见，本公开提供的缀合物1在SMMC-7721细胞系中有较高的抑制活性，在50nM的siRNA浓度下，PNP mRNA抑制率达到84.89％。

实验例4siRNA缀合物在Huh7细胞中对PNP mRNA表达量的抑制效率检测

按照与实验例3相同的方法检测缀合物1的抑制率，区别在于，用Huh7细胞代替SMMC-7721细胞。缀合物1在体外Huh7细胞中的抑制活性如表9所示。

表9：Huh7细胞中PNP mRNA的抑制

siRNA缀合物	编号	mRNA抑制率％
			缀合物1	L10-siPNa1M1S	73.82
缀合物NC2	L10-NC2	-4.73

由表9的结果可见，本公开提供的缀合物1在Huh7细胞系中有较高的抑制活性，在50nM的siRNA浓度，PNP mRNA抑制率高达73.82％。

实验例5siRNA缀合物在猴原代肝细胞中对PNP mRNA表达量的抑制效率检测

在I型胶原蛋白包被的组织培养皿中接种猴原代肝细胞(购自上海妙顺生物科技有限公司)，在含有1×双抗(Penicillin-Streptomycin，Gibco，Invitrogen公司)和10％胎牛血清(FBS，Hyclone公司)的RPMI 1460培养基中，于37℃在含5％CO₂/95％空气的培养箱中培养30min。

弃去培养基，以opti-MEM(GIBCO公司)调整猴原代肝细胞密度至8×10⁵细胞/mL，得到猴原代肝细胞悬液。随后在24孔板的不同培养孔中分别加入得到的猴原代肝细胞悬液，将猴原代肝细胞接种到培养孔中。加入猴原代肝细胞悬液的体积为0.5mL/孔，猴原代肝细胞数量为4×10⁵细胞/孔。

用DEPC水将以下siRNA缀合物中的每一个分别配制成80μM、40μM、20μM(以siRNA计)的共3种不同浓度的siRNA缀合物工作液。所用siRNA缀合物分别为缀合物1和缀合物NC1。

配制4A溶液，对于每一个siRNA缀合物,分别配制4A溶液，每份4A溶液依次含有上述siRNA缀合物工作液1.5μl和Opti-MEM培养基(GIBCO公司)48.5μl。

配制4B溶液，每份4B溶液含有1μl Lipofectamine^TM2000和50μl Opti-MEM培养基。

分别将一份4B溶液与得到的每个siRNA缀合物的4A溶液混合，分别室温下孵育20min，得到每个siRNA缀合物的转染复合物4X。

将一份4B溶液与Opti-MEM培养基50μl混合，在室温下孵育20min，得到转染复合物4X’。

在培养孔中，分别加入每一个siRNA缀合物的转染复合物4X，均匀混合，加入量为100μl/孔，得到每个siRNA缀合物终浓度(以siRNA计)分别约为200nM、100nM和50nM的转染复合物，每个siRNA的转染复合物4X分别转染2个培养孔，得到含缀合物1的转染混合物和含缀合物NC1的转染混合物，记为测试组。

在另外2个培养孔中，加入转染复合物4X’，加入量为100μl/孔，得到不含siRNA的转染混合物，记为空白对照组。

将含缀合物1的转染混合物、含缀合物NC1的转染混合物和不含siRNA的转染混合物分别在培养孔中转染4h后，每孔补加1ml OptiCμLture Hepatocyte Media培养基。将24孔板置于含5％CO₂/95％空气的培养箱在37℃下继续培养24h。

随后，使用RNAVzol(购自威格拉斯生物技术(北京)有限公司，货号N002)根据说明书记载的方法提取各孔细胞中的总RNA，分别得到含总RNA的溶液。

对于每孔细胞，分别取含1μg总RNA的溶液，使用反转录试剂盒Goldenstar^TM RT6cDNA Synthesis Kit(购自北京擎科新业生物技术有限公司，货号TSK301M)提供的试剂，其中选取Goldenstar^TM Oligo(dT)₁₇作为引物，按试剂盒说明书中反转录操作步骤配制反转录反应体系20μl，对各孔细胞的总RNA进行反转录。反转录的条件为：对于每一反转录反应体系，将反转录反应体系置于50℃孵育50min，然后85℃孵育5min，最后4℃孵育30s，反应结束后，向反转录反应体系中加入DEPC水80μl，得到含cDNA的溶液。

SYBR qPCR SuperMix Plus试剂盒(购自近岸蛋白质科技有限公司，货号E096-01B)提供的试剂配置qPCR反应体系20μl，其中，用于扩增目标基因PNP和内参基因GAPDH的PCR引物序列如表4所示，每条引物的终浓度为0.25μM。将各qPCR反应体系置于ABIStepOnePlus Real-Time PCR仪上，使用三步法进行扩增，扩增程序为在95℃预变性10min，然后在95℃变性30s，在60℃退火30s，在72℃延伸30s，重复上述变性、退火、延伸的过程共40次后，得到含有扩增了目标基因PNP和内参基因GAPDH的产物W。产物W随即依次经过95℃15s，60℃1min，95℃15s的孵育，通过实时荧光定量PCR仪分别测定获得产物W中目标基因PNP和内参基因GAPDH的溶解曲线，得到目标基因PNP和内参基因GAPDH的Ct值。

对于上述各测试组和对照组，分别进行2次上述定量PCR检测。

ΔCt(测试组)＝Ct(测试组目标基因)–Ct(测试组内参基因)

ΔCt(对照组)＝Ct(对照组目标基因)–Ct(对照组内参基因)

ΔΔCt(测试组)＝ΔCt(测试组)-ΔCt(对照组平均)

ΔΔCt(对照组)＝ΔCt(对照组)-ΔCt(对照组平均)

其中，ΔCt(对照组平均)是空白对照组两次检测测得的ΔCt(对照组)的算术平均值。从而，各测试组和空白对照组的每一次检测结果均对应一个ΔΔCt值。

以对照组为基准，对测试组PNP mRNA的表达水平进行归一化，定义对照组PNPmRNA表达水平为100％，

测试组PNP mRNA相对表达水平＝2^{-ΔΔCt(测试组)}×100％

测试组PNP mRNA抑制率＝(1-测试组PNP mRNA相对表达水平)×100％

图2为依次转染了本公开的siRNA缀合物1以及参比缀合物NC1后，猴原代肝细胞中PNP mRNA相对表达水平的柱状图。进一步地，根据上述计算式由图2中的PNP mRNA相对表达水平计算PNP mRNA的抑制率，不同浓度下缀合物1和缀合物NC1对PNP mRNA的抑制率总结于表10中。

表10猴原代肝细胞中PNP mRNA的抑制率

由表10的结果可见，本公开提供的siRNA缀合物在猴原代肝细胞中显示出较高的PNP mRNA抑制活性，在50nM的siRNA浓度下，PNP mRNA抑制率达到76.79％。

以上详细描述了本公开的一些实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述一些实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

序列表

<110> 苏州瑞博生物技术股份有限公司

<120> 一种核酸、含有该核酸的药物组合物与siRNA缀合物及制备方法和用途

<130> CP1211162-201052/CB

<150> CN202011596596.8

<151> 2020-12-29

<160> 75

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> n为A

<400> 1

cuaaaucacc agagaccan 19

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n为U

<400> 2

nuggucucug gugauuuag 19

<210> 3

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> n选自A、U、G或C

<400> 3

cuaaaucacc agagaccan 19

<210> 4

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n选自A、U、G或C

<400> 4

nuggucucug gugauuuag 19

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> n选自A、U、G或C

<400> 5

cuaaaucacc agagaccan 19

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n选自A、U、G或C

<400> 6

nuggucucug gugauuuaga u 21

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> n选自A、U、G或C

<400> 7

aucuaaauca ccagagacca n 21

<210> 8

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n选自A、U、G或C

<400> 8

nuggucucug gugauuuaga uaa 23

<210> 9

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 9

cuaaaucacc agagaccaa 19

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 10

uuggucucug gugauuuaga u 21

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 11

aucuaaauca ccagagacca a 21

<210> 12

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 12

uuggucucug gugauuuaga uaa 23

<210> 13

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 13

cuaaaucacc agagaccaa 19

<210> 14

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 14

uuggucucug gugauuuaga u 21

<210> 15

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 15

aucuaaauca ccagagacca a 21

<210> 16

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 16

uuggucucug gugauuuaga uaa 23

<210> 17

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 17

cuaaaucacc agagaccaa 19

<210> 18

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 18

uuggucucug gugauuuaga u 21

<210> 19

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 19

aucuaaauca ccagagacca a 21

<210> 20

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 20

uuggucucug gugauuuaga uaa 23

<210> 21

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 21

cuaaaucacc agagaccaa 19

<210> 22

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 22

uuggucucug gugauuuaga u 21

<210> 23

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 23

aucuaaauca ccagagacca a 21

<210> 24

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 24

uuggucucug gugauuuaga uaa 23

<210> 25

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 25

cuaaaucacc agagaccaa 19

<210> 26

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 26

uuggucucug gugauuuaga u 21

<210> 27

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 27

aucuaaauca ccagagacca a 21

<210> 28

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 28

uuggucucug gugauuuaga uaa 23

<210> 29

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 29

cuaaaucacc agagaccaa 19

<210> 30

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 30

uuggucucug gugauuuaga u 21

<210> 31

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 31

aucuaaauca ccagagacca a 21

<210> 32

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 32

uuggucucug gugauuuaga uaa 23

<210> 33

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 33

cuaaaucacc agagaccaa 19

<210> 34

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 34

uuggucucug gugauuuaga u 21

<210> 35

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 35

aucuaaauca ccagagacca a 21

<210> 36

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 36

uuggucucug gugauuuaga uaa 23

<210> 37

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 37

cuaaaucacc agagaccaa 19

<210> 38

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 38

uuggucucug gugauuuaga u 21

<210> 39

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 39

aucuaaauca ccagagacca a 21

<210> 40

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 40

uuggucucug gugauuuaga uaa 23

<210> 41

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 41

cuaaaucacc agagaccaa 19

<210> 42

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 42

uuggucucug gugauuuaga u 21

<210> 43

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 43

aucuaaauca ccagagacca a 21

<210> 44

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 44

uuggucucug gugauuuaga uaa 23

<210> 45

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 45

cuaaaucacc agagaccaa 19

<210> 46

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 46

uuggucucug gugauuuaga u 21

<210> 47

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 47

aucuaaauca ccagagacca a 21

<210> 48

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 48

uuggucucug gugauuuaga uaa 23

<210> 49

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 49

cuaaaucacc agagaccaa 19

<210> 50

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 50

uuggucucug gugauuuaga u 21

<210> 51

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 51

aucuaaauca ccagagacca a 21

<210> 52

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 52

uuggucucug gugauuuaga uaa 23

<210> 53

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 53

cuaaaucacc agagaccaa 19

<210> 54

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 54

uuggucucug gugauuuaga u 21

<210> 55

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 55

aucuaaauca ccagagacca a 21

<210> 56

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 56

uuggucucug gugauuuaga uaa 23

<210> 57

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 57

cuaaaucacc agagaccaa 19

<210> 58

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 58

uuggucucug gugauuuaga u 21

<210> 59

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 59

aucuaaauca ccagagacca a 21

<210> 60

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 60

uuggucucug gugauuuaga uaa 23

<210> 61

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 61

cuaaaucacc agagaccaa 19

<210> 62

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 62

uuggucucug gugauuuaga u 21

<210> 63

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 63

uucuccgaac gugucacgu 19

<210> 64

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 64

acgugacacg uucggagaac u 21

<210> 65

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 65

uucuccgaac gugucacgu 19

<210> 66

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 66

acgugacacg uucggagaac u 21

<210> 67

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 67

actggtgttt gggttcctga 20

<210> 68

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 68

tcctgctgca ttggtgacta 20

<210> 69

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 69

ggtcggagtc aacggattt 19

<210> 70

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 70

ccagcatcgc cccacttga 19

<210> 71

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 71

cuaaaucacc agagaccaa 19

<210> 72

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 72

uuggucucug gugauuuaga u 21

<210> 73

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 73

uucuccgaac gugucacgu 19

<210> 74

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> siRNA

<400> 74

acgugacacg uucggagaac u 21

<210> 75

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 目标序列

<400> 75

atctaaatca ccagagacca a 21

Claims

1.一种siRNA，所述siRNA含有正义链和反义链，所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中，所述正义链含有一段核苷酸序列I，反义链含有一段核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，其中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：

5'-CUAAAUCACCAGAGACCAZ₁-3'(SEQ ID NO:1)；

5'-Z₂UGGUCUCUGGUGAUUUAG-3'(SEQ ID NO:2)，

2.如权利要求1所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异。

3.如权利要求1或2所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列之间的核苷酸差异包括Z₄位置处的差异，且Z₄选自A、C或G。

4.如权利要求1-3中任一项所述的siRNA，其中Z₃是与Z₄互补的核苷酸。

5.如权利要求1-4中任一项所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补；所述基本上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于3个的碱基错配；所述实质上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；完全反向互补是指两个核苷酸序列之间没有错配。

6.如权利要求1-5中任一项所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列I是SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，所述核苷酸序列II是SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列：

5'-CUAAAUCACCAGAGACCAZ₃-3'(SEQ ID NO:3)；

5'-Z₄UGGUCUCUGGUGAUUUAG-3'(SEQ ID NO:4)，

其中，Z₃选自A、U、G或C，Z₄是与Z₃互补的核苷酸。

7.如权利要求6所述的siRNA，其中Z₃为A，Z₄为U。

8.如权利要求1-7中任一项所述的siRNA，其中，所述正义链还含有核苷酸序列III，所述反义链还含有核苷酸序列IV，核苷酸序列III和核苷酸序列IV的长度各自独立地为1-4个核苷酸，所述核苷酸序列III连接在核苷酸序列I的5'末端，核苷酸序列IV连接在核苷酸序列II的3'末端，所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV长度相等并且实质上反向互补或完全反向互补；所述实质上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；完全反向互补是指两个核苷酸序列之间没有错配。

9.如权利要求8所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，并且，所述核苷酸序列III和IV的长度均为1个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基为U；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基组成为AU；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基组成为UAU；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基组成为UUAU。

10.如权利要求1-9中任一项所述的siRNA，其中，所述反义链还含有核苷酸序列V，核苷酸序列V的长度为1至3个核苷酸，连接在所述反义链的3'末端，构成反义链的3'突出端；

或者所述核苷酸序列V的长度为2个核苷酸；

或者所述核苷酸序列V为连续的两个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸或连续的两个尿嘧啶核糖核苷酸，

或者所述核苷酸序列V与靶mRNA相应位置的核苷酸互补。

11.如权利要求1-10中任一项所述的siRNA，其中，所述siRNA的正义链含有如SEQ IDNO:5所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列：

5'-CUAAAUCACCAGAGACCAZ₃-3'(SEQ ID NO:5)；

5'-Z₄UGGUCUCUGGUGAUUUAGAU-3'(SEQ ID NO:6)；

或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列：

5'-AUCUAAAUCACCAGAGACCAZ₃-3'(SEQ ID NO:7)；

5'-Z₄UGGUCUCUGGUGAUUUAGAUAA-3'(SEQ ID NO:8)；

12.如权利要求1-11中任一项所述的siRNA，其中，所述siRNA为siPNa1或siPNa2中的任意一种。

13.如权利要求1-12中任一项所述的siRNA，其中，所述正义链或所述反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基。

14.如权利要求1-13中任一项所述的siRNA，其中，所述正义链和所述反义链中的每一个核苷酸独立地为氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸。

15.如权利要求14所述的siRNA，其中，所述氟代修饰的核苷酸位于核苷酸序列I和核苷酸序列II中，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的至少第7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的至少第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸；优选地，按照5'末端到3'末端的方向，在所述正义链中，所述核苷酸序列I的第7、8、9位或者5、7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，在所述反义链中，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16位或者2、6、8、9、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸。

16.如权利要求14-15中任一项所述的siRNA，其中，每一个非氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物中的一种。

17.如权利要求16所述的siRNA，其中，每一个非氟代修饰的核苷酸均为甲氧基修饰的核苷酸，所述甲氧基修饰的核苷酸指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。

18.如权利要求1-17中任一项所述的siRNA，其中，所述siRNA为siPNa1-M1、siPNa2-M1、siPNa1-M2、siPNa2-M2、siPNa1-M3或siPNa2-M3中的任意一种。

19.如权利要求13所述的siRNA，其中，所述具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基，所述硫代磷酸酯基连接存在于由以下位置组成的组中的至少一处：

所述正义链的5'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；

所述正义链的5'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；

所述正义链的3'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；

所述正义链的3'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；

所述反义链的5'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；

所述反义链的5'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；

所述反义链的3'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；以及

所述反义链的3'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间。

20.如权利要求1-19中任一项所述的siRNA，其中，所述siRNA为siPNa1-M1S、siPNa2-M1S、siPNa1-M2S、siPNa2-M2S、siPNa1-M3S或siPNa2-M3S中的任意一种。

21.如权利要求1-20中任一项所述的siRNA，其中，所述反义链的5'末端核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸。

22.如权利要求1-21中任一项所述的siRNA，其中，所述siRNA为siPNa1-M1P1、siPNa2-M1P1、siPNa1-M2P1、siPNa2-M2P1、siPNa1-M3P1、siPNa2-M3P1、siPNa1-M1SP1、siPNa2-M1SP1、siPNa1-M2SP1、siPNa2-M2SP1、siPNa1-M3SP1或siPNa2-M3SP1中的任意一种。

23.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有权利要求1-22中任意一项所述的siRNA和药学上可接受的载体。

24.如权利要求23所述的药物组合物，其中，所述siRNA与药学上可接受的载体的重量比为1:(1-500)；优选地，所述siRNA与药学上可接受的载体的重量比为1:(1-50)。

25.一种siRNA缀合物，所述siRNA缀合物含有权利要求1-23中任意一项所述的siRNA以及缀合连接至该siRNA的缀合基团。

26.如权利要求25所述的siRNA缀合物，其中，所述缀合基团包含药学上可接受的靶向基团和接头，并且，所述siRNA、所述接头和所述靶向基团依次共价或非共价连接。

27.权利要求1-22中任意一项所述的siRNA、权利要求23或24所述的药物组合物和/或权利要求25或26所述的siRNA缀合物在制备用于治疗和/或预防尿酸代谢异常或其引发的疾病或生理状况的药物中的用途。

28.如权利要求27所述的用途，其中，所述尿酸代谢异常引发的疾病或生理状况为高尿酸血症或痛风症。

29.一种治疗和/或预防尿酸代谢异常或其引发的疾病或生理状况的方法，所述方法包括将有效量的权利要求1-22中任意一项所述的siRNA、权利要求23或24所述的药物组合物和/或权利要求25或26所述的siRNA缀合物给予有需要的受试者。

30.如权利要求29所述的方法，其中，所述尿酸代谢异常引发的疾病或生理状况为高尿酸血症或痛风症。

31.一种抑制肝细胞中PNP基因表达的方法，该方法包括将有效量的权利要求1-22中任意一项所述的siRNA、权利要求23或24所述的药物组合物和/或权利要求25或26所述的siRNA缀合物与所述肝细胞接触。

32.一种试剂盒，其中，该试剂盒含有权利要求1-22任意一项所述的siRNA、权利要求23或24所述的药物组合物和/或权利要求25或26所述的siRNA缀合物。