CN111718999B - 小鼠短串联重复序列的多重扩增体系及检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小鼠短串联重复序列的多重扩增体系，该多重扩增体系中包含18对引物，可同时扩增18个小鼠的STR位点。本发明还包括由所述多重扩增体系构成的检测试剂盒。本发明所述多重扩增体系通过一次扩增即可获得大量信息；扩增产物带有荧光，可直接在测序仪上进行检测，结果准确，重复性高，数据可建立标准参考数据库；操作简便，需时短，易于规模化及自动化。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术检测领域，尤其涉及小鼠短串联重复序列的多重扩增体系及检测试剂盒。
背景技术
从第一株实验室培养的细胞系诞生后不久，就一直有关于细胞系交叉污染问题的文章及报道。曾有文献作者根据检测结果估算，全球在用的细胞系有高达20％至33％是被错误标记或辨识。从2015年开始，多家科学界权威杂志社陆续要求撰稿人需要对所使用的细胞系提供鉴定报告，以证明所使用的细胞系没有交叉污染或被错误标记。之后，细胞系交叉污染问题才得到广大科研工作人员的重视。近来，使用错误细胞系的情况虽有所改善，但仅仅是对于人源细胞系而言；对于其他种属的细胞，因为没有统一的数据库或没有稳定的检测体系等，情况一直没有很大的改善。而大量的未经鉴定的非人源细胞系的使用，同样会造成科研时间和经费的浪费，同时也会导致错误结论或误导其他科研人员。
短串联重复序列(STR)检测已广泛应用于亲缘鉴定、法医鉴定等检测中；而且在人源细胞系的鉴定中也非常成熟，并已建立起了统一的STR位点信息数据库，可供广大科研人员查询和比对。
小鼠细胞系是除人源细胞系外使用最多的一类细胞系。虽然小鼠已有全基因组序列，但仍没有一个标准的STR Marker组合和标准数据库可以检索。
在2016年，专利CN105648100A，更新了小鼠短串联重复序列的复合扩增体系及检测试剂盒，包含9个位点和一个性别判定位点。但9个位点所能提供的分辨率对于数量庞大的小鼠个体来说是远远不够的，并不确保能把每只小鼠个体区分开来。这对小鼠细胞系及小鼠个体的鉴定来说都是不利的，亟需开发针对更多位点的小鼠短串联重复序列多重扩增体系及检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述现有技术的缺点和不足，提供一种小鼠短串联重复序列的多重扩增体系及检测试剂盒，通过鉴定小鼠的STR位点来鉴定小鼠细胞系。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种小鼠短串联重复序列的多重扩增体系，包含18对引物，可同时扩增18个小鼠的STR位点Mmus-1、Mmus-2、Mmus-3、Mmus-4、Mmus-5、Mmus-6、Mmus-7、Mmus-8、Mmus-9、Mmus-10、Mmus-11、Mmus-12、Mmus-13、Mmus-14、Mmus-15、Mmus-16、Mmus-17、Mmus-18；所述引物分别为:
扩增Mmus-1的上游引物：AGCTATCAGAGATGCCCCCT(SEQ ID NO:1)；
扩增Mmus-1的下游引物：GACAGATAGTGAACTCTAGG(SEQ ID NO:2)；
扩增Mmus-2的上游引物：CTACAGTCTTTCTGTCTTT(SEQ ID NO:3)；
扩增Mmus-2的下游引物：GGACTTTGGGGGGGAGGTT(SEQ ID NO:4)；
扩增Mmus-3的上游引物：CTTTGCTGGAAAGAGAAAGAG(SEQ ID NO:5)；
扩增Mmus-3的下游引物：CATTCTAAAGTTCCTGCTTAGC(SEQ ID NO:6)；
扩增Mmus-4的上游引物：GGAGTTACAGATAGTTGTGAGC(SEQ ID NO:7)；
扩增Mmus-4的下游引物：ATGGATAGATACATACATCC(SEQ ID NO:8)；
扩增Mmus-5的上游引物：GGCAGGACAGGTGGTGACAAG(SEQ ID NO:9)；
扩增Mmus-5的下游引物：TGACATTTAATTTTTCTTGTAACCC(SEQ ID NO:10)；
扩增Mmus-6的上游引物：CACTTCCTGGGCCGGTGGCT(SEQ ID NO:11)；
扩增Mmus-6的下游引物：AACTTCCCCTTCCTGGTGTGG(SEQ ID NO:12)；
扩增Mmus-7的上游引物：GAAAAGTGAAGTTGTTTGCA(SEQ ID NO:13)；
扩增Mmus-7的下游引物：CTTAGGTAGTTCCAATACTT(SEQ ID NO:14)；
扩增Mmus-8的上游引物：AGTGGAGAAGAGGGAGCGCAAT(SEQ ID NO:15)；
扩增Mmus-8的下游引物：GATTACAAGTGACCTCAGTTG(SEQ ID NO:16)；
扩增Mmus-9的上游引物：TTTGACCCAACACCAGTTG(SEQ ID NO:17)；
扩增Mmus-9的下游引物：GGAATCCTAGTCCCCAACTGGT(SEQ ID NO:18)；
扩增Mmus-10的上游引物：GGCCACCTATGTTAGTGATCC(SEQ ID NO:19)；
扩增Mmus-10的下游引物：TACCCCAAAATGGTCTAGAG(SEQ ID NO:20)；
扩增Mmus-11的上游引物：TTCACAGTCCTGACACAGGG(SEQ ID NO:21)；
扩增Mmus-11的下游引物：TAGGAGACAGAGTCTCACC(SEQ ID NO:22)；
扩增Mmus-12的上游引物：AGGTCATAAATTGTCAATTT(SEQ ID NO:23)；
扩增Mmus-12的下游引物：CCTTGTTCAATATCAGAAT(SEQ ID NO:24)；
扩增Mmus-13的上游引物：GGTATTAACCCAAGTCCTTGAG(SEQ ID NO:25)；
扩增Mmus-13的下游引物：ATCCCCATAAACCATAAGCC(SEQ ID NO:26)；
扩增Mmus-14的上游引物：TGTCTGTCATAAATAAGGTAG(SEQ ID NO:27)；
扩增Mmus-14的下游引物：AGATCAAGAGGCTATCTAAAC(SEQ ID NO:28)；
扩增Mmus-15的上游引物：CCATCCTGGCATGTCTCTAC(SEQ ID NO:29)；
扩增Mmus-15的下游引物：TGATAAACTAAATCTGATCCCC(SEQ ID NO:30)；
扩增Mmus-16的上游引物：GTGTCATGCTAACTCACAGGTA(SEQ ID NO:31)；
扩增Mmus-16的下游引物：AATCACCAGGTCTGCTAAAT(SEQ ID NO:32)；
扩增Mmus-17的上游引物：ACATGTACCAGTCCTCAAGGC(SEQ ID NO:33)；
扩增Mmus-17的下游引物：CTGGTGCTCACAGCACTGAGT(SEQ ID NO:34)；
扩增Mmus-18的上游引物：TAGCCAAGATATGCAAAGAAC(SEQ ID NO:35)；
扩增Mmus-18的下游引物：GCATTATCATATTCATGACT(SEQ ID NO:36)。
进一步地，所述多重扩增体系还包括一对能扩增小鼠性别判定位点Kdm5的引物，分别为：
扩增Kdm5的上游引物：GAAGCTTTTGGCTTTGAGC(SEQ ID NO:37)；
扩增Kdm5的下游引物：CCGCTGCCAAATTCTTTGG(SEQ ID NO:38)。
进一步地，上述19对引物被分为四组，每组引物带有不同的荧光标记物，且四组引物分别在每一对引物的上游引物5‘末端添加相应颜色的荧光标记物；所述第一组为Mmus-16、Mmus-5、Kdm5、Mmus-8和Mmus-17；第二组为Mmus-2、Mmus-9、Mmus-1、Mmus-4和Mmus-10；第三组为Mmus-3、Mmus-14、Mmus-7和Mmus-11；第四组为Mmus-15、Mmus-12、Mmus-6、Mmus-18和Mmus-13。
进一步地，所述第一组、第二组、第三组和第四组引物分别采用不同的荧光标记，所述四组引物的荧光标记可以从6-FAM、VIC、NED、PET随机组合，或从FL、JOE、TMR、CXR随机组合。
进一步地，所述多重扩增体系还包括：PCR反应缓冲液、模板DNA和Taq酶。
更进一步地，所述Taq酶为热启动适合多重位点扩增用Taq酶。
本发明还包括小鼠短串联重复序列的多重扩增检测试剂盒，包括上述多重扩增体系。
进一步地，所述试剂盒的引物有19对，其用量体积比如下：
进一步地，所述试剂盒的多重扩增体系具体如下：
| 无核酸酶纯水 | 8.5μl |
| 2x PCR反应缓冲液 | 12.5μl |
| 引物混合物(PrimerMix) | 2.5μl |
| Taq酶 | 0.5μl |
| 模板DNA | 1μl |
| 总计 | 25μl |
本发明的优势在于：
1、一次扩增即可获得19个位点的大量信息。
2、扩增产物带有荧光，可直接在测序仪上进行检测，结果准确，重复性高，数据可建立标准参考数据库。
3、操作简便，需时短，易于规模化及自动化。
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1是小鼠4T1细胞的STR图谱。
图2是小鼠BV2细胞的STR图谱。
图3是小鼠CT26.WT细胞的STR图谱。
图4是小鼠Hepa1-6细胞的STR图谱。
图5是小鼠L929细胞的STR图谱。
图6是小鼠M-1细胞的STR图谱。
图7是小鼠MS1细胞的STR图谱。
图8是小鼠NIH/3T3细胞的STR图谱。
图9是小鼠P19细胞的STR图谱。
图10是小鼠RAW264.7细胞的STR图谱。
图11是小鼠Renca细胞的STR图谱。
图12是小鼠SP2/0-Ag14细胞的STR图谱。
图13是中国仓鼠CHO-K1细胞的STR图谱。
图14是大鼠H9C2细胞的STR图谱。
图15是人源SK-OV-3细胞的STR图谱。
具体实施方式
实施例1
小鼠短串联重复序列的多重扩增体系设计
1、引物组合的设计
首先，我们根据小鼠全基因组序列，在所有STR位点中选取核心序列为四碱基重复，且具有高度多态性及种属特异性的位点。用PrimerPremier5及NCBI Primer Blast等引物设计工具设计引物，并根据以往设计经验，尽量确保各引物的Tm值在(60±3)℃的范围内，扩增效率相当且各对引物的扩增产物大小相差在20bp以上，并用AutoDimer分析引物二聚体及引物间的相互作用。若引物的特异性不高或产生交叉扩增反应则需重新设计，直到符合要求。
选用NIH/3T3细胞的DNA作为模板，分别对每个STR位点进行扩增，并在2％的琼脂糖凝胶上进行电泳分析。根据电泳条带效果调整扩增体系和条件，使产物为单一条带且条带亮度相近，否则重新设计引物。
对符合上述要求的引物对的上游引物的5’末端进行荧光标记，所述荧光标记为6-FAM、VIC、NED、PET随机组合，或FL、JOE、TMR、CXR随机组合。在与非荧光标记的反向引物配对后，分别对STR位点进行扩增，产物用测序仪进行毛细管电泳，根据结果评估其扩增效率。
然后将同一种荧光标记的引物对混合后进行多重扩增，并进行毛细管电泳，以期评估混合状态下引物的扩增效率及检测引物的特异性。并根据单独及多重扩增的电泳结果，初步确定各对引物的体积比，混合好所有引物后进行多重扩增，最后根据电泳结果调整每对引物的浓度，使各引物对的扩增效率相近。
最终确定的19对引物如下所示：
扩增Mmus-1的上游引物：AGCTATCAGAGATGCCCCCT(SEQ ID NO:1)；
扩增Mmus-1的下游引物：GACAGATAGTGAACTCTAGG(SEQ ID NO:2)；
扩增Mmus-2的上游引物：CTACAGTCTTTCTGTCTTT(SEQ ID NO:3)；
扩增Mmus-2的下游引物：GGACTTTGGGGGGGAGGTT(SEQ ID NO:4)；
扩增Mmus-3的上游引物：CTTTGCTGGAAAGAGAAAGAG(SEQ ID NO:5)；
扩增Mmus-3的下游引物：CATTCTAAAGTTCCTGCTTAGC(SEQ ID NO:6)；
扩增Mmus-4的上游引物：GGAGTTACAGATAGTTGTGAGC(SEQ ID NO:7)；
扩增Mmus-4的下游引物：ATGGATAGATACATACATCC(SEQ ID NO:8)；
扩增Mmus-5的上游引物：GGCAGGACAGGTGGTGACAAG(SEQ ID NO:9)；
扩增Mmus-5的下游引物：TGACATTTAATTTTTCTTGTAACCC(SEQ ID NO:10)；
扩增Mmus-6的上游引物：CACTTCCTGGGCCGGTGGCT(SEQ ID NO:11)；
扩增Mmus-6的下游引物：AACTTCCCCTTCCTGGTGTGG(SEQ ID NO:12)；
扩增Mmus-7的上游引物：GAAAAGTGAAGTTGTTTGCA(SEQ ID NO:13)；
扩增Mmus-7的下游引物：CTTAGGTAGTTCCAATACTT(SEQ ID NO:14)；
扩增Mmus-8的上游引物：AGTGGAGAAGAGGGAGCGCAAT(SEQ ID NO:15)；
扩增Mmus-8的下游引物：GATTACAAGTGACCTCAGTTG(SEQ ID NO:16)；
扩增Mmus-9的上游引物：TTTGACCCAACACCAGTTG(SEQ ID NO:17)；
扩增Mmus-9的下游引物：GGAATCCTAGTCCCCAACTGGT(SEQ ID NO:18)；
扩增Mmus-10的上游引物：GGCCACCTATGTTAGTGATCC(SEQ ID NO:19)；
扩增Mmus-10的下游引物：TACCCCAAAATGGTCTAGAG(SEQ ID NO:20)；
扩增Mmus-11的上游引物：TTCACAGTCCTGACACAGGG(SEQ ID NO:21)；
扩增Mmus-11的下游引物：TAGGAGACAGAGTCTCACC(SEQ ID NO:22)；
扩增Mmus-12的上游引物：AGGTCATAAATTGTCAATTT(SEQ ID NO:23)；
扩增Mmus-12的下游引物：CCTTGTTCAATATCAGAAT(SEQ ID NO:24)；
扩增Mmus-13的上游引物：GGTATTAACCCAAGTCCTTGAG(SEQ ID NO:25)；
扩增Mmus-13的下游引物：ATCCCCATAAACCATAAGCC(SEQ ID NO:26)；
扩增Mmus-14的上游引物：TGTCTGTCATAAATAAGGTAG(SEQ ID NO:27)；
扩增Mmus-14的下游引物：AGATCAAGAGGCTATCTAAAC(SEQ ID NO:28)；
扩增Mmus-15的上游引物：CCATCCTGGCATGTCTCTAC(SEQ ID NO:29)；
扩增Mmus-15的下游引物：TGATAAACTAAATCTGATCCCC(SEQ ID NO:30)；
扩增Mmus-16的上游引物：GTGTCATGCTAACTCACAGGTA(SEQ ID NO:31)；
扩增Mmus-16的下游引物：AATCACCAGGTCTGCTAAAT(SEQ ID NO:32)；
扩增Mmus-17的上游引物：ACATGTACCAGTCCTCAAGGC(SEQ ID NO:33)；
扩增Mmus-17的下游引物：CTGGTGCTCACAGCACTGAGT(SEQ ID NO:34)；
扩增Mmus-18的上游引物：TAGCCAAGATATGCAAAGAAC(SEQ ID NO:35)；
扩增Mmus-18的下游引物：GCATTATCATATTCATGACT(SEQ ID NO:36)；
扩增Kdm5的上游引物：GAAGCTTTTGGCTTTGAGC(SEQ ID NO:37)；
扩增Kdm5的下游引物：CCGCTGCCAAATTCTTTGG(SEQ ID NO:38)。
2、扩增体系及条件的建立
2.1Taq酶的选择
Taq酶是扩增体系中最重要的组分，酶的扩增效率及保真性之间应保持平衡，而且因为需要同时扩增的位点较多，所选用的酶应当适合进行多重PCR。多种Taq酶体系都满足本发明的需要，如TOYOBO公司的KOD Multi&Epi反应体系、Takara公司的Multiplex PCRAssayKit反应体系和诺唯赞公司的Multiplex PCR Kit反应体系都能获得较好的扩增效率及特异性，且不需要再调整Mg2+浓度，减少开发难度。
2.2反应体积的选择
我们分别检测了5μl、10μl、25μl及50μl扩增体系的效果，经过比较发现，25μl与50μl体系的效果相近，10μl体系略差，5μl体系效果不稳定。
2.3反应程序的优化
本发明测试了从56℃-64℃的退火温度下的扩增效率，结果显示58-60℃范围内扩增效果较好，循环数在29-31个之间效果较好。所测试的变性、退火及延伸温度及时间在下表所列内均能获得较好扩增效果：
表1能获得较好扩增效果的反应程序
实施例2
以下是我们应用本发明对12例小鼠细胞、1例中国仓鼠细胞、1例大鼠细胞、1例人源细胞进行检测的具体实施情况。
1.DNA提取
使用DNA提取试剂盒(全式金)进行DNA提取，依照说明书步骤进行操作，DNA提取后用紫外分光光度计定量，稀释成2ng/μl溶液，马上进行下一步检测或-20℃保存备用。
2.PCR
2.1反应体系：
将19对引物分别溶解并配成浓度为100μM的储备液，然后按表2体积比配成10x引物混合液(10xPrimerMix)500μl：
表2各引物体积比
| 位点名称 | 体积(μl) |
| Mmus-1 | 7.5μl |
| Mmus-2 | 11.25μl |
| Mmus-3 | 6.25μl |
| Mmus-4 | 10μl |
| Mmus-5 | 10μl |
| Mmus-6 | 12.5μl |
| Mmus-7 | 10μl |
| Mmus-8 | 10μl |
| Mmus-9 | 10μl |
| Mmus-10 | 10μl |
| Mmus-11 | 10μl |
| Mmus-12 | 10μl |
| Mmus-13 | 12.5μl |
| Mmus-14 | 5μl |
| Mmus-15 | 10μl |
| Mmus-16 | 7.5μl |
| Mmus-17 | 10μl |
| Mmus-18 | 13.75μl |
| Kdm5 | 10μl |
| 水 | 147.5μl |
将各反应试剂(Buffer、PrimerMix、Taq酶等)振荡混匀后按表3体积比配成PCR反应混合液，分装24μl于PCR反应管中，然后分别加入1μl DNA模板，离心后进行PCR。
表3标准扩增体系
| 无核酸酶纯水 | 8.5μl |
| 2x PCR反应缓冲液 | 12.5μl |
| 10x引物混合物 | 2.5μl |
| Taq酶 | 0.5μl |
| 模板DNA | 1μl |
| 总计 | 25μl |
2.2PCR反应程序：
将PCR管放入PCR仪，设置如下程序：第1步：95℃变性10分钟，第2步：95℃变性30秒，第3步59℃退火1分30秒，第4步：72℃延伸30秒，重复2-4步29次，最后60℃延伸90分钟。反应结束后产物马上进行毛细管电泳或4℃保存备用。
3.毛细管电泳检测
3.1产物稀释
取3μl PCR产物进行电泳鉴定，条带大小相符就可进行毛细管电泳。取5μl样品至96孔板中，稀释至浓度为0.2-1ng/μl溶液，贴上封口膜离心。
3.2反应液配制
将HI-DI(甲酰胺)和内标(liz500)预混，按照“甲酰胺：内标＝990μl：10μl”比例混合，将预混液按照每孔5μl分装至96孔板，然后将0.5μl稀释后的产物按顺序加到孔内，盖上反应胶垫4000rpm离心1min。
3.3上机检测
输入板号，选择STR程序，点击运行程序，结束后导出样品数据。
4.数据分析
打开GeneMarkerv2.2软件，在窗口中点击OpenData，在新窗口中点击Add添加样品数据，选择数据后点击打开，并点击OK导入数据。设置panel文件，点击RunProject。在窗口中选择新定义的panel文件，SizeStandard选择GS500，StandardColor选择Orange，AnalysisType选择Fragment(Animal)，点击Next。新窗口中选择默认参数，点击Next。新窗口中同样选择默认参数并点击OK，开始分析，再次点击OK生成图谱，见图1-15。
5.结果分析
查看图谱(图1-15)可见，12种小鼠细胞的分型结果都是唯一的，故可以通过该方法建立起这12个小鼠细胞系的STR特征图谱，对其进行鉴定。而3种非小鼠细胞则无分型结果，表明该方法特异性强，其他物种细胞不干扰。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110>广州赛库生物技术有限公司
<120>小鼠短串联重复序列的多重扩增体系及检测试剂盒
<160> 13
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增Mmus-1的上游引物
<400>1
agctatcaga gatgccccct 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
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<220>
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gacagatagt gaactctagg 20
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<220>
<223>扩增Mmus-2的上游引物
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ctacagtctt tctgtcttt 19
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<220>
<223>扩增Mmus-2的下游引物
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ggactttggg ggggaggtt 19
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ctttgctgga aagagaaaga g 21
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增Mmus-3的下游引物
<400>6
cattctaaag ttcctgctta gc 22
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<211>22
<212>DNA
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<220>
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<223>扩增Mmus-4的下游引物
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<400>9
ggcaggacag gtggtgacaa g 21
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<220>
<223>扩增Mmus-5的下游引物
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tgacatttaa tttttcttgt aaccc 25
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<400>12
aacttcccct tcctggtgtg g 21
<210>13
<211>20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增Mmus-7的上游引物
<400>13
gaaaagtgaa gttgtttgca 20
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增Mmus-7的下游引物
<400>14
cttaggtagt tccaatactt 20
<210>15
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增Mmus-8的上游引物
<400>15
agtggagaag agggagcgca at 22
<210>16
<211>21
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增Mmus-8的下游引物
<400>16
gattacaagt gacctcagtt g 21
<210>17
<211>19
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增Mmus-9的上游引物
<400>17
tttgacccaa caccagttg 19
<210>18
<211>22
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增Mmus-9的下游引物
<400>18
ggaatcctag tccccaactg gt 22
<210>19
<211>21
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增Mmus-10的上游引物
<400>19
ggccacctat gttagtgatc c 21
<210>20
<211>20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增Mmus-10的下游引物
<400>20
taccccaaaa tggtctagag 20
<210>21
<211>20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增Mmus-11的上游引物
<400>21
ttcacagtcc tgacacaggg 20
<210>22
<211>19
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增Mmus-11的下游引物
<400>22
taggagacag agtctcacc 19
<210>23
<211>20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增Mmus-12的上游引物
<400>23
aggtcataaa ttgtcaattt 20
<210>24
<211>19
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增Mmus-12的下游引物
<400>24
ccttgttcaa tatcagaat 19
<210>25
<211>22
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增Mmus-13的上游引物
<400>25
ggtattaacc caagtccttg ag 22
<210>26
<211>20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增Mmus-13的下游引物
<400>26
atccccataa accataagcc 20
<210>27
<211>21
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增Mmus-14的上游引物
<400>27
tgtctgtcat aaataaggta g 21
<210>28
<211>21
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增Mmus-14的下游引物
<400>28
agatcaagag gctatctaaa c 21
<210>29
<211>20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增Mmus-15的上游引物
<400>29
ccatcctggc atgtctctac 20
<210>30
<211>22
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增Mmus-15的下游引物
<400>30
tgataaacta aatctgatcc cc 22
<210>31
<211>22
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增Mmus-16的上游引物
<400>31
gtgtcatgct aactcacagg ta 22
<210>32
<211>20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增Mmus-16的下游引物
<400>32
aatcaccagg tctgctaaat 20
<210>33
<211>21
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增Mmus-17的上游引物
<400>33
acatgtacca gtcctcaagg c 21
<210>34
<211>21
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增Mmus-17的下游引物
<400>34
ctggtgctca cagcactgag t 21
<210>35
<211>21
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增Mmus-18的上游引物
<400>35
tagccaagat atgcaaagaa c 21
<210>36
<211>20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增Mmus-18的下游引物
<400>36
gcattatcat attcatgact 20
<210>37
<211>19
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增Kdm5的上游引物
<400>37
gaagcttttg gctttgagc 19
<210>38
<211>19
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增Kdm5的下游引物
<400>38
ccgctgccaa attctttgg 19
Claims (6)
1.小鼠短串联重复序列的多重扩增体系，其特征在于，所述多重扩增体系包含可同时扩增检测18个小鼠的STR位点和一个小鼠性别判定位点Kdm5的19对引物；所述18个小鼠的STR位点为：Mmus-1、Mmus-2、Mmus-3、Mmus-4、Mmus-5、Mmus-6、Mmus-7、Mmus-8、Mmus-9、Mmus-10、Mmus-11、Mmus-12、Mmus-13、Mmus-14、Mmus-15、Mmus-16、Mmus-17和Mmus-18；
所述19对引物由以下序列组成：
扩增Mmus-1的上游引物序列SEQ ID NO:1；
扩增Mmus-1的下游引物序列SEQ ID NO:2；
扩增Mmus-2的上游引物序列SEQ ID NO:3；
扩增Mmus-2的下游引物序列SEQ ID NO:4；
扩增Mmus-3的上游引物序列SEQ ID NO:5；
扩增Mmus-3的下游引物序列SEQ ID NO:6；
扩增Mmus-4的上游引物序列SEQ ID NO:7；
扩增Mmus-4的下游引物序列SEQ ID NO:8；
扩增Mmus-5的上游引物序列SEQ ID NO:9；
扩增Mmus-5的下游引物序列SEQ ID NO:10；
扩增Mmus-6的上游引物序列SEQ ID NO:11；
扩增Mmus-6的下游引物序列SEQ ID NO:12；
扩增Mmus-7的上游引物序列SEQ ID NO:13；
扩增Mmus-7的下游引物序列SEQ ID NO:14；
扩增Mmus-8的上游引物序列SEQ ID NO:15；
扩增Mmus-8的下游引物序列SEQ ID NO:16；
扩增Mmus-9的上游引物序列SEQ ID NO:17；
扩增Mmus-9的下游引物序列SEQ ID NO:18；
扩增Mmus-10的上游引物序列SEQ ID NO:19；
扩增Mmus-10的下游引物序列SEQ ID NO:20；
扩增Mmus-11的上游引物序列SEQ ID NO:21；
扩增Mmus-11的下游引物序列SEQ ID NO:22；
扩增Mmus-12的上游引物序列SEQ ID NO:23；
扩增Mmus-12的下游引物序列SEQ ID NO:24；
扩增Mmus-13的上游引物序列SEQ ID NO:25；
扩增Mmus-13的下游引物序列SEQ ID NO:26；
扩增Mmus-14的上游引物序列SEQ ID NO:27；
扩增Mmus-14的下游引物序列SEQ ID NO:28；
扩增Mmus-15的上游引物序列SEQ ID NO:29；
扩增Mmus-15的下游引物序列SEQ ID NO:30；
扩增Mmus-16的上游引物序列SEQ ID NO:31；
扩增Mmus-16的下游引物序列SEQ ID NO:32；
扩增Mmus-17的上游引物序列SEQ ID NO:33；
扩增Mmus-17的下游引物序列SEQ ID NO:34；
扩增Mmus-18的上游引物序列SEQ ID NO:35；
扩增Mmus-18的下游引物序列SEQ ID NO:36；
扩增Kdm5的上游引物序列SEQ ID NO:37；
扩增Kdm5的下游引物序列SEQ ID NO:38；
所述的19对引物被分为四组，每组引物带有不同的荧光标记物，且四组引物分别在每一对引物的上游引物5’末端添加相应颜色的荧光标记物；第一组扩增检测的位点为Mmus-16、Mmus-5、Kdm5、Mmus-8和Mmus-17；第二组扩增检测的位点为Mmus-2、Mmus-9、Mmus-1、Mmus-4和Mmus-10；第三组扩增检测的位点为Mmus-3、Mmus-14、Mmus-7和Mmus-11；第四组扩增检测的位点为Mmus-15、Mmus-12、Mmus-6、Mmus-18和Mmus-13。
2.根据权利要求1所述的小鼠短串联重复序列的多重扩增体系，其特征在于，所述第一组、第二组、第三组和第四组引物分别采用不同的荧光标记，所述四组引物的荧光标记为6-FAM、VIC、NED、PET随机组合，或为FL、JOE、TMR、CXR随机组合。
3.根据权利要求2所述的小鼠短串联重复序列的多重扩增体系，其特征在于，所述多重扩增体系还包括：PCR反应缓冲液、模板DNA和Taq酶。
4.小鼠短串联重复序列的多重扩增检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的多重扩增体系。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述19对引物的用量体积比为：
。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述多重扩增体系具体如下：
。
Priority Applications (1)
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