CN111801421A - 使用双重shrna的增强的免疫细胞及包含免疫细胞的组合物 - Google Patents

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李永浩
李玉珍
李贤吉
李尚勋
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Cool Russell
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Abstract

本公开广泛地涉及癌症免疫疗法领域。例如，本发明总体上涉及免疫细胞，其包含与靶抗原特异性结合的基因工程化的抗原受体和减少或能够减少削弱免疫细胞功能的基因在所述免疫细胞中的表达的基因破坏剂。

Description

使用双重SHRNA的增强的免疫细胞及包含免疫细胞的组合物
相关申请
本申请要求2018年1月12日提交的韩国专利申请第10-2018-0004238号的优先权，所述专利申请的公开内容由此通过引用整体并入。
电子提交的序列表的引用
本申请通过引用随本申请一起提交的序列列表合并为名称为14570-001-228_SEQ_LISTING.txt的文本文件，其创建于2019年1月5日，大小为88,751字节。
技术领域
本公开广泛地涉及癌症免疫疗法领域。例如，本发明总体上涉及免疫细胞，其包含与靶抗原特异性结合的基因工程化的抗原受体和减少或能够减少免疫细胞中削弱免疫细胞功能的基因表达的基因破坏剂。
背景技术
通过从患者或供体的身体分离T细胞或NK细胞(天然杀伤细胞)，在体外培养这些细胞，然后将它们引回至患者体内，使用免疫细胞的抗癌疗法作为新的癌症治疗方法，目前正受到广泛关注。特别地，据报道，已经经历了使用病毒等注射新的遗传信息，随后在体外培养过程中进行培养的过程的免疫细胞比没有培养的细胞具有更大的抗癌效果。此处，注射到T细胞中的遗传信息通常是经修饰而对靶抗原具有高亲和力的嵌合抗原受体(下文中称为CAR)或单克隆T细胞受体(下文中称为mTCR)。这些经修饰的免疫细胞识别并攻击表达靶抗原的癌细胞，并诱导细胞死亡，而不受其固有抗原特异性的限制。1989年，Eshhar等人首次提出了利用CAR对T细胞进行基因修饰的方法，并将其命名为“T-体(T-body)”。
本文提供了免疫细胞组合物和方法，其解决了上面指出的常规同时免疫细胞疗法的问题，其中所述问题由于其高成本而给患者带来巨大的经济负担，作用于除CAR-T外的T细胞，并造成自身免疫症状和细胞因子释放综合征的风险。简言之，例如，本文公开了具有高产率和低生产成本的制备方法。此外，通过以更高的可能性和效力抑制抑制免疫细胞功能的分子，本文的公开内容满足了提供有效细胞疗法的技术需求。本公开旨在解决的技术问题不限于上述技术问题，并且其它未提及的技术问题对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的。
发明内容
本文提供了载体、免疫细胞、包含所述免疫细胞的药物组合物和包含所述免疫细胞的组合物。本文还提供了产生免疫细胞的方法，以及免疫细胞的治疗和使用方法。
一方面，本文提供了载体。在一些实施方案中，提供了载体，其包含编码两种类型的抑制削弱免疫细胞功能的基因表达的短发夹RNA(shRNA)的碱基序列，以及编码嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)(例如，单克隆T细胞受体(mTCR))的碱基序列。在一些实施方案中，CAR或TCR(例如，mTCR)的靶标是人肿瘤抗原，其选自在癌症中表现出表达增加的增加的抗原或癌症(例如，癌细胞、癌组织和/或肿瘤微环境)中发现的突变形式的抗原。
在一些实施方案中，两种类型的shRNA的表达的特征在于它们分别由两种不同的启动子调控。
在一些实施方案中，所述两种启动子是RNA聚合酶III启动子。在一些实施方案中，所述两种启动子是U6启动子，例如，源自不同物种的U6启动子。在一些实施方案中，所述两种启动子在载体上相对于彼此以相同的方向取向。在一些实施方案中，两种启动子在载体上彼此以不同的方向取向。例如，在某个实施方案中，启动子以头对头的取向来取向。在另一个实施方案中，启动子以尾对尾的取向来取向。
在一些实施方案中，削弱免疫细胞功能的基因是免疫检查点受体或配体。
在一些实施方案中，免疫检查点受体或配体选自由以下组成的组：PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3或CEACAM-5)、LAG 3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、MerTK和2B4。
在一些实施方案中，削弱免疫细胞功能的基因选自由以下组成的组：FAS、CD45、PP2A、SHIP1、SHIP2、DGKα、DGKζ、Cb1-b、CD147、LRR1、TGFBR1、IL10Rα、KLGR1、DNMT3A和A2aR。
在一些实施方案中，利用了两种类型的shRNA，其靶向削弱免疫细胞功能的一种或多种基因。在一些实施方案中，两种类型的shRNA或者靶向削弱免疫细胞功能的单个基因，或者它们靶向削弱免疫细胞功能的不同基因。在一些实施方案中，两种类型的shRNA靶向PD-1。在包含两种类型shRNA的一些实施方案中，一种shRNA靶向PD-1，并且第二种shRNA靶向TIM-3。在包含两种类型的shRNA的一些实施方案中，一种shRNA靶向PD-1，并且第二种shRNA靶向TIGIT。
shRNA形成包含有义shRNA序列和反义shRNA序列的发夹结构。在一些实施方案中，编码本文所述shRNA的碱基序列包含选自由SEQ ID NO：2-219组成的组的序列。在某些实施方案中，编码本文所述shRNA的碱基序列包含选自由SEQ ID NO：2-219组成的组的序列，其中所述序列编码有义shRNA序列。在某些实施方案中，编码本文所述shRNA的碱基序列包含选自由SEQ ID NO：2-219组成的组的序列，其中所述序列编码反义shRNA序列。
在一些实施方案中，载体包含碱基序列SEQ ID NO：220或221中的任何一个。在一些实施方案中，载体是质粒载体或病毒载体，例如慢病毒载体，例如，逆转录病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
在另一方面，本文提供了免疫细胞，其包含表达CAR或TCR(例如mTCR)的载体，并且其中两种类型的shRNA的靶基因的表达与不表达靶基因的shRNA的对照组的表达相比，减少至40％或更少。在一些实施方案中，免疫细胞选自人来源的T细胞与NK细胞之间。
另一方面，本文提供了用于人患者的免疫疗法的药物组合物，其包含上述免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞最初来源于患者。在一些实施方案中，患者患有肿瘤或癌症，在所述肿瘤或癌症中检测到细胞中表达的由CAR或TCR(例如，mTCR)靶向的癌抗原的水平的升高或变化。
另一方面，本文提供了免疫细胞，其包含与靶抗原特异性结合的基因工程化的抗原受体和减少或能够减少免疫细胞中削弱免疫细胞功能的基因表达的基因破坏剂。
另一方面，本文提供了免疫细胞，其包含与靶抗原特异性结合的基因工程化的抗原受体和减少或能够减少免疫细胞中削弱免疫细胞功能的基因表达的基因破坏剂。
在一些实施方案中，基因工程化的抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
在一些实施方案中，基因工程化的抗原受体是CAR。在一些实施方案中，CAR包含胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和胞内信号转导结构域。在一些实施方案中，CAR的胞外抗原识别结构域与靶抗原特异性结合。
在一些实施方案中，CAR的胞内信号转导结构域包含CD3 zeta(CD3ζ)链的胞内结构域。在一些实施方案中，CAR的胞内信号转导结构域还包含共刺激分子。在一些实施方案中，共刺激分子选自由以下组成的组：ICOS、0X40、CD137(4-1BB)、CD27和CD28。在一些实施方案中，共刺激分子是CD137(4-1BB)。在一些实施方案中，共刺激分子是CD28。
在一些实施方案中，基因工程化的抗原受体是TCR。在一些实施例中，TCR是单克隆TCR(mTCR)。
在一些实施方案中，靶抗原在癌细胞、癌组织和/或肿瘤微环境中或表面上表达。
在一些实施方案中，靶抗原选自由以下组成的组：
5T4(滋养层糖蛋白)、707-AP、9D7、AFP(甲胎蛋白)、AlbZIP(雄激素诱导的bZIP)、HPG1(人前列腺特异性基因-1)、α5β1-整联蛋白、α5β6-整联蛋白、α-甲基酰基辅酶A消旋酶、ART-4(ADP核糖基转移酶-4)、B7H4(含v-set结构域的T细胞活化抑制剂1)、BAGE-1(B黑素瘤抗原-1)、BCL-2(B细胞CLL/淋巴瘤-2)、BING-4(WD重复结构域46)、CA 15-3/CA 27-29(粘蛋白1)、CA 19-9(癌抗原19-9)、CA 72-4(癌抗原72-4)、CA125(癌抗原125)、钙网蛋白、CAMEL(黑素瘤上CTL识别的抗原)、CASP-8(半胱天冬酶8)、组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、CD19(分化簇19)、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD4、CD52、CD55、CD56、CD80、CEA(癌胚抗原SG8)、CLCA2(氯离子通道附件2)、CML28(慢性髓性白血病肿瘤抗原28)、毛状蛋白样蛋白、胶原蛋白XXIII、COX-2(环氧化酶-2)、CT-9/BRD6(癌/睾丸抗原9)、Cten(c-末端张力蛋白样蛋白)、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1、cyp-B、CYPB1(细胞色素p450家族1亚家族b成员1)、DAM-10/MAGE-B1(黑素瘤相关抗原B1)、DAM-6/MAGE-B2、EGFR/Her1(表皮生长因子受体)、EMMPRIN(basigin)、EpCam、EphA2(EPH受体A2)、EphA3、ErbB3(Erb-B2受体酪氨酸激酶3)、EZH2(zeste 2多梳蛋白抑制复合体2亚单位的增强子)、FGF-5(成纤维细胞生长因子5)、FN(纤连蛋白)、Fra-1(Fos相关抗原-1)、G250/CAIX(碳酸酐酶9)、GAGE-1(G抗原-1)、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7b、GAGE-8、GDEP(前列腺中差异表达的基因)、GnT-V(葡萄糖酸激酶)、gp100(黑素细胞谱系特异性抗原GP100)、GPC3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖3)、HAGE(螺旋抗原)、HAST-2(磺基转移酶家族1A成员1)、hepsin、Her2/neu/ErbB2(Erb-B2受体酪氨酸激酶2)、HERV-K-MEL、HNE(髓质素)、同源异型框NKX 3.1、HOM-TES-14/SCP-1、HOM-TES-85、HPV-E6、HPVE7、HST-2(沉默调节蛋白(sirtuin)-2)、hTERT、iCE(半胱天冬酶1)、IGF-1R(胰岛素样生长因子-1受体)、IL-13Ra2(白介素-13受体亚单位α2)、IL-2R(白介素-2受体)、IL-5(白介素-5)、未成熟层粘连蛋白受体、激肽释放酶2、激肽释放酶4、Ki67、KIAA0205(溶血磷脂酰甘油酰基转移酶1)、KK-LC-1(北九州肺癌抗原-1)、KM-HN-1、LAGE-1(L抗原家族成员-1)、Livin、MAGE-A1、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGEA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-B1、MAGE-B10、MAGE-B16、MAGEB17、MAGE-B2、MAGE-B3、MAGE-B4、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-D1、MAGE-D2、MAGE-D4、MAGE-E1、MAGE-E2、MAGE-F1、MAGE-H1、MAGEL2(黑素瘤抗原家族L2)、乳房珠蛋白A、MART-1/Melan-A(由T细胞识别的黑素瘤抗原-1)、MART-2、基质蛋白22、MC1R(黑皮质素1受体)、M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)、间皮素、MG50/PXDN(过氧蛋白)、MMP11(基质金属蛋白酶11)、MN/CA1X-抗原(碳酸酐酶9)、MRP-3(多药耐药相关蛋白-3)、MUC1(粘蛋白1)、MUC2、NA88-A(VENT样同源异型框2假基因1)、N-乙酰葡糖胺基转移酶-V、Neo-PAP(Neo-聚(A)聚合酶)、NGEP(在前列腺中表达的新基因)、NMP22(核基质蛋白22)、NPM/ALK(核磷蛋白)、NSE(神经元特异性烯醇化酶)、NY-ESO-1、NY-ESO-B、OA1(骨关节炎QTL 1)、OFA-iLRP(癌胚抗原未成熟层粘连蛋白受体蛋白)、OGT(O-GlcNAc转移酶)、OS-9(内质网凝集素)、骨钙素、骨桥蛋白、p15(CDK抑制因子2B)、p53、PAGE-4(P抗原家族成员-4)、PAI-1(纤溶酶原激活物抑制物-1)、PAI-2、PAP(前列腺酸性磷酸酶)、PART-1(前列腺雄激素调节转录物1)、PATE(前列腺和睾丸表达1)、PDEF(前列腺源性Ets因子)、Pim-1-激酶(原病毒整合位点1)、Pin1(肽基-脯氨酰顺反异构酶NIMA相互作用1)、POTE(在前列腺、卵巢、睾丸和胎盘中表达)、PRAME(在黑素瘤中优先表达的抗原)、前列腺素、蛋白酶-3、PSA(前列腺特异性抗原)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、PSGR(前列腺特异性G蛋白偶联受体)、PSM、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、RAGE-1(肾肿瘤癌抗原)、RHAMM/CD168、RU1(肾遍在蛋白1)、RU2、SAGE(肉瘤抗原)、SART-1(由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原-1)、SART-2、SART-3、Sp17(精子蛋白17)、SSX-1(SSX家族成员1)、SSX-2/HOM-MEL-40、SSX-4、STAMP-1(STEAP2金属还原酶)、STEAP、存活素、存活素-213、TA-90(肿瘤相关抗原-90)、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白-72)、TARP(TCRγ交替阅读框蛋白)、TGFb(转化生长因子β)、TGFbR11(转化生长因子β受体11)、TGM-4(转谷氨酰胺酶4)、TRAG-3(紫杉醇耐药相关基因3)、TRG(T细胞受体γ基因座)、TRP-1(瞬时受体电位-1)、TRP-2/6b、TRP-2/INT2、Trp-p8、酪氨酸酶、UPA(U型纤溶酶原激活剂)、VEGF(血管内皮生长因子A)、VEGFR-2/FLK-1和WT1(肾母细胞瘤1)。在一些实施方案中，靶抗原是CD19或CD22。在一些实施方案中，靶抗原是CD19。
在一些实施方案中，靶抗原是癌抗原，其在癌细胞、癌症组织和/或肿瘤微环境中或表面上的表达增加。
在一些实施方案中，靶抗原选自由以下组成的组：
α-辅肌动蛋白-4/m、ARTC1/m、bcr/abl、β-连环蛋白/m、BRCA1/m、BRCA2/m、CASP-5/m、CASP-8/m、CDC27/m、CDK4/m、CDKN2A/m、CML66、COA-1/m、DEK-CAN、EFTUD2/m、ELF2/m、ETV6-AML1、FN1/m、GPNMB/m、HLA-A*0201-R170I、HLA-A11/m、HLA-A2/m、HSP70-2M、KIAA0205/m、K-Ras/m、LDLR-FUT、MART2/m、ME1/m、MUM-1/m、MUM-2/m、MUM-3/m、肌球蛋白1类/m、neo-PAP/m、NFYC/m、N-Ras/m、OGT/m、OS-9/m、p53/m、Pml/RARa、PRDX5/m、PTPRX/m、RBAF600/m、SIRT2/m、SYTSSX-1、SYT-SSX-2、TEL-AML1、TGFbRII和TPI/m；并且其中靶抗原是在癌细胞、癌组织和/或肿瘤微环境中或表面上表达的癌抗原的突变形式。
在一些实施方案中，削弱免疫细胞功能的基因的表达导致以下的一种或多种：
i)抑制免疫细胞的增殖；
ii)诱导免疫细胞的细胞死亡；
iii)抑制免疫细胞识别目标抗原和/或获得活化的能力；
iv)诱导免疫细胞分化成不诱导对靶抗原的免疫响应的细胞；
v)减少免疫细胞与促进免疫细胞的免疫响应的分子的反应；或者
vi)增加免疫细胞与抑制免疫细胞的免疫响应的分子的反应。
在一些实施方案中，削弱免疫细胞功能的基因选自由以下组成的组：PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3或CEACAM-5)、LAG 3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、MerTK、2B4、FAS、CD45、PP2A、SHP1、SHP2、DGKα、DGKζ、Cb1-b、Cb1-c、CD148、LRR1、TGFBR1、IL10RA、KLGR1、DNMT3A和A2aR。
在一些实施方案中，削弱免疫细胞功能的基因增加了免疫细胞与抑制免疫细胞的免疫响应的分子的反应。
在一些实施方案中，增加免疫细胞与抑制免疫细胞的免疫响应的分子的反应的基因编码免疫检查点受体或配体。
在一些实施方案中，免疫检查点受体或配体选自由以下组成的组：PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3或CEACAM-5)、LAG 3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、MerTK和2B4。
在一些实施方案中，与不存在基因破坏剂的免疫细胞相比，基因破坏剂使削弱免疫细胞功能的基因在免疫细胞中的表达减少了至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。
在一些实施方案中，基因破坏剂减少基因的表达，所述基因增加免疫细胞与抑制免疫细胞的免疫响应的分子的反应。
在一些实施方案中，基因破坏剂减少编码免疫检查点受体或配体的基因的表达。
在一些实施方案中，基因破坏剂减少选自由以下组成的组的基因的表达：PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、MerTK和2B4。
在一些实施方案中，基因破坏剂通过RNA干扰(RNAi)减少削弱免疫细胞功能的基因的表达。在一些实施方案中，多于一种基因破坏剂通过RNAi减少削弱免疫细胞功能的基因在免疫细胞中的表达。
在一些实施方案中，基因破坏剂靶向削弱免疫细胞功能的单个基因，或靶向削弱免疫细胞功能的不同基因，其中第一基因破坏剂靶向第一基因，第二基因破坏剂靶向第二基因，或其任何组合。
在一些实施方案中，RNAi由短发夹核RNA(shRNA)介导。在一些实施方案中，RNAi由多于一种shRNA介导。在一些实施方案中，RNAi由两种shRNA介导。
在一些实施方案中，两种shRNA靶向PD-1。在一些实施方案中，第一shRNA靶向PD-1，并且第二shRNA靶向TIM-3。在一些实施方案中，第一shRNA靶向PD-1，并且第二shRNA靶向CTLA-4。在一些实施方案中，第一shRNA靶向PD-1，并且第二shRNA靶向LAG-3。在一些实施方案中，第一shRNA靶向PD-1，并且第二shRNA靶向TIGIT。
在一些实施方案中，免疫细胞包含编码shRNA的核苷酸序列。在一些实施方案中，免疫细胞包含编码多于一种shRNA的核苷酸序列。在一些实施方案中，免疫细胞包含编码两种shRNA的核苷酸序列。除非另有说明，否则本文使用的术语“碱基序列”和“核苷酸序列”是可互换的。
在一些实施方案中，编码shRNA的核苷酸序列包含选自由SEQ ID NO：2-219和238-267组成的组的序列。
在一些实施方案中，编码shRNA的核苷酸序列在载体上。
在一些实施方案中，不同shRNA的表达分别由不同的启动子调控。在一些实施方案中，两种不同shRNA的表达分别由两种不同的启动子调控。在一些实施方案中，两种不同的启动子是RNA聚合酶III启动子。在一些实施方案中，两种启动子是U6启动子。在一些实施方案中，U6启动子来自不同的物种。在一些实施方案中，两种启动子彼此以不同的方向取向。例如，在某个实施方案中，启动子以头对头的取向来取向。在另一个实施方案中，启动子以尾对尾的取向来取向。
在一些实施方案中，基因工程化的抗原受体和基因破坏剂各自由载体表达。在一些实施方案中，基因工程化的抗原受体和基因破坏剂由同一载体表达。
在一些实施方案中，载体是质粒载体或病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是慢病毒载体或腺病毒载体。在一些实施方案中，慢病毒载体是逆转录病毒载体。
在一些实施方案中，免疫细胞选自由T细胞和天然杀伤(NK)细胞组成的组。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞包含在同一载体上编码两种shRNA和CAR的核苷酸序列。在一些实施方案中，两种shRNA各自由两种不同的RNA聚合酶III启动子调控，所述启动子彼此以不同的方向取向。例如，在某个实施方案中，启动子以头对头的取向来取向。在另一个实施方案中，启动子以尾部对尾部的取向来取向。在一些实施方案中，CAR靶向CD19，第一shRNA靶向PD-1，并且第二shRNA靶向TIGIT。
在另一方面，本文提供了生产免疫细胞的方法，其包括同时或以任何顺序依次将以下物质引入免疫细胞：
(1)编码与靶抗原特异性结合的基因工程化的抗原受体的基因；和
(2)减少或能够减少削弱免疫细胞功能的基因在免疫细胞中表达的基因破坏剂，
从而产生免疫细胞，在所述免疫细胞中表达基因工程化的抗原受体并且减少削弱免疫细胞功能的基因的表达。
在一些实施方案中，基因工程化的抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
在一些实施方案中，基因工程化的抗原受体是CAR。在一些实施方案中，CAR包含胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和胞内信号转导结构域。在一些实施方案中，CAR的胞外抗原识别结构域与靶抗原特异性结合。
在一些实施方案中，CAR的胞内信号转导结构域包含CD3 zeta(CD3ζ)链的胞内结构域。在一些实施方案中，CAR的胞内信号转导结构域还包含共刺激分子。在一些实施方案中，共刺激分子选自由以下组成的组：ICOS、0X40、CD137(4-1BB)、CD27和CD28。在一些实施方案中，共刺激分子是CD137(4-1BB)。在一些实施方案中，共刺激分子是CD28。
在一些实施方案中，基因工程化的抗原受体是TCR。在一些实施例中，TCR是单克隆TCR(mTCR)。
在一些实施方案中，靶抗原在癌细胞、癌组织和/或肿瘤微环境中或表面上表达。
在一些实施方案中，靶抗原选自由以下组成的组：
5T4(滋养层糖蛋白)、707-AP、9D7、AFP(甲胎蛋白)、AlbZIP(雄激素诱导的bZIP)、HPG1(人前列腺特异性基因-1)、α5β1-整联蛋白、α5β6-整联蛋白、α-甲基酰基辅酶A消旋酶、ART-4(ADP核糖基转移酶-4)、B7H4(含v-set结构域的T细胞活化抑制剂1)、BAGE-1(B黑素瘤抗原-1)、BCL-2(B细胞CLL/淋巴瘤-2)、BING-4(WD重复结构域46)、CA 15-3/CA 27-29(粘蛋白1)、CA 19-9(癌抗原19-9)、CA 72-4(癌抗原72-4)、CA125(癌抗原125)、钙网蛋白、CAMEL(黑素瘤上CTL识别的抗原)、CASP-8(半胱天冬酶8)、组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、CD19(分化簇19)、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD4、CD52、CD55、CD56、CD80、CEA(癌胚抗原SG8)、CLCA2(氯离子通道附件2)、CML28(慢性髓性白血病肿瘤抗原28)、毛状蛋白样蛋白、胶原蛋白XXIII、COX-2(环氧化酶-2)、CT-9/BRD6(癌/睾丸抗原9)、Cten(c-末端张力蛋白样蛋白)、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1、cyp-B、CYPB1(细胞色素p450家族1亚家族b成员1)、DAM-10/MAGE-B1(黑素瘤相关抗原B1)、DAM-6/MAGE-B2、EGFR/Her1(表皮生长因子受体)、EMMPRIN(basigin)、EpCam、EphA2(EPH受体A2)、EphA3、ErbB3(Erb-B2受体酪氨酸激酶3)、EZH2(zeste 2多梳蛋白抑制复合体2亚单位的增强子)、FGF-5(成纤维细胞生长因子5)、FN(纤连蛋白)、Fra-1(Fos相关抗原-1)、G250/CAIX(碳酸酐酶9)、GAGE-1(G抗原-1)、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7b、GAGE-8、GDEP(前列腺中差异表达的基因)、GnT-V(葡萄糖酸激酶)、gp100(黑素细胞谱系特异性抗原GP100)、GPC3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖3)、HAGE(螺旋抗原)、HAST-2(磺基转移酶家族1A成员1)、hepsin、Her2/neu/ErbB2(Erb-B2受体酪氨酸激酶2)、HERV-K-MEL、HNE(髓质素)、同源异型框NKX 3.1、HOM-TES-14/SCP-1、HOM-TES-85、HPV-E6、HPVE7、HST-2(沉默调节蛋白-2)、hTERT、iCE(半胱天冬酶1)、IGF-1R(胰岛素样生长因子-1受体)、IL-13Ra2(白介素-13受体亚单位α2)、IL-2R(白介素-2受体)、IL-5(白介素-5)、未成熟层粘连蛋白受体、激肽释放酶2、激肽释放酶4、Ki67、KIAA0205(溶血磷脂酰甘油酰基转移酶1)、KK-LC-1(北九州肺癌抗原-1)、KM-HN-1、LAGE-1(L抗原家族成员-1)、Livin、MAGE-A1、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGEA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-B1、MAGE-B10、MAGE-B16、MAGEB17、MAGE-B2、MAGE-B3、MAGE-B4、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-D1、MAGE-D2、MAGE-D4、MAGE-E1、MAGE-E2、MAGE-F1、MAGE-H1、MAGEL2(黑素瘤抗原家族L2)、乳房珠蛋白A、MART-1/Melan-A(由T细胞识别的黑素瘤抗原-1)、MART-2、基质蛋白22、MC1R(黑皮质素1受体)、M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)、间皮素、MG50/PXDN(过氧蛋白)、MMP 11(基质金属蛋白酶11)、MN/CA1X-抗原(碳酸酐酶9)、MRP-3(多药耐药相关蛋白-3)、MUC1(粘蛋白1)、MUC2、NA88-A(VENT样同源异型框2假基因1)、N-乙酰葡糖胺基转移酶-V、Neo-PAP(Neo-聚(A)聚合酶)、NGEP(在前列腺中表达的新基因)、NMP22(核基质蛋白22)、NPM/ALK(核磷蛋白)、NSE(神经元特异性烯醇化酶)、NY-ESO-1、NY-ESO-B、OA1(骨关节炎QTL 1)、OFA-iLRP(癌胚抗原未成熟层粘连蛋白受体蛋白)、OGT(O-GlcNAc转移酶)、OS-9(内质网凝集素)、骨钙素、骨桥蛋白、p15(CDK抑制因子2B)、p53、PAGE-4(P抗原家族成员-4)、PAI-1(纤溶酶原激活物抑制物-1)、PAI-2、PAP(前列腺酸性磷酸酶)、PART-1(前列腺雄激素调节转录物1)、PATE(前列腺和睾丸表达1)、PDEF(前列腺源性Ets因子)、Pim-1-激酶(原病毒整合位点1)、Pin1(肽基-脯氨酰顺反异构酶NIMA相互作用1)、POTE(在前列腺、卵巢、睾丸和胎盘中表达)、PRAME(在黑素瘤中优先表达的抗原)、前列腺素、蛋白酶-3、PSA(前列腺特异性抗原)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、PSGR(前列腺特异性G蛋白偶联受体)、PSM、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、RAGE-1(肾肿瘤癌抗原)、RHAMM/CD168、RU1(肾遍在蛋白1)、RU2、SAGE(肉瘤抗原)、SART-1(由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原-1)、SART-2、SART-3、Sp17(精子蛋白17)、SSX-1(SSX家族成员1)、SSX-2/HOM-MEL-40、SSX-4、STAMP-1(STEAP2金属还原酶)、STEAP、存活素、存活素-213、TA-90(肿瘤相关抗原-90)、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白-72)、TARP(TCRγ交替阅读框蛋白)、TGFb(转化生长因子β)、TGFbR11(转化生长因子β受体11)、TGM-4(转谷氨酰胺酶4)、TRAG-3(紫杉醇耐药相关基因3)、TRG(T细胞受体γ基因座)、TRP-1(瞬时受体电位-1)、TRP-2/6b、TRP-2/INT2、Trp-p8、酪氨酸酶、UPA(U型纤溶酶原激活剂)、VEGF(血管内皮生长因子A)、VEGFR-2/FLK-1和WT1(肾母细胞瘤1)。在一些实施方案中，靶抗原是CD19或CD22。在一些实施方案中，靶抗原是CD19。
在一些实施方案中，靶抗原是癌抗原，其在癌细胞、癌症组织和/或肿瘤微环境中或表面上的表达增加。
在一些实施方案中，靶抗原选自由以下组成的组：
α-辅肌动蛋白-4/m、ARTC1/m、bcr/abl、β-连环蛋白/m、BRCA1/m、BRCA2/m、CASP-5/m、CASP-8/m、CDC27/m、CDK4/m、CDKN2A/m、CML66、COA-1/m、DEK-CAN、EFTUD2/m、ELF2/m、ETV6-AML1、FN1/m、GPNMB/m、HLA-A*0201-R170I、HLA-A11/m、HLA-A2/m、HSP70-2M、KIAA0205/m、K-Ras/m、LDLR-FUT、MART2/m、ME1/m、MUM-1/m、MUM-2/m、MUM-3/m、肌球蛋白1类/m、neo-PAP/m、NFYC/m、N-Ras/m、OGT/m、OS-9/m、p53/m、Pml/RARa、PRDX5/m、PTPRX/m、RBAF600/m、SIRT2/m、SYTSSX-1、SYT-SSX-2、TEL-AML1、TGFbRII和TPI/m；并且其中靶抗原是在癌细胞、癌组织和/或肿瘤微环境中或表面上表达的癌抗原的突变形式。
在一些实施方案中，削弱免疫细胞功能的基因的表达导致以下的一种或多种：
i)抑制免疫细胞的增殖；
ii)诱导免疫细胞的细胞死亡；
iii)抑制免疫细胞识别目标抗原和/或获得活化的能力；
iv)诱导免疫细胞分化成不诱导对靶抗原的免疫响应的细胞；
v)减少免疫细胞与促进免疫细胞的免疫响应的分子的反应；或者
vi)增加免疫细胞与抑制免疫细胞的免疫响应的分子的反应。
在一些实施方案中，削弱免疫细胞功能的基因选自由以下组成的组：PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3或CEACAM-5)、LAG 3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、MerTK、2B4、FAS、CD45、PP2A、SHP1、SHP2、DGKα、DGKζ、Cb1-b、Cb1-c、CD148、LRR1、TGFBR1、IL10RA、KLGR1、DNMT3A和A2aR。
在一些实施方案中，削弱免疫细胞功能的基因增加了免疫细胞与抑制免疫细胞的免疫响应的分子的反应。
在一些实施方案中，增加免疫细胞与抑制免疫细胞的免疫响应的分子的反应的基因编码免疫检查点受体或配体。
在一些实施方案中，免疫检查点受体或配体选自由以下组成的组：PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3或CEACAM-5)、LAG 3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、MerTK和2B4。
在一些实施方案中，与不存在基因破坏剂的免疫细胞相比，基因破坏剂使削弱免疫细胞功能的基因在免疫细胞中的表达减少了至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。
在一些实施方案中，基因破坏剂减少基因的表达，所述基因增加免疫细胞与抑制免疫细胞的免疫响应的分子的反应。
在一些实施方案中，基因破坏剂减少编码免疫检查点受体或配体的基因的表达。
在一些实施方案中，基因破坏剂减少选自由以下组成的组的基因的表达：PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、MerTK和2B4。
在一些实施方案中，基因破坏剂通过RNA干扰(RNAi)减少削弱免疫细胞功能的基因的表达。在一些实施方案中，多于一种基因破坏剂通过RNAi减少削弱免疫细胞功能的基因在免疫细胞中的表达。
在一些实施方案中，基因破坏剂靶向削弱免疫细胞功能的单个基因，或靶向削弱免疫细胞功能的不同基因，其中第一基因破坏剂靶向第一基因，并且第二基因破坏剂靶向第二基因，或其任何组合。
在一些实施方案中，RNAi由短发夹核RNA(shRNA)介导。在一些实施方案中，RNAi由多于一种shRNA介导。在一些实施方案中，RNAi由两种shRNA介导。
在一些实施方案中，两种shRNA靶向PD-1。在一些实施方案中，第一shRNA靶向PD-1，并且第二shRNA靶向TIM-3。在一些实施方案中，第一shRNA靶向PD-1，并且第二shRNA靶向CTLA-4。在一些实施方案中，第一shRNA靶向PD-1，并且第二shRNA靶向LAG-3。在一些实施方案中，第一shRNA靶向PD-1，并且第二shRNA靶向TIGIT。
在一些实施方案中，免疫细胞包含编码shRNA的核苷酸序列。在一些实施方案中，免疫细胞包含编码多于一种shRNA的核苷酸序列。在一些实施方案中，免疫细胞包含编码两种shRNA的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码shRNA的核苷酸序列包含选自由SEQ ID NO：2-219和238-267组成的组的序列。
在一些实施方案中，编码shRNA的核苷酸序列在载体上。
在一些实施方案中，不同shRNA的表达分别由不同的启动子调控。在一些实施方案中，两种不同shRNA的表达分别由两种不同的启动子调控。在一些实施方案中，两种不同的启动子是RNA聚合酶III启动子。在一些实施方案中，两种启动子是U6启动子。在一些实施方案中，U6启动子来自不同的物种。在一些实施方案中，两种启动子彼此以不同的方向取向。例如，在某个实施方案中，启动子以头对头的取向来取向。在另一个实施方案中，启动子以尾对尾的取向来取向。
在一些实施方案中，基因工程化的抗原受体和基因破坏剂各自由载体表达。在一些实施方案中，基因工程化的抗原受体和基因破坏剂由同一载体表达。
在一些实施方案中，载体是质粒载体或病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是慢病毒载体或腺病毒载体。在一些实施方案中，慢病毒载体是逆转录病毒载体。
在一些实施方案中，免疫细胞选自由T细胞和天然杀伤(NK)细胞组成的组。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞包含在同一载体上编码两种shRNA和CAR的核苷酸序列。在一些实施方案中，两种shRNA各自由两种不同的RNA聚合酶III启动子调控，所述启动子彼此以不同的方向取向。例如，在某个实施方案中，启动子以头对头的取向来取向。在另一个实施方案中，启动子以尾部对尾部的取向来取向。在一些实施方案中，CAR靶向CD19，第一shRNA靶向PD-1，并且第二shRNA靶向TIGIT。
另一方面，本文提供了包含工程化免疫细胞的组合物。另一方面，本文提供了包含免疫细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。
另一方面，本文提供了治疗方法，其包括向患有疾病或疾患的受试者施用免疫细胞或组合物。在一些实施方案中，基因工程化的抗原受体与抗原特异性结合，所述抗原与所述疾病或疾患相关。在一些实施方案中，所述疾病或疾患是癌症或肿瘤。
另一方面，本文提供了用于治疗疾病或疾患的免疫细胞或组合物。另一方面，本文提供了免疫细胞或组合物在制造用于治疗疾病或疾患的药物中的用途。在一些实施方案中，基因工程化的抗原受体与抗原特异性结合，所述抗原与所述疾病或疾患相关。在一些实施方案中，所述疾病或疾患是癌症或肿瘤。
下面给出另外的非限制性实施方案。
1.一种载体，其包含：
编码两种类型的短发夹RNA(shRNA)的碱基序列，所述短发夹RNA抑制至少一种削弱免疫细胞功能的基因的表达；和
编码嵌合抗原受体(CAR)或单克隆T细胞受体(mTCR)的碱基序列。
2.根据实施方案1的载体，其中所述两种类型的shRNA的表达的特征在于它们分别由两种不同的启动子调控。
3.根据实施方案2的载体，其中两种启动子是RNA聚合酶III启动子。
4.根据实施方案2的载体，其中两种启动子是源自不同物种的U6启动子。
5.根据实施方案2的载体，其中所述两种启动子在载体上彼此以不同的方向取向。
6.根据实施方案1的载体，其中削弱免疫细胞功能的基因是免疫检查点受体或配体。
7.根据实施方案6的载体，其中所述免疫检查点受体或配体选自由以下组成的组：PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3或CEACAM-5)、LAG 3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、MerTK和2B4。
8.根据实施方案1的载体，其中削弱免疫细胞功能的基因选自由以下组成的组：FAS、CD45、PP2A、SHIP1、SHIP2、DGKα、DGKζ、Cb1-b、CD147、LRR1、TGFBR1、IL10Rα、KLGR1、DNMT3A和A2aR。
9.根据实施方案1的载体，其中所述两种类型的shRNA靶向削弱免疫细胞功能的单个基因，或者其中所述两种类型的shRNA靶向削弱免疫细胞功能的不同基因。
10.根据实施方案1的载体，其中所述两种类型的shRNA靶向PD-1。
11.根据实施方案1的载体，其中在两种类型的shRNA中，i)一种shRNA靶向PD-1，并且第二种shRNA靶向TIM-3，或者ii)一种shRNA靶向PD-1，并且第二种shRNA靶向TIGIT。
12.根据实施方案1的载体，其中在两种类型的shRNA中，编码一种shRNA的碱基序列包含选自由SEQ ID NO：2-219组成的组的序列，并且编码第二种shRNA的碱基序列包含选自由SEQ ID NO：2-219组成的组的不同序列。
13.根据实施方案1的载体，其中所述CAR或mTCR的靶标是在癌细胞、癌组织和/或肿瘤微环境中表现出增加的表达的人肿瘤抗原，或者是在癌细胞、癌组织和/或肿瘤微环境中发现的抗原的突变形式。
14.根据实施方案1的载体，所述载体是否包含SEQ ID NO：220或221的碱基序列。
15.根据实施方案1的载体，其中所述载体是质粒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关载体或逆转录病毒载体。
16.一种包含根据实施方案1的载体的免疫细胞，其中所述一个或多个基因的表达与在shRNA不存在的情况下的表达相比减少至40％或更少。
17.根据实施方案16的免疫细胞，其中所述免疫细胞是人来源的T细胞或天然杀伤(NK)细胞。
18.一种药物组合物，其包含根据实施方案1-17中任一项的免疫细胞。
19.根据实施方案18的药物组合物，其用于治疗需要免疫疗法的患者，其中所述免疫细胞最初获自患者。
20.根据实施方案19的药物组合物，其中所述患者患有肿瘤或癌症，在所述肿瘤或癌症中检测到在免疫细胞中表达的CAR或mTCR的靶标和/或靶标水平的升高或变化。
21.一种免疫细胞，所述免疫细胞包含与靶抗原特异性结合的所述因工程抗原受体，以及减少或能够减少削弱免疫细胞功能的基因在免疫细胞中的表达的所述基因破坏剂。
22.实施方案21的免疫细胞，其中所述基因工程化的抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
23.实施方案22的免疫细胞，其中所述基因工程化的抗原受体是CAR。
24.实施方案23的免疫细胞，其中所述CAR包含胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和胞内信号转导结构域。
25.实施方案24的免疫细胞，其中所述CAR的胞外抗原识别结构域与靶抗原特异性结合。
26.实施方案24的免疫细胞，其中所述CAR的胞内信号转导结构域包含CD3 zeta(CD3ζ)链的胞内结构域。
27.实施方案26的免疫细胞，其中所述CAR的胞内信号转导结构域还包含共刺激分子。
28.实施方案27的免疫细胞，其中所述共刺激分子选自由以下组成的组：ICOS、0X40、CD137(4-1BB)、CD27和CD28。
29.实施方案28的免疫细胞，其中所述共刺激分子是CD137(4-1BB)。
30.实施方案28的免疫细胞，其中所述共刺激分子是CD28。
31.实施方案22的免疫细胞，其中所述基因工程化的抗原受体是TCR。
32.实施方案31的免疫细胞，其中所述TCR是单克隆TCR(mTCR)。
33.实施方案31或32的免疫细胞，其中所述靶抗原在癌细胞、癌组织和/或肿瘤微环境中或表面上表达。
34.实施方案33的免疫细胞，其中所述靶抗原选自由以下组成的组：
5T4(滋养层糖蛋白)、707-AP、9D7、AFP(甲胎蛋白)、AlbZIP(雄激素诱导的bZIP)、HPG1(人前列腺特异性基因-1)、α5β1-整联蛋白、α5β6-整联蛋白、α-甲基酰基辅酶A消旋酶、ART-4(ADP核糖基转移酶-4)、B7H4(含v-set结构域的T细胞活化抑制剂1)、BAGE-1(B黑素瘤抗原-1)、BCL-2(B细胞CLL/淋巴瘤-2)、BING-4(WD重复结构域46)、CA 15-3/CA 27-29(粘蛋白1)、CA 19-9(癌抗原19-9)、CA 72-4(癌抗原72-4)、CA125(癌抗原125)、钙网蛋白、CAMEL(黑素瘤上CTL识别的抗原)、CASP-8(半胱天冬酶8)、组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、CD19(分化簇19)、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD4、CD52、CD55、CD56、CD80、CEA(癌胚抗原SG8)、CLCA2(氯离子通道附件2)、CML28(慢性髓性白血病肿瘤抗原28)、毛状蛋白样蛋白、胶原蛋白XXIII、COX-2(环氧化酶-2)、CT-9/BRD6(癌/睾丸抗原9)、Cten(c-末端张力蛋白样蛋白)、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1、cyp-B、CYPB1(细胞色素p450家族1亚家族b成员1)、DAM-10/MAGE-B1(黑素瘤相关抗原B1)、DAM-6/MAGE-B2、EGFR/Her1(表皮生长因子受体)、EMMPRIN(basigin)、EpCam、EphA2(EPH受体A2)、EphA3、ErbB3(Erb-B2受体酪氨酸激酶3)、EZH2(zeste 2多梳蛋白抑制复合体2亚单位的增强子)、FGF-5(成纤维细胞生长因子5)、FN(纤连蛋白)、Fra-1(Fos相关抗原-1)、G250/CAIX(碳酸酐酶9)、GAGE-1(G抗原-1)、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7b、GAGE-8、GDEP(前列腺中差异表达的基因)、GnT-V(葡萄糖酸激酶)、gp100(黑素细胞谱系特异性抗原GP100)、GPC3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖3)、HAGE(螺旋抗原)、HAST-2(磺基转移酶家族1A成员1)、hepsin、Her2/neu/ErbB2(Erb-B2受体酪氨酸激酶2)、HERV-K-MEL、HNE(髓质素)、同源异型框NKX 3.1、HOM-TES-14/SCP-1、HOM-TES-85、HPV-E6、HPVE7、HST-2(沉默调节蛋白-2)、hTERT、iCE(半胱天冬酶1)、IGF-1R(胰岛素样生长因子-1受体)、IL-13Ra2(白介素-13受体亚单位α2)、IL-2R(白介素-2受体)、IL-5(白介素-5)、未成熟层粘连蛋白受体、激肽释放酶2、激肽释放酶4、Ki67、KIAA0205(溶血磷脂酰甘油酰基转移酶1)、KK-LC-1(北九州肺癌抗原-1)、KM-HN-1、LAGE-1(L抗原家族成员-1)、Livin、MAGE-A1、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGEA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-B1、MAGE-B10、MAGE-B16、MAGEB17、MAGE-B2、MAGE-B3、MAGE-B4、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-D1、MAGE-D2、MAGE-D4、MAGE-E1、MAGE-E2、MAGE-F1、MAGE-H1、MAGEL2(黑素瘤抗原家族L2)、乳房珠蛋白A、MART-1/Melan-A(由T细胞识别的黑素瘤抗原-1)、MART-2、基质蛋白22、MC1R(黑皮质素1受体)、M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)、间皮素、MG50/PXDN(过氧蛋白)、MMP 11(基质金属蛋白酶11)、MN/CA1X-抗原(碳酸酐酶9)、MRP-3(多药耐药相关蛋白-3)、MUC1(粘蛋白1)、MUC2、NA88-A(VENT样同源异型框2假基因1)、N-乙酰葡糖胺基转移酶-V、Neo-PAP(Neo-聚(A)聚合酶)、NGEP(在前列腺中表达的新基因)、NMP22(核基质蛋白22)、NPM/ALK(核磷蛋白)、NSE(神经元特异性烯醇化酶)、NY-ESO-1、NY-ESO-B、OA1(骨关节炎QTL 1)、OFA-iLRP(癌胚抗原未成熟层粘连蛋白受体蛋白)、OGT(O-GlcNAc转移酶)、OS-9(内质网凝集素)、骨钙素、骨桥蛋白、p15(CDK抑制因子2B)、p53、PAGE-4(P抗原家族成员-4)、PAI-1(纤溶酶原激活物抑制物-1)、PAI-2、PAP(前列腺酸性磷酸酶)、PART-1(前列腺雄激素调节转录物1)、PATE(前列腺和睾丸表达1)、PDEF(前列腺源性Ets因子)、Pim-1-激酶(原病毒整合位点1)、Pin1(肽基-脯氨酰顺反异构酶NIMA相互作用1)、POTE(在前列腺、卵巢、睾丸和胎盘中表达)、PRAME(在黑素瘤中优先表达的抗原)、前列腺素、蛋白酶-3、PSA(前列腺特异性抗原)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、PSGR(前列腺特异性G蛋白偶联受体)、PSM、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、RAGE-1(肾肿瘤癌抗原)、RHAMM/CD168、RU1(肾遍在蛋白1)、RU2、SAGE(肉瘤抗原)、SART-1(由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原-1)、SART-2、SART-3、Sp17(精子蛋白17)、SSX-1(SSX家族成员1)、SSX-2/HOM-MEL-40、SSX-4、STAMP-1(STEAP2金属还原酶)、STEAP、存活素、存活素-213、TA-90(肿瘤相关抗原-90)、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白-72)、TARP(TCRγ交替阅读框蛋白)、TGFb(转化生长因子β)、TGFbR11(转化生长因子β受体11)、TGM-4(转谷氨酰胺酶4)、TRAG-3(紫杉醇耐药相关基因3)、TRG(T细胞受体γ基因座)、TRP-1(瞬时受体电位-1)、TRP-2/6b、TRP-2/INT2、Trp-p8、酪氨酸酶、UPA(U型纤溶酶原激活剂)、VEGF(血管内皮生长因子A)、VEGFR-2/FLK-1和WT1(肾母细胞瘤1)。
35.实施方案35的免疫细胞，其中所述靶抗原是CD19或CD22。
36.实施方案36的免疫细胞，其中所述靶抗原是CD19。
37.实施方案34-36中任一项的免疫细胞，其中所述靶抗原是在癌细胞、癌组织和/或肿瘤微环境中或表面上表达增加的癌抗原。
38.实施方案33的免疫细胞，其中所述靶抗原选自由以下组成的组：
α-辅肌动蛋白-4/m、ARTC1/m、bcr/abl、β-连环蛋白/m、BRCA1/m、BRCA2/m、CASP-5/m、CASP-8/m、CDC27/m、CDK4/m、CDKN2A/m、CML66、COA-1/m、DEK-CAN、EFTUD2/m、ELF2/m、ETV6-AML1、FN1/m、GPNMB/m、HLA-A*0201-R170I、HLA-A11/m、HLA-A2/m、HSP70-2M、KIAA0205/m、K-Ras/m、LDLR-FUT、MART2/m、ME1/m、MUM-1/m、MUM-2/m、MUM-3/m、肌球蛋白1类/m、neo-PAP/m、NFYC/m、N-Ras/m、OGT/m、OS-9/m、p53/m、Pml/RARa、PRDX5/m、PTPRX/m、RBAF600/m、SIRT2/m、SYTSSX-1、SYT-SSX-2、TEL-AML1、TGFbRII和TPI/m；以及
其中所述靶抗原是癌抗原，所述癌抗原是在癌细胞、癌症组织和/或肿瘤微环境中或表面上表达的抗原的突变形式。
39.实施方案21-38中任一项的免疫细胞，其中削弱免疫细胞功能的基因的表达导致以下的一种或多种：
i)抑制免疫细胞的增殖；
ii)诱导免疫细胞的细胞死亡；
iii)抑制免疫细胞识别靶抗原和/或进行活化的能力；
iv)诱导免疫细胞分化成不诱导对靶抗原的免疫响应的细胞；
v)减少免疫细胞与促进免疫细胞的免疫响应的分子的反应；或者
vi)增加免疫细胞与抑制免疫细胞的免疫响应的分子的反应。
40.实施方案39的免疫细胞，其中所述削弱免疫细胞功能的基因选自由以下组成的组：PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3或CEACAM-5)、LAG 3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、MerTK、2B4、FAS、CD45、PP2A、SHP1、SHP2、DGKα、DGKζ、Cb1-b、Cb1-c、CD148、LRR1、TGFBR1、IL10RA、KLGR1、DNMT3A和A2aR。
41.实施方案39的免疫细胞，其中所述削弱免疫细胞功能的基因增加免疫细胞与抑制免疫细胞的免疫响应的分子的反应。
42.实施方案41的免疫细胞，其中所述增加免疫细胞与抑制免疫细胞的免疫响应的分子的反应的基因编码免疫检查点受体或配体。
43.实施方案42的免疫细胞，其中所述免疫检查点受体或配体选由以下组成的组：PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3或CEACAM-5)、LAG 3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、MerTK和2B4。
44.实施方案21-43中任一项的免疫细胞，其中与不存在所述基因破坏剂的免疫细胞相比，所述基因破坏剂使削弱免疫细胞功能的基因在免疫细胞中的表达减少至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。
45.实施方案44的免疫细胞，其中所述基因破坏剂减少基因的表达，所述基因增加免疫细胞与抑制免疫细胞的免疫响应的分子的反应。
46.实施方案45的免疫细胞，其中所述基因破坏剂减少编码免疫检查点受体或配体的基因的表达。
47.实施方案46的免疫细胞，其中所述基因破坏剂减少选自由以下组成的组的基因的表达：PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、MerTK和2B4。
48.实施方案45-47中任一项的免疫细胞，其中所述基因破坏剂通过RNA干扰(RNAi)减少削弱免疫细胞功能的基因的表达。
49.实施方案48的免疫细胞，其中多于一种基因破坏剂通过RNAi减少削弱免疫细胞功能的基因在免疫细胞中的表达。
50.实施方案49的免疫细胞，其中所述基因破坏剂靶向削弱免疫细胞功能的单个基因，或者其中不同的基因破坏剂靶向不同的削弱免疫细胞功能的基因，例如，其中第一基因破坏剂靶向第一基因，并且第二基因破坏剂靶向第二基因。
51.实施方案48-50中任一项的免疫细胞，其中所述RNAi由短发夹RNA(shRNA)介导。
52.实施方案51的免疫细胞，其中所述RNAi由多于一种shRNA介导。
53.实施方案52的免疫细胞，其中所述RNAi由两种shRNA介导。
54.实施方案52-53中任一项的免疫细胞，其中两种shRNA靶向PD-1。
55.实施方案52-53中任一项的免疫细胞，其中第一shRNA靶向PD-1，并且第二shRNA靶向TIM-3。
56.实施方案52-53中任一项的免疫细胞，其中第一shRNA靶向PD-1，并且第二shRNA靶向CTLA-4。
57.实施方案52-53中任一项的免疫细胞，其中第一shRNA靶向PD-1，并且第二shRNA靶向LAG-3。
58.实施方案52-53中任一项的免疫细胞，其中第一shRNA靶向PD-1，并且第二shRNA靶向TIGIT。
59.实施方案51-58中任一项的免疫细胞，其中所述免疫细胞包含编码shRNA的核苷酸序列。
60.实施方案59的免疫细胞，其中所述免疫细胞包含编码多于一种shRNA的核苷酸序列。
61.实施方案59的免疫细胞，其中所述免疫细胞包含编码两种shRNA的核苷酸序列。
62.根据实施方案59-61中任一项所述的免疫细胞，其中编码一种或多种所述shRNA的所述核苷酸序列包含选自由SEQ ID NO：2-219和238-267组成的组的核苷酸序列。
63.实施方案59-62中任一项的免疫细胞，其中编码一种或多种所述shRNA的所述核苷酸序列存在于载体上。
64.实施方案63中任一项的免疫细胞，其中不同shRNA的表达由不同的启动子调控。
65.实施方案64的免疫细胞，其中两种不同shRNA的表达由两种不同的启动子调控。
66.实施方案65的免疫细胞，其中所述两种不同的启动子是RNA聚合酶III启动子。
67.实施方案66的免疫细胞，其中所述两种启动子是U6启动子。
68.实施方案67的免疫细胞，其中所述U6启动子源自不同物种。
69.实施方案65-68中任一项所述的免疫细胞，其中所述两种启动子彼此以不同的方向取向
70.实施方案21-69中任一项的免疫细胞，其中所述基因工程化的抗原受体和一种或多种所述基因破坏剂各自由载体表达。
71.实施方案70的免疫细胞，其中所述基因工程化的抗原受体和一种或多种所述基因破坏剂由同一载体表达。
72.实施方案70-71中任一项的免疫细胞，其中所述载体是质粒载体或病毒载体。
73.实施方案72的免疫细胞，其中所述病毒载体是慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
74.实施方案73的免疫细胞，其中所述慢病毒载体是逆转录病毒载体。
75.实施方案21-74中任一项的免疫细胞，其中所述免疫细胞选自由T细胞和天然杀伤(NK)细胞的组成的组。
76.实施方案75的免疫细胞，其中所述免疫细胞是T细胞。
77.实施方案76的免疫细胞，其中所述T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。
78.实施方案76或77中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞包含在同一载体上编码两种shRNA和CAR或mTCR的核苷酸序列。
79.实施方案78的免疫细胞，其中所述两种shRNA各自由两种不同的彼此以不同的方向取向的RNA聚合酶III启动子调控。
80.实施方案79的免疫细胞，其中所述CAR靶向CD19，第一shRNA靶向PD-1，并且第二shRNA靶向TIGIT。
81.一种产生免疫细胞的方法，其包括同时或以任何顺序依次向免疫细胞中引入：
(1)编码与靶抗原特异性结合的基因工程化的抗原受体的基因；和
(2)基因破坏剂，其中基因破坏剂或其表达减少或能够减少削弱免疫细胞功能的基因在免疫细胞中的表达，
从而产生免疫细胞，在所述免疫细胞中表达基因工程化的抗原受体并且减少削弱免疫细胞功能的基因的表达。
82.实施方案81的方法，其中所述基因工程化的抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
83.实施方案82的方法，其中所述基因工程化的抗原受体是CAR。
84.实施方案83的方法，其中所述CAR包含胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和胞内信号转导结构域。
85.实施方案84的方法，其中所述CAR的胞外抗原识别结构域与靶抗原特异性结合。
86.实施方案84的方法，其中所述CAR的胞内信号转导结构域包含CD3 zeta(CD3ζ)链的胞内结构域。
87.实施方案86的方法，其中所述CAR的胞内信号转导结构域还包含共刺激分子。
88.实施方案87的方法，其中所述共刺激分子选自由以下组成的组：ICOS、0X40、CD137(4-1BB)、CD27和CD28。
89.实施方案88的方法，其中所述共刺激分子是CD137(4-1BB)。
90.实施方案88的方法，其中所述共刺激分子是CD28。
91.实施方案82的方法，其中所述基因工程化的抗原受体是TCR。
92.实施方案91的方法，其中所述TCR是单克隆TCR(mTCR)。
93.实施方案81-92中任一项的方法，其中所述靶抗原在癌细胞、癌组织和/或肿瘤微环境中或表面上表达。
94.实施方案93的方法，其中所述靶抗原选自由以下组成的组：
5T4(滋养层糖蛋白)、707-AP、9D7、AFP(甲胎蛋白)、AlbZIP(雄激素诱导的bZIP)、HPG1(人前列腺特异性基因-1)、α5β1-整联蛋白、α5β6-整联蛋白、α-甲基酰基辅酶A消旋酶、ART-4(ADP核糖基转移酶-4)、B7H4(含v-set结构域的T细胞活化抑制剂1)、BAGE-1(B黑素瘤抗原-1)、BCL-2(B细胞CLL/淋巴瘤-2)、BING-4(WD重复结构域46)、CA 15-3/CA 27-29(粘蛋白1)、CA 19-9(癌抗原19-9)、CA 72-4(癌抗原72-4)、CA125(癌抗原125)、钙网蛋白、CAMEL(黑素瘤上CTL识别的抗原)、CASP-8(半胱天冬酶8)、组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、CD19(分化簇19)、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD4、CD52、CD55、CD56、CD80、CEA(癌胚抗原SG8)、CLCA2(氯离子通道附件2)、CML28(慢性髓性白血病肿瘤抗原28)、毛状蛋白样蛋白、胶原蛋白XXIII、COX-2(环氧化酶-2)、CT-9/BRD6(癌/睾丸抗原9)、Cten(c-末端张力蛋白样蛋白)、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1、cyp-B、CYPB1(细胞色素p450家族1亚家族b成员1)、DAM-10/MAGE-B1(黑素瘤相关抗原B1)、DAM-6/MAGE-B2、EGFR/Her1(表皮生长因子受体)、EMMPRIN(basigin)、EpCam、EphA2(EPH受体A2)、EphA3、ErbB3(Erb-B2受体酪氨酸激酶3)、EZH2(zeste 2多梳蛋白抑制复合体2亚单位的增强子)、FGF-5(成纤维细胞生长因子5)、FN(纤连蛋白)、Fra-1(Fos相关抗原-1)、G250/CAIX(碳酸酐酶9)、GAGE-1(G抗原-1)、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7b、GAGE-8、GDEP(前列腺中差异表达的基因)、GnT-V(葡萄糖酸激酶)、gp100(黑素细胞谱系特异性抗原GP100)、GPC3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖3)、HAGE(螺旋抗原)、HAST-2(磺基转移酶家族1A成员1)、hepsin、Her2/neu/ErbB2(Erb-B2受体酪氨酸激酶2)、HERV-K-MEL、HNE(髓质素)、同源异型框NKX 3.1、HOM-TES-14/SCP-1、HOM-TES-85、HPV-E6、HPVE7、HST-2(沉默调节蛋白-2)、hTERT、iCE(半胱天冬酶1)、IGF-1R(胰岛素样生长因子-1受体)、IL-13Ra2(白介素-13受体亚单位α2)、IL-2R(白介素-2受体)、IL-5(白介素-5)、未成熟层粘连蛋白受体、激肽释放酶2、激肽释放酶4、Ki67、KIAA0205(溶血磷脂酰甘油酰基转移酶1)、KK-LC-1(北九州肺癌抗原-1)、KM-HN-1、LAGE-1(L抗原家族成员-1)、Livin、MAGE-A1、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGEA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-B1、MAGE-B10、MAGE-B16、MAGEB17、MAGE-B2、MAGE-B3、MAGE-B4、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-D1、MAGE-D2、MAGE-D4、MAGE-E1、MAGE-E2、MAGE-F1、MAGE-H1、MAGEL2(黑素瘤抗原家族L2)、乳房珠蛋白A、MART-1/Melan-A(由T细胞识别的黑素瘤抗原-1)、MART-2、基质蛋白22、MC1R(黑皮质素1受体)、M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)、间皮素、MG50/PXDN(过氧蛋白)、MMP 11(基质金属蛋白酶11)、MN/CA1X-抗原(碳酸酐酶9)、MRP-3(多药耐药相关蛋白-3)、MUC1(粘蛋白1)、MUC2、NA88-A(VENT样同源异型框2假基因1)、N-乙酰葡糖胺基转移酶-V、Neo-PAP(Neo-聚(A)聚合酶)、NGEP(在前列腺中表达的新基因)、NMP22(核基质蛋白22)、NPM/ALK(核磷蛋白)、NSE(神经元特异性烯醇化酶)、NY-ESO-1、NY-ESO-B、OA1(骨关节炎QTL 1)、OFA-iLRP(癌胚抗原未成熟层粘连蛋白受体蛋白)、OGT(O-GlcNAc转移酶)、OS-9(内质网凝集素)、骨钙素、骨桥蛋白、p15(CDK抑制因子2B)、p53、PAGE-4(P抗原家族成员-4)、PAI-1(纤溶酶原激活物抑制物-1)、PAI-2、PAP(前列腺酸性磷酸酶)、PART-1(前列腺雄激素调节转录物1)、PATE(前列腺和睾丸表达1)、PDEF(前列腺源性Ets因子)、Pim-1-激酶(原病毒整合位点1)、Pin1(肽基-脯氨酰顺反异构酶NIMA相互作用1)、POTE(在前列腺、卵巢、睾丸和胎盘中表达)、PRAME(在黑素瘤中优先表达的抗原)、前列腺素、蛋白酶-3、PSA(前列腺特异性抗原)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、PSGR(前列腺特异性G蛋白偶联受体)、PSM、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、RAGE-1(肾肿瘤癌抗原)、RHAMM/CD168、RU1(肾遍在蛋白1)、RU2、SAGE(肉瘤抗原)、SART-1(由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原-1)、SART-2、SART-3、Sp17(精子蛋白17)、SSX-1(SSX家族成员1)、SSX-2/HOM-MEL-40、SSX-4、STAMP-1(STEAP2金属还原酶)、STEAP、存活素、存活素-213、TA-90(肿瘤相关抗原-90)、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白-72)、TARP(TCRγ交替阅读框蛋白)、TGFb(转化生长因子β)、TGFbR11(转化生长因子β受体11)、TGM-4(转谷氨酰胺酶4)、TRAG-3(紫杉醇耐药相关基因3)、TRG(T细胞受体γ基因座)、TRP-1(瞬时受体电位-1)、TRP-2/6b、TRP-2/INT2、Trp-p8、酪氨酸酶、UPA(U型纤溶酶原激活剂)、VEGF(血管内皮生长因子A)、VEGFR-2/FLK-1和WT1(肾母细胞瘤1)。
95.实施方案95的方法，其中所述靶抗原是CD19或CD22。
96.实施方案96的方法，其中所述靶抗原是CD19。
97.实施方案94-96中任一项的方法，其中所述靶抗原是癌抗原，其中所述癌抗原是在癌细胞、癌症组织和/或肿瘤微环境中或表面上表达增加的抗原。
98.实施方案93的方法，其中所述靶抗原选自由以下组成的组：
α-辅肌动蛋白-4/m、ARTC1/m、bcr/abl、β-连环蛋白/m、BRCA1/m、BRCA2/m、CASP-5/m、CASP-8/m、CDC27/m、CDK4/m、CDKN2A/m、CML66、COA-1/m、DEK-CAN、EFTUD2/m、ELF2/m、ETV6-AML1、FN1/m、GPNMB/m、HLA-A*0201-R170I、HLA-A11/m、HLA-A2/m、HSP70-2M、KIAA0205/m、K-Ras/m、LDLR-FUT、MART2/m、ME1/m、MUM-1/m、MUM-2/m、MUM-3/m、肌球蛋白1类/m、neo-PAP/m、NFYC/m、N-Ras/m、OGT/m、OS-9/m、p53/m、Pml/RARa、PRDX5/m、PTPRX/m、RBAF600/m、SIRT2/m、SYTSSX-1、SYT-SSX-2、TEL-AML1、TGFbRII和TPI/m；以及
其中所述靶抗原是癌抗原，其中所述癌抗原是在癌细胞、癌症组织和/或肿瘤微环境中或表面上表达的抗原的突变形式。
99.实施方案81-98中任一项的方法，其中所述削弱免疫细胞功能的基因的表达导致以下的一种或多种：
i)抑制免疫细胞的增殖；
ii)诱导免疫细胞的细胞死亡；
iii)抑制免疫细胞识别靶抗原和/或获得活化的能力；
iv)诱导免疫细胞分化成不诱导对靶抗原的免疫响应的细胞；
v)减少免疫细胞与促进免疫细胞的免疫响应的分子的反应；或者
vi)增加免疫细胞与抑制免疫细胞的免疫响应的分子的反应。
100.实施方案99的方法，其中所述削弱免疫细胞功能的基因选自由以下组成的组：PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3或CEACAM-5)、LAG 3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、MerTK、2B4、FAS、CD45、PP2A、SHP1、SHP2、DGKα、DGKζ、Cb1-b、Cb1-c、CD148、LRR1、TGFBR1、IL10RA、KLGR1、DNMT3A和A2aR。
101.实施方案99的方法，其中所述削弱免疫细胞功能的基因增加免疫细胞与抑制免疫细胞的免疫响应的分子的反应。
102.实施方案101的方法，其中所述增加免疫细胞与抑制免疫细胞的免疫响应的分子的反应的基因编码免疫检查点受体或配体。
103.实施方案102的方法，其中所述免疫检查点受体或配体选自由以下组成的组：PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3或CEACAM-5)、LAG 3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、MerTK和2B4。
104.实施方案81-103中任一项的方法，其中与不存在一种或多种基因破坏剂的免疫细胞相比，所述基因破坏剂使削弱免疫细胞功能的基因在免疫细胞中的表达减少至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。
105.实施方案104的方法，其中所述基因破坏剂减少基因的表达，所述基因增加免疫细胞与抑制免疫细胞的免疫响应的分子的反应。
106.实施方案105的方法，其中所述基因破坏剂减少编码免疫检查点受体或配体的基因的表达。
107.实施方案106的方法，其中所述基因破坏剂降低选自由以下组成的组的基因的表达：PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、MerTK和2B4。
108.实施方案105-107中任一项的方法，其中所述基因破坏剂通过RNA干扰(RNAi)减少削弱免疫细胞功能的基因的表达。
109.实施方案108的方法，其中多于一种基因破坏剂通过RNAi减少削弱免疫细胞功能的基因在免疫细胞中的表达。
110.实施方案109的方法，其中所述基因破坏剂靶向削弱免疫细胞功能的单个基因，或靶向削弱免疫细胞功能的不同基因，其中第一基因破坏剂靶向第一基因，并且第二基因破坏剂靶向第二基因，或其任何组合。
111.实施方案108-110中任一项的方法，其中所述RNAi是由短发夹RNA(shRNA)介导的。
112.实施方案111的方法，其中所述RNAi由多于一种shRNA介导。
113.实施方案112的方法，其中所述RNAi由两种shRNA介导。
114.实施方案112或113的方法，其中两种shRNA靶向PD-1。
115.实施方案112或113的方法，其中第一shRNA靶向PD-1，并且第二shRNA靶向TIM-3。
116.实施方案112或113的方法，其中第一shRNA靶向PD-1，并且第二shRNA靶向CTLA-4。
117.实施方案112或113的方法，其中第一shRNA靶向PD-1，并且第二shRNA靶向LAG-3。
118.实施方案112或113的方法，其中第一shRNA靶向PD-1，并且第二shRNA靶向TIGIT。
119.实施方案111-118中任一项的方法，其中所述免疫细胞包含编码shRNA的核苷酸序列。
120.实施方案119的方法，其中所述免疫细胞包含编码多于一种shRNA的核苷酸序列。
121.实施方案119的方法，其中所述免疫细胞包含编码两种shRNA的核苷酸序列。
122.实施方案119-121中任一项的方法，其中编码一种或多种所述shRNA的所述核苷酸序列包含选自由SEQ ID NO：2-219和238-267组成的组的序列。
123.实施方案119-122中任一项的方法，其中编码所述shRNA的所述核苷酸序列存在于载体上。
124.实施方案123中任一项的方法，其中不同shRNA的表达分别由不同的启动子调控。
125.实施方案124的方法，其中两种不同shRNA的表达分别由两种不同的启动子调控。
126.实施方案125的方法，其中所述两种不同的启动子是RNA聚合酶III启动子。
127.实施方案126的方法，其中所述两种启动子是U6启动子。
128.实施方案127的方法，其中所述U6启动子源自不同物种。
129.实施方案125-128中任一项的方法，其中所述两种启动子彼此以不同的方向取向。
130.实施方案81-129中任一项的方法，其中所述基因工程化的抗原受体和一种或多种所述基因破坏剂各自由载体表达。
131.实施方案130的方法，其中所述基因工程化的抗原受体和一种或多种所述基因破坏剂由同一载体表达。
132.实施方案130-131中任一项的方法，其中所述载体是质粒载体或病毒载体。
133.实施方案132的方法，其中所述病毒载体是慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
134.实施方案133的方法，其中所述慢病毒载体是逆转录病毒载体。
135.实施方案81-134中任一项的方法，其中所述免疫细胞选自由T细胞和在然杀伤(NK)细胞组成的组。
136.实施方案135的方法，其中所述免疫细胞是T细胞。
137.实施方案136的方法，其中所述T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。
138.实施方案136或137的方法，其中所述免疫细胞包含在同一载体上编码两种shRNA和CAR的核苷酸序列。
139.实施方案138的方法，其中所述两种shRNA各自由两种以不同的彼此以不同的方向取向的RNA聚合酶III启动子调控。
140.实施方案139的方法，其中所述CAR靶向CD19，所述第一shRNA靶向PD-1，并且所述第二shRNA靶向TIGIT。
141.一种组合物，其包含实施方案21-80中任一项的免疫细胞。
142.一种药物组合物，其包含实施方案21-80中任一项的免疫细胞和药学上可接受的载体。
143.一种治疗方法，其包括向患有需要免疫疗法的疾病或疾患的受试者施用实施方案21-80中任一项的免疫细胞或实施方案141或142的组合物。
144.实施方案143所述的方法，其中所述基因工程化的抗原受体与抗原特异性结合，所述抗原与所述疾病或疾患相关。
145.实施方案143或144的方法，其中所述疾病或所述疾患是癌症，例如，肿瘤。
146.实施方案21-80中任一项的免疫细胞或实施方案141-142的组合物，其用于治疗疾病或疾患。
147.实施方案21-80中任一项的免疫细胞或实施方案121-122的组合物在制造用于治疗疾病或疾患的药物中的用途。
148.实施方案146的免疫细胞或组合物或实施方案147的用途，其中所述基因工程化的抗原受体与抗原特异性结合，所述抗原与所述疾病或疾患相关。
149.实施方案147或实施方案148的用途、组合物或免疫细胞，其中所述疾病或疾患是癌症，例如，肿瘤。
附图说明
图1A-1E.细胞固有的PD-1的产生阻断了CAR-T细胞。(图1A)二合一CAR载体的示意图。(图1B-C)在转导后第4天分析LNGFR和CAR表达。(图1D)通过使用LNGFR磁珠分选CAR-T细胞，并以2×105/ml接种所述细胞。通过台盼蓝染色评估累积的CAR T细胞计数。(图1E)在外源性细胞因子不存在的情况下将LNGFR+CAR T细胞与γ射线-照射的NALM-6混合。
图2.Pol III启动子类型对细胞固有的PD-1阻断的影响。
图3A-3B.CD19和PD-1阻断的PD-L1刺激下的体外细胞毒性和增殖。(图3A)将LNGFR+CAR T细胞与活的NALM-6或NALM-6-PDL1以1∶1、0.3∶1、0.1∶1的E∶T比率混合。(图3B)在无外源性细胞因子的情况下将LNGFR+CAR T细胞与γ射线-照射的NALM-6-PDL1、NALM-6-PDL1-CD80或K562-CD19-PDL1以1∶1的E∶T比率混合。
图4.具有细胞固有的PD-1阻断剂的CAR-T细胞在体内的抗肿瘤作用。
图5A.在CAR-T细胞的细胞固有的PD-1破坏中体内细胞因子产生减少。图5B显示了具有细胞固有的PD-1破坏的CAR-T细胞的延迟的体内扩增。
图6A-6B.CD28/CD3ζ或4-1BB/CD3ζCAR-T细胞在细胞固有的PD-1破坏中的功能。(图6A)G28z、GBBz、P28z和PBBz载体的示意图。(图6B)流式细胞术分析显示转导后4天的被转导的T细胞的LNGFR表达。
图7A-7B.与CD28或4-1BB共刺激时的PD-1表达水平。(图7A)在外源性细胞因子不存在的情况下将LNGFR+CAR T细胞与γ射线照射的NALM-6或K562-CD19一起孵育。孵育后第3天，分析LNGFR+CART细胞的PD-1表达。(图7B)用PD-1引物进行的定量实时PCR结果。
图8A-8B.NFAT或NF-κB报告系统的建立。(图8A)NFAT-RE 3x-eGFP和NF-κB-RE 5x-eGFR受体报告载体的示意图。(图8B)使用LNGFR+CAR T细胞的eGFP gMFI计算的报道分子活性的倍数变化。
图9A-9B.CD28共刺激中的激活的NFAT信号传导，但在4-1BB共刺激中不存在该激活的信号传导。(图9A)用G28z或GBBz再次刺激和转导报道分子转导的T细胞。(图9B)通过qPCR来评估CART细胞中NFAT靶基因的mRNA水平。
图10.CD28和4-1BB共刺激两者中的激活的NF-κB信号传导。
图11A-11C.G28z CART的TGF-β信号传导强度略高于BBz CART。(图11A)在与NALM-6以1∶1的E∶T细胞比率一起孵育4小时或24小时后，通过细胞内流式细胞术分析了CAR-T细胞中磷酸化的SMAD2/3。(图11B)流式细胞术分析显示，在10ng/ml的重组人TGF-β1存在的情况下G28z和GBBz CAR T细胞中的PD-1表达。(图11C)通过qPCR评估CAR T细胞中TGF-β1、TGFBR1和TGFBR2的mRNA水平。
图12A-12B.在重复CD19和PD-L1刺激下，PBBz CAR T细胞在体外保持细胞毒性和增殖能力。(图12A)细胞毒性。上图，在LNGFR磁性分选后，将12天的原代LNGFR+CAR T细胞与NALM-6-PDL1以1∶1、0.3∶1、0.1∶1的E∶T比率混合。底图，用γ射线-照射的K562-CD19-PDL1以1∶1的E∶T比率刺激LNGFR+CART细胞。(图12B)在外源性细胞因子不存在的情况下，将LNGFR+CAR T与γ-照射的NALM-6-PDL1-CD80或K562-CD19-PDL1以1∶1的E∶T比率混合来重复刺激LNGFR+CAR T细胞。
图13A-13C.对TGF-β介导的功能障碍不太敏感，并且在PBBz CAR T细胞中体外生成的源自CAR的调节性T细胞含量低。(图13A)TGF-β介导的对细胞增殖的抑制。(图13B)针对Treg诱导的TGF-β敏感性。(图13C)PDL 1/PD-1对Treg诱导的作用。
图14.PBBz CAR T细胞对白血病进展的持续抑制。
图15.编码两种类型shRNA(其中一种抑制PD-1的表达，第二种抑制TIM-3的表达)的两种类型载体以及CD19 CAR表达盒的组成图。
图16.CAR-T细胞制备过程图，其中如本文所述制备并分离ΔLNGFR-CART19/mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6细胞和ΔLNGFR-CART19/shTIM-3-mU6←→hU6-shPD-1细胞。
图17.来自包含图15所示载体的CAR-T细胞的流式细胞术数据((ΔLNGFR-CART19/mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6细胞和ΔLNGFR-CART19/shTIM-3-mU6→←hU6-shPD-1细胞)。
图18A-18B.图18A.使用实施例8中的方法产生的ΔLNGFR-CART19/mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6细胞和ΔLNGFR-CART19/shTIM-3-mU6→←hU6-shPD-1细胞的流式细胞术数据。图18B.CAR-T细胞中PD-1和TIM-3的表达。
图19.流式细胞术数据，其中使用靶细胞重复刺激CAR-T细胞，之后使用CD45RA和CCR7抗体确认细胞分化程度。
图20A-20C.使用实施例8中的方法产生的CAR-T细胞的评价。图20A：转导效率。图20B：增殖能力。图20C：生存力。
图21A-21C.靶向CTLA-4、LAG-3、TIGIT和TIM-3的shRNA的选择。图21A：用靶向CTLA-4、LAG-3、TIGIT和TIM-3的21聚体siRNA对2天的CD3/CD28刺激的T细胞进行电穿孔。转染后第2天确认了siRNA介导的敲低效率。阴影部分：基于选择的siRNA的序列，构建表达CAR和shRNA的二合一载体。阴影部分表示最初选择的siRNA。图21B：用包含CTLA-4、LAG-3、TIGIT或TIM-3shRNA的二合一载体转导T细胞，并用LNGFR磁珠分选。以2×105/ml接种后，每隔3天测量一次LNGFR+CAR T细胞计数。图21C：Tim3表达(％)。
图22A-22E.双重免疫检查点破坏的CART细胞的产生。(图22A)双重二合一载体的示意图。图22B：双重二合一转导后第4天分析LNGFR+T细胞％。(图22C)分选双重KD(敲低)CAR-T细胞，并以2×105/ml进行接种。用台盼蓝染色法测定累积的CAR T细胞计数。(图22D-22E)在γ射线-照射的NALM-6或K562-CD19共培养后3天，分析LNGFR+CAR T细胞的LAG-4、PD-1、TIGIT或TIM-3表达。用细胞内流式细胞术分析CTLA-4的表达。
图23.使用靶向两个免疫检查点的双重KD CAR-T细胞在体内治疗CD19+血癌。
图24.在实体肿瘤模型中使用靶向PD-1和TIGIT的双重KD CAR-T细胞治疗癌症。
具体实施方式
在所附权利要求中具体阐述了本公开的特征。通过参考以下阐述说明性实施方案的详细描述，将获得对本公开的特征和益处的更好理解，在所述实施方案中利用了本公开的原理。为了便于全面理解本文阐述的公开内容，下面定义了一些术语。
简言之，在一个方面，本文公开了载体，其包含：编码两种类型的短发夹RNA(shRNA)的碱基序列，所述shRNA抑制一种或多种削弱免疫细胞功能的基因(包括免疫检查点受体和配体)的表达，以及编码抗原受体诸如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)(例如单克隆T细胞受体(mTCR))的碱基序列；免疫细胞，其包含与靶抗原特异性结合的基因工程化的抗原受体和一种或多种基因破坏剂，所述基因破坏剂减少或能够减少免疫细胞中削弱免疫细胞功能的一种或多种基因的表达；产生所述免疫细胞的方法；包含所述免疫细胞的组合物或药物组合物，例如，用于人患者的免疫疗法；以及治疗方法，其包括向患有疾病或疾患的受试者施用所述免疫细胞。由于免疫细胞、组合物或药物组合物包含一种或多种基因破坏剂，例如编码两种shRNA，所述两种shRNA减少两种免疫检查点分子基因的表达，所述免疫检查点分子基因可被癌细胞激活以削弱免疫细胞的功能，因此有可能消除严重的全身性不良反应(诸如细胞因子释放综合征或自身免疫症状)，所述不良反应可由使用这些基因的单独抑制剂引起，以及减轻由于昂贵的并行治疗导致的治疗成本增加而带来的负担，同时提供比仅表达一种shRNA的情况更有效的细胞疗法。
1.通用技术
本文描述或引用的技术和程序包括本领域技术人员使用常规方法普遍理解和/或普遍使用的那些技术和程序，例如在以下参考文献中描述的广泛使用的方法：Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第4版2012)；Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编辑，2003)；Therapeutic Monoclonal Antibodies： From Bench to Clinic(An编辑2009)；Monoclonal Antibodies：Methods and Protocols(Albitar编辑2010)以及Antibody Engineering第1卷和第2卷(Kontermann和Dübel编辑，第2版，2010Molecular Biology ofthe Cell(第6版，2014)。
2.定义
除非另外描述，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。出于解释本说明书的目的，术语的以下描述将适用，并且只要合适，以单数使用的术语也将包括复数，反之亦然。所有专利、申请、公开的申请和其它出版物均通过引用整体并入本文。如果对所述术语的任何描述与通过引用并入本文的任何文件相冲突，则应以下文所述术语的描述为准。
本公开中使用的术语仅用于解释特定实施方案，而不旨在限制本发明的范围。除非上下文中另有明确指示，否则单数表述包括复数表述。应当理解，本发明不限于本文所述的特定的方法、方案和试剂等，因此可以变化。本文所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方案，而不意图限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书限定。
如本文中所用，冠词“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”在本文中用于指代该冠词的一个或多于一个(即至少一个)语法对象。举例来说，“一个元素”是指一个元素或一个以上的元素。
备选方案(例如，“或”)的使用应理解为意指备选方案中的一个、两个或其任何组合。
术语“和/或”应该被理解为意指两种选择中的一种或两种。
如本文中所用，术语“约”或“大约”是指数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度与参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相比变化多达15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。在一个实施方案中，术语“约”或“大约”是指关于参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％的范围。
在整个说明书中，对“一个实施方案”、“实施方案”、“特定实施方案”、“相关实施方案”、“某一实施方案”、“另外的实施方案”或“另一实施方案”或其组合等的引用意味着结合该实施方案描述的特定特性、结构或特征被包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在整个说明书的各个地方出现的前述短语不一定都指同一实施方案。此外，在一个或多个实施方案中，可以以任何合适的方式组合特定特性、结构或特征。
“构建体”是指包含要在体外或体内递送至靶细胞的多核苷酸的大分子或分子复合物。如本文中所用，“载体”是指能够将外源遗传物质递送或转移至靶细胞的任何核酸构建体，在靶细胞中可以复制和/或表达所述外源遗传物质。如本文中所用，术语“载体”包含待递送的构建体。载体可以是线性或圆形的分子。载体可以是整合的或非整合的。载体的主要类型包括但不限于质粒、游离型载体、病毒载体、粘粒和人工染色体。病毒载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒载体等。
本文所述的“二合一载体”是这样的载体，其包含编码一种或多种抑制削弱免疫细胞功能的一种或多种基因表达的短发夹RNA(shRNA)的碱基序列，以及编码嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(例如，单克隆T细胞受体(mTCR))的碱基序列。本文所述的“双重二合一载体”是这样的载体，其包含编码两种类型的抑制削弱免疫细胞功能的基因表达的短发夹RNA(shRNA)的碱基序列，以及编码嵌合抗原受体(CAR)和T细胞受体(例如，单克隆T细胞受体(mTCR))中的任一种的碱基序列。本文所述的双重二合一载体是二合一载体的一种形式。
“RNAi”(也称为转录后基因沉默(PTGS)、压制(quelling)或共抑制)是转录后基因沉默过程，其中RNA分子以序列特异性方式抑制(通常通过破坏特定的mRNA分子)基因表达。RNAi的活性组分是短/小的双链RNA(dsRNA)，称为小干扰RNA(siRNA)，通常含有15-30个核苷酸(例如，19-25、19-24或19-21个核苷酸)和2个核苷酸3’悬突，并与靶基因的核酸序列匹配。这些短的RNA种类可以在体内通过Dicer介导的较大dsRNA的裂解自然产生，并且它们在哺乳动物细胞中具有功能。DNA表达质粒可用于在细胞中稳定表达本发明的siRNA双链体或dsRNA，并实现对靶基因表达的长期抑制。一方面，siRNA双链体的有义和反义链通常通过短间隔序列连接，导致被称为短发夹RNA(shRNA)的茎环结构表达。发夹被Dicer识别并切割，从而产生成熟的siRNA分子。
术语“shRNA”是指其中一些自身互补序列产生具有其茎干的致密发夹结构的RNA分子。RNA分子可具有约80bp的长度。当shRNA在细胞中表达时，其经过一系列步骤被加工成小干扰RNA(siRNA)，用于引导基因沉默。简言之，当shRNA被表达时，其在细胞中被Drosha复合物加工成前shRNA，然后被转运到细胞核外，在那里其被Dicer进一步加工成siRNA，然后被单链化以及被RISC(RNA诱导的沉默复合物)复合物装载。此处，siRNA的反义链作为RISC复合物与靶基因的mRNA结合的引导者，当以这种方式结合的RISC复合物切割mRNA时，发生基因沉默。由于靶基因中的shRNA允许对特定基因持续且特异的基因沉默，因此为了抑制靶基因，将其包含在载体中。
术语“启动子”是指参与基因转录开始的基因上游区域。上述两种类型的shRNA也引起启动子调控表达。此处，两种类型的shRNA的表达特征可在于它们分别由两种不同的启动子调控。如果使用重复的插入片段以相同的碱基序列进行克隆，则很有可能由于这些相同的碱基序列之间的结合而无法进行正确的克隆，从而导致重组或缺失。启动子可以是RNA聚合酶I启动子、RNA聚合酶II启动子或RNA聚合酶III启动子，这取决于哪个RNA聚合酶与启动子结合并开始转录。上述两种启动子的特征在于它们是RNA聚合酶III启动子(以下称为pol III启动子)。可使pol III启动子精确地从5’末端转录到3’末端，而无需在RNA的5’末端连接帽或在3’末端连接poly(A)尾，所述RNA由启动子调控转录。Pol III启动子的类型包括但不限于U6启动子、H1启动子和7SK启动子等。
如本文中所用，术语“G28z”是指包含shGFP表达盒、CD28共刺激结构域和CD3ζ结构域的构建体(图6A)。更具体地，在术语“G28z”中，“G”代表shGFP；“28”代表CD28；“z”代表CD3ζ。遵循相同的模式，如本文中所用，术语“P28z”指的是包含shPD-1表达盒、CD28共刺激结构域和CD3ζ结构域的构建体(图6A)，其中“P”代表shPD-1，“28”代表“CD28”，并且“z”代表CD3ζ。如本文中所用，术语“GBBz”是指包含shGFP表达盒、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ结构域的构建体(图6A)，其中“G”代表shGFP；“BB”代表4-1BB；“z”代表CD3ζ。如本文中所用，术语“PBBz”是指包含shPD-1表达盒、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ结构域的构建体(图6A)，其中“P”代表shPD-1；“BB”代表4-1BB；“z”代表CD3ζ。
“CAR”通常是一组多肽，当其存在于免疫细胞上时，导致免疫细胞对靶细胞(通常是癌细胞)具有特异性，同时导致细胞中的信号转导。CAR至少包括识别下述靶抗原的胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和胞内信号转导结构域，其中胞内信号转导结构域来源于下述促进分子或共刺激分子。包含多肽的组可以被连接，或者可以是它们通过开关连接的形式，该开关通过刺激而被二聚化。促进分子可以是上述TCR的ζ链。“CD19 CAR”是靶向CD19癌抗原的CAR。
如本文中所用，术语“T细胞受体(TCR)”是指由alpha(α)和beta(β)链的异二聚体组成的T细胞上的蛋白质受体，尽管在一些细胞中，TCR由γ和δ(γ/δ)链组成。在某些实施方案中，可在包含TCR的任何细胞上修饰TCR，所述细胞包括例如辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、天然杀伤T细胞和γδT细胞。
如本文中所用，术语“单克隆T细胞受体(mTCR)”是指经遗传修饰以特异性靶向特定抗原的T细胞受体(TCR)。其也可被称为抗原特异性TCR。据报道，具有mTCR效应的T细胞用于病毒感染和癌症的免疫疗法，诸如过继性T细胞疗法。在某些方面，嵌合单链抗体构建体(scFv)的逆转录病毒转移已被用作产生具有确定抗原特异性的T细胞的策略。在大多数情况下，嵌合单链抗体构建体与FcR-γ或CD3ζ的胞内信号域相连，以触发T细胞效应子功能。已将CD3ζ结构域与共刺激分子诸如CD28、4-1BB或OX40的信号传导结构域组合。单克隆T细胞受体(mTCR)及其在癌症疗法中的应用描述于Stauss等人，2007，Molecular Therapy，15(10)：1744-50，Zhang和Morgan，2012，Advanced Drug Delivery Reviews，64(8)：756-762以及Liddy等人，2012，Nature Medicine，18(6)：980-7中，所述参考文献的每一篇的内容通过引用整体并入本文。
如本文中所用，术语“ΔLNGFR”是指没有用于纯化其中已发生了上述插入的细胞的胞质结构域的LNGFR(低亲和力神经生长因子受体)。
“免疫细胞”在本文中可表征为选自但不限于淋巴细胞，诸如杀伤T细胞、辅助T细胞、γδT细胞和B细胞、天然杀伤细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞；吞噬细胞包括巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞。T细胞包括CD4+T细胞和CD8+T细胞。
如本文中所用，术语“T淋巴细胞”和“T细胞”可互换使用，是指在胸腺中完成成熟并在免疫系统中具有各种作用(包括体内特定外源抗原的识别和其它免疫细胞的激活和失活)的主要类型的白细胞。T细胞可以是任何T细胞，诸如培养的T细胞，例如原代T细胞，或者来自培养的T细胞系的T细胞，例如Jurkat、SupT1等，或获自哺乳动物的T细胞。T细胞可以是CD3+细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞，并且可处于任何发育阶段，包括但不限于CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助T细胞(例如，Th1和Th2细胞)、CD8+T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、外周血单核细胞(PBMC)、外周血白细胞(PBL)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、记忆T细胞、原初T细胞、调节性T细胞、γδT细胞(γδT细胞)等。辅助T细胞的其它类型包括Th3(Treg)、Th17、Th9或Tfh细胞。其它类型的记忆T细胞包括诸如中央记忆T细胞(Tcm细胞)、效应记忆性T细胞(Tem细胞和TEMRA细胞)等的细胞。T细胞也可以指基因工程化的T细胞，诸如经修饰以表达T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。T细胞也可以从干细胞或祖细胞分化而来。
“CD4+T细胞”是指在其表面表达CD4并与细胞介导的免疫响应相关的T细胞亚群。它们的特征在于刺激后的分泌谱，其可包括细胞因子诸如IFN-γ、TNF-α、IL2、IL4和IL10的分泌。“CD4”是最初定义为T淋巴细胞上的分化抗原的55-kD糖蛋白，但也存在于包括单核细胞/巨噬细胞在内的其它细胞中。CD4抗原是免疫球蛋白表基因家族的成员，在MHC(主要组织相容性复合体)II类限制性免疫响应中被认为是联合识别元件。在T淋巴细胞上，它们定义了辅助细胞/诱导细胞亚群。
“CD8+T细胞”是指在其表面表达CD8的T细胞的亚群，其是MHC I类限制性的，并作为细胞毒性T细胞发挥作用。“CD8”分子是在胸腺细胞上和在细胞毒性和抑制性T淋巴细胞上发现的分化抗原。CD8抗原是免疫球蛋白超基因家族的成员，是主要组织相容性复合体I类限制性相互作用中的联合识别元件。
如本文中所用，术语“NK细胞”或“天然杀伤细胞”是指由CD56或CD16的表达和T细胞受体(CD3)的缺失所定义的外周血淋巴细胞亚群。如本文中所用，术语“适应性NK细胞”和“记忆NK细胞”是可互换的，并且是指表型为CD3-和CD56+的NK细胞的亚群，其表达NKG2C和CD57中的至少一种，以及任选的CD16，但缺乏以下一种或多种的表达：PLZF、SYK、FceRγ和EAT-2。在一些实施方案中，CD56+NK细胞的分离的亚群包括CD16、NKG2C、CD57、NKG2D、NCR配体、NKp30、NKp40、NKp46、激活和抑制性KIR、NKG2A和/或DNAM-1的表达。CD56+可以是暗淡或明亮的表达。
如本文中所用，术语“免疫检查点”是指存在于免疫系统中，并且能够开启或关闭免疫响应的分子。最初，它们是调节免疫细胞过度激活的安全装置，过度激活会导致细胞死亡或自身免疫响应。这些免疫检查点分子可宽泛地分为增加免疫响应的刺激性免疫检查点分子和抑制免疫响应的抑制性免疫检查点分子。例如，免疫检查点受体和配体可以选自由以下组成的组：PD1(程序性细胞死亡蛋白1)、PD-L1(程序性死亡配体1)、CTLA4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)、TIM-3(含T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域-3(T-cellimmunoglobulin and mucin-domain containing-3))、CEACAM(癌胚抗原相关细胞粘附分子，包括三个亚型CEACAM-1、CEACAM-3或CEACAM-5)、LAG3(淋巴细胞活化基因3)、VISTA(T细胞活化的V-结构域Ig抑制剂)、BTLA(B淋巴细胞和T淋巴细胞衰减子)、TIGIT(具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体)、LAIR1(白细胞相关免疫球蛋白样受体1)、CD160(分化簇160)、CD96(分化簇96)、MerTK(原癌基因酪氨酸蛋白激酶MER)和2B4(NK细胞活化诱导配体)，并且可以例如在PD1和TIM3之间选择。
术语“培养”或“细胞培养”是指细胞在体外环境中的维持、生长和/或分化。“细胞培养基”、“培养基”(在每种情况下都是单数“培养基”)、“补充剂”和“培养基补充剂”是指培养细胞培养物的营养成分。术语“培养”或“维持”是指细胞在组织或身体外部，例如在无菌塑料(或(或涂层塑料)细胞培养皿或烧瓶中的维持、繁殖(生长)和/或分化。“培养”或“维持”可利用培养基作为有助于细胞繁殖和/或维持的营养、激素和/或其它因素的来源。
本文所述的用于人患者的免疫疗法的“药物组合物”包含免疫细胞。正如不言而喻的是，除了细胞之外，还可将可进一步提高免疫响应的其它药学上可接受的盐、载体、赋形剂、媒介物和其它添加剂等添加到药物组合物中，因此将省略其详细解释。
术语“受试者”是指任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物等，它们将是特定治疗的接受者。通常，术语“受试者”和“患者”在本文中可互换地用于指人受试者。
术语“治疗(treating)”或“治疗(treat)”是指抑制、消除、减轻和/或改善正在治疗的疾病的症状、症状的严重程度和/或症状的频率。如本文中所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”也指由施用一种或多种疗法导致的疾病或疾患的进展、严重程度和/或持续时间的减少或改善。
“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换使用，是指如本文所述的化合物、制剂、材料或组合物(者如T细胞)有效达到特定生物学结果的量。此类结果可以包括但不限于通过本领域任何合适的方法测定的癌症抑制。
“施用(Administer)”或“施用(administration)”是指将存在于体外的物质注射或以其它方式物理地递送到患者体内的行为，诸如通过粘膜、皮内、静脉内、肌内递送和/或本文所述或本领域已知的任何其它物理递送方法。
3.靶向一个或多个免疫检查点的二合一载体
肿瘤细胞表达各种免疫检查点，例如，检查点配体。因此，即使一个免疫检查点被抑制，也可能难以期望通过激活其它免疫检查点来获得CAR-T的持续效果。单克隆抗体的组合主要用于抑制多种免疫检查点，其抗肿瘤作用不断被报道(J Clin Invest.，2015，Chauvin JM；PNAS，2010，Curran MA；Blood，2018，Wierz M；Cancer cell.2014，JohnstonRJ)。然而，众所周知，治疗性抗体可诱导全身性过度免疫响应。另外，CAR-T疗法还与威胁生命的细胞因子释放综合征(CRS)和神经毒性相关(Nat Rev Clin Oncol，2017，NeelapuSS)，这表明CAR-T疗法和抗体疗法的结合可以最大限度地发挥副作用的潜力。此外，常规的并行免疫细胞疗法由于其成本高昂而给患者带来了更大的经济负担，并且它们还作用于除了CAR-T以外的T细胞，并带来了自身免疫症状和细胞因子释放综合征的风险。本发明正是为了解决上述问题而作出的。
在一个实施方案中，本文提供了二合一载体，所述载体包含：编码一种或多种类型的抑制削弱免疫细胞功能的基因表达的短发夹RNA(shRNA)的碱基序列，以及编码嵌合抗原受体(CAR)和T细胞受体(诸如单克隆T细胞受体(mTCR))的碱基序列。
载体可选自DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体。例如，慢病毒载体和逆转录病毒载体可将基因插入细胞的基因组DNA中，使基因稳定表达。在一些实施方案中，例如，二合一慢病毒载体，例如，双重二合一载体，可用于将载体上的基因引入细胞基因组。
在一些实施方案中，提供了载体，其包含编码两种类型的抑制削弱免疫细胞功能的基因表达的短发夹RNA(shRNA)的碱基序列，以及编码嵌合抗原受体(CAR)和T细胞受体(例如单克隆T细胞受体(mTCR))中的任一种的碱基序列。
在一些实施方案中，两种类型的shRNA的表达的特征在于它们分别由两种不同的启动子调控。在一些实施方案中，所述两种启动子是RNA聚合酶III启动子。在一些实施方案中，所述两种启动子是源自不同物种的U6启动子。在一些实施方案中，两种启动子在载体上彼此以不同的方向取向。例如，在某个实施方案中，启动子以头对头的取向来取向。在另一个实施方案中，启动子以尾对尾的取向来取向。在一些实施方案中，削弱免疫细胞功能的基因是免疫检查点受体或配体。
在一些实施方案中，免疫检查点受体或配体选自由以下组成的组：PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3或CEACAM-5)、LAG 3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、MerTK和2B4。在一些实施方案中，削弱免疫细胞功能的基因选自由以下组成的组：FAS、CD45、PP2A、SHIP1、SHIP2、DGKα、DGKζ、Cb1-b、CD147、LRR1、TGFBR1、IL10Rα、KLGR1、DNMT3A和A2aR。
在一些实施方案中，两种类型的shRNA或者靶向削弱免疫细胞功能的单个基因的不同部分，或者靶向削弱免疫细胞功能的不同基因。在一些实施方案中，两种类型的shRNA靶向PD-1的不同部分。在一些实施方案中，两种类型的shRNA分别靶向PD-1和TIM-3。在一些实施方案中，编码两种类型的shRNA的碱基序列包含选自由SEQ ID NO：2-219组成的组的不同序列。
在一些实施方案中，CAR或TCR(例如mTCR)的靶标是选自癌症中增加的癌抗原或癌症中发现的癌抗原的突变形式的人肿瘤抗原。
在一些实施方案中，载体包含碱基序列SEQ ID NO：220或221中的任一种。在一些实施方案中，载体选自DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体。
3.1 RNA干扰和短发夹RNA
RNAi(也称为转录后基因沉默(PTGS)、压制(quelling)或共抑制)是转录后基因沉默过程，其中RNA分子以序列特异性方式抑制(通常通过破坏特定的mRNA分子)基因表达。RNAi的活性组分是短/小的双链RNA(dsRNA)，称为小干扰RNA(siRNA)，通常含有15-30个核苷酸(例如，19-25、19-24或19-21个核苷酸)和2个核苷酸3’悬突，并与靶基因的核酸序列匹配。这些短的RNA种类可以在体内通过Dicer介导的较大dsRNA的裂解自然产生，并且它们在哺乳动物细胞中具有功能。DNA表达质粒可用于在细胞中稳定表达本文所述的siRNA双链体或dsRNA，并实现对靶基因表达的长期抑制。一方面，siRNA双链体的有义和反义链通常通过短间隔序列连接，导致被称为短发夹RNA(shRNA)的茎环结构表达。发夹被Dicer识别并切割，从而产生成熟的siRNA分子。
本文所用的短发夹RNA(shRNA)是其中一些自身互补序列产生具有其茎的紧密发夹结构的RNA分子。本文所述的shRNA分子的长度可为约40至120个核苷酸长，例如，长度为约70至90个核苷酸。在示例性实施方案中，shRNA的长度可为80个核苷酸。shRNA是以微小干扰RNA(miRNA)(一种RNAi途径的内源性触发物)为模型的(Lu等人，2005，Advances inGenetics 54：117-142，Fewell等人，2006，Drug Discovery Today 11：975-982)。当shRNA在细胞中表达时，其经过一系列步骤被加工成小干扰RNA(siRNA)，用于引导基因沉默。简言之，当shRNA被表达时，其在细胞中被Drosha复合物加工成前shRNA，然后被转运到细胞核外，在那里其被Dicer进一步加工成siRNA，然后被单链化以及被RISC(RNA诱导的沉默复合物)装载。此处，siRNA的反义链作为RISC复合物与靶基因的mRNA结合的引导者，当以这种方式结合的RISC复合物切割mRNA时，发生基因沉默。由于靶基因中的shRNA允许对特定基因持续且特异的基因沉默，因此为了抑制靶基因，将其包含在载体中。
天然表达的小RNA分子，称为微RNA(miRNA)，通过调控mRNA的表达来引发基因沉默。含有miRNA的RISC靶向mRNA，所述mRNA呈现与miRNA的5′区中的被称为种子区的核苷酸2-7和其3′区的其它碱基对具有完美的序列互补性。miRNA介导的基因表达下调可由靶mRNA的断裂、靶mRNA的翻译抑制或mRNA衰减引起。miRNA靶向序列通常位于靶mRNA的3’UTR。单个miRNA可靶向100多种来自不同基因的转录物，一种mRNA可被不同的miRNA靶向。
可在体外设计和合成靶向特定mRNA的siRNA双链体或dsRNA，并将其引入细胞以激活RNAi过程。Elbashir等人证明了21-核苷酸siRNA双链体(称为小干扰RNA)能够在哺乳动物细胞中实现强效和特异的基因敲低而不诱导免疫响应(Elbashir SM等人，Nature，2001，411，494-498)。从最初的报道开始，由siRNA引起的转录后基因沉默迅速成为哺乳动物细胞基因分析的有力工具，并有可能产生新型治疗剂。
在美国专利第9,169,483号和第9,181,544号以及国际专利公开第WO2015179525号(所述专利和国际专利公开中的每一个通过引用整体并入本文)中，描述了被设计成靶向编码引起多谷氨酰胺膨胀疾病(poly-glutamine expansion diseases)诸如亨廷顿氏病的多谷氨酰胺重复蛋白的核酸序列的RNAi分子。美国专利第9,169,483号和第9,181,544号以及国际专利公开第WO2015179525号各自提供了包含RNA第一链(例如，15个连续核苷酸)和RNA的第二链(例如，与第一链的至少12个连续核苷酸互补)的分离的RNA双链体，其中所述RNA双链体的长度约为15至30个碱基对。第一RNA与第二RNA链可通过RNA环(约4至50个核苷酸)可操作地连接，形成发夹结构，可将该结构插入表达盒中。环部分的非限制性实例包括美国专利第9,169,483号(其内容通过引用整体并入本文)的SEQ ID NO：9-14。可用于(无论是全序列还是部分序列)形成RNA双链体的RNA链的非限制性实例包括美国专利第9,169,483号的SEQ ID NO：1-8和美国专利第9,181,544号的SEQ ID NO：1-11、33-59、208-210、213-215和218-221，所述专利的每一个的内容通过引用整体并入本文。RNAi分子的非限制性实例包括美国专利第9,169,483号的SEQ ID NO：1-8、美国专利第9,181,544号的SEQ IDNO：1-11、33-59、208-210、213-215和218-221以及国际专利公开第WO2015179525号的SEQID NO：1、6、7和35-38，所述美国专利和国际专利公开的每一个的内容通过引用整体并入本文。
可将体外合成的siRNA分子引入细胞以激活RNAi。当外源性siRNA双链体被引入细胞时，与内源性dsRNA类似，其可被组装形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)，一种与互补于siRNA双链体的两条链之一(即，反义链)的RNA序列相互作用的多单位复合物。在此过程中，siRNA的有义链(或乘客链)从复合物中丢失，而siRNA的反义链(或引导链)与其互补RNA相匹配。特别地，包含siRNA的RISC复合物的靶标是呈现完美序列互补性的mRNA。然后，siRNA介导的基因沉默通过切割、释放和降解靶标发生。
与使用单链(ss)-siRNA(例如反义链RNA或反义寡核苷酸)相比，由与靶mRNA同源的有义链和与靶mRNA互补的反义链组成的siRNA双链体在靶RNA破坏效率方面具有更大的优势。在许多情况下，其需要更高浓度的β-siRNA来实现相应双链体的有效基因沉默效力。
现有技术中存在设计siRNA的指导原则。这些指导原则通常建议产生靶向待沉默的基因中的区域的19个核苷酸的双链区、对称的2-3个核苷酸的3’悬突、5’-磷酸和3’-羟基。可支配siRNA序列偏好的其它规则包括，但不限于，(i)反义链的5’末端处的A/U；(ii)有义链的5’末端处的G/C；(iii)反义链的5’末端三分之一处的至少五个A/U残基；和(iv)不存在任何长度超过9个核苷酸的GC区段。根据这种考虑，结合靶基因的特定序列，可以容易地设计抑制哺乳动物靶基因表达所必需的高效siRNA分子。
如本文所提供的，二合一载体包括编码一种或多种类型的抑制一种或多种削弱免疫细胞功能的基因表达的短发夹RNA(shRNA)的碱基序列，以及编码嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(例如，单克隆T细胞受体(mTCR))中的任一种的碱基序列。
在一些实施方案中，碱基序列编码一种类型的shRNA，其抑制削弱免疫细胞功能的基因的表达。在一些实施方案中，碱基序列编码两种类型的shRNA，其抑制削弱免疫细胞功能的两种基因的表达，其中载体可被称为“双重二合一载体”。在其它实施方案中，碱基序列编码两种以上的shRNA，其抑制两种以上削弱免疫细胞功能的基因的表达。
在一些实施方案中，两种或更多种类型的shRNA的特征在于它们靶向削弱免疫细胞的功能的单个基因，例如单个基因的不同部分。例如，两种或更多种类型的shRNA可以靶向PD-1，例如PD-1的不同部分。在其它实施方案中，两种或更多种类型的shRNA的特征可在于它们靶向削弱免疫细胞功能的不同基因，例如靶向PD-1和TIM-3。
在示例性实施方案中，编码两种或更多种类型的shRNA的碱基序列的特征在于它们包含选自SEQ第2至219位和第238至267位的不同序列，例如，它们可以包含选自由SEQ IDNO 2至117和238至267组成的组的不同序列，例如，它们可以包含选自由SEQ ID NO 2至12、70至75以及266至267组成的组的不同序列。
在一些实施方案中，两种类型的shRNA的表达的特征在于它们分别由两种不同的启动子调控，以使克隆过程中的重组或缺失假象最小化。
在一些实施方案中，启动子可以是RNA聚合酶I启动子、RNA聚合酶II启动子或RNA聚合酶III启动子，这取决于哪个RNA聚合酶与启动子结合并开始转录。上述两种启动子的特征可在于它们是RNA聚合酶III启动子(以下称为pol III启动子)。可使pol III启动子精确地从5’末端转录到3’末端，而无需在RNA的5’末端连接帽或在3’末端连接poly(A)尾，所述RNA由启动子调控转录。pol III启动子的类型包括但不限于U6启动子、H1启动子和7SK启动子等。包含在载体中的两个启动子可以不同，选自包括上述三种类型的pol III启动子，如果选择相同类型的启动子，则它们可以来自不同的物种。例如，两种启动子可以是U6启动子，例如，来自不同物种的U6启动子，例如来自人和小鼠的U6启动子。由于由U6启动子产生的转录物保留在细胞核内，因此判断这将能够导致存在于细胞核中的Drosha复合物促进shRNA加工成前shRNA的过程。
在一些实施方案中，两种或多种启动子的特征可在于它们在载体上以与其它启动子不同的方向取向。例如，在某个实施方案中，启动子以头对头(→←)的取向来取向。在另一个实施方案中，启动子以尾对尾(←→)的取向来取向。在双重二合一载体中，在载体上以不同方向取向意指当其表达受两种启动子调控的相应shRNA被转录时，其中RNA聚合酶移动的方向在单个核酸分子上以不同的方向取向。在一个示例性实施方案中，两个启动子可处于→←方向(图15A)。在另一个示例性实施方案中，两个启动子可处于←→方向上(图15B)。例如，两个启动子可在载体上采取→←方向。
在一些实施方案中，多种类型的shRNA中的一种的靶基因的表达减少到对照组的约90％或更少，例如靶基因的表达减少到对照组的约80％或更少、约70％或更少、约60％或更少、约50％或更少、约40％或更少、约30％或更少、约20％或更少以及约10％或更少。
通常，shRNA被设计为具有与其靶基因的部分mRNA序列具有高同源性的序列(下文称为有义shRNA碱基序列)，能够产生锋利的发夹(sharp hairpin)的序列，以及与具有高同源性的序列互补的序列(下文称为反义shRNA碱基序列)。自身互补部分之间的非共价键形成干细胞结构，当shRNA在细胞中表达和加工时，反义shRNA碱基序列在基因沉默过程中充当靶基因的mRNA的引导者。例如，本文中用于shRNA表达的盒的碱基序列可包含NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(21个碱基)-环序列-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(19个碱基)结构。在一个实施方案中，21个碱基的区段编码有义shRNA碱基序列，19个碱基的区段与21个碱基的区段互补或基本上互补，并编码反义shRNA碱基序列。在另一个实施方案中，19个碱基的区段编码有义shRNA碱基序列，21个碱基的区段与19个碱基的区段互补或基本上互补，并编码反义shRNA碱基序列。因此，当表达时，产生的RNA形成一个茎和环结构。在某些实施方案中，可包含在盒中的靶基因(人来源的)的此类有义或反义shRNA碱基序列选自由SEQ ID NO：1-219组成的组。在具体的实施方案中，本文中用于shRNA表达的盒的碱基序列可选自由SEQID NO：220-224组成的组。
在一些实施方案中，整个shRNA碱基序列可位于小鼠或人U6启动子的3’末端，并且终止U6启动子转录所必需的TTTTT可位于所有shRNA碱基序列的3’末端。
在一些实施方案中，除了本文所述的序列以外，相应shRNA的核酸序列还可包括与这些序列显示至少50％，特别地至少70％，更特别地至少80％，甚至更特别地至少90％，最特别地至少95％的序列同源性的核酸序列。这是因为，在siRNA(小干扰RNA)，特别是在细胞内加工成siRNA的shRNA的情况下，据报道某种程度的突变，尤其是5’末端的突变是可容忍的，导致靶基因的正常敲低，并且使siRNA和shRNA具有与在基因沉默中起作用的miRNA的结构相似的结构的突变更有效地诱导靶基因的敲低。另外，在载体的使用中，对本领域技术人员来说不言而喻的是载体内的变体，即在将特定序列引入载体的克隆过程中可能发生的碱基序列的添加、修饰或缺失，或者对组分的改变或组分的引入(以提高载体的易用性，达到预期基因表达的程度)。
削弱免疫细胞功能的基因有多种作用方式。实例包括抑制免疫细胞的增殖或导致细胞死亡，减少与免疫细胞需要与之反应以被激活的分子的反应，抑制免疫细胞识别反应靶标所必需的基因的表达，以及导致分化成不同类型的免疫细胞以发挥不同的功能，而不是导致对特定靶的免疫响应。代表性实例包括，但不限于，将在下面解释的与免疫检查点相关的分子。
在一些实施方案中，削弱免疫细胞功能的基因的特征可在于其是免疫检查点受体或配体。免疫检查点是存在于免疫系统中的分子，能够开启或关闭免疫响应。它们可以被认为是调节免疫细胞过度激活的安全装置，过度激活会导致细胞死亡或自身免疫响应。这些免疫检查点分子可宽泛地分为增加免疫响应的刺激性免疫检查点分子和抑制免疫响应的抑制性免疫检查点分子。据报道，许多癌细胞通过激活抑制性免疫检查点信号，尤其是免疫细胞上的抑制性免疫检查点受体和配体而逃离免疫系统。因此，靶向特定癌症的免疫细胞疗法可通过使癌症的这种逃避作用无效而变得有效，并且这可通过抑制抑制性免疫检查点受体及其配体的激活或者通过降低它们的表达来实现。例如，免疫检查点受体和配体可以选自由以下组成的组：PD1(程序性细胞死亡蛋白1)、PD-L1(程序性死亡配体1)、CTLA4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)、TIM-3(含T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域-3(T-cellimmunoglobulin and mucin-domain containing-3))、CEACAM(癌胚抗原相关细胞粘附分子，包括三个亚型CEACAM-1、CEACAM-3或CEACAM-5)、LAG3(淋巴细胞活化基因3)、VISTA(T细胞活化的V-结构域Ig抑制剂)、BTLA(B淋巴细胞和T淋巴细胞衰减子)、TIGIT(具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体)、LAIR1(白细胞相关免疫球蛋白样受体1)、CD160(分化簇160)、CD96(分化簇96)、MerTK(原癌基因酪氨酸蛋白激酶MER)和2B4(NK细胞活化诱导配体)，并且可以例如在PD1、TIM3和TIGIT之间选择。
在其它实施方案中，削弱免疫细胞功能的基因的特征可在于其编码能促进AICD(激活诱导细胞死亡)，充当T淋巴细胞的负调节因子的受体，所述T淋巴细胞已通过TCR例如FAS(也称为CD95、APO-1或细胞凋亡抗原-1)的重复刺激而被活化。在一些实施方案中，削弱免疫细胞功能的基因的特征可在于其编码抑制TCR的信号激活的因子，例如所述因子可选自CD45、PP2A、SHP1、SHP2、DGKα、DGKζ、Cb1-b、Cb1-c和CD148。在一些实施方案中，削弱免疫细胞功能的基因的特征可在于其编码抑制CAR和/或TCR(例如通过4-1BB的信号抑制的mTCR)功效的蛋白质(例如LRR1(富含亮氨酸的重复蛋白1))，其中4-1BB是本文所述的TCR的共刺激分子。在一些实施方案中，削弱免疫细胞功能的基因的特征可在于其编码抑制T细胞的受体(其配体是细胞因子)，例如TGFBR1(转化生长因子β受体1)和IL10Rα(IL10R亚单位α)。在一些实施方案中，削弱免疫细胞功能的基因的特征可在于其编码抑制T细胞和NK细胞增殖能力和细胞毒性的受体，例如KLGR1(杀伤细胞凝集素样受体G1)。在一些实施方案中，削弱免疫细胞功能的基因的特征可在于其编码与新DNA的甲基化相关的调节因子(据报道所述调节因子在被敲除(KO)时抑制T细胞的耗竭)，例如TNMT3a(DNA甲基转移酶3α)。在一些实施方案中，削弱免疫细胞功能的基因的特征可在于其编码在肿瘤微环境中过量存在的腺苷受体，当其被激活时可以抑制T细胞的细胞毒性和细胞因子产生能力，例如A2aR(腺苷受体亚型A2a)。
在一些实施方案中，削弱免疫细胞功能的基因的特征可在于其选自由以下组成的组：FAS、CD45、PP2A、SHP1、SHP2、DGKα、DGKζ、Cb1-b、Cb1-c、CD148、LRR1、TGFBR1、IL10RA、KLGR1、DNMT3A和A2aR。
3.2嵌合抗原受体(CAR)和T细胞受体，例如单克隆T细胞受体(mTCR)。
如本文所提供的，二合一载体包括编码一种或多种类型的抑制一种或多种削弱免疫细胞功能的基因表达的短发夹RNA(shRNA)的碱基序列，以及编码嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(例如，单克隆T细胞受体(mTCR))中的任一种的碱基序列。
CAR通常是一组多肽，当其存在于免疫细胞上时，导致免疫细胞对靶细胞(通常是癌细胞)具有特异性，同时导致细胞中的信号转导。CAR至少包含识别下述靶抗原的胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和胞内信号转导结构域，其中所述胞内信号转导结构域源自促进分子或共刺激分子。
目前临床应用中普遍使用的CAR的结构包括对抗原具有特异性的单链可变片段结构域(在下文中称为scFv)、调节scFv与细胞膜之间距离的间隔子结构域、跨膜结构域和胞内传导信号结构域(在下文中称为ISD)。ISD又包含有助于一个或多个T细胞体内增殖和长寿的共刺激结构域(CD28、CD137或OX40)，以及有助于T细胞活化的TCR信号传导结构域(CD3zeta，CD3ζ)。已经以这种方式制备的经修饰以表达CAR的T细胞可通过识别以高特异性表达靶抗原的癌细胞而被激活，有效地诱导此类癌细胞死亡，同时在体内指数增殖，并长时间存活。例如，当向B细胞白血病患者施用制备成靶向CD19(一种B细胞特异性抗原)的CAR-T细胞(CART-19)时，据报道所述细胞增殖至1,000至10,000倍，并在体内存活数年。因此，在对常规化疗等对其无效的晚期急性淋巴母细胞性白血病(B-ALL)患者进行的临床试验中，CART-19显示出90％的完全响应，这导致了罕见的案例，即在早期研究者发起的临床试验阶段向全球制药公司发放许可。2017年，其成为美国FDA批准的第一个CAR-T细胞疗法，此后，第二个CAR-T也获得了批准。
在免疫细胞例如T细胞的表面上，存在免疫检查点受体，诸如CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4)或PD-1(程序性细胞死亡蛋白-1)。这些受体最初是调节T细胞过度活化和细胞死亡，或自身免疫响应触发的安全装置。然而，据报道，癌细胞，尤其是实体癌，用它来避免T细胞的免疫监视。例如，如果癌细胞在表面上表达PD-L1(程序性死亡配体1)，则表达PD-1及其受体的T细胞识别癌细胞并被激活，但很快会被来自PD-1的激活抑制信号耗尽。为了防止来自这些免疫检查点受体的信号对T细胞活性的抑制，开发了通过靶向免疫检查点受体来抑制信号传输的针对CTLA4或PD-1的单克隆抗体。通过使用这些免疫检查点受体抑制剂阻断免疫检查点来改善T细胞整体免疫功能的疗法也显示出对各种实体癌的疗效。
由于CAR-T细胞最终也是依赖于活化的T细胞的细胞毒性的疗法，所以CAR-T细胞周围的免疫抑制环境的存在是其治疗效果的主要障碍。事实上，与它们在B细胞白血病中表现出的治疗效果不同，针对实体瘤制备的CAR-T很少表现出有希望的治疗效果。这被认为是因为实体瘤不同于血癌，其产生了免疫抑制性肿瘤微环境来抑制CAR-T细胞的活性和增殖。另外，即使在B细胞血癌中，也有报道称，与几乎90％对使用CART-19的疗法有反应的急性淋巴母细胞性白血病(ALL)患者不同，淋巴瘤患者(20-50％响应)或慢性淋巴母细胞性白血病患者(CLL，约20％响应)的治疗效果相对较低。
另外，据报道，PD-L1和其它免疫抑制配体在由淋巴瘤形成的肿瘤微环境中表达，根据该肿瘤微环境，癌组织中的T细胞的功能被耗尽。另外，据报道，从CLL患者获得的T细胞已经基本耗尽，其中免疫检查点受体诸如PD-1、CD160和CD244高度表达。
据报道，临床前试验结果显示，同时使用抗CTLA或抗PD-1抑制性抗体和CAR-T细胞来恢复这种降低的CAR-T细胞活性可提高抗癌效果，目前正在进行使用这些组合的临床试验。然而，此类抗体和CAR-T细胞的并行治疗的问题是，遍布全身的抗体不仅影响CAR-T细胞，而且影响体内存在的所有其它T细胞，潜在地导致严重的全身性不良反应，诸如细胞因子释放综合征以及自身免疫症状。已经指出的另一个问题是由于同时使用昂贵的抗体疗法和细胞疗法而导致治疗成本增加。
因此，最近有人试图调节细胞内的基因表达，以允许抑制CAR-T细胞的免疫检查点。国际专利申请公开WO2016/069282公开了用于产生经修饰的T细胞的组合物和方法，所述经修饰的T细胞具有能够下调内源性基因(选自由TCRα链、TCRβ链、β-2微球蛋白和FAS组成的组)表达的核酸，所述核酸还包含编码经修饰的T细胞受体(TCR)(其对靶细胞上的表面抗原具有亲和力)的核酸或编码嵌合抗原受体(CAR)的电穿孔核酸。该公开指出，基因剪刀诸如CRISPR/Cas9可用于敲除内源性基因的表达，但该专利公开中公开的制备CAR-T细胞的方法相当复杂，并且具有产率低和生产成本高的问题。
同时，国际专利公开WO2015/090230公开了抑制另外地抑制T细胞功能的分子的单一类型的短发夹RNA(shRNA)，可用于表达CAR的细胞。由于细胞治疗的成本负担很高，因此患者在失败时会面临各种负担。然而，单一类型的shRNA可能不能有效抑制此类靶分子的活性。在一些实施方案中，可以附加包含多肽的组。在一些实施方案中，包含多肽的组可呈其中它们通过开关结合的形式，所述开关通过刺激而被二聚化。在一些实施方案中，CAR可以是包含胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和胞内信号转导结构域的融合蛋白。在另外的实施方案中，CAR融合蛋白可以在N末端另外包含前导序列，并且前导序列可以在CAR被表达并锚定在细胞膜中的过程中被切掉。
本文所述的TCR，例如mTCR，可包含选自α、β、γ和δ链的链。在一些实施方案中，所述链能够识别下述靶抗原、CD3和ζ链，以及另外的共刺激分子，其中共刺激分子可选自ICOS、OX40、CD137(4-1BB)、CD27或CD28。
在一些实施方案中，嵌合单链抗体构建体(scFv)的逆转录病毒转移可用于产生TCR，例如具有确定的抗原特异性的mTCR。在另外的实施方案中，可将嵌合scFv构建体与FcR-γ或CD3ζ的胞内信号结构域连接以触发T细胞效应子功能。在CD3ζ结构域中可以与共刺激分子的信号传导结构域组合，其中抗体结合可以触发效应T细胞功能，并且还传递共刺激信号。在另外的实施方案中，共刺激分子可选自CD28、4-1BB和OX40。
在一些实施方案中，二合一载体可包含CD3ζ结构域，其中TCR(例如mTCR)的链可以通过与CD3和zeta(ζ)链的非共价键形成复合物。当抗原通过链的抗原识别位点被识别时，CD3和ζ链将信号发送到在其上表达这种TCR复合物的免疫细胞的细胞质中，诱导功能性激活。
在一些实施方案中，胞内信号转导结构域可另外包含一个或多个源自共刺激分子的功能性信号转导结构域。在一些实施方案中，促进分子可以是上文所述的TCR的ζ链。
CAR和TCR(例如，mTCR)是细胞表面受体。在一些实施方案中，CAR或TCR(例如mTCR)的靶的特征可在于其是癌抗原，其在癌症中的表达特异性增加。在一些实施方案中，CAR或TCR(例如mTCR)的靶标的特征可在于其是癌症中以突变形式存在的癌抗原。
在一些实施方案中，CAR或TCR(例如mTCR)的靶标可以是其在待治疗的癌症中的表达增加的人肿瘤抗原。例如，所述靶标可选自5T4(滋养层糖蛋白)、707-AP、9D7、AFP(甲胎蛋白)、AlbZIP(雄激素诱导的bZIP)、HPG1(人前列腺特异性基因-1)、α5β1-整联蛋白、α5β6-整联蛋白、α-甲基酰基辅酶A消旋酶、ART-4(ADP核糖基转移酶-4)、B7H4(含v-set结构域的T细胞活化抑制剂1)、BAGE-1(B黑素瘤抗原-1)、BCL-2(B细胞CLL/淋巴瘤-2)、BING-4(WD重复结构域46)、CA 15-3/CA 27-29(粘蛋白1)、CA 19-9(癌抗原19-9)、CA 72-4(癌抗原72-4)、CA125(癌抗原125)、钙网蛋白、CAMEL(黑素瘤上CTL识别的抗原)、CASP-8(半胱天冬酶8)、组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、CD19(分化簇19)、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD4、CD52、CD55、CD56、CD80、CEA(癌胚抗原SG8)、CLCA2(氯离子通道附件2)、CML28(慢性髓性白血病肿瘤抗原28)、毛状蛋白样蛋白、胶原蛋白XXIII、COX-2(环氧化酶-2)、CT-9/BRD6(癌/睾丸抗原9)、Cten(c-末端张力蛋白样蛋白)、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1、cyp-B、CYPB1(细胞色素p450家族1亚家族b成员1)、DAM-10/MAGE-B1(黑素瘤相关抗原B1)、DAM-6/MAGE-B2、EGFR/Her1(表皮生长因子受体)、EMMPRIN(basigin)、EpCam、EphA2(EPH受体A2)、EphA3、ErbB3(Erb-B2受体酪氨酸激酶3)、EZH2(zeste2多梳蛋白抑制复合体2亚单位的增强子)、FGF-5(成纤维细胞生长因子5)、FN(纤连蛋白)、Fra-1(Fos相关抗原-1)、G250/CAIX(碳酸酐酶9)、GAGE-1(G抗原-1)、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7b、GAGE-8、GDEP(前列腺中差异表达的基因)、GnT-V(葡萄糖酸激酶)、gp100(黑素细胞谱系特异性抗原GP100)、GPC3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖3)、HAGE(螺旋抗原)、HAST-2(磺基转移酶家族1A成员1)、hepsin、Her2/neu/ErbB2(Erb-B2受体酪氨酸激酶2)、HERV-K-MEL、HNE(髓质素)、同源异型框NKX3.1、HOM-TES-14/SCP-1、HOM-TES-85、HPV-E6、HPVE7、HST-2(沉默调节蛋白-2)、hTERT、iCE(半胱天冬酶1)、IGF-1R(胰岛素样生长因子-1受体)、IL-13Ra2(白介素-13受体亚单位α2)、IL-2R(白介素-2受体)、IL-5(白介素-5)、未成熟层粘连蛋白受体、激肽释放酶2、激肽释放酶4、Ki67、KIAA0205(溶血磷脂酰甘油酰基转移酶1)、KK-LC-1(北九州肺癌抗原-1)、KM-HN-1、LAGE-1(L抗原家族成员-1)、Livin、MAGE-A1、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGEA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-B1、MAGE-B10、MAGE-B16、MAGEB17、MAGE-B2、MAGE-B3、MAGE-B4、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-D1、MAGE-D2、MAGE-D4、MAGE-E1、M[AGE-E2、MAGE-F1、MAGE-H1、MAGEL2(黑素瘤抗原家族L2)、乳房珠蛋白A、MART-1/Melan-A(由T细胞识别的黑素瘤抗原-1)、MART-2、基质蛋白22、MC1R(黑皮质素1受体)、M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)、间皮素、MG50/PXDN(过氧蛋白)、MMP 11(基质金属蛋白酶11)、MN/CA1X-抗原(碳酸酐酶9)、MRP-3(多药耐药相关蛋白-3)、MUC1(粘蛋白1)、MUC2、NA88-A(VENT样同源异型框2假基因1)、N-乙酰葡糖胺基转移酶-V、Neo-PAP(Neo-聚(A)聚合酶)、NGEP(在前列腺中表达的新基因)、NMP22(核基质蛋白22)、NPM/ALK(核磷蛋白)、NSE(神经元特异性烯醇化酶)、NY-ESO-1、NY-ESO-B、OA1(骨关节炎QTL 1)、OFA-iLRP(癌胚抗原未成熟层粘连蛋白受体蛋白)、OGT(O-GlcNAc转移酶)、OS-9(内质网凝集素)、骨钙素、骨桥蛋白、p15(CDK抑制因子2B)、p53、PAGE-4(P抗原家族成员-4)、PAI-1(纤溶酶原激活物抑制物-1)、PAI-2、PAP(前列腺酸性磷酸酶)、PART-1(前列腺雄激素调节转录物1)、PATE(前列腺和睾丸表达1)、PDEF(前列腺源性Ets因子)、Pim-1-激酶(原病毒整合位点1)、Pin1(肽基-脯氨酰顺反异构酶NIMA相互作用1)、POTE(在前列腺、卵巢、睾丸和胎盘中表达)、PRAME(在黑素瘤中优先表达的抗原)、前列腺素、蛋白酶-3、PSA(前列腺特异性抗原)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、PSGR(前列腺特异性G蛋白偶联受体)、PSM、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、RAGE-1(肾肿瘤癌抗原)、RHAMM/CD168、RU1(肾遍在蛋白1)、RU2、SAGE(肉瘤抗原)、SART-1(由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原-1)、SART-2、SART-3、Sp17(精子蛋白17)、SSX-1(SSX家族成员1)、SSX-2/HOM-MEL-40、SSX-4、STAMP-1(STEAP2金属还原酶)、STEAP、存活素、存活素-213、TA-90(肿瘤相关抗原-90)、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白-72)、TARP(TCRγ交替阅读框蛋白)、TGFb(转化生长因子β)、TGFbR11(转化生长因子β受体11)、TGM-4(转谷氨酰胺酶4)、TRAG-3(紫杉醇耐药相关基因3)、TRG(T细胞受体γ基因座)、TRP-1(瞬时受体电位-1)、TRP-2/6b、TRP-2/INT2、Trp-p8、酪氨酸酶、UPA(U型纤溶酶原激活剂)、VEGF(血管内皮生长因子A)、VEGFR-2/FLK-1和WT1(肾母细胞瘤1)，或者可以是在待治疗的癌症中发现的人肿瘤抗原的突变形式，其选自α-辅肌动蛋白-4/m、ARTC1/m、bcr/abl、β-连环蛋白/m、BRCA1/m、BRCA2/m、CASP-5/m、CASP-8/m、CDC27/m、CDK4/m、CDKN2A/m、CML66、COA-1/m、DEK-CAN、EFTUD2/m、ELF2/m、ETV6-AML1、FN1/m、GPNMB/m、HLA-A*0201-R170I、HLA-A11/m、HLA-A2/m、HSP70-2M、KIAA0205/m、K-Ras/m、LDLR-FUT、MART2/m、ME1/m、MUM-1/m、MUM-2/m、MUM-3/m、肌球蛋白1类/m neo-PAP/m、NFYC/m、N-Ras/m、OGT/m、OS-9/m、p53/m、Pml/RARa、PRDX5/m、PTPRX/m、RBAF600/m、SIRT2/m、SYTSSX-1、SYT-SSX-2、TEL-AML1、TGFbRII和TPI/m。例如，靶抗原可以在CD19或CD22之间选择。
3.3二合一载体的组分
如本文所提供的，二合一载体包括编码一种或多种类型的抑制一种或多种削弱免疫细胞功能的基因表达的短发夹RNA(shRNA)的碱基序列，以及编码嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)(例如单克隆T细胞受体(mTCR))的碱基序列。
在一些实施方案中，二合一载体可包含编码促进序列插入宿主细胞基因组中的因子的序列。在一些实施方案中，序列位于载体基因的任一末端或两个末端。在一些实施方案中，序列是LTR(长末端序列)。
在一些实施方案中，二合一载体可包含编码用于纯化其中已发生了上述插入的细胞的蛋白质的结构域。在一些实施方案中，所述结构域是ΔLNGFR结构域，其中ΔLNGFR是没有用于纯化其中已发生上述插入的细胞的细胞质结构域的LNGFR(低亲和力神经生长因子受体)。
在一些实施方案中，二合一载体可包含诱导特征在于持续表达的ΔLNGFR和CAR表达的启动子，例如如图22A所示的诱导ΔLNGFR和CD19 CAR表达的EF1α启动子。在另外的实施方案中，首先将ΔLNGFR和CD19 CAR转录成它们存在于单一mRNA上的形式。在此类实施方案中，其中两个或多个顺反子存在于同一mRNA上，其间可IRES(内部核糖体进入位点)，以引起两个顺反子的表达。然而，IRES过长，并且据报道下游顺反子的表达效率降低。在一些实施方案中，可使用除IRES外的组分(例如P2A(2a肽))来克服此类不利方面，其中在翻译过程中，核糖体通过而在P2A的C末端不形成肽键，从而允许下游基因稍后表达。
一些示例性二合一载体是图1、图6、图14和图22A中所示的二合一载体，所述载体包括碱基序列SEQ ID 220或221中的任何一个。包含SEQ ID 220和221的碱基序列的示例性向量可具有图1A和1B所示的结构。表1列出了一些示例性质粒。
表1.示例性质粒。
Figure BDA0002658560110000491
在一些实施方案中，除了本文所述的序列之外，上述载体中包含的碱基序列和相应shRNA的核酸序列可包含与这些序列显示至少50％，特别地至少70％，更特别地至少80％，甚至更特别地至少90％，最特别地至少95％的序列同源性的核酸序列。这是因为，在siRNA(小干扰RNA)，特别是在细胞内加工成siRNA的shRNA的情况下，据报道某种程度的突变，尤其是5’末端的突变是可容忍的，导致靶基因的正常敲低，并且使siRNA和shRNA具有与在基因沉默中起作用的miRNA的结构相似的结构的突变更有效地诱导靶基因的敲低。另外，在载体的使用中，对本领域技术人员来说不言而喻的是载体内的变体，即在将特定序列引入载体的克隆过程中可能发生的碱基序列的添加、修饰或缺失，或者对组分的改变或组分的引入(以提高载体的易用性，达到预期基因表达的程度)。
4.靶向一个或多个免疫检查点的CAR-T细胞的产生和评估
如本文所提供的，二合一载体包含编码一种或多种类型的抑制削弱免疫细胞功能的基因表达的短发夹RNA shRNA)的碱基序列，以及编码嵌合抗原受体(CAR)和T细胞受体(TCR)(例如，克隆T细胞受体(mTCR))中的任一种的碱基序列。所述载体可用于生产免疫细胞，所述免疫细胞抑制削弱免疫细胞功能的基因表达。在一些实施方案中，载体选自由以下组成的组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体。
一方面，本文描述的免疫细胞的特征在于其包含上述载体并表达CAR或TCR，例如mTCR，并且一种或多种类型的shRNA的靶基因的表达减少。在一些实施方案中，多种类型的shRNA中的一种的靶基因的表达减少到对照组的约90％或更少，例如靶基因的表达减少到对照组的约80％或更少、约70％或更少、约60％或更少、约50％或更少、约40％或更少、约30％或更少、约20％或更少以及约10％或更少。在一些实施方案中，免疫细胞选自人来源的T细胞与NK细胞之间。
在另一方面，本文提供了方法。在一些实施方案中，提供了产生免疫细胞的方法，其包括同时或以任何顺序依次地向免疫细胞中引入：(1)编码与靶抗原特异性结合的基因工程化的抗原受体的基因；和(2)减少或能够减少削弱免疫细胞功能的基因在免疫细胞中的表达的基因破坏剂，从而产生其中表达基因工程化的抗原受体并且削弱免疫细胞功能的基因表达减少的免疫细胞。
在一些实施方案中，基因工程化的抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，基因工程化的抗原受体是CAR。在一些实施方案中，CAR包含胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和胞内信号转导结构域。
在一些实施方案中，CAR的胞外抗原识别结构域与靶抗原特异性结合。
在一些实施方案中，CAR的胞内信号转导结构域包含CD3 zeta(CD3ζ)链的胞内结构域。在一些实施方案中，CAR的胞内信号转导结构域还包含共刺激分子。
在一些实施方案中，共刺激分子选自由ICOS、OX40、CD137(4-1BB)、CD27和CD28组成的组。在一些实施方案中，共刺激分子是CD137(4-1BB)。在一些实施方案中，共刺激分子是CD28。
在一些实施方案中，靶抗原在癌细胞、癌组织和/或肿瘤微环境的细胞表面上表达。在一些实施方案中，靶抗原是在癌细胞、癌组织和/或肿瘤微环境中表达增加的癌抗原或癌抗原的突变形式。
在一些实施方案中，在癌细胞、癌组织和/或肿瘤微环境中表达增加的癌抗原选自由以下组成的组：5T4(滋养层糖蛋白)、707-AP、9D7、AFP(甲胎蛋白)、AlbZIP(雄激素诱导的bZIP)、HPG1(人前列腺特异性基因-1)、α5β1-整联蛋白、α5β6-整联蛋白、α-甲基酰基辅酶A消旋酶、ART-4(ADP核糖基转移酶-4)、B7H4(含v-set结构域的T细胞活化抑制剂1)、BAGE-1(B黑素瘤抗原-1)、BCL-2(B细胞CLL/淋巴瘤-2)、BING-4(WD重复结构域46)、CA 15-3/CA27-29(粘蛋白1)、CA 19-9(癌抗原19-9)、CA 72-4(癌抗原72-4)、CA125(癌抗原125)、钙网蛋白、CAMEL(黑素瘤上CTL识别的抗原)、CASP-8(半胱天冬酶8)、组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、CD19(分化簇19)、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD4、CD52、CD55、CD56、CD80、CEA(癌胚抗原SG8)、CLCA2(氯离子通道附件2)、CML28(慢性髓性白血病肿瘤抗原28)、毛状蛋白样蛋白、胶原蛋白XXIII、COX-2(环氧化酶-2)、CT-9/BRD6(癌/睾丸抗原9)、Cten(c-末端张力蛋白样蛋白)、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1、cyP-B、CYPB1(细胞色素p450家族1亚家族b成员1)、DAM-10/MAGE-B1(黑素瘤相关抗原B1)、DAM-6/MAGE-B2、EGFR/Her1(表皮生长因子受体)、EMMPRIN(basigin)、EpCam、EphA2(EPH受体A2)、EphA3、ErbB3(Erb-B2受体酪氨酸激酶3)、EZH2(zeste 2多梳蛋白抑制复合体2亚单位的增强子)、FGF-5(成纤维细胞生长因子5)、FN(纤连蛋白)、Fra-1(Fos相关抗原-1)、G250/CAIX(碳酸酐酶9)、GAGE-1(G抗原-1)、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7b、GAGE-8、GDEP(前列腺中差异表达的基因)、GnT-V(葡萄糖酸激酶)、gp100(黑素细胞谱系特异性抗原GP100)、GPC3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖3)、HAGE(螺旋抗原)、HAST-2(磺基转移酶家族1A成员1)、hepsin、Her2/neu/ErbB2(Erb-B2受体酪氨酸激酶2)、HERV-K-MEL、HNE(髓质素)、同源异型框NKX 3.1、HOM-TES-14/SCP-1、HOM-TES-85、HPV-E6、HPVE7、HST-2(沉默调节蛋白-2)、hTERT、iCE(半胱天冬酶1)、IGF-1R(胰岛素样生长因子-1受体)、IL-13Ra2(白介素-13受体亚单位α2)、IL-2R(白介素-2受体)、IL-5(白介素-5)、未成熟层粘连蛋白受体、激肽释放酶2、激肽释放酶4、Ki67、KIAA0205(溶血磷脂酰甘油酰基转移酶1)、KK-LC-1(北九州肺癌抗原-1)、KM-HN-1、LAGE-1(L抗原家族成员-1)、Livin、MAGE-A1、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGEA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-B1、MAGE-B10、MAGE-B16、MAGEB17、MAGE-B2、MAGE-B3、MAGE-B4、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-D1、MAGE-D2、MAGE-D4、MAGE-E1、MAGE-E2、MAGE-F1、MAGE-H1、MAGEL2(黑素瘤抗原家族L2)、乳房珠蛋白A、MART-1/Melan-A(由T细胞识别的黑素瘤抗原-1)、MART-2、基质蛋白22、MC1R(黑皮质素1受体)、M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)、间皮素、MG50/PXDN(过氧蛋白)、MMP 11(基质金属蛋白酶11)、MN/CA1X-抗原(碳酸酐酶9)、MRP-3(多药耐药相关蛋白-3)、MUC1(粘蛋白1)、MUC2、NA88-A(VENT样同源异型框2假基因1)、N-乙酰葡糖胺基转移酶-V、Neo-PAP(Neo-聚(A)聚合酶)、NGEP(在前列腺中表达的新基因)、NMP22(核基质蛋白22)、NPM/ALK(核磷蛋白)、NSE(神经元特异性烯醇化酶)、NY-ESO-1、NY-ESO-B、OA1(骨关节炎QTL 1)、OFA-iLRP(癌胚抗原未成熟层粘连蛋白受体蛋白)、OGT(O-GlcNAc转移酶)、OS-9(内质网凝集素)、骨钙素、骨桥蛋白、p15(CDK抑制因子2B)、p53、PAGE-4(P抗原家族成员-4)、PAI-1(纤溶酶原激活物抑制物-1)、PAI-2、PAP(前列腺酸性磷酸酶)、PART-1(前列腺雄激素调节转录物1)、PATE(前列腺和睾丸表达1)、PDEF(前列腺源性Ets因子)、Pim-1-激酶(原病毒整合位点1)、Pin1(肽基-脯氨酰顺反异构酶NIMA相互作用1)、POTE(在前列腺、卵巢、睾丸和胎盘中表达)、PRAME(在黑素瘤中优先表达的抗原)、前列腺素、蛋白酶-3、PSA(前列腺特异性抗原)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、PSGR(前列腺特异性G蛋白偶联受体)、PSM、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、RAGE-1(肾肿瘤癌抗原)、RHAMM/CD168、RU1(肾遍在蛋白1)、RU2、SAGE(肉瘤抗原)、SART-1(由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原-1)、SART-2、SART-3、Sp17(精子蛋白17)、SSX-1(SSX家族成员1)、SSX-2/HOM-MEL-40、SSX-4、STAMP-1(STEAP2金属还原酶)、STEAP、存活素、存活素-213、TA-90(肿瘤相关抗原-90)、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白-72)、TARP(TCRγ交替阅读框蛋白)、TGFb(转化生长因子β)、TGFbR11(转化生长因子β受体11)、TGM-4(转谷氨酰胺酶4)、TRAG-3(紫杉醇耐药相关基因3)、TRG(T细胞受体γ基因座)、TRP-1(瞬时受体电位-1)、TRP-2/6b、TRP-2/INT2、Trp-p8、酪氨酸酶、UPA(U型纤溶酶原激活剂)、VEGF(血管内皮生长因子A)、VEGFR-2/FLK-1和WT1(肾母细胞瘤1)。
在一些实施方案中，靶抗原是CD19或CD22。在一些实施方案中，靶抗原是CD19。
在一些实施方案中，肿瘤抗原的突变形式选自由以下组成的组：α-辅肌动蛋白-4/m、ARTC1/m、bcr/abl、β-连环蛋白/m、BRCA1/m、BRCA2/m、CASP-5/m、CASP-8/m、CDC27/m、CDK4/m、CDKN2A/m、CML66、COA-1/m、DEK-CAN、EFTUD2/m、ELF2/m、ETV6-AML1、FN1/m、GPNMB/m、HLA-A*0201-R170I、HLA-A11/m、HLA-A2/m、HSP70-2M、KIAA0205/m、K-Ras/m、LDLR-FUT、MART2/m、ME1/m、MUM-1/m、MUM-2/m、MUM-3/m、肌球蛋白1类/m、neo-PAP/m、NFYC/m、N-Ras/m、OGT/m、OS-9/m、p53/m、Pml/RARa、PRDX5/m、PTPRX/m、RBAF600/m、SIRT2/m、SYTSSX-1、SYT-SSX-2、TEL-AML1、TGFbRII和TPI/m
在一些实施方案中，削弱免疫细胞功能的基因的表达导致以下的一种或多种：i)抑制免疫细胞的增殖；ii)诱导免疫细胞的细胞死亡；iii)抑制免疫细胞识别靶抗原和/或获得活化所必需的分子的功能；iv)诱导免疫细胞分化成发挥不同功能而不是引起对靶抗原的免疫响应的不同类型；v)减少免疫细胞与促进免疫细胞的免疫响应的分子的反应；或vi)增加免疫细胞与抑制免疫细胞的免疫响应的分子的反应。
在一些实施方案中，削弱免疫细胞功能的基因选自由以下组成的组：PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3或CEACAM-5)、LAG 3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、MerTK、2B4、FAS、CD45、PP2A、SHP1、SHP2、DGKα、DGKζ、Cb1-b、Cb1-c、CD148、LRR1、TGFBR1、IL10RA、KLGR1、DNMT3A和A2aR。在一些实施方案中，削弱免疫细胞功能的基因增加了免疫细胞与抑制免疫细胞的免疫响应的分子的反应。在一些实施方案中，增加免疫细胞与抑制免疫细胞的免疫响应的分子的反应的基因编码免疫检查点受体或配体。
在一些实施方案中，免疫检查点受体或配体选自由以下组成的组：PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3或CEACAM-5)、LAG 3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、MerTK和2B4。
在一些实施方案中，与不存在基因破坏剂的免疫细胞相比，基因破坏剂使削弱免疫细胞功能的基因在免疫细胞中的表达减少了至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，基因破坏剂减少基因的表达，所述基因增加免疫细胞与抑制免疫细胞的免疫响应的分子的反应。在一些实施方案中，基因破坏剂减少编码免疫检查点受体或配体的基因的表达。在一些实施方案中，基因破坏剂减少选自由以下组成的组的基因的表达：PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、MerTK和2B4。
在一些实施方案中，基因破坏剂通过RNA干扰(RNAi)减少削弱免疫细胞功能的基因的表达。在一些实施方案中，多于一种基因破坏剂通过RNAi减少削弱免疫细胞功能的基因在免疫细胞中的表达。在一些实施方案中，基因破坏剂靶向削弱免疫细胞功能的单个基因的不同部分，靶向削弱免疫细胞功能的不同基因，或其任何组合。在一些实施方案中，RNAi由短发夹核RNA(shRNA)介导。在一些实施方案中，RNAi由多于一种shRNA介导。
在一些实施方案中，RNAi由两种shRNA介导。在一些实施方案中，两种shRNA靶向PD-1的不同部分。在一些实施方案中，两种shRNA分别靶向PD-1和TIM-3。在一些实施方案中，两种shRNA分别靶向PD-1和CTLA-4。在一些实施方案中，两种shRNA分别靶向PD-1和LAG-3。在一些实施方案中，两种shRNA分别靶向PD-1和TIGIT。
在一些实施方案中，编码shRNA的碱基序列包含选自SEQ ID NO：1-219和238-267组成的组的序列。
在一些实施方案中，不同shRNA的表达分别由不同的启动子调控。在一些实施方案中，两种不同shRNA的表达分别由两种不同的启动子调控。在一些实施方案中，两种不同的启动子是RNA聚合酶III启动子。在一些实施方案中，所述两种启动子是源自不同物种的U6启动子。在一些实施方案中，两种启动子彼此以不同的方向取向。
在一些实施方案中，基因工程化的抗原受体和基因破坏剂各自由载体表达。在一些实施方案中，基因工程化的抗原受体和基因破坏剂由同一载体表达。在一些实施方案中，载体选自由以下组成的组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体。在一些实施方案中，载体是慢病毒载体。
免疫细胞的特征在于其选自淋巴细胞，诸如杀伤T细胞、辅助T细胞、γδT细胞和B细胞、天然杀伤细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞；吞噬细胞包括巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞。T细胞包括CD4+T细胞和CD8+T细胞。在一些实施方案中，B细胞淋巴瘤是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤、纵隔灰区淋巴瘤(mediastinal gray zone lymphoma)或结节性硬化型HL。在一些实施方案中，T细胞淋巴瘤是间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、外周T细胞淋巴瘤未特指型(PTCL-NOS)或血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)。在优选实施方案中，免疫细胞可选自人来源的T细胞或T淋巴细胞和天然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。
在一些实施方案中，免疫细胞由最初源自受试者的细胞产生。在一些实施例中，受试者可以是人类。在一些实施例中，人类可以是健康的供体。在其它实施方案中，受试者可被表征为患有肿瘤或癌症，在所述肿瘤或癌症中检测到细胞中表达的由CAR或TCR(例如，mTCR)靶向的癌抗原的水平的升高或变化。在一些实施例中，通常可使用例如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041和美国专利申请公开第20060121005中描述的方法来产生和扩增细胞。
在一些实施方案中，产生了CAR-T细胞。在另外的实施方案中，CAR-T细胞的生产包括提供外周血单克隆细胞的步骤。在另外的实施方案中，可从全血样品中分离外周血单克隆细胞。在一些实施方案中，本文所述的CAR-T细胞的产生包括使用抗体刺激外周血单克隆细胞的步骤。举例来说，提供初级刺激信号的剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，提供共刺激信号的剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本文所述的CAR-T细胞的产生包括转导CAR的步骤，其中CAR可以靶向本文所述的任何靶标和CAR的任何其它已知靶标，例如CAR可以是靶向CD19的CD19 CAR。在另外的实施方案中，分离产生的CAR-T细胞。
适合于T细胞培养的条件包括合适的培养基(例如，最小必需培养基或RPMI培养基1640或，X-vivo 15(Lonza))，其可包含增殖和生存力所必需的因子，包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、干扰素-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-I0、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或本领域技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉(plasmanate)和还原剂，诸N-乙酰半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer，其中添加了氨基酸、丙酮酸钠和维生素，或者不含血清或补充了适量的血清(或血浆)或一组确定的激素，和/或一定量的足以使T细胞生长和扩增的一种或或多种细胞因子。抗生素，例如青霉素和链霉素，只包含在实验培养物中，而不包含在要输注给受试者的细胞培养物中。将靶细胞保持在支持生长所必需的条件下，例如，合适的温度(例如，37℃)和大气(例如，空气加5％CO2)。还可能需要几个刺激周期，使得T细胞的培养时间可以是60天或更长。
暴露于不同刺激时间的T细胞可表现出不同的特征。例如，典型的血液或单采外周血单核细胞产品具有大于细胞毒性或抑制性T细胞群(TC，CD8+)的辅助T细胞群(TH，CD4+)。通过刺激CD3和CD28受体体外扩增的T细胞产生在约8-9天之前主要由TH细胞组成的T细胞群，而在约8-9天之后，该T细胞群包含越来越大的TC细胞群。因此，根据治疗的目的，给受试者输注主要由TH细胞组成的T细胞群可以是有利的。类似地，如果已经分离出一个抗原特异性的TC细胞亚群，则将该亚群扩增至更大程度可以是有益的。另外，除了CD4和CD8标志物以外，其它表型标志物也有显著变化，但在很大程度上在细胞扩增过程中是可重现的。因此，这种重现性使得能够有能力为特定目的定制活化的T细胞产品。
可使用各种测定来评估CAR-T细胞，诸如但不限于抗原刺激后的扩增能力、在无再刺激的情况下维持T细胞的扩增以及在适当的体外和动物模型中的抗癌活性。下文将进一步详细描述测定。
在一些实施方案中，原代T细胞中CAR表达的蛋白质印迹分析可用于检测单体和二聚体的存在。参见，例如，Milone等人，Molecular Therapy 17(8)：1453-1464(2009)。
在一些实施方案中，抗原刺激后CAR+T的体外扩增可通过流式细胞术来测量。例如，用αCD3/αCD28 aAPC刺激CD4+和CD8+T细胞的混合物，然后用在待分析的启动子的控制下表达GFP的慢病毒载体进行转导。示例性的启动子包括CMV IE基因、EF-1a、遍在蛋白C或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。通过流式细胞术在CD4+和/或CD8+T细胞亚群中在培养的第6天评估GFP荧光。参见，例如，Milone等人，Molecular Therapy 17(8)：1453-1464(2009)。或者，在第0天用涂覆有αCD3/αCD28的磁珠刺激CD4+和CD8+T细胞的混合物，并在第1天用双顺反子慢病毒载体用CAR进行转导，所述载体使用2A核糖体跳跃序列表达CAR以及eGFP。洗涤后，在抗CD3和抗CD28抗体(K562-BBL-3/28)存在的情况下，用例如表达hCD32和4-lBBL的K562细胞再次刺激培养物。每隔一天向培养物中加入100IU/ml的外源性IL-2。通过流式细胞术使用基于珠粒的计数来计数绿GFP+T细胞。参见，例如，Milone等人，MolecularTherapy 17(8)：1453-1464(2009)。还可测量在再刺激不存在的情况下持续的CAR+T细胞扩增。
细胞增殖和细胞因子产生的评估先前已在，例如，Milone等人，MolecularTherapy 17(8)：1453-1464(2009)中进行了描述。简言之，通过将洗涤后的T细胞与靶细胞(如K562-Meso、Ovcar3、Ovcar8、SW1990、Panc02.03细胞或CD32和CD137(KT32-BBL))以1∶1的最终T细胞：靶细胞比率混合，在微量滴定板中进行CAR介导的增殖的评估。将抗CD3(克隆OKT3)和抗CD28(克隆9.3)单克隆抗体添加到含有KT32-BBL细胞的培养物中，用作刺激T细胞增殖的阳性对照，因为这些信号支持长期CD8+T细胞离体扩增。按照制造商的说明，使用CountBrightTM荧光珠(Invitrogen，Carlsbad，CA)和流式细胞术对培养物中的T细胞进行计数。使用利用表达eGFP-2A连接的CAR的慢病毒载体工程化的T细胞，通过GFP表达来鉴定CAR+T细胞。CD4+和CD8+在T细胞上的表达也用特异性单克隆抗体同时检测(BDBiosciences)。根据制造商的说明，使用人TH1/TH2细胞因子细胞计数珠阵列试剂盒(BD Biosciences，SanDiego，CA)对再次刺激后24小时收集的上清液进行细胞因子测量。使用FACScalibur流式细胞仪评估荧光，并根据制造商的说明分析数据。
可以例如在实施例中通过本文所述的方法，或通过标准51Cr-释放测定(Milone等人，Molecular Therapy 17(8)：1453-1464(2009))评估细胞毒性可。简言之，在37℃和频繁搅拌下用51Cr(如NaCr04，New England Nuclear，Boston，MA)加载靶细胞(例如，BHK或CHO细胞)2小时，在完全RPMI中洗涤两次，并将其涂板至微量滴定板中。以不同的效应细胞：靶细胞(E：T)比率将效应T细胞与靶细胞于孔中的完全RPMI中混合。还制备了仅含有培养基(自发释放，SR)或1％triton-X100去垢剂溶液(总释放，TR)的额外孔。在37℃孵育4小时后，收集每个孔的上清液。然后使用伽玛粒子计数器(Packard Instrument Co.，Waltham，MA)测量释放的51Cr。每种条件至少进行三次，裂解的百分比使用以下公式计算：裂解％＝(ER-SR)/(TR-SR)，其中ER代表每种实验条件释放的平均51Cr。还可使用替代细胞毒性测定，诸如基于流动的细胞毒性测定。
其它测定，包括本文实施例部分中描述的以及本领域已知的那些测定，也可用于评估本文产生的CAR-T细胞。
在一些实施方案中，本文产生的免疫细胞可参与对疾病(其中表达由两种类型的shRNA和CAR或TCR(例如mTCR)靶向的抗原)的免疫响应。在另外的实施方案中，免疫细胞可用于提供用于人患者的免疫疗法的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物可以显示对目标疾病的治疗效果，而不需要免疫检查点抑制剂，所述免疫检查点抑制剂可导致严重的不良反应，并且额外给患者带来高成本负担。
在一些实施方案中，免疫细胞可以用作免疫细胞治疗剂；此类免疫细胞通常用于治疗癌症，但不限于此。在另外的实施方案中，为了使这些免疫细胞识别癌症，对它们进行修饰以表达靶向癌症抗原的细胞表面受体。
另一方面，本文提供了包含上述工程化免疫细胞的组合物。
5.使用针对一个或多个免疫检查点的CAR-T细胞的治疗
如本文所提供的，二合一载体包含编码一种或多种类型的抑制削弱免疫细胞功能的基因表达的短发夹RNA(shRNA)的碱基序列，以及编码嵌合抗原受体(CAR)和T细胞受体(TCR)(例如，单克隆T细胞受体(mTCR))中的任一种的碱基序列。使用根据一个实施方案的载体，可产生免疫细胞，其中所述免疫细胞具有减少的免疫检查点受体表达，并且其表达CAR或TCR，例如特异于靶分子的mTCR。所述免疫细胞可用于提供用于免疫疗法的药物组合物。
通过将本文所述的免疫细胞引入适于过继性免疫疗法的受试者，可以改善多种疾病。在一些实施方案中，所提供的所产生的CAR-T细胞用于同种异体过继性细胞疗法。本文还提供了本文所述组合物的治疗性用途，包括将所述组合物引入适于过继性细胞疗法的受试者，其中所述受试者患有自身免疫性疾病；血液恶性肿瘤；实体瘤；或与HIV、RSV、EBV、CMV、腺病毒或BK多瘤病毒相关的感染。
血液恶性肿瘤的实例包括但不限于急性和慢性白血病(急性髓性白血病(AML)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性髓母细胞性白血病(CML)、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金病、多发性骨髓瘤和骨髓增生异常综合征。实体癌的实例包括但不限于脑癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、子宫癌、皮肤癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、卵巢癌、睾丸癌、膀胱癌、肾癌、头癌、颈癌、胃癌、宫颈癌、直肠癌、喉癌和食道癌。各种自身免疫性疾病的实例包括但不限于斑秃、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、皮肌炎、糖尿病(1型)、某些形式的幼年特发性关节炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、Guillain-Barré syndrome综合征、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、某些形式的心肌炎、多发性硬化症、天疱疮/类天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、类风湿性关节炎、硬皮病/系统性硬化症、
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氏综合征、系统性红斑狼疮、某些形式的甲状腺炎、某些形式的甲状腺炎、某些形式的葡萄膜炎、白癜风、伴有多血管炎的肉芽肿病(Wegener氏病)。病毒感染的实例包括但不限于，HIV-(人免疫缺陷病毒)、HSV-(单纯疱疹病毒)、KSHV-(卡波西斯肉瘤相关疱疹病毒)、RSV-(呼吸道合胞病毒)、EBV-(爱泼斯坦-巴尔病毒)、CMV-(巨细胞病毒)、VZV(水痘带状疱疹病毒)、腺病毒、慢病毒、BK多瘤病毒相关病症。
急性白血病的特征在于未成熟血细胞的快速增殖。这种拥挤使得骨髓无法产生健康的血细胞。急性形式的白血病可以在儿童和年轻成人中发生。事实上，其是美国儿童的比任何其它类型的恶性疾病更常见的死亡原因。急性白血病需要立即治疗，因为恶性细胞会迅速发展和积累，然后溢出进入血流中并扩散到身体的其它器官。中枢神经系统(CNS)受累是罕见的，尽管这种疾病偶尔会引起脑神经麻痹。慢性白血病的特征是相对成熟但仍然异常的血细胞的过度积累。通常需要数月至数年的时间来发展，这些细胞以比正常细胞高得多的速度产生，导致血液中出现许多异常白细胞。慢性白血病大多发生在老年人中，但理论上可发生在任何年龄组。然而急性白血病必须立即治疗，而慢性白血病有时在治疗前要监测一段时间，以确保治疗的最大效果。此外，疾病被分为淋巴细胞性或淋巴母细胞性的(这表明癌变发生在通常会形成淋巴细胞的一种类型的骨髓细胞中)以及骨髓性或髓性的(这表明癌变发生在一种类型的通常会形成红细胞、某些类型的白细胞和血小板的骨髓细胞中)(参见淋巴样细胞对比髓样细胞)。
急性淋巴细胞白血病(也称为急性淋巴母细胞性白血病，或ALL)是幼儿中最常见的白血病类型。这种疾病也影响成年人，尤其是65岁及以上的人。慢性淋巴细胞白血病(CLL)最常影响55岁以上的成年人。其有时在年轻人中发生，但几乎从不影响儿童。急性骨髓性白血病(也称为急性髓性白血病，或AML)在成人中比在儿童中更常见。这种类型的白血病以前被称为“急性非淋巴细胞白血病”慢性粒细胞白血病(CML)主要在成人中发生。极少数儿童也会患上这种疾病。
淋巴瘤是一种类型的起源于淋巴细胞(脊椎动物免疫系统中的一种类型的白细胞)的癌症。淋巴瘤有多种类型。根据美国国立卫生研究院的数据，淋巴瘤约占美国所有癌症病例的5％，尤其是霍奇金淋巴瘤占美国所有癌症病例的不到1％。由于淋巴系统是人体免疫系统的一部分，因此免疫系统薄弱的患者，诸如因HIV感染或服用某些药物或药剂，也具有较高的淋巴瘤发病率。
在19世纪和20世纪，这种疾病被称为霍奇金病，因为其是由托马斯·霍奇金在1832年发现的。通俗地说，淋巴瘤宽泛地分为霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(所有其它类型的淋巴瘤)。淋巴瘤类型的科学分类更为详细。虽然较早的分类指的是组织细胞淋巴瘤，但这些在较新的分类中被认为是B、T或NK细胞谱系。
当将所述药物组合物向患有其中表达了CAR或TCR(例如，mTCR)的靶分子的癌症的患者施用时，所述药物组合物能够识别癌症并具有免疫活性，而不激活削弱免疫细胞对癌细胞的功能的基因，并且不存在诸如由于由此引起的抑制活化的信号传导而导致的衰竭等问题。
在一些实施方案中，上述包含免疫细胞的药物组合物能够更有效地抑制免疫检查点受体的表达，同时最大化其中嵌合抗原受体能够发挥作用的抗癌免疫细胞疗法的功性。在另外的实施方案中，当在药物组合物中使用如上所述抑制免疫检查点受体表达的细胞时，有可能消除严重的全身性不良反应，诸如细胞因子释放综合征或自身免疫症状(所述不良反应可能是由于使用免疫检查点受体的单独抑制剂而导致的)，以及由于同时使用昂贵的抗体疗法和细胞疗法而导致的治疗成本增加而导致的负担。
正如不言而喻的是，除了细胞之外，还可将可进一步提高免疫响应的其它药学上可接受的盐、载体、赋形剂、媒介物和其它添加剂等添加到药物组合物中，因此将省略其详细解释。
在一些实施方案中，药物组合物包含靶向两个如本文所述的免疫检查点的双重CAR-T细胞。例如，双重免疫检查点可选自由以下组成的组：PD1(程序性细胞死亡蛋白1)、PD-L1(程序性死亡配体1)、CTLA4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)、TIM-3(含T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域-3)、CEACAM(癌胚抗原相关细胞粘附分子，包括三个亚型CEACAM-1、CEACAM-3或CEACAM-5)、LAG3(淋巴细胞活化基因3)、VISTA(T细胞活化的V-结构域Ig抑制剂)、BTLA(B淋巴细胞和T淋巴细胞衰减子)、TIGIT(具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体)、LAIR1(白细胞相关免疫球蛋白样受体1)、CD160(分化簇160)、CD96(分化簇96)、MerTK(原癌基因酪氨酸蛋白激酶MER)和2B4(NK细胞活化诱导配体)，并且可以例如在PD1与TIM3之间选择。
在一些实施方案中，被靶向的免疫检查的类型影响药物组合物的抗肿瘤效果。例如，靶向PD-1和TIM3的药物组合物可以显示出与靶向PD-1和TIGIT的药物组合物不同水平的抗肿瘤效果。在另外的实施方案中，所述抗肿瘤效果的差异是不可从关于靶向相同免疫检查点的其它药物(例如，所述其它药物可包括靶向免疫检查点的抗体)的抗肿瘤效果的知识预测的。在一些实施方案中，靶向某两个免疫检查点可以产生令人惊讶的高抗肿瘤效果。在示例性实施方案(实施例10)中，靶向PD-1和TIGIT的CAR-T细胞与靶向PD-1和CTLA-4、PD-1和LAG-3以及PD-1和TIM-3的组合的其它双重KD CAR-T细胞相比，显示出令人惊讶的更优的抗肿瘤效果。
一方面，本文所述的组合物可以以单位剂型提供，其中每个剂量单位，例如注射剂，包含预定量的单独的或与其它活性剂适当组合的组合物。如本文中所用，术语单位剂型是指适合作为人和动物受试者的单一剂量的物理上离散的单位，每个单位含有以足以产生所需效果的量计算的预定量的单独的或与其它活性剂组合的本文所述组合物(在适当情况下，与药学上可接受的稀释剂、载体或媒介物结合)。本文所述的细胞或组合物的新型单位剂型的规格取决于特定受试者中与药物组合物相关的特定药效学。
在一些实施方案中，本文所述的细胞或组合物的优选药物剂型可基于本公开的内容和制剂技术的一般知识并根据预期的施用途径、递送方法和目标剂量来确定。不管施用方法如何，有效剂量可以根据患者的体重、表面积或器官大小来计算。使用本说明书中所述的各种剂型以及额外的纯化来确定用于疗法的适当给药剂量的计算在本领域中每天都在进行，并且包括在本领域中每天进行的工作范围内。适当的给药剂量可通过使用适当的剂量-响应数据来确定。
本文所述的药物组合物可单独使用或与其它已知的用于治疗癌症的剂组合使用。无论是单独递送还是与其它药物组合递送，本文所述的药物组合物都可以通过各种途径递送，并递送至哺乳动物(尤其是人)体内的各种部位，以达到特定的效果。本领域技术人员将认识到，尽管可以使用多于一种途径施用，但特定的途径可以提供比另一种途径更直接和更有效的反应。例如，对于黑素瘤的治疗，相对于吸入，可有利地使用皮内递送。局部或全身性递送可通过施用完成，所述施用包括将制剂涂敷在或滴注到体腔内，吸入或吹入气雾剂，或通过胃肠外引入，包括肌内、静脉内、门静脉内、肝内、腹膜内、皮下或皮内施用。对受试者的示例性施用途径包括静脉内(IV)注射和局部(瘤内、腹膜内)施用。在一些实施方案中，可通过输注将药物组合物施用到实体瘤中。
在一些实施方案中，除了本文提供的基因工程化的免疫细胞以外，还可在联合治疗中与这些效应细胞一起使用额外治疗剂，所述治疗剂包靶向与疾患、疾病或适应症相关的抗原的抗体或抗体片段。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体、人源化单克隆抗体或嵌合抗体。在一些实施方案中，所述抗体或抗体片段与病毒抗原特异性结合。在其它实施方案中，所述抗体或抗体片段与肿瘤抗原特异性结合。在一些实施方案中，适于作为对所施用的基因工程化的免疫细胞的额外治疗剂用于联合治疗的抗体包括但不限于抗CD20(利妥昔单抗、维妥珠单抗、奥法木单抗、乌布曲西单抗(ublituximab)、卡鲁珠单抗、阿托珠单抗)、抗HER2(曲妥珠单抗、培妥珠单抗)、抗CD52(阿仑珠单抗)、抗EGFR(西妥昔单抗)、抗GD2(dinutuximab)、抗PDL1(阿维鲁单抗)、抗CD38(达雷木单抗、伊沙妥昔单抗、MOR202)、抗CD123(7G3、CSL362)、抗SLAMF7(依洛珠单抗(elotuzumab))；以及它们的人源化或Fc修饰的变体或片段，或其功能等同物和生物仿制药。
理想地，在组合物中存在有效量或足够数量的分离的转导的T细胞，并将其引入受试者，使得建立长期的、特异性的抗肿瘤响应，以减少肿瘤的尺寸或消除肿瘤的生长或再生，而不进行这种治疗则不会产生这种效果。理想地，当与其中不存在转导的T细胞的在其它方面相同的条件相比时，重新引入受试者的转导的T细胞的量导致肿瘤尺寸减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％。
因此，转导的T细胞的施用量应考虑到施用途径，并且应使得足够数量的转导的T细胞被引入，从而获得期望的治疗响应。此外，本文所述组合物中包含的每种活性剂的量(例如，每种待接触的细胞的量或每特定体重的量)可在不同的应用中变化。一般而言，转导的T细胞的浓度理想地应该足以在被治疗的受试者中提供至少约1×106至约1×109个转导的T细胞，甚至更理想地，约1×107至约5×108个转导的T细胞，尽管可使用高于例如大于5×108个细胞，或低于例如少于1×107个细胞的任何合适的量。给药方案可基于良好建立的基于细胞的疗法(参见，例如，Topalian and Rosenberg，1987；美国专利第4,690,915号)，或者可采用替代的连续输注策略。
这些值提供了从业者在优化本文所述方法时要使用的转导的T细胞的范围的一般指导。在本文中列举此类范围决不排除使用更高或更低量的组分，这在特定的应用中可能是有保证的。例如，实际剂量和时间表可根据组合物是否与其它药物组合物联合施用，或者根据药代动力学、药物配置和代谢的个体间差异而变化。本领域的技术人员可根据特定情况的紧急情况容易地进行任何必要的调整。
本文所述的任何组合物都可以包含在试剂盒中。在一些实施方案中，将在CAR T细胞在试剂盒中提供，所述试剂盒还可包括适于扩增细胞的试剂，诸如培养基、aAPC、生长因子、抗体(例如，用于分选或表征CART细胞)和/或编码CAR或转座酶的质粒。
在非限制性实例中，嵌合受体表达构建体、产生嵌合受体表达构建体的一种或多种试剂、用于转染表达构建体的细胞和/或用于获得用于转染表达构建体的同种异体细胞的一种或多种仪器(这种仪器可以是注射器、移液管、镊子和/或任何此类医学认可的仪器)。
在一些实施方案中，在试剂盒中提供了用于消除内源性TCRα/β表达的表达构建体、产生该构建体的一种或多种试剂和/或CAR+T细胞。在一些实施方案中，包括编码一种或多种锌指核酸酶的表达构建体。在一些方面，试剂盒包括用于细胞电穿孔的试剂或装置。
试剂盒可包含一种或多种本文所述的适当等分的组合物或用于产生本文所述的组合物的试剂。试剂盒的组分可以包装在水性介质中或以冻干形式包装。试剂盒的容器装置可包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其它容器装置，其中可以放置成分，并且在某些实施例中，适当地等分。当试剂盒中有多于一种组分时，试剂盒通常还包含第二、第三或其它附加容器，附加成分可以单独放置在所述容器中。然而，可将各种组分的组合包含在小瓶中。本文所述的试剂盒通常还包括用于容纳嵌合受体构建体的装置和任何其它封闭的试剂容器以用于商业销售。此类容器可包括例如将所需的小瓶保持在其中的注射或吹塑塑料容器。
一方面，本文提供了包含上述免疫细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。另一方面，本文提供了用于人患者的免疫疗法的药物组合物，其包含上述免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞最初来源于患者。在一些实施方案中，患者患有肿瘤或癌症，在所述肿瘤或癌症中，检测到细胞中表达的由CAR或TCR(例如mTCR)靶向的癌抗原的水平的升加或变化。
在另一方面，本文提供了方法。在一些实施方案中，提供了治疗方法，其包括对患有疾病或疾患的受试者施用上述免疫细胞或上述组合物。在一些实施方案中，基因工程化的抗原受体与抗原特异性结合，所述抗原与所述疾病或疾患相关。在一些实施方案中，所述疾病或疾患是癌症或肿瘤。
另一方面，本文提供了免疫细胞和组合物。在一些实施方案中，提供了用于治疗疾病或疾患的上述免疫细胞和组合物。
另一方面，本文提供了免疫细胞或组合物的用途。在一些实施方案中，提供了上述免疫细胞或组合物在制造用于治疗疾病或疾患的方法的药物中的用途。在一些实施方案中，基因工程化的抗原受体与抗原特异性结合，所述抗原与所述疾病或疾患相关。在一些实施方案中，所述疾病或疾患是癌症或肿瘤。
本发明的上述描述旨在是示例性的，本领域普通技术人员应该理解，在不改变本发明的技术思想或基本特征的情况下，可将本发明容易地修改成某些其它形式。因此，上面描述的实施例应该被理解为是示例性的，而不是在所有方面进行限制。例如，被描述为集成的各个组成元件可被单独执行，同样，被描述为单独执行的组成元件可以以集成的方式执行。
本发明的范围由所附权利要求书来表示，并且从权利要求书的含义和范围以及与其等同的概念中得出的所有修改或改变的形式应被解释为包括在本发明的范围内。
序列列表
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实施例
下面描述与本发明相关的实施例。在大多数情况下，可以使用替代技术。所述实施例旨在是说明性的，而不是限制本发明的范围。
一般方法
细胞系和培养。将Nalm-6、Nalm-6GL(表达GFP和萤火虫萤光素酶)、K562、K562-CD19、IM-9、Raji、Daudi细胞系在37℃下于具有5％CO2的湿润培养箱中培养在RPMI-1640中，所述RPMI-1640补充有10％热灭活的胎牛血清和2mML-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素。Lenti-XTM293T细胞系购自Takara，在DMEM中维持，所这DMEM补充有10％热灭活的胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠和1％青霉素/链霉素。为了产生CD19+PD-L1+细胞系，用编码人PD-L1(NM_014143.3)的慢病毒转导K562-CD19或NALM-6-G1细胞。通过用编码人CD80(NM_005191.3)的慢病毒转导Nalm-6-PDL1细胞，产生Nalm-6-PDL1-CD80细胞系。
质粒构建。包含抗CD19 scFv(FMC63)、CD8α铰链和跨膜区以及4-1BB(CD137)和CD3ζ的胞质结构域的pLV-CD19-BBz载体的构建之前已有描述(PNAS，2016，MaJSY)。为了产生pLV-CD19-28z，用人CD28共刺激结构域的序列替代4-1BB的胞质结构域。为了检测和纯化转导的CAR-T细胞，从pMACs-ΔLNGFR(Milteny Biotec)载体中扩增ΔLNGFR(胞质结构域截短的CD271)序列，并将其通过P2A序列插入到CAR-转基因的前面，以产生pLV-ΔLNGFR-CD19-28z或PlV-ΔLNGFR-CD19-bBz。
为了产生编码CAR和shRNA表达盒两者的二合一LV载体，合成包含shRNA(连接序列；终止序列。TTTTT)和Pol启动子(mU6、hU6或hH1)的shRNA表达盒，并将其在中央多聚嘌呤区(central polypurine tract)(cPPT)上游亚克隆到编码CAR的LV载体中。为了通过不同的启动子(mU6和hU6)产生表达两种shRNA的双重二合一载体，将BstZ171-Xba1-Nde1-Bmt1-Spe1 MCS序列插入到位于hU6启动子下游的pLV-hU6-shPD-1_ΔLNGFR-CD19-BBz载体中。将第二mU6-shRNA盒片段亚克隆到MCS中。
为了建立报告载体，通过PCR扩增来源于pGL2_NFAT-Luc报告基因(addgene#10959)的NFAT RE x3序列。合成了NF-kB-re5x(5’-GGGAATTTCC-3’)和miniP序列(IDTTechnologies)。用这些报告片段替代了pLV-eGFP载体的EF-1a启动子，以产生pLV-NFAT-RE3x-eGFP或pLV-NF-kB-RE 5x-eGFP报告载体。
选择siRNA或shRNA序列。在合成之前，通过使用BLOCK-iTTM RNAi Designer或Sfold程序设计了对抑制性免疫检查点(CTLA-4、LAG-3、TIGIT和TIM-3)特异的21聚体siRNA的候选序列。RNA寡聚体。靶向CTLA-4的siRNA选自由SEQ ID NO.255-260组成的组。靶向LAG-3的siRNA选自由SEQ ID NO.244-254组成的组。靶向TIGIT的siRNA选自由SEQ IDNO.238-243组成的组。靶向TIM-3的siRNA选自由SEQ ID NO.261-264组成的组。(IDTTechnologies)。为了分析免疫检查点的表达动力学，在人重组IL-2存在的情况下，用Dynabeads人T激活物CD3/CD28(Thermofisher)或4μg/ml抗CD3抗体和2μg/ml抗CD28抗体刺激PBMC。分析免疫检查点的表达水平12天(第3天、第6天和第12天)。为了选择最佳的siRNA序列，在刺激后2天，使用
Figure BDA0002658560110000741
转染系统(Thermofisher)用siRNA寡聚体对PBMC进行电穿孔。转染后第2天，通过流式细胞术测量siRNA的敲低效率。基于它们的效率，为每个免疫检查点选择2-3个siRNA序列，并将其转换成shRNA格式以产生双重二合一慢病毒载体。为了验证shRNA介导的敲低效率，用γ射线照射的K562-CD19细胞以1∶1的比率刺激慢病毒转导的T细胞3天，并通过流式细胞术分析其免疫检查点的表达水平。
流式细胞术。通过与缀合有AF 647的链霉抗生物素蛋白(405237，Biolegend)偶联的缀合有AF 647的抗小鼠F(ab′)2抗体(115-606-072，Jackson ImmunoResearch)或缀合有生物素的rhCD19-Fc(CD9-H5259，ACRO Biosystems)来分析抗CD19 CAR的表达水平。通过缀合有APC或缀合有FITC的抗CD271抗体(ME20.4-1.H4；Mitenyi Biotec)分析ΔLNGFR表达。通过常规流式细胞术，使用下列抗体来测量CAR-T细胞中免疫检查点的表达：PD-1(PE，克隆J105；Thermofisher)、TIM-3(PE，克隆344823；R&Dsystems)、LAG-3(PE，克隆7H2C65；Biolgend)、TIGIT(PE，克隆MBSA43；Thermofisher)。
在与照射的NALM-6或K562-CD19细胞以1∶1的E∶T比率孵育3天后，通过细胞内流式细胞术分析CAR-T细胞上的CTLA-4表达。用Cytofix/CytopermTM溶液(BD Bioscience)固定/渗透细胞，然后用抗人CD152(CTLA-4)抗体(PE，克隆BNI3；Biolegend)进行染色。
使用以下抗体分析肿瘤细胞上的刺激性或抑制性免疫检查点配体的表达：CD80(PE，克隆2D10；Biolgend)、CD86(BV421，克隆2331(FUN-1)；BD Bioscience)、PD-L1(APC，克隆29E.2A3；Biolgend)、HLA-DR(PE，克隆L243；Biolgend)、CD112(PE，克隆TX31；Biolgend)、CD155(PE，克隆SKII.4；Biolgend)。
为了分析TGF-β对PD-1表达的影响，在用流式细胞术测量PD-1表达之前，在10ng/ml重组人TGF-β1(R&D systems)存在的情况下，用辐射的NALM-6细胞刺激CAR-T细胞3天。
通过细胞内流式细胞术分析SMAD2/3的磷酸化状态。为了确定SMAD2/3的磷酸化状态，将CAR-T细胞与NALM-6细胞以1∶1的E∶T细胞比率孵育4小时或24小时。将细胞用裂解/固定缓冲液(BD Bioscience)固定，然后用Perm缓冲液III(BD Bioscience)进行透化。用抗人Smad2(pS465/pS467)/Smad3(pS423/pS425)抗体(PE，克隆O72-670；BD Bioscience)测定LNGFR+CAR-T细胞上的磷酸化状态。
诱导的调节性T细胞的检测。在与NALM-6细胞共培养3天后，通过细胞内染色分析由CAR-T细胞产生的调节性T细胞(CD4+CD25+FOXP3+)的诱导。用Foxp3/转录因子染色缓冲液(Thermofisher)固定和透化的细胞用下列抗体染色：抗CD4(BV605，克隆OKT4；Biolgend)、抗CD25(FITC，克隆VT-072；Biolgend)和anti-FOXP3(APC，克隆236A/E7；Thermofisher)。
CAR-T增殖测定。通过磁珠(Miltenyi Biotec)分选表达ΔLNGFR表面标志物的CAR-T细胞。将LNGFR+CAR-T细胞(1×106；＞95％的纯度)在细胞因子不存在的情况下，每6天用γ射线照射的K562-CD19-PDL1细胞(1×106)进行刺激。使用台盼蓝排除法在第6天、第12天和第18天通过细胞计数来计算CAR-T细胞的倍数扩增。
CAR-T细胞的体外细胞毒性。通过使用Incucyte S3活细胞分析系统测定CAR-T的细胞毒性。以一式三份将组成型表达GFP的NALM-6或NALM-6-PDL1靶细胞以1×105个细胞/孔的密度涂板到96孔板中。在每一个孔中以1∶1、0.3∶1、0.1∶1的E∶T比率加入LNGFR+CAR-T细胞。每2小时一次将各孔GFP强度的实时变化记录为绿色物体积分强度(平均GFP强度xμm2/孔))。通过以下公式计算相对绿色物体积分强度的百分比：(每个时间点的总积分GFP强度/开始时间点的总积分GFP强度)*100。
NFAT和NF-κB报告测定。为了确定NFAT转录因子在CAR-T细胞中的比活性，在人重组IL-2(300IU/mL)存在的情况下，首先用编码NFAT-RE x3-eGFP报告基因的慢病毒转导用4μg/ml抗CD3和2μg/ml抗CD28抗体刺激PBMC 2天。转导后8天，在人重组IL-2(300IU/mL)存在的情况下，用抗CD3和抗CD28抗体再次刺激总细胞2天。将活化的细胞分到两个单独的孔中，并用不同的编码CAR的慢病毒(CD19-28z或CD19-BBz)进行转导。6天后，将每个孔中的总细胞与NALM-6细胞以1∶1的比率共孵育。在24小时和48小时的时间点，通过LNGFR+CAR-T群体(占总CD3+细胞的20～25％)内的eGFP信号的gMFI值来确定CAR-T细胞中的NFAT的报告活性。NF-κB转录因子在CAR-T细胞中的比活性是按照类似的方法，但使用编码NF-κB-RE x5-eGFP报告基因的慢病毒来测定的。
定量实时PCR。将3×106LNGFR+G28z或GBBz CAR-T与CD19+NALM-6靶细胞以1∶1的比率共培养。在共培养4小时和48小时后，使用MoFlo Astrios分选仪(Beckman Coulter)对LNGFR+CAR-T细胞进行分选。用RNeasy mini试剂盒(Qiagen)提取LNGFR+CAR-T细胞的基因，用QuantiTect反转录试剂盒(Qiagen)将其反转录成cDNA。使用CFX96实时聚合酶链反应检测系统(Biorad)和SYBR Green实时PCR预混合物(TOYOBO)，采用SYBR方案进行定量实时PCR。用于检测18s rRNA的引物序列包含SEQ ID NO：268和269。用于检测PDCD1的引物序列包含SEQ ID NO：270和271。用于检测IL2的引物序列包含SEQ ID NO：272和273。用于检测IL4的引物序列包含SEQ ID NO：274和275。用于检测IL17A的引物序列包含SEQ ID NO：276和277。用于检测CD25的引物序列包含SEQ ID NO：278和279。用于检测CTLA4的引物序列包含SEQ ID NO∶280和281。用于检测FOXP3的引物序列包含SEQ ID NO：282和283。用于检测TGF-β1的引物序列包含SEQ ID NO：284和285。用于检测TGFBR1的引物序列包含SEQ ID NO：286和287。用于检测TGFBR2的引物序列包含SEQ ID NO：288和289。
将靶mRNA的量标准化为内源性参考18s rRNA：ΔCt(样品)＝Ct(靶基因)-Ct(18srRNA)。基于下面的公式，应用比较Ct方法分析靶mRNA与未刺激的条件相比的相对倍数变化：2-ΔΔCt＝2∧-(ΔCt[刺激的]-ΔCt[未刺激的])。
动物实验。本文所述的所有程序均由KAIST的机构动物护理和使用委员会批准。为了建立CD19+血癌模型，将NSG小鼠(4至6周龄)静脉内注射1x106个CD19+NALM-6白血病细胞，所述细胞经工程化以表达融合EGFP的萤火虫萤光素酶以及人PDL1(NALM6-GL-PDL1细胞)。按照上述程序从健康供体的全血样品中制备CAR-T细胞。在转导后的第4天，分选CAR-T细胞并进一步扩增6天，然后注射入小鼠。在注射NALM6-GL-PDL1细胞后5天，向小鼠静脉内输注2.5或1×106个CAR-T细胞。用Xenogen IVIS光谱监测小鼠体内NALM6-GL-PDL1的生物发光成像，并用Living Image软件(Perkin Elmer)将信号定量为目标区域的辐射强度(光子/秒)。对于实体瘤模型，将NSG小鼠皮下注射5×106个IM-9细胞(CD19+PD-L1+CD155+)。在注射肿瘤细胞(肿瘤体积约为150～300mm3)后14天，向小鼠静脉内输注LNGFR+CAR-T细胞。每周通过测径器测量来监测肿瘤，并且通过(长度×宽度2)/2来估计体积。
实施例1：产生和评估表达CART19和靶向PD-1的shRNA的二合一载体的方法
本实施例描述了产生和评估表达CART19和抑制PD-1表达的shRNA的二合一载体的方法。
为了产生编码CAR和shRNA表达盒两者的二合一慢病毒载体，合成包含shRNA(连接序列；TTCAAGAGA，终止序列；TTTTT)和Pol III启动子(mU6、hU6或hH1)的shRNA表达盒，并将其在中央多聚嘌呤区(cPPT)上游亚克隆到编码CAR的LV载体中。构建了慢病毒载体，其通过EF-1α启动子自发表达基于4-1BB的CART19，并通过mU6启动子表达靶向PD-1的shRNA(图1A和图1B)。
为了选择靶向PD-1的shRNA，使用了三种shRNA候选物。shPD-1#1对PD-1的表达显示出令人惊讶的有效抑制作用(图1F)，而不影响CAR表达(图1C)、稳态扩增(图1D)、分化状态和CD4/CD8组成。(图1F)。据报道，根据Pol III启动子的类型，shRNA的表达水平可以不同(MolTher，2006，Irvin S.Y.Chen)。因此，评估了mU6、hU6或hH1启动子对PD-1表达的影响。mU6和hu6具有相似的KD功效，但hH1较低(图2)。
本文产生的二合一慢病毒载体显示出对PD-1表达的令人惊讶的有效抑制，因此在以下实施例中可用于产生PD-1KD修饰的CAR-T细胞。
实施例2：产生和体外评价PD-1KD CAR-T细胞的方法
本实施例描述了产生和体外评价PD-1 KD修饰的CAR-T细胞的方法。
通过Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare)密度梯度离心法从健康供体的全血样品中分离外周血单核细胞。在300IU/ml人重组IL-2(BMIKOREA)存在的情况下，用4μg/ml平板结合的抗CD3抗体(克隆OKT3；Bio X cell)和2μg/ml可溶性抗CD28抗体(克隆CD28.2；BioX cell)刺激这些细胞。为了产生重组慢病毒，在转染前24小时，将在2.5mL生长培养基(补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸和1mM丙酮酸钠的DMEM)中的6x105293T个细胞接种在6孔板中。使用10μlLipofectamine2000(Thermofisher)，用包装载体(pMDL，pRev，pMDG.1)和转移载体的混合物转染细胞。转染后两天，收集含有慢病毒的培养上清液，并以1800rpm离心5分钟。在硫酸鱼精蛋白(1μg/ml)存在的情况下，将活化的T细胞与病毒上清液混合，以1000×g离心90分钟，并在37℃下孵育过夜。第二天，吸取培养物上清液，用补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠和55μMβ-巯基乙醇的新鲜PRMI-1640替换。将转导的T细胞以低于1×106个细胞/mL的密度培养在补充有10％热灭活的FBS和2mM的L-谷氨酰胺以及1％青霉素/链霉素的RPMI-1640中。T细胞培养基含有重组IL-2(300IU/mL)，每2-3天补充一次。
对shPD-1CAR-T细胞的体外裂解和增殖活性进行了研究。使用Nalm-6-PDL1或K562-CD19-PDL1作为CD19+PDL1+靶细胞。首先，使用IncuCyte实时成像系统检查长期裂解活性。当将CAR-T细胞与NALM-6细胞混合时，WT(shGFP)CART和PD-1KD(shPD-1)CAR-T细胞具有相似的裂解活性。然而，当将CAR-T细胞与NALM-6-PDL1细胞一起培养时，shPD-1CAR-T细胞显示出比shGFP CAR更有效的裂解活性(图3A)。还发现，出乎意料地，BBz w/o shRNA盒CAR-T细胞和shGFP CAR-T细胞保留了相似的细胞毒性，表明shRNA表达本身对CAR-T细胞的活性几乎没有影响。
接下来，评估反复暴露于CD19抗原和PD-L1的CAR-T细胞的增殖活性。在外源性IL-2不存在的情况下，shPD-1CAR-T细胞实现了为shGFP CAR-T细胞4至5倍的针对K562-CD19-PDL1靶标的T细胞增殖活性(图3B)。已知，共刺激配体有助于最佳的T细胞扩增，并且在肿瘤细胞中经常表达。为了检查在重复刺激时靶细胞中共刺激配体的表达是否影响细胞增殖，检查了CD80(一种代表性共刺激配体)是否在靶细胞中表达。K562-CD19表达CD80，但不表达Nalm-6(图3C)。发现过表达CD80的NALM-6-PDL1(NALM-6-PDL1-CD80)能使CAR-T细胞在重复刺激下增殖。CD80可能在反复体外刺激下促进CART增殖(图3B)。总的来说，证实了细胞固有的PD-1破坏令人惊讶地有效地促成CD19特异性CAR-T细胞在反复的CAR和PDL1刺激下的体外功能改善。
在本实施例中，使用实施例1中描述的二合一载体产生的PD-1 KD修饰的CAR-T细胞与WT CAR-T细胞相比，在体外裂解和增殖活性方面显示出令人惊讶的增强水平，因此在以下实施例中，在荷有CD19+PDL1+血液肿瘤的小鼠模型的体内模型中进一步评估了它们的治疗潜力。
实施例3：使用PD-1 KD CAR-T细胞在体内治疗CD19+血癌的方法
本实施例描述了使用PD-1 KD CAR-T细胞在体内治疗CD19+血癌的方法。
为了建立CD19+血癌模型，将NSG小鼠(4至6周龄)静脉内注射1x106CD19+NALM-6个白血病细胞，所述细胞经工程化以表达融合EGFP的萤火虫萤光素酶以及人PDL1(NALM6-GL-PDL1细胞)。按照上述程序从健康供体的全血样品中制备CAR-T细胞。在转导后的第4天，分选CAR-T细胞并进一步扩增6天，然后注射入小鼠。在注射NALM6-GL-PDL1细胞后5天，将1×106CAR-T细胞静脉内输注给小鼠。用Xenogen IVIS光谱监测小鼠体内NALM6-GL-PDL1的生物发光成像，并用Living Image软件(Perkin Elmer)将信号定量为目标区域的辐射强度(光子/秒)。与shGFP CAR-T细胞相比，用shPD-1CAR-T细胞处理的小鼠具有令人惊讶的均匀的肿瘤负荷的减小(图4)。此外，发现两种类型的shRNA表达启动子具有相似的抗肿瘤效果，并且shRNA表达本身令人惊讶地不影响抗肿瘤效果。
检查CAR-T细胞的细胞固有的PD-1破坏对体内细胞因子产生的影响。在注射CAR-T后24小时和72小时获得了单个小鼠的外周血。通过在室温下以300×g离心5分钟从外周血中收集血浆。按照制造商的说明，用人Th1/Th2细胞因子试剂盒(BD Bioscience)分析体内细胞因子水平。CAR-T细胞的细胞固有的PD-1破坏出人意外地减少了体内细胞因子的产生(图5A)。
为了检测CAR-T细胞的细胞固有的PD-1破坏对CAR-T细胞的体内扩增的影响，在CAR-T注射后3或20天获取单个小鼠的脾脏。用流式细胞术评估CAR-T细胞(活/死的-CD3+)或NALM-6-PDL1(活/死的-GFP+)的百分比。细胞固有的PD-1破坏出乎意料地延迟了CAR-T细胞的体内扩增(图5B)。
通过本文所述的二合一载体系统获得的CAR-T细胞固有的PD-1破坏，显示出CD19特异性CAR-T细胞针对CD19+PDL1+肿瘤的体内抗肿瘤作用的出乎意料的高水平增加。因此，在以下实施例中的方法中进一步使用了PD-1KD CAR-T细胞。
实施例4：PD-1信号传导中的共刺激分子的环境的评估
本实施例描述了对PD-1信号传导中的共刺激分子(包括CD28和4-1BB)的环境的评估。
研究了细胞固有的PD-1破坏如何影响CD28/CD3ζ或4-1BB/CD3ζCAR-T细胞的功能(图6A)。首先产生G28z GBBz、P28z和PBBz CAR-T细胞。类似地转导这些细胞(图6B)。在G28zCAR-T细胞中的PD-1的表达水平高于GBBz CAR-T细胞中的PD-1的表达水平，P28z的PD-1水平高于PBBz的PD-1水平(图7A)。还发现这种不同的PD-1蛋白水平源于转录水平(图7B)。假设每个共刺激结构域对参与PD-1转录的因子的激活表现出不同的强度。在参与PD-1转录的转录因子中，NFAT和NF-κB显著参与PD-1转录，并且在作为肿瘤微环境的主要免疫抑制因子的外源性TGF-β存在的情况下，SMAD2/3参与PD-1转录(Cancer Discov.，2016，BenjamineV.Park)。在CAR刺激过程中研究NFAT或NF-kB的活性。构建了NFAT应答元件(NFAT-RE x3)-eGFP或经典NF-κB应答元件(NF-κB RE x5)-eGFP报告慢病毒载体。结果表明，NFAT或NF-kBRE介导的eGFP诱导(图8A和图8B)。再刺激报告分子转导的T细胞，并用G28z或GbZ进行额外转导。发现G28z转导的NFAT报告细胞CAR-T细胞(G28z-NFAT)与GbZ-NFAT相比具有稍高水平的NFAT活性(图9A)，并且NFAT靶基因的mRNA水平在G28z中也较高(图9B)。然而，G28z转导的NF-κB报告CAR-T细胞(G28z-NF-κB)在NFAT活性上与GBB-NF-κB相似(图10)。为了研究每种CAR-T细胞的SMAD2/3活性，在CAR刺激过程中，将TGF-β处理成G28z或GBBz CAR-T细胞。发现G28z CART的SMAD2/3磷酸化略高于BBz CART(图11A)，并且G28z通过TGF-β处理的PD-1表达的增加程度大于GBBz(G28z的倍数变化为2.39±0.031，GBBz为1.61+0.034)(图11B)。研究了这种差异是否由TGF-β信号传导组分的表达水平的差异导致。发现TGF-β和TGF-β受体1(TGFBR1)在两种CART之间没有显著差异，但是TGF-β受体2(TGFBR2)在CD28z中以更高水平表达(图11C)。
在该实施例中，评估了PD-1信号传导中共刺激分子(包括CD28和4-1BB)的环境。CD28共刺激强烈诱导与PD-1转录相关的信号，该诱导可能与NFAT和TGF-β信号传导的激活相关。CD28共刺激的诱导作用强于4-1BB共刺激的诱导作用。
实施例5：PD-1KD CAR-T细胞的工程化及评价方法
本实施例描述了PD-1 KD CAR-T细胞的工程化和评估方法。
为了模拟具有多个顺序抗原和免疫检查点配体相遇的CAR-T细胞的体内条件，在外源性细胞因子不存在的情况下将CAR-T细胞与CD19+PDL1+靶细胞共培养。在原代CAR-T细胞中，PD-1KD CAR-T组显示出比WT CAR-T组高得惊人的裂解活性，但在基于CD28与基于4-1BB的CAR-T组之间没有裂解活性的差异(图12A)。在第二restim CAR-T细胞后，G28z CAR-T细胞在第二次刺激后失去扩增能力，因此分析了3个CAR-T细胞的裂解活性。与GBBz CAR-T细胞相比，PBBz和P28z CAR-T细胞在重复抗原和PD-L1暴露时具有令人惊讶的高裂解活性。与P28z CAR-T细胞相比，PBBz CAR-T细胞显示出人意料地更高的保持裂解功能的能力(图12A)。在细胞增殖试验中也观察到这种趋势(图12B)。总的来说，与CD28共刺激结构域相比，将4-1BB共刺激结构域应用于PD-1KD CART在体外有助于保持细胞毒性和增殖能力。在重复CD19和PD-L1暴露后，PBBz CAR-T细胞显示延迟的衰竭。
检查了免疫抑制机制对BBz CAR-T细胞的可能影响。CD28 CAR-T细胞对TGF-β的敏感性高于BBz CART对TGF-β的敏感性(图11)，因此将GBBz CAR-T细胞与G28z CAR-T细胞在它们的抗原特异性增殖会被TGF-β抑制多少方面进行比较。虽然在TGF-β不存在的情况下的CAR刺激过程，在两种CAR-T细胞之间没有观察到增殖的显著差异，但G28z CAR-T细胞而非GBBz CAR-T细胞的增殖显著减少(图13A)。
据报道，TGF-β不仅抑制增殖，而且还深入参与调节性T细胞的诱导(JEM，2003，WanJun Chen；Science，2003，Shohei Hori；Blood，2007，Dat Q.Tran)。为了检查在外源性TGF-β不存在的情况下G28z与BBz CAR-T细胞之间的Treg诱导是否不同，在3天期间将G28z和BBz CAR-T细胞与NALM-6靶细胞一起培养。G28z CAR-T细胞的体外CD4+CD25+FOXP3+Treg％是GBBz CAR-T细胞的2至3倍(图13B)。这一结果与Treg相关基因诸如CD25和FOXP3的表达的增加一致(图9B)。接下来，观察并比较TGF-β处理后Treg％的变化。结果显示，TGF-β显著提高了28z CAR-T细胞的Treg％，但不影响BBz CAR-T细胞的Treg％(图13B)。结论是CD28共刺激比4-1BB共刺激具有更大的诱导Treg的潜力，并且如果TGF-β存在，其潜力进一步爆发。还研究了细胞固有的PD-1破坏是否影响Treg的诱导。P28z和PBBz CAR-T细胞的Treg％分别比G28z和GBBz细胞低2-3倍。尤其是，PBBz具有最低的Treg％(图13C)。最后，检查在激活PD-1/PD-L1信号传导的条件下的Treg％。检查了NALM-6或NALM-6-PDL1共培养后的Treg％变化。发现PD-1/PDL1信号传导并不显著影响CAR-T来源的Treg的诱导(图13C)，表明细胞内PD-1表达水平与Treg的形成相关。结论是PBBz CAR-T细胞可能令人惊讶地对免疫抑制机制不敏感。
在该实施例中，产生了PBBz CAR-T细胞，并在重复CD19和PD-L1暴露时显示出延迟的衰竭。PBBz CAR-T细胞也出人意料地避免了免疫抑制机制。因此，进一步评价了这些细胞的体内抗肿瘤效果。
实施例6：用PBBz CAR-T细胞在体内治疗CD19+血癌的方法本实施例描述了使用PBBz CAR-T细胞在体内治疗CD19+血癌的方法。
如实施例3所述建立CD19+血液肿瘤模型。比较G28z、GBBz、P28z和PBBz CAR-T细胞针对CD19+B-ALL细胞的体内抗肿瘤效果。在靶细胞输注后第4天，以2.5×106的单剂量施用CAR-T细胞。用异源Xenogen IVIS光谱获得荷NALM6-GL-PDL1小鼠的体内成像，并将其定量为目标区域的辐射强度(光子/秒)。如图14所示，PD-1KD CART细胞(PBBz或P28z)显示出优于WT CAR-T细胞(GBBz或G28z)的抗肿瘤效果。特别是，PBBz CAR-T细胞比其它三种CAR-T细胞抑制白血病进展的时间更长。WT CAR-T细胞具有很强的抗肿瘤响应，但没有持续的抗肿瘤响应。另一方面，PD-1KD CAR-T对初始阶段表现出微弱的反应，但是持续的抗肿瘤响应，表明在CAR-T细胞中PD-1的破坏可能潜在地降低CRS的风险。PBBz CAR-T细胞出乎意料地赋予了优于P28z的体内抗肿瘤效果。
实施例7：具有以→←或←→方向进入的两种类型的shRNA盒的双重二合一载体的产生方法
本实施例描述了产生双重二合一载体的方法，其中2种类型的shRNA盒以←→方向(shTIM-3-mU6←→hU6-shPD-1)或→←方向(mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6)进入并同时表达shPD-1、shTIM-3和CD19-CAR。
构建其中针对PD-1的shRNA(下文中称为shPD-1)、针对TIM-3的shRNA(下文中称为shTIM-3)和CD19-CAR的表达分别由人U6启动子(下文中称为hU6)、小鼠U6启动子(下文中称为mU6)和EF1-α启动子调控的慢病毒。制备其中两种类型的shRNA同时表达的质粒，使得相应的shRNA盒以→←方向(mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6)和←→方向(shTIM-3-mU6←→hU6-shPD-1)放置(图15)。为此，(1)插入多克隆位点(MCS)，(2)将shPD-1的小鼠U6启动子转换为人U6启动子，(3)插入shTIM-3和(4)克隆诸如shTIM-3和shPD-1的切换位置。
将MCS插入到mU6-shPD-1(pLV-ΔLNGFR_P2A_CD19-CAR_mU6-shPD-1(质粒ID#2)的3’部分)，并将包含SEQ ID NO.228和229的引物用于制备PCR产物(416bp)，其中将mU6-shPD-13’的Hpa1限制性内切酶识别位点修饰成BsgZ171-Xba1-Nde-1-Bmt1-Spe1多克隆位点。之后，用BstZ17y和Hpa1限制性酶处理PCR产物，用Hpa1限制性酶和CIP处理质粒ID#2，之后用平端连接制备包含shPD-1-mU6-MCS碱基序列(shRNA盒SEQ ID NO.223)的pLV-ΔLNGFR-P2A-CD19-CAR-mU6-shPD-1_MCS(质粒ID#4)。
之后，构建质粒，使得shPD-1由人U6启动子而不是小鼠U6启动子表达。将LentiCRISPR V2质粒与包含SEQ ID NO.230和231的引物一起使用，以获得包含人U6启动子的PCR产物。用Hpa1和Spe1限制性酶处理PCR产物，然后连接到用Hpa1和Spe1限制性酶处理的质粒ID#4，以制备包含hU6-shPD-1碱基序列(SEQ ID NO.224)的pLV-ΔLNGFR_P2A_CD19-CAR_hU6-shPD-1_MSC(质粒ID#5)。目的是将mU6-shTIM-3盒插入质粒ID#5，以构建同时表达shTIM-3和shPd-1的质粒。
使用质粒ID#3和包含SEQ ID NO.232和233的引物获得包括mU6-shTIM-3盒的PCR产物。用Bmt1和Spe1限制性酶处理PCR产物后，将其连接到用Bmt1和Spe1限制性酶处理的质粒ID#5上，以制备包含→←方向(mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6)碱基序列(SEQ ID NO.220)的pLV-ΔLNGFR_P2A_CD19-CAR mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6(质粒ID#6)。
为了构建其中两种类型的shRNa盒以←→方向(shTIM-3-mU6←→hU6-shPD-1)排列的质粒，使用质粒ID#6和包含SEQ ID NO.234和235的引物来获得PCR产物。用Spe1和Hpa1限制性酶处理后，将其插入用相同限制性酶处理的质粒ID#4中，以产生pLV-ΔLNGFR-P2A-CD19-CAR-shPD-1-hU6-MCS(质粒ID#7)。之后，使用质粒ID#6和包含SEQ ID NO.236和237的引物获得PCR产物。在用Bmt1和Spe1限制性酶处理后，将其连接到用相同限制性酶处理的质粒ID#7上，以最终制备包含←→方向(shTIM-3-mU6←→hU6-shPD-1)碱基序列(SEQ IDNO.221)的pLV-ΔLNGFR-P2A-CD19-CAR_shTIM-3-mU6←→hU6-shPD-1(质粒ID#8)。
在下面的实施例中，本文中产生的其中2种类型的shRNA盒以←→或→←方向进入的二合一慢病毒载体可用于产生PD-1KD修饰的CAR-T细胞。
实施例8：PD-1 KD CAR-T细胞的产生和体外评价方法
本实施例描述了产生和体外评估其中shPD-1、shTIM-3和CD19-CAR同时表达的双重KD CAR-T细胞的方法。
使用lipofectamine将表1中的质粒ID#1(pLV-ΔLNGFR_P2A_CD19-CAR_mU6-shGFP)、#6(pLV-ΔLNGFR_P2A_CD19-CAR_mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6)和#8(pLV-ΔLNGFR_P2A_CD19-CAR_shTIM-3-mU6←→hU6-shPD-1)和包装质粒pMDL g/p、pRSVrev和pMDG.1转染到HEK293 T细胞中，并且在经过48小时后，获得包含慢病毒的细胞培养物。使用菲科尔-帕克溶液(ficoll-paque solution)，从人血液中分离外周血单核细胞(PBMC)，并且使用人CD3和CD28靶抗体来特异性激活T细胞。在最初激活T细胞后的1至2天后，用先前获得的病毒转导它们。随后使用包含5％人血浆和人IL-2的AIM-V培养液培养制备的CAR-T细胞。转导后第6天，使用MACSelect LNGFR系统(miltenyibiotec，Germany)获得纯的CAR-T细胞，并使用LNGFR靶抗体利用流式细胞仪分离LNGFR+CAR-T细胞。在下文中，使用质粒ID#1、#6和#8制备的细胞分别表示为ΔLNGFRCART19/shGFP(或shGFP/CART19)、ΔLNGFR-CART19/mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6(或shPD-1_shTIM-3/CART19)和ΔLNGFR-CART19/shTIM-3-mU6←→hU6-shPD-1(图16)。
为了制备分别包含mU6-shPD-1、mU6-TIM-3和shPD-1-hU6盒的对照CAR-T细胞，使用lipofectamine将表1中的质粒ID#2(pLV-ΔLNGFR_P2A_CD19-CAR_mU6-shPD-1)、#3(pLV-ΔLNGFR_P2A_CD19-CAR_mU6-shTIM-3)和#7(pLV-ΔLNGFR_P2A_CD19-CAR_shPD-1-hU6_MCS)以及包装质粒pMDL g/p、pRSVrev和pMDG.1转染到HEK293T细胞中。经过48小时后，获得包含慢病毒的细胞培养液。使用菲科尔-帕克溶液(ficoll-paque solution)，从人血液中分离外周血单核细胞(PBMC)，并且使用人CD3和CD28靶抗体来特异性激活T细胞。在最初激活T细胞后的1至2天后，用先前获得的病毒转导它们。随后使用包含5％人血浆和人IL-2的AIM-V培养液培养制备的CAR-T细胞。转导后第6天，使用MACSelect LNGFR系统(miltenyibiotec，Germany)获得纯的CAR-T细胞，并使用LNGFR靶抗体利用流式细胞仪分离LNGFR+CAR-T细胞。在下文中，使用质粒ID#2、#3和#7制备的细胞分别表示为ΔLNGFR-CART19/shPD-1(或shPD-1/CART19)、ΔLNGFR-CART19/shTIM-3(或shTIM-3/CART19)和ΔLNGFRCART19/shPD-1-hU6。
为了测量本文产生的双重KD CAR-T细胞的纯度，使用上述制备的细胞的LNGFR靶抗体进行流式细胞术。如图17所示，获得了约80％的LNGFR+CAR-T细胞。
测量到本文产生的双重KD CAR-T细胞中的PD-1和TIM-3表达降低，并其表达持续降低。用人CD3和CD28靶抗体刺激双重KD CAR-T细胞3天，以诱导PD-1和TIM-3的表达。之后，通过流式细胞术，使用CAR、PD-1和TIM-3靶抗体分析双重KD CAR-T细胞的PD-1和TIM-3表达。如图18A和图18B所示，对两种同时表达的shRNA类型对PD-1和TIM-3表达减少的影响的分析表明，在同时表达shPD-1和shTIM-3的CD19-CAR T细胞中观察到的PD-1和TIM-3表达的减少程度与其中仅表达shPD-1或shTIM-3的CD19-CAR T细胞中的减少程度相似。
测量本文产生的双重KD CAR-T细胞对分化的影响。为了观察双重KD CAR-T细胞的PD-1和TIM-3分化程度，使用CD45RA和CCR7靶抗体进行流式细胞术。如图19所示，在经受重复抗原刺激的ΔLNGFR-CART19/shPD-1细胞中，与ΔLNGFR-CART19/shGFP相比，最终分化的TEMRA(CCR7-CD45RA+)T细胞增加。另一方面，添加了shTIM-3的ΔLNGFR-CART 19/mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6比ΔLNGFR-CART19/shPD-1包含更多的TN(CCR7+CD45RA+)T细胞、TCM(CCR7+CD45RA-)T细胞和TEM(CCR7-CD45RA-)T细胞亚型。由于对ΔLNGFR-CART19/shTIM-3细胞也观察到类似的结果，可以说ΔLNGFR-CART19/mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6细胞的分化能力降低是由TIM-3表达的抑制导致的，因此，可以说就对细胞分化的影响而言，ShTiM-3的作用优先于ShPD-1的作用。已知的是，分化程度较低的T细胞亚型可促进T细胞癌症治疗能力的提高，预计ΔLNGFR-CART19/mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6细胞将比ΔLNGFR-CART19/shPD-1细胞显示更好的体内抗癌效率。
比较了已引入包含具有不同取向的shRNA盒的CD19-CAR载体的双重KD CAR-T细胞的转导效率、增殖能力和生存力。在本文产生的CAR-T细胞中，使用LNTER抗体对使用包含→←方向(mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6)和←→方向(shTIM-3-mU6←→hU6-shPD-1)盒的质粒的细胞进行流式细胞术。对于细胞生存力的分析，进行台盼蓝染色，并发现未染色的细胞比率。如图20A-20C所示，与使用→←方向盒(ΔLNGFR-CART19/mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6)的细胞相比，使用←→方向盒(ΔLNGFR-CART19/shTIM-3-mU6←→hU6-shPD-1)的细胞在形成转导细胞时具有意想不到的困难，并且转导的T细胞具有低增殖能力和生存力。
本实施例描述了产生其中shPD-1、shTIM-3和CD19-CAR同时表达的双重KD CAR-T细胞的方法。使用本文产生的二合一慢病毒载体产生双重KD CAR-T细胞，所述载体具有以→←或←→方向进入的2种类型的shRNA盒。当与使用←→方向盒的细胞相比时，使用→←方向盒(ΔLNGFR-CART19/mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6)的细胞显示出令人惊讶的更高的增殖能力和生存力，因此用于以下实施例中。
实施例9：产生双重二合一载体和双重KD CAR-T细胞的方法
本实施例描述了产生双重二合一载体和双重KD CAR-T细胞的方法。
为了通过不同的启动子(mU6和hU6)产生表达两种shRNA的双重二合一载体，将BstZ171-Xba1-Nde1-Bmt1-Spe1多克隆位点(MCS)在hU6启动子下游插入pLV-hU6-shPD-1_ΔLNGFR-CD19-BBz载体。将第二mU6-shRNA盒片段亚克隆到MCS中。为了将对多个免疫检查点的阻断仅限制于CAR-T，双重二合一载体被设计成通过mU6和hU6 Pol III启动子表达两个shRNA，以抑制CAR-T细胞的两个免疫检查点的表达。为了发现有效的CTLA-4、LAG-3、TIGIT或TIM-3靶向siRNA，将siRNA电穿孔至CD3/CD28刺激的T细胞中。选择了两种或更多种有效的siRNA(图21A)。通过将21聚体siRNA转化成shRNA形式而构建CTLA-4、LAG-3、TIGIT或TIM-3 KD CAR-T细胞的二合一载体，并最终选择每种靶向免疫检查点的shRNA(shCTLA-4：#1；shLAG-3：#1278；shTIGIT：#739；shTIM-3：#3)，所述shRNA显著抑制表达并且对CAR-T扩增影响较小(图21B-C)。最后，通过双重二合一载体构建了PD-1_CTLA-4、PD-1_LAG-3、PD-1_TIGIT或PD-1_TIM-3CAR-T细胞(图22A-22E)。与单个PD-1 KD CAR-T细胞相比，所有双重KDCAR-T细胞的扩增较少(图22C)。这些结果也在单个KD CAR-T细胞中观察到(图21B)。
在这个实施例中，产生了双重二合一载体。使用双重二合一载体产生双重KD CAR-T细胞，并且在荷有CD19+PDL1+血液肿瘤的体内小鼠模型中和在下面实施例中的实体肿瘤模型中进一步评估它们的治疗潜力。
实施例10：使用靶向PD-1和TIGIT的双重KD CAR-T细胞体内治疗CD19+血癌的方法
本实施例描述了使用靶向两个免疫检查点的双重KD CAR-T细胞体内治疗CD19+血癌的方法，所述两个免疫检查点包括以下组合：PD-1和CTLA-4、PD-1和LAG-3、PD-1和TIGIT以及PD-1和TIM-3。
如实施例3所述建立CD19+血液肿瘤模型。评价了PD-1_CTLA-4、PD-1_LAG-3、PD-1_TIGIT或PD-1_TIM-3KD CAR-T细胞针对血液CD19+B-ALL模型的抗肿瘤作用。在靶细胞输注后第5天，以1×106的单剂量注射每种CAR-T细胞。已经发现，与其它双重KD CAR-T细胞相比，PD-1_TIGITKD CAR-T细胞显示出令人惊讶的更优的抗肿瘤效果(图23)。因此，在下面的实施例中，进一步评估了实体肿瘤模型中的PD-1_TIGITKD CAR-T细胞。
实施例11：在实体肿瘤模型中使用靶向PD-1和TIGIT的双重KD CAR-T细胞的治疗方法
本实施例描述了在实体肿瘤模型中使用靶向PD-1和TIGIT的双重KD CAR-T细胞治疗癌症的方法。
为建立实体瘤模型，在4至6周龄的NSG小鼠皮下注射5×106个IM-9细胞(CD19+PD-L1+CD155+)。一旦肿瘤体积达到150～250mm3，就以×106的单次剂量静脉内注射CAR-T细胞。每周一次通过测径器测量来监测肿瘤，并且通过(长度×宽度2)/2来估计体积。如在血液肿瘤模型(Nalm-6-PDL1)中所示，PD-1_TIGITKD CAR-T细胞也对实体肿瘤模型(IM-9)最令人惊讶地有效(图24)。细胞固有的PD-1_TIGIT阻断比PD-1阻断具有意想不到的更高水平的抗肿瘤作用。
序列表
<110> 酷罗赛尔公司(CUROCELL CO. LTD.)
韩国科学技术院(KOREA ADVANCED INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY)
<120> 使用双重SHRNA的增强的免疫细胞及包含免疫细胞的组合物
<130> 14570-001-228
<140> 待分配的
<141> 随同的
<150> KR 10-2018-0004238
<151> 2018-01-12
<160> 289
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向GFP以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 1
tctcggcatg gacgagctgt a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向PD-1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 2
tggaacccat tcctgaaatt a 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向PD-1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 3
ggaacccatt cctgaaatta t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向PD-1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 4
gaacccattc ctgaaattat t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向PD-1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 5
acccattcct gaaattattt a 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 6
cccattcctg aaattattta a 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向PD-1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 7
ccttccctgt ggttctatta t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向PD-1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 8
cttccctgtg gttctattat a 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向PD-1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 9
ttccctgtgg ttctattata t 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向PD-1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 10
tccctgtggt tctattatat t 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向PD-1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 11
ccctgtggtt ctattatatt a 21
<210> 12
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<212> DNA
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cctgtggttc tattatatta t 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
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<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向TIM-3以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 13
gatgaaaggg atgtgaatta t 21
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<211> 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向TIM-3以进行RNA干扰的shRNA中
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gggagcctcc ctgatataaa t 21
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向TIM-3以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 15
ggaattcgct cagaagaaa 19
<210> 16
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<212> DNA
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<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向TIM-3以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 16
ggaccaaact gaagctatat t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向TIM-3以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 17
agaactttgg tttcctttaa t 21
<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向TIM-3以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 18
atgaaaggga tgtgaattat t 21
<210> 19
<211> 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向TIM-3以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 19
tcttatcttc ggcgctttaa t 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向TIM-3以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 20
cttatcttcg gcgctttaat t 21
<210> 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向TIM-3以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 21
ttatcttcgg cgctttaatt t 21
<210> 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向TIM-3以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 22
gaggagccca atgagtatta t 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向TIM-3以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 23
aggagcccaa tgagtattat t 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向TIM-3以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 24
atagatccaa ccaccttatt t 21
<210> 25
<211> 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向TIM-3以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 25
atgtcattgc ctctgtattt a 21
<210> 26
<211> 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向TIM-3以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 26
tgtcattgcc tctgtattta a 21
<210> 27
<211> 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<400> 27
accaccatgc ccagctaatt t 21
<210> 28
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<400> 28
tgttgagatt taggcttatt t 21
<210> 29
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向TIM-3以进行RNA干扰的shRNA中
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gaccaaactg aagctatatt t 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向TIM-3以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 30
aggccttcag caatctatat t 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向TIM-3以进行RNA干扰的shRNA中
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<400> 32
gagtggtccc taaacttaaa t 21
<210> 33
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向TIM-3以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 33
agtggtccct aaacttaaat t 21
<210> 34
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向TIM-3以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 34
gtggtcccta aacttaaatt t 21
<210> 35
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向TIM-3以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 35
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向LAG-3以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 36
tcagcagccc agtccaaata a 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向LAG-3以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 37
cagcagccca gtccaaataa a 21
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向LAG-3以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 38
tcaacgtctc catcatgtat a 21
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向LAG-3以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 39
caacgtctcc atcatgtata a 21
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向LAG-3以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 40
ctggagacaa tggcgacttt a 21
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向LAG-3以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 41
ctcagcagcc cagtccaaat a 21
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向LAG-3以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 42
agcagcccag tccaaataaa c 21
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CTLA-4以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 43
gggatcaaag ctatctatat a 21
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CTLA-4以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 44
ggatcaaagc tatctatata a 21
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CTLA-4以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 45
ggcaacggaa cccagattta t 21
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CTLA-4以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 46
tgaagaagag agtccatatt t 21
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CTLA-4以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 47
ttggatgcgg aacccaaatt a 21
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CTLA-4以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 48
agcatcactt gggattaata t 21
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CTLA-4以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 49
tgatgtgggt caaggaatta a 21
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CTLA-4以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 50
agcgagggag aagactatat t 21
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CTLA-4以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 51
tttacgtatg agacgtttat a 21
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向BTLA以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 52
gctcctgtat agtttacttc c 21
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向BTLA以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 53
ggaaattaac ctggttgatg c 21
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向BTLA以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 54
gcaccaacag aatatgcatc c 21
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向BTLA以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 55
gctcaacagg atgtcaaata a 21
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向BTLA以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 56
gcatcttgct gttcttctta c 21
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向BTLA以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 57
gcatttgtgg acaacttatg t 21
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CD160以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 58
ggaacgcgac taaacttaat c 21
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CD160以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 59
gatgttcacc ataagccaag t 21
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CD160以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 60
gcaagatgag tctgactatg g 21
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CD160以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 61
ggcacagaga agaatgcaac a 21
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CD160以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 62
gggaagagat gctaaatata c 21
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CD160以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 63
gcaaatcagt gtaatccttg a 21
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向VISTA以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 64
gcaacttctc catcaccatg c 21
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向VISTA以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 65
gcaaagatgc accatccaac t 21
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向VISTA以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 66
gcggatggac agcaacattc a 21
<210> 67
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向VISTA以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 67
ggacacttct gagtatgaag c 21
<210> 68
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向VISTA以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 68
gggaaccaca atgcacgaaa g 21
<210> 69
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向VISTA以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 69
ggtgctttcc aacacacttt c 21
<210> 70
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向TIGIT以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 70
gcttctggcc atttgtaatg c 21
<210> 71
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向TIGIT以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 71
gggagtactt ctgcatctat c 21
<210> 72
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向TIGIT以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 72
gctgcatgac tacttcaatg t 21
<210> 73
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向TIGIT以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 73
taacgtggat cttgatcata a 21
<210> 74
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向TIGIT以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 74
ggagacatac acaggccttc a 21
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向TIGIT以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 75
gcatttgggc cttgatctac c 21
<210> 76
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向2B4以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 76
gacaggttgc aaggcagttc t 21
<210> 77
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向2B4以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 77
gggagtgcct cttcagttac a 21
<210> 78
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向2B4以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 78
ggacgaggag gttgacatta a 21
<210> 79
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向2B4以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 79
gaggagaaag aggaaggaga a 21
<210> 80
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向2B4以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 80
gcccttcctt caatagcact a 21
<210> 81
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向2B4以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 81
ggttgactgc atttctagac t 21
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向PD-L1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 82
gcatttgctg aacgcattta c 21
<210> 83
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向PD-L1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 83
gctgcactaa ttgtctattg g 21
<210> 84
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向PD-L1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 84
ggatccagtc acctctgaac a 21
<210> 85
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向PD-L1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 85
gcacatcctc caaatgaaag g 21
<210> 86
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向PD-L1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 86
ggattctcaa cctgtggttt a 21
<210> 87
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向PD-L1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 87
ggtgcttggt ctcctctata a 21
<210> 88
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CEACAM-1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 88
gcacagtact cctggcttat c 21
<210> 89
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CEACAM-1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 89
gcaacaggac cacagtcaag a 21
<210> 90
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CEACAM-1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 90
gcaacaccac cctcagcata a 21
<210> 91
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CEACAM-1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 91
gcctgttcag agcactcatt c 21
<210> 92
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CEACAM-1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 92
gcagtaatgc cttctcctat t 21
<210> 93
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CEACAM-1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 93
gcaccttggt gcttagctag a 21
<210> 94
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CEACAM-3以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 94
gcttccatct atgaggaatt g 21
<210> 95
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CEACAM-3以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 95
gccagagaac cagctataag t 21
<210> 96
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CEACAM-3以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 96
gggtccctga tgaatatctg g 21
<210> 97
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CEACAM-3以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 97
ggcttgcagg gaaagtgaat g 21
<210> 98
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CEACAM-3以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 98
gcttgcaggg aaagtgaatg g 21
<210> 99
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CEACAM-3以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 99
agcttccatc tatgaggaat t 21
<210> 100
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CEACAM-5以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 100
ggaatccaga acgaattaag t 21
<210> 101
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CEACAM-5以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 101
ggctgattga tgggaacatc c 21
<210> 102
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CEACAM-5以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 102
ggactacagt caagacaatc a 21
<210> 103
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CEACAM-5以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 103
ggaccctcac tctattcaat g 21
<210> 104
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CEACAM-5以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 104
gctactggcc gcaataattc c 21
<210> 105
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CEACAM-5以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 105
gctctttgta tgacagaata c 21
<210> 106
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CD96以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 106
ggtccaaggt caccaataag a 21
<210> 107
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CD96以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 107
gcaaccatac gatagaaata g 21
<210> 108
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CD96以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 108
ggttctgaaa tttcctcaac a 21
<210> 109
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CD96以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 109
gcaagatatc cagctacatc t 21
<210> 110
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CD96以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 110
gcaactcacc ctcttccatc t 21
<210> 111
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CD96以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 111
gctgcattcc ctaagataat t 21
<210> 112
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向LAIR1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 112
gggacagtag atccacatac a 21
<210> 113
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向LAIR1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 113
ggacaacagt cacaatgagc a 21
<210> 114
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向LAIR1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 114
ggctgttgat gttctagaga g 21
<210> 115
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向LAIR1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 115
gcagacaagg ccacagtcaa t 21
<210> 116
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向LAIR1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 116
ggaggtttct aaccagcatc c 21
<210> 117
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向LAIR1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 117
gccttgagac tgtgctatac a 21
<210> 118
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向KLRG1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 118
ccaagcccag aatgactatg g 21
<210> 119
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向KLRG1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 119
gccttcttgt tcttgccttg t 21
<210> 120
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向KLRG1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 120
gcttctgact gcagttcttc t 21
<210> 121
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向KLRG1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 121
gctggatgaa atatggtaac c 21
<210> 122
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向KLRG1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 122
ggaaatgagc ctgctccaag t 21
<210> 123
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向KLRG1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 123
ggattggtct gaggaacaat t 21
<210> 124
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向FAS以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 124
gccaagaagg gaaggagtac a 21
<210> 125
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向FAS以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 125
gccaattcca ctaattgttt g 21
<210> 126
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向FAS以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 126
ggttctcatg aatctccaac t 21
<210> 127
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向FAS以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 127
gctggagtca tgacactaag t 21
<210> 128
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向FAS以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 128
gcctggtttg gagatactaa c 21
<210> 129
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向FAS以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 129
ggaaccacct aaagaacttc c 21
<210> 130
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向Cbl-b以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 130
ccgcgttgat ttaaagaaag a 21
<210> 131
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向Cbl-b以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 131
gcctgataca tatcagcatt t 21
<210> 132
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向Cbl-b以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 132
gcggaattgg aatttcttag c 21
<210> 133
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向Cbl-b以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 133
gcacgactac agaaatatag c 21
<210> 134
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向Cbl-b以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 134
tttccggtta agttgcactc g 21
<210> 135
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向Cbl-b以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 135
gcctggatct aattcagaaa g 21
<210> 136
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向LRR1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 136
gaaagccact gttcggttaa a 21
<210> 137
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向LRR1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 137
tcctgtggat atctgtctaa g 21
<210> 138
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向LRR1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 138
ggctcataga ggctgtaatg t 21
<210> 139
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向LRR1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 139
gggcttgtcc gagttgatat g 21
<210> 140
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向LRR1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 140
aagatttgga taccgcaaaa a 21
<210> 141
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向LRR1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 141
gtggtactga agcacctatt a 21
<210> 142
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向TGFBR1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 142
gcttgttcag agaacaattg c 21
<210> 143
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向TGFBR1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 143
ggagattgtt ggtacccaag g 21
<210> 144
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向TGFBR1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 144
gcagctaggc ttacagcatt g 21
<210> 145
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向TGFBR1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 145
ggtcctttct gtgcactatg a 21
<210> 146
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向TGFBR1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 146
ggtggtagct aaagaacatt c 21
<210> 147
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向TGFBR1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 147
ggacctgtct acaggtgatc t 21
<210> 148
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向DNMT3A以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 148
gccaaggtca ttgcaggaat g 21
<210> 149
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向DNMT3A以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 149
gcagaacaag cccatgattg a 21
<210> 150
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向DNMT3A以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 150
cccaaggtca aggagattat t 21
<210> 151
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向DNMT3A以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 151
gcagaagtgc cggaacattg a 21
<210> 152
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向DNMT3A以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 152
gcgtcacaca gaagcatatc c 21
<210> 153
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向DNMT3A以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 153
ccggctcttc tttgagttct a 21
<210> 154
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向A2aR以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 154
cagaacgtca ccaactactt t 21
<210> 155
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向A2aR以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 155
ccatgctagg ttggaacaac t 21
<210> 156
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向A2aR以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 156
ccaagtggcc tgtctctttg a 21
<210> 157
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向A2aR以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 157
ggtgtctatt tgcggatctt c 21
<210> 158
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向A2aR以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 158
agaccttccg caagatcatt c 21
<210> 159
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向A2aR以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 159
tccttagcca tgagctcaag g 21
<210> 160
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向Cbl-c以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 160
gaaagtactg tggacacatg t 21
<210> 161
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向Cbl-c以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 161
gcacgtgtcc atcttcgagt t 21
<210> 162
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向Cbl-c以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 162
ggccaacact cctcaagaac t 21
<210> 163
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向Cbl-c以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 163
ggcttctacc tctacccaga t 21
<210> 164
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向Cbl-c以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 164
ggccatggac tccacatttg a 21
<210> 165
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向Cbl-c以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 165
ggccgtgagt atctaccagt t 21
<210> 166
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向DGKα以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 166
gccagaagac aagttagaat t 21
<210> 167
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向DGKα以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 167
gctctggaag ttccagtata t 21
<210> 168
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向DGKα以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 168
ggaaatgatc tggctcgatg c 21
<210> 169
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向DGKα以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 169
gcaaagatcc tcaaggattt a 21
<210> 170
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向DGKα以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 170
ggatgcctct attgctcatc g 21
<210> 171
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向DGKα以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 171
gctatggtac ttcgaatttg c 21
<210> 172
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向DGKζ以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 172
ggaagggatt ccagcagaag t 21
<210> 173
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向DGKζ以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 173
gcaaggagat tgtggccatc a 21
<210> 174
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向DGKζ以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 174
gggcatcctt caagaggaag t 21
<210> 175
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向DGKζ以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 175
gcaaagatca tccagtcttt c 21
<210> 176
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向DGKζ以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 176
gctggagatg taccgcaaag t 21
<210> 177
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向DGKζ以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 177
gcacaggatg agatttatat c 21
<210> 178
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向MerTK以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 178
ggaagaccac atacaggaaa c 21
<210> 179
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向MerTK以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 179
gcattggtgt ttcctgcatg a 21
<210> 180
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向MerTK以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 180
gcacacggtt gggtagatta t 21
<210> 181
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向MerTK以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 181
gggtctgtaa tggaaggaaa t 21
<210> 182
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向MerTK以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 182
gcatgttgcg agatgacatg a 21
<210> 183
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向MerTK以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 183
gcagaccgag tctacacaag t 21
<210> 184
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向SHP1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 184
gcaccatcat ccacctcaag t 21
<210> 185
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向SHP1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 185
ggtcacccac atcaaggtca t 21
<210> 186
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向SHP1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 186
gggcaagaac cgctacaaga a 21
<210> 187
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向SHP1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 187
ggaacaaatg cgtcccatac t 21
<210> 188
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向SHP1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 188
gcctggactg tgacattgac a 21
<210> 189
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向SHP1以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 189
gaacctgcac actaagaaca a 21
<210> 190
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向SHP2以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 190
gcagatccta cctctgaaag g 21
<210> 191
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向SHP2以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 191
gcaatgacgg caagtctaaa g 21
<210> 192
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向SHP2以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 192
ggaactgaaa tacgacgttg g 21
<210> 193
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向SHP2以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 193
gcgtgttagg aacgtcaaag a 21
<210> 194
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向SHP2以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 194
gctcatgact atacgctaag a 21
<210> 195
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向SHP2以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 195
ggagagaacg gtctggcaat a 21
<210> 196
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向PP2A以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 196
gcagctgaac gagaaccaag t 21
<210> 197
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向PP2A以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 197
ggagactgtg actcttcttg t 21
<210> 198
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向PP2A以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 198
ggaatgccaa cgtttggaaa t 21
<210> 199
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向PP2A以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 199
ggatcgttta caggaagttc c 21
<210> 200
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向PP2A以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 200
gcctttgtat gtggaagtat a 21
<210> 201
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向PP2A以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 201
gcctgctgta tttatagtaa c 21
<210> 202
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CD45以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 202
gctgcacatc aaggagtaat t 21
<210> 203
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CD45以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 203
gctggaaata ctctggttag a 21
<210> 204
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CD45以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 204
ggagcttgtt gaaagggatg a 21
<210> 205
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CD45以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 205
gcagaatact ggccgtcaat g 21
<210> 206
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CD45以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 206
ggttatgttg tcaagctaag g 21
<210> 207
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CD45以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 207
gcagaaccca aggaattaat c 21
<210> 208
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CD148以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 208
ggtgtaacat cacaggctta c 21
<210> 209
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CD148以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 209
gccatagagt tcaggacaaa t 21
<210> 210
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CD148以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 210
gcaattctcg ggtagaaata a 21
<210> 211
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CD148以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 211
gctggcttca ccaacattac c 21
<210> 212
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CD148以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 212
gggagcaaat catctgcatt c 21
<210> 213
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向CD148以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 213
gcgactcaaa tatcaccttg a 21
<210> 214
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向IL-10Rα以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 214
gctcctgagg tatggaatag a 21
<210> 215
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向IL-10Rα以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 215
gcaaatgaca catatgaaag c 21
<210> 216
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向IL-10Rα以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 216
ggtctaaaga ggagtgcatc t 21
<210> 217
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向IL-10Rα以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 217
gggctatttg aaacaggatc c 21
<210> 218
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向IL-10Rα以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 218
gctgtaggaa tggaagcttc a 21
<210> 219
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 部分shRNA序列，其包含在靶向IL-10Rα以进行RNA干扰的shRNA中
<400> 219
gcttgtgttt gctgctaatg t 21
<210> 220
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> mU6-shTIM-3-><-shPD-1-hU6
<400> 220
gttaacaagg tcgggcagga agagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata 60
cgatacaagg ctgttagaga gataattaga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta 120
gtacaaaata cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta 180
tgttttaaaa tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct 240
ttatatatct tgtggaaagg acgaaacacc gcctgtggtt ctattatatt atttcaagag 300
aataatataa tagaaccaca ggtttttgac tagtcaaaaa ggaattcgct cagaagaaat 360
ctcttgaatt tcttctgagc gaattccaaa caaggctttt ctccaaggga tatttatagt 420
ctcaaaacac acaattactt tacagttagg gtgagtttcc ttttgtgctg ttttttaaaa 480
taataattta gtatttgtat ctcttataga aatccaagcc tatcatgtaa aatgtagcta 540
gtattaaaaa gaacagatta tctgtctttt atcgcacatt aagcctctat agttactagg 600
aaatattata tgcaaattaa ccggggcagg ggagtagccg agcttctccc acaagtctgt 660
gcgagggggc cggcgcgggc ctagagatgg cggcgtcgga tcgctagcca tatgtctaga 720
gtatac 726
<210> 221
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> shTIM-3-mU6<-->hU6-shPD-1
<400> 221
gttaaccaaa aacctgtggt tctattatat tattctcttg aaataatata atagaaccac 60
aggcggtgtt tcgtcctttc cacaagatat ataaagccaa gaaatcgaaa tactttcaag 120
ttacggtaag catatgatag tccattttaa aacataattt taaaactgca aactacccaa 180
gaaattatta ctttctacgt cacgtatttt gtactaatat ctttgtgttt acagtcaaat 240
taattctaat tatctctcta acagccttgt atcgtatatg caaatatgaa ggaatcatgg 300
gaaataggcc ctcttcctgc ccgaccttac tagtgatccg acgccgccat ctctaggccc 360
gcgccggccc cctcgcacag acttgtggga gaagctcggc tactcccctg ccccggttaa 420
tttgcatata atatttccta gtaactatag aggcttaatg tgcgataaaa gacagataat 480
ctgttctttt taatactagc tacattttac atgataggct tggatttcta taagagatac 540
aaatactaaa ttattatttt aaaaaacagc acaaaaggaa actcacccta actgtaaagt 600
aattgtgtgt tttgagacta taaatatccc ttggagaaaa gccttgtttg gaattcgctc 660
agaagaaatt caagagattt cttctgagcg aattcctttt tggctagcca tatgtctaga 720
gtatac 726
<210> 222
<211> 385
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> shRNA盒碱基序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (323)..(343)
<223> n is a, c, g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (353)..(373)
<223> n is a, c, g或t
<400> 222
gttaacgatc cgacgccgcc atctctaggc ccgcgccggc cccctcgcac agacttgtgg 60
gagaagctcg gctactcccc tgccccggtt aatttgcata taatatttcc tagtaactat 120
agaggcttaa tgtgcgataa aagacagata atctgttctt tttaatacta gctacatttt 180
acatgatagg cttggatttc tataagagat acaaatacta aattattatt ttaaaaaaca 240
gcacaaaagg aaactcaccc taactgtaaa gtaattgtgt gttttgagac tataaatatc 300
ccttggagaa aagccttgtt tgnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnttcaaga gannnnnnnn 360
nnnnnnnnnn nnntttttgg ttaac 385
<210> 223
<211> 409
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> mU6-shPD-1 MCS碱基序列
<400> 223
gttaacgatc cgacgccgcc atctctaggc ccgcgccggc cccctcgcac agacttgtgg 60
gagaagctcg gctactcccc tgccccggtt aatttgcata taatatttcc tagtaactat 120
agaggcttaa tgtgcgataa aagacagata atctgttctt tttaatacta gctacatttt 180
acatgatagg cttggatttc tataagagat acaaatacta aattattatt ttaaaaaaca 240
gcacaaaagg aaactcaccc taactgtaaa gtaattgtgt gttttgagac tataaatatc 300
ccttggagaa aagccttgtt tgcctgtggt tctattatat tatttcaaga gaataatata 360
atagaaccac aggtttttga ctagtgctag ccatatgtct agagtatac 409
<210> 224
<211> 328
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hU6-shPD-1碱基序列
<400> 224
gttaacaagg tcgggcagga agagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata 60
cgatacaagg ctgttagaga gataattaga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta 120
gtacaaaata cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta 180
tgttttaaaa tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct 240
ttatatatct tgtggaaagg acgaaacacc gcctgtggtt ctattatatt atttcaagag 300
aataatataa tagaaccaca ggtttttg 328
<210> 225
<211> 468
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD22-CAR
<400> 225
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu Glu Asp Ala Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
145 150 155 160
Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Trp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser
180 185 190
Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Phe Ala Thr
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
245 250 255
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
260 265 270
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
275 280 285
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
290 295 300
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys
305 310 315 320
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
325 330 335
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
340 345 350
Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
355 360 365
Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
370 375 380
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
385 390 395 400
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
405 410 415
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
420 425 430
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
435 440 445
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
450 455 460
Leu Pro Pro Arg
465
<210> 226
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD19-CAR
<400> 226
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
50 55 60
Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
100 105 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
130 135 140
Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser
145 150 155 160
Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
165 170 175
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
180 185 190
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
195 200 205
Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys
210 215 220
Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys
225 230 235 240
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
275 280 285
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
290 295 300
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
305 310 315 320
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg
325 330 335
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
340 345 350
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
355 360 365
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
370 375 380
Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
385 390 395 400
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
405 410 415
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
420 425 430
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
435 440 445
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
450 455 460
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
465 470 475 480
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 227
<211> 782
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> △LNGFR_P2A_CD19-CAR
<400> 227
Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala Lys Glu Ala Cys
20 25 30
Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala Cys Asn
35 40 45
Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr Val Cys
50 55 60
Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr
65 70 75 80
Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Met Ser
85 90 95
Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly
100 105 110
Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys
115 120 125
Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln Asn Thr
130 135 140
Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Asn His
145 150 155 160
Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu Arg Gln
165 170 175
Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu Ile Pro
180 185 190
Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser Asp Ser Thr
195 200 205
Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gln Asp Leu Ile
210 215 220
Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Ser Ser Gln
225 230 235 240
Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn Leu Ile Pro Val Tyr Cys
245 250 255
Ser Ile Leu Ala Ala Val Val Val Gly Leu Val Ala Tyr Ile Ala Phe
260 265 270
Lys Arg Trp Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala
275 280 285
Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu
290 295 300
Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln
305 310 315 320
Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val
325 330 335
Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp
340 345 350
Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr
355 360 365
Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
370 375 380
Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile
385 390 395 400
Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly
405 410 415
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
420 425 430
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro
435 440 445
Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser
450 455 460
Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro
465 470 475 480
Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr
485 490 495
Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn
500 505 510
Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp
515 520 525
Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr
530 535 540
Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr
545 550 555 560
Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser
565 570 575
Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly
580 585 590
Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp
595 600 605
Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile
610 615 620
Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
625 630 635 640
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
645 650 655
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val
660 665 670
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn
675 680 685
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
690 695 700
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
705 710 715 720
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
725 730 735
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
740 745 750
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
755 760 765
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
770 775 780
<210> 228
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向 PCR克隆引物#1
<400> 228
ggtatactct agacatatgg ctagcactag tcaaaaacct gtggttc 47
<210> 229
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向 PCR克隆引物#1
<400> 229
ttgtaccgtt aacgatccga cgccgc 26
<210> 230
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向 PCR克隆引物#2
<400> 230
tgactagtca aaaacctgtg gttctattat attattctct tgaaataata taatagaacc 60
acaggcggtg tttcgtcctt tccacaagat atataaagcc aa 102
<210> 231
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向 PCR克隆引物#2
<400> 231
gtaccgttaa caaggtcggg caggaagagg gcctatttcc catgattcct 50
<210> 232
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向 PCR克隆引物#3
<400> 232
aggactagtc aaaaaggaat tcgctcagaa gaaatctct 39
<210> 233
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向 PCR克隆引物#3
<400> 233
ctagctagcg atccgacgcc gccatct 27
<210> 234
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向 PCR克隆引物#4
<400> 234
atgttaacca aaaacctgtg gttctattat attattctct tg 42
<210> 235
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向 PCR克隆引物#4
<400> 235
tcactagtaa ggtcgggcag gaagagggcc tatt 34
<210> 236
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向 PCR克隆引物#5
<400> 236
taggccctca ctagtgatcc gacgccgcc 29
<210> 237
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向 PCR克隆引物#5
<400> 237
ctagctagcc aaaaaggaat tcgctcagaa gaaatctc 38
<210> 238
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TIGIT-268
<400> 238
gcttctggcc atttgtaatg c 21
<210> 239
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TIGIT-2
<400> 239
gggagtactt ctgcatctat c 21
<210> 240
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TIGIT-739
<400> 240
gctgcatgac tacttcaatg t 21
<210> 241
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TIGIT-1
<400> 241
taacgtggat cttgatcata a 21
<210> 242
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TIGIT-1386
<400> 242
ggagacatac acaggccttc a 21
<210> 243
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TIGIT-1750
<400> 243
gcatttgggc cttgatctac c 21
<210> 244
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LAG3-138
<400> 244
ccagctttcc agctttcctc t 21
<210> 245
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LAG3-503
<400> 245
gatctcagcc ttctgcgaag a 21
<210> 246
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LAG3-1092
<400> 246
gcttcaacgt ctccatcatg t 21
<210> 247
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LAG3-1221
<400> 247
ggtctttcct cactgccaag t 21
<210> 248
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LAG3-1278
<400> 248
ctggagacaa tggcgacttt a 21
<210> 249
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LAG3-1379
<400> 249
gccactgtca cattggcaat c 21
<210> 250
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LAG3-1465
<400> 250
tccagtatct ggacaagaac g 21
<210> 251
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LAG3-1616
<400> 251
gcagcagtgt acttcacaga g 21
<210> 252
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LAG3-1702
<400> 252
gctgtttctc atccttggtg t 21
<210> 253
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LAG3-1751
<400> 253
gcctttggct ttcacctttg g 21
<210> 254
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LAG3-1954
<400> 254
tcagcagccc agtccaaata a 21
<210> 255
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4-3
<400> 255
ggtggagctc atgtacccac c 21
<210> 256
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4-1
<400> 256
cccaaattac gtgtactaca a 21
<210> 257
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4-1058
<400> 257
gcatcacttg ggattaatat g 21
<210> 258
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4-1154
<400> 258
gcgagggaga agactatatt g 21
<210> 259
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4-1309
<400> 259
gccagtgatg ctaaaggttg t 21
<210> 260
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4-1686
<400> 260
ggtggtatct gagttgactt g 21
<210> 261
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Tim3-1
<400> 261
gatgaaaggg atgtgaatta t 21
<210> 262
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Tim3-2
<400> 262
gggagcctcc ctgatataaa t 21
<210> 263
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Tim3-3
<400> 263
ggaattcgct cagaagaaa 19
<210> 264
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Tim3-4
<400> 264
ggaccaaact gaagctatat t 21
<210> 265
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PD1-1
<400> 265
cctgtggttc tattatatta t 21
<210> 266
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PD1-2
<400> 266
gcctagagaa gtttcaggga a 21
<210> 267
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PD1-3
<400> 267
cattgtcttt cctagcggaa t 21
<210> 268
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 18s rRNA 正向
<400> 268
gattaagtcc ctgccctttg 20
<210> 269
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 18s rRNA 反向
<400> 269
gttcacctac ggaaaccttg 20
<210> 270
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PDCD1 正向
<400> 270
cctccacctt tacacatgcc 20
<210> 271
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PDCD1 反向
<400> 271
cttactgcct cagcttccct 20
<210> 272
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IL2 正向
<400> 272
ccaagaaggc cacagaactg a 21
<210> 273
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IL2 反向
<400> 273
gttgtttcag atccctttag ttccag 26
<210> 274
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IL4 正向
<400> 274
actttgaaca gcctcacaga g 21
<210> 275
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IL4 反向
<400> 275
ccgagttgac cgtaacagac at 22
<210> 276
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IL17A 正向
<400> 276
caaccgatcc acctcacctt 20
<210> 277
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IL17A 反向
<400> 277
ggcactttgc ctcccagat 19
<210> 278
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD25 正向
<400> 278
cacaagctct gccactcgga a 21
<210> 279
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD25 反向
<400> 279
tgcagtgacc tggaaggctc 20
<210> 280
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4 正向
<400> 280
ctacctgggc ataggcaacg 20
<210> 281
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CTLA4 反向
<400> 281
ccccgaacta actgctgcaa 20
<210> 282
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FOXP3 正向
<400> 282
gaaacagcac attcccagag ttc 23
<210> 283
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FOXP3 反向
<400> 283
atggcccagc ggatgag 17
<210> 284
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TGF-β1 正向
<400> 284
cccagcatct gcaaagctc 19
<210> 285
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TGF-β1 反向
<400> 285
gtccttgcgg aagtcaatgt 20
<210> 286
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TGFBR1 正向
<400> 286
acatgattca gccacagata cc 22
<210> 287
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TGFBR1 反向
<400> 287
gcatagatgt cagcacgttt g 21
<210> 288
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TGFBR2 正向
<400> 288
acgtgttgag agatcgagg 19
<210> 289
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TGFBR2 反向
<400> 289
cccagcactc agtcaacgtc 20

Claims (149)

1.一种载体，其包含：
编码两种类型的短发夹RNA(shRNA)的碱基序列，所述短发夹RNA抑制至少一种削弱免疫细胞功能的基因的表达，和
编码嵌合抗原受体(CAR)或单克隆T细胞受体(mTCR)的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的载体，其中所述两种类型的shRNA的表达的特征在于它们分别由两种不同的启动子调控。
3.根据权利要求2所述的载体，其中所述两种启动子是RNA聚合酶III启动子。
4.根据权利要求2所述的载体，其中所述两种启动子是源自不同物种的U6启动子。
5.根据权利要求2所述的载体，其中所述两种启动子在所述载体上彼此以不同的方向取向。
6.根据权利要求1所述的载体，其中所述削弱所述免疫细胞功能的基因是免疫检查点受体或配体。
7.根据权利要求6所述的载体，其中所述免疫检查点受体或配体选自由以下组成的组：PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3或CEACAM-5)、LAG 3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、MerTK和2B4。
8.根据权利要求1所述的载体，其中所述削弱所述免疫细胞功能的基因选自由以下组成的组：FAS、CD45、PP2A、SHIP1、SHIP2、DGKα、DGKζ、Cbl-b、CD147、LRR1、TGFBR1、IL10Rα、KLGR1、DNMT3A和A2aR。
9.根据权利要求1所述的载体，其中所述两种类型的shRNA靶向削弱所述免疫细胞功能的单个基因，或者其中所述两种类型的shRNA靶向削弱所述免疫细胞功能的不同基因。
10.根据权利要求1所述的载体，其中所述两种类型的shRNA靶向PD-1。
11.根据权利要求1所述的载体，其中在所述两种类型的shRNA中，i)一种shRNA靶向PD-1，并且第二种shRNA靶向TIM-3，或者ii)一种shRNA靶向PD-1，并且第二种shRNA靶向TIGIT。
12.根据权利要求1所述的载体，其中在所述两种类型的shRNA中，编码一种shRNA的所述碱基序列包含选自由SEQ ID NO：2-219组成的组的序列，并且编码第二种shRNA的所述碱基序列包含选自由SEQ ID NO：2-219组成的组的不同序列。
13.根据权利要求1所述的载体，其中所述CAR或mTCR的靶标是在癌细胞、癌组织和/或肿瘤微环境中表现出增加的表达的人肿瘤抗原，或者是在癌细胞、癌组织和/或肿瘤微环境中发现的抗原的突变形式。
14.根据权利要求1所述的载体，所述载体是否包含SEQ ID NO：220或221的碱基序列。
15.根据权利要求1所述的载体，其中所述载体是质粒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关载体或逆转录病毒载体。
16.一种包含权利要求1所述的载体的免疫细胞，其中所述一个或多个基因的表达与在所述shRNA不存在的情况下的表达相比减少至40％或更少。
17.根据权利要求16所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是人来源的T细胞或天然杀伤(NK)细胞。
18.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-17中任一项所述的免疫细胞。
19.根据权利要求18所述的药物组合物，其用于治疗需要免疫疗法的患者，其中所述免疫细胞最初获自所述患者。
20.根据权利要求19所述的药物组合物，其中所述患者患有肿瘤或癌症，在所述肿瘤或癌症中检测到在所述免疫细胞中表达的所述CAR或mTCR的靶标和/或靶标水平的升高或变化。
21.一种免疫细胞，其包含与靶抗原特异性结合的所述基因工程抗原受体，以及减少或能够减少削弱免疫细胞功能的基因在免疫细胞中的表达的所述基因破坏剂。
22.如权利要求21所述的免疫细胞，其中所述基因工程化的抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
23.如权利要求22所述的免疫细胞，其中所述基因工程化的抗原受体是CAR。
24.如权利要求23所述的免疫细胞，其中所述CAR包含胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和胞内信号转导结构域。
25.如权利要求24所述的免疫细胞，其中所述CAR的胞外抗原识别结构域与所述靶抗原特异性结合。
26.如权利要求24所述的免疫细胞，其中所述CAR的胞内信号转导结构域包含CD3 zeta(CD3ζ)链的胞内结构域。
27.如权利要求26所述的免疫细胞，其中所述CAR的胞内信号转导结构域还包含共刺激分子。
28.如权利要求27所述的免疫细胞，其中所述共刺激分子选自由以下组成的组：ICOS、0X40、CD137(4-1BB)、CD27和CD28。
29.如权利要求28所述的免疫细胞，其中所述共刺激分子是CD137(4-1BB)。
30.如权利要求28所述的免疫细胞，其中所述共刺激分子是CD28。
31.如权利要求22所述的免疫细胞，其中所述基因工程化的抗原受体是TCR。
32.如权利要求31所述的免疫细胞，其中所述TCR是单克隆TCR(mTCR)。
33.如权利要求31或32所述的免疫细胞，其中所述靶抗原在癌细胞、癌组织和/或肿瘤微环境中或表面上表达。
34.如权利要求33所述的免疫细胞，其中所述靶抗原选自由以下组成的组：
5T4(滋养层糖蛋白)、707-AP、9D7、AFP(甲胎蛋白)、AlbZIP(雄激素诱导的bZIP)、HPG1(人前列腺特异性基因-1)、α5β1-整联蛋白、α5β6-整联蛋白、α-甲基酰基辅酶A消旋酶、ART-4(ADP核糖基转移酶-4)、B7H4(含v-set结构域的T细胞活化抑制剂1)、BAGE-1(B黑素瘤抗原-1)、BCL-2(B细胞CLL/淋巴瘤-2)、BING-4(WD重复结构域46)、CA 15-3/CA 27-29(粘蛋白1)、CA 19-9(癌抗原19-9)、CA 72-4(癌抗原72-4)、CA125(癌抗原125)、钙网蛋白、CAMEL(黑素瘤上CTL识别的抗原)、CASP-8(半胱天冬酶8)、组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、CD19(分化簇19)、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD4、CD52、CD55、CD56、CD80、CEA(癌胚抗原SG8)、CLCA2(氯离子通道附件2)、CML28(慢性髓性白血病肿瘤抗原28)、毛状蛋白样蛋白、胶原蛋白XXIII、COX-2(环氧化酶-2)、CT-9/BRD6(癌/睾丸抗原9)、Cten(c-末端张力蛋白样蛋白)、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1、cyp-B、CYPB1(细胞色素p450家族1亚家族b成员1)、DAM-10/MAGE-B1(黑素瘤相关抗原B1)、DAM-6/MAGE-B2、EGFR/Her1(表皮生长因子受体)、EMMPRIN(basigin)、EpCam、EphA2(EPH受体A2)、EphA3、ErbB3(Erb-B2受体酪氨酸激酶3)、EZH2(zeste 2多梳蛋白抑制复合体2亚单位的增强子)、FGF-5(成纤维细胞生长因子5)、FN(纤连蛋白)、Fra-1(Fos相关抗原-1)、G250/CAIX(碳酸酐酶9)、GAGE-1(G抗原-1)、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7b、GAGE-8、GDEP(前列腺中差异表达的基因)、GnT-V(葡萄糖酸激酶)、gp100(黑素细胞谱系特异性抗原GP100)、GPC3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖3)、HAGE(螺旋抗原)、HAST-2(磺基转移酶家族1A成员1)、hepsin、Her2/neu/ErbB2(Erb-B2受体酪氨酸激酶2)、HERV-K-MEL、HNE(髓质素)、同源异型框NKX 3.1、HOM-TES-14/SCP-1、HOM-TES-85、HPV-E6、HPVE7、HST-2(沉默调节蛋白-2)、hTERT、iCE(半胱天冬酶1)、IGF-1R(胰岛素样生长因子-1受体)、IL-13Ra2(白介素-13受体亚单位α2)、IL-2R(白介素-2受体)、IL-5(白介素-5)、未成熟层粘连蛋白受体、激肽释放酶2、激肽释放酶4、Ki67、KIAA0205(溶血磷脂酰甘油酰基转移酶1)、KK-LC-1(北九州肺癌抗原-1)、KM-HN-1、LAGE-1(L抗原家族成员-1)、Livin、MAGE-A1、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGEA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-B1、MAGE-B10、MAGE-B16、MAGEB17、MAGE-B2、MAGE-B3、MAGE-B4、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-D1、MAGE-D2、MAGE-D4、MAGE-E1、MAGE-E2、MAGE-F1、MAGE-H1、MAGEL2(黑素瘤抗原家族L2)、乳房珠蛋白A、MART-1/Melan-A(由T细胞识别的黑素瘤抗原-1)、MART-2、基质蛋白22、MC1R(黑皮质素1受体)、M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)、间皮素、MG50/PXDN(过氧蛋白)、MMP 11(基质金属蛋白酶11)、MN/CA1X-抗原(碳酸酐酶9)、MRP-3(多药耐药相关蛋白-3)、MUC1(粘蛋白1)、MUC2、NA88-A(VENT样同源异型框2假基因1)、N-乙酰葡糖胺基转移酶-V、Neo-PAP(Neo-聚(A)聚合酶)、NGEP(在前列腺中表达的新基因)、NMP22(核基质蛋白22)、NPM/ALK(核磷蛋白)、NSE(神经元特异性烯醇化酶)、NY-ESO-1、NY-ESO-B、OA1(骨关节炎QTL 1)、OFA-iLRP(癌胚抗原未成熟层粘连蛋白受体蛋白)、OGT(O-GlcNAc转移酶)、OS-9(内质网凝集素)、骨钙素、骨桥蛋白、p15(CDK抑制因子2B)、p53、PAGE-4(P抗原家族成员-4)、PAI-1(纤溶酶原激活物抑制物-1)、PAI-2、PAP(前列腺酸性磷酸酶)、PART-1(前列腺雄激素调节转录物1)、PATE(前列腺和睾丸表达1)、PDEF(前列腺源性Ets因子)、Pim-1-激酶(原病毒整合位点1)、Pin1(肽基-脯氨酰顺反异构酶NIMA相互作用1)、POTE(在前列腺、卵巢、睾丸和胎盘中表达)、PRAME(在黑素瘤中优先表达的抗原)、前列腺素、蛋白酶-3、PSA(前列腺特异性抗原)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、PSGR(前列腺特异性G蛋白偶联受体)、PSM、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、RAGE-1(肾肿瘤癌抗原)、RHAMM/CD168、RU1(肾遍在蛋白1)、RU2、SAGE(肉瘤抗原)、SART-1(由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原-1)、SART-2、SART-3、Sp17(精子蛋白17)、SSX-1(SSX家族成员1)、SSX-2/HOM-MEL-40、SSX-4、STAMP-1(STEAP2金属还原酶)、STEAP、存活素、存活素-213、TA-90(肿瘤相关抗原-90)、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白-72)、TARP(TCRγ交替阅读框蛋白)、TGFb(转化生长因子β)、TGFbR11(转化生长因子β受体11)、TGM-4(转谷氨酰胺酶4)、TRAG-3(紫杉醇耐药相关基因3)、TRG(T细胞受体γ基因座)、TRP-1(瞬时受体电位-1)、TRP-2/6b、TRP-2/INT2、Trp-p8、酪氨酸酶、UPA(U型纤溶酶原激活剂)、VEGF(血管内皮生长因子A)、VEGFR-2/FLK-1和WT1(肾母细胞瘤1)。
35.如权利要求35所述的免疫细胞，其中所述靶抗原是CD19或CD22。
36.如权利要求36所述的免疫细胞，其中所述靶抗原是CD19。
37.如权利要求34-36中任一项所述的免疫细胞，其中所述靶抗原是在癌细胞、癌组织和/或肿瘤微环境中或表面上表达增加的癌抗原。
38.如权利要求33所述的免疫细胞，其中所述靶抗原选自由以下组成的组：
α-辅肌动蛋白-4/m、ARTC1/m、bcr/abl、β-连环蛋白/m、BRCA1/m、BRCA2/m、CASP-5/m、CASP-8/m、CDC27/m、CDK4/m、CDKN2A/m、CML66、COA-1/m、DEK-CAN、EFTUD2/m、ELF2/m、ETV6-AML1、FN1/m、GPNMB/m、HLA-A*0201-R170I、HLA-A11/m、HLA-A2/m、HSP70-2M、KIAA0205/m、K-Ras/m、LDLR-FUT、MART2/m、ME1/m、MUM-1/m、MUM-2/m、MUM-3/m、肌球蛋白1类/m、neo-PAP/m、NFYC/m、N-Ras/m、OGT/m、OS-9/m、p53/m、Pml/RARa、PRDX5/m、PTPRX/m、RBAF600/m、SIRT2/m、SYTSSX-1、SYT-SSX-2、TEL-AML1、TGFbRII和TPI/m；以及
其中所述靶抗原是癌抗原，所述癌抗原是在癌细胞、癌症组织和/或肿瘤微环境中或表面上表达的抗原的突变形式。
39.如权利要求21-38中任一项所述的免疫细胞，其中所述削弱所述免疫细胞功能的基因的表达导致以下的一种或多种：
i)抑制所述免疫细胞的增殖；
ii)诱导所述免疫细胞的细胞死亡；
iii)抑制所述免疫细胞识别所述靶抗原和/或进行活化的能力；
iv)诱导所述免疫细胞分化成不诱导对所述靶抗原的免疫响应的细胞；
v)减少所述免疫细胞与促进所述免疫细胞的免疫响应的分子的反应；或者
vi)增加所述免疫细胞与抑制所述免疫细胞的免疫响应的分子的反应。
40.如权利要求39所述的免疫细胞，其中所述削弱所述免疫细胞功能的基因选自由以下组成的组：PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3或CEACAM-5)、LAG 3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、MerTK、2B4、FAS、CD45、PP2A、SHP1、SHP2、DGKα、DGKζ、Cbl-b、Cbl-c、CD148、LRR1、TGFBR1、IL10RA、KLGR1、DNMT3A和A2aR。
41.如权利要求39所述的免疫细胞，其中所述削弱所述免疫细胞功能的基因增加所述免疫细胞与抑制所述免疫细胞的免疫响应的分子的反应。
42.如权利要求41所述的免疫细胞，其中所述增加免疫细胞与抑制所述免疫细胞的免疫响应的分子的反应的基因编码免疫检查点受体或配体。
43.如权利要求42所述的免疫细胞，其中所述免疫检查点受体或配体选自由以下组成的组：PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3或CEACAM-5)、LAG 3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、MerTK和2B4。
44.如权利要求21-43中任一项所述的免疫细胞，其中与不存在所述基因破坏剂的免疫细胞相比，所述基因破坏剂使削弱所述免疫细胞功能的基因在所述免疫细胞中的表达减少至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。
45.如权利要求44所述的免疫细胞，其中所述基因破坏剂减少基因的表达，所述基因增加所述免疫细胞与抑制所述免疫细胞的免疫响应的分子的反应。
46.如权利要求45所述的免疫细胞，其中所述基因破坏剂减少编码免疫检查点受体或配体的基因的表达。
47.如权利要求46所述的免疫细胞，其中所述基因破坏剂减少选自由以下组成的组的基因的表达：PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、MerTK和2B4。
48.如权利要求45-47中任一项所述的免疫细胞，其中所述基因破坏剂通过RNA干扰(RNAi)减少削弱所述免疫细胞功能的基因的表达。
49.如权利要求48所述的免疫细胞，其中多于一种基因破坏剂通过RNAi减少削弱所述免疫细胞功能的基因在所述免疫细胞中的表达。
50.如权利要求49所述的免疫细胞，其中所述基因破坏剂靶向削弱所述免疫细胞功能的单个基因，或者其中不同的基因破坏剂靶向削弱所述免疫细胞功能的不同基因，例如，其中第一基因破坏剂靶向第一基因，并且第二基因破坏剂靶向第二基因。
51.如权利要求48-50中任一项所述的免疫细胞，其中所述RNAi由短发夹RNA(shRNA)介导。
52.如权利要求51所述的免疫细胞，其中所述RNAi由多于一种shRNA介导。
53.如权利要求52所述的免疫细胞，其中所述RNAi由两种shRNA介导。
54.如权利要求52-53中任一项所述的免疫细胞，其中所述两种shRNA靶向PD-1。
55.如权利要求52-53中任一项所述的免疫细胞，其中第一shRNA靶向PD-1，并且第二shRNA靶向TIM-3。
56.如权利要求52-53中任一项所述的免疫细胞，其中第一shRNA靶向PD-1，并且第二shRNA靶向CTLA-4。
57.如权利要求52-53中任一项所述的免疫细胞，其中第一shRNA靶向PD-1，并且第二shRNA靶向LAG-3。
58.如权利要求52-53中任一项所述的免疫细胞，其中第一shRNA靶向PD-1，并且第二shRNA靶向TIGIT。
59.如权利要求51-58中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞包含编码shRNA的核苷酸序列。
60.如权利要求59所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞包含编码多于一种shRNA的核苷酸序列。
61.如权利要求59所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞包含编码两种shRNA的核苷酸序列。
62.如权利要求59-61中任一项所述的免疫细胞，其中编码一种或多种所述shRNA的所述核苷酸序列包含选自由SEQ ID NO：2-219和238-267组成的组的核苷酸序列。
63.如权利要求59-62中任一项所述的免疫细胞，其中编码一种或多种所述shRNA的所述核苷酸序列存在于载体上。
64.如权利要求63中任一项所述的免疫细胞，其中所述不同shRNA的表达由不同的启动子调控。
65.如权利要求64所述的免疫细胞，其中所述两种不同shRNA的表达由两种不同的启动子调控。
66.如权利要求65所述的免疫细胞，其中所述两种不同的启动子是RNA聚合酶III启动子。
67.如权利要求66所述的免疫细胞，其中所述两种启动子是U6启动子。
68.如权利要求67所述的免疫细胞，其中所述U6启动子源自不同物种。
69.如权利要求65-68中任一项所述的免疫细胞，其中所述两种启动子彼此以不同的方向取向。
70.如权利要求21-69中任一项所述的免疫细胞，其中所述基因工程化的抗原受体和一种或多种所述基因破坏剂各自由载体表达。
71.如权利要求70所述的免疫细胞，其中所述基因工程化的抗原受体和一种或多种所述基因破坏剂由同一载体表达。
72.如权利要求70-71中任一项所述的免疫细胞，其中所述载体是质粒载体或病毒载体。
73.如权利要求72所述的免疫细胞，其中所述病毒载体是慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
74.如权利要求73所述的免疫细胞，其中所述慢病毒载体是逆转录病毒载体。
75.如权利要求21-74中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞选自由T细胞和天然杀伤(NK)细胞的组成的组。
76.如权利要求75所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是T细胞。
77.如权利要求76所述的免疫细胞，其中所述T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。
78.如权利要求76或77中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞包含在同一载体上编码两种shRNA和CAR或mTCR的核苷酸序列。
79.如权利要求78所述的免疫细胞，其中所述两种shRNA各自由两种不同的彼此以不同的方向取向的RNA聚合酶III启动子调控。
80.如权利要求79所述的免疫细胞，其中所述CAR靶向CD19，所述第一shRNA靶向PD-1，并且所述第二shRNA靶向TIGIT。
81.一种产生免疫细胞的方法，所述方法包括同时或以任何顺序依次向免疫细胞中引入：
(1)编码与靶抗原特异性结合的基因工程化的抗原受体的基因；和
(2)基因破坏剂，其中所述基因破坏剂或其表达减少或能够减少削弱所述免疫细胞功能的基因在免疫细胞中的表达，
从而产生免疫细胞，在所述免疫细胞中表达基因工程化的抗原受体并且减少削弱所述免疫细胞功能的基因的表达。
82.如权利要求81所述的方法，其中所述基因工程化的抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
83.如权利要求82所述的方法，其中所述基因工程化的抗原受体是CAR。
84.如权利要求83所述的方法，其中所述CAR包含胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和胞内信号转导结构域。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述CAR的胞外抗原识别结构域与所述靶抗原特异性结合。
86.如权利要求84所述的方法，其中所述CAR的胞内信号转导结构域包含CD3 zeta(CD3ζ)链的胞内结构域。
87.如权利要求86所述的方法，其中所述CAR的胞内信号转导结构域还包含共刺激分子。
88.如权利要求87所述的方法，其中所述共刺激分子选自由以下组成的组：ICOS、0X40、CD137(4-1BB)、CD27和CD28。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述共刺激分子是CD137(4-1BB)。
90.权利要求88所述的方法，其中所述共刺激分子是CD28。
91.如权利要求82所述的方法，其中所述基因工程化的抗原受体是TCR。
92.如权利要求91所述的方法，其中所述TCR是单克隆TCR(mTCR)。
93.如权利要求81-92中任一项所述的方法，其中所述靶抗原在癌细胞、癌组织和/或肿瘤微环境中或表面上表达。
94.如权利要求93所述的方法，其中所述靶抗原选自由以下组成的组：
5T4(滋养层糖蛋白)、707-AP、9D7、AFP(甲胎蛋白)、AlbZIP(雄激素诱导的bZIP)、HPG1(人前列腺特异性基因-1)、α5β1-整联蛋白、α5β6-整联蛋白、α-甲基酰基辅酶A消旋酶、ART-4(ADP核糖基转移酶-4)、B7H4(含v-set结构域的T细胞活化抑制剂1)、BAGE-1(B黑素瘤抗原-1)、BCL-2(B细胞CLL/淋巴瘤-2)、BING-4(WD重复结构域46)、CA 15-3/CA 27-29(粘蛋白1)、CA 19-9(癌抗原19-9)、CA 72-4(癌抗原72-4)、CA125(癌抗原125)、钙网蛋白、CAMEL(黑素瘤上CTL识别的抗原)、CASP-8(半胱天冬酶8)、组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、CD19(分化簇19)、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD4、CD52、CD55、CD56、CD80、CEA(癌胚抗原SG8)、CLCA2(氯离子通道附件2)、CML28(慢性髓性白血病肿瘤抗原28)、毛状蛋白样蛋白、胶原蛋白XXIII、COX-2(环氧化酶-2)、CT-9/BRD6(癌/睾丸抗原9)、Cten(c-末端张力蛋白样蛋白)、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1、cyp-B、CYPB1(细胞色素p450家族1亚家族b成员1)、DAM-10/MAGE-B1(黑素瘤相关抗原B1)、DAM-6/MAGE-B2、EGFR/Her1(表皮生长因子受体)、EMMPRIN(basigin)、EpCam、EphA2(EPH受体A2)、EphA3、ErbB3(Erb-B2受体酪氨酸激酶3)、EZH2(zeste 2多梳蛋白抑制复合体2亚单位的增强子)、FGF-5(成纤维细胞生长因子5)、FN(纤连蛋白)、Fra-1(Fos相关抗原-1)、G250/CAIX(碳酸酐酶9)、GAGE-1(G抗原-1)、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7b、GAGE-8、GDEP(前列腺中差异表达的基因)、GnT-V(葡萄糖酸激酶)、gp100(黑素细胞谱系特异性抗原GP100)、GPC3(磷脂酰肌醇蛋白聚糖3)、HAGE(螺旋抗原)、HAST-2(磺基转移酶家族1A成员1)、hepsin、Her2/neu/ErbB2(Erb-B2受体酪氨酸激酶2)、HERV-K-MEL、HNE(髓质素)、同源异型框NKX 3.1、HOM-TES-14/SCP-1、HOM-TES-85、HPV-E6、HPVE7、HST-2(沉默调节蛋白-2)、hTERT、iCE(半胱天冬酶1)、IGF-1R(胰岛素样生长因子-1受体)、IL-13Ra2(白介素-13受体亚单位α2)、IL-2R(白介素-2受体)、IL-5(白介素-5)、未成熟层粘连蛋白受体、激肽释放酶2、激肽释放酶4、Ki67、KIAA0205(溶血磷脂酰甘油酰基转移酶1)、KK-LC-1(北九州肺癌抗原-1)、KM-HN-1、LAGE-1(L抗原家族成员-1)、Livin、MAGE-A1、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGEA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-B1、MAGE-B10、MAGE-B16、MAGEB17、MAGE-B2、MAGE-B3、MAGE-B4、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-D1、MAGE-D2、MAGE-D4、MAGE-E1、MAGE-E2、MAGE-F1、MAGE-H1、MAGEL2(黑素瘤抗原家族L2)、乳房珠蛋白A、MART-1/Melan-A(由T细胞识别的黑素瘤抗原-1)、MART-2、基质蛋白22、MC1R(黑皮质素1受体)、M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)、间皮素、MG50/PXDN(过氧蛋白)、MMP 11(基质金属蛋白酶11)、MN/CA1X-抗原(碳酸酐酶9)、MRP-3(多药耐药相关蛋白-3)、MUC1(粘蛋白1)、MUC2、NA88-A(VENT样同源异型框2假基因1)、N-乙酰葡糖胺基转移酶-V、Neo-PAP(Neo-聚(A)聚合酶)、NGEP(在前列腺中表达的新基因)、NMP22(核基质蛋白22)、NPM/ALK(核磷蛋白)、NSE(神经元特异性烯醇化酶)、NY-ESO-1、NY-ESO-B、OA1(骨关节炎QTL 1)、OFA-iLRP(癌胚抗原未成熟层粘连蛋白受体蛋白)、OGT(O-GlcNAc转移酶)、OS-9(内质网凝集素)、骨钙素、骨桥蛋白、p15(CDK抑制因子2B)、p53、PAGE-4(P抗原家族成员-4)、PAI-1(纤溶酶原激活物抑制物-1)、PAI-2、PAP(前列腺酸性磷酸酶)、PART-1(前列腺雄激素调节转录物1)、PATE(前列腺和睾丸表达1)、PDEF(前列腺源性Ets因子)、Pim-1-激酶(原病毒整合位点1)、Pin1(肽基-脯氨酰顺反异构酶NIMA相互作用1)、POTE(在前列腺、卵巢、睾丸和胎盘中表达)、PRAME(在黑素瘤中优先表达的抗原)、前列腺素、蛋白酶-3、PSA(前列腺特异性抗原)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、PSGR(前列腺特异性G蛋白偶联受体)、PSM、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、RAGE-1(肾肿瘤癌抗原)、RHAMM/CD168、RU1(肾遍在蛋白1)、RU2、SAGE(肉瘤抗原)、SART-1(由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原-1)、SART-2、SART-3、Sp17(精子蛋白17)、SSX-1(SSX家族成员1)、SSX-2/HOM-MEL-40、SSX-4、STAMP-1(STEAP2金属还原酶)、STEAP、存活素、存活素-213、TA-90(肿瘤相关抗原-90)、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白-72)、TARP(TCRγ交替阅读框蛋白)、TGFb(转化生长因子β)、TGFbR11(转化生长因子β受体11)、TGM-4(转谷氨酰胺酶4)、TRAG-3(紫杉醇耐药相关基因3)、TRG(T细胞受体γ基因座)、TRP-1(瞬时受体电位-1)、TRP-2/6b、TRP-2/INT2、Trp-p8、酪氨酸酶、UPA(U型纤溶酶原激活剂)、VEGF(血管内皮生长因子A)、VEGFR-2/FLK-1和WT1(肾母细胞瘤1)。
95.如权利要求95所述的方法，其中所述靶抗原是CD19或CD22。
96.如权利要求96所述的方法，其中所述靶抗原是CD19。
97.如权利要求94-96中任一项所述的方法，其中所述靶抗原是癌抗原，其中所述癌抗原是在癌细胞、癌症组织和/或肿瘤微环境中或表面上表达增加的抗原。
98.如权利要求93所述的方法，其中所述靶抗原选自由以下组成的组：
α-辅肌动蛋白-4/m、ARTC1/m、bcr/abl、β-连环蛋白/m、BRCA1/m、BRCA2/m、CASP-5/m、CASP-8/m、CDC27/m、CDK4/m、CDKN2A/m、CML66、COA-1/m、DEK-CAN、EFTUD2/m、ELF2/m、ETV6-AML1、FN1/m、GPNMB/m、HLA-A*0201-R170I、HLA-A11/m、HLA-A2/m、HSP70-2M、KIAA0205/m、K-Ras/m、LDLR-FUT、MART2/m、ME1/m、MUM-1/m、MUM-2/m、MUM-3/m、肌球蛋白1类/m、neo-PAP/m、NFYC/m、N-Ras/m、OGT/m、OS-9/m、p53/m、Pml/RARa、PRDX5/m、PTPRX/m、RBAF600/m、SIRT2/m、SYTSSX-1、SYT-SSX-2、TEL-AML1、TGFbRII和TPI/m；以及
其中所述靶抗原是癌抗原，其中所述癌抗原是在癌细胞、癌症组织和/或肿瘤微环境中或表面上表达的抗原的突变形式。
99.如权利要求81-98中任一项所述的方法，其中所述削弱所述免疫细胞功能的基因的表达导致以下的一种或多种：
i)抑制所述免疫细胞的增殖；
ii)诱导所述免疫细胞的细胞死亡；
iii)抑制所述免疫细胞识别所述靶抗原和/或获得活化的能力；
iv)诱导所述免疫细胞分化成不诱导对所述靶抗原的免疫响应的细胞；
v)减少免所述疫细胞与促进所述免疫细胞的免疫响应的分子的反应；或者
vi)增加所述免疫细胞与抑制所述免疫细胞的免疫响应的分子的反应。
100.如权利要求99所述的方法，其中所述削弱所述免疫细胞功能的基因选自由以下组成的组：PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3或CEACAM-5)、LAG 3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、MerTK、2B4、FAS、CD45、PP2A、SHP1、SHP2、DGKα、DGKζ、Cbl-b、Cbl-c、CD148、LRR1、TGFBR1、IL10RA、KLGR1、DNMT3A和A2aR。
101.如权利要求99所述的方法，其中所述削弱所述免疫细胞功能的基因增加所述免疫细胞与抑制所述免疫细胞的免疫响应的分子的反应。
102.如权利要求101所述的方法，其中所述增加所述免疫细胞与抑制所述免疫细胞的免疫响应的分子的反应的基因编码免疫检查点受体或配体。
103.如权利要求102所述的方法，其中所述免疫检查点受体或配体选自由以下组成的组：PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3或CEACAM-5)、LAG 3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、MerTK和2B4。
104.如权利要求81-103中任一项所述的方法，其中与不存在一种或多种所述基因破坏剂的所述免疫细胞相比，所述基因破坏剂使削弱所述免疫细胞功能的基因在所述免疫细胞中的表达减少至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。
105.如权利要求104所述的方法，其中所述基因破坏剂减少基因的表达，所述基因增加所述免疫细胞与抑制所述免疫细胞的免疫响应的分子的反应。
106.如权利要求105所述的方法，其中所述基因破坏剂减少编码免疫检查点受体或配体的基因的表达。
107.如权利要求106所述的方法，其中所述基因破坏剂减少选自由以下组成的组的基因的表达：PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、MerTK和2B4。
108.如权利要求105-107中任一项所述的方法，其中所述基因破坏剂通过RNA干扰(RNAi)减少削弱所述免疫细胞功能的基因的表达。
109.如权利要求108所述的方法，其中多于一种基因破坏剂通过RNAi减少削弱所述免疫细胞功能的基因在所述免疫细胞中的表达。
110.如权利要求109所述的方法，其中所述基因破坏剂靶向削弱所述免疫细胞功能的单个基因，或靶向削弱所述免疫细胞功能的不同基因，其中第一基因破坏剂靶向第一基因，并且第二基因破坏剂靶向第二基因，或其任何组合。
111.如权利要求108-110中任一项所述的方法，其中所述RNAi是由短发夹RNA(shRNA)介导的。
112.如权利要求111所述的方法，其中所述RNAi由多于一种shRNA介导。
113.如权利要求112所述的方法，其中所述RNAi由两种shRNA介导。
114.如权利要求112或113所述的方法，其中所述两种shRNA靶向PD-1。
115.如权利要求112或113所述的方法，其中第一shRNA靶向PD-1，并且第二shRNA靶向TIM-3。
116.如权利要求112或113所述的方法，其中第一shRNA靶向PD-1，并且第二shRNA靶向CTLA-4。
117.如权利要求112或113所述的方法，其中第一shRNA靶向PD-1，并且第二shRNA靶向LAG-3。
118.如权利要求112或113所述的方法，其中第一shRNA靶向PD-1，并且第二shRNA靶向TIGIT。
119.如权利要求111-118中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞包含编码shRNA的核苷酸序列。
120.如权利要求119所述的方法，其中所述免疫细胞包含编码多于一种shRNA的核苷酸序列。
121.如权利要求119所述的方法，其中所述免疫细胞包含编码两种shRNA的核苷酸序列。
122.如权利要求119-121中任一项所述的方法，其中编码一种或多种所述shRNA的所述核苷酸序列包含选自由SEQ ID NO：2-219和238-267组成的组的序列。
123.如权利要求119-122中任一项的方法，其中编码所述shRNA的所述核苷酸序列存在于载体上。
124.如权利要求123中任一项所述的方法，其中所述不同shRNA的表达分别由不同的启动子调控。
125.如权利要求124所述的方法，其中所述两种不同shRNA的表达分别由两种不同的启动子调控。
126.如权利要求125所述的方法，其中所述两种不同的启动子是RNA聚合酶III启动子。
127.如权利要求126所述的方法，其中所述两种启动子是U6启动子。
128.如权利要求127所述的方法，其中所述U6启动子源自不同物种。
129.如权利要求125-128中任一项所述的方法，其中所述两种启动子彼此以不同的方向取向。
130.如权利要求81-129中任一项所述的方法，其中所述基因工程化的抗原受体和一种或多种所述基因破坏剂各自由载体表达。
131.如权利要求130所述的方法，其中所述基因工程化的抗原受体和一种或多种所述基因破坏剂由同一载体表达。
132.如权利要求130-131中任一项所述的方法，其中所述载体是质粒载体或病毒载体。
133.如权利要求132所述的方法，其中所述病毒载体是慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
134.如权利要求133所述的方法，其中所述慢病毒载体是逆转录病毒载体。
135.如权利要求81-134中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞选自由T细胞和天然杀伤(NK)细胞组成的组。
136.如权利要求135所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞。
137.如权利要求136所述的方法，其中所述T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。
138.如权利要求136或137所述的方法，其中所述免疫细胞包含在同一载体上编码两种shRNA和CAR的核苷酸序列。
139.如权利要求138所述的方法，其中所述两种shRNA各自由两种不同的彼此以不同的方向取向的RNA聚合酶III启动子调控。
140.如权利要求139所述的方法，其中所述CAR靶向CD19，所述第一shRNA靶向PD-1，并且所述第二shRNA靶向TIGIT。
141.一种组合物，其包含权利要求21-80中任一项所述的免疫细胞。
142.一种药物组合物，其包含权利要求21-80中任一项所述的免疫细胞和药学上可接受的载体。
143.一种治疗方法，其包括向患有需要免疫疗法的疾病或疾患的受试者施用权利要求21-80中任一项所述的免疫细胞或权利要求141或142所述的组合物。
144.如权利要求143所述的方法，其中所述基因工程化的抗原受体与抗原特异性结合，所述抗原与所述疾病或疾患相关。
145.如权利要求143或144所述的方法，其中所述疾病或所述疾患是癌症，例如，肿瘤。
146.如权利要求21-80中任一项所述的免疫细胞或如权利要求141-142所述的组合物，其用于治疗疾病或疾患。
147.如权利要求21-80中任一项所述的免疫细胞或如权利要求121-122所述的组合物在制造用于治疗疾病或疾患的药物中的用途。
148.如权利要求146所述的免疫细胞或组合物或如权利要求147所述的用途，其中所述基因工程化的抗原受体与抗原特异性结合，所述抗原与所述疾病或疾患相关。
149.如权利要求147或权利要求148所述的用途、组合物或免疫细胞，其中所述疾病或所述疾患是癌症，例如肿瘤。
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