JP2006515993A - 短鎖干渉ｒｎａ遺伝子治療 - Google Patents

Abstract

【構成】 遺伝子に特異的であるｓｉＲＮＡをコードするレンチウィルスベクターを細胞へ導入することによって、前記細胞において前記遺伝子の発現を阻害する。癌関連遺伝子に特異的であるｓｉＲＮＡをコードするレンチウィルスベクターは、癌細胞に導入された後、前記遺伝子の発現を阻害して、細胞死を引き起こした。ＨＩＶ遺伝子に特異的であるｓｉＲＮＡをコードするレンチウィルスベクターを細胞へ導入した後、ＨＩＶ感染細胞のウィルス複製は阻害された。

Description

（関連特許）
本出願は、２００３年１月１７日に出願された米国仮特許出願第６０／４４０，９８７号の利益を主張する。

（連邦政府委託研究に関する宣言）
本発明は、国立衛生研究所 (National Institutes of Health) により付与された助成番号Ｐ５０ ＨＬ５９４１２の下、合衆国政府の支援によってなされた。合衆国政府は、本発明における特定の権利を有する。

（発明の分野）
本発明は、概して生物学、腫瘍学及び遺伝子治療の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）をコードするレンチウィルスベクターを用いて、遺伝子発現を調整する方法に関する。

（発明の背景）
線虫Caenorhabditis elegans（P. Sharp, Genes & Development 13:139-141, 1999）において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を介した遺伝子サイレンシング、すなわちＲＮＡ干渉が発見され、遺伝子発現をノックアウトするための遺伝学の手法として用いられてきた。この遺伝子サイレンシングの現象は、多くの真核細胞で高度に保存されていることが後にわかった。長鎖ｄｓＲＮＡの生物の細胞への導入は、ホモログ遺伝子転写物の配列特異的な分解をもたらす。Ｄｉｃｅｒとして知られている内因性のリボヌクレアーゼの作用によって、長鎖ｄｓＲＮＡ分子は、短鎖（例えば、２１〜２３ヌクレオチド）干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）へ代謝される(Grishok et al., Science 287:2494-2497, 2000; 及びZamore et al., Cell 101: 25-33, 2000)。ｓｉＲＮＡ分子は、ヘリカーゼ活性及びエンドヌクレアーゼ活性を含むＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）名付けられた蛋白質複合体に結合する。ヘリカーゼ活性はＲＮＡ分子の２本鎖をほどき、アンチセンス鎖を標的ＲＮＡ分子へ結合できるようにする（Zamore et al., Cell 101:25-33, 2000、Zamore, P.D., Science 296:1265-1269, 2002及びVickers et al., J Biol Chem. 2003 Feb 28; 278(9): 7108-18）。エンドヌクレアーゼ活性は、アンチセンス鎖が結合した部位の標的ＲＮＡを加水分解する。このため、ＲＮＡｉは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）分子がワトソン−クリック塩基対規則によって標的ＲＮＡ分子へ結合し、標的ＲＮＡを分解するリボヌクレアーゼを集めるような、アンチセンスメカニズムの作用である。

マイクロＲＮＡ、すなわちｍｉＲＮＡ（ｍＲＮＡの翻訳を抑制するｓｓＲＮＡ種）によって、別の転写後の遺伝子サイレンシング過程は調節される（Lee et al., Cell 75, 843-54 (1993)）。ｓｉＲＮＡと同様に、エンドヌクレアーゼＤｉｃｅｒによって２１〜２５ヌクレオチド配列へ処理されるＲＮＡ前駆体からｍｉＲＮＡを得て、配列特異的遺伝子サイレンシング複合体を形成する。McManus及びSharp, Nat Rev Genet 3, 737-47. (2002)を参照。

哺乳動物細胞では、３０塩基対より長いｄｓＲＮＡは、インターフェロンα応答によって、非特異的遺伝子抑制を起こすことができる。しかし、両３末端から突出する２のヌクレオチドを保持する、２１ヌクレオチドの合成二本鎖ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞は、インターフェロン応答を避けて、配列特異的な遺伝子サイレンシング機能を効率よく発揮することができる。しかし、合成ｓｉＲＮＡのサイレンシング効果は、一過性のものである。Ｔ７ポリメラーゼ及び哺乳動物のｐｏｌＩＩ又はｐｏｌＩＩＩプロモーターを含む転写系を利用して、ｓｉＲＮＡを発現するプラスミドＤＮＡも開発された（Wang et al., J Biol Chem 275, 40174-9 (2000)及びYu et al., Proc Natl Acad Sci USA 99, 6047-52 (2002)）。ｓｉＲＮＡをコードするプラスミドによる遺伝子サイレンシングの効率は、ＤＮＡトランスフェクション効率によるが、それは、多くの細胞型、特に生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）の研究では低い。また、プラスミドＤＮＡトランスフェクションは、一過性のｓｉＲＮＡ発現となる。（例えば、遺伝子治療の適用で望まれるように）効率的な遺伝子サイレンシングのため、長期間、高レベルのｓｉＲＮＡ発現を供給する系が望ましい。

（要約）
本発明は、ｓｉＲＮＡをコードするレンチウィルスベクターを用いて、細胞内の遺伝子発現を調節するための方法及び組成物に関する。細胞内の遺伝子発現を調節する（例えば、減少させる）ため、調節する遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡをコードするレンチウィルスベクターを細胞へ導入する。いったんレンチウィルスベクターを細胞へ導入すると、ｓｉＲＮＡ分子が発現され、相補的なＲＮＡ配列の分解を促進するように作用し、これらの配列によってコードされる遺伝子の発現を妨げる。

以下に述べる実験において、哺乳動物細胞において特定の遺伝子の発現を減少させるために用いられる、ｓｉＲＮＡをコードするレンチウィルスベクターの一例を述べる。ｐｏｌＩＩＩプロモーターで制御された、腫瘍に特異的な遺伝子である幹細胞抗原−２（Ｓｃａ−２）に特異的なｓｉＲＮＡをコードするレンチウィルスベクターは、マウス肝臓癌細胞株においてＳｃａ−２の発現を効率的にサイレンシングし、迅速なアポトーシス性の細胞死を誘導した。

この系の重大な利点は、それが安定でかつ長期にわたるｓｉＲＮＡの発現を達成できるということである。例えば、上記の実験において、レンチウィルスｓｉＲＮＡベクター形質導入の後、Ｓｃａ−２の発現の９０％以上が阻害された。さらに、そのベクターが逆方向のｐｏｌＩＩＩ−ｓｉＲＮＡを含むとき、このサイレンシング効果は、少なくとも２か月間続いた。

以下に示されたさらなる実験は、ｓｉＲＮＡをコードするレンチウィルスベクターを用いて、細胞内のウィルスの複製を阻害するために使用可能であることを示している。特に、ＨＩＶ型１（ＨＩＶ−１）ゲノムにおいて複数の高度に保存された領域を標的とするいくつかのレンチウィルスｓｉＲＮＡベクターを開発し、実験を行った。ｓｉＲＮＡが標的とする部位のいくつかは、ベクター系のヘルパーコンストラクト中にも存在しているのでベクター生産が抑制されると推定されたが、これらのレンチウィルスｓｉＲＮＡベクターの生産は著しく影響されなかった。異なるＨＩＶ−１分子のクローンに対して実験されたとき、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｉｎｔおよびｖｐｕ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡは、全ての種の複製を効率よく阻害した。また、これらレンチウィルスｓｉＲＮＡベクターは、合胞体を形成する、マクロファージ向性ＨＩＶ−１が誘導した毒性から宿主細胞を保護した。そして、レンチウィルスｓｉＲＮＡでの、長期の慢性的に感染したヒト・リンパ腫細胞株の形質導入は、ＨＩＶ−１複製の安定した阻害となった。

従って、本発明は、短鎖干渉ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含んでいるレンチウィルスベクター（例えば、自己不活性ベクター）を特徴とする。レンチウィルスベクターは、レンチウィルスビリオン内に含まれたものであってもよい。短鎖干渉ＲＮＡは、Ｓｃａ−２のような癌と関連した遺伝子に特異的であり、また、ＨＩＶ−１からのｇａｇ、ｐｏｌ、ｉｎｔ、ｖｐｕのようなウィルス（例えば、ＨＩＶ）に存在している遺伝子に特異的である。

ベクターは、プロモーターと短鎖干渉ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を特徴とするカセット含み得る。前記カセットは、ウィルスベクターのゲノムに関して逆方向または順方向であってもよい。

別の側面では、本発明は、本発明であるレンチウィルスベクター（例えば、短鎖干渉ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むベクター）を細胞へ導入するステップを含む方法を特徴とする。前記細胞はヒト細胞等の哺乳動物細胞であってもよい。また、前記細胞は腫瘍細胞であってもよい。

本発明の方法の一変形例では、短鎖干渉ＲＮＡは癌と関連した遺伝子に特異的であり、核酸を細胞へ導入するステップは、遺伝子の発現の減少および／または細胞死となる。

本発明の方法の別の変形例では、細胞をウィルスと感染させて、短鎖干渉ＲＮＡは、ＨＩＶ−１からのｇａｇ、ｐｏｌ、ｉｎｔまたはｖｐｕのような、ウィルス（例えば、ＨＩＶ）内に存在している遺伝子に特異的である。この変形例では、ベクターを細胞へ導入するステップは、細胞内のウィルスの複製の阻害となりうる。

本発明の方法で用いられるベクターは、プロモーターと短鎖干渉ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を特徴とするカセットを含み得る。前記カセットは、ベクター内の他の遺伝子（つまり、ウィルスゲノムを構成する遺伝子）に関して逆方向または順方向であってもよい。ベクターを細胞へ導入するステップは、３週間以上もの間、短鎖干渉ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の発現をもたらす。

他に定義しなければ、ここで用いる全ての技術用語は、本発明の属する分野の通常の知識を有するものによって理解されるものと同様な意味を有する。分子生物学用語の一般に理解される定義は、Rieger et al., Glossary of Genetics : Classical and Molecular,5th edition, Springer-Verlag : New York, 1991;及び Lewin, Genes VII, Oxford University Press: New York, 1999.で知ることができる。ウイルス学用語の一般に理解される定義は、Granoff and Webster, Encyclopedia of Virology, 2nd edition, Academic Press: San Diego, CA,1999 ; 及び Tidona and Darai, The Springer Index of Viruses,1st edition, Springer-Verlag : New York, 2002.で知ることができる。微生物学用語の一般に理解される定義は、Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 3rd edition, John Wiley & Sons: New York, 2002.で知ることができる。

用語「遺伝子」とは、特定の蛋白質をコードする核酸分子、またはある場合においては、機能的なまたは構造的なＲＮＡ分子を意味する。

ここで用いられる用語「ベクター」は、別の核酸を輸送することができる核酸分子を指し、その核酸分子は別の核酸分子と連結している。ここで用いられる用語「レンチウィルスベクター」は、レンチウィルスベクターに由来した（つまり、レンチウィルスベクターに独自のヌクレオチド配列を共有する）ベクターを指す。

「短鎖干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」とは、メッセンジャーＲＮＡ触媒作用を媒介する、一般的に約２１〜２３ヌクレオチドのＲＮＡを意味する。

第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係を有するように配置されたとき、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と「作用可能なように」連結している。例えば、プロモーターがコード配列の転写か発現に作用する場合、プロモーターがコード配列に作用可能なように連結されている。一般に、作用可能なように連結した核酸配列は連続していて、２の蛋白質をコードする領域を結ぶ必要がある場合は、リーディングフレームの中にある。

ここで説明することと類似又は同等の方法と物質は、本発明の実施や試験で使用可能であるが、適した方法と物質は以下で説明される。すべての出版物、特許出願、特許、及びここで言及された参考文献は、引用して完全に援用される。抵触の場合は、定義を含む本明細書が法的に規制するであろう。さらに、以下に論じた特定の実施形態は、一実施例であって、これに制限されるものではない。

（詳細な発明）
本発明は、ｓｉＲＮＡをコードするレンチウィルスベクターを用いて、細胞中の遺伝子発現を調節するための方法及び組成物を提供する。ここで述べられた実験では、ｓｉＲＮＡをコードするレンチウィルスベクターを用いて、動物細胞中で特異的な遺伝子の発現を減少させ、細胞中でＨＩＶ−１複製を阻害する。

以下に記述された好適な実施形態は、これらの組成物と方法の適用を説明する。それにもかかわらず、これらの実施形態の記述から、本発明の他の側面を作成し及び／又は以下で提供される記述に基づいて実施することができる。

（生物学的方法）
従来の生物的手法を含む方法をここで述べる。そのような手法は、当技術分野でよく知られており、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. , vol.
1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1989及びCurrent Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992（定期的な最新版）等の方法に関する専門書に詳細に述べられている。核酸の化学合成のための方法は、例えば、Beaucage and Carruthers, Tetra. Letts. 22:1859-1862, 1981, and Matteucci et al. , J. Am. Chem. Soc. , 103: 3185,1981.に述べられている。例えば市販の自動オリゴヌクレオチド合成機器を用いて、核酸の化学合成を行うことができる。遺伝子導入と遺伝子治療の従来からの方法は、例えば、Gene Therapy: Principles and Applications,ed. T. Blackenstein, Springer Verlag, 1999 ; Gene Therapy Protocols (Methods in Molecular Medicine), ed. P. D. Robbins, Humana Press, 1997; 及び Retro-vectors for Human Gene Therapy, ed. C. P. Hodgson, Springer Verlag, 1996.に述べられている。

（核酸と使用方法）
本発明は、レンチウィルスベクターとｓｉＲＮＡをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。核酸を用いて、細胞中の標的遺伝子の発現を阻害することができる。核酸のレンチウィルスベクター部分は、ウィルスの生産及びｓｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の発現に必要な配列を提供する。核酸のｓｉＲＮＡ部分は、細胞中で発現されたとき、ＲＮＡ干渉によって、標的遺伝子の発現を阻害することのできるポリヌクレオチドをコードする。本発明の特定用途に適しているｓｉＲＮＡをコードする任意のレンチウィルスベクター及びヌクレオチドを用いてもよい。いくつかの例を以下に述べる。

（レンチウィルスベクター）
ヒト免疫不全ウィルス1（ＨＩＶ−１）、ＨＩＶ−２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）及び他のウィルスのような自然発生的に生じるレンチウィルスを含めて、多くの異なる型のレンチウィルスベクターが知られている。米国特許第６，２０７，４５５号を参照。ここで述べる情報を適用することによって、他のレンチウィルスに由来した他のベクターを用いてもよいが、ＨＩＶ−１に基づいたベクターが遺伝子治療の適用時にもたらす多くの利点のため、現在はこれらが好まれる。

遺伝子治療の適用に関して、ＨＩＶ−１に由来したベクターが安全で、効率的なものとするためには、（１）組換えによって、ウィルスの効能を干渉することなく、野生型ウィルスの生産を防止する最大量のウィルス配列を削除し、（２）ベクターの効能を増加させるために異種起源の配列を挿入することが望ましい。ＨＩＶ−１プロウイルスのＤＮＡから始めて、そのようなベクターの例を作成した。例えば、ＨＩＶ−１のＧａｇ−Ｐｏｌの効率的な合成は、ＬＴＲのｔａｔ活性化及びｍＲＮＡの核輸出を媒介するためのＲｅｖ−ＲＲＥの相互作用を必要とするので、これらの機能を残すべきである。他方、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ及びｎｅｆといったアクセサリー遺伝子の機能は、ウィルスの複製のため重要でないことが示されているので、これらの一以上を削除してもよい。

また、例えば、制限された宿主の細胞向性を克服するため、本発明のレンチウィルスベクターは、偽型であってもよい。例えば、水疱性口内炎ウィルスＧ（ＶＳＶ−Ｇ）ウィルス外被で偽型とされたレンチウィルスベクターを用いてもよい。さらに、ベクター生産に関し、３のプラスミドの同時トランスフェクション戦略を設計することによって、野生型組換えの潜在的リスクを減少させることができる。そのような３のプラスミド設計は、（ウィルス蛋白質に必要な）ｇａｇ−ｐｏｌをコードするヘルパーコンストラクト（ｐＨＰ）、ｓｉＲＮＡおよび外来遺伝子カセット（レポーター遺伝子）を保持するウィルスゲノムをコードする形質導入ベクター・コンストラクト（ｐＴＹＦ−ｎｌａｃＺ）、ＶＳＶ−Ｇ外殻発現プラスミド（例えば、ｐＨＥＦ−ＶＳＶＧ）を含む。また、この系でのベクター力価を増加させるため、新たな真核生物の発現プラスミド（例えば、ｐＣＥＰ４−ｔａｔ等の転写活性化プラスミドコンストラクト）を用いてもよい。

また、安全性を増強するために、ＳＩＮレンチウィルスベクターを用いてもよい。例えば、３’Ｕ３プロモーターを不活性化し、宿主染色体への融合のために重要な５’融合接着部位以外の全ての３’Ｕ３配列を削除することによって、ＳＩＮレンチウィルスベクターを作成することができる。本発明のベクターを設計するために特に好適なコンストラクトは図１に示されるｐＴＹＦ−ｎｌａｃＺである。

（標的遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡ）
本発明のレンチウィルスｓｉＲＮＡベクターは、細胞中で任意の適切な遺伝子（つまり、標的遺伝子）の発現を調整する（例えば、サイレンシングまたは抑制）ために用いてもよい。レンチウィルスｓｉＲＮＡベクターを有さないコントロールと比較して、遺伝子の転写もしくは翻訳の減少の検出によって、または遺伝子発現の生産物（例えば、ポリペプチド）のレベルもしくは活性の減少の検出によって、細胞の遺伝子発現の調節を評価できる。

ここで述べたいくつかの実験では、Ｓｃａ−２遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡをコードするレンチウィルスベクターを用いた。ここで述べる他の実験では、ＨＩＶ−１遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡをコードするレンチウィルスベクターを用いた。しかし、レンチウィルスｓｉＲＮＡベクターを用いる調節（例えば、抑制またはサイレンシング）のために他の遺伝子を標的としてもよい。レンチウィルスｓｉＲＮＡベクターを用いて標的とされる遺伝子は、限定されず、その発現が望ましくない表現型の特性と相関しているものを含む。したがって、癌、慢性関節リウマチおよびウィルスに関係する遺伝子を標的としてもよい。癌関連遺伝子は、癌遺伝子（例えば、Ｋ−ｒａｓ、ｃ−ｍｙｃ、ｂｃｒ／ａｂｌ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｆｍｓ、ｃ−ｆｏｓ及びｃｅｒｂ−Ｂ）、成長因子遺伝子（例えば、上皮細胞増殖因子およびそのレセプター、繊維芽細胞増殖因子結合蛋白質）、マトリクス・メタロプロテイナーゼ遺伝子（例えば、ＭＭＰ−９をコードする遺伝子）、接着分子遺伝子（例えば、ＶＬＡ−６インテグリンをコードする遺伝子）、癌抑制遺伝子（例えば、ｂｃｌ−２及びｂｃｌ−ＸＩ）、血管形成遺伝子および転移遺伝子を含む。慢性関節リウマチに関連する遺伝子は、例えば、ストロメリシンと腫瘍壊死因子をコードする遺伝子を含む。ウィルスの遺伝子は、ヒト乳頭腫ウィルス遺伝子（例えば、子宮頸癌に関連する）、Ｂ型およびＣ型肝炎遺伝子、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）遺伝子(例えば、網膜炎に関連する)を含む。これらの症状または他の症状に関係する多数の他の遺伝子を標的としてもよい。

（調節因子）
プロモーター制御領域（例えば、誘導性発現もしくは構成的発現、環境的に制御された発現もしくは発生的に制御された発現、または細胞特異的発現もしくは組織特異的発現を調節する制御領域）、転写開始部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡ処理信号、転写終結部位、および／またはポリアデニル化シグナルのようなさまざまな調整因子を含むように、本発明のレンチウィルスベクターを作成してもよい。

挿入した外因性の核酸の発現を増加させるため、異種起源のプロモーターの使用はしばしば好まれるが、多くの用途で内因性のレンチウィルスのプロモーターを利用してもよい。使用する特定のレンチウィルスと適合可能な異種起源のプロモーターを用いてもよい。そのような異種起源のプロモーターの例としては、ＳＶ４０早期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウィルスＬＴＲプロモーター、マウス白血病ウイルスＬＴＲ（ＭｕＬＶ ＬＴＲ）、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、アデノウイルス逆方向末端反復（ＩＴＲ）、単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）プロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）のようなプロモーター、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）プロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーター、他のｐｏｌＩＩとｐｏｌＩＩＩとウィルスのプロモーター等が挙げられる。さらに、マウス・メタロチオネイン遺伝子、またはメタロチオネインＩＩプロモーターのような非ウィルスの遺伝子に由来した配列を用いてもよい。多くのそのようなプロモーター配列は、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ）から入手可能である。使用可能な他の調節因子としては、ベータ・アクチン、α胎児蛋白質、ガンマまたはベータグロブリン、ＩＬ−２、およびベータ・インターフェロンの転写を調節する天然の調節因子に由来したものが挙げられる。さらに、他の使用可能な調節因子としては、伸長因子１（ＥＦ１）プロモーター、ニューロン特異的プロモーターおよびＣＭＶエンハンサー・ベータ・アクチンハイブリッドプロモーターが挙げられる。

外因性の核酸の発現を制御することが望まれる場合、誘導可能な調節因子を用いてもよい。例として、テトラサイクリン誘導発現系（Baron and Bujard Methods Enzymol. 327: 401-421, 2000 ; Schonig et al. , NAR 30:el34, 2002 ; andLamartina et al. , Hum. Gene Ther.）を用いてもよい。キメラテトラサイクリン応答因子およびｐｏｌＩＩＩを含む誘導可能なレンチウィルスｓｉＲＮＡベクターは、特に有用である。

プロモーターのような調節因子は、ｓｉＲＮＡをコードする核酸に作用可能なように連結されて、レンチウィルスベクターへ挿入されるカセットを形成する。そのようなカセットは、順方向（レンチウィルス配列と同じ方向）または逆方向（レンチウィルス配列と反対方向）でレンチウィルスベクターに挿入されてもよい。ｓｉＲＮＡの長期の発現に関しては、逆方向が好まれる。下記の実施例１を参照。

（許容宿主細胞）
レンチウィルスベクター粒子で形質導入できる任意の細胞または細胞株を、本発明で用いてもよい。そのような細胞の例は以下のものを含む:ジャルカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞(ヒトのＴ細胞株)、Ｈ９細胞（ヒトのＴ−リンパ細胞株）、Ａ３．０１細胞（ヒトのＴ−リンパ細胞株）、Ｃ８１６６細胞(ヒトのＴ−リンパ細胞株)、ＣＯＳ−７細胞（アフリカミドリザル腎臓細胞株）、ヒト末梢血リンパ細胞（ＰＢＬ）、サルＰＢＬ、ネコＰＢＬ、ネコＣＤ４＋Ｔ細胞株、２９３細胞（ヒトの腎臓繊維芽細胞細胞株）、２９３Ｔ細胞（ヒトの腎臓繊維芽細胞細胞株）、哺乳動物末梢血樹状細胞、哺乳動物肝細胞、ヒト・マスト細胞前駆体、哺乳動物マクロファージ、哺乳動物濾胞樹状細胞、哺乳動物表皮ランゲルハンス細胞、哺乳動物巨大核細胞、哺乳動物小膠細胞、哺乳動物星状細胞、哺乳動物乏突起膠細胞、哺乳動物ＣＤ８＋細胞、哺乳動物網膜細胞、哺乳動物腎上皮細胞、哺乳動物頚部細胞、哺乳動物直腸粘膜細胞、哺乳動物栄養膜細胞、哺乳動物心筋細胞、ヒト・神経芽細胞腫細胞、哺乳動物ＣＤ４＋細胞、哺乳動物造血幹細胞、哺乳動物グリア細胞、成体の哺乳動物神経幹細胞、哺乳動物ニューロン、哺乳動物リンパ細胞、および哺乳動物の繊維芽細胞。ＨＩＶによって感染させることができるＣＤ４＋およびＣＤ４細胞タイプのリストを編集した（Rosenburg and Fauci, Adv. Immunol. 47: 377-431,1989 ; 及び Connor and Ho, 1992, in AIDS : etiology, diagnosis, treatment, and prevention, 3rd edition, Hellman and Rosenburg (eds) Lippincott, Philadelphiaを参照）。また、Vigna and Naldini, J. Gene Med. 5: 308-316,2000.を参照。

また、本発明の組成物および方法に偽型レンチウィルスベクターを用いてもよい。例えば、ＨＩＶ粒子の表面に発現される、ＶＳＶエンベロープ糖蛋白質をコードする核酸を有するベクターを包むために用いられるパッケージング細胞株に形質導入することによって、ＨＩＶベクターは偽型とされた。ＶＳＶは分割および無分裂の両方のＣＤ３４＋細胞に感染し、ＶＳＶエンベロープ蛋白質を発現する偽型ベクターは、これらの細胞に形質導入する能力を有する。Naldini et al., Science 272: 263,1996 ; andAkkina et al. , J. Virol. 70: 2581,1996.を参照。

レンチウィルスベクター粒子を（例えば、培地中でまたは原位置で（ｉｎ ｓｉｔｕ））細胞へ加えて、後にベクター粒子内の1つ以上の遺伝子が発現するかどうかを調べることによって、感受性に関して他の細胞を調べることができる。

（培地内におけるベクターの細胞への投与）
形質導入によって、培地内でレンチウィルスベクター粒子を細胞へ投与することができる。例えば、遠心分離をするまたはしないことにより、細胞株をレンチウィルスで形質導入してもよい。以下に述べられた実験で用いたベクター濃度は、１０−２０の重複感染度（ＭＯＩ）の範囲であった。ウィルスを生産するため、レンチウィルスベクターの形質導入に寛容な細胞（例えば、２９３Ｔ細胞）を以下のプラスミドで感染させた：レンチウィルス形質導入プラスミド（例えば、６ウェルプレートで１ウェルにつき０．８μｇのｐＴＹＦ形質導入プラスミド）、ｇａｇとｐｏｌ遺伝子産物を与えるヘルパープラスミド（例えば、６ウェルプレートで１ウェルにつき１．８μｇのｐＮＨＰ）、エンベロープ蛋白質をコードするヘルパープラスミド（例えば、６ウェルプレートで１ウェルにつき０．５μｇのｐＨＥＦ−ＶＳＶＧ）、状況に応じて転写活性化蛋白質をコードするプラスミド（例えば、６ウェルプレートで１ウェルにつき０．２μｇのｐＣＥＰ４ｔａｔ）、及びコントロール・プラスミド（例えば、６ウェルプレートで１ウェルにつき０．２μｇのｐＨＥＦｅＧＦＰ）。任意の適切な細胞トランスフェクション手法（例えば、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ、Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、細胞をこれらのプラスミドでトランスフェクションしてもよい。トランスフェクションの後、細胞を洗浄し、供給した。その後、ウィルスを回収し、貯留した。ここで述べた実験では、５時間後に細胞を洗浄し、供給した。そして、トランスフェクションの２４、３６、４８時間後に、ウィルスを回収し、貯留した。その後、使用前にウィルスを濃縮し、滴定した。レンチウィルスベクターの調整と使用のためのさらなるプロトコルはChang and Zaiss, Methods Mol. Med. 69: 303-318,2002.で述べられている。

（宿主動物へのベクターの投与）
宿主動物における遺伝子発現を調節するための方法で、本発明のレンチウィルスベクター粒子を用いることができる。この方法では、ｓｉＲＮＡが発現されるように、調節（抑制）される遺伝子に特異的であるｓｉＲＮＡをコードするレンチウィルスベクターを動物へ投与する。一般的な２つの方法によって、レンチウィルスベクターの宿主動物への投与を達成できる。第１の方法では、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で、動物内に含まれていない細胞（例えば、ＰＢＬ等の哺乳動物検体から分離された細胞；骨髄、胎児の肝臓または胎盤から造血幹細胞；ＣＤ３４＋細胞等の精製された造血肝細胞）をレンチウィルスベクター粒子で形質導入させた。そして、細胞を動物へ導入する（例えば、形質導入した分離細胞を動物の血流中へ再感染させた）。第２の方法では、例えば、静脈注射、腹腔内投与、標的組織へのインサイツ注射によって、レンチウィルスベクター粒子を直接動物へ導入する。任意の適切な方式によって、形質導入された細胞またはレンチウィルスベクター粒子を動物へ導入してもよい。例えば、従来からの注射器および針を用いて、動物にレンチウィルスベクター粒子懸濁液または形質導入された細胞懸濁液を注入してもよい。希望の投与ルートに従って、インサイツ（つまり、組織中の特定の組織または位置に）、筋肉内、静脈、腹腔内、または別の腸管外のルートによる注入ができる。

例えば、ボーラス注入か連続的な注入によって、注入によるベクターまたはベクター粒子の非経口投与を実施可能である。注入のための形式は、例えば、アンプルまたはマルチドース容器といったユニット投薬形式で、追加した防腐剤を備えて、提供されてもよい。組成物は、油性または水性の賦形剤中で、懸濁液、溶液、エマルジョンのような形状をとってもよく、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤等の成形剤を包含してもよい。また、例えば、適当な賦形剤（例えば、殺菌された、ピロゲンが存在しない水)と共に構成するために、ベクターまたはベクターの粒子を、使用前に（例えば、凍結乾燥して）粉の形にしてもよい。

また、任意の既知の適した手法による吸入によって、レンチウィルスベクターまたはベクター粒子を動物へ送達してもよい。例えば、ジクロロジフルロメタン、トリクロロトリフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素もしくは他の適切なガスのような適切な高圧ガスの使用で、加圧したパックもしくは噴射器から生産されたエアロゾルスプレーの形態で本発明のベクターまたはベクター粒子を送達してもよい。加圧されたエアロゾルの場合、一定量を送達するためのバルブを用いて、投与単位を制御してもよい。ベクターまたはベクターの粒子の粉末混合物および適当な塩基（例えば、ラクトースあるいはデンプン）を含んでいる（例えば、ゼラチンの）カプセルおよびカートリッジを吸入器または通気器の中で、動物の呼吸器官にベクターまたはベクターの粒子を送達可能である。

また、本発明の特定の用途において、他の投与ルートを用いてもよい。例えば、経口、口腔、尿道、膣または直腸投与でベクターまたはベクターの粒子を処方してもよい。

ベクターまたはベクター粒子の動物への送達を促進させるため、本発明のベクターまたはベクターの粒子をキャリアーまたは賦形剤と混ぜてもよい。使用されるキャリアーおよび賦形剤は、食塩水（特に、殺菌された、ピロゲンが存在しない食塩水）、食塩水緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液および重炭酸緩衝液）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、蛋白質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、およびグリセリンを含む。ＵＳＰ規格キャリアーおよび賦形剤は、ヒト検体へのベクターやベクター粒子の送達のために特に好適である。そのような製剤を作成する方法は、よく知られており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎの薬剤科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）で知ることができる。

さらに、前に記述された製剤に加えて、持続性薬剤として、ベクターまたはベクターの粒子を製剤化することができる。（例えば、皮下または筋肉内への）移植によって、または筋肉内注入によって、そのような長い作用を有する製剤を投与してもよい。このため、例えば、適切なポリマー性または疎水性の材料（例えば、許容できる油中でエマルジョンとして）又はイオン交換樹脂を用いて、或いはやや可溶性である派生物として、ベクターまたはベクター粒子を製剤化してもよい。

（投与）
ＬＤ₅₀（集団の５０％にとって致死的な投与量）およびＥＤ₅₀（集団の５０％にとって治療効果を有する投与量）を決定するため、培地中の細胞または実験動物のどちらか一方を用いる標準的な薬学上の手順によって、遺伝子治療に関する本発明で利用されるレンチウィルスベクターの毒性と治療効力を決定できる。毒性と治療効果の投与量比は治療指数（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｎｄｅｘ）であり、ＬＤ₅₀／ＥＤ₅₀比として表すことができる。大きな治療指数を示すベクターが好ましい。毒性の副作用を示すものを用いてもよいが、感染していない細胞への潜在的な損傷を最小限にして、その結果副作用を減少させるために、そのようなベクターを感染した組織の部位に仕向ける送達システムを設計するように注意を払うべきである。

細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータを用いて、ヒトにおける使用のための投与量を決定できる。好ましくは、そのようなベクターの投与量を、ほとんどまたは全く毒性がないＥＤ₅₀を含む循環濃度の範囲内とする。採用される投与形式及び利用される投与ルート次第で、投与量をこの範囲内で変化させてもよい。本発明の方法で用いられるあらゆるベクターに関して、細胞培養アッセイから、最初に治療効果を有する投与量を評価できる。細胞培養で決定したように、動物モデル中で投与量を決定し、ＩＣ₅₀（つまり、症状の最大阻害の半分を達成するベクター投与）を得ることができる。そのような情報を用いて、ヒトにおいて有効な投与量をより正確に決定できる。

（遺伝子サイレンシングの評価）
細胞または生物の核酸の存在を直接検出することによって、レンチウィルスベクターによる宿主細胞または生物への外因性の核酸の移転を評価できる。当技術分野においてよく知られるいくつかの方法によって、そのような検出を達成することができる。例えば、サザンブロットによって、または前記核酸と関連するヌクレオチド配列を特異的に増幅するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術によって、外因性核酸の存在を検出できる。また、従来の方法を用いて、外因性の核酸の発現を測定できる。例えば、ノーザンブロットおよび逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、外因性の核酸から生産されたｍＲＮＡを検出し、定量してもよい。

また、酵素活性またはリポーター蛋白質活性を測定することによって、外因性の核酸からのＲＮＡの発現を検出してもよい。例えば、標的核酸の発現の減少のように、外因性の核酸がエフェクターＲＮＡを生産していることを示すようなことで、ｓｉＲＮＡ活性を間接的に評価できる。

ＳＣＡ−２の阻害
レンチウィルスｓｉＲＮＡは、Ｓｃａ−２の発現を９０％以上抑制するのに成功し、その抑制は３ヶ月以上続いた。

（材料と方法）
プラスミド・コンストラクト。マウス１ＭＥＡ７Ｒ肝臓癌から単離されたゲノムＤＮＡから、マウスＵ６ｓｎＲＮＡプロモーターをＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位の間でｐＢＳＫＳＩＩへクローンし、ｐＢＳ−Ｕ６を作成した。２のプライマー（センス鎖 5'-TTT GCT CCT TCT GCA ACT TCA GTT CAA GAG ACT GAA GTT GCA GAA GGA GCT TTT TT-3' (SEQ ID NO :1)及びアンチセンス鎖 5'-AGC TAA AAA AGC TCC TTC TGC AAC TTC AGT CTC TTG AAC TGA AGT TGC AGA AGG AG-3' (SEQID NO : 2)）をアニールさせることによって、Ｓｃａ−２ ｓｉＲＮＡをコードする配列を構築した。そして、２のプライマー（センス鎖 5'-TTT GAG AGA CCA CAT GGT CCT GTT CAA GAG ACA GGA CCA TGT GGT CTC TCT TTT T-3' (SEQ ID NO : 3)及びアンチセンス鎖 5'-AGC TAA AAA GAG AGA CCA CAT GGT CCT GTC TCT TGA ACA GGA CCA TGT GGT CTC T-3' (SEQ ID NO : 4)）をアニールさせることによって、ＧＦＰ ｓｉＲＮＡをコードする配列を構築した。そして、両者をｐＢＳ−Ｕ６のＢｂｓＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位へクローンして、ｐＢＳ−Ｕ６ｓｉＲＮＡコンストラクトを作成した。レンチウィルスｓｉＲＮＡベクターコンストラクトを促進するため、部位突然変異とＰＣＲによって、２の異なるＳｆｉＩクローニング部位（Ａ及びＢ）をＵ６−ｓｉＲＮＡ領域の上流及び下流に挿入した。後のＵ６−ｓｉＲＮＡクローニングのために２のＳｆｉＩ（Ａ／Ｂ）部位及び１１００塩基対のスタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）を保持するレンチウィルスＳＩＮベクター（ｐＴＹＦ−ＥＦｎｌａｃＺ）を構築した（ｐＴＹＦ−ＳｉｆＡ／ＢまたはＢ／Ａ）。レンチウィルスｓｉＲＮＡベクターを作成するため、ＳｆｉＩ消化によって、ｐＢＳ−Ｕ６ｓｉＲＮＡからＵ６−ｓｉＲＮＡフラグメントを脱離させ、ｐＴＹＦ−ＳｆｉＡ／ＢまたはｐＴＹＦ−ＳｆｉＢ／Ａへ挿入し、順方向または逆方向ｓｉＲＮＡ挿入クローンのどちらか一方を得た。以下のプライマーを用いてＰＣＲに基づく部位突然変異によって、野生型Ｓｃａ−２アミノ酸と同義である突然変異体Ｍｕ−Ｓｃａ−２を生成した：プライマー１ 5'-AAT CTA GAC CAC CAT GTC TGC CAC TTC CAA CAT GAG-3' (SEQID NO : 5)、プライマー２ 5'- GTG AAC AGC TAC TGC TGC CAA TCG TCG TTC TGC AAC TTC AGC GCA GCT G-3' (SEQID NO : 6)及びプライマー３ 5'-AAG AAT TCT GGT CAG GGG CTC AGC TGC AG-3' (SEQID NO : 7)。そして、ＳｐｅＩ及びＥｃｏＲＩ部位で増幅されたＤＮＡをｐＴＹＦ−ＥＦｎｌａｃＺへ挿入した。

レンチウィルスベクター産物、濃度および滴定。ＤＮＡ同時トランスフェクションによってレンチウィルスベクターを作成し、前述したように、小型微量遠心分離またはろ過によってウィルスを濃縮した（Morgan J, editor. Gene Therapy Protocols. 2nd ed. Volume 2 :Methods in Molecular Medicine. Totowa: Humana Press, Inc. ; 2001. p 303-318におけるＣｈａｎｇとＺａｉｓｓによるレンチウィルスベクターの調製と使用のための方法）。βガラクトシダーゼ酵素アッセイを用いてＴＥ６７１細胞でウィルス力価を決定した。

細胞培養、ＲＮＡトランスフェクションおよびウィルス形質導入。ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）からＩＭＥＡ７ＲとＢＬＮ.ＣＬ２を得て、１０％ＦＢＳと１００ユニット／ｍｌのペニシリン・ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を含んでいるダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）中に保持した。前述したように、１０％のＦＢＳを有するＤＭＥＭ中で２９３ＴとＴＥ６７１細胞を培養し、長期間増殖させて、より吸着性である表現型を確立した（文献同上）。Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社によって、Ｓｃａ−２ ｓｉＲＮＡ二本鎖オリゴ（センス鎖 5'-GCT CCT TCT GCA ACT TCA GTT-3' (SEQID NO : 8)、アンチセンス鎖 5'- CTG AAG TTG CAG AAG GAG CTT-3' (SEQID NO : 9)）が化学合成された。オリゴフェクタミン（ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を用いてメーカーの説明書に従って、合成二重鎖ＲＮＡオリゴをマウス細胞へトランスフェクションした。レンチウィルスの形質導入については、ポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）（８μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）の存在下で、１０〜２０のＭＯＩで、異なるｌｅｎｔｉ−Ｕ６−ｓｉＲＮＡウィルスベクターで１×１０⁵のマウス細胞に形質導入した。前述したように、リポーター遺伝子ｎｌａｃＺアッセイによって形質導入効率をモニターした（文献同上）。

細胞分裂および増殖アッセイ。レンチウィルスによる形質導入の後、腫瘍細胞をトリプシン処理し、２ｍｌのＤＭＥＭ中で懸濁した。細胞の１００μｌのサンプルを取り出し、トリパンブルーで染色して、細胞の生存と総数を決定した。継続した培養のため、残りは植え継ぎをした。形質導入の後７日間毎に細胞を数えた。ＣＦＳＥ（Carboxyfluorescein diacetate succinidyl ester）染色（Ｓｉｇｍａ社）によって、染色細胞分裂の相対速度を評価した。ＣＦＳＥについては、ＤＭＥＭ中で５μＭのＣＦＳＥで腫瘍細胞を１０分間室温でインキュベートした。その後、培地で３回洗浄することによって、過剰ＣＦＳＥを除いた。そして、細胞を完全ＤＭＥＭ中で細胞を培養し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒによって、３日間の時間経過にわたるＣＦＳＥ強度を測定した。

フローサイトメトリー。表面蛋白質分析については、フルオロセイン結合ラット抗マウスＳｃａ−２モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはフィコエリトリン結合ハムスター抗マウス抗体ＴＮＦα受容体１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で細胞をインキュベートし、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒとＣＥＬＬＱＵＥＳＴプログラム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。

ノーザン、サザン、ウェスタン分析。ポリＡ＋ＲＮＡまたはＲＮＡおよびゲノムＤＮＡの総量を得て、サザンおよびノーザン分析のためにアガロースゲルで分離した。全蛋白質を得て、１２％のＮｕＰＡＧＥビストリスゲル電気泳動（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって分離し、ウェスタン分析のためニトロセルロール膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ社）へ転写した。ウサギポリクローナル抗カスパーゼ８抗体（１：１０００）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギポリクローナル抗切断カスパーゼ３抗体（１：１０００）、ウサギポリクローナル抗ＰＡＲＰ抗体（１：１０００）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、マウスモノクローナル抗ＴＮＦα−Ｒ１抗体（１：１０００）またはマウスポリクローナル抗αチューブリン抗体（１：１０００）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で、蛋白質ブロットをインキュベートした。ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ結合二次抗体（１：２０００）で化学発光を増強させることによって、カスパーゼ３のシグナルであるＰＡＲＰを呈色させた。ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ Ｕｌｔｒａ−ＳｅｎｓｉｔｉｖｅＡＢＣ染色キット（Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いてメーカーの説明書に従って、ビオチン結合二抗体（１：１００００）でカスパーゼ８のシグナルであるαチューブリンとＴＮＦα−Ｒ１を呈色させた。

アポトーシス誘導とアッセイ。シクロヘキシミド（５μｇ／ｍｌ）とともに、もしくはシクロヘキシミドなしで異なる濃度（０〜１０ｎｇ／ｍｌ）のＴＮＦαで腫瘍細胞を処理し、またはシスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）（２５μＭ）もしくは紫外線放射（１０ｍＪ／ｃｍ²）で処理し、アポトーシスを引き起こした。初期アポトーシスの分析のため、ＡｐｏｐＮｅｘｉｎアポトーシス検出キット（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）を用いてメーカーの説明書に従って、ＦＩＴＣ−アネキシン/ヨウ化プロピジウムで細胞を染色した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒによって、染色された腫瘍細胞を分析した。アポトーシス性のＤＮＡ染色のため、腫瘍細胞をペレットとし、ＰＢＳ中の３％パラホルムアルデヒドの５０μｌ中で再懸濁し、室温で１０分間インキュベートし、ＰＢＳで一度洗浄し、３２μｇ／ｍｌのビスベンズイミド（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、Ｓｉｇｍａ社）を含むＰＢＳの１０μ中で再懸濁した。室温での１５分間のインキュベーションの後、細胞を顕微鏡用スライド上に広げ、フルオロレンズとフィルターを用いて倒立Ａｘｉｏｓｋｏｐ Ｚｅｉｓｓ蛍光顕微鏡（Ｚｅｓｉｓｓ社、Ｇｅｒｍａｎｙ）の下で観察した。染色体凝縮および核膜ブレブ形成を含む形態変化によって、アポトーシス細胞を点数化した。

統計分析。ＳＰＳＳ統計プログラム（ＳＰＳＳ社、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）の仕様に従って、データ分析における有意差を検出した。

（結果）
ｓｉＲＮＡ遺伝子ノックダウン・アプローチを用いてのＳｃａ−２の下方制御。癌細胞中でＳｃａ−２は過剰発現することが明らかにされた。腫瘍形成におけるＳｃａ−２の役割を調べるため、２１ｎｔの合成ｓｉＲＮＡでＳｃａ−２ｍＲＮＡを標的とした。マウス肝臓癌細胞を２１ｎｔのｓｉＲＮＡでトランスフェクションし、特異的抗Ｓｃａ−２抗体を用いたＦＡＣＳとノーザンブロッティングによって、それぞれＳｃａ−２蛋白質とＲＮＡを分析した。ＦＡＣＳと全ＲＮＡのノーザンブロッティングによって示されたが、トランスフェクションの３日後、ｓｉＲＮＡは、Ｓｃａ−２の発現を効率良く下方制御した。２１ｎｔのＳｃａ−２ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした細胞は、１〜２日以内に迅速な細胞死した。コントロールの感染細胞ではこれは観察されなかった。トランスフェクションの１０日後、Ｓｃａ−２発現と細胞成長は、通常のレベルまで戻ったので、トランスフェクションされた細胞中でのＳｃａ−２抑制と腫瘍細胞死の効果は一時的であった。

レンチウィルスｓｉＲＮＡの形質導入後のＳｃａ−２発現の長期的な抑制。長期にわたる、Ｓｃａ−２機能とｓｉＲＮＡ効果を研究するため、合成ｓｉＲＮＡで効果があると判明した部位と同一部位を標的とするレンチウィルスを図１Ａのように構築した。レンチウィルスＳＩＮベクターで５’から内部であるＥＦ１α−ｎｌａｃＺレポーター遺伝子の前に、マウスｓｎＵ６プロモーターｓｉＲＮＡカセットをウィルスゲノムに準じて順方向または逆方向で挿入した。そして、図１Ｂで示されたようにおよび以前の研究で述べられたように、ヘルパープラスミドｐＮＨＰとｐＶＳＶ−Ｇを用いて、レンチウィルスベクターを生産した（Morgan J, editor. Gene Therapy Protocols. 2nd ed. Volume 2 :Methods in Molecular Medicine. Totowa: Humana Press, Inc. ; 2001. p 303-318におけるＣｈａｎｇとＺａｉｓｓによるレンチウィルスベクターの調製と使用のための方法、およびZaiss et al. , J Virol2002 ; 76 : 7209-7219）。順方向（ｌｅｎｔｉ−Ｓｃａｉ−Ｆ）と逆方向（ｌｅｎｔｉ−Ｓｃａｉ−Ｒ）のｓｉＲＮＡの両方のレンチウィルスコンストラクトは、コントロールであるｌｅｎｔｉ−ＥＦｎｌａｃＺと比較して、同様のベクター力価を示した。

２のレンチウィルスＳｃａ−２ｓｉＲＮＡベクターのどちらか一方で、またはコントロールレンチウィルスＵ６プロモーターベクター（ｌｅｎｔｉ−Ｕ６Ｐ）で、肝臓癌細胞を感染させた。ｌａｃＺリポーター遺伝子アッセイによって、感染効率をモニターし、形質導入後の異なる時点におけるＦＡＣＳとノーザン分析によって、Ｓｃａ−２発現を分析した。この結果より、レンチウィルスベクターによって肝臓癌細胞を効率よく感染させて（〜１００％）、順方向と逆方向の両方のレンチウィルスＳｃａ−２ｓｉＲＮＡベクターは、Ｓｃａ−２発現（〜８０−９０％）を抑制することが示された。レンチウィルスｓｉＲＮＡベクターの阻害効果は３週間以上安定であった。一時的なｓｉＲＮＡトランスフェクションの結果と一致して、トランスフェクションの後すぐに腫瘍細胞死を観察した。順方向と逆方向のレンチウィルスｓｉＲＮＡベクターは、短期間のＳｃａ−２発現において、わずかな違いのみを示した。

形質導入した腫瘍細胞を２ヶ月間引き続き増殖させて、Ｓｃａ−２の発現に関して分析した。ＦＡＣＳとＲＮＡブロッティングの両方によって決定されたことだが、ｌｅｎｔｉ−Ｓｃａｉ−Ｒベクターは、効果的な阻害効果（〜９０％）を保ったが、順方向のｌｅｎｔｉ−Ｓｃａｉ−Ｆベクターは次第に５０〜６０％までその阻害効果を失った。ｎｌａｃＺ遺伝子アッセイで観察されたように、阻害の効率はトランスフェクション効率とよく相関した。サザン分析により、阻害の減少は、導入遺伝子を保持する細胞数の減少と相関することが明らかとなった。同様に、順方向と逆方向の両方でクローンされて、異なるｐｏｌＩＩＩプロモーター、ヒトＨ１ＲＮＡプロモーターで制御される、構築したレンチウィルスｓｉＲＮＡベクターも、逆方向のｓｉＲＮＡコンストラクトでは、高い阻害効率と、長期間にわたる安定効果を示した。

Ｓｃａ−２抑制が誘導した腫瘍細胞のアポトーシス。同一種の細胞集団を得るため、フローサイトメトリーで抗Ｓｃａ−２抗体を用いることにより、Ｓｃａ−２陽性細胞を選別した。選別されたＳｃａ−２陽性細胞をＳｃａ−２レンチウィルスｓｉＲＮＡベクターで再び形質導入し、Ｓｃａ−２発現は効率よく阻害された（＞９０％）。異なる時点における分裂細胞を計数することによって、腫瘍細胞の成長におけるＳｃａ−２阻害の効果を分析した。コントロール細胞（ｌｅｎｔｉ−Ｕ６Ｐ）と比較すると、順方向と逆方向の両方のレンチウィルスＳｃａ−２ｓｉＲＮＡベクター（ｌｅｎｔｉ−ＳｃａｉＦとＲ）で形質導入した腫瘍細胞の成長速度は有意に減少した。アネキシン/ＰＩ染色及びＦＡＣＳ分析を用いて、アポトーシスに関して細胞を分析した。その結果は、Ｓｃａ−２が阻害された腫瘍細胞のかなりの部分が初期アポトーシスをうけることを示し、ＰＩ陰性及びアネキシン陽性の細胞集団の増加（３９．８８％）によって証明された。ヘキスト染色を用いて、核凝縮と膜小胞形成を示す細胞の形態的特性によって、この結果を確認した。ＣＦＳＥ生存細胞染色と細胞サイクルＰＩ染色を含むアッセイを用いて、Ｓｃａ−２抑制の後、細胞周期進行において違いが見られなかった。

Ｓｃａ−２が抑制された腫瘍細胞は、内因性ではなく、外因性アポトーシスシグナルに感受性であった。レンチウィルスＳｃａ−２ｓｉＲＮＡを形質導入した腫瘍細胞は２週間後、アポトーシスから徐々に回復して、Ｓｃａ−２が抑制されたままで増殖し続けた。Ｓｃａ−２の阻害が迅速なアポトーシスを誘導するので、回復された細胞が外因性および内因性のアポトーシスシグナルに対して異なって反応するかどうかを調べた。肝臓細胞における通常の細胞死レセプターを媒介したアポトーシスは、ＴＮＦα／ＴＮＦαレセプター（ＴＮＦＲ）およびＦａｓ／ＦａｓＬシグナル経路を含む。外因性（または細胞死レセプター媒介）アポトーシスシグナルの分析のため、シクロヘキシイミド（ＣＨＸ）の存在下でまたは不在下で、腫瘍細胞をＴＮＦαで処理した。ヘキスト染色および形態上の変化に基づくアポトーシスを起こした細胞の計数によって処理の６時間と３６時間後のアポトーシスを決定した。この結果より、肝臓癌細胞が用量依存性でＴＮＦα誘導細胞死に反応し、Ｓｃａ−２発現（ｌｅｎｔｉ−ｓｃａｉ−Ｒ）を抑制した腫瘍細胞は、コントロールよりＴＮＦα媒介細胞死に対して感受性を示すことが明らかとなった。この発見を確認するため、全て、ＴＮＦαレセプター１（ＴＮＦＲ１）媒介アポトーシス経路の重要な構成物である、プロカスパーゼ８、カスパーゼ３及びポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）をウェスタン分析によって分析した。これらの蛋白質の動態解析は、ｌｅｎｔｉ−ｓｃａｉ−Ｒで形質導入した肝臓癌細胞が、増加したＴＮＦＲ１媒介アポトーシスと一致して、プロカスパーゼ８分解物の増加した割合ならびに２４時間で分解したカスパーゼ３および分解した核ＰＡＲＰ産物の蓄積を示すことを明らかにした。Ｆａｓ／ＦａｓＬ媒介アポトーシスも調べたが、Ｓｃａ−２陽性と陰性の肝臓癌細胞では違いが見られなかった。

ＵＶ放射またはシスプラチン処理からのＤＮＡ損害シグナルを、腫瘍細胞に与えることによって、内因性のアポトーシス経路を調べた。これらの処理のどちらかによって、Ｓｃａ−２陽性と陰性の肝臓癌細胞ではアポトーシスについて有意差が見られなかった。

突然変異体Ｓｃａ−２遺伝子のレンチウィルスによる形質導入のＴＮＦαに対する減少した感受性の回復。ｌｅｎｔｉ−Ｓｃａ−２ｓｉＲＮＡベクターで形質導入された腫瘍細胞の表現型が、別のｓｉＲＮＡによる効果というよりむしろ、Ｓｃａ−２の抑制により確かに生じることを確かめるため、野生型アミノ酸配列を維持する一方、Ｓｃａ−２コード配列におけるｓｉＲＮＡ標的部位の３のヌクレオチドを変換したＳｃａ−２突然変異体を設計した。ｓｉＲＮＡ媒介ｍＲＮＡの分解は厳密に配列依存的であるので、突然変異体Ｓｃａ−２（ｍｕＳｃａ−２）がｌｅｎｔｉ−ｓｉＲＮＡで形質導入した肝臓癌細胞へ導入されたとき、Ｓｃａ−２発現は、これらの細胞において、回復する。ｍｕＳｃａ−２遺伝子をｐＴＹＦレンチウィルスベクターへクローンして（ｌｅｎｔｉ−ｍｕＳｃａ−２）、ベクターを調製した。Ｓｃａ−２ ｓｉＲＮＡ（ｌｅｎｔｉ−Ｓｃａｉ−Ｒ）で形質導入した肝臓癌細胞（ｓｉＳｃａ−２ Ｔｄ．細胞）をｌｅｎｔｉ−ｍｕＳｃａ−２またはコントロールであるｌｅｎｔｉ−ｌａｃＺウィルス（ｌｅｎｔｉ−ＥＦｎｌａｃＺ）に感染し、３日後に、抗Ｓｃａ−２抗体を用いてＦＡＣＳによってＳｃａ−２発現に関して形質導入した細胞を分析した。この結果は、ｌｅｎｔｉ−ｌａｃＺではなく、ｌｅｎｔｉ―ｍｕＳｃａ−２が、ｓｉＳｃａ−２ Ｔｄ．細胞におけるＳｃａ−２発現を効果的に回復させることを示した。ＴＮＦαへのこれらの細胞株の反応性を調べた。３６時間異なる濃度のＴＮＦαと細胞を処理し、アポトーシス分析のためヘキスト染色で染色した。この分析の結果は、再構成されたＳｃａ−２の発現を示す腫瘍細胞は、ＴＮＦαで誘導されるアポトーシスに感受性を示すことを明白に実証した。

Ｓｃａ−２によるＴＮＦＲ１表面発現の制御。
特異的である抗ＴＮＦＲ１抗体とＦＡＣＳを用いて、腫瘍細胞表面上のＴＮＦＲ１発現を測定した。レンチウィルスのトランスフェクションの３日または３０日後、ｌｅｎｔｉ−Ｓｃａｉ−Ｒ（Ｓｃａｉ）またはコントロールであるレンチウィルスＧＦＰｓｉＲＮＡベクター（ＧＦＰｉ）のどちらか一方で形質導入した肝臓癌細胞の表面のＴＮＦＲ１発現を分析した。この結果は、ＧＦＰｉではなく、Ｓｃａｉで形質導入した細胞の表面のＴＮＦＲ１の発現が著しく増加したことを示した。Ｓｃａ−２のｓｉＲＮＡ阻害の後、表面のＴＮＦＲ１発現のこの増加が急速に生じ、その後３０日、発現量は高く維持された。Ｓｃａ−２の再導入が表面のＴＮＦＲ１の発現に影響を与えるかどうかを調べるため、ｌｅｎｔｉ−ｍｕＳｃａ−２またはｌｅｎｔｉ−ＥＦｎｌａｃＺを用いて、３０ＤＰＩのＳｃａｉで形質導入した肝臓癌細胞に感染させて、その２０日後に表面のＴＮＦＲ１の発現を分析した。Ｓｃａ−２の発現が回復するとともに、表面のＴＮＦＲ１の発現は、コントロール群と同程度まで下方制御された。新規なレセプター合成と増加した表面のＴＮＦＲ１というトランスポーターを見分けるため、抗ＴＮＦＲ１抗体を用いてウェスタンブロッティングによって全細胞溶解物を分析した。Ｓｃａ−２が抑制された肝臓癌細胞（ｌｅｎｔｉ−Ｓｃａｉ−Ｒ）とコントロール（ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰｉ）肝臓癌細胞の間で、全ＴＮＦＲ１は大幅な違いはなかった。

レンチウィルスｓｉＲＮＡによるＨＩＶ−１の阻害
複数の高度に保存されたＨＩＶ−１配列を標的とするｓｉＲＮＡを保持する自己不活性化レンチウィルス・インシュレーター（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）ベクター系を用いて、急性かつ慢性的に感染した宿主細胞におけるｓｉＲＮＡによるＨＩＶ感染の抑制を調べた。異なる種のＨＩＶ−１で高度に保存されたｇａｇ、ｐｏｌ、ｉｎｔおよびｖｐｕ配列を標的とするｓｉＲＮＡを用いて、急性感染症のほとんど１００％が阻害されることが示された。また、これらのｓｉＲＮＡは、慢性的に感染した細胞と主要末梢血単核細胞の中で、ＨＩＶ−１複製を効果的に抑制した。阻害のメカニズムは、特異的なウィルスＤＮＡの分解ならびに細胞質および核の両方のウィルスＲＮＡのサイレンシングを含んでいる。

（材料と方法）
組織培養およびＨＩＶ−１分子クローン。１０％のＦＢＳ、１％のグルタミンおよび１％のペニシリン−ストレプトマイシンを備えたＤＭＥＭ中で、２９３Ｔ、ＴＥ６７１およびＧＨＯＳＴｈｉ５細胞を培養し、増殖させて、前述のように、吸着性の表現型を確立した（Morgan J, editor. Gene Therapy Protocols. 2nd ed. Volume 2 :Methods in Molecular Medicine. Totowa: Humana Press, Inc. ; 2001. p 303-318におけるＣｈａｎｇ Ｌ−ＪとＺａｉｓｓ Ａ−Ｋによるレンチウィルスベクターの調製と使用のための方法）。密度勾配遠心分離Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（シグマ社）を用いて密度勾配遠心分離によって、健康なドナーの軟膜から主要末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製した。ＧＨＯＳＴｈｉ５は、ＣＤ４とＣＣＲ５で安定的に形質転換されたＨＯＳ細胞に由来した。ＣＥＭ−Ａは、ＨＩＶ感染症および合胞体の形成に感受性を示す接着性の表現型を有するＣＥＭと正常なＰＢＭＣの融合細胞クローンである。米国微生物系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）からＭＯＬＴ−３を購入した。低ＭＯＩのＨＩＶ−１_NL4-3を感染させることによって、慢性的なＭｏｌｔ−３−ＨＩＶ−１_NL4-3生産株を作製して、細胞変性効果から回復して、長期にわたるＨＩＶ−１生産株となるまで、増殖させた。エイズ研究と関連試薬に関するプログラム（ＡＩＤ部門、ＮＩＡＩＤ、ＮＩＨ）からＧＨＯＳＴ ｈｉ５、ＣＥＭ−ＡならびにＨＩＶ−１分子クローンｐ８９．６およびｐ９０ＣＦ４０２．１を得た。ＨＩＶ−１_NL4-3、ＨＩＶ−１ＮＬＡＤ８およびＨＩＶ−２ＲＯＤは、それぞれＭ．Ｍａｒｔｉｎ博士、Ｅ．Ｆｒｅｅｄ博士（ＮＩＨ，ＵＳＡ）およびＫ．Ｐｅｄｅｎ博士（ＦＤＡ，ＵＳＡ）によって懇意に提供された。１０％ウシ胎児血清、１％のグルタミンおよび１％のペニシリン・ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０においてＣＥＭ−ＡおよびＭＯＬＴ−３−ＨＩＶ−１ＮＬ４−３細胞を培養した。そして、組み換えヒトＩＬ−２（１００μ／ｍｌ）で補充された上記のＲＰＭＩ培地において、ＰＢＭＣを培養した。

ｓｉＲＮＡプラスミドおよびレンチウィルス形質導入ベクターの構築。ヒトのＨ１プロモーターを得るため、５’プライマー（５’から３’）：CCATGGAATTCGAACGCTGACGTC (SEQ ID NO:10)と３’プライマー：CCTCACCTCAGCCATTGAACTCAC (SEQ ID NO:11)を用いて、２９３細胞のゲノムＤＮＡからＨ１遺伝子を増幅した。その後、増幅したＨ１配列、前記の５’プライマーと新３’プライマー：GCAAGCTTAGATCTGTGGTCTCATACAGAACTTATAAGATTCCC (SEQ ID NO:12)を用いて、Ｈ１プロモーターを増幅した。増幅したＤＮＡはＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＢＳＫＳＩＩへクローンして、ｐＢＳ−Ｈ１を作成した。方向性のあるクローニングを促進するため、以下の４のプライマーを使ってＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位を側面におく２のリンカーを挿入することによって、Ｈ１−プロモーター領域を側面に位置する、ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＢＳ−Ｈ１に２の異なるＳｆｉＩクローニング部位（ＡとＢ）を挿入して、ｐＢＳ−Ｈ１−Ｓｆｉを作成した：5'-CTAGAGGCCATTATGGCCG-3'(SEQ ID NO:13)、5'-AATTCG GCCATAATGGCCT-3' (SEQ ID NO:14)、5'- AGCTTGGCCGCCTCGGCC-3' (SEQ ID NO:15)および5'-TCGAGGCCG AGGCGGCCA-3' (SEQ ID NO:16)。４のプライマーをアニールさせることによって、ＧＦＰｓｉＲＮＡコンストラクトを作成した。９ｎｔのループ配列TTCAAGAGA (SEQ ID NO : 17)を有するステム・ループｓｉＲＮＡ配列を含み、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位を隣接させる２のプライマーをアニールさせることによって、ＨＩＶ−１ｓｉＲＮＡコンストラクトを作成し、ｐＢＳ−Ｈ１−Ｓｆｉプラスミド中のＨ１プロモーターの３’末端へクローンした。本研究のために用いたｓｉＲＮＡプライマーを以下に列挙する。

ＧＦＰｉ−１：GATCCCCCATTCTCGGCCACAAGCTGTT （SEQ ID NO:18)
ＧＦＰｉ−２：TCTTGAACAGCTTGTGGCCGAGAATGGGG （SEQ ID NO:19)
ＧＦＰｉ−３：CAAGAGACAGCTTGTGGCCGAGAATGTTTT TGGAAA （SEQ ID NO:20)
ＧＦＰｉ−４：AGCTTTTCCA AAAACATTCT CGGCCACAAG CTGTC (SEQ ID NO:21)
Ｕ５ｉ−１：GATC CCC GTAGTGTGTGCCCGTCTGT TTCAAGAGAACAGACGGGCACACACTACTTTTTG (SEQ ID NO:22)
Ｕ５ｉ−２： AGCTT TTCC AAAAA GTAGTGTGTGCCCGTCTGT TCT CTT GAA ACAGACGG GCACACACTACGGG (SEQ ID NO:23)
１^st ｇａｇｉ−１： GATCCCCGAA ATGATGACAG CATGTCTTCA AGAGAGACAT GCTGTCATCA TTTCTTTTTGGAAA (SEQ ID NO:24)
１^st ｇａｇｉ−２：AGCTTTTCCA AAAAGAAATG ATGACAGCAT GTCTCTCTTG AAGACATGCT GTCATCATTT CGGG (SEQ ID NO:25)
２^nd ｇａｇｉ−１：GATCCCCTAG TAAGAATGTA TAGCCCTTCA AGAGAGGGCT ATACATTCTT ACTATTTTTGGAAA (SEQ ID NO:26)
２^nd ｇａｇｉ−２：AGCTTTTCCA AAAATAGTAA GAATGTATAG CCCTCTCTTG AAGGGCTATA CATTCTTACTAGGG (SEQ ID NO:27)
１^st ｐｏｌｉ−１：GATCCCCGCC AGGAATGGAT GGCCCATTCA AGAGATGGGC CATCCATTCC TGGCTTTTTGGAAA (SEQ ID NO:28)
１^st ｐｏｌｉ−２：AGCTTTTCCA AAAAGCCAGG AATGGATGGC CCATCTCTTG AATGGGCCAT CCATTCCTGGCGGG (SEQ ID NO:29)
２^nd ｐｏｌｉ−１：GATCCCCGGA ATTGGAGGAA ATGAACTTCA AGAGAGTTCA TTTCCTCCAA TTCCTTTTTGGAAA (SEQ ID NO:30)
２^nd ｐｏｌｉ−２：AGCTTTTCCA AAAAGGAATT GGAGGAAATG AACTCTCTTG AAGTTCATTT CCTCCAATTCCGGG (SEQ ID NO:31)
１^st ｉｎｔｉ−１：GATCCCCTTA GCAGGAAGAT GGCCAGTTCA AGAGACTGGC CATCTTCCTG CTAATTTTTGGAAA (SEQ ID NO:32)
１^st ｉｎｔｉ−２：AGCTTTTCCA AAAATTAGCA GGAAGATGGC CAGTCTCTTG AACTGGCCAT CTTCCTGCTAAGGG (SEQ ID NO:33)
２^nd ｉｎｔｉ−１：GATCCCCGGT GAAGGGGCAG TAGTAATTCA AGAGATTACT ACTGCCCCTT CACCTTTTTGGAAA (SEQ ID NO:34)
２^nd ｉｎｔｉ−２：AGCTTTTCCA AAAAGGTGAA GGGGCAGTAG TAATCTCTTG AATTACTACT GCCCCTTCACCGGG (SEQ ID NO:35)
１^st ｖｐｕｉ−１：GATCCCCGAC AGTGGCAATG AGAGTGTTCA AGAGACACTC TCATTGCCAC TGTCTTTTTGGAAA (SEQ ID NO:36)
１^st ｖｐｕｉ−２：AGCTTTTCCA AAAAGACAGT GGCAATGAGA GTGTCTCTTG AACACTCTCA TTGCCACTGTCGGG (SEQ ID NO:37)
２^nd ｖｐｕｉ−１：GATCCCCGAG CAGAAGACAG TGGCAATTCA AGAGATTGCC ACTGTCTTCT GCTCTTTTTGGAAA (SEQ ID NO:38)
２^nd ｖｐｕｉ−２：AGCTTTTCCA AAAAGAGCAG AAGACAGTGG CAATCTCTTG AATTGCCACT GTCTTCTGCTCGGG (SEQ ID NO:39)
ｎｅｆｉ−１：GATC CCC GTAGTGTGATTGG ATGGCCTTCA AGAGAGGCCA TCCAATCACA CTACTTTTTGGAAA (SEQ ID NO:40)
ｎｅｆｉ−２： AGCTTTTCCA AAAAGTAGTG TGATTGGATG GCCTCTCTTG AAGGCCATCC AATCACACTACGGG (SEQ ID NO:41)
Ｕ３ｉ−１：GATCCCCGGA GAGAACACCA GCTTGTTTCA AGAGAACAAG CTGGTGTTCT CTCCTTTTTGGAAA (SEQ ID NO:42)
Ｕ３Ｉ−２：AGCTTTTCCA AAAAGGAGAG AACACCAGCT TGTTCTCTTG AAACAAGCTG GTGTTCTCTCCGGG (SEQ ID NO:43)

２のＳｆｉＩ（Ａ／Ｂ）クローニング部位、１１００塩基対のスタッファー（stuffer）およびニワトリＨＳ４インシュレーター配列（ｃＨＳ４）を含んでいるレンチウィルスＳＩＮインシュレーターベクター（ｐＴＹＦ−ＥＦｎｌａｃＺｃＨＳ）を用いて、全てのレンチウィルスｓｉＲＮＡベクターを構築した。ＳｆｉＩ分解によってｐＢＳ−Ｈ１−Ｓｆｉ−ｓｉＲＮＡプラスミドからＨ１−ｓｉＲＮＡフラグメントを脱離させて、逆方向のレンチウィルスｐＴＹＦ−ＳｆｉＢ／Ａベクターへクローンして、ｓｉＲＮＡ形質導入ベクターを得た。全てのｓｉＲＮＡ配列をＤＮＡシークエンシングによって確認した。

ＤＮＡトランスフェクションおよびＨＩＶ−１調製。ＨＩＶ−１へのｓｉＲＮＡ効果の分析に関して、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔを用いてそのメーカー（Ｑｉａｇｅｎｅ社）が説明したように、１２ウェルプレート中でｐＢＳ−Ｈｌ−Ｓｆｉ−ｓｉＲＮＡ（１．８μｇ／ウェル）およびＨＩＶ−１ＤＮＡ（０．２μｇ／ウェル）で２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクションさせた。トランスフェクション２４時間後に、上清を得て、ＭＡＧＩと（逆転写酵素）ＲＴアッセイのために用いた。ＨＩＶ−１株の調製のため、２９３Ｔ細胞をＨＩＶ−１ＤＮＡでトランスフェクションし、ＤＮＡを添加後１２時間後、１２時間間隔で３回上清を集めた。

レンチウィルスベクターの調製、滴定および形質導入。ＤＮＡ同時トランスフェクションによってレンチウィルスベクターを作成して、前述のように小型微量遠心分離またはろ過によって、ウィルスを濃縮した（文献同上）。βガラクトシダーゼ酵素アッセイを用いて、ＴＥ６７１細胞でウィルス力価を決定した。レンチウィルスの形質導入に関して、ポリブレン（８μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）の存在下において文中で示したように異なるＭＯＩで形質導入した。レポーター遺伝子ｎｌａｃＺアッセイによって、形質導入効率をモニターした。

ＨＩＶ−１インフェクション、ＲＴおよびＭＡＧＩアッセイ。ＲＰＭＩ１６４０培地中で２μｇ／ｍｌのフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）で１日間ＰＢＭＣを活性化させ、ＭＯＩ１０でのレンチウィルスｓｉＲＮＡベクター形質導入の前に、細胞を３回洗浄した。２４時間後、ｓｉＲＮＡ形質導入ＰＢＭＣを２０ＭＯＩで野生型ＨＩＶ−１に暴露した。ＨＩＶ−１への暴露後の異なる時点において、ＲＴアッセイのため上清を得た。各々の得る段階で細胞を計測し、同数の生存細胞を新鮮な培地に播種した。１０ＭＯＩで１０μｇ／ｍｌのポリブレンを含むＲＰＭＩ１６４０中のレンチウィルスｓｉＲＮＡベクターでＭｏｌｔ−３細胞を形質導入した。ウィルス生産を決定するため、新鮮なＲＰＭＩ１６４０を１ウェルにつき３００μｌ有する２４ウェルプレートに、１×１０⁵細胞を播種して、２４時間後、ＲＴアッセイのため、上清を得た。

細胞質および核ＲＮＡ分析。微修正を加えた、前述した方法に従って、核および細胞質ＲＮＡを得た（Zaiss et al., J Virol. 2002; 76: 7209-7219）。簡潔に言うと、冷ＰＢＳで細胞を２〜３回洗浄し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ₂および２５μｌ ＶＲＣ（２０ｍＭ ＢＲＬ）を含む２５０μｌの氷冷溶液で細胞ペレットを再懸濁して、１２．５μｌの１０％ＮＰ４０を加えることによってゆるやかに溶解し、簡単に混合し、２〜３分間、氷上で攪拌した。２分間、８００ｇで遠心分離した後、上清と核のペレットを分離して、メーカーに述べられたようにＴＲＩ試薬（ＢＲＬ）を用いて、ＲＮＡを得た。ホルムアルデヒド・アガロース上の電気泳動によってＲＮＡを分析し、ブロットし、全長のＨＩＶ−１またはβ―アクチンに特異的な配列を用いて、ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｄ ｐｒｏｂｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｌａ ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）でプローブした。再ハイブリダイゼーションに関しては、０．１％ＳＤＳを含むｄｄＨ２Ｏ中で１０分間沸騰させることによって、古いプローブをはずした。

多数の高度に保存されたＨＩＶ−１配列を標的とするｓｉＲＮＡ。ＨＩＶ−１ゲノム中の複数のｓｉＲＮＡ標的部位を同定するため、ＨＩＶ配列の概要を調べた。全ウィルスゲノムにまたがって、ＡＡジヌクレオチドの後の高度に保存された配列を有する１１の部位を図２のように同定した。これらの部位は、非コード配列（Ｕ５ｉとＵ３ｉ）、ならびにｇａｇ、ｐｏｌ、ｉｎｔ、ｖｐｕ、ｅｎｖ（１^st ｖｐｕｉ）およびｎｅｆ（図２の下部）と重複するコード配列を含む。Ｕ５ｉ、Ｕ３ｉおよびｎｅｆｉは全ウィルスＲＮＡ種を標的とする。一方、残りの配列は、全長またはスプライシングされたウィルスＲＮＡのどちらか一方を標的とする。２の合成オリゴヌクレオチドをアニールし、ヒトＨ１ｐｏｌＩＩＩプロモーターの後ろでｐＢＳプラスミドにクローンすることによって、ｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築した。レンチウィルスｓｉＲＮＡベクターを生成するため、ｐＢＳ−Ｈ１プラスミドからＨ１−ｓｉＲＮＡ発現カセットを切り出し、図３に示されるように内部ＥＦ１α−ｎｌａｃＺリポーター遺伝子の前でレンチウィルスＳＩＮインシュレーターベクターへライゲーションした。推定された１９ｎｔのステム・ループｓｉＲＮＡ前駆体と、それに対応するＨＩＶ−１標的配列（２^nd ｐｏｌｉ）との例を図３の下部に示す。

ｇａｇ、ｐｏｌ、ｉｎｔおよびｖｐｕを標的とするｓｉＲＮＡによる３のＨＩＶ−１種の効果的な阻害。ＤＮＡ同時トランスフェクションを用いて、これらのｓｉＲＮＡの効果を調べた。ｐＢＳ ｓｉＲＮＡ発現プラスミドを、ｐＮＬ４−３、ｐ８９．６（ｐ８９）およびｐ９０ＣＦ４０２．１．８（ｐ９０）からなる、３の感染性分子クローンのうちの１つと、２０：１のモル比で２９３Ｔ細胞へ同時トランスフェクションさせた。そして、４８時間後、ウィルスＲＴアッセイのため、培養液上清を集めて、分析した。レポーター遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡコンストラクト（ＧＦＰｉ）をコントロールとして含ませた。ＲＴアッセイは、１１のＨＩＶ−１特異的ｓｉＲＮＡコンストラクトのうち５つ（１^st ｇａｇｉ、２^nd ｐｏｌｉ、２^nd ｉｎｔｉおよび両方のｖｐｕｉ）は、ＨＩＶ−１_NL4-3およびＨＩＶ−１_89.6に顕著な阻害効果（＞９０％）を示すことを実証した。１１ｓｉＲＮＡのうち４つ（２^nd ｇａｇｉ、１^st ｐｏｌｉ、２^nd ｉｎｔｉおよび２^nd ｖｐｕｉ）は、ＨＩＶ−１_90CF402.1.8（サブタイプＡ／Ｅ組換え体）を５０％より大きい効率で阻害した。ＨＩＶ−１ゲノムの非コード領域を標的とするＵ５ｉおよびＵ３ｉｓｉＲＮＡは、ＨＩＶ−１_NL4-3およびＨＩＶ−１_89.6に対して〜５０％の阻害を示したが、ＨＩＶ−１_90CF402.1.8に対しては効果がなかった。ＨＩＶ−２分子クローンとのＤＮＡ同時トランスフェクションにおいては、いずれのｓｉＲＮＡコンストラクトも阻害効果を示さなかった。

ＲＴアッセイはＨＩＶのＰｏｌ蛋白質合成と活性を測定する。ウィルス感染価に対するｓｉＲＮＡの影響を調べるため、これらのＨＩＶ−１特異的ｓｉＲＮＡコンストラクトまたはｇｆｐｉコントロールと、ｐＮＬ４−３で２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクションさせた。そして、その４８時間後、子孫ウィルスを得て、それを用いてＬＴＲ−β―ｇａｌレポーター細胞株であるＣＤ４＋ＭＡＧＩ細胞に感染させた。Ｘ−ｇａｌ染色後のＭＡＧＩ細胞における子孫ウィルス感染価の定量比較は、ｎｅｆｉコンストラクトを含めて、ウィルスのコード領域を標的とするｓｉＲＮＡの全てはＨＩＶ−１感染（８０〜９９％）を抑制するのに効果があることを示した。そして、ｎｅｆｉコンストラクトはＲＴアッセイによって阻害効果を示さなかったが、ＨＩＶ−１感染（〜８０％）を抑制する効果があることを示した。また、興味深いことに、ＨＩＶ−１ゲノムの中の非コード領域を標的とするＵ５ｉおよびＵ３ｉは〜５０％の阻害効果を示した。

レンチウィルスｓｉＲＮＡの形質導入後のＨＩＶ−１が誘導する細胞毒性からの保護。一時的なトランスフェクション分析は、プラスミドｓｉＲＮＡ発現コンストラクトがＨＩＶ−１阻害に効果があることを示した。レンチウィルスベクターが、標的細胞へ効率的な遺伝子運搬、および一時的なｓｉＲＮＡ遺伝子導入に関する問題を克服する標的細胞への恒久的な結合を促進させるので、これらのＨＩＶ−１特異的ｓｉＲＮＡを保持するレンチウィルスｓｉＲＮＡベクターをさらに調べた。ｐＮＨＰ、ｐＨＥＦ−ＶＳＶＧおよびｐＴＹＦｓｉＲＮＡ−ＥＺ（図３）の２９３Ｔ細胞への同時トランスフェクションによって、レンチウィルスｓｉＲＮＡベクターを生産した。ＴＥ６７１細胞のβ−ガラクトシダーゼ・レポーター遺伝子アッセイによってベクター力価を決定した。これらの異なるレンチウィルスｓｉＲＮＡコンストラクトの力価を比較した。全てのレンチウィルスｓｉＲＮＡコンストラクトは、１〜１．５×１０⁷／ｍｌの範囲でウィルス力価を示した。ヘルパーコンストラクトを標的とするＵ５ｉ、ｇａｇｉ、ｐｏｌｉおよびｉｎｔｉ ｓｉＲＮＡコンストラクトは、ベクター力価に著しく影響を与えなかった。おそらく、ベクターの生産を妨害する、効果的なｓｉＲＮＡの阻害のためであると思われるが、２^nd ｐｏｌｉは一貫して他のものより低いベクター力価を示した。

最初、ｇｆｐｉ、２^nd ｇａｇｉ、２^nd ｖｐｕｉというレンチウィルスｓｉＲＮＡベクターで、ＨＩＶ−１、２のヒトＣＤ４＋細胞株、ＣＥＭ−Ａ、接着性リンパ腫細胞株およびＧＨＯＳＴ ｈｉ５細胞（それらの両者とも、Ｍ−指向性ＨＩＶ−１感染に感受性を有する）に形質導入した。レンチウィルスｓｉＲＮＡで形質導入したＣＥＭ−ＡおよびＧＨＯＳＴ ｈｉ５細胞を５日間増殖させ、合胞体を形成するＨＩＶ−１（ＨＩＶ−１_NL-AD8）で暴露して、合胞体形成について細胞をモニターした。結果より、ｇｆｐｉで形質導入したＣＥＭ−Ａ細胞は合胞体を全培地中に形成して、ウィルス感染の６日後、ほとんど死滅することが示された。対照として、２^nd ｇａｇｉで形質導入したＣＥＭ−Ａは部分的に、２^nd ｖｐｕｉで形質導入したＣＥＭ−Ａ細胞はほとんどが、ＨＩＶ−１_NL-AD8の合胞体形成の細胞毒性効果から保護された。レンチウィルスｓｉＲＮＡ形質導入とＨＩＶ−１_NL-AD8の暴露の後、ＧＨＯＳＴ ｈｉ５細胞中で同様の結果を観察した。ｌａｃＺレポーター遺伝子アッセイによって示されるように、レンチウィルスの形質導入効率は１００％近くであった。

慢性感染したヒト・リンパ細胞内のＨＩＶ−１レンチウィルスｓｉＲＮＡ阻害。上記の形質導入と暴露の実験は、レンチウィルスｓｉＲＮＡが、ＨＩＶ−１感染およびそれに関連する細胞変性効果から細胞を保護することを示した。設定されたＨＩＶ−１感染細胞中のレンチウィルスｓｉＲＮＡがＨＩＶ−１を阻害するかどうかを調査した。高い力価でＨＩＶ−１を生産し続けて野生型ＨＩＶ−１に慢性的に感染したＭＯＬＴ−３・ヒトＴ細胞株を、ｇｆｐｉ、２^nd ｐｏｌｉ、２^nd ｉｎｔｉ、２^nd ｖｐｕｉを含むｓｉＲＮＡおよび後者ｓｉＲＮＡ３つ全ての組み合わせで形質導入した。ＨＩＶ−１に慢性感染したＭＯＬＴ−３細胞を９ヶ月間増殖させ、全ての細胞を感染させ、ＨＩＶ−１を継続的に生産した。レンチウィルスｓｉＲＮＡ形質導入の後、ｌａｃＺレポーター遺伝子アッセイを用いてｓｉＲＮＡの形質導入をモニターした。培養液上清中のウィルスのＲＴ活性を分析して、ｓｉＲＮＡの阻害効果を決定した。ＭＯＬＴ−３細胞へのレンチウィルスの形質導入効率は、９０％より大きかった。３のレンチウィルスｓｉＲＮＡ（２^nd ｐｏｌｉ、２^nd ｉｎｔｉおよび２^nd ｖｐｕｉ）全てが、慢性ＨＩＶ−１陽性ＭＯＬＴ−３細胞においてＨＩＶ−１の複製を阻害したが、ｇｆｐｉでは阻害しなかった。３の異なるＨＩＶ−１特異的ｓｉＲＮＡベクターの組み合わせは、最も高い阻害効果（＞９５％）を示した。

阻害は、ＭＯＬＴ−３細胞における非特異的ウィルス阻害ではなく、ＨＩＶ−１ＲＮＡ分解を原因とすることを確認するため、細胞質と核ＲＮＡを得て、調べた。ＲＮＡの質は、アガロースゲルのＥｔＢｒ染色によって、モニターされ、示された。偽体で、ｇｆｐｉで、および２^nd ｖｐｕｉで形質導入したＭＯＬＴ−３細胞のノーザン分析は、ＨＩＶ−１ｓｉＲＮＡ（２^nd ｖｐｕｉ）レンチウィルス形質導入細胞において、ＨＩＶ−１ＲＮＡ種（全長およびスプライシングされたＲＮＡ）の著しい減少を示したが、偽体およびｇｆｐｉ形質導入細胞においては示さなかった。β−アクチンＲＮＡがこれらのサンプルの全てにおいて同量存在したことに示されるように、非特異的ＲＮＡ分解は検出されなかったので、ｓｉＲＮＡ阻害はＨＩＶ特異的であった。レンチウィルス２^nd ｖｐｕｉは、慢性感染したＭＯＬＴ−３細胞の細胞質（Ｃ）および核（Ｎ）画分の両方においてＨＩＶ−１ＲＮＡを阻害した。

主要末梢血リンパ細胞中のレンチウィルスｓｉＲＮＡのＨＩＶ−１阻害。主要ヒト・リンパ細胞でｓｉＲＮＡによるＨＩＶ−１阻害効率を調べるため、主要ヒト・ＰＢＭＣをレンチウィルスｓｉＲＮＡベクターで形質導入した後、高いＭＯＩで野生型ＨＩＶ−１に暴露した。ＰＨＡでドナーＰＢＭＣは活性化された。そして、ｇｆｐｉ、２^nd ｐｏｌｉ又は２^nd ｖｐｕｉをコードするレンチウィルスｓｉＲＮＡベクターで前記ドナーＰＢＭＣに形質導入した。レンチウィルスの形質導入の後、ＰＢＭＣを計測して、同数の生存細胞を２４ウェル培養皿へプレートして、主要ウィルス種ＨＩＶ−１_89.6で暴露した。β―ガラクトシダーゼ・レポーター遺伝子アッセイによって、ＰＢＭＣへのレンチウィルス形質導入の効率を評価した。ＨＩＶ−１暴露の後（ｄｐｃ）の１〜２日毎に１０日間、培地上清を集めて、ＲＴ活性を測定した。ＲＴ動態によれば、偽体およびｇｆｐｉレンチウィルスベクターで形質導入したＰＢＭＣと比較して、ＨＩＶ−１特異的２^nd ｐｏｌｉおよび２^nd ｖｐｕｉレンチウィルスベクターで形質導入したＰＢＭＣ内ではＨＩＶ−１_89.6複製が減少することが示された。ＨＩＶ−１_NL4-3で暴露された、異なるドナーからのＰＢＭＣでも同様の結果を得た。

（他の実施形態）
本発明の詳細な説明とともに本発明は記述されている一方、前述の説明は説明することを意図しており、本発明の範囲を限定することを意図していないのを理解するべきである。本発明の範囲は添付された特許請求の範囲の範囲によって定義される。他の側面、利点及び変更は次に述べる特許請求の範囲内である。

Ｓｃａ−２を標的とするレンチウィルスｓｉＲＮＡと、レンチウィルスの形質導入後の長期間のＳｃａ−２発現抑制との概略図である。（Ａ）ｌｅｎｔｉ−ｓｉＲＮＡベクター系とウィルス力価。３４０〜３６０ｎｔからの２１ｎｔのＳｃａ−２ｍＲＮＡ標的部位が示されている。推定されるＵ６プロモーターをコードするｓｉＲＮＡステム・ループが示されている。（Ｂ）ｌｅｎｔｉ−ｓｉＲＮＡベクター系。ｓｉＲＮＡ発現カセットＵ６−Ｓｃａ−２ｓｉＲＮＡを、順方向または逆方向のどちらか一方で、ポリプリン領域（ｃＰＰＴ）とＥＦ１αプロモーターの間で、形質導入するベクターｐＴＹＦ−ＥＦｎｌａｃＺへ挿入した。ｐＴＹＦ形質導入プラスミド、ｐＨＰおよびｐＨＥＦ−ＶＳＶＧプラスミドで２９３Ｔ細胞を同時トランスフェクションさせることによって、ウィルスベクターを生成した。 ＨＩＶ−１ゲノム構造、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ標的配列の概略図である。点線とした５’と３’のスプライス部位を有するウィルスゲノム上でｓｉＲＮＡ標的部位を矢印で示した。ＨＩＶ−１_NL4-3の番号に従って、ｓｉＲＮＡ標的部位を示した。 レンチウィルスベクター・コンストラクトと、推定されるｓｉＲＮＡの構造との概略図である。ｇａｇ−ｐｏｌおよびＶＳＶ−Ｇ発現コンストラクトならびに自己不活性化ベクターの特徴が示されている。Ｈ１プロモーターｓｉＲＮＡカセットを、ＥＦ１ａ−ｎｌａｃＺレポーター遺伝子の上流にクローンした。推定されるステム・ループｓｉＲＮＡ前駆体と２^nd ｐｏｌｉ標的部位が示されている。

【配列表】

Claims (31)

1. 短鎖干渉ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とするレンチウィルスベクター。
2. 前記ベクターはレンチウィルスビリオンに含まれることを特徴とする請求項１記載のレンチウィルスベクター。
3. 前記短鎖干渉ＲＮＡは癌と関連する遺伝子に特異的であることを特徴とする請求項１記載のレンチウィルスベクター。
4. 癌と関連する前記遺伝子がＳｃａ−２であることを特徴とする請求項３記載のレンチウィルスベクター。
5. 前記短鎖干渉ＲＮＡは、ウィルスに存在する遺伝子に特異的であることを特徴とする請求項１記載のレンチウィルスベクター。
6. 前記ウィルスがＨＩＶであることを特徴とする請求項５記載のレンチウィルスベクター。
7. 前記ウィルスがＨＩＶ−１であり、前記遺伝子がｇａｇであることを特徴とする請求項６記載のレンチウィルスベクター。
8. 前記ウィルスがＨＩＶ−１であり、前記遺伝子がｐｏｌであることを特徴とする請求項６記載のレンチウィルスベクター。
9. 前記ウィルスがＨＩＶ−１であり、前記遺伝子がｉｎｔであることを特徴とする請求項６記載のレンチウィルスベクター。
10. 前記ウィルスがＨＩＶ−１であり、前記遺伝子がｖｐｕであることを特徴とする請求項６記載のレンチウィルスベクター。
11. 前記ベクターが、前記短鎖干渉ＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列と作用可能なように連結されたプロモーターを含んでいるカセットを含むことを特徴とする請求項１記載のレンチウィルスベクター。
12. 前記カセットは、前記ベクターの他の遺伝子に対して逆方向であることを特徴とする請求項１１記載のレンチウィルスベクター。
13. 前記カセットは、前記ベクターの他の遺伝子に対して順方向であることを特徴とする請求項１１記載のレンチウィルスベクター。
14. 細胞内の標的遺伝子の発現を減少させるための方法であって、
    （Ａ）前記遺伝子に特異的である短鎖干渉ＲＮＡをコードするレンチウィルスベクターを前記細胞へ導入するステップと、
    （Ｂ）前記遺伝子に特異的である前記短鎖干渉ＲＮＡが、前記遺伝子の発現の検出可能な減少を引き起こすために十分な量、発現される条件下に前記細胞を置くステップと、からなることを特徴とする方法。
15. 前記ベクターはレンチウィルスビリオンに含まれることを特徴とする請求項１４記載の方法。
16. 前記細胞は哺乳動物細胞であることを特徴とする請求項１４記載の方法。
17. 前記哺乳動物細胞はヒト細胞であることを特徴とする請求項１６記載の方法。
18. 前記細胞は腫瘍細胞であることを特徴とする請求項１６記載の方法。
19. 前記遺伝子が通常の細胞よりも癌細胞においてより高いレベルで発現されるものであることを特徴とする請求項１８記載の方法。
20. 前記遺伝子に特異的である短鎖干渉ＲＮＡをコードするレンチウィルスベクターを前記細胞へ導入するステップは、細胞死をもたらすことを特徴とする請求項１９記載の方法。
21. 前記細胞はウィルスで感染されて、前記標的遺伝子はウィルスに由来するものであることを特徴とする請求項１６記載の方法。
22. 前記ウィルスがＨＩＶであることを特徴とする請求項２１記載の方法。
23. 前記ウィルスがＨＩＶ−１であり、前記遺伝子がｇａｇであることを特徴とする請求項２２記載の方法。
24. 前記ウィルスがＨＩＶ−１であり、前記遺伝子がｐｏｌであることを特徴とする請求項２２記載の方法。
25. 前記ウィルスがＨＩＶ−１であり、前記遺伝子がｉｎｔであることを特徴とする請求項２２記載の方法。
26. 前記ウィルスがＨＩＶ−１であり、前記遺伝子がｖｐｕであることを特徴とする請求項２２記載の方法。
27. 前記遺伝子に特異的である短鎖干渉ＲＮＡをコードするレンチウィルスベクターを前記細胞へ導入するステップが、前記細胞内の前記ウィルスの複製の阻害をもたらすことを特徴とする請求項１６記載の方法。
28. 前記ベクターが、前記短鎖干渉ＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列と作用可能なように連結されたプロモーターを含んでいるカセットを含むことを特徴とする請求項１４記載の方法。
29. 前記カセットは、前記ベクターの他の遺伝子に対して逆方向であることを特徴とする請求項２８記載の方法。
30. 前記カセットは、前記ベクターの他の遺伝子に対して順方向であることを特徴とする請求項２８記載の方法。
31. 前記遺伝子に特異的である短鎖干渉ＲＮＡをコードするレンチウィルスベクターを前記細胞へ導入するステップが、前記短鎖干渉ＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列の発現を３週間以上もたらすことを特徴とする請求項１４記載の方法。