JP7068498B2 - 二重ｓｈＲＮＡを用いて強化された免疫細胞及びそれを含む組成物 - Google Patents

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Description

関連出願
本出願は、２０１８年１月１２日に出願された韓国特許出願第１０－２０１８－０００４２３８号に対する優先権を主張し、その開示は参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
電子的に提出された配列表への参照
本出願は、２０１９年１月５日に作成され、サイズが８８，７５１バイトである１４５７０－００１－２２８＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔと表題を付けたテキストファイルとして本出願と共に提出された配列表を参照によって組み入れる。
技術分野
本開示は、がん免疫療法の分野に広く関係する。例えば、本発明は一般に、標的抗原に特異的に結合する遺伝子操作された抗原受容体と、免疫細胞の機能を弱める遺伝子の免疫細胞における発現を低下させるまたは低下させることができる遺伝子破壊剤とを含む免疫細胞に関する。
患者またはドナーの体からＴ細胞またはＮＫ細胞（ナチュラルキラー細胞）を単離し、これらの細胞を試験管内で培養し、次いで患者の体内に戻すことによる免疫細胞を用いた抗がん療法は、がん治療の新しい方法として現在多く注目を集めている。特に、ウイルス等を用いて新たな遺伝情報を注入し、その後、試験管内培養プロセスで培養するプロセスに供されている免疫細胞はそうでない細胞よりも大きな抗がん効果を有することが報告されている。ここで、Ｔ細胞に注入される遺伝情報は普通、標的抗原に対して高い親和性を有するように改変されたキメラ抗原受容体（以後、ＣＡＲ）またはモノクローナルＴ細胞受容体（以後、ｍＴＣＲ）である。これらの改変免疫細胞は、固有の抗原特異性に限定されることなく、標的抗原を発現しているがん細胞を認識して攻撃し、細胞死を誘導する。ＣＡＲを用いてＴ細胞を遺伝子操作する方法は、最初に１９８９年、Ｅｓｈｈａｒ ｅｔ ａｌ．によって提案され、「Ｔ－ｂｏｄｙ」の名で呼ばれた。
本明細書で提供されるのは、上記で指摘した従来の同時免疫細胞療法の問題に対処する免疫細胞組成物及び方法であり、該問題は、費用が高いために患者に多大な経済的負担を課し、ＣＡＲ－Ｔ以外のＴ細胞に作用し、自己免疫症状及びサイトカイン放出症候群のリスクがある。手短に言えば、例えば、本明細書に開示されているのは、高収率及び低生産コストでの調製方法である。さらに、免疫細胞の機能をより高い確率及び有効性で抑制する分子を阻害することにより、本明細書での開示は効果的な細胞治療を提供する技術の必要性を満たす。本開示が解決しようとする技術的問題は、上記の技術的問題に限定されず、言及されていない他の技術的問題は以下から当業者にとって明らかであるものとする。
本明細書で提供されるのは、ベクターと、免疫細胞と、免疫細胞を含む医薬組成物と、免疫細胞を含む組成物とである。本明細書では提供されるのはまた、免疫細胞を作り出す方法と、治療方法及び免疫細胞の使用方法とである。
一態様では、本明細書で提供されるのはベクターである。いくつかの実施形態では、提供されるのは、免疫細胞の機能を弱める遺伝子の発現を阻害する２種類の短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする塩基配列と、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、モノクローナルＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）をコードする塩基配列を含むベクターである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲまたはＴＣＲ、例えば、ｍＴＣＲの標的は、がんにおいて発現の増加を示す増加した抗原の中から、またはがん、例えば、がん細胞、がん組織及び／または腫瘍微小環境において見いだされる抗原の変異した形態から選択されるヒト腫瘍抗原である。
いくつかの実施形態では、２種類のｓｈＲＮＡの発現は、それらが２つの異なるプロモーターによってそれぞれ調節されることを特徴とする。
いくつかの実施形態では、２つのプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターである。いくつかの実施形態では、２つのプロモーターは、Ｕ６プロモーター、例えば、異なる種に由来するＵ６プロモーターである。いくつかの実施形態では、２つのプロモーターは、ベクター上で互いに同じ方向に向けられる。いくつかの実施形態では、２つのプロモーターは、ベクター上で互いに異なる方向に向けられる。例えば、特定の実施形態では、プロモーターはヘッドトゥーヘッド（head to head）の方向に向けられる。別の実施形態では、プロモーターは末尾－末尾の方向に向けられる。
いくつかの実施形態では、免疫細胞の機能を弱める遺伝子は、免疫チェックポイントの受容体またはリガンドである。
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイントの受容体またはリガンドは、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、ＣＤ９６、ＭｅｒＴＫ及び２Ｂ４から成る群から選択される。
いくつかの実施形態では、免疫細胞の機能を弱める遺伝子は、ＦＡＳ、ＣＤ４５、ＰＰ２Ａ、ＳＨＩＰ１、ＳＨＩＰ２、ＤＧＫアルファ、ＤＧＫゼータ、Ｃｂｌ－ｂ、ＣＤ１４７、ＬＲＲ１、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ１０Ｒアルファ、ＫＬＧＲ１、ＤＮＭＴ３Ａ及びＡ２ａＲから成る群から選択される。
いくつかの実施形態では、免疫細胞の機能を弱める１つまたは複数の遺伝子を標的とする２種類のｓｈＲＮＡが利用される。いくつかの実施形態では、２種類のｓｈＲＮＡは免疫細胞の機能を弱める単一の遺伝子を標的にする、またはそれらは免疫細胞の機能を弱める異なる遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態では、２種類のｓｈＲＮＡはＰＤ－１を標的とする。２種類のｓｈＲＮＡを含むいくつかの実施形態では、一方のｓｈＲＮＡはＰＤ－１を標的とし、第２のｓｈＲＮＡはＴＩＭ－３を標的とする。２種類のｓｈＲＮＡを含むいくつかの実施形態では、一方のｓｈＲＮＡはＰＤ－１を標的とし、第２のｓｈＲＮＡはＴＩＧＩＴを標的とする。
ｓｈＲＮＡは、センスｓｈＲＮＡ配列とアンチセンスｓｈＲＮＡ配列を含むヘアピン構造を形成する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているｓｈＲＮＡをコードする塩基配列は、配列番号２～２１９から成る群から選択される配列を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載されているｓｈＲＮＡをコードする塩基配列は、配列番号２～２１９から成る群から選択される配列を含み、その際、該配列はセンスｓｈＲＮＡ配列をコードする。特定の実施形態では、本明細書に記載されているｓｈＲＮＡをコードする塩基配列は、配列番号２～２１９から成る群から選択される配列を含み、その際、該配列はアンチセンスｓｈＲＮＡ配列をコードする。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２２０または２２１の塩基配列のいずれか一方を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミドベクターまたはウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターである。
別の態様では、本明細書で提供されているのは、ＣＡＲまたはＴＣＲ、例えばｍＴＣＲを発現するベクターを含む免疫細胞であり、２種類のｓｈＲＮＡの標的遺伝子の発現は、標的遺伝子についてｓｈＲＮＡを発現させない対照群よりも４０％以下に低下する。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ヒト由来のＴ細胞とＮＫ細胞との間から選択される。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、上述の免疫細胞を含むヒト患者の免疫療法のための医薬組成物である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はもともと患者に由来する。いくつかの実施形態では、患者は、細胞内で発現されたＣＡＲまたはＴＣＲ、例えば、ｍＴＣＲによって標的とされるがん抗原のレベルの増加または変動が検出される腫瘍またはがんを有する。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、標的抗原に特異的に結合する遺伝子操作された抗原受容体と、免疫細胞の機能を弱める遺伝子の免疫細胞における発現を低下させるまたは低下させることができる遺伝子破壊剤とを含む免疫細胞である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、標的抗原に特異的に結合する遺伝子操作された抗原受容体と、免疫細胞の機能を弱める遺伝子の免疫細胞における発現を低下させるまたは低下させることができる遺伝子破壊剤とを含む免疫細胞である。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された抗原受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された抗原受容体はＣＡＲである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原認識ドメインは、標的抗原に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖の細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは共刺激分子をさらに含む。いくつかの実施形態では、共刺激分子は、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７、及びＣＤ２８から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、共刺激分子はＣＤ１３７（４－１ＢＢ）である。いくつかの実施形態では、共刺激分子はＣＤ２８である。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された抗原受容体はＴＣＲである。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、モノクローナルＴＣＲ（ｍＴＣＲ）である。
いくつかの実施形態では、標的抗原は、がん細胞、がん組織及び／または腫瘍微小環境の中でまたはその表面で発現される。
いくつかの実施形態では、標的抗原は５Ｔ４（栄養膜糖タンパク質）、７０７－ＡＰ、９Ｄ７、ＡＦＰ（α－フェトプロテイン）、ＡｌｂＺＩＰ（アンドロゲン誘導のｂＺＩＰ）、ＨＰＧ１（ヒト前立腺特異的遺伝子－１）、α５β１－インテグリン、α５β６－インテグリン、α－メチルアシル－補酵素Ａラセマーゼ、ＡＲＴ－４（ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ－４）、Ｂ７Ｈ４（ｖ－セットドメイン含有Ｔ－細胞活性化阻害剤１）、ＢＡＧＥ－１（Ｂメラノーマ抗原－１）、ＢＣＬ－２（Ｂ－細胞 ＣＬＬ／リンパ腫－２）、ＢＩＮＧ－４（ＷＤ反復ドメイン４６）、ＣＡ１５－３／ＣＡ２７－２９（ムチン１）、ＣＡ１９－９（がん抗原１９－９）、ＣＡ７２－４（がん抗原７２－４）、ＣＡ１２５（がん抗原１２５）、カルレチクリン、ＣＡＭＥＬ（メラノーマ上のＣＴＬ認識抗原）、ＣＡＳＰ－８（カスパーゼ８）、カテプシンＢ、カテプシンＬ、ＣＤ１９（分化抗原群１９）、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＥＡ（がん胎児性抗原ＳＧ８）、ＣＬＣＡ２（塩化物チャネルアクセサリー２）、ＣＭＬ２８（慢性骨髄性白血病腫瘍抗原２８）、コアクトシン様タンパク質、コラーゲンＸＸＩＩＩ、ＣＯＸ－２（シクロオキシゲナーゼ－２）、ＣＴ－９／ＢＲＤ６（がん／精巣抗原９）、Ｃｔｅｎ（ｃ－末端テンシン様タンパク質）、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、ｃｙｐ－Ｂ、ＣＹＰＢ１（チトクロームｐ４５０ファミリー１サブファミリーｂメンバー１）、ＤＡＭ－１０／ＭＡＧＥ－Ｂ１（メラノーマ関連抗原Ｂ１）、ＤＡＭ－６／ＭＡＧＥ－Ｂ２、ＥＧＦＲ／Ｈｅｒ１（表皮増殖因子受容体）、ＥＭＭＰＲＩＮ（ベイシジン）、ＥｐＣａｍ、ＥｐｈＡ２（ＥＰＨ受容体Ａ２）、ＥｐｈＡ３、ＥｒｂＢ３（Ｅｒｂ－Ｂ２受容体チロシンキナーゼ３）、ＥＺＨ２（ｚｅｓｔｅ２ポリコーム抑制性複合体２サブユニットのエンハンサー）、ＦＧＦ－５（線維芽細胞増殖因子５）、ＦＮ（フィブロネクチン）、Ｆｒａ－１（Ｆｏｓ関連抗原－１）、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ（炭酸脱水酵素９）、ＧＡＧＥ－１（Ｇ抗原－１）、ＧＡＧＥ－２、ＧＡＧＥ－３、ＧＡＧＥ－４、ＧＡＧＥ－５、ＧＡＧＥ－６、ＧＡＧＥ－７ｂ、ＧＡＧＥ－８、ＧＤＥＰ（前立腺にて差次的に発現される遺伝子）、ＧｎＴ－Ｖ（グルコン酸キナーゼ）、ｇｐ１００（メラニン細胞系列特異的抗原ＧＰ１００）、ＧＰＣ３（グリピカン３）、ＨＡＧＥ（らせん抗原）、ＨＡＳＴ－２（スルホトランスフェラーゼファミリー１Ａメンバー１）、ヘプシン、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２（Ｅｒｂ－Ｂ２受容体チロシンキナーゼ２）、ＨＥＲＶ－Ｋ－ＭＥＬ、ＨＮＥ（メデュラシン）、ホメオボックスＮＫＸ３．１、ＨＯＭ－ＴＥＳ－１４／ＳＣＰ－１、ＨＯＭ－ＴＥＳ－８５、ＨＰＶ－Ｅ６、ＨＰＶＥ７、ＨＳＴ－２（シルツイン－２）、ｈＴＥＲＴ、ｉＣＥ（カスパーゼ１）、ＩＧＦ－１Ｒ（インスリン様増殖因子－１受容体）、ＩＬ－１３Ｒａ２（インターロイキン－１３受容体サブユニットα２）、ＩＬ－２Ｒ（インターロイキン－２受容体）、ＩＬ－５（インターロイキン－５）、未成熟ラミニン受容体、カリクレイン２、カリクレイン４、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５（リソホスファチジルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１）、ＫＫ－ＬＣ－１（北九州肺癌抗原－１）、ＫＭ－ＨＮ－１、ＬＡＧＥ－１（Ｌ抗原ファミリーメンバー－１）、リビン、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥＡ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ｂ１、ＭＡＧＥ－Ｂ１０、ＭＡＧＥ－Ｂ１６、ＭＡＧＥＢ１７、ＭＡＧＥ－Ｂ２、ＭＡＧＥ－Ｂ３、ＭＡＧＥ－Ｂ４、ＭＡＧＥ－Ｂ５、ＭＡＧＥ－Ｂ６、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＭＡＧＥ－Ｃ３、ＭＡＧＥ－Ｄ１、ＭＡＧＥ－Ｄ２、ＭＡＧＥ－Ｄ４、ＭＡＧＥ－Ｅ１、ＭＡＧＥ－Ｅ２、ＭＡＧＥ－Ｆ１、ＭＡＧＥ－Ｈ１、ＭＡＧＥＬ２（メラノーマ抗原ファミリーＬ２）、ママグロビンＡ、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ（Ｔ－細胞－１によって認識されるメラノーマ抗原）、ＭＡＲＴ－２、マトリクスタンパク質２２、ＭＣ１Ｒ（メラノコルチン１受容体）、Ｍ－ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）、メソテリン、ＭＧ５０／ＰＸＤＮ（ペルオキシダシン）、ＭＭＰ１１（マトリクスメタロプロテイナーゼ１１）、ＭＮ／ＣＡ ＩＸ－抗原（炭酸脱水酵素９）、ＭＲＰ－３（多剤耐性関連タンパク質－３）、ＭＵＣ１（ムチン１）、ＭＵＣ２、ＮＡ８８－Ａ（ＶＥＮＴ様ホメオボックス２偽遺伝子１）、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ－Ｖ、Ｎｅｏ－ＰＡＰ（Ｎｅｏ－ポリ（Ａ）ポリメラーゼ）、ＮＧＥＰ（前立腺で発現される新しい遺伝子）、ＮＭＰ２２（核マトリクスタンパク質２２）、ＮＰＭ／ＡＬＫ（ヌクレオホスミン）、ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－Ｂ、ＯＡ１（変形性関節症ＱＴＬ１）、ＯＦＡ－ｉＬＲＰ（がん胎児性抗原未成熟ラミニン受容体タンパク質）、ＯＧＴ（Ｏ－ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ）、ＯＳ－９（小胞体レクチン）、オステオカルシン、オステオポンチン、ｐ１５（ＣＤＫ阻害剤２Ｂ）、ｐ５３、ＰＡＧＥ－４（Ｐ抗原ファミリーメンバー－４）、ＰＡＩ－１（プラスミノーゲン活性化因子阻害剤－１）、ＰＡＩ－２、ＰＡＰ（前立腺酸ホスファターゼ）、ＰＡＲＴ－１（前立腺アンドロゲン調節転写物１）、ＰＡＴＥ（前立腺及び精巣で発現された１）、ＰＤＥＦ（前立腺由来のＥｔｓ因子）、Ｐｉｍ－１－キナーゼ（プロウイルス組み込み部位１）、Ｐｉｎ１（ペプチジル－プロリルｃｉｓ－ｔｒａｎｓイソメラーゼＮＩＭＡ－相互作用１）、ＰＯＴＥ（前立腺、卵巣、精巣、及び胎盤で発現される）、ＰＲＡＭＥ（メラノーマで優先的に発現される抗原）、プロステイン、プロテイナーゼ－３、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、ＰＳＧＲ（前立腺特異的Ｇ－タンパク質共役受容体）、ＰＳＭ、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＲＡＧＥ－１（腎腫瘍癌腫抗原）、ＲＨＡＭＭ／ＣＤ１６８、ＲＵ１（腎遍在タンパク質１）、ＲＵ２、ＳＡＧＥ（肉腫抗原）、ＳＡＲＴ－１（Ｔ－細胞－１によって認識される扁平上皮細胞癌腫抗原）、ＳＡＲＴ－２、ＳＡＲＴ－３、Ｓｐ１７（精子タンパク質１７）、ＳＳＸ－１（ＳＳＸファミリーメンバー１）、ＳＳＸ－２／ＨＯＭ－ＭＥＬ－４０、ＳＳＸ－４、ＳＴＡＭＰ－１（ＳＴＥＡＰ２ メタロレダクターゼ）、ＳＴＥＡＰ、サバイビン、サバイビン－２１３、ＴＡ－９０（腫瘍関連抗原－９０）、ＴＡＧ－７２（腫瘍関連糖タンパク質－７２）、ＴＡＲＰ（ＴＣＲγ代替リーディングフレームタンパク質）、ＴＧＦｂ（形質転換増殖因子β）、ＴＧＦｂＲ１１（形質転換増殖因子β受容体１１）、ＴＧＭ－４（トランスグルタミナーゼ４）、ＴＲＡＧ－３（タキソール耐性関連遺伝子３）、ＴＲＧ（Ｔ－細胞受容体γ遺伝子座）、ＴＲＰ－１（一過性受容体ポテンシャル－１）、ＴＲＰ－２／６ｂ、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、Ｔｒｐ－ｐ８、チロシナーゼ、ＵＰＡ（Ｕ－プラスミノーゲン活性化因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子Ａ）、ＶＥＧＦＲ－２／ＦＬＫ－１、及びＷＴ１（ウィルムス腫瘍１）から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、標的抗原はＣＤ１９またはＣＤ２２である。いくつかの実施形態では、標的抗原はＣＤ１９である。
いくつかの実施形態では、標的抗原は、その発現ががん細胞、がん組織及び／または腫瘍微小環境の中でまたはその表面で増加するがん抗原である。
いくつかの実施形態では、標的抗原は、α－アクチニン－４／ｍ、ＡＲＴＣ１／ｍ、ｂｃｒ／ａｂｌ、ベータ－カテニン／ｍ、ＢＲＣＡ１／ｍ、ＢＲＣＡ２／ｍ、ＣＡＳＰ－５／ｍ、ＣＡＳＰ－８／ｍ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ／ｍ、ＣＭＬ６６、ＣＯＡ－１／ｍ、ＤＥＫ－ＣＡＮ、ＥＦＴＵＤ２／ｍ、ＥＬＦ２／ｍ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１、ＦＮ１／ｍ、ＧＰＮＭＢ／ｍ、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１－Ｒ１７０Ｉ、ＨＬＡ－Ａ１１／ｍ、ＨＬＡ－Ａ２／ｍ、ＨＳＰ７０－２Ｍ、ＫＩＡＡ０２０５／ｍ、Ｋ－Ｒａｓ／ｍ、ＬＤＬＲ－ＦＵＴ、ＭＡＲＴ２／ｍ、ＭＥ１／ｍ、ＭＵＭ－１／ｍ、ＭＵＭ－２／ｍ、ＭＵＭ－３／ｍ、ミオシンクラス１／ｍ、ｎｅｏ－ＰＡＰ／ｍ、ＮＦＹＣ／ｍ、Ｎ－Ｒａｓ／ｍ、ＯＧＴ／ｍ、ＯＳ－９／ｍ、ｐ５３／ｍ、Ｐｍｌ／ＲＡＲａ、ＰＲＤＸ５／ｍ、ＰＴＰＲＸ／ｍ、ＲＢＡＦ６００／ｍ、ＳＩＲＴ２／ｍ、ＳＹＴＳＳＸ－１、ＳＹＴ－ＳＳＸ－２、ＴＥＬ－ＡＭＬ１、ＴＧＦｂＲＩＩ、及びＴＰＩ／ｍから成る群から選択され、その際、標的抗原は、がん細胞、がん組織及び／または腫瘍微小環境の中でまたは表面上で発現されるがん抗原の変異した形態である。
いくつかの実施形態では、免疫細胞の機能を弱める遺伝子の発現は、以下の１つ以上を引き起こす：
（ｉ）免疫細胞の増殖の阻害、
（ｉｉ）免疫細胞の細胞死の誘導、
（ｉｉｉ）免疫細胞が標的抗原を認識する及び／または活性化される能力の阻害、
（ｉｖ）標的抗原に対する免疫応答を誘導しない細胞への免疫細胞の分化の誘導、
（ｖ）免疫細胞の免疫応答を促進する分子に対する免疫細胞の反応の低下、または
（ｖｉ）免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する免疫細胞の反応の上昇。
いくつかの実施形態では、免疫細胞の機能を弱める遺伝子は、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、ＣＤ９６、ＭｅｒＴＫ、２Ｂ４、ＦＡＳ、ＣＤ４５、ＰＰ２Ａ、ＳＨＰ１、ＳＨＰ２、ＤＧＫアルファ、ＤＧＫゼータ、Ｃｂｌ－ｂ、Ｃｂｌ－ｃ、ＣＤ１４８、ＬＲＲ１、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＫＬＧＲ１、ＤＮＭＴ３Ａ、及びＡ２ａＲから成る群から選択される。
いくつかの実施形態では、免疫細胞の機能を弱める遺伝子は、免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する免疫細胞の反応を高める。
いくつかの実施形態では、免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する免疫細胞の反応を高める遺伝子は、免疫チェックポイントの受容体またはリガンドをコードする。
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイントの受容体またはリガンドは、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、ＣＤ９６、ＭｅｒＴＫ及び２Ｂ４から成る群から選択される。
いくつかの実施形態では、遺伝子破壊剤は、遺伝子破壊剤の非存在下での免疫細胞と比べて、免疫細胞の機能を弱める免疫細胞における遺伝子の発現を少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または９５％低下させる。
いくつかの実施形態では、遺伝子破壊剤は、免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する免疫細胞の反応を高める遺伝子の発現を低下させる。
いくつかの実施形態では、遺伝子破壊剤は免疫チェックポイントの受容体またはリガンドをコードする遺伝子の発現を低下させる。
いくつかの実施形態では、遺伝子破壊剤は、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、ＣＤ９６、ＭｅｒＴＫ及び２Ｂ４から成る群から選択される遺伝子の発現を低下させる。
いくつかの実施形態では、遺伝子破壊剤は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって免疫細胞の機能を弱める遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、１を超える遺伝子破壊剤が、ＲＮＡｉによって免疫細胞における免疫細胞の機能を弱める遺伝子の発現を低下させる。
いくつかの実施形態では、遺伝子破壊剤は、免疫細胞の機能を弱める単一の遺伝子を標的とする、または免疫細胞の機能を弱める異なる遺伝子を標的とし、その際、第１の遺伝子破壊剤は第１の遺伝子を標的とし、第２の遺伝子破壊剤は第２の遺伝子を標的とし、またはそれらの任意の組み合わせで標的とする。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉには短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が介在する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉには１を超えるｓｈＲＮＡが介在する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉには２つのｓｈＲＮＡが介在する。
いくつかの実施形態では、２つのｓｈＲＮＡはＰＤ－１を標的とする。いくつかの実施形態では、第１のｓｈＲＮＡはＰＤ－１を標的とし、第２のｓｈＲＮＡはＴＩＭ－３を標的とする。いくつかの実施形態では、第１のｓｈＲＮＡはＰＤ－１を標的とし、第２のｓｈＲＮＡはＣＴＬＡ－４を標的とする。いくつかの実施形態では、第１のｓｈＲＮＡはＰＤ－１を標的とし、第２のｓｈＲＮＡはＬＡＧ－３を標的とする。いくつかの実施形態では、第１のｓｈＲＮＡはＰＤ－１を標的とし、第２のｓｈＲＮＡはＴＩＧＩＴを標的とする。
いくつかの実施形態では、免疫細胞はｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞は１を超えるｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞は２つのｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む。特に言及されない限り、本明細書で使用されるとき、「塩基配列」「ヌクレオチド配列」という用語は相互交換可能である。
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２～２１９及び２３８～２６７から成る群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はベクター上にある。
いくつかの実施形態では、異なるｓｈＲＮＡの発現は異なるプロモーターによってそれぞれ調節される。いくつかの実施形態では、２つの異なるｓｈＲＮＡの発現は２つの異なるプロモーターによってそれぞれ調節される。いくつかの実施形態では、２つの異なるプロモーターはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターである。いくつかの実施形態では、２つのプロモーターはＵ６プロモーターである。いくつかの実施形態では、Ｕ６プロモーターは異なる種に由来する。いくつかの実施形態では、２つのプロモーターは互いに異なる方向に向けられる。例えば、特定の実施形態では、プロモーターはヘッドトゥーヘッドの方向に向けられる。別の実施形態では、プロモーターは末尾－末尾の方向に向けられる。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された抗原受容体及び遺伝子破壊剤はそれぞれベクターから発現される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された抗原受容体及び遺伝子破壊剤は同じベクターから発現される。
いくつかの実施形態では、ベクターはプラスミドベクターまたはウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。
いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
いくつかの実施形態では、免疫細胞は２つのｓｈＲＮＡ及び１つのＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を同一ベクター上で含む。いくつかの実施形態では、２つのｓｈＲＮＡは互いに異なる方向に向けられた２つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターによってそれぞれ調節される。例えば、特定の実施形態では、プロモーターはヘッドトゥーヘッドの方向に向けられる。別の実施形態では、プロモーターは末尾－末尾の方向に向けられる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲはＣＤ１９を標的とし、第１のｓｈＲＮＡはＰＤ－１を標的とし、第２のｓｈＲＮＡはＴＩＧＩＴを標的とする。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、免疫細胞に
（１）標的抗原に特異的に結合する遺伝子操作された抗原受容体をコードする遺伝子と、
（２）免疫細胞の機能を弱める遺伝子の免疫細胞における発現を低下させる、または低下させることができる遺伝子破壊剤とを同時にまたは任意の順序で連続的に導入し、
それによって、遺伝子操作された抗原受容体が発現され、免疫細胞の機能を弱める遺伝子の発現が低減される免疫細胞を作り出すことを含む、免疫細胞を作り出す方法である。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された抗原受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された抗原受容体はＣＡＲである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原認識ドメインは、標的抗原に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖の細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは共刺激分子をさらに含む。いくつかの実施形態では、共刺激分子は、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７、及びＣＤ２８から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、共刺激分子はＣＤ１３７（４－１ＢＢ）である。いくつかの実施形態では、共刺激分子はＣＤ２８である。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された抗原受容体はＴＣＲである。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、モノクローナルＴＣＲ（ｍＴＣＲ）である。
いくつかの実施形態では、標的抗原は、がん細胞、がん組織及び／または腫瘍微小環境の中でまたはその表面で発現される。
いくつかの実施形態では、標的抗原は５Ｔ４（栄養膜糖タンパク質）、７０７－ＡＰ、９Ｄ７、ＡＦＰ（α－フェトプロテイン）、ＡｌｂＺＩＰ（アンドロゲン誘導のｂＺＩＰ）、ＨＰＧ１（ヒト前立腺特異的遺伝子－１）、α５β１－インテグリン、α５β６－インテグリン、α－メチルアシル－補酵素Ａラセマーゼ、ＡＲＴ－４（ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ－４）、Ｂ７Ｈ４（ｖ－セットドメイン含有Ｔ－細胞活性化阻害剤１）、ＢＡＧＥ－１（Ｂメラノーマ抗原－１）、ＢＣＬ－２（Ｂ－細胞 ＣＬＬ／リンパ腫－２）、ＢＩＮＧ－４（ＷＤ反復ドメイン４６）、ＣＡ１５－３／ＣＡ２７－２９（ムチン１）、ＣＡ１９－９（がん抗原１９－９）、ＣＡ７２－４（がん抗原７２－４）、ＣＡ１２５（がん抗原１２５）、カルレチクリン、ＣＡＭＥＬ（メラノーマ上のＣＴＬ認識抗原）、ＣＡＳＰ－８（カスパーゼ８）、カテプシンＢ、カテプシンＬ、ＣＤ１９（分化抗原群１９）、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＥＡ（がん胎児性抗原ＳＧ８）、ＣＬＣＡ２（塩化物チャネルアクセサリー２）、ＣＭＬ２８（慢性骨髄性白血病腫瘍抗原２８）、コアクトシン様タンパク質、コラーゲンＸＸＩＩＩ、ＣＯＸ－２（シクロオキシゲナーゼ－２）、ＣＴ－９／ＢＲＤ６（がん／精巣抗原９）、Ｃｔｅｎ（ｃ－末端テンシン様タンパク質）、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、ｃｙｐ－Ｂ、ＣＹＰＢ１（チトクロームｐ４５０ファミリー１サブファミリーｂメンバー１）、ＤＡＭ－１０／ＭＡＧＥ－Ｂ１（メラノーマ関連抗原Ｂ１）、ＤＡＭ－６／ＭＡＧＥ－Ｂ２、ＥＧＦＲ／Ｈｅｒ１（表皮増殖因子受容体）、ＥＭＭＰＲＩＮ（ベイシジン）、ＥｐＣａｍ、ＥｐｈＡ２（ＥＰＨ受容体Ａ２）、ＥｐｈＡ３、ＥｒｂＢ３（Ｅｒｂ－Ｂ２受容体チロシンキナーゼ３）、ＥＺＨ２（ｚｅｓｔｅ２ポリコーム抑制性複合体２サブユニットのエンハンサー）、ＦＧＦ－５（線維芽細胞増殖因子５）、ＦＮ（フィブロネクチン）、Ｆｒａ－１（Ｆｏｓ関連抗原－１）、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ（炭酸脱水酵素９）、ＧＡＧＥ－１（Ｇ抗原－１）、ＧＡＧＥ－２、ＧＡＧＥ－３、ＧＡＧＥ－４、ＧＡＧＥ－５、ＧＡＧＥ－６、ＧＡＧＥ－７ｂ、ＧＡＧＥ－８、ＧＤＥＰ（前立腺にて差次的に発現される遺伝子）、ＧｎＴ－Ｖ（グルコン酸キナーゼ）、ｇｐ１００（メラニン細胞系列特異的抗原ＧＰ１００）、ＧＰＣ３（グリピカン３）、ＨＡＧＥ（らせん抗原）、ＨＡＳＴ－２（スルホトランスフェラーゼファミリー１Ａメンバー１）、ヘプシン、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２（Ｅｒｂ－Ｂ２受容体チロシンキナーゼ２）、ＨＥＲＶ－Ｋ－ＭＥＬ、ＨＮＥ（メデュラシン）、ホメオボックスＮＫＸ３．１、ＨＯＭ－ＴＥＳ－１４／ＳＣＰ－１、ＨＯＭ－ＴＥＳ－８５、ＨＰＶ－Ｅ６、ＨＰＶＥ７、ＨＳＴ－２（シルツイン－２）、ｈＴＥＲＴ、ｉＣＥ（カスパーゼ１）、ＩＧＦ－１Ｒ（インスリン様増殖因子－１受容体）、ＩＬ－１３Ｒａ２（インターロイキン－１３受容体サブユニットα２）、ＩＬ－２Ｒ（インターロイキン－２受容体）、ＩＬ－５（インターロイキン－５）、未成熟ラミニン受容体、カリクレイン２、カリクレイン４、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５（リソホスファチジルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１）、ＫＫ－ＬＣ－１（北九州肺癌抗原－１）、ＫＭ－ＨＮ－１、ＬＡＧＥ－１（Ｌ抗原ファミリーメンバー－１）、リビン、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥＡ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ｂ１、ＭＡＧＥ－Ｂ１０、ＭＡＧＥ－Ｂ１６、ＭＡＧＥＢ１７、ＭＡＧＥ－Ｂ２、ＭＡＧＥ－Ｂ３、ＭＡＧＥ－Ｂ４、ＭＡＧＥ－Ｂ５、ＭＡＧＥ－Ｂ６、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＭＡＧＥ－Ｃ３、ＭＡＧＥ－Ｄ１、ＭＡＧＥ－Ｄ２、ＭＡＧＥ－Ｄ４、ＭＡＧＥ－Ｅ１、ＭＡＧＥ－Ｅ２、ＭＡＧＥ－Ｆ１、ＭＡＧＥ－Ｈ１、ＭＡＧＥＬ２（メラノーマ抗原ファミリーＬ２）、ママグロビンＡ、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ（Ｔ－細胞－１によって認識されるメラノーマ抗原）、ＭＡＲＴ－２、マトリクスタンパク質２２、ＭＣ１Ｒ（メラノコルチン１受容体）、Ｍ－ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）、メソテリン、ＭＧ５０／ＰＸＤＮ（ペルオキシダシン）、ＭＭＰ１１（マトリクスメタロプロテイナーゼ１１）、ＭＮ／ＣＡ ＩＸ－抗原（炭酸脱水酵素９）、ＭＲＰ－３（多剤耐性関連タンパク質－３）、ＭＵＣ１（ムチン１）、ＭＵＣ２、ＮＡ８８－Ａ（ＶＥＮＴ様ホメオボックス２偽遺伝子１）、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ－Ｖ、Ｎｅｏ－ＰＡＰ（Ｎｅｏ－ポリ（Ａ）ポリメラーゼ）、ＮＧＥＰ（前立腺で発現される新しい遺伝子）、ＮＭＰ２２（核マトリクスタンパク質２２）、ＮＰＭ／ＡＬＫ（ヌクレオホスミン）、ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－Ｂ、ＯＡ１（変形性関節症ＱＴＬ１）、ＯＦＡ－ｉＬＲＰ（がん胎児性抗原未成熟ラミニン受容体タンパク質）、ＯＧＴ（Ｏ－ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ）、ＯＳ－９（小胞体レクチン）、オステオカルシン、オステオポンチン、ｐ１５（ＣＤＫ阻害剤２Ｂ）、ｐ５３、ＰＡＧＥ－４（Ｐ抗原ファミリーメンバー－４）、ＰＡＩ－１（プラスミノーゲン活性化因子阻害剤－１）、ＰＡＩ－２、ＰＡＰ（前立腺酸ホスファターゼ）、ＰＡＲＴ－１（前立腺アンドロゲン調節転写物１）、ＰＡＴＥ（前立腺及び精巣で発現された１）、ＰＤＥＦ（前立腺由来のＥｔｓ因子）、Ｐｉｍ－１－キナーゼ（プロウイルス組み込み部位１）、Ｐｉｎ１（ペプチジル－プロリルｃｉｓ－ｔｒａｎｓイソメラーゼＮＩＭＡ－相互作用１）、ＰＯＴＥ（前立腺、卵巣、精巣、及び胎盤で発現される）、ＰＲＡＭＥ（メラノーマで優先的に発現される抗原）、プロステイン、プロテイナーゼ－３、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、ＰＳＧＲ（前立腺特異的Ｇ－タンパク質共役受容体）、ＰＳＭ、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＲＡＧＥ－１（腎腫瘍癌腫抗原）、ＲＨＡＭＭ／ＣＤ１６８、ＲＵ１（腎遍在タンパク質１）、ＲＵ２、ＳＡＧＥ（肉腫抗原）、ＳＡＲＴ－１（Ｔ－細胞－１によって認識される扁平上皮細胞癌腫抗原）、ＳＡＲＴ－２、ＳＡＲＴ－３、Ｓｐ１７（精子タンパク質１７）、ＳＳＸ－１（ＳＳＸファミリーメンバー１）、ＳＳＸ－２／ＨＯＭ－ＭＥＬ－４０、ＳＳＸ－４、ＳＴＡＭＰ－１（ＳＴＥＡＰ２ メタロレダクターゼ）、ＳＴＥＡＰ、サバイビン、サバイビン－２１３、ＴＡ－９０（腫瘍関連抗原－９０）、ＴＡＧ－７２（腫瘍関連糖タンパク質－７２）、ＴＡＲＰ（ＴＣＲγ代替リーディングフレームタンパク質）、ＴＧＦｂ（形質転換増殖因子β）、ＴＧＦｂＲ１１（形質転換増殖因子β受容体１１）、ＴＧＭ－４（トランスグルタミナーゼ４）、ＴＲＡＧ－３（タキソール耐性関連遺伝子３）、ＴＲＧ（Ｔ－細胞受容体γ遺伝子座）、ＴＲＰ－１（一過性受容体ポテンシャル－１）、ＴＲＰ－２／６ｂ、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、Ｔｒｐ－ｐ８、チロシナーゼ、ＵＰＡ（Ｕ－プラスミノーゲン活性化因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子Ａ）、ＶＥＧＦＲ－２／ＦＬＫ－１、及びＷＴ１（ウィルムス腫瘍１）から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、標的抗原はＣＤ１９またはＣＤ２２である。いくつかの実施形態では、標的抗原はＣＤ１９である。
いくつかの実施形態では、標的抗原は、その発現ががん細胞、がん組織及び／または腫瘍微小環境の中でまたはその表面で増加するがん抗原である。
いくつかの実施形態では、標的抗原は、α－アクチニン－４／ｍ、ＡＲＴＣ１／ｍ、ｂｃｒ／ａｂｌ、ベータ－カテニン／ｍ、ＢＲＣＡ１／ｍ、ＢＲＣＡ２／ｍ、ＣＡＳＰ－５／ｍ、ＣＡＳＰ－８／ｍ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ／ｍ、ＣＭＬ６６、ＣＯＡ－１／ｍ、ＤＥＫ－ＣＡＮ、ＥＦＴＵＤ２／ｍ、ＥＬＦ２／ｍ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１、ＦＮ１／ｍ、ＧＰＮＭＢ／ｍ、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１－Ｒ１７０Ｉ、ＨＬＡ－Ａ１１／ｍ、ＨＬＡ－Ａ２／ｍ、ＨＳＰ７０－２Ｍ、ＫＩＡＡ０２０５／ｍ、Ｋ－Ｒａｓ／ｍ、ＬＤＬＲ－ＦＵＴ、ＭＡＲＴ２／ｍ、ＭＥ１／ｍ、ＭＵＭ－１／ｍ、ＭＵＭ－２／ｍ、ＭＵＭ－３／ｍ、ミオシンクラス１／ｍ、ｎｅｏ－ＰＡＰ／ｍ、ＮＦＹＣ／ｍ、Ｎ－Ｒａｓ／ｍ、ＯＧＴ／ｍ、ＯＳ－９／ｍ、ｐ５３／ｍ、Ｐｍｌ／ＲＡＲａ、ＰＲＤＸ５／ｍ、ＰＴＰＲＸ／ｍ、ＲＢＡＦ６００／ｍ、ＳＩＲＴ２／ｍ、ＳＹＴＳＳＸ－１、ＳＹＴ－ＳＳＸ－２、ＴＥＬ－ＡＭＬ１、ＴＧＦｂＲＩＩ、及びＴＰＩ／ｍから成る群から選択され、その際、標的抗原は、がん細胞、がん組織及び／または腫瘍微小環境の中でまたは表面上で発現されるがん抗原の変異した形態である。
いくつかの実施形態では、免疫細胞の機能を弱める遺伝子の発現は、以下の１つ以上を引き起こす：
（ｉ）免疫細胞の増殖の阻害、
（ｉｉ）免疫細胞の細胞死の誘導、
（ｉｉｉ）免疫細胞が標的抗原を認識する及び／または活性化される能力の阻害、
（ｉｖ）標的抗原に対する免疫応答を誘導しない細胞への免疫細胞の分化の誘導、
（ｖ）免疫細胞の免疫応答を促進する分子に対する免疫細胞の反応の低下、または
（ｖｉ）免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する免疫細胞の反応の上昇。
いくつかの実施形態では、免疫細胞の機能を弱める遺伝子は、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、ＣＤ９６、ＭｅｒＴＫ、２Ｂ４、ＦＡＳ、ＣＤ４５、ＰＰ２Ａ、ＳＨＰ１、ＳＨＰ２、ＤＧＫアルファ、ＤＧＫゼータ、Ｃｂｌ－ｂ、Ｃｂｌ－ｃ、ＣＤ１４８、ＬＲＲ１、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＫＬＧＲ１、ＤＮＭＴ３Ａ、及びＡ２ａＲから成る群から選択される。
いくつかの実施形態では、免疫細胞の機能を弱める遺伝子は、免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する免疫細胞の反応を高める。
いくつかの実施形態では、免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する免疫細胞の反応を高める遺伝子は、免疫チェックポイントの受容体またはリガンドをコードする。
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイントの受容体またはリガンドは、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、ＣＤ９６、ＭｅｒＴＫ及び２Ｂ４から成る群から選択される。
いくつかの実施形態では、遺伝子破壊剤は、遺伝子破壊剤の非存在下での免疫細胞と比べて、免疫細胞の機能を弱める免疫細胞における遺伝子の発現を少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または９５％低下させる。
いくつかの実施形態では、遺伝子破壊剤は、免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する免疫細胞の反応を高める遺伝子の発現を低下させる。
いくつかの実施形態では、遺伝子破壊剤は免疫チェックポイントの受容体またはリガンドをコードする遺伝子の発現を低下させる。
いくつかの実施形態では、遺伝子破壊剤は、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、ＣＤ９６、ＭｅｒＴＫ及び２Ｂ４から成る群から選択される遺伝子の発現を低下させる。
いくつかの実施形態では、遺伝子破壊剤は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって免疫細胞の機能を弱める遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、１を超える遺伝子破壊剤が、ＲＮＡｉによって免疫細胞における免疫細胞の機能を弱める遺伝子の発現を低下させる。
いくつかの実施形態では、遺伝子破壊剤は、免疫細胞の機能を弱める単一の遺伝子を標的とする、または免疫細胞の機能を弱める異なる遺伝子を標的とし、その際、第１の遺伝子破壊剤は第１の遺伝子を標的とし、第２の遺伝子破壊剤は第２の遺伝子を標的とし、またはそれらの任意の組み合わせで標的とする。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉには短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が介在する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉには１を超えるｓｈＲＮＡが介在する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉには２つのｓｈＲＮＡが介在する。
いくつかの実施形態では、２つのｓｈＲＮＡはＰＤ－１を標的とする。いくつかの実施形態では、第１のｓｈＲＮＡはＰＤ－１を標的とし、第２のｓｈＲＮＡはＴＩＭ－３を標的とする。いくつかの実施形態では、第１のｓｈＲＮＡはＰＤ－１を標的とし、第２のｓｈＲＮＡはＣＴＬＡ－４を標的とする。いくつかの実施形態では、第１のｓｈＲＮＡはＰＤ－１を標的とし、第２のｓｈＲＮＡはＬＡＧ－３を標的とする。いくつかの実施形態では、第１のｓｈＲＮＡはＰＤ－１を標的とし、第２のｓｈＲＮＡはＴＩＧＩＴを標的とする。
いくつかの実施形態では、免疫細胞はｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞は１を超えるｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞は２つのｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２～２１９及び２３８～２６７から成る群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はベクター上にある。
いくつかの実施形態では、異なるｓｈＲＮＡの発現は異なるプロモーターによってそれぞれ調節される。いくつかの実施形態では、２つの異なるｓｈＲＮＡの発現は２つの異なるプロモーターによってそれぞれ調節される。いくつかの実施形態では、２つの異なるプロモーターはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターである。いくつかの実施形態では、２つのプロモーターはＵ６プロモーターである。いくつかの実施形態では、Ｕ６プロモーターは異なる種に由来する。いくつかの実施形態では、２つのプロモーターは互いに異なる方向に向けられる。例えば、特定の実施形態では、プロモーターはヘッドトゥーヘッドの方向に向けられる。別の実施形態では、プロモーターは末尾－末尾の方向に向けられる。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された抗原受容体及び遺伝子破壊剤はそれぞれベクターから発現される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された抗原受容体及び遺伝子破壊剤は同じベクターから発現される。
いくつかの実施形態では、ベクターはプラスミドベクターまたはウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。
いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
いくつかの実施形態では、免疫細胞は２つのｓｈＲＮＡ及び１つのＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を同一ベクター上で含む。いくつかの実施形態では、２つのｓｈＲＮＡは互いに異なる方向に向けられた２つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターによってそれぞれ調節される。例えば、特定の実施形態では、プロモーターはヘッドトゥーヘッドの方向に向けられる。別の実施形態では、プロモーターは末尾－末尾の方向に向けられる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲはＣＤ１９を標的とし、第１のｓｈＲＮＡはＰＤ－１を標的とし、第２のｓｈＲＮＡはＴＩＧＩＴを標的とする。
別の態様では、本明細書で提供されるのは操作された免疫細胞を含む組成物である。別の態様では、本明細書で提供されるのは免疫細胞と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、疾患または状態を有する対象に免疫細胞または組成物を投与することを含む治療方法である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された抗原受容体は疾患または状態に関連する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、疾患または状態はがんまたは腫瘍である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、疾患または状態の治療に使用するための免疫細胞または組成物である。別の態様では、本明細書で提供されるのは、疾患または状態を治療するための薬物の製造における免疫細胞または組成物の使用である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された抗原受容体は疾患または状態に関連する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、疾患または状態はがんまたは腫瘍である。
さらなる非限定的な実施形態を以下に提示する。
１．ベクターであって、
免疫細胞の機能を弱める少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害する２種類の短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする塩基配列と、
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはモノクローナルＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）をコードする塩基配列とを含む、前記ベクター。
２．前記２種類のｓｈＲＮＡの発現は、それらが２つの異なるプロモーターによってそれぞれ調節されることを特徴とする実施形態１に記載のベクター。
３．前記２つのプロモーターがＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターである実施形態２に記載のベクター。
４．前記２つのプロモーターが異なる種に由来するＵ６プロモーターである実施形態２に記載のベクター。
５．前記２つのプロモーターが前記ベクター上で互いに異なる方向に向けられる実施形態２に記載のベクター。
６．免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子が免疫チェックポイントの受容体またはリガンドである実施形態１に記載のベクター。
７．前記免疫チェックポイントの受容体またはリガンドが、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、ＣＤ９６、ＭｅｒＴＫ及び２Ｂ４から成る群から選択される実施形態６に記載のベクター。
８．免疫細胞の機能を弱める遺伝子が、ＦＡＳ、ＣＤ４５、ＰＰ２Ａ、ＳＨＩＰ１、ＳＨＩＰ２、ＤＧＫアルファ、ＤＧＫゼータ、Ｃｂｌ－ｂ、ＣＤ１４７、ＬＲＲ１、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ１０Ｒアルファ、ＫＬＧＲ１、ＤＮＭＴ３Ａ及びＡ２ａＲから成る群から選択される実施形態１に記載のベクター。
９．前記２種類のｓｈＲＮＡが免疫細胞の機能を弱める単一の遺伝子を標的とする、または前記２種類のｓｈＲＮＡが免疫細胞の機能を弱める異なる遺伝子を標的とする実施形態１に記載のベクター。
１０．前記２種類のｓｈＲＮＡがＰＤ－１を標的とする実施形態１に記載のベクター。
１１．前記２種類のｓｈＲＮＡのうち、（ｉ）一方のｓｈＲＮＡがＰＤ－１を標的とし、第２のｓｈＲＮＡがＴＩＭ－３を標的とする、または（ｉｉ）一方のｓｈＲＮＡがＰＤ－１を標的とし、第２のｓｈＲＮＡがＴＩＧＩＴを標的とする、実施形態１に記載のベクター。
１２．前記２種類のｓｈＲＮＡのうち、一方のｓｈＲＮＡをコードする前記塩基配列が配列番号２～２１９から成る群から選択される配列を含み、第２のｓｈＲＮＡをコードする前記塩基配列が配列番号２～２１９から成る群から選択される異なる配列を含む実施形態１に記載のベクター。
１３．前記ＣＡＲまたはｍＴＣＲの前記標的が、がん細胞、がん組織及び／または腫瘍微小環境における発現の上昇を示すヒト腫瘍抗原である、またはがん細胞、がん組織及び／または腫瘍微小環境に見られる抗原の変異した形態である実施形態１に記載のベクター。
１４．前記ベクターが配列番号２２０または２２１の塩基配列を含む実施形態１に記載のベクター。
１５．前記ベクターが、プラスミドベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである実施形態１に記載のベクター。
１６．実施形態１に記載のベクターを含む免疫細胞であって、１以上の遺伝子の発現がｓｈＲＮＡの非存在下での発現のそれよりも４０％以下に低下する、前記免疫細胞。
１７．前記免疫細胞がヒト由来のＴ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、実施形態１６に記載の免疫細胞。
１８．実施形態１～１７のいずれか１つに記載の免疫細胞を含む医薬組成物。
１９．前記免疫細胞がもともと患者から得られる、免疫療法を必要とする前記患者の治療のための実施形態１８に記載の医薬組成物。
２０．前記患者が、前記免疫細胞で発現される前記ＣＡＲまたはｍＴＣＲの前記標的及び／または前記標的のレベルの上昇または変動が検出される腫瘍またはがんを有する実施形態１９に記載の医薬組成物。
２１．免疫細胞であって、標的抗原に特異的に結合する遺伝子操作された抗原受容体と、前記免疫細胞の機能を弱める遺伝子の前記免疫細胞における発現を低下させるまたは低下させることができる遺伝子破壊剤とを含む、前記免疫細胞。
２２．前記遺伝子操作された抗原受容体がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である実施形態２１に記載の免疫細胞。
２３．前記遺伝子操作された抗原受容体がＣＡＲである実施形態２２に記載の免疫細胞。
２４．前記ＣＡＲが、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む実施形態２３に記載の免疫細胞。
２５．前記ＣＡＲの前記細胞外抗原認識ドメインが前記標的抗原に特異的に結合する実施形態２４に記載の免疫細胞。
２６．前記ＣＡＲの前記細胞内シグナル伝達ドメインがＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖の細胞内ドメインを含む実施形態２４に記載の免疫細胞。
２７．前記ＣＡＲの前記細胞内シグナル伝達ドメインが共刺激分子をさらに含む実施形態２６に記載の免疫細胞。
２８．前記共刺激分子がＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７、及びＣＤ２８から成る群から選択される実施形態２７に記載の免疫細胞。
２９．前記共刺激分子がＣＤ１３７（４－１ＢＢ）である実施形態２８に記載の免疫細胞。
３０．前記共刺激分子がＣＤ２８である実施形態２８に記載の免疫細胞。
３１．前記遺伝子操作された抗原受容体がＴＣＲである実施形態２２に記載の免疫細胞。
３２．前記ＴＣＲがモノクローナルＴＣＲ（ｍＴＣＲ）である実施形態３１に記載の免疫細胞。
３３．前記標的抗原ががん細胞、がん組織及び／または腫瘍微小環境の中でまたはその表面で発現される実施形態３１または３２に記載の免疫細胞。
３４．前記標的抗原が、５Ｔ４（栄養膜糖タンパク質）、７０７－ＡＰ、９Ｄ７、ＡＦＰ（α－フェトプロテイン）、ＡｌｂＺＩＰ（アンドロゲン誘導のｂＺＩＰ）、ＨＰＧ１（ヒト前立腺特異的遺伝子－１）、α５β１－インテグリン、α５β６－インテグリン、α－メチルアシル－補酵素Ａラセマーゼ、ＡＲＴ－４（ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ－４）、Ｂ７Ｈ４（ｖ－セットドメイン含有Ｔ－細胞活性化阻害剤１）、ＢＡＧＥ－１（Ｂメラノーマ抗原－１）、ＢＣＬ－２（Ｂ－細胞ＣＬＬ／リンパ腫－２）、ＢＩＮＧ－４（ＷＤ反復ドメイン４６）、ＣＡ１５－３／ＣＡ２７－２９（ムチン１）、ＣＡ１９－９（がん抗原１９－９）、ＣＡ７２－４（がん抗原７２－４）、ＣＡ１２５（がん抗原１２５）、カルレチクリン、ＣＡＭＥＬ（メラノーマ上のＣＴＬ認識抗原）、ＣＡＳＰ－８（カスパーゼ８）、カテプシンＢ、カテプシンＬ、ＣＤ１９（分化抗原群１９）、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＥＡ（がん胎児性抗原ＳＧ８）、ＣＬＣＡ２（塩化物チャネルアクセサリー２）、ＣＭＬ２８（慢性骨髄性白血病腫瘍抗原２８）、コアクトシン様タンパク質、コラーゲンＸＸＩＩＩ、ＣＯＸ－２（シクロオキシゲナーゼ－２）、ＣＴ－９／ＢＲＤ６（がん／精巣抗原９）、Ｃｔｅｎ（ｃ－末端テンシン様タンパク質）、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、ｃｙｐ－Ｂ、ＣＹＰＢ１（チトクロームｐ４５０ファミリー１サブファミリーｂメンバー１）、ＤＡＭ－１０／ＭＡＧＥ－Ｂ１（メラノーマ関連抗原Ｂ１）、ＤＡＭ－６／ＭＡＧＥ－Ｂ２、ＥＧＦＲ／Ｈｅｒ１（表皮増殖因子受容体）、ＥＭＭＰＲＩＮ（ベイシジン）、ＥｐＣａｍ、ＥｐｈＡ２（ＥＰＨ受容体Ａ２）、ＥｐｈＡ３、ＥｒｂＢ３（Ｅｒｂ－Ｂ２受容体チロシンキナーゼ３）、ＥＺＨ２（ｚｅｓｔｅ２ポリコーム抑制性複合体２サブユニットのエンハンサー）、ＦＧＦ－５（線維芽細胞増殖因子５）、ＦＮ（フィブロネクチン）、Ｆｒａ－１（Ｆｏｓ関連抗原－１）、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ（炭酸脱水酵素９）、ＧＡＧＥ－１（Ｇ抗原－１）、ＧＡＧＥ－２、ＧＡＧＥ－３、ＧＡＧＥ－４、ＧＡＧＥ－５、ＧＡＧＥ－６、ＧＡＧＥ－７ｂ、ＧＡＧＥ－８、ＧＤＥＰ（前立腺にて差次的に発現される遺伝子）、ＧｎＴ－Ｖ（グルコン酸キナーゼ）、ｇｐ１００（メラニン細胞系列特異的抗原ＧＰ１００）、ＧＰＣ３（グリピカン３）、ＨＡＧＥ（らせん抗原）、ＨＡＳＴ－２（スルホトランスフェラーゼファミリー１Ａメンバー１）、ヘプシン、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２（Ｅｒｂ－Ｂ２受容体チロシンキナーゼ２）、ＨＥＲＶ－Ｋ－ＭＥＬ、ＨＮＥ（メデュラシン）、ホメオボックスＮＫＸ ３．１、ＨＯＭ－ＴＥＳ－１４／ＳＣＰ－１、ＨＯＭ－ＴＥＳ－８５、ＨＰＶ－Ｅ６、ＨＰＶＥ７、ＨＳＴ－２（シルツイン－２）、ｈＴＥＲＴ、ｉＣＥ（カスパーゼ１）、ＩＧＦ－１Ｒ（インスリン様増殖因子－１受容体）、ＩＬ－１３Ｒａ２（インターロイキン－１３受容体サブユニットα２）、ＩＬ－２Ｒ（インターロイキン－２受容体）、ＩＬ－５（インターロイキン－５）、未成熟ラミニン受容体、カリクレイン２、カリクレイン４、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５（リソホスファチジルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１）、ＫＫ－ＬＣ－１（北九州肺癌抗原－１）、ＫＭ－ＨＮ－１、ＬＡＧＥ－１（Ｌ抗原ファミリーメンバー－１）、リビン、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥＡ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ｂ１、ＭＡＧＥ－Ｂ１０、ＭＡＧＥ－Ｂ１６、ＭＡＧＥＢ１７、ＭＡＧＥ－Ｂ２、ＭＡＧＥ－Ｂ３、ＭＡＧＥ－Ｂ４、ＭＡＧＥ－Ｂ５、ＭＡＧＥ－Ｂ６、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＭＡＧＥ－Ｃ３、ＭＡＧＥ－Ｄ１、ＭＡＧＥ－Ｄ２、ＭＡＧＥ－Ｄ４、ＭＡＧＥ－Ｅ１、ＭＡＧＥ－Ｅ２、ＭＡＧＥ－Ｆ１、ＭＡＧＥ－Ｈ１、ＭＡＧＥＬ２（メラノーマ抗原ファミリーＬ２）、ママグロビンＡ、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ（Ｔ－細胞－１によって認識されるメラノーマ抗原）、ＭＡＲＴ－２、マトリクスタンパク質２２、ＭＣ１Ｒ（メラノコルチン１受容体）、Ｍ－ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）、メソテリン、ＭＧ５０／ＰＸＤＮ（ペルオキシダシン）、ＭＭＰ１１（マトリクスメタロプロテイナーゼ１１）、ＭＮ／ＣＡ ＩＸ－抗原（炭酸脱水酵素９）、ＭＲＰ－３（多剤耐性関連タンパク質－３）、ＭＵＣ１（ムチン１）、ＭＵＣ２、ＮＡ８８－Ａ（ＶＥＮＴ様ホメオボックス２偽遺伝子１）、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ－Ｖ、Ｎｅｏ－ＰＡＰ（Ｎｅｏ－ポリ（Ａ）ポリメラーゼ）、ＮＧＥＰ（前立腺で発現される新しい遺伝子）、ＮＭＰ２２（核マトリクスタンパク質２２）、ＮＰＭ／ＡＬＫ（ヌクレオホスミン）、ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－Ｂ、ＯＡ１（変形性関節症ＱＴＬ１）、ＯＦＡ－ｉＬＲＰ（がん胎児性抗原未成熟ラミニン受容体タンパク質）、ＯＧＴ（Ｏ－ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ）、ＯＳ－９（小胞体レクチン）、オステオカルシン、オステオポンチン、ｐ１５（ＣＤＫ阻害剤２Ｂ）、ｐ５３、ＰＡＧＥ－４（Ｐ抗原ファミリーメンバー－４）、ＰＡＩ－１（プラスミノーゲン活性化因子阻害剤－１）、ＰＡＩ－２、ＰＡＰ（前立腺酸ホスファターゼ）、ＰＡＲＴ－１（前立腺アンドロゲン調節転写物１）、ＰＡＴＥ（前立腺及び精巣で発現された１）、ＰＤＥＦ（前立腺由来のＥｔｓ因子）、Ｐｉｍ－１－キナーゼ（プロウイルス組み込み部位１）、Ｐｉｎ１（ペプチジル－プロリルｃｉｓ－ｔｒａｎｓイソメラーゼＮＩＭＡ－相互作用１）、ＰＯＴＥ（前立腺、卵巣、精巣、及び胎盤で発現される）、ＰＲＡＭＥ（メラノーマで優先的に発現される抗原）、プロステイン、プロテイナーゼ－３、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、ＰＳＧＲ（前立腺特異的Ｇ－タンパク質共役受容体）、ＰＳＭ、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＲＡＧＥ－１（腎腫瘍癌腫抗原）、ＲＨＡＭＭ／ＣＤ１６８、ＲＵ１（腎遍在タンパク質１）、ＲＵ２、ＳＡＧＥ（肉腫抗原）、ＳＡＲＴ－１（Ｔ－細胞－１によって認識される扁平上皮細胞癌腫抗原）、ＳＡＲＴ－２、ＳＡＲＴ－３、Ｓｐ１７（精子タンパク質１７）、ＳＳＸ－１（ＳＳＸファミリーメンバー１）、ＳＳＸ－２／ＨＯＭ－ＭＥＬ－４０、ＳＳＸ－４、ＳＴＡＭＰ－１（ＳＴＥＡＰ２ メタロレダクターゼ）、ＳＴＥＡＰ、サバイビン、サバイビン－２１３、ＴＡ－９０（腫瘍関連抗原－９０）、ＴＡＧ－７２（腫瘍関連糖タンパク質－７２）、ＴＡＲＰ（ＴＣＲγ代替リーディングフレームタンパク質）、ＴＧＦｂ（形質転換増殖因子β）、ＴＧＦｂＲ１１（形質転換増殖因子β受容体１１）、ＴＧＭ－４（トランスグルタミナーゼ４）、ＴＲＡＧ－３（タキソール耐性関連遺伝子３）、ＴＲＧ（Ｔ－細胞受容体γ遺伝子座）、ＴＲＰ－１（一過性受容体ポテンシャル－１）、ＴＲＰ－２／６ｂ、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、Ｔｒｐ－ｐ８、チロシナーゼ、ＵＰＡ（Ｕ－プラスミノーゲン活性化因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子Ａ）、ＶＥＧＦＲ－２／ＦＬＫ－１、及びＷＴ１（ウィルムス腫瘍１）から成る群から選択される実施形態３３に記載の免疫細胞。
３５．前記標的抗原がＣＤ１９またはＣＤ２２である実施形態３５に記載の免疫細胞。
３６．前記標的抗原がＣＤ１９である実施形態３６に記載の免疫細胞。
３７．前記標的抗原ががん抗原であり、前記がん抗原が、その発現ががん細胞、がん組織及び／または腫瘍微小環境の中でまたはその表面で増加するがん抗原である実施形態３４～３６のいずれかの免疫細胞。
３８．前記標的抗原が、α－アクチニン－４／ｍ、ＡＲＴＣ１／ｍ、ｂｃｒ／ａｂｌ、ベータ－カテニン／ｍ、ＢＲＣＡ１／ｍ、ＢＲＣＡ２／ｍ、ＣＡＳＰ－５／ｍ、ＣＡＳＰ－８／ｍ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ／ｍ、ＣＭＬ６６、ＣＯＡ－１／ｍ、ＤＥＫ－ＣＡＮ、ＥＦＴＵＤ２／ｍ、ＥＬＦ２／ｍ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１、ＦＮ１／ｍ、ＧＰＮＭＢ／ｍ、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１－Ｒ１７０Ｉ、ＨＬＡ－Ａ１１／ｍ、ＨＬＡ－Ａ２／ｍ、ＨＳＰ７０－２Ｍ、ＫＩＡＡ０２０５／ｍ、Ｋ－Ｒａｓ／ｍ、ＬＤＬＲ－ＦＵＴ、ＭＡＲＴ２／ｍ、ＭＥ１／ｍ、ＭＵＭ－１／ｍ、ＭＵＭ－２／ｍ、ＭＵＭ－３／ｍ、ミオシンクラス１／ｍ、ｎｅｏ－ＰＡＰ／ｍ、ＮＦＹＣ／ｍ、Ｎ－Ｒａｓ／ｍ、ＯＧＴ／ｍ、ＯＳ－９／ｍ、ｐ５３／ｍ、Ｐｍｌ／ＲＡＲａ、ＰＲＤＸ５／ｍ、ＰＴＰＲＸ／ｍ、ＲＢＡＦ６００／ｍ、ＳＩＲＴ２／ｍ、ＳＹＴＳＳＸ－１、ＳＹＴ－ＳＳＸ－２、ＴＥＬ－ＡＭＬ１、ＴＧＦｂＲＩＩ、及びＴＰＩ／ｍから成る群から選択され、その際、前記標的抗原はがん抗原であり、前記がん抗原はがん細胞、がん組織及び／または腫瘍微小環境の中でまたは表面上で発現される抗原の変異した形態である実施形態３３に記載の免疫細胞。
３９．前記免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子の発現が、以下：
（ｉ）前記免疫細胞の増殖の阻害、
（ｉｉ）前記免疫細胞の細胞死の誘導、
（ｉｉｉ）前記免疫細胞が前記標的抗原を認識する及び／または活性化される能力の阻害、
（ｉｖ）前記標的抗原に対する免疫応答を誘導しない細胞への前記免疫細胞の分化の誘導、
（ｖ）前記免疫細胞の免疫応答を促進する分子に対する前記免疫細胞の反応の低下、または
（ｖｉ）前記免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する前記免疫細胞の反応の上昇の１以上を引き起こす実施形態２１～３８のいずれかに記載の免疫細胞。
４０．前記免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子が、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、ＣＤ９６、ＭｅｒＴＫ、２Ｂ４、ＦＡＳ、ＣＤ４５、ＰＰ２Ａ、ＳＨＰ１、ＳＨＰ２、ＤＧＫアルファ、ＤＧＫゼータ、Ｃｂｌ－ｂ、Ｃｂｌ－ｃ、ＣＤ１４８、ＬＲＲ１、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＫＬＧＲ１、ＤＮＭＴ３Ａ、及びＡ２ａＲから成る群から選択される実施形態３９に記載の免疫細胞。
４１．前記免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子が、前記免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する前記免疫細胞の反応を高める実施形態３９に記載の免疫細胞。
４２．前記免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する前記免疫細胞の反応を高める前記遺伝子が免疫チェックポイントの受容体またはリガンドをコードする実施形態４１に記載の免疫細胞。
４３．前記免疫チェックポイントの受容体またはリガンドが、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、ＣＤ９６、ＭｅｒＴＫ及び２Ｂ４から成る群から選択される実施形態４２に記載の免疫細胞。
４４．前記遺伝子破壊剤が、前記遺伝子破壊剤の非存在下での前記免疫細胞と比べて、前記免疫細胞の機能を弱める前記免疫細胞における遺伝子の発現を少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または９５％低下させる実施形態２１～４３に記載のいずれかの免疫細胞。
４５．前記遺伝子破壊剤が、前記免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する前記免疫細胞の反応を高める遺伝子の発現を低下させる実施形態４４に記載の免疫細胞。
４６．前記遺伝子破壊剤が免疫チェックポイントの受容体またはリガンドをコードする遺伝子の発現を低下させる実施形態４５に記載の免疫細胞。
４７．前記遺伝子破壊剤が、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、ＣＤ９６、ＭｅｒＴＫ及び２Ｂ４から成る群から選択される遺伝子の発現を低下させる実施形態４６に記載の免疫細胞。
４８．前記遺伝子破壊剤が、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって前記免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子の発現を低下させる実施形態４５～４７のいずれかに記載の免疫細胞。
４９．１を超える遺伝子破壊剤が、ＲＮＡｉによって前記免疫細胞における前記免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子の発現を低下させる実施形態４８に記載の免疫細胞。
５０．前記遺伝子破壊剤が、前記免疫細胞の機能を弱める単一の遺伝子を標的とする、または異なる遺伝子破壊剤が前記免疫細胞の機能を弱める異なる遺伝子を標的とし、例えば、第１の遺伝子破壊剤は第１の遺伝子を標的とし、第２の遺伝子破壊剤は第２の遺伝子を標的とする実施形態４９に記載の免疫細胞。
５１．前記ＲＮＡｉには短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が介在する実施形態４８～５０のいずれかに記載の免疫細胞。
５２．前記ＲＮＡｉには１を超えるｓｈＲＮＡが介在する実施形態５１に記載の免疫細胞。
５３．前記ＲＮＡｉには２つのｓｈＲＮＡが介在する実施形態５２に記載の免疫細胞。
５４．２つのｓｈＲＮＡがＰＤ－１を標的とする実施形態５２～５３のいずれかに記載の免疫細胞。
５５．第１のｓｈＲＮＡがＰＤ－１を標的とし、第２のｓｈＲＮＡがＴＩＭ－３を標的とする実施形態５２～５３のいずれかに記載の免疫細胞。
５６．第１のｓｈＲＮＡがＰＤ－１を標的とし、第２のｓｈＲＮＡがＣＴＬＡ－４を標的とする実施形態５２～５３のいずれかに記載の免疫細胞。
５７．第１のｓｈＲＮＡがＰＤ－１を標的とし、第２のｓｈＲＮＡがＬＡＧ－３を標的とする実施形態５２～５３のいずれかに記載の免疫細胞。
５８．第１のｓｈＲＮＡがＰＤ－１を標的とし、第２のｓｈＲＮＡがＴＩＧＩＴを標的とする実施形態５２～５３のいずれかに記載の免疫細胞。
５９．前記免疫細胞がｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む実施形態５１～５８のいずれかに記載の免疫細胞。
６０．前記免疫細胞が１を超えるｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む実施形態５９に記載の免疫細胞。
６１．前記免疫細胞が２つのｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む実施形態５９に記載の免疫細胞。
６２．前記ｓｈＲＮＡ（複数可）をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２～２１９及び２３８～２６７から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む実施形態５９～６１のいずれかに記載の免疫細胞。
６３．前記ｓｈＲＮＡ（複数可）をコードするヌクレオチド配列がベクター上に存在する実施形態５９～６２のいずれかに記載の免疫細胞。
６４．異なるｓｈＲＮＡの発現が異なるプロモーターによって調節される実施形態６３のいずれかに記載の免疫細胞。
６５．２つの異なるｓｈＲＮＡの発現が２つの異なるプロモーターによって調節される実施形態６４に記載の免疫細胞。
６６．前記２つの異なるプロモーターがＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターである実施形態６５に記載の免疫細胞。
６７．前記２つの異なるプロモーターがＵ６プロモーターである実施形態６６に記載の免疫細胞。
６８．前記Ｕ６プロモーターが異なる種に由来する実施形態６７に記載の免疫細胞。
６９．前記２つのプロモーターが互いに異なる方向に向けられる実施形態６５～６８のいずれかに記載の免疫細胞。
７０．前記遺伝子操作された抗原受容体及び前記遺伝子破壊剤（複数可）がベクターからそれぞれ発現される実施形態２１～６９のいずれかに記載の免疫細胞。
７１．前記遺伝子操作された抗原受容体及び前記遺伝子破壊剤（複数可）が同一ベクターから発現される実施形態７０に記載の免疫細胞。
７２．前記ベクターが、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである実施形態７０～７１のいずれかに記載の免疫細胞。
７３．前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターである実施形態７２に記載の免疫細胞。
７４．前記レンチウイルスベクターがレトロウイルスベクターである実施形態７３に記載の免疫細胞。
７５．前記免疫細胞がＴ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞から成る群から選択される実施形態２１～７４のいずれかに記載の免疫細胞。
７６．前記免疫細胞がＴ細胞である実施形態７５に記載の免疫細胞。
７７．前記Ｔ細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である実施形態７６に記載の免疫細胞。
７８．前記免疫細胞が２つのｓｈＲＮＡ及びＣＡＲまたはｍＴＣＲをコードするヌクレオチド配列を同一ベクター上で含む実施形態７６または７７のいずれかに記載の免疫細胞。
７９．前記２つのｓｈＲＮＡが互いに異なる方向に向けられた２つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターによってそれぞれ調節される実施形態７８に記載の免疫細胞。
８０．前記ＣＡＲがＣＤ１９を標的とし、前記第１のｓｈＲＮＡがＰＤ－１を標的とし、前記第２のｓｈＲＮＡがＴＩＧＩＴを標的とする実施形態７９に記載の免疫細胞。
８１．免疫細胞を作り出す方法であって、
（１）標的抗原に特異的に結合する遺伝子操作された抗原受容体をコードする遺伝子と、
（２）遺伝子破壊剤またはその発現が前記免疫細胞の機能を弱める遺伝子の前記免疫細胞における発現を低下させる、または低下させることができる遺伝子破壊剤とを同時または任意の順序で連続的に前記免疫細胞に導入することを含み、
それによって、遺伝子操作された抗原受容体が発現され、前記免疫細胞の機能を弱める遺伝子の発現が低減される前記免疫細胞を作り出す、前記方法。
８２．前記遺伝子操作された抗原受容体がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である実施形態８１に記載の方法。
８３．前記遺伝子操作された抗原受容体がＣＡＲである実施形態８２に記載の方法。
８４．前記ＣＡＲが、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む実施形態８３に記載の方法。
８５．前記ＣＡＲの前記細胞外抗原認識ドメインが前記標的抗原に特異的に結合する実施形態８４に記載の方法。
８６．前記ＣＡＲの前記細胞内シグナル伝達ドメインがＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖の細胞内ドメインを含む実施形態８４に記載の方法。
８７．前記ＣＡＲの前記細胞内シグナル伝達ドメインが共刺激分子をさらに含む実施形態８６に記載の方法。
８８．前記共刺激分子がＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７、及びＣＤ２８から成る群から選択される実施形態８７に記載の方法。
８９．前記共刺激分子がＣＤ１３７（４－１ＢＢ）である実施形態８８に記載の方法。
９０．前記共刺激分子がＣＤ２８である実施形態８８に記載の方法。
９１．前記遺伝子操作された抗原受容体がＴＣＲである実施形態８２に記載の方法。
９２．前記ＴＣＲがモノクローナルＴＣＲ（ｍＴＣＲ）である実施形態９１に記載の方法。
９３．前記標的抗原ががん細胞、がん組織及び／または腫瘍微小環境の中でまたはその表面で発現される実施形態８１～９２のいずれかに記載の方法。
９４．前記標的抗原が、５Ｔ４（栄養膜糖タンパク質）、７０７－ＡＰ、９Ｄ７、ＡＦＰ（α－フェトプロテイン）、ＡｌｂＺＩＰ（アンドロゲン誘導のｂＺＩＰ）、ＨＰＧ１（ヒト前立腺特異的遺伝子－１）、α５β１－インテグリン、α５β６－インテグリン、α－メチルアシル－補酵素Ａラセマーゼ、ＡＲＴ－４（ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ－４）、Ｂ７Ｈ４（ｖ－セットドメイン含有Ｔ－細胞活性化阻害剤１）、ＢＡＧＥ－１（Ｂメラノーマ抗原－１）、ＢＣＬ－２（Ｂ－細胞 ＣＬＬ／リンパ腫－２）、ＢＩＮＧ－４（ＷＤ反復ドメイン４６）、ＣＡ１５－３／ＣＡ２７－２９（ムチン１）、ＣＡ１９－９（がん抗原１９－９）、ＣＡ７２－４（がん抗原７２－４）、ＣＡ１２５（がん抗原１２５）、カルレチクリン、ＣＡＭＥＬ（メラノーマ上のＣＴＬ認識抗原）、ＣＡＳＰ－８（カスパーゼ８）、カテプシンＢ、カテプシンＬ、ＣＤ１９（分化抗原群１９）、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＥＡ（がん胎児性抗原ＳＧ８）、ＣＬＣＡ２（塩化物チャネルアクセサリー２）、ＣＭＬ２８（慢性骨髄性白血病腫瘍抗原２８）、コアクトシン様タンパク質、コラーゲンＸＸＩＩＩ、ＣＯＸ－２（シクロオキシゲナーゼ－２）、ＣＴ－９／ＢＲＤ６（がん／精巣抗原９）、Ｃｔｅｎ（ｃ－末端テンシン様タンパク質）、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、ｃｙｐ－Ｂ、ＣＹＰＢ１（チトクロームｐ４５０ファミリー１サブファミリーｂメンバー１）、ＤＡＭ－１０／ＭＡＧＥ－Ｂ１（メラノーマ関連抗原Ｂ１）、ＤＡＭ－６／ＭＡＧＥ－Ｂ２、ＥＧＦＲ／Ｈｅｒ１（表皮増殖因子受容体）、ＥＭＭＰＲＩＮ（ベイシジン）、ＥｐＣａｍ、ＥｐｈＡ２（ＥＰＨ受容体Ａ２）、ＥｐｈＡ３、ＥｒｂＢ３（Ｅｒｂ－Ｂ２受容体チロシンキナーゼ３）、ＥＺＨ２（ｚｅｓｔｅ２ポリコーム抑制性複合体２サブユニットのエンハンサー）、ＦＧＦ－５（線維芽細胞増殖因子５）、ＦＮ（フィブロネクチン）、Ｆｒａ－１（Ｆｏｓ関連抗原－１）、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ（炭酸脱水酵素９）、ＧＡＧＥ－１（Ｇ抗原－１）、ＧＡＧＥ－２、ＧＡＧＥ－３、ＧＡＧＥ－４、ＧＡＧＥ－５、ＧＡＧＥ－６、ＧＡＧＥ－７ｂ、ＧＡＧＥ－８、ＧＤＥＰ（前立腺にて差次的に発現される遺伝子）、ＧｎＴ－Ｖ（グルコン酸キナーゼ）、ｇｐ１００（メラニン細胞系列特異的抗原ＧＰ１００）、ＧＰＣ３（グリピカン３）、ＨＡＧＥ（らせん抗原）、ＨＡＳＴ－２（スルホトランスフェラーゼファミリー１Ａメンバー１）、ヘプシン、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２（Ｅｒｂ－Ｂ２受容体チロシンキナーゼ２）、ＨＥＲＶ－Ｋ－ＭＥＬ、ＨＮＥ（メデュラシン）、ホメオボックスＮＫＸ ３．１、ＨＯＭ－ＴＥＳ－１４／ＳＣＰ－１、ＨＯＭ－ＴＥＳ－８５、ＨＰＶ－Ｅ６、ＨＰＶＥ７、ＨＳＴ－２（シルツイン－２）、ｈＴＥＲＴ、ｉＣＥ（カスパーゼ１）、ＩＧＦ－１Ｒ（インスリン様増殖因子－１受容体）、ＩＬ－１３Ｒａ２（インターロイキン－１３受容体サブユニットα２）、ＩＬ－２Ｒ（インターロイキン－２受容体）、ＩＬ－５（インターロイキン－５）、未成熟ラミニン受容体、カリクレイン２、カリクレイン４、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５（リソホスファチジルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１）、ＫＫ－ＬＣ－１（北九州肺癌抗原－１）、ＫＭ－ＨＮ－１、ＬＡＧＥ－１（Ｌ抗原ファミリーメンバー－１）、リビン、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥＡ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ｂ１、ＭＡＧＥ－Ｂ１０、ＭＡＧＥ－Ｂ１６、ＭＡＧＥＢ１７、ＭＡＧＥ－Ｂ２、ＭＡＧＥ－Ｂ３、ＭＡＧＥ－Ｂ４、ＭＡＧＥ－Ｂ５、ＭＡＧＥ－Ｂ６、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＭＡＧＥ－Ｃ３、ＭＡＧＥ－Ｄ１、ＭＡＧＥ－Ｄ２、ＭＡＧＥ－Ｄ４、ＭＡＧＥ－Ｅ１、ＭＡＧＥ－Ｅ２、ＭＡＧＥ－Ｆ１、ＭＡＧＥ－Ｈ１、ＭＡＧＥＬ２（メラノーマ抗原ファミリーＬ２）、ママグロビンＡ、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ（Ｔ－細胞－１によって認識されるメラノーマ抗原）、ＭＡＲＴ－２、マトリクスタンパク質２２、ＭＣ１Ｒ（メラノコルチン１受容体）、Ｍ－ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）、メソテリン、ＭＧ５０／ＰＸＤＮ（ペルオキシダシン）、ＭＭＰ１１（マトリクスメタロプロテイナーゼ１１）、ＭＮ／ＣＡ ＩＸ－抗原（炭酸脱水酵素９）、ＭＲＰ－３（多剤耐性関連タンパク質－３）、ＭＵＣ１（ムチン１）、ＭＵＣ２、ＮＡ８８－Ａ（ＶＥＮＴ様ホメオボックス２偽遺伝子１）、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ－Ｖ、Ｎｅｏ－ＰＡＰ（Ｎｅｏ－ポリ（Ａ）ポリメラーゼ）、ＮＧＥＰ（前立腺で発現される新しい遺伝子）、ＮＭＰ２２（核マトリクスタンパク質２２）、ＮＰＭ／ＡＬＫ（ヌクレオホスミン）、ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－Ｂ、ＯＡ１（変形性関節症ＱＴＬ１）、ＯＦＡ－ｉＬＲＰ（がん胎児性抗原未成熟ラミニン受容体タンパク質）、ＯＧＴ（Ｏ－ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ）、ＯＳ－９（小胞体レクチン）、オステオカルシン、オステオポンチン、ｐ１５（ＣＤＫ阻害剤２Ｂ）、ｐ５３、ＰＡＧＥ－４（Ｐ抗原ファミリーメンバー－４）、ＰＡＩ－１（プラスミノーゲン活性化因子阻害剤－１）、ＰＡＩ－２、ＰＡＰ（前立腺酸ホスファターゼ）、ＰＡＲＴ－１（前立腺アンドロゲン調節転写物１）、ＰＡＴＥ（前立腺及び精巣で発現された１）、ＰＤＥＦ（前立腺由来のＥｔｓ因子）、Ｐｉｍ－１－キナーゼ（プロウイルス組み込み部位１）、Ｐｉｎ１（ペプチジル－プロリルｃｉｓ－ｔｒａｎｓイソメラーゼＮＩＭＡ－相互作用１）、ＰＯＴＥ（前立腺、卵巣、精巣、及び胎盤で発現される）、ＰＲＡＭＥ（メラノーマで優先的に発現される抗原）、プロステイン、プロテイナーゼ－３、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、ＰＳＧＲ（前立腺特異的Ｇ－タンパク質共役受容体）、ＰＳＭ、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＲＡＧＥ－１（腎腫瘍癌腫抗原）、ＲＨＡＭＭ／ＣＤ１６８、ＲＵ１（腎遍在タンパク質１）、ＲＵ２、ＳＡＧＥ（肉腫抗原）、ＳＡＲＴ－１（Ｔ－細胞－１によって認識される扁平上皮細胞癌腫抗原）、ＳＡＲＴ－２、ＳＡＲＴ－３、Ｓｐ１７（精子タンパク質１７）、ＳＳＸ－１（ＳＳＸファミリーメンバー１）、ＳＳＸ－２／ＨＯＭ－ＭＥＬ－４０、ＳＳＸ－４、ＳＴＡＭＰ－１（ＳＴＥＡＰ２ メタロレダクターゼ）、ＳＴＥＡＰ、サバイビン、サバイビン－２１３、ＴＡ－９０（腫瘍関連抗原－９０）、ＴＡＧ－７２（腫瘍関連糖タンパク質－７２）、ＴＡＲＰ（ＴＣＲγ代替リーディングフレームタンパク質）、ＴＧＦｂ（形質転換増殖因子β）、ＴＧＦｂＲ１１（形質転換増殖因子β受容体１１）、ＴＧＭ－４（トランスグルタミナーゼ４）、ＴＲＡＧ－３（タキソール耐性関連遺伝子３）、ＴＲＧ（Ｔ－細胞受容体γ遺伝子座）、ＴＲＰ－１（一過性受容体ポテンシャル－１）、ＴＲＰ－２／６ｂ、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、Ｔｒｐ－ｐ８、チロシナーゼ、ＵＰＡ（Ｕ－プラスミノーゲン活性化因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子Ａ）、ＶＥＧＦＲ－２／ＦＬＫ－１、及びＷＴ１（ウィルムス腫瘍１）から成る群から選択される実施形態９３に記載の方法。
９５．前記標的抗原がＣＤ１９またはＣＤ２２である実施形態９５に記載の方法。
９６．前記標的抗原がＣＤ１９である実施形態９６に記載の方法。
９７．前記標的抗原ががん抗原であり、前記がん抗原はその発現ががん細胞、がん組織及び／または腫瘍微小環境の中でまたはその表面で増加する抗原である実施形態９４～９６のいずれかに記載の方法。
９８．前記標的抗原が、α－アクチニン－４／ｍ、ＡＲＴＣ１／ｍ、ｂｃｒ／ａｂｌ、ベータ－カテニン／ｍ、ＢＲＣＡ１／ｍ、ＢＲＣＡ２／ｍ、ＣＡＳＰ－５／ｍ、ＣＡＳＰ－８／ｍ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ／ｍ、ＣＭＬ６６、ＣＯＡ－１／ｍ、ＤＥＫ－ＣＡＮ、ＥＦＴＵＤ２／ｍ、ＥＬＦ２／ｍ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１、ＦＮ１／ｍ、ＧＰＮＭＢ／ｍ、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１－Ｒ１７０Ｉ、ＨＬＡ－Ａ１１／ｍ、ＨＬＡ－Ａ２／ｍ、ＨＳＰ７０－２Ｍ、ＫＩＡＡ０２０５／ｍ、Ｋ－Ｒａｓ／ｍ、ＬＤＬＲ－ＦＵＴ、ＭＡＲＴ２／ｍ、ＭＥ１／ｍ、ＭＵＭ－１／ｍ、ＭＵＭ－２／ｍ、ＭＵＭ－３／ｍ、ミオシンクラス１／ｍ、ｎｅｏ－ＰＡＰ／ｍ、ＮＦＹＣ／ｍ、Ｎ－Ｒａｓ／ｍ、ＯＧＴ／ｍ、ＯＳ－９／ｍ、ｐ５３／ｍ、Ｐｍｌ／ＲＡＲａ、ＰＲＤＸ５／ｍ、ＰＴＰＲＸ／ｍ、ＲＢＡＦ６００／ｍ、ＳＩＲＴ２／ｍ、ＳＹＴＳＳＸ－１、ＳＹＴ－ＳＳＸ－２、ＴＥＬ－ＡＭＬ１、ＴＧＦｂＲＩＩ、及びＴＰＩ／ｍから成る群から選択され、その際、前記標的抗原はがん抗原であり、前記がん抗原はがん細胞、がん組織及び／または腫瘍微小環境の中でまたは表面上で発現される抗原の変異した形態である実施形態９３に記載の方法。
９９．前記免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子の発現が、以下：
（ｉ）前記免疫細胞の増殖の阻害、
（ｉｉ）前記免疫細胞の細胞死の誘導、
（ｉｉｉ）前記免疫細胞が前記標的抗原を認識する及び／または活性化される能力の阻害、
（ｉｖ）前記標的抗原に対する免疫応答を誘導しない細胞への前記免疫細胞の分化の誘導、
（ｖ）前記免疫細胞の免疫応答を促進する分子に対する前記免疫細胞の反応の低下、または
（ｖｉ）前記免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する前記免疫細胞の反応の上昇の１以上を引き起こす実施形態８１～９８のいずれかに記載の方法。
１００．前記免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子が、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、ＣＤ９６、ＭｅｒＴＫ、２Ｂ４、ＦＡＳ、ＣＤ４５、ＰＰ２Ａ、ＳＨＰ１、ＳＨＰ２、ＤＧＫアルファ、ＤＧＫゼータ、Ｃｂｌ－ｂ、Ｃｂｌ－ｃ、ＣＤ１４８、ＬＲＲ１、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＫＬＧＲ１、ＤＮＭＴ３Ａ、及びＡ２ａＲから成る群から選択される実施形態９９に記載の方法。
１０１．前記免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子が、前記免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する前記免疫細胞の反応を高める実施形態９９に記載の方法。
１０２．前記免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する前記免疫細胞の反応を高める前記遺伝子が免疫チェックポイントの受容体またはリガンドをコードする実施形態１０１に記載の方法。
１０３．前記免疫チェックポイントの受容体またはリガンドが、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、ＣＤ９６、ＭｅｒＴＫ及び２Ｂ４から成る群から選択される実施形態１０２に記載の方法。
１０４．前記遺伝子破壊剤が前記遺伝子破壊剤（複数可）の非存在下での前記免疫細胞と比べて、前記免疫細胞の機能を弱める前記免疫細胞における遺伝子の発現を少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または９５％低下させる実施形態８１～１０３のいずれかに記載の方法。
１０５．前記遺伝子破壊剤が、前記免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する前記免疫細胞の反応を高める遺伝子の発現を低下させる実施形態１０４に記載の方法。
１０６．前記遺伝子破壊剤が免疫チェックポイントの受容体またはリガンドをコードする遺伝子の発現を低下させる実施形態１０５に記載の方法。
１０７．前記遺伝子破壊剤が、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、ＣＤ９６、ＭｅｒＴＫ及び２Ｂ４から成る群から選択される遺伝子の発現を低下させる実施形態１０６に記載の方法。
１０８．前記遺伝子破壊剤が、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって前記免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子の発現を低下させる実施形態１０５～１０７のいずれかに記載の方法。
１０９．１を超える遺伝子破壊剤が、ＲＮＡｉによって前記免疫細胞における前記免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子の発現を低下させる実施形態１０８の方法。
１１０．前記遺伝子破壊剤が前記免疫細胞の機能を弱める単一の遺伝子を標的とする、または前記免疫細胞の機能を弱める異なる遺伝子を標的とし、第１の遺伝子破壊剤は第１の遺伝子を標的とし、第２の遺伝子破壊剤は第２の遺伝子を標的とし、またはそれらの任意の組み合わせで標的とする実施形態１０９に記載の方法。
１１１．前記ＲＮＡｉには短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が介在する実施形態１０８～１１０のいずれかに記載の方法。
１１２．前記ＲＮＡｉには１を超えるｓｈＲＮＡが介在する実施形態１１１に記載の方法。
１１３．前記ＲＮＡｉには２つのｓｈＲＮＡが介在する実施形態１１２に記載の方法。
１１４．２つのｓｈＲＮＡがＰＤ－１を標的とする実施形態１１２または１１３に記載の方法。
１１５．第１のｓｈＲＮＡがＰＤ－１を標的とし、第２のｓｈＲＮＡがＴＩＭ－３を標的とする実施形態１１２または１１３に記載の方法。
１１６．第１のｓｈＲＮＡがＰＤ－１を標的とし、第２のｓｈＲＮＡがＣＴＬＡ－４を標的とする実施形態１１２または１１３に記載の方法。
１１７．第１のｓｈＲＮＡがＰＤ－１を標的とし、第２のｓｈＲＮＡがＬＡＧ－３を標的とする実施形態１１２または１１３に記載の方法。
１１８．第１のｓｈＲＮＡがＰＤ－１を標的とし、第２のｓｈＲＮＡがＴＩＧＩＴを標的とする実施形態１１２または１１３に記載の方法。
１１９．前記免疫細胞がｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む実施形態１１１～１１８のいずれかに記載の方法。
１２０．前記免疫細胞が１を超えるｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む実施形態１１９に記載の方法。
１２１．前記免疫細胞が２つのｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む実施形態１１９に記載の方法。
１２２．前記ｓｈＲＮＡ（複数可）をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２～２１９及び２３８～２６７から成る群から選択される配列を含む実施形態１１９～１２１のいずれかに記載の方法。
１２３．前記ｓｈＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列がベクター上に存在する実施形態１１９～１２２のいずれかに記載の方法。
１２４．異なるｓｈＲＮＡの発現が異なるプロモーターによってそれぞれ調節される実施形態１２３のいずれかに記載の方法。
１２５．２つの異なるｓｈＲＮＡの発現が２つの異なるプロモーターによってそれぞれ調節される実施形態１２４に記載の方法。
１２６．前記２つの異なるプロモーターがＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターである実施形態１２５に記載の方法。
１２７．前記２つのプロモーターがＵ６プロモーターである実施形態１２６に記載の方法。
１２８．前記Ｕ６プロモーターが異なる種に由来する実施形態１２７に記載の方法。
１２９．前記２つのプロモーターが互いに異なる方向に向けられる実施形態１２５～１２８のいずれかに記載の方法。
１３０．前記遺伝子操作された抗原受容体及び前記遺伝子破壊剤（複数可）がベクターからそれぞれ発現される実施形態８１～１２９のいずれかに記載の方法。
１３１．前記遺伝子操作された抗原受容体及び前記遺伝子破壊剤（複数可）が同一ベクターから発現される実施形態１３０に記載の方法。
１３２．前記ベクターが、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである実施形態１３０～１３１のいずれかに記載の方法。
１３３．前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターである実施形態１３２に記載の方法。
１３４．前記レンチウイルスベクターがレトロウイルスベクターである実施形態１３３に記載の方法。
１３５．前記免疫細胞がＴ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞から成る群から選択される実施形態８１～１３４のいずれかに記載の方法。
１３６．前記免疫細胞がＴ細胞である実施形態１３５に記載の方法。
１３７．前記Ｔ細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である実施形態１３６に記載の方法。
１３８．前記免疫細胞が２つのｓｈＲＮＡ及びＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を同一ベクター上で含む実施形態１３６または１３７のいずれかに記載の方法。
１３９．前記２つのｓｈＲＮＡが互いに異なる方向に向けられた２つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターによってそれぞれ調節される実施形態１３８に記載の方法。
１４０．前記ＣＡＲがＣＤ１９を標的とし、前記第１のｓｈＲＮＡがＰＤ－１を標的とし、前記第２のｓｈＲＮＡがＴＩＧＩＴを標的とする実施形態１３９に記載の方法。
１４１．実施形態２１～８０のいずれかに記載の免疫細胞を含む組成物。
１４２．実施形態２１～８０のいずれかに記載の免疫細胞と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
１４３．免疫療法を必要とする疾患または状態を有する対象に実施形態２１～８０のいずれかに記載の免疫細胞または実施形態１４１もしくは１４２に記載の組成物を投与することを含む治療方法。
１４４．前記遺伝子操作された抗原受容体が前記疾患または前記状態に関連する抗原に特異的に結合する実施形態１４３に記載の方法。
１４５．前記疾患または前記状態ががん、例えば腫瘍である実施形態１４３または１４４に記載の方法。
１４６．疾患または状態の治療に使用するための実施形態２１～８０のいずれかに記載の免疫細胞または実施形態１４１～１４２に記載の組成物。
１４７．疾患または状態を治療するための薬物の製造における実施形態２１～８０のいずれかに記載の免疫細胞または実施形態１２１～１２２に記載の組成物の使用。
１４８．前記遺伝子操作された抗原受容体が前記疾患または前記状態に関連する抗原に特異的に結合する実施形態１４６に記載の免疫細胞もしくは組成物または実施形態１４７に記載の使用。
１４９．前記疾患または前記状態ががん、例えば腫瘍である、実施形態１４７または実施形態１４８に記載の使用、組成物、または免疫細胞。
細胞固有のＰＤ－１遮断ＣＡＲ－Ｔ細胞の生成。１つで２つの機能があるＣＡＲベクターの模式図である。 細胞固有のＰＤ－１遮断ＣＡＲ－Ｔ細胞の生成。形質導入の４日後にＬＮＧＦＲ及びＣＡＲの発現を分析した。 細胞固有のＰＤ－１遮断ＣＡＲ－Ｔ細胞の生成。形質導入の４日後にＬＮＧＦＲ及びＣＡＲの発現を分析した。 細胞固有のＰＤ－１遮断ＣＡＲ－Ｔ細胞の生成。ＬＮＧＦＲ磁気ビーズを用いてＣＡＲ－Ｔ細胞を選別し、２×１０５個／ｍｌで播種した。累積ＣＡＲ－Ｔ細胞の数はトリパンブルー染色によって評価した。 細胞固有のＰＤ－１遮断ＣＡＲ－Ｔ細胞の生成。ＬＮＧＦＲ＋ＣＡＲ－Ｔ細胞を、外因性サイトカインなしでγ線照射ＮＡＬＭ－６と混合した。
細胞固有のＰＤ－１遮断に対するＰｏｌ ＩＩＩプロモーター型の影響を示す図である。
ＰＤ－１遮断を伴ったＣＤ１９及びＰＤ－Ｌ１の刺激のもとでの試験管内の細胞毒性及び増殖。ＬＮＧＦＲ＋ＣＡＲ－Ｔ細胞をＮＡＬＭ－６またはＮＡＬＭ－６－ＰＤＬ１の生細胞と１：１、０．３：１、０．１：１のＥ：Ｔ比で混合する。 ＰＤ－１遮断を伴ったＣＤ１９及びＰＤ－Ｌ１の刺激のもとでの試験管内の細胞毒性及び増殖。ＬＮＧＦＲ＋ＣＡＲ－Ｔ細胞を外因性サイトカインなしでγ線照射したＮＡＬＭ－６－ＰＤＬ１、ＮＡＬＭ－６－ＰＤＬ１－ＣＤ８０、またはＫ５６２－ＣＤ１９－ＰＤＬ１と１：１のＥ：Ｔ比にて混合した。
細胞固有のＰＤ－１遮断によるＣＡＲ－Ｔ細胞の生体内抗腫瘍機能を示す図である。
ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞固有のＰＤ－１破壊における生体内サイトカイン産生の低下を示す図である。 細胞固有のＰＤ－１破壊によるＣＡＲ－Ｔ細胞の生体内増殖の遅延を示す図である。
細胞固有のＰＤ－１破壊におけるＣＤ２８／ＣＤ３ζまたは４－１ＢＢ／ＣＤ３ζ ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能。Ｇ２８ｚ、ＧＢＢｚ、Ｐ２８ｚ及びＰＢＢｚベクターの模式図である。 細胞固有のＰＤ－１破壊におけるＣＤ２８／ＣＤ３ζまたは４－１ＢＢ／ＣＤ３ζ ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能。形質導入の４日後での形質導入Ｔ細胞のＬＮＧＦＲ発現を示すフローサイトメトリー解析を示す図である。
ＣＤ２８または４－１ＢＢとの共刺激時のＰＤ－１発現レベル。外因性サイトカインなしでＬＮＧＦＲ＋ＣＡＲ－Ｔ細胞をγ線照射したＮＡＬＭ－６またはＫ５６２－ＣＤ１９とインキュベートした。インキュベートの３日後、ＬＮＧＦＲ＋ＣＡＲ－Ｔ細胞のＰＤ－１発現を解析した。 ＣＤ２８または４－１ＢＢとの共刺激時のＰＤ－１発現レベル。ＰＤ－１プライマーを用いて行われた定量的リアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。
ＮＦＡＴまたはＮＦ－κＢのレポーター系の確立。ＮＦＡＴ－ＲＥ３×－ｅＧＦＰ及びＮＦ－κＢ－ＲＥ５×－ｅＧＦＲのレポーターベクターの模式図である。 ＮＦＡＴまたはＮＦ－κＢのレポーター系の確立。ＬＮＧＦＲ＋ＣＡＲＴ細胞のｅＧＦＰ ｇＭＦＩを用いて算出したレポーター活性の倍率変化を示す図である。
ＣＤ２８共刺激では活性化されたが、４－１ＢＢ共刺激では活性化されなかったＮＦＡＴシグナル伝達。レポーター形質導入Ｔ細胞を再刺激し、Ｇ２８ｚまたはＧＢＢｚを用いて形質導入した。 ＣＤ２８共刺激では活性化されたが、４－１ＢＢ共刺激では活性化されなかったＮＦＡＴシグナル伝達。ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＮＦＡＴ標的遺伝子のｍＲＮＡレベルをｑＰＣＲによって評価した。
ＣＤ２８及び４－１ＢＢ双方の共刺激で活性化されたＮＦ－κＢシグナル伝達を示す図である。
Ｇ２８ｚ ＣＡＲＴのＴＧＦ－βシグナル伝達強度はＢＢｚ ＣＡＲＴよりわずかに高い。ＮＡＬＭ－６との１：１のＥ：Ｔ細胞比での４時間または２４時間のインキュベートの後、ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるリン酸化ＳＭＡＤ２／３を細胞内フローサイトメトリーによって解析した。 Ｇ２８ｚ ＣＡＲＴのＴＧＦ－βシグナル伝達強度は、ＢＢｚ ＣＡＲＴよりわずかに高い。１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＧＦ－β１によるＧ２８ｚ及びＧＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＰＤ－１発現を示すフローサイトメトリー解析。 Ｇ２８ｚ ＣＡＲＴのＴＧＦ－βシグナル伝達強度は、ＢＢｚ ＣＡＲＴよりわずかに高い。ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＴＧＦ－β１、ＴＧＦＢＲ１及びＴＧＦＢＲ２のｍＲＮＡレベルをｑＰＣＲにより評価した。
ＣＤ１９及びＰＤ－Ｌ１による反復刺激のもとでのＰＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の試験管内で保持された細胞傷害性及び増殖能を示す。細胞傷害性を示す図である。（上）ＬＮＧＦＲの磁気選別の後、１２日目の初代ＬＮＧＦＲ＋ ＣＡＲ Ｔ細胞をＮＡＬＭ－６－ＰＤＬ１と１：１、０．３：１、０．１：１のＥ：Ｔ比で混合した。（下）ＬＮＧＦＲ＋ＣＡＲ Ｔ細胞をγ線照射したＫ５６２－ＣＤ１９－ＰＤＬ１によって１：１のＥ：Ｔ比で刺激した。 ＣＤ１９及びＰＤ－Ｌ１による反復刺激のもとでのＰＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞の試験管内で保持された細胞傷害性及び増殖能を示す。外因性サイトカインなしでＬＮＧＦＲ＋ＣＡＲ Ｔ細胞をγ線を照射したＮＡＬＭ－６－ＰＤＬ１－ＣＤ８０またはＫ５６２－ＣＤ１９－ＰＤＬ１と１：１のＥ：Ｔ比で混合して繰り返し刺激した。
ＰＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＴＧＦ－βが介在する機能障害に対する感受性が低く、試験管内で低生成であるＣＡＲ由来の制御性Ｔ細胞を示す。ＣＡＲ－Ｔ増殖のＴＧＦ－ベータが介在する抑制を示す図である。 ＰＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＴＧＦ－βが介在する機能障害に対する感受性が低く、試験管内で低生成であるＣＡＲ由来の制御性Ｔ細胞を示す。Ｔｒｅｇ誘導に対するＴＧＦ－ベータの感受性を示す図である。 ＰＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＴＧＦ－βが介在する機能障害に対する感受性が低く、試験管内で低生成であるＣＡＲ由来の制御性Ｔ細胞を示す。Ｔｒｅｇ誘導に対するＰＤＬ１／ＰＤ－１の効果を示す図である。
ＰＢＢｚ ＣＡＲ Ｔ細胞による白血病の進行の継続的な阻害を示す図である。
１つはＰＤ－１の発現を阻害し、２つ目はＴＩＭ－３の発現を阻害する２種類のｓｈＲＮＡと、ＣＤ１９ ＣＡＲ発現カセットとをコードする２種類のベクターの構成図である。
ＣＡＲ－Ｔ細胞調製のプロセスを示す図であり、ΔＬＮＧＦＲ－ＣＡＲＴ１９／ｍＵ６－ｓｈＴＩＭ－３→←ｓｈＰＤ－１－ｈＵ６細胞とΔＬＮＧＦＲ－ＣＡＲＴ１９／ｓｈＴＩＭ－３－ｍＵ６←→ｈＵ６－ｓｈＰＤ－１細胞とを本明細書に記載されているように調製し、単離した。
図１５に示すベクターを含むＣＡＲ－Ｔ細胞（ΔＬＮＧＦＲ－ＣＡＲＴ１９／ｍＵ６－ｓｈＴＩＭ－３→←ｓｈＰＤ－１－ｈＵ６細胞及びΔＬＮＧＦＲ－ＣＡＲＴ１９／ｓｈＴＩＭ－３－ｍＵ６←→ｈＵ６－ｓｈＰＤ－１細胞）からのフローサイトメトリーデータを示す図である。
実施例８の方法を用いて生成したΔＬＮＧＦＲ－ＣＡＲＴ１９／ｍＵ６－ｓｈＴＩＭ－３→←ｓｈＰＤ－１－ｈＵ６細胞及びΔＬＮＧＦＲ－ＣＡＲＴ１９／ｓｈＴＩＭ－３－ｍＵ６←→ｈＵ６－ｓｈＰＤ－１細胞についてのフローサイトメトリーデータを示す図である。 ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＰＤ－１及びＴＩＭ－３の発現を示す図である。
標的細胞を用いてＣＡＲ－Ｔ細胞を繰り返し刺激し、その後、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７の抗体を用いて細胞分化の程度を確認したフローサイトメトリーのデータである。
実施例８の方法を用いて作製されたＣＡＲ－Ｔ細胞の評価を示す。形質導入効率を示す図である。 実施例８の方法を用いて作製されたＣＡＲ－Ｔ細胞の評価を示す。増殖能を示す図である。 実施例８の方法を用いて作製されたＣＡＲ－Ｔ細胞の評価を示す。生存率を示す図である。
ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、及びＴＩＭ－３を標的とするｓｈＲＮＡの選択を示す。２日間ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激したＴ細胞にＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、及びＴＩＭ－３を標的とする２１塩基長のｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションで導入する。形質移入の２日後に、ｓｉＲＮＡが介在するノックダウン効率を確認した。網掛け：選択したｓｉＲＮＡの配列に基づいて、ＣＡＲ及びｓｈＲＮＡを発現する１つで２つの機能があるベクターを構築した。網掛けは、最初に選択したｓｉＲＮＡを示す。 ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、及びＴＩＭ－３を標的とするｓｈＲＮＡの選択を示す。ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴまたはＴＩＭ－３のｓｈＲＮＡを含有する１つで２つの機能があるベクターでＴ細胞に形質導入し、ＬＮＧＦＲ磁気ビーズで選別した。２×１０５個／ｍｌで播種した後、３日ごとにＬＮＧＦＲ＋ＣＡＲ Ｔ細胞の数を測定した。 ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、及びＴＩＭ－３を標的とするｓｈＲＮＡの選択を示す。Ｔｉｍ３の発現（％）を示す図である。
二重免疫チェックポイント破壊ＣＡＲ Ｔ細胞の生成を示す。１つで２つの機能がある二重ベクターの模式図である。 二重免疫チェックポイント破壊ＣＡＲ Ｔ細胞の生成を示す。１つで２つの機能がある二重形質導入の４日後、ＬＮＧＦＲ＋Ｔ細胞％を解析した。 二重免疫チェックポイント破壊ＣＡＲ Ｔ細胞の生成を示す。二重ＫＤ（ノックダウン）ＣＡＲ－Ｔ細胞を選別し、２×１０５／ｍｌで播種した。累積ＣＡＲ Ｔ細胞の数はトリパンブルー染色によって評価した。 二重免疫チェックポイント破壊ＣＡＲ Ｔ細胞の生成を示す。γ線を照射したＮＡＬＭ－６またはＫ５６２－ＣＤ１９の共培養後３日目にＬＮＧＦＲ＋ＣＡＲ Ｔ細胞のＬＡＧ－４、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴまたはＴＩＭ－３の発現を解析した。ＣＴＬＡ－４の発現を細胞内フローサイトメトリーで解析した。 二重免疫チェックポイント破壊ＣＡＲ Ｔ細胞の生成を示す。γ線を照射したＮＡＬＭ－６またはＫ５６２－ＣＤ１９の共培養後３日目にＬＮＧＦＲ＋ＣＡＲ－Ｔ細胞のＬＡＧ－４、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴまたはＴＩＭ－３の発現を解析した。ＣＴＬＡ－４の発現を細胞内フローサイトメトリーで解析した。
２つの免疫チェックポイントを標的とする二重ＫＤのＣＡＲ－Ｔ細胞を用いた生体内でのＣＤ１９＋血液がんの治療を示す図である。
ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴを標的とする二重ＫＤのＣＡＲ－Ｔ細胞を用いた固形腫瘍モデルでのがんの治療を示す図である。
本開示の特徴は添付のクレームに具体的に示されている。本開示の特徴及び利点のよりよい理解は、本開示の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明を参照することによって得られるであろう。本明細書に記載される開示の完全な理解を円滑にするために、多数の用語を以下で定義する。
簡単に言えば、一態様では、本明細書で開示されるのは、免疫チェックポイントの受容体及びリガンドを含む免疫細胞の機能を弱める１以上の遺伝子の発現を阻害する２種類の短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする塩基配列と、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、モノクローナルＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）のような抗原受容体をコードする塩基配列とを含むベクター；標的抗原に特異的に結合する遺伝子操作された抗原受容体と、免疫細胞の機能を弱める遺伝子（単数）または遺伝子（複数）の免疫細胞における発現を低下させるまたは低下させることができる１以上の遺伝子破壊剤とを含む免疫細胞；免疫細胞を生産する方法；例えば、ヒト患者の免疫療法のための、免疫細胞を含む組成物または医薬組成物；及び疾患または状態を有する対象に免疫細胞を投与することを含む治療方法である。免疫細胞、組成物、または医薬組成物は、１以上の遺伝的破壊剤を含むので、例えば、がん細胞によって活性化されて免疫細胞の機能を弱めてもよい２つの免疫チェックポイント分子の遺伝子の発現を低下させる２つのｓｈＲＮＡをコードするので、これらの遺伝子に対する別個の阻害剤の使用に起因する可能性のあるサイトカイン放出症候群や自己免疫症状のような重篤で全身性の有害反応を排除することが可能であり、同様に、高価な同時治療から生じる治療コストの増加による負担を軽減しながら、ｓｈＲＮＡが１つだけ発現する場合よりも効果的な細胞療法を提供する。
１．一般技法
本明細書に記載され、または参照されている技法及び手順には、当業者によって一般的によく理解されている、及び／または従来の方法を用いて一般的に採用されているもの、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ ｅｄ．２０１２）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，２００３）；Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ（Ａｎ ｅｄ．２００９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ａｌｂｉｔａｒ ｅｄ．２０１０）；及びＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌｓ．１ ａｎｄ ２ （Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ ｅｄｓ．，２ｎｄ ｅｄ．２０１０）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ（６ｔｈ Ｅｄ．，２０１４）に記載されている広く利用されている方法が含まれる。
２．定義
特に明記しない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語はすべて、当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。この明細書を解釈する目的で、用語の以下の説明が適用され、適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語は複数形も含み、逆もまた同様である。特許、出願、公開出願及びその他の刊行物はすべて、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。述べられている用語のいずれかの記載が参照によって本明細書に組み込まれるいずれかの文書と矛盾する場合には、以下に述べられる用語の記載が優先されるものとする。
本開示で使用されている用語は、特定の実施形態を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するようには意図されない。単数表現は、文脈によって明確に示されていない限り、複数表現を含む。本発明は、本明細書に記述される特定の方法、プロトコール、及び試薬等に制限されず、したがって変化し得ることが理解されるべきである。本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を記述することのみを目的としており、クレームによってのみ定義される本発明の範囲を制限するようには意図されない。
本明細書で使用されるとき、冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は本明細書では、冠詞の文法的対象の１つまたは１を超えるもの（すなわち、少なくとも１つ）を指すように使用される。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または１を超える要素を意味する。
選択肢（例えば、「または」）の使用は、選択肢のうちの一方、双方、またはその任意の組み合わせのいずれかを意味すると理解されるべきである。
「及び／または」という用語は、選択肢のうちの一方または双方のいずれかを意味すると理解されるべきである。
本明細書で使用されるとき、「約」または「およそ」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対し、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％の分変動する量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態では、「約」または「およそ」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さについて、±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの範囲を指す。
本明細書全体における「一実施形態（ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「一実施形態（ａｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「特定の実施形態（ａ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「関連した実施形態」、「特定の実施形態（ａ ｃｅｒｔａｉｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「追加的な実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、またはそれらの組み合わせ等に対する言及は、実施形態に関連して記載されている特定の特徴、構造、または特色が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれていることを意味する。したがって、本明細書全体のさまざまな箇所で出現する上記フレーズが、必ずしもすべて同じ実施形態を言及しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、または特色は、１つ以上の実施形態における任意の好適な方法で組み合わせられてもよい。
「構築物」は、試験管内または生体内のいずれかで標的細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む高分子または分子の複合体を指す。「ベクター」は本明細書で使用されるとき、外来遺伝物質の標的細胞への送達または移入を指示することができる任意の核酸構築物を指し、それはそこで複製させることができ、及び／または発現させることができる。「ベクター」という用語は本明細書で使用されるとき、送達される構築物を含む。ベクターは線状分子または環状分子であることができる。ベクターは組み込み型または非組み込み型であることができる。ベクターの主な種類には、プラスミド、エピソームベクター、ウイルスベクター、コスミド、及び人工染色体が挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載されているような「１つで２つの機能があるベクター」は、免疫細胞の機能を弱める遺伝子（単数）または遺伝子（複数）の発現を阻害する１以上の短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする塩基配列と、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、モノクローナルＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）をコードする塩基配列とを含むベクターである。本明細書に記載されているような「１つで２つの機能がある二重ベクター」は、免疫細胞の機能を弱める遺伝子の発現を阻害する２種類の短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする塩基配列と、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、モノクローナルＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）のいずれか１つをコードする塩基配列とを含むベクターである。本明細書に記載されている１つで２つの機能がある二重ベクターは１つで２つの機能があるベクターの形態である。
「ＲＮＡｉ」（転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）、クェリング、または共抑制としても知られる）は、ＲＮＡ分子が通常、特定のｍＲＮＡ分子の破壊を引き起こすことによって遺伝子発現を配列特異的に阻害する転写後遺伝子サイレンシングのプロセスである。ＲＮＡｉの活性がある成分は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる短／小二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、それは通常１５～３０のヌクレオチド（例えば、１９～２５、１９～２４または１９～２１のヌクレオチド）及び２のヌクレオチド３’オーバーハングを含有し、且つ標的遺伝子の核酸配列と一致する。これらの短いＲＮＡ種は、さらに大きなｄｓＲＮＡのダイサーが介在する切断によって生体内で自然に生成されてもよく、それらは哺乳類細胞で機能的である。ＤＮＡ発現プラスミドを用いて、本開示のｓｉＲＮＡ二本鎖またはｄｓＲＮＡを細胞内で安定して発現させ、標的遺伝子発現の長期阻害を達成することができる。一態様では、ｓｉＲＮＡ二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖は通常、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）と呼ばれるステムループ構造の発現をもたらす短いスペーサー配列によって連結される。ヘアピンはダイサーによって認識及び切断されるので、成熟したｓｉＲＮＡ分子を生成する。
「ｓｈＲＮＡ」という用語は、いくつかの自己相補性配列がそのステムとの堅固なヘアピン構造を作り出すＲＮＡ分子を指す。ＲＮＡ分子はおよそ８０ｂｐの長さを有することができる。ｓｈＲＮＡが細胞で発現されると、それは一連の工程を経て処理され、遺伝子サイレンシングのガイドとして作用する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）になる。簡単に言えば、ｓｈＲＮＡが発現されると、細胞内のＤｒｏｓｈａ複合体によって処理されてプレｓｈＲＮＡになり、次いで核の外に輸送され、そこでダイサーによってさらに処理されてｓｉＲＮＡになり、次に一本鎖になり、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）複合体によって負荷される。ここで、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、ＲＩＳＣ複合体が標的遺伝子のｍＲＮＡに付着するためのガイドとして作用し、この方法で付着しているＲＩＳＣ複合体がｍＲＮＡを切断すると、遺伝子サイレンシングが発生する。標的遺伝子のｓｈＲＮＡは、特定の遺伝子に持続的且つ特異的な遺伝子サイレンシングを可能にするので、標的遺伝子を阻害する目的でベクターに含められる。
「プロモーター」という用語は、遺伝子の転写の開始に関与する遺伝子の上流領域を指す。上述の２種類のｓｈＲＮＡもプロモーターに発現を調節させる。ここで、２種類のｓｈＲＮＡの発現は、それらが２つの異なるプロモーターによってそれぞれ調節されることを特徴とする。反復挿入断片を用いた同一の塩基配列によるクローニングが存在するならば、これらの同一の塩基配列間の結合が原因で適切なクローニングが発生せず、組換えまたは欠失が生じる可能性が高いと判断される。どのＲＮＡポリメラーゼがプロモーターに結合して転写を開始するかに応じて、プロモーターはＲＮＡポリメラーゼＩのプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのプロモーターまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターであることができる。上記２つのプロモーターは、それらがＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーター（以後、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター）であることを特徴としてもよい。Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、５’末端にキャップを付けることなく、またはプロモーターによる調節で転写されるＲＮＡの３’末端にポリ（Ａ）テールを付けることなく、５’末端から３’末端に正確に転写するように作製されてもよい。Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの種類には、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター及び７ＳＫプロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「Ｇ２８ｚ」という用語は、ｓｈＧＦＰ発現カセットと、ＣＤ２８共刺激ドメインと、ＣＤ３ζドメインとを含む構築物を指す（図６Ａ）。さらに具体的には、「Ｇ２８ｚ」という用語では、「Ｇ」はｓｈＧＦＰを表し；「２８」はＣＤ２８を表し；「ｚ」はＣＤ３ζを表す。同じパターンに従って、本明細書で使用される「Ｐ２８ｚ」という用語は、ｓｈＰＤ－１発現カセットと、ＣＤ２８共刺激ドメインと、ＣＤ３ζドメインとを含む構築物（図６Ａ）を指し、「Ｐ」はｓｈＰＤ－１を表し；「２８」は「ＣＤ２８」を表し；「ｚ」はＣＤ３ζを表す。本明細書で使用される「ＧＢＢｚ」という用語は、ｓｈＧＦＰ発現カセットと、４－１ＢＢ共刺激ドメインと、ＣＤ３ζドメインとを含む構築物（図６Ａ）を指し、「Ｇ」はｓｈＧＦＰを表し；「ＢＢ」は「４－１ＢＢ」を表し；「ｚ」はＣＤ３ζを表す。本明細書で使用される「ＰＢＢｚ」という用語は、ｓｈＰＤ－１発現カセットと、４－１ＢＢ共刺激ドメインと、及びＣＤ３ζドメインとを含む構築物（図６Ａ）を指し、「Ｐ」はｓｈＰＤ－１を表し；「ＢＢ」は「４－１ＢＢ」を表し；「ｚ」はＣＤ３ζを表す。
「ＣＡＲ」は一般に、免疫細胞上に存在する場合、免疫細胞に標的細胞（通常はがん細胞）に対する特異性を持たせる一方で、細胞内にてシグナル伝達を引き起こすポリペプチドのセットである。ＣＡＲは最低でも、以下に記載されている標的抗原を認識する細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、細胞内シグナル伝達ドメインは、以下に記載されている促進分子または共刺激分子に由来する。ポリペプチドを含むセットは、連結されてもよく、または刺激によって二量化されるスイッチを介して連結する形態であってもよい。促進分子は上記に記載されているＴＣＲのゼータ鎖であってもよい。「ＣＤ１９ ＣＡＲ」はＣＤ１９がん抗原を標的とするＣＡＲである。
本明細書で使用されるとき「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」という用語は、アルファ（α）鎖及びベータ（β）鎖のヘテロ二量体で構成されるＴ細胞上のタンパク質受容体を指すが、一部の細胞では、ＴＣＲはガンマ鎖とデルタ鎖（γ／δ）から成る。特定の実施形態では、ＴＣＲは、例えば、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、抑制性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、及びガンマデルタＴ細胞を含む、ＴＣＲを含む任意の細胞で改変されてもよい。
本明細書で使用される「モノクローナルＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）」という用語は、特定の抗原を特異的に標的とするように遺伝子操作されるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を指す。それは抗原特異的ＴＣＲとも呼ばれ得る。ｍＴＣＲを有するＴ細胞は、養子Ｔ細胞療法のようなウイルス感染やがんの免疫療法に使用されると報告されている。いくつかの態様では、キメラ単鎖抗体構築物（ｓｃＦｖ）のレトロウイルス移入は、定義された抗原特異性を持つＴ細胞を作り出すための戦略として使用されてきた。ほとんどの場合、キメラｓｃＦｖ構築物は、ＦｃＲ－ガンマまたはＣＤ３ゼータの細胞内シグナル伝達ドメインに連結され、Ｔ細胞エフェクター機能を誘発した。ＣＤ３ゼータドメインは、例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢまたはＯＸ４０のような共刺激分子のシグナル伝達ドメインと組み合わせられている。モノクローナルＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）及びがん治療におけるそれらの応用は、Ｓｔａｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，１５（１０）：１７４４－５０，Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍｏｒｇａｎ，２０１２，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，６４（８）：７５６－７６２、及びＬｉｄｄｙ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１８（６）：９８０－７に記載されており、それぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される「ΔＬＮＧＦＲ」という用語は、上記の挿入が行われている細胞の精製に使用される細胞質ドメインのないＬＮＧＦＲ（低親和性神経成長因子受容体）を指す。
「免疫細胞」は、キラーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞及びＢ細胞、ナチュラルキラー細胞のようなリンパ球、肥満細胞、好酸球、好塩基球から選択されるが、これらに限定されないものとして本明細書で特徴付けられてもよく；食細胞にはマクロファージ、好中球、及び樹状細胞が含まれる。Ｔ細胞にはＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞が含まれる。
本明細書で使用されるとき、「Ｔリンパ球」及び「Ｔ細胞」という用語は相互交換可能に使用され、胸腺での成熟を完了し、体内における特定の外来抗原の同定及び他の免疫細胞の活性化や不活化を含む、免疫系におけるさまざまな役割を有する白血球の主要なタイプを指す。Ｔ細胞は、任意のＴ細胞、例えば、培養Ｔ細胞、例えば、初代Ｔ細胞、または培養Ｔ細胞株、例えば、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１等に由来するＴ細胞、または哺乳動物から得られるＴ細胞であることができる。Ｔ細胞はＣＤ３＋細胞であることができる。Ｔ細胞は、任意のタイプのＴ細胞であることができ、且つＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（例えば、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、末梢血白血球（ＰＢＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、抑制性Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞（γδＴ細胞）、等を含むが、これらに限定されない任意の発達段階にあることができる。ヘルパーＴ細胞の追加の種類には、Ｔｈ３（Ｔｒｅｇ）、Ｔｈ１７、Ｔｈ９、またはＴｆｈ細胞のような細胞が含まれる。メモリーＴ細胞の追加の種類には、中央メモリーＴ細胞（Ｔｃｍ細胞）、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｍ細胞及びＴＥＭＲＡ細胞）のような細胞が含まれる。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変されたＴ細胞のような遺伝子操作されたＴ細胞を指すこともできる。Ｔ細胞は幹細胞または前駆細胞から分化させることもできる。
「ＣＤ４＋Ｔ細胞」はそれらの表面でＣＤ４を発現し、細胞介在性の免疫応答に関連するＴ細胞のサブセットを指す。それらは刺激後の分泌プロファイルを特徴とし、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ２、ＩＬ４及びＩＬ１０のようなサイトカインの分泌が含まれてもよい。「ＣＤ４」は、もともとＴリンパ球上の分化抗原として定義された５５－ｋＤの糖タンパク質であるが、単球／マクロファージを含む他の細胞にも見いだされる。ＣＤ４抗原は、免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、ＭＨＣ（主要組織適合性複合体）クラスＩＩ拘束の免疫応答の関連認識要素として関与する。Ｔリンパ球では、それらはヘルパー／インデューサーのサブセットを定義する。
「ＣＤ８＋Ｔ細胞」は、それらの表面上でＣＤ８を発現し、ＭＨＣクラスＩに拘束され、細胞傷害性Ｔ細胞として機能するＴ細胞のサブセットを指す。「ＣＤ８」分子は、胸腺細胞と細胞傷害性Ｔリンパ球及びサプレッサーＴリンパ球に見られる分化抗原である。ＣＤ８抗原は、免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、主要組織適合性複合体クラスＩ拘束の相互作用における関連認識要素である。
本明細書で使用されるとき、「ＮＫ細胞」または「ナチュラルキラー細胞」という用語は、ＣＤ５６またはＣＤ１６の発現及びＴ細胞受容体（ＣＤ３）の非存在によって定義される末梢血リンパ球のサブセットを指す。本明細書で使用されるとき、「適応ＮＫ細胞」及び「記憶ＮＫ細胞」という用語は相互交換可能であり、表現型がＣＤ３－及びＣＤ５６＋であり、ＮＫＧ２ＣとＣＤ５７の少なくとも１つ、及び任意でＣＤ１６を発現するが、以下：ＰＬＺＦ、ＳＹＫ、ＦｃｅＲγ、及びＥＡＴ－２の１以上の発現が欠如するＮＫ細胞のサブセットを指す。いくつかの実施形態では、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の単離された亜集団は、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ５７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＣＲリガンド、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４０、ＮＫｐ４６、活性化及び阻害性ＫＩＲ、ＮＫＧ２Ａ及び／またはＤＮＡＭ－１の発現を含む。ＣＤ５６＋は弱い発現またははっきりした発現であってもよい。
本明細書で使用されるとき、「免疫チェックポイント」という用語は、免疫系に存在し、免疫応答をオンまたはオフにすることができる分子を指す。本来、それらは、細胞死や自己免疫反応を引き起こす、免疫細胞の過剰な活性化を調節する安全装置である。これらの免疫チェックポイント分子は、免疫応答を高める刺激性免疫チェックポイント分子と、免疫応答を阻害する抑制性免疫チェックポイント分子とに大きく分類することができる。例えば、免疫チェックポイントの受容体及びリガンドは、ＰＤ１（プログラム細胞死タンパク質１）、ＰＤ－Ｌ１（プログラム死リガンド１）、ＣＴＬＡ４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４）、ＴＩＭ－３（Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有－３）、ＣＥＡＣＡＭ（３つのサブタイプＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３またはＣＥＡＣＡＭ－５を含む癌胎児性抗原関連細胞接着分子）、ＬＡＧ３（リンパ球活性化遺伝子３）、ＶＩＳＴＡ（Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー）、ＢＴＬＡ（Ｂ及びＴリンパ球減衰因子）、ＴＩＧＩＴ（Ｉｇ及びＩＴＩＭのドメインを持つＴ細胞免疫受容体）、ＬＡＩＲ１（白血球関連免疫グロブリン様受容体１）、ＣＤ１６０（分化抗原群１６０）、ＣＤ９６（分化抗原群９６）、ＭｅｒＴＫ（癌原遺伝子チロシンタンパク質キナーゼＭＥＲ）、及び２Ｂ４（ＮＫ細胞活性化誘導リガンド）から成る群から選択されてもよく、例えば、ＰＤ１とＴＩＭ３の間で選択されてもよい。
「培養」または「細胞培養」という用語は、試験管内環境における細胞の維持、増殖及び／または分化を指す。「細胞培養培地」、「培養培地」（いずれの場合も単数の「培地」）、「栄養補助剤」及び「培地栄養補助剤」は、細胞培養物を培養する栄養組成物を指す。「培養する」または「維持する」という用語は、組織または身体の外側で、例えば滅菌プラスチック（またはコーティングされたプラスチック）の細胞培養用の皿またはフラスコにて細胞を持続させること、増殖させること（成長させること）及び／または分化させることを指す。「栽培」または「維持」は、培養培地を、細胞を増殖させ、及び／または持続させるのに役立つ栄養、ホルモン及び／または他の因子の供給源として利用してもよい。
本明細書に記載されているヒト患者における免疫療法用の「医薬組成物」は免疫細胞を含む。細胞に加えて、免疫応答をさらに改善し得る他の薬学的に許容される塩、担体、賦形剤、ビヒクル及び他の添加剤等が医薬組成物に添加されてもよいことは自明であるので、その詳細な説明は省略されるべきである。
「対象」という用語は、特定の治療のレシピエントとなる、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類等を含むがこれらに限定されない任意の動物（例えば、哺乳動物）を指す。通常、「対象」及び「患者」という用語は、ヒト対象を参照して本明細書では相互交換可能に使用される。
「治療すること」または「治療する」という用語は、治療されている疾患の症状、症状の重症度、及び／または症状の頻度を抑制すること、排除すること、軽減すること、及び／または改善することを指す。本明細書で使用されるとき、「治療する」、「治療」及び「治療すること」という用語は、１以上の治療法の施行に起因する疾患または状態の進行、重症度及び／または持続期間の軽減または改善を指す。
「有効量」または「治療上有効な量」は、本明細書では相互交換可能に使用され、特定の生物学的結果を達成するのに有効な、本明細書に記載されているようなＴ細胞のような化合物、製剤、材料、または組成物の量を指す。そのような結果には、当該技術分野で好適な任意の手段によって判定されるようながんの抑制が含まれてもよいが、これに限定されない。
「投与する」または「投与」は、それが体外で存在しているとき、例えば、粘膜送達、皮内送達、静脈内送達、筋肉内送達及び／または本明細書に記載されているかもしくは当該技術分野において知られているいずれかの他の物理的送達方法によって物質を患者に注射する、またはさもなければ物理的に送達する行為を指す。
３．１以上の免疫チェックポイントを標的とする１つで２つの機能があるベクター
腫瘍細胞は種々の免疫チェックポイント、例えば、チェックポイントリガンドを発現する。したがって、１つの免疫チェックポイントが阻害されたとしても、他の免疫チェックポイントの活性化によってＣＡＲ－Ｔの持続的な効果を期待することは困難であり得る。モノクローナル抗体の組み合わせを主として用いて複数の免疫チェックポイントを阻害しており、その抗腫瘍効果が継続的に報告されている（Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２０１５．，Ｃｈａｕｖｉｎ，ＪＭ；ＰＮＡＳ，２０１０，Ｃｕｒｒａｎ ＭＡ；Ｂｌｏｏｄ，２０１８，Ｗｉｅｒｚ，Ｍ；Ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ．２０１４，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＲＪ）。しかしながら、治療用抗体は全身性に過剰な免疫応答を誘導し得ることが知られていた。さらに、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は生命にかかわるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）及び神経毒性にも関連している（Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２０１７，Ｎｅｅｌａｐｕ ＳＳ）ということは、ＣＡＲ－Ｔと抗体療法の併用が副作用の可能性を最大化し得ることを示唆している。さらに、従来の同時免疫細胞療法は、それらの高いコストと、それらがＣＡＲ－Ｔ以外のＴ細胞に作用し、自己免疫症状及びサイトカイン放出症候群のリスクがあるということとに起因して患者に多大な経済的負担を課している。本発明は上記の課題に対処するために考案された。
一実施形態では、本明細書で提供されるのは１つで２つの機能があるベクターであり、該ベクターは免疫細胞の機能を弱める遺伝子の発現を阻害する１以上の種類の短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする塩基配列と、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、モノクローナルＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）をコードする塩基配列とを含む。
ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びレトロウイルスベクターの中から選択されてもよい。例えば、レンチウイルスベクター及びレトロウイルスベクターは細胞のゲノムＤＮＡに遺伝子を挿入して、遺伝子の安定した発現を可能にする。いくつかの実施形態では、例えば、１つで２つの機能があるレンチウイルスベクター、例えば、１つで２つの機能がある二重ベクターを用いて、ベクター上の遺伝子を細胞のゲノムに挿入することができる。
いくつかの実施形態では、提供されるのは、免疫細胞の機能を弱める遺伝子の発現を阻害する２種類の短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする塩基配列と、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、モノクローナルＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）のいずれか１つをコードする塩基配列とを含むベクターである。
いくつかの実施形態では、２種類のｓｈＲＮＡの発現は、それらが２つの異なるプロモーターによってそれぞれ調節されることを特徴とする。いくつかの実施形態では、２つのプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターである。いくつかの実施形態では、２つのプロモーターは異なる種に由来するＵ６プロモーターである。いくつかの実施形態では、２つのプロモーターは、ベクター上で互いに異なる方向に向けられる。例えば、特定の実施形態では、プロモーターはヘッドトゥーヘッドの方向に向けられる。別の実施形態では、プロモーターは末尾－末尾の方向に向けられる。いくつかの実施形態では、免疫細胞の機能を弱める遺伝子は免疫チェックポイントの受容体またはリガンドである。
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイントの受容体またはリガンドは、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、ＣＤ９６、ＭｅｒＴＫ及び２Ｂ４から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、免疫細胞の機能を弱める遺伝子は、ＦＡＳ、ＣＤ４５、ＰＰ２Ａ、ＳＨＩＰ１、ＳＨＩＰ２、ＤＧＫアルファ、ＤＧＫゼータ、Ｃｂｌ－ｂ、ＣＤ１４７、ＬＲＲ１、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ１０Ｒアルファ、ＫＬＧＲ１、ＤＮＭＴ３Ａ及びＡ２ａＲから成る群から選択される。
いくつかの実施形態では、２種類のｓｈＲＮＡは免疫細胞の機能を弱める単一の遺伝子の異なる部分を標的とする、またはそれらは免疫細胞の機能を弱める異なる遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態では、２種類のｓｈＲＮＡはＰＤ－１の異なる部分を標的とする。いくつかの実施形態では、２種類のｓｈＲＮＡはそれぞれＰＤ－１及びＴＩＭ－３を標的とする。いくつかの実施形態では、２種類のｓｈＲＮＡをコードする塩基配列は、配列番号２～２１９から成る群から選択される異なる配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲまたはＴＣＲ、例えば、ｍＴＣＲの標的は、がんにおいて増加したがん抗原の中から、またはがんにおいて見いだされるがん抗原の変異した形態から選択されるヒト腫瘍抗原である。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号２２０または２２１の塩基配列のいずれか一方を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びレトロウイルスベクターの中から選択される。
３．１ ＲＮＡ干渉及び短ヘアピンＲＮＡ
ＲＮＡｉ（転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）、クェリング、または共抑制としても知られる）は、ＲＮＡ分子が通常、特定のｍＲＮＡ分子の破壊を引き起こすことによって遺伝子発現を配列特異的に阻害する転写後遺伝子サイレンシングのプロセスである。ＲＮＡｉの活性がある成分は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる短／小二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、それは通常１５～３０のヌクレオチド（例えば、１９～２５、１９～２４または１９～２１のヌクレオチド）及びジヌクレオチド３’オーバーハングを含有し、且つ標的遺伝子の核酸配列と一致する。これらの短いＲＮＡ種は、さらに大きなｄｓＲＮＡのダイサーが介在する切断によって生体内で自然に生成されてもよく、それらは哺乳類細胞で機能的である。ＤＮＡ発現プラスミドを用いて、本明細書に記載されているｓｉＲＮＡ二本鎖またはｄｓＲＮＡを細胞内で安定して発現させ、標的遺伝子発現の長期阻害を達成することができる。一態様では、ｓｉＲＮＡ二本鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖は通常、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）と呼ばれるステムループ構造の発現をもたらす短いスペーサー配列によって連結される。ヘアピンはダイサーによって認識及び切断されるので、成熟したｓｉＲＮＡ分子を生成する。
短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は本明細書で使用されるとき、いくつかの自己相補性配列がそのステムとの堅固なヘアピン構造を作り出すＲＮＡ分子である。本明細書に記載されているｓｈＲＮＡ分子は、約４０～１２０のヌクレオチド長、例えば、約７０～９０のヌクレオチド長であってもよい。例示的な実施形態では、ｓｈＲＮＡは８０ヌクレオチド長であることができる。ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡｉ経路の内在性の誘因であるマイクロ干渉ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をモデルにしている（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５４：１１７－１４２，Ｆｅｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ，１１：９７５－９８２）。ｓｈＲＮＡが細胞で発現されると、それは一連の工程を経て処理され、遺伝子サイレンシングのガイドとして作用する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）になる。簡単に言えば、ｓｈＲＮＡが発現されると、細胞内のＤｒｏｓｈａ複合体によって処理されてプレｓｈＲＮＡになり、次いで核の外に輸送され、そこでダイサーによってさらに処理されてｓｉＲＮＡになり、次に一本鎖になり、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）によって負荷される。ここで、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、ＲＩＳＣ複合体が標的遺伝子のｍＲＮＡに付着するためのガイドとして作用し、この方法で付着しているＲＩＳＣ複合体がｍＲＮＡを切断すると、遺伝子サイレンシングが発生する。標的遺伝子のｓｈＲＮＡは、特定の遺伝子に持続的且つ特異的な遺伝子サイレンシングを可能にするので、標的遺伝子を阻害する目的でベクターに含められる。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる自然に発現する小分子ＲＮＡは、ｍＲＮＡの発現を調節することによって遺伝子サイレンシングを引き起こす。ＲＩＳＣを含有するｍｉＲＮＡは、シード領域と呼ばれるｍｉＲＮＡの５’領域のヌクレオチド２～７と完全な配列相補性を提示するｍＲＮＡと、その３’領域での他の塩基対を標的とする。ｍｉＲＮＡが介在する遺伝子発現の下方調節は、標的ｍＲＮＡの切断、標的ｍＲＮＡの翻訳阻害、またはｍＲＮＡ崩壊によって引き起こされてもよい。ｍｉＲＮＡが標的とする配列は普通、標的ｍＲＮＡの３’－ＵＴＲに位置する。単一のｍｉＲＮＡは種々の遺伝子に由来する１００を超える転写物を標的にしてもよく、１つのｍＲＮＡはさまざまなｍｉＲＮＡの標的になってもよい。
特定のｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ二本鎖またはｄｓＲＮＡは、試験管内で設計され、合成されて、ＲＮＡｉプロセスを活性化するために細胞に導入されてもよい。Ｅｌｂａｓｈｉｒらは、２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ二本鎖（低分子干渉ＲＮＡと呼ばれる）が、哺乳動物細胞で免疫応答を誘導することなく、強力で特異的な遺伝子ノックダウンを達成することができることを実証した（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ＳＭ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４１１，４９４－４９８）。この最初の報告以来、ｓｉＲＮＡによる転写後の遺伝子サイレンシングは、哺乳動物細胞における遺伝子分析のための強力なツールとしてすぐに浮上し、新しい治療法を生み出す可能性を有する。
例えば、ハンチントン病のようなポリグルタミン拡張疾患を引き起こすポリグルタミン反復タンパク質をコードする核酸配列を標的とするように設計されたＲＮＡｉ分子は、米国特許第９，１６９，４８３号及び９，１８１，５４４号、ならびに国際特許公開ＷＯ２０１５１７９５２５に記載されており、これらのそれぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。米国特許第９，１６９，４８３号及び第９，１８１，５４４号ならびに国際特許公開番号ＷＯ２０１５１７９５２５はそれぞれ、ＲＮＡの第１の鎖（例えば、１５の隣接ヌクレオチド）及びＲＮＡの第２の鎖（例えば、第１の少なくとも１２の隣接ヌクレオチドに相補性）を含む単離されたＲＮＡ二本鎖を提供し、ＲＮＡ二本鎖は長さ約１５～３０塩基対である。ＲＮＡの第１の鎖とＲＮＡの第２の鎖は、ＲＮＡループ（約４から５０ヌクレオチド）によって操作可能に連結されて、発現カセットに挿入されてもよいヘアピン構造を形成してもよい。ループ部分の非限定例には、その内容が参照により全体として本明細書に組み入れられる米国特許第９，１６８，４８３号の配列番号９～１４が挙げられる。ＲＮＡ二本鎖を形成するのに使用されてもよいＲＮＡの鎖、完全な配列または配列の一部のいずれかの非限定例には、米国特許第９，１６９，４８３号の配列番号１～８及び米国特許第９，１８１，５４４号の配列番号１～１１、３３～５９、２０８～２１０、２１３～２１５及び２１８～２２１が挙げられ、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＲＮＡｉ分子の非限定例には、米国特許第９，１６９，４８３号の配列番号１～８、米国特許第９，１８１，５４４号の配列番号１～１１、３３～５９、２０８～２１０、２１３～２１５及び２１８～２２１、及び国際特許公開番号ＷＯ２０１５１７９５２５の配列番号１、６、７と３５～３８が挙げられ、これらのそれぞれの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
試験管内で合成されたｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡｉを活性化するために細胞に導入されてもよい。外来性ｓｉＲＮＡ二本鎖は、内在性ｄｓＲＮＡと同様に、それが細胞に導入されると、組み立てられて、ｓｉＲＮＡ二本鎖の２つの鎖の一方に対して相補性である（すなわち、アンチセンス鎖）ＲＮＡ配列と相互作用する集合複合体である、ＲＮＡ誘導のサイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成することができる。プロセス中に、ｓｉＲＮＡのセンス鎖（またはパッセンジャー鎖）は複合体から失われる一方で、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖（またはガイド鎖）はその相補性ＲＮＡと一致する。特に、ｓｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体の標的は完全な配列相補性を提示するｍＲＮＡである。次いで、ｓｉＲＮＡが介在する遺伝子サイレンシングは、標的を切断、遊離、及び分解することによって発生する。
標的ｍＲＮＡに相同なセンス鎖と標的ｍＲＮＡに相補的なアンチセンス鎖で構成されるｓｉＲＮＡ二本鎖は、一本鎖（ｓｓ）－ｓｉＲＮＡ（例えばアンチセンス鎖ＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド）の使用と比べて、標的ＲＮＡの破壊の効率という点ではるかに大きな利点を提供する。多くの場合、対応する二本鎖の効果的な遺伝子サイレンシング効力を達成するには、さらに高濃度のｓｓ－ｓｉＲＮＡを必要とする。
当該技術分野では、ｓｉＲＮＡを設計するためのガイドラインが存在する。これらのガイドラインは一般に、サイレンシングされる遺伝子の領域を標的とする１９ヌクレオチドの二本鎖領域、対称の２～３ヌクレオチドの３’オーバーハング、５’－リン酸基及び３’－ヒドロキシル基を生成することを推奨した。ｓｉＲＮＡ配列の優先性を管理してもよい他のルールには、（ｉ）アンチセンス鎖の５’末端でのＡ／Ｕ；（ｉｉ）センス鎖の５’末端でのＧ／Ｃ；（ｉｉｉ）アンチセンス鎖の５’末端の１／３での少なくとも５つＡ／Ｕ残基；（ｉｖ）長さが９ヌクレオチドを超えるＧＣ区間の非存在が挙げられるが、これらに限定されない。そのような考察に従って、標的遺伝子の特定の配列と一緒に、哺乳動物の標的遺伝子の発現を抑制するのに不可欠な非常に効果的なｓｉＲＮＡ分子が容易に設計されてもよい。
本明細書で提供されているように、１つで２つの機能があるベクターは免疫細胞の機能を弱める１以上の遺伝子の発現を阻害する１以上の種類の短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする塩基配列と、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、モノクローナルＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）のいずれか１つをコードする塩基配列とを含む。
いくつかの実施形態では、塩基配列は、免疫細胞の機能を弱める遺伝子の発現を阻害する１種類のｓｈＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、塩基配列は、免疫細胞の機能を弱める２つの遺伝子の発現を阻害する２種類のｓｈＲＮＡをコードし、その際、ベクターは「１つで２つの機能がある二重ベクター」と呼ばれる。他の実施形態では、塩基配列は、免疫細胞の機能を弱める２を超える遺伝子の発現を阻害する２を超える種類のｓｈＲＮＡをコードする。
いくつかの実施形態では、２つ以上の種類のｓｈＲＮＡは、それらが免疫細胞の機能を弱める単一遺伝子、例えば、単一遺伝子のさまざまな部分を標的とすることを特徴としてもよい。例えば、２つ以上の種類のｓｈＲＮＡは、ＰＤ－１、例えば、ＰＤ－１のさまざまな部分を標的とすることができる。他の実施形態では、２つ以上の種類のｓｈＲＮＡは、それらが免疫細胞の機能を弱める異なる遺伝子を標的とする、例えば、ＰＤ－１及びＴＩＭ－３を標的とすることを特徴としてもよい。
例示的な実施形態では、２つ以上の種類のｓｈＲＮＡをコードする塩基配列は、それらが配列番号２から２１９及び２３８から２６７から成る群から選択されるさまざまな配列を含むこと、例えば、それらが配列番号２から１１７及び２３８から２６７から成る群から選択される異なる配列を含んでもよいこと、例えば、それらが配列番号２から１２、７０から７５、及び２６６から２６７から成る群から選択されるさまざまな配列を含んでもよいことを特徴としてもよい。
いくつかの実施形態では、２種類のｓｈＲＮＡの発現は、それらが２つの異なるプロモーターによってそれぞれ調節されてクローニングの間での組換えまたは欠失の作為を最小限に抑えることを特徴としてもよい。
いくつかの実施形態では、どのＲＮＡポリメラーゼがプロモーターに結合して転写を開始するかに応じて、プロモーターはＲＮＡポリメラーゼＩのプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのプロモーターまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターであってもよい。上記２つのプロモーターは、それらがＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーター（以後、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター）であることを特徴としてもよい。Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、５’末端にキャップを付けることなく、またはプロモーターによる調節で転写されるＲＮＡの３’末端にポリ（Ａ）テールを付けることなく、５’末端から３’末端に正確に転写するように作製されてもよい。Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの種類には、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、７ＳＫプロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターに含まれる２つのプロモーターは異なっていてもよく、上記の３種を含むＰｏｌ ＩＩＩプロモーターの中から選択されてもよく、同じ種類のプロモーターが選択されるならば、それらは異なる種に由来してもよい。例えば、２つのプロモーターは、Ｕ６プロモーター、例えば、ヒト及びマウスに由来するＵ６プロモーターのような、異なる種に由来するＵ６プロモーターであってもよい。Ｕ６プロモーターによって作り出された転写物は核内に留まるので、これは核に存在するＤｒｏｓｈａ複合体にｓｈＲＮＡがプレｓｈＲＮＡにプロセシングされるプロセスを促進させることができると判断される。
いくつかの実施形態では、２以上のプロモーターはベクター上で互いに異なる方向に向けられることを特徴としてもよい。例えば、特定の実施形態では、プロモーターはヘッドトゥーヘッドの（→←）方向に向けられる。別の実施形態では、プロモーターは、末尾－末尾（←→）の方向に向けられる。１つで２つの機能がある二重ベクターでは、ベクター上で異なる方向に向けられるということは、その発現が２つのプロモーターによって調節されているそれぞれのｓｈＲＮＡが転写されると、ＲＮＡポリメラーゼが動く方向が単一の核酸分子にて異なる方向を向くことを意味する。例示的な実施形態では、２つのプロモーターは→←方向であることができる（図１５Ａ）。別の例示的な実施形態では、２つのプロモーターは←→方向であることができる（図１５Ｂ）。例えば、２つのプロモーターはベクターでの→←方向を想定してもよい。
いくつかの実施形態では、１以上の種類のｓｈＲＮＡの標的遺伝子の発現は、対照群のそれの約９０％以下に低減され、例えば、標的遺伝子の発現は、対照群のそれの約８０％以下、７０％以下、約６０％以下、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、及び約１０％以下に低減される。
普通、ｓｈＲＮＡは、標的遺伝子のｍＲＮＡ配列の一部と相同性の高い配列（以後、センスｓｈＲＮＡの塩基配列）、鋭いヘアピンを生成できる配列、及び相同性の高い配列に相補性の配列（以後、アンチセンスｓｈＲＮＡ塩基配列）を有するように設計される。自己相補性部分間の非共有結合はステム構造を形成し、ｓｈＲＮＡが細胞内で発現され、及び処理されると、アンチセンスｓｈＲＮＡ塩基配列が、遺伝子サイレンシングプロセスにおける標的遺伝子のｍＲＮＡのガイドとして作用する。例えば、本明細書においてｓｈＲＮＡの発現に使用されるカセットの塩基配列は、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ（２１塩基）－ループ配列－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ（１９塩基）の構造を含むことができる。一実施形態では、２１塩基の区間はセンスｓｈＲＮＡ塩基配列をコードし、１９塩基の区間は２１塩基の区間に相補性または実質的に相補性であり、アンチセンスｓｈＲＮＡ塩基配列をコードする。別の実施形態では、１９塩基の区間はセンスｓｈＲＮＡ塩基配列をコードし、２１塩基の区間は１９塩基の区間に相補性または実質的に相補性であり、アンチセンスｓｈＲＮＡ塩基配列をコードする。したがって、発現させると、得られるＲＮＡはステムとループの構造を形成する。特定の実施形態では、カセットに含まれてもよい標的遺伝子（ヒト由来）のそのようなセンスまたはアンチセンスｓｈＲＮＡ塩基配列は、配列番号１～２１９から成る群から選択される。具体的な実施形態では、本明細書でｓｈＲＮＡの発現に使用されるカセットの塩基配列は配列番号２２０～２２４から成る群から選択することができる。
いくつかの実施形態では、完全なｓｈＲＮＡ塩基配列をマウスまたはヒトのＵ６プロモーターの３’末端に配置することができ、Ｕ６プロモーターによって転写を停止するのに必要なＴＴＴＴＴはすべてのｓｈＲＮＡ塩基配列の３’末端に配置することができる。
いくつかの実施形態では、各ｓｈＲＮＡの核酸配列は、本明細書に記載される配列に加えて、これらの配列と少なくとも５０％、具体的には少なくとも７０％、さらに具体的には少なくとも８０％、一層さらに具体的には少なくとも９０％、そして最も具体的には少なくとも９５％の配列相同性を示す核酸配列を含んでもよい。これは、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）や細胞内で処理されて特にｓｉＲＮＡとなるｓｈＲＮＡの場合、ある程度の変異、特に５’末端の変異は認容され、標的遺伝子の正常なノックダウンを引き起こすこと、且つ遺伝子サイレンシングで役割を担うｍｉＲＮＡと同様の構造を有するように行われるｓｉＲＮＡとｓｈＲＮＡの変異が標的遺伝子のノックダウンをさらに効果的に誘導することが報告されているためである。さらに、ベクターの使用において、当業者に自明であるのは、ベクター内の変動、すなわち、特定の配列をベクターに導入するためのクローニングプロセスにおいて生じてもよい塩基配列の付加、修飾または欠失であり、または意図された遺伝子が発現される程度のベクターの使いやすさを改善するための構成要素の変更または導入である。
免疫細胞の機能を弱める遺伝子にはさまざまな作用機序が存在する。例には、免疫細胞の増殖を阻害することまたは細胞死を引き起こすこと、活性化するために免疫細胞が反応する必要がある分子との反応を低下させること、免疫細胞が反応標的を認識するために必要な遺伝子の発現を阻害すること、及び特定の標的に対して免疫応答を引き起こす代わりに異なる機能を担う異なる種類の免疫細胞への分化を引き起こすことが挙げられる。代表的な例には、以下に説明される免疫チェックポイントに関連する分子が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、免疫細胞の機能を弱める遺伝子は、それが免疫チェックポイントの受容体またはリガンドであることを特徴としてもよい。免疫チェックポイントは、免疫系に存在し、免疫応答をオンまたはオフにすることができる分子である。それらは、細胞死や自己免疫反応を引き起こす免疫細胞の過剰な活性化を調節する安全装置と見なすことができる。これらの免疫チェックポイント分子は、免疫応答を高める刺激性免疫チェックポイント分子と、免疫応答を阻害する抑制性免疫チェックポイント分子とに大きく分類することができる。多くのがん細胞は、抑制性免疫チェックポイントシグナル、特に免疫細胞上の抑制性免疫チェックポイントの受容体及びリガンドを活性化することにより、免疫系を免れることが報告されている。したがって、特定のがんを標的とする免疫細胞療法は、がんのこの回避作用を無効にすることによって効果的にされてもよく、これは、抑制性免疫チェックポイント受容体及びそれらのリガンドの活性化を阻害することによって、またはそれらの発現を低下させることによって達成されてもよい。例えば、免疫チェックポイントの受容体及びリガンドは、ＰＤ１（プログラム細胞死タンパク質１）、ＰＤ－Ｌ１（プログラム死リガンド１）、ＣＴＬＡ４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４）、ＴＩＭ－３（Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有－３）、ＣＥＡＣＡＭ（３つのサブタイプＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３またはＣＥＡＣＡＭ－５を含む癌胎児性抗原関連細胞接着分子）、ＬＡＧ３（リンパ球活性化遺伝子３）、ＶＩＳＴＡ（Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー）、ＢＴＬＡ（Ｂ及びＴリンパ球減衰因子）、ＴＩＧＩＴ（Ｉｇ及びＩＴＩＭのドメインを持つＴ細胞免疫受容体）、ＬＡＩＲ１（白血球関連免疫グロブリン様受容体１）、ＣＤ１６０（分化抗原群１６０）、ＣＤ９６（分化抗原群９６）、ＭｅｒＴＫ（癌原遺伝子チロシンタンパク質キナーゼＭＥＲ）、及び２Ｂ４（ＮＫ細胞活性化誘導リガンド）から成る群から選択されてもよく、例えば、ＰＤ１、ＴＩＭ３及びＴＩＧＩＴの間で選択されてもよい。
他の実施形態では、免疫細胞の機能を弱める遺伝子は、それがＴＣＲによる反復刺激によって活性化されているＴリンパ球に対して負の調節因子、例えば、ＦＡＳ（ＣＤ９５、ＡＰＯ－１またはアポトーシス抗原－１とも呼ばれる）として作用するＡＩＣＤ（活性化誘導細胞死）を促進することができる受容体をコードすることを特徴としてもよい。いくつかの実施形態では、免疫細胞の機能を弱める遺伝子は、それがＴＣＲのシグナル活性化を抑制する因子をコードすることを特徴としてもよく、例えば、因子はＣＤ４５、ＰＰ２Ａ、ＳＨＰ１、ＳＨＰ２、ＤＧＫアルファ、ＤＧＫゼータ、Ｃｂｌ－ｂ、Ｃｂｌ－ｃ及びＣＤ１４８から選択することができる。いくつかの実施形態では、免疫細胞の機能を弱める遺伝子は、それが４－１ＢＢのシグナル抑制を介してＣＡＲ及び／またはＴＣＲ、例えば、ｍＴＣＲの効力を抑制するタンパク質をコードすることを特徴としてもよく、４－１ＢＢは、ＴＣＲの本明細書に記載される共刺激分子、例えば、ＬＲＲ１（ロイシンリッチ反復タンパク質１）である。いくつかの実施形態では、免疫細胞の機能を弱める遺伝子は、そのリガンドがサイトカインであり、Ｔ細胞を抑制する受容体、例えばＴＧＦＢＲ１（形質転換増殖因子ベータ受容体１）及びＩＬ１０Ｒアルファ（ＩＬ－１０Ｒサブユニットアルファ）をコードすることを特徴としてもよい。いくつかの実施形態では、免疫細胞の機能を弱める遺伝子は、それがＴ細胞及びＮＫ細胞の増殖能力及び細胞傷害性を阻害する受容体、例えばＫＬＧＲ１（キラー細胞レクチン様受容体Ｇ１）をコードすることを特徴としてもよい。いくつかの実施形態では、免疫細胞の機能を弱める遺伝子は、ノックアウト（ＫＯ）されるとＴ細胞疲弊の疲弊を抑制すると報告されている新しいＤＮＡのメチル化に関連する調節因子、例えばＴＮＭＴ３ａ（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ ３アルファ）をコードすることを特徴としてもよい。いくつかの実施形態では、免疫細胞の機能を弱める遺伝子は、活性化されるとＴ細胞の細胞毒性及びサイトカイン産生能を阻害することができる、腫瘍微小環境に過剰に存在するアデノシンの受容体、例えばＡ２ａＲ（アデノシン受容体サブタイプＡ２ａ）をコードすることを特徴としてもよい。
いくつかの実施形態では、免疫細胞の機能を弱める遺伝子は、それが、ＦＡＳ、ＣＤ４５、ＰＰ２Ａ、ＳＨＰ１、ＳＨＰ２、ＤＧＫアルファ、ＤＧＫゼータ、Ｃｂｌ－ｂ、Ｃｂｌ－ｃ、ＣＤ１４８、ＬＲＲ１、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＫＬＧＲ１、ＤＮＭＴ３Ａ及びＡ２ａＲから成る群から選択されることを特徴としてもよい。
３．２ キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びＴ細胞受容体、例えば、モノクローナルＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）
本明細書で提供されているように、１つで２つの機能があるベクターは免疫細胞の機能を弱める１以上の遺伝子の発現を阻害する１以上の種類の短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする塩基配列と、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、モノクローナルＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）のいずれか１つをコードする塩基配列とを含む。
ＣＡＲは一般に、免疫細胞上に存在する場合、免疫細胞に標的細胞（通常はがん細胞）に対する特異性を持たせる一方で、細胞内にてシグナル伝達を引き起こすポリペプチドのセットである。ＣＡＲは最低でも、以下に記載されている標的抗原を認識する細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、細胞内シグナル伝達ドメインは促進分子または共刺激分子に由来する。
臨床応用で今日一般的に使用されているＣＡＲの構造は、抗原に特異性を付与する単鎖可変断片ドメイン（以後、ｓｃＦｖ）と、ｓｃＦｖと細胞膜の間の距離を調節するスペーサードメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメイン（以後、ＩＳＤ）とを含む。ＩＳＤは次に、１以上のＴ細胞の生体内増殖及び長寿命に寄与する共刺激ドメイン（ＣＤ２８、ＣＤ１３７またはＯＸ４０）と、Ｔ細胞の活性化に寄与するＴＣＲシグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３ζ）とを含む。このようにして調製されているＣＡＲを発現するように改変されたＴ細胞は、標的抗原を発現しているがん細胞を高い特異性で認識することによって活性化され、そのようながん細胞の死を効果的に誘導し、同時に体内で指数関数的に増殖し、且つ長い間生き続けることができる。例えば、Ｂ細胞特異的抗原であるＣＤ１９を標的とするように調製されたＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＡＲＴ－１９）をＢ細胞白血病患者に投与したところ、細胞は１，０００～１０，０００倍に増殖し、体内で数年間生き続けることが報告された。その結果、ＣＡＲＴ－１９は、従来の化学療法などが有効でなかった末期急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）患者に対して実施された臨床試験で９０％の完全奏効を示し、治験責任医師が開始した早期の臨床試験段階でグローバルな製薬会社へのライセンス供与のまれな症例につながった。それは、２０１７年に米国ＦＤＡの認可を受けた最初のＣＡＲ－Ｔ細胞療法剤となったが、その後、２番目のＣＡＲ－Ｔも認可された。
免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の表面には、ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４）またはＰＤ－１（プログラム細胞死タンパク質１）のような免疫チェックポイント受容体が存在する。これらの受容体は本来、Ｔ細胞の過剰な活性化及び細胞死、または自己免疫反応の誘発を調節するための安全装置である。しかしながら、がん細胞、特に固形がんは、これを用いてＴ細胞による免疫監視を回避すると報告されている。例えば、がん細胞がＰＤ－Ｌ１（プログラム死リガンド１）を表面で発現すると、その受容体であるＰＤ－１を発現するＴ細胞ががん細胞を認識して活性化されるが、ＰＤ－１からの活性化抑制シグナルによって程なく疲弊してしまう。これらの免疫チェックポイント受容体からのシグナルによるＴ細胞活性の阻害を防ぐために、標的免疫チェックポイント受容体によるシグナル伝達を阻害する、ＣＴＬＡ４またはＰＤ－１、等に対するモノクローナル抗体などが開発された。これらの免疫チェックポイント受容体阻害剤を使用することによって免疫チェックポイントの遮断を介してＴ細胞の全体的な免疫機能を改善する治療法は、さまざまな固形がんに対しても同様に有効性を示している。
ＣＡＲ－Ｔ細胞は、最終的には活性化Ｔ細胞の細胞傷害性に依存する治療法でもあるので、ＣＡＲ－Ｔ細胞の周囲での免疫抑制環境の存在は治療効果に対する主要な障害として作用する。実際、Ｂ細胞白血病に示される治療効果とは異なって、固形腫瘍を標的とするように調製されたＣＡＲ－Ｔは、期待できる治療効果をまれにしか示してこなかった。これは、血液がんとは異なり、固形腫瘍が免疫抑制性の腫瘍微小環境を作り出し、ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性及び増殖を抑制するためであると考えられている。さらに、Ｂ細胞血液がんの間でさえ、ほぼ９０％がＣＡＲＴ―１９を用いた治療法に反応した急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）患者とは異なり、治療効果はリンパ腫患者（２０～５０％の奏効）または慢性リンパ芽球性白血病患者（ＣＬＬ、２０％前後の奏効）では相対的に低かったことが報告されている。
さらに、ＰＤ－Ｌ１及び他の免疫抑制リガンドは、リンパ腫によって形成される腫瘍微小環境にて発現され、それに従ってがん性組織内のＴ細胞の機能が疲弊することが報告された。さらに、ＣＬＬ患者から得られたＴ細胞は、ＰＤ－１、ＣＤ１６０及びＣＤ２４４のような免疫チェックポイント受容体の高度な発現によってすでに実質的に疲弊していることが報告されている。
ＣＡＲ－Ｔ細胞のこの低下した活性を回復するためにＣＡＲ－Ｔ細胞と抗ＣＴＬＡまたは抗ＰＤ－１阻害抗体の同時使用が抗がん効果を改善することを示す前臨床試験の結果が報告されたが、これらの組み合わせを用いた臨床試験は現在進行中である。しかしながら、抗体とＣＡＲ－Ｔ細胞のそのような同時治療による課題は、身体全体に広がった抗体が、ＣＡＲ－Ｔ細胞だけでなく、体内に存在する他のすべてのＴ細胞にも影響を及ぼし、例えば、サイトカイン放出症候群、ならびに自己免疫症状のような重篤且つ全身性の有害反応を生じる可能性があることである。指摘されている別の課題は、細胞療法と高価な抗体療法の併用から生じる治療コストの上昇である。
したがって、ＣＡＲ－Ｔ細胞の免疫チェックポイントの抑制を可能にするために、細胞内の遺伝子発現を調節する試みが最近行われている。国際特許出願公開ＷＯ２０１６／０６９２８２は、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、β－２ミクログロブリン及びＦＡＳから成る群から選択される内在性遺伝子発現を下方調節することができる核酸で修飾され、さらに標的細胞上の表面抗原に対する親和性を含む修飾されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸、またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするエレクトロポレーションで導入された核酸を含むＴ細胞を生成するための組成物及び方法を開示する。出版物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のような遺伝子ハサミを用いて内在性遺伝子の発現をノックアウトすることができるが、特許公報にて開示されているＣＡＲ－Ｔ細胞の調製方法はかなり複雑であり、生産収率が低く、生産コストが高いという課題を有すると述べている。
一方、国際特許公開ＷＯ２０１５／０９０２３０は、Ｔ細胞の機能をさらに抑制する分子を阻害する単一種類の短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）がＣＡＲを発現する細胞に使用されてもよいことを開示している。細胞療法の費用負担が高いので、失敗した場合の患者は種々の負担に直面する。しかしながら、単一種類のｓｈＲＮＡは、そのような標的分子の活性を効果的に阻害することができない可能性がある。いくつかの実施形態では、ポリペプチドを含むセットが連結されてもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドを含むセットは、それらが刺激によって二量化されるスイッチを介して連結する形態であってもよい。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む融合タンパク質であってもよい。さらなる実施形態では、ＣＡＲ融合タンパク質は、Ｎ末端にリーダー配列をさらに含んでもよく、リーダー配列はＣＡＲが発現され、そして細胞膜に固定されるようになる過程において切断されてもよい。
本明細書に記載されているＴＣＲ、例えば、ｍＴＣＲは、α、β、γ及びδの鎖から選択される鎖を含んでもよい。いくつかの実施形態では、鎖は、以下に記載される標的抗原、ＣＤ３、及びゼータ鎖、さらには共刺激分子を認識することができ、共刺激分子は、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７またはＣＤ２８の中から選択されてもよい。
いくつかの態様では、キメラ単鎖抗体構築物（ｓｃＦｖ）のレトロウイルス移入を用いて、定義された抗原特異性を持つＴＣＲ、例えば、ｍＴＣＲを作り出すことができる。さらなる実施形態では、キメラｓｃＦｖ構築物は、ＦｃＲ－ガンマまたはＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインに連結されて、Ｔ細胞エフェクター機能を誘発することができる。ＣＤ３ζでは、ドメインを共刺激分子のシグナル伝達ドメインと組み合わせることができ、その際、抗体の結合は、エフェクターＴ細胞の機能を始動させることができ、共刺激シグナルを送達することもできる。さらなる実施形態では、共刺激分子はＣＤ２８、４－１ＢＢ、及びＯＸ４０から選択することができる。
いくつかの実施形態では、１つで２つの機能があるベクターは、ＣＤ３ζドメインを含むことができ、ＴＣＲ、例えば、ｍＴＣＲの鎖はＣＤ３及びゼータ（ζ）鎖との非共有結合を介して複合体を形成することができる。抗原が鎖の抗原認識部位を介して認識されると、ＣＤ３及びゼータ鎖は、そのようなＴＣＲ複合体が発現されている免疫細胞の細胞質にシグナルを送り、機能的活性化を誘導する。
いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインはさらに、共刺激分子に由来する１以上の機能的シグナル伝達ドメインを含んでもよい。いくつかの実施形態では、促進分子は上記に記載されているＴＣＲのゼータ鎖であってもよい。
ＣＡＲ及びＴＣＲ、例えばｍＴＣＲは細胞表面受容体である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲまたはＴＣＲ、例えば、ｍＴＣＲの標的は、その発現ががんにおいて特異的に増加するがん抗原であることを特徴としてもよい。いくつかの実施形態では、ＣＡＲまたはＴＣＲ、例えば、ｍＴＣＲの標的は、がんにて変異した形態で存在するがん抗原であることを特徴としてもよい。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲまたはＴＣＲ、例えば、ｍＴＣＲの標的は、その発現が治療されるべきであるがんにおいて増加するヒト腫瘍抗原であってもよい。例えば、標的抗原は、５Ｔ４（栄養膜糖タンパク質）、７０７－ＡＰ、９Ｄ７、ＡＦＰ（α－フェトプロテイン）、ＡｌｂＺＩＰ（アンドロゲン誘導のｂＺＩＰ）、ＨＰＧ１（ヒト前立腺特異的遺伝子－１）、α５β１－インテグリン、α５β６－インテグリン、α－メチルアシル－補酵素Ａラセマーゼ、ＡＲＴ－４（ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ－４）、Ｂ７Ｈ４（ｖ－セットドメイン含有Ｔ－細胞活性化阻害剤１）、ＢＡＧＥ－１（Ｂメラノーマ抗原－１）、ＢＣＬ－２（Ｂ－細胞 ＣＬＬ／リンパ腫－２）、ＢＩＮＧ－４（ＷＤ反復ドメイン４６）、ＣＡ１５－３／ＣＡ２７－２９（ムチン１）、ＣＡ１９－９（がん抗原１９－９）、ＣＡ７２－４（がん抗原７２－４）、ＣＡ１２５（がん抗原１２５）、カルレチクリン、ＣＡＭＥＬ（メラノーマ上のＣＴＬ認識抗原）、ＣＡＳＰ－８（カスパーゼ８）、カテプシンＢ、カテプシンＬ、ＣＤ１９（分化抗原群１９）、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＥＡ（がん胎児性抗原ＳＧ８）、ＣＬＣＡ２（塩化物チャネルアクセサリー２）、ＣＭＬ２８（慢性骨髄性白血病腫瘍抗原２８）、コアクトシン様タンパク質、コラーゲンＸＸＩＩＩ、ＣＯＸ－２（シクロオキシゲナーゼ－２）、ＣＴ－９／ＢＲＤ６（がん／精巣抗原９）、Ｃｔｅｎ（ｃ－末端テンシン様タンパク質）、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、ｃｙｐ－Ｂ、ＣＹＰＢ１（チトクロームｐ４５０ファミリー１サブファミリーｂメンバー１）、ＤＡＭ－１０／ＭＡＧＥ－Ｂ１（メラノーマ関連抗原Ｂ１）、ＤＡＭ－６／ＭＡＧＥ－Ｂ２、ＥＧＦＲ／Ｈｅｒ１（表皮増殖因子受容体）、ＥＭＭＰＲＩＮ（ベイシジン）、ＥｐＣａｍ、ＥｐｈＡ２（ＥＰＨ受容体Ａ２）、ＥｐｈＡ３、ＥｒｂＢ３（Ｅｒｂ－Ｂ２受容体チロシンキナーゼ３）、ＥＺＨ２（ｚｅｓｔｅ２ポリコーム抑制性複合体２サブユニットのエンハンサー）、ＦＧＦ－５（線維芽細胞増殖因子５）、ＦＮ（フィブロネクチン）、Ｆｒａ－１（Ｆｏｓ関連抗原－１）、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ（炭酸脱水酵素９）、ＧＡＧＥ－１（Ｇ抗原－１）、ＧＡＧＥ－２、ＧＡＧＥ－３、ＧＡＧＥ－４、ＧＡＧＥ－５、ＧＡＧＥ－６、ＧＡＧＥ－７ｂ、ＧＡＧＥ－８、ＧＤＥＰ（前立腺にて差次的に発現される遺伝子）、ＧｎＴ－Ｖ（グルコン酸キナーゼ）、ｇｐ１００（メラニン細胞系列特異的抗原ＧＰ１００）、ＧＰＣ３（グリピカン３）、ＨＡＧＥ（らせん抗原）、ＨＡＳＴ－２（スルホトランスフェラーゼファミリー１Ａメンバー１）、ヘプシン、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２（Ｅｒｂ－Ｂ２受容体チロシンキナーゼ２）、ＨＥＲＶ－Ｋ－ＭＥＬ、ＨＮＥ（メデュラシン）、ホメオボックスＮＫＸ３．１、ＨＯＭ－ＴＥＳ－１４／ＳＣＰ－１、ＨＯＭ－ＴＥＳ－８５、ＨＰＶ－Ｅ６、ＨＰＶＥ７、ＨＳＴ－２（シルツイン－２）、ｈＴＥＲＴ、ｉＣＥ（カスパーゼ１）、ＩＧＦ－１Ｒ（インスリン様増殖因子－１受容体）、ＩＬ－１３Ｒａ２（インターロイキン－１３受容体サブユニットα２）、ＩＬ－２Ｒ（インターロイキン－２受容体）、ＩＬ－５（インターロイキン－５）、未成熟ラミニン受容体、カリクレイン２、カリクレイン４、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５（リソホスファチジルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１）、ＫＫ－ＬＣ－１（北九州肺癌抗原－１）、ＫＭ－ＨＮ－１、ＬＡＧＥ－１（Ｌ抗原ファミリーメンバー－１）、リビン、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥＡ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ｂ１、ＭＡＧＥ－Ｂ１０、ＭＡＧＥ－Ｂ１６、ＭＡＧＥＢ１７、ＭＡＧＥ－Ｂ２、ＭＡＧＥ－Ｂ３、ＭＡＧＥ－Ｂ４、ＭＡＧＥ－Ｂ５、ＭＡＧＥ－Ｂ６、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＭＡＧＥ－Ｃ３、ＭＡＧＥ－Ｄ１、ＭＡＧＥ－Ｄ２、ＭＡＧＥ－Ｄ４、ＭＡＧＥ－Ｅ１、ＭＡＧＥ－Ｅ２、ＭＡＧＥ－Ｆ１、ＭＡＧＥ－Ｈ１、ＭＡＧＥＬ２（メラノーマ抗原ファミリーＬ２）、ママグロビンＡ、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ（Ｔ－細胞－１によって認識されるメラノーマ抗原）、ＭＡＲＴ－２、マトリクスタンパク質２２、ＭＣ１Ｒ（メラノコルチン１受容体）、Ｍ－ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）、メソテリン、ＭＧ５０／ＰＸＤＮ（ペルオキシダシン）、ＭＭＰ１１（マトリクスメタロプロテイナーゼ１１）、ＭＮ／ＣＡ ＩＸ－抗原（炭酸脱水酵素９）、ＭＲＰ－３（多剤耐性関連タンパク質－３）、ＭＵＣ１（ムチン１）、ＭＵＣ２、ＮＡ８８－Ａ（ＶＥＮＴ様ホメオボックス２偽遺伝子１）、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ－Ｖ、Ｎｅｏ－ＰＡＰ（Ｎｅｏ－ポリ（Ａ）ポリメラーゼ）、ＮＧＥＰ（前立腺で発現される新しい遺伝子）、ＮＭＰ２２（核マトリクスタンパク質２２）、ＮＰＭ／ＡＬＫ（ヌクレオホスミン）、ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－Ｂ、ＯＡ１（変形性関節症ＱＴＬ１）、ＯＦＡ－ｉＬＲＰ（がん胎児性抗原未成熟ラミニン受容体タンパク質）、ＯＧＴ（Ｏ－ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ）、ＯＳ－９（小胞体レクチン）、オステオカルシン、オステオポンチン、ｐ１５（ＣＤＫ阻害剤２Ｂ）、ｐ５３、ＰＡＧＥ－４（Ｐ抗原ファミリーメンバー－４）、ＰＡＩ－１（プラスミノーゲン活性化因子阻害剤－１）、ＰＡＩ－２、ＰＡＰ（前立腺酸ホスファターゼ）、ＰＡＲＴ－１（前立腺アンドロゲン調節転写物１）、ＰＡＴＥ（前立腺及び精巣で発現された１）、ＰＤＥＦ（前立腺由来のＥｔｓ因子）、Ｐｉｍ－１－キナーゼ（プロウイルス組み込み部位１）、Ｐｉｎ１（ペプチジル－プロリルｃｉｓ－ｔｒａｎｓイソメラーゼＮＩＭＡ－相互作用１）、ＰＯＴＥ（前立腺、卵巣、精巣、及び胎盤で発現される）、ＰＲＡＭＥ（メラノーマで優先的に発現される抗原）、プロステイン、プロテイナーゼ－３、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、ＰＳＧＲ（前立腺特異的Ｇ－タンパク質共役受容体）、ＰＳＭ、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＲＡＧＥ－１（腎腫瘍癌腫抗原）、ＲＨＡＭＭ／ＣＤ１６８、ＲＵ１（腎遍在タンパク質１）、ＲＵ２、ＳＡＧＥ（肉腫抗原）、ＳＡＲＴ－１（Ｔ－細胞－１によって認識される扁平上皮細胞癌腫抗原）、ＳＡＲＴ－２、ＳＡＲＴ－３、Ｓｐ１７（精子タンパク質１７）、ＳＳＸ－１（ＳＳＸファミリーメンバー１）、ＳＳＸ－２／ＨＯＭ－ＭＥＬ－４０、ＳＳＸ－４、ＳＴＡＭＰ－１（ＳＴＥＡＰ２ メタロレダクターゼ）、ＳＴＥＡＰ、サバイビン、サバイビン－２１３、ＴＡ－９０（腫瘍関連抗原－９０）、ＴＡＧ－７２（腫瘍関連糖タンパク質－７２）、ＴＡＲＰ（ＴＣＲγ代替リーディングフレームタンパク質）、ＴＧＦｂ（形質転換増殖因子β）、ＴＧＦｂＲ１１（形質転換増殖因子β受容体１１）、ＴＧＭ－４（トランスグルタミナーゼ４）、ＴＲＡＧ－３（タキソール耐性関連遺伝子３）、ＴＲＧ（Ｔ－細胞受容体γ遺伝子座）、ＴＲＰ－１（一過性受容体ポテンシャル－１）、ＴＲＰ－２／６ｂ、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、Ｔｒｐ－ｐ８、チロシナーゼ、ＵＰＡ（Ｕ－プラスミノーゲン活性化因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子Ａ）、ＶＥＧＦＲ－２／ＦＬＫ－１、及びＷＴ１（ウィルムス腫瘍１）から選択することができ、または治療されるべきがんにて発見され、α－アクチニン－４／ｍ、ＡＲＴＣ１／ｍ、ｂｃｒ／ａｂｌ、ベータ－Ｃａｔｅｎｉｎ／ｍ、ＢＲＣＡ１／ｍ、ＢＲＣＡ２／ｍ、ＣＡＳＰ－５／ｍ、ＣＡＳＰ－８／ｍ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ／ｍ、ＣＭＬ６６、ＣＯＡ－１／ｍ、ＤＥＫ－ＣＡＮ、ＥＦＴＵＤ２／ｍ、ＥＬＦ２／ｍ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１、ＦＮ１／ｍ、ＧＰＮＭＢ／ｍ、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１－Ｒ１７０Ｉ、ＨＬＡ－Ａ１１／ｍ、ＨＬＡ－Ａ２／ｍ、ＨＳＰ７０－２Ｍ、ＫＩＡＡ０２０５／ｍ、Ｋ－Ｒａｓ／ｍ、ＬＤＬＲ－ＦＵＴ、ＭＡＲＴ２／ｍ、ＭＥ１／ｍ、ＭＵＭ－１／ｍ、ＭＵＭ－２／ｍ、ＭＵＭ－３／ｍ、ミオシンクラス１／ｍ、ｎｅｏ－ＰＡＰ／ｍ、ＮＦＹＣ／ｍ、Ｎ－Ｒａｓ／ｍ、ＯＧＴ／ｍ、ＯＳ－９／ｍ、ｐ５３／ｍ、Ｐｍｌ／ＲＡＲａ、ＰＲＤＸ５／ｍ、ＰＴＰＲＸ／ｍ、ＲＢＡＦ６００／ｍ、ＳＩＲＴ２／ｍ、ＳＹＴＳＳＸ－１、ＳＹＴ－ＳＳＸ－２、ＴＥＬ－ＡＭＬ１、ＴＧＦｂＲＩＩ及びＴＰＩ／ｍの中から選択されるヒト腫瘍抗原の変異した形態であってもよい。例えば、標的抗原はＣＤ１９またはＣＤ２２の間から選択されてもよい。
３．３ １つで２つの機能があるベクターの成分
本明細書で提供されているように、１つで２つの機能があるベクターは免疫細胞の機能を弱める１以上の遺伝子の発現を阻害する１以上の種類の短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする塩基配列と、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、モノクローナルＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）をコードする塩基配列とを含む。
いくつかの実施形態では、１つで２つの機能があるベクターは、宿主細胞ゲノムへの配列の挿入を促進する因子をコードする配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、配列はベクター遺伝子の一方または双方の末端に位置する。いくつかの実施形態では、配列はＬＴＲ（長い末端配列）である。
いくつかの実施形態では、１つで２つの機能があるベクターは、上記に記載されている挿入が行われている細胞の精製に使用されるタンパク質をコードするドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、ドメインはΔＬＮＧＦＲドメインであり、その際、ΔＬＮＧＦＲは上記に記載されている挿入が行われている細胞の精製に使用される細胞質ドメインのないＬＮＧＦＲ（低親和性神経成長因子受容体）である。
いくつかの実施形態では、１つで２つの機能があるベクターは、持続的発現を特徴とするΔＬＮＧＦＲ及びＣＡＲの双方の発現を誘導するプロモーター、例えば、図２２Ａに示されるようなΔＬＮＧＦＲ及びＣＤ１９ ＣＡＲの双方の発現を誘導するＥＦ１αプロモーターを含むことができる。さらなる実施形態では、ΔＬＮＧＦＲ及びＣＤ１９ ＣＡＲは先ず、それらが単一のｍＲＮＡ上に存在する形態で転写される。同じｍＲＮＡ上に２以上のシストロンが存在するそのような実施形態では、ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）がその間に挿入されて、双方のシストロンの発現を引き起こしてもよい。しかしながら、ＩＲＥＳは過剰に長く、下流のシストロンの発現効率が低下することが報告されている。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳ以外の成分、例えば、Ｐ２Ａ（２ａペプチド）を用いてそのような欠点を克服することができ、その際、翻訳中に、リボソームはＰ２ＡのＣ末端でペプチド結合を形成せずに通過し、下流の遺伝子が後で発現されるようにする。
いくつかの例示的な１つで２つの機能があるベクターは、図１、６、１４及び２２Ａに示す１つで２つの機能があるベクターであり、ベクターは配列番号２２０または２２１の塩基配列のいずれか１つを含む。配列番号２２０及び２２１の塩基配列を含む例示的なベクターは、図１Ａ及び１Ｂに示される構造を有することができる。いくつかの例示的なプラスミドを表１に列挙する。
表１．例示的なプラスミド。
Figure 0007068498000001
いくつかの実施形態では、上記に記載されているベクターに含まれる塩基配列、及び各ｓｈＲＮＡの核酸配列は、本明細書に記載されている配列に加えて、これらの配列と少なくとも５０％、具体的には少なくとも７０％、さらに具体的には少なくとも８０％、一層さらに具体的には少なくとも９０％、そして最も具体的には少なくとも９５％の配列相同性を示す核酸配列を含んでもよい。これは、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）や細胞内で処理されて特にｓｉＲＮＡとなるｓｈＲＮＡの場合、ある程度の変異、特に５’末端の変異は認容され、標的遺伝子の正常なノックダウンを引き起こすこと、且つ遺伝子サイレンシングで役割を担うｍｉＲＮＡと同様の構造を有するように行われるｓｉＲＮＡとｓｈＲＮＡの変異が標的遺伝子のノックダウンをさらに効果的に誘導することが報告されているためである。さらに、ベクターの使用において、当業者に自明であるのは、ベクター内の変動、すなわち、特定の配列をベクターに導入するためのクローニングプロセスにおいて生じてもよい塩基配列の付加、修飾または欠失であり、または意図された遺伝子が発現される程度のベクターの使いやすさを改善するための構成要素の変更または導入である。
４．１以上の免疫チェックポイントを標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞の生産と評価
本明細書で提供されているように、１つで２つの機能があるベクターは免疫細胞の機能を弱める遺伝子の発現を阻害する１以上の種類の短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする塩基配列と、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、モノクローナルＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）のいずれか１つをコードする塩基配列とを含む。ベクターは、免疫細胞の機能を弱める遺伝子の発現を阻害した免疫細胞の作製に使用することができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びレトロウイルスベクターから成る群から選択される。
一態様では、本明細書に記載されている免疫細胞は、上記ベクターを含み、ＣＡＲまたはＴＣＲ、例えばｍＴＣＲを発現すること、且つ１以上の種類のｓｈＲＮＡの標的遺伝子の発現が低下することを特徴とする。いくつかの実施形態では、１以上の種類のｓｈＲＮＡの標的遺伝子の発現は、対照群のそれの約９０％以下に低減され、例えば、標的遺伝子の発現は、対照群のそれの約８０％以下、７０％以下、約６０％以下、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、及び約１０％以下に低減される。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ヒト由来のＴ細胞とＮＫ細胞との間から選択される。
別の態様では、本明細書で提供されるのは方法である。いくつかの実施形態では、提供されるのは、（１）標的抗原に特異的に結合する遺伝子操作された抗原受容体をコードする遺伝子と；（２）免疫細胞の機能を弱める遺伝子の免疫細胞における発現を低下させるまたは低下させることができる遺伝子破壊剤とを同時にまたは任意の順序で連続して免疫細胞に導入し、それによって、遺伝子操作された抗原受容体が発現され、免疫細胞の機能を弱める遺伝子の発現が低下する免疫細胞を作り出すことを含む、免疫細胞を作り出す方法である。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された抗原受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された抗原受容体はＣＡＲである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞外抗原認識ドメインは、標的抗原に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖の細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは共刺激分子をさらに含む。
いくつかの実施形態では、共刺激分子はＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７、及びＣＤ２８から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、共刺激分子はＣＤ１３７（４－１ＢＢ）である。いくつかの実施形態では、共刺激分子はＣＤ２８である。
いくつかの実施形態では、標的抗原は、がん細胞、がん組織及び／または腫瘍の微小環境の細胞表面上で発現される。いくつかの実施形態では、標的抗原は、その発現ががん細胞、がん組織及び／または腫瘍微小環境にて増加するがん抗原、またはがん抗原の変異した形態である。
いくつかの実施形態では、その発現ががん細胞、がん組織及び／または腫瘍微小環境にて増加するがん抗原は、５Ｔ４（栄養膜糖タンパク質）、７０７－ＡＰ、９Ｄ７、ＡＦＰ（α－フェトプロテイン）、ＡｌｂＺＩＰ（アンドロゲン誘導のｂＺＩＰ）、ＨＰＧ１（ヒト前立腺特異的遺伝子－１）、α５β１－インテグリン、α５β６－インテグリン、α－メチルアシル－補酵素Ａラセマーゼ、ＡＲＴ－４（ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ－４）、Ｂ７Ｈ４（ｖ－セットドメイン含有Ｔ－細胞活性化阻害剤１）、ＢＡＧＥ－１（Ｂメラノーマ抗原－１）、ＢＣＬ－２（Ｂ－細胞 ＣＬＬ／リンパ腫－２）、ＢＩＮＧ－４（ＷＤ反復ドメイン４６）、ＣＡ１５－３／ＣＡ２７－２９（ムチン１）、ＣＡ１９－９（がん抗原１９－９）、ＣＡ７２－４（がん抗原７２－４）、ＣＡ１２５（がん抗原１２５）、カルレチクリン、ＣＡＭＥＬ（メラノーマ上のＣＴＬ認識抗原）、ＣＡＳＰ－８（カスパーゼ８）、カテプシンＢ、カテプシンＬ、ＣＤ１９（分化抗原群１９）、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＥＡ（がん胎児性抗原ＳＧ８）、ＣＬＣＡ２（塩化物チャネルアクセサリー２）、ＣＭＬ２８（慢性骨髄性白血病腫瘍抗原２８）、コアクトシン様タンパク質、コラーゲンＸＸＩＩＩ、ＣＯＸ－２（シクロオキシゲナーゼ－２）、ＣＴ－９／ＢＲＤ６（がん／精巣抗原９）、Ｃｔｅｎ（ｃ－末端テンシン様タンパク質）、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、ｃｙｐ－Ｂ、ＣＹＰＢ１（チトクロームｐ４５０ファミリー１サブファミリーｂメンバー１）、ＤＡＭ－１０／ＭＡＧＥ－Ｂ１（メラノーマ関連抗原Ｂ１）、ＤＡＭ－６／ＭＡＧＥ－Ｂ２、ＥＧＦＲ／Ｈｅｒ１（表皮増殖因子受容体）、ＥＭＭＰＲＩＮ（ベイシジン）、ＥｐＣａｍ、ＥｐｈＡ２（ＥＰＨ受容体Ａ２）、ＥｐｈＡ３、ＥｒｂＢ３（Ｅｒｂ－Ｂ２受容体チロシンキナーゼ３）、ＥＺＨ２（ｚｅｓｔｅ２ポリコーム抑制性複合体２サブユニットのエンハンサー）、ＦＧＦ－５（線維芽細胞増殖因子５）、ＦＮ（フィブロネクチン）、Ｆｒａ－１（Ｆｏｓ関連抗原－１）、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ（炭酸脱水酵素９）、ＧＡＧＥ－１（Ｇ抗原－１）、ＧＡＧＥ－２、ＧＡＧＥ－３、ＧＡＧＥ－４、ＧＡＧＥ－５、ＧＡＧＥ－６、ＧＡＧＥ－７ｂ、ＧＡＧＥ－８、ＧＤＥＰ（前立腺にて差次的に発現される遺伝子）、ＧｎＴ－Ｖ（グルコン酸キナーゼ）、ｇｐ１００（メラニン細胞系列特異的抗原ＧＰ１００）、ＧＰＣ３（グリピカン３）、ＨＡＧＥ（らせん抗原）、ＨＡＳＴ－２（スルホトランスフェラーゼファミリー１Ａメンバー１）、ヘプシン、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２（Ｅｒｂ－Ｂ２受容体チロシンキナーゼ２）、ＨＥＲＶ－Ｋ－ＭＥＬ、ＨＮＥ（メデュラシン）、ホメオボックスＮＫＸ３．１、ＨＯＭ－ＴＥＳ－１４／ＳＣＰ－１、ＨＯＭ－ＴＥＳ－８５、ＨＰＶ－Ｅ６、ＨＰＶＥ７、ＨＳＴ－２（シルツイン－２）、ｈＴＥＲＴ、ｉＣＥ（カスパーゼ１）、ＩＧＦ－１Ｒ（インスリン様増殖因子－１受容体）、ＩＬ－１３Ｒａ２（インターロイキン－１３受容体サブユニットα２）、ＩＬ－２Ｒ（インターロイキン－２受容体）、ＩＬ－５（インターロイキン－５）、未成熟ラミニン受容体、カリクレイン２、カリクレイン４、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５（リソホスファチジルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１）、ＫＫ－ＬＣ－１（北九州肺癌抗原－１）、ＫＭ－ＨＮ－１、ＬＡＧＥ－１（Ｌ抗原ファミリーメンバー－１）、リビン、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥＡ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ｂ１、ＭＡＧＥ－Ｂ１０、ＭＡＧＥ－Ｂ１６、ＭＡＧＥＢ１７、ＭＡＧＥ－Ｂ２、ＭＡＧＥ－Ｂ３、ＭＡＧＥ－Ｂ４、ＭＡＧＥ－Ｂ５、ＭＡＧＥ－Ｂ６、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＭＡＧＥ－Ｃ３、ＭＡＧＥ－Ｄ１、ＭＡＧＥ－Ｄ２、ＭＡＧＥ－Ｄ４、ＭＡＧＥ－Ｅ１、ＭＡＧＥ－Ｅ２、ＭＡＧＥ－Ｆ１、ＭＡＧＥ－Ｈ１、ＭＡＧＥＬ２（メラノーマ抗原ファミリーＬ２）、ママグロビンＡ、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ（Ｔ－細胞－１によって認識されるメラノーマ抗原）、ＭＡＲＴ－２、マトリクスタンパク質２２、ＭＣ１Ｒ（メラノコルチン１受容体）、Ｍ－ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）、メソテリン、ＭＧ５０／ＰＸＤＮ（ペルオキシダシン）、ＭＭＰ１１（マトリクスメタロプロテイナーゼ１１）、ＭＮ／ＣＡ ＩＸ－抗原（炭酸脱水酵素９）、ＭＲＰ－３（多剤耐性関連タンパク質－３）、ＭＵＣ１（ムチン１）、ＭＵＣ２、ＮＡ８８－Ａ（ＶＥＮＴ様ホメオボックス２偽遺伝子１）、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ－Ｖ、Ｎｅｏ－ＰＡＰ（Ｎｅｏ－ポリ（Ａ）ポリメラーゼ）、ＮＧＥＰ（前立腺で発現される新しい遺伝子）、ＮＭＰ２２（核マトリクスタンパク質２２）、ＮＰＭ／ＡＬＫ（ヌクレオホスミン）、ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－Ｂ、ＯＡ１（変形性関節症ＱＴＬ１）、ＯＦＡ－ｉＬＲＰ（がん胎児性抗原未成熟ラミニン受容体タンパク質）、ＯＧＴ（Ｏ－ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ）、ＯＳ－９（小胞体レクチン）、オステオカルシン、オステオポンチン、ｐ１５（ＣＤＫ阻害剤２Ｂ）、ｐ５３、ＰＡＧＥ－４（Ｐ抗原ファミリーメンバー－４）、ＰＡＩ－１（プラスミノーゲン活性化因子阻害剤－１）、ＰＡＩ－２、ＰＡＰ（前立腺酸ホスファターゼ）、ＰＡＲＴ－１（前立腺アンドロゲン調節転写物１）、ＰＡＴＥ（前立腺及び精巣で発現された１）、ＰＤＥＦ（前立腺由来のＥｔｓ因子）、Ｐｉｍ－１－キナーゼ（プロウイルス組み込み部位１）、Ｐｉｎ１（ペプチジル－プロリルｃｉｓ－ｔｒａｎｓイソメラーゼＮＩＭＡ－相互作用１）、ＰＯＴＥ（前立腺、卵巣、精巣、及び胎盤で発現される）、ＰＲＡＭＥ（メラノーマで優先的に発現される抗原）、プロステイン、プロテイナーゼ－３、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、ＰＳＧＲ（前立腺特異的Ｇ－タンパク質共役受容体）、ＰＳＭ、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＲＡＧＥ－１（腎腫瘍癌腫抗原）、ＲＨＡＭＭ／ＣＤ１６８、ＲＵ１（腎遍在タンパク質１）、ＲＵ２、ＳＡＧＥ（肉腫抗原）、ＳＡＲＴ－１（Ｔ－細胞－１によって認識される扁平上皮細胞癌腫抗原）、ＳＡＲＴ－２、ＳＡＲＴ－３、Ｓｐ１７（精子タンパク質１７）、ＳＳＸ－１（ＳＳＸファミリーメンバー１）、ＳＳＸ－２／ＨＯＭ－ＭＥＬ－４０、ＳＳＸ－４、ＳＴＡＭＰ－１（ＳＴＥＡＰ２ メタロレダクターゼ）、ＳＴＥＡＰ、サバイビン、サバイビン－２１３、ＴＡ－９０（腫瘍関連抗原－９０）、ＴＡＧ－７２（腫瘍関連糖タンパク質－７２）、ＴＡＲＰ（ＴＣＲγ代替リーディングフレームタンパク質）、ＴＧＦｂ（形質転換増殖因子β）、ＴＧＦｂＲ１１（形質転換増殖因子β受容体１１）、ＴＧＭ－４（トランスグルタミナーゼ４）、ＴＲＡＧ－３（タキソール耐性関連遺伝子３）、ＴＲＧ（Ｔ－細胞受容体γ遺伝子座）、ＴＲＰ－１（一過性受容体ポテンシャル－１）、ＴＲＰ－２／６ｂ、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、Ｔｒｐ－ｐ８、チロシナーゼ、ＵＰＡ（Ｕ－プラスミノーゲン活性化因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子Ａ）、ＶＥＧＦＲ－２／ＦＬＫ－１、及びＷＴ１（ウィルムス腫瘍１）から成る群から選択される。
いくつかの実施形態では、標的抗原はＣＤ１９またはＣＤ２２である。いくつかの実施形態では、標的抗原はＣＤ１９である。
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原の変異した形態は、α－アクチニン－４／ｍ、ＡＲＴＣ１／ｍ、ｂｃｒ／ａｂｌ、ベータ－カテニン／ｍ、ＢＲＣＡ１／ｍ、ＢＲＣＡ２／ｍ、ＣＡＳＰ－５／ｍ、ＣＡＳＰ－８／ｍ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ／ｍ、ＣＭＬ６６、ＣＯＡ－１／ｍ、ＤＥＫ－ＣＡＮ、ＥＦＴＵＤ２／ｍ、ＥＬＦ２／ｍ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１、ＦＮ１／ｍ、ＧＰＮＭＢ／ｍ、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１－Ｒ１７０Ｉ、ＨＬＡ－Ａ１１／ｍ、ＨＬＡ－Ａ２／ｍ、ＨＳＰ７０－２Ｍ、ＫＩＡＡ０２０５／ｍ、Ｋ－Ｒａｓ／ｍ、ＬＤＬＲ－ＦＵＴ、ＭＡＲＴ２／ｍ、ＭＥ１／ｍ、ＭＵＭ－１／ｍ、ＭＵＭ－２／ｍ、ＭＵＭ－３／ｍ、ミオシンクラス１／ｍ、ｎｅｏ－ＰＡＰ／ｍ、ＮＦＹＣ／ｍ、Ｎ－Ｒａｓ／ｍ、ＯＧＴ／ｍ、ＯＳ－９／ｍ、ｐ５３／ｍ、Ｐｍｌ／ＲＡＲａ、ＰＲＤＸ５／ｍ、ＰＴＰＲＸ／ｍ、ＲＢＡＦ６００／ｍ、ＳＩＲＴ２／ｍ、ＳＹＴＳＳＸ－１、ＳＹＴ－ＳＳＸ－２、ＴＥＬ－ＡＭＬ１、ＴＧＦｂＲＩＩ、及びＴＰＩ／ｍから成る群から選択される。
いくつかの実施形態では、免疫細胞の機能を弱める遺伝子の発現は、以下のうちの１つ以上を引き起こす：（ｉ）免疫細胞の増殖を阻害する；（ｉｉ）免疫細胞の細胞死を誘導する；（ｉｉｉ）免疫細胞が標的抗原を認識する及び／または活性化されるために必要な分子の機能を阻害する；（ｉｖ）標的抗原に対する免疫応答を引き起こす代わりに、異なる機能を担う異なる種類への免疫細胞の分化を誘導する；（ｖ）免疫細胞の免疫応答を促進する分子との免疫細胞の反応を低下させる；または（ｖｉ）免疫細胞の免疫応答を抑制する分子との免疫細胞の反応を高める。
いくつかの実施形態では、免疫細胞の機能を弱める遺伝子は、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、ＣＤ９６、ＭｅｒＴＫ、２Ｂ４、ＦＡＳ、ＣＤ４５、ＰＰ２Ａ、ＳＨＰ１、ＳＨＰ２、ＤＧＫアルファ、ＤＧＫゼータ、Ｃｂｌ－ｂ、Ｃｂｌ－ｃ、ＣＤ１４８、ＬＲＲ１、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＫＬＧＲ１、ＤＮＭＴ３Ａ、及びＡ２ａＲから成る群から選択される。いくつかの実施形態では、免疫細胞の機能を弱める遺伝子は、免疫細胞の免疫応答を抑制する分子との免疫細胞の反応を高める。いくつかの実施形態では、免疫細胞の免疫応答を抑制する分子との免疫細胞の反応を高める遺伝子は免疫チェックポイントの受容体またはリガンドをコードする。
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイントの受容体またはリガンドは、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、ＣＤ９６、ＭｅｒＴＫ及び２Ｂ４から成る群から選択される。
いくつかの実施形態では、遺伝子破壊剤は、遺伝子破壊剤の非存在下での免疫細胞と比べて、免疫細胞の機能を弱める免疫細胞における遺伝子の発現を少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または９５％低下させる。いくつかの実施形態では、遺伝子破壊剤は、免疫細胞の免疫応答を抑制する分子との免疫細胞の反応を高める遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、遺伝子破壊剤は免疫チェックポイントの受容体またはリガンドをコードする遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、遺伝子破壊剤は、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、ＣＤ９６、ＭｅｒＴＫ及び２Ｂ４から成る群から選択される遺伝子の発現を低下させる。
いくつかの実施形態では、遺伝子破壊剤は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって免疫細胞の機能を弱める遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、１を超える遺伝子破壊剤が、ＲＮＡｉによって免疫細胞における免疫細胞の機能を弱める遺伝子の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、遺伝子破壊剤は免疫細胞の機能を弱める単一の遺伝子の異なる部分を標的とする、免疫細胞の機能を弱める異なる遺伝子を標的とする、またはそれらの任意の組み合わせで遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉには短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が介在する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉには１を超えるｓｈＲＮＡが介在する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉには２つのｓｈＲＮＡが介在する。いくつかの実施形態では、２つのｓｈＲＮＡはＰＤ－１の異なる部分を標的とする。いくつかの実施形態では、２つのｓｈＲＮＡはそれぞれＰＤ－１及びＴＩＭ－３を標的とする。いくつかの実施形態では、２つのｓｈＲＮＡはそれぞれＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４を標的とする。いくつかの実施形態では、２つのｓｈＲＮＡはそれぞれＰＤ－１及びＬＡＧ－３を標的とする。いくつかの実施形態では、２つのｓｈＲＮＡはそれぞれＰＤ－１及びＴＩＧＩＴを標的とする。
いくつかの実施形態では、ｓｈＲＮＡをコードする塩基配列は、配列番号１～２１９及び２３８～２６７から成る群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、異なるｓｈＲＮＡの発現は異なるプロモーターによってそれぞれ調節される。いくつかの実施形態では、２つの異なるｓｈＲＮＡの発現は２つの異なるプロモーターによってそれぞれ調節される。いくつかの実施形態では、２つの異なるプロモーターはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターである。いくつかの実施形態では、２つのプロモーターは異なる種に由来するＵ６プロモーターである。いくつかの実施形態では、２つのプロモーターは互いに異なる方向に向けられる。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された抗原受容体及び遺伝子破壊剤はそれぞれベクターから発現される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された抗原受容体及び遺伝子破壊剤は同じベクターから発現される。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びレトロウイルスベクターから成る群から選択される。いくつかの実施形態では、ベクターはレンチウイルスベクターである。
「免疫細胞」は、キラーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞及びＢ細胞、ナチュラルキラー細胞のようなリンパ球、肥満細胞、好酸球、好塩基球から選択されることを特徴としてもよく；食細胞にはマクロファージ、好中球、及び樹状細胞が含まれる。Ｔ細胞にはＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞リンパ腫は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫、縦隔グレーゾーンリンパ腫、または結節性硬化症ＨＬである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞リンパ腫は、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、他に特定されていない末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）、または血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）である。好ましい実施形態では、免疫細胞は、ヒト由来のＴ細胞またはＴリンパ球及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
いくつかの実施形態では、免疫細胞はもともと患者に由来する細胞から作り出される。いくつかの実施形態では、対象はヒトであることができる。いくつかの実施形態では、ヒトは健常なドナーであることができる。他の実施形態では、対象は腫瘍またはがんを有することを特徴としてもよく、その際、細胞内で発現されたＣＡＲまたはＴＣＲ、例えば、ｍＴＣＲによって標的とされるがん抗原のレベルの上昇または変動が検出される。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，９０５，６８０号、同第６，６９２，９６４号、同第５，８５８，３５８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８１号、同第７，１４４，５７５号、同第７，０６７，３１８号、同第７，１７２，８６９号、同第７，２３２，５６６号、同第７，１７５，８４３号、同第５，８８３，２２３号、同第６，９０５，８７４号、同第６，７９７，５１４号、同第６，８６７，０４１号、及び米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に記載されている方法を一般に用いて作り出されてもよく、増殖させてもよい。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞が作り出される。さらなる実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞の作製は末梢血モノクローナル細胞を提供する工程を含む。さらなる実施形態では、末梢血モノクローナル細胞は全血試料から分離することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているＣＡＲ－Ｔ細胞の作製は、抗体を用いて末梢血モノクローナル細胞を刺激する工程を含む。例として、一次刺激シグナルを提供する作用剤は抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片であり、共刺激シグナルを提供する作用剤は抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているＣＡＲ－Ｔ細胞の作製はＣＡＲの形質導入の工程を含み、その際、ＣＡＲは本明細書に記載されている任意の標的及びＣＡＲの他の既知の標的を標的とすることができ、例えば、ＣＡＲはＣＤ１９を標的とするＣＤ１９ ＣＡＲであることができる。いくつかの実施形態では、作り出されたＣＡＲ－Ｔ細胞は単離される。
Ｔ細胞培養に適切な条件には、血清（例えば、ウシ胎児またはヒトの血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦβ、及びＴＮＦ－α、または当業者に既知の細胞増殖のための任意の他の添加物を含む、増殖及び生存に必要な因子を含有してもよい適切な培地（例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０またはＸ－ｖｉｖｏ１５（Ｌｏｎｚａ））が含まれる。細胞の増殖のための他の添加物には、界面活性剤、プラスマネート、ならびに例えば、Ｎ－アセチルーシステイン及び２－メルカプトエタノールのような還元剤が挙げられるが、これらに限定されない。培地には、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及びビタミンが添加され、無血清である、または適切な量の血清（もしくは血漿）または定義されたセットのホルモン、及び／またはＴ細胞の増殖及び増加に十分な量のサイトカイン（複数可）を補充しているのいずれかのＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ１５、及びＸ－Ｖｉｖｏ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを挙げることができる。抗生物質、例えば、ペニシリン及びストレプトマイシンは、実験培養物にのみ含まれ、対象に注入される細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、成長を支援するのに必要な条件下、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）及び大気（例えば、空気＋５％ＣＯ２）で維持される。Ｔ細胞の培養時間が６０日間以上であることができるように、いくつかの刺激サイクルも所望されてもよい。
種々の刺激時間に曝露されているＴ細胞はさまざまな特徴を示してもよい。例えば、典型的な血液製剤またはアフェレーシス末梢血単核細胞製剤は、細胞傷害性Ｔ細胞またはサプレッサーＴ細胞の集団（ＴＣ、ＣＤ８）より大きいヘルパーＴ細胞の集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。ＣＤ３及びＣＤ２８の受容体を刺激することによるＴ細胞の生体外増殖は、約８～９日目より前では主にＴＨ細胞から成るＴ細胞の集団を生じる一方で、約８～９日目以降は、Ｔ細胞の集団は、次第にさらに多くのＴＣ細胞の集団を含む。したがって、治療の目的に応じて、ＴＨ細胞が優勢に構成するＴ細胞集団を対象に注入することが有利であってもよい。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットが単離されているならば、このサブセットをさらに大きな程度に増殖させることが有益であってもよい。さらに、ＣＤ４及びＣＤ８のマーカーに加えて、他の表現型マーカーは細胞増殖プロセスの過程の間に著しく変化するが、大部分は再現可能に変化する。したがって、そのような再現性によって、特定の目的のために活性化されたＴ細胞製剤を誂える能力が可能になる。
種々のアッセイを用いて、ＣＡＲ－Ｔ細胞を評価する、例えば、抗原刺激に続いて増殖する能力、再刺激の非存在下でＴ細胞の増殖を持続させる能力、及び適切な試験管内及び動物のモデルにおける抗がん活性を評価することができる。アッセイは以下にさらに詳細に記載されている。
いくつかの実施形態では、初代Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現のウエスタンブロット解析を用いて、単量体及び二量体の存在を検出することができる。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，１７（８）：１４５３－１４６４（２００９）を参照のこと。
いくつかの実施形態では、抗原刺激に続くＣＡＲ＋Ｔ細胞の試験管内増殖はフローサイトメトリーによって測定することができる。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物はαＣＤ３／αＣＤ２８によって刺激され、その後、分析されるプロモーターの制御下でＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターによる形質導入が続く。例示的なプロモーターには、ＣＭＶ ＩＥ遺伝子、ＥＦ－１ａ、ユビキチンＣ、またはホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）のプロモーターが挙げられる。ＧＦＰ蛍光は、ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞のサブセットにて培養の６日目にフローサイトメトリーによって評価する。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，１７（８）：１４５３－１４６４（２００９）を参照のこと。あるいは、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物は、αＣＤ３／αＣＤ２８をコーティングした磁気ビーズによって０日目に刺激され、２Ａリボゾームスキッピング配列を用いてｅＧＦＰと共にＣＡＲを発現している２シストロン性のレンチウイルスベクターを用いて１日目にＣＡＲで形質導入する。培養物は、例えば、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の存在下でｈＣＤ３２及び４－ＩＢＢＬを発現しているＫ５６２細胞で再刺激され（Ｋ５６２－ＢＢＬ－３／２８）、その後、洗浄が続く外来性ＩＬ－２が１００ＩＵ／ｍｌで１日おきに培養に添加される。ＧＦＰ＋Ｔ細胞は、ビーズに基づくカウントを用いてフローサイトメトリーによって数えられる。例えば、Ｍｉｌｏｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，１７（８）：１４５３－１４６４（２００９）を参照のこと。再刺激の非存在下でのＣＡＲ＋Ｔ細胞の持続した増殖も測定することができる。
細胞の増殖及びサイトカイン産生の評価は、例えば、Ｍｉｌｏｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，１７（８）：１４５３－１４６４（２００９）にて以前記載されている。手短に言えば、ＣＡＲが介在する増殖の評価は、マイクロタイタープレートにて、洗浄したＴ細胞を標的細胞、例えば、Ｋ５６２－Ｍｅｓｏ、Ｏｖｃａｒ３、Ｏｖｃａｒ８、ＳＷ１９９０、Ｐａｎｃ０２．０３細胞またはＣＤ３２及びＣＤ１３７（ＫＴ３２－ＢＢＬ）と１：１のＴ細胞：標的細胞の最終比で混合することによって実施される。これらのシグナルが長期の生体外でのＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を支えるので、抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）及び抗ＣＤ２８（クローン９．３）モノクローナル抗体をＫＴ３２－ＢＢＬ細胞との培養物に添加して、Ｔ細胞増殖を刺激するための陽性対照として役立てる。製造元によって記載されているように、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ（商標）蛍光ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）及びフローサイトメトリーを用いて培養物にてＴ細胞を数える。ＣＡＲ＋Ｔ細胞は、ｅＧＦＰ－２Ａを連結したＣＡＲを発現しているレンチウイルスベクターで操作されているＴ細胞を用いて、ＧＦＰ発現によって同定される。Ｔ細胞でのＣＤ４＋及びＣＤ８＋の発現は特異的なモノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によっても同時に検出される。サイトカイン測定は製造者の指示書に従って、ヒトＴＨ１／ＴＨ２サイトカイン細胞測定ビーズアレイキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、再刺激の２４時間後に回収した上清で実施する。蛍光はＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いて評価し、データは製造者の指示書に従って分析する。
細胞傷害性は、例えば、実施例にて本明細書に記載されている方法によってまたは標準的な５１Ｃｒ放出アッセイによって評価することができる（Ｍｉｌｏｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，１７（８）：１４５３－１４６４（２００９））。手短に言えば、標的細胞（例えば、ＢＨＫまたはＣＨＯ細胞）に５１Ｃｒ（ＮａＣｒＯ４，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を３７℃で２時間頻繁に攪拌しながら負荷し、完全ＲＰＭＩで２回洗浄し、マイクロタイタープレートに入れる。エフェクターＴ細胞はエフェクター細胞：標的細胞の種々の比率（Ｅ：Ｔ）で完全ＲＰＭＩにてウェル内の標的細胞と混合する。培地のみを含有する追加のウェル（自然放出、ＳＲ）または１％のｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００界面活性剤（総放出、ＴＲ）の溶液も調製する。３７℃で４時間インキュベートした後、各ウェルの上清を回収する。次いで、放出された５１Ｃｒはガンマ粒子カウンター（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて測定する。各条件は少なくとも３つ組で実施し、溶解の比率は式：％溶解＝（ＥＲ－ＳＲ）／（ＴＲ－ＳＲ）を用いて算出し、ここでＥＲは各実験条件で放出された平均５１Ｃｒを表す。フローベースの細胞傷害性アッセイのような代替の細胞傷害性アッセイも使用されてもよい。
本明細書の実施例のセクションに記載されているもの、と同様に当該技術分野で知られているものを含む他のアッセイも、本明細書で作製されるＣＡＲ－Ｔ細胞を評価するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書で生成される免疫細胞は、２種類のｓｈＲＮＡ及びＣＡＲまたはＴＣＲ、例えばｍＴＣＲによって標的とされる抗原が発現される疾患に対する免疫応答に関与することができる。さらなる実施形態では、免疫細胞を用いて、ヒト患者の免疫療法のための医薬組成物を提供することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、重篤な有害反応を引き起こし、さらに患者に高コストを負担させる可能性がある免疫チェックポイント阻害剤を必要とすることなく、標的疾患に対して治療効果を示すことができる。
いくつかの実施形態では、免疫細胞を免疫細胞治療剤として使用することができ；そのような免疫細胞は普通、がんの治療に使用されるが、これらに限定されない。さらなる実施形態では、これらの免疫細胞にがんを認識させるために、それらはがん抗原を標的とする細胞表面受容体を発現するように改変される。
別の態様では、本明細書で提供されるのは上記に記載されている操作された免疫細胞を含む組成物である。
５．１以上の免疫チェックポイントを標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞を用いた治療
本明細書で提供されているように、１つで２つの機能があるベクターは免疫細胞の機能を弱める遺伝子の発現を阻害する１以上の種類の短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする塩基配列と、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、モノクローナルＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）のいずれか１つをコードする塩基配列とを含む。一実施形態に従ってベクターを用いて、免疫細胞を作製することができ、その際、免疫細胞は免疫チェックポイント受容体の低下した発現を有し、標的分子に特異的なＣＡＲまたはＴＣＲ、例えばｍＴＣＲを発現する。前記免疫細胞を用いて免疫療法のための医薬組成物を提供することができる。
養子免疫療法に好適な対象に本明細書に記載されているような免疫細胞を導入することによって、種々の疾患が改善されてもよい。いくつかの実施形態では、提供されるような作製されたＣＡＲ－Ｔ細胞は同種養子細胞療法のためのものである。本明細書でさらに提供されるのは、養子細胞療法に好適な対象に組成物を導入することを含む、本明細書に記載されている組成物の治療的使用であり、その際、対象は自己免疫疾患；血液悪性腫瘍；固形腫瘍；または、ＨＩＶ、ＲＳＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、ＢＫポリオーマウイルスに関連する感染症を有する。
血液悪性腫瘍の例には、急性及び慢性の白血病（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ））、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキン病、多発性骨髄腫、及び骨髄異形成症候群が挙げられるが、これらに限定されない。固形がんの例には、脳、前立腺、乳腺、肺、結腸、子宮、皮膚、肝臓、骨、膵臓、卵巣、精巣、膀胱、腎臓、頭部、頚部、胃、子宮頚部、直腸、喉頭及び食道のがんが挙げられるが、これらに限定されない。種々の自己免疫障害の例には、円形脱毛症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚筋炎、糖尿病（１型）、若年性特発性関節炎のいくつかの形態、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、いくつかの形態の心筋炎、多発性硬化症、天疱瘡／類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、強皮症／全身性硬化症、シェーグレン症候群、全身性ループス、エリテマトーデス、甲状腺炎のいくつかの形態、ブドウ膜炎のいくつかの形態、白斑、多発血管炎を伴う肉芽腫症（ウェゲナー病）が挙げられるが、これらに限定されない。ウイルス性感染症の例には、ＨＩＶ－（ヒト免疫不全ウイルス）、ＨＳＶ－（単純ヘルペスウイルス）、ＫＳＨＶ－（カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス）、ＲＳＶ－（呼吸器合胞体ウイルス）、ＥＢＶ－（エプスタイン－バーウイルス）、ＣＭＶ－（サイトメガロウイルス）、ＶＺＶ（水痘帯状疱疹ウイルス）、アデノウイルス－、レンチウイルス－、ＢＫポリオーマウイルスに関連する疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
急性白血病は、未熟な血液細胞の急速な増殖を特徴とする。この過密状態により、骨髄は健康な血液細胞を産生できなくなる。急性型の白血病は小児及び若年成人に発生し得る。実際、それは他のどの種類の悪性疾患よりも米国の小児たちにとって一層一般的な死因である。急性白血病では、悪性細胞の急速な進行と蓄積が原因で即時の治療が必要であり、次いで悪性細胞は血流に溢れ出して身体の他の臓器に広がる。中枢神経系（ＣＮＳ）の関与はまれであるが、この疾患は時々脳神経麻痺を引き起こし得る。慢性白血病は、比較的成熟しているが依然として異常な血液細胞の過剰な蓄積によって区別される。通常、進行に数ヵ月から数年かかり、細胞は正常な細胞よりもはるかに速い速度で産生され、その結果、血液中に多くの異常な白血球が生じる。慢性白血病は主に年長者で発生するが、理論的にはどの年齢層でも発生し得る。急性白血病は直ちに治療しなければならないのに対し、慢性形態は治療の最大の効果を確実にするために治療前にしばらくモニターされることがある。さらに、疾患は、通常はリンパ球を形成するように進む骨髄細胞のある種でがん性の変化が起こったことを示すリンパ球性またはリンパ芽球性、及び通常は赤血球、一部の種類の白血球、血小板を形成するように進む骨髄細胞のある種でがん性の変化が起こったことを示す骨髄で生じたまたは骨髄性（リンパ系細胞と骨髄系細胞を参照）に分類される。
急性リンパ性白血病（急性リンパ芽球性白血病、またはＡＬＬとしても知られる）は小児における最も一般的なタイプの白血病である。この疾患は成人、特に６５歳以上にも発症する。慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）は５５歳を超える成人に最もよく発症する。それは若年成人に時々発生するが、小児にはほとんど発症しない。急性骨髄性白血病（急性骨髄性白血病、またはＡＭＬとしても知られる）は小児よりも成人に多く発生する。この種の白血病は以前は「急性非リンパ性白血病」と呼ばれていた。慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）は主として成人に発生する。ごく少数の小児もこの病気を発症する。
リンパ腫は、リンパ球（脊椎動物の免疫システムにおける白血球の一種）で発生するがんの一種である。リンパ腫には多くの種類がある。米国国立衛生研究所によれば、リンパ腫は米国におけるがんの症例すべての約５％を占め、特にホジキンリンパ腫は米国におけるがんの症例すべての１％未満を占める。リンパ系は生体の免疫系の一部であるので、ＨＩＶ感染または特定の薬剤や薬物などによって免疫系が弱っている患者もリンパ腫の高い発生率を有する。
１９世紀及び２０世紀には、１８３２年にトーマスホジキンによって発見されたので、この病気はホジキン病と呼ばれていた。口語的に、リンパ腫はホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫（他のすべての種類のリンパ腫）に大別される。リンパ腫の種類の科学的分類はさらに詳細である。古い分類は組織球性リンパ腫を指していたが、これらはＢ、Ｔ、またはＮＫの細胞系列のものとしてさらに新しい分類で認識されている。
ＣＡＲまたはＴＣＲ、例えば、ｍＴＣＲの標的分子が発現されているがんを有する患者に医薬組成物を投与すると、医薬組成物は、がん細胞に関する免疫細胞の機能を弱める遺伝子を活性化しないで、且つそれによって引き起こされる活性化阻害シグナル伝達に起因する疲弊のような問題を起こさずに、がんを認識し、免疫活性を有することができる。
いくつかの実施形態では、免疫細胞を含む上記の医薬組成物は、免疫チェックポイント受容体の発現をさらに効果的に抑制することができる一方で同時に、キメラ抗原受容体が機能することができる抗がん免疫細胞療法の有効性を最大化することができる。さらなる実施形態では、上記に記載されているように免疫チェックポイント受容体の発現が抑制されている細胞が医薬組成物に使用されるので、免疫チェックポイント受容体の別の阻害剤の使用に起因してもよいサイトカイン放出症候群または自己免疫症状のような重篤且つ全身性の有害反応を、ならびに細胞療法との高価な抗体療法の併用から生じる治療コストの増加による負担を排除することが可能である。
細胞に加えて、免疫応答をさらに改善し得る他の薬学的に許容される塩、担体、賦形剤、ビヒクル及び他の添加剤等が医薬組成物に添加されてもよいことは自明であるので、その詳細な説明は省略されるべきである。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載されているような２つの免疫チェックポイントを標的とする二重ＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。例えば、二重免疫チェックポイントは、ＰＤ１（プログラム細胞死タンパク質１）、ＰＤ－Ｌ１（プログラム死リガンド１）、ＣＴＬＡ４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４）、ＴＩＭ－３（Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有－３）、ＣＥＡＣＡＭ（３つのサブタイプＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３またはＣＥＡＣＡＭ－５を含む癌胎児性抗原関連細胞接着分子）、ＬＡＧ３（リンパ球活性化遺伝子３）、ＶＩＳＴＡ（Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー）、ＢＴＬＡ（Ｂ及びＴリンパ球減衰因子）、ＴＩＧＩＴ（Ｉｇ及びＩＴＩＭのドメインを持つＴ細胞免疫受容体）、ＬＡＩＲ１（白血球関連免疫グロブリン様受容体１）、ＣＤ１６０（分化抗原群１６０）、ＣＤ９６（分化抗原群９６）、ＭｅｒＴＫ（癌原遺伝子チロシンタンパク質キナーゼＭＥＲ）、及び２Ｂ４（ＮＫ細胞活性化誘導リガンド）から成る群から選択することができ、例えば、ＰＤ１とＴＩＭ３の間で選択されてもよい。
いくつかの実施形態では、標的とされる免疫チェックの種類は、医薬組成物の抗腫瘍効果に影響を与える。例えば、ＰＤ－１及びＴＩＭ３を標的とする医薬組成物は、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴを標的とする医薬組成物とは異なるレベルの抗腫瘍効果を示すことができる。さらなる実施形態では、抗腫瘍効果における前記差異は、同じ免疫チェックポイントを標的とする他の薬剤の抗腫瘍効果に関する既知の知識から予測不可能であり、例えば、他の薬剤は免疫チェックポイントを標的とする抗体を含むことができる。いくつかの実施形態では、特定の２つの免疫チェックポイントを標的とすることは、驚くほど高い抗腫瘍効果を生み出すことができる。例示的な実施形態（実施例１０）では、ＰＤ－１とＴＩＧＩＴを標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＰＤ－１とＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１とＬＡＧ－３及びＰＤ－１とＴＩＭ－３の組み合わせを標的とする他の二重ＫＤ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して驚くほど優れた抗腫瘍効果を示す。
一態様では、本明細書に記載されている組成物は、単位剤形で提供することができ、各用量単位、例えば注射は、単独でまたは他の活性剤との適切な組み合わせで所定量の組成物を含有する。「単位剤形」という用語は本明細書で使用されるとき、ヒト及び動物の対象についての単位投与量として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位は、所望の効果を生じるのに十分な量で計算された所定量の本明細書に記載されている組成物を単独で、または他の活性剤との併用で、適宜薬学上に許容できる希釈剤、担体または媒体と関連して含有する。本明細書に記載されている細胞または組成物の新規の単位剤形の明細は、特定の対象における医薬組成物に関連する特定の薬力学に左右される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている細胞または組成物に好ましい医薬剤形は、本開示の内容及び製剤技術の一般知識に基づいて、ならびに意図される投与経路、送達方法及び標的用量に従って決定されてもよい。投与方法にかかわらず、患者の体重、表面積、または臓器の大きさに従って有効用量が算出されてもよい。本明細書に記載されたそれぞれの剤形を使用する治療に適切な投与量を決定するための計算、ならびに追加の精製は、当該技術分野で毎日実施され、当該技術分野で毎日実施される作業の範囲内に含まれる。適切な投与用量は、適切な用量反応データの使用を介して同定されてもよい。
本明細書に記載されている医薬組成物は、単独で、またはがんの治療に有用な他の既知の作用剤と組み合わせて使用することができる。単独でまたは他の作用剤と組み合わせて送達されるかどうかにかかわらず、本明細書に記載されている医薬組成物は、種々の経路を介して哺乳動物、特にヒトの身体の種々の部位に送達されて、特定の効果を達成することができる。当業者は、１を超える経路を投与に使用することができるが、特定の経路が別の経路よりもさらに迅速且つあらに効果的な反応を提供できることを認識するであろう。例えば、皮内送達は、黒色腫の治療のために吸入よりも有利に使用されてもよい。局所または全身性の送達は、体腔への製剤の適用もしくは点滴、エアロゾルの吸入もしくは吹送を含む投与によって、または筋肉内、静脈内、門脈内、肝内、腹腔内、皮下、もしくは皮内の投与を含む非経口導入によって達成することができる。対象への投与の例示的な経路には、静脈内（ＩＶ）注射、及び局所（腫瘍内、腹腔内）投与が挙げられる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は固形腫瘍への注入を介して投与することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるようなゲノム操作された免疫細胞に加えて、状態、疾患、または適応症に関連する抗原を標的とする抗体または抗体断片を含む追加の治療剤が、これらのエフェクター細胞と共に併用療法で使用されてもよい。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト化抗体、ヒト抗体モノクローナル抗体またはキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体または抗体断片はウイルス抗原に特異的に結合する。他の実施形態では、抗体または抗体断片は腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、投与されるゲノム操作された免疫細胞に対する追加の治療剤としての併用治療に好適な抗体は、抗ＣＤ２０（リツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ）、抗ＨＥＲ２（トラスツズマブ、パーツズマブ）、抗ＣＤ５２（アレムツズマブ）、抗ＥＧＦＲ（セルツキシマブ）、抗ＧＤ２（ジヌツキシマブ）、抗ＰＤＬ１（アベルマブ）、抗ＣＤ３８（ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２）、抗ＣＤ１２３（７Ｇ３、ＣＳＬ３６２）、抗ＳＬＡＭＦ７（エロツズマブ）；及びそれらのヒト化されたまたはＦｃ修飾された変異体または断片、またはそれらの機能的な同等物及びバイオ後続品が挙げられるが、これらに限定されない。
望ましくは、有効量または十分な数の単離された形質導入されたＴ細胞が組成物中に存在し、長期の特異的な抗腫瘍応答が確立されてそうでなければそのような治療の非存在下で生じるよりも腫瘍のサイズを小さくする、腫瘍の増殖または再増殖を排除するように、対象に導入される。望ましくは、対象に再導入された形質導入されたＴ細胞の量は、形質導入されたＴ細胞が存在しないこと以外では同じ条件と比較した場合の腫瘍サイズで１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または１００％の減少を引き起こす。
したがって、投与される形質導入されたＴ細胞の量は、投与経路を考慮に入れるべきであり、十分な数の形質導入されたＴ細胞が導入されて所望の治療反応が達成されるような量でなければならない。さらに、本明細書に記載されている組成物に含まれる各活性剤の量（例えば、接触される各細胞当たりの量または特定の体重当たりの量）はさまざまな応用において変化することができる。一般に、形質導入されたＴ細胞の濃度は望ましくは、少なくとも約１×１０６個～約１×１０９個の形質導入されたＴ細胞、一層さらに望ましくは約１×１０７個～約５×１０８個の形質導入されたＴ細胞を治療される対象にて提供するのに十分であるべきであるが、好適な量は、例えば５×１０８個の細胞を上回って、または１×１０７個の細胞を下回って利用することができる。投薬スケジュールは、確立された細胞ベースの治療法に基づくことができ（例えば、Ｔｏｐａｌｉａｎ及びＲｏｓｅｎｂｅｒｇ、１９８７；米国特許第４，６９０，９１５号を参照のこと）、または代替の連続注入戦略を採用することができる。
これらの値は、本明細書に記載されている方法を最適化する際に開業医によって利用される形質導入されたＴ細胞の範囲の一般的なガイダンスを提供する。そのような範囲の本明細書での列挙は、特定の応用で正当化され得るように、さらに多いまたはさらに少ない量の成分の使用を決して排除するものではない。例えば、実際の用量及びスケジュールは、組成物が他の医薬組成物と併用して投与されるかどうかに応じて、または薬物動態、薬物の体内動態、及び代謝における個人間の差異に応じて変化することができる。当業者は、特定の状況の緊急性に従って必要な調整を容易に行うことができる。
本明細書に記載されている組成物のいずれかがキットに含まれてもよい。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、細胞を増殖させるのに好適な試薬、例えば、培地、ａＡＰＣ、増殖因子、抗体（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞を選別するまたは特徴付けるための）、及び／またはＣＡＲもしくはトランスポザーゼをコードするプラスミドも含んでもよいキットにて提供される。
非限定的例では、キメラ受容体発現構築物、キメラ受容体発現構築物を生成するための１以上の試薬、発現構築物の形質移入のための細胞、及び／または発現構築物の形質移入のための同種細胞を得るための１以上の器具（そのような器具は、シリンジ、ピペット、鉗子及び／またはそのような医学的に承認された装置であってもよい）。
いくつかの実施形態では、内在性ＴＣＲα／βの発現を排除するための発現構築物、構築物を生成するための１以上の試薬、及び／またはＣＡＲ ＋ Ｔ細胞はキットにて提供されている。いくつかの実施形態では、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（複数の）をコードする発現構築物が含まれる。いくつかの態様では、キットは細胞のエレクトロポレーションのための試薬または装置を含む。
キットは、本明細書に記載されている１以上の好適に等分された組成物、または本明細書に記載されているような組成物を生成するための試薬を含んでもよい。キットの成分は、水性媒体または凍結乾燥形態のいずれかで包装されてもよい。キットの容器手段は、成分が入れられてもよく、特定の実施形態では好適に等分されてもよい少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または他の容器手段を含んでもよい。キットに１以上の成分がある場合、キットは一般に、追加の成分が別々に入れられてもよい２番目、３番目、または他の追加の容器も含有するであろう。しかしながら、成分のさまざまな組み合わせがバイアルに含まれてもよい。本明細書に記載されているキットはまた通常、商業的販売のために厳重に閉じ込められたキメラ受容体構築物及び任意の他の試薬の容器を含有するための手段も含むであろう。そのような容器は、例えば、所望のバイアルが保持される射出成形されたまたはブロー成形されたプラスチック容器を含んでもよい。
一態様では、本明細書で提供されるのは、上記に記載されている免疫細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。別の態様では、本明細書で提供されるのは、上述の免疫細胞を含むヒト患者の免疫療法のための医薬組成物である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はもともと患者に由来する。いくつかの実施形態では、患者は、細胞にて発現されたＣＡＲまたはＴＣＲ、例えば、ｍＴＣＲによって標的とされるがん抗原のレベルの増加または変動が検出される腫瘍またはがんを有する。
別の態様では、本明細書で提供されるのは方法である。いくつかの実施形態では、提供されるのは、疾患または状態を有する対象に上記に記載されている免疫細胞または上記に記載されている組成物を投与することを含む治療方法である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された抗原受容体は疾患または状態に関連する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、疾患または状態はがんまたは腫瘍である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは免疫細胞及び組成物である。いくつかの実施形態では、提供されるのは疾患または状態の治療に使用するための上記に記載されている免疫細胞及び組成物である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは免疫細胞または組成物の使用である。いくつかの実施形態では、提供されるのは疾患または状態を治療する方法にて使用するための薬物の製造における上記に記載されている免疫細胞または組成物の使用である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された抗原受容体は疾患または状態に関連する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、疾患または状態はがんまたは腫瘍である。
本発明の上記の記載は例示であることを意図したものであり、当業者は本発明の技術的思想または本質的な特徴を変更することなく、本発明が特定の他の形態に容易に改変されてもよいことを理解すべきである。したがって、上記に記載されている実施形態は例示的であり、すべての態様で限定するものではないことが理解されるべきである。例えば、統合されていると記載されている各構成要素が個別に実施されてもよいし、同様に個別に実施されていると記載されている構成要素が統合して実施されてもよい。
本発明の範囲は添付のクレームによって表され、クレーム及びそれと同等の概念の意味及び範囲に由来する改変されたまたは変更された形態すべては本発明の範囲内に含まれると解釈されるべきである。
配列表
Figure 0007068498000002
Figure 0007068498000003
Figure 0007068498000004
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Figure 0007068498000013
Figure 0007068498000014
本発明に関連する実施例を以下で説明する。ほとんどの場合、代替技法を使用することができる。実施例は、説明であることが意図され、本発明の範囲に対して限定するまたは制約するようには意図されない。
一般的な方法
細胞株及び培養。Ｎａｌｍ－６、Ｎａｌｍ－６ＧＬ（ＧＦＰ及びホタルルシフェラーゼを発現している）、Ｋ５６２、Ｋ５６２－ＣＤ１９、ＩＭ－９、Ｒａｊｉ、Ｄａｕｄｉの細胞株を３７℃での５％ＣＯ ２ の加湿インキュベーターにて１０％熱非働化ウシ胎児血清及び２ｍＭのＬ－グルタミンと１％ペニシリン／ストレプトマイシンで補完したＲＰＭＩ－１６４０で培養した。Ｌｅｎｔｉ－Ｘ（商標）２９３Ｔ細胞株はＴａｋａｒａから購入し、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ－グルタミン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンで補完したＤＭＥＭにて維持した。ＣＤ１９＋ＰＤ－Ｌ１＋細胞株を生成するために、Ｋ５６２－ＣＤ１９細胞またはＮＡＬＭ－６－ＧＬ細胞にヒトＰＤ－Ｌ１をコードするレンチウイルス（ＮＭ＿０１４１４３．３）で形質導入した。Ｎａｌｍ－６－ＰＤＬ１－ＣＤ８０細胞株は、ヒトＣＤ８０をコードするレンチウイルス（ＮＭ＿００５１９１．３）によるＮａｌｍ－６－ＰＤＬ１細胞の形質導入によって生成された。
プラスミドの構築。抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ（ＦＭＣ６３）と、ＣＤ８αヒンジ及び膜貫通領域と、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）及びＣＤ３ζの細胞質ドメインとを含有するｐＬＶ－ＣＤ１９－ＢＢｚベクターの構築は、以前に記載されている（ＰＮＡＳ，２０１６，Ｍａ ＪＳＹ）。ｐＬＶ－ＣＤ１９－２８ｚを生成するために、４－１ＢＢの細胞質ドメインをヒトＣＤ２８共刺激ドメインの配列で置き換えた。形質導入されたＣＡＲ－Ｔ細胞の検出と精製のために、ΔＬＮＧＦＲ（細胞質ドメインを切り詰めたＣＤ２７１）配列をｐＭＡＣＳ－ΔＬＮＧＦＲ（Ｍｉｌｔｅｎｙ Ｂｉｏｔｅｃ）ベクターから増幅し、Ｐ２Ａ配列を介してＣＡＲ－導入遺伝子の前に挿入して、ｐＬＶ－ΔＬＮＧＦＲ－ＣＤ１９－２８ｚまたはｐＬＶ－ΔＬＮＧＦＲ－ＣＤ１９－ＢＢｚを得た。
ＣＡＲとｓｈＲＮＡの双方の発現カセットをコードする１つで２つの機能があるＬＶベクターを生成するために、ｓｈＲＮＡ（連結配列；ＴＴＣＡＡＧＡＧＡ、終了配列；ＴＴＴＴＴ）とＰｏｌ ＩＩＩプロモーター（ｍＵ６、ｈＵ６またはｈＨ１）を含有するｓｈＲＮＡ発現カセットを合成し、セントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）の上流のＣＡＲをコードするＬＶベクターにサブクローニングした。異なるプロモーター（ｍＵ６とｈＵ６）によって２つのｓｈＲＮＡを発現する１つで２つの機能がある二重ベクターを生成するために、ＢｓｔＺ１７１－Ｘｂａ１－Ｎｄｅ１－Ｂｍｔ１－Ｓｐｅ１ ＭＣＳ配列をｈＵ６プロモーターの下流のｐＬＶ－ｈＵ６－ｓｈＰＤ－１＿ΔＬＮＧＦＲ－ＣＤ１９－ＢＢｚベクターに挿入した。２番目のｍＵ６－ｓｈＲＮＡカセット断片をＭＣＳにサブクローニングした。
レポーターベクターの確立のために、ｐＧＬ２＿ＮＦＡＴ－Ｌｕｃレポーター（ａｄｄｇｅｎｅ ＃１０９５９）に由来するＮＦＡＴＲＥ×３配列をＰＣＲによって増幅する。ＮＦ－ｋＢ－ＲＥ５×（５’－ＧＧＧＡＡＴＴＴＣＣ－３’）及びｍｉｎｉＰの配列を合成した（ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ｐＬＶ－ｅＧＦＰベクターのＥＦ－１ａプロモーターをこれらのレポーター断片で置き換え、ｐＬＶ－ＮＦＡＴ－ＲＥ ３×－ｅＧＦＰまたはｐＬＶ－ＮＦ－ｋＢ－ＲＥ ５×－ｅＧＦＰレポーターベクターを得た。
ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの配列の選択。阻害性免疫チェックポイント（ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、及びＴＩＭ－３）に特異的である２１塩基長のｓｉＲＮＡの候補配列は、合成前にＢＬＯＣＫ－ｉＴ（商標）ＲＮＡｉ ＤｅｓｉｇｎｅｒまたはＳｆｏｌｄのプログラムを用いて設計された。ＲＮＡオリゴマー。ＣＴＬＡ－４を標的とするｓｉＲＮＡは配列番号２５５～２６０から成る群から選択された。ＬＡＧ－３を標的とするｓｉＲＮＡは配列番号２４４～２５４から成る群から選択された。ＴＩＧＩＴを標的とするｓｉＲＮＡは配列番号２３８～２４３から成る群から選択された。ＴＩＭ－３を標的とするｓｉＲＮＡは配列番号２６１～２６４から成る群から選択された（ＩＤＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。免疫チェックポイントの発現動態を分析するために、ＰＢＭＣをヒト組換えＩＬ－２の存在下でＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）または４μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体及び２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体によって刺激した。免疫チェックポイントの発現レベルを１２日間（３日目、６日目、１２日目）分析した。最適なｓｉＲＮＡ配列の選択のために、刺激の２日後、ＰＢＭＣにＮｅｏｎ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いてｓｉＲＮＡオリゴマーをエレクトロポレーションで導入した。ｓｉＲＮＡのノックダウン効率は形質移入の２日後、フローサイトメトリーによって測定した。その効率に基づいて各免疫チェックポイントについて２～３のｓｉＲＮＡ配列を選択し、ｓｈＲＮＡ形式に変換して、１つで２つの機能がある二重レンチウイルスベクターを生成した。ｓｈＲＮＡが介在するノックダウン有効性を検証するために、レンチウイルスで形質導入したＴ細胞を１：１の比にてγ線照射したＫ５６２－ＣＤ１９細胞で３日間刺激し、フローサイトメトリーによって免疫チェックポイントのそれの発現レベルについて分析した。
フローサイトメトリー。抗ＣＤ１９ ＣＡＲの発現レベルは、ＡＦ６４７を結合した抗マウスＦ（ａｂ’）２抗体（１１５－６０６－０７２、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）またはＡＦ６４７を結合したストレプトアビジン（４０５２３７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と併せたビオチンを結合したｒｈＣＤ１９－Ｆｃ（ＣＤ９－Ｈ５２５９、ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって分析した。ΔＬＮＧＦＲ発現は、ＡＰＣまたはＦＩＴＣを結合した抗ＣＤ２７１抗体（ＭＥ２０．４－１．Ｈ４；Ｍｉｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって分析した。ＣＡＲ－Ｔ細胞における免疫チェックポイントの発現は、以下の抗体：ＰＤ－１（ＰＥ、クローンＪ１０５；Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、ＴＩＭ－３（ＰＥ、クローン３４４８２３；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＬＡＧ－３（ＰＥ、クローン７Ｈ２Ｃ６５；Ｂｉｏｌｇｅｎｄ）、ＴＩＧＩＴ（ＰＥ、クローンＭＢＳＡ４３；Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて従来のフローサイトメトリーによって測定した。
ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＴＬＡ－４発現は、照射したＮＡＬＭ－６細胞またはＫ５６２－ＣＤ１９細胞との１：１のＥ：Ｔ比での３日間のインキュベートの後、細胞内フローサイトメトリーによって分析した。細胞はＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で固定し／透過処理し、続いて抗ヒトＣＤ１５２（ＣＴＬＡ－４）抗体（ＰＥ、クローンＢＮＩ３；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）によって染色した。
腫瘍細胞上の刺激性または抑制性の免疫チェックポイントリガンドの発現を以下の抗体：ＣＤ８０（ＰＥ、クローン２Ｄ１０；Ｂｉｏｌｇｅｎｄ）、ＣＤ８６（ＢＶ４２１、クローン２３３１（ＦＵＮ－１）；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰＤ－Ｌ１（ＡＰＣ、クローン２９Ｅ．２Ａ３；Ｂｉｏｌｇｅｎｄ）、ＨＬＡ－ＤＲ（ＰＥ、クローンＬ２４３；Ｂｉｏｌｇｅｎｄ）、ＣＤ１１２（ＰＥ、クローンＴＸ３１；Ｂｉｏｌｇｅｎｄ）、ＣＤ１５５（ＰＥ、クローンＳＫＩＩ．４；Ｂｉｏｌｇｅｎｄ）を用いて分析した。
ＰＤ－１の発現に対するＴＧＦ－βの効果を分析するために、ＣＡＲ－Ｔ細胞を、１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＧＦ－β１（Ｒ＆Ｄシステム）の存在下で照射されたＮＡＬＭ－６細胞によって３日間刺激し、その後、フローサイトメトリーによってＰＤ－１発現を測定した。
細胞内フローサイトメトリーによるＳＭＡＤ２／３のリン酸化状態の分析。ＳＭＡＤ２／３のリン酸化状態を判定するために，ＣＡＲ－Ｔ細胞を１：１のＥ：Ｔ細胞比でＮＡＬＭ－６細胞と共に４時間または２４時間インキュベートした。細胞はＬｙｓｅ／Ｆｉｘ緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって固定し、続いてＰｅｒｍ緩衝液ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって透過処理した。ＬＮＧＦＲ＋ＣＡＲ－Ｔ細胞のリン酸化状態は、抗ヒトＳｍａｄ２（ｐＳ４６５／ｐＳ４６７）／Ｓｍａｄ３（ｐＳ４２３／ｐＳ４２５）抗体（ＰＥ、クローン０７２－６７０；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって判定した。
誘導された抑制性Ｔ細胞の検出。ＣＡＲ－Ｔ細胞から生成される抑制性Ｔ細胞の誘導（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋）は、ＮＡＬＭ－６細胞との３日間の共培養の後、細胞内染色によって分析した。Ｆｏｘｐ３／転写因子染色緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で固定し、透過処理した細胞を以下の抗体：抗ＣＤ４（ＢＶ６０５、クローンＯＫＴ４；Ｂｉｏｌｇｅｎｄ）、抗ＣＤ２５（ＦＩＴＣ、クローンＶＴ－０７２；Ｂｉｏｌｇｅｎｄ）、及び抗ＦＯＸＰ３（ＡＰＣ、クローン２３６Ａ／Ｅ７；Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で染色した。
ＣＡＲ－Ｔ増殖アッセイ。ΔＬＮＧＦＲ表面マーカーを発現しているＣＡＲ－Ｔ細胞を磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）によって選別した。ＬＮＧＦＲ＋ＣＡＲ－Ｔ細胞（１×１０６個、純度＞９５％）をサイトカインの非存在下で６日ごとに、γ線照射したＫ５６２－ＣＤ１９－ＰＤＬ１細胞（１×１０６個）で刺激した。ＣＡＲ－Ｔ細胞の倍数増殖はトリパンブルー排除を用いて６、１２、及び１８日目に細胞を数えることによって算出した。
ＣＡＲ－Ｔ細胞の試験管内細胞傷害性。ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性は、ＩｎｃｕｃｙｔｅＳ３生細胞分析システムを用いて判定した。ＧＦＰを構成的に発現しているＮＡＬＭ―６またはＮＡＬＭ－６－ＰＤＬ１の標的細胞を３つ組にてウェルあたり１×１０５個の細胞の密度で９６ウェルプレートに入れた。ＬＮＧＦＲ＋ＣＡＲ－Ｔ細胞を１：１、０．３：１、０．１：１のＥ：Ｔ比で各ウェルに加えた。各ウェルのＧＦＰ強度のリアルタイム変化は緑色物積分強度として２時間ごとに記録した（平均、平均ＧＦＰ強度×μｍ２／ウェル）。相対的な緑色物積分強度の比率は、以下の式：（各時点での合計ＧＦＰ積分強度／開始時点での合計ＧＦＰ積分強度）＊１００によって算出した。
ＮＦＡＴ及びＮＦ－κＢレポーターアッセイ。ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＮＦＡＴ転写因子の比活性を決定するために、ヒト組換えＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍＬ）の存在下にて４μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３及び２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体で２日間刺激したＰＢＭＣに先ず、ＮＦＡＴ－ＲＥ×３－ｅＧＦＰレポーター遺伝子をコードするレンチウイルスで形質導入した。形質導入の８日後、全細胞をヒト組換えＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍＬ）の存在下にて２日間、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体によって再刺激した。活性化された細胞を２つの別々のウェルに分割し、異なるＣＡＲをコードするレンチウイルス（ＣＤ１９－２８ｚまたはＣＤ１９－ＢＢｚ）で形質導入した。６日後、各ウェルの全細胞をＮＡＬＭ－６細胞と１：１の比で共培養した。ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＮＦＡＴのレポーター活性は２４時間及び４８時間の時点で、ＬＮＧＦＲ＋ＣＡＲ－Ｔ集団（合計ＣＤ３＋細胞の２０～２５％）内でのｅＧＦＰシグナルのｇＭＦＩ値によって決定した。ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＮＦ－κＢ転写因子の比活性は、同様の手順に従って、しかし、ＮＦ－κＢ－ＲＥ ｘ５－ｅＧＦＰレポーター遺伝子をコードするレンチウイルスを用いて測定した。
定量的リアルタイムＰＣＲ。３×１０６個のＬＮＧＦＲ＋Ｇ２８ｚまたはＧＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＣＤ１９＋ＮＡＬＭ－６標的細胞と共に１：１の比で共培養した。４時間及び４８時間の共培養の後、ＬＮＧＦＲ＋ＣＡＲ－Ｔ細胞はＭｏＦｌｏ Ａｓｔｒｉｏｓソーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて選別した。ＬＮＧＦＲ＋ＣＡＲ－Ｔ細胞からｍＲＮＡをＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）によって抽出し、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。定量的リアルタイムＰＣＲは、ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏｒａｄ）及びＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎリアルタイムＰＣＲマスターミックス（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ＳＹＢＲプロトコールで実施した。１８ｓ ｒＲＮＡの検出のためのプライマー配列は配列番号２６８及び２６９を含む。ＰＤＣＤ１の検出のためのプライマー配列は配列番号２７０及び２７１を含む。ＩＬ２の検出のためのプライマー配列は配列番号２７２及び２７３を含む。ＩＬ４の検出のためのプライマー配列は配列番号２７４及び２７５を含む。ＩＬ１７Ａの検出のためのプライマー配列は配列番号２７６及び２７７を含む。ＣＤ２５の検出のためのプライマー配列は配列番号２７８及び２７９を含む。ＣＴＬＡ４の検出のためのプライマー配列は配列番号２８０及び２８１を含む。ＦＯＸＰ３の検出のためのプライマー配列は配列番号２８２及び２８３を含む。ＴＧＦ－ベータ１の検出のためのプライマー配列は配列番号２８４及び２８５を含む。ＴＧＦＢＲ１の検出のためのプライマー配列は配列番号２８６及び２８７を含む。ＴＧＦＢＲ２の検出のためのプライマー配列は配列番号２８８及び２８９を含む。
標的ｍＲＮＡの量は、内在性参照１８ｓ ｒＲＮＡに対して基準化された：ΔＣｔ（試料）＝Ｃｔ（標的の遺伝子）－Ｃｔ（１８ｓ ｒＲＮＡ）。比較Ｃｔ法を適用して、以下の方程式：２－ΔΔＣｔ＝２∧－（ΔＣｔ［刺激した］－ΔＣｔ［非刺激］）に基づいて、刺激されていない状態と比較した標的ｍＲＮＡの相対的な倍率変化を分析した。
動物実験。本明細書に記載されているすべての手順はＫＡＩＳＴの施設内動物管理使用委員会によって承認された。ＣＤ１９＋血液がんモデルを確立するために、ＮＳＧマウス（４～６週齢）に、ＥＧＦＰ融合ホタルルシフェラーゼならびにヒトＰＤＬ１を発現するように操作されている１ｘ１０６個のＣＤ１９＋ＮＡＬＭ－６白血病細胞（ＮＡＬＭ６－ＧＬ－ＰＤＬ１細胞）を静脈内注射した。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、上記に記載されている手順に従って健常なドナーの全血試料から調製した。形質導入後４日目、ＣＡＲ－Ｔ細胞を選別し、マウスへの注射に先立ってさらに６日間増殖させた。ＮＡＬＭ６－ＧＬ－ＰＤＬ１細胞注射の５日後、２．５または１×１０６個のＣＡＲ－Ｔ細胞をマウスに静脈内注入した。マウス内のＮＡＬＭ６－ＧＬ－ＰＤＬ１の生物発光画像処理はＸｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍでモニターし、シグナルはＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて対象とする領域における放射輝度（光子／秒）として定量した。固形腫瘍モデルについては、ＮＳＧマウスに５×１０６個のＩＭ－９細胞（ＣＤ１９＋ＰＤ－Ｌ１＋ＣＤ１５５＋）を皮下注射した。ＬＮＧＦＲ＋ＣＡＲ－Ｔ細胞は、腫瘍細胞の注射の１４日後（約１５０～３００ｍｍ ３の腫瘍体積）にマウスに静脈内注入した。腫瘍はキャリパー測定によって毎週モニターし、体積は（長さ×幅２）／２によって推定した。
実施例１：ＣＡＲＴ１９とＰＤ－１を標的とするｓｈＲＮＡとを発現する１つで２つの機能があるベクターの作製と評価の方法
この実施例は、ＣＡＲＴ１９と、ＰＤ－１を阻害するｓｈＲＮＡとを発現する１つで２つの機能があるベクターの作製と評価の方法を記載している。
ＣＡＲとｓｈＲＮＡの双方の発現カセットをコードする１つで２つの機能があるレンチウイルスベクターを生成するために、ｓｈＲＮＡ（連結配列；ＴＴＣＡＡＧＡＧＡ、終了配列；ＴＴＴＴＴ）とＰｏｌ ＩＩＩプロモーター（ｍＵ６、ｈＵ６またはｈＨ１）を含有するｓｈＲＮＡ発現カセットを合成し、セントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）の上流でＣＡＲをコードするＬＶベクターにサブクローニングした。ＥＦ－１αプロモーターによって４－１ＢＢベースのＣＡＲＴ１９を、ｍＵ６プロモーターによってＰＤ－１を標的とするｓｈＲＮＡを自発的に発現するレンチウイルスベクターを構築した（図１Ａ及び１Ｂ）。
ＰＤ－１を標的とするｓｈＲＮＡを選択するために、３つのｓｈＲＮＡ候補を使用した。ｓｈＰＤ－１＃１はＣＡＲの発現（図１Ｃ）、恒常性増殖（図１Ｄ）、分化状態及びＣＤ４／ＣＤ８組成（図１Ｆ）に影響を与えることなく、ＰＤ－１の発現（図１Ｆ）に対して驚くほど効果的な阻害効果を示した。ｓｈＲＮＡの発現レベルは、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの種類に応じて異なる可能性があることが報告されている（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００６，Ｉｒｖｉｎ Ｓ．Ｙ．Ｃｈｅｎ）。したがって、ＰＤ－１発現に対するｍＵ６、ｈＵ６、またはｈＨ１プロモーターの効果を評価した。ｍＵ６とｈｕ６は類似のＫＤ有効性を示したが、ｈＨ１はさらに低かった（図２）。
本明細書で作製した１つで２つの機能があるレンチウイルスベクターは、ＰＤ－１の発現に対して驚くほど効果的な阻害を示したので、以下の実施例にてＰＤ－１ ＫＤ改変ＣＡＲ－Ｔ細胞の作製に使用することができる。
実施例２：ＰＤ－１ ＫＤ ＣＡＲ－Ｔ細胞の製造方法と試験管内での評価
この実施例は、ＰＤ－１ ＫＤ改変ＣＡＲ－Ｔ細胞の製造方法と試験管内での評価を記載している。
末梢血単核細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）密度勾配遠心分離法によって健常なドナーの全血試料から分離した。これらの細胞は３００ＩＵ／ｍｌのヒト組換えＩＬ－２（ＢＭＩＫＯＲＥＡ）の存在下で４μｇ／ｍｌのプレートに結合した抗ＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ３；Ｂｉｏ Ｘ ｃｅｌｌ）及び２μｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ２８抗体（クローンＣＤ２８．２；Ｂｉｏ Ｘ ｃｅｌｌ）で刺激した。組換えレンチウイルス作製のために、形質移入の２４時間前に２．５ｍＬの増殖培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、及び１ｍＭピルビン酸ナトリウムで補完したＤＭＥＭ）における６ｘ１０５個の２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートに播種した。細胞に、１０μｌのリポフェクトアミン２０００（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて、パッケージングベクター（ｐＭＤＬ、ｐＲｅｖ、ｐＭＤＧ．１）とトランスファーベクターの混合物で形質移入した。形質移入の２日後、レンチウイルスを含有する培養上清を回収し、１８００ｒｐｍで５分間遠心分離した。活性化Ｔ細胞を硫酸プロタミン（１μｇ／ｍｌ）の存在下でウイルス上清と混合し、１０００×ｇで９０分間遠心し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、培養上清を吸引し、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５５μＭのβ－メルカプトエタノールで補完した新鮮なＰＲＭＩ－１６４０と交換した。形質導入されたＴ細胞を１×１０６個の細胞／ｍＬを下回る密度にて１０％熱非働化ＦＢＳ及び２ｍＭのＬ－グルタミン及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンで補完したＲＰＭＩ－１６４０、ヒト組換えＩＬ－２（３００ＩＵ／ｍＬ）を含有するＴ細胞培地で培養し、それを２～３日ごとに補充した。
ｓｈＰＤ－１ ＣＡＲ－Ｔ細胞の試験管内での溶解活性及び増殖活性を調べた。Ｎａｌｍ－６－ＰＤＬ１またはＫ５６２－ＣＤ１９－ＰＤＬ１をＣＤ１９＋ＰＤＬ１＋標的細胞として使用した。先ず、ＩｎｃｕＣｙｔｅリアルタイムイメージングシステムを使用した長期の溶解活性を調べた。ＣＡＲ－Ｔ細胞をＮＡＬＭ－６細胞と混合した場合、ＷＴ（ｓｈＧＦＰ）ＣＡＲＴ及びＰＤ－１ ＫＤ（ｓｈＰＤ－１）ＣＡＲ－Ｔ細胞は類似の溶解活性を示した。しかしながら、ＣＡＲ－Ｔ細胞をＮＡＬＭ－６－ＰＤＬ１細胞と共に培養した場合、ｓｈＰＤ－１ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ｓｈＧＦＰ ＣＡＲの溶解活性よりも驚くほど効果的な溶解活性を示した（図３Ａ）。予想外にｓｈＲＮＡカセットを含まないＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞とｓｈＧＦＰ ＣＡＲ－Ｔ細胞は同様の細胞傷害性を保持することも見いだされたということは、ｓｈＲＮＡ発現自体がＣＡＲ－Ｔ細胞の活性にほとんど効果を有さないことを示唆している。
次に、ＣＤ１９抗原及びＰＤ－Ｌ１に繰り返し曝露されたＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖活性を評価した。ｓｈＰＤ－１ ＣＡＲ－Ｔ細胞は外来性ＩＬ－２の非存在下でｓｈＧＦＰ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりはむしろＫ５６２－ＣＤ１９－ＰＤＬ１標的に対して４～５倍高いＴ細胞増殖活性を達成した（図３Ｂ）。共刺激性リガンドは最適なＴ細胞の増殖を促進し、腫瘍細胞で発現されるのはまれではないことが知られている。標的細胞における共刺激リガンドの発現が反復刺激の際に細胞増殖に影響を与えるかどうかを調べるために、代表的な共刺激リガンドであるＣＤ８０が標的細胞で発現されるかどうかを調べた。Ｋ５６２－ＣＤ１９はＣＤ８０を発現したが、Ｎａｌｍ－６は発現しなかった（図３Ｃ）。ＣＤ８０を過剰発現するＮＡＬＭ－６－ＰＤＬ１（ＮＡＬＭ－６－ＰＤＬ１－ＣＤ８０）は、反復刺激のもとでＣＡＲ－Ｔ細胞が増殖することを可能にすることが見いだされた。ＣＤ８０は反復試験管内刺激のもとでＣＡＲＴ増殖を促進する可能性がある（図３Ｂ）。まとめると、細胞固有のＰＤ－１破壊は、ＣＡＲ ＆ＰＤＬ１の反復刺激の際にＣＤ１９特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の試験管内での機能改善に驚くほど効果的に寄与することが裏付けられた。
この実施例では、実施例１に記載されている１つで２つの機能があるベクターを用いて生成されたＰＤ－１ ＫＤ改変ＣＡＲ－Ｔ細胞はＷＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して試験管内での溶解活性及び増殖活性の驚くほどのレベルの増強を示したので、その治療の可能性が、以下の実施例におけるＣＤ１９＋ＰＤＬ１＋の血液腫瘍を担うマウスモデルにおける生体内モデルにてさらに評価された。
実施例３：ＰＤ－１ ＫＤ ＣＡＲ－Ｔ細胞を使用したＣＤ１９＋血液がんの生体内での治療方法
この実施例はＰＤ－１ ＫＤ ＣＡＲ－Ｔ細胞を使用したＣＤ１９＋血液がんの生体内での治療方法を記載している。
ＣＤ１９＋血液がんモデルを確立するために、ＮＳＧマウス（４～６週齢）に、ＥＧＦＰ融合ホタルルシフェラーゼ及びヒトＰＤＬ１を発現するように設計された１ｘ１０６個のＣＤ１９＋ＮＡＬＭ－６白血病細胞（ＮＡＬＭ６－ＧＬ－ＰＤＬ１細胞）を静脈内注射した。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、上記に記載されている手順に従って健常なドナーの全血試料から調製した。形質導入後４日目、ＣＡＲ－Ｔ細胞を選別し、マウスへの注射に先立ってさらに６日間増殖させた。ＮＡＬＭ６－ＧＬ－ＰＤＬ１細胞注射の５日後、１×１０６個のＣＡＲ－Ｔ細胞をマウスに静脈内注入した。マウス内のＮＡＬＭ６－ＧＬ－ＰＤＬ１の生物発光画像処理はＸｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍでモニターし、シグナルはＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて対象とする領域における放射輝度（光子／秒）として定量した。ｓｈＰＤ－１ ＣＡＲ－Ｔ細胞で処理したマウスは、ｓｈＧＦＰ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、腫瘍量の驚くほど均一な低下を有した（図４）。加えて、２種類のｓｈＲＮＡを発現するプロモーターが同様の抗腫瘍効果を有し、ｓｈＲＮＡ発現自体は驚くほど抗腫瘍効果には影響を与えないことが見いだされた。
生体内サイトカイン産生に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞固有のＰＤ－１破壊の効果を調べること。個々のマウスの末梢血は、ＣＡＲ－Ｔ注射の２４時間後と７２時間後に得た。室温にて３００×ｇで５分間遠心分離することによって末梢血から血漿を回収した。生体内でのサイトカインレベルは製造元の指示に従ってヒトＴｈ１／Ｔｈ２サイトカインキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で分析した。ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞固有のＰＤ－１破壊は生体内サイトカイン産生を予想外に低下させた（図５Ａ）。
ＣＡＲ－Ｔ細胞の生体内での増殖に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞固有のＰＤ－１破壊の効果を調べるために、ＣＡＲ－Ｔ注射の３または２０日後に個々のマウスの脾臓を得た。ＣＡＲ－Ｔ細胞（生細胞／死細胞―ＣＤ３＋）またはＮＡＬＭ－６－ＰＤＬ１（生細胞／死細胞―ＧＦＰ＋）の比率をフローサイトメトリーで評価した。細胞固有のＰＤ－１破壊はＣＡＲ－Ｔ細胞の生体内増殖を予想外に遅延させた（図５Ｂ）。
本明細書に記載されている１つで２つの機能があるベクターシステムによって取得されたＣＡＲ－Ｔ細胞固有のＰＤ－１破壊は、ＣＤ１９＋ＰＤＬ１＋腫瘍に対するＣＤ１９特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の生体内抗腫瘍効果で予想外に高いレベルの増加を示した。したがって、ＰＤ－１ ＫＤ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、以下の実施例の方法でさらに使用された。
実施例４：ＰＤ－１シグナル伝達における共刺激分子の環境評価
この実施例は、ＰＤ－１シグナル伝達におけるＣＤ２８及び４－１ＢＢを含む共刺激分子の環境評価を記載している。
細胞固有のＰＤ－１破壊がＣＤ２８／ＣＤ３ζまたは４－１ＢＢ／ＣＤ３ζ ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能にどのように影響を及ぼすのかを調べた（図６Ａ）。Ｇ２８ｚ ＧＢＢｚ、Ｐ２８ｚ、及びＰＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞を先ず生成した。これらのＣＡＲ－Ｔ細胞を同様に形質導入した（図６Ｂ）。ＰＤ－１発現レベルはＧ２８ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞においてＧＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも高く、Ｐ２８ｚのＰＤ－１レベルはＰＢＢｚのそれよりも高かった（図７Ａ）。この異なるＰＤ－１タンパク質レベルが転写レベルに起因することも見いだされた（図７Ｂ）。各共刺激ドメインは、ＰＤ－１転写に関与する因子の活性化に対する異なる強度を表すという仮説を立てた。ＰＤ－１転写に関与する転写因子の中で、ＮＦＡＴ及びＮＦ－κＢはＰＤ－１転写に大きく関与し、ＳＭＡＤ２／３は腫瘍微小環境の主要な免疫抑制因子である外因性ＴＧＦ－βの存在下でＰＤ－１転写に関与していた（Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．，２０１６，Ｂｅｎｊａｍｉｎｅ，Ｖ．Ｐａｒｋ）。ＮＦＡＴまたはＮＦ－κＢの活性をＣＡＲ刺激の間に調べた。ＮＦＡＴ応答要素（ＮＦＡＴ－ＲＥ ×３）－ｅＧＦＰまたは古典的ＮＦ－κＢ応答要素（ＮＦ－κＢ ＲＥ ×５）－ｅＧＦＰのレポーターレンチウイルスベクターを構築した。ＮＦＡＴまたはＮＦ－ｋＢ ＲＥはｅＧＦＰ誘導に介在することが示された（図８Ａ及び８Ｂ）。レポーターを形質導入したＴ細胞を再刺激し、さらにＧ２８ｚまたはＧＢＢｚで形質導入した。Ｇ２８ｚ形質導入ＮＦＡＴレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｇ２８ｚ－ＮＦＡＴ）は、ＧＢＢｚ－ＮＦＡＴと比較してわずかに高いレベルのＮＦＡＴ活性を有し（図９Ａ）、ＮＦＡＴ標的遺伝子のｍＲＮＡレベルもまたＧ２８ｚにおいてさらに高かった（図９Ｂ）。しかしながら、Ｇ２８ｚ形質導入ＮＦ－κＢレポーターＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｇ２８ｚ－ＮＦ－κＢ）は、ＧＢＢ－ＮＦ－κＢと比較してＮＦＡＴ活性において類似している（図１０）。各ＣＡＲ－Ｔ細胞のＳＭＡＤ２／３の活性を調べるために、ＴＧＦ－βがＣＡＲ刺激の間にＧ２８ｚまたはＧＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞に処理された。Ｇ２８ｚ ＣＡＲＴのＳＭＡＤ２／３リン酸化はＢＢｚ ＣＡＲＴがわずかに高く（図１１Ａ）、ＴＧＦ－β処理によるＰＤ－１発現の増加の程度はＧ２８ｚの方がＧＢＢｚよりも大きい（Ｇ２８ｚ ２．３９±０．０３１、ＧＢＢｚ １．６１＋０．０３４の倍数変化）ことが見いだされた（図１１Ｂ）。この差異がＴＧＦ－βシグナル伝達要素の発現レベルの差異によるものかどうかを調べた。ＴＧＦ－β及びＴＧＦ－β受容体１（ＴＧＦＢＲ１）は、２つのＣＡＲＴ間で有意差はなかったが、ＴＧＦ－β受容体２（ＴＧＦＢＲ２）は、ＣＤ２８ｚにおいてさらに高いレベルで発現されることが見いだされた（図１１Ｃ）。
この実施例では、ＰＤ－１シグナル伝達におけるＣＤ２８及び４－１ＢＢを含む共刺激分子の環境を評価した。ＣＤ２８共刺激はＰＤ－１転写に関連するシグナル伝達を強く誘導し、その誘導はＮＦＡＴ及びＴＧＦ－βのシグナル伝達の活性化に関連し得る。ＣＤ２８共刺激の誘導は４－１ＢＢ共刺激の誘導よりも強かった。
実施例５：ＰＤ－１ ＫＤ ＣＡＲ－Ｔ細胞の操作方法と評価
この実施例はＰＤ－１ ＫＤ ＣＡＲ－Ｔ細胞の操作方法と評価を記載している。
複数の連続した抗原及び免疫チェックポイントリガンドの遭遇を伴うＣＡＲ－Ｔ細胞の生体内状態を模倣するために、ＣＡＲ－Ｔ細胞を外因性サイトカインのない状態でＣＤ１９＋ＰＤＬ１＋標的細胞と共に共培養した。初代ＣＡＲ－Ｔ細胞では、ＰＤ－１ ＫＤ ＣＡＲ－Ｔ群は、ＷＴ ＣＡＲ－Ｔ群よりも驚くほど高い溶解活性を示したが、ＣＤ２８系と４－１ＢＢ系のＣＡＲ－Ｔ群の間では溶解活性に差異はなかった（図１２Ａ）。２回目のＣＡＲ－Ｔ細胞の再刺激後、Ｇ２８ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は２回目の刺激後に増殖する能力を失ったので、３種のＣＡＲ－Ｔ細胞の溶解活性を分析した。ＰＢＢｚ及びＰ２８ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＧＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも抗原及びＰＤ－Ｌ１の反復曝露の際、驚くほど高い溶解活性を有した。ＰＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｐ２８ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも溶解機能を保持することで予想外に高い能力を示した（図１２Ａ）。この傾向は、細胞増殖アッセイでも観察された（図１２Ｂ）。まとめると、ＰＤ－１ ＫＤ ＣＡＲＴへの４－１ＢＢ共刺激ドメインの適用は、ＣＤ２８共刺激ドメインと比較して、試験管内での保持された細胞傷害性及び増殖能力に寄与する。ＰＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞はＣＤ１９及びＰＤ－Ｌ１の反復曝露で疲弊の遅延を示す。
ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞に対する免疫抑制機構の影響の可能性を調べた。ＣＤ２８ ＣＡＲ－Ｔ細胞はＢＢｚ ＣＡＲＴよりもＴＧＦ－βに対して感受性が高かったので（図１１）、ＴＧＦ－βによって抗原特異的増殖がどれくらい抑制されるについてＧＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＧ２８ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較した。ＴＧＦ－βがない状態でのＣＡＲ刺激の間、２つのＣＡＲ－Ｔ細胞間では増殖の有意差は観察されなかった一方で、ＧＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞ではなくＧ２８ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖は意味があるように低下した（図１３Ａ）。
ＴＧＦ－βは増殖を阻害するだけでなく、制御性Ｔ細胞の誘導にも深く関与していることが報告されている（ＪＥＭ，２００３，ＷａｎＪｕｎ Ｃｈｅｎ；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００３，Ｓｈｏｈｅｉ Ｈｏｒｉ；Ｂｌｏｏｄ，２００７，Ｄａｔ Ｑ．Ｔｒａｎ）。外因性ＴＧＦ－βの非存在下でＧ２８ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞とＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の間でＴｒｅｇ誘導が異なるかどうかを調べるために、Ｇ２８ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＮＡＬＭ－６標的細胞と３日間培養した。Ｇ２８ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞はＧＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比べて、２倍から３倍の試験管内でのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇ％を有した（図１３Ｂ）。この結果は、ＣＤ２５及びＦＯＸＰ３のようなＴｒｅｇ関連遺伝子の発現の増加と一致している（図９Ｂ）。次に、ＴＧＦ－β処理後Ｔｒｅｇ％の変化を観察し、比較した。ＴＧＦ－βは２８ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＴｒｅｇ％を有意に改善するが、ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞ではＴｒｅｇ％に影響を及ぼさないことが示された（図１３Ｂ）。ＣＤ２８共刺激は４－１ＢＢ共刺激よりもＴｒｅｇを誘導する高い可能性を有し、ＴＧＦ－βが存在すれば、その可能性はさらに突出すると結論付けられた。細胞固有のＰＤ－１破壊がＴｒｅｇの誘導に影響を与えるかどうかも調べた。Ｐ２８ｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＰＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞はＧ２８ｚ及びＧＢＢｚと比べてそれぞれ、２～３倍低いＴｒｅｇの％を有した。特に、ＰＢＢｚは最低のＴｒｅｇ％を有した（図１３Ｃ）。最後に、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達が活性化されている状態でのＴｒｅｇの比率を調べた。ＮＡＬＭ－６またはＮＡＬＭ－６－ＰＤＬ１との共培養後のＴｒｅｇ％の変化を調べた。ＰＤ－１／ＰＤＬ１シグナル伝達はＣＡＲ－Ｔ由来Ｔｒｅｇの誘導に有意な影響を与えないことが見いだされた（図１３Ｃ）ということは、細胞内ＰＤ－１の発現レベルがＴｒｅｇの形成に関連していることを示唆している。ＰＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は免疫抑制メカニズムに驚くほど鈍感であり得ると結論付けられた。
この実施例では、ＰＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞が生成され、それはＣＤ１９及びＰＤ－Ｌ１の反復曝露で疲弊の遅延を示した。ＰＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞はまた免疫抑制メカニズムを予想外に回避する。したがって、これらの細胞は生体内の抗腫瘍効果についてさらに評価された。
実施例６：ＰＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞を用いたＣＤ１９＋血液がんの生体内での治療方法
この実施例はＰＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞を用いたＣＤ１９＋血液がんの生体内での治療方法を記載している。
ＣＤ１９＋血液腫瘍モデルを実施例３に記載されるように確立した。ＣＤ１９＋Ｂ－ＡＬＬ細胞に対するＧ２８ｚ、ＧＢＢｚ、Ｐ２８ｚ及びＰＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の生体内での抗腫瘍効果を比較した。ＣＡＲ－Ｔ細胞は、標的細胞注入の４日後、２．５×１０６個の単回用量で投与された。ＮＡＬＭ６－ＧＬ－ＰＤＬ１を担ったマウスの生体内画像処理はＸｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍで取得し、対象とする領域の放射輝度（光子／秒）として定量化した。図１４に示すように、ＰＤ－１ ＫＤ ＣＡＲＴ細胞（ＰＢＢｚまたはＰ２８ｚ）は、ＷＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＧＢＢｚまたはＧ２８ｚ）よりも優れた抗腫瘍効果を示す。特に、ＰＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、他の３つのＣＡＲ－Ｔ細胞よりも長期間、白血病の進行を抑制した。ＷＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞は強力な抗腫瘍反応を有したが、持続的な抗腫瘍反応を有さなかった。一方、ＰＤ－１ ＫＤ ＣＡＲ－Ｔは初期に対して弱い反応を示したが、持続的な抗腫瘍反応を示すということは、ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＰＤ－１の破壊がＣＲＳのリスクを低下させる可能性があってもよいことを示唆している。ＰＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞はＰ２８ｚのそれよりも予想外に優れた生体内の抗腫瘍効果を付与した。
実施例７：→←または←→の方向で入る２種類のｓｈＲＮＡカセットを有する１つで２つの機能がある二重ベクターの作製方法
この実施例は１つで２つの機能がある二重ベクターの作製方法を記載しており、その際、２種類のｓｈＲＮＡカセットが←→方向（ｓｈＴＩＭ－３－ｍＵ６←→ｈＵ６－ｓｈＰＤ－１）または→←方向（ｍＵ６－ｓｈＴＩＭ－３→←ｓｈＰＤ－１－ｈＵ６）で入り、ｓｈＰＤ－１、ｓｈＴＩＭ－３、及びＣＤ１９－ＣＡＲを同時に発現させる。
ＰＤ－１のためのｓｈＲＮＡ（以後ｓｈＰＤ－１）、ＴＩＭ－３のためのｓｈＲＮＡ（以後ｓｈＴＩＭ－３）及びＣＤ１９－ＣＡＲの発現がそれぞれヒトＵ６プロモーター（以下ｈＵ６）、マウスＵ６プロモーター（以下ｍＵ６）、及びＥＦ１－αプロモーターによって調節されるレンチウイルスを構築すること。双方の種類のｓｈＲＮＡが同時に発現するプラスミドは、各ｓｈＲＮＡカセットが→←方向（ｍＵ６－ｓｈＴＩＭ－３→←ｓｈＰＤ－１－ｈＵ６）及び←→方向（ｓｈＴＩＭ－３－ｍＵ６←→ｈＵ６－ｓｈＰＤ－１）に配置されるように調製した（図１５）。この目的で、（１）マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）の挿入、（２）ｓｈＰＤ－１のマウスＵ６プロモーターのヒトＵ６プロモーターへの変換、（３）ｓｈＴＩＭ－３の挿入、及び（４）ｓｈＴＩＭ－３とｓｈＰＤ－１の切り替え位置のようなクローニングを実施した。
ＭＣＳをｍＵ６－ｓｈＰＤ－１に挿入するために、ｐＬＶ－ΔＬＮＧＦＲ＿Ｐ２Ａ＿ＣＤ１９－ＣＡＲ＿ｍＵ６－ｓｈＰＤ－１（プラスミドＩＤ＃２）の３’部分及び配列番号２２８及び２２９を含むプライマーを用いて、ｍＵ６－ｓｈＰＤ－１の３’のＨｐａ１制限酵素認識部位がＢｓｇＺ１７１－Ｘｂａ１－Ｎｄｅ－１－Ｂｍｔ１－Ｓｐｅ１マルチクローニング部位に改変されるＰＣＲ産物（４１６ｂｐ）を作製した。その後、ＰＣＲ産物をＢｓｔＺ１７ｙ及びＨｐａ１制限酵素で処理し、プラスミドＩＤ＃２をＨｐａ１制限酵素とＣＩＰで処理した後、平滑末端ライゲーションを用いてｓｈＰＤ－１－ｍＵ６－ＭＣＳ塩基配列（ｓｈＲＮＡカセット配列番号２２３）を含むｐＬＶ－ΔＬＮＧＦＲ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１９－ＣＡＲ－ｍＵ６－ｓｈＰＤ－１＿ＭＣＳ（プラスミドＩＤ＃４）を調製した。
その後、ｓｈＰＤ－１がマウスＵ６プロモーターの代わりにヒトＵ６プロモーターによって発現されるようにプラスミドを構築した。ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ Ｖ２プラスミドは、配列番号２３０及び２３１を含むプライマーと共に用いてヒトＵ６プロモーターを含むＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ産物をＨｐａ１及びＳｐｅ１制限酵素で処理し、次いでＨｐａ１及びＳｐｅ１制限酵素で処理したプラスミドＩＤ＃４とライゲーションして、ｈＵ６－ｓｈＰＤ－１塩基配列（配列番号２２４）を含むｐＬＶ－ΔＬＮＧＦＲ＿Ｐ２Ａ＿ＣＤ１９－ＣＡＲ＿ｈＵ６－ｓｈＰＤ－１＿ＭＳＣ（プラスミドＩＤ＃５）を調製した。ｍＵ６－ｓｈＴＩＭ－３カセットをプラスミドＩＤ＃５に挿入してｓｈＴＩＭ－３とｓｈＰＤ－１とを同時に発現するプラスミドを構築することを目的とした。
ｍＵ６－ｓｈＴＩＭ－３カセットを含むＰＣＲ産物は、プラスミドＩＤ＃３と配列番号２３２及び２３３を含むプライマーとを用いて得た。ＰＣＲ産物をＢｍｔ１及びＳｐｅ１制限酵素で処理した後、Ｂｍｔ１及びＳｐｅ１制限酵素で処理したプラスミドＩＤ＃５とそれをライゲーションして、→←方向（ｍＵ６－ｓｈＴＩＭ－３→←ｓｈＰＤ－１－ｈＵ６）の塩基配列（配列番号２２０）を含むｐＬＶ－ΔＬＮＧＦＲ＿Ｐ２Ａ＿ＣＤ１９－ＣＡＲ ｍＵ６－ｓｈＴＩＭ－３→←ｓｈＰＤ－１－ｈＵ６（プラスミドＩＤ＃６）を調製した。
２種類のｓｈＲＮＡカセットが←→方向（ｓｈＴＩＭ－３－ｍＵ６←→ｈＵ６－ｓｈＰＤ－１）に配置されているプラスミドを構築するために、プラスミドＩＤ＃６と配列番号２３４及び２３５を含むプライマーとを用いてＰＣＲ産物を得た。Ｓｐｅ１及びＨｐａ１制限酵素で処理した後、同じ制限酵素で処理したプラスミドＩＤ＃４にそれを挿入してｐＬＶ－ΔＬＮＧＦＲ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１９－ＣＡＲ－ｓｈＰＤ－１－ｈＵ６－ＭＣＳ（プラスミドＩＤ＃７）を作製した。その後、プラスミドＩＤ＃６と配列番号２３６及び２３７を含むプライマーとを用いてＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ産物をＢｍｔ１及びＳｐｅ１制限酵素で処理した後、Ｂｍｔ１及びＳｐｅ１制限酵素で処理したプラスミドＩＤ＃７とそれをライゲーションして最終的に、←→方向（ｓｈＴＩＭ－３－ｍＵ６←→ｈＵ６－ｓｈＰＤ－１）の塩基配列（配列番号２２１）を含むｐＬＶ－ΔＬＮＧＦＲ－Ｐ２Ａ－ＣＤ１９－ＣＡＲ＿ｓｈＴＩＭ－３－ｍＵ６←→ｈＵ６－ｓｈＰＤ－１（プラスミドＩＤ＃８）を調製した。
本明細書で作製した２種類のｓｈＲＮＡカセットが←→または→←方向で入る１つで２つの機能があるレンチウイルスベクターは、以下の実施例におけるＰＤ－１ ＫＤ改変ＣＡＲ－Ｔ細胞の作製に使用することができる。
実施例８：ＰＤ－１ ＫＤ ＣＡＲ－Ｔ細胞の製造方法及び試験管内での評価
この実施例は、ｓｈＰＤ－１、ｓｈＴＩＭ－３、及びＣＤ１９－ＣＡＲを同時に発現させる、二重ＫＤ ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製し、試験管内で評価する方法を記載している。
リポフェクタミンを用いて表１におけるプラスミドＩＤ＃１（ｐＬＶ－ΔＬＮＧＦＲ＿Ｐ２Ａ＿ＣＤ１９－ＣＡＲ＿ｍＵ６－ｓｈＧＦＰ）、＃６（ｐＬＶ－ΔＬＮＧＦＲ＿Ｐ２Ａ＿ＣＤ１９－ＣＡＲ＿ｍＵ６－ｓｈＴＩＭ－３→←ｓｈＰＤ－１－ｈＵ６）、及び＃８（ｐＬＶ－ΔＬＮＧＦＲ＿Ｐ２Ａ＿ＣＤ１９－ＣＡＲ＿ｓｈＴＩＭ－３－ｍＵ６←→ｈＵ６－ｓｈＰＤ－１）、ならびにパッケージングプラスミドｐＭＤＬ ｇ／ｐ、ｐＲＳＶｒｅｖ及びｐＭＤＧ．１でＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質移入し、４８時間経過後、レンチウイルスを含む細胞培養液を得た。Ｆｉｃｏｌｌ－ｐａｑｕｅ溶液を用いて、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をヒトの血液から単離し、ヒトＣＤ３及びＣＤ２８標的抗体を用いてＴ細胞を特異的に活性化した。Ｔ細胞の最初の活性化から１～２日後、以前に得られたウイルスを用いてそれらに形質導入した。調製したＣＡＲ－Ｔ細胞はその後、５％ヒト血漿及びヒトＩＬ－２を含むＡＩＭ－Ｖ培養液を用いて培養した。形質導入後６日目に、ＭＡＣＳｅｌｅｃｔ ＬＮＧＦＲシステム（ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて純粋なＣＡＲ－Ｔ細胞を取得し、ＬＮＧＦＲ標的抗体を用いてフローサイトメーターでＬＮＧＦＲ＋ＣＡＲ－Ｔ細胞を単離した。以下では、プラスミドＩＤ＃１、＃６及び＃８を用いて調製した細胞はそれぞれ、ΔＬＮＧＦＲＣＡＲＴ１９／ｓｈＧＦＰ（またはｓｈＧＦＰ／ＣＡＲＴ１９）、ΔＬＮＧＦＲ－ＣＡＲＴ１９／ｍＵ６－ｓｈＴＩＭ－３→←ｓｈＰＤ－１－ｈＵ６（またはｓｈＰＤ－１＿ｓｈＴＩＭ－３／ＣＡＲＴ１９）及びΔＬＮＧＦＲ－ＣＡＲＴ１９／ｓｈＴＩＭ－３－ｍＵ６←→ｈＵ６－ｓｈＰＤ－１として示される（図１６）。
ｍＵ６－ｓｈＰＤ－１、ｍＵ６－ＴＩＭ－３、及びｓｈＰＤ－１－ｈＵ６カセットをそれぞれ含む対照ＣＡＲ－Ｔ細胞を調製するために、リポフェクタミンを用いて表１におけるプラスミドＩＤ＃２（ｐＬＶ－ΔＬＮＧＦＲ＿Ｐ２Ａ＿ＣＤ１９－ＣＡＲ＿ｍＵ６－ｓｈＰＤ－１）、＃３（ｐＬＶ－ΔＬＮＧＦＲ＿Ｐ２Ａ＿ＣＤ１９－ＣＡＲ＿ｍＵ６－ｓｈＴＩＭ－３）、及び＃７（ｐＬＶ－ΔＬＮＧＦＲ＿Ｐ２Ａ＿ＣＤ１９－ＣＡＲ＿ｓｈＰＤ－１－ｈＵ６＿ＭＣＳ）、及びパッケージングプラスミドｐＭＤＬ ｇ／ｐ、ｐＲＳＶｒｅｖ及びｐＭＤＧ．１でＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質移入した。４８時間経過後、レンチウイルスを含む細胞培養液を得た。Ｆｉｃｏｌｌ－ｐａｑｕｅ溶液を用いて、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をヒトの血液から単離し、ヒトＣＤ３及びＣＤ２８標的抗体を用いてＴ細胞を特異的に活性化した。Ｔ細胞の最初の活性化から１～２日後、以前に得られたウイルスを用いてそれらに形質導入した。調製したＣＡＲ－Ｔ細胞はその後、５％ヒト血漿及びヒトＩＬ－２を含むＡＩＭ－Ｖ培養液を用いて培養した。形質導入後６日目に、ＭＡＣＳｅｌｅｃｔ ＬＮＧＦＲシステム（ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて純粋なＣＡＲ－Ｔ細胞を取得し、ＬＮＧＦＲ標的抗体を用いてフローサイトメーターでＬＮＧＦＲ＋ＣＡＲ－Ｔ細胞を単離した。以下では、プラスミドＩＤ＃２、＃３及び＃７を用いて調製した細胞はそれぞれ、ΔＬＮＧＦＲ－ＣＡＲＴ１９／ｓｈＰＤ－１（またはｓｈＰＤ－１／ＣＡＲＴ１９）、ΔＬＮＧＦＲ－ＣＡＲＴ１９／ｓｈＴＩＭ－３（またはｓｈＴＩＭ－３／ＣＡＲＴ１９）及びΔＬＮＧＦＲＣＡＲＴ１９／ｓｈＰＤ－１－ｈＵ６として示される。
本明細書で作製した二重ＫＤ ＣＡＲ－Ｔ細胞の純度を測定するために、上記で調製した細胞についてＬＮＧＦＲ標的抗体を用いてフローサイトメトリーを行った。図１７に示すように、約８０％のＬＮＧＦＲ＋ＣＡＲ－Ｔ細胞が得られた。
本明細書で作製された二重ＫＤ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＰＤ－１及びＴＩＭ－３の発現の低下が測定され、その発現の持続的な低下が見られた。二重ＫＤ ＣＡＲ－Ｔ細胞をヒトＣＤ３及びＣＤ２８標的抗体で３日間刺激して、ＰＤ－１及びＴＩＭ－３の発現を誘導した。その後、ＣＡＲ、ＰＤ－１、及びＴＩＭ－３標的抗体を使用したフローサイトメトリーを介して二重ＫＤ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＰＤ－１及びＴＩＭ－３発現を分析した。図１８Ａ及び１８Ｂに示すように、ＰＤ－１及びＴＩＭ－３の発現の低下に対する２つの同時に発現されたｓｈＲＮＡの種類の効果の分析は、ｓｈＰＤ－１とｓｈＴＩＭ－３を同時に発現しているＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｔ細胞で観察されたＰＤ－１及びＴＩＭ－３発現の低下の程度は、ｓｈＰＤ－１またはｓｈＴＩＭ－３のみが発現しているＣＤ１９－ＣＡＲ－Ｔ細胞における低下の程度に類似することを示した。
本明細書で作製された二重ＫＤ ＣＡＲ－Ｔ細胞の分化に対する影響を測定した。二重ＫＤ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＰＤ－１及びＴＩＭ－３の分化の程度を観察するために、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７標的抗体を用いてフローサイトメトリーを実施した。図１９に示すように、反復抗原刺激に供されたΔＬＮＧＦＲ－ＣＡＲＴ１９／ｓｈＰＤ－１細胞では、ΔＬＮＧＦＲ－ＣＡＲＴ１９／ｓｈＧＦＰと比べて最終分化したＴＥＭＲＡ（ＣＣＲ７－ＣＤ４５ＲＡ＋）Ｔ細胞の増加がある。一方、ｓｈＴＩＭ－３が加えられているΔＬＮＧＦＲ－ＣＡＲＴ１９／ｍＵ６－ｓｈＴＩＭ－３→←ｓｈＰＤ－１－ｈＵ６は、ΔＬＮＧＦＲ－ＣＡＲＴ１９／ｓｈＰＤ－１よりも多くのＴＮ（ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ＋）Ｔ細胞、ＴＣＭ（ＣＣＲ７＋ＣＤ４５ＲＡ－）Ｔ細胞及びＴＥＭ（ＣＣＲ７－ＣＤ４５ＲＡ－）Ｔ細胞のサブタイプを含む。同様の結果がΔＬＮＧＦＲ－ＣＡＲＴ１９／ｓｈＴＩＭ－３細胞でも同様に観察されるので、ＴＩＭ－３の発現の抑制に起因してΔＬＮＧＦＲ－ＣＡＲＴ１９／ｍＵ６－ｓｈＴＩＭ－３→←ｓｈＰＤ－１－ｈＵ６細胞の低下した分化能が生じると言え、したがってｓｈＴＩＭ－３の効果はｓｈＰＤ－１の効果よりも細胞分化に対する影響を有するという点で優先されていると言うことができる。あまり分化していないＴ細胞サブタイプがＴ細胞のがん治療能力の向上を促進できることが知られているので、ΔＬＮＧＦＲ－ＣＡＲＴ１９／ｍＵ６－ｓｈＴＩＭ－３→←ｓｈＰＤ－１－ｈＵ６細胞はΔＬＮＧＦＲ－ＣＡＲＴ１９／ｓｈＰＤ－１細胞よりも良好な生体内の抗がん効率を示すであろうことが期待される。
異なる方向のｓｈＲＮＡカセットを含むＣＤ１９－ＣＡＲベクターが導入されている二重ＫＤ ＣＡＲ－Ｔ細胞の形質導入効率、増殖能力、及び生存率を比較した。本明細書で作製されたＣＡＲ－Ｔ細胞のうち、→←方向（ｍＵ６－ｓｈＴＩＭ－３→←ｓｈＰＤ－１－ｈＵ６）及び←→方向（ｓｈＴＩＭ－３－ｍＵ６←→ｈＵ６－ｓｈＰＤ－１）のカセットを含むプラスミドを用いた細胞についてＬＮＴＦＲ抗体を用いてフローサイトメトリーを実施した。細胞生存率解析については、トリパンブルー染色を行い、染色されなかった細胞の割合を求めた。図２０Ａ～２０Ｃに示すように、→←方向カセット（ΔＬＮＧＦＲ－ＣＡＲＴ１９／ｍＵ６－ｓｈＴＩＭ－３→←ｓｈＰＤ－１－ｈＵ６）を用いた細胞と比べて、←→方向カセット（ΔＬＮＧＦＲ－ＣＡＲＴ１９／ｓｈＴＩＭ－３－ｍＵ６←→ｈＵ６－ｓｈＰＤ－１）を用いた細胞は、形質導入細胞を形成するのに予想外に苦労し、形質導入されたＴ細胞は低い増殖能力と生存能力を有した。
この実施例は、二重ＫＤ ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製する方法を記載しており、その際、ｓｈＰＤ－１、ｓｈＴＩＭ－３、及びＣＤ１９－ＣＡＲは同時に発現させる。←→または→←方向で入る２種類のｓｈＲＮＡカセットを有する、本明細書で作製した１つで２つの機能があるレンチウイルスベクターを用いて、二重ＫＤ ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製した。←→方向カセットを用いた細胞と比較すると、→←方向カセットを用いた細胞（ΔＬＮＧＦＲ－ＣＡＲＴ１９／ｍＵ６－ｓｈＴＩＭ－３→←ｓｈＰＤ－１－ｈＵ６）は驚くほど高い増殖能力と生存能力を示したので、以下の実施例で使用された。
実施例９：１つで２つの機能がある二重ベクター及び二重ＫＤ ＣＡＲ－Ｔ細胞の作製方法
この実施例は、１つで２つの機能があるベクター及び二重ＫＤ ＣＡＲ－Ｔ細胞の作製方法を記載している。
異なるプロモーター（ｍＵ６とｈＵ６）によって２つのｓｈＲＮＡを発現する１つで２つの機能がある二重ベクターを生成するために、ＢｓｔＺ１７１－Ｘｂａ１－Ｎｄｅ１－Ｂｍｔ１－Ｓｐｅ１のマルチクローニング部位（ＭＣＳ）をｈＵ６プロモーターの下流でｐＬＶ－ｈＵ６－ｓｈＰＤ－１＿ΔＬＮＧＦＲ－ＣＤ１９－ＢＢｚベクターに挿入した。２番目のｍＵ６－ｓｈＲＮＡカセット断片をＭＣＳにサブクローニングした。複数の免疫チェックポイントの遮断をＣＡＲ－Ｔ細胞のみに限定するために、１つで２つの機能があるベクターを考案してｍＵ６及びｈＵ６のＰｏｌ ＩＩＩプロモーターによって２つのｓｈＲＮＡを発現させ、ＣＡＲ－Ｔ細胞の２つの免疫チェックポイントの発現を抑制した。ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、またはＴＩＭ－３を標的とする効果的なｓｉＲＮＡを見つけるために、ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激したＴ細胞にｓｉＲＮＡをエレクトロポレーションで導入した。２以上の有効なｓｉＲＮＡを選択した（図２１Ａ）。ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、またはＴＩＭ－３ ＫＤ ＣＡＲ－Ｔ細胞のための１つで２つの機能があるベクターは、２１塩基長のｓｉＲＮＡをｓｈＲＮＡ形式に変換することによって構築され、最終的に各免疫チェックポイントを標的とするｓｈＲＮＡ（ｓｈＣＴＬＡ－４：＃１；ｓｈＬＡＧ－３：＃１２７８；ｓｈＴＩＧＩＴ：＃７３９；ｓｈＴＩＭ－３：＃３）を選択したが、それらは発現を有意に抑制し、ＣＡＲ－Ｔの増殖にあまり影響を与えない（図２１Ｂ～Ｃ）。最終的に、１つで２つの機能がある二重ベクターによってＰＤ－１＿ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１＿ＬＡＧ－３、ＰＤ－１＿ＴＩＧＩＴ、またはＰＤ－１＿ＴＩＭ－３のＣＡＲ－Ｔ細胞が構築された（図２２Ａ～２２Ｅ）。二重ＫＤ ＣＡＲ－Ｔ細胞はすべて、単一のＰＤ－１ ＫＤ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較してあまり増殖しなかった（図２２Ｃ）。これらの結果は、単一のＫＤ ＣＡＲ－Ｔ細胞でも観察された（図２１Ｂ）。
この実施例では、１つで２つの機能がある二重ベクターが作製された。１つで２つの機能がある二重ベクターを用いて二重ＫＤ ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製し、その治療可能性を、以下の実施例におけるＣＤ１９＋ＰＤＬ１＋血液腫瘍を担う生体内マウスモデル及び固形腫瘍モデルにてさらに評価した。
実施例１０：ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴを標的とする二重ＫＤ ＣＡＲ－Ｔ細胞を用いたＣＤ１９＋血液がんの生体内での治療方法
この実施例は、以下の組み合わせ、ＰＤ－１とＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１とＬＡＧ－３、ＰＤ－１とＴＩＧＩＴ、及びＰＤ－１とＴＩＭ－３を含む２つの免疫チェックポイントを標的とする二重ＫＤ ＣＡＲ－Ｔ細胞を用いて生体内でＣＤ１９＋血液がんを治療する方法を記載している。
ＣＤ１９＋血液腫瘍モデルは実施例３に記載されているように確立された。血液ＣＤ１９＋Ｂ－ＡＬＬモデルに対するＰＤ－１＿ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１＿ＬＡＧ－３、ＰＤ－１＿ＴＩＧＩＴ、またはＰＤ－１＿ＴＩＭ－３ ＫＤ ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果を評価した。各ＣＡＲ－Ｔ細胞は、標的細胞注入の５日後、１×１０６個の単回用量で注射した。ＰＤ－１＿ＴＩＧＩＴ ＫＤ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、他の二重ＫＤ ＣＡＲ－Ｔ細胞と比べて驚くほど優れた抗腫瘍効果を示すことが見いだされた（図２３）。したがって、固形腫瘍モデルにおけるＰＤ－１＿ＴＩＧＩＴ ＫＤ ＣＡＲ－Ｔ細胞を以下の実施例でさらに評価した。
実施例１１：ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴを標的とする二重ＫＤのＣＡＲ－Ｔ細胞を用いた固形腫瘍モデルにおける治療方法。
この実施例は、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴを標的とする二重ＫＤのＣＡＲ－Ｔ細胞を用いた固形腫瘍モデルにおけるがんの治療方法を記載している。
固形腫瘍モデルを確立するために、４～６週齢のＮＳＧマウスに５×１０６個のＩＭ－９細胞（ＣＤ１９＋ＰＤ－Ｌ１＋ＣＤ１５５＋）を皮下注射した。いったん腫瘍が１５０～２５０ｍｍ３の体積に達すると、ＣＡＲ－Ｔ細胞を３×１０６個の単回用量で静脈内注射した。腫瘍はキャリパー測定によって毎週モニターし、体積は（長さ×幅２）／２によって推定した。血液腫瘍モデル（Ｎａｌｍ－６－ＰＤＬ１）に示されているように、ＰＤ－１＿ＴＩＧＩＴ ＫＤ ＣＡＲ－Ｔ細胞も固形腫瘍モデル（ＩＭ－９）に対して最も驚くほど効果的であった（図２４）。細胞固有のＰＤ－１＿ＴＩＧＩＴの遮断はＰＤ－１の遮断よりも予想外に高いレベルの抗腫瘍効果を有する。
本件出願は、以下の態様の発明を提供する。
（態様１）
ベクターであって、
免疫細胞の機能を弱める少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害する２種類の短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする塩基配列と、
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはモノクローナルＴ細胞受容体（ｍＴＣＲ）をコードする塩基配列とを含む、前記ベクター。
（態様２）
前記２種類のｓｈＲＮＡの発現は、それらが２つの異なるプロモーターによってそれぞれ調節されることを特徴とする態様１に記載のベクター。
（態様３）
前記２つのプロモーターがＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターである態様２に記載のベクター。
（態様４）
前記２つのプロモーターが異なる種に由来するＵ６プロモーターである態様２に記載のベクター。
（態様５）
前記２つのプロモーターが前記ベクター上で互いに異なる方向に向けられる態様２に記載のベクター。
（態様６）
免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子が免疫チェックポイントの受容体またはリガンドである態様１に記載のベクター。
（態様７）
前記免疫チェックポイントの受容体またはリガンドが、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、ＣＤ９６、ＭｅｒＴＫ及び２Ｂ４から成る群から選択される態様６に記載のベクター。
（態様８）
免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子が、ＦＡＳ、ＣＤ４５、ＰＰ２Ａ、ＳＨＩＰ１、ＳＨＩＰ２、ＤＧＫアルファ、ＤＧＫゼータ、Ｃｂｌ－ｂ、ＣＤ１４７、ＬＲＲ１、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ１０Ｒアルファ、ＫＬＧＲ１、ＤＮＭＴ３Ａ及びＡ２ａＲから成る群から選択される態様１に記載のベクター。
（態様９）
前記２種類のｓｈＲＮＡが免疫細胞の機能を弱める単一の遺伝子を標的とする、または前記２種類のｓｈＲＮＡが免疫細胞の機能を弱める異なる遺伝子を標的とする態様１に記載のベクター。
（態様１０）
前記２種類のｓｈＲＮＡがＰＤ－１を標的とする態様１に記載のベクター。
（態様１１）
前記２種類のｓｈＲＮＡのうち、（ｉ）一方のｓｈＲＮＡがＰＤ－１を標的とし、第２のｓｈＲＮＡがＴＩＭ－３を標的とする、または（ｉｉ）一方のｓｈＲＮＡがＰＤ－１を標的とし、第２のｓｈＲＮＡがＴＩＧＩＴを標的とする、態様１に記載のベクター。
（態様１２）
前記２種類のｓｈＲＮＡのうち、一方のｓｈＲＮＡをコードする前記塩基配列が配列番号２～２１９から成る群から選択される配列を含み、第２のｓｈＲＮＡをコードする前記塩基配列が配列番号２～２１９から成る群から選択される異なる配列を含む態様１に記載のベクター。
（態様１３）
前記ＣＡＲまたはｍＴＣＲの前記標的が、がん細胞、がん組織及び／または腫瘍微小環境における発現の上昇を示すヒト腫瘍抗原である、またはがん細胞、がん組織及び／または腫瘍微小環境に見られる抗原の変異した形態である態様１に記載のベクター。
（態様１４）
前記ベクターが配列番号２２０または２２１の塩基配列を含む態様１に記載のベクター。
（態様１５）
前記ベクターが、プラスミドベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである態様１に記載のベクター。
（態様１６）
態様１に記載のベクターを含む免疫細胞であって、１以上の遺伝子の発現がｓｈＲＮＡの非存在下での発現のそれよりも４０％以下に低下する、前記免疫細胞。
（態様１７）
前記免疫細胞がヒト由来のＴ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である態様１６に記載の免疫細胞。
（態様１８）
態様１～１７のいずれか１項に記載の免疫細胞を含む医薬組成物。
（態様１９）
前記免疫細胞がもともと患者から得られる、免疫療法を必要とする前記患者の治療のための態様１８に記載の医薬組成物。
（態様２０）
前記患者が、前記免疫細胞で発現される前記ＣＡＲまたはｍＴＣＲの前記標的及び／または前記標的のレベルの上昇または変動が検出される腫瘍またはがんを有する態様１９に記載の医薬組成物。
（態様２１）
免疫細胞であって、標的抗原に特異的に結合する遺伝子操作された抗原受容体と、前記免疫細胞の機能を弱める遺伝子の前記免疫細胞における発現を低下させるまたは低下させることができる遺伝子破壊剤とを含む、前記免疫細胞。
（態様２２）
前記遺伝子操作された抗原受容体がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である態様２１に記載の免疫細胞。
（態様２３）
前記遺伝子操作された抗原受容体がＣＡＲである態様２２に記載の免疫細胞。
（態様２４）
前記ＣＡＲが、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む態様２３に記載の免疫細胞。
（態様２５）
前記ＣＡＲの前記細胞外抗原認識ドメインが前記標的抗原に特異的に結合する態様２４に記載の免疫細胞。
（態様２６）
前記ＣＡＲの前記細胞内シグナル伝達ドメインがＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖の細胞内ドメインを含む態様２４に記載の免疫細胞。
（態様２７）
前記ＣＡＲの前記細胞内シグナル伝達ドメインが共刺激分子をさらに含む態様２６に記載の免疫細胞。
（態様２８）
前記共刺激分子がＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７、及びＣＤ２８から成る群から選択される態様２７に記載の免疫細胞。
（態様２９）
前記共刺激分子がＣＤ１３７（４－１ＢＢ）である態様２８に記載の免疫細胞。
（態様３０）
前記共刺激分子がＣＤ２８である態様２８に記載の免疫細胞。
（態様３１）
前記遺伝子操作された抗原受容体がＴＣＲである態様２２に記載の免疫細胞。
（態様３２）
前記ＴＣＲがモノクローナルＴＣＲ（ｍＴＣＲ）である態様３１に記載の免疫細胞。
（態様３３）
前記標的抗原ががん細胞、がん組織及び／または腫瘍微小環境の中でまたはその表面で発現される態様３１または３２に記載の免疫細胞。
（態様３４）
前記標的抗原が、５Ｔ４（栄養膜糖タンパク質）、７０７－ＡＰ、９Ｄ７、ＡＦＰ（α－フェトプロテイン）、ＡｌｂＺＩＰ（アンドロゲン誘導のｂＺＩＰ）、ＨＰＧ１（ヒト前立腺特異的遺伝子－１）、α５β１－インテグリン、α５β６－インテグリン、α－メチルアシル－補酵素Ａラセマーゼ、ＡＲＴ－４（ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ－４）、Ｂ７Ｈ４（ｖ－セットドメイン含有Ｔ－細胞活性化阻害剤１）、ＢＡＧＥ－１（Ｂメラノーマ抗原－１）、ＢＣＬ－２（Ｂ－細胞 ＣＬＬ／リンパ腫－２）、ＢＩＮＧ－４（ＷＤ反復ドメイン４６）、ＣＡ１５－３／ＣＡ２７－２９（ムチン１）、ＣＡ１９－９（がん抗原１９－９）、ＣＡ７２－４（がん抗原７２－４）、ＣＡ１２５（がん抗原１２５）、カルレチクリン、ＣＡＭＥＬ（メラノーマ上のＣＴＬ認識抗原）、ＣＡＳＰ－８（カスパーゼ８）、カテプシンＢ、カテプシンＬ、ＣＤ１９（分化抗原群１９）、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＥＡ（がん胎児性抗原ＳＧ８）、ＣＬＣＡ２（塩化物チャネルアクセサリー２）、ＣＭＬ２８（慢性骨髄性白血病腫瘍抗原２８）、コアクトシン様タンパク質、コラーゲンＸＸＩＩＩ、ＣＯＸ－２（シクロオキシゲナーゼ－２）、ＣＴ－９／ＢＲＤ６（がん／精巣抗原９）、Ｃｔｅｎ（ｃ－末端テンシン様タンパク質）、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、ｃｙｐ－Ｂ、ＣＹＰＢ１（チトクロームｐ４５０ファミリー１サブファミリーｂメンバー１）、ＤＡＭ－１０／ＭＡＧＥ－Ｂ１（メラノーマ関連抗原Ｂ１）、ＤＡＭ－６／ＭＡＧＥ－Ｂ２、ＥＧＦＲ／Ｈｅｒ１（表皮増殖因子受容体）、ＥＭＭＰＲＩＮ（ベイシジン）、ＥｐＣａｍ、ＥｐｈＡ２（ＥＰＨ受容体Ａ２）、ＥｐｈＡ３、ＥｒｂＢ３（Ｅｒｂ－Ｂ２受容体チロシンキナーゼ３）、ＥＺＨ２（ｚｅｓｔｅ２ポリコーム抑制性複合体２サブユニットのエンハンサー）、ＦＧＦ－５（線維芽細胞増殖因子５）、ＦＮ（フィブロネクチン）、Ｆｒａ－１（Ｆｏｓ関連抗原－１）、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ（炭酸脱水酵素９）、ＧＡＧＥ－１（Ｇ抗原－１）、ＧＡＧＥ－２、ＧＡＧＥ－３、ＧＡＧＥ－４、ＧＡＧＥ－５、ＧＡＧＥ－６、ＧＡＧＥ－７ｂ、ＧＡＧＥ－８、ＧＤＥＰ（前立腺にて差次的に発現される遺伝子）、ＧｎＴ－Ｖ（グルコン酸キナーゼ）、ｇｐ１００（メラニン細胞系列特異的抗原ＧＰ１００）、ＧＰＣ３（グリピカン３）、ＨＡＧＥ（らせん抗原）、ＨＡＳＴ－２（スルホトランスフェラーゼファミリー１Ａメンバー１）、ヘプシン、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２（Ｅｒｂ－Ｂ２受容体チロシンキナーゼ２）、ＨＥＲＶ－Ｋ－ＭＥＬ、ＨＮＥ（メデュラシン）、ホメオボックスＮＫＸ３．１、ＨＯＭ－ＴＥＳ－１４／ＳＣＰ－１、ＨＯＭ－ＴＥＳ－８５、ＨＰＶ－Ｅ６、ＨＰＶＥ７、ＨＳＴ－２（シルツイン－２）、ｈＴＥＲＴ、ｉＣＥ（カスパーゼ１）、ＩＧＦ－１Ｒ（インスリン様増殖因子－１受容体）、ＩＬ－１３Ｒａ２（インターロイキン－１３受容体サブユニットα２）、ＩＬ－２Ｒ（インターロイキン－２受容体）、ＩＬ－５（インターロイキン－５）、未成熟ラミニン受容体、カリクレイン２、カリクレイン４、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５（リソホスファチジルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１）、ＫＫ－ＬＣ－１（北九州肺癌抗原－１）、ＫＭ－ＨＮ－１、ＬＡＧＥ－１（Ｌ抗原ファミリーメンバー－１）、リビン、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥＡ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ｂ１、ＭＡＧＥ－Ｂ１０、ＭＡＧＥ－Ｂ１６、ＭＡＧＥＢ１７、ＭＡＧＥ－Ｂ２、ＭＡＧＥ－Ｂ３、ＭＡＧＥ－Ｂ４、ＭＡＧＥ－Ｂ５、ＭＡＧＥ－Ｂ６、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＭＡＧＥ－Ｃ３、ＭＡＧＥ－Ｄ１、ＭＡＧＥ－Ｄ２、ＭＡＧＥ－Ｄ４、ＭＡＧＥ－Ｅ１、ＭＡＧＥ－Ｅ２、ＭＡＧＥ－Ｆ１、ＭＡＧＥ－Ｈ１、ＭＡＧＥＬ２（メラノーマ抗原ファミリーＬ２）、ママグロビンＡ、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ（Ｔ－細胞－１によって認識されるメラノーマ抗原）、ＭＡＲＴ－２、マトリクスタンパク質２２、ＭＣ１Ｒ（メラノコルチン１受容体）、Ｍ－ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）、メソテリン、ＭＧ５０／ＰＸＤＮ（ペルオキシダシン）、ＭＭＰ１１（マトリクスメタロプロテイナーゼ１１）、ＭＮ／ＣＡ ＩＸ－抗原（炭酸脱水酵素９）、ＭＲＰ－３（多剤耐性関連タンパク質－３）、ＭＵＣ１（ムチン１）、ＭＵＣ２、ＮＡ８８－Ａ（ＶＥＮＴ様ホメオボックス２偽遺伝子１）、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ－Ｖ、Ｎｅｏ－ＰＡＰ（Ｎｅｏ－ポリ（Ａ）ポリメラーゼ）、ＮＧＥＰ（前立腺で発現される新しい遺伝子）、ＮＭＰ２２（核マトリクスタンパク質２２）、ＮＰＭ／ＡＬＫ（ヌクレオホスミン）、ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－Ｂ、ＯＡ１（変形性関節症ＱＴＬ１）、ＯＦＡ－ｉＬＲＰ（がん胎児性抗原未成熟ラミニン受容体タンパク質）、ＯＧＴ（Ｏ－ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ）、ＯＳ－９（小胞体レクチン）、オステオカルシン、オステオポンチン、ｐ１５（ＣＤＫ阻害剤２Ｂ）、ｐ５３、ＰＡＧＥ－４（Ｐ抗原ファミリーメンバー－４）、ＰＡＩ－１（プラスミノーゲン活性化因子阻害剤－１）、ＰＡＩ－２、ＰＡＰ（前立腺酸ホスファターゼ）、ＰＡＲＴ－１（前立腺アンドロゲン調節転写物１）、ＰＡＴＥ（前立腺及び精巣で発現された１）、ＰＤＥＦ（前立腺由来のＥｔｓ因子）、Ｐｉｍ－１－キナーゼ（プロウイルス組み込み部位１）、Ｐｉｎ１（ペプチジル－プロリルｃｉｓ－ｔｒａｎｓイソメラーゼＮＩＭＡ－相互作用１）、ＰＯＴＥ（前立腺、卵巣、精巣、及び胎盤で発現される）、ＰＲＡＭＥ（メラノーマで優先的に発現される抗原）、プロステイン、プロテイナーゼ－３、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、ＰＳＧＲ（前立腺特異的Ｇ－タンパク質共役受容体）、ＰＳＭ、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＲＡＧＥ－１（腎腫瘍癌腫抗原）、ＲＨＡＭＭ／ＣＤ１６８、ＲＵ１（腎遍在タンパク質１）、ＲＵ２、ＳＡＧＥ（肉腫抗原）、ＳＡＲＴ－１（Ｔ－細胞－１によって認識される扁平上皮細胞癌腫抗原）、ＳＡＲＴ－２、ＳＡＲＴ－３、Ｓｐ１７（精子タンパク質１７）、ＳＳＸ－１（ＳＳＸファミリーメンバー１）、ＳＳＸ－２／ＨＯＭ－ＭＥＬ－４０、ＳＳＸ－４、ＳＴＡＭＰ－１（ＳＴＥＡＰ２ メタロレダクターゼ）、ＳＴＥＡＰ、サバイビン、サバイビン－２１３、ＴＡ－９０（腫瘍関連抗原－９０）、ＴＡＧ－７２（腫瘍関連糖タンパク質－７２）、ＴＡＲＰ（ＴＣＲγ代替リーディングフレームタンパク質）、ＴＧＦｂ（形質転換増殖因子β）、ＴＧＦｂＲ１１（形質転換増殖因子β受容体１１）、ＴＧＭ－４（トランスグルタミナーゼ４）、ＴＲＡＧ－３（タキソール耐性関連遺伝子３）、ＴＲＧ（Ｔ－細胞受容体γ遺伝子座）、ＴＲＰ－１（一過性受容体ポテンシャル－１）、ＴＲＰ－２／６ｂ、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、Ｔｒｐ－ｐ８、チロシナーゼ、ＵＰＡ（Ｕ－プラスミノーゲン活性化因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子Ａ）、ＶＥＧＦＲ－２／ＦＬＫ－１、及びＷＴ１（ウィルムス腫瘍１）から成る群から選択される態様３３に記載の免疫細胞。
（態様３５）
前記標的抗原がＣＤ１９またはＣＤ２２である、態様３５に記載の免疫細胞。
（態様３６）
前記標的抗原がＣＤ１９である態様３６に記載の免疫細胞。
（態様３７）
前記標的抗原ががん抗原であり、前記がん抗原が、その発現ががん細胞、がん組織及び／または腫瘍微小環境の中でまたはその表面で増加するがん抗原である態様３４～３６のいずれかに記載の免疫細胞。
（態様３８）
前記標的抗原が、α－アクチニン－４／ｍ、ＡＲＴＣ１／ｍ、ｂｃｒ／ａｂｌ、ベータ－カテニン／ｍ、ＢＲＣＡ１／ｍ、ＢＲＣＡ２／ｍ、ＣＡＳＰ－５／ｍ、ＣＡＳＰ－８／ｍ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ／ｍ、ＣＭＬ６６、ＣＯＡ－１／ｍ、ＤＥＫ－ＣＡＮ、ＥＦＴＵＤ２／ｍ、ＥＬＦ２／ｍ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１、ＦＮ１／ｍ、ＧＰＮＭＢ／ｍ、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１－Ｒ１７０Ｉ、ＨＬＡ－Ａ１１／ｍ、ＨＬＡ－Ａ２／ｍ、ＨＳＰ７０－２Ｍ、ＫＩＡＡ０２０５／ｍ、Ｋ－Ｒａｓ／ｍ、ＬＤＬＲ－ＦＵＴ、ＭＡＲＴ２／ｍ、ＭＥ１／ｍ、ＭＵＭ－１／ｍ、ＭＵＭ－２／ｍ、ＭＵＭ－３／ｍ、ミオシンクラス１／ｍ、ｎｅｏ－ＰＡＰ／ｍ、ＮＦＹＣ／ｍ、Ｎ－Ｒａｓ／ｍ、ＯＧＴ／ｍ、ＯＳ－９／ｍ、ｐ５３／ｍ、Ｐｍｌ／ＲＡＲａ、ＰＲＤＸ５／ｍ、ＰＴＰＲＸ／ｍ、ＲＢＡＦ６００／ｍ、ＳＩＲＴ２／ｍ、ＳＹＴＳＳＸ－１、ＳＹＴ－ＳＳＸ－２、ＴＥＬ－ＡＭＬ１、ＴＧＦｂＲＩＩ、及びＴＰＩ／ｍから成る群から選択され、その際、前記標的抗原はがん抗原であり、前記がん抗原は、がん細胞、がん組織及び／または腫瘍微小環境の中でまたはその表面上で発現される抗原の変異した形態である態様３３に記載の免疫細胞。
（態様３９）
前記免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子の発現が、以下：
（ｉ）前記免疫細胞の増殖の阻害、
（ｉｉ）前記免疫細胞の細胞死の誘導、
（ｉｉｉ）前記免疫細胞が前記標的抗原を認識する及び／または活性化される能力の阻害、
（ｉｖ）前記標的抗原に対する免疫応答を誘導しない細胞への前記免疫細胞の分化の誘導、
（ｖ）前記免疫細胞の免疫応答を促進する分子に対する前記免疫細胞の反応の低下、または
（ｖｉ）前記免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する前記免疫細胞の反応の上昇の１以上を引き起こす態様２１～３８のいずれかに記載の免疫細胞。
（態様４０）
前記免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子が、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、ＣＤ９６、ＭｅｒＴＫ、２Ｂ４、ＦＡＳ、ＣＤ４５、ＰＰ２Ａ、ＳＨＰ１、ＳＨＰ２、ＤＧＫアルファ、ＤＧＫゼータ、Ｃｂｌ－ｂ、Ｃｂｌ－ｃ、ＣＤ１４８、ＬＲＲ１、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＫＬＧＲ１、ＤＮＭＴ３Ａ、及びＡ２ａＲから成る群から選択される態様３９に記載の免疫細胞。
（態様４１）
前記免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子が、前記免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する前記免疫細胞の反応を高める態様３９に記載の免疫細胞。
（態様４２）
前記免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する前記免疫細胞の反応を高める前記遺伝子が免疫チェックポイントの受容体またはリガンドをコードする態様４１に記載の免疫細胞。
（態様４３）
前記免疫チェックポイントの受容体またはリガンドが、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、ＣＤ９６、ＭｅｒＴＫ及び２Ｂ４から成る群から選択される態様４２に記載の免疫細胞。
（態様４４）
前記遺伝子破壊剤が、前記遺伝子破壊剤の非存在下での前記免疫細胞と比べて、前記免疫細胞の機能を弱める前記免疫細胞における遺伝子の発現を少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または９５％低下させる態様２１～４３のいずれかに記載の免疫細胞。
（態様４５）
前記遺伝子破壊剤が、前記免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する前記免疫細胞の反応を高める遺伝子の発現を低下させる態様４４に記載の免疫細胞。
（態様４６）
前記遺伝子破壊剤が免疫チェックポイントの受容体またはリガンドをコードする遺伝子の発現を低下させる態様４５に記載の免疫細胞。
（態様４７）
前記遺伝子破壊剤が、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、ＣＤ９６、ＭｅｒＴＫ及び２Ｂ４から成る群から選択される遺伝子の発現を低下させる態様４６に記載の免疫細胞。
（態様４８）
前記遺伝子破壊剤が、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって前記免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子の発現を低下させる態様４５～４７のいずれかに記載の免疫細胞。
（態様４９）
１を超える遺伝子破壊剤が、ＲＮＡｉによって前記免疫細胞における前記免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子の発現を低下させる態様４８に記載の免疫細胞。
（態様５０）
前記遺伝子破壊剤が、前記免疫細胞の機能を弱める単一の遺伝子を標的とする、または異なる遺伝子破壊剤が前記免疫細胞の機能を弱める異なる遺伝子を標的とし、例えば、第１の遺伝子破壊剤は第１の遺伝子を標的とし、第２の遺伝子破壊剤は第２の遺伝子を標的とする態様４９に記載の免疫細胞。
（態様５１）
前記ＲＮＡｉには短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が介在する態様４８～５０のいずれかに記載の免疫細胞。
（態様５２）
前記ＲＮＡｉには１を超えるｓｈＲＮＡが介在する態様５１に記載の免疫細胞。
（態様５３）
前記ＲＮＡｉには２つのｓｈＲＮＡが介在する態様５２に記載の免疫細胞。
（態様５４）
２つのｓｈＲＮＡがＰＤ－１を標的とする態様５２～５３のいずれかに記載の免疫細胞。
（態様５５）
第１のｓｈＲＮＡがＰＤ－１を標的とし、第２のｓｈＲＮＡがＴＩＭ－３を標的とする態様５２～５３のいずれかに記載の免疫細胞。
（態様５６）
第１のｓｈＲＮＡがＰＤ－１を標的とし、第２のｓｈＲＮＡがＣＴＬＡ－４を標的とする態様５２～５３のいずれかに記載の免疫細胞。
（態様５７）
第１のｓｈＲＮＡがＰＤ－１を標的とし、第２のｓｈＲＮＡがＬＡＧ－３を標的とする態様５２～５３のいずれかに記載の免疫細胞。
（態様５８）
第１のｓｈＲＮＡがＰＤ－１を標的とし、第２のｓｈＲＮＡがＴＩＧＩＴを標的とする態様５２～５３のいずれかに記載の免疫細胞。
（態様５９）
前記免疫細胞がｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む態様５１～５８のいずれかに記載の免疫細胞。
（態様６０）
前記免疫細胞が１を超えるｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む態様５９に記載の免疫細胞。
（態様６１）
前記免疫細胞が２つのｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む態様５９に記載の免疫細胞。
（態様６２）
前記ｓｈＲＮＡ（複数可）をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２～２１９及び２３８～２６７から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む態様５９～６１のいずれかに記載の免疫細胞。
（態様６３）
前記ｓｈＲＮＡ（複数可）をコードする前記ヌクレオチド配列がベクター上に存在する態様５９～６２のいずれかに記載の免疫細胞。
（態様６４）
異なるｓｈＲＮＡの発現が異なるプロモーターによって調節される態様６３のいずれかに記載の免疫細胞。
（態様６５）
２つの異なるｓｈＲＮＡの発現が２つの異なるプロモーターによって調節される態様６４に記載の免疫細胞。
（態様６６）
前記２つの異なるプロモーターがＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターである態様６５に記載の免疫細胞。
（態様６７）
前記２つのプロモーターがＵ６プロモーターである態様６６に記載の免疫細胞。
（態様６８）
前記Ｕ６プロモーターが異なる種に由来する態様６７に記載の免疫細胞。
（態様６９）
前記２つのプロモーターが互いに異なる方向に向けられる態様６５～６８のいずれかに記載の免疫細胞。
（態様７０）
前記遺伝子操作された抗原受容体及び前記遺伝子破壊剤（複数可）がベクターからそれぞれ発現される態様２１～６９のいずれかに記載の免疫細胞。
（態様７１）
前記遺伝子操作された抗原受容体及び前記遺伝子破壊剤（複数可）が同一ベクターから発現される態様７０に記載の免疫細胞。
（態様７２）
前記ベクターがプラスミドベクターまたはウイルスベクターである態様７０～７１のいずれかに記載の免疫細胞。
（態様７３）
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターである態様７２に記載の免疫細胞。
（態様７４）
前記レンチウイルスベクターがレトロウイルスベクターである態様７３に記載の免疫細胞。
（態様７５）
前記免疫細胞がＴ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞から成る群から選択される態様２１～７４のいずれかに記載の免疫細胞。
（態様７６）
前記免疫細胞がＴ細胞である態様７５に記載の免疫細胞。
（態様７７）
前記Ｔ細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である態様７６に記載の免疫細胞。
（態様７８）
前記免疫細胞が２つのｓｈＲＮＡ及びＣＡＲまたはｍＴＣＲをコードするヌクレオチド配列を同一ベクター上で含む態様７６または７７のいずれかに記載の免疫細胞。
（態様７９）
前記２つのｓｈＲＮＡが互いに異なる方向に向けられた２つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターによってそれぞれ調節される態様７８に記載の免疫細胞。
（態様８０）
前記ＣＡＲがＣＤ１９を標的とし、前記第１のｓｈＲＮＡがＰＤ－１を標的とし、前記第２のｓｈＲＮＡがＴＩＧＩＴを標的とする態様７９に記載の免疫細胞。
（態様８１）
免疫細胞を作り出す方法であって、
（１）標的抗原に特異的に結合する遺伝子操作された抗原受容体をコードする遺伝子と、
（２）遺伝子破壊剤またはその発現が前記免疫細胞の機能を弱める遺伝子の前記免疫細胞における発現を低下させる、または低下させることができる遺伝子破壊剤とを同時または任意の順序で連続的に前記免疫細胞に導入することを含み、
それによって、遺伝子操作された抗原受容体が発現され、前記免疫細胞の機能を弱める遺伝子の発現が低減される前記免疫細胞を作り出す、前記方法。
（態様８２）
前記遺伝子操作された抗原受容体がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である態様８１に記載の方法。
（態様８３）
前記遺伝子操作された抗原受容体がＣＡＲである態様８２に記載の方法。
（態様８４）
前記ＣＡＲが、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む態様８３に記載の方法。
（態様８５）
前記ＣＡＲの前記細胞外抗原認識ドメインが前記標的抗原に特異的に結合する態様８４に記載の方法。
（態様８６）
前記ＣＡＲの前記細胞内シグナル伝達ドメインがＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖の細胞内ドメインを含む態様８４に記載の方法。
（態様８７）
前記ＣＡＲの前記細胞内シグナル伝達ドメインが共刺激分子をさらに含む態様８６に記載の方法。
（態様８８）
前記共刺激分子がＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７、及びＣＤ２８から成る群から選択される態様８７に記載の方法。
（態様８９）
前記共刺激分子がＣＤ１３７（４－１ＢＢ）である態様８８に記載の方法。
（態様９０）
前記共刺激分子がＣＤ２８である態様８８に記載の方法。
（態様９１）
前記遺伝子操作された抗原受容体がＴＣＲである態様８２に記載の方法。
（態様９２）
前記ＴＣＲがモノクローナルＴＣＲ（ｍＴＣＲ）である態様９１に記載の方法。
（態様９３）
前記標的抗原ががん細胞、がん組織及び／または腫瘍微小環境の中でまたはその表面で発現される態様８１～９２のいずれかに記載の方法。
（態様９４）
前記標的抗原が、５Ｔ４（栄養膜糖タンパク質）、７０７－ＡＰ、９Ｄ７、ＡＦＰ（α－フェトプロテイン）、ＡｌｂＺＩＰ（アンドロゲン誘導のｂＺＩＰ）、ＨＰＧ１（ヒト前立腺特異的遺伝子－１）、α５β１－インテグリン、α５β６－インテグリン、α－メチルアシル－補酵素Ａラセマーゼ、ＡＲＴ－４（ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ－４）、Ｂ７Ｈ４（ｖ－セットドメイン含有Ｔ－細胞活性化阻害剤１）、ＢＡＧＥ－１（Ｂメラノーマ抗原－１）、ＢＣＬ－２（Ｂ－細胞 ＣＬＬ／リンパ腫－２）、ＢＩＮＧ－４（ＷＤ反復ドメイン４６）、ＣＡ１５－３／ＣＡ２７－２９（ムチン１）、ＣＡ１９－９（がん抗原１９－９）、ＣＡ７２－４（がん抗原７２－４）、ＣＡ１２５（がん抗原１２５）、カルレチクリン、ＣＡＭＥＬ（メラノーマ上のＣＴＬ認識抗原）、ＣＡＳＰ－８（カスパーゼ８）、カテプシンＢ、カテプシンＬ、ＣＤ１９（分化抗原群１９）、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＥＡ（がん胎児性抗原ＳＧ８）、ＣＬＣＡ２（塩化物チャネルアクセサリー２）、ＣＭＬ２８（慢性骨髄性白血病腫瘍抗原２８）、コアクトシン様タンパク質、コラーゲンＸＸＩＩＩ、ＣＯＸ－２（シクロオキシゲナーゼ－２）、ＣＴ－９／ＢＲＤ６（がん／精巣抗原９）、Ｃｔｅｎ（ｃ－末端テンシン様タンパク質）、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、ｃｙｐ－Ｂ、ＣＹＰＢ１（チトクロームｐ４５０ファミリー１サブファミリーｂメンバー１）、ＤＡＭ－１０／ＭＡＧＥ－Ｂ１（メラノーマ関連抗原Ｂ１）、ＤＡＭ－６／ＭＡＧＥ－Ｂ２、ＥＧＦＲ／Ｈｅｒ１（表皮増殖因子受容体）、ＥＭＭＰＲＩＮ（ベイシジン）、ＥｐＣａｍ、ＥｐｈＡ２（ＥＰＨ受容体Ａ２）、ＥｐｈＡ３、ＥｒｂＢ３（Ｅｒｂ－Ｂ２受容体チロシンキナーゼ３）、ＥＺＨ２（ｚｅｓｔｅ２ポリコーム抑制性複合体２サブユニットのエンハンサー）、ＦＧＦ－５（線維芽細胞増殖因子５）、ＦＮ（フィブロネクチン）、Ｆｒａ－１（Ｆｏｓ関連抗原－１）、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ（炭酸脱水酵素９）、ＧＡＧＥ－１（Ｇ抗原－１）、ＧＡＧＥ－２、ＧＡＧＥ－３、ＧＡＧＥ－４、ＧＡＧＥ－５、ＧＡＧＥ－６、ＧＡＧＥ－７ｂ、ＧＡＧＥ－８、ＧＤＥＰ（前立腺にて差次的に発現される遺伝子）、ＧｎＴ－Ｖ（グルコン酸キナーゼ）、ｇｐ１００（メラニン細胞系列特異的抗原ＧＰ１００）、ＧＰＣ３（グリピカン３）、ＨＡＧＥ（らせん抗原）、ＨＡＳＴ－２（スルホトランスフェラーゼファミリー１Ａメンバー１）、ヘプシン、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２（Ｅｒｂ－Ｂ２受容体チロシンキナーゼ２）、ＨＥＲＶ－Ｋ－ＭＥＬ、ＨＮＥ（メデュラシン）、ホメオボックスＮＫＸ３．１、ＨＯＭ－ＴＥＳ－１４／ＳＣＰ－１、ＨＯＭ－ＴＥＳ－８５、ＨＰＶ－Ｅ６、ＨＰＶＥ７、ＨＳＴ－２（シルツイン－２）、ｈＴＥＲＴ、ｉＣＥ（カスパーゼ１）、ＩＧＦ－１Ｒ（インスリン様増殖因子－１受容体）、ＩＬ－１３Ｒａ２（インターロイキン－１３受容体サブユニットα２）、ＩＬ－２Ｒ（インターロイキン－２受容体）、ＩＬ－５（インターロイキン－５）、未成熟ラミニン受容体、カリクレイン２、カリクレイン４、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５（リソホスファチジルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１）、ＫＫ－ＬＣ－１（北九州肺癌抗原－１）、ＫＭ－ＨＮ－１、ＬＡＧＥ－１（Ｌ抗原ファミリーメンバー－１）、リビン、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥＡ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ｂ１、ＭＡＧＥ－Ｂ１０、ＭＡＧＥ－Ｂ１６、ＭＡＧＥＢ１７、ＭＡＧＥ－Ｂ２、ＭＡＧＥ－Ｂ３、ＭＡＧＥ－Ｂ４、ＭＡＧＥ－Ｂ５、ＭＡＧＥ－Ｂ６、ＭＡＧＥ－Ｃ１、ＭＡＧＥ－Ｃ２、ＭＡＧＥ－Ｃ３、ＭＡＧＥ－Ｄ１、ＭＡＧＥ－Ｄ２、ＭＡＧＥ－Ｄ４、ＭＡＧＥ－Ｅ１、ＭＡＧＥ－Ｅ２、ＭＡＧＥ－Ｆ１、ＭＡＧＥ－Ｈ１、ＭＡＧＥＬ２（メラノーマ抗原ファミリーＬ２）、ママグロビンＡ、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ（Ｔ－細胞－１によって認識されるメラノーマ抗原）、ＭＡＲＴ－２、マトリクスタンパク質２２、ＭＣ１Ｒ（メラノコルチン１受容体）、Ｍ－ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）、メソテリン、ＭＧ５０／ＰＸＤＮ（ペルオキシダシン）、ＭＭＰ１１（マトリクスメタロプロテイナーゼ１１）、ＭＮ／ＣＡ ＩＸ－抗原（炭酸脱水酵素９）、ＭＲＰ－３（多剤耐性関連タンパク質－３）、ＭＵＣ１（ムチン１）、ＭＵＣ２、ＮＡ８８－Ａ（ＶＥＮＴ様ホメオボックス２偽遺伝子１）、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ－Ｖ、Ｎｅｏ－ＰＡＰ（Ｎｅｏ－ポリ（Ａ）ポリメラーゼ）、ＮＧＥＰ（前立腺で発現される新しい遺伝子）、ＮＭＰ２２（核マトリクスタンパク質２２）、ＮＰＭ／ＡＬＫ（ヌクレオホスミン）、ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－Ｂ、ＯＡ１（変形性関節症ＱＴＬ１）、ＯＦＡ－ｉＬＲＰ（がん胎児性抗原未成熟ラミニン受容体タンパク質）、ＯＧＴ（Ｏ－ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ）、ＯＳ－９（小胞体レクチン）、オステオカルシン、オステオポンチン、ｐ１５（ＣＤＫ阻害剤２Ｂ）、ｐ５３、ＰＡＧＥ－４（Ｐ抗原ファミリーメンバー－４）、ＰＡＩ－１（プラスミノーゲン活性化因子阻害剤－１）、ＰＡＩ－２、ＰＡＰ（前立腺酸ホスファターゼ）、ＰＡＲＴ－１（前立腺アンドロゲン調節転写物１）、ＰＡＴＥ（前立腺及び精巣で発現された１）、ＰＤＥＦ（前立腺由来のＥｔｓ因子）、Ｐｉｍ－１－キナーゼ（プロウイルス組み込み部位１）、Ｐｉｎ１（ペプチジル－プロリルｃｉｓ－ｔｒａｎｓイソメラーゼＮＩＭＡ－相互作用１）、ＰＯＴＥ（前立腺、卵巣、精巣、及び胎盤で発現される）、ＰＲＡＭＥ（メラノーマで優先的に発現される抗原）、プロステイン、プロテイナーゼ－３、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）、ＰＳＧＲ（前立腺特異的Ｇ－タンパク質共役受容体）、ＰＳＭ、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＲＡＧＥ－１（腎腫瘍癌腫抗原）、ＲＨＡＭＭ／ＣＤ１６８、ＲＵ１（腎遍在タンパク質１）、ＲＵ２、ＳＡＧＥ（肉腫抗原）、ＳＡＲＴ－１（Ｔ－細胞－１によって認識される扁平上皮細胞癌腫抗原）、ＳＡＲＴ－２、ＳＡＲＴ－３、Ｓｐ１７（精子タンパク質１７）、ＳＳＸ－１（ＳＳＸファミリーメンバー１）、ＳＳＸ－２／ＨＯＭ－ＭＥＬ－４０、ＳＳＸ－４、ＳＴＡＭＰ－１（ＳＴＥＡＰ２メタロレダクターゼ）、ＳＴＥＡＰ、サバイビン、サバイビン－２１３、ＴＡ－９０（腫瘍関連抗原－９０）、ＴＡＧ－７２（腫瘍関連糖タンパク質－７２）、ＴＡＲＰ（ＴＣＲγ代替リーディングフレームタンパク質）、ＴＧＦｂ（形質転換増殖因子β）、ＴＧＦｂＲ１１（形質転換増殖因子β受容体１１）、ＴＧＭ－４（トランスグルタミナーゼ４）、ＴＲＡＧ－３（タキソール耐性関連遺伝子３）、ＴＲＧ（Ｔ－細胞受容体γ遺伝子座）、ＴＲＰ－１（一過性受容体ポテンシャル－１）、ＴＲＰ－２／６ｂ、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、Ｔｒｐ－ｐ８、チロシナーゼ、ＵＰＡ（Ｕ－プラスミノーゲン活性化因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子Ａ）、ＶＥＧＦＲ－２／ＦＬＫ－１、及びＷＴ１（ウィルムス腫瘍１）から成る群から選択される態様９３に記載の方法。
（態様９５）
前記標的抗原がＣＤ１９またはＣＤ２２である態様９５に記載の方法。
（態様９６）
前記標的抗原がＣＤ１９である態様９６に記載の方法。
（態様９７）
前記標的抗原ががん抗原であり、前記がん抗原はその発現ががん細胞、がん組織及び／または腫瘍微小環境の中でまたはその表面で増加する抗原である態様９４～９６のいずれかに記載の方法。
（態様９８）
前記標的抗原が、α－アクチニン－４／ｍ、ＡＲＴＣ１／ｍ、ｂｃｒ／ａｂｌ、ベータ－カテニン／ｍ、ＢＲＣＡ１／ｍ、ＢＲＣＡ２／ｍ、ＣＡＳＰ－５／ｍ、ＣＡＳＰ－８／ｍ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ／ｍ、ＣＭＬ６６、ＣＯＡ－１／ｍ、ＤＥＫ－ＣＡＮ、ＥＦＴＵＤ２／ｍ、ＥＬＦ２／ｍ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１、ＦＮ１／ｍ、ＧＰＮＭＢ／ｍ、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１－Ｒ１７０Ｉ、ＨＬＡ－Ａ１１／ｍ、ＨＬＡ－Ａ２／ｍ、ＨＳＰ７０－２Ｍ、ＫＩＡＡ０２０５／ｍ、Ｋ－Ｒａｓ／ｍ、ＬＤＬＲ－ＦＵＴ、ＭＡＲＴ２／ｍ、ＭＥ１／ｍ、ＭＵＭ－１／ｍ、ＭＵＭ－２／ｍ、ＭＵＭ－３／ｍ、ミオシンクラス１／ｍ、ｎｅｏ－ＰＡＰ／ｍ、ＮＦＹＣ／ｍ、Ｎ－Ｒａｓ／ｍ、ＯＧＴ／ｍ、ＯＳ－９／ｍ、ｐ５３／ｍ、Ｐｍｌ／ＲＡＲａ、ＰＲＤＸ５／ｍ、ＰＴＰＲＸ／ｍ、ＲＢＡＦ６００／ｍ、ＳＩＲＴ２／ｍ、ＳＹＴＳＳＸ－１、ＳＹＴ－ＳＳＸ－２、ＴＥＬ－ＡＭＬ１、ＴＧＦｂＲＩＩ、及びＴＰＩ／ｍから成る群から選択され、その際、前記標的抗原はがん抗原であり、前記がん抗原はがん細胞、がん組織及び／または腫瘍微小環境の中でまたは表面上で発現される抗原の変異した形態である態様９３に記載の方法。
（態様９９）
前記免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子の発現が、以下：
（ｉ）前記免疫細胞の増殖の阻害、
（ｉｉ）前記免疫細胞の細胞死の誘導、
（ｉｉｉ）前記免疫細胞が前記標的抗原を認識する及び／または活性化される能力の阻害、
（ｉｖ）前記標的抗原に対する免疫応答を誘導しない細胞への前記免疫細胞の分化の誘導、
（ｖ）前記免疫細胞の免疫応答を促進する分子に対する前記免疫細胞の反応の低下、または
（ｖｉ）前記免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する前記免疫細胞の反応の上昇の１以上を引き起こす態様８１～９８のいずれかに記載の方法。
（態様１００）
前記免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子が、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、ＣＤ９６、ＭｅｒＴＫ、２Ｂ４、ＦＡＳ、ＣＤ４５、ＰＰ２Ａ、ＳＨＰ１、ＳＨＰ２、ＤＧＫアルファ、ＤＧＫゼータ、Ｃｂｌ－ｂ、Ｃｂｌ－ｃ、ＣＤ１４８、ＬＲＲ１、ＴＧＦＢＲ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＫＬＧＲ１、ＤＮＭＴ３Ａ、及びＡ２ａＲから成る群から選択される態様９９に記載の方法。
（態様１０１）
前記免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子が、前記免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する前記免疫細胞の反応を高める態様９９に記載の方法。
（態様１０２）
前記免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する前記免疫細胞の反応を高める前記遺伝子が免疫チェックポイントの受容体またはリガンドをコードする態様１０１に記載の方法。
（態様１０３）
前記免疫チェックポイントの受容体またはリガンドが、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、ＣＤ９６、ＭｅｒＴＫ及び２Ｂ４から成る群から選択される態様１０２に記載の方法。
（態様１０４）
前記遺伝子破壊剤が前記遺伝子破壊剤（複数可）の非存在下での前記免疫細胞と比べて、前記免疫細胞の機能を弱める前記免疫細胞における遺伝子の前記発現を少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または９５％低下させる態様８１～１０３のいずれかに記載の方法。
（態様１０５）
前記遺伝子破壊剤が、前記免疫細胞の免疫応答を抑制する分子に対する前記免疫細胞の反応を高める遺伝子の発現を低下させる態様１０４に記載の方法。
（態様１０６）
前記遺伝子破壊剤が免疫チェックポイントの受容体またはリガンドをコードする遺伝子の発現を低下させる態様１０５に記載の方法。
（態様１０７）
前記遺伝子破壊剤が、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－３またはＣＥＡＣＡＭ－５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、ＣＤ９６、ＭｅｒＴＫ及び２Ｂ４から成る群から選択される遺伝子の発現を低下させる態様１０６に記載の方法。
（態様１０８）
前記遺伝子破壊剤が、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって前記免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子の発現を低下させる態様１０５～１０７のいずれかに記載の方法。
（態様１０９）
１を超える遺伝子破壊剤が、ＲＮＡｉによって前記免疫細胞における前記免疫細胞の機能を弱める前記遺伝子の発現を低下させる態様１０８に記載の方法。
（態様１１０）
前記遺伝子破壊剤が前記免疫細胞の機能を弱める単一の遺伝子を標的とする、または前記免疫細胞の機能を弱める異なる遺伝子を標的とし、第１の遺伝子破壊剤は第１の遺伝子を標的とし、第２の遺伝子破壊剤は第２の遺伝子を標的とし、またはそれらの任意の組み合わせで標的とする態様１０９に記載の方法。
（態様１１１）
前記ＲＮＡｉには短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が介在する態様１０８～１１０のいずれかに記載の方法。
（態様１１２）
前記ＲＮＡｉには１を超えるｓｈＲＮＡが介在する態様１１１に記載の方法。
（態様１１３）
前記ＲＮＡｉには２つのｓｈＲＮＡが介在する態様１１２に記載の方法。
（態様１１４）
２つのｓｈＲＮＡがＰＤ－１を標的とする態様１１２または１１３に記載の方法。
（態様１１５）
第１のｓｈＲＮＡがＰＤ－１を標的とし、第２のｓｈＲＮＡがＴＩＭ－３を標的とする態様１１２または１１３に記載の方法。
（態様１１６）
第１のｓｈＲＮＡがＰＤ－１を標的とし、第２のｓｈＲＮＡがＣＴＬＡ－４を標的とする態様１１２または１１３に記載の方法。
（態様１１７）
第１のｓｈＲＮＡがＰＤ－１を標的とし、第２のｓｈＲＮＡがＬＡＧ－３を標的とする態様１１２または１１３に記載の方法。
（態様１１８）
第１のｓｈＲＮＡがＰＤ－１を標的とし、第２のｓｈＲＮＡがＴＩＧＩＴを標的とする態様１１２または１１３に記載の方法。
（態様１１９）
前記免疫細胞がｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む態様１１１～１１８のいずれかに記載の方法。
（態様１２０）
前記免疫細胞が１を超えるｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む態様１１９に記載の方法。
（態様１２１）
前記免疫細胞が２つのｓｈＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む態様１１９に記載の方法。
（態様１２２）
前記ｓｈＲＮＡ（複数可）をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２～２１９及び２３８～２６７から成る群から選択される配列を含む態様１１９～１２１のいずれかに記載の方法。
（態様１２３）
前記ｓｈＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列がベクター上に存在する態様１１９～１２２のいずれかに記載の方法。
（態様１２４）
異なるｓｈＲＮＡの発現が異なるプロモーターによってそれぞれ調節される態様１２３のいずれかに記載の方法。
（態様１２５）
２つの異なるｓｈＲＮＡの発現が２つの異なるプロモーターによってそれぞれ調節される態様１２４に記載の方法。
（態様１２６）
前記２つの異なるプロモーターがＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターである態様１２５に記載の方法。
（態様１２７）
前記２つのプロモーターがＵ６プロモーターである態様１２６に記載の方法。
（態様１２８）
前記Ｕ６プロモーターが異なる種に由来する態様１２７に記載の方法。
（態様１２９）
前記２つのプロモーターが互いに異なる方向に向けられる態様１２５～１２８のいずれかに記載の方法。
（態様１３０）
前記遺伝子操作された抗原受容体及び前記遺伝子破壊剤（複数可）がベクターからそれぞれ発現される態様８１～１２９のいずれかに記載の方法。
（態様１３１）
前記遺伝子操作された抗原受容体及び前記遺伝子破壊剤（複数可）が同一ベクターから発現される態様１３０に記載の方法。
（態様１３２）
前記ベクターが、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである態様１３０～１３１のいずれかに記載の方法。
（態様１３３）
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターである態様１３２に記載の方法。
（態様１３４）
前記レンチウイルスベクターがレトロウイルスベクターである態様１３３に記載の方法。
（態様１３５）
前記免疫細胞がＴ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞から成る群から選択される態様８１～１３４のいずれかに記載の方法。
（態様１３６）
前記免疫細胞がＴ細胞である態様１３５に記載の方法。
（態様１３７）
前記Ｔ細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である態様１３６に記載の方法。
（態様１３８）
前記免疫細胞が２つのｓｈＲＮＡ及びＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を同一ベクター上で含む態様１３６または１３７に記載の方法。
（態様１３９）
前記２つのｓｈＲＮＡが互いに異なる方向に向けられた２つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーターによってそれぞれ調節される態様１３８に記載の方法。
（態様１４０）
前記ＣＡＲがＣＤ１９を標的とし、前記第１のｓｈＲＮＡがＰＤ－１を標的とし、前記第２のｓｈＲＮＡがＴＩＧＩＴを標的とする態様１３９に記載の方法。
（態様１４１）
態様２１～８０のいずれかに記載の免疫細胞を含む組成物。
（態様１４２）
態様２１～８０のいずれかに記載の免疫細胞と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
（態様１４３）
免疫療法を必要とする疾患または状態を有する対象に態様２１～８０のいずれかに記載の免疫細胞または態様１４１もしくは１４２に記載の組成物を投与することを含む治療方法。
（態様１４４）
前記遺伝子操作された抗原受容体が前記疾患または前記状態に関連する抗原に特異的に結合する態様１４３に記載の方法。
（態様１４５）
前記疾患または前記状態ががん、例えば腫瘍である態様１４３または１４４に記載の方法。
（態様１４６）
疾患または状態の治療に使用するための態様２１～８０のいずれかに記載の免疫細胞または態様１４１～１４２に記載の組成物。
（態様１４７）
疾患または状態を治療するための薬物の製造における態様２１～８０のいずれかに記載の免疫細胞または態様１２１～１２２に記載の組成物の使用。
（態様１４８）
前記遺伝子操作された抗原受容体が前記疾患または前記状態に関連する抗原に特異的に結合する態様１４６に記載の免疫細胞もしくは組成物または態様１４７に記載の使用。
（態様１４９）
前記疾患または前記状態ががん、例えば腫瘍である、態様１４７または１４８に記載の使用、組成物、または免疫細胞。

Claims (15)

  1. プログラム細胞死1(PD-1)の発現を阻害する第1のshRNAをコードするヌクレオチド配列、Ig及びITIMドメインを持つT細胞免疫受容体(TIGIT)の発現を阻害する第2のshRNAをコードするヌクレオチド配列、及び、キメラ抗原受容体(CAR)をコードするヌクレオチド配列を含む、ベクター。
  2. 前記第1のshRNAの発現が、第1のプロモーターによって調節され、且つ前記第2のshRNAの発現が、第2のプロモーターによって調節される、請求項1記載のベクター。
  3. 前記第1及び第2のプロモーターが、RNAポリメラーゼIIIプロモーターである、請求項2記載のベクター。
  4. 前記RNAポリメラーゼIIIプロモーターが、U6プロモーターである、請求項3記載のベクター。
  5. 前記2つのプロモーターが、前記ベクター上で互いに異なる方向に向けられる、請求項2～4のいずれか1項記載のベクター。
  6. 前記2つのプロモーターが、ヘッドトゥーヘッドの方向に向けられる、請求項5記載のベクター。
  7. 前記2つのプロモーターが、末尾-末尾の方向に向けられる、請求項5記載のベクター。
  8. 請求項1～7のいずれか1項記載のベクターを含む、免疫細胞。
  9. 前記CARの標的抗原が、がん細胞、がん組織、及び／または腫瘍微小環境の中で、または、がん細胞、がん組織、及び／または腫瘍微小環境の表面でその発現が増加するがん抗原である、請求項8記載の免疫細胞。
  10. 前記CARの標的抗原が、CD19またはCD22である、請求項8または9記載の免疫細胞。
  11. 前記免疫細胞が、ヒト由来のT細胞またはナチュラルキラー(NK)細胞である、請求項8～10のいずれか1項記載の免疫細胞。
  12. 前記免疫細胞が、ヒト由来のT細胞である、請求項8～11のいずれか1項記載の免疫細胞。
  13. 前記CARの細胞内シグナル伝達ドメインが、ICOS、OX40、CD137(4-1BB)、CD27、及びCD28からなる群から選択される共刺激分子をさらに含む、請求項8～12のいずれか1項記載の免疫細胞。
  14. 請求項8～13のいずれか1項記載の免疫細胞を含む、医薬組成物。
  15. ヒト対象のがんを治療するための、請求項14記載の医薬組成物。
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