CN114075562A - Mage-c3抑制剂及其作为制备治疗和/或预防食管鳞状细胞癌药物的用途 - Google Patents

Mage-c3抑制剂及其作为制备治疗和/或预防食管鳞状细胞癌药物的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种MAGE‑C3抑制剂，该MAGE‑C3抑制剂为核酸抑制剂或特异地结合并抑制MAGE‑C3蛋白质的抗体。该MAGE‑C3抑制剂通过抑制MAGE‑C3的表达能够抑制食管鳞状细胞癌细胞的侵袭及迁移，使得抑制了MAGE‑C3的食管鳞状细胞癌细胞对淋巴细胞的杀伤更为敏感，并且抑制了MAGE‑C3的食管鳞状细胞癌细胞还会影响T细胞的正常功能。

Description

MAGE-C3抑制剂及其作为制备治疗和/或预防食管鳞状细胞癌 药物的用途
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及一种MAGE-C3抑制剂及其作为制备治疗和/或预防食管鳞状细胞癌药物的用途。
背景技术
在2018年全球范围的各类癌症统计中，食管癌是发病率排名第七、死亡率排名第六的恶性肿瘤。亚洲是全球食管癌发病率和死亡率最高的地区，而我国是亚洲食管癌发病率最高的国家。食管癌主要存在两种类型，即食管鳞状细胞癌和食管腺癌，我国主要以食管鳞状细胞癌为主。食管鳞状细胞癌前期症状不明显，患者确诊时多为中晚期，治疗手段以手术及放化疗为主，但由于食管鳞状细胞癌具有恶性程度高、转移快、复发率高的特点，因此大部分患者在接受治疗后仍无法获得良好的预后，参见Bray F等人(2018).“Globalcancer statistics 2018:Globocan estimates of incidence and mortalityworldwide for 36cancers in 185countries.”CA Cancer J Clin,68(6):394-424.
食管鳞状细胞癌化疗药物中，传统药物多为细胞毒性药物如顺铂和5-氟尿嘧啶，这些药物虽然能减轻症状但其抗肿瘤活性仍无法满足临床需求，并且由于药物剂量大而产生严重的毒副作用。现代研究中的靶向分子抑制剂如抗EGFR的抑制剂，其在食管鳞状细胞癌中的疗效目前仍未在III期临床试验中得到证实。近年热门的肿瘤免疫治疗亦是食管鳞状细胞癌的研究热点，但肿瘤免疫治疗在食管鳞状细胞癌中仍处于起步阶段，目前仅有抗PD-1疗法帕博利珠单抗(Pembrolizumab)获得FDA批准作为单药用于PD-L1阳性的复发性局部晚期或转移性食管鳞状细胞癌的二线治疗。因此，在食管鳞状细胞癌治疗中开发新一代免疫治疗方案具有重要的应用意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种MAGE-C3抑制剂，该MAGE-C3抑制剂通过抑制MAGE-C3的表达能够抑制食管鳞状细胞癌细胞的侵袭及迁移，并且使得抑制了MAGE-C3的食管鳞状细胞癌细胞对淋巴细胞的杀伤更为敏感。
为了实现上述目的，本发明提供一种MAGE-C3抑制剂，所述MAGE-C3抑制剂为核酸抑制剂或特异地结合并抑制MAGE-C3蛋白质的抗体。
更进一步地，所述核酸抑制剂为特异地结合编码MAGE-C3，并抑制MAGE-C3的翻译的多核苷酸。
优选地，所述核酸抑制剂为核酶、反义分子、寡核苷酸抑制剂、适体、microRNA或siRNA。
更优选地，所述siRNA由siRNA-1和/或siRNA-2组成，其中，siRNA-1的正义链序列如Seq ID No.1所示，siRNA-1的反义链序列如Seq ID No.2所示；siRNA-2的正义链序列如Seq ID No.3所示，siRNA-2的反义链序列如Seq ID No.4所示。
本发明还提供一种慢病毒，其特征在于，该慢病毒中包含编码所述的siRNA-1或siRNA-2。
本发明还提供上述MAGE-C3抑制剂或慢病毒作为制备治疗和/或预防食管鳞状细胞癌的药物的用途。
优选地，所述食管鳞状细胞癌为哺乳动物中的食管鳞状细胞癌。
优选地，所述的哺乳动物为人。
本发明的有益效果在于：
本发明提供一种MAGE-C3抑制剂，该MAGE-C3抑制剂通过抑制MAGE-C3的表达能够抑制食管鳞状细胞癌细胞的侵袭及迁移，并且使得抑制了MAGE-C3的食管鳞状细胞癌细胞对淋巴细胞的杀伤更为敏感。
附图说明
图1A为MAGE-C3在87食管鳞状细胞癌组织和配对的癌旁组织的免疫组化染色结果图，仅展示其中部分代表性的组织样本及配对样本。
图1B为图1A的统计结果图。
图2为本发明提供的靶向MAGE-C3的siRNA在食管鳞状细胞癌细胞KYSE30中的干扰效率。
图3为本发明提供的靶向MAGE-C3的siRNA在食管鳞状细胞癌细胞KYSE140中的干扰效率。
图4A和图4B为本发明提供的siRNA能够抑制食管鳞状细胞癌细胞KYSE30的侵袭效果及t-test检测统计图。
图5A和图5B为本发明提供的siRNA能够抑制食管鳞状细胞癌细胞KYSE140的侵袭效果及t-test检测统计图。
图6A和图6B为本发明提供的siRNA能够抑制食管鳞状细胞癌细胞KYSE30的迁移效果及t-test检测统计图。
图7A和图7B为本发明提供的siRNA能够抑制食管鳞状细胞癌细胞KYSE140的迁移效果及t-test检测统计图。
图8为MAGE-C3的shRNA重组慢病毒载体及插入酶切位点示意图。
图9为包含本发明提供的siRNA序列的病毒在食管鳞状细胞癌细胞KYSE30中的干扰效率。
图10为包含本发明提供的siRNA序列的病毒在食管鳞状细胞癌细胞KYSE140中的干扰效率。
图11A和图11B为食管鳞状细胞癌细胞KYSE30在感染了包含本发明提供的siRNA序列的病毒后的流式细胞图及结果统计图。
图12A和图12B为食管鳞状细胞癌细胞KYSE140在感染了包含本发明提供的siRNA序列的病毒后的流式细胞图及结果统计图。
图13为食管鳞状细胞癌细胞KYSE30在感染了包含本发明提供的siRNA序列的病毒后促进T细胞分泌TNF-α的结果图。
图14为食管鳞状细胞癌细胞KYSE30在感染了包含本发明提供的siRNA序列的病毒后促进T细胞分泌IFN-γ的结果图。
图15为食管鳞状细胞癌细胞KYSE30在感染了包含本发明提供的siRNA序列的病毒后抑制T细胞分泌IL-10的结果图。
图16为食管鳞状细胞癌细胞KYSE30在感染了包含本发明提供的siRNA序列的病毒后抑制T细胞分泌IL-1β的结果图。
图17为食管鳞状细胞癌细胞KYSE140在感染了包含本发明提供的siRNA序列的病毒后促进T细胞分泌TNF-α的结果图。
图18为食管鳞状细胞癌细胞KYSE140在感染了包含本发明提供的siRNA序列的病毒后促进T细胞分泌IFN-γ的结果图。
图19为食管鳞状细胞癌细胞KYSE140在感染了包含本发明提供的siRNA序列的病毒后抑制T细胞分泌IL-10的结果图。
图20为食管鳞状细胞癌细胞KYSE140在感染了包含本发明提供的siRNA序列的病毒后抑制T细胞分泌IL-1β的结果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
分子靶向治疗为近年来研究热点，随着研究的不断深入，靶向治疗开创了癌症治疗的新领域。如小分子蛋白激酶抑制剂伊马替尼可用于治疗各期慢性髓细胞白血病，也用于治疗CD117阳性的胃肠道间质细胞瘤。酪氨酸激酶受体抑制剂克唑替尼获可用于治疗间变型淋巴瘤激酶基因重排的非小细胞肺癌(NSCLC)。参见Hirano H等人(2019).“Systemictreatment of advanced esophageal squamous cell carcinoma:chemotherapy,molecular-targeting therapy and immunotherapy.”Jpn J Clin Oncol.49:412-420.因此，阐明肿瘤发生发展的分子机制对治疗恶性肿瘤和提高肿瘤患者生存率有很大的帮助。
发明人发现一个在食管鳞状细胞癌组织中具有较高的特异性表达的癌睾抗原MAGE-C3，MAGE-C3基因定位于X染色体上，其蛋白含有643个氨基酸，在NCBI上MAGE-C3基因的Genbank登录号为Gene ID:139081。该基因属于MAGE基因家族，该家族成员在除生殖系统外的正常组织中不表达，但在各种类型的肿瘤中表达，尚未有文献在食管鳞状细胞癌中报道MAGE-C3的功能研究。
多项基因组相关的研究先后在食管鳞状细胞癌患者中展开，全面而系统地描绘食管鳞状细胞癌的整体基因组变化情况。参见Song Y.等人(2014).“Identification ofgenomic alterations in oesophageal squamous cell cancer.”Nature 509,91-95.和Chen XX等人(2017).“Genomic comparison of esophageal squamous cell carcinomaand its precursor lesions by multi-region whole-exome sequencing.”NatCommun.8(1):52.出人意料的发现，MAGE-C3在食管鳞状细胞癌中高表达，具有8.2％的扩增率。
发明人通过免疫组织化学分析发现，MAGE-C3在87例食管鳞状细胞癌患者组织中的表达水平显著高于其配对的癌旁组织。随后的功能实验证明，在食管鳞状细胞癌细胞系中高表达MAGE-C3可以促进肿瘤细胞的侵袭和迁移，而在食管鳞状细胞癌细胞系中抑制MAGE-C3的表达不仅可以抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移，还能促进免疫系统对肿瘤细胞的杀伤作用并影响T细胞分泌细胞因子的正常功能。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
“核酸抑制剂”用于文中，指如适体的核酸分子，其通过以类似于对上述抗体所描述的方式结合多肽来抑制MAGE-C3多肽活性，或者指与编码MAGE-C3多肽的多核苷酸互补而结合所述多核苷酸的核酸分子，其抑制多核苷酸的转录或翻译。例如，抑制性核酸可通过干扰MAGE-C3基因的正确转录作为三螺旋形成寡核苷酸发挥作用。而且，抑制性核酸可以是核酶，其特异地结合并降解MAGE-C3转录物。可替换地，其可以是能够结合、降解转录物或至少抑制其有效翻译的反义(核酸)、siRNA或microRNA。后一类型的抑制性核酸的特征在于其通常包含于MAGE-C3转录物中的序列互补的核酸序列。该互补序列应该足够长，且应当包含足够数目的匹配核苷酸，从而允许与细胞中转录物的特异杂交。
根据本发明的“核酶”是包含与MAGE-C3转录物互补的序列的RNA分子。核酶技术是本领域公知的，本领域技术人员能够设计和应用合适的核酶，而无需周折；参见，例如，Khan2006,Clin.Chim.Acta367(1-2):20-27和Kalota 2004,Cancer Biology&Therapy 3(1):4-12。
“反义分子”用于文中，指与MAGE-C3转录物互补的治疗性反义RNA或能够结合MAGE-C3转录物的吗啉代寡核苷酸。包括吗啉代寡核苷酸应用的反义技术是本领域公知的，参见，例如Kalota 2004,Cancer Biology&Therapy 3(1):4-12和Morcos 2007,BiochemBiophys Res Commun 358(2):521-7。
抑制性寡核苷酸用于文中，优选地，指能够结合靶标基因组DNA特定的区域，从而实现基因沉默(所谓的三螺旋形成寡核苷酸)的小双链DNA分子，或者指作为诱饵发挥作用，而阻隔靶标基因转录特异地需要的转录因子的寡核苷酸。这些技术已经成功地用于体内，而且在某种程度上在治疗中已经获得结果(也参见Kalota 2004,Cancer Biology&Therapy3(1):4-12)。
术语“适体”用于文中，指特异地结合MAGE-C3多肽的核酸适体。通过使用，例如通过指数富集的配体系统进化(SELEX)技术，可生成适体的库(pool)。能将选择步骤用于那些特异地结合MAGE-C3多肽的适体。在特异地结合的适体中，阻断配体结合那些适体，或阻断相互作用结构域的那些适体，因而能被鉴定为本发明意义上适合的适体。用于生成适体的技术是本领域公知的，参见，例如Tuerk 1990,Science.Aug 3；249(4968):505-10；Ellington 1990,Nature.Aug 30；346(6287):818-822。
在本发明意义上的“microRNA”指单链RNA分子，其与MAGE-C3转录物中包含的核酸序列至少部分互补。microRNA通常具有大约19至26个核苷酸长度。microRNA作为前体合成，即所谓的pri-microRNA，所述pri-microRNA具有发夹结构和形成发夹茎的两个互补的自互补区域。
术语“小干扰RNA(siRNA)”指为双链RNA剂的核酸分子，其与MAGE-C3转录物的一部分互补，并能够碱基配对。siRNA通过特异地指导宿主细胞中的酶而发挥作用，从而切割靶标RNA。凭借siRNA序列的特异性，以及其与RNA靶标的同源性，siRNA能够引起靶标RNA链的切割，从而失活靶标RNA分子。优选地，足以调节RNAi的siRNA包含如下核酸序列，其含有靶标基因反向重复片段和目标基因编码区域(或部分)。siRNA的互补区域允许siRNA足以与靶标RNA杂交，从而调节RNAi。在哺乳动物中，siRNA是大约19-25个核苷酸的长度。
术语“抗体”用于文中，指所有类型的特异地结合MAGE-C3多肽、并抑制MAGE-C3活性的抗体。优选地，本发明的该抑制性抗体特异地结合位于配体结合结构域的MAGE-C3多肽中的表位。优选地，本发明的抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体或任何该抗体的片段或衍生物。包含在术语抗体中的这样的片段或衍生物用于文中，包括双特异抗体、合成的抗体、Fab、F(ab)2、Fv或scFv片段、或这些抗体中任何一个的化学修饰的衍生物。在本发明抗体的上下文中使用的特异的结合，指抗体不与其他多肽交叉反应。可使用公知技术检测特异的结合。
材料：
1.食管鳞状细胞癌细胞系KYSE30，KYSE140细胞以及人源细胞株Jurkat T淋巴细胞购买自国家生物医学实验细胞资源库(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)，由北京大学肿瘤医院分子肿瘤学研究室保存。
2.食管鳞状细胞癌组织芯片(货号：HEso-Squ180Sur-03)购自上海芯超生物科技有限公司。
3.免疫组化二步法检测试剂盒(货号：PV-9000，包含内源性过氧化物酶阻断剂；试剂1：反应增强液；试剂2：增强酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物)、EDTA免疫组化抗原修复缓冲液(货号：ZLI-9079)、DAB显色试剂盒(货号：ZLI-9019)、封闭用正常羊血清(货号：ZLI-9022)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
4.PBS(货号：P05B01)、即用型彩色预染蛋marker(货号：P06M02)均购自金普来生物科技有限公司。
5.苏木素染料(货号：G1080)购自北京索莱宝科技有限公司。
6.MAGE-C3抗体(货号：PA5-68045)、脂质体Lipo2000(货号：11668019)、CD3/CD28Dynabeads(货号：11131D)、BCA蛋白定量试剂盒(货号：23225)均购自Thermo Fisher公司。
7.鼠抗人Actin一抗(货号：3700)、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗(货号：7670)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)二抗(货号：7044)均购自CST公司(Cell Signaling Technology)。
8.MAGE-C3的siRNA-1，siRNA-2和siRNA-3由广州锐博生物技术有限公司合成；阴性对照序列siNC(产品编号：siN0000001-1-5)购买自广州锐博生物技术有限公司。
9.Transwell平板(货号：3422)购自Corning公司。
10.基质胶(货号：356234)购自BD公司。
11.0.25％胰酶(货号：C125C1)、5×上样缓冲液(货号WB2001)、超敏ECL化学发光试剂盒、10％ExpressCast PAGE彩色凝胶快速试剂盒(货号：P2012)、20×快速转膜液(货号：WB4600)均购自苏州新赛美生物科技有限公司。
12.CFSE试剂(货号：C1031)、RIPA蛋白裂解液(货号：P0013B)、Annexin-V-PI凋亡试剂盒(货号：C1062L)均购自上海碧云天生物技术有限公司。
13.1640培养基(货号：SH30809.01)均购自Hyclone公司。
14.慢病毒空载体pLKD-CMV-G&PR-U6-shRNA由和元生物技术(上海)股份有限公司(简称：和元生物)提供，慢病毒pLKD-CMV-G&PR-U6-MAGE-C3-sh-1，pLKD-CMV-G&PR-U6-MAGE-C3-sh-2和pLKD-CMV-G&PR-U6-MAGE-C3-shnc委托和元生物技术(上海)股份有限公司合成。
实施例1：MAGE-C3在87对食管鳞状细胞癌组织和配对的癌旁组织的表达情况
选择购买的食管鳞状细胞癌组织芯片HEso-Squ180Sur-03，芯片中含有93例食管鳞状细胞癌组织，其中有87例还带有配对的癌旁组织，因此选择带有配对的癌旁组织的87例食管鳞状细胞癌组织及配对的癌旁组织进行表达检测。
1.免疫组织化学法检测MAGE-C3在人食管鳞癌组织芯片HEso-Squ180Sur-03中的表达
1)将人食管鳞癌组织芯片HEso-Squ180Sur-03在65℃烤片过夜；
2)脱蜡：二甲苯15min，换新鲜的二甲苯15min；
3)水化：无水乙醇10min；换新鲜的无水乙醇10min；90％5min；80％5min；70％5min；60％5min；50％5min；
4)PBS洗3min 3遍；
5)3％内源性过氧化物酶阻断剂室温孵育20min；
6)PBS洗3min 3遍；
7)抗原修复液放进盒中，在微波炉中高火煮8min，待液体煮沸冒泡后，将片子放入盛有抗原修复液的盒中，中低火煮15min；
8)室温自然冷却；
9)PBS洗3min 3遍；
10)羊血清室温孵育15min；
11)MAGE-C3抗体(稀释比例1:500)4℃过夜；
12)PBS洗3min 3遍；
13)试剂1(反应增强液)室温20min，PBS洗3min 3遍；试剂2(增强酶标山羊抗小鼠/兔IgG聚合物)室温20min，PBS洗3min 3遍；
14)DAB显色，水洗终止；
15)苏木素染色5-10min，水洗；
16)盐酸乙醇分化5s，水洗；
17)氨水返蓝，10s水洗；
18)无水乙醇脱水：50％5min；60％5min；70％5min；80％5min；90％5min；二甲苯封片。
2.数据收集
通过MAGE-C3抗体对MAGE-C3标记来检测MAGE-C3在87人食管鳞癌状细胞癌组织样本及其配对的癌旁组织样本中的表达情况，采用数字病理扫描系统ScanScope CS2(Leica)扫描成像，并根据染色强度(深棕色、棕色、浅棕色和未着色)进行人工判读，分为MAGE-C3高表达组(深棕色和棕色)和MAGE-C3低表达组(浅棕色和未着色)。
结果如图1A所示，为MAGE-C3在人食管鳞癌状细胞癌组织及其配对的癌旁组织的免疫组化染色结果，仅展示其中部分代表性的组织样本及配对样本，分别为人食管鳞癌状细胞癌组织中的MAGE-C3高表达组和MAGE-C3低表达组以及癌旁组织中的MAGE-C3高表达组和MAGE-C3低表达组。如图1B所示为87对食管鳞癌状细胞癌样本和癌旁组织样本中MAGE-C3高表达组和MAGE-C3低表达组的分布数量，卡方检验显示具有统计学差异(P<0.01)，说明MAGE-C3在食管鳞癌状细胞癌组织中的表达水平显著高于配对的癌旁组织。
实施例2：靶向MAGE-C3的siRNA对MAGE-C3的干扰效果的检测
为了检测靶向MAGE-C3的siRNA对MAGE-C3的干扰效果，合成多条MAGE-C3的siRNA序列，具体如表1所示。
表1 MAGE-C3的siRNA序列
Figure BDA0002970138570000081
阴性对照序列siNC(产品编号：siN0000001-1-5)为商业产品。
1.实验分组：
设计转染阴性对照Sinc组、转染Si-1组；转染Si-2组；转染Si-3组四个组别。
2.分组转染
按照分组数量准备KYSE30和KYS140细胞。
1)取生长状态良好的KYSE30和KYS140细胞，于转染前一天将细胞接种60mm培养皿中，待细胞密度达到80％～90％时进行转染；
2)取两个无菌EP管分别加入200ul无血清无抗生素的1640培养基，向其中一个EP管加入8ul浓度为50nM的MAGE-C3的siRNA并混匀，向另一个EP管加入4ul的转染试剂lipo2000并混匀；
3)室温静置5min后将两管液体混合，并静置15min；
4)取出待转染的细胞，弃掉旧培养基，加入2ml无血清1640培养基，将制备的siRNA-脂质体混合物滴加入细胞培养皿，轻轻混匀，放入培养箱；
5)6h后换新鲜1640完全培养基，48h后收取细胞进行检测。
3.Western Blotting检测MAGE-C3蛋白表达
1)将转染48h后的细胞胰酶消化后300g离心，PBS清洗一次，离心去上清；
2)加入相对细胞沉淀体积2倍的RIPA蛋白裂解液，冰上孵育10分钟，每隔5min震荡一次，12000g离心15min，收集上清；
3)采用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白的浓度；
4)按体积计算加入5×上样缓冲液，100℃变性5min；
5)取30ug蛋白液上样，10％SDS-PAGE电泳，90v，2h；转膜至PVDF膜，400mA，40min；
6)用含5％脱脂奶粉的TBS封闭液封闭60min；
7)一抗孵育：MAGE-C3一抗(1：1000)、actin一抗(1：5000)4℃孵育过夜；PBST洗膜10min×3次；
8)二抗孵育：辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗(1：5000)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)二抗(1：5000)室温孵育1h；PBST洗膜10min×3次；
9)ECL显影后，用Image Quant LAS4000mini(GE Healthcare)对图象扫描处理，并采用Image J软件对条带进行灰度分析，结果如图2和图3所示。
从图2可以看出，在KYSE30中转染Si-1，Si-2和Si-3组的MAGE-C3的蛋白表达水平显著低于转染Sinc组，以Sinc组表达为100％，则转染Si-1，Si-2和Si-3组的表达效率分别为60％、50％和80％；计算敲降效率(敲降效率＝100％-表达效率)可以得出转染Si-1，Si-2和Si-3组的敲降效率分别为40％、50％和20％。
从图3可以看出，KYSE140细胞中转染Si-1，Si-2和Si-3组的MAGE-C3的蛋白表达水平显著低于转染Sinc组，以Sinc组表达为100％，则转染Si-1，Si-2和Si-3组的表达效率分别为70％、60％和80％，计算转染Si-1，Si-2和Si-3组的敲降效率分别为30％、40％、20％。
从图2和图3可以看出，Si-1和Si-2组的效果均优于Si-3组，因此选择Si-1和Si-2进行后续步骤。
实施例3：转染靶向MAGE-C3的siRNA后对食管鳞状细胞癌细胞侵袭和迁移的影响
1.实验分组
设计转染阴性对照sinc组；转染si-1组；转染si-2组三个组别。
2.分组转染
按照分组数量准备KYSE30和KYS140细胞。按照实施例2中方法分组转染sinc、si-1和si-2到KYSE30和KYS140细胞中，转染24h后收集细胞用于检测细胞的侵袭和迁移。
肿瘤转移一般是指肿瘤细胞从原发部位脱离，运动并侵袭到邻近组织或者远端部位。因此，研究肿瘤细胞的侵袭和迁移能力能反应恶性肿瘤的转移能力。
3.transwell方法检测细胞侵袭
1)将基质胶在4℃中融解，同时将无血清的培养基、EP管、枪头预冷处理，用无血清培养基配制2％浓度的基质胶；
2)取100ul的2％基质胶培养基加入Transwell的上室，放入孵箱中孵育1小时以上；
3)提前将转染后的肿瘤细胞采用无血清的1640培养基处理6小时，胰酶消化后离心，并用1ml无血清培养基重悬细胞，吹打均匀，进行细胞计数；
4)向Transwell的下室中加入600ul含20％血清的1640完全培养基，再向上室加入100ul含有20×104细胞的无血清培养基；
5)将Transwell板放入孵箱中孵育20小时后，取出Transwell板并将上室放入甲醇中固定约20分钟；
6)再将上室放入0.25％的结晶紫染色5分钟，去离子水洗涤小室并洗去多余着色；
7)Leica正置显微镜(DFC450C)观察小室底部穿透过的染色细胞，并进行拍照和计数，结果如图4A、图4B、图5A和图5B所示，其中，图4A为KYSE30细胞中的侵袭照片，图4B为对应的t-test检测结果，图5A为KYSE140细胞中的侵袭照片，图5B为对应的t-test检测结果。
从图4A和图4B可以看出，在KYSE30细胞中，阴性对照组穿透小室的细胞数153±7.81，转染si-1组和si-2组穿透小室的细胞数分别为36.67±3.756和45±2.887，采用t-test检测两者具有统计学差异(P<0.01)；从图5A和图5B可以看出，在KYSE140细胞中，阴性对照组穿透小室的细胞数252±6.245，转染si-1组和si-2组穿透小室的细胞数分别为126.7±6.119和128±13.11，采用t-test检测两者具有统计学差异(P<0.01)。以上结果说明当特异性抑制MAGE-C3的表达后，能明显抑制肿瘤细胞的侵袭。
4.transwell方法检测细胞迁移实验
1)提前将转染后的肿瘤细胞采用无血清的1640培养基饥饿处理6小时，胰酶消化后离心，并用1ml无血清培养基重悬细胞，吹打均匀，进行细胞计数；
2)向Transwell的下室中加入600ul含20％血清的1640完全培养基，再向上室加入100ul含有2×105细胞的无血清培养基；
3)将Transwell板放入孵箱中孵育20小时后，取出Transwell板并将上室放入甲醇中固定约20分钟；
4)再将上室放入0.25％的结晶紫染色5分钟，用去离子水洗涤小室并洗去多余着色；
5)正置显微镜观察小室底部穿透过的染色细胞，并进行拍照和计数，结果如图6A、图6B、图7A和图7B所示，其中，图6A为KYSE30细胞中的迁移照片，图6B为对应的t-test检测结果，图7A为KYSE140细胞中的迁移照片，图7B为对应的t-test检测结果。
从图6A和图6B可以看出，在KYSE30细胞中，阴性对照组穿透小室的细胞数193±7.513，转染si-1组和si-2组穿透小室的细胞数分别为54.33±4.41和57.67±4.333，采用t-test检测两者具有统计学差异(P<0.01)；从图7A和图7B可以看出，在KYSE140细胞中，阴性对照组穿透小室的细胞数293.7±7.055，转染si-1组和si-2组穿透小室的细胞数分别为146.7±10.84和156.3±9.244，如图7B采用t-test检测两者具有统计学差异(P<0.01)。以上结果说明当特异性抑制MAGE-C3的表达后，能明显抑制肿瘤细胞的迁移。
从上述实验可以看出，si-1及si-2可以明显抑制食管鳞状细胞癌细胞的转移。
实施例4：慢病毒感染食管鳞状细胞癌细胞并检测稳定干扰MAGE-C3表达的效率
1.靶向干扰MAGE-C3的慢病毒包装
委托和元生物根据si-1和si-2的序列，通过在空载体pLKD-CMV-G&PR-U6-shRNA的相应位点插入si-1或si-2序列生产靶向干扰MAGE-C3的慢病毒pLKD-CMV-G&PR-U6-MAGE-C3-sh-1(简称：sh1)或pLKD-CMV-G&PR-U6-MAGE-C3-sh-2(简称：sh2)，同时生产阴性对照pLKD-CMV-G&PR-U6-MAGE-C3-shnc(简称：shnc，shnc的序列由公司提供并合成慢病毒)，滴度均为1×108TU。空载体pLKD-CMV-G&PR-U6-shRNA质粒图谱及si-1和si-2的插入位点如图8所示。
1.慢病毒感染食管鳞状细胞癌细胞并筛选稳定干扰MAGE-C3的细胞株
1)分别取生长状态良好的食管鳞状细胞癌细胞KYSE30和KYSE140，于转染前一天将0.3×106数量的细胞接种于六孔板中；
2)提前2h将待感染的KYSE30或KYSE140细胞换上1ml新鲜的1640完全培养基，同时加入试剂polybrene，使得终浓度为5ug/ml；
3)在生物安全柜中操作，各取15ul的sh1和sh2混合病毒液体，命名为shc3加入KYSE30或KYSE140细胞培养皿，同样将阴性对照shnc，加入到另外的KYSE30或KYSE140细胞培养皿，以保证对MAGE-C3进行最佳的干扰效果，并将细胞放回培养箱；其中感染KYSE30细胞的组称为K30-shc3，K30-shnc(阴性对照)，感染KYSE140细胞的组称为K140-shc3，K140-shnc(阴性对照)；
4)12h后，在生物安全柜中弃去旧的培养基，加入新鲜培养基；
5)待细胞密度约为90％时，消化细胞，将细胞转入100mm培养皿中培养；
6)待大皿中的细胞密度为70％时，加入含有嘌呤霉素的1640培养基(2ug/ml)，筛选细胞；另取未做处理的相同细胞系做为空白对照，加入相同的1640培养基；
7)加入筛选培养基约24h后，做为空白对照的细胞基本全部死亡，感染病毒的细胞生长状态良好。
8)在筛选后的细胞中加入含有0.5ug/ml嘌呤霉素的培养基，持续培养。
9)收取细胞进行western blot步骤检测MAGE-C3的表达，用Image QuantLAS4000mini(GE Healthcare)对图象扫描处理，并采用Image J软件对条带进行灰度分析，结果如图9和图10所示，其中，图9表示KYSE30细胞中的干扰效率，图10表示KYSE140细胞中的干扰效率。
从图9和图10可以看出，感染靶向MAGE-C3的shRNA质粒的慢病毒的KYSE30(K30-shc3)和KYSE140(K140-shc3)细胞，相对感染阴性对照组细胞K30-shnc和K140-shnc，MAGE-C3的蛋白表达水平显著降低，在KYSE30细胞中K30-shc3的表达效率为30％，计算敲降效率为70％，在KYSE140细胞中K140-shc3表达效率为40％，计算敲降效率为60％。说明，转染靶向MAGE-C3的shRNA质粒的慢病毒能有效干扰MAGE-C3的蛋白表达，并且比单条的si效果(见实施例2)更佳。
实施例5：感染靶向MAGE-C3的sh干扰病毒的食管鳞状细胞癌细胞对淋巴细胞杀伤的敏感性检测
1.人外周血淋巴细胞分离及活化
1)取健康志愿者新鲜外周血，用生理盐水稀释一倍；
2)在15ml无菌离心管中加入7ml人外周血淋巴细胞分离液，按照1：1比例轻柔地加入稀释后的外周血；
3)500g室温离心20min；
4)弃去上层部分血浆，再小心吸取白色环状层(即为淋巴细胞层)，移至新的15ml无菌离心管；
5)加入10ml生理盐水洗涤，250g室温离心10min；
6)用2ml的1640完全培养基重悬细胞并计数，随后取8×104的淋巴细胞中加入2μL的CD3/CD28 Dynabeads，混匀37℃；
7)孵育活化48h，等待进行下一步细胞杀伤实验。
2.淋巴细胞杀伤实验
1)实验分组：阴性对照组shnc、靶向干扰MAGE-C3组shc3、感染阴性对照与淋巴细胞共培养组shnc+PBMC、感染靶向干扰MAGE-C3组与淋巴细胞共培养组shc3+PBMC。
2)胰酶消化稳各实验组的肿瘤细胞，并用PBS清洗三次；
3)用1mL CFSE工作液(浓度为10μM)重悬细胞，37℃避光孵育10min，每5min轻柔摇晃混匀；
4)加入10mL10％1640培养基中止染色，100g离心5min去上清，再用PBS清洗两次；
5用1640完全培养基重悬细胞计数，将已激活的外周血淋巴细胞与肿瘤细胞按照20:1比例共培养24h；
6)收集上清并消化肿瘤细胞，100g离心5min收集细胞，并用预冷的PBS清洗2次；
7)采用凋亡试剂盒，用400μL 1×Binding buffer重悬细胞，加入10μL PI混匀，室温避光染色10min后采用LSRII流式细胞仪(BD)检测，统计CFSE和PI双阳性的肿瘤细胞比例，即为被淋巴细胞杀伤的肿瘤细胞。
结果如图11A、图11B、图12A和图12B所示，其中，图11A是流式细胞仪检测的KYSE30组的等高线图结果，同一个环线上细胞的密度相同，等高线越密集说明这个地方的细胞数目密度越高。四个子图分别为阴性对照组shnc、靶向干扰MAGE-C3组shc3、感染阴性对照与淋巴细胞共培养组shnc+PBMC、感染靶向干扰MAGE-C3组与淋巴细胞共培养组shc3+PBMC。单个图横坐标为CFSE强度，纵坐标为PI强度，方框内为CFSE和PI双阳性的肿瘤细胞(即为被淋巴细胞杀伤的肿瘤细胞)，图11B为图11A的统计结果，从图11A和图11B可以看出，当KYSE30细胞与淋巴细胞共培养时，shc3+PBMC组细胞相对shnc+PBMC细胞具有更高的凋亡比例，如图11B所示shc3+PBMC组细胞凋亡比例为11.57±1.157％，shc3+PBMC组细胞凋亡比例为18.78±1.442％，t-test分析具有统计学差异(P<0.05)；同理，图12A是流式细胞仪检测的KYSE140组的等高线图结果，图12B为图12A的统计结果，从图12A和图12B可以看出，当KYSE140细胞与淋巴细胞共培养时，shc3+PBMC组细胞相对shnc+PBMC细胞同样具有更高的凋亡比例，如图12B所示shc3+PBMC组细胞凋亡比例为22.72±3.223％，shc3+PBMC组细胞凋亡比例为31.73±2.324％，t-test分析具有统计学差异(P<0.05)。以上结果说明当特异性抑制MAGE-C3的表达后，肿瘤细胞对淋巴细胞的杀伤更为敏感。
实施例6：感染靶向MAGE-C3的sh干扰病毒的食管鳞状细胞癌细胞对T细胞正常功能的影响检测
由于实施例5分离的外周血淋巴细胞包含了T细胞(占70-80％)和B细胞(占20-30％)，适用于模拟体内免疫系统的功能。本实施例用于针对性研究T细胞的功能，因此选用商品化细胞系人源细胞株Jurkat T淋巴细胞进行实验。
1.实验分组
设计感染了靶向干扰MAGE-C3病毒组shc3和阴性对照组shnc。
2.T淋巴细胞与食管鳞状细胞癌细胞共培养
1)取8×104的人源细胞株Jurkat T淋巴细胞加入2μL的CD3/CD28Dynabeads，混匀37℃；孵育活化48h；
2)将1×104食管鳞状细胞癌细胞KYSE30或KYSE140接种进96孔板，并将活化后的Jurkat T淋巴细胞按照淋巴细胞和食管鳞状细胞癌细胞5:1比例加入；
3)共培养48h后吸取培养上清，并采用500g离心取上清；
4)将上清稀释一倍，采用Elisa法检测细胞因子IL-1β、IL-10、TNF-α和IFN-γ的含量。
3.ELISA法检测shnc和shc3实验组中T细胞相关分泌细胞因子的水平
1)取ELISA孔板，向孔中分别加入稀释样品和标准品(100μL/孔)，封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育90min；
2)采用试剂盒的洗涤液洗板5次后，向空白孔加入生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100μL/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育60min；
3)采用试剂盒的洗涤液洗板5次后，向空白孔加入酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100μL/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱避光孵育30min；
4)采用试剂盒的洗涤液洗板5次后，加入显色底物(100μL/孔)，37℃孵箱避光孵育15min；
5)加入终止液(100μL/孔)，混匀后即刻测量OD450值(3min内)；
6)Elisa结果判断:每个标准品和标本的OD值应减去空白孔OD值；以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标标准曲线；根据样本的OD值在标准曲线上计算其浓度，结果如图13至图16所示。
从图13至图16可以看出，KYSE30-shc3细胞及其阴性对照组细胞KYSE30-shnc与T淋巴细胞共培养后，T淋巴细胞分泌的促进免疫作用的因子TNF-α和IFN-γ的水平显著上升(如图13和图14)；而具有抑制免疫作用的细胞因子IL-10和IL-1β的水平显著下降(如图15和图16)，t-test分析具有统计学差异(P<0.05)。同样地在图17至图20中，KYSE140-shc3细胞及其阴性对照组细胞KYSE140-shnc与T淋巴细胞共培养后，T淋巴细胞分泌的促进免疫作用的因子TNF-α和IFN-γ的水平显著上升(如图17和图18)；而具有抑制免疫作用的细胞因子IL-10和IL-1β的水平显著下降(如图19和图20)，t-test分析具有统计学差异(P<0.05)。以上结果说明感染靶向MAGE-C3的sh干扰病毒的食管鳞状细胞癌细胞将影响T细胞的正常功能。
从上述实施例可以看出，本发明提供的MAGE-C3抑制剂通过抑制MAGE-C3的表达能够抑制食管鳞状细胞癌细胞的侵袭及迁移，并且使得抑制了MAGE-C3的食管鳞状细胞癌细胞对淋巴细胞的杀伤更为敏感。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京肿瘤医院（北京大学肿瘤医院）
<120> MAGE-C3抑制剂及其作为制备治疗和/或预防食管鳞状细胞癌药物的用途
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggaugccacc uucagugau 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 2
aucacugaag guggcaucc 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggaacuucag aucagcgaa 19
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 4
uucgcugauc ugaaguucc 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccgugaguuc auagagauu 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 6
aaucucuaug aacucacgg 19

Claims (8)

1.一种MAGE-C3抑制剂，其特征在于，所述MAGE-C3抑制剂为核酸抑制剂或特异地结合并抑制MAGE-C3蛋白质的抗体。
2.如权利要求1所述的MAGE-C3抑制剂，其特征在于，所述核酸抑制剂为特异地结合编码MAGE-C3，并抑制MAGE-C3的翻译的多核苷酸。
3.如权利要求1所述的MAGE-C3抑制剂，其特征在于，所述核酸抑制剂为核酶、反义分子、寡核苷酸抑制剂、适体、microRNA或siRNA。
4.如权利要求3所述的MAGE-C3抑制剂，其特征在于，所述siRNA由siRNA-1和/或siRNA-2组成，其中，siRNA-1的正义链序列如Seq ID No.1所示，siRNA-1的反义链序列如Seq IDNo.2所示；siRNA-2的正义链序列如Seq ID No.3所示，siRNA-2的反义链序列如Seq IDNo.4所示。
5.一种慢病毒，其特征在于，该慢病毒中包含编码如权利要求4所述的siRNA-1或siRNA-2。
6.如权利要求1至4任一项所述的MAGE-C3抑制剂或权利要求5所述慢病毒作为制备治疗和/或预防食管鳞状细胞癌的药物的用途。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述食管鳞状细胞癌为哺乳动物中的食管鳞状细胞癌。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的哺乳动物为人。
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