CN103820552A - 一种用于检测小鼠胆固醇代谢基因表达的实时定量pcr芯片 - Google Patents

一种用于检测小鼠胆固醇代谢基因表达的实时定量pcr芯片 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于检测小鼠胆固醇代谢基因表达的实时定量PCR芯片，该实时定量PCR芯片以与胆固醇代谢密切相关的88基因作为检测位点，并选取了4个看家基因。本发明的实时定量PCR芯片能对小鼠胆固醇代谢相关基因进行针对性分析，实验周期短，数据处理简单，花费少，且不需要专门的实验机构检测，只要拥有一台定量PCR仪，本发明的实时定量PCR芯片的扩增效率高，定量结果可靠，重复性好，特异性高。

Description

一种用于检测小鼠胆固醇代谢基因表达的实时定量PCR芯片
技术领域
本发明属于检测胆固醇基因的表达领域，特别涉及一种用于检测小鼠胆固醇代谢基因表达的实时定量PCR芯片（qPCR array）。
背景技术
目前，研究基因表达差异的技术主要有表达谱芯片，RNA测序以及qPCR array等。表达谱芯片是采用cDNA或寡核苷酸片段作探针，固化在芯片上；将待测样品（处理组）与对照样品的mRNA以两种不同的荧光分子进行标记，然后同时与芯片进行杂交，通过分析两种样品与探针杂交的荧光强度的比值，来检测基因表达水平的变化。RNA测序，也称转录组测序。转录组是指某个物种的特定组织或细胞在某一生理功能状态下所有转录的mRNA产物的集合，是基因组遗传信息传递和表达的重要步骤和过程。其基本原理：提取样本总RNA后，分离纯化RNA。mRNA片段化处理，反转录反应合成双链cDNA，反转录后连接测序接头。DNA成簇扩增，使其达到一定丰度，获得足够的序列；高通量测序，获得序列信息；数据分析，通过与参考基因组比对或从头组装形成全基因组范围的转录谱。高通量转录组测序可以获得大量转录本序列信息，定量基因转录表达水平。qPCR array技术结合了实时定量PCR以及基因芯片特点，每张qPCR芯片如同上百个qPCR微反应池的集成，每个微反应池都固定有基因特异性引物，当加入含有模板和荧光基团的qPCR反应体系后，在相同的反应条件下，不同的基因都能同时进行特异性扩增，每个微反应池的位置信息就代表了某个特定基因，利用荧光信号的积累实时监测每个微反应池中PCR反应的过程，最后通过标准曲线就能同时对上百个基因的mRNA水平进行准确定量分析。它是一种高度灵敏和可靠的功能基因组研究方法。
现有的关于研究胆固醇代谢基因表达的方法，大都是基于表达谱芯片，RNA测序。但是这两种方法具有以下缺点：表达谱芯片中并没有准确的定量信息，结果需要大量的实验验证；表达谱芯片是一种广谱的筛选方法，其并没有针对性研究基因，许多与研究对象无关的基因会产生大量无用或错误的信息，干扰结果分析；RNA-Seq能够检测样品中的所有RNA，而细胞中很大一部分RNA都来自核糖体和线粒体，限制了其他RNA的读取数量以及这些RNA表达水平的准确性。同时这两种方法，科研花费高，并且只能在专业实验中心完成。不具备在普通实验室完成的条件。而qPCR array技术具有实时定量PCR的精确定量以及基因芯片的高通量检测技术与功能分类的优点，能够同时准确定量分析上百个基因；实验周期短，数据处理简单；花费少，且不需要专门的实验机构检测，只要拥有一台定量PCR仪，其可以在任何一间普通的分子生物学实验室完成。所以，其是一种高度灵敏和可靠的功能基因组研究方法。
随着功能基因组研究的逐步深入，qPCR芯片越来越受到重视，使用量逐年上升，成为了功能基因组研究的重要工具。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测小鼠胆固醇代谢基因表达的实时定量PCR芯片，该芯片能对小鼠胆固醇代谢相关基因进行针对性分析，具有扩增效率高、重复性好、特异性强的优点。
本发明的一种用于检测小鼠胆固醇代谢基因表达的实时定量PCR芯片，该实时定量PCR芯片以与胆固醇代谢密切相关的88基因作为检测位点，并选取了4个看家基因，所述的与胆固醇代谢密切相关的88基因、4个看家基因以及其对应的引物如下：
与胆固醇代谢密切相关的88基因及其对应的引物：
Figure BDA0000470216970000021
Figure BDA0000470216970000031
Figure BDA0000470216970000041
所述的4个看家基因及其对应的引物如下：
Figure BDA0000470216970000042
所述的与胆固醇代谢密切相关的88基因和4个看家基因，共92个基因的上游引物和下游引物分别放置在96孔PCR板中。
所述的实时定量PCR芯片中还设有基因组DNA污染质控和阴性对照，所述的实时定量PCR芯片中基因的排列方式如下：
Figure BDA0000470216970000051
其中E12和F12孔含有基因组DNA污染质控，G12和H12则为阴性对照。
本发明建立了特异性检测小鼠中胆固醇代谢基因表达的qPCR芯片检测方案，包括胆固醇代谢途径中基因的选择，特异性引物的设计，实时定量PCR条件摸索，引物固化等过程。并从扩增效率、重复性、特异性3个方面对qPCR array检测方案进行了评估。最终建立了稳定可靠qPCR array方案，可以将其用来研究胆固醇合成相关基因的研究。
步骤一：基因选择
根据代谢通路数据库KEGG以及脂类代谢网站LIPID MAPS选取88个与胆固醇代谢密切相关的基因，这些基因在胆固醇代谢通路（消化、吸收、合成、分解、转运）中都起到非常重要的作用。
步骤二：引物设计
为了得到单一的特异扩增产物，避免扩增出序列相似的产物，采用BLAST或者其他比对方法，检测引物在在小鼠基因组中的特异性。为了保证在相同的反应条件下（特别是同一退火温度），不同基因均能扩增出相应的特异性产物，对引物的CT值，解链温度以及其他化学和物理的特性都进行了优化调整。为了获得高扩增效率，对扩增片段的长度都进行了优化，一般为70到150bp，确保在统一的循环反应的时间范围内，不同基因均能扩增出完整片段。
步骤三：定量检测
1）RNA抽提
用Trizol法提取肝脏组织的总RNA，详细操作步骤如下：
a.匀浆处理：将肝脏在液氮中磨碎，每50～100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.将匀浆样品在室温（15～30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。
c.每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。
d.2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
e.把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1mlTRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。
f.2～8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。
g.用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml75℅乙醇。2～8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。
h.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5～10分钟。加入25～200μl无RNase的水，用枪头吸打几次，55～60℃放置10分钟使RNA溶解。
i.Nanodrop2000c鉴定RNA的质量和浓度。
2）DNase I处理
DNase I处理RNA，以去除RNA中残留的基因组DNA，消除基因组污染。采用Fermentas公司的DNase I试剂处理RNA，具体操作如下：1μg RNA，1μl10×Reaction Buffer withMgCl2，1μl DNase I，RNase-free（1U/μl），另外添加Water，nuclease-free使反应总体积为10μl。反应程序为37℃，30min。反应结束后添加1μl EDTA（50mM），继续反应65℃，10min；处理完成后将其用于后续的反转录实验。
3）反转录
利用AMV反转录酶将RNA反转录成cDNA。采用Thermo Scientific RevertAid FirstStrand cDNA Synthesis Kit进行反转录，反应终体系10μL包括：6.25μL DNase I处理的总RNA，0.5μL随机引物（2μM），0.5μL dNTP Mix(10mM)。首先反应在65℃进行5min后，加入剩余体系（2μL5×RT buffer，0.5μL RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase（200U/μL），0.25μL RNase inhibitor（20U/μL）），反应程序为：50℃60min，70℃15min。cDNA置于-20℃保存待用。
4）qPCR芯片检测
反应体系：10μl定量PCR mix，2.5μl cDNA，7.1μl H2O，0.4μl ROX。
反应条件：95℃预变性2min；95℃15s，60℃15s，72℃40s，40个循环。利用ABI7500进行定量PCR。
步骤四：引物固化
预先加入荧光定量96孔板中的3μl（2μM）引物，以PCR仪65℃加热20min至干，放于-20℃保存，同时设置基因组污染质控、阴性对照。
92个基因（包括看家基因）在96孔PCR板中的排列（见表1）：基因在荧光定量96孔PCR板中的排列：A1至H11（1-88）孔含有实时PCR检测的胆固醇代谢相关基因。A12至D12孔含有看家基因（HK1-4）。E12和F12孔含有基因组DNA污染质控（GDC），G12和H12则为阴性对照（NTC）。
表1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A ABCA1 APOA1 APOF CYP7B1 HDLBP INSIG2 LRP1 NR0B2 PLTP SC5D SLCO1B2 ACTB
B ABCG1 APOA2 CNBP CYP8B1 HMGCR LCAT LSS NR1H2 PMVK SCAP SOAT1 B2M
C ABCG5 APOA4 CRP DHCR24 HMGCS1 LDLR MTTP NR1H3 PON1F SCARB1 SOAT2 GAPDH
D ABCG8 APOB CYB5R3 DHCR7 HMGCS2 LDLRAP1 MVD NR1H4 PPARA SCARF1 SQLEF HPRT
E ACAA2 APOC1 CYP27A1 EBP HSD17B7 LIPA MVK NSDHL PPARD SCP2 SREBF1 GDC
F ACOT1 APOC2 CYP39A1 FDFT1 HSD3B7 LIPC MYLIP OSBP PPARG SLC10A1 SREBF2 GDC
G AKR1D1 APOC3 CYP51 FDPS IDI1 LIPG NPC1 OSBPL1A PRKAA2 SLC27A2 STARD3 NTC
H ANGPTL3 APOE CYP7A1 GGPS1F INSIG1 LPL NPC2 PCSK9 SC4MOL SLC27A5 TM7SF2 NTC
检测样品内的单个基因（HPRT）的统计学参数（表2）
表2
Figure BDA0000470216970000071
有益效果：
qPCR芯片是能对某一特定生物学通路或一组功能相关基因进行针对性分析的定量工具，具有扩增效率高、重复性好、特异性强等特点。
1）扩增效率高，定量结果可靠
将cDNA模板连续稀释4倍形成4个浓度梯度，绘制看家基因和胆固醇相关基因标准曲线。以CT值为纵坐标，RNA样品量为横坐标。根据标准曲线计算基因扩增效率，结果显示所有基因PCR引物扩增效率大都介于90%-110%。
2）重复性好
图2上显示的是92个基因（88个胆固醇基因和4个看家基因）CT值的均值，重复3次，每个点上都标明了标准差，可见CT值低时，重复性好。CT值高时，重复性差。CT值标准差均值约为0.2。因此，对于大多数基因超过2倍表达差异的可以准确测出。通过CT值的CV值检测重复性。同样，CV值表明重复性好。
3）特异性高
为了检测PCR array的特异性，测定了细胞色素氧化酶P450（CYP）中的同源基因。图3为CYP家族中的6个同源基因的溶解曲线。结果显示6个基因的溶解曲线是单峰。CYP家族中的6个同源基因PCR产物的电泳图。结果显示PCR产物是单一条带，并且条带大小与预期相一致。因此，PCR array检测结果特异性高，可以区分RNA样品中同一基因家族的同源基因。
综上所述，PCR array由于其扩增效率高、使其可以采用相对定量分析，比较基因间的差异；重复性好，CT值的平均差异只有0.2个循环，可检测超过2倍的基因表达量变化。因此，PCR array是可以用来研究胆固醇代谢相关基因表达量的变化。
附图说明
图1为cDNA模板4倍梯度稀释的扩增效率图；其中A为cDNA模板4倍梯度稀释后单个基因（HPRT）的扩增曲线，B为基因扩增效率，C为92个基因的扩增效率范围；
图2为样品检测的重复性；其中A为92个基因重复3次后CT值的均值及标准差，B为92个基因3重复后CT值间的CV变化范围；
图3为CYP家族中溶解曲线以及凝胶电泳图，其中A为CYP家族中的6个同源基因的溶解曲线，B为CYP家族中的6个同源基因PCR产物的电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
本研究通过设计稳定可靠的qPCR array检测方案，以小鼠肝癌细胞Hepa1-6为研究对象，利用qPCR array检测高糖诱导下Hepa1-6中胆固醇代谢基因mRNA的表达量，旨在mRNA水平上探讨高糖对胆固醇合成相关基因的影响。
1材料与试剂
小鼠肝癌细胞Hepa1-6购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。LowDMEM培养基（美国Hycolon）、胎牛血清（美国Hycolon）、D-葡萄糖（美国Sigma）、Trizol（美国Invitrogen）、Dnase1、反转录试剂（美国Fermentas）、SYBR real-time PCR Premixture试剂盒（Bioteke）、PCR引物由上海生工设计合成。细胞培养箱（美国Thermo）、实时荧光定量PCR仪(美国ABI7500)。
2细胞培养、实验分组
首先将Hepa1-6肝癌细胞培养于Low DMEM中，待其生长至铺满瓶底70%时，分别用5、15、30mmol/L D-葡萄糖刺激Hepa1-6肝癌细胞18h，以5mmol/L为对照组。用15mmol/L D-葡萄糖分别刺激Hepa1-6肝癌细胞0、6、12、18、24h，以0h为对照组。实验重复3次。
3RNA抽提、cDNA反转录
1）RNA抽提
用Trizol法提取肝脏组织的总RNA，详细操作步骤如下：
a.匀浆处理：将肝脏在液氮中磨碎，每50～100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.将匀浆样品在室温（15～30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。
c.每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。
d.2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
e.把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1mlTRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。
f.2～8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。
g.用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml75℅乙醇。2～8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。
h.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5～10分钟。加入25～200μl无RNase的水，用枪头吸打几次，55～60℃放置10分钟使RNA溶解。
i.Nanodrop2000c鉴定RNA的质量和浓度。
2）DNase I处理
DNase I处理RNA，以去除RNA中残留的基因组DNA，消除基因组污染。采用Fermentas公司的DNase I试剂处理RNA，具体操作如下：1μg RNA，1μl10×Reaction Buffer withMgCl2，1μl DNase I，RNase-free（1U/μl），另外添加Water，nuclease-free使反应总体积为10μl。反应程序为37℃，30min。反应结束后添加1μl EDTA（50mM），继续反应65℃，10min；处理完成后将其用于后续的反转录实验。
3）反转录
利用AMV反转录酶将RNA反转录成cDNA。采用Thermo Scientific RevertAid FirstStrand cDNA Synthesis Kit进行反转录，反应终体系10μL包括：6.25μL DNase I处理的总RNA，0.5μL随机引物（2μM），0.5μL dNTP Mix(10mM)。首先反应在65℃进行5min后，加入剩余体系（2μL5×RT buffer，0.5μL RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase（200U/μL），0.25μL RNase inhibitor（20U/μL）），反应程序为：50℃60min，70℃15min。cDNA置于-20℃保存待用。
4引物设计及qPCR array
预先加入荧光定量96孔板中的3μl（2μM）引物，以PCR仪65℃加热20min至干，放于-20℃保存，同时设置基因组污染质控、阴性对照。
qPCR array反应体系：10μl定量PCR mix，2.5μl cDNA，7.1μl H2O，0.4μl ROX。反应条件：95℃预变性2min；95℃15s，60℃15s，72℃40s，40个循环。利用ABI7500进行定量PCR。采用ΔΔCt计算各基因相对表达量。
5统计学分析
基因表达定量分析每组实验均重复3次，所有数据采用x±s表示，用SPSS10.0软件处理。两个样本均数间的比较采用t检验，以P<0.05为差异有显著性。
Figure IDA0000470217060000021
Figure IDA0000470217060000031
Figure IDA0000470217060000051
Figure IDA0000470217060000061
Figure IDA0000470217060000071
Figure IDA0000470217060000081
Figure IDA0000470217060000091
Figure IDA0000470217060000111
Figure IDA0000470217060000121
Figure IDA0000470217060000141
Figure IDA0000470217060000151
Figure IDA0000470217060000161
Figure IDA0000470217060000181
Figure IDA0000470217060000201
Figure IDA0000470217060000211
Figure IDA0000470217060000231
Figure IDA0000470217060000241
Figure IDA0000470217060000251
Figure IDA0000470217060000281
Figure IDA0000470217060000301
Figure IDA0000470217060000321
Figure IDA0000470217060000331
Figure IDA0000470217060000341
Figure IDA0000470217060000351
Figure IDA0000470217060000371
Figure IDA0000470217060000381

Claims (3)

1.一种用于检测小鼠胆固醇代谢基因表达的实时定量PCR芯片，其特征在于：该实时定量PCR芯片以与胆固醇代谢密切相关的88基因作为检测位点，并选取了4个看家基因，所述的与胆固醇代谢密切相关的88基因、4个看家基因以及其对应的引物如下：
Figure FDA0000470216960000011
Figure FDA0000470216960000021
Figure FDA0000470216960000031
上述为与胆固醇代谢密切相关的88基因及其对应的引物；
上述为4个看家基因及其对应的引物。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测小鼠胆固醇代谢基因表达的实时定量PCR芯片，其特征在于：所述的与胆固醇代谢密切相关的88基因和4个看家基因，共92个基因的上游引物和下游引物分别放置在两块96孔PCR板中。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测小鼠胆固醇代谢基因表达的实时定量PCR芯片，其特征在于：所述的实时定量PCR芯片中还设有基因组DNA污染质控和阴性对照，所述的实时定量PCR芯片中基因在96孔PCR板上的排列方式如下：
Figure FDA0000470216960000033
Figure FDA0000470216960000041
其中E12和F12孔含有基因组DNA污染质控，G12和H12则为阴性对照。
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