CN102586456A - 一种多重竞争性pcr检测拷贝数变异的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基于通用荧光引物的多重竞争性PCR检测拷贝数变异的方法，包括下列步骤：(1)提供多重竞争性PCR引物，由至少一对通用荧光引物、至少一对位于待测基因上下游的嵌合特异引物和至少三对参照引物组成；(2)定量合成内对照DNA片段；(3)多重竞争性PCR反应过程；和(4)数据分析。本发明还提供基于以上分析方法的试剂盒，适用于5～28个基因/反应的拷贝数变异的检测，是一种快速、中通量、经济的拷贝数变异检测方案。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于荧光通用引物的多重竞争性PCR检测拷贝数变异的方法，应用于生物科学研究与临床分子诊断。
背景技术
拷贝数变异(copy number variations，CNVs)是近年来发现的基因组多样性的新形式，它是指与参考序列相比，基因组中1kb～3Mb的DNA片段的结构变异现象。CNVs广泛存于基因组中，与一些遗传性疾病的发生相关，对人类抗病性和易感性表型等变异有重要影响。这就要求建立一种快速、准确和低成本的CNVs分型检测技术。
随着生物技术的发展，不同的研究小组相继开发了许多的检测方法，主要包括以杂交为基础和以PCR为基础的检测技术。前者可以在全基因组水平上对CNVs进行检测，代表技术有微阵列比较基因杂交(SolinasToldo，Lampel et al.1997)、全基因组SNP芯片(Irving，Bloodworth et al.2005)、代表性寡核苷酸微阵列技术(Lucito，Healy et al.2003)等，其优点是通量高且易于实现自动化，但是普遍存在分辨率低、成本高和周期长的缺点。后者主要是针对具体的目标位点进行检测，代表性的技术有实时荧光定量PCR、多重连接探针扩增技术(MLPA)(Schouten，McElgunn et al.2002)和多重可扩增探针杂交(MAPH)(Armour，Sismani et al.2000)等。实时荧光定量技术有操作简单、重复性好、实验周期短等优点，但是检测通量较小；与实时荧光定量PCR相比，MLPA和MAPH的检测通量有了很大提高，不过PCR微环境的变化会导致不同位点不能完全同步扩增，而且PCR的平台效应也会影响检测结果。以PCR为基础的检测技术存在一个共同的缺陷就是待测样本和对照样本是分开检测的，这样两者PCR效率的差异会引起检测结果的偏差。
竞争性PCR克服了这个缺陷，实现CNVs的快速、准确、经济的检测。在PCR扩增过程中，PCR产物的量可以用公式Y＝A(1+R)n来表示，其Y表示PCR产物的量，A表示初始模板的量，R表示PCR的扩增效率，n表示PCR的循环数，当PCR扩增效率相同时，PCR产物的量与初始模板的量成正比。竞争性PCR利用了这一原理，在同一PCR反应体系中涉及两组模板，一组是待测样本，另一组是合成的一段核酸序列，用作内对照，两组模板仅在目标序列长度上(存在一些碱基的插入或缺失)存在一些差异，其他反应条件一致，因此两者扩增效率接近一致，两种扩增产物量的比直观的反映了初始模板(待测样本和内对照不存在拷贝数差异)量的比，可以根据内对照的初始模板的量来计算样本的浓度。在检测拷贝数变异时，当两模板具有相同的浓度或削除了浓度差异带来的影响时，PCR产物量的比值就反映模板拷贝数的差异。PRT法(Paralogue Ratio Test)(Armour，Palla et al.2007)是基于竞争性PCR的一种检测CVNs的一种方法，此方法的优点是待测位点和内对照共存于基因组序列中，但是缺点也是很明显的，只能针对有限的基因位点进行检测，而且针对不同检测位点都要设计一对荧光引物，加大了实验成本。内对照可以采用人工合成的方法，还有其他的一些制备方法(Zentilin and Giacca 2007)，不过这种方法设计的内对照序列较待测位点的序列不一致，导致两者PCR扩增效率差异大，最终影响拷贝数的检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种成本低、通量较高、样本需求低、检测灵敏性高的CNVs检测方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
技术方案之一是提供一种基于荧光通用引物的多重竞争性PCR检测拷贝数变异的方法，包括以下步骤：
(1)提供多重竞争性PCR引物，由至少一对通用荧光引物、至少一对位于待测基因上下游的嵌合特异引物和至少三对参照引物组成：
所述通用荧光引物长度范围为10～25bp，5’端用荧光标记，TM值≤57℃值，且通用引物对待测基因组具有特异性；
所述嵌合特异引物和所述参照引物针对参照区段和检测区段设计，TM值≥62℃，长度范围为28～50bp，3’端为18～25bp的特异引物序列，5’端为所述通用引物序列，所述3’端和5’端的序列之间插入两个碱基的固定组合；所有嵌合引物之间的TM值的差异不超过3℃；所述三对参照引物设计在相同或不同的参照区段上，且与待测基因无特异性匹配；
所述多重竞争性PCR引物所产生的不同扩增产物片段之间有可检出的长度差异；
(2)定量合成内对照DNA片段：针对每一个待测区段和每一个参照区段的扩增产物片段，合成相对应的内对照序列，并进行精确定量；所述内对照序列与所述待测区段和参照区段的扩增产物片段相比插入或缺失2～3bp的DNA片段；
(3)多重竞争性PCR的反应过程：
(a)将含待测区段和参照区段的待测样本和对照样本分别与相等或整数倍mol数的内对照DNA片段混合在一起，然后进行PCR，前3～16个循环，退火温度高于所述通用荧光引物的退火温度，用于所述嵌合特异引物引导的扩增，后17～20个循环，退火温度低于所述通用荧光引物的退火温度，用于所述通用引物引导的扩增，两组退火温度的差距≥5℃；
(b)根据荧光标记PCR扩增产物长度不同，对扩增产物片段进行检测，获得待测样本中待测区段和参照区段以及内对照扩增产物片段的长度信息与相应的荧光强度信息；
(4)数据分析
i.计算每个待测区段和参照区段的样本峰高和/或峰面积(S)和内对照的峰高和或峰面积(I)，得到每个待测区段和参照区段的比值(S/I)；
ii.以一个参照区段的比值为标准，将所有待测区段和参照区段的比值同其作比，进行数据内部标化；
iii.按照i和ii的步骤将对照样本进行数据内部标化；
iv.将待测样本和对照样本的内部标化值作比，获得待测样本与对照样本的比值，该比值乘以对照样本的拷贝数，得到待测样本的拷贝数。
上述技术方案的优选方式之一为，所述通用荧光引物长度范围为18～20bp。
上述技术方案的优选方式之二为，所述嵌合特异引物和所述参照引物的长度范围为38～45bp。
上述技术方案的优选方式之三为，所述多重PCR引物对应的扩增产物的长度范围为120～350bp，不同扩增产物片段的长度差异为8～50bp。
上述技术方案的优选方式之四为，所述嵌合特异引物和所述参照引物的3’端的特异引物序列段长度为18～20bp。
上述技术方案的优选方式之五为，所述的多重竞争性PCR引物由一到四对不同荧光标记的通用荧光引物、一到二十五对针对相同或不同待测基因的嵌合特异引物和三到六对针对相同或不同基因的参照引物组成。或者作为另一种优选方式，所述的多重竞争性PCR引物由一对通用荧光引物、一到五对针对不同待测基因的嵌合特异引物和三到五对参照引物组成。
上述技术方案的优选方式之六为，所述的三到六对参照引物中至少两对设计在常染色体上，至少一对设计在X染色体上。
本发明的技术方案之二是提供上述的分析方法在检测基因拷贝数变异中的应用。
本发明的技术方案之二是一种基于上述的分析方法的试剂盒，提供通用荧光引物、嵌合特异引物、参照引物和定量的内对照DNA、和/或多重竞争性PCR的反应的试剂。
本发明在总结现有技术中各种检测方法的优缺点基础上，经过自主创新研发，成功地试用于应用于生物科学研究与临床分子诊断等领域，并且有广泛的潜在应用市场。
本发明令人惊奇地发现具有以下优点：
1、成本低。针对所有的检测位点，应用了通用荧光引物，并采用同一的参照区段，这些措施都大大降低了实验成本。
2、实验周期短。相对于MLPA技术(需要两天)来讲，一天内就可以得到实验结果。可对少量样本多个基因进行同时检测，大大缩短了实验周期，提高了实验效率。
3、数据更准确。本发明中使用了通用荧光引物，而引物的3’端统一为ct两个碱基，保证了不同位点扩增的同步性和起始效率的一致性。
附图说明
图1为一个参照区段和三个目标区段的多重PCR的试验结果。
图2为图1的多重PCR的试验的原理示意图(分析过程中涉及两组引物：一组是多重上下游嵌合特异引物；另一组是荧光通用引物)。
图3为实施例1中样本检测结果示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解，实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式有同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
利用本发明所述的方法对3个转基因小鼠(ZYJ-1、ZJY-2、ZJY-3)进行了拷贝数的检测，另外还包括2只C57BL/6小鼠(其中一只为雌性B6F，一只为雄性B6M)为对照样本。
实验步骤：
1、通用引物、嵌合特异引物的设计：
通用引物的设计：设计原则保证上下游引物的TM值≤57℃，且差距不超过3℃，针对小鼠和人基因组特异，引物相互作用小，上游通用引5’端用Fam荧光标记。通用引物序列为上游：5’-TTCATCCGTTCGTCCTAC-3’；下游：5’-ACAGCGTCAATCTCGTTC-3’。
嵌合特异引物的设计：根据小鼠转基因的区段，我们选择了3个目标基因和5个参基因区段(其中3个位于常染色个上，2个位于X染色体上)，共设计了8对特异引物，并与通用引物组合成特异引物，且在通用引物的3’端插入ct两个碱基，要求TM值≥62℃，扩增产物的长度在120～350bp之间，相邻产物长度的差至少为8bp。所有的引物均经过Blast和Oligo mask软件的分析，从而减少非特异扩增和引物二聚体。
表一目标区段和参照区段的嵌合特异引物序列
2、制备内对照片段：
针对不同的位点，使得嵌合特异引物延伸处插入或缺失2bp碱基，并人工合成内对照序列。
稀释合适的摩尔浓度为103～104个分子/μL，作为内对照备用。
3、多重竞争性PCR的反应过程
(1)样本DNA(待测样本和对照样本)紫外定量，并稀释到30ng/μL备用，将样本DNA和内对照等摩尔浓度混合。
(2)混合所有嵌合特异引物，并将浓度调为0.5μM，通用引物稀释为20μM，将通用引物和嵌合特异引物等比例混合。
(3)多重PCR反应体系及反应程序
表二(1)多重PCR反应体系
表二(2)多重PCR温度循环条件
(4)取1μL PCR产物稀释16倍，从中取1μL，加入8.6μL的Hi-Di和0.4μL的DNA分子标准。上述混合物95℃，变性5min，然后迅速冰水浴2min，离心后用ABI测序仪3730进行检测。
4、数据分析：
3730测序仪检测结果经GeneScan
3.0和GeneMapper
ID software v3.2软件分析获得产物大小，峰高、峰面积等数据。产物大小由DNA分子标准得出，峰高或峰面积用判断PCR产物的量。
表三数据分析
Rfx3、Ankrd42、Atp8a1三个参照基设定在常染色体上，Atrx、Reps2两个参照基因设定在X染色体上。数据内部标化时，以基因Rfx3作为标准，数据外部标化时以B6F作为标准。
B6F和B6M为对照样本，其基因组是2拷贝；ZYJ-1、ZJY-2、ZJY-3三个为待测样本。根据目标基因对三个待测小鼠样本进行分析，我们可以看出ZYJ-1目标区段为4拷贝，ZJY-2目标区段为3拷贝，ZJY-3目标区段为5拷贝。
Claims (10)
1.一种基于荧光通用引物的多重竞争性PCR检测拷贝数变异的方法，包括以下步骤：
(1)提供多重竞争性PCR引物，由至少一对通用荧光引物、至少一对位于待测基因上下游的嵌合特异引物和至少三对参照引物组成：
所述通用荧光引物长度范围为10～25bp，5’端用荧光标记，TM值≤57℃值，且通用引物对待测基因组具有特异性；
所述嵌合特异引物和所述参照引物针对检测区段和参照区段设计，TM值≥62℃，长度范围为28～50bp，3’端为18～25bp的特异引物序列，5’端为所述通用引物序列，所述3’端和5’端的序列之间插入两个碱基的固定组合；所有嵌合引物之间的TM值的差异不超过3℃；所述三对参照引物设计在相同或不同的参照区段上，且与待测基因无特异性匹配；
所述多重竞争性PCR引物所产生的不同扩增产物片段之间有可检出的长度差异；
(2)定量合成内对照DNA片段：针对每一个待测区段和每一个参照区段的扩增产物片段，合成相对应的内对照序列，并进行精确定量；所述内对照序列与所述待测区段和参照区段的扩增产物片段相比插入或缺失2～3bp的DNA片段；
(3)多重竞争性PCR的反应过程：
(a)将含待测区段和参照区段的待测样本和对照样本分别与相等或整数倍mol数的内对照DNA片段混合在一起，然后进行PCR，前3～16个循环，退火温度高于所述通用荧光引物的退火温度，用于所述嵌合特异引物引导的扩增，后17～20个循环，退火温度低于所述通用荧光引物的退火温度，用于所述通用引物引导的扩增，两组退火温度的差距≥5℃；
(b)根据荧光标记PCR扩增产物长度不同，对扩增产物片段进行检测，获得待测样本中待测区段和参照区段以及内对照扩增产物片段的长度信息与相应的荧光强度信息；
(4)数据分析
i.计算每个待测区段和参照区段的样本峰高和/或峰面积(S)和内对照的峰高和或峰面积(I)，得到每个待测区段和参照区段的比值(S/I)；
ii.以一个参照区段的比值为标准，将所有待测区段和参照区段的比值同其作比，进行数据内部标化；
iii.按照i和ii的步骤将对照样本进行数据内部标化；
iv.将待测样本和对照样本的内部标化值作比，获得待测样本与对照样本的比值，该比值乘以对照样本的拷贝数，得到待测样本的拷贝数。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述通用荧光引物长度范围为18～20bp。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述嵌合特异引物和所述参照引物的长度范围为38～45bp。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述多重PCR引物对应的扩增产物的长度范围为120～350bp，不同扩增产物片段的长度差异为8～50bp。
5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述嵌合特异引物和所述参照引物的3’端的特异引物序列段长度为18～20bp。
6.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的多重竞争性PCR引物由一到四对不同荧光标记的通用荧光引物、一到二十五对针对相同或不同待测基因的嵌合特异引物和三到六对针对相同或不同基因的参照引物组成。
7.根据权利要求6所述的分析方法，其特征在于，所述的多重竞争性PCR引物由一对通用荧光引物、一到五对针对不同待测基因的嵌合特异引物和三到五对参照引物组成。
8.根据权利要求6所述的分析方法，其特征在于，所述的三到六对参照引物中至少两对设计在常染色体上，至少一对设计在X染色体上。
9.权利要求1所述的分析方法在检测基因拷贝数变异中的应用。
10.一种基于权利要求1所述的分析方法的试剂盒，提供通用荧光引物、嵌合特异引物、参照引物和定量的内对照DNA、和/或多重竞争性PCR的反应的试剂。
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