CN107075514A - 亨廷顿氏病的治疗化合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及靶向亨廷顿氏病核酸序列的RNA干扰(RNAi)分子，以及使用这些RNAi分子以治疗亨廷顿氏病的方法。本发明提供了分离的miRNA穿梭载体，其表达具有有限脱靶毒性的治疗性siRNA。在某些实施方案中，将具有脱靶毒性的siRNA包含在本发明的miRNA穿梭载体的背景中限制了所述siRNA的所述脱靶毒性。

Description

亨廷顿氏病的治疗化合物

相关专利申请

本申请要求于2014年5月20日提交的美国临时专利申请No.61/000,895的优先权，其全文以引用方式并入本文。

政府支持

本发明是在国家卫生研究院资助的11033、DK054759、NS050210和NS068099下由政府支持完成的。政府享有本发明的某些权利。

发明背景

RNAi通过被加工成功能性的小的抑制性RNA(~21nt)的双链RNA(dsRNA)引导序列特异性基因沉默。在自然界中，用于调控基因表达的RNAi主要通过被称为微RNA(miRNA)的小RNA进行。成熟的微RNA(~19-25个核苷酸)是由更大的含有茎-环区的初级miRNA转录物(pri-miRNA)加工而成。经过由核糖核酸酶Drosha和Dicer催化的一系列加工事件，miRNA双链区被解开，而随后一条单链(反义“引导”链)被并入到RNA诱导沉默复合体(RISC)中，从而生成能够与靶转录物碱基配对并使之沉默的功能性复合体。靶标抑制的模式主要取决于互补程度；转录物裂解通常要求高度的碱基配对，而当小RNA不完全结合至靶转录物（最常在3′UTR中）时发生翻译抑制和mRNA去稳定。事实上对于后者而言，一小段的互补–短至6 bp–可能足以引起基因沉默。

发明概述

本发明提供了分离的miRNA穿梭载体，其表达具有有限的脱靶毒性的治疗性siRNA。在某些实施方案中，将具有脱靶毒性的siRNA嵌入本发明的miRNA穿梭载体的背景中会限制所述siRNA的脱靶毒性。在某些实施方案中，所述miRNA穿梭载体在脑中表达具有有限的脱靶毒性的治疗性siRNA。在某些实施方案中，所述miRNA穿梭载体在纹状体中表达具有有限的脱靶毒性的治疗性siRNA。在某些实施方案中，所述miRNA穿梭载体在大脑中表达具有有限的脱靶毒性的治疗性siRNA。

本发明提供了编码初级转录物(pri-miRNA)的分离的核酸，其包括，依位置顺序：5′-侧翼区、非引导(乘客)区、环区、引导区和3′-侧翼区，其中所述引导区由SEQ ID NO: 37(miHDss3)、SEQ ID NO:6(miHDS1v5U)或SEQ ID NO:7(miHDS1v6A)组成，并且所述非引导区与所述引导区至少80%互补。在某些实施方案中，所述非引导区与所述引导区至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互补。在某些实施方案中，所述5′-侧翼区连续连接至所述非引导区，所述环区位于所述非引导区和所述引导区之间，而所述引导区连续连接至所述3′-侧翼区。如本文所用，术语“siRNA引导区”是与靶序列互补的RNA单链序列。如本文所用，术语“siRNA非引导区”是与“siRNA引导区”互补的RNA单链序列。因此，在适当条件下，所述siRNA引导区与所述siRNA非引导区缔合以形成RNA双链。如本文所用，按惯例，以5′至3′的方向列出了所有的核酸序列。

在某些实施方案中，所述5′-侧翼区含有连续连接至所述非引导区的5′-接合序列。如本文所用，术语“接合位点”或“接合序列”是少于60个核苷酸的短核酸序列，其将两个其它核酸序列连接起来。在某些实施方案中，接合位点的长度为4至50之间的任意整数（包括端点）。在某些实施方案中，所述5′-接合序列由5-8个核苷酸组成（例如，由6个核苷酸组成）。在某些实施方案中，所述5′-接合序列编码GUGAGCGA(SEQ ID NO:13)或GUGAGCGC(SEQID NO:14)。

在某些实施方案中，所述5′-侧翼区还包含位于所述5′-接合序列上游的5′-凸序列。如本文所用，术语“凸序列”是与在双链中与之相对的核酸非互补的核酸区。例如，双链将含有互补核酸区，然后是非互补核酸区，后接第二个互补核酸区。这些互补核酸区将彼此结合，而中间的非互补区将不结合，从而形成“凸起”。在某些实施方案中，位于所述两个互补区之间的两条核酸链将具有不同的长度，从而形成“凸起”。在某些实施方案中，所述5′-凸序列将含有2至15个核苷酸。在某些实施方案中，所述5′-凸序列由约1-10个核苷酸组成。在某些实施方案中，所述5′-凸序列编码UAAACUCGA(SEQ ID NO:15)。在某些实施方案中，所述5′-凸序列与3′-凸序列具有0-50%的互补性。

在某些实施方案中，所述5′-侧翼区还含有位于所述5′-凸序列上游的5′-间隔序列。在某些实施方案中，所述5′-间隔序列由9-12个核苷酸（如10-12个核苷酸）组成。在某些实施方案中，所述5′-间隔序列与3′-间隔序列具有60-100%的互补性。在某些实施方案中，所述5′-凸序列包含克隆位点，如XhoI位点。在某些实施方案中，所述5′-间隔序列是UGGUACCGUU(SEQ ID NO:16)。

在某些实施方案中，所述5′-侧翼区还含有位于所述5′-间隔序列上游的5′-上游序列。在某些实施方案中，所述5′-上游序列长约5-5000个核苷酸（如30-2000个核苷酸）。

在某些实施方案中，所述3′-侧翼区含有连续连接至所述引导区的3′-接合序列。在某些实施方案中，接合位点的长度为4至50之间的任意整数（包括端点）。在某些实施方案中，所述3′-接合序列由5-8个核苷酸组成（例如，由6个核苷酸组成）。在某些实施方案中，所述3′-接合序列与5′-接合序列至少约85%互补。在某些实施方案中，所述3′-接合序列编码CGCYUAC(SEQ ID NO:17)，其中Y是C或U。在某些实施方案中，所述3′-接合序列编码CGCCUAC(SEQ ID NO:18)。

在某些实施方案中，所述3′-侧翼区还包含位于所述3′-接合序列下游的3′-凸序列。在某些实施方案中，所述3′-凸序列包含克隆位点，如SpeI/XbaI位点或SpeI位点。在某些实施方案中，所述3′-凸序列由约1-15个核苷酸（如2-15个核苷酸或1-10个核苷酸）组成。在某些实施方案中，所述3′-凸序列编码UAG(SEQ ID NO: 30)。在某些实施方案中，所述5′-凸序列与所述3′-凸序列仅在位于序列两端的各一个核苷酸处互补。

在某些实施方案中，所述3′-侧翼区还含有位于所述3′-凸序列下游的3′-间隔序列。在某些实施方案中，所述3′-间隔序列由9-12个核苷酸（如10-12个核苷酸）组成。在某些实施方案中，所述3′-间隔序列是AGCGGCCGCCA(SEQ ID NO:19)。在某些实施方案中，所述3′-间隔序列与5′-间隔序列至少约70%互补。

在某些实施方案中，所述3′-侧翼区还含有位于所述3′-间隔序列下游的3′-下游序列。在某些实施方案中，5′-上游序列不与3′-下游序列明显配对。如本文所用，术语“不与…明显配对”意指这两条链的同源性低于20%。在某些实施方案中，所述3′-下游序列长约5-5000个核苷酸（如30-2000个核苷酸）。

在某些实施方案中，所述环区长4-20个核苷酸（如15-19个核苷酸）。所述环区的0-50%可以与该环区的另一部分互补。如本文所用，术语“环区”是将两条互补核酸链接合起来的序列。在某些实施方案中，所述环区的1-3个核苷酸紧接着可能与该环区的最后1-3个核苷酸互补的互补核酸链。例如，所述环区中头两个核酸可能与该环区的最后两个核苷酸互补。在某些实施方案中，所述环区长17个核苷酸。在某些实施方案中，所述环区编码CUNNNNNNNNNNNNNNNGG(SEQ ID NO:20)或CCNNNNNNNNNNNNNNNGG(SEQ ID NO:21)。在某些实施方案中，所述环区编码CUGUGAAGCCACAGAUGGG(SEQ ID NO:22)或CCGUGAAGCCACAGAUGGG(SEQ ID NO:23)。

本发明还提供了由本文所述的核酸编码的RNA。

本发明还提供了表达盒，其含有连续连接至本文所述的核酸的启动子。在某些实施方案中，所述启动子是polII或polIII启动子，如U6启动子（例如，小鼠U6启动子）。在某些实施方案中，所述表达盒还含有标志物基因。在某些实施方案中，所述启动子是polII启动子。在某些实施方案中，所述启动子是组织特异性启动子。在某些实施方案中，所述启动子是诱导型启动子。在某些实施方案中，所述启动子是polIII启动子。

在某些实施方案中，所述表达盒还包含标志物基因。

本发明提供了含有本文所述的表达盒的载体。在某些实施方案中，所述载体是腺相关病毒（AAV）载体。在某些实施方案中，所述AAV是AAV1、AAV2、AAV5、AAV6和/或AAV9。在某些实施方案中，所述AAV是AAV2。在某些实施方案中，所述AAV是AAV2/1。此类AAV的实例可见于Davidson 等人，PNAS (2000) 97:3428-3432中。在某些实施方案中，所述AAV是AAV2/1。在某些实施方案中，所述AAV是AAV2/5。如本文所用，术语AAV2/1被用于意指AAV2 ITR 和AAV1衣壳，术语AAV2/2是AAV2 ITR 和 AAV2衣壳，术语AAV2/4是AAV2 ITR 和 AAV4衣壳，等。在某些实施方案中，所述AAV是AAV1、AAV2、AAV5、AAV6和/或AAV9。在某些实施方案中，所述AAV是AAV1。在某些实施方案中，所述AAV是AAV2。在某些实施方案中，所述AAV是AAV5。在某些实施方案中，所述AAV是AAV6。在某些实施方案中，所述AAV是AAV8。在某些实施方案中，所述AAV是AAV9。在某些实施方案中，所述AAV是AAVrh10。

在某些实施方案中，所述AAV衣壳与以下任何参考AAV血清型衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3等具有至少80%的同源性，例如，与AAV1衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如，与AAV2衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如，与AAV3衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如，与AAV4衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如，与AAV5衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如，与AAV6衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如，与AAV7衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如，与AAV8衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如，与AAV9衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如，与AAVrh10衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如，与AAVrh74衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3。

在某些实施方案中，所述AAV衣壳与以下任何参考AAV血清型衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3等具有100%的同源性，例如，与AAV1衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如，与AAV2衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如，与AAV3衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如，与AAV4衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如，与AAV5衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如，与AAV6衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如，与AAV7衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如，与AAV8衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如，与AAV9衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如，与AAVrh10衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3，或例如，与AAVrh74衣壳蛋白VP1、VP2和/或VP3。

本发明提供了包含本文所述的核酸、表达盒、载体或双链的非人动物。

本发明提供了长80-4000个核苷酸的分离的核酸，其包含编码人工初级miRNA转录物(pri-miRNA)的核酸，其由以下部分组成，依位置顺序：5′-侧翼区、非引导区、环区、引导区和3′-侧翼区，其中所述引导区由SEQ ID NO: 37(miHDss3)、SEQ ID NO:6(miHDS1v5U)或SEQ ID NO:7(miHDS1v6A)组成，并且所述非引导区与所述引导区至少80%互补。

本发明提供了分离的核酸，其由Pri-miHDS1v5U(SEQ ID NO:8)、Pri-miHDS1v6A(SEQ ID NO:9)、Pre-miHDS1v5U(SEQ ID NO:10)或Pre-miHDS1v6A(SEQ ID NO:11)组成。在一个实施方案中，全长miHDS1(SEQ ID NO:12)具有如下序列：

本发明提供了分离的RNA双链，其包含核酸引导区和核酸非引导区，其中所述引导区是SEQ ID NO: 37(miHDss3)、SEQ ID NO:6(miHDS1v5U)或SEQ ID NO:7(miHDS1v6A)，并且所述非引导区与所述引导区至少80%互补。在某些实施方案中，所述分离的RNA双链长19-30个碱基对。某些实施方案包括编码上述分离的核酸的表达盒。在某些实施方案中，所述表达盒还包含标志物基因。

本发明提供了通过向个体施用本文所述的核酸、表达盒、载体或组合物来诱导RNA干扰的方法。

本发明提供了含有U6启动子的载体，所述U6启动子可操作地连接至编码miRNA的核酸。本发明的构建体的预测的转录起始位点不同于研究人员过去所使用的那些。在本发明的某些实施方案中，U6miRNA具有延长的5′端。如果类似于之前基于CMV的策略而将所述5′端截短，则沉默功效严重减弱。本发明还提供了改善的侧翼序列，其相对于天然的miR-30侧翼序列具有改善的功效。使用本发明的miRNA策略似乎缓解了与传统shRNA方法相关的毒性。miRNA策略通常不像U6shRNA方法那样生成过量的RNAi。

如本文所用，术语“茎序列”是与同一分子中另一序列互补的序列，其中这两条互补链退火以形成双链（例如，所述非引导区和引导区）。所形成的双链彼此可能完全互补或可能不完全互补，如99%、98%、97%、96%、95,%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、75%或70%互补。另外，在某些实施方案中，一条链可能比另一条链含有更多的核苷酸，使得能够形成侧环。

本发明还提供了含有本文所述的表达盒的载体。合适的载体的实例包括腺病毒载体、慢病毒载体、腺相关病毒（AAV）载体、脊髓灰质炎病毒载体、单纯疱疹病毒（HSV）载体或小鼠莫洛尼基（Maloney-based）病毒载体。在一个实施方案中，所述载体是腺相关病毒载体。这些盒和载体可被包含在细胞如哺乳动物细胞中。非人哺乳动物可含有所述盒或载体。

本发明提供了含有本文所述的核酸分子、表达盒或载体的细胞（如哺乳动物细胞）。本发明还提供了含有本文所述的核酸分子、表达盒或载体的非人哺乳动物。

本发明提供了如本文所述的核酸、表达盒、载体或组合物，用于治疗，如用于治疗神经退行性疾病。

本发明提供了分离的RNAi分子，其含有在3′端具有突出端的微RNA。在某些实施方案中，所述突出端是2至5个核苷酸的重复序列。在某些实施方案中，所述突出端是UU(SEQID NO:24)、UUU(SEQ ID NO:25)、UUUU(SEQ ID NO:26)、CUU(SEQ ID NO:27)、CUUU(SEQ IDNO:28)或CUUUU(SEQ ID NO:29)序列。在某些实施方案中，所述微RNA是天然存在的微RNA。在某些实施方案中，微RNA是人工微RNA。在某些实施方案中，所述RNAi分子产生降低水平的脱靶毒性。

本发明提供了通过向个体施用如本文所述的核酸、表达盒、载体或组合物来诱导低毒性RNA干扰的方法。在某些实施方案中，所述表达盒含有polII启动子。

本发明提供了通过向个体施用编码polII启动子的表达盒来诱导低毒性RNA干扰的方法，所述表达盒可操作地连接至编码miRNA的核酸。在某些实施方案中，所述miRNA包含2或3个核苷酸的5′或3′-突出端。在某些实施方案中，所述miRNA包含2个核苷酸的3′-突出端。在某些实施方案中，所述miRNA是人工miRNA。

本发明提供了治疗患有亨廷顿氏病的个体的方法，其通过向所述个体施用如本文所述的核酸、表达盒、载体或组合物从而治疗亨廷顿氏病。

本发明提供了在细胞中抑制亨廷顿蛋白积聚的方法，其通过向所述细胞中引入一定量的本文所述的核酸分子（例如，核糖核酸(RNA)）而实现，所述量足以抑制亨廷顿蛋白在该细胞中积聚。在某些实施方案中，所述亨廷顿蛋白的积聚被抑制至少10%。在某些实施方案中，所述亨廷顿蛋白的积聚被抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%。在某些实施方案中，对所述蛋白积聚的抑制是以足以引起治疗效果（例如，减少缠结形成）的量实现的。

本发明提供了在细胞中预防突变型亨廷顿蛋白的细胞毒性作用的方法，其通过向所述细胞中引入一定量的本文所述的核酸分子（例如，核糖核酸(RNA)）而实现，所述量足以抑制亨廷顿蛋白的积聚。在某些实施方案中，所述核酸分子例如在神经元细胞中预防亨廷顿蛋白的细胞毒性作用。

本发明提供了在细胞中抑制亨廷顿蛋白基因表达的方法，其通过向所述细胞中引入一定量的本文所述的核酸分子（例如，核糖核酸(RNA)）而实现，所述量足以抑制亨廷顿蛋白的表达，并且其中所述RNA抑制所述亨廷顿蛋白基因的表达。在某些实施方案中，亨廷顿蛋白被抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%。

本发明提供了在哺乳动物（例如，人或非人哺乳动物）中抑制亨廷顿蛋白基因表达的方法，其通过如下实现：(a) 提供含有神经元细胞的哺乳动物，其中所述神经元细胞含有所述亨廷顿蛋白基因并且所述神经元细胞容易受RNA干扰的影响，并且所述亨廷顿蛋白基因在所述神经元细胞中表达；以及 (b) 使所述哺乳动物与本文所述的核糖核酸(RNA)或载体接触，从而抑制所述亨廷顿蛋白基因的表达。在某些实施方案中，所述亨廷顿蛋白的积聚被抑制至少10%。在某些实施方案中，亨廷顿蛋白被抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%。在某些实施方案中，所述细胞位于哺乳动物体内。

本发明提供了包含启动子和微RNA(miRNA)穿梭的病毒载体，其含有特异于靶序列的嵌入siRNA。在某些实施方案中，所述启动子是诱导型启动子。在某些实施方案中，所述载体是腺病毒载体、慢病毒载体、腺相关病毒（AAV）载体、脊髓灰质炎病毒载体、HSV载体或小鼠马洛尼基病毒载体。在某些实施方案中，所述靶序列是与亨廷顿氏病相关的序列。所述靶序列，在某些实施方案中，是编码亨廷顿蛋白的序列。

本发明提供了在有需要的哺乳动物中预防神经退行性疾病的细胞毒性作用的方法，其通过向细胞中引入一定量的本文所述的编码miRNA的载体而实现，所述量足以抑制与亨廷顿氏病相关的蛋白质的积聚，并且其中所述RNA预防亨廷顿氏病（也称为HD，而所涉及的蛋白质是亨廷顿蛋白，也称为htt）的细胞毒性作用。

本发明还提供了在有需要的哺乳动物中抑制与亨廷顿氏病相关的蛋白质的表达的方法，其通过向细胞中引入一定量的本文所述的编码miRNA的载体而实现，所述量足以抑制所述亨廷顿蛋白的表达，其中所述RNA抑制所述亨廷顿蛋白的表达。所述亨廷顿蛋白被抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%。

本发明涉及这样的化合物、组合物和方法，其可用于使用短干扰核酸(siRNA)分子调节亨廷顿氏病基因表达。本发明还涉及这样的化合物、组合物和方法，其可用于使用小核酸分子通过RNA干扰(RNAi)调节涉及HD基因表达和/或活性的途径的其它基因的表达和活性。具体地讲，本发明涉及用于调节HD基因表达的小核酸分子（如短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)和短发夹RNA(shRNA)分子）及方法。本发明的siRNA分子可以是，例如，化学合成的、从载体表达的或酶促合成的。

如本文所用，当权利要求指示“对应的”RNA时，其意指与DNA具有相同序列的RNA，不同之处在于尿嘧啶取代了胸腺嘧啶。

本发明还提供了基本上沉默目标靶基因或目标基因的靶向等位基因以提供治疗效果的方法。如本文所用，术语“基本上沉默”或“被基本上沉默”指代降低、减少或抑制靶基因或靶等位基因的表达至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%至100%。如本文所用，术语“治疗效果”指代：疾病状态的相关异常的改变，包括病理和行为缺陷；疾病状态的进展时间的改变；疾病症状的减少、减轻或改变；或患者生活质量的改善。治疗效果可以由医生定量测量或由具有siRNA所靶向的疾病状态的患者定性测量。在某些实施方案中，其中突变型和野生型等位基因被基本上沉默，术语治疗效果定义了这样的状况，其中沉默该野生型等位基因的表达对正常功能没有有害或不利影响，使得该患者将没有治疗效果。

在一个实施方案中，本发明涉及用于在个体或生物体中治疗或预防亨廷顿氏病的方法，其包括：在合适条件下使所述个体或生物体与本发明的siRNA接触以调节所述个体或生物体中HD基因的表达，从而可以实现对亨廷顿氏病的治疗或预防。在一个实施方案中，所述HD基因靶标包括两种HD等位基因（例如，包含三核苷酸(CAG)重复扩展序列的等位基因和野生型等位基因）。本发明的siRNA分子可以从如本文所述或本领域已知另外的载体表达以靶向所述个体或生物体中适当的组织或细胞。

在一个实施方案中，本发明涉及用于在个体或生物体中治疗或预防亨廷顿氏病的方法，其包括：经由向相关组织或细胞如脑细胞和组织（例如，基底节、纹状体或皮质）局部施用而使所述个体或生物体与本发明的siRNA分子接触，例如，通过向相关细胞（例如，基底节、纹状体或皮质）施用提供本发明的siRNA分子的本发明的载体或表达盒。在一个实施方案中，通过对脑部立体定位或对流增强递送而向所述个体或生物体施用所述siRNA、载体或表达盒。例如，美国专利No.5,720,720提供了可用于对脑部立体定位和对流增强递送试剂的方法和装置。此类方法和装置可以容易地用于将本发明的siRNA、载体或表达盒递送至个体或生物体，而美国专利No.5,720,720以引用方式全文并入本文。美国专利申请No.2002/0141980、2002/0114780和2002/0187127均提供了可用于立体定位和对流增强递送试剂的方法和装置，所述方法和装置可以容易地适用于将本发明的siRNA、载体或表达盒递送至个体或生物体，而这些专利申请均以引用方式全文并入本文。可用于将本发明的siRNA、载体或表达盒递送至个体或生物体的具体装置在例如美国专利申请No.2004/0162255中有述，其以引用方式全文并入本文。本发明的siRNA分子可以从如本文所述或本领域已知另外的载体表达以靶向所述个体或生物体中适当的组织或细胞。

病毒载体的递送方法包括但不限于：动脉内、肌内、静脉内、鼻内以及口腔途径。通常，可使用体内或体外转导技术将AAV病毒粒子引入到CNS的细胞中。如果经体外转导，则所需的受体细胞将从个体中被移除，用AAV病毒粒子转导并被重新引入到该个体中。作为另外一种选择，可以使用同种或异种细胞，其中这些细胞将不会在该个体中生成不恰当的免疫应答。

已经描述了合适的用于将经转导的细胞递送和引入个体中的方法。例如，细胞可以通过如下进行体外转导：例如，在适当的培养液中将重组AAV病毒粒子与CNS细胞结合，并筛选那些携带目标DNA的细胞，可以使用常规技术如Southern印迹和/或PCR或通过使用选择标志物进行筛选。随后可以将经转导的细胞配制成药物组合物（详述于下），并通过各种技术将所述组合物引入个体中，如通过移植、肌内注射、静脉内注射、皮下注射和腹腔内注射。

对于体内递送而言，在一个实施方案中，AAV病毒粒子被配制成药物组合物并将通常肠胃外施用，例如，通过直接肌内注射入骨骼肌或心肌或通过注射入CNS。

在一个实施方案中，本发明的病毒载体经由对流增强递送（CED）系统被递送至CNS，该系统可以将病毒载体例如AAV有效地递送至个体脑部的大片区域（例如，纹状体和/或皮质）。如下详述并举例说明，这些方法适用于各种病毒载体，例如携带治疗基因（例如，siRNA）的AAV载体。

任何对流增强递送装置均可适用于递送病毒载体。在一个实施方案中，所述装置是渗透泵或输液泵。渗透泵和输液泵均可从多个供应商处商购获得，例如AlzetCorporation、Hamilton Corporation、Aiza, Inc.(Palo Alto, Calif.)。通常，病毒载体经由CED装置递送如下。将导管、套管或其它注射装置插入所选个体的CNS组织中。根据本文的教导，本领域技术人员可以容易地确定CNS的哪个一般区域是适当的靶标。例如，当递送编码治疗基因的AAV载体以治疗HD时，纹状体是适合靶向的脑区。立体定位作图和定位装置可得自例如ASI Instruments, Warren, Mich.。还可通过使用由CT和/或MRI成像获得的个体脑部解剖图进行定位以帮助将注射装置引导至所选靶标。此外，因为实施本文所述的方法可以使得相对大的脑区吸收病毒载体，所以需要更少的输液套管。由于手术并发症与穿刺的次数有关，本文所述的方法还会减轻见于常规递送技术中的副作用。

在一个实施方案中，药物组合物将包含足够的遗传物质以产生治疗有效量的目标siRNA，即，所述量足以减轻或改善所考虑的疾病状态的症状或足以赋予所需的益处。所述药物组合物还可含有药学上可接受的赋形剂。此类赋形剂包括任何药物试剂，其自身不会诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，并且其可被施用而无异常毒性。药学上可接受的赋形剂包括但不限于：山梨糖醇、Tween80以及液体如水、盐水、甘油和乙醇。其中可以包括药学上可接受的盐，例如，矿物酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸盐如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。另外，此类媒介物中可含有辅料，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等。有关药学上可接受的赋形剂的全面讨论可参见REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub.Co., N.J.1991)。

正如根据本说明书的教导而对于本领域技术人员显而易见的是，必须添加的病毒载体的有效量可以凭经验确定。可以在整个治疗过程中连续地或间歇地以一个剂量施用。确定最有效的施用方式和剂量的方法是本领域技术人员熟知的，并且将随病毒载体、治疗组成、靶细胞和接受治疗的个体而变化。可以采用由主治医生选择的剂量水平和模式进行单次和多次施用。

应当理解，可以通过所递送的病毒载体表达不止一个转基因。作为另外一种选择，各自表达一个或多个不同转基因的单独的载体也可以如本文所述被递送至CNS。此外，还预期将由本发明的方法递送的病毒载体与其它合适的组合物和疗法结合。

本发明还提供了如本文所述的miRNA或shRNA、表达盒和/或载体，用于医学治疗或诊断。

本发明提供了如本文所述的miRNA或shRNA、表达盒和/或载体在制备药物上的用途，所述药物可用于在动物中治疗适合RNAi的状况，例如可用于治疗亨廷顿氏病。

本发明还提供了本发明的核酸、表达盒、载体或组合物，用于治疗。

本发明还提供了本发明的核酸、表达盒、载体或组合物，用于治疗，例如，用于预防性或治疗性治疗亨廷顿氏病。

在某些实施方案中，所述试剂被施用至个体的脑部。在某些实施方案中，所述试剂被直接施用至脑部或经由血液施用。在某些实施方案中，颅内施用所述治疗剂。在某些实施方案中，所述治疗剂被施用至个体的枕大池、纹状体、皮质或脑室、蛛网膜下腔间隙和/或鞘内间隙。在某些实施方案中，所述个体是人。在某些实施方案中，所述个体是非人哺乳动物。在某些实施方案中，所述试剂被注射至脑部的1-5个位置，如脑部的一、二或三个位置。在某些实施方案中，所述方法还包括另外施用rAAV至非人灵长类的脑室、蛛网膜下腔间隙和/或鞘内间隙。更具体地讲，本发明提供了将核酸递送至与循环CSF接触的细胞（如室管膜细胞、软脑膜细胞、脑膜细胞、脑血管内皮细胞）的方法，其包括：向所述细胞施用含有载体的AAV颗粒，所述载体包含插入到一对AAV末端反向重复序列之间的核酸，从而将所述核酸递送至所述细胞。

本发明还提供了使细胞与本文所述的核酸、表达盒、载体或双链接触从而治疗亨廷顿氏病的方法，其中所述细胞是室管膜细胞、软脑膜细胞、内皮细胞、脑室细胞和/或脑膜细胞。

附图简述

图1A-1G: 过表达miHDS1引起小鼠脑部的不良反应。a) miHDS1与小鼠和人亨廷顿蛋白mRNA的配对(miHDS1是SEQ ID NO:1；小鼠Htt是SEQ ID NO:2；而人Htt是SEQ ID NO:3)。b)含有miHDS1和miCtl表达盒的AAV/填充序列穿梭载体的图示。c) 评价miHDS1体内耐受性的实验策略。d) 来自注射了miHDS1(n=13)或miCtl(n=11)的小鼠的转杆数据。数据显示为在7周（基础）、16周和24周时所测试的连续四天中每只小鼠/天的最好的两次试验的平均值。延迟掉落显示为平均值±s.e.m.。(*p>0.05，在指定时间的非配对t检验)。e) 注射了miHDS1和miCtl的小鼠的重量增加分析。数据显示为在7周时相对于基础时间点的重量增加。f) 注射了miHDs1和miCtl的小鼠的抱握分析。数据显示为在指定的时间点表现出抱握的小鼠的百分比和数量。g) U6/miHDS1载体的链偏好。测量报告基因构建体的萤光素酶活性来评估链偏好，所述报告基因构建体含有与乘客（有义）或引导（反义）miHDS1链互补的靶序列。结果是3次不同实验(n=4/组)中的代表性实验。数据显示为相对于用miCtl转染的细胞的平均值±sem，并证实，miHDS1优先装载引导miHDS1链。

图2A-2D: miHDS1脱靶基因的表征。a) 在预测的miHDS1脱靶基因的25百分位数内的基因的列表。显示的信息：基因ID、参考序列、miRNA结合位点类型、核苷酸3’UTR位置、预测的靶扫描背景分数、由PITA算法预测的ddG分数。b) 在预测的脱靶基因上的miHDS1:mRNA结合位点的图示(miHDS1是SEQ ID NO: 1)(Bcl2是SEQ ID NO:31；Smad9是SEQ ID NO:32；Sdf4是SEQ ID NO:33；Map2k6是SEQ ID No:34)。c) miHDS1注射后4个月的纹状体样品中Htt、Bcl2、Smad9、Sdf4和Map2k6 mRNA水平的定量Q-PCR分析。所有样品均针对ß-肌动蛋白进行了标准化，并且结果是相对于注射了miCtl的小鼠的平均值±sem。(n=6只小鼠/组；*p<0.05, **p<0.01, Mann Whitney检验) d) miHDS1电穿孔后的SthdhQ7细胞中Htt、Bcl2、Smad9、Sdf4和Map2k6 mRNA水平的定量Q-PCR分析。所有样品均针对ß-肌动蛋白进行了标准化，并且结果是相对于用含有U6启动子或miCtl表达盒的质粒电穿孔的细胞的平均值±sem。(n=8个电穿孔的孔；**p<0.01, 单因素ANOVA后接Bonferroni事后检验)

图3A-3C: 生成单核苷酸miHDS1种变体。a) miHDS1序列的种区内单核苷酸修饰的位置的图示(Pri-miHDS1是SEQ ID NO:4；Pre-miHDS1是SEQ ID NO:5；RISC装载的miRNA序列是SEQ ID NO:1)。b) 对SPS分数的影响取决于miHDS1脱靶上核苷酸错配的位置。c) 图表显示了miHDS1和miHDS1-变体的预测的脱靶基因的数量(总体以及纹状体特异的)，以及共享的脱靶的数量。

图4A-4I: 单核苷酸miHDS1种变体的沉默功效。a) 用U6/miHDS1表达盒转染的HEK293细胞中hHttmRNA水平的定量分析。在转染后24小时收集总RNA，并通过Q-PCR测定hHtt水平。所有样品均针对ß-肌动蛋白进行了标准化，并且结果是相对于用miHDS1转染的细胞的平均值±sem(n=12个孔；**p<0.01, ***p<0.001, 单因素ANOVA后接Bonferroni事后检验)。b) 将miHDS1、miHDS1v5u、miHDS1v6a和miHDS1v7u表达盒转染到人HEK293细胞中，并在转染后48小时测定内源性亨廷顿蛋白水平。miCtl被用作无沉默对照而β-连环蛋白充当装载对照。c) 在miHDS1、miHDS1v5u、miHDS1v6a和miHDS1v7u转染后48小时对hHtt蛋白水平进行定量。数据是相对于用miCtl转染的细胞的平均值±sem(n=6, 三次不同的western印迹，* p<0.01, Mann Whitney检验)。d) miHDS1v5u和miHDS1v6a与小鼠亨廷顿蛋白mRNA的配对(miHDS1v5U是SEQ ID NO:6；小鼠Htt是SEQ ID NO:2；miHDS1v6A是SEQ ID NO:7)。e)将miHDS1、miHDS1v5u和miHDS1v6a表达盒电穿孔到小鼠SthdhQ7细胞中，并在电穿孔48小时后测定内源性亨廷顿蛋白水平。miCtl被用作无沉默对照而β-连环蛋白充当装载对照。f)在miHDS1、miHDS1v5u和miHDS1v6a电穿孔后48小时对mHtt蛋白水平进行定量。数据是相对于用miCtl转染的细胞的平均值±sem(n=6, 三次不同的western印迹，*p<0.01, MannWhitney检验)。g-h-i) 用U6/miHDS1、U6/miHDS1v5u和U6/miHDS1v6a表达盒电穿孔的SthdhQ7细胞中mHtt、Bcl2和Smad9mRNA水平的定量分析。在电穿孔后24小时收集总RNA，并通过Q-PCR测定mHtt、Bcl2和Smad9水平。所有样品均针对ß-肌动蛋白进行了标准化，并且结果是相对于用含有启动子和U6/miCtl表达盒的U6转染的细胞的平均值±sem(n=12个孔；#p<0.01, 单因素ANOVA后接Bonferroni事后检验)。

图5A-5F: 生成miHDss1-4序列以靶向人亨廷顿蛋白表达。a)生成了含有miCtl种序列的四种人工miRNA触发序列，允许种区与所靶向的人Htt mRNA之间的单核苷酸错配。MiHDss1和miHDss4结合位点位于3’UTR，而miHDss2和3分别结合hHtt mRNA的外显子7-8的交界和外显子33。b) miRNA/mRNA在miHDss1-4与人亨廷顿蛋白mRNA之间结合配对。单核苷酸错配分别存在于miHDss1、2、3和4序列各自的种区位置7、6、5和4处(miHDss1是SEQ IDNO:35；miHDss2是SEQ ID NO:36；miHDss3是SEQ ID NO:37；miHDss4是SEQ ID NO:38)。图还按出现顺序分别公开了SEQ ID NOS 40-43。c) 用U6/miHDss1-4表达盒转染的HEK293细胞中hHttmRNA水平的定量分析。在转染后24小时收集总RNA，并通过Q-PCR测定hHtt水平。所有样品均针对ß-肌动蛋白进行了标准化，并且结果是相对于用miCtl转染的细胞的平均值±sem(n=8个孔；*p<0.001，单因素ANOVA后接Bonferroni事后检验)。d) 将miHDss3表达盒转染到人HEK293细胞中，并在转染后48小时测定内源性亨廷顿蛋白水平。miCtl被用作无沉默对照而β-连环蛋白充当装载对照。e) 在miHDss3转染后48小时对hHtt蛋白水平进行定量。数据是相对于用miCtl转染的细胞的平均值±sem(n=6，两次不同的western印迹，*p<0.01,Mann Whitney检验)。f) 使用PITA算法确定miHDss3(SEQ ID NO:37)和miCtl(SEQ ID No:39)在预测的非预期mRNA结合位点上的结合稳定性。miCtl和miHDss3的种区以粗体标记。数据显示为各个脱靶基因相对于miCtl或miHDss3的ddG(Kcal/mol)分数。我们的预测表明，相比miCtl，miHDss3的3’序列提供更好的脱靶基因结合稳定性。

图6A-6E: miHDS1-变体和miHDss3序列的体内耐受性。a) 评价新miRNA序列设计的体内耐受性的实验策略。b) 含有miHDS1变体和miHDss3表达盒的AAV/填充序列穿梭载体的图示。c) 来自注射了制剂缓冲液(n=7)、miCtl(n=8)、miHDS1(n=9)、miHDS1v5u(n=10)、miHDS1v6a(n=11)或miHDss3(n=10)的小鼠的转杆数据。数据显示为在7周（基础）、16周和24周时所测试的连续四天中每只小鼠/天的最好的两次试验的平均值。延迟掉落显示为相对于注射了miCtl的小鼠的平均值±s.e.m.。(*p<0.05，单因素ANOVA后接Bonferroni事后检验)。d) 注射了制剂缓冲液、miCtl、miHDS1、miHDS1v5u、miHDS1v6a或miHDss3的小鼠的重量增加分析。数据显示为在7周时相对于基础时间点的重量增加。e) 注射了miHDs1和miCtl的小鼠的抱握分析。数据显示为在指定的时间点表现出抱握的小鼠的百分比和数量。

发明详述

RNA干扰(RNAi)是由小dsRNA介导的基因调控方法。RNAi被用作研究基因功能的常用生物学工具，并且正在研究其作为治疗手段以治疗各种疾病。RNAi的递送或表达可以通过施用外源性siRNA（瞬时基因沉默）或通过施用表达茎-环RNA的载体（持续基因沉默）。RNAi的绝对特异性值得怀疑。必须解决的问题包括：对dsRNA(IFN-b、PKR、OAS1)的细胞应答和由于RNAi机制的饱和或经由与非预期mRNA的部分互补而造成的脱靶效应。需要不断优化RNAi载体并潜在地开发组织特性性且受调控的表达策略。

使用RNAi作为治疗剂取决于对若干因素的阐明，这些因素包括：i) RNAi构建体的递送和持续性，用于有效沉默靶基因序列；ii) siRNA的设计，以实现对靶序列的有效下调或基因抑制，和 iii) 最佳siRNA表达系统(shRNA或miRNA)，用于递送治疗性siRNA。虽然许多研究已经评价了以化学合成的寡核苷酸结构递送的RNAi在许多临床状况和疾病状态如亨廷顿氏病上的用途，但是据信，为了实现治疗益处，需要通过内源生产表达的siRNA而实现治疗性siRNA的长期和/或持续的高水平表达。迄今为止，已经比较了基于shRNA和基于人工miRNA的策略，得到矛盾的结果。由于对dsRNA (IFN-b、PKR、OAS1)的细胞应答、RNAi机制的饱和或经由与非预期mRNA部分互补而沉默脱靶基因所产生的脱靶毒性，使得出于安全性顾虑，表达的RNAi的治疗实用性尚未解决。因此，需要不断优化安全有效的表达的RNAi载体。

shRNA由茎-环结构构成，其被设计为含有5′侧翼区、siRNA区节段、环区、3′siRNA区和3′侧翼区。大多数RNAi表达策略利用由基于polIII的强启动子驱动的短发夹RNA(shRNA)。许多shRNA已经表现出体外及体内有效下调靶序列，然而，一些表现出有效下调靶基因的shRNA也发现具有体内毒性。新近发现的替代方法是使用人工miRNA(pri-miRNA支架穿梭siRNA序列)作为RNAi载体。人工miRNA更天然类似于内源性RNAi底物并且更适合Pol-II转录(例如，允许组织特异性表达RNAi)和多顺反子策略(例如，允许递送多个siRNA序列)。迄今为止，基于miRNA的载体系统的功效相比shRNA始终混杂着矛盾的结果。重要的是，这两种系统所产生的脱靶毒性的问题尚未得到评价。

开发表达的siRNA的重要考量是用所述表达的siRNA构建体向宿主细胞“给药”的概念。表达的siRNA的“给药”，在本发明的上下文中，指代并且可以取决于递送媒介物(例如，病毒的或非病毒的)、递送媒介物的相对量或浓度、以及用于驱动siRNA序列表达的启动子的强度和特异性。

本发明人已经开发了人工miRNA穿梭载体，其并入了包含在shRNA中的茎环序列并且修饰天然存在的人微RNA 30序列或mi30序列用于运送这些小干扰RNA(siRNA)序列。参见，例如，PCT公布WO 2008/150897，其以引用方式并入本文。

本发明人已经开发了用于治疗亨廷顿氏病的人工miRNA、pri-miRNA、pre-miRNA、表达载体、双链及方法。参见，例如，PCT公布WO 2012/109667，其以引用方式并入本文。

用于RNAi的微RNA穿梭

miRNA是小的细胞RNA(~22nt)，其由前体茎环转录物加工而成。已知的miRNA茎环可以经修饰以含有特异于目标基因的RNAi序列。miRNA分子可以较shRNA分子优选，因为miRNA是内源表达的。因此，miRNA分子不太可能诱导dsRNA-反应性干扰素途径，相比shRNA，其被更高效地加工，并且其已经被证明80%更有效地沉默。

相比shRNA分子，miRNA分子的启动子作用也不同。shRNA的组织特异性诱导型表达涉及针对转录起始位点的polII启动子的截短。相比之下，miRNA可以从任何polII启动子表达，因为转录起始和终止位点可以是相对随意的。

治疗亨廷顿氏病

主要的多谷氨酰胺扩增疾病，包括1型脊髓小脑共济失调(SCA1)和亨廷顿氏病(HD)，是进行性、无法治疗的神经退行性疾病。在诱导型小鼠模型HD中，抑制突变型等位基因表达改善了疾病表型。因此，经设计以抑制疾病基因表达的疗法将是有益的。本发明提供了体内使用RNAi以治疗亨廷顿氏病的方法。如本文所用的“治疗”指代改善疾病或状况的至少一种症状、治愈疾病或状况和/或预防其发展。

在本发明的某些实施方案中，采用RNAi分子以抑制靶基因的表达。所谓“抑制表达”意指减少、减弱或抑制靶基因的表达。靶基因的表达可经由“基因沉默”而抑制。基因沉默指代抑制基因表达，例如，转基因、异源基因和/或内源基因表达，其可通过影响转录的方法和/或通过影响转录后机制的方法来介导。在一些实施方案中，当RNAi分子启动经由RNA干扰以序列特异性方式抑制或降解从目标基因转录的mRNA，从而阻止该基因产物的翻译时，发生基因沉默。

本文涉及的siRNA意在包括shRNA及其它小RNA，其可以或能够例如经由RNA干扰而调节靶基因（例如，HD基因）的表达。此类小RNA包括但不限于shRNA和微RNA(miRNAs)。

本文公开了经由RNAi而导致靶基因基本沉默的策略。使用此策略导致靶基因的体外和体内表达明显减弱。此策略可用于减少靶基因表达以建模生物学过程或提供针对人类疾病的疗法。例如，此策略可以应用于亨廷顿氏病。如本文所用，术语“基本沉默”意指由于所引入siRNA的存在而抑制和/或降解靶基因的mRNA，使得相比当不存在所述siRNA时所观察到的表达水平，该靶基因的表达减少约10%至100%。通常，当基因被基本上沉默时，相比当不存在所述siRNA时，其将具有至少40%、50%、60%至70%，例如71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%至79%，通常至少80%，例如81%-84%、至少85%，例如86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100%减少的表达。如本文所用，术语“基本正常的活性”意指当siRNA尚未被引入细胞中时基因的表达水平。

亨廷顿氏病(HD)是基于siRNA的疗法的强力候选者。HD是由在疾病蛋白质中编码polyQ的CAG重复序列扩增引起的。PolyQ扩增赋予了突变型蛋白质主要的毒性特性，所述毒性特性与该疾病蛋白质在神经元中的异常积聚相关。HD是进行性、最终致命的疾病，其通常始于成年期。CAG重复序列/polyQ结构域的扩增赋予了所编码蛋白质主要的毒性特性。因此，作为治疗策略，在细胞死亡之前努力降低突变基因产物的表达可对患者高度有利。

RNA干扰(RNAi)分子

“RNA干扰”、“RNAi”、“小干扰RNA”或“短干扰RNA”或“siRNA”或“短发夹RNA”或“shRNA”分子或“miRNA”是RNA双链核苷酸，其靶向目标核酸序列，例如，亨廷顿蛋白(htt)。如本文所用，术语“siRNA”是通用术语，其涵盖了shRNA和miRNA的子集。“RNA双链”指代由RNA分子的两个区之间的互补配对而形成的结构。siRNA“靶向”基因，其中siRNA的双链部分的核苷酸序列与靶基因的核苷酸序列互补。在某些实施方案中，所述siRNA靶向编码共济失调蛋白-1（ataxin-1）或亨廷顿蛋白的序列。在一些实施方案中，siRNA双链的长度小于30个碱基对。在一些实施方案中，所述双链可以长29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个碱基对。在一些实施方案中，所述双链的长度为19至25个碱基对。在某些实施方案中，所述双链的长度为19或21个碱基对。所述siRNA的RNA双链部分可以是发夹结构的一部分。除了所述双链部分之外，所述发夹结构可含有位于形成所述双链的两个序列之间的环部分。所述环的长度可以是变化的。在一些实施方案中，所述环的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在某些实施方案中，所述环长18个核苷酸。所述发夹结构还可以含有3′和/或5′突出端部分。在一些实施方案中，所述突出端是长0、1、2、3、4或5个核苷酸的3′和/或5′突出端。

“shRNA”的转录单元由通过非配对核苷酸的环连接的有义和反义序列构成。shRNA由输出蛋白-5从细胞核输出，并且一旦处于细胞质中，即由Dicer加工以生成功能性siRNA。“miRNA”茎-环由通过非配对核苷酸的环连接的有义和反义序列构成，其通常表达为更大的初级转录物(pri-miRNA)的一部分，其由Drosha-DGCR8复合体剪切而生成被称为pre-miRNA的中间体，该中间体随后由输出蛋白-5从细胞核输出，并且一旦处于细胞质中，即由Dicer加工以生成功能性siRNA。“人工miRNA”或“人工miRNA穿梭载体”，如本文所互换使用，指代曾经具有双链茎环区（至少约9-20个核苷酸）的初级miRNA转录物，所述双链茎环区经由Drosha和Dicer加工而替换以针对靶基因的siRNA序列，同时在所述茎环内保留有效Drosha加工所必需的结构元件。术语“人工的”基于这样的事实：侧翼序列（~35个上游核苷酸和~40个下游核苷酸）产生于siRNA的多个克隆位点内的限制性内切酶位点。如本文所用，术语“miRNA”同时涵盖了天然存在的miRNA序列以及人工生成的miRNA穿梭载体。

siRNA可以由核酸序列编码，并且所述核酸序列还可以包含启动子。所述核酸序列还可以包含多腺苷酸化信号。在一些实施方案中，所述多腺苷酸化信号是合成的最小多腺苷酸化信号或六T序列。

“脱靶毒性”指代表达或含有siRNA的宿主细胞的有害的、不期望的或非预期的表型变化。脱靶毒性可导致在细胞或生物体水平上丧失所需功能、得到非期望功能、或甚至死亡。脱靶毒性可在siRNA表达时立刻发生或可随时间推移逐渐发生。脱靶毒性可作为表达siRNA的直接结果而发生或可作为诱导针对表达该siRNA的细胞的宿主免疫应答的结果而发生。不希望受理论的约束，脱靶毒性被认为产生于细胞内高水平或过多的RNAi底物。这些过多或过表达的RNAi底物（包括但不限于pre-RNAi或pri-RNAi底物以及过多的成熟反义-RNA）可能竞争内源RNAi机制，因而破坏天然miRNA的生物发生和功能。脱靶毒性还可能产生于由于序列的部分互补造成的沉默非预期mRNA（即，脱靶）的增加的可能性。脱靶毒性的发生还可能是由于对非引导区的不正确的链偏好，使得优先于RNAi的靶向或引导区而装配非引导区。脱靶毒性还可能产生于针对dsRNA（包括dsRNA(IFN-b、PKR、OAS1)）的细胞应答的刺激。“降低的脱靶毒性”指代脱靶毒性的降低、减少、消除或减弱，使得治疗效果相比有限或有害的毒性更有利于宿主，其通过持续时间或生活质量的改善或siRNA所靶向的疾病或状况的病征或症状的改善来量度。“有限的脱靶毒性”或“低脱靶毒性”被用于指代对细胞或生物体的非预期的不期望的表型变化，无论是否可检测到，其不排除或超过或限制对用siRNA治疗的宿主的治疗益处并且可被视为所述疗法的“副作用”。降低的或有限的脱靶毒性可通过如下测定或推断：比较体外分析（如siRNA底物水平的Northern印迹或QPCR）或比较等价的shRNA载体与本发明的miRNA穿梭载体的体内作用。

“下调”、“下调技术”指代基因沉默技术，其中靶基因的表达相比引入siRNA之前的基因表达有所减少，其可以导致对靶基因产物生产的抑制。术语“减少的”在本文中用于表明靶基因表达被降低了1-100%。换句话讲，可用于翻译成多肽或蛋白质的RNA的量被最小化。例如，蛋白质的量可减少10、20、30、40、50、60、70、80、90、95或99%。在一些实施方案中，表达减少了约90%（即，相比其中尚未施用siRNA分子的细胞，在细胞中仅观察到约10%的蛋白质的量）。可以通过使用dsRNA或siRNA来指导基因表达的下调。

“RNA干扰(RNAi)”是由siRNA启动的序列特异性、转录后基因沉默的方法。在RNAi过程中，siRNA诱导靶mRNA降解从而导致基因表达的序列特异性抑制。

根据本发明的方法，亨廷顿蛋白的表达可以经由RNAi修饰。例如，可以抑制细胞中亨廷顿蛋白的积聚。术语“抑制”指代减少、降低或消除具体细胞中存在的转录物的数目或量。例如，可以通过RNA干扰(RNAi)抑制细胞中编码亨廷顿蛋白的mRNA的积聚，例如，通过序列特异性双链RNA(dsRNA)，也被称为短干扰RNA(siRNA)，而沉默所述基因。这些siRNA可以是已经杂交在一起的两个单独的RNA分子，或其可能是单个发夹，其中RNA分子的两个部分已经杂交在一起以形成双链。

突变型蛋白质指代由具有突变的基因编码的蛋白质，例如，亨廷顿蛋白中的错义或无义突变。突变型亨廷顿蛋白可能是致病的，即，可能导致与动物体内存在具有一个或两个突变型等位基因的亨廷顿蛋白相关的疾病。

术语“基因”广义地用于指代与生物学功能相关的任何核酸节段。因此，基因包括编码序列和/或其表达所需的调控序列。例如，“基因”指代这样的核酸片段，其表达mRNA、功能性RNA或特定蛋白质，包括调控序列。“基因”还包括非表达DNA节段，其例如形成其它蛋白质的识别序列。“基因”可以得自各种来源，包括从目标来源克隆或从已知或预测的序列信息合成，并且可包括设计成具有所需参数的序列。“等位基因”是占据染色体上给定基因座的基因的若干种可选形式之一。

术语“核酸”指代由单体（核苷酸）构成的单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物，所述单体含有糖、磷酸和碱基（嘌呤或嘧啶）。除非特别限定，否则该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参照核酸相似的结合特性，并且以类似于天然存在的核苷酸的方式被代谢。除非另外指明，否则具体的核酸序列还涵盖其经保守修饰的变体（例如，简并密码子置换）和互补序列以及所明示的序列。具体地讲，简并密码子置换可通过生成如下序列而实现，其中一个或多个选定（或全部）密码子的第三位被混合的碱基和/或脱氧肌苷残基置换。“核酸片段”是给定核酸分子的一部分。

“核苷酸序列”是DNA或RNA聚合物，其可以是单链的或双链的，任选地含有能够掺入到DNA或RNA聚合物中的合成的、非天然的或经改变的核苷酸碱基。

术语“核酸”、“核酸分子”、“核酸片段”、“核酸序列或节段”或“多核苷酸”可互换使用，并且还可与基因、cDNA、基因编码的DNA和RNA互换使用。

本发明涵盖了分离的或基本上纯化的核酸、核酸分子以及含有这些分子的组合物。在本发明的上下文中，“分离的”或“纯化的”DNA分子或RNA分子是脱离其原生环境而存在的DNA分子或RNA分子，并且因此是非天然产物。分离的DNA分子或RNA分子可以纯化形式存在或可存在于非原生环境中，如例如，在转基因宿主细胞中。例如，“分离的”或“纯化的”核酸分子或其生物活性部分基本上不含其它细胞物质或培养基（当通过重组技术生产时），或基本上不含化学前体或其它化学物质（当化学合成时）。在一个实施方案中，“分离的”核酸不含在所述核酸来源的生物体的基因组DNA中天然侧接于该核酸的序列（即，位于所述核酸的5′与3′端的序列）。例如，在各种实施方案中，所述分离的核酸分子可以含有小于约5kb、4 kb、3 kb、2 kb、1 kb、0.5 kb或0.1 kb的核苷酸序列，其在所述核酸来源的细胞的基因组DNA中天然侧接于该核酸分子。本发明还涵盖了本公开的核苷酸序列的片段和变体。所谓“片段”或“部分”意指全长或小于全长的核苷酸序列。

“天然存在的”、“天然的”或“野生型”被用于描述不同于人工产生的、可见于自然界中的对象。例如，这样的蛋白质或核苷酸序列是天然存在的：其存在于生物体（包括病毒）中、可以从天然来源中分离并且尚未在实验室中经过有意的人工修饰。

分子的“变体”是与天然分子的序列基本上类似的序列。对于核苷酸序列而言，变体包括由于遗传密码的简并性而编码与天然蛋白质相同的氨基酸序列的那些序列。天然存在的等位变体是如可以使用分子生物学技术例如聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术识别的那些。变体核苷酸序列还包括合成衍生的核苷酸序列，如例如通过使用定点诱变生成的编码天然蛋白质的那些，以及编码具有氨基酸置换的多肽的那些。通常，本发明的核苷酸序列变体将与天然（内源性）核苷酸序列具有至少40%、50%、60%至70%，例如71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%至79%，通常至少80%，例如81%-84%，至少85%，例如86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%至98%的序列同一性。

“转基因”指代已经通过转化而被引入到基因组中的基因。转基因包括，例如，与待转化的具体细胞的DNA异源或同源的DNA。另外，转基因可包括被插入到非原生生物体中的天然基因，或嵌合基因。

术语“内源性基因”指代处于其在生物体的基因组中的天然位置的天然基因。

术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”在本文中可互换使用。

“野生型”指代存在于自然界中的正常基因或生物体。

“基因组”指代生物体的完整遗传物质。

“载体”被定义为特别包括任何病毒载体以及双链或单链的线性或环形的任何质粒、粘粒、噬菌体或双元载体，其可能是或可能不是自转移或可移动的，并且其可以通过整合进细胞基因组或存在于染色体外（例如，具有复制起点的自主复制质粒）而转化原核或真核宿主。

如本文所用的“表达盒”意指能够指导具体核苷酸序列在合适的宿主细胞中表达的核酸序列，其可包含可操作地连接至目标核苷酸序列的启动子，所述目标核苷酸序列可被可操作地连接至终止信号。编码区通常编码目标功能性RNA，例如siRNA。包含目标核苷酸序列的表达盒可能是嵌合的。所述表达盒也可能是天然存在的，但已经以可用于异源表达的重组形式获得。表达盒中核苷酸序列的表达可能处于组成型启动子或仅当宿主细胞暴露于一些特定刺激时才启动转录的可调控启动子的控制之下。就多细胞生物体而言，所述启动子还可以特异于具体组织或器官或发育阶段。

此类表达盒可以包含连接至目标核苷酸序列的转录起始区。此类表达盒具有多个限制性位点，用于插入目标基因以将其置于调控区的转录调控之下。所述表达盒可另外含有选择标志物基因。

“编码序列”指代编码特定氨基酸序列的DNA或RNA序列。其可构成“不间断的编码序列”，即，缺少内含子，如在cDNA中，或其可包含由合适的剪接位点限定的一个或多个内含子。“内含子”是这样的RNA序列，其被包含在初级转录物中但通过在细胞内切割和重连接RNA而被移除，以产生可以被翻译成蛋白质的成熟的mRNA。

术语“开放阅读框”(ORF)指代编码序列的翻译起始和终止密码子之间的序列。术语“起始密码子”和“终止密码子”指代编码序列中三个相邻核苷酸的单元（“密码子”），其分别指定蛋白质合成（mRNA翻译）的起始和链终止。

“功能性RNA”指代有义RNA、反义RNA、核酶RNA、siRNA或可能不翻译但依然对至少一种细胞加工有影响的其它RNA。

术语“RNA转录物”或“转录物”指代由RNA聚合酶催化的DNA序列的转录所得的产物。当RNA转录物是DNA序列的完全互补拷贝时，其被称为初级转录物，或其可能是衍生自初级转录物的转录后加工的RNA序列并且被称为成熟的RNA。“信使RNA”(mRNA)指代不含内含子并可以由细胞翻译成蛋白质的RNA。

“cDNA”指代与mRNA互补并衍生自mRNA的单链或双链DNA。

“调控序列”是位于编码序列上游(5′非编码序列)、内或下游(3′非编码序列)的核苷酸序列，并且其影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。调控序列包括增强子、启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化信号序列。其包括天然序列和合成序列以及可能是合成与天然序列的组合的序列。正如本文所提到的,术语“合适的调控序列”不限于启动子。然而，可用于本发明的一些合适的调控序列将包括但不限于：组成型启动子、组织特异性启动子、发育特异性启动子、可调控启动子和病毒启动子。

“5′非编码序列”指代位于编码序列的5′(上游)的核苷酸序列。其存在于起始密码子上游的完全加工的mRNA中并可影响将初级转录物加工成mRNA、mRNA稳定性或翻译效率。

“3′非编码序列”指代位于编码序列的3′(下游)的核苷酸序列，并且可包括多腺苷酸化信号序列及编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其它序列。多腺苷酸化信号通常特征在于影响将多腺苷酸区添加至mRNA前体的3′端。

术语“翻译前导序列”指代启动子与编码序列之间的基因的DNA序列部分，其被转录成RNA并存在于翻译起始密码子上游(5′)的完全加工的mRNA中。翻译前导序列可影响将初级转录物加工成mRNA、mRNA稳定性或翻译效率。

术语“成熟的”蛋白质指代经翻译后加工的不含其信号肽的多肽。“前体”蛋白质指代mRNA翻译的初级产物。“信号肽”指代多肽的氨基末端伸出部，其与多肽一同翻译形成前体肽并且是进入分泌途径所必需的。术语“信号序列”指代编码信号肽的核苷酸序列。

“启动子”指代通常位于其编码序列上游(5′)的核苷酸序列，其通过提供RNA聚合酶识别以及正确转录所需的其它因素来指导和/或控制编码序列的表达。“启动子”包括最小启动子，其是由TATA框和用于指定转录起始位点的其它序列构成的短DNA序列，向其上添加调控元件以控制表达。“启动子”还指代包含最小启动子外加调控元件的核苷酸序列，其能够控制编码序列或功能性RNA表达。此类型的启动子序列由近端和更远端的上游元件组成，后者元件通常被称为增强子。因此，“增强子”是可以刺激启动子活性的DNA序列并且可能是启动子的固有元件或被插入以增强启动子水平或组织特异性的异源元件。其能够在两个取向（正常或反转）上操作，并且甚至当被移向启动子的上游或下游时，依然能够起作用。增强子和其它上游启动子元件均结合介导其效应的序列特异性DNA结合蛋白。启动子可整个来源于天然基因，或由来源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或甚至由合成的DNA节段构成。启动子还可含有涉及蛋白因子结合的DNA序列，所述蛋白因子响应于生理或发育条件而控制转录起始的有效性。可用于本发明的启动子的实例包括：小鼠U6 RNA启动子、合成的人H1RNA启动子、SV40、CMV、RSV、RNA聚合酶II及RNA聚合酶III启动子。

“起始位点”是围绕第一个核苷酸的位置，其是被转录序列的一部分，也被定义为位置+1。该基因及其控制区的所有其它序列均相对于此位点进行编号。将下游序列(即，在3′方向上另外的蛋白质编码序列)定为正，而将上游序列(在5′方向上的大多数控制区)定为负。

在缺少上游活化的情况下而失活或具有大幅降低的启动子活性的启动子元件，尤其是TATA元件，被称为“最小或核心启动子”。在存在合适的转录因子的情况下，最小启动子发挥作用以允许转录。因此，“最小或核心启动子”仅由转录起始所需的所有基本元件（例如，TATA框和/或起始子）组成。

“组成型表达”指代使用组成型或受调控的启动子表达。“有条件的”和“受调控表达”指代由受调控的启动子控制的表达。

“可操作地连接”指代单个核酸片段上核酸序列间的关联，使得其中一个序列的功能受到另一个的影响。例如，调控DNA序列被称为“可操作地连接至”编码RNA或多肽的DNA序列或“与之相关联”，如果这两个序列的位置关系使得调控DNA序列影响编码DNA序列的表达（即，编码序列或功能性RNA处于启动子的转录控制之下）。编码序列可以有义或反义取向而被可操作地连接至调控序列。

“表达”指代细胞中内源基因、异源基因或核酸节段、或转基因的转录和/或翻译。例如，就siRNA构建体而言，表达可仅指代该siRNA的转录。另外，表达指代有义(mRNA)或功能性RNA的转录和稳定积聚。表达还可指代蛋白质生产。

“改变的水平”指代转基因细胞或生物体中的表达水平，其不同于正常或未转化细胞或生物体中的表达水平。

“过表达”指代转基因细胞或生物体中的表达水平，其超出正常或未转化细胞或生物体中的表达水平。

“反义抑制”指代产生反义RNA转录物，其能够抑制内源基因或转基因的蛋白质表达。

“转录终止片段”指代含有一种或多种能够终止转录的调控信号（如多腺苷酸化信号序列）的核苷酸序列。实例包括编码胭脂碱合成酶的基因的3′非调控区和二磷酸核酮糖羧化酶的小亚单元。

“翻译终止片段”指代含有一种或多种能够终止翻译的调控信号（如在所有三个框架中的一种或多种终止密码子）的核苷酸序列。在编码序列5′端的起始密码子相邻处或附近插入翻译终止片段将导致没有翻译或不正确的翻译。通过位点特异性重组切除翻译终止片段将在编码序列内留下位点特异性序列，该序列不会妨碍使用起始密码子的正确翻译。

术语“顺式作用序列”和“顺式作用元件”指代这样的DNA或RNA序列，其功能要求其位于同一分子上。复制子上的顺式作用序列的实例是病毒复制起点。

术语“反式作用序列”和“反式作用元件”指代这样的DNA或RNA序列，其功能不要求其位于同一分子上。

“染色体整合的”指代通过共价键将外来基因或核酸构建体整合到宿主DNA中。当基因不是“染色体整合的”时，其可被“瞬时表达”。基因的瞬时表达指代未被整合到宿主染色体中但例如作为自主复制质粒或表达盒的一部分，或作为另一种生物系统如病毒的一部分而独立起作用的基因的表达。

下列术语用于描述两种或更多种核酸或多核苷酸之间的序列关系：(a) “参考序列”、(b) “比较窗口”、(c) “序列同一性”、(d) “序列同一性百分比”和 (e) “基本同一性”。

(a) 如本文所用，“参考序列”是限定的序列，用作序列比较的基础。参考序列可能是指定序列的子集或全部；例如，作为全长cDNA或基因序列的节段，或整个cDNA或基因序列。

(b) 如本文所用，“比较窗口”指代多核苷酸序列的连续且指定的节段，其中相比参考序列(其不包含添加或缺失)，所述比较窗口中的多核苷酸序列可包含添加或缺失(即，空位)，用于这两个序列的最佳比对。通常，比较窗口长至少20个连续核苷酸，并且任选地可以是30、40、50、100或更长。本领域技术人员应当理解，为了避免由于在多核苷酸序列中包含空位而造成的与参考序列的高度相似性，通常会引入空位罚分并且将其从匹配数目中减去。

用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的。因此，确定任意两个序列之间的百分比同一性可以使用数学算法完成。

这些数学算法的计算机实现可以用于比较序列以确定序列同一性。此类实现包括但不限于：PC/Gene程序中的CLUSTAL(可得自Intelligenetics, Mountain View,California)；ALIGN程序(版本2.0)以及Wisconsin Genetics Software Package，版本8中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA(可得自Genetics Computer Group (GCG), 575Science Drive, Madison, Wisconsin, USA)。使用这些程序的比对可以使用默认参数进行。

用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。此算法涉及首先通过在查询序列中识别长度为W的短字串来识别高分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字串比对时，其匹配或满足某个正值阈限分数T。T被称为相邻字串分数阈值。这些最初的相邻字串命中用作种子用于启动搜索以找到包含其的更长的HSP。随后沿着每个序列使字串命中在两个方向上延伸，只要累积的比对分数可以增加。对于核苷酸序列，使用参数M(匹配残基对的奖分；总是 > 0)和N(错配残基的罚分；总是 < 0)计算累积分数。对于氨基酸序列，使用评分矩阵计算累积分数。当累积比对分数从其所达到的最大值回落数量X、累积分数由于累积一个或多个负分残基比对而降至零或以下、或到达任一序列的末端时，则在各个方向上的字串命中的延伸停止。

除了计算百分比序列同一性，BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计分析。BLAST算法提供的对相似性的一种量度是最小和概率(P(N))，其提供对两个核苷酸序列之间将偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸序列与参考核酸序列的比较中的最小和概率小于约0.1，更优选地小于约0.01，并且最优选地小于约0.001，则该测试核酸序列被认为与该参考序列相似。

为了获得空位比对以用于比较目的，可以使用Gapped BLAST(在BLAST 2.0中)。作为另外一种选择，可以使用PSI-BLAST(在BLAST 2.0中)进行迭代搜索以检测分子间的远亲关系。当使用BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST时，可以使用相应程序的默认参数(例如，BLASTN用于核苷酸序列)。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用以下默认值：字串长度(W)为11、期望值(E)为10、截断值为100、M=5、N=-4、以及比较两条链。还可以通过检测手动进行比对。

对于本发明的目的而言，优选使用采用其默认参数的BlastN程序(版本1.4.7或更新)或任何等同程序进行用于确定与本文公开的启动子序列的百分比序列同一性的核苷酸序列比较。所谓“等同程序”意为任何序列比较程序，对于所考虑的任何两个序列而言，当相比由优选程序所生成的对应比对结果时，其生成具有相同核苷酸匹配和相同百分比序列同一性的比对结果。

(c) 如本文所用，“序列同一性”或“同一性”在两个核酸序列的上下文中指代当比对在指定比较窗口上的最大对应时，这两个序列中相同核苷酸的特定百分比，正如通过序列比较算法或通过视觉检测所测量的。

(d) 如本文所用，“序列同一性百分比”指代通过在比较窗口上比较两个最佳比对序列而确定的值，其中相比参考序列(其不包含添加或缺失)，所述比较窗口中的多核苷酸序列的部分可包含添加或缺失(即，空位)，用于这两个序列的最佳比对。所述百分比通过如下计算：确定两个序列中存在相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100以得到序列同一性百分比。

(e) 术语多核苷酸序列的“基本同一性”意指多核苷酸包含这样的序列，使用采用标准参数的所述比对程序之一而与参考序列相比，所述序列具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%或79%，优选至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%，更优选至少90%、91%、92%、93%或94%，并且最优选至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。

核苷酸序列基本上相同的另一个指标是在严格条件下两种分子是否彼此杂交。通常，严格条件被选为：在限定的离子强度和pH下，比特定序列的热力学熔点(Tm)低约5°C。然而，严格条件涵盖约1°C至约20°C范围内的温度，取决于其它符合本文所需的严格程度。

对于序列比较，通常一个序列充当参考序列以供测试序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机中，确定子序列坐标（如果有必要），并确定序列算法程序参数。序列比较算法随后基于所确定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。

正如本文所提到的，两个核酸序列基本上相同的另一个指标是在严格条件下这两种分子彼此杂交。短语“特异性杂交至”指代在严格条件下分子仅与特定核苷酸序列结合、成双链或杂交，当该序列存在于复杂混合物（例如，总细胞DNA或RNA）中时。“基本上结合”指代探针核酸与靶核酸之间的互补杂交，并包含可以通过降低杂交介质的严格性而容忍的少量错配以实现对靶核酸序列的所需检测。

“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”在核酸杂交实验如Southern和Northern杂交的背景中是序列依赖性的，并且在不同环境参数下而有所不同。更长的序列在更高的温度下特异性杂交。Tm是当50%的靶序列杂交至完全匹配的探针时的温度（在限定的离子强度和pH下）。特异性通常是杂交后洗涤的函数，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交，Tm可以由以下公式近似得出：Tm 81.5°C + 16.6 (log M) +0.41 (%GC) - 0.61 (% form) - 500/L；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，%GC是DNA中鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分比，% form是杂交溶液中甲酰胺的百分比，而L是杂交产物的碱基对长度。对于每1%的错配，Tm降低约1°C；因此，可以调整Tm、杂交和/或洗涤条件以杂交至具有所需同一性的序列。例如，如果寻求具有>90%同一性的序列，可以将Tm降低10°C。通常，严格条件被选为：在限定的离子强度和pH下，比特定序列及其补体的热力学熔点(Tm)低约5°C。然而，特别严格条件可以低于热力学熔点(Tm)1、2、3或4°C使用杂交和/或洗涤；中等严格条件可以低于热力学熔点(Tm)6、7、8、9或10°C使用杂交和/或洗涤；低严格条件可以低于热力学熔点(Tm)11、12、13、14、15或20°C使用杂交和/或洗涤。使用此公式、杂交和洗涤组成以及所需T，普通技术人员将理解，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化已经被固有地描述。如果所需错配程度导致T小于45°C(水溶液)或32°C(甲酰胺溶液)，则优选地增加SSC浓度使得可以使用更高的温度。通常，高度严格杂交和洗涤条件被选为：在限定的离子强度和pH下，比特定序列的热力学熔点(Tm)低约5°C。

高度严格洗涤条件的实例是：0.15 M NaCl、72°C、约15分钟。严格洗涤条件的实例是：0.2X SSC在65°C洗涤15分钟(参见，Sambrook 和 Russell 2001，对SSC缓冲液的说明)。通常，在高严格性洗涤之前会有低严格性洗涤以移除背景探针信号。对于短核酸序列(例如，约10至50个核苷酸)，严格条件通常涉及：盐浓度在pH 7.0至8.3时低于约1.5 M，更优选地约0.01至1.0 M的Na离子浓度(或其它盐类)，而温度通常为至少约30°C。严格条件还可通过加入去稳定剂如甲酰胺而实现。通常，信噪比为在具体杂交测定中所观察到的不相关探针的信噪比的2X(或更高)表明检测到特定杂交。非常严格条件被选为：等于特定核酸分子的Tm。

非常严格条件被选为：等于特定探针的T_m。在Southern或Northern印迹的过滤器上具有超过100个互补残基的互补核酸的杂交的严格条件的实例是50% 甲酰胺，例如，在50% 甲酰胺、1 M NaCl、1% SDS中于37°C杂交，并且在0.1X SSC中于60至65°C洗涤。示例性低严格性条件包括：用30至35% 甲酰胺、1M NaCl、1% SDS (十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液于37°C杂交，并且在1X至2X SSC (20X SSC = 3.0 M NaCl/0.3 M 柠檬酸三钠)中于50至55°C洗涤。示例性中等严格性条件包括：在40至45% 甲酰胺、1.0 M NaCl、1% SDS中于37°C杂交，并且在0.5X至1X SSC中于55至60°C洗涤。

术语“转化”指代将核酸片段转移到宿主细胞的基因组中，得到基因上稳定的遗传。“宿主细胞”是已经或能够被外源核酸分子转化的细胞。含有转化的核酸片段的宿主细胞被称为“转基因”细胞。

“转化的”、“转导的”、“转基因的”和“重组的”指代其中已经引入了异源核酸分子的宿主细胞。如本文所用，术语“转染”指代将DNA递送到真核（例如，哺乳动物）细胞中。术语“转化”在本文中用于指代将DNA递送到原核（例如，大肠杆菌）细胞中。术语“转导”在本文中用于指代用病毒颗粒感染细胞。核酸分子可以被稳定地整合到本领域众所周知的基因组中。已知的PCR方法包括但不限于使用下列引物的方法：配对引物、嵌套引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等。例如，“转化的”、“转化子”和“转基因的”细胞已经经过了转化过程并且含有被整合到其染色体中的外来基因。术语“未转化的”指代尚未经过转化过程的正常细胞。

“遗传学上改变的细胞”指代已经通过引入重组或异源核酸（例如，一种或多种DNA构建体或其RNA相对物）而修饰的细胞，并且还包括保留部分或全部此类基因修饰的此类细胞的子代。

如本文所用，术语“衍生自”或“涉及”在针对核苷酸分子时意指该分子与特定的目标分子具有互补的序列同一性。

本发明的siRNA可以通过本领域已知的任何方法生成，例如，通过体外转录、重组生成，或通过合成方法生成。在一个实例中，siRNA可以通过使用重组酶（如T7 RNA聚合酶）和DNA寡核苷酸模板体外生成。

本发明的核酸分子

术语“分离的和/或纯化的”指代在体外将核酸（例如，DNA或RNA分子）从其天然细胞环境，并从与细胞的其它组分（如核酸或多肽）的缔合中分离，使得其可以被测序、复制和/或表达。RNA或DNA是“分离的”，如果其不含在该RNA或DNA的天然来源中其通常缔合的至少一种污染核酸，并且优选地基本上不含任何其它哺乳动物RNA或DNA。短语“不含其通常缔合的至少一种污染来源核酸”包括这样的情况：其中所述核酸被重新引入到来源或天然细胞中但是在不同的染色体位置，或其侧接通常不存在于来源细胞中的核酸序列（例如，在载体或质粒中）。

除了编码siRNA的DNA序列之外，本发明的核酸分子包括双链干扰RNA分子，其也可用于抑制靶基因的表达。

如本文所用，术语“重组核酸”，例如，“重组DNA序列或节段”指代这样的核酸（例如，DNA），其已经衍生自或分离自任何适当的细胞来源，其可随后被体外化学改变，使得其序列并非天然存在的，或对应于不位于其将在尚未用外源DNA转化的基因组中所处位置的天然存在的序列。“衍生”自来源的预选DNA的实例将是这样的DNA序列，其被鉴别为给定生物体内的有用片段，并且其随后以基本上纯的形式被化学合成。“分离”自来源的此类DNA的实例将是有用的DNA序列，其通过化学方法（例如，通过使用限制性核酸内切酶）而从来源被切除或移除，使得其可以通过基因工程方法被进一步操纵（例如，扩增）而用于本发明。“重组DNA”包括：完全合成的DNA序列、半合成的DNA序列、分离自生物来源的DNA序列和衍生自RNA的DNA序列以及其混合物。

本发明的表达盒

为了制备表达盒，重组DNA序列或节段可以是环状或线性、双链或单链的。通常，DNA序列或节段为嵌合DNA的形式，如质粒DNA或载体，其还可以含有侧接控制序列的编码区，所述控制序列促进存在于所得转化细胞中的重组DNA的表达。

“嵌合”载体或表达盒，如本文所用，意指这样的载体或盒，其包含来自至少两个不同物种的核酸序列，或具有来自同一物种的核酸序列，该序列以不存在于“天然”或野生型物种中的方式连接或缔合。

除了用作RNA转录物或其部分的转录单元的重组DNA序列之外，该重组DNA的一部分可能未转录，起到调控或结构功能。例如，所述重组DNA可具有在哺乳动物细胞中有活性的启动子。

宿主细胞中的其它功能性元件，如内含子、增强子、多腺苷酸化序列等，也可能是该重组DNA的一部分。此类元件可能是或可能不是所述DNA功能所必要的，但可通过影响转录、siRNA的稳定性等而提供该DNA的改善的表达。此类元件可根据需要而被包含在DNA中以在细胞中获得siRNA的最佳性能。

控制序列是在特定宿主生物体中表达经可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。适用于原核细胞的控制序列，例如，包括启动子和任选地操纵子序列以及核糖体结合位点。已知真核细胞使用启动子、多聚腺苷酸化信号和增强子。

可操作连接的核酸是与另一核酸序列处于功能关系的核酸。例如，启动子或增强子被有效连接至编码序列，如果其影响了该序列的转录；或者核糖体结合位点被有效连接至编码序列，如果其被布置成便于翻译。通常，可操作连接的DNA序列是连续连接的DNA序列。然而，增强子不必是连续的。连接通过在便利的限制性位点处的连接反应而完成。如果不存在此类位点，则根据常规操作使用合成的寡核苷酸接头（adaptor）或连接基（linker）。

待引入细胞中的重组DNA可含有选择标志物基因或报道基因或二者皆有以有助于从试图通过病毒载体转染或感染的细胞群体中识别和选择表达细胞。在其它实施方案中，所述选择标志物可由单独的DNA片断携带并用于共转染程序。选择标志物和报道基因均可侧接合适的调控序列以允许在宿主细胞中表达。可用的选择标志物是本领域已知的并且包括，例如，抗生素抗性基因如neo等。

报道基因被用于识别潜在的转染细胞并被用于评价调控序列的功能性。编码容易测定的蛋白质的报道基因是本领域熟知的。通常，报道基因是不存在于受体生物体或组织中或不由其表达的基因，并且该基因编码这样的蛋白质，其表达表现出一些容易检测到的特性，例如，酶活性。例如，报道基因包括来自大肠杆菌的Tn9的氯霉素乙酰基转移酶基因(cat)和来自萤火虫（Photinus pyralis）的萤光素酶基因。在DNA已经被引入受体细胞后的合适时间测定报道基因的表达。

用于构建可以转染靶细胞的重组DNA的一般方法是本领域技术人员熟知的，并且可使用相同的构建组成和方法以生产可用于本文的DNA。

重组DNA可以通过用由编码siRNA的DNA构成的表达载体转染，通过任何可用于引入特定细胞的程序，例如，物理或生物方法，而被容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞，以得到含有该重组DNA的细胞，所述重组DNA被稳定整合至该细胞基因组中或以附加元件存在，使得本发明的DNA分子或序列被该宿主细胞表达。优选地，DNA经由载体被引入到宿主细胞中。宿主细胞优选为真核来源，例如，植物、哺乳动物、昆虫、酵母或真菌来源，但也可采用非真核来源的宿主细胞。

将预选DNA引入宿主细胞的物理方法包括：磷酸钙沉淀、微脂粒感染、粒子轰击、微注射、电穿孔等。将目标DNA引入宿主细胞的生物方法包括使用DNA和RNA病毒载体。对于哺乳动物基因疗法而言，如下文所述，希望使用有效的方法将基因拷贝插入到宿主基因组中。病毒载体，并且尤其是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的用于将基因插入到哺乳动物（例如，人类）细胞中的方法。其它病毒载体可以来源于痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见，例如，美国专利No.5,350,674 和 5,585,362。

如本文所述，“转染的”或“转导的”宿主细胞或细胞系中的基因组已经由于至少一个异源或重组核酸序列的存在而改变或扩大。本发明的宿主细胞通常由DNA序列转染产生，所述DNA序列是在质粒表达载体、病毒表达载体中，或作为分离的线性DNA序列。转染的DNA可以成为染色体整合的重组DNA序列，其由编码siRNA的序列构成。

为了确认宿主细胞中存在重组DNA，可进行各种测定。此类测定包括，例如，本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，如检测是否存在特定肽，例如，通过免疫学方法(ELISA和Western印迹)或通过本文所述的测定，以识别落入本发明范围内的试剂。

为了检测并定量引入的重组DNA节段所产生的RNA，可采用RT-PCR。在这种PCR应用中，首先需要使用酶如逆转录酶将RNA反转录成DNA，并随后通过使用常规PCR技术扩增DNA。在大多数情况下，PCR技术（尽管有用）将无法证明RNA产物的完整性。有关RNA产物性质的另外信息可通过Northern印迹获得。此技术证明RNA物质的存在并提供有关该RNA完整性的信息。RNA物质的存在与否还可以使用点印迹或狭缝印迹Northern杂交确定。这些技术是Northern印迹的修改形式并且仅证明RNA物质的存在与否。

虽然Southern印迹和PCR可用于检测所考虑的重组DNA节段，但其无法提供诸如预选DNA节段是否被表达的信息。可通过特异性识别所引入的重组DNA序列的肽产物或评价由于在宿主细胞中表达所引入的重组DNA节段而引起的表型变化来评价表达。

本发明提供了用于在哺乳动物受体中表达外源核酸物质的细胞表达系统。所述表达系统，也被称为“基因修饰的细胞”，包括细胞和用于表达所述外源核酸物质的表达载体。所述基因修饰的细胞适用于向哺乳动物受体施用，其中所述细胞取代该受体的内源细胞。因此，优选的基因修饰的细胞是非永生化并且非致瘤性的。

根据一个实施方案，所述细胞被转染或以其它方式离体基因修饰。所述细胞分离自哺乳动物（优选人类），用载体引入核酸（即，体内转导或转染）用于表达编码治疗剂的异源（例如，重组）基因，并随后施用于哺乳动物受体以原位递送所述治疗剂。所述哺乳动物受体可以是人，而所述待修饰的细胞是自体细胞，即，所述细胞分离自所述哺乳动物受体。

根据另一个实施方案，所述细胞被转染或转导以其它方式体内基因修饰。用含有外源核酸物质的载体体内转导或转染来自哺乳动物受体的细胞，用于表达编码治疗剂的异源（例如，重组）基因，并原位递送所述治疗剂。

如本文所用，“外源核酸物质”指代这样的天然或合成的核酸或寡核苷酸，其并非天然存在与细胞中；或如果其天然存在于细胞中，则在其原始或天然形式上经过修饰。因此，“外源核酸物质”包括，例如，可以被转录成反义RNA、siRNA的非天然存在的核酸以及“异源基因”（即，编码在同一类型的天然存在的细胞中不表达或以生物学上不显著的水平表达的蛋白质的基因）。譬如，相对于人腹膜间皮细胞，编码人促红细胞生成素(EPO)的合成或天然基因将被视为“外源核酸物质”，因为该细胞不天然表达EPO。“外源核酸物质”的仍另一个实例是仅引入基因的一部分以生成重组基因，如经由同源重组将可调控启动子与内源编码序列结合。

适合基因抑制疗法的状况可能是预防方法，即，用于预防疾病或不期望的医疗状况的方法。因此，本发明包括用于递送siRNA的系统，其对哺乳动物受体具有预防功能（即，预防剂）。

用于将本发明的表达盒引入细胞中的方法

可以通过基因转移方法（如转染或转导）将抑制性核酸物质（例如，编码针对目标基因的siRNA的表达盒）离体或体内引入细胞中，以提供基因修饰的细胞。各种表达载体（即，有助于将外源核酸递送至靶细胞中的媒介物）是本领域普通技术人员已知的。

如本文所用，“细胞转染”指代细胞通过并入所添加的DNA而获得新的核酸物质。因此，转染指代使用物理或化学方法将核酸插入到细胞中。若干转染技术是本领域普通技术人员已知的，包括：磷酸钙DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖、电穿孔、阳离子脂质体介导的转染、钨粒子促进的微粒轰击以及磷酸锶DNA共沉淀。

相比之下，“细胞转导”指代使用DNA或RNA病毒将核酸转移至细胞中的方法。用于将核酸转移至细胞中的RNA病毒（即，逆转录病毒）在本文中指代转导嵌合逆转录病毒。包含在逆转录病毒内的外源核酸物质被整合到转导细胞的基因组中。已经用嵌合DNA病毒（例如，携带编码治疗剂的cDNA的腺病毒）转导的细胞将不会把该外源核酸物质整合到其基因组中但将能够表达该外源核酸物质，所述外源核酸物质以染色体外的形式保留在细胞内。

所述外源核酸物质可以包含编码siRNA的核酸连同控制转录的启动子。所述启动子的特征在于具有启动转录所必需的特定核苷酸序列。所述外源核酸物质还可包含获得所需基因转录活性所要求的另外的序列（即，增强子）。对于本讨论的目的而言，“增强子”只是任何非翻译DNA序列，其与编码序列一同作用（顺式）以改变由启动子决定的基础转录水平。所述外源核酸物质可被引入到细胞基因组中紧接着启动子的下游，使得启动子与编码序列可操作地连接从而允许编码序列的转录。表达载体可以包含外源启动子元件以控制所插入外源基因的转录。此类外源启动子既包括组成型启动子也包括可调控启动子。

天然存在的组成型启动子控制基本细胞功能的表达。因此，处于组成型启动子控制之下的核酸序列在所有细胞生长条件下均表达。组成型启动子包括下列基因（其编码某些组成型或“持家”功能）的启动子：次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、腺苷脱氨酶、磷酸甘油激酶(PGK)、丙酮酸激酶、磷酸甘油变位酶，β-肌动蛋白启动子以及本领域技术人员已知的其它组成型启动子。另外，许多病毒启动子在真核细胞中组成性地起作用。这些包括：SV40的早期和晚期启动子；莫洛尼白血病病毒及其它逆转录病毒的长末端重复序列(LTR)；和单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子，以及许多其它启动子。

处于可调控启动子控制之下的核酸序列仅在存在诱导剂或抑制剂的情况下表达或以更高或更低程度表达（例如，金属硫蛋白启动子控制下的转录在存在某些金属离子的情况下大幅提高）。可调控启动子包括当其诱导因子结合时刺激转录的反应元件(RE)。例如，存在针对下列物质的RE：血清因子、类固醇激素、视黄酸、环腺苷酸（cAMP）和四环素以及多西环素。可以选择含有特定RE的启动子以获得可调控的反应，并且在一些情况下，所述RE本身可被附接至不同的启动子，从而给所编码的核酸序列赋予可调控性。因此，通过选择适当的启动子（组成型对可调控；强对弱），有可能控制核酸序列在基因修饰细胞中的存在和表达水平。如果核酸序列处于可调控启动子的控制下，则通过将基因修饰的细胞原位暴露于允许该核酸序列转录的条件以触发治疗剂的原位递送，例如，通过腹腔内注射控制所述试剂转录的所述可调控启动子的特定诱导物。例如，在基因修饰的细胞中处于金属硫蛋白启动子控制下的核酸序列的原位表达通过将所述基因修饰的细胞与含有适当（即，诱导）金属离子的溶液原位接触而增强。

因此，原位生成的siRNA的量通过控制诸如以下的因素来调控：用于指导核酸序列转录的启动子的性质（即，该启动子是组成型还是可调控的、是强还是弱）以及细胞中编码siRNA序列的外源核酸序列的拷贝数。

除了至少一个启动子和至少一个编码siRNA的异源核酸序列之外，表达载体可包含选择基因，例如，新霉素抗性基因，以有助于选择已经用所述表达载体转染或转导的细胞。

还可以用两种或多种表达载体转染细胞，至少一种载体含有编码siRNA的核酸序列，另一种载体含有选择基因。选择合适的启动子、增强子、选择基因和/或信号序列被视为在本领域普通技术人员的能力范围内而无需过度实验。

以下讨论涉及本发明的各种实用价值。例如，本发明作为适用于沉默目标基因表达的表达系统而具有实用性。

本发明还提供了用于体内基因修饰哺乳动物受体的细胞的方法。根据一个实施方案，所述方法包括引入用于在所述哺乳动物受体的细胞中原位表达siRNA序列的表达载体，通过，例如，将所述载体注射到所述受体内。

本发明的表达盒的递送媒介物

将化合物递送到组织中并穿过血脑屏障可受限于所述化合物的大小和生物化学性质。目前，只有当分子较小（通常小于600道尔顿）时，才可以将化合物有效体内递送到细胞中。已经使用重组腺病毒载体完成了基因转移，所述基因转移是用于矫正先天性代谢缺陷和中枢神经系统(CNS)的神经退行性疾病，以及用于治疗癌症。

选择和优化用于在细胞中表达特定siRNA的特定表达载体可以通过如下实现：获得该siRNA的核酸序列，有可能的话，连同一个或多个适当的控制区（例如，启动子、插入序列）；制备包含载体的载体构建体，所述载体中插入了编码所述siRNA的核酸序列；用所述载体构建体体外转染或转导培养的细胞；并且确定所述siRNA是否存在于所培养的细胞中。

用于细胞基因疗法的载体包括病毒，如复制缺陷型病毒（详述于下）。示例性病毒载体来源于哈维肉瘤病毒、劳氏肉瘤病毒、（MPSV）、莫洛尼小鼠白血病病毒和DNA病毒（例如，腺病毒）。

复制缺陷型逆转录病毒能够指导所有病毒粒子蛋白质的合成，但不能制造感染性颗粒。因此，这些基因上改变的逆转录病毒表达载体对于核酸序列在培养细胞中的高效转导具有一般实用性，而对于用在本发明的方法中具有特别实用性。此类逆转录病毒还对于将核酸序列有效体内转导至细胞中具有实用性。逆转录病毒已经被广泛用于将核酸物质转移至细胞中。用于生产复制缺陷型逆转录病毒的方案（包括以下步骤：将外源核酸物质并入质粒中，用所述质粒转染包装细胞系，由所述包装细胞系生产重组逆转录病毒，从组织培养液中收集病毒颗粒，以及用所述病毒颗粒感染靶细胞）是本领域众所周知的。

将逆转录病毒用于基因疗法的优点在于：病毒将编码siRNA的核酸序列插入到宿主细胞基因组中，从而允许编码siRNA的核酸序列在细胞分裂时被传递给该细胞的子代。LTR区内的启动子序列可以在各种细胞类型中增强所插入编码序列的表达。使用逆转录病毒表达载体的一些缺点在于：(1) 插入诱变，即，将编码siRNA的核酸序列插入到靶细胞基因组中不期望的位置，其例如导致不受调控的细胞生长；以及(2) 需要靶细胞增殖以使得载体携带的编码siRNA的核酸序列被整合到靶基因组中。

可用作表达载体以转化细胞的另一病毒候选是腺病毒，一种双链DNA病毒。腺病毒可感染广泛的细胞类型，包括，例如，肌肉细胞和内皮细胞。

腺病毒(Ad)是双链线性DNA病毒，其基因组为36 kb。腺病毒的若干特征已使其可用作转基因递送媒介物，用于治疗应用，如促进体内基因递送。已经证明，重组腺病毒载体能够有效原位基因转移至各种器官（包括肺、脑、胰腺、胆囊和肝）的实质细胞。这已允许在用于治疗遗传的基因疾病（如囊性纤维化）的方法中使用这些载体，其中载体可被递送至靶器官。另外，腺病毒载体实现原位肿瘤转导的能力已经允许开发出针对非播散性疾病的各种抗癌基因治疗方法。在这些方法中，载体控制有利于肿瘤细胞特异性转导。

类似于逆转录病毒，腺病毒基因组适于用作基因疗法的表达载体，即，通过移除控制病毒自身生产的基因信息。因为腺病毒以染色体外的方式起作用，所以重组腺病毒理论上没有插入诱变的问题。

在传统上已经使用了若干种方法生成重组腺病毒。一种方法涉及将含有目标核酸序列的限制性核酸内切酶片段直接连接至腺病毒基因组的部分。作为另外一种选择，可通过同源重组结果将目标核酸序列插入缺陷型腺病毒中。通过筛选在互补细胞的菌苔上生成的单独菌斑而识别出所需重组。

大多数腺病毒载体是基于5型腺病毒(Ad5)的骨架，其中含有目标核酸序列的表达盒已经被引入以替代早期区1(E1)或早期区3(E3)。其中E1已缺失的病毒具有复制缺陷，并且在人互补细胞(例如，293或911细胞)中传播，所述人互补细胞以反式提供了缺失的基因E1和pIX。

在本发明的一个实施方案中，将希望在脑细胞或脑组织中生成siRNA。适用于本申请的载体是FIV载体或AAV载体。例如，可使用AAV5。也可应用脊髓灰质炎病毒或HSV载体。

通常通过转染合成的siRNA、体外合成的RNA或表达shRNA或miRNA的质粒来实现siRNA的应用。近来，病毒已经被用于体外研究并用于生成转基因小鼠的靶基因下调。重组腺病毒、腺相关病毒(AAV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)可以被用于体外和体内递送基因。各有各的优缺点。腺病毒是具有大基因组(36 kb)的双链DNA病毒，并且已经由本人和其它的实验室工程改造以在不同区域包含表达盒。

腺相关病毒具有包被的基因组，类似于Ad，但尺寸和包装容量更小（~30 nm 对 ~100 nm；包装极限 ~4.5 kb）。AAV含有+或-链的单链DNA基因组。已经充分研究了AAV的八种血清型(1-8)，其中三种已经在脑中进行了评价。本申请的一个重要考量是AAV5转导纹状体和皮质神经元，并且不与任何已知病理相关。

腺相关病毒(AAV)是细小病毒科的小型非致病性病毒。AAV不同于此科的其它成员，因为其复制依赖于辅助病毒。在不存在辅助病毒的情况下，AAV可以基因座特异性方式整合到染色体19的q-臂中。AAV的大约5 kb的基因组由正或负极性的单链DNA的一个节段组成。基因组的端部是短的末端反向重复序列，其可以折叠成发夹结构并充当病毒DNA复制的起点。在物理上，细小病毒病毒粒子是无包膜的并且其二十面体衣壳的直径为大约20 nm。

本发明还提供了嵌合病毒，其中AAV可以与疱疹病毒、疱疹病毒扩增子、杆状病毒或其它病毒结合以实现与另一种病毒相关的所需嗜性。例如，可将AAV4 ITR插入疱疹病毒中并可感染细胞。感染后，在系统中或单独媒介物中提供的AAV4 rep可作用于AAV4的ITR以从基因组中拯救AAV4。因此，单纯疱疹病毒的细胞嗜性可以与AAV4 rep介导的靶向整合相结合。可以用于构建嵌合病毒的其它病毒包括：慢病毒、逆转录病毒、假型逆转录病毒载体和腺病毒载体。

本发明还提供了变体AAV载体。例如，可以在单个核苷酸水平修饰天然AAV（如AAV5）的序列。本发明包括天然和突变型AAV载体。本发明还包括所有的AAV血清型。

FIV是在人类中具有强安全概况的有包膜病毒；被FIV感染的猫咬伤或抓伤的个体不会血清转化并且尚未报道表现出任何病征。类似于AAV，FIV在小鼠和非人灵长类的神经元中提供持续的转基因表达，并且转导可以通过假型化（将病毒的天然包膜替换成另一种病毒的包膜的方法）而指向不同的细胞类型。

因此，正如对于本领域普通技术人员将是显而易见的，多种合适的病毒表达载体可用于将外源核酸物质转移到细胞中。选择适当的表达载体以表达针对适于基因沉默疗法的特定状况的治疗剂并且优化将所选表达载体插入细胞中的条件，是在本领域普通技术人员的能力范围内而无需过度实验。

在另一个实施方案中，所述表达载体是质粒的形式，其通过下列各种方法之一被转移至靶细胞中：物理的（例如，微注射、电穿孔、划痕负载、微粒轰击）或作为化学复合物（例如，钙或锶共沉淀、与脂质复合、与配体复合）由细胞吸收。若干商业产品可用于阳离子脂质体复合，包括Lipofectin™ (Gibco-BRL, Gaithersburg, Md.)和Transfectam™(Promega®, Madison, Wis.)。然而，这些方法的转染效率高度依赖于靶细胞的性质，并因此，使用本文提及的程序将核酸转染到细胞中的最佳条件必须经过优化。此类优化是在本领域普通技术人员的能力范围内而无需过度实验。

腺相关病毒(AAV)

腺相关病毒(AAV)是细小病毒科的小型非致病性病毒。AAV不同于此科的其它成员，因为其复制依赖于辅助病毒。在不存在辅助病毒的情况下，AAV可以基因座特异性方式整合到染色体19的q臂中。AAV的大约5 kb的基因组由正或负极性的单链DNA的一个节段组成。基因组的端部是短的末端反向重复序列，其可以折叠成发夹结构并充当病毒DNA复制的起点。在物理上，细小病毒病毒粒子是无包膜的并且其二十面体衣壳的直径为大约20 nm。

迄今为止，已经识别出许多血清学上不同的AAV，并且超过一打已经从人类或灵长类中被分离出。AAV2的基因组长4680个核苷酸并且含有两个开放阅读框(ORF)。左边的ORF编码非结构Rep蛋白：Rep 40、Rep 52、Rep 68和Rep 78，其除了生产单链子代基因组之外还涉及调控复制和转录。此外，这些Rep蛋白中的两种已经与AAV基因组被优先整合到人类染色体19的q臂的区中相关联。还已证明，Rep68/78具有NTP结合活性以及DNA和RNA解旋酶活性。Rep蛋白具有核定位信号以及若干潜在的磷酸化位点。这些激酶位点之一的突变导致复制活性的丧失。

基因组的端部是短的末端反向重复序列(ITR)，其有可能折叠成T形发夹结构而充当病毒DNA复制的起点。在ITR区内，已经描述了对ITR功能至关重要的两种元件：GAGC重复基序和末端拆分位点(trs)。已经证明，当ITR处于线性或发夹构象时，重复基序结合Rep。这种结合起到定位Rep68/78的作用，用于在trs的裂解，该裂解以位点和链特异性方式进行。除了其在复制中的作用，这两种元件似乎也是病毒整合的关键。包含在染色体19内的整合基因座是Rep结合位点连同相邻的trs。已经证明，这些元件是功能性的并且是基因座特异性整合所必需的。

AAV病毒粒子是无包膜的、直径约25 nm的二十面体颗粒，由被称为VP1、VP2和VP3的三种相关蛋白质组成。右边的ORF编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。这些蛋白质分别以1:1:10的比率存在，并且均来源于右手边的ORF。衣壳蛋白的彼此不同之处在于：使用选择性剪接和不寻常的起始密码子。缺失分析已经表明，移除或改变从选择性剪接的信息翻译而来的VP1，导致感染颗粒的产率降低。VP3编码区内的突变导致无法产生任何单链子代DNA或感染颗粒。AAV颗粒是包含AAV衣壳蛋白的病毒颗粒。AAV衣壳多肽可以编码整个VP1、VP2和VP3多肽。所述颗粒可以是包含AAV2和其它AAV衣壳蛋白(即，嵌合蛋白，如AAV1和AAV2)的颗粒。本文设想了AAV2衣壳蛋白的氨基酸序列的变型形式，只要所得到的包含AAV2衣壳的病毒颗粒保持在抗原或免疫学上不同于AAV1，正如可以通过标准方法常规测定的。具体地讲，例如，ELISA和Western印迹可以用于测定病毒颗粒是否在抗原或免疫学上不同于AAV1。此外，AAV2病毒颗粒优选地保持不同于AAV1的组织嗜性。

AAV2颗粒是包含AAV2衣壳蛋白的病毒颗粒。编码整个VP1、VP2和VP3多肽的AAV2衣壳多肽可以与具有由NC_001401中所示的核苷酸(编码AAV2衣壳蛋白的核苷酸序列)编码的氨基酸序列的多肽在总体上具有至少约63%的同源性(或同一性)。衣壳蛋白可以与由NC_001401中所示的核苷酸序列编码的蛋白质具有约70%同源性、约75%同源性、80%同源性、85%同源性、90%同源性、95%同源性、98%同源性、99%同源性或甚至100%同源性。衣壳蛋白可以与由NC_001401中所示的核苷酸序列编码的蛋白质具有约70%同一性、约75%同一性、80%同一性、85%同一性、90%同一性、95%同一性、98%同一性、99%同一性或甚至100%同一性。所述颗粒可以是包含另一种AAV和AAV2衣壳蛋白（即，嵌合蛋白）的颗粒。本文设想了AAV2衣壳蛋白的氨基酸序列的变型形式，只要所得到的包含AAV2衣壳的病毒颗粒保持在抗原或免疫学上不同于AAV4，正如可以通过标准方法常规测定的。具体地讲，例如，ELISA和Western印迹可以用于测定病毒颗粒是否在抗原或免疫学上不同于AAV1。此外，AAV2病毒颗粒优选地保持不同于AAV1的组织嗜性，正如本文实例中所示例的，然而包含至少一种AAV2外壳蛋白的AAV2嵌合颗粒可具有不同于仅由AAV2外壳蛋白组成的AAV2颗粒的组织嗜性。

在某些实施方案中，本发明还提供了AAV2颗粒，其含有（即，包被）包含一对AAV2末端反向重复序列的载体。AAV2 ITR的核苷酸序列是本领域已知的。此外，所述颗粒可以是同时包含AAV1和AAV2衣壳蛋白（即，嵌合蛋白）的颗粒。此外，所述颗粒可以是包被载体的颗粒，所述载体包含一对来自其它AAV（例如，AAV1-AAV9以及AAVrh10）的AAV末端反向重复序列。所述包被在颗粒中的载体还可以包含被插入到所述末端反向重复序列之间的外源核酸。

AAV的下列特征已使其成为用于基因转移的有吸引力的载体。已经体外证明，AAV载体稳定整合到细胞基因组中；具有宽广的宿主范围；体外和体内转导分裂中和非分裂中的细胞并且维持转导基因的高水平表达。病毒颗粒是热稳定的，对溶剂、去垢剂、pH变化、温度具有抗性，并且可以在CsCl梯度上或通过其它方式浓缩。本发明提供了施用AAV颗粒、重组AAV载体和重组AAV病毒粒子的方法。例如，AAV2颗粒是包含AAV2衣壳蛋白的病毒颗粒，或AAV1颗粒是包含AAV1衣壳蛋白的病毒颗粒。重组AAV2载体是核酸构建体，其包含至少一种独特的AAV2核酸。重组AAV2病毒粒子是含有重组AAV载体的颗粒。要想被纳入术语“AAV2ITR”的范畴，核苷酸序列必须保持本文所述的区别AAV2 ITR与AAV1 ITR的特征或之一：(1)三个(而非AAV1中的四个)"GAGC"重复序列以及(2) 在AAV2 ITR Rep结合位点，头两个"GAGC"重复序列中的第四个核苷酸是C而非T。

驱动所述蛋白质或编码另一种待递送试剂的序列的表达的启动子可以是任何所需启动子，其通过已知考量进行选择，如功能连接至所述启动子的核酸的表达水平以及载体将要被用于的细胞类型。启动子可以是外源或内源启动子。启动子可以包括，例如，已知的强启动子如SV40或诱导型金属硫蛋白启动子，或AAV启动子如AAV p5启动子。启动子的另外的实例包括来源于以下的启动子：肌动蛋白基因、免疫球蛋白基因、细胞巨化病毒(CMV)、腺病毒、牛乳头状瘤病毒、腺病毒启动子如腺病毒主要晚期启动子（一种诱导型热休克启动子）、呼吸道合胞病毒、劳氏肉瘤病毒(RSV)等。另外的实例包括受调控的启动子。

AAV载体还可以包含功能连接至启动子的外源(异源)核酸。所谓“异源核酸”是指任何异源或外源核酸，其可以被插入到载体中用于转移到细胞、组织或生物体中。所述核酸可以编码例如多肽或蛋白质或反义RNA。所谓“功能连接”是指使得启动子可以促进所述异源核酸的表达，正如本领域已知的，如启动子相对于所述异源核酸适当定位。此外，异源核酸优选地具有如本领域已知的用于核酸表达的所有适当序列，以功能性编码，即，允许核酸被表达。所述核酸可以包含，例如，表达控制序列（如增强子）和必要的信息加工位点（如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点）以及转录终止序列。所述核酸可以编码不止一种基因产物，仅受限于可以被包装的核酸的大小。

在本发明的某些实施方案中，所述异源核酸可以编码有益蛋白，其取代载体所转移进入的个体所需的缺失或缺陷蛋白，如Rheb或Rhes。

AAV1颗粒是包含AAV1衣壳蛋白的病毒颗粒。本文设想了AAV1衣壳蛋白的氨基酸序列的变型形式，只要所得到的包含AAV1衣壳的病毒颗粒保持在抗原或免疫学上不同于其它AAV衣壳，正如可以通过标准方法常规测定的。具体地讲，例如，ELISA和Western印迹可以用于测定病毒颗粒是否在抗原或免疫学上不同于其它AAV血清型。

如本文所用的术语“多肽”指代氨基酸聚合物并且包括全长蛋白质及其片段。因此，“蛋白质”和“多肽”在本文中通常可互换使用。可以通过已知参数选择中性置换。正如本领域技术人员将认识到的，本发明还包括在氨基酸序列或其它性质上具有些微变化的那些多肽。此类变化可以等位基因变化的形式自然产生（例如，由于基因多态性）或可通过人为干预产生（例如，通过诱变克隆的DNA序列），如经诱导的点、缺失、插入和置换突变体。通常优选的是氨基酸序列中的微小变化，如保守氨基酸替换、小的内部缺失或插入、以及分子端部的添加或缺失。这些修饰可以导致氨基酸序列变化、提供沉默突变、修饰限制性位点或提供其它特定突变。

本发明提供了将核酸递送至细胞的方法，其包括：向所述细胞施用含有载体的AAV颗粒，所述载体包含插入到一对AAV末端反向重复序列之间的核酸，从而将所述核酸递送至所述细胞。向所述细胞的施用可以通过任何方式实现，包括简单地使颗粒与所述细胞接触，所述颗粒任选地被包含在所需液体（如组织培养液或缓冲盐溶液）中。可以允许所述颗粒保持与所述细胞接触任意所需长度的时间，并且通常施用并允许所述颗粒无限期保持。对于此类体外方法，可以通过标准病毒转导方法向细胞施用病毒，如本领域已知并且如本文所例示的。施用的病毒效价可以变化，具体取决于细胞类型，但通常将是一般用于AAV转导的那类型。另外，可以使用用于转导本发明的实例中的特定细胞的效价。所述细胞可以包括人类以及其它大型（非啮齿类）哺乳动物（如灵长类、马、绵羊、山羊、猪和狗）中的任何所需细胞。

更具体地讲，本发明提供了将核酸递送至脑部细胞（特别是中型多棘神经元）的方法，其包括：插入到一对AAV末端反向重复序列之间的核酸，从而将所述核酸递送至所述细胞。

本发明还提供了将核酸递送至个体内细胞的方法，其包括：向所述个体施用AAV颗粒，所述AAV颗粒包含插入到一对AAV末端反向重复序列之间的核酸，从而将所述核酸递送至所述个体内的细胞。

还提供了将核酸递送至脑细胞（如个体的纹状体或皮质中的神经元）的方法，其包括：向所述个体施用AAV颗粒，所述AAV颗粒包含插入到一对AAV末端反向重复序列之间的核酸，从而将所述核酸递送至所述神经元或所述个体内的其它细胞。

本公开的某些实施方案提供了细胞，其包含如本文所述的病毒载体。

AAV载体

在一个实施方案中，本公开的病毒载体是AAV载体。“AAV”载体指代腺相关病毒，并且可被用于指代天然存在的野生型病毒本身或其衍生物。该术语涵盖了所有的亚型、血清型和假型，以及天然存在的和重组形式，除非其中另有要求。如本文所用，术语“血清型”指代这样的AAV，其基于与限定的抗血清的衣壳蛋白反应性而被识别并与其它AAV区分，例如，存在八种已知的灵长类AAV血清型、AAV-1至AAV-9以及AAVrh10。例如，血清型AAV2被用于指代这样的AAV，其含有AAV2的cap基因所编码的衣壳蛋白和来自同一AAV2血清型的含有5'和3’ITR序列的基因组。如本文所用，例如，rAAV1可被用于指代同时具有来自同一血清型的衣壳蛋白和5'-3'ITR的AAV，或其可指代这样的AAV，其具有来自一种血清型的衣壳蛋白和来自不同AAV血清型的5'-3'ITR，例如，来自AAV血清型2的衣壳蛋白和来自AAV血清型5的ITR。对于本文所示的每个实例，对载体设计和生产的说明描述了衣壳和5'-3' ITR序列的血清型。缩写“rAAV”指代重组腺相关病毒，也被称为重组AAV载体（或“rAAV载体”）。

“AAV病毒”或“AAV病毒颗粒”指代由至少一种AAV衣壳蛋白(优选由野生型AAV的所有衣壳蛋白)和包被的多核苷酸构成的病毒颗粒。如果所述颗粒包含异源多核苷酸（即，不同于野生型AAV基因组的多核苷酸，如待递送至哺乳动物细胞的转基因），则其通常被称为“rAAV”。

在一个实施方案中，使用已知技术构建AAV表达载体以至少在转录方向上操作性连接的组分的形式提供，控制元件包括转录起始区、目标DNA和转录终止区。所述控制元件被选为在哺乳动物细胞中起作用。所得的含有操作性连接组分的构建体侧接（5'和3’）功能性AAV ITR序列。

所谓“腺相关病毒末端反向重复序列”或“AAV ITR”是指存在于AAV基因组的各端部的本领域公认的区，其作为DNA复制起点并作为病毒的包装信号共同顺式作用。AAV ITR，连同AAV rep编码序列，提供了有效的剪切和拯救以及将置于两个侧翼ITR之间的核苷酸序列整合至哺乳动物基因组中。

AAV ITR区的核苷酸序列是已知的。如本文所用，“AAV ITR”不必具有所述野生型核苷酸序列，但可例如通过核苷酸的插入、缺失或置换而改变。另外，AAV ITR可来源于若干AAV血清型中的任一种，包括但不限于：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7等。此外，在AAV载体中侧接选定核苷酸序列的5'和3'ITR不必一定相同或来源于同一AAV血清型或分离物，只要其发挥预期功能，即，当细胞中存在AAV Rep基因产物时，允许从宿主细胞基因组或载体剪切和拯救目标序列，并且允许将异源序列整合到受体细胞基因组中。

在一个实施方案中，AAV ITR可来源于若干AAV血清型中的任一种，包括但不限于：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7等。此外，在AAV表达载体中侧接选定核苷酸序列的5'和3'ITR不必一定相同或来源于同一AAV血清型或分离物，只要其发挥预期功能，即，当细胞中存在AAV Rep基因产物时，允许从宿主细胞基因组或载体剪切和拯救目标序列，并且允许将DNA分子整合到受体细胞基因组中。

在一个实施方案中，AAV衣壳可以来源于AAV2。适合用于AAV载体中的DNA分子将在尺寸上小于约5千碱基对(kb)、小于约4.5 kb、小于约4kb、小于约3.5 kb、小于约3 kb、小于约2.5 kb并且是本领域已知的。

在一个实施方案中，所选核苷酸序列被可操作地连接至在个体内指导其体内转录或表达的控制元件。此类控制元件可以包含通常与所选基因关联的控制序列。作为另外一种选择，可以采用异源控制序列。可用的异源控制序列通常包括来源于编码哺乳动物或病毒基因的序列的那些。实例包括但不限于：SV40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子；腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)；单纯疱疹病毒(HSV)启动子、细胞巨化病毒(CMV)启动子如CMV立即早期启动子区(CMVIE)、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、pol II启动子、pol III启动子、合成启动子、杂交启动子等。另外，来源于非病毒基因（如小鼠金属硫蛋白基因）的序列也将用于本文中。此类启动子序列可商购自例如Stratagene(San Diego, Calif.)。

在一个实施方案中，异源启动子和其它控制元件，如CNS-特异性启动子和诱导型启动子、增强子等，均将具有特定用途。异源启动子的实例包括CMV启动子。CNS特异性启动子的实例包括分离自髓鞘碱性蛋白(MBP)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)的基因的那些。诱导型启动子的实例包括针对蜕皮激素、四环素、缺氧和生长素的DNA反应元件。

在一个实施方案中，可以通过将所选序列直接插入AAV基因组中来构建包含由AAVITR结合的目标DNA分子的AAV表达载体，所述AAV基因组已经切除了主要AAV开放阅读框（“ORF”）。所述AAV基因组的其它部分也可以缺失，只要保留足够的ITR部分以允许复制和包装功能。此类构建体可使用本领域熟知的技术设计。

作为另外一种选择，AAV ITR可以从病毒基因组中或从含有它的AAV载体中被切除并使用标准连接技术而被融合至存在于另一载体中的所选核酸构建体的5'和3'。例如，连接可以在以下中实现：20 mM Tris-Cl pH 7.5、10 mM MgCl₂、10 mM DTT、33 µg/ml BSA、10mM-50 mM NaCl、以及40 uM ATP、0.01-0.02(Weiss)单位T4 DNA连接酶于0°C(对于“粘端”连接)或1 mM ATP、0.3-0.6(Weiss)单位T4 DNA连接酶于14°C(对于“平端”连接)。分子间“粘端”连接通常在30-100 µg/ml的总DNA浓度(5-100 nM的总最终浓度)下进行。含有ITR的AAV载体。

另外，可以合成产生嵌合基因以在一个或多个所选核酸序列的5'和3'包含AAVITR序列。可以使用在哺乳动物CNS细胞中表达嵌合基因序列的优选密码子。从通过标准方法制备的重叠寡核苷酸装配出完整的嵌合序列。

为了生产rAAV病毒粒子，使用已知技术（如通过转染）将AAV表达载体引入到合适的宿主细胞中。许多转染技术是本领域众所周知的。参见，例如，Sambrook 等人(1989)Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, NewYork。特别合适的转染方法包括：磷酸钙共沉淀、直接微注射入培养细胞中、电穿孔、脂质体介导的基因转移、脂质介导的转导以及使用高速微粒的核酸递送。

在一个实施方案中，适用于生产rAAV病毒粒子的宿主细胞包括微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，其可以或已经被用作异源DNA分子的受体。该术语包括已经转染的原始细胞的子代。因此，如本文所用的“宿主细胞”通常指代已经用外源DNA序列转染的细胞。来自稳定人类细胞系293（可容易地从例如美国典型培养物保藏中心以登录号ATCCCRL1573获得）的细胞可以被用在本公开的实践中。具体地讲，人类细胞系293是已经用5型腺病毒DNA片段转化的人胚肾细胞系，并表达腺病毒E1a和E1b基因。293细胞系易于转染，并提供了特别便利的平台以生产rAAV病毒粒子。

所谓“AAV rep编码区”是指本领域公认的AAV基因组的区，其编码复制蛋白Rep78、Rep 68、Rep 52和Rep 40。已经证明，这些Rep表达产物具有许多功能，包括识别、结合并缺刻AAV的DNA复制起点、DNA解旋酶活性以及调节来自AAV（或其它异源）启动子的转录。复制AAV基因组需要全体的Rep表达产物。AAV rep编码区的合适的同源物包括人疱疹病毒6(HHV-6) rep基因，已知其还介导AAV-2 DNA复制。

所谓“AAV cap编码区”是指本领域公认的AAV基因组的区，其编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3或其功能性同源物。这些Cap表达产物提供了包装功能，其整体是包装病毒基因组所需的。

在一个实施方案中，通过在AAV表达载体转染之前或同时用AAV辅助构建体转染宿主细胞而将AAV辅助功能引入宿主细胞中。AAV辅助构建体因此被用于提供AAV rep和/或cap基因的至少瞬时表达以弥补缺失的生产性AAV感染所必需的AAV功能。AAV辅助构建体不含AAV ITR并且不可以自行复制或包装。这些构建体可以是质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒粒子的形式。已经描述了许多AAV辅助构建体，如常用的质粒pAAV/Ad和pIM29+45，其同时编码Rep和Cap表达产物。已经描述了许多编码Rep和/或Cap表达产物的其它载体。

病毒载体的递送方法包括将AAV注射到个体中。通常，可使用体内或体外转导技术将rAAV病毒粒子引入到CNS的细胞中。如果经体外转导，则所需的受体细胞将从个体中被移除，用rAAV病毒粒子转导并被重新引入到该个体中。作为另外一种选择，可以使用同种或异种细胞，其中这些细胞将不会在该个体中生成不恰当的免疫应答。

已经描述了合适的用于将经转导的细胞递送和引入个体中的方法。例如，细胞可以通过如下进行体外转导：例如，在适当的培养液中将重组AAV病毒粒子与CNS细胞结合，并筛选那些携带目标DNA的细胞，可以使用常规技术如Southern印迹和/或PCR或通过使用选择标志物进行筛选。随后可以将经转导的细胞配制成药物组合物（详述于下），并通过各种技术将所述组合物引入个体中，如通过移植、肌内注射、静脉内注射、皮下注射和腹腔内注射。

在一个实施方案中，药物组合物将包含足够的遗传物质以产生治疗有效量的目标核酸，即，所述量足以减轻或改善所考虑的疾病状态的症状或足以赋予所需的益处。所述药物组合物还将含有药学上可接受的赋形剂。此类赋形剂包括任何药物试剂，其自身不会诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，并且其可被施用而无异常毒性。药学上可接受的赋形剂包括但不限于：山梨糖醇、Tween80以及液体如水、盐水、甘油和乙醇。其中可以包括药学上可接受的盐，例如，矿物酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸盐如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。另外，此类媒介物中可含有辅料，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等。有关药学上可接受的赋形剂的全面讨论可参见Remington'sPharmaceutical Sciences (Mack Pub.Co., N.J.1991)。

应当理解，可以通过所递送的病毒载体表达不止一个转基因。作为另外一种选择，各自表达一个或多个不同转基因的单独的载体也可以如本文所述被递送至个体。此外，还预期将由本公开的方法递送的病毒载体与其它合适的组合物和疗法结合。

正如根据本说明书的教导而对于本领域技术人员显而易见的是，必须添加的病毒载体的有效量可以凭经验确定。可以在整个治疗过程中连续地或间歇地以一个剂量施用。确定最有效的施用方式和剂量的方法是本领域技术人员熟知的，并且将随病毒载体、治疗组成、靶细胞和接受治疗的个体而变化。可以采用由主治医生选择的剂量水平和模式进行单次和多次施用。

在某些实施方案中，rAAV以约0.3-2 ml的1x10⁵ -1x10¹⁶vg/ml的剂量施用。在某些实施方案中，rAAV以约1-3 ml的1x10⁷ -1x10¹⁴vg/ml的剂量施用。在某些实施方案中，rAAV以约1-2 ml的1x10⁸ -1x10¹³vg/ml的剂量施用。

含有rAAV颗粒的制剂将在媒介物中含有有效量的rAAV颗粒，所述有效量可由本领域技术人员容易地确定。rAAV颗粒可通常占组合物的约1%至约95%(w/w)或甚至更高或更低（如果合适）。待施用的量取决于诸如考虑治疗的动物或人类个体的年龄、重量和身体状况等因素。有效剂量可以由本领域普通技术人员通过常规试验建立剂量反应曲线而确立。通过施用一个或多个剂量的rAAV颗粒来治疗个体。可按需施用多个剂量以维持充足的酶活性。

本发明可以采用的媒介物包括：水、盐水、人工CSF或其它已知物质。为了制备制剂，可以分离、冻干并稳定经纯化的组合物。随后可将组合物调整至合适的浓度，任选地与抗炎剂组合，并包装备用。

本发明提供了提高细胞中靶蛋白水平的方法，其通过将一定量的上述蛋白质或编码蛋白质的核酸分子引入到细胞中而实现，所述量足以提高所述细胞中所述靶蛋白的水平。在某些实施方案中，靶蛋白的积聚被提高至少10%。靶蛋白的积聚被提高至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%。

此外，可根据所需施用途径（例如且不限于，用于全身施用）选择/设计AAV载体，可使用能够穿过血脑屏障的AAV载体（例如，AAV9或含有AAV9衣壳蛋白的嵌合AAV载体）。本发明还提供了向血液中施用AAV的方法，因为一些血清型能够穿过血脑屏障。

靶向肽

已经识别出这样的肽，其起到将试剂如病毒载体靶向中枢神经系统的血管内皮细胞的作用。本公开描述了使用这些新型肽以将例如病毒衣壳重定向至目标细胞类型的方法。在这种情况下，识别出的肽靶向脑血管内衬的内皮细胞。经修饰以包含此类肽的包含衣壳蛋白的载体可以被用于提供针对中枢神经系统（例如，脑）的治疗剂。

如本文所用，术语“靶向”意指病毒（如腺相关病毒（AAV））的衣壳蛋白结合一种类型的组织（例如，脑组织）优先于另一种类型的组织（例如，肝组织），并且/或者结合处于某种状态下的组织（例如，野生型或病变的）。在某些实施方案中，基因修饰的衣壳蛋白可通过以高于可比较的未修饰的衣壳蛋白10%至1000%的水平结合而“靶向”脑血管上皮组织。例如，具有基因修饰的衣壳蛋白的AAV可以大于未修饰的AAV病毒50%至100%的水平结合脑血管上皮组织。在某些实施方案中，编码病毒的衣壳蛋白的核酸经过修饰使得所述病毒衣壳在患有溶酶体贮积症的哺乳动物中优先结合脑血管内皮细胞，或使用不同的序列，在同一物种的脑中优先结合野生型脑血管内皮细胞。

本发明提供了含有靶向肽的经修饰的腺相关病毒（AAV）衣壳蛋白，其中所述靶向肽长3至10个氨基酸，并且其中所述靶向肽将AAV靶向至脑血管内皮细胞。在某些实施方案中，所述靶向肽长3、4、5、6或7个氨基酸。在某些实施方案中，所述AAV是AAV2，但嗜性按照以下原则经过修饰：此类修饰将改变任何AAV的嗜性。

本公开的某些实施方案提供了包含经修饰的衣壳的病毒载体，其中所述经修饰的衣壳包含将所述病毒载体靶向至脑血管内皮细胞的至少一个氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述病毒载体是腺相关病毒载体（AAV）。在某些实施方案中，所述AAV是AAV2。

在某些实施方案中，所述靶向肽靶向野生型脑血管内皮细胞。在某些实施方案中，所述靶向肽是PXXPS (SEQ ID NO:44)、SPXXP (SEQ ID NO:45)、TLH (SEQ ID NO:46)或QSXY (SEQ ID NO:47)，按氨基至羧基取向或羧基至氨基取向表达。在某些实施方案中，所述靶向肽是PYFPSLS (SEQ ID NO:48)、YAPLTPS (SEQ ID NO:49)、PLSPSAY (SEQ ID NO:50)、DSPAHPS (SEQ ID NO:51)、GTPTHPS (SEQ ID NO:52)、PDAPSNH (SEQ ID NO:53)、TEPHWPS (SEQ ID NO:54)、SPPLPPK (SEQ ID NO:55)、SPKPPPG (SEQ ID NO:56)、NWSPWDP(SEQ ID NO:57)、DSPAHPS (SEQ ID NO:58)、GWTLHNK (SEQ ID NO:59)、KIPPTLH (SEQ IDNO:60)、ISQTLHG (SEQ ID NO:61)、QSFYILT (SEQ ID NO:62)或TTQSEYG (SEQ ID NO:63)，按氨基至羧基取向或羧基至氨基取向表达。应当指出的是，序列的取向并不重要。例如，所述肽按所述肽的氨基末端至羧基末端取向可能是TTQSEYG (SEQ ID NO:63)或按所述肽的氨基末端至羧基末端取向可能是GYESQTT (SEQ ID NO:65)。

在某些实施方案中，所述靶向肽靶向病变的脑血管内皮细胞。在某些实施方案中，所述靶向肽靶向患有溶酶体贮积症的个体的脑血管内皮细胞。在某些实施方案中，所述靶向肽靶向粘多糖(MPS) VII脑血管内皮细胞。在某些实施方案中，所述靶向肽是LXSS (SEQID NO:66)、PFXG (SEQ ID NO:67)或SIXA (SEQ ID NO:68)，按氨基至羧基取向或羧基至氨基取向表达。在某些实施方案中，所述靶向肽是MLVSSPA (SEQ ID NO:69)、LPSSLQK (SEQID NO:70)、PPLLKSS (SEQ ID NO:71)、PXKLDSS (SEQ ID NO:72)、AWTLASS (SEQ ID NO:73)、WPFYGTP (SEQ ID NO:74)、GTFPFLG (SEQ ID NO:75)、GQVPFMG (SEQ ID NO:76)、ANFSILA (SEQ ID NO:77)、GSIWAPA (SEQ ID NO:78)或SIAASFS (SEQ ID NO:79)，按氨基至羧基取向或羧基至氨基取向表达。

在某些实施方案中，所述靶向肽靶向TPP1脑血管内皮细胞。在某些实施方案中，所述靶向肽是GMNAFRA (SEQ ID NO:64)，按氨基至羧基取向或羧基至氨基取向表达。

在某些实施方案中，所述靶向脑血管内皮细胞的氨基酸序列包含SEQ ID NO 44-47中的至少一个。

在某些实施方案中，所述靶向脑血管内皮细胞的氨基酸序列包含SEQ ID NO 66-68中的至少一个。

在某些实施方案中，所述靶向脑血管内皮细胞的氨基酸序列包含SEQ ID NO 48-63中的至少一个。

在某些实施方案中，所述靶向脑血管内皮细胞的氨基酸序列包含SEQ ID NO 69-79中的至少一个。

在某些实施方案中，所述靶向脑组织的氨基酸序列选自下表1中所列的那些：

表1：靶向脑的PM-AAV

名称	序列	SEQ ID NO.	靶向
				THR	THRPPMWSPVWP	80	转铁蛋白
CRT	CRTIGPSVC	81	转铁蛋白
				BX2	GHKVKRPKG	82	转铁蛋白
BX3	KDKIKMDKK	83	转铁蛋白
				BX6	GHKAKGPRK	84	转铁蛋白
BX8	KWKTPKVRV	85	转铁蛋白
				AAV-PPS	DSPAHPS	51	野生型
	PYFPSLS	48	野生型
					YAPLTPS	49	野生型
	PLSPSAY	50	野生型
					GTPTHPS	52	野生型
	PDAPSNH	53	野生型
					TEPHWPS	54	野生型
	SPPLPPK	55	野生型
					SPKPPPG	56	野生型
	NWSPWDP	57	野生型
				AAV-TLH	GWTLHNK	59	野生型
	KIPPTLH	60	野生型
					ISQTLHG	61	野生型
	QSFYILT	62	野生型
					TTQSEYG	63	野生型
AAV-PFG	WPFYGTP	74	MPS VII
					GTFPFLG	75	MPS VII
	GQVPFMG	76	MPS VII
					PPLLKSS	71	MPS VII
	MLVSSPA	69	MPS VII
					AWTLASS	73	MPS VII
AAV-LSS	LPSSLQK	70	MPS VII
					PXKLDSS	72	MPS VII
	GSIWAPA	78	MPS VII
					ANFSILA	77	MPS VII
	SIAASFS	79	MPS VII
				AAV-GMN	GMNAFRA	64	CLN2

在某些实施方案中，所述靶向脑血管内皮细胞的氨基酸序列靶向患病（例如溶酶体贮积症）个体的脑血管内皮细胞。

在某些实施方案中，所述靶向脑血管内皮细胞的氨基酸序列靶向不患有溶酶体贮积症的个体的脑血管内皮细胞。

在某些实施方案中，所述病毒载体包含编码治疗剂的核酸序列。在某些实施方案中，所述治疗剂是β-葡糖苷酸酶。

在某些实施方案中，所述靶向脑血管内皮细胞的氨基酸序列至多长十个氨基酸。

在某些实施方案中，所述靶向脑血管内皮细胞的氨基酸序列长3、4、5、6或7个氨基酸。

本公开的某些实施方案提供了核酸序列，其编码如本文所述的病毒载体。

本公开的某些实施方案提供了核酸序列，其编码如本文所述的经修饰的衣壳。本公开的某些实施方案提供了经修饰的衣壳，其由本文所述的核酸序列编码。

本公开的某些实施方案提供了细胞，其包含如本文所述的病毒载体。

本公开的某些实施方案提供了细胞，其由如本文所述的病毒载体转导。

在某些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，所述细胞是人类细胞。在某些实施方案中，所述细胞是非人细胞。在某些实施方案中，所述细胞在体外。在某些实施方案中，所述细胞在体内。在某些实施方案中，所述细胞是内皮细胞。在某些实施方案中，所述细胞是血管内皮细胞。

本发明的试剂的剂量、制剂和施用途径

优选施用本发明的试剂以导致减少至少一种与疾病相关的症状。施用量将根据各种因素而变化，所述因素包括但不限于：所选组合物、具体疾病、哺乳动物的重量、身体状况和年龄、以及想要实现预防还是治疗。此类因素可以由临床医生采用本领域熟知的动物模型或其它测试系统容易地确定。如本文所用，术语“治疗性siRNA”指代对接受者具有有益效果的任何siRNA。因此，“治疗性siRNA”同时包括治疗性和预防性siRNA。

siRNA的施用可通过施用编码该siRNA的核酸分子而实现。核酸的药物制剂、剂量和施用途径是众所周知的。

本发明设想了通过施用本发明的试剂（例如，核酸组合物、表达载体或病毒颗粒）在哺乳动物中治疗亨廷顿氏病。根据本发明施用治疗剂可以是连续的或间歇的，取决于例如接受者的身体状况、施用目的是治疗性还是预防性、以及技术人员已知的其它因素。施用本发明的试剂可以是在预选的时间段上基本上连续的或可以是一系列间隔的剂量。设想了局部和全身施用。

含有本发明的治疗剂的一种或多种合适的单位剂型，如下所述，可任选地被配制成持续释放（例如使用微胶囊化，参见WO 94/07529和美国专利No.4,962,091，其公开内容以引用方式并入本文），其可以通过各种途径施用，包括胃肠外，包括通过静脉内和肌内途径，以及通过直接注射到病变组织中。例如，治疗剂可被直接注射到脑部中。作为另外一种选择，针对脑和脊髓状况，治疗剂可被鞘内引入。又如，针对从肌肉回运至受影响神经元的病毒，如AAV、慢病毒和腺病毒，治疗剂可被肌内引入。所述制剂（在适当情况下）可以离散单位剂型方便地制备，并且可通过药剂学领域熟知的任何方法制备。此类方法可包括以下步骤：使治疗剂与液体载体、固体基质、半固体载体、细分的固体载体或其组合缔合，并随后，如果有必要，将产物引入或适形至所需递送系统中。

当制备本发明的治疗剂用于施用时，优选地将其与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合以形成药物制剂或单位剂型。此类制剂中包含的总活性成分按制剂的重量计在0.1至99.9%。“药学上可接受的”是指载体、稀释剂、赋形剂和/或盐与制剂的其它成分相容并且对其接受者无害。用于施用的活性成分可以粉末或颗粒、溶液、悬浮液或乳液的形式提供。

含有本发明的治疗剂的药物制剂可以通过本领域已知的程序使用熟知并容易获得的成分制备。本发明的治疗剂还可以被配制成适于胃肠外施用的溶液，例如通过肌内、皮下或静脉内途径。

本发明的治疗剂的药物制剂还可以采取水溶液或无水溶液或分散液的形式，或作为另外一种选择，采取乳液或悬浮液的形式。

因此，所述治疗剂可被配制成用于胃肠外施用（例如，通过注射，例如，推注或连续输注）并且可以单位剂型在安瓿、预装填注射器、小容量输液容器或含有添加的防腐剂的多剂量容器中提供。所述活性成分可采取如在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可含有配方试剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。作为另外一种选择，所述活性成分可以是粉末形式，其通过无菌分离灭菌固体或通过冻干溶液而获得，用于在使用前与合适的媒介物（例如，灭菌的、无热原的水）组构。

应当理解，各剂型的单个气溶胶剂量中所含的单位活性成分含量其本身不必构成用于治疗特定指征或疾病的有效量，因为必要的有效量可以通过施用多个剂量单位而达到。此外，所述有效量可使用小于剂型中的剂量单独地或在一连串施用中达到。

本发明的药物制剂可包含药学上可接受的载体、稀释剂、增溶剂或乳化剂以及本领域熟知类型的盐作为任选成分。可用于本发明的药物制剂中的载体和/或稀释剂的具体非限制性实例包括：水和生理上可接受的缓冲盐水溶液（如磷酸盐缓冲盐水溶液）、pH 7.0-8.0的盐水溶液和水。

现在将通过以下非限制性实施例说明本发明。

实施例 1

单核苷酸种修饰恢复小鼠脑中毒性miRNA序列的体内耐受性

亨廷顿氏病(HD)是由于亨廷顿蛋白(HTT)的多谷氨酰胺扩增形式的表达所引起的致命的神经退行性疾病。近来的研究表明，包括RNA干扰(RNAi)在内的基因沉默方法改善HD小鼠模型中的疾病指示数据。为了将靶向HTT的RNAi应用于临床上，我们设计了RNAi构建体，HDS1，其具有稳健的对靶标的沉默功效和最小化的非预期人转录物沉默(McBride 等人，Mol Ther.Dec 2011; 19(12): 2152-2162)。在恒河猴中，将AAV.miHDS1递送至壳核降低了HTT表达而在注射后6周对神经功能状态（包括精细和粗放运动技能）没有不利影响、无免疫活化并且无神经病理发生。其他人证明了，注射后6个月，另一不同的靶向HTT的RNAi在猴子中的安全性。

将HDS1应用于HD患者需要在啮齿类动物中进行进一步的安全测试，尽管其是针对人类进行优化的。为了满足这一监管要求，我们评价了接受AAV.miHDS1注射后的小鼠。与猴子不同，小鼠脑中发生了急性神经功能缺损并且可以归咎于miHDS1与其它转录物的3’未翻译区的相互作用所造成的脱靶沉默。虽然我们解决了miHDS1在小鼠脑中的毒性并保持了miHDS1沉默功效，但这些研究凸显了，优化基于核酸的药物的人类使用安全性在啮齿类动物或其它远亲物种的安全性测试上面临挑战。

HD是由亨廷顿蛋白的第一个外显子内的CAG重复扩增(>36个重复)引起的。尽管突变型亨廷顿蛋白(mHTT)广泛表达，但脑部并且尤其是纹状体显示出稳健并更早的退化。HD在欧洲和美国的发病率为~5-10/100,000人，其通常在三十或四十岁左右发作。迄今为止，HD的管理包括可以减少运动或精神症状的药物。

使用可诱导的HD模型的更早期的研究表明，一旦关闭mHTT表达，则疾病症状得以改善，甚至在疾病发作许多周之后以及纹状体萎缩之后也是如此。这意味着，存在一个在早期症状发作后治疗HD的时机。因此，使用基因沉默技术（包括RNAi）降低基因表达的方法应当作为备选的治疗手段加以研究。

RNAi是进化上保守的转录后基因沉默方法，通过这种方法，双链小型非编码RNA(例如，miRNA)引起靶mRNA序列的序列特异性降解。内源RNAi途径始于表达较大的初级RNA转录物(pri-miRNA)，其随后在细胞核中被Drosha（微处理器复合物的组分）切割，以生成前体miRNA(pre-miRNA)。Pre-miRNA被输出至细胞质中并随后被Dicer切割以释放成熟的miRNA。miRNA序列的两条链之一(反义“引导”链)通常被优先并入到RNA诱导沉默复合体(RISC)中，其中其将指导结合靶mRNA并抑制表达。MiRNA通常通过部分互补而抑制mRNA表达。当由Dicer切割产生的dsRNA的一条链与其靶标完全互补时，所得到的小型干扰RNA(siRNA)指导该靶标在所述“引导”链的核苷酸10和11对面的碱基处进行核酸内切割，触发mRNA破坏。科学家已经开发了不同的基于表达的系统以利用内源RNAi途径并抑制特定基因的表达。例如，RNAi表达系统可以经过设计以表达小型发夹RNA序列，其中其链之一与靶mRNA互补，并且在pre-miRNA(短发夹RNA；shRNA)或pri-miRNA(人工miRNA)步骤进入所述途径。

对于急性转染至细胞中的表达系统或siRNA而言，有活性的引导链被设计成尽可能特异的并具有最小的偏离序列的沉默。由于引导与其它具有完全互补性的转录物的相互作用而产生的偏离序列的沉默可以使用标准搜索算法而得以避免。更难以避免的脱靶类型是由于RNAi种序列（装载链的5’端的碱基2-7）与其它mRNA 3’UTR序列的部分互补而发生的那种。在这种情况下，表达抑制经由miRNA样机制进行。在之前的研究中，我们开发了算法siSPOTR以设计强力RNAi序列，其对RISC装载具有强烈的链偏好，并且对未预期的人转录物具有最小化的脱靶沉默潜力。当siSPOTR被用于设计HTT沉默的触发物时，我们发现，miHDS1（由AAV载体表达）在被递送至非人灵长类的壳核后在多个水平上显示出安全性。

作为人类应用的先决条件，我们进行了后续实验以评估在正常啮齿类动物中的安全性。值得注意的是，我们发现，在纹状体注射后，HDS1诱导了稳健的运动缺陷，其可以归咎于未预期的Bcl2沉默。我们还证明，可以在保持HTT沉默功效的同时通过若干策略解决脱靶毒性。总而言之，这些研究凸显了优化基于核酸的药物在人类中的特异性和安全性的困难：当其用在远亲物种中时将表现不同，并且可能具有诱导疾病、脱靶的概况。

结果

miHDS1在小鼠脑中诱导神经功能缺损。

在之前的研究中，我们设计了miHDS1，一种针对亨廷顿蛋白的人工miRNA序列，其具有高靶标沉默功效和最小化的脱靶可能性(图1A)。当表达miHDS1的AAV载体被注射到非人灵长类的壳核中时，HTT水平显著降低并且不存在神经元变性、免疫应答或运动缺陷的病征。总而言之，这些研究凸显了miHDS1作为HD治疗剂的潜力。然而，作为人类应用的先决条件，需要在其它物种如啮齿类动物中进一步测试。因此，我们着手在正常小鼠中进行AAV.miHSD1的安全性测试，尽管其事实上是针对人类细胞中的安全性设计的。

作为建立临床前构建体的第一步，我们重新设计了AAV.miHSD1载体以包含填充序列而非eGFP表达盒，其在我们的早期研究中被用于转导区域的可视化。所述填充序列经过设计以缺少增强子或阻遏子序列、剪接活化因子或阻遏子以及反义或其它非编码RNA，并具有足够的大小用于小型RNAi表达盒的最优包装。最终的AAV2/1载体表达miHDS1或miCtl（在我们早期的许多体内研究中使用的对照）(图1B)。

在7周龄，对野生型小鼠进行称重并评估基本转杆表现，之后将动物分配到具有同等能力的组中(以避免组间的治疗前差异)。在8周龄时，采用AAVmiHDS1/填充序列(n=13)和AAVmiCtl/填充序列(n=11)病毒将AAV.miHDS1或AAV.miCtl双侧注射到纹状体中(图1C、D)。早在AAV递送2个月后，表达miHDS1的小鼠就具有显著的转杆缺陷并相比用对照治疗的同窝小鼠显示出缩短的掉落延迟时间(图1D)。并且，虽然在研究期间所有动物均增重，但用HDS1治疗的小鼠的增重明显低于用miCtl治疗的小鼠(图1E)。

在小鼠脑中表征miHDS1脱靶基因。

miHDS1被设计成具有最小化的人转录物脱靶沉默，但并未针对在小鼠中的安全性进行优化，并且我们之前并未从生物信息学上评价所述序列针对小鼠转录物的潜在毒性。尽管早先在猴子中使用的AAV.miHDS1.eGFP构建体显示出正确的链装载，但我们接下来测试了miHDS1.填充序列表达盒的链偏好的保真度，因为任一条链，如果装载，都可能诱发脱靶沉默。为此，我们设计了由克隆到萤光素酶报道基因的下游的miHDS1靶标组成的报道构建体。我们发现，引导链受到抑制，而非引导链未受抑制(图1G)。这与我们早先对HDS1.eGFP表达盒的体外表达分析是一致的，并且得到了以下事实的支持：我们设计出具有低的5’端热力学稳定性的miHDS1序列以促进将引导“反义”链正确装载到RISC复合体中。因此，由miHDS1表达所观察到的神经功能缺损很可能是由于引导“反义”链与未预期的mRNA的3’UTR结合以及通过miRNA样机制的沉默表达造成的。

因为之前的研究表明，大多数脱靶效应是由于种介导的与其它mRNA 3’UTR的结合造成的，所以我们首先使用常用的生物信息学方法识别出可能的miHDS1脱靶。已经描述了许多不同的靶标预测程序以识别推测的miRNA结合位点，如TargetScan(TS)和PITA算法。TargetScan通过搜索3’UTR序列中与miRNA种序列互补的8聚体和7聚体位点的存在来预测该特定miRNA的生物靶标。该算法通过优先考虑已知有利于miRNA介导的调控的具有补偿性3’碱基配对、本地序列背景和强序列保守性的靶位点而提高了靶标预测的准确性。因为之前的研究已经显示，种介导的脱靶效应是物种特异性的，所以我们基于小鼠3’UTR转录物组中的种序列互补性使用了TargetScan以预测靶标。PITA算法结合了靶位点可及性以预测miRNA结合位点。对于给定的靶位点，PITA确定ddG分值，即miRNA与靶标结合(dG_双链)和与靶位点核苷酸失配(dG_开放)之间的自由能差异。根据PITA，ddG分数低于-10更有可能对内源miRNA靶标具有功能性，但针对过表达的miRNA序列的阈值可能更高(0至-10之间)。因此，在我们的方法中，我们使用了TargetScan以识别所有可能的种结合位点，然后采用PITA算法以确定ddG分数，并对所有可能的miHDS1位点进行排序。使用我们的方法针对小鼠3’UTR组，我们预测了197种转录物作为潜在的miHDS1脱靶，其中170种在纹状体中表达(图3c)。正如所预计的，对直系同源的人和恒河猴的3’UTR中miHDS1脱靶的预测显示，小鼠中的miHDS1脱靶不是保守的。

我们在脱靶基因列表的前25百分位数中识别出了Bcl2、Sdf4、Smad9、Bmi1、Mettl2、Lancl1和Map2k6(图2a、b)。我们通过Q-PCR分析了得自用miCtl或miHDS1治疗的小鼠的纹状体样品中的这些预测的脱靶和小鼠Htt。正如所预计的，相比用miCtl治疗的小鼠，在用miHDS1治疗的小鼠中的小鼠Htt表达显著降低(最多达70%)(图2c)。在所评估的这组脱靶转录物中，Bcl2、Sdf4和Map2k6在得自用AAV.miHDS1治疗的小鼠的组织样品中显著降低(图2c)。这些转录物无一预测受miCtl影响。我们使用具有正常Htt等位基因的永生化小鼠神经元纹状体细胞系(SthdhQ7细胞)确认了这些结果。用表达miHDS1、miCtl或不表达转录物(仅含有U6启动子)的质粒对SthdhQ7细胞进行电穿孔，并在24小时后，通过Q-PCR分析转录物。正如在小鼠脑中所观察到的，Bcl2的表达在表达miHDS1的细胞中降低，但在用表达miCtl或对照U6的质粒处理的那些细胞中并未降低(图2d)。相比之下，通过miHDS1的过表达并未降低Sdf4和Map2k6的表达(图2d)，表明这些基因可能并非体内直接脱靶，并且可能反映了Htt抑制随时间推移的间接效应或在非神经元细胞中的脱靶抑制；尽管AAV2/1主要转导神经元。有趣的是，Smad9的表达在SthdhQ7细胞中显著升高，并且在用miHDS1处理的纹状体中升高，尽管并非如此显著。(图2d)。因此，我们的筛查显示，在小鼠的3’UTR组中，Bcl2是HDS1的潜在的有害脱靶。

针对在小鼠脑中的安全性拯救miHDS1。

当miRNA序列被装载到含有催化argonaute蛋白(Ago2)的RISC中时，需要miRNA与其靶序列之间的完全结合互补性以介导mRNA核酸内切割。然而，由miRNA序列上的单点突变产生的错配是可以容忍的。因此，为了调整miHDS1的脱靶概况（其主要由种区控制），我们引入了单点突变，其经过设计以改变种而不影响沉默功效(图3A)。

为了识别哪些种突变(i) 有效改变脱靶概况，(ii) 保持低的总脱靶可能性并且(iii) 沉默人HTT，作为第一步，我们使用miHDS1的所有单核苷酸种变体(位置2-7)重复了脱靶预测分析(图3C)。抛弃了位置8的突变体，因为其脱靶概况与miHDS1充分重叠。这是在意料之中的，因为对于miRNA介导的沉默而言，位置8的配对不是必要的。还抛弃了位置3和4的种突变体，因为这些突变显著增加了预测脱靶的数目。对于剩下的种变体而言，总脱靶可能性与miHDS1相当，其中小于10%的miHDS1脱靶在miHDS1变体间共享(图3C)。

因此，我们在miHDS1种区的位置2、5、6和7引入了单点突变以生成miHDS1变体。由于我们的目标是沉默人HTT，所以我们首先在来源于人的HEK293细胞系中筛查了所有变体并通过Q-PCR确定了沉默功效(图4A)。并非所有miHDS1变体均等同原始miHDS1般降低HTT表达。相比miHDS1，在位置2和7具有错配的miHDS1变体破坏了miHDS1沉默功效。然而，在位置5或6含有错配的miHDS1变体并未观察到显著差异。值得注意的是，在不同的于位置7具有错配的miHDS1变体中，仅具有C>U置换的变体与miHDS1具有等同的沉默功效，这可能是由于G:U摆动的热力学稳定性造成的。我们选择miHDS1v6A和miHDS1v5U用于进一步实验，其根据是：(1) 其更高的沉默功效，相对于在相同种位置含有错配的其它miRNA变体，和(2) 所生成的核苷酸错配类型(U:U，miHDS1v5U；A:G，miHDS1v6A，图4D)，其具有与HDS1充分不同的中等脱靶概况(图4B、4C、4E、4F)。

RISC装载的miRNA序列如下(备注: 3’→ 5’):

Pri-miHDS1如下(5’→ 3’):

Pre-miHDS1如下(5’→ 3’):

正如所预计的，miHDS1v6A和miHDS1v5U的表达降低了Htt蛋白在小鼠(SthdhQ7)和人(HEK293)细胞系中的水平，而与miHDS1没有显著差异(图4A-4E)。

接下来，我们评价了miHDS1v6A和miHDS1v5U对经验证的miHDS1脱靶小鼠转录物的影响。种配对稳定性(SPS)，即miRNA种与其靶mRNA之间结合的自由能，影响miRNA序列是否产生脱靶沉默效应。尽管miHDS1变体与原始miHDS1（针对其自己的靶标）具有相似的SPS值，但是miHDS1变体的种区内的错配降低了针对miHDS1脱靶的SPS值(图3b)。根据PITA，在种区内引入错配降低了所有的HDS1预测脱靶基因上的ddG分值，而miHDS1v6A比miHDS1v5U更显著。有趣的是，miHDS1变体的种序列在一些相同的miHDS1脱靶上生成了不同的靶位点。

我们之前证实了miHDS1对Bcl2的体内和体外沉默。根据TargetScan，miHDS1v6A和miHDS1v5U将不再靶向Bcl2 3’UTR，并且PITA预测了在miHDS1位点的降低的ddG分数，暗示miHDS1v6A或miHDS1v5U将削弱Bcl2沉默。为了测试这一点，用含有miRNA表达盒的质粒或仅含U6启动子的对照质粒对SthdhQ7细胞进行电穿孔，并在24小时后，通过Q-PCR确定Bcl2、Htt和Smad9的表达。相对于对照(miCtl和U6)，Htt mRNA水平在用miHDS1和miHDS1变体电穿孔的细胞中均显著降低(图4g)。但重要的是，尽管miHDS1显著降低Bcl2的表达（降幅达40%），但用miHDS1v6A电穿孔后未观察到沉默。miHDS1v5U的表达依然针对Bcl2有活性，将沉默水平保持在20%(图4h)。有趣的是，在用miHDS1v5U或miHDS1v6电穿孔的细胞中未观察到与miHDS1表达相关的Smad9过表达(图4i)。

重定向miCtl以针对人亨廷顿蛋白mRNA。

我们之前的实验披露了miHDS1的由于其脱靶效应造成的毒性，但也凸显了miCtl当在小鼠脑中表达时是可容忍的。MiCtl被设计成具有低脱靶沉默概况，但并非旨在靶向亨廷顿蛋白mRNA。因此，我们测试了我们是否可以利用miCtrl种在小鼠纹状体中的相对安全性并且围绕该种来设计靶向HTT的RNAi触发物。

作为第一步，我们筛选了人HTT mRNA或临床靶标，寻找与miCtl种区完全互补的序列，但没有任何发现。遵循与设计miHDS1变体相同的策略，我们重复了这一生物信息学分析，允许miRNA序列的核苷酸2至7之间的单个错配。我们发现了四个互补序列(miHDss1-4)：MiHDss1(在位置7的错配)和miHDss4(在位置4的错配)靶向HTT的3’UTR，而miHDss2(在位置6的错配)和miHDss3(在位置5的错配)分别靶向HTT的跨越外显子7-8的接合区域或外显子33内的编码区(图5a、b)。当在HEK 293细胞中测试时，仅miHDss3将HTT表达沉默至用对照处理的细胞的40-50%，如通过Q-PCR(图5c)和western印迹所确定(图5d、e)。

因为miCtl与miHDSS3共享相同的种序列，所以我们预计这两种miRNA将具有相同的脱靶概况。然而，正如在来自特定miRNA家族的内源miRNA上所观察到的，沉默功效可能由于各个miRNA的3’区的序列差异而变化。我们使用了PITA算法以比较miCtl脱靶与miHDss3脱靶的miRNA结合稳定性和沉默潜力。通过我们的生物信息学方法，我们预测了针对miCtl和miHDss3两者的89个脱靶位点，其中67个在纹状体中表达。有趣的是，相比miCtl，miHDss3的3’区提高了脱靶-miRNA结合稳定性(图5f)。

在小鼠脑中表征miHDS1变体和miHDss3的耐受性。

为了确定新序列的体内耐受性，将miRNA表达盒克隆到我们的AAV穿梭载体中(图6b)。根据同等重量和基本转杆表现，将七周龄的野生型小鼠分组，并随后用病毒表达的miHDS1v6A、miHDS1v5U、miHDss3或miHDS1在纹状体双侧注射，将miCtl和配制缓冲液(FB)作为实验对照。在注射后两个月和四个月，记录小鼠重量，并通过使用加速转杆、抱握和开放场地测试来确定神经系统不良反应(图6a)。

与我们之前的结果一致，表达miHDS1的小鼠在加速转杆装置上表现出运动缺陷(图6c)。同样，在仅注射FB缓冲液或miCtl的小鼠中未观察到差异。此结果很重要，因为其表明不良反应并非利用内源途径的结果，而是特定的miHDS1脱靶效应。有趣的并且与我们的体外研究一致的是，miHDS1v5U也显示出转杆缺陷。这可能反映了嘧啶:嘧啶错配(U:U,miRNA:mRNA)显示出中等辨识力并且此变体依然部分沉默Bcl2(图4H)。从我们的体外研究中还预测，在AAV注射后2或4个月，miHDS1v6A改善了miHDS1介导的毒性，同时未在miHDS1v6A与miCtl之间观察到显著差异。除了沉默人亨廷顿蛋白之外，miHDss3还与miCtl共享相同的脱靶概况。然而，PITA算法暗示，miHDss3更容易通过提高miRNA:mRNA对的结合稳定性而沉默miCtl脱靶库(图5f)。然而，在2或4个月时，在加速转杆上并未观察到显著差异(图6c)。

除了用miHDS1v5U注射的小鼠随时间推移发生了减重(-1.7g，在4个月时减少了8%)以外，在所有其它组中均记录了体重增加。与之前一样，用miHDS1治疗时，重量增加也显著降低。在4个月时，注射了miHDS1的小鼠的体重增加了1.3克(5%)，而其它组的重量增加了3.6至5.2克(在4个月时增加了15-22%)(图6d)。

讨论

在本研究中，我们着手测试了RNAi触发物在正常小鼠中的安全性，所述RNAi触发物是针对人类安全性设计的并在早前研究中被证明对于非人灵长类是安全的。在两个物种（通常一种啮齿类动物和一种更大型的哺乳动物）中测试人用药物是用于监管审批以进入早期研究的标准程序。虽然我们未在猴子中发现显著毒性（这也由他人在更近期的研究中报道），但是当预期构建体在啮齿类动物中进行测试时，发现了急性毒性。

我们发现，通过在种内制造点突变以改变脱靶概况，我们可以降低所测试序列（miHDS1）的毒性。单个种序列修饰改变了原始miHDS1的脱靶概况，同时保持了沉默功效。miHDS1v6而非miHDS1v5恢复了miHDS1在小鼠脑中的耐受性。miHDS1v5U生成了U:U错配（一种嘧啶:嘧啶错配），而miHDS1v6A生成了A:G（一种嘌呤:嘧啶错配），并据发现是能最有效区分的。

作为改变HDS1的种的备选方式，我们早先发现，我们的控制序列（也是针对低脱靶可能性而设计的）可以经过重新工程改造以靶向人HTT。当在小鼠中测试时，这两种序列均耐受良好并且不会诱导神经病理或神经功能缺损，正如之前在亲本HDS1中发现的。

这些发现凸显了传统药物开发与基于核酸的药物的新兴领域之间的反差。虽然所有人用药物开发的目标都是安全性和在目标人群中的功效，但就基于核酸的药物而言，预期的药物直接与基因组和/或所表达的转录物相互作用。因此，依靠序列特异性并针对人类安全性优化的药物将很可能与其它物种（并且特别是那些远亲物种如啮齿类动物）的基因组发生不同的相互作用。另一方面，如果针对啮齿类动物安全性进行序列优化，则在人类基因组的背景中出现问题的风险会更大。

总结

本结果凸显：(1) miRNA的安全性和耐受性概况是物种特异的，强调了对使用小鼠疾病模型的初步研究的谨慎解释，以及(2) 单一种序列修饰是解决miRNA序列的脱靶毒性并同时保持沉默功效的有效策略。

材料和方法

细胞系和转染。

HEK293得自ATCC并在制造商提供的条件下培养。SthdhQ7幸运地得自MarcyMacDonald。HEK293上的所有质粒DNA转染均采用lipofectamine 2000 (Invitrogen)使用制造商提供的指南完成。SthdhQ7细胞的DNA转染使用Invitrogen Neon转染系统采用电穿孔条件并按照制造商提供的指南完成。

载体设计和AAV生产。

人工miRNA序列(miCtl、miHDss变体、miHDS1及miHDS1变体)通过重叠DNA寡核苷酸的聚合酶延伸而生成(IDT, Coralville)。使用Qiaquick PCR纯化试剂盒纯化聚合酶延伸产物，用XhoI-SpeI消化并克隆到Pol-III表达盒上的XhoI-XbaI位点，所述Pol-III表达盒含有小鼠U6启动子、MCS和Pol-III-终止子(6T)。

使用psiCheck2载体(Promega)构建了RNAi萤光素酶报道载体。将有尾的DNA寡核苷酸（其含有针对miHDS1的有义或反义链的单个、完全互补的RNAi靶位点）退火并克隆到海肾萤光素酶cDNA序列的终止子下游的XhoI-NotI位点。

对于体内研究而言，将miRNA表达盒移入AAV穿梭质粒中DNA填充序列的上游。所述miRNA表达盒和填充序列的各端侧接AAV血清型2 145-bp的末端反向重复序列。

体外萤光素酶测定法。

将在24-孔板中生长至70%汇合度的HEK293细胞与表达miRNA的质粒和RNAi萤光素酶报道质粒共转染。在24小时，用冰冷的PBS冲洗细胞，并使用双萤光素酶报道分子测定系统(Promega)根据制造商说明使用20 μl的细胞裂解产物评估海肾和萤火虫萤光素酶的活性。发光读数由Monolight 3010光度计(Pharmigen, USA)获得。相对光单位被计算为所表达的海肾/萤火虫的相对光单位和结果相对于对照miRNA的商。

Western印迹分析。

如上所示，用miRNA表达盒转染HEK293细胞。在48小时，用冰冷的PBS冲洗细胞一次，并用Passive裂解缓冲液(PBL, Promega)裂解。通过Bradford-Lowry法(BioRad)测定蛋白质浓度，并将10 μg的蛋白质上样到NuPAGE 3-8% Tris-Acetate凝胶上(Novex Lifetechnologies)。将蛋白质转移到PVDF膜上，并与小鼠抗-Htt(1:5000, Millipore, CA)或兔抗β-肌动蛋白(1:40000, Sigma)抗体然后是辣根过氧化物酶偶联抗体(1:10,000, 小鼠；或 1:50,000, 兔; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)温育。用ECL-Plus试剂(Amersham Pharmacia)冲显出印迹。用VersaDocTM成像系统(Biorad)和Quantity OneR分析软件通过相对于β肌动蛋白的蛋白质水平密度测定(n=4个独立实验)来确定沉默功效。

RNA提取和QPCR分析。

使用Trizol(Life Technologies, Grand Island, NY)根据制造商方案提取总RNA分离物，不同的是在异丙醇沉淀步骤时向水相中加入1µl Glycoblue和用冷的70%乙醇单次洗涤。通过分光光度法对RNA样品进行定量，并随后用随机六聚体(TaqMan RT 试剂,Applied Biosystems)从500 ng的总RNA生成cDNA。使用实时PCR定制测定设计网络服务器(IDT, Coralville)设计针对小鼠脱靶基因的SyBrGreen Q-PCR引物对。完成最终熔化曲线测定的七点标准曲线以验证每个引物对。只有具有100±5%的扩增效率和单一扩增产物的引物对才被用于使用ddCt法确定相对基因表达。

小鼠研究

所有动物方案均得到了爱荷华大学动物护理和使用委员会的批准。野生型FBV和BACHD小鼠得自Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA)。使用特异于侧接CAG重复的突变型人亨廷顿蛋白转基因的引物对小鼠进行基因分型，并将转基因且年龄匹配的野生型同窝小鼠用于指示的实验。小鼠被安置于控温环境、12-h光/暗周期中。随意供应食物和水。在指示的时间，为小鼠注射AAV2/1-mU6-miRNA/填充序列病毒。对于AAV注射，将小鼠用开他敏和甲苯噻嗪的混合物麻醉，并将5µl的AAV以0.2 µl/min的速率两侧注射到纹状体中(坐标：+0.86 mm 前囟吻侧，+/-1.8 mm 外侧向内侧，-2.5 mm 脑面腹侧)。将用于基因表达分析的小鼠用开他敏和甲苯噻嗪的混合物麻醉，并用18 ml 0.9%冷盐水与2ml RNAlater(Ambion)的混合溶液灌注。在指示的时间，处死小鼠并将脑部移除、阻断并切成1-mm厚的冠状切片。通过使用组织取样器(直径1.4-mm; Zivic Instruments, Pittsburgh, PA, USA)从纹状体取得组织环切片。将所有的组织环切片在液氮中速冻并保存于-80C备用。

行为分析

使用转杆装置(型号47,600; Ugo Basile, Comerio, Italy)测定经注射小鼠的运动协调能力。在7周龄时进行基本转杆测试，并在AAV注射后2和4个月再次进行。小鼠在连续四天中每天测试三次，测试间有30分钟的休息时间，并且在每天的第一次测试前六十分钟开始有5分钟的适应期。通过将每只小鼠在连续四天的测试中每天最好的两次测试结果取平均值来计算每只小鼠的延迟掉落时间。对于抱握测试，将每只小鼠以尾部悬垂一分钟，而如果小鼠将其前爪一起抱在其躯干附近，则记分为抱握。

所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文中。虽然在上述说明书中，本发明已经联系其某些优选实施方案进行了描述，并且已经出于说明目的而示出了许多细节，但对于本领域技术人员将显而易见的是，本发明容易具有另外的实施方案并且本文所述的某些细节可发生相当大的变化而不脱离本发明的基本原理。

术语“一个（种）”（“a”和“an”）和“该”（“the”）以及类似指称的使用在描述本发明的上下文中应当被理解为同时涵盖单数和复数形式，除非本文另外指明或上下文有明显抵触。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应当被理解为开放式术语（即，意味着“包括但不限于”）。除非本文另外指明，否则本文中数值范围的表述仅仅旨在作为便捷方式以分别指代落入该范围内的各个单独的值，并且各个单独的值被并入本说明书中如同其在本文中被分别列举。本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行，除非本文另外指明或上下文有其它明显的抵触。除非另行声明，否则本文提供的任何及所有实例或示例性语言（例如，“诸如”）的使用仅仅旨在更好地说明本发明并且对本发明的范围不产生限制作用。本说明书中的语言不应当被理解为指示任何未要求保护的要素是实施本发明所必需的。

本文描述了本发明的实施方案，包括本发明人已知的实施本发明的最佳方式。这些实施方案的变型形式对于本领域普通技术人员而言在阅读上述说明后可能变得显而易见。本发明人预计技术人员会酌情采用此类变型形式，并且本发明人预期本发明会以不同于本文所具体描述的方式实施。因此，本发明在适用法律所允许的情况下包括本文所附权利要求书中列举的主题的所有修改形式和等同形式。此外，本发明涵盖了上述要素以其所有可能的变型形式的任何组合，除非本文另外指明或上下文有其它明显的抵触。

Claims (76)

1.核酸，其编码人工初级miRNA转录物(pri-miRNA)，所述核酸由以下部分组成，依位置顺序：5′-侧翼区、非引导区、环区、引导区和3′-侧翼区，其中所述引导区由SEQ ID NO: 37(miHDss3)、SEQ ID NO:6(miHDS1v5U)或SEQ ID NO:7(miHDS1v6A)组成，并且所述非引导区与所述引导区至少80%互补。

2.权利要求1的核酸，其中所述5′-侧翼区连续连接至所述非引导区，所述环区位于所述非引导区和所述引导区之间，而所述引导区连续连接至所述3′-侧翼区。

3.权利要求1或2的核酸，其中所述5′-侧翼区包含连续连接至所述非引导区的5′-接合序列。

4.权利要求3的核酸，其中所述5′-接合序列由5-8个核苷酸组成。

5.权利要求4的核酸，其中所述5′-接合序列由7个核苷酸组成。

6.权利要求3的核酸，其中所述5′-接合序列编码GUGAGCGA(SEQ ID NO:13)或GUGAGCGC(SEQ ID NO:14)。

7.权利要求3-6中任一项的核酸，其中所述5′-侧翼区还包含位于所述5′-接合序列上游的5′-凸序列。

8.权利要求7的核酸，其中所述5′-凸序列包含克隆位点。

9.权利要求7的核酸，其中所述5′-凸序列由约1-10个核苷酸组成。

10.权利要求7的核酸，其中所述5′-凸序列编码UAAACUCGA(SEQ ID NO:15)。

11.权利要求7-10中任一项的核酸，其中所述5′-侧翼区还包含位于所述5′-凸序列上游的5′-间隔序列。

12.权利要求11的核酸，其中所述5′-间隔序列由10-12个核苷酸组成。

13.权利要求11的核酸，其中所述5′-间隔序列编码UGGUACCGUU(SEQ ID NO:16)。

14.权利要求11-13中任一项的核酸，其中所述5′-侧翼区还包含位于所述5′-间隔序列上游的5′-上游序列。

15.权利要求14的核酸，其中所述5′-上游序列长约30-2000个核苷酸。

16.权利要求1-15中任一项的核酸，其中所述3′-侧翼区包含连续连接至所述引导区的3′-接合序列。

17.权利要求16的核酸，其中所述3′-接合序列由5-8个核苷酸组成。

18.权利要求16的核酸，其中所述3′-接合序列与所述5′-接合序列至少约85%互补。

19.权利要求16的核酸，其中所述3′-接合序列编码CGCCUAC(SEQ ID NO:18)。

20.权利要求16-19中任一项的核酸，其中所述3′-侧翼区还包含位于所述3′-接合序列下游的3′-凸序列。

21.权利要求20的核酸，其中所述3′-凸序列包含克隆位点。

22.权利要求20的核酸，其中所述3′-凸序列由约1-10个核苷酸组成。

23.权利要求20的核酸，其中3′-凸序列编码UAG(SEQ ID NO:30)。

24.权利要求20的核酸，其中所述5′-凸序列与所述3′-凸序列仅在位于所述凸序列两端的各一个核苷酸处互补。

25.权利要求20-24中任一项的核酸，其中所述3′-侧翼区还包含位于所述3′-凸序列下游的3′-间隔序列。

26.权利要求25的核酸，其中所述3′-间隔序列由10-12个核苷酸组成。

27.权利要求25的核酸，其中所述3′-间隔序列编码AGCGGCCGCCA(SEQ ID NO:19)。

28.权利要求25-27中任一项的核酸，其中所述3′-间隔序列与所述5′-间隔序列至少约70%互补。

29.权利要求25-28中任一项的核酸，其中所述3′-侧翼区还包含位于所述3′-间隔序列下游的3′-下游序列。

30.权利要求29的核酸，其中所述5′-上游序列不与所述3′-下游序列明显配对。

31.权利要求29或30的核酸，其中所述3′-下游序列长约30-2000个核苷酸。

32.权利要求1-31中任一项的核酸，其中所述环区长15-25个核苷酸。

33.RNA，其由权利要求1-32中任一项的核酸编码。

34.表达盒，其编码权利要求1-32中任一项所述的分离的核酸。

35.权利要求34的表达盒，其还包含连续连接至所述核酸的启动子。

36.权利要求35的表达盒，其中所述启动子是polII或polIII启动子。

37.权利要求36的表达盒，其中所述polIII启动子是U6启动子。

38.权利要求36的表达盒，其中所述polIII启动子是小鼠U6启动子。

39.权利要求36的表达盒，其中所述启动子是polII启动子。

40.权利要求35的表达盒，其中所述启动子是组织特异性启动子。

41.权利要求35的表达盒，其中所述启动子是诱导型启动子。

42.权利要求35-41中任一项的表达盒，其还包含标志物基因。

43.载体，其包含权利要求34-42中任一项的表达盒。

44.权利要求43的载体，其中所述载体是腺相关病毒（AAV）载体。

45.权利要求44的载体，其中所述AAV是AAV1、AAV2、AAV5、AAV6和/或AAV9。

46.权利要求45的载体，其中所述AAV是AAV2。

47.权利要求45的载体，其中所述AAV是AAV2/1。

48.分离的核酸，长80-4000个核苷酸，其包含编码人工初级miRNA转录物(pri-miRNA)的核酸，其由以下部分组成，依位置顺序：5′-侧翼区、非引导区、环区、引导区和3′-侧翼区，其中所述引导区由SEQ ID NO: 37(miHDss3)、SEQ ID NO:6(miHDS1v5U)或SEQ ID NO:7(miHDS1v6A)组成，并且所述非引导区与所述引导区至少80%互补。

49.分离的核酸，其由Pri-miHDS1v5U(SEQ ID NO:8)、Pri-miHDS1v6A(SEQ ID NO:9)、Pre-miHDS1v5U(SEQ ID NO:10)或Pre-miHDS1v6A(SEQ ID NO:11)组成。

50.分离的RNA双链，其包含核酸引导区和核酸非引导区，其中所述引导区由SEQ IDNO: 37(miHDss3)、SEQ ID NO:6(miHDS1v5U)或SEQ ID NO:7(miHDS1v6A)组成，并且所述非引导区与所述引导区至少80%互补。

51.权利要求44的分离的RNA双链，其中所述双链长19-30个碱基对。

52.非人动物，其包含权利要求1-33或48-49中任一项的核酸、权利要求34-42中任一项的表达盒、权利要求43-47中任一项的载体或权利要求50-51中任一项的双链。

53.诱导RNA干扰的方法，其包括向个体施用有效量的下列物质：权利要求1-33或48-49中任一项的核酸、权利要求34-42中任一项的表达盒、权利要求43-47中任一项的载体或权利要求50-51中任一项的双链。

54.权利要求1-33或48-49中任一项的核酸、权利要求34-42中任一项的表达盒、权利要求43-47的载体或权利要求50-51中任一项的双链，用于治疗。

55.权利要求1-33或48-49中任一项的核酸、权利要求34-42中任一项的表达盒、权利要求43-47的载体或权利要求50-51中任一项的双链在治疗亨廷顿氏病上的用途。

56.分离的微RNA分子，其包含权利要求1的核酸并在3′端具有突出端。

57.权利要求56的分离的微RNA分子，其中所述突出端是2至5个核苷酸的重复序列。

58.权利要求56或57的分离的微RNA分子，其中所述微RNA是天然存在的微RNA。

59.权利要求56或57的分离的微RNA分子，其中所述微RNA是人工微RNA。

60.权利要求56-59中任一项的分离的微RNA，其中所述微RNA分子产生降低水平的脱靶毒性。

61.权利要求56的分离的微RNA，其中所述突出端是UU(SEQ ID NO:24)、UUU(SEQ IDNO:25)或UUUU(SEQ ID NO:26)序列。

62.权利要求56的分离的微RNA，其中所述突出端是CUU(SEQ ID NO:27)、CUUU(SEQ IDNO:28)或CUUUU(SEQ ID NO:29)序列。

63.诱导低毒性RNA干扰的方法，其包括向个体施用下列物质：权利要求1-33或48-49中任一项的核酸、权利要求34-42中任一项的表达盒、权利要求43-47中任一项的载体或权利要求50-51中任一项的双链。

64.权利要求63的方法，其中所述表达盒包含polII启动子。

65.诱导低毒性RNA干扰的方法，其包括向个体施用权利要求35的表达盒，所述表达盒编码可操作地连接至编码miRNA的核酸的polII启动子。

66.权利要求65的方法，其中所述miRNA包含2或3个核苷酸的5′或3′-突出端。

67.权利要求65或66的方法，其中所述miRNA包含2个核苷酸的3′-突出端。

68.权利要求65-67中任一项的方法，其中所述miRNA是人工miRNA。

69.治疗患有亨廷顿氏病的个体的方法，其包括向所述个体施用下列物质：权利要求1-33或48-49中任一项的核酸、权利要求34-42中任一项的表达盒、权利要求43-47中任一项的载体或权利要求50-51中任一项的双链，以治疗亨廷顿氏病。

70.权利要求53或63-69中任一项的方法，其中将所述治疗剂直接或经由血液施用至所述个体的脑部。

71.权利要求70的方法，其中颅内施用所述治疗剂。

72.权利要求71的方法，其中将所述治疗剂施用至所述个体的枕大池、纹状体、皮质或脑室、蛛网膜下腔间隙和/或鞘内间隙。

73.权利要求70-72中任一项的方法，其中所述个体是人。

74.权利要求70-73中任一项的方法，其中将所述试剂注射到CNS中的1-5个位置。

75.权利要求70-73中任一项的方法，其中将所述试剂注射到脑中的单个位置。

76.治疗亨廷顿氏病的方法，其包括使细胞与下列物质接触：权利要求1-33或48-49中任一项的核酸、权利要求34-42中任一项的表达盒、权利要求43-47中任一项的载体或权利要求50-51中任一项的双链，其中所述细胞是室管膜细胞、软脑膜细胞、内皮细胞、脑室细胞和/或脑膜细胞。