CN114438159A - 诊断和治疗化疗耐药小细胞肺癌的新靶点及其应用 - Google Patents

诊断和治疗化疗耐药小细胞肺癌的新靶点及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种诊断和治疗化疗耐药小细胞肺癌的新靶点及其应用。本发明揭示了一种新型的与化疗耐药的小细胞肺癌治疗密切相关的信号通路：GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路，披露了由该信号通路参与的、调控小细胞肺癌及其耐药性的新机制。

Description

诊断和治疗化疗耐药小细胞肺癌的新靶点及其应用
技术领域
本发现属于分子生物学以及肿瘤学领域，更具体地，本发明涉及诊断和治疗化疗耐药小细胞肺癌的新靶点及其应用。
背景技术
肺癌是高发病率和高死亡率的恶性肿瘤，根据世界卫生组织统计，肺癌是当今在全球造成死亡人数第一的癌症。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高。而在中国，由于大量的吸烟人群和环境的不断恶化，肺癌已经成为中国发病率最高的一类癌症。诸多因素阻碍了肺癌治疗方案的改进和完善程，目前五年存活率尚不足10％。
肺癌有多种亚型，根据其组织形态差异，可分为非小细胞肺癌(NSCLC；占肺癌的80-85％)和小细胞肺癌(SCLC；占肺癌的15-20％)。非小细胞肺癌可细分为肺腺癌，肺鳞癌和大细胞肺癌。小细胞肺癌由于其高转移和治疗手段单一的局限，是肺癌中恶性程度最高、预后最差的亚型。小细胞肺癌多发生于肺中央部，生长迅速、转移较早。在对于小细胞肺癌治疗上，因确诊时大部分患者已经发生癌细胞转移，手术适应症窄，大概仅2-5％的患者适合手术治疗。依托泊苷(VP-16)联合顺铂(DDP)方案，因具有化疗效果好而且毒性较轻成为一线治疗的标准方案。化疗可以缓解小细胞肺癌患者症状和延长患者的生存期，但耐药很快发生，使的目前小细胞肺癌患者的生存率不理想，5年生存率低于5％。过去30年中，由于小细胞肺癌患者的肿瘤样本难获取，导致对其发病机制的认知严重滞后。小细胞肺癌患者的生存期和治疗方法基本没有发生较大变化。
细胞拥有复杂而多样的代谢途径来支撑自身的生长和增殖，肿瘤细胞尤其依赖于多样的代谢途径，来合成其快速增殖所需的物质和能量。鉴于肿瘤细胞过度依赖于重编程后的代谢途径来支撑它们的生存和增殖，可以针对肿瘤细胞的代谢特异性来开展靶向治疗。所以深入研究肿瘤代谢和其生存增殖的关系尤显重要。
从上世纪七十年代开始，化疗特别是依托泊苷联合顺铂(E/P方案)已经成为临床上治疗小细胞肺癌的首选方案。尽管化疗一开始疗效显著，约80％局限期患者和几乎全部的广泛期患者在治疗一年内出现肿瘤顽固性耐药和恶性进展，由于耐药机制的认识匮乏导致临床上面临对耐药患者基本无药可用。基于伦理限制，几乎不可能通过让这些耐药患者接受活检获得标本来研究小细胞肺癌耐药的机制。而这更进一步导致人们对耐药机制的认识匮乏。因此，在小细胞肺癌临床治疗过程中存在着这样一个怪圈：化疗一线治疗的高效性导致手术治疗不能普及，从而使得临床样本获取非常困难，而这直接导致人们对化疗耐药机制认识的匮乏，这种认识的匮乏直接影响了新的治疗策略和方案的产生，致使患者耐药后面临基本无药可治的困境。在伦理限制下，临床耐药样本的获取更加困难，进一步导致人们对小细胞肺癌耐药机制的认识不够，最终进入一个难以打开的死结。这个小细胞肺癌耐药研究的死结从上世纪七十年代一直延续至今，在将近五十年的时间里，患者一旦发生耐药几乎无一例外地面临无药可治的处境。
因此，建立有效的研究体系进行小细胞肺癌化疗耐药的机制研究迫在眉睫；同时，本领域也亟待开发新的小细胞肺癌治疗药物。
发明内容
本发明的目的在于提供诊断和治疗化疗耐药小细胞肺癌的新靶点及其应用。本发明涉及一类化疗耐药小细胞肺癌治疗新靶点的发现与应用。公开了小细胞肺癌化疗耐药小鼠模型的构建方法；还公开了小分子抑制剂他汀类药物是通过香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)-RAB7A-自噬途径选择性抑制化疗耐药小细胞癌的生长；还公开了敲低GGPP合成酶(GGPS1)或RAB7A的基因表达可以选择性抑制化疗耐药小细胞癌肿瘤的增殖；还公开了他汀类药物及其与化疗药物联用可以选择性抑制化疗耐药小细胞癌，尤其是高表达GGPS1的化疗耐药小细胞癌肿瘤的生长；本发明首次揭示了一类化疗耐药小细胞肺癌的新治疗靶点及其应用，为针对小细胞肺癌化疗耐药的治疗提供了全新的思路和方法。
在本发明的第一方面，提供一种筛选抑制化疗耐药小细胞肺癌的物质的方法，所述方法包括：(1)将候选物质与含有GGPS1(GGPP合成酶)/RAB7A(Ras相关蛋白7A)/自噬流信号通路的体系接触；(2)筛选出调节GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路的物质，所述物质是对于抑制化疗耐药小细胞肺癌有用的物质(包括潜在物质)；其中，所述的调节包括：抑制GGPS1的表达或活性，抑制RAB7A的膜定位，抑制GGPS1代谢产物GGPP对RAB7A的修饰作用，或促进自噬流障碍。
在一个优选例中，所述的GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路被包含于甲羟戊酸途径中，或为甲羟戊酸途径的下游通路。
在另一优选例中，所述的GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路包括：GGPS1蛋白，RAB7A蛋白；所述自噬流为自噬体与溶酶体相互融合引发的自噬流。
在另一优选例中，步骤(1)包括：向含有GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路的体系中添加候选物质；步骤(2)包括：检测GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路中各蛋白或其编码基因的变化，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的、含有GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路的体系；若候选物质抑制GGPS1的表达或活性，抑制RAB7A的膜定位，抑制GGPS1代谢产物GGPP对RAB7A的修饰作用，或促进自噬流障碍，则该候选物质是对于抑制化疗耐药小细胞肺癌有用的物质。
在另一优选例中，所述的含有GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路的体系选自：细胞(培养物)体系、亚细胞(培养物)体系、组织(培养物)体系或动物体系。
在另一优选例中，所述的提高或促进为统计学上的提高或促进，如与对照或基底相比，提高或促进10％或20％以上，较佳地提高或促进40％或50％以上，更佳地提高或促进80％或100％以上。
在另一优选例中，所述的抑制也可被称为下调，为统计学上的抑制或下调，如与对照或基底相比，抑制或下调10％或20％以上，较佳地抑制或下调40％或50％以上，更佳地抑制或下调80％或100％以上。
在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路、或其通路蛋白、或其上游或下游蛋白或基因设计的调控分子(如但不限于上调剂、干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体))，CRISPR构建物，小分子化合物，来自化合物库的化合物。
在本发明的另一方面，提供GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路的用途，用于筛选抑制化疗耐药小细胞肺癌的物质；较佳地，所述的GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路被包含于甲羟戊酸途径中，或为甲羟戊酸途径的下游通路；或，所述的GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路包括：GGPS1蛋白，RAB7A蛋白；所述自噬流为自噬体与溶酶体相互融合引发的自噬流。
在本发明的另一方面，提供调节GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路的调节剂的用途，用于制备抑制化疗耐药小细胞肺癌的药物组合物；其中，所述的调节剂包括选自下组：GGPS1的表达或活性抑制剂，RAB7A膜定位抑制剂，GGPS1代谢产物GGPP对RAB7A的修饰作用的抑制剂，或促进自噬流障碍的促进剂。
在一个优选例中，所述GGPS1的表达或活性抑制剂包括(但不限于)：敲除或沉默GGPS1基因的试剂，抑制GGPS1蛋白活性的试剂；较佳地，包括：特异性干扰GGPS1基因表达的干扰分子，针对GGPS1基因的CRISPR基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂，所述试剂将GGPS1进行功能丧失性突变。
在另一优选例中，所述RAB7A膜定位抑制剂包括(但不限于)：敲除或沉默RAB7A基因的试剂，抑制RAB7A蛋白活性的试剂；较佳地，包括：特异性干扰RAB7A基因表达的干扰分子，针对RAB7A基因的CRISPR基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂，所述试剂将RAB7A进行功能丧失性突变。
在另一优选例中，所述GGPS1代谢产物GGPP对RAB7A的修饰作用的抑制剂包括(但不限于)：抑制GGPS1合成GGPP的试剂。
在另一优选例中，所述促进自噬流障碍的促进剂包括(但不限于)：GGPS1的表达或活性抑制剂，RAB7A膜定位抑制剂，GGPS1代谢产物GGPP对RAB7A的修饰作用的抑制剂。
在另一优选例中，所述的敲除或沉默GGPS1基因的试剂为敲低GGPS1的shRNA质粒；用于敲低的功能序列为：CCTGAGCTAGTAGCCTTAGTA所述的敲除或沉默RAB7A基因的试剂为敲低RAB7A的shRNA质粒；用于敲低的功能序列为：GGCTAGTCACAATGCAGATAT。
在本发明的另一方面，提供他汀类药物、依托泊苷和顺铂的组合在制备抑制化疗耐药小细胞肺癌的药物组合物中的用途。
在本发明的另一方面，提供一种抑制化疗耐药小细胞肺癌的药物组合物，包括他汀类药物、依托泊苷和顺铂。
在本发明的另一方面，提供一种抑制化疗耐药小细胞肺癌的药盒，其中包括所述的药物组合物；或其中包括容器，以及分别置于所述容器中的他汀类药物、依托泊苷和顺铂。
在一个优选例中，所述他汀类药物包括选自：美伐他汀(MevaStatin)，辛伐他汀(SimvaStatin)，匹伐他汀(PitvaStatin)，阿托伐他汀(AtorvStatin)，洛伐他汀(LovaStatin)，FluaStatin。
在另一优选例中，所述的化疗耐药小细胞肺癌为高表达GGPS1耐药性的小细胞肺癌。
在另一优选例中，所述的“高表达”为统计学意义上的“高表达”，例如，“高表达GGPS1的小细胞肺癌”与“小细胞肺癌”总人群(或统计学意义上足够量的人群)的平均GGPS1的表达相比，显著高10％或20％以上，较佳地高30％或50％以上，更佳地高80％或100％以上。
在另一优选例中，用于一个单位疗程时，所述的他汀类药物、依托泊苷和顺铂的用量比例为(35～105)：(3～9)：1；较佳地为(49～70)：(4.5～7.5)：1(如58.3：5：1)。
在另一优选例中，所述顺铂、依托泊苷和所述他汀类药物的用药方法为：按1周1个疗程计算，根据个体体重，通过腹腔注射方式第1天给予0.5～10毫克/千克(如0.8～6毫克/千克，更具体如1、2、3、4、5毫克/千克)顺铂(CDDP)；第1～3天给予0.5～15毫克/千克/天(如1～12毫克/千克/天，更具体如2、4、6、8、10毫克/千克/天)依托泊苷(VP16)；同时通过灌胃方式给予2～100毫克/千克/天(如5～60毫克/千克/天，更具体如6、8、10、15、20、30、40、50毫克/千克/天)的美伐他汀或辛伐他汀或匹伐他汀等药物处理；较佳地，当药物被置于药盒中时，所述用药方法被记载于所述药盒的使用说明书中。
在本发明的另一方面，提供GGPS1蛋白或其编码基因在制备诊断试剂中的用途，所述的诊断试剂用于对小细胞肺癌进行诊断或预后；较佳地，所述的诊断或预后包括：根据GGPS1蛋白的表达情况，判断其是否适用于进行他汀类药物的治疗方案；若GGPS1蛋白高表达，则适用该治疗方案。
在本发明的另一方面，提供特异性识别GGPS1蛋白或其编码基因的试剂的用途，用于制备对小细胞肺癌进行诊断或预后的诊断试剂或诊断试剂盒；较佳地，所述的诊断或预后包括：根据GGPS1蛋白的表达情况，判断其是否适用于进行他汀类药物的治疗方案；若GGPS1蛋白高表达，则适用该治疗方案。
在一个优选例中，所述的治疗方案为他汀类药物、依托泊苷和顺铂联合用药的治疗方案。
在另一优选例中，所述的诊断试剂包括选自：特异性扩增GGPS1蛋白的编码基因的引物；特异性识别GGPS1蛋白的编码基因或其转录本的探针；或特异性抗GGPS1蛋白的抗体。
在本发明的另一方面，提供一种用于对小细胞肺癌进行诊断或预后的试剂盒，所述的试剂盒中含有：检测GGPS1蛋白或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：核酸抽提试剂，聚合酶链反应试剂，蛋白免疫印迹试剂，和/或酶链免疫反应试剂。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、建立小鼠小细胞肺癌化疗耐药肿瘤的方案。
A.模型建立和实验流程图。皮下成瘤的动物会每周给予依托泊苷/顺铂(E/P)或对照的处理，通过不断的肿瘤传代接种直至产生化疗耐药模型。
B.根据临床上的标准流程给药。按照1周1个疗程计算，第1天：顺铂处理，第1-3天：依托泊苷处理，第4-7天，不给药。
图2、建立小鼠模型的小细胞肺癌化疗耐药肿瘤。
A.每一代敏感细胞系体内对于E/P药物的效应。对照组(绿色)和化疗处理组(红色)数据以单线条的显示呈现。
B.对敏感和耐药肿瘤在给与E/P药物情况下生存分析，采用log rank(Mantle-Cox)检验。本发明人定义肿瘤体积达到1000立方毫米时为小鼠的生存终点。
C.比较肿瘤H82，H209，H526，H146和H82R，H209R，H526R，H146R之间E/P的抑制效率和小鼠生存周期。
D.H82和H82R肿瘤在给予E/P处理情况下的，凋亡相关标志物Cleaved-Caspase 3(CC3)的免疫组化染色。比例尺：50μm。后为H82和H82R肿瘤在给予E/P处理情况下的CC3染色统计图。
E.小细胞化疗耐药细胞系(H446，DMS114)体内每一代肿瘤对于E/P的响应。对照组(绿色)和化疗处理组(红色)数据以单线条的显示呈现。
F.对耐药肿瘤在给与E/P药物情况下生存分析，用log rank(Mantle-Cox)检验。
G.在耐药肿瘤H446和DMS114，检测E/P的抑制效率和小鼠生存周期。
所有数据分析采用双因素方差分析或者未配对的t检验。生存分析采用log-rank(Mantel–Cox)检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。所有误差采用均数标准误差。
图3、建立小细胞肺癌化疗耐药细胞株。
A.在E/P处理下，通过检测细胞活力检测H82和H82R细胞的IC50。
B.体外检测H82和H82R细胞对于E/P处理的响应。
C.体外检测H526和H526R细胞对于E/P处理的响应。
D.体外检测H209和H209R细胞对于E/P处理的响应。
E.体外检测化疗耐药细胞H446，DMS114和H196对于E/P处理的响应。
所有数据分析采用双因素方差分析或者未配对的t检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。所有误差采用均数标准误差。
图4、用FDA认证的代谢类药物进行药库筛选。
A.利用H82和H82R细胞进行药库筛选的流程。有256个小分子抑制剂被用于药库筛选。每孔按2000细胞铺下，24小时后按5微摩尔的浓度加入药库药物，在第四天检测细胞活力。
B.对于药库按照应用的人类疾病分类。
C.对于药库按照所属的代谢通路分类。
图5、他汀类药物抑制H82R细胞生长。
A.比较H82R/H82的生长差异，得出药物的筛选抑制效率(每个药物三次重复)。红色点代表的药物显著抑制H82R细胞生长(log2大于0.5，p值小于0.05)，蓝色点代表的药物显著抑制H82细胞生长(log2小于-0.5，p值小于0.05)。他汀类药物被发现相对于H82细胞，可以显著抑制H82R细胞生长。
B.在细胞给予MevaStatin按照2μM、5μM和10μM处理72小时，检测H82和H82R细胞生长。
C.在细胞给予不同浓度他汀(AtorvStatin、PitvaStatin、LovaStatin、MevaStatin、SimvaStatin和FluaStatin)处理后，检测H82和H82R细胞的生长。D.在细胞给予对照处理，E/P处理，美伐他汀(MevaStatin，Meva)处理和联合处理后，连续四天每天检测H82和H82R细胞生长。
所有数据分析采用双因素方差分析或者未配对的t检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。所有误差采用均数标准误差。
图6、他汀类药物抑制多株小细胞肺癌化疗耐药细胞的生长。
A.化疗敏感细胞系(H146、H209和H526)和化疗耐药细胞系(H196、H446和DMS114)在给予对照处理，E/P处理，MevaStatin处理和联合处理的情况下，连续四天每天检测细胞的增殖。
B.比较化疗敏感细胞系和化疗耐药系对于E/P的响应。比较化疗敏感细胞系和化疗耐药细胞系对于5μM MevaStatin的响应。处理72小时后，WB检测蛋白PARP、CC3、P21和P27水平。
所有数据分析采用双因素方差分析或者未配对的t检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。所有误差采用均数标准误差。
图7、他汀类药物抑制H82R移植瘤生长。
A.H82R细胞皮下成瘤后，分成四组：按照对照处理，E/P处理，MevaStatin处理和联合处理。肿瘤体积用游标卡尺测量后计算。图中显示了每组肿瘤增长曲线图(左)，每组肿瘤重量图(中)，每组小鼠体重图(右)。
B.H82R肿瘤在不同药物处理后，对于每组的肿瘤取后拍照。
C.免疫组化显示每组药物处理后，H82R肿瘤凋亡标志物CC3和DNA损伤标志物
H2AX染色。比例尺：50μm。
D.对于H82R每组肿瘤CC3和H2AX的染色比例统计图。E.H82R细胞皮下成瘤后，分成多组按照对照处理，E/P处理，SimvaStatin处理，PitvaStatin处理和联合处理。图中显示了每组肿瘤增长曲线图(左)，每组肿瘤重量图(中)，每组小鼠体重图(右)。
所有数据分析采用双因素方差分析或者未配对的t检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。所有误差采用均数标准误差。
图8、GGPP逆转Statin对H82R细胞的抑制效应。
A.甲羟戊酸(MVA)、香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)和香叶基香叶醇(GGOH)的加入可以回复5μM MevaStatin处理对于H82R细胞的抑制效应，但加入法尼焦磷酸(FPP)、法尼醇(FFOH)、鲨烯(SQ)、辅酶Q9(CoQ9)和辅酶Q10(CoQ10)无法回复5μM MevaStatin处理对于H82R细胞的抑制效应。
B.检测不同浓度的FPP、FFOH、GGPP、GGOH、SQ或CoQ9、CoQ10加入是否可以回复5μMMevaStatin处理对于H82R细胞的抑制效应。
所有数据分析采用双因素方差分析或者未配对的t检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。所有误差采用均数标准误差。
图9、Statin通过抑制GGPP产生影响RAB7A的胞内分布来抑制H82R细胞。
A.RNA-seq检测大部分RAB蛋白家族基因的FKM值。
B.热图分析由小G蛋白和MVA通路的基因构成的shRNA库对于H82R细胞生长影响。
C.利用Tet-on系统，四环霉素(Doxycycline)处理H82和H82R细胞会诱导GGPS1和RAB7A的敲低。
D.细胞在对照处理、5μM MevaStatin、5μM MevaStatin和2μM GGPP处理72小时后，检测RAB7A在细胞的胞质内，膜上和总的表达水平。钠/钾离子转运ATP酶α1肽(ATP1A1)为特异性表达在细胞膜上的蛋白，微管蛋白(Tubulin)是内参蛋白。所有数据分析采用双因素方差分析或者未配对的t检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。所有误差采用均数标准误差。
图10、Statin通过GGPP-RAB7A-自噬途径引起H82R细胞的自噬障碍。
A.H82和H82R细胞在对照处理、5μM MevaStatin、5μM MevaStatin和2μM GGPP处理72小时后，WB检测P62和LC3B的表达水平。
B.H82和H82R细胞在对照处理、5μM MevaStatin、5μM MevaStatin和2μM GGPP处理72小时后，WB检测PARP和CC3的表达水平。
C.敏感细胞系(H209、H526)和耐药细胞系(H446、DMS114)细胞在对照处理，5μMMevaStatin处理72小时后，WB检测P62和LC3B的表达水平。
D.H82R细胞敲低GGPS1或RAB7A后，WB检测P62和LC3B的表达水平。
E.H82R细胞敲低GGPS1或RAB7A后，WB检测PARP和CC3的表达水平。
F.H82R细胞敲低HMGCR后，WB检测HMGCR、CC3、P62和LC3B的表达水平。
G.检测H446细胞在敲低GGPS1或RAB7A后的细胞活力。
H.H446细胞敲低GGPS1或RAB7A后，WB检测P62和LC3B的表达水平。
I.WB检测H82R肿瘤对照组，MevaStatin组，联合处理组中的P62和LC3B的表达水平。
所有数据分析采用双因素方差分析或者未配对的t检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。所有误差采用均数标准误差。
图11、免疫荧光示踪小细胞肺癌化疗耐药细胞的自噬流。
A.稳转细胞株H82R mRFP-GFP-LC3分别给予对照处理、5μM MevaStatin、5μMMevaStatin和2μM GGPP处理72小时后，统计细胞内自噬溶酶体的数目。
B.稳转细胞株H446 mRFP-GFP-LC3分别给予对照处理、5μM MevaStatin、5μMMevaStatin和2μM GGPP处理72小时后，统计细胞内自噬溶酶体的数目。
C.稳转细胞株H446 mRFP-GFP-LC3在GGPS1或RAB7A敲低后，统计细胞内自噬溶酶体的数目。
所有数据分析采用双因素方差分析或者未配对的t检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。所有误差采用均数标准误差。
图12、敲低GGPS1或RAB7A抑制H82R肿瘤的生长。
A.H82R诱导敲低GGPS1细胞皮下成瘤后，分别给予对照处理(水，每组五只)和doxycycline(1毫克/毫升溶于饮用水中，每组五只)。肿瘤体积通过游标卡尺测量后计算。图中显示了每组肿瘤增长曲线图(左)，每组肿瘤重量图(中)，肿瘤拍照图(右)。
B.H82R肿瘤诱导敲低GGPS1后，WB检测P62和LC3B的表达水平。
C.免疫组化检测NCAM、GGPS1、CC3和H2AX染色在H82R肿瘤和诱导敲低GGPS1肿瘤中。统计GGPS1、CC3和H2AX染色在H82R肿瘤和诱导敲低GGPS1肿瘤中的染色比例。比例尺：50μm。
D.H82R诱导敲低RAB7A细胞皮下成瘤后，分别给予对照处理(水，每组五只)和doxycycline(1毫克/毫升溶于饮用水中，每组五只)。肿瘤体积通过游标卡尺测量后计算。图中显示了每组肿瘤增长曲线图(左)，每组肿瘤重量图(中)，肿瘤拍照图(右)。
E.H82R肿瘤诱导敲低RAB7A后，WB检测P62和LC3B的表达水平。
F.免疫组化检测NCAM、RAB7A、CC3和H2AX染色在H82R肿瘤和诱导敲低RAB7A肿瘤中。比例尺：50μm。统计GGPS1、CC3和H2AX染色在H82R肿瘤和诱导敲低RAB7A肿瘤中的染色比例。
所有数据分析采用双因素方差分析或者未配对的t检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。所有误差采用均数标准误差。
图13、Statin抑制GGPS1升高的小细胞肺癌化疗耐药PDX。
A.每一代小细胞肺癌PDX ZS7体内对于E/P药物的效应。对照组(绿色)和化疗处理组(红色)数据以单线条的显示呈现。对小鼠接种PDX敏感肿瘤和耐药肿瘤在给与E/P药物情况下生存分析。
B.每一代小细胞肺癌PDX ZS4体内对于E/P药物的效应。对照组(绿色)和化疗处理组(红色)数据以单线条的显示呈现。对小鼠接种PDX敏感肿瘤和耐药肿瘤在给与E/P药物情况下生存分析。
C.通过WB检测MVA通路基因在PDX肿瘤ZS7和ZS7R，ZS4和ZS4R的表达水平。
D.小鼠接种PDX ZS7R后，分为四组，分别按照对照处理，E/P处理，MevaStatin处理和联合处理。肿瘤体积通过游标卡尺测量后计算。图中显示了每组肿瘤增长曲线图(左)，每组肿瘤重量图(右)。
E.免疫组化检测CC3和H2AX染色在不同处理组下ZS7R肿瘤。统计CC3和H2AX染色在不同处理组下ZS7R肿瘤的染色比例。
所有数据分析采用双因素方差分析或者未配对的t检验。生存分析采用log-rank(Mantel–Cox)检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。所有误差采用均数标准误差。
图14、Statin抑制高表达GGPS1的PD小细胞肺癌PDX。
A.处于PR和PD阶段的小细胞肺癌PDX中GGPS1表达水平代表性组化图。比例尺：50μm。
B.免疫组化检测不同阶段的PR、SD和PD小细胞肺癌PDX肿瘤的GGPS1表达并给予组化打分。
C.通过WB检测GGPS1在不同阶段的PR、SD和PD小细胞肺癌PDX的表达水平。
D.接种PDX SP9后，分别按照对照处理，E/P处理，MevaStatin处理和联合处理。肿瘤体积通过游标卡尺测量后计算。图中显示了每组肿瘤增长曲线图(左)，每组肿瘤重量图(中)，小鼠重量图(右)。
E.对取下的肿瘤拍照图。
F.不同处理组下，免疫组化检测SP9肿瘤中CC3和H2AX染色。比例尺：50μm。统计CC3和H2AX染色在不同处理组下SP9肿瘤的染色比例。
所有数据分析采用双因素方差分析或者未配对的t检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。所有误差采用均数标准误差。
图15、通过TCGA分析发现高表达GGPS1的小细胞肺癌患者预后更差。
A.通过TCGA分析检测香叶基香叶基二磷酸合酶1(GGPS1)的表达水平和小细胞肺癌患者预后关系。
B.通过TCGA分析检测鲨烯环氧酶(SQLE)和法尼二磷酸酯法尼基转移酶(FDFT1)的表达水平和小细胞肺癌患者预后关系。生存分析采用log-rank(Mantel-Cox)检验。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。所有误差采用均数标准误差。
具体实施方式
本发明首次揭示了一种新型的与小细胞肺癌的诊断和治疗密切相关的信号通路：GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路。本发明披露了由该信号通路参与的、调控小细胞肺癌及其耐药性的新机制。
小细胞肺癌耐药模型
与大多数肿瘤不同，小细胞肺癌的首选治疗方案是化疗而不是手术，而化疗耐药的快速出现和后续治疗方案的匮乏是导致小细胞肺癌患者预后差、死亡率高的主要原因。其中，耐药后治疗手段匮乏的原因主要在于小细胞肺癌的耐药样本很难获取，使得对其耐药机制的研究及理解严重滞后。代谢异常在肿瘤恶性进展中发挥着重要作用，然而其在小细胞肺癌化疗耐药中的功能并不清楚。因此，建立能够真实模拟临床化疗耐药的小细胞肺癌模型是解除目前研究困境、解答上述科学问题的关键。
目前本领域没有通过体内肿瘤模型建立配对的化疗耐药细胞系，而本发明人成功建立了小细胞肺癌化疗耐药模型。作为本发明的优选方式，小细胞肺癌细胞系(如实施例中称为H82、H209、H526和H146)在体外和体内都对化疗药物(如E/P)敏感。在体内不断给药处理后，得到化疗耐药肿瘤(如实施例中称为H82R、H209R、H526R和H146R)。进一步通过原代培养，成功建立耐药细胞株。
作为本发明的优选方式，所述耐药性小细胞肺癌的细胞株的方法包括：(a)将对化疗药物敏感的小细胞肺癌细胞移植于受体；(b)对(a)的受体给予化疗药物处理，使对化疗药物敏感的小细胞肺癌细胞形成的肿瘤发生耐药；较佳地，所述处理包括：对化疗药物敏感的小细胞肺癌细胞给予受体后，肿瘤体积长至约50-400mm3(较佳地，100-200mm3)时，给予依托泊苷和顺铂(E/P)化疗药物处理；若给药后肿瘤明显消退则暂停给药，等肿瘤重新恢复生长再继续给药；重复此过程直至化疗药物无法有效抑制肿瘤生长；(c)从(b)的受体的肿瘤中分离出小细胞肺癌细胞，进行原代培养和/或继代培养，获得耐药性小细胞肺癌的细胞株。
在获得该模型的基础上，利用FDA认证的代谢类药物进行药库筛选，发现他汀类药物可以显著抑制化疗耐药小细胞肺癌的存活。
GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路及其调控
如本发明所用，所述的“(信号)通路”是指由一系列基因或蛋白或其代谢产物(合成产物或加工产物)之间发生相互制约或相互作用而形成的信号系统，也包括通路蛋白与细胞内其它元件或细胞器的相互作用，有时也包括其上下游基因或蛋白的共同参与，其一般会导致一些细胞事件的发生。所述的GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路主要包括以下要件：GGPS1基因(和/或其编码的蛋白)、RAB7A基因(和/或其编码的蛋白)、自噬流信号通路。其中，所述的自噬流信号通路包括自噬体与溶酶体的参与。
如本发明所用，所述的“(信号)通路”与“(信号)途径”可互换使用。
如本发明所用，术语“GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路”与“GGPS1-RAB7A-自噬流信号通路”可互换使用。
GGPS1基因的核苷酸序列例如如GenBank_NC_000001.11(人源)所示；其蛋白氨基酸序列例如如GenBank_AAH67768.1(人源)所示。
RAB7A基因的核苷酸序列例如如GenBank_NC_000003.12(人源)所示；其蛋白氨基酸序列例如如GenBank_AAH13728.2(人源)所示。
HMGCR基因的核苷酸序列例如如GenBank_NC_000005.10(人源)所示；其蛋白氨基酸序列例如如GenBank_AAH33692.1(人源)所示。
本发明中，除非另外说明，涉及MVA信号通路的其它通路蛋白/基因或其上下游蛋白/基因的信息，也是本领域技术人员已知的。
上述蛋白(多肽)也包括其变异形式，包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。任何与所述蛋白同源性高(比如与所述多肽序列的同源性为70％或更高；优选地同源性为80％或更高；更优选地同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有蛋白相同功能的蛋白也包括在本发明内。本发明还包括一种突变形式的蛋白或蛋白截短体，只要该突变蛋白或截短体基本上保留了全长蛋白的功能。
上述基因的序列也包括与之相简并的序列。编码蛋白的多核苷酸(基因)可以是天然基因，也可以是它们的简并的序列。
经过广泛的药物筛选实验，本发明人发现，他汀(Statin)类药物可显著抑制化疗耐药肿瘤的存活。进一步体外和体内实验验证，发现Statin可以抑制多株小细胞肺癌化疗耐药细胞的生长。本发明人发现，甲羟戊酸途径(Mevalonate pathway)下游代谢物GGPP能够完全逆转Statin对于耐药细胞的抑制效应。
MVA途径是以乙酰辅酶A为原料合成异戊二烯焦磷酸和二甲烯丙基焦磷酸的一条代谢途径，存在于所有高等真核生物和很多病毒中。该途径的产物是类固醇、类萜等生物分子的合成前体，也是胆固醇合成途径的必经步骤。其下游参与细胞很多重要功能，比如胆固醇合成、线粒体功能、蛋白的异戊二烯化修饰。其中HMGCR是MVA代谢通路的起始和限速步骤，它会合成甲羟戊酸，该代谢酶可由他汀药物所抑制。之后会到下游产物GPP，经FDPS合成FPP，FPP会经FDFT1合成为鲨烯，鲨烯会由SQLE继续合成胆固醇。除此之外，FPP还可以经GGPS1合成GGPP，GGPP可对靶蛋白进行香叶基香叶基化修饰，这类修饰属于异戊二烯类修饰，在细胞内发挥着重要功能。
本发明人研究发现，补充甲羟戊酸途径的甲羟戊酸(MVA)或其下游中间代谢物香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)可以有效阻断他汀类药物对化疗耐药小细胞肺癌的杀伤。深入分析揭示，他汀类药物(Statin)主要是通过抑制MVA代谢途径中GGPP的产生，干扰了GGPP对小G蛋白RAB7A进行香叶基香叶基化修饰，使后者无法上膜发挥正常功能，进而抑制了自噬体与溶酶体的融合，引发自噬流障碍，最终导致化疗耐药细胞死亡。也即，Statin由GGPS1-RAB7A-Autophagic途径(自噬流信号通路)介导、可导致自噬流障碍，引发细胞死亡，发挥抑制耐药癌细胞存活效应的。
如本发明所用，所述的“抑制(剂)”与“下调(剂)”可互换使用，其也包括：阻滞(剂)，拮抗(剂)等。
本发明人发现，所述的信号通路中，下调GGPS1的表达或活性、下调RAB7A的膜定位或下调GGPS1代谢产物GGPP对RAB7A的修饰作用，可以抑制小细胞肺癌。因此，可以通过这种作用模式，来筛选或设计适用于靶向调控的药物。
应理解，在得知了所述GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路(较佳地，也包括其上下游蛋白或基因)的功能后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路。比如可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节通路蛋白的表达或使之缺失表达。或采用本领域技术人员熟知的方法来促进或减弱自噬流的发生。
作为本发明的优选方式，提供了下调GGPS1的表达或活性、下调RAB7A的膜定位或下调GGPS1代谢产物GGPP对RAB7A的修饰作用的下调剂。所述下调剂是指任何可降低GGPS1或RAB7A的活性、降低GGPS1或RAB7A的稳定性、下调GGPS1或RAB7A的表达、减少GGPS1或RAB7A有效作用时间、抑制GGPS1或RAB7A的转录和翻译的物质的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于抑制小细胞肺癌潜在有用的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。例如，所述的下调剂是：特异性干扰GGPS1或RAB7A或其上游基因表达的干扰RNA分子或反义核苷酸；或是特异性编辑GGPS1或RAB7A或其上游基因编辑试剂，等等。
本发明提供了一种下调GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路的方法，包括对GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路中GGPS1或RAB7A基因进行靶向性地突变、基因编辑或基因重组，从而实现下调。作为一种更为具体的实施例方式，藉由上述任一的方法，可使GGPS1或RAB7A转变为其功能丧失的截短体或突变体。作为一种更为具体的可实施方式，采用CRISPR/Cas系统进行基因编辑，从而敲除或下调靶基因。合适的sgRNA靶位点，会带来更高的基因编辑效率，所以在着手进行基因编辑前，可以设计并找到合适的靶位点。在设计特异性靶位点后，还需要进行体外细胞活性筛选，以获得有效的靶位点用于后续实验。
作为本发明的另一种实施方式，提供了一种下调GGPS1或RAB7A的表达的方法，包括：将干扰GGPS1或RAB7A基因表达的干扰分子转入细胞，或通过合适的途径处理细胞、使之被引入到细胞内，例如设计穿膜功能域使之具有穿膜的能力。
当用于作为人工调控的靶标时或人为建立筛选系统时，以上的蛋白或编码基因可以是天然存在的，比如其可被纯化和分离自哺乳动物；也可以是重组制备的，比如可以根据常规的基因重组技术来生产重组的蛋白。此外，任何不影响这些蛋白的生物活性的变化形式都是可用的，如它们的功能未发生改变的衍生物或变异体。
基于GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路的药物筛选
基于本发明人的新发现，对GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路的研究有着多方面的用途，所述的用途包括：筛选调节该信号通路的物质，以期用于抑制小细胞肺癌。其中，所述的调节包括：下调GGPS1的表达或活性，下调RAB7A的膜定位，下调GGPS1代谢产物GGPP对RAB7A的修饰作用，或促进自噬流障碍等。
本发明提供了一种筛选调节GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路的调节剂方法，通过向含有GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路的体系中添加待筛选的候选物，并观察GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路中各蛋白或基因的变化或相互作用来进行筛选。若候选物质下调GGPS1的表达或活性，下调RAB7A的膜定位，下调GGPS1代谢产物GGPP对RAB7A的修饰作用，或促进自噬流障碍，则该候选物质是对于抑制小细胞肺癌有用的物质。
如本文所用，所述的“抑制”、“提高”、“促进”均是指具有统计学意义的“抑制”、“提高”、“促进”。也即：显著地“抑制”、“提高”、“促进”。如与对照组的蛋白活性、蛋白表达、蛋白结合或甲基化程度相比，显著“抑制”、“提高”、“促进”10％，20％，30％，40％，50％以上；更佳的60％，70％，80％以上。
所述的含有GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路的体系选自：细胞体系(或细胞培养物体系)、亚细胞体系(或亚细胞培养物体系)、溶液体系、动物体系或组织体系(或组织培养物体系)。
作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于抑制小细胞肺癌有用的物质。
当进行筛选时，可以采用本领域熟知的各种技术来确定蛋白或其编码基因的变化情况以及相互作用情况。
可以采用多种常规的技术来鉴定系统中基因的转录或表达情况。这些技术包括但不限于：寡核苷酸杂交技术(如探针)，多聚酶链反应(PCR)，聚丙烯酰胺凝胶电泳等。检测蛋白与蛋白之间相互作用以及相互作用的强弱可采用多种本领域技术人员熟知的技术，比如免疫共沉淀技术、GST沉降技术、噬菌体展示技术或酵母双杂交系统。蛋白的核定位也是本领域熟知的技术。
通过上述方法初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于抑制小细胞肺癌真正有用的物质。
本发明还提供了采用所述筛选方法获得的可用于抑制小细胞肺癌的潜在物质。
本发明还提供了一种制备抑制小细胞肺癌(特别是抑制小细胞肺癌)的药物的方法，所述方法包括：合成和/或纯化前述筛选获得的对于抑制小细胞肺癌有用的物质，作为用于抑制小细胞肺癌的药物。
可将获得的对于抑制小细胞肺癌有用的物质用于制备药物组合物，如本发明的下文中所述。
以蛋白或基因或其上特定的区域作为靶点，来筛选作用于该靶点的物质的方法是本领域人员所熟知的，这些方法均可用于本发明。所述的候选物质可以选自：肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗体或抗体片段、配体、有机小分子、无机小分子和核酸序列等。根据待筛选的物质的种类，本领域人员清楚如何选择适用的筛选方法。
联合用药
本发明人发现，他汀类药物、依托泊苷和顺铂的联合用药，能够极其显著地增强小细胞肺癌的抑制效果。他汀类药物与依托泊苷和顺铂的协同作用藉由以下作用方式：他汀类药物抑制MVA代谢途径中GGPP的产生，干扰GGPP对小G蛋白RAB7A进行香叶基香叶基化修饰，使后者无法上膜发挥正常功能，进而抑制了自噬体与溶酶体的融合，引发自噬流障碍，最终导致化疗耐药细胞死亡。本发明中，下调GGPS1，可以进一步地减少GGPP对小G蛋白RAB7A进行香叶基香叶基化修饰，也可直接下调RAB7A，进而抑制自噬体与溶酶体的融合，引发自噬流障碍。
基于本发明人的新发现，本发明提供了一种抑制小细胞肺癌的药物组合物，包括药物组合：他汀类药物、依托泊苷和顺铂。
如本发明所述，所述的“抑制小细胞肺癌”包括了“降低(逆转)小细胞肺癌的耐药性”。优选地，所述的小细胞肺癌为耐药性的小细胞肺癌。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的如本文所用。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明也提供了一种用于抑制肿瘤或降低肿瘤耐药性的药盒，所述的药盒中包括：他汀类药物、依托泊苷和顺铂。更优选地，所述药盒中还包括：使用说明书，以指导临床医师以正确合理的方式用药。
为了方便给药，所述的他汀类药物、依托泊苷和顺铂被混合，制成单元剂型的形式，置于试剂盒中。“单元剂型”是指为了服用方便，将药物制备成单次服用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。此外，所述的他汀类药物、依托泊苷和顺铂也可被独立地分置于不同的容器中，在需要时进行混合，应用。
作为本发明的优选方式，所述的他汀类药物、依托泊苷和顺铂的用量比例为(5～15)：(1～3)：1；较佳地为(7～10)：(1.5～2.5)：1(如8.6：1.7：1)。
作为本发明的优选方式，所述顺铂、依托泊苷和所述他汀类药物的用药方法为：按1周1个疗程计算，根据个体体重，通过腹腔注射方式第1天给予0.5～10毫克/千克(如0.8～6毫克/千克，更具体如1、2、3、4、5毫克/千克)顺铂(CDDP)；第1～3天给予0.5～15毫克/千克/天(如1～12毫克/千克/天，更具体如2、4、6、8、10毫克/千克/天)依托泊苷(VP16)；同时通过灌胃方式给予2～100毫克/千克/天(如5～60毫克/千克/天，更具体如6、8、10、15、20、30、40、50毫克/千克/天)的美伐他汀或辛伐他汀或匹伐他汀等药物处理。
在本发明的具体实施例中，所述的个体为小鼠，按1周1个疗程计算，根据小鼠体重按照10毫克/千克/天第1，2，3天给予依托泊苷(VP16)，按6毫克/千克/天在第1天给予顺铂(CDDP)，通过腹腔注射的方式给予药物处理。他汀类药物根据小鼠体重按照50毫克/千克/天通过灌胃给予美伐他汀，辛伐他汀，匹伐他汀等药物处理。
尽管本发明的具体实施例中，给出了针对动物如小鼠的给药方案。但应理解，从动物如鼠的给药剂量换算为适用于人类的给药剂量是本领域技术人员易于作出的，例如可根据Meeh-Rubner公式来进行计算：Meeh-Rubner公式：A＝k×(W2/3)/10,000。式中A为体表面积，以m2计算；W为体重，以g计算；K为常数，随动物种类而不同，一般而言，小鼠和大鼠9.1，豚鼠9.8，兔10.1，猫9.9，狗11.2，猴11.8，人10.6。应理解，根据药物以及临床情形的不同，根据有经验的药师的评估，给药剂量的换算是可以变化的。
肿瘤诊断或预后评估的应用
本发明摁发现，高表达GGPS1的化疗耐药PDX小鼠模型对他汀类药物非常敏感，而他汀与化疗联用可以达到更好的效果。临床数据分析揭示，高表达GGPS1的小细胞肺癌患者预后往往更差。因此，GGPS1可作为指导耐药患者给予Statin治疗的潜在分子标志物。
本发明人也利用TCGA的数据分析临床样本中GGPS1表达和患者预后的关系，发现高表达GGPS1患者的预后更差。
基于本发明人的上述新发现，可以将GGPS1作为小细胞肺癌的诊断或预后的标志物，尤其适用于作为化疗后阶段的预后评估的标志物：(i)进行癌症化疗后阶段的疾病分型、鉴别诊断、和/或无病生存率分析；(ii)评估相关人群的肿瘤治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法。比如，可分离出GGPS1基因表达异常的人群，从而可进行更有针对性地治疗。
可以通过判断待评估样本中GGPS1的表达情况或活性情况，来预测提供该待评估样本的受试者的疾病预后情况，选择合适的药物实施治疗。通常，可以规定一个GGPS1的阈值，当GGPS1的表达情况高于所规定的阈值时，考虑采用抑制GGPS1的方案进行治疗。所述的阈值对于本领域技术人员而言是易于确定的，例如可以通过将小细胞肺癌患者的一般GGPS1的表达情况或正常健康人的表达情况进行比较和分析后，获得GGPS1表达异常的阈值。
因此，本发明提供了GGPS1基因或蛋白的用途，用于制备小细胞肺癌预后评估的试剂或试剂盒。可采用各种本领域已知的技术来检测GGPS1基因或蛋白的存在与否以及表达情况，这些技术均包含在本发明中。例如可用已有的技术如Southern印迹法、Western印迹法、DNA序列分析、PCR等，这些方法可结合使用。本发明还提供了用于在分析物中检测GGPS1基因或蛋白的存在与否以及表达情况的试剂。优选的，当进行基因水平的检测时，可以采用特异性扩增GGPS1的引物；或特异性识别GGPS1的探针来确定GGPS1基因的存在与否；当进行蛋白水平的检测时，可以采用特异性结合GGPS1蛋白的抗体或配体来确定GGPS1蛋白的表达情况。
所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或核酸序列分析软件等。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
1.材料和试剂
DH5α感受态(E.coli)；质粒小提试剂盒(Generay)；质粒中提试剂盒(TIANGEN)；DMEM基础培养基(货号：SH30243.01B)和RPMI 1640基础培养基(货号：SH30809.01B)，均购自HyClone公司；胎牛血清(FBS)：货号：S0615，500ml/瓶，购自德国Biochrom AG公司，40ml/管分装后-20℃保存；青霉素、链霉素储存液：货号：15140122，100ml/瓶，购自Invitrogen公司；RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(购自美国Fermentas公司，货号K1622)，SYBR Green Realtime PCR Master Mix(购自美国TOYOBO公司，货号TY-QPK-201)。BABL/C裸鼠，购自上海必凯公司(BK)。SCID小鼠，购自中科院斯莱克实验动物中心(SLAC)。
2.质粒
pLKO.1-U6-puro购自Addgene。先将载体用AgeI/EcoRI双酶切，将针对目的基因中5′-UTR，CDS或3′-UTR序列中的21个碱基序列加上XhoI酶切位点再加上其反向互补序列插入到该载体中。慢病毒包装质粒：PSPA和PMD2.G。逆转录病毒包装质粒：pCL10A。pBabe-mCherry-GFP-Puro质粒由美国纪念斯隆凯特琳癌症中心提供。pLKO.1-U6-Tet-on-puro购自Addgene，可以条件性地敲低。使用试剂盒完成质粒的小提中量(TIANGEN，DP107)和质粒的大量制备(TIANGEN，DP117)。
用于敲低GGPS1的shRNA序列为CCTGAGCTAGTAGCCTTAGTA：
引物序列为shhGGPS1-CDS1-F：
5’-ccggcctgagctagtagccttagtactcgagtactaaggctactagctcaggtttttg-3’(SEQID NO:1)；
shhGGPS1-CDS1-R：
5’-aattcaaaaacctgagctagtagccttagtactcgagtactaaggctactagctcagg-3’(SEQID NO:2)。
用于敲低RAB7A的shRNA序列为：ggctagtcacaatgcagatat(SEQ ID NO:3)；
引物序列为shhRAB7A-CDS1-F：
5’-ccggggctagtcacaatgcagatatctcgagatatctgcattgtgactagcctttttg-3’(SEQID NO:4)；
shhRAB7A-CDS1-R：
5’-aattcaaaaaggctagtcacaatgcagatatctcgagatatctgcattgtgactagcc-3’(SEQID NO:5)。
3.细胞
小细胞肺癌细胞株H146，H196，DMS114细胞，购自ATCC，培养条件RPMI medium(Hyclone)+8％FBS+1×P/S。小细胞肺癌细胞株H82，H209细胞，由天津医科大学提供，培养条件RPMI medium(Hyclone)+8％FBS+1×P/S。小细胞肺癌细胞株H446，H526细胞，由上海交通大学提供，培养条件RPMI(Hyclone)配基+8％FBS+1×P/S。
悬浮细胞取出细胞于倒置显微镜下观察密度，吸取培养基，800rpm 3min离心后，去上清，1×PBS洗一篇，800rpm 3min离心后，去上清后加入新鲜配基重悬，用1mL移液器将细胞吹散至单细胞后，按照一定比例(一般1：3或1：4)传入新的培养皿中。用十字形摇匀细胞后置于37℃培养箱。
贴壁细胞取出细胞于倒置显微镜下观察密度，一般地，密度大于70％适于传代。传代时，先吸去培养液，加入2mL 1×PBS(10cm Dish)洗两遍，再以1ml/25cm2面积的量加入胰酶消化液，上下左右摇匀使其均匀覆盖细胞，放入37℃培箱消化，间隙取出在显微镜下观察细胞变圆即可加入适量的培养基终止消化，用1mL移液器将细胞吹散至单细胞后，按照一定比例(一般1：3或1：4)传入新的培养皿中。用十字形摇匀细胞后置于37℃培养箱。
4.稳转细胞株的建立
将目的基因通过磷酸钙法制备成携带外源目的基因的retrovirus(逆转录病毒)或lentivirus(慢病毒)。得到病毒后，用Retrovirus或Lentivirus病毒上清液感染目的细胞，以2.5x 105/6cm培养皿的密度传代待感染细胞，24小时后，于4℃冰箱取出已过滤的病毒上清液，加入适量体积的4mg/ml polybrane液体(1：1000稀释，终浓度4μg/ml)，混匀，吸取适量病毒液至待感染细胞的培养基中，37℃培养箱培养。24小时后更换新鲜病毒液，继续感染细胞。感染结束后24～48小时，对于携带表达抗生素基因的病毒，加入相应的抗生素进行阳性克隆的筛选(Puromycin或G418，不同的细胞用不同的浓度进行筛选)，筛选5-7天；对于携带表达荧光标记基因的病毒，则用相应的荧光标记进行筛选(copGFP或DsRed2)。收集病毒感染且筛选过的细胞的总RNA和总蛋白，分别进行real-time RT-PCR和western blot检测这些细胞中目的基因转录和翻译水平的表达情况，以鉴定过表达外源基因或者shRNA沉默内源基因的稳定细胞株的建立。
据此通过转染相关质粒构建H82R pBabe-mCherry-GFP-LC3稳转细胞株，H446pBabe-mCherry-GFP-LC3稳转细胞株，H82R pLko.1-Tet-shGGPS1稳转细胞株，pLko.1-Tet-shRAB7A稳转细胞株。
5.抗体
所用抗体如表1。
表1
Figure BDA0002753244310000191
Figure BDA0002753244310000201
6.动物实验
本发明人根据影像学，判断为小细胞肺癌特征后，利用穿刺的组织建立人源来源的小细胞肺癌肿瘤模型(PDX)，如果肿瘤在小鼠接种后成功长起来，并可以连续传代，可认为该PDX建立成功。成功建立20个SCLC PDX模型。动物实验流程：提前1周订购3-4周龄的裸鼠，使其在动物房适应1周。将需要接种的细胞扩增到大致的量(一般为5个10cm)，消化成单细胞后计数。按照每只裸鼠1×106的细胞(细胞量根据不同的细胞种类决定)，每组6只小鼠的量取对应体积的细胞悬液在新的离心管后离心，每只小鼠对应100μL的量用灭菌1×PBS重悬。用1mL的注射器将细胞悬液通过皮下注射到裸鼠的背部两侧或者前肢的腋下。如果是组织的话，接种组织块大小约3x3 mm至小鼠背部皮下。1周之后观察是否长出肿瘤，随后开始每2天用游标卡尺记录肿瘤的大小(肿瘤体积＝长×宽×宽/2)。直到肿瘤体积达到2000mm3或小鼠死亡结束记录，取下并称取小鼠皮下肿瘤重量，固定过夜后进行石蜡包埋、切片和H&E染色。
7.免疫组化
采用免疫组织化学LSAB法(Labelled StreptAvidin-Biotin，抗生物素蛋白链菌素-生物素标记法)检测组织标本中目的蛋白的表达情况。
8.蛋白的收集和检测
样品的准备：将贴壁培养的细胞株弃去培养液(悬浮细胞离心去上清)，PBS漂洗两次，尽量吸尽残留的PBS液，每瓶加100-200μl 1×SDS蛋白裂解液，用细胞刮匙轻轻把细胞刮下，收集到1.5ml的EP管中，待裂解充分后，用1ml注射器将粘稠物上下吹打，至裂解液变成悬滴状为止，置-20℃冰箱保存备用；BCA(标准曲线)蛋白定量。Western Blot检测目的蛋白。细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取，使用碧云天(P0033)试剂盒抽提。
9.药物处理
E/P药物：在建立化疗耐药模型时，等肿瘤到给药体积，给予小鼠E/P药物处理，按照1周1个疗程计算，根据小鼠体重按照10毫克/千克/天第1，2，3天给予依托泊苷(VP16)，按6毫克/千克/天在第1天给予顺铂(CDDP)，配好药用生理盐水稀释，最终注射体积为0.2mL/只小鼠，腹腔注射。依托泊苷购买自sigma公司，货号E1383。顺铂购买自sigma公司，货号P4394。用DMSO(二甲基亚枫)配制成贮备浓度。依托泊苷为30mg/ml，顺铂为1.5mg/ml。
Statin药物：等肿瘤到给药体积，给予小鼠Statin药物处理，每天给药，根据小鼠体重按照50毫克/千克/天通过灌胃给予美伐他汀，辛伐他汀，匹伐他汀等药物处理。配好药用生理盐水稀释，最终注射体积为0.2mL/只小鼠。美伐他汀购买自MCE公司，货号HY-17408。辛伐他汀购买自MCE公司，货号HY-17502，匹伐他汀购买自MCE公司，货号HY-B0165A。
药库筛选实验：待处理细胞按照2500细胞每孔铺装96孔板，每孔体积100微升。24小时后，将待处理药物按照2X浓度配制好。按每孔100微升的体积将药物加入96孔板，终体积200微升。所用药库信息为MCE公司FDA认证的代谢类小分子抑制剂，货号HYCPK4390，HYCPK4391，HYCPK4392，HYCPK4393。72小时后，加入CTG试剂检测。根据读值分析药库筛选数据。
10.激光共聚焦显微镜检测自噬流
根据之前提到的质粒建立稳转细胞系H82R pBabe-mCherry-GFP-LC3，H446pBabe-mCherry-GFP-LC3和DMS114 pBabe-mCherry-GFP-LC3，将细胞铺在12孔板中，提前已加入盖玻片。24h后:A.药物实验:分别加入DMSO对照组，5μm美伐他汀(MevaStatin)处理组，5μmMevaStatin和2μm GGPP处理组B.基因敲低实验：慢病毒感染细胞敲低RAB7A和GGPS1。3天处理后，细胞收集在显微镜下检测。在莱卡公司SP8 WLL显微镜下63倍检测。实验原理是基于不同pH值稳定的绿色和红色荧光蛋白强弱显示。绿色荧光蛋白的荧光信号会在在溶酶体酸性条件下淬火(pH值低于5)，而mRFP荧光信号在酸性条件下没有显著变化。绿色和红色合在一起的图像，自噬溶酶体显示为黄色点状物(即RFP阳性和GFP阳性)，而自噬小体显示红色点状物(即RFP阳性和GFP阴性)。自噬流流畅时，自噬溶酶体正常形成，为黄色点状物，而自噬流障碍时，自噬小体正常形成，但不能与溶酶体结合，形成自噬溶酶体，所以为红色点状物。
实施例1、小细胞肺癌小鼠模型的化疗给药流程
为了尽可能知道小细胞肺癌化疗耐药过程中的细胞变化，本发明人用四株化疗敏感细胞系(H82、H209、H526和H146)和两株化疗耐药细胞系(H446和DMS114)，按照1×106/只的细胞数目皮下注射到裸鼠背侧，等肿瘤体积长至约100-200mm3，分成两组：对照组给予生理盐水处理(图1A)；给药组按照标准流程(SOP)给予依托泊苷和顺铂(E/P)化疗药物处理(图1B)。若化疗药物处理后，肿瘤明显消退，本发明人会暂停给药，等肿瘤重新恢复生长后，再继续给予化疗药物处理；重复此过程，直至化疗药物无法有效抑制肿瘤生长，最终建立化疗耐药的小细胞肺癌模型(图1A)。在此过程，若小鼠状态很差或者肿瘤体积超过2000mm3，本发明人会将肿瘤接种至另一只小鼠，重复给药过程直至得到耐药肿瘤。
实施例2、小细胞肺癌化疗耐药肿瘤模型的建立
如图所示(图2A)，通过连续的药物处理，相对于P1代肿瘤对E/P化疗药物的敏感，H82、H209、H526和H146在后续传代中逐渐呈现出对化疗药物的耐受。H82在传至P4代，H209在传至P5代，H526在传至P4代，H146在传至P3代时，化疗药物已经无法抑制药物处理组的肿瘤生长，由此认为已成功获取小细胞肺癌化疗耐药肿瘤(图2A)。
生存分析的结果显示，在给予化疗药物处理的情况下，接种H82、H209和H526肿瘤的小鼠生存期长，而接种耐药肿瘤的小鼠生存期短(图2B，C)。IHC检测显示敏感肿瘤在给药处理的情况下，凋亡发生标志物CC3和DNA损伤标志物H2AX表达上升，细胞凋亡和DNA损伤增加。而化疗耐药肿瘤在给予药物处理情况下，CC3和H2AX没有变化，没有诱导细胞凋亡和引起DNA损伤(图2D)。这提示化疗耐药肿瘤已经对化疗药物不响应，小细胞肺癌化疗耐药模型建立成功。
本发明人也在裸鼠上接种小细胞肺癌化疗耐药细胞系H446和DMS114，发现肿瘤初始就对化疗药物不响应(图2E)。生存分析显示，在给予化疗药物处理的情况下，接种H446和DMS114肿瘤的小鼠生存期短(图2F，G)。
实施例3、利用小细胞肺癌化疗耐药小鼠模型建立原代细胞株
为了深入开展小细胞肺癌耐药研究，本发明人将耐药肿瘤进行原代培养，成功地构建原代小细胞肺癌化疗耐药细胞株H82R，H209R和H526R。本发明人发现，相对于H82细胞，H82R细胞呈现出对化疗药物的高度耐受(图3A，B)；而H209R和H526R细胞并没有呈现出比H209和H526细胞更显著的化疗耐受(图3C，D)。说明化疗耐药机制可能和肿瘤微环境相关，而化疗耐药细胞H82R在体内和体外都对化疗药物处理高度耐受，更加适合后续在细胞上进行药物筛选和机制研究。
对其它小细胞肺癌化疗耐药细胞系H446、DMS114和H196的药物响应检测，显示它们对化疗药物处理都是高度耐受(图3E)。这说明小细胞肺癌化疗耐药细胞系H446和DMS114在体内和体外都保持对化疗药物的高度耐受(图3E)。
实施例4、利用代谢类药物库进行功能学筛选
以上的结果说明，H82和H82R适合作为配对的细胞系进行药库筛选，为了更快和安全地应用于临床，本发明人选取FDA认证的256个代谢相关的药物抑制剂，实验流程按照图中所示(图4A)。对这些药物分类，在人类疾病治疗方面，这些小分子抑制剂可以归类为代谢类疾病(22％)，肿瘤的治疗(15.2％)，心血管疾病(14.8％)，炎症/免疫的治疗(13.7％)，神经类疾病(12.3％)，感染(9.4％)，内分泌类疾病(3.2％)和一些其他疾病(9.4％)(图4B)。对于小分子抑制剂涉及到代谢分类，可以分为脂质类代谢，氨基酸/蛋白质类代谢，葡萄糖代谢，核酸代谢，辅酶/维生素代谢以及其他类代谢(图4C)。
实施例5、Statin抑制化疗耐药H82R细胞生长
药库筛选的结果显示，相对于H82，H82R不仅对E/P化疗药物耐药，对很多其它药物都有一定耐药性(蓝点所示)(图5A)，但对他汀(Statin)类药物(包括AtorvStatin、PitvaStatin、LovaStatin、MevaStatin、SimvaStatin和FluaStatin)则非常敏感(图5A)。为了确定Statin是否对H82R细胞有很强的抑制效应，本发明人检测了H82和H82R细胞在不同药物浓度下对六种Statin的效应(图5B，C)，结果显示这些Statin类药物都能剂量依赖性抑制H82R细胞生长。在持续给药处理下，相对于H82细胞，H82R对单独E/P处理耐药，细胞生长不受影响。但对Statin处理和Statin加E/P的联合处理敏感，细胞生长受到显著抑制(图5D)。这提示Statin可以抑制化疗耐药H82R细胞生长。
实施例6、Statin抑制多株小细胞肺癌化疗耐药细胞的生长
为确定Statin对于其它小细胞肺癌化疗耐药细胞株是否具有同样的抑制效果，本发明人对敏感细胞株(H209、H526、H146)和耐药细胞株(DMS114、H446、H196)分别给予E/P处理，MevaStatin处理和E/P加上MevaStatin联合处理(图6A)。
结果显示，相对于敏感细胞株，化疗耐药细胞株对Statin和E/P加上MevaStatin联合处理非常敏感，细胞生长受到显著抑制(图6B)，而对E/P处理耐药，细胞生长不受影响(图6B)。这些结果表明，Statin可以抑制多株化疗耐药细胞生长。
实施例7、Statin抑制H82R移植瘤生长
为了确定Statin是否在体内抑制H82R细胞生长，本发明人使用H82R细胞皮下成瘤，然后分成4组：对照组，E/P处理组，MevaStatin处理组，E/P和MevaStatin联合处理组。结果显示，H82R肿瘤对E/P处理耐药，而MevaStatin处理和E/P加MevaStatin联合处理可以有效抑制H82R肿瘤的生长(图7A，B)。同时这些药物处理不会影响小鼠的体重(图7A)。IHC组化结果显示，MevaStatin处理组和E/P加MevaStatin联合处理组中的肿瘤CC3和H2AX会显著上升，提示药物处理引起细胞凋亡和DNA损伤增加。而肿瘤CC3和H2AX在E/P处理组没有明显变化，说明H82R肿瘤已经对E/P处理耐受(图7C，D)。在给予其它Statin(PitvaStatin和SimvaStatin)处理以及这些Statin加E/P联合处理下，H82R肿瘤生长同样会受到显著的抑制，这些药物处理不会影响小鼠体重(图7E)。这说明Statin类药物不仅在体外抑制化疗耐药细胞H82R的生长，在体内也能有效抑制化疗耐药肿瘤H82R的生长。
实施例8、GGPP逆转Statin对H82R细胞的抑制效应
小分子药物抑制性经常不够特异，为了明确具体哪个MVA途径下游代谢物对耐药细胞有着重要功能和作用。本发明人在给予Statin处理的情况下，同时回补MVA途径的下游代谢物。结果显示，除了MVA可以逆转Statin对H82R细胞的抑制效应，GGPP和GGOH也可以逆转Statin对H82R细胞的抑制效应。其中GGOH在细胞内不存在，但拥有和GGPP一样的基团，发挥蛋白香叶基香叶基化作用(图8A)。
为了进一步确定其它代谢物是否可以逆转Statin对H82R细胞的抑制效应，在给予Statin处理的情况下，同时回补不同浓度的MVA途径的下游代谢物。结果显示，只有MVA、GGPP和GGOH可以逆转Statin对H82R细胞的抑制效应(图8B)。这提示GGPP是H82R细胞生长所必需的代谢物质。
实施例9、Statin抑制H82R细胞内GGPP产生进而影响RAB7A的膜定位
MVA下游产物GGPP可以逆转Statin对耐药细胞的抑制效应，后续本发明人想研究GGPP发挥该作用的机制。GGPP主要通过蛋白翻译后的香叶基香叶基化修饰小G蛋白(SmallGTP-ase)，使其结合于膜上，进一步被GTP酶磷酸化发挥功能。为了明确哪些小G蛋白被GGPP修饰从而在耐药细胞发挥功能，本发明人构建shRNA文库对H82R细胞进行目的基因敲低，该文库选取细胞中重要的小G蛋白(RHOA、RHOB、RAP1A、RAP1B、CDC42)，以及MVA通路中关键的代谢酶基因。同时根据RNA-seq结果(图9A)，选取在耐药细胞中有表达的RAB基因。结果显示敲低GGPS1和RAB7A是抑制化疗耐药细胞增殖最明显的两个基因(图9B)。而相对于H82R细胞，在H82细胞中敲低这两个基因则没有那么显著的生长抑制(图9C)。
为了确定GGPP是通过香叶基香叶基化修饰RAB7A影响其在细胞膜上的定位，本发明人用细胞膜质分离实验来检测RAB7A在细胞膜上和细胞质里的表达情况。结果显示在正常情况下，RAB7A主要定位在H82R细胞膜上，少量表达于细胞质里。而在给予Statin处理后，会影响RAB7A的细胞膜膜定位，导致RAB7A主要堆积在细胞质里(图9D)。如果回补GGPP则可以回复RAB7A的细胞膜定位(图9D)。这些实验证明GGPP通过香叶基香叶基化修饰RAB7A使其结合于细胞膜上继而发挥功能。
实施例10、敲低GGPS1或RAB7A引发化疗耐药细胞的自噬障碍
自噬溶酶体可以在细胞内清除损伤的蛋白和细胞器等，为细胞提供物质和能量。在整个过程中，细胞将待降解物吞噬到自噬小体，直到最后自噬溶酶体形成并降解物质的过程称为自噬流(Autophagic flux)。已有研究表明，自噬小体和溶酶体的结合需要RAB7A帮助形成自噬溶酶体。若抑制RAB7A功能会影响自噬溶酶体的形成，引起细胞自噬流障碍。为了确定H82R细胞中自噬流的状况，本发明人拟检测P62和LC3B的蛋白表达水平。其中LC3B指示细胞内自噬小体的形成。P62具有底物的特异性，它连接LC3B与待降解的泛素化蛋白进入到自噬小体后，再与溶酶体融合形成自噬溶酶体从而被降解，可以用来指示自噬流是否正常。自噬流正常的话，自噬小体增加，P62被降解，其表达降低。如果自噬溶酶体的形成受影响，引起自噬流障碍，会出现LC3B上升，而P62无法被降解，其表达水平不变。结果显示，Statin处理后，相对于H82细胞，LC3B在H82R中显著升高，但P62没有变化。这提示，Statin会引起细胞自噬流障碍。而回补GGPP则会回复LC3B和P62的蛋白表达水平。这提示GGPP会逆转Statin引起的细胞自噬流障碍(图10A)。同时本发明人发现Statin处理后，细胞内PARP和CC3显著升高，细胞凋亡增多。而回补GGPP可以阻断细胞凋亡的发生(图10B)。
在其他小细胞肺癌细胞中给予Statin处理后，相对于化疗敏感细胞株(H209、H526)，化疗耐药细胞株(H446、DMS114)中LC3B显著上升，P62没有明显变化。这提示Statin会影响耐药细胞株中自噬溶酶体的形成，引起自噬流障碍(图10C)。
为了确定RAB7A是影响自噬溶酶体形成的关键。本发明人在H82R中敲低GGPS1或RAB7A，之后检测P62和LC3B的表达。结果显示敲低GGPS1或RAB7A，细胞内LC3B显著上升，P62没有明显变化。这提示GGPS1和RAB7A是保障化疗耐药细胞自噬流顺畅的关键蛋白(图10D)。同样本发明人发现敲低GGPS1或RAB7A会诱导细胞凋亡发生(图10E)。HMGCR作为MVA途径的起始基因，细胞内敲低HMGCR，也会引起LC3B和CC3显著上升(图10F)。
在化疗耐药细胞株H446中敲低GGPS1或RAB7A会抑制细胞增殖。同时细胞内LC3B会显著上升，而P62没有明显变化(图10G，H)。
在体内H82R肿瘤上，给予Statin处理或Statin加E/P处理，同样会引起LC3B显著上升，而P62没有明显变化(图10I)。这些结果提示，Statin通过抑制GGPP-RAB7A-Autophagic途径引发化疗耐药细胞的自噬流障碍。
实施例11、双荧光系统示踪化疗耐药细胞的自噬流
为了直接观察抑制GGPP的产生会引起化疗耐药细胞的自噬流障碍，本发明人用荧光标记示踪的方法检测自噬的发生过程。在建立H82R pBabe-mCherry-GFP-LC3和H446pBabe-mCherry-GFP-LC3稳转细胞株后，本发明人给予细胞Statin处理，进一步通过免疫荧光来观察细胞内的自噬流状况。结果显示在对照组细胞中，指示自噬流正常的RFP+GFP-puncta处于较高水平，指示自噬流障碍的RFP+GFP+puncta处于低水平。而在Statin处理组中，RFP+GFP-puncta变低，指示自噬流障碍的RFP+GFP+puncta显著上升。这时回补GGPP可以使RFP+GFP-puncta变高，RFP+GFP+puncta降低，细胞自噬流回复正常。这提示Statin处理会引起化疗耐药细胞的自噬流障碍，而补充GGPP可以使细胞自噬流回复正常(图11A，B)。
在H446细胞敲低GGPS1或RAB7A，同样发现RFP+GFP-puncta变低，而指示细胞自噬流障碍的RFP+GFP+puncta上升(图11C)。
这些结果表明，Statin会抑制MVA途径的GGPP产生，使RAB7A无法结合到细胞膜上，阻碍自噬溶酶体形成，引起自噬流障碍，诱导细胞凋亡，而外源补充GGPP则可以回复细胞生长。
实施例12、敲低GGPS1或RAB7A抑制化疗耐药肿瘤生长
为了确定敲低GGPS1或RAB7A会抑制小细胞肺癌化疗耐药细胞移植瘤生长。在建立H82R pLko.1-Tet-shGGPS1和pLko.1-Tet-shRAB7A稳转细胞后，将细胞在裸鼠皮下成瘤，分成对照组处理和实验组处理：其中对照组小鼠喂正常的水；实验组小鼠喂含有Dox(Doxycycline)的水。结果显示在细胞敲低GGPS1的情况下，肿瘤生长受到显著抑制(图12A)，甚至有40％比例的肿瘤完全被抑制，没有生长(图12A)。Western Blot(WB)结果显示肿瘤敲低GGPS1后，LC3B显著上升，而P62没有明显变化，提示在体内肿瘤敲低GGPS1会引起自噬流障碍(图12B)。IHC结果显示肿瘤在敲低GGPS1后，CC3和H2AX水平显著上升，肿瘤中凋亡发生和DNA损伤显著增加(图12C)。
同样在细胞敲低RAB7A的情况下，肿瘤生长受到抑制(图12D)。WB结果显示显示肿瘤敲低RAB7A后，LC3B显著上升，而P62没有明显变化，提示在体内肿瘤敲低RAB7A会引起自噬流障碍(图12E)。免疫组化结果显示肿瘤在敲低RAB7A后，CC3和H2AX水平显著上升，肿瘤中凋亡发生和DNA损伤显著增加(图12F)。同时本发明人注意到敲低GGPS1比敲低RAB7A对于肿瘤的抑制效果更为明显，提示这是因为GGPS1对于细胞的功能非常重要，受影响的小G蛋白众多，而不仅仅是RAB7A。
实施例13、Statin抑制高表达GGPS1的小细胞肺癌化疗耐药PDX肿瘤生长
为了确定Statin对于小细胞肺癌PDX肿瘤的治疗效果，本发明人建立了小细胞肺癌化疗耐药PDX肿瘤小鼠模型(图13A)。在建立的SCLC PDX ZS7和ZS4(ZS7和ZS4指模型代号)中，本发明人发现接种的肿瘤初始对于E/P处理敏感，后续在体内连续给予化疗药物处理下，肿瘤逐渐耐药，直至获得小细胞肺癌化疗耐药肿瘤PDX ZS7R和ZS4R(图13A，B)(ZS7R和ZS4R指耐药模型代号)。肿瘤的生长曲线和生存分析显示相对于PDX肿瘤ZS7和ZS4，ZS7R和ZS4R已经对E/P化疗药物处理耐受(图13A，B)。
通过WB检测ZS7、ZS7R和ZS4、ZS4R中MVA相关基因的表达，结果显示相对于敏感肿瘤，ZS7R中MVA途径的FDPS和GGPS1高表达，而FDFT1和SQLE低表达。ZS4R中MVA途径的FDPS和GGPS1低表达，而FDFT1和SQLE高表达，说明MVA途径在ZS7A(化疗药物敏感模型代号)更多的合成GGPP，而ZS4R更多的合成胆固醇(图13C)。这提示相对于ZS4R，ZS7R更适合给予Statin治疗。体内的结果证明Statin和Statin加E/P联合处理组显著抑制ZS7R肿瘤的生长，而对ZS4R肿瘤没有抑制效应。ZS7R和ZS4R肿瘤都对E/P处理耐药(图13D)。其中也可见，Statin加E/P联合处理组的效果显著优于Statin单处理或E/P单处理组。
这说明小细胞肺癌化疗耐药过程中，若肿瘤GGPS1水平升高可以用来指示使用Statin靶向治疗。
实施例14、Statin抑制临床上高表达GGPS1的小细胞肺癌化疗耐药PDX肿瘤生长
为了确定Statin可以用于临床治疗。本发明人与医院合作，获取对化疗药物响应不同的病人肿瘤组织，并将其建成小细胞肺癌PDX模型。目前临床上根据病人对药物的响应可以分为四种情况：
PD：疾病进展(progressive disease)，靶病灶最大径之和至少增加≥20％，或出现新病灶。SD：疾病稳定(stable disease)，靶病灶最大径之和缩小未达PR，或增大未达PD。PR：部分缓解(partial response)，靶病灶最大径之和减少≥30％。CR:完全缓解(completeresponse)，靶病灶完全消失。
IHC和WB结果显示在10个小细胞肺癌PDX中，处于SD和PD阶段的小细胞肺癌病人GGPS1高表达(图14A，B)，其中在处于PD的小细胞肺癌病人中，GGPS1表达最高(图14A，B，C)。为了确定Statin对于处于PD阶段的小细胞肺癌病人有好的疗效，本发明人接种处于PD阶段的小细胞肺癌PDX肿瘤SP9(肿瘤模型代号)，并分组给予不同药物处理。结果显示Statin和Statin加E/P处理显著抑制SP9的肿瘤生长。E/P处理也部分抑制肿瘤的生长，提示是肿瘤组织取材时，该病人尚未给予化疗药物治疗，存在一部分细胞处于不耐药的状态，所以联合处理会显著抑制肿瘤的生长(图14D，E)。免疫组化结果显示，肿瘤CC3和H2AX水平在Statin和Statin加E/P联合处理下显著上升，肿瘤中凋亡发生和DNA损伤显著增加(图14F)。
实施例15、TCGA数据库分析显示高表达GGPS1的小细胞肺癌患者预后更差
接下来通过TCGA数据库分析MVA途径相关基因表达水平和病人预后的相关性。结果显示高表达GGPS1的小细胞肺癌病人预后差(图15A)。而MVA途径其他基因(SQLE，FDFT1)与小细胞肺癌病人的预后没有相关性(图15B)。这说明高表达GGPS1的小细胞肺癌患者可能通过GGPP-RAB7A-Autophagic途径对化疗药物耐受，而MVA途径其它下游通路则不影响小细胞肺癌患者预后。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心
<120> 诊断和治疗化疗耐药小细胞肺癌的新靶点及其应用
<130> 207364
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 1
ccggcctgag ctagtagcct tagtactcga gtactaaggc tactagctca ggtttttg 58
<210> 2
<211> 58
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 2
aattcaaaaa cctgagctag tagccttagt actcgagtac taaggctact agctcagg 58
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 干扰RNA(shRNA)
<400> 3
ggctagtcac aatgcagata t 21
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 4
ccggggctag tcacaatgca gatatctcga gatatctgca ttgtgactag cctttttg 58
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 5
aattcaaaaa ggctagtcac aatgcagata tctcgagata tctgcattgt gactagcc 58

Claims (18)

1.一种筛选抑制化疗耐药小细胞肺癌的物质的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)将候选物质与含有GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路的体系接触；
(2)筛选出调节GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路的物质，所述物质是对于抑制化疗耐药小细胞肺癌有用的物质；
其中，所述的调节包括：抑制GGPS1的表达或活性，抑制RAB7A的膜定位，抑制GGPS1代谢产物GGPP对RAB7A的修饰作用，或促进自噬流障碍。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路被包含于甲羟戊酸途径中，或为甲羟戊酸途径的下游通路；或
所述的GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路包括：GGPS1蛋白，RAB7A蛋白；所述自噬流为自噬体与溶酶体相互融合引发的自噬流。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：向含有GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路的体系中添加候选物质；和
步骤(2)包括：检测GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路中各蛋白或其编码基因的变化，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的、含有GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路的体系；
若候选物质抑制GGPS1的表达或活性，抑制RAB7A的膜定位，抑制GGPS1代谢产物GGPP对RAB7A的修饰作用，或促进自噬流障碍，则该候选物质是对于抑制化疗耐药小细胞肺癌有用的物质。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的含有GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路的体系选自：细胞体系、亚细胞体系、组织体系或动物体系。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的候选物质包括：针对GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路、或其通路蛋白、或其上游或下游蛋白或基因设计的调控分子，CRISPR构建物，小分子化合物，来自化合物库的化合物。
6.GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路的用途，用于筛选抑制化疗耐药小细胞肺癌的物质；较佳地，所述的GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路被包含于甲羟戊酸途径中，或为甲羟戊酸途径的下游通路；或
所述的GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路包括：GGPS1蛋白，RAB7A蛋白；所述自噬流为自噬体与溶酶体相互融合引发的自噬流。
7.调节GGPS1/RAB7A/自噬流信号通路的调节剂的用途，用于制备抑制化疗耐药小细胞肺癌的药物组合物；其中，所述的调节剂包括选自下组：GGPS1的表达或活性抑制剂，RAB7A膜定位抑制剂，GGPS1代谢产物GGPP对RAB7A的修饰作用的抑制剂，或促进自噬流障碍的促进剂。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述GGPS1的表达或活性抑制剂包括：敲除或沉默GGPS1基因的试剂，抑制GGPS1蛋白活性的试剂；较佳地，包括：特异性干扰GGPS1基因表达的干扰分子，针对GGPS1基因的CRISPR基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂，所述试剂将GGPS1进行功能丧失性突变；
所述RAB7A膜定位抑制剂包括：敲除或沉默RAB7A基因的试剂，抑制RAB7A蛋白活性的试剂；较佳地，包括：特异性干扰RAB7A基因表达的干扰分子，针对RAB7A基因的CRISPR基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂，所述试剂将RAB7A进行功能丧失性突变；
所述GGPS1代谢产物GGPP对RAB7A的修饰作用的抑制剂包括：抑制GGPS1合成GGPP的试剂；或
所述促进自噬流障碍的促进剂包括：GGPS1的表达或活性抑制剂，RAB7A膜定位抑制剂，GGPS1代谢产物GGPP对RAB7A的修饰作用的抑制剂。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的敲除或沉默GGPS1基因的试剂为敲低GGPS1的shRNA质粒；用于敲低的功能序列为：CCTGAGCTAGTAGCCTTAGTA所述的敲除或沉默RAB7A基因的试剂为敲低RAB7A的shRNA质粒；用于敲低的功能序列为：GGCTAGTCACAATGCAGATAT。
10.他汀类药物、依托泊苷和顺铂的组合在制备抑制化疗耐药小细胞肺癌的药物组合物中的用途。
11.一种抑制化疗耐药小细胞肺癌的药物组合物，其特征在于，包括他汀类药物、依托泊苷和顺铂。
12.一种抑制化疗耐药小细胞肺癌的药盒，其特征在于，其中包括权利要求11所述的药物组合物；或其中包括容器，以及分别置于所述容器中的他汀类药物、依托泊苷和顺铂。
13.如权利要求10～12任一所述，其特征在于，所述他汀类药物包括选自：美伐他汀，辛伐他汀，匹伐他汀，阿托伐他汀，洛伐他汀，FluaStatin；或
所述的化疗耐药小细胞肺癌为高表达GGPS1耐药性的小细胞肺癌。
14.如权利要求10～12任一所述，其特征在于，用于一个单位疗程时，所述的他汀类药物、依托泊苷和顺铂的用量比例为(35～105)：(3～9)：1；较佳地为(49～70)：(4.5～7.5)：1；或
所述顺铂、依托泊苷和所述他汀类药物的用药方法为：按1周1个疗程计算，根据个体体重，通过腹腔注射方式第1天给予0.5～10毫克/千克顺铂；第1～3天给予0.5～15毫克/千克/天依托泊苷；同时通过灌胃方式给予2～100毫克/千克/天的美伐他汀或辛伐他汀或匹伐他汀等药物处理；较佳地，当药物被置于药盒中时，所述用药方法被记载于所述药盒的使用说明书中。
15.GGPS1蛋白或其编码基因在制备诊断试剂中的用途，所述的诊断试剂用于对小细胞肺癌进行诊断或预后；较佳地，所述的诊断或预后包括：根据GGPS1蛋白的表达情况，判断其是否适用于进行他汀类药物的治疗方案；若GGPS1蛋白高表达，则适用该治疗方案。
16.特异性识别GGPS1蛋白或其编码基因的试剂的用途，用于制备对小细胞肺癌进行诊断或预后的诊断试剂或诊断试剂盒；较佳地，所述的诊断或预后包括：根据GGPS1蛋白的表达情况，判断其是否适用于进行他汀类药物的治疗方案；若GGPS1蛋白高表达，则适用该治疗方案。
17.如权利要求15或16所述，其特征在于，所述的治疗方案为他汀类药物、依托泊苷和顺铂联合用药的治疗方案。
18.如权利要求15或16任一所述，其特征在于，所述的诊断试剂包括选自：特异性扩增GGPS1蛋白的编码基因的引物；特异性识别GGPS1蛋白的编码基因或其转录本的探针；或特异性抗GGPS1蛋白的抗体。
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