CN105648100A

CN105648100A - 小鼠短串联重复序列的复合扩增体系及检测试剂盒

Info

Publication number: CN105648100A
Application number: CN201610177489.9A
Authority: CN
Inventors: 孟淑芳; 樊金萍; 徐苗; 吴雪伶; 吕悦心; 陈初光; 赵翔; 冯建平
Original assignee: BEIJING MICROREAD GENE TECHNOLOGY CO LTD; National Institutes for Food and Drug Control
Current assignee: Beijing Yuewei Gene Technology Co.,Ltd.; National Institutes for Food and Drug Control
Priority date: 2016-03-25
Filing date: 2016-03-25
Publication date: 2016-06-08
Anticipated expiration: 2036-03-25
Also published as: CN105648100B

Abstract

本发明涉及小鼠短串联重复序列的复合扩增体系及检测试剂盒，属于生物检测技术领域。本发明选择了9个具有高度灵敏性及扩增特异性的小鼠STR位点，一次性扩增，其扩增的位点是一些可以用来鉴定小鼠细胞系的STR位点，在鉴定小鼠细胞系时，具有快速、操作简单、结果准确、便于大规模推广等优点，这种方法随着试剂盒开发成功可以批量生产，使用条件可以模式化，全部过程都有自动化设备，不再依赖于人的操作经验，可以实现自动化，所需时间短，整个检测时间需要6小时左右。

Description

小鼠短串联重复序列的复合扩增体系及检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及鉴定小鼠多个短串联重复序列的复合扩增体系及其试剂盒，可以快速准确进行小鼠细胞STR分型进而鉴定小鼠细胞系类型。

背景技术

2009年，Nature上的一篇社论指出：在数以千计的使用细胞系的生物实验室中，许多实验室并不知道，介于1/5-1/3之间的常用细胞系可能已不是原先认为的那样了。过去的25年里，大量的研究，加上美国、英国、德国和日本细胞库的经验发现：18-36％的培养物含有错误鉴定的物种或其它细胞类型。

2010年5月ATCCSDO(StandardsDevelopmentOrganization)工作组在Naturereviewcancer杂志上发表了题为《Celllinemisidentification：thebeginningoftheend》前瞻性报道。报道指出：细胞系作为正常或肿瘤组织的模式细胞被广泛应用于科学研究和药物开发，然而很大一部分的细胞系被错误标记或被其它个体、组织、种系来源的细胞所替代，由于科学界无法解决此类问题以致大量因使用错误鉴定的细胞系而导致误导或存在潜在错误的学术论文发表。

目前许多方法已被用来检测细胞系交叉污染，包括同工酶分析、核型分析、人类白细胞抗原(HLA)分型，免疫分型和DNA指纹识别。这些方法都可以鉴别出某一种细胞系，但是鉴别细胞交叉污染的能力各不相同。而且，这些方法在不同实验室所得到的数据却不尽相同，以致没有任何一种方法可以用来建立一个标准参考数据库。

STR位点是生物物种基因组上存在的由不同数目重复单元组成的重复DNA序列，具有高度多态性，是一种良好的物种内或物种间鉴别的标记。通过一个PCR反应，可同时扩增出多个长短不一的STR片段，通过引物上标记的不同荧光基团，对不同的STR组别加以区分，可形成具有个体特征的图谱，进而可以对细胞进行鉴别。STR检测最先应用于亲缘鉴定、法医鉴定、以及鉴定在20年之前的大灾难中遇难的受害者。随后，STR分型用于细胞鉴定中。目前，STR分型技术已被广泛应用于人源细胞系的鉴定，并已建立起标准的STRMarker组合，用于鉴定1000多种细胞。

在过去一个世纪的研究中，小鼠已经成为建立人类遗传性疾病的动物模型的最佳实验材料，小鼠细胞系已广泛应用于生命科学研究的各个领域。如3T3、小鼠骨髓瘤细胞、L-929、和CTLL-2等多种，是除了人类细胞外被应用数量最多的动物细胞，数量有几百种。因此，建立小鼠细胞系的STR分型方法，对于每一位使用小鼠细胞系的研究者来说无疑是一个福音，也必将极大地促进人类健康事业的发展。

在2011年，专利CN102559878B，率先建立了小鼠短串联重复序列的复合扩增体系及检测试剂盒，包含7个STR位点和1个性别判定位点，打开STR小鼠细胞分型检测的新篇章。但该专利采用的STR位点均为2nt.重复，导致stutter峰高，不利于判断小鼠细胞间交叉污染；并且仅有小鼠STR位点，无法对人、鼠细胞交叉污染做出判断。

发明内容

针对上述领域中的不足和需求，本发明提供一种鉴定小鼠细胞系的复合扩增体系，其扩增的位点是一些可以用来鉴定小鼠细胞系的STR位点，在鉴定小鼠细胞系时，具有快速、操作简单、结果准确、便于大规模推广等优点，这种方法随着试剂盒开发成功可以批量生产，使用条件可以模式化，全部过程都有自动化设备，不再依赖于人的操作经验，可以实现自动化，所需时间短，整个检测时间需要6小时左右。

小鼠短串联重复序列的复合扩增体系，所述扩增体系中同时扩增小鼠STR位点M-1、M-2、M-3、M-4、M-5、M-6、M-7、M-8和M-9，其序列分别如SEQIDNO:1、SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:11所述。

所述扩增体系中还包括性别判定位点Jarid1。

所述扩增体系中还包括人源STR位点CSF1PO和vWA。

所述引物分别为：

扩增M-1的引物：

引物1：TCACAGGTATTTTCTAGATGGTTCCA，

引物2：CAGCCTTAGAGTCAATCACCAGGT；

扩增M-2的引物：

引物1：TTTGAGGACAGTCTGTTTCAAA，

引物2：CAGACATTCCTGAGTTGTGG；

扩增M-3的引物：

引物1：CAGCCAGTGGAGAAGAGGGAGC，

引物2：AAACTAAGGGGCCAGTAAGATGG；

扩增M-4的引物：

引物1：TGGCTTTGAAAGAAATCCTTGATG，

引物2：GGGGAGGGTGTCCCAGACTCCA；

扩增M-5的引物：

引物1：GCCAAGATATGCAAAGAACAAAAA，

引物2：AGATGGCATTATCATATTCATGA；

扩增M-6的引物：

引物1：ATAAATAAGGTAGGAGATTAGAT，

引物2：ACTTGACATGCTTCTCAGGGAGG；

扩增M-7的引物：

引物1：TCTATACTTACATGTAACAGGT，

引物2：AAAGATTATTTTATAGTGATGGACTTAT；

扩增M-8的引物：

引物1：AGCACCAAGGTTCAACTAAGAATA，

引物2：ACTACTTCACTATAAGTAGGTAG；

扩增M-9的引物：

引物1：AGCCATGGCAGGACAGGTGGTG，

引物2：TTTAATTTTTCTTGTAACCCACA。

扩增Jarid1的引物：

引物1：GCTGACTACTTCAACATGC，

引物2：CCGCTGCCAAATTCTTTGG。

扩增CSF1PO的引物：

引物1：TCTTAACCTATTGGGAGGTCATTGT，

引物2：AGCCTTCTCAGATACTATCTCCTGG；

扩增vWA的引物：

引物1：CAAGTTGACTTGGCTGAGATGTG，

引物2：GGATGGATAGATGGATAGATAGATA。

所述扩增体系中的被扩增位点，分别由三种分别在每一对引物的其中一条引物的5’末端带有不同颜色的荧光标记物，三组组合分别为：第一组：M-1、M-2、M-3、M-4和M-5；第二组：M-6、M-7、M-8和CSF1PO；第三组：vWA、M-9和Jarid1。

所述三组中可以分别标记为FAM或荧光素、HEX或JOE、TMR或VIC。

所述第一组的标记为FAM或荧光素；所述第二组标记为HEX或JOE；所述第三组标记为TMR或VIC。

所述的扩增组合物还包括：PCR反应缓冲液和Taq酶。

小鼠短串联重复序列的检测试剂盒，包括上述扩增组合物。

所述扩增组合物引物的用量体积比为：

位点名称	体积(μl)
		M-1	5μl
M-2	2μl
		M-3	2μl
M-4	4μl
		M-5	3μl
M-6	1μl
		M-7	3μl
M-8	1μl
		CSF1PO	2μl
vWA	2μl
		M-9	3μl
Jarid1	4μl

上述试剂盒在小鼠细胞鉴别中的应用。

本发明的优势在于：

1.一次性扩增10个小鼠STR位点和性别判定位点，能得到大量的信息。

2.小鼠STR位点选用核心序列四碱基重复，Stutter峰低，易于判别细胞是否存在交叉污染。

3.增加了2个人源STR位点，可判别人鼠细胞交叉污染。

4.各个位点采用荧光标记的引物，得到的产物带有荧光标记，可以在遗传分析仪等仪器上进行检测，得到的片段长度更精确，可重复性更高。

5.能得到可重复的数据，且数据格式适合建立一个标准参考数据库。

6.所需时间短，整个检测时间需要6小时左右。

7.操作简单、便于大规模推广，这种方法随着试剂盒开发成功可以批量生产，使用条件可以模式化，全部过程都有自动化设备，不再依赖于人的操作经验，可以实现自动化。

本发明的技术思路

1、引物组合的设计

首先，我们选择了9个具有高度灵敏性及扩增特异性的小鼠STR位点，选择的位点包括M-1、M-2、M-3、M-4、M-5、M-6、M-7，M-8和M-9以及性别判定位点Jarid1。我们从小鼠的基因组数据中筛选了这些STR位点，具有高度多态性，和很强的种属特异性，跟人、大鼠、仓鼠、土拨鼠和豚鼠等物种均没有高度同源序列。为了鉴别人鼠交叉污染，我们选择2个具有高度灵敏性及扩增特异性的人源STR位点，选择位点CSF1PO和vWA。各位点所在基因的部分序列见序列表SEQIDNO1-12。

用于扩增M-1的引物对是由位于SEQIDNO1中1～26位26个连续碱基构成的引物，和与SEQIDNO1中127～150位的互补序列的24个连续碱基构成的引物的组合，

用于扩增M-2的引物对是由位于SEQIDNO2中1～22位22个连续碱基构成的引物，和与SEQIDNO2中203～222位的互补序列的20个连续碱基构成的引物的组合，

用于扩增M-3的引物对是由位于SEQIDNO3中1～22位22个连续碱基构成的引物，和与SEQIDNO3中257～279位的互补序列的23个连续碱基构成的引物的组合，

用于扩增M-4的引物对是由位于SEQIDNO4中1～24位24个连续碱基构成的引物，和与SEQIDNO4中340～361位的互补序列的22个连续碱基构成的引物的组合，

用于扩增M-5的引物对是由位于SEQIDNO5中1～24位24个连续碱基构成的引物，和与SEQIDNO5中406～428位的互补序列的23个连续碱基构成的引物的组合，

用于扩增M-6的引物对是由位于SEQIDNO6中1～23位23个连续碱基构成的引物，和与SEQIDNO6中169～191位的互补序列的23个连续碱基构成的引物的组合，

用于扩增M-7的引物对是由位于SEQIDNO7中1～22位22个连续碱基构成的引物，和与SEQIDNO7中193～220位的互补序列的28个连续碱基构成的引物的组合，

用于扩增M-8的引物对是由位于SEQIDNO8中1～24位24个连续碱基构成的引物，和与SEQIDNO8中264～286位的互补序列的23个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增CSF1PO的引物对是由位于SEQIDNO9中1～25位25个连续碱基构成的引物，和与SEQIDNO9中325～349位的互补序列的25个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增vWA的引物对是由位于SEQIDNO10中1～23位23个连续碱基构成的引物，和与SEQIDNO10中129～153位的互补序列的25个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增M-9的引物对是由位于SEQIDNO11中1～22位22个连续碱基构成的引物，和与SEQIDNO11中216～238位的互补序列的23个连续碱基构成的引物的组合。

用于扩增Jarid1的引物对是由位于SEQIDNO12中1～19位19个连续碱基构成的引物，和与SEQIDNO12中236～254位的互补序列的19个连续碱基构成的引物的组合。

以上引物由Primer3、PrimerPremier5和NCBIBlast等软件设计而成。设计引物时应尽量确保各引物的Tm值在(60±2)℃的范围内，扩增效率类似并确保各对引物的扩增产物大小相差50bp以上。设计完成后，用AutoDimer等软件分析引物二聚体和不同引物之间的相互作用，如果有相互作用可产生非特异产物或者二聚体的需要重新设计，直至得到符合要求的引物序列。

选用BALB/c小鼠DNA模板，分别用10对引物进行单重扩增，选用任一人类DNA模板，分别用2对引物进行单重扩增，将扩增产物置于1.5～2.0％的琼脂糖凝胶上电泳，根据电泳结果来调整PCR体系及扩增条件以得到12对引物共同的扩增条件。最终要达成的效果是：在相同体系及扩增条件下，所有的引物对均能出现明亮且较单一的目的条带。如果有引物满足不了上述条件，则重新设计引物。

然后，将满足要求的12对引物，分为三组进行荧光标记。每组采用一种荧光素，分别可以是FAM或荧光素、HEX或JOE和TMR或VIC。获得荧光标记引物后，用与之相配对的非荧光引物组合后分别进行单重扩增，将扩增产物置于ABI3130xl遗传分析仪上进行毛细管电泳，根据毛细管电泳检测的结果来评估每对引物的扩增效率。

其后，将同一荧光素标记的3对至5对引物混合置于同一管中扩增，将扩增产物置于ABI3130xl遗传分析仪上进行毛细管电泳，根据毛细管电泳检测的结果来确定每对引物的扩增效率以及此3对至5对引物的混合扩增是否引起非特异扩增。

最后，根据单重扩增及组合扩增的毛细管电泳结果来初步确定各引物对的加入量，将12对引物混合置于同一管中扩增，再根据复合扩增的电泳结果来调整各自的浓度，使各引物对的扩增效率(反应在电泳结果的峰高上)基本一致为准。最终确定的12对引物序列分别见序列表。

2.扩增体系及条件的建立

2.1Taq酶的选择

Taq酶是扩增体系的重要组分，多种Taq酶都满足本发明的需要，如Takara公司的rTaq酶和HSTaq酶、KAPABiosystems公司的Taq酶、Roche公司的AmpliTaqGold酶等均能得到较好的扩增效率和特异性，采用热启动Taq酶比非热启动酶的扩增特异性要好。

2.2Mg²⁺浓度的选择

我们摸索了在不同Mg²⁺浓度梯度下复合扩增的效果，其中在1.0-2.5mM的浓度范围内均能得到较好的扩增。

2.3反应体积的选择

我们分别采用了50μl、20μl和10μl体系进行了复合扩增，结果显示：50μl与20μl的体系效果基本相当，优于10μl体系的扩增效果。

2.4反应程序的优化

退火及延伸温度：我们摸索了退火温度从55℃到62℃之间各温度下的扩增情况，结果显示在59-61℃范围内均能得到较好结果。扩增循环数在28-32个之间有较好的效果。

我们摸索了在以下变性、退火及延伸温度下各时间范围内(见表1)的扩增可以得到较好的结果：表1温度与时间

附图说明

图1小鼠sp2/0细胞STR图谱，

图2小鼠SC-1细胞STR图谱，

图3小鼠NIH/3T3细胞STR图谱，

图4小鼠A9细胞STR图谱，

图5小鼠3T3Swissalbino细胞STR图谱，

图6小鼠3T6Swissalbino细胞STR图谱，

图7小鼠BALB/c3T3细胞STR图谱，

图8小鼠NS-1细胞STR图谱，

图9小鼠P3X63Ag8.653细胞STR图谱，

图10小鼠J774A.1细胞STR图谱，

图11小鼠L-M(TK-)细胞STR图谱，

图12小鼠L929细胞STR图谱，

图13小鼠NS0细胞STR图谱，

图14小鼠WEHI-13VAR细胞STR图谱，

图15小鼠CTLL-2细胞STR图谱，

图16小鼠P388细胞STR图谱，

图17小鼠M-NFS-60细胞STR图谱，

图18小鼠32DMRE-1/S#13细胞STR图谱，

图19小鼠T1165.17细胞STR图谱，

图20大鼠C6细胞STR图谱，

图21仓鼠CHO-K1细胞STR图谱，

图22土拨鼠WCH-17细胞STR图谱，

图23豚鼠104C1细胞STR图谱，

图24人源DNASTR图谱，

图25小鼠M-NFS-60细胞与人源MRC-5细胞5:1掺和STR图谱，

具体实施方式

实施例1

以下是我们采用本发明对19例小鼠细胞、1例大鼠细胞、1例仓鼠细胞、1例土拨鼠细胞、1例豚鼠细胞、1例人源DNA和1例按5:1比例掺和小鼠与人源细胞样本进行检测的具体实施情况。

1.DNA提取

采用Chelex-100、DNA提取试剂盒(天根生化)进行DNA提取，操作步骤依照说明书，DNA提取完毕用紫外分光光度计定量，并稀释成2ng/μl。

2.PCR

2.1反应体系：

将9个小鼠STR位点及性别判定位点Jarid1和2个人源STR位点，共12对引物分别溶解并配成浓度为10μM的工作液，然后按表2体积比配成引物混合液(Primermix)：引物序列见附录中序列表。

表2各引物体积比

将各反应试剂(Buffer、PrimerMix、Taq等)振荡混合后按表3体积比(DNA除外)配成PCR反应混合液，分装19μl于PCR反应管中，最后往各反应管加入1μl模板，离心后进入下一步。

表3标准扩增反应体系

H₂O	6.8μl
		2.5×Buffer	8μl
Primer mix	4μl
		Taq	0.2μl
DNA	1μl
		总计	20μl

2.2PCR反应程序：

将PCR反应管置于扩增仪上，设计并运行如下程序：第1步：95℃变性10分钟，第2步：94℃变性30秒，第3步60℃退火1分钟，第4步：70℃延伸1分钟，重复2至4步30次，最后60℃延伸15分钟。运行结束后将产物置于冰箱4℃保存。

3.毛细管电泳检测

3.1取上一步得到的PCR扩增产物，点样于1.5-2.0％琼脂糖凝胶上，电泳20min后观察结果，若在100-450bp处出现明亮的阶梯条带则可上机检测。

3.2根据电泳胶图上的样品的条带亮度，确定样品稀释倍数，按稀释倍数将扩增产物稀释待用。将ROX500内标和甲酰胺按比例50：1000混合，取9μl混合物加到96孔板里，再加入稀释过的样品1μl，混合静置数分钟，写上板号，离心后放入ABI3130xl测序仪上，准备检测。

3.3打开ABI3130xl测序仪数据采集软件，编辑上机检测的板标，导入检测程序。

3.4点击运行，即开始检测。

3.5检测完毕后，将数据拷贝至光盘。

4.数据分析

4.1导入原始数据，在主页面的File菜单选择Addsampletoproject，找到样品文件，选中文件夹，点击addtolist，点击add，样品文件即显示在Project窗口；

4.2选择分析参数。定义analysismethod、panel和sizestandard。浏览样本电泳的原始数据，任一样本文件名，在“Sample”菜单下选择“Rawdata”。移动追踪线，使光标停在引物峰右侧(第一个红色的内标峰之前)，以此时窗口左下角X轴上显示的数值作为analysismethod分析参数中的起始点；

4.3点击绿色分析按钮，出现Saveproject对话框，命名后保存，软件即开始处理数据，分析完成后左下角显示analysiscompleted。

4.4采用GeneMapperv3.2软件分析得到的数据并生成图谱，见图1-25。

5.结果分析

通过分型图(见图1-19)可知，19种小鼠细胞在M-1、M-2、M-3、M-4、M-5、M-6、M-7、M-8和M-9，9个小鼠STR位点分型没有完全相同的分型结果。因此可以用这种方法为这19个小鼠细胞系建立特征性的STR图谱，对这些小鼠细胞进行鉴定。

通过分型图(见图20-25)可知，6种非小鼠细胞或DNA在M-1、M-2、M-3、M-4、M-5、M-6、M-7、M-8和M-9，9个小鼠STR位点均无分型结果，其中人源DNA在CSF1PO和vWA人源STR位点有分型结果。因此可以证明我们选用的9个小鼠STR位点物种特异性强，无其他物种干扰。

支持课题：

1、国家科技部十二五“863”计划：疫苗效果和质量评价新技术研究，课题编号：2012AA02A402

2、国家科技基础条件平台：国家实验细胞资源共享平台。

Claims

1.小鼠短串联重复序列的复合扩增体系，其特征在于：所述复合扩增体系中包括引物混合物，所述引物可同时扩增9个小鼠STR位点M-1、M-2、M-3、M-4、M-5、M-6、M-7、M-8、M-9，所述位点的序列分别如SEQIDNO:1、SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:11所述，所述引物分别为：

扩增M-1的引物：

引物1：TCACAGGTATTTTCTAGATGGTTCCA，

引物2：CAGCCTTAGAGTCAATCACCAGGT；

扩增M-2的引物：

引物1：TTTGAGGACAGTCTGTTTCAAA，

引物2：CAGACATTCCTGAGTTGTGG；

扩增M-3的引物：

引物1：CAGCCAGTGGAGAAGAGGGAGC，

引物2：AAACTAAGGGGCCAGTAAGATGG；

扩增M-4的引物：

引物1：TGGCTTTGAAAGAAATCCTTGATG，

引物2：GGGGAGGGTGTCCCAGACTCCA；

扩增M-5的引物：

引物1：GCCAAGATATGCAAAGAACAAAAA，

引物2：AGATGGCATTATCATATTCATGA；

扩增M-6的引物：

引物1：ATAAATAAGGTAGGAGATTAGAT，

引物2：ACTTGACATGCTTCTCAGGGAGG；

扩增M-7的引物：

引物1：TCTATACTTACATGTAACAGGT，

引物2：AAAGATTATTTTATAGTGATGGACTTAT；

扩增M-8的引物：

引物1：AGCACCAAGGTTCAACTAAGAATA，

引物2：ACTACTTCACTATAAGTAGGTAG；

扩增M-9的引物：

引物1：AGCCATGGCAGGACAGGTGGTG，

引物2：TTTAATTTTTCTTGTAACCCACA。

2.根据权利要求1所述小鼠短串联重复序列的复合扩增体系，所述引物混合物中还包括1对引物，还能同时扩增1个小鼠性别判定位点Jarid1，所述引物为：

扩增Jarid1的引物：

引物1：GCTGACTACTTCAACATGC，

引物2：CCGCTGCCAAATTCTTTGG。

3.根据权利要求1或2所述小鼠短串联重复序列的复合扩增体系，所述引物混合物中还包括2对引物，还能同时扩增人源STR位点CSF1PO和vWA，所述引物为：

扩增CSF1PO的引物：

引物1：TCTTAACCTATTGGGAGGTCATTGT，

引物2：AGCCTTCTCAGATACTATCTCCTGG；

扩增vWA的引物：

引物1：CAAGTTGACTTGGCTGAGATGTG，

引物2：GGATGGATAGATGGATAGATAGATA。

4.根据权利要求3所述小鼠短串联重复序列的复合扩增体系，所述引物混合物中有12对引物，分为三组，每组引物带有不同的荧光标记物，三组引物分别在每一对引物的其中一条引物的5’末端带有不同颜色的荧光标记物，所述第一组为M-1、M-2、M-3、M-4和M-5；第二组为M-6、M-7、M-8和CSF1PO；第三组为vWA、M-9和Jarid1。

5.根据权利要求4所述的小鼠短串联重复序列的复合扩增体系的扩增组合物，所述第一组、第二组和第三组分别采用以下三种荧光标记：FAM或荧光素、HEX或JOE和TMR或VIC。

6.根据权利要求5所述的小鼠短串联重复序列的复合扩增体系，所述的扩增组合物还包括：PCR反应缓冲液、模板DNA和Taq酶。

7.根据权利要求6所述的小鼠短串联重复序列的复合扩增体系，所述Taq酶为热启动Taq酶。

8.小鼠短串联重复序列的复合扩增检测试剂盒，包括权利要求1-7任一所述的复合扩增体系。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，所述引物有12对，其用量体积比为：

10.根据权利要求7所述的试剂盒，所述扩增组合物的含量如下：

无核酸酶纯水 6.8μl 2.5×PCR反应缓冲液 8μl 引物混合物 4μl Taq酶 0.2μl 模板DNA 1μl 总计 20μl

。