JP7394914B2 - 二重shRNAを用いて強化された免疫細胞及びそれを含む組成物 - Google Patents
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Description
本出願は、2018年1月12日に出願された韓国特許出願第10-2018-000
4238号に対する優先権を主張し、その開示は参照によってその全体が本明細書に組み
込まれる。
本出願は、2019年1月5日に作成され、サイズが88,751バイトである145
70-001-228_SEQ_LISTING.txtと表題を付けたテキストファイ
ルとして本出願と共に提出された配列表を参照によって組み入れる。
本開示は、がん免疫療法の分野に広く関係する。例えば、本発明は一般に、標的抗原に
特異的に結合する遺伝子操作された抗原受容体と、免疫細胞の機能を弱める遺伝子の免疫
細胞における発現を低下させるまたは低下させることができる遺伝子破壊剤とを含む免疫
細胞に関する。
これらの細胞を試験管内で培養し、次いで患者の体内に戻すことによる免疫細胞を用いた
抗がん療法は、がん治療の新しい方法として現在多く注目を集めている。特に、ウイルス
等を用いて新たな遺伝情報を注入し、その後、試験管内培養プロセスで培養するプロセス
に供されている免疫細胞はそうでない細胞よりも大きな抗がん効果を有することが報告さ
れている。ここで、T細胞に注入される遺伝情報は普通、標的抗原に対して高い親和性を
有するように改変されたキメラ抗原受容体(以後、CAR)またはモノクローナルT細胞
受容体(以後、mTCR)である。これらの改変免疫細胞は、固有の抗原特異性に限定さ
れることなく、標的抗原を発現しているがん細胞を認識して攻撃し、細胞死を誘導する。
CARを用いてT細胞を遺伝子操作する方法は、最初に1989年、Eshhar et
al.によって提案され、「T-body」の名で呼ばれた。
免疫細胞組成物及び方法であり、該問題は、費用が高いために患者に多大な経済的負担を
課し、CAR-T以外のT細胞に作用し、自己免疫症状及びサイトカイン放出症候群のリ
スクがある。手短に言えば、例えば、本明細書に開示されているのは、高収率及び低生産
コストでの調製方法である。さらに、免疫細胞の機能をより高い確率及び有効性で抑制す
る分子を阻害することにより、本明細書での開示は効果的な細胞治療を提供する技術の必
要性を満たす。本開示が解決しようとする技術的問題は、上記の技術的問題に限定されず
、言及されていない他の技術的問題は以下から当業者にとって明らかであるものとする。
免疫細胞を含む組成物とである。本明細書では提供されるのはまた、免疫細胞を作り出す
方法と、治療方法及び免疫細胞の使用方法とである。
供されるのは、免疫細胞の機能を弱める遺伝子の発現を阻害する2種類の短ヘアピンRN
A(shRNA)をコードする塩基配列と、キメラ抗原受容体(CAR)またはT細胞受
容体(TCR)、例えば、モノクローナルT細胞受容体(mTCR)をコードする塩基配
列を含むベクターである。いくつかの実施形態では、CARまたはTCR、例えば、mT
CRの標的は、がんにおいて発現の増加を示す増加した抗原の中から、またはがん、例え
ば、がん細胞、がん組織及び/または腫瘍微小環境において見いだされる抗原の変異した
形態から選択されるヒト腫瘍抗原である。
ーターによってそれぞれ調節されることを特徴とする。
ーターである。いくつかの実施形態では、2つのプロモーターは、U6プロモーター、例
えば、異なる種に由来するU6プロモーターである。いくつかの実施形態では、2つのプ
ロモーターは、ベクター上で互いに同じ方向に向けられる。いくつかの実施形態では、2
つのプロモーターは、ベクター上で互いに異なる方向に向けられる。例えば、特定の実施
形態では、プロモーターはヘッドトゥーヘッド(head to head)の方向に向けられる。別
の実施形態では、プロモーターは末尾-末尾の方向に向けられる。
受容体またはリガンドである。
PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-
3またはCEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR
1、CD160、CD96、MerTK及び2B4から成る群から選択される。
2A、SHIP1、SHIP2、DGKアルファ、DGKゼータ、Cbl-b、CD14
7、LRR1、TGFBR1、IL10Rアルファ、KLGR1、DNMT3A及びA2
aRから成る群から選択される。
る2種類のshRNAが利用される。いくつかの実施形態では、2種類のshRNAは免
疫細胞の機能を弱める単一の遺伝子を標的にする、またはそれらは免疫細胞の機能を弱め
る異なる遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態では、2種類のshRNAはPD-1
を標的とする。2種類のshRNAを含むいくつかの実施形態では、一方のshRNAは
PD-1を標的とし、第2のshRNAはTIM-3を標的とする。2種類のshRNA
を含むいくつかの実施形態では、一方のshRNAはPD-1を標的とし、第2のshR
NAはTIGITを標的とする。
造を形成する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているshRNAをコード
する塩基配列は、配列番号2~219から成る群から選択される配列を含む。特定の実施
形態では、本明細書に記載されているshRNAをコードする塩基配列は、配列番号2~
219から成る群から選択される配列を含み、その際、該配列はセンスshRNA配列を
コードする。特定の実施形態では、本明細書に記載されているshRNAをコードする塩
基配列は、配列番号2~219から成る群から選択される配列を含み、その際、該配列は
アンチセンスshRNA配列をコードする。
れか一方を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミドベクターまたはウイ
ルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクター、アデ
ノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターである。
を発現するベクターを含む免疫細胞であり、2種類のshRNAの標的遺伝子の発現は、
標的遺伝子についてshRNAを発現させない対照群よりも40%以下に低下する。いく
つかの実施形態では、免疫細胞は、ヒト由来のT細胞とNK細胞との間から選択される。
のための医薬組成物である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はもともと患者に由来す
る。いくつかの実施形態では、患者は、細胞内で発現されたCARまたはTCR、例えば
、mTCRによって標的とされるがん抗原のレベルの増加または変動が検出される腫瘍ま
たはがんを有する。
れた抗原受容体と、免疫細胞の機能を弱める遺伝子の免疫細胞における発現を低下させる
または低下させることができる遺伝子破壊剤とを含む免疫細胞である。
れた抗原受容体と、免疫細胞の機能を弱める遺伝子の免疫細胞における発現を低下させる
または低下させることができる遺伝子破壊剤とを含む免疫細胞である。
)またはT細胞受容体(TCR)である。
施形態では、CARは、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル
伝達ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、CARの細胞外抗原認識ドメインは、
標的抗原に特異的に結合する。
3ζ)鎖の細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、CARの細胞内シグナル伝
達ドメインは共刺激分子をさらに含む。いくつかの実施形態では、共刺激分子は、ICO
S、OX40、CD137(4-1BB)、CD27、及びCD28から成る群から選択
される。いくつかの実施形態では、共刺激分子はCD137(4-1BB)である。いく
つかの実施形態では、共刺激分子はCD28である。
施形態では、TCRは、モノクローナルTCR(mTCR)である。
の中でまたはその表面で発現される。
9D7、AFP(α-フェトプロテイン)、AlbZIP(アンドロゲン誘導のbZIP
)、HPG1(ヒト前立腺特異的遺伝子-1)、α5β1-インテグリン、α5β6-イ
ンテグリン、α-メチルアシル-補酵素Aラセマーゼ、ART-4(ADPリボシルトラ
ンスフェラーゼ-4)、B7H4(v-セットドメイン含有T-細胞活性化阻害剤1)、
BAGE-1(Bメラノーマ抗原-1)、BCL-2(B-細胞 CLL/リンパ腫-2
)、BING-4(WD反復ドメイン46)、CA15-3/CA27-29(ムチン1
)、CA19-9(がん抗原19-9)、CA72-4(がん抗原72-4)、CA12
5(がん抗原125)、カルレチクリン、CAMEL(メラノーマ上のCTL認識抗原)
、CASP-8(カスパーゼ8)、カテプシンB、カテプシンL、CD19(分化抗原群
19)、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD4、CD52、CD
55、CD56、CD80、CEA(がん胎児性抗原SG8)、CLCA2(塩化物チャ
ネルアクセサリー2)、CML28(慢性骨髄性白血病腫瘍抗原28)、コアクトシン様
タンパク質、コラーゲンXXIII、COX-2(シクロオキシゲナーゼ-2)、CT-
9/BRD6(がん/精巣抗原9)、Cten(c-末端テンシン様タンパク質)、サイ
クリンB1、サイクリンD1、cyp-B、CYPB1(チトクロームp450ファミリ
ー1サブファミリーbメンバー1)、DAM-10/MAGE-B1(メラノーマ関連抗
原B1)、DAM-6/MAGE-B2、EGFR/Her1(表皮増殖因子受容体)、
EMMPRIN(ベイシジン)、EpCam、EphA2(EPH受容体A2)、Eph
A3、ErbB3(Erb-B2受容体チロシンキナーゼ3)、EZH2(zeste2
ポリコーム抑制性複合体2サブユニットのエンハンサー)、FGF-5(線維芽細胞増殖
因子5)、FN(フィブロネクチン)、Fra-1(Fos関連抗原-1)、G250/
CAIX(炭酸脱水酵素9)、GAGE-1(G抗原-1)、GAGE-2、GAGE-
3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7b、GAGE-8、GD
EP(前立腺にて差次的に発現される遺伝子)、GnT-V(グルコン酸キナーゼ)、g
p100(メラニン細胞系列特異的抗原GP100)、GPC3(グリピカン3)、HA
GE(らせん抗原)、HAST-2(スルホトランスフェラーゼファミリー1Aメンバー
1)、ヘプシン、Her2/neu/ErbB2(Erb-B2受容体チロシンキナーゼ
2)、HERV-K-MEL、HNE(メデュラシン)、ホメオボックスNKX3.1、
HOM-TES-14/SCP-1、HOM-TES-85、HPV-E6、HPVE7
、HST-2(シルツイン-2)、hTERT、iCE(カスパーゼ1)、IGF-1R
(インスリン様増殖因子-1受容体)、IL-13Ra2(インターロイキン-13受容
体サブユニットα2)、IL-2R(インターロイキン-2受容体)、IL-5(インタ
ーロイキン-5)、未成熟ラミニン受容体、カリクレイン2、カリクレイン4、Ki67
、KIAA0205(リソホスファチジルグリセロールアシルトランスフェラーゼ1)、
KK-LC-1(北九州肺癌抗原-1)、KM-HN-1、LAGE-1(L抗原ファミ
リーメンバー-1)、リビン、MAGE-A1、MAGE-A10、MAGE-A12、
MAGEA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、M
AGE-B1、MAGE-B10、MAGE-B16、MAGEB17、MAGE-B2
、MAGE-B3、MAGE-B4、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-C1
、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-D1、MAGE-D2、MAGE-D4
、MAGE-E1、MAGE-E2、MAGE-F1、MAGE-H1、MAGEL2(
メラノーマ抗原ファミリーL2)、ママグロビンA、MART-1/Melan-A(T
-細胞-1によって認識されるメラノーマ抗原)、MART-2、マトリクスタンパク質
22、MC1R(メラノコルチン1受容体)、M-CSF(マクロファージコロニー刺激
因子)、メソテリン、MG50/PXDN(ペルオキシダシン)、MMP11(マトリク
スメタロプロテイナーゼ11)、MN/CA IX-抗原(炭酸脱水酵素9)、MRP-
3(多剤耐性関連タンパク質-3)、MUC1(ムチン1)、MUC2、NA88-A(
VENT様ホメオボックス2偽遺伝子1)、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラ
ーゼ-V、Neo-PAP(Neo-ポリ(A)ポリメラーゼ)、NGEP(前立腺で発
現される新しい遺伝子)、NMP22(核マトリクスタンパク質22)、NPM/ALK
(ヌクレオホスミン)、NSE(ニューロン特異的エノラーゼ)、NY-ESO-1、N
Y-ESO-B、OA1(変形性関節症QTL1)、OFA-iLRP(がん胎児性抗原
未成熟ラミニン受容体タンパク質)、OGT(O-GlcNAcトランスフェラーゼ)、
OS-9(小胞体レクチン)、オステオカルシン、オステオポンチン、p15(CDK阻
害剤2B)、p53、PAGE-4(P抗原ファミリーメンバー-4)、PAI-1(プ
ラスミノーゲン活性化因子阻害剤-1)、PAI-2、PAP(前立腺酸ホスファターゼ
)、PART-1(前立腺アンドロゲン調節転写物1)、PATE(前立腺及び精巣で発
現された1)、PDEF(前立腺由来のEts因子)、Pim-1-キナーゼ(プロウイ
ルス組み込み部位1)、Pin1(ペプチジル-プロリルcis-transイソメラー
ゼNIMA-相互作用1)、POTE(前立腺、卵巣、精巣、及び胎盤で発現される)、
PRAME(メラノーマで優先的に発現される抗原)、プロステイン、プロテイナーゼ-
3、PSA(前立腺特異的抗原)、PSCA(前立腺幹細胞抗原)、PSGR(前立腺特
異的G-タンパク質共役受容体)、PSM、PSMA(前立腺特異的膜抗原)、RAGE
-1(腎腫瘍癌腫抗原)、RHAMM/CD168、RU1(腎遍在タンパク質1)、R
U2、SAGE(肉腫抗原)、SART-1(T-細胞-1によって認識される扁平上皮
細胞癌腫抗原)、SART-2、SART-3、Sp17(精子タンパク質17)、SS
X-1(SSXファミリーメンバー1)、SSX-2/HOM-MEL-40、SSX-
4、STAMP-1(STEAP2 メタロレダクターゼ)、STEAP、サバイビン、
サバイビン-213、TA-90(腫瘍関連抗原-90)、TAG-72(腫瘍関連糖タ
ンパク質-72)、TARP(TCRγ代替リーディングフレームタンパク質)、TGF
b(形質転換増殖因子β)、TGFbR11(形質転換増殖因子β受容体11)、TGM
-4(トランスグルタミナーゼ4)、TRAG-3(タキソール耐性関連遺伝子3)、T
RG(T-細胞受容体γ遺伝子座)、TRP-1(一過性受容体ポテンシャル-1)、T
RP-2/6b、TRP-2/INT2、Trp-p8、チロシナーゼ、UPA(U-プ
ラスミノーゲン活性化因子)、VEGF(血管内皮増殖因子A)、VEGFR-2/FL
K-1、及びWT1(ウィルムス腫瘍1)から成る群から選択される。いくつかの実施形
態では、標的抗原はCD19またはCD22である。いくつかの実施形態では、標的抗原
はCD19である。
瘍微小環境の中でまたはその表面で増加するがん抗原である。
cr/abl、ベータ-カテニン/m、BRCA1/m、BRCA2/m、CASP-5
/m、CASP-8/m、CDC27/m、CDK4/m、CDKN2A/m、CML6
6、COA-1/m、DEK-CAN、EFTUD2/m、ELF2/m、ETV6-A
ML1、FN1/m、GPNMB/m、HLA-A*0201-R170I、HLA-A
11/m、HLA-A2/m、HSP70-2M、KIAA0205/m、K-Ras/
m、LDLR-FUT、MART2/m、ME1/m、MUM-1/m、MUM-2/m
、MUM-3/m、ミオシンクラス1/m、neo-PAP/m、NFYC/m、N-R
as/m、OGT/m、OS-9/m、p53/m、Pml/RARa、PRDX5/m
、PTPRX/m、RBAF600/m、SIRT2/m、SYTSSX-1、SYT-
SSX-2、TEL-AML1、TGFbRII、及びTPI/mから成る群から選択さ
れ、その際、標的抗原は、がん細胞、がん組織及び/または腫瘍微小環境の中でまたは表
面上で発現されるがん抗原の変異した形態である。
引き起こす:
(i)免疫細胞の増殖の阻害、
(ii)免疫細胞の細胞死の誘導、
(iii)免疫細胞が標的抗原を認識する及び/または活性化される能力の阻害、
(iv)標的抗原に対する免疫応答を誘導しない細胞への免疫細胞の分化の誘導、
(v)免疫細胞の免疫応答を促進する分子に対する免疫細胞の反応の低下、または
(vi)免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する免疫細胞の反応の上昇。
TLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3またはCEA
CAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160
、CD96、MerTK、2B4、FAS、CD45、PP2A、SHP1、SHP2、
DGKアルファ、DGKゼータ、Cbl-b、Cbl-c、CD148、LRR1、TG
FBR1、IL10RA、KLGR1、DNMT3A、及びA2aRから成る群から選択
される。
制する分子に対する免疫細胞の反応を高める。
を高める遺伝子は、免疫チェックポイントの受容体またはリガンドをコードする。
PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-
3またはCEACAM-5)、LAG 3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAI
R1、CD160、CD96、MerTK及び2B4から成る群から選択される。
べて、免疫細胞の機能を弱める免疫細胞における遺伝子の発現を少なくとも30、40、
50、60、70、80、90、または95%低下させる。
る免疫細胞の反応を高める遺伝子の発現を低下させる。
ドをコードする遺伝子の発現を低下させる。
3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3またはCEACAM-5)、L
AG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、Me
rTK及び2B4から成る群から選択される遺伝子の発現を低下させる。
の機能を弱める遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、1を超える遺伝子
破壊剤が、RNAiによって免疫細胞における免疫細胞の機能を弱める遺伝子の発現を低
下させる。
的とする、または免疫細胞の機能を弱める異なる遺伝子を標的とし、その際、第1の遺伝
子破壊剤は第1の遺伝子を標的とし、第2の遺伝子破壊剤は第2の遺伝子を標的とし、ま
たはそれらの任意の組み合わせで標的とする。
いくつかの実施形態では、RNAiには1を超えるshRNAが介在する。いくつかの実
施形態では、RNAiには2つのshRNAが介在する。
形態では、第1のshRNAはPD-1を標的とし、第2のshRNAはTIM-3を標
的とする。いくつかの実施形態では、第1のshRNAはPD-1を標的とし、第2のs
hRNAはCTLA-4を標的とする。いくつかの実施形態では、第1のshRNAはP
D-1を標的とし、第2のshRNAはLAG-3を標的とする。いくつかの実施形態で
は、第1のshRNAはPD-1を標的とし、第2のshRNAはTIGITを標的とす
る。
。いくつかの実施形態では、免疫細胞は1を超えるshRNAをコードするヌクレオチド
配列を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞は2つのshRNAをコードするヌクレ
オチド配列を含む。特に言及されない限り、本明細書で使用されるとき、「塩基配列」「
ヌクレオチド配列」という用語は相互交換可能である。
219及び238~267から成る群から選択される配列を含む。
る。
ぞれ調節される。いくつかの実施形態では、2つの異なるshRNAの発現は2つの異な
るプロモーターによってそれぞれ調節される。いくつかの実施形態では、2つの異なるプ
ロモーターはRNAポリメラーゼIIIのプロモーターである。いくつかの実施形態では
、2つのプロモーターはU6プロモーターである。いくつかの実施形態では、U6プロモ
ーターは異なる種に由来する。いくつかの実施形態では、2つのプロモーターは互いに異
なる方向に向けられる。例えば、特定の実施形態では、プロモーターはヘッドトゥーヘッ
ドの方向に向けられる。別の実施形態では、プロモーターは末尾-末尾の方向に向けられ
る。
クターから発現される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された抗原受容体及び遺伝
子破壊剤は同じベクターから発現される。
る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターまたはアデノ
ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターはレトロウ
イルスベクターである。
る群から選択される。いくつかの実施形態では、免疫細胞はT細胞である。いくつかの実
施形態では、T細胞はCD4+T細胞またはCD8+T細胞である。
ヌクレオチド配列を同一ベクター上で含む。いくつかの実施形態では、2つのshRNA
は互いに異なる方向に向けられた2つの異なるRNAポリメラーゼIIIのプロモーター
によってそれぞれ調節される。例えば、特定の実施形態では、プロモーターはヘッドトゥ
ーヘッドの方向に向けられる。別の実施形態では、プロモーターは末尾-末尾の方向に向
けられる。いくつかの実施形態では、CARはCD19を標的とし、第1のshRNAは
PD-1を標的とし、第2のshRNAはTIGITを標的とする。
(1)標的抗原に特異的に結合する遺伝子操作された抗原受容体をコードする遺伝子と、
(2)免疫細胞の機能を弱める遺伝子の免疫細胞における発現を低下させる、または低下
させることができる遺伝子破壊剤とを同時にまたは任意の順序で連続的に導入し、
それによって、遺伝子操作された抗原受容体が発現され、免疫細胞の機能を弱める遺伝子
の発現が低減される免疫細胞を作り出すことを含む、免疫細胞を作り出す方法である。
)またはT細胞受容体(TCR)である。
施形態では、CARは、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル
伝達ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、CARの細胞外抗原認識ドメインは、
標的抗原に特異的に結合する。
3ζ)鎖の細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、CARの細胞内シグナル伝
達ドメインは共刺激分子をさらに含む。いくつかの実施形態では、共刺激分子は、ICO
S、OX40、CD137(4-1BB)、CD27、及びCD28から成る群から選択
される。いくつかの実施形態では、共刺激分子はCD137(4-1BB)である。いく
つかの実施形態では、共刺激分子はCD28である。
施形態では、TCRは、モノクローナルTCR(mTCR)である。
の中でまたはその表面で発現される。
D7、AFP(α-フェトプロテイン)、AlbZIP(アンドロゲン誘導のbZIP)
、HPG1(ヒト前立腺特異的遺伝子-1)、α5β1-インテグリン、α5β6-イン
テグリン、α-メチルアシル-補酵素Aラセマーゼ、ART-4(ADPリボシルトラン
スフェラーゼ-4)、B7H4(v-セットドメイン含有T-細胞活性化阻害剤1)、B
AGE-1(Bメラノーマ抗原-1)、BCL-2(B-細胞 CLL/リンパ腫-2)
、BING-4(WD反復ドメイン46)、CA15-3/CA27-29(ムチン1)
、CA19-9(がん抗原19-9)、CA72-4(がん抗原72-4)、CA125
(がん抗原125)、カルレチクリン、CAMEL(メラノーマ上のCTL認識抗原)、
CASP-8(カスパーゼ8)、カテプシンB、カテプシンL、CD19(分化抗原群1
9)、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD4、CD52、CD5
5、CD56、CD80、CEA(がん胎児性抗原SG8)、CLCA2(塩化物チャネ
ルアクセサリー2)、CML28(慢性骨髄性白血病腫瘍抗原28)、コアクトシン様タ
ンパク質、コラーゲンXXIII、COX-2(シクロオキシゲナーゼ-2)、CT-9
/BRD6(がん/精巣抗原9)、Cten(c-末端テンシン様タンパク質)、サイク
リンB1、サイクリンD1、cyp-B、CYPB1(チトクロームp450ファミリー
1サブファミリーbメンバー1)、DAM-10/MAGE-B1(メラノーマ関連抗原
B1)、DAM-6/MAGE-B2、EGFR/Her1(表皮増殖因子受容体)、E
MMPRIN(ベイシジン)、EpCam、EphA2(EPH受容体A2)、EphA
3、ErbB3(Erb-B2受容体チロシンキナーゼ3)、EZH2(zeste2ポ
リコーム抑制性複合体2サブユニットのエンハンサー)、FGF-5(線維芽細胞増殖因
子5)、FN(フィブロネクチン)、Fra-1(Fos関連抗原-1)、G250/C
AIX(炭酸脱水酵素9)、GAGE-1(G抗原-1)、GAGE-2、GAGE-3
、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7b、GAGE-8、GDE
P(前立腺にて差次的に発現される遺伝子)、GnT-V(グルコン酸キナーゼ)、gp
100(メラニン細胞系列特異的抗原GP100)、GPC3(グリピカン3)、HAG
E(らせん抗原)、HAST-2(スルホトランスフェラーゼファミリー1Aメンバー1
)、ヘプシン、Her2/neu/ErbB2(Erb-B2受容体チロシンキナーゼ2
)、HERV-K-MEL、HNE(メデュラシン)、ホメオボックスNKX3.1、H
OM-TES-14/SCP-1、HOM-TES-85、HPV-E6、HPVE7、
HST-2(シルツイン-2)、hTERT、iCE(カスパーゼ1)、IGF-1R(
インスリン様増殖因子-1受容体)、IL-13Ra2(インターロイキン-13受容体
サブユニットα2)、IL-2R(インターロイキン-2受容体)、IL-5(インター
ロイキン-5)、未成熟ラミニン受容体、カリクレイン2、カリクレイン4、Ki67、
KIAA0205(リソホスファチジルグリセロールアシルトランスフェラーゼ1)、K
K-LC-1(北九州肺癌抗原-1)、KM-HN-1、LAGE-1(L抗原ファミリ
ーメンバー-1)、リビン、MAGE-A1、MAGE-A10、MAGE-A12、M
AGEA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MA
GE-B1、MAGE-B10、MAGE-B16、MAGEB17、MAGE-B2、
MAGE-B3、MAGE-B4、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-C1、
MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-D1、MAGE-D2、MAGE-D4、
MAGE-E1、MAGE-E2、MAGE-F1、MAGE-H1、MAGEL2(メ
ラノーマ抗原ファミリーL2)、ママグロビンA、MART-1/Melan-A(T-
細胞-1によって認識されるメラノーマ抗原)、MART-2、マトリクスタンパク質2
2、MC1R(メラノコルチン1受容体)、M-CSF(マクロファージコロニー刺激因
子)、メソテリン、MG50/PXDN(ペルオキシダシン)、MMP11(マトリクス
メタロプロテイナーゼ11)、MN/CA IX-抗原(炭酸脱水酵素9)、MRP-3
(多剤耐性関連タンパク質-3)、MUC1(ムチン1)、MUC2、NA88-A(V
ENT様ホメオボックス2偽遺伝子1)、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラー
ゼ-V、Neo-PAP(Neo-ポリ(A)ポリメラーゼ)、NGEP(前立腺で発現
される新しい遺伝子)、NMP22(核マトリクスタンパク質22)、NPM/ALK(
ヌクレオホスミン)、NSE(ニューロン特異的エノラーゼ)、NY-ESO-1、NY
-ESO-B、OA1(変形性関節症QTL1)、OFA-iLRP(がん胎児性抗原未
成熟ラミニン受容体タンパク質)、OGT(O-GlcNAcトランスフェラーゼ)、O
S-9(小胞体レクチン)、オステオカルシン、オステオポンチン、p15(CDK阻害
剤2B)、p53、PAGE-4(P抗原ファミリーメンバー-4)、PAI-1(プラ
スミノーゲン活性化因子阻害剤-1)、PAI-2、PAP(前立腺酸ホスファターゼ)
、PART-1(前立腺アンドロゲン調節転写物1)、PATE(前立腺及び精巣で発現
された1)、PDEF(前立腺由来のEts因子)、Pim-1-キナーゼ(プロウイル
ス組み込み部位1)、Pin1(ペプチジル-プロリルcis-transイソメラーゼ
NIMA-相互作用1)、POTE(前立腺、卵巣、精巣、及び胎盤で発現される)、P
RAME(メラノーマで優先的に発現される抗原)、プロステイン、プロテイナーゼ-3
、PSA(前立腺特異的抗原)、PSCA(前立腺幹細胞抗原)、PSGR(前立腺特異
的G-タンパク質共役受容体)、PSM、PSMA(前立腺特異的膜抗原)、RAGE-
1(腎腫瘍癌腫抗原)、RHAMM/CD168、RU1(腎遍在タンパク質1)、RU
2、SAGE(肉腫抗原)、SART-1(T-細胞-1によって認識される扁平上皮細
胞癌腫抗原)、SART-2、SART-3、Sp17(精子タンパク質17)、SSX
-1(SSXファミリーメンバー1)、SSX-2/HOM-MEL-40、SSX-4
、STAMP-1(STEAP2 メタロレダクターゼ)、STEAP、サバイビン、サ
バイビン-213、TA-90(腫瘍関連抗原-90)、TAG-72(腫瘍関連糖タン
パク質-72)、TARP(TCRγ代替リーディングフレームタンパク質)、TGFb
(形質転換増殖因子β)、TGFbR11(形質転換増殖因子β受容体11)、TGM-
4(トランスグルタミナーゼ4)、TRAG-3(タキソール耐性関連遺伝子3)、TR
G(T-細胞受容体γ遺伝子座)、TRP-1(一過性受容体ポテンシャル-1)、TR
P-2/6b、TRP-2/INT2、Trp-p8、チロシナーゼ、UPA(U-プラ
スミノーゲン活性化因子)、VEGF(血管内皮増殖因子A)、VEGFR-2/FLK
-1、及びWT1(ウィルムス腫瘍1)から成る群から選択される。いくつかの実施形態
では、標的抗原はCD19またはCD22である。いくつかの実施形態では、標的抗原は
CD19である。
瘍微小環境の中でまたはその表面で増加するがん抗原である。
cr/abl、ベータ-カテニン/m、BRCA1/m、BRCA2/m、CASP-5
/m、CASP-8/m、CDC27/m、CDK4/m、CDKN2A/m、CML6
6、COA-1/m、DEK-CAN、EFTUD2/m、ELF2/m、ETV6-A
ML1、FN1/m、GPNMB/m、HLA-A*0201-R170I、HLA-A
11/m、HLA-A2/m、HSP70-2M、KIAA0205/m、K-Ras/
m、LDLR-FUT、MART2/m、ME1/m、MUM-1/m、MUM-2/m
、MUM-3/m、ミオシンクラス1/m、neo-PAP/m、NFYC/m、N-R
as/m、OGT/m、OS-9/m、p53/m、Pml/RARa、PRDX5/m
、PTPRX/m、RBAF600/m、SIRT2/m、SYTSSX-1、SYT-
SSX-2、TEL-AML1、TGFbRII、及びTPI/mから成る群から選択さ
れ、その際、標的抗原は、がん細胞、がん組織及び/または腫瘍微小環境の中でまたは表
面上で発現されるがん抗原の変異した形態である。
引き起こす:
(i)免疫細胞の増殖の阻害、
(ii)免疫細胞の細胞死の誘導、
(iii)免疫細胞が標的抗原を認識する及び/または活性化される能力の阻害、
(iv)標的抗原に対する免疫応答を誘導しない細胞への免疫細胞の分化の誘導、
(v)免疫細胞の免疫応答を促進する分子に対する免疫細胞の反応の低下、または
(vi)免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する免疫細胞の反応の上昇。
TLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3またはCEA
CAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160
、CD96、MerTK、2B4、FAS、CD45、PP2A、SHP1、SHP2、
DGKアルファ、DGKゼータ、Cbl-b、Cbl-c、CD148、LRR1、TG
FBR1、IL10RA、KLGR1、DNMT3A、及びA2aRから成る群から選択
される。
制する分子に対する免疫細胞の反応を高める。
を高める遺伝子は、免疫チェックポイントの受容体またはリガンドをコードする。
PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-
3またはCEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR
1、CD160、CD96、MerTK及び2B4から成る群から選択される。
べて、免疫細胞の機能を弱める免疫細胞における遺伝子の発現を少なくとも30、40、
50、60、70、80、90、または95%低下させる。
る免疫細胞の反応を高める遺伝子の発現を低下させる。
ドをコードする遺伝子の発現を低下させる。
3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3またはCEACAM-5)、L
AG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、Me
rTK及び2B4から成る群から選択される遺伝子の発現を低下させる。
の機能を弱める遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、1を超える遺伝子
破壊剤が、RNAiによって免疫細胞における免疫細胞の機能を弱める遺伝子の発現を低
下させる。
的とする、または免疫細胞の機能を弱める異なる遺伝子を標的とし、その際、第1の遺伝
子破壊剤は第1の遺伝子を標的とし、第2の遺伝子破壊剤は第2の遺伝子を標的とし、ま
たはそれらの任意の組み合わせで標的とする。
いくつかの実施形態では、RNAiには1を超えるshRNAが介在する。いくつかの実
施形態では、RNAiには2つのshRNAが介在する。
形態では、第1のshRNAはPD-1を標的とし、第2のshRNAはTIM-3を標
的とする。いくつかの実施形態では、第1のshRNAはPD-1を標的とし、第2のs
hRNAはCTLA-4を標的とする。いくつかの実施形態では、第1のshRNAはP
D-1を標的とし、第2のshRNAはLAG-3を標的とする。いくつかの実施形態で
は、第1のshRNAはPD-1を標的とし、第2のshRNAはTIGITを標的とす
る。
。いくつかの実施形態では、免疫細胞は1を超えるshRNAをコードするヌクレオチド
配列を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞は2つのshRNAをコードするヌクレ
オチド配列を含む。
219及び238~267から成る群から選択される配列を含む。
る。
ぞれ調節される。いくつかの実施形態では、2つの異なるshRNAの発現は2つの異な
るプロモーターによってそれぞれ調節される。いくつかの実施形態では、2つの異なるプ
ロモーターはRNAポリメラーゼIIIのプロモーターである。いくつかの実施形態では
、2つのプロモーターはU6プロモーターである。いくつかの実施形態では、U6プロモ
ーターは異なる種に由来する。いくつかの実施形態では、2つのプロモーターは互いに異
なる方向に向けられる。例えば、特定の実施形態では、プロモーターはヘッドトゥーヘッ
ドの方向に向けられる。別の実施形態では、プロモーターは末尾-末尾の方向に向けられ
る。
クターから発現される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された抗原受容体及び遺伝
子破壊剤は同じベクターから発現される。
る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターまたはアデノ
ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターはレトロウ
イルスベクターである。
る群から選択される。いくつかの実施形態では、免疫細胞はT細胞である。いくつかの実
施形態では、T細胞はCD4+T細胞またはCD8+T細胞である。
ヌクレオチド配列を同一ベクター上で含む。いくつかの実施形態では、2つのshRNA
は互いに異なる方向に向けられた2つの異なるRNAポリメラーゼIIIのプロモーター
によってそれぞれ調節される。例えば、特定の実施形態では、プロモーターはヘッドトゥ
ーヘッドの方向に向けられる。別の実施形態では、プロモーターは末尾-末尾の方向に向
けられる。いくつかの実施形態では、CARはCD19を標的とし、第1のshRNAは
PD-1を標的とし、第2のshRNAはTIGITを標的とする。
の態様では、本明細書で提供されるのは免疫細胞と薬学的に許容される担体とを含む医薬
組成物である。
たは組成物を投与することを含む治療方法である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作
された抗原受容体は疾患または状態に関連する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施
形態では、疾患または状態はがんまたは腫瘍である。
疫細胞または組成物である。別の態様では、本明細書で提供されるのは、疾患または状態
を治療するための薬物の製造における免疫細胞または組成物の使用である。いくつかの実
施形態では、遺伝子操作された抗原受容体は疾患または状態に関連する抗原に特異的に結
合する。いくつかの実施形態では、疾患または状態はがんまたは腫瘍である。
さらなる非限定的な実施形態を以下に提示する。
1.ベクターであって、
免疫細胞の機能を弱める少なくとも1つの遺伝子の発現を阻害する2種類の短ヘアピンR
NA(shRNA)をコードする塩基配列と、
キメラ抗原受容体(CAR)またはモノクローナルT細胞受容体(mTCR)をコードす
る塩基配列とを含む、前記ベクター。
2.前記2種類のshRNAの発現は、それらが2つの異なるプロモーターによってそ
れぞれ調節されることを特徴とする実施形態1に記載のベクター。
3.前記2つのプロモーターがRNAポリメラーゼIIIのプロモーターである実施形
態2に記載のベクター。
4.前記2つのプロモーターが異なる種に由来するU6プロモーターである実施形態2
に記載のベクター。
5.前記2つのプロモーターが前記ベクター上で互いに異なる方向に向けられる実施形
態2に記載のベクター。
6.免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子が免疫チェックポイントの受容体またはリガン
ドである実施形態1に記載のベクター。
7.前記免疫チェックポイントの受容体またはリガンドが、PD1、PD-L1、CT
LA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3またはCEAC
AM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、
CD96、MerTK及び2B4から成る群から選択される実施形態6に記載のベクター
。
8.免疫細胞の機能を弱める遺伝子が、FAS、CD45、PP2A、SHIP1、S
HIP2、DGKアルファ、DGKゼータ、Cbl-b、CD147、LRR1、TGF
BR1、IL10Rアルファ、KLGR1、DNMT3A及びA2aRから成る群から選
択される実施形態1に記載のベクター。
9.前記2種類のshRNAが免疫細胞の機能を弱める単一の遺伝子を標的とする、ま
たは前記2種類のshRNAが免疫細胞の機能を弱める異なる遺伝子を標的とする実施形
態1に記載のベクター。
10.前記2種類のshRNAがPD-1を標的とする実施形態1に記載のベクター。
11.前記2種類のshRNAのうち、(i)一方のshRNAがPD-1を標的とし
、第2のshRNAがTIM-3を標的とする、または(ii)一方のshRNAがPD
-1を標的とし、第2のshRNAがTIGITを標的とする、実施形態1に記載のベク
ター。
12.前記2種類のshRNAのうち、一方のshRNAをコードする前記塩基配列が
配列番号2~219から成る群から選択される配列を含み、第2のshRNAをコードす
る前記塩基配列が配列番号2~219から成る群から選択される異なる配列を含む実施形
態1に記載のベクター。
13.前記CARまたはmTCRの前記標的が、がん細胞、がん組織及び/または腫瘍
微小環境における発現の上昇を示すヒト腫瘍抗原である、またはがん細胞、がん組織及び
/または腫瘍微小環境に見られる抗原の変異した形態である実施形態1に記載のベクター
。
14.前記ベクターが配列番号220または221の塩基配列を含む実施形態1に記載
のベクター。
15.前記ベクターが、プラスミドベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイル
スベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである実施形態
1に記載のベクター。
16.実施形態1に記載のベクターを含む免疫細胞であって、1以上の遺伝子の発現が
shRNAの非存在下での発現のそれよりも40%以下に低下する、前記免疫細胞。
17.前記免疫細胞がヒト由来のT細胞またはナチュラルキラー(NK)細胞である、
実施形態16に記載の免疫細胞。
18.実施形態1~17のいずれか1つに記載の免疫細胞を含む医薬組成物。
19.前記免疫細胞がもともと患者から得られる、免疫療法を必要とする前記患者の治
療のための実施形態18に記載の医薬組成物。
20.前記患者が、前記免疫細胞で発現される前記CARまたはmTCRの前記標的及
び/または前記標的のレベルの上昇または変動が検出される腫瘍またはがんを有する実施
形態19に記載の医薬組成物。
21.免疫細胞であって、標的抗原に特異的に結合する遺伝子操作された抗原受容体と
、前記免疫細胞の機能を弱める遺伝子の前記免疫細胞における発現を低下させるまたは低
下させることができる遺伝子破壊剤とを含む、前記免疫細胞。
22.前記遺伝子操作された抗原受容体がキメラ抗原受容体(CAR)またはT細胞受
容体(TCR)である実施形態21に記載の免疫細胞。
23.前記遺伝子操作された抗原受容体がCARである実施形態22に記載の免疫細胞
。
24.前記CARが、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル
伝達ドメインとを含む実施形態23に記載の免疫細胞。
25.前記CARの前記細胞外抗原認識ドメインが前記標的抗原に特異的に結合する実
施形態24に記載の免疫細胞。
26.前記CARの前記細胞内シグナル伝達ドメインがCD3ゼータ(CD3ζ)鎖の
細胞内ドメインを含む実施形態24に記載の免疫細胞。
27.前記CARの前記細胞内シグナル伝達ドメインが共刺激分子をさらに含む実施形
態26に記載の免疫細胞。
28.前記共刺激分子がICOS、OX40、CD137(4-1BB)、CD27、
及びCD28から成る群から選択される実施形態27に記載の免疫細胞。
29.前記共刺激分子がCD137(4-1BB)である実施形態28に記載の免疫細
胞。
30.前記共刺激分子がCD28である実施形態28に記載の免疫細胞。
31.前記遺伝子操作された抗原受容体がTCRである実施形態22に記載の免疫細胞
。
32.前記TCRがモノクローナルTCR(mTCR)である実施形態31に記載の免
疫細胞。
33.前記標的抗原ががん細胞、がん組織及び/または腫瘍微小環境の中でまたはその
表面で発現される実施形態31または32に記載の免疫細胞。
34.前記標的抗原が、5T4(栄養膜糖タンパク質)、707-AP、9D7、AF
P(α-フェトプロテイン)、AlbZIP(アンドロゲン誘導のbZIP)、HPG1
(ヒト前立腺特異的遺伝子-1)、α5β1-インテグリン、α5β6-インテグリン、
α-メチルアシル-補酵素Aラセマーゼ、ART-4(ADPリボシルトランスフェラー
ゼ-4)、B7H4(v-セットドメイン含有T-細胞活性化阻害剤1)、BAGE-1
(Bメラノーマ抗原-1)、BCL-2(B-細胞CLL/リンパ腫-2)、BING-
4(WD反復ドメイン46)、CA15-3/CA27-29(ムチン1)、CA19-
9(がん抗原19-9)、CA72-4(がん抗原72-4)、CA125(がん抗原1
25)、カルレチクリン、CAMEL(メラノーマ上のCTL認識抗原)、CASP-8
(カスパーゼ8)、カテプシンB、カテプシンL、CD19(分化抗原群19)、CD2
0、CD22、CD25、CD30、CD33、CD4、CD52、CD55、CD56
、CD80、CEA(がん胎児性抗原SG8)、CLCA2(塩化物チャネルアクセサリ
ー2)、CML28(慢性骨髄性白血病腫瘍抗原28)、コアクトシン様タンパク質、コ
ラーゲンXXIII、COX-2(シクロオキシゲナーゼ-2)、CT-9/BRD6(
がん/精巣抗原9)、Cten(c-末端テンシン様タンパク質)、サイクリンB1、サ
イクリンD1、cyp-B、CYPB1(チトクロームp450ファミリー1サブファミ
リーbメンバー1)、DAM-10/MAGE-B1(メラノーマ関連抗原B1)、DA
M-6/MAGE-B2、EGFR/Her1(表皮増殖因子受容体)、EMMPRIN
(ベイシジン)、EpCam、EphA2(EPH受容体A2)、EphA3、ErbB
3(Erb-B2受容体チロシンキナーゼ3)、EZH2(zeste2ポリコーム抑制
性複合体2サブユニットのエンハンサー)、FGF-5(線維芽細胞増殖因子5)、FN
(フィブロネクチン)、Fra-1(Fos関連抗原-1)、G250/CAIX(炭酸
脱水酵素9)、GAGE-1(G抗原-1)、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-
4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7b、GAGE-8、GDEP(前立腺に
て差次的に発現される遺伝子)、GnT-V(グルコン酸キナーゼ)、gp100(メラ
ニン細胞系列特異的抗原GP100)、GPC3(グリピカン3)、HAGE(らせん抗
原)、HAST-2(スルホトランスフェラーゼファミリー1Aメンバー1)、ヘプシン
、Her2/neu/ErbB2(Erb-B2受容体チロシンキナーゼ2)、HERV
-K-MEL、HNE(メデュラシン)、ホメオボックスNKX 3.1、HOM-TE
S-14/SCP-1、HOM-TES-85、HPV-E6、HPVE7、HST-2
(シルツイン-2)、hTERT、iCE(カスパーゼ1)、IGF-1R(インスリン
様増殖因子-1受容体)、IL-13Ra2(インターロイキン-13受容体サブユニッ
トα2)、IL-2R(インターロイキン-2受容体)、IL-5(インターロイキン-
5)、未成熟ラミニン受容体、カリクレイン2、カリクレイン4、Ki67、KIAA0
205(リソホスファチジルグリセロールアシルトランスフェラーゼ1)、KK-LC-
1(北九州肺癌抗原-1)、KM-HN-1、LAGE-1(L抗原ファミリーメンバー
-1)、リビン、MAGE-A1、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGEA2
、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-B1
、MAGE-B10、MAGE-B16、MAGEB17、MAGE-B2、MAGE-
B3、MAGE-B4、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-C1、MAGE-
C2、MAGE-C3、MAGE-D1、MAGE-D2、MAGE-D4、MAGE-
E1、MAGE-E2、MAGE-F1、MAGE-H1、MAGEL2(メラノーマ抗
原ファミリーL2)、ママグロビンA、MART-1/Melan-A(T-細胞-1に
よって認識されるメラノーマ抗原)、MART-2、マトリクスタンパク質22、MC1
R(メラノコルチン1受容体)、M-CSF(マクロファージコロニー刺激因子)、メソ
テリン、MG50/PXDN(ペルオキシダシン)、MMP11(マトリクスメタロプロ
テイナーゼ11)、MN/CA IX-抗原(炭酸脱水酵素9)、MRP-3(多剤耐性
関連タンパク質-3)、MUC1(ムチン1)、MUC2、NA88-A(VENT様ホ
メオボックス2偽遺伝子1)、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ-V、N
eo-PAP(Neo-ポリ(A)ポリメラーゼ)、NGEP(前立腺で発現される新し
い遺伝子)、NMP22(核マトリクスタンパク質22)、NPM/ALK(ヌクレオホ
スミン)、NSE(ニューロン特異的エノラーゼ)、NY-ESO-1、NY-ESO-
B、OA1(変形性関節症QTL1)、OFA-iLRP(がん胎児性抗原未成熟ラミニ
ン受容体タンパク質)、OGT(O-GlcNAcトランスフェラーゼ)、OS-9(小
胞体レクチン)、オステオカルシン、オステオポンチン、p15(CDK阻害剤2B)、
p53、PAGE-4(P抗原ファミリーメンバー-4)、PAI-1(プラスミノーゲ
ン活性化因子阻害剤-1)、PAI-2、PAP(前立腺酸ホスファターゼ)、PART
-1(前立腺アンドロゲン調節転写物1)、PATE(前立腺及び精巣で発現された1)
、PDEF(前立腺由来のEts因子)、Pim-1-キナーゼ(プロウイルス組み込み
部位1)、Pin1(ペプチジル-プロリルcis-transイソメラーゼNIMA-
相互作用1)、POTE(前立腺、卵巣、精巣、及び胎盤で発現される)、PRAME(
メラノーマで優先的に発現される抗原)、プロステイン、プロテイナーゼ-3、PSA(
前立腺特異的抗原)、PSCA(前立腺幹細胞抗原)、PSGR(前立腺特異的G-タン
パク質共役受容体)、PSM、PSMA(前立腺特異的膜抗原)、RAGE-1(腎腫瘍
癌腫抗原)、RHAMM/CD168、RU1(腎遍在タンパク質1)、RU2、SAG
E(肉腫抗原)、SART-1(T-細胞-1によって認識される扁平上皮細胞癌腫抗原
)、SART-2、SART-3、Sp17(精子タンパク質17)、SSX-1(SS
Xファミリーメンバー1)、SSX-2/HOM-MEL-40、SSX-4、STAM
P-1(STEAP2 メタロレダクターゼ)、STEAP、サバイビン、サバイビン-
213、TA-90(腫瘍関連抗原-90)、TAG-72(腫瘍関連糖タンパク質-7
2)、TARP(TCRγ代替リーディングフレームタンパク質)、TGFb(形質転換
増殖因子β)、TGFbR11(形質転換増殖因子β受容体11)、TGM-4(トラン
スグルタミナーゼ4)、TRAG-3(タキソール耐性関連遺伝子3)、TRG(T-細
胞受容体γ遺伝子座)、TRP-1(一過性受容体ポテンシャル-1)、TRP-2/6
b、TRP-2/INT2、Trp-p8、チロシナーゼ、UPA(U-プラスミノーゲ
ン活性化因子)、VEGF(血管内皮増殖因子A)、VEGFR-2/FLK-1、及び
WT1(ウィルムス腫瘍1)から成る群から選択される実施形態33に記載の免疫細胞。
35.前記標的抗原がCD19またはCD22である実施形態35に記載の免疫細胞。
36.前記標的抗原がCD19である実施形態36に記載の免疫細胞。
37.前記標的抗原ががん抗原であり、前記がん抗原が、その発現ががん細胞、がん組
織及び/または腫瘍微小環境の中でまたはその表面で増加するがん抗原である実施形態3
4~36のいずれかの免疫細胞。
38.前記標的抗原が、α-アクチニン-4/m、ARTC1/m、bcr/abl、
ベータ-カテニン/m、BRCA1/m、BRCA2/m、CASP-5/m、CASP
-8/m、CDC27/m、CDK4/m、CDKN2A/m、CML66、COA-1
/m、DEK-CAN、EFTUD2/m、ELF2/m、ETV6-AML1、FN1
/m、GPNMB/m、HLA-A*0201-R170I、HLA-A11/m、HL
A-A2/m、HSP70-2M、KIAA0205/m、K-Ras/m、LDLR-
FUT、MART2/m、ME1/m、MUM-1/m、MUM-2/m、MUM-3/
m、ミオシンクラス1/m、neo-PAP/m、NFYC/m、N-Ras/m、OG
T/m、OS-9/m、p53/m、Pml/RARa、PRDX5/m、PTPRX/
m、RBAF600/m、SIRT2/m、SYTSSX-1、SYT-SSX-2、T
EL-AML1、TGFbRII、及びTPI/mから成る群から選択され、その際、前
記標的抗原はがん抗原であり、前記がん抗原はがん細胞、がん組織及び/または腫瘍微小
環境の中でまたは表面上で発現される抗原の変異した形態である実施形態33に記載の免
疫細胞。
39.前記免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子の発現が、以下:
(i)前記免疫細胞の増殖の阻害、
(ii)前記免疫細胞の細胞死の誘導、
(iii)前記免疫細胞が前記標的抗原を認識する及び/または活性化される能力の阻害
、
(iv)前記標的抗原に対する免疫応答を誘導しない細胞への前記免疫細胞の分化の誘導
、
(v)前記免疫細胞の免疫応答を促進する分子に対する前記免疫細胞の反応の低下、また
は
(vi)前記免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する前記免疫細胞の反応の上昇の1
以上を引き起こす実施形態21~38のいずれかに記載の免疫細胞。
40.前記免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子が、PD1、PD-L1、CTLA4、
TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3またはCEACAM-5
)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96
、MerTK、2B4、FAS、CD45、PP2A、SHP1、SHP2、DGKアル
ファ、DGKゼータ、Cbl-b、Cbl-c、CD148、LRR1、TGFBR1、
IL10RA、KLGR1、DNMT3A、及びA2aRから成る群から選択される実施
形態39に記載の免疫細胞。
41.前記免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子が、前記免疫細胞の免疫応答を抑制する
分子に対する前記免疫細胞の反応を高める実施形態39に記載の免疫細胞。
42.前記免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する前記免疫細胞の反応を高める前
記遺伝子が免疫チェックポイントの受容体またはリガンドをコードする実施形態41に記
載の免疫細胞。
43.前記免疫チェックポイントの受容体またはリガンドが、PD1、PD-L1、C
TLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3またはCEA
CAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160
、CD96、MerTK及び2B4から成る群から選択される実施形態42に記載の免疫
細胞。
44.前記遺伝子破壊剤が、前記遺伝子破壊剤の非存在下での前記免疫細胞と比べて、
前記免疫細胞の機能を弱める前記免疫細胞における遺伝子の発現を少なくとも30、40
、50、60、70、80、90、または95%低下させる実施形態21~43に記載の
いずれかの免疫細胞。
45.前記遺伝子破壊剤が、前記免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する前記免疫
細胞の反応を高める遺伝子の発現を低下させる実施形態44に記載の免疫細胞。
46.前記遺伝子破壊剤が免疫チェックポイントの受容体またはリガンドをコードする
遺伝子の発現を低下させる実施形態45に記載の免疫細胞。
47.前記遺伝子破壊剤が、PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACA
M(CEACAM-1、CEACAM-3またはCEACAM-5)、LAG3、VIS
TA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、MerTK及び2B
4から成る群から選択される遺伝子の発現を低下させる実施形態46に記載の免疫細胞。
48.前記遺伝子破壊剤が、RNA干渉(RNAi)によって前記免疫細胞の機能を弱
める前記遺伝子の発現を低下させる実施形態45~47のいずれかに記載の免疫細胞。
49.1を超える遺伝子破壊剤が、RNAiによって前記免疫細胞における前記免疫細
胞の機能を弱める前記遺伝子の発現を低下させる実施形態48に記載の免疫細胞。
50.前記遺伝子破壊剤が、前記免疫細胞の機能を弱める単一の遺伝子を標的とする、
または異なる遺伝子破壊剤が前記免疫細胞の機能を弱める異なる遺伝子を標的とし、例え
ば、第1の遺伝子破壊剤は第1の遺伝子を標的とし、第2の遺伝子破壊剤は第2の遺伝子
を標的とする実施形態49に記載の免疫細胞。
51.前記RNAiには短ヘアピンRNA(shRNA)が介在する実施形態48~5
0のいずれかに記載の免疫細胞。
52.前記RNAiには1を超えるshRNAが介在する実施形態51に記載の免疫細
胞。
53.前記RNAiには2つのshRNAが介在する実施形態52に記載の免疫細胞。
54.2つのshRNAがPD-1を標的とする実施形態52~53のいずれかに記載
の免疫細胞。
55.第1のshRNAがPD-1を標的とし、第2のshRNAがTIM-3を標的
とする実施形態52~53のいずれかに記載の免疫細胞。
56.第1のshRNAがPD-1を標的とし、第2のshRNAがCTLA-4を標
的とする実施形態52~53のいずれかに記載の免疫細胞。
57.第1のshRNAがPD-1を標的とし、第2のshRNAがLAG-3を標的
とする実施形態52~53のいずれかに記載の免疫細胞。
58.第1のshRNAがPD-1を標的とし、第2のshRNAがTIGITを標的
とする実施形態52~53のいずれかに記載の免疫細胞。
59.前記免疫細胞がshRNAをコードするヌクレオチド配列を含む実施形態51~
58のいずれかに記載の免疫細胞。
60.前記免疫細胞が1を超えるshRNAをコードするヌクレオチド配列を含む実施
形態59に記載の免疫細胞。
61.前記免疫細胞が2つのshRNAをコードするヌクレオチド配列を含む実施形態
59に記載の免疫細胞。
62.前記shRNA(複数可)をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号2~
219及び238~267から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む実施形態5
9~61のいずれかに記載の免疫細胞。
63.前記shRNA(複数可)をコードするヌクレオチド配列がベクター上に存在す
る実施形態59~62のいずれかに記載の免疫細胞。
64.異なるshRNAの発現が異なるプロモーターによって調節される実施形態63
のいずれかに記載の免疫細胞。
65.2つの異なるshRNAの発現が2つの異なるプロモーターによって調節される
実施形態64に記載の免疫細胞。
66.前記2つの異なるプロモーターがRNAポリメラーゼIIIのプロモーターであ
る実施形態65に記載の免疫細胞。
67.前記2つの異なるプロモーターがU6プロモーターである実施形態66に記載の
免疫細胞。
68.前記U6プロモーターが異なる種に由来する実施形態67に記載の免疫細胞。
69.前記2つのプロモーターが互いに異なる方向に向けられる実施形態65~68の
いずれかに記載の免疫細胞。
70.前記遺伝子操作された抗原受容体及び前記遺伝子破壊剤(複数可)がベクターか
らそれぞれ発現される実施形態21~69のいずれかに記載の免疫細胞。
71.前記遺伝子操作された抗原受容体及び前記遺伝子破壊剤(複数可)が同一ベクタ
ーから発現される実施形態70に記載の免疫細胞。
72.前記ベクターが、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである実施形態7
0~71のいずれかに記載の免疫細胞。
73.前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまた
はアデノ随伴ウイルスベクターである実施形態72に記載の免疫細胞。
74.前記レンチウイルスベクターがレトロウイルスベクターである実施形態73に記
載の免疫細胞。
75.前記免疫細胞がT細胞及びナチュラルキラー(NK)細胞から成る群から選択さ
れる実施形態21~74のいずれかに記載の免疫細胞。
76.前記免疫細胞がT細胞である実施形態75に記載の免疫細胞。
77.前記T細胞がCD4+T細胞またはCD8+T細胞である実施形態76に記載の
免疫細胞。
78.前記免疫細胞が2つのshRNA及びCARまたはmTCRをコードするヌクレ
オチド配列を同一ベクター上で含む実施形態76または77のいずれかに記載の免疫細胞
。
79.前記2つのshRNAが互いに異なる方向に向けられた2つの異なるRNAポリ
メラーゼIIIのプロモーターによってそれぞれ調節される実施形態78に記載の免疫細
胞。
80.前記CARがCD19を標的とし、前記第1のshRNAがPD-1を標的とし
、前記第2のshRNAがTIGITを標的とする実施形態79に記載の免疫細胞。
81.免疫細胞を作り出す方法であって、
(1)標的抗原に特異的に結合する遺伝子操作された抗原受容体をコードする遺伝子と、
(2)遺伝子破壊剤またはその発現が前記免疫細胞の機能を弱める遺伝子の前記免疫細胞
における発現を低下させる、または低下させることができる遺伝子破壊剤とを同時または
任意の順序で連続的に前記免疫細胞に導入することを含み、
それによって、遺伝子操作された抗原受容体が発現され、前記免疫細胞の機能を弱める遺
伝子の発現が低減される前記免疫細胞を作り出す、前記方法。
82.前記遺伝子操作された抗原受容体がキメラ抗原受容体(CAR)またはT細胞受
容体(TCR)である実施形態81に記載の方法。
83.前記遺伝子操作された抗原受容体がCARである実施形態82に記載の方法。
84.前記CARが、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル
伝達ドメインとを含む実施形態83に記載の方法。
85.前記CARの前記細胞外抗原認識ドメインが前記標的抗原に特異的に結合する実
施形態84に記載の方法。
86.前記CARの前記細胞内シグナル伝達ドメインがCD3ゼータ(CD3ζ)鎖の
細胞内ドメインを含む実施形態84に記載の方法。
87.前記CARの前記細胞内シグナル伝達ドメインが共刺激分子をさらに含む実施形
態86に記載の方法。
88.前記共刺激分子がICOS、OX40、CD137(4-1BB)、CD27、
及びCD28から成る群から選択される実施形態87に記載の方法。
89.前記共刺激分子がCD137(4-1BB)である実施形態88に記載の方法。
90.前記共刺激分子がCD28である実施形態88に記載の方法。
91.前記遺伝子操作された抗原受容体がTCRである実施形態82に記載の方法。
92.前記TCRがモノクローナルTCR(mTCR)である実施形態91に記載の方
法。
93.前記標的抗原ががん細胞、がん組織及び/または腫瘍微小環境の中でまたはその
表面で発現される実施形態81~92のいずれかに記載の方法。
94.前記標的抗原が、5T4(栄養膜糖タンパク質)、707-AP、9D7、AF
P(α-フェトプロテイン)、AlbZIP(アンドロゲン誘導のbZIP)、HPG1
(ヒト前立腺特異的遺伝子-1)、α5β1-インテグリン、α5β6-インテグリン、
α-メチルアシル-補酵素Aラセマーゼ、ART-4(ADPリボシルトランスフェラー
ゼ-4)、B7H4(v-セットドメイン含有T-細胞活性化阻害剤1)、BAGE-1
(Bメラノーマ抗原-1)、BCL-2(B-細胞 CLL/リンパ腫-2)、BING
-4(WD反復ドメイン46)、CA15-3/CA27-29(ムチン1)、CA19
-9(がん抗原19-9)、CA72-4(がん抗原72-4)、CA125(がん抗原
125)、カルレチクリン、CAMEL(メラノーマ上のCTL認識抗原)、CASP-
8(カスパーゼ8)、カテプシンB、カテプシンL、CD19(分化抗原群19)、CD
20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD4、CD52、CD55、CD5
6、CD80、CEA(がん胎児性抗原SG8)、CLCA2(塩化物チャネルアクセサ
リー2)、CML28(慢性骨髄性白血病腫瘍抗原28)、コアクトシン様タンパク質、
コラーゲンXXIII、COX-2(シクロオキシゲナーゼ-2)、CT-9/BRD6
(がん/精巣抗原9)、Cten(c-末端テンシン様タンパク質)、サイクリンB1、
サイクリンD1、cyp-B、CYPB1(チトクロームp450ファミリー1サブファ
ミリーbメンバー1)、DAM-10/MAGE-B1(メラノーマ関連抗原B1)、D
AM-6/MAGE-B2、EGFR/Her1(表皮増殖因子受容体)、EMMPRI
N(ベイシジン)、EpCam、EphA2(EPH受容体A2)、EphA3、Erb
B3(Erb-B2受容体チロシンキナーゼ3)、EZH2(zeste2ポリコーム抑
制性複合体2サブユニットのエンハンサー)、FGF-5(線維芽細胞増殖因子5)、F
N(フィブロネクチン)、Fra-1(Fos関連抗原-1)、G250/CAIX(炭
酸脱水酵素9)、GAGE-1(G抗原-1)、GAGE-2、GAGE-3、GAGE
-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7b、GAGE-8、GDEP(前立腺
にて差次的に発現される遺伝子)、GnT-V(グルコン酸キナーゼ)、gp100(メ
ラニン細胞系列特異的抗原GP100)、GPC3(グリピカン3)、HAGE(らせん
抗原)、HAST-2(スルホトランスフェラーゼファミリー1Aメンバー1)、ヘプシ
ン、Her2/neu/ErbB2(Erb-B2受容体チロシンキナーゼ2)、HER
V-K-MEL、HNE(メデュラシン)、ホメオボックスNKX 3.1、HOM-T
ES-14/SCP-1、HOM-TES-85、HPV-E6、HPVE7、HST-
2(シルツイン-2)、hTERT、iCE(カスパーゼ1)、IGF-1R(インスリ
ン様増殖因子-1受容体)、IL-13Ra2(インターロイキン-13受容体サブユニ
ットα2)、IL-2R(インターロイキン-2受容体)、IL-5(インターロイキン
-5)、未成熟ラミニン受容体、カリクレイン2、カリクレイン4、Ki67、KIAA
0205(リソホスファチジルグリセロールアシルトランスフェラーゼ1)、KK-LC
-1(北九州肺癌抗原-1)、KM-HN-1、LAGE-1(L抗原ファミリーメンバ
ー-1)、リビン、MAGE-A1、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGEA
2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-B
1、MAGE-B10、MAGE-B16、MAGEB17、MAGE-B2、MAGE
-B3、MAGE-B4、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-C1、MAGE
-C2、MAGE-C3、MAGE-D1、MAGE-D2、MAGE-D4、MAGE
-E1、MAGE-E2、MAGE-F1、MAGE-H1、MAGEL2(メラノーマ
抗原ファミリーL2)、ママグロビンA、MART-1/Melan-A(T-細胞-1
によって認識されるメラノーマ抗原)、MART-2、マトリクスタンパク質22、MC
1R(メラノコルチン1受容体)、M-CSF(マクロファージコロニー刺激因子)、メ
ソテリン、MG50/PXDN(ペルオキシダシン)、MMP11(マトリクスメタロプ
ロテイナーゼ11)、MN/CA IX-抗原(炭酸脱水酵素9)、MRP-3(多剤耐
性関連タンパク質-3)、MUC1(ムチン1)、MUC2、NA88-A(VENT様
ホメオボックス2偽遺伝子1)、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ-V、
Neo-PAP(Neo-ポリ(A)ポリメラーゼ)、NGEP(前立腺で発現される新
しい遺伝子)、NMP22(核マトリクスタンパク質22)、NPM/ALK(ヌクレオ
ホスミン)、NSE(ニューロン特異的エノラーゼ)、NY-ESO-1、NY-ESO
-B、OA1(変形性関節症QTL1)、OFA-iLRP(がん胎児性抗原未成熟ラミ
ニン受容体タンパク質)、OGT(O-GlcNAcトランスフェラーゼ)、OS-9(
小胞体レクチン)、オステオカルシン、オステオポンチン、p15(CDK阻害剤2B)
、p53、PAGE-4(P抗原ファミリーメンバー-4)、PAI-1(プラスミノー
ゲン活性化因子阻害剤-1)、PAI-2、PAP(前立腺酸ホスファターゼ)、PAR
T-1(前立腺アンドロゲン調節転写物1)、PATE(前立腺及び精巣で発現された1
)、PDEF(前立腺由来のEts因子)、Pim-1-キナーゼ(プロウイルス組み込
み部位1)、Pin1(ペプチジル-プロリルcis-transイソメラーゼNIMA
-相互作用1)、POTE(前立腺、卵巣、精巣、及び胎盤で発現される)、PRAME
(メラノーマで優先的に発現される抗原)、プロステイン、プロテイナーゼ-3、PSA
(前立腺特異的抗原)、PSCA(前立腺幹細胞抗原)、PSGR(前立腺特異的G-タ
ンパク質共役受容体)、PSM、PSMA(前立腺特異的膜抗原)、RAGE-1(腎腫
瘍癌腫抗原)、RHAMM/CD168、RU1(腎遍在タンパク質1)、RU2、SA
GE(肉腫抗原)、SART-1(T-細胞-1によって認識される扁平上皮細胞癌腫抗
原)、SART-2、SART-3、Sp17(精子タンパク質17)、SSX-1(S
SXファミリーメンバー1)、SSX-2/HOM-MEL-40、SSX-4、STA
MP-1(STEAP2 メタロレダクターゼ)、STEAP、サバイビン、サバイビン
-213、TA-90(腫瘍関連抗原-90)、TAG-72(腫瘍関連糖タンパク質-
72)、TARP(TCRγ代替リーディングフレームタンパク質)、TGFb(形質転
換増殖因子β)、TGFbR11(形質転換増殖因子β受容体11)、TGM-4(トラ
ンスグルタミナーゼ4)、TRAG-3(タキソール耐性関連遺伝子3)、TRG(T-
細胞受容体γ遺伝子座)、TRP-1(一過性受容体ポテンシャル-1)、TRP-2/
6b、TRP-2/INT2、Trp-p8、チロシナーゼ、UPA(U-プラスミノー
ゲン活性化因子)、VEGF(血管内皮増殖因子A)、VEGFR-2/FLK-1、及
びWT1(ウィルムス腫瘍1)から成る群から選択される実施形態93に記載の方法。
95.前記標的抗原がCD19またはCD22である実施形態95に記載の方法。
96.前記標的抗原がCD19である実施形態96に記載の方法。
97.前記標的抗原ががん抗原であり、前記がん抗原はその発現ががん細胞、がん組織
及び/または腫瘍微小環境の中でまたはその表面で増加する抗原である実施形態94~9
6のいずれかに記載の方法。
98.前記標的抗原が、α-アクチニン-4/m、ARTC1/m、bcr/abl、
ベータ-カテニン/m、BRCA1/m、BRCA2/m、CASP-5/m、CASP
-8/m、CDC27/m、CDK4/m、CDKN2A/m、CML66、COA-1
/m、DEK-CAN、EFTUD2/m、ELF2/m、ETV6-AML1、FN1
/m、GPNMB/m、HLA-A*0201-R170I、HLA-A11/m、HL
A-A2/m、HSP70-2M、KIAA0205/m、K-Ras/m、LDLR-
FUT、MART2/m、ME1/m、MUM-1/m、MUM-2/m、MUM-3/
m、ミオシンクラス1/m、neo-PAP/m、NFYC/m、N-Ras/m、OG
T/m、OS-9/m、p53/m、Pml/RARa、PRDX5/m、PTPRX/
m、RBAF600/m、SIRT2/m、SYTSSX-1、SYT-SSX-2、T
EL-AML1、TGFbRII、及びTPI/mから成る群から選択され、その際、前
記標的抗原はがん抗原であり、前記がん抗原はがん細胞、がん組織及び/または腫瘍微小
環境の中でまたは表面上で発現される抗原の変異した形態である実施形態93に記載の方
法。
99.前記免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子の発現が、以下:
(i)前記免疫細胞の増殖の阻害、
(ii)前記免疫細胞の細胞死の誘導、
(iii)前記免疫細胞が前記標的抗原を認識する及び/または活性化される能力の阻害
、
(iv)前記標的抗原に対する免疫応答を誘導しない細胞への前記免疫細胞の分化の誘導
、
(v)前記免疫細胞の免疫応答を促進する分子に対する前記免疫細胞の反応の低下、また
は
(vi)前記免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する前記免疫細胞の反応の上昇の1
以上を引き起こす実施形態81~98のいずれかに記載の方法。
100.前記免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子が、PD1、PD-L1、CTLA4
、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3またはCEACAM-
5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD9
6、MerTK、2B4、FAS、CD45、PP2A、SHP1、SHP2、DGKア
ルファ、DGKゼータ、Cbl-b、Cbl-c、CD148、LRR1、TGFBR1
、IL10RA、KLGR1、DNMT3A、及びA2aRから成る群から選択される実
施形態99に記載の方法。
101.前記免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子が、前記免疫細胞の免疫応答を抑制す
る分子に対する前記免疫細胞の反応を高める実施形態99に記載の方法。
102.前記免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する前記免疫細胞の反応を高める
前記遺伝子が免疫チェックポイントの受容体またはリガンドをコードする実施形態101
に記載の方法。
103.前記免疫チェックポイントの受容体またはリガンドが、PD1、PD-L1、
CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3またはCE
ACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD16
0、CD96、MerTK及び2B4から成る群から選択される実施形態102に記載の
方法。
104.前記遺伝子破壊剤が前記遺伝子破壊剤(複数可)の非存在下での前記免疫細胞
と比べて、前記免疫細胞の機能を弱める前記免疫細胞における遺伝子の発現を少なくとも
30、40、50、60、70、80、90、または95%低下させる実施形態81~1
03のいずれかに記載の方法。
105.前記遺伝子破壊剤が、前記免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する前記免
疫細胞の反応を高める遺伝子の発現を低下させる実施形態104に記載の方法。
106.前記遺伝子破壊剤が免疫チェックポイントの受容体またはリガンドをコードす
る遺伝子の発現を低下させる実施形態105に記載の方法。
107.前記遺伝子破壊剤が、PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEAC
AM(CEACAM-1、CEACAM-3またはCEACAM-5)、LAG3、VI
STA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、MerTK及び2
B4から成る群から選択される遺伝子の発現を低下させる実施形態106に記載の方法。
108.前記遺伝子破壊剤が、RNA干渉(RNAi)によって前記免疫細胞の機能を
弱める前記遺伝子の発現を低下させる実施形態105~107のいずれかに記載の方法。
109.1を超える遺伝子破壊剤が、RNAiによって前記免疫細胞における前記免疫
細胞の機能を弱める前記遺伝子の発現を低下させる実施形態108の方法。
110.前記遺伝子破壊剤が前記免疫細胞の機能を弱める単一の遺伝子を標的とする、
または前記免疫細胞の機能を弱める異なる遺伝子を標的とし、第1の遺伝子破壊剤は第1
の遺伝子を標的とし、第2の遺伝子破壊剤は第2の遺伝子を標的とし、またはそれらの任
意の組み合わせで標的とする実施形態109に記載の方法。
111.前記RNAiには短ヘアピンRNA(shRNA)が介在する実施形態108
~110のいずれかに記載の方法。
112.前記RNAiには1を超えるshRNAが介在する実施形態111に記載の方
法。
113.前記RNAiには2つのshRNAが介在する実施形態112に記載の方法。
114.2つのshRNAがPD-1を標的とする実施形態112または113に記載
の方法。
115.第1のshRNAがPD-1を標的とし、第2のshRNAがTIM-3を標
的とする実施形態112または113に記載の方法。
116.第1のshRNAがPD-1を標的とし、第2のshRNAがCTLA-4を
標的とする実施形態112または113に記載の方法。
117.第1のshRNAがPD-1を標的とし、第2のshRNAがLAG-3を標
的とする実施形態112または113に記載の方法。
118.第1のshRNAがPD-1を標的とし、第2のshRNAがTIGITを標
的とする実施形態112または113に記載の方法。
119.前記免疫細胞がshRNAをコードするヌクレオチド配列を含む実施形態11
1~118のいずれかに記載の方法。
120.前記免疫細胞が1を超えるshRNAをコードするヌクレオチド配列を含む実
施形態119に記載の方法。
121.前記免疫細胞が2つのshRNAをコードするヌクレオチド配列を含む実施形
態119に記載の方法。
122.前記shRNA(複数可)をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号2
~219及び238~267から成る群から選択される配列を含む実施形態119~12
1のいずれかに記載の方法。
123.前記shRNAをコードする前記ヌクレオチド配列がベクター上に存在する実
施形態119~122のいずれかに記載の方法。
124.異なるshRNAの発現が異なるプロモーターによってそれぞれ調節される実
施形態123のいずれかに記載の方法。
125.2つの異なるshRNAの発現が2つの異なるプロモーターによってそれぞれ
調節される実施形態124に記載の方法。
126.前記2つの異なるプロモーターがRNAポリメラーゼIIIのプロモーターで
ある実施形態125に記載の方法。
127.前記2つのプロモーターがU6プロモーターである実施形態126に記載の方
法。
128.前記U6プロモーターが異なる種に由来する実施形態127に記載の方法。
129.前記2つのプロモーターが互いに異なる方向に向けられる実施形態125~1
28のいずれかに記載の方法。
130.前記遺伝子操作された抗原受容体及び前記遺伝子破壊剤(複数可)がベクター
からそれぞれ発現される実施形態81~129のいずれかに記載の方法。
131.前記遺伝子操作された抗原受容体及び前記遺伝子破壊剤(複数可)が同一ベク
ターから発現される実施形態130に記載の方法。
132.前記ベクターが、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである実施形態
130~131のいずれかに記載の方法。
133.前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターま
たはアデノ随伴ウイルスベクターである実施形態132に記載の方法。
134.前記レンチウイルスベクターがレトロウイルスベクターである実施形態133
に記載の方法。
135.前記免疫細胞がT細胞及びナチュラルキラー(NK)細胞から成る群から選択
される実施形態81~134のいずれかに記載の方法。
136.前記免疫細胞がT細胞である実施形態135に記載の方法。
137.前記T細胞がCD4+T細胞またはCD8+T細胞である実施形態136に記
載の方法。
138.前記免疫細胞が2つのshRNA及びCARをコードするヌクレオチド配列を
同一ベクター上で含む実施形態136または137のいずれかに記載の方法。
139.前記2つのshRNAが互いに異なる方向に向けられた2つの異なるRNAポ
リメラーゼIIIのプロモーターによってそれぞれ調節される実施形態138に記載の方
法。
140.前記CARがCD19を標的とし、前記第1のshRNAがPD-1を標的と
し、前記第2のshRNAがTIGITを標的とする実施形態139に記載の方法。
141.実施形態21~80のいずれかに記載の免疫細胞を含む組成物。
142.実施形態21~80のいずれかに記載の免疫細胞と薬学的に許容される担体と
を含む医薬組成物。
143.免疫療法を必要とする疾患または状態を有する対象に実施形態21~80のい
ずれかに記載の免疫細胞または実施形態141もしくは142に記載の組成物を投与する
ことを含む治療方法。
144.前記遺伝子操作された抗原受容体が前記疾患または前記状態に関連する抗原に
特異的に結合する実施形態143に記載の方法。
145.前記疾患または前記状態ががん、例えば腫瘍である実施形態143または14
4に記載の方法。
146.疾患または状態の治療に使用するための実施形態21~80のいずれかに記載
の免疫細胞または実施形態141~142に記載の組成物。
147.疾患または状態を治療するための薬物の製造における実施形態21~80のい
ずれかに記載の免疫細胞または実施形態121~122に記載の組成物の使用。
148.前記遺伝子操作された抗原受容体が前記疾患または前記状態に関連する抗原に
特異的に結合する実施形態146に記載の免疫細胞もしくは組成物または実施形態147
に記載の使用。
149.前記疾患または前記状態ががん、例えば腫瘍である、実施形態147または実
施形態148に記載の使用、組成物、または免疫細胞。
よい理解は、本開示の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明を
参照することによって得られるであろう。本明細書に記載される開示の完全な理解を円滑
にするために、多数の用語を以下で定義する。
体及びリガンドを含む免疫細胞の機能を弱める1以上の遺伝子の発現を阻害する2種類の
短ヘアピンRNA(shRNA)をコードする塩基配列と、キメラ抗原受容体(CAR)
またはT細胞受容体(TCR)、例えば、モノクローナルT細胞受容体(mTCR)のよ
うな抗原受容体をコードする塩基配列とを含むベクター;標的抗原に特異的に結合する遺
伝子操作された抗原受容体と、免疫細胞の機能を弱める遺伝子(単数)または遺伝子(複
数)の免疫細胞における発現を低下させるまたは低下させることができる1以上の遺伝子
破壊剤とを含む免疫細胞;免疫細胞を生産する方法;例えば、ヒト患者の免疫療法のため
の、免疫細胞を含む組成物または医薬組成物;及び疾患または状態を有する対象に免疫細
胞を投与することを含む治療方法である。免疫細胞、組成物、または医薬組成物は、1以
上の遺伝的破壊剤を含むので、例えば、がん細胞によって活性化されて免疫細胞の機能を
弱めてもよい2つの免疫チェックポイント分子の遺伝子の発現を低下させる2つのshR
NAをコードするので、これらの遺伝子に対する別個の阻害剤の使用に起因する可能性の
あるサイトカイン放出症候群や自己免疫症状のような重篤で全身性の有害反応を排除する
ことが可能であり、同様に、高価な同時治療から生じる治療コストの増加による負担を軽
減しながら、shRNAが1つだけ発現する場合よりも効果的な細胞療法を提供する。
本明細書に記載され、または参照されている技法及び手順には、当業者によって一般的
によく理解されている、及び/または従来の方法を用いて一般的に採用されているもの、
例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A
Laboratory Manual(4th ed.2012);Current P
rotocols in Molecular Biology(Ausubel et
al.eds.,2003);Therapeutic Monoclonal An
tibodies:From Bench to Clinic(An ed.2009
);Monoclonal Antibodies:Methods and Prot
ocols(Albitar ed.2010);及びAntibody Engine
ering,Vols.1 and 2 (Kontermann and Dubel
eds.,2nd ed.2010).Molecular Biology of
the Cell(6th Ed.,2014)に記載されている広く利用されている方
法が含まれる。
特に明記しない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語はすべて、当業者に
よって一般に理解されているのと同じ意味を有する。この明細書を解釈する目的で、用語
の以下の説明が適用され、適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語は複数形も含
み、逆もまた同様である。特許、出願、公開出願及びその他の刊行物はすべて、参照によ
ってその全体が本明細書に組み込まれる。述べられている用語のいずれかの記載が参照に
よって本明細書に組み込まれるいずれかの文書と矛盾する場合には、以下に述べられる用
語の記載が優先されるものとする。
明の範囲を限定するようには意図されない。単数表現は、文脈によって明確に示されてい
ない限り、複数表現を含む。本発明は、本明細書に記述される特定の方法、プロトコール
、及び試薬等に制限されず、したがって変化し得ることが理解されるべきである。本明細
書において使用される用語は、特定の実施形態を記述することのみを目的としており、ク
レームによってのみ定義される本発明の範囲を制限するようには意図されない。
冠詞の文法的対象の1つまたは1を超えるもの(すなわち、少なくとも1つ)を指すよう
に使用される。例として、「要素(an element)」は、1つの要素または1を
超える要素を意味する。
の組み合わせのいずれかを意味すると理解されるべきである。
と理解されるべきである。
、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対し、15%
、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、または1%の分変動する
量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指
す。一実施形態では、「約」または「およそ」という用語は、参照の量、レベル、値、数
、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さについて、±15%、±
10%、±9%、±8%、±7%、±6%、±5%、±4%、±3%、±2%、または±
1%の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長
さの範囲を指す。
態(an embodiment)」、「特定の実施形態(a particular
embodiment)」、「関連した実施形態」、「特定の実施形態(a certa
in embodiment)」、「追加的な実施形態」、もしくは「さらなる実施形態
」、またはそれらの組み合わせ等に対する言及は、実施形態に関連して記載されている特
定の特徴、構造、または特色が本発明の少なくとも1つの実施形態に含まれていることを
意味する。したがって、本明細書全体のさまざまな箇所で出現する上記フレーズが、必ず
しもすべて同じ実施形態を言及しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、また
は特色は、1つ以上の実施形態における任意の好適な方法で組み合わせられてもよい。
チドを含む高分子または分子の複合体を指す。「ベクター」は本明細書で使用されるとき
、外来遺伝物質の標的細胞への送達または移入を指示することができる任意の核酸構築物
を指し、それはそこで複製させることができ、及び/または発現させることができる。「
ベクター」という用語は本明細書で使用されるとき、送達される構築物を含む。ベクター
は線状分子または環状分子であることができる。ベクターは組み込み型または非組み込み
型であることができる。ベクターの主な種類には、プラスミド、エピソームベクター、ウ
イルスベクター、コスミド、及び人工染色体が挙げられるが、これらに限定されない。ウ
イルスベクターには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウ
イルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが挙げられる
が、これらに限定されない。
機能を弱める遺伝子(単数)または遺伝子(複数)の発現を阻害する1以上の短ヘアピン
RNA(shRNA)をコードする塩基配列と、キメラ抗原受容体(CAR)またはT細
胞受容体(TCR)、例えば、モノクローナルT細胞受容体(mTCR)をコードする塩
基配列とを含むベクターである。本明細書に記載されているような「1つで2つの機能が
ある二重ベクター」は、免疫細胞の機能を弱める遺伝子の発現を阻害する2種類の短ヘア
ピンRNA(shRNA)をコードする塩基配列と、キメラ抗原受容体(CAR)及びT
細胞受容体(TCR)、例えば、モノクローナルT細胞受容体(mTCR)のいずれか1
つをコードする塩基配列とを含むベクターである。本明細書に記載されている1つで2つ
の機能がある二重ベクターは1つで2つの機能があるベクターの形態である。
としても知られる)は、RNA分子が通常、特定のmRNA分子の破壊を引き起こすこと
によって遺伝子発現を配列特異的に阻害する転写後遺伝子サイレンシングのプロセスであ
る。RNAiの活性がある成分は低分子干渉RNA(siRNA)と呼ばれる短/小二本
鎖RNA(dsRNA)であり、それは通常15~30のヌクレオチド(例えば、19~
25、19~24または19~21のヌクレオチド)及び2のヌクレオチド3’オーバー
ハングを含有し、且つ標的遺伝子の核酸配列と一致する。これらの短いRNA種は、さら
に大きなdsRNAのダイサーが介在する切断によって生体内で自然に生成されてもよく
、それらは哺乳類細胞で機能的である。DNA発現プラスミドを用いて、本開示のsiR
NA二本鎖またはdsRNAを細胞内で安定して発現させ、標的遺伝子発現の長期阻害を
達成することができる。一態様では、siRNA二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖は
通常、短ヘアピンRNA(shRNA)と呼ばれるステムループ構造の発現をもたらす短
いスペーサー配列によって連結される。ヘアピンはダイサーによって認識及び切断される
ので、成熟したsiRNA分子を生成する。
ピン構造を作り出すRNA分子を指す。RNA分子はおよそ80bpの長さを有すること
ができる。shRNAが細胞で発現されると、それは一連の工程を経て処理され、遺伝子
サイレンシングのガイドとして作用する低分子干渉RNA(siRNA)になる。簡単に
言えば、shRNAが発現されると、細胞内のDrosha複合体によって処理されてプ
レshRNAになり、次いで核の外に輸送され、そこでダイサーによってさらに処理され
てsiRNAになり、次に一本鎖になり、RISC(RNA誘導サイレンシング複合体)
複合体によって負荷される。ここで、siRNAのアンチセンス鎖は、RISC複合体が
標的遺伝子のmRNAに付着するためのガイドとして作用し、この方法で付着しているR
ISC複合体がmRNAを切断すると、遺伝子サイレンシングが発生する。標的遺伝子の
shRNAは、特定の遺伝子に持続的且つ特異的な遺伝子サイレンシングを可能にするの
で、標的遺伝子を阻害する目的でベクターに含められる。
す。上述の2種類のshRNAもプロモーターに発現を調節させる。ここで、2種類のs
hRNAの発現は、それらが2つの異なるプロモーターによってそれぞれ調節されること
を特徴とする。反復挿入断片を用いた同一の塩基配列によるクローニングが存在するなら
ば、これらの同一の塩基配列間の結合が原因で適切なクローニングが発生せず、組換えま
たは欠失が生じる可能性が高いと判断される。どのRNAポリメラーゼがプロモーターに
結合して転写を開始するかに応じて、プロモーターはRNAポリメラーゼIのプロモータ
ー、RNAポリメラーゼIIのプロモーターまたはRNAポリメラーゼIIIのプロモー
ターであることができる。上記2つのプロモーターは、それらがRNAポリメラーゼII
Iのプロモーター(以後、pol IIIプロモーター)であることを特徴としてもよい
。Pol IIIプロモーターは、5’末端にキャップを付けることなく、またはプロモ
ーターによる調節で転写されるRNAの3’末端にポリ(A)テールを付けることなく、
5’末端から3’末端に正確に転写するように作製されてもよい。Pol IIIプロモ
ーターの種類には、U6プロモーター、H1プロモーター及び7SKプロモーター等が挙
げられるが、これらに限定されない。
8共刺激ドメインと、CD3ζドメインとを含む構築物を指す(図6A)。さらに具体的
には、「G28z」という用語では、「G」はshGFPを表し;「28」はCD28を
表し;「z」はCD3ζを表す。同じパターンに従って、本明細書で使用される「P28
z」という用語は、shPD-1発現カセットと、CD28共刺激ドメインと、CD3ζ
ドメインとを含む構築物(図6A)を指し、「P」はshPD-1を表し;「28」は「
CD28」を表し;「z」はCD3ζを表す。本明細書で使用される「GBBz」という
用語は、shGFP発現カセットと、4-1BB共刺激ドメインと、CD3ζドメインと
を含む構築物(図6A)を指し、「G」はshGFPを表し;「BB」は「4-1BB」
を表し;「z」はCD3ζを表す。本明細書で使用される「PBBz」という用語は、s
hPD-1発現カセットと、4-1BB共刺激ドメインと、及びCD3ζドメインとを含
む構築物(図6A)を指し、「P」はshPD-1を表し;「BB」は「4-1BB」を
表し;「z」はCD3ζを表す。
胞)に対する特異性を持たせる一方で、細胞内にてシグナル伝達を引き起こすポリペプチ
ドのセットである。CARは最低でも、以下に記載されている標的抗原を認識する細胞外
抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、細胞内
シグナル伝達ドメインは、以下に記載されている促進分子または共刺激分子に由来する。
ポリペプチドを含むセットは、連結されてもよく、または刺激によって二量化されるスイ
ッチを介して連結する形態であってもよい。促進分子は上記に記載されているTCRのゼ
ータ鎖であってもよい。「CD19 CAR」はCD19がん抗原を標的とするCARで
ある。
鎖及びベータ(β)鎖のヘテロ二量体で構成されるT細胞上のタンパク質受容体を指すが
、一部の細胞では、TCRはガンマ鎖とデルタ鎖(γ/δ)から成る。特定の実施形態で
は、TCRは、例えば、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、メモリーT細胞、抑制性T
細胞、ナチュラルキラーT細胞、及びガンマデルタT細胞を含む、TCRを含む任意の細
胞で改変されてもよい。
定の抗原を特異的に標的とするように遺伝子操作されるT細胞受容体(TCR)を指す。
それは抗原特異的TCRとも呼ばれ得る。mTCRを有するT細胞は、養子T細胞療法の
ようなウイルス感染やがんの免疫療法に使用されると報告されている。いくつかの態様で
は、キメラ単鎖抗体構築物(scFv)のレトロウイルス移入は、定義された抗原特異性
を持つT細胞を作り出すための戦略として使用されてきた。ほとんどの場合、キメラsc
Fv構築物は、FcR-ガンマまたはCD3ゼータの細胞内シグナル伝達ドメインに連結
され、T細胞エフェクター機能を誘発した。CD3ゼータドメインは、例えば、CD28
、4-1BBまたはOX40のような共刺激分子のシグナル伝達ドメインと組み合わせら
れている。モノクローナルT細胞受容体(mTCR)及びがん治療におけるそれらの応用
は、Stauss et al.,2007、Molecular Therapy,1
5(10):1744-50,Zhang and Morgan,2012,Adva
nced Drug Delivery Reviews,64(8):756-762
、及びLiddy et al.,2012,Nature Medicine,18(
6):980-7に記載されており、それぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書
に組み込まれる。
の精製に使用される細胞質ドメインのないLNGFR(低親和性神経成長因子受容体)を
指す。
チュラルキラー細胞のようなリンパ球、肥満細胞、好酸球、好塩基球から選択されるが、
これらに限定されないものとして本明細書で特徴付けられてもよく;食細胞にはマクロフ
ァージ、好中球、及び樹状細胞が含まれる。T細胞にはCD4+T細胞及びCD8+T細
胞が含まれる。
に使用され、胸腺での成熟を完了し、体内における特定の外来抗原の同定及び他の免疫細
胞の活性化や不活化を含む、免疫系におけるさまざまな役割を有する白血球の主要なタイ
プを指す。T細胞は、任意のT細胞、例えば、培養T細胞、例えば、初代T細胞、または
培養T細胞株、例えば、Jurkat、SupT1等に由来するT細胞、または哺乳動物
から得られるT細胞であることができる。T細胞はCD3+細胞であることができる。T
細胞は、任意のタイプのT細胞であることができ、且つCD4+/CD8+二重陽性T細
胞、CD4+ヘルパーT細胞(例えば、Th1及びTh2細胞)、CD8+T細胞(例え
ば、細胞傷害性T細胞)、末梢血単核細胞(PBMC)、末梢血白血球(PBL)、腫瘍
浸潤リンパ球(TIL)、メモリーT細胞、ナイーブT細胞、抑制性T細胞、ガンマデル
タT細胞(γδT細胞)、等を含むが、これらに限定されない任意の発達段階にあること
ができる。ヘルパーT細胞の追加の種類には、Th3(Treg)、Th17、Th9、
またはTfh細胞のような細胞が含まれる。メモリーT細胞の追加の種類には、中央メモ
リーT細胞(Tcm細胞)、エフェクターメモリーT細胞(Tem細胞及びTEMRA細
胞)のような細胞が含まれる。T細胞は、T細胞受容体(TCR)またはキメラ抗原受容
体(CAR)を発現するように改変されたT細胞のような遺伝子操作されたT細胞を指す
こともできる。T細胞は幹細胞または前駆細胞から分化させることもできる。
るT細胞のサブセットを指す。それらは刺激後の分泌プロファイルを特徴とし、IFN-
γ、TNF-α、IL2、IL4及びIL10のようなサイトカインの分泌が含まれても
よい。「CD4」は、もともとTリンパ球上の分化抗原として定義された55-kDの糖
タンパク質であるが、単球/マクロファージを含む他の細胞にも見いだされる。CD4抗
原は、免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、MHC(主要組織適
合性複合体)クラスII拘束の免疫応答の関連認識要素として関与する。Tリンパ球では
、それらはヘルパー/インデューサーのサブセットを定義する。
、細胞傷害性T細胞として機能するT細胞のサブセットを指す。「CD8」分子は、胸腺
細胞と細胞傷害性Tリンパ球及びサプレッサーTリンパ球に見られる分化抗原である。C
D8抗原は、免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、主要組織適合
性複合体クラスI拘束の相互作用における関連認識要素である。
は、CD56またはCD16の発現及びT細胞受容体(CD3)の非存在によって定義さ
れる末梢血リンパ球のサブセットを指す。本明細書で使用されるとき、「適応NK細胞」
及び「記憶NK細胞」という用語は相互交換可能であり、表現型がCD3-及びCD56
+であり、NKG2CとCD57の少なくとも1つ、及び任意でCD16を発現するが、
以下:PLZF、SYK、FceRγ、及びEAT-2の1以上の発現が欠如するNK細
胞のサブセットを指す。いくつかの実施形態では、CD56+NK細胞の単離された亜集
団は、CD16、NKG2C、CD57、NKG2D、NCRリガンド、NKp30、N
Kp40、NKp46、活性化及び阻害性KIR、NKG2A及び/またはDNAM-1
の発現を含む。CD56+は弱い発現またははっきりした発現であってもよい。
、免疫応答をオンまたはオフにすることができる分子を指す。本来、それらは、細胞死や
自己免疫反応を引き起こす、免疫細胞の過剰な活性化を調節する安全装置である。これら
の免疫チェックポイント分子は、免疫応答を高める刺激性免疫チェックポイント分子と、
免疫応答を阻害する抑制性免疫チェックポイント分子とに大きく分類することができる。
例えば、免疫チェックポイントの受容体及びリガンドは、PD1(プログラム細胞死タン
パク質1)、PD-L1(プログラム死リガンド1)、CTLA4(細胞傷害性Tリンパ
球関連タンパク質4)、TIM-3(T細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有-3
)、CEACAM(3つのサブタイプCEACAM-1、CEACAM-3またはCEA
CAM-5を含む癌胎児性抗原関連細胞接着分子)、LAG3(リンパ球活性化遺伝子3
)、VISTA(T細胞活性化のVドメインIgサプレッサー)、BTLA(B及びTリ
ンパ球減衰因子)、TIGIT(Ig及びITIMのドメインを持つT細胞免疫受容体)
、LAIR1(白血球関連免疫グロブリン様受容体1)、CD160(分化抗原群160
)、CD96(分化抗原群96)、MerTK(癌原遺伝子チロシンタンパク質キナーゼ
MER)、及び2B4(NK細胞活性化誘導リガンド)から成る群から選択されてもよく
、例えば、PD1とTIM3の間で選択されてもよい。
び/または分化を指す。「細胞培養培地」、「培養培地」(いずれの場合も単数の「培地
」)、「栄養補助剤」及び「培地栄養補助剤」は、細胞培養物を培養する栄養組成物を指
す。「培養する」または「維持する」という用語は、組織または身体の外側で、例えば滅
菌プラスチック(またはコーティングされたプラスチック)の細胞培養用の皿またはフラ
スコにて細胞を持続させること、増殖させること(成長させること)及び/または分化さ
せることを指す。「栽培」または「維持」は、培養培地を、細胞を増殖させ、及び/また
は持続させるのに役立つ栄養、ホルモン及び/または他の因子の供給源として利用しても
よい。
含む。細胞に加えて、免疫応答をさらに改善し得る他の薬学的に許容される塩、担体、賦
形剤、ビヒクル及び他の添加剤等が医薬組成物に添加されてもよいことは自明であるので
、その詳細な説明は省略されるべきである。
、ネコ、げっ歯類等を含むがこれらに限定されない任意の動物(例えば、哺乳動物)を指
す。通常、「対象」及び「患者」という用語は、ヒト対象を参照して本明細書では相互交
換可能に使用される。
の重症度、及び/または症状の頻度を抑制すること、排除すること、軽減すること、及び
/または改善することを指す。本明細書で使用されるとき、「治療する」、「治療」及び
「治療すること」という用語は、1以上の治療法の施行に起因する疾患または状態の進行
、重症度及び/または持続期間の軽減または改善を指す。
の生物学的結果を達成するのに有効な、本明細書に記載されているようなT細胞のような
化合物、製剤、材料、または組成物の量を指す。そのような結果には、当該技術分野で好
適な任意の手段によって判定されるようながんの抑制が含まれてもよいが、これに限定さ
れない。
皮内送達、静脈内送達、筋肉内送達及び/または本明細書に記載されているかもしくは当
該技術分野において知られているいずれかの他の物理的送達方法によって物質を患者に注
射する、またはさもなければ物理的に送達する行為を指す。
腫瘍細胞は種々の免疫チェックポイント、例えば、チェックポイントリガンドを発現す
る。したがって、1つの免疫チェックポイントが阻害されたとしても、他の免疫チェック
ポイントの活性化によってCAR-Tの持続的な効果を期待することは困難であり得る。
モノクローナル抗体の組み合わせを主として用いて複数の免疫チェックポイントを阻害し
ており、その抗腫瘍効果が継続的に報告されている(J Clin.Invest.,2
015.,Chauvin,JM;PNAS,2010,Curran MA;Bloo
d,2018,Wierz,M;Cancer cell.2014,Johnston
RJ)。しかしながら、治療用抗体は全身性に過剰な免疫応答を誘導し得ることが知ら
れていた。さらに、CAR-T細胞療法は生命にかかわるサイトカイン放出症候群(CR
S)及び神経毒性にも関連している(Nat Rev Clin Oncol,2017
,Neelapu SS)ということは、CAR-Tと抗体療法の併用が副作用の可能性
を最大化し得ることを示唆している。さらに、従来の同時免疫細胞療法は、それらの高い
コストと、それらがCAR-T以外のT細胞に作用し、自己免疫症状及びサイトカイン放
出症候群のリスクがあるということとに起因して患者に多大な経済的負担を課している。
本発明は上記の課題に対処するために考案された。
該ベクターは免疫細胞の機能を弱める遺伝子の発現を阻害する1以上の種類の短ヘアピン
RNA(shRNA)をコードする塩基配列と、キメラ抗原受容体(CAR)、T細胞受
容体(TCR)、例えば、モノクローナルT細胞受容体(mTCR)をコードする塩基配
列とを含む。
ベクター及びレトロウイルスベクターの中から選択されてもよい。例えば、レンチウイル
スベクター及びレトロウイルスベクターは細胞のゲノムDNAに遺伝子を挿入して、遺伝
子の安定した発現を可能にする。いくつかの実施形態では、例えば、1つで2つの機能が
あるレンチウイルスベクター、例えば、1つで2つの機能がある二重ベクターを用いて、
ベクター上の遺伝子を細胞のゲノムに挿入することができる。
害する2種類の短ヘアピンRNA(shRNA)をコードする塩基配列と、キメラ抗原受
容体(CAR)及びT細胞受容体(TCR)、例えば、モノクローナルT細胞受容体(m
TCR)のいずれか1つをコードする塩基配列とを含むベクターである。
ーターによってそれぞれ調節されることを特徴とする。いくつかの実施形態では、2つの
プロモーターは、RNAポリメラーゼIIIのプロモーターである。いくつかの実施形態
では、2つのプロモーターは異なる種に由来するU6プロモーターである。いくつかの実
施形態では、2つのプロモーターは、ベクター上で互いに異なる方向に向けられる。例え
ば、特定の実施形態では、プロモーターはヘッドトゥーヘッドの方向に向けられる。別の
実施形態では、プロモーターは末尾-末尾の方向に向けられる。いくつかの実施形態では
、免疫細胞の機能を弱める遺伝子は免疫チェックポイントの受容体またはリガンドである
。
PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-
3またはCEACAM-5)、LAG 3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAI
R1、CD160、CD96、MerTK及び2B4から成る群から選択される。いくつ
かの実施形態では、免疫細胞の機能を弱める遺伝子は、FAS、CD45、PP2A、S
HIP1、SHIP2、DGKアルファ、DGKゼータ、Cbl-b、CD147、LR
R1、TGFBR1、IL10Rアルファ、KLGR1、DNMT3A及びA2aRから
成る群から選択される。
の異なる部分を標的とする、またはそれらは免疫細胞の機能を弱める異なる遺伝子を標的
とする。いくつかの実施形態では、2種類のshRNAはPD-1の異なる部分を標的と
する。いくつかの実施形態では、2種類のshRNAはそれぞれPD-1及びTIM-3
を標的とする。いくつかの実施形態では、2種類のshRNAをコードする塩基配列は、
配列番号2~219から成る群から選択される異なる配列を含む。
いて増加したがん抗原の中から、またはがんにおいて見いだされるがん抗原の変異した形
態から選択されるヒト腫瘍抗原である。
れか一方を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、DNA、RNA、プラスミド、
レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びレトロウイルスベクターの中から
選択される。
RNAi(転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)、クェリング、または共抑制とし
ても知られる)は、RNA分子が通常、特定のmRNA分子の破壊を引き起こすことによ
って遺伝子発現を配列特異的に阻害する転写後遺伝子サイレンシングのプロセスである。
RNAiの活性がある成分は低分子干渉RNA(siRNA)と呼ばれる短/小二本鎖R
NA(dsRNA)であり、それは通常15~30のヌクレオチド(例えば、19~25
、19~24または19~21のヌクレオチド)及びジヌクレオチド3’オーバーハング
を含有し、且つ標的遺伝子の核酸配列と一致する。これらの短いRNA種は、さらに大き
なdsRNAのダイサーが介在する切断によって生体内で自然に生成されてもよく、それ
らは哺乳類細胞で機能的である。DNA発現プラスミドを用いて、本明細書に記載されて
いるsiRNA二本鎖またはdsRNAを細胞内で安定して発現させ、標的遺伝子発現の
長期阻害を達成することができる。一態様では、siRNA二本鎖のセンス鎖及びアンチ
センス鎖は通常、短ヘアピンRNA(shRNA)と呼ばれるステムループ構造の発現を
もたらす短いスペーサー配列によって連結される。ヘアピンはダイサーによって認識及び
切断されるので、成熟したsiRNA分子を生成する。
配列がそのステムとの堅固なヘアピン構造を作り出すRNA分子である。本明細書に記載
されているshRNA分子は、約40~120のヌクレオチド長、例えば、約70~90
のヌクレオチド長であってもよい。例示的な実施形態では、shRNAは80ヌクレオチ
ド長であることができる。shRNAは、RNAi経路の内在性の誘因であるマイクロ干
渉RNA(miRNA)をモデルにしている(Lu et al.,2005,Adva
nces in Genetics,54:117-142,Fewell et al
.,2006,Drug Discovery Today,11:975-982)。
shRNAが細胞で発現されると、それは一連の工程を経て処理され、遺伝子サイレンシ
ングのガイドとして作用する低分子干渉RNA(siRNA)になる。簡単に言えば、s
hRNAが発現されると、細胞内のDrosha複合体によって処理されてプレshRN
Aになり、次いで核の外に輸送され、そこでダイサーによってさらに処理されてsiRN
Aになり、次に一本鎖になり、RISC(RNA誘導サイレンシング複合体)によって負
荷される。ここで、siRNAのアンチセンス鎖は、RISC複合体が標的遺伝子のmR
NAに付着するためのガイドとして作用し、この方法で付着しているRISC複合体がm
RNAを切断すると、遺伝子サイレンシングが発生する。標的遺伝子のshRNAは、特
定の遺伝子に持続的且つ特異的な遺伝子サイレンシングを可能にするので、標的遺伝子を
阻害する目的でベクターに含められる。
発現を調節することによって遺伝子サイレンシングを引き起こす。RISCを含有するm
iRNAは、シード領域と呼ばれるmiRNAの5’領域のヌクレオチド2~7と完全な
配列相補性を提示するmRNAと、その3’領域での他の塩基対を標的とする。miRN
Aが介在する遺伝子発現の下方調節は、標的mRNAの切断、標的mRNAの翻訳阻害、
またはmRNA崩壊によって引き起こされてもよい。miRNAが標的とする配列は普通
、標的mRNAの3’-UTRに位置する。単一のmiRNAは種々の遺伝子に由来する
100を超える転写物を標的にしてもよく、1つのmRNAはさまざまなmiRNAの標
的になってもよい。
れ、合成されて、RNAiプロセスを活性化するために細胞に導入されてもよい。Elb
ashirらは、21ヌクレオチドのsiRNA二本鎖(低分子干渉RNAと呼ばれる)
が、哺乳動物細胞で免疫応答を誘導することなく、強力で特異的な遺伝子ノックダウンを
達成することができることを実証した(Elbashir,SM et al.,Nat
ure,2001,411,494-498)。この最初の報告以来、siRNAによる
転写後の遺伝子サイレンシングは、哺乳動物細胞における遺伝子分析のための強力なツー
ルとしてすぐに浮上し、新しい治療法を生み出す可能性を有する。
反復タンパク質をコードする核酸配列を標的とするように設計されたRNAi分子は、米
国特許第9,169,483号及び9,181,544号、ならびに国際特許公開WO2
015179525に記載されており、これらのそれぞれの内容は、その全体が参照によ
り本明細書に組み込まれる。米国特許第9,169,483号及び第9,181,544
号ならびに国際特許公開番号WO2015179525はそれぞれ、RNAの第1の鎖(
例えば、15の隣接ヌクレオチド)及びRNAの第2の鎖(例えば、第1の少なくとも1
2の隣接ヌクレオチドに相補性)を含む単離されたRNA二本鎖を提供し、RNA二本鎖
は長さ約15~30塩基対である。RNAの第1の鎖とRNAの第2の鎖は、RNAルー
プ(約4から50ヌクレオチド)によって操作可能に連結されて、発現カセットに挿入さ
れてもよいヘアピン構造を形成してもよい。ループ部分の非限定例には、その内容が参照
により全体として本明細書に組み入れられる米国特許第9,168,483号の配列番号
9~14が挙げられる。RNA二本鎖を形成するのに使用されてもよいRNAの鎖、完全
な配列または配列の一部のいずれかの非限定例には、米国特許第9,169,483号の
配列番号1~8及び米国特許第9,181,544号の配列番号1~11、33~59、
208~210、213~215及び218~221が挙げられ、これらのそれぞれの内
容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。RNAi分子の非限定例には、米
国特許第9,169,483号の配列番号1~8、米国特許第9,181,544号の配
列番号1~11、33~59、208~210、213~215及び218~221、及
び国際特許公開番号WO2015179525の配列番号1、6、7と35~38が挙げ
られ、これらのそれぞれの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
てもよい。外来性siRNA二本鎖は、内在性dsRNAと同様に、それが細胞に導入さ
れると、組み立てられて、siRNA二本鎖の2つの鎖の一方に対して相補性である(す
なわち、アンチセンス鎖)RNA配列と相互作用する集合複合体である、RNA誘導のサ
イレンシング複合体(RISC)を形成することができる。プロセス中に、siRNAの
センス鎖(またはパッセンジャー鎖)は複合体から失われる一方で、siRNAのアンチ
センス鎖(またはガイド鎖)はその相補性RNAと一致する。特に、siRNAを含むR
ISC複合体の標的は完全な配列相補性を提示するmRNAである。次いで、siRNA
が介在する遺伝子サイレンシングは、標的を切断、遊離、及び分解することによって発生
する。
siRNA二本鎖は、一本鎖(ss)-siRNA(例えばアンチセンス鎖RNAまたは
アンチセンスオリゴヌクレオチド)の使用と比べて、標的RNAの破壊の効率という点で
はるかに大きな利点を提供する。多くの場合、対応する二本鎖の効果的な遺伝子サイレン
シング効力を達成するには、さらに高濃度のss-siRNAを必要とする。
イドラインは一般に、サイレンシングされる遺伝子の領域を標的とする19ヌクレオチド
の二本鎖領域、対称の2~3ヌクレオチドの3’オーバーハング、5’-リン酸基及び3
’-ヒドロキシル基を生成することを推奨した。siRNA配列の優先性を管理してもよ
い他のルールには、(i)アンチセンス鎖の5’末端でのA/U;(ii)センス鎖の5
’末端でのG/C;(iii)アンチセンス鎖の5’末端の1/3での少なくとも5つA
/U残基;(iv)長さが9ヌクレオチドを超えるGC区間の非存在が挙げられるが、こ
れらに限定されない。そのような考察に従って、標的遺伝子の特定の配列と一緒に、哺乳
動物の標的遺伝子の発現を抑制するのに不可欠な非常に効果的なsiRNA分子が容易に
設計されてもよい。
を弱める1以上の遺伝子の発現を阻害する1以上の種類の短ヘアピンRNA(shRNA
)をコードする塩基配列と、キメラ抗原受容体(CAR)またはT細胞受容体(TCR)
、例えば、モノクローナルT細胞受容体(mTCR)のいずれか1つをコードする塩基配
列とを含む。
る1種類のshRNAをコードする。いくつかの実施形態では、塩基配列は、免疫細胞の
機能を弱める2つの遺伝子の発現を阻害する2種類のshRNAをコードし、その際、ベ
クターは「1つで2つの機能がある二重ベクター」と呼ばれる。他の実施形態では、塩基
配列は、免疫細胞の機能を弱める2を超える遺伝子の発現を阻害する2を超える種類のs
hRNAをコードする。
弱める単一遺伝子、例えば、単一遺伝子のさまざまな部分を標的とすることを特徴として
もよい。例えば、2つ以上の種類のshRNAは、PD-1、例えば、PD-1のさまざ
まな部分を標的とすることができる。他の実施形態では、2つ以上の種類のshRNAは
、それらが免疫細胞の機能を弱める異なる遺伝子を標的とする、例えば、PD-1及びT
IM-3を標的とすることを特徴としてもよい。
が配列番号2から219及び238から267から成る群から選択されるさまざまな配列
を含むこと、例えば、それらが配列番号2から117及び238から267から成る群か
ら選択される異なる配列を含んでもよいこと、例えば、それらが配列番号2から12、7
0から75、及び266から267から成る群から選択されるさまざまな配列を含んでも
よいことを特徴としてもよい。
ーターによってそれぞれ調節されてクローニングの間での組換えまたは欠失の作為を最小
限に抑えることを特徴としてもよい。
始するかに応じて、プロモーターはRNAポリメラーゼIのプロモーター、RNAポリメ
ラーゼIIのプロモーターまたはRNAポリメラーゼIIIのプロモーターであってもよ
い。上記2つのプロモーターは、それらがRNAポリメラーゼIIIのプロモーター(以
後、pol IIIプロモーター)であることを特徴としてもよい。Pol IIIプロ
モーターは、5’末端にキャップを付けることなく、またはプロモーターによる調節で転
写されるRNAの3’末端にポリ(A)テールを付けることなく、5’末端から3’末端
に正確に転写するように作製されてもよい。Pol IIIプロモーターの種類には、U
6プロモーター、H1プロモーター、7SKプロモーター等が挙げられるが、これらに限
定されない。ベクターに含まれる2つのプロモーターは異なっていてもよく、上記の3種
を含むPol IIIプロモーターの中から選択されてもよく、同じ種類のプロモーター
が選択されるならば、それらは異なる種に由来してもよい。例えば、2つのプロモーター
は、U6プロモーター、例えば、ヒト及びマウスに由来するU6プロモーターのような、
異なる種に由来するU6プロモーターであってもよい。U6プロモーターによって作り出
された転写物は核内に留まるので、これは核に存在するDrosha複合体にshRNA
がプレshRNAにプロセシングされるプロセスを促進させることができると判断される
。
けられることを特徴としてもよい。例えば、特定の実施形態では、プロモーターはヘッド
トゥーヘッドの(→←)方向に向けられる。別の実施形態では、プロモーターは、末尾-
末尾(←→)の方向に向けられる。1つで2つの機能がある二重ベクターでは、ベクター
上で異なる方向に向けられるということは、その発現が2つのプロモーターによって調節
されているそれぞれのshRNAが転写されると、RNAポリメラーゼが動く方向が単一
の核酸分子にて異なる方向を向くことを意味する。例示的な実施形態では、2つのプロモ
ーターは→←方向であることができる(図15A)。別の例示的な実施形態では、2つの
プロモーターは←→方向であることができる(図15B)。例えば、2つのプロモーター
はベクターでの→←方向を想定してもよい。
それの約90%以下に低減され、例えば、標的遺伝子の発現は、対照群のそれの約80%
以下、70%以下、約60%以下、約50%以下、約40%以下、約30%以下、約20
%以下、及び約10%以下に低減される。
ンスshRNAの塩基配列)、鋭いヘアピンを生成できる配列、及び相同性の高い配列に
相補性の配列(以後、アンチセンスshRNA塩基配列)を有するように設計される。自
己相補性部分間の非共有結合はステム構造を形成し、shRNAが細胞内で発現され、及
び処理されると、アンチセンスshRNA塩基配列が、遺伝子サイレンシングプロセスに
おける標的遺伝子のmRNAのガイドとして作用する。例えば、本明細書においてshR
NAの発現に使用されるカセットの塩基配列は、NNNNNNNNNNNNNNNNNN
NNN(21塩基)-ループ配列-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(19塩
基)の構造を含むことができる。一実施形態では、21塩基の区間はセンスshRNA塩
基配列をコードし、19塩基の区間は21塩基の区間に相補性または実質的に相補性であ
り、アンチセンスshRNA塩基配列をコードする。別の実施形態では、19塩基の区間
はセンスshRNA塩基配列をコードし、21塩基の区間は19塩基の区間に相補性また
は実質的に相補性であり、アンチセンスshRNA塩基配列をコードする。したがって、
発現させると、得られるRNAはステムとループの構造を形成する。特定の実施形態では
、カセットに含まれてもよい標的遺伝子(ヒト由来)のそのようなセンスまたはアンチセ
ンスshRNA塩基配列は、配列番号1~219から成る群から選択される。具体的な実
施形態では、本明細書でshRNAの発現に使用されるカセットの塩基配列は配列番号2
20~224から成る群から選択することができる。
ーターの3’末端に配置することができ、U6プロモーターによって転写を停止するのに
必要なTTTTTはすべてのshRNA塩基配列の3’末端に配置することができる。
えて、これらの配列と少なくとも50%、具体的には少なくとも70%、さらに具体的に
は少なくとも80%、一層さらに具体的には少なくとも90%、そして最も具体的には少
なくとも95%の配列相同性を示す核酸配列を含んでもよい。これは、siRNA(低分
子干渉RNA)や細胞内で処理されて特にsiRNAとなるshRNAの場合、ある程度
の変異、特に5’末端の変異は認容され、標的遺伝子の正常なノックダウンを引き起こす
こと、且つ遺伝子サイレンシングで役割を担うmiRNAと同様の構造を有するように行
われるsiRNAとshRNAの変異が標的遺伝子のノックダウンをさらに効果的に誘導
することが報告されているためである。さらに、ベクターの使用において、当業者に自明
であるのは、ベクター内の変動、すなわち、特定の配列をベクターに導入するためのクロ
ーニングプロセスにおいて生じてもよい塩基配列の付加、修飾または欠失であり、または
意図された遺伝子が発現される程度のベクターの使いやすさを改善するための構成要素の
変更または導入である。
の増殖を阻害することまたは細胞死を引き起こすこと、活性化するために免疫細胞が反応
する必要がある分子との反応を低下させること、免疫細胞が反応標的を認識するために必
要な遺伝子の発現を阻害すること、及び特定の標的に対して免疫応答を引き起こす代わり
に異なる機能を担う異なる種類の免疫細胞への分化を引き起こすことが挙げられる。代表
的な例には、以下に説明される免疫チェックポイントに関連する分子が挙げられるが、こ
れらに限定されない。
ントの受容体またはリガンドであることを特徴としてもよい。免疫チェックポイントは、
免疫系に存在し、免疫応答をオンまたはオフにすることができる分子である。それらは、
細胞死や自己免疫反応を引き起こす免疫細胞の過剰な活性化を調節する安全装置と見なす
ことができる。これらの免疫チェックポイント分子は、免疫応答を高める刺激性免疫チェ
ックポイント分子と、免疫応答を阻害する抑制性免疫チェックポイント分子とに大きく分
類することができる。多くのがん細胞は、抑制性免疫チェックポイントシグナル、特に免
疫細胞上の抑制性免疫チェックポイントの受容体及びリガンドを活性化することにより、
免疫系を免れることが報告されている。したがって、特定のがんを標的とする免疫細胞療
法は、がんのこの回避作用を無効にすることによって効果的にされてもよく、これは、抑
制性免疫チェックポイント受容体及びそれらのリガンドの活性化を阻害することによって
、またはそれらの発現を低下させることによって達成されてもよい。例えば、免疫チェッ
クポイントの受容体及びリガンドは、PD1(プログラム細胞死タンパク質1)、PD-
L1(プログラム死リガンド1)、CTLA4(細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4
)、TIM-3(T細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有-3)、CEACAM(
3つのサブタイプCEACAM-1、CEACAM-3またはCEACAM-5を含む癌
胎児性抗原関連細胞接着分子)、LAG3(リンパ球活性化遺伝子3)、VISTA(T
細胞活性化のVドメインIgサプレッサー)、BTLA(B及びTリンパ球減衰因子)、
TIGIT(Ig及びITIMのドメインを持つT細胞免疫受容体)、LAIR1(白血
球関連免疫グロブリン様受容体1)、CD160(分化抗原群160)、CD96(分化
抗原群96)、MerTK(癌原遺伝子チロシンタンパク質キナーゼMER)、及び2B
4(NK細胞活性化誘導リガンド)から成る群から選択されてもよく、例えば、PD1、
TIM3及びTIGITの間で選択されてもよい。
よって活性化されているTリンパ球に対して負の調節因子、例えば、FAS(CD95、
APO-1またはアポトーシス抗原-1とも呼ばれる)として作用するAICD(活性化
誘導細胞死)を促進することができる受容体をコードすることを特徴としてもよい。いく
つかの実施形態では、免疫細胞の機能を弱める遺伝子は、それがTCRのシグナル活性化
を抑制する因子をコードすることを特徴としてもよく、例えば、因子はCD45、PP2
A、SHP1、SHP2、DGKアルファ、DGKゼータ、Cbl-b、Cbl-c及び
CD148から選択することができる。いくつかの実施形態では、免疫細胞の機能を弱め
る遺伝子は、それが4-1BBのシグナル抑制を介してCAR及び/またはTCR、例え
ば、mTCRの効力を抑制するタンパク質をコードすることを特徴としてもよく、4-1
BBは、TCRの本明細書に記載される共刺激分子、例えば、LRR1(ロイシンリッチ
反復タンパク質1)である。いくつかの実施形態では、免疫細胞の機能を弱める遺伝子は
、そのリガンドがサイトカインであり、T細胞を抑制する受容体、例えばTGFBR1(
形質転換増殖因子ベータ受容体1)及びIL10Rアルファ(IL-10Rサブユニット
アルファ)をコードすることを特徴としてもよい。いくつかの実施形態では、免疫細胞の
機能を弱める遺伝子は、それがT細胞及びNK細胞の増殖能力及び細胞傷害性を阻害する
受容体、例えばKLGR1(キラー細胞レクチン様受容体G1)をコードすることを特徴
としてもよい。いくつかの実施形態では、免疫細胞の機能を弱める遺伝子は、ノックアウ
ト(KO)されるとT細胞疲弊の疲弊を抑制すると報告されている新しいDNAのメチル
化に関連する調節因子、例えばTNMT3a(DNAメチルトランスフェラーゼ 3アル
ファ)をコードすることを特徴としてもよい。いくつかの実施形態では、免疫細胞の機能
を弱める遺伝子は、活性化されるとT細胞の細胞毒性及びサイトカイン産生能を阻害する
ことができる、腫瘍微小環境に過剰に存在するアデノシンの受容体、例えばA2aR(ア
デノシン受容体サブタイプA2a)をコードすることを特徴としてもよい。
5、PP2A、SHP1、SHP2、DGKアルファ、DGKゼータ、Cbl-b、Cb
l-c、CD148、LRR1、TGFBR1、IL10RA、KLGR1、DNMT3
A及びA2aRから成る群から選択されることを特徴としてもよい。
受容体(mTCR)
本明細書で提供されているように、1つで2つの機能があるベクターは免疫細胞の機能
を弱める1以上の遺伝子の発現を阻害する1以上の種類の短ヘアピンRNA(shRNA
)をコードする塩基配列と、キメラ抗原受容体(CAR)またはT細胞受容体(TCR)
、例えば、モノクローナルT細胞受容体(mTCR)のいずれか1つをコードする塩基配
列とを含む。
に対する特異性を持たせる一方で、細胞内にてシグナル伝達を引き起こすポリペプチドの
セットである。CARは最低でも、以下に記載されている標的抗原を認識する細胞外抗原
認識ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、細胞内シグ
ナル伝達ドメインは促進分子または共刺激分子に由来する。
可変断片ドメイン(以後、scFv)と、scFvと細胞膜の間の距離を調節するスペー
サードメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメイン(以後、ISD)とを
含む。ISDは次に、1以上のT細胞の生体内増殖及び長寿命に寄与する共刺激ドメイン
(CD28、CD137またはOX40)と、T細胞の活性化に寄与するTCRシグナル
伝達ドメイン(CD3ゼータ、CD3ζ)とを含む。このようにして調製されているCA
Rを発現するように改変されたT細胞は、標的抗原を発現しているがん細胞を高い特異性
で認識することによって活性化され、そのようながん細胞の死を効果的に誘導し、同時に
体内で指数関数的に増殖し、且つ長い間生き続けることができる。例えば、B細胞特異的
抗原であるCD19を標的とするように調製されたCAR-T細胞(CART-19)を
B細胞白血病患者に投与したところ、細胞は1,000~10,000倍に増殖し、体内
で数年間生き続けることが報告された。その結果、CART-19は、従来の化学療法な
どが有効でなかった末期急性リンパ芽球性白血病(B-ALL)患者に対して実施された
臨床試験で90%の完全奏効を示し、治験責任医師が開始した早期の臨床試験段階でグロ
ーバルな製薬会社へのライセンス供与のまれな症例につながった。それは、2017年に
米国FDAの認可を受けた最初のCAR-T細胞療法剤となったが、その後、2番目のC
AR-Tも認可された。
パク質4)またはPD-1(プログラム細胞死タンパク質1)のような免疫チェックポイ
ント受容体が存在する。これらの受容体は本来、T細胞の過剰な活性化及び細胞死、また
は自己免疫反応の誘発を調節するための安全装置である。しかしながら、がん細胞、特に
固形がんは、これを用いてT細胞による免疫監視を回避すると報告されている。例えば、
がん細胞がPD-L1(プログラム死リガンド1)を表面で発現すると、その受容体であ
るPD-1を発現するT細胞ががん細胞を認識して活性化されるが、PD-1からの活性
化抑制シグナルによって程なく疲弊してしまう。これらの免疫チェックポイント受容体か
らのシグナルによるT細胞活性の阻害を防ぐために、標的免疫チェックポイント受容体に
よるシグナル伝達を阻害する、CTLA4またはPD-1、等に対するモノクローナル抗
体などが開発された。これらの免疫チェックポイント受容体阻害剤を使用することによっ
て免疫チェックポイントの遮断を介してT細胞の全体的な免疫機能を改善する治療法は、
さまざまな固形がんに対しても同様に有効性を示している。
で、CAR-T細胞の周囲での免疫抑制環境の存在は治療効果に対する主要な障害として
作用する。実際、B細胞白血病に示される治療効果とは異なって、固形腫瘍を標的とする
ように調製されたCAR-Tは、期待できる治療効果をまれにしか示してこなかった。こ
れは、血液がんとは異なり、固形腫瘍が免疫抑制性の腫瘍微小環境を作り出し、CAR-
T細胞の活性及び増殖を抑制するためであると考えられている。さらに、B細胞血液がん
の間でさえ、ほぼ90%がCART―19を用いた治療法に反応した急性リンパ芽球性白
血病(ALL)患者とは異なり、治療効果はリンパ腫患者(20~50%の奏効)または
慢性リンパ芽球性白血病患者(CLL、20%前後の奏効)では相対的に低かったことが
報告されている。
小環境にて発現され、それに従ってがん性組織内のT細胞の機能が疲弊することが報告さ
れた。さらに、CLL患者から得られたT細胞は、PD-1、CD160及びCD244
のような免疫チェックポイント受容体の高度な発現によってすでに実質的に疲弊している
ことが報告されている。
は抗PD-1阻害抗体の同時使用が抗がん効果を改善することを示す前臨床試験の結果が
報告されたが、これらの組み合わせを用いた臨床試験は現在進行中である。しかしながら
、抗体とCAR-T細胞のそのような同時治療による課題は、身体全体に広がった抗体が
、CAR-T細胞だけでなく、体内に存在する他のすべてのT細胞にも影響を及ぼし、例
えば、サイトカイン放出症候群、ならびに自己免疫症状のような重篤且つ全身性の有害反
応を生じる可能性があることである。指摘されている別の課題は、細胞療法と高価な抗体
療法の併用から生じる治療コストの上昇である。
内の遺伝子発現を調節する試みが最近行われている。国際特許出願公開WO2016/0
69282は、TCRα鎖、TCRβ鎖、β-2ミクログロブリン及びFASから成る群
から選択される内在性遺伝子発現を下方調節することができる核酸で修飾され、さらに標
的細胞上の表面抗原に対する親和性を含む修飾されたT細胞受容体(TCR)をコードす
る核酸、またはキメラ抗原受容体(CAR)をコードするエレクトロポレーションで導入
された核酸を含むT細胞を生成するための組成物及び方法を開示する。出版物は、CRI
SPR/Cas9のような遺伝子ハサミを用いて内在性遺伝子の発現をノックアウトする
ことができるが、特許公報にて開示されているCAR-T細胞の調製方法はかなり複雑で
あり、生産収率が低く、生産コストが高いという課題を有すると述べている。
子を阻害する単一種類の短ヘアピンRNA(shRNA)がCARを発現する細胞に使用
されてもよいことを開示している。細胞療法の費用負担が高いので、失敗した場合の患者
は種々の負担に直面する。しかしながら、単一種類のshRNAは、そのような標的分子
の活性を効果的に阻害することができない可能性がある。いくつかの実施形態では、ポリ
ペプチドを含むセットが連結されてもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドを含
むセットは、それらが刺激によって二量化されるスイッチを介して連結する形態であって
もよい。いくつかの実施形態では、CARは、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメイ
ンと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む融合タンパク質であってもよい。さらなる実
施形態では、CAR融合タンパク質は、N末端にリーダー配列をさらに含んでもよく、リ
ーダー配列はCARが発現され、そして細胞膜に固定されるようになる過程において切断
されてもよい。
択される鎖を含んでもよい。いくつかの実施形態では、鎖は、以下に記載される標的抗原
、CD3、及びゼータ鎖、さらには共刺激分子を認識することができ、共刺激分子は、I
COS、OX40、CD137(4-1BB)、CD27またはCD28の中から選択さ
れてもよい。
て、定義された抗原特異性を持つTCR、例えば、mTCRを作り出すことができる。さ
らなる実施形態では、キメラscFv構築物は、FcR-ガンマまたはCD3ζの細胞内
シグナル伝達ドメインに連結されて、T細胞エフェクター機能を誘発することができる。
CD3ζでは、ドメインを共刺激分子のシグナル伝達ドメインと組み合わせることができ
、その際、抗体の結合は、エフェクターT細胞の機能を始動させることができ、共刺激シ
グナルを送達することもできる。さらなる実施形態では、共刺激分子はCD28、4-1
BB、及びOX40から選択することができる。
むことができ、TCR、例えば、mTCRの鎖はCD3及びゼータ(ζ)鎖との非共有結
合を介して複合体を形成することができる。抗原が鎖の抗原認識部位を介して認識される
と、CD3及びゼータ鎖は、そのようなTCR複合体が発現されている免疫細胞の細胞質
にシグナルを送り、機能的活性化を誘導する。
る1以上の機能的シグナル伝達ドメインを含んでもよい。いくつかの実施形態では、促進
分子は上記に記載されているTCRのゼータ鎖であってもよい。
、CARまたはTCR、例えば、mTCRの標的は、その発現ががんにおいて特異的に増
加するがん抗原であることを特徴としてもよい。いくつかの実施形態では、CARまたは
TCR、例えば、mTCRの標的は、がんにて変異した形態で存在するがん抗原であるこ
とを特徴としてもよい。
が治療されるべきであるがんにおいて増加するヒト腫瘍抗原であってもよい。例えば、標
的抗原は、5T4(栄養膜糖タンパク質)、707-AP、9D7、AFP(α-フェト
プロテイン)、AlbZIP(アンドロゲン誘導のbZIP)、HPG1(ヒト前立腺特
異的遺伝子-1)、α5β1-インテグリン、α5β6-インテグリン、α-メチルアシ
ル-補酵素Aラセマーゼ、ART-4(ADPリボシルトランスフェラーゼ-4)、B7
H4(v-セットドメイン含有T-細胞活性化阻害剤1)、BAGE-1(Bメラノーマ
抗原-1)、BCL-2(B-細胞 CLL/リンパ腫-2)、BING-4(WD反復
ドメイン46)、CA15-3/CA27-29(ムチン1)、CA19-9(がん抗原
19-9)、CA72-4(がん抗原72-4)、CA125(がん抗原125)、カル
レチクリン、CAMEL(メラノーマ上のCTL認識抗原)、CASP-8(カスパーゼ
8)、カテプシンB、カテプシンL、CD19(分化抗原群19)、CD20、CD22
、CD25、CD30、CD33、CD4、CD52、CD55、CD56、CD80、
CEA(がん胎児性抗原SG8)、CLCA2(塩化物チャネルアクセサリー2)、CM
L28(慢性骨髄性白血病腫瘍抗原28)、コアクトシン様タンパク質、コラーゲンXX
III、COX-2(シクロオキシゲナーゼ-2)、CT-9/BRD6(がん/精巣抗
原9)、Cten(c-末端テンシン様タンパク質)、サイクリンB1、サイクリンD1
、cyp-B、CYPB1(チトクロームp450ファミリー1サブファミリーbメンバ
ー1)、DAM-10/MAGE-B1(メラノーマ関連抗原B1)、DAM-6/MA
GE-B2、EGFR/Her1(表皮増殖因子受容体)、EMMPRIN(ベイシジン
)、EpCam、EphA2(EPH受容体A2)、EphA3、ErbB3(Erb-
B2受容体チロシンキナーゼ3)、EZH2(zeste2ポリコーム抑制性複合体2サ
ブユニットのエンハンサー)、FGF-5(線維芽細胞増殖因子5)、FN(フィブロネ
クチン)、Fra-1(Fos関連抗原-1)、G250/CAIX(炭酸脱水酵素9)
、GAGE-1(G抗原-1)、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE
-5、GAGE-6、GAGE-7b、GAGE-8、GDEP(前立腺にて差次的に発
現される遺伝子)、GnT-V(グルコン酸キナーゼ)、gp100(メラニン細胞系列
特異的抗原GP100)、GPC3(グリピカン3)、HAGE(らせん抗原)、HAS
T-2(スルホトランスフェラーゼファミリー1Aメンバー1)、ヘプシン、Her2/
neu/ErbB2(Erb-B2受容体チロシンキナーゼ2)、HERV-K-MEL
、HNE(メデュラシン)、ホメオボックスNKX3.1、HOM-TES-14/SC
P-1、HOM-TES-85、HPV-E6、HPVE7、HST-2(シルツイン-
2)、hTERT、iCE(カスパーゼ1)、IGF-1R(インスリン様増殖因子-1
受容体)、IL-13Ra2(インターロイキン-13受容体サブユニットα2)、IL
-2R(インターロイキン-2受容体)、IL-5(インターロイキン-5)、未成熟ラ
ミニン受容体、カリクレイン2、カリクレイン4、Ki67、KIAA0205(リソホ
スファチジルグリセロールアシルトランスフェラーゼ1)、KK-LC-1(北九州肺癌
抗原-1)、KM-HN-1、LAGE-1(L抗原ファミリーメンバー-1)、リビン
、MAGE-A1、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGEA2、MAGE-A
3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-B1、MAGE-B
10、MAGE-B16、MAGEB17、MAGE-B2、MAGE-B3、MAGE
-B4、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE
-C3、MAGE-D1、MAGE-D2、MAGE-D4、MAGE-E1、MAGE
-E2、MAGE-F1、MAGE-H1、MAGEL2(メラノーマ抗原ファミリーL
2)、ママグロビンA、MART-1/Melan-A(T-細胞-1によって認識され
るメラノーマ抗原)、MART-2、マトリクスタンパク質22、MC1R(メラノコル
チン1受容体)、M-CSF(マクロファージコロニー刺激因子)、メソテリン、MG5
0/PXDN(ペルオキシダシン)、MMP11(マトリクスメタロプロテイナーゼ11
)、MN/CA IX-抗原(炭酸脱水酵素9)、MRP-3(多剤耐性関連タンパク質
-3)、MUC1(ムチン1)、MUC2、NA88-A(VENT様ホメオボックス2
偽遺伝子1)、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ-V、Neo-PAP(
Neo-ポリ(A)ポリメラーゼ)、NGEP(前立腺で発現される新しい遺伝子)、N
MP22(核マトリクスタンパク質22)、NPM/ALK(ヌクレオホスミン)、NS
E(ニューロン特異的エノラーゼ)、NY-ESO-1、NY-ESO-B、OA1(変
形性関節症QTL1)、OFA-iLRP(がん胎児性抗原未成熟ラミニン受容体タンパ
ク質)、OGT(O-GlcNAcトランスフェラーゼ)、OS-9(小胞体レクチン)
、オステオカルシン、オステオポンチン、p15(CDK阻害剤2B)、p53、PAG
E-4(P抗原ファミリーメンバー-4)、PAI-1(プラスミノーゲン活性化因子阻
害剤-1)、PAI-2、PAP(前立腺酸ホスファターゼ)、PART-1(前立腺ア
ンドロゲン調節転写物1)、PATE(前立腺及び精巣で発現された1)、PDEF(前
立腺由来のEts因子)、Pim-1-キナーゼ(プロウイルス組み込み部位1)、Pi
n1(ペプチジル-プロリルcis-transイソメラーゼNIMA-相互作用1)、
POTE(前立腺、卵巣、精巣、及び胎盤で発現される)、PRAME(メラノーマで優
先的に発現される抗原)、プロステイン、プロテイナーゼ-3、PSA(前立腺特異的抗
原)、PSCA(前立腺幹細胞抗原)、PSGR(前立腺特異的G-タンパク質共役受容
体)、PSM、PSMA(前立腺特異的膜抗原)、RAGE-1(腎腫瘍癌腫抗原)、R
HAMM/CD168、RU1(腎遍在タンパク質1)、RU2、SAGE(肉腫抗原)
、SART-1(T-細胞-1によって認識される扁平上皮細胞癌腫抗原)、SART-
2、SART-3、Sp17(精子タンパク質17)、SSX-1(SSXファミリーメ
ンバー1)、SSX-2/HOM-MEL-40、SSX-4、STAMP-1(STE
AP2 メタロレダクターゼ)、STEAP、サバイビン、サバイビン-213、TA-
90(腫瘍関連抗原-90)、TAG-72(腫瘍関連糖タンパク質-72)、TARP
(TCRγ代替リーディングフレームタンパク質)、TGFb(形質転換増殖因子β)、
TGFbR11(形質転換増殖因子β受容体11)、TGM-4(トランスグルタミナー
ゼ4)、TRAG-3(タキソール耐性関連遺伝子3)、TRG(T-細胞受容体γ遺伝
子座)、TRP-1(一過性受容体ポテンシャル-1)、TRP-2/6b、TRP-2
/INT2、Trp-p8、チロシナーゼ、UPA(U-プラスミノーゲン活性化因子)
、VEGF(血管内皮増殖因子A)、VEGFR-2/FLK-1、及びWT1(ウィル
ムス腫瘍1)から選択することができ、または治療されるべきがんにて発見され、α-ア
クチニン-4/m、ARTC1/m、bcr/abl、ベータ-Catenin/m、B
RCA1/m、BRCA2/m、CASP-5/m、CASP-8/m、CDC27/m
、CDK4/m、CDKN2A/m、CML66、COA-1/m、DEK-CAN、E
FTUD2/m、ELF2/m、ETV6-AML1、FN1/m、GPNMB/m、H
LA-A*0201-R170I、HLA-A11/m、HLA-A2/m、HSP70
-2M、KIAA0205/m、K-Ras/m、LDLR-FUT、MART2/m、
ME1/m、MUM-1/m、MUM-2/m、MUM-3/m、ミオシンクラス1/m
、neo-PAP/m、NFYC/m、N-Ras/m、OGT/m、OS-9/m、p
53/m、Pml/RARa、PRDX5/m、PTPRX/m、RBAF600/m、
SIRT2/m、SYTSSX-1、SYT-SSX-2、TEL-AML1、TGFb
RII及びTPI/mの中から選択されるヒト腫瘍抗原の変異した形態であってもよい。
例えば、標的抗原はCD19またはCD22の間から選択されてもよい。
本明細書で提供されているように、1つで2つの機能があるベクターは免疫細胞の機能
を弱める1以上の遺伝子の発現を阻害する1以上の種類の短ヘアピンRNA(shRNA
)をコードする塩基配列と、キメラ抗原受容体(CAR)またはT細胞受容体(TCR)
、例えば、モノクローナルT細胞受容体(mTCR)をコードする塩基配列とを含む。
列の挿入を促進する因子をコードする配列を含むことができる。いくつかの実施形態では
、配列はベクター遺伝子の一方または双方の末端に位置する。いくつかの実施形態では、
配列はLTR(長い末端配列)である。
挿入が行われている細胞の精製に使用されるタンパク質をコードするドメインを含むこと
ができる。いくつかの実施形態では、ドメインはΔLNGFRドメインであり、その際、
ΔLNGFRは上記に記載されている挿入が行われている細胞の精製に使用される細胞質
ドメインのないLNGFR(低親和性神経成長因子受容体)である。
るΔLNGFR及びCARの双方の発現を誘導するプロモーター、例えば、図22Aに示
されるようなΔLNGFR及びCD19 CARの双方の発現を誘導するEF1αプロモ
ーターを含むことができる。さらなる実施形態では、ΔLNGFR及びCD19 CAR
は先ず、それらが単一のmRNA上に存在する形態で転写される。同じmRNA上に2以
上のシストロンが存在するそのような実施形態では、IRES(内部リボソーム侵入部位
)がその間に挿入されて、双方のシストロンの発現を引き起こしてもよい。しかしながら
、IRESは過剰に長く、下流のシストロンの発現効率が低下することが報告されている
。いくつかの実施形態では、IRES以外の成分、例えば、P2A(2aペプチド)を用
いてそのような欠点を克服することができ、その際、翻訳中に、リボソームはP2AのC
末端でペプチド結合を形成せずに通過し、下流の遺伝子が後で発現されるようにする。
示す1つで2つの機能があるベクターであり、ベクターは配列番号220または221の
塩基配列のいずれか1つを含む。配列番号220及び221の塩基配列を含む例示的なベ
クターは、図1A及び1Bに示される構造を有することができる。いくつかの例示的なプ
ラスミドを表1に列挙する。
表1.例示的なプラスミド。
shRNAの核酸配列は、本明細書に記載されている配列に加えて、これらの配列と少な
くとも50%、具体的には少なくとも70%、さらに具体的には少なくとも80%、一層
さらに具体的には少なくとも90%、そして最も具体的には少なくとも95%の配列相同
性を示す核酸配列を含んでもよい。これは、siRNA(低分子干渉RNA)や細胞内で
処理されて特にsiRNAとなるshRNAの場合、ある程度の変異、特に5’末端の変
異は認容され、標的遺伝子の正常なノックダウンを引き起こすこと、且つ遺伝子サイレン
シングで役割を担うmiRNAと同様の構造を有するように行われるsiRNAとshR
NAの変異が標的遺伝子のノックダウンをさらに効果的に誘導することが報告されている
ためである。さらに、ベクターの使用において、当業者に自明であるのは、ベクター内の
変動、すなわち、特定の配列をベクターに導入するためのクローニングプロセスにおいて
生じてもよい塩基配列の付加、修飾または欠失であり、または意図された遺伝子が発現さ
れる程度のベクターの使いやすさを改善するための構成要素の変更または導入である。
本明細書で提供されているように、1つで2つの機能があるベクターは免疫細胞の機能
を弱める遺伝子の発現を阻害する1以上の種類の短ヘアピンRNA(shRNA)をコー
ドする塩基配列と、キメラ抗原受容体(CAR)及びT細胞受容体(TCR)、例えば、
モノクローナルT細胞受容体(mTCR)のいずれか1つをコードする塩基配列とを含む
。ベクターは、免疫細胞の機能を弱める遺伝子の発現を阻害した免疫細胞の作製に使用す
ることができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、DNA、RNA、プラスミド、
レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びレトロウイルスベクターから成る
群から選択される。
はTCR、例えばmTCRを発現すること、且つ1以上の種類のshRNAの標的遺伝子
の発現が低下することを特徴とする。いくつかの実施形態では、1以上の種類のshRN
Aの標的遺伝子の発現は、対照群のそれの約90%以下に低減され、例えば、標的遺伝子
の発現は、対照群のそれの約80%以下、70%以下、約60%以下、約50%以下、約
40%以下、約30%以下、約20%以下、及び約10%以下に低減される。いくつかの
実施形態では、免疫細胞は、ヒト由来のT細胞とNK細胞との間から選択される。
されるのは、(1)標的抗原に特異的に結合する遺伝子操作された抗原受容体をコードす
る遺伝子と;(2)免疫細胞の機能を弱める遺伝子の免疫細胞における発現を低下させる
または低下させることができる遺伝子破壊剤とを同時にまたは任意の順序で連続して免疫
細胞に導入し、それによって、遺伝子操作された抗原受容体が発現され、免疫細胞の機能
を弱める遺伝子の発現が低下する免疫細胞を作り出すことを含む、免疫細胞を作り出す方
法である。
)またはT細胞受容体(TCR)である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された抗
原受容体はCARである。いくつかの実施形態では、CARは、細胞外抗原認識ドメイン
と、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。
合する。
3ζ)鎖の細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、CARの細胞内シグナル伝
達ドメインは共刺激分子をさらに含む。
)、CD27、及びCD28から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、共刺
激分子はCD137(4-1BB)である。いくつかの実施形態では、共刺激分子はCD
28である。
境の細胞表面上で発現される。いくつかの実施形態では、標的抗原は、その発現ががん細
胞、がん組織及び/または腫瘍微小環境にて増加するがん抗原、またはがん抗原の変異し
た形態である。
て増加するがん抗原は、5T4(栄養膜糖タンパク質)、707-AP、9D7、AFP
(α-フェトプロテイン)、AlbZIP(アンドロゲン誘導のbZIP)、HPG1(
ヒト前立腺特異的遺伝子-1)、α5β1-インテグリン、α5β6-インテグリン、α
-メチルアシル-補酵素Aラセマーゼ、ART-4(ADPリボシルトランスフェラーゼ
-4)、B7H4(v-セットドメイン含有T-細胞活性化阻害剤1)、BAGE-1(
Bメラノーマ抗原-1)、BCL-2(B-細胞 CLL/リンパ腫-2)、BING-
4(WD反復ドメイン46)、CA15-3/CA27-29(ムチン1)、CA19-
9(がん抗原19-9)、CA72-4(がん抗原72-4)、CA125(がん抗原1
25)、カルレチクリン、CAMEL(メラノーマ上のCTL認識抗原)、CASP-8
(カスパーゼ8)、カテプシンB、カテプシンL、CD19(分化抗原群19)、CD2
0、CD22、CD25、CD30、CD33、CD4、CD52、CD55、CD56
、CD80、CEA(がん胎児性抗原SG8)、CLCA2(塩化物チャネルアクセサリ
ー2)、CML28(慢性骨髄性白血病腫瘍抗原28)、コアクトシン様タンパク質、コ
ラーゲンXXIII、COX-2(シクロオキシゲナーゼ-2)、CT-9/BRD6(
がん/精巣抗原9)、Cten(c-末端テンシン様タンパク質)、サイクリンB1、サ
イクリンD1、cyp-B、CYPB1(チトクロームp450ファミリー1サブファミ
リーbメンバー1)、DAM-10/MAGE-B1(メラノーマ関連抗原B1)、DA
M-6/MAGE-B2、EGFR/Her1(表皮増殖因子受容体)、EMMPRIN
(ベイシジン)、EpCam、EphA2(EPH受容体A2)、EphA3、ErbB
3(Erb-B2受容体チロシンキナーゼ3)、EZH2(zeste2ポリコーム抑制
性複合体2サブユニットのエンハンサー)、FGF-5(線維芽細胞増殖因子5)、FN
(フィブロネクチン)、Fra-1(Fos関連抗原-1)、G250/CAIX(炭酸
脱水酵素9)、GAGE-1(G抗原-1)、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-
4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7b、GAGE-8、GDEP(前立腺に
て差次的に発現される遺伝子)、GnT-V(グルコン酸キナーゼ)、gp100(メラ
ニン細胞系列特異的抗原GP100)、GPC3(グリピカン3)、HAGE(らせん抗
原)、HAST-2(スルホトランスフェラーゼファミリー1Aメンバー1)、ヘプシン
、Her2/neu/ErbB2(Erb-B2受容体チロシンキナーゼ2)、HERV
-K-MEL、HNE(メデュラシン)、ホメオボックスNKX3.1、HOM-TES
-14/SCP-1、HOM-TES-85、HPV-E6、HPVE7、HST-2(
シルツイン-2)、hTERT、iCE(カスパーゼ1)、IGF-1R(インスリン様
増殖因子-1受容体)、IL-13Ra2(インターロイキン-13受容体サブユニット
α2)、IL-2R(インターロイキン-2受容体)、IL-5(インターロイキン-5
)、未成熟ラミニン受容体、カリクレイン2、カリクレイン4、Ki67、KIAA02
05(リソホスファチジルグリセロールアシルトランスフェラーゼ1)、KK-LC-1
(北九州肺癌抗原-1)、KM-HN-1、LAGE-1(L抗原ファミリーメンバー-
1)、リビン、MAGE-A1、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGEA2、
MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-B1、
MAGE-B10、MAGE-B16、MAGEB17、MAGE-B2、MAGE-B
3、MAGE-B4、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-C1、MAGE-C
2、MAGE-C3、MAGE-D1、MAGE-D2、MAGE-D4、MAGE-E
1、MAGE-E2、MAGE-F1、MAGE-H1、MAGEL2(メラノーマ抗原
ファミリーL2)、ママグロビンA、MART-1/Melan-A(T-細胞-1によ
って認識されるメラノーマ抗原)、MART-2、マトリクスタンパク質22、MC1R
(メラノコルチン1受容体)、M-CSF(マクロファージコロニー刺激因子)、メソテ
リン、MG50/PXDN(ペルオキシダシン)、MMP11(マトリクスメタロプロテ
イナーゼ11)、MN/CA IX-抗原(炭酸脱水酵素9)、MRP-3(多剤耐性関
連タンパク質-3)、MUC1(ムチン1)、MUC2、NA88-A(VENT様ホメ
オボックス2偽遺伝子1)、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ-V、Ne
o-PAP(Neo-ポリ(A)ポリメラーゼ)、NGEP(前立腺で発現される新しい
遺伝子)、NMP22(核マトリクスタンパク質22)、NPM/ALK(ヌクレオホス
ミン)、NSE(ニューロン特異的エノラーゼ)、NY-ESO-1、NY-ESO-B
、OA1(変形性関節症QTL1)、OFA-iLRP(がん胎児性抗原未成熟ラミニン
受容体タンパク質)、OGT(O-GlcNAcトランスフェラーゼ)、OS-9(小胞
体レクチン)、オステオカルシン、オステオポンチン、p15(CDK阻害剤2B)、p
53、PAGE-4(P抗原ファミリーメンバー-4)、PAI-1(プラスミノーゲン
活性化因子阻害剤-1)、PAI-2、PAP(前立腺酸ホスファターゼ)、PART-
1(前立腺アンドロゲン調節転写物1)、PATE(前立腺及び精巣で発現された1)、
PDEF(前立腺由来のEts因子)、Pim-1-キナーゼ(プロウイルス組み込み部
位1)、Pin1(ペプチジル-プロリルcis-transイソメラーゼNIMA-相
互作用1)、POTE(前立腺、卵巣、精巣、及び胎盤で発現される)、PRAME(メ
ラノーマで優先的に発現される抗原)、プロステイン、プロテイナーゼ-3、PSA(前
立腺特異的抗原)、PSCA(前立腺幹細胞抗原)、PSGR(前立腺特異的G-タンパ
ク質共役受容体)、PSM、PSMA(前立腺特異的膜抗原)、RAGE-1(腎腫瘍癌
腫抗原)、RHAMM/CD168、RU1(腎遍在タンパク質1)、RU2、SAGE
(肉腫抗原)、SART-1(T-細胞-1によって認識される扁平上皮細胞癌腫抗原)
、SART-2、SART-3、Sp17(精子タンパク質17)、SSX-1(SSX
ファミリーメンバー1)、SSX-2/HOM-MEL-40、SSX-4、STAMP
-1(STEAP2 メタロレダクターゼ)、STEAP、サバイビン、サバイビン-2
13、TA-90(腫瘍関連抗原-90)、TAG-72(腫瘍関連糖タンパク質-72
)、TARP(TCRγ代替リーディングフレームタンパク質)、TGFb(形質転換増
殖因子β)、TGFbR11(形質転換増殖因子β受容体11)、TGM-4(トランス
グルタミナーゼ4)、TRAG-3(タキソール耐性関連遺伝子3)、TRG(T-細胞
受容体γ遺伝子座)、TRP-1(一過性受容体ポテンシャル-1)、TRP-2/6b
、TRP-2/INT2、Trp-p8、チロシナーゼ、UPA(U-プラスミノーゲン
活性化因子)、VEGF(血管内皮増殖因子A)、VEGFR-2/FLK-1、及びW
T1(ウィルムス腫瘍1)から成る群から選択される。
形態では、標的抗原はCD19である。
TC1/m、bcr/abl、ベータ-カテニン/m、BRCA1/m、BRCA2/m
、CASP-5/m、CASP-8/m、CDC27/m、CDK4/m、CDKN2A
/m、CML66、COA-1/m、DEK-CAN、EFTUD2/m、ELF2/m
、ETV6-AML1、FN1/m、GPNMB/m、HLA-A*0201-R170
I、HLA-A11/m、HLA-A2/m、HSP70-2M、KIAA0205/m
、K-Ras/m、LDLR-FUT、MART2/m、ME1/m、MUM-1/m、
MUM-2/m、MUM-3/m、ミオシンクラス1/m、neo-PAP/m、NFY
C/m、N-Ras/m、OGT/m、OS-9/m、p53/m、Pml/RARa、
PRDX5/m、PTPRX/m、RBAF600/m、SIRT2/m、SYTSSX
-1、SYT-SSX-2、TEL-AML1、TGFbRII、及びTPI/mから成
る群から選択される。
以上を引き起こす:(i)免疫細胞の増殖を阻害する;(ii)免疫細胞の細胞死を誘導
する;(iii)免疫細胞が標的抗原を認識する及び/または活性化されるために必要な
分子の機能を阻害する;(iv)標的抗原に対する免疫応答を引き起こす代わりに、異な
る機能を担う異なる種類への免疫細胞の分化を誘導する;(v)免疫細胞の免疫応答を促
進する分子との免疫細胞の反応を低下させる;または(vi)免疫細胞の免疫応答を抑制
する分子との免疫細胞の反応を高める。
TLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3またはCEA
CAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160
、CD96、MerTK、2B4、FAS、CD45、PP2A、SHP1、SHP2、
DGKアルファ、DGKゼータ、Cbl-b、Cbl-c、CD148、LRR1、TG
FBR1、IL10RA、KLGR1、DNMT3A、及びA2aRから成る群から選択
される。いくつかの実施形態では、免疫細胞の機能を弱める遺伝子は、免疫細胞の免疫応
答を抑制する分子との免疫細胞の反応を高める。いくつかの実施形態では、免疫細胞の免
疫応答を抑制する分子との免疫細胞の反応を高める遺伝子は免疫チェックポイントの受容
体またはリガンドをコードする。
PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-
3またはCEACAM-5)、LAG 3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAI
R1、CD160、CD96、MerTK及び2B4から成る群から選択される。
べて、免疫細胞の機能を弱める免疫細胞における遺伝子の発現を少なくとも30、40、
50、60、70、80、90、または95%低下させる。いくつかの実施形態では、遺
伝子破壊剤は、免疫細胞の免疫応答を抑制する分子との免疫細胞の反応を高める遺伝子の
発現を低下させる。いくつかの実施形態では、遺伝子破壊剤は免疫チェックポイントの受
容体またはリガンドをコードする遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、
遺伝子破壊剤は、PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEAC
AM-1、CEACAM-3またはCEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTL
A、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、MerTK及び2B4から成る群
から選択される遺伝子の発現を低下させる。
の機能を弱める遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、1を超える遺伝子
破壊剤が、RNAiによって免疫細胞における免疫細胞の機能を弱める遺伝子の発現を低
下させる。いくつかの実施形態では、遺伝子破壊剤は免疫細胞の機能を弱める単一の遺伝
子の異なる部分を標的とする、免疫細胞の機能を弱める異なる遺伝子を標的とする、また
はそれらの任意の組み合わせで遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態では、RNAi
には短ヘアピンRNA(shRNA)が介在する。いくつかの実施形態では、RNAiに
は1を超えるshRNAが介在する。
形態では、2つのshRNAはPD-1の異なる部分を標的とする。いくつかの実施形態
では、2つのshRNAはそれぞれPD-1及びTIM-3を標的とする。いくつかの実
施形態では、2つのshRNAはそれぞれPD-1及びCTLA-4を標的とする。いく
つかの実施形態では、2つのshRNAはそれぞれPD-1及びLAG-3を標的とする
。いくつかの実施形態では、2つのshRNAはそれぞれPD-1及びTIGITを標的
とする。
び238~267から成る群から選択される配列を含む。
ぞれ調節される。いくつかの実施形態では、2つの異なるshRNAの発現は2つの異な
るプロモーターによってそれぞれ調節される。いくつかの実施形態では、2つの異なるプ
ロモーターはRNAポリメラーゼIIIのプロモーターである。いくつかの実施形態では
、2つのプロモーターは異なる種に由来するU6プロモーターである。いくつかの実施形
態では、2つのプロモーターは互いに異なる方向に向けられる。
クターから発現される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された抗原受容体及び遺伝
子破壊剤は同じベクターから発現される。いくつかの実施形態では、ベクターは、DNA
、RNA、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びレトロウ
イルスベクターから成る群から選択される。いくつかの実施形態では、ベクターはレンチ
ウイルスベクターである。
チュラルキラー細胞のようなリンパ球、肥満細胞、好酸球、好塩基球から選択されること
を特徴としてもよく;食細胞にはマクロファージ、好中球、及び樹状細胞が含まれる。T
細胞にはCD4+T細胞及びCD8+T細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、B細
胞リンパ腫は、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、原発性縦隔B細胞リン
パ腫(PMBL)、ホジキンリンパ腫(HL)、非ホジキンリンパ腫、縦隔グレーゾーン
リンパ腫、または結節性硬化症HLである。いくつかの実施形態では、T細胞リンパ腫は
、未分化大細胞型リンパ腫(ALCL)、他に特定されていない末梢T細胞リンパ腫(P
TCL-NOS)、または血管免疫芽球性T細胞リンパ腫(AITL)である。好ましい
実施形態では、免疫細胞は、ヒト由来のT細胞またはTリンパ球及びナチュラルキラー(
NK)細胞から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、免疫細胞はT細胞である。
いくつかの実施形態では、T細胞はCD4+T細胞またはCD8+T細胞である。
いくつかの実施形態では、対象はヒトであることができる。いくつかの実施形態では、ヒ
トは健常なドナーであることができる。他の実施形態では、対象は腫瘍またはがんを有す
ることを特徴としてもよく、その際、細胞内で発現されたCARまたはTCR、例えば、
mTCRによって標的とされるがん抗原のレベルの上昇または変動が検出される。いくつ
かの実施形態では、細胞は、例えば、米国特許第6,352,694号、同第6,534
,055号、同第6,905,680号、同第6,692,964号、同第5,858,
358号、同第6,887,466号、同第6,905,681号、同第7,144,5
75号、同第7,067,318号、同第7,172,869号、同第7,232,56
6号、同第7,175,843号、同第5,883,223号、同第6,905,874
号、同第6,797,514号、同第6,867,041号、及び米国特許出願公開第2
0060121005号に記載されている方法を一般に用いて作り出されてもよく、増殖
させてもよい。
AR-T細胞の作製は末梢血モノクローナル細胞を提供する工程を含む。さらなる実施形
態では、末梢血モノクローナル細胞は全血試料から分離することができる。いくつかの実
施形態では、本明細書に記載されているCAR-T細胞の作製は、抗体を用いて末梢血モ
ノクローナル細胞を刺激する工程を含む。例として、一次刺激シグナルを提供する作用剤
は抗CD3抗体またはその抗原結合断片であり、共刺激シグナルを提供する作用剤は抗C
D28抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載さ
れているCAR-T細胞の作製はCARの形質導入の工程を含み、その際、CARは本明
細書に記載されている任意の標的及びCARの他の既知の標的を標的とすることができ、
例えば、CARはCD19を標的とするCD19 CARであることができる。いくつか
の実施形態では、作り出されたCAR-T細胞は単離される。
ロイキン-2(IL-2)、インスリン、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CS
F、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ、及びTNF-α、または当業者に
既知の細胞増殖のための任意の他の添加物を含む、増殖及び生存に必要な因子を含有して
もよい適切な培地(例えば、最小必須培地またはRPMI培地1640またはX-viv
o15(Lonza))が含まれる。細胞の増殖のための他の添加物には、界面活性剤、
プラスマネート、ならびに例えば、N-アセチルーシステイン及び2-メルカプトエタノ
ールのような還元剤が挙げられるが、これらに限定されない。培地には、アミノ酸、ピル
ビン酸ナトリウム、及びビタミンが添加され、無血清である、または適切な量の血清(も
しくは血漿)または定義されたセットのホルモン、及び/またはT細胞の増殖及び増加に
十分な量のサイトカイン(複数可)を補充しているのいずれかのRPMI1640、AI
M-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo15、及びX-Viv
o20、Optimizerを挙げることができる。抗生物質、例えば、ペニシリン及び
ストレプトマイシンは、実験培養物にのみ含まれ、対象に注入される細胞の培養物には含
まれない。標的細胞は、成長を支援するのに必要な条件下、例えば、適切な温度(例えば
、37℃)及び大気(例えば、空気+5%CO2)で維持される。T細胞の培養時間が6
0日間以上であることができるように、いくつかの刺激サイクルも所望されてもよい。
型的な血液製剤またはアフェレーシス末梢血単核細胞製剤は、細胞傷害性T細胞またはサ
プレッサーT細胞の集団(TC、CD8)より大きいヘルパーT細胞の集団(TH、CD
4+)を有する。CD3及びCD28の受容体を刺激することによるT細胞の生体外増殖
は、約8~9日目より前では主にTH細胞から成るT細胞の集団を生じる一方で、約8~
9日目以降は、T細胞の集団は、次第にさらに多くのTC細胞の集団を含む。したがって
、治療の目的に応じて、TH細胞が優勢に構成するT細胞集団を対象に注入することが有
利であってもよい。同様に、TC細胞の抗原特異的サブセットが単離されているならば、
このサブセットをさらに大きな程度に増殖させることが有益であってもよい。さらに、C
D4及びCD8のマーカーに加えて、他の表現型マーカーは細胞増殖プロセスの過程の間
に著しく変化するが、大部分は再現可能に変化する。したがって、そのような再現性によ
って、特定の目的のために活性化されたT細胞製剤を誂える能力が可能になる。
する能力、再刺激の非存在下でT細胞の増殖を持続させる能力、及び適切な試験管内及び
動物のモデルにおける抗がん活性を評価することができる。アッセイは以下にさらに詳細
に記載されている。
用いて、単量体及び二量体の存在を検出することができる。例えば、Milone,et
al.,Molecular Therapy,17(8):1453-1464(2
009)を参照のこと。
トメトリーによって測定することができる。例えば、CD4+T細胞とCD8+T細胞の
混合物はαCD3/αCD28によって刺激され、その後、分析されるプロモーターの制
御下でGFPを発現するレンチウイルスベクターによる形質導入が続く。例示的なプロモ
ーターには、CMV IE遺伝子、EF-1a、ユビキチンC、またはホスホグリセロキ
ナーゼ(PGK)のプロモーターが挙げられる。GFP蛍光は、CD4+及び/またはC
D8+T細胞のサブセットにて培養の6日目にフローサイトメトリーによって評価する。
例えば、Milone,et al.,Molecular Therapy,17(8
):1453-1464(2009)を参照のこと。あるいは、CD4+及びCD8+T
細胞の混合物は、αCD3/αCD28をコーティングした磁気ビーズによって0日目に
刺激され、2Aリボゾームスキッピング配列を用いてeGFPと共にCARを発現してい
る2シストロン性のレンチウイルスベクターを用いて1日目にCARで形質導入する。培
養物は、例えば、抗CD3抗体及び抗CD28抗体の存在下でhCD32及び4-IBB
Lを発現しているK562細胞で再刺激され(K562-BBL-3/28)、その後、
洗浄が続く外来性IL-2が100IU/mlで1日おきに培養に添加される。GFP+
T細胞は、ビーズに基づくカウントを用いてフローサイトメトリーによって数えられる。
例えば、Milone,et al.,Molecular Therapy,17(8
):1453-1464(2009)を参照のこと。再刺激の非存在下でのCAR+T細
胞の持続した増殖も測定することができる。
olecular Therapy,17(8):1453-1464(2009)にて
以前記載されている。手短に言えば、CARが介在する増殖の評価は、マイクロタイター
プレートにて、洗浄したT細胞を標的細胞、例えば、K562-Meso、Ovcar3
、Ovcar8、SW1990、Panc02.03細胞またはCD32及びCD137
(KT32-BBL)と1:1のT細胞:標的細胞の最終比で混合することによって実施
される。これらのシグナルが長期の生体外でのCD8+T細胞増殖を支えるので、抗CD
3(クローンOKT3)及び抗CD28(クローン9.3)モノクローナル抗体をKT3
2-BBL細胞との培養物に添加して、T細胞増殖を刺激するための陽性対照として役立
てる。製造元によって記載されているように、CountBright(商標)蛍光ビー
ズ(Invitrogen、Carlsbad、CA)及びフローサイトメトリーを用い
て培養物にてT細胞を数える。CAR+T細胞は、eGFP-2Aを連結したCARを発
現しているレンチウイルスベクターで操作されているT細胞を用いて、GFP発現によっ
て同定される。T細胞でのCD4+及びCD8+の発現は特異的なモノクローナル抗体(
BD Biosciences)によっても同時に検出される。サイトカイン測定は製造
者の指示書に従って、ヒトTH1/TH2サイトカイン細胞測定ビーズアレイキット(B
D Biosciences,San Diego,CA)を用いて、再刺激の24時間
後に回収した上清で実施する。蛍光はFACScaliburフローサイトメーターを用
いて評価し、データは製造者の指示書に従って分析する。
的な51Cr放出アッセイによって評価することができる(Milone,et al.
,Molecular Therapy,17(8):1453-1464(2009)
)。手短に言えば、標的細胞(例えば、BHKまたはCHO細胞)に51Cr(NaCr
O4,New England Nuclear,Boston,MA)を37℃で2時
間頻繁に攪拌しながら負荷し、完全RPMIで2回洗浄し、マイクロタイタープレートに
入れる。エフェクターT細胞はエフェクター細胞:標的細胞の種々の比率(E:T)で完
全RPMIにてウェル内の標的細胞と混合する。培地のみを含有する追加のウェル(自然
放出、SR)または1%のtriton-X 100界面活性剤(総放出、TR)の溶液
も調製する。37℃で4時間インキュベートした後、各ウェルの上清を回収する。次いで
、放出された51Crはガンマ粒子カウンター(Packard Instrument
Co.,Waltham,MA)を用いて測定する。各条件は少なくとも3つ組で実施
し、溶解の比率は式:%溶解=(ER-SR)/(TR-SR)を用いて算出し、ここで
ERは各実験条件で放出された平均51Crを表す。フローベースの細胞傷害性アッセイ
のような代替の細胞傷害性アッセイも使用されてもよい。
ているものを含む他のアッセイも、本明細書で作製されるCAR-T細胞を評価するため
に使用することができる。
CARまたはTCR、例えばmTCRによって標的とされる抗原が発現される疾患に対す
る免疫応答に関与することができる。さらなる実施形態では、免疫細胞を用いて、ヒト患
者の免疫療法のための医薬組成物を提供することができる。いくつかの実施形態では、医
薬組成物は、重篤な有害反応を引き起こし、さらに患者に高コストを負担させる可能性が
ある免疫チェックポイント阻害剤を必要とすることなく、標的疾患に対して治療効果を示
すことができる。
ような免疫細胞は普通、がんの治療に使用されるが、これらに限定されない。さらなる実
施形態では、これらの免疫細胞にがんを認識させるために、それらはがん抗原を標的とす
る細胞表面受容体を発現するように改変される。
含む組成物である。
本明細書で提供されているように、1つで2つの機能があるベクターは免疫細胞の機能
を弱める遺伝子の発現を阻害する1以上の種類の短ヘアピンRNA(shRNA)をコー
ドする塩基配列と、キメラ抗原受容体(CAR)及びT細胞受容体(TCR)、例えば、
モノクローナルT細胞受容体(mTCR)のいずれか1つをコードする塩基配列とを含む
。一実施形態に従ってベクターを用いて、免疫細胞を作製することができ、その際、免疫
細胞は免疫チェックポイント受容体の低下した発現を有し、標的分子に特異的なCARま
たはTCR、例えばmTCRを発現する。前記免疫細胞を用いて免疫療法のための医薬組
成物を提供することができる。
によって、種々の疾患が改善されてもよい。いくつかの実施形態では、提供されるような
作製されたCAR-T細胞は同種養子細胞療法のためのものである。本明細書でさらに提
供されるのは、養子細胞療法に好適な対象に組成物を導入することを含む、本明細書に記
載されている組成物の治療的使用であり、その際、対象は自己免疫疾患;血液悪性腫瘍;
固形腫瘍;または、HIV、RSV、EBV、CMV、アデノウイルス、BKポリオーマ
ウイルスに関連する感染症を有する。
ンパ芽球性白血病(ALL)、慢性骨髄性白血病(CML))、リンパ腫、非ホジキンリ
ンパ腫(NHL)、ホジキン病、多発性骨髄腫、及び骨髄異形成症候群が挙げられるが、
これらに限定されない。固形がんの例には、脳、前立腺、乳腺、肺、結腸、子宮、皮膚、
肝臓、骨、膵臓、卵巣、精巣、膀胱、腎臓、頭部、頚部、胃、子宮頚部、直腸、喉頭及び
食道のがんが挙げられるが、これらに限定されない。種々の自己免疫障害の例には、円形
脱毛症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚筋炎、糖尿病(1型)、若年性特
発性関節炎のいくつかの形態、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、特発性
血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、いくつかの形態の心筋炎、多発性硬化症、天疱瘡/
類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関
節リウマチ、強皮症/全身性硬化症、シェーグレン症候群、全身性ループス、エリテマト
ーデス、甲状腺炎のいくつかの形態、ブドウ膜炎のいくつかの形態、白斑、多発血管炎を
伴う肉芽腫症(ウェゲナー病)が挙げられるが、これらに限定されない。ウイルス性感染
症の例には、HIV-(ヒト免疫不全ウイルス)、HSV-(単純ヘルペスウイルス)、
KSHV-(カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス)、RSV-(呼吸器合胞体ウイルス)、
EBV-(エプスタイン-バーウイルス)、CMV-(サイトメガロウイルス)、VZV
(水痘帯状疱疹ウイルス)、アデノウイルス-、レンチウイルス-、BKポリオーマウイ
ルスに関連する疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
は健康な血液細胞を産生できなくなる。急性型の白血病は小児及び若年成人に発生し得る
。実際、それは他のどの種類の悪性疾患よりも米国の小児たちにとって一層一般的な死因
である。急性白血病では、悪性細胞の急速な進行と蓄積が原因で即時の治療が必要であり
、次いで悪性細胞は血流に溢れ出して身体の他の臓器に広がる。中枢神経系(CNS)の
関与はまれであるが、この疾患は時々脳神経麻痺を引き起こし得る。慢性白血病は、比較
的成熟しているが依然として異常な血液細胞の過剰な蓄積によって区別される。通常、進
行に数ヵ月から数年かかり、細胞は正常な細胞よりもはるかに速い速度で産生され、その
結果、血液中に多くの異常な白血球が生じる。慢性白血病は主に年長者で発生するが、理
論的にはどの年齢層でも発生し得る。急性白血病は直ちに治療しなければならないのに対
し、慢性形態は治療の最大の効果を確実にするために治療前にしばらくモニターされるこ
とがある。さらに、疾患は、通常はリンパ球を形成するように進む骨髄細胞のある種でが
ん性の変化が起こったことを示すリンパ球性またはリンパ芽球性、及び通常は赤血球、一
部の種類の白血球、血小板を形成するように進む骨髄細胞のある種でがん性の変化が起こ
ったことを示す骨髄で生じたまたは骨髄性(リンパ系細胞と骨髄系細胞を参照)に分類さ
れる。
児における最も一般的なタイプの白血病である。この疾患は成人、特に65歳以上にも発
症する。慢性リンパ性白血病(CLL)は55歳を超える成人に最もよく発症する。それ
は若年成人に時々発生するが、小児にはほとんど発症しない。急性骨髄性白血病(急性骨
髄性白血病、またはAMLとしても知られる)は小児よりも成人に多く発生する。この種
の白血病は以前は「急性非リンパ性白血病」と呼ばれていた。慢性骨髄性白血病(CML
)は主として成人に発生する。ごく少数の小児もこの病気を発症する。
んの一種である。リンパ腫には多くの種類がある。米国国立衛生研究所によれば、リンパ
腫は米国におけるがんの症例すべての約5%を占め、特にホジキンリンパ腫は米国におけ
るがんの症例すべての1%未満を占める。リンパ系は生体の免疫系の一部であるので、H
IV感染または特定の薬剤や薬物などによって免疫系が弱っている患者もリンパ腫の高い
発生率を有する。
この病気はホジキン病と呼ばれていた。口語的に、リンパ腫はホジキンリンパ腫と非ホジ
キンリンパ腫(他のすべての種類のリンパ腫)に大別される。リンパ腫の種類の科学的分
類はさらに詳細である。古い分類は組織球性リンパ腫を指していたが、これらはB、T、
またはNKの細胞系列のものとしてさらに新しい分類で認識されている。
に医薬組成物を投与すると、医薬組成物は、がん細胞に関する免疫細胞の機能を弱める遺
伝子を活性化しないで、且つそれによって引き起こされる活性化阻害シグナル伝達に起因
する疲弊のような問題を起こさずに、がんを認識し、免疫活性を有することができる。
受容体の発現をさらに効果的に抑制することができる一方で同時に、キメラ抗原受容体が
機能することができる抗がん免疫細胞療法の有効性を最大化することができる。さらなる
実施形態では、上記に記載されているように免疫チェックポイント受容体の発現が抑制さ
れている細胞が医薬組成物に使用されるので、免疫チェックポイント受容体の別の阻害剤
の使用に起因してもよいサイトカイン放出症候群または自己免疫症状のような重篤且つ全
身性の有害反応を、ならびに細胞療法との高価な抗体療法の併用から生じる治療コストの
増加による負担を排除することが可能である。
、ビヒクル及び他の添加剤等が医薬組成物に添加されてもよいことは自明であるので、そ
の詳細な説明は省略されるべきである。
チェックポイントを標的とする二重CAR-T細胞を含む。例えば、二重免疫チェックポ
イントは、PD1(プログラム細胞死タンパク質1)、PD-L1(プログラム死リガン
ド1)、CTLA4(細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4)、TIM-3(T細胞免
疫グロブリン及びムチンドメイン含有-3)、CEACAM(3つのサブタイプCEAC
AM-1、CEACAM-3またはCEACAM-5を含む癌胎児性抗原関連細胞接着分
子)、LAG3(リンパ球活性化遺伝子3)、VISTA(T細胞活性化のVドメインI
gサプレッサー)、BTLA(B及びTリンパ球減衰因子)、TIGIT(Ig及びIT
IMのドメインを持つT細胞免疫受容体)、LAIR1(白血球関連免疫グロブリン様受
容体1)、CD160(分化抗原群160)、CD96(分化抗原群96)、MerTK
(癌原遺伝子チロシンタンパク質キナーゼMER)、及び2B4(NK細胞活性化誘導リ
ガンド)から成る群から選択することができ、例えば、PD1とTIM3の間で選択され
てもよい。
果に影響を与える。例えば、PD-1及びTIM3を標的とする医薬組成物は、PD-1
及びTIGITを標的とする医薬組成物とは異なるレベルの抗腫瘍効果を示すことができ
る。さらなる実施形態では、抗腫瘍効果における前記差異は、同じ免疫チェックポイント
を標的とする他の薬剤の抗腫瘍効果に関する既知の知識から予測不可能であり、例えば、
他の薬剤は免疫チェックポイントを標的とする抗体を含むことができる。いくつかの実施
形態では、特定の2つの免疫チェックポイントを標的とすることは、驚くほど高い抗腫瘍
効果を生み出すことができる。例示的な実施形態(実施例10)では、PD-1とTIG
ITを標的とするCAR-T細胞は、PD-1とCTLA-4、PD-1とLAG-3及
びPD-1とTIM-3の組み合わせを標的とする他の二重KD CAR-T細胞と比較
して驚くほど優れた抗腫瘍効果を示す。
用量単位、例えば注射は、単独でまたは他の活性剤との適切な組み合わせで所定量の組成
物を含有する。「単位剤形」という用語は本明細書で使用されるとき、ヒト及び動物の対
象についての単位投与量として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位は、所望の効果
を生じるのに十分な量で計算された所定量の本明細書に記載されている組成物を単独で、
または他の活性剤との併用で、適宜薬学上に許容できる希釈剤、担体または媒体と関連し
て含有する。本明細書に記載されている細胞または組成物の新規の単位剤形の明細は、特
定の対象における医薬組成物に関連する特定の薬力学に左右される。
剤形は、本開示の内容及び製剤技術の一般知識に基づいて、ならびに意図される投与経路
、送達方法及び標的用量に従って決定されてもよい。投与方法にかかわらず、患者の体重
、表面積、または臓器の大きさに従って有効用量が算出されてもよい。本明細書に記載さ
れたそれぞれの剤形を使用する治療に適切な投与量を決定するための計算、ならびに追加
の精製は、当該技術分野で毎日実施され、当該技術分野で毎日実施される作業の範囲内に
含まれる。適切な投与用量は、適切な用量反応データの使用を介して同定されてもよい。
の作用剤と組み合わせて使用することができる。単独でまたは他の作用剤と組み合わせて
送達されるかどうかにかかわらず、本明細書に記載されている医薬組成物は、種々の経路
を介して哺乳動物、特にヒトの身体の種々の部位に送達されて、特定の効果を達成するこ
とができる。当業者は、1を超える経路を投与に使用することができるが、特定の経路が
別の経路よりもさらに迅速且つあらに効果的な反応を提供できることを認識するであろう
。例えば、皮内送達は、黒色腫の治療のために吸入よりも有利に使用されてもよい。局所
または全身性の送達は、体腔への製剤の適用もしくは点滴、エアロゾルの吸入もしくは吹
送を含む投与によって、または筋肉内、静脈内、門脈内、肝内、腹腔内、皮下、もしくは
皮内の投与を含む非経口導入によって達成することができる。対象への投与の例示的な経
路には、静脈内(IV)注射、及び局所(腫瘍内、腹腔内)投与が挙げられる。いくつか
の実施形態では、医薬組成物は固形腫瘍への注入を介して投与することができる。
えて、状態、疾患、または適応症に関連する抗原を標的とする抗体または抗体断片を含む
追加の治療剤が、これらのエフェクター細胞と共に併用療法で使用されてもよい。いくつ
かの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は
ヒト化抗体、ヒト抗体モノクローナル抗体またはキメラ抗体である。いくつかの実施形態
では、抗体または抗体断片はウイルス抗原に特異的に結合する。他の実施形態では、抗体
または抗体断片は腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、投与されるゲ
ノム操作された免疫細胞に対する追加の治療剤としての併用治療に好適な抗体は、抗CD
20(リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマ
ブ、オビヌツズマブ)、抗HER2(トラスツズマブ、パーツズマブ)、抗CD52(ア
レムツズマブ)、抗EGFR(セルツキシマブ)、抗GD2(ジヌツキシマブ)、抗PD
L1(アベルマブ)、抗CD38(ダラツムマブ、イサツキシマブ、MOR202)、抗
CD123(7G3、CSL362)、抗SLAMF7(エロツズマブ);及びそれらの
ヒト化されたまたはFc修飾された変異体または断片、またはそれらの機能的な同等物及
びバイオ後続品が挙げられるが、これらに限定されない。
在し、長期の特異的な抗腫瘍応答が確立されてそうでなければそのような治療の非存在下
で生じるよりも腫瘍のサイズを小さくする、腫瘍の増殖または再増殖を排除するように、
対象に導入される。望ましくは、対象に再導入された形質導入されたT細胞の量は、形質
導入されたT細胞が存在しないこと以外では同じ条件と比較した場合の腫瘍サイズで10
%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98
%、または100%の減少を引き起こす。
あり、十分な数の形質導入されたT細胞が導入されて所望の治療反応が達成されるような
量でなければならない。さらに、本明細書に記載されている組成物に含まれる各活性剤の
量(例えば、接触される各細胞当たりの量または特定の体重当たりの量)はさまざまな応
用において変化することができる。一般に、形質導入されたT細胞の濃度は望ましくは、
少なくとも約1×106個~約1×109個の形質導入されたT細胞、一層さらに望まし
くは約1×107個~約5×108個の形質導入されたT細胞を治療される対象にて提供
するのに十分であるべきであるが、好適な量は、例えば5×108個の細胞を上回って、
または1×107個の細胞を下回って利用することができる。投薬スケジュールは、確立
された細胞ベースの治療法に基づくことができ(例えば、Topalian及びRose
nberg、1987;米国特許第4,690,915号を参照のこと)、または代替の
連続注入戦略を採用することができる。
れる形質導入されたT細胞の範囲の一般的なガイダンスを提供する。そのような範囲の本
明細書での列挙は、特定の応用で正当化され得るように、さらに多いまたはさらに少ない
量の成分の使用を決して排除するものではない。例えば、実際の用量及びスケジュールは
、組成物が他の医薬組成物と併用して投与されるかどうかに応じて、または薬物動態、薬
物の体内動態、及び代謝における個人間の差異に応じて変化することができる。当業者は
、特定の状況の緊急性に従って必要な調整を容易に行うことができる。
施形態では、CAR-T細胞は、細胞を増殖させるのに好適な試薬、例えば、培地、aA
PC、増殖因子、抗体(例えば、CAR-T細胞を選別するまたは特徴付けるための)、
及び/またはCARもしくはトランスポザーゼをコードするプラスミドも含んでもよいキ
ットにて提供される。
1以上の試薬、発現構築物の形質移入のための細胞、及び/または発現構築物の形質移入
のための同種細胞を得るための1以上の器具(そのような器具は、シリンジ、ピペット、
鉗子及び/またはそのような医学的に承認された装置であってもよい)。
築物を生成するための1以上の試薬、及び/またはCAR + T細胞はキットにて提供
されている。いくつかの実施形態では、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(複数の)をコード
する発現構築物が含まれる。いくつかの態様では、キットは細胞のエレクトロポレーショ
ンのための試薬または装置を含む。
書に記載されているような組成物を生成するための試薬を含んでもよい。キットの成分は
、水性媒体または凍結乾燥形態のいずれかで包装されてもよい。キットの容器手段は、成
分が入れられてもよく、特定の実施形態では好適に等分されてもよい少なくとも1つのバ
イアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または他の容器手段を含んでもよい。キ
ットに1以上の成分がある場合、キットは一般に、追加の成分が別々に入れられてもよい
2番目、3番目、または他の追加の容器も含有するであろう。しかしながら、成分のさま
ざまな組み合わせがバイアルに含まれてもよい。本明細書に記載されているキットはまた
通常、商業的販売のために厳重に閉じ込められたキメラ受容体構築物及び任意の他の試薬
の容器を含有するための手段も含むであろう。そのような容器は、例えば、所望のバイア
ルが保持される射出成形されたまたはブロー成形されたプラスチック容器を含んでもよい
。
許容される担体とを含む医薬組成物である。別の態様では、本明細書で提供されるのは、
上述の免疫細胞を含むヒト患者の免疫療法のための医薬組成物である。いくつかの実施形
態では、免疫細胞はもともと患者に由来する。いくつかの実施形態では、患者は、細胞に
て発現されたCARまたはTCR、例えば、mTCRによって標的とされるがん抗原のレ
ベルの増加または変動が検出される腫瘍またはがんを有する。
されるのは、疾患または状態を有する対象に上記に記載されている免疫細胞または上記に
記載されている組成物を投与することを含む治療方法である。いくつかの実施形態では、
遺伝子操作された抗原受容体は疾患または状態に関連する抗原に特異的に結合する。いく
つかの実施形態では、疾患または状態はがんまたは腫瘍である。
形態では、提供されるのは疾患または状態の治療に使用するための上記に記載されている
免疫細胞及び組成物である。
かの実施形態では、提供されるのは疾患または状態を治療する方法にて使用するための薬
物の製造における上記に記載されている免疫細胞または組成物の使用である。いくつかの
実施形態では、遺伝子操作された抗原受容体は疾患または状態に関連する抗原に特異的に
結合する。いくつかの実施形態では、疾患または状態はがんまたは腫瘍である。
思想または本質的な特徴を変更することなく、本発明が特定の他の形態に容易に改変され
てもよいことを理解すべきである。したがって、上記に記載されている実施形態は例示的
であり、すべての態様で限定するものではないことが理解されるべきである。例えば、統
合されていると記載されている各構成要素が個別に実施されてもよいし、同様に個別に実
施されていると記載されている構成要素が統合して実施されてもよい。
ができる。実施例は、説明であることが意図され、本発明の範囲に対して限定するまたは
制約するようには意図されない。
細胞株及び培養。Nalm-6、Nalm-6GL(GFP及びホタルルシフェラーゼ
を発現している)、K562、K562-CD19、IM-9、Raji、Daudiの
細胞株を37℃での5%CO2の加湿インキュベーターにて10%熱非働化ウシ胎児血清
及び2mMのL-グルタミンと1%ペニシリン/ストレプトマイシンで補完したRPMI
-1640で培養した。Lenti-X(商標)293T細胞株はTakaraから購入
し、10%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、2mMのL-グルタミン、0.1mMの非
必須アミノ酸、1mMのピルビン酸ナトリウム及び1%ペニシリン/ストレプトマイシン
で補完したDMEMにて維持した。CD19+PD-L1+細胞株を生成するために、K
562-CD19細胞またはNALM-6-GL細胞にヒトPD-L1をコードするレン
チウイルス(NM_014143.3)で形質導入した。Nalm-6-PDL1-CD
80細胞株は、ヒトCD80をコードするレンチウイルス(NM_005191.3)に
よるNalm-6-PDL1細胞の形質導入によって生成された。
通領域と、4-1BB(CD137)及びCD3ζの細胞質ドメインとを含有するpLV
-CD19-BBzベクターの構築は、以前に記載されている(PNAS,2016,M
a JSY)。pLV-CD19-28zを生成するために、4-1BBの細胞質ドメイ
ンをヒトCD28共刺激ドメインの配列で置き換えた。形質導入されたCAR-T細胞の
検出と精製のために、ΔLNGFR(細胞質ドメインを切り詰めたCD271)配列をp
MACS-ΔLNGFR(Milteny Biotec)ベクターから増幅し、P2A
配列を介してCAR-導入遺伝子の前に挿入して、pLV-ΔLNGFR-CD19-2
8zまたはpLV-ΔLNGFR-CD19-BBzを得た。
クターを生成するために、shRNA(連結配列;TTCAAGAGA、終了配列;TT
TTT)とPol IIIプロモーター(mU6、hU6またはhH1)を含有するsh
RNA発現カセットを合成し、セントラルポリプリン配列(cPPT)の上流のCARを
コードするLVベクターにサブクローニングした。異なるプロモーター(mU6とhU6
)によって2つのshRNAを発現する1つで2つの機能がある二重ベクターを生成する
ために、BstZ171-Xba1-Nde1-Bmt1-Spe1 MCS配列をhU
6プロモーターの下流のpLV-hU6-shPD-1_ΔLNGFR-CD19-BB
zベクターに挿入した。2番目のmU6-shRNAカセット断片をMCSにサブクロー
ニングした。
gene #10959)に由来するNFATRE×3配列をPCRによって増幅する。
NF-kB-RE5×(5’-GGGAATTTCC-3’)及びminiPの配列を合
成した(IDT Technologies)。pLV-eGFPベクターのEF-1a
プロモーターをこれらのレポーター断片で置き換え、pLV-NFAT-RE 3×-e
GFPまたはpLV-NF-kB-RE 5×-eGFPレポーターベクターを得た。
4、LAG-3、TIGIT、及びTIM-3)に特異的である21塩基長のsiRNA
の候補配列は、合成前にBLOCK-iT(商標)RNAi DesignerまたはS
foldのプログラムを用いて設計された。RNAオリゴマー。CTLA-4を標的とす
るsiRNAは配列番号255~260から成る群から選択された。LAG-3を標的と
するsiRNAは配列番号244~254から成る群から選択された。TIGITを標的
とするsiRNAは配列番号238~243から成る群から選択された。TIM-3を標
的とするsiRNAは配列番号261~264から成る群から選択された(IDT Te
chnologies)。免疫チェックポイントの発現動態を分析するために、PBMC
をヒト組換えIL-2の存在下でDynabeads Human T-Activat
or CD3/CD28(Thermofisher)または4μg/mlの抗CD3抗
体及び2μg/mlの抗CD28抗体によって刺激した。免疫チェックポイントの発現レ
ベルを12日間(3日目、6日目、12日目)分析した。最適なsiRNA配列の選択の
ために、刺激の2日後、PBMCにNeon(登録商標)Transfection S
ystem(Thermofisher)を用いてsiRNAオリゴマーをエレクトロポ
レーションで導入した。siRNAのノックダウン効率は形質移入の2日後、フローサイ
トメトリーによって測定した。その効率に基づいて各免疫チェックポイントについて2~
3のsiRNA配列を選択し、shRNA形式に変換して、1つで2つの機能がある二重
レンチウイルスベクターを生成した。shRNAが介在するノックダウン有効性を検証す
るために、レンチウイルスで形質導入したT細胞を1:1の比にてγ線照射したK562
-CD19細胞で3日間刺激し、フローサイトメトリーによって免疫チェックポイントの
それの発現レベルについて分析した。
マウスF(ab’)2抗体(115-606-072、Jackson ImmunoR
esearch)またはAF647を結合したストレプトアビジン(405237、Bi
olegend)と併せたビオチンを結合したrhCD19-Fc(CD9-H5259
、ACRO Biosystems)によって分析した。ΔLNGFR発現は、APCま
たはFITCを結合した抗CD271抗体(ME20.4-1.H4;Mitenyi
Biotec)によって分析した。CAR-T細胞における免疫チェックポイントの発現
は、以下の抗体:PD-1(PE、クローンJ105;Thermofisher)、T
IM-3(PE、クローン344823;R&D Systems)、LAG-3(PE
、クローン7H2C65;Biolgend)、TIGIT(PE、クローンMBSA4
3;Thermofisher)を用いて従来のフローサイトメトリーによって測定した
。
2-CD19細胞との1:1のE:T比での3日間のインキュベートの後、細胞内フロー
サイトメトリーによって分析した。細胞はCytofix/Cytoperm(商標)溶
液(BD Bioscience)で固定し/透過処理し、続いて抗ヒトCD152(C
TLA-4)抗体(PE、クローンBNI3;Biolegend)によって染色した。
:CD80(PE、クローン2D10;Biolgend)、CD86(BV421、ク
ローン2331(FUN-1);BD Bioscience)、PD-L1(APC、
クローン29E.2A3;Biolgend)、HLA-DR(PE、クローンL243
;Biolgend)、CD112(PE、クローンTX31;Biolgend)、C
D155(PE、クローンSKII.4;Biolgend)を用いて分析した。
ng/mlの組換えヒトTGF-β1(R&Dシステム)の存在下で照射されたNALM
-6細胞によって3日間刺激し、その後、フローサイトメトリーによってPD-1発現を
測定した。
/3のリン酸化状態を判定するために,CAR-T細胞を1:1のE:T細胞比でNAL
M-6細胞と共に4時間または24時間インキュベートした。細胞はLyse/Fix緩
衝液(BD Bioscience)によって固定し、続いてPerm緩衝液III(B
D Bioscience)によって透過処理した。LNGFR+CAR-T細胞のリン
酸化状態は、抗ヒトSmad2(pS465/pS467)/Smad3(pS423/
pS425)抗体(PE、クローン072-670;BD Bioscience)によ
って判定した。
CD4+CD25+FOXP3+)は、NALM-6細胞との3日間の共培養の後、細胞
内染色によって分析した。Foxp3/転写因子染色緩衝液(Thermofisher
)で固定し、透過処理した細胞を以下の抗体:抗CD4(BV605、クローンOKT4
;Biolgend)、抗CD25(FITC、クローンVT-072;Biolgen
d)、及び抗FOXP3(APC、クローン236A/E7;Thermofisher
)で染色した。
磁気ビーズ(Miltenyi Biotec)によって選別した。LNGFR+CAR
-T細胞(1×106個、純度>95%)をサイトカインの非存在下で6日ごとに、γ線
照射したK562-CD19-PDL1細胞(1×106個)で刺激した。CAR-T細
胞の倍数増殖はトリパンブルー排除を用いて6、12、及び18日目に細胞を数えること
によって算出した。
teS3生細胞分析システムを用いて判定した。GFPを構成的に発現しているNALM
―6またはNALM-6-PDL1の標的細胞を3つ組にてウェルあたり1×105個の
細胞の密度で96ウェルプレートに入れた。LNGFR+CAR-T細胞を1:1、0.
3:1、0.1:1のE:T比で各ウェルに加えた。各ウェルのGFP強度のリアルタイ
ム変化は緑色物積分強度として2時間ごとに記録した(平均、平均GFP強度×μm2/
ウェル)。相対的な緑色物積分強度の比率は、以下の式:(各時点での合計GFP積分強
度/開始時点での合計GFP積分強度)*100によって算出した。
子の比活性を決定するために、ヒト組換えIL-2(300IU/mL)の存在下にて4
μg/mlの抗CD3及び2μg/mlの抗CD28抗体で2日間刺激したPBMCに先
ず、NFAT-RE×3-eGFPレポーター遺伝子をコードするレンチウイルスで形質
導入した。形質導入の8日後、全細胞をヒト組換えIL-2(300IU/mL)の存在
下にて2日間、抗CD3及び抗CD28抗体によって再刺激した。活性化された細胞を2
つの別々のウェルに分割し、異なるCARをコードするレンチウイルス(CD19-28
zまたはCD19-BBz)で形質導入した。6日後、各ウェルの全細胞をNALM-6
細胞と1:1の比で共培養した。CAR-T細胞におけるNFATのレポーター活性は2
4時間及び48時間の時点で、LNGFR+CAR-T集団(合計CD3+細胞の20~
25%)内でのeGFPシグナルのgMFI値によって決定した。CAR-T細胞におけ
るNF-κB転写因子の比活性は、同様の手順に従って、しかし、NF-κB-RE x
5-eGFPレポーター遺伝子をコードするレンチウイルスを用いて測定した。
AR-T細胞をCD19+NALM-6標的細胞と共に1:1の比で共培養した。4時間
及び48時間の共培養の後、LNGFR+CAR-T細胞はMoFlo Astrios
ソーター(Beckman Coulter)を用いて選別した。LNGFR+CAR-
T細胞からmRNAをRNeasyミニキット(Qiagen)によって抽出し、Qua
ntiTect Reverse Transcriptionキット(Qiagen)
を用いてcDNAに逆転写した。定量的リアルタイムPCRは、CFX96リアルタイム
PCR検出システム(Biorad)及びSYBR GreenリアルタイムPCRマス
ターミックス(TOYOBO)を用いて、SYBRプロトコールで実施した。18s r
RNAの検出のためのプライマー配列は配列番号268及び269を含む。PDCD1の
検出のためのプライマー配列は配列番号270及び271を含む。IL2の検出のための
プライマー配列は配列番号272及び273を含む。IL4の検出のためのプライマー配
列は配列番号274及び275を含む。IL17Aの検出のためのプライマー配列は配列
番号276及び277を含む。CD25の検出のためのプライマー配列は配列番号278
及び279を含む。CTLA4の検出のためのプライマー配列は配列番号280及び28
1を含む。FOXP3の検出のためのプライマー配列は配列番号282及び283を含む
。TGF-ベータ1の検出のためのプライマー配列は配列番号284及び285を含む。
TGFBR1の検出のためのプライマー配列は配列番号286及び287を含む。TGF
BR2の検出のためのプライマー配列は配列番号288及び289を含む。
料)=Ct(標的の遺伝子)-Ct(18s rRNA)。比較Ct法を適用して、以下
の方程式:2-ΔΔCt=2∧-(ΔCt[刺激した]-ΔCt[非刺激])に基づいて
、刺激されていない状態と比較した標的mRNAの相対的な倍率変化を分析した。
委員会によって承認された。CD19+血液がんモデルを確立するために、NSGマウス
(4~6週齢)に、EGFP融合ホタルルシフェラーゼならびにヒトPDL1を発現する
ように操作されている1x106個のCD19+NALM-6白血病細胞(NALM6-
GL-PDL1細胞)を静脈内注射した。CAR-T細胞は、上記に記載されている手順
に従って健常なドナーの全血試料から調製した。形質導入後4日目、CAR-T細胞を選
別し、マウスへの注射に先立ってさらに6日間増殖させた。NALM6-GL-PDL1
細胞注射の5日後、2.5または1×106個のCAR-T細胞をマウスに静脈内注入し
た。マウス内のNALM6-GL-PDL1の生物発光画像処理はXenogen IV
IS Spectrumでモニターし、シグナルはLiving Imageソフトウェ
ア(Perkin Elmer)を用いて対象とする領域における放射輝度(光子/秒)
として定量した。固形腫瘍モデルについては、NSGマウスに5×106個のIM-9細
胞(CD19+PD-L1+CD155+)を皮下注射した。LNGFR+CAR-T細
胞は、腫瘍細胞の注射の14日後(約150~300mm3の腫瘍体積)にマウスに静脈
内注入した。腫瘍はキャリパー測定によって毎週モニターし、体積は(長さ×幅2)/2
によって推定した。
能があるベクターの作製と評価の方法
この実施例は、CART19と、PD-1を阻害するshRNAとを発現する1つで2
つの機能があるベクターの作製と評価の方法を記載している。
ウイルスベクターを生成するために、shRNA(連結配列;TTCAAGAGA、終了
配列;TTTTT)とPol IIIプロモーター(mU6、hU6またはhH1)を含
有するshRNA発現カセットを合成し、セントラルポリプリン配列(cPPT)の上流
でCARをコードするLVベクターにサブクローニングした。EF-1αプロモーターに
よって4-1BBベースのCART19を、mU6プロモーターによってPD-1を標的
とするshRNAを自発的に発現するレンチウイルスベクターを構築した(図1A及び1
B)。
。shPD-1#1はCARの発現(図1C)、恒常性増殖(図1D)、分化状態及びC
D4/CD8組成(図1F)に影響を与えることなく、PD-1の発現(図1F)に対し
て驚くほど効果的な阻害効果を示した。shRNAの発現レベルは、Pol IIIプロ
モーターの種類に応じて異なる可能性があることが報告されている(Mol.Ther.
,2006,Irvin S.Y.Chen)。したがって、PD-1発現に対するmU
6、hU6、またはhH1プロモーターの効果を評価した。mU6とhu6は類似のKD
有効性を示したが、hH1はさらに低かった(図2)。
現に対して驚くほど効果的な阻害を示したので、以下の実施例にてPD-1 KD改変C
AR-T細胞の作製に使用することができる。
この実施例は、PD-1 KD改変CAR-T細胞の製造方法と試験管内での評価を記
載している。
e)密度勾配遠心分離法によって健常なドナーの全血試料から分離した。これらの細胞は
300IU/mlのヒト組換えIL-2(BMIKOREA)の存在下で4μg/mlの
プレートに結合した抗CD3抗体(クローンOKT3;Bio X cell)及び2μ
g/mlの可溶性抗CD28抗体(クローンCD28.2;Bio X cell)で刺
激した。組換えレンチウイルス作製のために、形質移入の24時間前に2.5mLの増殖
培地(10%FBS、2mMのL-グルタミン、0.1mMの非必須アミノ酸、及び1m
Mピルビン酸ナトリウムで補完したDMEM)における6x105個の293T細胞を6
ウェルプレートに播種した。細胞に、10μlのリポフェクトアミン2000(Ther
mofisher)を用いて、パッケージングベクター(pMDL、pRev、pMDG
.1)とトランスファーベクターの混合物で形質移入した。形質移入の2日後、レンチウ
イルスを含有する培養上清を回収し、1800rpmで5分間遠心分離した。活性化T細
胞を硫酸プロタミン(1μg/ml)の存在下でウイルス上清と混合し、1000×gで
90分間遠心し、37℃で一晩インキュベートした。翌日、培養上清を吸引し、10%F
BS、2mMのL-グルタミン、0.1mMの非必須アミノ酸、1mMのピルビン酸ナト
リウム、55μMのβ-メルカプトエタノールで補完した新鮮なPRMI-1640と交
換した。形質導入されたT細胞を1×106個の細胞/mLを下回る密度にて10%熱非
働化FBS及び2mMのL-グルタミン及び1%のペニシリン/ストレプトマイシンで補
完したRPMI-1640、ヒト組換えIL-2(300IU/mL)を含有するT細胞
培地で培養し、それを2~3日ごとに補充した。
m-6-PDL1またはK562-CD19-PDL1をCD19+PDL1+標的細胞
として使用した。先ず、IncuCyteリアルタイムイメージングシステムを使用した
長期の溶解活性を調べた。CAR-T細胞をNALM-6細胞と混合した場合、WT(s
hGFP)CART及びPD-1 KD(shPD-1)CAR-T細胞は類似の溶解活
性を示した。しかしながら、CAR-T細胞をNALM-6-PDL1細胞と共に培養し
た場合、shPD-1 CAR-T細胞は、shGFP CARの溶解活性よりも驚くほ
ど効果的な溶解活性を示した(図3A)。予想外にshRNAカセットを含まないBBz
CAR-T細胞とshGFP CAR-T細胞は同様の細胞傷害性を保持することも見
いだされたということは、shRNA発現自体がCAR-T細胞の活性にほとんど効果を
有さないことを示唆している。
評価した。shPD-1 CAR-T細胞は外来性IL-2の非存在下でshGFP C
AR-T細胞よりはむしろK562-CD19-PDL1標的に対して4~5倍高いT細
胞増殖活性を達成した(図3B)。共刺激性リガンドは最適なT細胞の増殖を促進し、腫
瘍細胞で発現されるのはまれではないことが知られている。標的細胞における共刺激リガ
ンドの発現が反復刺激の際に細胞増殖に影響を与えるかどうかを調べるために、代表的な
共刺激リガンドであるCD80が標的細胞で発現されるかどうかを調べた。K562-C
D19はCD80を発現したが、Nalm-6は発現しなかった(図3C)。CD80を
過剰発現するNALM-6-PDL1(NALM-6-PDL1-CD80)は、反復刺
激のもとでCAR-T細胞が増殖することを可能にすることが見いだされた。CD80は
反復試験管内刺激のもとでCART増殖を促進する可能性がある(図3B)。まとめると
、細胞固有のPD-1破壊は、CAR &PDL1の反復刺激の際にCD19特異的CA
R-T細胞の試験管内での機能改善に驚くほど効果的に寄与することが裏付けられた。
生成されたPD-1 KD改変CAR-T細胞はWT CAR-T細胞と比較して試験管
内での溶解活性及び増殖活性の驚くほどのレベルの増強を示したので、その治療の可能性
が、以下の実施例におけるCD19+PDL1+の血液腫瘍を担うマウスモデルにおける
生体内モデルにてさらに評価された。
治療方法
この実施例はPD-1 KD CAR-T細胞を使用したCD19+血液がんの生体内
での治療方法を記載している。
P融合ホタルルシフェラーゼ及びヒトPDL1を発現するように設計された1x106個
のCD19+NALM-6白血病細胞(NALM6-GL-PDL1細胞)を静脈内注射
した。CAR-T細胞は、上記に記載されている手順に従って健常なドナーの全血試料か
ら調製した。形質導入後4日目、CAR-T細胞を選別し、マウスへの注射に先立ってさ
らに6日間増殖させた。NALM6-GL-PDL1細胞注射の5日後、1×106個の
CAR-T細胞をマウスに静脈内注入した。マウス内のNALM6-GL-PDL1の生
物発光画像処理はXenogen IVIS Spectrumでモニターし、シグナル
はLiving Imageソフトウェア(Perkin Elmer)を用いて対象と
する領域における放射輝度(光子/秒)として定量した。shPD-1 CAR-T細胞
で処理したマウスは、shGFP CAR-T細胞と比較して、腫瘍量の驚くほど均一な
低下を有した(図4)。加えて、2種類のshRNAを発現するプロモーターが同様の抗
腫瘍効果を有し、shRNA発現自体は驚くほど抗腫瘍効果には影響を与えないことが見
いだされた。
べること。個々のマウスの末梢血は、CAR-T注射の24時間後と72時間後に得た。
室温にて300×gで5分間遠心分離することによって末梢血から血漿を回収した。生体
内でのサイトカインレベルは製造元の指示に従ってヒトTh1/Th2サイトカインキッ
ト(BD Bioscience)で分析した。CAR-T細胞の細胞固有のPD-1破
壊は生体内サイトカイン産生を予想外に低下させた(図5A)。
効果を調べるために、CAR-T注射の3または20日後に個々のマウスの脾臓を得た。
CAR-T細胞(生細胞/死細胞―CD3+)またはNALM-6-PDL1(生細胞/
死細胞―GFP+)の比率をフローサイトメトリーで評価した。細胞固有のPD-1破壊
はCAR-T細胞の生体内増殖を予想外に遅延させた(図5B)。
たCAR-T細胞固有のPD-1破壊は、CD19+PDL1+腫瘍に対するCD19特
異的CAR-T細胞の生体内抗腫瘍効果で予想外に高いレベルの増加を示した。したがっ
て、PD-1 KD CAR-T細胞は、以下の実施例の方法でさらに使用された。
この実施例は、PD-1シグナル伝達におけるCD28及び4-1BBを含む共刺激分
子の環境評価を記載している。
T細胞の機能にどのように影響を及ぼすのかを調べた(図6A)。G28z GBBz、
P28z、及びPBBz CAR-T細胞を先ず生成した。これらのCAR-T細胞を同
様に形質導入した(図6B)。PD-1発現レベルはG28z CAR-T細胞において
GBBz CAR-T細胞よりも高く、P28zのPD-1レベルはPBBzのそれより
も高かった(図7A)。この異なるPD-1タンパク質レベルが転写レベルに起因するこ
とも見いだされた(図7B)。各共刺激ドメインは、PD-1転写に関与する因子の活性
化に対する異なる強度を表すという仮説を立てた。PD-1転写に関与する転写因子の中
で、NFAT及びNF-κBはPD-1転写に大きく関与し、SMAD2/3は腫瘍微小
環境の主要な免疫抑制因子である外因性TGF-βの存在下でPD-1転写に関与してい
た(Cancer Discov.,2016,Benjamine,V.Park)。
NFATまたはNF-κBの活性をCAR刺激の間に調べた。NFAT応答要素(NFA
T-RE ×3)-eGFPまたは古典的NF-κB応答要素(NF-κB RE ×5
)-eGFPのレポーターレンチウイルスベクターを構築した。NFATまたはNF-k
B REはeGFP誘導に介在することが示された(図8A及び8B)。レポーターを形
質導入したT細胞を再刺激し、さらにG28zまたはGBBzで形質導入した。G28z
形質導入NFATレポーターCAR-T細胞(G28z-NFAT)は、GBBz-NF
ATと比較してわずかに高いレベルのNFAT活性を有し(図9A)、NFAT標的遺伝
子のmRNAレベルもまたG28zにおいてさらに高かった(図9B)。しかしながら、
G28z形質導入NF-κBレポーターCAR-T細胞(G28z-NF-κB)は、G
BB-NF-κBと比較してNFAT活性において類似している(図10)。各CAR-
T細胞のSMAD2/3の活性を調べるために、TGF-βがCAR刺激の間にG28z
またはGBBz CAR-T細胞に処理された。G28z CARTのSMAD2/3リ
ン酸化はBBz CARTがわずかに高く(図11A)、TGF-β処理によるPD-1
発現の増加の程度はG28zの方がGBBzよりも大きい(G28z 2.39±0.0
31、GBBz 1.61+0.034の倍数変化)ことが見いだされた(図11B)。
この差異がTGF-βシグナル伝達要素の発現レベルの差異によるものかどうかを調べた
。TGF-β及びTGF-β受容体1(TGFBR1)は、2つのCART間で有意差は
なかったが、TGF-β受容体2(TGFBR2)は、CD28zにおいてさらに高いレ
ベルで発現されることが見いだされた(図11C)。
分子の環境を評価した。CD28共刺激はPD-1転写に関連するシグナル伝達を強く誘
導し、その誘導はNFAT及びTGF-βのシグナル伝達の活性化に関連し得る。CD2
8共刺激の誘導は4-1BB共刺激の誘導よりも強かった。
この実施例はPD-1 KD CAR-T細胞の操作方法と評価を記載している。
生体内状態を模倣するために、CAR-T細胞を外因性サイトカインのない状態でCD1
9+PDL1+標的細胞と共に共培養した。初代CAR-T細胞では、PD-1 KD
CAR-T群は、WT CAR-T群よりも驚くほど高い溶解活性を示したが、CD28
系と4-1BB系のCAR-T群の間では溶解活性に差異はなかった(図12A)。2回
目のCAR-T細胞の再刺激後、G28z CAR-T細胞は2回目の刺激後に増殖する
能力を失ったので、3種のCAR-T細胞の溶解活性を分析した。PBBz及びP28z
CAR-T細胞は、GBBz CAR-T細胞よりも抗原及びPD-L1の反復曝露の
際、驚くほど高い溶解活性を有した。PBBz CAR-T細胞は、P28z CAR-
T細胞よりも溶解機能を保持することで予想外に高い能力を示した(図12A)。この傾
向は、細胞増殖アッセイでも観察された(図12B)。まとめると、PD-1 KD C
ARTへの4-1BB共刺激ドメインの適用は、CD28共刺激ドメインと比較して、試
験管内での保持された細胞傷害性及び増殖能力に寄与する。PBBz CAR-T細胞は
CD19及びPD-L1の反復曝露で疲弊の遅延を示す。
AR-T細胞はBBz CARTよりもTGF-βに対して感受性が高かったので(図1
1)、TGF-βによって抗原特異的増殖がどれくらい抑制されるについてGBBz C
AR-T細胞をG28z CAR-T細胞と比較した。TGF-βがない状態でのCAR
刺激の間、2つのCAR-T細胞間では増殖の有意差は観察されなかった一方で、GBB
z CAR-T細胞ではなくG28z CAR-T細胞の増殖は意味があるように低下し
た(図13A)。
とが報告されている(JEM,2003,WanJun Chen;Science,2
003,Shohei Hori;Blood,2007,Dat Q.Tran)。外
因性TGF-βの非存在下でG28z CAR-T細胞とBBz CAR-T細胞の間で
Treg誘導が異なるかどうかを調べるために、G28z CAR-T細胞及びBBz
CAR-T細胞をNALM-6標的細胞と3日間培養した。G28z CAR-T細胞は
GBBz CAR-T細胞と比べて、2倍から3倍の試験管内でのCD4+CD25+F
OXP3+Treg%を有した(図13B)。この結果は、CD25及びFOXP3のよ
うなTreg関連遺伝子の発現の増加と一致している(図9B)。次に、TGF-β処理
後Treg%の変化を観察し、比較した。TGF-βは28z CAR-T細胞における
Treg%を有意に改善するが、BBz CAR-T細胞ではTreg%に影響を及ぼさ
ないことが示された(図13B)。CD28共刺激は4-1BB共刺激よりもTregを
誘導する高い可能性を有し、TGF-βが存在すれば、その可能性はさらに突出すると結
論付けられた。細胞固有のPD-1破壊がTregの誘導に影響を与えるかどうかも調べ
た。P28z CAR-T細胞及びPBBz CAR-T細胞はG28z及びGBBzと
比べてそれぞれ、2~3倍低いTregの%を有した。特に、PBBzは最低のTreg
%を有した(図13C)。最後に、PD-1/PD-L1シグナル伝達が活性化されてい
る状態でのTregの比率を調べた。NALM-6またはNALM-6-PDL1との共
培養後のTreg%の変化を調べた。PD-1/PDL1シグナル伝達はCAR-T由来
Tregの誘導に有意な影響を与えないことが見いだされた(図13C)ということは、
細胞内PD-1の発現レベルがTregの形成に関連していることを示唆している。PB
Bz CAR-T細胞は免疫抑制メカニズムに驚くほど鈍感であり得ると結論付けられた
。
1の反復曝露で疲弊の遅延を示した。PBBz CAR-T細胞はまた免疫抑制メカニズ
ムを予想外に回避する。したがって、これらの細胞は生体内の抗腫瘍効果についてさらに
評価された。
この実施例はPBBz CAR-T細胞を用いたCD19+血液がんの生体内での治療
方法を記載している。
LL細胞に対するG28z、GBBz、P28z及びPBBz CAR-T細胞の生体内
での抗腫瘍効果を比較した。CAR-T細胞は、標的細胞注入の4日後、2.5×106
個の単回用量で投与された。NALM6-GL-PDL1を担ったマウスの生体内画像処
理はXenogen IVIS Spectrumで取得し、対象とする領域の放射輝度
(光子/秒)として定量化した。図14に示すように、PD-1 KD CART細胞(
PBBzまたはP28z)は、WT CAR-T細胞(GBBzまたはG28z)よりも
優れた抗腫瘍効果を示す。特に、PBBz CAR-T細胞は、他の3つのCAR-T細
胞よりも長期間、白血病の進行を抑制した。WT CAR-T細胞は強力な抗腫瘍反応を
有したが、持続的な抗腫瘍反応を有さなかった。一方、PD-1 KD CAR-Tは初
期に対して弱い反応を示したが、持続的な抗腫瘍反応を示すということは、CAR-T細
胞におけるPD-1の破壊がCRSのリスクを低下させる可能性があってもよいことを示
唆している。PBBz CAR-T細胞はP28zのそれよりも予想外に優れた生体内の
抗腫瘍効果を付与した。
の機能がある二重ベクターの作製方法
この実施例は1つで2つの機能がある二重ベクターの作製方法を記載しており、その際
、2種類のshRNAカセットが←→方向(shTIM-3-mU6←→hU6-shP
D-1)または→←方向(mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6)で入り、
shPD-1、shTIM-3、及びCD19-CARを同時に発現させる。
以後shTIM-3)及びCD19-CARの発現がそれぞれヒトU6プロモーター(以
下hU6)、マウスU6プロモーター(以下mU6)、及びEF1-αプロモーターによ
って調節されるレンチウイルスを構築すること。双方の種類のshRNAが同時に発現す
るプラスミドは、各shRNAカセットが→←方向(mU6-shTIM-3→←shP
D-1-hU6)及び←→方向(shTIM-3-mU6←→hU6-shPD-1)に
配置されるように調製した(図15)。この目的で、(1)マルチクローニングサイト(
MCS)の挿入、(2)shPD-1のマウスU6プロモーターのヒトU6プロモーター
への変換、(3)shTIM-3の挿入、及び(4)shTIM-3とshPD-1の切
り替え位置のようなクローニングを実施した。
D19-CAR_mU6-shPD-1(プラスミドID#2)の3’部分及び配列番号
228及び229を含むプライマーを用いて、mU6-shPD-1の3’のHpa1制
限酵素認識部位がBsgZ171-Xba1-Nde-1-Bmt1-Spe1マルチク
ローニング部位に改変されるPCR産物(416bp)を作製した。その後、PCR産物
をBstZ17y及びHpa1制限酵素で処理し、プラスミドID#2をHpa1制限酵
素とCIPで処理した後、平滑末端ライゲーションを用いてshPD-1-mU6-MC
S塩基配列(shRNAカセット配列番号223)を含むpLV-ΔLNGFR-P2A
-CD19-CAR-mU6-shPD-1_MCS(プラスミドID#4)を調製した
。
って発現されるようにプラスミドを構築した。LentiCRISPR V2プラスミド
は、配列番号230及び231を含むプライマーと共に用いてヒトU6プロモーターを含
むPCR産物を得た。PCR産物をHpa1及びSpe1制限酵素で処理し、次いでHp
a1及びSpe1制限酵素で処理したプラスミドID#4とライゲーションして、hU6
-shPD-1塩基配列(配列番号224)を含むpLV-ΔLNGFR_P2A_CD
19-CAR_hU6-shPD-1_MSC(プラスミドID#5)を調製した。mU
6-shTIM-3カセットをプラスミドID#5に挿入してshTIM-3とshPD
-1とを同時に発現するプラスミドを構築することを目的とした。
232及び233を含むプライマーとを用いて得た。PCR産物をBmt1及びSpe1
制限酵素で処理した後、Bmt1及びSpe1制限酵素で処理したプラスミドID#5と
それをライゲーションして、→←方向(mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU
6)の塩基配列(配列番号220)を含むpLV-ΔLNGFR_P2A_CD19-C
AR mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6(プラスミドID#6)を調製
した。
D-1)に配置されているプラスミドを構築するために、プラスミドID#6と配列番号
234及び235を含むプライマーとを用いてPCR産物を得た。Spe1及びHpa1
制限酵素で処理した後、同じ制限酵素で処理したプラスミドID#4にそれを挿入してp
LV-ΔLNGFR-P2A-CD19-CAR-shPD-1-hU6-MCS(プラ
スミドID#7)を作製した。その後、プラスミドID#6と配列番号236及び237
を含むプライマーとを用いてPCR産物を得た。PCR産物をBmt1及びSpe1制限
酵素で処理した後、Bmt1及びSpe1制限酵素で処理したプラスミドID#7とそれ
をライゲーションして最終的に、←→方向(shTIM-3-mU6←→hU6-shP
D-1)の塩基配列(配列番号221)を含むpLV-ΔLNGFR-P2A-CD19
-CAR_shTIM-3-mU6←→hU6-shPD-1(プラスミドID#8)を
調製した。
つの機能があるレンチウイルスベクターは、以下の実施例におけるPD-1 KD改変C
AR-T細胞の作製に使用することができる。
この実施例は、shPD-1、shTIM-3、及びCD19-CARを同時に発現さ
せる、二重KD CAR-T細胞を作製し、試験管内で評価する方法を記載している。
P2A_CD19-CAR_mU6-shGFP)、#6(pLV-ΔLNGFR_P2
A_CD19-CAR_mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6)、及び#8
(pLV-ΔLNGFR_P2A_CD19-CAR_shTIM-3-mU6←→hU
6-shPD-1)、ならびにパッケージングプラスミドpMDL g/p、pRSVr
ev及びpMDG.1でHEK293T細胞に形質移入し、48時間経過後、レンチウイ
ルスを含む細胞培養液を得た。Ficoll-paque溶液を用いて、末梢血単核細胞
(PBMC)をヒトの血液から単離し、ヒトCD3及びCD28標的抗体を用いてT細胞
を特異的に活性化した。T細胞の最初の活性化から1~2日後、以前に得られたウイルス
を用いてそれらに形質導入した。調製したCAR-T細胞はその後、5%ヒト血漿及びヒ
トIL-2を含むAIM-V培養液を用いて培養した。形質導入後6日目に、MACSe
lect LNGFRシステム(miltenyibiotec,Germany)を用
いて純粋なCAR-T細胞を取得し、LNGFR標的抗体を用いてフローサイトメーター
でLNGFR+CAR-T細胞を単離した。以下では、プラスミドID#1、#6及び#
8を用いて調製した細胞はそれぞれ、ΔLNGFRCART19/shGFP(またはs
hGFP/CART19)、ΔLNGFR-CART19/mU6-shTIM-3→←
shPD-1-hU6(またはshPD-1_shTIM-3/CART19)及びΔL
NGFR-CART19/shTIM-3-mU6←→hU6-shPD-1として示さ
れる(図16)。
れぞれ含む対照CAR-T細胞を調製するために、リポフェクタミンを用いて表1におけ
るプラスミドID#2(pLV-ΔLNGFR_P2A_CD19-CAR_mU6-s
hPD-1)、#3(pLV-ΔLNGFR_P2A_CD19-CAR_mU6-sh
TIM-3)、及び#7(pLV-ΔLNGFR_P2A_CD19-CAR_shPD
-1-hU6_MCS)、及びパッケージングプラスミドpMDL g/p、pRSVr
ev及びpMDG.1でHEK293T細胞に形質移入した。48時間経過後、レンチウ
イルスを含む細胞培養液を得た。Ficoll-paque溶液を用いて、末梢血単核細
胞(PBMC)をヒトの血液から単離し、ヒトCD3及びCD28標的抗体を用いてT細
胞を特異的に活性化した。T細胞の最初の活性化から1~2日後、以前に得られたウイル
スを用いてそれらに形質導入した。調製したCAR-T細胞はその後、5%ヒト血漿及び
ヒトIL-2を含むAIM-V培養液を用いて培養した。形質導入後6日目に、MACS
elect LNGFRシステム(miltenyibiotec,Germany)を
用いて純粋なCAR-T細胞を取得し、LNGFR標的抗体を用いてフローサイトメータ
ーでLNGFR+CAR-T細胞を単離した。以下では、プラスミドID#2、#3及び
#7を用いて調製した細胞はそれぞれ、ΔLNGFR-CART19/shPD-1(ま
たはshPD-1/CART19)、ΔLNGFR-CART19/shTIM-3(ま
たはshTIM-3/CART19)及びΔLNGFRCART19/shPD-1-h
U6として示される。
た細胞についてLNGFR標的抗体を用いてフローサイトメトリーを行った。図17に示
すように、約80%のLNGFR+CAR-T細胞が得られた。
現の低下が測定され、その発現の持続的な低下が見られた。二重KD CAR-T細胞を
ヒトCD3及びCD28標的抗体で3日間刺激して、PD-1及びTIM-3の発現を誘
導した。その後、CAR、PD-1、及びTIM-3標的抗体を使用したフローサイトメ
トリーを介して二重KD CAR-T細胞のPD-1及びTIM-3発現を分析した。図
18A及び18Bに示すように、PD-1及びTIM-3の発現の低下に対する2つの同
時に発現されたshRNAの種類の効果の分析は、shPD-1とshTIM-3を同時
に発現しているCD19-CAR-T細胞で観察されたPD-1及びTIM-3発現の低
下の程度は、shPD-1またはshTIM-3のみが発現しているCD19-CAR-
T細胞における低下の程度に類似することを示した。
KD CAR-T細胞のPD-1及びTIM-3の分化の程度を観察するために、CD4
5RA及びCCR7標的抗体を用いてフローサイトメトリーを実施した。図19に示すよ
うに、反復抗原刺激に供されたΔLNGFR-CART19/shPD-1細胞では、Δ
LNGFR-CART19/shGFPと比べて最終分化したTEMRA(CCR7-C
D45RA+)T細胞の増加がある。一方、shTIM-3が加えられているΔLNGF
R-CART19/mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6は、ΔLNGFR
-CART19/shPD-1よりも多くのTN(CCR7+CD45RA+)T細胞、
TCM(CCR7+CD45RA-)T細胞及びTEM(CCR7-CD45RA-)T
細胞のサブタイプを含む。同様の結果がΔLNGFR-CART19/shTIM-3細
胞でも同様に観察されるので、TIM-3の発現の抑制に起因してΔLNGFR-CAR
T19/mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6細胞の低下した分化能が生じ
ると言え、したがってshTIM-3の効果はshPD-1の効果よりも細胞分化に対す
る影響を有するという点で優先されていると言うことができる。あまり分化していないT
細胞サブタイプがT細胞のがん治療能力の向上を促進できることが知られているので、Δ
LNGFR-CART19/mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6細胞はΔ
LNGFR-CART19/shPD-1細胞よりも良好な生体内の抗がん効率を示すで
あろうことが期待される。
重KD CAR-T細胞の形質導入効率、増殖能力、及び生存率を比較した。本明細書で
作製されたCAR-T細胞のうち、→←方向(mU6-shTIM-3→←shPD-1
-hU6)及び←→方向(shTIM-3-mU6←→hU6-shPD-1)のカセッ
トを含むプラスミドを用いた細胞についてLNTFR抗体を用いてフローサイトメトリー
を実施した。細胞生存率解析については、トリパンブルー染色を行い、染色されなかった
細胞の割合を求めた。図20A~20Cに示すように、→←方向カセット(ΔLNGFR
-CART19/mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6)を用いた細胞と比
べて、←→方向カセット(ΔLNGFR-CART19/shTIM-3-mU6←→h
U6-shPD-1)を用いた細胞は、形質導入細胞を形成するのに予想外に苦労し、形
質導入されたT細胞は低い増殖能力と生存能力を有した。
hPD-1、shTIM-3、及びCD19-CARは同時に発現させる。←→または→
←方向で入る2種類のshRNAカセットを有する、本明細書で作製した1つで2つの機
能があるレンチウイルスベクターを用いて、二重KD CAR-T細胞を作製した。←→
方向カセットを用いた細胞と比較すると、→←方向カセットを用いた細胞(ΔLNGFR
-CART19/mU6-shTIM-3→←shPD-1-hU6)は驚くほど高い増
殖能力と生存能力を示したので、以下の実施例で使用された。
法
この実施例は、1つで2つの機能があるベクター及び二重KD CAR-T細胞の作製
方法を記載している。
つの機能がある二重ベクターを生成するために、BstZ171-Xba1-Nde1-
Bmt1-Spe1のマルチクローニング部位(MCS)をhU6プロモーターの下流で
pLV-hU6-shPD-1_ΔLNGFR-CD19-BBzベクターに挿入した。
2番目のmU6-shRNAカセット断片をMCSにサブクローニングした。複数の免疫
チェックポイントの遮断をCAR-T細胞のみに限定するために、1つで2つの機能があ
るベクターを考案してmU6及びhU6のPol IIIプロモーターによって2つのs
hRNAを発現させ、CAR-T細胞の2つの免疫チェックポイントの発現を抑制した。
CTLA-4、LAG-3、TIGIT、またはTIM-3を標的とする効果的なsiR
NAを見つけるために、CD3/CD28で刺激したT細胞にsiRNAをエレクトロポ
レーションで導入した。2以上の有効なsiRNAを選択した(図21A)。CTLA-
4、LAG-3、TIGIT、またはTIM-3 KD CAR-T細胞のための1つで
2つの機能があるベクターは、21塩基長のsiRNAをshRNA形式に変換すること
によって構築され、最終的に各免疫チェックポイントを標的とするshRNA(shCT
LA-4:#1;shLAG-3:#1278;shTIGIT:#739;shTIM
-3:#3)を選択したが、それらは発現を有意に抑制し、CAR-Tの増殖にあまり影
響を与えない(図21B~C)。最終的に、1つで2つの機能がある二重ベクターによっ
てPD-1_CTLA-4、PD-1_LAG-3、PD-1_TIGIT、またはPD
-1_TIM-3のCAR-T細胞が構築された(図22A~22E)。二重KD CA
R-T細胞はすべて、単一のPD-1 KD CAR-T細胞と比較してあまり増殖しな
かった(図22C)。これらの結果は、単一のKD CAR-T細胞でも観察された(図
21B)。
能がある二重ベクターを用いて二重KD CAR-T細胞を作製し、その治療可能性を、
以下の実施例におけるCD19+PDL1+血液腫瘍を担う生体内マウスモデル及び固形
腫瘍モデルにてさらに評価した。
D19+血液がんの生体内での治療方法
この実施例は、以下の組み合わせ、PD-1とCTLA-4、PD-1とLAG-3、
PD-1とTIGIT、及びPD-1とTIM-3を含む2つの免疫チェックポイントを
標的とする二重KD CAR-T細胞を用いて生体内でCD19+血液がんを治療する方
法を記載している。
9+B-ALLモデルに対するPD-1_CTLA-4、PD-1_LAG-3、PD-
1_TIGIT、またはPD-1_TIM-3 KD CAR-T細胞の抗腫瘍効果を評
価した。各CAR-T細胞は、標的細胞注入の5日後、1×106個の単回用量で注射し
た。PD-1_TIGIT KD CAR-T細胞は、他の二重KD CAR-T細胞と
比べて驚くほど優れた抗腫瘍効果を示すことが見いだされた(図23)。したがって、固
形腫瘍モデルにおけるPD-1_TIGIT KD CAR-T細胞を以下の実施例でさ
らに評価した。
形腫瘍モデルにおける治療方法。
この実施例は、PD-1及びTIGITを標的とする二重KDのCAR-T細胞を用い
た固形腫瘍モデルにおけるがんの治療方法を記載している。
9細胞(CD19+PD-L1+CD155+)を皮下注射した。いったん腫瘍が150
~250mm3の体積に達すると、CAR-T細胞を3×106個の単回用量で静脈内注
射した。腫瘍はキャリパー測定によって毎週モニターし、体積は(長さ×幅2)/2によ
って推定した。血液腫瘍モデル(Nalm-6-PDL1)に示されているように、PD
-1_TIGIT KD CAR-T細胞も固形腫瘍モデル(IM-9)に対して最も驚
くほど効果的であった(図24)。細胞固有のPD-1_TIGITの遮断はPD-1の
遮断よりも予想外に高いレベルの抗腫瘍効果を有する。
本件出願は、以下の態様の発明を提供する。
(態様1)
ベクターであって、
免疫細胞の機能を弱める少なくとも1つの遺伝子の発現を阻害する2種類の短ヘアピンR
NA(shRNA)をコードする塩基配列と、
キメラ抗原受容体(CAR)またはモノクローナルT細胞受容体(mTCR)をコードす
る塩基配列とを含む、前記ベクター。
(態様2)
前記2種類のshRNAの発現は、それらが2つの異なるプロモーターによってそれぞ
れ調節されることを特徴とする態様1に記載のベクター。
(態様3)
前記2つのプロモーターがRNAポリメラーゼIIIのプロモーターである態様2に記
載のベクター。
(態様4)
前記2つのプロモーターが異なる種に由来するU6プロモーターである態様2に記載の
ベクター。
(態様5)
前記2つのプロモーターが前記ベクター上で互いに異なる方向に向けられる態様2に記
載のベクター。
(態様6)
免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子が免疫チェックポイントの受容体またはリガンドで
ある態様1に記載のベクター。
(態様7)
前記免疫チェックポイントの受容体またはリガンドが、PD1、PD-L1、CTLA
4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3またはCEACAM
-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD
96、MerTK及び2B4から成る群から選択される態様6に記載のベクター。
(態様8)
免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子が、FAS、CD45、PP2A、SHIP1、S
HIP2、DGKアルファ、DGKゼータ、Cbl-b、CD147、LRR1、TGF
BR1、IL10Rアルファ、KLGR1、DNMT3A及びA2aRから成る群から選
択される態様1に記載のベクター。
(態様9)
前記2種類のshRNAが免疫細胞の機能を弱める単一の遺伝子を標的とする、または
前記2種類のshRNAが免疫細胞の機能を弱める異なる遺伝子を標的とする態様1に記
載のベクター。
(態様10)
前記2種類のshRNAがPD-1を標的とする態様1に記載のベクター。
(態様11)
前記2種類のshRNAのうち、(i)一方のshRNAがPD-1を標的とし、第2
のshRNAがTIM-3を標的とする、または(ii)一方のshRNAがPD-1を
標的とし、第2のshRNAがTIGITを標的とする、態様1に記載のベクター。
(態様12)
前記2種類のshRNAのうち、一方のshRNAをコードする前記塩基配列が配列番
号2~219から成る群から選択される配列を含み、第2のshRNAをコードする前記
塩基配列が配列番号2~219から成る群から選択される異なる配列を含む態様1に記載
のベクター。
(態様13)
前記CARまたはmTCRの前記標的が、がん細胞、がん組織及び/または腫瘍微小環
境における発現の上昇を示すヒト腫瘍抗原である、またはがん細胞、がん組織及び/また
は腫瘍微小環境に見られる抗原の変異した形態である態様1に記載のベクター。
(態様14)
前記ベクターが配列番号220または221の塩基配列を含む態様1に記載のベクター
。
(態様15)
前記ベクターが、プラスミドベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベク
ター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである態様1に記載の
ベクター。
(態様16)
態様1に記載のベクターを含む免疫細胞であって、1以上の遺伝子の発現がshRNA
の非存在下での発現のそれよりも40%以下に低下する、前記免疫細胞。
(態様17)
前記免疫細胞がヒト由来のT細胞またはナチュラルキラー(NK)細胞である態様16
に記載の免疫細胞。
(態様18)
態様1~17のいずれか1項に記載の免疫細胞を含む医薬組成物。
(態様19)
前記免疫細胞がもともと患者から得られる、免疫療法を必要とする前記患者の治療のた
めの態様18に記載の医薬組成物。
(態様20)
前記患者が、前記免疫細胞で発現される前記CARまたはmTCRの前記標的及び/ま
たは前記標的のレベルの上昇または変動が検出される腫瘍またはがんを有する態様19に
記載の医薬組成物。
(態様21)
免疫細胞であって、標的抗原に特異的に結合する遺伝子操作された抗原受容体と、前記
免疫細胞の機能を弱める遺伝子の前記免疫細胞における発現を低下させるまたは低下させ
ることができる遺伝子破壊剤とを含む、前記免疫細胞。
(態様22)
前記遺伝子操作された抗原受容体がキメラ抗原受容体(CAR)またはT細胞受容体(
TCR)である態様21に記載の免疫細胞。
(態様23)
前記遺伝子操作された抗原受容体がCARである態様22に記載の免疫細胞。
(態様24)
前記CARが、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ド
メインとを含む態様23に記載の免疫細胞。
(態様25)
前記CARの前記細胞外抗原認識ドメインが前記標的抗原に特異的に結合する態様24
に記載の免疫細胞。
(態様26)
前記CARの前記細胞内シグナル伝達ドメインがCD3ゼータ(CD3ζ)鎖の細胞内
ドメインを含む態様24に記載の免疫細胞。
(態様27)
前記CARの前記細胞内シグナル伝達ドメインが共刺激分子をさらに含む態様26に記
載の免疫細胞。
(態様28)
前記共刺激分子がICOS、OX40、CD137(4-1BB)、CD27、及びC
D28から成る群から選択される態様27に記載の免疫細胞。
(態様29)
前記共刺激分子がCD137(4-1BB)である態様28に記載の免疫細胞。
(態様30)
前記共刺激分子がCD28である態様28に記載の免疫細胞。
(態様31)
前記遺伝子操作された抗原受容体がTCRである態様22に記載の免疫細胞。
(態様32)
前記TCRがモノクローナルTCR(mTCR)である態様31に記載の免疫細胞。
(態様33)
前記標的抗原ががん細胞、がん組織及び/または腫瘍微小環境の中でまたはその表面で
発現される態様31または32に記載の免疫細胞。
(態様34)
前記標的抗原が、5T4(栄養膜糖タンパク質)、707-AP、9D7、AFP(α
-フェトプロテイン)、AlbZIP(アンドロゲン誘導のbZIP)、HPG1(ヒト
前立腺特異的遺伝子-1)、α5β1-インテグリン、α5β6-インテグリン、α-メ
チルアシル-補酵素Aラセマーゼ、ART-4(ADPリボシルトランスフェラーゼ-4
)、B7H4(v-セットドメイン含有T-細胞活性化阻害剤1)、BAGE-1(Bメ
ラノーマ抗原-1)、BCL-2(B-細胞 CLL/リンパ腫-2)、BING-4(
WD反復ドメイン46)、CA15-3/CA27-29(ムチン1)、CA19-9(
がん抗原19-9)、CA72-4(がん抗原72-4)、CA125(がん抗原125
)、カルレチクリン、CAMEL(メラノーマ上のCTL認識抗原)、CASP-8(カ
スパーゼ8)、カテプシンB、カテプシンL、CD19(分化抗原群19)、CD20、
CD22、CD25、CD30、CD33、CD4、CD52、CD55、CD56、C
D80、CEA(がん胎児性抗原SG8)、CLCA2(塩化物チャネルアクセサリー2
)、CML28(慢性骨髄性白血病腫瘍抗原28)、コアクトシン様タンパク質、コラー
ゲンXXIII、COX-2(シクロオキシゲナーゼ-2)、CT-9/BRD6(がん
/精巣抗原9)、Cten(c-末端テンシン様タンパク質)、サイクリンB1、サイク
リンD1、cyp-B、CYPB1(チトクロームp450ファミリー1サブファミリー
bメンバー1)、DAM-10/MAGE-B1(メラノーマ関連抗原B1)、DAM-
6/MAGE-B2、EGFR/Her1(表皮増殖因子受容体)、EMMPRIN(ベ
イシジン)、EpCam、EphA2(EPH受容体A2)、EphA3、ErbB3(
Erb-B2受容体チロシンキナーゼ3)、EZH2(zeste2ポリコーム抑制性複
合体2サブユニットのエンハンサー)、FGF-5(線維芽細胞増殖因子5)、FN(フ
ィブロネクチン)、Fra-1(Fos関連抗原-1)、G250/CAIX(炭酸脱水
酵素9)、GAGE-1(G抗原-1)、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、
GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7b、GAGE-8、GDEP(前立腺にて差
次的に発現される遺伝子)、GnT-V(グルコン酸キナーゼ)、gp100(メラニン
細胞系列特異的抗原GP100)、GPC3(グリピカン3)、HAGE(らせん抗原)
、HAST-2(スルホトランスフェラーゼファミリー1Aメンバー1)、ヘプシン、H
er2/neu/ErbB2(Erb-B2受容体チロシンキナーゼ2)、HERV-K
-MEL、HNE(メデュラシン)、ホメオボックスNKX3.1、HOM-TES-1
4/SCP-1、HOM-TES-85、HPV-E6、HPVE7、HST-2(シル
ツイン-2)、hTERT、iCE(カスパーゼ1)、IGF-1R(インスリン様増殖
因子-1受容体)、IL-13Ra2(インターロイキン-13受容体サブユニットα2
)、IL-2R(インターロイキン-2受容体)、IL-5(インターロイキン-5)、
未成熟ラミニン受容体、カリクレイン2、カリクレイン4、Ki67、KIAA0205
(リソホスファチジルグリセロールアシルトランスフェラーゼ1)、KK-LC-1(北
九州肺癌抗原-1)、KM-HN-1、LAGE-1(L抗原ファミリーメンバー-1)
、リビン、MAGE-A1、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGEA2、MA
GE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-B1、MA
GE-B10、MAGE-B16、MAGEB17、MAGE-B2、MAGE-B3、
MAGE-B4、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-C1、MAGE-C2、
MAGE-C3、MAGE-D1、MAGE-D2、MAGE-D4、MAGE-E1、
MAGE-E2、MAGE-F1、MAGE-H1、MAGEL2(メラノーマ抗原ファ
ミリーL2)、ママグロビンA、MART-1/Melan-A(T-細胞-1によって
認識されるメラノーマ抗原)、MART-2、マトリクスタンパク質22、MC1R(メ
ラノコルチン1受容体)、M-CSF(マクロファージコロニー刺激因子)、メソテリン
、MG50/PXDN(ペルオキシダシン)、MMP11(マトリクスメタロプロテイナ
ーゼ11)、MN/CA IX-抗原(炭酸脱水酵素9)、MRP-3(多剤耐性関連タ
ンパク質-3)、MUC1(ムチン1)、MUC2、NA88-A(VENT様ホメオボ
ックス2偽遺伝子1)、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ-V、Neo-
PAP(Neo-ポリ(A)ポリメラーゼ)、NGEP(前立腺で発現される新しい遺伝
子)、NMP22(核マトリクスタンパク質22)、NPM/ALK(ヌクレオホスミン
)、NSE(ニューロン特異的エノラーゼ)、NY-ESO-1、NY-ESO-B、O
A1(変形性関節症QTL1)、OFA-iLRP(がん胎児性抗原未成熟ラミニン受容
体タンパク質)、OGT(O-GlcNAcトランスフェラーゼ)、OS-9(小胞体レ
クチン)、オステオカルシン、オステオポンチン、p15(CDK阻害剤2B)、p53
、PAGE-4(P抗原ファミリーメンバー-4)、PAI-1(プラスミノーゲン活性
化因子阻害剤-1)、PAI-2、PAP(前立腺酸ホスファターゼ)、PART-1(
前立腺アンドロゲン調節転写物1)、PATE(前立腺及び精巣で発現された1)、PD
EF(前立腺由来のEts因子)、Pim-1-キナーゼ(プロウイルス組み込み部位1
)、Pin1(ペプチジル-プロリルcis-transイソメラーゼNIMA-相互作
用1)、POTE(前立腺、卵巣、精巣、及び胎盤で発現される)、PRAME(メラノ
ーマで優先的に発現される抗原)、プロステイン、プロテイナーゼ-3、PSA(前立腺
特異的抗原)、PSCA(前立腺幹細胞抗原)、PSGR(前立腺特異的G-タンパク質
共役受容体)、PSM、PSMA(前立腺特異的膜抗原)、RAGE-1(腎腫瘍癌腫抗
原)、RHAMM/CD168、RU1(腎遍在タンパク質1)、RU2、SAGE(肉
腫抗原)、SART-1(T-細胞-1によって認識される扁平上皮細胞癌腫抗原)、S
ART-2、SART-3、Sp17(精子タンパク質17)、SSX-1(SSXファ
ミリーメンバー1)、SSX-2/HOM-MEL-40、SSX-4、STAMP-1
(STEAP2 メタロレダクターゼ)、STEAP、サバイビン、サバイビン-213
、TA-90(腫瘍関連抗原-90)、TAG-72(腫瘍関連糖タンパク質-72)、
TARP(TCRγ代替リーディングフレームタンパク質)、TGFb(形質転換増殖因
子β)、TGFbR11(形質転換増殖因子β受容体11)、TGM-4(トランスグル
タミナーゼ4)、TRAG-3(タキソール耐性関連遺伝子3)、TRG(T-細胞受容
体γ遺伝子座)、TRP-1(一過性受容体ポテンシャル-1)、TRP-2/6b、T
RP-2/INT2、Trp-p8、チロシナーゼ、UPA(U-プラスミノーゲン活性
化因子)、VEGF(血管内皮増殖因子A)、VEGFR-2/FLK-1、及びWT1
(ウィルムス腫瘍1)から成る群から選択される態様33に記載の免疫細胞。
(態様35)
前記標的抗原がCD19またはCD22である、態様35に記載の免疫細胞。
(態様36)
前記標的抗原がCD19である態様36に記載の免疫細胞。
(態様37)
前記標的抗原ががん抗原であり、前記がん抗原が、その発現ががん細胞、がん組織及び
/または腫瘍微小環境の中でまたはその表面で増加するがん抗原である態様34~36の
いずれかに記載の免疫細胞。
(態様38)
前記標的抗原が、α-アクチニン-4/m、ARTC1/m、bcr/abl、ベータ
-カテニン/m、BRCA1/m、BRCA2/m、CASP-5/m、CASP-8/
m、CDC27/m、CDK4/m、CDKN2A/m、CML66、COA-1/m、
DEK-CAN、EFTUD2/m、ELF2/m、ETV6-AML1、FN1/m、
GPNMB/m、HLA-A*0201-R170I、HLA-A11/m、HLA-A
2/m、HSP70-2M、KIAA0205/m、K-Ras/m、LDLR-FUT
、MART2/m、ME1/m、MUM-1/m、MUM-2/m、MUM-3/m、ミ
オシンクラス1/m、neo-PAP/m、NFYC/m、N-Ras/m、OGT/m
、OS-9/m、p53/m、Pml/RARa、PRDX5/m、PTPRX/m、R
BAF600/m、SIRT2/m、SYTSSX-1、SYT-SSX-2、TEL-
AML1、TGFbRII、及びTPI/mから成る群から選択され、その際、前記標的
抗原はがん抗原であり、前記がん抗原は、がん細胞、がん組織及び/または腫瘍微小環境
の中でまたはその表面上で発現される抗原の変異した形態である態様33に記載の免疫細
胞。
(態様39)
前記免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子の発現が、以下:
(i)前記免疫細胞の増殖の阻害、
(ii)前記免疫細胞の細胞死の誘導、
(iii)前記免疫細胞が前記標的抗原を認識する及び/または活性化される能力の阻害
、
(iv)前記標的抗原に対する免疫応答を誘導しない細胞への前記免疫細胞の分化の誘導
、
(v)前記免疫細胞の免疫応答を促進する分子に対する前記免疫細胞の反応の低下、また
は
(vi)前記免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する前記免疫細胞の反応の上昇の1
以上を引き起こす態様21~38のいずれかに記載の免疫細胞。
(態様40)
前記免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子が、PD1、PD-L1、CTLA4、TIM
3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3またはCEACAM-5)、L
AG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、Me
rTK、2B4、FAS、CD45、PP2A、SHP1、SHP2、DGKアルファ、
DGKゼータ、Cbl-b、Cbl-c、CD148、LRR1、TGFBR1、IL1
0RA、KLGR1、DNMT3A、及びA2aRから成る群から選択される態様39に
記載の免疫細胞。
(態様41)
前記免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子が、前記免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に
対する前記免疫細胞の反応を高める態様39に記載の免疫細胞。
(態様42)
前記免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する前記免疫細胞の反応を高める前記遺伝
子が免疫チェックポイントの受容体またはリガンドをコードする態様41に記載の免疫細
胞。
(態様43)
前記免疫チェックポイントの受容体またはリガンドが、PD1、PD-L1、CTLA
4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3またはCEACAM
-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD
96、MerTK及び2B4から成る群から選択される態様42に記載の免疫細胞。
(態様44)
前記遺伝子破壊剤が、前記遺伝子破壊剤の非存在下での前記免疫細胞と比べて、前記免
疫細胞の機能を弱める前記免疫細胞における遺伝子の発現を少なくとも30、40、50
、60、70、80、90、または95%低下させる態様21~43のいずれかに記載の
免疫細胞。
(態様45)
前記遺伝子破壊剤が、前記免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する前記免疫細胞の
反応を高める遺伝子の発現を低下させる態様44に記載の免疫細胞。
(態様46)
前記遺伝子破壊剤が免疫チェックポイントの受容体またはリガンドをコードする遺伝子
の発現を低下させる態様45に記載の免疫細胞。
(態様47)
前記遺伝子破壊剤が、PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(C
EACAM-1、CEACAM-3またはCEACAM-5)、LAG3、VISTA、
BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、MerTK及び2B4から
成る群から選択される遺伝子の発現を低下させる態様46に記載の免疫細胞。
(態様48)
前記遺伝子破壊剤が、RNA干渉(RNAi)によって前記免疫細胞の機能を弱める前
記遺伝子の発現を低下させる態様45~47のいずれかに記載の免疫細胞。
(態様49)
1を超える遺伝子破壊剤が、RNAiによって前記免疫細胞における前記免疫細胞の機
能を弱める前記遺伝子の発現を低下させる態様48に記載の免疫細胞。
(態様50)
前記遺伝子破壊剤が、前記免疫細胞の機能を弱める単一の遺伝子を標的とする、または
異なる遺伝子破壊剤が前記免疫細胞の機能を弱める異なる遺伝子を標的とし、例えば、第
1の遺伝子破壊剤は第1の遺伝子を標的とし、第2の遺伝子破壊剤は第2の遺伝子を標的
とする態様49に記載の免疫細胞。
(態様51)
前記RNAiには短ヘアピンRNA(shRNA)が介在する態様48~50のいずれ
かに記載の免疫細胞。
(態様52)
前記RNAiには1を超えるshRNAが介在する態様51に記載の免疫細胞。
(態様53)
前記RNAiには2つのshRNAが介在する態様52に記載の免疫細胞。
(態様54)
2つのshRNAがPD-1を標的とする態様52~53のいずれかに記載の免疫細胞
。
(態様55)
第1のshRNAがPD-1を標的とし、第2のshRNAがTIM-3を標的とする
態様52~53のいずれかに記載の免疫細胞。
(態様56)
第1のshRNAがPD-1を標的とし、第2のshRNAがCTLA-4を標的とす
る態様52~53のいずれかに記載の免疫細胞。
(態様57)
第1のshRNAがPD-1を標的とし、第2のshRNAがLAG-3を標的とする
態様52~53のいずれかに記載の免疫細胞。
(態様58)
第1のshRNAがPD-1を標的とし、第2のshRNAがTIGITを標的とする
態様52~53のいずれかに記載の免疫細胞。
(態様59)
前記免疫細胞がshRNAをコードするヌクレオチド配列を含む態様51~58のいず
れかに記載の免疫細胞。
(態様60)
前記免疫細胞が1を超えるshRNAをコードするヌクレオチド配列を含む態様59に
記載の免疫細胞。
(態様61)
前記免疫細胞が2つのshRNAをコードするヌクレオチド配列を含む態様59に記載
の免疫細胞。
(態様62)
前記shRNA(複数可)をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号2~219
及び238~267から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む態様59~61の
いずれかに記載の免疫細胞。
(態様63)
前記shRNA(複数可)をコードする前記ヌクレオチド配列がベクター上に存在する
態様59~62のいずれかに記載の免疫細胞。
(態様64)
異なるshRNAの発現が異なるプロモーターによって調節される態様63のいずれか
に記載の免疫細胞。
(態様65)
2つの異なるshRNAの発現が2つの異なるプロモーターによって調節される態様6
4に記載の免疫細胞。
(態様66)
前記2つの異なるプロモーターがRNAポリメラーゼIIIのプロモーターである態様
65に記載の免疫細胞。
(態様67)
前記2つのプロモーターがU6プロモーターである態様66に記載の免疫細胞。
(態様68)
前記U6プロモーターが異なる種に由来する態様67に記載の免疫細胞。
(態様69)
前記2つのプロモーターが互いに異なる方向に向けられる態様65~68のいずれかに
記載の免疫細胞。
(態様70)
前記遺伝子操作された抗原受容体及び前記遺伝子破壊剤(複数可)がベクターからそれ
ぞれ発現される態様21~69のいずれかに記載の免疫細胞。
(態様71)
前記遺伝子操作された抗原受容体及び前記遺伝子破壊剤(複数可)が同一ベクターから
発現される態様70に記載の免疫細胞。
(態様72)
前記ベクターがプラスミドベクターまたはウイルスベクターである態様70~71のい
ずれかに記載の免疫細胞。
(態様73)
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデ
ノ随伴ウイルスベクターである態様72に記載の免疫細胞。
(態様74)
前記レンチウイルスベクターがレトロウイルスベクターである態様73に記載の免疫細
胞。
(態様75)
前記免疫細胞がT細胞及びナチュラルキラー(NK)細胞から成る群から選択される態
様21~74のいずれかに記載の免疫細胞。
(態様76)
前記免疫細胞がT細胞である態様75に記載の免疫細胞。
(態様77)
前記T細胞がCD4+T細胞またはCD8+T細胞である態様76に記載の免疫細胞。
(態様78)
前記免疫細胞が2つのshRNA及びCARまたはmTCRをコードするヌクレオチド
配列を同一ベクター上で含む態様76または77のいずれかに記載の免疫細胞。
(態様79)
前記2つのshRNAが互いに異なる方向に向けられた2つの異なるRNAポリメラー
ゼIIIのプロモーターによってそれぞれ調節される態様78に記載の免疫細胞。
(態様80)
前記CARがCD19を標的とし、前記第1のshRNAがPD-1を標的とし、前記
第2のshRNAがTIGITを標的とする態様79に記載の免疫細胞。
(態様81)
免疫細胞を作り出す方法であって、
(1)標的抗原に特異的に結合する遺伝子操作された抗原受容体をコードする遺伝子と、
(2)遺伝子破壊剤またはその発現が前記免疫細胞の機能を弱める遺伝子の前記免疫細胞
における発現を低下させる、または低下させることができる遺伝子破壊剤とを同時または
任意の順序で連続的に前記免疫細胞に導入することを含み、
それによって、遺伝子操作された抗原受容体が発現され、前記免疫細胞の機能を弱める遺
伝子の発現が低減される前記免疫細胞を作り出す、前記方法。
(態様82)
前記遺伝子操作された抗原受容体がキメラ抗原受容体(CAR)またはT細胞受容体(
TCR)である態様81に記載の方法。
(態様83)
前記遺伝子操作された抗原受容体がCARである態様82に記載の方法。
(態様84)
前記CARが、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ド
メインとを含む態様83に記載の方法。
(態様85)
前記CARの前記細胞外抗原認識ドメインが前記標的抗原に特異的に結合する態様84
に記載の方法。
(態様86)
前記CARの前記細胞内シグナル伝達ドメインがCD3ゼータ(CD3ζ)鎖の細胞内
ドメインを含む態様84に記載の方法。
(態様87)
前記CARの前記細胞内シグナル伝達ドメインが共刺激分子をさらに含む態様86に記
載の方法。
(態様88)
前記共刺激分子がICOS、OX40、CD137(4-1BB)、CD27、及びC
D28から成る群から選択される態様87に記載の方法。
(態様89)
前記共刺激分子がCD137(4-1BB)である態様88に記載の方法。
(態様90)
前記共刺激分子がCD28である態様88に記載の方法。
(態様91)
前記遺伝子操作された抗原受容体がTCRである態様82に記載の方法。
(態様92)
前記TCRがモノクローナルTCR(mTCR)である態様91に記載の方法。
(態様93)
前記標的抗原ががん細胞、がん組織及び/または腫瘍微小環境の中でまたはその表面で
発現される態様81~92のいずれかに記載の方法。
(態様94)
前記標的抗原が、5T4(栄養膜糖タンパク質)、707-AP、9D7、AFP(α
-フェトプロテイン)、AlbZIP(アンドロゲン誘導のbZIP)、HPG1(ヒト
前立腺特異的遺伝子-1)、α5β1-インテグリン、α5β6-インテグリン、α-メ
チルアシル-補酵素Aラセマーゼ、ART-4(ADPリボシルトランスフェラーゼ-4
)、B7H4(v-セットドメイン含有T-細胞活性化阻害剤1)、BAGE-1(Bメ
ラノーマ抗原-1)、BCL-2(B-細胞 CLL/リンパ腫-2)、BING-4(
WD反復ドメイン46)、CA15-3/CA27-29(ムチン1)、CA19-9(
がん抗原19-9)、CA72-4(がん抗原72-4)、CA125(がん抗原125
)、カルレチクリン、CAMEL(メラノーマ上のCTL認識抗原)、CASP-8(カ
スパーゼ8)、カテプシンB、カテプシンL、CD19(分化抗原群19)、CD20、
CD22、CD25、CD30、CD33、CD4、CD52、CD55、CD56、C
D80、CEA(がん胎児性抗原SG8)、CLCA2(塩化物チャネルアクセサリー2
)、CML28(慢性骨髄性白血病腫瘍抗原28)、コアクトシン様タンパク質、コラー
ゲンXXIII、COX-2(シクロオキシゲナーゼ-2)、CT-9/BRD6(がん
/精巣抗原9)、Cten(c-末端テンシン様タンパク質)、サイクリンB1、サイク
リンD1、cyp-B、CYPB1(チトクロームp450ファミリー1サブファミリー
bメンバー1)、DAM-10/MAGE-B1(メラノーマ関連抗原B1)、DAM-
6/MAGE-B2、EGFR/Her1(表皮増殖因子受容体)、EMMPRIN(ベ
イシジン)、EpCam、EphA2(EPH受容体A2)、EphA3、ErbB3(
Erb-B2受容体チロシンキナーゼ3)、EZH2(zeste2ポリコーム抑制性複
合体2サブユニットのエンハンサー)、FGF-5(線維芽細胞増殖因子5)、FN(フ
ィブロネクチン)、Fra-1(Fos関連抗原-1)、G250/CAIX(炭酸脱水
酵素9)、GAGE-1(G抗原-1)、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、
GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7b、GAGE-8、GDEP(前立腺にて差
次的に発現される遺伝子)、GnT-V(グルコン酸キナーゼ)、gp100(メラニン
細胞系列特異的抗原GP100)、GPC3(グリピカン3)、HAGE(らせん抗原)
、HAST-2(スルホトランスフェラーゼファミリー1Aメンバー1)、ヘプシン、H
er2/neu/ErbB2(Erb-B2受容体チロシンキナーゼ2)、HERV-K
-MEL、HNE(メデュラシン)、ホメオボックスNKX3.1、HOM-TES-1
4/SCP-1、HOM-TES-85、HPV-E6、HPVE7、HST-2(シル
ツイン-2)、hTERT、iCE(カスパーゼ1)、IGF-1R(インスリン様増殖
因子-1受容体)、IL-13Ra2(インターロイキン-13受容体サブユニットα2
)、IL-2R(インターロイキン-2受容体)、IL-5(インターロイキン-5)、
未成熟ラミニン受容体、カリクレイン2、カリクレイン4、Ki67、KIAA0205
(リソホスファチジルグリセロールアシルトランスフェラーゼ1)、KK-LC-1(北
九州肺癌抗原-1)、KM-HN-1、LAGE-1(L抗原ファミリーメンバー-1)
、リビン、MAGE-A1、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGEA2、MA
GE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-B1、MA
GE-B10、MAGE-B16、MAGEB17、MAGE-B2、MAGE-B3、
MAGE-B4、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-C1、MAGE-C2、
MAGE-C3、MAGE-D1、MAGE-D2、MAGE-D4、MAGE-E1、
MAGE-E2、MAGE-F1、MAGE-H1、MAGEL2(メラノーマ抗原ファ
ミリーL2)、ママグロビンA、MART-1/Melan-A(T-細胞-1によって
認識されるメラノーマ抗原)、MART-2、マトリクスタンパク質22、MC1R(メ
ラノコルチン1受容体)、M-CSF(マクロファージコロニー刺激因子)、メソテリン
、MG50/PXDN(ペルオキシダシン)、MMP11(マトリクスメタロプロテイナ
ーゼ11)、MN/CA IX-抗原(炭酸脱水酵素9)、MRP-3(多剤耐性関連タ
ンパク質-3)、MUC1(ムチン1)、MUC2、NA88-A(VENT様ホメオボ
ックス2偽遺伝子1)、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ-V、Neo-
PAP(Neo-ポリ(A)ポリメラーゼ)、NGEP(前立腺で発現される新しい遺伝
子)、NMP22(核マトリクスタンパク質22)、NPM/ALK(ヌクレオホスミン
)、NSE(ニューロン特異的エノラーゼ)、NY-ESO-1、NY-ESO-B、O
A1(変形性関節症QTL1)、OFA-iLRP(がん胎児性抗原未成熟ラミニン受容
体タンパク質)、OGT(O-GlcNAcトランスフェラーゼ)、OS-9(小胞体レ
クチン)、オステオカルシン、オステオポンチン、p15(CDK阻害剤2B)、p53
、PAGE-4(P抗原ファミリーメンバー-4)、PAI-1(プラスミノーゲン活性
化因子阻害剤-1)、PAI-2、PAP(前立腺酸ホスファターゼ)、PART-1(
前立腺アンドロゲン調節転写物1)、PATE(前立腺及び精巣で発現された1)、PD
EF(前立腺由来のEts因子)、Pim-1-キナーゼ(プロウイルス組み込み部位1
)、Pin1(ペプチジル-プロリルcis-transイソメラーゼNIMA-相互作
用1)、POTE(前立腺、卵巣、精巣、及び胎盤で発現される)、PRAME(メラノ
ーマで優先的に発現される抗原)、プロステイン、プロテイナーゼ-3、PSA(前立腺
特異的抗原)、PSCA(前立腺幹細胞抗原)、PSGR(前立腺特異的G-タンパク質
共役受容体)、PSM、PSMA(前立腺特異的膜抗原)、RAGE-1(腎腫瘍癌腫抗
原)、RHAMM/CD168、RU1(腎遍在タンパク質1)、RU2、SAGE(肉
腫抗原)、SART-1(T-細胞-1によって認識される扁平上皮細胞癌腫抗原)、S
ART-2、SART-3、Sp17(精子タンパク質17)、SSX-1(SSXファ
ミリーメンバー1)、SSX-2/HOM-MEL-40、SSX-4、STAMP-1
(STEAP2メタロレダクターゼ)、STEAP、サバイビン、サバイビン-213、
TA-90(腫瘍関連抗原-90)、TAG-72(腫瘍関連糖タンパク質-72)、T
ARP(TCRγ代替リーディングフレームタンパク質)、TGFb(形質転換増殖因子
β)、TGFbR11(形質転換増殖因子β受容体11)、TGM-4(トランスグルタ
ミナーゼ4)、TRAG-3(タキソール耐性関連遺伝子3)、TRG(T-細胞受容体
γ遺伝子座)、TRP-1(一過性受容体ポテンシャル-1)、TRP-2/6b、TR
P-2/INT2、Trp-p8、チロシナーゼ、UPA(U-プラスミノーゲン活性化
因子)、VEGF(血管内皮増殖因子A)、VEGFR-2/FLK-1、及びWT1(
ウィルムス腫瘍1)から成る群から選択される態様93に記載の方法。
(態様95)
前記標的抗原がCD19またはCD22である態様95に記載の方法。
(態様96)
前記標的抗原がCD19である態様96に記載の方法。
(態様97)
前記標的抗原ががん抗原であり、前記がん抗原はその発現ががん細胞、がん組織及び/
または腫瘍微小環境の中でまたはその表面で増加する抗原である態様94~96のいずれ
かに記載の方法。
(態様98)
前記標的抗原が、α-アクチニン-4/m、ARTC1/m、bcr/abl、ベータ
-カテニン/m、BRCA1/m、BRCA2/m、CASP-5/m、CASP-8/
m、CDC27/m、CDK4/m、CDKN2A/m、CML66、COA-1/m、
DEK-CAN、EFTUD2/m、ELF2/m、ETV6-AML1、FN1/m、
GPNMB/m、HLA-A*0201-R170I、HLA-A11/m、HLA-A
2/m、HSP70-2M、KIAA0205/m、K-Ras/m、LDLR-FUT
、MART2/m、ME1/m、MUM-1/m、MUM-2/m、MUM-3/m、ミ
オシンクラス1/m、neo-PAP/m、NFYC/m、N-Ras/m、OGT/m
、OS-9/m、p53/m、Pml/RARa、PRDX5/m、PTPRX/m、R
BAF600/m、SIRT2/m、SYTSSX-1、SYT-SSX-2、TEL-
AML1、TGFbRII、及びTPI/mから成る群から選択され、その際、前記標的
抗原はがん抗原であり、前記がん抗原はがん細胞、がん組織及び/または腫瘍微小環境の
中でまたは表面上で発現される抗原の変異した形態である態様93に記載の方法。
(態様99)
前記免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子の発現が、以下:
(i)前記免疫細胞の増殖の阻害、
(ii)前記免疫細胞の細胞死の誘導、
(iii)前記免疫細胞が前記標的抗原を認識する及び/または活性化される能力の阻害
、
(iv)前記標的抗原に対する免疫応答を誘導しない細胞への前記免疫細胞の分化の誘導
、
(v)前記免疫細胞の免疫応答を促進する分子に対する前記免疫細胞の反応の低下、また
は
(vi)前記免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する前記免疫細胞の反応の上昇の1
以上を引き起こす態様81~98のいずれかに記載の方法。
(態様100)
前記免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子が、PD1、PD-L1、CTLA4、TIM
3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3またはCEACAM-5)、L
AG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、Me
rTK、2B4、FAS、CD45、PP2A、SHP1、SHP2、DGKアルファ、
DGKゼータ、Cbl-b、Cbl-c、CD148、LRR1、TGFBR1、IL1
0RA、KLGR1、DNMT3A、及びA2aRから成る群から選択される態様99に
記載の方法。
(態様101)
前記免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子が、前記免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に
対する前記免疫細胞の反応を高める態様99に記載の方法。
(態様102)
前記免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する前記免疫細胞の反応を高める前記遺伝
子が免疫チェックポイントの受容体またはリガンドをコードする態様101に記載の方法
。
(態様103)
前記免疫チェックポイントの受容体またはリガンドが、PD1、PD-L1、CTLA
4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3またはCEACAM
-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD
96、MerTK及び2B4から成る群から選択される態様102に記載の方法。
(態様104)
前記遺伝子破壊剤が前記遺伝子破壊剤(複数可)の非存在下での前記免疫細胞と比べて
、前記免疫細胞の機能を弱める前記免疫細胞における遺伝子の前記発現を少なくとも30
、40、50、60、70、80、90、または95%低下させる態様81~103のい
ずれかに記載の方法。
(態様105)
前記遺伝子破壊剤が、前記免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する前記免疫細胞の
反応を高める遺伝子の発現を低下させる態様104に記載の方法。
(態様106)
前記遺伝子破壊剤が免疫チェックポイントの受容体またはリガンドをコードする遺伝子
の発現を低下させる態様105に記載の方法。
(態様107)
前記遺伝子破壊剤が、PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(C
EACAM-1、CEACAM-3またはCEACAM-5)、LAG3、VISTA、
BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD96、MerTK及び2B4から
成る群から選択される遺伝子の発現を低下させる態様106に記載の方法。
(態様108)
前記遺伝子破壊剤が、RNA干渉(RNAi)によって前記免疫細胞の機能を弱める前
記遺伝子の発現を低下させる態様105~107のいずれかに記載の方法。
(態様109)
1を超える遺伝子破壊剤が、RNAiによって前記免疫細胞における前記免疫細胞の機
能を弱める前記遺伝子の発現を低下させる態様108に記載の方法。
(態様110)
前記遺伝子破壊剤が前記免疫細胞の機能を弱める単一の遺伝子を標的とする、または前
記免疫細胞の機能を弱める異なる遺伝子を標的とし、第1の遺伝子破壊剤は第1の遺伝子
を標的とし、第2の遺伝子破壊剤は第2の遺伝子を標的とし、またはそれらの任意の組み
合わせで標的とする態様109に記載の方法。
(態様111)
前記RNAiには短ヘアピンRNA(shRNA)が介在する態様108~110のい
ずれかに記載の方法。
(態様112)
前記RNAiには1を超えるshRNAが介在する態様111に記載の方法。
(態様113)
前記RNAiには2つのshRNAが介在する態様112に記載の方法。
(態様114)
2つのshRNAがPD-1を標的とする態様112または113に記載の方法。
(態様115)
第1のshRNAがPD-1を標的とし、第2のshRNAがTIM-3を標的とする
態様112または113に記載の方法。
(態様116)
第1のshRNAがPD-1を標的とし、第2のshRNAがCTLA-4を標的とす
る態様112または113に記載の方法。
(態様117)
第1のshRNAがPD-1を標的とし、第2のshRNAがLAG-3を標的とする
態様112または113に記載の方法。
(態様118)
第1のshRNAがPD-1を標的とし、第2のshRNAがTIGITを標的とする
態様112または113に記載の方法。
(態様119)
前記免疫細胞がshRNAをコードするヌクレオチド配列を含む態様111~118の
いずれかに記載の方法。
(態様120)
前記免疫細胞が1を超えるshRNAをコードするヌクレオチド配列を含む態様119
に記載の方法。
(態様121)
前記免疫細胞が2つのshRNAをコードするヌクレオチド配列を含む態様119に記
載の方法。
(態様122)
前記shRNA(複数可)をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号2~219
及び238~267から成る群から選択される配列を含む態様119~121のいずれか
に記載の方法。
(態様123)
前記shRNAをコードする前記ヌクレオチド配列がベクター上に存在する態様119
~122のいずれかに記載の方法。
(態様124)
異なるshRNAの発現が異なるプロモーターによってそれぞれ調節される態様123
のいずれかに記載の方法。
(態様125)
2つの異なるshRNAの発現が2つの異なるプロモーターによってそれぞれ調節され
る態様124に記載の方法。
(態様126)
前記2つの異なるプロモーターがRNAポリメラーゼIIIのプロモーターである態様
125に記載の方法。
(態様127)
前記2つのプロモーターがU6プロモーターである態様126に記載の方法。
(態様128)
前記U6プロモーターが異なる種に由来する態様127に記載の方法。
(態様129)
前記2つのプロモーターが互いに異なる方向に向けられる態様125~128のいずれ
かに記載の方法。
(態様130)
前記遺伝子操作された抗原受容体及び前記遺伝子破壊剤(複数可)がベクターからそれ
ぞれ発現される態様81~129のいずれかに記載の方法。
(態様131)
前記遺伝子操作された抗原受容体及び前記遺伝子破壊剤(複数可)が同一ベクターから
発現される態様130に記載の方法。
(態様132)
前記ベクターが、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである態様130~13
1のいずれかに記載の方法。
(態様133)
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデ
ノ随伴ウイルスベクターである態様132に記載の方法。
(態様134)
前記レンチウイルスベクターがレトロウイルスベクターである態様133に記載の方法
。
(態様135)
前記免疫細胞がT細胞及びナチュラルキラー(NK)細胞から成る群から選択される態
様81~134のいずれかに記載の方法。
(態様136)
前記免疫細胞がT細胞である態様135に記載の方法。
(態様137)
前記T細胞がCD4+T細胞またはCD8+T細胞である態様136に記載の方法。
(態様138)
前記免疫細胞が2つのshRNA及びCARをコードするヌクレオチド配列を同一ベク
ター上で含む態様136または137に記載の方法。
(態様139)
前記2つのshRNAが互いに異なる方向に向けられた2つの異なるRNAポリメラー
ゼIIIのプロモーターによってそれぞれ調節される態様138に記載の方法。
(態様140)
前記CARがCD19を標的とし、前記第1のshRNAがPD-1を標的とし、前記
第2のshRNAがTIGITを標的とする態様139に記載の方法。
(態様141)
態様21~80のいずれかに記載の免疫細胞を含む組成物。
(態様142)
態様21~80のいずれかに記載の免疫細胞と薬学的に許容される担体とを含む医薬組
成物。
(態様143)
免疫療法を必要とする疾患または状態を有する対象に態様21~80のいずれかに記載
の免疫細胞または態様141もしくは142に記載の組成物を投与することを含む治療方
法。
(態様144)
前記遺伝子操作された抗原受容体が前記疾患または前記状態に関連する抗原に特異的に
結合する態様143に記載の方法。
(態様145)
前記疾患または前記状態ががん、例えば腫瘍である態様143または144に記載の方
法。
(態様146)
疾患または状態の治療に使用するための態様21~80のいずれかに記載の免疫細胞ま
たは態様141~142に記載の組成物。
(態様147)
疾患または状態を治療するための薬物の製造における態様21~80のいずれかに記載
の免疫細胞または態様121~122に記載の組成物の使用。
(態様148)
前記遺伝子操作された抗原受容体が前記疾患または前記状態に関連する抗原に特異的に
結合する態様146に記載の免疫細胞もしくは組成物または態様147に記載の使用。
(態様149)
前記疾患または前記状態ががん、例えば腫瘍である、態様147または148に記載の
使用、組成物、または免疫細胞。
Claims (21)
- a)免疫細胞の機能を弱める少なくとも1つの遺伝子の発現を阻害する2種類の短ヘアピンRNA(shRNA)をコードする塩基配列であって、該2種類のshRNAの一方が、Ig及びITIMドメインを持つT細胞免疫受容体(TIGIT)の発現を標的とする、前記塩基配列、及び
b)キメラ抗原受容体(CAR)をコードするヌクレオチド配列であって、該CARが、細胞外抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、前記ヌクレオチド配列
を含む、ベクター。 - 第1のshRNAがプログラム細胞死1(PD-1)の発現を標的とし、かつ、第2のshRNAがTIGITの発現を標的とする、請求項1記載のベクター。
- 前記細胞内シグナル伝達ドメインがCD3ゼータ(CD3ζ)鎖のものである、請求項1又は2記載のベクター。
- 前記CARの前記細胞内シグナル伝達ドメインが共刺激分子を含む、請求項3記載のベクター。
- 前記第1のshRNAの発現が第1のプロモーターによって調節され、かつ、前記第2のshRNAの発現が第2のプロモーターによって調節される、請求項2~4のいずれか1項記載のベクター。
- 前記2つのプロモーターが、前記ベクター上で互いに異なる方向に向けられる、請求項5記載のベクター。
- 前記shRNAをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号2~12、70~75、266~267、又は238~243からなる群から選択される配列を含む、請求項2~6のいずれか1項記載のベクター。
- 前記shRNAが、前記免疫細胞の機能を弱める該免疫細胞における遺伝子の発現を、遺伝子破壊剤の非存在下での該免疫細胞と比べて少なくとも30、40、50、60、70、80、90、又は95%低下させる、請求項1~7のいずれか1項記載のベクター。
- 請求項1~8のいずれか1項記載のベクターを含む、免疫細胞。
- 前記CARが標的抗原に特異的に結合する、請求項9記載の免疫細胞。
- 前記免疫細胞が、ヒト由来のT細胞又はナチュラルキラー(NK)細胞である、請求項9~10のいずれか1項記載の免疫細胞。
- 請求項9~11のいずれか1項記載の免疫細胞を含む、医薬組成物。
- 患者の疾患又は状態であって、がん又は腫瘍である前記疾患又は状態を治療する方法において使用するための、請求項12記載の医薬組成物。
- 前記患者がヒトである、請求項13記載の使用のための医薬組成物。
- 請求項1~8のいずれか1項記載のベクター、請求項9~11のいずれか1項記載の免疫細胞、又は、請求項12記載の医薬組成物を含む、キット。
- 前記共刺激分子が、ICOS、OX40、CD137(4-IBB)、CD27及びCD28からなる群から選択される、請求項4記載のベクター。
- 前記第1及び第2のプロモーターがRNAポリメラーゼIIIプロモーターである、請求項5記載のベクター。
- 前記2つのプロモーターがU6プロモーターである、請求項5記載のベクター。
- 前記プロモーターが、ヘッドトゥーヘッドの方向又は末尾-末尾の方向に向けられる、請求項6記載のベクター。
- 前記標的抗原が、
(i)がん細胞、がん組織、及び/又は腫瘍微小環境の中で又は表面でその発現が増加するがん抗原であるか、又は
(ii)該がん細胞、該がん組織、及び/又は該腫瘍微小環境における、がん抗原の変異した形態であるか、又は
(iii)がん細胞、がん組織、及び/又は腫瘍微小環境の中で又は表面で発現される、
請求項10記載の免疫細胞。 - 前記標的抗原がCD19又はCD22である、請求項10記載の免疫細胞。
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