CN101942481B - 一种针对PKC γ基因RNA干扰的重组慢病毒载体的构建及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种针对PKCγ基因RNA干扰的重组慢病毒载体及其构建和应用。实验构建了针对PKCγ基因的ShRNA的慢病毒载体，将合成的针对ShRNA的DNA片段通过慢病毒载体介导，还与pHelper 1.0、pHelper 2.0两种载体共转染293T细胞培养，获得重组慢病毒载体后，转染目的细胞，实现针对PKCγ基因的RNA干扰。采用的自身失活的第三代慢病毒载体(SIN)，具有安全可靠、可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长时程表达、免疫反应小等优点，是一种理想载体。本发明的慢病毒载体，对大鼠原代培养神经元干扰效果达85％以上，因此本发明重组慢病毒载体可能成为慢性神经病理性疼痛基因治疗的有力工具。

Description

一种针对PKC γ基因RNA干扰的重组慢病毒载体的构建及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学与生物医药技术领域。具体涉及一种针对PKCγ基因RNA干扰的重组慢病毒载体及其构建方法，并将这种病毒载体用于制备治疗慢性神经病理性疼痛的药物。

背景技术

(1)PKCγ基因是慢性神经病理性疼痛治疗重要的分子靶。

慢性疼痛不仅是医学界的一个难题，而且已成为社会经济的一大负担，据统计，全世界有三亿二千多万人受到慢性疼痛的困扰。神经病理性疼痛(Neuropathic Pain)是与多种周围神经障碍相关联的一组共同表现的症状，包括与糖尿病、甲状腺功能低下、尿毒症、营养缺乏和化疗药物(长春新碱、顺铂等)相关的神经障碍；也包括：格-巴二氏综合征、带状疱疹后神经痛、进行性神经病性肌萎缩病、复合性局部疼痛综合征I型和缺血性神经病变等(Gregory T，2001)。国际疼痛研究会(IASP，1994)将这种由于外周或中枢神经系统的直接损伤功能紊乱引起的疼痛称为神经病理性疼痛。神经病理性疼痛是医学领域的挑战性研究课题，目前发病机制不清，尚缺乏有效的治疗措施。近年来，对外周神经损伤所致的神经病理性疼痛的分子、细胞机制，特别是在初级感觉神经原和脊髓水平的研究积累了比较丰富的资料，为进一步研究提供了基础。

在外周神经受损引起的慢性神经病理性疼痛，常表现痛觉过敏、自发性疼痛、痛感觉异常等。众多研究表明：痛觉过敏等反应性增强过程可能与中枢敏感化有关，众多致痛性物质、神经递质以及其所引起的细胞内第二信使的变化在中枢敏感化的形成过程中可能发挥重要作用，尤其是蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)在其中起着关键性的作用。PKC是重要的细胞内信号转导分子，是磷酸脂依赖的丝氨酸和苏氨酸激酶异构酶，在细胞内信号转导起重要作用。PKC cDNA克隆的研究表明PKC包含一个超家族。其中PKCγ主要存在于大脑和脊髓中，研究表明PKC γ阳性神经元主要位于脊髓背角的II层内侧部及II、III层的交界处，而脊髓背角浅层(I、II层)是外周伤害性信息传递和调控的初级中枢，传递伤害性信息的Aδ纤维和C纤维多终止于I、II层，尤其是II层，它们在伤害性信息传递、整合过程中发挥重要作用。Hua等在结扎一侧坐骨神经的大鼠鞘内注射PKC抑制剂GF109203X，发现其具有明显的抗痛觉过敏效应，由此推断PKC在神经损伤诱发的痛觉过敏中发挥重要作用。Martin等在大鼠完全氟氏佐剂致痛模型中发现，在致痛侧L₄～L₅背角浅层各时间点PKCγ免疫性反应增加70～100倍，行为学表现为机械性痛觉过敏，上述结果提示：PKCγ免疫反应的持续性改变与机械性痛觉过敏相一致，痛觉过敏的维持依赖于PKCγ调节兴奋性中间神经元所致。Malmberg等发现.PKCγ基因敲除的小鼠发育正常，在坐骨神经结扎疼痛模型上，几乎不能形成神经痛但其急性痛行为正常，说明PKCγ在痛觉过敏中起关键性作用。国内万丽等报道对大鼠鞘内注射反义PKCγ寡核甘酸对慢性神经痛有明显镇痛效应，但是具体机制尚不清楚。因此PKCγ基因是慢性神经病理性疼痛治疗重要的分子靶。

(2)鞘内注射高转染效率的编码PKCγ基因shRNA重组慢病毒载体对NP大鼠的镇痛效应。

所谓RNA干扰RNAi就是利用双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)高效、特异的阻断体内特定基因表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的过程，即诱导序列特异的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是由双链RNA诱导的，其作用机制起始阶段和效应阶段(initiationand effector steps)。在起始阶段，外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的双链RNA将被RNase III家族中的一个能够特异性识别双链RNA的酶Dicer，以ATP依赖的方式逐步切割为21～23nt的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs，siRNA)。siRNA3’末端有2～3个游离末配对的核苷酸(dTdT或UU)。在效应阶段，siRNA双链与核酶复合物结合形成RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC以ATP依赖性方式激活，RISC中siRNA变性，双链解开，卸下正义链，反义链仍结合在复合物上，并引导RISC与同源的靶目标RNA结合，在核酸内切酶的作用下，自距离siRNA 3’端12个碱基的位置处将靶mRNA切断，从而阻断了基因表达。siRNA还可以作为一种特殊的引物，在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)的作用下，以靶mRNA为模板合成dsRNA分子，后者又可被RISC降解为新的siRNA，新生成的siRNA又进入上述循环，这一过程被称为随机降解性聚合酶链反应(random degradative PCR)。新生的dsRNA反复合成与降解，不断形成新的siRNA，从而使靶mRNA不断减少，导致目的基因沉默，呈现RNAi现象。RdRP一般只对所表达的靶mRNA发挥特异性扩增作用，每个细胞仅需少量dsRNA即有可能完全抑制相应基因表达。RNAi干扰(RNA interference，RNAi)技术是封闭特异基因表达，从而无法指导合成相应的蛋白质，导致该基因表达沉默的新技术。且双链RNA抑制基因表达的效率比单链RNA高得多，1998年首次发现RANi现象的Andrew Fire和Craig Mello获得了2006年诺贝尔医学奖。RNAi技术与其他技术相比较有其独特的优点：比基因敲除周期短，成本低；比反义技术具有高度特异性和高效性；可进行高通量基因功能分析。从而应用RNAi技术对慢性疼痛进行治疗的前景非常值得期待。国外已有少数报道初步肯定了这一点，Medline目前收录有7篇文献，其中选出的分子靶有野香草受体(vanilloid receptor TRPVl)，河豚毒素不敏感的电压门控钠离子通道NaV1.8，P2X3受体及血管加压素受体V2亚型。

由于RNAi抑制基因表达的作用在很大程度上受到转染效率的限制，提高转染效率的关键是选择合适的载体。慢病毒是逆转录病毒的一种，具有逆转录病毒的基本结构，但也有不同于逆转录病毒的组份和特性，作为基因治疗载体发展起来，最近已用于转基因动物制备。利用慢病毒构建的shRNA载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的shRNA相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，lentivirus-shRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。慢病毒载体(lentivirus-based vector，LV)具有可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长时程表达、免疫反应小等优点，是一种比较理想的用于中枢神经系统基因治疗的理想载体。我们选用第三代自我失活慢病毒载体，能很好解RNAi技术基因治疗的靶向性、安全性、整合效率的问题。鞘内是慢性疼痛治疗给药的经典途径，最近有学者报道在大鼠鞘内注射NMDA受体亚单位NR2B的shRNA，可以有效地减轻福尔马林引起的疼痛；也有报道鞘内持续给予P2X3siRNA，发现P2X3在脊髓背角和背根神经节表达显著下调，同时大鼠的疼痛反应明显减轻。提示鞘内注射针对某特定基因的RNAi技术是一种很有前景的疼痛治疗方法，shRNA具有长时程表达的特点，重组病毒载体能够作用于PKCγ较密集的脊髓表层，局部浓度高，能够达到最佳转染效率。从而有效治疗神经病理性疼痛。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种针对PKCγ基因RNA干扰的重组慢病毒载体及其制备方法。

本发明的另一目的是提供该病毒载体的用途。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

一种针对PKCγ基因RNA干扰的重组慢病毒载体，是自身失活的第三代慢病毒载体SIN。所述的载体SIN含有pGCSIL-GFP/U6-Sh PKCγ重组载体，所述的pGCSIL-GFP/U6-Sh PKCγ重组载体是在pGCSIL-GFP载体的MCS中连接了针对ShRNA的双链DNA片段；所述的双链DNA片段为以下序列中的一种：PSCSI625：

5’-CCGGCAGAAGACAAAGACCGTGAAATTCAAGAGATTTCACGGTCTTTGTCTTCTGTTTTTG-3’

3’-GTCTTCTGTTTCTGGCACTTTAAGTTCTCTAAAGTGCCAGAAACAGAAGACAAAAACTTAA-5’PSCSI626：

5’-CCGGGAAGTTTGAGGCCTGTAATTATTCAAGAGATAATTACAGGCCTCAAACTTCTTTTTG-3’

3’-CTTCAAACTCCGGACATTAATAAGTTCTCTATTAATGTCCGGAGTTTGAAGAAAAACTTAA-5’PSCSI627：

5’-CCGGAACTCTATGCCATCAAGATACTTCAAGAGAGTATCTTGATGGCATAGAGTTTTTTTG-3’

3’-TTGAGATACGGTAGTTCTATGAAGTTCTCTCATAGAACTACCGTATCTCAAAAAAACTTAA-5’PSCSI628：

5’-CCGGCAGACTACATAGCACCTGAGATTCAAGAGATCTCAGGTGCTATGTAGTCTGTTTTTG-3’

3’-GTCTGATGTATCGTGGACTCTAAGTTCTCTAGAGTCCACGATACATCAGACAAAAACTTAA-5’。

所述的针对PKC γ基因RNA干扰的重组慢病毒载体的制备方法如下：根据PKCγmRNA序列，设计合成了针对ShRNA的双链DNA片段，所述的双链DNA片段为以下序列中的一种：PSCSI625：

正义链：5’-CCGGCAGAAGACAAAGACCGTGAAATTCAAGAGATTTCACGGTCTTTGTCTTCTGTTTTTG-3’

反义链：3’-GTCTTCTGTTTCTGGCACTTTAAGTTCTCTAAAGTGCCAGAAACAGAAGACAAAAACTTAA-5’PSCSI626：

正义链：5’-CCGGGAAGTTTGAGGCCTGTAATTATTCAAGAGATAATTACAGGCCTCAAACTTCTTTTTG-3’

反义链：3’-CTTCAAACTCCGGACATTAATAAGTTCTCTATTAATGTCCGGAGTTTGAAGAAAAACTTAA-5’PSCSI627：

正义链：5’-CCGGAACTCTATGCCATCAAGATACTTCAAGAGAGTATCTTGATGGCATAGAGTTTTTTTG-3’

反义链：3’-TTGAGATACGGTAGTTCTATGAAGTTCTCTCATAGAACTACCGTATCTCAAAAAAACTTAA-5’PSCSI628：

正义链：5’-CCGGCAGACTACATAGCACCTGAGATTCAAGAGATCTCAGGTGCTATGTAGTCTGTTTTTG-3’

反义链：3’-GTCTGATGTATCGTGGACTCTAAGTTCTCTAGAGTCCACGATACATCAGACAAAAACTTAA-5’，

然后将所述的DNA片段连接到pGCSIL-GFP载体的MCS中构建成pGCSIL-GFP/U6-ShPKCγ重组载体；再将pGCSIL-GFP/U6-Sh PKCγ重组载体、pHelper 1.0、pHelper 2.0三种载体共转染293T细胞培养，获得所述的重组慢病毒载体。

在DNA片段末端引入Age I和EcoR I酶切位点；用AgeI和EcoRI酶将pGCSIL-GFP载体酶切，回收大片段，将所述的大片段与DNA片段用T4DNA连接酶连接后转化感受态菌DH5α，挑取重组阳性克隆。

所述的重组慢病毒载体可用于制备治疗慢性神经病理性疼痛的制剂。

针对PKCγ基因的RNA干扰，被识别的序列为：

Marker	gene	TargetSeq	StartPos	GC	流水号
						PscSI-1	PKC	GAAGACAAAGACCGTGAAA	847	42.10％	PscSI625
PscSI-2	PKC	AGTTTGAGGCCTGTAATTA	1119	36.84％	PscSI626
						PscSI-3	PKC	CTCTATGCCATCAAGATAC	1343	42.10％	PscSI627
PscSI-4	PKC	GACTACATAGCACCTGAGA	1775	47.36％	PscSI628
						PSC-NC		TTCTCCGAACGTGTCACGT			PSC NC

病毒载体构建框架：

本发明的优点在于：

本发明采用的pGCSIL-GFP载体含有U6启动子，能够在宿主细胞中持续表达有干扰作用的小RNA。同时该质粒能表达由CMV启动子驱动的荧光蛋白GFP，方便病毒包装时转染效率，以及感染宿主细胞的感染效率的检测。pHelper 1.0质粒中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper 2.0质粒中含有单纯疱疹病毒来源的VSVg基因，提供病毒包装所需要的衣壳蛋白。将以上三种载体共转入293T细胞能高效组装自身失活的第三代慢病毒载体(SIN)

组装的自身失活的第三代慢病毒载体(SIN)，增加了两个安全特性：其一构建了自身失活(SIN)的慢病毒载体，即删除了U3区的3′LTR，使载体失去HIV-1增强子及启动子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA。第二个特点是去除了tat基因代之以异源启动子序列，这样原始的HIV基因，组中的9个基因在构建的HIV慢病毒载体中只保留了3个(gag、pol和rev)。因此第三代HIV慢病毒载体系统更加安全。将针对ShRNA的序列构建入慢病毒载体中，转入靶细胞后可以插入染色体并稳定表达，不会导致插入失活，此外，该病毒载体还具有可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长时程表达、免疫反应小等优点，是一种比较理想的用于中枢神经系统基因治疗的载体。

而且PKC是重要的细胞内信号转导分子，PKC cDNA克隆的研究表明PKC包含一个超家族，其中PKCγ主要存在于大脑和脊髓中，其在伤害性信息传递、整合过程中发挥重要作用。本发明正是针对PKCγ基因，提供一种针对该基因的RNA干扰技术的慢病毒载体，使之成为慢性神经病理性疼痛基因治疗的有力工具，应用前景广阔。本发明的操作过程简单易实施，成本低，效果好，对大鼠原代培养神经元敲减效率高达85％以上，并对正常神经细胞无任何毒副作用。

附图说明

图1为pGCSIL-GFP载体结构示意图；

图2为pHelper 1.0载体结构示意图；

图3为pHelper 2.0载体结构示意图；

图4为阳性克隆质粒抽提琼脂糖凝胶电泳图谱；

1号泳道：PscSI 625(含PSCSI625片段的质粒)；

2号泳道：PscSI 626(含PSCSI626片段的质粒)；

3号泳道：PscSI 627(含PSCSI627片段的质粒)；

4号泳道：Marker  10kb，9kb，8kb，7kb，6kb，5kb，4kb，3kb，2kb，1Kb，900bp，750bp，600bp，500bp

5号泳道：PscSI 628(含PSCSI628片段的质粒)。

图5为定量PCR扩增标准曲线；

图6为PKCγ目的基因扩增产物熔解曲线；

图7为内参照基因Actin扩增产物熔解曲线；

图8为PKCγ目的基因Real-time PCR检测结果显示的判断靶点的干扰效率图；

图9为PKCγ目的基因Western blot检测结果显示图；

CON组，未感染任何病毒的细胞组(Control)；

NC组，加阴性对照病毒感染的细胞组(Negative Control)；

KD626组，含PSCSI626片段质粒的病毒颗粒感染的细胞组(Knock Down)；

1号泳道为CON；

2号泳道为NC；

3号泳道为KD626；

4号泳道为CON；

5号泳道为NC；

6号泳道为KD626；

图10为PKCγ目的基因Western blot检测结果显示ShRNA的敲除(KD)效率图；

CON组，未感染任何病毒的细胞组(Control)；

NC组，加阴性对照病毒感染的细胞组(Negative Control)；

RNAi组，加RNAi靶点病毒感染的细胞组(Knock Down)。

图11为pGCSIL-GFP/U6-Sh PKCγ重组载体构建流程图；

图12为本发明慢病毒载体包装流程图。

具体实施方式

以下结合实施例进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1：针对ShRNA的DNA的设计合成

根据PKCγ mRNA序列(NCBI 012628)，根据Ambion在线软件设计合成以下核苷酸序列的正、反义链。

PSCSI625：

正义链：5’-CCGGCAGAAGACAAAGACCGTGAAATTCAAGAGATTTCACGGTCTTTGTCTTCTGTTTTTG-3’

反义链：3’-GTCTTCTGTTTCTGGCACTTTAAGTTCTCTAAAGTGCCAGAAACAGAAGACAAAAACTTAA-5’PSCSI626：

正义链：5’-CCGGGAAGTTTGAGGCCTGTAATTATTCAAGAGATAATTACAGGCCTCAAACTTCTTTTTG-3’

反义链：3’-CTTCAAACTCCGGACATTAATAAGTTCTCTATTAATGTCCGGAGTTTGAAGAAAAACTTAA-5’PSCSI627：

正义链：5’-CCGGAACTCTATGCCATCAAGATACTTCAAGAGAGTATCTTGATGGCATAGAGTTTTTTTG-3’

反义链：3’-TTGAGATACGGTAGTTCTATGAAGTTCTCTCATAGAACTACCGTATCTCAAAAAAACTTAA-5’PSCSI628：

正义链：5’-CCGGCAGACTACATAGCACCTGAGATTCAAGAGATCTCAGGTGCTATGTAGTCTGTTTTTG-3’

反义链：3’-GTCTGATGTATCGTGGACTCTAAGTTCTCTAGAGTCCACGATACATCAGACAAAAACTTAA-5’。

DNA末端引入Age I和EcoR I酶切位点。由NEB公司合成，中间有Loop序列TTCAAGAGA。

另外，还设计合成了阴性对照片段。

PSCNC

正义链：5’-TTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTC-3’

反义链：3’-AAAGAGGCTTGCACAGTGCAAAGTTCTCTTGCACTGTGCAAGGCCTCTTAAAAAAGAGCT-3’

实施例2：重组质粒的构建

构建重组质粒的过程如图11所示，取实施例1合成并纯化的正、反义链各5μg，退火形成的互补双链，以上任意一种互补双链均可连接到载体pGCSIL-GFP上。15mL/L非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis PAGE)凝胶检测双链形成效率，用Age I和EcoRI将pGCSIL-GFP/U6载体(购自上海吉凯基因化学技术有限公司)酶切以使其线性化，凝胶电泳回收大片段。质粒载体回收大片段与合成的DNA用T4噬菌体DNA连接酶连接，转化感受态菌DH5α，挑取重组阳性克隆进行PCR及测序鉴定(Invitrogen公司进行ABI 3730型测序仪进行测序分析)，PCR鉴定阳性克隆的primer：

Up(+)：5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’

Down(-)：5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3’

结果见图4，测序后进行阳性克隆质粒抽提，获得命名为pGCSIL-GFP/U6-Sh PKCγ重组载体，用于制备慢病毒包装质粒。

实施例3：RNAi慢病毒包装

1、病毒包装(见图12)

制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒，即pGCSIL-GFP/U6-Sh PKCγ重组载体，pHelper 1.0(gag/pol元件)载体，pHelper 2.0(VSVG元件)。三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，按Invitrogen公司Lipofectamine2000使用说明进行共转染293T细胞，转染后8h更换为完全培养基，培养48h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，在293T细胞中测定并标定病毒滴度。在一定滴度范围内的慢病毒颗粒可以满足大部分体内体外实验需求。

细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10％FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。

大肠杆菌菌株DH5α，用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。

病毒载体慢病毒载体系统(购于上海吉凯基因化学技术有限公司)由pGCSIL-GFP载体(见图1)，pHelper 1.0(gag/pol元件)载体(见图2)，Helper 2.0(VSVG元件)载体(见图3)，三质粒组成，其中pGCSIL-GFP载体含有能持续表达小RNA的元件，同时能表达荧光蛋白marker(GFP/RFP)。pHelper 1.0和pHelper 2.0含有病毒包装所必须的元件。

2、病毒的收获及浓缩具体步骤

1)收集转染后48小时(转染即可为0小时计起)的293T细胞上清液；

2)于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；

3)以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；

4)把病毒粗提液样品加入到过滤杯中(最多19ml)，盖上盖子。将过滤杯插到滤过液收集管中；

5)组合好后，做好平衡，放在转头上；

6)在4000×g离心，至需要的病毒浓缩体积。通常需要的时间为10-15分钟；

7)离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开；

8)将过滤杯倒扣在样品收集杯上。离心力不超过1000g，时间为2分钟。过高转速会导致样品损失。把离心杯从样品收集杯上移开。样品收集杯中的即为病毒浓缩液；

9)将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-80℃长期保存。取其中一支进行病毒生物学滴度测定。

3、RNAi慢病毒滴度检测具体步骤

逐孔稀释滴度测定法

1)测定前一天，为测定滴度所需的细胞(293T细胞：贴壁生长)铺板，96孔板，每个孔加4×10⁴个细胞，体积为100μl；

2)根据病毒的预期滴度，准备7～10个无菌的Ep管。在每个管中加入90μl的无血清培养基；

3)取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中，混匀后，取10μl加入到第二个管中。继续相同的操作直到最后一管；

4)选取所需的细胞孔，吸去90μl培养基，丢弃。加入90μl稀释好的病毒溶液。放入培养箱培养；

5)24小时后，加入完全培养基100μl。小心操作，不要吹起细胞；

6)4天后，观察荧光表达情况。荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。

结果表明：Pscsil 626慢病毒(即含PSCSI626片段的质粒构建的慢病毒颗粒)滴度为1×10⁹TU/ml。

实施例4：重组慢病毒载体对原代培养的神经细胞中PKCγ的干扰作用

1、大鼠皮层神经元原代培养

孕16d SD大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，消毒腹部皮肤后，剪开皮肤、肌肉、皮下筋膜，无菌操作下取出胚胎放入预冷的D-Hanks平衡盐液中。分离并取出胚胎大脑皮层，除去脑膜，剪碎组织成约1mm³大小，加入胰酶-EDTA消化液并放入37℃孵箱内消化20min，中间摇晃一次。随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的培养液(DMEM+10％FBS)的离心管内终止消化液作用5min。用滴管吸出组织转移到装有预冷的DMEM+10％FBS的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清吸到另一支离心管内。重复上述步骤2～3次。将所收集的上清经200目筛网过滤。过滤后的细胞悬液于800r/min离心5min，弃上清，管内加入新鲜培养液(DMEM+20％FBS)并吹打成单细胞悬液。细胞计数，调整细胞密度按5×10⁵/cm²种入6孔板内，放入CO₂孵箱中培养。培养48h后换液并加入阿糖胞苷(Ara-C)使其终浓度为1×10^-5mM/L。Ara-C作用24h后全量换液。以后每隔3天半量换液一次。

2、慢病毒感染大鼠神经元细胞

接种于6孔板中大鼠神经元细胞(每孔神经元细胞数约为5×10⁵)分为三组：CON组，未感染任何病毒的细胞组(Control)；NC组，加阴性对照病毒感染的细胞组(NegativeControl)；RNAi组，加RNAi靶点病毒感染的细胞组(Knock Down)，以CON组及NC组为对照，根据MOI值，加入适宜量的病毒感染大鼠神经元细胞(本研究慢病毒的MOI值为10，如慢病毒滴度为1×10⁹TU/ml，所以6孔板板每孔加入5μl浓缩慢病毒液)。12h后观察细胞状态：如果没有明显的细胞毒性作用，继续培养24h后更换培养基；如果有明显的细胞毒性作用，立即更换培养基。感染3天后观察慢病毒上报告基因GFP的表达情况，感染效率大于50％者继续培养，待感染时间达到5天后收集细胞蛋白进行Real time PCR和Western Blot检测实验；感染效率低于50％的实验组，重新进行感染实验。

3、Real-Time PCR内源筛选有效靶点

培养生长状态良好的目的细胞(大鼠原代培养神经元)，病毒感染前一天将目的细胞分入6-well培养板培养，感染当天按实验设计的组别加入RNAi慢病毒颗粒进行目的细胞的感染实验。感染3天后荧光显微镜下观察GFP表达情况，感染5天后收集细胞，采用RT-PCR的方法检测目的基因的mRNA表达情况，进而判断靶点的干扰效果。

目的细胞慢病毒感染实验在6孔板中进行，每孔样品排列如下表所示：

	1	2	3
				A	CON	NC	KD1
B	KD2	KD3	KD4

说明：

1)CON为正常目的细胞，未感染任何病毒的细胞组(Control)；

2)NC为正常目的细胞，加阴性对照病毒感染的细胞组(Negative Control)；

3)KD为正常目的细胞，加RNAi靶点病毒感染的细胞组(Knock Down)；

KD1，2，3，4中的序号表示待筛选靶点病毒的序号，与之相对应的RNAi靶点病毒流水号分别为：psc625，psc626，psc627，psc628；同时分别对应的是含有PSCSI625、PSCSI626、PSCSI627、PSCSI628的病毒颗粒感染的细胞组。

Real time PCR步骤：

1)总RNA抽提(根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书进行)；

2)RNA逆转录获得cDNA(根据Promega公司的M-MLV操作说明书进行)；

3)Real-time PCR检测PKC γ引物和Actin引物采用软件Beacon designer 2设计，引物序列信息如下，由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。

a.再按下列比例配置反应体系；

试剂	每管加入量
		SYBR premix ex taq：	10μl
上游引物(5μM)：	0.5μl
		下游引物(5μM)：	0.5μl
cDNA	1.0μl
		水	8.0μl

b.设定程序为两步法Real-Time PCR：预变性95℃，15S；之后每一步变性95℃，5S；退火延伸60℃，30S；共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值；

Cycle 1：(1X)

Step 1：    95.0℃  for 00:15.

Cycle 2：(45X)

Step 1：    95.0℃  for 00:05.

Step 2：    60.0℃  for 00:30.

数据收集分析结果；

c.制作熔解曲线：PCR结束后，95℃变性1min，然后冷却至55℃，使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持30S，同时读取吸光值；

Cycle 3：(1X)

Step 1：         95.0℃        for 01:00.

Cycle 4：(1X)

Step 1：         55.0℃        for 01:00.

Cycle 5：(81X)

Step 1：         55.0℃-95.0℃ for 00:30.

第二个循环后，每一步增加0.5℃

结果表明：psc625，psc626，psc628是RNAi有效靶点。实验中敲除(KD)效率为95％以上，见图8。

4、Western blot检测KD效率

培养生长状态良好的目的细胞，即原代神经元细胞。病毒感染前一天将目的细胞分入6-well培养板培养，感染当天按实验设计的组别加入RNAi慢病毒颗粒进行目的细胞的感染实验。感染3天后荧光显微镜下观察GFP表达情况，感染7天后收集细胞，采用WesternBlot的方法检测目的基因的表达情况，进而判断靶点的干扰效果。

目的细胞慢病毒感染实验在6孔板中进行，每孔样品排列如下表所示：

	1	2	3
				A	CON	NC	KD626
B	CON	NC	KD626

说明：

1)CON为正常目的细胞，未感染任何病毒的细胞组(Control)；

2)NC为正常目的细胞，加阴性对照病毒感染的细胞组(Negative Control)；

3)KD626为正常目的细胞，加RNAi 626靶点病毒感染的细胞组(Knock Down)，即加入PSCSI626的病毒颗粒感染的细胞组。

Western Blot检测目的基因表达水平

A、总蛋白抽提

1)从培养箱中取出细胞，弃去细胞培养液，PBS洗涤2次；

2)弃去PBS，加入适量预冷的2×Lysis Buffer，配方如下：

1M Tris-HCl(pH6.8)  100mM

巯基乙醇            2％

甘油                20％

SDS                 4％

3)细胞刮刮下细胞，将样品转移入Ep管中，冰上裂解细胞10～15min；

4)超声破碎仪破碎细胞(200W共4次，每次5秒，间隔2秒)；

5)4℃，12000g，离心15min；

6)取上清，测蛋白浓度后，每个样品蛋白终浓度均调整为2μg/μl，-80℃保存备用。

B、上样样品准备

1)每个样品取相同总蛋白量，加入相同体积的2X loading buffer上样缓冲液，配方如下：

1M Tris-HCl(pH6.8)  100mM

巯基乙醇            2％

溴酚兰              0.02％

甘油                20％

SDS                 4％

2)混匀后，沸水浴煮5-10min，4℃存放备用。

C、SDS-PAGE

1)制胶

根据目的蛋白分子量大小配制不同浓度的胶，具体体系如下：

分离胶(8mL体系)
								8％	9％	10％	12％	13％	15％
H2O	3.7	3.4	3.1	2.6	2.3	1.8
							30％PAGE	2.1	2.4	2.7	3.2	3.5	4
1.5mol/L Tris(pH8.8)	2	2	2	2	2	2
							10％SDS	0.08	0.08	0.08	0.08	0.08	0.08
10％APS	0.08	0.08	0.08	0.08	0.08	0.08
							TEMED	0.005	0.004	0.004	0.004	0.004	0.004
分离胶(10mL体系)
								8％	9％	10％	12％	13％	15％
H2O	4.6	4.3	4	3.3	2.9	2.3
							30％PAGE	2.7	3	3.3	4	4.4	5
1.5mol/L Tris(pH8.8)	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5
							10％SDS	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
10％APS	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
							TEMED	0.006	0.004	0.004	0.004	0.004	0.004
浓缩胶(5％)
								3mL	4mL	5mL
H2O	2.1	2.7	3.4
							30％PAGE	0.5	0.67	0.83
1.0mol/L Tris(pH6.8)	0.38	0.5	0.63
							10％SDS	0.03	0.04	0.05
10％APS	0.03	0.04	0.05
							TEMED	0.003	0.004	0.005

2)上样：等胶凝固好后，拔去梳子，电泳缓冲液清洗上样孔，将准备好的样品进行上样；

3)电泳：30mA2h。

D、免疫印迹(湿转)

电泳结束后，使用转移电泳装置，在4℃，400mA恒流条件下电转120min，将蛋白转移到PVDF膜上。

E、免疫显色

1)封闭：用封闭液(含5％脱脂牛奶的TBST溶液)室温封闭PVDF膜1h或4℃过夜；

2)一抗孵育：封闭液稀释抗体，然后与封闭好的PVDF膜室温孵育2h或4℃过夜；

3)洗膜：TBST洗膜3次，每次10min；

4)二抗孵育：用封闭液稀释相应的二抗，室温下孵育PVDF膜2h；

5)洗膜：TBST洗膜3次，每次10min；

6)采用Amersham公司ECL+plusTM Western blotting system试剂盒进行显色；

7)X光显影：在暗房中进行获得显示条带的胶片。

加ECL、曝光、显影、定影的具体步骤如下：

a)将PVDF膜置于平铺好的保鲜膜上，以1∶40的比例混合A液和B液，将混合液均匀滴加在PVDF膜上，避光反应3-5min；

b)将膜取出，稍微沥干多余的ECL底物反应液，放入暗盒，铺上保鲜膜(避免产生气泡)，放上X光片(避免X光片的移动)，关上暗盒，曝光1-2min；

c)取出X光片，放入显影液中，约1min后取出，在清水中漂洗几秒钟，后放入定影液中至少2min；

d)取出X光片，晾干，分析。

结果表明：通过转染体外培养的原代神经元细胞，采用Western Blot方法检测ShRNA的敲除(KD)效率分别为85％以上，见图9、10。

Claims (4)

1.一种针对PKCγ基因RNA干扰的重组慢病毒载体，是自身失活的第三代慢病毒载体SIN，其特征在于，所述的载体SIN含有pGCSIL-GFP/U6-Sh PKCγ重组载体，所述的pGCSIL-GFP/U6-Sh PKCγ重组载体是在pGCSIL-GFP载体的MCS中连接了针对ShRNA的双链DNA片段；所述的双链DNA片段的序列如下：

PSCSI626：

5’-CCGGGAAGTTTGAGGCCTGTAATTATTCAAGAGATAATTACAGGCCTCAAACTTCTTTTTG-3’

3’-CTTCAAACTCCGGACATTAATAAGTTCTCTATTAATGTCCGGAGTTTGAAGAAAAACTTAA-5’。

2.权利要求1所述的针对PKCγ基因RNA干扰的重组慢病毒载体的制备方法，其特征在于，根据PKCγmRNA序列，设计合成了针对ShRNA的双链DNA片段，所述的双链DNA片段的序列如下：

PSCSI626：

正义链：5’-CCGGGAAGTTTGAGGCCTGTAATTATTCAAGAGATAATTACAGGCCTCAAACTTCTTTTTG-3’

反义链：3’-CTTCAAACTCCGGACATTAATAAGTTCTCTATTAATGTCCGGAGTTTGAAGAAAAACTTAA-5’

然后将所述的DNA片段连接到pGCSIL-GFP载体的MCS中构建成

pGCSIL-GFP/U6-Sh PKCγ重组载体；再将pGCSIL-GFP/U6-Sh PKCγ重组载体、具有图2所示结构的pHelper 1.0、具有图3所示结构的pHelper 2.0三种载体共转染293T细胞培养，获得所述的重组慢病毒载体。

3.根据权利要求2所述的针对PKCγ基因RNA干扰的重组慢病毒载体的制备方法，其特征在于，在所述的DNA片段末端引入Age I和EcoR I酶切位点。

4.权利要求1所述的针对PKCγ基因RNA干扰的重组慢病毒载体的应用，其特征在于，所述的重组慢病毒载体用于制备治疗慢性神经病理性疼痛的制剂。

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