CN113528516A - 核酸、含有该核酸的药物组合物与siRNA缀合物及制备方法和用途 - Google Patents
核酸、含有该核酸的药物组合物与siRNA缀合物及制备方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本公开提供了一种抑制血管紧张素转化酶2(ACE2)基因表达的siRNA，含有该siRNA的药物组合物和缀合物。所述siRNA含有正义链和反义链，所述的siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中，所述正义链含有一段核苷酸序列I，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，所述反义链含有核苷酸序列II，所述核苷酸序列II与SEQIDNO:2所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异。本公开提供的siRNA及其药物组合物和缀合物，可以有效治疗和/或预防新型冠状病毒病。
Description
技术领域
本公开涉及一种能够抑制血管紧张素转化酶2(ACE2)基因表达的核酸和含有该核酸的药物组合物与siRNA缀合物。本公开还涉及这些核酸、药物组合物与siRNA缀合物的制备方法和用途。
背景技术
2019冠状病毒病(Corona Virus Disease 2019，下称COVID-19，旧称NCP，即新型冠状病毒肺炎)，是指2019年被发现的严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe AcuteRespiratory Syndrome Coronavirus 2，下称SARS-CoV-2病毒或新型冠状病毒，旧称2019-nCoV)感染引发的以急性呼吸道传染病为主要特征的疾病。COVID-19的病程发展较为迅速，患者的主要临床表现为发热、乏力、干咳，鼻塞、流涕等上呼吸道症状少见，会出现缺氧低氧状态。约半数患者多在一周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。因此，急需一种能够预防或治疗由SARS-CoV-2病毒的表达引起的疾病或生理状况，尤其是COVID-19的药物。
发明内容
研究表明，ACE2基因编码的蛋白是多种冠状病毒、特别是SARS-CoV-2病毒进入细胞的细胞表面受体。例如，Zhou,P.,Yang,XL.,Wang,XG.等人报道(参见A pneumoniaoutbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin.Nature 579,270–273(2020))，体外实验证明，对于SARS-CoV-2病毒仅能够感染表达ACE2的受体的细胞，而对于未表达ACE2的细胞，均不能感染新型冠状病毒。
鉴于此，若能从基因水平沉默ACE2基因表达，就可以有效阻断各种冠状病毒，例如SARS-CoV-2病毒进入细胞的途径，起到预防和/或治疗冠状病毒引发的疾病，特别是，例如SARS-CoV-2病毒引起的COVID-19的作用。小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)可基于RNA干扰(RNA interference，RNAi)这一机制，以序列特异性的方式抑制或阻断任何感兴趣的目的基因的表达，从而达到治疗疾病的目的。
因此，发明人作出如下发明。
在一些实施方式中，本公开提供了第一种能够抑制ACE2基因表达的siRNA，该siRNA含有正义链和反义链，所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中，所述正义链含有一段核苷酸序列I，所述反义链含有一段核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II选自如下i)、ii)所示序列中的一组：
i)所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5'-CUCUGUUCCAUGUUUCUAZ1-3'(SEQ ID NO:1)，
5'-Z2UAGAAACAUGGAACAGAG-3'(SEQ ID NO:2)；
其中，Z1为A，Z2为U，所述核苷酸序列I中包含位置对应于Z1的核苷酸Z3，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Z2的核苷酸Z4，所述Z4是所述反义链5'末端的第一个核苷酸。
ii)所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:61所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:62所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5'-GGGAUAAUCUAAAUGUAAZ5-3'(SEQ ID NO:61)，
5'-Z6UUACAUUUAGAUUAUCCC-3'(SEQ ID NO:62)；
其中，Z5为A，Z6为U，所述核苷酸序列I中包含位置对应于Z5的核苷酸Z7，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Z6的核苷酸Z8，所述Z8是所述反义链5'末端的第一个核苷酸。
在一些实施方式中，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有本公开的siRNA和药学上可接受的载体。
在一些实施方式中，本公开提供了一种siRNA缀合物，所述siRNA缀合物含有本公开提供的siRNA以及缀合连接至该siRNA的缀合基团。
在一些实施方式中，本公开提供了本公开的siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物在制备用于治疗和/或预防由冠状病毒引起的相关疾病的药物中的用途；可选地，所述冠状病毒是SARS-CoV-2病毒；可选地，所述疾病是COVID-19。
在一些实施方式中，本公开提供了一种治疗和/或冠状病毒引起的疾病的方法，所述方法包括将有效量的本公开的siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物给予患有所述冠状病毒引起的疾病的受试者；可选地，所述冠状病毒是SARS-CoV-2病毒；可选地，所述疾病是COVID-19。
在一些实施方式中，本公开提供了一种抑制细胞中ACE2基因表达的方法，该方法包括将有效量的本公开的siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物与所述细胞接触。
在一些实施方式中，本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有本公开的siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物。
以引用的方式并入
本说明书中提及的所有出版物、专利以及专利申请均以引用的方式并入本文，其程度与每一单独的出版物、专利或专利申请均专门并且单独地以引用的方式并入本文的程度相同。
有益效果
本公开提供的siRNA、药物组合物和siRNA缀合物具有良好的稳定性，较高的ACE2基因抑制活性，很低的脱靶效应，和/或能显著治疗或缓解由SARS-Cov-2病毒引起的疾病的症状。
在一些实施方式中，本公开提供的siRNA、药物组合物或siRNA缀合物在体外细胞实验中显示出优异的靶基因抑制活性。在一些实施方式中，本公开提供的siRNA、药物组合物或siRNA缀合物在细胞中显示出至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％的靶基因表达抑制率。在一些实施方式中，0.1nM的siRNA浓度下，本公开提供的siRNA在在体外psiCheck系统中显示出至少61.36％的目标序列表达量抑制率；在10nM的siRNA浓度下，本公开提供的siRNA在体外psiCheck系统中显示出至少97.10％，甚至可达99.15％的目标序列表达量抑制率。在一些实施方式中，在稳定表达hACE2的HEK293A-ACE2半稳转细胞中，本公开提供的siRNA显示出至少82.60％、甚至可达90.17％的ACE2 mRNA表达量抑制率，并且不同长度和修饰方案的本公开siRNA均有很高的抑制效率。在一些实施方式中，本公开的经修饰的siRNA在体外人源和鼠源溶酶体裂解液中均显示出十分优异的抗酶解稳定性。
在一些实施方式中，本公开提供的siRNA、药物组合物或siRNA缀合物可在体内具有更高的稳定性和/或更高的活性。在一些实施方式中，本公开提供的siRNA、药物组合物或siRNA缀合物在体内显示出至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％的靶基因表达抑制率。在一些实施方式中，本公开提供的siRNA、药物组合物或siRNA缀合物在体内显示出至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％的ACE2基因表达抑制率。在一些实施方式中，本公开提供的siRNA、药物组合物或siRNA缀合物在体内显示出至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％的肺内ACE2基因表达抑制率。在一些实施方式中，本公开提供的siRNA、药物组合物或siRNA缀合物在体内显示出至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％的动物模型中肺内ACE2基因表达抑制率。在一些实施方式中，本公开提供的siRNA、药物组合物或siRNA缀合物在体内显示出至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％的人类受试者中肺内ACE2基因表达抑制率。
在一些实施方式中，本公开提供的siRNA、药物组合物或siRNA缀合物未显示出明显脱靶效应。脱靶效应可以是例如抑制非靶基因的基因正常表达的mRNA。据认为，如果脱靶基因表达的mRNA的结合/抑制与在靶基因表达的mRNA的效果相比低于50％、40％、30％、20％或10％时，该脱靶效应就是不显著的。
由此说明，本公开提供的siRNA、药物组合物以及siRNA缀合物能够抑制ACE2基因的表达，有效治疗和/或预防由SARS-CoV-2病毒引起的相关疾病症状，具有良好的应用前景。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是不同浓度的本公开siRNA和参比siRNA在体外HEK293A细胞中的靶基因抑制活性。
图2是不同浓度的本公开siRNA和参比siRNA在体外HEK293A细胞中的靶基因抑制活性。
图3是在不同浓度下，不同长度的本公开siRNA和参比siRNA在体外HEK293A-hACE2半稳转细胞中的靶基因抑制活性。
图4是不同浓度下，不同修饰的本公开siRNA和参比siRNA在体外HEK293A-hACE2半稳转细胞中的靶基因抑制活性。
图5是本公开siRNA在体外人源溶酶体裂解液中的稳定性。
图6是本公开siRNA在体外鼠源溶酶体裂解液中的稳定性。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
在本公开中，ACE2 mRNA是指Genbank注册号为NM_001371415.1所示的序列。进一步地，若无其它说明，本公开中所使用的术语“靶基因”是指编码上述ACE2 mRNA的基因，术语“靶mRNA”是指上述ACE2 mRNA。
定义
在上文及下文中，冠状病毒是指在系统分类上属套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)的病毒。冠状病毒属的病毒是具囊膜(envelope)、基因组为线性单股正链的RNA病毒。在一些实施方式中，本文所述冠状病毒，包括但不限于能感染人的HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2病毒。在一些实施方式中，本文所述冠状病毒是SARS-COV-2病毒。在一些实施方式中，冠状病毒引起的疾病包括但不限于普通感冒、呼吸道感染、严重急性呼吸综合征(SARS)、中东呼吸综合征(MERS)和新型冠状病毒病(COVID-19)。在一些实施方式中，本文所述冠状病毒引起的疾病是COVID-19。如无特别说明，COVID-19指发现于2019年的新型冠状病毒病，或称为新型冠状肺炎。SARS-COV-2病毒指引起COVID-19的新型冠状病毒及其变体中的一种，旧称为2019-nCoV。所述变体指SARS-COV-2病毒基因突变后的病毒。
在上文及下文中，所述“氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代形成的核苷酸，“非氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物。“核苷酸类似物”指能够在核酸中代替核苷酸，但结构不同于腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的基团。如异核苷酸、桥联的核苷酸(bridged nucleic acid，简称BNA)或无环核苷酸。所述“甲氧基修饰的核苷酸”指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
在本文的上下文中，表述“互补”或“反向互补”可互相替代使用，并具有本领域技术人员周知的含义，即，在双链核酸分子中，一条链的碱基各自与另一条链上的碱基以互补的方式相配对。在DNA中，嘌呤碱基腺嘌呤(A)始终与嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)(或者在RNA中为尿嘧啶(U))相配对；嘌呤碱基鸟嘌呤(C)始终与嘧啶碱基胞嘧啶(G)相配对。每个碱基对都包括一个嘌呤和一个嘧啶。当一条链上的腺嘌呤始终与另一条链上的胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配对，以及鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对时，两条链被认为是彼此相互补的，以及从其互补链的序列中可以推断出该链的序列。与此相应地，“错配”在本领域中意指在双链核酸中，对应位置上的碱基并未以互补的形式配对存在。
在上文及下文中，如无特别说明，“基本上反向互补”是指所涉及的两段核苷酸序列之间存在不多于3个的碱基错配；“实质上反向互补”是指两段核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；“完全反向互补”是指两段核苷酸序列之间不存在碱基错配。
在上文及下文中，一个核苷酸序列与另外一个核苷酸序列存在“核苷酸差异”，是指前者与后者相比，相同位置的核苷酸的碱基种类发生了改变，例如，在后者中一个核苷酸碱基为A时，在前者的相同位置处的对应核苷酸碱基为U、C、G或者T的情况下，认定为两个核苷酸序列之间在该位置处存在核苷酸差异。在一些实施方式中，以无碱基核苷酸或其等同物代替原位置的核苷酸时，也可认为在该位置处产生了核苷酸差异。
在上文及下文中，特别是在描述本公开的siRNA、药物组合物或siRNA缀合物的制备方法时，除非特别说明，所述核苷单体(nucleoside monomer)指，根据欲制备的siRNA或siRNA缀合物中核苷酸的种类和顺序，亚磷酰胺固相合成中使用的修饰或未修饰的核苷亚磷酰胺单体(unmodified or modified RNA phosphoramidites，有时RNAphosphoramidites也称为Nucleoside phosphoramidites)。亚磷酰胺固相合成为本领域技术人员所公知的RNA合成中所用的方法。本公开所用的核苷单体均可商购得到。
在本公开的上下文中，除非另有说明，“缀合”是指两个或多个各自具有特定功能的化学部分之间以共价连接的方式彼此连接；相应地，“缀合物”是指该各个化学部分之间通过共价连接而形成的化合物。进一步地，“siRNA缀合物”表示一个或多个具有特定功能的化学部分共价连接至siRNA上而形成的化合物。siRNA缀合物应根据上下文，理解为多个siRNA缀合物的总称或者某个化学式所示的siRNA缀合物。在本公开的上下文中，“缀合分子”应当理解为可通过反应缀合至siRNA，最终形成本公开的siRNA缀合物的特定化合物。
如本文所使用的，“任选的”或“任选地”是指其后描述的事件或状况可以发生或不发生，并且该描述包括事件或状况发生的情况和不发生的情况。例如，“任选地取代”的“烷基”包括下文定义的“烷基”和“取代烷基”。本领域技术人员将理解的是，对于包含一个或多个取代基的任何基团，这些基团不打算引入空间上不切实际、合成上不可行和/或本身不稳定的任何取代或取代模式。
如本文所使用的，“烷基”是指具有指定数量的碳原子的直链和支链，所述数量通常为1至20个碳原子，例如1至10个碳原子，如1至8个或1至6个碳原子。例如，C1-C6烷基包含1至6个碳原子的直链和支链烷基。当提及具有特定数量的碳的烷基残基时，旨在涵盖具有该数量的碳的所有支链和直链形式；因此，例如，“丁基”意味着包括正丁基、仲丁基、异丁基和叔丁基；“丙基”包括正丙基和异丙基。亚烷基是烷基的子集，指与烷基相同、但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的不饱和支链或直链烷基，所述碳-碳双键是通过从母体烷基的相邻碳原子中除去一分子氢而获得的。该基团可以处于双键的顺式或反式构型。典型的烯基基团包括但不限于：乙烯基；丙烯基，如丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基(烯丙基)、丙-2-烯-2-基；丁烯基，例如丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1,3-二烯-1-基、丁-1,3-二烯-2-基等等。在某些实施方式中，烯基基团具有2到20个碳原子，而在其他实施方式中，具有2至10个、2至8个或2至6个碳原子。亚烯基是烯基的一个子集，指与烯基相同、但具有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“炔基”是指具有至少一个碳-碳三键的不饱和支链或直链烷基，所述碳-碳三键是通过从母体烷基的相邻碳原子中除去两分子氢而获得的。典型的炔基基团包括但不限于：乙炔基；丙炔基，如丙-1-炔-1-基，丙-2-炔-1-基；丁炔基，例如丁-1-炔-1-基，丁-1-炔-3-基，丁-3-炔-1-基等。在某些实施方式中，炔基具有2到20个碳原子，而在其他实施方式中，具有2至10、2至8或2至6个碳原子。亚炔基是炔基的一个子集，指的是与炔基相同、但有两个连接点的残基。
如本文所使用的，“烷氧基”是指通过氧桥连接的指定数量碳原子的烷基，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、2-戊氧基、异戊氧基、新戊氧基、己氧基、2-己氧基、3-己氧基、3-甲基戊氧基等。烷氧基通常具有1至10个、1至8个、1至6个，或1至4个通过氧桥连接的碳原子。
如本文所使用的，“芳基”是指通过从环碳原子中除去氢原子而衍生自芳香族单环或多环烃环系统形成的基团。所述芳香族单环或多环烃环系统仅含有氢和6至18个碳原子的碳，其中所述环系统中的至少一个环是完全不饱和的，即，包含根据Hückel理论的环状、离域的(4n+2)π-电子体系。芳基包括但不限于苯基、芴基和萘基等基团。亚芳基是芳基的子集，指与芳基相同、但具有两个连接点的残基。
“杂芳基”指由3-至18-元芳香环自由基衍生而成的基团，包含2个至17个碳原子和选自氮、氧和硫的1至6个杂原子。如本文所使用的，杂芳基可以是单环、双环、三环或四环系统，其中环系统中的至少一个环是完全不饱和的，即，包含根据Hückel理论的环状离域(4n+2)π-电子体系。杂芳基包括稠环或桥环系统。杂芳基中的杂原子被任选地氧化。一个或多个氮原子(如果存在的话)任选地被季铵化。杂芳基通过任何环原子附着至分子的其余部分。杂芳基的实例包括但不限于：氮杂环庚三烯基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并吲哚基、1,3-苯并二噁唑基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并[d]噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1,4]二噁庚英基(benzo[b][1,4]dioxepinyl)、苯并[b][1,4]噁嗪基(benzo[b][1,4]oxazinyl)、1,4-苯并二噁烷基(1,4-benzodioxanyl)、苯并萘并呋喃基、苯并噁唑基、苯并间二氧杂环戊烯基(benzodioxolyl)、苯并二噁英基(benzodioxinyl)、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基、苯并噻吩并[3,2-d]嘧啶基、苯并三唑基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、咔唑基、噌啉基(cinnolinyl)、环戊烷并[d]嘧啶基、6,7-二氢-5H-环戊烷并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6-二氢苯并[h]喹唑啉基(5,6-dihydrobenzo[h]quinazolinyl)、5,6-二氢苯并[h]噌啉基(5,6dihydrobenzo[h]cinnolinyl)、6,7-二氢-5H-苯并[6,7]环庚烷并[1,2-c]哒嗪基、二苯并呋喃基、二苯并噻吩基、呋喃基、呋喃酮基、呋喃并[3,2-c]吡啶基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]嘧啶基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]哒嗪基、5,6,7,8,9,10-六氢环辛烷并[d]吡啶基、异噻唑基、咪唑基、吲唑基(indazolyl)、吲哚基、异吲哚基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、异喹啉基、吲哚嗪基(indolizinyl)、异噁唑基、5,8-甲醇-5,6,7,8-四氢喹唑啉基(5,8-methano-5,6,7,8-tetrahydroquinazolinyl)、萘啶基(naphthyridinyl)、1,6-萘啶酮基(1,6-naphthyridinonyl)、噁二唑基、2-氧杂吖庚因基(2-oxoazepinyl)、噁唑基、氧杂环丙烷基(oxiranyl)、5,6,6a,7,8,9,10,10a-八氢苯并[H]喹唑啉基、1-苯基-1H-吡咯基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、酞嗪基(phthalazinyl)、蝶啶基(pteridinyl)、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡唑并[3,4-d]嘧啶基、吡啶基、吡啶并[3,2-d]嘧啶基、吡啶并[3,4-d]嘧啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吡咯基、喹唑啉基、喹喔啉基(quinoxalinyl)、喹啉基、四氢喹啉基、5,6,7,8-四氢喹唑啉基、5,6,7,8-四氢苯并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、6,7,8,9-四氢-5H-环庚烷并[4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶基、5,6,7,8-四氢吡啶并[4,5-c]哒嗪基、噻唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、三嗪基、噻吩并[2,3-d]嘧啶基、噻吩并[3,2-d]嘧啶基、噻吩并[2,3-c]吡啶基(thieno[2,3-c]pridinyl)和噻吩基(thiophenyl/thienyl)。
在本公开中可以使用各种羟基保护基团。一般来说，保护基团使化学官能度对特定的反应条件不敏感，并且可以在分子中的该官能度上添加以及去除，而不实质上损害分子的其余部分。代表性的羟基保护基团公开于Beaucage等人，Tetrahedron 1992,48,2223-2311，以及Greeneand Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，Chapter 2,2ded，John Wiley&Sons，New York，1991中，以引用的方式将上述文献各自整体并入本文。在一些实施方式中，保护基团在碱性条件下稳定，但可以在酸性条件下脱除。在一些实施方式中，本文可使用的羟基保护基的非排他性实例包括二甲氧基三苯甲基(DMT)、单甲氧基三苯甲基、9-苯基氧杂蒽-9-基(Pixyl)和9-(对甲氧基苯基)氧杂蒽-9-基(Mox)。在一些实施方式中，本文可使用的羟基保护基的非排他性实例包括Tr(三苯甲基)、MMTr(4-甲氧基三苯甲基)、DMTr(4,4'-二甲氧基三苯甲基)和TMTr(4,4',4”-三甲氧基三苯甲基)。
“受试者”一词，如本文所使用的，指任何动物，例如哺乳动物或有袋动物。本公开的受试者包括但不限于人类、非人灵长类(例如，恒河猴或其他类型的猕猴)、小鼠、猪、马、驴、牛、绵羊、大鼠和任何种类的家禽。
如本文所使用的，“治疗”指的是获得有益的或期望的结果的方法，包括但不限于治疗益处。“治疗益处”意味着根除或改善被治疗的潜在障碍。此外，治疗益处通过根除或改善与潜在障碍相关的一个或多个生理症状，从而在受试者中观察到改善而获得，尽管受试者可能仍然受到潜在障碍的折磨。
如本文所使用的“预防”指获得有益或期望的结果的方法，包括但不限于预防性益处。为了获得“预防性益处”，可将siRNA、药物组合物或siRNA缀合物给予有罹患特定疾病风险的受试者，或给予报告疾病的一种或多种生理症状的受试者，即便可能该疾病的诊断尚未作出。
本公开的siRNA含有核苷酸基团作为基本结构单元，本领域技术人员公知，所述核苷酸基团含有磷酸基团、核糖基团和碱基，在此不再赘述。
本公开的siRNA含有正义链和反义链，所述正义链和反义链长度相同或不同，所述正义链的长度为19-23个核苷酸，反义链的长度为19-26个核苷酸。这样，本公开提供的siRNA正义链和反义链的长度比可以是19/19、19/20、19/21、19/22、19/23、19/24、19/25、19/26、20/20、20/21、20/22、20/23、20/24、20/25、20/26、21/20、21/21、21/22、21/23、21/24、21/25、21/26、22/20、22/21、22/22、22/23、22/24、22/25、22/26、23/20、23/21、23/22、23/23、23/24、23/25或23/26。在一些实施方式中，所述siRNA正义链和反义链的长度比为19/21、21/23或23/25。
第一种siRNA
按照本公开，所述siRNA可以是第一种siRNA。
所述第一种siRNA含有正义链和反义链，所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中，所述正义链含有一段核苷酸序列I，所述反义链含有一段核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，其中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5'-CUCUGUUCCAUGUUUCUAZ1-3'(SEQ ID NO:1)；
5'-Z2UAGAAACAUGGAACAGAG-3'(SEQ ID NO:2)，
其中，Z1为A，Z2为U，所述核苷酸序列I中包含位置对应于Z1的核苷酸Z3，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Z2的核苷酸Z4，所述Z4是所述反义链5'末端的第一个核苷酸。
在上文与下文中，“位置对应”是指从核苷酸序列相同端起算，处于核苷酸序列中相同的位置。例如，核苷酸序列I的3'端第1个核苷酸是位置对应于SEQ ID NO:1的3'端第1个核苷酸的核苷酸。
在一些实施方式中，所述正义链仅包含核苷酸序列I，所述反义链仅包含核苷酸序列II。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列之间的核苷酸差异包括Z4位置处的差异，且Z4选自A、C或G。在一些实施方式中，所述核苷酸差异为Z4位置处的差异，Z4选自A、C或G。在一些实施方式中，Z3是与Z4互补的核苷酸。具有上述核苷酸差异的siRNA具有较高的靶mRNA抑制能力，而这些包含核苷酸差异的siRNA也在本公开的保护范围之内。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补；所述基本上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于3个的碱基错配；所述实质上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；完全反向互补是指两个核苷酸序列之间没有碱基错配。
在一些实施方式中，核苷酸序列I是SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，核苷酸序列II是SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列：
5'-CUCUGUUCCAUGUUUCUAZ3-3'(SEQ ID NO:3)；
5'-Z4UAGAAACAUGGAACAGAG-3'(SEQ ID NO:4)，
其中，所述Z4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Z3选自A、U、G或C，并且Z4是与Z3互补的核苷酸；在一些实施方式中，Z3为A，Z4为U；
在一些实施方式中，所述正义链还含有核苷酸序列III，所述反义链还含有核苷酸序列IV，核苷酸序列III和核苷酸序列IV长度各自为1-4个核苷酸；所述核苷酸序列Ⅲ和所述核苷酸序列Ⅳ长度相等并且实质上反向互补或者完全反向互补；所述核苷酸序列III连接在所述核苷酸序列I的5'末端，所述核苷酸序列IV连接在所述核苷酸序列II的3'末端。在一些实施方式中，所述核苷酸序列IV与第二段核苷酸序列实质上反向互补或者完全反向互补，该第二段核苷酸序列是指和靶mRNA中与由SEQ ID NO:1表示的核苷酸序列的5'末端相邻、且长度与所述核苷酸序列IV相同的核苷酸序列。
在一些实施方式中，按照5'-3'的方向，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的长度均为1个核苷酸，核苷酸序列III的碱基为U，核苷酸序列IV的碱基为A；此时，正义链和反义链的长度比为20/20；或者，核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基组成为AU，核苷酸序列IV的碱基组成为AU；此时，正义链和反义链的长度比为21/21；或者，核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基组成为CAU，核苷酸序列IV的碱基组成为AUG；此时，正义链和反义链的长度比为22/22；或者，核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基组成为GCAU，核苷酸序列IV的碱基组成为AUGC；此时，正义链和反义链的长度比为23/23。在一些实施方式中，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的长度为2个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基组成为AU，核苷酸序列IV的碱基组成为AU；此时，正义链和反义链的长度比为21/21。
在一些实施方式中，核苷酸序列III和核苷酸序列IV完全反向互补，因此，给出了核苷酸序列III的碱基，核苷酸序列IV的碱基也就确定了。
第二种siRNA
按照本公开，所述siRNA可以是第二种siRNA。
所述第二种siRNA含有正义链和反义链，所述第二种siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中，所述正义链含有一段核苷酸序列I，所述反义链含有一段核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区，其中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:61所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:62所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5'-GGGAUAAUCUAAAUGUAAZ5-3'(SEQ ID NO:61)；
5'-Z6UUACAUUUAGAUUAUCCC-3'(SEQ ID NO:62)，
其中，Z5为A，Z6为U，所述核苷酸序列I中包含位置对应于Z5的核苷酸Z7，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Z6的核苷酸Z8，所述Z8是所述反义链5'末端的第一个核苷酸。
在一些实施方式中，所述正义链仅包含核苷酸序列I，所述反义链仅包含核苷酸序列II。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:61所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:62所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:62所示的核苷酸序列之间的核苷酸差异包括Z8位置处的差异，且Z8选自A、C或G。在一些实施方式中，所述核苷酸差异为Z8位置处的差异，Z8选自A、C或G。在一些实施方式中，Z7是与Z8互补的核苷酸。具有上述核苷酸差异的siRNA具有较高的靶mRNA抑制能力，而这些包含核苷酸差异的siRNA也在本公开的保护范围之内。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补。
在一些实施方式中，核苷酸序列I是SEQ ID NO:63所示的核苷酸序列，核苷酸序列II是SEQ ID NO:64所示的核苷酸序列：
5'-GGGAUAAUCUAAAUGUAAZ7-3'(SEQ ID NO:63)；
5'-Z8UUACAUUUAGAUUAUCCC-3'(SEQ ID NO:64)，
其中，所述Z8是反义链5'末端的第一个核苷酸，Z7选自A、U、G或C，并且Z8是与Z7互补的核苷酸；在一些实施方式中，Z7为A，Z8为U；
并且，所述正义链和反义链长度相同或不同，所述正义链的长度为19-23个核苷酸，反义链的长度为19-26个核苷酸。
在一些实施方式中，所述正义链还含有核苷酸序列III，所述反义链还含有核苷酸序列IV，核苷酸序列III和核苷酸序列IV长度各自为1-4个核苷酸；所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV长度相等并且实质上反向互补或者完全反向互补；所述核苷酸序列III连接在所述核苷酸序列I的5'末端，所述核苷酸序列IV连接在所述核苷酸序列II的3'末端，所述核苷酸序列IV与第二段核苷酸序列实质上反向互补或者完全反向互补，该第二段核苷酸序列是指和靶mRNA中与由SEQ ID NO:61表示的核苷酸序列的5'末端相邻、且长度与所述核苷酸序列IV相同的核苷酸序列。
在一些实施方式中，按照5'-3'的方向，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的长度均为1个核苷酸，核苷酸序列III的碱基为A，核苷酸序列IV的碱基为U；此时，正义链和反义链的长度比为20/20；或者，核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基组成为CA，核苷酸序列IV的碱基组成为UG；此时，正义链和反义链的长度比为21/21；或者，核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基组成为UCA，核苷酸序列IV的碱基组成为UGA；此时，正义链和反义链的长度比为22/22；或者，核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基组成为UUCA，核苷酸序列IV的碱基组成为UGAA；此时，正义链和反义链的长度比为23/23。在一些实施方式中，所述核苷酸序列III和核苷酸序列IV的长度为2个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基组成为CA，核苷酸序列IV的碱基组成为UG；此时，正义链和反义链的长度比为21/21。在一些实施方式中，核苷酸序列III和核苷酸序列IV完全反向互补，因此，给出了核苷酸序列III的碱基，核苷酸序列IV的碱基也就确定了。
以下，对核苷酸序列V、核苷酸序列VI、核酸序列、siRNA中的核苷酸修饰以及修饰序列的描述适用于上述第一种siRNA或第二种siRNA。即如果没有特指，下面对siRNA的描述应视为是对第一种siRNA和第二种siRNA逐一进行了描述。例如，如不特别指明具体的siRNA，“所述siRNA还含有核苷酸序列V”的意思是“第一种siRNA或第二种siRNA还含有核苷酸序列V”。
在一些实施方式中，所述正义链和反义链长度不同，所述反义链还含有核苷酸序列V，核苷酸序列V的长度为1至3个核苷酸，连接在所述反义链的3'末端，构成反义链的3'突出端。
在一些实施方式中，所述正义链还含有核苷酸序列VI，核苷酸序列VI的长度为1至3个核苷酸，连接在所述正义链的3'末端，构成正义链的3'突出端。
本公开提供的siRNA包括核苷酸序列V，但不包括核苷酸序列VI。由此，本公开提供的siRNA正义链和反义链的长度比可以是19/20、19/21、19/22、20/21、20/22、20/23、21/22、21/23、21/24、22/23、22/24、22/25、23/24、23/25或23/26。在一些实施方式中，本公开提供的siRNA包括核苷酸序列V和VI。在一些实施方式中，核苷酸序列V的长度与核苷酸序列VI的长度相同或不同。由此，本公开提供的siRNA正义链和反义链的长度比可以是(19-26):(19-26)。在一些实施方式中，所述核苷酸序列V和/或VI的长度为2个核苷酸，由此，本公开提供的siRNA正义链和反义链的长度比可以是19/21、21/21、21/23、23/23、23/25或25/25。
所述核苷酸序列V中的每一个核苷酸可以是任意的核苷酸，为了便于合成并节约合成成本，所述核苷酸序列V为连续的2个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(dTdT)或连续的2个尿嘧啶核糖核苷酸(UU)；或者，为了提高siRNA反义链与靶mRNA的亲和力，核苷酸序列V与靶mRNA的相应位置的核苷酸互补。因此，在一些实施方式中，本公开的siRNA的正义链和反义链的长度之比为19/21或21/23，此时，本公开的siRNA具有更好的mRNA沉默活性。
所述核苷酸序列VI中的每一个核苷酸可以是任意的核苷酸，为了便于合成并节约合成成本，所述核苷酸序列VI为连续的两个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(dTdT)或连续的两个尿嘧啶核糖核苷酸(UU)；或者，为了提高siRNA正义链与反义链的亲和力，核苷酸序列VI与靶mRNA的相应位置的核苷酸相同。因此，在一些实施方式中，本公开的siRNA包含核苷酸序列V和VI，siRNA正义链和反义链的长度之比为21/21或23/23，此时，本公开的siRNA具有更好的mRMA沉默活性。
靶mRNA的相应位置的核苷酸是指与靶mRNA的一段核苷酸序列在5'末端相邻的核苷酸或核苷酸序列，该段靶mRNA的核苷酸序列是与核苷酸序列II实质上反向互补或完全反向互补，或者与核苷酸序列II和核苷酸序列IV构成的核苷酸序列实质上反向互补或完全反向互补的那段核苷酸序列。
在一些实施方式中，对于所述第一种siRNA，所述siRNA的正义链含有如SEQ IDNO:5所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列：
5'-CUCUGUUCCAUGUUUCUAZ3-3'(SEQ ID NO:5)；
5'-Z4UAGAAACAUGGAACAGAGAU-3'(SEQ ID NO:6)；
或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列：
5'-AUCUCUGUUCCAUGUUUCUAZ3-3'(SEQ ID NO:7)；
5'-Z4UAGAAACAUGGAACAGAGAUGC-3'(SEQ ID NO:8)；
其中，所述Z4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Z3选自A、U、G或C，并且Z4是与Z3互补的核苷酸。
在一些实施方式中，对于所述第二种siRNA，所述siRNA的正义链含有如SEQ IDNO:65所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:66所示的核苷酸序列：
5'-GGGAUAAUCUAAAUGUAAZ7-3'(SEQ ID NO:65)，
5'-Z8UUACAUUUAGAUUAUCCCUG-3'(SEQ ID NO:66)；
或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:67所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:68所示的核苷酸序列：
5'-CAGGGAUAAUCUAAAUGUAAZ7-3'(SEQ ID NO:67)，
5'-Z8UUACAUUUAGAUUAUCCCUGAA-3'(SEQ ID NO:68)；
其中，所述Z8是反义链5'末端的第一个核苷酸，Z7选自A、U、G或C，并且Z8是与Z7互补的核苷酸。
在一些实施方式中，本公开所述siRNA为为表1a-表1b中列出的siACE2a1、siACE2a2、siACE2a3、siACE2b1、siACE2b2或siACE2b3。
如前所述，本公开的siRNA中的核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸。在一些实施方式中，本公开的siRNA中的核苷酸为未经修饰的核苷酸；在一些实施方式中，本公开的siRNA中的部分或全部核苷酸为修饰的核苷酸，核苷酸基团上的这些修饰不会导致本公开的siRNA抑制ACE2基因表达的功能明显削弱或丧失。
在一些实施方式中，本公开的siRNA至少含有1个修饰的核苷酸。在本公开的上下文中，所使用的术语“修饰的核苷酸”是指核苷酸的核糖基2'位羟基被其他基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物，或者核苷酸上的碱基是经修饰的碱基的核苷酸。所述修饰的核苷酸不会导致siRNA抑制基因表达的功能明显削弱或丧失。例如，可以选择J.K.Watts,G.F.Deleavey,and M.J.Damha,Chemically modified siRNA:tools andapplications.Drug Discov Today,2008,13(19-20):842-55中公开的修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，本公开提供的siRNA的正义链或所述反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基；换句话说，所述正义链和所述反义链中至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基和/或核糖基的至少一部分为具有修饰基团的磷酸酯基和/或具有修饰基团的核糖基。
在一些实施方式中，所述正义链和/或所述反义链中的全部核苷酸均为修饰的核苷酸。在一些实施方式中，本公开提供的siRNA的正义链和所述反义链中的每一个核苷酸独立地为氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸。
本公开的发明人惊奇地发现，本公开所述的siRNA在动物实验中获得了血浆中稳定性和基因沉默效率的高度平衡。
在一些实施方式中，所述氟代修饰的核苷酸位于核苷酸序列I和核苷酸序列II中，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的至少第7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列II的至少第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，所述氟代修饰的核苷酸位于核苷酸序列I和核苷酸序列II中，所述核苷酸序列I中氟代修饰的核苷酸不多于5个，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列I的第7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸；所述核苷酸序列II中氟代修饰的核苷酸不多于7个，并且，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，在所述正义链中，所述核苷酸序列I的第7、8、9位或者5、7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，在所述反义链中，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16位或者2、6、8、9、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸。
在本公开的上下文中，“氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代形成的核苷酸，其具有以下式(7)所示的结构。“非氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸、或核苷酸类似物。在一些实施方式中，每一个非氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物中的一种。
这些核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸是本领域技术人员所公知的，这些核苷酸可以选自2'-烷氧基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷基修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-经取代的氨基修饰的核苷酸、2'-脱氧核苷酸中的一种。
在一些实施方式中，2'-烷氧基修饰的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸(2'-OMe)，如式(8)所示。在一些实施方式中，2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸，例如可以是2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸(2'-MOE)，如式(9)所示。在一些实施方式中，2'-氨基修饰的核苷酸(2'-NH2)如式(10)所示。在一些实施方式中，2'-脱氧核苷酸(DNA)如式(11)所示：
核苷酸类似物指能够在核酸中代替核苷酸，但结构不同于腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的基团。在一些实施方式中，核苷酸类似物可以是异核苷酸、桥联的核苷酸(bridged nucleicacid，简称BNA)或无环核苷酸。
BNA是指受约束的或不能接近的核苷酸。BNA可以含有五元环、六元环、或七元环的具有“固定的”C3'-内切糖缩拢的桥联结构。通常将该桥掺入到该核糖的2'-、4'-位处以提供一个2',4'-BNA核苷酸。在一些实施方式中，BNA可以是LNA、ENA、cET BNA等，其中，LNA如式(12)所示，ENA如式(13)所示，cET BNA如式(14)所示：
无环核苷酸是核苷酸的糖环被打开形成的一类核苷酸。在一些实施方式中，无环核苷酸可以是解锁核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)，其中，UNA如式(15)所示，GNA如式(16)所示：
上述式(15)和式(16)中，R选自H、OH或烷氧基(O-烷基)。
异核苷酸是指核苷酸中碱基在核糖环上的位置发生改变而形成的化合物。在一些实施方式中，异核苷酸可以是碱基从核糖环的1'-位移动至2'-位或3'-位而形成的化合物，如式(17)或(18)所示。
上述式(17)-式(18)化合物中，Base表示核酸碱基，例如A、U、G、C或T；R选自H、OH、F或者如上所述的非氟基团。
在一些实施方式中，核苷酸类似物选自异核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA和GNA中的一种。在一些实施方式中，每一个非氟代修饰的核苷酸均为甲氧基修饰的核苷酸，在上文和下文中，所述甲氧基修饰的核苷酸指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
在上文及下文中，“氟代修饰的核苷酸”、“2'-氟修饰的核苷酸”、“核糖基团的2'-羟基被氟取代的核苷酸”和“具有2’-氟代核糖基的核苷酸”意义相同，均指核苷酸的2'-羟基被氟取代，而形成的具有如式(7)所示结构的化合物；“甲氧基修饰的核苷酸”、“2'-甲氧基修饰的核苷酸”、“核糖基团的2'-羟基被甲氧基取代的核苷酸”和“具有2’-甲氧基核糖基的核苷酸”意义相同，均指核苷酸核糖基团的2'-羟基被甲氧基取代而形成的具有如式(8)所示结构的化合物。
在一些实施方式中，本公开的siRNA是具有以下修饰的siRNA：按照5'末端到3'末端的方向，在所述正义链中，所述核苷酸序列I的第7、8、9位或者第5、7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；在所述反义链中，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16位或者第2、6、8、9、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，本公开的siRNA是具有以下修饰的siRNA：按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的正义链中核苷酸序列I的第5、7、8和9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，siRNA的正义链的其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的反义链中核苷酸序列II的第2、6、8、9、14和16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，siRNA的反义链其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；
或者，按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的正义链中核苷酸序列I的第5、7、8和9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，siRNA的正义链的其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的反义链中核苷酸序列II的第2、6、14和16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，siRNA的反义链其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；
或者，按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的正义链中核苷酸序列I的第7、8和9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，siRNA的正义链的其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述siRNA的反义链中核苷酸序列II的第2、6、14和16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，siRNA的反义链其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，本公开提供的siRNA为siACE2a1-M1、siACE2a1-M2、siACE2a1-M3、siACE2a2-M1、siACE2a2-M2、siACE2a2-M3、siACE2b1-M1、siACE2b1-M2、siACE2b1-M3、siACE2b2-M1、siACE2b2-M2、siACE2b2-M3中的任意一种。
具有上述修饰的siRNA不仅成本低，而且可使血液中的核糖核酸酶不易切割核酸，由此增加核酸的稳定性，使核酸具有更强的抵抗核酸酶水解的性能。同时，上述修饰的siRNA具有较高的抑制靶mRNA的活性。
在一些实施方式中，本公开提供的siRNA的正义链和反义链中至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基中的至少一部分为具有修饰基团的磷酸酯基。在一些实施方式中，具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基；在一些实施方式中，所述具有修饰基团的磷酸酯基为具有如式(1)所示结构的硫代磷酸酯基：
这种修饰能稳定siRNA的双链结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。
在一些实施方式中，本公开提供的siRNA中，硫代磷酸酯基连接存在于由以下位置组成的组中的至少一处：正义链或反义链任意一端的第一个和第二个核苷酸之间；正义链或反义链任意一端的第二个和第三个核苷酸之间；或上述的任意组合。在一些实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于除正义链5'末端以外的全部上述位置处。在一些实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于除正义链3'末端以外的全部上述位置处。在一些实施方式中，硫代磷酸酯基连接存在于以下位置中的至少一处：
所述正义链的5'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的5'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的3'末端第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；以及
所述反义链的3'末端第2个核苷酸和第3个核苷酸之间。
在一些实施方式中，本公开提供的siRNA为表1a-表1b中列出的siACE2a1-M1S、siACE2a1-M2S、siACE2a1-M3S、siACE2a2-M1S、siACE2a2-M2S、siACE2a2-M3S、siACE2a1-M1S1、siACE2a1-M2S1、siACE2a1-M3S1、siACE2a2-M1S1、siACE2a2-M2S1、siACE2a2-M3S1、siACE2b1-M1S、siACE2b1-M2S、siACE2b1-M3S、siACE2b2-M1S、siACE2b2-M2S、siACE2b2-M3S、siACE2b1-M1S1、siACE2b1-M2S1、siACE2b1-M3S1、siACE2b2-M1S1、siACE2b2-M2S1、siACE2b2-M3S1中的任意一种。
在一些实施方式中，所述siRNA反义链的5'末端核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸。
常用的所述5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸是本领域技术人员所公知的，如5'-磷酸核苷酸可具有如下结构：
再如，Anastasia Khvorova and Jonathan K.Watts,The chemical evolut ionof oligonucleotide therapies of clinical utility.Nature Biotechnology,2017,35(3):238-48中公开了如下4种5'-磷酸类似物修饰的核苷酸：
其中，R选自H、OH、甲氧基、氟；Base表示核酸碱基，选自A、U、C、G或T。
在一些实施方式中，5'-磷酸核苷酸为式(2)所示的含有5'-磷酸修饰的核苷酸，5'-磷酸类似物修饰的核苷酸为含有乙烯基磷酸酯(5'-(E)-vinylphos phonate，E-VP)修饰的核苷酸，如式(3)所示，或者为硫代磷酸酯修饰的核苷酸，如式(5)所示。
在一些实施方式中，本公开提供的siRNA为表1a-表1b中列出的siACE2a1-M1P1、siACE2a1-M2P1、siACE2a1-M3P1、siACE2a2-M1P1、siACE2a2-M2P1、siACE2a2-M3P1、siACE2a1-M1SP1、siACE2a1-M2SP1、siACE2a1-M3SP1、siACE2a2-M1SP1、siACE2a2-M2SP1、siACE2a2-M3SP1、siACE2a1-M1S1P1、siACE2a1-M2S1P1、siACE2a1-M3S1P1、siACE2a2-M1S1P1、siACE2a2-M2S1P1、siACE2a2-M3S1P1、siACE2b1-M1P1、siACE2b1-M2P1、siACE2b1-M3P1、siACE2b2-M1P1、siACE2b2-M2P1、siACE2b2-M3P1、siACE2b1-M1SP1、siACE2b1-M2SP1、siACE2b1-M3SP1、siACE2b2-M1SP1、siACE2b2-M2SP1、siACE2b2-M3SP1、siACE2b1-M1S1P1、siACE2b1-M2S1P1、siACE2b1-M3S1P1、siACE2b2-M1S1P1、siACE2b2-M2S1P1、siACE2b2-M3S1P1中的任意一种。
本公开的发明人意外发现，本公开提供的siRNA不仅具有显著增强的血浆和溶酶体稳定性，还具有较高的靶mRNA抑制活性。
本公开提供的siRNA可以通过本领域常规的siRNA制备方法(例如固相合成和液相合成的方法)得到；其中，固相合成已经有商业化订制服务。可以通过使用具有相应修饰的核苷单体来将修饰的核苷酸基团引入本公开所述的siRNA中，制备具有相应修饰的核苷单体的方法及将修饰的核苷酸基团引入siRNA的方法也是本领域技术人员所熟知的。
药物组合物
本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有如上所述的siRNA作为活性成分和药学上可接受的载体。
所述药学上可接受的载体可以是siRNA给药领域常规使用的载体，例如但不限于磁性纳米粒(magnetic nanoparticles，如基于Fe3O4或Fe2O3的纳米粒)、碳纳米管(carbonnanotubes)、介孔硅(mesoporous silicon)、磷酸钙纳米粒(calcium phosphatenanoparticles)、聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)、聚酰胺型树形高分子(polyamidoamine(PAMAM)dendrimer)、聚赖氨酸(poly(L-lysine)，PLL)、壳聚糖(chitosan)、1,2-二油酰基-3-三甲铵丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，DOTAP)、聚D型或L型乳酸/羟基乙酸共聚物(poly(D&L-lactic/glycolic acid)copolymer，PLGA)、聚(氨乙基乙撑磷酸酯)(poly(2-aminoethyl ethylene phosphate)，PPEEA)和聚(甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯)(poly(2-dimethylaminoethylmethacrylate)，PDMAEMA)以及它们的衍生物中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述药物组合物中，对siRNA和药学上可接受的载体的含量没有特别要求，在一些实施方式中，siRNA与药学上可接受的载体的重量比可以为1:(1-500)，在一些实施方式中，上述重量比为1:(1-50)。
在一些实施方式中，所述药物组合物中，还可以包含药学上可接受的其它辅料，该辅料可以为本领域常规采用的各种制剂或化合物的一种或多种。例如，所述药学上可接受的其它辅料可以包括pH缓冲液、保护剂和渗透压调节剂中的至少一种。
所述pH缓冲液可以为pH值7.5-8.5的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液和/或pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液，例如可以为pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液。
所述保护剂可以为肌醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖和葡萄糖中的至少一种。以所述药物组合物的总重量为基准，所述保护剂的含量可以为0.01-30重量％。
所述渗透压调节剂可以为氯化钠和/或氯化钾。所述渗透压调节剂的含量使所述药物组合物的渗透压为200-700毫渗摩尔/千克(mOsm/kg)。根据所需渗透压，本领域技术人员可以容易地确定所述渗透压调节剂的含量。在一些实施方式中，所述药物组合物所制成的制剂在给药过程中的剂量会因给药方式的不同而发生调整。
在一些实施方式中，所述药物组合物可以为液体制剂，例如注射液；也可以为冻干粉针剂，实施给药时与液体辅料混合，配制成液体制剂。所述液体制剂可以但不限于用于皮下、肌肉或静脉注射给药，也可以但不限于通过喷雾给药到肺部、或通过喷雾经肺部给药到其它脏器组织(如肝脏)、或通过口咽吸入、或鼻腔给药等方式递送所述药物组合物。在一些实施方式中，所述药物组合物用于喷雾给药。
在一些实施方式中，所述药物组合物可以为脂质体制剂的形式。在一些实施方式中，所述脂质体制剂中使用的药学上可接受的载体包含含胺的转染化合物(下文也可将其称为有机胺)、辅助脂质和/或聚乙二醇化脂质。其中，所述有机胺、辅助脂质和聚乙二醇化脂质可分别选自于中国专利申请CN103380113A(通过引用的方式将其整体并入本文)中所描述的含胺的转染化合物或其药学上可接受的盐或衍生物、辅助脂质和聚乙二醇化脂质中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述有机胺可为中国专利申请CN103380113A中描述的如式(201)所示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
X101和X102各自独立地是O、S、N-A或C-A，其中A是氢或C1-C20烃链；
Y101和Z101各自独立地是C＝O、C＝S、S＝O、CH-OH或SO2；
R101、R102、R103、R104、R105、R106和R107各自独立地是氢，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链脂族基团，环状或无环的、被取代的或未被取代的、支链或直链杂脂族基团，被取代的或未被取代的、支链或直链酰基，被取代的或未被取代的、支链或直链芳基，被取代的或未被取代的、支链或直链杂芳基；
x是1-10的整数；
n是1-3的整数，m是0-20的整数，p是0或1；其中，如果m＝p＝0，则R102是氢；
并且，如果n或m中的至少一个是2，那么R103和在式(201)中的氮形成如式(202)或式(203)所示的结构：
其中，g、e和f各自独立地是1-6的整数，“HCC”代表烃链，且每个*N代表式(201)中的氮原子。
在一些实施方式中，R103是多胺。在其它实施方式中，R103是缩酮。在一些实施方式中，在式(201)中的R101和R102中的每一个独立地是任意的被取代的或未被取代的、支链或直链烷基或烯基，所述烷基或烯基具有3至约20个碳原子，诸如8至约18个碳原子，和0至4个双键，诸如0至2个双键。
在一些实施方式中，如果n和m中的每一个独立地具有1或3的值，那么R103可以是下述式(204)-式(213)中的任一个：
其中，式(204)-式(213)中，g、e和f各自独立地是1-6的整数，每个“HCC”代表烃链，且每个*显示R103与在式(201)中的氮原子的可能连接点，其中在任意*位置上的每个H可以被替换以实现与在式(201)中的氮原子的连接。
其中，式(201)所示化合物可以根据中国专利申请CN103380113A中的描述制备。
在一些实施方式中，所述有机胺为如式(214)所示的有机胺和/或如式(215)所示的有机胺：
所述辅助脂质为胆固醇、胆固醇的类似物和/或胆固醇的衍生物；
所述聚乙二醇化脂质为1,2-二棕榈酰胺-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)]-2000。
在一些实施方式中，所述药物组合物中，所述有机胺、所述辅助脂质和所述聚乙二醇化脂质三者之间的摩尔比为(19.7-80):(19.7-80):(0.3-50)，例如可以为(50-70):(20-40):(3-20)。
在一些实施方式中，由本公开的siRNA与上述含胺的转染试剂形成的药物组合物颗粒具有约30nm至约200nm的平均直径，通常为约40nm至约135nm，更通常地，该脂质体颗粒的平均直径是约50nm至约120nm、约50nm至约100nm、约60nm至约90nm或约70nm至约90nm，例如，该脂质体颗粒的平均直径是约30、40、50、60、70、75、80、85、90、100、110、120、130、140、150或160nm。
在一些实施方式中，由本公开的siRNA与上述含胺的转染试剂形成的药物组合物中，siRNA与全部脂质(例如有机胺、辅助脂质和/或聚乙二醇化脂质)的重量比(重量/重量比)在从约1:1至约1:50、从约1:1至约1:30、从约1:3至约1:20、从约1:4至约1:18、从约1:5至约1:17、从约1:5至约1:15、从约1:5至约1:12、从约1:6至约1:12或从约1:6至约1:10的范围内，例如，本公开的siRNA与全部脂质的重量比为约1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17或1:18。
在一些实施方式中，所述药物组合物在销售时各组分可以独立存在，在使用时可以液体制剂的形式存在。在一些实施方式中，本公开提供的siRNA与上述药学上可接受的载体形成的药物组合物可以按照已知的各种方法制备，只是用本公开提供的siRNA替代现有siRNA即可；在一些实施方式中，可以按照如下方法制备：
将有机胺、辅助脂质和聚乙二醇化脂质按照上述摩尔比悬浮于醇中并混匀得到脂质溶液；醇的用量使得到的脂质溶液的总质量浓度为2-25mg/mL，例如可以为8-18mg/mL。所述醇选自药学上可接受的醇，诸如在室温附近为液体的醇，例如，乙醇、丙二醇、苯甲醇、甘油、聚乙二醇200，聚乙二醇300，聚乙二醇400中的一种或多种，例如可以为乙醇。
将本公开提供的siRNA溶解于缓冲盐溶液中，得到siRNA水溶液。缓冲盐溶液的浓度为0.05-0.5M，例如可以为0.1-0.2M，调节缓冲盐溶液的pH至4.0-5.5，例如可以为5.0-5.2，缓冲盐溶液的用量使siRNA的浓度不超过0.6mg/mL，例如可以为0.2-0.4mg/mL。所述缓冲盐选自可溶性醋酸盐、可溶性柠檬酸盐中的一种或多种，例如可以为醋酸钠和/或醋酸钾。
将脂质溶液和siRNA水溶液混合，将混合后得到的产物在40-60℃孵育至少2分钟，例如可以为5-30分钟，得到孵育后的脂质体制剂。脂质溶液和siRNA水溶液的体积比为1：(2-5)，例如可以为1:4。
将孵育后的脂质体制剂浓缩或稀释，去除杂质，除菌，得到本公开提供的药物组合物，其理化参数为pH值为6.5-8，包封率不低于80％，粒径为40-200nm，多分散指数不高于0.30，渗透压为250-400mOsm/kg；例如理化参数可以为pH值为7.2-7.6，包封率不低于90％，粒径为60-100nm，多分散指数不高于0.20，渗透压为300-400mOsm/kg。
其中，浓缩或稀释可以在去除杂质之前、之后或同时进行。去除杂质的方法可以采用现有各种方法，例如可以使用切相流系统、中空纤维柱，在100K Da条件下超滤，超滤交换溶液为pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)。除菌的方法可以采用现有各种方法，例如可以在0.22μm滤器上过滤除菌。
siRNA缀合物
本公开提供了一种siRNA缀合物，所述siRNA缀合物含有上述siRNA以及缀合连接至该siRNA的缀合基团。
一般来说，所述缀合基团包含药学上可接受的至少一个靶向基团和任选的接头(linker)，并且，所述siRNA、所述接头和所述靶向基团依次连接。在一些实施方式中，所述靶向基团为1-6个。在一些实施方式中，所述靶向基团为2-4个。所述siRNA分子可以非共价或共价缀合至所述缀合基团，例如可以共价缀合至所述缀合基团。siRNA与缀合基团的缀合位点可以在siRNA正义链的3'端或5'端，也可在反义链的5'端，还可以在siRNA的内部序列中。在一些实施方式中，所述siRNA与缀合基团的缀合位点在siRNA正义链的3'末端。
在一些实施方式中，所述缀合基团可以连接在核苷酸的磷酸基团、2'-位羟基或者碱基上。在一些实施方式中，所述缀合基团还可以连接在3'-位羟基上，此时核苷酸之间采用2'-5'磷酸二酯键连接。当缀合基团连接在siRNA链的末端时，所述缀合基团通常连接在核苷酸的磷酸基团上；当缀合基团连接在siRNA的内部序列时，所述缀合基团通常连接在核糖糖环或者碱基上。各种连接方式可以参考文献：Muthiah Manoharan et.al.siRNAconjugates carrying sequentially assembled trivalent N-acetylgalactosaminelinked through nucleosides elicit robust gene silencing in vivo inhepatocytes.ACS Chemical biology,2015,10(5):1181-7.
在一些实施方式中，所述siRNA与缀合基团间可以通过酸不稳定的、或可还原的化学键相连，在细胞内涵体的酸性环境下，这些化学键可降解，从而使siRNA成为自由状态。对于不可降解的缀合方式，缀合基团可连接在siRNA的正义链，从而尽量降低缀合对siRNA活性的影响。
在一些实施方式中，所述药学上可接受的靶向基团可以是siRNA给药领域常规使用的配体。在一些实施方式中，所述药学上可接受的靶向基团可以选自以下靶向分子或其衍生物形成的配体中的一种或多种；靶向肝细胞表面的受体的配体，如亲脂分子，例如胆固醇、胆汁酸、维生素(例如维生素E)、不同链长的脂质分子；聚合物，例如聚乙二醇；糖类，例如乳糖、聚乳糖、甘露糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)；肝实质细胞表达的受体配体，例如去唾液酸糖蛋白、去唾液酸糖残基、脂蛋白(如高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等)、胰高血糖素、神经递质(如肾上腺素)、生长因子、转铁蛋白等适配体；抗体；量子点。
在一些实施方式中，所述的每个配体独立地选自一个能够与细胞表面受体结合的配体。在一些实施方式中，至少一个靶向基团是能够与新型冠状病毒在细胞表面的受体结合的配体。这些配体的种类为本领域技术人员所公知，其作用是与靶细胞表面的特异性受体相结合，介导与配体连接的siRNA递送至靶细胞。在一些实施方式中，至少一个所述靶向基团选自能够和表达ACE2的细胞表面受体结合的配体。在一些实施方式中，每个所述靶向基团选自能够和表达ACE2的细胞表面受体结合的配体。在一些实施方式中，至少一个靶向基团是靶向肺细胞表面的受体的配体。在一些实施方式中，每个靶向基团是靶向肺细胞表面的受体的配体。在一些实施方式中，至少一个靶向基团是能够靶向ACE2的配体。在一些实施方式中，每个靶向基团是能够靶向ACE2的配体。在一些实施方式中，至少一个靶向基团是能够靶向整合素αvβ6的基团。在一些实施方式中，每个靶向基团是能够靶向整合素αvβ6的基团。在一些实施方式中，至少一个靶向基团是多肽，例如透膜肽；或者小分子配体，例如WO2019010274A1表6中列举的靶向基团，或WO2019089765A1中描述的各种靶向基团(如[0094]段中描述的编号为Structure 1-Structure 37的配体)，或WO2014154725A1中描述的各种靶向基团(如第5页描述的各种化合物衍生的基团)，以引用的方式将其全部公开内容并入本文。
本公开的发明人意外发现，本公开的siRNA缀合物在具有显著提高的血浆中稳定性、低脱靶效应的同时，还表现出较高的ACE2 mRNA沉默活性。在一些实施方式中，本公开的siRNA可以为表1a-1b中示出的siRNA中的一种。采用这些siRNA，本公开的siRNA缀合物表现出更高的ACE2 mRNA沉默活性。
表1a本公开的第一种siRNA序列
表1b本公开的第二种siRNA序列
其中，大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸；小写字母s表示该字母左右两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接；P1表示该P1右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸。在一些实施方式中，P1是表示具体修饰的VP、Ps或P，其中，字母组合VP表示该字母组合VP右侧相邻的一个核苷酸为乙烯基磷酸酯(5'-(E)-vinylphosphonate，E-VP)修饰的核苷酸，字母组合Ps表示该字母组合Ps右侧相邻的一个核苷酸为硫代磷酸酯修饰的核苷酸，大写字母P表示该字母P右侧相邻的一个核苷酸为5'-磷酸核苷酸。
本公开所述siRNA、药物组合物或siRNA缀合物中，每个相邻核苷酸之间由磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键连接，磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键中的非桥接氧原子或硫原子带有负电荷，它可以以羟基或巯基的形式存在，羟基或巯基中的氢离子也可以部分或全部被阳离子取代。所述阳离子可以是任意的阳离子，如金属阳离子，铵离子NH4 +，有机铵阳离子中的一种。出于提高溶解性考虑，在一种实施方式中，所述阳离子选自碱金属离子、三级胺形成的铵阳离子和季铵阳离子中的一种或多种。碱金属离子可以是K+和/或Na+，三级胺形成的阳离子可以是三乙胺形成的铵离子和/或N,N-二异丙基乙胺形成的铵离子。因此，本公开所述siRNA或siRNA缀合物可以至少部分以盐的形式存在。在一种方式中，磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键中的非桥接氧原子或硫原子至少部分与钠离子结合，本公开所述siRNA或siRNA缀合物以钠盐或部分钠盐的形式存在。
本领域技术人员清楚知晓的是，可以通过使用具有相应修饰的核苷单体来将修饰的核苷酸基团引入本公开所述的siRNA中。制备具有相应修饰的核苷单体的方法及将修饰的核苷酸基团引入siRNA的方法也是本领域技术人员所熟知的。所有修饰的核苷单体均可以商购得到或者采用已知方法制备得到。
可以采用任意合理的合成路线制备本公开的siRNA缀合物。例如，对于包含靶向基团和可与亚磷酰胺发生反应而形成共价连接的活性反应基团的缀合分子，可先将该缀合分子中的活性基团用保护剂保护后，连接至固相载体，随后通过亚磷酰胺固相合成方法，按照siRNA正义链和反义链的核苷酸种类和顺序，按照3'到5'的方向逐一连接核苷单体，每个核苷单体的连接包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应；分离出siRNA的正义链和反义链，退火，从而获得本公开的siRNA缀合物。
进一步地，siRNA缀合物的制备也可参照已有文献的公开内容进行。例如，WO2019010274A1在实施例1中描述了将具有特定结构的连接基团和靶向配体经反应依次连接至siRNA的方法。以引用的方式将其全部内容并入本文。
本公开的siRNA及含该siRNA的药物组合物及siRNA缀合物的应用
在一些实施方式中，本公开提供了本公开的siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物在制备用于抑制细胞中ACE2基因表达的药物中的用途。在一些实施方式中，本公开提供了本公开的siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物在制备用于治疗和/或预防由于ACE2基因表达而引起的疾病或病症的药物中的用途。
在一些实施方式中，本公开提供了本公开的siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物在制备用于治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病的药物中的用途。在一些实施方式中，所述冠状病毒是SARS-CoV-2病毒。在一些实施方式中，所述冠状病毒引起的疾病是COVID-19。
在一些实施方式中，本公开提供了一种预防和/或冠状病毒引起的疾病的方法，该方法包括将有效量的本公开的siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物给予有需要的受试者。在一些实施方式中，所述冠状病毒是SARS-CoV-2病毒。在一些实施方式中，所述冠状病毒引起的疾病是COVID-19。通过将本公开的siRNA活性成分给予有需要的受试者，可以通过RNA干扰的机制达到预防和/或治疗冠状病毒所引起的疾病的目的。因此，本公开的siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物可用于预防和/或治疗冠状病毒引起的疾病，或用于制备用于预防和/或治疗冠状病毒引起的疾病的药物。
本文所使用的术语“给药/给予”是指通过使得至少部分地将本公开的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物定位于期望的位点以产生期望效果的方法或途径，将本公开的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物放置入受试者体内。适于本公开方法的给药途径包括局部给药和全身给药。一般而言，局部给药导致与受试者体循环相比将更多siRNA缀合物递送至特定位点；而全身给药导致将本公开的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物递送至受试者的基本体循环。考虑到本公开旨在提供预防和/或治疗冠状病毒引起的疾病的手段，在一些实施方式中采用能够将药物递送至肺部的给药方式。
可通过本领域已知的任何合适途径向受试者给药，所述途径包括但不仅限于：口服或胃肠外途径，如静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、经皮给药、气道给药(气雾剂)、肺部给药、鼻部给药、直肠给药和局部给药(包括口腔含化给药和舌下给药)。给药频率可以是每天、每周、每两周、每三周、每个月或每年1次或多次。
本公开所述的siRNA、药物组合物或siRNA缀合物的使用剂量可为本领域常规的剂量，所述剂量可以根据各种参数、尤其是受试者的年龄、体重和性别来确定。可在细胞培养或实验动物中通过标准药学程序测定毒性和疗效，例如测定LD50(使50％的群体死亡的致死剂量)和ED50(在量反应中指能引起50％最大反应强度的剂量，在质反应中指能引起50％实验对象出现阳性反应时的剂量)。可基于由细胞培养分析和动物研究得到的数据得出人用剂量的范围。在一些实施方式中，根据给药方式的不同对所述siRNA、药物组合物或siRNA缀合物所制成的制剂在给药过程中的剂量进行调整。
在给予本公开所述的siRNA、药物组合物、和/或siRNA缀合物时，例如，对于雄性或雌性、6-12周龄、体重18-25g的C57BL/6J或30-45g的ob/ob小鼠，以siRNA的量计：(i)对于siRNA缀合物，其siRNA用量可以为0.001-100mg/kg体重，在一些实施方式中为0.01-50mg/kg体重，在一些实施方式中为0.05-20mg/kg体重，另一些实施方式中为0.1-15mg/kg体重，另一些实施方式中为0.1-10mg/kg体重；(ii)对于siRNA与药学上可接受的载体形成的药物组合物，其siRNA用量可以为0.001-50mg/kg体重，在一些实施方式中为0.01-10mg/kg体重，在一些实施方式中为0.05-5mg/kg体重，在一些实施方式中为0.1-3mg/kg体重。
在一些实施方式中，本公开提供了一种抑制细胞中ACE2基因表达的方法，该方法包括将有效量的本公开的siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物与所述细胞接触，将本公开的siRNA和/或药物组合物和/或siRNA缀合物导入所述细胞，通过RNA干扰的机制达到抑制细胞中ACE2基因表达的目的。
采用本公开提供的方法抑制ACE2基因在细胞中表达，所提供的修饰的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物中的siRNA用量一般是这样的量：其足以减少靶基因的表达，并导致在靶细胞表面处1pM至1μM、或0.01nM至100nM、或0.05nM至50nM或0.05nM至约5nM的细胞外浓度。达到该局部浓度所需的量将随各种因素而变化，所述因素包括递送方法、递送部位、在递送部位和靶细胞或组织之间的细胞层的数目、递送途径(局部还是全身)等。在递送部位处的浓度可以显著高于在靶细胞或组织的表面处的浓度。
试剂盒
本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含有效量的本公开的siRNA、药物组合物和siRNA缀合物的至少一种。
在一些实施方式中，本文所述的试剂盒可在一个容器中提供siRNA。在一些实施方式中，本文所述的试剂盒可包含一个提供药学上可接受的赋形剂的容器。在一些实施方式中，所述试剂盒中还可包含其它成分，如稳定剂或防腐剂等。在一些实施方式中，本文所述的试剂盒可在不同于提供本文所述siRNA的容器以外的其它容器中包含至少一种其它治疗剂。在一些实施方式中，所述试剂盒可包含用于将siRNA与药学上可接受的载体和/或辅料或其它成分(若有的话)进行混合的说明书。
在本公开的试剂盒中，所述siRNA和药学上可接受的载体和/或辅料、以及所述修饰的siRNA、药物组合物和/或siRNA缀合物，和/或药学上可接受的载体和/或辅料可以任何形式提供，例如液体形式、干燥形式或冻干形式。在一些实施方式中，所述siRNA和药学上可接受的载体和/或辅料以及所述药物组合物和/或siRNA缀合物和任选的药学上可接受的载体和/或辅料基本上纯净和/或无菌。在一些实施方式中，可在本公开的试剂盒中提供无菌水。
下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
除非特别说明，以下实施例中所用到的试剂、培养基均为市售商品，所用到的核酸电泳、real-time PCR等操作均参照Molecular Cloning(Cold Spring Harbor LBboratoryPress(1989))所记载的方法进行。
本公开合成的针对ACE2基因的siRNA、siRNA缀合物或作为阴性对照的siRNA、siRNA缀合物转染细胞时，使用LipofectamineTM2000(Invitrogen)作为转染试剂，具体操作参照制造商提供的说明书。
若无其它说明，以下提供的试剂比例均按体积比(v/v)计算。
数据分析采用Graphpad prism6.0统计分析软件。
制备例1-7
本公开提供的siRNA的合成
通过固相合成方法分别合成表2中所列的siRNA序列，使用DEPC水溶解等摩尔表2中相互互补的正义链和反义链，随后退火得到本公开提供的siACE2a1M1S、siACE2b1M1S、siACE2a1、siACE2a2、siACE2a3、siACE2a1M2S和siACE2a1M3S，其序列如表2所示。
对比制备例1-2
参比siRNA的合成
通过固相合成方法分别合成了表2中siRNA编号为NC的siRNA对应的正义链和反义链。使用DEPC水，分别溶解得到的等摩尔的正义链和反义链，随后退火得到参比siRNA，编号为NC。
表2 siRNA序列
其中，大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸；小写字母s表示该字母s左右两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接。
实验例1-2
本公开的siRNA在体外psiCHECK系统中的的抑制活性
本实验例中所使用的HEK293A细胞细胞购自南京科佰生物科技有限公司，用含有20％的胎牛血清(FBS，Hyclone公司)及0.2体积％的青链霉素双抗(Penicillin-Streptomycin，Gibco，Invitrogen公司)的DMEM完全培养基(Hyclone公司)培养细胞，于37℃在含5％CO2/95％空气的培养箱中培养。
本实验例考察了siACE2a1-M1S和siACE2b1-M1S在体外psiCHECK系统中的抑制活性，即测定了上述siRNA靶向完全匹配目标序列的活性。
根据Kumico Ui-Tei et.al.,Functional dissection of siRNA sequence bysystematic DNA substitution:modified siRNA with a DNA seed arm is apowerfultool for mammalian gene silencing with significantly reduced off-targeteffect.Nucleic Acids Research,2008.36(7),2136-2151描述的方法，构建检测质粒，与待评价的siRNA(siACE2a1-M1S和siACE2b1-M1S)共转染至HEK293A细胞中，通过双萤光素酶报告基因的表达水平，来反映siRNA的抑制活性。
具体步骤如下：
[1]构建检测质粒
采用psiCHECKTM-2(PromegaTM)质粒构建检测质粒，该质粒含有一个目标序列，即siRNA靶序列。对于每一待测siRNA，目标序列如下所示：
对于siACE2a1-M1S，目标序列为：
ATCTCTGTTCCATGTTTCTAA(SEQ ID NO:171)
对于siACE2b1-M1S，目标序列为：
CAGGGATAATCTAAATGTAAA(SEQ ID NO:172)
将目标序列克隆到psiCHECKTM-2质粒的Xho I/Not I位点。
[2]转染
将HEK293A细胞以8x103细胞/孔接种于96孔板中，16h后细胞生长密度达到70-80％时，吸尽培养孔中H-DMEM完全培养基，每孔加入80μLOpti-MEM培养基(GIBCO公司)继续培养1.5h。
对于待测siRNA siACE2a1-M1S和siACE2b1-M1S中的每一个，分别用DEPC化水配制成浓度分别为100nM、10nM和1nM(以siRNA的量计)的siRNA工作液。
配制1A1溶液，每份1A1溶液含有浓度为100nM的siRNA工作液1μL、检测质粒工作液0.05μL(含检测质粒10ng)和10μL的Opti-MEM培养基。
配制1A2溶液，每份1A2溶液含有浓度为10nM的siRNA工作液1μL、检测质粒工作液0.05μL(含检测质粒10ng)和10μL的Opti-MEM培养基。
配制1A3溶液，每份1A3溶液含有浓度为1nM的siRNA工作液1μL、检测质粒工作液0.05μL(含检测质粒10ng)和10μL的Opti-MEM培养基。
配制1B溶液，每份1B溶液含有0.2μL LipofectamineTM 2000(Invitrogen公司)和10μL Opti-MEM培养基。
配制1C溶液，每份1C溶液含有检测质粒工作液0.05μL(含检测质粒10ng)和10μL的Opti-MEM培养基。
对于每一个siRNA，分别将一份1B溶液与1份1A1溶液、一份1A2溶液、一份1A3溶液混合，室温下孵育20min，分别得到转染复合物1X1、1X2或1X3。将一份1B溶液与一份1C溶液混合，室温下孵育20min得到转染复合物1X4。
对于每一个siRNA，在三个培养孔(均为上述含有HEK293A细胞和80μL培养基的培养孔，下同)中，分别加入转染复合物1X1，均匀混合，加入量为20μL/孔，得到siRNA终浓度约为1nM的共转染混合物，记为测试组1。
对于每一个siRNA，在另外三个培养孔中，分别加入转染复合物1X2，均匀混合，加入量为20μL/孔，得到siRNA终浓度约为0.1nM的共转染混合物，记为测试组2。
对于每一个siRNA，在另外三个培养孔中，分别加入转染复合物1X3，均匀混合，加入量为20μL/孔，得到siRNA终浓度约为0.01nM的共转染混合物，记为测试组3。
在另外三个培养孔中，分别加入转染复合物1X4，得到不含siRNA的共转染混合物，加入量为20μL/孔，记为对照组。
将含siRNA的共转染混合物和不含siRNA的转染混合物在培养孔中培养4h后，每孔补加100μL含20％FBS的H-DMEM完全培养基。将96孔板置于CO2培养箱继续培养24h。
[3]μ检测
吸去培养孔中的培养基，每孔加入150μl的
Luciferase试剂与H-DMEM混合溶液(体积比1:1)，充分混匀，室温孵育10min后，转移120μl混合液到96孔酶标板上，使用Synergy II多功能酶标仪(BioTek公司)读取各培养孔中的Firefly化学发光值(Fir)；再向每孔加入60μl
Stop&
试剂，充分混匀，室温孵育10min后，按照读取Fir的排布方式，使用酶标仪读取各培养孔中的Renilla的化学发光值(Ren)。
计算每孔发光比值Ratio＝Ren/Fir，各测试组或对照组的发光比值Ratio(测试)或Ratio(对照)为三个培养孔Ratio的平均值；以对照组的发光比值为基准，对各测试组的发光比值进行归一化，获得Ratio(测试)/Ratio(对照)的比值R，以此表示Renilla报告基因的相对表达水平，即残留活性。siRNA对目标序列的抑制率＝(1-R)×100％。
结果如图1所示。表达水平以标准化后的百分比表示，在图1中标记为“Renilla/FireFly活性(％，相对于对照)”。
对比实验例1
参比siRNA NC在体外(in vitro)的抑制活性。
按照实验例1的方法同时考察了参比siRNA NC在体外psiCHECK系统中的抑制活性。结果如图1所示。
结果表明，siACE2a1-M1S和siACE2b1-M1S在1nM-0.1nM浓度时都具有较好的体外抑制活性。特别是，在1nM浓度下，siACE2a1-M1S的目标序列表达量抑制率高达99.15％、siACE2b1-M1S的目标序列表达量抑制率高达98.33％，显示出优异的抑制ACE2基因表达的效果。
实验例3-4
本公开的siRNA在体外(in vitro)的抑制活性
进一步地，使用与实验例1相同的方法测试siACE2a1-M1S和siACE2b1-M1S在体外psiCHECK系统中的抑制活性，区别仅在于，在构建检测质粒时，对于每一siRNA而言，目标序列为以下的序列：
siACE2a1-M1S的目标序列为：
CATGAAGCTGTTGGGGAAATCATGTCACTTTCTGCAGCCACACCTAAGCATTTAAAATCCATTGGTCTTCTGTCACCCGATTTTCAAGAAGACAATGAAACAGAAATAAACTTCCTGCTCAAACAAGCACTCACGATTGTTGGGACTCTGCCATTTACTTACATGTTAGAGAAGTGGAGGTGGATGGTCTTTAAAGGGGAAATTCCCAAAGACCAGTGGATGAAAAAGTGGTGGGAGATGAAGCGAGAGATAGTTGGGGTGGTGGAACCTGTGCCCCATGATGAAACATACTGTGACCCCGCATCTCTGTTCCATGTTTCTAATGATTACTCATTCATTCGATATTACACAAGGACCCTTTACCAATTCCAGTTTCAAGAAGCACTTTGTCAAGCAGCTAAACATGAAGGCCCTCTGCACAAATGTGACATCTCAAACTCTACAGAAGCTGGACAGAAACTGTTCAATATGCTGAGGCTTGGAAAATCAGAACCCTGGACCCTAGCATTGGAAAATGTTGTAGGAGCAAAGAACATGAATGTAAGGCCACTGCTCAACTACTTTGAGCCCTTATTTACCTGGCTGAAAGACCAGAACAAGAATTCTTTTGTGGGATGGAGTACCGACTGGAGTCCATATGCAGACCAAAGCATCAAAGTGAGGATAAGCCTAAAATCAGCTCTTGGAGATAAAGCATATG(SEQ ID NO:173)
siACE2b1-M1S的目标序列为：
TCGGAAGAAGAAAAATAAAGCAAGAAGTGGAGAAAATCCTTATGCCTCCATCGATATTAGCAAAGGAGAAAATAATCCAGGATTCCAAAACACTGATGATGTTCAGACCTCCTTTTAGAAAAATCTATGTTTTTCCTCTTGAGGTGATTTTGTTGTATGTAAATGTTAATTTCATGGTATAGAAAATATAAGATGATAAAGATATCATTAAATGTCAAAACTATGACTCTGTTCAGAAAAAAAATTGTCCAAAGACAACATGGCCAAGGAGAGAGCATCTTCATTGACATTGCTTTCAGTATTTATTTCTGTCTCTGGATTTGACTTCTGTTCTGTTTCTTAATAAGGATTTTGTATTAGAGTATATTAGGGAAAGTGTGTATTTGGTCTCACAGGCTGTTCAGGGATAATCTAAATGTAAATGTCTGTTGAATTTCTGAAGTTGAAAACAAGGATATATCATTGGAGCAAGTGTTGGATCTTGTATGGAATATGGATGGATCACTTGTAAGGACAGTGCCTGGGAACTGGTGTAGCTGCAAGGATTGAGAATGGCATGCATTAGCTCACTTTCATTTAATCCATTGTCAAGGATGACATGCTTTCTTCACAGTAACTCAGTTCAAGTACTATGGTGATTTGCCTACAGTGATGTTTGGAATCGATCATGCTTTCTTCAAGGTGACAGGTCTAAAGAGAG(SEQ ID NO:174)
上述各目标序列均是为NM_001371415.1中的序列片段。
实验结果参见图2所示。
对比实验例2
参比siRNA NC在体外(in vitro)的抑制活性。
按照实验例3的方法同时考察了参比siRNA NC在体外psiCHECK系统中的抑制活性，区别仅在于，使用的siRNA为参比siRNA NC。结果如图2所示。
由图2结果可知，参比siRNA NC在体外未显示出任何抑制活性，而本公开的siRNA均在体外显示出较好的ACE2抑制活性，在0.1nM的siRNA浓度下，siACE2a1M1S的目标mRNA表达量抑制率为61.36％，siACE2b1M1S的目标mRNA表达量抑制率为79.60％；在1nM的siRNA浓度下，siACE2a1M1S的目标mRNA表达量抑制率高达97.10％，siACEb1M1S的目标mRNA表达量抑制率高达98.12％，显示出优异的抑制ACE2基因表达的效果。
实验例5-7，对比实验例3-4
本公开的siRNA在体外(in vitro)HEK293A-ACE2半稳转细胞中的抑制活性。
本试验例测试了siACE2a1,siACE2a2，siACE2a3，和空白MOCK样品参比siRNA NC在体外HEK293A-ACE2半稳转细胞中的抑制活性，结果如图3所示。表达水平以标准化后的百分比表示，在图3中标记为“Renilla/FireFly活性(％，相对于对照)”。
本试验例中，将以ACE2 DNA(NM_001371415.1所示的序列)构建的ACE2 pcDNA3.1-3xFlag-C质粒转染至HEK293A细胞中，构建HEK293A-hACE2半稳转细胞系，根据LipofectamineTM 2000试剂(InvitrogenTM)的说明书，将待评价的siRNA转染至HEK293A-hACE2稳转细胞中，通过双萤光素酶报告基因的表达水平，来反映siRNA的抑制活性。
具体步骤如下：
[1]构建HEK293A-hACE2半稳转细胞系
取对数期HEK293A细胞消化后稀释成8x104个/mL浓度的细胞悬液，接种于25cm2培养瓶中，每瓶接种6mL，培养至汇合率约70％时，去除瓶内原培养基，加入5mL OPTI-MEM培养基。
将3μg的质粒DNA加至500μL的OPTI-MEM培养基中混匀，将20μL的Lipo 2000试剂加至另外500μL的OPTI-MEM培养基中混匀，室温静置5min，与前述含有质粒的OPTI-MEM培养基混匀后，在室温下孵育20min后加入前述HEK293A细胞的培养瓶中。共同培养4h后，吸取除去上层培养基，再加入6mL添加有10％FBS的DMEM培养基继续培养48h。
将培养液转移至75cm2包被培养瓶中，待细胞贴壁后，用6mL添加有900μg/mL G418遗传霉素(Geneticin)和10％FBS的DMEM培养基进行筛选，每2天更换一次新的筛选培养基，去掉死亡的细胞，当正常细胞完全死亡后，换用新的6mL不含G418的添加10％FBS的DMEM培养基培养。当细胞达到60％汇合率时再用6mL添加800μg/mL G418和10％FBS的DMEM培养基筛选一次，去除死亡细胞后继续培养，当细胞达到90％汇合率时将每个培养瓶的培养液分入两个75cm2包被培养瓶中继续培养，每隔4天使用6mL添加800μg/mL G418和10％FBS的DMEM培养基筛选一次，去除死亡细胞并继续培养。通过标准qPCR法对细胞表达ACE2 mRNA的水平进行监测。共筛选10次后，获得稳定转染hACE2 mRNA的HEK293A-hACE2半稳转细胞。每一培养瓶使用6mL添加400μg/mL G418和10％FBS的DMEM培养基继续扩增培养细胞并冻存待用。
[2]细胞培养
用添加有10％的胎牛血清(FBS，Hyclone公司)的DMEM完全培养基(Hyclone公司)培养冻存的HEK293A-hACE2半稳转细胞，于37℃在含5％CO2/95％空气的培养箱中培养。
[3]转染
将HEK293A-hACE2半稳转细胞以1x105细胞/孔接种于12孔板中，每孔1mL细胞液，24h后细胞生长密度达到70-80％时，吸尽培养孔中培养基，每孔加入1mL Opti-MEM培养基(GIBCO公司)继续培养1.5h。
所测试的siRNA为siACE2a1,siACE2a2，siACE2a3。对于每一siRNA，用DEPC化水配制成浓度分别为10nM、1nM和0.1nM(以siRNA的量计)的siRNA工作液。
配制2A1溶液，每份2A1溶液含有3μL 10nM的siRNA工作液和97μLOpti-MEM培养基。
配制2A2溶液，每份2A2溶液含有3μL 1nM的siRNA工作液和97μLOpti-MEM培养基。
配制2A3溶液，每份2A3溶液含有3μL 0.1nM的siRNA工作液和97μLOpti-MEM培养基。
配制2B溶液，每份2B溶液含有98μL Opti-MEM培养基和2μLLipofectamineTM 2000(Invitrogen公司)。
配制2C溶液，每份2C溶液含有3μL 10nM的siRNA NC工作液和97μLOpti-MEM培养基。
对于每一个siRNA，分别将一份2B溶液与1份2A1溶液、一份2A2溶液、一份2A3溶液混合，室温下孵育20min，分别得到转染复合物2X1、2X2或2X3。将一份2B溶液与一份2C溶液混合，室温下孵育20min得到对比转染复合物2X4。将1份2B溶液与100μL Opti-MEM培养基混合，室温下孵育20min得到空白对照复合物2X5。
对于每一个siRNA，在三个培养孔(指含有上述HEK293A-hACE2半稳转细胞培养液的培养孔，下同)中，分别加入转染复合物2X1，均匀混合，加入量为200μL/孔，得到siRNA终浓度约为1nM的转染混合物，记为测试组1。
对于每一个siRNA，在另外三个培养孔中，分别加入转染复合物2X2，均匀混合，加入量为200μL/孔，得到siRNA终浓度约为0.1nM的转染混合物，记为测试组2。
对于每一个siRNA，在另外三个培养孔中，分别加入转染复合物2X3，均匀混合，加入量为200μL/孔，得到siRNA终浓度约为0.01nM的转染混合物，记为测试组3。
在另外两个培养孔中，分别加入转染复合物2X4，得到得到siRNA终浓度约为1nM的含参比siRNA NC的转染混合物，加入量为200μL/孔，记为siRNA NC组。
在另外两个培养孔中，分别加入空白对照复合物2X5，得到不含siRNA的空白对照混合物，加入量为200μL/孔，分别记为MOCK1和MOCK2组。
将上述含siRNA的转染混合物和空白对照混合物在培养孔中培养4h后，每孔补加100μL含20％FBS的H-DMEM完全培养基。将12孔板置于CO2培养箱继续培养24h。
[4]检测
吸去培养孔中的培养基，每孔加入150μl的
Luciferase试剂与H-DMEM混合溶液(体积比1:1)，充分混匀，室温孵育10min后，转移120μl混合液到96孔酶标板上，使用Synergy II多功能酶标仪(BioTek公司)读取各培养孔中的Firefly化学发光值(Fir)；再向每孔加入60μl
Stop&
试剂，充分混匀，室温孵育10min后，按照读取Fir的排布方式，使用酶标仪读取各培养孔中的Renilla的化学发光值(Ren)。
计算每孔发光比值Ratio＝Ren/Fir，各测试组的发光比值Ratio(测试)为三个培养孔Ratio的平均值；各对照组的发光比值Ratio(对照)为两个培养孔Ratio的平均值。以空白对照组MOCK1和MOCK2的发光比值的平均值Ratio(空白)为基准，对各测试组的发光比值进行归一化，获得Ratio(测试)/Ratio(空白)的比值R，以此表示Renilla报告基因的相对表达水平，即残留活性。siRNA对目标序列的抑制率＝(1-R)×100％。
由图3结果可知，本公开的siRNA均在体外半稳转细胞系中显示出较好的ACE2抑制活性，在0.1nM的siRNA浓度下，siACE2a1、siACE2a2和siACE2a3的目标mRNA表达量抑制率分别为74.15％、74.00％、74.35％；在1nM的siRNA浓度下，siACE2a1、siACE2a2和siACE2a3的目标mRNA表达量抑制率分别高达82.04％、81.46％和81.02％；在10nM的siRNA浓度下，siACE2a1、siACE2a2和siACE2a3的目标mRNA表达量抑制率分别高达83.55％、84.43％和87.99％，均显示出优异的抑制ACE2基因表达的效果。
实验例8-10，对比实验例5-6
本公开的siRNA在体外(in vitro)HEK293A-ACE2半稳转细胞中的抑制活性
本试验例使用和上述实验例5中的相同的方法测试了siACE2a1-M1S,siACE2a1-M2S，siACE2a1-M3S，和空白MOCK样品参比siRNA NC在体外HEK293A-ACE2半稳转细胞中的抑制活性，区别仅在于，分别使用siACE2a1-M1S,siACE2a1-M2S，siACE2a1-M3S配制siRNA工作液进行试验，结果如图4所示。表达水平以标准化后的百分比表示，在图4中标记为“Renilla/FireFly活性(％，相对于对照)”。
由图4结果可知，本公开的siRNA均在体外HEK293A-ACE2半稳转细胞中显示出较好的ACE2抑制活性，在0.1nM的siRNA浓度下，siACE2a1-M1S、siACE2a1-M2S和siACE2a1-M3S的目标mRNA表达量抑制率分别为82.60％、82.77％、79.68％；在1nM的siRNA浓度下，siACE2a1-M1S、siACE2a1-M2S和siACE2a1-M3S的目标mRNA表达量抑制率分别高达87.48％、89.11％和88.18％；在10nM的siRNA浓度下，siACE2a1-M1S、siACE2a1-M2S和siACE2a1-M3S的目标mRNA表达量抑制率分别高达84.17％、88.08％和90.17％，均显示出优异的抑制ACE2基因表达的效果。
实验例11
本公开的siRNA在体外(in vitro)人源溶酶体裂解液中的稳定性
经溶酶体裂解液处理的测试样品制备：将siACE2a1和siACE2a1M1S(分别以siRNA浓度为20μM的0.9％氯化钠水溶液形式提供，每组6μl)分别与27.2μL柠檬酸钠水溶液(pH5.0)、4.08μL去离子水和2.72μL人源溶酶体酶Lysosome(商购自Xenotech公司，货号H0610L，批号1710180，浓度为0.269mU/μL)混匀。37℃恒温孵育。分别在0h、1h、2h、4h、6h、24h、48h取出5μl样本，分别加入到15μL 9M的尿素中变性，随后加入4μl 6×上样缓冲液(索莱宝公司，货号20160901)，立即冷冻于-80℃冰箱终止反应。0小时表示，将待测样品与人源溶酶体裂解液混匀后，立即取出的时刻。
未经溶酶体裂解液处理的参比样品制备：取等摩尔量的上述siRNA(20μM)各1.5μl分别与7.5μL柠檬酸钠水溶液(pH5.0)、1μL去离子水混匀，加入30μL 9M的尿素溶液变性，随后加入8μL 6×上样缓冲液混匀，立即冷冻于-80℃冰箱终止反应。各缀合物参比样品在电泳图中标记为M。
配制16重量％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，上述测试样品及参比样品各取10μl上样至凝胶，在20mA恒流条件下电泳20min后，继续在40mA恒流条件下电泳60min。电泳结束后，将凝胶置于摇床上，用Gelred染料(BioTium公司，货号13G0306)染色10min。凝胶成像观察并拍照，结果如图5所示。
图5显示了所测试siRNA在体外人源溶酶体裂解液中的稳定性半定量检测结果。结果显示，本公开的siRNA在进行修饰后，在人源溶酶体裂解液中可维持长时间不降解，显示出很好的稳定性。
实验例12
本公开的siRNA在体外(in vitro)鼠源溶酶体裂解液中的稳定性
使用和实验例11中相同的方法测试了siACE2a1MIS在鼠源溶酶体裂解液中的稳定性，区别在于加入2.72μL鼠源Lysosome(商购自Xenotech公司，货号R0610LT，批号1610405，浓度2.83mU/μL)。结果如图6所示。
图6显示了所测试siRNA在体外鼠源溶酶体裂解液中的稳定性半定量检测结果。结果显示，本公开的siRNA在进行修饰后，在鼠源溶酶体裂解液中可维持长时间不降解，显示出很好的稳定性。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 北京瑞博开拓医药科技有限公司
<120> 核酸、含有该核酸的药物组合物与siRNA缀合物及制备方法和用途
<130> 16702RIBO-R-DJ
<150> 202010309596.9
<151> 2020-04-17
<160> 178
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
uuuacauuua gauuaucccu g 21
<210> 87
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
gggauaaucu aaauguaaa 19
<210> 88
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
uuuacauuua gauuaucccu g 21
<210> 89
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
gggauaaucu aaauguaaa 19
<210> 90
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
uuuacauuua gauuaucccu g 21
<210> 91
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
cagggauaau cuaaauguaa a 21
<210> 92
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
uuuacauuua gauuaucccu gaa 23
<210> 93
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
cagggauaau cuaaauguaa a 21
<210> 94
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
uuuacauuua gauuaucccu gaa 23
<210> 95
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
cagggauaau cuaaauguaa a 21
<210> 96
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
uuuacauuua gauuaucccu gaa 23
<210> 97
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
gggauaaucu aaauguaaa 19
<210> 98
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
uuuacauuua gauuaucccu g 21
<210> 99
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
gggauaaucu aaauguaaa 19
<210> 100
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
uuuacauuua gauuaucccu g 21
<210> 101
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
gggauaaucu aaauguaaa 19
<210> 102
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
uuuacauuua gauuaucccu g 21
<210> 103
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
cagggauaau cuaaauguaa a 21
<210> 104
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
uuuacauuua gauuaucccu gaa 23
<210> 105
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
cagggauaau cuaaauguaa a 21
<210> 106
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
uuuacauuua gauuaucccu gaa 23
<210> 107
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
cagggauaau cuaaauguaa a 21
<210> 108
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
uuuacauuua gauuaucccu gaa 23
<210> 109
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
gggauaaucu aaauguaaa 19
<210> 110
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
uuuacauuua gauuaucccu g 21
<210> 111
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
gggauaaucu aaauguaaa 19
<210> 112
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
uuuacauuua gauuaucccu g 21
<210> 113
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
gggauaaucu aaauguaaa 19
<210> 114
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
uuuacauuua gauuaucccu g 21
<210> 115
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
cagggauaau cuaaauguaa a 21
<210> 116
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
uuuacauuua gauuaucccu gaa 23
<210> 117
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
cagggauaau cuaaauguaa a 21
<210> 118
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
uuuacauuua gauuaucccu gaa 23
<210> 119
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
cagggauaau cuaaauguaa a 21
<210> 120
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
uuuacauuua gauuaucccu gaa 23
<210> 121
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
cucuguucca uguuucuaa 19
<210> 122
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
uuagaaacau ggaacagaga u 21
<210> 123
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
cucuguucca uguuucuaa 19
<210> 124
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
uuagaaacau ggaacagaga u 21
<210> 125
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
cucuguucca uguuucuaa 19
<210> 126
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
uuagaaacau ggaacagaga u 21
<210> 127
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
aucucuguuc cauguuucua a 21
<210> 128
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
uuagaaacau ggaacagaga ugc 23
<210> 129
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
aucucuguuc cauguuucua a 21
<210> 130
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 130
uuagaaacau ggaacagaga ugc 23
<210> 131
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 131
aucucuguuc cauguuucua a 21
<210> 132
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 132
uuagaaacau ggaacagaga ugc 23
<210> 133
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 133
cucuguucca uguuucuaa 19
<210> 134
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 134
uuagaaacau ggaacagaga u 21
<210> 135
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 135
cucuguucca uguuucuaa 19
<210> 136
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 136
uuagaaacau ggaacagaga u 21
<210> 137
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 137
cucuguucca uguuucuaa 19
<210> 138
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 138
uuagaaacau ggaacagaga u 21
<210> 139
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 139
aucucuguuc cauguuucua a 21
<210> 140
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 140
uuagaaacau ggaacagaga ugc 23
<210> 141
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 141
aucucuguuc cauguuucua a 21
<210> 142
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 142
uuagaaacau ggaacagaga ugc 23
<210> 143
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 143
aucucuguuc cauguuucua a 21
<210> 144
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 144
uuagaaacau ggaacagaga ugc 23
<210> 145
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 145
gggauaaucu aaauguaaa 19
<210> 146
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 146
uuuacauuua gauuaucccu g 21
<210> 147
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 147
gggauaaucu aaauguaaa 19
<210> 148
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 148
uuuacauuua gauuaucccu g 21
<210> 149
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 149
gggauaaucu aaauguaaa 19
<210> 150
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 150
uuuacauuua gauuaucccu g 21
<210> 151
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 151
cagggauaau cuaaauguaa a 21
<210> 152
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 152
uuuacauuua gauuaucccu gaa 23
<210> 153
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 153
cagggauaau cuaaauguaa a 21
<210> 154
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 154
uuuacauuua gauuaucccu gaa 23
<210> 155
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 155
cagggauaau cuaaauguaa a 21
<210> 156
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 156
uuuacauuua gauuaucccu gaa 23
<210> 157
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 157
gggauaaucu aaauguaaa 19
<210> 158
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 158
uuuacauuua gauuaucccu g 21
<210> 159
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 159
gggauaaucu aaauguaaa 19
<210> 160
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 160
uuuacauuua gauuaucccu g 21
<210> 161
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 161
gggauaaucu aaauguaaa 19
<210> 162
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 162
uuuacauuua gauuaucccu g 21
<210> 163
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 163
cagggauaau cuaaauguaa a 21
<210> 164
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 164
uuuacauuua gauuaucccu gaa 23
<210> 165
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 165
cagggauaau cuaaauguaa a 21
<210> 166
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 166
uuuacauuua gauuaucccu gaa 23
<210> 167
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 167
cagggauaau cuaaauguaa a 21
<210> 168
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 168
uuuacauuua gauuaucccu gaa 23
<210> 169
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 169
uucuccgaac gugucacgu 19
<210> 170
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 170
acgugacacg uucggagaac u 21
<210> 171
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 171
atctctgttc catgtttcta a 21
<210> 172
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 172
cagggataat ctaaatgtaa a 21
<210> 173
<211> 700
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 173
catgaagctg ttggggaaat catgtcactt tctgcagcca cacctaagca tttaaaatcc 60
attggtcttc tgtcacccga ttttcaagaa gacaatgaaa cagaaataaa cttcctgctc 120
aaacaagcac tcacgattgt tgggactctg ccatttactt acatgttaga gaagtggagg 180
tggatggtct ttaaagggga aattcccaaa gaccagtgga tgaaaaagtg gtgggagatg 240
aagcgagaga tagttggggt ggtggaacct gtgccccatg atgaaacata ctgtgacccc 300
gcatctctgt tccatgtttc taatgattac tcattcattc gatattacac aaggaccctt 360
taccaattcc agtttcaaga agcactttgt caagcagcta aacatgaagg ccctctgcac 420
aaatgtgaca tctcaaactc tacagaagct ggacagaaac tgttcaatat gctgaggctt 480
ggaaaatcag aaccctggac cctagcattg gaaaatgttg taggagcaaa gaacatgaat 540
gtaaggccac tgctcaacta ctttgagccc ttatttacct ggctgaaaga ccagaacaag 600
aattcttttg tgggatggag taccgactgg agtccatatg cagaccaaag catcaaagtg 660
aggataagcc taaaatcagc tcttggagat aaagcatatg 700
<210> 174
<211> 700
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 174
tcggaagaag aaaaataaag caagaagtgg agaaaatcct tatgcctcca tcgatattag 60
caaaggagaa aataatccag gattccaaaa cactgatgat gttcagacct ccttttagaa 120
aaatctatgt ttttcctctt gaggtgattt tgttgtatgt aaatgttaat ttcatggtat 180
agaaaatata agatgataaa gatatcatta aatgtcaaaa ctatgactct gttcagaaaa 240
aaaattgtcc aaagacaaca tggccaagga gagagcatct tcattgacat tgctttcagt 300
atttatttct gtctctggat ttgacttctg ttctgtttct taataaggat tttgtattag 360
agtatattag ggaaagtgtg tatttggtct cacaggctgt tcagggataa tctaaatgta 420
aatgtctgtt gaatttctga agttgaaaac aaggatatat cattggagca agtgttggat 480
cttgtatgga atatggatgg atcacttgta aggacagtgc ctgggaactg gtgtagctgc 540
aaggattgag aatggcatgc attagctcac tttcatttaa tccattgtca aggatgacat 600
gctttcttca cagtaactca gttcaagtac tatggtgatt tgcctacagt gatgtttgga 660
atcgatcatg ctttcttcaa ggtgacaggt ctaaagagag 700
<210> 175
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 175
cucuguucca uguucuaaug 20
<210> 176
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 176
uuagaacaug gaacagagau 20
<210> 177
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 177
gggauaaucu aaauguaaau g 21
<210> 178
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 178
uuuacauuua gauuaucccu g 21
Claims (33)
1.一种siRNA，所述siRNA含有正义链和反义链，所述的siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸；其中，所述正义链含有一段核苷酸序列I，反义链含有一段核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区；其中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5'-CUCUGUUCCAUGUUUCUAZ1-3'SEQ ID NO:1，
5'-Z2UAGAAACAUGGAACAGAG-3'SEQ ID NO:2；
其中，Z1为A，Z2为U，所述核苷酸序列I中包含位置对应于Z1的核苷酸Z3，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Z2的核苷酸Z4，所述Z4是所述反义链5'末端的第一个核苷酸；或者，
所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:61所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，且所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:62所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异：
5'-GGGAUAAUCUAAAUGUAAZ5-3'SEQ ID NO:61，
5'-Z6UUACAUUUAGAUUAUCCC-3'(SEQ ID NO:62)；
其中，Z5为A，Z6为U，所述核苷酸序列I中包含位置对应于Z5的核苷酸Z7，所述核苷酸序列II中包含位置对应于Z6的核苷酸Z8，所述Z8是所述反义链5'末端的第一个核苷酸。
2.根据权利要求1所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异；
或者，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:61所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异，和/或所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:62所示的核苷酸序列之间不多于1个核苷酸差异。
3.根据权利要求1或2所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列之间的核苷酸差异包括Z4位置处的差异，且Z4选自A、C或G；
或者，所述核苷酸序列II与SEQ ID NO:62所示的核苷酸序列之间的核苷酸差异包括Z8位置处的差异，且Z8选自A、C或G。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的siRNA，其中Z3是与Z4互补的核苷酸；或者，Z7是与Z8互补的核苷酸。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补；所述基本上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于3个的碱基错配；所述实质上反向互补是指两个核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；完全反向互补是指两个核苷酸序列之间没有错配。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的siRNA，其中，所述正义链和反义链长度相同或不同，所述正义链的长度为19-23个核苷酸，反义链的长度为19-26个核苷酸；并且，
所述核苷酸序列I是SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，所述核苷酸序列II是SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列：
5'-CUCUGUUCCAUGUUUCUAZ3-3'SEQ ID NO:3，
5'-Z4UAGAAACAUGGAACAGAG-3'(SEQ ID NO:4)；
其中，Z3选自A、U、G或C，Z4是与Z3互补的核苷酸；
或者，所述核苷酸序列I是SEQ ID NO:63所示的核苷酸序列，所述核苷酸序列II是SEQID NO:64所示的核苷酸序列：
5'-GGGAUAAUCUAAAUGUAAZ7-3'SEQ ID NO:63，
5'-Z8UUACAUUUAGAUUAUCCC-3'SEQ ID NO:64；
其中，Z7选自A、U、G或C，Z8是与Z7互补的核苷酸。
7.根据权利要求6所述的siRNA，其中，Z3为A，Z4为U；或者Z7为A，Z8为U。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的siRNA，其中，所述正义链还含有核苷酸序列III，所述反义链还含有核苷酸序列IV，核苷酸序列III和核苷酸序列IV的长度各自独立地为1-4个核苷酸，所述核苷酸序列III连接在核苷酸序列I的5'末端，核苷酸序列IV连接在核苷酸序列II的3'末端，所述核苷酸序列III和所述核苷酸序列IV长度相等并且实质上反向互补或完全反向互补。
9.根据权利要求8所述siRNA，其中，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，并且，所述核苷酸序列III和IV的长度均为1个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基为U；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基组成为AU；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基组成为CAU；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基组成为GCAU；
或者，所述核苷酸序列I与SEQ ID NO:61所示的核苷酸序列长度相等，且不多于3个核苷酸差异，并且，所述核苷酸序列III和IV的长度均为1个核苷酸，所述核苷酸序列III的碱基为A；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为2个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基组成为CA；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为3个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基组成为UCA；或者，所述核苷酸序列III和IV的长度均为4个核苷酸，按照5'末端到3'末端的方向，核苷酸序列III的碱基组成为UUCA。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的siRNA，其中，所述反义链还含有核苷酸序列V，核苷酸序列V的长度为1至3个核苷酸，连接在所述反义链的3'末端，构成反义链的3'突出端；和/或所述正义链还含有核苷酸序列VI，核苷酸序列VI的长度为1至3个核苷酸，连接在所述正义链的3'末端，构成正义链的3'突出端。
11.根据权利要求10所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列V和/或核苷酸序列VI的长度为2个核苷酸。
12.根据权利要求10或11所述的siRNA，其中，所述核苷酸序列V和/或VI为连续的两个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸或连续的两个尿嘧啶核糖核苷酸；或者所述核苷酸序列V与靶mRNA相应位置的核苷酸互补，和/或所述核苷酸序列VI与靶mRNA相应位置的核苷酸相同。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的siRNA，其中，所述siRNA的正义链含有如SEQ IDNO:5所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列：
5'-CUCUGUUCCAUGUUUCUAZ3-3'(SEQ ID NO:5)，
5'-Z4UAGAAACAUGGAACAGAGAU-3'(SEQ ID NO:6)；
或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列：
5'-AUCUCUGUUCCAUGUUUCUAZ3-3'(SEQ ID NO:7)，
5'-Z4UAGAAACAUGGAACAGAGAUGC-3'(SEQ ID NO:8)；
其中，所述Z4是反义链5'末端的第一个核苷酸，Z3选自A、U、G或C，并且Z4是与Z3互补的核苷酸；
或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:65所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:66所示的核苷酸序列：
5'-GGGAUAAUCUAAAUGUAAZ7-3'(SEQ ID NO:65)，
5'-Z8UUACAUUUAGAUUAUCCCUG-3'(SEQ ID NO:66)；
或者，所述siRNA的正义链含有如SEQ ID NO:67所示的核苷酸序列，所述siRNA的反义链含有如SEQ ID NO:68所示的核苷酸序列：
5'-CAGGGAUAAUCUAAAUGUAAZ7-3'(SEQ ID NO:67)，
5'-Z8UUACAUUUAGAUUAUCCCUGAA-3'(SEQ ID NO:68)；
其中，所述Z8是反义链5'末端的第一个核苷酸，Z7选自A、U、G或C，并且Z8是与Z7互补的核苷酸。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的siRNA，其中，所述siRNA为siACE2a1、siACE2a2、siACE2a3、siACE2b1、siACE2b2或siACE2b3。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的siRNA，其中，所述正义链或所述反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，和/或至少一个磷酸酯基为具有修饰基团的磷酸酯基。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的siRNA，其中，所述正义链和所述反义链中的每一个核苷酸独立地为氟代修饰的核苷酸或非氟代修饰的核苷酸。
17.根据权利要求16所述的siRNA，其中，按照5'末端到3'末端的方向，在所述正义链中，所述核苷酸序列I的第7、8、9位或者5、7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸；按照5'末端到3'末端的方向，在所述反义链中，所述核苷酸序列II的第2、6、14、16位或者2、6、8、9、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为非氟代修饰的核苷酸。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的siRNA，其中，所述siRNA为siACE2a1-M1、siACE2a1-M2、siACE2a1-M3、siACE2a2-M1、siACE2a2-M2、siACE2a2-M3、siACE2b1-M1、siACE2b1-M2、siACE2b1-M3、siACE2b2-M1、siACE2b2-M2、siACE2b2-M3中的任意一种。
19.根据权利要求15所述的siRNA，其中，所述具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的siRNA，其中，所述siRNA为siACE2a1-M1S、siACE2a1-M2S、siACE2a1-M3S、siACE2a2-M1S、siACE2a2-M2S、siACE2a2-M3S、siACE2a1-M1S1、siACE2a1-M2S1、siACE2a1-M3S1、siACE2a2-M1S1、siACE2a2-M2S1、siACE2a2-M3S1、siACE2b1-M1S、siACE2b1-M2S、siACE2b1-M3S、siACE2b2-M1S、siACE2b2-M2S、siACE2b2-M3S、siACE2b1-M1S1、siACE2b1-M2S1、siACE2b1-M3S1、siACE2b2-M1S1、siACE2b2-M2S1和siACE2b2-M3S1、siACE2a1-M1P1、siACE2a1-M2P1、siACE2a1-M3P1、siACE2a2-M1P1、siACE2a2-M2P1、siACE2a2-M3P1、siACE2a1-M1SP1、siACE2a1-M2SP1、siACE2a1-M3SP1、siACE2a2-M1SP1、siACE2a2-M2SP1、siACE2a2-M3SP1、siACE2a1-M1S1P1、siACE2a1-M2S1P1、siACE2a1-M3S1P1、siACE2a2-M1S1P1、siACE2a2-M2S1P1、siACE2a2-M3S1P1、siACE2b1-M1P1、siACE2b1-M2P1、siACE2b1-M3P1、siACE2b2-M1P1、siACE2b2-M2P1、siACE2b2-M3P1、siACE2b1-M1SP1、siACE2b1-M2SP1、siACE2b1-M3SP1、siACE2b2-M1SP1、siACE2b2-M2SP1、siACE2b2-M3SP1、siACE2b1-M1S1P1、siACE2b1-M2S1P1、siACE2b1-M3S1P1、siACE2b2-M1S1P1、siACE2b2-M2S1P1和siACE2b2-M3S1P1中的任意一种。
21.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有权利要求1-20中任意一项所述的siRNA和药学上可接受的载体。
22.根据权利要求21所述的药物组合物，其中，所述siRNA与药学上可接受的载体的重量比为1:(1-500)。
23.根据权利要求22所述的药物组合物，其中，所述siRNA与药学上可接受的载体的重量比为1:(1-50)。
24.一种siRNA缀合物，所述siRNA缀合物含有权利要求1-20中任意一项所述的siRNA以及缀合连接至该siRNA的缀合基团，所述缀合基团包含药学上可接受的靶向基团和接头，并且，所述siRNA、所述接头和所述靶向基团依次共价或非共价连接，每个所述靶向基团选自能够和细胞表面受体结合的配体。
25.根据权利要求24所述的siRNA缀合物，其中，每个所述靶向基团选自能够和表达ACE2的细胞表面受体结合的配体。
26.根据权利要求24或25所述的siRNA缀合物，其中，每个所述靶向基团选自于靶向ACE2的基团或靶向整合素αvβ6的基团。
27.根据权利要求24-26中任意一项所述的siRNA缀合物，其中，每个所述靶向基团独立地为多肽或小分子配体。
28.权利要求1-20中任意一项所述的siRNA和/或权利要求21-23中任意一项所述的药物组合物和/或权利要求24-27中任意一项所述的siRNA缀合物在制备用于抑制细胞中ACE2基因表达的药物中的用途。
29.权利要求1-20中任意一项所述的siRNA和/或权利要求21-23中任意一项所述的药物组合物和/或权利要求24-27中任意一项所述的siRNA缀合物在制备用于治疗和/或预防冠状病毒引起的疾病的药物中的用途。
30.根据权利要求29所述的用途，其中，所述冠状病毒是SARS-CoV-2病毒。
31.根据权利要求29或30所述的用途，其中，所述冠状病毒所引起的疾病为COVID-19。
32.一种抑制细胞中ACE2基因表达的方法，该方法包括将有效量的权利要求1-20中任意一项所述的siRNA和/或权利要求21-23中任意一项所述的药物组合物和/或权利要求24-27中任意一项所述的siRNA缀合物与所述细胞接触。
33.一种试剂盒，该试剂盒包含权利要求1-20中任意一项所述的siRNA和/或权利要求21-23中任意一项所述的药物组合物和/或权利要求24-27中任意一项所述的siRNA缀合物。
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