CN103656642A - 预防和治疗结直肠癌的方法和试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及结直肠癌的预防与治疗的方法和试剂。首次揭示Bcl-3与结直肠癌的发生或发展密切相关。在结直肠癌细胞中敲低Bcl-3基因后，Bcl-3敲低的结肠癌细胞增殖能力显著降低。因此可知Bcl-3蛋白是结直肠癌的发生或发展中发挥重要作用的因素，从而可以作为药物靶点开发防治结直肠癌的药物。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域；更具体地，本发明涉及结直肠癌的预防与治疗的方法和试剂。
背景技术
癌症是全世界一个主要的死亡原因。2008年的癌症死亡人数达760万(约占所有死亡人数的13%)。而结直肠癌的发病率和死亡率在所有恶性肿瘤中仅于肺癌和胃癌之后位列第三，其中结肠癌的发病率约是直肠癌的两倍。男性结直肠癌的发病率明显高于女性，约为1.6：1。据世界肿瘤流行病学调查统计，结直肠癌在北美、西欧、澳大利亚、新西兰等地的发病率最高，中国、日本、智利、非洲等地则较低。在欧洲，每年约有25万结直肠癌新增病例，占所有新增恶性肿瘤的9%；在美国，结直肠癌的发病率和致死率也占到所有恶性肿瘤的10%左右。中国属于结直肠癌的低发区，但是中国和亚洲其他一些国家属于结直肠癌发病率的高增长区，在中国结直肠癌的发病率已从上世纪七十年代的万分之一上升到现在的万分之二至三，目前居中国恶性肿瘤发病率第四位(前三位依次为肺癌，肝癌，胃癌)。结直肠癌的病因尚未明确，但是与环境因素、生活习惯，尤其是饮食方式密切相关。结直肠癌的发病率与食物中的高脂肪消耗量有正向关系。另外，也可能与微量元素缺乏、纤维素不足有关。
Bcl-3不仅能作为转录因子NF-κB的调节因子而且还参与蛋白稳定性的调节，所以能够在很多的生命过程中发挥作用。在免疫系统中，Bcl-3基因敲除小鼠更易患感染性疾病，这与其外周免疫器官发育不健全有关。敲除小鼠的生发中心缺失，在免疫刺激下DC细胞和B细胞的免疫应答减弱。另有报道，敲除Bcl-3基因能够影响T细胞的免疫应答，Bcl-3通过调控GATA-3的表达以调控Th2细胞的分化。此外，Bcl-3能够影响胸腺髓质区上皮细胞的发育，Bcl-3敲除后髓质区发育不良造成T细胞阴性选择缺陷而致自身免疫性疾病。在肿瘤发生中，已知Bcl-3高表达于各种类型的肿瘤中。最早Bcl-3在一种淋巴细胞白血病中通过异位到免疫球蛋白轻链基因α位点而高表达；此后在乳腺癌、子宫内膜癌、子宫颈癌及鼻咽癌中均检测到Bcl-3的表达增高。但这种高表达Bcl-3是如何发生的却是研究的难点。
发明内容
本发明的目的在于提供预防和治疗结直肠癌的方法和试剂。
在本发明的第一方面，提供一种Bcl-3的下调剂的用途，用于制备预防、缓解或治疗结直肠(即：结肠癌或直肠癌)癌的组合物。
在一个优选例中，所述的Bcl-3的下调剂选自：
核酸抑制物(如干扰分子)，蛋白抑制剂，蛋白水解酶，蛋白结合分子(如抗体或配体)，其能够在蛋白或基因水平上下调Bcl-3的表达或活性。
在另一优选例中，所述的Bcl-3的下调剂选自：
以Bcl-3基因或其转录本为靶序列、且能够抑制Bcl-3基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物；或
特异性与Bcl-3蛋白结合的结合分子(如能够抑制Bcl-3蛋白活性的抗体或配体)。
在另一优选例中，所述的Bcl-3的下调剂具有以下shRNA结构：
Seq正向-X-Seq反向；
其中，Seq正向的核苷酸序列具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示；Seq反向为与Seq正向互补的序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。
在另一优选例中，所述的具有shRNA结构的Bcl-3的下调剂可形成以下结构：
其中，
Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，
‖表示在Seq正向和Seq反向之间形成的氢键。
在另一优选例中，Seq正向和Seq反向并非完全互补(包括基本上互补的情形)，可以存在一些错配，或者突起。
在另一优选例中，所述的间隔序列长度5-50nt；更佳地，7-30nt。
在另一优选例中，所述的Bcl-3的下调剂是包含所述shRNA结构的表达载体；较佳地，所述表达载体是病毒表达载体；更佳地，为慢病毒载体。
在另一优选例中，所述的病毒表达载体中，还包括与所述shRNA结构操作性连接的启动表达元件，该组成型或诱导型的启动子。
在另一优选例中，所述的病毒载体为四环素诱导表达(tet-on)慢病毒载体，使用四环素类似物(如多烯环素(doxycyclin，简称DOX))诱导其表达。
在另一优选例中，所述的病毒载体为pTRIPz慢病毒载体。
在另一优选例中，所述的Bcl-3的下调剂是pRS shBcl-3质粒(较佳地，其为Origene公司产品，货号为TI563087)。
在另一优选例中，所述的组合物还用于：
降低原癌蛋白c-Myc蛋白表达；或
促进原癌蛋白c-Myc蛋白的降解。
在本发明的另一方面，提供一种用于预防、缓解或治疗结直肠癌的Bcl-3下调剂，所述的Bcl-3下调剂具有以下shRNA结构：
Seq正向-X-Seq反向；
其中，Seq正向的核苷酸序列具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示；Seq反向为与Seq正向互补的序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。
在本发明的另一方面，提供一种用于预防、缓解或治疗结直肠癌的组合物，所述的组合物含有：
(1)所述的Bcl-3下调剂(较佳地，为有效量的)；和
(2)药学上可接受的载体。
在本发明的另一方面，提供一种筛选预防、缓解或治疗结直肠癌的潜在物质的方法，所述方法包括：
(1)用候选物质处理表达或含有Bcl-3的体系；和
(2)检测所述体系中Bcl-3的表达或活性；
其中，若所述候选物质可降低Bcl-3的表达或活性，则表明该候选物质是预防、缓解或治疗结直肠癌的潜在物质。
在一个优选例中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达或含有Bcl-3的体系中；和/或
步骤(2)包括：检测测试组的体系中Bcl-3的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达或含有Bcl-3的体系；
如果测试组中Bcl-3的表达或活性在统计学上低于(优选显著低于，如低20%以上，较佳的低50%以上；更佳的低80%以上)对照组，就表明该候选物是预防、缓解或治疗结直肠癌的潜在物质。
在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系(如表达Bcl-3的细胞，更特别如HCT116细胞或CT26WT细胞)(或细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对Bcl-3或其上游或下游蛋白设计的干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)、小分子化合物等。
在另一优选例中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于预防、缓解或治疗结直肠癌有用的物质。
在本发明的另一方面，提供一种Bcl-3的用途，用于制备检测(包括诊断、疗效评估和预后预测)结直肠癌的试剂。
在本发明的另一方面，提供一种特异性识Bcl-3的试剂的用途，用于制备检测(包括诊断、疗效评估和预后预测)结直肠癌的试剂盒。
在一个优选例中，所述的特异性识Bcl-3的试剂选自：
特异性扩增Bcl-3基因的引物；
特异性识别Bcl-3基因的探针；或
特异性结合Bcl-3蛋白的抗体或配体。
较佳的，所述的特异性扩增Bcl-3基因的引物和/或探针是ABI公司的Hs00180403_m1产品。
较佳的，所述的特异性结合Bcl-3蛋白的抗体是购自Santa Cruz的Anti-Bcl-3。
在本发明的另一方面，提供一种检测(包括诊断、疗效评估和预后预测)结直肠癌的试剂盒，所述的试剂盒中含有：特异性识别Bcl-3的试剂。
在本发明的另一方面，还提供一种预防、缓解或治疗结直肠癌的方法，所述方法包括：下调所述哺乳动物体内Bcl-3的表达或活性。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1A、Bcl-3蛋白在结直肠癌组织标本中也存在着较高水平的表达。
图1B、Bcl-3在结直肠癌组织标本中的表达水平与NF-κB信号通路的激活存在显著相关性。
图1C、TNFα和Il-6可以在很多结肠癌细胞系中显著诱导Bcl3的表达。
图2A、以多烯环素(终浓度1ug/ml)诱导转染了pTRIPz shRNA(V3THS_407972)的HCT116细胞，可观察到5天(D)以后Bcl-3有较好的敲低效果。GAPDH作为内参。
图2B、敲低小鼠结肠癌细胞系CT26WT中Bcl-3表达，转染3天后Bcl-3敲低效果明显。
图3、干扰Bcl-3的表达能够抑制结直肠癌细胞系的体外增殖。
图3A、WST-1法检测24、48、72、96、120小时时细胞数量与活力。
图3B、细胞在24、48、72、96、120小时时计数绘制细胞生长曲线。
图3C、克隆形成实验，细胞诱导培养11天，结晶紫染色计数大于20个细胞的克隆数，进行统计分析，统计分析见下排图。
图3D、软琼脂实验，稳转细胞系以10000个细胞种植于软琼脂胶内，培养28天后，结晶紫染色计数大于20个细胞的克隆数。
图3E、细胞周期分析，BrdU-7AAD加入诱导培养的稳转细胞系，继续培养50分钟，流式检测细胞周期，Flowjo7.6软件分析结果。
图4A、在敲低Bcl-3的HCT116(以shBcl-3(72#)敲低)中，应用免疫印迹的方法检测了与细胞周期尤其是G1/S期相关蛋白的表达情况。左图为蛋白表达情况，右图为Real time PCR检测的RNA转录情况。
图4B、在敲低Bcl-3的CT26WT细胞中，应用免疫印迹的方法检测了与细胞周期尤其是G1/S期相关蛋白的表达情况。左图为蛋白表达情况，右图为Real time PCR检测的RNA转录情况。
图4C、在dKO TSC细胞中异位表达Bcl-3对于c-Myc蛋白水平影响。
图5A、将前述HCT116.shtGFP对照和HCT116.shBcl-3稳转细胞系皮下注射到裸鼠体内，注射后28天获取肿瘤进行比较。
图5B、将前述HCT116.shtGFP对照和HCT116.shBcl-3稳转细胞系皮下注射到裸鼠体内，注射后不同时期肿瘤的体积统计。
图5C、将前述HCT116.shtGFP对照和HCT116.shBcl-3稳转细胞系皮下注射到裸鼠体内，注射后28天，肿瘤的重量。
图5D、对小鼠皮下肿瘤组织进行免疫组化病理分析。右图为Ki67阳性细胞统计。
图5E、应用免疫印迹及定量PCR的方法检测移植肿瘤组织中Bcl-3及c-Myc的表达情况。
图5F、将对照CT26.con(转入shtGFP)及敲低Bcl-3的CT26.shBcl-3稳转细胞系皮下注射Babl/c小鼠，观察注射19天后的成瘤情况。
图5G、将对照CT26.con及敲低Bcl-3的CT26.shBcl-3稳转细胞系皮下注射Babl/c小鼠，注射后不同天数的肿瘤体积。
图5H、将对照CT26.con及敲低Bcl-3的CT26.shBcl-3稳转细胞系皮下注射Babl/c小鼠，注射后19天的肿瘤重量。
图5I、将对照CT26.con及敲低Bcl-3的CT26.shBcl-3稳转细胞系皮下注射Babl/c小鼠，注射后19天的肿瘤，进行免疫印迹测定c-Myc等的表达。
图5J、用裸鼠取代Babl/c小鼠进行图5F-H成瘤实验，敲低Bcl-3抑制CT26WT裸鼠皮下成瘤(21天)。
图6A、用蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)处理多烯环素诱导的对照HCT116.con及HCT116.shBcl-3稳转细胞系，在指定时间点收取蛋白检测c-Myc蛋白的降解速度。
图6B、Bcl-3过表达对于c-Myc蛋白降解的影响。
图6C、利用蛋白酶体抑制剂MG132处理多烯环素诱导的对照HCT116.con与HCT116.shBcl-3稳转细胞系，6小时后检测c-Myc蛋白水平。
图6D、过表达Bcl-3对c-Myc泛素化的影响。
图6E、检测导致c-Myc蛋白泛素化的E3泛素化酶的表达。
图7A、利用免疫印迹的方法检测异位表达Bcl-3对乙酰化或磷酸化位点突变的c-Myc蛋白(Myc T58A，Myc K323R)稳定性的影响。
图7B、在HCT116结肠癌细胞系中，敲低Bcl-3，检测c-My磷酸化及与c-Myc蛋白Thr58及Ser62磷酸化相关的信号通路。
图7C、在CT26WT结肠癌细胞系中，敲低Bcl-3，检测c-My磷酸化及与c-Myc蛋白Thr58及Ser62磷酸化相关的信号通路。
图7D、在dKO TSC细胞中异位表达Bcl-3，发现Bcl-3过表达增强MEK-Erk介导的c-Myc Ser62的磷酸化。
图8A、在HCT116 Bcl-3敲低细胞系(V3THS_407972)，TNFα诱导的c-Myc表达情况。
图8B、在HCT116Bcl-3敲低细胞系(V3THS_407972)，Il-6诱导的c-Myc表达情况。
图8C、用PD98059处理抑制Erk磷酸化后，TNFα诱导细胞内c-Myc的诱导水平。
图8D、在CT26WT中，利用Licl诱导激活Wnt信号通路，通过免疫印迹检测Wnt信号所诱导的c-Myc蛋白等的表达。
图8E、在dKO TSC细胞中，利用Licl或MG132处理，通过免疫印迹检测Wnt信号所诱导的c-Myc蛋白的表达。
图8F、HCT116饥饿24h后加血清刺激的实验。
图9A、免疫组化的方法检测结直肠癌组织中Bcl-3、磷酸化Bcl-3（p-Bcl-3）、c-Myc及Erk磷酸化水平。
图9B-F、直肠癌组织中Bcl-3、磷酸化Bcl-3（p-Bcl-3）、c-Myc及Erk磷酸化水平的相关性分析。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次揭示Bcl-3与结直肠癌(包括：结肠癌和/或直肠癌)的发生或发展密切相关。在结直肠癌细胞中敲低Bcl-3基因后，Bcl-3敲低的结肠癌细胞增殖能力显著降低，因此可知Bcl-3蛋白是结直肠癌的发生或发展中发挥重要作用的因素，从而可以作为药物靶点开发防治结直肠癌的药物。
Bcl-3及其用途
本发明涉及的Bcl-3蛋白包括全长的Bcl-3蛋白或其生物活性片段。优选的，所述的Bcl-3蛋白的氨基酸序列可以与GenBank登录号：NP_005169所示的序列基本上相同。所述的Bcl-3基因的核苷酸序列可以与GenBank登录号：NM_005178所示的序列或该序列的简并序列基本上相同。
本发明人的研究发现，Bcl-3分子可以促进结直肠癌细胞的成瘤，因此抑制Bcl-3的表达或活性将成为结直肠癌预防与治疗的新药物靶标；而且通过诱导型慢病毒介导的RNAi方法可以降低Bcl-3表达，进而抑制结直肠癌细胞的成瘤。更具体地，首先通过对结直肠癌组织标本进行免疫组化分析，本发明人确认Bcl-3在结直肠癌组织中表达显著高于正常组织。体外实验证实诱导型系统效果显著，随着诱导时间增长，Bcl-3蛋白表达降低；稳转pRS系统Bcl-3蛋白表达降低显著。Bcl-3降低后能够有效的抑制结直肠癌细胞的体外增殖及克隆形成能力；动物体内实验，人结肠癌细胞系HCT116皮下注射到裸鼠体内。一组正常水饲养，一组喂多烯环素(四环素类似物，shRNA诱导剂)水，发现诱导组皮下成瘤能力大大降低；对于小鼠结肠癌细胞系CT26.WT，将Bcl-3敲低的稳转系及对照细胞系皮下注射到裸鼠及Babl/c小鼠体内，发现Bcl-3敲低组肿瘤显著小于对照组，说明降低Bcl-3表达水平显著抑制结直肠癌细胞系的成瘤能力。
进而，本发明人应用分子生物学的方法对Bcl-3影响结直肠癌发生的机制进行研究。发现Bcl-3缺失后，原癌基因c-Myc蛋白水平明显降低，但是对其mRNA转录没有明显影响。本发明人还发现，Bcl-3通过调控MEK-Erk信号通路，增强c-Myc Ser62磷酸化，抑制c-Myc蛋白的泛素化降解而使其蛋白稳定性增强。同时本发明人从临床标本进一步证实了Bcl-3与Erk磷酸化及c-Myc蛋白水平存在显著的正相关性。
通过上述的研究工作可知，Bcl-3是一个新的、对结直肠癌的研究有用的药物靶点。针对Bcl-3的各种治疗手段可以作为抑制结直肠癌的新颖和有效的手段。
Bcl-3的下调剂及其用途
基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种Bcl-3的下调剂的用途，用于制备抑制(哺乳动物)结直肠癌的组合物。
如本文所用，所述的Bcl-3基因或蛋白的下调剂包括了抑制剂、拮抗剂、阻滞剂、阻断剂、核酸抑制物等。
所述的Bcl-3基因或蛋白的下调剂是指任何可降低Bcl-3蛋白的活性、降低Bcl-3基因或蛋白的稳定性、下调Bcl-3蛋白的表达、减少Bcl-3蛋白有效作用时间、或抑制Bcl-3基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调Bcl-3有用的物质，从而可用于预防或治疗结直肠癌。例如，所述的抑制剂是：核酸抑制物，蛋白抑制剂，抗体，配体，蛋白水解酶，蛋白结合分子，只要其能够在蛋白或基因水平上下调Bcl-3蛋白或其编码基因的表达。
作为本发明的一种选择方式，所述的Bcl-3的下调剂是一种特异性与Bcl-3结合的抗体。所述的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。可用Bcl-3蛋白免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等来生产多克隆抗体；多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。与之相似的，表达Bcl-3或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。所述的抗体也可以是单克隆抗体，此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier，N.Y.，1981)。
在得知了所针对的下调对象(Bcl-3)后，可以设计出合适的siRNA或shRNA等干扰分子，这些干扰分子都可应用于本发明中。
作为本发明的一种选择方式，所述的Bcl-3的下调剂是一种Bcl-3特异性的小干扰RNA分子(siRNA)。如本文所用，所述的“小干扰RNA(small interferingRNA，siRNA)”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNA interference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。
作为本发明的一种优选方式，所述的Bcl-3的下调剂是一种“小发夹RNA(Small hairpin RNA，shRNA)”，其是能够形成发夹结构的非编码小RNA分子，小发夹RNA能够通过RNA干扰途径来抑制基因的表达。如上述，shRNA可以由编码需要的转录物的双链DNA模板来表达。编码需要的转录物的双链DNA模板被插进一个载体，例如质粒或病毒载体，然后在体外或体内连接到一个启动子进行表达。shRNA在真核细胞内DICER酶的作用下，可被切割成小干扰RNA分子，从而进入RNAi途径。“shRNA表达载体”是指一些本领域常规用于构建shRNA结构的质粒，通常该质粒上存在“间隔序列”以及位于“间隔序列”两边的多克隆位点或供替换序列，从而人们可以将shRNA(或类似物)相应的DNA序列通过正向和反向的方式插入多克隆位点或替换其上的供替换序列，该DNA序列转录后的RNA可形成shRNA(Short Hairpin)结构。所述的“shRNA表达载体”目前已经完全可以通过商购的途径购买获得，例如一些病毒载体。
本发明中，所述的“基本互补”或“基本上互补”指的是一条核苷酸序列对于另一条特定的核苷酸序列有至少80%，较佳的90%，更佳的95%，最佳的100%的互补性。
在筛选有效的shRNA序列时，可通过比对分析，从而找出最佳的有效片段。本发明人设计合成了多种shRNA序列，并将它们分别组装入慢病毒载体进行验证，结果两种干扰效果较好的干扰分子，它们分别具有SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4所示的序列，它们被制成shRNA构建物后，进一步地在细胞、动物水平实验，结果证明对于体内试验而言抑制效率非常高。
作为本发明特别优选的实施方式，在RNAi实验中，本发明人采用了诱导型慢病毒载体，在其中包含有所述的shRNA结构(Seq正向-X-Seq反向)。较佳地，所述的病毒载体为四环素诱导表达(tet-on)慢病毒载体，使用四环素类似物(如多烯环素(doxycyclin，简称DOX))诱导其表达。该系统优点是：a.感染效率高，可以感染90%以上的细胞。b.诱导性表达，只在含有四环素环境中才能表达shRNA。这就具有良好的可控性。
本发明的核酸抑制物如shRNA或siRNA可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。siRNA或shRNA (或含有shRNA的构建物或表达载体)等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。
所述的“基本互补”或“基本上互补”指的是一条核苷酸序列对于另一条特定的核苷酸序列有至少80%，较佳的90%，更佳的95%，最佳的100%的互补性。
组合物
本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt%；较佳的0.00001-20wt%；更佳的，0.0001-10wt%)的所述的Bcl-3的下调剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于抑制结直肠癌。任何前述的Bcl-3的下调剂均可用于组合物的制备。
如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。
在得知了所述Bcl-3基因或蛋白的下调剂的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的下调剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。
优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将Bcl-3的下调剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带Bcl-3的下调剂的表达单位(比如表达载体或病毒等，或siRNA或shRNA)递送到靶点上，并使之表达活性的Bcl-3下调剂，具体情况需视所述的下调剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。
本发明所述的Bcl-3的下调剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的Bcl-3基因或蛋白的下调剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的Bcl-3的下调剂每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
药物筛选
在得知了Bcl-3与结直肠癌的密切相关性后，可以基于该特征来筛选抑制Bcl-3的表达或活性的物质。可从所述的物质中找到对于预防或治疗结直肠癌真正有用的药物。
因此，本发明提供一种筛选抑制结直肠癌的潜在物质的方法，所述的方法包括：用候选物质处理表达Bcl-3的体系；和检测所述体系中Bcl-3的表达或活性；若所述候选物质可抑制Bcl-3的表达或活性，则表明该候选物质是抑制结直肠癌的潜在物质。所述的表达Bcl-3的体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达Bcl-3的细胞；或可以是重组表达Bcl-3的细胞。所述的表达Bcl-3的体系还可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。
在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到Bcl-3的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达Bcl-3的体系。
作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于抑制结直肠癌真正有用的物质。
本发明对于Bcl-3蛋白的表达、活性、存在量或分泌情况的检测方法没有特别的限制。可以采用常规的蛋白定量或半定量检测技术，例如(但不限于)：SDS-PAGE法，Western-Blot法等。
另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的抑制结直肠癌的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于抑制Bcl-3的表达和活性，进而抑制结直肠癌有用的物质。
检测试剂或试剂盒
基于本发明人的上述新发现，可以将Bcl-3作为检测结直肠癌的标志物：(i)进行结直肠癌细胞的鉴别诊断；(ii)评估相关人群的结直肠癌治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法；(iii)早期评估相关人群结直肠癌患病风险，早期监测早期防治。比如，可分离出由Bcl-3基因表达异常而潜在高发结直肠癌的人群，从而可进行更有针对性地诊断或治疗。
因此，本发明提供了Bcl-3基因或蛋白的用途，用于制备诊断(或检测)结直肠癌的试剂或试剂盒。
可采用各种本领域已知的技术来检测Bcl-3的存在与否以及表达情况，这些技术均包含在本发明中。例如可用已有的技术如Southern印迹法、Western印迹法、DNA序列分析、PCR等，这些方法可结合使用。
本发明还提供了用于在分析物中检测Bcl-3的存在与否以及表达情况的试剂。优选的，当进行基因水平的检测时，可以采用特异性扩增Bcl-3的引物；或特异性识别Bcl-3的探针来确定Bcl-3的存在与否；当进行蛋白水平的检测时，可以采用特异性结合Bcl-3蛋白的抗体或配体来确定Bcl-3蛋白的表达情况。
针对Bcl-3的引物或特异性探针的设计是本领域人员熟知的技术，例如，制备一种探针，其可与Bcl-3基因上特定位点发生特异性结合，而不与Bcl-3基因以外的其它基因特异性结合，且所述探针带有可检测信号。
利用特异性结合Bcl-3蛋白的抗体来检测分析物中Bcl-3蛋白表达情况的方法也是本领域人员熟知的技术。
本发明还提供了用于在分析物中检测Bcl-3的存在与否以及表达情况的试剂盒，该试剂盒包括：特异性扩增Bcl-3基因的引物；特异性识别Bcl-3基因的探针；或特异性结合Bcl-3蛋白的抗体或配体。
此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。
此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或核酸序列分析软件等。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料与方法
细胞系及实验动物
HCT116细胞系：人结直肠癌细胞系，购买于美国典型培养物保藏中心(ATCC，CCL-247)；完全培养基为含有10%FBS的DMEM，培养于37℃，5%CO2细胞培养箱内。
CT26WT细胞系：小鼠结直肠癌细胞系，源于Babl/c小鼠诱导形成的未分化结直肠癌细胞，购买于美国典型培养物保藏中心(ATCC，CRL-2638)；完全培养基为含有10%FBS的RPMI-1640，培养于37℃，5%CO2细胞培养箱内。
293T细胞系：人胚肾细胞系，购买于中国科学院细胞库(GNhu17)；完全培养基为含有10%FBS的DMEM，培养于37℃，5%CO2细胞培养箱内。
dKO TSC细胞系：小鼠胸腺上皮细胞系，来自C57bl/6遗传背景的Bcl-3与NF-κB2基因敲除小鼠(获自NIH)胸腺，完全培养基为含有10%FBS的DMEM，培养于37℃，5%CO2细胞培养箱内。
裸小鼠：Babl/c遗传背景，T细胞免疫缺陷小鼠，购买于上海斯莱克实验动物中心，饲养于中科院上海生命科学研究院健康科学研究所SPF级动物房。
Babl/c小鼠：近交系小鼠，购买于上海斯莱克实验动物中心，饲养于中科院上海生命科学研究院健康科学研究所SPF级动物房。
人结直肠癌组织芯片制作及免疫组化分析
87例结直肠癌病人肿瘤组织标本及20例癌旁组织标本用中性甲醛固定后包埋于石蜡中。常规切片后通过HE染色分析选取理想区域，重新排列于组织芯片模具中，浸蜡包埋。然后常规切片成6微米组织芯片以备后续免疫组化分析。
免疫组化染色遵循常规免疫组化过程，简述如下：
(1)脱蜡：组织切片依次经二甲苯、苯乙醇、100%、95%、75%、50%乙醇至水，每次3分钟；
(2)抗原修复：切片放入抗原修复液(10mM柠檬酸盐缓冲液，pH=6.0)，加热至95℃，20分钟，再冷却至室温；
(3)洗片：PBS-0.05%Triton X-100洗液洗三次，每次5分钟；
(4)封闭：用含有1%BSA，10%胎牛血清，0.05%Triton X-100的PBS室温封闭2小时；
(5)一抗：Bcl-3，phosph-Bcl-3抗体按1：50稀释，4℃封闭过夜；
(6)洗片：PBS洗三次，每次5分钟；
(7)灭活内源过氧化物酶：用0.3%过氧化氢室温处理15分钟；
(8)二抗：适当稀释的二抗室温孵育2小时；
(9)洗片：PBS洗三次，每次5分钟；
(10)DAB显色适宜时间后用苏木素染色10秒；
(11)中性树胶封片观察，保存。
质粒构建
人Bcl-3表达质粒和小鼠Bcl-3表达质粒购买于Origene公司，货号分别为RC209116和MC215920。
小鼠Bcl-3 shRNA质粒购买于Origene公司，货号为TI563087。人Bcl-3shRNA质粒克隆于pTRIPZ载体上，该系统是一个Open Biosystems公司开发的Tet-on诱导型的shRNA表达系统，为tet-on(四环素诱导表达)慢病毒载体，使用四环素类似物多烯环素(doxycyclin，简称DOX)诱导其表达；除非另外说明，试验中DOX终浓度1ug/ml。用于Bcl-3shRNA构建的序列如下：V3THS-407972(CTTGGTTGGATTTCTTTTGTAA(SEQ ID NO:1))和V3THS-356488(ACCGGGAGCTCGACATCTACAA(SEQ ID NO:2))；序列退火形成带有粘端双链互补序列。针对tGFP的shRNA序列为GCTACGGCTTCTACCACTTCGGCACCTAC作为对照。退火体系采用碧云天公司核酸退火缓冲液，依据公司推荐程序进行，详述如下：
(1)pTRIPz shRNA(V3THS_407972)载体构建(相应于shRNA1，简称shBcl-3(72#))
采用XhoI/EcoRI双酶切pTRIPz载体，双酶切后回收。合成两条互补长shRNA寡核苷酸，退火后即成为有粘性末端的双链DNA。载体与片段按照按照1:200的摩尔比连接过夜，转化Stbl3细菌(购自Invitrogen公司)。挑阳性克隆，Axygen质粒抽提试剂抽提，酶切，测序验证。
合成序列为：
L1:CTCGAGTGCTGTTGACAGTGAGCGCTTGGTTGGATTTCTTTTGTAATAGTGAAGCCACAGATGTATTACAAAAGAAATCCAACCAAATGCCTACTGCCTCGGAGAATTC(SEQ ID NO:3)
L2:GAGCTCACGACAACTGTCACTCGCGAACCAACCTAAAGAAAACATTATCACTTCGGTGTCTACATAATGTTTTCTTTAGGTTGGTTCGACGGATGACGGAGCCTCTTAAG(SEQ ID NO:4)
(2)pTRIPz shRNA(V3THS_356488)载体构建方法(相应于shRNA2，简称shBcl-3(88#))
采用XhoI/EcoRI双酶切pTRIPz载体，双酶切后回收。合成两条互补长shRNA寡核苷酸，退火后即成为有粘性末端的双链DNA。载体与片段按照按照1:200的摩尔比连接过夜，转化Stbl3细菌(购自Invitrogen公司)。挑阳性克隆，Axygen质粒抽提试剂抽提，酶切，测序验证。
合成序列为：
L1:CTCGAGTGCTGTTGACAGTGAGCGACCGGGAGCTCGACATCTACAATAGTGAAGCCACAGATGTATTGTAGATGTCGAGCTCCCGGCTGCCTACTGCCTCGGAGAATTC(SEQ ID NO:5)
L2:GAGCTCACGACAACTGTCACTCGCTGGCCCTCGAGCTGTAGATGTTATCACTTCGGTGTCTACATAACATCTACAGCTCGAGGGCCGACGGATGACGGAGCCTCTTAAG(SEQ ID NO:6)
(3)pTRIpz shRNA(tGFP)载体构建方法(相应于shRNA control，简称shtGFP)
采用XhoI/EcoRI双酶切pTRIPz载体，双酶切后回收。合成两条互补长shRNA寡核苷酸，退火后即成为有粘性末端的双链DNA。载体与片段按照按照1:200的摩尔比连接过夜，转化Stbl3细菌(购自Invitrogen公司)。挑阳性克隆，Axygen质粒抽提试剂抽提，酶切，测序验证。
L1:GATCCGCTACGGCTTCTACCACTTCGGCACCTACTCAAGAGGTAGGTGCCGAAGTGGTAGAAGCCGTAGCTTTTTTG(SEQ ID NO:7)
L2:AATTCAAAAAAGCTACGGCTTCTACCACTTCGGCACCTACCTCTTGAGTAGGTGCCGAAGTGGTAGAAGCCGTAGCG(SEQ ID NO:8)
病毒包装过程为将构建好的pTRIPz shRNA载体与psPAX2(购自Addgene)和pMD2G(购自Addgene)三种载体按质量比3:2:1转入lenti-X细胞系(Clontech)，48小时后收细胞培养液即为病毒液，取1ml病毒液，加入终浓度4mg/ml的Polybrene孵育靶细胞过夜，然后用1ug/ml的Puromycin筛选，即得稳转细胞系。
脂质体转染
重组病毒载体对于dKO TSC及293T细胞的转染，按照Invitrogen公司Lipofectamine 2000试剂说明书进行：
(1)dKO TSC及293T细胞于转染前20-24小时铺板，使转染时细胞汇合度约为70-80%；
(2)用DMEM培养液分别稀释Lipofectamine 2000与质粒，混匀后，室温放置5分钟；
(3)将上述两种稀释液混合均匀，室温放置20分钟；
(4)将上述混合液逐滴加入细胞，轻摇混匀；
(5)放入细胞培养箱中培养4小时后，将培养液换成完全培养液继续培养48小时后进行相应的实验分析。
慢病毒包装与感染
(1)Lenti-X 293T细胞于转染前20-24小时铺板，使转染时细胞汇合度约为70-80%；
(2)用DMEM培养液分别稀释Lipofectamine 2000与质粒(pTRIPZ shRNA4.5μg，pMD2G(购自Addgene)1.5μg，psPAX2(购自Addgene)3μg)，混匀后，室温放置5分钟；
(3)将上述两种稀释液混合均匀，室温放置20分钟；
(4)将上述混合液逐滴加入细胞，轻摇混匀；
(5)放入细胞培养箱中培养4小时后，将培养液换成完全培养液继续培养48小时后，收病毒上清进行感染或冻存于-80℃冰箱。
(6)病毒感染靶细胞：将病毒液与两倍体积的新鲜完全培养基混合，并加入4μg/ml的Polybrene(Sigma)，混匀后，加入靶细胞；感染后一天换液。
稳转细胞系筛选
(1)转染或感染HCT116细胞，在感染后48小时加入嘌呤霉素(2μg/ml)进行筛选培养，培养过程中细胞正常传代，筛选过程约为7-10天；
(2)转染或感染CT26WT细胞，在感染后48小时加入嘌呤霉素(10μg/ml)进行筛选培养，培养过程中细胞正常传代，筛选过程约为7-10天；
(3)得到的稳转细胞系通过Real-time PCR和Western Blot检测基因敲低效果；进行后续实验。
实时荧光定量PCR(Real-time PCR)
1、RNA抽提，采用TRIzol法从哺乳动物细胞中抽提RNA，具体过程如下：
(1)用预冷PBS洗细胞后，加入1ml TRIzol，充分混匀裂解；
(2)室温放置5分钟，然后加入200μl的三氯甲烷，剧烈震荡15秒，室温静止3分钟；
(3)4℃，13000转离心15分钟，取上层水相于一新离心管，并加入400μl异丙醇，室温放置10分钟；
(4)4℃，13000转离心10分钟，弃上清，用1ml DEPC水配置的70%乙醇洗沉淀，4℃，9000转离心5分钟；
(5)弃上清，小心风干沉淀，将RNA溶于适量体积的DEPC水中，冻存于-80℃。
2、反转录
RNA经Nanodrop测定浓度后，使用SYBR PrimeScript RT-PCR kit(DRR037A，Takara)反转录mRNA成cDNA。
(1)反应体系
| 试剂 | 用量 |
| 5×PrimeScript缓冲液 | 2μl |
| PrimeScript RT Enzyme Mix | 0.5μl |
| 50μM Oligo dT引物 | 0.5μl |
| 100μM Random 6mers | 0.5μl |
| RNase Free dH2O | Up to 10μl |
| 总RNA | 500ng(X μl) |
| Total | 10μl |
(2)反应程序：
37℃15分钟；
85℃5秒；
(3)反转录产物cDNA储存于-20℃。
3、实时荧光定量PCR(Real-time PCR)
人和鼠Bcl-3，c-myc，cyclin d1(ccnd1)，p27(cdkn1b)，Skp2，IL6及内参gapdh等基因检测20×Primer/Probe Mix购于ABI公司，Assay ID如表1。
表1
| Assay ID | |
| 人Bcl-3 | Hs00180403_m1 |
| 人c-myc | Hs00153408_m1 |
| 人ccnd1 | Hs00765553_m1 |
| 人cdkn1b | Hs01597588_m1 |
| 人skp2 | Hs01021864_m1 |
| 人fbw7 | Hs00217794_m1 |
| 人Truss | Hs00367501_m1 |
| 人Huwe1 | Hs00948075_m1 |
| 人il6 | Hs00985639_m1 |
| 人gapdh | Hs02758991_g1 |
| 小鼠Bcl-3 | Mm00504306_m1 |
| 小鼠c-myc | Mm00487804_m1 |
| 小鼠ccnd1 | Mm00432359_m1 |
| 小鼠cdkn1b | Mm00438168_m1 |
| 小鼠il6 | Mm00446190_m1 |
| 小鼠gapdh | Mm03302249_g1 |
实时荧光定量PCR检测在96孔板上使用ABI公司Taqman Gene ExpressionMaster Mix的20微升反应体系：
| 试剂 | 用量 |
| 2×Taq man Gene expres sionMaster Mix | 10μl |
| 20×Primer/Probe Mix | 1μl |
| cDNA | 1μl |
| ddH2O | 8μl |
在ABI 7500Fast实时定量PCR仪上设置并运行以下程序：
95℃10分钟；
95℃15秒，60℃30秒，40循环。
数据分析采用相对于内参gapdh的相对定量统计计算：RQ=2-ΔΔCt
两组间统计分析采用双尾Student’s T检验(Two-tailed Student’s T test)。p值小于0.05视为有统计学显著差异。
蛋白抽提与免疫印迹
细胞总蛋白抽提：用预冷PBS洗细胞两次，离心沉淀细胞用RIPA(50mMTris-HCl，150mM NaCl，1%NP40，1%脱氧胆酸钠，0.1%SDS，1mMEDTA)+1%PMSF冰上裂解细胞15分钟，4℃最高转速离心15分钟，收蛋白裂解上清。
将蛋白样品加入5×Loading Buffer 100℃加热10分钟变性，储存于-20℃或直接进行Western blot检测：
(1)上样：将20-40μg的蛋白样品加入到配好的10%SDS-PAGE胶中；
(2)电泳：浓缩胶恒压80V 40分钟，分离胶恒压120V 60分钟；
(3)转膜：PVDF膜预先甲醇浸泡5分钟，转膜液浸泡5分钟；采用夹心湿法转膜，顺序为：黑(负极)-海绵-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵-白(正极)，再将转膜夹按正确电极方向放入转膜槽中；加入转膜液，恒压100V冰浴中转1小时；
(4)封闭：5%脱脂牛奶，室温2小时
(5)一抗：按适宜一抗浓度稀释抗体，4℃孵育过夜；
(6)二抗：PBS-0.05%Tween 20洗膜三次，每次5分钟；加入适当浓度的HRP标记二抗，室温孵育1小时；
(7)显影：用Pierce West Pico底物显影，FujiFilm LAS4000扫膜成像。
所用抗体信息如表2。
表2
| 抗体名称 | 货号 | 公司 |
| Anti-Bcl-3 | Sc-185 | Santa Cruz |
| Anti-p-Bcl-3 | sc-33883 | Santa Cruz |
| Anti-c-Myc | sc-764 | Santa Cruz |
| Anti-Skp2 | sc-7164 | Santa Cruz |
| Anti-p27 | sc-528 | Santa Cruz |
| Anti-p21 | sc-397 | Santa Cruz |
| Anti-cyclinD1 | sc-8396 | Santa Cruz |
| Anti-HA | sc-805 | Santa Cruz |
| Anti-GAPDH | KC-5G4 | 康成生物 |
| Anti phospho-Myc Ser62 | ab51156 | Abcam |
| Anti-phospho-p44/p42 | 9101 | CST |
| anti-phospho-MEK1/2 | 9121 | CST |
| anti-phospho-GSK-3β | 9336 | CST |
| anti-phospho-c-Raf | 9427 | CST |
| anti-phospho-p70 S6K(T389) | 9205 | CST |
| anti-p70S6K | 9202 | CST |
| anti-phospho-S6(s235/236) | 2855 | CST |
体内泛素化实验
采用dKO TSC细胞作为研究系统，按如下过程进行实验：
(1)dKO TSC细胞铺60mm细胞培养皿，24小时后进行脂质体介导的转染，共转对照(pCMV6-XL5)+HA Ub(pcDNA HA Ubiquitin，获自中科院健康科学研究所)，或共转小鼠Bcl-3表达载体+HA Ub，转染后48小时抽提总蛋白；
(2)测定蛋白浓度，以1mg总蛋白进行免疫沉淀IP实验：加入2μganti-c-Myc抗体(sc-42，Santa Cruz)，4℃旋转孵育1小时；加入20μl protein-Gplus agarose(sc-2002，Santa Cruz)，4℃旋转孵育过夜；第二天用蛋白裂解液洗Beads五次后，加入40μl 1×上样缓冲液，加热100℃，变性10分钟；
(3)Western Blot检测Ubiquitin HA及Bcl-3，c-Mcy，GAPDH。
细胞增殖曲线
HCT116及CT26WT细胞增殖曲线绘制按照如下实验步骤：
(1)指数生长期细胞消化、计数传代，以每孔10000个细胞铺12孔板；
(2)在铺板后24、48、72、96、120小时分别充分消化细胞，适当体积PBS重悬细胞，计数；每种类型细胞在每个时间点计3个复孔。
(3)以所计细胞数(×10000)为纵坐标，以计数时间为横坐标绘制细胞增殖曲线。
细胞活性检测
以WST-1法检测HCT116及CT26WT细胞增殖及活力，具体步骤如下：
(1)指数生长期细胞消化、传代计数，以每孔1000个细胞铺96孔板；
(2)在铺板后24、48、72、96、120小时，分别向培养细胞中加入10μl WST-1细胞活力及细胞毒性检测试剂(C0036，碧云天)，继续培养3小时；
(3)多功能读板机读取相应孔的OD450nm吸光度值，每种细胞每个时间点做4复孔重复。
克隆形成实验
HCT116细胞克隆形成实验按照以下实验步骤进行：
(1)指数生长期细胞消化、传代计数，以每孔1000个细胞铺60mm细胞培养皿；
(2)细胞继续培养10-14天，培养期间正常更换培养液；
(3)培养后，细胞吸去培养液，用PBS洗2次；
(4)4%多聚甲醛固定，室温20分钟
(5)吸去多聚甲醛，结晶紫染色液(C0121，碧云天)染色20分钟；
(6)吸去结晶紫染色液，用PBS洗去残留后自然风干；
(7)用Canon EOS50拍照，计数多于20个细胞的克隆数。
软琼脂克隆形成实验
HCT116软琼脂细胞克隆形成实验按照以下实验步骤进行：
(1)下层胶配制：配制1%琼脂糖胶，冷却至40℃并保持，同时将2×(DMEM+10%FBS)培养基预温至40℃并保持，将上述两种液体等体积混合后迅速加入60mm细胞培养皿，每皿3ml；
(2)上层胶配制：配制0.7%琼脂糖胶，冷却至40℃并保持，同时将2×(DMEM+10%FBS)培养基预温至40℃并保持，待用；
(3)指数生长期细胞消化、传代计数，以每个60mm细胞培养皿加10000个细胞，每种细胞做5个重复的细胞量加入50ml离心管；
(4)将上层胶的两种液体等体积混合后，迅速重悬细胞，混匀后加入到已铺下层胶的60mm细胞培养皿中，每皿3ml；
(5)室温静止10分钟后，加入2ml完全培养基到凝胶上覆盖；
(6)细胞继续培养20-30天，培养期间正常更换培养液；
(7)培养后，细胞吸去培养液，用PBS洗2次；
(8)结晶紫染色液(C0121，碧云天)染色20分钟；
(9)吸去结晶紫染色液，用PBS洗去残留后自然风干；
(10)用Canon EOS50拍照，计数多于20个细胞的克隆数。
流式细胞术分析细胞周期(FACS)
HCT116及CT26WT细胞细胞周期分析采用FACS法按照如下步骤进行：
(1)指数生长期细胞消化、传代计数，以2×105细胞铺6孔细胞培养板；
(2)细胞继续培养48小时后，加入BrdU，终浓度3μM；继续培养1小时；
(3)充分消化细胞为单细胞悬液，用75%冰乙醇固定，室温20分钟或冻存于-20℃冰箱中；
(4)离心，弃上清；加入2M盐酸，室温变性20分钟；
(5)用PBS-1%BSA洗一次
(6)加入1ml 0.1M硼酸钠中和盐酸，室温2分钟；
(7)离心，弃上清；加入稀释的FITC标记的BrdU抗体100μl，室温孵育1小时；
(8)离心，PBS洗2次，加入100μl稀释的7AAD，室温孵育20分钟；
(9)FACS检测，FlowJo7.6软件进行结果分析。
小鼠皮下成瘤模型
1、HCT116细胞裸鼠皮下成瘤模型
(1)实验1周前购买斯莱克动物中心3周龄雄性裸鼠，饲养于健康科学研究所SPF级动物房内；
(2)消化指数生长期细胞HCT116.con和HCT116.ShBcl-3(多烯环素诱导表达细胞系)，制成单细胞悬液，计数，用PBS重悬至1×107细胞/ml；
(3)每只裸小鼠左侧腋窝皮下注射200μl细胞悬液；
(4)40只小鼠分组为：
| 组号 | 注射细胞类型 | 喂水情况 | 小鼠数量 |
| 1 | HCT116.con | 正常水 | 10 |
| 2 | HCT116.con | 加多烯环素水 | 10 |
| 3 | HCT116.shBcl-3 | 正常水 | 10 |
| 4 | HCT116.shBcl-3 | 加多烯环素水 | 10 |
(5)小鼠继续饲养于SPF动物房内，每3天更换一次饮水同时测量小鼠肿瘤大小；
(6)注射肿瘤细胞后28天，处死小鼠，剥离肿瘤称量重量，并用10%中性甲醛固定。
CT26WT细胞裸鼠及Babl/c小鼠皮下成瘤模型
(1)实验1周前购买斯莱克动物中心3周龄雄性裸鼠及Babl/c小鼠，饲养于健康科学研究所SPF级动物房内；
(2)消化指数生长期细胞CT26.con和CT26.ShBcl-3，制成单细胞悬液，计数，用PBS重悬至5×106细胞/ml；
(3)每只小鼠左侧腋窝皮下注射200μl细胞悬液；
(4)小鼠继续饲养于SPF动物房内，每3天测量小鼠肿瘤大小；
(5)注射肿瘤细胞后21天，处死小鼠，剥离肿瘤称重量，并用10%中性甲醛固定。
II.实施例
实施例1、炎症因子激活NF-κB信号通路，诱导结直肠癌细胞中高表达Bcl-3
Bcl-3是一个原癌基因，先前的研究报告指出在乳腺癌、子宫内膜癌、子宫颈癌及鼻咽癌中就发现Bcl-3蛋白的高表达。本发明人发现，Bcl-3蛋白在结直肠癌组织标本中也存在着较高水平的表达(图1A)。本发明人对磷酸化形式的Bcl-3蛋白进行免疫组化分析，发现磷酸化的Bcl-3在结直肠癌组织中的阳性率和表达强度同样升高(图1A)。
本发明人同时对以上Bcl-3及磷酸化形式的Bcl-3的免疫染色进行病理学打分，并进行统计学分析，结果显示在结直肠癌的发生中Bcl-3及磷酸化的Bcl-3的表达显著增强(表3)。提示Bcl-3在结直肠癌的发生过程中起到一定的作用。
表3、人结直肠癌中Bcl-3表达升高
本发明人通过免疫组化方法发现，Bcl-3在结直肠癌组织标本中的表达水平与NF-κB信号通路的激活存在显著相关性(图1B)。
炎症因子TNFα和Il-6能够激活NF-κB信号通路且在结肠癌发生中的关键作用，本发明人发现TNFα和Il-6可以在很多结肠癌细胞系(COLO205购自中国科学院细胞库、H508获自上海交通大学、HT29购自中国科学院细胞库)中显著诱导Bcl3的表达(如图1C)。
实施例2、Bcl-3在细胞系中敲低策略
对于Bcl-3的体外敲低(knock-down)，本发明人使用了Openbiosysytem的pTRIPz诱导型慢病毒载体，这种方法的好处在于对敲低的可控性，另外用同一种细胞系，以不加诱导剂为对照组，这样实验大大简便。以多烯环素(终浓度1ug/ml)诱导转染了pTRIPz shRNA(V3THS_407972)的HCT116细胞，可观察到5天(D)以后Bcl-3有较好的敲低效果(图2A)，GAPDH作为内参。
对于小鼠结肠癌细胞系CT26WT，本发明人使用Origene公司pRS shBcl-3质粒(货号为TI563087)敲低其Bcl-3表达，转染3天后Bcl-3敲低效果明显(图2B)。所获得的细胞系称为CT26.shBcl-3。
实施例3、Bcl-3敲低抑制结直肠癌细胞体外增殖
本发明人通过WST-1实验与细胞绝对计数的方法检测敲低Bcl-3对HCT116(HCT116/shBcl-3(72#))及CT26WT细胞增殖能力及细胞活性的影响，结果显示敲低Bcl-3能够显著抑制HCT116与CT26WT细胞的体外增殖(图3A，3B)。
肿瘤细胞的克隆形成能力是反映肿瘤细胞恶性程度的一个重要指标。本发明人利用二维及三维(软琼脂)克隆形成实验检测敲低Bcl-3对结直肠癌细胞HCT116的恶性增殖的影响，结果显示敲低Bcl-3能够显著降低HCT116细胞的克隆形成能力(图3C，3D)。
为了进一步探讨敲低Bcl-3对细胞增殖的影响，本发明人应用BrdU-7AAD实验，通过流式细胞术分析发现敲低Bcl-3能够使HCT116与CT26WT细胞周期发生G1/S期阻抑(图3E)。
上述实验结果显示，Bcl-3对结直肠癌细胞系的体外增殖有重要作用，敲低Bcl-3能够显著抑制结直肠癌细胞系的体外增殖。
实施例4、Bcl-3以转录非依赖的方式调控c-Myc蛋白表达
对于Bcl-3调控结直肠癌细胞增殖的机制研究，本发明人应用免疫印迹的方法检测了与细胞周期尤其是G1/S期相关蛋白的表达情况。在敲低Bcl-3的HCT116(以shBcl-3(72#)敲低)及CT26WT细胞中，发现原癌蛋白c-Myc表达显著低于相应对照细胞(图4A-B)。本发明人同时应用定量PCR的方法检测细胞周期相关基因的转录情况，发现敲低Bcl-3不影响c-Myc以及其它基因的转录。
为了进一步证明Bcl-3对c-Myc的调控是以转录非依赖的方式，本发明人在dKO TSC细胞中异位表达(指在原本不表达Bcl-3的细胞中进行表达)Bcl-3，发现Bcl-3过表达(MC215920)能够显著上调c-Myc蛋白水平，但是并不影响其mRNA的转录(图4C)。
实施例5、敲低Bcl-3抑制结直肠癌细胞体内成瘤
体外实验结果显示，敲低Bcl-3能够抑制结直肠癌细胞系的体外增殖，这促使本发明人进一步研究其对结直肠癌细胞系体内成瘤的影响。本发明人首先将前述HCT116.shtGFP对照和HCT116.shBcl-3(72#)稳转细胞系皮下注射到裸鼠体内，实验分组如下表4。
表4
| 组号 | 注射细胞类型 | 喂水情况 | 小鼠数量 |
| 1 | HCT116.shtGFP | 正常水 | 10 |
| 2 | HCT116.shtGFP | 加多烯环素水 | 10 |
| 3 | HCT116.shBcl-3 | 正常水 | 10 |
| 4 | HCT116.shBcl-3 | 加多烯环素水 | 10 |
实验结果显示，注射对照组细胞HCT116.shtGFP小鼠在喂正常水和多烯环素水的条件下，肿瘤生长没有显著差异，说明多烯环素对HCT116细胞体内成瘤没有影响。但在注射HCT116.shBcl-3稳转细胞系的裸鼠中，由于多烯环素水诱导Bcl-3siRNA的表达使Bcl-3基因被敲低，在该组中肿瘤生长明显受到抑制，注射后28天获取肿瘤测定体积和重量，肿瘤体积和肿瘤重量明显小于正常水喂养组(图5A-C)。
进一步地，本发明人对小鼠皮下肿瘤组织进行免疫组化病理分析，发现增殖细胞核抗原Ki67在敲低Bcl-3(以shBcl-3(72#)敲低)的肿瘤组织中表达明显降低，阳性率和染色强度均低于对照组(图5D)，说明敲低Bcl-3能够显著降低结直肠癌细胞HCT116在裸鼠体内的增殖。
本发明人同时应用免疫印迹及定量PCR的方法检测移植肿瘤组织中Bcl-3及c-Myc的表达情况，发现多烯环素诱导Bcl-3RNAi组(以shBcl-3(72#)敲低)中，Bcl-3敲低效果明显，且c-Myc蛋白表达显著下调；但是mRNA没有发生明显变化(图5E)。
为了进一步证实敲低Bcl-3能够抑制结直肠癌细胞的体内成瘤，本发明人将对照CT26.con(转入了shtGFP)及敲低Bcl-3的CT26.shBcl-3稳转细胞系皮下注射Babl/c小鼠(CT26WT细胞来源于Babl/c小鼠结直肠癌，故能在Babl/c小鼠皮下成瘤，不会产生免疫排斥)。实验结果显示，敲低Bcl-3能够显著抑制CT26WT细胞在Babl/c小鼠皮下成瘤，肿瘤体积与肿瘤重量均明显小于对照组，免疫印迹显示肿瘤组织中Bcl-3被显著敲低，且c-Myc被显著下调(图5F-I)。本发明人同时用裸鼠重复上述成瘤实验，得到相同的结果，敲低Bcl-3抑制CT26WT裸鼠皮下成瘤(图5J)。
实施例6、Bcl-3抑制c-Myc蛋白泛素化而增强其稳定性
前述Bcl-3以一种转录非依赖的方式调控c-Myc蛋白表达，本发明人推测Bcl-3分子可能影响c-Myc蛋白稳定性。为了证实此种假设，本发明人用蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)处理多烯环素诱导的对照HCT116.con(转入了shtGFP)及HCT116.shBcl-3稳转细胞系，在指定时间点收取蛋白检测c-Myc蛋白的降解速度。结果显示，在敲低Bcl-3的HCT116细胞(以shBcl-3(72#)敲低)中，c-Myc蛋白降解明显快于对照细胞(图6A)。
同时本发明人从相反的方面证明，Bcl-3过表达(MC215920)抑制c-Myc蛋白降解(图6B)。
已有报道称c-Myc蛋白的降解主要以其泛素化后的蛋白酶体方式进行。本发明人利用蛋白酶体抑制剂MG132处理多烯环素诱导的对照HCT116.con与HCT116.shBcl-3稳转细胞系(以shBcl-3(72#)敲低)，6小时后检测c-Myc蛋白水平。结果显示，敲低Bcl-3导致c-Myc蛋白水平降低，而MG132处理能够消除这种差异(图6C)。说明Bcl-3影响c-Myc降解的蛋白酶体通路。
而后，本发明人直接检测Bcl-3对c-Myc泛素化的影响，发现过表达Bcl-3(MC215920)能够抑制c-Myc蛋白的泛素化(图6D)。
本发明人还检测了导致c-Myc蛋白泛素化的E3泛素化酶的表达，结果显示skp2、fbw7、Huwe1、Truss均不受Bcl-3的转录调控(图6E)。
实施例7、Bcl-3通过调控Erk信号通路导致c-Myc Ser62磷酸化，抑制c-Myc降解
文献报道(Salghetti SE,Kim SY,Tansey WP:Destruction of Myc byubiquitin-mediated proteolysis:cancer-associated and transforming mutationsstabilize Myc,EMBO J 1999,18:717-726)，c-Myc蛋白的乙酰化与磷酸化修饰影响其泛素化及后续的降解。本发明人利用免疫印迹的方法检测异位表达Bcl-3对乙酰化或磷酸化位点突变的c-Myc蛋白(Myc T58A，Myc K323R)稳定性的影响。结果显示，Bcl-3影响c-Myc蛋白稳定性与其磷酸化有关(图7A)。
进而本发明人检测了c-My磷酸化及与c-Myc蛋白Thr58及Ser62磷酸化相关的信号通路，发现在HCT116及CT26WT结肠癌细胞系中，敲低Bcl-3显著降低MEK-Erk通路所介导的c-Myc Ser62的磷酸化，从而导致c-Myc蛋白稳定性降低(图7B-C)。
为了进一步确定该机制，本发明人从相反的方向，在dKO TSC细胞中异位表达Bcl-3，发现Bcl-3过表达增强MEK-Erk介导的c-Myc Ser62的磷酸化(图7D)。
实施例8、炎症诱导的c-Myc表达蛋白依赖于Bcl-3
本发明人发现，在HCT116中TNFα和Il-6诱导的c-Myc表达依赖于Bcl-3，并且与影响c-Myc稳定性的Erk磷酸化水平有关，此外c-Myc的RNA诱导水平在HCT116 Bcl-3敲低细胞系(V3THS_407972)也会部分被抑制，两者都在6h的时候差异最为显著(图8A-B)。而当用PD98059处理抑制Erk磷酸化后，c-Myc的诱导水平受到显著抑制(图8C)。先前文献(He,T.C.,Sparks,A.B.,Rago,C.,Hermeking,H.,Zawel,L.,da Costa,L.T.,Morin,P.J.,Vogelstein,B.,andKinzler,K.W.1998.Identification of c-MYC as a target of the APC pathway.Science 281:1509-1512；Wilkins,J.A.,and Sansom,O.J.2008.C-Myc is a criticalmediator of the phenotypes of Apc loss in the intestine.Cancer Res 68:4963-4966等)报道，Wnt信号通路失调易致结直肠癌的发生，这与该通路诱导的c-Myc表达增加密切相关。本发明人在HCT116与CT26WT细胞中，利用Licl诱导激活Wnt信号通路，通过免疫印迹检测发现Wnt信号所诱导的c-Myc蛋白需要Bcl-3，且与Bcl-3调节的MEK-Erk通路磷酸化c-Myc有关(图8D-E)。
此外，Bcl3还影响了生长因子诱导的c-Myc，在HCT116饥饿24h后加血清刺激的实验中可以看到c-Myc的诱导水平在HCT116 Bcl-3敲除细胞系(V3THS_407972)中显著降低(图8F)。
实施例9、人结直肠癌组织标本中Bcl-3表达与Erk磷酸化及c-Myc表达呈显著正相关
前面的实验结果(实施例7)证实，在结直肠癌中Bcl-3分子通过调控MEK-Erk信号通路致使c-Myc Ser62磷酸化以增强其稳定性。因此，本发明人推测在结直肠癌病人组织中高表达的Bcl-3分子引起的c-Myc Ser62磷酸化而使其半衰期延长可能是结直肠癌发生的重要原因。
为了证实，本发明人通过免疫组化的方法检测结直肠癌组织中Bcl-3、c-Myc及Erk磷酸化水平并进行相关性分析。结果表明，在结直肠癌组织中Bcl-3表达与Erk磷酸化及c-Myc蛋白水平存在显著的正相关性(图9A-F)。
实施例10、药物筛选
细胞模型：HCT116，其中表达Bcl-3蛋白。
测试组：用候选物质处理的上述细胞的培养物；
对照组：不用候选物质处理的上述细胞的培养物。
如果与对照组相比，测试组中的Bcl-3蛋白的表达显著下降50%以上，则说明该候选物质是潜在的抑制肿瘤转移的物质。
采用上述方法，将前述制备的shRNA1(候选物质1)，以及shRNA2(等量混合)的siRNA(候选物质2)病毒表达载体作为候选物质，转染所述细胞模型。结果发现，候选物质1和2是抑制肿瘤转移的物质。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (14)
1.一种Bcl-3的下调剂的用途，用于制备预防、缓解或治疗结直肠癌的组合物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的Bcl-3的下调剂选自：
核酸抑制物，蛋白抑制剂，蛋白水解酶，蛋白结合分子，其能够在蛋白或基因水平上下调Bcl-3的表达或活性。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的Bcl-3的下调剂选自：
以Bcl-3基因或其转录本为靶序列、且能够抑制Bcl-3基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物；或
特异性与Bcl-3蛋白结合的结合分子。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的Bcl-3的下调剂具有以下shRNA结构：
Seq正向-X-Seq反向；
其中，Seq正向的核苷酸序列具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示；Seq反向为与Seq正向互补的序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。
5.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的Bcl-3的下调剂是pRSshBcl-3质粒。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于：
降低原癌蛋白c-Myc蛋白表达；或
促进原癌蛋白c-Myc蛋白的降解。
7.一种用于预防、缓解或治疗结直肠癌的Bcl-3下调剂，其特征在于，所述的Bcl-3下调剂具有以下shRNA结构：
Seq正向-X-Seq反向；
其中，Seq正向的核苷酸序列具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示；Seq反向为与Seq正向互补的序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。
8.一种用于预防、缓解或治疗结直肠癌的组合物，其特征在于，所述的组合物含有：
(1)权利要求7所述的Bcl-3下调剂；和
(2)药学上可接受的载体。
9.一种筛选预防、缓解或治疗结直肠癌的潜在物质的方法，所述方法包括：
(1)用候选物质处理表达或含有Bcl-3的体系；和
(2)检测所述体系中Bcl-3的表达或活性；
其中，若所述候选物质可降低Bcl-3的表达或活性，则表明该候选物质是预防、缓解或治疗结直肠癌的潜在物质。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达或含有Bcl-3的体系中；和/或
步骤(2)包括：检测测试组的体系中Bcl-3的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达或含有Bcl-3的体系；
如果测试组中Bcl-3的表达或活性在统计学上低于对照组，就表明该候选物是预防、缓解或治疗结直肠癌的潜在物质。
11.一种Bcl-3的用途，用于制备检测结直肠癌的试剂。
12.一种特异性识Bcl-3的试剂的用途，用于制备检测结直肠癌的试剂盒。
13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述的特异性识Bcl-3的试剂选自：
特异性扩增Bcl-3基因的引物；
特异性识别Bcl-3基因的探针；或
特异性结合Bcl-3蛋白的抗体或配体。
14.一种检测结直肠癌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有：特异性识别Bcl-3的试剂。
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